Untersuchung Von Harzen Des Weihrauchbaums (Boswellia Spp.)

Universitätsklinikum Ulm Institut für Naturheilkunde und Klinische Pharmakologie Komm. Direktor: Prof. Dr. Oliver Zolk

Untersuchung von Harzen des Weihrauchbaums (Boswellia spp.) hinsichtlich chemischer Zusammensetzung, zytokinregulatorischer Eigenschaften und Wirkung auf Mammakarzinomzellen

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie (Dr. biol. hum.) der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm

vorgelegt von: Michael Schmiech aus Moosburg a. d. Isar

2020

Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth Erstgutachter: Prof. Dr. Thomas Simmet Zweitgutachter: Prof. Dr. Boris Mizaikoff Tag der Promotion: 11.12.2020

Teile dieser Arbeit wurden bereits in wissenschaftlichen Fachzeitschriften publiziert:

1.) Schmiech, M.; Ulrich, J.; Lang, S.J.; Büchele, B.; Paetz, C.; St-Gelais, A.; Syrovets, T.; Simmet, T.,11-Keto-α-Boswellic Acid, a Novel Terpenoid from Boswellia spp. with Chemotaxonomic Potential and Antitumor Activity against Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecules 2021, 26, 366, doi: 10.3390/molecules26020366. © 2021, CC- BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/. (IF2019 = 3,267)

2.) Schmiech, M.; Lang, S.J.; Ulrich, J.; Werner, K.; Rashan, L.J.; Syrovets, T.; Simmet, T., Comparative Investigation of Frankincense Nutraceuticals: Correlation of Boswellic and Lupeolic Acid Contents with Cytokine Release Inhibition and Toxicity against Triple-Negative Breast Cancer Cells. Nutrients 2019, 11, 2341, doi: 10.3390/nu11102341. © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/. (IF2019 = 4,546)

3.) Schmiech, M.; Lang, S.J.; Werner, K.; Rashan, L.J.; Syrovets, T.; Simmet, T., Comparative Analysis of Pentacyclic Triterpenic Acid Compositions in Oleogum Resins of Different Boswellia Species and Their In Vitro Cytotoxicity against Treatment-Resistant Human Breast Cancer Cells. Molecules 2019, 24, 2153, doi: 10.3390/molecules24112153. © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/ by/4.0/. (IF2019 = 3,267)

4.) Schmidt, C.; Loos, C.; Jin, L.; Schmiech, M.; Schmidt, C. Q.; Gaafary, M.E.; Syrovets, T.; Simmet, T., Acetyl-lupeolic acid inhibits Akt signaling and induces apoptosis in chemoresistant prostate cancer cells in vitro and in vivo. Oncotarget 2017, 8, 55147- 55161, doi: 10.18632/oncotarget.19101. © 2017, CC-BY 3.0, creativecommons.org/ licenses/by/3.0/. (IF2016 = 5,168)

Darüber hinaus wurden Teile dieser Arbeit als Konferenzbeiträge publiziert:

5.) Schmiech, M.; Lang S.J.; Paetz, C.; Ulrich, J.; Büchele, B.; Syrovets, T.; Simmet, T., 11-Keto--Boswellic Acid, a Novel Triterpenoid from Boswellia spp., with Cytotoxic Efficacy against Treatment-Resistant Triple Negative Breast Cancer Cell Lines. FASEB J 2020, 34 (1-1), doi: 10.1096/fasebj.2020.34.s1.03970. (IF2019 = 4,966) Konferenz: Experimental Biology 2020, San Diego, CA, USA.

6.) Schmiech, M.; Lang, S.J.; Werner, K.; Schmidt, C. Q.; Syrovets, T.; Simmet, T., Boswellic Acid Composition of Frankincense Dietary Supplements and Correlation to Cytotoxic Efficacy against Treatment-Resistant Triple Negative Breast Cancer Cells. FASEB J 2019, 33 (1_supplement), 816.5-816.5, doi: 10.1096/fasebj.2019.33.1_ supplement.816.5. (IF2019 = 4,966) Konferenz: Experimental Biology 2019, Orlando, FL, USA.

III

Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ...... VI 1. Einleitung ...... 1 1.1 Weihrauch ...... 1 1.1.1 Die Botanik des Weihrauchbaums...... 1 1.1.2 Boswellia-Spezies und ihre Vorkommen...... 2 1.1.3 Die Ernte von Weihrauchharz ...... 5 1.1.4 Die Bedeutung von Weihrauchharz in der Antike ...... 6 1.2 Inhaltstoffe von Weihrauchharzen ...... 7 1.2.1 Mono- und Diterpenoide...... 7 1.2.2 Triterpenoide...... 8 1.2.3 Pentazyklische Triterpensäuren: Boswellia- und Lupeolsäuren ...... 9 1.3 Medizinische Verwendung von Weihrauchharzen ...... 11 1.3.1 Der Weg von der altertümlichen in die moderne Medizin ...... 11 1.3.2 Wirkung von Weihrauchharzextrakten und Boswelliasäuren auf Entzündungsprozesse ...... 12 1.3.3 Anwendung von Weihrauchharzextrakten bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen (Klinische Studien) ...... 15 1.3.4 Wirkung von Weihrauchharzextrakten und Boswelliasäuren auf Krebszellen 18 1.3.5 Anwendung von Weihrauchharzextrakten bei Krebspatienten ...... 20 1.4 Zielsetzung dieser Arbeit ...... 21 2. Material und Methoden ...... 22 2.1 Materialien und Geräte ...... 22 2.1.1 Reagenzien und Chemikalien ...... 22 2.1.2 Weihrauchharzproben ...... 23 2.1.3 Weihrauchharzpräparate ...... 24 2.1.4 Zelllinien ...... 25 2.1.5 Geräte ...... 25 2.1.6 Software ...... 25 2.2 Methoden ...... 26 2.2.1 Extraktion, fraktionierte Extraktion und Wasserdampfdestillation ...... 26 2.2.2 Synthese von 11-Keto--boswelliasäure (-KBA) ...... 27 2.2.3 HPLC-MS/MS: Simultane Quantifizierung von acht Boswellia- und Lupeolsäuren...... 27 2.2.4 HPLC-MS/MS: Chromatographische Trennung der Konstitutionsisomere von KBA und AKBA ...... 29 2.2.5 Gaschromatographische Untersuchung der ätherischen Öle ...... 30 2.2.6 Kernspinresonanzspektroskopie von α-KBA ...... 30 2.2.7 Untersuchung der Zytokinausschüttung ...... 30 2.2.8 Zellvitalitäts- und Proliferationsanalyse ...... 31 2.2.9 Xenotransplantation humaner Mammakarzinomzellen ...... 32 2.2.10 Statistik ...... 32 3. Ergebnisse ...... 33 3.1 Extraktion und Destillation von Weihrauchharzen ...... 33 3.1.1 Methanolische Extraktion von Weihrauchharzen ...... 33 3.1.2 Säurefraktion und Neutralfraktion ...... 35 3.1.3 Ätherische Öle ...... 35 3.2 Quantifizierung von Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzproben mittels HPLC-MS/MS ...... 35 3.2.1 Entwicklung und Validierung einer Methode zur simultanen Quantifizierung von acht Boswellia- und Lupeolsäuren...... 36

3.2.2 Unterschiede in der Boswellia-und Lupeolsäure-Zusammensetzung in Weihrauchharzen verschiedener Boswellia-Spezies...... 40 3.2.3 Einführung des Boswellia-Indizes (Bosi) ...... 45 3.2.4 Boswellia- und Lupeolsäuren in speziellen Harzextrakt-Fraktionen und ätherischen Ölen ...... 46 3.2.5 Gehalte an Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzpräparaten...... 47 3.3 Charakterisierung einer neuen Boswelliasäure: 11-Keto--boswelliasäure (-KBA) ...... 50 3.3.1 Synthese von 11-Keto--boswelliasäure ...... 50 3.3.2 Charakterisierung von 11-Keto--boswelliasäure ...... 51 3.3.3 Quantifizierung von 11-Keto--boswelliasäure in Weihrauchharzen ...... 55 3.4 Gaschromatographische Untersuchung ätherischer Öle aus Weihrauchharzen ...... 58 3.5 Hemmung der Zytokinausschüttung durch Weihrauchharzpräparate ...... 59 3.5.1 Hemmung der TNF-- und IL-10-Ausschüttung in LPS-stimuliertem, humanem Vollblut ...... 59 3.5.2 Hemmung der Zytokinausschüttung aus LPS-stimulierten PBMC ...... 60 3.6 Zytotoxische Eigenschaften auf humane Mammakarzinomzellen ...... 63 3.6.1 Zytotoxische Effekte von Weihrauchharzextrakten auf Mammakarzinomzellen in vitro ...... 63 3.6.2 Zytotoxische Effekte von Weihrauchharzpräparaten auf Mammakarzinomzellen in vitro ...... 65 3.6.3 Zytotoxische Effekte von Boswellia- und Lupeolsäuren auf Mammakarzinomzellen in vitro ...... 69 3.6.4 Effekte von Weihrauchharzpräparaten und Boswelliasäuren auf xenotransplantierte Mammakarzinome in vivo ...... 70 3.7 Untersuchung von Korrelationen ...... 72 3.7.1 Korrelation zwischen chemischer Zusammensetzung und Wirkung auf die Zytokinausschüttung ...... 72 3.7.2 Korrelation zwischen chemischer Zusammensetzung und zytotoxischer Wirkung auf Mammakarzinomzellen ...... 73 3.7.3 Korrelation zwischen der Zytokinausschüttung aus LPS-stimulierten PBMC und der zytotoxischen Wirkung auf Mammakarzinomzellen ...... 74 4. Diskussion ...... 75 4.1 Extraktion potentiell bioaktiver Stoffgruppen aus Weihrauchharzen...... 76 4.2 Quantifizierung von Boswellia- und Lupeolsäuren ...... 77 4.3 Charakterisierung einer neuen Boswelliasäure: 11-Keto--boswelliasäure (-KBA) ...... 78 4.4 Chemische Zusammensetzung ätherischer Öle aus Weihrauchharzen ...... 79 4.5 Chemotaxonomische Unterscheidung verschiedener Boswellia-Spezies ...... 80 4.6 Immunregulatorische Effekte von Weihrauchharzpräparaten ...... 82 4.7 Zytotoxische Effekte auf humane Mammakarzinomzellen in vitro und in vivo...... 84 4.8 Weihrauchharzextrakte und Boswelliasäuren als potentielle Therapeutika bei chronischen Entzündungen und malignen Tumoren ...... 87 5. Zusammenfassung ...... 89 6. Literaturverzeichnis ...... 91 Abbildungsverzeichnis ...... 105 Tabellenverzeichnis ...... 107 Anhang ...... 109 Danksagung ...... 114 Lebenslauf ...... 116

Abkürzungsverzeichnis -ABA 3-O-Acetyl--boswelliasäure (3-O-Acetyl--boswellic acid) β-ABA 3-O-Acetyl--boswelliasäure (3-O-Acetyl--boswellic acid) ALA Acetyl-lupeolsäure (Acetyl-lupeolic acid) -AKBA 3-O-Acetyl-11-keto--boswelliasäure (3-O-Acetyl-11-keto--boswellic acid) -AKBA 3-O-Acetyl-11-keto-β-boswelliasäure (3-O-Acetyl-11-keto-β-boswellic acid) AKBA 3-O-Acetyl-11-keto-boswelliasäure ohne Differenzierung zwischen - und -Isomer AKT Proteinkinase B ANOVA Varianzanalyse (analysis of variance) -BA -Boswelliasäure (α-Boswellic acid) β-BA β-Boswelliasäure (β-Boswellic acid) B. Boswellia CAM Chorioallantoismembran Caspase Spezielle Gruppe von Cysteinproteasen (cysteinyl-aspartate specific protease) CAT G Cathepsin G CED Chronisch-entzündliche Darmerkrankung CID Kollisionsinduzierte Dissoziation (collision-induced dissociation) COX Cyclooxygenase DMSO Dimethylsulfoxid DNS Desoxyribonukleinsäure DoE Statistische Versuchsplanung (design of experiments) ERK Extrazelluläre Signal-regulierte Kinasen (extracellular signal-regulated kinases) ESI Electrospray-Ionisation EtAc Ethylacetat FCS Fetales Kälberserum (fetal calf serum) FN Weihrauchpräparate (frankincense nutraceticals) HAc Essigsäure HCl Salzsäure HLE Humane Leukozytenelastase (human leukocyte elastase) HPLC-MS/MS Hochleistungsflüssigkeitschromatograhie mit tandem massenspektrometrischer Detektion IC50 Mittlere inhibitorische Konzentration IKK IB-Kinase IL Interleukin -KBA 11-Keto--boswelliasäure (11-Keto--boswellic acid) -KBA 11-Keto-β-boswelliasäure (11-Keto-β-boswellic acid) KBA 11-Keto-boswelliasäure ohne Differenzierung zwischen - und - Isomer KOH Kaliumhydroxid LA Lupeolsäure (Lupeolic acid) VI

5-LO 5-Lipoxygenase LPS Lipopolysaccharide MA Maslinsäure (Maslinic acid) MeOH Methanol MRM Multiple-reaction monitoring MS Massenspektrometrie MS/MS Tandem-Massenspektrometrie Na2SO4 Natriumsulfat NF-B Nuclear factor ‘kappa-light-chain-enhancer’ of activated B-cells NMR Kernspinresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance) PBMC Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells) PCA Hauptkomponentenanalyse (principal component analysis) PFP Pentafluorphenyl PGE2 Prostaglandin E2 PGES Prostaglandin-E-Synthase PLA2 Phospholipase A2 PTA Pentazyklische Triterpensäuren (pentacyclic triterpenic acids) SRM Selected-reaction-monitoring STAT Signal transducers and activators of transcription TNBC Dreifach negatives Mammakarzinom (triple-negative breast cancer) TNF- Tumornekrosefaktor- TOP Topoisomerase TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling VEGF Vaskulärer(e) endotheliale-(r) Wachstumsfaktor(en) (vascular endothelial growth factor) XTT 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5- ((phenylamino)carbonyl)-2H-tetrazoliumhydroxid

VII

Einleitung

1. Einleitung 1.1 Weihrauch „…und gingen in das Haus und sahen das Kindlein mit Maria, seiner Mutter, und fielen nieder und beteten es an und taten ihre Schätze auf und schenkten ihm Gold, Weihrauch und Myrrhe“ [Mt 2,11; Lutherbibel 2017]. Schon seit vielen Jahrhunderten ist Weihrauch, genauer gesagt das Harz des Weihrauchbaums, in zahlreichen Kulturen aus zeremoniellen und medizinischen Gründen hochgeschätzt. Als eines der wichtigsten altertümlichen Handelsgüter ist Weihrauch gleichzeitig auch der Namensgeber einer der ältesten und bedeutendsten Handelsrouten der Welt. Erste medizinische Anwendungen des Weihrauchharzes wurden bereits im 16. Jahrhundert vor Christus dokumentiert. Das Wissen über den medizinischen Nutzen wurde durch Ärzte der indischen und griechisch-römischen Antike vertieft und weitergegeben. So findet die entzündungshemmende, schmerzstillende und antibiotische Wirkung des Weihrauchharzes seit hunderten Jahren in der indischen, arabischen, afrikanischen und chinesischen Volksmedizin Anwendung. Seit Ende des 20. Jahrhunderts wird Weihrauchharz intensiv von der modernen Medizin und Wissenschaft erforscht. Auch die Untersuchungen dieser Arbeit sollen dazu beitragen sowohl die chemische Zusammensetzung von Weihrauchharz als auch seine Wirkung auf Entzündungsprozesse und Krebszellen besser zu verstehen [1-4].

Abbildung 1: Boswellia-Bäume und Weihrauchharzernte. (a) Baum der Spezies B. sacra. Diese Spezies ist überwiegend in trockenen Gebieten der Arabischen Halbinsel (Oman und Jemen) verbreitet. (b) Die Spezies B. frereana aus Somalia bevorzugt felsigen Untergrund. (c) Durch Anritzen der Baumrinde tritt das Harz aus, welches anschließend an der Luft getrocknet wird. Das getrocknete Harz der Boswellia-Bäume wird als Weihrauchharz oder umgangssprachlich als Weihrauch bezeichnet. Bilder mit freundlicher Genehmigung von Herrn Georg Huber (https://weihrauch-blog.de/bilder/, Zugriff am 29.05.2019).

1.1.1 Die Botanik des Weihrauchbaums Als Weihrauchharz oder umgangssprachlich als Weihrauch wird das getrocknete Harz von Bäumen der Gattung Boswellia Roxb. ex Colebr. bezeichnet. Diese Pflanzengattung stammt aus der Familie der Balsambaumgewächse (Burseraceae), zu welchen auch der

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Myrrhenstrauch (Commiphora myrrha) und der Palo-santo-Baum (Bursera graveolens) gehören [2, 5]. Der Weihrauchbaum oder auch Boswellia-Baum zeichnet sich zumeist durch seine oft eher strauchartige Form aus und wird zwischen 2 und 6 Meter hoch (Abbildung 1a, b). Einzelne Arten können jedoch auch Höhen von bis zu 13 Metern erreichen [6]. Die Blätter des Weihrauchbaums wachsen unpaarig gefiedert am Ende der Zweige und sind ganzrandig oder gekerbt-gesägt. Während der Blütezeit im April trägt der Weihrauchbaum weiße oder rötliche Blüten in zusammengesetzten Trauben [1]. Das Verbreitungsgebiet des Weihrauchbaums erstreckt sich von Indien, über die Arabische Halbinsel und dem Horn von Afrika bis nach Westafrika (Abbildung 2). Die Bäume bevorzugen vor allem trockene, felsige Böden und trockene Luft. Dank ihrer breiten, flachen Wurzeln können sie die begrenzten Wasserressourcen optimal nutzen. Trotzdem kann der benötigte Abstand zwischen einzelnen Bäumen in trockenen Regionen bis zu mehreren hundert Metern betragen [1].

Abbildung 2: Verbreitungsgebiet der Gattung Boswellia und ihrer unterschiedlichen Arten. Boswellia-Bäume wachsen überwiegen in den trockenen Gebieten der Arabischen Halbinsel (Oman und Jemen), am Horn von Afrika (u. a. Somalia, Äthiopien und Eritrea) und in Indien, aber auch vereinzelt in West- und Zentralafrika. Im Biodiversitäts-Hotspot in und um Somalia ist die höchste Artenvielfallt beheimatet. Kartendaten © 2019 ORION- ME, Google.

1.1.2 Boswellia-Spezies und ihre Vorkommen Als Stammpflanzen der Gattung Boswellia werden heutzutage vier Spezies angesehen: B. sacra Flueck, B. carterii Birdw., B. frereana Birdw. und B. serrata Roxb. ex Colebr. [1]. Insgesamt sind mittlerweile über 25 verschiedene Boswellia-Spezies beschrieben, wobei nicht klar ist, ob u. a. wegen der geografischen Überlappung der Verbreitungsgebiete Arten doppelt gezählt wurden [2]. Taxonomische Beschreibungen des Weihrauchbaums sind nicht

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immer eindeutig. So gibt es z. B. immer wieder Diskussionen, ob nicht sogar die Stammpflanzen B. sacra und B. carterii derselben Spezies angehören [2, 7-11]. Am Horn von Afrika, das als ein Biodiversitäts-Hotspot gilt, herrscht eine besonders hohe Artenvielfalt. Dies gilt auch im Hinblick auf Weihrauchbaumarten. Die meisten aller Boswellia-Spezies sind in diesem Gebiet verbreitet [10, 12]. In Richtung Zentral- und Westafrika wird die Vielfalt an Weihrauchbaumarten sowie ihr Vorkommen deutlich geringer [6, 13]. Durch das Arabische Meer von der afrikanischen Artenvielfalt abgetrennt gibt es in Indien eine eigene Boswellia-Population [2, 14]. Im Folgenden werden die wichtigsten Boswellia-Arten kurz erläutert.

(I) Boswellia serrata Roxb. ex Colebr. Die Spezies B. serrata, die auch unter den Namen B. thurifera Colebr. oder B. glabra Roxb. bekannt ist, wächst hauptsächlich in den mittleren und nördlichen Teilen Indiens sowie in Parkistan [2, 6]. In seinen Verbreitungsgebieten ist das indische Weihrauchharz auch als Salai guggal oder Salai guggul bekannt [14]. Dabei ist dieses das wohl am besten erforschte Weihrauchharz. Bereits in jahrhundertealten ayurvedischen Schriftstücken wird die medizinische Verwendung von indischem Weihrauchharz beschrieben [6]. Aufgrund der räumlichen Trennung zu anderen Verbreitungsgebieten durch das Arabische Meer ist B. serrata eindeutig von anderen Boswellia-Arten zu unterscheiden.

(II) Boswellia sacra Flueck. B. sacra ist hauptsächlich auf der Arabischen Halbinsel, insbesondere im Oman und im Jemen verbreitet. Vereinzelt wurden aber auch Exemplare in Somalia beschrieben [2, 15]. Das omanische Weihrauchharz gilt das reinste der Welt und erzielt die höchsten Preise auf dem Markt [6]. Das tropfenförmige Weihrauchharz kann in unterschiedlichen Färbungen auftreten. Die höchsten Qualitätsstufen (Royal Hojari) weisen eine grünliche bis leicht türkisene Färbung auf. Andere Sorten sind weiß (Superior Hojari), gelb (Amber Hojari) oder braun-rötlich (Red Hojari / Black Hojari) gefärbt (Abbildung 3). Die Farbe des Weihrauchharzes hängt dabei maßgeblich mit dem Anbaugebiet zusammen. Bäume, die in Küstennähe wachsen, produzieren eher dunkleres Weihrauchharz und Bäume, die im trockenen Landesinneren wachsen, helles Harz generieren [6].

(III) Boswellia carterii Birdw. B. carterii oder B. carteri war früher auch als B. bhaw-dajiana Birdw. bekannt und ist vor allem im Norden von Somalia verbreitet, insbesondere in der Region Bari, Puntland und in der autonomen Region Somaliland [2, 6, 16]. B. carterii gilt als eine der Stammpflanzen der Gattung Boswellia [1]. Somalisches Weihrauchharz stellt eines der wichtigsten Exportgüter der Region dar, wird aber auch von der einheimischen Bevölkerung selbst als Räuchergut verwendet. Dabei steht nicht nur der gute Duft im Vordergrund, vielmehr dient der Rauch auch als natürliches Abwehrmittel gegen Mücken und Sandflöhe [6].

Einleitung

(IV) Boswellia frereana Birdw. B. frereana wächst in den selben nordsomalischen Gebieten wie B. carterii, bevorzugt jedoch höhere Regionen und steinigen bis felsigen Untergrund [10]. Das goldgelbe Weihrauchharz, das von der indigenen Bevölkerung Maydi oder Königsweihrauch genannt wird, unterscheidet sich von allen anderen Boswellia-Arten (Abbildung 3). Im Gegensatz zu anderen Weihrauchharzsorten ist es sehr weich, sodass es von den Einheimischen gekaut wird [6]. Darüber hinaus ist Weihrauchharz der Spezies B. frereana die einzige Art, die keine Boswelliasäuren enthält [7].

(V) Boswellia papyrifera Hochst. B. papyrifera ist in christlichen Kirchen das meist verwendete Weihrauchharz. Seine Hauptverbreitungsgebiete sind Äthiopien, Eritrea und Sudan [6]. Dieses Weihrauchharz zeichnet sich durch eine einzigartige Zitrusnote aus und hat einen besonders hohen Anteil an Incensol und Incensolacetat, welche eine potentiell antidepressive und angstlösende Wirkung aufweisen [17, 18]. Am Beispiel von B. papyrifera wird die Notwendigkeit von nachhaltiger Ernte besonders sichtbar. Eine aktuelle Studie von Bongers et al. prognostiziert, dass sich der Weihrauchbaumbestand durch Übererntung innerhalb der nächsten 20 Jahre halbieren könnte [12].

(VI) Boswellia dalzielli Hutch. Im Gegensatz zu anderen Boswellia-Arten ist B. dalzielli in West- und Zentralafrika verbreitet. Besonders häufig ist diese Art in den Ländern Nigeria, Senegal und Burkina Faso anzufinden [2, 6]. Im Vergleich zu anderen Arten werden Dalzielli-Bäume mit bis zu 13 Metern Höhe relativ groß. In der traditionellen afrikanischen Medizin wird vor allem die Rinde des Baumes verwendet [13]. Der Farbe des Weihrauchs variiert zwischen grünlich und gelb bis orange und ähnelt stark den Harzen der Spezies B. sacra und B. carterii.

(VII) Boswellia neglecta S. Moore

B. neglecta kommt sowohl in Kenia als auch in Somalia vor [2]. Das Weihrauchharz aus Kenia ist auch unter dem Namen Dakkara bekannt und fällt durch seine auffällig schwarze Färbung auf [6]. Im Gegensatz zu anderen Weihrauchharzen ist es nicht tränenförmig, sondern wird in ca. 5 cm großen, sehr harten Brocken vertrieben (Abbildung 3). Eine genaue Klassifizierung ist vor Ort nicht immer möglich und so wird Harz von B. neglecta teilweise mit der recht unbekannten Myrrhe-Art Commiphora confusa verwechselt [6, 19]. Die Neglecta-Bäume in Somalia produzieren hingegen sehr unterschiedlich gefärbte Weihrauchharze. Die Färbung kann dabei von goldgelb bis dunkelgrau variieren [6].

(VIII) Boswellia rivae Engl. B. rivae gehört zu den weniger bekannten Weihrauchbaumarten. Er kommt vor allem in der Ogaden-Region vor. Dieses Gebiet gehört zu Äthiopien, wird aber auch von Somalia beansprucht, was immer wieder zu politischen Konflikten führt. Das Weihrauchharz der Spezies B. rivae hat eine dunkle, braun-gräuliche Färbung und ist sehr hart und spröde.

