“Luiz De Queiroz” Microbiota Intestinal De Spodoptera Guenée

Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”

Microbiota intestinal de Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae) associada aos agrossistemas do Novo Mundo: diversidade e capacidade de utilização de inseticidas

Ana Flávia Freitas Gomes

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestra em Ciências. Área de concentração: Entomologia

Piracicaba 2018 Ana Flávia Freitas Gomes Engenheira Agrônoma

Microbiota instestinal de Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae) associada aos agrossistemas do Novo Mundo: diversidade e capacidade de utilização de inseticidas

Orientador: Prof. Dr. FERNANDO LUIS CÔNSOLI

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestra em Ciências. Área de concentração: Entomologia

Piracicaba 2018 2

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA – DIBD/ESALQ/USP

Gomes, Ana Flávia Freitas Microbiota intestinal de Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae) associada aos agrossistemas do novo mundo: diversidade e capacidade de utilização de inseticidas / Ana Flávia Freitas Gomes. - - Piracicaba, 2018. 73 p.

Dissertação (Mestrado) - - USP / Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”.

1. Desintoxicação 2. Holobionte 3. Microbioma 4. Simbiose I. Título

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Custódio e Dorinha, e ao meu irmão, Arthur, por todo apoio e carinho. Por serem meu porto seguro.

Ao meu namorado, Diego, pelo carinho, companheirismo e cumplicidade.

À Mariana e Bruna, minha primeira família de Piracicaba, e a todos os amigos que conquistei ao longo dessa caminhada.

Ao Prof. Dr. Fernando Luis Cônsoli, pela orientação, ensinamentos e confiança. Por ser um exemplo de profissional e me incentivar sempre.

Aos amigos do Laboratório de Interações em Insetos (ESALQ/USP), Bruna, Luís, Nathalia, Wanessa, Pedro, Diandra, Ana, Iara, Aline, Caio, Letícia, Mariane, Eloísa, Matheus e Marcele, pelo auxílio nos experimentos, pela companhia e apoio. Pelos cafés, conversas e risadas.

Aos amigos e familiares que me auxiliaram nas coletas de insetos no campo.

Ao Laboratório de Biologia de Insetos (ESALQ/USP) pelo fornecimento das lagartas de Spodoptera albula, Spodoptera cosmioides, Spodoptera eridania e Spodoptera frugiperda.

Ao Laboratório de Resistência de Artrópodes a Táticas de Controle (ESALQ/USP) pelo fornecimento das linhagens de Spodoptera frugiperda resistentes e suscetíveis a inseticidas.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Entomologia da ESALQ/USP pelos conhecimentos transmitidos.

Ao Departamento de Entomologia e Acarologia da ESALQ-USP pelo suporte.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudos

“Somewhere, something incredible is waiting to be known.” – Carl Sagan

SUMÁRIO

RESUMO ...... 7 ABSTRACT ...... 8 1. INTRODUÇÃO ...... 9 2. MICROBIOTA INTESTINAL DE ESPÉCIES AMERICANAS DE Spodoptera GUENÉE (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) ...... 15 Resumo ...... 15 Abstract ...... 15 2.1. Introdução ...... 16 2.2. Material e métodos ...... 17 2.2.1. Obtenção e dissecação dos insetos ...... 17 2.2.2. Extração do DNA genômico, amplificação e sequenciamento da região V3-V4 do gene 16S rRNA ...... 18 2.2.3. Análise das sequências ...... 18 2.3. Resultados ...... 20 2.4. Discussão ...... 26 2.5. Conclusão ...... 28 Referências ...... 28 3. MICROBIOTA INTESTINAL DE Spodoptera frugiperda (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE): A INFLUÊNCIA DE INSETICIDAS NA SUA DIVERSIDADE E A SELEÇÃO DE BACTÉRIAS METABOLIZADORAS DE INSETICIDAS ...... 33 Resumo ...... 33 Abstract ...... 33 3.1. Introdução ...... 34 3.2. Objetivos e predições ...... 35 3.3. Material e métodos ...... 36 3.3.1. Análise metagenômica da microbiota associada ao intestino de linhagens resistentes, suscetíveis e naturais de S. frugiperda ...... 36 3.3.1.1. Extração do DNA genômico, amplificação e sequenciamento da região V3-V4 do gene 16S rRNA ...... 36 3.3.1.2. Análise das sequências ...... 37 6

3.3.2. Isolamento, cultivo e caracterização molecular de bacterias associadas ao intestino médio de S. frugiperda com capacidade de utilizar inseticida como única fonte de carbono ...... 38 3.3.2.1. Isolamento e cultivo ...... 38 3.3.2.2. Caracterização molecular ...... 39 3.3.3. Determinação da capacidade de crescimento da microbiota associada a S. frugiperda em múltiplos inseticidas ...... 41 3.4. Resultados ...... 42 3.4.1. Análise metagenômica ...... 42 3.4.2. Isolamento e cultivo de bactérias capazes de metabolizar inseticidas ...... 49 3.4.3. Caracterização molecular ...... 51 3.4.4. Determinação da capacidade de crescimento da microbiota associada a S. frugiperda em múltiplos inseticidas ...... 57 3.5. Discussão ...... 59 3.6. Conclusões ...... 62 Referências ...... 63 ANEXOS ...... 70 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS ...... 73

RESUMO

Microbiota intestinal de Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae) associada aos agrossistemas do Novo Mundo: diversidade e capacidade de utilização de inseticidas

Insetos são os organismos multicelulares mais bem-sucedidos no ecossistema terrestre e sua riqueza se deve, em parte, à simbiose com microrganismos. Geradora de diversidade fenotípica, a comunidade microbiana associada a insetos permite a manutenção de fenótipos complexos capazes de colonizar novos nichos e de se adaptar a fatores de estresse. A relevância da relação de simbiose na ordem Lepidoptera, todavia, tem sido questionada em função da alta variabilidade da comunidade bacteriana associada aos seus representantes. Tendo como modelo de estudo lagartas do gênero Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), esse trabalho teve por objetivo melhor compreender a composição e diversidade da microbiota associada ao intestino de lepidópteros, assim como verificar o efeito da pressão de seleção direcionada à resistência na sua estrutura e capacidade de utilização de inseticidas como fonte de carbono. Para isso, foi realizada a análise metagenômica da comunidade microbiana intestinal de quatro espécies do gênero Spodoptera assim como de cinco populações naturais de S. frugiperda e de linhagens suscetível e resistentes desse inseto praga. Foram avaliadas linhagens de S. frugiperda resistentes aos inseticidas spinosad, chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, flubendiamide, teflubenzuron e à toxina de Bacillus thuringiensis Cry1A.105+Cry2Ab2. A análise da composição, riqueza e capacidade da comunidade bacteriana utilizar inseticidas foi baseada na determinação de índices de diversidade alfa e beta, no isolamento de bactérias intestinais em meio seletivo e na análise do potencial de crescimento dos isolados em inúmeros inseticidas. Nossos resultados indicam a importância da microbiota intestinal para esse gênero de Lepidoptera. Bactérias do gênero Enterococcus foram predominantes em todas as populações de Spodoptera analisadas, independentemente da espécie, dieta ou pressões de seleção às quais as lagartas foram expostas. Populações naturais de S. frugiperda apresentaram um microbioma mais diverso e com maior número de bactérias capazes de metabolizar inseticidas. A diversidade do microbioma, assim como a presença e capacidade de bactérias utilizarem inseticidas como fonte de carbono para o seu crescimento foram influenciadas pelo nível de exposição a tais compostos, demonstrando que, assim como o hospedeiro, a microbiota intestinal também se encontra em pressão de seleção direcionada a resistência.

Palavras-chave: Desintoxicação; Holobionte; Microbioma; Simbiose

ABSTRACT

Gut microbiota of Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae) associated with New World agrosystems: diversity and capacity of inseticides utilization

Insects are the most successful multicellular organisms in the terrestrial ecosystem and their richness is partially due to symbiosis with microorganisms. The microbial community associated with insects allows the maintenance of complex phenotypes capable of colonizing new niches and adapting to stressors. The relevance of symbiosis in Lepidoptera, however, has been questioned due to the high variability of the bacterial community associated with its representatives. Using Spodoptera larvae as a model, this work aimed to better understand the composition and diversity of the gut microbiota associated with Lepidoptera, as well as to verify the effects of the selection pressure with insecticides in the microbial gut structure and the ability of members of the community to metabolize insecticides as carbon source. Thus, we performed a metagenomic analysis of the gut microbial community of four species of the genus Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), as well as for five natural populations of S. frugiperda and susceptible and resistant strains of this pest. Strains of S. frugiperda resistant to the insecticides spinosad, chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, flubendiamide, teflubenzuron and Bacillus thuringiensis toxin Cry1A.105 + Cry2Ab2 were evaluated. The analysis of the composition, richness and ability of the bacterial community to metabolize insecticides were carried out through alpha and beta diversity indexes, isolation of intestinal bacteria in selective medium and analysis of the growth potential of isolates in multiple insecticides. Our data indicate the importance of symbiosis for S. frugiperda. Enterococcus prevailed in all populations analyzed, regardless of the species of Spodoptera, food source or selection pressure that the larvae were exposed. Microbial diversity and ability to metabolize insecticides were higher in natural populations exposed to a range of stressors in the field. The diversity of the gut microbial community associated to Spodoptera frugiperda, as well as the ability of its members to metabolize insecticides, were influenced by the degree of exposure to insecticides, showing that, like the host, the gut microbiota is also under selection pressure to resistance.

Keywords: Detoxification; Holobiont; Microbiome; Symbiosis

1. INTRODUÇÃO

A simbiose, definida como a associação próxima entre quaisquer organismos por De Bary (1879), desempenha papel fundamental na evolução e adaptação a novos nichos (Shapira, 2016). Organismos em simbiose são denominados simbiontes e podem estabelecer relação de mutualismo, comensalismo ou parasitismo (Moran, 2006). A colonização por microrganismos não patogênicos é intrínseca à classe Insecta (Douglas, 2015) e pode ser benéfica ou até mesmo requerida para o desenvolvimento normal do inseto hospedeiro. Microrganismos que não estabelecem relações de patogenicidade com insetos influenciam da nutrição à defesa e reprodução do hospedeiro (Moran, 2007), interferindo na aptidão e diversidade de insetos no ecossistema terrestre (Voirol et al., 2018). De acordo com a localização em relação ao hospedeiro, simbiontes são classificados como ecto ou endossimbionte, sendo os últimos ainda denominados endocitobiontes quando sua colonização é intracelular, ou ectocitobionte, quando está no lúmen de algum órgão ou na hemocele (Hansen & Moran, 2014). Quanto a relação de dependência hospedeiro- microrganismo, simbiontes são classificados como primários obrigatórios ou secundários facultativos (Moran, 2006). Simbiontes obrigatórios normalmente têm histórias evolutivas longas com seus hospedeiros (Feldhaar, 2011), enquanto os facultativos parecem ter estabelecido associações mais recentes, mantendo a capacidade de retornar a uma condição de vida livre (Moya et al., 2008). Embora não sejam essenciais à sobrevivência do hospedeiro, simbiontes facultativos podem beneficiar o hospedeiro oferecendo proteção a inimigos naturais e tolerância à fontes de estresse (Montllor et al., 2002; Oliver et al., 2005), além de, em alguns casos, atuarem como manipuladores reprodutivos, como Spiroplasma (Tenericutes) (Martins et al., 2010; Anbutsu & Fukatsu, 2011) e Wolbachia (Proteobacteria) (Werren et al., 2008). Simbiontes secundários são frequentemente encontrados em apenas uma fração da população, na qual eles podem ter efeitos marcantes sobre o fenótipo do hospedeiro (Oliver et al., 2010). Em associação obrigatória ou facultativa com microrganismos, o inseto pode adquirir características fenotípicas que garantem a sobrevivência frente à exposição a fatores de estresse e, como unidade, estão sujeitos à ação da pressão de seleção em condições naturais (Guégan et al., 2018). Desafiando o conceito clássico de individuo (Gilbert et al., 2012), inseto e sua microbiota residente podem ser vistos assim como um organismo quimérico – uma unidade ecológica denominada holobionte (Margulis, 1991), formada pelo genoma do hospedeiro e pelos genomas da microbiota associada (hologenoma) (Zilber-Rosenberg & 10

Rosenberg, 2008; Rosenberg & Zilber-Rosenberg, 2018). Do ponto de vista evolutivo, o hologenoma atua como uma fonte de variabilidade e de informação genética (Bordenstein & Theis, 2015). Enquanto o genoma do hospedeiro é altamente conservado, o genoma do microbioma é dinâmico e capaz de mudar rapidamente em resposta ao ambiente, seja através do aumento ou redução de microrganismos particulares, da aquisição de novos microrganismos ou da transferência horizontal de genes (Rosenberg & Zilber-Rosenberg, 2018). O microbioma atua como força motriz para a inovação evolutiva, permitindo a manutenção de fenótipos complexos capazes de se adaptar às condições adversas presentes no meio (Mereghetti et al., 2017; Itoh et al., 2018). Em insetos, o conceito de holobionte como unidade de seleção em evolução (Zilber-Rosenberg & Rosenberg, 2008) foi abordado principalmente em relações de simbiose obrigatória (Guerrero et al., 2013; Mandrioli & Manicardi, 2013), onde ocorre alto grau de fidelidade e o genoma microbiano é transmitido verticalmente – da mãe para os descendentes. Simbioses facultativas, todavia, também abrangem o termo holobionte uma vez que afetam o fenótipo do hospedeiro e são estabelecidas a cada geração através da transmissão horizontal (Theis et al., 2016). Simbiontes facultativos são encontrados principalmente no intestino de insetos (Dillon & Dillon, 2004; Engel & Moran, 2013) e podem ter sua diversidade moldada em função da dieta (Colman et al., 2012), localização geográfica e clima (Gayatri Priya et al., 2012), além de variar de acordo com o estágio de desenvolvimento, filogenia (Yun et al., 2014) e pressões de seleção às quais o hospedeiro foi exposto (Almeida et al., 2017). Em Lepidoptera, a associação com microrganismos está envolvida em atividades como nutrição (Visôtto et al., 2009; Pal & Karmakar, 2018), reprodução (Werren et al., 2008) e proteção contra inseticidas ou metabólitos secundários de plantas (Itoh et al., 2018; Mason et al., 2018). Pesquisas sobre a composição da microbiota intestinal de lepidópteros indicam uma comunidade microbiana altamente variável intra e interespecificamente, o que foi justificado como uma resposta à ausência de condições adequadas para a colonização estável de comunidades bacterianas (Hammer et al., 2017; Voirol et al., 2018). Em geral, o intestino de lepidópteros não é compartimentabilizado, apresenta pH alcalino e tem sua estrutura modificada durante a metamorfose, o que pode comprometer o estabelecimento de uma microbiota residente fixa a cada geração (Staudacher et al., 2016; Hammer et al., 2017). Alguns grupos bacterianos, no entanto, são observados com frequência na literatura relacionada ao microbioma de lagartas (Mereghetti et al., 2017), como as famílias Clostridiaceae (Firmicutes), Enterococcaceae (Firmicutes) e Enterobacteriaceae 11

(Proteobacteria), reconhecidas como um núcleo funcional potencial na espécie Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae) (Tang et al., 2012; Shao et al., 2014; Chen et al., 2016). O microbioma variável de lepidópteros sugere a possibilidade da manutenção de uma microbiota dinâmica com alta adaptabilidade em diferentes condições de estresse, baseado na redundância de sua contribuição funcional. O papel da comunidade simbionte na plasticidade fenotípica na ordem Lepidoptera, no entanto, ainda não é clara, sendo necessários estudos mais aprofundados sobre a interação hospedeiro-microrganismo nesse grupo de insetos, assim como a sua contribuição como holobionte frente às pressões de seleção em condições naturais.

Referências

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2. MICROBIOTA INTESTINAL DE ESPÉCIES AMERICANAS DE Spodoptera GUENÉE (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)

Resumo

O avanço de técnicas moleculares, como o sequenciamento de nova geração (NGS), nos permitiu melhor investigar a dinâmica e diversidade de microrganismos associados a eucariotos. De forma independente do cultivo, tornou-se possível a compreensão da relação de simbiose ao nível de comunidade – quem são os microrganismos, qual sua abundância e o que fazem. A associação com microrganismos é comum a insetos e, seja obrigatória ou facultativa, pode afetar diretamente a bioecologia do hospedeiro. Em Lepidoptera, a contribuição funcional de simbiontes, assim como a existência de uma microbiota residente, tem sido alvo de discussão na comunidade cientifica. A fim de melhor compreender a relação da microbiota intestinal e seus insetos hospedeiros, esse trabalho teve por objetivo comparar a microbiota associada ao intestino de espécies do gênero Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), todas pragas de culturas de importância econômica como milho, soja e algodão. Assim, lagartas de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), Spodoptera albula (Walker), Spodoptera eridania (Cramer) e Spodoptera cosmioides (Walker), obtidas de criação em condições de laboratório, foram dissecadas para a extração do intestino médio e posterior análise metagenômica da microbiota associada. A caracterização da composição da microbiota foi realizada via sequenciamento da região V3 - V4 do gene 16S do RNA ribossomal. Os experimentos foram realizados em triplicata e as leituras obtidas em plataforma Illumina MiSeq analisadas com o software QIIME2. A diversidade e estrutura da comunidade microbiana associada ao intestino das diferentes espécies de Spodoptera foi analisada utilizando-se de índices de diversidade alfa e beta e da classificação taxonômica via busca heurística contra sequencias do banco SILVA 128. A microbiota mostrou-se predominantemente composta por bactérias do gênero Enterococcus, com mais de 95% de abundância em todas as espécies amostradas, o que sugere a importância do táxon ao gênero Spodoptera. No entanto, pelo menos quatro filotipos de Enterococcus foram identificados associados ao intestino de Spodoptera, indicando haver diferenças entre os Enterococcus de algumas das espécies estudadas.

