DANIEL MALENFANT

ÉTUDE DES FONCTIONS DÉVELOPPEMENTALES ET MÉTABOLIQUES DU RÉCEPTEUR NUCLÉAIRE FETOPROTEIN (FTF)

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval dans le cadre du programme de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2012

© Daniel Malenfant, 2012

Résumé

Le récepteur nucléaire Fetoprotein Transcription Factor (FTF) identifié par notre laboratoire et exprimé principalement dans le système digestif est un régulateur important du métabolisme des lipides et des stéroïdes, de la prolifération cellulaire et du développement embryonnaire. Plusieurs groupes ont constaté que l’influence du récepteur FTF sur la synthèse de stéroïdes et la régulation du cycle cellulaire stimule la prolifération tumorale de cellules d’origine tissulaire diverse. Mes études de doctorat ont porté sur l’expression tissulaire de FTF, sur la caractérisation d’un nouvel élément régulateur de son promoteur et sur l’identification par immunoprécipitation de chromatine (ChIP-chip) des cibles transcriptionnelles de FTF dans le foie de souris fœtale et adulte et dans les cellules d’hépatome humain. Ces études ont permis de mieux définir le rôle métabolique de FTF ainsi que son rôle développemental et son implication potentielle dans la carcinogenèse hépatique. L’expression de FTF par les organes du système digestif et par certaines structures nerveuses, sa régulation par des récepteurs nucléaires métaboliques et sa liaison aux promoteurs de multiples enzymes et transporteurs impliqués dans le métabolisme énergétique placent FTF dans une position clé dans l’homéostasie métabolique et énergétique de l’organisme. Le facteur de transcription C/EBPpartenaire de FTF au promoteur de l’AFP et impliqué lui aussi dans le développement hépatique et le métabolisme énergétique, est lié au promoteur de 20% des cibles transcriptionnelles de FTF. De plus, C/EBP lie le promoteur de FTF formant ainsi une autre boucle activatrice s’ajoutant au réseau transcriptionnel hépatique. Dans les cellules d’hépatome, FTF lie les promoteurs de plusieurs gènes impliqués dans la prolifération et le maintien des cellules tumorales, soit des régulateurs de la réplication, de la croissance et de l’apoptose cellulaire. FTF fait donc partie intégrante du réseau transcriptionnel hépatique régissant le développement et la différenciation hépatique et le maintien du métabolisme énergétique chez l’adulte et est vraisemblablement impliqué dans la promotion de la cancérogenèse hépatique.

ii

Abstract

FTF is a nuclear principally expressed in adult digestive organs that has been shown to act as a major regulator of lipids and , cellular proliferation and embryonic development. FTF involvement in synthesis and cell cycle regulation tends toward the stimulation of tumor proliferation in neoplasic tissues in which FTF is expressed. However, more studies of FTF function in normal and disease states and on its regulation are needed to draw a complete picture of FTF activity in cell physiology. Within the context of my studies, I delineated the FTF adult and fetal tissular expression, characterized a novel Ftf promoter element and identified FTF direct hepatic transcriptional targets in fetal, adult and tumor cell lines by using chromatin immunoprecipitation (ChIP- on-chip). These studies defined new FTF functions in metabolism, fetal development and hepatic carcinogenesis. FTF expression in digestive system and in neural structures controlling eating behavior, its transcriptional regulation by metabolic nuclear receptors and its binding to enzyme and transporter promoters driving energy metabolism, puts FTF in a key location for governing cellular and organismal energy metabolism. C/EBP, a transcriptional FTF partner on the Afp gene promoter and also involved in energy metabolism, is bound to 20% of the FTF targets including FTF itself thus adding branches to the complex hepatic transcriptional network. In hepatoma cells, FTF binds to proliferation and tumor cell maintenance like replication, growth and apoptosis regulators. Therefore, FTF belongs to the hepatic transcription network that governs hepatic development, differentiation and adult energy metabolism and is likely to be involved in promoting hepatic tumorogenesis.

Avant-Propos

Je remercie le Dr. Luc Bélanger pour m’avoir permis d’effectuer mes travaux de recherche dans son laboratoire ainsi que pour son support financier tout au cours de mes études graduées. Je remercie aussi le Dr. Jacques Côté et Génome Québec pour le financement d’une partie des mes recherches doctorales.

Merci à Alain-Roger Bataille et Éric Paquet pour leur implication directe dans la l’acquisition et l’analyse des données présentées dans le chapitre 3 de cette thèse.

Un gros merci à tous les gens ayant travaillé dans le laboratoire du Dr. Bélanger durant mes études graduées, tout particulièrement Sylvie Roy, Denis Allard, Frédéric St- Pierre, Alain Lamontagne, Julie Poulin, Chantal Courtemanche, Jean-François Paré et Mariève Jacob-Wagner. Ils m’ont apporté un support autant moral qu’immoral et ont égayé mes journées.

Enfin, merci à tous ceux avec qui j’ai joué au soccer, fait de l’escalade, et surtout à mon équipe de bateau-dragon « les Barbares de Québec » pour des heures de divertissement et de dépassement de soi. J’ai vraiment beaucoup de plaisirs à vous cotôyer et à repousser les limites avec vous.

"Patience et longueur de temps font plus que force ni que rage" -Jean De la Fontaine

Table des matières

Résumé ...... i Abstract ...... ii Avant-Propos ...... iii Table des matières ...... v Liste des tableaux ...... vii Liste des figures ...... viii Liste des abréviations ...... ix Chapitre 1 Introduction ...... 1 1.1 Le foie ...... 2 1.1.1 Architecture ...... 2 1.1.2 Développement ...... 6 1.1.3 Fonctions ...... 9 1.1.4 Maladies hépatiques et cancer ...... 15 1.2 Transcription ...... 18 1.2.1 Généralités ...... 18 1.2.2 Les éléments régulateurs ...... 23 1.2.3 Facteurs de transcription ...... 27 1.3 Transcription hépatique ...... 30 1.3.1 Hepatocyte Nuclear Factor (HNF) ...... 31 1.3.2 CAAT/enhancer binding (C/EBP) ...... 34 1.3.3 Les récepteurs nucléaires ...... 37 1.3.4 Autres facteurs ...... 43 1.4 FTF (Fetoprotein Transcription Factor) ...... 44 1.4.1 Généralités ...... 44 1.4.2 Structure et activité ...... 46 1.4.3 Promoteurs ...... 48 1.4.4 Expression tissulaire ...... 50 1.4.5 Fonction ...... 51 1.5 But des travaux de doctorat ...... 54 Chapitre 2 The Fetoprotein Transcription Factor (FTF) gene is essential to embryogenesis and cholesterol homeostasis and is regulated by a DR4 element .... 56 2.1 Avant-propos ...... 57 2.2 Résumé ...... 57 2.3 Abstract ...... 58 2.4 Introduction ...... 59 2.5 Experimental procedure ...... 60 2.5.1 FTF Gene Inactivation ...... 60 2.5.2 In Situ Hybridization ...... 62 2.5.3 LacZ Activity ...... 62 2.5.4 Microarray Analysis ...... 63 2.5.5 Northern Blots ...... 63 2.5.6 Quantitative PCR ...... 63 2.5.7 Electromobility Shift and Scatchard Assays ...... 64 2.5.8 Western Blots ...... 65 vi

2.5.9 Transfection Assays ...... 65 2.5.10 Diets and Hormone Treatment ...... 66 2.5.11 FTF Transgenic Mice ...... 66 2.6 Results ...... 67 2.6.1 The FTF-lacZ Mouse ...... 67 2.6.2 FTF Expression Sites Throughout Development ...... 69 2.6.3 Phenotype of FTF-/- Mice ...... 71 2.6.4 Phenotype of FTF+/- Mice ...... 72 2.6.5 DR4 Regulatory Element in the FTF Gene Promoter...... 77 2.7 Discussion ...... 81 2.7.1 FTF in the Embryo ...... 81 2.7.2 FTF in the Adult ...... 82 2.8 Données complémentaires ...... 86 Expression développementale de FTF ...... 86 Chapitre 3 Genome wide analysis of FTF transcriptional targets in liver cells ...... 89 3.1 Avant propos ...... 90 3.2 Résumé ...... 90 3.3 Abstract ...... 91 3.4 Introduction ...... 91 3.5 Material and methods ...... 93 3.5.1 Animals ...... 93 3.5.2 Cell culture ...... 93 3.5.3 Chromatin immunoprecipitation assays (ChIP) ...... 93 3.6 Results ...... 96 3.6.1 Adult liver ...... 96 3.6.2 Fetal liver ...... 100 3.6.3 Hepatoma cells ...... 102 3.7 Discussion ...... 102 3.8 Conclusions ...... 105 Chapitre 4 Discussion ...... 106 4.1 Développement embryonnaire et différenciation ...... 107 4.2 Métabolisme hépatique chez l’adulte ...... 109 4.2.1 Métabolisme des lipides ...... 110 4.2.2 Métabolisme du glucose ...... 113 4.2.3 Métabolisme énergétique ...... 116 4.2.4 Métabolisme des xénobiotiques ...... 118 4.3 Cancérogenèse ...... 119 4.4 Cibles communes de FTF et C/EBP ...... 120 4.5 Conclusion générale ...... 121 4.6 Perspectives ...... 122 Bibliographie ...... 125 Données supplémentaires ...... 155 Liste des figures ...... 155 Liste des tableaux ...... 155

Liste des tableaux

Table 2.1 : Genotypes of embryos (E, embryonic day) from interbred FTF+/- mice. .. 72 Table 2.2 : Serum cholesterol levels in wild-type (+/+) and FTF-haploid (+/-) mice fed a control diet or a 2% cholesterol diet for 5 days...... 73 Table 2.3 : Microarray analysis of liver in adult male Ftf+/- mice...... 75 Table 3.1 : FTF gene targets related to mitochondrion in adult mouse liver...... 98 Table 3.2 : FTF potential transcriptional partners...... 99

Liste des figures

Figure 1.1 : Morphologie du foie...... 4 Figure 1.2 : Zonation métabolique des lobules du foie...... 5 Figure 1.3 : Spécification hépatique de l’endoderme...... 7 Figure 1.4 : Formation du bourgeon hépatique...... 8 Figure 1.5 : Métabolisme hépatique...... 11 Figure 1.6 : Le processus de la respiration cellulaire...... 13 Figure 1.7 : Développement de l’hépatocarcinome...... 16 Figure 1.8 : Déroulement de la transcription...... 19 Figure 1.9 : Assemblage du complexe de pré-initiation...... 21 Figure 1.10 : Les étapes de l’élongation transcriptionnelle...... 22 Figure 1.11 : Types de promoteur eukaryote...... 24 Figure 1.12 : Élements consensus des promoteurs minimaux...... 25 Figure 1.13 : Module de régulation de la transcription chez l’eukaryote...... 27 Figure 1.14 : Mode de liaison des facteurs de transcription...... 29 Figure 1.15 : La régulation de la transcription par les facteurs de transcription...... 29 Figure 1.16 : Réseaux transcriptionnels hépatiques à divers stades du développement murin (E14,5 et E18,5) et chez l’adulte (P45)...... 30 Figure 1.17 : Structure des récepteurs nucléaires...... 38 Figure 1.18 : Arbre phylogénique de la famille NR5A...... 45 Figure 1.19 : Structure du récepteur nucléaire FTF...... 47 Figure 1.20 : Promoteur proximal du gène Ftf...... 49 Figure 2.1 : Ftf gene inactivation...... 68 Figure 2.2 : FTF expression sites and knockout phenotype...... 70 Figure 2.3 : EMSA analyses on liver nuclear from FTF+/+ and FTF+/- mice...... 73 Figure 2.4 : Northern blot analysis of liver mRNAs from adult Ftf+/+ and Ftf+/- mice...... 75 Figure 2.5 : Quantitative analysis of liver mRNAs from TgF35 MTI-HA-FTF transgenic and wild-type B6C3F1 mice...... 77 Figure 2.6 : Characterization of a DR4 sequence in the FTF gene promoter...... 80 Figure 2.7 : Liver FTF response in vivo to cholesterol or thyroid hormone...... 81 Figure 2.8 : Model derived from the present and other studies, integrating FTF regulation and function in cholesterol-bile acid homeostasis...... 85 Figure 2.9 : Expression tissulaire développementale de l’hybride FTF/-gal chez la souris...... 87 Figure 3.1 : Genome wide location analysis of FTF and CEBP gene targets in adult mouse liver...... 97 Figure 3.2 : Adult liver FTF gene targets in energy metabolism related pathways...... 98 Figure 3.3 : C/EBP targets related to major energy metabolism pathways...... 100 Figure 3.4 : Genome wide location analysis of FTF and CEBP binding targets in fetal mouse liver...... 101

ix

Liste des abréviations aa acide aminé ABC1 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 1 acétyl-CoA acétyl coenzyme A ADN acide désoxyribonucléique ADP adénosine diphosphate AF-2 activating function 2 (fonction activatrice 2) AFB1 aflatoxine B1 AFP alpha-1-foetoprotéine AMPc Adénosine monophosphate cyclique APC adenomatosis polyposis coli APOA1 apolipoprotéine A1 APR acute phase response (réaction de phase aigüe) AR (récepteur des androgènes) ARN acide ribonucléique ARNi interférence de l’ARN ARNm ARN messager ARN pol ARN polymérase ARNr ARN ribosomal ARNt ARN de transfert ASBT ileal apical sodium-dependent bile acid transporter Asp aspartate ATF activating transcription factor ATP adénosine triphosphate BA bile acid Baat bile acid-coenzyme A : N-acyltransferase bHLH basic helix-loop-helix BMP bone morphogenic protein bp BPP broad peak promoter BRE TFIIB recognition element (élément de reconnaisance de TFIIB) BSEP bile salt export pump bZip basic region C/EBP CAAT/enhancer binding protein CA cholic acid CAR constitutive androstane receptor (NR1I3) CAT chloramphenicol acetyl transferase CDK cyclin dependant kinase cDNA complementary DNA (ADN complémentaire) CEP cellule endothéliale primitive CETP cholesteryl ester transfert protein CHAF1A chromatin assembly factor 1, subunit A ChIP chromatine immunoprecipitation (immunoprécipitation de chromatine) ChIP-chip chromatine immunoprecipitation on chip immunoprécipitation de chromatine couplée à une micropuce CHKA choline kinase alpha x

Chol cholestérol C-JUN jun oncogene CLOCK circadian locomoter output cycles kaput protein CoA coenzyme A c- myelocytomatosis oncogene CMST cellule du mésenchyme du septum tranversum

CO2 carbon dioxyde (dioxide de carbone) COUPTFII chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor II (NR2F2) CPF cyp7a promoter-binding factor CREB cyclic-AMP response element binding protein CTD carboxy-terminal domain (domaine carboxy-terminal) CYP cytochrome p450 DBD DNA binding domain (domaine de liaison à l’ADN) DBP D site of albumin promoter binding protein DCE downstream core element Dhcr24 24-dehydrocholesterol reductase DNA desoxyribonucleic acid (acide désoxyribonucléique) dpc day post coitum DPE downstream core promoter element DR direct repeat (répétition directe) DSIF DRB sensitivity-inducing factor e- électron E2 estradiol E(X) jour embryonnaire (X) EDTA ethylene diamine tetra-acetic acid EGTA ethylene glycol tetra-acetic acid Elovl elongation of very long chain fatty acids like EMSA electro-mobility shift assay ER (récepteur de l’oestrogène) ERK extracellular signal-regulated kinase (MAPK1) ERR estrogen related receptor (NR3B) ES embryonic stem ETS E-twenty-six F1,6P fructose 1,6 phosphate F-6-P fructose-6-phosphate FA fatty acid (acide gras) FACoA fatty acyl coenzyme A FADH2 flavin adenine dinucleotide dihydrogen FAS fatty acid synthase FBS fetal bovine serum FBP fructose bisphosphatase FGF fibroblast growth factor FLAP full length liver enriched transcriptional activator protein FOXA forkhead box A FOXO1 forkhead box O1 FTF fetoprotein transcription factor (NR5A2) FTFRE FTF response element FTZ fushi tarazu xi

FTZ-F1 fushi tarazu factor 1 FXR (NR1H4) FZD frizzled g microgramme G-6-P glucose-6-phosphate G6Pc glucose-6-phosphatase, catalytic GABP GA repeat binding protein GABPA GA repeat binding protein alpha Gadd45 growth arrest and DNA damage-inducible protein 45 beta -gal -galactosidase GAPDH glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase GATA GATA binding protein GCK glucokinase GCNF GDP guanosine diphosphate GLRX5 glutaredoxin 5 GLUT2 glucose transporter 2 GNMT glycine N-methyltransferase GO GPS2 G protein pathway suppressor 2 GR (récepteur des glucocorticoïdes) GS glycogen synthase GST Glutathione-S-transferase GTF general transcription factor (facteur de transcription auxiliaire) GTP guanosine triphosphate h heure (hour) H+ ion hydrogène (proton) HA human influenza virus hemagglutinine epitope HAL histidine ammonia lyase HBV hepatitis B virus (virus de l’hépatite B) HCC hepatocellular carcinoma (hépatocarcinome) HCE human capping enzyme (enzyme de “capping” humain) HCV hepatitis C virus (virus de l’hépatite C) HDL high density lipoprotein (lipoprotéine à haute densité) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Hex (Hhex) hematopoietically expressed HGF hepatocyte growth factor HIF-1 hypoxia induced factor 1 HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A HMGCR 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase HNF hepatocyte nuclear factor HSD hydroxy steroid dehydrogenase HSP heat shock protein HT hormone thyroïdienne IDL intermediate density lipoprotein (lipoprotéine à densité intermédiaire) IFN- interféron gamma IB inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells IL interleukine xii

IL1-RA interleukin 1 receptor antagonist Inr initiateur IR inverted repeat JAK janus kinase JNK c-Jun N-terminal kinase KB kétone body (corps cétonique) kb kilobase

Kd dissociation constant kD kilo Dalton kg kilogramme KG alphakétoglutarate (alphacétoglutarate) KLF kruppel like factor LacZ beta-galactosidase LAP liver enriched transcriptional activator protein LBD ligand binding domain (domaine de liaison du ligand) LCR locus control region LDL low density lipoprotein LETF liver enriched transcription factor (facteur de transcription enrichis au foie) LGMN asparagyl endopeptidase (legumain) LIF leukemia inhibitory factor LIP liver enriched transcriptional inhibitory protein LPS lipopolysaccharide LRH-1 liver receptor homolog 1 LSS lanosterol synthase LTA4H leukotriene A4 hydrolase LXR (NR1H) LZ leucine zipper M molaire M micromolaire MAPK mitogen-activated protein kinase MAT2A methionine adenosyltransferase II, alpha MDH1 malate dehydrogenase 1 mDR4 mutant DR4 MET met proto oncogene mM millimolaire MR mineralocorticoid receptor (récepteur des minéralocorticoïdes) mRNA messenger RNA MEST mesoderm specific transcript MRP3 multidrug resistance protein 3 MSH6 MutS homolog 6 MT1 metallothionein 1 MTE mutation ten element NAD nicotinamide adenine dinucleotide NADH nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen NELF negative elongation factor NFB nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells NIH National institutes of health Nkx Nk homeobox xiii nm nanomètre nM nanomolaire NR (récepteur nucléaire) NRF1 nuclear respiratory factor 1 nt nucléotide NTP nucléotide triphosphate OAA oxaloacétate OC onecut OCT optimum cutting temperature OCT4 octamer binding protein 4 OXPHOS oxydative phosphorylation P phosphate pA polyadénylation PAINT promoter analysis and interaction network toolset PAX paired box pb paire de base Peff PCR efficiency Pi phosphate ion (ion phosphate) transformation related protein 53 PAGE polyacrylamide gel electrophoresis PBS phosphate buffered saline PCK1 phosphoénolpyruvate carboxykinase 1 PCR polymerase chain reaction PDGF becaplermin (plaletet derived growth factor beta polypeptide) PDH complex PDHx pyruvate dehydrogenase complex, component x PDK pyruvate dehydrogenase kinase PDX-1 pancreatic and duodenal homeobox 1 PEP phosphénolpyruvate PEPCK phosphoénolpyruvate carboxykinase PER1 period homolog 1 PFKl Phosphofructokinase, liver PGC-1 PPAR gamma coactivator 1 PIC preinitiation complex (complexe de préinitiation) PK pyruvate kinase PKA protein kinase A PKC protein kinase C PM primary metabolism (métabolisme primaire) PML promyelocytic leukemia POLII ARN polymérase II POLR2A polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide A PPCS phosphopantothenoylcysteine synthetase PPAR peroxisome proliferator activated receptor (récepteur activé par la prolifération péroxisomale) PR (récepteur de la progestérone) pRB retinoblastoma (protéine du rétinoblastome) PROX1 prospero related homeobox 1 P-TEFb positive transcription elongation factor b PXR pregrane X receptor (NR1I2) xiv qPCR real-time quantitative polymerase chain reaction RA retinoic acid (acide rétinoïque) RAD23B Rad23B homolog RALB GTP binding protein (v ral simian leukemia viral oncogene homolog B) RAR (récepteur de l’acide rétinoïque) RAS rat sarcoma viral oncogene RASSF ras association domain family RNA ribonucleic acid (acide ribonucléique) RNAi RNA interference RNAPII RNA polymerase II (ARN polymérase II) RSK ribosomal S6 kinase RXR SCAP srebp cleavage activating protein SCARB1 scavenger receptor class, B member 1 SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis SF-1 SFRP5 secreted frizzled-related sequence protein 5 SHP small heterodimeric partner (NR0B2) SLC solute carrier SMRT silencing mediator of retinoic acid and thyroid snRNA small nuclear RNA (petit ARN nucléaire) SOCS suppressor of cytokine signalling SRY containing homeobox 2 SP1 specificity protein 1, SPP single peak promoter SR protéine riche en sérine arginine SR-B1 scavenger receptor class, B member 1 (SCARB1) SRC1 steroid receptor coactivator 1 SRE sterol response element Srebf sterol regulatory element-binding transcription factor SREBP sterol regulatory element binding protein SSC saline sodium citrate STAR steroidogenic acute regulatory protein STAT signal transducer and activator of transcription SULT2A1 alcohol/hydroxysteroid sulfotransferase 2A1 SWI/SNF mating type switching/sucrose non T3 triiodothyronine TAF TBP associated factor (facteur associé à TBP) TAT tyrosine aminotransferase TBP TATA binding protein TBS tris buffered saline TCA tricarboxylic acid TCF transcription factor TG triglycéride TgF35 transgenic FTF 35 TGF- transforming growth factor beta TNF tumor necrosis factor alpha Tpi triosephosphate isomerase xv

TR thyroid receptor (récepteur des hormones thyroïdiennes) TRE thyroid hormone response element tRNA transfert RNA TSS transcription start site (site d’initiation de la transcription) UTP uridine triphosphate UTR untranslated region (région non-traduite) VDAC1 voltage-dependant anion channel 1 VDR (NR1I1) (récepteur de la vitamine D) VLDL very low density lipoprotein (lipoprotéine à très basse densité) w/v weight/volume (poids/volume) WNT wingless-type MMTV integration site family wt wild type (sauvage) X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside XRCC5 ATP-dependent DNA helicase II (X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5)

Chapitre 1

Introduction 2

1.1 Le foie

1.1.1 Architecture Le foie est un organe glandulaire effectuant de multiples tâches nécessaires à la survie d’un organisme : il a une fonction d’épuration, une fonction de synthèse et une fonction de stockage. Situé au niveau de l’abdomen, le foie se divise en plusieurs lobes, le nombre variant selon les espèces (2 chez l’humain, 5 chez la souris). Le foie est majoritairement composé d’hépatocytes en étroite interaction avec un réseau vasculaire et le système biliaire. D’autres types cellulaires résident dans le foie et participent activement aux fonctions hépatocytaires soit les cellules ovales (cellules souches), les cellules de Kupffer (macrophages), les cellules pit (lymphocytes) et les cellules stellaires (entreposage de la vitamine A) (revu dans [1, 2]).

1.1.1.1 Parenchyme Le parenchyme hépatique est formé par les hépatocytes. Les hépatocytes, formés à partir des hépatoblastes, représentent 60% des cellules et 80% de la masse cellulaire hépatique (revu dans [3, 4]). Les hépatocytes possèdent une grande quantité de mitochondries et de ribosomes et un large réticulum endoplasmique reflétant leur rôle dans le métabolisme énergétique et la synthèse de nombreuses protéines plasmatiques. Ils sont regroupés en lobules, chacun étant délimité par 4 à 6 espaces portes et possèdant une veinule hépatique terminale en son centre (veine centrolobulaire) (Fig. 1.1 A). Chaque espace porte est occupé par une branche de l’artère hépatique, une branche de la veine porte et un ductule biliaire, le tout formant la triade hépatique (Fig. 1.1 B). De plus, un vaisseau lymphatique qui draine le plasma sanguin à la périphérie des lobules se retrouve souvent au niveau de l’espace porte.

1.1.1.2 Système vasculaire La masse hépatique est irriguée par deux vaisseaux sanguins majeurs, soit la veine porte et l’artère hépatique (Fig. 1.1 A-B). Contrairement aux autres organes, la majorité de l’apport sanguin du foie (75%) est constitué de sang veineux permettant ainsi le traitement des nutriments et des dérivés provenant de la digestion. Le sang provenant de la veine porte et 3 de l’artère hépatique circule à travers les hépatocytes des espaces portes vers la veine centrolobulaire de chaque lobule en passant par les sinusoïdes situés entre les travées (ou lames) d’hépatocytes (Fig. 1.1 B). Les veines centrolobulaires, qui reçoivent le sang filtré par les lobules, convergent pour former les veines sus-hépatiques transportant le sang efférent vers la veine cave inférieure (Fig. 1.1). Pour permettre la filtration du sang, la paroi sinusoïdale, formée par des cellules endothéliales, est fenestrée (revue dans [5]). Les fenestrations sont de l’ordre de 100 à 200 nm de diamètre et servent de tamis moléculaire hépatique, permettant de filtrer les molécules qui pourront être acheminées de la circulation sanguine hépatique vers les hépatocytes via l’espace de Disse et vice-versa. La modulation de l’ouverture et de la quantité de ces fenestrations peut avoir un rôle fonctionnel majeur en contrôlant les interactions entre le parenchyme hépatique et la circulation sanguine. L’espace de Disse sert aussi de refuge pour plusieurs des types cellulaires hépatiques en plus de permettre le drainage de la lymphe vers les vaisseaux lymphatiques situés en périphérie des lobules (Fig. 1.1 C).

1.1.1.3 Système biliaire La synthèse de la bile, favorisant la digestion par les intestins, est effectuée par le foie. La bile, produite par les hépatocytes, est sécrétée dans les canalicules biliaires situés entre les faces en contact d’hépatocytes adjacents pour ensuite se déverser dans les ductules biliaires (Fig. 1.1 C). Les cholangiocytes, des cellules épithéliales provenant des hépatoblastes, forment les ductules biliaires permettant la circulation de la bile à l’intérieur du foie (revu dans [6, 7]). La jonction entre les canalicules et les ductules se nomme canal de Hering, un étroit canal tapissé d’hépatocytes et de cholangiocytes (Fig. 1.1 B/encadré). La bile provenant des ductules s’écoule, via de plus gros canaux, dans les branches hépatiques droite et gauche qui s’uniront pour former le canal hépatique commun (Fig. 1.1). La bile peut alors être entreposée dans la vésicule biliaire via le canal cystique ou emprunter le canal cholédoque qui se jette directement dans le duodénum via l’ampoule de Vater, jonction entre le canal cholédoque et le canal de Wirsung provenant du pancréas (Fig. 1.1). 4

Figure 1.1 : Morphologie du foie. Au centre : anatomie générale du foie humain. Encarts : A) Lobule hépatique B) Systèmes vasculaire et biliaire : 1- Branche de la veine porte; 2- Branche de l’artère hépatique; 3- Canal biliaire; 4- Plaque limitante; 5- Veine centrolobulaire; 6- Travées cellulaires hépatiques; 7- Sinusoïdes; Flèche rose : flux sanguin; Flèche verte : flux biliaire (entre les encadrés); Encadré : 8- canalicule biliaire; 9- Canal d’Hering; 10- Ductule biliaire C) Sinusoïde : 11- Cellules stellaires; 12- Lumière des capillaires sinusoïdes; 13- Espace de Disse; 14- Canalicule biliaire; 15- Hépatocyte; 16- jonction serrée; 17- Cellules de Küpffer; 18- Cellule endothéliale des sinusoïdes hépatiques. Adapté de www.embryologie.ch et du Merck manual of medical information-Second home edition, online version

1.1.1.4 Zonation Bien que la disposition des hépatocytes semble uniforme, il existe une zonation fonctionnelle des lobules basée sur la position des vaisseaux sanguins, soit les branches terminales des veines portes et centrolobulaires et la direction du flux sanguin (revu dans 5

[8]). En effet, les hépatocytes de chaque lobule peuvent être divisés grossièrement en deux sous-populations, une population périportale en amont du flux sanguin (veine porte) et une population péricentrolobulaire en aval (veine centrolobulaire). Les fonctions relatives aux hépatocytes de ces deux zones sont différentes, souvent complémentaires, et dictées par les différences entre l’expression et l’activité des divers enzymes responsables du métabolisme (Fig. 1.2).

Figure 1.2 : Zonation métabolique des lobules du foie. La zonation peut être régie par le flux sanguin, les niveaux d’oxygène, d’hormones, de facteurs de croissance et par certaines signalisations cellulaires. L’activité des diverses voies métaboliques hépatiques est répartie en gradient à partir de la zone périportale (gris pâle) ou périveineuse (gris foncé). O2, oxygène. Tiré de [9]

Les hépatocytes périportaux, de par leur proximité à l’artère hépatique et la veine porte, vont être les mieux oxygénés mais aussi les plus susceptibles d’être en contact avec les 6 métabolites et les toxines ingérés par l’organisme et mis en circulation portale après leur absorption par le petit intestin. Les niveaux de ces métabolites et les niveaux d’oxygène sont responsables en partie de la zonation de l’expression des divers enzymes hépatiques (revu dans [8-10]). D’autre part, la présence de deux signaux opposés, diffusés en gradient à partir des deux zones centrales, soit l’espace porte et la veine centrolobulaire vont influencer la zonation fonctionnelle des lobules hépatiques. Le premier signal, permettant l’activation de la voie -caténine, proviendrait des cellules endothéliales de la veine centrale tandis que le signal opposé serait généré par les molécules du sang et permettrait l’activation de la voie signalétique dépendante de Ras dans les hépatocytes périportaux. Ces deux signaux dicteraient l’expression et l’activité des différents enzymes spécifiques à chaque zone [11, 12].

1.1.2 Développement Comme les poumons, le pancréas, la thyroïde et le tube digestif, le foie est un organe dérivé de l’endoderme embryonnaire définitif, une couche de cellules épithéliales qui se forme à la partie ventrale de l’embryon lors de la gastrulation [13, 14]. L’invagination de l’endoderme dans la partie ventrale de l’embryon forme le tube digestif antérieur duquel se formeront le foie, les poumons, la thyroïde et la partie ventrale du pancréas. Les intestins et la partie dorsale du pancréas sont formés à partir de la région dorsale du tube digestif antérieur.

La première étape nécessaire au développement du foie est l’acquisition de la compétence hépatique permettant à l’endoderme définitif d’interpréter et de répondre aux signaux d’induction de la lignée hépatique. L’établissement de cette compétence hépatique de l’endoderme est en partie régulé par les facteurs de transcription FoxA (section 1.3.1.2) et GATA (section 1.3.4.1) [15, 16]. Ces facteurs ont la capacité de se lier à l’ADN encore compacté par la chromatine et ainsi de rendre leurs gènes cibles compétents pour une activation ultérieure [17-19]. L’ouverture de la chromatine provoquée par ces facteurs va favoriser la liaison ultérieure de facteurs de transcription enrichis au foie menant à l’expression de gènes permettant la spécification du foie (Fig. 1.3). 7

Figure 1.3 : Spécification hépatique de l’endoderme. La liaison des facteurs FoxA et GATA provoque l’ouverture de la chromatine (acquisition de la compétence) permettant la spécification ultérieure de l’endoderme lors de la liaison de facteurs de transcription hépatiques sous l’influence de signaux morphogéniques (BMP et FGF). Adapté de Zhao et al. Hepatology 2005 [20].

Après environ 8,5 jours de gestation chez la souris, des signaux provenant du mésoderme cardiaque adjacent à l’endoderme (fibroblast growth factors [FGF]) et du mésenchyme du septum transversum (bone morphogenic proteins [BMP]) vont engager ces cellules endodermiques compétentes vers la lignée hépatique par l’activation de ces gènes spécifiques aux hépatocytes (Fig. 1.4 A) [21, 22]. Cette étape s’accompagne de changements morphologiques et de prolifération cellulaire menant à la différenciation des cellules épithéliales endodermiques en hépatoblastes qui formeront le diverticulum hépatique. Ces hépatoblastes vont proliférer, dégrader la matrice extracellulaire du diverticulum, délaminer du tube digestif antérieur et envahir le septum transversum pour former le bourgeon hépatique (Fig. 1.4 B). Les gènes Hex (Hhex), Prox1, Gata6 et Gata4 ont un rôle important à jouer lors des étapes précoces de l’hépatogenèse, suivant la spécification hépatique, provoquant l’invasion du septum transversum par les hépatoblastes et leur prolifération subséquente [23-27]. La présence de cellules endothéliales primitives (CEP) à proximité des hépatoblastes est aussi essentielle à l’invasion du septum transversum par les hépatoblastes (Fig. 1.4 A). 8

Figure 1.4 : Formation du bourgeon hépatique. A- Les signaux FGF provenant du cœur et BMP provenant des cellules du mésenchyme du septum transversum (CMST) permettent la spécification des cellules endodermiques (vertes) vers la lignée hépatique (H). B- Les cellules hépatiques migrent dans le septum transversum grâce, entre autres, aux signaux générés par les cellules endothéliales primitives (CEP). Tiré de [28]

Durant leur migration, les hépatoblastes vont s’associer à ces cellules endothéliales primitives situées à proximité permettant ainsi la formation de structures ressemblant à des capillaires entre les lames d’hépatoblastes ce qui favorisera la morphogenèse hépatique. Le reste du système vasculaire hépatique sera à la fois formé par vasculogenèse et angiogenèse tout au cours du développement [29, 30].

La croissance et la maturation du foie sont assurées par plusieurs signalisations permettant de stimuler la prolifération des cellules hépatiques mais aussi de protéger ces cellules contre l’apoptose [28, 31]. Certains de ces signaux vont provenir des cellules mésenchymateuses situées au niveau du site d’invasion et de croissance des hépatoblastes [32, 33]. Les cellules hématopoïétiques, représentant 50% de la masse hépatique à la mi- gestation murine, participeront aussi au développement du foie en stimulant sa croissance [34]. Ces cellules hématopoïétiques proviennent de précurseurs ayant migré, vers le jour 10 de gestation, du sac vitellin vers le foie, un site important de l’hématopoïèse. À partir du jour 15, les cellules hématopoïétiques migreront vers d’autres sites d’hématopoïèse comme le thymus et la moelle osseuse pour compléter leur maturation.

L’architecture hépatique terminale sera atteinte lors de la différenciation des hépatoblastes en hépatocytes et cholangiocytes [35, 36]. La différenciation des hépatoblastes est 9 graduelle : elle s’étend du jour 12 au jour 18 de gestation chez la souris. Plusieurs signalisations et facteurs de transcription interviennent dans la régulation de la différenciation des hépatoblastes [37]. Durant cette période, les hépatoblastes subiront des transformations morphologiques importantes se terminant par la polarisation de l’épithélium hépatique menant à la formation des canalicules biliaires et à la formation du système biliaire.

1.1.3 Fonctions Le foie joue un rôle prépondérant dans l’homéostasie métabolique étant responsable du catabolisme, de la synthèse, de l’entreposage et de la redistribution des nutriments, des carbohydrates, des lipides, de certains acides aminés et de vitamines [38]. Il est aussi l’organe principal permettant la détoxification des déchets corporels et des xénobiotiques absorbés par l’organisme en effectuant la conversion métabolique de ces composés et leur excrétion dans la bile. Le foie est aussi impliqué dans la synthèse et la sécrétion de la majorité des protéines plasmatiques.

1.1.3.1 Métabolisme (revu dans [39])

1.1.3.1.1 Hydrates de carbone Le foie est responsable de l’homéostasie du glucose dans l’organisme en maintenant la balance entre l’entreposage du glucose et sa remise en circulation (revu dans [40, 41]). Lorsque le glucose est assimilé par les intestins, il passe par la circulation portale pour être capté en partie par le foie afin d’être entreposé sous forme de glycogène par la glycogène synthase (glycogénogenèse) (Fig. 1.5 -1) ou transformé en acide gras lorsque les réserves de glycogène sont complètes (lipogenèse) (Fig. 1.5 -5). Contrairement aux autres organes et tissus, et en accord avec son rôle d’entreposage, le foie n’absorbe et n’utilise le glucose que lorsqu’il est en surplus dans l’organisme. Lorsque le glucose sanguin diminue, le foie peut utiliser ses réserves de glycogène pour fournir le glucose nécessaire au reste de l’organisme (glycogénolyse) (Fig. 1.5 -2). En situation de jeûne prolongé, le foie peut aussi produire du glucose à partir de lactate, de pyruvate ou d’acides aminés glucogéniques par le procédé très énergivore de la gluconéogenèse, une voie métabolique presque exclusive au foie (Fig. 10

1.5 -4). Enfin, le glucose peut aussi être utilisé par le foie pour produire l’énergie nécessaire à ses fonctions via la glycolyse qui permet la génération de pyruvate et d’acétyl-coenzyme A (acétyl-CoA) qui servira à la production d’adenosine triphosphate (ATP) par le cycle de Krebs (Fig. 1.5 -7) et la chaîne respiratoire.

1.1.3.1.2 Lipides Le foie est un organe majeur dans l’homéostasie lipidique de l’organisme. La majorité des réactions menant à la synthèse et à l’utilisation des lipides peuvent être réalisées par le foie (revu dans [42]). Lors d’un apport en glucose supérieur à la demande de l’organisme, l’acétyl-CoA provenant de la dégradation du glucose (glycolyse) (Fig. 1.5 -3) peut être transporté sous forme de citrate de la mitochondrie vers le cytoplasme afin d’être utilisé pour la formation d’acides gras (lipogenèse) (Fig. 1.5 -5). Les acides gras ainsi formés pourront servir à la biosynthèse de divers lipides qui seront excrétés et transportés sous forme de lipoprotéines à très faible densité (VLDL) pour être entreposés dans les cellules adipeuses situées en périphérie ou encore utilisés comme source d’énergie par d’autres tissus ou localement pour la synthèse de membrane et pour la signalisation cellulaire.

Les hépatocytes peuvent aussi générer de l’énergie à partir de l’oxydation des acides gras effectuée par les mitochondries ou les peroxisomes. L’oxydation des acides gras provenant de la nutrition ou des tissus adipeux mène à la formation d’acétyl-CoA qui pourra être, entre autres choses, utilisé par le cycle de Krebs pour la génération d’ATP via la respiration cellulaire (Fig. 1.5 -8).

L’acetyl-CoA peut aussi être utilisé pour la formation de cholestérol à l’intérieur du réticulum endoplasmique (Fig. 1.5 -6). Le cholestérol est un constituant important des membranes cellulaires. Il est aussi un précurseur de plusieurs hormones stéroïdiennes et vitamines en plus d’être un modulateur de la transcription (revu dans [43, 44]). Le cholestérol peut aussi être transformé en acides biliaires qui seront excrétés dans la bile et serviront en partie à favoriser l’absorption des lipides par l’intestin (revu dans [45]). Le foie a aussi un rôle central à jouer lors du transport inverse du cholestérol, permettant la réutilisation ou l’excrétion sous forme d’acides biliaires du cholestérol provenant des tissus périphériques (revu dans [46]). 11

Figure 1.5 : Métabolisme hépatique. Voies métaboliques hépatiques. 1, glycogénogenèse ; 2, glycogénolyse ; 3, glycolyse ; 4, gluconéogenèse ; 5, lipidogenèse ; 6, cholestérogenèse et synthèse des acides biliaires ; 7, cycle de Krebs ; 8, oxydation des acides gras. Flèches bleues, voies d’utilisation et d’entreposage du glucose. KG, alpha-cétoglutarate ; Asp, aspartate ; ATP, adenosine triphosphate; CO2, dioxyde de carbone ; CoA, coenzyme A ; F, fructose ; FA, acides gras ; FACoA, fatty acyl coenzyme A ; FADH2, flavine adénine dinucléotide dihydrogène ; G, glucose; GDP, guanosine diphosphate; GTP, guanosine triphosphate; HMG-CoA, 3- hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A; IDL, lipoprotéines à densité intermédiaire ; KB, corps cétonique ; LDL, lipoprotéine à faible densité ; NAD, nicotinamide adénine dinucléotide ; NADH, nicotinamide adénine dinucléotide hydrogène ; OAA, oxaloacétate ; P, phosphate ; Pi, ion phosphate ; PEP, phosphoénolpyruvate ; TG, triglycérides ; VLDL, lipoprotéine à très faible densité. Adapté de www.scienceslides.com/Kzr/hepatic-metabolism

1.1.3.1.3 Acides aminés Les protéines provenant de l’alimentation sont dégradées en acides aminés lors de la digestion. Ces acides aminés sont absorbés par l’intestin et acheminés au foie par la 12 circulation portale. Les acides aminés peuvent servir à synthétiser d’autres protéines ou encore être utilisés comme source d’énergie. La plupart des acides aminés peuvent être transformés en intermédiaires du cycle de Krebs permettant leur utilisation pour la gluconéogenèse. Ces acides aminés sont dits glucogéniques. D’autres acides aminés sont dits cétogéniques, pouvant être dégradés en acétoacetate ou en acétyl-CoA. Certains acides aminés peuvent être synthétisés dans le foie mais la plupart sont essentiels et doivent faire partie de la diète. La dégradation des acides aminés mène à la formation d’ammoniac qui devra être éliminé par l’organisme dû à sa toxicité. La formation d’urée par le cycle de l’urée permet de détoxifier et d’expulser l’ammoniac hors de l’organisme.

1.1.3.1.4 Respiration cellulaire La respiration cellulaire représente l’ensemble des réactions et processus biologiques qui ont lieu dans une cellule permettant la production d’énergie biochimique à partir de molécules carburants. L’énergie est libérée des molécules carburants par leur oxydation et est entreposée dans des transporteurs de haute énergie. Le glucose, les acides aminés et les acides gras sont les carburants les plus utilisés par la cellule pour produire de l’énergie. L’agent oxydant utilisé est l’oxygène dans le cas de la respiration aérobie mais peut aussi être une molécule organique dans le cas de la respiration anaérobie ou fermentation. L’ATP est la molécule de haute-énergie la plus utilisée pour le stockage chimique de l’énergie ainsi récupérée.

Le glucose entrant dans la cellule est transformé en 2 molécules de pyruvate par la glycolyse permettant d’engendrer 2 molécules d’ATP et 2 molécules de NADH (Fig. 1.6 : étape 1). Le pyruvate est transporté dans les mitochondries pour être complètement oxydé par le cycle de Krebs. Le produit énergétique de cette réaction est sous forme d’ATP, de NADH et FADH2 (Fig. 1.6 : étape 2). Le potentiel réducteur des molécules de NADH et FADH2 est ensuite converti en ATP par une chaîne de transport des électrons ayant l’oxygène comme accepteur terminal d’électron (Fig. 1.6 : étape 3). Au total, une molécule de glucose génère théoriquement, en condition aérobie, 36 molécules d’ATP (et seulement 2 en condition anaérobie). Cependant, le transport du pyruvate, du phosphate et de l’ADP nécessite de l’énergie contribuant à la diminution de l’apport énergétique d’une molécule de glucose. 13

Figure 1.6 : Le processus de la respiration cellulaire. Étapes de conversion du glucose en ATP lors de la respiration cellulaire. ADP, adénosine diphosphate; e-, électron ; H+, ion hydrogène (proton). Tiré de http://www.vt-net.org/tpe-sucre/bilan-respiration-cellulaire.php

14

1.1.3.1.5 Contrôle du métabolisme Il existe plusieurs mécanismes permettant de contrôler les voies métaboliques hépatiques. La régulation des voies enzymatiques peut se faire au niveau de l’accessibilité du substrat, par une rétroinhibition induite par l’accumulation d’un des produits de la voie ou encore en contrôlant la synthèse des divers enzymes impliqués dans la voie métabolique. Les principaux signaux métaboliques jouant un rôle dans l’homéostasie métabolique hépatique sont l’insuline et le glucagon. L’insuline, sécrétée par le pancréas lorsque les niveaux de glucose augmentent dans l’organisme, stimule l’absorption du glucose par le foie en plus d’accroître l’activité et la transcription des enzymes favorisant le stockage et l’utilisation du glucose ainsi que la synthèse lipidique. De plus, l’insuline inhibe les voies responsables de la synthèse du glucose et de l’oxydation des acides gras (revu dans [47]). À l’inverse, le glucagon, sécrété lors des périodes de jeûne, stimule la production de glucose et sa mise en circulation, accroît l’oxydation des acides gras et inhibe les voies métaboliques réciproques via, entre autres, l’activation de la voie signalétique de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) (revu dans [48]). D’autres hormones comme les catécholamines, les glucocorticoïdes et les hormones thyroïdiennes ont aussi des effets régulateurs importants sur le métabolisme hépatique (revu dans [49]).

1.1.3.2 Détoxification Il existe 2 voies majeures d’élimination des produits toxiques par le foie nommées sentiers de détoxification de phase 1 et de phase 2 (revu dans [50, 51]). Lors de la détoxification de phase 1, les produits toxiques sont transformés en métabolites polaires moins toxiques par diverses réactions chimiques (oxydation, réduction, hydrolyse) catalysées par divers enzymes hépatiques permettant l’ajout ou le démasquage d’un « groupement polaire». Ces réactions chimiques entraînent la formation de radicaux libres qui devront à leur tour être neutralisés par des antioxydants afin d’éviter des dommages aux cellules hépatiques. Les cytochromes P450 sont un exemple d’enzyme impliqué dans la détoxification de phase 1 (revu dans [52]).

Pour ce qui est de la détoxification de phase 2, elle consiste à conjuguer une molécule (glycine, sulfate, glutathion) à un produit toxique pour le rendre moins réactif et hydrosoluble permettant ainsi son excrétion dans la bile ou l’urine. La conjugaison peut 15 avoir lieu sur un métabolite résultant de la phase 1 ou encore directement sur le produit toxique original.

D’autre part, le foie est aussi responsable de la dégradation de l’hémoglobine créant ainsi des métabolites qui seront éliminés dans la bile et l’urine sous forme de pigment. L’ammoniac créé par la dégradation des acides aminés est aussi traité par le foie pour être transformé en urée qui sera éliminée dans l’urine.

1.1.3.3 Synthèse des protéines plasmatiques Les protéines plasmatiques occupent le plasma sanguin qui représente 55% du volume sanguin. Elles servent au transport de multiples molécules comme les lipides, les métaux, les hormones et les vitamines. Elles ont aussi un rôle à jouer pour le système immunitaire et dans la coagulation. L’albumine représente 60% de toutes les protéines plasmatiques. Elle permet le maintien de la pression osmotique du plasma sanguin en plus de transporter des lipides et des hormones. Les globulines représentent 35% des protéines du plasma et sont responsables du transport de lipides, ions et hormones impliqués dans la réponse immunitaire (les gamma globulines sont les seules protéines plasmatiques à ne pas être synthétisées dans le foie). D’autre part, les fibrinogènes, qui représentent 4% des protéines plasmatiques, sont essentiels à la coagulation du sang. Le plasma sanguin est aussi constitué d’enzymes, d’hormones et d’autres transporteurs comme les lipoprotéines, les transferrines et la prothrombine.

1.1.4 Maladies hépatiques et cancer

1.1.4.1 Généralités Le foie étant responsable de l’homéostasie métabolique, les maladies pouvant altérer ses fonctions ont un effet majeur sur l’organisme. Plusieurs maladies peuvent se développer au foie. Les plus répandues sont les hépatites, une inflammation du foie principalement d’origine virale; les cirrhoses, causées par la cicatrisation ou le remplacement par des tissus fibreux (fibrose) de cellules hépatiques détruites par une hépatite ou par des agents hépatotoxiques comme l’alcool; et le cancer du foie ou hépatocarcinome. Ces diverses maladies hépatiques apparaissent souvent de façon séquentielle. Les premiers stades des maladies hépatiques s’accompagnent souvent d’une inflammation (hépatite) pouvant être 16 causée par des virus ou des agents toxiques. La persistance de l’inflammation peut occasionner des dommages au foie et provoquer l’apparition de tissus cicatriciels (fibrose). L’accumulation chronique de ces tissus cicatriciels et la perte de tissus normaux entraînera une diminution de l’apport sanguin et de la capacité fonctionnelle du foie résultant en l’apparition de la cirrhose. Les dommages subséquents pourront favoriser le développement de l’hépatocarcinome (HCC) (Fig. 1.7).

Figure 1.7 : Développement de l’hépatocarcinome. Séquence chronologique des lésions cellulaires culminant en développement du carcinome hépatocellulaire chez l’humain. HBV, virus de l’hépatite B; HCV, virus de l’hépatite C; AFB1, aflatoxine B1. Adaptée de [53]

L’hépatocarcinome est le cinquième cancer en importance au monde et la troisième cause de décès impliquant un cancer [54]. La grande majorité des hépatocarcinomes (80%) se développent chez des individus atteints de cirrhose dont les principaux agents causaux sont l’infection chronique par les virus de l’hépatite B (HBV) et C (HCV), les facteurs nutritionnels comme la consommation abusive d’alcool, les toxines dont l’aflatoxine, les maladies autoimmunes du foie, les maladies métaboliques et toutes autres maladies résultant en une inflammation chronique du foie [55]. Comme c’est le cas pour plusieurs types de cancer, la formation et le développement de l’hépatocarcinome résultent d’un processus lent à plusieurs étapes caractérisé par l’accumulation d’altérations génétiques et épigénétiques de gènes régulateurs menant à l’activation d’oncogènes et l’inactivation ou la perte de gènes suppresseurs de tumeur permettant l’activation ou l’inactivation de voies de 17 signalisation contrôlant les processus de croissance cellulaire, de différenciation, d’apoptose et de migration. L’activation conjointe de plusieurs de ces voies signalétiques dont celles impliquant p53 (TRP53), TGF et -caténine semble être un point en commun entre les différents HCC (revu dans [53, 56-58]).

1.1.4.2 Voie P53 Dans environ 30 à 50% des cas d’HCC, le sentier de signalisation par p53 est inactivé [57, 59]. p53 est un supresseur de tumeur jouant un rôle important dans le cycle cellulaire, l’apoptose, la réparation d’acide désoxyribonucléique (ADN) et l’angiogenèse. Dans plusieurs cas, les altérations de la voie p53 favorisent la progression tumorale plutôt que l’initiation des HCC [60]. Des mutations génétiques de certains des gènes de la voie p53, l’hyperméthylation de leur promoteur et l’inhibition de leur activité ou de leur transcription par des protéines virales produites par HBV et HCV sont tous des mécanismes caractérisés de répression de la voie p53 (revu dans [57, 59]).