Einleitung

Aufgrund seiner Ähnlichkeit zu dem dunklen Weihrauchharz der Spezies B. neglecta kann es leicht zu Verwechslungen kommen [6].

(IX) Boswellia occulta Thulin, DeCarlo & S. P. Johnson Im Jahr 2019 beschrieben Thulin et al. die Entdeckung einer neuen Weihrauchart: B. occulta [20]. Diese Spezies ist ausschließlich in einem sehr kleinen Gebiet im Nordwesten von Somalia (Somaliland) verbreitet (Abbildung 2) und blieb bis vor kurzem zwischen den anderen Boswellia-Arten im Biodiversitäts-Hotspot Somalias verborgen [20]. Daher leitet sich auch sein Name von dem lateinischen Wort occultus (deutsch: verborgen, geheim) ab. Obwohl die Pflanze und ihr Harz große Ähnlichkeiten zur Spezies B. sacra aufweisen, zeichnet sich das Weihrauchharz durch eine charakteristisch hohe Konzentration an Methoxy-Alkanen aus [21, 22].

Abbildung 3: Unterschiede in Morphologie und Färbung von Weihrauchharzen. Die Farbe des Weihrauchharzes variiert je nach Art von türkisgrün, über gelb und orange bis schwarz. Auch innerhalb einer Art kann es zu unterschiedlichen Färbungen kommen. So ist Weihrauchharz der Spezies B. sacra aus dem trockenen Landesinneren eher hell und aus der etwas feuchteren Küstenregion dunkler.

1.1.3 Die Ernte von Weihrauchharz Die Ernte des Weihrauchharzes beginnt in den Monaten März und April und wird damit eingeleitet, dass dem Stamm des Baumes je nach Alter, Größe und Zustand 10 - 30 Wundstellen zugefügt werden [2, 4]. Es ist wichtig, dass der Stamm nicht zu tief eingeschnitten wird, da es ansonsten zu Verletzungen des Baumes und somit zu nachhaltigen

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Ernteeinbußen kommen kann [1]. Dazu wird ein spezielles Schabemesser verwendet, das im Oman Manqaf und in Somalia Minqaf genannt wird [6]. Durch die Schnitte tritt aus den Zwischenzellräumen der sekundären Rinde eine milchige Flüssigkeit aus, welche kleine Tränen bildet (Abbildung 1c). Die Flüssigkeit gerinnt an der Luft und wird drei Wochen später abgekratzt [2]. Diese erste Ernte ist jedoch von minderer Qualität und wird verworfen [6]. In den folgenden Monaten tritt Harz von guter Qualität aus der Wunde aus, das gelbliche Tränen und Tropfen bildet und alle ein bis zwei Wochen durch Abkratzen geerntet wird. Je nach Zustand des Baumes können auf diese Weise 2 - 8 kg Weihrauchharz pro Erntesaison und Baum gewonnen werden [1]. Nach der Ernte wird das Harz in kühlen und trockenen Orten, meist in Höhlen getrocknet. Das auf diese Weise gewonnene Weihrauchharz wird im arabischen Raum als Olibanum oder Bakhour bezeichnet [14, 23]. Ein Weihrauchbaum kann maximal in drei aufeinander folgenden Jahren abgeerntet werden. Danach benötigt er eine mehrjährige Regenerationsphase [2].

1.1.4 Die Bedeutung von Weihrauchharz in der Antike Die Bedeutung von Weihrauchharz wird daran ersichtlich, dass eine der bedeutendsten und ältesten Handelsrouten der Welt nach ihm benannt wurde: die Weihrauchstraße. Bereits im dritten Jahrtausend vor Christus gehörten Weihrauch und Myrrhe zu den wichtigsten Handelsgütern der arabischen und ostafrikanischen Länder [1]. Dabei war die Herkunft des kostbaren Gutes lange Zeit ein gut geschütztes Staatsgeheimnis. Die Stadt Dhofar im heutigen Oman war eines der Zentren der Weihrauchproduktion. Das Weihrauchharz wurde von dort aus über die Weihrauchstraße bis ans Mittelmeer transportiert [2]. Die Reise dauerte oft mehrere Monate. Entlang der Handelsroute wurden teils hohe Zölle erhoben, was den Preis des Weihrauchharzes in die Höhe trieb. Ein Umgehen der Zölle durch Abweichen von den vorgegebenen Routen wurde teilweise mit dem Tode bestraft [4]. Später wurde das Weihrauchharz im ägyptischen Alexandria zum Weiterverkauf vorbereitet. Dabei mussten die Arbeiter alle Kleider ablegen, damit niemand die Möglichkeit hatte die teuren Güter zu stehlen. Ein Pfund des günstigsten Weihrauchharzes kostete zu dieser Zeit ungefähr den Wochenlohn eines Arbeiters [1]. Verwendung fand das wohlriechende Weihrauchharz sowohl als zeremonielles Duft- und Räuchermittel als auch schon damals als Heilmittel. Von Ägypten aus fand das Weihrauchharz seinen Weg bis in die westliche Welt. In katholischen und orthodoxen Kirchen gehört das Verbrennen von Weihrauchharz bis in die heutige Zeit zum Ritus und symbolisiert das aufsteigende Gebet zu Gott [vgl. 2.Mose 30,34; Offb 8,4; Lutherbibel 2017].

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1.2 Inhaltstoffe von Weihrauchharzen Je nach Spezies bestehen Weihrauchharze zu 5 - 15 % aus ätherischem Öl, 55 - 66 % reinem Harz, 20 - 23 % Gummen und 12 - 23 % Schleimstoffen [1, 23]. Historisch wurden Weihrauchharzbestandteile in nur zwei Fraktionen aufgeteilt: etherlösliche Bestandteile und etherunlösliche Bestandteile. Die etherunlöslichen Bestandteile setzen sich aus wasserlöslichen Gummen und Schleimstoffe zusammen, die hauptsächlich aus neutralen und sauren Polysacchariden bestehen. Die Etherphase enthielt hingegen das ätherischen Öl und das reine Harz [2].

1.2.1 Mono- und Diterpenoide Das ätherische Öl des Weihrauchharzes setzt sich hauptsächlich aus Mono- und Diterpenoiden zusammen [24]. Terpenoide leiten sich strukturell von Isopren (C5H8) ab und unterscheiden sich von Terpenen durch das Vorhandensein von funktionellen Gruppen. Monoterpenoiden liegen zwei Isopreneinheiten zugrunde und besitzen somit ein Monoterpen-Grundgerüst aus zehn C-Atomen. Analog dazu liegen Diterpenoiden vier Isopreneinheiten zugrunde und somit ein Diterpen-Grundgerüst aus 20 C-Atomen [25]. Mono- und Diterpenoide verleihen Weihrauchharz nicht nur seinen charakteristischen Geruch, sondern dienen der Pflanze zur Abwehr vor schädlichen Insekten [23]. Hauptbestandteile des ätherischen Öls sind u. a. -Pinen, -Pinen, -Thujen, Camphen, Sabinen und Limonen (Abbildung 4) [11].

Abbildung 4: Beispiele für Mono- und Diterpenoide in Weihrauchharz. Monoterpenoide liegen zwei Isopreneinheiten zugrunde, sie sind verantwortlich für den charakteristischen Geruch von Weihrauchharzen. Monoterpenoide können in aliphatischer (z. B. Myrcen), monozyklischer (z. B. Limonen) oder bizyklischer Form (z. B. -Pinen und -Pinen) vorkommen. Incensol gehört hingegen zu den Diterpenoiden, welche aus vier Isopreneinheiten aufgebaut sind. 7

Einleitung

1.2.2 Triterpenoide Die reine Harzfraktion besteht zu großen Teilen aus Triterpenoiden. Diese höheren Terpenoide sind aus sechs Isopreneinheiten aufgebaut und besitzen somit ein Titerpen- Grundgerüst aus 30 C-Atomen [25]. Weiter kann diese Stoffgruppe in tetrazyklische und pentazyklische Triterpenoide aufgeteilt werden [9]. Pentazyklischen Triterpenoide können wiederrum in drei verschiedenen Strukturtypen vorkommen: dem Oleanan-Typ, dem Ursan- Typ und dem Lupan-Typ [26, 27]. Diese drei Strukturtypen differenzieren sich allein durch unterschiedliche Konstitutionen am E-Ring (Abbildung 5).

Abbildung 5: Chemische Strukturen von pentazyklischen Triterpenoiden. (a) Pentazyklische Triterpenoide lassen sich im Wesentlichen auf die Strukturen von Oleanan, Ursan und Lupan zurückführen. Die Grundstrukturen sind aus sechs Isopreneinheiten

aufgebaut und besitzen die gemeinsame Summenformel C30H52. Unterscheidungsmerkmal ist die Konstitution an Ring E. Oleanan besitzt einen 6-C-Ring mit zwei geminalen Methylgruppen an Position C-20, Ursan zwei vicinale Methylgruppen an den Positionen C-20 und C-21. Bei Lupan besteht Ring E aus einem 5-C-Ring mit Isopropylgruppe an Position C-19. (b) Beispiele von pentazyklischen Triterpenoiden in Weihrauchharzen sind α-Amyrin, β-Amyrin und Lupeol. Auch die Strukturen von Boswellia- und Lupeolsäuren können auf diese Grundgerüste zurückgeführt werden.

(I) Oleanan-Typ Pentazyklische Triterpenoide des Oleanan-Typs besitzen fünf 6-C-Ringe und zeichnen sich durch zwei geminale Methyl-Gruppen an Position C-20 aus (Abbildung 5). Zu den Inhaltstoffen des Weihrauchharzes dieser Stoffklasse gehören u. a. -Amyrin, sowie alle - Boswelliasäuren [27].

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(II) Ursan-Typ Wie der Oleanan-Typ besitzt der Ursan-Typ fünf 6-C-Ringe, unterscheidet sich jedoch in der Stellung der Methyl-Gruppen an Ring E. Für den Ursan-Typ sind zwei vicinale Methyl-Gruppen an den Positionen C-19 und C-20 charakteristisch [27]. Vertreter dieser Stoffklasse im Weihrauchharz sind u. a. -Amyrin, sowie jegliche -Boswelliasäuren.

(III) Lupan-Typ Der Lupan-Typ zeichnet sich durch einen 5-C-Ring an Position Ring E mit zusätzlicher Isopropyl-Gruppe an Position C-19 aus [26]. Die wichtigsten Triterpenoide dieses Typs in Weihrauch sind u. a. Lupeol, aber auch Lupeolsäure und Acetyl-lupeolsäure [7, 28, 29].

1.2.3 Pentazyklische Triterpensäuren: Boswellia- und Lupeolsäuren Im Jahr 1892 untersuchten Tschirch und Halbey Extrakte des indischen Weihrauchharzes und trennten erstmals die Säurefraktion ab, die sie „Boswellinsäure“ nannten. [30]. Nach weiterführenden Arbeiten beschrieben im Jahr 1932 Winterstein und Stein die Isolation der ersten Boswelliasäuren [31]. In den folgenden Jahrzehnten wurden nach und nach weitere Boswellia- und Lupeolsäuren isoliert und charakterisiert sowie eine einheitliche Nomenklatur eingeführt [26, 27, 32-34]. Heute wissen wir, dass Boswellia- und Lupeolsäuren zu der Stoffklasse der pentazyklischen Triterpensäuren gehören. Charakteristisch für diese Triterpenoide ist die Carboxyl-Gruppe an der Position C-24. Die Hydroxylgruppe an Position C-3 kann sowohl acetyliert als auch deacetyliert vorliegen (Abbildung 6) [26, 27].

Abbildung 6: Chemische Strukturen von Boswellia- und Lupeolsäuren. (a) -Boswelliasäure (-BA) und 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA). (b) -Boswelliasäure (-BA) und 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA). (c) 11-Keto-β- boswelliasäure (-KBA) und 3-O-Acetyl-11-keto-β-boswelliasäure (-AKBA). (d) Lupeolsäure (LA) und Acetyl-lupeolsäure (ALA).

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Während die decarboxylierten Formen der Triterpenoide (u. a. Lupeol, -Amyrin und -Amyrin) auch in anderen Pflanzen vorkommen, sind Boswellia- und Lupeolsäuren bisher ausschließlich in Pflanzen der Gattung Boswellia nachgewiesen worden [26, 28, 29, 35, 36]. Anfang der 2000er-Jahre konnten die einzelnen Boswellia- und Lupeolsäuren unter Verwendung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) erstmals hochselektiv in Weihrauchharzen quantifiziert werden [7, 28, 37]. Dabei erwiesen sich folgende acht Boswellia- und Lupeolsäuren als die wichtigsten Vertreter dieser Stoffklasse: -Boswelliasäure (-BA), 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA), -Boswelliasäure (- BA), 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA), 11-Keto-β-boswelliasäure (-KBA), 3-O- Acetyl-11-keto-β-boswelliasäure (-AKBA), Lupeolsäure (LA) und Acetyl-lupeolsäure (ALA). Zusätzlich konnten weitere Boswelliasäuren nachgewiesen werden, die aber in vernachlässigbaren Konzentrationen enthalten waren. Dazu zählen 11-Hydroxy- boswelliasäuren und 9,11-Dehydro-boswelliasäuren [9, 28]. Neben pentazyklischen Triterpensäuren wurden in Weihrauchharzen auch tetrazyklische Triterpensäuren gefunden, zu denen die Tirucallensäuren gehören [7, 38]. Die höchsten Konzentrationen an Boswellia- und Lupeolsäuren wurden im Harz des Boswellia-Baums, also dem Weihrauchharz nachgewiesen. Büchele et al. ermittelten im Jahr 2003 einen Gesamtgehalt von 14,3 % in indischem Weihrauchharz und 19,3 % in afrikanischem Weihrauchharz [28]. Untersuchungen anderer Pflanzenteile zeigten deutlich geringere Konzentrationen. In der inneren Rinde (Cambium) konnten 4,9 % und in der äußeren Rinde (Hypodermis), den Blättern sowie den Wurzeln konnten weniger als 1 % Boswellia- und Lupeolsäuren nachgewiesen werden [39]. Die Biosynthese von -Boswelliasäuren wird ausgehend vom Vorläufermolekül Epi-- amyrin beschrieben (Abbildung 7) [39]. Katalysiert durch das Enzym Cytochrom P450 (CYP) wird Epi--amyrin an der Position C-24 über drei Stufen oxidiert. Zwischenprodukte sind der entsprechende Alkohol und das entsprechende Aldehyd. Endprodukt dieser Oxidation ist -Boswelliasäure (-BA). Ausgehend von -BA kann zum einen unter Verwendung von Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) die Hydroxylgruppe an Position C-3 acetyliert und dadurch 3-O-Acetyl-β-boswelliasäure (β-ABA) gebildet werden. Zum anderen kann durch Oxidation an der Position C-11 über das Zwischenprodukt 11-Hydroxy--boswelliasäure die Ketoboswelliasäure 11-Keto-β-boswelliasäure (-KBA) synthetisiert werden. Durch anschließende Acetylierung entsteht 3-O-Acetyl-11-keto-β-boswelliasäure (-AKBA) als Endprodukt der Biosynthesekaskade. Für -Boswelliasäuren wird analog dazu eine Biosynthese ausgehend von Epi--amyrin angenommen, wobei Keto--boswelliasäuren lange Zeit nicht nachgewiesen werden konnten. Erst im Jahr 2005 beschrieben Büchele et al. die Charakterisierung von 3-O- Acetyl-11-keto--boswelliasäure (-AKBA) [40, 41]. Da die Biosynthese von -AKBA über 11-Keto--boswelliasäure (-KBA) verläuft, wird dessen Existenz zwar angenommen, konnte jedoch bis heute noch nicht nachgewiesen werden [39]. -KBA und -AKBA gelten mitunter als die pharmakologisch interessantesten Inhaltsstoffe des Weihrauchharzes [42-45]. Da die Existenz von -AKBA immer noch weitgehend unbekannt ist und -KBA noch nicht

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nachgewiesen wurde, werden -KBA und -AKBA oft vereinfacht KBA und AKBA abgekürzt [42, 45-48]. So wird z. B. im Europäischen Arzneibuch der Gehalt an KBA und AKBA zur Standardisierung von Zubereitungen aus indischem Weihrauch beschrieben [Ph.Eur. ab 2008]. In der vorliegenden Arbeit werden die Abkürzungen KBA und AKBA verwendet, wenn nicht weiter zwischen den -und -Isomeren unterschieden wird

Abbildung 7: Biosynthese von -Boswelliasäuren. Ausgehend von Epi--amyrin wird durch Oxidation mit Hilfe des Enzyms Cytochrom P450 -Boswelliasäure (-BA) gebildet. Durch Acetylierung der Hydroxylgruppe an Position C-3 entsteht 3-O-Acetyl-β- boswelliasäure (β-ABA). Wird -BA an Position C-11 oxidiert entsteht 11-Keto-β- boswelliasäure (-KBA). Anschließende Acetylierung führt schlussendlich zu 3-O-Acetyl- 11-keto-β-boswelliasäure (-AKBA) [39].

1.3 Medizinische Verwendung von Weihrauchharzen 1.3.1 Der Weg von der altertümlichen in die moderne Medizin Die älteste dokumentierte medizinische Verwendung von Weihrauchharz geht bis in das 16. Jahrhundert vor Christus zurück. Im ägyptischen Schriftstück Papyrus Ebers wird eine Zubereitung aus Weihrauchharz und Honig als Heilmittel beschrieben [2]. In der griechisch- römischen Antike setzten die Ärzte Hippokrates, Celsus, Galen und Dioskurides Tinkturen, Salben und Pulver aus Weihrauchharz für medizinische Zwecke ein [4]. Diese wurden zum einem zur Wundreinigung verwendet, aber auch zur Behandlung von Ohren- und Mandelentzündungen, Schuppenflechte, Warzen, Geschwülste, Abszessen und vielen anderen Krankheitsbildern [2, 4, 23]. Ähnliche Verwendungen von Weihrauchharzen findet man auch in der afrikanischen, arabischen und chinesischen Volksmedizin [2, 13, 49]. In der traditionellen indischen Medizin, Ayurveda, ist die Verwendung von Weihrauchharz seit Jahrhunderten ein fester Bestandteil [1]. Schon in der ältesten Textsammlung der indischen Naturheilkunde, der Charaka Samhita, die ca. 600 Jahre vor Christus entstand, wird Weihrauchharz erwähnt. In der Ayurveda-Medizin wurde Weihrauchharz meist bei

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Krankheiten verabreicht, die im Zusammenhang mit einem Übermaß an Pitta, d. h. Hitze oder Wärme gesehen wurden [1]. In der modernen westlichen Medizin ist Erwärmung (Calor) wiederum eines der charakteristischen Symptome einer Entzündung [50]. Interessanterweise wurde Weihrauchharz in allen traditionellen Volksmedizinen vor allem bei Symptomen eingesetzt, die wir heute in Zusammenhang mit entzündlichen Krankheiten oder Krebs setzen [23]. Die medizinische Verwendung von Weihrauchharz wurde über die Jahrhunderte kulturübergreifend weitergegeben und so war Weihrauchharz bis Mitte der 1950er als Olibanum im Deutschen Arzneibuch enthalten. Erst nach seiner Neuentdeckung und infolge von pharmakologischen Untersuchungen in den 1990er-Jahren ist das indische Weihrauchharz als Olibanum indicum im Jahr 2008 in das Europäische Arzneibuch aufgenommen worden [23]. In Deutschland gibt es jedoch kein Weihrauchharzpräparat mit Arzneimittelzulassung. So werden Weihrauchharzpräparate in Deutschland als Importarzneimittel aus Indien bezogen oder in kleinen Mengen von approbierten Pharmazeuten als Defekturarzneimittel aus standardisierten Extrakten des indischen Weihrauchharzes hergestellt [23]. Der überwiegende Teil an Weihrauchharzpräparaten wird jedoch als Nahrungsergänzungsmittel vertrieben. Da Nahrungsergänzungsmittel keinen Regulierungen und Standardisierungen wie Arzneimittel unterliegen, sind Wirkstoffgehalt und Qualität der Produkte sehr unterschiedlich und unübersichtlich [51].

1.3.2 Wirkung von Weihrauchharzextrakten und Boswelliasäuren auf Entzündungsprozesse Eine Entzündung ist die physiologische Reaktion des Körpers auf eine Noxe, d. h. die Schädigung eines Gewebes. Die Schädigung kann thermischer, mechanischer, chemischer, mikrobakterieller oder sonstiger Natur sein. Dabei sind die fünf charakteristischen Symptome einer Entzündung Schmerz (Dolor), Rötung (Rubor), Erwärmung (Calor), Schwellung (Tumor) und Einschränkung der Funktion (Functio laesa) [50]. Nach Aktivierung durch eine Noxe setzen Makrophagen und dendritische Zellen des betroffenen Gewebes Entzündungsmediatoren wie Tumornekrosefaktor, Interleukine und Chemokine frei [52]. Durch diese Botenstoffe werden u. a. Monozyten chemotaktisch angelockt und phagozytieren das zerstörte Gewebe, die Fremdstoffe oder die Krankheitserreger. Bei Krankheitserregern, die sich rasch vermehren, produzieren Lymphozyten zusätzlich Antikörper, die sich an die Krankheitserreger binden und dadurch die Phagozytose verstärken [50]. Es muss jedoch zwischen akuten und chronischen Entzündungsprozessen unterschieden werden. Akute Entzündungen zielen im Allgemeinen darauf ab, den entstandenen Schaden zu beseitigen. Bei längerfristigen Entzündungen oder Infektionen kann es zu chronisch- entzündlichen Erkrankungen, insbesondere auch Autoimmunerkrankungen kommen. Dabei steht nicht mehr die physiologische Heilung im Mittelpunkt, vielmehr dauert der Entzündungsprozess an, obwohl der Auslöser nicht mehr nachweisbar ist. Dies führt zu einer signifikanten Schädigung des Gewebes [50]. Beispiele für chronisch-entzündliche Erkrankungen sind rheumatoide Arthritis, Asthma bronchiale, Psoriasis und Morbus Crohn. 12

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Zudem existieren Hinweise, dass chronische Entzündungen im engen Zusammenhang mit der Entstehung von Krebserkrankungen stehen [53, 54]. Obwohl die entzündungshemmende Wirkung von Weihrauchharzen schon seit der Antike bekannt ist und weitergegeben wurde, geriet sie Mitte des 20. Jahrhundert in Vergessenheit. Erst im Jahr 1986 nachdem Singh et al. über die antiinflammatorische Wirkung von indischem Weihrauch bei Ratten berichteten, flammte das Interesse wieder auf [55]. Zu diesem Zeitpunkt war der Wirkmechanismus noch völlig unklar. In den darauffolgenden Jahren wurde die Wirkung von Weihrauchharz und seinen Inhaltsstoffen auf Entzündungsprozesse intensiv untersucht und verschiedene Mechanismen postuliert. Im Folgenden werden einige Wirkmechanismen kurz erläutert.

(I) Boswelliasäuren hemmen die Aktivität der Serinproteasen CAT G und HLE Cathepsin G (CAT G) ist eine Serinprotease, die überwiegend in neutrophilen Granulozyten vorkommt. Die Aufgabe von CAT G besteht zum einen in der Zerstörung von pathogenen Mikroorganismen sowie verletztem Gewebe. Desweitern induziert CAT G die Chemokin-Freisetzung [56]. In einer Studie von Tausch et al. wurde gezeigt, dass Boswelliasäuren die Aktivität von Cat G in vitro mit mittleren inhibitorischen Konzentrationen (IC50) von 0,6 – 3,7 µM hemmen können. Dabei konnte mit Hilfe eines Affinitätstests eine spezifische, reversible Bindung von Boswelliasäuren an CAT G nachgewiesen werden. Der inhibitorische Effekt von Boswelliasäuren auf die Aktivität von CAT G wurde zusätzlich ex vivo durch Verabreichung eines Weihrauchharzextraktes (4 Wochen, 3 x 800 mg/d) beim Menschen bestätigt. Eine Reduzierung bezüglich der Anzahl an Neutrophilen wurde dabei nicht beobachtet [48]. Eine weitere Serinprotease ist die humane Leukozytenelastase (HLE, human leukocyte elastase). Mit Hilfe eines synthetischen Peptid-Substrats wurde von Safayhi et al. der Effekt von β-AKBA auf die Aktivität von isolierter HLE in vitro untersucht. Dabei wurde beobachtet, dass β-AKBA die Hydrolyse in vitro mit einer IC50 von 13,8 µM hemmte [57]. Ex vivo konnte der Effekt bisher jedoch noch nicht bestätigt werden [48].

