UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
VIVIAN ZAMBON
DINÂMICA DE PRODUÇÃO DE NÉCTAR E ESTRATÉGIAS REPRODUTIVAS EM BROMELIACEAE: UMA ABORDAGEM MORFOFUNCIONAL
NECTAR PRODUCTION DINAMYCS AND REPRODUCTIVE STRATEGIES IN BROMELIACEAE: A MORPHOFUNCTIONAL PERSPECTIVE
CAMPINAS 2020 VIVIAN ZAMBON
DINÂMICA DE PRODUÇÃO DE NÉCTAR E ESTRATÉGIAS REPRODUTIVAS EM BROMELIACEAE: UMA ABORDAGEM MORFOFUNCIONAL
NECTAR PRODUCTION DINAMYCS AND REPRODUCTIVE STRATEGIES IN BROMELIACEAE: A MORPHOFUNCTIONAL PERSPECTIVE
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Vegetal.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Plant Biology.
Orientadora: MARLIES SAZIMA
Coorientadora: ADRIANA PINHEIRO MARTINELLI
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA VIVIAN ZAMBON E ORIENTADA PELA PROF. DRA. MARLIES SAZIMA.
CAMPINAS
2020
Campinas, 25 de novembro de 2020.
COMISSÃO EXAMINADORA
Dra. Adriana Pinheiro Martinelli
Dra. Kayna Agostini
Profa. Dra. Juliana Lischka Sampaio Mayer
Dr. Leonardo de Melo Versieux
Dr. Kleber Resende Silva
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal do Instituto de Biologia.
Agradecimentos
Agradeço a tudo e a todos que guiaram meus passos até aqui e que me permitiram viver as experiências mais inesquecíveis e enriquecedoras. Agradeço aos meus mestres, por despertarem em mim a curiosidade e o prazer pelo conhecimento.
À minha orientadora, Prof. Marlies Sazima, por toda experiência compartilhada e por todos os ensinamentos acadêmicos e de vida (que mesmo que por vezes calada, me inspirou e ensinou muito sobre o bem viver). Agradeço imensamente por cada palavra doce de incentivo e por cada troca que a vida nos proporcionou!
À minha coorientadora, Prof. Adriana Pinheiro Martinelli, por todo apoio, incentivo e por sempre manter as portas do CENA (Centro de Energia Nuclear na Agricultura – USP) abertas para tudo que eu precisei ao longo dessa trajetória. Agradeço pelo seu entusiasmo e por sempre acreditar que somos capazes de realizar tudo o que quisermos!
À Prof. Kayna Agostini, por me acompanhar e me incentivar ao longo de toda essa trajetória acadêmica e por despertar em mim o encanto pelas flores e seus polinizadores, sempre falando sobre eles de uma forma apaixonante! Obrigada por compartilhar tanto conhecimento comigo e com todos que podem ter o prazer de aprender com você!
Ao Prof. Massimo Nepi, por me receber com tanto carinho e entusiasmo na Universidade de Siena, proporcionando experiências incríveis e trocas de conhecimento que fizeram toda a diferença no desenvolvimento dessa tese. Agradeço pelas discussões riquíssimas, por me mostrar as belezas de Siena e Florença e por todos os frutos que esse período gerou! Agradeço também ao Prof. Etore Pacini, do Orto Botanico di Siena, por todas as conversas e por todo carinho.
À minha família, pelo apoio incondicional e suporte em todos os momentos da minha vida! Não seria nem um pouquinho do que sou sem o suporte e o amor que recebi dos meus pais, meus irmãos e meus avós. A eles, minha eterna gratidão.
À Mônica Lanzoni Rossi, técnica do laboratório de Histopatologia em Plantas do CENA (Centro de Energia Nuclear na Agricultura – USP), pela imensa ajuda na elaboração das amostras e nas análises em microscopia. Seu apoio e sua alegria em cada etapa dessas análises foram essenciais para o desenvolvimento desse trabalho! Agradeço pelo tempo em que pudemos conviver e por todo aprendizado compartilhado.
Aos amigos do CENA: Tati, Juci, Brayan e Sílvia, por todo a apoio e alegrias compartilhadas! E um agradecimento especial à Sandra Santa Rosa, por toda ajuda no laboratório, no campo (enfrentando até a madrugada comigo para coletar néctar!) e em todas as etapas importantes desse doutorado, sempre me encorajando e partilhando as alegrias e ansiedades desse período. Agradeço pela pesquisa ter me apresentado pessoas tão especiais e queridas, que quero levar comigo pra vida toda.
Aos amigos e parceiros de viagens de campo Nathi e Pedro, por todas as nossas viagens ao Parque Nacional de Itatiaia, pelas conversas e risadas e por toda ajuda de sempre! Vou levar sempre comigo e com muito carinho tudo que vivemos e compartilhamos!
Aos professores Leonardo Versieux, Kayna Agostini e Juliana Lischka Sampaio Mayer pelas contribuições no exame de qualificação.
Às minhas amigas Amália, Lidi, Suelen, Jana, Júlia, Gabi e Mayra por serem a rede que me segura em tantos momentos dessa vida! Agradeço por todo o amor, parceria e por serem minhas maiores incentivadoras sempre. Obrigada por estarem sempre ao meu lado, comemorando juntinho todas as minhas conquistas! “Quem tem um amigo, tem tudo!”
Ao Centro de Microscopia e Imagem (Fop/Unicamp) e ao NAP/MEPA (Esalq/Usp) pela disponibilidade de equipamentos para observações em microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão.
Aos técnicos do Laboratório de Fisiologia Molecular de Plantas (LaFiMP – Unicamp) pelo auxílio nas análises de composição de néctar.
Finalmente, agradeço aos funcionários e diretores do Parque Nacional de Itatiaia pela disponibilidade dos alojamentos e por permitirem a realização de pesquisas nas áreas do parque. Agradeço também a todos os amigos que me ajudaram nos experimentos e coletas, nas caminhadas e nas conversas ao longo desses anos no Parque.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Cnpq) – processo 141877/2019-7.
Resumo
Dentre os atributos florais presentes em plantas, o néctar tem um importante papel na atração de polinizadores, uma vez que é fonte de recursos energéticos para diversos animais. Os fatores envolvidos com a dinâmica de produção de néctar frequentemente apresentam variações inter e intraespecíficas, as quais podem estar associadas a fatores ambientais e ecológicos, bem como à diversidade ultraestrutural do nectário floral. De maneira geral, muitas vezes essas variações podem indicar aspectos importantes de estratégias reprodutivas em plantas. Assim, este trabalho teve como objetivo principal avaliar a dinâmica da produção de néctar sob uma perspectiva morfofuncional, utilizando como estudo de caso espécies de bromélias polinizadas por diferentes grupos de animais. Os resultados obtidos reforçam a importância e a influência do ritmo de produção de néctar, bem como de sua composição na riqueza e frequência de diferentes grupos de polinizadores. As características morfoanatômicas e ultraestruturais dos nectários florais das espécies estudadas também explicam grande parte dos aspectos envolvidos nas variações na dinâmica de produção de néctar entre elas, especialmente referente ao ritmo de secreção e à concentração de açúcares e aminoácidos no néctar. Em linhas gerais, esses resultados sugerem que a ação dos polinizadores influencia o ritmo da produção de néctar de forma considerável em todas as espécies estudadas, no entanto a singularidade do aparato morfoanatômico dos nectários florais responde fortemente por aspectos qualitativos e quantitativos dessa produção. Reforça-se a necessidade de estudos pertinentes à fisiologia vegetal para uma completa compreensão do funcionamento da produção de néctar em diferentes espécies.
Palavras-chave: interação planta-polinizador, nectários florais, estratégias reprodutivas.
Abstract
Among the floral attributes present in plants, nectar has an important role in attracting pollinators, since it is a source of energetic resources for several animals. The factors involved in nectar production dynamics often show inter- and intraspecific variations, which may be associated with environmental and ecological factors, as well as with the ultrastructural diversity of the floral nectary. In general, these variations can often indicate important aspects of reproductive strategies in plants. Thus, this work aims to evaluate nectar productiondynamics from a morphofunctional perspective, using as a case study bromeliads species pollinated by different groups of animals. The obtained results reinforce the importance and influence of the pace of nectar production, as well as its composition in the diferente groups of pollinators richness and frequency. The morphoanatomical and ultrastructural characteristics of floral nectaries also explain a considerable part of the aspects involved in nectar production dynamics variations among them, especially regarding the secretion rate and nectar sugar concentration. In general, these results suggest that the pollinators action influences the rhythm of nectar production considerably in all studied species, however the singularity of the floral nectaries morpho-anatomical is strongly related with qualitative and quantitative aspects of this production. The need for studies relevant to plant physiology is reinforced for a complete understanding of nectar production in different species.
Key words: plant-pollinator interactions, floral nectaries, reproductive strategies.
Sumário
Introdução Geral ...... 12
Referências...... 14
Capítulo 1 – Dinâmica de produção de néctar e estratégias reprodutivas em
Bromeliaceae: aspectos ecológicos...... 17
Introdução...... 18
Material e Métodos...... 21
Resultados...... 25
Discussão...... 65
Considerações Finais...... 81
Referências...... 82
Capítulo 2 – Relação néctar e nectário: aspectos da composição de néctar e morfoanatomia de nectários florais em Bromeliaceae ...... 91
Introdução...... 92
Material e Métodos...... 94
Resultados...... 96
Discussão...... 128
Considerações Finais...... 145
Referências...... 146
Capítulo 3 – Biologia floral e da polinização de Fernseea itatiaie: um estudo de caso de uma espécie ameaçada de extinção ...... 152 Introdução...... 153
Material e Métodos...... 155
Resultados...... 158
Discussão...... 166
Considerações Finais...... 172
Considerações Finais e Perspectivas...... 173
Referências...... 174
Anexo I - Termo de aprovação da pesquisa – Comitê de Bioética e Biossegurança...... 180
Anexo II - Declaração – Lei nº 9610/98...... 181
12
Introdução Geral
A polinização é um processo fundamental para a reprodução de grande parte das angiospermas, uma vez que cerca de 90% possui algum nível de dependência de vetores bióticos para transferência de pólen (Ollerton et al., 2011). Para atrair seus visitantes, as plantas polinizadas bioticamente apresentam determinados atributos florais, como recursos, coloração e odores específicos. Dentre os recursos florais que atuam como mediadores na interação planta-polinizador, o néctar apresenta papel fundamental como fonte de energia para muitas espécies de animais (Wilson, 1983; Parachnowitsch et al., 2019). A dinâmica de produção de néctar envolve alguns aspectos, como os padrões envolvidos nos processos de secreção, interrupção e reabsorção, os quais podem apresentar variações inter e intraespecíficas, que frequentemente podem estar relacionadas a estratégias reprodutivas em plantas (Pike, 2016). As estratégias reprodutivas podem ser entendidas como um complexo de atributos determinantes para a reprodução das plantas e são construídas a partir de várias características morfológicas e fisiológicas na história de vida das plantas, cada uma delas interferindo de alguma forma no sucesso reprodutivo da espécie (Doust, 1989). De forma geral, existem duas causas principais para a apresentação de estratégias reprodutivas: restrições de desenvolvimento e forças evolutivas, como a seleção natural, sendo ambas as causas não excludentes (Doust, 1989). Estudos sobre estratégias reprodutivas relacionadas à dinâmica de produção de néctar geralmente envolvem aspectos pertinentes à sua reabsorção, isto é, ao reaproveitamento energético de fontes de carboidratos para posterior formação de frutos e sementes (Búrquez & Corbet, 1991; Stpiczynska, 2005). No entanto, ainda existem lacunas sobre outros aspectos que possam estar diretamente relacionados a estratégias reprodutivas e produção de néctar, como questões envolvidas com a morfoanatomia de nectários florais e com as interações ecológicas, como a polinização, por exemplo (McDade e Weeks, 2004). Assim, estudos envolvendo espécies filogeneticamente próximas, com diferentes sistemas de polinização, bem como hábitos de vida distintos, podem auxiliar na elucidação de questões importantes sobre as causas da variação na produção de néctar. Esses fatores – isolados ou em
13
conjunto - podem contribuir positivamente para uma maior compreensão da dinâmica de produção de néctar, proporcionando diferentes variáveis a serem avaliadas. Nesse contexto, a família Bromeliaceae Juss. representa um modelo de estudo interessante, uma vez que o principal recurso floral ofertado por essas espécies é o néctar, que responde por uma porcentagem considerável dos recursos alimentares utilizados por beija-flores (Sazima et al., 1996), morcegos (Sazima et al., 1999) e abelhas (Kamke et al., 2011) em diferentes formações florestais do Brasil. A família Bromeliaceae Juss possui 58 gêneros e 3.352 espécies e compõe a maior família com distribuição natural essencialmente restrita ao Novo Mundo (Luther, 2012). No Brasil, são encontrados cerca de 40 gêneros e 1.500 espécies, sendo 650 endêmicas (Benzing & Bennett, 2000), números que constantemente são ampliados devido às descobertas de novos táxons (Wanderley & Martins, 2007). Espécies de bromélias são encontradas em todos os biomas brasileiros, no entanto a maior diversidade está concentrada na Mata Atlântica e no Cerrado (Flora do Brasil, 2020). Essas espécies também costumam apresentar floração sequencial, um padrão fenológico fundamental para a permanência e manutenção da guilda de polinizadores na área em que ocorrem (Fischer & Araújo, 1995). Em Bromeliaceae, variações interespecíficas na produção de néctar de determinadas espécies já foram encontradas, especialmente quanto a características de sua composição de açúcares e aminoácidos, o que sugere fortes evidências de que a composição do néctar seja determinada a partir da preferência dos polinizadores e não por relações filogenéticas (Krömer et al., 2007). Em relação a outros aspectos envolvidos na produção de néctar em espécies de Bromeliaceae, Stahl et al. (2012) observaram que a atividade dos polinizadores se reflete diretamente na produção total de néctar, bem como em sua concentração de açúcares. A partir de uma perspectiva mais qualitativa, Ordano & Ornelas (2004) observaram que o efeito da retirada de néctar em duas espécies do gênero Tillandsia apresentou forte resposta positiva às sucessivas visitas, repondo o néctar consumido em até três vezes adicionais. Nessa perspectiva, considerando que estudos recentes relatam que as características do néctar em bromélias são fortemente relacionadas às preferências de seus polinizadores (Krömer et al., 2008; Stahl et al., 2012), estudos sobre a dinâmica de produção de néctar nessas espécies podem auxiliar na elucidação sobre
14
o funcionamento de estratégias reprodutivas a partir da produção de um recurso floral. Adicionalmente, compreender como os polinizadores alteram seu comportamento de forrageamento em resposta às mudanças nas características florais – como a composição e quantidade de açúcares no néctar – pode contribuir para o conhecimento sobre estratégias adaptativas em plantas (Pyke, 1991). Assim, o objetivo principal dessa tese foi estudar a dinâmica de produção de néctar e a morfoanatomia de nectários florais das seguintes espécies de Bromeliaceae do Parque Nacional de Itatiaia (PNI): Aechmea vanhoutteana, Billbergia distachia, Canistropsis marceloi, Fernseea itatiaiae, Nidularium itatiaiae, Vriesea gradata e Vriesea itatiaiae. No primeiro capítulo, a dinâmica de produção de néctar foi analisada a partir de uma perspectiva ecológica, considerando as interações planta-polinizador e aspectos de vida da planta, como hábito de crescimento e características ambientais. A relação entre o padrão de secreção, interrupção e reabsorção de néctar com a morfoanatomia e ultraestrutura dos nectários florais foi discutida no segundo capítulo, estabelecendo dessa forma, uma relação entre os conteúdos discutidos nos dois primeiros capítulos. Por fim, no terceiro capítulo analisou-se um estudo de caso da biologia floral e da polinização de uma espécie ameaçada de extinção: Fernseea itatiaie.
Referências
Benzing, D.H., Bennett, B. 2000. Bromeliaceae: profile of an adaptive radiation. Reino Unido: Cambridge University Press.
Burquez A., Corbet S.A. 1991. Do flowers reabsorb nectar? Functional Ecology 5: 369–379.
Doust, J.L. 1989. Plant reproductive strategies and resource allocation. Trends in ecology & Evolution 4: 230-234.
Fischer, E.A., Araujo, A.C. 1995. Spatial organization of a bromeliad community in the Atlantic rainforest, south-eastern Brazil. Journal of Tropical Ecology 559-567.
15
Flora do Brasil. 2020 em construção. Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016. Disponível em:< http://floradobrasil. jbrj. gov. br/>. Acesso em 19 jan. 2020.
Kamke, R., Schimid, S., Zillikens, A., Lopes, B.C., Steiner, J. 2011. The importance bees as pollinators in the short corolla bromeliad Aechmea caudata in southern Brazil. Flora 206: 749-756.
Krömer, T., Kessler, M., Lohaus, G., Schmidt-Lebuhn, A.N. 2008. Nectar sugar composition and concentration in relation to pollination syndromes in Bromeliaceae. Plant Biology 10: 502- 511.
Luther, H.E. 2012. An alphabetical list of bromeliad binomials. Marie Selby Botanical Gardens and Bromeliad Society. International.
McDade, L.A., Weeks, J.A. 2004. Nectar in hummingbird‐pollinated Neotropical plants I: patterns of production and variability in 12 species. Biotropica 36: 196-215.
Ordano, M., Ornelas, F.O. 2004. The cost of nectar replenishment in two epiphytic bromeliads. Journal of Tropical Ecology 21: 541-547.
Parachnowitsch, A.L., Manson, J.S., Sletvold, N. 2019. Evolutionary ecology of nectar. Annals of Botany 20: 1-15.
Pike, G.H. 1991. What does it cost a plant to produce floral nectar? Nature 350: 58-59.
Pyke, G.H. 2016. Floral nectar: pollinator attraction or manipularion? Trends in Ecology & Evolution 31: 339-341.
Sazima, I., Buzato, S., Sazima, M. 1996. An assemblage of hummingbird‐pollinated flowers in a montane forest in southeastern Brazil. Botanica Acta 109: 149-160.
16
Sazima, M., Buzato, S., Sazima, I. 1999. Bat-pollinated flower assemblages and bat visitors at two Atlantic forest sites in Brazil. Annals of Botany 83: 705-712.
Stahl, J.M., Nepi, M., Galetto, L., Guimarães, E., Machado, S.R. 2012. Functional aspects of floral nectar secretion of Ananas ananassoides, an ornithophilous bromeliad from the Brazilian savanna. Annals of Botany 109: 1243-1252.
Stpiczynska, M., Davies, K.L., Gregg, A. 2005. Comparative account of nectary structure in Hexisea imbricate (Lindl.) Rchb.f. (Orchidaceae). Annals of Botany 95: 749–756.
Wanderley, M.G.L., Martins, S.E. 2007. Bromeliaceae. In: Wanderley, M.G.L., Shepherd, G.J., Melhem, T.S.A., Giulietti, A.M. (Coords.). Flora Fanerogâmica do Estado de São Paulo. São Paulo: Instituto de Botânica.
Wilson, M.F. 1983. Plant reproductive ecology. New York: John Wiley and Sons. 360p.
17
Capítulo 1
Aspectos ecológicos da dinâmica de produção de néctar em Bromeliaceae
18
Introdução
Dentre os atributos florais encontrados em plantas polinizadas bioticamente, o néctar representa uma importante fonte de recursos energéticos para muitos grupos de animais (Wilson, 1983; Parachnowitsch et al., 2019). Juntamente com as características morfológicas e de coloração da flor, as características específicas do néctar – composição química, volume, entre outras – atuam como determinantes na relação planta-polinizador (Proctor et al., 1996). A produção de néctar pode apresentar variações significativas e em diferentes escalas: entre distintas espécies, entre populações e indivíduos de uma mesma espécie e também entre flores de um mesmo indivíduo (Agostini et al., 2014). Do ponto de vista evolutivo, as variações e similaridades nos aspectos que envolvem a produção de néctar são frequentemente interpretadas como moduladas pela ação de visitantes florais, indicando que estas características seriam resultado de adaptações das plantas às preferências de seus polinizadores (Baker et al., 1998). Em relação às bases moleculares associadas a essa produção, estudos realizados com Arabidopsis sp. indicam que o tecido nectarífero é independente do modelo ABC do desenvolvimento floral, ou seja, o nectário seria potencialmente “livre” para se modificar ao longo do processo evolutivo da flor, em resposta a pressões exercidas por fatores ecológicos, como as interações, por exemplo (Baum et al., 2001). Por outro lado, sob uma perspectiva ecológica, estudos vêm mostrando que o papel do néctar no estabelecimento da relação planta-polinizador não se resume apenas na produção de um recurso energético por parte da planta e do consumo desse recurso por parte do animal (Nepi, 2017). A variação em sua composição química, por exemplo, pode indicar proteção contra microrganismos e patógenos, bem como modular o comportamento de seus consumidores (Nepi, 2017). Por ser uma substância largamente complexa e de composição variável, o néctar pode estar relacionado a variados processos ecológicos e também indicar aspectos importantes da estratégia reprodutiva da planta (Truchado et al., 2008). Pyke (2016) sugere que o néctar pode ser definido como “pollinator manipulant”, uma vez que o mesmo pode “controlar” o comportamento do polinizador, afetando a transferência de pólen e, consequentemente, o sucesso reprodutivo da planta.
19
As variações intra e inter-específicas na produção de néctar são associadas a causas diversas, tanto bióticas quanto abióticas (Freeman & Head, 1990). Fatores como temperatura e umidade do ar, presença ou ausência de animais pilhadores, estágio de desenvolvimento floral, características fisiológicas da planta e remoção sucessiva do néctar têm sido atribuídos às variações intra e interespecíficas na dinâmica do néctar em determinadas espécies (Baker & Baker, 1983; Galetto & Bernardello, 2005). O néctar de flores nas quais o nectário se apresenta de maneira exposta ao ambiente, por exemplo, pode sofrer intensa influência da umidade do ar, uma vez que a baixa umidade relativa favorece a evaporação da água, tornando o néctar mais concentrado, enquanto que o contrário tende a favorecer a diluição do néctar (Corbet, 2003). Por outro lado, a temperatura também pode exercer influência no padrão de secreção do néctar através da alteração na taxa fotossintética da planta, (Burquéz & Corbet, 1991). A atividade dos polinizadores também pode atuar como um fator influente na dinâmica de produção de néctar, como foi reportado em um experimento com duas espécies do gênero Aquilegia (Ranunculaceae) mantidas em condições de campo e de casa de vegetação (Canto et al., 2007). Constatou-se que a variação intraespecífica na composição de açúcares no néctar foi significativamente maior em plantas que estavam em condições naturais do que as que foram mantidas em casa de vegetação e sem contato com polinizadores (Canto et al., 2007). Como possíveis causas dessa variação, atribuiu-se a ação de microrganismos trazidos pelos polinizadores (Davis, 1997), a remoção do néctar pelos polinizadores (Galetto & Bernardello, 1993) e também as enzimas presentes em secreções hipofaringeais dos insetos polinizadores (Roy et al., 2017), as quais podem hidrolisar a sacarose em glicose e frutose. Em sua composição, o néctar pode conter muitos nutrientes, como açúcares, aminoácidos, ácidos orgânicos, proteínas, lipídios, vitaminas e até mesmo alguns metabólitos secundários como terpenos, alcaloides e flavonóides, o que o caracteriza como uma substância largamente complexa (Truchado et al., 2008). Há três tipos principais de açúcares presentes no néctar: glicose e frutose (hexoses) e sacarose (dissacarídeo) (Percival, 1961). De acordo com alguns autores (Baker & Baker 1983; Stiles & Freeman 1993; Krömer et al., 2008), diferentes proporções desses açúcares no néctar podem predizer o principal polinizador da espécie, de acordo com suas
20
necessidades energéticas e restrições fisiológicas, assim como a preferência pelos sabores. Flores que produzem néctar com alta quantidade de sacarose, por exemplo, são frequentemente visitadas por beija-flores, moscas e borboletas, enquanto que as que produzem néctar com maior quantidade de hexoses têm como visitantes frequentes as abelhas, os morcegos e algumas espécies de aves (Stiles & Freeman, 1993). Assim como os açúcares, a composição de outros compostos no néctar também pode variar entre espécies e impactar na relação planta-polinizador. Entretanto, poucos estudos foram realizados nesse sentido e a função biológica desses compostos no néctar ainda não é claramente entendida (Galetto & Bernardello, 2005), especialmente quanto às proteínas, que são os solutos mais abundantes depois do açúcar e compõem uma alta variedade de aminoácidos essenciais e não essenciais (Petanidou et al., 2006). Em algumas espécies de plantas, foram identificados no néctar os vinte tipos de aminoácidos encontrados em proteínas, os quais representam uma importante fonte de nitrogênio para polinizadores nectarívoros (Nicolson & Thornburg, 2007). Nessa perspectiva, neste capítulo é proposto o estudo da dinâmica de produção de néctar a partir de uma abordagem ecológica e reprodutiva, levando-se em conta como fatores relacionados à estratégia reprodutiva da planta podem estar interligados com distintos padrões de produção de néctar e como esse processo pode se refletir na relação planta-polinizador nas seguintes espécies de Bromeliaceae: Aechmea vanhoutteana, Billbergia distachia, Canistropsis marceloi, Fernseea itatiaiae, Nidularium itatiaiae, Vriesea gradata e Vriesea itatiaiae do Parque Nacional do Itatiaia (PNI). Para tanto, buscou-se responder as seguintes questões: 1) Levando-se em conta que a dinâmica de produção de néctar pode refletir fortemente aspectos da estratégia reprodutiva da planta, espécies com diferentes níveis de dependência de polinizadores investem de maneiras distintas nessa produção? Por outro lado, as variações na frequência de visitantes florais ao longo do período da antese floral também podem estar relacionadas ou até mesmo modular o padrão de produção de néctar? Espera-se que espécies com diferentes níveis de dependência de polinizadores para reprodução, isto é, com sistemas de polinização e reprodutivos distintos, invistam de formas diferentes na produção de néctar ao longo da antese floral. Assim, espécies
21
essencialmente auto incompatíveis e com grupos de polinizadores específicos deveriam investir mais recursos energéticos na produção de néctar, garantindo sua secreção ao longo de toda a antese (especialmente nos períodos de maior frequência dos polinizadores), enquanto espécies menos dependentes não investiriam na produção de néctar ao longo de toda a antese e sim principalmente no início (independente dos períodos de maior frequência dos polinizadores), realocando recursos para outros fins. 2) As variações inter e intra-específicas na composição química do néctar e em seu padrão de produção ao longo da antese floral podem estar relacionadas à preferência dos polinizadores, assim como a sistemas de polinização generalistas e especialistas, determinando-os? Considerando que estudos recentes demonstram que a diversificação de atributos florais mediada por polinizadores é mais provável de ocorrer em espécies com sistemas de polinização especialistas, uma vez que esses polinizadores exercem forte pressão seletiva (Gómez et al., 2015), espera-se que a composição química do néctar em espécies com grupos de polinizadores específicos reflita a preferência dos mesmos. Por outro lado, em espécies com sistema de polinização generalista, que são simultaneamente visitadas por mais de um grupo de animais, espera-se que a composição química do néctar não esteja necessariamente relacionada à preferência de um grupo específico de polinizadores. Dessa forma, através desses dados, será possível obter uma maior compreensão sobre a variação dessa composição em espécies com diferentes sistemas de polinização, gerando informações relevantes para aprimorar a discussão sobre o efeito dos polinizadores na seleção de atributos florais em espécies generalistas.
Material e Métodos
Área e espécies de estudo
Este estudo foi conduzido no Parque Nacional de Itatiaia (PNI), localizado na Serra da Mantiqueira, entre os estados do Rio de Janeiro (RJ) e Minas Gerais (MG), região sudeste do Brasil. Com área total de 30.000 ha, o PNI possui uma altitude entre 600 a 2.791 metros e é composto por duas porções: a partir de 600 m, tem-se a Parte
22
Baixa (22º26’14”S/44º36’3”O), onde predominam formações de Floresta Ombrófila Densa e acima de 1.600 m, tem-se a Parte Alta (22º20’23”S/44º43’17”O), com predominância de formações de Floresta Estacional Semidecidual Altomontana e campos de altitude (Oliveira-Filho & Fontes, 2000). O clima é classificado como subtropical úmido (Peel et al., 2007). O presente estudo foi realizado em ambas as porções do PNI. Foram estudadas duas espécies encontradas em campos de altitude, a saber: Fernseea itatiaiae e Vriesea itatiaiae e cinco espécies encontradas em formação de floresta baixa: Aechmea vanhoutteana, Billbergia distachia, Canistropsis marceloi, Nidularium itatiaiae e Vriesea gradata.
Visitantes florais e interação planta-polinizador
As observações de visitantes florais foram realizadas em dois anos consecutivos (2016/2017) por cerca de 60 horas/espécie e os dados sobre fenologia floral das diferentes espécies foram coletados em aproximadamente dez indivíduos/espécie, de forma a determinar o período da antese floral. A frequência relativa dos visitantes florais foi calculada através da metodologia proposta por Silveira-Neto et al. (1976), utilizando-se a fórmula: F=(n/N) x 100, onde F representa a porcentagem da frequência, n representa o número de indivíduos observados em um período específico e N representa o número total de indivíduos observados. Para verificar a existência de correlação entre a frequência de visitantes florais e a produção de néctar, realizou-se o teste de correlação de Pearson (r). A identificação taxonômica dos visitantes florais foi realizada com auxílio de chaves de identificação específicas para beija-flores (Grantsau, 1988) e abelhas (Silveira et al., 2002) e com base de dados disponível na literatura (Canela, 2006).
Caracterização da dinâmica de produção de néctar
A dinâmica de produção de néctar foi estudada a partir da realização de três tratamentos: 1) Néctar acumulado (NA - “flores não-visitadas”), utilizado para avaliar o ritmo de produção e secreção de néctar na ausência de visitantes florais; 2) Efeito da remoção sucessiva de néctar (ERN - “flores visitadas”), utilizada para avaliar a resposta das flores após sucessivas retiradas de néctar; e 3) Standing crop (flores
23
visitadas), utilizado para determinar o padrão diário de disponibilidade de néctar. Flores em pré-antese foram ensacadas e isoladas com ‘voile’ para a realização dos tratamentos “Néctar acumulado” e “Efeito de remoção sucessiva de néctar” e para o tratamento “Standing crop”, as flores não foram ensacadas, permanecendo disponíveis para a visitação. Para a realização dos distintos tratamentos, foram utilizados aproximadamente trinta indivíduos/espécie. A amostragem de néctar nos distintos tratamentos foi realizada ao longo de toda a antese floral, em intervalos determinados de acordo com o período da antese floral de cada espécie. De forma a obter dados de comparação sobre o ritmo de produção de néctar na presença e ausência de visitantes florais, as amostragens foram realizadas nos mesmos horários do dia nos tratamentos “Néctar Acumulado” e “Efeito da remoção sucessiva de néctar”. Dessa forma, para Aechmea vanhoutteana (n=40 flores para NA, n=20 flores para ERN), Canistropsis marceloi (n=40 flores para NA, n=15 flores para ERN), Nidularium itatiaiae (n=40 flores para NA, n=15 flores para ERN), Vriesea gradata (n=40 flores para NA, n=15 flores para ERS) e Vriesea itatiaiae (n=40 flores para NA, n=20 para ERN), as amostragens de néctar foram realizadas em 4 sessões de intervalos de 3h, enquanto que para Billbergia distachia (n=63 flores para NA, n=15 para ERN) em 9 sessões de intervalos de 6h e para Fernseea itatiaiae (n=50 flores para NA, n=12 flores para ERN) em 5 sessões de intervalos de 3h (ver detalhes sobre a antese floral em ‘Resultados’). Para o tratamento “Standing crop”, as amostragens de néctar foram realizadas em três períodos do dia: início da antese, meio do dia e final da antese. As flores utilizadas nos tratamentos “Néctar acumulado” e “Standing crop” foram drenadas apenas uma vez em cada sessão e descartas, enquanto que as flores utilizadas no tratamento “Efeito da remoção sucessiva de néctar” foram drenadas mais de uma vez, de acordo com os intervalos definidos previamente. Em todos os tratamentos realizados, foram analisadas duas variáveis: volume, através da utilização de micro seringas graduadas (Hamilton 50/100µl) e concentração, através da utilização de refratômetro de bolso (0-50%, w/w, Atago, Tokyo, Japan). Cálculos sobre a quantidade de açúcares produzida por flor (miligramas de açúcar/flor) foram realizados a partir das medidas de volume e concentração através da regressão exponencial elaborada por Galetto & Bernardello (2005). Esses dados foram testados quanto à normalidade através dos testes
24
Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk. Para os dados com distribuição normal, foi utilizada análise de variância (ANOVA) e para os dados com distribuição não-normal foi utilizado o teste não-paramétrico Kruskal Wallis e posteriormente, o teste de Bonferroni para comparações múltiplas entre médias.
Composição química do néctar
Para determinar a composição química do néctar (açúcares e aminoácidos) as amostragens de néctar foram coletadas em flores ensacadas e não-ensacadas, selecionadas aleatoriamente ao longo da antese floral (n= 9 flores; 3 indivíduos/espécie para composição de açúcares e n=9 flores, 3 indivíduos/espécie para composição de aminoácidos). Essas amostras foram armazenadas em eppendorfs (0.5ml) e mantidas em freezer (-20º). Dessa forma, para cada classe de componentes (açúcares e aminoácidos), foram analisadas três amostras/espécie, cada uma contendo néctar proveniente de três flores do mesmo indivíduo. Durante a retirada de néctar, medidas preventivas para evitar contaminação do mesmo por pólen foram aplicadas. Para determinar os tipos e proporções dos diferentes açúcares no néctar, as amostras foram processadas através de cromatografia gasosa do tipo gás-líquido (GLC) (Galetto & Bernardello, 2005). Dessa forma, as amostras foram liofilizadas (Sweeley et al., 1963) e injetadas no equipamento Konik KNK 3000-HRGS gas–liquid chromatograph (Spectra-Physics SP 4290). Os tipos de açúcares analisados foram sacarose, glicose e frutose. A proporção dos açúcares (r) foram calculadas de acordo com Baker & Baker (1983): sacarose / (glicose + frutose), e classificadas em uma das seguintes categorias: sacarose dominante (r > 0·999), rico em sacarose (0·999–0·5), rico em hexoses (0·499–0·1) e hexose dominante (r < 0·1). As análises e separação dos aminoácidos foram realizadas com base no sistema OPA (ophthaldialdehyde; Benson & Hare, 1975) modificado por Marur et al. (1994), através de cromatografia líquida. Para cada amostra, foi utilizada uma alíquota de aproximadamente 5 µl de néctar com 15 µl do reagente OPA. Após cinco minutos de reação com o OPA, essa solução foi injetada na coluna do HPLC (ODS- 2 Superpac) com tampão fosfato (Na2HPO4 - 50 mM, C2H3NaO2 - 50 mM, 1,5 mL de ácido acético glacial, 20 mL de tetrahidrofurano e 20 mL de metanol em 1 L de
25
solução). A concentração de cada aminoácido nas amostras foi determinada através da relação entre a área dos picos integrados e os picos integrados de um padrão comercial AAS-18 (Sigma®, USA) com os aminoácidos proteicos Asparagina, Serina, Glutamina, Histidina, Glicina, Treonina, Arginina, Alanina, Tirosina, Metionina, Valina, Fenilalanina, Isoleucina, Leucina, Lisina e o aminoácido não-proteico ácido Ƴ- aminobutírico (GABA).
Resultados
De maneira geral, as espécies estudadas apresentaram distintos padrões de produção de néctar, assim como variações acentuadas em determinadas características do néctar, como a concentração de açúcares, por exemplo (Tabela 1 e 2). O período total de secreção de néctar variou entre horas e dias, enquanto algumas características foram comuns em todas as espécies, como a composição de açúcares (Tabela 1 e 2). Em grande parte das espécies a retirada de néctar causou um efeito positivo, principalmente de forma a estimular as flores a produzirem e reporem o néctar consumido (Tabela 1 e 2). Em contrapartida, grande parte das espécies não apresentaram o fenômeno de reabsorção do néctar não consumido/retirado nos períodos finais de antese floral. Os sistemas de polinização variaram entre as espécies, sendo observados sistemas especialistas e generalistas (Tabela 1 e 2).
