Tesis Doctoral

Caracterización de cepas de Acinetobacter baumannii que no producen lipopolisacárido, y su uso en el desarrollo preclínico de anticuerpos monoclonales terapéuticos

Marta Claudia Carretero Ledesma

Sevilla 2018

Programa Doctoral en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica

Departamento de Medicina

Univesidad de Sevilla

Director 1: Dr. Jerónimo Pachón Díaz

Director 2: Dr. Michael J. McConnell

PRODUCCIONES CIENTÍFICAS FRUTO DE LA TESIS DOCTORAL

Publicaciones

1. Meritxell García-Quintanilla, Marta Carretero-Ledesma, Patricia Moreno-Martínez, Reyes Martín-Peña, Jerónimo Pachón, Michael J. McConnell. Lipopolysaccharide loss produces partial colistin dependence and collateral sensitivity to azithromycin, rifampicin and vancomycin in Acinetobacter baumannii. International Journal of Antimicrobial Agents. Volumen: 46. 696 -702. Mayo 2015.

2. Marta Carretero-Ledesma, Meritxell García-Quintanilla, Reyes Martín-Peña, Marina R. Pulido1, Jerónimo Pachón and Michael J. McConnell. Phenotypic Changes Associated with Colistin Resistance due to Lipopolysaccharide Loss in Acinetobacter baumannii. Virulence. Abril 2018.

Comunicaciones a congresos

1. Marta Carretero-Ledesma, Meritxell García-Quintanilla, Jerónimo Pachón, Michael J. McConnell. Colistin dependence and phenotypic changes in Acinetobacter baumannii acquiring colistin resistance due to loss of lipopolysaccharide. European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID 2015), 25 - 28 Abril del 2015, Copenhagen, Dinamarca. Tipo de participación: Póster. Publicación: P0281.

2. Marta Carretero-Ledesma, Meritxell García-Quintanilla, Jerónimo Pachón and Michael J. McConnell. Loss of lipopolysaccharide produces alters growth, biofilm production, disinfectant susceptibility and motility in Acinetobacter baumannii. 10th International Symposium on the Biology of Acinetobacter. (Junio de 2015). Atenas, Grecia. Tipo de participación: Comunicación oral. Publicación: 0-10.

3. Cebrero-Cangueiro T, Mazzotta S, Carretero-Ledesma M, Iglesias-Guerra F, Jiménez-Baus A, Sánchez Céspedes J, Vega-Holm M, Smani Y, Candela-Lena JI, Labrador-Herrera G, Vega-Pérez JM, Pachón J, Pachón-Ibáñez ME. In vitro activity of a library of piperazine derivatives against two clinical strain of colistin resistant Acinetobacter baumannii. 11th International Symposium on the Biology of Acinetobacter. (Septiembre de 2017). Sevilla, España. Tipo de participación: Póster. Publicación: P7-6.

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4. Juan Domínguez-Herrera, Marta Carretero-Ledesma, Pilar Pérez-Romero, Jerónimo Pachón, Michael J. McConnell, Juan José Infante. A unique vaccine candidate against Acinetobacter baumannii based on lipopolysaccharide-deficient whole cells. 11th International Symposium on the Biology of Acinetobacter. (Septiembre de 2017). Sevilla, España. Tipo de participación: Póster. Publicación: P7-7.

PUBLICACIONES ASOCIADAS A LA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN

1. Meritxell García-Quintanilla, Marina R. Pulido, Marta Carretero-Ledesma, and Michael J. McConnell. Vaccines for Antibiotic-Resistant Bacteria: Possibility or Pipe Dream?. Trends in Pharmacological Sciences. Volumen: 37. 143-152. Febrero 2016.

2. Mazzota, Sarah; Cebrero-Cangueiro, Tania; Vega-Holm, Margarita; Sanchez- Cespedes, Javier; AIELLO, Francesca; Fernández, Inmaculada; Carretero-Ledesma, Marta; Vega-Pérez, José; Smani, Younes; Pachón, Jerónimo; Iglesias-Guerra, Fernando; Pachón-Ibáñez, Mª Eugenia. Piperazin-derived thioureas against clinical isolates of colistin-resistant Acinetobacter baumannii. Synthesis and in vitro biological evaluation. Future Medicinal Chemistry. EN PREPARACIÓN.

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INDICE

Abreviaciones 10

INTRODUCCIÓN 13

1. Taxonomía y biología de Acinetobacter 14

1.1 Taxonomía 14 1.2. Biología de A. baumannii 16 1.2.1 Características de la membrana externa 17 1.2.2 Lipopolisacárido 18 1.2.3 Síntesis del lípido A 19 1.2.4 Importancia biológica del LPS 20 1.2.5 Implicaciones biológicas en A. baumannii por la pérdida del LPS 22 1.3 Patogénesis del microorganismo 23 1.3.1 La producción de biofilm 23 1.3.2 La motilidad en superficies semisólidas 25 1.3.3 La adquisición de hierro 25 1.3.4 La presencia de la OmpA en la membrana 26 2. Implicación clínica de A. baumannii 28

2.1 Importancia clínica 28 2.2 Manifestaciones clínicas e infecciones más frecuentes 29 2.2.1 Infecciones respiratorias 30 2.2.2 Bacteriemias 31 2.2.3 Infecciones del tracto urinario 31 2.2.4 Infecciones del sistema nervioso central 32 2.2.5 Otras infecciones 32 3. Resistencia antibiótica en A. baumannii 33

3.1. Perspectiva histórica del desarrollo de resistencias en A. baumannii y emergencia de cepas multirresistentes 33 3.2. Principales grupos de antibióticos utilizados como tratamiento de infecciones causadas por A. baumannii 36 3.2.1 Betalactámicos 36 3.2.2. Fluoroquinolonas 38 3.2.3 Aminoglucósidos 38 3.2.4 Tetraciclinas 39 3.2.5 Glicilciclinas. 40 3.2.6 Sulbactam 40 3.2.7 Rifamicinas 41 3.2.8 Polimixinas 41

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INDICE

3.2.8.1 Colistina 42 4. Desarrollo de nuevas estrategias de prevención. Inmunoterapia 45

4.1. Potencial terapéutico de anticuerpos monoclonales. 46 4.2 Anticuerpos monoclonales humanizados 48 4.3 Anticuerpos en uso y desarrollo para el tratamiento de enfermedades infecciosas 50 4.4 Inmunoterapia para A. baumannii 53 5. Fundamento 55

HIPÓTESIS 57

Capítulo 1 58 Capítulo 2 58 OBJETIVOS 59

OBJETIVO GENERAL 60

OBJETIVOS ESPECÍFICOS POR CAPÍTULO 60

Capítulo 1 60 Capítulo 2 61 MATERIALES Y REACTIVOS 62

1. Material invariable 63

2. Material fungible 64

2.1 Material de laboratorio 64 2.2. Medios de cultivo 65 2.3. Antimicrobianos para estudios in vitro 65 2.4. Material para experimentación animal 67 2.5 Reactivos y Kits de experimentación 67 3. Material biológico 69

3.1 Cepas bacterianas 69 3.2 Línea celular en cultivo 70 3.3 Animales de experimentación 70 METODOLOGÍA 71

1. Aislamiento de cepas con mutación en LPS 72 2. Niveles de endotoxina 73 3. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diversos antibióticos 73 4. Estudio de permeabilidad de la membrana bacteriana 74 5. Curva de crecimiento en presencia de péptidos antimicrobianos 75

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INDICE

6. Ensayos E-test de colistina 75 7. Ensayo de supervivencia 76 8. Curva de crecimiento 76 9. Curva de crecimiento en Mueller Hinton Broth y suero humano 77 10. Tiempo de generación 77 11. Determinación del índice de competencia 78 12. Producción de biofilm 79 13. Determinación de la CMI de desinfectantes 80 14. Determinación de la motilidad 80 15. Curvas de crecimiento en presencia del quelante de hierro 2,2'- Bipyridyl (Bip) 81 RESULTADOS 82

CAPÍTULO 1. Caracterización microbiológica de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y la dependencia a colistina 83

1. Aislamiento de cepas de A. baumannii resistentes a colistina y comprobación de la deficiencia en LPS 83 2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diversos antibióticos 87 3. Análisis de la permeabilidad de la membrana bacteriana 90 4. Estudio de la actividad de péptidos antimicrobianos frente a dichas cepas 91 5. Análisis del crecimiento en presencia de colistina mediante el ensayo E-Test 98 6. Efecto del sobrecrecimiento bacteriano de las cepas de A. baumannii deficientes en LPS en ausencia y en presencia de colistinA 100 7. Análisis del crecimiento monitorizado durante 24 horas en presencia y ausencia de colistina 101 CAPÍTULO 2. Caracterización del fenotipo de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y comparación con las cepas silvestres. 109

8. Estudio del crecimiento in vitro en medio enriquecido y suero humano 110 9. Caracterización del tiempo de generación 111 10. Estudio del índice de competencia in vitro e in vivo 112 11. Determinación de la producción de biofilm 113 12. Determinación de la CMI de diversos desinfectantes 114 13. Determinación de la motilidad 116 14. Determinación de la capacidad de crecimiento en condiciones de baja concentración de hierro 118

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INDICE

DISCUSIÓN 133

CAPÍTULO 1. Caracterización microbiológica de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y la dependencia a colistina 134 CAPÍTULO 2. Caracterización del fenotipo de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y comparación con las cepas silvestres. 136 CONCLUSIONES 141

CAPÍTULO 1 142 CAPÍTULO 2 142 REFERENCIAS 143

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ABREVIACIONES

Abreviaciones

AAC: Acetiltransferasa

ABMDR: A. baumannii multirresistentes

ADN: Ácido desoxirribonucleico

AFLP: Polimorfismos en la amplitud de fragmentos amplificados

AMK: Amikacina

AMP: Ampicilina

ANT: Adenililtranferasa

APH: Fosfotanferasa

AZM: Azitromicina

ARN: Ácido ribonucleico

Bap: Proteína asociada al biofilm

Bip: 2,2’-Bipyridyl

BLEE: Betalactamasas de amplio especto

BrEt: Bromuro de etidio

CAZ: Ceftazidima

CIP: Ciprofloxacino

CST: Colistina

CC: Clonal Complex

CDR: Región Determinante de Complementariedad

CI I, II, III: Clon Internacional I, II, III.

CLSI: Clinical Laboratory Standards Institute

D: Diferencia de susceptibilidad

DO: Densidad Óptica

ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay

FEP: Cefepime

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ABREVIACIONES

GEIH: Grupo de Estudio de Infección Hospitalaria

GEN: Gentamicina

IPM: Imipenem

IROMPs: Proteínas de Regulación del Hierro en la Membrana Externa

LAL: Limulus Amebocyte Assay

LB: Luria-Bertani

LC-MS/MS: Cromatografía líquida- Espectrometría de masas

LPS: Lipopolisacárido

MAC: Complejo de ataque de membrana

MBL: Metalobetalactamasas

MDR: Multirresistencia

MEM: Meropenem

MHA: Mueller Hinton Agar

MHB: Mueller Hinton Broth

MLST: Multilocus Sequence Typing

MoAb: Anticuerpo Monoclonal

NucAb: Nucleasa de la Membrana Externa

OMC: Complejos de la Membrana Externa Celular

OMP: Proteinas de la Membrana Externa Celular

OMV: Vesículas de la Membrana Externa

PBP: Proteínas de Unión a la Penicilina

PBS: Buffer Fosfato Salino

PBST: Buffer Fosfato Salino con Tween

PBSTM: Buffer Fosfato Salino con Tween y Leche

PDR: Panresistentes

PNAG: Poli-N-acetil-b-(1-6)-Glucosamina

PMA: Forbol 12-Miristato 13-Acetato

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ABREVIACIONES

QRDR: Región de Determinación de Resistencia a Quinolonas

R: Resistente

RIF: Rifampicina

RPMI: Roswell Park Memorial Institute

S: Susceptible

SBT: Sulbactam

SDS: Dodecilsulfatosódico

SPF: Specific Pathogen Free

Tg: Tiempo de Generación

TGC: Tigeciclina

TIC: Ticarcilina

TSB: Tryptone Soya Broth

T6SS: Sistema de Secreción Tipo VI

Ufc: Unidades Formadoras de Colonia

VAN: Vancomicina

XDR: Extremadamente Resistentes

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INTRODUCCIÓN

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INTRODUCCIÓN

1. Taxonomía y biología de Acinetobacter

1.1 Taxonomía

El género Acinetobacter fué identificado por primera vez a principios del siglo XX (1). Durante este periodo, este conjunto de bacterias ha sido profundamente estudiado y ha ido adquiriendo distintas denominaciones a lo largo de los años. Por primera vez, en 1956, Brisou y Prévot propusieron la denominación actual Acinetobacter, que denota a este microorganismo como bacteria inmóvil (2), En 1971 se establecieron íntegramente las características del género (3) y no fue hasta 1976 que, bajo estudios fenotípicos de requerimientos nutricionales, se relacionó este género en la familia de bacterias Neisseriaceae (4, 5). Años más tarde surgieron nuevas técnicas de identificación de especies basadas en estudios de fenotipaje (6-8), serotipaje (9, 10), caracterización de las proteínas de la membrana externa (11-13), estudio de bacteriófagos (14, 15), estudio de ribotipos (16-19), estudio del ADN ribosómico (20, 21) y, fundamentalmente, diferentes estudios que han permitido establecer homologías en el ADN cromosómico (22-26). Estas técnicas han contribuido en el avance del conocimiento de este género y en 1986 dio lugar a una de las clasificaciones taxonómicas más robustas establecida en la historia de Acinetobacter, que diferenciaba un total de 12 genospecies o especies genómicas distintas, a algunas de las cuales les asignaron nombres formales tales como A. baumannii, A. calcoaceticus, A. haemolyticus, A. johnsonii, A. junii y A. lwoffii (27).

Estudios más recientes, adentrándonos en la década de los 90, proponen que el género se incluya dentro de la familia Moraxellaceae dentro del orden Gammaproteobacteria (28), y, gracias a la incorporación de nuevas técnicas de hibridación de ADN, han permitido ampliar la clasificación de nuevas especies genómicas válidas para el género Acinetobacter.

Sin embargo, en la actualidad sigue existiendo dificultad para diferenciar y dar nombre a las distintas especies del género. A fecha de mayo de 2018 se han descrito un total de 57 especies (29) (Tabla 1).

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INTRODUCCIÓN

Nombre de la especie Cepa de referencia Bibliografía A. albensis CCM 8611 (30) A. apis KACC 16906 (31) A. baumannii ATCC 19606 (27) A. baylyi DSM 14961 (32) A. beijerinckii DSM 22901 (33) A. bereziniae ATCC 17924 (34) A. bohemicus CCM 8462 (35, 36) A. boissieri DSM 29976 (37) A. bouvetii DSM 14964 (32) A. brisouii DSM 18516 (38) A. calcoaceticus ATCC 23055 (39, 40) A. celticus CCM 8700 (41) A. courvalinii CCM 8635 (42) A. dijkshoorniae CECT 9134 (43) A. dispersus CCM 8636 (42) A. equi DSM 27228 (44) A. gandensis DSM 28097 (45) A. gerneri DSM 14967 (32) A. grimontii DSM 14968 (32, 46) A. guangdongensis DSM 100979 (47) A. guillouiae ATCC 11171 (34) A. gyllenbergii DSM 22705 (33) A. haemolyticus ATCC 17906 (27) A. harbinensis DSM 100418 (48) A. indicus DSM 25388 (49) A. johnsonii ATCC 17909 (27) A. junii ATCC 17908 (27) A. kookii DSM 29071 (50) A. lactucae CCUG 68785 (51) A. lwoffii ATCC 15309 (27, 40) A. modestus CCM 8639, NIPH 236 (42) A. nectaris DSM 29975, CECT 8127 (37) A. nosocomialis CCM 7791, NIPH 2119 (52) A. pakistanensis DSM 100419 (36, 53) A. parvus DSM 16617 (54) A. pittii ATCC 19004 (52) A. populi CFCC 11170 (55) A. pragensis CNCTC 7530 (56) A. proteolyticus CCM 8640 (27) A. puyangensis CFCC 10780 (57) A. qingfengensis CFCC 10890 (58) A. radioresistensis DSM 6976 (59) A. rudis CECT 7818 (60) A. schindleri DSM 16038 (61) A. seifertii CCM 8535 (62) A. soli DSM 22956 (63) A. tandoii DSM 14670, DSM 14970 (32) A. tjernbergiae DSM 14971 (32) A. towneri DSM 14962 (32) A. ursingii DSM 16037 (61) A. variabilis CCM 8555 (64) A. venetianus ATCC 31012 (65, 66) A. vivianii CCM 8642 (42) A. colistiniresistens CCM 8641, CCUG 67966 (67) A. defluvii CCTCC AB 2016203, KCTC 52503 (68) A. halotolerans JCM 31009, KACC 18453 (69, 70) A. larvae ACCC 19936, JCM 31367 (71)

Tabla 1. Taxonomía actual del género Acinetobacter

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INTRODUCCIÓN

En particular las especies A. calcoaceticus, A. baumannii, gen.sp. 3 y gen.sp. 13TU descritas por Tjernber y Ursing (72) resultaron muy difíciles de distinguir por métodos genómicos de identificación y fueron diferenciadas basándose únicamente en características fenotípicas, lo que llevó a agruparlas en un único complejo denominado A. calcoaceticus-baumannii complex (72) para referirse a estas cuatro especies, cuyo uso sigue estando muy extendido en la clínica actual. Un estudio posterior, en 2011, consigue diferenciar estas cuatro especies, asignando el nombre formal de A. pittii y A. nosocomialis a las antiguas especies gen.sp. 3 y gen. Sp 13 TU respectivamente (52). A pesar de todas estas controversias, Acinetobacter es en la actualidad un género bien definido. La especie de mayor importancia en la práctica clínica es A. baumannii, asociada principalmente a brotes de infecciones nosocomiales y es, por tanto, en la que vamos a centrarnos en este trabajo.

1.2. Biología de A. baumannii

El género Acinetobacter comprende organismos unicelulares gram negativos, de un tamaño que oscila entre 1 y 2,5 µm de longitud, su morfología es variable a lo largo del ciclo de reproducción, adquiriendo una forma bacilar durante la fase de crecimiento exponencial y una forma más coloidal en la fase estacionaria, agrupándose de manera diploide o incluso en cadenas de longitud variable en esta fase.

Todas las especies de este género son inmóviles, incoloros, encapsulados, aerobios estrictos, oxidasa e indol negativo, catalasa positivos, no fermentadores, incapaces de reducir nitrilos que presentan un contenido de CG en el ADN del 39% a 47% (1). La mayoría de ellas son metabólicamente versatiles y se pueden cultivar fácilmente en medios microbiológicos simples, que contenga amonio o nitratos y una única fuente de carbono que puede ser lactato, acetato o piruvato. Se tratan de bacterias mesófilas cuyo rango óptimo de temperatura está en torno los 37ºC en bacterias clinicamente relevantes, en cuanto a las bacterias ambientales pueden preferir temperaturas más bajas (73). Esta versatilidad metabólica confiere a este género la capacidad de ubicuidad y de sobrevivir a las condiciones ambientales. Se han encontrado especies de Acinetobacter en muestras de suelo y agua superficial (39). Si bien, A. baumannii, a pesar de poder encontrarse en el hábitat natural (74), suele presentarse como patógeno en el organismo humano y dirigirse fundamentalmete a los tejidos húmedos del huésped, como las membranas mucosas o areas de la piel expuestas al exterior ya sean heridas o lesiones. No suele encontrarse en la microflora habitual de la piel; sin

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INTRODUCCIÓN embargo, se ha encontrado un porcentaje considerable en muestras de personas en la comunidad (75).

En cuanto a la estructura celular de A. baumannii, como todas las bacterias gram negativas, se caracterizan por tener:

-Una envoltura o pared celular compuesta por la membrana interna o plasmática, que consiste en una doble capa de fosfolípidos impermeable a moléculas polares que regula el paso de nutrientes, metabolitos y macromoléculas. -Un espacio periplasmático, delimitado por dos membranas que consiste en un entorno acuoso compuesto principalmente de proteínas y peptidoglucanos. Este espacio es responsable de la forma y estabilidad osmótica del microorganismo. -Una membrana externa, que es la capa más externa de la estructura del microorganismo, se encuentra en contacto con el medio exterior, por lo que sus características son cruciales en la supervivencia de la bacteria en distintos ambientes, así como en su virulencia y patogenia por lo que será nuestro foco de estudio en este trabajo.

1.2.1 Características de la membrana externa

La membrana externa o pared celular de las bacterias gram negativa negativas está formada por una bicapa lipídica asimétrica. La cara interna tiene una composición lipídica muy parecida a la membrana citosólica, formada fundamentalmente de fosfolípidos y la cara externa cuyo componente principal es el lipopolisacárido (LPS) (76, 77) (Figura 1).

En esta membrana también encontramos inmersa una gran cantidad de proteínas que le confieren la permeabilidad y permiten el intercambio de solutos con el medio exterior, así como la protección ante la entrada de toxinas, enzimas degradativas y detergentes. Podemos encontrar estructuras diferentes como proteínas integrales de membrana, con plegamiento antiparalelo en forma de β-barril en su totalidad, tal como la proteína OmpA que tiene muy alta expresión en la membrana de Acinetobacter; porinas multiméricas, que regulan el paso de moléculas hidrofílicas y facilitan el paso de diversas sustancias, incluidos los antibióticos β-lactámicos; así como lipoproteínas fijadas al péptidoglucano periplasmático. Además, existen proteínas cuya síntesis es fuertemente inducida en caso de ser necesario tales como porinas, receptores específicos de membrana que permiten la difusión de solutos de mayor peso molecular, como el caso de la transferrina, la lactoferrina, la hemoglobina y la mayoría

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INTRODUCCIÓN de los complejos férrico-sideróforo que permiten la captación de hierro (78), componentes que forman distintos sistemas de exportación de proteínas a la membrana, proteínas implicadas en la biogénesis de apéndices extracelulares que incluye el pili tipo IV que es un importante factor de virulencia en este género (79) y enzimas tales como la fosfolipasa A (80).

Todas estas peculiaridades, confieren a la membrana externa un papel fundamentalmente protector frente al medio exterior que le dota de gran resistencia y le ofrece la facilidad de sobrevivir por periodos prolongados de tiempo en condiciones adversas.

Figura 1. Estructura de las envolturas de una bacteria gram negativa. En la parte inferior tenemos a la membrana citoplasmática. Envolviéndola, está la pared de peptidoglucano y finalmente la membrana externa. Los cuadrados amarillos con colas de hexágonos rojos y morados son los lipopolisacáridos. Fuente: Universidad a partir del Brock, Biología de los Microorganismo 2004.

1.2.2 Lipopolisacárido

El lipopolisacárido (LPS), como se citó anteriormente, es el componente mayoritario en la capa externa de la membrana externa de las bacterias gram negativas. Es una molécula aniónica muy voluminosa, compuesta por tres dominios estructurales: el lípido A o endotoxina, el núcleo o core y las cadenas laterales de oligosacáridos o antígeno-O (81) (Figura 2).

El lípido A es la parte biológicamente activa de la moléculadel LPS. Consiste en un disacárido de dos glucosaminas y dos ácidos grasos, responsable del reconocimiento de los receptores del huésped y por tanto desencadenar la respuesta inmune. Debido a su actividad endotóxica, el lípido A contribuye en la toxicidad de la bacteria y,

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INTRODUCCIÓN durante mucho tiempo, ha sido considerado como una estructura esencial para la viabilidad de las bacterias gram negativas (82).

El núcleo o core es un oligosacárido formado por dos subdominios, el núcleo externo y la zona interna unida covalentemente al lípido A (83).

El antígeno-O es la región del LPS más expuesta al medio externo, por lo que sus características son esenciales para la supervivencia de la bacteria. Se trata de un polímero de oligosacáridos, de longitud variable y que es considerado receptor para bacteriófagos. Contiene los determinantes antigénicos responsables de la especificidad serológica del microorganismo (82, 84).

Figura 2. Estructura química del lipopolisacárido de una bacteria gram negativa. Fuente: Universidad de Granada a partir del Brock, Biología de los Microorganismos 2004.

1.2.3 Síntesis del lípido A

Los genes que codifican las enzimas responsables de la síntesis del lípido A se localizan dispersos en el genoma bacteriano y, en general, no se encuentran sujetos a ningún tipo de regulación (82, 85). Las enzimas implicadas en la síntesis del lípido A han sido identificadas y sus correspondientes genes han sido clonados y expresados en primer lugar en E. coli (86).

Generalmente, las enzimas responsables de la síntesis del lípido A se encuentran muy conservadas en las bacterias gram negativas, aunque se han descrito algunas heterogeneidades en cuanto al grado de acilación y la longitud de los ácidos grasos que constituyen la molécula de lípido A (86). En la Figura 3 se muestra la ruta de biosíntesis del lípido A descrita en E. coli. Se conocen 9 enzimas constitutivas implicadas en la síntesis del lípido A, la cual tiene lugar en la cara citoplasmática de la membrana interna. Las primeras reacciones de la ruta están catalizadas por tres enzimas que se consideran esenciales en el proceso de biosíntesis del lípido A y, por tanto, fundamentales en la integridad de la estructura del LPS. La primera es una

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INTRODUCCIÓN aciltransferasa, Lpx A, seguida de una desacetilada, Lpx C y de nuevo una aciltransferasa, Lpx D.