1.1.4.3 Voie -caténine Plusieurs études ont démontré l’implication de la voie -caténine (aussi désignée sous le nom -caténine/WNT) dans la cancérogenèse hépatique (revu dans [57, 61]). En fait, la voie -caténine est altérée dans environ 50% des cas d’hépatocarcinome. Plusieurs protéines de la voie -caténine peuvent être impliquées lors de la progression des HCC. Ces protéines peuvent agir à titre d’oncogène (-caténine) ou de suppresseur de tumeur (E- cadhérine, APC, axine). Des mutations génétiques activant -caténine, des altérations dans l’expression ou l’activité des suppresseurs de tumeur et la surexpression des récepteurs des WNT, mènent toutes à la suractivation de la voie -caténine résultant en une augmentation de la prolifération et du potentiel invasif des cellules hépatiques via, entre autres, la régulation des proto-oncogènes c-Myc et cycline D1. La suractivation de la voie -caténine ne peut induire à elle seule la tumorogenèse mais peut, en coopération avec d’autres stimuli oncogéniques, promouvoir le développement de la tumeur. Par exemple, dans les cas de HCC murin où la surexpression de la protéine MET, récepteur du facteur de croissance HGF, agit à titre d’inducteur de la tumorogenèse, l’activation conjointe de la voie - caténine accroît considérablement le potentiel oncogénique de MET [62]. 18

1.1.4.4 Voies RAS et JAK/STAT Les voies RAS et JAK/STAT sont aussi impliquées dans plusieurs cas de cancer hépatique. La voie RAS est impliquée dans la croissance, la survie et la migration cellulaire tandis que la voie JAK/STAT joue un rôle dans la différenciation, la prolifération et l’apoptose en réponse à l’activation par des cytokines et des facteurs de croissance. Les voies RAS et JAK/STAT sont étroitement régulées par des inhibiteurs spécifiques dont les membres des familles RASSF et SOCS, inhibiteurs de la voie RAS et JAK/STAT respectivement. Dans plusieurs cas d’hépatocarcinome, on observe une dérégulation de l’expression ou de l’activité de ces inhibiteurs signalétiques (revu dans [57, 63]).

1.1.4.5 La méthylation Un des mécanismes menant à l’inhibition de l’expression des suppresseurs de tumeurs est l’hyperméthylation de leur promoteur (revu dans [64]). Un des gènes impliqués dans les processus de méthylation de l’ADN, dont l’activité est altérée dans environ 40% des HCC, est le gène Gnmt. GNMT utilise la S-adénosylméthionine (SAM) comme donneur de groupement méthyl pour catalyser la synthèse de sarcosine à partir de glycine et ainsi joue un rôle important dans la régulation de la réserve de SAM hépatique. La mutation de Gnmt chez la souris peut entraîner la formation d’HCC [65, 66]. D’autres gènes impliqués dans le processus de méthylation ont aussi été caractérisés pour leur rôle dans l’hépatocarcinogenèse. L’hyperméthylation semble être étroitement liée à la formation et au développement des hépatocarcinomes.

1.2 Transcription

1.2.1 Généralités La transcription est l’ensemble des étapes qui vont mener à la formation d’un acide ribonucléique (ARN) à partir de l’ADN. La synthèse de l’ARN est effectuée par trois complexes enzymatiques distincts, l’ARN polymérase I, II et III (ARN pol I-II-III), chacun étant responsable de la synthèse d’ARN particuliers. L’ARN pol I effectue la synthèse des ARN ribosomaux (ARNr) dans les nucléoles et représente 50 à 70% de l’activité ARN polymérase totale d’une cellule. L’ARN pol II effectue la transcription des ARN messagers 19

(ARNm), des microARN (miARN) et des petits ARN nucléaires (snARN). Pour ce qui est de l’ARN pol III, elle transcrit les ARN de transfert (ARNt), l’ARN 5S et les snARN nucléaires et miARN.

La transcription par l’ARN pol II, permettant l’expression des gènes codant pour les protéines chez les eukaryotes, implique plusieurs étapes : la liaison des activateurs à l’ADN, le recrutement du complexe de pré-initiation, l’initiation de la transcription, le dégagement du promoteur, l’élongation par l’ARN polymérase, la terminaison de la transcription et le recyclage de la polymérase (Fig. 1.8) (revu dans [67]).

Figure 1.8 : Déroulement de la transcription. La transcription d’un gène se divise en plusieurs étapes : recrutement et formation du complexe de préinitiation (PIC) au niveau du promoteur; initiation de la transcription (nécessite un apport d’énergie); élongation de l’ARNm (par l’ajout de NTPs); terminaison de la transcription permettant le relargage de l’ARNm et de la polymérase qui sera recyclée pour permettre la formation d’un autre complexe d’initiation. ATP, adenosine triphosphate; Med, médiateur ; NTP, nucleotide triphosphate ; Pol II, ARN polymérase II. Adapté de [67]

Le complexe multiprotéique de l’ARN pol II est totalement dépendant des protéines auxiliaires pour initier la transcription. La machinerie transcriptionnelle de base est constituée de l’ARN pol II et de plusieurs facteurs de transcription généraux (GTF) le tout 20 formant un mégacomplexe de plus de 2500 kD. Le recrutement de ce complexe au promoteur d’un gène est nécessaire pour la transcription génique. L’assemblage du complexe de préinitiation (PIC), c’est-à-dire la formation du complexe entre les GTF et l’ARN pol II sur le promoteur d’un gène, s’effectue dans un ordre défini et est hautement régulée (revu dans [67-72]). Les divers GTF essentiels (facteur de transcription II [TFII]-B- D-E-F-H) vont être impliqués dans la liaison à l’ADN du PIC, dans le recrutement de sous- unités dont la polymérase, dans la stabilisation des divers complexes en formation et dans la détermination du site d’initiation. Certaines sous-unités possèdent aussi des activités enzymatiques permettant de modifier la conformation structurale de certaines composantes du PIC ou de la chromatine favorisant ainsi le déroulement de la transcription.

L’exemple classique du recrutement et de l’assemblage du PIC s’effectue sur un promoteur minimal contenant une boîte TATA. Le début de l’assemblage de la machinerie transcriptionnelle est marqué par la liaison du facteur de transcription « TATA binding protein » (TBP) à la boîte TATA. Un groupe de facteurs associés à TBP (TAF) viennent alors se fixer à TBP pour former le complexe connu sous le nom TFIID (Fig. 1.9). La liaison de TBP/TFIID induit une courbure dans l’ADN permettant son agencement avec la structure de la polymérase et TFIIB. La présence de TFIIB facilite l’association du complexe pré-assemblé de TFIIF-ARN pol II non-phosphorylée et permet de situer le site actif de la polymérase vis-à-vis le site d’initiation de la transcription. Par la suite, TFIIE entre dans le complexe et recrute TFIIH dont la sous-unité ATPase/hélicase permet d’introduire une tension superhélicale négative dans l’ADN induisant la formation d’une bulle transitoire qui sera captée par TFIIF au niveau du brin non-gabarit afin de stabiliser l’ouverture du duplexe d’ADN. Pendant la formation du complexe entre l’ARN pol II et les GTF, un autre complexe constitué d’une vingtaine de protéines, le complexe médiateur (revu dans [73]), viendra s’assembler sur le domaine carboxy-terminal (CTD) de l’ARN pol II pour achever la formation du PIC.

Lorsque le PIC est formé, pour que la transcription débute, le CTD de la polymérase doit être phosphorylé (revu dans [74, 75]). Ce domaine est constitué de plusieurs répétitions du peptide YSPTSPS (52 chez les mammifères; Y, tyrosine; S, sérine; P, proline; T, thréonine) situées à l’extrémité C-terminale de la plus large sous-unité de l’ARN pol II, POLR2A. La phosphorylation des sérines 2 et 5 de ce peptide joue un rôle important lors de l’initiation 21 de la transcription mais aussi lors de l’élongation et de la maturation de l’ARN messager. La phosphorylation de la sérine 5 du CTD est effectuée par CDK7 (une sous-unité de TFIIH) et CDK8 (une sous-unité du médiateur). Elle permet la stabilisation du PIC, l’initiation de la transcription, la transition vers l’étape de l’élongation et le dégagement du promoteur. La phosphorylation de la sérine 5 va aussi permettre le recrutement des enzymes responsables de l’installation de la coiffe ou « capping » de l’ARN en 5’, des enzymes permettant l’épissage et d’une méthyltransférase permettant la triméthylation de la lysine 4 de l’histone H3 favorisant la maturation de l’ARN.

Figure 1.9 : Assemblage du complexe de pré-initiation. TFIID se lie à la boîte TATA, suivi par TFIIB. TFIIF et l’ARN polymérase II entrent ensemble dans le complexe. À cette étape, le domaine C-terminal (CTD) de l’ARN polymérase II (Pol II) recrute le complexe médiateur (Med). TFIIE et TFIIH complètent la formation du complexe. Tiré de [70]

En plus de la phosphorylation de la sérine 5, plusieurs autres changements dans le PIC, dont la rupture de certaines interactions entre la polymérase et certaines protéines du PIC liées à l’ADN et le resserrement concomitant de l’interaction entre la polymérase et l’ARN naissant, permettent le dégagement du promoteur et la formation du complexe d’élongation 22 précoce qui s’effectue suite à la synthèse d’un ARN de 8nt (revu dans [76, 77]). Peu après le début de l’élongation (environ 25 nt), les complexes NELF et DSIF s’associent à l’ARN pol II provoquant une pause dans l’élongation afin de favoriser la maturation précoce de l’ARN naissant (Fig. 1.10). La phosphorylation de la sérine 2 du CTD par la sous-unité CDK9 de P-TEFb permet de rétablir la transcription suite à la pause engendrée par les protéines NELF et DSIF. Durant l’élongation, le CTD de la polymérase devient hyperphosphorylé au niveau de la sérine 2 permettant le recrutement des protéines responsables de la terminaison et de la polyadénylation de l’ARN en plus de favoriser le recrutement d’une autre méthyltransférase qui tri-méthyle la lysine 36 de l’histone H3 induisant la déacétylation des histones dans le sillage de la polymérase afin d’empêcher l’initiation intragénique de la transcription [78]. Plusieurs complexes protéiques, entraînant entre autres des modifications chromatiniennes, sont nécessaires pour promouvoir l’élongation (revu dans [79]).

Figure 1.10 : Les étapes de l’élongation transcriptionnelle. (1) Formation du complexe de préinitiation (PIC) ; (2) Dégagement du promoteur avec la phosphorylation de la sérine 5 du domaine carboxyterminal de RNAPII (CTD) ; (3) Recrutement de l’enzyme de “capping” humain (HCE), « 5′ capping » (m7G) du transcrit naissant, et pause de l’ARN polymérase II (RNAPII) ; (4) Recrutement de P-TEFb et phosphorylation de la sérine 2 du CTD, suivi de l’élongation productive et de la modification co-transcriptionnelle du messager par les machineries d’épissage (SR) et de polyadénylation (pA). DSIF, DRB sensitivity-inducing factor ; NELF, negative elongation factor ; P, phosphate ; p-TEFb, positive transcription elongation factor b; S2, sérine 2 ; S5, sérine 5 ; SR, protéine riche en sérine et arginine ; cercle rouge, phosphorylation. Tiré de [77]

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La fin de la transcription est marquée par deux événements étroitement reliés, soit la polyadénylation du messager et la terminaison de la transcription (revu dans [80-82]). Chez les eukaryotes, il n’existe pas de site de terminaison; la fin d’un gène est plus ou moins indiquée par la présence d’un site de polyadénylation. Pour la grande majorité des pré- messagers, lorsque le complexe d’élongation rencontre le site de polyadénylation (AAUAAA) plusieurs protéines sont recrutées afin de cliver l’ARN en aval (10-30nt) du site de polyadénylation pour permettre l’ajout d’une queue poly-A (200-250 A) par la poly- A-polymérase. La terminaison permet de recycler la polymérase et d’éviter des perturbations de la transcription des gènes situés en aval du gène nouvellement transcrit. Il existe deux modèles de terminaison chez les eukaryotes, les deux étant étroitement liés à la polyadénylation. Le premier, appelé modèle « torpedo », implique le recrutement d’une exonucléase sur la partie 5’ du nouveau brin d’ARN engendré soit par le clivage de l’ARN en aval du site de polyadénylation ou par un site d’autoclivage situé plus en aval (revu dans [83, 84]). La dégradation de l’ARN par l’exonucléase de 5’ vers 3’ favoriserait la terminaison de la transcription par un mécanisme encore inconnu. Le deuxième modèle dit allostérique ou d’« anti-terminaison » implique le recrutement d’une protéine provoquant la terminaison, ou la perte d’une protéine empêchant la terminaison, au complexe d’élongation lors de sa rencontre avec le site de polyadénylation [85]. Dans ce cas-ci, la pause du complexe d’élongation engendrée par les protéines recrutées au site de polyadénylation pourrait jouer un rôle important pour la terminaison. La déphosphorylation subséquente du CTD de la polymérase par des phosphatases spécifiques permet son recyclage, la déphosphorylation étant essentielle pour la liaison de l’ARN pol II au promoteur lors de l’initiation de la transcription.

1.2.2 Les éléments régulateurs En plus des étapes d’initiation et d’élongation, la transcription est aussi contrôlée lors de l’étape du recrutement du PIC. Afin de diriger la transcription, des séquences spécifiques d’ADN permettant la liaison de diverses protéines impliquées dans la transcription sont regroupées dans des régions d’ADN particulières. La séquence d’ADN située directement en amont d’un gène constitue le promoteur. Un promoteur peut être divisé en deux sections, soit le promoteur minimal permettant la liaison de la machinerie transcriptionnelle, 24 l’orientation de la transcription et la transcription basale d’un gène, et le promoteur distal permettant la régulation spécifique de la transcription.

1.2.2.1 Le promoteur minimal Il existe plusieurs types de promoteurs minimaux ou « core promoter » que l’on peut regrouper en deux catégories différentes : les promoteurs possédant un pic d’initiation de la transcription simple (SPP) et ceux possédant un large pic d’initiation (BPP) (Fig. 1.11) (revu dans [86-88]). Les SPP possèdent un site d’initiation de la transcription (TSS) ayant une position relativement définie à l’intérieur de quelques bases. Ils sont souvent associés à des sites consensus permettant la liaison de facteurs de transcription généraux, comme la boîte TATA, et sont souvent impliqués dans la régulation fine associée aux gènes dont l’expression est tissu-spécifique. Les BPP quant à eux montrent une distribution aléatoire de TSS à l’intérieur d’une zone de 100 pb, possèdent souvent des séquences riches en GC ou ilôts CpG, sont rarement associés à des sites consensus pour des facteurs de transcription généraux et dirigent majoritairement la transcription des gènes exprimés de façon ubiquitaire.

Figure 1.11 : Types de promoteur eukaryote. Les SPP possèdent un site précis d’initiation de la transcription (TSS) et des éléments de liaisons consensus de facteurs de transcription généraux (Boîte TATA; initiateur, Inr). Les promoteurs BPP possèdent plusieurs TSS et des îlots CpG. UTR : region non traduite Adapté de [87]

Bien qu’aucun élément d’ADN ne soit commun ou majoritairement représenté dans les promoteurs minimaux, plusieurs éléments consensus ont été identifiés à l’intérieur de sous- groupes de promoteurs. Ces éléments sont la boîte TATA, l’initiateur (Inr), les élément de reconnaissance de TFIIB (BRE), les « Downstream Core Element » (DCE), les 25

« Downstream Core Promoter Element » (DPE) et les « Mutation Ten Element » (MTE) (revu dans [89, 90]). Ces éléments se retrouvent seuls ou en combinaison et se situent généralement dans une région précise du promoteur, à proximité du TSS (Fig. 1.12).

Figure 1.12 : Élements consensus des promoteurs minimaux. Localisation des éléments consensus pouvant se retrouver dans les promoteurs minimaux. BREu, élément de reconnaissance de TFIIB en amont; BREd, élément de reconnaissance de TFIIB en aval; TATA, boîte TATA; Inr, initiateur; MTE, mutation ten element; DPE, downstream core promoteur element; DCE, downstream core element. Tiré de [89]

La coopération entre ces divers éléments permet le contrôle de l’initiation de la transcription en modulant la liaison d’un ou plusieurs éléments de la machinerie transcriptionelle. Puisque les promoteurs à boîte TATA liant TBP ne constituent qu’environ 10% de tous les promoteurs, d’autres protéines du complexe de pré-initiation ont le rôle de lier l’ADN pour permettre la formation du PIC sur les promoteurs minimaux (revu dans [90]). Par exemple, TAF1 et TAF2 peuvent lier l’Inr et l’hétérodimère TAF6/9 peut lier les DPE. Les BRE sont liés par la sous-unité TFIIB et peuvent stimuler ou réprimer la transcription selon le type de promoteur. Pour ajouter à la complexité de l’interaction entre la machinerie transcriptionelle et le promoteur minimal, des complexes TFIID dépourvus de certains TAF ou contenant certains TAF alternatifs existent. De plus, d’autres facteurs reliés à TBP et pouvant le remplacer ont été identifiés (revu dans [91, 92]).

Pour les BPP, l’assemblage du ou des PIC sur le ou les TSS se fait sur la région d’ADN libre de nucléosome qui se situe généralement en amont des promoteurs actifs. La spécificité de cet assemblage reste à déterminer mais il semble que certains BPP montrent une certaine spécificité cellulaire, ce qui laisse croire que l’initiation à ces promoteurs n’est pas aléatoire même si l’on ne retrouve pas de motifs d’ADN évidents à l’instar des SPP (revu dans [90]). 26

1.2.2.2 Le promoteur distal En plus des séquences constituant le promoteur minimal et permettant une transcription basale des gènes, des séquences d’ADN permettant une régulation plus contrôlée de la transcription se retrouvent dans les promoteurs. Ces séquences qui permettent la liaison de facteurs de transcription spécifiques sont situées plus ou moins à proximité du cœur du promoteur et vont faciliter ou réprimer l’initiation de la transcription.

1.2.2.3 Autres régions régulatrices D’autres régions régulatrices de la transcription coopérant avec les promoteurs pour contrôler le niveau de transcription existent dans le génome, soit les amplificateurs, les atténuateurs, les régions de contrôle de locus (LCR), les barrières et les isolants (Fig. 1.13).

Les amplificateurs sont constitués d’un regroupement de sites de liaison pour des activateurs dont l’effet sur la transcription est indépendant de leur orientation et de leur position (revu dans [93]). Ils peuvent être situés à des distances du site d’initiation de la transcription pouvant aller jusqu’à 800 kb en aval ou en amont et peuvent se retrouver à l’intérieur d’un intron (Fig. 1.13). Les amplificateurs, et les activateurs s’y liant, vont influencer la transcription en recrutant des complexes de remodelage de la chromatine (voir ci-après) ou en ciblant la machinerie transcriptionnelle au promoteur minimal. En contrepartie, les atténuateurs sont des séquences permettant la répression de l’activité d’un promoteur indépendamment de leur orientation et de leur position.

Les LCR sont, comme les amplificateurs, des regroupements de sites de liaison d’activateurs mais cette fois-ci constituant un arrangement complexe d’éléments régulateurs (revu dans [94]). L’activité des LCR ne dépend pas de leur site d’insertion dans l’ADN contrairement aux amplificateurs dont l’activité peut être bloquée par leur site d’intégration dans la chromatine native. Néanmoins, l’activité des LCR peut être limitée par leur position et leur orientation.

L’activité de ces régions régulatrices pouvant affecter plusieurs gènes situés dans une même région, des éléments d’ADN bloquant l’effet des amplificateurs et des LCR, soit les isolants et les barrières respectivement, permettent de restreindre leur champ d’action assurant ainsi un contrôle accru de la transcription (Fig. 1.13) (revu dans [95-97]). 27

Figure 1.13 : Module de régulation de la transcription chez l’eukaryote. Arrangement complexe d’éléments amplificateurs, d’un élément atténuateur et d’un isolant permettant la régulation de la transcription par le promoteur composé d’une partie distale contenant des éléments de réponse (RE) permettant la liaison de facteurs de transcription et d’un promoteur minimal formé par une boîte TATA (TATA), un initiateur (INR) et un élément promoteur en aval (DPE). Adapté de [98]

1.2.3 Facteurs de transcription

1.2.3.1 Généralités Plusieurs types de facteurs de transcription vont interagir avec les diverses séquences d’ADN pour contrôler la transcription. La majorité de ces facteurs peuvent être regroupés en trois groupes principaux : les facteurs généraux de transcription (GTF), les facteurs de transcription constitutivement actifs et les facteurs de transcription conditionnellement actifs ou inductibles. Les GTF, comme expliqué précédemment, sont nécessaires à la formation du complexe de préinitiation de la transcription. Les facteurs de transcription constitutivement actifs et ubiquitaires ont la capacité d’activer ou réprimer de façon constitutive la transcription génique en liant une séquence d’ADN spécifique située à l’intérieur d’une des régions régulatrices définies antérieurement. Par exemple, le facteur SP1 lie les séquences riches en GC, comme les îlots CpG, présents dans plusieurs promoteurs de gènes exprimés de façon constitutive. Pour leur part, les facteurs de transcription dont l’activité est conditionnelle ou inductible lient aussi des séquences 28 d’ADN spécifiques, dans ce cas-ci nommées éléments de réponse, mais leur activité est modulée par différents mécanismes : ils peuvent être constitutivement actifs mais être synthétisés de façon spécifique par un tissu; leur localisation nucléaire peut être contrôlée; leur activation peut nécessiter la liaison d’un ligand dont l’origine peut être intracellulaire ou extracellulaire; ou encore, ils peuvent être activés par une modification post- traductionnelle résultant de l’activation d’une cascade signalétique spécifique. Les facteurs de transcription inductibles peuvent aussi agir à titre d’activateurs et/ou de répresseurs de la transcription.

1.2.3.2 Mode d’action Chez les eukaryotes, l’ADN contenu dans le noyau est enroulé sous forme de nucléosome. Ces nucléosomes formés par les histones se ressèrent à leur tour pour éventuellement former la chromatine. Ces divers niveaux de compaction rendent l’ADN réfractaire à la transcription génique (revu dans [99]). Plusieurs mécanismes sont utilisés pour permettre l’accès des activateurs primaires à l’ADN. Premièrement, certains activateurs, comme HNF3 (FOXA) et le récepteur des glucocorticoïdes (GR), peuvent lier l’ADN même en présence d’un nucléosome, formant ainsi une structure tertiaire permettant le recrutement des autres facteurs nécessaires à l’activation de la transcription (Fig. 1.14 A) [100, 101]. La liaison des histones à l’ADN étant dynamique, il peut exister une compétition entre les diverses protéines ayant la capacité de lier l’ADN (Fig. 1.14 B) [102, 103]. De plus, certaines régions d’ADN ne possèdent pas de nucléosome et ce de façon permanente permettant ainsi la liaison d’un ou de plusieurs activateurs de la transcription (Fig. 1.14 C) (revu dans [104]). Enfin, dans certains cas particuliers, l’accès à un site activateur empaqueté dans un nucléosome peut être facilité par la présence proximale d’une séquence d’ADN particulière ou d’un site d’adhésion d’une autre protéine architecturale qui aura pour effet d’ouvrir la chromatine et ainsi de favoriser la liaison de l’activateur au détriment des histones (Fig. 1.14 D) [105, 106].

29

Figure 1.14 : Mode de liaison des facteurs de transcription. Voir le texte de la section 1.2.3.2. Adapté de [107]

La liaison d’un activateur primaire au promoteur d’un gène permet de recruter, via leur domaine d’activation, soit la machinerie transcriptionnelle ou encore des mégacomplexes multiprotéiques responsables de la modification des histones et du remaniement de la chromatine (Fig. 1.15) (revu dans [108-112]). Ces complexes de remodelage peuvent aussi être recrutés par certains composants de la machinerie transcriptionnelle. L’action de ces complexes va permettre d’expulser ou de déplacer les nucléosomes à proximité permettant la liaison d’autres facteurs de transcription. La structure de la chromatine de chaque promoteur sera déterminante pour la régulation séquentielle des événements de liaison, de recrutement et de modification de facteurs de transcription qui mèneront ultimement à la transcription génique.

Figure 1.15 : La régulation de la transcription par les facteurs de transcription. Les activateurs ou facteurs de transcription liant les éléments de réponse (RE) situés au promoteur ou à un amplificateur vont permettre le recrutement de complexes de cofacteurs favorisant ultimement le recrutement de la machinerie transcriptionnelle sur le promoteur minimal. TAF, facteur associé à TBP; Inr, initiateur; DPE downstream promoter element. Adapté de [113] 30

1.3 Transcription hépatique La spécification, le développement, la différenciation, la maturation et le maintien de l’homéostasie métabolique hépatique sont contrôlés en grande partie au niveau transcriptionnel. L’expression tissulaire spécifique des gènes responsables de ces diverses étapes et la coordination dans le temps de cette expression sont rendues possibles par l’action concertée des facteurs de transcription enrichis au foie (LETF) et de leurs co- activateurs sur leurs gènes cibles, et ce, sous l’influence de stimuli extracellulaires. Ces LETF se régulent entre eux pour permettre l’établissement d’un réseau transcriptionnel autonome contrôlant les fonctions hépatocytaires (Fig.1.16). Parmi les LETF les mieux étudiés, on retrouve les « Hepatocyte Nuclear Factor » (HNF) HNF-1, HNF-3 (FOXA), HNF-4 (NR2A1) et HNF-6 (ONECUT); les membres de la famille des « basic region leucine zipper » (bZip), C/EBP, C/EBP et DBP; et certains récepteurs nucléaires comme COUPTFII (NR2F2), FXR (NR1H4), PXR (NR1I2), CAR (NR1I3) et FTF (NR5A2 [LRH- 1]) (revu dans [114-116]).

Figure 1.16 : Réseaux transcriptionnels hépatiques à divers stades du développement murin (E14,5 et E18,5) et chez l’adulte (P45). Représentations schématiques des interactions inter-régulatoires entre les régulateurs hépatiques. Les niveaux d’expression relatifs de chaque régulateur sont illustrés comme suit : (cercle blanc interrompu) pas d’expression; (cercle gris pâle interrompu) faible expression; (cercle gris pâle) expression moyenne; (cercle gris foncé) forte expression. Tiré de [116] 31

1.3.1 Hepatocyte Nuclear Factor (HNF)

1.3.1.1 HNF1 La famille HNF1, appartenant à la grande famille des protéines à homéodomaine, est composée de deux membres, HNF1 et HNF1revu dans . Leur structure se divise en trois domaines fonctionnels distincts : la partie en N-terminal constitue le domaine de dimérisation; au centre de la protéine se trouve l’homéodomaine atypique couplé à un domaine POU permettant la liaison à l’ADN; en C-terminal se retrouve le domaine de transactivation de la protéine. Les HNF1 se lient à l’ADN sous forme d’homodimère ou d’hétérodimère (). HNF1 et  sont exprimés principalement dans le foie, les reins, le tube digestif et le pancréas. L’expression de HNF1 précède celle de son paralogue au cours de l’embryogenèse. Dans le foie, on retrouve plus de protéine  que  et l’inverse est observé dans les reins. Bien que leur structure soit similaire, HNF1 a une meilleure capacité transactivatrice que HNF1. Des études d’immunoprécipitation de chromatine couplée à des puces contenant 13000 régions promotrices ont permis de démontrer que HNF1 lie les promoteurs de gènes permettant la réalisation d’une partie substantielle des fonctions biochimiques du foie soit le métabolisme des hydrates de carbone, le métabolisme des lipides, la détoxification et la synthèse de protéines plasmatiques [117]. L’inactivation de Hnf1 provoque des dysfonctions hépatiques, pancréatiques et rénales résultant en la mort post-natale des souris [118]. Une hépatomégalie provoquée par une augmentation de la prolifération des hépatocytes est observée chez ces souris. Étant donné leur grande homologie, l’augmentation du niveau d’HNF1 dans les souris Hnf1 -/- peut compenser en partie pour la perte de HNF1. Contrairement à Hnf1, l’inactivation de Hnf1 est létale durant l’embryogenèse dû à un problème de formation de l’endoderme viscéral [119, 120]. HNF1 peut compenser la perte de HNF1 dans la formation des corps embryonnaires à partir de cellule ES venant ainsi confirmer leur similitude fonctionnelle [121].

1.3.1.2 HNF3 (FOXA) La sous-famille HNF3 comprend trois membres    (FOXA1-3) et fait partie de la famille des facteurs de transcription de type « forkhead » (revu dans [122]). Les 32

« forkhead » possèdent un domaine de liaison à l’ADN de 110 acides aminés conservé de la levure à l’humain. La structure tridimensionnelle du domaine de liaison des FOXA est similaire à celle de l’histone H1 permettant aux FOXA d’ouvrir la chromatine hautement compacte sans l’intervention de complexe de remodelage de la chromatine [17, 123]. Cette caractéristique permet aux FOXA d’être des facteurs pionniers dans l’activation de gènes, leur liaison à l’ADN provoquant le déplacement de l’histone adaptateur H1 et ouvrant ainsi l’accès à l’ADN pour d’autres facteurs de transcription. En plus du domaine de liaison à l’ADN qui est flanqué par des sites de localisation nucléaire, les FOXA possèdent deux régions activatrices conservées en N et C terminal [124, 125]. FOXA1 et 2 ont un patron d’expression développemental et adulte plutôt similaire mais présentant quelques différences, FOXA2 étant exprimé plus tôt lors de l’embryogenèse [122, 126]. Les deux protéines sont exprimées dans diverses structures ayant un rôle important à jouer lors de la gastrulation dont la ligne primitive antérieure et le nœud. Elles sont aussi exprimées dans le mésoderme et l’endoderme définitif formés après la gastrulation. Les FOXA1 et 2 sont aussi retrouvés ultérieurement dans les organes issus de l’endoderme où leur expression persiste jusque chez l’adulte. Les patrons d’expression des FOXA1 et 2 chez l’adulte dans les tractus gastro-intestinal et respiratoire sont plutôt similaires. Par contre FOXA1 est exprimé dans le système urinaire et les organes reproducteurs mâles. FOXA3 est pour sa part principalement exprimé par une région restreinte de l’endoderme définitif et par les organes issus de cette région incluant le foie où il est le membre de la famille le plus exprimé chez l’adulte.

L’inactivation des trois gènes de la famille a été effectuée chez la souris (revu dans [122]). La délétion de Foxa1 entraîne la mort des souris dans la première semaine après leur naissance dû à une malformation pulmonaire et à une hypoglycémie [127]. Les souris Foxa2-/- meurent pendant l’embryogenèse au 10ième jour de gestation [128, 129]. Des problèmes de morphologie de structures essentielles au développement comme le nœud, la notochorde, le tube neural et le tube digestif sont responsables de la résorption des embryons. Pour ce qui est de Foxa3, son inactivation n’entraîne que de légers problèmes métaboliques sous certaines conditions [130]. L’inactivation de Foxa1 couplée à celle de Foxa2 dans la région d’expression de Foxa3 dans l’endoderme par inactivation conditionnelle empêche complètement la formation du foie confirmant l’importance de la 33 famille FOXA dans l’hépatogenèse [131]. D’autre part, l’inactivation conditionnelle de Foxa2 dans les hépatocytes, après la spécification hépatique, ne provoque que des problèmes bénins dans le métabolisme du glucose chez l’adulte [132, 133].

1.3.1.3 HNF4 (NR2A) Les protéines HNF4 font partie de la superfamille des récepteurs nucléaires. Il existe deux membres, HNF4 (NR2A1) et HNF4 (NR2A2). HNF4 est exprimé sous forme de plusieurs variants d’épissage. Il lie l’ADN sous forme d’homodimère à deux motifs AGGTCA espacé par un nucléotide (DR1). L’activité de HNF4 peut être modulée par son ligand, les Acyl-CoA gras thioesters [134]. La protéine HNF4 est exprimée dès le jour embryonnaire 4,5 (E4,5) dans l’endoderme primitif du blastocyste et sera exprimée tout au cours du développement dans l’endoderme viscéral extraembryonnaire du sac vitellin. Dans l’embryon, HNF4 est détecté dans le bourgeon hépatique et le tube digestif à partir de E8,5 et dans le pancréas et les reins vers E10 [135, 136]. Chez l’adulte, HNF4 est exprimé dans le foie, le pancréas, les reins, le tube digestif et la peau [137]. Dans le foie, HNF4 est un important régulateur de divers sentiers métaboliques via la régulation d’une grande quantité de gènes impliqués dans le métabolisme du glucose, du cholestérol et des acides gras [117, 138-141]. Des études de ChIP-chip avec un anticorps HNF4 sur des foies de souris adultes ont montré que la protéine était liée sur 12% des promoteurs présents sur la puce et sur 42% des gènes hépatiques étant transcriptionnellement actifs (caractérisés par la présence de l’ARN polymérase II sur leur promoteur) [117, 141]. L’inactivation conditionnelle de Hnf4 dans le bourgeon hépatique altère la morphologie et la différenciation des hépatocytes et affecte une grande quantité de gènes impliqués dans la plupart des fonctions hépatiques matures [139]. Cependant, Hnf4 n’est pas essentiel aux étapes précoces du développement hépatique [142]. L’inactivation de Hnf4 dès le début du développement provoque la résorption des embryons à l’étape de la gastrulation à E7,5 due à la réduction de l’expression de plusieurs protéines du sac vitellin permettant la gastrulation [143, 144].

De son côté, HNF4 est exprimé dans les reins, le tube digestif, le pancréas et les testicules. L’inactivation de Hnf4 provoque la diminution des dépenses énergétiques et de l’activité 34 locomotrice des souris, résultant en une augmentation du poids corporel malgré une diminution de la prise de nourriture et d’eau [145].

1.3.1.4 HNF6 (Onecut1) HNF6, aussi nommé Onecut1 (OC-1), est un facteur de transcription à domaine Homeo possédant en plus un domaine CUT permettant la liaison à l’ADN [146, 147]. Il est exprimé principalement dans l’endoderme et ses dérivés, principalement le foie et le pancréas en plus d’être exprimé dans certaines structures du système nerveux [148-151]. La famille Onecut comprend deux autres membres OC-2 et OC-3 qui partagent certaines fonctions avec HNF6 dans le développement du foie. La double inactivation de Hnf6 et Oc-2 a permis de démontrer l’importance de ces protéines lors de la migration des hépatoblastes dans le septum transversum puisqu’elles dirigent l’expression de gènes d’adhésion et de migration [152]. L’inactivation simple de Hnf6 a démontré qu’il est aussi essentiel pour la formation et la morphogenèse du tractus biliaire hépatique [148]. HNF6 contrôle la différenciation des hépatoblastes en hépatocytes ou cholangiocytes en modulant la réponse au TGF- . HNF6 régule aussi plusieurs des LETF et joue un rôle dans la détoxification et dans le métabolisme du glucose en plus d’être indirectement relié à la différenciation des lymphocytes B [116, 155, 156].

1.3.2 CAAT/enhancer binding protein (C/EBP) La sous-famille des protéines C/EBP appartient à la famille bZip. Les protéines C/EBPs se lient à l’ADN sous forme d’homodimère ou d’hétérodimère avec les membres de la sous- famille C/EBP ou avec d’autres membres de la famille bZip à des séquences variant selon la nature du dimère [157-159] (revu dans [160]). Les dimères C/EBP se lient spécifiquement à deux boîtes CAAT inversées, espacées par deux nucléotides (RTTGcgYAAY [R = A/G ; Y = C/T]) [161]. Six gènes,  (nommés selon leur ordre chronologique de découverte), dont quatre (etne possèdent pas d’intron, codent pour un nombre de protéines supérieur à six : l’utilisation de promoteurs et de sites d’initiation de la traduction alternatifs, l’épissage alternatif, et la protéolyse dirigée permettent de produire les diverses isoformes des protéines C/EBP pouvant agir à titre d’activateurs ou de répresseurs de type dominant négatif. Généralement, les C/EBP possèdent un domaine d’activation de la transcription en N-terminal et un domaine de 35 dimérisation de type « leucine zipper » en C-terminal. La spécificité de la liaison à l’ADN est déterminée par une région basique adjacente au domaine de dimérisation [162]. C/EBP et C/EBP sont les membres de la famille les plus étudiés. Ils sont tous les deux exprimés dans le foie où ils jouent un rôle dans la différenciation (sections 1.3.2.1 et 1.3.2.2). C/EBP est exprimé faiblement au foie mais est induit lors de la phase de réponse aigüe (APR). C/EBP est aussi induit par des signaux de stress comme les dommages à l’ADN ou l’arrêt de la croissance et agit à titre de dominant négatif. C/EBP est exprimé seulement dans des lignées cellulaires myéloide et lymphoide tandis que C/EBP est exprimé constitutivement et de façon ubiquitaire et agit généralement à titre de dominant négatif de la famille bZip. La famille C/EBP est auto-régulable, les membres de la famille ayant souvent un rôle régulateur sur leur promoteur et le promoteur de leurs paralogues.

1.3.2.1 C/EBP C/EBP est le premier membre de la famille à avoir été identifié. En plus d’être présent au foie, C/EBP est exprimé dans les tissus adipeux, les intestins, les poumons, les surrénales, le placenta et les cellules mononucléées du sang périphérique [163]. Des isoformes C/EBP de 42 kD et 30 kD sont produites par un mécanisme de balayage ou « scanning » du ribosome [164-166]. En plus du domaine de dimérisation et de liaison à l’ADN (domaine bZip), l’isoforme la plus longue possède aussi trois domaines modulant son activité, les deux premiers médiant la liaison coopérative à l’ADN de C/EBP avec TBP et TFIIB et le troisième agissant à titre de domaine régulateur négatif [167, 168]. L’isoforme la plus courte (30 kD) possède aussi le domaine bZip mais a une capacité transactivatrice réduite comparativement à l’isoforme de 42 kD.

L’expression du gène C/ebp est observée dès le début de la formation du foie (E9,5) [169]. L’inactivation de C/ebp provoque des changements dans l’architecture hépatique marqués par l’apparition d’acinus constitués de cellules en prolifération ressemblant à des cellules d’hépatocarcinomes [170]. L’absence de C/EBP entraîne aussi des altérations métaboliques, notamment dans le métabolisme du glucose, provoquant la mort post-natale des embryons, conséquence d’une hypoglycémie sévère. La réduction de l’expression de la glycogène synthase (GS) et de trois enzymes gluconéogéniques (G6Pc, PCK1 et TAT) 36 empêchant l’entreposage (sous forme de glycogène) et la synthèse du glucose respectivement, provoque cette hypoglycémie [171].

1.3.2.2 C/EBP Comme C/EBP, C/EBP est exprimé dans le foie dès le début de sa formation à E9,5 et son expression y persiste tout au cours du développement embryonnaire [169]. Chez l’adulte, C/EBP est exprimé dans le foie, les intestins, le tissu adipeux et les poumons. En plus des domaines de dimérisation, de liaison à l’ADN et d’activation transcriptionnelle, C/EBP contient deux domaines répresseurs, le premier modulant le domaine d’activation transcriptionnelle et le deuxième inhibant la liaison à l’ADN de C/EBP de façon tissu dépendante [172, 173]. À l’instar de C/EBP, des mécanismes impliquant des codons d’initiation alternatifs et la protéolyse permettent la synthèse de 3 isoformes majeures de C/EBP : l’isoforme pleine longueur de 38 kD (FLAP : Full lenth Liver-enriched transcriptional Activator Protein), l’isoforme LAP (Liver-enriched transcriptional Activator

Protein) de 35 kD et LIP (Liver-enriched transcriptional Inhibitory Protein) de 21 kD [165, 174, 175]. L’isoforme pleine longueur FLAP possède une extension N-terminale de 21 acides aminés permettant le recrutement du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF, conférant à cette isoforme un plus grand potentiel d’ouverture de chromatine et d’activation de la transcription [176]. L’isoforme LIP ne possède pas de domaine de transactivation et agit à titre de dominant négatif en formant des hétéroduplexes C/EBP inactifs.

L’inactivation de C/ebp provoque plusieurs changements métaboliques. Deux phénotypes différents ont été observés. Tout d’abord, l’absence de C/EBP chez certaines souris provoque la mort des nouveau-nés causée par une hypoglycémie [177]. Cette hypoglycémie résulte d’une incapacité des hépatocytes à mobiliser les réserves de glycogène et à produire du glucose. D’autres souris, dont le gène C/ebp est inactivé, survivent jusqu’à l’âge adulte. Cependant, ces souris présentent une réduction des lipides sanguins, une hypoglycémie lors du sevrage et une altération de la production de glucose hépatique et de la lipolyse dans les tissus adipeux en réponse à la stimulation avec des hormones comme le glucagon et l’adrénaline. Ces problèmes métaboliques sont principalement causés par une 37 réduction de la production d’AMPc hépatique et de l’activité de la protéine kinase A (PKA).

En plus de son rôle métabolique, C/EBPparticipe aussi aux cascades signalétiques hépatiques régissant l’inflammation. L’expression de C/EBP est induite par plusieurs cytokines comme l’interleukine 6 (IL-6), IL-1 et le « tumor necrosis factor alpha» (TNF mais aussi par le lipopolysaccharide (LPS), le glucagon et la dexamethasone [178-181]. L’activité transcriptionelle de C/EBPpeut aussi être induite par l’interféron gamma (IFN- [182, 183]De plus, certaines cytokines peuvent moduler sa capacité de liaison à l’ADN [182, 183]. Plusieurs des gènes cibles de C/EBPsont reliés aux mécanismes inflammatoires incluant des gènes codant pour des cytokines et leur récepteurs, des protéines plasmatiques hépatiques induites lors de l’APR et plusieurs composants des sentiers de transduction de signal (revu dans [162]).

L’activité de C/EBPpeut-être modulée par plusieurs modifications post-traductionnelles dont la phosphorylation, l’acétylation et la sumoylation permettant un contrôle aigu de son activité (revu dans [162]). De plus, C/EBP peut interagir avec des facteurs de transcription n’appartenant pas à la famille ip comme NFB, SP1, STAT, pRB [184-187]. L’interaction peut mener à une activation synergique ou encore à un effet antagoniste entre les deux protéines selon l’organisation du promoteur et le type cellulaire élargissant ainsi le champ d’action transcriptionnel de C/EBP.

1.3.3 Les récepteurs nucléaires

1.3.3.1 Généralités Les récepteurs nucléaires (NR) sont des facteurs de transcription ayant un rôle majeur dans l’exécution des processus biologiques importants permettant la croissance, le développement et l’homéostasie métabolique de la majorité des organismes. La signalisation par les NR est très complexe, les NR pouvant moduler un gène directement par liaison à l’ADN ou par transrépression (sans liaison à l’ADN) ou en provoquant le relâchement de la répression du gène lors de sa liaison. Les différents modes d’action des NR peuvent être dépendants ou non d’un ligand et peuvent être génomiques ou non- 38 génomiques. L’activité des récepteurs nucléaires est aussi modulée par le recrutement de coactivateurs et de corépresseurs. De plus, plusieurs signalisations cellulaires interagissent avec les NR et leurs corégulateurs, les modifiant de façon post-traductionnelle. La phosphorylation, la sumoylation, l’acétylation et l’ubiquitination des NR ont un rôle important à jouer dans la régulation de leur activité transcriptionelle (revu dans [188-193]).

Avec ses 48 membres chez l’humain et 49 chez la souris (le gène supplémentaire chez la souris code pour le récepteur FXR), les récepteurs nucléaires représentent une des plus grandes familles de facteurs de transcription. La superfamille des NR est divisée en 7 sous- familles (NR0-NR6) selon leur homologie de séquence [194, 195]. La structure modulaire des récepteurs est très conservée chez tous les membres de la famille (Fig. 1.17) (revu dans [189]). Elle comprend 6 domaines (A-F) : les domaines A/B situés en N-terminal possèdent parfois une fonction activatrice indépendante d’un ligand; le domaine C, formé par deux doigts de zinc est le domaine de liaison à l’ADN (DBD); le domaine E représente le domaine de liaison du ligand (LBD) et possède une fonction activatrice dépendante du ligand (domaine F) permettant l’association avec les coactivateurs; le domaine charnière D procure une flexibilité entre les domaines DBD et LBD. L’activité de plusieurs des récepteurs nucléaires est contrôlée par la liaison d’un petit ligand lipophile au LBD (Fig. 1.17).

Figure 1.17 : Structure des récepteurs nucléaires. Haut – Représentation schématique des domaines conservés des récepteurs nucléaires. Bas – Représentation 3D des structures du domaine de liaison à l’ADN (DBD) (lié à l’ADN) et du domaine de liaison du ligand (LBD) (lié à une hormone) du récepteur nucléaire aux oestrogènes (ER). Tiré de www.wikipedia.org/wiki/Nuclear_receptor 39

En plus de leur classification par homologie de séquence, les récepteurs nucléaires peuvent aussi être divisés en trois classes selon leur mode d’action, soit les récepteurs stéroïdiens (classe I), les récepteurs de type thyroïde/rétinoïde (classe II) et les récepteurs orphelins (classe III).

1.3.3.1.1 Classe I Les récepteurs de la classe I ont pour ligand des hormones stéroïdiennes soit la progestérone (PR), les androgènes (AR), les glucocorticoïdes (GR), les oestrogènes (ER) et les minéralocorticoïdes (MR). Lors de la liaison d’un ligand, ces récepteurs se dissocient de la chaperone (HSP) avec laquelle ils sont associés dans le cytoplasme, provoquant leur translocation vers le noyau et permettant leur interaction avec le génome et la régulation de la transcription. Ces récepteurs lient l’ADN sous forme d’homodimère (en configuation tête-à-tête) à un palindrome imparfait (répétitions inversées) formé de deux hexamères de type AGGTCA pour ER ou AGAACA pour les autres (un des deux hexamères est hautement conservé) séparés par 3 nucléotides variables (IR3).

1.3.3.1.2 Classe II Pour leur part, les récepteurs de classe II lient l’ADN sous forme de dimère avec le récepteur rétinoïque X (RXR). La classe II est formée des récepteurs de la famille thyroïde/rétinoïde soit le récepteur thyroïdien (TR), le récepteur de la vitamine D (VDR), le récepteur de l’acide rétinoïque (RAR) et les récepteurs activés par la prolifération peroxisomale (PPAR). Contrairement à la classe I, les récepteurs se dimérisent en conformation tête-à-queue et lient chacun un hexamère de type AGGTCA positionné en répétitions directes (DR) ou inversées (IR) séparées par un nombre de nucléotides variant de 1 à 6. De façon générale, en l’absence de ligand agoniste, les hétérodimères sont liés à l’ADN et empêchent l’activation de la transcription par leur interaction avec des corépresseurs. La liaison d’un ligand provoque le relargage des protéines co-répresseures et le recrutement de coactivateurs menant à l’activation de la transcription.

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1.3.3.1.3 Classe III La classe III est formée de tous les récepteurs nucléaires identifiés par similarité de structure et pour lesquels aucun ligand n’était identifié. Plusieurs de ces récepteurs « orphelins » ont maintenant été « adoptés », un ou plusieurs ligands leur étant maintenant assignés. Une fraction de ces récepteurs lie l’ADN sous forme d’hétérodimère avec RXR, d’homodimère ou encore de façon monomérique. Comme les récepteurs de classe II, les récepteurs de classe III interagissent avec des hexamères de type AGGTCA dont l’orientation et la distance les séparant varient selon le ou les types de protomères impliqués. Puisque certains des récepteurs orphelins se lient à l’ADN sous forme de monomères, la séquence de nucléotides flanquant l’hexamère (en 5’) a cette fois-ci une grande importance dans la spécificité de la liaison.

Les membres de la classe III ont été par la suite séparés selon leur mode de liaison à l’ADN. Les membres liant l’ADN sous forme d’hétérodimères font maintenant partie de la classe II, ceux qui lient l’ADN sous forme d’homodimère à deux hexamères disposés en répétition directe forment la classe III et les membres liant l’ADN sur un seul hexamère prolongé sous forme de monomère ou d’homodimère constituent une quatrième classe (revu dans [196]).

1.3.3.2 Les récepteurs nucléaires hépatiques Plusieurs récepteurs nucléaires sont impliqués de façon très importante dans la régulation transcriptionelle hépatique dont les principaux sont LXR, FXR, PPAR, PXR, CAR, SHP et FTF.

1.3.3.2.1 LXR Il existe deux membres de la famille « Liver X Receptor » (LXR), LXR (NR1H3) et LXR (NR1H2). LXR appartient à la classe II des récepteurs nucléaires, liant l’ADN sous forme d’hétérodimère avec RXR. Le complexe LXR/RXR lie l’élément de réponse à LXR, un DR4, et est activé à la fois par le ligand de RXR, l’acide 9-cis-rétinoïque, et les ligands de LXR, les oxystérols [197-200]. LXR est exprimé très fortement dans le foie mais aussi dans les surrénales, les intestins, le tissu adipeux, les macrophages, les poumons et les reins tandis que LXR est ubiquitaire (revu dans [201]). Au foie, LXR joue un rôle majeur dans 41 le métabolisme et le transport inverse du cholestérol, modulant l’expression de plusieurs transporteurs de la famille ABC en plus du gène Cyp7A1 (chez les rongeurs) codant l’enzyme limitant de la transformation du cholestérol en acides biliaires [202-206]. LXR est aussi un important régulateur de la lipogenèse hépatique via la régulation de l’expression de SREBP1c, un facteur de transcription, et de plusieurs enzymes responsables de la synthèse des lipides et du remodelage des lipoprotéines [207, 208]. Enfin, LXR joue aussi un rôle dans le métabolisme du glucose, favorisant son utilisation (glycolyse) et réprimant les gènes, Pck1 et G6pc, responsables de la gluconéogenèse [209, 210].

1.3.3.2.2 FXR La famille FXR comprend deux membres, FXR (NR1H4) et FXRNR1H5). FXR est présent chez quelques mammifères dont les rongeurs, mais est absent chez les primates ou l’on ne retrouve qu’un pseudogène [211]. La fonction de FXR reste à être caractérisée. FXR (FXR ci-après) est produit en quatre isoformes dont les particularités fonctionnelles sont très peu connues. FXR est exprimé principalement dans le foie, les intestins, les reins, les surrénales et faiblement dans le tissu adipeux [212-214]. FXR fait partie de la classe II des récepteurs nucléaires, liant l’ADN sous forme d’hétérodimère avec RXR. Le récepteur lie un IR1 et est activé par les acides biliaires [215, 216]. FXR est impliqué dans la synthèse des acides bilaires, le métabolisme des lipoprotéines, la regénération hépatique, le métabolisme du glucose et la protection contre des agents hépatotoxiques (revu dans [217]).