Palavras-chave: Adaptação hospedeira; Metagenômica; Microbiota intestinal; Simbiose

Abstract

The advancement of molecular techniques, such as the new generation sequencing (NGS), allowed to better investigate the dynamics and diversity of the microorganisms associated with eukaryotes. Regardless of cultivation, it became possible to understand the relationship with microbes at the community level – diversity, abundance and functional contribution of microorganisms. The association with microorganisms is common in insects and, whether obligate or facultative, can directly affect host bioecology. In Lepidoptera, however, the functional contribution of symbionts, as well as the existence of a resident microbiota, has been a matter of debate in the scientific community. In order to better understand the relationship between symbionts and insects, this research aimed to compare the gut microbial community of species of the genus Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae). 16

All species are known as pests of important crops such as corn, soybeans and cotton. Larvae of Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), Spodoptera albula (Walker), Spodoptera eridania (Cramer) and Spodoptera cosmioides (Walker) were reared under laboratory conditions and dissected for midgut collection and subsequent metagenomic analysis of the associated microbiota. Microbiota characterization was performed by sequencing the V3 - V4 region of the 16S rRNA gene. Experiments were performed in triplicate and the results were analyzed with the QIIME2 software. Diversity and structure of the gut microbial community associated with different species of Spodoptera were analyzed using alpha and beta diversity indexes and the taxonomic classification was performed by comparison to the sequences of the SILVA 128 database. Gut microbiota of species of Spodoptera was predominantly composed of bacteria of the genus Enterococcus, with more than 95% abundance in all Spodoptera species, suggesting the importance of this taxon to the genus Spodoptera. At least four Enterococcus phylotypes were identified in the midgut of the studied species of Spodoptera.

Keywords: Host adaptation; Metagenomics; Gut microbiota; Symbiosis

2.1. Introdução

Nos últimos anos, avanços em técnicas moleculares, como as tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS), permitiram-nos compreender melhor sobre as comunidades bacterianas associadas a insetos, esclarecendo sua diversidade taxonômica e funcional (Chen et al., 2016; Mereghetti et al., 2017). Apesar dos questionamentos envolvendo a relevância da simbiose na ordem Lepidoptera (Staudacher et al., 2016; Hammer et al., 2017), análises da comunidade microbiana associada a essa ordem de insetos indicam a frequência e predominância de grupos particulares de bactérias no intestino de lagartas, com destaque para as famílias Enterococcaceae (Firmicutes), Clostridiaceae (Firmicutes) e Enterobacteriaceae (Proteobacteria) (Voirol et al., 2018). Embora o estágio de desenvolvimento e a dieta tenham grande impacto na composição da comunidade bacteriana (Yun et al., 2014; Adair & Douglas 2017), as condições presentes no intestino de lepidópteros, como o pH alcalino, parecem selecionar filotipos específicos de bactérias (Mazumdar et al., 2018). Bactérias do gênero Enteroccocus, por exemplo, foram detectadas em diversas espécies de lepidópteros (Mereghetti et al., 2017; Voirol et al., 2018). Enteroccocus mundtii, associado a Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae), persistiu no intestino do hospedeiro por até duas gerações, independente da dieta ( Shao et al., 2014; Teh et al., 2016; Mereghetti et al., 2017). Marcadas com fluorescência, cepas dessa bactéria foram detectadas nos ovos de S. littoralis, sugerindo sua transmissão vertical entre gerações desse inseto praga (Teh et al., 2016). Ainda, essas bactérias podem controlar a composição do microbioma do hospedeiro através da secreção de compostos com atividade antimicrobiana (Shao et al., 17

2017). Análises da atividade metabólica ao longo do ciclo de S. litorallis demonstraram o papel de simbiontes em diversas categorias funcionais como metabolismo energético, transporte de membrana, transcrição e biossíntese de metabólitos secundários (Chen et al., 2016). A presença de membros persistentes na comunidade bacteriana de alguns lepidópteros, assim como seu envolvimento em processos funcionais no hospedeiro (Chen et al., 2016), contradiz argumentos contrários à presença de microbiota residente em Lepidoptera (Hammer et al., 2017). A alta frequência e abundância dessas bactérias, assim como a capacidade de algumas delas serem transmitidas para próximas gerações (Teh et al., 2016), nos permite hipotetizar que a interação com simbiontes intestinais é relevante para essa ordem de insetos, ou pelo menos para alguns de seus representantes. Como associações de simbiose que contribuem funcionalmente com o hospedeiro, exigindo período de adaptação ao longo do processo de evolução (Moran, 2007; Brucker & Bordenstein, 2012), e em sendo verdadeira a hipótese apresentada, poderíamos predizer que espécies de hospedeiros pertencendo a um mesmo gênero estariam associadas a microbiota intestinal semelhante e/ou contariam com um grupo de bactérias predominante semelhante. Assim, para testarmos essa hipótese escolhemos como modelo o gênero Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae) para avaliar a diversidade e composição interespecífica em lepidópteros e, assim, melhor compreender a relação de simbiose nesse diverso e abundante grupo de insetos.

2.2. Material e métodos

2.2.1. Obtenção e dissecação dos insetos

Lagartas de quinto ínstar de Spodoptera albula (Walker), Spodoptera cosmioides (Walker), Spodoptera eridania (Stoll) e Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) criadas em dieta artificial sob condições controladas (25±2°C; 60±10% UR; fotofase de 14h) (Parra, 1998), foram utilizadas para a obtenção do intestino médio. As lagartas foram esterilizadas superficialmente em solução de hiploclorito de sódio a 0,5%, etanol a 70% e água destilada estéril, e foram dissecadas em solução salina estéril (0,85% NaCl) em condições assépticas para a remoção do intestino. Os intestinos obtidos foram transferidos para recipientes contendo etanol absoluto para posterior extração do DNA genômico (gDNA) e análise da microbiota associada pelo sequenciamento metagenômico da região V3-V4 do gene do 16S do RNA ribossomal (16S rRNA). O experimento foi conduzido em triplicatas biológicas, 18

sendo cada repetição um conjunto de cinco mesênteros. Os tecidos foram armazenados a -20 oC até a extração do gDNA.

2.2.2. Extração do DNA genômico, amplificação e sequenciamento da região V3- V4 do gene 16S rRNA

Os intestinos coletados foram retirados dos recipientes contendo etanol absoluto e foram macerados em nitrogênio liquido. A extração do gDNA ocorreu pelo método de fenol- clorofórmio (Gilbert et al., 2007). A qualidade, integridade e pureza do DNA obtido foi verificada por eletroforese em gel de agarose a 0,8% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídio em tampão TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8,2) sob voltagem constante de 100V. O gDNA extraído foi armazenado a -20oC até ser enviado ao Centro Multiusuário de Biotecnologia Agrícola, Departamento de Zootecnia, ESALQ/USP, onde ocorreu o preparo e sequenciamento paired-end (2 x 250) das amostras em plataforma Illumina MiSeq. A região V3-V4 do gene 16S do RNA ribossomal (16SrRNA) de interesse foi obtida após reação em cadeia de polimerase (PCR) com iniciadores específicos para o alvo (iniciador senso: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGC AG; iniciador reverso: 5'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTAC HVGGGTATCTAATC), contendo sequências para a inclusão de adaptadores Illumina. Após purificação e quantificação, a indexação dos identificadores (tags) e adaptadores ocorreu após segunda reação de amplificação utilizando o produto comercial Nextera XT (Illumina). Os amplicons obtidos foram purificados com auxílio do produto comercial Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter Genomics), seguindo as instruções do fabricante. Os produtos purificados foram quantificados, normalizados e sequenciados em plataforma Illumina MiSeq.

2.2.3. Análise das sequências

A análise das leituras foi realizada com auxílio do software QIIME2 (Caporaso et al., 2010). Após importação e desmultiplexação, as leituras obtidas foram submetidas a processos de ajustes e a filtros de qualidade. O controle de qualidade das leituras e a construção de tabelas de recursos foi realizada seguindo a pipeline DADA2 (Callahan et al., 2016) para eliminação de sequências quiméricas e regiões de baixa qualidade (Phred Quality Score > 30) (Ewing et al., 1998; Ewing & Green, 1998). As sequências foram alinhadas contra o banco de 19

dados Silva 128 (Quast et al., 2013) pelo método PyNAST (Caporaso et al., 2010), e classificadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) através do método “UCLUST” (Edgar, 2010) (similaridade ≥ 97%). Com os dados gerados pelo software QIIME2, a abundância dos táxons em cada uma das amostras foi analisada no software R (R Core Team, 2013). OTUs com leituras de abundância relativa inferior a 1% foram agrupadas e consideradas como “outros”, sendo as sequências mitocondriais e cloroplásticas excluídas da análise. A complexidade e riqueza da comunidade bacteriana no intestino médio das espécies de Spodoptera foi estimada pelos índices de diversidade alfa e beta, considerando uma profundidade amostral de 5028 leituras. A diversidade alfa prevê a riqueza e uniformidade dentro de cada amostra e foi avaliada através dos índices de Shannon, de Pielou e pela análise de diversidade filogenética Faith. O índice de Shannon mede o número de espécies (OTUs) que seria esperado encontrar se todas as espécies tivessem a mesma abundância (equabilidade máxima), enquanto o índice de Pielou avalia a equabilidade dos microbiomas em estudo. O parâmetro de Faith, todavia, avalia a diversidade dos táxons presente na comunidade através da quantidade e distância entre os ramos na árvore filogenética. Curvas de rarefação foram utilizadas para confirmar a eficiência do esforço amostral utilizado. A fim de comparar as diferenças entre a microbiota associada às espécies de Spodoptera estudadas, foram utilizados o índice de diversidade beta de Jaccard, uma medida qualitativa de dissimilaridade da comunidade associada aos diferentes tratamentos, e as análises de UniFrac ponderada e não ponderada. A análise UniFrac compara a distância filogenética entre espécies associadas a cada amostra e, quando ponderada, inclui a abundância relativa de cada OTU. Os índices de diversidade alfa e beta foram avaliados por meio dos testes estatísticos Kruskal-Wallis e Permanova, considerando p≤0,05 como significativo. As matrizes de distância dos dados de Jaccard e Unifrac ponderada e não ponderada foram utilizadas como base para as análises de agrupamento hierárquico UPGMA (“Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean”) e de PCoA (“Principal Coordinates Analysis”). Testes estatísticos para comparação taxonômica da microbiota associada às espécies de Spodoptera foram realizados no software STAMP (“Statistical Analysis of Metagenomic Profiles”) (Parks et al., 2014), utilizando o teste não paramétrico de White, combinado com o método Bonferroni para o cálculo dos intervalos de confiança, com cobertura nominal de 95%. O teste Bonferroni foi utilizado para a correção de hipóteses múltiplas e indicação de falsos positivo. A relação filogenética entre as OTUs foi inferida através da comparação com 20

sequências tipo depositadas no genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Nesta análise foram utilizadas as sequências das OTUs mais abundantes e que apresentavam pelo menos 450pb. Sequências que compartilharam mais de 99,5% de similaridade em análises par a par dentro de cada espécie de Spodoptera foram agrupadas e a sequência mais longa selecionada como representativa. A árvore foi construída pelo método de máxima verossimilhança, utilizando o modelo de Kimura (Kimura, 1980) com 2 parâmetros e distribuição gamma, resultante da análise do critério de informação Bayesiana (“Bayesian information criterion” - BIC) e do critério de informação de Akaike (“Akaike information criterion” – AIC), disponíveis do software MEGA X (Kumar et al., 2018). O suporte da análise filogenética gerada foi avaliado utilizando-se da análise de bootstrap com 500 iterações, sendo utilizado como grupo externo sequências do 16S rRNA de Lactobacillus casei (NR 041893.1) e Lactobacillus plantarum (NR 042254.1).

2.3. Resultados

O sequenciamento das bibliotecas metagenômicas da região V3-V4 do 16S rRNA da microbiota intestinal associada às espécies S. albula, S. cosmioides, S. eridania e S. frugiperda gerou 1.919.440 leituras, com uma média de 159.953 leituras por amostra. Após a aplicação dos filtros de qualidade, o número total de leituras válidas foi de 230,120 leituras, com comprimento médio de 244 pb. As curvas de rarefação da microbiota indicaram que a amostragem obtida foi suficiente para identificar a riqueza da microbiota intestinal das espécies estudadas, sendo as variações do índice de diversidade intraespecífica irrisórias após a amostragem de 600 leituras, exceção feita à microbiota intestinal de S. albula, que necessitou da amostragem de pouco mais de 600 leituras para que o índice de diversidade se estabilizasse (Figura 2.1a). Lagartas de S. eridania apresentaram maior riqueza de OTUs considerando um microbioma com equabilidade máxima (Figura 2.1 b). Ainda, segundo o índice de Shannon, S. albula e S. frugiperda apresentaram diversidade intermediária e S. cosmioides foi a espécie de Spodoptera com o microbioma menos diverso.

4 4 44424 4 3.5 22 A B 3.54 3.53.53.5 3.5 20 3 3.53 33318 3 2.5 3 2.516 2.52.52.5 2.5 14 2.5 2 2 22212 2 Shannon observadas 2 Shannon Shannon Shannon Shannon

Shannon 10 1.5Shannon

Shannon 1.5 1.51.51.5 1.5 1.58 1 OTUs Número de OTUs observadas Número 1 16 1 11 1 4 0.5 0.5 0.50.50.50.5 2

0 0 0 000 0 0 0 0 599599 599 111811181118 16761676 223522352235 27932793 335233523352 391039103910 446944694469502850285028 0 599 1118 1676 2235 2793 3352 3910 4469 5028 0 00 0 599599599599 1118111811181118 1676167616761676 2235223522352235 2793279327932793 3352335233523352 3910391039103910 4469446944694469 5028502850285028 SequênciasSequências por por amostra amostra SequênciasSequênciasSequênciasSequênciasSequênciasSequências porporpor por poramostra poramostraamostra amostra amostra SequênciasSequências porpor amostraamostra

S.#albula S.#cosmioides S.eridania S.#frugiperda S.#albula S.#cosmioides S.eridania S.#frugiperda S.#albula S.#cosmioides S.eridania S.#frugiperda S.#albulaS.S.#albulaS.#albula albulaS.#albula S.#cosmioidesS.#cosmioidesS.S.#cosmioides S.#cosmioidescosmioides S.eridaniaS.eridaniaS.eridaniaS.S.eridania eridania S.#frugiperdaS.#frugiperdaS.#frugiperdaS.#frugiperdaS. frugiperda

Figura 2.1. Curvas de rarefação obtidas pela análise metagenômica da região V3-V4 do gene 16S do rRNA (A) e índice de diversidade de Shannon da microbiota (B) associada ao intestino de lagartas de Spodoptera albula, Spodoptera cosmioides, Spodoptera eridania e Spodoptera frugiperda.

A equabilidade da comunidade bacteriana associada às populações em estudo, assim como a distância sistemática entre seus membros (OTUs), foi confirmada, respectivamente, pelo índice de uniformidade de Pielou (J) e pelo índice de Faith, e comparadas através do teste de Kruskal Wallis (p≤ 0,05) (Tabela 2.1). Dentre as espécies de Spodoptera em estudo, S. eridania foi a que apresentou microbiota com OTUs mais uniformemente distribuídas (J=0,87) e se diferiu da comunidade microbiana associada a S. albula quanto a equabilidade de sua estrutura (J=0,77) (H=3,8571, p=0,0495, q=0,1899). Quanto a distância sistemática, a microbiota de S. frugiperda diferiu daquela de S. cosmioides (H=3,8571, p=0,0495, q=0,2972), a qual apresentou microbiota intestinal com OTUs filogeneticamente mais próximas. Os índices de diversidade beta de Jaccard e Unifrac ponderado e não ponderado foram utilizados para comparar a estrutura e diversidade da comunidade microbiana associada entre as espécies de Spodoptera. As análises de PCoA e UPGMA resultante da matriz de distância de Jaccard gerada resolveram a microbiota intestinal das espécies de Spodoptera estudadas em dois grupos. Um grupo representado por S. frugiperda e S. cosmioides e outro por S. eridania e S. albula, com a maioria das amostras de cada espécie resolvidas em subclados bem definidos (Figura 2.2). A matriz de distância gerada pela análise Unifrac não ponderada não resultou na formação clara de grupos na análise PCoA, principalmente pela grande dispersão das diferentes amostras dentro do mesmo grupo, com exceção daquelas de S. frugiperda (Figura 22

2.3a). Análises de Permanova não indicaram haver diferenças entre a diversidade da microbiota associada às espécies de Spodoptera (p=0,124). No entanto, quando a abundância dos táxons é incorporada na análise Unifrac, a microbiota intestinal associada às espécies se separa em quatro grupos distintos (Figura 2.3b).