Tabela 1. Características da dinâmica de produção de néctar entre as diferentes espécies: Aechmea vanhoutteana, Billbergia distachia, Canistropsis marceloi e Fernseea itatiaiae.
Características da dinâmica de produção A. vanhoutteana B. distachia C. marceloi F. itatiaiae de néctar Período total de secreção 9h 2,5 dias 6h 1 dia Volume total/flor (µl) 23,5 32,6 15,5 9,5 Volume total/inflorescência (µl) 705 195,6 95 47,5 Período de máxima acumulação de néctar manhã tarde tarde manhã Reposição de néctar após retirada sim sim sim não Concentração (%) 22-28 12,5-25,5 15-33 15-30 Composição de açúcares sacarose dominante sacarose dominante sacarose dominante sacarose dominante
26
Reabsorção não sim sim não Sistema de polinização generalista especialista generalista especialista
Tabela 2. Características da dinâmica de produção de néctar entre as diferentes espécies: Nidularium itatiaiae, Vriesea gradata e Vriesea itatiaiae.
Características da dinâmica de produção N. itatiaiae V. gradata V. itatiaiae de néctar Período total de secreção 9h 9h 9h Volume total/flor (µl) 42,5 25,5 147,5 Volume total/inflorescência (µl) 127,5 50 590 Período de máxima acumulação de néctar tarde tarde tarde Reposição de néctar após retirada sim sim sim Concentração (%) 15-30 10-25 12-20 Composição de açúcares sacarose dominante sacarose dominante sacarose dominante Reabsorção não não não Sistema de polinização especialista especialista especialista
Aechmea vanhoutteana (Van Houtte) Mez
Aechmea vanhoutteana apresenta diferentes hábitos, podendo ser: rupícola, epífita e terrícola e ocorre no domínio da mata atlântica, sendo endêmica do sudeste do Brasil (Flora do Brasil, 2020). Seu período de floração ocorre entre os meses de agosto e novembro e suas flores apresentam antese de aproximadamente nove horas, com abertura às 6:00h e senescência aproximadamente às 15:00h do mesmo dia. Os indivíduos em fase reprodutiva apresentam uma inflorescência com 15-40 flores/dia. Na população estudada, foram observadas espécies de diferentes grupos de animais visitando as flores de A. vanhoutteana, como beija-flores (Thalurania glaucopis e Clytolaema rubricauda), abelhas (Bombus brasiliensis, Euglossini sp. e Plebeia sp) e borboletas (Heliconius beskei e Phoebis sennae) (Figura 1).
27
Figura 1. Aechmea vanhoutteana e seus visitantes florais. (A) indivíduos com inflorescência. (B) indivíduo de beija-flor Thalurania glaucopis sondando néctar. (C) abelha Euglossini com probóscide estendida aproximando-se da inflorescência. (D) abelha Plebeia sp. no ápice da corola. (E) abelha Bombus brasiliensis visitando uma flor. (F) borboletas Phoebis sennae e (G) Heliconius beskei, ambas pousadas na inflorescência provavelmente consumindo néctar.
O comportamento de visitação das diferentes espécies variou em relação à frequência durante a antese floral, ao número de flores visitadas em uma mesma inflorescência e quanto ao tempo de permanência em uma única flor. No entanto, todas as espécies contataram os órgãos reprodutivos, atuando como polinizadores legítimos. De maneira geral, abelhas e borboletas permaneciam mais tempo visitando as flores (de 30 segundos a 1 minuto) e visitavam de uma a cinco flores em uma mesma inflorescência, enquanto que as visitas de ambas as espécies de beija-flores usualmente eram mais rápidas (de 5 a 15 segundos), abordando um maior número de flores por inflorescência e muitas vezes visitando todas as flores do mesmo indivíduo. Os visitantes florais mais frequentes ao longo de todo o período da antese floral foram indivíduos machos de Thalurania glaucopis (Figura 1B), realizando
28
aproximadamente 60% do total de visitas. No entanto, a frequência de visitação das demais espécies variou em diferentes períodos do dia (Figura 2). Durante o período da manhã, especialmente nas primeiras horas do dia, indivíduos de T. glaucopis foram os visitantes exclusivos, entretanto, a partir das 10:00h as diferentes espécies de abelhas iniciavam suas visitas, as quais aumentavam significantemente ao redor das 12:00h (geralmente o período mais quente do dia). Após as 14:00h, quando as flores começam a se tornar senescentes, a frequência de visitação por parte de todas as espécies diminuiu significativamente (Figura 2).
Figura 2. Quantidade de visitas realizadas por diferentes espécies de visitantes florais em flores de Aechmea vanhoutteana ao longo da antese floral.
Em relação à dinâmica de produção de néctar, observou-se que a secreção de néctar se iniciou por ocasião da antese e sessou no período próximo à senescência da flor, variando significativamente em volume e quantidade de açúcar ao longo da antese floral (Figuras 3 e 4). O padrão de produção de néctar variou diferentemente em “flores visitadas” e “flores não-visitadas”. O pico de produção em volume nas “flores visitadas” ocorreu no início da antese (ca. 15,3µl) (Figura. 3), enquanto que em
29
“flores não-visitadas” houve alta produção de néctar após aproximadamente três horas do início da antese (ca. 23,5µl), seguido por uma tendência de estabilização no volume de néctar (Figura 3). Dessa forma, as flores de A. vanhoutteana respondem positivamente à remoção sucessiva de néctar, isto é, sucessivas visitas causaram o aumento no volume de néctar produzido ao longo da antese se comparado ao volume de néctar produzido em “flores não-visitadas” (p= 0,019; F= 8,13), aumentando o volume total produzido durante a antese floral, mas não causando efeito significativo no total de açúcares no néctar (Figura 4).
Figura 3. Padrão de produção de néctar (volume) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 20 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Aechmea vanhoutteana. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
Detectou-se uma particular heterogeneidade e variabilidade espaço-temporal na produção de néctar em “flores visitadas”, especialmente em relação às características do néctar que é reposto após as visitas. Após sucessivas remoções de néctar nas primeiras horas de antese, as “flores visitadas” continuam produzindo néctar, porém em volume e quantidade de açúcar menores (Figuras 3 e 4). As características do néctar parecem variar consideravelmente entre flores da mesma
30
inflorescência: algumas flores produzindo altas quantidades de volume e açúcar, enquanto outras produzindo baixa quantidade. Nesse sentido, foi registrado um resultado interessante em relação à essa variabilidade: as primeiras remoções de néctar parecem causar um aumento significativo na concentração e quantidade de açúcares no néctar secretado em torno de 12:00 h, o que, após esse período, decresce novamente (Figuras 4 e 5).
Figura 4. Quantidade total de açúcar (mg) produzido por flor entre os intervalos nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 20 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Aechmea vanhoutteana. Médias 25% e 75% percentiles. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post- hoc Bonferroni (CI = 95 %).
Ao longo da antese floral, a concentração de solutos no néctar não apresentou diferenças significativas em “flores não-visitadas”, enquanto que “flores visitadas” apresentaram particular variação: após as primeiras remoções de néctar, a concentração diminuiu, voltando a aumentar ao redor das 12:00h (p= 0,04; F= 2,44 – entre os intervalos 9:00h-12:00h) e diminuindo novamente nos períodos finais da antese (Figura 5), evidenciando uma similaridade com o padrão de produção de açúcares no néctar em “flores não-visitadas” (Figura 4).
31
35
30
25
20
15
Concentração(%) 10
5
0 06:00 09:00 12:00 15:00
"Flores visitadas" "Flores não-visitadas"
Figura 5. Concentração de solutos no néctar em “flores não-visitadas” (néctar acumulado) e “flores visitadas” (efeito da remoção sucessiva de néctar) de Aechmea vanhoutteana.
Análises sobre a composição química do néctar (açúcar e aminoácido) indicaram que as flores de A. vanhoutteana produzem um néctar rico em sacarose (em porcentagens: sacarose 70,8 ± 0,1; glicose 16,6 ± 0,1; frutose 9,9 ± 0,1) e uma composição de aminoácidos variável, com uma alta concentração de alguns aminoácidos proteicos, como asparagina, serina, alanina e lisina, assim como do aminoácido não-proteico GABA (ácido Ƴ-aminobutírico) (Tabela 1). No entanto, enfatiza-se que o aminoácido GABA não foi detectado em todas as amostras analisadas, fato que demonstra que a composição do néctar também pode variar entre indivíduos de A. vanhoutteana.
Tabela 1. Composição de aminoácidos no néctar em flores de Aechmea vanhoutteana. asp, aspartato; glu, glutamato; asn, asparagina; ser, serina; gln, glutamina; his, histidina; gly, glicina; thr, treonina; arg, arginina; ala, alanina; tyr, tirosina; met, metionina; val, valina; phe, fenilalanina; ile, isoleucina; leu, leucina; lys, lisina; GABA, ácido Ƴ-aminobutírico. Dados reportados como média ± desvio padrão.
32
Aminoácido Concentração (nmol/ml) % total aa asp 4,8 ± 5,4 1,8 ± 0,2 glu 9,0 ± 8,0 4,1 ± 1,0 asn 32,7 ± 33,2 12,5 ± 4,2 ser 33,7 ± 37,7 12,5 ± 2,1 gln 15,4 ± 14,7 7,8 ± 3,6 his 13,6 ± 18,3 4,2 ± 1,9 gly 3,9 ± 4,8 3,2 ± 3,1 thr 5,0 ± 4,1 3,3 ± 2,8 arg 9,4 ± 10,0 4,6 ± 2,6 ala 50,3 ± 68,3 13,5 ± 10,6 tyr 5,5 ± 3,9 4,7 ± 5,8 met 2,2 ± 0,9 1,8 ± 1,2 val 2,6 ± 1,2 1,8 ± 0,9 phe 5,3 ± 5,3 2,3 ± 0,1 ile 3,6 ± 5,1 0,9 ± 0,8 leu 5,3 ± 4,1 3,5 ± 1,0 lys 17,2 ± 14,4 10,7 ± 8,5 GABA 23,0 ± 27,5 6,8 ± 5,8
Billbergia distachia (Vell.) Mez
Billbergia distachia é predominantemente epífita e ocorre nos domínios da mata atlântica e do cerrado, com distribuição entre as regiões sul e sudeste (Martinelli et al., 2008). Seu período de floração ocorre na estação seca (junho-setembro) e suas flores apresentam antese floral de aproximadamente 60 horas, com abertura às 10:00h e senescência às 12:00h do terceiro dia de antese. Os indivíduos em fase reprodutiva apresentam uma inflorescência com 5-12 flores e 2-5 floras abertas por dia. O beija-flor Phaethornis eurynome foi o único visitante floral observado (Figura 6). Seu comportamento de visitação consistiu em visitar todas as flores de uma mesma inflorescência sequencialmente – algumas vezes visitando a mesma flor mais de uma vez – e após esse processo, visita flores de outros indivíduos próximos. Em grande parte das visitas, P. eurynome contatou as anteras e o estigma e usualmente os grãos de pólen aderiam à sua cabeça (Figura 6B), região que também contatava o estigma (Figura 6C), o que sugere que essa espécie age como um polinizador efetivo de B. distachia. A frequência de visitação de P. eurynome variou ao longo do dia, iniciando com visitas esparsas durante o período da manhã (principalmente após as 09:00h) e aumentando significativamente no período da tarde, no qual realizou a maior
33
quantidade de visitas (aproximadamente 90% da frequência total) entre o período das 12:00h às 16:00h.
Figura 6. Flores de Billbergia distachia e o beija-flor Phaethornis eurynome. (A) inflorencência da bromélia e o beija-flor. (B) P. eurynome aproximando-se da flor - note grãos de pólen aderidos ao topo da cabeça (seta). (C) P. eurynome visitando a flor – note o estigma em contato com os grãos de pólen na cabeça do beija-flor (seta).
Em relação à produção de néctar, detectou-se que as flores de B. distachia iniciam a secreção aproximadamente duas horas após o início da antese e cessam quase completamente no período da manhã do terceiro dia de antese, ocasião em que as flores iniciam a senescência. O padrão de produção de néctar apresentou diferenças acentuadas durante o dia e durante a noite. A produção de néctar no período noturno diminuiu significativamente em comparação com essa produção durante o dia, especialmente em relação ao volume (Figuras 7 e 8). No tratamento “Néctar acumulado” (NA), a concentração do néctar se manteve relativamente estável ao longo da antese floral (em torno de 25%), enquanto que em relação ao volume, houve maior produção durante o dia, queda significativa durante a noite e aumento novamente na manhã subsequente, especialmente no primeiro dia da antese (Figura 7). Dessa forma, quando o néctar não é consumido, a produção em volume diminui durante a noite, no entanto a concentração permanece estável ao longo da antese floral (Figura 7).
34
Figura 7. Padrão de produção de néctar (volume e concentração) no tratamento “Néctar acumulado” (NA “flores não-visitadas”) em flores de Billbergia distachia (n=63 flores). Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
No tratamento “Efeito da remoção sucessiva na produção de néctar” (ERN), também foi observado diminuição no volume de néctar durante o período noturno. No entanto, nesse tratamento, a concentração do néctar apresentou variação ao longo da antese floral, diminuindo significativamente em alguns horários durante a noite – especialmente entre 22:00h - 04:00h (Figura 8). De maneira geral, a concentração do néctar durante o dia se manteve em média ao redor de 20%, enquanto que durante a noite observou-se uma significativa queda, com algumas flores produzindo néctar com concentração ao redor de 10%. Por outro lado, é interessante notar que apesar da remoção/consumo de néctar causar certa variabilidade em sua concentração entre as flores de uma mesma inflorescência, nos períodos em torno das 16:00h observa-se uma tendência de estabilidade na concentração do néctar entre diferentes flores e indivíduos (Figura 8). Dessa forma, comparado com o néctar produzido na ausência de visitas, a remoção sucessiva de néctar não apresentou efeito significativo em sua produção em relação ao volume (p= 1,89; F= 0,24), porém teve efeito expressivo na
35
quantidade de açúcares, causando uma diminuição significativa em “flores visitadas” ao longo da antese (p= 0,028; F= 6,26).
Figura 8. Padrão de produção de néctar (volume e concentração) no tratamento “efeito da remoção sucessiva de néctar” (ERN “flores visitadas”) em flores de Billbergia distachia (n=15 flores). Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
Os períodos de maior produção de néctar e os de maior frequência do polinizador apresentaram correlação positiva (r = 0.72), com o pico de produção de néctar em volume e quantidade de açúcares ocorrendo durante o período da tarde (das 13:00h às 16:00h – ca. 7μl/1.50mg no primeiro dia de antese e ca. 10μl/1.90mg no segundo dia de antese) e a maior frequência de visitação de P. eurynome ocorrendo no mesmo período (aproximadamente 90% do total de visitas) (Figura 9). Dessa maneira, baseado no ritmo de secreção de néctar, foram definidas quatro fases da dinâmica de produção de néctar em B. distachia: pré-secretora (pré-antese), secretora (flores em antese – período diurno), pausa na secreção (flores em antese- período noturno) e pós-secretora (flores senescentes).
36
30
25
20
15
10
5
0 10h - 16h 16h - 22h 22h - 04h 04h - 10h 10h - 16h 16h - 22h 22h - 04h 04h - 10h 1º dia 1º dia 1º dia 2º dia 2º dia 2º dia 2º dia 3º dia
Volume néctar (µl/flor) Frequência polinizador (nº de visitas)
Figura 9. Correlação positiva entre a frequência de visitação de Phaethornis eurynome e produção de néctar em Billbergia distachia (r = 0.72).
A quantidade de açúcares no néctar por flor também variou entre os tratamentos e apresentou diferenças significativas durante o dia e durante a noite, diminuindo no período noturno de maneira semelhante ao volume e a concentração (Figura 10). “Flores visitadas” produziram menor quantidade de açúcares no néctar em comparação às “flores não-visitadas”, indicando que a atividade do polinizador causa efeito na produção de açúcar no néctar em B. distachia. Sobre isso, detectou-se que a capacidade da planta em repor os açúcares no néctar diminui à medida que o néctar é consumido durante o dia, enquanto que durante a noite, essa produção diminui na presença ou ausência de polinizadores, isto é, com ou sem retirada de néctar (especialmente após 22:00h). Por outro lado, em “flores visitadas” nota-se que a remoção de néctar nas primeiras horas da manhã, parece estimular a produção de um “novo néctar” mais concentrado durante o período da tarde (Figura 10).
37
14
12
10
8
6
Açúcar/flor (mg) 4
2
0 10:00 16:00 22:00 04:00 10:00 16:00 22:00 04:00 10:00 1º dia 1º dia 1º dia 1º dia 2º dia 2º dia 2º dia 2º dia 3º dia
"Flores visitadas" "Flores não-visitadas"
Figura 10. Quantidade de açúcares no néctar (mg/flor) em “flores visitadas” (efeito da remoção sucessiva de néctar) e em “flores não-visitadas” (néctar acumulado) em flores de Billbergia distachia.
A composição química do néctar (açúcares e aminoácidos) indicou que as flores de B. distachia produzem néctar rico em sacarose (em porcentagens: sacarose 69,5 ± 0,4; glicose 14,8 ± 0,1; frutose 15,3 ± 0,2) e variável em relação à composição de aminoácidos, com alta concentração de alguns aminoácidos proteicos (histidina, alanina, glutamina e treonina) e do aminoácido não-proteico GABA (ácido Ƴ- aminobutírico), detectados em todas as amostras analisadas (Tabela 2).
Tabela 2. Composição de aminoácidos no néctar em flores de Billbergia distachia. asp, aspartato; glu, glutamato; asn, asparagina; ser, serina; gln, glutamina; his, histidina; gly, glicina; thr, treonina; arg, arginina; ala, alanina; tyr, tirosina; met, metionina; val, valina; phe, fenilalanina; ile, isoleucina; leu, leucina; lys, lisina; GABA, ácido Ƴ-aminobutírico. Dados reportados como média ± desvio padrão.
Aminoácido Concentração (nmol/ml) % total aa asp 11.5 ± 9.7 4,8 ± 0,9 glu 19.0 ± 17.4 7,9 ± 1,6 asn 15.0 ± 18.8 3,3 ± 3,3 ser 18.7 ± 16.8 5,1 ± 4,7 gln 22.5 ± 26.3 9,0 ± 3,6 his 27,4 ± 30.9 11,6 ± 5,1
38
gly 19.7 ± 18.8 6,4 ± 1,7 thr 19.7 ± 18.8 6,4 ± 1,7 arg 10.0 ± 9.1 4,9 ± 2,2 ala 27.3 ± 24.0 9,6 ± 2,4 tyr 6.8 ± 5.9 1,9 ± 2,0 met 7.7 ± 12.2 1,5 ± 2,2 val 7.4 ± 7.0 1,9 ± 1,6 phe 6.8 ± 6.6 1,7 ± 1,5 ile 5.4 ± 5.2 1,4 ± 1,2 leu 15.0 ± 14.4 3,8 ± 3,3 lys 18.1 ±17.6 4,7 ± 4,0 GABA 10.8 ± 3.8 13,0 ± 16,0
Canistropsis marceloi (E. Pereira & Moutinho) Leme
Canistropsis marceloi apresenta diferentes hábitos de crescimento: rupícola e terrícola e ocorre no domínio mata atlântica, sendo endêmica do sudeste do Brasil (Flora do Brasil, 2020). Seu período de floração é relativamente curto, ocorrendo entre os meses de fevereiro e março. A antese floral é de aproximadamente nove horas, com abertura às 08:00h e senescência aproximadamente às 17:00h do mesmo dia. Os indivíduos em fase reprodutiva apresentam uma inflorescência com 30-50 flores e 2-6 flores abertas por dia. Na população estudada, foram observadas diferentes espécies de visitantes florais atuando como polinizadores, isto é, observadas em contato com as anteras e o estigma: borboletas (Heliconius beskei e uma espécie de Hesperiidae) e abelhas (Bombus brasiliensis e Bombus morio) (Figura 11).
39
Figura 11. Canistropsis marceloi e seus visitantes florais. (A) indivíduo com inflorescência. (B) abelha Bombus brasiliensis visitando as flores. (C) borboletas Heliconius beskei e (D) Hesperiidae sp., ambas pousadas na inflorescência.
As espécies observadas apresentaram comportamento de forrageamento e frequências distintas ao longo da antese floral (Figura 12). Bombus brasiliensis foi a mais frequente, realizando cerca de 60% das visitas ao longo de toda a antese floral e apresentou comportamento de forrageamento caracterizado por visitas rápidas (1-5 segundos) e sequenciais às flores de um mesmo indivíduo e de indivíduos próximos, isto é, visitava todas as flores disponíveis na área de visitação. Bombus morio apresentou comportamento semelhante, no entanto sua frequência foi baixa. As espécies de borboletas foram mais frequentes no período da manhã e não realizaram visitas no período vespertino. O comportamento de forrageio dessas espécies se caracterizou por visitas longas (30-60 segundos) e em poucas flores, geralmente em um indivíduo apenas.
40
90 80 70 Hesperiidae sp. 60 Heliconius beskei 50 Bombus morio 40 Bombus brasiliensis
30 Nºvisitas de 20 10 0
Horário
Figura 12. Frequência de visitantes florais em flores de Canistropsis marceloi ao longo da antese floral.
Referente à produção de néctar, as flores de C. marceloi iniciaram sua secreção por ocasião da antese e o padrão de produção ao longo da antese variou entre os distintos tratamentos e entre flores de um mesmo indivíduo. Em “flores não- visitadas”, houve aumento considerável no volume e concentração do néctar produzido no período da tarde, com picos em ambos os aspectos aproximadamente às 14:00h (ca. 22,5µl e 35%) (Figura 13 e 14). De forma geral, a reposição do néctar consumido foi relativamente baixa em “flores visitadas”, com algumas flores repondo cerca de 50% do néctar produzido no início da antese após as primeiras retiradas e diminuindo significativamente essa produção a partir das 14:00h (Figura 8). Interessante notar que em ambos os tratamentos a produção de néctar na maior parte das flores cessou completamente nos últimos horários da antese, próximo à senescência da flor (Figuras 13 e 14).
41
Figura 13. Padrão de produção de néctar (volume) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 15 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Canistropsis marceloi. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
A concentração do néctar produzido nos distintos tratamentos variou de maneira significativa, apresentando uma notável queda em “flores visitadas”, especialmente no néctar reposto a partir das 14:00h, que atingiu concentrações próximas à 10% (cerca de 60% a menos do néctar produzido nas primeiras horas de antese) (Figura 14). Em “flores não-visitadas”, a concentração do néctar se manteve relativamente estável ao longo da antese floral (Figura 14).
42
Figura 14. Padrão de produção de néctar (concentração) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 15 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Canistropsis marceloi. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
A remoção sucessiva de néctar não causou um efeito significativo em sua produção em relação ao volume (p= 0,73; F= 0,87), no entanto causou uma redução significativa na quantidade de açúcar por flor ao longo da antese floral (p= 0,02; F= 5,55). Em “flores não-visitadas”, após as mesmas apresentarem um pico de produção de néctar (em volume e quantidade de açúcares) por volta das 14:00h, esta produção sofre uma notável queda após esse horário (Figuras 13 e 15). Portanto, foram registradas três fases da dinâmica de produção de néctar em C. marceloi: 1) pré- secretora/produtora (pré antese); 2) secretora (flores em antese); e 3) pós- secretora/reabsorção (flores próximas à senescência).
43
7
6
5
4
3
2 Áçucar/flor (mg)
1
0 08:00 11:00 14:00 17:00 "Flores visitadas" "Flores não-visitadas"
Figura 15. Quantidade de açúcares no néctar (mg/flor) em “flores visitadas” (efeito da remoção sucessiva de nectar) e em “flores não-visitadas” (néctar acumulado) em flores de Canistropsis marceloi.
A composição química do néctar (açúcares e aminoácidos) indicou que as flores de C. marceloi produzem néctar sacarose-dominante (em porcentagens: sacarose 91,9 ± 3,7; glicose 3,9 ± 1,4; frutose 4,1 ± 2,2) e variável em relação à composição de aminoácidos, com alta concentração de alguns aminoácidos proteicos (glutamato, glutamina e fenilanina) e do aminoácido não-proteico GABA (ácido Ƴ-aminobutírico), detectados em todas as amostras analisadas (Tabela 3).
Tabela 3. Composição de aminoácidos no néctar em flores de Canistropsis marceloi. asp, aspartato; glu, glutamato; asn, asparagina; ser, serina; gln, glutamina; his, histidina; gly, glicina; thr, treonina; arg, arginina; ala, alanina; tyr, tirosina; met, metionina; val, valina; phe, fenilalanina; ile, isoleucina; leu, leucina; lys, lisina; GABA, ácido Ƴ-aminobutírico. Dados reportados como média ± desvio padrão.
Aminoácido Concentração (nmol/ml) % total aa asp 21,4 ± 8,6 3,3 ± 0,7 glu 63,8 ± 15,7 9,7 ± 1,2 asn 23,8 ± 15,8 3,6 ± 1,3 ser 30,0 ± 19,0 4,6 ± 1,7 gln 48,0 ± 14,9 7,4 ± 1,4 his 1,3 ± 1,3 0,2 ± 0,1 gly 32,6 ± 11,4 5,0 ± 0,9 thr 27,7 ± 7,6 4,2 ± 0,6
44
arg 9,7 ± 3,6 1,5 ± 0,3 ala 47,0 ± 8,9 7,1 ± 0,6 tyr 5,1 ± 1,4 0,8 ± 0,1 met 2,6 ± 1,5 0,4 ± 0,1 val 13,0 ± 4,3 2,0 ± 0,4 phe 175,0 ± 43,1 26,9 ± 4,3 ile 13,6 ± 5,6 2,0 ± 0,4 leu 11,5 ± 4,3 1,8 ± 0,3 lys 14,8 ± 4,2 2,2 ± 0,3 GABA 113,8 ± 18,8 17,3 ± 1,3
Fernseea itatiaiae (Wawra) Baker
Fernseea itatiaiae apresenta hábito estritamente rupícola e ocorre no domínio mata atlântica, em campos de altitude, sendo endêmica do sudeste do Brasil (Flora do Brasil, 2020). Seu período de floração ocorre na estação chuvosa, entre os meses de setembro a janeiro. A antese floral se dá aproximadamente às 10:00h e a senescência por volta das 10:00h do dia seguinte. Os indivíduos em fase reprodutiva apresentam uma inflorescência com 10-20 flores e 1-5 flores abertas por dia e ocorrem com frequência em agrupamentos (Figura 16A). Na população estudada, foram observadas três espécies de beija-flores atuando como polinizadores: Clytolaema rubricauda (Figura 16C), Stephanoxis lalandi e Phaethornis eurynome.
45
Figura 16. Fernseea itatiaiae e visitantes florais. (A) agrupamento de indivíduos e diversas inflorescências. (B) detalhe de uma inflorescência com uma flor e botões florais. (C) beija-flor Clytolaema rubricauda visitando as flores.
De maneira geral, as diferentes espécies de beija-flor apresentaram baixa frequência ao longo da antese floral, com pico de visitação ocorrendo no período vespertino (Figura 17). Indivíduos de C. rubricauda realizaram a maior parte das visitas (cerca de 75% do total de visitas), especialmente no período entre 14:00h a 15:00h (Figura 17). O comportamento de forrageamento das espécies de beija-flores foi semelhante, caracterizado por visitas sequenciais a todas as flores de um indivíduo e dos indivíduos próximos.
25
20
15
10
5 Número de visitas de Número 0 12h-13h 13h-14h 14h-15h 15h-16h 16h-17h Período
Clytolaema rubricauda Phaetornis eurynome Stephanoxis lalandi
Figura 17. Quantidade de visitas das espécies de visitantes florais em flores de Fernseea itatiaiae ao longo da antese floral.
Referente à produção de néctar, as flores de F. itatiaiae iniciaram a secreção logo após a antese e, em “flores visitadas”, houve reposição do néctar consumido apenas no período seguinte à primeira retirada de néctar (por volta das 16:00h), sendo reposto cerca de 20% do volume produzido por ocasião da antese (Figura 18). No entanto, houve grande variabilidade entre as flores (entre e dentre indivíduos) em relação à capacidade de reposição do néctar após a primeira retirada, com algumas flores repondo e outras não repondo. Referente a isso, notou-se certo padrão, no qual flores que secretavam maior quantidade de néctar - em volume e açúcar - atingindo o
46
pico de produção no início da antese (ca. 15µl/4,3mg/flor) não repunham o néctar após o consumo, enquanto flores que produziam menor quantidade nesses mesmos períodos, repunham o néctar consumido uma vez após a primeira retirada. Em flores “não visitadas” foi constatado que, se não forem visitadas, as flores produzem néctar apenas por ocasião da antese, não aumentando sua produção ao longo do período (Figura 18).
Figura 18. Padrão de produção de néctar (volume) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 12 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 50 flores) em flores de Fernseea itatiaiae. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
A concentração de açúcares não variou significativamente nos distintos tratamentos ao longo da antese floral (Figura 19). Em “flores não-visitadas” houve constante concentração no néctar ao longo de todo o período da antese floral, enquanto que em “flores visitadas”, a concentração do néctar reposto após a primeira retirada apresentou uma tendência de diminuição e, após esse período, as flores não repuseram mais o néctar consumido (Figura 19).
47
Figura 19. Padrão de produção de néctar (concentração) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 12 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 50 flores) em flores de Fernseea itatiaiae. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
A remoção sucessiva de néctar não causou efeito significativo em sua produção em relação ao volume (p= 0,47; F= 4,57) e quantidade de açúcar por flor ao longo da antese floral (p= 1,63; F= 2,59) (Figura 20). Dessa forma, foi possível identificar três fases da dinâmica de produção de néctar em F. itaiaie: 1) pré- secretora/produtora (pré antese); 2) secreção ativa (flores nas primeiras seis horas de antese); e 3) pós-secretora (flores após seis horas de antese e flores senescentes).
48
4
3,5
3
2,5
2
1,5 Mg açúcar/flor Mg 1
0,5
0 10:00h 16:00h 22:00h 04:00h 10:00h
"flores visitadas" "flores não-visitadas"
Figura 20. Quantidade de açúcares no néctar (mg/flor) em “flores visitadas” (efeito da remoção sucessiva de néctar) e em “flores não-visitadas” (néctar acumulado) em flores de Fernseea itatiaiae.
A composição química do néctar (açúcares e aminoácidos) indicou que as flores de F. itatiaiae produzem néctar sacarose-dominante (em porcentagens: sacarose 90,4 ± 1,1; glicose 4,8 ± 0,4; frutose 4,7 ± 0,6) e variável em relação à composição de aminoácidos, com alta concentração de alguns aminoácidos proteicos, como asparagina, histidina, alanina e do aminoácido não-proteico GABA (ácido Ƴ- aminobutírico), detectados em todas as amostras analisadas (Tabela 4).
Tabela 4. Composição de aminoácidos no néctar em flores de Fernseea itatiaiae. asp, aspartato; glu, glutamato; asn, asparagina; ser, serina; gln, glutamina; his, histidina; gly, glicina; thr, treonina; arg, arginina; ala, alanina; tyr, tirosina; met, metionina; val, valina; phe, fenilalanina; ile, isoleucina; leu, leucina; lys, lisina; GABA, ácido Ƴ- aminobutírico. Dados reportados como média ± desvio padrão.
Aminoácido Concentração (nmol/ml) % total aa asp 7,6 ± 5,1 1,4 ± 0,3 glu 10,5 ± 6,1 2,0 ± 0,2 asn 76,5 ± 44,6 14,8 ± 2,0 ser 29,3 ± 18,6 5,5 ± 0,9 gln 18,4 ± 21,4 4,0 ± 2,0 his 23,2 ± 20,4 7,3 ± 5,0 gly 24,6 ± 12,2 4,9 ± 0,1
49
thr 24,6 ± 12,2 4,9 ± 0,1 arg 15,4 ± 4,7 3,4 ± 0,5 ala 49,9 ± 17,0 10,8 ± 1,2 tyr 12,1 ± 5,2 3,6 ± 2,1 met 14,0 ± 7,3 3,8 ± 1,8 val 18,8 ± 9,7 3,9 ± 0,5 phe 23,7 ± 16,4 4,3 ± 1,0 ile 7,7 ± 6,7 1,2 ± 0,6 leu 13,6 ± 11,9 2,2 ± 1,1 lys 19,7 ± 16,5 5,0 ± 2,4 GABA 100,8 ± 83,0 16,7 ± 7,2
Nidularium itatiaiae L.B. Sm.
Nidularium itaitiaie apresenta diferentes hábitos de crescimento: rupícola e terrícola e ocorre no domínio da mata atlântica, sendo endêmica do sudeste do Brasil (Flora do Brasil, 2020). Seu período de floração ocorre nos meses de dezembro a fevereiro e suas flores apresentam antese de aproximadamente nove horas, com abertura às 08:00h e senescência aproximadamente às 17:00h do mesmo dia. Os indivíduos em fase reprodutiva apresentam uma inflorescência com 30-45 flores e 1- 3 flores abertas por dia. Ao redor da inflorescência, no centro da roseta foliar, forma- se uma estrutura em formato de “tanque” na qual ocorre o acúmulo de água e outros materiais, como partes de flores e folhas provenientes de vegetação das suas proximidades (Figura 21A, B). No interior das flores e próximo aos “tanques” é comum a presença de formigas (Figura 21C).
50
Figura 21. Nidularium itatiaiae. (A) indivíduos com inflorescência agrupados. (B) detalhe de uma inflorescência com uma flor e um botão floral. (C) detalhe de uma flor com a presença de formigas (seta).
Na população estudada, observou-se apenas o beija-flor Phaetornis eurynome visitando as flores de N. itatiaiae, no entanto, com baixa frequência ao longo da antese floral (Figura 22). O comportamento de visitação consistiu em visitar todas as flores de um mesmo indivíduo e, ocasionalmente, visitar flores de outros indivíduos nos arredores. As visitas eram realizadas de forma rápida, com duração de cerca de 2-5 segundos em cada flor.
6
5
4
3
2 Númerode visitas 1
0 08h-09h 09h-10h 10h-11h 12h-13h 13h-14h 14h-15h 15h-16h 16h-17h Período
51
Figura 22. Quantidade de visitas realizadas por Phaethornis eurynome em flores de Nidularium itatiaiae ao longo da antese floral.
Referente à produção de néctar, as flores de N. itatiaiae iniciaram sua secreção por ocasião da antese e o padrão de produção ao longo da antese variou entre os distintos tratamentos. Em “flores não-visitadas”, a produção de néctar apresentou aumento gradual ao longo da antese floral, atingindo picos de volume e concentração no período da tarde (aproximadamente às 14:00h – ca. 60µl e 33%) e estabilizando após esse período até os momentos próximos à senescência da flor (Figuras 23 e 24). Em “flores visitadas”, após as sucessivas retiradas de néctar, as flores repuseram cerca de 50-80% do total de volume do néctar consumido, cessando a reposição apenas no período próximo à senescência (Figura 23). Dessa forma, a remoção sucessiva de néctar não causou efeito significativo em sua produção em relação ao volume (p= 0,92; F= 0,65).
Figura 23. Padrão de produção de néctar (volume) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 15 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Nidularium itatiaiae. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são
52
significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
A concentração de açúcares apresentou variação entre os distintos tratamentos, especialmente em alguns períodos específicos (aproximadamente às 14:00h) ao longo da antese floral (Figura 24). Em “flores não-visitadas”, houve constante concentração no néctar ao longo de todo o período da antese floral, enquanto que em “flores visitadas”, a concentração do néctar reposto após a primeira retirada apresentou diminuição significativa, especialmente após às 14:00h, ocasião em que essa concentração alcança cerca de 50% da concentração total observada no início da antese (Figura 24).
Figura 24. Padrão de produção de néctar (concentração) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 15 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Nidularium itatiaiae. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
53
Em relação à quantidade de açúcares, sucessivas retiradas de néctar causaram um efeito nesta produção, diminuindo significativamente a quantidade de açúcar no néctar produzido por flor (p= 0,01; F= 7,68). Em “flores não-visitadas”, as flores apresentarem um pico de produção de açúcares no néctar secretado por volta das 14:00h e, após isso, a produção tendeu a estabilizar (Figura 25). Em “flores visitadas”, no entanto, a produção de açúcares no néctar tende a diminuir conforme o mesmo vai sendo reposto ao longo da antese floral (Figura 25). Portanto, foram identificadas três fases da dinâmica de produção de néctar em N. itatiaiae: 1) pré-secretora/produtora (pré antese); 2) secretora (flores em antese); e 3) pós-secretora (flores próximas à senescência).