Figura 3. Ruta constitutiva de la biosíntesis del lípido A y la parte Kdo2 perteneciente al núcleo del LPS en E. coli. Representación en color rosa de las enzimas que regulan cada paso de la ruta. Fuente: Raetz CR, et al. (2009) (87)

1.2.4 Importancia biológica del LPS

El LPS, al ser el componente mayoritario y más voluminoso de la membrana externa, ha sido de gran interés y profundamente estudiado en A. baumannii y en las bacterias gram negativas en general.

En primer lugar, la robusta estructura que presenta esta molécula confiere a la membrana y a la estructura celular en general una gran integridad y consistencia que permite actuar frente moléculas y compuestos hidrófobos, como disolventes orgánicos y detergentes, haciéndose resistente a ellos (77). Además, esta estructura voluminosa la convierte en una diana accesible y le permite enmascarar otros componentes de la membrana externa. El LPS actuando en sinergia junto a los exopolisacáridos capsulares, bloquean el acceso del complemento humano a la pared celular promoviendo la resistencia de las bacterias frente a la respuesta inmunitaria del huésped (88).

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INTRODUCCIÓN

Una peculiaridad de gran importancia es la capacidad de adherirse a las células del epitelio. En A. baumannii, el LPS, junto al pili de superficie que interactúa con las células de distintos epitelios humano, promueve la adherencia a las células del huésped y permiten el primer paso de la colonización por parte del patógeno (89).

Sin duda, el dominio de más interés que convierte a esta molécula en el principal factor de virulencia de las bacterias gram negativas es el lípido A. Se ha descrito que la endotoxina es responsable de producir toxicidad letal en modelos experimentales murinos y fiebres altas en conejos (90) y, probablemente, es también la causante de los síntomas clínicos que se producen en los pacientes con sepsis mediada por A. baumannii.

Otra actividad producida durante la colonización por microorganismos gram negativos, causada por el LPS y que tiene gran relevancia en el ámbito clínico, es la potente activación de macrófagos y la producción de gran cantidad de citoquinas en el huéspedque desencadena una respuesta inflamatoria sistémica en el mismo (91, 92). En un modelo de ratón se ha demostrado que el LPS es el principal componente inmunoestimulador que activa la respuesta inflamatoria en una neumonía (89).

La estructura del LPS en la membrana ha sido considerada durante muchos años como esencial en la supervivencia y el crecimiento de la bacteria, particularmente en el ensamblaje de la membrana. Estudios genéticos realizados en E. coli han localizado al gen principal de la síntesis del lípido A, el gen lpxA, formando parte de un operón complejo, llamado operón de síntesis macromolecular II en el que se encuentran también genes vitales para la bacteria (93), lo que reafirma su naturaleza esencial. Sin embargo, estudios posteriores, han puesto de manifiesto que la estructura del lípido A no es esencial para todas las bacterias gram negativas. Así, en los últimos años, se han descrito una serie de mutaciones estables que producen la pérdida completa del LPS en la membrana externa en tres especies bacterianas: Moraxella catarrhalis (94), Neisseria meningitidis (95) y, por último, en 2009, A. baumannii (96, 97).

Las cepas mutantes deficientes en LPS en su membrana, se obtuvieron al ser sometidas a colistina. Este descubrimiento ha sido de alta trascendencia en la historia evolutiva de estas especies bacterianas y en la clínica hospitalaria, ya que la pérdida del LPS en la membrana externa ha supuesto la pérdida de una diana fundamental en el mecanismo de acción de la colistina. Este suceso es de gran interés y conocer el comportamiento, fisiología y patogenia de estos mutantes forma parte de los objetivos de este trabajo, por lo que nos adentraremos a fondo más adelante.

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INTRODUCCIÓN

1.2.5 Implicaciones biológicas en A. baumannii por la pérdida del LPS

En anteriores estudios acerca de las peculiaridades de la membrana externa de A. baumannii tras la pérdida del LPS se han observado diversas diferencias en comparación con la membrana de las cepas silvestres. Por microscopía electrónica de transmisión se ha estudiado la estructura de la membrana externa de cepas que han adquirido la resistencia a colistina mediante la pérdida de LPS en comparación con las cepas silvestres sensibles y se han visualizado diferencias entre ambas membranas (97). Se ha demostrado que en estas cepas deficientes en LPS existe una modificación en la expresión de genes en comparación con el transcriptoma de las cepas silvestres que dan lugar a que la membrana externa esté formada por compuestos diferentes que compensan la falta del LPS. Así, se han identificado los genes implicados en la biosíntesis y el transporte de componentes que forman la membrana externa y que se encuentran sobreexpresados. Concretamente, existe un aumento de la expresión de genes que codifican componentes del sistema de transporte Lol (lolA, lolB, lolD, loE) que se están implicados en el transporte ABC de la membrana interna, el transporte periplasmático y el transporte en la membrana externa entre otros. También se ha visto un aumento en la expresión de genes encargados en la biosíntesis y el transporte del exopolisacárido poly-β-1,6-N- acetylglucosamine (PNAG) asociado a la formación de la matriz del biofilm y a la estabilidad de la membrana externa. Otro tipo de transporte que se está sobreexpresando en estos mutantes es el transporte o translocación de fosfolípidos, donde se encuentra implicado el transporte retrógrado Mla que produce el aumento de fosfolípidos en la membrana externa. Además, se ha detectado la inducción de genes implicados en la respuesta a situaciones de estrés celular como un posible mecanismo de defensa a la falta de LPS y de sistemas asociados al flujo de compuestos tóxicos y antibióticos hacia el exterior celularlo que, a su vez, podría aumentar la permeabilidad de la membrana y la susceptibilidad a otros antibióticos como se ha descrito anteriormente. No obstante, muchos otros genes, implicados fundamentalmente en procesos de secreción en la membrana, se encuentran disminuidos en su expresión, como por ejemplo el sistema secreción tipo VI (T6SS) y genes que codifican apéndices superficiales como adhesinas, hemaglutinina filamentosa o proteínas fimbriales que producen el pili los cuales también forman parte del biofilm bacteriano (98).

Otro ejemplo de los cambios estructurales producidos en la membrana en cepas mutantes de microorganismos gram negativos deficientes en LPS, en este caso en un estudio realizado en la bacteria Neisseria meningitidis, es una menor expresión de

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INTRODUCCIÓN receptores de hierro en la membrana externa como lactoferrina y transferrina que dan lugar a una mayor sensibilidad de estas cepas respecto a las cepas silvestres a condiciones de escasez de hierro (99).

1.3 Patogénesis del microorganismo

A. baumannii se considera uno de los microorganismos menos virulentos dentro de los bacilos gram negativos, en comparación con Pseudomonas aeruginosa o Klebsiella pneumoniae (100). Este microorganismo, a pesar de poseer múltiples factores de virulencia, tan sólo produce infecciones en huéspedes que tienen el sistema inmunitario debilitado, en la mayoría de los casos. Como se mencionó anteriormente, la mayoría de infecciones y muertes asociadas a A. baumannii son de origen nosocomial y se producen en pacientes gravemente enfermos por otras causas.

A pesar de todo esto, este microorganismo ha sido clasificado como un patógeno importante desde el punto de vista clínico, debido a la diseminación global de cepas con resistencia y multirresistencia a la mayoría de las clases de antibióticos de uso clínico, así como a las numerosas infecciones que se producen en hospitales.

Recientemente, se han elaborado estudios muy completos que abordan los factores que contribuyen a la patogénesis de este microorganismo. Estos estudios cuentan con la disponibilidad de secuencias completas del genoma del microorganismo, de herramientas moleculares novedosas que permiten manipular el genoma bacteriano y de modelos animales de infección que han facilitado la identificación de aquellos factores o peculiaridades de A. baumannii que juegan un papel importante en la persistencia e infección del patógeno (101).

Los principales mecanismos de virulencia estudiados en A. baumannii se detallan a continuación

1.3.1 La producción de biofilm

El biofilm bacteriano se define como una comunidad de múltiples células bacterianas asociadas a una superficie biótica o abiótica, dispuesta en una estructura tridimensional compleja en contacto íntimo unas con otras y encerrada en una matriz polimérica extracelular producida por ellas mismas, que puede estar compuesta por hidratos de carbono, ácidos nucleicos, proteínas y otras macromoléculas (102). La

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INTRODUCCIÓN producción de biofilm confiere a las bacterias una serie de ventajas respecto a sus homólogos de forma planctónica. Esta estructura proporciona a la bacteria una organización estructural que las hace resistentes a los mecanismos de defensa del huésped tales como opsonización, lisis por complemento y fagocitosis (103). Se ha demostrado también que les permite sobrevivir durante más tiempo en medios no hidratados y con nutrientes limitados (104). Otros estudios revelan que puede conferir a la bacteria gran resistencia a algunos antimicrobianos. De esta forma, en 2008, Lee et al. mostraron una relación directa entre la expresión de la betalactamasa PER-1 en cepas clínicas de A. baumannii multirresistentes y su capacidad de producir biofilm sobre células epiteliales (105). Todas estas características contribuyen a la supervivencia de estos organismos y a su mayor diseminación en el medio hospitalario.

La formación de biofilm bacteriano puede estar influenciada por diferentes factores, como la disponibilidad de nutrientes, los componentes superficiales de la membrana como el pili y apéndices bacterianos, proteínas de la membrana externa o adhesinas, la detección de quorum sensing, así como secreciones macromoleculares entre las que se encuentran polisacáridos y ácidos nucleicos (106). Complejas redes bioquímicas regulan la expresión de productos relacionados con la generación de biofilm en respuesta a señales del medio externo (101).

A. baumannii tiene la capacidad de adherirse a muchos tipos de superficies inertes y biológicas, entre las que se encuentran los epitelios humanos o filamentos de Candida albicans. Esta adherencia es muy variable en los diferentes aislados clínicos que se han estudiado de A. baumannii (107). Generalmente, durante la colonización de cualquier superficie, las bacterias forman biofilm.

Varios estudios han observado cierta relación entre la producción de biofilm y la capacidad de adhesión de las bacterias a las células epiteliales hospedadoras. Se han identificado distintos mecanismos genéticos y celulares de A. baumannii relacionados con la capacidad de formar biofilm y de adherirse a superficies biológicas e inertes. Tomaras et al. (108). demostraron que la capacidad de adhesión y de formar pili y biofilm en la cepa ATCC 19606 estaban relacionados entre sí y dependían de la expresión de un único gen que a su vez era controlado por un sistema de regulación inducido según las características de la superficie en las que se encontraba (109, 110). Sin embargo, no se ha observado una relación directa entre la capacidad de adhesión de las bacterias a células epiteliales y la formación de biofilm y se ha visto variación entre las distintas especies de Acinetobacter (111). Otros estudios abogan diversos mecanismos implicados en la capacidad de producir biofilm bacteriano no relacionados

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INTRODUCCIÓN con el pili, entre los que se encuentra la proteína asociada al biofilm (Bap) implicada en las interacciones célula-célula (112, 113), la producción de poli- β-1,6-N- acetilglucosamina y los sistemas de O-glicosilación que, por tanto, también podrían estar implicados en la virulencia de la especie (114, 115).

1.3.2 La motilidad en superficies semisólidas

A. baumannii ha sido descrita desde el inicio como una bacteria no móvil debido a que no presenta flagelo en su forma silvestre (2). Sin embargo, se sabe que esta especie se disemina rápidamente por las superficies y se ha comprobado que algunas cepas tienen la capacidad de moverse en la superficie de medios semi-sólidos.

Recientemente, se han descrito otros tipos de motilidad no dependientes del flagelo para el desplazamiento, que son los mediados por otros componentes de la bacteria. En este grupo se encuentra el Twitching, el Sliding y el Gliding (116). Los estudios confirman que A. baumannii tiene la capacidad de desplazarse mediante el mecanismo deTwitching, conocido como un proceso de desplazamiento basado en la extensión y retracción de pili tipo IV, que está presente en A. baumannii (117, 118). La capacidad de motilidad en A. baumannii está muy influenciada por las condiciones del medio externo. Se han realizado estudios in vitro en los que sólo se produce motilidad en medios semisólidos y esta capacidad va disminuyendo al aumentar la solidez del medio (118). Además, factores como la disponibilidad de hierro libre en el medio (118), la densidad celular o la luz también influyen significativamente sobre la motilidad (117).

En principio, tendría sentido que las bacterias capaces de establecer movimiento a lo largo de una superficie posean mayor virulencia que las bacterias inmóviles. De hecho, son numerosos los artículos que clasifican esta capacidad como un factor de virulencia en el patógeno en cuestión (117). Sin embargo, actualmente no existen estudios que puedan esclarecer esta cuestión.

1.3.3 La adquisición de hierro

Normalmente en los medios biológicos y en el hábitat humano existe una importante escasez de hierro, ya que este ión es en su mayoría secuestrado por quelantes de hierro internos como hemoglobina, lactoferrina y transferrina. Con el fin de evitar efectos citotóxicos debido a la presencia de hierro libre y para el control de infecciones

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INTRODUCCIÓN microbianas a través de mecanismos no específicos, esta escasez es más evidente cuando se tratan de tejidos afectados o patológicos (119, 120). Puesto que se conoce que el hierro férrico es un ión fundamental para el crecimiento bacteriano, se esperaría que aquellas bacterias con mayor capacidad para captar el hierro del medio posean ventajas para sobrevivir en nichos con bajos contenido en hierro y por tanto adquieran mayor virulencia.

La mayoría de las bacterias aerobias han desarrollado sistemas de alta afinidad de captación de hierro que habitualmente están basados en procesos de producción, emisión al medio y receptación de quelantes de hierro unidos al ión férrico conocidos como sideróforos (121). La escasez de hierro en forma férrica en el medio estimula la producción de sideróforos. Se conoce que A. baumannii puede adquirir iones en estado férrico a través de sideróforos, siendo la acinetobactina el sistema mejor caracterizado (122, 123). Existen evidencias según un estudio realizado en la cepa ATCC 19606 de que las funciones de biosíntesis y transporte del sistema mediado por la acinetobactina en A. baumannii juega un papel fundamental en la capacidad de persistencia y de virulencia en el organismo hospedador (124).

1.3.4 La presencia de la OmpA en la membrana

El factor de virulencia mejor caracterizado en A. baumannii hasta la fecha es la proteína de membrana externa OmpA. Son numerosos los estudios en los que se demuestra que la proteína OmpA está implicada en la mayoría de los mecanismos de virulencia que se han citado anteriormente, como la formación de biofilm, la adherencia de células epiteliales y colonización del organismo hospedador (110), lo cual proporciona a este patógeno una alta persistencia y supervivencia (125). En uno de los estudios más destacados sobre la contribución de OmpA en la virulencia de A. baumannii se muestra la capacidad de inducir apoptosis en las células epiteliales que presentan estas proteínas en caso de infección (126). Además, hay evidencias de que la proteína OmpA es la responsable de inhibir la vía alternativa del complemento, siendo ésta una vía fundamental de la respuesta inmune innata que permite la lisis bacteriana en suero humano (127), provocando así la persistencia de la bacteria.

Debido a las múltiples funciones de OmpA en la patogénesis de A. baumannii, constituye una diana atractiva para el desarrollo de nuevos tratamientos y estrategias tanto preventivas como terapéuticas y ha dado lugar a estudios en los que se aplica esta proteína como principal mediador en la inmunidad activa y pasiva para prevenir

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INTRODUCCIÓN infecciones causadas por cepas de A. baumannii resistentes a antibióticos (128).

Existen otras características propias de la especie implicadas en mecanismos de virulencia, como la presencia del LPS, concretamente del lípido A, como se detalla en el apartado anterior. Se han encontrado también muchas otras particularidades que le proporcionan ciertas ventajas en su desarrollo y aunque han sido menos estudiadas, también son consideradas mecanismos de virulencia. Se puede citar, por ejemplo, la capacidad de quorum sensing que se describe como un mecanismo regulador generalizado, en bacilos gram negativos, implicado en importantes funciones bacterianas, tales como formación de biofilm y biosíntesis de enzimas, antibióticos y factores de virulencia extracelulares (129); las vesículas de membrana externa (OMVs, del inglés outer membrane vesicules), compuestas por LPS y proteínas de membrana externa, son liberadas durante el crecimiento celular y se ha observado que participan en el quorum sensing y transportan factores de virulencia como OmpA. Estas vesículas inhiben la maduración de los macrófagos y transfieren material genético. Además, en un estudio realizado en nuestro grupo, se ha observado mayor supervivencia en ratones que han sido inmunizados con OMVs, por lo que estas vesículas también muestran protección en modelo de ratón (130). Otro factor que podría contribuir en el crecimiento celular así como a la resistencia de la bacteria frente las defensas del huésped son las proteínas de unión a la penicilina, penicillin binding proteins (PBPs) que son enzimas que catalizan la síntesis de peptidoglucano (131).

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INTRODUCCIÓN

2. Implicación clínica de A. baumannii

2.1 Importancia clínica

A. baumannii es considerada, actualmente, la especie de mayor importancia clínica en el género. Esto se debe principalmente a dos características microbiológicas con implicaciones epidemiológicas importantes en el entorno hospitalario.

En primer lugar, destaca la capacidad de resistir en condiciones ambientales adversas durante periodos prolongados de tiempo. Una característica común del género Acinetobacter es que se puede encontrar tanto en seres vivos como en cualquier tipo de objeto inanimado, húmedo o seco (40), donde puede sobrevivir durante días (132, 133). Esta gran resistencia a sobrevivir ante condiciones desfavorables se debe a su habilidad para utilizar diferentes fuentes de carbono en su metabolismo (134) que hace que sea capaz de sobrevivir más de 25 días en superficies secas (132, 133), mientras que otras especies, como A. lwoffi, sobreviven unos 7 días (135), incluso otros bacilos gram negativos, como Pseudomonas aeruginosa o E. coli sólo son capaces de sobrevivir alrededor de 24 horas (136). La capacidad de persistir a la desecación depende también de la procedencia del aislado. Se ha visto que las cepas procedentes de aislados clínicos son más resistentes que cepas estándares de la American Type Culture Collection (ATCC) (132), y que cepas de orígenes de fuentes secas sobreviven mejor que las de fuentes húmedas (137). Esta propiedad permite la presencia de reservorios duraderos de A baumannii en todo tipo de materiales quirúrgicos y superficies hospitalarias en general.

La segunda característica de A. baumannii que explica esta implicación epidemiológica es la elevada capacidad de desarrollar patrones de resistencia ante diferentes tipos de antimicrobianos. Esta habilidad es debida en parte a la alta ubicuidad de hábitat, ya que a lo largo de toda su evolución, esta especie bacteriana ha sido expuesta a gran diversidad de organismos productores de todo tipo de antibióticos que se conoce que existen en los distintos entornos naturales (138), especialmente en el ámbito hospitalario, donde el uso de antibióticos de amplio espectro se encuentra en continuo aumento. Esta habilidad de rápida adaptación a medios con elevada presión antimicrobiana, que no poseen otras bacterias oportunistas potenciales, ha permitido a lo largo de la evolución de la especie el surgimiento de cepas resistentes a los antibióticos usualmente utilizados en clínica frente a infecciones causadas por bacterias gram negativas. A continuación, aparecieron cepas multirresistente con la

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INTRODUCCIÓN imposibilidad de ser tratadas con los principales antibióticos conocidos y disponibles. Este hallazgo ha desembocado en la situación actual, donde la emergencia de cepas multirresistentes y panresistentes, que incluyen resistencias a todos los antibióticos conocidos, siguen en continuo aumento (139-142) siendo necesario el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas para el tratamiento de infecciones causadas por este tipo de cepas bacterianas cada vez más frecuentes.

La propensión a adquirir resistencia a diferentes antimicrobianos, junto al uso extendido de éstos en el ámbito nosocomial, ha permitido la inminente difusión de cepas de A. baumannii resistentes a la mayoría de los antimicrobianos conocidos, incluso a todos, produciéndose con alta frecuencia, brotes de infección nosocomial originada por patógenos multirresistentes de A. baumannii.

Estas dos características microbiológicas son las principales razones por las que seleccionamos este microorganismo como objeto de estudio en este trabajo y, a su vez, se empleará como plataforma biológica para tratar de ralentizar o solventar esta problemática de la resistencia frente a antimicrobianos y desarrollar nuevas alternativas terapéuticas con mejores proyecciones para un futuro incierto en el contexto de resistencias bacterianas a antibióticos.

2.2 Manifestaciones clínicas e infecciones más frecuentes

La característica de ubicuidad en A. baumannii genera frecuentemente colonización en diferentes superficies epiteliales humanas, tanto de pacientes hospitalizados como de individuos sanos, sin necesidad de originar infección activa (143, 144). Es por tanto, habitual encontrar aislados de esta especie bacteriana en diversas muestras biológicas como secreciones respiratorias, superficies de heridas o en la orina. Por esta razón, es fundamental que se realice siempre una valoración clínica correcta de las muestras biológicas con la precaución de evitar tratamientos innecesarios que produzcan daños en el paciente y acentúen la problemática de la resistencia antibiótica.

A. baumannii puede causar infecciones en cualquier sistema, aparato u órgano del huésped, particularmente cuando éste se ve sometido a maniobras invasivas que provocan disrupción de las barreras de defensa naturales (145).

Aunque se han descrito casos esporádicos de infecciones comunitarias por este microorganismo (146, 147), la mayoría de las infecciones que se produce por A.

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INTRODUCCIÓN baumannii son de origen nosocomial, especialmente en las Unidades de Cuidados Intensivos (UCIs), que son en las que nos vamos a centrar en este trabajo. Las más frecuentes son, por este orden: infecciones del tracto respiratorio, bacteriemia, infección del tracto urinario, infección de la herida quirúrgica y meningitis postquirúrgica (145, 148).

2.2.1 Infecciones respiratorias

Las infecciones de tracto respiratorio, concretamente la neumonía y la traqueobronquitis, son las infecciones nosocomiales más frecuentemente causadas por A. baumannii (1, 72, 145). Se ha referido en varios estudios de epidemiología que este microorganismo ha constituido hasta un 5% de todas las neumonías de origen nosocomial. Los pacientes ingresados en la UCI que reciben ventilación mecánica son el grupo de mayor riesgo en este tipo de infecciones (138, 149), aumentando el porcentaje de incidencia hasta en un 27% (149, 150). También presentan riesgo los pacientes que han sufrido una cirugía previa y enfermedad pulmonar subyacente, aquellos con propensión a la aspiración de secreciones, la traqueostomía, la intubación orotraqueal y el uso previo de terapia antibiótica (72, 151). La neumonía nosocomial por A. baumannii suele aparecer en los dos lóbulos pulmonares y puede desarrollar complicaciones como derrame pleural, cavitación y fístula broncopleural. Además, en un 12% de los casos, suele acompañarse de bacteriemia general, siendo la neumonía el foco clínico más frecuente de la misma en general (145).

Diferentes estudios epidemiológicos han determinado que A. baumannii es la quinta causa de neumonía de origen nosocomial, por detrás de P. aeruginosa, principalmente en pacientes ingresados en UCIs (152). Además esta enfermedad suele tener muy mal pronóstico, con una mortalidad atribuible en torno al 40% en los pacientes que presentan ventilación mecánica, tal y como se observó en un estudio realizado por Garnacho et al. (153). No obstante, existen actualmente ciertas controversias sobre el impacto de este patógeno como agente etiológico. Recientemente, se han comunicado resultados contradictorios respecto a la mortalidad atribuida a los pacientes con neumonía que reciben ventilación mecánica, es decir la mortalidad a causa de la infección por este patógeno o consecuentemente por esta maniobra. Revisiones relativamente recientes han descrito una mortalidad atribuible del 8-23% por neumonía nosocomial causada por A. baumannii (154, 155) como agente patógeno y del 10-46% por neumonías asociadas a la ventilación mecánica (156, 157).

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INTRODUCCIÓN

2.2.2 Bacteriemias

La bacteriemia es la segunda infección nosocomial más frecuente producida por A. baumannii (138). El foco clínico más frecuente suele ser la neumonía (158), seguido de las infecciones causadas por los catéteres intravenosos; otros focos menos frecuentes son las infecciones en el tracto urinario, las infecciones de piel y tejidos blandos, heridas quirúrgicas, quemaduras, meningitis nosocomial o infecciones intra- abdominales (159, 160). Sin embargo, el origen de la bacteriemia es desconocido hasta en un 44% de los episodios (161).

Los grupos de mayor riesgo para el desarrollo de bacteriemias son los pacientes con enfermedades de base debilitantes y disrupción de las barreras naturales de defensa, especialmente aquellos ingresados en la UCI, tanto adultos como niños, sometidos a ventilación mecánica, con catéter intravascular, sonda vesical o sonda nasogástrica, según refleja una reciente revisión realizada por Zhou et al. en 2014 (162).

A diferencia de los otros brotes infectivos, las bacteriemias suelen ser infecciones polimicrobianas, es decir, son causadas por varios genotipos bacterianos distintos. En estas infecciones la sinergia bacteriana es importante en el mecanismo de invasión (163) por lo que la determinación de la verdadera mortalidad atribuible a A. baumannii causada por bacteriemia no está tan clara. Sin embargo, un estudio realizado en Estados Unidos refleja que este microorganismo presenta una incidencia del 1,3% en las bacteriemias de origen nosocomial, siendo el décimo patógeno más frecuente y presentando la tercera mortalidad cruda más importante tras P. aeruginosa y Candidas spp (164). En general, la mortalidad cruda de la bacteriemia por A. baumannii es elevada. Se han publicado estudios que muestran un porcentaje de mortalidad entre el 20% y 70%. Este porcentaje se ve altamente influenciado por los factores de riesgo asociados a la mortalidad por esta infección entre los cuales se destaca el mal uso de antimicrobianos en el tratamiento de la infección (165, 166).

2.2.3 Infecciones del tracto urinario

Las infecciones procedentes del tracto urinario son muy esporádicas en los hospitales. La mayoría de los aislados de A. baumannii recogidos en muestras biológicas de orina corresponden a colonizaciones, sin llegar a producir infección activa (167).