1.3.3.2.3 PPAR La famille PPAR comprend trois membres, PPAR, et . PPAR est exprimé dans le foie, les tissus adipeux, les muscles, le cœur et dans certains types de cellules immunitaires (revu dans [218]). Les récepteurs PPAR appartiennent à la classe II des récepteurs nucléaires et lient donc l’ADN conjointement avec RXR sur un élément de type DR1. Plusieurs ligands naturels permettent l’activation de PPAR dont les eicosanoïdes et les acides gras insaturés. PPAR joue un rôle important dans le catabolisme des acides gras en régulant plusieurs enzymes responsables de l’oxidation des acides gras dans les mitochondries et les peroxisomes ainsi que plusieurs sentiers cellulaires du métabolisme des acides gras. De plus, PPAR est impliqué dans le métabolisme du glucose et du cholestérol et il est aussi un important régulateur de l’inflammation en réduisant 42 l’expression des gènes inflammatoires, entre autres, par l’inhibition de l’activité de NFB via IB (revu dans [218, 219]).

L’inactivation du gène Ppar provoque plusieurs altérations au cerveau, à la peau et aux tissus adipeux lui conférant un rôle dans le développement, l’inflammation et le métabolisme des lipides [220, 221]. L’activation de PPAR stimule l’oxidation des acides gras et inhibe la réponse inflammatoire [222, 223]. Dans le foie, PPAR est exprimé plus particulièrement dans les cellules endothéliales [224].

Pour ce qui est de PPARil est un important régulateur de l’adipogenèse et joue aussi un rôle anti-inflammatoire. PPAR est activé par les acides gras. Au foie, les agonistes de PPAR (comme les thiazolidinediones) activent la glycolyse, la synthèse de glycogène et la lipogenèse et inhibent la gluconéogenèse et l’oxydation des acides gras. De plus, PPAR joue un rôle dans l’homéostasie des triglycérides hépatiques (revu dans [225, 226]).

1.3.3.2.4 PXR et CAR PXR et CAR appartiennent à la classe II des récepteurs nucléaires. PXR et CAR sont des xénosenseurs, c’est-à-dire qu’ils sont activés par les xénobiotiques et par des molécules endogènes toxiques. Ils sont donc activés par une variété de ligands incluant certaines molécules thérapeutiques, les insecticides, les pesticides et par des composants nutritionnels. Ces xénosenseurs modulent l’expression de plusieurs enzymes et transporteurs responsables de la détoxification du foie en inactivant ou éliminant les composés toxiques amenés au foie (revu dans [227]). Bien qu’ils activent sensiblement les mêmes gènes et partagent certains ligands, les modes d’activation de PXR et CAR diffèrent (revu dans [228]). PXR se trouve dans le noyau et possède une faible activité transactivatrice basale qui est fortement augmentée par la liaison d’un ligand tandis que le récepteur CAR réside dans le cytoplasme et est transloqué au noyau après interaction avec un ligand, permettant ainsi l’activation de ses gènes cibles. PXR et CAR étant aussi impliqués dans le métabolisme des acides biliaires et des hormones thyroïdiennes et stéroïdiennes, les xénobiotiques activant PXR et CAR peuvent interférer avec les fonctions physiologiques hépatiques normales (revu dans [229-231]). En effet, PXR et CAR jouent un rôle activateur dans la lipogenèse via leur régulation de facteurs de transcription et gènes 43 lipogéniques. À l’inverse, PXR et CAR ont un effet inhibiteur sur l’oxydation des acides gras et la gluconéogenèse en interagissant physiquement avec plusieurs activateurs de ces sentiers dont FOXA2 et FOXO1 empêchant leur liaison à l’ADN et en titrant PGC-1 un coactivateur transcriptionnel de plusieurs facteurs de transcription métaboliques dont HNF4 et FOXO1.

1.3.3.2.5 SHP SHP est un récepteur nucléaire atypique constitué d’un LBD putatif, mais ne possèdant pas de DBD (revu dans [232]). SHP hétérodimérise avec plusieurs récepteurs nucléaires et autres facteurs de transcription et réprime leur activité transcriptionelle. Trois mécanismes de répression ont jusqu’à maintenant été identifiés. SHP peut compétitionner pour la liaison de coactivateurs à un facteur de transcription; il peut aussi empêcher la liaison à l’ADN du facteur avec lequel il interagit; et il peut créer une répression active par recrutement de corépresseurs. SHP est principalement exprimé dans le foie, obéissant au rythme circadien, mais on le retrouve à de plus faibles niveaux dans d’autres tissus dont plusieurs appartenant aux systèmes digestif, nerveux et reproducteur. Les études sur SHP ont permis de démontrer qu’il a un effet négatif sur l’expression de plusieurs gènes impliqués dans divers sentiers métaboliques hépatiques dont le métabolisme des acides biliaires et du cholestérol, le métabolisme des lipides, la gluconéogenèse et le métabolisme des drogues et la détoxification.

1.3.4 Autres facteurs En plus des LETF et des récepteurs nucléaires, d’autres facteurs de transcription ont un rôle hépatique important. Parmi ceux-ci, les protéines GATA et SREBP sont respectivement impliquées dans le développement et le métabolisme hépatique.

1.3.4.1 GATA Le domaine de liaison à l’ADN des facteurs de transcription GATA (dont le nom vient de la séquence de leur site de liaison [A/T]GATA[A/G]) est constitué d’un ou deux doigts de zinc et d’une région basique adjacente (revu dans [233]). Il existe six membres chez les vertébrés dont deux, GATA4 et GATA6, sont exprimés dans l’endoderme et ont un rôle important à jouer dans l’hépatogenèse. GATA4 et GATA6 sont des facteurs de tête dans 44 l’établissement du réseau de facteurs de transcription hépatiques menant à la différenciation du foie. Ces facteurs font d’ailleurs partie du réseau signalétique TGF- menant à la spécification du foie à partir de l’endoderme [26, 27, 234].

1.3.4.2 SREBP Les SREBP appartiennent à la famille des « basic helix loop helix leucine zipper » (bHLH- LZ). Ils sont synthétisés sous forme de précurseurs de 1150 acides aminés rattachés à la membrane du réticulum endoplasmique (revu dans [235, 236]). Il existe deux gènes codant pour les SREBPs, Srebf1 et Srebf2, produisant les trois protéines de la famille : SREBP1a, SREBP1c et SREBP2. La structure des SREBPs est constituée de trois sections distinctes : la partie N-terminale d’environ 480 aa contient le domaine transactivateur et le domaine de liaison à l’ADN et de dimérisation (bHLH-LZ); au centre se retrouvent deux domaines transmembranaires hydrophobes; en C-terminal se situe un domaine de régulation. Lors de l’activation provoquée, entre autres, par une déplétion en stérols (SREBP1a et 2) ou par l’insuline (SREBP1c), le domaine N-terminal est clivé en deux étapes impliquant la protéine SCAP et deux protéases (S1P et S2P). Le SREBP actif est par la suite importé dans le noyau par l’importine permettant la liaison de SREBP à ses sites de reconnaissance, soit les éléments de réponse aux stérols (SRE) (5’-TCACNCCAC-3’) et les boîtes E (5’- CANNTG-3’) [237]. Les SREBPs modulent principalement l’expression des enzymes de la synthèse du cholestérol, de la lipogenèse et de la synthèse de NADPH, un cofacteur essentiel à la synthèse lipidique. Bien que les divers SREBPs aient des rôles assez similaires, quelques distinctions existent entre eux. En général, une augmentation des niveaux de stérols entraîne une augmentation du niveau de SREBP1c et conséquemment, une activation de la lipogenèse tandis qu’une diminution des niveaux de cholestérol entraîne une augmentation du niveau de SREBP2 et ainsi une activation du sentier de synthèse du cholestérol.

1.4 FTF (Fetoprotein Transcription Factor)

1.4.1 Généralités FTF est un récepteur nucléaire orphelin appartenant à la famille FTZ-F1 (NR5A). La famille FTZ-F1 comprend plusieurs membres provenant de plusieurs espèces dont la 45 drosophile, le poisson, le nématode et la grenouille (Fig. 1.18) (revu dans [238, 239]). Chez les mammifères, deux membres de cette famille, soit FTF (NR5A2) et SF-1 (NR5A1) ont été identifiés. Le membre le plus caractérisé, SF-1, est exprimé dans l’axe hypothalomo- pituitaire-surrénale où il agit sur le développement, la différenciation, la stéroïdogenèse et la détermination sexuelle (revu dans [240]).

Figure 1.18 : Arbre phylogénique de la famille NR5A.

FF1a d’omble chevalier (acFF1a); LRH-1 de souris (mLRH-1); SF-1 de rat (rSF-1); ELP de souris (mELP); FTZ-F1 de Rana rugosa (rrFTZ-F1); FF1b de poisson zèbre (zFF1b); FF1a de poisson zèbre (zFF1a); FF1c de poisson zèbre (zFF1c); FF1d de poisson zèbre (zFF1d); FTF de rat (rFTF); FTZ-F1 de medaka (mdFTZ-F1); FTZ-F1 de truite arc-en-ciel (rtFTZ- F1); SF-1 de poulet (cSF-1); FTF de poulet (cFTF); et ftz-f1 de drosophile (dmFTZ-F1). Les nombres représentent les valeurs « bootstrap » après 1000 répétitions. Tiré de [241]

Plusieurs groupes ont isolé le gène NR5A2 menant à l’attribution de plusieurs noms différents pour le même récepteur, LRH-1 étant le plus commun et FTF celui accepté par le « nuclear receptors nomenclature committee » (revu dans [194, 239]). Notre laboratoire ayant identifié l’ -Foetoprotéine (AFP) comme première cible du récepteur NR5A2 chez le mammifère [242], j’utiliserai le sigle FTF pour identifier ce récepteur. 46

1.4.2 Structure et activité

1.4.2.1 Gène Le gène FTF humain contient 8 exons et s’étend sur plus de 150 kb dans la région du 1q32.11 [243, 244]. Divers messagers sont produits par l’utilisation de séquences de polyadénylation différentes. Le foie humain produit l’ARNm le plus long (5,2 kb) tandis que la lignée cellulaire d’hépatome humain HepG2 produit un ARNm supplémentaire de 3,8 kb [245]. Au moins trois isoformes protéiques sont produites à partir d’ARNm formés par épissage alternatif. La plus petite isoforme (323 aa) présente une délétion provenant d’un épissage supplémentaire dans l’exon 5, créant une protéine incapable d’activer la transcription et agissant donc comme dominant négatif ; cependant, la production de cette isoforme est minimale [244, 246, 247].

La structure génomique du gène Ftf murin est très semblable à celle de l’humain [246]. Le gène compte 9 exons et se localise aussi sur le (bande E4); l’exon supplémentaire se situe entre les deux premiers exons homologues humains. Chez les organismes supérieurs autres que les mammifères, la structure du gène est également bien conservée sauf en 5’, le premier exon correspondant à l’exon 2 humain. Plusieurs isoformes (ARN et protéines) sont aussi produites chez les rongeurs résultant d’épissages alternatifs ou de l’utilisation de promoteurs alternatifs [242, 246, 248].

1.4.2.2 Protéines Comme pour la majorité des récepteurs nucléaires, la structure de FTF est divisée en plusieurs domaines fonctionnels (Fig. 1.19). Le domaine A/B de FTF est de longueur variable selon les isoformes et ne possède apparemment pas de fonction activatrice : en transfection, la délétion de ce domaine n’entraîne pas une diminution de l’activité de transactivation du récepteur [242]. Le domaine de liaison à l’ADN, constitué de deux doigts de zinc, est suivi par une boîte Ftz-f1 exclusive à la famille NR5A. Contrairement à la majorité des récepteurs nucléaires, FTF se lie à l’ADN sous forme de monomère à un hémisite de liaison des récepteurs nucléaires précédé d’une extension en 5’ (PyCAAGGPyCPu : Py, pyrimidine [T, C] ; Pu, purine [A, G]) ; la boîte Ftz-F1 permet la liaison à l’extension PyCA et confère au récepteur sa spécificité pour son site de liaison 47

(Fig. 1.19 B) [249]. Le domaine D, ou région charnière, situé entre le DBD et le LBD contient des sites de modification post-traductionnelle et possède une région répressible permettant la régulation de l’activité du récepteur (Fig. 1.19 A) [250-253].

Figure 1.19 : Structure du récepteur nucléaire FTF. A. Représentation des domaines du récepteur nucléaire FTF, de son site de liaison canonique à l’ADN et de ses modifications post-traductionnelles. DBD, domaine de liaison à l’ADN; LBD, domaine de liaison du ligand; P, phosphorylation; S, sumoylation; PML- NBs, Promyelocytic leukemia nuclear bodies; PIP, phosphoinositolphosphate; AF-2, fonction activatrice 2; PKA, Protein Kinase A. B. Structure du complexe DBD-ADN du hFTF [254]. Le DBD est représenté en brun, le domaine Ftz-f1 en vert et l’extension TCA (en 5’) du site consensus pour FTF est représentée en bleu et mauve. C. LBD du hFTF en complexe avec un peptide SHP et un phospholipide [255]. Diagramme en ruban de hFTF- LBD (hélice-, bleu; feuillet , jaune) associé au peptide (NR box1) SHP humain (hSHP) en rouge. Le phospholipide lié au LBD est représenté par des bâtons verts.

Le domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire FTF possède une structure particulière. En effet, le LBD de la majorité des récepteurs nucléaires est constitué de 12 hélices alpha, numérotées H1 à H12. L’arrangement de ces hélices forme la poche de liaison du ligand dont les dimensions varient selon le récepteur. La liaison d’un ligand provoque un repositionnement de l’hélice 12 permettant le recrutement de coactivateurs via l’AF2 et conséquemment l’activation de la transcription [256, 257]. Par contre, plusieurs études en cristallographie effectuées pour déterminer la structure du domaine de liaison du 48 ligand de FTF et identifier un ligand potentiel pour FTF, ont permis d’observer une structure particulière à la protéine murine. En effet, il semble que le LBD de la protéine FTF de souris soit constamment en conformation active et ne nécessite donc pas la liaison d’un ligand. La conformation active du récepteur semble être causée par la présence chez les récepteurs de la famille NR5 d’une hélice 2 prolongée et rigide ce qui stabilise l’hélice 12 permettant l’activation constitutive du récepteur. Chez l’humain, la liaison d’un phospholipide n’est pas essentielle mais permet une activation optimale du récepteur (Fig. 1.19 C) [255, 258-260].

Bien que le récepteur FTF soit structuralement constitutivement actif, son activité peut être modulée par plusieurs modifications post-traductionnelles. Par exemple, FTF peut être suractivé par la phosphorylation par ERK de deux sérines situées dans le domaine charnière et, par PKA, d’une sérine de l’AF2 (Fig. 1.19 A) [251, 261]. FTF peut aussi être séquestré dans des corps nucléaires (PML, promyelocytic leukaemia) par la sumoylation d’une lysine empêchant l’interaction du récepteur avec l’ADN [250]. Enfin, l’activité de FTF est modulée par son interaction avec les corégulateurs transcriptionnels PGC-1, SRC1 et SCR3 qui stimulent son activité, et GPS2, PROX1 et SMRT qui la répriment [253, 262- 265].

1.4.3 Promoteurs Le gène FTF est régulé par deux promoteurs (5’ proximal et intronique) et des sous-régions promotrices stage- et tissu-spécifiques. Les études réalisées par notre laboratoire et par d’autres groupes ont permis de bien caractériser le promoteur 5’ proximal des gènes FTF humain et murin [116, 244, 246, 266]. La transcription du gène FTF est régie par des facteurs importants du développement et de la différenciation endodermique et hépatique mais aussi par plusieurs facteurs de transcription métaboliques chez l’adulte.

Plusieurs sites de liaison aux facteurs de transcription GATA se retrouvent au promoteur proximal (Fig. 1.20). Étant donné que les GATA ont un rôle important lors de la différenciation de l’endoderme, la régulation de FTF par ces facteurs le place comme intermédiaire précoce potentiel de la signalisation menant à la différenciation endodermale hépatique. 49

D’autre part, des sites de liaison pour des facteurs de type bHLH et pour la famille Nkx sont aussi présents et fonctionnels. Cependant, les protéines liant ces sites in vivo restent toujours à être identifiées. Étant donné les relations métaboliques et fonctionnelles entre les protéines SREBP et FTF [267], la protéine liant la boîte E pourrait faire partie de cette famille de bHLH. Pour ce qui est de la famille Nkx, à ce jour, seule la protéine NKX2.8 a été identifiée dans le foie [268].

Des sites pour les facteurs HNF1 et HNF4 sont aussi retrouvés au promoteur de FTF. Bien que le site pour HNF1 soit conservé et que chez l’humain HNF1 active la transcription de FTF [244], son rôle reste toujours à confirmer chez la souris. Le site HNF4 situé en aval du site d’initiation de la transcription permet l’activation de la transcription du gène murin. Cependant, ce site n’est pas conservé chez l’humain. De plus, chez des souris Hnf4-/-, la transcription embryonnaire du gène Ftf n’est pas altérée suggérant un rôle tardif pour le facteur HNF4 dans la régulation de la transcription du gène Ftf (ou encore l’existence d’un mécanisme compensatoire)[143].

Figure 1.20 : Promoteur proximal du gène Ftf. Représentation schématique du promoteur Ftf. Les sites de liaison sont illustrés avec les protéines pouvant s’y lier. Forme pleine, site conservé; forme hachurée, site non conservé.

Un site de liaison de type DR4, conservé du poisson zèbre à l’humain situé lui aussi en aval du site d’initiation de la transcription, a été caractérisé par notre laboratoire [266]. Le site DR4 permet la liaison des hétérodimères de récepteurs nucléaires LXR/RXR et TR/RXR qui contribuent à la régulation transcriptionnelle de Ftf par les hormones thyroïdiennes et les oxystérols.

Des séquences plus en amont permettant la liaison de facteurs ayant un rôle tissulaire plus spécifique ont été identifiées. Trois sites de liaison pour le facteur PDX-1, un facteur de transcription nécessaire à la différenciation et au développement du pancréas à partir de l’endoderme (revu dans [269]), ont été caractérisés par Annicotte et al. [270]. La forte expression pancréatique de FTF pourrait être, en grande partie, attribuée à son activation 50 par PDX-1. Annicotte et al. ont aussi caractérisé un site de liaison pour le récepteur de l’oestrogène dans la séquence distale du promoteur FTF humain. La présence d’oestrogène augmente l’expression de FTF favorisant ainsi la prolifération des cellules MCF-7 [271].

L’expression de FTF est régulée par un deuxième promoteur situé dans le premier intron du gène [248]. Le messager produit via ce promoteur est exprimé dans les cellules ES murines et est détecté faiblement dans les autres tissus exprimant FTF.

1.4.4 Expression tissulaire FTF est exprimé de façon ubiquitaire dès les premiers stades du développement de la souris soit aux stades morula et blastocyste. Son expression se restreint par la suite à l’endoderme viscéral et embryonnaire. Les organes dérivés de l’endoderme embryonnaire, soit le foie, le pancréas et les intestins, expriment par la suite le récepteur. Au cours du développement murin, FTF est aussi exprimé par des ganglions sensitifs (dorsaux, submandibulaires, trigéminaux) ainsi que par certaines régions neurales et par la couche marginale de la moelle épinière. On retrouve aussi FTF dans certains os dont la croissance se fait par ossification endochondrale (neurocranium, côtes, membres). FTF est aussi exprimé dans le tissu conjonctif du poumon. Dans le système reproducteur, FTF se retrouve dans des types cellulaires spécifiques des testicules et des ovaires [266, 272, 273].

Chez l’adulte, FTF est détecté dans certaines populations cellulaires tout au long de l’épithélium du système digestif soit sur la langue, dans l’œsophage, dans l’estomac, dans le petit et le gros intestin et dans la vésicule biliaire [274-276]. Il est aussi exprimé par les cellules exocrines du pancréas, les glandes salivaires, les pré-adipocytes et les hépatocytes. Dans les organes du système reproducteur, FTF est exprimé dans les cellules de Leydig des testicules et dans les cellules des follicules ovariens en plus d’être présent dans la partie antérieure de la glande pituitaire. Des neurones spécifiques à certaines régions du cerveau expriment aussi la protéine FTF [277]. Enfin, le cœur et certaines cellules alvéolaires des poumons expriment le récepteur. 51

1.4.5 Fonction

1.4.5.1 Développement L’inactivation du gène Ftf effectuée chez la souris dans notre laboratoire mène à la mort des embryons in utero au moment de la gastrulation [266]. Bien que la spécification de l’axe antéro-postérieur ait lieu chez les embryons Ftf-/-, la formation de la ligne primitive est altérée et aucun mésoderme, que ce soit embryonnaire ou extraembryonnaire, n’est formé. Les embryons mutants montrent un retard de croissance, une désorganisation de l’épiblaste et une constriction à la jonction embryonnaire-extraembryonnaire [278]. L’agrégation d’un embryon mutant au stade 2-cellules avec des cellules tétraploïdes normales permet aux cellules de l’épiblaste de terminer la gastrulation normalement démontrant l’importance de la présence de FTF dans les tissus extraembryonnaires.

Dans les cellules ES, FTF module l’expression de Oct4, un gène impliqué dans la pluripotentialité cellulaire [279]. Des analyses bioinformatiques ont aussi suggéré que FTF fait partie intégrante du réseau transcriptionnel de régulation génique dans les cellules ES [280]. Considérant les sites d’expression de FTF et le phénotype lié à son inactivation, FTF aurait donc un rôle important dans le maintien de la pluripotentialité des cellules de l’épiblaste au cours du développement embryonnaire précoce, via l’activation de Oct4. D’ailleurs, des études ont démontré que FTF, en association avec SOX2 et , permet la reprogrammation d’une cellule somatique en cellule pluripotentielle [281].

1.4.5.2 Métabolisme

1.4.5.1.1 Métabolisme du cholestérol et des acides biliaires La fonction d’un facteur de transcription est définie en grande partie par les processus physiologiques contrôlés par le réseau formé de ses gènes cibles. Plusieurs cibles transcriptionnelles pour FTF ont été identifiées jusqu’à maintenant dont la première par notre laboratoire. Il s’agit de l’AFP, une albumine embryonnaire permettant le transport de lipides dans le sang et marquant l’initiation du développement du foie [242]. Par la suite, FTF a été étroitement relié au métabolisme lipidique, participant entre autres à la régulation de plusieurs enzymes et transporteurs nécessaires au transport inverse du cholestérol et à la synthèse et au recyclage des acides biliaires (revu dans [239]). FTF active l’expression des 52 enzymes hépatiques CYP7A1 et CYP8B1, le premier régissant l’étape limitante dans la voie classique de la synthèse des acides biliaires et le deuxième permettant la formation d’acide cholique [282-284]. FTF est aussi un activateur de la transcription de deux facteurs de transcription importants dans les mécanismes de répression génique par les acides biliaires, SHP et FXR [283-286]. De plus, FTF induit l’expression de CETP, une protéine responsable du remodelage des particules HDL qui transportent le cholestérol des tissus périphériques vers le foie ; CETP transfère les esters de cholestérol des molécules de HDL à des lipoprotéines riches en triglycérides (VLDL, IDL, LDL) qui seront subséquemment éliminées par le foie [287]. FTF régule aussi le gène codant pour le transporteur SR-B1 (SCARB1) assurant la récupération et l’excrétion par le foie du cholestérol contenu dans les particules HDL circulant dans le sang [288]. Il stimule aussi l’expression de l’APOA1, l’une des apolipoprotéines pouvant constituer les HDL, ainsi que l’apolipoprotéine M [289, 290]. De plus, FTF contribue à la circulation entérohépatique des acides biliaires en activant la transcription de deux transporteurs entériques, l’un, ASBT, qui capte les acides biliaires dans l’intestin et l’autre, MRP3, qui relâche les acides biliaires dans la circulation portale [291, 292]. Le transporteur MRP3 est aussi exprimé dans le foie permettant de gérer la réserve d’acides biliaires pour éviter des dommages aux hépatocytes dus à leur toxicité. L’expression de BSEP, un transporteur permettant l’excrétion de la bile dans les canalicules biliaires, est aussi contrôlée par FTF ainsi que celle des transporteurs ABCG5 et ABCG8 permettant l’excrétion hépatobiliaire du cholestérol [293, 294]. Le niveau d’expression de plusieurs de ces gènes, soit Mrp3, Bsep, Abcg5, Abcg8, Shp, Fxr et Scarb1, est d’ailleurs diminué dans le foie de souris où le gène FTF est inactivé [295].

1.4.5.1.2 Métabolisme des stéroïdes À l’instar de son homologue SF-1, FTF est exprimé par les tissus stéroïdogéniques (revu dans [239]). Plus spécifiquement, FTF est exprimé dans le corps jaune (corpus luteum) et les cellules granulosaires de l’ovaire, dans les cellules Leydig des testicules, dans les surrénales et dans les préadipocytes. L’expression des deux récepteurs de la famille NR5A (SF-1 et FTF) se chevauche parfois, mais peut être spécifique à certains types cellulaires ou à certains stades de développement et de maturation. Plusieurs des enzymes et protéines responsables de la stéroïdogenèse et dont le contrôle de l’expression était attribué précédemment à SF-1 sont maintenant caractérisés comme pouvant être également 53 contrôlés par FTF : l’expression des gènes Star, Cyp11a, Cyp19a1 et Hsd3b2 est, dans des conditions spécifiques, modulée par FTF [296-299].

1.4.5.3 Prolifération cellulaire et cancérogenèse La voie -caténine est une des voies signalétiques importantes régissant la prolifération cellulaire. Dans les cellules intestinales, FTF stimule la transcription des cyclines D1 et E2 via son interaction avec TCF, l’effecteur de la voie -caténine. L’activation conjointe par FTF et la voie -caténine peut être indépendante de la liaison de FTF à l’ADN, FTF pouvant agir comme un coactivateur de TCF. Cette coactivation a été observée sur le promoteur de la cycline D mais aussi sur le promoteur de l’oncogène c-Myc. L’activation des cyclines par FTF permet la prolifération et le renouvellement cellulaire dans la paroi intestinale [300].

Par ailleurs, les rôles de FTF dans la régulation de gènes stéroïdogéniques et du cycle cellulaire ont été beaucoup étudiés étant donné leur implication potentielle dans la cancérogenèse.

1.4.5.1.3 Cancer du sein Une des cibles transcriptionnelles de FTF est l’aromatase (Cyp19a1), l’enzyme limitant de la voie de synthèse de l’oestrogène [297, 301]. L’aromatase est souvent surexprimée dans le cancer du sein, permettant une production locale accrue d’oestrogènes qui, via leur récepteur ER, stimulent la prolifération cellulaire et le développement du cancer [302, 303]. FTF module l’expression de l’aromatase dans les cellules malignes exprimant le récepteur ER et aussi dans les cellules pré-adipocytaires adjacentes permettant ainsi une production autocrine et paracrine d’oestrogènes favorisant le développement des tumeurs [297, 301]. La transcription de FTF pouvant être activée par les oestrogènes et le récepteur ER, une boucle régulatrice favorisant la prolifération des cellules cancéreuses est ainsi formée [271, 304]. D’autre part, la progestérone active également l’expression de FTF et de l’aromatase et stimule donc aussi la prolifération tumorale [301, 305, 306]. La transcription de deux enzymes responsables de la production de progestérone, STAR et HSD3B2, est activée par FTF formant ainsi une deuxième boucle régulatrice impliquant FTF dans le développement du cancer du sein [296, 307]. 54

1.4.5.1.4 Cancer gastro-intestinaux Plusieurs cancers gastro-intestinaux sont provoqués par une altération de la voie - caténine/APC (revu dans [308, 309]). Étant donné l’association entre FTF et la -caténine dans la régulation des cyclines D et E, plusieurs groupes ont étudié le lien éventuel entre FTF et le développement des cancers gastro-intestinaux. Ces études ont déterminé que FTF est surexprimé dans plusieurs cas de cancers gastriques et qu’il favorise la prolifération cellulaire via l’activation de la cycline E1 [310]. Il a été observé, chez des souris haploinsuffisantes pour FTF, que FTF peut favoriser, lorsque présent en quantité normale, le développement de tumeurs intestinales via l’activation du cycle cellulaire et la modulation de la réponse inflammatoire [311].

1.4.5.1.5 Hépatocarcinome Bien que moins documenté, il semble que FTF puisse stimuler le développement de certains hépatocarcinomes. La technique d’interférence à l’ARN a été utilisée par Wang et al. [312] pour éliminer l’expression de FTF dans la lignée d’hépatocarcinome BEL-7402. La perte de FTF provoque l’arrêt du cycle cellulaire via l’inhibition de la transcription de la cycline E1 et la stimulation de l’apoptose suite à la diminution de la transcription de Gadd45. Par ailleurs, FTF est aussi un activateur de la transcription et de la réplication du virus de l’HBV, un agent causal majeur des HCC [313, 314].

1.5 But des travaux de doctorat Notre laboratoire a identifié FTF comme étant un activateur clé du locus AFP, le premier gène associé à la fonction de FTF. Les études menées par la suite sur le promoteur de Ftf et certains autres gènes cibles de FTF nous ont permis de le classifier parmi les facteurs de transcription constituant le réseau transcriptionnel de différenciation hépatique. Afin de déterminer le rôle développemental de FTF, Jean-François Paré a effectué l’inactivation du gène Ftf chez la souris. Le but de mon doctorat était d’établir le patron d’expression tissulaire de FTF dans les souris Ftf+/- (l’allèle est inactivé par l’insertion d’une cassette LacZ) et d’approfondir les fonctions hépatiques de FTF par l’analyse fonctionnelle de son promoteur et par l’analyse du réseau hépatique des gènes cibles de FTF en comparaison avec les gènes cibles de C/EBP, partenaire de FTF dans l’activation du promoteur de 55 l’AFP. L’état du réseau transcriptionnel de FTF dans les cellules d’hépatocarcinome a aussi été analysé afin d’examiner l’implication de FTF dans la cancérogenèse hépatique.

J’ai d’abord déterminé le patron d’expression de FTF selon le type de tissu et le stade de son expression, permettant ainsi de cerner le type de fonctions développementales et adultes attribuables à FTF. J’ai ensuite procédé à la caractérisation d’un élément de réponse hormonale de type DR4 repéré par notre groupe et conservé dans le promoteur proximal du gène FTF, renforcant ainsi le lien entre FTF et le métabolisme du cholestérol et ouvrant sur le rôle de FTF dans la signalisation par les hormones thyroïdiennes. Enfin, j’ai effectué des analyses pan-génomiques d’immunoprécipitation de chromatine couplée à des micropuces d’ADN (ChIP-chip) afin d’identifier les cibles de FTF et C/EBP dans le foie de souris fœtal et adulte et dans des lignées de cellules cancéreuses hépatiques.

Les résultats pris dans leur ensemble indiquent des rôles distincts de FTF au cours de l’embryogenèse et à l’état adulte, et des fonctions métaboliques et énergétiques multiples et insoupçonnées dans l’hépatocyte adulte, entrecroisées entre FTF et C/EBP et profondément perturbées dans l’hépatocarcinome.

Chapitre 2 The Fetoprotein Transcription Factor (FTF) Gene Is Essential to Embryogenesis and Cholesterol Homeostasis and Is Regulated by a DR4 Element

Jean-François Paré, Daniel Malenfant, Chantal Courtemanche, Mariève Jacob- Wagner, Sylvie Roy, Denis Allard, and Luc Bélanger

From the Département de biologie médicale, Faculté de médecine, Le Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, Québec G1R 2J6, Canada

The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No.20, Issue of May 14, pp.21206-21216, 2004

Received for publication, February 11, 2004, and revised form, March 8, 2004 Published, JBC Papers in Press, March 10, 2004, DOI 10.1074/jbc.M401523200 57

2.1 Avant-propos L’inactivation du gène Ftf rapportée dans cet article [266] a été réalisée par Jean-François Paré (section 2.6.1 à 2.6.3). Pour ma part, j’ai effectué les colorations -galactosidase présentées dans la figure 2.2 (C à F). J’ai effectué toutes les expériences de transfections et les gels de retardement (EMSA) (incluant la figure 2.3) présentées dans l’article. De plus, j’ai participé, conjointement avec Sylvie Roy, aux expériences effectuées sur les animaux soumis aux diverses diètes et traitements hormonaux. Les expériences effectuées sur les souris transgéniques 35 ont été réalisées en majeure partie par Mariève Jacob-Wagner et Chantal Courtemanche. Noter qu’une section (2.8) présentant des données complémentaires non publiées sur le patron d’expression de FTF à été ajoutée ici à l’article original ; ces données complémentaires sont entièrement mon travail.

2.2 Résumé Le gène Ftf (Fetoprotein Transcription Factor) a été inactivé chez la souris par l’insertion en phase du gène lacZ dans l’exon 4 du gène. La coloration X-gal des embryons Ftf+/- montre que le gène Ftf murin est activé aux stades initiaux de la transcription zygotique. L’activité du gène Ftf est ubiquitaire aux stades morula et blastocyste et par la suite son patron d’expression est indicatif de plusieurs fonctions développementales. Les embryons Ftf-/- meurent à E6,5-7,5 et montrent des caractéristiques phénotypiques typiques d’un endoderme viscéral dysfonctionnel. Les souris Ftf+/- adultes sont hypocholestérolémiques et n’expriment que 40% du niveau de FTF hépatique normal. La surexpression de FTF dans les souris transgéniques indique que FTF est un activateur in vivo de Cyp7a1. Toutefois, l’expression de Cyp7a1 est augmentée dans les foies Ftf+/- : les profils d’expression génique indiquent que cette hausse de l’expression de Cyp7a1 est due à une atténuation des signalisations de stress des cellules hépatiques. Des expériences diététiques supportent un modèle où l’activité de FTF au promoteur de Cyp7a1 est réprimée à la fois par C-JUN et par SHP, ce dernier étant un effecteur plus efficace de rétrorégulation. Un élément DR4 est conservé au promoteur Ftf et activé par LXR/RXR et TR/RXR qualifiant le gène Ftf comme senseur métabolique direct. La production hépatique de FTF augmente chez des rats traités aux hormones thyroïdiennes ou soumis à une diète riche en cholestérol. 58

L’élément DR4 renforce les liens fonctionnels entre FTF et LXR dans l’homéostasie du cholestérol et peut expliquer les activations tissulaires transitoires du gène Ftf au cours du développement et le niveau d’expression de FTF plus bas que prévu dans les foies Ftf+/-. La souris Ftf-LacZ établit un rôle central de FTF dans les fonctions développementales, nutritives et métaboliques du mammifère, depuis l’embryogenèse précoce jusqu’à l’âge adulte.

2.3 Abstract The fetoprotein transcription factor (Ftf) gene was inactivated in the mouse, with a lacZ gene inserted inframe into exon 4. X-gal staining of Ftf+/- embryos shows that the mFTF gene is activated at initial stages of zygotic transcription. Ftf gene activity is ubiquitous at the morula and blastocyst stages and then follows expression patterns indicative of multiple FTF functions in fetal development. Ftf-/- embryos die at E6.5-7.5, with features typical of visceral endoderm dysfunction. Adult Ftf+/- mice are hypocholesterolemic, and express liver FTF at about 40% of the normal level. Overexpression of liver FTF in transgenic mice indicates in vivo that FTF is an activator of Cyp7a1. However, CYP7A1 expression is increased in Ftf+/- liver. Gene expression profiles indicate that higher CYP7A1 expression is caused by attenuated liver cell stress signaling. Diet experiments support a model where FTF is quenched both by activated C-JUN, and by SHP as a stronger feedback mechanism to repress Cyp7a1. A DR4 element is conserved in the Ftf gene promoter and activated by LXR-RXR and TR-RXR, qualifying the Ftf gene as a direct metabolic sensor. Liver FTF increases in rats treated with thyroid hormone or a high cholesterol diet. The Ftf DR4 element tightens functional links between FTF and LXR in cholesterol homeostasis and can explain transient surges of Ftf gene activities during development and FTF levels lower than predicted in Ftf+/- liver. The Ftf-lacZ mouse establishes a central role for FTF in developmental, nutritive, and metabolic functions from early embryogenesis through adulthood. 59

2.4 Introduction Development of the mammalian embryo relies upon nutritive functions fulfilled by the visceral endoderm and then by the liver [315]. A part of these functions is accomplished by nutrient carrier proteins of the albumin gene family, a multigene locus expressed by the liver and subject to precise developmental controls. One albumin-related gene, the 1- fetoprotein (Afp) gene, is activated at the onset of liver differentiation and operates tightly coupled with liver growth [316, 317]. In 1988, our group circumscribed a proximal Afp promoter element essential to Afp gene activity in hepatocytes, and distinct from promoter components regulating the other albumin loci [318]. The Afp-specific activator was then identified as orphan receptor fetoprotein transcription factor [242, 243, 319], so named for its first identified target locus (genome data base nomenclature, NR5A2 in the nuclear receptor nomenclature [194]); also referred to as LRH1 or CPF). FTF belonged to a primitive class of nuclear receptors and emerged as a critical lead to connect Afp gene activation with early embryonic growth and differentiation processes.

Subsequent studies indicated that developmental FTF functions even preceded its activation of the AFP locus in hepatocytes. In situ hybridization analysis in the mouse at embryonic day 8-9 (E8-9) showed abundant FTF transcripts in the foregut endoderm, before liver morphogenesis [273]. Characterization of the Ftf gene promoter also revealed a cluster of regulatory motifs conserved in distant species and potential targets of cell lineage specification factors [246]. Among these were three proximal binding sites for GATA factors, known to be essential for visceral endoderm function [320, 321]. Furthermore, three Hnf genes important to liver differentiation, Hnf1, Hnf4, and Hnf3, were found to each contain double FTF binding sites in their proximal promoter and to be activated by FTF in transfection assays [246]. Thus, a pivotal role was suggested for FTF in a transcriptional cascade using determination factors to activate FTF in prehepatic endodermal cells, and then using FTF to drive Afp and other effectors of the hepatic program.

Besides functions in early development, FTF was expected to maintain important nutritive roles in the adult, FTF being maintained at high levels in liver, intestine, and acinar pancreas. A landmark finding was the identification of FTF as one factor that binds and 60 regulates the Cyp7a1 gene promoter, the rate-limiting enzyme in the conversion of cholesterol to bile acids (BA) [247, 283, 284, 322]. A model emerged whereby FTF would act as a "competence" factor driving the BA pathway, subject to negative feedback regulation by interaction of FTF with orphan receptor SHP, activated by the BA receptor FXR and by FTF itself [283, 284, 286, 323]. Additional reports associated further FTF action with membrane transporters of the enterohepatic BA recycling system [291, 324] and with pancreatic cholesterol esterase [325], all of which pointing to an important systemic role for FTF in adult cholesterol/BA homeostasis.

Here we document an Ftf-lacZ gene knockout in the mouse, delineating FTF expression sites at all developmental stages and confirming crucial developmental and metabolic FTF functions from early embryogenesis to adulthood. We also identify a promoter DR4 regulatory element directly connecting Ftf gene regulation with hormonal and metabolic homeostasis.

2.5 Experimental procedure

2.5.1 FTF Gene Inactivation A 7.5 kb SpeI mFtf gene fragment encompassing exons 4-6 was retrieved from a mouse 129/SV genomic library screened with rat FTF cDNA [246]. The 7.5 kb fragment was used to generate a knockout vector carrying a lacZ gene inserted in-frame into mFtf exon 4. Briefly, a 4 kb lacZ fragment was derived from vector pCH110 (Amersham Biosciences) using PstI, S1 nuclease, and KpnI, and spliced into pSVK3 (Invitrogen) pretreated with EcoRI, Klenow, and KpnI. Recombinant pSVK3-lacZ was digested with SmaI/XbaI and ligated with the 5'-end mFtf gene fragment obtained with BglII (which cuts exon 4 at position 462 in the sequence shown in ref. [242]) and treated with Klenow. This placed lacZ (with a stop codon and polyadenylation signal at its end) in phase with the N-terminal portion of mFtf exon 4, interrupting the FTF sequence upstream from the first of the DNA binding domain [246]. An MC1-neo cassette was ligated to the 3'-BglII mFtf fragment and inserted downstream from lacZ in the opposite polarity, and an MC1-tk cassette was inserted at the 5'-SpeI end of the Ftf gene fragment. The construct was then used for electroporation into ES cells. This knockout vector predicted that an Ftf-lacZ allele 61 would transcribe a 4 kb Ftf-lacZ mRNA in all FTF-permissive cells (i.e. from either the mFtf promoter 5'-flanking exon 1, or any other putative promoter elements between exons 1 and 3) [246], and that Ftf-lacZ translation products would carry 19, 40, or 101 residues of the mFTF N-terminal domain (from three in-frame initiation codons in exons 1 and 3), with no DNA binding capacity and no other apparent regulatory function [242].

For gene targeting in embryonic stem (ES) cells, mouse WW6 (129SV) ES cells [326] were grown on STO fibroblasts in high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum and recombinant LIF [327]. ES cells were electroporated with Ftf-lacZ plasmid DNA linearized with NotI, and cultured on neomycin-resistant STO fibroblasts for 14 days in selection medium containing 200 µg/ml G418 and 2 µM ganciclovir. Resistant colonies were genotyped by Southern blot using a mFtf probe flanking the SpeI site in intron 3 and detecting a 3.8 kb StuI fragment from the wild-type Ftf allele and a 7.8 kb fragment from the mutant allele.

Four ES clones carrying the lacZ-Ftf allele were injected into mouse MF1 blastocysts which were then transferred to pseudopregnant C57BL/6J x CBA mice. The chimeric male progeny (129SV x MF1) was crossed with MF1 females to establish germ line transmission, and subsequent breeding was maintained in the 129SV x MF1 genetic background. Mice were housed in filter-topped microisolator cages, under 50-70 air changes per hour and 10:14 h dark/light cycle, and fed on Teklad standard chow TD2018. Neonatal mice were genotyped using tail DNA, by Southern blot as above or by PCR with neo gene primers 5'-GGGATCGGCCATTGAACAAGATGG-3' and 5'- CGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAG-3'. Embryos from E9.5 onward were genotyped by Southern blot using yolk sac DNA. At E7.5 and E8.5, whole-embryo DNA was used with PCR primers from FTF exon 4 (5'-flanking the BglII lacZ insertion site) (ATGGTGAATTACTCCTATGATGAAG) and FTF exon 5 (GTAGGGACATCGTTTTCTCTGCC), generating a 1.7 kb product only from a wild-type Ftf allele; the FTF primers also amplified a 204bp segment from the FTF pseudogene [246], common to all genotypes and providing an internal PCR control. At E5.5 and E6.5, we used in situ hybridization (below) to distinguish Ftf-/- embryos from Ftf+/+ or Ftf+/- embryos. 62

2.5.2 In Situ Hybridization Conditions were adapted from Aubin et al. [328] and Rausa et al. [329]. FTF riboprobes were generated from a 1.2 kb ClaI/HindIII mFTF cDNA fragment (nt 661-1856 in ref. [242]) cloned in pBluescript SK+: the sense probe was obtained with HindIII-digested DNA and T7 RNA polymerase and the antisense probe with ClaI-digested DNA and T3 RNA polymerase, with radiolabeling using [-33P]UTP. HNF3 probes were obtained as before [273]. Embryos were fixed 15-20 h in 4% paraformaldehyde/PBS, dehydrated in ethanol and toluene, and embedded in paraffin. Whole mount sections (8 µM) were treated with xylene, ethanol and 4% paraformaldehyde, washed with PBS, and then treated for 7.5 min. with proteinase K (20 µg/ml in 50 mM Tris, pH 8.0, 5 mM EDTA), washed with PBS and treated again with 4% paraformaldehyde and PBS. This was followed by a 10 min. incubation in 0.25% acetic anhydride in 0.1M triethanolamine, pH 8.0, washes in PBS, saline, and water, and dehydration in ethanol gradients (30-100%). Slides were then overlaid with 150 µl of 1:1 mix of formamide (Fisher Super Pure) and hybridization buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 1.2 M NaCl, 4 mM EDTA, 2x Denhardt's, 1 mg/ml yeast tRNA, 200 µg/ml salmon sperm DNA) and incubated for 2 h at room temperature. Hybridization was conducted with 5 x 106 cpm of riboprobe overlaid on tissue sections in 75 µl of a 2:2:1 mix of hybridization buffer:formamide:50% dextran sulfate and overnight incubation at 65°C with a coverslip. Slides were then washed twice at 50°C with 5x SSC and 10 mM dithiothreitol, once at 65°C with 2x SSC, 50% formamide, and 20 mM dithiothreitol, followed by RNase A treatment (50 µg/ml), washes at 65°C in 2x SSC and 50% formamide then at room temperature in 2x SSC and 0.1x SSC, and dehydration in ethanol gradients in 0.3 M NaOAc, pH 5.5. Slides were embedded in a Kodak emulsion and left 2-4 weeks in a dark dessicator at 4°C. They were developed with the Kodak D19 reagent and stained with hematoxylin-eosin.

2.5.3 LacZ Activity Expression from the Ftf/lacZ transgene was monitored by -galactosidase staining on whole embryos or cryostat tissue sections, essentially as described by Larochelle et al. [330]. Embryos were fixed 5-30 min. at 4°C with 0.2% glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde in PBS, washed three times with PBS, and stained 15-20 h at 30°C in 4 mM 63

K4Fe(CN)6·3H2O, 4 mM K3Fe(CN)6, 2 mM MgCl2, and 1 mg/ml X-gal in PBS. Morulae and blastocysts were treated with 0.5% Pronase 10 min at 37 °C before fixation. For tissue sections, organs were incubated overnight in 30% sucrose in PBS and embedded in OCT before freezing.

2.5.4 Microarray Analysis Liver gene expression profiles were established in 2-4 month old male Ftf+/- and Ftf+/+ mice (groups of 4-6 littermates from 4 or 5 litters) fed a normal diet or a diet supplemented with cholesterol or cholic acid (below). Total liver RNA was purified using the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), quantitated by spectroscopy and pooled (equal amounts of RNA from each mouse). RNA labeling, hybridization, and image analysis were performed at the McGill University Genome Quebec Innovation Center, using the Affymetrix U74Av2 and 430A GeneChip arrays and GENECHIP data processing software (Affymetrix, Santa Clara, CA). Fold changes in mRNA levels were calculated for fluorescence intensities greater than 250.

2.5.5 Northern Blots Total liver RNA was purified with guanidine thiocyanate [331], and poly(A)+ RNA was isolated with the Oligotex mRNA Maxi Kit (Qiagen). Poly(A)+ RNA (15 µg) was run on a

1% agarose/10 mM guanidine thiocyanate gel, transferred onto a positively charged nylon membrane (Roche Applied Science), and hybridized with Ftf, Shp, Cyp7a1, and Gapdh cDNA probes PCR-labeled with digoxigenin-11-dUTP (Roche Applied Science). mRNA bands were detected with a chemiluminescence kit (Roche Applied Science) and quantitated with IMAGEQUANT (Molecular Dynamics).

2.5.6 Quantitative PCR Real-time quantitative PCR (qPCR) was used to determine the relative expression levels of liver FTF, SHP, CYP7A1, C-JUN, HNF1, and HNF4 mRNAs. Total RNA (5 µg) was reverse-transcribed with oligo(dT) primer and Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen). Quantitative PCR was carried out with 0.5% of the reverse transcription 64 product in a 20 µl reaction volume of Platinum SYBR Green qPCR superMix UDG (Invitrogen), using the Light-Cycler 1.2 instrument and software (Roche Applied Science) and the following sets of primers: FTF forward, 5'- CCTATGATGAAGATCTGGAAGAGC-3'; FTF reverse, 5'- GTTTTCTCTGCGTTTTGTCAATTT-3'; SHP forward, 5'- AGCTGGGTCCCAAGGAGTAT-3'; SHP reverse, 5'-CTTGAGGGTAGAGGCCATGA- 3'; CYP7A1 forward, 5'-TCCTTGAATATCCGGACAGC-3'; CYP7A1 reverse, 5'- TGGTCTTTGCTTTCCCACTT-3'; c-Jun forward, 5'-TCCCCTATCGACATGGAGTC3'; c-Jun reverse, 5'-TGAGTTGGCACCCACTGTTA-3'; HNF1 forward 5'- GCCTCCTCTTCCCAGTAACC-3'; HNF1 reverse 5'-GGAGCAGCAGTGTCAATGAA- 3'; HNF4 forward 5'-TCCCAACAGATCACCTCTCC-3'; HNF4 reverse 5'- AGGAGCAGCACGTCCTTAAA-3'; GAPDH forward 5'- ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'; GAPDH reverse 5'- CACATTGGGGGTAGGAACAC-3'. Each reaction was carried out in triplicate and repeated at least twice. Relative mRNA expression levels were calculated by CT analysis, using GAPDH mRNA for internal normalization.

2.5.7 Electromobility Shift and Scatchard Assays Saturation electromobility shift analyses were conducted in 2 month old Ftf+/+ and Ftf+/- mice, as described before [242]. Livers were pooled from five or more littermates per group, and tested in parallel. Five micrograms of total nuclear protein was incubated 30 min. on ice with 0.9-9 nM 32P-labeled FTF probe TGTTCAAGGACA (from the AFP gene promoter) [242], and FTF-bound and free double-strand probes were resolved by PAGE and counted with a phosphorimager. Nonspecific binding (50 fold excess cold oligo) was subtracted, and net counts were used to obtain a Scatchard plot. EMSA analysis of the DR4- like sequence at position +6/+21 in the mFtf gene promoter was carried out with mFTF probe -1AGACATGGTTTACAGCAGGTCATAC+24 (probe F), its mutated version AGACATcaTTTAgAGCAttTCATAC (mF oligo), and DR4 elements from the CYP7A1 promoter (TGCTTTGGTCACTCAAGTTCAAGTTAT) (oligo 7A) [282] and the ABC1 promoter (GCGCAGAGGTTACTATCGGTCAAAGCC) (oligo AB) [332]. EMSAs used 3 µg of total nuclear proteins from adult rat liver and 0.2 ng of 32P-labeled F probe, 65 coincubated 30 min. at 4°C with 20 fold molar excess of cold competitors. For EMSA- antibody assays, nuclear proteins were preincubated 1 h at 4°C with 1 µl of antiserum against LXR (Santa Cruz Biotechnology C19x), RXR (SCB N197x, reacting against RXR , , and ), TR (SCB FL-408x, reacting against TR 1 and 1), or FXR (SCB Q- 20x). EMSA for HNF1 and HNF4 used probes GCTTAATCATTTCTT and GCAGGTGACCTTTGCCCAGCGCC and their mutant (lower case letters) version GCTTggTCATTTCTT and GCAGcTGcCCgTTtCgCAGCGCC.

2.5.8 Western Blots Western blot assays were used to determine the relative amounts of FTF, HNF1, HNF4, and C/EBP proteins in liver nuclei from rats fed a high-cholesterol diet or treated with thyroid hormone (T3) (below). Total liver nuclear proteins (pooled from 5 rats) were resolved by SDS-PAGE and transferred onto Immobilon-P membranes (Millipore). Blotted membranes were blocked in TBS (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.2 M NaCl, 5% w/v nonfat dry milk, 0.1% Tween-20) 1 h at room temperature under agitation, and incubated 1 h with antisera against mouse FTF (1:1000 dilution in TBS), rat C/EBP (1:10000), human HNF4 (1:10000) (Santa Cruz 6556x), or mouse HNF1 (1:1000) (BD Biosciences H69220 [GenBank] ). Membranes were washed four times in TBS and incubated for 1 h with a 1:10000 TBS dilution of secondary antibody linked to horseradish peroxidase (Jackson ImmunoResearch Laboratories). After four more washes in TBS, reactions were developed using the Amersham Biosciences Enhanced Chemiluminescence System, and signals were quantitated using the NIH Image software. Samples from high cholesterol and

T3 groups were analyzed in triplicate sets of 10 or 20 µg of nuclear proteins against standard curves run in parallel with 2.5-25 µg of liver nuclear proteins from control groups.