20 18 16 14 12 10 8
Mg açúcar/flor Mg 6 4 2 0 08:00h 11:00h 14:00h 17:00h
"flores visitadas" "flores não-visitadas"
Figura 25. Quantidade de açúcares no néctar (mg/flor) em “flores visitadas” (efeito da remoção sucessiva de néctar) e em “flores não-visitadas” (néctar acumulado) em flores de Nidularium itatiaiae.
A composição química do néctar (açúcares e aminoácidos) indicou que as flores de N. itatiaiae produzem néctar sacarose-dominante (em porcentagens: sacarose 94,8 ± 0,007; glicose 2,7 ± 0,002; frutose 2,3 ± 0,005), com baixa variação nas amostras analisadas, isto é, a composição de açúcares parece ser constante entre as diferentes flores e indivíduos. Em relação à composição de aminoácidos, detectou-se alta concentração de alguns aminoácidos proteicos, como glutamina, arginina e tirosina (Tabela 5).
54
Tabela 5. Composição de aminoácidos no néctar em flores de Nidularium itatiaiae. asp, aspartato; glu, glutamato; asn, asparagina; ser, serina; gln, glutamina; his, histidina; gly, glicina; thr, treonina; arg, arginina; ala, alanina; tyr, tirosina; met, metionina; val, valina; phe, fenilalanina; ile, isoleucina; leu, leucina; lys, lisina; GABA, ácido Ƴ-aminobutírico. Dados reportados como média ± desvio padrão.
Aminoácido Concentração (nmol/ml) % total aa asp 14,6 ± 7,3 3,6 ± 1,0 glu 18,6 ± 11,3 4,7 ± 1,6 asn 19,2 ± 18,0 4,6 ± 2,4 ser 27,6 ± 18,0 7,0 ± 2,8 gln 48,8 ± 20,0 12,1 ± 3,1 his 2,0 ± 2,1 0,4 ± 0,3 gly 5,0 ± 2,3 1,2 ± 0,3 thr 5,9 ± 2,2 1,5 ± 0,3 arg 103,7 ± 52,5 26,1 ± 8,1 ala 19,6 ± 8,9 4,8 ± 1,1 tyr 45,1 ± 12,5 11,2 ± 1,5 met 8,8 ± 4,2 2,1 ± 0,5 val 1,6 ± 0,9 0,4 ± 0,1 phe 15,4 ± 4,8 3,8 ± 0,6 ile 1,5 ± 1,8 0,3 ± 0,2 leu 18,2 ± 13,8 4,5 ± 2,0 lys 39,2 ± 10,0 9,7 ± 1,3 GABA 5,0 ± 3,6 1,2 ± 0,3
Vriesea gradata (Baker) Mez
Vriesea gradata apresenta hábito predominantemente epífita e ocorre no domínio mata atlântica, nos estados do Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo (Flora do Brasil, 2020). Seu período de floração ocorre na estação chuvosa, entre os meses de outubro a janeiro. A antese floral se dá aproximadamente às 08:00h e a senescência por volta das 17:00h do mesmo dia. Os indivíduos em fase reprodutiva apresentam uma inflorescência com 15-30 flores e 1-2 flores abertas por dia. Ao longo da antese floral ocorre a deflexão do estilete, isto é, a orientação do estilete se modifica ao longo do dia. Durante a manhã - no início da antese - o estigma está posicionado acima do nível de inserção das anteras (Figura 26A), enquanto que no início do período vespertino o estigma se encontra no mesmo nível de inserção
55
das anteras (Figura 26B) e no final do período vespertino – início da senescência floral – o estigma se encontra abaixo do nível das anteras (Figura 26C). Na população estudada, diferentes grupos de animais atuaram como visitantes florais: os beija-flores Florisuga fusca (Figura 26D) e Phaethornis eurynome – ambos observados em contato com as estruturas reprodutivas da flor, as abelhas Plebeia sp. (Figura 26E, F) e Trigona spinipes (Figura 26G, H) – ambas observadas em contato apenas com as anteras no momento em que coletavam pólen (com frequência as anteras eram esvaziadas), e uma espécie não identificada de formiga (Figura 26F), as quais não contatavam as estruturas reprodutivas da flor, apenas adentravam o tubo floral, provavelmente à procura de néctar. A deposição de grãos de pólen nos beija- flores ocorreu principalmente na região do topo da cabeça, local que também contatava o estigma.
Figura 26. Vriesea gradata e seus visitantes florais. (A-C) indivíduos com inflorescências. Note a deflexão do estilete ao longo da antese floral (setas). (A) flor
56
no início da antese (manhã). (B) flor no início do período vespertino e (C) flor nos períodos finais da antese. (D) indivíduo de beija-flor Florisuga fusca. (E) abelha Plebeia sp. coletando pólen (seta). (F) formiga (não identificada) no ápice da corola. (G) abelha Trigona spinipes no estigma da flor e (H) entrando no tubo floral.
De maneira geral, as duas espécies de beija-flor apresentaram baixa frequência ao longo da antese floral, com pico de visitação ocorrendo nos primeiros horários de antese floral (Figura 27). No período da tarde, a maior parte das visitas foi realizada pelas distintas espécies de abelhas, sendo que T. spinipes realizou suas visitas até o período próximo à senescência das flores (Figura 27). O comportamento das espécies de beija-flor foi semelhante, caracterizado por visitas sequenciais a todas as flores de uma mesma inflorescência e de inflorescências nas proximidades. As espécies de abelhas, embora não tenham sido observadas coletando diretamente néctar, adentravam o tubo floral frequentemente e ocasionalmente contactavam as estruturas reprodutivas da flor.
35
30
25
20
15
10 Númerode visitas
5
0 8h-9h 9h-10h 10h-11h 11h-12h 12h-13h 13h-14h 14h-15h 15h-16h 16h-17h
Período
Florisuga fusca Phaetornis eurynome Trigona spinipes Plebeia sp.
Figura 27. Quantidade de visitas realizadas por diferentes espécies de visitantes florais em flores de Vriesea gradata ao longo da antese floral.
A produção de néctar em flores de V. gradata se iniciou por ocasião da antese floral, aumentando consideravelmente em volume no início da tarde e cessando após
57
às 14h00 em “flores não visitadas” (Figura 28). Em “flores visitadas”, o padrão de secreção de néctar ocorreu de forma distinta, no qual, após a primeira retirada do mesmo, as flores repuseram cerca de 50% da quantidade produzida nas primeiras horas de antese e cessaram totalmente a produção após esse período (Figura 28). As “flores visitadas” atingiram o pico de produção/secreção de néctar em volume nas primeiras horas de antese (ca. 21,5µl/flor), enquanto que as “flores não visitadas” atingiram esse pico entre às 11h00 e 14h00 (ca. 26,9µl/flor).
Figura 28. Padrão de produção de néctar (volume) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 15 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Vriesea gradata. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
A concentração de açúcares no néctar foi constante ao longo da antese floral em ambos os tratamentos – “flores visitadas” (ca.17,5%/flor) e “flores não visitadas” (ca. 21,3%/flor) (Figura 29). No entanto, nota-se grande variação nesse aspecto entre as flores de um mesmo indivíduo e de indivíduos diferentes, especialmente nos horários iniciais e finais da antese (Figura 29).
58
Figura 29. Padrão de produção de néctar (concentração) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 15 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Vriesea gradata. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
Em relação à quantidade de açúcares, observou-se padrões de produção distintos entre “flores visitadas” e “flores não visitadas”. No néctar reposto após sucessivas retiradas, a quantidade de açúcar por flor diminuiu significativamente ao longo do período da antese floral, quando comparado com o néctar acumulado (p= 0,04; F= 16,91), isto é, a retirada de néctar causou um efeito na em sua produção em relação à quantidade de açúcares. Em ambos os tratamentos, observou-se a existência de um pico de produção de açúcares no néctar secretado entre 11:00h e 14:00h, sendo que, a partir desse horário ocorre uma queda nessa produção, mais notável em “flores não visitadas” (Figura 30). Dessa forma, foram registradas três fases da dinâmica de produção de néctar em V. gradata: 1) pré-secretora/produtora
59
(pré antese); 2) secretora (flores em antese); e 3) pós-secretora (flores próximas à senescência).
9
8
7
6
5
4
Mg açúcar/flor Mg 3
2
1
0 8:00h 11:00h 14:00h 17:00h
"flores visitadas" "flores não-visitadas"
Figura 30. Quantidade de açúcares no néctar (mg/flor) em “flores visitadas” (efeito da remoção sucessiva de néctar) e em “flores não-visitadas” (néctar acumulado) em flores de Vriesea gradata.
A composição de açúcares no néctar indicou que as flores de V. gradata produzem néctar sacarose-dominante (em porcentagens: sacarose 69,5 ± 38,5; glicose 25,2 ± 36,7; frutose 4,9 ± 2,4), com variação entre as amostras analisadas, isto é, a composição de açúcares parece variar entre as diferentes flores e indivíduos.
Vriesea itatiaiae Wawra
Vriesea itatiaiae apresenta hábitos rupícola, terrícola e epífita. Ocorre no domínio mata atlântica, predominantemente em campos de altitude, nos estados do Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo (Flora do Brasil, 2020). Seu período de floração ocorre na estação chuvosa, entre os meses de dezembro a março. A antese floral se dá aproximadamente às 10:00h da manhã e a senescência por volta das 17:00h do mesmo dia. No entanto, não há um padrão em relação ao horário da antese floral, pois algumas flores de um mesmo indivíduo iniciam a antese no período da tarde. Os indivíduos em fase reprodutiva apresentam uma inflorescência composta
60
em racemos heterotéticos duplos com 15-20 flores e 1-4 flores por inflorescência abertas por dia (Figura 31A). Na população estudada, diferentes grupos de animais atuaram como visitantes florais: as espécies de beija-flores Thalurania glaucopis (Figura 31B), Clytolaema rubricauda (Figura 31C), Stephanoxis lalandi (Figura 31D) e Leocochloris albicollis e a abelha Apis mellifera (Figura 31E,F). Os beija-flores contataram as estruturas reprodutivas da flor durante grande parte de suas visitas, enquanto que indivíduos de A. mellifera coletavam grãos de pólen e, eventualmente, néctar, no entanto contatavam as estruturas reprodutivas com baixa frequência durante suas visitas.
Figura 31. Vriesea itatiaiae e seus visitantes florais. (A) indivíduo com inflorescência. (B) indivíduo de beija-flor Thalurania glaucopis. (C) beija-flor Clytolaema rubricauda visitando uma flor. (D) beija-flor Stephanoxis lalandi. (E) abelha Apis mellifera se aproximando da flor. (F) abelha Apis mellifera no ápice do tubo floral (provavelmente consumindo néctar).
61
Dentre as espécies de beija-flores que visitaram as flores de V. itatiaiae, foi registrado comportamento de forrageamento semelhante, caracterizados por visitas rápidas (1-5 segundos) e sequenciais às flores de um mesmo indivíduo (na população estudada, não foram observados indivíduos de V. itatiaiae agrupados em uma mesma área). O beija-flor T. glaucopis foi o mais frequente deste grupo, realizando aproximadamente 40% das visitas ao longo da antese floral (Figura 32). A abelha A. mellifera apresentou alta frequência de visitação (cerca de 50%) (Figura 32), no entanto frequentemente coletava pólen sem entrar em contato com o estigma.
40
35
30
25
20
15 Númerode visitas 10
5
0 8h-9h 9h-10h 10h-11h 11h-12h 12h-13h 13h-14h 14h-15h 15h-16h 16h-17h Período
Thalurania glaucopis Stephanoxix lalandi Clytolaema rubricauda Leocochloris albicollis Apis mellifera
Figura 32. Quantidade de visitas realizadas por diferentes espécies de visitantes florais em flores de Vriesea itatiaiae ao longo da antese floral.
Referente à produção de néctar, as flores de V. itatiaiae iniciaram sua secreção por ocasião da antese e o padrão de produção ao longo da antese variou entre os distintos tratamentos. De maneira geral, a produção de néctar em relação ao volume foi maior em flores de V. itatiaiae se comparada com as outras espécies deste estudo. Em “flores não-visitadas”, a produção de néctar apresentou aumento gradual ao longo da antese floral, atingindo pico de volume no período da tarde, próximo à senescência floral em grande parte das flores (aproximadamente às 17:00h – ca. 147,3µl) (Figura 33).
62
Em “flores visitadas”, após as sucessivas retiradas de néctar, as flores continuaram a produzi-lo, no entanto repuseram cerca de 30% do total de volume produzido nas primeiras horas da antese e diminuíram essa produção especialmente no período próximo à senescência floral (Figura 33). Assim, a remoção sucessiva de néctar causou efeito em sua produção em relação ao volume, diminuindo-o significativamente ao longo da antese floral (p= 0,03; F= 16,03).
Figura 33. Padrão de produção de néctar (volume) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 10 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Vriesea itatiaiae. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
A concentração de açúcares no néctar foi constante em “flores não visitadas” ao longo da antese floral (ca. 18%/flor), com baixa variação entre as flores de um mesmo indivíduo e de indivíduos diferentes (Figura 34). Em “flores visitadas” a concentração de açúcares no néctar apresentou baixa variação ao longo da antese floral, especialmente nos horários próximos à senescência das flores (entre 14:00h e 17:00h), variando entre 10% a 15% nesse período (Figura 34).
63
Figura 34. Padrão de produção de néctar (concentração) nos tratamentos “Efeito da remoção sucessiva de néctar” (R “flores visitadas” – n= 10 flores) e “Néctar acumulado” (A “flores não-visitadas” – n= 40 flores) em flores de Vriesea itatiaiae. Médias 25% e 75%. Boxplots acompanhados por letras iguais não são significativamente diferentes entre si de acordo com o teste post-hoc Bonferroni (CI = 95 %).
Referente à quantidade de açúcares no néctar, observou-se padrões de produção distintos entre “flores visitadas” e “flores não visitadas”. Em “flores visitadas”, o néctar reposto após a primeira retirada apresentou uma quantidade de açúcar inferior ao néctar secretado por ocasião da antese floral (Figura 35). Quando comparadas com “flores não visitadas”, pode-se afirmar que a retirada do néctar causou efeito em sua produção em relação à quantidade de açúcares, diminuindo-a significativamente (p=0,006; F= 19,1). O pico de produção de açúcares no néctar em “flores não visitadas” ocorreu em duas ocasiões distintas durante o período da antese floral: aproximadamente às 11:00h e às 17:00h, enquanto que em “flores visitadas” esse pico ocorreu por ocasião da antese floral (Figura 35). Dessa forma, foram registradas três fases da dinâmica de produção de néctar em V. itatiaiae: 1) pré-
64
secretora/produtora (pré antese); 2) secretora (flores em antese); e 3) pós-secretora (flores próximas à senescência).
30
25
20
15
Mg açúcar/flor Mg 10
5
0 08:00h 11:00h 14:00h 17:00h
"flores visitadas" "flores não-visitadas"
Figura 35. Quantidade de açúcares no néctar (mg/flor) em “flores visitadas” (efeito da remoção sucessiva de néctar) e em “flores não-visitadas” (néctar acumulado) em flores de Vriesea itatiaiae.
A composição química do néctar (açúcares e aminoácidos) indicou que as flores de V. itatiaiae produzem néctar sacarose-dominante (em porcentagens: sacarose 65,1 ± 41,1; glicose 9,6 ± 7,8; frutose 25,1 ± 33,2), com baixa variação nas amostras analisadas, isto é, a composição de açúcares parece ser constante entre as diferentes flores e indivíduos. Em relação à composição de aminoácidos, detectou-se alta concentração de alguns aminoácidos proteicos, como histidina e fenilalanina (Tabela 6).
Tabela 6. Composição de aminoácidos no néctar em flores de Vriesea itatiaiae. asp, aspartato; glu, glutamato; asn, asparagina; ser, serina; gln, glutamina; his, histidina; gly, glicina; thr, treonina; arg, arginina; ala, alanina; tyr, tirosina; met, metionina; val, valina; phe, fenilalanina; ile, isoleucina; leu, leucina; lys, lisina; GABA, ácido Ƴ- aminobutírico. Dados reportados como média ± desvio padrão.
65
Aminoácido Concentração (nmol/ml) % total aa asp 11,8 ± 10,7 1,8 ± 0,8 glu 32,5 ± 15,4 5,7 ± 0,8 asn 22,3 ± 31,3 3,7 ± 2,5 ser 23,8 ± 14,1 3,9 ± 0,8 gln 38,8 ± 54,6 6,5 ± 4,4 his 109,4 ± 153,1 17,0 ± 12,2 gly 37,4 ± 16,2 7,0 ± 1,4 thr 12,6 ± 5,5 2,2 ± 0,2 arg 8,1 ± 2,0 1,5 ± 0,2 ala 21,5 ± 19,3 4,3 ± 2,0 tyr 3,0 ± 2,3 0,6 ± 0,3 met 1,9 ± 0,9 0,4 ± 0,2 val 5,2 ± 2,6 1,2 ± 0,6 phe 175,3 ± 42,7 33,0 ± 5,2 ile 5,1 ± 3,1 0,8 ± 0,2 leu 9,7 ± 1,7 1,9 ± 0,3 lys 16,2 ± 3,3 3,0 ± 0,3 GABA 17,7 ± 22,4 2,7 ± 1,8
Discussão
Aechmea vanhoutteana
Os diferentes visitantes florais contataram os órgãos reprodutivos durante a realização das visitas às flores de A. vanhoutteana, no entanto seu papel como polinizadores efetivos pode depender de seu comportamento de forrageio, que difere consideravelmente entre as espécies. Os beija-flores – Thalurania glaucopis e Clytolaema rubricauda – demonstraram comportamento territorialista e dominante (Canela, 2006), isto é, os indivíduos apresentaram comportamento agressivo, defendendo áreas com recursos alimentares abundantes e, geralmente, forrageando por curtas distâncias, o que pode resultar em menor dispersão dos grãos de pólen entre os indivíduos visitados (Feinsinger, 1976; Lanna et al., 2017). Por outro lado, as espécies de abelhas (especialmente as abelhas do gênero Bombus e abelhas Euglossini), cujo comportamento de forrageio do tipo “trapline” (Janzen, 1971; Thomson, 1996) implica em visitas a vários indivíduos ao longo de uma rota – muitas vezes distantes entre si – promovem um fluxo de grãos de pólen mais efetivo, o que pode representar uma vantagem para A. vanhoutteana, uma espécie auto-incompatível (Wolowski et al., 2013). Além disso, outras espécies de Bombus foram registradas como polinizadores efetivos de espécies de Aechmea, como A. caudata (Kamke et al., 2011) e A. nudicaulis (Schmid et al., 2011). As espécies de
66
borboletas, devido à baixa frequência de visitação, foram consideradas polinizadores não efetivos, uma vez que grande parte do pólen coletado é rapidamente digerido, não sendo utilizado para polinização, resultado que concorda com outros estudos sobre espécies de Aechmea (Schmid et al., 2011). Referente à produção de néctar, as flores de A. vanhoutteana apresentaram, de maneira geral, um ritmo rápido de secreção, sendo classificadas como “fast producers” (secretam de 22% a 68% do máximo acumulado por hora) (Pacini & Nepi, 2007). No entanto, a alta variabilidade no volume e na quantidade de açúcares no néctar de “flores visitadas”, especialmente nos horários próximos às 12:00, indica que essas flores são altamente heterogêneas em relação à habilidade de produzir “novo néctar”. Dessa forma, pode-se inferir que a variabilidade espaço-temporal na quantidade de açúcares no néctar pode estar relacionada ao aumento na quantidade de visitas realizadas por abelhas durante esse período específico, uma vez que as abelhas possuem preferência em visitar flores que produzem néctar altamente concentrado em açúcar (ca. 5 mg de açúcar/dia), o que garante a quantidade de carboidratos requeridos em suas atividades de forrageamento (Roubik et al., 1995). Nessa perspectiva, essa variabilidade pode representar um aspecto importante da estratégia reprodutiva de A. vanhoutteana, uma vez que as abelhas (especialmente Euglossini), possuem a capacidade de forragear distâncias mais longas quando comparadas com as espécies de beija-flores - Thalurania glaucopis e Clytolaema rubricauda – que nessa espécie de bromélia apresentaram comportamento territorialista, como reportado também em outros estudos (Lanna et al., 2017). Assim, pode-se dizer que A. vanhoutteana economiza na alocação de recursos do néctar, garantindo uma dispersão eficiente do pólen. Considerando que as características do néctar encontradas pelo polinizador em determinada flor (ou flores) são decisivas para sua escolha em visitar outra flor da mesma inflorescência ou de outro indivíduo, essa variabilidade no néctar produzido por flores da mesma inflorescência e entre indivíduos de A. vanhoutteana pode estar relacionada a um processo de manipulação do polinizador (Pyke, 2016). Dessa forma, diferentes indivíduos da mesma espécie podem “manipular” o comportamento de forrageio dos polinizadores durante e após as visitas através da produção de néctar, fator que irá influenciar diretamente na transferência dos grãos de pólen e na taxa de
67
reprodução (Pyke, 2016). Em espécies auto compatíveis com inflorescências que possuem muitas flores que abrem a cada dia, a variação intraespecífica no ritmo de produção e nas características do néctar pode representar um tipo de estratégia reprodutiva para evitar a geitonogamia e a perda de grãos de pólen através da redução do tempo de visitação do polinizador (Biernaskie et al., 2002). No caso de A. vanhouttena, uma espécie auto incompatível, as variações intraespecíficas nas características do néctar parecem estar diretamente relacionadas com outro aspecto da estratégia reprodutiva dessa espécie: a dispersão de pólen. Assim, o padrão de produção de néctar nessa espécie parece estar estrategicamente adaptado para aumentar a dispersão de pólen entre as flores e indivíduos e, ao mesmo tempo, economizar recursos para a produção de néctar: quando o néctar é coletado pelos beija-flores nas primeiras horas da antese, a planta reduz o investimento energético na produção futura de néctar, porém apresenta alta variabilidade de néctar entre as flores quando as abelhas são os principais visitantes, contribuindo para sua atração. Os valores médios de volume, concentração e composição de açúcar do néctar produzido pelas flores de A. vanhoutteana são compatíveis com as preferências de beija-flores e abelhas do gênero Bombus (Baker & Baker, 1983; Ohashi & Yaharas, 2002). A composição de aminoácidos no néctar apresentou variação entre flores e indivíduos, uma vez que determinados aminoácidos não foram detectados em todas as amostras analisadas. No entanto, detectou-se maior quantidade/proporção dos aminoácidos proteicos alanina, fenilalanina e o não-proteico GABA (ácido Ƴ- aminobutírico), característica que parece estar diretamente relacionada com a preferência do néctar por parte das abelhas. Estudos recentes demonstram que GABA é um aminoácido particularmente importante para os insetos, uma vez que o mesmo apresenta um efeito fagoestimulante neste grupo de animais e, combinado com fenilalanina pode estimular quimiorreceptores sensíveis ao açúcar, aumentando a capacidade de forrageamento em algumas espécies (Petanidou et al., 2006; Nepi, 2014). O aminoácido GABA também pode estar relacionado à sobrevivência de algumas espécies de abelhas, funcionando como “stress-protect” (Bogo et al., 2019). Nessa perspectiva, características como volume, composição de açúcares e aminoácidos combinadas com fatores que controlam a secreção de néctar, possuem alto impacto no padrão de visitação e frequência de visitantes florais (Baker & Baker, 1983; Pacini et al., 2003). Sugere-se que em A. vanhoutteana esses fatores, bem
68
como sua variabilidade durante a antese floral contribuem consideravelmente para a atração de diferentes grupos de animais, revelando uma estratégia reprodutiva baseada em produção de néctar.
Billbergia distachia
As flores de B. distachia apresentaram longevidade maior quando comparadas com outras espécies de bromélias do Parque Nacional de Itatiaia (PNI), que usualmente apresentam flores com antese floral curta (menor que 24 horas) (Canela, 2006). Essa característica parece estar diretamente relacionada com a autoincompatibilidade de B. distachia, bem como com o fato de que, em algumas populações, essas flores são visitadas exclusivamente por uma espécie de beija-flor. Além disso, o longo tubo floral também previne a polinização por beija-flores de bico curto (Maglianesi et al., 2014). O período de maturação dos órgãos reprodutivos parece apresentar sincronia com a produção de néctar (detalhes em Pansarin & Pedro, 2016), uma vez que o pico dessa produção ocorre simultaneamente à máxima liberação de grãos de pólen pelas anteras. Dessa forma, o longo período da antese combinado com a maturação lenta dos órgãos reprodutivos e um ritmo lento de produção de néctar contribuem de forma a assegurar uma boa taxa de visitação do polinizador, aumentando o fluxo de pólen ao longo da antese floral - essencial para o processo reprodutivo dessa espécie. Em relação à produção de néctar, as flores de B. distachia apresentam ritmos diferentes ao longo do período de antese floral. No primeiro dia de antese, as flores podem ser classificadas como “fast producers” (secretam de 22% a 68% do máximo acumulado por hora) (Pacini & Nepi, 2007), enquanto que nos dias seguintes à antese apresentam um padrão “slow producers”, secretando de 5% a 10% do máximo acumulado por hora (Pacini & Nepi, 2007). A remoção sucessiva de néctar causou efeito significativo na quantidade de açúcares, indicando que a produção de um “novo néctar” foi influenciada pelas visitas. Estudos sugerem que a secreção de néctar pode aumentar em resposta à sua remoção, isto é, flores que são visitadas repetidamente produzem maior quantidade de néctar (geralmente em volume) em detrimento de flores visitadas uma única vez ao longo da antese (Luo et al., 2014).
69
No caso de B. distachia o efeito de retirada de néctar ocorre de maneira distinta, diminuindo a quantidade de açúcares e sem alteração no volume total produzido ao longo da antese floral. Dessa forma, a reposição de néctar após as visitas (especialmente no período de maior visitação do polinizador) provavelmente está relacionada ao alto número de visitas que favorece deposição e transporte de grãos de pólen (Pacini & Nepi, 2007) e, além disso, esse processo parece influenciar a reabsorção do néctar durante o período noturno. A frequência do polinizador parece exercer forte influência no padrão de produção de néctar, uma vez que as flores de B. distachia demonstram um padrão de reposição fortemente correlacionado com a frequência do polinizador. Adicionalmente, algumas características do néctar, como a sua composição química também parece estar relacionada à frequência de visitação de P. eurynome. A concentração de açúcares durante o dia, isto é, durante seu período de visitação, variou entre 20% e 25%, fator que é compatível com a preferência de beija-flores. De acordo com Galetto & Bernardello (2005), flores ornitófilas geralmente produzem néctar diluído (com cerca de 70% de água em sua composição) e, dentre os açúcares presentes, sacarose geralmente está em maior quantidade. De forma geral, a remoção de néctar causou alta variação em sua concentração de açúcares entre flores de B. distachia, mas em torno das 16:00h se encontrava estabilizada. Segundo Heinrich (1975), a concentração de açúcares no néctar exerce papel importante na atração do polinizador, uma vez que o açúcar é utilizado como fonte primária de energia pela maioria de seus consumidores. Dessa forma, a concentração de açúcares no néctar e os requerimentos energéticos do polinizador geralmente apresentam uma alta correlação e em B. distachia esses fatores estão claramente relacionados. Apesar de grande parte das espécies de beija-flores geralmente complementarem a dieta com insetos, que suprem seus requerimentos de aminoácidos (Baker & Baker, 1983), sugere-se que alguns aminoácidos que compõem o néctar de B. distachia também podem exercer papel na preferência de P. eurynome, como o aminoácido proteico treonina, presente em altas concentrações. Esse aminoácido possui importante função em determinados mecanismos fisiológicos em aves, estando diretamente envolvido com a resposta imune desse grupo (Ojano-Dirain & Waldroup, 2002). De acordo com Zulkifli et al. (1994), estresses ambientais podem
70
diminuir a função imune em aves através da diminuição de produção de anticorpos. Nesse contexto, considerando que no período de floração de B. distachia (estação seca) os recursos são limitados e as temperaturas muito variáveis, seria vantajoso para o polinizador consumir recursos com alta concentração desse aminoácido. Outros aminoácidos em alta concentração no néctar, como histidina, alanina e glutamina podem estar relacionados ao sabor do néctar, assim como com a resposta imune em aves (Wu, 2009). Nessa perspectiva, a composição do néctar representa um fator importante relacionado à estratégia reprodutiva de B. distachia, visto que contribui fortemente com a atração de seu único polinizador que, por sua vez, apresenta comportamento não territorial, contribuindo com uma efetiva transferência de pólen entre indivíduos distantes entre si. Esse comportamento consiste em um padrão sequencial de visitação em indivíduos isolados, geralmente através da memorização dos locais que possuem grande quantidade de recursos (Gill, 1988). Considerando que a quantidade de néctar disponível pode influenciar no tempo e na frequência de retorno das visitas de beija-flores com comportamento trapliner (Gill, 1988), a correlação positiva entre a produção de néctar e frequência do polinizador em B. distachia pode estar indicando que o investimento em produção de néctar é maximizado durante a tarde e esse fato condiz com a alta quantidade de visitas de P. eurynome nesse período. Segundo Pansarin & Pedro (2016), o comportamento de forrageamento de P.eurynome é independente da temperatura do ar e umidade, sendo o fator de maior influência nessa característica a disponibilidade de luz ao longo do dia. Os resultados aqui apresentados estão de acordo Pansarin & Pedro (2016), uma vez que a alta quantidade de visitas de P. eurynome ocorreu durante o período da tarde – das 12:00h às 16:00h, o que indica que a planta pode ajustar os mecanismos envolvidos na produção de néctar, aumentando-a no período de maior frequência do polinizador.
Canistropsis marceloi
De modo geral, todos os visitantes florais contataram os órgãos reprodutivos das flores de C. marceloi ao longo de suas visitas. No entanto, devido à alta frequência de visitação de Bombus brasiliensis (realizando cerca de 90% do total das visitas observadas), sugere-se que essa espécie seja o polinizador mais efetivo de C.
71
marceloi. Abelhas do gênero Bombus também foram observadas como principais polinizadores em outras espécies de bromélias, como Aechmea caudata (Kamke et al., 2011), na qual foram os únicos polinizadores que contribuíram de forma efetiva para a formação de frutos e sementes e Aechmea lindenii, na qual atuaram como polinizadores efetivos (Lenzi et al., 2006). Referente à produção de néctar, as flores de C. marceloi apresentaram um ritmo acelerado de secreção (fast producers), característica que parece estar fortemente relacionada ao curto período de antese floral e à alta demanda de néctar apresentada pelo seu principal polinizador. A produção de néctar e a frequência dos polinizadores apresentaram correlação positiva moderada (r 0,41), isto é, as visitas e a produção de néctar apresentam ritmos semelhantes ao longo da antese. A reposição continuada de aproximadamente a mesma quantidade de néctar produzida no início da antese até próximo da senescência em “flores visitadas”, garante a disponibilidade desse recurso para seus visitantes. Embora os resultados sobre o efeito de retirada de néctar sejam variáveis, estudos indicam que há uma tendência de aumento dessa produção após a realização de sucessivas visitas (Luo et al., 2014). Em C. marceloi, o efeito de retirada de néctar resulta em uma continuidade da sua produção ao longo de grande parte da antese floral, favorecendo a alta quantidade de visitas. Em “flores não visitadas”, a maximização na produção de néctar em relação ao volume e a quantidade de açúcares no período de maior visitação de B. brasiliensis, indica um efeito da não retirada do néctar. Diante da ausência de visitantes florais, as flores de C. marceloi parecem investir o máximo de seus recursos na produção de néctar nos períodos próximos à senescência das flores e da maior visitação de B. brasiliensis, indicando um aspecto de sua estratégia reprodutiva para assegurar a visitação nesse período. A interrupção da secreção de néctar no período final da antese floral (em torno das 17:00h) em ambos os tratamentos (“flores visitadas” e “flores não visitadas”) indica a ocorrência de reabsorção de néctar. Esse mecanismo de reabsorção parece ocorrer independente da presença ou ausência de polinizadores, no entanto em “flores não visitadas” a quantidade de néctar nas flores no final da antese é maior em relação às “flores visitadas”. Segundo Búrquez & Corbet (1991), se o polinizador não consome néctar, a reabsorção pode proteger a flor contra ácaros e também reduzir os efeitos negativos da fase “pós-polinização”, que podem causar danos até em flores
72
polinizadas efetivamente. Em flores anteriormente polinizadas, a reabsorção do néctar pode contribuir de maneira a fornecer açúcares e outros componentes para o desenvolvimento de frutos e sementes e, em alguns casos, esses açúcares podem ser translocados para as folhas e raízes (Pedersen et al., 1958). A variação da concentração de açúcares do néctar em “flores visitadas” (diminuiu consideravelmente após às 11:00h) parece ter exercido influência na frequência dos diferentes grupos de visitantes florais. Levando-se em conta que lepidópteros em geral, especialmente as borboletas, possuem preferência por néctar em concentrações elevadas (cerca de 30-50% - Pivnick & McNeil, 1985), a interrupção de suas visitas no período vespertino pode estar relaciona à queda da concentração do néctar nesse período, que por sua vez pode ter sido causada pelo elevado consumo por parte das abelhas no período matutino, alterando as características do néctar reposto. Apesar das abelhas, especialmente as mamangavas (bumblebees), possuírem preferência por concentrações de açúcares mais elevadas no néctar, entretanto, continuaram a visitar as flores mesmo no período próximo à senescência, ocasião em que a concentração estava abaixo de 15%. Embora modificando seu comportamento, ao passar a visitar a mesma flor repetitivamente – e, muitas vezes, causando danos à corola - os indivíduos de B. brasiliensis continuaram a visitá-las até o final da antese. Algumas espécies de Bombus parecem ser sensíveis a mudanças nas características do néctar, reagindo a essas variações de forma a não visitar indivíduos vizinhos e aumentando a distância de voo, o que poderia causar efeito positivo na dispersão dos grãos de pólen (Zhao et al., 2016). No caso de B. brasiliensis, a variação nas características do néctar parece causar efeito apenas na velocidade da visita e modo de abordagem à flor, não afetando, portanto, o transporte dos grãos de pólen. A composição química do néctar, tanto de açúcares (sacarose dominante) como aminoácidos, reflete a preferência por parte de abelhas de língua de longa (“bumblebees”) e borboletas. Determinados aminoácidos em alta concentração no néctar de C. marceloi, como fenilalanina e GABA, estão altamente relacionados com a preferência de abelhas do gênero Bombus, uma vez que agem como fagoestimulante e exercem efeitos na atividade muscular dessas espécies (Bogo et al., 2019). O aminoácido não proteico GABA também pode exercer efeito no
73
comportamento de determinadas espécies de abelhas, visto que interage com sua atividade neurológica, o que também pode surtir efeito no comportamento de forrageamento dessas espécies (Bogo et al., 2019). No caso de B. brasiliensis, de acordo com o padrão de visitação observado – indivíduos agindo agressivamente com frequência e competindo com as espécies de borboleta – pode ser explicado, dentre outros fatores, pela presença desse aminoácido no néctar produzido pelas flores de C. marceloi. De forma geral, pode-se dizer que aspectos importantes da dinâmica de produção de néctar em C. marceloi refletem sua estratégia reprodutiva, uma vez que esse o processo parece ser ajustado de acordo com a presença ou ausência de polinizadores, favorecendo sucessivas visitas ao longo da antese através da reposição de néctar ou reabsorvendo o néctar não consumido em flores não visitadas.
