Symposium 3 : The 39 th Annual Meeting of JASP

PAIN RESEARCH 33 (2018 ) 1–9 Review Article

Physiological significances of TRP–ANO1 interaction

Yasunori Takayama 1, Koji Shibasaki 2, Hidemasa Furue 3, Daisuke Uta 4, and Makoto Tominaga 1

1 Division of Cell Signaling, Okazaki Institute for Integrative Bioscience (National Institute for Physiological Sciences) 2 Department of Molecular and Cellular Neurobiology, Gunma University Graduate School of Medicine 3 Department of Neurophysiology, Hyogo College of Medicine 4 Department of Applied Pharmacology, Graduate School of Medicine and Pharmaceutical Sciences, University of Toyama

Abstract A calcium–activated , anoctamin 1 (ANO 1), is strongly activated by intracellular calcium increases through activation of transient receptor potential (TRP ) channel because these ion channels physically interact with one another on the plasma membrane. The functional inter action occurs when TRP channels and ANO 1 are within 20 nm, although ANO 1 could be activated by global calcium increases as well. Recently, we obtained data that suggested the significance of the inter actions in the choroid plexus and primary sensory neurons. TRPV 4 and ANO 1 inter action in the apical membrane of choroid plexus epithelial cells could induce water efflux to the ventricle side. This interaction could be important in the homeostatic release of cerebro spinal fluid. That is, TRPV 4 could be activated by the combined effects of body temperature and membrane stretch evoked by continuous water influx from the basolateral (capillary ) side. Furthermore, TRPV 1 and ANO 1 inter action enhances TRPV 1–mediated pain sensation. TRPV 1 and ANO 1 are co–expressed in small dorsal root ganglion (DRG ) neurons. In our study, ANO 1 current was induced by capsaicin application in small DRG neurons. ANO 1–dependent depolarization following TRPV 1 activation evoked action potentials. Furthermore, capsaicin–evoked pain–related behaviors in mice were strongly inhibited by a selective ANO 1 blocker whereas the compound did not completely abolish the behaviors. The significance of these observations is that selective ANO 1 inhibi tion reduces pain sensation. We also investigated non–specific inhibitory effects of chemicals on activities. We recently found that 4–isopropylcyclohexanol (4–iPr–CyH–OH ) has an analgesic effect on burning pain sensation. 4–iPr–CyH–OH, a menthol analogue, is an aliphatic higher alcohol and used as a food– or flavor–additive. This compound inhibits TRPV 1 and ANO 1 without agonistic effects on TRPV 1, TRPA 1 or ANO 1. Menthol also inhibits TRPV 1 and ANO 1, however, the TRPM 8 agonist activates TRPA 1 followed by pain sensation. Therefore, 4–iPr–CyH–OH might be a novel analgesia,

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although the effect is non–specific. In fact, 4–iPr–CyH–OH reduced capsaicin–evoked action potentials and pain–related behavior in mice. Moreover, 4–iPr–CyH–OH also inhibited TRPV 4 and TRPA 1 involved in both pain and itch sensations. These results indicate that 4–iPr–CyH–OH could function globally to reduce skin hypersensitivity. TRP–ANO 1 interactions are involved in many physiological mechanisms and these could be pharmacologically controlled.

Keywords TRP channe l; Anoctamin 1; Isopropylcyclohexano l; Acute pain

Receive d: 7 November 2017

TRP チャネル − アノクタミン 1 相互作用 の生理機能

高山 靖規 1／柴崎 貢志 2／古江 秀昌 3／歌 大介 4／富永 真琴 1

1 岡崎統合 バイオサイエンスセンタ ー（生理学研究所 ） 細胞生理研究部門 2 群馬大学 分子細胞生物学講座 3 兵庫医科大学 神経生理部門 4 富山大学大学院 医学薬学研究部 応用薬理学研究室