2.5.9 Transfection Assays Transfection assays were conducted with FTF reporter vector 4F-CAT, which carries mFTF gene segment -3.9 kb to +79 bp cloned into pBluescript SK-CAT [246]. Point mutations were introduced in the Ftf DR4-like element using PCR [246] and oligonucleotide primer GAAACTGGAGACATcaTTTAgAGCAttTCATACATGCTGGAAAAAGTGC; mutations 66

(lower case letters) were confirmed by sequencing. Transient transfections followed a calcium phosphate procedure described before [246, 319], and were conducted with HepG2 or Hep3B human hepatoma cells. Cells were cultured in DMEM containing 10% charcoal- stripped fetal bovine serum (Wisent) (DMEM/FBS). Cells (106, in DMEM/FBS) were plated in 6 cm dishes and transfected 24 h later with 5 µg of 4F-CAT reporter vector, 2-5 µg of transcription factor expression vector (pSG5-hRXR, pCMX-hLXR, pCMX-T3R) (pSG5 or pCMX vectors were used for reference transfections), and 2.5 µg of pCMV-lacZ as an internal standard. Transfected cells were washed after 16 h with HEPES pH 7.3 and cultured in DMEM/FBS without or with ligands (9-cis-retinoic acid (1 µM), 22(R)- hydroxycholesterol (10 µM), or 3,3',5-triiodothyronine (100 µM)) (Sigma). Cells were harvested 48 h after transfection, and CAT activity was measured by thin layer chromatography and phosphorimaging. Wild-type and mutant 4F-CAT constructs were also assayed as stable transfectants in Morris McA-RH7777 rat hepatoma cells (variant 7777.6) [318], by cotransfection with CMV-neo, 10 days selection in G418, and measurement of CAT activity on pools of 200-300 clones per construct, as described before [318, 319].

2.5.10 Diets and Hormone Treatment Serum cholesterol levels and liver gene expression profiles were analyzed in adult male Ftf+/+ and Ftf+/- mice (5 or more per group) fed for 5 days on 2% cholesterol diet Teklad TD86295 against control diet Teklad 7001, or fed for 5 days on 1% cholic acid diet Teklad TD00629 against control diet Teklad TD94045. Cholesterol was measured on a Beckman Coulter LX-20 analyzer with reagent 467825; group values were compared by Student's two-tailed unpaired t test. Changes in liver FTF levels were assessed in male Fisher rats (75-100 g, 5 per group) fed for 5 days on 2% cholesterol TD86295 diet versus control M/R7001 diet, and in male Sprague/Dawley rats (300 g, 5 per group, fed on regular Teklad chow TD97350) 5 or 24 h following intraperitoneal injection of 375 µg/kg triiodothyronine (Sigma) or saline vehicle.

2.5.11 FTF Transgenic Mice To assess FTF effect on CYP7A1 expression in vivo, we used a transgenic mouse line expressing FTF under the control of an inducible promoter. This system will be 67 documented in detail elsewhere. Briefly, mFtf cDNA was ligated at its 5'-end with a hemagglutinin (HA) epitope sequence, and the HA-Ftf cDNA was cloned in the NruI site of SK+-derived vector MT5'/3' [333], placing the HA-Ftf sequence under the control of the mouse metallothionein I (MTI) promoter. The MTI-HA-Ftf recombinant vector, linearized with SalI, was microinjected into fertilized mouse eggs from C57BL/6J x C3H F1 mice (B6C3F1), followed by transfer to pseudopregnant B6C3F1 mice. Eight transgenic lines were characterized for basal and zinc-induced HA-FTF levels in adult liver nuclei. Transgenic line TgF35 cosegregated 3 copies of the HA-Ftf transgene, nearly silent in basal conditions, and was derived to homozygosity. Zinc injection in adult TgF35 mice induces dose-dependent increase of liver HA-FTF protein level, reaching a maximum within 3 h and homogeneously distributed in all hepatocytes. For the present study, we used 2 month old male TgF35 and wild-type B6C3F1 mice; they received a single intraperitoneal injection of saline or 60 mg/kg ZnSO4, and liver RNA was prepared after 6h.

2.6 Results

2.6.1 The FTF-lacZ Mouse A total of 4 x 108 ES cells were transfected with the Ftf-lacZ recombination vector (Fig. 2.1 A). Of 502 ES clones analyzed, 15 displayed homologous recombination at one FTF allele (Fig. 2.1 B). Four of those 15 clones were used to generate heterozygous Ftf+/- mice (Fig. 2.1 C). Crosses among Ftf+/- mice generated early stage embryos with the expected Ftf+/+, Ftf+/-, and Ftf-/- genotypes (Fig. 2.1 D).

68

Figure 2.1 : Ftf gene inactivation. A. the upper map locates the 7.5 kb mFTF gene fragment used to generate a recombination vector disrupting mFtf exon IV with lacZ-neo inserted at a BglII restriction site, and the resulting mutant Ftf allele. Open arrows, direction of transcription. Intronic probe A, used in Southern blots, detects a 3.8 kb StuI restriction fragment from a wild-type Ftf allele and a 7.8 kb fragment from a recombinant Ftf-lacZ allele. PCR primers 1-2 and 3-4 (arrowheads) amplify a 1.7 kb fragment from the mFtf gene, a 204 bp product from the mFtf pseudogene, and a 700 bp neo gene fragment. B. Southern blot analysis of genomic DNA from embryonic stem cell clones obtained by transfection with the FTF targeting vector. C. Southern blot genotyping of littermates born to an Ftf+/- mouse. D, embryonic genotyping by PCR analysis, an amplification product from the neo gene signals one or two mutant Ftf alleles, and the lack of a 1.7 kb Ftf gene product identifies an Ftf-null embryo. 69

2.6.2 FTF Expression Sites Throughout Development Mice expressing lacZ inserted at the Ftf locus allowed us to combine -galactosidase staining and in situ hybridization to delineate FTF expression sites at all developmental stages. For -galactosidase analysis, Ftf+/- males were mated with Ftf+/+ females. At 2.5 dpc (morula stage), Ftf+/- embryos displayed homogeneous -galactosidase staining, and at 3.5 dpc (blastocyst stage) all inner cell mass and trophectoderm cells were positive (Fig. 2.2, A and B) (lacZ activity was also easily detected at the 4-cell stage) (not shown). In the egg cylinder (E5.5), FTF expression segregated in the visceral endoderm (embryonic and extra-embryonic); ectodermal cells were uniformly negative (Fig. 2.2, G and H). At gastrulation (E6.5, E7.5), strong FTF signals persisted in the endodermal layers, and now also marked the node giving rise to the mesoderm layer and definitive endoderm (Fig. 2.2, K and L, and O and P). At mid-gestation (E8-E15), Ftf gene activity expanded to endodermal derivatives (yolk sac, liver, pancreas, intestine), with strong transient - galactosidase staining recorded in extra-endodermal structures, growing bone, testis, lung mesenchyme, sensory ganglions, posterior brain, and thalamus (Fig. 2.2, C and D and data not shown). At postnatal stages, Ftf gene activity was detected in all hepatocytes and pancreas acinar cells (not shown), and it persisted in the intestine (prominently in the crypts of Lieberkuhn) (Fig. 2.2 E) and in the granulosa layer of ovarian follicles (Fig. 2.2 F). 70

Figure 2.2 : FTF expression sites and knockout phenotype. Panels A-F, -galactosidase staining of Ftf+/- embryos or adult tissues. A, morulae (E2.5). B, blastocysts (E3.5, two Ftf+/-, one Ftf+/+). C, embryo at E11.5 (l, liver bud; r, rib primordium; b, ocular bones; o, otic vesicle; m, mesencephalon). D, ossification zone in a limb at E14.5 (c, cartilage). E, adult intestine. F, adult ovary. Panels G-V: brightfield and darkfield/in situ hybridization analyses of wild-type and Ftf-knockout embryos; the results shown were obtained with antisense riboprobes, control sense probes gave no signals. At 71

E5.5, FTF hybridization signals mark the visceral endoderm (G and H), and an Ftf- knockout embryo (no signal) shows no apparent abnormalities (I-J). At E6.5, Ftf+/+ signals also come from the node (K and L), and Ftf-/- embryos exhibit severe dysmorphogenesis (M and N). At E7.5, normal endodermal layers express FTF whereas ectoderm and mesoderm are negative (O and P), and some Ftf-/- embryos maintain recognizable structures (Q and R). At E6.5, HNF3 signals mark both the endoderm and node of normal embryos (S and T) but only the endoderm of Ftf-knockout embryos (U and V). ee, embryonic visceral endoderm; em, embryonic mesoderm; eec, embryonic ectoderm; exe, extra-embryonic visceral endoderm; exec, extra-embryonic ectoderm; pec, primitive ectoderm; a, amnion; c, chorion; ac, amniotic cavity; pac, proamniotic cavity; epc, ectoplacental cavity; ecc, exocoelomic cavity.

2.6.3 Phenotype of FTF-/- Mice Crosses among Ftf+/- mice yielded no homozygous Ftf-/- newborns, indicating an embryonic lethal phenotype. A total of 186 embryos were genotyped between E5.5 and E12.5 (Table 2.1). At E5.5 and E6.5, Ftf-/- embryos were recovered at the expected mendelian ratio of 25%, which then declined abruptly between E7.5 and E9.5, to 0% at E10.5, indicating fetal death prior to liver differentiation. At E5.5, Ftf-/- embryos showed no histological abnormalities (Fig. 2.2, G, H, I and J). At E6.5 however, they showed conspicuous anomalies, with a disorganized ectoderm and the amniotic cavity absent or malformed (Fig. 2.2, K, L, M and N). At E7.5, Ftf-/- embryos appeared as cell clumps typical of uterine resorption; a few embryos had recognizable structures with a constricted extra-embryonic junction and no mesodermal cells outside the junction (Fig. 2.2, O, P, Q and R); at E8.5, no structures were identifiable. The constriction and mesoderm clustering at E7.5 was typical of a defective node organizer or primitive line [334]. E6.5 embryos were further analyzed for expression of HNF3, a marker of the node and visceral endoderm [128, 129]. Ftf-/- embryos expressed HNF3 in the visceral endoderm but not in the anterior portion of the primitive line (Fig. 2.2, S, T, U and V): this suggests that the node does not form in Ftf knockout embryos, and consequently they cannot pass gastrulation.

72

Table 2.1 : Genotypes of embryos (E, embryonic day) from interbred FTF+/- mice. Genotyping was done by in situ hybridization (E5.5, E6.5), PCR (E7.5, E8.5), or Southern (E9.5 onward). Data are number of embryos (and percent of total) from two or three pregnant mice per time point. At E5.5 and E6.5, Ftf+/+ and Ftf+/- embryos are combined (in situ hybridization does not distinguish the two genotypes). Ftf+/+ Ftf+/- Ftf-/-

E5.5 10 (77%) 3 (23%) E6.5 22 (76%) 7 (24%) E7.5 6 (24%) 15 (60%) 4 (16%) E8.5 6 (23%) 18 (69%) 2 (8%) E9.5 7 (24%) 20 (69%) 2 (7%) E10.5 6 (33%) 12 (67%) 0 E11.5 8 (29%) 20 (71%) 0 E12.5 6 (33%) 12 (67%) 0

2.6.4 Phenotype of FTF+/- Mice Heterozygous Ftf+/- mice had no apparent defect, their growth and reproduction were normal, they had no visible changes in liver histology, and their plasma levels of AFP, glucose, triglycerides, bilirubin, hepatic enzymes, and amylase were normal (data not shown). However, in each of four pilot experiments comparing adult Ftf+/+ with Ftf+/- littermates (5-8 per group), fasting level of total plasma cholesterol was consistently 14- 17% lower in the Ftf+/- group (data not shown). Further measurements were made in larger groups of 2 month old male littermates fed a 2% cholesterol diet or a control diet for 5 days, and confirmed a 10-12% lower serum cholesterol level in Ftf+/- mice (Table 2.2). Scatchard assays on several pools of adult Ftf+/- versus Ftf+/+ livers indicated little changes in FTF dissociation constants (Kd values in Fig. 2.3), but they suggested that FTF in the haploid group could be lower than 50% of normal (y-axis intercepts y0 in Fig. 2.3) (HNF1 and HNF4 appeared unchanged in EMSAs) (Fig. 2.3). Further qPCR assays on three pools of livers from Ftf+/+ and Ftf+/- littermates indicated an average 94 FTF mRNA copies per cell (assuming 20 pg of RNA per cell) in Ftf+/+ liver, and an average 35 copies per cell (37% of normal) in Ftf+/- livers (data not shown). These initial observations thus indicated a role for FTF in adult cholesterol homeostasis, and suggested FTF-dependent feedback on Ftf gene activity. 73

Table 2.2 : Serum cholesterol levels in wild-type (+/+) and FTF-haploid (+/-) mice fed a control diet or a 2% cholesterol diet for 5 days. Results are mean mM values ± 1 SD (in parentheses: number of animals). Control Cholesterol Ftf+/+ 2.37 ± 0.33 (21) 3.37 ± 0.60 (26) Ftf+/- 2.14 ± 0.30 (14) 2.99 ± 0.63 (22) p < 0.05 p < 0.05

Figure 2.3 : EMSA analyses on liver nuclear proteins from FTF+/+ and FTF+/- mice. Livers were pooled from 5 adult mice in each group, and equal amounts of nuclear proteins were run in EMSA reactions with increasing amounts of FTF probe; free and bound probes were then resolved by electrophoresis and counts were processed by Scatchard plot transformation. Autoradiograms illustrate EMSA reactions using FTF, HNF4, or HNF1 probes with constant amounts of liver nuclear proteins (C, no competitor; wt and m, 50 fold molar excess of cold wild-type or mutant oligos; FTF mutant oligo was TGTTCAAtGAaA; split FTF bands are translational isoforms; lower-case letters indicate base changes from wild-type Ftf sequence).

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To gain further insight into hepatic changes incurred in the Ftf+/- state, liver microarray analyses were performed. Gene profiling using the Affymetrix U74Av2 GeneChip array displayed reduced expression (4.3 fold) of FTF target gene Mrp3 [292, 324], but a strong increase in CYP7A1 mRNA levels (8.4 fold) and a slightly increased SHP mRNA level (array 1 in Table 2.3). Northern blot analysis confirmed the CYP7A1 and SHP results (Fig. 2.4). Gene profiling was repeated twice using the Affymetrix 430A GeneChip array: although not as pronounced, again MRP3 mRNA level was lower, and CYP7A1 mRNA higher in Ftf+/- liver (arrays 2 and 3 in Table 2.3). These results seemed to conflict with the postulated activating role of FTF on Cya7A1 gene activity. To clarify the point, we used transgenic mice (TgF35) carrying an Ftf transgene controlled by the inducible MTI promoter. qPCR analysis of liver mRNAs was performed 6 h following zinc or saline injection to TgF35 transgenic versus B6C3F1 wild-type mice. Control transgenic mice showed some increase in total FTF mRNA level compared with wild-type controls, with slightly increased CYP7A1 mRNA, nearly 5 fold higher SHP mRNA, and no change in HNF1 or HNF4 mRNAs (Fig. 2.5 A). Upon zinc injection, total FTF mRNA was raised 5 fold in transgenic liver relative to wild-type liver, and CYP7A1 and SHP mRNA levels were over 6 and 18 fold higher in the transgenic group (Fig. 2.5 A). Northern blot quantitation gave comparable results, and also showed lower amounts of endogenous FTF mRNA following induction of HA-Ftf transgene expression by zinc injection (Fig. 2.5 B). These results supported the activating role of FTF on Cyp7a1 gene activity and thus pointed to indirect mechanisms for higher CYP7A1 levels in Ftf+/- mice. Gene expression profiles further revealed striking pleiotropic changes in Ftf+/- liver, indicative of broadly attenuated cell stress signaling pathways, including reduced levels of C-JUN (arrays 1-3 in Table 2.3). Apart from Cyp7a1, Mrp3, and cell signaling markers, only a few other genes showed consistent changes of expression in Ftf+/- liver (arrays 1-3 in Table 2.3). Liver gene expression profiles were then analyzed in Ftf+/- mice fed on a diet containing 2% cholesterol versus a control diet (array Chol in Table 2.3) or on a 1% cholic acid diet versus a control diet (array CA in Table 2.3). As expected, cholesterol feeding reduced the level of mRNAs involved in cholesterol synthesis, and cholic acid increased SHP and decreased CYP7A1 and CYP8B1 mRNA levels (Table 2.3). Notably, the hepatic content of C-JUN 75 mRNA was markedly enhanced by either cholesterol or cholic acid feeding (Table 2.3). CYP7A1, SHP, and C-JUN results were confirmed by qPCR analysis (not shown).

Figure 2.4 : Northern blot analysis of liver mRNAs from adult Ftf+/+ and Ftf+/- mice. Equal amounts of poly(A)+ RNA (from liver pools used for microarray 1 (Table 2.3) were run in duplicates on 1% agarose/10 mM guanidine thiocyanate gels, transferred onto a nylon membrane, and hybridized with digoxigenin-labeled FTF, CYP7A1, SHP, or GAPDH cDNA probes; hybridization signals were quantitated by chemiluminescence. Quantitation of the bands is expressed as fold change in Ftf+/- liver relative to Ftf+/+ liver, after correction for GAPDH levels. FTF ratio 0.4 refers to transcripts originating from wild-type Ftf alleles.

Table 2.3 : Microarray analysis of liver gene expression in adult male Ftf+/- mice. Arrays 1, 2 and 3 are three separate analyses comparing Ftf-haploid (+/-) and wild-type (+/+) livers: data are fold changes of Ftf+/- over Ftf+/+ liver. Array Chol is the analysis conducted with Ftf+/- mice fed for 5 days on a control diet or on a diet containing 2% cholesterol: fold changes are cholesterol liver over control liver. Array CA is an analysis using Ftf+/- mice fed for 5 days a control diet or a diet containing 1% cholic acid: fold changes are cholic acid liver over control liver.

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GenBank Ftf+/- / Ftf+/+ Ftf+/- Accession no. Gene Name 1a 2b 3 b Chol b CA b Cholesterol/Bile Acid NM_030676 FTF -3.0 -1.4 -1.5 -1.2 -1.2 NM_007824 CYP7A1 +8.4 +2.1 +2.0 -1.3 -5.8 L76567 SHP +1.7 -1.3 1.0 +1.3 +2.7 NM_010012 CYP8B1 +1.4 -1.4 -1.1 +1.2 -4.0 NM_007825 CYP7B1 +1.6 +1.2 -1.2 -1.4 -1.3 NM_009108 FXR +1.1 +1.2 1.0 -1.2 +1.2 U77683 RXR 1.0 -1.1 -1.2 +1.1 +1.4 X07750 TR 1.0 1.0 -1.2 -1.2 -1.1 NM_013839 LXR -1.2 -1.2 +1.2 -1.1 -1.1 NM_008261 HNF4 -1.5 +1.3 +1.2 +1.1 -1.1 NM_029600 mrp3 -4.3 -1.8 -2.1 +1.4 -1.3 NM_145942 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1 1.0 -1.3 -1.9 -5.9 -4.4 NM_020010 CYP51 -1.4 -1.2 -1.4 -12.2 -2.5 NM_025436 sterol-C4-methyl oxidase-like +1.3 +1.4 +2.5 -15.7 -5.2 NM_145360 isopentenyl-diphosphate delta isomerase -1.5 +1.1 -1.4 -24.5 +1.1

2.6.4.1.1.1 Cell Signaling M59378 TNF receptor 1b -2.3 -1.2 -1.6 1.0 +1.2 NM_009883 C/EBP -2.9 -1.7 -1.9 +1.1 -1.5 X61800 C/EBP -4.7 -1.7 -2.0 -1.1 -1.1 FB 1 L28118 -3.7 1.0 1.0 -1.2 +1.2 NM_008416 jun-B -4.0 -2.8 -4.5 +1.1 NDc NM_010591 c-jun ND -4.3 -2.8 +4.9 +6.8 NM_010234 c-fos ND -25.3 -46.1 ND ND M12573 heat shock protein 1B -4.8 -8.4 -7.0 +3.2 +6.3 M33036 intercellular adhesion molecule 1 -15.6 -1.6 -1.4 -1.2 -1.1 NM_013602 metallothionein 1 -19.7 -5.5 -5.4 +2.2 -4.5 NM_011817 GADD45 -34.0 -3.1 -4.3 +1.6 -1.4 NM_008341 IGFBP1 -34.4 -19.2 -21.5 +1.4 -1.2

2.6.4.1.1.2 All other genes showing ≥ 2 fold change in arrays 1,2,3 NM_011575 trefoil factor 3 +4.8 +2.4 +2.6 +1.2 1.2 NM_016808 ubiquitin specific protease 2 +3.6 +5.1 +3.7 +1.3 ND NM_009263 secreted phosphoprotein 1 +3.0 +2.3 +3.0 -3.0 +1.7 NM_010738 lymphocyte antigen 6 complex, locus A +2.4 +2.1 +2.0 -2.1 -1.4 NM_008059 G0/G1 switch gene 2 +2.0 +2.4 +2.1 +3.6 +1.2 NM_011809 E26 avian leukemia oncogene 2, 3' domain -3.1 -2.7 -2.3 -1.1 +2.1 NM_019466 Down syndrome critical region homolog 1 -3.4 -4.8 -5.4 ND 1.0 a U74Av2 GeneChip array (≈ 12,000 transcripts). b 430A GeneChip array (≈ 20,000 transcripts). c ND, nondetectable in that sample as determined by GENECHIP software.

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Figure 2.5 : Quantitative analysis of liver mRNAs from TgF35 MTI-HA-FTF transgenic and wild-type B6C3F1 mice. Five adult male mice in each group received an intraperitoneal injection of saline or 60 mg/kg ZnSO4. After 6 h, livers from each group were pooled, and RNA was prepared. A. real-time qPCR analysis using total RNA expressed as fold change in transgenic liver relative to wild-type liver, normalized to GAPDH. Bars are 1 S.D. in triplicate assays from two preparations of RNA. B. Northern blot analysis using equal amounts of liver poly(A)+ RNA from zinc-treated TgF35 versus B6C3F1 mice (RNA samples processed and run in duplicates as in Fig. 2.4). Quantitation of mRNA bands is fold change in zinc-induced transgenic liver relative to zinc-treated control, corrected for GAPDH levels. FTF ratios 0.5 or 3.3 are values calculated for mRNA transcripts originating from the endogenous Ftf gene, or from the endogenous Ftf gene plus the HA-Ftf transgene.

2.6.5 DR4 Regulatory Element in the FTF Gene Promoter The Ftf gene promoter contains a sequence closely matching a direct AGGTCA repeat with a 4 nt spacer (DR4 motif), at +6 in the mFtf promoter and conserved from fish to man (Fig. 2.6 A). This DR4-like sequence was characterized for its potential regulation by LXR-RXR and TR-RXR heterodimeric receptors. First, electromobility shift assays were conducted with an FTF DR4 probe and rat liver nuclear extracts. Two retarded complexes were specifically competed by low molar excess of cold DR4 oligos from the Ftf, CYP7A1, or ABC1 gene promoters (Fig. 2.6 B, lanes 2-4), and not by a mutated FTF DR4 oligo (lane 5). Antibodies against RXR attenuated both complexes (lanes 8 and 12), anti-LXR attenuated 78 the slower complex (lanes 7 and 14), anti-TR attenuated the faster complex (lanes 9 and 13), and anti-FXR had no effect (lane 10). These results indicated that the FTF DR4 sequence can bind LXR-RXR and TR-RXR heterodimers in vitro, like bona fide DR4 elements found in the CYP7A1 and ABC1 gene promoters. Functional assays were then conducted with FTF-CAT reporter 4F-CAT [246], carrying 4 kb of contiguous 5'-flanking mFtf promoter sequence. We started with stable transfection in the well differentiated rat hepatoma 7777.6 subline [318]. This stringent system, in which transfected genes are integrated in the genome, has shown much higher sensitivity to mutations affecting basal Afp gene activity, compared with transient expression systems, in which reporter genes function as episomes [318, 319]. The activity of 4F-CAT stably transfected in 7777.6 cells was reduced by about 75% upon mutation of the FTF DR4 motif (Fig. 2.6 C), indicating that the DR4 element was used to up-regulate Ftf gene activity. Because parental McA- RH7777 cells express functional LXR [335], but no TR [336], the result suggested that the DR4 element was activated by LXR-RXR. To directly test the effect of LXR, TR, and RXR receptors and ligands on the DR4 element, transient coexpression assays were conducted in HepG2 and Hep3B hepatoma cells. Cotransfection of RXR and LXR enhanced 4F-CAT activity 2 fold in Hep3B cells and 2.5 fold in HepG2 cells (Fig. 2.6 D, lanes 3-4), and over 3 fold in HepG2 cells upon addition of 9-cis-RA and 22(R)-OH-cholesterol (lane 6).

Cotransfection of RXR and TR in the presence of 9-cis-RA and T3 also enhanced 4F- CAT activity 2-2.5 fold in Hep3B or HepG2 cells (lanes 9 and 10). The DR4 mutant reporter was not enhanced in any of these conditions (lanes 13-20), indicating that receptor and ligand effects were mediated by the DR4 element. Transfections with control vectors pSG5 or pCMX (lanes 1-2 and 11-12) were unreactive to ligands (not shown). 79

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Figure 2.6 : Characterization of a DR4 sequence in the FTF gene promoter. A. the upper diagram locates Ftf gene regulatory elements (G, GATA; N, Nkx; E, E-box; H, homeo) [244, 246] and the position of the DR4 motif conserved in human, mouse, and zebrafish FTF genes; mDR4: base changes in DR4-mutant oligo mF (panel B) and in DR4- mutant 4F-CAT (panels C and D). B. EMSA analyses using an FTF DR4 probe and total liver nuclear proteins (3 µg) from adult male Sprague-Dawley rats. Lanes 1-10, pool of 5 normal livers; lanes 11-14, pool of 3 livers taken 24 h following intraperitoneal injection of 375 µg/kg triiodothyronine; lanes C and T3, no competitor; lanes F, 7A, AB, mF, 20 fold molar excess of cold FTF, CYP7A1, and ABC1 DR4 oligos, and FTF DR4-mutant oligo. C. functional assay of FTF reporter construct 4F-CAT and its DR4 mutant, using stable transfection in 7777.6 hepatoma cells. Results are CAT activity in cells transfected with mDR4, relative to CAT activity in cells transfected with 4F-CAT and given a value of 1 (triplicate assays in two sets of transfections with pools of 200-300 cell clones per transfection; bar is 1 S.D.). D. functional assays of 4F-CAT and mDR4 constructs, using transient transfection in HepG2 and Hep3B hepatoma cells. Reporter constructs were cotransfected with a RXR expression vector, and with LXR or TR expression vectors, and cells were cultured without (-) or with (+) ligands added to the medium (22(R)-OHC and 9-cis-RA in LXR-RXR transfections, T3 and 9-cis-RA in TR-RXR transfections). Results are CAT activities from three or more transfections, relative to 4F-CAT activity in control transfections (lanes 1 and 2) using vectors pSG5 or pCMX and given a value of 1 (bars are 1 S.D.).

Finally, we tested if Ftf would react in vivo to cholesterol-derived LXR ligands or to TR hormone ligands. We measured liver FTF levels in Fisher rats fed for 5 days on a 2% cholesterol diet, and in Sprague-Dawley rats 5 and 24 h following an intraperitoneal injection of T3 thyroid hormone (serum T3 levels were maximal at 5 h, but still 10-fold over control levels (2.5 nM) at 24 h (data not shown)). With the high cholesterol diet, liver FTF protein level increased about 2 fold, C/EBP about 3.5-fold, HNF4 1.4 fold, and HNF1 was diminished (Fig. 2.7 A). Injection of T3 increased liver FTF level about 2.3 fold after 5 h, and 3 fold after 24 h; C/EBP showed some increase at 5 h (Fig. 2.7 B). T3 injection also enhanced the relative amount of TR-RXR complexes bound to the FTF DR4 element in band-shift assays (Fig. 2.7 C). Northern blot measurements at 5 h showed about 2 fold increase in liver FTF mRNA in T3-injected animals (Fig. 2.7 D). Liver FTF responses in vivo were thus consistent with a functional DR4 response element at the rat Ftf gene locus.

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Figure 2.7 : Liver FTF response in vivo to cholesterol or thyroid hormone. A. Western blot analysis of liver nuclear proteins from Fisher rats fed for 5 days on a control diet (C) or on a 2% cholesterol diet. These chemiluminescence reactions illustrate results obtained with duplicate runs of 10 µg total liver nuclear proteins (pools of 5 rats per group). Quantitation of protein bands is expressed as fold change of liver protein levels in rats fed the cholesterol diet, relative to rats fed the control diet, calculated as described under "Experimental Procedures"; split FTF bands are translational isoforms. B. measurement of liver nuclear proteins from Sprague-Dawley rats, 5 and 24 h following intraperitoneal injection of 375 µg/kg triiodothyronine, using Western blots quantitated in reference to liver nuclear proteins from rats injected with saline (C); bars are 1 S.D. in triplicate assays from two sets of experiments. C. autoradiogram of duplicate EMSA reactions using the mFTF DR4 probe and liver nuclear proteins from Sprague-Dawley rats (pools of 5), 5 or 24 h following T3 injection, or 5 h following saline injection (C); quantitation is the ratio of radioactivity counted in TR-RXR complexes relative to LXR- RXR complexes. D. Northern blot analysis of liver FTF mRNA from Sprague-Dawley rats 5 h following T3 injection, quantitated in reference to liver FTF mRNA from rats injected with saline (C), and normalized to GAPDH (mRNA pooled from 5 livers per group and run in duplicate). 2.7 Discussion

2.7.1 FTF in the Embryo The Ftf/lacZ mouse shows that Ftf gene activation is part of prime genomic events surrounding initiation of zygotic transcription at the 2-cell stage. FTF is also ubiquitously expressed in the early embryo, like its homolog in Xenopus [337], and FTF is essential to mouse embryogenesis, like its distant relative Ftz-F1 in Drosophila [338]. In contrast, SF1, the closest FTF homolog, is specifically required for development of steroidogenic organs [339]. This supports the notion of FTF being a more primitive receptor [340], which also fulfills SF1 functions in lower vertebrates like fish [341]. Ftf-null mouse embryos provide no signs of essential FTF functions at preimplantation stages. FTF relatives in fly or frog 82 are maternal genes [338, 342], whereas FTF is not expressed in mouse oocytes, which could suggest other more ancient functions in lower species. Ftf-/- mouse embryos die at E6.5-7.5 with morphological features typical of aborted gastrulation and visceral endoderm dysfunction. This mimics similar phenotypes obtained by inactivating upstream activators (GATA) [320, 321, 343, 344] or downstream targets (HNF4, HNF3) [128, 129, 142, 144, 334] of the Ftf gene, suggesting the possibility of inter-dependent lethal phenotypes in the GATA-FTF-HNF cascade. Gata6 knockout, for instance, is also lethal at E6.5–7.5 [320], and FTF expression could be expected to be severely curtailed in Gata6-/- embryos. Reciprocally, Ftf-/- lethality occurs somewhat earlier than with Hnf or Hnf4 knockouts [128, 129, 144], possibly because the Ftf-null state depletes both HNF3 and HNF4. The Ftf/lacZ mouse also shows expression patterns indicative of transient FTF functions in multiple fetal structures outside endodermal derivatives. High Ftf gene expression in actively growing cell compartments, such as ossification zones, reinforces the suggestion that the Ftf gene may generally react to cell surface growth receptor signaling [246]. It also predicts extensive differential use of Ftf promoter elements in a developmentally restricted manner. As a case in point, mouse PDX1 is coexpressed with FTF in fetal pancreas and intestine, but PDX1 binds to the Ftf promoter only in pancreas, and only from E13.5 through E16.5 [270]. The FTF DR4 regulatory element, responding to retinoid and thyroid ligands, also opens multiple signaling pathways through which Ftf could be transiently up- regulated during fetal development. Finally, FTF physically interacts with the homeodomain protein FTZ [340], a mandatory partner of FTF ancestor FTZ-F1 [338], suggesting that homeodomain proteins may be important FTF coeffectors in developmental events.

2.7.2 FTF in the Adult Converging evidence suggests that FTF basically operates the enterohepatic cholesterol/BA cycle by activating liver BA production and export via CYP7A1 and MRP3 [247, 282-284, 292], intestinal BA absorption via ASBT [291], and BA reentry from intestinal cells into portal blood via mrp3 [324]. Short term overexpression of hepatic FTF in transgenic TgF35 mice provides compelling in vivo support for the activating effect of FTF on Cyp7a1 and Shp. FTF-haploinsufficient mice allowed us to investigate further the net systemic effect of 83 reducing FTF production at both hepatic and intestinal FTF expression sites. Ftf+/- mice express higher levels of CYP7A1 mRNA than wild-type mice. Recently, a dual mechanism was brought to light in the feedback repression of Cyp7a1. One proceeds via BA activation of FXR leading to Shp induction and FTF quenching [283, 284], while the other involves BA-FXR activation of an FGF/JNK/C-JUN signaling cascade [345-348]. Basal Cyp7a1 activity is thus higher in Fxr-/- [323], Shp-/- [347, 348], or Fgfr4-/- [349] mice, and BA repression of Cyp7a1 is eliminated in Fxr-/- mice [323] but not in Shp-/- mice [347, 348]. Under Fft+/- steady-state conditions, liver SHP expression is not diminished, but C-JUN level and cell signaling are reduced, thus enhancing Cyp7a1 activity. This resembles ASBT- deficient mice, in which ileal BA recycling is eliminated, also resulting in 3 fold increase in CYP7A1, with no change in SHP [350]. Like Cyp7a1, the Afp gene is a negative acute phase reactant [319], and has long been known to be repressed by C-JUN via the FTF- binding Afp promoter element [319, 351, 352]; furthermore, C-JUN strongly interacts with FTF in GST pull-down assays [353]. FTF is thus a plausible feedback target for both SHP and C-JUN.

When Ftf+/- mice were fed a cholesterol or cholic acid enriched diet, liver c-Jun expression was increased (Table 2.3). However, only cholic acid resulted in Cyp7a1 repression, showing that C-JUN enhancement per se is not sufficient to mount a feedback response. Robust BA activation of FXR, indicated by higher SHP and lower CYP8B1 in the cholic acid group (array CA, Table 2.3), thus appears required to activate C-JUN into an effective repressor. On the other hand, a pure FXR agonist cannot repress Cyp7a1 in the absence of SHP [347, 348] and therefore activation of the FXR-FGF-JNK pathway is also not sufficient to mount a significant repressive response. We conclude that a threshold of repressive C-JUN is contributed by both the absolute level and the activation state of C- JUN. Consistent with this, coexpression of C-JUN in transfection assays enhances the repressive effect of JNK on Cyp7a1 [345]. Cholic acid does not completely repress Cyp7a1 in the absence of SHP [347, 348], suggesting that SHP is a more effective silencer in using both competitive and active repression mechanisms to quench FTF activity [354].

Cell signaling and the FXR-SHP loop provide first-line feedback mechanisms to reduce BA production in normal conditions. Under cholestasis such as produced by ligation of the bile 84 duct, a second-line hepatoprotective mechanism is activated whereby intense cytokine signaling exacerbates the JNK pathway, resulting in enhancement of hepatic FTF level, with a strong increase of liver MRP3 to expel BA from hepatocytes [292]. Since Fxr-/- mice are refractory to Cyp7a1 repression by excess BA feeding [323], cytokine shortcuts to JNK activation may have limited bearing on normal physiology. Nevertheless, it illustrates that FTF regulated genes respond differently to homeostatic changes. In Ftf+/- liver, FTF target genes Mrp3 and Cyp7a1 showed opposite changes in steady-state conditions (arrays 1-3, Table 2.3), and Cyp7a, but not Mrp3, was inhibited by cholic acid feeding (array CA, Table 2.3). Likewise, in isolated intestinal cells, bile acids activate Mrp3 and deactivate Asbt, via their FTF regulatory domains [291, 324]. Thus, Mrp3 and Cyp7a1/Asbt respond to bile acids in opposite directions, as a coherent systemic way to reduce cellular toxicity. This differential regulation seems to be provided by the particular arrangement of tandem FTF activation sites in the Mrp3 promoter [324], whereas Cyp7a1 and mouse Asbt promoters contain a single FTF activation site.

A simplified model of FTF regulation and function is presented in Fig. 2.8. In essence, FTF activates Cyp7a1 and BA production in hepatocytes (steps 1 and 2), and BA export from enterocytes via MRP3 (step 3). FTF activation of Cyp7a1 is subject to feedback repression by SHP (step 4) and by JNK-activated C-JUN (step 5). In the Ftf+/- mouse, BA recycling (step 3) and signaling (steps 6 and 7) is attenuated, resulting in higher CYP7A1 activity, higher cholesterol elimination, and lower plasma cholesterol levels. The model can explain why FXR is essential for BA feedback repression of Cyp7a1 (in the absence of FXR, steps 7 and 8 are not operational), while the loss of SHP can be bypassed by BA via step 5, but not by an FXR specific ligand (step 4 is not operational, and step 6 is not activated). The FTF DR4 element further integrates metabolic functions of FTF and LXR (step 9) in reducing hepatic cholesterol stores and enhancing cholesterol secretion. LXR can also indirectly activate genes carrying an FTF response element but devoid of a DR4 element, such as the human Cyp7a1 gene. FTF levels somewhat lower than predicted in Ftf+/- liver, and negative feedback on the endogenous Ftf gene following acute induction of transgenic FTF (Fig. 2.5 B) may be explained by reduced signaling to the DR4 element as a result of enhanced CYP7A1 activity and reduced availability of cholesterol derived LXR ligands (step 2). 85

By affecting all FTF regulated genes in a mildly disruptive way, the Ftf+/- mouse establishes a new systemic model closely relevant to physiological conditions, and to better control of atherogenic processes. The FTF-inducible transgenic mouse (TgF35) also provides a powerful tool to identify primary Ftf gene targets: this work is in progress in our laboratory.

Figure 2.8 : Model derived from the present and other studies, integrating FTF regulation and function in cholesterol-bile acid homeostasis. FTF exerts positive control on BA synthesis and recycling, and Cyp7a1 activation by FTF is subject to repression by SHP and activated C-JUN. In Ftf+/- mice, hepatic FTF level is reduced but cell signaling is attenuated, resulting in net enhancement of Cyp7a1. See "Discussion" for reference to numbers 1 to 9. L, FXR specific ligand. 86

2.8 Données complémentaires

Expression développementale de FTF L’inactivation de Ftf chez la souris par l’insertion d’une cassette LacZ a permis de générer un patron d’expression détaillé de la fusion FTF/-gal dans l’embryon de souris et chez l’adulte. La figure 2.9 illustre que l’expression de FTF, ubiquitaire aux premiers stades du développement (Fig. 2.2 A-B), se restreint à E8 à l’endoderme embryonnaire de la région du tube digestif postérieur et à certaines structures antérieures (Fig. 2.9 A). À ce stade et tout au long du développement, FTF est aussi exprimé dans l’endoderme extraembryonnaire du sac vitellin (Fig. 2.9 P). L’expression de FTF dans le tube digestif observée à E8 est conservée à E16,5 (Fig. 2.9 K) et jusque chez l’adulte. À E9,5 (Fig. 2.9 B), le bourgeon hépatique exprimant FTF se distingue du tube digestif. Le foie, le pancréas et les intestins, dérivés de l’endoderme embryonnaire, produisent FTF tout au cours de leur développement et cette expression persiste chez l’adulte (Fig. 2.7 C-H, K-L et Fig. 2.2 E)

En plus des cellules endodermiques, plusieurs cellules disséminées dans la région du repli neural (ectoderme neural) (possiblement, en partie, des cellules de la crête neurale), expriment FTF/-gal à E8 (Fig. 2.9 A cercle et [270, 273]). Aux stades suivants, soit à E9,5 et E10,5, une coloration FTF/-gal est observée dans les arcs branchiaux (Fig. 2.9 B,C) : les cellules de la crête neurale ayant colonisé les arcs branchiaux à ce stade sont possiblement la source de cette coloration; en effet, plusieurs structures, dont les cellules expriment FTF/-gal de façon transitoire au cours du développement, proviennent de la différenciation des cellules de la crête neurale. La poche de Rathke qui formera la future hypophyse, les structures cartilagineuses ou osseuses du crâne et plusieurs ganglions, dont les ganglions trigéminaux et les ganglions de la racine dorsale (« dorsal root ganglion »), font partie des structures dérivées des cellules de la crête neurale qui présentent une coloration positive (Fig. 2.9 D-H et N-O).

À partir de E11,5, l’expression de FTF/-gal est aussi observée dans des structures formées par ossification endochondrale soit les côtes, les métatarses et les os longs des membres supérieurs (Fig. 2.9 I-J). Les stades de développement pendant lesquels ces colorations sont observées portent à croire que FTF est exprimé dans le mésenchyme pré-cartilagineux, 87 donc au stade précoce de l’ossification. De E12,5 à E14,5, FTF est exprimé à l’intérieur de la vésicule otique, précurseur des structures de l’oreille (Fig. 2.9 D-F). À E14,5, FTF est aussi exprimé par des cellules localisées aux membres supérieurs qui semblent être mésenchymateuses et se différencieront en muscle squelettique (Fig. 2.9 F). À ce stade (E14,5), FTF est aussi présent dans le mésenchyme du poumon (Fig. 2.9 M) et dans les glandes salivaires (Fig. 2.9 G). Les images E, H, N et O de la figure 2.9 montrent l’expression de FTF/-gal par certaines structures neurales situées dans des régions du mésencéphale, du thalamus, de l’hypothalamus et de la ligne marginale de la colonne vertébrale. Enfin, en plus d’être présent dans les ovaires (Fig. 2.2 F) FTF est aussi exprimé dans les tubules séminifères du testicule (Fig. 2.9 Q).

Ces données complémentaires, détaillant le patron d’expression de FTF lors du développement embryonnaire, suggèrent, en plus de sa fonction développementale dans les organes digestifs, un rôle plus spécifique à certaines étapes du développement de certains organes et types cellulaires, démontré par l’expression transitoire de FTF comme par exemple dans le poumon ou encore dans les cellules de la crête neurale et probablement les chondrocytes. La provenance exacte de la coloration observée dans certaines régions de l’embryon reste à être déterminée. Par exemple, dans la structure nasale (n) (Fig. 2.9 F), la coloration pourrait provenir des cellules épithéliales tapissant la capsule nasale ou encore du cartilage. Au niveau de la tête, il pourrait s’agir de cellules formant du cartilage, de ganglions en formation ou de cellules en migration (Fig. 2.9 A, D, F-cercles). L’analyse fine de ces structures pourrait permettre d’identifier les types cellulaires exprimant FTF et ainsi de clarifier davantage les fonctions développementales de ce récepteur.

Figure 2.9 : Expression tissulaire développementale de l’hybride FTF/-gal chez la souris. A-F : embryon complet ; A- E8; B- E9.5; C- E10.5; D- E11.5; E- E12.5; F- E14.5. G-H : coupe sagittale d’embryon E14.5. I : Patte antérieure E14.5. J-O, Q : partie d’embryon E16,5 : J- patte antérieure ; K- système digestif ; L- foie ; M- poumon (bleu), cœur (blanc) ; N- cerveau, vue supérieure ; O- cerveau, vue inférieure ; Q- testicule. P : Sac vitellin E14.5. e, endoderme; ab, arc branchial; bh, bourgeon hépatique; f, foie; c, côtes; vo, vésicule otique ; o, oreille interne ; lm, ligne marginale ; os, os long ; ca, cartilage ; me, mésencéphale ; m, muscle ; n, cavité nasale ; sg, glande salivaire ; t, thalamus ; i, intestin ; mt, métatarse ; g, ganglion trigéminal ; h, hypothalamus ; pr, poche de Rathke ; ee, endoderme extraembryonnaire. 88

89

Chapitre 3 Genome wide analysis of FTF transcriptional targets in liver cells

Daniel Malenfant1, Alain-Roger Bataille2, Éric Paquet1, Jacques Côté1, François Robert2,3, and Luc Bélanger1

1 Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec 2 Laboratoire de chromatine et expression du génome, Institut de recherches cliniques de Montréal 3 Département de Médecine, Faculté de Médecine, Université de Montréal.

(article en préparation) 90

3.1 Avant propos Les données présentées dans cet article sont définitives et telles qu’elles seront soumises pour publication. J’ai réalisé toutes les expériences présentées dans ce chapitre sauf les étapes d’hybridation et de lecture des micro-puces qui ont été réalisées par Alain-Roger Bataille du laboratoire de François Robert (IRCM). Les analyses bioinformatiques ont été réalisées conjointement avec Éric Paquet (CRHDQ). J’ai rédigé cet article sous cette forme initiale, sans retouche significative de l’auteur sénior ni revue des autres co-auteurs. La discussion de ce chapitre a été allégée pour limiter la redondance avec la discussion générale (chapitre 4). La discussion sera bonifiée pour la publication de l’article.

3.2 Résumé

FTF, un récepteur nucléaire originalement identifié au promoteur AFP, fait partie d’un réseau transcriptionnel gouvernant le développement, la maturation et les fonctions adultes du foie. Afin d’approfondir les fonctions hépatiques de FTF, nous avons exploité l’approche ChIP-chip pour identifier les cibles transcriptionnelles directes de FTF dans le foie de souris foetale et adulte, et dans une lignée d’hépatocarcinome. De plus, C/EBPétant un activateur partenaire de FTF au promoteur Afp, nous avons comparé le profil ChIP-chip C/EBPà celui de FTFet évalué son interaction potentielle avec ce dernier à l’échelle génomique. Les résultats montrent principalement que dans le foie adulte, FTF est lié aux promoteurs de multiples gènes impliqués dans le métabolisme énergétique, dont plusieurs enzymes du métabolisme du glucose, des lipides et des complexes mitochondriaux de phosphorylation oxydative. C/EBPlie également de nombreux gènes impliqués dans les mêmes sentiers biochimiques, dont 20% des gènes cibles de FTF. Ces cibles peuvent être contrôlées par une « feedforward loop » puisque C/EBP est lié au promoteur FTF. Les résultats obtenus pour le foie foetal et adulte montrent que contrairement à C/EBP les cibles directes de FTF diffèrent considérablement selon l’état développemental de l’hépatocyte. Dans les cellules d’hépatocarcinome, la fonction de FTF s’adapte au nouvel état métabolique associé à une cellule dédifférenciée. FTF semble donc s’imposer comme régulateur majeur de 91 l’homéostasie énergétique dans l’hépatocyte mature, un rôle combiné avec C/EBP, et qui semble fortement dépendant de l’état de différenciation de l’hépatocyte.

3.3 Abstract

FTF, a nuclear receptor originally identified at the AFP gene promoter, belongs to a transcriptional network governing liver development, maturation and adult functions. Here we sought to further identify direct transcriptional targets of FTF in fetal and adult mouse liver and in a hepatocarcinoma cell line. As our laboratory identified C/EBP as FTF partner on the Afp promoter, we also investigated the potential interaction between FTF and C/EBP signalling on other loci. Using ChIP-chip, we found that in adult liver, FTF binding largely occurs on the promoters of genes involved in energy metabolism, including enzymes of glucose and , and mitochondrial oxidative phosphorylation complexes. We also found that C/EBPregulates genes involved in the same biochemical pathways, including 20% of the FTF target genes. Those targets may be under the control of a feed-forward loop as C/EBP binds to the Ftf promoter. Our results obtained in fetal and adult liver indicate that in contrast to C/EBP , FTF targets differ considerably according to the developmental state. In hepatocarcinoma cells, FTF gene targets differ again with a new metabolic dysdifferentiated state. Our study broadly expands the metabolic role of FTF beyond sterol homeostasis and points to FTF as a major regulator of hepatic energy metabolism. These metabolic functions are in part coordinated with C/EBP and depend on the hepatocyte differentiation state.

3.4 Introduction

FTF (NR5A2) is an orphan nuclear receptor belonging to the FTZ-F1 family that we first identified as a regulator of the Alpha-1-fetoprotein (AFP) gene, encoding a plasma protein selectively expressed in fetal liver and hepatocellular carcinomas (HCC) [242]. Multiple studies have later attributed an important role for FTF in liver lipid homeostasis (reviewed in [239]). FTF binds DNA as a monomer to an extended nuclear receptor hemisite (5’- PyCAAGGPyCpu-3’); it does so in absence of ligand, but crystallographic studies have shown that phospholipids can occupy the ligand binding domain of FTF, prompting a 92 search for potential natural FTF ligands [242, 249, 255, 259, 260]. FTF is principally expressed in endoderm derived organs (liver, pancreas, intestine), ovary and pre- adipocytes, but also in some specific structures such as ganglions and neural crest derivatives during embryo development [266, 272, 274, 275]. In ES cells, FTF plays an important role in maintaining pluripotency at the epiblast stage of embryonic development by regulating the expression of OCT4 [279]. Our group has shown that FTF is essential to embryogenesis : the inactivation of Ftf in mice is embryonic lethal at E6,5 [266]. In fact, FTF plays an important role in extra-embryonic tissues and is required for proper primitive streak morphogenesis [278]. Later in development, FTF participates in the establishment of the liver self-sustaining transcriptional network by regulating Hnf1, Hnf3 and Hnf4 and by being itself regulated by HNF1 and HNF4 [116, 117, 141, 244, 246]. In the adult, FTF is involved in lipid and steroid metabolism. Among the genes reported to be regulated by FTF are the rate limiting enzyme of the bile acid biosynthetic pathway CYP7A1 and several lipid transporters (reviewed in [239]). FTF also regulates the expression of SHP [286], an atypical orphan nuclear receptor lacking a DNA binding domain, that interacts with many nuclear receptors, including FTF, to repress their activity (reviewed in [232]). FTF is also connected with the proliferation of intestinal crypt cells through the -catenin pathway [300, 312]. Finally, recent studies confer anti-inflammatory functions to FTF by a mechanism involving FTF regulation of the Il-1 receptor antagonist (Il-1ra) [355, 356].

Studies on the transcriptional control of the Afp locus uncovered a functional interaction between FTF and C/EBP at the Afp promoter and enhancers in proliferating hepatocytes and hepatoma cells ([242, 357, 358] and our unpublished data). Our in vitro studies also showed a physical interaction between FTF and C/EBP and their co-occupation of the Afp promoter in vivo (our unpublished results). C/EBP is a basic-leucine zipper (bZip) transcription factor that binds as a homodimer or heterodimer with other C/EBP family members to CCAAT motifs present in numerous gene promoters. During development, C/EBP is first found in the early liver bud at E9.5 [169]. Inactivation of C/ebp in mice affects among other things hepatocytes differentiation manifested by metabolic abnormalities [160, 177, 359, 360]. In addition to their functional coactivation on the Afp promoter, FTF and C/EBP coactivate the aromatase and HBV promoters [245, 306, 314, 93

361, 362] and it has been recently shown that FTF can also interfere with C/EBP-dependent gene activation regulating the hepatic acute-phase response [356].

