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Tesis Doctoral Reducida

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Tesis Doctoral Reducida Tesis Doctoral Caracterización de cepas de Acinetobacter baumannii que no producen lipopolisacárido, y su uso en el desarrollo preclínico de anticuerpos monoclonales terapéuticos Marta Claudia Carretero Ledesma Sevilla 2018 Programa Doctoral en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica Departamento de Medicina Univesidad de Sevilla Director 1: Dr. Jerónimo Pachón Díaz Director 2: Dr. Michael J. McConnell PRODUCCIONES CIENTÍFICAS FRUTO DE LA TESIS DOCTORAL Publicaciones 1. Meritxell García-Quintanilla, Marta Carretero-Ledesma, Patricia Moreno-Martínez, Reyes Martín-Peña, Jerónimo Pachón, Michael J. McConnell. Lipopolysaccharide loss produces partial colistin dependence and collateral sensitivity to azithromycin, rifampicin and vancomycin in Acinetobacter baumannii. International Journal of Antimicrobial Agents. Volumen: 46. 696 -702. Mayo 2015. 2. Marta Carretero-Ledesma, Meritxell García-Quintanilla, Reyes Martín-Peña, Marina R. Pulido1, Jerónimo Pachón and Michael J. McConnell. Phenotypic Changes Associated with Colistin Resistance due to Lipopolysaccharide Loss in Acinetobacter baumannii. Virulence. Abril 2018. Comunicaciones a congresos 1. Marta Carretero-Ledesma, Meritxell García-Quintanilla, Jerónimo Pachón, Michael J. McConnell. Colistin dependence and phenotypic changes in Acinetobacter baumannii acquiring colistin resistance due to loss of lipopolysaccharide. European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID 2015), 25 - 28 Abril del 2015, Copenhagen, Dinamarca. Tipo de participación: Póster. Publicación: P0281. 2. Marta Carretero-Ledesma, Meritxell García-Quintanilla, Jerónimo Pachón and Michael J. McConnell. Loss of lipopolysaccharide produces alters growth, biofilm production, disinfectant susceptibility and motility in Acinetobacter baumannii. 10th International Symposium on the Biology of Acinetobacter. (Junio de 2015). Atenas, Grecia. Tipo de participación: Comunicación oral. Publicación: 0-10. 3. Cebrero-Cangueiro T, Mazzotta S, Carretero-Ledesma M, Iglesias-Guerra F, Jiménez-Baus A, Sánchez Céspedes J, Vega-Holm M, Smani Y, Candela-Lena JI, Labrador-Herrera G, Vega-Pérez JM, Pachón J, Pachón-Ibáñez ME. In vitro activity of a library of piperazine derivatives against two clinical strain of colistin resistant Acinetobacter baumannii. 11th International Symposium on the Biology of Acinetobacter. (Septiembre de 2017). Sevilla, España. Tipo de participación: Póster. Publicación: P7-6. 3 4. Juan Domínguez-Herrera, Marta Carretero-Ledesma, Pilar Pérez-Romero, Jerónimo Pachón, Michael J. McConnell, Juan José Infante. A unique vaccine candidate against Acinetobacter baumannii based on lipopolysaccharide-deficient whole cells. 11th International Symposium on the Biology of Acinetobacter. (Septiembre de 2017). Sevilla, España. Tipo de participación: Póster. Publicación: P7-7. PUBLICACIONES ASOCIADAS A LA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN 1. Meritxell García-Quintanilla, Marina R. Pulido, Marta Carretero-Ledesma, and Michael J. McConnell. Vaccines for Antibiotic-Resistant Bacteria: Possibility or Pipe Dream?. Trends in Pharmacological Sciences. Volumen: 37. 143-152. Febrero 2016. 2. Mazzota, Sarah; Cebrero-Cangueiro, Tania; Vega-Holm, Margarita; Sanchez- Cespedes, Javier; AIELLO, Francesca; Fernández, Inmaculada; Carretero-Ledesma, Marta; Vega-Pérez, José; Smani, Younes; Pachón, Jerónimo; Iglesias-Guerra, Fernando; Pachón-Ibáñez, Mª Eugenia. Piperazin-derived thioureas against clinical isolates of colistin-resistant Acinetobacter baumannii. Synthesis and in vitro biological evaluation. Future Medicinal Chemistry. EN PREPARACIÓN. 4 5 INDICE Abreviaciones 10 INTRODUCCIÓN 13 1. Taxonomía y biología de Acinetobacter 14 1.1 Taxonomía 14 1.2. Biología de A. baumannii 16 1.2.1 Características de la membrana externa 17 1.2.2 Lipopolisacárido 18 1.2.3 Síntesis del lípido A 19 1.2.4 Importancia biológica del LPS 20 1.2.5 Implicaciones biológicas en A. baumannii por la pérdida del LPS 22 1.3 Patogénesis del microorganismo 23 1.3.1 La producción de biofilm 23 1.3.2 La motilidad en superficies semisólidas 25 1.3.3 La adquisición de hierro 25 1.3.4 La presencia de la OmpA en la membrana 26 2. Implicación clínica de A. baumannii 28 2.1 Importancia clínica 28 2.2 Manifestaciones clínicas e infecciones más frecuentes 29 2.2.1 Infecciones respiratorias 30 2.2.2 Bacteriemias 31 2.2.3 Infecciones del tracto urinario 31 2.2.4 Infecciones del sistema nervioso central 32 2.2.5 Otras infecciones 32 3. Resistencia antibiótica en A. baumannii 33 3.1. Perspectiva histórica del desarrollo de resistencias en A. baumannii y emergencia de cepas multirresistentes 33 3.2. Principales grupos de antibióticos utilizados como tratamiento de infecciones causadas por A. baumannii 36 3.2.1 Betalactámicos 36 3.2.2. Fluoroquinolonas 38 3.2.3 Aminoglucósidos 38 3.2.4 Tetraciclinas 39 3.2.5 Glicilciclinas. 