子機構 であることを 筆者 らは 明らかにした 29 ）。 はじめに 本稿 では， TRPV 1−ANO 1 相互作用 について， 体外環境 の変化 を知覚 することは 生存 におい その 発見 に至った 経緯 も踏まえて 論じたいと 思 て重要 であり， 特に侵害性刺激 を感じることは う。 時として 生命維持 に直結 する 不可欠 な生理機能 である。 末梢 の自由神経終末 には 化学的 および アノクタミン 物理的刺激 の多くを 受容 する 分子機構 があるた め， 一次感覚神経 は危機的環境 の回避 にも 重要 アノクタミン （anoctamin, ANO ）は である。 侵害性熱刺激 や酸刺激 はカプサイシン TransMEMbrane 16 （TMEM 16 ）とも 呼 の受容体 である TRPV 1を活性化 し， 且つそれ ばれる 膜タンパク 質であり， 陰イオンチャネル らの 同時刺激 は TRPV 1を相乗的 に賦活化 す としての 機能 の他にスクランブラーゼ 活性 やイ る 4）。一方， アノクタミン 1（ ANO 1）は 2008 ンターナリゼーション の亢進 に寄与 している 年に同定 された カルシウム 活性化型陰 イオン （Fig. 1）。 ANO の活性化 は細胞内 カルシウム に チャネル であり， 熱感受性 を持つことが 報告 さ 依存 しており 3,23 ,35 ），ANO 1の場合 は第 2〜第 3 れている 5）。TRPV 1は一次感覚神経 において 膜貫通領域間 の細胞内 ドメイン （S2–S3 ドメイ ANO 1と共局在 しており，これら 二つの イオ ン） にグルタミン 酸から 成るカルシウムボウル ンチャネル の相互作用 は神経興奮 を増強 する 分 を持っている （Fig. 1）が， 実際 のカルシウム 結

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Fig. 1 Functions of each subtype of ANO molecules (also called TMEM 16 ) and a schematic model of the structure of ANO 1. Plus or minus symbols indicate existence or non–existence of each activity, respectively from refs 8,26 ,31 ). ANO 1 has ten transmembrane regions (TMRs) and a calcium binding site is configured by the 6th to 8th TMRs. Pore regio n is configured by the 3rd to 6th TMRs.

合部位 は第 6〜第 8 膜貫通領域 によって 複合的 TRPV 4−ANO 1 相互作用 に形成 されている 2）。10 個のサブタイプ の内， ANO 1とANO 2に関しては 陰イオンチャネル 哺乳類 TRP チャネルファミリー には 28 の 活性 があることがわかっているが，その 他のサ チャネル が存在 しており， TRPV サブファミ ブタイプ が持つチャネル 活性 については 諸説 あ リー には 6 つの チャネル がある 10 ）。TRP チャ り明確 にはなっていない 8,26 ,31 ）。真菌 の一種 で ネル は TRPM 4とTRPM 5を除いて カルシウム ある Nectria haematococca から クローニング さ 透過性 が高く， 細胞膜直下 では チャネル から 数 れた ANO ホモログ の X 線結晶構造解析 によっ µm の範囲 で拡散 した カルシウム による 影響 が て細かい 立体構造 が明らかとなり 2），また 近年， 生じると 考えられる 19 ）。TRPV 4は上皮系細胞 マウス ANO 1がクライオ 電子顕微鏡 によって に広く発現 しているが， 神経系 の細胞 でも 機能 解析 されたが， 哺乳類 における ANO 1の全体 的発現 が確認 されており， 深部体温下 における 像は未だ不鮮明 である 20 ）。ただし， マウス 神経興奮 の亢進 などに 関わっている 24 ）。このよ ANO 1も第10 膜貫通領域 で接合 する 二量体 で うに 多くの 組織 において 機能的 に存在 する あるなど 生化学的 に解析 されていた 結果 と重な TRPV 4は脈絡叢上皮細胞 においても 高発現 し る部分 もある 32 ）。興味深 いことに， 二量体 の中 ている 28 ）。脈絡叢 は脳室内 に存在 し， 上皮細胞， 心でポア が形成 されているのではなく， 各サブ 軟膜 および 有窓性毛細血管 からなる 単層 の組織 ユニット が一つずつ ポア 構造 を持つことが 機能 である （Fig. 2–A）。上皮細胞頂端側 （脳室側） の 的解析 から 示唆 されている 15 ）。立体構造解析 か 強固 なタイトジャンクション により 脳脊髄液 と ら， ポア は第 3〜第 6 膜貫通領域 によって 複合 血液 は分断 されているが， トリセルラータイト 的に構成 されると 考えられているが 20 ），最新 の ジャンクション は明白 でないため， パラセル 構造解析 により 第7膜貫通領域 もポア 形式 に関 ラー 経路 が存在 すると 考えられる 12 ）。 わることが 示唆 された 7,21 ）。また ANO 6 におい 脳脊髄液分泌 は， 上皮細胞 の基底外側部 （血 てこの ポア 領域 は主にリン 脂質転移 に関わるこ 管側） から 頂端側 へイオン が能動的 ・受動的 に とが 示唆 されている 13 ）。 輸送 されることで 生じる。 深部体温 や細胞膜 の