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INTRODUCCIÓN

Los grupos de mayor riesgo son pacientes de edad avanzada, con cierta debilidad, que poseen catéter urinario permanente. Se ha observado que el 80% de los casos de infecciones urinarias por este microorganismo corresponde al sexo masculino, lo cual podría explicarse por la mayor prevalencia que existe en esta población en el sondaje urinario fundamentalmente debido a hiperplasias prostáticas.

2.2.4 Infecciones del sistema nervioso central

La infección del sistema nervioso central más frecuente producida por A. baumannii es la meningitis aguda. Actualmente la mayoría de meningitis ocasionadas por este patógeno son de origen nosocomial, normalmente derivadas de cirugías como craneotomías, derivaciones ventrículo-peritoneales, ventriculares externas o lumbares, traumatismos craneoencefálicos (138, 160, 168-173), catéteres intraventriculares y fístulas de líquido cefalorraquídeo (174).

Los estudios más antiguos sobre la mortalidad asociada a la meningitis ocasionada por A. baumannii indican un 25% aproximadamente de los casos (169, 171, 174, 175). Sin embargo, actualmente, debido a los brotes nosocomiales de cepas multirresistentes que están surgiendo, este porcentaje se ha incrementado hasta en un 70% en los últimos estudios realizados en 2007 (176).

2.2.5 Otras infecciones

A. baumannii puede producir ocasionalmente otras enfermedades mucho menos frecuentes como endocarditis (163, 177-181), peritonitis (182, 183), infecciones de la piel, partes blandas o heridas quirúrgicas (184, 185), las cuales suelen aparecer en superficies quemadas en pacientes ingresados durante largos periodos de tiempo en unidades de grandes quemados (186-188).

En estos casos suelen aparecer acompañados de bacteriemias. Se han recogido, incluso, aislados de este microorganismo en heridos de guerra que han ocasionado brotes del mismo en hospitales de Iraq y Afganistán(189-193).

Además se han observado casos muy esporádicos de infecciones como colangitis (194), tiflitis (195), osteomielitis (196), conjuntivitis(197) y otras infecciones oculares como endoftalmitis e infecciones ocasionadas por lentes de contacto (198-200).

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INTRODUCCIÓN

3. Resistencia antibiótica en A. baumannii

3.1. Perspectiva histórica del desarrollo de resistencias en A. baumannii y emergencia de cepas multirresistentes

Como ya se comentó anteriormente, la causa principal de la problemática actual sobre las resistencias antimicrobianas que han ido apareciendo en la mayoría de los aislados clínicos procedentes de hospitales de todo el mundo es el uso indebido y extendido de antibióticos sobre bacterias que desarrollan, con gran facilidad, alta adaptabilidad y persistencia en condiciones adversas, como es el caso de A. baumannii.

Hasta la década de los 70, todas las cepas de A. baumannii eran sensibles a los antimicrobianos disponibles por entonces y eran utilizados como tratamiento eficaz. Desde finales de esa década y principio de los 80, comenzaron a extenderse los estudios de sensibilidad a antibióticos en brotes de cepas de Acinetobacter resistentes que iban apareciendo en hospitales de todo el mundo (201-203). Estas resistencias surgían, principalmente, a los antibióticos más utilizados por entonces, incluyendo algunos betalactámicos, aminoglucósido y quinolonas. Así, desde su descubrimiento en 1985, las carbapenemas, concretamente el imipenem, fué durante mucho tiempo el tratamiento más efectivo para las cepas de A. baumannii resistentes a los antimicrobianos disponibles en la clínica (204). Sin embargo, rápidamente, en 1993, comenzaron a aparecer brotes de infecciones nosocomiales de cepas resistentes a los primeros carbapenemas (205). A partir de entonces, ha habido un aumento progresivo de resistencias a todos los grupos de antibióticos, con perfiles distintos en los distintos centros, según el uso autóctono de los mismos. Entrados en el nuevo siglo, hubo una extensión de cepas resistentes a los antibióticos pertenecientes a grupos carbapenémicos debido a la adquisición de carbapenemasas plasmídicas en estas bacterias (206, 207). Esto dio lugar a la reincorporación en la práctica clínica de antimicrobianos antiguos que quedaron de desuso como la colistina, que fue desechado inicialmente por unos estudios que detectaron nefrotoxicidad en los pacientes a los que se les administraba.

En el ámbito geográfico de Andalucía, se realizó un estudio del principal patrón de resistencia que presentaban por entonces, los aislados de cepas multirresistentes más frecuentes en el Hospital Virgen del Rocío (208). Como era de esperar, la diseminación y el frecuente uso de la colistina como única alternativa terapéutica frente a estas infecciones ha producido el surgimiento de brotes resistentes a colistina

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INTRODUCCIÓN y a todos los antimicrobianos comercialmente disponibles, denominándose a estos brotes panresistentes (209, 210). Bajo este escenario son escasas las posibilidades terapéuticas que existen en la actualidad para estos patógenos, lo que ha provocado la motivación de estudios sobre el desarrollo de nuevas alternativas no antibióticas, preventivas y terapéuticas.

El concepto de la multirresistencia (MDR) ligado a microorganismos patógenos ha cobrado mucha importancia en el marco de la epidemiología clínica en la última década. No existe una definición universalmente aceptada de multirresistencia que sea aplicable a todos los microorganismos y puede tener matices según el enfoque sea clínico, microbiológico o epidemiológico. Desde un punto de vista general, la definición debe incluir al menos dos condiciones: que exista resistencia a más de una familia o grupo de antimicrobianos de uso habitual y que esa resistencia tenga relevancia clínica, es decir, que suponga o pueda suponer una dificultad para el tratamiento y epidemiológica, con la posibilidad de producir brotes epidémicos y transmisión del mecanismo de resistencia (211). Si además son resistentes a los carbapenems, reciben el nombre de extremadamente resistentes (XDR) y, si amplían la resistencia a colistina y tigeciclina que han sido los últimos antibióticos empleados en la clínica, se las denomina panresistentes (PDR) (212).

La aparición y diseminación de cepas resistentes a los antibióticos tiene origen en numerosas especies bacterianas entre las que se destacan Staphylococcus aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, Clostridium difficile y A. baumannii. Esta preocupante tendencia bacteriana es continuamente subrayada en informes que describen la problemática ante las resistencias antimicrobianas. El Informe Global de Vigilancia de Resistencia a los Antibióticos publicado en 2014 por la Organización Mundial de la Salud, indica la presencia de infecciones producidas por bacterias resistentes a antibióticos en las 6 áreas geográficas donde se realizó el estudio (213). Asimismo, los resultados del Centro Europeo de Prevención y Control de Enfermedades, en un estudio de prevalencia que evaluaba la resistencia a antibióticos en infecciones producidas en más de 900 hospitales incluyendo 30 países distintos, destacaba la elevada tasa de resistencias surgidas en múltiples especies bacterianas (214). La carga sanitaria producida por estas infecciones es significativa, tal y como indican los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) que estimaban que tan sólo en los Estados Unidos más de dos millones de personas se ven afectadas cada año por infecciones causadas por organismos resistentes a antibióticos, resultando aproximadamente 23.000 muertes (215). La carga económica que resulta de estas infecciones es también sustancial ya que tan solo en Estados Unidos se estima un

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INTRODUCCIÓN coste anual de veinte mil millones de dólares relacionados directamente en la salud y de unos 35 mil millones de dólares en productividad perdida (215, 216).

Como se citó anteriormente, la propensión de A. baumannii al desarrollo de resistencias frente a multitud de antimicrobianos se debe principalmente a cuatro factores (161): la ubicuidad de hábitat o su gran capacidad para adaptarse rápidamente a medios con condiciones adversas y con elevada presión de antimicrobianos, el uso extendido de antimicrobianos de amplio espectro en el ámbito hospitalario, la capacidad de desarrollar mecanismos de resistencias a múltiples fármacos, así como los mecanismos de resistencia intrínsecos que presenta la bacteria de manera constitutiva, comentada en el apartado anterior, y el aumento de huéspedes potencialmente susceptibles de adquirir infecciones causadas por estos patógenos, siendo la terapia previa con antibióticos uno de los factores de riesgo más frecuente para adquirir infecciones causadas por A. baumannii multirresistentes (ABMDR) (217). Otro factor de gran importancia en la emergencia de este tipo de patógenos es la transmisión de las cepas con estas características entre los pacientes (218, 219). La combinación de todas estas particularidades hace que ABMDR sea un patógeno nosocomial con éxito, causante de los principales brotes globales (220, 221).

En los últimos años se ha producido un preocupante aumento en la resistencia a antibióticos de A. baumannii en los hospitales de todo el mundo (222-225), con la alarmante aparición de cepas que son resistentes a prácticamente todos los antibióticos disponibles (160). Las tasas de resistencia varían enormemente según el país y el hospital y depende fundamentalmente de factores biológicos, epidemiológicos o metodológicos. Hay informes de brotes de ABMDR aparecidos en hospitales de Europa, América del Norte, Argentina, Brasil, China, Taiwán, Hong Kong, Japón y Corea y de zonas tan remotas como Tahití y en el Pacífico Sur (226-235) (217, 239- 247). En algunos países europeos y del continente asiático, la situación actual es alarmante debido a la circulación de clones de A. baumannii panresistentes o extremadamente resistentes que producen infecciones para las que no hay terapias eficaces (236, 237).

Se ha mostrado que los aislados multirresistentes de áreas geográficamente distantes pueden estar relacionados clonalmente (22, 238), lo que sugiere que el problema de la resistencia podría estar asociado con un número limitado de linajes de A. baumannii.Un estudio epidemiológico molecular, con objeto de identificar la relación clonal que existe entre los diferentes aislados recogidos de los brotes epidémicos causados por cepas de A. baumannii multirresistentes en hospitales de todo el mundo, determinó la existencia de diferentes linajes clonales, agrupados en 3 clones

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INTRODUCCIÓN internacionales (CI) CI 1, CI 2 y CI 3 diseminados ampliamente por todo el mundo, así como otros complejos clonales (CC) localizados más esporádicamente en distintos países (239, 240). Estos clones se han analizado por diferentes métodos de tipificación genotípica tales como el análisis AFLP, ribotipificación, análisis de macrorrestricción por electroforesis en gel de campo pulsado y, más recientemente, por secuenciación obtenida mediante MLST (multilocus sequence typing). Las cepas que pertenecen a estos clones son, por lo general, altamente resistentes a los antibióticos, aunque suele haber variaciones dentro de cada clon y son genéticamente estables, lo que las hace muy exitosas en hospitales.

3.2. Principales grupos de antibióticos utilizados como tratamiento de infecciones causadas por A. baumannii

A lo largo de los años se han ido utilizando diversos grupos de antibióticos en relación con las necesidades de la clínica hospitalaria y a las resistencias que se han dio desarrollando por este patógeno. Los principales antibióticos empleados fueron los siguientes:

3.2.1 Betalactámicos

Los antibióticos betalactámicos es la familia más extensa de antimicrobianos y la más utilizada en la práctica clínica. Su mecanismo de acción consiste en la inhibición de la síntesis de peptidoglicanos, que es el componente mayoritario de la pared celular bacteriana, la bacteria al quedar desprovista de ella es susceptible a cambios en la presión osmótica, lo que produce su muerte. Además también actúan activando una autolisina endógenas que destruyen los peptidoglicanos y producen la autolisis bacteriana (241). Se conoce que el parámetro farmacocinético que tiene mayor eficacia en este tipo de antibióticos es la prolongación del tiempo de tratamiento por encima de su concentración mínima inhibitoria (CMI) (242).

Existen muchas modificaciones de la molécula original que han dado lugar a antibióticos con mayor espectro antimicrobiano. En esta se pueden citar las penicilinas, las cefalosporinas, los monobactámicos y especialmente los carbapenemas, siendo el tratamiento de elección en la mayoría de las infecciones

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INTRODUCCIÓN nosocomiales e infecciones causadas por bacterias multirresistentes. Los carbapenémicos (imipenen, meropenem, doripenem, ertapenem, faropenem, biapenem y panipenem), es el grupo de antibióticos que actualmente tiene mayor actividad en el conjunto de cepas de A. baumannii y se utiliza en la mayoría de las infecciones causadas por esta bacteria en el hospital (219, 243).

Entre los mecanismos de resistencias que presenta A. baumannii frente a los antibióticos betalactámicos se encuentra principalmente la inactivación enzimática, mediante las enzimas betalactamasas. Algunas de estas enzimas están presentes en el genoma de la bacteria de forma constitutiva, ofreciéndole resistencia intrínseca a estos antibióticos y otras han sido adquiridas mediante transformación natural o conjugación plasmídica. Existen diversos tipos de betalactamasas que se pueden clasificar en cuatro clases según el sitio activo que presentan (de la clase A a la D) y dentro de cada clase se pueden clasificar también según presenten un espectro reducido, entre las que se encuentran las AmpC especificas de las cefalosporinas (244, 245) o las de amplio espectro (BLEE), normalmente de codificación plasmídica por lo que son fácilmente fransferibles, entre ellas, las más reconocidas en A. baumannii son VEB-1 (246-248), TEM-92 – 116 (249, 250) , CTX-M-2 y -42 (251, 252), PER-1 (253-256), PER-2 (247) y las carbapenemasas, de especial interés, ya que contribuyen en las resistencias a carbapenémicos, las más destacadas son las OXAs, cuyos subgrupos más prevalentes en A. baumannii son las OXA-23 (231, 257-259), - 24 (206, 260, 261), -51 (262), -58 (263). Las metalobetalactamasas (MBL), a pesar de identificarse con menos frecuencia en A. baumannii, son de gran interés ya que su actividad hidrolítica hacia los carbapenémincos es significativamente más potente que las carbapenemasas convencionales. Las identificadas en A. baumannii son IMP (IMP- 1,-2,-4,-5,-6,-8,-11,-19,-24) (264-266), VIM (VIM-1-4, -11) (267, 268), NDM (NDM 1-3) (269, 270) y SIM-1 (271).

Otros mecanismos de resistencia que podemos encontrar frente esta clase de antibióticos es la expresión reducida de proteínas de membrana, como las proteínas CarO (272, 273), proteínas 33-36 kDa (274) y proteínas OprD (275) y similares, así como la alteración en la expresión de proteínas de unión a la membrana (PBPs), la más habitual en A. baumannii es PBP2 (276).

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INTRODUCCIÓN

3.2.2. Fluoroquinolonas

Las fluoroquinolonas o quinolonas de segunda generación, pertenecen a un grupo de antimicrobianos sintéticos de acción bactericida derivados de la degradación de moléculas de alcaloides que tienen como estructura básica el núcleo quinolónico o ácido nalidíxico, a raíz de esta molécula surgen radicales con diferentes propiedades que originan las cuatro generaciones de quinolonas que se conocen actualmente.

El mecanismo de acción de este grupo de antimicrobianos consiste en la inhibición selectiva del dominio ligasa de la enzima ADN girasa bacteriana (topoisomerasa II) dejando intacto el dominio nucleasa. Esta actividad es constante y esencial en bacterias gram negativas, por lo que su acción en cepas de Acinetobacter susceptibles a fluoroquinolonas es bactericida, rápida y dosis dependiente (277) . Los mecanismos de resistencia más frecuentes en Acinetobacter son las mutaciones localizadas en la región de determinación de resistencia a quinolonas (QRDR), presente en los genes que codifican las cuatro subunidades de las enzimas topoisomerasas, estas mutaciones producen modificaciones en la diana del antibiótico por lo que impide su unión. Las mutaciones más relevantes en Acinetobacter son las producidas en los genes gyrA y parC que codifican las subunidades de las enzimas topoisomerasas II y IV respectivamente (278, 279). Otro mecanismo de resistencia que podemos encontrar en estas cepas es la producción de bombas de eflujo que producen la salida activa del antibiótico del interior celular o la disminución de la permeabilidad en la membrana que impide su entrada en el que se puede citar las bombas tipo RND como AdeABC (280) y las bombas MATE como las AdeM (281).

3.2.3 Aminoglucósidos

Es un grupo de antibióticos bactericidas, dependiente de concentración, su mecanismo de acción implica la interacción inicial con la membrana externa de la bacteria, el transporte a través de la membrana interna y finalmemte la unión a la subunidad 30S de los ribosomasocasionando la inhibición de la síntesis de proteínas y conduciendo a la muerte del microorganismo (282). Los antibióticos de esta familia más utilizados en enfermedades infecciosas son la amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, estreptomicina y tobramicina, que siguen siendo actualmente una alternativa importante en el tratamiento de infecciones causadas por cepas multirresistentes.

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INTRODUCCIÓN

Estudios previos han demostrado una gran diversidad de mecanismos de resistencia a estos antibióticos en el género Acinetobacter (283) Esta resistencia se atribuye principalmente a la inactivación enzimática por acetiltransferasas (AAC) (284), nucleotidiltransferasas o adenililtranferasa (ANT) (284) y fosfotransferasas (APH) (285), muy frecuentes en el género Acinetobacter. También se han encontrado bombas de eflujo AdeABC (286) y bombas de la familia MATE, encargadas de la explusión de compuestos tóxicos principalmente, AdeM (281)

3.2.4 Tetraciclinas

Es un grupo de antibióticos, en su mayoría naturales y otros obtenidos por semisíntesis, que abarcan un amplio espectro en su actividad antimicrobiana. Los antibibióticos más relevantes de este grupo son la tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina y minociclina.

Poseen un mecanismo de acción bacteriostático debido a que la unión que establece la molécula de tetraciclina con la subunidad 30S del ribosoma de la bacteria es de forma reversible, lo que produce la inhibición de la síntesis de proteínas, sin embargo esta función podría recuperarse en el momento que disminuye la concentración del antibiótico en el interior celular (287, 288).

Los principales mecanismos de resistencias que se conocen frente a esta familia de antibióticos son la protección del ribosoma, debida a la unión de proteínas citoplasmáticas con el ribosoma, codificada por el gen tetM, descrito en un aislamiento clínico de A. baumannii que suele encontrarse con alta prevalencia en estas cepas puesto que se trata de una adquisición fruto de una transferencia horizontal de origen en bacterias gram positivas (289). El otro mecanismo de resistencia conocido es la expulsión activa del fármaco, donde se encuentran implicadas principalmente las proteínas citoplasmáticas (Tet) que actúan como transportador activo codificadas por los genes tetA y tetB (290) y las bombas de eflujo AdeABC (286) . El proceso de resistencia está regulado por dos genes; uno que codifica una bomba activa y otro una proteína represora, la actividad de ambos genes está regulada por la presencia y ausencia de la tetraciclina (287).

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INTRODUCCIÓN

3.2.5 Glicilciclinas.

Es una nueva familia de antibiótico procedente de un derivado semisintético de la molécula de minociclina que procede de las tetraciclinas. Esta clase de antibióticos exhibe un amplio espectro bacteriano fundamentalmente frente a patógenos productores de infecciones nosocomiales que incluyen mecanismos de resistencia a betalactámicos, quinolonas y tetraciclinas. El primer miembro de esta familia, más estudiado y efectivo frente bacterias multirresistentes es la tigeciclina, que ha tenido gran éxito frente infecciones de piel, tejidos blandos y neumonías principalmente comunitarias (291).

Su mecanismo de acción es, de la misma forma que en las tetraciclinas, bacteriostático, debido a la unión reversible con la subunidad 30S del ribosoma bacteriano. Sin embargo la tigeciclina no se ha visto afectada por los principales mecanismos de resistencia estudiados en el apartado anterior, el mecanismo de resistencia que se conoce frente esta familia de antibióticos es la presencia de bombas de eflujo AdeABC, descrito en aislados clínicos de A. baumannii (292, 293).

Actualmente, se están poniendo en marcha las terapias de combinación de antibióticos. A pesar de que la mayoría de los análisis realizados hasta ahora no han demostrado beneficios de la terapia combinada frente a la monoterapia de fármacos (294), estos se encuentran en continuo desarrollo debido a que implica una considerable disminución de la presión antibiótica en los hospitales y conlleva la eliminación de nuevos brotes nosocomiales de cepas resistentes.

3.2.6 Sulbactam

El sulbactam no se considera miembro de ninguna de las familias anteriores de antibióticos. Se trata de una molécula capaz de inhibir algunas de las enzimas betalactamasas, por lo que se suelen administrar en combinación con derivados sintéticos de la penicilina y otros betalactámicos. Además, fomenta el uso de la terapia combinada que evita los problemas de presión antibiótica y surgimiento de resistencias para los fármacos que implica el uso de la monoterapia, como se ha visto anteriormente. El sulbactam, además de poseer una actividad inhibidora intrínseca frente A. baumannii, relacionada con la unión que se produce entre esta molécula y las

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INTRODUCCIÓN proteínas de unión a la penicilina (PBP) (295), tiene un perfil de seguridad y una penetración en los tejidos del organismo donde se administra que ofrece muchas ventajas en la clínica farmacéutica, por lo que sigue siendo en casos de resistencia a carbapenémicos, el tratamiento de elección para infecciones causadas por estos microorganismos (296, 297). Se conoce poco sobre los mecanismos de resistencias que emplean las cepas bacterianas que se ven inhibidas por este antibiótico, un estudio en A. baumannii correlacionó esta resistencia con las mutaciones emplazadas en las proteínas PBP3 y en un menor nivel en mutaciones implicadas en la biosíntesis de pared celular o en genes implicados en respuesta de estrés (298).

3.2.7 Rifamicinas

Las rifamicinas es una familia de antibióticos semisintéticos macrocíclicos con actividad bactericida que comprende los antibióticos rifabutina, rifaximina, rifapentina y el más utilizado que es la rifampicina. Su mecanimos de acción consiste en la supresión de la síntesis de ARN de la bacteria, debido a una unión compleja que se produce entre el fármaco y la subunidad β de la polimerasa de ARN dependiente del ADN (rpoB).

La rifampicina ha sido un antibiótico muy estudiado ya que ha sido muy eficaz como tratamiento en infecciones causadas por A. baumannii aplicado principalmente en combinación con otros fármacos como imipenem, sulbactam (299) o colistina (299- 301), puesto que se conoce, que el empleo de este fármaco en monoterapia tiene alta probabilidad de desarrollar resistencias en A. baumannii (301).

3.2.8 Polimixinas

Las polimixinas son un grupo de antibióticos peptídicos policatiónicos, descubiertos en 1947 que exhiben potente actividad frente la mayoría de las bacterias gram negativas (302). Existen cinco moléculas diferentes de polimixinas (A-E), sin embargo, tan solo dos de ellas son utilizadas en clínica polimixina B y E, esta última es la más conocida, también denominada colistina.

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INTRODUCCIÓN

3.2.8.1 Colistina

La colistina ha sido considerada durante algunos años, tras la emergencia de resistencias a todos los antibióticos anteriormente descritos, como el único antibiótico clínicamente disponible que retenía actividad frente las cepas de A. baumannii multirresistentes, es por ello que ha sido ampliamente estudiada a lo largo de la década del 2000 y figura gran importancia en el presente trabajo.

Se trata de un decapéptido cíclico, catiónico, estable, que pertenece al grupo de las polimixinas, también es denominado polimixina E (303). Tiene origen biológico y procede de productos biosintéticos de la bacteria Bacillus colistinus. Es un agente anfipático que posee grupos hidrofóbicos e hidrofílicos capaces de actuar a nivel de la membrana celular de los microorganismos. Como se muestra en la estructura química (Figura 4), se encuentra unido a un ácido graso a través de un enlace α – amida y tiene un peso molecular total de 1750 Da.

Figura 4. Estructura química de la colistina o Polimixina E. Fuente: http://www.info-farmacia.com/

Este antibiótico era ampliamente empleado en la clínica hace más de 50 añospero cayó en desuso debido a que detectaron cierta nefrotoxicidad en los pacientes a los que se les administraba. Años después fue reincorporado en la clínica farmacéutica ante la ausencia de tratamientos disponibles para infecciones por bacilos gram negativos multirresistentes (304). Actualmente, se encuentra disponible en clínica en forma de colistemato sódico (305). Actúa dirigíendose a la membrana celular externa

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INTRODUCCIÓN de las bacterias gram negativas, produciéndose una interacción electrostática entre el polipéptido y el LPS de la membrana, concretamente con el lípido A, el cual es reconocido como la diana principal de este antibiótico. La porción policatiónica de la colistina produce un desplazamiento de los puentes de magnesio y calcio que se encuentran normalmente estabilizando la estructura molecular del LPS, produciéndose así una disrupción de la membrana que provoca un aumento en la permeabilidad y la fuga del contenido celular, causando la muerte de la bacteria. Su acción bactericida es concentración dependiente (306). Además, al unirse al lípido A, es capaz de bloquear la respuesta inflamatoria de la endotoxina.

La resistencia bacteriana frente al antibiótico de colistina, no está muy extendida en los géneros de patógenos bacterianos. Sin embargo, la emergencia de cepas resistentes a colistina en A. baumannii fue detectada a principios del siglo XXI y es cada vez más preocupante (141, 307).