Tabela 2.1. Análise estatística da diversidade alfa da comunidade microbiana associada às espécies Spodoptera albula, Spodoptera cosmioides, Spodoptera eridania e Spodoptera frugiperda. Comparação par a par dos Índices de Pielou e de Faith da comunidade bacteriana associada ao intestino das espécies em estudo, levando em consideração sua uniformidade e riqueza filogenética, respectivamente. Análise de variância não paramétrica de Kruskal- Wallis, considerando p≤ 0,05 como significativo.

Análise par a par - Kruskal Wallis Grupo 1 Grupo 2 H p q Índice de Pielou S. albula (n=3) S. cosmioides (n=3) 2,3333 0,1266 0,1899 S. albula (n=3) S. eridania (n=3) 3,8571 0,0495 0,1899 S. albula (n=3) S. frugiperda (n=3) 0,0476 0,8273 0,8273 S. cosmioides (n=3) S. eridania (n=3) 1,1905 0,2752 0,3303 S. cosmioides (n=3) S. frugiperda (n=3) 2,3333 0,1266 0,1899 S. eridania (n=3) S. frugiperda (n=3) 2,3333 0,1266 0,1899

Índice de Faith S. albula (n=3) S. cosmioides (n=3) 1,1905 0,2752 0,4129 S. albula (n=3) S. eridania (n=3) 1,1905 0,2752 0,4129 S. albula (n=3) S. frugiperda (n=3) 0,0476 0,8273 0,8273 S. cosmioides (n=3) S. eridania (n=3) 0,0476 0,8273 0,8273 S. cosmioides (n=3) S. frugiperda(n=3) 3,8571 0,0495 0,2972 S. eridania (n=3) S. frugiperda (n=3) 1,1905 0,2752 0,4129

sa1

sa2

se2 sa3 se3

se1

sc1

sc2 sc3 Sf sf3 Se Sc sf1 Sa sf2

0.05

Figura 2.2. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) e de Agrupamento Hierárquico (UPGMA) a partir da matriz de distância gerada pelo índice de diversidade beta de Jaccard para a diversidade da comunidade microbiana associada a Spodoptera albula (Sa), Spodoptera cosmioides (Sc), Spodoptera eridania (Se) e Spodoptera frugiperda (Sf).

Sc Sa

Figura 2.3. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) a partir de matrizes de distâncias geradas pelo índice de diversidade beta Unifrac ponderado (A) e não ponderado (B) da diversidade da comunidade microbiana associada a Spodoptera albula (Sa), Spodoptera cosmioides (Sc), Spodoptera eridania (Se) e Spodoptera frugiperda (Sf).

A comunidade de microrganismos associadas às espécies de Spodoptera em estudo apresentou majoritariamente bactérias do filo Firmicutes (Figura 2.4). Spodoptera albula e S. eridania apresentaram duas OTUs dominantes do gênero Enteroccocus, enquanto S. cosmioides e S. frugiperda apresentaram apenas uma OTU dominante, segundo comparação com o banco de sequências SILVA 128. A classificação taxonômica realizada pelo software QIIME2 não resolveu a composição da microbiota ao nível de espécie, mostrando, no entanto, a maior proximidade entre a estrutura da comunidade microbiana de S. frugiperda e S. cosmioides e de S eridania e S. albula. Análises comparativas a nível taxonômico conduzidas no software STAMP indicaram diferenças significativas na composição da microbiota em função da proporção das duas OTUs do gênero Enteroccocus (I e II) em cada uma das espécies de Spodoptera, sendo a comunidade bacteriana associada a S. albula a mais distinta (Figura 2.5). Em análises posteriores, as sequências de Enterococcus obtidas via sequenciamento metagenômico foram atribuídas a pelo menos quatro filotipos de Enterococcus (Figura 2.6), as quais incluem cepas bacterianas filogeneticamente próximas a Enterococcus mundtii, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus gallinarum, Enterococcus plantarum e, a mais divergente delas, próxima a Enterococcus cecorum e Enterococcus columbae. Embora composta majoritariamente por Enterococcaceae, a microbiota intestinal de S. albula, S. eridania, S. cosmioides e S. frugiperda se diferiu quanto a composição e diversidade de bactérias do gênero Enterococcus. A maior parte dos filotipos de Enterococcus foi compartilhada por pelo menos duas espécies de Spodoptera. Mesmo os filotipos que resolveram em um mesmo clado carregavam alguma diferença entre eles, assim como demonstrado pelo comprimento dos ramos na árvore filogenética (Figura 2.6).

S. albula S. cosmioides S. eridania S. frugiperda 100

OTUs Firmicutes_EnterococcusI 50 Firmicutes_EnterococcusII

Proporção Outros

Figura 2.4. Abundância das OTUs identificadas na microbiota associada ao intestino de lagartas de Spodoptera albula, Spodoptera cosmioides, Spodoptera eridania e Spodoptera frugiperda.

S. cosmioides S. albula Intervalo de confiança 95%

Enterococcus I

S. eridania S. albula

Enterococcus I

S. eridania S. cosmioides

Enterococcus II Valor p corrigido p Valor

S. frugiperda S. albula

Enterococcus II

Proporção média (%) Diferença na proporção média (%)

Figura 2.5. Diferença na proporção relativa (%) de OTUs associadas ao trato dige das espécies Spodoptera albula, Spodoptera cosmioides, Spodoptera frugiperda e Spodoptera eridania. Análise comparativa pelo teste de White com correção pelo método de Bonferroni (p≤0,05). 26

NR_113924.1 Enterococcus gallinarum

31 ENT1Sf

ENT1Se 30 70 NR_104560.1 Enterococcus casseliflavus

ENT1Sa

12 KX280776.1 Enterococcus casseliflavus

ENT1Sc

ENT2Sa 78 NR_024905.1 Enterococcus cecorum 84

97 NR_041708.1 Enterococcus columbae 54 NR_042055.1 Enterococcus malodoratus

KX280778.1 Enterococcus mundtii

ENT4Sc

74 ENT4Se

NR_042406.1 Enterococcus termitis

NR_118050.1 Enterococcus plantarum 81 ENT3Sf 57 ENT3Sa 36 ENT3Sc

NR_041893.1 Lactobacillus casei

100 NR_042254.1 Lactobacillus plantarum

0.020

Figura 2.6. Análise filogenética entre as OTUs de Enterococcus associadas ao trato intestinal de Spodoptera albula (Sa), Spodoptera cosmioides (Sc), Spodoptera eridania (Se) e Spodoptera frugiperda (Sf). Os valores nos diferentes ramos correspondem aos valores de bootstrap. A barra de escala indica 0,02 substituições por posição de nucleotídeo.

2.4. Discussão

A análise metagenômica da microbiota intestinal de Spodoptera albula, Spodoptera cosmioides, Spodoptera eridania e Spodoptera frugiperda demonstrou a predominância de bactérias do gênero Enterococcus (Firmicutes), o que também foi relatado em trabalhos com 27

outras espécies desse gênero, como Spodoptera litura (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae) e Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidotera: Noctuidae) (Tang et al., 2012; Shao et al., 2014; Thakur et al., 2016). Apesar da discussão sobre a presença de uma microbiota residente e funcional em Lepidoptera (Staudacher et al., 2016; Hammer et al., 2017), a frequência de alguns grupos bacterianos, como Enterococcaceae (Firmicutes), Clostridiaceae (Firmicutes) e Enterobacteriaceae (Proteobacteria) em estudos envolvendo a microbiota intestinal de lepidópteros sugere a importância funcional da relação de simbiose para essa ordem de insetos (Chen et al., 2016; Voirol et al., 2018) . Enterococcus são onipresentes na natureza, sendo isolados de animais, plantas, água e solo (Palmer et al., 2012; Zhong et al., 2017). Em lepidópteros, esse grupo de bactérias pode estar envolvido tanto em processos metabólicos (Chen et al., 2016) quanto na adaptação de insetos a diferentes plantas hospedeiras, através da cristalização de compostos tóxicos e da produção de biofilmes por exemplo (Shao et al., 2011). Pragas de hábito polífago, as lagartas do gênero Spodoptera em estudo são nativas de áreas neotropicais e neárticas e podem se alimentar de diversas famílias de plantas (Kergoat et al., 2012). De acordo com a análise evolutiva e biogeográfica do gênero (Kergoat et al., 2012), S. albula é mais próxima filogeneticamente de S. eridania, enquanto S. cosmioides é mais próxima de S. frugiperda. A relação filogenética entre as espécies de Spodoptera foi ao encontro dos resultados quanto a diversidade da sua microbiota associada (Figura 2.2). A análise da diversidade da comunidade bacteriana associada a Spodoptera resultou em uma similaridade quanto ao número de OTUs presentes entre as espécies S. albula e S. eridania, e entre S. cosmioides e S. frugiperda. Apesar de composta principalmente por Enterococcus, a diferença entre o comprimento dos ramos entre os filotipos de Enterococcus (Figura 2.6) mostra que, apesar de próximos filogeneticamente, cada população de Spodoptera carrega filotipos únicos, o que pode ser resultado do processo de diversificação decorrente do estabelecimento das associações com os hospedeiros em eventos de especiação, ou, até mesmo, de filosimbiose com a espécie hospedeira (Brucker & Bordenstein, 2011, 2012; Theis et al., 2016). Relações de filosimbiose descrevem a concordância entre a filogenia do hospedeiro e da comunidade microbiana, baseado no grau de taxonomia compartilhada e abundância de membros da comunidade (Brooks et al., 2017) e já foram relatadas em trabalhos envolvendo himenópteros da família Nasonia (Brucker & Bordenstein, 2011) e em espécies de hidras (Franzenburg et al., 2013). Dentre os filotipos identificados no microbioma das espécies de Spodoptera, os mais abundantes são próximos a Enterococcus mundtii, Enterococcus casseliflavus, Enteococcus 28

gallinarum, Enterococcus plantarum, Enterococcus cecorum e Enterococcus columbae, sendo E. mundtii, E. casseliflavus e E. gallinarum já descritos em associação com lepidópteros por outros autores (Xiang et al., 2006; Shao et al., 2014; Mereghetti et al., 2017). E. plantarum, E. cecorum e E. columbae foram inicialmente isolados de plantas e vertebrados, e não há registros na literatura de sua associação com insetos (Zhong et al., 2017). Devido ao tamanho das sequências utilizadas na análise filogenética (450pb) não foi possível classificar filotipos a nível de espécie, mas, somada às evidencias já relatas na literatura, a predominância interespecífica de Enterococcus em acordo com a predição de que espécies próximas apresentariam microbiota semelhante, indica a importância da relação de simbiose entre esse táxon bacteriano e lepidópteros do gênero Spodoptera.

2.5. Conclusão

A microbiota intestinal de lagartas de S. albula, S. cosmioides, S. eridania e S. albula mostrou-se composta majoritariamente por firmicutes do gênero Enterococcus, indicando a importância desse táxon para o gênero Spodoptera. Apesar de filogeneticamente próximas, os filotipos de Enterococcus identificados nessa análise se diferiram a depender da espécie de Spodoptera.

Referências

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3. MICROBIOTA INTESTINAL DE Spodoptera frugiperda (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE): A INFLUÊNCIA DE INSETICIDAS NA SUA DIVERSIDADE E A SELEÇÃO DE BACTÉRIAS METABOLIZADORAS DE INSETICIDAS

Resumo

A simbiose com bactérias pode ter efeito direto na fisiologia e desenvolvimento de insetos e atuar como facilitadora na adaptação a novos nichos. O inseto, junto com sua microbiota associada, adquire características fenotípicas que garantem a sobrevivência frente a fatores de estresse, como em situações de escassez de alimento e exposição a compostos tóxicos. Utilizando como modelo Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) e sua microbiota intestinal associada, esse trabalho teve por objetivo avaliar a influência da pressão de seleção presente no meio agrícola sobre a estrutura, diversidade e aptidão da microbiota intestinal desse inseto. O efeito da pressão de seleção, nesse caso direcionada a resistência à inseticidas, foi avaliado sobre a microbiota associada ao intestino de linhagens de S. frugiperda suscetíveis e resistentes a inseticidas, assim como de populações naturais amostradas em campo. Os experimentos foram conduzidos via análise metagenômica das regiões v3 e v4 do 16S ribossomal (16S rRNA), isolamento e cultivo de bactérias em meio mínimo seletivo e análise da performance dos isolados em múltiplos inseticidas. O grau de exposição a inseticidas influenciou na composição do microbioma de S. frugiperda, assim como na capacidade e potencial de seus membros degradarem inseticidas. Todas as populações de S. frugiperda em estudo demonstraram microbiota composta majoritariamente por bactérias do gênero Enterococcus (Firmicutes). A maioria dos filotipos com capacidade de metabolizar inseticidas, no entanto, foi classificada como Proteobacteria. A microbiota intestinal das populações naturais de S. frugiperda foi mais diversa e uniforme do que aquela das linhagens resistentes selecionadas em laboratório e apresentou maior número de filotipos com capacidade de degradar múltiplos inseticidas. Ainda, grande parte dos filotipos isolados em meio seletivo mostraram-se fixados na microbiota intestinal das populações naturais de S. frugiperda, indicando a importância da relação de simbiose e do possível papel funcional de bactérias desintoxicantes no intestino desse lepidóptero.

Palavras-chave: Desintoxicação; Holobionte; Seleção microbiana; Simbiose

Abstract

Bacterial symbiosis directly affects insect physiology and development, facilitating insect adaption to new environmental conditions. Insects and associated microbiota acquire phenotypic features that guarantee survival against biotic and abiotic stress factors, as in situations of food shortage and exposure to toxic compounds. Using Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) and its associated gut microbiota as a model, we aimed to evaluate the influence of selection pressures on the structure, diversity and fitness of the gut microbiota. We focused our work on inseticide resistant phenotypes of S. frugiperda using inseticides as a source of selection pressure. We thus compared the gut microbiota composition of susceptible and insecticide-resistant strains of S. frugiperda, as well as the microbiota of natural populations sampled in the field. The experiments were conducted through metagenomic analysis of the 16S ribosomal (16S rRNA) regions v3 and v4, isolation 34

and culture of bacteria in selective minimal medium (SMM), and analysis of the growth of isolates in SMM using multiple insecticides as the only source of carbon. The degree of insecticide exposure influenced the composition of the gut microbiota of S. frugiperda, as well as the growth capacity and potential of its members to use the insecticides tested as a source of carbon. In addition, most of the phylotypes isolated in SMM were fixed in the gut microbiota of natural populations of S. frugiperda, indicating the importance of the symbiotic relationships identified and their possible role in the detoxification of inseticides in the host.

Keywords: Detoxification; Holobionte; Microbial selection; Symbiosis

3.1. Introdução

O sucesso evolutivo da classe Insecta, assim como a diversidade e abundância de seus representantes, pode ser atribuído, em parte, à associação a bactérias simbiontes que influenciam diretamente a aptidão biológica de insetos (Engel and Moran, 2013). A associação com bactérias atua como fator de adaptabilidade à planta hospedeira (Frago et al., 2012; Hansen & Moran, 2014) e pode estar relacionada à aptidão bioecológica de pragas polífagas como Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) (Mason et al., 2018). No processo de herbivoria, a relação de simbiose pode estar envolvida na melhor digestão e utilização da fonte de alimento, seja através da disponibilização de nutrientes, digestão de compostos recalcitrantes ou da supressão das defesas da planta (Anand et al., 2010; Chu et al., 2013; Acevedo et al., 2017). Dinâmica e com alta adaptabilidade frente a fatores de estresse, a comunidade microbiana associada a insetos também está sujeita à ação da pressão de seleção em condições naturais, tendo sua composição e aptidão moldada em função de fatores como variações na dieta, escassez de alimento e exposição a compostos tóxicos (Yun et al., 2014; Adair & Douglas, 2017). Quando expostos à pressão de seleção direcionada à resistência a inseticidas, por exemplo, simbiontes podem auxiliar na metabolização e desintoxicação e, em alguns casos, na diminuição da suscetibilidade do hospedeiro a ação tóxica desses compostos (Itoh et al., 2018b). Bactérias com capacidade de degradar inseticidas são onipresentes na natureza, e já foram detectadas em diversas ordens de insetos (Hammer & Bowers, 2015; Itoh et al., 2018). Em Lepidoptera, bactérias isoladas do intestino de Plutella xylostella (Linnaeus) (Lepidoptera: Plutellidae) (Ramya et al., 2016) e de linhagens resistentes de S. frugiperda (Almeida et al., 2017) apresentaram capacidade de degradar inseticidas em testes in vitro. Segundo resultados obtidos por Almeida et al. (2017), populações resistentes de S. frugiperda carregam membros em sua microbiota com capacidade de degradar inseticidas, os quais não 35

estão presentes em populações suscetíveis deste inseto praga. Estaria a comunidade bacteriana associada a esse lepidóptero também respondendo à pressão de seleção direcionada a resistência? Inseto e microbiota estariam, nesse caso, atuando como um holobionte frente a exposição a inseticidas? Utilizando como modelo S. frugiperda e sua microbiota intestinal associada, esse trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da pressão de seleção direcionada a resistência na composição da comunidade bacteriana, assim como na habilidade de seus membros utilizar inseticidas e, dessa forma, influenciar a resposta do hospedeiro a esta condição de estresse. Para isso, avaliamos o efeito da exposição a inseticidas sobre a comunidade bacteriana associada a populações de S. frugiperda resistentes a inseticidas, selecionadas em laboratório e expostas a inseticidas a cada geração, assim como sobre populações naturais desse inseto, submetidas a pressões de seleção multilaterais no campo. Como um holobionte, o microbioma desse lepidóptero poderia estar exercendo um papel fundamental na plasticidade fenotípica do hospedeiro no campo, mediando sua performance através da relação de simbiose.