(II) Boswelliasäuren hemmen die Leukotrien- und Prostaglandinbiosynthese Wichtige Mediatoren der Entzündungsregulation sind Leukotriene und Prostaglandine. Diese Eicosanoide werden physiologisch aus Arachidonsäure synthetisiert, welche bei Bedarf aus Phospholipiden bereitgestellt wird (Abbildung 8). An dieser Stelle setzen viele antiinflammatorische Arzneimittel an. Glukokortikoide hemmen das Enzym Phospholipase A2 (PLA2), das Arachidonsäure aus Membranlipiden freisetzt. Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) wie z. B. Acetylsalicylsäure und Ibuprofen hemmen die Cyclooxygenasen COX-1 und COX-2, die für die Prostaglandin-Synthese verantwortlich sind [58]. Safayhi und Ammon et al. entdeckten, dass Extrakte aus B. serrata und die darin enthalten Boswelliasäuren die Leukotriensynthese durch Hemmung des Enzyms 5-Lipoxygenase (5-LO) in vitro hemmen [59-62]. Leukotriene wirken zum einen kapillarpermeabilitätssteigernd als auch chemotaktisch auf Leukozyten. β-AKBA hemmte

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in vitro die Ausschüttung von Leukotrienen aus neutrophilen Granulozyten von Ratten mit IC50 = 1,5 µM und aus isolierten humanen Leukozyten mit IC50 = 16 µM [61, 62]. Ein ausreichend hoher Plasmaspiegel an Boswelliasäuren zur Hemmung von 5-LO in vivo konnte jedoch bisher nicht nachgewiesen werden, da diese eine sehr hohe Affinität zu Plasmaproteinen aufweisen [63]. Untersuchungen von Siemoneit et al. und Cao et al. zeigten, dass Boswelliasäuren die für die Prostaglandinsynthese verantwortlichen Enzyme Cyclooxygenase-1 (COX-1) und Prostaglandin-E-Synthase (PGES) in vitro hemmen [47, 64, 65]. Prostaglandine sind u. a. für das Schmerzempfinden und für die Entstehung von Fieber verantwortlich. In vitro senkte β-AKBA die Ausschüttung von COX-1-spezifischen Produkten aus humanen Thrombozyten mit IC50 = 6 µM sowie die Aktivität von isolierter COX-1 unter zellfreien Bedingungen mit IC50 = 32 µM [47]. Die Wirkung von Boswelliasäuren auf COX-2 war hingegen deutlich geringer [64]. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Boswelliasäuren das Enzym PGES hemmen, welches die Weiterreaktion von COX-2-Produkten zu Prostaglandin E2 (PGE2) katalysiert. Unter zellfreien Bedingungen inhibierten Boswelliasäuren isolierte mikrosomale PGES aus A549-Zellen in vitro mit IC50-Werten von 3 - 10 µM und in intakten A549-Zellen mit IC50-Werten von 20 - 30 µM [65]. Die direkte Interaktion von Boswelliasäuren mit den Enzymen COX-1 und PGES konnte mit Hilfe von Affinitäts-Tests bzw. Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR, surface plasmon resonance spectroscopy) nachgewiesen werden [47, 65]. Im Tierversuch mit Latex-Papaya-induzierten Ödemen an Rattenpfoten zeigten Boswelliasäuren auch in vivo Wirkung [65]. Dieses Tiermodell wird in direktem Zusammenhang mit der Freisetzung von Arachidonsäure und damit der Bildung von Leukotrienen und Prostaglandinen gesehen [66].

Abbildung 8: Einfluss von Boswelliasäuren auf die Arachidonsäurekaskade. Boswelliasäuren hemmen die Ausschüttung von Leukotrienen und Prostaglandinen durch Interaktion mit den Enzymen 5-Lipoxygenase (5-LO), Cyclooxygenase-1 (COX-1) und Prostaglandin-E-Synthase (PGES).

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(III) Boswelliasäuren hemmen die Expression von proinflammatorischen Proteinen Durch Bindung an spezifische Regionen der DNS regulieren Transkriptionsfaktoren die Expression von bestimmten Genen. Der Transkriptionsfaktor NF-B aktiviert die Expression von Proteinen, die als Entzündungsmediatoren und Wachstumsfaktoren fungieren. Zusätzlich aktiviert NF-B die Bildung der Enzyme PLA2, 5-LO und COX-2 und fördert damit die Synthese von Prostaglandinen und Leukotrienen [58]. NF-B liegt inaktiviert gebunden an den Inhibitor IB im Zytoplasma vor (Abbildung 9). Stimuliert durch z. B. die Entzündungsmediatoren Tumornekrosefaktor- (TNF-) und Interleukin-1 (IL-1) wird NF-B durch das Enzym IB-Kinase (IKK) über Phosphorylierung von IB getrennt und somit aktiviert. Anschließend kann NF-B in den Zellkern gelangen und dort die Transkription von proinflammatorischen Proteinen stimulieren [67]. Syrovets et al. konnten in vitro und in vivo zeigen, dass die Acetyl- Boswelliasäuren -ABA und -AKBA selektiv die Aktivität von IKK hemmen und somit NF-B inaktiv bleibt [68, 69]. Auf diese Weise konnte die Expression des proinflammatorischen Zytokins TNF- signifikant gesenkt werden [70]. Durch die Interaktion von Boswelliasäuren mit IKK wird nicht nur die Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen gesenkt, sondern auch indirekt die Bildung von Leukotrienen und Prostaglandinen durch die Hemmung der Expression entsprechender Enzyme (z. B. 5-LO, PLA2 und COX-2) [58].

Abbildung 9: Boswelliasäuren hemmen die Genexpression proinflammatorischer Proteine durch Interaktion mit dem Enzym IB-Kinase (IKK). Der Transkriptionsfaktor NF-B liegt inaktiviert durch seinen Inhibitor IB im Zytoplasma vor. Durch das Enzym IB- Kinase (IKK) wird der NF-B-IκB-Komplex in seine aktive Form, d. h. freies NF-κB, überführt. Infolgedessen können proinflammatorische Proteine exprimiert werden. Boswelliasäuren unterdrücken deren Expression durch Inhibierung des Enzyms IKK.

1.3.3 Anwendung von Weihrauchharzextrakten bei chronisch- entzündlichen Erkrankungen (Klinische Studien) Anfang der 1990er-Jahre erschienen unter den Namen Sallaki© und H15© die ersten standardisierten Weihrauchharzextrakte auf dem Markt. Infolgedessen wurde die Wirkung von Weihrauchharzextrakten verstärkt in klinischen Studien an Patienten untersucht. Bei vielen Anwendungen, insbesondere bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen, wurden

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bemerkenswerte Resultate berichtet. Im Folgenden werden einige Krankheitsbilder und die Behandlung mit Weihrauchharzextrakten aufgezeigt.

(I) Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen Zu den chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) gehören u. a. Morbus Crohn (Ileitis terminialis) und Colitis ulcerosa. Während Morbus Crohn den gesamten Verdauungstrakt betreffen kann, sind Symptome von Colitis ulcerosa ausschließlich Entzündungen des Dickdarms. Folgen der Funktionsstörung des Darms sind chronische wässrige, teils blutige Durchfälle. Diese treten oft in Verbindung mit Schmerzen und Krämpfen im Unterleib auf [23, 50]. 1997 veröffentlichen Gupta et al. die erste klinische Studie zur Behandlung von Colitis ulcerosa (Stufe 2 und 3) mit Extrakten aus dem Harz von B. serrata [71]. Die Patienten wurden über sechs Wochen dreimal täglich mit 350 mg Weihrauchharzextrakt behandelt. Bei 82 % der Patienten trat eine Remission ein. Im Vergleich dazu betrug die Remissionsrate bei Behandlung mit dem Standardpräparat Sulfasalazin 75 %. Auch in weiteren klinischen Studien zur Behandlung von Kolitis, kollagener Kolitis und Morbus Chron mit Weihrauchharzextrakten konnte eine signifikante Verbesserung der Symptome beobachtet werden [72-74]. In einer achtwöchigen Studie wurde die Wirksamkeit eines Weihrauchharzextrakts mit dem Standardpräparat Mesalazin bei aktivem Morbus Crohn verglichen [72]. Die statistische Auswertung ergab, dass die Alternativtherapie der Standardtherapie nicht unterlegen war.

(II) Asthma bronchiale Bei Asthma bronchiale handelt es sich um eine komplexe chronische Entzündung der Atemwege. Dabei kommt es infolge von Bronchospasmen zu anfallsweise auftretender Atemnot. In einer placebokontrollierten Doppelblindstudie wurden 40 Patienten über sechs Wochen dreimal täglich mit 300 mg eines standardisierten Weihrauchharzextraktes behandelt [75]. 70 % der Patienten zeigten eine deutliche Verbesserung der Symptome hinsichtlich Atemnot, Rasselgeräusche bei Atmen und Häufigkeit der Anfälle. Zudem konnte ein Rückgang an eosinophilen Granulozyten im Blut der Patienten festgestellt werden.

(III) Rheumatoide Arthritis Rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Autoimmunerkrankung, die hauptsächlich die Gelenke betrifft. Als Symptome treten Schwellungen der Gelenke in Verbindung mit schmerzhaften Bewegungseinschränkungen auf. Langfristig kann rheumatoide Arthritis zu einer Zerstörung der Gelenke führen [23]. 1996 fasste R. Etzel elf unveröffentlichte Studien zur Behandlung von rheumatoider Arthritis mit Weihrauchharzextrakten zusammen [76]. Die Metaanalyse ergab, dass bei 50 - 60 % der Patienten, die mit Weihrauchharzextrakten behandelt worden waren, eine signifikante Verbesserung bezüglich Schmerzen sowie ein Rückgang der Gelenkschwellung zu beobachten war.

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(IV) Osteoarthritis Unter Osteoarthritis oder auch Arthrose versteht man eine chronisch-degenerative Erkrankung von Gelenken. Ursachen können chronische Überlastung der Gelenke, akute Traumata oder entzündliche Prozesse sein. Besonders häufig betrifft diese Erkrankung die Kniegelenke. In mehreren randomisierten placebokontrollierten Doppelblindstudien wurde eine signifikante Verbesserung der Symptome durch die Behandlung mit Weihrauchharzextrakten berichtet [77-83]. Kimmatkar et al. behandelten 15 Patienten mit Osteoarthritis über acht Wochen dreimal täglich mit 333 mg eines Weihrauchharzextrakts [79]. Alle Patienten, die mit dem Weihrauchharzextrakt behandelt worden waren, zeigten deutliche Verbesserungen hinsichtlich Schmerz, Beuge- und Bewegungsfähigkeit. Sengupta et al. verwendeten für zwei Studien über 90 Tage Weihrauchharzextrakte, die mit β-AKBA angereichert waren. Beide Studien führten zu einer signifikanten Verbesserung im Hinblick auf Schmerzen und Funktionsfähigkeit des Knies [81, 82]. In einer sechsmonatigen randomisierten Doppelblindstudie verglichen Chopra et al. die Wirkung eines ayurvedischen, weihrauchharzhaltigem Medikaments mit einem therapeutischen COX-2-Hemmer (Celecoxib) bei Patienten mit Osteoarthritis des Knies [77]. Dabei zeigten sich vergleichbare Verbesserungen in Bezug auf Schmerz und Schwellung.

(V) Psoriasis Psoriasis oder auch Schuppenflechte ist eine entzündliche Autoimmunerkrankung der Haut. Im Jahr 2009 untersuchten Wang et al. die Wirkung der Boswelliasäure β-AKBA auf Psoriasis [69]. Im Mausversuch konnte gezeigt werden, dass durch die Inhibierung von NF-B die Produktion von TNF- gehemmt wurde. Nach dreiwöchiger Behandlung waren die betroffenen Hautstellen der Mäuse praktisch vollständig wiederhergestellt. In einer randomisierten placebokontrollierten Doppelblindstudie wurden Patienten mit Psoriasis und eythematösen Ekzemen topisch mit einem Boswelliasäurepräparat behandelt [84]. Bei 70 % der Patienten führte das Präparat zu einer deutlichen Verbesserung der Schuppenflechte. Im Gegensatz dazu wurde in der Placebogruppe bei 90 % der Patienten kein Effekt beobachtet und bei 10 % sogar eine Verschlechterung.

(VI) Nebenwirkungen Zusätzlich zur Wirksamkeit wurde in vielen der Studien auch die Unbedenklichkeit von Weihrauchharzextrakten untersucht. Interessanterweise konnten in keiner Studie schwerwiegende Nebenwirkungen beobachtet werden. Wenn überhaupt, dann wurde vereinzelt von leichten Störungen im Magen-Darm-Trakt berichtet. Darunter zählen Übelkeit, Sodbrennen und in Einzelfällen Durchfall [72, 73, 81, 82].

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1.3.4 Wirkung von Weihrauchharzextrakten und Boswelliasäuren auf Krebszellen Schon in der antiken Medizin wurde Weihrauchharz zur Behandlung von Symptomen verwendet, die wir heute im Zusammenhang mit Krebserkrankungen sehen [2]. Als wesentliche Merkmale von bösartigen Tumoren gelten Proliferation, (verringerte) Apoptose, Angiogenese und Metastasierung. Moderne Zytostatika zielen bei der Chemotherapie von Krebserkrankungen auf diese Merkmale als Angriffspunkte. In der Zeit, in der die Wirksamkeit von Weihrauchharz auf Entzündungsprozesse eingehend erforscht wurde, trat im Allgemeinen der kausale Zusammenhang zwischen Entzündungserkrankungen und der Entstehung von Krebs weiter in den Vordergrund des Interesses [53, 85]. Nach den ersten Hinweisen, dass Weihrauchharzextrakte und Boswelliasäuren neben entzündungshemmenden Eigenschaften potentiell auch das Wachstum von Krebszellen hemmen, wurden die molekularen Wirkmechanismen intensiv untersucht (Abbildung 10) [29, 38, 43-45, 68, 86-91]. Ein wichtiger Angriffspunkt von Zytostatika ist die Unterdrückung der Proliferation, d. h. das Wachstum und die Vermehrung von Krebszellen. Essentiell für die Proliferation sind Topoisomerasen, Enzyme, die die DNS entspannen und dadurch z. B. die Transkription ermöglichen. Syrovets et al. konnten nachweisen, dass acetylierte Boswelliasäuren humane Topoisomerasen-I/IIα (TOP-I/IIα) katalytisch hemmen [91]. Mit Hilfe von SPR- Experimenten zeigten sie, dass acetylierte Boswelliasäuren direkt an das Enzym Topoisomerase-I mit einer Dissoziationskonstanten von KD = 7,6 nM und an Topoisomerase-IIα mit KD = 70,6 nM binden. Infolge dessen wurde eine Bindung von TOP-I/IIα an DNS verhindert. Auch die Hemmung des AKT/mTOR-Signalwegs führt zu einer Unterdrückung der Zellproliferation. Es konnte in mehreren Studien nachgewiesen werden, dass nicht nur Boswelliasäuren, sondern auch Lupeolsäuren und Tirucallensäuren den AKT/mTOR-Signalweg inhibieren. In Experimenten mit der chemoresistenten Prostatakarzinomzelllinie PC-3 zeigte β-AKBA antiproliferative Eigenschaften mit einer IC50 = 17 µM, ALA mit IC50 = 9,7 µM und Acetoxy-tirucallensäure mit IC50 = 6,2 µM, welche auf Hemmung des AKT/mTOR-Signalwegs zurückgeführt werden konnte [29, 38, 87]. Wichtige Transkriptionsfaktoren im Hinblick auf das Zellwachstum sind STAT-Proteine (signal transducers and activators of transcription). In einer In-vitro-Studie beobachteten Liu et al. eine konzentrationsabhängige Herabregulation des STAT-Signalwegs durch β-AKBA (c = 10 - 30 µM) in PC-3-Zellen [87]. Ein weiterer Angriffspunkt bei der Bekämpfung von Krebs ist die Apoptose, eine Form des programmierten Zelltodes. Diese Funktion ist bei Krebszellen oft eingeschränkt. Die Inhibierung des Transkriptionsfaktors NF-B ist neben der Expression von proinflammatorischen Proteinen auch für die Expression von Wachstumsfaktoren verantwortlich [67, 70]. In PC-3-Zellen konnte eine Induzierung von Apoptose durch Inhibierung von NF-B mit Hilfe von acetylierten Boswelliasäuren in vitro und in vivo beobachtet werden [68]. In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass -AKBA die intrazelluläre Signaltransduktion über die ERK-Kaskade (extracellular signal-regulated kinases) hemmt. Dabei inhibierte β-AKBA in vitro die Phosphorylierung von ERK-1/2 in

Einleitung

Meningeomzellen mit einer IC50 von ca. 15 µM [44]. Es wird angenommen, dass eine Senkung der Leukotrien-Produktion eine Ras-Inaktivierung (Rat sacroma Proto-Onkogen) fördert, die wiederum eine Reduzierung der ERK-1/2-Phosphorylierung zur Folge hat [92, 93]. Da NF-κB die Expression des für die Leukotrienbiosynthese verantwortlichen Enzyms 5-LO reguliert [58], kann der Effekt von β-AKBA auf die ERK-Kaskade möglicherweise auf die Interaktion mit IKK zurückgeführt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass -

AKBA (IC50 = 12,1 µM) und -ABA (IC50 = 4,9 µM) zu Apoptose in PC-3-Zellen in vitro und in vivo führten [40]. In diesem Zusammenhang wurde beobachtet, dass die genannten Substanzen die Protease Caspase-3 aktivierten, die zusammen mit weiteren Caspasen kaskadenartig zelleigene Proteine spalten und dadurch die Apoptose einleiten. Zum Wachstum benötigen Tumore eine ausreichende Sauerstoffversorgung, jedoch besitzen sie nicht selbst die Fähigkeit Blutgefäße zu bilden. Daher initiieren Tumore mit Hilfe von vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF, vascular endothelial growth factor) das umliegende Gewebe zu Angiogenese, d. h. zum Ausbilden von Gefäßen. Es stellte sich heraus, dass -AKBA die Angiogenese in vitro und in vivo durch die Suppression von entsprechenden Wachstumsfaktoren hemmt und dadurch das Tumorwachstum durch Unterversorgung signifikant verringert [89, 94]. Mit Hilfe eines In- vitro-Kinase-Tests konnte gezeigt werden, dass β-AKBA die Aktivität des verantwortlichen Enyzms VEGFR2-Kinase mit einer IC50 = 1,7 µM direkt hemmt [94].

Abbildung 10: Molekulare Angriffspunkte von Weihrauchharzextrakten und Boswelliasäuren. NF-B (nuclear factor ‘kappa-light-chain-enhancer’ of activated B- cells), 5-LO (5-Lipoxygenase), COX-1 (Cyclooxygenase-1), PGES (Prostaglandin-E2- Synthase), AKT (Proteinkinase B), VEGF (vascular endothelial growth factor), Caspase- 3 (cysteinyl-aspartate specific protease), HLE (humane Leukozytenelastase), TOP-I/IIα (Topoisomerase-I/IIα), CAT G (Cathepsin G), ERK-1/2 (extracellular signal-regulated kinases) und STAT-3 (signal transducers and activators of transcription).

Einleitung

Insgesamt konnte die Zytotoxizität von Weihrauchharzextrakten und den darin enthaltenen Boswellia- und Lupeolsäuren auf eine Vielzahl von Krebszelllinien nachgewiesen werden. Dazu zählen Leukämiezellen, Leberkarzinomzellen, Glioblastomzellen, Kolonkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Melanomzellen und Pankreaskarzinomzellen [45, 95]. Suhail et al. beobachteten in ihren Experimenten mit ätherischem Öl aus B. sacra zudem in vitro einen Effekt auf dreifach negative Mammakarzinomzellen, einen besonders aggressiven Subtyp des Brustkrebses [90]. In einer weiteren Studie wurde der Effekt hingegen Boswelliasäuren wie -ABA zugeschrieben [96]. Die Wirkung von Weihrauchharzextrakten und Boswelliasäuren auf dreifach negative Mammakarzinomzelllinien wird daher durch die Experimente dieser Arbeit genauer untersucht, um die Ursache-Wirkungs-Beziehung weiter zu konkretisieren.

1.3.5 Anwendung von Weihrauchharzextrakten bei Krebspatienten Schon im Jahr 1996 und 1997 untersuchten Heldt et al. sowie Böker et al. die Wirkung eines Weihrauchharzextraktes auf Patienten mit Hirntumoren. Nach nur sieben Tagen Behandlung mit dreimal täglich 1200 mg Weihrauchharzextrakt wurde eine Verringerung des perifokalen Ödemvolumens beobachtet [97, 98]. In einer randomisierten, placebokontrollierten Doppelblindstudie behandelten 2011 Kirste et al. 44 Patienten mit Hirntumoren zusätzlich zur Strahlentherapie entweder mit 4200 mg Weihrauchharzextrakt pro Tag oder mit einem Placebo [86]. Bei 60 % der Patienten, die zusätzlich mit dem Weihrauchharzextrakt behandelt worden waren, wurde eine Reduktion des Tumorvolumens auf unter 25 % festgestellt. In der Placebogruppe waren es nur 26 % der Patienten. Die Anwendung von Weihrauchharz in der Krebstherapie ist nicht nur auf die Behandlung von Hirntumoren limitiert. Lee et al. berichten in einem Fallbericht über die Behandlung eines Patienten mit Blasenkrebs und Metastasen in beiden Lungenflügeln [99]. Der Patient lehnte eine Chemotherapie ab und wurde alternativ mit einem Phytotherapeutikum behandelt, das u. a. Weihrauchharz enthielt. Im Zuge der Therapie verringerten sich sowohl Größe als auch Anzahl der Metastasen signifikant. Eine weitere interessante Anwendung von Weihrauchharzpräparaten ist die Behandlung von Hautschäden infolge von Strahlentherapie. Togni et al. und Bonucci et al. behandelten Mammakarzinompatienten begleitend zur Strahlentherapie topisch mit einer Creme, die Boswelliasäuren enthielt [100, 101]. Mit Hilfe der Boswelliasäuren-Creme konnten Rötungen und oberflächliche Symptome im Vergleich zum Placebo signifikant reduziert werden.

Einleitung

1.4 Zielsetzung dieser Arbeit Seit Jahrhunderten wird Weihrauchharz von Boswellia-Bäumen in der traditionellen Medizin verschiedener Kulturen eingesetzt [3]. Die antiinflammatorische und potentiell antitumorale Wirkung des Weihrauchharzes konnte überwiegend auf die enthaltenen Boswellia- und Lupeolsäuren zurückgeführt werden [42, 45, 46]. Der Gehalt dieser Triterpenoide im Weihrauchharz variiert stark zwischen den verschiedenen Arten [7, 8, 28]. Aber auch die Weiterverarbeitung wie Extraktion, Fraktionierung oder Destillation hat großen Einfluss auf den Wirkstoffgehalt [24, 28, 31]. Die botanische Zuordnung eines Weihrauchbaums zu einer der insgesamt ca. 25 Arten ist aufgrund von schwierigen geographischen und politischen Bedingungen in den Verbreitungsgebieten oft nicht eindeutig möglich [2, 12]. Als Teil dieser Studie soll die Möglichkeit einer chemotaxonomischen Unterscheidung verschiedener Boswellia-Arten auf Grundlage der Triterpenoid-Zusammensetzung untersucht werden. Zu diesem Zweck soll eine analytische Methode entwickelt werden, die mit Hilfe von Hochleistungs- flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) die hochsensitive und selektive Quantifizierung von Boswellia- und Lupeolsäuren erlaubt. Mit der entwickelten Analysenmethode wird sodann die chemische Zusammensetzung von 41 verschiedenen Weihrauchharzproben bestimmt und anschließend mit Verfahren der multivariaten Statistik ausgewertet und verglichen. Aufgrund nicht vorhandener Arzneimittelzulassungen für Weihrauchharzpräparate in Deutschland werden diese überwiegend als Nahrungsergänzungsmittel vertrieben. Infolge fehlender Standardisierungen sind Präparate mit sehr unterschiedlichem und für den Verbraucher nicht abschätzbarem Wirkstoffgehalt auf dem Markt verfügbar [51]. Im Zuge dieser Arbeit soll der Gesamtgehalt und die Zusammensetzung an Boswellia- und Lupeolsäuren von 16 kommerziell erhältlichen Weihrauchharzpräparaten bestimmt werden. Des Weiteren werden die immunregulatorischen Effekte der Präparate untersucht. Als Modell hierfür dient die Analyse der Zytokinausschüttung in LPS-stimuliertem humanem Vollblut und in den daraus isolierten Immunzellen. Nachdem der zytotoxische Effekt von Weihrauchharz auf einer Vielzahl an Krebszelllinien bekannt ist, soll speziell die Wirkung auf besonderes aggressive, dreifach negative Mammakarzinomzellen untersucht werden. Mit Hilfe von In-vitro- und In-vivo- Studien wird die Zytotoxizität von Weihrauchharzextrakten und Weihrauchharzpräparaten analysiert. Durch Korrelationsanalysen und Untersuchungen von Reinsubstanzen sollen besonders wirksame Komponenten identifiziert werden. Zusammenfassend soll diese Studie neue Einblicke in den Zusammenhang zwischen der chemischen Zusammensetzung und pharmakologischen Wirkung von Weihrauchharzen geben. Insbesondere sollen dabei neue Erkenntnisse über die Wirkung von Weihrauchharzen auf Entzündungsprozesse und Mammakarzinome gewonnen werden. Der therapeutische Nutzen von Weihrauchharz und seinen Inhaltsstoffen soll mit diesem Projekt und den damit gewonnen Erkenntnissen weiter vorangetrieben werden.

Material und Methoden

2. Material und Methoden 2.1 Materialien und Geräte 2.1.1 Reagenzien und Chemikalien Tabelle 1: Bezugsquellen von pentazyklischen Triterpensäuren. 11-Keto-β-boswelliasäure (-KBA), 3-O-Acetyl-11-keto--boswelliasäure (-AKBA), 3-O-Acetyl-11-keto-β- boswelliasäure (-AKBA), -Boswelliasäure (-BA), -Boswelliasäure (-BA), 3-O- Acetyl--boswelliasäure (-ABA), 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA), Lupeolsäure (LA), Acetyl-lupeolsäure (ALA) und Maslinsäuren (MA).

Substanz Bezugsquelle -KBA Extrasynthese (Genay Cedex, Frankreich)

-AKBA Synthetisiert und charakterisiert von B. Büchele et al. [40, 41] -AKBA Extrasynthese (Genay Cedex, Frankreich) -BA Extrasynthese (Genay Cedex, Frankreich) -BA Extrasynthese (Genay Cedex, Frankreich) -ABA Extrasynthese (Genay Cedex, Frankreich) -ABA Extrasynthese (Genay Cedex, Frankreich)

LA Isoliert und charakterisiert von B. Büchele et al. [26, 27]

ALA Isoliert und charakterisiert von B. Büchele et al. [26, 27] MA Extrasynthese (Genay Cedex, Frankreich)

Tabelle 2: Verwendete Chemikalien und Lösungsmittel.