Fernseea itatiaiae
As flores de F. itatiaiae receberam, de forma geral, baixa quantidade de visitas, quando comparadas com as outras espécies estudadas nesse trabalho. As três espécies de beija-flores contataram as estruturas reprodutivas da flor, sendo consideradas potenciais polinizadores de F. itatiaiae. E, embora as três espécies tenham apresentado baixa frequência, Clytolaema rubricauda foi o mais frequente, fator que pode estar fortemente associado ao seu comportamento, que é classificado como dominante (territorialista) (Lanna et al., 2017). Esse tipo de comportamento é caracterizado pela defesa de determinados “territórios” onde exista alta disponibilidade de recursos e exclusão das possíveis espécies que possam competir por esses recursos (Stiles, 1978). Entretanto, ele ocorre apenas quando o ganho de energia obtido através dos recursos é maior que a perda de energia despendida para defendê-los. Dessa forma, essa espécie pode, muitas vezes, apresentar comportamento agressivo diante de espécies com comportamento “subordinado ou traplining”, que visitam as flores na ausência da espécie dominante ou até serem repelidas, como Stephanoxis lalandi e Phaethornis eurynome (Stiles, 1978). Devido ao ritmo lento de secreção de secreção de néctar, as flores de F. itatiaie são classificadas como slow producers (secretam de 5 a 10% do máximo acumulado por hora) (Pacini & Nepi 2007). Em ambos os tratamentos (“flores visitadas” e “flores
74
não visitadas”) houve baixa variação no volume de néctar produzido, assim como na concentração de açúcares. O padrão distinto de reposição de néctar das “flores visitadas” consiste em não repor o néctar consumido ao longo da antese, mas o repõe apenas após a primeira visita. Entretanto, há variações nesse padrão, no qual flores que secretavam maior quantidade de néctar (em volume e açúcar) já nos primeiros períodos da antese não repunham o néctar após o consumo, enquanto flores que produziam menor quantidade de néctar nesses mesmos períodos, repunham o néctar consumido uma vez após a primeira retirada. Nesse sentido, há relatos de espécies que reagiram de forma semelhante diante da retirada de néctar, diminuindo consideravelmente sua produção (Bernardello et al., 1994; Carlson, 2007), fator que pode estar relacionado, dentre outras causas, à altas temperaturas (Freeman & Head, 1990). As “flores não visitadas” não investem em uma maior produção de néctar ao longo da antese floral quando há ausência de visitação, característica que também difere das outras espécies estudadas. Nessa perspectiva, o padrão de produção de néctar em F. itatiaiae indica a existência de uma estratégia reprodutiva que favorece, por um lado, baixo investimento de recursos energéticos para produção de néctar e por outro, alto investimento em duração do período de antese floral. Esse tipo de estratégia pode estar fortemente relacionado ao tipo de ambiente em que F. itatiaiae ocorre (campos de altitude), uma vez que esses ambientes possuem substratos pobres em nutrientes, assim como grande escassez de água. Nesse sentido, considerando que em campos de altitude beija-flores são visitantes florais relativamente escassos – sendo os insetos os agentes polinizadores mais abundantes (Freitas e Sazima, 2006), seria mais vantajoso para F. itatiaiae manter suas flores abertas por um período maior (funcionando como um display) para atração visual desses polinizadores, porém com baixa disponibilidade de néctar. Outro ponto da estratégia reprodutiva dessa espécie parece ser o agrupamento de indivíduos em um mesmo local, que pode favorecer de forma a aumentar esse display visual, atraindo polinizadores mesmo com baixa e/ou nenhuma produção de néctar.
75
Nidularium itatiaiae
A baixa frequência de visitação de Phaetornis eurynome às flores de N. itatitaiae difere da sua frequência às outras espécies de bromélias estudadas. Apesar de ser o único visitante dessa espécie de bromélia, em todas as visitas P. eurynome contatou as estruturas reprodutivas da flor, indicando que esse beija-flor atua como um potencial polinizador de N. itatiaiae. Estudos realizados sobre a biologia da polinização dessa espécie de bromélia no PNI também relataram apenas o beija-flor P. eurynome atuando como polinizador (Canela, 2006; Wolowski et al., 2013), o que indica a existência de uma relação especialista entre essas duas espécies. Segundo Wolowski et al. (2013), na população do PNI, os indivíduos de N. itatiaiae apresentaram alto grau de autoincompatibilidade, isto é, possuem alta dependência de polinizadores para que ocorra uma reprodução efetiva. Devido à rápida produção e reposição de néctar, as flores de N. itatiaiae foram classificadas “fast producers” (secretam de 22% a 68% do máximo acumulado por hora) (Pacini & Nepi, 2007), uma vez que repuseram rapidamente volume próximo a totalidade do néctar consumido após as “visitas”, cessando a produção apenas nos momentos próximos à senescência das flores (aproximadamente 17:00h). Portanto, a retirada de néctar nessa espécie causou um efeito em sua produção em relação ao volume total produzido, aumentando-o na presença de visitantes florais. Alguns estudos demonstram efeito semelhante em determinadas espécies (Nicolson & Nepi, 2005; Ornelas et al., 2007), nas quais, de forma geral, a reposição do néctar também ocorreu de forma rápida, como em N. itatiaiae. Na ausência total de visitantes florais, as “flores não visitadas” parecem investir o máximo de recursos na produção de néctar, tanto em volume, quanto em açúcares, até o período próximos à senescência das flores, o que não ocorreu em “flores visitadas”, que cessaram a produção de néctar nessa ocasião. Portanto, essa característica provavelmente está relacionada à condição de autocompatibilidade dessa espécie, que precisa de polinizadores para sua reprodução. Nesse sentido, parece que quando ocorre a deposição de grãos de pólen no estigma, a produção de néctar tende a diminuir e cessar, enquanto que em situação contrária, a planta continua investindo no aumento dessa produção até a senescência floral. Segundo Corbet et al. (2003), o aumento na produção de néctar em algumas espécies está
76
fortemente relacionado à necessidade de várias visitas dos polinizadores para que ocorra deposição suficiente de grãos de pólen no estigma, o que parece acontecer em N. itatiaiae. A variação na concentração de açúcares no néctar entre os diferentes tratamentos, baixando significativamente em “flores visitadas” ao longo da antese floral e, em alguns momentos, chegando a atingir entre 10% a 15%, não é comum em flores visitadas por beija-flores (Baker & Baker, 1983). Concentração semelhante no néctar de N. itatiaiae também foi observada por Canela (2006). Dessa forma, a baixa frequência do beija-flor parece estar relacionada de alguma forma a esse fator, uma vez que a preferência de concentração de açúcares no néctar por parte dessas espécies geralmente é em torno de 20-25% (Baker & Baker, 1983). De forma geral, pode-se dizer que o padrão e o ritmo de produção de néctar em N. itatiaiae refletem aspectos importantes de sua reprodução, sendo modulados pela presença ou ausência de seus visitantes florais.
Vriesea gradata
Os diferentes grupos de visitantes florais de V. gradata atuaram de forma distinta em suas visitas. Apenas as espécies de beija-flores (Phaethornis eurynome e Florisuga fusca) contataram ambas as estruturas reprodutivas da flor ao consumirem néctar, o que indica que atuaram como polinizadores efetivos de V. gradata. No período da tarde, a frequência de visitação dessas duas espécies diminuiu consideravelmente, cessando totalmente após as 14:00h, quando apenas as espécies de abelhas realizaram visitas. Assim, dois principais motivos podem estar relacionados a esse acontecimento: diminuição considerável do volume de néctar no período da tarde (em “flores visitadas”) e a alta frequência das espécies de abelhas, que atuaram principalmente como pilhadoras. As espécies de abelhas – especialmente Trigona spinipes - apresentaram intensa atividade de pilhagem de pólen e néctar, principalmente a partir das 10:00h, fator que pode estar influenciando diretamente no sucesso reprodutivo de V. gradata. Segundo Laverty & Plowright (1985), em flores que são visitadas por mais de um grupo de animais (beija-flores e abelhas, por exemplo), é comum ocorrer a exclusão de um
77
dos grupos em determinados períodos da antese floral, uma vez que passa a existir uma competição pelos recursos. Em um estudo com uma espécie de Malvaceae - na qual abelhas do gênero Trigona foram observadas pilhando pólen e néctar e agindo de maneira agressiva para defender seus locais de recursos - foi registrada significativa diminuição na frequência da única espécie de beija-flor que atuava como polinizador (Phaethornis superciliosus), diminuindo consideravelmente a produção de frutos e sementes dessa espécie (Roubik, 1982). Devido à baixa produção de néctar, as flores de V. gradata podem ser classificadas, de forma geral, como “slow producers” (secretam de 5% a 10% do máximo acumulado por hora) (Pacini & Nepi, 2007). A reposição de cerca de 50% do néctar produzido nas primeiras horas de antese, no tratamento de “flores visitadas” ocorreu apenas após a primeira retirada de néctar, cessando totalmente após às 11:00h. Curiosamente, notou-se que, se as flores recebiam visitas durante o período da manhã, a produção de néctar cessava no período da tarde, enquanto que, se as flores não recebiam visitas durante a manhã, continuavam a produção de néctar até o período próximo da senescência floral. Dessa forma, pode-se inferir que, devido à baixa frequência de seus polinizadores (especialmente no período da tarde), essas flores investem fortemente na produção de néctar na ausência de visitantes, de forma a reforçar sua atração para assegurar sua reprodução. A variação na concentração de açúcares no néctar entre os tratamentos e entre as flores analisadas em um mesmo tratamento, indicou aspectos interessantes que podem estar relacionados à mudança no grupo de visitantes florais (polinizadores e pilhadores) ao longo da antese floral, isto é, em algumas flores, a concentração de néctar atinge níveis atrativos para as abelhas (principalmente durante a tarde – cerca de 30%) e durante a manhã essa concentração é menor, cerca de 20% - mais compatível com a preferência dos beija-flores, assim como a composição de açúcares no néctar (sacarose dominante) (Baker & Baker 1983). A variação na orientação do estilete ao longo da antese floral, altera a posição do estigma ao longo da antese floral. Apesar da ocorrência de hercogamia nessa espécie, evitando a auto deposição de pólen nas flores, a deflexão do estilete parece facilitar a deposição de grãos de pólen no estigma por parte dos polinizadores nos períodos da manhã e da tarde, quando a frequência dos beija-flores é maior. Sobre isso, Varassin & Silva (1998) indicam que, em determinadas espécies, pode ocorrer a
78
movimentação de estruturas reprodutivas, o que estabelece uma barreira temporal para a polinização. No caso de V. gradata, a deflexão do estilete parece apresentar relação com o ritmo da produção de néctar, uma vez que o período em que o estigma se apresenta em posição favorável para entrar em contato com o corpo do polinizador corresponde à maior produção de néctar em volume. Nessa perspectiva, pode-se dizer que a dinâmica de produção de néctar em V. gradata está fortemente relacionada à sua estratégia reprodutiva, visto que a frequência de visitas de seus polinizadores responde diretamente à disponibilidade de néctar, ao mesmo tempo que a ação de pilhadores parece influenciar nessa produção. Da mesma forma, a flexão dos estiletes também contribui de maneira a assegurar a reprodução dessa espécie.
Vriesea itatiaiae
As espécies de beija-flores que visitaram as flores de V. itatiaiae contataram as suas estruturas reprodutivas, característica que, de forma geral, indica que os beija- flores atuaram como polinizadores efetivos dessa espécie. Dentre essas espécies, Thalurania glaucopis foi a mais frequente, como registrado em outro estudo com espécies do gênero Vriesea (Nunes et al., 2018). Apesar da alta frequência de visitação, Apis melífera contatou as estruturas reprodutivas da flor poucas vezes ao longo do período de observações, sendo observada mais frequentemente em contato com as anteras, coletando pólen. Dessa forma, as abelhas atuaram na maior parte das vezes como pilhadoras de pólen e também de néctar, quando extravasava para o ápice da corola, uma vez que o tubo floral é estreito para essa espécie conseguir adentrá-lo. Apis mellifera foi relatada como visitante floral de outras espécies de Bromeliaceae, no entanto atuando majoritariamente de forma a promover a autopolinização nessas espécies (Jorge et al., 2018). Segundo Jorge et al. (2018), o maior impacto do comportamento de pilhagem de pólen dessa espécie parece ser em relação à sua eficiência na remoção de pólen das anteras. As flores de V. itatiaiae produzem alta quantidade tanto de pólen, como de néctar, o que parece ser altamente atrativo para essas abelhas. Aparentemente, o efeito dessa pilhagem não representa
79
um prejuízo reprodutivo significativo para V. itatiaiae, visto que as espécies de beija- flores foram visitantes frequentes ao longo de toda a antese floral. Referente ao ritmo de produção de néctar, as flores de V. itatiaiae podem ser classificadas como “fast producers” (secretam de 22% a 68% do máximo acumulado por hora) (Pacini & Nepi, 2007). Comparadas às outras espécies deste trabalho, as flores de V. itatiaiae produziram alto volume de néctar, atingindo picos de cerca de 200µl por flor, aspecto pouco comum em espécies de campos de altitude, que comumente produzem néctar em baixa quantidade, cerca de 2µl (Freitas & Sazima, 2016). Nesse sentido, essa espécie investe grande parte de seus recursos na produção de néctar, o que promove alta quantidade de visitas por parte de seus polinizadores. Além disso, essa espécie desempenha um papel ecológico muito importante no ambiente em que ocorre, pois fornece recursos florais para as espécies de beija-flores que ocorrem nessas áreas, caracterizadas pela escassez de recursos. A queda significativa na produção de néctar em “flores visitadas” - especialmente em volume e quantidade de açúcares - resultou em quantidade menor de visitas por parte de todos os visitantes florais. Segundo Corbet (2003), alterações no volume e quantidade de açúcares no néctar são causadas geralmente pela remoção dos forrageadores, bem como por fatores ambientais como umidade e temperatura. Ordano & Ornelas (2005) indicam que, após sucessivas retiradas de néctar, as plantas parecem manter o tipo e quantidade de açúcares em detrimento da quantidade de água, fator que é diretamente relacionado à preferência dos polinizadores. O padrão de produção de néctar em “flores não visitadas” foi semelhante ao de outras espécies estudadas neste trabalho: diante da ausência de polinizadores, investiram em um aumento significativo nessa produção, o que indica a existência de certa dependência de polinizadores para uma efetiva reprodução dessa espécie. De forma geral, espécies do gênero Vriesea possuem alta dependência de polinizadores, não formando frutos na ausência dos mesmos (Nunes et al., 2018), situação que parece também ocorrer em V. itatiaiae. A composição de açúcares no néctar – sacarose dominante - reflete a preferência por parte dos beija-flores (Stiles & Freeman 1993), assim como a predominância de determinados aminoácidos também pode estar relacionada à essa preferência, como fenilalanina e histidina. É interessante notar que o aminoácido
80
histidina atua como repelente de abelhas, isto é, néctar com composição de aminoácidos rica em histidina costuma ser menos consumido por abelhas que néctar composto por glicina e cisteína, por exemplo (Hendriksma et al., 2014). De forma geral, a composição química do néctar de V. itatiaiae reflete, concomitantemente, a preferência de beija-flores e a repelência de abelhas, favorecendo o consumo de néctar por parte dos beija-flores. Nesse sentido, pode-se dizer que aspectos importantes da dinâmica de produção de néctar em V. itatiaiae refletem sua estratégia reprodutiva, visto que o ritmo de produção e a sua composição química favorecem a visitação por parte dos beija-flores, que por sua vez, atuam como polinizadores efetivos dessa espécie.
81
Considerações Finais
De maneira geral, as variações na dinâmica de produção de néctar indicaram que diferentes espécies investem de maneiras distintas na produção de néctar para atrair seus polinizadores (fast ou slow producer), isto é, espécies com apenas um grupo específico de polinizador (especialistas) parecem investir em uma lenta e longa produção de néctar, enquanto espécies com mais de um grupo de polinizadores (generalistas) parecem investir em uma rápida e breve produção de néctar. As variações na frequência de visitantes florais, por outro lado, parecem exercer influência direta na produção de néctar, especialmente em sua reposição após o consumo, indicando que os mesmos podem modular essa produção. A reabsorção de néctar parece ser um ponto importante da estratégia reprodutiva de grande parte das espécies de Bromeliaceae, especialmente em espécies com flores de antese longa. Em relação à composição química do néctar, a concentração e os tipos de açúcares responderam positivamente à preferência dos diferentes grupos de animais já relatadas na literatura. Por outro lado, a composição de aminoácidos demonstrou aspectos peculiares envolvidos na atração dos polinizadores, trazendo resultados inéditos nesse sentido.
82
Referências
Agostini K., Lopes A.V., Machado I.C. 2014. Recursos Florais. In: Biologia da Polinização. 1 ed. Rio de Janeiro: Projeto Cultural. p. 129-150.
Baker, H.G., Baker, I. 1983. Floral nectar sugar constituents in relation to pollinator type. In: Jones, C.E.; Little, R.J. (Ed.). Handbook of experimental pollination biology. New York: Van Nostrand Reinhold Company Inc. p. 117-141.
Baker, H.G., Baker, I., Hodges, S.A. 1998. Sugar composition of nectar and fruits consumed by birds and bats in the tropics and subtropics. Biotropica 30: 559-586.
Baum, S.F., Eshed, Y., Bowman, J.L. 2001. The Arabidopsis nectary is an ABC independent floral structure. Development 128: 4657–4667.
Benson, J.R., Hare, P.E. 1975. o-Phthalaldehyde: fluorogenic detection of primary amines in the picomole range. Comparation with Fluorescamine and Ninhydrin. Proceedings of the National Academy of Sciences 72: 619-622.
Bernardello, L., Galetto, L., Rodriguez, I.G. 1994. Reproductive biology, variability of nectar features and pollination of Combretum fruticosum (Combretaceae) in Argentina. Botanical Journal of the Linnean Society 114: 293-308.
Biernaskie, J.M., Cartar, R.V., Hurly, A. 2002. Risk-averse inflorescence departure in hummingbirds and bumble bees: could plants benefit from variable nectar volumes? Oikos 98: 98-104.
Bogo, G., Bortolotti, L., Sagona, S., Felicioli, A., Galloni, M., Barberis, M., Nepi, M. 2019. Effects of non-protein amino acids in nectar on bee survival and behavior. Journal of Chemical Ecology 1-8.
Burquez A., Corbet S.A. 1991. Do flowers reabsorb nectar? Functional Ecology 5: 369–379.
83
Canela, M.B.F. 2006. Interações entre plantas e beija-flores numa comunidade de Floresta Atlântica Montana em Itatiaia, Rio de Janeiro. Tese de Doutorado – Universidade Estadual de Campinas. 75p.
Canto, A., Pérez, R., Medrano, M., Castellanos, M. C., Herrera, C. M. 2007. Intra-plant variation in nectar sugar composition in two Aquilegia species (Ranunculaceae): contrasting patterns under field and glasshouse conditions. Annals of Botany 99: 653- 660.
Carlson, J.E. 2007. Male‐biased nectar production in a protandrous herb matches predictions of sexual selection theory in plants. American Journal of Botany, 94: 674- 682.
Corbet, S.A. 2003. Nectar sugar content: estimating standing crop and secretion rate in the field. Apidologie 34: 1-10.
Davis, A. R.1997. Influence of floral visitation on nectar-sugar composition and nectary surface changes in Eucalyptus. Apidologie 28: 27-42.
Feisinger, P. 1976. Organization of a tropical guild of nectarivorous birds. Ecological Monographs 46: 257–291.
Flora do Brasil. 2020 em construção. Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016. Disponível em:< http://floradobrasil. jbrj. gov. br/>. Acesso em 19 jan. 2018.
Freeman, C.E., Head, K.C. 1990. Temperature and sucrose composition of floral nectars in Ipomopsis longiflora under field conditions. The Southwestern Naturalist 35: 423-426.
84
Freitas, L., Sazima, M. 2006. Pollination biology in a tropical high-altitude grassland in Brazil: interactions at the community level. Annals of the Missouri Botanical Garden 93: 465-516.
Forcone, A., Galetto, L., Bernardello, L. 1997. Floral nectar chemical composition of some species from Patagonia. Biochemical Systematics and Ecology 25: 395-402.
Galetto, L., Bernardello, L. 1993. Nectar secretion pattern and removal effects in three species of Solanaceae. Canadian Journal of Botany 71: 1394-1398.
Galetto, L., Bernardello, G. 2005. Rewards in flowers - Nectar. In: Dafni, A.; Kevan, P. (Ed). Pollination ecology: a practical approach. Canada: Enviroquest. p. 261-313.
Gill, F.B. 1988. Trapline foraging by hermit hummingbirds: competition for an undefended,renewable resource. Ecology 69: 1933–1942.
Gómez, J.M., Perfectti, F., Abdelaziz, M., Lorite, J., Muñoz‐Pajares, A.J., Valverde, J. 2015. Evolution of pollination niches in a generalist plant clade. New Phytologist 205: 440-453.
Grantsau R. 1988. Os beija-flores do Brasil: uma chave de identificação para todas as formas de beija-flores do Brasil. Rio de Janeiro: Expressão e Cultura. 233p.
Heinrich, B. 1975. Energetics of pollination. Annual Review of Ecology and Systematics 6:139–170.
Hendriksma, H.P., Oxman, K.L., Shafir, S. 2014. Amino acid and carbohydrate tradeoffs by honey bee nectar foragers and their implications for plant–pollinator interactions. Journal of insect physiology 69: 56-64.
Janzen, D.H.1971. Euglossini bees as long‐distance pollinators of tropical plants. Science 17: 203–205.
85
Jorge, J., Rocha, L.H.S., Jorge, J.P.S., Sousa, P.H.P., Santos, R.L., Freire, E.M.X. 2018. Floral visitors and potential pollinators of a rupicolous bromeliad (Pitcairnioideae) in the Brazilian semiarid. Neotropical Biology and Conservation 13: 101-110.
Kamke, R., Schimid, S., Zillikens, A., Lopes, B.C., Steiner, J. 2011. The importance bees as pollinators in the short corolla bromeliad Aechmea caudata in southern Brazil. Flora 206: 749-756.
Krömer, T., Kessler, M., Lohaus, G., Schmidt-Lebuhn, A.N. 2008. Nectar sugar composition and concentration in relation to pollination syndromes in Bromeliaceae. Plant Biology 10: 502- 511.
Lanna, L.L., Azevedo, C.S., Claudino, R.M., Oliveira, R., Antonini, Y. 2017. Feeding behavior by hummingbirds (Aves: Trochilidae) in artificial food patches in an Atlantic Forest remnant in southastern Brazil. Zoologia – An International Journal for Zoology 34: 1-9.
Laverty, T.M., Plowright, R.C. 1985. Competition between hummingbirds and bumble bees for nectar in flowers of Impatiens biflora. Oecologia 66: 25-32.
Lenzi, M., Matos, J.Z.D., Orth, A.I. 2006. Variação morfológica e reprodutiva de Aechmea lindenii (E. Morren) Baker var. lindenii (Bromeliaceae). Acta Botanica Brasilica 20: 487-500.
Luo, E.Y., Ogilvie, J.E., Thomson, J.D. 2014. Stimulation of flower nectar replenishment by removal: a survey of eleven animal-pollinated plant species. Journal of Pollination Ecology 12: 52-62.
Maglianesi, M.A., Bleuthgen, N., Beohning-Gaese, K., Schleuning, M. 2014. Morphological traits determine specialization and resource use in plant–hummingbird networks in the neotropics. Ecology 95: 3325-334.
86
Marur, C.J., Sodek, L., Magalhães, A.C. 1994. Free amino acids in leaves of cotton plants under water deficit. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal 6: 103-108.
Nicolson, S.W., Nepi, M. 2005. Dilute nectars in dry atmospheres: nectar secretion patterns in Aloe castanea (Asphodelaceae). International Journal of Plant Sciences 166: 227–233.
Nicolson, S.W., Thornburg, R.W. 2007. Nectar chemistry. In: Nectaries and nectar. Springer, Dordrecht: Springer. p. 215-264.
Nepi, M. 2014. Beyond nectar sweetness: the hidden ecological role of non-protein amino acids in nectar. Journal of Ecology 102: 108–115.
Nepi, M. 2017. New perspectives in nectar evolution and ecology: simple alimentary reward or a complex multiorganism interaction? Acta Agrobotanica 70: 1-12.
Nunes, C.E., Briet, J., Galetto, L., Sazima, M., Amorim, F.W. 2018. Nectar ecology of the endemic epiphytic hummingbird-pollinated bromeliad Vriesea altodaserrae: secretion dynamics and pollinator visitation pattern. Acta Botanica Brasilica 32: 479- 486.
Ohashi, K., Yaharas, T. 2002. Visit larger displays but probe proportionally fewer flowers: counterintuitive behavior of nectar-collecting bumble bees achieves an ideal free distribution. Functional Ecology 16: 492-503.
Ojano-Dirain, C.P., Waldroup, P.W. 2002. Protein and amino acid needs of broilers in warm weather: a review. International Journal of Poultry Science 1: 40-46.
Oliveira-Filho, A.T., Fontes M.A.L. 2000. Patterns of floristic differentiation among Atlantic Forests in Southeastern Brazil and the influence of climate. Biotropica 32:793- 810
87
Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. 2011. How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos 120: 321-326.
Ordano, M., Ornelas, F.O. 2005. The cost of nectar replenishment in two epiphytic bromeliads. Journal of Tropical Ecology 21: 541-547.
Ornelas, J.F., Ordano, M., De-Nova, A.J, Quintero, M.E., Garland Jr, T. 2007. Phylogenetic analysis of interspecific variation in nectar of hummingbird‐visited plants. Journal of evolutionary biology 20: 1904-1917.
Paccini, E., Nepi, M. 2007. Nectar production and presentarion.In: Nicolson, S. W.; Nepi, M.; Pacini, E. (Ed.) Nectaries and nectar. Alemanha: Springer Netherlands. p. 167-214.
Pacini, E., Nepi, M., Vesprini, J.L. 2003. Nectar biodiversity: a short review. Plant Systematics and Evolution 238: 7-21.
Pansarin, E.R., Pedro, S.R.M. 2016. Reproductive biology of a hummingbird-pollinated Billbergia: light influence on pollinator behaviour and specificity in a Brazilian semi- decidous forest. Plant Biology 18: 920-927.
Parachnowitsch, A.L., Manson, J.S., Sletvold, N. 2019. Evolutionary ecology of nectar. Annals of Botany 20: 1-15.
Pedersen, M.W., LeFevre, C.W., Wiebe, H.H. 1958. Absorption of C14-labelled sucrose by alfalfa nectaries. Science 127: 758–759.
Peel, M.C., Finlayson, B.L., McMahon, T.A. 2007. Updated world map of the Köppen– Geiger climate classification. Hydrology and Earth System Sciences 11: 1633–1644.
Percival, M. S. 1961. Types of nectar in angiosperms. New Phytology 60: 235–281.
88
Petanidou, T., Van Laere, A., Ellis, W.N., Smets, E. 2006. What shapes amino acid and sugar composition in Mediterranean floral nectars? Oikos 115: 155–169.
Pivnick, K. A., McNeil, J. N. 1985. Effects of nectar concentration on butterfly feeding: measured feeding rates for Thymelicus lineola (Lepidoptera: Hesperiidae) and a general feeding model for adult Lepidoptera. Oecologia 66: 226-237.
Pyke, G.H. 2016. Floral nectar: pollinator attraction or manipularion? Trends in Ecology & Evolution 31: 339-341.
Proctor, M.; Yeo, P.; Lack, A. 1996. The natural history of pollination. Portland: Timber Press. 480p.
Pyke, G.H. 2016. Floral nectar: pollinator attraction or manipularion? Trends in Ecology & Evolution 31: 339-341.
Roubik, D.W. 1982. The ecological impact of nectar‐robbing bees and pollinating hummingbirds on a tropical shrub. Ecology 63: 354-360.
Roubik, D.W., Yanega, D., Aluja, M., Buchmann, S. L.,Inouye, D.W. 1995. On optimal nectar foraging by some tropical bees (Hymenoptera: Apidae). Apidologie 26: 197– 211.
Roy, R., Schmitt, A.J., Thomas, J.B., Carter, C.J. 2017. Nectar biology: from molecules to ecosystems. Plant Science 262: 148-164.
Schmid, S., Schmid, V.S., Zillikens, A., Harter-Marques, B., Steiner, J. 2011. Bimodal pollination system of the bromeliad Aechmea nudicaulis involving hummingbirds and bees. Plant Biology 3: 41-50.
Silveira F.A., Melo G.A.R., Almeida E.A.B. 2002. Abelhas brasileiras- Sistemática e Identificação. Belo Horizonte: Fernando A. Silveira. 254p.
89
Silveira Neto S., Nakano O., Barbin D., Villa Nova N.A. 1976. Manual de ecologia dos insetos. Piracicaba: Ceres. 419p.
Stiles, F.G. 1978. Temporal organization of flowering among hummingbird foodplants of a tropical wet forest. Biotropica 10: 194-210.
Stiles, F.G., Freeman, C.E.1993. Patterns in floral nectar characteristics of some bird- visited plant species from Costa Rica. Biotropica 25: 191-205.
Sweeley, C.C., Bentley, R., Makita, M., Wells, W.W. 1963. Gas-Liquid Chromatography of Trimethylsilyl derivatives of sugars and related substances. Journal of the American Chemical Society 85: 2497-2507.
Thomson, J.D. 1996. Trapline foraging by bumblebees: I. persistence of flight-patch geometry. Behavioral Ecology 7: 158-164.
Truchado, P., Ferreres, F., Bortolotti, L., Sabatini, A.G., Tomás-Barberán, F.A. 2008. Nectar flavonol rhamnosides are floral markers of acacia (Robinia pseudacacia) honey. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56: 8815-8824.
Varassin, I.G., Silva, A.G. 1998. A melitofilia em Passiflora alata Dryander (Passifloraceae), em vegetação de restinga. Rodriguésia, 50: 5-18.
Wilson, M.F. 1983. Plant reproductive ecology. New York: John Wiley and Sons. 360p.
Wolowski M.T., Ashman T., Freitas L. 2013. Community-wide assessment of pollen limitation in hummingbird-pollinated plants of a tropical montane rain forest. Annals of Botany 112: 903-910.
Wu, G. 2009. Amino acids: metabolism, functions, and nutrition. Amino Acids 37: 1-17. Zhao, Z., Lu, N., Conner, J. K. 2016. Adaptive pattern of nectar volume within inflorescences: bumblebee foraging behavior and pollinator-mediated natural selection. Scientific reports 6: 1-8.
90
Zulkifli, I., Dunnington, E.A., Gross, W.B., Siegel, P.B. 1994. Food restriction early or later in life and its effect on adaptability, disease resistance, and immunocompetence of heat stressed dwarf and nondwarf chickens. British Poultry Science 35: 203-214.
91
Capítulo 2
Relação néctar e nectário: morfoanatomia e ultraestrutura de nectários florais em Bromeliaceae
92
Introdução
A ocorrência de tecidos secretores é uma característica recorrente em muitas espécies vegetais e pode estar frequentemente relacionada à atração de visitantes florais (Smets et al., 2000). Nectários florais são estruturas secretoras de grande importância no processo da polinização, uma vez que o néctar é um dos principais recursos produzidos pelas plantas polinizadas bioticamente para atração de seus polinizadores (Wilson, 1983). Do ponto de vista anatômico, os nectários florais variam largamente quanto à ontogenia, morfologia e estrutura (Fahn, 1979) tanto entre espécies, quanto dentro da mesma espécie (Nepi et al., 1996) e essa diversidade pode estar associada com a morfologia e comportamento dos polinizadores (Bernardello, 2007). A origem evolutiva dessas estruturas ainda não está totalmente esclarecida, entretanto alguns autores apontam que os nectários se originaram como órgãos secretores com função de eliminar substâncias líquidas em excesso nas flores (de La Barrera & Nobel, 2004). Em angiospermas, estruturas nectaríferas estão presentes em grande parte das espécies e podem se apresentar como nectários florais e extraflorais, de acordo com a sua posição na planta (Pacini & Nicolson, 2007). Nectários florais são definidos como estruturas associadas a partes florais, com tecidos especializados que produzem e secretam soluções açucaradas e estão envolvidos em interações com animais (Fahn, 1979). A grande diversidade em relação à posição e estrutura dos nectários florais sugere que essas estruturas podem ter evoluído diversas vezes após a grande diversificação das angiospermas, isto é, a produção de néctar não seria um traço monofilético e, em determinadas famílias, parece ter surgido e desaparecido muitas vezes ao longo da evolução das plantas (Lee et al., 2005). Em monocotiledôneas, a ocorrência desses tecidos ocorre quase exclusivamente na forma de nectários septais, que se localizam no ovário da flor e são resultantes de um processo de fusão incompleta da região marginal dos carpelos ao longo da diferenciação desse grupo (Smets et al., 2000). Na família Bromeliaceae, a presença de nectários florais parece ser uma condição ancestral e, dentro da ordem Poales, os nectários evoluíram de forma independente nas diferentes famílias (Linder & Rudall, 2005). Nessa perspectiva, estudos recentes vêm mostrando que o tecido
93
nectarífero é independente do modelo ABC de desenvolvimento floral e que aspectos ecológicos, como as interações, podem modificar sua expressão (Baum et al., 2001). Os nectários florais nas espécies de Bromeliaceae também podem apresentar variações significativas em relação à morfologia, anatomia e ultraestrutura, especialmente entre as diferentes subfamílias e de acordo com a posição do ovário (Sajo et al., 2004). Espécies da subfamília Bromelioideae, por exemplo, possuem flores epígenas e semi-epígenas com nectário septal do tipo interlocular, que geralmente se localiza entre a base e o ápice do ovário, formando três canais nectaríferos posicionados no centro do ovário (Sajo et al., 2004). Por outro lado, espécies da subfamília Tillandsioideae possuem flores hipógenas e semi-hipógenas com nectário septal do tipo infralocular labiríntico, que se localiza ao longo de todo o receptáculo floral (Sajo et al., 2004). De acordo com alguns autores (Schmid, 1985, Sajo et al., 2004), nectários infraloculares possuem tecidos mais especializados, que produzem maior quantidade de néctar e que, provavelmente, evoluíram para atrair grupos específicos de polinizadores, como grandes vertebrados (aves e morcegos). Grande parte dos aspectos envolvidos na biologia do nectário ainda não são devidamente explorados, como por exemplo, as etapas de desenvolvimento do nectário, os distintos padrões de produção de néctar entre espécies, a morfoanatomia e ultraestrutura celular, assim como de que maneira a produção de outros compostos podem influenciar no comportamento do polinizador (Roy et al., 2017). Dessa forma, este capítulo teve como objetivo principal responder a seguinte questão: em que extensão aspectos da morfoanatomia e ultraestrutura celular dos nectários florais das seguintes espécies de Bromeliaceae: Aechmea vanhoutteana, Billbergia distachia, Canistropsis marceloi, Fernseea itatiaiae, Nidularium itatiaiae, Vriesea gradata e Vriesea itatiaiae podem elucidar as causas de variações intra e interespecífica no padrão de produção e secreção de néctar? Levando-se em conta que algumas características anatômicas de nectários florais, como extensão do parênquima nectarífero, presença ou ausência de cutícula, entre outras, podem estar relacionadas à quantidade de néctar produzido (Nepi, 2007), espera-se que a distribuição de organelas e outros aspectos ultraestruturais dos tecidos dos nectários florais apresentem diferenças qualitativas e quantitativas entre espécies que produzem maior quantidade de néctar em maior velocidade e espécies que produzem menor quantidade de néctar em menor velocidade, assim
94
como entre espécies com distintos padrões de reposição de néctar ao longo da antese floral. Espera-se também detectar, através das mudanças ocorridas ao longo do desenvolvimento do nectário floral, as organelas que estão diretamente envolvidas com o processo de secreção de néctar. Concomitantemente, espera-se que a constituição dos componentes nutricionais no néctar, como açúcares e aminoácidos, também reflita o maquinário celular envolvido em sua produção.
Material e métodos
Área e espécies de estudo
Este estudo foi conduzido no Parque Nacional de Itatiaia (PNI), localizado na Serra da Mantiqueira, entre os estados do Rio de Janeiro (RJ) e Minas Gerais (MG), região sudeste do Brasil. Com área total de 30.000 ha, o PNI possui uma altitude entre 600 a 2.791 metros e é composto por duas porções: a partir de 600 m, tem-se a Parte Baixa (22º26’14”S/44º36’3”O), onde predominam formações de Floresta Ombrófila Densa e acima de 1.600 m, tem-se a Parte Alta (22º20’23”S/44º43’17”O), com predominância de formações de Floresta Estacional Semidecidual Altomontana e campos de altitude (Oliveira-Filho & Fontes 2000). O clima é classificado como subtropical úmido ((Peel et al., 2007). O presente estudo foi realizado em ambas as porções do PNI. Foram estudadas duas espécies encontradas em campos de altitude, a saber: Fernseea itatiaiae e Vriesea itatiaiae e cinco espécies encontradas em formação de floresta baixa: Aechmea vanhoutteana, Billbergia distachia, Canistropsis marceloi, Nidularium itatiaiae e Vriesea gradata.