Los mecanismos de resistencia a colistina más estudiados en estos microorganismos son los que implican una modificación en la diana principal del antibiótico, el lípido A, o la eliminación de la misma, que implican la disminución de la susceptibilidad de estas cepas por el antibiótico. Se conocen otros mecanismos de resistencia a colistina como la escisión proteolítica del compuesto antimicrobiano y la exclusión del polipéptido por parte de las proteínas transportadoras de flujo al exterior (308). En un estudio reciente se han identificado más de 30 genes implicados en inducir resistencia a la colistina en mutantes de A. baumannii con transposones, entre ellos destaca el gen lps B, implicado en la biosíntesis del núcleo del LPS, cuyo silenciamiento ocasiona la susceptibilidad a colistina de la cepa (309). También se han descrito cepas que contienen islas de resistencia que implican el aumento de la CMI de colistina (310, 311). Por último, un alarmante estudio en China ha identificado un plásmido en E. coli que contiene una enzima fosfoetanolaminatransferasa que confiere resistencia a colistina (mcr-1) (312). Este plásmido tiene un alto potencial de transferencia entre bacterias y, de hecho, ha vuelto a ser identificado en otros países, incluso en Vietnam (313) y en otros microorganimos como K. pneumoniae (314). Hasta la fecha, este plásmido no ha sido identificado en ninguna cepa de A. baumannii resistente a colistina, pero tal y como se muestra la evolución bacteriana, será cuestión de tiempo (315).

A continuación, se describen los dos mecanismos de resistencia a colistina de interés en este trabajo:

-Mutación en el sistema pmrAB. La mutación puntual en uno de los dos componentes

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INTRODUCCIÓN de este sistema, concretamente en los genes pmrA o pmrB, conduce a la síntesis de la enzima fosfoetanolaminatransferasa, responsable de la incorporación de una molécula de etanolamina en el lípido A que produce un aumento de la carga positiva en el sitio de unión e impide la interacción electrostática con el polipéptido de colistina (96, 316). Esta mutación también ha sido descrita por nuestro grupo en una cepa clínica de A.baumannii aislada de un paciente ingresado en el hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla, esta cepa se mostraba sensible a colistina en el primer aislamiento que se realizó en el paciente y tras 9 días de tratamiento con colistina se seleccionó una cepa resistente a colistina, con un perfil de resistencia distinto también para otro antibióticos, además esta cepa mutante presentaba también diferencia en la expresión de proteínas respecto a la cepa original, incluyendo proteínas de la membrana externa, proteínas de biosíntesis de proteínas y de enzimas metabólicas, lo que podría causar la pérdida de la virulencia en el patógeno (317).

-Mutación en los genes de biosíntesis del lípido A. Mutaciones en los genes esenciales (IpxA, lpxC o IpxD) responsables de codificar las enzimas implicadas en los primeros pasos de la biosíntesis del lípido A que, como se ha descrito anteriormente, catalizan las reacciones críticas y fundamentales en la síntesis del lípido A. Estas mutaciones producen la pérdida completa de la expresión de LPS y por tanto de la principal diana de la colistina, lo que confiere a la cepa resistencia a este antibiótico (97, 98). Este mecanismo de resistencia se convirtió en un gran hallazgo puesto que, como hemos visto en el apartado de la importancia del lípido A en estos microorganismos, el lípido A y el LPS se ha considerado durante mucho tiempo como una estructura esencial para la viabilidad de las bacterias gram negativas (93). De hecho, existen muchos géneros de este grupo en los que no se ha descrito ninguna cepa viable con esta mutación.

La siguiente tabla resume los principales mecanismos de resistencia conocidos en A. baumannii descritos en los principales grupos antibióticos (101).

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INTRODUCCIÓN

Clases de Mecanismos de resistencias Ejemplos antibióticos

β-lactamasas (AmpC, TEM, VEB, PER, CTX-M, SHV). Inactivación enzimática Carbapenemasas (OXA-23, -40, -51, - 58-143-like; VIM, IMP, NDM-1; -2)

Expresión reducida de β- lactámicos CarO, proteínas 33–36 kDa, proteínas proteínas de membrana OprD-like externa

Alteración en la expresión de PBP2 las PBPs

Bombas de eflujo AdeABC

Diana modificada Mutaciones en gyrA y parC Fluoroquinolonas Bombas de eflujo AdeABC, AdeM

Enzimas modificadoras de AAC, ANT, APH aminoglucósidos Aminoglucósidos Bombas de eflujo AdeABC, AdeM

Metilación ribosomal ArmA

Bombas de eflujo AdeABC, TetA, TetB Tetraciclinas Protección ribosomal TetM

Glicilciclinas Bombas de eflujo AdeABC

Mutaciones en PmrA/B (modificación Polimixinas Diana modificada LPS), mutaciones en los genes de (colistina) biosíntesis del lípido A

Tabla 2. Principales mecanismos de resistencia encontrados en A. baumannii.

4. Desarrollo de nuevas estrategias de prevención. Inmunoterapia

En el contexto de una gran problemática concebida a nivel mundial sobre la aparición de cepas bacterianas que presentan resistencias a la mayoría de los fármacos y compuestos antimicrobianos, estudiados y sintetizados, es obvia la necesidad de desarrollar nuevos enfoques preventivos y terapéuticos.

En las dos últimas décadas, la elaboración e introducción de nuevas clases de antibióticos en la clínica se ha estancado de forma considerada y el número de empresas farmacéuticas con programas activos de desarrollo de antibióticos ha disminuido (318, 319).

Como se ha comentado anteriormente, el desarrollo de nuevos antimicrobianos, sin duda, ha desempeñado un papel fundamental en el desarrollo de nuevos mecanismos

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INTRODUCCIÓN de resistencia y sigue siendo una problemática el uso de los mismos en la clínica. El alcance de esta preocupación ha impulsado la investigación destinada al desarrollo de vacunas y nuevos enfoques terapéuticos, no antibióticos, para combatir microorganismos resistentes a antibióticos en los sectores de la biotecnología y la farmacéutica.

El beneficio más evidente que ofrecen las estrategias basadas en la inmunoterapia es la posibilidad de reducir las tasas de infecciones causadas por bacterias difíciles de tratar, así como la morbilidad y mortalidad asociada a estas infecciones. Además, el fomento de su uso clínico promueve una disminución en la emergencia y la transmisión de cepas resistentes a antibióticos, ya que reduce la prescripción antibiótica y con ello la presión antibiótica intrahospitalaria. Varios estudios apoyan esta idea indicando que una reducción en el uso clínico de antibióticos se asocia con una tasa menor de resistencias en los mismos (320-322). Otra ventaja que presentan estas alternativas respecto a los antimicrobianos convencionales es su aplicación dirigida exclusivamente a los microorganismos patógenos, debido a su enfoque basado en la estimulación del sistema inmune del huésped, su actividad estará focalizada a los patógenos externos, sin afectar a las bacterias no patógenas propias de la flora normal del individuo. Este efecto perjudicial producido en el organismo del huésped, que causan las terapias antibióticas ha sido descrito en varios estudios recientes con distintos antibióticos (323-325).

Todos estos datos indican que existe una importante y consistente base teórica que sugiere que el empleo de las nuevas estrategias basadas en la inmunoterapia podría contribuir a la reducción de la emergencia de resistencias antimicrobianas y ofrecer una solución a esta problemática mundial.

4.1. Potencial terapéutico de anticuerpos monoclonales.

Realmente el auge y expansión de los MoAbs fue a partir de los años 80, donde empezaron a ganar gran relevancia en el campo financiero y de la medicina. Fue entonces cuando se les designó con el nombre de “la bala mágica” o “magic bullet” por ser un diseño terapéutico alentador y exclusivo. A principios del siglo XXI, varios fármacos basados en MoAbs fueron introducidos para una amplia variedad de usos terapéuticos. El anticuerpo Herceptin, humanizado para el tratamiento del cáncer de mama, se convirtió en el primer fármaco diseñado por un enfoque de ingeniería

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INTRODUCCIÓN biomolecular que fue aprobado por la FDA (326) Un sondeo reciente informó de que un cuarto de todos los medicamentos biotecnológicos que se encuentran en desarrollo actualmente están basados en MoAb (327) siendo al menos 400 MoAbs los que se encuentran bajo ensayos clínicos para tratar distintas enfermedades como cáncer, rechazo de trasplantes, para combatir enfermedades autoinmunes y en menor medida, enfermedades infecciosas (328).

Los MoAbs terapéuticos pueden emplear diversos mecanismos de acción frente al antígeno diana. Los mecanismos de acción que han sido estudiados para los MoAbs antibacterianos son los siguientes:

- Neutralización: Aquellos anticuerpos que al unirse al antígeno lo bloquean e impiden que realicen su función. Los anticuerpos neutralizantes más frecuentes son los anticuerpos frente a toxinas bacterianas, fruto de productos bioquímicos excretados o localizados en la membrana (329, 330). También se pueden citar los anticuerpos frente a los factores esenciales de virulencia superficiales (331, 332) que interfieren en la patogénesis de la bacteria. Normalmente estos anticuerpos no requieren las funciones de la fracción constante de su estructura, por lo que podría ser reemplazada por técnicas de ingeniería y mantener su eficacia.

- Lisis bacteriana mediadas por el complemento: Este tipo de mecanismo de acción es propio en las bacterias gram negativas, ya que los microorganismos gram positivos se encuentran habitualmente protegidos frente el complejo de ataque de membrana (MAC- Membrane Attack Complex) por la gruesa pared celular que los recubre, es por ello menos frecuente en esta población.

- Opsonofagocitosis: Los anticuerpos con capacidad de opsonofagocitosis se unen a las moléculas dianas de superficie y posteriormente inducen la atracción de células fagocíticas propias del organismo hospedador, donde se incluyen principalmente neutrófilos, células dendríticas, monocitos, macrófagos y mastocitos, que producen la fagocitosis del antígeno diana. Este proceso requiere la función de la fracción constante del anticuerpo o de los receptores del complemento en la superficie de los fagocitos. Este mecanismo es de la misma forma efector efectivo frente patógenos gram positivos como gram negativos.

- Anticuerpos moduladores de la respuesta inmune: Anticuerpos que se unen al antígeno bacteriano específico. Estos no inducen la fagocitosis o la muerte directa por sí mismos, pero son capaces de producir un aumento de la respuesta inmune sistémica, de manera que conduce a la eliminación de bacterias por parte de los moduladores del sistema inmune del huésped (333, 334).

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INTRODUCCIÓN

- Anticuerpos bactericidas directos o anti-virulencia: La unión de los anticuerpos a las proteínas superficiales de las bacterias pueden inducir, independientemente de la acción del complemento, la lisis del patógeno. Por ejemplo, por la inducción de la formación de pequeños poros en la membrana externa (335). Otros anticuerpos que se unen al LPS pueden interferir con el flagelo bacteriano y dificultar la motilidad de la bacteria (336) o interferir en la función del mecanismo de secreción de tipo III lo cual está relacionado con patógenos de la familia de Enterobacterias (336, 337).

En ocasiones, los MoAbs pueden unirse a una sustancia ajena a la estructura de la inmunoglobulina, son los denominados anticuerpos conjugados. Las sustancias a las que se unen pueden ser fármacos o drogas con actividad bactericida, toxinas o partículas radiactivas (338). Estos últimos son los denominados anticuerpos radiomarcados empleados en las radioinmunoterapias. Los MoAbs unidos a toxinas se conocen como inmunotoxinas y funcionan como vehículo para localizar las células dañadas o cancerosas que presentan el antígeno específico y les administra la toxina adherente para combatir la célula marcada, minimizando el daño al resto de células del organismo.

4.2 Anticuerpos monoclonales humanizados

Los MoAb producidos con fines terapéuticos son fundamentalmente generados en especies murinas. Los primeros fueron producidos por Milstein y Köhler en un modelo murino publicado en 1975 (339), por el que años más tarde recibieron el premio Nobel.

Sin embargo, la inmunogenicidad inherente de la estructura de las inmunoglobulinas murinas en los organismos humanos o en otras especies ha presentado grandes obstáculos en la aplicación clínica de MoAbs terapéuticos. Dicho de otra forma, los anticuerpos producidos en ratones incluyen secuencias antigénicas dentro de organismos de otra especie que pueden inducir la formación de anticuerpos con la consiguiente reacción inmunológica. Esto plantea un riesgo significativo para los pacientes y puede disminuir la eficacia de estas terapias.

Por esta razón se han introducido técnicas de ingeniería genética y molecular que han dado lugar a diferentes estructuras de anticuerpos procedentes de distintas especies animales o los denominados anticuerpos de segunda generación. En primer lugar, aparecieron los MoAbs quiméricos que consisten en anticuerpos cuya estructura pertenece a dos especies diferentes, combinando la zona variable del MoAb

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INTRODUCCIÓN procedente del ratón con la zona constante de un anticuerpo humano. Se pueden citar entre otros el infliximab, rituximab, abciximab (340, 341). Seguidamente, debido a los problemas de inmunogenicidad que seguían produciendo este tipo de terapias, se introdujeron los MoAbs humanizados que tan solo contienen la región determinante de complementariedad de una fuente no humana y el resto de la estructura pertenece a la especie humana. Este anticuerpo combina solamente los aminoácidos responsables del sitio de unión al antígeno, la región hipervariable o región determinante de complementariedad (CDR), procedente del anticuerpo de ratón con el resto de la molécula de una inmunoglobulina humana. La técnica más estudiada para la producción de este tipo de anticuerpos humanizados se denomina CDR grafting (342) que se explica detalladamente en la figura 6. Como ejemplo de anticuerpos humanizados se pueden citar el daclizumab, herceptin, vitaxin (340, 341).

Por último, se han desarrollado otras técnicas alternativas para la producción de anticuerpos completamente humanos para su uso terapéutico. Entre estas técnicas se destacan dos que han sido las más estudiadas. Una de ellas consiste en la presentación de anticuerpos en la superficie del fago o Phage-Display, en la que existen bibliotecas de fagos recombinantes con la secuencia de ADN de anticuerpos de interés. Estos fagos expresarán el anticuerpo en su superficie y mediante la infección en una cepa bacteriana, normalmente E. coli conseguirán la proliferación del anticuerpo de interés. Por otro lado, está la técnica de ratones transgénicos, mediante la cual se producen ratones que contengan genes de anticuerpos humanos insertados en las células madre embrionarias y sus propios genes que codifican para producir anticuerpos son eliminados o inhibidos. Por lo tanto, el ratón puede ser inmunizado con el antígeno deseado y producir anticuerpos completamente humanos frente los antígenos (343).

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INTRODUCCIÓN

Figura 6. Técnica CDR grafting. Técnica de ingeniería genética mediante la cual se seleccionan las regiones determinantes de complementariedad o regiones variables (en gris) producidas en el anticuerpo de ratón, que son específicas en el reconocimiento del antígeno para ser instaladas en la fracción constante de la estructura de un anticuerpo humano. De forma que el MoAb resultante posee un 97% de su estructura procedente de la especie humana y tan sólo el 3% procede de la especie de ratón.

4.3 Anticuerpos en uso y desarrollo para el tratamiento de enfermedades infecciosas

En contraste con otros campos de la biomédicina como la oncología y la reumatología donde los anticuerpos monoclonales (MoAbs) han proporcionado nuevas terapias muy eficaces, en el campo de las enfermedades infecciosas los anticuerpos monoclonales no han tenido una gran cabida. La razón más evidente de esta desidia como agente terapéutico han sido los elevados costes económicos, la dificultad y complejidad de su elaboración, así como de su introducción en el mercado farmacéutico en comparación con los antimicrobianos convencionales. Sin embargo, como se ha detallado a lo largo de todo este trabajo, las opciones de intervención terapéutica mediante antibióticos en el campo de las enfermedades infecciosas actualmente están en pleno declive (344)

A principios del siglo XX comenzó a emplearse la terapia basada en suero de anticuerpos policlonales frente una gama diversa de enfermedades infecciosas en las que se incluía la neumonía neumocócica, meningitis meningocócica, el ántrax y otros (336, 337) Sin embargo, el empleo de estos sueros en clínica producía graves complicaciones inmunológicas sistémicas, lo que limitó significativamente su administración en procedimientos terapéuticos (337),

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INTRODUCCIÓN

El empleo de MoAbs en el campo de las enfermedades infecciosas ha reducido en gran medida estas complicaciones debido al desarrollo tecnológico que requiere, tales como la purificación y la posibilidad de aplicar técnicas de ingeniería para realizar la humanización de los mismos. Estos procesos evitan las reacciones inmunológicas sistémicas por reactividad cruzada interespecífica. Debido a la alta especificidad inherente de estos anticuerpos, serán exclusivamente dirigidos hacia patógenos nocivos inmersos en el organismo del huésped y no frente a la flora natural como podría afectar el uso de antibióticos generales (338, 345). Además, este perfil terapéutico resulta cada vez más atractivo para las empresas farmacéuticas y biotecnológicas debido a la multitud de herramientas que permiten generar anticuerpos con diferentes formatos, como puede ser el diseño del objetivo de reconocimiento, el tamaño, vida media y función efectoras deseadas, así como la diversidad de formas de empleo, haciendo referencia a la administración de anticuerpos individuales, combinaciones de anticuerpos, fragmentos de los mismos, conjugaciones de estos con isótopos radiactivos, fármacos citotóxicos o estructuras similares como la fibronectina, ya sean como tratamiento exclusivo o en combinación con otros antimicrobianos y antibióticos. Por último, como se citó en apartados anteriores, el uso de estas estrategias terapéuticas reduce el surgimiento de resistencias antimicrobianas y brotes nosocomiales multirresistentes.

Son varias las revisiones bibliográficas que han sido publicadas sobre el empleo de MoAb como terapias frente enfermedades infecciosas (346-350) y cada vez más las empresas interesadas en el estudio de anticuerpos frente a bacterias multirresistentes a antimicrobianos, principalmente frente a las denominadas cepas bacterianas “ESKAPE” acrónimo proveniente de las principales cepas bacterianas que presentan los mayores índices de resistencias antimicrobianas (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, K. pneumoniae, A.baumannii , P. aeruginosa y Enterobacter spp.) (351). A su vez, cada vez son más los estudios en este campo que superan la fase preclínica en investigación. Es por ello por lo que en este trabajo se evalúa la eficacia terapéutica de MoAb frente a las enfermedades infecciosas causadas por A. baumannii, como alternativa a todas las estrategias que se han ido desarrollando con anterioridad y que han sido poco exitosas.

Sin embargo, aunque son numerosas las terapias basadas en MoAbs que han sido aprobadas fundamentalmente para la oncología y para indicaciones antiinflamatorias, tan solo existen dos MoAbs a fecha de hoy que hayan sido aprobados frente un agente relacionado con enfermedades infecciosas. En una revisión sobre el uso de MoAbs en enfermedades infecciosas, se recoge una tabla, (denominada tabla 1) con

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INTRODUCCIÓN los monoclonales que han sido aprobados hasta el 2015 para diferentes terapias (348).

El primer MoAb aprobado frente un agente infeccioso fue el denominado Synagis (Palivizumab), de la empresa MedImmune, para la prevención y tratamiento del virus respiratorio RSV que produce alto riesgo de infección en niños (352). El segundo MoAb aprobado frente las infecciones causadas por Clostridium difficile, denominada Bezlotoxumab, de la empresa Merck que actúa bloqueando una de las toxinas producidas por este patógeno (353). Otra variable que surgió al poco tiempo de esta terapia fue una terapia combinada de este anticuerpo unido a otro denominados Actoxumab–Bezlotoxumab, bloqueando ambos a dos toxinas en total, la toxina A y la toxina B de este patógeno, respectivamente (354).

Otros tratamientos esperanzadores basados en MoAb fue el anticuerpo Raxibacumab, comercializado por la empresa Genome Science (GSK) y aprobado por la FDA en 2012, para el tratamiento de inhalación del ántrax. Sin embargo, no superó las posteriores fases II y III en clínica (355). Otro ejemplo de MoAb generado para el tratamiento y prevención de enfermedades causadas por P. aeruginosa es el Panobacumab, de la empresa Kenta Biotech. Se trata de una inmunoglobulina (Ig M) completamente humana dirigida hacia el LPS, concretamente para los serotipos O11 de este patógeno y, actualmente, se encuentra en fase II de la clínica (356, 357). Frente a este patógeno también se ha generado un anticuerpo biespecífico (BiS4αPa) que debe su doble especificidad a una obra de ingeniería genética que ha permitido introducir en cada una de las cadenas variables un CDR distinto por lo que es capaz de reconocer dos antígenos distintos. Este anticuerpo es capaz de conferir hasta tres mecanismos de acción diferentes frente a este patógeno, dirigidos hacia el sistema de secreción de tipo III independiente del serotipo de la cepa, el factor de virulencia PcrV y el exopolisacárido que actúa como factor de persistencia Psl. Este formato ha demostrado más eficacia y protección que otras combinaciones de anticuerpos u otras estructuras de anticuerpos biespecíficas disponibles (358). Este MoAb también se encuentra actualmente en fase clínica II.

Los elevados costes económicos que suponen las terapias basadas en MoAbs, así como el mercado relativamente pequeño que se encuentra detrás de estas estrategias, resultó de poco interés en las empresas farmacéuticas y fueron los principales obstáculos que se encontró en el desarrollo de los mismos. Sin embargo, todos estos resultados alentadores que se han ido comentando abren gradualmente el campo de la investigación en estas terapias.

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INTRODUCCIÓN

4.4 Inmunoterapia para A. baumannii

A lo largo del presente trabajo se fundamenta la necesidad del abordaje del campo de la inmunoterapia frente a infecciones nosocomiales causadas por A. baumannii. Los primeros ensayos de inmunización realizados en A. baumannii aparecen a principios del año 2000 en la India y se basan en la inmunización pasiva de un anticuerpos monoclonal (359). Sin embargo el ritmo con el que fueron apareciendo cepas MDR y la incapacidad de los antimicrobianos convencionales en hacer frente a estas, extendieron y aceleraron los estudios de este sector de forma que a partir del año 2010 son varios los grupos que realizaron estudios de inmunización pasiva y activa en A. baumannii, se pueden citar estudios en España (360), EEUU (361, 362), Irán (363), Australia (364) y China (365). A partir del año 2013, en nuestro grupo se realizan varios estudios en los que se comienza a concienciar a la sociedad sobre la vacunación frente a este patógeno (366-368). Otros grupos mientras tanto basaban sus estudios en la búsqueda de antígenos para su uso en nuevas estrategias de inmunoterapia (369, 370), que además fueron respaldados con estudios posteriores que confirmaron que el empleo de antígenos en estado puro provocan una respuesta inmune más potente (371). Uno de los estudios sobre búsqueda de antígenos que tuvo más trascendencia en el sector de la inmunoterapia frente A. baumannii fue realizado por el grupo de Chiang et al. donde se combina los conocimientos sobre vacunas, bioinformática e inmunoproteómica, en este trabajo se logró identificar 13 nuevos genes de 2752 genes homólogos en A. baumannii como potenciales antigénicos candidatos a vacuna y en 3 de ellos fueron capaces de proporcionar hasta un 60% de protección en un modelo murino de neumonía por A. baumannii (372).Hasta la fecha, los modelos que se conocen sobre inmunidad activa para prevenir infecciones causadas por A. baumannii están basado en el empleo de células completas inactivadas o atenuadas, con el que nuestro grupo inició los primeros abordajes en el año 2010 con células inactivadas con formalina (360).Otros grupos también han seguido desarrollando este tipo de vacunas en los que se han obtenido grandes logros. En uno de ellos exponiendo células bacterianas completas a antibióticos han obtenido un amplio aclaramiento y protección contra las infecciones por A. baumannii multirresistentes (373).También se han realizado estudios de inmunidad activa empleando complejos de la membrana externa celular (OMC) (130) o vesículas secretadas por las bacterias durante el crecimiento (OMV) (374, 375). Además, se han desarrollado numerosos estudios de inmunidad activa con las nuevas técnicas que emplean proteínas o antígenos purificados. Existen publicaciones que emplean las

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INTRODUCCIÓN proteínas principales de la membrana externa de Acinetobacter, como OmpA (376, 377), Omp 22 (378), OmpW (379), la nucleasa de la membrana externa (NucAb) (380) o las proteínas Bap (112). También se ha probado la combinación de varias proteínas, como OMV junto Bap o OmpA y se ha obtenido un aumento en la eficacia en comparación a las vacunas de componentes individuales (381).

En cuanto a la inmunidad pasiva, se conocen diferentes antisueros capaces de producir protección frente infecciones agudas causadas por A. baumannii. Se pueden citar sueros originados de células completas, nuevamente, nuestro grupo formuló por primera vez preparaciones de multiantígenos de células completas en combinación de adjuvante capaces de dar lugar a una respuesta hiperinmune y como resultado se obtuvo un suero policlonal que produjo protección frente A. baumannii (360). Se han producido también antisueros frente OMV y OMC de este patógeno que han resultado eficaces frente infecciones del mismo (130, 365). Otras tentativas de inmunización pasiva se han realizado con polisacáridos de superficie, como Poli-N-acetil-b-(1-6)- glucosamina (PNAG) (361, 382) o el polisacárido capsular K1 (88, 383). Resultados alentadores se han obtenido también en la obtención de suero frente a proteínas purificadas, principalmente de proteínas implicadas en alguno de los mecanismos de virulencia del patógeno. Hay estudios realizados con diversas proteínas, también estudiadas en la inmunización pasiva, como Ata (362) , proteínas de regulación del hierro en la membrana externa (IROMPs) (359), OmpA (126, 128), Omp W (379), Omp 22 (378) y NucAb (380).

El empleo de MoAb como agente terapéutico frente A. baumannii, sin embargo. no ha sido del mismo extendido. El uso de MoAb frente infecciones bacterianas es escaso en comparación a las numerosas aplicaciones que se conocen en la investigación clínica, biomédica, diagnótico, terapias, así como en la biología general. Sin embargo, son numerosas las ventajas asociadas a este tipo de inmunoterapia debido a la alta especificidad, la composición bien definida del antígeno, su bajo nivel de impurezas y los métodos estandarizados a los que son sometidos para la producción industrial que simplifica mucho su elaboración.