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Fig. 2 Interactions between the TRP channel and ANO 1. (A) TRPV 4–ANO 1 interaction in choroid plexus epithelial cells. The choroid plexus releases cerebrospinal fluid by ion transport (mainly sodium and chloride) from basolateral to apical membranes followed by water movement in monolayer structures formed by epitheli al cells, leptomeninges and fenestrated capillaries. TRPV 4 is located in the apical membrane of epithelia l cells. First, TRPV 4 is activated, leading to an influx of calcium. Second, ANO 1 is activated by the calcium entering the cell. Finally, water efflux occurs, driven by chloride transport. (B) TRPV 1–ANO 1 interacti on on both the peripheral side (free nerve ending) and the central side (presynaptic area) of a DRG neuron. TRPV 1 is initially activated and ANO 1 is also immediately activated in calcium nano–domains or a global field inside of the cells 14 ). Opening of the chloride channel induces depolarization (∆ ψ) because NKCC 1 constantly takes up chloride from the extracellular region, although KCC 2 expression is undetectable. Therefor e, ANO 1 activation enhances neuronal activity. TRPV 1 interacts with ANO 1 in the central side, and the depolarization activates voltage–gated calcium channels followed by transmitter release. Calcium influx through TRPV 1 activation itself and calcium release from mitochondria (Mt) are also involved in the transmitter release as shown by previous reports 18 ).

伸展 により 活性化 する TRPV 4は脈絡叢上皮細 が存在 するものと 仮定 して 検討 を進めた。この 胞の頂端側 に局在 しており， 脳脊髄液分泌 に伴 仮定 において， 対象 となる クロライドチャネル い上皮細胞 が膨張 ・収縮 を繰り返すことで 活性 には TRPV 4 活性化 に対する 即応性 とカチオン 化していると 考えられる。しかし 不可思議 なこ 流入 に打ち勝つ高いクロライド 透過性 が必要 で とは， TRPV 4が活性化 すると 細胞内 へナトリ あると 考えた。 結果 として， カルシウム 活性化 ウム が引き戻されてしまい， 脳室 への 水輸送 が クロライドチャネル の機能的発現 を確認 した 28 ）。 抑制 される 点である。そこで， 筆者 らは ナトリ カルシウム 活性化 クロライドチャネル のうち， ウム 流入 のカウンターパート となる イオン 動態 条件 から 考えて ANO 1 である 可能性 が高いと