Estudos morfoanatômicos de nectários florais
Amostras de flores das espécies estudadas foram coletadas e dissecadas em laboratório a partir de material fresco ou preservado em Karnovsky (Karnovsky, 1965) para análise dos nectários florais. Realizou-se a caracterização morfoanatômica e ultraestrutural em diferentes estágios de desenvolvimento das flores – desde a pré- antese até a senescência - de forma a caracterizar as mudanças ocorridas ao longo de todo o período de produção e secreção de néctar.
95
Análises da anatomia e ultraestrutura dos nectários florais foram realizadas através da utilização de microscopia de luz (ML), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET), em quatro estágios de desenvolvimento floral em flores não-encasacadas. Os estágios foram definidos da seguinte forma: primeiro corresponde a botões florais em estágio inicial de desenvolvimento, o segundo a botões florais em estágio tardio de desenvolvimento (aproximadamente um dia anterior à antese floral), o terceiro a flores em antese e o quarto a flores senescentes. No entanto, algumas pequenas variações ocorreram de acordo com o período de antese floral de cada espécie estudada (ver detalhes em Resultados). Para a realização de microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura, as amostras foram fixadas em paraformaldeído (4%v/v) em câmara de vácuo. Após 48 horas de fixação a 4ºC, o material foi desidratado em séries de etanol (30% to 100%) em intervalos de 30 minutos. Para ML, a desidratação foi seguida de imersão das amostras em propanol (100%) durante 8 horas e butanol (100%) durante aproximadamente 12 horas. A infiltração foi realizada a 4ºC utilizando butanol (glicol metacrilato, kit Historesina (Leica, Heidelberg, Germany) (3:1, 1:1, 1:3, mínimo de 7dias cada etapa), seguida de infiltração em 100% dessa solução por 10 dias seguidos. A polimerização foi realizada em temperatura ambiente por 48 horas. As secções histológicas (4 to 5μm de espessura) foram obtidas em micrótomo rotativo (Leica RM 2155, Nussloch, Germany) e finalizadas com coloração de 1% de fucsina ácida e 0.05% de azul de toluidina (Feder & O’Brien, 1968), que então foram cobertas com lamínulas e observadas em microscópio óptico (Leica LMD- 7000- Germany). Para MEV, as amostras foram submetidas ao ponto crítico de secagem com CO2 líquido (Leica EM CPD 300, Balzers, Germany), montadas em stubs de metal através da utilização fita condutora de carbono e pulverização (sputter-coating) com ouro (Leica EM ACE 600). As amostras foram analisadas/fotografadas em JEOL JSM- IT300LV (Tokyo, Japan). Para as análises em MET, as amostras foram coletadas e imediatamente fixadas em solução modificada de Karnovsky (Karnovsky, 1965) (glutaraldeído 2%, paraformaldeído 2% e 5 mM CaCl2 em 0.05 M tampão de cacodilato de sódio, pH 7.2) por 48 horas. As amostras foram então lavadas em tampão de cacodilato (0.1M) e pós fixado em tetróxido de ósmio 1% em 0.1M de tampão de cacodilato, pH 7.2, em
96
temperatura ambiente por 1 hora. Após esse procedimento, as amostras foram gradualmente desidratadas em séries de acetona (30% - 100%) e embebidas em resina Spurr (EMS, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) por 48 horas. Foram obtidas secções ultrafinas (60–90 nm) em ultramicrótomo (Porter Blum MT2- Dupont-Sorvall) equipado com lâmina de diamante (malha 300) e essas secções foram submetidas à coloração com acetato de uranila (2.5 %), seguido de citrato de chumbo (0.1%) (Reynolds, 1963). As secções foram observadas em 80 kV utilizando microscópio eletrônico de transmissão (JEM1400 JEOL, Tokyo, Japan) e as imagens obtidas foram digitalizadas.
Resultados
De maneira geral, os nectários florais das espécies estudadas podem ser classificados como estruturados (Fahn, 1979), uma vez que possuem tecido nectarífero diferenciado em duas regiões bem delimitadas: parênquima e epitélio secretor. No entanto, as espécies estudadas possuem variações acentuadas em determinadas características (Tabela 1). As flores das espécies da subfamília Bromeliodeae (Aechmea vanhoutteana, Billbergia distachia, Canistropsis marceloi, Fernseea itatiaiae e Nidularium itatiaiae) são epígenas (ovário ínfero) e possuem nectário do tipo interlocular, composto por um canal tripartido, que se estende da base até o ápice do ovário e se divide em três aberturas nectaríferas. Esse tipo de nectário apresenta três regiões principais, que diferem em relação à abundância de tecido secretor e feixes vasculares ao redor do tecido nectarífero: na região basal, há maior quantidade de feixes vasculares e células secretoras (e provavelmente maior produção de néctar) e os canais secretores de néctar se encontram ainda fechados; na região mediana, a quantidade de tecido secretor diminui e os canais secretores iniciam o processo de abertura; e na região apical o tecido secretor está totalmente ausente, a quantidade de feixes vasculares diminui significativamente e os canais secretores estão completamente abertos (ver detalhes nos resultados específicos para cada espécie). As flores das espécies da subfamília Tillandsioideae (Vriesea gradata e Vriesea itatiaiae) são hipógenas (ovário súpero) e possuem nectário do tipo infralocular composto por canais labirínticos que se estendem da base até o ápice do receptáculo
97
floral, isto é, a disposição dos canais nectaríferos nessas espécies não ocorre no interior do ovário e sim do receptáculo floral. De maneira semelhante ao que ocorre com os nectários das flores da subfamília Bromeliodeae, os canais labirínticos também possuem três regiões principais, que se diferenciam em relação à abundância de tecido secretor e feixes vasculares ao redor do tecido nectarífero: região basal, com maior quantidade de feixes vasculares, células secretoras e canais labirínticos se encontram ainda fechados, região mediana, com quantidade menor de tecido secretor e os canais começam a se abrir e região apical com tecido secretor totalmente ausente e canais completamente abertos. Os canais nectaríferos analisados nas espécies estudadas se desenvolvem através de um processo denominado esquizogênese (exceto em Canistropsis marceloi), que envolve a degradação das pectinas da lamela média para formação do canal secretor. O néctar é secretado diretamente para o canal nectarífero através da parede celular das células epiteliais, não ocorrendo secreção nos espaços intercelulares. O tipo de secreção de néctar apresentada pelas espécies é granulócrina, uma vez que é possível observar células epiteliais e do parênquima nectarífero com grande quantidade de retículo endoplasmático e suas cisternas, dictiossomos e vesículas, sugerindo que o néctar é liberado para o exterior das células por exocitose. O transporte de substâncias entre parênquima nectarífero e epitélio secretor parece ocorrer majoritariamente via simplasto, uma vez que se observou grande quantidade de plasmodesmas em todas as espécies estudadas. Em todas as espécies, o tecido nectarífero não possui feixes vasculares, no entanto estes feixes estão presentes nos tecidos do ovário ao redor do parênquima nectarífero e provavelmente contribuem para o suprimento de água e açúcar para a produção de néctar.
Tabela 1. Características anatômicas gerais do tecido nectarífero entre as diferentes espécies. (vascularização +, um ou dois feixes por canal nectarífero; ++ três feixes por canal nectarífero; +++ mais de três feixes por canal nectarífero) (*formação dos canais nectaríferos: inferência a partir das análises em microscopia de luz).
Espécie Tipo de Nectário Estágios de Epitélio Parênquima Vascularização Tipo de Tipo de desenvolvimento Secretor Nectarífero Região formação dos Secreção Secretora
98
(nº (nº de canais camadas) camadas) nectaríferos* A. vanhoutteana Interlocular 3 1-3 4-5 +++ Esquizógeno Granulócrina B. distachia Interlocular 3 1-3 8-12 +++ Esquizógeno Granulócrina C. marceloi Interlocular 2 1-2 3-6 ++ Esquizo- Granulócrina lisígeno F. itatiaiae Interlocular 3 1-2 2-5 + Esquizógeno Granulócrina N. itatiaiae Interlocular 3 1-2 5-10 +++ Esquizógeno Granulócrina V. gradata Infralocular 3 1-2 10-15 +++ Esquizógeno Granulócrina V. itatiaiae Infralocular 3 1-2 10-12 +++ Esquizógeno Granulócrina
Foi constatado que a ultraestrutura celular está fortemente relacionada ao padrão de produção de néctar nas diferentes espécies. Embora todas as espécies apresentem epitélio secretor com células secretoras típicas (protoplasto denso, grande quantidade de mitocôndrias, paredes primárias finas, alta razão núcleo/citoplasma, numerosos vacúolos pequenos, projeções labirínticas na parede celular, plasmodesmas e vesículas), identificou-se variações entre as espécies e entre os estágios de desenvolvimento do nectário (Tabela 2,3).
Tabela 2. Características ultraestruturais das células do epitélio secretor ao longo do desenvolvimento floral. (*secreção ativa/ - ausente; + presente, mas não comum; ++ presente; +++ presente em alta quantidade/ razão núcleo-citoplasma: A alta; B baixa). Estágios de desenvolvimento - A. vanhoutteana: 1. botão em estágio inicial, 2. flor em antese, 3. flor senescente; B. distachia: 1. botão em estágio inicial, 2. botão em estágio final, 3. flor em antese – 1º dia, 4. flor em antese – 2º dia, 5. flor senescente; C. marceloi: 1. botão em estágio inicial, 2. flor em antese, 3. flor senescente; N. itatiaiae: 1. botão em estágio inicial, 2. botão em estágio final, 3. flor em antese, 4. flor senescente.
A. vanhoutteana B. distachia C. marceloi N.itatiaie
Estágios 1 2* 3 1 2 3* 4* 5 1 2* 3 1 2 3* 4 Cutícula - - - + ------+ - - - Razão N/C A B A A B B B A A B A A B B A Vacúolo ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ + Mitocôndria +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++ Retículo +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ Endoplasmático
99
Ribossomos +++ + + +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ + ++ ++ + Dictiossomos ++ +++ ++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ + +++ +++ + Vesículas ++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ - ++ +++ +++ Projeções labirínticas ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ +++ - + + ++ na parede celular Corpos Lipídicos ++ +++ ++ - ++ + - ++ - +++ + + + ++ + Plastídios ++ - +++ - ++ +++ +++ +++ +++ + + + + + + Plastídios com cristais ------+ + - + Plasmodesmas +++ + ++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ + + + ++ ++ +
Tabela 3. Características ultraestruturais das células do epitélio secretor ao longo do desenvolvimento floral. (*secreção ativa/ - ausente; + presente, mas não comum; ++ presente; +++ presente em alta quantidade/ razão núcleo-citoplasma: A alta; B baixa). Estágios de desenvolvimento - F. itatiaiae: 1. botão em estágio inicial, 2. botão em estágio final, 3. flor em antese, 4. flor senescente; V. gradata: 1. botão em estágio inicial, 2. botão em estágio final, 3. flor em antese, 4. flor senescente; V. itatiaiae: 1. botão em estágio inicial, 2. botão em estágio final, 3. flor em antese durante o período da manhã, 4. flor em antese durante o período da tarde; 5. flor senescente.
F. itatiaiae V. gradata V. itatiaiae
Estágios 1 2 3* 4 1 2 3* 4* 5 1 2 3* 4 Cutícula ------Razão N/C A A B A A B B A A A B B A Vacúolo +++ +++ +++ ++ + ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ ++ Mitocôndria +++ +++ +++ +++ + ++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ Retículo +++ +++ ++ ++ + +++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ Endoplasmático Ribossomos +++ +++ ++ ++ + ++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ Dictiossomos +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ Vesículas ++ +++ ++ ++ + ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ Projeções labirínticas ++ +++ ++ +++ - - ++ ++ +++ - + +++ +++ na parede celular Corpos Lipídicos - - + - - + +++ + + + +++ ++ +++ Plastídios ++ + ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + + + + Plastídios com cristais - + - - ++ ++ + + + + ++ ++ + Plasmodesmas ++ ++ +++ +++ + ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++
100
Aechmea vanhoutteana (Van Houtte) Mez
A. vanhoutteana possui inflorescência simples do tipo espádice, com 10 a 25 flores abertas/dia. Suas flores são tubulares e possuem coloração branca com o ápice da corola arroxeado e brácteas de coloração rosa (aproximadamente 1,5 cm de comprimento). As flores apresentam perianto trímero, heteroclamídeo, diferenciado em sépalas, pétalas (com apêndices petalares) e brácteas florais. O nectário é composto por um canal tripartido, que se divide em três aberturas nectaríferas (Figura 1A,B,D,E), que por sua vez se abrem no hipanto floral (Figura 1C,F). As três regiões principais do nectário diferem visivelmente em região basal (Figura 1A,D,G), região mediana (Figura 1B,E,H) e região apical (Figura 1C, F, I). O tecido nectarífero é composto de duas regiões principais: um epitélio secretor com uma a três camadas de células posicionadas perpendicularmente à superfície do nectário e um parênquima nectarífero com quatro a oito camadas de células isodiamétricas (Figura 1G). Identificamos três estágios principais de desenvolvimento no epitélio secretor e no parênquima nectário, de acordo com as principais alterações ocorrentes em cada um deles. No primeiro estágio (botões florais no início do desenvolvimento), os tecidos do epitélio e do parênquima se encontram pouco distinguíveis, com as células do epitélio menos alongadas (Figura 1G). Nos botões florais no estágio de aproximadamente um dia antes da antese (fase pré-secretora), as células epiteliais se encontram mais alongadas e diferenciadas (Figura 1H) e, nas flores em antese, as células epiteliais se encontram completamente alongadas (fase secretora) (Figura 1I). Na fase secretora, as células epiteliais e do parênquima apresentaram uma fina parede radial e tangencial e um citoplasma denso com muitos vacúolos pequenos.
101
Figura 1. Características anatômicas do nectário floral de A. vanhoutteana (cortes transversais). (A) MEV - região basal do nectário (região produtora/secretora – ausência de canais nectaríferos). Escala = 500 µm; (B) MEV – região apical do nectário (canais nectaríferos totalmente formados). Escala = 500 µm; (C) região apical do ovário, evidenciando a câmara nectarífera, local de armazenamento do néctar. Escala = 500 µm; (D) ML – região basal do nectário altamente vascularizado (seta indicando os feixes vasculares); (E) ML – região mediana do nectário (início da formação dos canais nectaríferos – perda progressiva do tecido secretor), evidenciando a grande quantidade de idioblastos com ráfides (setas) ao longo de toda a extensão do ovário; (F) ML – região apical do nectário (canais nectaríferos totalmente formados); (G) ML - detalhe da região basal do nectário; (H) ML – detalhe da região mediana do nectário; (I) ML – detalhe da região apical do nectário.
As características ultraestruturais do nectário indicaram mudanças expressivas e eventos importantes durante os diferentes estágios de desenvolvimento das flores. De maneira geral, as células epiteliais (epitélio secretor) em flores em antese – quando
102
há secreção ativa – apresentaram um citoplasma denso com numerosas mitocôndrias, retículo endoplasmático, dictiossomos com vesículas secretoras adjacentes e eventualmente, ocorrem alguns corpos lipídicos (Figura 2D,E). Botões florais em estágio tardio de desenvolvimento apresentaram características típicas de células em alta atividade secretora: numerosos vacúolos, mitocôndrias e plasmodesmas, estes últimos observados geralmente na parede anticlinal de células epiteliais (Figura 2A,C). Uma característica notável nesse estágio foi a presença de numerosos amiloplastos vazios, sem grãos de amido em seu interior (Figura 2B). Flores em antese apresentaram diferenças acentuadas quando comparadas aos botões florais em estágio tardio de desenvolvimento: aumento visível na quantidade de dictiossomos, retículo endoplasmático e projeções labirínticas da parede celular nos espaços periplasmáticos (Figura 2D,E,F). Também houve aumento no número de vesículas nessa fase, provavelmente derivadas das cisternas do retículo endoplasmático e dos dictiossomos (Figura 2E), assim como substâncias no espaço periplasmático, possivelmente remanescentes de “pré-néctar” (Figura 2E). Em flores senescentes, houve aumento na quantidade de projeções labirínticas da parede celular (Figura 2G), bem como de amiloplastos sem grãos de amido (Figura 2H). Não foram observadas evidências morfoanatômicas e ultraestruturais para reabsorção de néctar em A. vanhoutteana.
103
Figura 2. Características ultraestruturais das células do tecido nectarífero de A. vanhoutteana. (A) detalhe de uma célula epitelial de flor em antese. Nota-se grande quantidade de retículo endoplasmático (re), projeções labirínticas da parede celular, mitocôndrias (m) e dictiossomos (d). Escala = 2µm; (B) detalhe de uma célula epitelial de botão em estágio inicial de desenvolvimento. Nota-se vesículas no espaço periplasmático e no canal nectarífero (cn) (setas), parede celular (pc), corpos lipídicos (L), vacúolos (v) e mitocôndrias (m). Escala = 1µm; (C) e (D) detalhe de uma célula epitelial de botão em estágio final de desenvolvimento. Nota-se vesículas próximas à lamela média e no canal nectarífero (setas), plasmodesmas (pl) e vacúolos (v). Escala = 1µm; (E) detalhe de uma célula epitelial de flor em antese. Nota-se grande quantidade de vesículas (seta) com provável origem dos dictiossomos (d), vacúolos (v), retículo endoplasmático (re) e mitocôndrias (m). Escala = 1µm; (F) e (G) visão geral e detalhes das células epiteliais em flor senescente. Nota-se grande quantidade de amiloplastos vazios (setas), canal nectarífero (cn), vacúolos (v), retículo endoplasmático (re), corpos lipídicos (L) e mitocôndrias (m). Escala = 1µm. (H) detalhe
104
de uma célula epitelial em flor senescente. Nota-se grande quantidade de projeções labirínticas da parede celular (setas). Escala = 2µm.
Billbergia distachia (Vell.) Mez
B. distachia possui inflorescência simples do tipo racemo, com uma a duas flores abertas/dia. Suas flores apresentam coloração esverdeada com o ápice da corola azulado e formato tubular (aproximadamente 7 cm de comprimento), com perianto trímero e homoclamídeo. As brácteas das flores são esverdeadas e menores que as sépalas e as do escapo floral são de coloração rosa, contribuindo para a atração dos visitantes florais. As pétalas apresentam dois apêndices petalares em sua base. O nectário possui um parênquima composto de 8-12 camadas de células isodiamétricas e um epitélio secretor composto de uma a três camadas de células dispostas perpendicularmente à superfície do nectário (Figura 3D). Ao redor do parênquima nectarífero, ocorre grande quantidade de feixes vasculares (Figura 3G). O nectário se estende da base ao ápice dos lóculos do ovário, no qual ocorrem as três regiões principais: região basal (Figura 3A,D,G; Figura 4B), região mediana (Figura 3B,E; Figura 4C) e região apical (Figura 3C,E; Figura 4D). A presença de tecido secretor diminui progressivamente da porção basal para a porção apical do ovário (Figura 4A), formando três canais secretores de néctar, localizados na porção central do ovário (Figura 3C, Figura 4C,D). O tecido nectarífero é composto por uma a três camadas de células posicionadas perpendicularmente à superfície do nectário, formando um epitélio secretor e cinco a dez camadas de células isodiamétricas formando o parênquima nectarífero (Figura 3G,H). O nectário septal não possui feixes vasculares, mas ocorrem no ovário, ao redor do parênquima nectarífero, provavelmente contribuindo com suprimento de açúcar e água para a produção de néctar (Figura 3E,J,H,I). Algumas características anatômicas do nectário, especialmente o epitélio secretor, se modificam ao longo dos estágios de desenvolvimento da flor e, na fase pré-secretora (botão floral em estágio tardio de desenvolvimento) as células do epitélio secretor e do parênquima nectarífero não se encontram totalmente diferenciada (Figura 3G), o que ocorre em flores em antese, quando que as células iniciam o processo de alongamento (Figura 3I).
105
Figura 3. Características anatômicas do nectário floral de B. distachia (cortes transversais - ML). (A) região basal do nectário (região produtora/secretora – ausência de canais nectaríferos); (B) região mediana do nectário (início da formação dos canais nectaríferos – perda progressiva do tecido secretor); (C) região apical do nectário (canais nectaríferos totalmente formados); (D) detalhe da região basal; (E) detalhe da região mediana; (F) detalhe da região apical; (G) região basal com epitélio secretor em botão em fase inicial de desenvolvimento; (H) região basal com epitélio secretor em botão em fase final de desenvolvimento; (I) região basal com epitélio secretor em flor em antese.
Foram registrados três estágios de desenvolvimento das células do parênquima nectarífero e do epitélio secretor (Figura 3G,H,I): no primeiro estágio (botão), as células do epitélio e do parênquima não estão totalmente diferenciadas umas das outras, entretanto nota-se grande diferença nas dimensões do núcleo entre elas, sendo que nas primeiras o núcleo é mais reduzido se comparado com as células do
106
parênquima. Nos botões mais próximos de completarem o desenvolvimento, as células epiteliais começam a se alongar, assim como o núcleo também inicia seu aumento. As células parenquimáticas nesse estágio estão totalmente diferenciadas das epiteliais e com núcleo reduzido em relação aos estágios iniciais dos botões. Nas flores em antese, as células epiteliais se alongam ainda mais e apresentam substâncias em seu interior. Outra característica peculiar observada nessas flores foi a presença de apêndices petalares (Figura 4E).
Figura 4. Características anatômicas do nectário floral de B. distachia (MEV). (A) corte longitudinal do ovário, evidenciando os canais nectaríferos (setas) e a câmara nectarífera (*). Escala = 500 µm; (B) região basal do nectário. Escala = 500 µm; (C) região mediana do nectário. Escala = 500 µm; (D) região apical do nectário. Escala = 500 µm; (E) apêndices petalares no ápice do ovário. Escala = 500 µm.
De forma geral, as células epiteliais apresentaram fina parede celular radial e tangencial, grande quantidade de pequenos vacúolos e citoplasma denso, enquanto que as células parenquimáticas também apresentaram grande quantidade de pequenos vacúolos, plastídios com grãos de amido (amiloplastos) e plasmodesmas são comumente observados em alguns estágios de desenvolvimento (especialmente botões florais em estágio tardio de desenvolvimento e flores em anteses). As células do epitélio secretor sofrem modificação ao longo do desenvolvimento do nectário: em
107
botões no início do desenvolvimento, nota-se quantidade reduzida de pequenos vacúolos e alta razão núcleo/citoplasma (núcleo com nucléolo muito evidente ocupa grande parte do citoplasma), assim como grande quantidade de ribossomos livres no citoplasma. Em botões no final do desenvolvimento (pré-antese), a razão núcleo/citoplasma diminui consideravelmente e a quantidade de pequenos vacúolos aumenta, assim como a de amiloplastos e mitocôndrias, evidenciando o alto metabolismo energético exigido nessa etapa que antecede o início da produção e secreção de néctar. Botões florais em estágio tardio de desenvolvimento (últimos estágios que precedem a antese floral), apresentaram células parenquimáticas contendo grande quantidade de plastídios com grãos de amido (Figura 5A) e células epiteliais contendo grande quantidade de mitocôndrias, dictiossomos, retículo endoplasmático e pequenos vacúolos (Figura 5B), evidenciando a alta atividade celular nesse estágio de desenvolvimento floral, caracterizando a fase pré-secretora. Em flores em primeiro dia de antese (durante o dia), o parênquima nectarífero também apresentou pequenos vacúolos e mitocôndrias, no entanto grande parte dos plastídios não apresentaram grãos de amido em seu interior nesta fase de desenvolvimento (Figura 5C). Em flores em anteses durante a noite, o número de vesículas aumentou consideravelmente, tanto em células parenquimáticas como epiteliais, quando comparadas com os estágios anteriores de desenvolvimento floral (Figura 5G) e algumas das vesículas também ocorreram em espaços periplasmáticos, próximas à membrana plasmática em células epiteliais (Figura 5F). Nesta fase, houve numerosos plasmodesmas (Figura 5D) e os plastídios das células parenquimáticas retornam a armazenar grãos de amido (Figura 6E). Em flores senescentes, ocorreram remanescentes de néctar nos canais nectaríferos e também aumento no número de vesículas em células epiteliais (Figura 5H, I). Nesta fase, as projeções labirínticas da parede celular se tornam mais proeminentes em células epiteliais (Figura 6H) e observou-se também o aparecimento de vácuolos microautofagocitados (Figura 6I). Foram registradas algumas evidências morfoanatômicas e ultraestruturais para reabsorção de néctar em B. distachia (ver detalhes em Discussão).
108
Figura 5. Características ultraestruturais das células do tecido nectarífero de B. distachia. (A) e (B) células em botões florais em estágio tardio de desenvolvimento, sendo (A) células parenquimáticas contendo plastídios com grãos de amido (setas) e (B) detalhe de células epiteliais com numerosas mitocôndrias (mi), dictiossomos (di), retículo endoplasmático (re) e vacúolos pequenos (v). Escala = 2µm e 1µm; (C) células parenquimáticas em flores no primeiro dia de antese (durante o dia). Nota-se os
109
plastídios vazios (sem grãos de amido) (*), assim como mitocôndrias (m) e vacúolos (v) Escala = 2µm; (D) – (G) células em flores em antese no segundo dia de antese (durante a noite), sendo (D) células epiteliais com números plasmodesmas (setas) Escala = 1µm; (E) células parenquimáticas contendo plastídios com grãos de amido (pl) Escala = 1µm; (F) células epiteliais com projeções labirínticas da parede celular (pr) e vesícula no espaço periplasmático (seta) Escala = 2µm; (G) células epiteliais com grande quantidade de vesículas (setas) Escala = 2µm; (H) e (I) células epiteliais em flores senescentes, sendo (H) demonstrando resquícios de néctar no canal nectarífero (cn) Escala = 2µm; e (I) demonstrando vacúolos microautofagocitados (seta) Escala = 1µm.
Canistropsis marceloi (E. Pereira & Moutinho) Leme
C. marceloi possui inflorescência simples do tipo obcônico-capitada, com uma a quatro flores/dia. Suas flores possuem coloração alvacenta e formato tubular (aproximadamente 1 cm de comprimento) com perianto trímero e homoclamídeo. O nectário possui um parênquima composto de três a seis camadas de células isodiamétricas e um epitélio secretor composto de uma a duas camadas de células dispostas perpendicularmente à superfície do nectário. Foram registrados dois estágios de desenvolvimento das células do parênquima nectarífero e do epitélio secretor: no primeiro estágio (botão em estágio inicial de desenvolvimento – fase pré- secretora), as células do epitélio e do parênquima estão totalmente diferenciadas umas das outras e nas flores em antese e senescentes, as células epiteliais apresentam completo desenvolvimento (fases secretora e pós-secretora) (Figura 6E,F).
110
Figura 6. Características anatômicas do nectário floral de C. marceloi (cortes transversais). (A) MEV – região basal do nectário (região produtora/secretora – ausência de canais nectaríferos). Escala = 500 µm; (B) ML – região basal do nectário; (C) detalhe da região mediana do nectário; (D) MEV – região apical do nectário (canais nectaríferos totalmente formados). Escala = 500 µm; (E) detalhe da região apical; (F) detalhe de um canal nectarífero totalmente desenvolvido.
As características ultraestruturais das células do nectário indicaram mudanças relevantes ao longo do período de desenvolvimento floral em C. marceloi. Em células parenquimáticas de botões em estágio tardio de desenvolvimento, notou-se aumento considerável na quantidade de plastídios contendo amido em seu interior (Figura 7B,D) quando comparados com células parenquimáticas de botões em estágio inicial de desenvolvimento (Figura 7A), que apresentaram baixa quantidade dessas organelas. Referente ao epitélio secretor, em suas células nos botões em estágio tardio apresentaram grande quantidade de vesículas provenientes especialmente do retículo endoplasmático, assim como a presença de plasmodesmas (Figura 7B). Em flores em antese, foi verificada nas células do epitélio secretor (as mais próximas do canal nectarífero) a ocasião em que ocorre a fusão entre a membrana do
111
vacúolo (tonoplasto) e a membrana plasmática (Figura 7E), processo que provavelmente resulta na liberação do conteúdo vacuolar no espaço periplasmático da célula. Também foi observado nessas células grande quantidade de corpos lipídicos (Figura 7F), bem como grandes espaços periplasmáticos (Figura 7G). As células do epitélio secretor em flores senescentes apresentaram características peculiares, como aumento na quantidade de projeções labirínticas da parede celular (Figura 7I) e na quantidade de vesículas (observadas frequentemente localizadas próximas à membrana plasmática) (Figura 7J). Também foram registradas algumas evidências morfoanatômicas e ultraestruturais para reabsorção de néctar em C. marceloi (ver detalhes em Discussão).
112
Figura 7. Características ultraestruturais das células do tecido nectarífero de C. marceloi. (A) visão geral das células epiteliais em botão em estágio inicial de desenvolvimento. Nota-se o canal nectarífero (cn) em evidência e grão de amido solto no canal nectarífero (seta). Escala = 2µm; (B) visão geral das células do parênquima nectarífero em botão em estágio tardio de desenvolvimento. Nota-se a grande quantidade de plastídios contendo amido (setas brancas) e de pequenos vacúolos. Escala = 1µm; (C) detalhe de uma célula parenquimática em botão em estágio tardio de desenvolvimento. Nota-se a presença de mitocôndrias (m), plasmodesmas (p), parede celular (pc) evidente e vesículas (seta) provavelmente derivadas da dilatação das cisternas do retículo endoplasmático. Escala = 1µm; (D) detalhe de uma célula epitelial em botão em estágio tardio de desenvolvimento. Nota-se numerosas mitocôndrias (m) e plastídios (pl) com grãos de amido. Escala = 1µm; (E) vista geral de células epiteliais em flor em antese. Nota-se a presença de vacúolos (v), mitocôndrias (m) e a ocasião da fusão entre a membrana do vacúolo e a membrana plasmática (seta). Escala = 2µm; (F) – (H) células epiteliais em flores em antese, sendo (F) detalhe de uma célula com numerosos corpos lipídicos (cl). Escala = 1µm, (G) demonstrando extenso espaço periplasmático (ep) no pólo apical dessas células. Escala = 2µm, e (H) detalhe demonstrando projeções labirínticas da parede celular (pr) Escala = 1µm. (I) e (J) células epiteliais em flores senescentes, sendo (I) detalhe demonstrando a grande quantidade de projeções labirínticas da parede celular (pr) e vesículas (seta) Escala = 2µm, e (J) demonstrando vesículas (seta) próximas à membrana celular. Escala = 1µm
Fernseea itatiaiae (Wawra) Baker
F. itatiaie possui inflorescência simples do tipo racemo, com duas a seis flores abertas/dia. Suas flores são tubulares (aproximadamente 1,5cm de comprimento), possuem coloração rosa com o ápice da corola arroxeado e apresentam perianto trímero, heteroclamídeo, diferenciado em sépalas, pétalas e brácteas florais. O nectário possui um parênquima composto de duas a cinco camadas de células isodiamétricas e um epitélio secretor composto de 1-2 camadas de células dispostas perpendicularmente à superfície do nectário (Figura 8G,H). Foram registrados três estágios de desenvolvimento das células do parênquima nectarífero e do epitélio
113
secretor: no primeiro estágio (botão em estágio inicial de desenvolvimento), as células do epitélio e do parênquima estão totalmente diferenciadas umas das outras, porém ainda não totalmente alongadas. Nos botões mais próximos de completarem o desenvolvimento, as células epiteliais começam a se alongar, estando totalmente diferenciadas nas flores em antese.
Figura 8. Características anatômicas do nectário floral de F. itatiaiae (cortes transversais). (A) MEV – região apical do nectário. Escala = 500 µm; (B) ML – região basal do nectário. Escala = 1 mm; (C) ML – região mediana do nectário. Escala = 1 mm; (D) ML – região apical do nectário. Escala = 1 mm; (E) MEV - região apical do ovário, evidenciando a câmara nectarífera, local de armazenamento do néctar. Escala = 500 µm; (F) ML - região basal com epitélio secretor em botão em fase inicial de desenvolvimento. Escala = 50 µm; (G) ML - região basal com epitélio secretor em botão em fase final de desenvolvimento. Escala = 100 µm; (H) detalhe de um canal nectarífero, evidenciando as células do parênquima nectarífero com grande quantidade de amido. Escala = 50 µm.
As características ultraestruturais das células do tecido nectarífero se modificaram de forma notável ao longo do desenvolvimento floral, especialmente em relação a determinadas organelas, como o vacúolo. Essa organela variou de forma peculiar nas células parenquimáticas e epiteliais do nectário de F. itatiaiae, quando
114
comparado ao tecido nectarífero das outras espécies estudadas. Em botões florais em estágios inicial e tardio de desenvolvimento, células do epitélio secretor e do parênquima nectarífero apresentaram pequenos e numerosos vacúolos (Figura 9A), enquanto que em flores em antese, as células parenquimáticas apresentaram vacúolos que parecem se fundir e formar apenas um, o qual ocupa aproximadamente a totalidade das células (Figura 9F,I). Curiosamente, em flores senescentes os vacúolos retornam ao tamanho menor em células epiteliais (Figura 9J), permanecendo grandes em células parenquimáticas, nas quais os vacúolos englobam plastídios (Figura 9G). Em botões florais em estágio tardio de desenvolvimento, ocorreu aumento no número de mitocôndrias em células do epitélio secretor (Figura 9C), bem como a presença de plastídios com cristais (Figura 9E). Nesse estágio, também observou-se pequenas projeções labirínticas da parede celular e a presença de vesículas próximas à membrana plasmática (Figura 9B,D). Em flores em antese, notou-se a ocorrência de uma característica exclusiva desse estágio floral: a presença de plastídios com amido em células parenquimáticas, embora em baixa quantidade, quando comparadas à outras espécies estudadas nesse trabalho (Figura 9E). Também ocorreu grande quantidade de plasmodesmas, tanto nas células epiteliais, quanto nas parenquimáticas (Figura 9G). As células do epitélio secretor em flores senescentes apresentaram algumas modificações em determinadas organelas, como em grande parte dos plastídios – que se apresentaram de forma mais alongada quando comparadas aos outros estágios de desenvolvimento floral – e a parede celular, que apresentaram um espessamente em algumas de suas porções (Figura 9J). Não há evidências morfoanatômicas e ultraestruturais para reabsorção de néctar em F. itatiaiae.
115
Figura 9. Características ultraestruturais das células do tecido nectarífero de F. itatiaie. (A) visão geral de uma célula epitelial em botão em estágio inicial de desenvolvimento. Nota-se núcleo (n) evidente, pequenos vacúolos (v), mitocôndrias (m), parede celular (pc) e canal nectarífero (cn). Escala = 2µm; (B) (C) (D) e (E) detalhe de células epiteliais em botão em estágio final de desenvolvimento. (B) nota-se vesícula próxima à membrana plasmática (setas), retículo endoplasmático (re) e
116
projeções labirínticas da parede celular (pr). Escala = 2µm; (C) nota-se grande quantidade de mitocôndrias (m). Escala 500nm; (D) nota-se projeções da parede celular (pr), vesículas próximas à membrana plasmática (seta) e conteúdo sendo englobado por pseudópodes (*). Escala 1µm; (E) detalhe de um plastídio com cristal. Escala = 500nm; (F) visão geral de células parenquimáticas em flor em antese. Nota- se grandes vacúolos (v) e plastídios contendo amido (am). Escala = 10µm; (G) visão geral de células parenquimáticas em flores senescentes. Nota-se plastídios (seta) sendo englobados por vacúolos (v). Escala = 10µm; (H) detalhe de células epiteliais em flor em antese, evidenciando a grande quantidade de plasmodesmas (seta). Escala = 1µm; (I) detalhe de amiloplastos contendo amido (seta) em células parenquimáticas em flores em antese. Escala = 1µm; (J) detalhe de células epiteliais em flores senescentes. Nota-se projeções labirínticas da parede celular (pr), mitocôndrias (m), vacúolos (v) e plastídios alongados (pl). Escala = 1µm.
Nidularium itatiaiae L.B. Sm.