Se han elaborado MoAB frente a proteínas de membrana que presentan un papel importante en la supervivencia de A. baumannii, cuya unión específica puede producir el bloqueo de las mismas y generar una actividad opsonizante y bactericida. Se puede citar por ejemplo el MoAb Ig M frente a las proteínas de membrana externa reguladas por hierro (IROMPs) que producen el bloqueo de la captación de hierro mediada por sideróforos en estas bacterias (359) o el MoAb Ig G1 específico de proteínas

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INTRODUCCIÓN asociadas al biofilm de A. baumannii (Bap) que nos permite conocer las funciones de esta proteína (113).

Entre los estudios más destacados sobre MoAb frente infecciones de A. baumannii se puede destacar el MoAb dirigido a la capsula K1, que aumentó significativamente la actividad bactericida mediada por neutrófilos y produjo una disminución significativa en una infección causada por una cepa de A. baumannii K1 positiva en un modelo experimental en rata (383). Posteriormente este mismo grupo descubrió la capacidad opsonizante y protectora que presentaba esta cápsula en la membrana bacteriana de A. baumannii, de forma que obstaculiza la unión del anticuerpo a su antígeno diana, en este caso la proteína Omp A, impidiendo realizar su actividad bactericida mediada por macrófagos, así como su capacidad protectora en un modelo de infección por sepsis en ratón (384).

Por último, en 2017, se ha descrito un prometedor MoAb como posible terapia frente infecciones letales de A. baumannii extremadamente resistentes a antibióticos que, tanto en su conformación natural murina como en su variante humanizada, presentaba actividad opsonofagocítica en macrófagos murinos y humanos y proporcionaba mejora en la supervivencia, en modelos murinos de sepsis bacteriémica y neumonía. Además, presentaba actividad sinérgica cuando era administrado en combinación con el antibiótico de colistina, mejorando sustancialmente los resultados de supervivencia (385).

5. Fundamento

A. baumannii se ha convertido en un arquetipo de microorganismo nosocomial emergente cuya situación epidemiológica es una de las grandes problemáticas mundiales. El continuo y creciente surgimiento de nuevos brotes nosocomiales presentan una enorme dificultad en el tratamiento, ya que se han originado cepas resistentes a la mayoría de los antibióticos disponibles en la práctica clínica, incluso a colistina, que ha mantenido actividad frente a la mayoría de las cepas multirresistentes.

La carencia actual de un tratamiento estandarizado y óptimo para este tipo de infecciones, hacen imperiosa la necesidad de, en primer lugar, conocer el comportamiento y virulencia de las cepas de A. baumannii multirresistentes y panresistentes y, en segundo lugar, buscar nuevas alternativas terapéuticas y

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INTRODUCCIÓN preventivas basadas en inmunoterapia activa o pasiva que, además de ofrecer una solución a esta problemática, contribuiría a la reducción de la emergencia de las cepas multirresistentes.

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HIPÓTESIS

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HIPÓTESIS

Capítulo 1

1. Las cepas de A. baumannii deficientes en lipopolisacárido presentan una estructura celular diferente a las cepas silvestres que les confiere diferencias biológicas.

2. Las diferencias estructurales de las cepas deficientes en lipopolisacárido les proporciona diferente susceptibilidad a los antimicrobianos indicados en clínica.

Capítulo 2

3. Las cepas de A. baumannii deficientes en lipopolisacárido presentan diferencias en el fenotipo y en el comportamiento bacteriano respecto a las cepas silvestres.

4. La pérdida del LPS en cepas de A. baumannii produce un descenso en la virulencia bacteriana que limita la capacidad de transmisión y patogénesis de la bacteria.

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OBJETIVOS

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OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

El objetivo general de este trabajo es caracterizar las cepas de A. baumannii que no producen lipopolisacárido, así como producir anticuerpos monoclonales con actividad terapéutica a partir de estas cepas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS POR CAPÍTULO

Capítulo 1

1. Aislar y caracterizar las bases genéticas de cepas de A. baumannii que no producen lipopolisacárico debido a mutaciones en los genes lpxA, lpxC y lpxD.

2. Caracterizar el efecto de la pérdida de lipopolisacárido en cepas de A. baumannii:

2.1. Caracterizar la susceptibilidad a antimicrobianos utilizados clínicamente.

2.2. Caracterizar la permeabilidad de la membrana celular.

2.3. Caracterizar el crecimiento bacteriano en presencia de péptidos antimicrobianos.

3. Caracterizar la dependencia a colistina en cepas de A. baumannii que no producen lipopolisacárido:

3.1. Caracterización de la supervivencia en presencia y ausencia de colistina.

3.2. Caracterización del crecimiento bacteriano en presencia y ausencia de colistina.

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OBJETIVOS

Capítulo 2

1. Caracterizar el fenotipo de las cepas de A. baumannii deficientes en lipopolisacárido y compararlo con el fenotipo de las cepas silvestres:

1.1. Caracterizar el crecimiento bacteriano en diferentes medios.

1.2. Caracterizar el tiempo de generación (tasa de crecimiento bacteriano).

1.3. Caracterizar el índice de competencia en diferentes medios experimentales in vitro e in vivo.

1.4. Caracterizar la producción de biofilm.

1.5. Caracterizar la sensibilidad a desinfectantes.

1.6. Caracterizar la motilidad.

1.7. Caracterizar el crecimiento en condiciones con bajas concentraciones de hierro.

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MATERIALES Y REACTIVOS

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MATERIALES Y REACTIVOS

1. Material invariable

-Para la incubación de las placas, muestras y medios de cultivo se utilizó una cámara a 37ºC de temperatura de marca Vizuete (España)

-Para la incubación de cultivos celulares se utilizó una cámara a 37ºC de temperatura, con una camisa de agua destilada en el interior, que ofrece 5% de CO2 y humedad. Forma Steri-Cycle CO2 Incubator. (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Estados Unidos)

-Las pesadas de los medios de cultivo, antibióticos y muestras de tejidos se realizaron en una balanza analítica electrónica Precisa modelo 300PS/480 (Precisa Gravimetrics AG, Dietikon, Suiza).

-Para agitar los tubos se utilizó un vórtex Heidolph modelo Reax 2000 (Heidolph ElektroGmbH, Kelheim, Alemania).

-Para la conservación de los medios de cultivos y los antimicrobianos a 4ºC se utilizó un frigorífico Liebherr FKS/UKS 360L (Liebherr Ibérica S.A., Azuqueca de Henares, Madrid, España.).

-Para la conservación de las muestras biológicas a -20ºC se utilizó un frigorífico Zanussi (Electrolux Home Products España S.A., Madrid, España).

-Para congelar de las muestras de tejido y las cepas se utilizó un congelador - 80ºCRevcoScientific modelo ULT 1786 V-O-F (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).

-Para la esterilización de los materiales se utilizó la máquina de autoclave Raypa modelo AES-75 (R. Espinar, S.L., Terrasa, (España).

-Para la homogeneización de los tejidos se usó el Stomacher Lab-Blender 80 (SewardLimited, West Sussex, Reino Unido).

-Para realizar las diluciones y tomar volúmenes en líquido se empleó un juego de pipetas Gilson modelo Pipetman serie P (Gilson Inc., Middleton, Wisconsin, Estados Unidos).

-Para el procesamiento de las muestras de sangre y recogida de suero de ratones se utilizó una centrifuga refrigerada Sigma 4K10 (Sigma Labor zentrifu gen GmbH, Osterode, Alemania).

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MATERIALES Y REACTIVOS

-Para centrifugar cultivos bacterianos de mayor volumen se utilizó la centrífugaRC6 Plus, Sorvall (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts) Rotor F13 (14X50 cy) y Rotor F14 (6X250y) para la producción de vacunas.

-Para medir la densidad óptica de los cultivos y la concentración de proteínas en los extractos de proteínas de la membrana externa, se utilizó el espectrofotómetro Bio Photomoter (eppendorf, Deltalab S.L.U., Rubí, Barcelona, España).

-Aparato de la transferencia (Trans-Blot SD. Semi-Dry Transfer Cell) (Bio-Rad, California, Estados Unidos).

-Aparato revelador de Western-BlotIQ LAS 4000.

-Para medir la densidad óptica de los cultivos en un análisis continuo y autónomo para la elaboración de una curva de crecimiento bacteriano se utilizó un espectrofotómetro (Tecan Trading AG, Suiza), para la medición instantánea de la densidad óptica en ensayos ELISA y de producción de biofilm se utilizó el lector de placas con ayuda del programa Scan Plus.

-Aparato termociclador: Thermal cycler 2720 (Aplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).

2. Material fungible

2.1 Material de laboratorio

-Tubos Eppendorf (Deltalab S.L.U., Rubí, Barcelona, España).

-Cubetas para medir la densidad óptica. Cuvettes 10x10x45 Semi-micro (GreinerBio- One Frickenhausen, Alemania).

-Placas de Petri de poliestireno estériles de 100 mm (Francisco Soria Melguizo, S.A., Valdemoro, Madrid, España).

-Tubos de polipropileno cónicos de 50 y 15 ml (Greiner Bio-One Frickenhausen, Alemania).

-Embudos y tubos de plástico MiniCollect (Greiner Bio-OneFrickenhausen, Alemania) de 0,8 ml con separador de suero.

-Criotubos de 1,2 ml (Thermo Fisher Scientific Inc., Roskilde, Dinamarca).

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MATERIALES Y REACTIVOS

-Pipetas serológicas de 5,10, 25 y 50 ml (BD BIOSCIENCESFalcon, MA 01730 USA).

-Placa para ELISA, High binding, de 96 pocillos fondo plano (Corning Inc., Corning, NY).

-Placa de microdilución de 96 pocillos fondo “V” y fondo “U” (Greiner Bio-one, Frickenhausen, Alemania.)

-Suero fisiológico 0,9% NaCl p/v (FreseniusKabi S.A., Barcelona, España).

-Phosphate Buffered Saline (10x) (PBS), BE17-517Q, Lonza (Basel, Suiza).

-Raspadores de células de cultivo: Cells crapers (Biologix Research company Cat#70- 1250, USA).

-Asas estériles de siembra (Copan, Medical Expo, Italia)

2.2. Medios de cultivo

-Mueller Hinton Broth (MHB) y Mueller Hinton Broth II con cationes ajustados (MHBII) (Fluka, Sigma-AldrichSt. Louis, MO 63103, USA).

-Tryptone Soya Broth (TSB) (Oxoid CM0129 LTD, Basingstoke, Hampshire, England).

-LB-Broth (Lennox) (Pronadisa, Cat #1231.00, Conda, Madrid, España).

-RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) medium without L-glutamine SH30096.01 (GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA).

-Mueller Hinton Agar (MHA) (Fluka, Sigma-Aldrich St. Louis, MO 63103, USA).

-Agarosa D1 LOW EEO (Pronadisa; Cat#8014, Conda, Madrid, España).

-Placas de agar sangre (Agar-Sangre Columbia, Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA).

2.3. Antimicrobianos para estudios in vitro

-Colistina: Colistin Sulfate Salt, Ref. C4461-1G (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

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MATERIALES Y REACTIVOS

-Amicacina: Amikacin Sulfate Salt, Ref. A2324-5G (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Ceftazidima: Ceftazidime Hydrate, Ref. C3809-1G (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Ciprofloxacino: Ciprofloxacin, Ref. 17850-5G (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Imipenem: Imipenem Monohydrate Ref. I0160-25 mg (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Rifampicina: Rifampicin Ref. R-3501 (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Sulbactam: Sulbactam Ref. S9701 (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Tigeciclina: Tigeciclina, Ref. SRP02356T (Sequoia Research Product, United Kingdom).

-Ampicilina: Ampicillin sodium Ref. 10169533 (Intron Biotechnology, Sangdaewon- Dong, Joongwon-Ku, Sungnam, Kyungki-Do, Korea).

-Gentamicina: Gentamicin sulfate salt. Ref. G1264 (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Ticarcilina: Ticarcillin disodium salt. Ref. T5639 (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Azitromicina: Azithromycin. Ref: 57941 (Fluka, Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Cefepime: Cefepime Hydrochloride Ref. A3737 (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Meropenem: Meropenem Trihydrate Ref. M2574 (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Vancomicina: Vancomycin Hydrochloride fromStreptomyces orientalis. Ref. V2002 (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Tiras de E-test de colistina (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Francia).

-Péptidos antimicrobianos: Melittin, Pigcecropin P1, Mastoparán, Indolicidin, Cecropin A (1-8)–Melittin (1-18) y Cecropin A (1-7)– Melittin A (2-9) (Biorbyt, Cambridge, UK)

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MATERIALES Y REACTIVOS

2.4. Material para experimentación animal

Para la administración del anestésico y bacterias se utilizaron:

-Agujas de 25G (0,5x16 mm) (NiproEurope NV, Zaventem, Bélgica) y jeringas de 1 ml de volumen Plastipak (Becton Dickinson S.A., San Agustín del Guadalix, Madrid, España).

-Mucina gástrica porcina tipo II en la preparación del inóculo bacteriano, para la diseminación adecuada de la bacteria en el organismo huésped y aumentar la virulencia del mismo (Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, España).

-Tiopental sódico al 5% p/v (Tiobarbital Braun, envase 500 mg, Braun Medical SA, Barcelona, España) como anestésico sistémico.

Para la administración de vacunas y anticuerpos monoclonales se utilizaron:

-Agujas de insulina (30G) (0,3x8 mm) (BD Micro-Fine + Deni, Becton Dickinson, Francia).

Para la recogida de sangre y obtención de suero, así como su almacenamiento, se utilizó:

-Embudos y tubos de plástico Mini Collect (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) de 0,8 ml con separador de suero.

-Criotubos de 1,2 ml (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).

2.5 Reactivos y Kits de experimentación

-Kits Lisado de amebocitos de Limulus: Kits Limulus Amebocyte Assay (LAL), QCL- 1000, Lonza (Basel, Suiza).

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MATERIALES Y REACTIVOS

-ECL Plus Western Blotting Detection Reagents quimioluminescence (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).

-Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad, California, Estados Unidos) para Bradford.

-Solución de Bromuro de Etidio, 10 mg/ml en H2OE1510 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA).

-Quelante de hierro: 2,2’-Bipyridyl (Bip) 798533(Sigma-AldrichSt. Louis, MO 63103, USA).

-3,3´,5,5´,-Tetramethyl-benzidine Liquid Substrate, Supersensitive, para ensayos ELISA (Sigma-AldrichSt. Louis, MO 63103, USA).

- Leche desnatada en polvo (Asturiana®, España).

-Tween-20 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA).

-TEMED (Tetramethylethylenediamine, #1610801, Bio-Rad, California, Estados Unidos)

-Bis/Acrilamida: 30% Acrylamide/Bis Solution, 29:1 #1610156(Bio-Rad, California, Estados Unidos).

-Ammonium persulfate, APS, A3678 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA).

-N-lauryl-Sarcosinato Sódico salt-solution Fluka Bio Chemica L5125 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA).

-Tris-Base (Intron Biotechnology, Korea).

-Sodium Carbonate, ACS reagents anhydrous S1641 (Sigma-Aldrich St. Louis, MO 63103, USA).

-β-Mercaptoetanol: M3701 (Sigma-Aldrich St. Louis, MO 63103, USA).

-Trizma Base (Intron Biotechnology, Korea).

-Dodecilsulfatosódico (SDS): Sodium dodecyl sulfate 436143 (Sigma-AldrichSt. Louis, MO 63103, USA).

-Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) P8139 (Sigma-AldrichSt. Louis, MO 63103, USA).

-Azul tripán: Trypan blue solution T8154 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA).

- Baby rabbit complement C12CA (Bio-Rad, California, Estados Unidos).

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MATERIALES Y REACTIVOS

-Agua estéril para PCR: Gibco Mol Bio grade Dnase,- Rnase and protease free, Ref: 1097-035, (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).

-dNTPs (Invitrogen, Ref: 18427088, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).

-Kit Expand High Fidelity PCR System (Roche, Ref: 11 759 078 001, Mannheim, Alemania).

-Kit QIAamp® DNA Mini Kit; Ref: 51306 Ref: 51306 (Hilden, Alemania).

- Azul de bromofenol: Ref: 32768 10 (Riedel-de Haën, Seelze, Alemania).

-RedSafe™ Ref: 21141 (iNtRON Biotechnology, Sangdaewon-Dong, Joongwon-Ku, Sungnam, Kyungki-Do, Korea).

-TAE 10X Ref: 15558-026 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).

-Adjuvante de aluminio fosfato (Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark).

-Anticuepo secundario Ig G (Goat Anti-Mouse Ig G (H+L) HRP conjugate AP308P (Sigma-Aldrich St. Louis, MO 63103, USA).

-Suero humano (suero del plasma masculino tipo AB) H4522 Sigma (Sigma-Aldrich St. Louis, MO 63103, USA).

-Suero Fetal Bovino Ref: 10270-106 Gibco (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).

3. Material biológico

3.1 Cepas bacterianas

En el presente trabajo se emplearon una variedad de aislados clínicos de A. baumannii procedentes de estudios nacionales con diferente origen y mecanismos de resistencia (Estudios GEIH-Ab2000 y GEIH Ab-2010), aislados clínicos procedentes del Hospital Universitario Virgen Del Rocío de Sevilla, aislados procedentes del Hospital Universitario de A Coruña, cedidos por la gentileza del Doctor Germán Bou.

Se empleó un total de 5 cepas controles:

-A. baumannii ATCC 19606

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MATERIALES Y REACTIVOS

-A. baumannii ATCC 17978

-E. coli 25922

-P. aeruginosa ATCC 27853

-P. aeruginosa ATCC HER-1018 (PAO1)

A partir los aislados anteriores y las cepas controles de A. baumannii se han obtenido variedad de cepas con mutaciones viables. El total de cepas bacterianas utilizadas a lo largo de este trabajo, se detalla en el apartado de resultados, distribuidas en las tablas ubicadas al inicio del capítulo correspondiente.

3.2 Línea celular en cultivo

-RAW 264.7 (ATCC® TIB-71™): Línea celular, adherente, de macrófagos murinos procedentes de leucemia inducida por virus. Organismo: Mus musculus, cepa de ratón: Balb/C. https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/TIB71.aspx?geo_country=es

-HL-60 (ATCC® CCL-240™): Línea celular, en suspensión, de células promielíticas procedentes de leucemia humana. Organismo: Homo sapiens, humano. https://www.lgcstandards-atcc.org/Products/All/CCL-240.aspx.

3.3 Animales de experimentación

Se utilizaron ratones hembras inmunocompetentes C57BL/6 con un peso de entre 16 y 20 g. Los ratones fueron suministrados por el Centro de Producción Animal y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla, contando con el certificado sanitario de SPF (specific pathogen free) y de autenticidad genética.

El uso de los animales para el presente trabajo fue autorizado por la Comisión Ética de Investigación Clínica del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla.

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METODOLOGÍA

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METODOLOGÍA

1. Aislamiento de cepas con mutación en LPS

Las cepas de A. baumannii con mutación en LPS resistentes a colistina se obtuvieron mediante un proceso de selección no dirigido en el que se sembraron cultivos líquidos de cepas parentales, de distinta procedencia, todas ellas sensibles a colistina, en placas de MHBII y agar 1,5% (p/v) añadiendo una concentración de colistina sulfato de 10 mg/l. Por tanto, las colonias obtenidas presentaron mutaciones espontáneas que les conferían resistencia a colistina.

En el proceso de selección se empleó la cepa tipo de A. baumannii ATCC 19606 (386) y cinco cepas clínicas multirresistentes obtenidas en 25 hospitales españoles (proyecto GEIH-Ab 2000), Ab-84, Ab-108, Ab-167, Ab-176, Ab-208 (387), todas ellas sensibles a colistina.

Todas las cepas mutantes con resistencia a colistina fueron caracterizadas por secuenciación (388) y los primers empleados para secuenciar los genes lpxA, lpxC y lpxD se muestran en la siguiente tabla.

Nombre del Primers Secuencia gen

lpxA BamHI-lpxA forward 5´-acgccaggatccggttcattattcctgtttgct-3´

BamHI-lpxA reverse 5´-attcaaggatcccacctcgagcattgtacca-3´

lpxC lpxC forward 5´-caaagcatggtgaaacagcg-3´

lpxC reverse 5´-gaccctaagcttagccaagc-3´

lpxD lpxD forward 5´-gctaattggtgaaggtagtc-3´

lpxD reverse 5´-gacgaatcgtttgaatctgc-3´

Tabla 3. Secuencia de las parejas de oligonucleótidos utilizados en la secuenciación de los genes lpxA, lpxC y lpxD.

Para confirmar la resistencia a colistina de las cepas mutantes, se determinó la CMI mediante microdilucción siguiendo las especificaciones descritas en la guía Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). El procedimiento de la CMI se explica más adelante en el presente trabajo.

Una de las cepas seleccionadas con una mutación en el gen lpxA fue complementada mediante electroporación con el plásmido pWH1266 que contiene el gen silvestre, en

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METODOLOGÍA el punto de corte BamH1 (97). Los transformantes fueron seleccionados por su resistencia al antibiótico ticarcilina a una concentración de 80 mg/L.

2. Niveles de endotoxina

La pérdida de LPS en las cepas mutantes fue confirmada mediante la medición de los niveles de endotoxina utilizando el kit QCL-1000 Lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Este ensayo determina la endotoxicidad de bacterias gram negativas, entre otros tipos de muestras biológicas, de forma cromogénica y ésta se correlaciona proporcionalmente con la presencia de LPS en su membrana. Así, el LAL es un extracto acuoso de células sanguíneas (amebocitos) del cangrejo herradura (Limulus polyphemus). En presencia de endotoxinas se produce la activación en una cascada proteolítica de proenzimas presentes en los reactivos del LAL que acaba originando la escisión de un sustrato peptídico (artificial e incoloro), liberando para-nitroanilina (pNA), de tonalidad amarillenta que absorbe a una longitud de onda de 405 nm, permitiendo su lectura mediante el espectrofotómetro, en cambio si no se detecta endotoxina en la muestra el volumen permanece incoloro.

Se cuantificó los niveles de endotoxina en tres cultivos independientes de cada cepa. Se añadió un volumen de 50 µl del reactivo libre de endotoxinas previamente preparado a un volumen de muestra y recta patrón de concentraciones conocidas de endotoxina y se incubó la mezcla de reacción a 37ºC.Tras el cumplimiento del protocolo y haber añadido la solución sustrato y la solución de parada de reacción, se realizó una lectura fotométrica de todas las muestras y de la recta patrón calculándose la concentración de endotoxina presente en cada una de las muestras. Cuanto mayor sea la concentración de endotoxinas de la muestra, más cantidad de PnA se produce y mayor será el valor de lectura realizada.

3. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diversos antibióticos

El estudio de la CMI se llevó a cabo mediante el método de microdilución en caldo tal como se especifica en el CLSI (389). Para ello, se utilizaron placas de microdilución de 96 pocillos fondo “V”, conteniendo 50 μl de MHBII a los que se añadieron 100μl totales de los antimicrobianos: ampicilina, ciproflaxacino, colistina, gentamicina, sulbactam,

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METODOLOGÍA ticarcilina, tigeciclina, amikacina, azitromicina, ceftazidima, cefepime, imipenem, meropenem, rifampicina y vancomicina. A continuación, se realizan diluciones seriadas al 50% a partir de la solución madre de los antimicrobianos. De esta forma se precisaron un total de 10 pocillos que contenían concentraciones de los antimicrobianos decrecientes. Finalmente, se añadieron 50 μlde cada una de las cepas de A. baumannii a testar ajustadas a la concentración 5x105ufc/ml, obtenidas a partir de un cultivo de 4 horas (fase de crecimiento logarítmico) en medio líquido MHBII a una temperatura de 37ºC, en aerobiosis. Se realizaron, además, controles de crecimiento con inóculo bacteriano y sin antibiótico, así como control de esterilidad sin antibiótico y sin inóculo.

Todas las placas se incubaron en aerobiosis a 37ºC, durante 24 horas. Tras ese período, se realizó la lectura de las mismas, definiendo como CMI la concentración más baja de antimicrobiano a la cual el caldo no presentaba turbidez macroscópica visible. Para la definición de sensibilidad y resistencia de los diferentes antimicrobianos se utilizaron los criterios definidos por el CLSI (390). El ensayo se realizó por duplicado, aceptándose un margen de error de una dilución por encima y por debajo del valor alcanzado previamente.

4. Estudio de permeabilidad de la membrana bacteriana

El estudio comparativo de la permeabilidad de membrana de los distintos aislados clínicos de A. baumannii deficientes en LPS empleados en el estudio se realizó mediante la detección de fluorescencia del bromuro de etidio (BrEt) que la célula es capaz de incorporar en su interior. Para ello, las distintas cepas bacterianas, crecidas de placas de agar sangre en el caso de las cepas multirresistentes y MHBII con 10 mg/L de colistina en el caso de las mutantes sin LPS, fueron resuspendidas en 5ml de tampón fosfato salino (PBS 1X) y la densidad óptica a 600 nm (DO600nm) fue ajustada a 0,2. Se añadieron 95 μl de cada cultivo ajustado en placas de microdilución de 96 pocillos fondo plano oscura con fondo transparente y se incubaron en aerobiosis a

37ºC y sin atmósfera de CO2 durante 10 minutos. A continuación, se añadieron 5μl de un stock preparado de BrEt a una concentración de 40 μg/ml a cada pocillo con suspensión bacteriana de diferentes cepas para alcanzar una concentración final de 2 μg/ml. Para medir la permeabilidad celular o la capacidad de la membrana celular de adquirir el BrEt y permitir su unión al ADN en el interior, se midió la fluorescencia en

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METODOLOGÍA longitud de excitación a 530 nm y de emisión a 600 nm cada 3 minutos durante 30 minutos y posteriormente cada 15 minutos hasta completar 120 minutos. Los valores obtenidos son arbitrarios representándose el incremento de fluorescencia en el tiempo que se correlaciona con la entrada de BrEt en la célula y la unión al ADN y, por tanto, una mayor fluorescencia se interpreta como mayor permeabilidad de la membrana de la cepa bacteriana.