40 3.2.6 Sulbactam 40 3.2.7 Rifamicinas 41 3.2.8 Polimixinas 41 6 INDICE 3.2.8.1 Colistina 42 4. Desarrollo de nuevas estrategias de prevención. Inmunoterapia 45 4.1. Potencial terapéutico de anticuerpos monoclonales. 46 4.2 Anticuerpos monoclonales humanizados 48 4.3 Anticuerpos en uso y desarrollo para el tratamiento de enfermedades infecciosas 50 4.4 Inmunoterapia para A. baumannii 53 5. Fundamento 55 HIPÓTESIS 57 Capítulo 1 58 Capítulo 2 58 OBJETIVOS 59 OBJETIVO GENERAL 60 OBJETIVOS ESPECÍFICOS POR CAPÍTULO 60 Capítulo 1 60 Capítulo 2 61 MATERIALES Y REACTIVOS 62 1. Material invariable 63 2. Material fungible 64 2.1 Material de laboratorio 64 2.2. Medios de cultivo 65 2.3. Antimicrobianos para estudios in vitro 65 2.4. Material para experimentación animal 67 2.5 Reactivos y Kits de experimentación 67 3. Material biológico 69 3.1 Cepas bacterianas 69 3.2 Línea celular en cultivo 70 3.3 Animales de experimentación 70 METODOLOGÍA 71 1. Aislamiento de cepas con mutación en LPS 72 2. Niveles de endotoxina 73 3. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diversos antibióticos 73 4. Estudio de permeabilidad de la membrana bacteriana 74 5. Curva de crecimiento en presencia de péptidos antimicrobianos 75 7 INDICE 6. Ensayos E-test de colistina 75 7. Ensayo de supervivencia 76 8. Curva de crecimiento 76 9. Curva de crecimiento en Mueller Hinton Broth y suero humano 77 10. Tiempo de generación 77 11. Determinación del índice de competencia 78 12. Producción de biofilm 79 13. Determinación de la CMI de desinfectantes 80 14. Determinación de la motilidad 80 15. Curvas de crecimiento en presencia del quelante de hierro 2,2'- Bipyridyl (Bip) 81 RESULTADOS 82 CAPÍTULO 1. Caracterización microbiológica de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y la dependencia a colistina 83 1. Aislamiento de cepas de A. baumannii resistentes a colistina y comprobación de la deficiencia en LPS 83 2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diversos antibióticos 87 3. Análisis de la permeabilidad de la membrana bacteriana 90 4. Estudio de la actividad de péptidos antimicrobianos frente a dichas cepas 91 5. Análisis del crecimiento en presencia de colistina mediante el ensayo E-Test 98 6. Efecto del sobrecrecimiento bacteriano de las cepas de A. baumannii deficientes en LPS en ausencia y en presencia de colistinA 100 7. Análisis del crecimiento monitorizado durante 24 horas en presencia y ausencia de colistina 101 CAPÍTULO 2. Caracterización del fenotipo de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y comparación con las cepas silvestres. 109 8. Estudio del crecimiento in vitro en medio enriquecido y suero humano 110 9. Caracterización del tiempo de generación 111 10. Estudio del índice de competencia in vitro e in vivo 112 11. Determinación de la producción de biofilm 113 12. Determinación de la CMI de diversos desinfectantes 114 13. Determinación de la motilidad 116 14. Determinación de la capacidad de crecimiento en condiciones de baja concentración de hierro 118 8 INDICE DISCUSIÓN 133 CAPÍTULO 1. Caracterización microbiológica de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y la dependencia a colistina 134 CAPÍTULO 2. Caracterización del fenotipo de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y comparación con las cepas silvestres. 136 CONCLUSIONES 141 CAPÍTULO 1 142 CAPÍTULO 2 142 REFERENCIAS 143 9 ABREVIACIONES Abreviaciones AAC: Acetiltransferasa ABMDR: A. baumannii multirresistentes ADN: Ácido desoxirribonucleico AFLP: Polimorfismos en la amplitud de fragmentos amplificados AMK: Amikacina AMP: Ampicilina ANT: Adenililtranferasa APH: Fosfotanferasa AZM: Azitromicina ARN: Ácido ribonucleico Bap: Proteína asociada al biofilm Bip: 2,2’-Bipyridyl BLEE: Betalactamasas de amplio especto BrEt: Bromuro de etidio CAZ: Ceftazidima CIP: Ciprofloxacino CST: Colistina CC: Clonal Complex CDR: Región Determinante de Complementariedad CI I, II, III: Clon Internacional I, II, III. CLSI: Clinical Laboratory Standards Institute D: Diferencia de susceptibilidad DO: Densidad Óptica ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay FEP: Cefepime 10 ABREVIACIONES GEIH: Grupo de Estudio de Infección Hospitalaria GEN: Gentamicina IPM: Imipenem IROMPs: Proteínas de Regulación del Hierro en la Membrana Externa LAL: Limulus Amebocyte Assay LB: Luria-Bertani LC-MS/MS: Cromatografía líquida- Espectrometría de masas LPS: Lipopolisacárido MAC: Complejo de ataque de membrana MBL: Metalobetalactamasas MDR: Multirresistencia MEM: Meropenem MHA: Mueller Hinton Agar MHB: Mueller Hinton Broth MLST: Multilocus Sequence Typing MoAb: Anticuerpo Monoclonal NucAb: Nucleasa de la Membrana Externa OMC: Complejos de la Membrana Externa Celular OMP: Proteinas de la Membrana
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