N. itatiaiae possui inflorescência simples do tipo nidular, com 2 a 4 flores abertas/dia e folhas distribuídas em roseta, com bainha alargada na base. Suas flores são tubulares (aproximadamente 5,0 cm de comprimento) e possuem coloração branca com a ápice da corola e brácteas avermelhadas. As flores apresentam perianto trímero, heteroclamídeo, diferenciado em sépalas, pétalas e brácteas florais. O nectário é composto por um canal tripartido, que se divide em três aberturas nectaríferas e três regiões principais que se diferem visivelmente: a região basal (Figura 10A,D), região mediana (Figura 10B,E) e região apical (Figura 10C, F). O tecido nectarífero é composto de duas regiões principais: um epitélio secretor com uma a duas camadas de células posicionadas perpendicularmente à superfície do nectário e um parênquima nectarífero com cinco a oito camadas de células isodiamétricas (Figura 10F). Foram registrados três estágios principais de desenvolvimento do tecido nectarífero (epitélio secretor e parênquima nectarífero), de acordo com as principais modificações em suas células. O primeiro estágio corresponde à botões florais no início de desenvolvimento, no qual as células do epitélio secretor e do parênquima se encontram pouco diferenciadas umas das outras, enquanto que o segundo estágio
117
corresponde à botões florais em estágio tardio de desenvolvimento (aproximadamente um dia anterior à antese floral), no qual as células epiteliais se encontram mais alongadas que as células parenquimáticas. Já o terceiro estágio corresponde à flores em antese, no qual as células epiteliais se apresentam totalmente alongadas (Figura 10D,F).
Figura 10. Características anatômicas do nectário floral de N. itatiaiae (cortes transversais). (A) MEV – região basal do nectário. Escala = 500 µm; (B) MEV – região mediana do nectário. Escala = 500 µm; (C) MEV – região apical do nectário. Escala = 500 µm; (D) ML – região basal do nectário, com epitélio secretor em botão em fase final de desenvolvimento. Escala = 1 mm; (E) MEV - região mediana do ovário, evidenciando a abertura dos canais nectaríferos. Escala = 500 µm; (F) ML - região apical com epitélio secretor em flor em antese. Escala = 50 µm.
As características ultraestruturais das células do nectário demonstraram mudanças expressivas ao longo do período de desenvolvimento floral em N. itatiaiae. Em botões em estágio inicial de desenvolvimento notou-se uma característica peculiar
118
quando comparados aos outros estágios de desenvolvimento floral: as células epiteliais e parenquimáticas apresentaram grandes vacúolos e plastídios alongados contendo amido em seu interior (Figura 11B,C). Nos demais estágios florais, houve uma diminuição no tamanho desses vacúolos, tanto em células epiteliais, quanto parenquimáticas. Em botões em estágio tardio de desenvolvimento, observou-se um aumento na quantidade de mitocôndrias e dictiossomos, especialmente em células epiteliais (Figura 11D,E). Em flores em antese, há a ocorrência de grande número de mitocôndrias e pequenos vacúolos nas células do epitélio secretor, assim como de plasmodesmas e eventuais corpos lipídicos (Figura 11A). As células epiteliais de flores senescentes apresentaram numerosas projeções da parede celular e mitocôndrias (Figura 11F,G) e também em algumas dessas células o processo de endocitose ocorrendo através de pseudópodes (Figura 11H). Não há evidências morfoanatômicas e ultraestruturais para reabsorção de néctar em N. itatiaiae.
119
Figura 11. Características ultraestruturais das células do tecido nectarífero de N. itatiaiae. (A) visão geral das células epiteliais em flor em antese. Núcleo (n), vacúolo (v), plasmodesmas (p), mitocôndria (m), corpo lipídico (cl) e canal nectarífero (cn). Escala = 2µm; (B) e (C) detalhe de uma célula epitelial em botão em estágio inicial de desenvolvimento. Nota-se vacúolos (v), parede celular (pc) e plastídios. Escala = 1µm; (D) e (E) detalhe de uma célula epitelial em botões em estágio final de
120
desenvolvimento. Nota-se grande quantidade de mitocôndrias (m) e vacúolos (v) e também alguns corpos lipídicos (cl). Escala = 1µm; (F) detalhe de uma célula epitelial em flor em antese. Nota-se grande quantidade de mitocôndrias (m), vacúolos (v) e corpos lipídicos (cl). Escala = 2µm; (G) e (H) detalhes de células epiteliais em flores senescentes. Nota-se projeções da parede celular (pr), vacúolos (v) parede celular (pc) evidente e o processo de endocitose ocorrendo através de pseudópodes (setas) Escala = 2µm.
Vriesea gradata (Baker) Mez
V. gradata possui inflorescência simples do tipo racemo, com uma a duas flores abertas/dia. Suas flores são tubulares (aproximadamente 6,0cm), possuem coloração amarela com brácteas avermelhadas, com perianto trímero e heteroclamídeo. O tipo de nectário apresentado pelas espécies de Vriesea (infralocular com canais labirínticos) se localiza no receptáculo floral (Figura 12D,E,F) e apresenta maior complexidade e maior quantidade de canais nectaríferos, quando comparado aos nectários de espécies da subfamília Bromelioideae. O tecido nectarífero em flores de V. gradata possui um parênquima composto de 10-15 camadas de células isodiamétricas e um epitélio secretor composto de uma a duas camadas de células dispostas perpendicularmente à superfície do nectário (Figura 12D,E,F). Semelhante às outras espécies estudadas, três estágios de desenvolvimento das células do parênquima nectarífero e do epitélio secretor foram registrados: no primeiro estágio (botão em estágio inicial de desenvolvimento), as células do epitélio e do parênquima se encontram diferenciadas umas das outras, no entanto as primeiras não se encontram totalmente alongadas. Nos botões em estágio tardio de desenvolvimentos, as células epiteliais começam a se alongar, estando totalmente diferenciadas nas flores em antese. Observou-se também uma característica particular no tecido nectarífero de V. gradata: a presença de numerosos canais de mucilagem ao redor do parênquima nectarífero (Figura 12C,G), característica incomum nas outras espécies estudadas nesse trabalho.
121
Figura 12. Características anatômicas do nectário floral de V. gradata (cortes transversais). (A) MEV – região apical do nectário. Escala = 500 µm; (B) MEV – região mediana do nectário, evidenciando o início da abertura dos canais nectaríferos (seta). Escala = 500 µm; (C) MEV – região basal do nectário, evidenciando o grande número de feixes vasculares ao redor do nectário (seta). Escala = 500 µm; (D) ML – região apical do nectário, evidenciando os canais nectaríferos (lariríntico) (seta). Escala = 100 µm; (E) ML - região mediana do nectário, evidenciando os canais nectaríferos (seta). Escala = 50 µm; (F) ML - região basal, evidenciando o grande número de feixes vasculares (seta). Escala = 100 µm. (G) ML – detalhe de um canal de mucilagem, localizado ao redor dos canais nectaríferos. Escala = 50 µm.
Referente às características ultraestruturais das células do nectário, houve mudanças importantes ao longo do período de desenvolvimento floral em V. gradata. Em botões florais em estágio inicial de desenvolvimento, células do epitélio secretor e do parênquima nectarífero apresentaram algumas características distintas entre si, como o tamanho dos vacúolos, que nas primeiras se apresentaram menor e em maior
122
quantidade (Figura 13A,C). Nesse estágio de desenvolvimento floral, também foi observado nas células parenquimáticas grande quantidade de plastídios alongados (Figura 13A) e na forma de esferas com cristais em seu interior (Figura 13B,C). Em botões em estágio tardio de desenvolvimento, notou-se aumento expressivo na quantidade de mitocôndrias, retículo endoplasmático e dictiossomos em células epiteliais (Figura 13D,E), assim como a presença de plastídios com cristais permaneceu nesse estágio de desenvolvimento floral (Figura 13E). Flores em antese também apresentaram diferenças expressivas nas características do tecido nectarífero em relação a diferentes períodos do dia: durante o período da manhã, as células epiteliais do nectário dessas flores apresentaram numerosos corpos lipídicos – característica que foi registrada apenas nesse estágio floral – e numerosos retículos endoplasmáticos (Figura 13F). Por outro lado, flores em antese no período de tarde apresentaram tecido nectarífero com células epiteliais contendo numerosas mitocôndrias, dictiossomos, plastídios e vesículas observadas próximas à membrana plasmática – provavelmente derivadas das cisternas dos retículos endoplasmáticos (Figura 13G,H,I). Em flores senescentes, observou-se nas células epiteliais um aumento expressivo na quantidade de projeções labirínticas da parede celular (Figura 13J), bem como numerosos plastídios sem conteúdo no interior dos mesmos (Figura 13K). Além disso, foram encontradas algumas evidências morfoanatômicas e ultraestruturais para reabsorção de néctar em V. gradata (ver detalhes em Discussão).
123
Figura 13. Características ultraestruturais das células do tecido nectarífero de V. gradata. (A) células epiteliais de botão em estágio inicial de desenvolvimento. Nota- se a presença de plastídios (pl), mitocôndria (m), núcleo evidenciado (n), alguns corpos lipídicos (cl) e grande número de vacúolos (v). Escala = 1µm; (B) e (C) detalhe de uma célula epitelial em botão em estágio inicial de desenvolvimento. Nota-se plastídios (pl) com cristal (setas) e vacúolos de tamanho grande (v). Escala = 1µm;
124
(D) e (E) detalhe de células epiteliais em botões em estágio final de desenvolvimento. Nota-se grande quantidade de retículo endoplasmático (re), mitocôndrias (m) e dictiossomos (di), assim como plastídios com cristal (pl). Escala = 1µm; (F) detalhe de células epiteliais em flores em antese durante o período da manhã. Nota-se grande número de corpos lipídicos (cl), mitocôndrias (m) e dictiossomos (di). Escala = 1µm; (G) e (H) detalhe de células epiteliais em flores em antese durante o período da tarde. Nota-se grande número de mitocôndrias (m), dictiossomos (di) e plastídios (pl), assim como alguns corpos lipídicos (cl) e remanescentes de néctar (seta) próximos à parede celular (pc). Escala = 1µm; (I) detalhe de célula epitelial em flores em antese durante o período da tarde. Nota-se grande número de vesículas (setas) próximo à membrana plasmática e de dictiossomos (di). Escala = 2 µm. (J) e (K) detalhe de células epiteliais em flores senescentes. Nota-se projeções da parede celular (setas), assim como a presença de plastídios vazios (pl). Escala = 2 µm e 1 µm.
Vriesea itatiaiae Wawra
V. itatiaiae possui inflorescência composta do tipo racemo, com uma a duas flores abertas/dia por inflorescência. Em média, um mesmo indivíduo possui de duas a seis inflorescências com flores abertas em um mesmo período. Suas flores são tubulares (aproximadamente 5,0cm de comprimento), possuem coloração amarela com brácteas avermelhadas, apresentando perianto trímero, heteroclamídeo, diferenciado em sépalas, pétalas e brácteas florais. O nectário possui um epitélio secretor composto de 1-2 camadas de células posicionadas perpendicularmente à superfície do nectário e um parênquima composto de 10-12 camadas de células isodiamétricas (Figura 14A,B). Quanto aos estágios de desenvolvimento, foram reados, de forma semelhante às outras espécies estudadas, três estágios de desenvolvimento do tecido nectarífero: no primeiro estágio (botão em estágio inicial de desenvolvimento), as células do epitélio e do parênquima se encontram diferenciadas umas das outras, no entanto as células epiteliais não se encontram totalmente alongadas. Nos botões em estágio tardio de desenvolvimentos, as células epiteliais começam a se alongar e em flores em antese se encontram totalmente diferenciadas.
125
Figura 14. Características anatômicas do nectário floral de V. itatiaiae (cortes transversais). (A) ML - região basal, evidenciando os canais nectaríferos do tipo labirínticos (seta). Escala = 100 µm. (B) ML - região mediana do nectário, evidenciando os canais nectaríferos entre os lóculos do ovário (seta). Escala = 200 µm; (C) ML - região basal, evidenciando a grande quantidade de feixes vasculares (seta). Escala = 100 µm; (D) MEV – região basal do nectário, evidenciando a grande quantidade de feixes vasculares ao redor do nectário (seta). Escala = 500 µm; (E) MEV – região mediana do nectário, evidenciando o início da abertura dos canais nectaríferos (seta). Escala = 500 µm; (F) MEV – região apical do nectário, demonstrando os canais nectaríferos totalmente abertos. Escala 200 µm.
Referente às características ultraestruturais das células do nectário, foram observadas modificações importantes ao longo do período de desenvolvimento floral em V. itatiaiae. Em botões em estágio inicial de desenvolvimento, é possível observar nas células epiteliais a alta razão núcleo/citoplasma, bem como o tamanho distinto entre os vacúolos de células epiteliais e parenquimáticas – menores e mais numerosos nas primeiras (Figura 15A). Nesse estágio de desenvolvimento floral, não foi registrada a presença de muitas organelas, uma vez que o núcleo ocupa grande parte da célula. Em botões em estágio tardio de desenvolvimento, observou-se em
126
células epiteliais numerosas mitocôndrias, corpos lipídicos e dictiossomos, assim como eventuais plastídios com cristais em seu interior (Figura 15B,C). Flores em antese apresentaram células do epiteliais com características peculiares, não observadas nas outras espécies estudadas nesse trabalho: um aumento expressivo nas projeções labirínticas da parede celular (característica comumente observadas em flores senescentes) e também na quantidade de mitocôndrias, as quais ocuparam grande parte dessas células nesse estágio de desenvolvimento floral (Figura 15D,E,F). Nesse estágio também foi registrado nas células epiteliais a presença de estruturas que se assemelham a gotas de óleo, bem como de corpos lipídicos (Figura 15F). Em flores senescentes, grande parte das células epiteliais e parenquimáticas retornam a apresentar vacúolos de tamanho grande, enquanto que a quantidade de mitocôndrias decai em relação às observadas em células epiteliais de flores em antese (Figura 15G). Também ocorre aumento na quantidade de corpos lipídicos dispersos no citoplasma dessas células nesse estágio de desenvolvimento floral (Figura 15H). Não há evidências morfoanatômicas e ultraestruturais para reabsorção de néctar em V. itatiaiae.
127
Figura 15. Características ultraestruturais das células do tecido nectarífero de V. itatiaiae. (A) visão geral do tecido nectarífero (células epiteliais e parenquimáticas) de botão em primeiro estágio de desenvolvimento. Nota-se a presença de um núcleo evidente (n), demonstrando a alta razão núcleo/citoplasma, bem como o canal nectarífero (cn) e grandes vacúolos (v) em células parenquimáticas. Escala = 2µm; (B) e (C) detalhe de células epiteliais em botões em estágio tardio de desenvolvimento.
128
Nota-se grande quantidade de mitocôndrias (m) e a presença de vacúolos (v) menores, plastídios (p), dictiossomos (di) e parede celular (pc). Escala = 1µm; (D) visão geral de células epiteliais em flores em antese. Nota-se grande quantidade de mitocôndrias (m) e projeções da parede celular (pr), assim como o canal nectarífero (cn). Escala = 2µm; (E) e (F) detalhe de células epiteliais em flores em antese. Nota- se grande quantidade de vacúolos (v) de tamanho grande, grande quantidade de mitocôndrias (m) e projeções da parede celular (pc). Escala = 2µm; (G) e (H) detalhe de células epiteliais em flores senescentes. Nota-se grande quantidade de vacúolos (v) grandes, alguns amiloplastos (am), plasmodesmas (pl), mitocôndrias (m) e estruturas que se assemelham a gotas de óleo (setas). Escala = 2µm e 1 µm.
Discussão
De forma geral, as características morfoanatômicas dos nectários das espécies estudadas se encontram de acordo com estudos prévios sobre outras espécies de Bromeliaceae, que usualmente apresentam um nectário estruturado, isto é, diferenciado em um epitélio secretor e um parênquima nectarífero (Fahn, 1979; Sajo et al., 2004). De acordo com Sajo et al. (2004), esse tipo de nectário representa uma característica derivada dentro do grupo das monocotiledôneas. Apesar de ser uma característica rara em Poales, os nectários septais estão presentes em espécies da família Bromeliaceae, o que parece estar diretamente relacionado aos sistemas de polinização apresentados por essas espécies, que frequentemente envolvem animais de grande porte e que consomem grandes quantidades de néctar, como aves e morcegos (Sajo et al., 2004). As distintas subfamílias de Bromeliaceae também apresentam variações estruturais na apresentação dos nectários florais, sendo comum na subfamília Bromelioideae a apresentação de nectário do tipo interlocular, isto é, com canais nectaríferos em número reduzido (geralmente três canais) e dispostos entre os lóculos do ovário (Sajo et al., 2004). Espécies da subfamília Tillandsioideae costumam apresentar nectário do tipo infralocular – de maior complexidade estrutural - os quais comumente estão localizados no receptáculo floral e possuem maior extensão longitudinal associada a canais nectaríferos dispostos na forma de superfície labiríntica e muitos feixes vasculares (Sajo et al., 2004). Esses fatores contribuem para
129
maior produção de néctar em volume, favorecendo visitas de polinizadores com tamanho corpóreo grande, como aves e morcegos (Sajo et al., 2004). Em relação às características ultraestruturais, o tecido nectarífero geralmente apresenta células meristemáticas com numerosos vacúolos pequenos, que se fundem e formam um único vacúolo de maio tamanho na célula diferenciada, ocupando volume considerável da célula em alguns estágios florais. A razão núcleo-citoplasma também apresentou um padrão comum em todas as espécies estudadas: em células meristemáticas foi alta, decaindo conforme a sua maturação, característica comumente observada em tecidos vegetais (Appezzato-da-Glória & Carmello- Guerreiro, 2006). De acordo com alguns estudos, pode haver uma correlação entre o nível de vascularização no nectário ou próximo a ele e a concentração de solutos no néctar, isto é, quanto maior a vascularização, maior o suprimento de água e menor a concentração do néctar (Gunning & Hughes, 1976), o que parece ocorrer em algumas espécies. De forma geral, a interação entre os feixes vasculares e o tecido nectarífero ocorre da seguinte forma: as terminações vasculares liberam as seivas floemática e xilemática no parênquima nectarífero, as quais geralmente são translocadas célula a célula, via simplasto e modificadas de pré-néctar a néctar no protoplasto das células nectaríferas (Appezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro, 2006). O processo de secreção de néctar ocorre principalmente por exocitose, através do processo de secreção ganulócrina e algumas características ultraestruturais evidenciam tal processo, como a presença de dictiossomos, retículo endoplasmático e vesículas próximas à membrana plasmática (Fahn, 1979). Nesse processo, o néctar é transportado através de vesículas derivadas do retículo endoplasmático e do dictiossomo, as quais se fundem com a membrana plasmática e liberam o conteúdo para o exterior das células nectaríferas (Fahn, 1988).
Aechmea vanhoutteana (Van Houtte) Mez
As características ultraestruturais do nectário indicaram acontecimentos importantes relacionados à produção de néctar nos diferentes estágios do desenvolvimento floral. A produção de néctar se iniciou em estágios tardios de desenvolvimento dos botões florais, uma vez que o néctar se encontrou disponível
130
logo nos períodos iniciais da antese, ocasião em que observou-se numerosos amiloplastos desprovidos de grãos de amido, indicando que o amido foi metabolizado para produzir carboidratos do néctar. Dessa maneira, pode-se dizer que o amido foi armazenado no parênquima nectarífero no estágio pré-secretor e hidrolisado anteriormente à secreção do néctar. Segundo Pacini e Nepi (2007), existem duas fontes principais de carboidratos do néctar que não são mutuamente exclusivas: amido acumulado no parênquima nectarífero na fase pré-secretora e a partir dos fotoassimilados através da fotossíntese no nectário ou em outras partes florais ou vegetativas. Considerando que a remoção sucessiva do néctar não afetou sua produção em relação ao volume, mas sim em quantidade de açúcares (ver detalhes no capítulo 1), pode-se dizer que o amido armazenado garante o pico de produção de néctar em grande parte das flores no início da antese. Dessa forma, pode haver uma produção mais variável de néctar (em média menor) a partir de fotoassimilados em algumas dessas flores ao longo do período de antese floral. O amido armazenado no parênquima nectarífero representa um recurso finito, especialmente em flores com período de antese curto, o que pode explicar a diminuição na quantidade de açúcares em “flores visitadas”, o que sugere a depleção de carboidratos disponíveis no tecido nectarífero (Stahl et al., 2012). Por outro lado, a reposição de água no néctar parece não representar um “problema” para as flores de A. vanhoutteana, uma vez que o volume de néctar em “flores não visitadas” e “flores visitadas” não diferiu consideravelmente ao longo do período de antese floral. Sobre esse processo, Pacini & Nepi (2007) apontam que a concentração de açúcares no néctar pode ser controlada por difusão passiva, enquanto que o volume é controlado por diferenças na pressão hidrostática. Assim, se o ritmo de difusão de açúcares é mais lento que a reposição de água, a concentração do néctar pode diminuir após sucessivas visitas dos polinizadores (Ordano & Ornelas, 2005). Em flores em antese, houve aumento peculiar na quantidade de duas organelas diretamente envolvidas na produção de açúcares: retículo endoplasmático e dictiossomos. De acordo com Pacini & Nepi (2007), os dictiossomos são as principais organelas envolvidas na produção e transporte de açúcares, de modo que variadas análises ultraestruturais concluíram que essa organela também está envolvida com a produção de polissacarídeos (Fahn, 1988). Dessa forma, o aumento na quantidade
131
de açúcares em algumas fases da antese floral (ca. 12:00h) pode estar diretamente relacionada às mudanças na ultraestrutura do tecido nectarífero, indicando a existência de um mecanismo adaptado envolvido na utilização de diferentes recursos para a produção de néctar. A abundância de dictiossomos e vesículas também sugere que a secreção de néctar ocorre através de processo granulócrino (Mosti et al., 2013). Considerando que muitos fatores ambientais podem influenciar na produção de néctar, incluindo os fatores que afetam a biossíntese e respiração (temperatura, solo, fotorrespiração, etc.), sugere-se que as condições de luz e temperatura podem estar diretamente relacionadas ao aumento na quantidade de dictiossomos no tecido nectarífero nos períodos de maior temperatura, uma vez que é nesses períodos que uma maior taxa fotossintética é esperada, o que pode ter contribuído para uma maior taxa de fotoassimilados e maior quantidade de açúcares produzidos no néctar. De acordo com Karban et al. (1999), as condições de luz e temperatura podem influenciar e controlar a expressão da planta, sendo cruciais para a disponibilidade de recursos. Temperatura e radiação solar, por exemplo, podem determinar e influenciar diretamente o ritmo de produção de néctar, uma vez que esses fatores estão diretamente relacionados ao metabolismo da planta (Rathcke, 1992). Um estudo recente sobre nectários extraflorais em Ricinus communis demonstrou que as mudanças na produção de néctar estão diretamente relacionadas ao conteúdo disponível no floema e esse processo é mediado pela enzima invertase, que por sua vez é envolvida com o descarregamento de sacarose do floema no interior do tecido nectarífero (Millán-Canongo et al., 2014). A rápida reposição de néctar (“fast producer”) parece estar fortemente relacionada com algumas características ultraestruturais específicas, como a grande quantidade de projeções labirínticas da parede celular, especialmente em células epiteliais do nectário. Essas projeções, acompanhadas por numerosos plasmodesmas, aprimoram a translocação de substâncias a curtas distâncias e facilita o transporte de componentes hidrofóbicos (aminoácidos, por exemplo) através da parede celular (Stpiczynska et al., 2005). Outra característica peculiar observada nesse sentido, foi o proeminente espaço periplasmático apresentado por grande parte das células epiteliais, que também pode estar envolvida com a rápida reposição e produção de néctar em A. vanhoutteana, uma vez que essas estruturas são diretamente relacionadas ao processo de secreção (Paiva, 2009). De acordo com
132
Paiva (2016), os produtos provenientes de secreção, após serem sintetizados, são liberados do protoplasto celular e se acumulam no espaço periplasmático, passando através da parede celular e sendo exposto extracelularmente. Em flores senescentes, nas quais os espaços periplasmáticos se tornam mais amplos, sugere-se também podem estar relacionados ao processo de desintegração do tecido nectarífero, uma vez que a pressão induzida pelo material acumulado dentro deles pode às vezes romper alguns plasmodesmas, o que afasta o protoplasto da parede celular, resultando em expansão maciça dos espaços periplásmicos (Paiva, 2016). Nessa perspectiva, os resultados sugerem que tanto as características fisiológicas como as anatômicas estão relacionadas com as variações na produção de néctar ao longo do período de desenvolvimento floral em A. vanhoutteana. A capacidade da planta em mobilizar o amido armazenado no tecido nectarífero para a produção de néctar nos períodos iniciais da antese, associada à utilização dos fotoassimilados para reposição do néctar consumido, bem como à aparente “plasticidade” na ultraestrutura do nectário (por exemplo, aumento na quantidade de disctiossomos e retículo endoplasmático nos períodos de maior temperatura) parecem estar fortemente relacionadas às variações intraespecíficas nas características do néctar ao longo da antese floral. Sugere-se também a existência de alocação de recursos para otimizar a reprodução através da produção de néctar nessa espécie, o que contribui para a atração de diferentes grupos de visitantes florais.
Billbergia distachia (Vell.) Mez
As características morfoanatômicas e ultraestruturais do tecido nectarífero de B. distachia indicaram importantes acontecimentos relacionados à dinâmica de produção de néctar nessa espécie. A presença de apêndices petalares é uma característica comum em espécies da subfamília Bromelioideae (Sajo et al., 2004) e estão envolvidos com a proteção do néctar dentro da câmara nectarífera (Brown & Terry, 1992). A secreção de néctar parece ocorrer através de um mecanismo que envolve diretamente a parede celular de células epiteliais e a grande quantidade de mitocôndrias nas células epiteliais e parenquimáticas indica a alta demanda energética envolvida no processo de secreção (Nepi, 2007; Paiva & Machado, 2008).
133
As mudanças no ritmo de produção de néctar durante distintos períodos ao longo da antese floral, isto é, em alguns momentos específicos algumas flores atuarem como “fast producers” e em outros atuarem como “slow producers”, assim como as mudanças na quantidade de açúcares nos diferentes períodos do dia (ver detalhes no capítulo 1), parecem estar diretamente relacionadas ao tipo de recurso energético acumulado no tecido nectarífero para produzir os carboidratos que compõem o néctar. Existem duas fontes (recursos energéticos) principais para a síntese dos carboidratos do néctar, que não são mutualmente excludentes: amido acumulado no parênquima nectarífero na fase pré-secretora e fotoassimilados adquiridos a partir da fotossíntese realizada no nectário e em outras partes florais e vegetativas (Pacini & Nepi, 2007). O armazenamento de amido no parênquima nectarífero contribui com a rápida reposição de néctar no início da antese e, uma vez que o amido é um recurso finito em flores com antese curta, o amido parece ser substituído gradualmente por fotoassimilados ao longo da antese floral (Paiva & Machado, 2008). A partir dessa perspectiva, no primeiro dia de antese, a principal fonte de energia para a produção de néctar é provavelmente o amido e, nos dias seguintes, a principal fonte são os fotoassimilados, uma vez que a diminuição na quantidade de amido acumulado no parênquima nectarífero foi observada durante determinadas fases da antese floral (principalmente a partir do segundo dia). A diminuição na concentração no néctar reposto ao longo da antese também pode estar diretamente relacionada a essas características do nectário e a redução nos carboidratos disponíveis no parênquima nectarífero pode contribuir com esse fenômeno (Stahl et al., 2012). Outra função importante dos plastídios parece estar diretamente envolvida na síntese de alguns tipos de aminoácidos pela planta, isto é, são nessas organelas que se encontram os precursores de determinados aminoácidos, como a glutamina, detectada em altas quantidades no néctar de B. distachia. Segundo Miflin & Lea (1975), a enzima glutamina-sintase se encontra associada somente aos plastídios, não havendo evidências de sua presença em outras organelas. Outra ocorrência interessante na dinâmica de produção de néctar em B. distachia foi a diminuição em sua produção durante o período noturno (com algumas flores não produzindo néctar), detectada nos dois tratamentos realizados: “flores visitadas” e “flores não visitadas” (ver detalhes no capítulo 1). Sobre isso, sugere-se
134
que diferentes processos podem estar relacionados à essa pausa na produção de néctar: ausência de polinizadores e reabsorção do néctar não consumido durante o período diurno. A diminuição no volume e na concentração do néctar ocorrendo na mesma ocasião, associadas a ausência de polinizadores durante a noite, sugerem a ocorrência de reabsorção do néctar no período noturno. Concomitantemente, evidências anatômicas e ultraestruturais, como o aumento na quantidade de vesículas e baixo acúmulo de amido durante um período de baixa produção de néctar sustentam essa conclusão. O aumento na quantidade de vesículas durante períodos sem secreção de néctar sugere que o processo de reabsorção ocorre através de endocitose, assim como o acúmulo de amido em amiloplastos nesse mesmo período parecem ser fortes evidências de reabsorção de néctar, pois os açúcares reabsorvidos geralmente são armazenados temporariamente nessas organelas na forma de amido (Nepi et al., 1996). Segundo Nepi (2007), amiloplastos podem estar envolvidos no armazenamento temporário de carboidratos reabsorvidos em situações nas quais o néctar não é totalmente consumido por visitantes florais. O processo de reabsorção de néctar parece ser estimulado pela taxa de visitação, uma vez que em “flores visitadas” o ritmo de produção de néctar foi menor (nulo em alguns períodos) que em “flores não visitadas” (ver detalhes no capítulo 1). Nesse contexto, considerando que a produção de néctar exige um gasto considerável de energia (Pyke, 1991), a reabsorção de néctar pode representar um mecanismo ativado e dirigido pelos polinizadores, especialmente em plantas com um nível alto de dependência de polinizadores para reprodução. Outras características ultraestruturais relacionadas ao processo de reabsorção de néctar são os vacúolos microautofagocitados e projeções labirínticas da parede celular, ambas ocorrendo especialmente no epitélio secretor. A primeira está provavelmente relacionada à reciclagem de substâncias que posteriormente irão compor o néctar reposto (Mosti et al., 2013), contribuindo com proteínas, aminoácidos e lipídios que enriquecem nutricionalmente o néctar (Fahn, 1979). As projeções labirínticas da parede celular, que ocorrem especialmente em flores senescentes, são estruturas relacionadas ao aumento da área de superfície da membrana plasmática e podem desempenhar um papel importante na otimização e velocidade do transporte lateral de substâncias em curta distância, também chamadas como “transfer cells” (Gunning & Pate, 1969).
135
A reabsorção do néctar representa um evento importante associado à estratégia reprodutiva de B. distachia, uma vez que permite que a planta continue produzindo néctar ao longo de todo o período de antese floral, aumentando a probabilidade de visitação das flores, ao mesmo tempo em que o néctar reabsorvido pode ser também utilizado para posterior desenvolvimento dos frutos e outras partes vegetativas da planta. Dessa forma, ambos os aspectos – reabsorção e a capacidade das células do nectário em armazenar amido e fotoassimilados para produção de açúcares do néctar – representam importantes fatores da estratégia reprodutiva dessa espécie e podem estar associados com o processo metabólico de nutrientes durante a noite, permitindo que as flores retomem a produção de néctar nas primeiras horas do dia seguinte. Portanto, a morfoanatomia do nectário, as características de composição do néctar (sacarose dominante) e o mecanismo de economia de energia através da reabsorção de néctar contribuem conjuntamente e estão fortemente relacionadas a interação bem estabelecida entre B. distachia e o beija-flor Phaethornis eurynome.
Canistropsis marceloi (E. Pereira & Moutinho) Leme
A formação dos canais nectaríferos em C. marceloi parece ocorrer através de processo esquizolisígeno, isto é, essa formação se inicia esquizoginamente, com a dissolução da lamela média, porém, ao longo do desenvolvimento as células epiteliais sofrem autólise após a ampliação do lúmen (Turner et al., 1998). Evidências desse processo ocorreram em botões em estágio inicial de desenvolvimento, nos quais grãos de amidos intactos estavam presentes, bem como remanescentes celulares dispostos no canal nectarífero, indicando a ocorrência parcial de lise celular para formação dos canais nectaríferos. As características ultraestruturais das células do nectário indicam que a queda na concentração do néctar, bem como na quantidade de açúcares em flores visitadas repetidas vezes (ver detalhes no capítulo 1) está fortemente relacionada ao tipo de recurso energético utilizado para produzi-lo, neste caso o amido, que está presente em grande quantidade em todo o tecido secretor, especialmente na fase pré- secretora. A grande quantidade de grãos de amido por plastídio também contribui para um aumento da área de superfície, facilitando a sua mobilização durante a produção de néctar, o que pode explicar a rápida reposição do néctar em C. marceloi (Nepi et
136
al., 1996). Nesse sentido, o acúmulo de amido na forma de pequenos e numerosos grãos também permite uma rápida mobilização de carboidratos (Nepi et al., 1996). Entretanto, por ser um recurso limitado e finito em flores com período curto de antese, o amido pode não estar disponível em altas quantidades ao longo de toda a antese, o que pode explicar a queda na concentração do néctar que é reposto após as primeiras visitas dos polinizadores (Stahl et al., 2012), causando efeito direto na visitação dessas flores por diferentes grupos de polinizadores. A grande quantidade de corpos lipídicos, especialmente em células epiteliais de flores em antese, pode estar indicando uma probabilidade de o néctar produzido por essas flores conter lipídios em sua composição, uma vez que esse é um composto comumente observado no néctar (Roy, 2017). Apesar de poucos estudos abordarem a questão de lipídios no néctar, alguns autores indicam que uma de suas funções seria evitar a evaporação do néctar através da formação de um filme sobre essas gotículas (Corbet & Wilmer, 1981). No entanto, sugere-se que em C. marceloi a alta frequência de visitação de abelhas pode indicar uma evidência para esse acontecimento, uma vez que grande parte das espécies de abelhas possuem preferência por pólen rico em ácidos graxos, o que sugere que as abelhas podem preferir perfis semelhantes de composição de néctar (Kram et al., 2008). Assim, a presença de grande quantidade dessas organelas pode explicar a alta frequência, bem como a preferência das abelhas pelo néctar produzido pelas flores de C. marceloi. Os volumosos espaços periplasmáticos presentes especialmente em flores em antese, associados com numerosos dictiossomos estão diretamente relacionadas ao processo de secreção de néctar, o que explica a sua abundância na fase secretora. Os espaços periplasmáticos são estruturas nas quais provavelmente o néctar é armazenado para ser secretado por ocasião da antese floral. Segundo Paiva (2016), existem vários estudos que observaram a fusão de vesículas - derivadas dos dictiossomos - com a membrana plasmática para liberar substâncias armazenadas nos dictiossomos, o que parece ocorrer nas células do epitélio secretor. Após a síntese, os produtos que serão secretados deixam o protoplasto e se acumulam no espaço periplasmático, a partir do qual esses produtos atravessam a parede celular e atingem o espaço extracelular. Esse processo resulta em aumento da pressão no protoplasto para que se comprima e sua matriz citoplasmática se torne mais densa, o que pode causar também a ruptura de alguns plasmosdesmas (Paiva, 2016).
137
As flores de C. marceloi também demonstram reabsorver o néctar não consumido e determinadas características ultraestruturais evidenciam esse fato, como o aumento na quantidade de vesículas, que sugere a ocorrência de reabsorção de néctar por endocitose (Nepi et al., 1996), bem como das projeções labirínticas em flores senescentes, que favorecem a translocação de substâncias a curta distância (Apezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro, 2006). Alguns fatores relacionados à morfologia floral também podem estar relacionados ao processo de reabsorção de néctar. Existe uma hipótese de que a reabsorção do néctar deve ocorrer principalmente em flores nas quais o néctar mantém contato com a superfície do nectário e nas quais os nectários permanecem fixos à planta após a queda da corola (Nepi & Stpiczynska, 2008), o que ocorre nas flores de C. marceloi. A ocorrência de reabsorção de néctar em C. marceloi parece estar diretamente relacionada a alta demanda de néctar exigida por seus visitantes florais (com frequência muito alta durante todo o período de antese floral) e também ao fato de seu principal recurso energético utilizado para sintetizar os carboidratos do néctar ser o amido armazenado no tecido nectarífero. Esses fatos sugerem que, espécies que utilizam a hidrólise de amido como recurso energético principal para síntese de açúcares do néctar (considerando que o amido é um recurso finito), podem ser mais susceptíveis à reabsorção do néctar não consumido. Nessa perspectiva, pode-se dizer que a dinâmica da produção de néctar em C. marceloi está diretamente relacionada à estratégia reprodutiva nesta espécie. A alta frequência de visitação por parte das abelhas no período da manhã parece ser suficiente para contribuir efetivamente com sua reprodução, assim parece haver um mecanismo ajustável: quando as flores recebem visitas, continuam produzindo néctar (em menor quantidade) e quando não recebem visitas, a produção de néctar continua aumentando ao longo da antese.