5. Curva de crecimiento en presencia de péptidos antimicrobianos

El estudio comparativo de la actividad que presentan distintos péptidos antimicrobianos (Melittin, Pig cecropin P1, Mastoparán, Indolicidin, Cecropin A (1-8)– Melittin (1-18) y Cecropin A (1-7)–Melittin A (2-9) en el crecimiento bacteriano de los distintos aislados clínicos de A. baumannii empleados en el estudio se realizó mediante curvas de crecimiento utilizando diferentes concentraciones de los mismos. Para ello, las distintas cepas bacterianas procedentes de un cultivo sólido, en placas de agar sangre en el caso de las cepas multirresistentes y de MHBII con 10 mg/L de colistina en el caso de las mutantes sin LPS, fueron resuspendidas en 10 mM de un tampón de fosfato sódico a pH 6,5 y la DO600nm fue ajustada a 0,5. Se realizó una dilución 1:10 de este cultivo bacteriano y se añadieron 100 µl de la dilución a 100 µl de cada uno de los péptidos antimicrobianos diluidos en el tampón de fosfato sódico 10 mM a pH 6,5. Las diluciones de los péptidos consistieron en concentraciones crecientes 2X de cada uno de los péptidos desde 0 a 32 mg/L en todos los casos. Esta mezcla fue incubada durante1 hora a 37ºC sin atmósfera de CO2. Tras la incubación, las diferentes mezclas fueron sembradas en diluciones seriadas en places de agar sangre para observar la viabilidad de las cepas bacterianas.

6. Ensayos E-test de colistina

El ensayo de E-test tiene como finalidad mostrar una visualización de la susceptibilidad y resistencia de las distintas cepas de A. baumannii utilizadas en este estudio. En dicho ensayo se emplean unas tiras de E-test con concentraciones crecientes del antibiótico desde 0,016 hasta 256 mg/L de colistina.

Las distintas cepas bacterianas procedentes de un cultivo sólido, en placas de agar sangre en el caso de las cepas multirresistentes y MHBII con 10 mg/L de colistina en

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METODOLOGÍA el caso de las mutantes sin LPS, fueron resuspendidas en 5ml suero fisiológico o cloruro de sodio 0,9% (p/v) y se ajustó la DO600nm a 0,2 en cada uno de los cultivos. En estos cultivos ajustados se humedeció un bastoncillo de algodón, que fue posteriormente extendido homogéneamente por toda la superficie de una placa de MHBII sobre la que se depositó la tira de E-test en el centro de la misma. Las placas se incubaron en aerobiosis a 37ºC y sin atmósfera de CO2 durante 24 horas antes de ser examinada.

De la misma forma, se empleó este mismo ensayo para determinar la diferencia de fenotipo que existía en las colonias crecidas en la zona próxima a la tira de E-test, con mayor concentración de colistina, y las colonias que crecían en la zona más alejada de la tira, o ausencia del antibiótico.

7. Ensayo de supervivencia

La supervivencia y la capacidad de crecer en presencia de colistina de las cepas deficientes en LPS fueron determinadas. Todas las cepas deficientes en LPS empleadas en el estudio, procedentes de un cultivo sólido en MHBII con 10 mg/L de colistina, fueron resuspendidas en 5 ml suero fisiológico o cloruro de sodio 0,9% (p/v), se ajustó la DO600nm a 0,2 en cada uno de los cultivos, se realizaron diluciones seriadas de dos logaritmos hasta 10-4 y fueron sembradas en volumen de 100 μl en placas de MHBII y MHBII con una concentración de colistina de 5 mg/L. Todas las placas fueron incubadas en aerobiosis a 37ºC. Se realizó una visualización de las placas tras 24 y 48 horas de incubación se determinó el número de colonias viables tras las 48 horas de incubación, momento en que finalizó el estudio. Este ensayo se realizó por triplicado.

8. Curva de crecimiento

La diferencia de crecimiento de las cepas de A. baumannii deficientes en LPS se determinó mediante curvas de crecimiento en medios en presencia y ausencia de colistina. Para ello, se realizaron caldos de cultivo en MHBII con 10 mg/L de colistina de todas las cepas deficientes en LPS del estudio incubándose en aerobiosis a 37ºC, sin atmósfera de CO2 durante 16 horas. La concentración de los mismos fue ajustada a 5x102ufc/ml en medios MHBII sin colistina y con colistina a una concentración de 5 mg/L. Se administró un volumen 200 μl de cada uno de los cultivos ajustados, por

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METODOLOGÍA triplicado, en una placa 96 pocillos. El crecimiento de los cultivos fue monitorizado en el espectrofotómetro (Tecan) que producía agitación y medición de la absorbancia a 595 nm cada 30 minutos durante 24 horas a 37ºC.

9. Curva de crecimiento en Mueller Hinton Broth y suero humano

La diferencia de crecimiento de las cepas de A. baumannii deficiente o no en LPS se determinó mediante curvas de crecimiento en el medio rico convencional, MHB y en suero humano inactivado a 56ºC durante 30 minutos.

Para ello, se realizaron caldos de cultivo de MHB y suero humano inactivado y filtrado añadiendo 3 ml de unos cultivos bacterianos previos incubados en aerobiosis a 37ºC, sin atmósfera de CO2 durante 16 horas, ajustados a una concentración bacteriana de 5x105cél/ml.

Las cepas empleadas en el estudio son la cepa tipo de A. baumannii ATCC 19606, una cepa mutante procedente de esta anterior deficiente en LPS y la cepa complementada procedente del mutante con fenotipo revertido al silvestre. Los cultivos ajustados fueron incubados a 37ºC, en estático, sin atmósfera de CO2 y se fueron recogiendo alícuotas de 150 µl a las 0, 12, 24, 36, 48, 60 y 72 horas de incubación en las que finalizó el estudio. Las alícuotas recogidas fueron sembradas en placas de agar sangre y el recuento de colonias se realizó tras las 24 horas de incubación de las placas a 37ºC, sin atmósfera de CO2. El ensayo fue realizado en triplicado para cada una de las cepas.

10. Tiempo de generación

El tiempo de generación (Tg) o replicación bacteriana es el periodo de tiempo que requiere la célula o la población microbiana en replicarse y dar lugar a una nueva generación. El Tg se determinó de forma similar a una curva de crecimiento. Concretamente, se realizaron caldos de cultivo de MHB ajustados a una concentración bacteriana de 5x105 ufc/ml procedentes de caldos de cultivos previos incubados en aerobiosis a 37ºC, durante 16 horas de cada una de las cepas del estudio. Se administró un volumen 200 μl de cada uno de los cultivos ajustados, por triplicado, en una placa de 96 pocillos. El crecimiento de los cultivos fue monitorizado en el

77

METODOLOGÍA espectrofotómetro (Tecan) que producía agitación y medición de la absorbancia a

DO595 nm cada 30 minutos durante 24 horas a una temperatura de 37ºC.

Tras la representación de las curvas de crecimiento de todas las cepas e identificar la fase exponencial en cada una de las gráficas, así como la zona de máxima pendiente dentro de la misma, el Tg fue calculado aplicando la siguiente fórmula:

Tg = 2t / (OD2/OD1)

Donde t representa el tiempo que transcurre en los puntos escogidos de máxima pendiente en la fase exponencial de la curva, OD1 es la DO595 nm del punto más bajo de la pendiente y OD2 la DO595 nm del punto más alto de la pendiente.

Se calculó la media ponderada de las máximas pendientes obtenidas en triplicado y se representó el tiempo de generación de cada cepa del estudio en minutos.

11. Determinación del índice de competencia

El índice de competencia de las cepas de A. baumannii deficientes en LPS en comparación con las cepas silvestres es una unidad relativa definida como el número de colonias viables recogidas en un cultivo de la cepa mutante/ el número de colonias viables en un cultivo de la cepa silvestre, dividido entre el número de células iniciales de la cepa mutante/ el número de células iniciales en la cepa silvestre. En definitiva, expresa la capacidad que posee la cepa deficiente en LPS para crecer en un medio determinado frente a la que presenta la cepa silvestre.

Las cepas empleadas en el estudio son la cepa tipo de A. baumannii ATCC 19606, una cepa mutante procedente de esta anterior deficiente en LPS y la cepa complementada procedente del mutante con fenotipo revertido al silvestre.

La determinación del índice de competencia en el crecimiento in vitro fue realizada en el medio rico MHB yen suero humano inactivado y filtrado. El procedimiento fue similar a la curva de crecimiento realizada en estos medios previamente. Tras 24 horas de incubación a 37ºC en estático sin atmósfera de CO2, se recogieron alícuotas de 150 µl que fueron sembradas en placas de agar sangre y el recuento de colonias se realizó tras las 24 horas de incubación de las placas a 37ºC.

Para determinar el índice de competencia en el crecimiento in vivo, se realizaron grupos de tres ratones hembras C57BL/6 (Universidad de Sevilla) que fueron infectados con un inóculo de 1,25x105ufc/ratón en un volumen total de 0,5 ml para

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METODOLOGÍA cada una de las cepas del estudio en una mezcla 1:1 con mucina porcina al 10%. Los ratones fueron infectados utilizando un modelo de infección intraperitoneal (130, 360). Este modelo produce la rápida diseminación de la bacteria a los distintos órganos y, normalmente, produce la muerte del animal entre las 24 y 48 horas tras la inoculación. A las 24 horas de la infección, los animales fueron sacrificados y se recogieron muestras del bazo que fueron homogeneizadas en un volumen de 2 ml de suero fisiológico estéril y sembrado en placas de agar sangre en diluciones seriadas. El recuento de colonias contenidas en el bazo se realizó tras las 24 horas de incubación de las placas sembradas a 37ºC sin atmósfera de CO2. El ensayo fue realizado en triplicado para cada combinación de cepas.

Todos los experimentos realizados con animales fueron aprobados por el Hospital Universitario Virgen del Rocío, en el Comité de Ética y Experimentación (Código de Evaluación: 2013PI/296). En todos los ensayos se trató de minimizar el sufrimiento del animal y si durante el procedimiento experimental el animal mostró síntomas agonizantes se procedió inmediatamente a la eutanasia.

12. Producción de biofilm

La producción de biofilm de las distintas cepas de A. baumannii empleadas en el estudio se determinó a partir de caldos de cultivo en MHBII con una concentración bacteriana de 5x103ufc/ml, en un volumen final de 10 ml procedentes de caldos de cultivos previos incubados en aerobiosis a 37ºC, sin atmósfera de CO2 durante 16 horas. Se tomaron 200 μl de cada uno de estos cultivos ajustados, tres volúmenes por cada cepa, y se depositaron en pocillos de una placa de 96 pocillos de poliestireno en fondo "U". La placa fue incubada a 37ºC, sin atmósfera de CO2 durante 24 horas sin agitación. Tras la incubación, el sobrenadante fue descartado, los pocillos se lavaron dos veces con agua destilada por inmersión, se añadieron 200 μl de cristal violeta al 0,4% (v/v) y se dejó incubar 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. A continuación, se retiró el exceso de solución, se volvió a lavar dos veces con agua destilada y se secó la placa al aire libre con ayuda de un papel de filtro. Finalmente, se añadieron 200 μl de etanol 95% (v/v) en cada pocillo para obtener una suspensión del producto de biofilm teñido y volvió a incubarse la placa 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. Tras este periodo de incubación, se homogeneizó la solución contenida en cada pocillo, se transfirió todo el volumen a una nueva placa de 96 pocillos de poliestireno en fondo plano con ayuda de una pipeta multicanal y, por

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METODOLOGÍA

último, se midió la absorbancia de la placa a una DO580nm conun lector de placas con ayuda del programa Scan plus. Este ensayo se realizó por triplicado.

13. Determinación de la CMI de desinfectantes

Para determinación la CMI de los desinfectantes bacterianos más comúnmente empleados en clínica, el procedimiento fue similar al de una CMI convencional detallada anteriormente. De la misma forma, se emplearon cultivos en MHBII en fase logarítmica de cada una de las cepas de A. baumannii a testar ajustados a 5x105ufc/ml. Para cada desinfectante se utilizó un stock a concentraciones distintas: para clorhexidina a 500 mg/L, el deoxicolato a 10 mM, SDS (dodecilsulfato sódico) a 12,5 g/L, etanol al 50% (v/v) y povidona yodada a 12,5 g/L. En una placa de poliestireno de 96 pocillos con fondo "V" se administró un volumen total de 100 μl de estos stocks, de los que se realizaron diluciones seriadas al 50% a los que se les inocularon 50μl de los cultivos ajustados de cada cepa. Se realizaron, además, controles de crecimiento con inóculo bacteriano y sin desinfectante, así como control de esterilidad sin desinfectante y sin inóculo. Todas las placas se incubaron en aerobiosis a 37ºC y sin atmósfera de CO2 durante 24 horas. Tras ese período se realizó la lectura de la misma forma que se estableció anteriormente. El ensayo se realizó por duplicado, aceptándose un margen de error de una dilución por encima y por debajo del valor alcanzado previamente.

14. Determinación de la motilidad

La motilidad o capacidad de desplazamiento que presentan las cepas del estudio se determinó a partir de caldos de cultivo en MHBII con una concentración bacteriana de 1x107ufc/ml, en un volumen final de 3 ml, procedentes de caldos de cultivos previos incubados en aerobiosis a 37ºC, sin atmósfera de CO2 durante 16 horas. Se inoculó una gota de un volumen de 2 μl de estos cultivos ajustados en el centro de placas de LB-Broth con 0,3% de agarosa secada durante 30 minutos en una campana de flujo laminar. Las gotas se dejan secar en la placa destapada en condiciones de esterilidad durante 10 minutos. Posteriormente, estas placas se incubaron en una cámara con un

80% de humedad a una temperatura de 37ºC, sin atmósfera de CO2. Los radios de crecimiento fueron medidos tras las 24, 48 y 72 horas de incubación. Como controles se emplearon dos cepas de A. baumannii en los que se había realizado este ensayo

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METODOLOGÍA previamente: en el caso del control positivo, se empleó una cepa clínica del GEIH 2010 Nº8 que había mostrado motilidad en un estudio previo y como control negativo la ATCC 19606 que no presentaba motilidad. Se realizaron tres placas por cada cepa a testar.

15. Curvas de crecimiento en presencia del quelante de hierro 2,2'- Bipyridyl (Bip)

La capacidad de crecimiento en un medio rico deficiente en hierro de las diferentes cepas del estudio se determinó mediante curvas de crecimiento a partir de caldos de cultivo de MHBII ajustados a una concentración bacteriana de 5x105ufc/ml, procedentes de caldos de cultivos previos incubados en aerobiosis a 37ºC, sin atmósfera de CO2 durante 16 horas. Se administró esta concentración bacteriana para cada una de las cepas del estudio en un volumen final de 200 μl de MHBII con una concentración de 150μM del quelante Bip, en una placa de 96 pocillos. El crecimiento de los cultivos fue monitorizado en un espectrofotómetro (Tecan i-control 1.6.19.2 machine) que producía agitación y medición de la absorbancia a DO595nm cada 30 minutos durante 24 horas a una temperatura de 37ºC. Este ensayo se realizó en triplicado.

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RESULTADOS

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RESULTADOS

CAPÍTULO 1. Caracterización microbiológica de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y la dependencia a colistina

Los resultados de este capítulo han sido publicados en el manuscrito “García- Quintanilla M, Carretero-Ledesma M, Moreno-Martínez P, Martín-Peña R, Pachón J, McConnell MJ. Lipopolysaccharide loss produces partial colistin dependence and collateral sensitivity to azithromycin, rifampicin and vancomycin in Acinetobacter baumannii. Int J Antimicrob Agents 2015 Dec; 46(6):696-702” (se adjunta la separate al final de los Resultados)

1. Aislamiento de cepas de A. baumannii resistentes a colistina y comprobación de la deficiencia en LPS

El proceso de selección de cepas de A. baumannii resistentes a colistina se detalla en la figura 9. En este proceso, realizado con la cepa ATCC 19606, se identificaron dos mutantes que albergaban mutaciones en los genes de biosíntesis de LPS, concretamente una delección en los genes lpxD y lpxA en las cepas IB010 y IB004, respectivamente (Tabla 4). Las cepas resistentes a colistina, procedentes de los aislados clínicos multirresistentes, presentaron mutaciones en el gen lpxA en la cepa Ab-108R, lpxC en las cepas Ab-84R y Ab-167Ry en lpxD en las cepas Ab-176R y Ab- 208R (Tabla 4).

La pérdida fenotípica de LPS se confirmó, midiendo los niveles de endotoxina de las cepas mutantes y se comparó con los resultados obtenidos con las cepas parentales que presentan LPS. Como se especifica en la figura 10 A, los niveles de endotoxicidad son menores de 1 UE/ 106 cél, donde se encuentra el límite de detección de este ensayo, en todas las células resistentes a colistina, deficientes en LPS, en cambio, las cepas silvestres de las que proceden estos mutantes presentan diferentes niveles de endotoxina siempre superior a 17 UE/ 106 cél en la media ponderada, fundamentalmente la cepa tipo ATCC 19606 que presenta 1060 UE/ 106cél. En la figura 10 B se observa la diferencia considerable de endotoxicidad que muestran las cepas deficientes en LPS frente a las silvestres con LPS.

Todas las cepas clínicas y derivados de la ATCC 19606 deficientes en LPS demostraron resistencia a colistina (CMI> 128 mg/l, excepto en Ab-208R cuya CMI fue de 256 mg/l). IB004, que contiene una mutación en lpxA, se complementó con un

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RESULTADOS plásmido que codifica una copia del gen lpxA silvestre (IB004 + pWH1266-lpxA). La complementación resultó restaurar tanto los niveles de endotoxina (figura 10) de la cepa parental como la susceptibilidad a la colistina, lo que indica que la mutación en lpxA fue responsable de la pérdida de LPS y la resistencia a colistina (tabla 4).

Figura 9. Obtención de cepas de A. baumannii deficientes en LPS, resistentes a colistina, incluidas en el estudio. Representación del operón que contienen los genes lpx A, C, D y descripción de las mutaciones que albergan los genotipos de cada una de las cepas obtenidas. Los diferentes elementos que componen el operón se representa por colores R: Regulador (amarrillo), P: Promotor (celeste), O: Operador (naranja). MHBII: Mueller Hinton Broth con cationes ajustados.

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RESULTADOS

Colistina

Cepas CMI Mutación/Descripción (mg/L)

ATCC 19606 Cepa bacteriana de referencia susceptible a antibióticos ≤ 0,25

Ab-84 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0,25

Ab-108 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0,25

Ab-167 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0,25

Ab-176 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0,25

Ab-208 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0,25

Inserción de 40 nucleótidos en el nucleótido 321 del gen lpxC generando un Ab-84R > 128 codón stop prematuro

Ab-108R Sustitución T614A que produce I205N en el gen lpxA > 128

Ab-167R Inserción de ISAbaI en el nucleótido 321 del gen lpxC > 128

Sustitución G739T en el nucleótido 739 del gen lpxD que produce un codón Ab-176R > 128 de stop prematuro

Ab-208R Sustitución de C593A que produce A198E en el gen lpxD >256

CS01 Aislado clínico de A. baumannii susceptible a colistina ≤ 0,25

Cepa resistente a colistina, derivada de CS01 que contiene el cambio de CR17 64 aminoácido M12K en el gen pmrA

Cepa resistente a colistina, derivada de ATCC 19606 que contiene mutación RC64 64 en el gen pmrB

Delección en el nucleotido 461 en el gen lpxA generando un desfase en la IB004 > 128 lectura después de S153

IB010 Delección entre los nucleótidos 103-565 en el gen lpxD > 128

IB004+ IB004 complementada con el plásmido pWH1266 expresando el gen ≤ 0,25 pWH1266-lpxA parental lpxA

ABP001-VXD Aislamiento clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0.25

Estirpe resistente a colistina, derivada deABP001-VXD, que contiene AB001-VXD > 128 inserción de 1 Kb en el gen lpxC

Tabla 4. Cepas de A. baumannii incluidas en el capítulo 1. Detalles de las mutaciones que albergan en el genotipo.

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RESULTADOS

Cepas Media UE/ 106cél Error estándar

ATCC 19606 1060 ± 814

IB004 <1 -

IB004 + pWH1266-lpxA 421 ± 67

IB010 <1 -

Ab-84 17,78 ± 3,5

Ab-108 18,53 ± 4,8

Ab-167 20,02 ± 2,36

Ab-176 42,97 ± 21,52

Ab-208 25,02 ± 5,04

Ab-84R <1 -

Ab-108R <1 -

Ab-167R <1 -

Ab-176R <1 -

Ab-208R <1 -

Figura 10. Análisis de la endotoxicidad en las cepas mutantes A. baumannii sin LPS en comparación con las cepas silvestres de las que proceden. A) Representación en gráfica de barras de los niveles de endotoxina y desviación típica de los resultados obtenidos en el triplicado del ensayo. B) Media ponderada de los niveles de endotoxina obtenidos en las cepas incluidas en el estudio y error estándar en el ensayo realizado por triplicado.

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RESULTADOS

2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diversos antibióticos

Se determinó el efecto de la pérdida de LPS en cambios de susceptibilidad a los antibióticos más utilizados en la clínica, comparándose con la susceptibilidad que presentan las cepas parentales con LPS de las que proceden. Así, se determinaron las CMI para 15 antibióticos clínicamente relevantes en las cepas parentales silvestres y en las cepas derivadas, resistentes a colistina deficientes en LPS (tablas 5 y 6).

En primer lugar, en los antibióticos gentamicina, ciprofloxacino, ticarcilina, ampicilina, tigeciclina y sulbactam no se observó variación considerable en la susceptibilidad entre la cepa parental y las derivadas deficientes en LPS (tabla 5).

La susceptibilidad aumentó moderadamente en las cepas deficientes en LPS frente a los antibióticos amikacina (4 - 16 veces), ceftazidima (4-64 veces), imipenem (4-32 veces), cefepima (0-8 veces para tres de las cepas) y meropenem (4-64 veces) comparada con las cepas parentales con LPS. Los cambios más considerables en susceptibilidad de las cepas sin LPS se mostraron en los antibióticos azitromicina (≥ 32 veces para todas las cepas), rifampicina (≥ 16 veces para todas las cepas) y vancomicina (Cambio de 64-512 veces) (tabla 6). En los casos de azitromicina y rifampicina, las cepas deficientes en LPS fueron extremadamente susceptibles a estos antibióticos, con CMI por debajo del límite inferior del rango de concentraciones de antibióticos utilizadas para el ensayo (0,25 mg/l para azitromicina y 0,125 mg/l para rifampicina) (tabla 6). En el caso de la vancomicina, un antibiótico al que A. baumannii es intrínsecamente resistente (97), su actividad se ve aumentada notablemente frente tres de las cepas deficientes en LPS (Ab-84R, Ab-167R y Ab-176R) de forma que los resultados de CMIs en estas cepas muestran que son susceptibles según la designación establecida en Enterococcus spp (396). Se muestra además la CMI de las cepas en colistina y el aumento de resistencia, en este caso, que presentan las cepas mutantes resistentes a colistina frente sus cepas parentales silvestres (tabla 6).

En cuanto el aislado clínico resistente a la colistina CR17, que contiene una mutación en pmrA, demostró mayor susceptibilidad a amikacina, cefepima (tabla 6) y sulbactam (tabla 5).

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RESULTADOS

Concentración Mínima Inhibitoria (mg/L)

Cepas (Sensible, Intermedio o Resistente)

AMP CIP GEN SBT TIC TGC

Ab-84 >256 (R) 64 (R) >128 (R) 16 (R) >256 (R) 2 (I)

Ab-84R >256 (R) 64 (R) 128 (R) 32 (R) >256 (R) 1 (S)

Ab-108 >256 (R) 64 (R) >128 (R) 32 (R) >256 (R) 1 (S)

Ab-108R >256 (R) 64 (R) >128 (R) 128 (R) >256 (R) 4 (R)

Ab-167 >256 (R) 128 (R) >128 (R) 64 (R) >256 (R) 4 (R)

Ab-167R >256 (R) 32 (R) 128 (R) 64 (R) >256 (R) 2 (I)

Ab-176 >256 (R) 64 (R) >128 (R) 64 (R) >256 (R) 2 (I)

Ab-176R >256 (R) 32 (R) >128 (R) 16 (R) >256 (R) 1 (S)

CS01 >256 (R) 32 (R) 1 (S) 16 (R) >256 (R) 0.5 (S)

CR17 >256 (R) 32 (R) 0.5 (S) 4 (S) >256 (R) 0.5 (S)

ATCC 19606 >256 (R) ≤0.25 (S) 1 (S) 2 (S) 16 (S) 1 (S)

Tabla 5. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) sobre la sensibilidad a antibióticos que permanece invariable entre las cepas de A. baumannii deficientes en LPS y sus cepas parentales silvestres. AMP: Ampicilina, CIP: Ciprofloxacino, GEN: Gentamicina, SBT: Sulbactam, TIC: Ticarcilina, TGC: Tigeciclina , S: Susceptible, R:Resistente, I: Intermedio.