Substanz Bezugsquelle HiPerSolv Chromanorm, Methanol (MeOH) VWR (Fontenay-sous-Bois, Frankreich) HiPerSolv Chromanorm, Essigsäure (HAc) VWR (Fontenay-sous-Bois, Frankreich) Hauseigene Umkehrosmose (pureAqua, Schnaitsee, Reinstwasser Deutschland) gekoppelt mit Milli-Q Station (Millipore, Eschborn, Deutschland) Kaliumhydroxid Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) (KOH) Natriumsulfat Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) (Na2SO4) Ethylacetat (EtAc) Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) Ameisensäure Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland)

Material und Methoden

2.1.2 Weihrauchharzproben Tabelle 3: Untersuchte Weihrauchharzproben. Bezugsquellen: Georg Huber (Jeomra, Seeheim, Deutschland), Alfred Galke (Alfred Galke GmbH, Bad Grund, Deutschland), Stephan Pohl (Staufen, Deutschland), Prof. Luay J. Rashan (Medicinal Plants Division, Research Center, Dhofar University, Salalah, Oman) und Prof. Mats Thulin (Evolutionary Biology Centre, Department of Organismal Biology, Uppsala, Schweden). Rückstellproben sind im Herbarium des botanischen Gartens der Universität Ulm hinterlegt (Voucher: ULM-24224). Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], Supplementary materials, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Probe # Spezies Spezifikation Herkunftsland Bezugsquelle Bezugsdatum Herbarium Ulm 1 B. sacra Superior Hojari Oman Georg Huber 2017, Q4 190425-1 2 B. sacra Black Hojari Oman Georg Huber 2017, Q4 190425-2 3 B. sacra Royal Hojari Oman Georg Huber 2017, Q4 190425-3 4 B. sacra Royal Hojari Oman Georg Huber 2018, Q1 190425-4 5 B. sacra Red Hojari Oman Georg Huber 2018, Q1 190425-5 6 B. sacra Black Hojari Oman Georg Huber 2018, Q1 190425-6 7 B. sacra Royal Hojari Oman Georg Huber 2018, Q4 190425-7 8 B. sacra Superior Hojari Oman Georg Huber 2018, Q4 190425-8 9 B. sacra Najdi Oman Luay J. Rashan 2017 190425-9 10 B. sacra Hojari Oman Luay J. Rashan 2017 190425-10 11 B. sacra Sahli Oman Luay J. Rashan 2017 190425-11 12 B. dalzielli Janawhi Burkina Faso Georg Huber 2017, Q4 190425-12 13 B. dalzielli / Nigeria Georg Huber 2018, Q2 190425-13 14 B. dalzielli / Senegal Georg Huber 2018, Q4 190425-14 15 B. papyrifera 1. Qualität Äthiopien Georg Huber 2017, Q4 190425-15 16 B. papyrifera / Eritrea Stephan Pohl 2018 190425-16 17 B. papyrifera / Sudan Georg Huber 2018, Q4 190425-17 18 B. serrata 1. Qualität Indien Georg Huber 2017, Q4 190425-18 19 B. serrata 1. Qualität Indien Georg Huber 2018, Q2 190425-19 20 B. serrata 1. Qualität Indien Georg Huber 2018, Q3 190425-20 21 B. serrata / Indien Georg Huber 2018, Q4 190425-21 22 B. serrata geschnitten Indien Alfred Galke 2017 190425-22 23 B. serrata gemahlen Indien Alfred Galke 2015 190425-23 24 B. serrata gemahlen Indien Alfred Galke 2018 190425-24 25 B. carterii 1. Qualität Somalia Georg Huber 2017, Q4 190425-25 26 B. carterii 1. Qualität Somalia Georg Huber 2018, Q1 190425-26 27 B. carterii grüner Weihrauch Somalia Georg Huber 2018, Q1 190425-27 28 B. carterii 1. Qualität Somalia (Puntland) Georg Huber 2018, Q4 190425-28 29 B. carterii 2. Qualität Somalia (Puntland) Georg Huber 2018, Q4 190425-29 30 B. neglecta Muqlo (schwarz) Somalia Georg Huber 2018, Q2 190425-30 31 B. neglecta Muqlo / Gunro Somalia Georg Huber 2018, Q2 190425-31 32 B. neglecta Muqlo (schwarz) Somalia Georg Huber 2018, Q4 190425-32 33 B. neglecta Mix Somalia Georg Huber 2018, Q4 190425-33 34 B. neglecta Mirafur Somalia Georg Huber 2018, Q4 190425-34 35 B. neglecta 1. Qualität (schwarz) Kenia Georg Huber 2017, Q4 190425-35 36 B. neglecta 1. Qualität (schwarz) Kenia Georg Huber 2018, Q4 190425-36 37 B. rivae 1. Qualität Äthiopien (Ogaden) Georg Huber 2017, Q4 190425-37 38 B. frereana Maydi (Mujarwaal / Fas Kabir) Somalia (Somaliland) Georg Huber 2017, Q4 190425-38 39 B. frereana Maydi Mushaat Somalia (Puntland) Georg Huber 2018, Q4 190425-39 40 B. frereana Maydi Mujarwaal Somalia (Puntland) Georg Huber 2018, Q4 190425-40 B.o. B. occulta / Somalia Mats Thulin 2019, Q2 190425-41

Material und Methoden

2.1.3 Weihrauchharzpräparate Tabelle 4: Untersuchte Weihrauchharzpräparate. Herstellerangaben mit Dosierungsempfehlung (Dos.). Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 15-16, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Herstellerangaben Probe Hersteller Produkt Batch Inhalt laut Hersteller Dos. Gall Pharma Boswellia serrata 200 mg GPH FN1 5260.53 200 mg B. serrata Extrakt 2 (Judenburg, Österreich) Kapseln Hecht Pharma H15© Weihrauch Boswellia FN2 2260.52 350 mg B. serrata Extrakt 1 x 1 (Bremervörde, Deutschland) serrata 350 mg (PZN 02260550) Hecht Pharma H15© Weihrauch Kapseln 200 mg FN3 5260.53 200 mg B. serrata Extrakt 1 x 2 (Bremervörde, Deutschland) (PZN 09528464) Heidelberg Apotheke Weihrauch-Extrakt-Kapseln FN4 HBMI07 300 mg B. serrata Extrakt 3 x 1-2 (Bisingen, Deutschland) (PZN 8263513) The Nutri Store Boswellia carterii Extrakt FN5 #7779529-1612 400 mg B. carterii Extrakt 1 x 1 (Mauren, Liechtenstein) Kapseln (PZN 07779529) Wellnest Nutrazeutika NB/BOS- 400 mg B. serrata Extrakt; FN6 Boswellia Weihrauchextrakt 2 (East Grinstead, England) 1215189 200 mg B. carterii Extrakt Vitabay (Masstricht, FN7 Weihrauch Extrakt 400 mg C17030104 400 mg B. serrata Extrakt 2 Niederlande) Vitacost Synergy 5-Loxin© Boswellia FN8 #703657 150 mg B. serrata Extrakt 2 (Boca Raton, Florida) serrata Extract Schloss Apotheke (Koblenz, FN9 Indische Weihrauchkapseln 611142B 400 mg B. serrata Extrakt / Deutschland) Heilsteine Methusalem 430 mg B. sacra FN10 Sacra Weihrauch Gold WS/102017/NT 2 x 2 (Neu-Ulm, Deutschland) Weihrauch Heilsteine Methusalem 500 mg B. serrata FN11 Weihrauch Boswellia serrata WBS/2425/12AS 2 x 1 (Neu-Ulm, Deutschland) Weihrauch Olibanum B.V. Boscari©, original afrikanischer 400 mg B. carterii FN12 B0417 3 x 1 (Kerkrade, Niederlande) Weihrauch Weihrauch Biotikon (Gorxheimertal, FN13 85 Premium Boswellia serrata BOSW-200917 400 mg B. serrata Extrakt 1 Deutschland) Gall Pharma Boswellia serrata Tabletten 400 FN14 261.29 400 mg B. serrata Extrakt 3 x 1 (Judenburg, Österreich) mg Gufic Biosciences Ltd. FN15 Sallaki© Tablets 400 mg AB17019 400 mg B. serrata Extrakt / (Mumbai, Indien) Delphin Apotheke (Langenau, FN16 Weihrauch-Kapseln MHD 05.04.2018 400 mg B. serrata Extrakt / Deutschland)

Material und Methoden

2.1.4 Zelllinien Tabelle 5: Verwendete Zelllinien.

Zelllinie Bezugsquelle MDA-MB-231 ATCC (Rockville, MD, USA) MDA-MB-453 DSMZ (Braunschweig, Deutschland) CAL-51 DSMZ (Braunschweig, Deutschland)

2.1.5 Geräte Tabelle 6: Verwendete Geräte.

Geräte Hersteller

Agilent 1260 Infinity HPLC Agilent (Santa Clara, CA, USA) AB API 2000 Triple-Quadrupol Applied Biosystems (Forster City, CA, USA) Massenspektrometer Tecan D300e Digital Dispenser Tecan (Männedorf, Schweiz) Tecan Infinite M1000 PRO Plate Tecan (Männedorf, Schweiz) Reader BD FACSVerse Durchflusszytometer Becton Dickinson (Heidelberg, Deutschland) Axio Lab.A1 Mikroskop Carl Zeiss (Göttingen, Deutschland) Zeiss 2/3“ CMOS Kamera

2.1.6 Software Tabelle 7: Verwendete Software.

Software Verwendung Analyst 1.6.1 Steuerung/Auswertung HPLC und MS (AB Sciex, Framingham, MA, USA) Valoo 2.10 Validierung (Applica, Bremen, Deutschland) Minitab 18 Statistische Auswertung (Minitab, München, Deutschland) SigmaPlot 14.0 Statistische Auswertung (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) Biovia Draw 19.1 (Dassault Systemes, Vélizy-Villacoublay, Chemisches Zeichnen Frankreich) BD FACSuite v.1.0.6 Durchflusszytometrie (Becton Dickinson Heidelberg, Deutschland) Progres Gryphax Mikroskopie (Carl Zeiss Göttingen, Deutschland)

Material und Methoden

2.2 Methoden 2.2.1 Extraktion, fraktionierte Extraktion und Wasserdampfdestillation Zur methanolischen Extraktion von Weihrauchharz wurden 10 g gefrorenes (-20 °C) Harz frisch gemörsert und mit 80 mL MeOH bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren für 45 min extrahiert. Anschließend wurde die Suspension für 5 min bei 5.000 g zentrifugiert, der Überstand abgenommen und gesammelt. Das Sediment wurde weitere zweimal wie zuvor beschrieben extrahiert. Die gesammelten Überstände wurde vereint und über regenerierte Cellulose filtriert. Das Lösungsmittel wurde anschließend im Rotationsverdampfer entfernt, um ein kristallines Extrakt zu erhalten [102]. Um das Weihrauchharzextrakt in eine Säure- und eine Neutralfraktion aufzutrennen, wurden 5 g des Extrakts in 50 mL 2%ige wässrige KOH gelöst und fünfmal mit 25 mL EtAc im Scheidetrichter extrahiert. Um die kristalline Neutralfraktion zu erhalten, wurden die vereinten EtAc-Phasen 12 h über Na2SO4 getrocknet und bis zur Trockene im Rotationsverdampfer eingedampft. Die wässrige Phase wurde mit 1 M HCl angesäuert (pH = 5) und erneut fünfmal mit 25 mL EtAc im Scheidetrichter extrahiert. Die EtAc-Phasen wurden gesammelt, über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel entfernt um die kristalline Säurefraktion zu erhalten [102]. Das Verfahren der Wasserdampfdestillation wurde angewandt, um das ätherische Öl des Weihrauchharzes abzutrennen. Dazu wurden 100 g frisch gemahlenes Weihrauchharz mit 250 mL Wasser vermengt und für mehrere Minuten gerührt bis sich eine dickflüssige Dispersion entwickelte. Anschließend wurde das Gemisch zur Wasserdampfdestillation für 6 - 7 h im Ölbad bei 120 - 125 °C erhitzt. Das Destillat wurde in einem Scheidetrichter aufgefangen, wobei sich das ätherische Öl von der wässrigen Phase trennte (Abbildung 11). Bei einigen Weihrauchharzsorten musste der Vorgang aufgrund von starker Schaumentwicklung mit ungemahlenem Weihrauchharz wiederholt werden. Nach der Wasserdampfdestillation wurde der Rückstand im Destillationskolben wie zuvor beschrieben mit MeOH extrahiert [102].

Abbildung 11: Wasserdampfdestillation von Weihrauchharz. Bei der Wasser- dampfdestillation werden schwerflüchtige Komponenten des ätherischen Öls von Wasserdampf verschleppt. Im Scheidetrichter trennt sich das wasserunlösliche ätherische Öl vom Schleppmittel Wasser. 26

Material und Methoden

2.2.2 Synthese von 11-Keto--boswelliasäure (-KBA) Die Synthese von -KBA (11-Keto--boswelliasäure) erfolgte durch alkalische Esterspaltung von -AKBA und anschließender Aufreinigung mit Hilfe von präparativer HPLC. Zu diesem Zweck wurden 6,99 mg (13,6 µmol) -AKBA in 420 µL 10%ige KOH in MeOH (m/v) gelöst und 25 min unter ständigem Rühren im Wasserbad auf 75 °C erhitzt. Anschließend wurde der pH-Wert durch Zugabe von 420 µL konz. Essigsäure auf pH = 4,5 eingestellt. Durch Hinzufügen von 1000 µL warmen Wassers wurde das Rohprodukt über 30 min bei 4 °C ausgefällt. Das Rohprodukt wurde anschließend dreimalig mit 1000 µL kaltem Wasser gewaschen, in 500 µL Wasser aufgenommen und über Nacht lyophilisiert. Dadurch wurden 5,73 mg (12,2 µmol) -KBA-Rohprodukt erhalten, was einer Ausbeute von 89,7 % (n/n) entspricht [104]. Das Rohprodukt wurde in 1000 µL DMSO gelöst und über semipräparative HPLC repetitiv aufgereinigt. Als Trennsäule diente eine Synergi Hydro-RP Säule (Phenomenex, 4 µm, 80 Å, 250 x 10 mm). Eluent A bestand aus MeOH/H2O (80/20, v/v) und Eluent B aus MeOH, beide angesäuert mit 0,1 % Ameisensäure (v/v). Die Fließgeschwindigkeit betrug 5000 µL/min, das Injektionsvolumen 250 µL. Das verwendete Gradientenprogramm ist in Tabelle 8 dargestellt. Die gesammelten Fraktionen wurden anschließend unter Zugabe von Wasser bei 45 °C im Stickstoffstrom eingeengt und über Nacht lyophilisiert. Das Endprodukt, 3,94 mg -KBA, lag anschließend in weißer, kristalliner Form vor. Die Gesamtausbeute betrug 61,8 % (n/n). Die Reinheitskontrolle des Endprodukts mit Hilfe von HPLC-DAD (210, 254 und 280 nm) ergab eine Reinheit > 99 % [104].

Tabelle 8: Elutionsgradient der semipräparativen Aufreinigung von -KBA. t [min] Eluent A [%] Eluent B [%] 0,0 30 70 15,0 10 90 25,0 10 90 25,5 30 70 30,0 30 70

2.2.3 HPLC-MS/MS: Simultane Quantifizierung von acht Boswellia- und Lupeolsäuren Um eine selektive, genaue und hochempfindliche Quantifizierung von acht verschiedenen pentazyklischen Triterpensäuren zu gewährleisten, wurde eine analytische Methode unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) entwickelt und validiert [102]. Die Analysen wurden mit Hilfe einer Agilent 1260 Infinity HPLC gekoppelt mit einem AB API 2000 Triple- Quadrupol-Massenspektrometer mit Elektrospray-Ionisation (ESI) durchgeführt. Die chromatographische Trennung erfolgte unter Verwendung einer analytischen Umkehrphasen-Trennsäule (Dr. Maisch ReproSil-Pur Basic-C18 HD, 3 µm, 125 x 3 mm) und zusätzlicher Vorsäule (Dr. Maisch ReproSil Universal RP, 5 µm, 10 x 4 mm). Die Säulen

Material und Methoden

wurden konstant auf 28 °C temperiert. Eluent A bestand aus MeOH/H2O (80/20, v/v) mit 0,2 % Essigsäure (v/v) und Eluent B aus MeOH mit 0,2 % Essigsäure (v/v). Die Fließgeschwindigkeit betrug 600 µL/min und das Injektionsvolumen 20 µL. Der Elutionsgradient ist in Tabelle 9 dargestellt.

Tabelle 9: Elutionsgradient der C18-HPLC-Methode. t [min] Eluent A [%] Eluent B [%] 0,0 60 40 15,0 10 90 25,0 10 90 25,5 60 40 30,0 60 40

Um eine selektive und empfindliche Quantifizierung zu ermöglichen, wurde das Massenspektrometer im Tandem-Modus (MS/MS) betrieben und die Analyten im Multiple- reaction-monitoring-Modus (MRM) bzw. Selected-reaction-monitoring-Modus (SRM) quantifiziert. Dazu wurde das intensivste Ion ([M-H]-) als Vorläufer-Ion (precursor ion) ausgewählt und mit Hilfe von kollisionsinduzierter Dissoziation (CID, collision induced dissociation) fragmentiert. Das jeweils intensivste Produkt-Ion (product ion) wurde zur Quantifizierung verwendet. Weitere Produkt-Ionen wurden zur Identifikationsbestätigung genutzt. Bei acetylierten Boswellia- und Lupeolsäuren konnte nur ein Massenübergang beobachtet werden. Die Parameter der MS-Methode sowie die Massenübergänge der Analyten sind in Tabelle 10 und Tabelle 14 aufgelistet.

Tabelle 10: Parameter der massenspektrometrischen Methode. Parameter Wert Justierung hor. [mm] 10 Justierung vert. [mm] 5 Ionisierung negativ Curtain Gas (Cur) [psi] 45 Collision Gas (CAD) [psi] 2 IonSpray Voltage (IS) [V] -4250 Temperature (TEM) [°C] 400 Ion Source Gas 1 (GS1) [psi] 20 Ion Source Gas 2 (GS2) [psi] 70 Declustering Potential (DP) [V] -65 Focusing Potential (FP) [V] -140 Entrance Potential (EP) [V] -11 Collision Energy (CE) [V] -40 Collision Cell Exit Potential (CXP) [V] -15 Dwell time [msec] 250

Material und Methoden

Die entwickelte Methode wurde hinsichtlich Linearität, Präzision, Richtigkeit, Wiederfindung, Bestimmungsgrenze (LOQ, limit of quantification) und Nachweisgrenze (LOD, limit of detection) validiert [102]. Als Grundlage der Validierung diente die Normierung gem. DIN 32645 [105]. Um LOD und LOQ zu ermitteln, wurden Referenzstandards zwischen 10 - 1000 ng/mL (8 Levels) analysiert (jeweils in Triplikaten) und mit der Validierungs-Software Valoo 2.10 (Applica, Bremen, Deutschland) ausgewertet. Zur Bestimmung der Richtigkeit und Wiederfindung wurde das Verfahren der Standardaddition angewandt. Dazu wurden drei Weihrauchharzextrakte (Probe # 2, 12 und 22) jeweils mit drei unterschiedlichen Konzentrationen (100 ng/mL, 200 ng/mL und 300 ng/mL) an Standards gespickt und in Triplikaten analysiert. Die Wiederhol- und Vergleichspräzision wurde ermittelt indem Standards in drei verschiedenen Konzentrationen sechsmal pro Tag an vier unterschiedlichen Tagen analysiert wurden. Die ermittelten Verfahrenskennzahlen sind in Tabelle 15 und 16 aufgelistet.

2.2.4 HPLC-MS/MS: Chromatographische Trennung der Konstitutionsisomere von KBA und AKBA Die Analysen zur Quantifizierung der Konstitutionsisomere von KBA (-KBA und -KBA) und AKBA (-AKBA und -AKBA) wurden mit Hilfe der selben Geräte und Detektionsparameter wie in Kapitel 2.2.3 beschrieben durchgeführt. Zur chromatographischen Trennung wurde eine Säule mit Pentafluorphenyl-Modifikationen (PFP) von Dr. Maisch (Fluorsil 100 PFP, 3 µm, 100 x 3 mm) sowie eine C18-Vorsäule (Dr. Maisch ReproSil Universal RP, 5 µm, 10 x 4 mm) verwendet. Eluent A bestand aus MeOH/ H2O (60/40, v/v) und Eluent B aus MeOH, beide mit 0,2 % Essigsäure (v/v) angesäuert. Die Säulen wurden konstant auf 28 °C temperiert und das Injektionsvolumen betrug 20 µL. Zur Ermittlung der optimalen Trennparameter wurde ein zentral zusammengesetzter statistischer Versuchsplan (DoE, design of experiment) mit drei Faktoren/Variablen durchgeführt (siehe Kapitel 3.3.3) [106]. Auf Grundlage dieses Versuchsplans wurde eine optimale Fließgeschwindigkeit von 690 µL/min ermittelt sowie das in Tabelle 11 dargestellte Elutionsprogramm.

Tabelle 11: Elutionsgradient der PFP-HPLC-Methode. t [min] Eluent A [%] Eluent B [%] 0,0 92 8 44,5 38 62 45,0 5 95 54,5 5 95 55,0 92 8 60,0 92 8

Material und Methoden

2.2.5 Gaschromatographische Untersuchung der ätherischen Öle Die gaschromatographischen Analysen (GC) wurden vom Laboratoire PhytoChemia (Saguenay, Quebec, Kanada) durchgeführt. Die Substanzidentifikation erfolgte mittels Vergleich der Retentionsindizes und Datenbankabgleich. Zusätzlich wurden die Substanzen durch Abgleich der Massenspektren mit staatlichen Datenbanken (NIST14), internen Datenbanken sowie Fachliteratur identifiziert [107, 108]. Einzelheiten bezüglich der verwendeten Geräte, Säulen, Trägergas und Temperaturprogramm sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: Verwendetet GC-Instrumente und Methodenparameter. GC-FID GC-MS Gerät Agilent 7890A Agilent 7890B/5977B Säule DB-5 & DB-Wax HP-5MS 10 m x 0,10 mm x 0,10 µm 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm

Trägergas H2 He Temp.-Programm 35 °C für 1 min 40 °C für 2 min 9 °C/min bis 260 °C 3 °C/min bis 220 °C 260 °C für 10 min 220 °C für 2 min

2.2.6 Kernspinresonanzspektroskopie von -KBA Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR, nuclear magnetic resonance) wurde dankenswerterweise vom Max-Planck-Institut (Institute for Chemical Ecology) in Jena durchgeführt. Die Spektren wurden mit einem 500 MHz Bruker Avance III NMR- Spektrometer mit CryoPlatform und 5 mm TCI Cryo-Probenkopf (Bruker Biospin; Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen. Spektrometerkontrolle und Datenprozessierung erfolgte mittels Bruker Topspin Ver. 3.6.1.

2.2.7 Untersuchung der Zytokinausschüttung Der Einfluss von Weihrauchharzpräparaten auf die Zytokinausschüttung wurde an humanem Vollblut untersucht, das aus der Vena mediana cubiti von gesunden, männlichen Probanden entnommen wurde. Die Entnahme und die Untersuchung von Blut sowie daraus gewonnenen Blutzellen wurde durch die Ethikkommission der Universität Ulm (# 177/18) genehmigt. Alle Probanden gaben schriftlich ihre Zustimmung zur Teilnahme an der Studie [103]. Das humane Vollblut wurde mit Weihrauchharzpräparaten ( = 30 µg/mL) behandelt, nach 20 min mit endotoxischen Lipopolysacchariden (LPS, aus Escherichia coli O55:B5,  = 10 ng/mL; Merck GmBH (formal Sigma-Aldrich); Darmstadt, Deutschland) stimuliert und anschließend 18 h inkubiert. Danach wurde das Plasma durch Zentrifugation abgetrennt und die Gehalte an TNF- und IL-10 mit Hilfe von ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay; Duo-Set Human; R&D Systems; Minneapolis, MN, USA) bestimmt [103].

Material und Methoden

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) wurden durch Dichtegradientenzentrifugation (Biocoll; Biochrom GmbH; Berlin, Deutschland) aus venösem Vollblut gesunder, männlicher Probanden gemäß den Herstellerangaben isoliert und anschließend in 96-Well-Platten (4 x 105 Zellen in 200 mL RPMI 1640 mit 1 % FCS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin) überführt. PBMC wurden mit Weihrauchharzpräparaten ( = 10 µg/mL) oder Boswellia- und Lupeolsäuren ( = 3 µg/mL) 20 min behandelt, mit endotoxischem LPS ( = 10 ng/mL) stimuliert und 18 h bei 37 °C und

5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und die Überstände durchflusszytometrisch mit Hilfe eines CBA (cytrometric bead assay; Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ, USA) hinsichtlich Gehalten an IL-12p70, TNF-, IL-10, IL-6, IL-1 und IL-8 untersucht [103].