3.2. Objetivos e predições

O objetivo desse trabalho foi verificar o efeito da exposição a inseticidas na composição e aptidão da microbiota associada ao trato digestivo de S. frugiperda e identificar a associação de bactérias capazes de degradar tais compostos em lagartas de populações naturais, resistentes e suscetíveis dessa espécie praga. Tendo como hipótese o envolvimento da microbiota intestinal na mediação dessa condição de estresse, esse trabalho avaliou as seguintes predições (i) a composição e diversidade da microbiota intestinal associada a lagartas de S. frugiperda suscetíveis e resistentes a inseticidas é diferente, (ii) a exposição de populações naturais a fontes diversas de pressão de seleção no campo resulta em microbiota intestinal mais diversa, (iii) a ocorrência e abundância de bactérias capazes de utilizar inseticidas será maior em insetos expostos a fontes diversas de pressão de seleção, e (iv) os isolados da microbiota intestinal de insetos expostos a diferentes pressões de seleção serão aptos a utilizarem maior diversidade de inseticidas do que aqueles que sofreram seleção direcionada a fontes específicas de inseticidas.

3.3. Material e métodos

3.3.1. Análise metagenômica da microbiota associada ao intestino de linhagens resistentes, suscetíveis e naturais de S. frugiperda

O efeito da pressão de seleção direcionada a resistência na composição e diversidade da comunidade microbiana associada a linhagens resistentes, suscetíveis e naturais de S. frugiperda foi avaliado via análise metagenômica em plataforma Illumina Miseq. Expostas a pressões multilaterais no campo, as populações naturais de S. frugiperda foram coletadas em

áreas de plantio de milho em Goiás (Rio Verde - 17°47′50″S, 50°54′0″W), Minas Gerais (Viçosa - 45′17″S, 42°52′57″W), São Paulo (Piracicaba - 30″S, 47°38′51″W), Paraná (Londrina - 23°17′34″S, 51°10′24″W) e Santa Catarina (São Miguel do Oeste - 26°43′33″S, 53°31′5″W) e se alimentaram de folhas provenientes do local de coleta até a coleta do trato digestivo para o isolamento de bactérias. Linhagens resistentes de S. frugiperda foram disponibilizadas pelo Laboratório de Manejo de Resistência de Artrópodes a Táticas de Controle, Departamento de Entomologia e Acarologia, ESALQ/USP, onde são expostas a cada geração aos produtos químicos para os quais tiveram sua resistência selecionada. As populações foram criadas em dieta artificial (Parra, 1998) em condições controladas (25±2°C; 60±10% UR; fotofase de 14h). Foram utilizadas populações de S. frugiperda resistentes aos inseticidas teflubenzuron (Nascimento, 2018), flubendiamide (Ribeiro, 2014), spinosad (Okuma et al., 2018), lambda-cyhalothrin (Diez-Rodríguez & Omoto, 2001), chlorpyrifos (Carvalho et al., 2013) e à toxina de Bacillus thuringiensis Cry1A.105+Cry2Ab2 (Bernardi et al., 2015). A linhagem suscetível de referência foi utilizada como controle.

3.3.1.1. Extração do DNA genômico, amplificação e sequenciamento da região V3-V4 do gene 16S rRNA

Lagartas de quinto instar foram esterilizadas superficialmente e dissecadas em solução salina (NaCl 0,85%) estéril, em condições assépticas. O experimento ocorreu em triplicata biológica, sendo cada repetição biológica representada por um conjunto de cinco intestinos médios. A extração do DNA genômico (gDNA) foi realizada seguindo protocolo de Gilbert et al. (2007). A integridade e qualidade do material obtido foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 0,8% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídio em tampão TAE (40 mM Tris- 37

acetato, 1 mM EDTA, pH = 8,2) a 90 V (Sambrook & Russel 2001). As amostras foram armazenadas em etanol absoluto a –80°C. O gDNA extraído foi amplificado em reação de PCR das regiões V3-V4 do gene 16S do RNA ribossomal (16S rRNA) em termociclador programado a 94°C por 2 min (1 ciclo); 95°C por 45 s, 55°C por 1 min; 72°C por 1,5 min (32 ciclos); 68°C por 10 min (1 ciclo), e 4°C até o momento da retirada das amostras do equipamento. Foram utilizados 20-40 ng de DNA genômico, tampão da enzima (1x), 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, e 0,625 U de Taq polimerase (PCRBIO Hifi Polymerase), 0,2 µM de cada um dos iniciadores universais empregados (iniciador senso: 5'TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCT ACGGGNGGCWGCAG; iniciador reverso: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAA GAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC), em reação com volume final de 25 µL. A eficiência de amplificação do amplicon desejado foi verificada por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, seguindo procedimento padrão (Sambrook & Russel 2001). Os amplicons obtidos foram enviados ao Centro Multiusuário de Biotecnologia Agrícola, Departamento Zootecnia, ESALQ/USP, onde foi realizada reação de amplificação com o produto comercial Nextera XT (Illumina) para a adição de indexadores e adaptores Illumina, a purificação dos produtos de amplificação com o auxílio do produto comercial Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter Genomics), e a quantificação e sequenciamento em plataforma Illumina MiSeq, seguindo protocolo paired-end (2x250).

3.3.1.2. Análise das sequências

A análise das sequências foi realizada utilizando-se das ferramentas disponíveis no software QIIME2 (Caporaso et al., 2010). As leituras obtidas foram separadas com base em sua sequência codificadora e submetidas a trimagem para a remoção dos iniciadores e a filtros de qualidade. O controle de qualidade foi realizado com base na pipeline DADA2 (Callahan et al., 2016), a fim de remover sequências quiméricas e de baixa qualidade (Phred Quality Score > 30). As sequências obtidas foram alinhadas contra as sequências disponíveis no banco de dados do Silva128 (Quast et al., 2013) pelo método PyNAST (Caporaso et al., 2010) e classificadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) pelo método “UCLUST” (Edgar, 2010), considerando 97% como valor limite de similaridade. Sequências com menos de 1% de abundância foram agrupadas e denominadas “outros” para a representação dos dados obtidos. Sequências relativas a cloroplastos e mitocôndrias não foram contabilizadas na análise. 38

As OTUs obtidas foram submetidas à análise de diversidade alfa pelos índices de Shannon, Faith e Pielou. Curvas de rarefação foram utilizadas para verificar a qualidade do esforço amostral na profundidade de 2.672 leituras. A estrutura e diversidade da comunidade microbiana associada às diferentes amostras de S. frugiperda analisadas foram comparadas através dos índices de diversidade beta de Jaccard e da análise Unifrac ponderada e não ponderada. A análise UniFrac permite verificar a distância filogenética entre as bactérias presentes nas diferentes comunidades, enquanto a análise ponderada permite incluir a abundância de cada entidade sistemática na análise da diversidade da composição da comunidade de microrganismos associados ao intestino das populações em estudo. As matrizes de distância de Jaccard e Unifrac foram utilizadas como base para a análise do agrupamento hierárquico com UPGMA (“Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean”) e das coordenadas principais (“Principal Coordinate Analysis” - PCoA) da diversidade beta. A análise estatística da diversidade alfa e beta foi conduzida no QIIME2 através do teste não paramétrico de análise de variância Kruskal Wallis e do teste de Permanova, ambos considerando p≤0,05 como significativo. As análises comparativas ao nível taxonômico foram conduzidas no software STAMP (“Statistical Analysis of Metagenomic Profiles”) (Parks et al., 2014), utilizando o teste não paramétrico de White combinado com o método Bonferroni, para o cálculo dos intervalos de confiança com cobertura nominal de 95%.

3.3.2. Isolamento, cultivo e caracterização molecular de bacterias associadas ao intestino médio de S. frugiperda com capacidade de utilizar inseticida como única fonte de carbono

3.3.2.1. Isolamento e cultivo

Lagartas de S. frugiperda de quinto instar foram dissecadas para obtenção do intestino médio e posterior isolamento de bactérias capazes de crescer em meio mínimo seletivo, contendo inseticida como única fonte de carbono. Para esse experimento, foram utilizadas as populações naturais descritas anteriormente (item 3.3.1), assim como a linhagem de S. frugiperda suscetível e as linhagens resistentes aos inseticidas flubendiamide, chlorantraniliprole, spinosad e teflubenzuron. Após a esterilização superficial das lagartas em solução de hipoclorito de sódio a 0,5% em etanol a 70% e banhos com água destilada estéril, a coleta do intestino médio das lagartas 39

ocorreu em condições assépticas utilizando solução salina estéril (0,85% NaCl). Para cada tratamento foram utilizados 10 intestinos, os quais foram macerados com auxílio de pistilo estéril em solução salina na proporção de 1:1 (1 mL de solução salina para cada intestino). O inóculo foi cultivado em meio mínimo M9 estéril (Sambrook & Russel, 2001) enriquecido com 10 µg/mL do inseticida ao qual cada linhagem teve sua resistência selecionada diluído em 0,1% do surfactante Tween 20 (v/v). No tratamento controle (linhagem suscetível), o isolamento da microbiota associada foi realizado em seis diferentes ensaios, utilizando os inseticidas lufenuron, teflubenzuron, flubendiamide, chlorantraniliprole, spinosad e indoxacarb como fonte de carbono. O material foi incubado a 28°C sob agitação constante a 120 rpm e a avaliação foi realizada após 5, 7 e 10 dias do inóculo inicial, quando aliquotas em diferentes diluições (1/10, 1/100 e 1/1000) foram plaqueadas no meio mínimo seletivo contendo ágar. O experimento foi conduzido em triplicata, no qual cada frasco de cultivo e placa inoculada foi considerada uma repetição. As colônias obtidas foram morfotipadas de acordo com a cor, formato, tamanho e brilho. Pelo menos três clones de cada morfotipo foram reisolados para posterior caracterização molecular. Para o isolamento da microbiota das populações naturais, lagartas obtidas a campo foram sujeitas aos mesmos procedimentos descritos anteriormente, sendo, no entanto, com três repetições compostas por 10 lagartas cada. O crescimento bacteriano em cada uma das repetições foi testado, assim como no tratamento com lagartas suscetíveis, utilizando seis diferentes fontes de carbono (lufenuron, teflubenzuron, flubendiamide, chlorantraniliprole, spinosad ou indoxacarb). As populações provenientes do campo, até serem dissecadas, foram alimentadas com folhas de milho provenientes do seu local de coleta. Após inóculo em meio mínimo M9 estéril enriquecido com 10 µg/mL do inseticida diluído em 0,1% do surfactante Tween 20 (v/v), o material foi incubado a 28°C sob agitação constante a 120 rpm e a avaliação do crescimento bacteriano foi realizada no quinto dia após o inóculo inicial.

3.3.2.2. Caracterização molecular

Os morfotipos selecionados foram caracterizados pela análise de PCR-RFLP de fragmento do gene 16S do RNA ribossomal (16S rRNA). Para isto, três isolados de cada morfotipo foram cultivados em meio nutritivo TSB por 16 h a 28°C, sob agitação constante de 120 rpm. O DNA genômico (gDNA) foi obtido seguindo o protocolo de Sunnucks & Hale (1996) e a sua qualidade e integridade foi verificada seguindo procedimento padrão 40

(Sambrook & Russel, 2001). Quando necessário, as amostras foram submetidas ao tratamento com RNAse A (Thermo Scientific), seguindo as recomendações do fabricante. As amplificações do 16S rRNA foram conduzidas em termociclador programado a 95°C por 4 min (1 ciclo); 95°C por 1 min, 55°C por 1 min; 72°C por 2 min (35 ciclos); 72°C por 10 min (1 ciclo), em reação com volume final de 25 µL. As amostras foram mantidas a 4°C até o momento da retirada do termociclador. Foi utilizado 40-50 ng de DNA genômico, tampão da enzima (1x), 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,32 µM de cada um dos iniciadores universais 8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') e 1491R (5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3') (Weisburg et al., 1991) e 0,625 U de Taq polimerase (Promega). Os amplicons foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose a 1,5% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídio em tampão TAE e visualizados em transluminador UV acoplado a fotodocumentador (DNR Bioimaging Systems). A fim de selecionar os amplicons a serem sequenciados, foi realizada a análise de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP), via digestão com as enzimas Hinf, EcoI, Rsa e DdeI (Promega). Uma alíquota de 4 µL de cada produto de PCR foi digerida em mistura de reação de 10 µL (0,5 µL da enzima, 1 µL de tampão e 4,5 µL de água), adequada de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, a reação foi incubada a 37°C por 16 h, e os produtos da digestão foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% a 100V. O tamanho dos fragmentos de restrição foi estimado com auxilio do programa GelQuant (DNR Bio-Imaging Systems Ltd.), utilizando o marcador molecular 100 pb DNA Ladder (Invitrogen) como referência. Amostras do mesmo morfotipo e padrão de restrição foram agrupadas, sendo três isolados de cada grupo selecionados e enviados para sequenciamento. Os amplicons foram purificados com as enzimas exonuclease e fosfatase alcalina a fim de eliminar resíduos de iniciadores e dNTPs. Em um volume de 10 µL do produto de PCR foram acrescentados 1 U de exonuclease (Promega) e 1 U de fosfatase alcalina (Promega). A reação ocorreu em termociclador programado a 37°C por 30 min e 80°C por 15 min. As amostras purificadas foram submetidas ao sequenciamento bidirecional junto à empresa Myleus Biotechnology e as sequências obtidas utilizadas em buscas heurísticas contra sequencias disponíveis nos bancos de dados do “National Center for Biotechnology” (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) e do EzTaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/), a fim de realizar a identificação putativa dos isolados obtidos. As sequências do 16S rDNA obtidas foram visualizadas no programa FinchTV v1.4.0 (Geospiza Inc.) e montadas com auxilio da ferramenta Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). As sequências completas foram 41

alinhadas com a ferramenta ClustalW disponível no programa MEGA X (Kumar et al., 2018), onde também foi conduzida a análise evolutiva dos isolados em estudos. Isolados que compartilharam mais de 99,5% de similaridade em análises par a par dentro de uma mesma população foram agrupadas e a sequência mais longa selecionada como representativa do filotipo. A história evolutiva dos filotipos selecionados foi inferida pelo método de máxima verossimilhança, utilizando modelo de substituição geral reversível no tempo (Tavaré, 1986), com distribuição gamma com 2 parâmetros e posições invariantes, resultante da análise do critério de informação Bayesiana (“Bayesian information criterion” - BIC) e do critério de informação de Akaike (“Akaike information criterion” – AIC), assim como implementados no MEGA. O suporte da análise filogenética gerada foi avaliado através de análise de bootstrap com 500 iterações.

3.3.3. Determinação da capacidade de crescimento da microbiota associada a S. frugiperda em múltiplos inseticidas

Após sequenciamento, identificação putativa e análise filogenética, os isolados foram classificados em filotipos de acordo com seu posicionamento sistemático e população do qual foi isolado. Um isolado de cada filotipo foi selecionado aleatoriamente para a análise da capacidade de crescimento em múltiplos inseticidas. Ainda, foram adicionados à análise cinco filotipos presentes no banco de bactérias do Laboratório de Interações em Insetos, ESALQ/USP, obtidos de populações de S. frugiperda resistentes aos inseticidas deltametrina, chlorpiryfos, lufenuron, deltametrina e spinosad (Almeida et al., 2017). Os isolados selecionados foram cultivados em meio nutritivo TSB até atingirem a concentração de 106 unidades formadoras de colônia (UFC)/mL, quando foram utilizados para a análise da curva de crescimento. A concentração do inóculo foi padronizada com base na absorbância em espectrofotômetro, utilizando 600 nm de comprimento de onda eletromagnética

(Abs600=0,450) e posterior determinação do número de células bacterianas pela técnica de microcolônias (Sambrook & Russel, 2001). Após uma sequência de lavagens e ressuspensões em meio M9 estéril para a remoção de qualquer traço de nutrientes de TSB, a suspensão bacteriana foi inoculada em meio M9 estéril acrescido de inseticida e do surfactante Tween 20 a 0,1% (v/v), na concentração final de 104 UFC/mL. A concentração do inseticida no meio foi padronizada de acordo com o número de moléculas do composto (indoxacarb, flubendiamide, chlorantraniliprole, lufenuron, teflubenzuron, spinosad, chlorpyrifos, deltametrina ou lambda-cyhalothrin), sendo adicionado 42

2 x 10-5 mol/L de cada inseticida por meio. A curva de crescimento dos isolados nos diferentes inseticidas foi obtida em espectrofotômetro Epoch TM com base na leitura da absorbância (Abs600) a cada 1 hora. O cultivo das bactérias nos diferentes meios ocorreu em microplaca a 28°C sob agitação constante a 120 rpm por 48 h. A performance dos isolados foi avaliada com base no valor máximo de absorbância durante o período (48 h) de cultivo.