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RESULTADOS

CMI (mg/L) (Sensible, Intermedio o Resistente) Cepas AMK D AZM D CAZ D FEP D IPM D Ab-84 8 (S) 16 1024 (R) 64 (R) 256 (R) ≥ 16 ≥ 64 32 = 16 Ab-84R ≤0.5 (S) ≤0.25 32 (R) 64 (R) 16 (R)

Ab-108 512 (R) 16 1024 (R) 128 (R) ≥ 256 (R) 8 ≥ 64 4 4 Ab-108R 64 (R) ≤0.25 256 (R) >256 (R) 0,5 64 (R) Ab-167 256 (R) 8 2048 (R) 128 (R) 256 (R) 8 ≥ 32 64 8 8 Ab-167R 32 (I) ≤0.25 32 (R) 16 (I) 32 (R) Ab-176 256 (R) 8 2048 (R) 128 (R) 256 (R) 4 ≥ 32 64 8 32 Ab-176R 64 (R) ≤0.25 32 (R) 16 (I) 8 (R) CS01 2 (S) 4 128 (R) 32 (R) 32 (R) ≥ 4 = 2 2 = CR17 ≤0.5 (S) 4 64 (R) 16 (I) 32 (R)

ATCC 19606 4 (S) 1 8 (S) 8 (S) 0.5 (S)

CMI (mg/L) (Sensible, Intermedio o Resistente) Cepas MEM D RIF D VAN D CST D

Ab-84 256 (R) 2 256 ≤0.25 (S) 64 16 256 512 Ab-84R 4 (I) ≤0.125 1 >128 (R) Ab-108 256 (R) 4 512 ≤0.25 (S) 4 32 64 512 Ab-108R 64 (R) ≤0.125 8 >128 (R) Ab-167 256 (R) 4 256 ≤0.25 (S) 32 32 64 512 Ab-167R 8 (R) ≤0.125 4 >128 (R)

Ab-176 256 (R) 4 256 ≤0.25 (S) 64 32 512 512 Ab-176R 4 (I) ≤0.125 0.5 >128 (R) CS01 64 (R) >256 32 ≤0.25 (S) 2 = = 256 CR17 32 (R) >256 32 64 (R) ATCC 19606 1 (S) 2 >64 ≤0.25 (S)

Tabla 6. CMI sobre la sensibilidad a antibióticos en la que las cepas de A. baumannii deficientes en LPS aumentan la susceptibilidad en comparación a sus cepas parentales silvestres.D: Diferencia en susceptibilidad, AMK: Amicacina, AZM: Azitromicina, CAZ: Ceftazidima, FEP: Cefepim, IPM: Imipenem, MEM: Meropenem, RIF: Rifampicina, VAN: Vancomicina,CST: Colistina, S: Susceptible, R: Resistente, I: Intermedio.

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RESULTADOS

3. Análisis de la permeabilidad de la membrana bacteriana

Para caracterizar la permeabilidad de las cepas de A. baumannii deficientes en la producción del LPS. Se realizó un estudio para medir la acumulación de bromuro de etidio (BrEt) en el interior celular, en cuatro de las cepas mutantes deficientes en LPS (Ab-84R, Ab-108R, Ab-167R, Ab-176R) derivadas de los aislados clínicos multirresistentes parentales (Ab-84, Ab-108, Ab-167, Ab-176).

En la figura 11, se observa que la totalidad de cepas deficientes en LPS mostraron mayor permeabilidad al BrEt en el interior celular, en comparación a las cepas parentales y muestran una fluorescencia mayor a lo largo de los 120 minutos de duración del ensayo. El aumento de fluorescencia que producen las cepas deficientes en LPS frente sus cepas parentales silvestres a los 120 minutos de exposición al BrEt fue en las cepas Ab-84/Ab-84R: 2,03 veces, Ab-108/Ab-108R: 4,53 veces, Ab-167/Ab- 167R: 2,38 veces, Ab-176/Ab-176R: 2,55 veces.

Figura 11. Estudio de permeabilidad de la membrana de cuatro cepas clínicas de A. baumannii deficientes en LPS y sus cepas parentales silvestres midiendo la acumulación de bromuro de etidio (BrEt) en el interior celular. Representación de la media ponderada de los valores y la desviación típica de los valores en barras de error.

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RESULTADOS

4. Estudio de la actividad de péptidos antimicrobianos frente a dichas cepas

Se realizaron curvas de muerte bacteriana utilizando concentraciones crecientes de seis péptidos antimicrobianos distintos, descritos en la tabla 7, los cuales tienen actividad frente cepas silvestres de A. baumannii.

En las figuras (12-17) se puede observar que la totalidad de los péptidos antimicrobianos testados en este estudio fueron capaces de reducir la viabilidad bacteriana hasta tres logaritmos de la concentración inicial tanto en las cepas deficientes en LPS como en sus parentales. Los resultados obtenidos en las cepas deficientes en LPS y aquellas que adquieren la resistencia a colistina mediante mutaciones en el sistema Pmr AB, tanto CR17 (que contiene una mutación en el gen pmrA) como RC64 (que contiene una mutación en el gen pmrB) presentan la misma proporción de muerte celular que sus respectivas cepas parentales.

Péptidos Descripción antimicrobianos Péptido catiónico, extraido del veneno de la abeja Apis mellifera, posee actividad antibacteriana de amplio Melitina espectro, basada en la capacidad de formar poros en la bicapa lipídica (397). La cecropina es un péptido catiónico, aislado de la Cecropin A (1-7) hemolinfa de la larva de lepidóptero Hyalophora – Melittin (2-9) cecropia. Este péptido, al unirse al péptido Melittin reduce significativamente la toxicidad de este último y Cecropin A (1-8) mejora la actividad antibacteriana de ambos, así como la – Melittin (1-18) actividad antifúngica y en protozoos (398-401). Toxina peptídica, procedente de la avispa Vespula Mastoparán lewisii , con actividad bactericida (402). Péptido aislado de gránulos cotoplasmáticos en Indolicidin neutrófilos bovinos con actividad bactericida (403). Es una de las conformaciones más relevantes y más estudiadas que presenta el péptido cecropin. Su Pig cecropin P1 actividad ha sido estudiada en cepas de A. baumannii resistentes a polimixinas (404).

Tabla 7. Descripción de los péptidos antimicrobianos testados en el estudio.

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RESULTADOS

Melitina

Figura 12. Curva de muerte en presencia del péptido antimicrobiano Melitina a diferentes concentraciones de cuatro cepas clínicas de A. baumannii deficientes en LPS y dos cepas mutantes en el sistema PmrAB en comparación con sus cepas parentales silvestres. Representación de la media ponderada de los valores y la desviación típica de los valores en barras de error. Empleando el test t-student, *P<0,05

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RESULTADOS

Cecropina A (1-7) –Melitina (2-9)

Figura 13. Curva de muerte en presencia del péptido antimicrobiano Cecropina A (1-7)-Melitina (2-9) a diferentes concentraciones de cuatro cepas clínicas de A. baumannii deficientes en LPS y dos cepas mutantes en el sistema PmrAB en comparación con sus cepas parentales silvestres. Representación de la media ponderada de los valores y la desviación típica de los valores en barras de error. Empleando el test t-student, *P<0,05

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RESULTADOS

Cecropina A (1-8)-Melitina (1-8)

Figura 14. Curva de muerte en presencia del péptido antimicrobiano cecropina A (1-8)-Melitina (1-18) a diferentes concentraciones de cuatro cepas clínicas de A. baumannii deficientes en LPS y dos cepas mutantes en el sistema PmrAB en comparación con sus cepas parentales silvestres. Representación de la media ponderada de los valores y la desviación típica de los valores en barras de error. Empleando el test t-student, *P<0,05

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RESULTADOS

Mastoparán

Figura 15. Curva de muerte en presencia del péptido antimicrobiano Mastoparán a diferentes concentraciones de cuatro cepas clínicas de A. baumannii deficientes en LPS y dos cepas mutantes en el sistema PmrAB en comparación con sus cepas parentales silvestres. Representación de la media ponderada de los valores y la desviación típica de los valores en barras de error. Empleando el test t- student, *P<0,05

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RESULTADOS

Indolicidina

Figura 16. Curva de muerte en presencia del péptido antimicrobiano Indolicidina a diferentes concentraciones de cuatro cepas clínicas de A. baumannii deficientes en LPS y dos cepas mutantes en el sistema PmrAB en comparación con sus cepas parentales silvestres. Representación de la media ponderada de los valores y la desviación típica de los valores en barras de error. Empleando el test t- student, *P<0,05

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RESULTADOS

Pig cecropina P1

Figura 17. Curva de muerte en presencia del péptido antimicrobiano Pig Cecropina P1 a diferentes concentraciones de cuatro cepas clínicas de A. baumannii deficientes en LPS y dos cepas mutantes en el sistema PmrAB en comparación con sus cepas parentales silvestres. Representación de la media ponderada de los valores y la desviación típica de los valores en barras de error. Empleando el test t- student, *P<0,05

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RESULTADOS

5. Análisis del crecimiento en presencia de colistina mediante el ensayo E-Test

Se analizó el crecimiento de todas las cepas del estudio en presencia de tiras de E- test de colistina a modo de comprobación de los resultados obtenidos en el ensayo de CMI por microdilución en caldo, de forma visual. En la figura 18 se muestra el crecimiento de una de las cepas mutantes deficientes en LPS y la cepa silvestre de la que se deriva (Ab-108R y Ab-108), la cepa deficiente en LPS (IB004), la cepa silvestre ATCC 19606 de la que procede la anterior y la cepa complementada con el plásmido que expresa el gen lpxA (IB004+pWH1266-lpxA). Además, se incluyó la cepa que contiene mutación en el pmrB (RC64), también procedente de la cepa ATCC 19606.Los resultados con el resto de las cepas clínicas (Ab-84/Ab-84R, Ab-167/Ab- 167R, Ab-176/Ab-176R, CS01/CR17) fueron similares a los obtenidos con las cepas anteriormente descritas.

Como se puede observar en la figura 19, el crecimiento de las cepas silvestres sensibles a colistina se inhibe en el área adyacente a la tira de E-test que contiene colistina a concentraciones crecientes. En cambio, todas las cepas mutantes derivadas resistentes a colistina, deficientes en LPS, presentaron un mayor crecimiento en el área adyacente a la tira de E-test, con mayor concentración de colistina, que en la zona sin colistina. En cambio, las cepas mutantes que adquieren la resistencia a colistina mediante mutaciones en el sistema PmrAB no muestran este sobrecrecimiento en la zona de mayor concentración de colistina; por el contrario. su crecimiento es inhibido al sobrepasar la concentración de 32-64 µg/ml de colistina.

La cepa IB004 no muestra este fenómeno con total claridad. Sin embargo, genera este sobrecrecimiento a colistina en una concentración por debajo de su CMI, estando esta concentración por encima del rango de resistencia a colistina. La cepa complementada con el plásmido que expresa el gen lpxA, IB004+pWH1266-lpxA, revierte el fenotipo de la cepa parental con una mutación en el lpxA, confirmando que la pérdida de LPS es la responsable de este fenómeno.

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RESULTADOS

Figura 18. Análisis del crecimiento en presencia de colistina mediante ensayo E-test con colistina. El ensayo fue realizado en el total de cepas clínicas de A. baumannii deficientes en LPS y sus cepas parentales silvestres, la cepa tipo ATCC 19606 y el aislado clínico CS01, sensibles a colistina, las cepas que contienen mutación en el sistema pmr AB (RC64 y CR17) derivadas respectivamente de las cepas anteriores, con resistencia a colistina, así como la cepa deficiente en LPS y la cepa complementada, procedente de la anterior, con el gen de síntesis del LPS silvestre (IB004 y IB004+pWH1266-lpxA). La presente imagen muestra el comportamiento habitual que presentan las cepas mutantes sin LPS en presencia de colistina en el medio de crecimiento (Ab-108R se muestra como ejemplo) y las cepas con mutación en el sistema pmr AB (RC64 se muestra como ejemplo). Los resultados obtenidos en las restantes cepas del estudio fueron similares por lo que no se muestran en la figura.

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6. Efecto del sobrecrecimiento bacteriano de las cepas de A. baumannii deficientes en LPS en ausencia y en presencia de colistinA

Tras los resultados obtenidos anteriormente, se podría pensar que el sobrecrecimiento en presencia de colistina observado en los ensayos de E-test podría deberse a una mayor supervivencia o aumento en la tasa de crecimiento de las cepas deficientes de LPS en presencia de colistina.

Para la examinación de este razonamiento con más detalle, en primer lugar, se cuantificó el número de colonias viables en un medio sin colistina y un medio con 5 mg/l de colistina y se comparó el recuento bacteriano tras 24 y 48 horas de incubación. Los resultados muestran que a las 24 horas de incubación el número de colonias viables es mayor en las placas de cultivo en presencia de colistina que en las placas sin colistina. Visualmente se puede apreciar la diferencia de crecimiento en las diferentes placas con y sin colistina. Sin embargo, después de 48 horas de incubación no se observó diferencia entre las placas con y sin colistina. Los datos mostrados corresponden a la cepa Ab-108R (Figura 19 A), El resto de cepas clínicas deficientes en LPS mostraron el mismo comportamiento, no observándose diferencias en el recuento bacteriano realizado a las 48 horas de incubación (P>0,05) (Figura 19 B).

MHBII

MHBII + Colistina 5mg/L

Figura 19. Ensayo de supervivencia. Cuantificación de colonias viables de las cepas deficientes en LPS, resistentes a colistina en Mueller-Hinton agar sin colistina o a 5 mg/L de concentración de colistina. El número de colonias fue cuantificado a las 24 y 48 horas. Se muestra, como ejemplo las fotos de la cepa Ab-108R (A). El ensayo fue realizado con cuatro mutantes deficientes en LPS y los resultados fueron similares por lo que no se muestran en la presente figura. A las 48 horas se cuantificó el número de colonias viables totales en medio sin colistina, representado en barras negras y con 5mg/L de colistina,

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representado en barras blancas, de todas las cepas empleadas en el estudio y se representó en gráfica de barras (B). Representación de la media ponderada de los valores y la desviación típica de los valores en barras de error. Empleando el test t-student, *P<0,05.

7. Análisis del crecimiento monitorizado durante 24 horas en presencia y ausencia de colistina

Se realizaron curvas de crecimiento en presencia y ausencia de colistina que fueron monitorizadas durante 24 horas comparándose el crecimiento de las cepas sin LPS en ambas condiciones. Como se muestra en la figura 22, todas las cepas deficientes en LPS presentan un crecimiento mayor en presencia de colistina en comparación con el crecimiento en ausencia de colistina, esta diferencia comienza a ser significativa a las 8 horas del crecimiento y permanece hasta el final del ensayo (P≤0,05).

Figura 20. Ensayo de supervivencia. Curva de crecimiento de las cepas deficientes en LPS en ausencia de colistina y con 5 mg/L de colistina. El ensayo se realizó con cuatro de las cepas mutantes deficientes en LPS. Representación de la media ponderada de los valores y la desviación típica de los valores en barras de error. Empleando el test t-student, *P<0,05

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CAPÍTULO 2. Caracterización del fenotipo de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y comparación con las cepas silvestres.

Los resultados de este capítulo han sido publicados en el manuscrito “Carretero- Ledesma M, García-Quintanilla M, Martín-Peña R, Pulido MR, Pachón J, McConnell MJ. Phenotypic changes associated with Colistin resistance due to Lipopolysaccharide loss in Acinetobacter baumannii. Virulence. 2018 Dec 31;9(1):930-942” (se adjunta la separate al final de los resultados).

Colistina Cepas Mutación/Descripción CMI (mg/L)

ATCC 19606 Cepa bacteriana de referencia susceptible a antibióticos ≤ 0.25 Ab-84 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0.25 Ab-108 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0.25 Ab-167 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0.25 Ab-176 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0.25 Ab-208 Aislado clínico multirresistente de A. baumannii ≤ 0.25 Inserción de 40 nucleótidos en el nucleótido 321 del gen Ab-84R > 128 lpxC generando un codón stop prematuro Ab-108R Sustitución T614A que produce I205N en el gen lpxA > 128 Ab-167R Inserción de ISAbaI en el nucleótido 321 del gen lpxC > 128 Sustitución G739T en el nucleótido 739 del gen lpxD que Ab-176R > 128 produce un codón de stop prematuro Ab-208R Sustitución de C593A que produce A198E en el gen lpxD >256 CS01 Aislado clínico de A. baumannii susceptible a colistina ≤ 0.25

Cepa resistente a colistina, derivada de CS01 que CR17 64 contiene el cambio de aminoácido M12K en el gen pmrA Delección en el nucleotido 461 en el gen lpxA generando IB004 > 128 un desfase en la lectura después de S153 IB004 + IB004 complementada con el plásmido pWH1266 ≤ 0.25 pWH1266-lpxA expresando el gen parental lpxA Aislado clínico de A. baumannii Grupo de Estudio de GEIH 8 ND Infección Hospitalaria en el año 2010 en España. Aislado clínico multirresistente de A. baumannii AC033 ND procedente del Hospital de La Coruña Aislado clínico multirresistente de A. baumannii AC001 ND procedente del Hospital de La Coruña

Tabla 8. Cepas de A. baumannii incluidas en el capítulo 2. Detalles de las mutaciones que albergan en el genotipo.

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8. Estudio del crecimiento in vitro en medio enriquecido y suero humano

El efecto de la pérdida de LPS se evaluó en el crecimiento bacteriano en medio rico (MHB en caldo) y suero humano. En la figura 20 A, se observa que la cepa sin LPS fue capaz de crecer en medio rico MHB en caldo con normalidad. No obstante, mostró cierta dificultad en comparación con el crecimiento que presentaron las cepas ATCC 19606 y IB004 + pWH1266-lpxA, con una diferencia aproximadamente 1 logaritmo y diferencias significativas en la mayoría de los tiempos analizados en el ensayo (P≤0,05). El crecimiento en suero humano, sin embargo, fue muy diferente en las cepas con y sin LPS. La cepa sin LPS, mostró un marcado defecto en el crecimiento, comparado con las cepas ATCC 19606 e IB004 + pWH1266-lpxA, con una extraordinaria disminución del número de colonias en las primeras 12 horas de incubación y una marcada inhibición del crecimiento tras 24 horas de incubación, manteniendo diferencias significativas en el crecimiento durante todo el periodo del ensayo (P≤0,05), la cepa complementada también presenta diferencias significativas en el crecimiento frente la ATCC 19606 pero menos evidentes (P≤0,05) (Figura 20B). La diferencia de crecimiento entre el medio rico y el suero humano indica que, en condiciones de laboratorio, se observa una modesta disminución en el crecimiento de las cepas sin LPS, mientras que, en suero humano, que representaría unas condiciones similares a las encontradas por estas cepas durante la infección humana, muestran a una dramática pérdida del fitness bacteriano.

Figura 20. Curva de crecimiento en medio Mueller Hinton Broth y Suero Humano de las cepas deficientes en LPS y sus cepas parentales. En la figura se muestra el crecimiento de la cepa silvestre sensible a colistina ATCC 19606, la cepa mutante deficiente en LPS procedente de la anterior IB004 y la cepa complementada, procedente de la anterior, con el gen de síntesis del LPS silvestre IB004 + pWH1266- lpxA en Mueller Hinton broth (A) y en suero humano (B). Representación de la media ponderada de tres ensayos independientes y la desviación típica en barras de error. Empleando el test Anova de un factor para comparar las tres cepas y Tukey´s post-hoc para las diferencias intergrupos, comparando frente a la cepa parental*P<0,05.

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9. Caracterización del tiempo de generación

El tiempo de generación se refiere al tiempo necesario para la duplicación celular de una población bacteriana. La figura 24 muestra la representación del tiempo de generación, en minutos, que emplea una generación bacteriana de A. baumannii y mutantes sin LPS en dar lugar a una nueva. Se incluyen en el ensayo las cinco cepas clínicas multirresistentes y las cinco cepas derivadas, sin LPS, la cepa sensible a colistina ATCC 19606, y sus derivadas, deficiente en LPS (IB004) y la cepa complementada (IB004+pWH1266-lpx A), así como la cepa sensible a antibióticos CS01 y la derivada de la misma que contiene mutación en el pmrA (CR17).

Como se observa en la figura 24, el tiempo de replicación bacteriana obtenido en medio rico en todas las cepas mutantes que presentan resistencia a colistina, independientemente de si presentaban LPS o no, es mayor que las cepas parentales silvestres (P≤0,05.). El periodo de replicación se vio incrementado en gran medida en las cepas deficientes en LPS en comparación con las cepas silvestres de las que proceden es decir el tiempo empleado en dar lugar una nueva generación, en las cepas mutantes sin LPS es mayor, por lo que crecen más lentamente en medios ricos. Esta diferencia es menos evidente en la cepa con mutación en el gen pmrA y la cepa silvestre de la que procede.

Figura 21. Tiempo de generación (Tg). Representación en gráfica de barras del tiempo de generación que presentan todas las clínicas cepas deficientes en LPS del estudio y sus parentales silvestres en medio de cultivo MHB II sin colistina. IB004 c (IB004 + pWH1266-lpxA). La fórmula utilizada para calcular el Tg = 2t / (OD2/OD1). Donde t representa el tiempo que transcurre en los puntos escogidos de máxima pendiente en la fase exponencial de la curva, OD1 es la densidad óptica a 595 nm del punto más bajo de la pendiente y OD2 la densidad óptica a 595 nm del punto más alto de la pendiente. Representación de la media ponderada y la desviación típica de tres ensayos independientes. Empleando el test de t-student para comparar los mutantes con sus parentales y el test Anova de un factor para comparar las tres cepas y Tukey´s post-hoc para las diferencias intergrupos, comparado frente a la cepa parental *P<0,05.

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10. Estudio del índice de competencia in vitro e in vivo

Para confirmar la pérdida de fitness observada en las cepas del estudio, deficientes en LPS, en condiciones de infección humana en el estudio de crecimiento in vitro descrito anteriormente, se realizó un estudio comparativo sobre el crecimiento in vitro e in vivo que presentan las cepas deficientes en LPS frente las cepas silvestres de las que proceden.

Con el fin de cuantificar la disminución de la aptitud bacteriana resultante de la pérdida de LPS en la membrana, se determinó el índice de competición a las 24 horas de incubación de las diferentes cepas en caldo MHB, suero humano y en modelo de infección murina mediante sepsis intraperitoneal cuantificando el número de colonias contenidas en el bazo de los animales.

Se comparó directamente el crecimiento de Ia cepa silvestre y la cepa mutante deficiente en LPS (ATCC 19606 y IB004) y la cepa silvestre y la cepa mutante complementada, con fenotipo revertido a silvestre (ATCC 19606 y IB004 + pWH1266- lpxA) creciendo de forma simultánea en los medios anteriormente descritos (Figura 22). En el caldo MHB, IB004 mostró una pérdida de aptitud moderada, en comparación con la cepa silvestre, presentando un índice de competencia de 0,58 que no es significativa comparada con el leve aumento de aptitud que presenta la cepa complementada con la cepa silvestre (p>0,05). Por el contrario, en suero humano y en el modelo de infección, se observó una pérdida dramática de aptitud bacteriana en la cepa IB004, con un índice de competencia de 7,1x10-7 y 6,7x10-8, respectivamente. La cepa IB004 + pWH1266-lpxA también mostró una pérdida moderada de aptitud al crecer en suero humano e in vivo en comparación con la cepa de tipo salvaje con un índice de competencia de 5x10-2 y 2,7x10-1, respectivamente que si se mostró significativa respecto a la pérdida de aptitud que presenta las cepas mutantes y complementadas (P≤0,05).

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RESULTADOS

Figura 22. Índice de competencia que presentan las cepas deficientes el LPS en comparación con sus cepas parentales en medio rico Mueller Hinton Broth y suero humano, in vitro y recuento bacteriano en el bazo, produciendo infección por sepsis en ratones C57BL/6. Las unidades relativas representan el número de colonias de la cepa mutante (IB004 o IB004 + pWH1266-lpxA) / el número de colonias de la cepa silvestre (ATCC19606), dividido entre el número células iniciales de la cepa mutante (IB004 o IB004 + pWH1266-lpxA) / el número de células iniciales en la cepa silvestre (ATCC 19606). Presentación de la media ponderada de tres ensayos independientes y la desviación típica en barras de error. Empleando el test de t-student para comparar los dos grupos *P<0,05.

11. Determinación de la producción de biofilm

Se realizó un estudio comparativo del biofilm producido de las cepas deficientes en LPS las cepas silvestres de las que proceden. Los resultados de la medida de absorbancia a 580 nm, obtenidos en todas las cepas del estudio, fueron comparados con dos cepas de A. baumannii, incluidas en el ensayo (AC+ y AC- como control positivo y control negativo, respectivamente).

Como se observa en la figura 23, todas las cepas del estudio que presentan una mutación que confiere resistencia a colistina, independientemente de la existencia de LPS en la membrana, producen menos cantidad de biofilm respecto a las cepas silvestres de las que proceden, sensibles a colistina (P≤0,05). Sin embargo, la cepa mutante con el plásmido de complementación con fenotipo revertido a silvestre (IB004 + pWH1266-lpxA) produce una cantidad de biofilm similar a la que se produce en la cepa silvestre (P>0,05).

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RESULTADOS

Figura 23. Estimación de la cantidad de biofilm producido por las cepas deficientes en LPS en comparación con sus cepas parentales silvestres.AC+ y AC- son las cepas controles positivo y negativo, respectivamente, de producción de biofilm. IB004 c (IB004 + pWH1266-lpxA). Representación de la media ponderada de tres ensayos independientes y la desviación típica en barras de error. Empleando el test de t-student para comparar los mutantes con sus parentales y el test Anova de un factor para comparar las tres cepas y Tukey´s post-hoc para las diferencias intergrupos, comparado frente a la cepa parental *P<0,05.

12. Determinación de la CMI de diversos desinfectantes

Se determinó la CMI de todas las cepas del estudio frente a cinco desinfectantes distintos con el fin de comparar la susceptibilidad que presentaban las cepas deficientes en LPS con la de las cepas silvestres del estudio.