2.2.8 Zellvitalitäts- und Proliferationsanalyse Jegliche Stammlösungen wurden in DMSO vorbereitet und anschließend in Zellmedium mit 1 % FCS (Fetales Kälberserum, fetal calf serum; Gibco, Thermo Fisher Scientific; Carlsbad, CA, USA) verdünnt. Die Verdünnungen wurden so gewählt, dass die DMSO- Konzentration im Medium maximal 0,5 % (v/v) betrug. Der Effekt von Weihrauchharzextrakten und Weihrauchharzpräparaten auf die Zellvitalität wurde an den dreifach negativen Mammakarzinomzelllinien MDA-MB-231, MDA-MB-453 und CAL-51, sowie PBMC als nicht-kanzerogener Vergleichsgruppe untersucht [102, 103]. MDA-MB-231-Zellen wurden in DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium; Thermo Fisher Scientific) mit 4,5 g/L Glucose kultiviert, welches mit 10 % FCS, 0,1 mM MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin (beide von Gibco, Thermo Fisher Scientific) angereichert wurde. CAL-51-Zellen wurden in DMEM mit 4,5 g/L Glucose kultiviert, welches mit 10 % FCS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin angereichert wurde. MDA-MB-453-Zellen wurden in Leibovitz´s L15 Medium kultiviert, welches mit 10 % FCS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin angereichert wurde. Sobald die Zellen 80 % Konfluenz erreicht hatten, wurden sie subkultiviert. Für die Experimente wurden 3.000 Zellen (MDA-MB-231, MDA-MB-453 und CAL-51) oder 300.000 PBMC je well in 96-Well-Platten ausgesät. PBMC wurden direkt nach dem Aussähen, MDA-MB-231- und CAL-51-Zellen 24 h nach dem Aussäen, MDA- MB-453-Zellen 72 h nach dem Aussäen behandelt. Anschließung wurden die Zellen 72 h inkubiert [102, 103]. Die Aktivität der Zellatmung wurde nach Zugabe von 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl)-5-((phenylamino)carbonyl)-2H-tetrazoliumhydroxid (XTT; AppliChem GmbH, Merck, Darmstadt) als Standard-Surrogatparameter für die Zellvitalität analysiert. Hier wurde die Absorption des orangenen Formazan-Farbstoffes gemessen, der aufgrund der Reduktion des Tetrazolium-Salzes durch die mitochondriale Dehydrogenase lebender Zellen entsteht. Die Messung erfolgte mit Hilfe eines Infinite M1000 Pro Tecan Platten-Lesegeräts (Tecan; Männedorf, Schweiz) bei λ = 450 nm mit Referenzfilter bei λ = 630 nm. Die Auswertung wurde durch Abzug des Blindwertes und Normalisierung durch die Kontrolle ausgeführt [102, 103].

Material und Methoden

2.2.9 Xenotransplantation humaner Mammakarzinomzellen Zur Untersuchung des Antitumoreffekts von Weihrauchharzpräparaten und Boswelliasäuren in vivo wurden humane, dreifach negative Mammakarzinomzellen (MDA- MB-231) auf die Chorioallantoismembran (CAM) von Hühnereiern xenotransplantiert [29, 109]. Zu diesem Zweck wurden befruchtete Hühnereier sieben Tage nach der Befruchtung verwendet. Zunächst wurden 0,7 x 106 MDA-MB-231-Zellen in Medium/Matrigel (1:1) (BD GmbH; Heidelberg, Deutschland) auf der CAM ausgesät. Beginnend nach 24 h wurden die Zellen täglich über drei Tage, topisch mit 20 µL der jeweiligen Probe (in 0,9 % NaCl) behandelt. Probe FN16 wurde in den Konzentrationen 5 und 10 µg/mL verabreicht, β-AKBA und -ABA in einer Konzentration von 5 µg/mL (10 µM) und Doxorubicin als Positivkontrolle in einer Konzentration von 1 µM. Als Negativkontrolle diente 0,5 % DMSO. Am vierten Tag wurden die Tumore zur immunhistochemischen Untersuchung asserviert, fotografiert und vermessen, anschließend fixiert und in Paraffin eingebettet. Das Tumorvolumen [mm3] wurde mit Hilfe der Formel Länge [mm] x Breite2 [mm2] x /6 berechnet. Zur immunhistochemischen Untersuchung wurden 5 µm dicke Schnitte des Tumors mit einem Antikörper gefärbt, der spezifisch mit dem nukleären Proliferationsmarker Ki-67 (Roche; Basel, Schweiz) reagiert. Zur Analyse der Apoptose wurden Brüche des DNS-Strangs mit Hilfe der TUNEL-Methode (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling; Roche; Basel, Schweiz) gefärbt [29, 103, 109].

2.2.10 Statistik Alle Experimente wurden mindestens in dreifacher Ausführung durchgeführt (n ≥ 3). Die Ergebnisse sind als arithmetischer Mittlerwert ± Standardabweichung (mean ± SD) oder arithmetischer Mittlerwert ± Standardfehler des Mittelwerts (mean ± SEM) angegeben. Statistische Auswertungen wurden mit Hilfe der Software Minitab 18 und SigmaPlot 14.0 durchgeführt. Die Daten wurden mit dem Anderson-Darlings-Test auf Normalverteilung und dem Levene-Test auf Varianzhomogenität getestet. Normalverteilte Daten wurden mit einer einfachen Varianzanalyse (one-way ANOVA) und post hoc mit dem Dunnett-Test untersucht. Nicht-normalverteilte Daten wurden vorab mit Hilfe einer Box-Cox- Transformation bearbeitet oder direkt über einem Kruskal-Wallis-Test analysiert. Zum Vergleich von zwei Verteilungen wurde der Student-t-Test für normalverteilte Daten und der Mann-Whitney-U-Test für nicht-normalverteilte Daten angewandt. Um zu überprüfen, ob der Median einer Verteilung innerhalb eines gewissen Konfidenzintervall liegt, wurde der Wilcoxon-Test verwendet. Korrelationen wurden mit Hilfe der Spearman-Korrelation (Rangkorrelation) für nicht-normalverteilte Daten untersucht. Signifikanzwerte von 0,001 ≤ p < 0,05 wurden als signifikant und p < 0,001 als hochsignifikant angesehen. Die hierarchische agglomerative Clusteranalyse wurde mit vollständiger Kopplung und euklidischen Abständen oder mit Ward-Kopplung und quadrierten euklidischen Abständen durchgeführt. Als Grundlage der Hauptkomponentenanalyse (PCA, principal component analysis) diente die Kovarianzmatrix der Rohdaten [102, 103].

Ergebnisse

3. Ergebnisse 3.1 Extraktion und Destillation von Weihrauchharzen Das Ziel dieses Projektabschnittes war es eine erschöpfende und gleichzeitig schonende Methode zu entwickeln, um potentiell wirksame Inhaltsstoffe des Weihrauchharzes zu extrahieren, anzureichern und etwaige Verunreinigung abzutrennen.

3.1.1 Methanolische Extraktion von Weihrauchharzen Ausgehend von früheren Arbeiten von Büchele et al. wurde Methanol (MeOH) als Lösungsmittel zur Extraktionen verwendet. Die Extrakte wurden durch schonende, repetitive Extraktion bei Raumtemperatur gewonnen. Zur Überprüfung, wie viele Extraktionszyklen notwendig sind, um eine erschöpfende Extraktion zu gewährleisten, wurden drei verschiedene Harze sechsmal repetitiv extrahiert (jeweils in Triplikaten). Im Vergleich zu der Extraktionsausbeute nach sechs Extraktionszyklen zeigte sich, dass bereits eine dreimalige Extraktion eine relative Extraktionsausbeute von 99,6 % gewährleistete (Abbildung 12b). Zudem bewies die Quantifizierung der Triterpensäuren mit Hilfe von HPLC-MS/MS, dass innerhalb der ersten drei Extraktionszyklen 99,95 % der enthaltenen Boswellia- und Lupeolsäuren extrahiert werden konnten (Abbildung 12c). Aufgrund dieser Resultate wurde eine repetitive Extraktion mit drei Extraktionszyklen als erschöpfend angesehen und für das weitere Verfahren angewendet [102]. Insgesamt wurden 41 verschiedene Weihrauchharzproben neun unterschiedlicher Boswellia-Spezies extrahiert. Die erhaltenen Extrakte lagen nach Entfernung des Lösungsmittels in kristalliner Form vor. Die Färbungen der Extrakte variierten von schneeweiß bei Extrakten der Spezies B. sacra, über gelb bei B. frereana bis hin zu bräunlich bei B. neglecta (Abbildung 12a). Die durchschnittliche Extraktionsausbeute betrug 65,4 % (w/w). Extrakte, die aus dem Weihrauchharz der Spezies B. frereana gewonnen wurden, wiesen eine signifikant überdurchschnittlich hohe Extraktionsausbeute von 88,8 % (w/w) auf (Tabelle 13 und Abbildung 12d). Auch im Vergleich zu Extrakten der Spezies B. sacra, B. serrata, B. carterii und B. neglecta, war die Ausbeute von B. frereana signifikant höher [102].

Tabelle 13: Durchschnittliche Extraktionsausbeuten (w/w) der methanolischen Extraktion von Weihrauchharzen. Die Ausbeuten sind arithmetische Mittelwerte mit Standardabweichungen (SD). n: Probenanzahl. Spezies Ausbeute [%] SD [%] n B. sacra 59,6 5,0 11 B. dalzielli 71,5 2,7 3 B. papyrifera 67,4 2,3 3 B. serrata 60,2 3,6 7 B. carterii 61,0 7,4 5 B. neglecta 69,4 17,1 7 B. rivae 64,6 / 1 B. frereana 88,8 1,8 3 B. occulta 66,3 / 1 Gesamt 65,4 11,0 41

Ergebnisse

Abbildung 12: Methanolische Extraktion von Weihrauchharzen. (a) Links: Drei Boswellia-Bäume unterschiedlicher Spezies. B. neglecta (I), B. sacra (II) und B. frereana (III). Bildmaterial mit freundlicher Genehmigung von Herrn Georg Huber (https://weihrauch-blog.de/bilder/, Zugriff am 29.05.2019). Mitte: Weihrauchharz der drei Spezies. Rechts: Erhaltene Extrakte nach Extraktion mit MeOH. (b) Durchschnittliche relative Extraktionsausbeute bei der Extraktion von drei verschiedenen Weihrauchharzproben (B. sacra: Probe #1; B. serrata: Probe #18; B. carterii: Probe #29) mit unterschiedlichen Anzahlen an Extraktionszyklen. Nach drei Extraktionszyklen wurde bereits eine relative Extraktionsausbeute von 99,6 % erreicht. (c) Vergleich der Gesamtgehalte an Boswellia- und Lupeolsäuren (BA/LA) nach dem 1.-3. bzw. 4.-6. Extraktionszyklus. Innerhalb der ersten drei Extraktionszyklen konnten 99,95 % der enthaltenen Boswellia- und Lupeolsäuren extrahiert werden. (d) Vergleich der Extraktionsausbeuten von Weihrauchharzen unterschiedlicher Boswellia-Spezies. Die Extraktionsausbeute von Weihrauchharz der Spezies B. frereana war signifikant überdurchschnittlich. Alle Daten sind arithmetische Mittelwerte ± Standardabweichung (SD). Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit Hilfe eines Kruskal-Wallis- Tests und anschließendem Mann-Whitney-U-Tests (* p < 0,05) untersucht. Abbildung

Ergebnisse

adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], S. 3-4, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/). 3.1.2 Säurefraktion und Neutralfraktion Das methanolische Extrakt, das aus dem Harz der Spezies B. sacra (Superior Hojari, Probe # 1) gewonnen wurde, konnte durch Flüssig-Flüssig-Extraktion in weitere Fraktionen aufgetrennt werden. Dazu wurden saure Komponenten (u. a. Bowellia- und Lupeolsäuren) durch Fällung mit KOH in einer wässrigen Phase aufkonzentriert und so von den neutralen Komponenten in einer Ethylacetat-Phase abgetrennt. Ausgehend vom methanolischem Gesamtextrakt wurden nach der Fraktionierung 26,0 % (w/w) Säurefraktion und 74,0 % (w/w) Neutralfraktion erhalten [102]. Die erfolgreiche Anreicherung von Boswellia- und Lupeolsäuren in der Säurefraktion wurden anhand HPLC-MS/MS-Analysen bestätigt (s. Kapitel 3.2.4).

3.1.3 Ätherische Öle Durch das Verfahren der Wasserdampfdestillation wurde das ätherische Öl des Weihrauchharzes abgetrennt. Mit Hilfe von Wasser als Schleppmittel konnten auf diese Weise schwerflüchtige Komponenten schonend abdestilliert werden. Die erschöpfende Wasserdampfdestillation von Weihrauchharz der Spezies B. sacra (Probe # 1) ergab einen Anteil von 9,7 % (w/w) an ätherischem Öl. Der Rückstand, der nach der Wasserdampfdestillation im Destillationskolben zurückblieb, wurde anschließend wie gewohnt mit MeOH extrahiert. Interessanterweise war die Ausbeute der Extraktion des Destillationsrückstands mit 31,7 % deutlich geringer als die Extraktion ohne vorheriger Wasserdampfdestillation (67,1 %). Auch wenn die Ausbeute durch den Anteil des ätherischen Öls korrigiert wird, weicht sie immer noch deutlich von der Ausbeute des Gesamtextraktes ab. Dies lässt darauf schließen, dass ein Teil der Inhaltsstoffe durch hohe Temperaturen während der Wasserdampfdestillation zerstört wurde [102]. Die erschöpfende Wasserdampfdestillation weiterer Harze lieferte Ausbeuten an ätherischen Ölen von 1,5 % (w/w) für B. serrata (Probe # 18), 5,1 % für B. carterii (Probe # 25), 5,9 % für B. frereana (Probe # 38), 9,0 % für B. dalzielli (Probe # 12), 1,2 % für B. papyrifera (Probe # 15), 3,3 % für B. neglecta (Probe # 35) und 3,3 % für B. rivae (Probe # 37) [104].

3.2 Quantifizierung von Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzproben mittels HPLC-MS/MS Die Entwicklung einer neuartigen Methode zur selektiven und zugleich simultanen Analyse von Triterpenoiden ermöglichte die präzise Quantifizierung von Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzextrakten und Weihrauchharzpräparaten. Die auf diese Weise gewonnenen Informationen über die chemische Zusammensetzung konnten genutzt werden, um sowohl unterschiedliche Proben zu vergleichen als auch im Zusammenhang mit biomedizinischen Ergebnissen zu betrachten.

Ergebnisse

3.2.1 Entwicklung und Validierung einer Methode zur simultanen Quantifizierung von acht Boswellia- und Lupeolsäuren Zur chemischen Charakterisierung von Weihrauchharzextrakten und -präparaten wurden acht Boswellia- und Lupeolsäuren untersucht: -Boswelliasäure (-BA), 3-O- Acetyl--boswelliasäure (-ABA), -Boswelliasäure (-BA), 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA), 11-Keto-β-boswelliasäure (-KBA), 3-O-Acetyl-11-keto-β-boswelliasäure (-AKBA), Lupeolsäure (LA) und Acetyl-lupeolsäure (ALA). Diese Substanzen gehören zur Klasse der pentazyklischen Triterpensäuren (PTA, pentacyclic triterpenic acids) und wurden in vorangegangen Studien als abundante und pharmakologisch interessante Bestandteile des Weihrauchharzes identifiziert. Da mit Hilfe der überwiegend in der Analytik verwendeten und auch hier genutzten C18-Trennsäulen keine Differenzierung zwischen - und -Isomeren von Keto- boswelliasäuren möglich ist, werden diese im Folgenden vereinfacht als KBA bzw. AKBA bezeichnet. Gehaltangaben von KBA und AKBA beziehen sich dement-sprechend auf die Summe aus -KBA und -KBA, bzw. -AKBA und -AKBA. Ausgehend von vorangegangenen Arbeiten wurde eine hoch sensitive, selektive und genaue Methode entwickelt um die Gehalte der einzelnen Substanzen in komplexen Matrizes zu quantifizieren. Die chromatographische Trennung erfolgte über Retention auf einer C18- Umkehrphasen-Trennsäule und Elution mit Hilfe einer Methanol-Wasser-Gradienten. Damit die Analyten in protonierter Form vorliegen, wurden die Eluenten mit Essigsäure auf pH = 2 eingestellt. Die Detektion der Analyten erfolgte über online-gekoppelte Massenspektrometrie im Multiple-reaction-monitoring-Modus (MRM), bzw. Selected- reaction-monitoring-Modus (SRM). Dazu wurden die Molekül-Ionen ([M-H]-) als Vorläufer-Ionen (precursor ions) ausgewählt, durch Kollision mit Stickstoffmolekülen fragmentiert und schließend die intensivsten Produkt-Ionen (product ions) quantifiziert (Abbildung 13 und Tabelle 14). Die Quantifizierung erfolgte über das Verfahren der externen Kalibrierung. Zusätzlich wurde Maslinsäure (MA) als interner Standard genutzt, um eine ausreichende Wiederfindung in komplexen Matrizes zu gewährleisten. Das natürliche Vorkommen von Maslinsäure wurde in Weihrauchharzen acht verschiedener Spezies überprüft (B. sacra, B. serrata, B. carterii, B. frereana, B. dalzielli, B. papyrifera, B. rivae und B. neglecta). In allen Proben lag der Maslinsäure-Gehalt unterhalb der Nachweiß- und Bestimmungsgrenzen. Durch die Abwesenheit von MA in Weihrauchharzen und die sehr ähnliche chemischen Struktur im Vergleich zu den Zielanalyten ist MA als interner Standard geeignet [102]. Die entwickelte HPLC-MS/MS-Methode wurde wie in Kapitel 2.2.3 beschrieben gemäß DIN 32645 hinsichtlich Linearität, Präzision, Genauigkeit, Nachweiß- und Bestimmungsgrenze validiert. Die Kennzahlen der Validierung sind in Tabelle 15 und 16 dargestellt. Anschließend konnten mit Hilfe der validierten Methode die Gehalte und die individuellen Zusammensetzungen an Boswellia- und Lupeolsäuren der 41 hergestellten Weihrauchharzextrakte untersucht werden (Tabelle 17). Die Gesamtgehalte an Boswellia- und Lupeolsäuren variierten dabei je nach Extrakt zwischen 0,0 % und 38,0 % (w/w) [102].

Ergebnisse

Abbildung 13: HPLC-DAD-MS/MS-Chromatogramme. (a) MRM-Chromatogramm der acht untersuchten Boswellia- und Lupeolsäuren und des internen Standards als Referenzstandards. (b) MRM-Chromatogramm und (c) DAD-Chromatogramm (210 nm, 254 nm und 280 nm) einer Realprobe (B. sacra, Superior Hojari, Probe # 1). Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], S. 5, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Tabelle 14: Massenübergänge und Retentionszeiten der Analyten und des internen Standards.

CID

Vorläufer-Ion Produkt-Ion Substanz t [min] [m/z] [m/z] R KBA 469,4 391,4 4,6 LA 455,4 437,2 10,1 -BA 455,4 437,2 11,7 -BA 455,4 437,2 12,5 AKBA 511,4 59,0 6,7 ALA 497,2 59,0 14,2 -ABA 497,2 59,0 15,9 -ABA 497,2 59,0 16,8 MA 471,4 423,0 3,8 MRM

Ergebnisse

Tabelle 15: Validierungskennzahlen der HPLC-MS/MS-Methode: Kalibrierfunktionen, Nachweis- und Bestimmungsgrenzen. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], S. 6, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Regressionsgleichung 풚 풄 LOD LOQ Substanz 풂⁄ = 풂 × ( 풂⁄ ) + 풃 풚풊 풄풊 Vx0 [ng/mg] [ng/mg] (a) (b) R2 [%] KBA 8,5009 0,0207 0,9992 4,71 0,7 2,6 LA 2,0181 0,0437 0,9984 9,40 1,9 7,2 -BA 2,9393 0,0344 0,9997 4,27 1,0 6,0 -BA 2,5022 0,0246 0,9997 4,20 1,6 5,9 AKBA 34,9050 0,1357 0,9998 3,55 0,4 1,5 ALA 20,5466 0,3225 0,9989 7,76 1,6 6,0 -ABA 36,4455 0,4111 0,9998 3,55 0,9 3,5 -ABA 37,0869 0,4314 0,9999 2,39 0,9 3,4 Regressionsgleichungen der externen Kalibrierung mit internem Standard. ya: Peakfläche

[counts] der entsprechenden Substanz. yi: Peakfläche [counts] des internen Standards. ca:

Konzentration [ng/mL] der entsprechenden Substanz. ci: Konzentration [ng/mL] des internen Standards. a: Steigung. b: Achsenabschnitt. Vx0: Verfahrensstandardabweichung. Nachweisgrenze (LOD) und Bestimmungsgrenze (LOQ) gemäß DIN 32645 mit  (Probe) = 10 mg/mL.

Tabelle 16: Validierungskennzahlen der HPLC-MS/MS-Methode: Präzision und Wiederfindung. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], S. 6, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Wiederhol- u. Vergleichspräzision (RSD [%]) Wieder- Substanz niedrig mittel hoch findung [%] WP VP WP VP WP VP Mean SD KBA 7,6 6,8 6,4 2,0 7,0 4,5 97,7 4,9 LA 9,3 6,8 5,8 5,1 9,8 4,8 99,8 3,6 -BA 9,9 7,4 7,2 7,4 7,7 3,8 91,2 4,6 -BA 6,4 6,3 5,9 4,7 7,1 3,9 95,1 1,9 AKBA 9,4 7,9 5,8 6,4 7,8 2,3 94,7 5,0 ALA 7,6 6,4 5,0 7,4 6,3 2,3 97,7 2,5 -ABA 6,9 6,0 5,4 6,4 7,5 2,1 98,7 1,5 -ABA 5,7 6,0 5,4 5,7 6,1 2,1 97,7 3,2 Wiederholpräzision (WP): n = 6. Vergleichspräzision (VP): n = 4. Präzisionsbestimmung mit drei unterschiedlichen Konzentrationen: niedrig (75 ng/mL), mittel (200 ng/mL) und hoch (500 ng/mL). Bestimmung der Wiederfindung nach dem Verfahren der Standardaddition (3 Realproben, jeweils auf drei Levels gespickt und in Triplikaten analysiert).

Ergebnisse

Tabelle 17: Quantifizierung von Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzextrakten mit Hilfe von HPLC-MS/MS. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], Supplementary material, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Extraktions- Konzentrationen an Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzextrakten Probe # Spezies ausbeute [%] deacetylierte Substanzen [µg/mg] acetylierte Substanzen [µg/mg] Σ [%] (w/w ) KBA LA -BA -BA AKBA ALA -ABA -ABA 1 B. sacra 67,1 4,048 7,123 15,400 40,600 62,325 29,500 43,400 72,425 27,5 2 B. sacra 64,2 4,490 7,420 11,573 31,967 46,233 28,475 27,400 48,525 20,6 3 B. sacra 63,1 2,010 4,223 6,817 21,575 56,567 27,825 34,125 59,150 21,2 4 B. sacra 57,7 1,907 10,063 11,150 36,600 57,000 51,550 43,750 85,800 29,8 5 B. sacra 62,8 3,443 12,400 21,150 46,800 57,150 50,650 61,300 99,175 35,2 6 B. sacra 49,7 4,615 6,550 15,425 49,900 43,800 20,525 34,075 62,825 23,8 7 B. sacra 53,6 3,017 7,590 14,250 41,733 69,933 48,700 50,733 71,867 30,8 8 B. sacra 61,1 3,435 6,863 10,967 29,733 54,533 41,633 31,000 53,000 23,1 9 B. sacra 60,6 1,643 6,523 9,640 31,550 43,033 40,125 38,150 73,375 24,4 10 B. sacra 59,3 1,833 4,977 7,845 31,400 36,733 22,000 31,700 67,300 20,4 11 B. sacra 56,0 2,058 5,397 8,255 24,625 53,633 42,967 42,250 65,550 24,5 Mean 59,6 2,954 7,193 12,043 35,135 52,813 36,723 39,808 68,999 25,6 SD 5,0 1,121 2,313 4,216 8,888 9,573 11,447 9,904 14,342 4,7 12 B. dalzielli 73,8 15,800 6,980 17,950 23,550 72,375 19,125 37,050 42,600 23,5 13 B. dalzielli 68,5 14,400 13,633 23,700 29,600 105,450 31,575 57,325 55,450 33,1 14 B. dalzielli 72,2 19,200 7,310 22,333 23,267 94,667 18,633 41,167 38,950 26,6 Mean 71,5 16,467 9,308 21,328 25,472 90,831 23,111 45,181 45,667 27,7 SD 2,7 2,468 3,750 3,004 3,578 16,868 7,334 10,717 8,667 4,9 15 B. papyrifera 65,7 6,675 5,617 16,625 36,000 66,900 16,100 32,550 45,750 22,6 16 B. papyrifera 66,4 5,130 3,577 8,357 24,750 41,933 9,927 21,475 29,927 14,5 17 B. papyrifera 70,0 4,550 4,330 14,750 45,350 24,000 13,100 28,800 66,400 20,1 Mean 67,4 5,452 4,508 13,244 35,367 44,278 13,042 27,608 47,359 19,1 SD 2,3 1,098 1,032 4,335 10,315 21,546 3,087 5,633 18,290 4,2 18 B. serrata 59,1 9,025 8,380 27,725 84,167 19,175 10,253 19,800 61,725 24,0 19 B. serrata 62,0 35,933 16,375 40,800 80,200 30,133 10,610 18,867 49,267 28,2 20 B. serrata 63,2 4,893 6,807 24,633 75,867 21,600 12,267 25,600 66,300 23,8 21 B. serrata 57,1 10,150 9,720 23,150 94,650 15,000 6,775 13,000 40,550 21,3 22 B. serrata 58,4 16,775 9,570 26,275 73,067 22,700 8,680 17,325 50,275 22,5 23 B. serrata 65,8 9,510 3,790 13,567 43,000 14,067 5,230 9,397 30,033 12,9 24 B. serrata 55,6 7,273 6,410 21,867 68,833 14,500 8,330 15,133 42,467 18,5 Mean 60,2 13,366 8,722 25,431 74,255 19,596 8,878 17,017 48,660 21,6 SD 3,6 10,598 3,953 8,180 16,124 5,810 2,396 5,207 12,489 4,9 25 B. carterii 61,1 0,131 17,750 19,350 62,250 0,168 38,433 31,818 75,925 24,6 26 B. carterii 66,7 0,024 22,733 23,233 85,900 0,089 70,550 50,600 126,750 38,0 27 B. carterii 49,4 0,289 31,200 58,450 135,000 0,003 0,148 0,028 0,263 22,5 28 B. carterii 59,8 1,447 33,100 61,033 140,333 0,010 0,071 0,055 0,224 23,6 29 B. carterii 68,1 9,483 5,637 30,367 26,667 72,500 22,267 25,633 37,433 23,0 Mean 61,0 2,275 22,084 38,487 90,030 14,554 26,294 21,627 48,119 26,3 SD 7,4 4,070 11,115 19,822 48,364 32,393 29,553 21,744 53,978 6,6 30 B. neglecta 76,4 1,890 53,825 35,075 106,000 0,057 4,155 0,983 4,780 20,7 31 B. neglecta 84,4 1,853 42,433 31,667 89,800 0,170 12,825 3,100 15,500 19,7 32 B. neglecta 80,5 2,150 48,067 37,033 106,667 0,060 3,747 0,763 5,310 20,4 33 B. neglecta 84,5 0,751 37,067 29,340 87,100 0,096 7,670 2,130 8,447 17,3 34 B. neglecta 49,4 0,486 15,600 14,600 41,700 0,050 4,040 0,991 5,287 8,3 35 B. neglecta 42,3 0,147 1,975 4,535 7,585 0,042 0,983 0,192 1,875 1,7 36 B. neglecta 68,3 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 0,003 < LOQ < LOQ 0,006 0,0 Mean 69,4 1,040 28,424 21,750 62,693 0,068 4,774 1,166 5,886 12,6 SD 17,1 0,902 22,263 15,208 45,731 0,052 4,327 1,095 5,026 9,1 37 B. rivae 64,6 0,058 0,075 0,080 0,475 0,086 0,154 0,087 0,300 0,1 38 B. frereana 90,6 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 0,0 39 B. frereana 87,0 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 0,0 40 B. frereana 88,8 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 0,0 Mean 88,8 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 0,0 SD 1,8 0,0 B.o. B. occulta 66,3 4,040 6,620 10,550 36,000 50,775 23,225 24,850 45,575 20,2