3.4. Resultados

3.4.1. Análise metagenômica

O sequenciamento das bibliotecas metagenômicas das regiões V3-V4 do 16S rRNA da microbiota associada ao intestino de linhagens de S. frugiperda resistentes e suscetível a inseticidas, assim como de populações naturais coletadas a campo, gerou um total de 5.872.219 leituras, com uma média de 163.117 leituras por amostra. Após passar por filtros de qualidade, o número total de leituras válidas foi 351.881 leituras, com um comprimento médio de 244 pb. As curvas de rarefação e o índice de diversidade de Shannon tendendo à assíntota, demonstraram que a amostragem foi adequada para a cobertura da riqueza da comunidade (Figura 3.1). Com a amostragem de aproximadamente 1000 sequências, não houve incremento de OTUs inéditas ou de diversidade.

60 6

SFRR_Spin SFRR_Spin 50 5 SFRR_Chlp SFRR_Chlp

SFRR_Lbda SFRR_Lbda 40 4 SFRR_Flu SFRR_Flu

SFRR_Tef SFRR_Tef 30 3

observadas SFRR_Cry SFRR_Cry Shannon Shannon SFMG SFMG OTUs OTUs observadas 20 2 SFSP SFSP OTUs OTUs

SFPR SFPR 10 1 SFSC SFSC

SFGO SFGO 0 0 SFSS SFSS 0 297 594 891 1188 1484 1781 2078 2375 2672 0 297 594 891 1188 1484 1781 2078 2375 2672 Sequências por amostras Sequências por amostra Sequências por amostra Sequências por amostra

Figura 3.1. Número de OTUs observadas (A) e índice de diversidade de Shannon (B) da microbiota intestinal de populações naturais de Spodoptera frugiperda e de linhagens resistentes e suscetível a inseticidas, selecionadas em laboratório. Populações naturais de S. frugiperda coletadas em MG, SP, PR, SC e GO e linhagens suscetível e resistentes aos inseticidas spinosad, chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, flubendiamide, teflubenzuron e à toxina Cry1A.105+Cry2Ab2. 43

A equabilidade e a distância sistemática das OTUs associadas às diferentes populações de S. frugiperda foi avaliada pelos índices de Pielou (J) e Faith, e comparadas através do teste não paramétrico de variância Kruskal Wallis (Tabela 3.1). Dentre as populações de laboratório, as populações de S. frugiperda resistentes ao flubendiamide, chlorpyrifos e spinosad foram as que mais se destacaram das demais e as únicas que apresentaram diferença em relação à população suscetível. Em comparação com a população suscetível, lagartas resistentes ao flubendiamide apresentaram menor índice J (H=3,857, p=0,0495, q= 0,260), o que indica microbiota intestinal com OTUs distribuídas de forma menos uniforme (ANEXO A). As populações resistentes aos inseticidas chlorpyrifos e spinosad, todavia, se diferenciaram quanto a proximidade sistemática das OTUs dentro de cada comunidade. Lagartas de S. frugiperda resistentes a spinosad apresentaram microbiota mais diversa (H=3,857, p=0,0495, q= 0,116), enquanto a microbiota oriunda da linhagem resistente a chlorpyrifos mostrou-se associada a OTUs sistematicamente mais próximas entre si (H=3,857, p=0,0495, q= 0,116) (ANEXO B). Populações naturais de S. frugiperda se diferiram das linhagens de laboratório quanto a diversidade de OTUs dentro de cada comunidade. Em relação a equabilidade da microbiota intestinal, lagartas coletadas em Santa Catarina e Goiás apresentaram o maior índice J (0,90 e 0,91) e se diferenciaram estatisticamente das linhagens de S. frugiperda resistentes ao inseticida flubendiamide e da linhagem suscetível, assim como das populações de S. frugiperda coletadas em Minas Gerais e São Paulo. Não houve diferença quanto a distância sistemática entre as OTUs associadas às populações de campo (2,04 a 2,72), a qual foi menor que a encontrada na microbiota das linhagens de S. frugiperda suscetível (3,60) e resistentes a spinosad (6,52) e flubendiamide (3,64), e maior que na linhagem resistente ao chlorpyrifos (1,36). Os índices de diversidade beta de Jaccard, Bray-Curtis e Unifrac ponderado e não ponderado foram utilizados para comparar a estrutura e diversidade da comunidade microbiana associada às diferentes populações de S. frugiperda, avaliando, respectivamente, o número, abundância e filogenia das OTUs em cada microbiota. A análise do índice de Jaccard mostrou alta similaridade entre a microbiota de linhagens de S. frugiperda resistentes ao teflubenzuron e chlorpyrifos, assim como em uma das repetições de S. frugiperda resistente à proteína Cry1A.105+Cry2Ab2 (Figura 3.2a). Na análise do índice de Bray-Curtis (Figura 3.2b), todavia, houve distanciamento das repetições relacionadas à linhagem resistente ao spinosad frente aos demais tratamentos. Ainda, as linhagens agrupadas anteriormente pelo índice de Jaccard mantiveram-se próximas, sendo possível notar similaridade entre a 44

linhagem resistente ao flubendiamide e aquelas resistentes ao piretróide lambda-cyhalothrin e à proteína Cry1A.105+Cry2Ab2.

Tabela 3.1: Populações e linhagens de Spodoptera frugiperda que apresentaram diferenças significativas quanto a equabilidade (Índice de Pielou) e/ou distância sistemática entre as OTUs bacterianas associadas. Médias comparadas pelo método de Kruskal Wallis considerando p ≤ 0,05 como significativo.

Grupo1 Grupo2 H p q Índice de Pielou SFRR_Flu SFRR_Chlp 3,8571 0,0495 0,2601 SFRR_Flu SFRR_Spin 3,8571 0,0495 0,2601 SFRR_Flu SFRR_Tef 3,8571 0,0495 0,2601 SFRR_Flu SFSS 3,8571 0,0495 0,2601 SFGO SFRR_Flu 3,8571 0,0495 0,2043 SFGO SFSS 3,8571 0,0495 0,2043 SFMG SFRR_Chlp 3,8571 0,0495 0,2043 SFMG SFRR_Flu 3,8571 0,0495 0,2043 SFMG SFRR_Tef 3,8571 0,0495 0,2043 SFPR SFRR_Flu 3,8571 0,0495 0,2043 SFSC SFRR_Flu 3,8571 0,0495 0,2043 SFSP SFRR_Flu 3,8571 0,0495 0,2043 SFMG SFGO 3,8571 0,0495 0,1238 SFMG SFPR 3,8571 0,0495 0,1238 SFMG SFSC 3,8571 0,0495 0,1238 SFSC SFSP 3,8571 0,0495 0,1238 Índice de Faith SFRR_Chlp SFRR_Cry 3,8571 0,0495 0,1156 SFRR_Chlp SFRR_Flu 3,8571 0,0495 0,1156 SFRR_Chlp SFRR_Lbda 3,8571 0,0495 0,1156 SFRR_Chlp SFRR_Spin 3,8571 0,0495 0,1156 SFRR_Chlp SFSS 3,8571 0,0495 0,1156 SFRR_Spin SFRR_Cry 3,8571 0,0495 0,1156 SFRR_Spin SFRR_Lbda 3,8571 0,0495 0,1156 SFRR_Spin SFRR_Tef 3,8571 0,0495 0,1156 SFRR_Spin SFSS 3,8571 0,0495 0,1156 SFGO SFRR_Chlp 3,8571 0,0495 0,1486 SFGO SFRR_Spin 3,8571 0,0495 0,1486 SFMG SFRR_Chlp 3,8571 0,0495 0,1486 SFMG SFRR_Flu 3,8571 0,0495 0,1486 SFMG SFRR_Spin 3,8571 0,0495 0,1486 SFMG SFSS 3,8571 0,0495 0,1486 SFPR SFRR_Chlp 3,8571 0,0495 0,1486 SFPR SFRR_Spin 3,8571 0,0495 0,1486 SFSC SFRR_Chlp 3,8571 0,0495 0,1486 SFSC SFRR_Spin 3,8571 0,0495 0,1486 SFSP SFRR_Spin 3,8571 0,0495 0,1486

Quando incorporada a relação filogenética entre as OTUs, houve distanciamento da linhagem de S. frugiperda resistente ao spinosad em relação às demais, o que também ocorreu com a linhagem resistente ao flubendiamide (Figura 3.3a). Na análise ponderada, todavia, as linhagens selecionadas em laboratório se agruparam, com exceção da resistente ao spinosad (Figura 3.3b). Apesar da distância sistemática indicada pela análise Unifrac não ponderada, a alta similaridade entre as amostras quando é incorporada a abundância relativa dos táxons sugere a presença majoritária de OTUs que são comuns ao intestino das diferentes populações S. frugiperda. A análise da diversidade beta da comunidade microbiana associada às populações naturais de S. frugiperda pelos índices de Jaccard, Bray-Curtis e Unifrac não geraram agrupamento evidente entre os tratamentos, demonstrando uma comunidade microbiana diversa, com diferentes graus de riqueza e abundância de OTUs a depender do local de coleta (ANEXO C).

A B

Figura 3.2. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) a partir da matriz de distância gerada pelo índice de diversidade beta de Jaccard (A) e de Bray-Curtis (B) da diversidade da comunidade microbiana associada a populações de Spodoptera frugiperda resistentes e suscetíveis a inseticidas, selecionadas em laboratório. Lagartas de Spodoptera frugiperda suscetíveis e resistentes aos inseticidas teflubenzuron, spinosad, lambda-cyhalothrin, flubendiamide, chlorpyrfos e à toxina Cry1A.105+Cry2Ab2. 46

A B

Figura 3.3. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) a partir de matrizes de distâncias geradas pelo índice de diversidade beta Unifrac ponderado (A) e não ponderado (B) da diversidade da comunidade microbiana associada a populações de Spodoptera frugiperda resistentes e suscetível a inseticidas, selecionadas em laboratório. Lagartas de Spodoptera frugiperda suscetíveis e resistentes aos inseticidas teflubenzuron, spinosad, lambda- cyhalothrin, flubendiamide, chlorpyrifos e à toxina Cry1A.105+Cry2Ab2.

A comparação das sequências obtidas na análise metagenômica contra o banco de dados SILVA 128, classificou as OTUs como representantes dos filos Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria e Bacterioidetes. A comunidade microbiana associada às linhagens de S. frugiperda resistentes e suscetível a inseticidas, selecionadas em laboratório, mostrou-se composta majoritariamente por Firmicutes, com um total de 94% das leituras atribuídas a esse filo (Figura 3.4). Dentre as linhagens selecionadas em laboratório, as que apresentaram maior número de OTUs associadas foram a linhagem suscetível a inseticidas e aquelas resistentes a spinosad e ao piretroide lambda-cyhalothrin, com 15 OTUs em cada. A família Enterococcaceae foi a que mais se destacou dentre a microbiota das linhagens de S. frugiperda resistentes e suscetível a inseticidas, presente em 89% da microbiota associada à população suscetível e em, pelo menos, 75% da comunidade microbiana associada às linhagens de S. frugiperda resistentes. A linhagem de S. frugiperda resistente a spinosad foi a que a apresentou maior proporção relativa de Proteobacteria (23%), representadas principalmente por bactérias da família Enterobacteriaceae (γ-Proteobacteria). Com a microbiota menos diversa dentre as linhagens resistentes, a linhagem de S. frugiperda 47

resistente ao teflubenzuron teve 99,27% da sua comunidade microbiana classificada como bactérias do gênero Enteroccocus (Enteroccocaceae). A composição da microbiota associada às populações naturais de S. frugiperda não diferiu em relação àquela encontrada nas linhagens de laboratório quanto ao número de OTUs associadas, variando, todavia, em função da abundância relativa de cada táxon. Dentre as leituras obtidas na análise metagenômica, 74% foram classificadas como Firmicutes, 18% como Proteobacteria e 2% como Actinobacteria e Bacterioidetes (Figura 3.5). Quanto ao número de OTUs associadas, a população de S. frugiperda coleta em Goiás foi a mais diversa, com 29 OTUs, seguida das obtidas em Santa Catarina e Paraná, com 17 OTUs cada, em Minas Gerais, com 12, e em São Paulo, com 9 OTUs associadas. Em relação à frequência e abundância nas diferentes populações naturais, as famílias de bactérias que mais se destacaram foram Enterococcaceae, Erysipelotrichaceae e Enterobacteriaceae.

chlorp cry flubend lambda spin sus teflu 100

OTUs Actinobacteria_Cellulomonas Proteobacteria_Acinetobacter Actinobacteria_Micrococcus Proteobacteria_Burkholderia 75 Actinobacteria_Propionibacterium Proteobacteria_Delftia Actinobacteria_Quadrisphaera Proteobacteria_Enterobacter Actinobacteria_Rubrobacter Proteobacteria_Enterobacteriaceae_und Bacteria_und Proteobacteria_Hydrogenophilus Bacteroidetes_Bergeyella Proteobacteria_Methylobacterium 50 Firmicutes_Enterococcus Proteobacteria_Ochrobactrum

Proporção Firmicutes_Erysipelatoclostridium Proteobacteria_Paracoccus Firmicutes_Ruminococcaceae_und Proteobacteria_Pseudomonas Firmicutes_Streptococcus Proteobacteria_Sphingomonas Firmicutes_Turicibacter Proteobacteria_Stenotrophomonas 25 Outros Proteobacteria_Vibrio Proteobacteria_Acetobacter Proteobacteria_Vulcaniibacterium GoiásGoiás Minas Minas Gerais Gerais ParanáParaná SantaSanta Catarina Catarina São São Paulo Paulo Proteobacteria_Achromobacter Thaumarchaeota_und 100100

0 chlorp cry flubend lambda spin sus teflu 100

Goiás Minas Gerais Paraná Santa Catarina São Paulo OTUs 100 OTUsOTUs Actinobacteria_Cellulomonas Proteobacteria_Acinetobacter 75 75 Figura 3.4. Análise taxonômica da comunidadeActinobacteria_Corynebacterium1Actinobacteria_Corynebacterium1 microbiana associadaFirmicutes_TuricibacterFirmicutes_Turicibacter a populações de Actinobacteria_Micrococcus Proteobacteria_Burkholderia Actinobacteria_GlutamicibacterActinobacteria_Glutamicibacter Firmicutes_Tyzzerella3Firmicutes_Tyzzerella3 75 Actinobacteria_Propionibacterium Proteobacteria_Delftia Spodoptera frugiperda suscetíveis e resistentesActinobacteria_LeucobacterActinobacteria_Leucobacter a inseticidas, selecionadasFirmicutesFirmicutes _und _und em laboratório. OTUs Actinobacteria_Quadrisphaera Proteobacteria_Enterobacter 75 A Actinobacteria_MicrobacteriumActinobacteria_Microbacterium OutrosOutros

Actinobacteria_Rubrobacter Proteobacteria_Enterobacteriaceae_und Classificação putativa da microbiota intestinalActinobacteria_RhodococcusActinobacteria_Rhodococcus da população Proteobacteria_Acinetobacter deProteobacteria_Acinetobacter Spodoptera frugiperda Bacteria_und Proteobacteria_Hydrogenophilus Actinobacteria_TimonellaActinobacteria_Timonella Proteobacteria_Brucellaceae_undProteobacteria_Brucellaceae_und suscetível (sus) e de linhagens resistentes aosBacteroidetes_BergeyellaBacteria_und inseticidas chlorpyrifosProteobacteria_EnterobacterProteobacteria_Methylobacterium (chlp), flubendiamide 5050 50 Bacteria_und Proteobacteria_Enterobacter Proporção Proporção