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推定 して， TRPV 4とANO 1の相互作用 に着目 の DRG ニューロン において 細胞内 クロライド して 研究 を進めたところ， 確かにそれらは 上皮 濃度 は比較的高 く保持 されており， クロライド 細胞 において 機能的 に共役 することが 判明 した。 チャネル の活性化 はクロライド の流出 によって また， 免疫沈降実験 により TRPV 4とANO 1の 脱分極 を引き起こす。そこで， DRG ニューロ タンパク 質間結合 が示唆 された。このことから， ンにおいて 観察 される カプサイシン 誘発活動電 TRPV 4 活性 を介して 細胞内 に流入 する カルシ 位と脱分極 に対する ANO 1 阻害剤 の影響 を観察 ウム によって ANO 1が活性化 され，それによ した。 実験 では， 最初 にカプサイシン 単独投与 る クロライドイオン 流出 が 駆動力 となり， による 応答 を確認 し， 10 分間 の洗浄後 に再びカ TRPV 4と相互作用 する アクアポリン 4（AQP 4） プサイシン により 引き起こされる 活動電位 を測 を介した 水の流出 が生じると 考えられた 1）。加 定した。この 状況 において，2 回目 の活動電位 えて， 脈絡叢上皮細胞 の頂端側 に局在 している が減弱 する ニューロン も存在 する 一方 で， 引き AQP 1も脳脊髄液分泌 に重要 であると 考えられ 続き神経興奮 を示すニューロン があることがわ る 25 ）。よって， TRPV 4−ANO 1 相互作用 は脳脊 かった。 既報 によれば， 脱感作後 1 時間程度 は 髄液分泌 の恒常性 に関わっていると 結論 づけた TRPV 1のカプサイシン 感受性 は回復 しないが， （Fig. 2–A）。 AKAP との 相互作用 を介した PKC 依存的 なリ ン酸化 により TRPV 1は断続的 に活性化 する 22 ）。 さらに， TRPV 1の一部 はそもそも リン 酸化 して TRPV 1−ANO 1 相互作用 おり 活性化 しやすいということも 報告 されてい TRPV 1とANO 1がDRG ニューロン で共発 る 16 ）。つまりは， 一部 のニューロン ではたまた 現することは 知られていたが，その 相互作用 に まリン 酸化 された TRPV 1が多かったため 継続 ついては 不明 であった 5）。そこで， 単離 した して 活動電位 が惹起 されたというのが 既報 から DRG ニューロン において カプサイシン 誘発電 の解釈 であるが， 選択的 ANO 1 阻害剤 である 流が ANO 1 阻害剤 で抑制 されるか 否かを 検討 T16 Ainh –A01 がこの 2 回目 の活動電位 をほぼ 完 したところ， 平均 しておよそ 半減 した 29 ）。これ 全に抑制 した。このことから， TRPV 1 活性単独 は，それまで TRPV 1 電流 のみと 理解 されてい ではなく ANO 1 活性 を介した クロライド 輸送 に た陰性電位 での 内向 き電流 の中には ANO 1を よって 神経興奮 が促進 したと 考えられた。すな 介した クロライド 電流 が含まれることを 示唆 す わち， 細胞内 クロライド 濃度 が高い場合， る結果 であった。さらに， TRPV 1とANO 1の TRPV 1−ANO 1 相互作用 は疼痛 を増悪 させるよ 物理的相互作用 も示唆 された。 うに 働くことがわかった。 中枢神経系 においては カリウム −クロライド しかしながら， 実際 には 細胞内 クロライド 濃 共輸送体2 （KCC 2）の発現 が豊富 であるため 細 度が低い DRG ニューロン も存在 しており， 痛 胞内 クロライド 濃度 は低く保たれている。しか 覚に対する 作用 として TRPV 1−ANO 1 相互作用 しながら， DRG ニューロン における KCC 2発 が促進的 なのか 抑制的 なのかはわからなかった。 現は非常 に乏しく， ナトリウム −カリウム −クロ そこで， マウス を用いて 行動薬理学的検討 を ライド 共輸送体 1（ NKCC 1）によって 細胞内 ク 行ったところ， カプサイシン による 足舐 め行動 ロライド が調節 されている 17 ）。そのため， 多く は ANO 1 阻害剤 により 抑制 された。これによっ