Los valores obtenidos en la CMI se recogen las tablas 9 y 10. En la tabla 19 se recogen los datos obtenidos con los desinfectantes etanol y povidona yodada en los que no existió diferencia en la CMI entre las cepas mutantes y las silvestres de las que proceden incluidas en el estudio, no observándose, por tanto, diferencias en la resistencia a los mismos. Por otro lado, en la tabla 10 se recogen los datos obtenidos con los desinfectantes clorhexidina, deoxicolato, dodecilsulfato sódico (SDS). Estos resultados muestran que las cepas deficientes en LPS presentan una mayor sensibilidad a esos desinfectantes que las cepas silvestres de las que proceden con diferencias importantes entre ambas, especialmente en deoxicolato. Sin embargo, la cepa que adquiere resistencia a colistina mediante la mutación en el pmrB (CR17) no muestra diferencias de resistencia ante ninguno de los cinco desinfectantes en comparación con la cepa silvestre de la que procede (CS01).

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RESULTADOS

Etanol Povidona Cepas (%) yodada (g/L) Ab-84 6,25 6,25 Ab-84R 12,5 6,25

Ab-108 6,25 6,25

Ab-108R 6,25 6,25

Ab-167 6,25 6,25

Ab-167R 6,25 6,25

Ab-176 12,5 6,25

Ab-176R 3,125 6,25

Ab-208 12,5 6,25

Ab-208R 12,5 6,25

ATCC19606 25 6,25

IB004 + 50 6,25 pWH1266-lpxA

IB004 12,5 6,25 CS01 12,5 6,25 CR17 12,5 6,25

Tabla 9. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) sobre la sensibilidad a desinfectantes de etanol y povidona yodada, que permanece invariable entre las cepas deficientes en LPS y sus cepas parentales silvestres.

Clorhexidina Deoxicolato Cepas D D SDS (g/L) D (mg/L) (mM) Ab-84 0,975 > 10 1,56 16 ≥ 32 16 Ab-84R 0,061 0,3125 0,1 Ab-108 0,487 > 10 ≥ 16 6,25 2 32 Ab-108R 0,244 0,625 0,2 Ab-167 0,975 > 10 1,56 8 ≥ 32 16 Ab-167R 0,122 0,3125 0,1 Ab-176 0,975 > 10 3,125 8 ≥ 67 16 Ab-176R 0,122 0,15 0,2 Ab-208 0,975 > 10 3,125 8 ≥ 67 16 Ab-208R 0,122 0,15 0,2 ATCC19606 0,487 > 10 1,56 IB004 + 0,487 4 10 ≥ 32 1,56 16 pWH1266-lpxA IB004 0,122 0,3125 0,1 CS01 0,487 > 10 0,4 = = 2 CR17 0,487 > 10 0,2

Tabla 10. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) sobre la sensibilidad a desinfectantes de Clorhexidina, deoxicolato yodada y dodecilsulfato sódico (SDS) que presentan un aumento en la susceptibilidad de las cepas deficientes en LPS en comparación con sus cepas parentales silvestres. D: diferencia en susceptibilidad entre ambas cepas.

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RESULTADOS

13. Determinación de la motilidad

Con el objetivo de comparar la capacidad motil que presentan las cepas deficientes en LPS frente a las cepas silvestres de las que proceden se determinó la distancia que recorrían todas las bacterias del estudio en un medio semi-sólido durante 72 horas de incubación.

La expresión de motilidad se calculó a partir de las medidas realizadas del radio mayor y menor de crecimiento en la placa medido en centímetros y se realizó el promedio de los dos datos y de las tres réplicas a las 24, 48 y 72 horas de incubación. Los resultados se representaron en una gráfica y fueron comparados con los resultados obtenidos en dos cepas de A. baumannii, cuya motilidad es conocida, incluidas en el ensayo (GEIH 8 y ATCC 19606 como control positivo y control negativo, respectivamente). En la figura 24 A se representan los resultados de motilidad de todas las cepas tras las 72 horas de incubación. Como se puede observar, generalmente, todas las cepas del estudio que presentan una mutación que confiere resistencia a colistina, independientemente de la existencia de LPS en la membrana, exhiben menos motilidad respecto a las cepas silvestres de las que proceden, sensibles a colistina, con una diferencia significativaP<0,05. Excepto aquellas que no presentan motilidad en la cepa parental silvestre. Sin embargo, la cepa mutante con el plásmido de complementación con fenotipo revertido a silvestre (IB004 + pWH1266-lpx A) presenta una motilidad considerable, incluso mayor que la que presenta la cepa silvestre. Este fenómeno se mantiene en continuo aumento, durante las 72 horas de incubación. En la figura 24 B se muestra una visualización más detallada de la motilidad producida a las 72 horas de incubación por una de las cepas deficiente en LPS que mostró alta motilidad junto la cepa parental de la que procede (Ab-176 y Ab- 176R), la cepa con mutación en el gen pmr A junto la cepa parental de la que procede (CR17 y CS01), comparadas con los controles descritos para la motilidad (GEIH 8 y ATCC 19606).

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RESULTADOS

Figura 24. Determinación de la capacidad de motilidad de las cepas deficientes en LPS en comparación con las cepas parentales. (A) Representación del promedio de los datos de radio máximo y mínimo obtenidos tras 72 horas de incubación por las cepas deficientes en LPS y sus cepas parentales silvestres. Las cepas GEIH 8 y ATCC 19606 corresponden a los controles positivos y negativos, respectivamente en motilidad. IB004 c (IB004 + pWH1266-lpxA). Representación de la media ponderada de tres ensayos independientes y la desviación típica en barras de error. (B) Fotografías representativas de la motilidad generada después de 72 horas de incubación de la cepa clínica silvestre Ab-167, la correspondiente cepa mutante deficiente en LPS, Ab-167R, la cepa mutada en el gen pmrA (CR17) y su cepa parental silvestres (CS01), comparada con los controles positivos y negativos, con motilidad descrita (GEIH8 y ATCC 19606 respectivamente). Empleando el test de t-student para comparar los mutantes con sus parentales y el test Anova de un factor para comparar las tres cepas y Tukey´s post-hoc para las diferencias intergrupos, comparado frente a la cepa parental *P<0,05.

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RESULTADOS

14. Determinación de la capacidad de crecimiento en condiciones de baja concentración de hierro

Se realizaron curvas de crecimiento en un medio rico en presencia del quelante del hierro 2,2'-Bipyridyl (Bip), que proporciona escasez de hierro en el mismo (MHBII con una concentración de 150 μM). Se incluyeron en el ensayo todas las cepas mutantes deficientes en LPS con el fin de comparar su crecimiento en estas condiciones con el crecimiento de las cepas silvestres de las que proceden.

Como muestran las curvas de crecimiento representadas en la figura 25, el crecimiento de todas las cepas resistentes a colistina, carentes de LPS, fue inhibido en escasez de hierro en el medio. Por el contrario, el crecimiento de las cepas silvestres parentales no pareció verse afectado por la escasez de hierro, produciéndose una diferencia significativa en el crecimiento de las cepas mutantes y las parentalesP<0,05. La cepa mutante con el plásmido de complementación presentó un comportamiento similar a la cepa parental ATCC 19606. Sin embargo, no se inhibió el crecimiento de la cepa que adquiere resistencia a colistina mediante la mutación en el gen pmr A (CR17), aunque éste sí se vio disminuido respecto al crecimiento de la cepa silvestre de la que procede (CS01) con una diferencia significativaP<0,05. la cepa mutante con el plásmido de complementación con fenotipo revertido a silvestre (IB004 + pWH1266- lpx A) también presenta una diminución significativa en el crecimiento, respecto al de la cepa silvestre (ATCC 19606)P<0,05, aunque menos pronunciado que el que se produce con la cepa mutante (IB004). En general, se observa que la escasez de hierro afecta pronunciadamente a las cepas sin LPS y en menor medida a la cepa con LPS modificado.

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Figura 25. Curvas de crecimiento de todas las cepas deficientes en LPS y sus parentales silvestresen medio rico MHB a concentraciones bajas en hierro debido a la presencia del quelante de hierro 2,2'- Bipyridyl (Bip) a una concentración de 150 μM. Representación de la media ponderada de tres ensayos independientes y la desviación típica en barras de error. Empleando el test de t-student para comparar los mutantes con sus parentales y el test Anova de un factor para comparar las tres cepas y Tukey´s post-hoc para las diferencias intergrupos, comparado frente a la cepa parental *P<0,05.

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CAPÍTULO 1. Caracterización microbiológica de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y la dependencia a colistina

Los resultados obtenidos en el presente capitulo confirman que la pérdida de LPS en la membrana externa de A. baumannii confiere una resistencia de alto nivel al antibiótico de colistina y produce alteraciones microbiológicas y fisiológicas en la bacteria mutante.

Como se comentó en la introducción de este trabajo, los primeros trabajos en E. coli y Salmonella indicaron que la biosíntesis LPS es esencial para la viabilidad celular bacteriana (405), destacando la importancia de LPS en la estructura bacteriana debido a su implicación en el mantenimiento de la integridad estructural y actuación como barrera celular en la difusión de sustancias. Posteriores estudios, sin embargo, demostraron la viabilidad bacteriana en ausencia de LPS en tres especies bacterianas distintas, entre ellas A. baumannii (97). La importancia de esta molécula en la estructura bacteriana explica los resultados obtenidos en el primer y segundo capítulo del presente trabajo.

En primer lugar se ha mostrado que la pérdida de LPS en la membrana externa de A. baumannii da como resultado un aumento de la sensibilidad a antimicrobianos de diferentes familias antibióticas, mientras que los péptidos antimicrobianos catiónicos mantienen la actividad bactericida frente las cepas resistentes a la colistina independientemente del mecanismo mediante el cual las bacterias han adquirido resistencia a la colistina y de forma muy similar, sin observar diferencias elocuentes en las cepas parentales, silvestres con LPS. Puesto que la adquisición de resistencia a colistina en cepas de A. baumannii MDR se encuentra normalmente en un marco donde las opciones de tratamiento con antibiótico son limitadas, estos resultados, tanto con antibióticos como péptidos antimicrobianos testado pueden tener relevancia clínica directa. Así el aumento de 16 veces la susceptibilidad a rifampicina, azitromicina y vancomicina sugiere que estos fármacos podrían representar posibles opciones de tratamiento para cepas de A. baumannii deficientes en LPS, resistentes a la colistina. Un estudio, realizado en E. coli con mutaciones en los genes lpxA y lpxD, muestra que el LPS juega un papel en la entrada pasiva de macrólidos y rifamicinas por la membrana externa bacteriana (406), lo que puede explicar el aumento de suscpetibilidad con azitromicina y rifampicina de nuestros mutantes. El hecho de que la azitromicina aumente la actividad antimicrobiana frente a cepas de A. baumannii deficientes en LPS en comparación con su cepa parental con LPS, fue publicado por un estudio anterior que describe que una cepa deficiente en LPS, derivada de la cepa

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DISCUSIÓN

ATCC 19606 era 32 veces más sensible a azitromicina que la cepa parental (97). Además, el llamativo aumento de la susceptibilidad observada con la vancomicina en las cepas deficientes en LPS es de interés ya que este antibiótico se utiliza tradicionalmente en infecciones bacterianas gram positivas debido a la resistencia intrínseca observada con la mayoría de las especies gram negativas.

Por otro lado, los resultados muestran que la pérdida de LPS produce un aumento de la permeabilidad en la membrana bacteriana de A. baumannii, este hecho sugiere que el incremento de susceptibilidad observado en la lista de antibióticos testados es debido al aumento de la permeabilidad de la membrana y la facilidad de penetrar a través de ella. Esta idea es reforzada por un estudio previo que muestran que el LPS es una de las principales barreras que contribuyen a la permeabilidad de la membrana hacia compuestos hidrofóbicos (406).

Los resultados obtenidos en los ensayos E-test y curvas de crecimiento con colistina proporcionan la evidencia de que la pérdida de LPS en A. baumannii da lugar no solo a una gran resistencia a la colistina, sino que la adicción de este antibiótico al medio de cultivo proporciona a estos mutantes mayor capacidad en el crecimiento. Este fenómeno, conocido como dependencia parcial, fue también observado y publicado en una carta al editor del año 2007, sin detallarse en ella las bases genéticas ni los factores que la producían (407).

Se considera que la dependencia a un antibiótico es completa cuando la presencia del antibiótico es esencial para el crecimiento de la bacteria. El fenómeno de dependencia ha sido descrito anteriormente en un gran número de antibióticos y especies bacterianas distintas a Acinetobacter, como por ejemplo dependencia de Enterococcus a la vancomicina (408), E. coli a la estreptomicina (409, 410), especies de Staphylococcus con actividad coagulasa negativa con dependencia hacia β- lactámicos (411) o Staphylococcus epidermidis a linezolid (412). Por otro lado, también se conoce, por definición, el comportamiento bacteriano de dependencia parcial a un antibiótico, que es considerado cuando la bacteria crece con más dificultad en ausencia del antibiótico que cuando éste se aplica a una concentración relevante, a la que la cepa silvestre posee susceptibilidad.

Los resultados obtenidos en el crecimiento de las cepas resistentes a colistina, deficientes en LPS en presencia y ausencia de colistina, muestran que el sobre crecimiento generado por el antibiótico en el medio no se debe a un aumento de la capacidad de supervivencia en dichas cepas con colistina, puesto que el crecimiento a las 48 horas de incubación es similar en ambos medios. En cambio, en el crecimiento

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DISCUSIÓN monitorizado en presencia y ausencia de colistina, se observa un claro retraso o demora del tiempo de crecimiento de las cepas deficientes en LPS en ausencia de colistina frente al medio con colistina.

Si bien los resultados proporcionados en el presente trabajo establecen la base genética para la dependencia de la colistina en A. baumannii, el mecanismo molecular por el cual la colistina favorece el crecimiento en estas cepas aún no se conoce.

CAPÍTULO 2. Caracterización del fenotipo de cepas de A. baumannii deficientes en LPS y comparación con las cepas silvestres.

Con el fin de conocer el mecanismo molecular capaz de promover el crecimiento de las cepas de A. baumannii resistentes a colistina, deficientes en LPS, se realizaron estudios orientados a la caracterización del fenotipo de dichas cepas.

Los resultados presentados en este estudio reflejan que la pérdida de LPS en A. baumannii produce modificaciones en el fenotipo de dichas cepas y se asocia con una pérdida de aptitud moderada de la bacteria en condiciones de laboratorio y en condiciones que intentan simular la infección humana.

En relación con la importancia que tiene el LPS en la viabilidad de otras especies bacterianas (405) y su implicación en interrumpir la difusión de sustancias tóxicas en la célula, así como en el mantenimiento de la integridad estructural de las bacterias, como se estudió anteriormente, a lo largo del presente capítulo se muestra que la pérdida de LPS en A. baumannii se asocia con una moderada pérdida de aptitud en condiciones de laboratorio (crecimiento en medio rico MHB) y, lo que es más importante, que esta pérdida de aptitud es mucho más evidente y acentuada en condiciones que intentan simular la infección humana (crecimiento en suero humano y en el tejido de ratón).

Debido a la gran pérdida de aptitud observada en la pérdida de LPS, parecería lógico que estas cepas surgieran con poca frecuencia durante el tratamiento clínico de las infecciones de A. baumannii con colistina. Hasta la fecha, sólo un informe ha descrito la resistencia a la colistina debido a la pérdida de la producción de LPS en un aislamiento clínico resistente a la colistina (97).

En este estudio, también se demuestra que la exposición a colistina de un aislado clínico de A. baumannii susceptible a colistina podría resultar en resistencia a través de la pérdida de LPS, lo que indica que las cepas clínicas tienen la capacidad de perder las funciones de biosíntesis de LPS en condiciones de laboratorio.

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DISCUSIÓN

Estos resultados también llegan a poner en duda la importancia clínica de las cepas de A. baumannii que carecen de expresión de LPS en su membrana, dado que se ha observado que estas cepas crecen con dificultad en medio rico y suero humano, son más susceptibles a condiciones fisiológicas, por lo que son rápidamente eliminadas en la infección murina, y no produjo la muerte después de la infección en los ratones. En un reciente estudio de Beceiro et al (413) también se evaluó la disminución de la aptitud y virulencia de A. baumannii tras la pérdida del LPS en su membrana. En este estudio, al igual que los resultados obtenidos en el presente trabajo, se observó una modesta disminución en la aptitud bacteriana en una cepa mutante con una mutación en el gen lpxA en condiciones in vitro en medio rico (índice de competencia 0,02 frente 0,58 obtenido en el presente trabajo). Sin embargo, los resultados obtenidos tanto en el estudio de Beceiro et al. como en nuestro trabajo, son cuantitativamente muy diferentes en cuanto al índice de competencia que observamos durante el crecimiento in vivo en modelo de infección murina (índice de competencia menor de 0,01 frente a 6,7x10-8 obtenido este trabajo) y en condiciones de laboratorio que simulan la infección humana como es el suero humano (índice de competencia 7x10-7 obtenida en este trabajo).

En definitiva, los resultados de nuestro trabajo indican que la diferencia en el medio de crecimiento produce una diferencia de hasta 100.000 veces en el índice de competencia, entre estas cepas y sus mutantes, destacando la importancia del medio de crecimiento que se emplea en realizar estudios comparativos de aptitud entre cepas bacterianas. El modelo experimental empleado, en cuanto al crecimiento bacteriano y la diseminación bacteriana a órganos distantes ha sido demostrado previamente (130) y ha sido empleado para caracterizar la aptitud y la virulencia de cepas de A. baumannii resistentes a colistina con mutaciones en el sistema PmrAB (307) (414).

Un estudio reciente que caracterizó la aptitud de cepas de A. baumannii que adquieren resistencia a la colistina mediante mutación en el sistema PmrAB, que consiste en una modificación en la molécula de LPS sin producir la pérdida completa de la misma, mostró que un derivado resistente a colistina de la cepa ATCC 19606 de A. baumannii (RC64) presentaba una disminución de 62 veces en la aptitud en modelo in vivo (índice de competencia 0.016) en comparación con su cepa parental susceptible a la colistina (414). Sin embargo, la disminución de la aptitud observada en el presente estudio en una cepa de A. baumannii tras la pérdida completa de la molécula de LPS fue más de 1 millón de veces mayor (índice de competencia: 6,7 x 10-8), lo que indica las mutaciones que implican una modificación del LPS producen una aptitud

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DISCUSIÓN moderadamente más baja de la bacteria, mientras que en las cepas que presentan la pérdida completa de LPS, esta disminución es sustancialmente mayor. Es interesante destacar que la mayoría de los aislados clínicos resistentes a colistina informados en la literatura contienen mutaciones en el sistema PmrAB. Esto puede reflejar el hecho de que las mutaciones en el sistema PmrAB dan como resultado una disminución mucho menos acentuada en la aptitud en comparación con la pérdida de LPS y por tanto mayor probabilidad de sobrevivir en condiciones in vivo.

Con el fin de determinar cómo la pérdida de LPS afecta los rasgos de virulencia potencialmente involucrados en la patogénesis y transmisión de A. baumannii y en base a las modificaciones descritas en la membrana externa de cepas de A. baumannii resistentes a colistina en respuesta a la pérdida de LPS citadas con detalle en el estudio de Moffatt et al (97) se caracterizaron algunos fenómenos fisiológicos que se producían en estas cepas y se procuró establecer una relación entre las modificaciones que alberga la membrana externa con los procesos fisiológicos que podrían explicar la optimización del crecimiento de estas cepas deficientes en LPS en presencia de colistina.

En primer lugar, se observó que el tiempo de generación sufría un importante aumento en las cepas resistentes a colistina, deficientes en LPS, cuando crecen en medio rico en ausencia de colistina que es mucho menos evidente en las cepas que adquieren la resistencia a colistina por el mecanismo de mutación en el sistema pmrAB. Este aumento del Tg corresponde a una reducción en la capacidad de replicación de estas cepas en comparación con las cepas parentales sensibles a la colistina, como se ha descrito en los anteriores ensayos de este mismo capítulo del presente trabajo.

Por otro lado, los resultados muestran una disminución en la producción de biofilm y una motilidad limitada observada en las cepas resistentes a colistina, independientemente del mecanismo de resistencia que estas presenten y por tanto de la pérdida definitiva o no del LPS en la membrana. Se piensa que la formación de biofilm en A. baumannii juega un papel en la resistencia a los antibióticos, el establecimiento de infecciones y la persistencia en las superficies ambientales (106, 415). De acuerdo con nuestros resultados, un estudio reciente demostró que los aislados clínicos que adquieren resistencia a la colistina mediante mutaciones en el sistema PmrAB también mostraron una menor capacidad para producir biofilm. Este fenómeno puede deberse en parte a la expresión reducida de proteínas fimbriales en la membrana de las cepas deficientes en LPS descrito en el estudio de Henry R et al.(98). Estas proteínas fimbriales producen el pili, que es un componente formador del biofilm bacteriano y generador del proceso de desplazamiento o tipo de motilidad

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DISCUSIÓN atribuida a la especie de Acinetobacter, Twitching, como se ha descrito anteriormente en el apartado de introducción. El papel desempeñado por la motilidad superficial en la virulencia bacteriana no se ha dilucidado, sin embargo recientemente se ha demostrado que los aislados clínicos obtenidos de muestras de sangre presentaron más motilidad superficial que los aislados obtenidos para las muestras de esputo, sugiriendo que la motilidad presenta cierta función en ciertos tipos de infección (416)

Los patógenos bacterianos experimentan condiciones limitantes en hierro tanto en el ambiente como durante la infección del huésped (417), lo que sugiere que la supervivencia en condiciones limitantes en hierro puede contribuir a la patogénesis y la transmisión de patógenos bacterianos. Los resultados de este trabajo indican que la pérdida de LPS da como resultado un defecto importante en el crecimiento bajo limitación de hierro, ya que no se observó crecimiento de ninguna de las cepas deficientes en LPS testadas, en medios con presencia de quelante de hierro. Estos hallazgos pueden explicar, en parte, la dificultad en el crecimiento, observada en suero humano e in vivo en el presente estudio. De acuerdo con estos resultados, un estudio previo realizado en nuestro grupo demostró un crecimiento reducido en condiciones limitantes de hierro en una cepa que adquiere resistencia a la colistina a través de mutaciones en el sistema PmrAB (418). En cuanto a las cepas desprovistas de LPS, también se ha observado una disminución en la expresión de receptores de hierro, tales como lactoferrina y transferrina, en la membrana externa de una cepa mutante carente de LPS en Neisseria meningitidis, debido a los cambios estructurales que se producen en la membrana (99), lo que produce mayor dificultad en el crecimiento en medios limitados en hierro.

La capacidad de las bacterias para sobrevivir en entornos clínicos puede facilitar su transmisión. En este contexto, la resistencia a los desinfectantes de uso común puede contribuir a la propagación de patógenos como A. baumannii, que se sabe que persisten en las superficies hospitalarias. Los datos presentados aquí indican que la pérdida de LPS produce un marcado aumento en la susceptibilidad a ciertos desinfectantes que se usan comúnmente en el ámbito hospitalario, específicamente a un péptido catiónico llamado clorhexidina (419) y a dos detergentes, el desoxicolato (420, 421) y el dodecil sulfato de sodio (SDS) (422). Esto puede indicar que las cepas deficientes en LPS son menos capaces de persistir en el contexto de los procedimientos de higiene en el que se emplean estos agentes en los protocolos de desinfección, lo que disminuye la transmisibilidad de estas cepas en los entornos clínicos.

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DISCUSIÓN

En resumen, en el presente capítulo se muestra la capacidad de A. baumannii para adaptarse a la presión antibiótica de la colistina a través de la pérdida de un importante componente estructural de la membrana y un factor de virulencia para este patógeno, a pesar de que esta adaptación supone una disminución cuantiosa de la aptitud fisiológica de la bacteria. Los fenómenos observados en este capítulo establecen un vínculo entre la adquisición de resistencia a colistina a través de la pérdida de LPS y la disminución de la aptitud y la virulencia, lo que puede explicar la baja prevalencia de aislados resistentes a la colistina con pérdida de LPS en el entorno clínico.

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CONCLUSIONES

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CONCLUSIONES

CAPÍTULO 1

1. Las cepas de A. baumannii deficientes en LPS presentan diferente patrón de resistencia a compuestos antimicrobianos que las cepas parentales que contienen LPS, mostrando en la mayoría de los casos mayor susceptibilidad a un gran número de antibióticos de diferentes familias y mayor permeabilidad en la membrana externa.

2. La pérdida del LPS en cepas de A. baumannii que albergan una mutación en los genes Ipx A, lpx C o Ipx D, no sólo confiere resistencia a colistina, sino que, además, crea una dependencia parcial a este antibiótico. Este fenómeno no ocurre si la resistencia se ha adquirido por modificación del LPS producida por una mutación en el sistema pmrAB.

3. La dependencia parcial a colistina produce un retraso en el crecimiento de la bacteria, pero no afecta a su supervivencia.

CAPÍTULO 2

4. La pérdida de LPS en cepas de A. baumannii produce la pérdida de fitness bacteriano en condiciones in vitro que simulan la infección humana y en condiciones in vivo de infección intraperitoneal murina, en comparación con la respuesta de las cepas parentales que contienen LPS.

5. La pérdida de LPS en cepas de A. baumannii produce cambios en el fenotipo. Se ha comprobado que estas cepas presentan un incremento del tiempo de generación en medios sin colistina, una menor producción de biofilm, una mayor sensibilidad a los desinfectantes clorhexidina, deoxicolato y SDS, una menor motilidad y un crecimiento más lento en condiciones de deficiencia en hierro.

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REFERENCIAS

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REFERENCIAS

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