Proporção Firmicutes_Enterococcus Proteobacteria_Ochrobactrum 50 Bacteroidetes_SphingobacteriumBacteroidetes_Sphingobacterium Proteobacteria_Enterobacteriaceae_undProteobacteria_Enterobacteriaceae_und Proporção (flubend), lambda-cyhalothrin (lambda), Firmicutes spinosadFirmicutes_ErysipelatoclostridiumFirmicutes _Bacillus _Bacillus (spin), teflubezuronProteobacteria_KlebsiellaProteobacteria_KlebsiellaProteobacteria_Paracoccus (teflu) e à toxina Firmicutes_EnterococcusFirmicutes_Ruminococcaceae_undFirmicutes_Enterococcus Proteobacteria_OchrobactrumProteobacteria_OchrobactrumProteobacteria_Pseudomonas Cry1A.105+Cry2Ab2, em unidades taxonômicasFirmicutes_ErysipelatoclostridiumFirmicutes_StreptococcusFirmicutes_Erysipelatoclostridium operacionais (OTUs).Proteobacteria_PseudomonasProteobacteria_PseudomonasProteobacteria_Sphingomonas Firmicutes_TuricibacterFirmicutes_Erysipelotrichaceae_und Proteobacteria_RizhobiumProteobacteria_Stenotrophomonas 2525 Firmicutes_Erysipelotrichaceae_und Proteobacteria_Rizhobium Firmicutes_Lactobacillales_undOutrosFirmicutes_Lactobacillales_und Proteobacteria_SerratiaProteobacteria_SerratiaProteobacteria_Vibrio 2525 Firmicutes_PaenibacillusProteobacteria_AcetobacterFirmicutes_Paenibacillus Proteobacteria_StenotrophomonasProteobacteria_StenotrophomonasProteobacteria_Vulcaniibacterium Proteobacteria_Achromobacter Thaumarchaeota_und

0 0

0 0 chlorp cry flubend lambda spin sus teflu 100

Proporção Firmicutes_Erysipelatoclostridium Proteobacteria_Paracoccus Firmicutes_Ruminococcaceae_und Proteobacteria_Pseudomonas Firmicutes_Streptococcus Proteobacteria_Sphingomonas Firmicutes_Turicibacter Proteobacteria_Stenotrophomonas 25 48 Outros Proteobacteria_Vibrio Proteobacteria_Acetobacter Proteobacteria_Vulcaniibacterium GoiásGoiás Minas Minas Gerais Gerais ParanáParaná SantaSanta Catarina Catarina São São Paulo Paulo Proteobacteria_Achromobacter Thaumarchaeota_und 100100

Goiás Minas Gerais Paraná Santa Catarina São Paulo 1000 chlorp cry flubend lambda spin sus teflu 100

Goiás Minas Gerais Paraná Santa Catarina São Paulo OTUs 100 OTUsOTUs Actinobacteria_Cellulomonas Proteobacteria_Acinetobacter 75 OTUs 75 Actinobacteria_Corynebacterium1Actinobacteria_Corynebacterium1 Firmicutes_TuricibacterFirmicutes_Turicibacter 75 Actinobacteria_Corynebacterium1Actinobacteria_MicrococcusFirmicutes_Turicibacter Proteobacteria_Burkholderia Actinobacteria_GlutamicibacterActinobacteria_Glutamicibacter Firmicutes_Tyzzerella3Firmicutes_Tyzzerella3 75 Actinobacteria_GlutamicibacterActinobacteria_PropionibacteriumFirmicutes_Tyzzerella3 Proteobacteria_Delftia Actinobacteria_Leucobacter Firmicutes _und OTUs Actinobacteria_LeucobacterActinobacteria_Leucobacter FirmicutesFirmicutes _und _und 75 Actinobacteria_MicrobacteriumActinobacteria_QuadrisphaeraOutros Proteobacteria_Enterobacter A Actinobacteria_MicrobacteriumActinobacteria_Microbacterium OutrosOutros Actinobacteria_Rhodococcus Proteobacteria_Acinetobacter

Actinobacteria_Rubrobacter Proteobacteria_Enterobacteriaceae_und Actinobacteria_TimonellaActinobacteria_RhodococcusActinobacteria_RhodococcusProteobacteria_Brucellaceae_und Proteobacteria_AcinetobacterProteobacteria_Acinetobacter Bacteria_und Proteobacteria_Hydrogenophilus 50 Bacteria_undActinobacteria_TimonellaProteobacteria_Enterobacter Proteobacteria_Brucellaceae_und Proporção Actinobacteria_Timonella Proteobacteria_Brucellaceae_und Bacteroidetes_SphingobacteriumBacteroidetes_BergeyellaProteobacteria_Enterobacteriaceae_und Proteobacteria_Methylobacterium 50 Bacteria_und Proteobacteria_Enterobacter 50 50 FirmicutesBacteria_und _Bacillus Proteobacteria_Klebsiella Proteobacteria_Enterobacter Proporção Proporção

Proporção Firmicutes_Enterococcus Proteobacteria_Ochrobactrum 50 Firmicutes_EnterococcusBacteroidetes_SphingobacteriumBacteroidetes_SphingobacteriumProteobacteria_Ochrobactrum Proteobacteria_Enterobacteriaceae_undProteobacteria_Enterobacteriaceae_und Proporção Firmicutes_ErysipelatoclostridiumFirmicutesFirmicutes_ErysipelatoclostridiumFirmicutes _Bacillus _BacillusProteobacteria_Pseudomonas Proteobacteria_KlebsiellaProteobacteria_KlebsiellaProteobacteria_Paracoccus Firmicutes_Erysipelotrichaceae_und Proteobacteria_Rizhobium Firmicutes_Ruminococcaceae_undFirmicutes_Enterococcus Proteobacteria_OchrobactrumProteobacteria_Pseudomonas Firmicutes_Lactobacillales_undFirmicutes_EnterococcusProteobacteria_Serratia Proteobacteria_Ochrobactrum 25 Firmicutes_PaenibacillusFirmicutes_ErysipelatoclostridiumFirmicutes_StreptococcusFirmicutes_ErysipelatoclostridiumProteobacteria_Stenotrophomonas Proteobacteria_PseudomonasProteobacteria_PseudomonasProteobacteria_Sphingomonas Firmicutes_TuricibacterFirmicutes_Erysipelotrichaceae_und Proteobacteria_RizhobiumProteobacteria_Stenotrophomonas 2525 Firmicutes_Erysipelotrichaceae_und Proteobacteria_Rizhobium Firmicutes_Lactobacillales_undOutrosFirmicutes_Lactobacillales_und Proteobacteria_SerratiaProteobacteria_SerratiaProteobacteria_Vibrio 2525 Firmicutes_PaenibacillusProteobacteria_AcetobacterFirmicutes_Paenibacillus Proteobacteria_StenotrophomonasProteobacteria_StenotrophomonasProteobacteria_Vulcaniibacterium

0 Proteobacteria_Achromobacter Thaumarchaeota_und

0 Figura0 3.5. Análise taxonômica da comunidade microbiana associada a populações naturais

0 0 de Spodoptera frugiperda. Classificação putativa da microbiota intestinal de populações de Spodoptera frugiperda coletadas nos estados de Goiás, Minas Gerais, Paraná, Santa Catarina e São Paulo, em unidades taxonômicas operacionais (OTUs).

Análises comparativas a nível taxonômico conduzidas no software STAMP indicaram diferença significativa entre a linhagem de S. frugiperda suscetível e aquelas resistentes a inseticidas. Segundo os testes estatísticos de White e Bonferroni, a proporção de bactérias do gênero Propionibacterium foi maior em lagartas de S. frugiperda suscetíveis a inseticidas (Figura 3.6). Na análise comparativa da microbiota das populações naturais de S. frugiperda, apenas a microbiota de lagartas coletadas no Paraná apresentou diferença em relação as demais (Figura 3.7), em função da abundância relativa de bactérias da família Lachnospiraceae que, dentre as populações naturais de S. frugiperda, só não foi associada a lagartas coletadas no estado de São Paulo.

S. frugiperda PR S. frugiperda MG SC GO SP Intervalo de confiança 95%

Lachnospiraceae

Proporção média (%) Diferença na proporção média (%) corrigido p

Figura 3.6. Diferença na proporção relativa (%) de OTUs associadas ao trato digestivo de populações de S. frugiperda suscetível e resistente a inseticidas. A microbiota associada de lagartas S. frugiperda suscetível a inseticidas apresentou uma proporção estatisticamente maior de bactérias do gênero Propionibacterium do que aquelas com resistência a inseticidas. 49

S. frugiperda suscetivel S.frugiperda resistentes Intervalo de confiança 95% Propionibacterium

Proporção média (%) Diferença na proporção média (%) corrigido p

Figura 3.7. Diferença na proporção relativa (%) de OTUs associadas ao trato digestivo de populações de naturais S. frugiperda. A comunidade microbiana associada às lagartas coletadas no Paraná foi a única que se diferiu das demais, com maior proporção de bactérias da família Lachnospiraceae.

3.4.2. Isolamento e cultivo de bactérias capazes de metabolizar inseticidas

O meio mínimo M9 acrescido de 10 µg/mL de inseticida em solução do surfactante tween 20 (0,1% v/v) mostrou-se eficiente para o isolamento bacteriano para a maioria das populações resistentes analisadas. Populações suscetíveis não apresentaram bactérias capazes de metabolizar e utilizar os inseticidas testados como fonte de carbono. No cultivo da microbiota intestinal das linhagens resistentes de S. frugiperda, apenas não foi possível isolar bactérias com capacidade de degradar inseticidas na linhagem resistente ao teflubenzuron. A linhagem resistente a spinosad foi a que apresentou o maior número de morfotipos (oito) ao final dos 10 dias de cultivo. A linhagem de S. frugiperda resistente ao flubendiamide e chlorantraniliprole apresentou três morfotipos para cada um dos inseticidas testados (Figura 3.8). Em populações naturais de S. frugiperda, obtidas em áreas de cultivo convencional de milho nos estados de Goiás, Minas Gerais, Paraná, São Paulo e Santa Catarina, foi possível observar maior diversidade de bactérias capazes de metabolizar inseticidas do que nas linhagens resistentes selecionadas em laboratório (Figura 3.9). Foram selecionados um total de 234 morfotipos das populações de campo, sendo a maioria deles obtidos das populações coletadas em Santa Catarina (58) e São Paulo (56). As populações que apresentaram menor número de morfotipos foram as coletadas em Minas Gerais e Goiás, com 38 morfotipos cada. Dentre os morfotipos obtidos, a maioria foi isolada utilizando indoxacarb como fonte de carbono (42). O tratamento com o teflubenzuron foi o que resultou na menor quantidade de morfotipos (36).

Isolamento bactérias Populações Resistentes Spodoptera frugiperda

6 4

Dias de cultivo 15 4 77

Morfotipos (n) Morfotipos 1010 2 1 1 2 1 1 2 1 1 0 chlorantraniliprole flubendiamide spinosad teflubenzuron Populações Resistentes

Figura 3.8. Isolamento de bactérias associadas ao intestino médio de linhagens resistentes de Spodoptera frugiperda a diferentes inseticidas, em função do tempo (dias) de crescimento em meio mínimo contendo inseticida como única fonte de carbono. Isolamento bactérias Populações naturais Spodoptera frugiperda

8 5 6 6 7 6 7 6 6 30 7 6 Local 6 8 7 7 GO MG 7 7 20 8 PR SC

Morfotipos (n) Morfotipos 9 10 10 SP 9 10 10 10 12 10 11 9 8 6

0 chlorantraniliprole flubendiamide indoxacarb lufenuron spinosad teflubenzuron Inseticidas

Figura 3.9. Morfotipos de bactérias associadas ao trato digestivo das populações naturais de Spodoptera frugiperda cultivadas em meio mínimo contendo inseticida.

3.4.3. Caracterização molecular

Após análise de PCR-RFLP e sequenciamento do 16S rDNA das amostras selecionadas, 85 filotipos foram identificados (Tabela 3.2). A relação filogenética entre as sequências obtidas foi inferida pelo método de máxima verossimilhança e modelo de substituição geral reversível no tempo, com distribuição gama discreta (2 parâmetros) e posições invariantes (Figura 3.10). A análise das sequências distribuiu os isolados em três filos distintos: Proteobacteria (89%), Bacterioidetes (7%) e Firmicutes (4%). Dentre Proteobacteria, 70% pertencem a classe gamma-Proteobacteria, sendo representadas pelas famílias Enterobacteriaceae, Moraxellaceae e Pseudomonadaceae.

Isolado Correspondente mais próximo Acesso Genbank Identidade IILRSPIN16 Serratia marcescens JMPQ01000005 99.71% IILRSPIN21 Acinetobacter bereziniae AIEI01000248 99.78% IILRSPIN24 Klebsiella pneumoniae AJJI01000018 99.78% IILRSPIN34 Chryseobacterium tructae FR871429 99.42% IILRSPIN38 Pseudomonas geniculata AB021404 99.49% IILRFLU44 Leclercia adecarboxylata BCNP01000062 98.13% IILRCHL56 Leclercia adecarboxylata BCNP01000062 98.13% IILSFSC64 Comamonas testosteroni AHIL01000001 99.93% IILSFSC81 Acinetobacter soli APPU01000012 99.93% IILSFSC87 Enterobacter asburiae BBED01000197 99.56% IILSFSC113 Acinetobacter baylyi APPT01000006 99.07% IILSFSC103 Acinetobacter oleivorans CP002080 100% IILSFSC100 Pseudomonas japonica BBIR01000146 99.56% IILSFSC124 Ochrobactrum pseudogrignonense NNRM01000012 99.85% IILSFSC133 Ochrobactrum pseudogrignonense NNRM01000012 98.43% IILSFSC134 Empedobacter brevis AM177497 99.56% IILSFSC168 Sphingobacterium multivorum AB100738 99.21% IILSFSC155 Klebsiella michiganensis JQ070300 99.85% IILSFSC157 Acinetobacter soli APPU01000012 100,00% IILSFSC199 Sphingobacterium siyangense EU046272 99.49% 52

Tabela 3.2: Identificação putativa das sequências do gene 16S rDNA (1350 pb) de bactérias do intestino médio de lagartas de Spodoptera frugiperda resistentes ao inseticida spinosad (RSPIN) ou de populações naturais (SFSC: Santa Catarina; SFSP: São Paulo; SFGO: Goiás; SFMG: Minas Gerais; SFPR: Paraná), após busca heurística utilizando cerca de 1350 pb por sequência contra aquelas depositadas no banco de dados do NCBi e do EzTaxon-e. (Continuação) Isolado Correspondente mais próximo Acesso Genbank Identidade IILSFSC193 Klebsiella pneumoniae ACZD01000038 99.85% IILSFSC203 Comamonas testosteroni AHIL01000001 99.85% IILSFSC189 Stenotrophomonas lactitubi LT222224 99.71% IILSFSC237 Bacillus siamensis AJVF01000043 99.85% IILSFSC224 Klebsiella quasipneumoniae CBZR010000040 99.57% IILSFSC219 Stenotrophomonas indicatrix KJ452162 99.50% IILSFSC221 Pseudomonas monteilii BBIS01000088 99.85% IILSFSC204 Acinetobacter baylyi APPT01000006 99.14% IILSFSC70 Klebsiella quasipneumoniae CBZR010000040 99.60% IILSFSP451 Serratia marcescens JMPQ01000005 99.93% IILSFSP438 Klebsiella quasivariicola CP022823 99.78% IILSFSP497 Leclercia adecarboxylata BCNP01000062 99.71% IILSFSP416 Acinetobacter oleivorans CP002080 99.93% IILSFSP361 Comamonas testosteroni AHIL01000001 99.43% IILSFSP357 Acinetobacter baylyi APPT01000006 99.07% IILSFSP371 Acinetobacter soli APPU01000012 99.85% IILSFSP373 Pseudomonas japonica BBIR01000146 99.78% IILSFSP440 Ochrobactrum pseudogrignonense NNRM01000012 98.81% IILSFSP461 Sphingobacterium multivorum AB100738 99.71% IILSFSP502 Klebsiella variicola CP010523 99.85% IILSFSP356 Staphylococcus argenteus FR821777 100,00% IILSFSP458 Delftia lacustris jgi.1102360 99.85% IILSFSP393 Acinetobacter lactucae LRPE01000019 99.79% IILSFSP462 Chryseobacterium cucumeris LUVZ01000011 99.78% IILSFSP482 Enterobacter tabaci KP990658 99.79% IILSFSP460 Acinetobacter baylyi APPT01000006 99.14% IILSFGO326 Acinetobacter bereziniae AIEI01000248 100,00% IILSFGO316 Klebsiella quasivariicola CP022823 99.78% IILSFGO303 Pseudomonas monteilii BBIS01000088 99.85% IILSFGO323 Acinetobacter soli APPU01000012 100,00% IILSFGO349 Klebsiella michiganensis JQ070300 99.85% IILSFGO313 Pseudomonas japonica BBIR01000146 99.78% IILSFGO246 Bacillus siamensis AJVF01000043 99.78% IILSFGO333 Klebsiella variicola CP010523 99.78% IILSFGO239 Pseudomonas taiwanensis EU103629 99.86% 53