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て， DRG ニューロン における TRPV 1−ANO 1 いうことが 示唆 された （Fig .2–B）。 このことは， 相互作用 が痛みの 増悪 に関わるということが 示 治療選択 の一つとして 脊髄 への ANO 1 阻害剤 された （Fig .2–B）。 このことは， ANO 1 を標的 投与 の重要性 を示唆 するものである。また， とした 鎮痛薬開発 の重要性 を示唆 するものであ ANO 1 活性化 がエクソサイトーシス を引き起こ るが， 全身投与 では 様々 な副作用 が予想 される すに 足る脱分極 を惹起 することの 証明 でもあり， ため 湿布 を用いた 皮膚 への 局所投与 などが 現実 事実，膵臓 β細胞 における インスリン 分泌 とグ 的な利用方法 であると 考えられる。 ルコース による 活動電位 は ANO 1 依存的 であ ることが 近年報告 された 6,34 ）。

TRPV 1–ANO 1 相互作用 の 神経伝達 における 意義 情報統合 システム としての 相互作用 と その 薬理学的制御 による 疼痛緩和 TRPV 1は末梢神経 において 自由神経終末 の みに 局在 するわけではなく， 中枢端 にも 分布 し 前述 のように ，TRPV 1 活性化 を引き金とする ている。そのため ，TRPV 1の活性化 は神経伝達 痛みは ANO 1 によって 増悪 する。すなわち， 物質 の放出 を促し，この 機構 はミトコンドリア TRPV 1は侵害性物質 に対する 検出器 であり， に依存 した 細胞内 カルシウム 濃度上昇 と共役 し ANO 1 がその 信号 の増幅器 として 機能 している ている 18 ）。神経傷害 などにより リン 酸化 された ことになる。 各々 はそれ 自体 が侵害受容性 チャ TRPV 1は体温下 で活性化 するため， 中枢端 に ネル として 独立 した 機能 を持つが， 複合体 とな おける 機能解析 も重要 であると 考えられた。 脊 ることで 情報系統 が統合 され， 一つの 集積素子 髄後角 の第二層 に分布 する substantia gelatinosa のように 機能 する。そこで， 単一 のイオンチャ （SG ）ニューロン は DRG ニューロン から 侵害性 ネル ではなく 複合体全体 を調節 する 方法 につい 刺激 による 入力 を多く受けている 9）。また， 同 て検討 した。 近年，筆者 らは メントール やカル 一の侵害性刺激 に対する DRG ニューロン と バクロール， 2–APB といった TRP チャネルア SG ニューロン の応答性 は常に一致 するもので ゴニスト が ANO 1を阻害 することを 発見 し はなく， 脊髄 レベル で神経信号 が統合 される 場 た 30 ）。特に， メントール は TRPV 1とANO 1 合もある 33 ）。そこで， 脊髄 スライス 標本 におい の両方 を阻害 することから，それが メントール て SG ニューロン で観察 される 興奮性 シナプス の鎮痛作用 のメカニズム と考えられる 27 ）。さら 後電流 （excitatory postsynaptic current, EPSC ） に， メントール の類似体 である 4–イソプロピル の解析 から TRPV 1−ANO 1 相互作用 を検討 した。 シクロヘキサノール （4–iPr –CyH –OH ）が その 結果， ANO 1 阻害剤 はカプサイシン により ANO 1に対して 効果的 であった。また， TRP 亢進 した EPSC の発生頻度 を抑制 するが， 後根 チャネル に対しても 広く抑制効果 が見られた 付きスライス 標本 において Aδ線維 や C 線維誘 （Fig .3）。 この 化合物 は， 商業的 には 食品・ 香料 起の EPSC に対しては 阻害効果 が無いことが 判 添加物 として 用いられる 脂肪族高級 アルコール 明した。すなわち， TRPV 1−ANO 1 相互作用 を 類であるが， 意外 にも 4–iPr –CyH –OH の腎毒 介した 脱分極 により 電位依存性 カルシウムチャ 性のみが 報告 されていた 11 ）。筆者 らは， 鎮痛効 ネル 活性化 に伴う自発性 の神経伝達 が起こると 果を検討 するため マウス の後肢 に4–iPr –CyH –