Ergebnisse

3.2.2 Unterschiede in der Boswellia-und Lupeolsäure-Zusammensetzung in Weihrauchharzen verschiedener Boswellia-Spezies Um die individuellen Zusammensetzungen an Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzen verschiedener Spezies zu vergleichen, wurden die Analyseergebnisse der Weihrauchharzextrakte mit Hilfe der entsprechenden Extraktionsausbeuten korrigiert. Auf diese Weise konnten die Konzentrationen der einzelnen Komponenten in Bezug auf die ursprüngliche Weihrauchprobe ermittelt werden (Tabelle 18). Der Gesamtgehalt an Boswellia- und Lupeolsäure betrug im arithmetischen Gesamtmittel 12,6 % (w/w), d. h. 126 µg je mg Weihrauchharz (SD = 64 µg/mg, n = 41). Die Werte variierten zwischen 0,0 % bei Proben der Spezies B. frereana und maximal 25,3 % bei einer Probe der Spezies B. carterii. Die Weihrauchharzproben unterschiedlicher Spezies zeigten nicht nur Abweichungen im Gesamtgehalt der Boswellia-/Lupeolsäuren, sondern wiesen auch bemerkenswerte Unterschiede in der Zusammensetzung der einzelnen Komponenten auf. Bei Proben derselben Spezies hingegen konnten ähnliche Gehalte und Zusammensetzungen beobachtet werden. Weihrauchharzproben der Spezies B. sacra aus dem Oman zeichneten sich durch einen höheren Anteil an acetylierten Boswellia- und Lupeolsäuren (-ABA, -ABA, ALA und AKBA) und einen geringeren Anteil an deacetylierten Komponenten (-BA, -BA, LA und KBA) aus. Im Gegensatz dazu zeigten Weihrauchharzproben der Spezies B. serrata aus Indien einen höheren Anteil an deacetylierten Boswellia-/Lupeolsäuren im Vergleich zu den acetylierten Komponenten. Obwohl die Zusammensetzungen der untersuchten Triterpenoide der Spezies B. sacra und B. serrata gegensätzlich waren, wiesen die Gesamtgehälter interessanterweise eine hohe Ähnlichkeit auf: 15,2 % ± 3,1 % bei B. sacra und 13,0 % ± 3,0 % bei B. serrata (einseitige ANOVA post hoc Tukey-Test: p = 0,984). Die Boswellia-/Lupeolsäuren-Zusammensetzung der Spezies B. papyrifera, die vor allem in Äthiopien, Eritrea und Sudan verbreitet ist, ähnelte der Zusammensetzung der Spezies B. sacra. Ebenso zeigten Weihrauchharzproben der Spezies B. dalzielli, die in West- und Zentralafrika vorkommt, Ähnlichkeiten zu den Ergebnissen von B. sacra. B. dalzielli wies jedoch deutlich höhere Konzentrationen hinsichtlich der pharmakologisch interessanten Keto-Boswelliasäuren KBA und AKBA auf. In Proben der Spezies B. frereana konnten keine Boswellia-/Lupeolsäuren nachgewiesen werden. Im Weihrauchharz der Spezies B. neglecta aus Kenia und B. rivae, das in der Ogaden-Region zwischen Äthiopien und Somalia vorkommt, konnten nur sehr geringe Konzentrationen an Boswellia-/Lupeolsäuren gefunden werden [102].

Ergebnisse

Tabelle 18: Boswellia- und Lupeolsäure-Gehalte in Weihrauchharzen verschiedener Boswellia-Spezies. In Proben derselben Spezies lassen sich ähnliche Muster hinsichtlich der Triterpenoid-Zusammensetzung erkennen. So enthielten z. B. Proben der Spezies B. sacra mehr acetylierte Triterpenoide als deacetylierte. Proben der Spezies B. serrata hingegen mehr deacetylierte Triterpenoide als acetylierte. Aus Gründen der Visualisierung sind Konzentrationen < LOQ als 0,000 µg/mg dargestellt. Rot: hohe Konzentration, grün: niedrige Konzentration. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], S. 8-9, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Konzentrationen an Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzen Probe Herkunfts- Spezies Spezifikation deacetylierte Substanzen [µg/mg] acetylierte Substanzen [µg/mg] # land Σ [%] KBA LA -BA -BA AKBA ALA -ABA -ABA 1 B. sacra Superior Hojari Oman 2,716 4,779 10,333 27,242 41,819 19,794 29,121 48,596 18,4 2 B. sacra Black Hojari Oman 2,834 4,683 7,304 20,174 29,178 17,971 17,292 30,624 13,0 3 B. sacra Royal Hojari Oman 1,221 2,566 4,142 13,110 34,373 16,908 20,736 35,942 12,9 4 B. sacra Royal Hojari Oman 1,101 5,810 6,437 21,131 32,909 29,762 25,259 49,536 17,2 5 B. sacra Red Hojari Oman 2,162 7,787 13,283 29,391 35,891 31,809 38,498 62,284 22,1 6 B. sacra Black Hojari Oman 2,294 3,256 7,668 24,805 21,773 10,203 16,939 31,230 11,8 7 B. sacra Royal Hojari Oman 1,616 4,067 7,635 22,360 37,469 26,093 27,182 38,505 16,5 8 B. sacra Superior Hojari Oman 2,100 4,196 6,705 18,180 33,344 25,456 18,955 32,406 14,1 9 B. sacra Najdi Oman 0,996 3,954 5,843 19,123 26,083 24,321 23,123 44,474 14,8 10 B. sacra Hojari Oman 1,087 2,950 4,651 18,614 21,776 13,042 18,792 39,895 12,1 11 B. sacra Sahli Oman 1,153 3,025 4,626 13,801 30,058 24,080 23,679 36,737 13,7 Mean 1,8 4,3 7,1 20,7 31,3 21,8 23,6 40,9 15,2 SD 0,7 1,5 2,7 5,1 6,3 6,8 6,4 9,6 3,1 12 B. dalzielli Janawhi Burkina Faso 11,663 5,152 13,250 17,384 53,425 14,117 27,349 31,446 17,4 13 B. dalzielli / Nigeria 9,859 9,334 16,226 20,266 72,197 21,618 39,248 37,964 22,7 14 B. dalzielli / Senegal 13,859 5,276 16,121 16,794 68,332 13,450 29,715 28,115 19,2 Mean 11,8 6,6 15,2 18,1 64,7 16,4 32,1 32,5 19,7 SD 2,0 2,4 1,7 1,9 9,9 4,5 6,3 5,0 2,7 15 B. papyrifera 1. Qualität Äthiopien 4,384 3,689 10,920 23,645 43,941 10,575 21,379 30,049 14,9 16 B. papyrifera / Eritrea 3,406 2,375 5,549 16,434 27,844 6,591 14,259 19,871 9,6 17 B. papyrifera / Sudan 3,187 3,033 10,331 31,762 16,809 9,175 20,171 46,505 14,1 Mean 3,7 3,0 8,9 23,9 29,5 8,8 18,6 32,1 12,9 SD 0,6 0,7 2,9 7,7 13,6 2,0 3,8 13,4 2,8 18 B. serrata 1. Qualität Indien 5,330 4,949 16,373 49,706 11,324 6,055 11,693 36,453 14,2 19 B. serrata 1. Qualität Indien 22,290 10,157 25,308 49,748 18,692 6,581 11,703 30,560 17,5 20 B. serrata 1. Qualität Indien 3,091 4,299 15,560 47,921 13,644 7,748 16,170 41,879 15,0 21 B. serrata / Indien 5,793 5,548 13,212 54,020 8,561 3,867 7,420 23,143 12,2 22 B. serrata geschnitten Indien 9,797 5,589 15,345 42,671 13,257 5,069 10,118 29,361 13,1 23 B. serrata gemahlen Indien 6,256 2,493 8,924 28,286 9,253 3,440 6,181 19,756 8,5 24 B. serrata gemahlen Indien 4,047 3,567 12,167 38,301 8,068 4,635 8,421 23,630 10,3 Mean 8,1 5,2 15,3 44,4 11,8 5,3 10,2 29,3 13,0 SD 6,6 2,4 5,1 8,8 3,7 1,5 3,3 7,9 3,0 25 B. carterii 1. Qualität Somalia 0,080 10,850 11,829 38,053 0,103 23,494 19,450 46,412 15,0 26 B. carterii 1. Qualität Somalia 0,016 15,168 15,501 57,312 0,060 47,071 33,760 84,567 25,3 27 B. carterii grüner Weihrauch Somalia 0,143 15,406 28,861 66,660 0,001 0,073 0,014 0,130 11,1 28 B. carterii 1. Qualität Somalia 0,865 19,782 36,476 83,868 0,006 0,042 0,033 0,134 14,1 29 B. carterii 2. Qualität Somalia 6,454 3,836 20,667 18,149 49,343 15,155 17,446 25,477 15,7 Mean 1,5 13,0 22,7 52,8 9,9 17,2 14,1 31,3 16,3 SD 2,8 6,0 10,0 25,5 22,0 19,5 14,3 35,5 5,4 30 B. neglecta Muqlo (schwarz) Somalia 1,444 41,127 26,801 80,994 0,044 3,175 0,751 3,652 15,8 31 B. neglecta Muqlo / Gunro Somalia 1,565 35,831 26,739 75,827 0,143 10,829 2,618 13,088 16,7 32 B. neglecta Muqlo (schwarz) Somalia 1,731 38,702 29,818 85,886 0,048 3,017 0,614 4,275 16,4 33 B. neglecta Mix Somalia 0,635 31,333 24,802 73,627 0,081 6,484 1,801 7,140 14,6 34 B. neglecta Mirafur Somalia 0,240 7,711 7,217 20,613 0,025 1,997 0,490 2,613 4,1 35 B. neglecta 1. Qualität (schwarz) Kenia 0,062 0,836 1,920 3,212 0,018 0,416 0,081 0,794 0,7 36 B. neglecta 1. Qualität (schwarz) Kenia 0,000 0,000 0,000 0,000 0,002 0,000 0,000 0,004 0,0 Mean 0,8 22,2 16,8 48,6 0,1 3,7 0,9 4,5 9,8 SD 0,8 18,5 13,1 38,8 0,0 3,8 1,0 4,5 7,8 37 B. rivae 1. Qualität Äthiopien 0,038 0,049 0,052 0,307 0,055 0,099 0,056 0,194 0,1 38 B. frereana Maydi (Mujarwaal / Fas Kabir) Somalia 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,0 39 B. frereana Maydi Mushaat Somalia 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,0 40 B. frereana Maydi Mujarwaal Somalia 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,0 Mean 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 SD 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 B.o. B. occulta / Somalia 2,677 4,386 6,991 23,854 33,644 15,389 16,466 30,198 13,4

Konzentration: niedrig hoch

Ergebnisse

Um die Daten zu visualisieren und Muster innerhalb des komplexen Datensatzes zu erkennen, wurden multivariate Statistikverfahren der Clusteranalyse und der Hauptkomponentenanalyse (PCA, principal component analysis) angewendet. Das Verfahren der Clusteranalyse verbindet Objekte (hier: Weihrauchproben) mit ähnlichen Boswellia-/Lupeolsäure-Zusammensetzungen zu Gruppen, sog. Clustern. Grundlage dieser Ähnlichkeiten sind die Abstände der einzelnen Proben im n-dimensionalen, kartesischen Raum. In diesem Fall wurden die euklidischen Abstände der einzelnen Weihrauchproben (= Beobachtungen) im 8-dimensionalen Raum untersucht. Dieser setze sich aus den Konzentrationen der acht Boswellia-/Lupeolsäuren (= Variablen) zusammen. Zusätzlich wurde das Verfahren der Hauptkomponentenanalyse (PCA) angewandt. Bei der PCA werden die Variablen (hier: Gehalte der einzelnen Boswellia-/Lupeolsäuren) eines multivariaten Datensatzes durch Linearkombination zu Hauptkomponenten (PC, principal components) zusammengefasst. Diese Hauptkomponenten bilden ein neues, niederdimensionales kartesisches Koordinatensystem, d. h. einen Subraum, in dem die Daten vereinfacht dargestellt werden können. Mit Hilfe der Effekte der einzelnen Konzentrationen auf die Hauptkomponenten (= loadings) konnten die Positionen der Proben im neuen Koordinatensystem (= scores) ermittelt werden:

PC1 = 0,031 [KBA] − 0,243 [LA] − 0,181 [α˗BA] − 0,589 [β˗BA] + 0,509 [AKBA] + 0,215 [ALA] + 0,309 [α˗ABA] + 0,399 [β˗ABA]

PC2 = 0,045 [KBA] + 0,207 [LA] + 0,237 [α˗BA] + 0,645 [β˗BA] + 0,233 [AKBA] + 0,267 [ALA] + 0,270 [α˗ABA] + 0,533 [β˗ABA]

PC3 = −0,151 [KBA] − 0,131 [LA] − 0,235 [α˗BA] − 0,106 [β˗BA] − 0,758 [AKBA] + 0,230 [ALA] − 0,008 [α˗ABA] + 0,516 [β˗ABA]

wobei [KBA], [LA], [-BA], [-BA], [AKBA], [ALA], [-ABA] und [-ABA] für die jeweiligen Konzentration in µg/mg Probe stehen. Die Verfahren der Clusteranalyse und der PCA ergänzen sich als orthogonale Verfahren, da bei der Clusteranalyse Beobachtungen (hier: Proben) und bei der PCA Variablen (hier: Boswellia-/Lupeolsäuren) zusammengefasst werden. Eine hierarchische agglomerative Clusteranalyse mit euklidischen Abständen und Ward-Kopplung ergab eine Aufteilung der Weihrauchharzproben in vier Cluster (Abbildung 14a). Die PCA, die auf Grundlage einer Kovarianzmatrix durchgeführt wurde, lieferte PC1 mit einem Eigenwert-Anteil von 50,2 %, PC2 mit einem Eigenwert-Anteil von 34,5 % und PC3 mit einem Eigenwert-Anteil von 11,5 %. Die Darstellung im zweidimensionalen Koordinatensystem mit PC1 als Abszisse und PC2 als Ordinate erklärte somit 84,7 % der Gesamtstreuung des Datensatzes (Abbildung 14b). Unter Einbeziehung von PC3 konnten sogar 96,2 % der Gesamtstreuung abgedeckt werden [102].

Ergebnisse

Cluster A (Abbildung 14a: rot) enthielt alle Weihrauchharzproben der Spezies B. sacra, B. papyrifera und B. dalzielli und somit alle Proben mit hohen Anteil an acetylierten Boswellia-/Lupeolsäuren. Interessanterweise war die Probe B. carterii # 29 aufgrund ihrer Ähnlichkeit im Cluster A enthalten. Auch im Biplot der PCA wurde die Ähnlichkeit von Probe # 29 zu Proben der Spezies B. sacra, B. papyrifera und B. dalzielli deutlich (Abbildung 14b: rot). Unter Einbeziehung von PC3, die hauptsächlich durch AKBA-Gehalte charakterisiert wird, konnten die Proben # 29 (B. carterii) und # 12-14 (B. dalzielli) von Proben der Spezies B. sacra unterschieden werden (Abbildung 15). Aufgrund der sehr hohen Gehalte an AKBA in Proben der Spezies B. dalzielli konnten diese zudem in einem eigenen Subcluster zusammengefasst werden [102]. Cluster B (Abbildung 14a, b: blau) inkludierte alle Proben der Spezies B. serrata sowie die Probe B. carterii # 25 und zeichnete sich durch einen erhöhten Anteil an deacetylierten Boswellia-/Lupeolsäuren aus. Probe # 25 zeigte die geringste Ähnlichkeit zu Cluster B und konnte durch seine geringen Konzentrationen an KBA und AKBA bei gleichzeitig hohem Gehalt an -ABA von Proben der Spezies B. serrata unterschieden werden. Es konnte zusätzlich unter Einbeziehung von PC3 in Abbildung 15 visualisiert werden, dass sich Probe # 25 (B. carterii) von Proben der Spezies B. serrata unterscheidet [102]. In Cluster C (Abbildung 14a, b: grau) wurden alle Proben vereint, die keine oder nur sehr geringe Boswellia-/Lupeolsäure-Konzentrationen aufwiesen: B. frereana (# 38-40), B. rivae (# 37) aus der Ogaden-Region sowie B. neglecta aus Kenia (# 35, 36) und der Bakool-Region (# 34) in Südsomalia [102]. Cluster D (Abbildung 14a, b: gelb) zeichnete sich durch einen sehr hohen Anteil an deacetylierten Boswellia-/Lupeolsäuren ohne Keto-Gruppe aus, d. h. LA, -BA und -BA. Enthalten in Cluster D waren Proben der Spezies B. neglecta (# 30-32) und B. carterii (# 27, 28), die alle aus den nordsomalischen Regionen Puntland und Somaliland stammten [102]. Die Probe # 26 (B. carterii) wies die geringste Ähnlichkeit zu allen anderen Proben auf und konnte aufgrund ihrer sehr hohen Konzentrationen an ALA und -ABA keinem Cluster zugeordnet werden. Allgemein zeigten Proben der Spezies B. carterii die größte Diversität innerhalb einer Spezies in Bezug auf die Boswellia-/Lupeolsäure-Zusammensetzung. Die Weihrauchharzprobe der Spezies B. occulta (B. o.) wurde nachträglich in die Studie mit aufgenommen. Die PCA-Koordination (scores) der Probe wurden mit Hilfe der Koeffizienten der Hauptkomponenten berechnet. Die Triterpenoid-Zusammensetzung von B. occulta zeigte große Ähnlichkeiten zu Proben der Spezies B. sacra (Black Hojari) sowie Proben der Spezies B. papyrifera [102].

Ergebnisse

Abbildung 14: Multivariate statistische Analyse der Triterpenoid-Zusammensetzung in Weihrauchharzproben. Probe # 1-11 (B. sacra, rot), Probe # 12-14 (B. dalzielli, violett), Probe # 15-17 (B. papyrifera, pink), Probe # 18-24 (B. serrata, blau), Probe # 25-29 (B. carterii, grün), Probe # 30-36 (B. neglecta, gelb), Probe # 37 (B. rivae, grau) und Probe # 38-40 (B. frereana, grau). (a) Dendrogramm der hierarchischen Clusteranalyse. Die Proben wurden aufgrund ähnlicher Triterpenoid-Zusammensetzungen vier unterschiedlichen Clustern zugeordnet: Cluster A (rot), Cluster B (blau), Cluster C (grau) und Cluster D (gelb). (b) Biplot der Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit Koordinaten der Weihrauchharzproben (scores) und Gewichtung der Triterpenoide auf die Hauptkomponenten (loadings). Die Koordination für die Probe B.o. (B. occulta) wurde nachträglich bestimmt und eingefügt. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], S. 10 © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Ergebnisse

Abbildung 15: Ergänzender Biplot der Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit Darstellung der dritten Hauptkomponente PC3. Unter Einbeziehung von PC3 konnten Weihrauchharzproben der Spezies B. dalzielli # 12 - 13 (violett) von Proben der Spezies B. sacra (rot) unterschieden werden. Auch die Proben # 25 und # 29 (B. carterii) waren nun von B. sacra und B. serrata (blau) unterscheidbar.

3.2.3 Einführung des Boswellia-Indizes (Bosi) Auf Grundlage der analytischen und statistischen Ergebnisse aus Kapitel 3.2.2 konnte eine Formel entwickelt werden, die es erlaubt unbekannte Weihrauchharzproben zu klassifizieren. Zur Berechnung des sog. Boswellia-Index (Bosi) werden lediglich die Gehalte von drei Boswelliasäuren benötigt, die als Kalibrierstandards kommerziell erhältlich sind (s. Tabelle 1): [퐴퐵퐴] + 1 퐵표푠 = ([퐴퐾퐵퐴] − 1) × × ([퐴퐾퐵퐴] + [퐵퐴] + [퐴퐵퐴] + 1) × ([퐴퐵퐴] − [퐵퐴]) 푖 [퐵퐴] + 1 mit [AKBA] dem Gehalt an -AKBA in µg je mg Weihrauchharz, [ABA] dem Gehalt an -ABA in µg je mg Weihrauchharz und [BA] dem Gehalt an -BA in µg je mg Weihrauchharz [102]. Die Berechnung der Boswellia-Indizes anhand der Analyseergebnisse aus Kapitel 3.2.2 ergab für Proben der Spezies B. serrata charakteristische, stark negative Werte zwischen ca. -21.000 und -2.900 (Tabelle 19). Proben der Spezies B. sacra, B. dalzielli, B. papyrifera und B. occulta waren davon deutlich differenzierbar mit positiven Werten zwischen ca. 7.000 und 310.000. Innerhalb dieser Gruppe wiesen Proben der Spezies B. dalzielli besonders hohe Bosi zwischen ca. 130.000 und 310.000 auf. Proben der Spezies B. neglecta aus Somalia zeigten positive, jedoch niedrigere Werte zwischen 360 und 888. Proben, die keine oder nur sehr geringe Konzentrationen an Boswellia-/Lupeolsäuren enthielten wie B. frereana aus Nordsomalia, B. rivae aus der Ogaden-Region und B. neglecta aus Kenia und Bakool-Region, zeigten charakteristische, sehr geringe Bosi zwischen 0 und 71. Proben der Spezies B. carterii waren aufgrund ihrer sehr unterschiedlichen Gehalte an Boswelliasäuren mit Bosi zwischen -5.376 und 46.026 nicht eindeutig zu klassifizieren [102].

Ergebnisse

Tabelle 19: Charakteristische Boswellia-Indizes (Bosi) von Weihrauchharzproben. Geordnet nach Spezies und Cluster gemäß Boswellia-/Lupeolsäure-Zusammensetzung (s. Abbildung 14). Cluster A Cluster B Cluster C Cluster D

# Spezies Bosi # Spezies Bosi # Spezies Bosi # Spezies Bosi 1 B. sacra 181631 18 B. serrata -9953 34 B. neglecta 71 27 B. carterii 75 2 B. sacra 35612 19 B. serrata -21112 35 B. neglecta 5 28 B. carterii 95 3 B. sacra 168427 20 B. serrata -6994 36 B. neglecta 0 30 B. neglecta 360 4 B. sacra 216446 21 B. serrata -8884 37 B. rivae 0 31 B. neglecta 888 5 B. sacra 307249 22 B. serrata -9787 38 B. frereana 0 32 B. neglecta 430 6 B. sacra 13137 23 B. serrata -2909 39 B. frereana 0 33 B. neglecta 546 7 B. sacra 98912 24 B. serrata -4614 40 B. frereana 0 8 B. sacra 68063 25 B. carterii -779 9 B. sacra 130306 10 B. sacra 74933 11 B. sacra 138655 12 B. dalzielli 134345 13 B. dalzielli 303439 14 B. dalzielli 142477 15 B. papyrifera 34172 Sonstige

16 B. papyrifera 7196 # Spezies Bosi 16 B. papyrifera 32469 26 B. carterii -5376 29 B. caterii 46026 41 B. occulta 23059

3.2.4 Boswellia- und Lupeolsäuren in speziellen Harzextrakt-Fraktionen und ätherischen Ölen Das Weihrauchharzextrakt aus Probe # 1 (B. sacra, Superior Hojari) wurde durch Flüssig-Flüssig-Extraktion in eine Säurefraktion und eine Neutralfraktion aufgetrennt (Kapitel 3.1.2). Der Gesamtgehalt an Boswellia- und Lupeolsäuren konnte dabei innnerhalb der Säurefraktion von 27,5 % auf 67,9 % (w/w) angereichert werden (Tabelle 20). Die Abtrennung der Säurekomponenten war jedoch nicht vollständig, da in der Neutralfraktion noch ein Gehalt von 13,0 % an Boswellia- und Lupeolsäuren nachgewiesen werden konnte [102]. In einem separaten Ansatz wurde von Weihrauchharz derselben Probe (B. sacra, Superior Hojari, Probe # 1) durch Wasserdampfdestillation das ätherische Öl abdestilliert. Der Anteil an ätherischem Öl im Weihrauchharz betrug 9,7 % (w/w). Der Rückstand im Destillationskolben wurde anschließend mit Methanol extrahiert. Im Vergleich zum Gesamtextrakt mit 27,5 % konnte im Extrakt nach der Wasserdampfdestillation ein Gesamtgehalt von 29,8 % Boswellia- und Lupeolsäuren nachgewiesen werden. Diese Anreicherung entsprach ungefähr dem entfernten Anteil an ätherischem Öl. [102]. Zusätzlich zum Weihrauchharz der Spezies B. sacra wurden auch die ätherischen Öle von Weihrauchharzen der Spezies B. serrata, B. carterii, B. frereana, B. dalzielli, B. papyrifera, B. neglecta und B. rivae abdestilliert (Tabelle 21). Die ermittelten Boswellia- und Lupeolsäure-Gehalte waren in allen Fällen entweder sehr gering (≤ 6 ng/mg) oder unterhalb der Bestimmungsgrenzen (< LOQ).