Tabela 3.2: Identificação putativa das sequências do gene 16S rDNA (1350 pb) de bactérias do intestino médio de lagartas de Spodoptera frugiperda resistentes ao inseticida spinosad (RSPIN) ou de populações naturais (SFSC: Santa Catarina; SFSP: São Paulo; SFGO: Goiás; SFMG: Minas Gerais; SFPR: Paraná), após busca heurística utilizando cerca de 1350 pb por sequência contra aquelas depositadas no banco de dados do NCBi e do EzTaxon-e. (Conclusão) Isolado Correspondente mais próximo Acesso Genbank Identidade IILSFGO339 Pseudomonas straminea FOMO01000019 99.93% IILSFGO260 Enterobacter asburiae BBED01000197 99.71% IILSFGO297 Klebsiella quasivariicola CP022823 99.56% IILSFMG731 Klebsiella quasivariicola CP022823 99.85% IILSFMG733 Acinetobacter oleivorans CP002080 99.78% IILSFMG715 Acinetobacter soli APPU01000012 99.85% IILSFMG699 Enterobacter asburiae BBED01000197 99.71% IILSFMG739 Pseudomonas japonica BBIR01000146 99.63% IILSFMG670 Enterobacter tabaci KP990658 99.57% IILSFMG688 Pseudomonas hunanensis JX545210 99.85% IILSFMG674 Achromobacter animicus HE613448 99.78% IILSFMG683 Klebsiella oxytoca AB004754 99.86% IILSFPR568 Acinetobacter bereziniae AIEI01000248 99.85% IILSFPR601 Klebsiella quasivariicola CP022823 99.64% IILSFPR577 Acinetobacter oleivorans CP002080 100% IILSFPR620 Pseudomonas monteilii BBIS01000088 99.78% IILSFPR541 Acinetobacter soli APPU01000012 99.78% IILSFPR532 Pseudomonas japonica BBIR01000146 99.63% IILSFPR604 Pseudomonas japonica BBIR01000146 99.78% IILSFPR554 Ochrobactrum pseudogrignonense NNRM01000012 98.81% IILSFPR529 Klebsiella variicola CP010523 99.93% IILSFPR619 Klebsiella variicola CP010523 99.85% IILSFPR547 Pseudomonas taiwanensis EU103629 99.78% IILSFPR570 Pseudomonas hunanensis JX545210 99.85% IILSFPR524 Pseudomonas indoloxydans DQ916277 98.68% IILSFPR551 Pseudomonas fulva BBIQ01000036 99.86% IILSFPR651 Comamonas terrigena BCNR01000021 99.93% IILSFPR603 Pseudomonas nitritireducens HM246143 99.56% IILSFPR536 Pseudomonas parafulva BBIU01000051 99.57% IILSFPR600 Delftia acidovorans JOUB01000005 99.93%

IILSFMG731_K.quasivariicola IILSFGO316_K.quasivariicola

IILSFPR601_K.quasivariicola IILSFPR619_K.variicola IILSFSP502_K.variIcola IILSFSP438_K.quasivariicola AJ JI01000018_K.pneumoniaeIILSFGO333_K.variicola

IILRSPIN24_K.pneumoniae CP022823_K.quasivariicola

IILSFSC70_K.quasipneumoniaeCP010523_K.variicola IILSFSP462_C.cucumeris IILSFPR529_K.variicola LUVZ01000011_C.cucumeris IILRSPIN34_C.tructae FR871429_C.tructae CBZR010000040_ K.quasipneumoniae IILSFSC134_E.brevis AM177497_E.brevis IILSFSP461_S.multivorum AB100738_S.multivorum IILSFSC193_K.pneumoniae IILSFSC168_S.multivorum IILSFSC199_S.siyangense EU046272_S.siyangense X80743_A.nicotinovorans 92 99 X77443_M.arborescens IILSFGO297_K.quasivariicola 100 97 AF039903_E.casseliflavus JXKV01000056_E.mundtii 100 99 IILSFSP356_S.argentus 84 IILSFGO260_E.asburiae FR821777_S.argentus 100 100 AJ VF01000043_B.siamensis 73 100 IILSFSC237_B.siamensis IILSFMG699_E.asburiae 100 IILSFGO246_B.siamensis BBED01000197_E.asburiae 100 100 IILSFSC124_O.pseudogrignonense 67 NNRM01000012_O.pseudogrignonense 59 IILSFSC133_O.pseudogrignonense IILSFSC87_E.asburiae 99 89 100 98 100 IILSFPR554_O.pseudogrignonense 73 100 KP990658_E.tabaci IILSFSP440_O.pseudogrignonense 53 IILSFSC219_S.indicatrix 69 99 97 IILSFMG670_E.tabaci 100 100 KJ 452162_S.indicatrix IILSFSP482_E.tabaci 58 74 LT222224_ S.lactitubi LECZ01000016_L.adecarboxylata 70 IILSFSP189_S.lactitube 71 100 IILSFMG674_A.animicus BCNP 01000062_L.adecarboxylata 66 51 100 HE613448-A.animicus IILSFSP497_L.adecarboxylata 93 IILSFPR600_D.acidovorans 77 100 69 JOUB01000005_D.acidovorans JQ070300_K.michiganensis 100 IILSFSP458_D.lacustris 56 jgi.1102360_D.lacustris AB004754_K.oxytoca 100 60 100 IILSFPR651_C.terrigena IILSFGO349_K.michiganensis 93 95 BCNR01000021_C.terrigena 100 IILSFSC203_C.testoteroni IILSFMG683_K.oxytoca 100 IILSFSP361_C.testoteroni 99 67 99 IILSFSC64_C.testoteroni 86 100 IILSFSC155_K.michiganensis 99 AHIL01000001_C.testosteroni 67 86 IILSFPR603_P.nitritireducens IILRSPIN16_S.marcescens 85 70 HM246143_P.nitritireducens 99 FMWB01000061_ P.psychrotolerans JMPQ01000005_S.marcescens 97 CP002881_P.stutzeri 100 100 IILSFSP451_S.marcescensIILSFSP357_A.baylyi 79 IILSFPR524_P.indoloxydans 100 DQ916277_P.indoloxydans IILSFSC113_A.baylyi 57 56 IILSFGO339_P.straminea 56 FOMO01000019_ P.straminea IILSFSC204_A.baylyi 96 64 69 IILSFPR620_P.monteilli IILSFGO303_P.monteilli 82 83 IILSFSC221_P.monteilli APPT01000006_A.baylyi IILSFPR570_P.hunanensis Flavobacteria IILSFSP460_A.baylyi 65 IILSFPR551_P.fulva

IILSFMG715_A.soli 68 65 IILSFPR536_P.parafulva IILSFSC81_A.soli BBIQ01000036_P.fulva 100 IILSFMG668_hunanensis

69 BBIU01000051_P.parafulva Sphingobacteria JX 5 4 5 2 1 0 _P . h u n a n e n s i s IILSFSP371_A.soli IILSFGO239_P.taiwanensis BBIS01000088_P.monteilli IILSFPR547_P.taiwanensis EU103629_ P.taiwanensis

IILSFSC100_P.japonica

IILSFSC157_A.soli IILSFMG739_P.japonica IILSFPR532_P.japonica IILSFGO313_P.japonicaBBIR01000146_P.japonica IILSFPR604_P.japonica IILSFSP373_P.japonica Actinobacteria IILSFGO323_A.soli

APPU01000012_A.soliIILSFPR541_A.soli Firmicutes Alphaproteobacteria IILSFMG733_A.oleivorans CP002080_A.oleivorans Betaproteobacteria LRPE01000019_A.lactucaeIILSP393_A.lactuacae IILSFSP416_A.oleivorans

IILSFPR577-A.oleivorans Gammaproteobacteria IILSFSC103_A.oleivorans

AIEI01000248_A.berezinaeIILSFGO326_A.berezinae IILSFPR568_A.berezinaeIILRSPIN21_A.berezinae

Figura 3.10, Árvore filogenética construída a partir das sequências da região 16S rDNA (1350 pb), pelo método de máxima verossimilhança e modelo de substituição geral reversível no tempo, mostrando a relação filogenética de bactérias isoladas do intestino médio de lagartas de populações naturais de Spodoptera frugiperda e de linhagens resistentes, selecionadas em laboratório. Os valores nos diferentes ramos correspondem aos valores de bootstrap.

Os isolados do intestino médio de S. frugiperda com capacidade de metabolização de inseticidas pertencem, majoritariamente, a gamma-Proteobacteria, sendo mais diversos e abundantes em populações naturais de S. frugiperda do que nas linhagens resistentes selecionadas em laboratório. Na linhagem de S. frugiperda resistente ao spinosad foram obtidos cinco filotipos, classificados como próximos a Serratia marcescens (16) (Proteobacteria), Acinetobacter bereziniae (21) (Proteobacteria), Klebsiella pneumoniae (24) (Proteobacteria), Chryseobacterium tructae (34) (Bacterioidetes) e Pseudomonas geniculata (38) (Proteobacteria), sendo os três primeiros também encontrados em populações naturais de S. frugiperda. Nas linhagens de S. frugiperda resistentes aos inseticidas flubendiamide e 55

chlorantraniliprole foram obtidos um filotipo em cada, ambos classificados como Leclercia adecarboxylata (44 e 56) (Proteobacteria). Dentre as populações coletadas a campo, a de Santa Catarina foi a que apresentou maior diversidade (22 filotipos), sendo a de Minas Gerais a com o menor (9) número de filotipos com capacidade de metabolizar inseticidas. Alguns dos isolados identificados putativamente como Acinetobacter soli e Pseudomonas japonica ocorreram em todas as populações naturais amostradas, independente do local de coleta (Figura 3.11). As populações de São Paulo, Paraná e Santa Catarina foram as que apresentaram o maior número de filotipos únicos, com seis deles em cada uma das populações. A maior parte dos isolados foi compartilhado em pelo menos duas das populações amostradas. O isolamento de bactérias com capacidade de metabolizar inseticidas foi testado em múltiplos inseticidas nas populações de campo e demonstrou que um mesmo filotipo pode ser apto a usar diferentes compostos como fonte de carbono (Figura 3.14). O filotipo Acinetobacter soli (371), obtido da população de S. frugiperda coletada em São Paulo, por exemplo, foi isolado nos seis inseticidas testados (flubendiamide, indoxacarb, chlorantraniliprole, lufenuron, teflubenzuron e spinosad), assim como o filotipo Pseudomonas parafulva (536), isolado do intestino médio de lagartas da população de S. frugiperda coletada no Paraná. Outros filotipos, no entanto, como Pseudomonas nitrireducens (603) e Delftia acidovorans (600), associadas ao intestino médio de lagartas de S. frugiperda coletadas no Paraná, mostraram-se especializados na metabolização de apenas um dos inseticidas.

! GO#MG#PR#SC#SP# P. japonica; A. soli MG#PR#SC#SP# A. oleivorans GO#MG#PR#SP# K. quasivariicola SP PR#SC#SP# O. pseudogrignonense GO#MG#SC# E. asburiae 6 GO#PR#SC# P. monteilii SC K. variicola 3 GO#PR#SP# 1 GO#SC# B. siamensis; K.michiganensis 6 1 MG#SP# E. tabaci 1 GO#PR# A. bereziniae; P. taiwanensis 1 GO 2 SC#SP# S. multivorum; A. baylyi; 2 ! C. testosteroni 1 SC# E. brevis; S. indicatrix; 1 1 !! K. quasipneumoniae; S. siyangense; 2 ! S. lactitubi; K. pneumoniae 1 SP# L. adecarboxylata; S. argenteus; PR 6 1 ! A. lactucae; D. lacustris; 2 ! C. cucumeris; S. marcescens MG GO# P. straminea MG# A. animicus K. oxytoca PR# C. terrigena; P. nitritireducens; D. acidovorans;P. parafulva; P. indoloxydans; P. fulva

Figura 3.11. Diagrama de venn demonstrando a distribuição dos filotipos isolados do intestino médio de lagartas de Spodoptera frugiperda nas populações naturais coletadas em São Paulo (SP), Goiás (GO), Minais Gerais (MG), Santa Catarina (SC) e Paraná (PR). 56

Flu Ind Chl Luf Te f S pin IILS FS P_S .multivorum IILS FS P_S .marcescens IILS FS P_S ,argentus IILS FS P_P.japonica IILSFSP_O.pseudogrignonense IILS FS P_L.adecarboxylata IILS FS P_K.variicola IILS FS P_K.quasivariicola IILS FS P_E.tabaci IILS FS P_D.lacustris IILSFSP_C.thiooxydans IILS FS P_C.cucumeris IILS FS P_A.oleivorans IILS FS P_A.lactuacae IILS FS P_A.baylyi IILS FS P_A. soli IILS FS C_S .siyangense IILS FS C_S .pavanii IILS FS C_S .multivorum IILS FS C_S .maltophilia IILS FS C_P.monteilii IILS FS C_P.japonica IILSFSC_O.pseudogrignonense IILSFSC_K.quasipneumoniae IILS FS C_K.pneumoniae IILS FS C_K.michiganensis IILS FS C_E.brevis IILS FS C_E.asburiae IILSFSC_C.thiooxydans IILS FS C_B.siamensis IILS FS C_A.oleivorans IILS FS C_A.baylyi IILS FS C_A. soli IILSFPR_P.taiwanensis IILS FPR_P.parafulva IILS FPR_P.nitrireducences IILS FPR_P.monteilii IILS FPR_P.japonica IILSFPR_P.indoloxydans IILS FPR_P.hunanensis IILS FPR_P.fulva IILSFPR_O.pseudogrignonense IILS FPR_K.variicola IILS FPR_K.quasivariicola IILS FPR_D.acidovorans IILS FPR_C.terrigena IILS FPR_A.oleivorans IILS FPR_A.bereziniae IILS FPR_A. soli IILS FMG_P.japonica IILS FMG_P.hunanensis IILS FMG_K.quasivariicola IILS FMG_K.oxytoca IILS FMG_E.asburiae IILS FMG_A.oleivorans IILS FMG_A.animicus IILS FMG_A. soli IILSFGO_P.taiwanensis IILS FGO_P.straminea IILS FGO_P.monteilii IILS FGO_P.japonica IILS FGO_K.variicola IILS FGO_K.quasivariicola IILS FGO_K.michiganensis IILS FGO_E.asburiae Presente IILS FGO_B.siamensis IILS FGO_A.bereziniae Ausente IILS FGO_A. soli

Figura 3.12. Filotipos associados às populações naturais de Spodoptera frugiperda e sua aptidão em metabolizar diferentes inseticidas como fonte de carbono (flubendiamide - flu, indoxacard - ind, chlorantraniliprole - chl, lufenuron - luf, teflubenzuron - tef, spinosad - spin). 57

3.4.4. Determinação da capacidade de crescimento da microbiota associada a S. frugiperda em múltiplos inseticidas

A performance dos filotipos em meio mínimo M9 contendo inseticida e o surfactante Tween 20 (0,1%) foi avaliada com base no valor máximo de absorbância durante o período de cultivo (48 h). O filotipo Serratia marcescens (451), isolado da população de S. frugiperda coletada em São Paulo, foi o que apresentou melhor performance dentre os isolados testados, apresentando também melhor capacidade de crescimento do que o filotipo Serratia marcences (16) isolado da linhagem resistente ao spinosad, selecionada em laboratório (Figura 3.13). A flavobactéria Empedobacter brevis (134) não cresceu bem em nenhum dos inseticidas testados, assim como a actinobactéria Arthrobacter nicotivorans (Dm05), isolada de linhagem de S. frugiperda resistente ao piretroide deltametrina (Figura 3.14). Outros filotipos demonstraram ainda deficiência na utilização de alguns dos inseticidas testados como fonte de carbono. Os filotipos de Ochrobactrum pseudogrignonense (124 e 133), associados à população de S. frugiperda coletada em Santa Catarina, por exemplo, não foram capazes de metabolizar os inibidores de síntese de quitina, lufenuron e teflubenzuron, e o modulador alostérico de receptores de acetilcolina, spinosad.

SFSP451 RSPIN16 Serratia marcescens Serratia marcescens

0.4 0.4

0.3 0.3 Inseticidas Chl Chlp Delta Flu 0.2 0.2 Ind Lambda Luf Spin Absorbância (A600) Absorbância 0.1 0.1 Tef

0.0 0.0

01020 30 40 50 01020 30 40 50 Tempo (h)

Figura 3.13. Performance dos filotipos de Serratia marcescens isolados do intestino médio da população natural de S. frugiperda coletada em São Paulo (451), e da população resistente ao spinosad, selecionada em laboratório (16), mostrando o maior potencial de crescimento do isolado obtido da população de campo. Valores de absorbância utilizando 600nm de comprimento de onda eletromagnética.

Flu Ind Chl Luf Tef Spin Chlp Delta Lambda Stenotrophomonas_lactitubi_189 Stenotrophomonas_indicatrix_219 Staphylococcus_argentus_356 Sphingobacterium_siyangense_199 Sphingobacterium_multivorum_168 Serratia_marcescens_451 Serratia_marcescens_16 Pseudomonas_taiwanensis_239 Pseudomonas_stutzeri_lb09 Pseudomonas_psychrotolerans_sp19 Pseudomonas_parafulva_536 Pseudomonas_nitrireducences_603 Pseudomonas_monteilii_67 Pseudomonas_japonica_373 Pseudomonas_hunanensis_668 Ochrobactrum_pseudogrignonense_133 Ochrobactrum_pseudogrignonense_124 Microbacterium_arborescens_Luf18 A600 Leclercia_adecarboxylata_cl29 0.3 Leclercia_adecarboxylata_497 0.2 Klebsiella_quasivariicola_438 Klebsiella_pneumoniae_24 0.1 Klebsiella_pneumoniae_193 0.0 Klebsiella_michiganensis_104 Klebisiella_variicola_333 Klebisiella_quasipneumoniae_70 Enterobacter_asburiae_87 Empedobacter_brevis_134 Delftia_acidovorans_600 Comamonas_testosteroni_91 Chryseobacterium_tructae_34 Bacillus_siamensis_237 Arthrobacter_nicotinovorans_Dm05 Acinetobacter_soli_81 Acinetobacter_soli_255 Acinetobacter_oleivorans_103 Acinetobacter_bereziniae_568 Acinetobacter_bereziniae_21 Acinetobacter_baylyi_113 Achromobacter_animicus_674

Figura 3. 14. Crescimento da microbiota associada às populações naturais e às linhagens resistentes de S. frugiperda em múltiplos inseticidas. Absorbância a 600nm (A600) após 48h de cultivo em meio mínimo M9 contendo inseticida como fonte de carbono.