The present genome-wide study was performed to uncover new FTF direct transcriptional targets in developing and neoplastic liver cells, and to further explore potential genomic interactions between FTF and C/EBP. Using chromatin immunoprecipitation coupled with promoter arrays (ChIP-chip) we found predominantly that FTF binds a broad range of adult liver genes controlling energy homeostasis, 20% of which are also C/EBPtargets. We also found that FTF functions appear broadly divergent in fetal, adult and cancer liver cells.

3.5 Material and methods

3.5.1 Animals

B6C3F1 outbred mice were housed in filter-topped microisolators, under 50-70 air changes per hour and 10:14 h dark/light cycle, and fed on Teklad standard chow TD2018.

3.5.2 Cell culture

Hep3B cells were grown near confluence in low-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (Life Technologies) supplemented with 100 U penicillin/ml, 100 µg streptomycin/ml, and 10% foetal bovine serum.

3.5.3 Chromatin immunoprecipitation assays (ChIP)

Mouse liver crosslinking

Livers were harvested from 2-3 month old mice (4 livers [2 males and 2 females]) or E19 embryos (4 litters). Portions of livers were pooled, washed in cold PBS and kept on ice. Livers (700 mg) were minced in 3 volumes of ice cold PBS and were passed 10 times through a size 18 needle before crosslinking in a 1% formaldehyde solution (1% formaldehyde, 10 mM NaCl, 100 mM EDTA, 50 mM EGTA, 5 mM HEPES pH 8.0) for 15 min. at room temperature; 1/10 volume of 2.5 M glycine was then added to stop the reaction. Cells were washed and dissociated in PBS with a Dounce homogeniser, centrifuged at 4C, flash frozen in liquid nitrogen and stored at -80C. 94

Hep3B cells crosslinking

Cells (150 X 106) were fixed in 1% formaldehyde solution for 10 min. at room temperature, and crosslinking was stopped by adding 1/10 volume of 2.5 M glycine. Cells were washed with PBS, centrifuged at 4C, flash frozen in liquid nitrogen and stored at –80C.

Immunoprecipitation

Cells were lysed in lysis buffer 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 0.25% Triton X-100) for 10 min. at 4°C, centrifuged at 4°C, and incubated with lysis buffer 2 (200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 10 mM Tris pH 8) for 10 min at room temperature. After centrifugation, nuclei were resuspended in sonication buffer (1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 0,1% Na-deoxycholate, 0.5% N-lauroyl sarcosine). Lysis and sonication buffers contained a protease-inhibitors cocktail (Complete, Roche). The suspension was sonicated with a Bioruptor (Diagenode) using 30 sec. intervals (5-8 cycles) to obtain DNA fragments averaging 500 bp (verified on 2% agarose gel). One-tenth volume of 10% Triton was added and debris were removed by centrifugation. An aliquot (1/50 volume) of supernatant solution was saved for later use as input fraction. Protein/DNA complexes were immunoprecipitated by 16 h incubation at 4°C with magnetic beads (Dynabeads protein G, Dynal Biotech) pre-treated with FTF-2 antibody [242], or C/EBPantibody (Santa-cruz Sc- 150X), or pre-immune serum; beads were washed with PBS/BSA buffer, incubated 16 h at 4°C with antibody or pre-immune serum and washed again with PBS/BSA buffer before use in the immunoprecipitation reaction. After immunoprecipitation, beads were washed six times (50 mM HEPES pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.7% Na-deoxycholate, 1% NP-40, 0.5 M LiCl) and DNA/protein complexes were eluted at 65°C (1% SDS Tris-EDTA buffer pH 8). Beads were removed by centrifugation and supernatants were reverse cross-linked for 16 h at 65°C. The input fraction was diluted in 3 volumes of elution buffer and also reverse cross-linked for 16 h at 65°C. DNA was treated with RNase A and proteinase K, purified using phenol:chloroform extractions, followed by precipitation with glycogen, NaCl and ethanol. 95

ChIP-chip hybridization and validation

We used a custom microarray of DNA sequences spanning 800 bp upstream and 200 bp downstream of transcription start sites from over 18000 human or mouse genes and DNA samples labelling and hybridization procedures as described in [363]. Two independent experiments were carried with mouse liver pools, and three with Hep3B cells. Hybridization data were analyzed as per Dufour et al. [363] using pre-immune data to correct for false positives, and applying background and median normalization followed by P-value assignment on weighted ratios, calculated from additive and multiplicative noise of the data and assumed to be normally distributed in the entire weighted ratios dataset.

Standard ChIPs on randomly selected putative targets for each antibody was used to generate and validate the target promoter lists, by empirically setting ChIP-chip P-value thresholds allowing an approximate false discovery rate of 10% and using a minimum ChIP-chip DNA enrichment of 2 fold for mouse liver and 1,5 fold for Hep3B cells (Fig. S1 and S2 in supplemental data). Using those criteria, P-values selected were P ≤ 0,02 for the FTF and C/EBPmouse liver experiments and P ≤ 0,002 for the Hep3B cells experiments. Primers for standard ChIP (Table S1 in supplemental data) were designed with LightCycler probe design software 2.0 (Roche) using DNA sequences located in the first kb upstream of the transcriptional start of putative gene targets (potential binding sites were located by visual inspection for FTF and by Alibaba 2.0 for C/EBP. Quantitative real-time PCR was performed on a LightCycler 1.2 (Roche) as described [266]. Promoter occupancy was calculated with the formula : [Peff (CP of pre-immune serum DNA - CP of specific antibody DNA)], where Peff is the PCR efficiency for each primer pair used for quantitative real time PCR determined by using serial dilutions of input DNA and the formula : [Peff = 10-1/slope]. Enrichment of DNA fragment was normalized against an amplified control region (intron 1 of mouse Afp).

Bioinformatic analyses

Motif enrichment in the immunoprecipitated DNA sequences was analysed using Weeder program with MM large S T10 parameters [364]. Coordinates of C/EBP and FTF target binding sequences were extracted and expanded by 250 bp on each side. Galaxy program [365] was used to fetch sequences from the mm5 build of the mouse genome : motifs were displayed using WebLogo [366], and enrichment P-values were calculated with TAMO 96

MotifsMetrics.py [367]. Biological themes and gene ontology enrichment in each target genes lists was assessed using DAVID Bioinformatics functional annotation tool [368, 369].

Potential FTF transcriptional partner binding sites were identified with the PAINT (Promoter Analysis and Interaction Network Toolset) program (version 4.0) [370] using 1000 bp upstream sequences (retrieved by PAINT using lists of GenBank accession numbers) and default feastnet builder and feasnet analysis and visualization settings.

3.6 Results

3.6.1 Adult liver

FTF

Our ChIP-chip analysis indicates that FTF is bound to at least 317 gene promoters in adult mouse liver, predominantly related to metabolism (26%) and that include the previously identified FTF gene targets Shp, Cyp7a1 and Hnf3Foxa2) [247, 273, 286] (Fig. 3.1 A and Table S2 in supplemental data). Applying the Weeder program to identify DNA sequences overrepresented in the 317 target DNA regions, we recovered the canonical FTF binding sequence, an extended nuclear receptor hemisite ([T/C]CAAGG[T/C]CA) (Fig. 3.1 B). Strikingly, FTF was recovered on promoters of multiple genes involved in major energy metabolism pathways including , , , fatty acid oxidation, cholesterogenesis and bile acids biosynthesis (Fig. 3.2). FTF targets are highly enriched in mitochondrial components (P-value of 1.4 x10-12), with at least 44 genes encoding proteins related to mitochondrial functions and biogenesis (Fig. 3.2 and Table 3.1). FTF is also found on gene promoters of metabolic transcription effectors, including transcription factors NR1I3 (CAR), GABPA, ERR and FOXA2. The PAINT program further allowed the identification of transcription factor binding sites overrepresented in FTF target gene promoters. In addition to the expected FTF binding site, response elements for CREB, PAX, ETS, HIF-1 transcription factors and GC-rich sequences were identified (Table 3.2). 97

Figure 3.1 : Genome wide location analysis of FTF and CEBP gene targets in adult mouse liver. A, C) Gene ontology pie chart categorizing biological functions of FTF and C/EBP target genes. B, D) Binding sites for FTF (B) and C/EBPD) as determined by Weeder analysis. E) Venn diagram giving the overlap between FTF and CEBP gene targets. PM, primary metabolism. 98

Figure 3.2 : Liver FTF gene targets in energy metabolism related pathways. Red : FTF targets identified in our ChIP-chip experiment; Red underlined : known FTF target ; Black : other known FTF targets.

Table 3.1 : FTF gene targets related to mitochondrion in adult mouse liver. David bioinformatics functional annotation tool: GO, cell compartment, mitochondrion.

Genbank ID Symbol Gene name Fatty acids metabolism NM_212442 Acsm3 Acyl-CoA synthetase medium-chain family member 3 NM_007382 Acadm Acetyl-coenzyme A dehydrogenase, medium chain NM_007760 Crat Carnitine acetyltransferase NM_009948 Cpt1b Carnitine palmitoyltransferase 1B, muscle NM_010023 Dci Dodecenoyl-coenzyme A delta isomerase (3,2 trans-enoyl-coenzyme A isomerase) NM_053119 Echs1 Enoyl coenzyme A hydratase, short chain, 1, mitochondrial NM_016772 Ech1 Enoyl coenzyme A hydratase 1, peroxisomal Oxydative phosphorylation NM_020615 Atp5c1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, gamma polypeptide 1 NM_007506 Atp5g1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit C, isoform 1 NM_175015 Atp5g3 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit C, isoform 3 NM_016774 Atp5b ATP synthase, H+ transporting mitochondrial F1 complex, beta subunit NM_026703 Ndufa8 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 8 NM_010885 Ndufa2 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 2 NM_007750 Cox8a Cytochrome C oxidase, subunit VIIIA 99

NM_007808 Cycs Cytochrome C, somatic Glucose metabolism NM_008797 Pcx Pyruvate carboxylase NM_010292 Gck Glucokinase NM_007608 Car5a Carbonic anhydrase 5A, mitochondrial Other NM_008906 Ctsa Cathepsin A NM_026508 Trap1 TNF receptor-associated protein 1 NM_024255 Hsdl2 Hydroxysteroid dehydrogenase likeE 2 NM_175094 Pdhx Pyruvate dehydrogenase complex, component X NM_011883 Rnf13 ring finger protein 13 NM_008743 Nthl1 NTH (endonuclease III)-like 1 (ECOLI) NM_007531 Phb2 Prohibitin 2 NM_010481 Hspa9 Heat shock protein 9A NM_145829 Nags N-acetylglutamate synthase NM_008162 Gpx4 glutathion peroxidase 4 NM_130450 Elovl6 ELOVL family member 6, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_134007 Cisd1 CDGSH iron sulfur domain 1 NM_007798 Ctsb Cathepsin B NM_010839 Mtcp1 Mature T-cell proliferation 1 BC058978 NR1I3 Nuclear receptor subfamily 1, group I, member 3 NM_011694 Vdac1 Voltage-dependant anion channel 1 NM_008175 Grn Granulin NM_026444 Cs citrate synthase NM_025784 Bcs1l BCS1-like (yeast) NM_133668 Slc25a3 Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, phosphate carrier), member 3 NM_011690 Vars Valyl-tRNA synthetase 2 NM_011591 Timm17b Translocase of inner mitochondrial membrane 17B NM_026452 Coq9 Coenzyme Q9 homolog (yeast) NM_016978 Oat ornithine aminotransferase NM_024174 Mrps23 Mitochondrial ribosomal protein S23 NM_173757 Mrps27 Mitochondrial ribosomal protein S27

Table 3.2 : FTF potential transcriptional partners.

Transcription factors associated with overrepresented DNA binding sequences in FTF gene target promoters identified in adult mouse liver. Numbers are percentages of FTF target promoters containing the binding site. ns, non-significant

Binding site All Mitochondrion Liver related function FTF 28 39 Development, metabolism CREB 25 18 Gluconeogenesis, mitochondrial biogenesis PAX 43 70 Liver regeneration, circadian transcription ETS (GABP) 41 ns Mitochondrial biogenesis HIF-1 ns 36 Hypoxia GC-rich 67 39

100

C/EBP

ChIP-chip analysis identified 443 potential C/EBP gene targets in adult mouse liver (Fig. 3.1 C and Table S3), with the expected overrepresented promoter motif ATTGCGCAAC recognized by C/EBP dimers (Fig. 3.1 D) [161, 162]. Like for FTF, C/EBP targets are enriched for metabolic functions (30% of targets, including 17 genes) and mitochondrial functions (53 genes) (Fig. 3.1 C, Fig. 3.3, Tables S2 and S4). Like FTF, C/EBP binds to genes encoding transcription factors (FXR, LXR, ATF3, KLF15 and DBP) involved in hepatic lipid, glucose or amino acid homeostasis, and to NRF1 also involved in mitochondrial biogenesis [239, 371-376]. And notably, C/EBP binds to the Ftf promoter itself. Furthermore, of the 317 FTF gene targets, 70 (22%) are also bound by C/EBP (Fig. 3.1 E and Table S5). The broader spectrum of C/EBP targets extends to biological fields and gene families known to be regulated by C/EBPsuch as acute phase reactants (8 genes) and cytochrome P450 (7 genes).

Figure 3.3 : C/EBP gene targets related to major energy metabolism pathways. * also FTF target.

3.6.2 Fetal liver ChIP-chip analysis at E19 indicated that FTF is bound to 125 gene promoters in fetal mouse liver, compared to 317 in adult liver, again including genes involved in metabolic 101 and mitochondrial functions (Fig. 3.2 and 3.4 A and Table S6), but with only 5% overlap between fetal and adult FTF gene targets (Fig 3.4 C and Table S9). In contrast, C/EBP is bound to more promoters in fetal liver (586) than in adult liver (443), with over 50% overlap between fetal and adult liver, including metabolic/mitochondrial genes NR1H3, NRF1, ATF3 and KLF15 (Fig 3.4 B, D and Table S7 and S10). In fetal liver, C/EBP is also bound to the ERR gene, a major energy regulator, and to its homolog genes CEBP and . Fetal-enriched C/EBPfields further include gene clusters involved in ribosome and chromatin organization (Table S7) Like in adult liver, about 20% of the fetal FTF gene targets are also bound by C/EBPFig. 3.4 E and Table S8)and C/EBP also binds the Ftf gene promoter.

Figure 3.4 : Genome wide location analysis of FTF and CEBP binding targets in fetal mouse liver. A, B) Gene ontology fields of FTF and C/EBPtarget genes. C, D, E) Overlap between adult and fetal targets for FTF (C) and C/EBPD) and between FTF and CEBP fetal targets (E). A, adult; F, fetal; PM, primary metabolism. 102

3.6.3 Hepatoma cells Classification of the 147 FTF target genes identified in Hep3B cells shows again a sizable fraction (20%) related to metabolism but with some significant differences : lipid metabolism genes in hepatoma cells only represent 2% of the total FTF target genes, as compared to 7% in adult mouse liver (Fig S2). FTF binds to genes different from those identified in mouse liver including 5 subunits of the OXPHOS complexes and genes involved in the protection against toxic compounds (SULT2A1, HAL, GLRX5), in DNA repair (MSH6, CHAF1A, XRCC5, RAD23B) and in proliferation and growth related metabolism (CHKA, MDH1, MAT2A, PPCS, LTA4H) (Table S11). Notably, FTF binds to the ATF4 promoter, a zinc finger protein whose pathway is critical for maintaining metabolic homeostasis in tumor cells [378].

3.7 Discussion

This ChIP-chip identification of direct FTF gene targets in mouse liver strengthens and expands FTF metabolic involvement in bile acid production, cholesterogenesis and lipogenesis, FTF being recovered on previously documented FTF-regulated genes and new genes operating these pathways. Of further interest, the data now also point to important novel FTF functions in metabolic energetic homeostasis.

In particular, some 14% of FTF gene targets in adult liver are related to mitochondrial biogenesis and function, including several subunits of the OXPHOS complexes and enzymes of the TCA and urea cycles and fatty acid catabolic pathways. Quite notably, a number of these FTF gene targets are known to be regulated by orphan nuclear receptor ERR which, in cardiac cells, binds the same DNA hemisite as FTF [363, 379]. For example, eight out of twelve OXPHOS complex subunits identified here as FTF targets have also been identified as ERR-binding genes [363]. Furthermore, ERR regulates mitochondrial biogenesis and oxidative metabolism in part by interaction with coactivator PGC-1 [380], and many gene promoters modulated by PGC-1 harbor the FTF/ERR DNA-binding site [381]. PGC-1 being also known to serve as an FTF coactivator [263], it thus seems highly likely that FTF, in concert with PGC-1, plays an important role in oxidative metabolism and mitochondrion biogenesis in hepatocytes, similar to ERR in 103 cardiac cells. In further support of this, and like for ERR target genes [363], regulatory motifs overrepresented in FTF target promoters include the binding site for ETS transcription factor GABP, abundantly expressed in liver and also acting as a regulator of mitochondrial energetic functions [382, 383]. FTF, like ERR, also binds to the promoter of the Gabpa gene, encoding a GABP subunit. CREB-binding DNA motifs are also overrepresented in FTF as well as ERR target promoters [363], CREB being also known to regulate hepatic metabolic and mitochondrial functions in concert with PGC-1[384-386]. Clearly then, PGC-1, GABP and CREB are strong FTF partner candidates in controlling metabolic mitochondrial and energetic liver functions. (Binding sites for oxygen sensor HIF-1 were also overrepresented in mitochondrial FTF targets, connecting again FTF with [387].)

Another pivotal function for FTF in hepatic nutrient metabolism points to glucose homeostasis, FTF being found by ChIP-chip on critical gluconeogenic genes, in particular G6pc and Pck1, coding two rate-limiting enzymes in the gluconeogenic pathway, as well as on genes of the reciprocal pathway, encoding transporters and enzymes for glucose (Fig. 3.2). In this regard, FTF transrepressor SHP is known to negatively regulate the gluconeogenic pathway by interaction with G6pc/Pepck transcriptional activators [232, 239], and thus plausibly with FTF as well: this would be similar to FTF- SHP antagonistic effect on Cyp7a1 gene activity in bile acid synthesis [388].

Strong evidence is thus growing that FTF in adult liver may exert an important role in overall energetic/metabolic body homeostasis by regulating the hepatocyte energetic balance and the production of systemic nutrients, and by sensing metabolic cues, for instance through the LXR-response element conserved in the FTF gene promoter [266]. Of further metabolic note is that 28% of FTF gene targets follow circadian expression patterns (like FTF itself) (Table S12) [389], and FTF-bound genes include Per1, a major circadian regulator of transcription. Furthermore, all potential regulatory motifs overrepresented in FTF-targeted promoters are also linked to circadian transcription (Table 3.2) [390, 391]. This, and the already described FTF/CLOCK interaction, points to an oscillating mode of metabolic energetic FTF action [392]. 104

Our parallel search for FTF gene targets potentially coregulated by C/EBP stemmed from the observation that the two factors coactivate the hepatic AFP gene locus, which encodes an oncofetal nutrient transporter of the albumin gene family. We detected C/EBP on 20% of the FTF-targeted promoters and on numerous loci involved in energetic processes, including OXPHOS complexes, or encoding transcriptional regulators of liver metabolism such as Klf15, Atf3, Fxr, Lxr, as well as on the Ftf gene promoter itself. Clearly then, FTF and C/EBP should broadly cooperate in regulating energetic metabolic liver states, with direct loop signalling between the two regulators. This co-homeostatic action would thus extend the concerted action of FTF and C/EBP in the developmental network of liver- enriched transcription factors presiding over hepatic organogenesis and hepatocyte differentiation [116, 356].

In striking contrast with C/EBP, recovered from more genes in fetal liver than in adult liver with over 50% overlap between the two developmental states, FTF was bound to far fewer fetal genes than adult genes, with only 5% overlap between fetal and adult. Part of this can be attributed to the lower FTF expression in fetal liver and to the activation of the mitochondrial proliferation program occurring after birth [116, 393]. However, FTF in the fetal state still binds to metabolic genes, in particular those related to glucose and hexose metabolism, and to mitochondrion-related genes, of which only one belongs to the OXPHOS complex. Notably, FTF is now found on the Pdk3 gene, encoding an enzyme which inhibits the coupling of glycolysis to OXPHOS. Compared to C/EBP, FTF may thus more finely adjust its transcriptional functions to cell growth and glycolytic conditions of the fetal liver state, and shift to mature metabolism and respiration functions following the perinatal period.

Finally, we tested the spectrum of FTF-bound genes in hepatocarcinoma cells: this revealed part of the fetal/adult metabolic energetic components, with specific novel FTF gene targets key to tumor cell metabolism, such as ATF4, KLF4, MAT2A, RALB, MEST, LGMN, MSH6. FTF thus again seems to adapt its functions to particular metabolic energetic tumor cell requirements. This also lends support to FTF favouring tumor cell progression [300, 301, 306]. That the AFP gene was not recovered in ChIP assays is intriguing. 105

3.8 Conclusions

This study widens the role of FTF in transcriptional controls of liver metabolism, the main observation being that FTF is most likely to play a key role in hepatic energy homeostasis, largely through its involvement in mitochondrial functions. The FTF regulated gene network may then largely underlie hepatocyte decisions to use, store or produce metabolic substrates such as glucose or fatty acids according to energetic needs of liver cells or peripheric tissues, and according to hepatic differentiation and proliferative growth states. Further identification of metabolic signals acting directly or indirectly through FTF to modulate its expression or activity should finely circumscribe how FTF may adjust liver metabolic rates or maintain enzymatic steady-state levels ready to receive specific metabolic signals. Current studies mostly indicate an activating role for FTF on its target genes, but FTF like other nuclear receptors may also be subject to repressive signals and thus specific target effects also remain to be addressed via FTF interactions with coactivators corepressors or other transcription factors. And last, this study now strongly involves both C/EBP and FTF in coregulating liver developmental and metabolic networks far beyond their concerted fine-tuning of the AFP locus, paradigm of liver developmental and metabolic growth.

Chapitre 4 Discussion 107

Le récepteur nucléaire FTF a été, à l’origine, identifié par notre laboratoire comme étant un facteur clé dans la régulation de la transcription du gène Afp [242]. Depuis son identification, FTF a fait l’objet de plusieurs études permettant : la caractérisation de ses structures protéique et génique; l’identification de facteurs et signaux modulant sa transcription et son activité transcriptionnelle; la détermination de son patron d’expression; et l’analyse de ses diverses fonctions développementales et adultes potentielles chez divers organismes. Mes travaux de doctorat ont permis : de déterminer le patron d’expression développemental de Ftf, de caractériser un segment du promoteur de Ftf permettant sa régulation par des facteurs de transcription répondant à des stimuli métaboliques et d’identifier de nouvelles cibles hépatiques directes du récepteur FTF chez l’embryon de souris, chez la souris adulte ainsi que dans la lignée cellulaire d’hépatome humain Hep3B. De plus, parallèlement aux études réalisées avec le facteur FTF, j’ai procédé à l’identification des cibles transcriptionnelles hépatiques de C/EBP un facteur de transcription agissant comme partenaire de FTF dans la régulation du promoteur de l’Afp, afin d’évaluer son implication dans le réseau transcriptionnel hépatique coordonné par FTF.

Ces études ont permis d’accroître notre compréhension des rôles biologiques de FTF dans le développement embryonnaire et dans l’homéostasie métabolique chez l’adulte, en plus de fournir des indices sur les rôles biologiques potentiels de FTF dans la cancérogenèse hépatique et dans les tissus extra-hépatiques où il est exprimé. Mes travaux ont aussi permis d’élargir et de mieux caractériser le réseau transcriptionnel de FTF et surtout de dévoiler un rôle majeur pour FTF au cœur du métabolisme énergétique cellulaire.

4.1 Développement embryonnaire et différenciation Mes premières études portant sur le récepteur FTF ont été effectuées sur des souris hétérozygotes possédant un allèle inactif du gène Ftf créé grâce à l’insertion d’une cassette LacZ dans l’exon 4 permettant la production d’une protéine de fusion FTF/-gal [266]. Les colorations tirant profit de l’activité -gal de la protéine fusionnée m’ont permis de déterminer les divers sites d’expression du gène FTF, de l’initiation du développement embryonnaire de la souris jusqu’à l’âge adulte. 108

L’invalidation génique de FTF chez la souris, réalisée dans notre laboratoire, a montré que la fonction FTF est essentielle à la gastrulation [266]. Bien que le rôle exact de FTF lors des étapes subséquentes à la gastrulation reste encore à définir, les données recueillies jusqu’à maintenant, dont le patron d’expression de FTF au cours du développement murin, suggèrent très fortement que FTF exerce aussi des rôles déterminants dans l’embryogenèse suite à la gastrulation et dans la différenciation de plusieurs organes et types cellulaires embryonnaires. Par exemple, la présence de FTF aux arcs branchiaux, dans les cellules de la crête neurale et ultérieurement dans les structures qui en sont dérivées sont l’indication d’un rôle probable de FTF dans le développement et la différenciation de ces structures.

De plus, bien que mes études de ChIP-chip n’aient pas abordé directement le développement embryonnaire, il est notable que certains des gènes cibles de FTF identifiés dans les cellules hépatiques ont des sites d’expression similaires à FTF suggérant l’existence de fonctions communes entre ces gènes cibles et FTF dans ces autres tissus. Par exemple, le gène PDGF est exprimé dans le mésenchyme des glandes salivaires tout comme FTF (Fig. 2.9 G), suggérant ainsi l’existence d’une relation fonctionnelle développementale entre ces deux protéines dans ce tissu [394]. De plus, le gène SFRP5, un antagoniste de la voie WNT/-caténine est coexprimé avec FTF dans l’endoderme viscéral antérieur, région où le bourgeon hépatique sera formé, lors des stades précoces du développement [395]. Le récepteur des WNT, FZD6, est aussi une cible de FTF identifiée par mes études. La voie de signalisation WNT/-caténine est fortement impliquée dans plusieurs processus de prolifération et de différenciation cellulaire au cours de l’embryogenèse et dans le cancer, et est étroitement liée à FTF dans la prolifération et la pluripotence cellulaire [300, 396, 397]. L’interaction fonctionnelle entre FTF et la voie WNT/-caténine ouvre sur de multiples rôles de FTF lors du développement embryonnaire.

Mes études ont détecté la présence de FTF au promoteur de KLF4 qui, en conjonction avec SOX2 et FTF, a la capacité de reprogrammer une cellule somatique en cellule pluripotente [280, 281, 398]. Bien que FTF ne puisse combler l’action de KLF4 lors des essais de reprogrammation, il est possible que l’utilisation d’une protéine FTF super-activée puisse permettre la reprogrammation d’une cellule somatique par l’action concertée de FTF et SOX2 seulement. 109

Les structures et types cellulaires produisant la protéine FTF et les gènes cibles de FTF répertoriés dans mes travaux permettront d’orienter les futures études sur les fonctions de FTF lors de l’embryogenèse.

4.2 Métabolisme hépatique chez l’adulte Les données cumulatives de mes travaux démontrent que FTF est au cœur de la gestion métabolique et énergétique de l’organisme. La caractérisation d’un site de liaison de type DR4 localisé au promoteur FTF permettant la modulation de la transcription du gène Ftf par des stimuli métaboliques, dont le cholestérol et les hormones thyroïdiennes (HT), crée un lien direct entre FTF et l’homéostasie métabolique. En effet, les récepteurs nucléaires LXR et TR, en association avec leur partenaire RXR, ont la capacité d’activer la transcription lorsque liés à un élément DR4, suite à leur activation par leur ligand respectif, soit les oxystérols (un dérivé du cholestérol) et les HT. L’élément de réponse DR4 constitue donc un point de contrôle métabolique majeur du gène Ftf.

En outre, l’expression de FTF dans les tissus du système digestif en développement, et persistant chez l’adulte, est indicatif d’un rôle important de FTF dans la fonction de ces organes et donc de l’homéostasie énergétique globale de l’organisme. En effet, les principaux organes constituant le système digestif, soit les intestins, le pancréas et le foie expriment tous abondamment le récepteur FTF. De plus, les glandes salivaires, impliquées dans les premières étapes de la digestion, et l’hypothalamus, responsable de la gestion de l’appétit, produisent la protéine FTF.

L’identification des cibles directes de FTF par ChIP-chip vient aussi appuyer directement le rôle métabolique/énergétique majeur de FTF dans le foie adulte. En plus d’étayer la fonction de FTF dans le métabolisme du cholestérol par l’identification de nouvelles cibles impliquées dans la synthèse du cholestérol et des acides biliaires, mes études ont permis de prédire des fonctions de FTF dans plusieurs autres voies métaboliques majeures dont la glycolyse, la gluconéogenèse, l’oxydation des acides gras, la lipogenèse, le cycle de Krebs et la phosphorylation oxydative. Bien que le rôle exact de FTF dans ces divers sentiers métaboliques ne peut être établi seulement par ChIP-chip (la liaison de FTF à des promoteurs d’enzymes réciproques [ex. : glycolyse et gluconéogenèse] illustre bien la 110 complexité de l’homéostasie métabolique), la somme de mes résultats et des données de la littérature sur les propriétés du récepteur FTF, la régulation de son promoteur, ses interactions protéiques et sa relation avec les autres récepteurs nucléaires permet d’envisager l’activité métabolique globale de FTF décrite dans les sections suivantes.

4.2.1 Métabolisme des lipides

Le métabolisme lipidique est régi par une panoplie d’enzymes et de transporteurs permettant la production et l’utilisation de lipides exogènes et endogènes. Plusieurs régulateurs transcriptionnels peuvent répondre à divers stimuli métaboliques (ex. : accumulation d’un produit ou d’un substrat) ou hormonaux (ex. : insuline) pour gérer les niveaux de transcription de ces enzymes et transporteurs. Mes données ChIP-chip ajoutent plusieurs candidats à la liste des gènes cibles de FTF impliqués dans la synthèse du cholestérol, des acides biliaires et des lipides, et en détectent d’autres impliqués dans l’oxydation des acides gras (Fig. 3.2 et table S2).

Il est donc de plus en plus évident que FTF s’insère profondément dans le contrôle global du métabolisme lipidique. Tel que mentionné plus haut, l’effet net de FTF, activateur ou répresseur, pourrait dépendre de mécanismes multiples et complexes suivant le contexte métabolique cellulaire, les signalisations hormonales, l’interaction directe entre facteurs ou cofacteurs, ou la structure même du promoteur cible [399]. Néammoins, il est plausible d’envisager la directionnalité de l’action de FTF selon les principales voies de signalisation connues qui croisent celles de FTF.

Signalisation par les oxystérols : le récepteur LXR Le promoteur Ftf peut être activé par LXR, le récepteur d’oxystérols, dont le rôle métabolique a été largement étudié (revu dans [200]). L’activation de LXR par les oxystérols entraîne une élévation de la transcription de gènes codant pour des enzymes responsables de la synthèse des acides biliaires (dont Cyp7a1) et de l’entreposage des lipides, en plus de moduler l’expression de transporteurs permettant le transport et l’excrétion du cholestérol. Plusieurs de ces gènes contrôlés par LXR sont également des 111 cibles transcriptionnelles connues du récepteur FTF [284, 287, 400, 401]. L’élévation du niveau protéique de FTF par LXR permettrait donc une activation plus efficace de leurs cibles transcriptionnelles communes. Une synergie transcriptionnelle est d’ailleurs démontrée entre FTF et LXR, la liaison de FTF provoquant une potentialisation de la réponse de certains promoteurs aux oxystérols via LXR, dont le gène Fas codant pour un enzyme lipogénique majeur [400]. Mes ChIP-chip ont aussi permis d’identifier de nouveaux gènes potentiellement activés par FTF dans la synthèse des acides biliaires (Baat, SULT2A1) et la lipogenèse (Elovl1 et Elovl6). Il sera donc particulièrement intéressant de vérifier la présence d’éléments de réponse à LXR dans les régions régulatrices de ces gènes et l’effet de LXR et des oxystérols sur leur transcription.

Signalisation par les hormones thyroïdiennes : le récepteur TR Plusieurs études ont démontré la capacité des HT à diminuer la quantité de lipides plasmatiques et de lipoprotéines athérogéniques en augmentant la transcription du récepteur des LDL, en augmentant l’absorption hépatique des HDL via une activation directe de la transcription de Sr-b1 et en stimulant la formation d’acides biliaires via CYP7A1 [402, 403]. Or, les gènes Sr-b1 et Cyp7a1 sont des cibles bien caractérisées de FTF qui, lui aussi, est activé par les HT via l’élément DR4 du promoteur que j’ai caractérisé. Ainsi, non seulement l’activation de la transcription de FTF par TR accentuerait et prolongerait l’activation de Sr-b1 et Cyp7a1 induite par les hormones thyroïdiennes, mais aussi FTF et TR pourraient stimuler de façon synergique les promoteurs de leurs cibles communes.

Signalisation par le cholestérol : les protéines SREBP FTF peut interagir physiquement avec la famille de facteurs de transcription SREBP [267]. comprenant trois membres, dont deux sont exprimés dans le foie, soit SREBP1c et SREBP2. Cette interaction entre FTF et les SREBP provoque une répression mutuelle de leur activité transcriptionnelle : l’utilisation de siRNA contre FTF augmente le niveau d’expression de certaines cibles de SREBP1c dont Fas [267]. Donc, selon le contexte, FTF peut soit activer Fas en synergie avec LXR ou le réprimer en interagissant physiquement avec SREBP1c, assurant ainsi un contrôle fin du gène Fas [267, 400]. 112

Réciproquement, l’interaction entre FTF et SREBP2 montre que SREBP2 peut agir à titre de répresseur sur les promoteurs FTF-dépendants de gènes du métabolisme du cholestérol [267, 404]. Lorsque les niveaux de cholestérol sont bas, la présence de FTF sur les promoteurs des gènes cholestérogeniques pourrait donc limiter leur activité en réponse à l’augmentation graduelle de ces niveaux suite à l’activation de SREBP2. La liaison de FTF au promoteur de ces gènes identifiés en ChIP-chip pourrait être indirecte via l’interaction avec SREBP; cependant, la séquence des promoteurs de Lss et Dhcr24 révèle des sites de liaison FTF, dont un site consensus parfait dans le cas de Dhcr24. Comme pour le gène Fas, FTF pourrait donc agir à titre d’activateur ou d’atténuateur de la transcription des gènes de synthèse du cholestérol selon le contexte métabolique de la cellule.

La signalisation par les acides biliaires : les récepteurs FXR et SHP Un autre important récepteur métabolique du réseau FTF est SHP dont la transcription peut-être activée par plusieurs récepteurs nucléaires, dont FTF. L’interaction physique entre SHP et FTF bloque l’activité transcriptionelle de ce dernier [232, 283, 284] formant ainsi une boucle de rétro-régulation, SHP pouvant atténuer sa propre transcription par interaction avec FTF. J’ai également observé une répression du gène Ftf par SHP en tranfections transitoires d’hépatome (résultats non présentés). La capacité de SHP à réprimer directement LXR (qui se lie et active le promoteur Ftf) et la possible autorégulation de FTF sur son promoteur peuvent expliquer aisément ce phénomène [246, 405, 406].

Lorsque les niveaux d’acides biliaires (ligands de FXR) augmentent suite à la transformation du cholestérol en acides biliaires (entre autres par l’enzyme CYP7A1, cible directe de FTF), le récepteur FXR est activé et se lie au promoteur Shp pour en augmenter la transcription, ce qui diminue la synthèse des acides biliaires en réduisant la transcription de Cyp7a1 par l’interaction de SHP avec FTF. Pour éviter l’accumulation subséquente de cholestérol, SHP bloque aussi l’activité de FTF lié aux promoteurs de Sr-b1, un transporteur de cholestérol, et de Hmgcr, enzyme limitant de la synthèse du cholestérol, diminuant donc à la fois l’entrée et la synthèse de cholestérol [407, 408]. Mes ChIP-chip ont permis d’identifier d’autres enzymes potentiellement régulés par FTF dans la voie de synthèse du cholestérol, soit Lss et Dhcr24. La liaison de FTF à ces deux gènes pourrait donc permettre leur répression concomitante par les acides biliaires via FXR-SHP pour 113 empêcher toute accumulation de cholestérol (et des intermédiaires métaboliques) suivant l’arrêt de production des acides biliaires.

Mentionnons que des études réalisées dans notre laboratoire suggèrent que les hormones glucocorticoïdes peuvent activer la transcription de Shp (données non-publiées). Vu l’implication de FTF dans la synthèse intestinale des hormones glucocorticoïdes [409], une boucle rétro-régulatrice FTF/SHP semblable à celle des acides biliaires pourrait aussi moduler la production de ces hormones dans l’intestin.

La présence de FTF sur un promoteur donné fournit donc une porte d’entrée pour la répression par SHP, tel qu’observé pour plusieurs cibles de FTF, et il ne fait aucun doute que la boucle régulatrice formée par FTF et SHP constitue une part significative du rôle de FTF chez l’adulte. La généralité des fonctions potentielles de cette boucle activateur- répresseur dans l’homéostasie lipidique reste à être mieux définie et il sera aussi important de résoudre pourquoi et comment les promoteurs dépendants de FTF ne sont pas tous réprimés par SHP.

4.2.2 Métabolisme du glucose

Le foie est responsable de la gestion des niveaux de glucose de l’organisme : les hépatocytes peuvent entreposer du glucose sous forme de glycogène (glycogénogenèse) et ont la capacité de générer du glucose à partir de diverses molécules (gluconéogenèse). De plus, le glucose peut être utilisé par les hépatocytes via la glycolyse comme source d’énergie mais aussi comme source d’intermédiaires métaboliques permettant la génération de molécules essentielles dont les triglycérides et le cholestérol. En plus d’être impliqué dans la régulation du métabolisme des lipides et du cholestérol, le récepteur FTF lie les promoteurs de gènes cruciaux des sentiers centraux du métabolisme du glucose, notamment Gck, Tpi (glycolyse) et Pck1, G6pc (gluconéogenèse). Étant donné l’opposition fonctionnelle des voies de la glycolyse et de la gluconéogenèse, l’une favorisant la dégradation du glucose et l’autre sa production, l’activation d’une de ces voies métaboliques est normalement accompagnée par la répression de la voie réciproque favorisant ainsi l’efficacité énergétique. Toutefois, des enzymes catabolisant des réactions 114 inverses peuvent être actives simultanément entraînant une perte d’énergie nette au niveau cellulaire [410]; chaque « cycle futile » semble avoir un rôle physiologique particulier permettant de compenser cette perte d’énergie au niveau de l’organisme. FTF se liant à des gènes appartenant et à la glycolyse et à la gluconéogenèse, des mécanismes rigoureux de régulation doivent donc entrer en jeu pour ajuster l’activité du récepteur.

Deux voies signalétiques majeures gouvernent la gluconéogenèse : l’une impliquant le coactivateur PGC-1 et l’autre impliquant la famille des récepteurs nucléaires NR4A [385, 411, 412]. Ces deux voies signalétiques ciblent l’AMP cyclique (AMPc) et pourraient théoriquement utiliser FTF comme intermédiaire pour activer ou réprimer la gluconéogenèse. 

En période de jeûne, la gluconéogenèse est activée par l’action synergique du glucagon et des glucocorticoïdes (revu dans [413]). L’activité inductrice du glucagon est transmise par la voie de l’AMPc et aboutit entre autres à l’augmentation de la transcription du coactivateur PGC-1permettant la coactivation des régulateurs transcriptionnels HNF4 et FOXO1 liés aux promoteurs des gènes Pck1 et G6pc [414, 415] L’activation de la PKA par l’AMPc permettant l’activation du facteur de transcription CREB par phosphorylation est responsable de l’induction de PGC-1Des études portant sur la régulation d’enzymes responsables de la synthèse de stéroïdes par FTF ont démontré que la PKA augmente aussi l’activité transcriptionnelle de FTF par la phosphorylation d’une sérine dans le domaine AF2 de FTF [261, 296, 416]. À l’instar de HNF4 et FOXO1, FTF peut interagir avec PGC-1et est donc possiblement un des facteurs de transcription permettant l’activation de la gluconéogenèse via l’AMPc et PGC-1. De plus, la recherche de partenaires transcriptionnels à permis d’identifier le site de liaison de CREB comme étant associé à la présence du site de liaison de FTF, permettant ainsi une coopération potentielle entre les deux facteurs dans la régulation du métabolisme du glucose.

Le deuxième mécanisme de régulation de la gluconéogenèse implique les récepteurs de la famille NR4A. Comme dans le cas de PGC-1, la transcription des gènes de la famille NR4A est activée par l’axe AMPc/CREB [412]. Les récepteurs de la famille NR4A activent la transcription de plusieurs gènes gluconéogéniques dont G6pc [412]. Étant donné 115 la similarité entre les sites de liaisons des membres des familles NR4A (AAAGGTCA) et NR5A (TCAAGGTCA), dont fait partie FTF, il est plausible que FTF lie les promoteurs des gènes gluconéogéniques via les sites de liaison des récepteurs de la famille NR4A. La liaison à ces sites pourrait provoquer l’activation de ces gènes ou encore compétitionner la liaison des NR4A et ainsi réprimer la transcription. Ces deux situations ont été observées pour des enzymes stéroïdiennes où SF-1 (NR5A1), l’homologue de FTF, active (Cyp17a1) ou réprime (Cyp11b2) la transcription de gènes aussi régulés par les NR4A [417-419].

Une autre famille de récepteurs nucléaires, NR3B (ERR [NR3B1], ERRβ [NR3B2], ERRγ [NR3B3]), partage avec FTF la même séquence de liaison à l’ADN. Plusieurs des cibles de FTF sont d’ailleurs les mêmes que celles identifiées pour la famille NR3B ERR réprime la transcription du gène Pck1 codant pour l’enzyme le plus étudié de la gluconéogenèse, via un mécanisme empêchant le recrutement de PGC-1 au promoteur Pck1 [420]. ERRpourrait aussi exercer son effet répresseur en compétitionnant FTF pour la liaison à l’ADN. D’un autre côté, FTF au promoteur de Pck1 pourrait lui aussi agir à titre de répresseur. Par ailleurs, le gène Pdk4 qui contrôle l’utilisation du glucose ou des acides gras comme source d’énergie, est lui aussi contrôlé par ERRConsidérant la gestion critique des sources d’énergie dans certaines maladies comme le diabète et le cancer, il sera fort intéressant de vérifier si FTF peut contrôler Pdk4, sachant en outre que le promoteur de Pdk3, un paralogue de Pdk4, est lié par FTF. La modulation du métabolisme cellulaire via FTF/PDK pourrait certes être envisagée dans l’approche thérapeutique de pathologies incluant le cancer.

L’inactivation de Shp chez la souris a également démontré l’importance de ce répresseur dans la régulation d’enzymes appartenant aux sentiers de la gluconéogenèse (G6PC, PCK1, PK) et de la glycolyse (GCK, FBP) [422]. Bien que la répression des gènes G6pc et Pck1 par SHP soit attribuéee à son interaction avec HNF4 et FOXO1 respectivement [388, 423], il est plausible que ces gènes puissent aussi être réprimés par l’interaction entre SHP et FTF.

Notons enfin que LXR, que j’ai identifié comme un transactivateur du promoteur FTF, peut être activé in vitro par le glucose via son O-GlcNAcylation [424]. La modulation du 116 promoteur Ftf par l’O-GlcNAcylation de LXR pourrait donc aussi permettre l’ajustement de l’action de FTF dans le métabolisme du glucose.

La présence de FTF aux promoteurs de gènes du métabolisme du glucose lui confère donc une place stratégique dans les mécanismes complexes régissant les niveaux de glucose de l’organisme. Il sera essentiel d’étudier l’effet des niveaux de glucose sur l’expression de FTF et sur sa liaison différentielle aux promoteurs glycolytiques versus gluconéogéniques pour déterminer le rôle exact de FTF dans l’homéostasie du glucose et sur l’activité précise d’enzymes réciproques. Évidemment, la zonation métabolique des hépatocytes (section 1.1.1.4) pourrait expliquer simplement la présence simultanée de FTF à des promoteurs glycolytiques et gluconéogéniques : FTF pourrait activer le sentier de la gluconéogenèse en zone périportale et de la glycolyse en zone péricentrolobulaire.

4.2.3 Métabolisme énergétique L’implication de FTF dans les voies métaboliques de la synthèse et de l’utilisation du glucose et des lipides laisse déjà présager un rôle important de FTF dans l’homéostasie énergétique. Deux voies cataboliques majeures sont utilisées pour la production d’énergie dans la cellule, soit l’oxydation des acides gras et la glycolyse. L’oxydation des acides gras mène à la production d’acétyl-CoA qui, en présence d’oxygène, permettra la production d’énergie (ATP) via le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire. La glycolyse produit du pyruvate à partir du glucose générant rapidement une petite quantité d’énergie. En condition aérobique, le pyruvate est transformé en acétyl-CoA par le complexe de la pyruvate déshydrogénase (PDH), ce qui permettra la production d’énergie par le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire. Le complexe PDH permet le couplage entre la glycolyse et la chaîne respiratoire assurant ainsi la production d’une quantité maximale d’énergie à partir du glucose. Sous certaines conditions, comme en absence d’oxygène, l’énergie provient en majorité de la glycolyse. L’inhibition du complexe PDH par les kinases de la pyruvate déshydrogénase (PDK) prévient la production d’énergie à partir du glucose via le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire [425].

Les protéines de la chaîne respiratoire localisées dans la membrane des mitochondries assurent la production de la majorité de l’ATP cellulaire par phosphorylation oxydative. 117

Mes analyses de ChIP-chip ont permis d’identifier des gènes cibles de FTF codant des sous-unités des différents complexes composant la chaîne respiratoire. Des enzymes du cycle de Krebs ont aussi été identifiés parmi les gènes cibles de FTF, ainsi que VDAC, une protéine associée à la mitochondrie permettant l’entrée et l’expulsion de métabolites mitochondriaux, dont les espèces réactives d’oxygène produites par la respiration cellulaire. De plus, FTF est aussi retrouvé au promoteur Pdhx, une composante importante du complexe PDH, et au promoteur du gène Pdk3, qui code pour une kinase inhibant le complexe PDH. La présence du récepteur FTF à ces promoteurs associe donc aussi fortement FTF à la gestion énergétique et la respiration cellulaire.

En fait, FTF est lié au promoteur de 44 gènes reliés aux mitochondries. Plusieurs régulateurs importants de la biogenèse mitochondriale et de sa capacité oxydative ont un lien étroit avec FTF : le coactivateur PGC-1peut interagir avec FTF les membres de la famille NR3B se fixe au même type de site de liaison que FTF; GABPA, une autre cible de FTF identifiée par mes analyses ChIP-chip et dont le site de liaison est souvent associé à celui de FTF; et CREB, un autre activateur dont le site de liaison est retrouvé sur une fraction des promoteurs liant FTF [374, 426, 427]. Les différentes fonctions énergétiques mitochondriales déjà attribuées à ces régulateurs pourraient être aussi associées au récepteur FTF.

La régulation du promoteur Ftf par TR peut également avoir son rôle dans le métabolisme énergétique. En effet, les HT accroissent les dépenses énergétiques en stimulant la transcription de plusieurs gènes impliqués dans les voies d’oxydation de substrats comme les acides gras [428, 429]. Les HT activent aussi plusieurs gènes impliqués dans le processus de phosphorylation oxydative, soit par des interactions directes entre le récepteur TR et les promoteurs de ces gènes, ou par des mécanismes indirects utilisant des facteurs intermédiaires incluant des activateurs transcriptionnels et des coactivateurs [428, 429]. L’activation de la transcription d’un de ces coactivateurs, PGC-1, est un des mécanismes indirects importants de régulation par les HT [429, 430]. L’activation transcriptionnelle de FTF par les HT (chapitre 2), son interaction physique et fonctionnelle avec le coactivateur PGC-1 et mes résultats de ChIP-chip associant FTF à l’oxydation des acides gras et la phosphorylation oxydative (chapitre 3), impliquent donc fortement le récepteur FTF dans 118 la régulation transcriptionnelle indirecte par les HT. La hausse concomitante des niveaux de transcription de FTF et PGC-1par les HT via TR permettrait d’amplifier la réponse aux HT aux promoteurs liés conjointement par FTF et par TR, ainsi qu’aux promoteurs utilisant PGC-1 comme coactivateur de FTF.

4.2.4 Métabolisme des xénobiotiques Le motif DR4 conservé au promoteur FTF est un site de liaison potentiel des hétérodimères de récepteurs nucléaires PXR/RXR et CAR/RXR [228]. En plus de leur rôle de xénosenseurs, PXR et CAR sont importants dans l’homéostasie métabolique, faisant partie des réseaux régulateurs contrôlant l’inflammation et le métabolisme des lipides, du cholestérol et du glucose [230]. Étant donné l’action de FTF dans ces réseaux, il serait intéressant de vérifier si Ftf peut être activé par PXR, CAR et leurs ligands. En outre, le gène Car fait partie des cibles de FTF nouvellement identifiées dans mon travail. La régulation réciproque de FTF et CAR ajouterait une autre boucle de régulation aux multiples interactions entre les récepteurs nucléaires hépatiques. Certains gènes cibles de FTF sont aussi impliqués dans l’inactivation des espèces réactives d’oxygène et dans l’élimination des acides biliaires, deux types de molécules toxiques pour la cellule. Étant donné l’implication des dommages hépatiques dans la carcinogenèse, le rôle de FTF dans les mécanismes de détoxification pourrait constituer un axe de recherche intéressant.

L’ensemble de mes résultats obtenus chez l’adulte précise considérablement le rôle métabolique de FTF. L’expression de FTF concentrée dans les organes ayant une fonction métabolique ou stéroïdogénique, la présence au promoteur FTF d’un élément conservé de réponse hormonale de type DR4 et l’éventail des gènes métaboliques pouvant être sous le contrôle de FTF laisse nul doute sur sa fonction centrale dans la biogenèse mitochondriale et l’homéostasie métabolique et énergétique adulte. Les interactions entre FTF et divers régulateurs et corégulateurs métaboliques permettraient la régulation fine des fonctions de FTF pouvant aller dans le sens d’une suractivation, ou d’une atténuation ou d’une répression selon le gène ou le sentier métabolique ciblé en fonction de la demande métabolique et énergétique hépatocellulaire. 119

4.3 Cancérogenèse Plusieurs études ont décelé un lien entre le récepteur nucléaire FTF et la cancérogenèse du tractus digestif et de la glande mammaire. Jusqu’à maintenant, le potentiel oncogénique de FTF pourrait être lié à deux voies signalétiques distinctes : dans les cas de cancer du sein, FTF induit la production d’oestrogène par l’activation de la transcription de Cyp19 en plus d’être lui-même une cible transcriptionnelle de ER, amplifiant ainsi le signal hormonal [271, 301, 306]; dans les cas de cancers gastro-intestinaux, FTF active le cycle cellulaire par l’induction de l’expression de la cycline E1 via la signalisation -caténine [300].