Fernseea itatiaiae (Wawra) Baker
As características ultraestruturais das células do tecido nectarífero em flores de F. itatiaiae indicaram que a baixa produção de néctar ao longo da antese floral (“slow producer” – ver detalhes no capítulo 1), assim como sua não reposição após consecutivas visitas, podem estar relacionadas a algumas características específicas,
138
como a baixa quantidade de plastídios com grãos de amido em seu interior (amiloplastos) e de dictiossomos na fase secretora. Como observado em outras espécies estudadas nesse estudo, os dictiossomos são as principais organelas envolvidas na síntese e no transporte de açúcares (Pacini & Nepi, 2007), ao mesmo tempo em que os plastídios com grãos de amido são organelas diretamente envolvidas na suplementação de açúcares no néctar (Ren et al., 2007). A ocorrência de uma queda notável na quantidade de dictiossomos entre botões em estágio final de desenvolvimento (fase pré-secretora e produtora) e flores em antese (fase secretora), indica que essa organela está fortemente relacionada à produção de néctar, isto é, a produção de néctar parece ocorrer apenas na fase pré-secretora, na qual essas organelas ocorrem em maior quantidade. A baixa quantidade de amido, que é um recurso finito, parece estar sendo utilizada apenas para a produção de néctar no início da antese. A concentração de açúcares no néctar em “flores não visitadas” foi constante ao longo de toda a antese floral (ver detalhes no capítulo 1), o que pode ser explicado através de dois acontecimentos principais: a produção de néctar apenas no início da antese floral, isto é, as flores não investem no aumento dessa produção ao longo da antese; e a baixa quantidade de plastídios com grãos de amido observada no tecido nectarífero durante a fase secretora, os quais provavelmente foram hidrolisados para compor os carboidratos do néctar secretado no início da antese, o que impossibilitou a produção de “novo néctar”. Sugere-se que essas características podem estar relacionadas também com as características do ambiente em que essa espécie está presente, os campos de altitude. Espécies presentes nesse ambiente geralmente apresentam flores que produzem baixa quantidade de néctar em volume (Freitas & Sazima, 2006), provavelmente devido as condições ambientais severas, como variações climáticas frequentes e solo pobre em nutrientes. Segundo Chapotin et al. (2003), plantas que estão sujeitas a estresse hídrico costumam apresentar flores menores e que investem menos no suprimento de água no néctar, características presentes em F. itatiaiae. Uma característica interessante do parênquima nectarífero de flores em antese (fase secretora) foi uma grande proximidade espacial entre os plastídios com grãos de amido e os grandes vacúolos. Segundo Peng et al. (2004), em tecidos nectaríferos é comum observar as membranas dos amiloplastos se “esticarem” em direção às
139
membranas dos vacúolos mais próximos. Dessa forma, por ocasião da secreção ativa, os vacúolos tendem a aumentar consideravelmente, formando um complexo a partir da combinação entre amiloplastos e vacúolos, que atua como o centro de transformação do pré-néctar em néctar (Peng et al., 2004). Além dos amiloplastos, outros tipos de plastídios também ocorreram no tecido nectarífero, como plastídios com cristais. Segundo Mosti et al. (2013), os cristais presentes no interior de plastídios são interpretados como cristais de proteínas, os quais podem estar diretamente envolvidos no enriquecimento do néctar em aminoácidos. Em flores senescentes, houve um processo semelhante em algumas células do parênquima nectarífero, nas quais as membranas dos vacúolos se fundiram com as membranas dos plastídios com cristais. Segundo Paiva & Machado (2008), essa característica está associada ao processo de degradação de plastídios mediada por vacúolos durante a morte celular programada, sendo observado em algumas espécies que a região do protoplasto que ao longo da antese era ocupada por plastídios se torna preenchida por vacúolos no período de senescência floral. Dessa forma, sugere-se que as características anatômicas do nectário podem explicar grande parte dos aspectos envolvidos na dinâmica de produção de néctar em F.itatiaie, especialmente aspectos relacionados à baixa produção de néctar, que por sua vez, está diretamente relacionada a baixa frequência de polinizadores. Sugere-se também que o ambiente em que a espécie ocorre também contribui para as características da dinâmica de sua produção de néctar.
Nidularium itatiaiae L.B. Sm.
O tipo de inflorescência apresentado por indivíduos de N. itatiaiae possui um papel ecológico importante na manutenção de outras espécies – vegetais e animais - presentes no mesmo ambiente. Sobre isso, Versieux (2009) indica que, além de representar grande parte dos recursos florais utilizados por animais em diferentes formações florestais brasileiras, algumas espécies de Bromeliaceae também contribuem para a manutenção de outras formas de vida, uma vez que, devido a um conjunto de características específicas - como a presença de um fitotelma (tanque) - podem atuar como espécies-chave nos ambientes em que estão presentes. Essas bromélias também criam microambientes mais favoráveis para o crescimento e
140
estabelecimento de outras espécies vegetais, sendo por esse motivo, denominadas “nurse-plants” (Scarano, 2002). O tecido nectarífero em flores de N. itatiaiae apresentou células com características específicas associadas diretamente à aspectos importantes da dinâmica de néctar. A presença de grandes vacúolos nas células do epitélio secretor e do parênquima nectarífero em botões em estágio tardio de desenvolvimento, indica que a produção de néctar em N. itatiaiae provavelmente ocorre anteriormente ao momento de antese floral. Segundo Nepi (2007), o tamanho dos vacúolos varia de acordo com a estágio de desenvolvimento do nectário, isto é, na fase pré-secretora é comum a presença de numerosos e pequenos vacúolos, enquanto que na fase secretora e pós-secretora o volume dos vacúolos tende a aumentar. Em N. itatiaiae, essa característica ocorre no tecido nectarífero de botões florais em estágio tardio de desenvolvimento e em flores senescentes. Dessa forma, sugere-se que essa característica esteja relacionada com a disponibilidade de néctar nos primeiros períodos dq antese floral, assim como com a alta produção de néctar ao longo da antese. As flores em antese, quando não recebem visitas (“flores não visitadas”), continuam investindo na produção de néctar ao longo de toda a antese floral, aumentando o volume de néctar secretado (ver detalhes no capítulo 1). Essa condição parece ser favorecida por características específicas do tecido nectarífero tanto em botões em estágio tardio de desenvolvimento, quanto em flores em antese – também observadas nas outras espécies estudadas -, como numerosas mitocôndrias e vacúolos, projeções labirínticas da parede celular e corpos lipídicos. Segundo Durkee et al. (1981), plantas com altas e longas taxas de secreção de néctar apresentam um aumento considerável na quantidade de mitocôndrias nas fases pré-secretora e secretora, uma vez que a hidrólise de amido e de fotoassimilados que irão compor o néctar exigem um grande gasto de energia imediata por parte das células do tecido nectarífero. As projeções labirínticas auxiliam na otimização do transporte e substâncias a curtas distâncias e os corpos lipídicos também contribuem como reserva energética para o processo de produção e secreção de néctar (Horn et al., 2013). As características observadas no tecido nectarífero de flores senescentes foram semelhantes às das espécies estudadas, como um aumento no tamanho dos
141
vacúolos e nas projeções labirínticas da parede celular, especialmente em células parenquimáticas. No entanto, não foram encontradas evidências morfoanatômicas para reabsorção do néctar não consumido nessas flores, isto é, o investimento energético maior parece envolver a produção de néctar ao longo da antese floral em detrimento da reabsorção de néctar.
Vriesea gradata (Baker) Mez
O nectário do tipo infralocular apresentado pelas espécies do gênero Vriesea representa uma adaptação floral a polinizadores especialistas com tamanho corpóreo grande, que exigem maior demanda de néctar em volume, como aves e morcegos (Sajo et al., 2004). Assim, grande parte dos representantes desse grupo costuma produzir grandes volumes de néctar, característica observada nas duas espécies do gênero Vriesea estudadas nesse trabalho. De acordo com Sajo et al. (2004), nectários infraloculares possuem determinadas características que contribuem com a alta produção de néctar, como maior tamanho longitudinal (o receptáculo floral geralmente apresenta tamanho maior do que o ovário), uma superfície labiríntica extensa (canais labirínticos), com muitos feixes vasculares circundando essa superfície. O tecido nectarífero em flores de V. gradata apresentou características morfoanatômicas e ultraestruturais peculiares, quando comparado ao das outras espécies estudadas. Em todos os estágios de desenvolvimento floral, detectou-se a presença de numerosos canais de mucilagem localizados ao redor do parênquima nectarífero. A mucilagem produzida por esses canais possuem algumas funções específicas nas flores, como proteção contra intensa radiação solar, retenção de umidade e, em alguns casos, proteção química contra herbivoria, uma vez que a mesma pode conter substâncias tóxicas para insetos (Trigo & Santos, 2000; Chapotin et al., 2003). No caso de V. gradata, a mucilagem parece exercer um papel importante na proteção das flores e botões florais contra a desidratação - uma vez que o período de floração dessa espécie ocorre nos meses de altas temperaturas – e também no balanço hídrico das flores através da redução da transpiração, o que por sua vez, pode contribuir com o suprimento de água no néctar. Em botões florais em estágios inicial e final de desenvolvimento, ocorrem numerosos plastídios com cristais cúbicos, especialmente em células do epitélio
142
secretor, os quais não se encontram da mesma forma nos outros estágios florais. Essa característica parece estar diretamente relacionada ao desenvolvimento estrutural do nectário, uma vez que a maior parte da maquinaria anabólica para suprir as necessidades energéticas e estruturais da planta se encontra nos plastídios, que podem armazenar cristais com morfologias diversas (Hoober, 2006). Segundo Hoober (2006), existem aproximadamente vinte tipos distintos de plastídios em células vegetais, os quais funcionam como organelas centrais para anabolismo, catabolismo e regulação de energia. Dessa forma, sugere-se que a presença de numerosos plastídios em botões em estágios iniciais de desenvolvimento contribui para o completo desenvolvimento do tecido nectarífero. Em botões em estágio final de desenvolvimento, a quantidade de plastídios diminuiu consideravelmente, enquanto que a quantidade de mitocôndrias aumentou, indicando que, se por um lado, os plastídios estão relacionados com o desenvolvimento do tecido nectarífero, as mitocôndrias são organelas diretamente envolvidas com a produção de néctar. As numerosas mitocôndrias nas células epiteliais e parenquimáticas nesse estágio floral (fase pré-secretora) indicam a alta demanda energética envolvida no processo de secreção (Nepi, 2007; Paiva & Machado, 2008). As diferentes organelas presentes no tecido nectarífero em flores durante o período da manhã e o período da tarde, estão diretamente relacionadas com as diferenças na composição/concentração do néctar nos distintos períodos. Em “flores não visitadas” houve aumento na concentração do néctar no período da tarde, ocasião em que a frequência de visitas por parte das abelhas é maior (ver detalhes no capítulo 1). Esse aumento na concentração parece estar diretamente relacionado ao aumento na quantidade de dictiossomos e vesículas derivadas nas células epiteliais e parenquimáticas, uma vez que essas organelas estão envolvidas com a síntese e o transporte de açúcares que compõem o néctar (Mosti et al., 2013). Sugere-se que outras organelas também podem estar relacionadas a esse processo, como os amiloplastos – grande parte sem amido em seu interior – e os plasmodesmas, ambas envolvidas ativamente com os processos de produção e secreção de néctar (Stahl et al., 2012). Em flores senescentes, há evidências ultraestruturais de reabsorção do néctar em células epiteliais e parenquimáticas, como por exemplo o aumento considerável
143
na quantidade de projeções labirínticas da parede celular. Essas projeções, que também ocorrem em outras espécies estudadas nesse trabalho, favorecem a translocação de substâncias a curtas distâncias através da parede celular, ao mesmo tempo em que promovem aumento da área de superfície da membrana plasmática (Stpiczynska et al., 2005). Outra evidência do processo de reabsorção foram os amiloplastos observados nesse estágio de desenvolvimento floral. Segundo Durkee et al. (1981), a presença de amiloplastos, tanto com amido em seu interior, quanto contendo apenas a membrana no final ou após a fase secretora representa uma característica indicativa do processo de reabsorção de néctar. Dessa forma, pode-se concluir que muitas características ultraestruturais do nectário estão envolvidas com aspectos importantes da estratégia reprodutiva de V. gradata. A maior parte da produção de néctar em volume no período da manhã, favorecida pelas características do tecido nectarífero, parece estar envolvida com a maior frequência de beija-flores nesse período, os quais por sua vez são os polinizadores mais efetivos dessa espécie. A reabsorção do néctar em flores senescentes, fenômeno observado em outras espécies estudadas nesse trabalho, também representa um ponto importante na reprodução dessa espécie, contribuindo para posterior desenvolvimento de frutos e sementes através dos açúcares do néctar que são reabsorvidos (Nepi & Stpiczynska, 2008).
Vriesea itatiaiae Wawra
O tecido nectarífero das flores de V. itatiaiae apresentou características morfoanatômicas e ultraestruturais semelhantes às de V. gradata, como por exemplo, os numerosos canais de mucilagem ao redor do parênquima nectarífero, formando um anel de canais. Essa característica nessa espécie parece estar diretamente relacionada à proteção contra radiação solar intensa, o que, no caso de V. itatiaiae sugere-se que seja uma condição floral necessária, levando-se em conta o ambiente em que essa espécie está presente: os campos de altitude. Segundo Givnish (2004), em espécies da ordem Poales essa seria a principal função da mucilagem, uma vez que grande parte das espécies estão presentes em regiões de grandes altitudes. Outra função importante desses canais parece estar relacionada com a alta produção de néctar em volume ao longo de toda a antese floral nessa espécie, visto que a
144
mucilagem auxilia no balanço hídrico das flores, contribuindo com o suprimento de água no néctar (Oriani & Scatena, 2013). Essa característica, associada à grande quantidade de feixes vasculares ao redor do tecido nectarífero, pode explicar a alta produção de néctar na espécie. Nesse sentido, em flores em antese outras características ultraesturais no tecido nectarífero podem também estar relacionadas a essa alta produção de néctar, assim como a rápida reposição do mesmo (“fast producer” – ver detalhes no capítulo 1), como a presença de grande quantidade de mitocôndrias e de grandes e numerosas projeções labirínticas da parede celular, estrutura comum em flores senescentes das outras espécies estudadas. Por ser uma estrutura que otimiza o transporte de substâncias a curta distância, acredita-se que essas projeções auxiliem diretamente numa rápida produção e reposição de néctar em V. itatiaiae. Segundo Gunning & Pate (1969), a frequência e a quantidade dessas projeções são, muitas vezes, moduladas quantitativamente pela intensidade do transporte lateral de substâncias provenientes do xilema, isto é, quanto maior o transporte de seiva do xilema para os órgãos dreno, maior será a quantidade dessas projeções nas células dos tecidos desses órgãos. Dessa forma, a rápida reposição e o alto volume de néctar podem ser explicados por esse conjunto de características ultraestruturais do tecido nectarífero. As características observadas no tecido nectarífero de flores senescentes foram semelhantes às das outras espécies estudadas: aumento no tamanho dos vacúolos (especialmente nas células epiteliais) e projeções labirínticas da parede celular, ambas relacionadas também a processos pós-polinização, como a formação de frutos. No entanto, a presença de corpos lipídicos no citosol nesse estágio de desenvolvimento floral é uma característica particular dessa espécie e, segundo Horn et al. (2013), essa organela funciona como um depósito para armazenamento temporário e eficiente de reservas de carbono, gerando energia para processos fisiológicos em diferentes órgãos da planta. Dessa forma, conclui-se para V. itatiaiae que características específicas do tecido nectarífero estão fortemente relacionadas e explicam fenômenos importantes envolvidos com a dinâmica de produção de néctar, como a produção de grande volume de néctar e sua rápida reposição. Características da morfoanatomia floral, como a presença de mucilagem nas peças florais, também explicam aspectos da adaptação dessa espécie ao ambiente.
145
Considerações Finais
De forma geral, conclui-se que as características morfoanatômicas e ultraestruturais dos nectários florais das espécies estudadas explicam grande parte dos aspectos envolvidos nas variações na dinâmica de produção de néctar entre elas, especialmente referente ao ritmo de secreção e à concentração de açúcares no néctar (ver detalhes no capítulo 1). As diferenças observadas entre os nectários de espécies das diferentes subfamílias estão diretamente envolvidas com o volume total de néctar produzido, assim como aos diferentes sistemas de polinização, onde espécies de Bromelioideae demonstram produzir menor volume de néctar e possuem polinizadores mais generalistas enquanto que espécies de Tillandsioideae produzem maior volume de néctar e possuem polinizadores mais especialistas e de maior tamanho corpóreo. Apesar de algumas características ultraestruturais serem compartilhadas por grande parte das espécies, especificidades importantes foram observadas. A contínua reposição de néctar após as visitas, por exemplo, pode estar associada a características específicas, como a abundância de feixes vasculares próximos ao tecido nectarífero, assim como as variações ocorridas na concentração de açúcares sugerem estar diretamente relacionadas à quantidade de determinadas organelas, como amiloplastos e dictiossomos. A reabsorção do néctar, observada em algumas espécies, também parece estar relacionada a características específicas do tecido nectarífero, como a presença de amiloplastos com amido em seu interior e aumento expressivo no número de vesículas e nas projeções labirínticas da parede celular em flores senescentes. Dessa forma, pode-se concluir que características anatômicas chaves estão fortemente relacionadas às variações na dinâmica de produção de néctar em diferentes espécies. Em suma: os polinizadores podem influenciar o ritmo de produção, no entanto, são as características anatômicas que “controlam” a qualidade do néctar produzido ao longo de toda a antese floral.
146
Referências
Appezzato-Da-Glória, B., armello-Guerreiro, S.M. 2006. Anatomia vegetal. 2ª rev. Viçosa: UFV. 438p.
Baum SF, Eshed Y, Bowman J.L. 2001. The Arabidopsis nectary is an ABC independent 493 floral structure. Development 128: 4657–4667.
Bernardello, G. 2007. A systematic survey of floral nectaries. In: Nectaries and nectar. Springer, Dordrecht: Springer. p. 19-128.
Brown, G.K., Terry, R.G. 1992. Petal appendages in Bromeliaceae. American Journal of Botany 79: 1051-1071.
Chapotin, S.M., Holbrook, N.M., Morse, S.R., Gutiérrez, M.V. 2003. Water relations of tropical dry forest flowers: pathways for water entry and the role of extracellular polysaccharides. Plant, Cell & Environment, 26: 623-630.
Corbet, S.A., Wilmer, P.G. 1981. The nectar of Justicia and Columnea: composition and concentration in a humid, tropical climate. Oecologia 51: 412-418.
De la Barrera, E., Nobel, P. S. 2004. Nectar: properties, floral aspects, and speculations on origin. Trends in plant science 9: 65-69.
Durkee, L.T., Gaal, D.J., Reisner, W.H. 1981. The floral and extra-floral nectaries of Passiflora.I. The floral nectary. American Journal of Botany 68: 453-462.
Fahn, A. 1979. Secretory tissues in plants. New York: Academic Press. 312p.
Fahn, A. 1988. Secretory tissues in vascular plants. New Phytologist 108: 229-257.
147
Freitas, L., Sazima, M. 2006. Pollination biology in a tropical high-altitude grassland in Brazil: interactions at the community level. Annals of the Missouri Botanical Garden 93: 465-516.
Givnish, T.J., Millam, K.C., Evans, T.M., Hall, J.C., Chris Pires, J., Berry, P.E., Sytsma, K.J. 2004. Ancient vicariance or recent long-distance dispersal? Inferences about phylogeny and South American–African disjunctions in Rapateaceae and Bromeliaceae based on ndh F sequence data. International Journal of Plant Sciences, 165: S35-S54.
Gunning, B.E.S., Hughes, J.E. 1976. Quantitative assessment of symplastic transport of pre-nectar into the trichomes of Abutilon nectaries. Functional Plant Biology 3: 619- 637.
Gunning, B.E.S., Pate, J.S. 1969. Transfer cells- plant cells with wall ingrowths specialized in relation to short distance transport of solutes-their occurrence, structure and development. Protoplsama 68: 107-133.
Horn, P.J., James, C.N., Gidda, S.K., Kilaru, A., Dyer, J.M., Mullen, R.T., Chapman, K.D. 2013. Identification of a new class of lipid droplet-associated proteins in plants. Plant physiology 162: 1926-1936.
Hoober, J. 2006. The structure and function of plastids. In: Advances in photosynthesis and respiration. Dordrecht: Springer.
Karban, R., Agrawal, A.A., Thaler, J. S., Adler, L.S. 1999. Induced plant responses and information content about risk of herbivory. Trends in Ecology & Evolution 14: 443-447.
Karnovsky, M.J. 1965. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology 1: 137-138.
148
Kram, B.W., Bainbridge, E.A., Perera, M.A.D., Carter, C. 2008. Identification, cloning and characterization of a GDSL lipase secreted into the nectar of Jacaranda mimosifolia. Plant molecular biology, 68: 173.
Lee, J.Y., Baum, S.F., Alvarez, J., Patel, A., Chitwood, D.H., Bowman, J.L. 2005. Activation of CRABS CLAW in the nectaries and carpels of Arabidopsis. The Plant Cell 17: 25-36.
Linder, H.P., Rudall, P.J. 2005. Evolutionary history of Poales. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 36: 107-124.
Miflin, B.J., Lea, P.J. 1975. Glutamine and asparagine as nitrogen donors for reductant-dependent glutamate synthesis in pea roots. Biochemical Journal 149: 403- 409.
Millàn-Canongo, C., Orona-Tamayo, D., Heil, M. 2014. Phloem sugar flux and jasmonic acid- responsive cell wall invertase control extrafloral nectar secretion in Ricinus communis. Journal of Chemical Ecology 40: 760-769.
Mosti, S., Friedman, C.R., Pacini, E., Brighigna, L., Papini, A. 2013. Nectary ultrastructure and secretory modes in three species of Tillandsia (Bromeliaceae) that have different pollinators. Botany 91: 786-798.
Nepi, M., Ciampolini, F., Pacini, E. 1996. Development and ultrastructure of Cucurbita pepo nectaries of male flowers. Annals of Botany 78: 95–104.
Nepi, M. 2007. Nectary structure and ultrastructure. In: Nicolson S, Nepi M, Pacini E, eds. Nectaries and nectar. Dordrecht: Springer Neitherlands, 129–166.
Nepi, M., Stpiczynska, M. 2008. The complexity of nectar: secretion and reabsorption dynamically regulate nectar features. Naturwissenschaften 95: 177-184.
149
Oliveira-Filho, A.T., Fontes M.A.L. 2000. Patterns of floristic differentiation among Atlantic Forests in Southeastern Brazil and the influence of climate. Biotropica 32:793- 810.
Ordano, M., Ornelas, F.O. 2005. The cost of nectar replenishment in two epiphytic bromeliads. Journal of Tropical Ecology 21: 541-547.
Oriani, A., Scatena, V.L. 2013. The taxonomic value of floral characters in Rapateaceae (Poales-Monocotyledons). Plant systematics and evolution, 299: 291- 303.
Paccini, E., Nepi, M. 2007. Nectar production and presentarion.In: Nicolson, S. W.; Nepi, M.; Pacini, E. (Ed.) Nectaries and nectar. Alemanha: Springer Netherlands. p. 167-214.
Paiva, E.A.S. 2009. Ultrastructure and post-floral secretion of the pericarpial nectaries of Erythrina speciosa (Fabaceae). Annals of Botany 104: 937-944.
Paiva, E.A.S. 2016. How do secretory products cross the plant cell wall to be released? A new hypothesis involving cyclic mechanical actions of the protoplast. Annals of Botany 117: 533-540.
Paiva, E.A.S., Machado, S.R. 2008. The floral nectary of Hymenaea stigonocarpa (Fabaceae, Caesalpinioideae): structural aspects during floral development. Annals of Botany 101: 125–133.
Peel, M.C., Finlayson, B.L., McMahon, T.A. 2007. Updated world map of the Köppen– Geiger climate classification. Hydrology and Earth System Sciences 11: 1633–1644.
Peng, Y.B., Li, Y.Q., Hao, Y.J., Xu, Z.H., Bai, S.N. 2004. Nectar production and transportation in the nectaries of the female Cucumis sativus L. flower during anthesis. Protoplasma, 224: 71-78.
150
Pike, G.H. 1991. What does it cost a plant to produce floral nectar? Nature 350: 58-59.
Rachmilevitz, T., Fahn, A. 1973. Ultrastructure of nectaries of Vinca rosea L., Vinca major L. and Citrus sinensis Osbeck cv. Valencia and its relation to the mechanism of nectar secretion. Annals of Botany, 37: 1-9.
Rathcke, B.J. 1992. Nectar distributions, pollinator behavior, and plant reproductive success. Effects of resource distribution on animal-plant interactions 113-138.
Ren, G., Healy, R.A., Klyne, A.M., Horner, H.T., James, M.G., Thornburg, R.W. 2007. Transient starch metabolism in ornamental tobacco floral nectaries regulates nectar composition and release. Plant Science, 173: 277-290.
Roy, R., Schmitt, A.J., Thomas, J.B., Carter, C.J. 2017. Nectar biology: from molecules to ecosystems. Plant Science 262: 148-164.
Sajo, M.G., Rudall, P.J., Prychid, C.J. 2004. Floral anatomy of Bromeliaceae, with particular reference to the evolution of epigyny and septal nectaries in commelinid monocots. Plant Systematics and Evolution 247: 215-231.
Scarano, F.R. 2002. Structure, function and floristic relationships of plant communities in stressful habitats marginal to the Brazilian Atlantic rainforest. Annals of Botany 90: 517-524.
Schmid, S., Schmid, V.S., Zillikens, A., Harter-Marques, B., Steiner, J. 2011. Bimodal pollination system of the bromeliad Aechmea nudicaulis involving hummingbirds and bees. Plant Biology 3: 41-50.
Smets, E.F., Ronse Decraene, L.P., Rudall, P.J. 2000. Floral nectaries in monocotyledons. In: Monocots: systematics and Evolution. Merbourne: CSIRO. p. 230-240.
151
Stahl, J.M., Nepi, M., Galetto, L., Guimarães, E., Machado, S.R. 2012. Functional aspects of floral nectar secretion of Ananas ananassoides, an ornithophilous bromeliad from the Brazilian savanna. Annals of Botany 109: 1243-1252.
Stpiczynska, M., Davies, K.L., Gregg, A. 2005. Comparative account of nectary structure in Hexisea imbricate (Lindl.) Rchb.f. (Orchidaceae). Annals of Botany 95: 749–756.
Trigo, J.R., Dos Santos, W.F. 2000. Insect mortality in Spathodea campanulata Beauv.(Bignoniaceae) flowers. Revista Brasileira de Biologia 60: 537-538.
Turner, G.W., Berry, A.M., Gifford, E.M. 1998. Schizogenous secretory cavities of Citrus limon (L.) Burm. F. and a reevaluation of the lysigenous gland concept. International journal of plant sciences 159: 75-88.
Versieux, L. de M. 2009. Sistemática, filogenia e morfologia de Alcantarea (Bromeliaceae). 2009. 252p. Tese de Doutorado - Instituto de Biociências - Universidade de São Paulo (USP).
Wilson, M.F. 1983. Plant reproductive ecology. New York: John Wiley and Sons.
152
Capítulo 3
Biologia floral e reprodutiva de Fernseea itatiaiae: um estudo de caso de uma espécie ameaçada de extinção
153
Introdução
A manutenção e conservação da biodiversidade é dependente de muitos fatores, sendo as interações entre plantas e animais de grande importância nesse sentido, contribuindo para a reprodução e dispersão de grande parte das espécies de plantas (Ollerton et al., 2011). Dentre as interações planta-animal, a polinização representa um dos processos ecológicos mais importantes na manutenção da biodiversidade, desempenhando papel chave na diversificação de muitos grupos de plantas e animais (Dodd et al., 1999). No Brasil, o domínio da Mata Atlântica é considerado um dos principais hotspots da biodiversidade global, no qual encontra-se grande parte da diversidade de espécies e altos níveis de endemismo (Mittermeier et al., 2011). Por outro lado, é neste mesmo domínio que se encontram também cerca de 70% das espécies ameaçadas de extinção no território brasileiro (Martinelli & Moraes, 2013), sendo os campos de altitude os locais com maior índice de espécies ameaçadas. Nesse contexto, se insere a família Bromeliaceae, que representa grande parte dos recursos florais utilizados por animais em diferentes formações florestais brasileiras (Buzato et al., 2000), sendo a Mata Atlântica – especialmente no estado do Rio de Janeiro - o local de maior ocorrência e nível de endemismo dessas espécies (Fontoura et al., 1991). O Parque Nacional de Itatiaia (PNI), localizado na Serra da Mantiqueira, que abrange os estados de Minas Gerais e Rio de Janeiro, possui formações florestais caracterizadas por floresta ombrófila densa e campos de altitude, que se localizam acima de 1.600 m (Oliveira-Filho & Fontes, 2000). Dentre as espécies de Bromeliaceae presentes no PNI, algumas estão atualmente em perigo de extinção, como Fernseea itatiaiae, endêmica dos campos de altitude do PNI (Flora do Brasil, 2020). F. itatiaiae apresenta atualmente o status de conservação “ameaçada de extinção”, de acordo com a legislação (Portaria 443, de 17/12/2014, de Ministério do Meio Ambiente do Brasil) (Medina et al., 2006). Os campos de altitude do PNI frequentemente passam pela ocorrência de incêndios, sendo a grande maioria de origem antrópica (Aximoff, 2011), apesar de algumas características desses locais facilitarem a ocorrência e a propagação do fogo, como o clima seco, geadas, ventos e vegetação seca no período de inverno (Safford, 1999). Segundo Aximoff (2011), até mesmo as ilhas de vegetação, que
154
frequentemente se encontram isoladas sobre grandes blocos de pedra, sofrem com a ação do fogo. No caso de F. itatiaiae, incêndios de forma recorrente pode estar contribuindo para a diminuição no número de indivíduos desta espécie do PNI. A recorrência do fogo pode contribuir para o desaparecimento gradual de espécies raras e endêmicas, o que afeta diretamente a perda de diversidade em nível mundial (Martinelli, 1996). Nesse sentido, Beniston (2003) indica que a alta quantidade de espécies endêmicas, raras e ameaçadas, bem como o importante papel dos campos de altitude na regulação do ciclo hidrológico, colocam esse ecossistema como prioritário para conservação. De maneira geral, além de contribuírem disponibilizando recursos florais para muitos grupos de polinizadores nesses ambientes, as bromélias também possuem papel importante na manutenção de outras formas de vida, uma vez que, devido a um conjunto de características específicas - como a presença de um fitotelma (tanque) - podem atuar como espécies-chave nos ambientes em que estão presentes (Versieux, 2009). Muitas espécies de bromélias criam micro-ambientes favoráveis para o crescimento e estabelecimento de outras espécies vegetais, sendo por esse motivo, denominadas “nurse-plants”, como é o caso de F. itatiaiae (Scarano, 2002). De acordo com Rodriguez-Echeverría et al. (2016), as “nurse-plants” frequentemente estão envolvidas em processos de facilitação em um determinado ambiente, isto é, participam da organização e manutenção da biodiversidade em comunidades vegetais, especialmente em ambientes com condições climáticas extremas. Dessa forma, estudos demonstram que essas plantas contribuem com a fertilidade do solo, aumentando sua atividade microbiana e favorecendo o estabelecimento de outras plantas nas proximidades, principalmente em sistemas áridos e semi-áridos (Rodriguez-Echeverría et al, 2015). No caso de F. itatiaiae, seus indivíduos frequentemente formam “ilhas” de vegetação em superfícies rochosas, o que favorece a retenção de nutrientes e contribui para o estabelecimento de outras espécies no mesmo local (Medina et al., 2006). Nessa perspectiva, neste capítulo foi proposto o estudo da biologia floral, reprodutiva e da polinização de F. itatiaiae, de forma a contribuir com a geração de dados sobre a espécie, contribuindo para sua conservação. Assim, considerando que uma etapa de grande importância para a conservação de espécies é o conhecimento sobre fatores que envolvem sua reprodução, espera-se com os dados levantados no
155
presente capítulo fornecer inéditas sobre essa espécie. Como resultado direto de sua conservação, os organismos dependentes serão beneficiados, que por sua vez constituem uma grande parcela da diversidade biológica nesses ecossistemas.
Material e Métodos
Área de estudo
As coletas de dados e observações foram realizadas entre os anos de 2016- 2020 e foram conduzidas no Parque Nacional de Itatiaia (PNI), localizado na Serra da Mantiqueira, entre os estados do Rio de Janeiro (RJ) e Minas Gerais (MG), região sudeste do Brasil. Com área total de 30.000 ha, o PNI possui altitudes entre 600 a 2.791 metros e, acima de 1.600 m, tem-se a Parte Alta (22º20’23”S/44º43’17”O), local onde os experimentos relacionados a este capítulo foram realizados (Figura 1). A vegetação predominante dessa área é caracterizada por formações de Floresta Estacional Semidecidual Altomontana e campos de altitude (Oliveira-Filho & Fontes 2000). O clima é classificado como mesotérmico, com invernos frios e secos e verões úmidos. A temperatura média anual é de aproximadamente 14ºC e, nos meses de temperaturas mais baixas, podem chegar a -10ºC. A precipitação anual é de cerca de 2400 mm, concentrada especialmente no período de novembro a março (Segadas- Vianna & Dau, 1965).
156
Figura 1. Localização do Parque Nacional de Itaitiaia (PNI) e delimitação das Partes Baixa e Alta. (Fonte: Tomzhinski, 2012).
Morfometria e Biologia Floral
Os dados de morfometria floral foram obtidos com auxílio de paquímetro manual e de estereomicroscópio. Por se tratar de uma espécie com flores actinomorfas, foram tomadas apenas as medidas do comprimento total da corola (tubo floral), assim como do comprimento do estilete e das anteras, a partir de flores frescas (n=10), sendo calculados a média e desvio padrão. Esses dados também foram testados em relação à correlação com a produção de néctar em volume (ver detalhes da produção de néctar no capítulo 1), através do teste de correlação de Pearson (r) utilizando-se o software Rstudio. As flores de Fernseea itatiaiae foram observadas quanto ao horário e período da antese. Para tanto, indivíduos contendo botões florais em estágio tardio de desenvolvimento (pré-antese) foram ensacados (n=10) e observados desde o início da antese até a completa senescência das flores. Ao longo da antese floral, observou- se a coloração das flores, o período em que as flores se mantiveram receptivas e
157
doadoras de pólen viável (n=10), assim como a receptividade do estigma (n=10). Dessa forma, foram registrados os seguintes atributos florais: cor, simetria, período de antese e longevidade floral (Kearns & Inouye, 1993). A viabilidade polínica foi quantificada através da coloração citoplasmática, utilizando-se a técnica do carmim acético (Radford et al., 1974). Para esta análise, foram utilizadas flores em antese e os grãos de pólen foram retirados das anteras com auxílio de microscópio estereoscópico e, em seguida, polvilhados sobre uma lâmina com o corante carmim acético 2%. A contagem dos grãos foi realizada utilizando-se microscópio de luz e a apresentação de coloração no citoplasma foi considerada um critério para determinar os grãos viáveis. De forma a se obter uma amostragem ao acaso desses grãos, utilizou-se o método de varredura, através do qual foram contabilizados 100 grãos de pólen/lâmina aleatoriamente. A receptividade do estigma foi analisada através do teste de peroxidase, utilizando peróxido de hidrogênio 3% (H2O2). A indicação do estigma receptivo foi observada através da liberação de bolhas na superfície estigmática, com auxílio de lupa de campo (Kearns & Inouye, 1997). Para esta análise, utilizou-se estigmas de flores nos períodos iniciais da antese (n=5) e nos períodos finais da antese (n=5).