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がると 考えている。このように， 天然化合物由 来の物質 にも TRP −ANO 1 相互作用 を制御 でき るものが 存在 する。

おわりに

本稿 で紹介 した 以外 にも TRP チャネル と ANO 1の相互作用 は様々 な生理現象 に関わって いることが 近年明 らかとなってきている。 生体 内の多くの 組織 に存在 する TRP チャネル 同様 に， ANO ファミリー も全身 に存在 している。 また， ANO が持つ機能 はチャネル 機能， スク ランブラーゼ 活性 および インターナリゼーショ ン活性 であるので 意義 を含めると 非常 に多くの 可能性 が存在 している。 今後，様々 な場面 で TRP チャネル と ANO と組み合わせることに よって 理解 できる 現象 が多々 あるのではないか Fig. 3 Structures of menthol and its analogues. と大いに 期待 される。 Values in parenstheses indicate logarithmic ratio (log P) of octanol–water partitioning coefficient at pH 7.40 (http://www.chemspider.com). Table shows agonistic or antagonistic effects of 4–iPr– CyH–OH on each ion channel, including TRPV 1, 文献 TRPA 1, TRPM 8, TRPV 4 and ANO 1 in both mice 1) Benfenati, V., Caprini, M., Dovizio, M., and humans. iPr–CyH, isopropylcyclohexane. 4– Mylonakou, M.N., Ferroni, S., Ottersen, O.P., iPr–CyH–OH, 4–ispropylcyclohexanol. 1–iPr– 4– Amiry –Moghaddam, M., An –4 ⁄ m–CyH, 1–isopropyl– 4–methylcyclohexane. CyH– transient receptor potential vanilloid 4 (AQP 4⁄ TRPV 4) complex is essential for cell –volume OH, cyclohexanol. –m–CyH–OH, –methylcyclo - 3 3 control in astrocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. hexanol. 2–PrOH, 2–propanol. U.S.A., 108 (2011 ) 2563–2568 . 2) Brunner, J.D., Lim, N.K., Schenck, S., Duerst, A., Dutzler, R., X –ray structure of a calcium –acti - vated TMEM 16 lipid scramblase, Nature, 516 OH を皮下投与 したところ， カプサイシン によ (2014 ) 207–212 . る疼痛関連行動 が抑制 された。また， TRPV 1 3) Caputo, A., Caci, E., Ferrera, L., Pedemonte, N., Barsanti, C., Sondo, E., Pfeffer, U., Ravazzolo, R., や ANO 1に対する アゴニスト 作用 は確認 され Zegarra –Moran, O., Galietta, L. J., TMEM 16 A, なかった。 興味深 いことに， 4–iPr –CyH –OH a membrane protein associated with calcium – dependent chloride channel activity, Science, は TRPA 1に対する アゴニスト 効果 も非常 に弱 322 (2008 ) 590–594 . かった。そのため， 4–iPr –CyH –OH を既存 の 4) Caterina, M.J., Schumacher, M.A., Tominaga, M., Rosen, T.A., Levine, J.D., Julius, D., The cap - 薬剤 に配合 する （香料添加物指定 であるため 比 saicin recepto r: a heat –activated ion channel in 較的自由 に配合 できる） などして 新薬開発 に繋 the pain pathway, Nature, 389 (1997 ) 816–824 .

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8 PAIN RESEARCH Vol.33 2018 Molecular mechanisms of TRP –ANO 1 interaction

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