Mes études de ChIP-chip sur les Hep3B identifient un nouveau volet à l’implication potentielle de FTF dans la cancérogenèse. En effet, FTF semble impliqué dans l’aspect métabolique de la carcinogenèse permettant l’établissement d’un équilibre énergétique subvenant à une demande en énergie et en matériel cellulaire requis par une prolifération cellulaire amplifiée lors de l’expansion tumorale. Notamment, FTF régule le gène ATF4 qui est important dans le maintien de l’homéostasie métabolique dans les cellules tumorales. FTF régule aussi les gènes CHKA et MAT2A, le premier impliqué dans la synthèse de la phosphatidylcholine, le phospholipide le plus important dans les membranes cellulaires eukaryotes, et le deuxième impliqué dans la formation de S-Adénosylméthionine, une molécule favorisant, entre autre, la prolifération cellulaire (revu dans [431, 432]).

Par ailleurs, les sentiers énergétiques des cellules tumorales sont altérés pour favoriser leur viabilité et leur survie en réponse au microenvironnement [433]. Par exemple, les cellules tumorales peuvent être hautement glycolytiques (dans le cas où la respiration cellulaire est déficiente) ou être favorisées par une augmentation de la respiration cellulaire [434, 435]. Étant donné la présence de FTF sur les promoteurs de gènes glycolytiques et de gènes OXPHOS, il est clair que FTF peut intervenir dans les sentiers métaboliques utilisés par les cellules tumorales afin d’assurer leur survie. Prenons le cas des cellules tumorales hautement glycolytiques (sans OXPHOS), où l’utilisation de la glycolyse comme source d’énergie permet, entre autres, de conserver le pyruvate pour la biosynthèse de molécules nécessaires à la croissance cellulaire [436], d’augmenter l’acidité du microenvironnement favorisant ainsi la dégradation de la matrice extracellulaire et l’invasion tumorale et 120 d’inhiber l’apoptose induite par la mitochondrie [437, 438]. FTF pourrait induire l’activation transcriptionnelle des gènes Gck, Pfkl, Tpi (enzymes de la glycolyse) ainsi que Pdk3 (qui inhibe le couplage glycolyse/OXPHOS) et ainsi favoriser la glycolyse dans les cellules tumorales. La régulation par FTF de l’oncogène c-Myc, un activateur de gènes glycolytiques, pourrait encore augmenter cet effet sur la glycolyse [300, 439, 440].

Ainsi, bien que l’effet transcriptionnel de FTF sur tous ces nouveaux gènes cibles ne soit pas encore déterminé, l’identification de suppresseurs de tumeur, d’oncogènes et de régulateurs énergétiques parmi ses cibles permet certes d’envisager FTF et ses corégulateurs comme cibles thérapeutiques potentielles dans divers types de cancer. Un ligand ou un peptide activateur ou antagoniste spécifique à FTF ou modulant les interactions de FTF avec ses coactivateurs pourrait peut-être bloquer ou atténuer le potentiel oncogénique ou la progression tumorale [441, 442].

 Cibles communes de FTF et C/EBP Nos études sur le promoteur de l’Afp ont démontré que FTF et C/EBP coopèrent pour activer la transcription de l’Afp [242]. De plus, une interaction physique entre FTF et C/EBP a été montrée in vitro dans notre laboratoire. Les deux facteurs ont aussi la capacité de lier et de réguler le promoteur de Ftf [405] en plus du promoteur de l’HBV [314, 362], un virus à tropisme hépatique. Plusieurs autres études suggèrent une coopération entre les deux facteurs sur divers promoteurs. La régulation des promoteurs des gènes stéroïdogéniques STAR et CYP19 utilise le tandem C/EBP-FTF et leur activation via la signalisation dépendante de PKA [261]. Récemment, une nouvelle interaction fonctionnelle a été établie entre les signalisations C/EBP et FTF aux gènes contrôlés par C/EBP dans la réaction de phase aigüe (APR). L’activation des promoteurs par IL-6 et IL- 1B, médiateurs de l’APR, via la signalisation C/EBP peut être inhibée par la surexpression du récepteur FTF, par interférence de FTF sur la signalisation C/EBP et sa liaison à l’ADN [356].

Mes analyses ChIP-chip avec FTF et C/EBP effectuées en parallèle confirment et renforcent le lien fonctionnel entre les deux facteurs de transcription. En effet, la 121 comparaison entre les cibles transcriptionnelles des deux facteurs montre une colocalisation de FTF et C/EBP sur environ 20% des promoteurs liés par FTF, et ce, tant dans le foie adulte qu’embryonnaire. De plus, les deux facteurs se lient aux promoteurs de plusieurs gènes distincts mais faisant partie de sentiers métaboliques communs. L’importance de la coopération entre les C/EBP et d’autres partenaires transcriptionnels pour l’élaboration de programmes de différenciation spécifiques a déjà été exposée [443]. Le chevauchement entre les réseaux transcriptionnels de FTF et C/EBP pourrait donc favoriser l’établissement du programme développemental menant à la différenciation du foie. La coopération des deux protéines dans le métabolisme adulte pourrait contribuer, entre autres, aux mécanismes d’adaptation du foie à des stimuli spécifiques, par exemple ceux provoquant l’APR. De plus, les protéines C/EBP et FTF étant toutes deux liées à la prolifération, à l’inflammation et au métabolisme énergétique, des stratégies axées sur la modulation de leur activité et interaction pourraient être envisagées pour le traitement de désordres métaboliques ou prolifératifs dont le cancer.

4.5 Conclusion générale Les récepteurs nucléaires sont des régulateurs à multiples facettes permettant la gestion de l’homéostasie métabolique et cellulaire des organismes, et sont directement impliqués dans de nombreuses maladies. Diverses fonctions métaboliques (cholestérol, acides biliaires, stéroïdes), prolifératives et de maintien de la pluripotence cellulaire ont été attribuées au récepteur nucléaire FTF au cours des dernières années. L’ensemble de mes résultats élargit le rôle métabolique dominant de FTF chez le mammifère adulte et son rôle développemental dans certains tissus et stades dans l’embryon. Cette conclusion est appuyée par l’expression de FTF dans les organes métaboliques, la régulation de sa transcription par des récepteurs nucléaires métaboliques, ses interactions physiques avec des régulateurs et corégulateurs métaboliques et sa liaison aux promoteurs de gènes métaboliques. De plus, la fonction de FTF est étroitement liée à celle de C/EBPen ce qu’ils partagent plusieurs gènes cibles et participent tous deux à la régulation de voies métaboliques similaires. 122

Dans l’embryon, l’expression transitoire de FTF dans plusieurs structures en développement et ses liens avec la voie -caténine et la signalisation induite par les hormones thyroïdiennes indiquent un rôle de FTF dans la prolifération et/ou la différenciation cellulaire. Des fonctions de FTF dans la prolifération et le maintien de la pluripotence cellulaire ayant déjà été documentées, FTF pourrait être responsable du maintien de l’état prolifératif de cellules progénitrices précédant leur différenciation en un type cellulaire défini, comme par exemple les adipocytes et les chondrocytes.

À l’instar de plusieurs récepteurs nucléaires, il existe donc une dualité fonctionnelle pour le récepteur FTF, pouvant être à la fois responsable de fonctions différenciées et prolifératives. La réponse globale (prolifération ou différenciation) ainsi que l’effet régulateur de FTF (activation ou répression) dépendrait alors du type cellulaire, du stade de développement (cellule progénitrice ou différenciée), de l’état physiopathologique (cellule normale ou tumorale) et du contexte cellulaire (co-activateurs présents, signalisations activées). Le rôle apparemment crucial de FTF dans le métabolisme et l’homéostasie énergétique, la prolifération cellulaire, la différenciation et la cancérogenèse et sa possible régulation par des ligands naturels ou des peptides synthétiques en font aussi une cible de choix pour mieux comprendre et aborder les désordres métaboliques et néoplasiques.

4.6 Perspectives Bien que plusieurs données aient été recueillies à ce jour sur la structure et la fonction du gène Ftf, relativement peu d’études fonctionnelles ont encore été réalisées et ceci laisse une grande place à la spéculation. L’analyse des effets provoqués par l’augmentation ou la diminution de l’activité d’un facteur de transcription permet d’obtenir des informations précises sur ses fonctions : ceci est certes une voie à envisager prioritairement pour approfondir le rôle de FTF.

Plusieurs statégies peuvent être utilisées pour diminuer l’expression de FTF. L’inactivation conditionnelle du gène Ftf (dans un tissu et à un stade spécifique) est l’approche la plus directe. Deux groupes ont généré des souris transgénique (Ftf-/- ) où l’inactivation du gène Ftf s’exécute spécifiquement dans les hépatocytes [295, 444] (et l’épithélium intestinal [295]). Les deux groupes se sont concentrés sur l’effet de l’inactivation de Ftf sur 123 l’expression des gènes responsables du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires. L’utilisation de micropuces d’expression pour identifier les ARN messagers différentiellement produits chez ces souris combinée aux résultats obtenus par ChIP-chip permettrait de clarifier la fonction de FTF dans le développement hépatique et dans le foie adulte en condition physiologique normale. Étant donné le rôle de FTF dans le métabolisme du glucose et dans l’inflammation, il serait aussi intéressant de soumettre ces mêmes souris Ftf-/- à différents stimuli métaboliques ou à des stress inflammatoires comme, par exemple, un sevrage prolongé, une surcharge de glucose ou une injection de LPS ou d’hormones thyroïdiennes et comparer les effets obtenus avec ceux de souris normales. Enfin, ces souris pourraient aussi être utilisées pour l’étude de maladies hépatiques ou gastrointestinales, soit en les soumettant à des diètes définies (ex. diètes à teneur élevée en gras) ou à des composés hépatotoxiques provoquant le développement de maladie hépatiques (ex. :

CCL4); ou encore en croisant des souris Ftf-/- à des souris possédant une altération génétique les rendant vulnérables à l’apparition de maladies hépatiques ou gastrointestinales (ex. souris APC +/-).

L’utilisation de ARNi pour diminuer l’expression de FTF dans divers modèles cellulaires, dont des lignées tumorales, pourra aussi être exploitée pour étudier ses effets spécifiques, par exemple, sur l’activité métabolique ou la tumorogénicité cellulaire. Cette approche a d’ailleurs permis de démontrer l’influence positive de FTF sur la prolifération de cellules tumorales hépatiques [312]. Pour prévenir d’autres activateurs de compenser la perte de FTF, il serait utile de tester un dominant négatif de FTF permettant ainsi de bloquer l’effet transcriptionnel de FTF et celui attribuable à d’autres régulateurs se fixant au même site de liaison. L’utilisation de peptides pouvant lier FTF et interférer avec ses fonctions régulatrices sans perturber sa liaison à l’ADN pourrait aussi être envisagée.

À l’inverse, la surexpression de FTF dans des lignées cellulaires (transfection stable, système d’expression inductible) pourrait distinguer les effets activateurs ou répresseurs de FTF sur l’expression de gènes donnés ou sur l’ensemble des processus transcriptionnels ou cellulaires. Un agoniste peptidique ou lipidique pourrait aussi accroître l’activité globale de FTF et ainsi amplifier ses fonctions cellulaires facilitant leur analyse [442]. 124

L’activation ou la répression sélective de sentiers métaboliques, prolifératifs, inflammatoires ou autres, suivant l’augmentation ou le blocage transcriptionnel de FTF selon la condition expérimentale pourront ensuite être mis à profit thérapeutique. Par exemple, le blocage de fonctions énergétiques cellulaires de FTF permettant la viabilité et la survie des cellules tumorales pourrait être envisagé pour l’élimination de cellules tumorales.

En somme, mes travaux mènent à une meilleure compréhension des fonctions de FTF dans l’homéostasie métabolique chez la souris, en particulier dans le métabolisme énergétique. Des études plus spécifiques sur l’effet transcriptionnel de FTF sur ses divers gènes cibles ainsi que sur son action globale sur la gestion de l’homéostasie métabolique dans diverses conditions physiologiques permettront de spécifier ces fonctions. La forte présence de FTF sur les promoteurs de gènes métaboliques et le développement de moyens de contrôle de son activité, nous permettent d’envisager l’utilisation de ce récepteur comme cible thérapeutique pour le traitement de plusieurs maladies métaboliques ainsi que dans le traitement du cancer.

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155

Données supplémentaires

Liste des figures Figure S 1 : FTF and C/EBP ChIP-chip P-value cut-off determination...... 156 Figure S 2 : Hep3B FTF ChIP-chip experiment ...... 157

Liste des tableaux Table S 1 : Primers used for ChIP-chip validation experiments...... 158 Table S 2 : FTF target genes in adult mouse liver...... 159 Table S 3 : C/EBP target genes in adult mouse liver...... 164 Table S 4 : C/EBP gene targets related to mitochondrion in adult mouse liver ... 171 Table S 5 : FTF and C/EBP common gene targets in adult mouse liver...... 173 Table S 6 : FTF target genes in fœtal mouse liver...... 174 Table S 7 : C/EBP target genes in foetal mouse liver...... 176 Table S 8 : FTF and C/EBP common gene targets in fetal mouse liver...... 185 Table S 9 : FTF common gene targets in fetal and adult mouse liver...... 186 Table S 10 : C/EBP common gene targets in fetal and adult mouse liver...... 186 Table S 11 : FTF target genes in human liver cancer cell line Hep3B...... 191 Table S 12 : FTF targets with circadian rhythm regulated transcription...... 193

156

Figure S 1 : FTF and C/EBP ChIP-chip P-value cut-off determination. ChIP-chip validation was performed by standard ChIPs as explained in Material and Methods. Oligos used for real time PCR measurements for FTF or C/EBP antibody are listed in supplemental Table S1. Positive targets have a 2 fold or more DNA enrichment. 157

Figure S 2 : Hep3B FTF ChIP-chip experiment

A-Gene ontology pie chart categorizing biological functions of FTF Hep3B target genes (P-value ≤ 0,002). B-Hep3B ChIP-chip P-value determination. C-List of oligos used for P-value determination. + Over two fold enrichment in standard ChIP. 158

Table S 1 : Primers used for ChIP-chip validation experiments.

Gene name Forward Reverse

FTF gene targets Shp TGGAAATGGGCATCAATAGA GCATAAACAGGGTCATTAAC Cyp7a1 TATGTCAGCACATGAGGGA ATAGCATTATCTGGCCTTGAA Cycs GCCTATGTACCGGTGTC TGTCCTGGAGCCAATGA Tert CTATCACAGTTGCCAACC ATCATCTCAACTCACGC Calu AGTGGGTGGTGACGTTA CCGCAACGACCTCATTTA Egfr GGACAGTTTGTAACCGAG TCCAGCCAATCTATGCC Foxa2 AGATCCTCCTGAAGTCAT GCCCAAAGCATTTCGTA Cxcl1 AAGTCTGGTGTATTGGC AATTACTACTCAGGGTTACCTA Cd164 AAATGCCTGTTCTGCCA TCGTGCCTCTTCCTATC Stc1 CTCAGCTAGACATCAAGTTC CTTGCTCTTCCACTTCTC Arfrp2 GCAGGAAGGTCAAGTTCA GACACCTTAAAGAAGGCAA Eif3s4 AGATAGGATAGCCTCACAA GGTGGAAAGACAGCTATG Vdac1 CTTCTCTACCGCAAATAGC TGAATGGAGATGCAGAGG Esrra CCTCAAGTGGAGAAGCA AGTGACCTTGAGTTTTGT Ubl4 GGTGGTGTCTCTCAGAT CGAGCTTCAGTCAGGAT Echs1 CATCACTTTGGTGGTGT GGTCAAGAACGAAAGCA Gprk5 ACTGTTAGAACCAGCAC CAGAGCAGCCAGGAAATA Jam4 GTCCGTGTTCATTTCTCTG GGAAGGAGCCTGGATAG Tpd52 GCTTAGAAGGAAACTCTGTAAT ATCTTGTTACATAGTCCATACTG Il15ra AGTCAAGCTCAGGGCTA TTTGAATCCACTCTGCG Il11ra1 TGTACTAATGTGTGACTTCAG GGAACACAGCTTCACTC Orm2 CTTGGCCCTTAACTTGAG AGACCTATTCGTTTATCACC C/ebpa ACTATGCTCCCCACTCA CGCTTTTATAGAGGGTCG Icam1 CGTCCAAAGGCCAGTAA GCAGTGAAACTGAGGCA Mesdc2 GGGTCAAGGTAGTTTGC TTCTCTAGCCAGGGTCT scarb1 CTGGTCTAGGTGGGAAC AGGAGTCCGGAAGAAAG Dbp CCAAATATAGGTCAGTGTCC GCTCAGCCAATGAGATG Epha5 CTACTGTAAGTGTGACTCG CTTTCTCAGAGACCGCTA Rab18 GCATGTACTGGATCTACC GTGCTCAAGGATAGTTGT Mug2 ATGTAGATGTCACATTCCC GTAAATCTTTGCAGCAGG

C/EBP gene targets Dbp CCAAATATAGGTCAGTGTCC GCTCAGCCAATGAGATG Mug2 ATGTAGATGTCACATTCCC GTAAATCTTTGCAGCAGG Echs1 CATCACTTTGGTGGTGT GGTCAAGAACGAAAGCA Ccng2 TCATCAGTTGTTTCTTTCTCAC TCGATGAGAGAATGGAGC Nr1h4 TTGTAACAGCAGAAGCAT ACAATTCTTCCCATATTACTAGAT Serpina6 AGACTGCTACGATCTCC GCATAAGGTCTTGGGTTC Bpgm CTTCAAACAGGTCTCTGG GATGGTAGTTTCGGACATAG Pex7 CAATTTGCGGTCTATAGGT GGCAAACATTTGAATGAAGAA 159

Taf15 TTGTTCTACACCAAGTCTGGA GAGAATCTGCAAGGACATTT Wnt5b GAAATGGTGCTTCTCCT TGAGCACGTAGATACCC Slc34a2 GAGAGGAACATTGTGGAG CACTGAGTCGTCCTACC Cd164 TAGTGTCAGGGTCAGGT AGAGAGGAAGACGGCTA Rnase4 CGGCACCACATGATATAC GTCCATGACTGTCAGGAAGA F2 GAATAGAGATAGGTGTGGCA AACCACAGCACCATTAG Bmp6 TCTGTGTGCTAGAAACCT GACTCTTGCGGGCTATTTA Rora CACACTGGAGTTCAGATG CCAGAAACTGTTTGGCA C4 CAGAAGATGAGGTACACT GTGTGGTGTATGTACGG Dvl2 ACATCTCTGAAGACTATTTCG GATATGGGCTGATGAGTGA Mup3 TCAGAAGAAGGAGTCCG CTGTAACTGAAGTTAGAGTCG Olfr178 AGAGTTGTTGATAGCTTACC ACACTGAAAGAGCAGATG Ptges2 TTCTCCCTGCCATCGTA GCTTAGGAAGTGGCTTG Si ATTGCTGGCAATCTACC CAAGACAGAGTGAAGAGAAT Rpl36 GGAGTTCTGTAAACTGACTTC AGAGTGAGTTCCAGGAC Map3k3 TTGGTCCGTCGTGATTAG CTCTCATTACCAGCCAATAAC Tlr3 TTGATAGTCTTGGCAAGATT AGCAAGTTCTTCTGTGAG Rad51c CTGCTGCTGAGGAAATC TTTGTGTTCACTGTCAGG Gsk3b GATTGCACAGCAGTGAG CACCTATAAAGTGCCATCT

Table S 2 : FTF target genes in adult mouse liver.

GenBank ID Symbol Name Metabolism Lipid NM_011044 Pck1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic NM_007824 Cyp7a1 cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1 NM_053272 Dhcr24 24-dehydrocholesterol reductase NM_009948 Mapk8ip2 mitogen-activated protein kinase 8 interacting protein 2 NM_027881 Osbpl3 oxysterol binding protein-like 3 NM_146006 Lss lanosterol synthase NM_008797 Pcx pyruvate carboxylase NM_028790 Cach cytosolic acetyl-CoA hydrolase NM_016772 Ech1 enoyl coenzyme A hydratase 1, peroxisomal NM_008175 Grn granulin NM_212442 Sah SA rat hypertension-associated homolog NM_011951 Mapk14 mitogen activated protein kinase 14 NM_053200 Ces3 carboxylesterase 3 NM_019422 Elovl1 elongation of very long chain fatty acids like 1 NM_007382 Acadm acetyl-Coenzyme A dehydrogenase, medium chain NM_053119 Echs1 enoyl Coenzyme A hydratase, short chain, 1, mitochondrial NM_023627 Isyna1 myo-inositol 1-phosphate synthase A1 NM_007760 Crat carnitine acetyltransferase NM_010023 Dci dodecenoyl-Coenzyme A delta isomerase NM_130450 Elovl6 ELOVL family member 6, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_007519 Baat bile acid-Coenzyme A: amino acid N-acyltransferase

Carbohydrate NM_010292 Gck Glucokinase NM_008407 Itih3 inter-alpha trypsin inhibitor, heavy chain 3 NM_007608 Car5a carbonic anhydrase 5a, mitochondrial NM_008061 G6pc Glucose-6-phosphatase, catalytic NM_008743 Nthl1 nth (endonuclease III)-like 1 (E.coli) NM_175015 Atp5g3 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, Subunit c, isoform 3 NM_008549 Man2a1 mannosidase 2, alpha 1 NM_026444 Cs citrate synthase

Amino acid NM_016668 Bhmt Betaine-homocysteine methyltransferase NM_016978 Oat ornithine aminotransferase 160

NM_010324 Got1 glutamate oxaloacetate transaminase 1, soluble NM_007912 Egfr epidermal growth factor receptor NM_145829 Nags N-acetylglutamate synthase NM_144940 BC022133 cDNA sequence BC022133 NM_011690 Vars2 valyl-tRNA synthetase 2 NM_080845 Ftcd formiminotransferase cyclodeaminase NM_138745 Mthfd1 methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NADP+ dependent),

DNA NM_009354 Tert telomerase reverse transcriptase NM_178196 Hist1h2bg Histone 1, H2bg NM_178187 Hist1h2ae Histone 1, H2ae NM_178188 Hist1h2ad Histone 1, H2ad NM_178195 Hist1h2bf Histone 1, H2bf NM_178198 Hist1h2bj Histone 1, H2bj BC065803 Hist1h2ag Histone 1, H2ag

RNA NM_026440 Rnmt RNA (guanine-7-) methyltransferase NM_026737 Phf5a PHD finger protein 5A NM_178576 Cpsf4 cleavage and polyadenylation specific factor 4 NM_013536 Grcc2f gene rich cluster, C2f gene NM_015782 Snrpa small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A NM_026554 Ncbp2 Nuclear cap binding protein subunit 2

Other NM_022434 Cyp4f14 cytochrome P450, family 4, subfamily f, polypeptide 14 NM_016774 Atp5b ATP synthase, H+ transporting mitochondrial F1 complex, beta subunit NM_145460 BC019806 cDNA sequence BC019806 NM_172254 RIKEN cDNA 2610018L09 gene BC085235 Hbs1l Hbs1-like (S. cerevisiae) NM_011675 Umpk Uridine monophosphate kinase NM_020282 Nqo2 NAD(P)H dehydrogenase, quinone 2 NM_173743 RIKEN cDNA 2310016F22 gene NM_177564 BC022224 cDNA sequence BC022224 NM_145478 Pim3 proviral integration site 3 NM_028779 Ampd2 adenosine monophosphate deaminase 2 (isoform L) XM_289885 RIKEN cDNA 0610005A07 gene NM_201408 Dhps deoxyhypusine synthase NM_176917 RIKEN cDNA A730091E08 gene NM_027857 RIKEN cDNA 0610006H10 gene NM_020615 Atp5c1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex,gamma polypeptide 1 NM_173763 BC037135 cDNA sequence BC037135 NM_020577 RIKEN cDNA 2310045H08 gene NM_177460 Slc41a3 solute carrier family 41, member 3 NM_025784 RIKEN cDNA 1700112N14 gene NM_009285 Stc1 stanniocalcin 1 NM_021450 Trpm7 transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 7 NM_007506 Atp5g1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, Subunit c (subunit 9), isoform 1 NM_013908 Fbxw5 F-box and WD-40 domain protein 5 NM_007750 Cox8a cytochrome c oxidase, subunit VIIIa NM_026947 RIKEN cDNA 1810022C23 gene NM_016876 Eif3s4 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 4 (delta) NM_145405 Ubl4 ubiquitin-like 4 NM_175094 Pdhx pyruvate dehydrogenase complex, component X NM_009479 Uros uroporphyrinogen III synthase NM_024255 RIKEN cDNA 2610207I16 gene NM_028500 Calr3 calreticulin 3 NM_133916 Eif3s9 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 9 (eta)

Transport NM_007618 Serpina6 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A, member 6 NM_007470 Apod apolipoprotein D NM_027400 Lman1 lectin, mannose-binding, 1 NM_146013 Sec14l4 SEC14-like 4 (S. cerevisiae) NM_177333 Sec6l1 SEC6-like 1 (S. cerevisiae) NM_013900 Mfi2 Antigen p97 identified by monoclonal antibodies 133.2 and 96.5 NM_026183 RIKEN cDNA 1300013J15 gene NM_172289 Slc36a4 solute carrier family 36 (proton/amino acid symporter), member 4 161

NM_025516 Sdbcag84 Serologically defined breast cancer antigen 84 BC061166 Mug2 Murinoglobulin 2 (Mug2), mRNA NM_025842 Vps28 vacuolar protein sorting 28 (yeast) NM_133668 Slc25a3 solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, phosphate carrier), member 3 NM_008168 Grik5 glutamate receptor, ionotropic, kainate 5 (gamma 2) NM_146076 Slc26a8 solute carrier family 26, member 8 NM_145368 RIKEN cDNA C730036D15 gene NM_011591 Timm17b translocator of inner mitochondrial membrane 17b NM_172758 BC031853 cDNA sequence BC031853 NM_146206 Tpcn2 two pore segment channel 2 NM_198103 AI414418 expressed sequence AI414418 NM_144856 Slc22a7 solute carrier family 22 (organic anion transporter), member 7 NM_024174 Mrps23 mitochondrial ribosomal protein S23 NM_011994 Abcd2 ATP-binding cassette, sub-family D (ALD), member 2 NM_021294 Dbil5 diazepam binding inhibitor-like 5 NM_007834 Dscr3 Down syndrome critical region gene 3

Transcription NM_011566 Tead3 TEA domain family member 3 NM_013608 Naca nascent polypeptide-associated complex alpha polypeptide NM_013914 Snai3 snail homolog 3 (Drosophila) NM_177712 RIKEN cDNA C330011K17 gene NM_019478 Pqbp1 polyglutamine binding protein 1 BC058978 Nr1i3 nuclear receptor subfamily 1, group I, member 3 NM_139149 Fus fusion, derived from t(12;16) malignant liposarcoma (human) NM_030251 Abtb1 Ankyrin repeat and BTB (POZ) domain containing 1 BC060118 Zfp142 zinc finger protein 142 NM_026423 RIKEN cDNA 2410018C20 gene NM_133971 Ankrd10 Ankyrin repeat domain 10 NM_145632 Polr2h polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide H NM_207215 Phr1 pam, highwire, rpm 1 NM_007953 Esrra estrogen related receptor, alpha NM_011764 Zfp90 zinc finger protein 90 NM_008065 Gabpa GA repeat binding protein, alpha NM_016683 Zfp95 zinc finger protein 95 NM_011749 Zfp148 zinc finger protein 148 NM_025999 Rnf141 ring finger protein 141 NM_013843 Zfp53 zinc finger protein 53

Development NM_008994 Pxmp3 peroxisomal membrane protein 3 NM_008707 Nmt1 N-myristoyltransferase 1 NM_134141 RIKEN cDNA 2810413N20 gene NM_008162 Gpx4 glutathione peroxidase 4 NM_010446 Foxa2 forkhead box A2 NM_013808 Csrp3 cysteine and glycine-rich protein 3 NM_015767 Ttpa tocopherol (alpha) transfer protein NM_026570 Gas41 Glioma-amplified sequence-41 NM_008927 Map2k1 mitogen activated protein kinase kinase 1 NM_008495 Lgals1 lectin, galactose binding, soluble 1 NM_013465 Ahsg alpha-2-HS-glycoprotein NM_145925 Pttg1ip pituitary tumor-transforming 1 interacting protein NM_010902 Nfe2l2 nuclear factor, erythroid derived 2, like 2 NM_013614 Odc ornithine decarboxylase, structural NM_027115 RIKEN cDNA 2310009E07 gene NM_018871 Ywhag 3-monooxgenase/tryptophan 5-monooxgenase activation protein, gamma polypeptide NM_010463 Hoxc12 Homeo box C12 NM_008104 Gcm2 glial cells missing homolog 2 (Drosophila) NM_022987 Zic5 zinc finger protein of the cerebellum 5

Cell cycle NM_008176 Cxcl1 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 NM_028232 Sgol1 shugoshin-like 1 (S. pombe) NM_019757 Fzr1 fizzy/cell division cycle 20 related 1 (Drosophila) NM_011647 Tsc2 tuberous sclerosis 2 NM_013917 Pttg1 pituitary tumor-transforming 1 NM_007635 Ccng2 cyclin G2 NM_175155 RIKEN cDNA 2500002E12 gene 162

NM_007836 Gadd45a Growth arrest and DNA-damage-inducible 45 alpha NM_025392 Bccip BRCA2 and CDKN1A interacting protein NM_011809 Ets2 E26 avian leukemia oncogene 2, 3' domain NM_010786 Mdm2 transformed mouse 3T3 cell double minute 2

Response to stress NM_010481 Hspa9a heat shock protein, A NM_009778 C3 complement component 3 NM_080844 Serpinc1 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade C (antithrombin), member 1 NM_010775 Mbl1 mannose binding lectin, liver (A) NM_025834 Proz Protein Z, vitamin K-dependent plasma glycoprotein NM_011694 Vdac1 Voltage-dependent anion channel 1 NM_009243 Serpina1a serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A, member 1a NM_026508 RIKEN cDNA 2410002K23 gene NM_007798 Ctsb cathepsin B NM_145956 C6.1A c6.1a protein NM_025541 Asf1a ASF1 anti-silencing function 1 homolog A (S. cerevisiae) NM_028042 Ckn1 Cockayne syndrome 1 homolog (human) NM_018808 Dnajb1 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 1

Apoptosis NM_007808 Cycs cytochrome c, somatic NM_011585 Tia1 cytotoxic granule-associated RNA binding protein 1 NM_144917 RIKEN cDNA C330008I15 gene NM_019735 Mmrp19 monocyte macrophage 19

Proteolysis NM_011638 Tfrc transferrin receptor NM_019447 Hgfac hepatocyte growth factor activator NM_173010 Ube3a ubiquitin protein ligase E3A NM_019517 Bace2 beta-site APP-cleaving enzyme 2 NM_011046 Furin furin (paired basic amino acid cleaving enzyme) NM_011883 Rnf13 ring finger protein 13 NM_174849 RIKEN cDNA 9430057O19 gene NM_008906 Ppgb protective protein for beta-galactosidase

Signal transduction NM_007443 Ambp alpha 1 microglobulin/bikunin NM_013867 Bcar3 breast cancer anti-estrogen resistance 3 NM_021345 AW742319 expressed sequence AW742319 NM_027687 Cabyr Calcium-binding tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated NM_007699 Chrm4 Cholinergic receptor, muscarinic 4 (Chrm4), mRNA NM_025931 Rabl4 RAB, member of RAS oncogene family-like 4 BC080799 Snx14 Sorting nexin 14 NM_177383 Gpr21 G protein-coupled receptor 21 NM_011065 Per1 period homolog 1 (Drosophila) NM_008066 Gabra2 Gamma-aminobutyric acid (GABA-A) receptor, subunit alpha 2 NM_146997 Olfr178 olfactory receptor 178 NM_027000 Gtpbp4 GTP binding protein 4 NM_010308 Gnao guanine nucleotide binding protein, alpha o NM_007531 Bcap37 B-cell receptor-associated protein 37 NM_018869 Gprk5 G protein-coupled receptor kinase 5 NM_020008 Clecsf12 C-type lectin, superfamily member 12 NM_133836 Il15ra interleukin 15 receptor, alpha chain NM_028964 RIKEN cDNA 4933437K13 gene NM_010367 Baiap1 BAI1-associated protein 1 NM_027141 Tce1 T-complex expressed gene 1 NM_008727 Npr1 natriuretic peptide receptor 1

Others NM_144791 MGC6357 hypothetical protein MGC6357 NM_019658 Shoc2 soc-2 (suppressor of clear) homolog (C. elegans) BC064128 Prdm10 PR domain containing 10 XM_129335 RIKEN cDNA 2700078E11 gene NM_133991 Ftsj Ftsj homolog (E. coli) NM_011366 Sh3d4 SH3 domain protein 4 BC061058 RIKEN cDNA 1700008F21 gene NM_198656 Gm1010 gene model 1010, (NCBI) 163

NM_013747 Golga5 golgi autoantigen, golgin subfamily a, 5 NM_025849 RIKEN cDNA 3110001D03 gene NM_153794 RIKEN cDNA 4933403F05 gene BC020150 RIKEN cDNA 4930520O04 gene NM_173735 RIKEN cDNA 2310044G17 gene NM_145218 Wbscr17 Williams-Beuren syndrome chromosome region 17 homolog (human) NM_001004185 Whdc1 MKIAA1971 protein NM_026452 RIKEN cDNA 2310005O14 gene NM_027419 RIKEN cDNA 2810408A11 gene NM_025538 RIKEN cDNA 2310045B01 gene NM_022324 Sdf2l1 stromal cell-derived factor 2-like 1 NM_133996 D10Ucla2 DNA segment, Chr 10, University of California at Los Angeles 2 NM_029844 RIKEN cDNA 1110025G12 gene NM_134130 Abhd3 abhydrolase domain containing 3 XM_135953 RIKEN cDNA 2410003J06 gene BC032970 RIKEN cDNA 2810026P18 gene NM_007594 Calu calumenin NM_053265 RIKEN cDNA 4930433N12 gene NM_019734 Asah1 N-acylsphingosine amidohydrolase 1 NM_025536 Commd5 COMM domain containing 5 NM_197945 Prosapip1 ProSAPiP1 protein XM_194410 RIKEN cDNA 2510019J09 gene NM_183312 Dmn desmuslin NM_011014 Oprs1 opioid receptor, sigma 1 NM_178398 RIKEN cDNA 2510001I10 gene NM_133898 RIKEN cDNA B230342M21 gene NM_013490 Chka Choline kinase alpha NM_177232 RIKEN cDNA A930033H14 gene NM_009266 Sephs2 selenophosphate synthetase 2 NM_026530 RIKEN cDNA E130307M08 gene NM_175239 RIKEN cDNA 2810410L24 gene NM_201375 Hrg histidine-rich glycoprotein NM_026159 RIKEN cDNA 0610039N19 gene NM_026367 Gpatc2 G patch domain containing 2 NM_028848 RIKEN cDNA 4930513F16 gene XM_130188 RIKEN cDNA 1700010A17 gene NM_026703 Ndufa8 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 8 NM_026519 RIKEN cDNA 2610318K02 gene NM_173734 RIKEN cDNA A930025J12 gene NM_030259 BC003324 cDNA sequence BC003324 NM_025280 Kin antigenic determinant of rec-A protein NM_030100 RIKEN cDNA A030010B05 gene NM_016898 Cd164 CD164 antigen NM_024445 Tsnaxip1 Translin-associated factor X (Tsnax) interacting protein 1 NM_145824 RIKEN cDNA 4432417N03 gene BC062898 RIKEN cDNA 1110034A24 gene NM_175286 RIKEN cDNA C430004E15 gene BC085253 Cdcp1 CUB domain containing protein 1, mRNA (cDNA clone IMAGE:3709937) NM_026494 RIKEN cDNA 6330579B17 gene NM_027865 Tmem25 transmembrane protein 25 NM_011879 Ik IK cytokine NM_010885 Ndufa2 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 2 NM_145540 C77668 expressed sequence C77668 NM_030692 Sacm1l SAC1 (supressor of actin mutations 1, homolog)-like (S. cerevisiae) NM_172876 RIKEN cDNA D930035B09 gene NM_175229 Srrm2 serine/arginine repetitive matrix 2 NM_201239 Rnase4 ribonuclease, RNase A family 4 NM_015817 Ppap2c phosphatidic acid phosphatase type 2c BC083097 NM_019988 Gbl G protein beta subunit-like NM_198027 AI839550 expressed sequence AI839550 NM_033075 DNA segment, Chr 17, human D6S56E 5 XM_130127 RIKEN cDNA 1700013L23 gene NM_026634 RIKEN cDNA A930018P22 gene NM_178686 AU016693 expressed sequence AU016693 164

NM_172595 Arfrp2 ADP-ribosylation factor related protein 2 NM_173427 RIKEN cDNA B230308G19 gene NM_028898 RIKEN cDNA 4932417H02 gene XM_127067 - - NM_178727 RIKEN cDNA D630039A03 gene NM_026240 RIKEN cDNA 9130427A09 gene NM_173757 Mrps27 mitochondrial ribosomal protein S27 XM_127497 Ptcd2 pentatricopeptide repeat domain 2 NM_013753 Pald Paladin NM_007962 Eva epithelial V-like antigen NM_178896 AI836376 expressed sequence AI836376 NM_026791 Fbxw9 F-box and WD-40 domain protein 9 NM_146067 RIKEN cDNA C530044N13 gene NM_177367 Gemin4 gem (nuclear organelle) associated protein 4 NM_028131 RIKEN cDNA 2610510J17 gene NM_026844 RIKEN cDNA 2310061C15 gene NM_009412 Tpd52 tumor protein D52 NM_019822 Adrm1 adhesion regulating molecule 1 XM_284425 RIKEN cDNA 2810422J05 gene BC066996 Gal3st3 galactose-3-O-sulfotransferase 3 BC080744 Hook2 hook homolog 2 (Drosophila) NM_172785 hypothetical protein D730019B10 NM_027250 RIKEN cDNA 2010305A19 gene NM_138583 DNA segment, Chr 16, human D22S680E, expressed NM_029077 Trim14 tripartite motif-containing 14 NM_138748 Ppp2r4 Protein phosphatase 2A, regulatory subunit B (PR 53) NM_028170 RIKEN cDNA 1700030K09 gene NM_183107 RIKEN cDNA 4930474M22 gene NM_172541 Tmpit transmembrane protein induced by tumor necrosis factor alpha NM_172888 Svs1 seminal vesicle secretion 1 NM_010839 Mtcp1 Mature T-cell proliferation 1 NM_024290 Tnfrsf23 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 23 NM_030688 Il1rapl2 interleukin 1 receptor accessory protein-like 2 NM_153508 Clstn3 calsyntenin 3 NM_175310 Aprin androgen-induced proliferation inhibitor NM_025320 RIKEN cDNA 0610012G03 gene NM_029083 Ddit4 DNA-damage-inducible transcript 4 NM_134007 DNA segment, Chr 10, ERATO Doi 214, expressed NM_145599 BC004056 cDNA sequence BC004056 NM_011956 Nubp2 nucleotide binding protein 2

Table S 3 : C/EBP target genes in adult mouse liver.

GenBank ID Symbol Name Metabolism Lipid NM_008819 Pemt phosphatidylethanolamine N-methyltransferase NM_011044 Pck1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic NM_053115 Acox2 acyl-Coenzyme A oxidase 2, branched chain NM_028790 Cach cytosolic acetyl-CoA hydrolase NM_025826 Acadsb acyl-Coenzyme A dehydrogenase, short NM_030676 Nr5a2 nuclear receptor subfamily 5, group A, member 2 NM_030210 Aacs acetoacetyl-CoA synthetase NM_007997 Fdxr ferredoxin reductase NM_008775 Pafah1b2 platelet-activating factor acetylhydrolase, isoform 1b, alpha2 subunit NM_010476 Hsd17b7 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7 NM_053119 Echs1 enoyl Coenzyme A hydratase, short chain, 1, mitochondrial NM_013839 Nr1h3 nuclear receptor subfamily 1, group H, member 3 NM_133808 Hdlbp high density lipoprotein (HDL) binding protein NM_016772 Ech1 enoyl coenzyme A hydratase 1, peroxisomal NM_008959 Ptdss1 phosphatidylserine synthase 1 NM_011169 Prlr prolactin receptor NM_009108 Nr1h4 nuclear receptor subfamily 1, group H, member 4 NM_133774 Stard4 StAR-related lipid transfer (START) domain containing 4 165

NM_008822 Pex7 peroxisome biogenesis factor 7 NM_145401 RIKEN cDNA 2410051C13 gene NM_019422 Elovl1 elongation of very long chain fatty acids (FEN1/Elo2, SUR4/Elo3, yeast)-like 1 NM_130864 Acaa1 Acetyl-Coenzyme A acyltransferase 1 NM_133880 Pafah2 platelet-activating factor acetylhydrolase 2 NM_080436 Rdh1 Retinal dehydrogenase 1 (all trans) NM_007981 Acsl1 acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 NM_130450 Elovl6 ELOVL family member 6, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_053200 Ces3 carboxylesterase 3 NM_023114 Apoc3 apolipoprotein C-III NM_011609 Tnfrsf1a tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1a

Carbohydrate NM_007446 Amy1 amylase 1, salivary NM_007498 Atf3 activating transcription factor 3 NM_173347 RIKEN cDNA 9230112O05 gene NM_025848 Sdhd succinate dehydrogenase complex, subunit D, integral membrane protein NM_010938 Nrf1 nuclear respiratory factor 1 NM_028636 Man2c1 mannosidase, alpha, class 2C, member 1 NM_007563 Bpgm 2,3-bisphosphoglycerate mutase NM_173371 H6pd hexose-6-phosphate dehydrogenase (glucose 1-dehydrogenase) NM_008195 Gys3 glycogen synthase 3, brain NM_028347 Neil1 nei endonuclease VIII-like 1 (E. coli) NM_010292 Gck Glucokinase NM_008618 Mdh1 malate dehydrogenase 1, NAD (soluble) NM_175380 DNA segment, Chr 9, ERATO Doi 660, expressed NM_010957 Ogg1 8-oxoguanine DNA-glycosylase 1

Amino acid NM_010324 Got1 glutamate oxaloacetate transaminase 1, soluble NM_013547 Hgd homogentisate 1, 2-dioxygenase NM_172015 Iars isoleucine-tRNA synthetase NM_146217 Aars alanyl-tRNA synthetase NM_008010 Fgfr3 fibroblast growth factor receptor 3 NM_010401 Hal histidine ammonia lyase NM_144940 BC022133 cDNA sequence BC022133 NM_00100391 3 Mars methionine-tRNA synthetase NM_144795 Pycr1 pyrroline-5-carboxylate reductase 1 NM_172644 RIKEN cDNA 5830468K18 gene NM_019546 Prodh2 Proline dehydrogenase (oxidase) 2

DNA NM_178197 Hist1h2bh histone 1, H2bh NM_013548 Hist1h3f histone 1, H3f NM_009354 Tert telomerase reverse transcriptase NM_177619 Myst2 MYST histone acetyltransferase 2 NM_172281 RIKEN cDNA 1700120K04 gene XM_130416 RIKEN cDNA 2810418N01 gene NM_011304 Ruvbl2 RuvB-like protein 2 NM_033596 Hist2h4 histone 2, H4 NM_145073 Hist1h3g histone 1, H3g NM_024184 Asf1b ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae) NM_009408 Top1 topoisomerase (DNA) I NM_019729 Usp8 ubiquitin specific protease 8 NM_007626 Cbx5 chromobox homolog 5 (Drosophila HP1a) NM_019957 Dnase2b deoxyribonuclease II beta

RNA NM_026623 Cpsf5 cleavage and polyadenylation specific factor 5 NM_133242 Rnpc2 RNA-binding region (RNP1, RRM) containing 2 NM_133671 U2af2 U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary factor (U2AF) 2 NM_020587 Sfrs4 splicing factor, arginine/serine-rich 4 (SRp75) NM_133840 AI462438 expressed sequence AI462438 NM_024183 Fip1l1 FIP1 like 1 (S. cerevisiae) NM_153092 Nupl2 nucleoporin like 2 NM_178576 Cpsf4 cleavage and polyadenylation specific factor 4 NM_009193 Slbp stem-loop binding protein NM_177301 Fbxo17 F-box only protein 17 166

BC080675 NM_175389 Rg9mtd2 RNA (guanine-9-) methyltransferase domain containing 2 BC035953 RIKEN cDNA 3010015K02 gene

Other NM_178767 RIKEN cDNA A530016O06 gene NM_019811 Acas2 acetyl-Coenzyme A synthetase 2 (ADP forming) NM_011287 Rpl10a ribosomal protein L10A NM_019792 Cyp3a25 cytochrome P450, family 3, subfamily a, polypeptide 25 NM_144869 BC021614 cDNA sequence BC021614 NM_177767 RIKEN cDNA 4930415J21 gene NM_008907 Ppia peptidylprolyl isomerase A NM_144866 Etf1 eukaryotic translation termination factor 1 NM_026030 Eif2s2 eukaryotic translation initiation factor 2, subunit 2 (beta) NM_145537 RIKEN cDNA 9530090G24 gene BC085235 Hbs1l Hbs1-like (S. cerevisiae) NM_028779 Ampd2 adenosine monophosphate deaminase 2 (isoform L) NM_198164 RIKEN cDNA 2700084L06 gene NM_025334 RIKEN cDNA 0610040B21 gene NM_133653 Mat1a methionine adenosyltransferase I, alpha BC046911 RIKEN cDNA 4833442J19 gene NM_007597 Canx Calnexin NM_145460 BC019806 cDNA sequence BC019806 NM_172254 RIKEN cDNA 2610018L09 gene NM_009467 Ugt2b5 UDP-glucuronosyltransferase 2 family, member 5 NM_023383 Aadac arylacetamide deacetylase (esterase) NM_133657 Cyp2a12 cytochrome P450, family 2, subfamily a, polypeptide 12 NM_025381 Atp6v1f ATPase, H+ transporting, V1 subunit F NM_011660 Txn1 thioredoxin 1 NM_009448 Tuba6 Tubulin, alpha 6 NM_010442 Hmox1 heme oxygenase (decycling) 1 NM_029272 Ndufs7 NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 7 NM_013760 Dnajb9 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 9 NM_008917 Ppt1 palmitoyl-protein thioesterase 1 NM_013632 Pnp Purine-nucleoside phosphorylase NM_010498 Ids iduronate 2-sulfatase NM_009945 Cox7a2 cytochrome c oxidase, subunit VIIa 2 NM_078479 Mrps21 mitochondrial ribosomal protein S21 NM_177382 Cyp2r1 cytochrome P450, family 2, subfamily r, polypeptide 1 NM_009121 spermidine/spermine N1-acetyl transferase 1 NM_028500 Calr3 calreticulin 3 NM_010004 Cyp2c40 cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 40 NM_009996 Cyp24a1 cytochrome P450, family 24, subfamily a, polypeptide 1 NM_019777 Ikbke inhibitor of kappaB kinase epsilon NM_026007 Eef1g eukaryotic translation elongation factor 1 gamma BC057082 Rnf123 ring finger protein 123 NM_144845 AI313915 expressed sequence AI313915 NM_023136 Dtymk deoxythymidylate kinase NM_198636 RIKEN cDNA 8430416H19 gene NM_011979 Vnn3 vanin 3 NM_027287 Dnajb4 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 4 NM_009997 Cyp2a4 cytochrome P450, family 2, subfamily a, polypeptide 4 NM_173740 Maoa monoamine oxidase A NM_013768 Skb1 SKB1 homolog (S. pombe) NM_008952 Pipox pipecolic acid oxidase NM_009474 Uox urate oxidase

Transport NM_146118 Slc25a25 solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, phosphate carrier),member 25 NM_198223 Aspscr1 alveolar soft part sarcoma chromosome region, candidate 1 (human) NM_008646 Mug2 murinoglobulin 2 NM_015728 Slc33a1 solute carrier family 33 (acetyl-CoA transporter), member 1 NM_021433 Stx6 syntaxin 6 NM_011076 Abcb1a ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1A NM_173015 RIKEN cDNA 5033413H12 gene NM_145368 RIKEN cDNA C730036D15 gene NM_053173 Kifc5a Kinesin family member C5A 167

NM_021538 Cope coatomer protein complex, subunit epsilon NM_013897 Timm8b translocase of inner mitochondrial membrane 8 homolog b (yeast) NM_011397 Slc23a1 solute carrier family 23 (nucleobase transporters), member 1 NM_027052 Slc38a4 solute carrier family 38, member 4 NM_007618 Serpina6 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A, member 6 NM_010749 M6pr mannose-6-phosphate receptor, cation dependent NM_146013 Sec14l4 SEC14-like 4 (S. cerevisiae) NM_153150 Slc25a1 solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, citrate transporter), member 1 NM_011387 Slc10a1 solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 1 NM_025516 Sdbcag84 serologically defined breast cancer antigen 84 BC061166 Mug2 Murinoglobulin 2 (Mug2), mRNA NM_028369 RIKEN cDNA 2810468K17 gene BC080204 Vti1b Vesicle transport through interaction with t-SNAREs 1B homolog NM_172758 BC031853 cDNA sequence BC031853 NM_017371 Hpxn Hemopexin NM_025828 Lman2 lectin, mannose-binding 2 NM_011929 Clcn6 chloride channel 6 NM_145543 Mclc Mid-1-related chloride channel 1 NM_172841 Slco5a1 solute carrier organic anion transporter family, member 5A1 NM_016810 Gosr1 golgi SNAP receptor complex member 1 NM_009714 Asgr1 asialoglycoprotein receptor 1

Transcription NM_023184 Klf15 Kruppel-like factor 15 NM_016974 Dbp D site albumin promoter binding protein NM_008097 Gcdh glutaryl-Coenzyme A dehydrogenase NM_133879 Hkr3 GLI-Kruppel family member HKR3 NM_133801 RIKEN cDNA 2810405L04 gene NM_026107 Zfp535 zinc finger protein 535 NM_025364 RIKEN cDNA 1110005A23 gene NM_011566 Tead3 TEA domain family member 3 NM_183167 AI987944 Expressed sequence AI987944 NM_010192 Fem1a feminization 1 homolog a (C. elegans) NM_020262 Gm1957 gene model 1957, (NCBI) NM_021307 Zfp112 zinc finger protein 112 BC068174 Zfp187 zinc finger protein 187 NM_027213 Med6 mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 6 homolog (yeast) NM_008250 Hlx H2.0-like homeo box gene NM_181274 RIKEN cDNA 1200003I07 gene BC061235 Pcnp PEST-containing nuclear protein NM_010753 Mxd4 Max dimerization protein 4 NM_145547 Zfp189 zinc finger protein 189 NM_134134 RIKEN cDNA A630042L21 gene NM_009281 Zfp143 zinc finger protein 143 NM_027017 RIKEN cDNA 3300002I08 gene NM_009191 Skd3 suppressor of K+ transport defect 3 NM_207215 Phr1 pam, highwire, rpm 1 NM_019512 Tcerg1 transcription elongation regulator 1 (CA150) NM_144787 Jmjd2c jumonji domain containing 2C NM_057172 DNA segment, Chr 3, ERATO Doi 330, expressed NM_016861 Pdlim1 PDZ and LIM domain 1 (elfin) NM_172132 Jmjd2b jumonji domain containing 2B