Sistema Reprodutivo
Para verificar o sistema reprodutivo, botões florais foram ensacados com ‘voile’ para verificar a produção de frutos e sementes por autopolinização espontânea. Seguindo os métodos estabelecidos por Radford et al. (1974), foram realizados os seguintes testes de polinização:
1- Autopolinização espontânea (autogamia): flores ensacadas e sem tratamento posterior (n=30 flores/5 indivíduos);
2 - Polinização em condições naturais (controle): flores foram identificadas e permaneceram sem ensacamento para serem visitadas, sendo ensacadas nos períodos finais da antese (n=30 flores/5 indivíduos).
158
Após aproximadamente 45-60 dias, as inflorescências foram coletadas para verificação dos frutos e sementes formados. Verificou-se a quantidade de frutos formados por inflorescência, bem como o diâmetro desses frutos e o número de sementes formadas. Esses dados foram testados através do teste t ao nível de significância de 0,05, utilizando-se o software R Studio. A fecundidade foi estimada utilizando-se a razão fruto/flor para cada um dos tratamentos e a autoincompatibilidade foi avaliada através do índice de autoincompatibilidade (ISI) (adaptado de Zapata & Arroyo, 1978). De acordo com esse índice, pode-se estimar o nível de autoincompatibilidade das espécies calculando-se a divisão da razão fruto/flor após autopolinização (nesse estudo utilizou-se o tratamento de autopolinização espontânea) pela razão/fruto após polinização cruzada (nesse estudo utilizou-se o tratamento de polinização em condições naturais) e, abaixo de 0.2, os valores desse cálculo permitem classificar as espécies como autoincompatíveis (adaptado de Zapata & Arroyo 1978). A estimativa da quantidade de grãos de pólen/flor e de óvulos/flor foi feita através da contagem do número de grãos de pólen produzidos por antera e do número de óvulos no ovário. Para isso, flores foram coletadas (n= 10 flores/3 indivíduos/tratamento) e as anteras e ovários foram armazenados em etanol (70%). Posteriormente, essas estruturas foram analisadas a partir da montagem de lâminas e observação em microscópio de luz. Um segundo indicador do sistema reprodutivo também foi utilizado, baseado na razão pólen/óvulo. Para tanto, utilizou-se a equação proposta por Cruden (1977), na qual divide-se o nº de grãos de pólen por antera pelo número de óvulos (n= 10 flores/ 3 indivíduos). Os resultados foram interpretados de acordo com a classificação de Cruden (1977): cleistogamia (2,7-5,4); autogamia obrigatória (5,5-39,0); autogamia facultativa (39,1- 396,9); alogamia facultativa (397- 2.588); e alogamia obrigatória (>2.588).
Resultados
Biologia Floral
Fernseea itatiaiae apresenta hábito estritamente rupícola (Figura 2A) e ocorre no domínio Mata Atlântica, em campos de altitude, sendo endêmica do sudeste do
159
Brasil (Flora do Brasil, 2020). Seu período de floração ocorre na estação chuvosa, entre os meses de setembro a janeiro. A antese floral é diurna e se dá aproximadamente às 10h, com as flores se tornando senescentes por volta das 10h do dia seguinte – período de antese de aproximadamente 24 horas. Os indivíduos em fase reprodutiva apresentam inflorescência simples e vistosa do tipo racemo com 10- 20 flores e 2-6 flores abertas por dia e ocorrem com frequência em agrupamentos (Tabela 1; Figura 2). Essa quantidade permanece constante, variando de forma não considerável de acordo com o tamanho da inflorescência. Suas flores são tubulares (aproximadamente 1,5cm de comprimento) e apresentam perianto trímero, heteroclamídeo, diferenciado em sépalas, pétalas e brácteas florais. Essas flores são bissexuadas, heteroclamídeas, actinomorfas, inodoras, pediceladas e de coloração roxa escura, com sépalas e pétalas livres e brácteas coloridas bem desenvolvidas, com grande quantidade de tricomas (Figura 4G,H,I). Os tubos das corolas são de coloração roxa escura e as brácteas florais são de coloração rosa, resultando em um contraste entre essas estruturas florais (Figura 2B).
Figura 2. Inflorescências de Fernseea itatiaiae. (A) Indivíduo evidenciando o hábito rupícola da espécie. (B) Detalhe de uma flor, evidenciando as brácteas florais de coloração rosa e a corola de coloração roxa escura. (C) Detalhe de uma inflorescência com flores e botões.
As flores de F. itatiaiae possuem ovário súpero (flores hipóginas) (Figura 4H,I), 3-locular e com aproximadamente 70 óvulos por flor (Figura 4C) e o comprimento da
160
corola é de aproximadamente 13 centímetros (Tabela 1). O androceu apresenta seis estames livres (Figura 4G) com anteras rimosas e o gineceu é sincárpico e apresenta estigma trífido e espiral-conduplicado (Figura 4F) (Medina et al., 2006). Foi verificada a ocorrência de hercogamia entre as estruturas reprodutivas – filete/antera e estilete/estigma (Tabela 1). F. itatiaiae também é caracterizada por possuir rosetas estreitas que possuem folhas de bordas serrilhadas, raízes finas e denso pseudobulbo (Medina et al., 2006).
Tabela 1. Características de flores e frutos de Fernseea itatiaiae. Características Florais Simetria floral actinomorfa Comprimento da corola (mm) 12,5 ± 0,8 (n=10) Comprimento do estilete (mm) 8,5 ± 0,6 (n=10) Comprimento androceu (filete + antera) (mm) 5,2 ± 0,6 (n=10) Coloração floral Roxo Escuro Quantidade de flores/indivíduo 5 ± 2,5 (n=10) Longevidade floral (hrs) 2 ± 2,1 (n=10) Tipo de inflorescência racemo Tipo de fruto cápsula
Referente ao desenvolvimento floral, foram identificados oito estágios que caracterizaram mudanças importantes ao longo da vida da flor - desde botões em estágios iniciais de desenvolvimento até flores senescentes (Figura 4A). Essas mudanças foram caracterizadas de acordo com o tamanho do botão floral e a extensão da corola para o exterior dos botões até a abertura da flor (flores em antese) (Figura 4A). As variáveis comprimento da corola (tubo floral) e volume de néctar produzido ao longo da antese floral apresentaram correlação positiva (r= 0,6; p< 0,05) (Figura 3). Em botões em estágios finais de desenvolvimento, foi verificado que em grande parte desses botões, os grãos de pólen se encontravam aderidos ao estigma antes das flores entrarem em antese, uma vez que observou-se a presença de fraca hercogamia nessas flores (Figura 4G).
161
12
10
8
6
4 Volume Volume néctar de (µl) 2
0 0 0,5 1 1,5 2 Comprimento da corola (cm)
Figura 3. Relação entre o comprimento da corola e o volume de néctar produzido ao longo da antese em flores de F. itatiaiae (n=10).
Por ocasião da abertura flor, a corola se apresenta com os lobos posicionados de forma a caracterizar um tubo floral longo e estreito (Figura 4A) e as estruturas reprodutivas se encontram maduras. Em relação ao amadurecimento das estruturas reprodutivas, constatou-se que a porcentagem média de viabilidade dos grãos de pólen foi de aproximadamente 70% e a receptividade do estigma foi constante ao longo do período de antese floral, desde os primeiros horários da antese até próximo à senescência floral. F. itatiaiae apresenta frutos do tipo cápsula, com grande quantidade de tricomas no epicarpo (Tabela 1; Figura 4B) e sementes numerosas, achatadas e providas de apêndices alados apicais (Figura 4D).
162
Figura 4. Estruturas da flor e do fruto de Fernseea itatiaiae. (A) Estágios de desenvolvimento floral: 1-4 – botões em estágios iniciais de desenvolvimento, 5-6 – botões em estágios finais de desenvolvimento, 7 – flor em antese, 8 – flor senescente. (B) Fruto do tipo cápsula. (C) Detalhe do fruto, com sementes em seu interior. (D) Detalhe de uma semente. (E) Androceu – antera e filete. (F) Estigma trífido com grãos de pólen aderidos. (G) Detalhe de botão em estágio final de desenvolvimento. Notam- se os grãos de pólen aderidos ao estigma. (H) Detalhe do ovário e da câmara nectarífera em flor em antese. (I) Detalhe do ovário e dos óvulos em flor em antese.
F. itatiaiae apresentou indivíduos em fase reprodutiva ao longo do ano, no entanto a frequência desses indivíduos variou entre os diferentes meses. O início do período de floração ocorreu nos meses de janeiro a abril, com pico de floração especialmente no período de setembro a dezembro, meses nos quais foi observada maior quantidade de indivíduos floridos ao longo do ano.
163
Sucesso reprodutivo e polinizadores
Ao longo do período de observações, foram registradas três espécies de beija- flores atuando como visitantes florais nos indivíduos de Fernseea itatiaiae: Clytolaema rubricauda (Figura 5C), Stephanoxis lalandi e Phaethornis eurynome. Os indivíduos de F. itataiae frequentemente ocorrem em agrupamentos (Figura 5A) e as visitas dos beija-flores eram realizadas sequencialmente em todos os indivíduos próximos.
Figura 5. Disposição de indivíduos de Fernseea itatiaiae. (A) e (B) Agrupamentos de indivíduos em floração sobre rochas. (C) beija-flor Clytolaema rubricauda visitando flor de F. itatiaiae.
De maneira geral, as diferentes espécies de beija-flores apresentaram baixa frequência ao longo de todo período de antese floral, com pico de visitação ocorrendo no período vespertino (Figura 6). Indivíduos de C. rubricauda realizaram a maior parte das visitas (cerca de 75% do total de visitas), especialmente no período entre 14h e 15h (Figura 6). O comportamento de forrageamento das espécies de beija-flores foi semelhante, caracterizado por visitas rápidas (de aproximadamente 3-5 segundos) e sequenciais a todas as flores de um indivíduo e dos indivíduos próximos.
164
25
20
15
10 Visitas (n) Visitas 5
0 12h-13h 13h-14h 14h-15h 15h-16h 16h-17h
Período
Clytolaema rubricauda Phaethornis eurynome Stephanoxis lalandi
Figura 6. Quantidade de visitas das espécies de beija-flores em flores de Fernseea itatiaiae ao longo da antese floral.
Em relação ao sistema reprodutivo, F. itatiaiae apresentou maior sucesso reprodutivo no tratamento de condições naturais comparado ao tratamento de autopolinização espontânea. As características dos frutos formados através desses experimentos apresentaram variações qualitativas e quantitativas, isto é, tanto no número de frutos por indivíduo, quanto no diâmetro e no número de sementes formadas nesses frutos (Tabela 2). Os indivíduos testados para autopolinização espontânea apresentaram formação de um número reduzido de frutos e sementes, com taxa de frutificação de cerca de 7% (Figura 7B; Tabela 2). Por outro lado, os indivíduos mantidos em condições naturais - com flores livres para visitação dos polinizadores – os indivíduos apresentaram formação de maior número de frutos, com maior diâmetro e número de sementes, apresentando taxa de frutificação de cerca de 70% (Figura 7B; Tabela 2). O índice da autoincompatibilidade (ISI) indicou a existência de autoincompatibilidade em F. itatiaiae (ISI = 0.2).
Tabela 2. Taxa de frutificação e características dos frutos formados nos diferentes tratamentos – autopolinização espontânea e condições naturais.
Tratamento Taxa de Frutificação Diâmetro do fruto (mm) Nº de sementes
165
Autopolinização espontânea (n=30) 6,9% 9.9 ± 0.9 a 19.6 ± 3,5 a
Condições naturais (n=30) 72% 16.8 ± 1.5 b 50.4 ± 7.8 b Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si a p<0,05
Figura 7. Indivíduos de F. itatiaiae em fase reprodutiva. (A) Inflorescência com flores e botões florais. (B) Comparação entre frutos formados nos diferentes tratamentos – à esquerda, indivíduo com frutos formados através do tratamento de condições naturais e à direita, indivíduo testado para autopolinização espontânea e sem frutos formados. (C) Indivíduo com frutos em desenvolvimento.
Em relação às estruturas reprodutivas, foi verificado que as flores apresentaram ovário contendo em média 70 óvulos e anteras contendo em média 1.500 grãos de pólen, totalizando aproximadamente 9.000 grãos de pólen por flor (Tabela 3). A razão pólen/óvulo indicou a existência de uma condição de autogamia facultativa em F. itatiaiae (Tabela 3).
Tabela 3. Características dos órgãos reprodutivos e razão pólen/óvulo de Fernseea itatiaiae. Variáveis Média ± desvio padrão Óvulos (n) 71,7 ± 12,7 Grãos de pólen por flor (n) 11.215,7 ± 565,8 Razão P:O 160,2 ± 8,0 Anteras (n) 6,0 ± 0,0
166
Discussão
Biologia Floral
A estrutura floral de Fernseea itatiaiae é característica da família Bromeliaceae (Smith & Downs, 1979) e está intimamente relacionada à polinização por beija-flores. Segundo Dahlgren et al. (1985), espécies de Bromeliaceae que apresentam inflorescências vistosas, com brácteas róseas, flores flexíveis que se posicionam de forma a ficarem expostas a partir do interior da roseta, estão adaptadas à ornitofilia. As flores de F. itatiaiae também apresentam disposição dos órgãos reprodutivos que favorecem o contato com o corpo do polinizador, especialmente o bico, fator que está diretamente relacionado ao seu sucesso reprodutivo. De acordo com Sajo et al. (2004), flores de Bromeliaceae apresentam características únicas dentre Poales, que as distinguem das outras espécies dessa ordem, como o ovário súpero e os nectários septais (ver detalhes no capítulo 2), que estão diretamente relacionados com a alta produção de néctar em determinadas espécies, favorecendo a visita por polinizadores vertebrados, como as aves. A correlação positiva entre o comprimento da corola e o volume de néctar está relacionada à baixa produção de néctar por essas flores, que possuem tamanho diminuto se comparadas às flores de outras espécies analisadas nesse estudo. Segundo Arizmendi & Ornelas (1990), espera-se que flores com corolas de tubo longo selecionem visitantes de bico mais longo e produzam maior quantidade de néctar, enquanto flores com corolas de tubo mais curto selecionem visitantes de bico curto. No caso de F. itatiaiae, essa seleção parece ocorrer, uma vez que a média do tamanho do bico dos beija-flores com maior frequência de visitação (beija flores com comportamento territorialista) é de cerca de 1,5 – 2,0cm (Buzato, 2000). Dessa forma, tanto o comportamento territorialista, quanto o ajuste entre o bico dos beija-flores e o tubo floral parecem otimizar o sucesso reprodutivo de F. itatiaiae. As flores de bromélias também apresentam algumas características especializadas, como a hercogamia, que muitas vezes dificultam a autopolinização espontânea e favorece a polinização cruzada mediada por animais (Benzing, 2000). De acordo com Lima et al. (1988), a hercogamia floral é um dos mecanismos que dificulta a autopolinização espontânea, uma vez que ocorre a separação espacial dos
167
órgãos reprodutivos – androceu e gineceu. No entanto, nas flores de F. itatiaiae, a hercogamia entre as estruturas reprodutivas parece não ser suficientemente desenvolvida para evitar a ocorrência de autopolinização espontânea, uma vez que mesmo formando poucos frutos em relação aos frutos formados em condições naturais, esse experimento resultou em alguns frutos formados. O estigma do tipo espiral-conduplicado é uma característica muito comum em grande parte das espécies da subfamília Bromelioideae (Brown & Gilmartin, 1989). A receptividade do estigma ao longo de todo o período de antese também é uma característica observada em estudos com outras espécies de Bromeliaceae (Siqueira- Filho & Machado, 2001; Canela & Sazima, 2003), e esse fato parece estar diretamente relacionado ao período de vida da flor nessa família. Essa característica amplia as chances de ocorrência da polinização e posterior fertilização, o que é de grande importância no ambiente em que F. itatiaiae ocorre, se considerarmos a baixa frequência de visitas dos beija-flores. O padrão de floração ao longo do ano aparentemente está relacionado ao início da estação chuvosa (setembro-outubro), período em que ocorreu a maior quantidade de indivíduos floridos. Esse dado sugere a importância hídrica como um fator desencadeador para a ocorrência desse processo. Segundo Bernier et al. (1993), para muitas espécies de plantas, a chegada da estação chuvosa é um fator decisivo para seu crescimento e floração, uma vez que nessa estação os dias ficam levemente mais longos e as temperaturas mais elevadas – sinais ambientais que favorecem a floração.
Sucesso reprodutivo e polinizadores
As flores de F. itatiaiae receberam, de forma geral, baixa quantidade de visitas, quando comparadas com as outras espécies estudadas nesse trabalho. As três espécies de beija-flores contataram as estruturas reprodutivas da flor, sendo consideradas potenciais polinizadores de F. itatiaiae. E, embora essas espécies tenham apresentado baixa frequência, Clytolaema rubricauda foi o mais frequente, fator que pode estar fortemente associado ao seu comportamento, que é classificado como dominante (territorialista) (Lanna et al., 2017). Esse tipo de comportamento é caracterizado pela defesa de determinados “territórios” onde exista alta disponibilidade de recursos e exclusão das possíveis espécies que possam competir
168
por esses recursos (Stiles, 1978). Entretanto, esse comportamento ocorre apenas quando o ganho de energia obtido através dos recursos é maior que a perda de energia despendida para defendê-los. Dessa forma, essa espécie pode, muitas vezes, apresentar comportamento agressivo diante de espécies com comportamento “subordinado ou traplining”, que visitam as flores na ausência da espécie dominante ou até serem repelidas, como ocorreu com Stephanoxis lalandi e Phaethornis eurynome (Stiles, 1978). A baixa frequência dos beija-flores pode estar relacionada a determinados padrões encontrados em campos de altitude, como as variações na distribuição temporal da floração de espécies ornitófilas e as flutuações e variações temporais na presença de beija-flores, fatores importantes na estruturação das interações planta- polinizador nesses ambientes (Vizentin-Bugoni et al., 2014). Em relação à contribuição dessas espécies de beija-flores para o sucesso reprodutivo das espécies presentes em campos de altitude, é fato conhecido que S. lalandi – uma espécie endêmica da Mata Atlântica - possui um papel importante na polinização de espécies ornitófilas ameaçadas de extinção nesses ambientes (Vale et al., 2018). Essa espécie também foi relatada em outros estudos como polinizador efetivo de outras espécies de Bromeliaceae (Siqueira-Filho & Machado, 2001; Scrok & Varasin, 2011) e, frequentemente, seu comportamento de migração entre áreas com diferentes altitudes – ao longo de mudanças sazonais – coincide com a floração de espécies ornitófilas nos distintos ambientes (Sick, 1997). É interessante notar que, nos meses nos quais ocorre o pico de floração de F. itatiaiae, também se encontra outras espécies em floração, no entanto grande parte delas não é ornitófila (observação pessoal), o que também pode ter contribuído para a baixa frequência de beija-flores no período de maior floração de F. itatiaiae. Segundo Poulin et al. (1992), a disponibilidade de flores ornitófilas ao longo do ano está diretamente relacionada à permanência de beija-flores na área, isto é, a alta disponibilidade de espécies ornitófilas em floração propicia maximização do sucesso reprodutivo de todas essas espécies. Nesse sentido, Machado e Semir (2006) indicam que as bromélias são fundamentais para a manutenção da fauna local de beija-flores em ambientes de Mata Atlântica, beneficiando tanto essas aves, quanto as próprias bromélias e outras espécies ornitófilas.
169
A baixa frequência de P. eurynome em relação à frequência das outras espécies de beija-flores, também pode estar relacionada ao seu tipo de comportamento, que difere do da maioria das espécies de beija-flores encontradas da Mata Atlântica, que são territorialistas (Piacentini & Varassin, 2007). Siqueira-Filho & Machado (2001) indicam que P. eurynome costuma se deslocar de forma considerável em grandes áreas, realizando uma “ronda” entre as fontes de alimento. Dessa forma, esse fator também pode ter contribuído para a baixa frequência de visitação dessa espécie nas flores de F. itatiaiae. Em relação ao sistema reprodutivo dos indivíduos da população estudada, a diferença entre o número de sementes e frutos formados através da autopolinização e polinização em condições naturais, indicou a prevalência de alogamia em F. itatiaiaie, embora ocorra o processo de autogamia facultativa (raras ocasiões), indicando a ocorrência de um sistema misto. Segundo Matallana et al. (2010), pode- se observar grande variação na fluidez dos sistemas reprodutivos em espécies de Bromeliaceae, com espécies apresentando autoincompatibilidade e um certo nível de compatibilidade e vice-versa. Entretanto, em Bromeliaceae, acredita-se que a autoincompatibilidade seja o sistema reprodutivo mais difundido na família (Benzing, 2000). Diversos estudos indicam que a autogamia em Bromeliaceae parece ter evoluído em resposta à simpatria das espécies, funcionando como uma barreira reprodutiva, isto é, evitando o contato do gineceu com pólen heteroespecífico e favorecendo a deposição de auto-pólen no estigma (Wendt et al., 2002; Matallana et al., 2010). No caso de F. itatiaiae, a predominância da autoincompatibilidade pode estar favorecendo o processo de manutenção da variabilidade genética entre os indivíduos da população estudada. Segundo Heslop-Harrison (1983), a autoincompatibilidade favorece a manutenção da variabilidade genética nas populações e é considerada um fator determinante no sucesso evolutivo das angiospermas. Matallana et al. (2010) apontam que, embora grande parte das espécies de Bromeliaceae apresentem a condição de autocompatibilidade, espécies pertencentes à subfamília Bromelioideae – caso de F. itatiaiae – geralmente apresentam grande variação em seus sistemas reprodutivos, sendo comum a presença de autoincompatibilidade. Espécies do gênero Aechmea e Tillandsia foram avaliadas nesse sentido e foi verificada a ocorrência de autoincompatibilidade
170
gametofítica (GSI) foi detectada (Vervaeke et al., 2001). Nesse tipo de autoincompatibilidade, a supressão dos tubos polínicos ocorre ao longo do estilete, os quais comumente se rompem precocemente e formam disposições irregulares (Oliveira & Gibbs, 1994). Embora sejam necessários mais experimentos, sugere-se que F. itatiaiae apresente autoincompatibilidade gametofítica, uma vez que também foi identificada a condição de autogamia facultativa através da razão pólen/óvulo. Segundo Gibbs (1990), espécies que apresentam a condição de GSI, podem apresentar em uma mesma população indivíduos autoincompatíveis, compatíveis e semicompatíveis, devido à expressão independente dos genótipos haploides de cada gameta, o que parece ocorrer nos diferentes indivíduos de F. itatiaiae. Segundo Lenzi et al. (2006), a razão pólen/óvulo explica aspectos diretamente relacionados à oferta de recursos florais, ao sistema de polinização e ao sistema reprodutivo em espécies vegetais. Dessa forma, os valores obtidos através desse indicador refletem a eficiência da polinização, isto é, quanto mais eficiente a transferência de pólen, menor é a razão pólen/óvulo, o que indica que plantas autoincompatíveis produzem maior quantidade de pólen do que as plantas autógamas (Cruden, 1977). No caso de F. itatiaiae, a apresentação de um sistema reprodutivo misto parece estar relacionada também com um aspecto importante de sua estratégia reprodutiva: a segurança reprodutiva. Segundo Oliveira & Maruyama (2014), mecanismos de endogamia mais flexíveis estão relacionados a uma estratégia reprodutiva interessante: ao mesmo tempo em que proporcionam a segurança reprodutiva, mantêm certo grau de variabilidade e flexibilidade reprodutiva. Levando-se em conta o ambiente no qual F. itatiaiae ocorre, que é muito variável em relação ao clima e abundância de espécies de polinizadores (como beija-flores, por exemplo), estratégias de segurança reprodutiva relacionadas à autogamia podem garantir a ocorrência do processo reprodutivo na ausência de polinizadores, que por sua vez, apresentaram baixa frequência de visitação. Sobre isso, Endress (1994) indica que em hábitats extremos, a autogamia facultativa se apresenta como uma condição vantajosa devido à baixa frequência de polinizadores e às condições ambientais adversas. No entanto, por se encontrar atualmente na condição de ameaçada de extinção, as medidas de conservação de F. itatiaiae precisam ser fortalecidas, uma vez que foi possível constatar que os processos envolvidos em sua reprodução não favorecem
171
rápida dispersão da espécie. Dessa forma, considerando que essa espécie se reproduz preferencialmente através de polinização cruzada, isto é, depende de polinizadores para se reproduzir, associado ao fato de que há baixa frequência de seus visitantes florais, é necessário que sejam propostas medidas de conservação, tanto para F. itatiaiae, quanto para outras espécies vegetais também ameaçadas presentes do PNI, que representam 11% de todas as espécies (Aximoff et al., 2016).
172
Considerações Finais
A partir das análises sobre as características da biologia floral e reprodutiva de Fernseea itatiaiae, como a morfologia floral que restringe os visitantes florais e a prevalência de autoincompatibilidade, sugere-se a necessidade de medidas que garantam sua conservação em uma larga escala de tempo, haja visto o importante papel ecológico que essa espécie desempenha no ambiente, contribuindo para a manutenção de espécies vegetais e animais. Dessa forma, conclui-se que estudos sobre espécies ameaçadas de extinção são largamente necessários, uma vez que o desenvolvimento e propostas de políticas públicas para a conservação dependem dessas informações.
173
Considerações Finais e Perspectivas
A partir dos resultados sobre os aspectos ecológicos da dinâmica de produção de néctar e da morfoanatomia de nectários florais, podemos concluir que em todas as espécies estudadas as características morfoanatômicas do nectário floral, assim como a ultraestrutura celular, exerceram grande influência nos mecanismos envolvidos na produção de néctar e nos aspectos quantitativos e qualitativos dessa produção. Esta tese trouxe como ponto inovador para a área o estudo de diferentes espécies de uma mesma família, explorando diferentes variáveis para explicar as possíveis causas dos distintos padrões de produção de néctar entre as espécies. Dessa forma, conclui-se que a dinâmica de produção de néctar nas espécies de Bromeliaceae estudadas é fortemente modulada pela ação dos polinizadores – como a frequência de visitação (que responde fortemente aos padrões de reposição do néctar) e a preferência por determinados tipos de açúcares e aminoácidos - e pelos mecanismos envolvidos com o maquinário celular dos nectários florais, sendo esses dois fatores complementares no sentido de maximizar o sucesso reprodutivo das espécies estudadas. Nessa perspectiva, este trabalho contribui com o avanço do conhecimento sobre os fatores que modulam a relação planta-polinizador, trazendo dados inéditos sobre a importância do recurso floral néctar no estabelecimento dessa interação. No entanto, muitas questões envolvidas com a produção de néctar e a biologia de nectários florais permanecem em aberto, especialmente em relação às bases fisiológicas – como o papel dos estômatos e do processo fotossintético nessa produção - e moleculares que as envolvem. Dessa forma, estudos complementares nesse sentido podem auxiliar na elucidação de questões importantes, esclarecendo de que maneira os mecanismos de produção de néctar são conservados entre as espécies e como isso se reflete na interação planta-polinizador.
174
Referências
Arizmendi, M., Ornelas, J.F. 1990. Hummingbirds and their floral resources in a tropical dry forest in Mexico. Biotropica 172-180.
Aximoff, I. 2011. O que perdemos com a passagem do fogo pelos campos de altitude do Estado do Rio de Janeiro. Revista Biodiversidade Brasileira, Número Temático: Ecologia e Manejo do Fogo em Áreas Protegidas, 2: 180-200.
Aximoff, I.A., Braga, J.M.A., Freitas, A. 2016. Regeneração natural dos campos de altitude pós-fogo no Parque Nacional do Itatiaia, sudeste do Brasil. Oecologia Australis 20: 62-80.
Beniston, M. 2003. Climatic Change in Mountain Regions: A Review of Possible Impacts. Climatic Change 59: 5-31.
Benzing, D.H., Bennett, B. 2000. Bromeliaceae: profile of an adaptive radiation. Cambridge: University Press.
Bernier, G., Havelange, A., Houssa, C., Petitjean, A., Lejeune, P. 1993. Physiological signals that induce flowering. The Plant Cell 5: 1147.
Brown, G.K., Gilmartin, A.J. 1989. Stigma types in Bromeliaceae-A systematic survey. Systematic Botany 110-132.
Buzato, S., Sazima, M., & Sazima, I. 2000. Hummingbird‐Pollinated Floras at Three Atlantic Forest Sites 1. Biotropica 32: 824-841.
Canela, M.B.F., Sazima, M. 2003. Aechmea pectinata: A Hummingbird‐dependent Bromeliad with inconspicuous flowers from the rainforest in South‐eastern Brazil. Annals of Botany, 92: 731-737.
175
Cruden, R.W. 1977. Pollen-ovule ratios: a conservative indicator of breeding systems in flowering plants. Evolution 32-46.
Dahlgren, R.M.T., Clifford, H.T., Yeo, P.F. 1985. The families of the monocotyledons: structure, evolution and taxonomy. Berlin: Springer.
Dodd, M.E., Silvertown, J., Chase, M.W. 1999. Phylogenetic analysis of trait evolution and species diversity variation among angiosperm families. Evolution 53: 732-744.
Endress, P.K. 1994. Diversity and evolutionary biology of tropical flowers. Cambridge: University Press.
Flora do Brasil. 2020 em construção. Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016. Disponível em:< http://floradobrasil. jbrj. gov. br/>. Acesso em 19 jan. 2018.
Fontoura, T., Costa, A., Wendt, T. 1991. Preliminary checklist of the Bromeliaceae of Rio de Janeiro state, Brazil. Selbyana 5-45.
Gibbs, P. 1990. Self-incompatibility in flowering plants: a neotropical perspective. Revista Brasileira de Botânica 13: 125-136.
Heslop-Harrison, J. 1983. Review Lecture Self-incompatibility: phenomenology and physiology. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences 218: 371-395.
Kearns, C.A., Inouye, D.W. 1997. Pollinators, Flowering Plants, and Conservation Biology. BioScience 47: 297-307.
Lanna, L.L., Azevedo, C.S., Claudino, R.M., Oliveira, R., Antonini, Y. 2017. Feeding behavior by hummingbirds (Aves: Trochilidae) in artificial food patches in an Atlantic Forest remnant in southastern Brazil. Zoologia – An International Journal for Zoology 34: 1-9.
176
Lenzi, M., Matos, J.Z.D., Orth, A.I. 2006. Morphological and reproductive variation of Aechmea lindenii (E. Morren) Baker var. lindenii (Bromeliaceae). Acta Botanica Brasilica, 20: 487-500.
Lima, H.A. 1988. Heterostilia em Psychotria leiocarpa Cham. & Schl. (Rubiaceae). Boletim do Museu Nacional 76: 1-16.
Machado, C.G., Semir, J. 2006. Fenologia da floração e biologia floral de bromeliáceas ornitófilas de uma área da Mata Atlântica do Sudeste brasileiro. Brazilian Journal of Botany, 29: 163-174.
Martinelli, G. 1996. Campos de altitude. 2ª Ed. Rio de Janeiro: Index. 160p.
Martinelli, G., Moraes, M.A. 2013. Desafios para implementação da estratégia global para a conservação de plantas no Brasil. In: Martinelli, G, Moraes, M.A. (Orgs). Livro vermelho da flora do Brasil. Rio de Janeiro: Andrea Jakobsson. p. 26-39.
Matallana, G., Godinho, M.A.S., Guilherme, F.A.G., Belisario, M., Coser, T.S., Wendt, T. 2010. Breeding systems of Bromeliaceae species: evolution of selfing in the context of sympatric occurrence. Plant systematics and evolution, 289: 57-65.
Medina, B.M.O., Ribeiro, K.T., Scarano, F.R. 2006. Plant-plant and plant-topography interactions on a rock outcrop at high altitude in southeastern Brazil. Biotropica 38: 1- 7.
Mittermeier, R.A., Turner, W.R., Larsen, F.W., Brooks, T.M., Gascon, C. 2011. Global biodiversity conservation: The critical role of hotspots. In: Zachos, F.E., Habel, J.C. (Eds). Biodiversity hotspots: Distribution and protection of conservation priority areas. Berlin: Springer. p. 3-22.
Oliveira, P., Gibbs, P. 1994. Pollination biology and breeding systems of six Vochysia species (Vochysiaceae) in Central Brazil. Journal of Tropical Ecology 509-522.
177
Oliveira, P.E., Maruyama, P.K. 2014. Sistemas reprodutivos. In: Biologia da polinização. 1 ed. Rio de Janeiro: Projeto Cultural. p. 71-92.
Oliveira-Filho, A.T., Fontes M.A.L. 2000. Patterns of floristic differentiation among Atlantic Forests in Southeastern Brazil and the influence of climate. Biotropica 32:793- 810.
Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. 2011. How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos 120: 321-326.
Poulin, B., Lefebvre, G., McNeil, R. 1992. Tropical avian phenology in relation to abundance and exploitation of food resources. Ecology, 73: 2295-2309.
Piacentini, V.Q., Varassin, I.G. 2007. Interaction network and the relationships between bromeliads and hummingbirds in an area of secondary Atlantic rain forest in southern Brazil. Journal of Tropical Ecology 663-671.
Radford, A.E., Dickinson, W.C., Massey, J.R., Bell, C.R. 1974. Vascular plant systematics. New York: Harper and Row.
Rodríguez‐Echeverría, S., Lozano, Y.M., Bardgett, R.D. 2016. Influence of soil microbiota in nurse plant systems. Functional Ecology 30: 30-40.
Safford, H.D. 1999. Brazilian páramos I. Introduction to the physical environment and vegetation of the campos de altitude. The Journal of Biogeography 26: 713-738.
Sajo, M.G., Rudall, P.J., Prychid, C.J. 2004. Floral anatomy of Bromeliaceae, with particular reference to the evolution of epigyny and septal nectaries in commelinid monocots. Plant Systematics and Evolution 247: 215-231.
178
Scarano, F.R. 2002. Structure, function and floristic relationships of plant communities in stressful habitats marginal to the Brazilian Atlantic rainforest. Annals of Botany 90: 517-524.
Scrok, G. J., Varassin, I.G. 2011. Reproductive biology and pollination of Aechmea distichantha Lem.(Bromeliaceae). Acta Botanica Brasilica, 25: 571-576.
Segadas-Vianna, F., Dau, L. 1965. Ecology of the Itatiaia range, southeastern Brazil. Imprensa nacional.
Sick, H. 1997. Ornitologia brasileira. Rio de Janeiro: Nova Fronteira.
Siqueira Filho, J.A.D., Machado, I.C.S. 2001. Biologia reprodutiva de Canistrum aurantiacum E. Morren (Bromeliaceae) em remanescente da Floresta Atlântica, nordeste do Brasil. Acta Botanica Brasilica 15: 427-443.
Smith, L.B., Downs, R.J. 1979. Bromeliaceae (Bromelioideaee). New York: Haffner Press.
Stiles, F.G. 1978. Temporal organization of flowering among hummingbird foodplants of a tropical wet forest. Biotropica 10: 194-210.
Tomzhinski, G.W. 2012. Análise Geoecológica dos Incêndios Florestais no Parque Nacional do Itatiaia. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa de Pós-Graduação em Geografia, 137 p.
Vale, M.M., Tourinho, L., Lorini, M.L., Rajão, H., Figueiredo, M.S. 2018. Endemic birds of the Atlantic Forest: traits, conservation status, and patterns of biodiversity. Journal of Field Ornithology, 89: 193-206.
Versieux, L. de M. 2009. Sistemática, filogenia e morfologia de Alcantarea (Bromeliaceae). 2009. 252p. Tese de Doutorado - Instituto de Biociências - Universidade de São Paulo (USP).
179
Vervaeke, I., Parton, E. Maene, L., Deroose, R., De Proft, M.P. 2001. Prefertilization barriers between diferente Bromeliaceae. Euphytica 118: 91-97.
Vizentin-Bugoni, J., Maruyama, P.K., Sazima, M. 2014. Processes entangling interactions in communities: forbidden links are more important than abundance in a hummingbird–plant network. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 281: 20132397.
Wendt, T., Canela, M.B.F., Klein, D.E., Rios, R. I. 2002. Selfing facilitates reproductive isolation among three sympatric species of Pitcairnia (Bromeliaceae). Plant Systematics and Evolution, 232: 201-212.
Zapata, T.R., Arroyo, M.T.K. 1978. Plant reproductive ecology of a secondary deciduous tropical forest in Venezuela. Biotropica 221-230.
180
Anexos
Anexo I - Termo de aprovação da pesquisa – Comitê de Bioética e Biossegurança
181
Anexo II
Declaração – Lei nº 9610/98