Ergebnisse

Tabelle 20: Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalte in speziellen Fraktionen von B. sacra. Die Ausbeuten beziehen sich jeweils die entsprechende Herstellungsstufe. Weihrauchharz: B. sacra, Superior Hojari, Probe # 1. SF: Säurefraktion. NF: Neutralfraktion. HD: Wasserdampfdestillation (hydro distillation). LOQ: Bestimmungsgrenze (limit of quantification). Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], Supplementary materials, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Triterpenoid-Konzentrationen (w/w) Probe Ausbeute Beschreibung deacetylierte Substanzen [µg/mg] acetylierte Substanzen [µg/mg] # [%] (w/w ) Σ [%] KBA LA -BA -BA AKBA ALA -ABA -ABA 1 Gesamtextrakt 67,1 4,048 7,123 15,400 40,600 62,325 29,500 43,400 72,425 27,5 SF1 Säurefraktion 26,0 10,100 12,850 34,400 89,700 155,000 74,350 120,000 183,000 67,9 NF1 Neutralfraktion 74,0 0,967 3,190 5,140 20,600 28,100 16,700 17,600 37,400 13,0 HD1 Extrakt nach HD 31,7 4,470 7,400 16,200 37,000 69,050 36,450 48,200 79,400 29,8 E1 Ätherisches Öl 9,7 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 0,0

Tabelle 21: Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalte in ätherischen Ölen verschiedener Boswellia- Spezies. Die ätherischen Öle enthielten keine nachweisbaren Mengen bzw. nur Spuren an Boswellia- und Lupeolsäuren. LOQ: Bestimmungsgrenze (limit of quantification).

Triterpenoid-Konzentrationen (w/w ) Ausbeute Spezies [%] (w/w ) deacetylierte Substanzen [µg/mg] acetylierte Substanzen [µg/mg] KBA LA -BA -BA AKBA ALA -ABA -ABA B. sacra 9,7 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ B. serrata 1,5 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ B. carterii 5,1 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ B. frereana 5,9 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ B. dalzielli 9,0 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ B. papyrifera 1,2 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 0,002 < LOQ < LOQ 0,006 B. neglecta 3,3 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 0,002 < LOQ < LOQ 0,003 B. rivae 3,3 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 0,003 < LOQ < LOQ < LOQ

3.2.5 Gehalte an Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzpräparaten Die zuvor beschriebene HPLC-MS/MS-Methode wurde zudem angewandt, um die Gesamtgehalte und Zusammensetzungen an Boswellia- und Lupeolsäuren von 16 unterschiedlichen Weihrauchharzpräparaten (FN, frankincense nutraceuticals) zu ermitteln (Abbildung 16a, b). Die untersuchten Weihrauchharzpräparate setzten sich aus einem Importarzneimittel (FN 15), drei Defekturarzneimitteln (FN 4, FN 9 und FN 16) und zwölf Nahrungsergänzungsmitteln (FN 1 - 3, FN 5 - 8 und FN 10 - 14) zusammen (s. Tabelle 4) [103]. Um eine adäquate Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, wurden von jedem Produkt drei Kapseln bzw. Tabletten analysiert und dies jeweils in Duplikaten. Die Gesamtgehalte an Boswellia-/Lupeolsäuren variierten zwischen 0,4 % und 35,7 % (Tabelle 22). Bezogen auf die Masse des Kapselinhalts bzw. der Tablette variierten die Gesamtgehalte zwischen 3,5 mg/Einheit und 157,3 mg/Einheit (Tabelle 23) [103].

Ergebnisse

Um Zusammenhänge und Muster der Boswellia-/Lupeolsäure-Zusammensetzungen zu erkennen, wurden die Verfahren der Clusteranalyse und der Hauptkomponentenanalyse (PCA) angewendet. Eine agglomerative hierarchische Clusteranalyse mit vollständiger Kopplung und euklidischen Abständen hat die 16 Weihrauchharzpräparate in drei Cluster eingeteilt (Abbildung 16c). Cluster A beinhaltete alle Proben mit sehr hohen Gehalten an Boswellia-/Lupeolsäuren mit Gesamtgehalten über 30 % (FN 9, FN 13 und FN 16). Zusätzlich konnte mit Hilfe der PCA gezeigt werden, dass die Proben innerhalb dieses Clusters eine sehr ähnliche Boswellia-/Lupeolsäure-Zusammensetzung aufweisen (Abbildung 16d). Cluster B enthielt alle Proben mit Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalten zwischen 30 % und 15 % (FN 2, FN 4, FN 6 und FN 14). Proben mit Boswellia- /Lupeolsäure-Gehalten unter 15 % wurden in Cluster C zusammengefasst (FN 1, FN 3, FN 4, FN 5, FN 7, FN 8, FN 10, FN 11 und FN 12). Die Probe FN 8 zeigte dabei die geringste Ähnlichkeit innerhalb des Clusters C. Dies kann darauf zurückgeführt werden, dass FN 8 einen ungewöhnlich hohen Gehalt an AKBA bei gleichzeitig sehr geringen Gehalten der restlichen untersuchten Komponenten aufwies. Interessanterweise wiesen die Proben FN 10, FN 11 und FN 12 sehr ähnliche Boswellia-/Lupeolsäure- Zusammensetzungen auf und könnten einem eigenen Subcluster zugordnet werden. Alle drei Proben enthielten laut Hersteller reines Weihrauchharz (keine Extrakte) unterschiedlicher Boswellia-Spezies: B. sacra (FN 10,) B. serrata (FN 11) und B. carterii (FN 12). Eine Berechnung der Bosi ergab Werte zwischen -5653 und -971, welche charakteristisch für Weihrauchharze der Spezies B. serrata sind [102, 103].

Tabelle 22: Konzentrationen an Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharz- präparaten. Sortiert nach Gesamtgehalt, absteigend. n = 3, jeweils Duplikate. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 5, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Boswellia-/Lupeolsäure-Konzentrationen (w/w ) Probe # deacetylierte Substanzen [µg/mg] acetylierte Substanzen [µg/mg] Σ [%] KBA LA -BA -BA AKBA ALA -ABA -ABA FN9 34,1 17,2 46,5 120,7 36,9 13,8 24,4 63,6 35,7 FN16 42,3 16,4 47,7 118,8 36,9 11,9 20,3 55,7 35,0 FN13 43,9 16,5 45,6 117,2 31,8 11,2 19,2 50,7 33,6 FN6 38,1 15,0 38,8 109,0 7,7 5,9 11,8 36,7 26,3 FN14 38,9 14,4 34,9 98,3 4,2 3,5 6,6 20,8 22,1 FN2 36,9 11,3 32,0 85,9 5,6 4,0 7,9 24,0 20,8 FN4 9,7 6,6 19,9 62,9 18,6 7,8 14,7 46,3 18,6 FN1 25,7 6,8 20,5 57,6 3,6 2,4 4,9 14,8 13,6 FN3 21,8 6,3 18,3 53,1 4,3 2,4 4,6 13,9 12,5 FN15 14,2 6,1 15,6 42,4 11,8 4,1 6,7 17,7 11,9 FN11 4,8 2,5 6,8 20,1 30,0 5,7 10,1 16,7 9,7 FN8 1,3 0,5 1,1 3,2 75,5 1,1 1,6 4,9 8,9 FN10 5,9 2,2 5,6 12,7 33,6 5,3 8,2 12,2 8,6 FN12 4,5 2,1 5,3 14,2 31,4 5,4 8,0 13,2 8,4 FN5 3,4 1,3 3,5 9,2 2,9 0,8 1,9 5,7 2,9 FN7 0,3 0,1 0,3 0,5 1,2 0,3 0,6 1,1 0,4

Ergebnisse

Abbildung 16: Untersuchung von Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharz- präparaten mittels HPLC-DAD-MS/MS und multivariater Statistik. (a) DAD- Chromatogramm der Probe FN 9 (210 nm, 254 nm und 280 nm). (b) MRM- Chromatogramm (Probe FN 9) und Strukturen der untersuchten Substanzen. (c) Dendrogramm der Clusteranalyse. Die Proben wurden in drei Cluster aufgeteilt: Cluster A > 30 % Gesamtgehalt an Boswellia- und Lupeolsäuren, Cluster B 30 - 15 % und Cluster C < 15 %. (d) Biplot der Hauptkomponentenanalyse mit Clustern der Clusteranalyse. Proben innerhalb eines Clusters ähneln sich nicht nur hinsichtlich des Gesamtgehalts an Boswellia- und Lupeolsäuren, sondern auch hinsichtlich der individuellen Zusammensetzung. Abbildung adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 6, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Ergebnisse

Tabelle 23: Gehalte an Boswellia- und Lupeolsäuren je Kapsel bzw. Tablette. Sortiert nach Gesamtgehalt, absteigend. Ermittlung der Massen der Kapselinhalte und Tabletten mit n = 3, jeweils Dublikate. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], Supplementary materials, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Masse Kapselinhalt Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalte je Kapsel / Tablette [mg/Einheit] Probe # bzw. Tablette [mg] deacetylierte Substanzen acetylierte Substanzen Σ Mean SD KBA LA -BA -BA AKBA ALA -ABA -ABA FN16 449,4 1,2 19,0 7,4 21,4 53,4 16,6 5,3 9,1 25,0 157,3 FN14 700,9 5,6 27,3 10,1 24,4 68,9 2,9 2,4 4,6 14,5 155,2 FN6 567,1 7,6 21,6 8,5 22,0 61,8 4,4 3,3 6,7 20,8 149,1 FN9 380,7 12,4 13,0 6,5 17,7 45,9 14,1 5,3 9,3 24,2 135,9 FN13 390,7 8,7 17,2 6,4 17,8 45,8 12,4 4,4 7,5 19,8 131,3 FN2 503,1 4,4 18,6 5,7 16,1 43,2 2,8 2,0 4,0 12,1 104,5 FN15 659,6 8,7 9,3 4,0 10,3 28,0 7,8 2,7 4,4 11,6 78,2 FN1 502,1 14,2 12,9 3,4 10,3 28,9 1,8 1,2 2,4 7,4 68,3 FN4 336,4 15,9 3,2 2,2 6,7 21,1 6,3 2,6 5,0 15,6 62,7 FN3 489,8 13,9 10,6 3,1 8,9 25,9 2,1 1,2 2,2 6,8 60,9 FN11 375,4 0,9 1,8 1,0 2,5 7,6 11,3 2,1 3,8 6,3 36,3 FN10 415,0 6,8 2,4 0,9 2,3 5,3 14,0 2,2 3,4 5,0 35,5 FN12 418,0 9,1 1,9 0,9 2,2 5,9 13,1 2,3 3,3 5,5 35,1 FN8 346,8 14,9 0,4 0,2 0,4 1,1 26,2 0,4 0,6 1,7 30,9 FN5 584,3 6,3 2,0 0,7 2,0 5,4 1,7 0,5 1,1 3,3 16,8 FN7 809,8 5,0 0,2 0,1 0,3 0,4 0,9 0,2 0,5 0,9 3,5

3.3 Charakterisierung einer neuen Boswelliasäure: 11-Keto-- boswelliasäure (-KBA) 3.3.1 Synthese von 11-Keto--boswelliasäure Ausgehend von 3-O-Acetyl-11-keto--boswelliasäure (-AKBA) wurde 11-Keto-- boswelliasäure (-KBA) durch Deacetylierung synthetisiert (Abbildung 17). Das Edukt wurde durch Oxidation von 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA) an der Allylstellung mit Hilfe von N-Bromsuccinimid (NBS) hergestellt. Die Deacetylierung von -AKBA erfolgte durch alkalische Esterspaltung mit einer Ausbeute von 89,7 % -KBA (n/n). Das Rohprodukt wurde mit Hilfe von semipräparativer HPLC aufgereinigt und anschließend mit analytischer HPLC auf seine Reinheit kontrolliert. Das Endprodukt lag als weißer, kristalliner Stoff mit einer Reinheit > 99,9 % und einer Gesamtausbeute von 61,8 % (n/n) vor [104].

Abbildung 17: Synthese zur Herstellung von 11-Keto--boswelliasäure (-KBA).

Ergebnisse

3.3.2 Charakterisierung von 11-Keto--boswelliasäure Die massenspektrometrische Untersuchung -KBA resultierte in dem Molekülpeak m/z 469,3 ([M-H]-), welcher mit der berechneten monoisotopischen Masse von 470,3 g/mol übereinstimmte (Abbildung 18a). Durch kollisionsinduzierte Dissoziation des Vorläufer- Ions wurden zusätzlich die charakteristischen Produkt-Ionen m/z 353,3, 376,3, 391,4, 407,4, und 451,4 identifiziert (Abbildung 18b) [104]. Mit Hilfe von ein- und zweidimensionaler 1H- und 13C-Kernspinresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie, nuclear magnetic resonance spectroscopy) konnte die chemische Struktur von -KBA aufgeklärt werden (Abbildung 19a). Das 1H-NMR-Spektrum zeigte sieben Methyl-Singuletts (CH3-23, CH3-25, CH3-26, CH3-27, CH3-28, CH3-29 und CH3-30), die darauf hinwiesen, dass alle Methylgruppen mit quartären Kohlenstoffen verbunden sind (Abbildung 20a). Charakteristisch für -Boswelliasäuren ist die geminale Stellung der 1 Methylgruppen an C-20, welche sich in Singuletts der H-Signale an den Positionen CH3-29 und CH3-30 mit chemischen Verschiebungen von  = 0,88 und  = 0,89 widerspiegelten (Tabelle 24). Die Ketogruppe an Position C-11 (δ = 198,9) konnte anhand der Singuletts H-9 (δ = 2,35) und H-12 (δ = 5,47) bestimmt werden (Abbildung 20a, b). Auf Grundlage von 2D-korrelierten NMR-Spektren (1H-1H-COSY, correlated spectroscopy; 1H-13C-HSQC, heteronuclear single quantum coherence spectroscopy; 1H-13C-HMBC-Spektrum, heteronuclear multiple bond correlation) wurden die restlichen Signale zugeordnet (Abbildung 21a sowie im Anhang Abbildung 34, 36 und 37). Zusätzlich wurde die Stereochemie mit Hilfe des 1H-1H-ROESY-Spektrums (rotating frame overhauser enhancement spectroscopy) aufgeklärt (Abbildung 19b und 21b sowie Anhang Abbildung 35). Dabei wurden besonders weitreichende Korrelationen mit 1H-1H-SELTOCSY (selective total correlation spectroscopy) untersucht (s. Anhang Abbildung 33) [104].

Abbildung 18: Massenspektren von -KBA. (a) Massenspektrum mit m/z 469,3 als Molekülpeak [M-H]-. (b) Produkt-Ionen-Massenspektrum mit dem Vorläufer-Ion m/z 469,4 und die Produkt-Ionen m/z 353,3, 376,3, 391,4, 407,4, und 451,4. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], Supplementary materials, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Ergebnisse

Tabelle 24: Chemische Verschiebungen für -KBA 3 in DMSO-d6.  in ppm (Multiplizität, JHH in Hz, Topozität). Tabelle aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], S. 5, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

Position, C  C  H 1 33,6 1,28 (ddd, 14/14/4, ) 2,27 (bd, 14, ) 2 25,9 1,33 (ddd, 4/4/14, ) 2,05 (dd, 14/14, ) 3 68,7 3,77 (bs, ) 4 46,7 - 5 47,6 1,39 (m, ) 6 18,6 1,61 (m, ) 1,76 (dd, 14/4, ) 7 32,3 1,36 (m, ) 1,60 (m, ) 8 44,9 - 9 60,1 2,35 (s, ) 10 37,1 - 11 198,9 - 12 127,3 5,47 (s) 13 170,3 - 14 43,1 - 15 25,9 1,74 (dd, 14/4, ) 2,06 (dd, 14/4, ) 16 25,8 0,91 (bd, 14, ) 1,15 (bd, 14, ) 17 32,0 - 18 46,9 2,12 (dd, 14/4, ) 19 44,7 1,00 (bd, 14, ) 1,70 (dd, 14/14, )

20 30,8 - Abbildung 19: Struktur und wichtige 21 33,9 1,11 (m, ) 1,39 (m, ) Korrelationen von -KBA. (a) 22 36,0 1,25 (m, ) Nummerierungsschema. (b) Aufklärung der Stereochemie durch ROESY- 1,40 (m, ) Korrelationen, d. h. Kopplungen von 23 24,4 1,13 (s, ) räumlich benachbarten Protonen. 24 178,7 - Abbildung adaptiert aus eigener 25 13,1 0,99 (s, ) Publikation (Schmiech et al. [104], S. 4, © 26 18,2 1,05 (s, ) 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ 27 23,1 1,35 (s, ) licenses/by/4.0/). 28 28,4 0,83 (s, ) 29 23,4 0,88 (s, ) 30 32,8 0,89 (s, )

Ergebnisse

Abbildung 20: Eindimensionale NMR-Spektren von -KBA. (a) 1H-NMR-Spektrum. (b) 13C-NMR-Spektrum. Gelöst in DMSO-d6. Zuordnung der Signale vgl. Abbildung 19a. Abbildung adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], Supplementary materials, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

Ergebnisse

Abbildung 21: 2D-heteronuklear- und 2D-homonuklear-korrelierte NMR-Spektren von -KBA. (a) 1H-13C-HSQC (heteronuclear single quantum coherence spectroscopy). 1H- 13C-Kopplungen über eine Bindung. (b) 1H-1H-ROESY (rotating frame overhauser enhancement spectroscopy). Kopplungen von räumlich benachbarten Protonen. Zuordnung der Signale und Kopplungen vgl. Abbildung 19a, b. Abbildung adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], Supplementary materials, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

Ergebnisse

3.3.3 Quantifizierung von 11-Keto--boswelliasäure in Weihrauchharzen Um eine Analysenmethode zu entwickeln, die fähig ist die Konstitutionsisomere von sowohl KBA als auch AKBA chromatographisch zu trennen, wurde das Verfahren der statistischen Versuchsplanung (DoE, design of experiments) angewandt. Als stationäre Phase wurde auf Grundlage vorangegangener Studien eine Säule mit Pentafluorphenyl- Gruppen (PFP) ausgewählt. Als Design diente ein vollständiger 3-faktorieller zentral zusammengesetzter Versuchsplan. Dieser Versuchsplan besteht aus einem vollständigen 23- faktoriellen Versuchsplan, dem zusätzlich ein Stern und ein Zentrum hinzugefügt wurden (Abbildung 22a, b). Die codierten Leveleinstellungen des vollständigen Versuchsplans wurden als +1 und -1 definiert. Der Abstand  der Sternpunkte zum Zentrum ergab sich aus der Formel:

1 ∝2 = (√푁 ∗ 푁 − 푁 ) 2 푤 푤

3 3 mit 푁푤 = 2 Versuchen im Würfel und 푁 = 2 + 2 ∗ 3 + 1 Gesamtversuchen. Mit Hilfe dieses Versuchsplan war es möglich, drei variable Faktoren (Variablen) auf fünf Leveleinstellungen zu untersuchen und gleichzeitig die Gesamtanzahl an notwendigen 3 Experimenten von 푁 = 5 = 125 auf 푁 = 15 zu verringern [104]. Als Variablen dienten die Startkonzentration des Eluenten B (Variable A), die Steigung des Gradienten (Variable B) und die Fließgeschwindigkeit der Eluenten (Variable C). Die chromatographische Auflösung R zwischen den Peaks von -KBA und -KBA bzw. -AKBA und -AKBA wurde als Antwortvariable definiert. Dabei wurde R über folgende Formel berechnet: 푡 (푃푒푎푘 2) − 푡 (푃푒푎푘 1) 푅 = 1,18 ∗ 푅 푅 푤0,5(푃푒푎푘 2) + 푤0,5(푃푒푎푘 1)

mit tR der jeweiligen Retentionszeit und w0,5 der jeweiligen Peakbreite bei halber Höhe. Vorteil der Verwendung der Auflösungen im Gegensatz zu den Peakabständen ist, dass in die Berechnung der Auflösung auch die Peakbreite, d. h. die Peakform mit eingeht. Bei einer Auflösung R  1,5 gelten Peaks als eindeutig voneinander getrennt und einzeln quantifizierbar. Die Experimente wurden in randomisierter Reihenfolge durchgeführt, um Verfälschungen des mathematischen Modells durch systematische Fehler zu verhindern [104]. Die Auswertung der Effekte im Wahrscheinlichkeitsnetz ergab, dass nur die beiden Variablen A und B, d. h. die Startkonzentration des Eluenten B und die Gradientensteigung einen signifikanten Effekt auf die chromatographische Auflösung des Trennsystems hatten (Abbildung 23a, b). Zur Untersuchung der Effekte der Variablen A und B auf die Auflösungen wurden die Ergebnisse in Kontourdiagrammen visualisiert (Abbildung 23c, d). Hierbei wurde ersichtlich, dass nur zwei Levelkombinationen die erforderliche Auflösung R  1,5 für die Trennung von -KBA und -KBA erzielten: Experiment 5 und Experiment 11 (Tabelle 24). Mit den Einstellungen von Experiment 11 war es jedoch nicht möglich -AKBA und -AKBA von der Säule zu eluieren. Die Auflösung wurde damit als unzureichend angesehen. Somit blieben nur die Einstellungen von Experiment 5 übrig, die

Ergebnisse

eine Trennung von sowohl -KBA und -KBA als auch -AKBA und -AKBA gewährleisteten [104].

Abbildung 22: Designs von zentral zusammengesetzten Versuchsplänen. (a) Grundsätzliches Design eines zentral zusammengesetzten Versuchsplans mit zwei Variablen. (b) Design des hier verwendeten zentral zusammengesetzten Versuchsplans mit drei zu optimierenden Variablen. Als Antwortvariable wurde die chromatographische Auflösung R zwischen den Analyten ausgewertet. Abbildung b adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], S. 6, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

Tabelle 25: Versuchsplan mit Leveleinstellungen der Variablen (codiert und uncodiert) und chromatographischen Auflösungen als Antwortvariablen. Grün: Würfel, blau: Stern und rot: Zentrum. Nur die Leveleinstellungen von Experiment 5 resultierten in einer ausreichenden Trennung aller Analyte. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], S. 7, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/). Variablen (codiert) Variablen (uncodiert) Auflösung R Exp. A B C -KBA/ -AKBA/ A B C [%] [%/min] [mL/min] -KBA -AKBA 1 -1 -1 -1 8,11 1,22 0,51 1,40 3,03 2 1 -1 -1 31,89[Grab your1,22 reader’s0,51 attention0,84 2,69 3 -1 1 -1 8,11with a great4,78 quote from0,51 the 0,84 1,89 4 1 1 -1 31,89document4,78 or use this0,51 space to0,51 1,42 5 -1 -1 1 8,11emphasize1,22 a key point.0,69 To place1,52 3,04 6 1 -1 1 31,89this text box1,22 anywhere0,69 on the0,80 2,65 7 -1 1 1 8,11page, just4,78 drag it.] 0,69 0,97 2,00 8 1 1 1 31,89 4,78 0,69 0,62 1,95 9 - 0 0 0,00 3,00 0,60 1,18 2,14 10  0 0 40,00 3,00 0,60 0,64 1,89 11 0 - 0 20,00 0,00 0,60 1,50 / 12 0  0 20,00 6,00 0,60 0,63 1,73 13 0 0 - 20,00 3,00 0,45 0,92 1,95 14 0 0  20,00 3,00 0,75 1,16 2,12 15 0 0 0 20,00 3,00 0,60 0,77 2,05

Ergebnisse

Abbildung 23: Darstellung der Effekte des statistischen Versuchsplans. (a) und (b) Standardisierte Effekte im Wahrscheinlichkeitsnetz. (a) Effekte auf die Auflösung R zwischen -KBA und -KBA, (b) Effekte auf die Auflösung R zwischen -AKBA und - AKBA, beide mit  = 0,05. Nur die Variablen A und B haben einen signifikanten Effekt auf die chromatographische Auflösung. (c) Kontourdiagramm der Auflösung R (-KBA / -KBA). (d) Kontourdiagramm der Auflösung R (-AKBA / -AKBA). Nur die Level- einstellungen von Experiment 5 (*) ermöglichten eine ausreichende Trennung aller vier Analyte. Mit den Leveleinstellungen von Experiment 11 (**) war es nicht möglich -AKBA und -AKBA von der Trennsäule zu eluieren. Abbildung c und d adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], S. 6, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

Auf Grundlage dieser Ergebnisse konnte eine Methode entwickelt werden, die fähig ist, selektiv die einzelnen Konstitutionsisomere von KBA und AKBA zu quantifizieren (Abbildung 24). Diese Methode wurde anschließend an Realproben der Spezies B. sacra und B. serrata angewandt. Erstmals konnte auf diese Weise -KBA in Weihrauchharzen nachgewiesen werden. Die ermittelten Verhältnisse der KBA-Isomere lagen bei B. sacra (Probe # 1) bei 3,6 % -KBA und 96,4 % -KBA sowie bei B. serrata (Probe # 22) bei 4,6 % -KBA und 95,4 % -KBA. Das entspricht einem Gehalt von 98 ng -KBA in B. sacra und 451 ng -KBA in B. serrata je mg Harz.