Development NM_011723 Xdh xanthine dehydrogenase NM_008707 Nmt1 N-myristoyltransferase 1 NM_054098 Abcb1a ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1A NM_008877 Plg Plasminogen NM_010813 Mnt binding protein NM_013465 Ahsg alpha-2-HS-glycoprotein NM_017462 Polg polymerase (DNA directed), gamma NM_011340 Serpinf1 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade F, member 1 NM_011898 Spry4 sprouty homolog 4 (Drosophila) NM_010787 Mea1 male enhanced antigen 1 NM_007387 Acp2 acid phosphatase 2, lysosomal NM_019827 Gsk3b glycogen synthase kinase 3 beta NM_022987 Zic5 zinc finger protein of the cerebellum 5 168

NM_153423 Wasf2 WAS protein family, member 2 NM_134141 RIKEN cDNA 2810413N20 gene NM_016968 Olig1 oligodendrocyte transcription factor 1 NM_008243 Mst1 macrophage stimulating 1 (hepatocyte growth factor-like) NM_008943 Psen1 presenilin 1 NM_010463 Hoxc12 Homeo box C12 NM_011817 Gadd45g Growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma NM_008927 Map2k1 mitogen activated protein kinase kinase 1 BC085180 Zfp260 Zinc finger protein 260 (Zfp260), mRNA

Cell cycle NM_008563 Mcm3 minichromosome maintenance deficient 3 (S. cerevisiae) NM_175155 RIKEN cDNA 2500002E12 gene NM_010891 septin 2 NM_007635 Ccng2 cyclin G2 NM_027910 BC011248 cDNA sequence BC011248 NM_008176 Cxcl1 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 NM_007746 Map3k8 mitogen activated protein kinase kinase kinase 8 NM_025415 Cks2 CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 NM_172560 RIKEN cDNA 9830165K03 gene NM_009101 Rras Harvey rat sarcoma oncogene, subgroup R

Response to stress NM_023125 Hrg histidine-rich glycoprotein NM_016704 C6 complement component 6 NM_011016 Orm2 orosomucoid 2 NM_008198 H2-Bf histocompatibility 2, complement component factor B NM_133819 Ppp1r15b Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 15b NM_022331 Herpud1 homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-like domain member 1 NM_010247 G22p1 thyroid autoantigen NM_009778 C3 complement component 3 NM_133969 Cyp4v3 cytochrome P450, family 4, subfamily v, polypeptide 3 NM_009776 Serping1 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade G, member 1 NM_009243 Serpina1a serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A, member 1a NM_017370 Hp haptoglobin NM_133862 Fgg fibrinogen, gamma polypeptide NM_010244 Fv1 Friend virus susceptibility 1 NM_007768 Crp C-reactive protein, petaxin related NM_015765 Hspa14 heat shock 70kDa protein 14 NM_007972 F10 coagulation factor X NM_009252 Serpina3n serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A, member 3N BC083108 Hmgb2 High mobility group box 2 NM_011316 Saa4 serum amyloid A 4 NM_010121 Eif2ak3 eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 3 NM_010851 Myd88 myeloid differentiation primary response gene 88 NM_008768 Orm1 orosomucoid 1 NM_008637 Nudt1 nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 1 BC034887 Tcrb-V13 T-cell receptor beta, variable 13 NM_021395 Hyou1 hypoxia up-regulated 1 NM_013930 Aass aminoadipate-semialdehyde synthase NM_011314 Saa2 serum amyloid A 2

Apoptosis NM_026117 Dedd2 death effector domain-containing DNA binding protein 2 NM_009761 Bnip3l BCL2/adenovirus E1B 19kDa-interacting protein 3-like NM_019745 Pdcd10 programmed cell death 10 NM_007808 Cycs cytochrome c, somatic NM_007983 Faf1 Fas-associated factor 1

Proteolysis NM_025275 X83328 EST X83328 NM_145984 RIKEN cDNA D030028O16 gene NM_198092 Usp2 ubiquitin specific protease 2 NM_146150 Nrd1 nardilysin, N-arginine dibasic convertase, NRD convertase 1 NM_174849 RIKEN cDNA 9430057O19 gene NM_011971 Psmb3 proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type 3 NM_025610 Asrgl1 asparaginase like 1 NM_173010 Ube3a ubiquitin protein ligase E3A 169

NM_012051 Etv3 ets variant gene 3 NM_007853 Degs degenerative spermatocyte homolog (Drosophila)

Signal transduction NM_146467 Olfr1388 Olfactory receptor 1388 (Olfr1388), mRNA NM_173029 Sacy Soluble adenylyl cyclase NM_019725 Tle2 transducin-like enhancer of split 2, homolog of Drosophila E(spl) NM_025859 Arl1 ADP-ribosylation factor-like 1 NM_010581 Cd47 CD47 antigen NM_028964 RIKEN cDNA 4933437K13 gene NM_008727 Npr1 natriuretic peptide receptor 1 NM_008542 Smad6 MAD homolog 6 (Drosophila) NM_183034 Plekhm1 pleckstrin homology domain containing, family M (with RUN domain) member 1 NM_133200 Gpr105 G protein-coupled receptor 105 NM_011862 Pacsin2 Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2 NM_013617 Olfr65 olfactory receptor 65 NM_054087 Slc19a2 solute carrier family 19 (thiamine transporter), member 2 NM_173453 RIKEN cDNA 5730466P16 gene NM_027141 Tce1 T-complex expressed gene 1 NM_133717 RIKEN cDNA 1810048P08 gene NM_009184 Ptk6 PTK6 protein tyrosine kinase 6 NM_080557 Snx4 Sorting nexin 4 NM_029035 RIKEN cDNA 4930422J18 gene NM_010557 Il4ra interleukin 4 receptor, alpha NM_011065 Per1 period homolog 1 (Drosophila) NM_018851 Samhd1 SAM domain and HD domain, 1 NM_017382 Rab11a RAB11a, member RAS oncogene family NM_021345 AW742319 expressed sequence AW742319

Others 34,54 153/443 NM_201375 Hrg histidine-rich glycoprotein NM_026929 RIKEN cDNA 1810008K03 gene NM_028071 Cotl1 coactosin-like 1 (Dictyostelium) NM_145215 Wbscr21 Williams Beuren syndrome chromosome region 21 NM_134130 Abhd3 abhydrolase domain containing 3 NM_030109 Sf3b2 splicing factor 3b, subunit 2 NM_009266 Sephs2 selenophosphate synthetase 2 NM_172051 RIKEN cDNA C630016B22 gene NM_029078 RIKEN cDNA 5730417B17 gene NM_197980 RIKEN cDNA 2810437L13 gene NM_010260 Gbp2 guanylate nucleotide binding protein 2 NM_175115 Zfpn1a5 branched chain NM_029844 RIKEN cDNA 1110025G12 gene NM_027346 RIKEN cDNA 2310066I18 gene NM_028731 DNA segment, Chr 12, ERATO Doi 551, expressed XM_129335 RIKEN cDNA 2700078E11 gene NM_029617 RIKEN cDNA 2310043D08 gene NM_133960 RIKEN cDNA 9130231C15 gene NM_134007 DNA segment, Chr 10, ERATO Doi 214, expressed NM_053265 RIKEN cDNA 4930433N12 gene NM_009253 Serpina3m serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A, member 3M NM_010196 Fga fibrinogen, alpha polypeptide NM_027420 RIKEN cDNA 2610034B18 gene NM_144791 MGC6357 hypothetical protein MGC6357 XM_133019 RIKEN cDNA 2410127E18 gene NM_033322 Lztfl1 Leucine zipper transcription factor-like 1 NM_133991 Ftsj Ftsj homolog (E. coli) NM_025687 Tex12 testis expressed gene 12 NM_134255 Elovl5 ELOVL family member 5, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_026787 RIKEN cDNA 1110012L19 gene NM_134095 DNA segment, Chr 15, Wayne State University 75, expressed NM_030692 Sacm1l SAC1 (supressor of actin mutations 1, homolog)-like (S. cerevisiae) NM_030694 Ifitm2 interferon induced transmembrane protein 2 NM_028771 DNA segment, Chr 7, ERATO Doi 462, expressed NM_153536 RIKEN cDNA B130050I23 gene 170

NM_026111 RIKEN cDNA 1810019P04 gene XM_133225 Snrpd2 small nuclear ribonucleoprotein D2 NM_009250 Serpini1 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade I, member 1 NM_172465 Zdhhc9 zinc finger, DHHC domain containing 9 XM_284425 RIKEN cDNA 2810422J05 gene BC004768 RIKEN cDNA 6430706D22 gene NM_025422 RIKEN cDNA 1110055L24 gene NM_024180 Ormdl2 ORM1-like 2 (S. cerevisiae) NM_009357 Tex261 testis expressed gene 261 NM_021564 Fetub fetuin beta NM_172635 AV312086 expressed sequence AV312086 NM_153600 RIKEN cDNA 9430097H08 gene NM_133858 RIKEN cDNA 4930504E06 gene NM_176982 RIKEN cDNA A630050E13 gene NM_170755 BC038286 cDNA sequence BC038286 NM_026977 RIKEN cDNA 1810031K17 gene NM_028343 RIKEN cDNA 2810439K08 gene NM_145539 Tm4sf4 transmembrane 4 superfamily member 4 BC080744 Hook2 hook homolog 2 (Drosophila) NM_175417 RIKEN cDNA 9530008L14 gene NM_011189 Psme1 proteasome (prosome, macropain) 28 subunit, alpha BC069266 RIKEN cDNA 0610011F06 gene NM_027453 RIKEN cDNA 4632412E09 gene NM_133873 DNA segment, Chr 4, Wayne State University 114, expressed NM_010884 Ndrg1 N-myc downstream regulated gene 1 NM_183183 hypothetical protein C730021L23 NM_178641 Inpp5f Inositol polyphosphate-5-phosphatase F NM_026365 RIKEN cDNA 5830427H10 gene XM_132163 Rassf6 Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 6 NM_138668 RIKEN cDNA 1810047C23 gene NM_025547 RIKEN cDNA 2410017I18 gene NM_177607 hypothetical protein 4933430I17 NM_021498 Pole3 polymerase (DNA directed), epsilon 3 (p17 subunit) NM_027865 Tmem25 transmembrane protein 25 NM_00100446 8 Tacc2 transforming, acidic coiled-coil containing protein 2 NM_172405 RIKEN cDNA 3830405G04 gene NM_027129 RIKEN cDNA 2310035K24 gene NM_198660 RIKEN cDNA E230008N13 gene NM_027419 RIKEN cDNA 2810408A11 gene NM_016763 Hadh2 hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase type II NM_133996 D10Ucla2 DNA segment, Chr 10, University of California at Los Angeles 2 NM_027853 RIKEN cDNA 0610006F02 gene NM_177647 hypothetical protein 9330140G23 NM_024480 BC003251 cDNA sequence BC003251 NM_026791 Fbxw9 F-box and WD-40 domain protein 9 XM_128548 RIKEN cDNA 1600002H07 gene NM_175307 RIKEN cDNA 4732473B16 gene NM_030705 Mesdc1 mesoderm development candidate 1 BC057025 C77604 expressed sequence C77604 NM_153126 AI429152 expressed sequence AI429152 NM_028287 RIKEN cDNA 2700019D07 gene NM_175250 RIKEN cDNA 2810007J24 gene NM_133219 Gcnt2 glucosaminyl (N-acetyl) transferase 2, I-branching enzyme XM_125594 Enpp3 ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3 NM_025849 RIKEN cDNA 3110001D03 gene NM_009349 Temt thioether S-methyltransferase NM_133734 Wdr23 WD repeat domain 23 NM_172943 AW050020 expressed sequence AW050020 XM_125641 Impk inositol polyphosphate multikinase BC083097 NM_009246 Serpina1b serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A, member 1b NM_182995 RIKEN cDNA 6330503K22 gene NM_133886 AU040320 expressed sequence AU040320 NM_011986 Ncdn neurochondrin 171

NM_028666 RIKEN cDNA 5430432M24 gene NM_027878 RIKEN cDNA 1200002N14 gene NM_133697 RIKEN cDNA 1110003E01 gene NM_025982 Sas sarcoma amplified sequence XM_358339 Nebl nebulette NM_053176 Hrg histidine-rich glycoprotein NM_026452 RIKEN cDNA 2310005O14 gene NM_029796 Lrg1 Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1 NM_199304 Znf341 zinc finger protein 341 NM_145566 Hrbl HIV-1 Rev binding protein-like BC062125 RIKEN cDNA 6430706D22 gene NM_145540 C77668 expressed sequence C77668 NM_033373 Krt1-23 Keratin complex 1, acidic, gene 23 NM_133684 RIKEN cDNA 2810484M10 gene NM_178603 Mrpl50 mitochondrial ribosomal protein L50 XM_358310 Mass1 monogenic, audiogenic seizure susceptibility 1 NM_026059 RIKEN cDNA 2900005J15 gene NM_028170 RIKEN cDNA 1700030K09 gene NM_201373 RIKEN cDNA A130009K11 gene NM_011956 Nubp2 nucleotide binding protein 2 NG_001505 D0H6S2654E NM_178692 RIKEN cDNA C130074G19 gene NM_183020 A2lp ataxin 2 related protein NM_019822 Adrm1 adhesion regulating molecule 1 NM_026899 RIKEN cDNA 1500011L16 gene NM_145980 RIKEN cDNA 8430408G22 gene NM_028672 RIKEN cDNA 4930430E16 gene NM_008340 Igfals Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit NM_177736 BC027309 cDNA sequence BC027309 NM_053215 RIKEN cDNA 0610033E06 gene NM_026510 RIKEN cDNA 2310037B18 gene XM_358318 Eif4g1 eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 NM_145425 AV249152 expressed sequence AV249152 NM_027973 Mlf1ip myeloid leukemia factor 1 interacting protein NM_029857 RIKEN cDNA 4632413C14 gene NM_183312 Dmn desmuslin NM_145122 Pex16 peroxisome biogenesis factor 16 NM_010493 Icam1 intercellular adhesion molecule NM_146133 RIKEN cDNA 2010204I15 gene NM_146234 BC032271 cDNA sequence BC032271 NM_009419 Tpst2 Protein-tyrosine sulfotransferase 2 NM_172722 RIKEN cDNA C330023M02 gene NM_176902 RIKEN cDNA 1110014K08 gene NM_011252 Rbmx RNA binding motif protein, NM_027721 RIKEN cDNA 4933439B08 gene NM_033146 RIKEN cDNA 1500005A01 gene NM_028900 Gcc1 golgi coiled coil 1 NM_029632 Ppp1r11 Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 11 NM_030252 BC003266 cDNA sequence BC003266 NM_138603 DXImx40e DNA segment, Chr X, Immunex 40, expressed NM_026240 RIKEN cDNA 9130427A09 gene NM_145919 Dorz1 downregulated in Zic1 deficient cerebellum NM_026530 RIKEN cDNA E130307M08 gene NM_133677 RIKEN cDNA 2310061J03 gene

Table S 4 : C/EBP gene targets related to mitochondrion in adult mouse liver

GeneBank ID Gene Name NM_010957 8-oxoguanine DNA-glycosylase 1 NM_134007 CDGSH iron sulfur domain 1 NM_009191 ClpB caseinolytic peptidase B homolog (E. coli) NM_026510 FtsJ homolog 2 (E. coli) 172

NM_133684 MOCO sulphurase C-terminal domain containing 2 NM_025547 MTERF domain containing 1 NM_029272 NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 7 NM_017382 RAB11a, member RAS oncogene family NM_145980 RIKEN cDNA 8430408G22 gene NM_133774 StAR-related lipid transfer (START) domain containing 4 NM_053215 UDP glucuronosyltransferase 2 family, polypeptide B37 NM_009467 UDP glucuronosyltransferase 2 family, polypeptide B5 NM_145215 abhydrolase domain containing 11 NM_130864 acetyl-Coenzyme A acyltransferase 1A NM_007981 acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 NM_198636 acyl-CoA synthetase short-chain family member 3 NM_025826 acyl-Coenzyme A dehydrogenase, short/branched chain NM_013930 aminoadipate-semialdehyde synthase NM_172644 aspartyl-tRNA synthetase 2 (mitochondrial) NM_026452 coenzyme Q9 homolog (yeast) NM_027346 coiled-coil domain containing 44 NM_009996 cytochrome P450, family 24, subfamily a, polypeptide 1 NM_009945 cytochrome c oxidase, subunit VIIa 2 NM_053119 enoyl Coenzyme A hydratase, short chain, 1, mitochondrial NM_016772 enoyl coenzyme A hydratase 1, peroxisomal NM_007997 ferredoxin reductase NM_010292 glucokinase NM_008097 glutaryl-Coenzyme A dehydrogenase NM_016763 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 10 NM_008618 malate dehydrogenase 1, NAD (soluble) NM_001003913 methionine-tRNA synthetase NM_178603 mitochondrial ribosomal protein L50 NM_078479 mitochondrial ribosomal protein S21; predicted gene 6686; predicted gene 6181 NM_173740 monoamine oxidase A NM_146150 nardilysin, N-arginine dibasic convertase, NRD convertase 1 NM_145460 oxidoreductase NAD-binding domain containing 1 NM_008819 phosphatidylethanolamine N-methyltransferase NM_017462 polymerase (DNA directed), gamma NM_007808 predicted gene 10108; cytochrome c, somatic; predicted gene 10053; similar to cytochrome c NM_130450 predicted gene 11295; ELOVL family member 6, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_011287 predicted gene 13573; predicted gene 15451; ribosomal protein L10A; predicted gene 7695 NM_008943 presenilin 1 NM_011169 prolactin receptor NM_019546 proline dehydrogenase (oxidase) 2 NM_144795 pyrroline-5-carboxylate reductase 1 NM_009761 similar to NIX; predicted gene 8283; BCL2/adenovirus E1B interacting protein 3-like NM_153150 solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, citrate transporter), member 1 NM_146118 solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, phosphate carrier), member 25 NM_025848 succinate dehydrogenase complex, subunit D, integral membrane protein NM_011660 thioredoxin 1 NM_013897 translocase of inner mitochondrial membrane 8 homolog b (yeast) NM_173453 transmembrane protein 11 NM_009474 urate oxidase

173

Table S 5 : FTF and C/EBP common gene targets in adult mouse liver. GenBank id Symbol Name NM_201375 Kng2 kininogen 2 NM_134130 Abhd3 abhydrolase domain containing 3 NM_009266 Sephs2 selenophosphate synthetase 2 NM_010324 Got1 glutamate oxaloacetate transaminase 1, soluble NM_008707 Nmt1 N-myristoyltransferase 1 NM_011044 Pck1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic NM_028790 Acot12 acyl-CoA thioesterase 12 NM_029844 Mrap melanocortin 2 receptor accessory protein XM_129335 - - NM_134007 Zcd1 zinc finger, CDGSH-type domain 1 NM_053265 4930433N12Rik RIKEN cDNA 4930433N12 gene NM_028964 4933437K13Rik RIKEN cDNA 4933437K13 gene NM_144791 Tor1aip1 torsin A interacting protein 1 NM_013465 Ahsg Alpha-2-HS-glycoprotein NM_133991 Ftsj1 FtsJ homolog 1 (E. coli) NM_053119 Echs1 enoyl Coenzyme A hydratase, short chain, 1, mitochondrial NM_009354 Tert telomerase reverse transcriptase NM_030692 Sacm1l SAC1 (suppressor of actin mutations 1, homolog)-like (S. cerevisiae) XM_284425 - - NM_175155 Sash1 SAM and SH3 domain containing 1 NM_009778 C3 complement component 3 NM_008727 Npr1 natriuretic peptide receptor 1 NM_011566 Tead3 TEA domain family member 3 NM_009243 Serpina1a serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 1a BC085235 Hbs1l Hbs1-like (S. cerevisiae) NM_174849 9430057O19Rik RIKEN cDNA 9430057O19 gene BC080744 Hook2 Hook homolog 2 (Drosophila) NM_007635 Ccng2 cyclin G2 NM_145368 C730036D15Rik RIKEN cDNA C730036D15 gene NM_028779 Ampd2 adenosine monophosphate deaminase 2 (isoform L) NM_145460 Oxnad1 oxidoreductase NAD-binding domain containing 1 NM_172254 Dph3 DPH3 homolog (KTI11, S. cerevisiae) NM_016772 Ech1 enoyl coenzyme A hydratase 1, peroxisomal NM_144940 Uroc1 urocanase domain containing 1 NM_027865 Tmem25 transmembrane protein 25 NM_027419 2810408A11Rik RIKEN cDNA 2810408A11 gene NM_133996 Apon apolipoprotein N NM_173010 Ube3a ubiquitin protein ligase E3A NM_008176 Cxcl1 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 NM_022987 Zic5 zinc finger protein of the cerebellum 5 NM_026791 Fbxw9 F-box and WD-40 domain protein 9 NM_007618 Serpina6 serine (or cysteine) peptidaseinhibitor, clade A, member 6 NM_025849 3110001D03Rik RIKEN cDNA 3110001D03 gene NM_178576 Cpsf4 cleavage and polyadenylation specific factor 4 BC083097 Ptcd1 pentatricopeptide repeat domain 1 NM_146013 Sec14l4 SEC14-like 4 (S. cerevisiae) NM_026452 Coq9 coenzyme Q9 homolog (yeast) NM_134141 Ciapin1 cytokine induced apoptosis inhibitor 1 NM_025516 Ergic3 ERGIC and golgi 3 NM_007808 Cycs cytochrome c, somatic NM_145540 Ints3 integrator complex subunit 3 BC061166 EG381806 predicted gene, EG381806 NM_019422 Elovl1 elongation of very long chain fatty acids (FEN1/Elo2, SUR4/Elo3, yeast)-like 1 NM_028170 1700030K09Rik RIKEN cDNA 1700030K09 gene NM_028500 Calr3 calreticulin 3 NM_027141 Spsb3 SplA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 3 NM_011956 Nubp2 nucleotide binding protein 2 NM_019822 Adrm1 adhesion regulating molecule 1 NM_010292 Gck Glucokinase NM_172758 BC031853 cDNA sequence BC031853 NM_207215 Phr1 Pam, highwire, rpm 1 NM_011065 Per1 period homolog 1 (Drosophila) 174

NM_183312 Dmn Desmuslin NM_010463 Hoxc12 homeo box C12 NM_130450 Elovl6 ELOVL family member 6, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_053200 Ces3 carboxylesterase 3 NM_008927 Map2k1 mitogen activated protein kinase kinase 1 NM_021345 Ptplad1 protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 1 NM_026240 Gramd3 GRAM domain containing 3 NM_026530 Mpnd MPN domain containing

Table S 6 : FTF target genes in fœtal mouse liver.

GenBank ID Symbol Name Metabolism Lipid NM_009415 Tpi triosephosphate isomerase NM_011044 Pck1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic NM_029019 Stard6 StAR-related lipid transfer (START) domain containing 6 NM_026283 Samd8 sterile alpha motif domain containing 8 carbohydrate NM_175154 Galk2 galactokinase 2 NM_183292 RIKEN cDNA 4931440L10 gene NM_011528 Taldo1 transaldolase 1 NM_008826 Pfkl phosphofructokinase, liver, B-type NM_198612 BC049816 cDNA sequence BC049816

DNA NM_178188 Hist1h2ad Histone 1, H2ad NM_178195 Hist1h2bf Histone 1, H2bf NM_178198 Hist1h2bj Histone 1, H2bj BC065803 Hist1h2ag Histone 1, H2ag NM_010061 Dnase1 deoxyribonuclease I

RNA BC079873 AI480556 Expressed sequence AI480556 (AI480556), mRNA NM_026440 Rnmt RNA (guanine-7-) methyltransferase

Other BC081468 Rpl18 Ribosomal protein L18 (Rpl18), mRNA NM_144549 Trib1 Tribbles homolog 1 (Drosophila) NM_007744 Comt catechol-O-methyltransferase BC053017 Ptpn9 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 9 NM_011654 Tuba2 Tubulin, alpha 2 NM_029097 RIKEN cDNA 1110012E06 gene NM_016774 Atp5b ATP synthase, H+ transporting mitochondrial F1 complex, beta subunit NM_009179 Siat5 sialyltransferase 5 NM_011100 Prkacb Protein kinase, cAMP dependent, catalytic, beta NM_133923 RIKEN cDNA 4833441J24 gene NM_019965 Dnajb12 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 12 NM_027314 RIKEN cDNA 1810015H18 gene NM_178845 Zfp277 zinc finger protein 277 NM_172119 Dio3 deiodinase, iodothyronine type III NM_145630 Pdk3 pyruvate dehydrogenase kinase, isoenzyme 3 NM_017374 Ppp2cb Protein phosphatase 2a, catalytic subunit, beta isoform NM_153527 RIKEN cDNA 1700014P03 gene

Transport NM_009483 Utx ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene, X chromosome NM_013683 Tap1 transporter 1, ATP-binding cassette, sub-family B (MDR NM_023596 Slc29a3 solute carrier family 29 (nucleoside transporters), member 3 NM_019723 Slc22a9 solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 9 NM_133700 RIKEN cDNA 1110056N09 gene

Transcription NM_016861 Pdlim1 PDZ and LIM domain 1 (elfin) NM_172563 Hlf hepatic leukemia factor NM_008065 Gabpa GA repeat binding protein, alpha NM_027002 RIKEN cDNA 2610028L19 gene NM_009087 Usp12 ubiquitin specific protease 12 NM_023910 0 RIKEN cDNA 0610009M14 gene

175

Development NM_009093 Rps29 ribosomal protein S29 NM_013711 Txnrd2 thioredoxin reductase 2 NM_023403 Mesdc2 mesoderm development candiate 2 NM_011141 Pou3f1 POU domain, class 3, transcription factor 1 NM_018780 Sfrp5 secreted frizzled-related sequence protein 5 NM_010279 Gfra1 glial cell line derived neurotrophic factor family receptor alpha 1 NM_029702 Arfrp1 ADP-ribosylation factor related protein 1 NM_019972 Sort1 Sortilin 1 NM_019673 C79802 expressed sequence C79802 NM_011817 Gadd45g Growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma NM_010784 Mdk midkine NM_029761 Dok5 downstream of tyrosine kinase 5 NM_020014 Gfra4 glial cell line derived neurotrophic factor family receptor alpha 4 NM_008054 Fyn Fyn proto-oncogene NM_134141 RIKEN cDNA 2810413N20 gene

Response to stress NM_016850 Irf7 interferon regulatory factor 7 NM_013653 Ccl5 chemokine (C-C motif) ligand 5

Apoptosis NM_053245 Aipl1 aryl hydrocarbon receptor-interacting protein-like 1

Proteolysis XM_148353 RIKEN cDNA 4930453N24 gene NM_013585 Psmb9 TAP) NM_008873 Plau plasminogen activator, urokinase NM_173369 Cyld cylindromatosis (turban tumor syndrome)

Signal transduction NM_017369 NM_009939 Cops2 COP9 (constitutive photomorphogenic) homolog, subunit 2 NM_013602 Mt1 metallothionein 1 NM_007699 Chrm4 Cholinergic receptor, muscarinic 4 (Chrm4), mRNA NM_008018 Sh3md1 SH3 multiple domains 1 NM_147063 Olfr520 Olfactory receptor 520 (Olfr520), mRNA NM_080795 Lnx2 Ligand of numb-protein X 2 NM_009184 Ptk6 PTK6 protein tyrosine kinase 6 NM_033475 Rab34 RAB34, member of RAS oncogene family NM_020008 Clecsf12 C-type (calcium dependent, carbohydrate recognition domain) lectin, superfamily member 12 NM_019417 Pdlim4 PDZ and LIM domain 4 NM_010581 Cd47 CD47 antigen NM_146444 Olfr458 Olfactory receptor 458 (Olfr458), mRNA

Others NM_019833 RIKEN cDNA B230317C12 gene NM_175033 Similar to selenoprotein W NM_013893 Ingaprp islet neogenesis associated protein-related protein NM_025894 Psmd12 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 12 NM_172522 RIKEN cDNA 2410080H04 gene NM_024290 Tnfrsf23 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 23 NM_024440 RIKEN cDNA 1810063P04 gene XM_126517 Car10 carbonic anhydrase 10 NM_016887 Cldn7 Claudin 7 NM_177628 hypothetical protein A030013D21 NM_172964 hypothetical protein E130310N06 NM_029077 Trim14 tripartite motif-containing 14 NM_144827 Tisp78 transcript increased in spermiogenesis 78 NM_175310 Aprin androgen-induced proliferation inhibitor NM_025365 RIKEN cDNA 1110002E23 gene NM_027133 Lnp limb and neural patterns NM_172888 Svs1 seminal vesicle secretion 1 NM_028795 RIKEN cDNA 1810018F18 gene NM_027307 Golph2 golgi phosphoprotein 2 NM_026553 Yif1 Yip1 interacting factor homolog (S. cerevisiae) NM_173375 BC064033 cDNA sequence BC064033 NM_198300 Cpeb3 cytoplasmic polyadenylation element binding protein 3 BC048780 Pla2g1br phospholipase A2, group IB, pancreas, receptor NM_173390 DNA segment, Chr 10, Brigham and Women's Genetics 0940 expressed 176

NM_029398 RIKEN cDNA 5730496E24 gene NM_134130 Abhd3 abhydrolase domain containing 3 NM_201375 Hrg histidine-rich glycoprotein NM_013882 Gtse1 G two S phase expressed protein 1 NM_153794 RIKEN cDNA 4933403F05 gene NR_001592 H19 H19 fetal liver mRNA NM_173408 BC030335 cDNA sequence BC030335 NM_029610 RIKEN cDNA 4930404J24 gene NM_026647 Zdhhc21 zinc finger, DHHC domain containing 21 NM_028131 RIKEN cDNA 2610510J17 gene NM_026844 RIKEN cDNA 2310061C15 gene NM_026530 RIKEN cDNA E130307M08 gene NM_007656 Kai1 Kangai 1 (suppression of tumorigenicity 6, prostate) NM_172485 RIKEN cDNA D130067I03 gene NM_172967 RIKEN cDNA 4930503L19 gene NM_177727 BC040823 cDNA sequence BC040823 NM_010028 Ddx3x DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 3, X-linked NM_133991 Ftsj Ftsj homolog (E. coli) NM_025865 RIKEN cDNA 2310030G06 gene NM_026452 RIKEN cDNA 2310005O14 gene NM_027346 RIKEN cDNA 2310066I18 gene NM_145836 RIKEN cDNA 6430527G18 gene

Table S 7 : C/EBP target genes in foetal mouse liver.

GenBank ID Symbol Name Metabolism Lipid NM_030210 Aacs Acetoacetyl-CoA synthetase NM_053115 Acox2 acyl-Coenzyme A oxidase 2, branched chain NM_008775 Pafah1b2 platelet-activating factor acetylhydrolase, isoform 1b, alpha2 subunit NM_053119 Echs1 enoyl Coenzyme A hydratase, short chain, 1, mitochondrial NM_028790 Cach cytosolic acetyl-CoA hydrolase NM_008819 Pemt phosphatidylethanolamine N-methyltransferase NM_025826 Acadsb acyl-Coenzyme A dehydrogenase, short NM_133808 Hdlbp high density lipoprotein (HDL) binding protein NM_011044 Pck1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic NM_013839 Nr1h3 nuclear receptor subfamily 1, group H, member 3 NM_203280 Sphk2 sphingosine kinase 2 NM_053200 Ces3 carboxylesterase 3 NM_011169 Prlr prolactin receptor NM_007997 Fdxr ferredoxin reductase dolichyl-phosphate (UDP-N-acetylglucosamine) acetylglucosaminephosphotransferase 1 NM_007875 Dpagt1 (GlcNAc-1-P transferase) NM_010476 Hsd17b7 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7 NM_030676 Nr5a2 nuclear receptor subfamily 5, group A, member 2 NM_133880 Pafah2 platelet-activating factor acetylhydrolase 2 NM_008175 Grn Granulin NM_008094 Gba Glucosidase, beta, acid NM_028292 RIKEN cDNA 2700017M01 gene NM_007856 Dhcr7 7-dehydrocholesterol reductase NM_011609 Tnfrsf1a tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1a NM_026058 Lass4 longevity assurance homolog 4 (S. cerevisiae) NM_008822 Pex7 Peroxisome biogenesis factor 7 NM_130450 Elovl6 ELOVL family member 6, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_008797 Pcx pyruvate carboxylase NM_009948 Mapk8ip2 mitogen-activated protein kinase 8 interacting protein 2

Carbohydrate NM_007498 Atf3 activating transcription factor 3 NM_025848 Sdhd succinate dehydrogenase complex, subunit D, integral membrane protein NM_173347 RIKEN cDNA 9230112O05 gene NM_009402 Pglyrp1 peptidoglycan recognition protein 1 NM_010368 Gus beta-glucuronidase NM_080463 Pofut1 protein O-fucosyltransferase 1 177

NM_008195 Gys3 glycogen synthase 3, brain NM_007446 Amy1 amylase 1, salivary NM_007695 Chi3l1 chitinase 3-like 1 NM_010938 Nrf1 nuclear respiratory factor 1 NM_008064 Gaa Glucosidase, alpha, acid NM_177741 Ppp1r3b protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 3B NM_008155 Gpi1 glucose phosphate isomerase 1 NM_013755 Gyg1 glycogenin 1

Amino acid NM_010324 Got1 glutamate oxaloacetate transaminase 1, soluble NM_010401 Hal histidine ammonia lyase NM_172015 Iars isoleucine-tRNA synthetase NM_013547 Hgd homogentisate 1, 2-dioxygenase NM_146217 Aars alanyl-tRNA synthetase NM_001003913 Mars methionine-tRNA synthetase NM_027350 Nars asparaginyl-tRNA synthetase NM_144795 Pycr1 pyrroline-5-carboxylate reductase 1 NM_172644 RIKEN cDNA 5830468K18 gene NM_053181 AA415817 expressed sequence AA415817 NM_173785 RIKEN cDNA A230051G13 gene NM_144940 BC022133 cDNA sequence BC022133

DNA NM_033596 Hist2h4 histone 2, H4 NM_178197 Hist1h2bh histone 1, H2bh NM_013548 Hist1h3f histone 1, H3f NM_177619 Myst2 MYST histone acetyltransferase 2 NM_009408 Top1 topoisomerase (DNA) I XM_130416 RIKEN cDNA 2810418N01 gene NM_011304 Ruvbl2 RuvB-like protein 2 NM_009354 Tert telomerase reverse transcriptase NM_145073 Hist1h3g histone 1, H3g NM_178198 Hist1h2bj histone 1, H2bj BC065803 Hist1h2ag histone 1, H2ag NM_178188 Hist1h2ad histone 1, H2ad NM_178195 Hist1h2bf histone 1, H2bf NM_178192 Hist1h4a histone 1, H4a NM_178196 Hist1h2bg histone 1, H2bg NM_178187 Hist1h2ae histone 1, H2ae NM_153173 Hist1h4h histone 1, H4h NM_178194 Hist1h2be histone 1, H2be NM_058214 Recql4 RecQ protein-like 4 NM_172281 RIKEN cDNA 1700120K04 gene NM_175665 NM_178201 Hist1h2bn histone 1, H2bn

RNA NM_133242 Rnpc2 RNA-binding region (RNP1, RRM) containing 2 NM_026623 Cpsf5 cleavage and polyadenylation specific factor 5 NM_024183 Fip1l1 FIP1 like 1 (S. cerevisiae) NM_178576 Cpsf4 cleavage and polyadenylation specific factor 4 NM_133840 AI462438 expressed sequence AI462438 NM_177301 Fbxo17 F-box only protein 17 NM_011882 Rnasel ribonuclease L (2, 5-oligoisoadenylate synthetase-dependent) NM_025447 RIKEN cDNA 1500031M22 gene NM_020587 Sfrs4 splicing factor, arginine/serine-rich 4 (SRp75) NM_019655 Adar adenosine deaminase, RNA-specific NM_028002 RIKEN cDNA 2310069P03 gene NM_008249 Tfb2m transcription factor B2, mitochondrial NM_146074 Tfb1m transcription factor B1, mitochondrial

Other NM_133740 Hrmt1l3 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein methyltransferase-like 3 NM_011287 Rpl10a ribosomal protein L10A NM_144869 BC021614 cDNA sequence BC021614 NM_019811 Acas2 acetyl-Coenzyme A synthetase 2 (ADP forming) NM_178767 RIKEN cDNA A530016O06 gene NM_010442 Hmox1 heme oxygenase (decycling) 1 178

NM_144866 Etf1 eukaryotic translation termination factor 1 NM_177767 RIKEN cDNA 4930415J21 gene NM_026030 Eif2s2 eukaryotic translation initiation factor 2, subunit 2 (beta) NM_029272 Ndufs7 NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 7 NM_133894 RIKEN cDNA 9430041C03 gene BC085235 Hbs1l Hbs1-like (S. cerevisiae) BC046911 RIKEN cDNA 4833442J19 gene NM_013768 Skb1 SKB1 homolog (S. pombe) NM_198164 RIKEN cDNA 2700084L06 gene NM_025381 Atp6v1f ATPase, H+ transporting, V1 subunit F NM_013632 Pnp purine-nucleoside phosphorylase NM_008907 Ppia peptidylprolyl isomerase A NM_009448 Tuba6 tubulin, alpha 6 NM_133657 Cyp2a12 cytochrome P450, family 2, subfamily a, polypeptide 12 NM_013524 Fut7 fucosyltransferase 7 NM_178882 AI325464 expressed sequence AI325464 NM_028800 RIKEN cDNA 2310004N11 gene NM_078479 Mrps21 mitochondrial ribosomal protein S21 BC081468 Rpl18 Ribosomal protein L18 (Rpl18), mRNA NM_007597 Canx Calnexin NM_013760 Dnajb9 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 9 NM_025334 RIKEN cDNA 0610040B21 gene NM_009996 Cyp24a1 cytochrome P450, family 24, subfamily a, polypeptide 1 NM_024195 Ncb5or NADPH cytochrome B5 oxidoreductase NM_009997 Cyp2a4 cytochrome P450, family 2, subfamily a, polypeptide 4 NM_011847 Dnajb6 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6 NM_011979 Vnn3 vanin 3 NM_009121 spermidine/spermine N1-acetyl transferase 1 NM_021485 Rps6kb2 ribosomal protein S6 kinase, polypeptide 2 NM_008917 Ppt1 palmitoyl-protein thioesterase 1 NM_013551 Hmbs hydroxymethylbilane synthase NM_011240 Ranbp2 RAN binding protein 2 NM_197979 RIKEN cDNA 1110020P15 gene NM_030221 RIKEN cDNA 9130012B15 gene NM_173745 Dusp18 dual specificity phosphatase 18 NM_133653 Mat1a methionine adenosyltransferase I, alpha NM_024264 Cyp27a1 cytochrome P450, family 27, subfamily a, polypeptide 1 NM_019777 Ikbke inhibitor of kappaB kinase epsilon NM_009467 Ugt2b5 UDP-glucuronosyltransferase 2 family, member 5 NM_024208 Echdc3 enoyl Coenzyme A hydratase domain containing 3 NM_178071 Nme7 non-metastatic cells 7, protein expressed in NM_173740 Maoa monoamine oxidase A NM_145537 RIKEN cDNA 9530090G24 gene NM_026498 Mrps11 mitochondrial ribosomal protein S11 NM_183313 hypothetical protein D930018N13 NM_018745 Oazin ornithine decarboxylase antizyme inhibitor NM_201408 Dhps deoxyhypusine synthase NM_201410 Ugt1a6 UDP glycosyltransferase 1 family, polypeptide A6 NM_024277 Rps27a ribosomal protein S27a NM_153762 Rnf26 ring finger protein 26 NM_011303 Dhrs3 dehydrogenase/reductase (SDR family) member 3 NM_145367 Txndc5 thioredoxin domain containing 5 NM_175677 RIKEN cDNA 9230105E10 gene NM_028260 RIKEN cDNA 1500034J20 gene NM_010952 Oaz2 ornithine decarboxylase antizyme 2

Transport NM_011076 Abcb1a ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1A NM_053173 Kifc5a kinesin family member C5A NM_013897 Timm8b translocase of inner mitochondrial membrane 8 homolog b (yeast) NM_146118 Slc25a25 solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, phosphate carrier), member 25 NM_013790 Abcc5 ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 5 NM_194333 Slc23a3 solute carrier family 23 (nucleobase transporters), member 3 NM_133977 Trf Transferring NM_025828 Lman2 lectin, mannose-binding 2 NM_010749 M6pr mannose-6-phosphate receptor, cation dependent 179

NM_011387 Slc10a1 solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 1 NM_011402 Slc34a2 solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2 NM_023712 RIKEN cDNA 2210013K02 gene NM_008522 Ltf Lactotransferrin NM_007830 Dbi diazepam binding inhibitor BC085131 NM_011929 Clcn6 chloride channel 6 NM_198223 Aspscr1 alveolar soft part sarcoma chromosome region, candidate 1 (human) solute carrier family 1 (neuronal/epithelial high affinity glutamate transporter, system Xag), NM_009199 Slc1a1 member 1 NM_021433 Stx6 syntaxin 6 NM_016810 Gosr1 golgi SNAP receptor complex member 1 NM_172841 Slco5a1 solute carrier organic anion transporter family, member 5A1 NM_145543 Mclc Mid-1-related chloride channel 1 NM_015728 Slc33a1 solute carrier family 33 (acetyl-CoA transporter), member 1 NM_028369 RIKEN cDNA 2810468K17 gene NM_026928 RIKEN cDNA 1810014F10 gene NM_025505 Blzf1 basic leucine zipper nuclear factor 1 NM_026155 Ssr3 signal sequence receptor, gamma NM_173015 RIKEN cDNA 5033413H12 gene NM_025588 Sec5l1 SEC5-like 1 (S. cerevisiae) NM_013851 Abca8b ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 8b NM_021538 Cope coatomer protein complex, subunit epsilon NM_018758 Apba3 amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family A, member 3 NM_011391 Slc16a7 solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 7 NM_030749 RIKEN cDNA 1810057E01 gene NM_134020 RIKEN cDNA 1110014L17 gene NM_144905 RIKEN cDNA 6330416G13 gene NM_181321 Tmc6 transmembrane channel-like gene family 6 NM_023044 Slc15a3 solute carrier family 15, member 3 NM_026232 Slc25a30 solute carrier family 25, member 30 NM_024282 RIKEN cDNA 5830417C01 gene NM_015747 Slc20a1 solute carrier family 20, member 1 NM_007493 Asgr2 asialoglycoprotein receptor 2

Transcription NM_023184 Klf15 Kruppel-like factor 15 NM_133801 RIKEN cDNA 2810405L04 gene NM_008097 Gcdh glutaryl-Coenzyme A dehydrogenase NM_183167 AI987944 Expressed sequence AI987944 NM_025364 RIKEN cDNA 1110005A23 gene NM_011461 Spic Spi-C transcription factor (Spi-1/PU.1 related) NM_009191 Skd3 suppressor of K+ transport defect 3 NM_016974 Dbp D site albumin promoter binding protein NM_008250 Hlx H2.0-like homeo box gene NM_011566 Tead3 TEA domain family member 3 NM_134134 RIKEN cDNA A630042L21 gene NM_173719 RIKEN cDNA 2210021A15 gene NM_026107 Zfp535 zinc finger protein 535 NM_133879 Hkr3 GLI-Kruppel family member HKR3 NM_058212 Dpf3 D4, zinc and double PHD fingers, family 3 NM_053170 Trim33 tripartite motif protein 33 NM_010192 Fem1a feminization 1 homolog a (C. elegans) NM_007953 Esrra estrogen related receptor, alpha NM_025426 Crsp9 cofactor required for Sp1 transcriptional activation, subunit 9 NM_020262 Gm1957 gene model 1957, (NCBI) BC011319 Cebpg CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), gamma NM_133968 Snapc2 small nuclear RNA activating complex, polypeptide 2 NM_027007 Zfp397 zinc finger protein 397 NM_021307 Zfp112 zinc finger protein 112 BC061235 Pcnp PEST-containing nuclear protein NM_027213 Med6 mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 6 homolog (yeast) NM_177201 Phf8 PHD finger protein 8 NM_025307 Nrbf2 nuclear receptor binding factor 2 NM_010711 Lhx3 LIM homeobox protein 3 BC047272 Ilf3 interleukin enhancer binding factor 3 180

NM_010753 Mxd4 Max dimerization protein 4 NM_025901 RIKEN cDNA 1500004O14 gene BC070434 hypothetical protein LOC100044193 NM_028812 Gtf2e1 general transcription factor II E, polypeptide 1 (alpha subunit) NM_008683 Nedd8 neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated gene 8

Development NM_008707 Nmt1 N-myristoyltransferase 1 NM_010813 Mnt max binding protein NM_011898 Spry4 sprouty homolog 4 (Drosophila) NM_011723 Xdh xanthine dehydrogenase NM_015759 Fgd3 FYVE, RhoGEF and PH domain containing 3 NM_054098 Abcb1a ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1A NM_008877 Plg Plasminogen NM_013465 Ahsg alpha-2-HS-glycoprotein NM_008943 Psen1 presenilin 1 NM_019768 Morf4l2 mortality factor 4 like 2 NM_009912 Ccr1 chemokine (C-C motif) receptor 1 NM_010787 Mea1 male enhanced antigen 1 NM_025630 RIKEN cDNA 2010009L17 gene NM_011340 Serpinf1 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade F, member 1 NM_009093 Rps29 ribosomal protein S29 sema domain, immunoglobulin domain (Ig), transmembrane domain (TM) and short NM_011976 Sema4g cytoplasmic domain, (semaphorin) 4G NM_019827 Gsk3b glycogen synthase kinase 3 beta NM_022987 Zic5 zinc finger protein of the cerebellum 5 NM_010784 Mdk Midkine NM_025319 RIKEN cDNA 0610009B22 gene NM_007678 Cebpa CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha NM_010463 Hoxc12 homeo box C12 NM_011415 Snai2 snail homolog 2 (Drosophila) NM_007960 Etv1 ets variant gene 1 NM_019984 Tgm1 transglutaminase 1, K polypeptide NM_008655 Gadd45b growth arrest and DNA-damage-inducible 45 beta NM_007893 E4F transcription factor 1 NM_009769 Klf5 Kruppel-like factor 5 NM_145634 RIKEN cDNA F730004D16 gene NM_009665 Amd1 S-adenosylmethionine decarboxylase 1 NM_011817 Gadd45g growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma NM_009510 Vil2 villin 2 NM_010949 Numb numb gene homolog (Drosophila) NM_080848 Wdr5 WD repeat domain 5 NM_010469 Hoxd3 homeo box D3 NM_177992 Gmpr2 guanosine monophosphate reductase 2

Cell cycle NM_008563 Mcm3 minichromosome maintenance deficient 3 (S. cerevisiae) NM_007635 Ccng2 cyclin G2 NM_009101 Rras Harvey rat sarcoma oncogene, subgroup R NM_027985 Mad2l2 MAD2 mitotic arrest deficient-like 2 (yeast) NM_007746 Map3k8 mitogen activated protein kinase kinase kinase 8 NM_010891 septin 2 NM_025415 Cks2 CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 NM_027910 BC011248 cDNA sequence BC011248 NM_175155 RIKEN cDNA 2500002E12 gene NM_008506 Lmyc1 lung carcinoma myc related oncogene 1 NM_009740 Bcl10 B-cell leukemia/lymphoma 10 NM_019774 Akap8 A kinase (PRKA) anchor protein 8 NM_010730 Anxa1 annexin A1 NM_007632 Ccnd3 cyclin D3 NM_017367 Ccni cyclin I

Response to stress NM_023125 Hrg histidine-rich glycoprotein homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-like domain member NM_022331 Herpud1 1 NM_133819 Ppp1r15b protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 15b 181

NM_009778 C3 complement component 3 NM_010244 Fv1 Friend virus susceptibility 1 NM_009014 Rad51l1 RAD51-like 1 (S. cerevisiae) NM_008768 Orm1 orosomucoid 1 NM_015765 Hspa14 heat shock 70kDa protein 14 NM_009011 Rad23b RAD23b homolog (S. cerevisiae) NM_007972 F10 coagulation factor X NM_010247 G22p1 thyroid autoantigen NM_017370 Hp Haptoglobin NM_008198 H2-Bf histocompatibility 2, complement component factor B BC083108 Hmgb2 High mobility group box 2 NM_016704 C6 complement component 6 NM_011315 Saa3 serum amyloid A 3 NM_011316 Saa4 serum amyloid A 4 NM_008160 Gpx1 glutathione peroxidase 1 NM_181569 Mare alpha globin regulatory element containing gene NM_016850 Irf7 interferon regulatory factor 7 NM_013653 Ccl5 chemokine (C-C motif) ligand 5 NM_009010 Rad23a RAD23a homolog (S. cerevisiae) NM_009533 Xrcc5 X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5 NM_133862 Fgg fibrinogen, gamma polypeptide NM_030612 AA408868 expreexpressed sequence AA408868 NM_023517 Tnfsf13 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 13 NM_011337 Ccl3 chemokine (C-C motif) ligand 3 NM_138648 Olr1 oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1 NM_011045 Pcna proliferating cell nuclear antigen NM_007782 Csf3r colony stimulating factor 3 receptor (granulocyte) NM_007999 Fen1 flap structure specific endonuclease 1 NM_013930 Aass aminoadipate-semialdehyde synthase NM_181849 Fgb fibrinogen, B beta polypeptide NM_009503 Vcp valosin containing protein

Apoptosis NM_019745 Pdcd10 programmed cell death 10 NM_007808 Cycs cytochrome c, somatic NM_018807 Plagl2 pleiomorphic adenoma gene-like 2 NM_026117 Dedd2 death effector domain-containing DNA binding protein 2 NM_009761 Bnip3l BCL2/adenovirus E1B 19kDa-interacting protein 3-like NM_028679 Irak3 interleukin-1 receptor-associated kinase 3 NM_146151 Tesk2 testis-specific kinase 2 NM_144554 Trib3 tribbles homolog 3 (Drosophila) NM_010607 Kcnk2 potassium channel, subfamily K, member 2

Proteolysis NM_011971 Psmb3 proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type 3 NM_007853 Degs degenerative spermatocyte homolog (Drosophila) NM_145984 RIKEN cDNA D030028O16 gene NM_198092 Usp2 ubiquitin specific protease 2 NM_011883 Rnf13 ring finger protein 13 NM_146150 Nrd1 nardilysin, N-arginine dibasic convertase, NRD convertase 1 NM_008611 Mmp8 matrix metalloproteinase 8 NM_181344 C1rl complement component 1, r subcomponent-like NM_173010 Ube3a ubiquitin protein ligase E3A NM_052835 Rpl10 ribosomal protein 10 NM_153583 Apg4d APG4 (ATG4) autophagy-related homolog D (S. cerevisiae) NM_011796 Capn10 calpain 10 NM_144937 Usp3 ubiquitin specific protease 3 NM_011046 Furin furin (paired basic amino acid cleaving enzyme)