3.5. Discussão

A comunidade microbiana presente no intestino de insetos é composta principalmente por bactérias dos filos Firmicute, Proteobacteria, Actinobacteria e Bacterioidetes (Douglas, 2015; Voirol et al., 2018), as quais podem afetar múltiplos aspectos da biologia do hospedeiro (Dillon & Dillon 2004; Hansen & Moran 2014). Em acordo com nossos resultados, estudos da composição do microbioma intestinal de S. littoralis resultaram na predominância de bactérias do filo Firmicutes, representadas principalmente por bactérias do gênero Enterococcus (Tang et al., 2012; Shao et al., 2014; Chen et al., 2016). Apesar das condições inóspitas para a colonização bacteriana presente no intestino larval de lepidópteros (Hammer et al., 2017), cepas de firmicutes são abundantes no intestino de Spodoptera litura (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae), Manduca sexta (Linnaeus) (Lepidoptera:Sphingidae) e Helicoverpa armigera (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae), assim como em outras espécies de Lepidoptera (Xiang et al., 2006; Brinkmann et al., 2008; Thakur et al., 2016; Mereghetti et al., 2017). Enterococcus foi o gênero com maior proporção relativa em todas as populações de S. frugiperda em análise – linhagens de S. frugiperda resistentes e suscetíveis a inseticidas, selecionadas em laboratório, e populações naturais de S. frugiperda, coletadas a campo (Figuras 3.4 e 3.5). Com exceção das linhagens de S. frugiperda resistente aos inseticidas spinosad e lambda-cyhalothrin, as linhagens de laboratório apresentaram mais de 98% da microbiota do intestino médio composta por Enterococcus. Assim como em Heliothis virescens (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae) (Staudacher et al., 2016), o microbioma intestinal de populações de S. frugiperda selecionadas em laboratório apresentaram estrutura mais simplificada do que aquele encontrado em populações naturais. Análises de sequenciamento de nova geração da microbiota intestinal de H. virescens revelaram a predominância de Enterococcaceae em populações de laboratório, em contraste com populações de campo, que apresentaram microbioma mais diverso e proporcional (Staudacher et al., 2016). No entanto, enquanto as populações de laboratório e campo de H. virescens não compartilharam nenhuma OTU, as populações de S. frugiperda tiveram membros da microbiota que foram comuns a todas as amostras analisadas, variando apenas em sua proporção relativa. A maior diversidade da comunidade bacteriana intestinal associada a populações de campo também foi observada em H. armigera e Ostrinia nubilalis (Hubner) (Lepidoptera: Crambidae) (Belda et al., 2011; Gayatri Priya et al., 2012). Em comparação com as populações de laboratório, as populações naturais de S. frugiperda apresentaram microbiota mais uniformemente distribuída, havendo um aumento na proporção 60

de proteobactérias. A maior plasticidade da microbiota associada às populações de campo pode ser associada como uma resposta ao maior influxo de bactérias associadas ao filoplano ou que tenham relação endofítica com a planta e a exposição continua às pressões de seleção presentes no campo (Douglas 2015; Mereghetti et al., 2017; Malathi et al., 2018). Além de uma comunidade bacteriana mais diversa, populações naturais de S. frugiperda expostas às pressões multilaterais presentes na natureza, apresentaram maior número de bactérias com capacidade de metabolização de inseticidas em sua microbiota intestinal do que as populações resistentes de laboratório, expostas a cada geração ao inseticida pelo qual tiveram sua resistência selecionada. Nenhuma bactéria associada ao intestino de lagartas suscetíveis a inseticidas foi capaz de utilizar tais compostos como única fonte de carbono, sugerindo uma relação entre o nível de exposição a inseticidas e a quantidade de bactérias capazes de metabolizá-los, apontando a existência de mecanismos de seleção da microbiota intestinal direcionados ao inseticida ao mesmo tempo em que o hospedeiro é selecionado para resistência. Bactérias com habilidade de metabolizar inseticidas já foram anteriormente isoladas do intestino de linhagens resistentes de S. frugiperda selecionadas em laboratório (Almeida et al., 2017), assim como de lagartas de Plutella xylostella (Linnaeus) (Lepidoptera: Plutellidae) (Ramya et al., 2016). Segundo Almeida e colaboradores 2017, lagartas de S. frugiperda resistentes aos inseticidas lambda-cyhalothrin, deltametrina, chlorpyrifos, spinosad e lufenuron carregam em sua microbiota bactérias selecionadas para degradar os inseticidas aos quais são resistentes. Ainda, cepas bacterianas isoladas do intestino de P. xylostella foram capazes de degradar os inseticidas indoxacarb e acefato. Em outras ordens de insetos, como Diptera (Cheng et al., 2017) e Hemiptera (Kikuchi et al., 2012) o papel de bacterias desintoxicantes foi associado à resistência do hospedeiro a tais compostos. Dentre os isolados capazes de metabolizar inseticidas, 89% foram classificados como Proteobacteria. A atividade desintoxicante desse grupo de bactérias já foi descrita em diversas ordens de inseto, incluindo Coleoptera, Diptera e Lepidoptera (Itoh et al., 2018b). Associados ao intestino do besouro Dendroctonus ponderosae Hopkin (Coleoptera: Curculionidae), as proteobactérias Brevundimonas vesicularis, Pseudomonas mandelli, Pseudomonas migulae, Rahnella aquatilis e Serratia marcescens demostraram atividade de degradação de terpenos (Boone et al., 2013). Isolados da família Pseudomonadaceae (γ- Proteobacteria) e de Enterobacteriaceae (γ-Proteobacteria) foram descritos ainda degradando alcaloides, glicosídeos e compostos fenólicos quando associados ao intestino de coleópteros, dípteros e lepidópteros (Capuzzo et al., 2005; Ceja-Navarro et al., 2015;Xia et al., 2017; Itoh et al., 2018). Quanto á habilidade em metabolizar inseticidas, destacam-se 61

isolados de proteobactérias das famílias Enterobacteriaceae (acefato, chlorpyrifos, trichlorphon) (Ramya et al., 2016; Almeida et al., 2017; Cheng et al., 2017), Pseudomonadaceae (lambda-cyhalothrin, spinosad) (Almeida et al., 2017) e Burkholderiaceae (fenitrothion) (Kikuchi et al., 2012; Itoh et al., 2018). Em uma menor proporção, o papel de bactérias desintoxicantes dos filos Actinobacteria (Almeida et al., 2017) e Firmicutes (Almeida, 2013; Ramya et al., 2016) também foram descritos na literatura. Bactérias intestinais do gênero Enterococcus (Firmicutes) associadas a linhagens resistentes de S. frugiperda foram capazes de degradar os inseticidas aos quais seus hospedeiros apresentavam resistência (Almeida, 2013). Apesar de predominantes na microbiota intestinal de todas as populações de S. frugiperda nesse estudo, nenhum filotipo de Enterococcus foi capaz de utilizar os inseticidas testados como fonte de carbono. Bactérias isoladas do intestino médio de lagartas de populações naturais de S. frugiperda apresentaram melhor performance na utilização de inseticidas como fonte de carbono do que as de linhagens selecionadas em laboratório. O filotipo Serratia marcescens (γ-Proteobacteria) isolado do intestino da população natural de S. frugiperda (SC) (451) foi o que apresentou o maior crescimento em meio mínimo com inseticida. Muitos autores indicam o potencial de Serratia sp. para a metabolização de inseticidas, sendo proposta como um agente biorremediador de inseticidas organoclorados, organofosforados e piretroides (Bidlan & Manonmani, 2002; Xu et al., 2007; Cycoń et al., 2014). Nesse trabalho, a performance de Serratia na metabolização de múltiplos inseticidas variou em função da população da qual foi isolada (Figura 3.13). O filotipo de S. marcescens (451) isolado do intestino de populações naturais de S. frugiperda teve melhor desempenho do que o filotipo de S. marcescens (16) isolado da população resistente ao spinosad, a qual, dentre as populações de laboratório, foi a mais diversa e com maior proporção de proteobactérias capazes de metabolizar inseticidas. Assim como no processo de resistência adaptativa a antibióticos, fenótipos desintoxicantes podem ser consequência dos gradientes de exposição aos inseticidas e às pressões de seleção às quais a comunidade bacteriana está sujeita, havendo favorecimento dos membros que conseguem ter o melhor desempenho em tais condições (Hibbing et al., 2010; Fernández et al., 2011). A maioria dos isolados apresentou capacidade de metabolizar múltiplos inseticidas em meio mínimo seletivo (Figura 3.14), enquanto alguns deles, como Arthrobacter nicotivorans (Dm95) (Actinobacteria) e Empedobacter brevis (134) (Flavobacteria) apresentaram pouco ou nenhum crescimento utilizando inseticida como fonte de carbono. A capacidade de microrganismos utilizarem inseticidas como fonte de carbono depende da sua habilidade de codificar os mecanismos bioquímicos necessários para lidar com esse 62

substrato, e varia em função de fatores como temperatura e pH, disponibilidade de nutrientes, concentração do composto e tamanho da população de bactérias (Bansal, 2011; Russell et al., 2011). A velocidade e a forma com que a bactéria utiliza inseticidas como recurso alimentar dependem ainda da estrutura química e complexidade do inseticida (Bansal, 2011). Com rápida taxa evolutiva, microrganismos exibem várias vias metabólicas para a degradação ou modificação de xenobióticos (Russell et al., 2011; Itoh al. 2018). Sabe-se, por exemplo, pelo menos três rotas de degradação de organofosforados por bactérias, as quais atuam pela hidrólise da ligação fosfoéster dessas moléculas (Horne et al., 2002; Park et al., 2004; Dong et al., 2005). Em grupos de pesticidas, como os piretroides, carbamatos, diamidas e organoclorados, enzimas de desintoxicação de origem bacteriana foram caracterizadas a partir de cepas de Bacillaceae (Firmicutes), Enterobacteriaceae (Proteobacteria), Pseudomonadaceae (Proteobacteria), Sphingomonadaceae (Proteobacteria) e Alcaligenaceae (Proteobacteria) (Finkelstein et al., 2001; Russell et al., 2011; Khalid et al., 2016). A maior parte dos isolados obtidos do intestino das linhagens de S. frugiperda em estudo foi compartilhado em pelo menos duas das populações amostradas em campo e alguns deles, como Acinetobacter soli (γ-Proteobacteria) e Pseudomonas japonica (γ- Proteobacteria), estavam presentes em todas as populações naturais de S. frugiperda. Apesar da recente discussão sobre a presença de uma microbiota residente e funcional na ordem Lepidoptera (Staudacher et al., 2016; Hammer et al., 2017), nossos resultados demonstram a persistência de filotipos com capacidade de metabolização de inseticidas associados ao intestino de S. frugiperda. Assim como seu hospedeiro, a microbiota intestinal desse lepidoptero também se encontra sob pressão de seleção direcionada a resistência e, junto com outros mecanismos de resistência, pode estar contribuindo para a desintoxicação do hospedeiro e para a menor eficiência do controle de pragas no campo.

3.6. Conclusões

A composição da comunidade microbiana intestinal associada a Spodoptera frugiperda, assim como a capacidade de seus membros em metabolizar inseticidas foi influenciada pelo grau de exposição a tais compostos. Em acordo com nossas predições, populações naturais expostas a pressões multilaterais no campo apresentaram microbiota intestinal mais diversa e com maior proporção de bactérias com potencial de metabolização de inseticidas. Apesar da composição e diversidade da microbiota associada às linhagens de S. frugiperda resistentes e 63

suscetível a inseticidas não ter diferido (predição i), a capacidade de utilização de inseticidas como fonte de carbono só foi observada nas linhagens resistentes. Nossos resultados indicam que, assim como o hospedeiro, a comunidade intestinal de S. frugiperda também está em pressão de seleção direcionada a resistência a inseticidas e sugerem que, como uma unidade, comportam como um holobionte frente a essa condição de estresse.

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ANEXOS

0.94

0.92

0.90

0.88

0.86 Pielou

de 0.84

0.82 pielou_e Índice

0.80 * 0.78

0.76

0.74

0.72

SFRR_Chlp SFRR_Cry SFRR_Flu SFRR_Lbda SFRR_Spin SFRR_Tef SFSS

Anexo A. Índice de diversidade Pielou referente a comunidade bacteriana associada(n=3) Sfrugiperda_suscetível ao Sfrugiperda_resistentesflu (n=3) Sfrugiperda_resistentesflu Sfrugiperda_resistentestef (n=3) Sfrugiperda_resistentestef Sfrugiperda_resistentesclp (n=3) Sfrugiperda_resistentesclp Sfrugiperda_resistentespin (n=3) Sfrugiperda_resistentespin Sfrugiperda_resistentescry (n=3) Sfrugiperda_resistentescry Sfrugiperda_resistenteslambda (n=3) Sfrugiperda_resistenteslambda intestino de populações de Spodoptera frugiperdaSample suscetíveis e resistentes a inseticidas. (*) Populações de S. frugiperda resistentes a inseticidas que se diferiram da população suscetível de acordo com o teste de variância de Krukal Wallis, p ≤ 0,05.

7.5 * 7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5 de Faith 4.0 faith_pd 3.5 Índice 3.0

2.5

2.0

1.5 *

1.0

0.5

SFRR_Chlp SFRR_Cry SFRR_Flu SFRR_Lbda SFRR_Spin SFRR_Tef SFSS

Anexo B. Índice de diversidade Faith referente a comunidade bacteriana associada(n=3) Sfrugiperda_suscetível ao Sfrugiperda_resistentesflu (n=3) Sfrugiperda_resistentesflu Sfrugiperda_resistentestef (n=3) Sfrugiperda_resistentestef Sfrugiperda_resistentesclp (n=3) Sfrugiperda_resistentesclp Sfrugiperda_resistentespin (n=3) Sfrugiperda_resistentespin Sfrugiperda_resistentescry (n=3) Sfrugiperda_resistentescry intestino de populações de Spodoptera frugiperda (n=3) Sfrugiperda_resistenteslambda suscetíveis e resistentes a inseticidas. (*) Sample Populações de S. frugiperda resistentes a inseticidas que se diferiram da população suscetível de acordo com o teste de variância de Krukal Wallis, p ≤ 0,05.

A C

B D

Anexo C – Análise de Coordenadas Principais (PCoA) a partir da matriz de distância gerada pelo índice de diversidade beta de Jaccard (A), Bray-Curtis (B) e Unifrac não ponderada (C) e ponderad (D) da diversidade da comunidade microbiana associada às populações naturais de Spodoptera frugiperda. A falta de agrupamento evidente entre os tratamentos demonstra uma comunidade microbiana diversa, com diferentes graus de riqueza e abundância de OTUs a depender do local de coleta (São Paulo – SP; Santa Catarina – SC; Paraná –Pr; Minas Gerais –MG; Goiás –Go).

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS

• A análise metagenômica da comunidade bacteriana associada ao intestino de S. albula, S. cosmioides, S. eridania e S. frugiperda, assim como de populações de S. frugiperda selecionadas em laboratório e amostradas no campo, demonstrou a predominância de bactérias do gênero Enterococcus (Firmicutes), independente da espécie, dieta ou pressões de seleção às quais as lagartas foram expostas. Nossos resultados indicam a importância desse táxon para o gênero Spodoptera. • Apesar da abundância de Enterococcus, Proteobacterias associadas ao intestino de S. frugiperda foram os membros do microbioma que apresentaram maior potencial na metabolização de inseticidas. • A composição e diversidade da microbiota intestinal de S. frugiperda, assim como a presença e capacidade de bactérias metabolizarem inseticidas foi influenciada pelo nível de exposição a tais compostos, demonstrando que a microbiota intestinal dessa espécie-praga também se encontra em pressão de seleção direcionada a resistência.

Nossos resultados indicam a importância da relação da simbiose para esse gênero de Lepidoptera. Pesquisas futuras incluem a avaliação da contribuição funcional destas bactérias, Enterococcus e proteobactérias capazes de metabolizar inseticidas, assim como o estudo da sua transmissão e estabelecimento entre as gerações de Spodoptera - pontos essenciais para a melhor compreensão do papel da simbiose no fenótipo e performance do hospedeiro em condições de estresse.