Signal transduction NM_176912 Gpr77 G protein-coupled receptor 77 NM_011065 Per1 period homolog 1 (Drosophila) NM_133200 Gpr105 G protein-coupled receptor 105 NM_025859 Arl1 ADP-ribosylation factor-like 1 NM_173029 Sacy soluble adenylyl cyclase NM_008727 Npr1 natriuretic peptide receptor 1 NM_010581 Cd47 CD47 antigen 182

NM_018851 Samhd1 SAM domain and HD domain, 1 NM_133717 RIKEN cDNA 1810048P08 gene NM_146467 Olfr1388 Olfactory receptor 1388 (Olfr1388), mRNA NM_139144 Ogt O-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) transferase NM_013617 Olfr65 olfactory receptor 65 NM_021345 AW742319 expressed sequence AW742319 NM_008542 Smad6 MAD homolog 6 (Drosophila) NM_030720 Gpr84 G protein-coupled receptor 84 NM_198405 RIKEN cDNA 9930027N05 gene NM_029494 Rsb30 RAB30, member RAS oncogene family NM_024454 Rab21 RAB21, member RAS oncogene family NM_173453 RIKEN cDNA 5730466P16 gene NM_010559 Il6ra interleukin 6 receptor, alpha NM_080557 Snx4 sorting nexin 4 NM_178702 RIKEN cDNA D930005D10 gene NM_009184 Ptk6 PTK6 protein tyrosine kinase 6 NM_153510 Pilra paired immunoglobin-like type 2 receptor alpha NM_026912 Snx15 sorting nexin 15 NM_007781 Csf2rb2 colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage) NM_017369 Gabre gamma-aminobutyric acid (GABA-A) receptor, subunit epsilon NM_019725 Tle2 transducin-like enhancer of split 2, homolog of Drosophila E(spl) NM_033475 Rab34 RAB34, member of RAS oncogene family NM_027687 Cabyr calcium-binding tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated(fibrousheathin 2) NM_011212 Ptpre protein tyrosine phosphatase, receptor type, E NM_027141 Tce1 T-complex expressed gene 1 NM_027000 Gtpbp4 GTP binding protein 4 NM_019439 Gabbr1 gamma-aminobutyric acid (GABA-B) receptor, 1 NM_026297 Rabl3 RAB, member of RAS oncogene family-like 3

Others NM_028071 Cotl1 coactosin-like 1 (Dictyostelium) NM_201375 Hrg histidine-rich glycoprotein NM_145215 Wbscr21 Williams Beuren syndrome chromosome region 21 NM_009266 Sephs2 selenophosphate synthetase 2 NM_030109 Sf3b2 splicing factor 3b, subunit 2 NM_010260 Gbp2 guanylate nucleotide binding protein 2 NM_033322 Lztfl1 leucine zipper transcription factor-like 1 NM_172051 RIKEN cDNA C630016B22 gene NM_029078 RIKEN cDNA 5730417B17 gene NM_027346 RIKEN cDNA 2310066I18 gene NM_025288 Stfa3 stefin A3 NM_182995 RIKEN cDNA 6330503K22 gene BC004768 RIKEN cDNA 6430706D22 gene NM_026899 RIKEN cDNA 1500011L16 gene NM_133991 Ftsj Ftsj homolog (E. coli) NM_177607 hypothetical protein 4933430I17 NM_021498 Pole3 polymerase (DNA directed), epsilon 3 (p17 subunit) NM_134130 Abhd3 abhydrolase domain containing 3 NM_133873 DNA segment, Chr 4, Wayne State University 114, expressed XM_129145 RIKEN cDNA 2210019E14 gene NM_010196 Fga fibrinogen, alpha polypeptide NM_028771 DNA segment, Chr 7, ERATO Doi 462, expressed XM_129335 RIKEN cDNA 2700078E11 gene NM_027865 Tmem25 transmembrane protein 25 NM_024180 Ormdl2 ORM1-like 2 (S. cerevisiae) A530020G20 NM_177014 Rik RIKEN cDNA A530020G20 gene NM_025849 RIKEN cDNA 3110001D03 gene XM_284425 RIKEN cDNA 2810422J05 gene NM_198638 RIKEN cDNA A630028O16 gene NM_009250 Serpini1 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade I, member 1 NM_027878 RIKEN cDNA 1200002N14 gene NM_178367 Dhx33 DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 33 NM_153126 AI429152 expressed sequence AI429152 NM_029617 RIKEN cDNA 2310043D08 gene BC057025 C77604 expressed sequence C77604 183

NM_177647 hypothetical protein 9330140G23 NM_026929 RIKEN cDNA 1810008K03 gene BC044883 RIKEN cDNA 1810027I20 gene NM_028731 DNA segment, Chr 12, ERATO Doi 551, expressed NM_028036 RIKEN cDNA 2410015B03 gene NM_177166 RIKEN cDNA 9930014A18 gene NM_177736 BC027309 cDNA sequence BC027309 NM_016763 Hadh2 hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase type II NM_026787 RIKEN cDNA 1110012L19 gene NM_173862 BC030396 cDNA sequence BC030396 NM_177225 RIKEN cDNA A830094I09 gene NM_177686 Micl myeloid inhibitory C-type lectin-like receptor NM_024480 BC003251 cDNA sequence BC003251 NM_010884 Ndrg1 N-myc downstream regulated gene 1 NM_178641 Inpp5f inositol polyphosphate-5-phosphatase F NM_172888 Svs1 seminal vesicle secretion 1 NM_133858 RIKEN cDNA 4930504E06 gene NM_134095 DNA segment, Chr 15, Wayne State University 75, expressed NM_172722 RIKEN cDNA C330023M02 gene NM_009357 Tex261 testis expressed gene 261 NM_175115 Zfpn1a5 branched chain NM_030694 Ifitm2 interferon induced transmembrane protein 2 NM_199311 BC049354 cDNA sequence BC049354 NM_176910 RIKEN cDNA 1700023O11 gene NM_176982 RIKEN cDNA A630050E13 gene NM_027129 RIKEN cDNA 2310035K24 gene NM_134255 Elovl5 ELOVL family member 5, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_133219 Gcnt2 glucosaminyl (N-acetyl) transferase 2, I-branching enzyme NM_001002842 RIKEN cDNA 4632424B03 gene NM_145566 Hrbl HIV-1 Rev binding protein-like NM_026365 RIKEN cDNA 5830427H10 gene NM_028618 RIKEN cDNA 1110014F24 gene NM_172405 RIKEN cDNA 3830405G04 gene NM_027420 RIKEN cDNA 2610034B18 gene BC083097 NM_011815 Fyb FYN binding protein XM_133019 RIKEN cDNA 2410127E18 gene NM_029000 RIKEN cDNA 9130002C22 gene BC055833 Thap11 THAP domain containing 11 NM_025289 Tbrg1 transforming growth factor beta regulated gene 1 NM_029844 RIKEN cDNA 1110025G12 gene NM_197980 RIKEN cDNA 2810437L13 gene NM_030692 Sacm1l SAC1 (supressor of actin mutations 1, homolog)-like (S. cerevisiae) NM_145539 Tm4sf4 transmembrane 4 superfamily member 4 NM_145122 Pex16 peroxisome biogenesis factor 16 NM_145540 C77668 expressed sequence C77668 BC032970 RIKEN cDNA 2810026P18 gene BC078642 Hnrpul1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U-like 1 (Hnrpul1), transcript variant 1, mRNA XM_134311 Katnb1 katanin p80 (WD40-containing) subunit B 1 NM_027453 RIKEN cDNA 4632412E09 gene NM_198660 RIKEN cDNA E230008N13 gene NM_053265 RIKEN cDNA 4930433N12 gene NM_028672 RIKEN cDNA 4930430E16 gene NM_025385 RIKEN cDNA 1110020C13 gene NM_177824 hypothetical protein 9830107B12 NM_010708 Lgals9 lectin, galactose binding, soluble 9 NM_025982 Sas sarcoma amplified sequence NM_153525 DNA segment, Chr 7, ERATO Doi 743, expressed BC080744 Hook2 hook homolog 2 (Drosophila) NM_194339 Bms1l BMS1-like, ribosome assembly protein (yeast) NM_019822 Adrm1 adhesion regulating molecule 1 NM_028439 RIKEN cDNA 3110009E18 gene NM_025459 RIKEN cDNA 1810015C04 gene NM_145487 Prr3 proline-rich polypeptide 3 NM_170755 BC038286 cDNA sequence BC038286 184

NM_026977 RIKEN cDNA 1810031K17 gene NM_144791 MGC6357 hypothetical protein MGC6357 NM_181821 Hcfc1r1 host cell factor C1 regulator 1 (XPO1-dependent) NM_011414 Slpi secretory leukocyte protease inhibitor NM_025482 Tpd52l2 tumor protein D52-like 2 NM_028343 RIKEN cDNA 2810439K08 gene NM_138668 RIKEN cDNA 1810047C23 gene NM_177468 DNA segment, Chr 7, ERATO Doi 413, expressed NM_008951 Psmd4 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 4 NM_153600 RIKEN cDNA 9430097H08 gene NM_025661 Ormdl3 ORM1-like 3 (S. cerevisiae) NM_025446 Aig1 androgen-induced 1 NM_026009 RIKEN cDNA 2610204L23 gene NM_028074 Ddx42 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 42 NM_183020 A2lp ataxin 2 related protein NM_025687 Tex12 testis expressed gene 12 NM_025967 DNA segment, Chr 16, ERATO Doi 472, expressed NM_153536 RIKEN cDNA B130050I23 gene NM_001001332 Stfa1 stefin A1 NM_203507 BC016198 cDNA sequence BC016198 NM_183183 hypothetical protein C730021L23 NM_146234 BC032271 cDNA sequence BC032271 NM_027419 RIKEN cDNA 2810408A11 gene NM_177374 RIKEN cDNA 6720458F09 gene NM_021511 Rrs1 RRS1 ribosome biogenesis regulator homolog (S. cerevisiae) NM_178930 AW049900 expressed sequence AW049900 NM_011241 Rangap1 RAN GTPase activating protein 1 NM_026015 RIKEN cDNA 2610510L01 gene XM_358318 Eif4g1 eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 NM_026150 RIKEN cDNA 4921536K21 gene NM_138603 DXImx40e DNA segment, Chr X, Immunex 40, expressed NM_028287 RIKEN cDNA 2700019D07 gene NM_153515 RIKEN cDNA E230022H04 gene NM_009113 S100a13 S100 calcium binding protein A13 NM_011309 S100a1 S100 calcium binding protein A1 NM_133901 AI481500 expressed sequence AI481500 NM_019948 Clecsf9 C-type (calcium dependent, carbohydrate recognition domain) lectin, superfamily member 9 XM_193842 RIKEN cDNA 1500031H01 gene NM_001001326 St5 suppression of tumorigenicity 5 NM_019658 Shoc2 soc-2 (suppressor of clear) homolog (C. elegans) NM_199304 Znf341 zinc finger protein 341 NM_172465 Zdhhc9 zinc finger, DHHC domain containing 9 NM_007927 Emd Emerin NM_011189 Psme1 proteasome (prosome, macropain) 28 subunit, alpha BC069266 RIKEN cDNA 0610011F06 gene NM_009452 Tnfsf4 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 4 NM_027226 RIKEN cDNA 3830421F13 gene NM_172507 RIKEN cDNA A930014C21 gene NM_025780 RIKEN cDNA 9030625G08 gene BC006910 Cdk2ap1 CDK2 (cyclin-dependent kinase 2)-associated protein 1 NM_133996 D10Ucla2 DNA segment, Chr 10, University of California at Los Angeles 2 XM_133217 Eml2 echinoderm microtubule associated protein like 2 NM_133684 RIKEN cDNA 2810484M10 gene NM_028666 RIKEN cDNA 5430432M24 gene XM_149712 RIKEN cDNA 2210010N04 gene NM_010511 Ifngr interferon gamma receptor NM_173408 BC030335 cDNA sequence BC030335 NM_029610 RIKEN cDNA 4930404J24 gene NM_009419 Tpst2 protein-tyrosine sulfotransferase 2 NM_026451 RIKEN cDNA 1600012H06 gene NM_175173 RIKEN cDNA 0610012K18 gene NM_172730 RIKEN cDNA C130022K22 gene NM_146252 Tbc1d13 TBC1 domain family, member 13 NM_024262 RIKEN cDNA 1200011M11 gene NM_146183 RIKEN cDNA 2410005H09 gene 185

NM_145471 RIKEN cDNA E130306I01 gene NM_133209 Pilrb paired immunoglobin-like type 2 receptor beta NM_030252 BC003266 cDNA sequence BC003266 NM_175692 RIKEN cDNA A930034L06 gene NM_025317 Mrpl54 mitochondrial ribosomal protein L54 NM_008988 Punc putative neuronal cell adhesion molecule NM_178692 RIKEN cDNA C130074G19 gene NM_023331 Mrpl46 mitochondrial ribosomal protein L46 NM_173181 RIKEN cDNA 3110050N22 gene NM_026537 - - NM_030705 Mesdc1 mesoderm development candidate 1 NM_011956 Nubp2 nucleotide binding protein 2 NM_133697 RIKEN cDNA 1110003E01 gene NM_025865 RIKEN cDNA 2310030G06 gene NM_021564 Fetub fetuin beta NM_144927 BC019943 cDNA sequence BC019943 BC061236 RIKEN cDNA 4833422F06 gene NM_146105 RIKEN cDNA 9630058J23 gene NM_133203 Klra17 killer cell lectin-like receptor, subfamily A, member 17 NM_201373 RIKEN cDNA A130009K11 gene NM_024227 Mrpl28 mitochondrial ribosomal protein L28 NM_133886 AU040320 expressed sequence AU040320 NM_011986 Ncdn Neurochondrin NM_139200 Pscdbp pleckstrin homology, Sec7 and coiled-coil domains, binding protein NM_026111 RIKEN cDNA 1810019P04 gene XM_133225 Snrpd2 small nuclear ribonucleoprotein D2 NM_029632 Ppp1r11 protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 11 NM_019482 Panx1 pannexin 1 NM_023887 Gcnt2 glucosaminyl (N-acetyl) transferase 2, I-branching enzyme NM_010238 Brd2 bromodomain containing 2 NM_001004468 Tacc2 transforming, acidic coiled-coil containing protein 2 NM_010593 Jup junction plakoglobin XM_126957 Rdh12 retinol dehydrogenase 12 NM_172117 Entpd6 ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 6 NM_172205 Sbsn Suprabasin NM_182996 AI839920 expressed sequence AI839920 NM_175294 RIKEN cDNA 8430423A01 gene NM_020583 Isg20 interferon-stimulated protein NM_023876 Pax6 paired box gene 6 NM_026757 RIKEN cDNA 0610010K14 gene NM_173750 RIKEN cDNA 2700007P21 gene NM_025892 RIKEN cDNA 1500031L02 gene NM_175659 Hist1h2ah histone 1, H2ah NM_025598 RIKEN cDNA 2700038C09 gene NM_181316 RIKEN cDNA E130103I17 gene BC048780 Pla2g1br phospholipase A2, group IB, pancreas, receptor NM_172943 AW050020 expressed sequence AW050020 NM_032002 Nrg4 neuregulin 4 NM_023734 RIKEN cDNA 1200009H11 gene NM_178183 XM_194410 RIKEN cDNA 2510019J09 gene

Table S 8 : FTF and C/EBP common gene targets in fetal mouse liver.

GenBank id Symbol Name NM_201375 Kng2 kininogen 2 NM_027346 Ccdc44 coiled-coil domain containing 44 NM_133991 Ftsj1 FtsJ homolog 1 (E. coli) NM_134130 Abhd3 abhydrolase domain containing 3 NM_010581 Cd47 CD47 antigen (Rh-related antigen, integrin-associated signal transducer) NM_172888 Svs1 seminal vesicle secretory protein 1 NM_011044 Pck1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic 186

BC081468 Rpl18 ribosomal protein L18 NM_009093 Rps29 ribosomal protein S29 NM_016850 Irf7 interferon regulatory factor 7 NM_013653 Ccl5 chemokine (C-C motif) ligand 5 NM_010784 Mdk Midkine NM_009184 Ptk6 PTK6 protein tyrosine kinase 6 NM_178198 Hist1h2bj histone cluster 1, H2bj BC065803 Hist1h2ag histone cluster 1, H2ag NM_178188 Hist1h2ad histone cluster 1, H2ad NM_178195 Hist1h2bf histone cluster 1, H2bf NM_017369 Gabre gamma-aminobutyric acid (GABA-A) receptor, subunit epsilon NM_173408 Dcun1d3 DCN1, defective in cullin neddylation 1, domain containing 3 (S. cerevisiae) NM_029610 Lyrm1 LYR motif containing 1 NM_033475 Rab34 RAB34, member of RAS oncogene family NM_011817 Gadd45g Growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma NM_025865 2310030G06Rik RIKEN cDNA 2310030G06 gene BC048780 Pla2r1 phospholipase A2 receptor 1

Table S 9 : FTF common gene targets in fetal and adult mouse liver.

GenBank id Symbol Name NM_011044 Pck1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic NM_016774 Atp5b ATP synthase, H+ transporting mitochondrial F1 complex, beta subunit NM_133991 Ftsj1 FtsJ homolog 1 (E. coli) NM_026440 Rnmt RNA (guanine-7-) methyltransferase NM_153794 4933403F05Rik RIKEN cDNA 4933403F05 gene NM_026452 Coq9 coenzyme Q9 homolog (yeast) NM_134141 Ciapin1 cytokine induced apoptosis inhibitor 1 NM_134130 Abhd3 abhydrolase domain containing 3 NM_026530 Mpnd MPN domain containing NM_201375 Kng2 kininogen 2 NM_178188 Hist1h2ad histone cluster 1, H2ad NM_178195 Hist1h2bf histone cluster 1, H2bf NM_007699 Chrm4 cholinergic receptor, muscarinic 4 NM_178198 Hist1h2bj histone cluster 1, H2bj BC065803 Hist1h2ag histone cluster 1, H2ag NM_008065 Gabpa GA repeat binding protein, alpha NM_028131 2610510J17Rik RIKEN cDNA 2610510J17 gene NM_026844 2310061C15Rik RIKEN cDNA 2310061C15 gene NM_020008 Clec7a C-type lectin domain family 7, member a NM_029077 Trim14 tripartite motif-containing 14 NM_172888 Svs1 seminal vesicle secretory protein 1 NM_024290 Tnfrsf23 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 23 NM_175310 Aprin androgen-induced proliferation inhibitor

Table S 10 : C/EBP common gene targets in fetal and adult mouse liver.

GenBank id Symbol Name NM_201375 Kng2 kininogen 2 NM_026929 Chac1 ChaC, cation transport regulator-like 1 (E. coli) NM_028071 Cotl1 coactosin-like 1 (Dictyostelium) NM_023184 Klf15 Kruppel-like factor 15 NM_145215 Abhd11 Abhydrolase domain containing 11 NM_134130 Abhd3 Abhydrolase domain containing 3 NM_023125 Kng1 kininogen 1 NM_011723 Xdh xanthine dehydrogenase NM_030109 Sf3b2 splicing factor 3b, subunit 2 NM_146467 Olfr1388 olfactory receptor 1388 NM_173029 Sacy soluble adenylyl cyclase NM_009266 Sephs2 selenophosphate synthetase 2 NM_010324 Got1 glutamate oxaloacetate transaminase 1, soluble NM_172051 Tmcc3 transmembrane and coiled coil domains 3 NM_016974 Dbp D site albumin promoter bindingprotein 187

NM_029078 Pcf11 cleavage and polyadenylation factor subunit homolog (S. cerevisiae) NM_197980 Cox19 COX19 cytochrome c oxidase assembly homolog (S. cerevisiae) NM_019725 Tle2 transducin-like enhancer of split 2, homolog of Drosophila E(spl) NM_010260 Gbp2 guanylate nucleotide binding protein 2 NM_008707 Nmt1 N-myristoyltransferase 1 NM_054098 Steap4 STEAP family member 4 NM_008819 Pemt phosphatidylethanolamine N-methyltransferase NM_013547 Hgd homogentisate 1, 2-dioxygenase NM_011044 Pck1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic NM_016704 C6 complement component 6 NM_053115 Acox2 acyl-Coenzyme A oxidase 2, branched chain NM_178767 A530016O06Rik RIKEN cDNA A530016O06 gene NM_025859 Arl1 ADP-ribosylation factor-like 1 NM_028790 Acot12 acyl-CoA thioesterase 12 NM_008877 Plg plasminogen NM_008097 Gcdh glutaryl-Coenzyme A dehydrogenase NM_025826 Acadsb acyl-Coenzyme A dehydrogenase, short/branched chain NM_175115 Ikzf5 IKAROS family zinc finger 5 NM_029844 Mrap melanocortin 2 receptor accessory protein NM_010813 Mnt max binding protein NM_019811 Acss2 acyl-CoA synthetase short-chain family member 2 NM_027346 Ccdc44 Coiled-coil domain containing 44 NM_030676 Nr5a2 nuclear receptor subfamily 5, group A, member 2 NM_028731 D12Ertd551e DNA segment, Chr 12, ERATO Doi 551, expressed NM_026117 - - NM_172015 Iars isoleucine-tRNA synthetase NM_146118 Slc25a25 Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, phosphate carrier), member 25 NM_010581 Cd47 CD47 antigen (Rh-related antigen, integrin-associated signal transducer) NM_030210 Aacs acetoacetyl-CoA synthetase XM_129335 - - NM_008198 Cfb complement factor B NM_133879 Zbtb48 zinc finger and BTB domain containing 48 NM_007446 Amy1 amylase 1, salivary NM_007997 Fdxr ferredoxin reductase NM_008775 Pafah1b2 platelet-activating factor acetylhydrolase, isoform 1b, alpha2 subunit NM_029617 Casc5 cancer susceptibility candidate 5 NM_011287 Rpl10a ribosomal protein L10A NM_010476 Hsd17b7 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7 NM_146217 Aars alanyl-tRNA synthetase NM_178197 Hist1h2bh histone cluster 1, H2bh NM_013548 Hist1h3f histone cluster 1, H3f NM_053265 4930433N12Rik RIKEN cDNA 4930433N12 gene NM_010196 Fga fibrinogen, alpha polypeptide NM_027420 2610034B18Rik RIKEN cDNA 2610034B18 gene NM_144791 Tor1aip1 Torsin A interacting protein 1 NM_008563 Mcm3 minichromosome maintenance deficient 3 (S. cerevisiae) NM_133801 Gtf2f1 general transcription factor IIF, polypeptide 1 NM_198223 Aspscr1 alveolar soft part sarcoma chromosome region, candidate 1 (human) XM_133019 - - NM_033322 Lztfl1 leucine zipper transcription factor-like 1 NM_013465 Ahsg Alpha-2-HS-glycoprotein NM_133991 Ftsj1 FtsJ homolog 1 (E. coli) NM_144869 BC021614 CDNA sequence BC021614 NM_053119 Echs1 Enoyl Coenzyme A hydratase, short chain, 1, mitochondrial NM_025687 Tex12 Testis expressed gene 12 NM_133819 Ppp1r15b protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 15b NM_015728 Slc33a1 solute carrier family 33 (acetyl-CoA transporter), member 1 NM_145984 Prepl prolyl endopeptidase-like NM_198092 Usp2 ubiquitin specific peptidase 2 NM_134255 Elovl5 ELOVL family member 5, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_026787 1110012L19Rik RIKEN cDNA 1110012L19 gene NM_009761 Bnip3l BCL2/adenovirus E1B interacting protein 3-like NM_177767 Ogfod1 2-oxoglutarate and iron-dependent oxygenase domain containing 1 NM_026623 Nudt21 Nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 21 NM_009354 Tert telomerase reverse transcriptase 188

NM_022331 Herpud1 homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-like domain member 1 NM_013839 Nr1h3 nuclear receptor subfamily 1, group H, member 3 NM_026107 Zkscan6 zinc finger with KRAB and SCAN domains 6 NM_010247 Xrcc6 X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6 NM_134095 D15Wsu75e DNA segment, Chr 15, Wayne State University 75, expressed NM_030692 Sacm1l SAC1 (suppressor of actin mutations 1, homolog)-like (S. cerevisiae) NM_030694 Ifitm2 interferon induced transmembrane protein 2 NM_028771 Ccdc97 Coiled-coil domain containing 97 NM_153536 - - NM_026111 Qpctl glutaminyl-peptide cyclotransferase-like XM_133225 - - NM_019745 Pdcd10 programmed cell death 10 NM_009250 Serpini1 Serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade I, member 1 NM_172465 Zdhhc9 zinc finger, DHHC domain containing 9 XM_284425 - - NM_175155 Sash1 SAM and SH3 domain containing 1 NM_008907 Ppia peptidylprolyl isomerase A NM_021433 Stx6 syntaxin 6 NM_011076 Abcb1a ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1A NM_009778 C3 complement component 3 NM_008727 Npr1 natriuretic peptide receptor 1 NM_007498 Atf3 activating transcription factor 3 BC004768 6430706D22Rik RIKEN cDNA 6430706D22 gene NM_146150 Nrd1 nardilysin, N-arginine dibasic convertase, NRD convertase 1 NM_144866 Etf1 eukaryotic translation termination factor 1 NM_010891 Sept2 septin 2 NM_133808 Hdlbp high density lipoprotein (HDL) binding protein NM_173015 Mon1b MON1 homolog b (yeast) NM_025364 1110005A23Rik RIKEN cDNA 1110005A23 gene NM_024180 Ormdl2 ORM1-like 2 (S. cerevisiae) NM_009357 Tex261 Testis expressed gene 261 NM_021564 Fetub fetuinbeta NM_010401 Hal histidine ammonia lyase NM_153600 Ttc26 tetratricopeptide repeat domain 26 NM_133242 Rbm39 RNA binding motif protein 39 NM_011340 Serpinf1 serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade F, member 1 NM_011566 Tead3 TEA domain family member 3 NM_173347 Prune Prune homolog (Drosophila) NM_133858 4930504E06Rik RIKEN cDNA 4930504E06 gene NM_176982 A630050E13Rik RIKEN cDNA A630050E13 gene NM_183167 AI987944 expressed sequence AI987944 NM_011898 Spry4 sprouty homolog 4 (Drosophila) NM_010192 Fem1a feminization 1 homolog a (C. elegans) NM_170755 BC038286 cDNA sequence BC038286 NM_026977 1810031K17Rik RIKEN cDNA 1810031K17 gene NM_026030 Eif2s2 eukaryotic translation initiation factor 2, subunit 2 (beta) NM_028343 Tmem135 transmembrane protein 135 NM_017370 Hp haptoglobin NM_145537 Edem2 ER degradation enhancer, mannosidase alpha-like 2 NM_008542 Smad6 MAD homolog 6 (Drosophila) NM_145539 Tm4sf4 transmembrane 4 superfamily member 4 BC085235 Hbs1l Hbs1-like (S. cerevisiae) BC080744 Hook2 Hook homolog 2 (Drosophila) NM_007635 Ccng2 cyclin G2 NM_011189 Psme1 proteasome (prosome, macropain) 28 subunit, alpha NM_011971 Psmb3 proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type 3 NM_053173 Kifc1 kinesin family member C1 NM_021538 Cope coatomer protein complex, subunit epsilon NM_133862 Fgg fibrinogen, gamma polypeptide BC069266 0610011F06Rik RIKEN cDNA 0610011F06 gene NM_198164 Cdc2l6 cell division cycle 2-like 6 (CDK8-like) NM_177619 Myst2 MYST histone acetyltransferase 2 NM_027453 Btf3l4 Basic transcription factor 3-like 4 NM_025334 Txndc12 thioredoxin domain containing 12 (endoplasmic reticulum) NM_133653 Mat1a methionine adenosyltransferase I, alpha 189

NM_010244 Fv1 Friend virus susceptibility 1 NM_133873 D4Wsu114e DNA segment, Chr 4, Wayne State University 114, expressed NM_010884 Ndrg1 N-myc downstream regulated gene 1 NM_020262 Zfp109 zinc finger protein 109 NM_021307 Zfp112 zinc finger protein 112 NM_183183 Gprin3 GPRIN family member 3 BC046911 4833442J19Rik RIKEN cDNA 4833442J19 gene NM_020587 Sfrs4 splicing factor, arginine/serine-rich 4 (SRp75) NM_007597 Canx calnexin NM_178641 Inpp5f inositol polyphosphate-5-phosphatase F NM_026365 Jagn1 jagunal homolog 1 (Drosophila) NM_138668 1810047C23Rik RIKEN cDNA 1810047C23 gene NM_177607 4933430I17Rik RIKEN cDNA 4933430I17 gene NM_021498 Pole3 polymerase (DNA directed), epsilon 3 (p17 subunit) NM_013897 Timm8b translocase of inner mitochondrial membrane 8 homolog b (yeast) NM_025848 Sdhd succinate dehydrogenase complex, subunit D, integral membrane protein NM_144940 Uroc1 urocanase domain containing 1 NM_027865 Tmem25 transmembrane protein 25 NM_001004468 Tacc2 transforming, acidic coiled-coil containing protein 2 NM_172405 Ccdc98 Coiled-coil domain containing 98 NM_011169 Prlr prolactin receptor NM_027213 Med6 mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 6 homolog (yeast) NM_027129 2310035K24Rik RIKEN cDNA 2310035K24 gene NM_009467 Ugt2b5 UDP glucuronosyltransferase 2 family, polypeptide B5 NM_198660 - - NM_027419 2810408A11Rik RIKEN cDNA 2810408A11 gene NM_010787 Mea1 Protein phosphatase 2, regulatory subunit B (B56), delta isoform NM_027910 Klhdc3 kelch domain containing 3 NM_016763 Hsd17b10 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 10 NM_010938 Nrf1 nuclear respiratory factor 1 NM_008250 Hlx1 H2.0-like homeo box 1 (Drosophila) NM_172281 Rnf40 ring finger protein 40 NM_133996 Apon apolipoprotein N NM_173010 Ube3a ubiquitin protein ligase E3A NM_133840 Clp1 CLP1, cleavage and polyadenylation factor I subunit, homolog (S. cerevisiae) NM_019827 Gsk3b glycogen synthase kinase 3 beta NM_177647 Armetl1 arginine-rich, mutated in early stage tumors-like 1 NM_015765 Hspa14 heat shock protein 14 NM_024480 Sh3bp5l SH3 binding domain protein 5 like NM_133200 P2ry14 purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 14 NM_001003913 Mars methionine-tRNA synthetase NM_022987 Zic5 zinc finger protein of the cerebellum 5 NM_024183 Fip1l1 FIP1 like 1 (S. cerevisiae) NM_007972 F10 coagulation factor X NM_133657 Cyp2a12 cytochrome P450, family 2, subfamily a, polypeptide 12 NM_030705 Mesdc1 mesoderm development candidate 1 NM_025381 Atp6v1f ATPase, H+ transporting, lysosomal V1 subunit F BC057025 - Pentatricopeptide repeat domain 1 NM_153126 Nat10 N-acetyltransferase 10 NM_028287 2700019D07Rik RIKEN cDNA 2700019D07 gene NM_144795 Pycr1 pyrroline-5-carboxylate reductase 1 NM_009448 Tuba1c tubulin, alpha 1C NM_133219 Gcnt2 glucosaminyl (N-acetyl) transferase 2, I-branching enzyme NM_010442 Hmox1 Heme oxygenase (decycling) 1 NM_025849 3110001D03Rik RIKEN cDNA 3110001D03 gene NM_029272 Ndufs7 NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 7 NM_010749 M6pr mannose-6-phosphate receptor, cation dependent NM_007746 Map3k8 mitogen activated protein kinase kinase kinase 8 NM_013760 Dnajb9 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 9 NM_172943 Alkbh5 alkB,alkylation repair homolog 5 (E. coli) BC061235 Pcnp PEST proteolytic signal containing nuclear protein XM_130416 Gins1 GINS complex subunit 1 (Psf1 homolog) NM_178576 Cpsf4 cleavage and polyadenylation specific factor 4 BC083097 Ptcd1 pentatricopeptide repeat domain 1 NM_013617 Olfr64 olfactory receptor 64 190

NM_182995 6330503K22Rik RIKEN cDNA 6330503K22 gene NM_008917 Ppt1 palmitoyl-protein thioesterase 1 NM_008822 Pex7 peroxisome biogenesis factor 7 NM_133886 AU040320 expressed sequence AU040320 NM_011986 Ncdn neurochondrin NM_028666 5430432M24Rik RIKEN cDNA 5430432M24 gene NM_027878 1200002N14Rik RIKENcDNA 1200002N14 gene NM_133697 1110003E01Rik RIKEN cDNA 1110003E01 gene NM_013632 Pnp purine-nucleoside phosphorylase NM_025982 Tspan31 tetraspanin 31 NM_011304 Ruvbl2 RuvB-like protein 2 NM_008195 - predicted gene, EG545124 NM_011387 Slc10a1 solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 1 NM_199304 Zfp341 zinc finger protein 341 NM_145566 Hrbl HIV-1 Rev binding protein-like NM_010753 Mxd4 Max dimerization protein 4 NM_007808 Cycs cytochrome c, somatic NM_145540 Ints3 integrator complex subunit 3 NM_173453 Tmem11 transmembrane protein 11 NM_033596 Hist2h4 histone cluster 2, H4 NM_145073 Hist1h3g histone cluster 1, H3g NM_172644 Dars2 aspartyl-tRNA synthetase 2 (mitochondrial) NM_078479 Mrps21 mitochondrial ribosomal protein S21 NM_025415 Cks2 CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 NM_009121 Sat1 spermidine/spermine N1-acetyl transferase 1 NM_133684 Mosc2 MOCO sulphurase C-terminal domain containing 2 NM_134134 A630042L21Rik RIKEN cDNA A630042L21 gene BC083108 Hmgb2 high mobility group box 2 NM_011316 Saa4 serum amyloid A 4 NM_201373 Trim56 tripartite motif-containing 56 NM_027141 Spsb3 SplA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 3 NM_011956 Nubp2 nucleotide binding protein 2 NM_178692 C130074G19Rik RIKEN cDNA C130074G19 gene NM_028369 Mon1a MON1 homolog A (yeast) NM_133717 Rab43 RAB43, member RAS oncogene family NM_183020 Atxn2l ataxin 2-like NM_019822 Adrm1 adhesion regulating molecule 1 NM_009996 Cyp24a1 cytochrome P450, family 24, subfamily a, polypeptide 1 NM_026899 Ssu72 Ssu72 RNA polymerase II CTD phosphatase homolog (yeast) NM_019777 Ikbke inhibitor of kappaB kinase epsilon NM_008768 Orm1 orosomucoid 1 NM_009191 Clpb ClpB caseinolytic peptidase B homolog (E. coli) NM_009184 Ptk6 PTK6 protein tyrosine kinase 6 NM_177301 Hnrpl heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L NM_028672 4930430E16Rik RIKEN cDNA 4930430E16 gene NM_025828 Lman2 lectin, mannose-binding 2 NM_080557 Snx4 sorting nexin 4 NM_133880 Pafah2 platelet-activating factor acetylhydrolase 2 NM_177736 Lrrc61 leucine rich repeat containing 61 XM_358318 - - NM_009408 Top1 topoisomerase (DNA) I NM_011065 Per1 period homolog 1 (Drosophila) NM_011929 Clcn6 chloride channel 6 NM_145122 Pex16 peroxisome biogenesis factor 16 NM_013930 Aass aminoadipate-semialdehyde synthase NM_146234 Tmem32 transmembrane protein 32 NM_008943 Psen1 presenilin 1 NM_145543 Clcc1 chloride channel CLIC-like 1 NM_010463 Hoxc12 homeo box C12 NM_009419 Tpst2 protein-tyrosine sulfotransferase 2 NM_172722 C330023M02Rik RIKEN cDNA C330023M02 gene NM_130450 Elovl6 ELOVL family member 6, elongation of long chain fatty acids (yeast) NM_011979 Vnn3 vanin 3 NM_011817 Gadd45g growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma NM_007853 Degs1 degenerative spermatocyte homolog 1 (Drosophila) 191

NM_053200 Ces3 carboxylesterase 3 NM_018851 Samhd1 SAM domain and HD domain, 1 NM_009997 Cyp2a4 cytochrome P450, family 2, subfamily a, polypeptide 4 NM_173740 Maoa monoamine oxidase A NM_013768 Prmt5 protein arginine N-methyltransferase 5 NM_029632 Ppp1r11 protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 11 NM_030252 BC003266 cDNA sequence BC003266 NM_021345 Ptplad1 protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 1 NM_009101 Rras Harvey rat sarcoma oncogene, subgroup R NM_172841 Slco5a1 solute carrier organic anion transporter family, member 5A1 NM_138603 Ccdc22 coiled-coil domain containing 22 NM_016810 Gosr1 golgi SNAP receptor complex member 1 NM_011609 Tnfrsf1a tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1a

Table S 11 : FTF target genes in human liver cancer cell line Hep3B.

GenBank id Symbol Name Metabolism Lipid NM_000895 LTA4H leukotriene A4 hydrolase BC036471 CHKA choline kinase alpha NM_003167 SULT2A1 alcohol/hydroxysteroid sulfotransferase

Carbohydrate NM_002394 SLC3A2 4F2 cell-surface antigen heavy chain NM_003465 CHIT1 chitinase 1 (chitotriosidase) NM_016286 DCXR carbonyl reductase NM_001675 ATF4 activating transcription factor 4 NM_003549 HYAL3 hyaluronidase 3 BC001484 MDH1 cytosolic malate dehydrogenase

Amino acid NM_002108 HAL histidine ammonia-lyase BC001686 MAT2A methionine adenosyltransferase II, alpha NM_002161 IARS isoleucine tRNA ligase 1, cytoplasmic

DNA NM_002874 RAD23B RAD23 homolog B (S. cerevisiae) BC066238 HIST1H2BA H2B histone family, member U, (testis-specific) NM_004537 NAP1L1 HSP22-like protein interacting protein NM_021141 XRCC5 ATP-dependent DNA helicase II BC067093 CHAF1A chromatin assembly factor 1, subunit A (p150) NM_000179 MSH6 MutS homolog 6

RNA NM_004902 RBM39 coactivator of activating protein-1 and estrogen receptors NM_002937 RNASE4 angiogenin, ribonuclease, RNase A family, 5 BC024777 SNURF Angelman syndrome-5 NM_006414 RPP38 MRP 38kDa subunit

Other NM_022041 GAN giant axonal neuropathy (gigaxonin) BC035279 THEX1 3'exoribonuclease BC005954 NDUFS7 My017 protein BC066928 EIF4H eukaryotic translation initiation factor 4H NM_198920 C6orf157 chromosome 6 open reading frame 157 NM_016298 FBXO40 F-box protein 40 NM_004362 CLGN Calmegin BC016172 H2AFY2 Core histone macroH2A2.2 NM_016417 GLRX5 glutaredoxin 5 NM_024664 PPCS phosphopantothenoylcysteine synthetase

Transport NM_007347 AP4E1 adaptor-related protein complex 4, epsilon 1 subunit BC020961 SLC17A5 OTTHUMP00000039323 NM_006933 MRPS6 human solute carrier family 5, member 3, Sodium/myo-inositol cotransporter NM_004798 KIF3B kinesin family member 3B NM_177987 - HSA10p15 beta-tubulin 4Q BC011888 SLC35B1 solute carrier family 35, member B1 192

NM_005692 ABCF2 ABC-type transport protein NM_197965 SLC10A6 sodium-dependent organic anion transporter NM_000101 CYBA cytochrome b-245, alpha polypeptide NM_003490 SYN3 cN28H9.2 (synapsin III)

Transcription NM_004235 KLF4 endothelial Kruppel-like zinc finger protein BC030788 ZNF548 Zinc finger protein 17 NM_018119 POLR3E polymerase (RNA) III (DNA directed) polypeptide E NM_012204 GTF3C4 general transcription factor IIIC, polypeptide 4 (90kD) NM_013375 ABT1 activator of basal transcription 1 NM_173631 ZNF547 spondyloepiphyseal dysplasia, late, pseudogene NM_014415 ZBTB11 Zinc finger and BTB domain containing 11 NM_031218 ZNF93 Zinc finger protein 505 BC045626 PKNOX2 PBX BC060801 DPF3 2810403B03Rik NM_013450 BAZ2B bromodomain adjacent to zinc finger domain, 2B NM_016631 C21orf66 chromosome 21 open reading frame 66 NM_032458 PHF6 PHD finger protein 6 NM_182894 CHX10 ceh-10 homeo domain containing homolog NM_021998 ZNF711 dJ75N13.1 (znf6-like) BC039002 IRF2BP1 interferon regulatory factor 2 binding protein 1

Development NM_170589 CASC5 cancer susceptibility candidate 5 NM_002433 MOG MOG alpha-6 NM_002608 PDGFB Becaplermin NM_177524 MEST mesoderm specific transcript NM_019590 KIAA1217 KIAA1217 NM_000585 IL15 interleukin 15 NM_007281 SCRG1 scrapie responsive protein 1 NM_003506 FZD6 frizzled 6

Cell cycle BC007081 CCNL1 cyclin L1 BC034381 RBM7 RNA binding motif protein 7 NM_003591 CUL2 cullin 2 BC007308 RPS4X 40S ribosomal protein S4, X isoform BC013916 PCNP PEST-containing nuclear protein NM_024808 C13orf34 aurora borealis BC008437 CALM2 calmodulin 1 (phosphorylase kinase, delta) BC013136 MTBP hypothetical protein MGC21051 NM_172170 CAMK2G calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM kinase) II gamma

Response to stress NM_001512 GSTA4 glutathione S-alkyltransferase A4 BC053621 IL1RAP interleukin 1 receptor accessory protein BC002772 NDUFA6 Complex I-B14 NM_000748 CHRNB2 cholinergic receptor, nicotinic, beta 2 (neuronal) NM_000608 ORM2 alpha-1-acid glycoprotein, type 2 NM_002089 CXCL2 chemokine (C-X-C motif) ligand 2 BC063385 TRA T-cell antigen receptor, alpha polypeptide

Apoptosis NM_004620 TRAF6 TNF receptor-associated factor 6 NM_001191 BCL2L1 BCL2-like 1 NM_006595 API5 API5-like 1 NM_022037 TIA1 cytotoxic granule-associated RNA-binding protein NM_018947 CYCS cytochrome c NM_033503 BMF Bcl2 modifying factor

Proteolysis NM_003183 ADAM17 ADAM metallopeptidase domain 17 BC003061 LGMN asparaginyl endopeptidase NM_014265 ADAM28 adam 23 precursor NM_024539 RNF128 gene related to anergy in lymphocytes BC022804 HIP2 huntingtin interacting protein 2 BC024256 FBXL18 F-box and leucine-rich repeat protein 18

Signal NM_020134 DPYSL5 collapsin response mediator protein-5 193

transduction NM_002605 PDE8A cAMP-specific cyclic nucleotide phosphodiesterase 8A NM_005959 MTNR1B melatonin receptor 1B BC005270 NDUFS4 mitochondrial respiratory chain complex I (18-KD subunit) BC043610 P2RY8 G-protein coupled purinergic receptor P2Y8 NM_022825 PORCN 2410004O13Rik NM_005119 THRAP3 thyroid hormone receptor-associated protein, 150 kDa subunit NM_152730 C6orf170 bA301B7.2 (novel protein) NM_002881 RALB GTP binding protein BC000658 STC2 stanniocalcin 2 NM_203365 RAPH1 amyotrophic lateral sclerosis 2 (juvenile) chromosome region, candidate 18 BC060794 RARB HBV-activated protein NM_024577 SH3TC2 SH3 domain and tetratricopeptide repeats 2 NM_002927 RGS13 regulator of G-protein signalling 13 BC057809 ALCAM activated leucocyte cell adhesion molecule NM_181794 PKIB cAMP-dependent protein kinase inhibitor2 BC028074 SMAP1 stromal membrane-associated protein 1

Other BC005069 C2orf7 open reading frame 7 BC004498 CHCHD5 coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 5 NM_181428 - - BC002335 KLHDC2 host cell factor homolog NM_032127 C11orf56 chromosome 11 open reading frame 56 NM_004802 OTOF otoferlin NM_198995 C18orf34 chromosome 18 open reading frame 34 BC067743 C3orf17 chromosome 3 open reading frame 17 NM_015921 CUTA acetylcholinesterase-associated protein NM_031862 NBR1 membrane component, chromosome 17, surface marker 2 (ovarian carcinoma antigen CA125) NM_173522 - - NM_033426 KIAA1737 KIAA1737 NM_181337 KAAG1 kidney associated antigen 1 NM_013275 ANKRD11 ankyrin repeat-containing protein 11 NM_177965 C8orf37 chromosome 8 open reading frame 37 NM_021944 C14orf93 chromosome 14 open reading frame 93 BC039719 C1orf74 chromosome 1 open reading frame 74 BC063877 DENND1B DENN/MADD domain containing 1B NM_000412 HRG histidine-proline rich glycoprotein BC028381 BSDC1 BSD domain containing 1 NM_018372 C1orf103 chromosome 1 open reading frame 103 BC000272 DDX50 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 50 BC049850 NOC3L nucleolar complex associated 3 homolog NM_173511 ALS2CR13 amyotrophic lateral sclerosis 2 (juvenile) chromosome region, candidate 13 NM_020181 C14orf162 chromosome 14 open reading frame 162 NM_014455 ZNF364 Rabring 7 NM_015886 PI15 25 kDa trypsin inhibitor BC016559 SACM1L SAC1 suppressor of actin mutations 1-like (yeast) BC007526 CXorf34 chromosome X open reading frame 34 BC041788 GRINA glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-asparate-associated protein 1 BC008001 - - NM_152283 - - BC034823 IQCK IQ motif containing K NM_080650 ATPBD4 ATP binding domain 4 NM_006533 MIA melanoma inhibitory activity NM_022102 CCDC90A coiled-coil domain containing 90A

Table S 12 : FTF targets with circadian rhythm regulated transcription.

GenBank ID Name NM_013753 cDNA sequence X99384 NM_201239 ribonuclease, RNase A family 4 NM_010902 nuclear factor, erythroid derived 2, like 2 NM_146006 lanosterol synthase NM_173763 cysteine conjugate-beta lyase 2 194

NM_133991 similar to Ftsj homolog; FtsJ homolog 1 (E. coli) NM_145478 proviral integration site 3 NM_028790 acyl-CoA thioesterase 12 NM_025538 alkB, alkylation repair homolog 7 (E. coli) NM_011065 period homolog 1 (Drosophila) NM_013917 pituitary tumor-transforming gene 1 NM_009266 selenophosphate synthetase 2 NM_027250 RIKEN cDNA 2010305A19 gene NM_029083 DNA-damage-inducible transcript 4 NM_138583 DNA segment, Chr 16, human D22S680E, expressed NM_013867 breast cancer anti-estrogen resistance 3 NM_018808 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 1 NM_178727 RIKEN cDNA D630039A03 gene NM_145925 pituitary tumor-transforming 1 interacting protein NM_011994 ATP-binding cassette, sub-family D (ALD), member 2 NM_133898 NEDD4 binding protein 2-like 1 NM_145632 predicted gene 7511; polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide H NM_212442 acyl-CoA synthetase medium-chain family member 3 NM_053200 carboxylesterase 3 NM_007519 bile acid-Coenzyme A: amino acid N-acyltransferase NM_007962 myelin protein zero-like 2 NM_013747 golgi autoantigen, golgin subfamily a, 5 NM_175229 serine/arginine repetitive matrix 2; similar to Serine/arginine NM_027141 splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 3 NM_018869 G protein-coupled receptor kinase 5 NM_020577 arsenic (+3 oxidation state) methyltransferase NM_030251 ankyrin repeat and BTB (POZ) domain containing 1 NM_026554 nuclear cap binding protein subunit 2 NM_177460 poly (ADP-ribose) polymerase family, member 16 NM_026444 citrate synthase NM_029844 melanocortin 2 receptor accessory protein NM_019822 adhesion regulating molecule 1; similar to Adhesion regulating molecule 1 NM_007635 cyclin G2 NM_013608 nascent polypeptide-associated complex alpha polypeptide NM_013490 choline kinase alpha NM_145824 RAN binding protein 10 NM_133996 apolipoprotein N NM_013614 predicted gene 6742; ornithine decarboxylase, structural 1; similar to Ornithine decarboxylase (ODC) NM_133836 interleukin 15 receptor, alpha chain NM_172254 DPH3 homolog (KTI11, S. cerevisiae) NM_007808 predicted gene 10108; cytochrome c, somatic; predicted gene 10053 NM_021450 transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 7 NM_007953 estrogen related receptor, alpha NM_153794 RIKEN cDNA 4933403F05 gene NM_172541 transmembrane protein 120A NM_144940 urocanase domain containing 1 NM_010292 glucokinase NM_019422 elongation of very long chain fatty acids (FEN1/Elo2, SUR4/Elo3,yeast)-like 1 NM_008061 glucose-6-phosphatase, catalytic NM_175094 pyruvate dehydrogenase complex, component X; similar to pyruvate dehydrogenase complex, component X NM_009412 similar to Tpd52 protein; tumor protein D52 NM_172595 ADP-ribosylation factor-like 15 NM_009354 telomerase reverse transcriptase NM_011044 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic NM_139149 fusion, derived from t(12;16) malignant liposarcoma (human) NM_021345 protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 1 NM_007506 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit c (subunit 9), isoform 1 NM_178398 WD repeat domain, phosphoinositide interacting 2 NM_016898 CD164 antigen NM_178896 DCN1, defective in cullin neddylation 1, domain containing 4 (S.cerevisiae) NM_007618 serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 6 NM_130450 predicted gene 11295; ELOVL family member 6, elongation of longchain fatty acids (yeast) NM_011638 transferrin receptor NM_173757 mitochondrial ribosomal protein S27 NM_175155 SAM and SH3 domain containing 1; predicted gene 2082 195

NM_007836 growth arrest and DNA-damage-inducible 45 alpha NM_010367 membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing1 NM_025999 predicted gene 10179; ring finger protein 141 NM_145460 oxidoreductase NAD-binding domain containing 1 NM_145368 acyl-coenzyme A amino acid N-acyltransferase 2 NM_024255 hydroxysteroid dehydrogenase like 2 NM_013808 cysteine and glycine-rich protein 3 NM_016978 ornithine aminotransferase NM_020282 NAD(P)H dehydrogenase, quinone 2 NM_016668 betaine-homocysteine methyltransferase NM_026570 YEATS domain containing 4 NM_007824 cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1 NM_145405 ubiquitin-like 4 NM_026844 RIKEN cDNA 2310061C15 gene NM_026791 F-box and WD-40 domain protein 9 NM_026519 transmembrane protein 85 NM_011675 uridine-cytidine kinase 1; predicted gene 4482