Ergebnisse

Abbildung 24: Chromatographische Trennung von KBA und AKBA auf unterschiedlichen Trennsäulen. (a) C18-Säule: keine Trennung der Konstitutionsisomere möglich. (b) PFP- Säule: mit Hilfe der entwickelten Methode war es erstmals möglich die Konstitutionsisomere von KBA (α-KBA und β-KBA) und AKBA (α-AKBA und β-AKBA) chromatographisch zu trennen und somit selektiv zu quantifizieren. Abbildung adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], S. 8, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

3.4 Gaschromatographische Untersuchung ätherischer Öle aus Weihrauchharzen Die ätherischen Öle aus Weihrauchharzen acht verschiedener Spezies wurden mit Hilfe der Gaschromatographie (GC) untersucht. Die Inhaltstoffe wurden durch Abgleich der Retentionsindizes und Massenspektren unter Zuhilfenahme mehrerer Datenbanken identifiziert. Die Bestimmung der Gehalte erfolgte durch relative Quantifizierung anhand Flammenionisationsdetektion (FID). Die Analysen ergaben, dass die ätherischen Öle hauptsächlich aus den Monoterpenoiden -Thujen, -Pinen, -Pinen, Sabinen, Myrcen, para-Cymen und Limonen bestanden (Tabelle 25). In ätherischen Ölen aus B. sacra, B. carterii, B. dalzielli, B. neglecta und B. rivae stellte -Pinen mit 42,3 - 71,4 % die Hauptkomponente dar. Das ätherische Öl aus B. frereana enthielt zwar auch 24,4 % -Pinen, jedoch mit 37,1 % einen höheren Anteil an -Thujen. Die Hauptkomponente des Öls aus B. serrata war hingegen Myrcen mit 41,4 %. Das ätherische Öl der Spezies B. papyrifera unterschied sich deutlich von allen anderen Proben, da es hauptsächlich aus Octanol (7,0 %) und Octylacetat (77,7 %) bestand. Zudem war im ätherischen Öl aus B. papyrifera mit 0,05 % die höchste Konzentration des potentiell psychoaktiven Diterpenoids Incensol enthalten [104]. Interessanterweise konnte in allen Proben die Substanz Hashishin nachgewiesen werden. Hashishen wird photochemisch aus Myrcen gebildet und galt bisher als charakteristisch für Haschisch, dem Harz der Cannabispflanze. Höhere Terpenoide, wie die pentazyklischen 58

Ergebnisse

Triterpenoide -Amyrin, -Amyrin und Lupeol konnten in keiner der Proben nachgewiesen werden [104].

Tabelle 26: Analysenergebnisse der gaschromatographischen Untersuchung ätherischer Öle verschiedener Boswellia-Spezies. Relative Quantifizierung [%] anhand Flammenionisationsdetektion (FID). Es sind alle Substanzen aufgeführt ab einer Mindestkonzentration von 1 %. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], S. 11, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

Probe: E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 Spezies: B. sacra B. serrata B. carterii B. frereana B. dalzielli B. papyrifera B. neglecta B. rivae Hashishen 0,32 5,24 0,12 2,89 1,01 0,03 0,01 0,12 α-Thujen 0,40 14,46 3,69 37,07 5,36 0,41 7,86 1,55 α-Pinen 71,44 14,71 52,16 24,41 70,29 1,58 46,95 42,33 Camphene 1,76 0,19 0,80 0,56 1,10 0,10 0,98 1,03 Thuja-2,4(10)-dien 0,75 0,06 0,26 0,36 1,08 0,03 0,47 0,58 Sabinen 2,39 2,34 2,77 4,87 0,68 0,26 0,22 0,99 β-Pinen 1,47 1,57 1,86 1,16 1,74 0,14 1,42 7,64 Myrcen 2,10 41,36 4,93 0,97 1,91 0,37 0,81 0,13 α-Phellandren 0,30 0,40 3,16 0,11 0,03 0,02 0,11 0,16 Δ3-Caren 1,84 0,47 0,81 0,02 0,03 0,03 1,23 6,51 para-Cymen 0,82 1,10 4,50 8,20 1,54 0,29 4,61 7,86 Limonen 3,17 4,63 15,90 0,85 2,19 2,03 2,23 4,39 (E)-β-Ocimen 0,16 0,05 0,06 0,01 0,02 1,62 0,02 0,03 Linalool 0,04 0,66 0,02 0,26 0,17 1,00 0,08 0,07 trans-Pinocarveol 0,94 0,08 0,21 0,33 1,45 0,00 0,39 1,83 trans-Verbenol 0,79 0,09 0,37 0,37 1,12 0,02 0,45 2,52 α-Phellandren-8-ol 1,08 0,04 0,24 0,48 1,39 0,01 0,63 0,61 Terpinen-4-ol 0,28 0,09 0,19 1,73 0,19 0,07 16,81 0,69 α-Terpineol 0,03 0,09 0,06 0,26 0,11 0,00 4,00 0,38 Verbenon 0,64 0,03 0,16 0,31 0,74 0,00 0,66 1,76 Methylchavicol 0,00 5,96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Octanol 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,96 0,01 0,00 Octylacetat 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 77,67 0,00 0,00 S 90,70 93,61 92,29 85,22 92,16 92,64 89,94 81,20 rel. Konzentration: niedrig hoch

3.5 Hemmung der Zytokinausschüttung durch Weihrauchharzpräparate 3.5.1 Hemmung der TNF-- und IL-10-Ausschüttung in LPS- stimuliertem, humanem Vollblut Um die immunregulatorischen Eigenschaften von 16 Weihrauchharzpräparaten (FN, frankincense nutraceuticals) zu untersuchen, wurde ein akuter Entzündungsprozess in humanem Blut in vitro imitiert. Zu diesem Zweck wurde Vollblut von gesunden, männlichen Probanden entnommen. Nach Zugabe der Weihrauchharzpräparate ( = 30 µg/mL) wurden die Zellen des Immunsystems durch Endotoxine, bakterielle Lipopolysaccharide (LPS,  = 10 ng/mL), aktiviert. Die von Monozyten und Macrophagen ausgeschütteten Zytokine wurde mit Hilfe eines Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) quantifiziert. Als Vergleichsgruppe diente LPS-stimuliertes Blut ohne Behandlung mit Weihrauchharzpräparaten, dessen Wert als „100 % Zytokinausschüttung“ definiert wurde (Tabelle 27 und Abbildung 25a) [103].

Ergebnisse

Durch die Behandlung mit Weihrauchharzpräparaten konnte die Produktion des proinflammatorischen Zytokins TNF- im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant auf 82,7 % gesenkt werden (Wilcoxon-Test, p < 0,001). Auch die Ausschüttung des antiinflammatorischen Zytokins IL-10 wurde signifikant auf 79,2 % gesenkt (Wilcoxon- Test, p < 0,001). Eine Varianzanalyse (einfache ANOVA) ergab, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Proben bestanden. Daher war ein Vergleich der Effekte einzelner Weihrauchharzpräparate in humanem Vollblut nicht möglich [103].

Tabelle 27: Effekte von Weihrauchharzpräparaten (FN, frankincense nutraceuticals) auf die Ausschüttung von TNF- und IL-10 in LPS-stimuliertem humanen Vollblut.

 FN = 30 µg/mL,  LPS = 10 ng/mL und n = 5 Donoren. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], Supplementary materials, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/). TNF- IL-10 Probe Mean SEM Mean SEM FN1 88,3 8,7 80,2 16,4 FN2 87,9 5,6 92,3 11,3 FN3 55,7 10,9 89,1 17,9 FN4 90,3 5,7 90,4 9,6 FN5 93,0 8,1 80,6 13,0 FN6 76,1 7,9 68,9 21,4 FN7 92,3 10,2 77,6 14,4 FN8 92,0 9,5 67,4 5,1 FN9 75,0 5,6 70,3 8,0 FN10 79,2 6,4 77,0 6,7 FN11 81,7 8,0 80,3 8,6 FN12 80,2 7,0 62,4 12,1 FN13 85,4 7,7 81,9 9,9 FN14 91,8 9,3 93,4 3,6 FN15 56,7 14,3 80,7 20,4 FN16 97,6 9,7 74,8 16,8 Mean 82,7 79,2 SD 12,2 9,1 SEM 3,1 2,3

3.5.2 Hemmung der Zytokinausschüttung aus LPS-stimulierten PBMC Um Matrixeffekte des Blutes zu minimieren, wurde der Einfluss der Weihrauchharzpräparate auf die Zytokinexpression aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC, peripheral blood mononuclear cells) untersucht. Diese Zellen bestehen hauptsächlich aus Monozyten, welche für die Zytokinausschüttung verantwortlich sind. Für die Experimente wurden PBMC verwendet, die frisch aus dem Vollblut gesunder, männlicher Probanden isoliert wurden. Die Behandlung und Anregung wurden wie in Kapitel 3.5.1 beschrieben durchgeführt. Abweichend von der vorherigen

Ergebnisse

Versuchsdurchführung wurde die Behandlung mit den individuellen Weihrauchharzpräparaten in einer Konzentration von  = 10 µg/mL durchgeführt. Die Unbedenklichkeit dieser Konzentration auf die Zellvitalität wurde vorab durch Zellvitalitäts- /Proliferations-Analyse (XTT), Laktatdehydrogenase-Analyse (LDH) und Propidiumiodid- Färbung überprüft. Quantifiziert wurde die Ausschüttung der Zytokine TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 und IL-12p70, wobei die Konzentrationen an IL-12p70 zu gering waren um ausgewertet zu werden. Als Positivkontrolle diente der Proteasom-Inhibitor MG132 (Tabelle 28) [103].

Tabelle 28: Effekte von Weihrauchharzpräparaten (FN) auf die Zytokinausschüttung aus LPS-stimulierten PBMC. Die Weihrauchharzpräparate FN4, FN6, FN9, FN13 und FN16 zeigten die stärkste Hemmung auf die Zytokine TNF-, IL-6, IL-8 und IL-10. Alle Ergebnisse sind im Verhältnis zur LPS-stimulierten, aber unbehandelten Kontrollgruppe

(= 100 %) angegeben.  FN = 10 µg/mL,  LPS = 10 ng/mL und n = 7 Donoren. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], Supplementary materials, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/). TNF- IL-1 IL-6 IL-8 IL-10 Probe Mean SEM Mean SEM Mean SEM Mean SEM Mean SEM FN1 112,2 37,7 122,5 27,2 104,1 26,4 93,0 13,7 57,6 16,6 FN2 43,7 21,6 120,1 29,6 19,9 11,7 26,8 9,3 28,4 12,8 FN3 137,6 49,6 141,6 22,4 93,5 24,9 84,6 11,7 47,0 11,4 FN4 14,4 7,2 90,8 38,4 7,2 3,3 14,4 4,8 21,6 11,4 FN5 179,8 49,0 92,8 17,1 133,1 24,0 114,5 13,3 85,0 21,6 FN6 22,1 12,5 68,3 19,9 11,6 6,5 17,6 6,7 26,4 14,6 FN7 207,1 57,2 171,3 49,7 246,4 88,6 178,5 62,2 86,1 23,9 FN8 101,7 35,7 100,9 22,3 112,1 42,7 70,9 17,2 63,4 19,2 FN9 22,5 13,3 59,8 15,4 8,1 4,6 13,5 4,1 24,5 13,6 FN10 61,5 23,8 58,3 14,1 57,6 21,5 50,9 11,1 30,0 12,0 FN11 60,6 20,3 87,4 32,0 46,1 14,4 47,3 12,0 27,4 11,0 FN12 106,5 38,4 71,2 13,3 85,7 33,8 67,4 19,1 55,6 24,3 FN13 18,2 9,6 82,5 28,6 6,7 3,1 16,5 4,4 24,9 13,6 FN14 67,3 18,3 122,4 37,0 35,0 14,3 45,9 14,4 32,5 13,4 FN15 76,1 24,9 98,2 38,2 49,5 16,7 61,0 14,7 35,5 15,4 FN16 26,1 11,9 58,5 21,9 12,4 8,1 22,2 10,8 24,3 12,3 MG132 15,2 7,4 18,5 7,7 5,2 3,5 20,2 7,2 37,5 14,8

Die Weihrauchharzpräparate FN9, FN13 und FN16 mit einem Gesamtgehalt von > 30 % Boswellia- und Lupeolsäuren (Cluster A, siehe Kapitel 3.2.5) konnten die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine TNF-, IL-6 und IL-8 signifikant senken (Abbildung 25b-f). Ebenso zeigten die Proben FN4 und FN6 einen signifikanten Einfluss auf die Zytokinausschüttung im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Im arithmetischen Mittel senkten diese fünf Proben die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine auf 20,7 % für TNF-, 9,2 % für IL-6 und 16,8 % für IL-8. Die Untersuchung der chemischen Zusammensetzung dieser fünf Proben zeigte, dass sie die höchsten Gehalte an ALA, -ABA und -ABA beinhalteten. Im Gegensatz dazu zeigten die Proben FN5 und 61

Ergebnisse

FN7, welche zuvor die niedrigsten Gehalte an Boswellia- und Lupeolsäure aufwiesen, nicht nur die geringsten Effekte auf die Zytokinausschüttung, sondern erhöhten diese sogar teilweise. FN5 erhöhte die durchschnittliche Ausschüttung von TNF-, IL-6 und IL-8 auf 142,4 %, FN7 sogar auf 210,7 % im Vergleich zu der Kontrollgruppe [103].

Abbildung 25: Effekte von Weihrauchharzpräparaten (FN) auf die Zytokinausschüttung von LPS-stimuliertem Vollblut und PBMC. (a) Hemmung der Ausschüttung von TNF- und IL-10 in LPS-stimuliertem, humanem Vollblut. Mittelwerte (mean) ± SEM. n = 16 Weihrauchharzpräparate ( = 30 µg/mL), je 5 Donoren. Vergleich zur Kontrollgruppe über Wilcoxon-Test. (b-f) Einfluss der einzelnen Weihrauchharzpräparate ( = 10 µg/mL) auf die Ausschüttung von TNF- (b), IL-1 (c), IL-6 (d), IL-8 (e) und IL-10 (f) aus isolierten PBMC. Die Proben sind in absteigender Reihenfolge entsprechend ihres Gehaltes an -ABA angeordnet. Zusätzlich sind Cluster hinsichtlich der Gehalte und Zusammensetzungen an Boswellia- und Lupeolsäuren angegeben (siehe Abbildung 16): Cluster A (rot), Cluster B (gelb) und Cluster C (grün). Mittelwerte ± SEM. n = 7 Donoren. Vergleich mit Kontrollgruppe über Box-Cox-Transformation, ANOVA und post hoc mit Dunnett-Test. * p < 0,05, ** p < 0,01 und *** p < 0,001. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 8, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Ergebnisse

3.6 Zytotoxische Eigenschaften auf humane Mammakarzinomzellen 3.6.1 Zytotoxische Effekte von Weihrauchharzextrakten auf Mammakarzinomzellen in vitro Um die Effekte von Weihrauchharzextrakten auf Mammakarzinomzellen in vitro zu untersuchen, wurden Zellvitalitäts- und Proliferationsanalysen an der dreifach negativen, humanen Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 durchgeführt. Ein Extrakt, das aus dem Harz der Spezies B. sacra (Probe # 1) gewonnen wurde, inhibierte konzentrationsabhängig die Vitalität von MDA-MB-231-Zellen mit einer mittleren inhibitorischen Konzentration (IC50) von 7,9 µg/mL. PBMC, die als nicht-kanzerogene Kontrollzellen verwendet wurden, reagierten deutlich unempfindlicher auf den Weihrauchharzextrakt (Abbildung 26a) [102].

Die Bestimmung der IC50-Werte aller Weihrauchharzextrakte auf die Zellvitalität ergab eine durchschnittliche inhibitorische Konzentration von 9,7 µg/mL (Abbildung 26b). Proben der Spezies B. sacra waren mit einer durchschnittlichen IC50 von 8,3 µg/mL signifikant zytotoxischer (Mann-Whitney-U-Test, p = 0,015). Extrakte der Spezies B. frereana, die keine nachweisbaren Konzentrationen an Boswellia-/Lupeolsäuren enthielten, waren signifikant untoxischer im Vergleich zu Extrakten der Spezies B. sacra (Mann-Whitney-U- Test, p = 0,013), B. serrata (Mann-Whitney-U-Test, p = 0,023), B. carterii (Mann-Whitney- U-Test, p = 0,037) und B. neglecta (Mann-Whitney-U-Test, p = 0,023). Die Probe # 26 der Spezies B. carterii, die sich aufgrund ihrer außergewöhnlichen Boswellia-/Lupeolsäure- Zusammensetzung von allen anderen Proben unterschied (s. auch Abbildung 14b), wies mit IC50 = 7,3 µg/mL die höchste Zytotoxizität auf (Tabelle 29) [102]. Untersuchungen bezüglich der Korrelation zwischen den Gesamtgehalten an Boswellia-/Lupeolsäuren und der Zytotoxizität auf MDA-MB-231-Zellen in vitro ergaben einen statistisch signifikanten Zusammenhang (Abbildung 26c). Eine genauere Untersuchung der Korrelationen im Hinblick auf die Gehalte der einzelnen Boswellia- /Lupeolsäuren wird im Kapitel 3.7.2 beschrieben.

Tabelle 29: Mittlere inhibitorische Konzentrationen (IC50 in µg/mL) von Weihrauchharzextrakten auf die Vitalität der humanen, dreifach negativen Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 in vitro. XTT-Analyse, 72 h Inkubationszeit, n = 3, jeweils Triplikate. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], S. 8-9, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

B. sacra B. dalzielli B. papyrifera B. serrata B. carterii B. neglecta B. rivae B. frereana

# IC50 # IC50 # IC50 # IC50 # IC50 # IC50 # IC50 # IC50 1 7,90 12 11,44 15 9,47 18 8,81 25 10,38 30 9,06 37 11,10 38 15,72 2 8,70 13 8,99 16 11,65 19 9,81 26 7,28 31 7,89 39 16,81 3 8,08 14 10,10 17 10,12 20 8,14 27 9,42 32 8,10 40 15,28 4 8,84 21 8,29 28 9,83 33 9,13 5 7,67 22 7,82 29 9,26 34 8,73 6 8,99 23 11,62 35 12,85 7 7,62 24 10,89 36 8,63 8 8,63 9 8,14 10 7,33 11 8,81

Ergebnisse

Abbildung 26: Zytotoxizität von Weihrauchharzextrakten auf die humane, dreifach negative Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231. (a) Konzentrationsabhängige Inhibierung der Vitalität von Mammakarzinomzellen (MDA-MB-231) und nicht- kanzerogenen Zellen (PBMC) durch ein Weihrauchharzextrakt (Probe # 1). XTT-Analyse, 72 h Inkubationszeit, n = 3, jeweils Triplikate. Datenpunkte sind Mittelwerte ± SEM. (b) Vergleich der Zytotoxizität von Weihrauchharzextrakten verschiedener Boswellia-Spezies. Kruskal-Wallis-Test und post hoc Mann-Whitney-U-Test (* p < 0,05). Alle Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. (c) Korrelation zwischen dem Gesamtgehalt an Boswellia-/Lupeolsäuren (PTA, pentacyclic triterpenic acids) in Weihrauchharzextrakten und der Zytotoxizität auf MDA-MB-231-Zellen (Spearman-Korrelation, n = 40). Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], S. 12, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Aus dem Harz der Probe # 1 (B. sacra, Superior Hojari) wurde nicht nur ein Gesamtextrakt gewonnen, sondern durch Flüssig-Flüssig-Extraktion und Wasserdampfdestillation bestimmte Stoffgruppen in einzelnen Fraktionen angereichert (Abbildung 27). Auf diese Weise konnte das Gesamtextrakt in eine Säurefraktion und eine Neutralfraktion aufgetrennt werden. Durch Anreicherung der Boswellia-/Lupeolsäuren innerhalb der Säurefraktion von 27,5 % (w/w) auf 67,9 % (w/w) wurde gleichzeitig auch die Toxizität auf MDA-MB-231-Zellen von IC50 = 7,9 µg/mL auf IC50 = 6,0 µg/mL erhöht. Die Neutralfraktion, deren Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalt auf 13,0 % (w/w) reduziert wurde, wies hinsichtlich der Zellvitalität nur eine IC50 = 19,4 µg/mL auf. Das ätherische Öl, das keine nachweisbaren Konzentrationen an Boswellia-/Lupeolsäuren enthielt, zeigte eine eher geringe Zytotoxizität mit IC50 = 25,2 µg/mL. Diese Resultate lassen den Rückschluss zu,

Ergebnisse

dass vor allem saure Komponenten für die zytotoxischen Eigenschaften auf Mammakarzinomzellen verantwortlich sind [102]. Interessanterweise führte die Extraktion des Rückstandes nach der Wasserdampfdestillation zu einem Extrakt mit einer geringeren Ausbeute als erwartet. Trotz Anreicherung der Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalte durch Entfernung des ätherischen Öls, zeigte das Extrakt nach Wasserdampfdestillation mit einer IC50 = 8,8 µg/mL eine geringere Zytotoxizität im Vergleich zum Gesamtextrakt. Dies lässt darauf schließen, dass durch hohe Temperaturen während des Destillationsvorgangs empfindliche Bestandteile des Weihrauchharzes zerstört wurden [102].

Abbildung 27: Zytotoxizität spezieller Extraktfraktionen von Probe # 1 (B. sacra, Superior Hojari) auf MDA-MB-231-Zellen. Quantifizierung von Boswellia-/Lupeolsäuren (PTA, pentacyclic triterpenic acids) mit Hilfe von HPLC-MS/MS. Bestimmung der mittleren

inhibitorischen Konzentrationen (IC50) auf die Zellvitalität gemäß XTT-Analyse (72 h Inkubationszeit, n = 3). Ausbeuten (yields, w/w) beziehen sich auf den jeweiligen Extraktions-/Produktionsschritt. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [102], S. 14, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

3.6.2 Zytotoxische Effekte von Weihrauchharzpräparaten auf Mammakarzinomzellen in vitro 16 kommerziell erhältliche Weihrauchharzpräparate wurden hinsichtlich ihrer inhibitorischen Effekte auf die Zellvitalität der dreifach negativen Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 in vitro untersucht.

Die Proben zeigten eine durchschnittliche mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) von 15,9 µg/mL auf die Zellvitalität (Tabelle 30). Dabei wies die Probe FN16 die höchste

Ergebnisse

Zytotoxizität mit IC50 = 6,0 µg/mL auf. Interessanterweise war der Effekt auf die nicht- kanzerogene Kontrollgruppe (PBMC) geringer, was auf eine mögliche selektive Wirkung auf Krebszellen hinweisen könnte (Abbildung 28a). Auch die Proben FN13 und FN9, die wegen ihrer hohen Gehalte an Boswellia-/Lupeolsäuren zusammen mit Probe FN16 in Cluster A zusammengefasst wurden, zeigten eine signifikant überdurchschnittliche Toxizität auf MDA-MB-231-Zellen (Abbildung 28b). Die Proben FN5 und FN7, welche sich durch ihre geringen Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalte und ihre schlechte Wirkung auf die Zytokinausschüttung auszeichneten, zeigten auch hinsichtlich Zytotoxizität auf MDA-MB- 231-Zellen den geringsten Effekt. Mit IC50 = 44,3 µg/mL für FN5 und IC50 = 30,7 µg/mL für FN7 waren die Effekte auf die Zellvitalität signifikant schlechter als der Gesamtmittelwert. Diese Tatsache deutete auf einen korrelativen Zusammenhang zwischen den Gehalten an Boswellia-/Lupeolsäuren und der Zytotoxizität auf die Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 hin. Um diesen Zusammenhang zu visualisieren, wurde in Abbildung 28c die Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Boswellia-/Lupeolsäure- Zusammensetzung mit einem Kontourplot der IC50-Werte für Zellvitalität kombiniert [103].

Tabelle 30: Mittlere inhibitorische Konzentrationen (IC50 in µg/mL) von 16 Weihrauchharzpräparaten (FN) auf die Vitalität der Mamakarzinomzelllinie MDA-MB- 231. Die Proben sind absteigend nach experimentell ermittelter Toxizität sortiert. Experimentell: XTT-Analyse, 72 h Inkubationszeit, n = 3, jeweils Triplikate. Regressionsanalyse: Hauptkomponentenregression (PCR, principal component regression). Probe FN5 wurde als Ausreißer klassifiziert und nicht für die Regressionsanalyse verwendet (Grubbs-Test). Alle Werte sind Mittelwerte (mean) ± SEM, bzw. SE (Standardfehler des Regressionsmodells). (XTT/Regression) ist die absolute Differenz zwischen experimentellen und berechneten Werten in µg/mL. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 11, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

XTT: IC [µg/mL] Regression: IC [µg/mL]  Probe 50 50 Mean SEM Wert SE (XTT/Regression) FN16 5,99 0,93 6,65 0,93 0,66 FN13 6,62 0,62 5,66 0,62 0,96 FN9 7,04 0,40 7,54 0,40 0,50 FN4 9,46 0,90 8,41 0,90 1,06 FN6 11,03 1,76 9,22 1,76 1,80 FN14 11,63 0,72 13,66 0,72 2,03 FN2 12,22 1,61 13,09 1,61 0,88 FN15 13,15 1,11 15,35 1,11 2,20 FN12 13,17 0,56 14,48 0,56 1,32 FN11 13,87 0,50 13,55 0,50 0,31 FN10 14,98 0,91 14,40 0,91 0,58 FN1 19,43 2,74 18,12 2,74 1,31 FN3 19,55 1,01 18,43 1,01 1,11 FN8 21,52 3,63 21,36 3,63 0,16 FN7 30,74 6,71 30,43 6,71 0,30 FN5 44,30 8,55 / / /

Ergebnisse

Abbildung 28: Zytotoxizität von Weihrauchharzpräparaten (FN) auf die humane, dreifach negative Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231. (a) Konzentrationsabhängige Hemmung der Vitalität von Mammakarzinomzellen (MDA-MB-231) und nicht- kanzerogenen Zellen (PBMC) durch das Weihrauchharzpräparat FN16. XTT-Analyse, 72 h Inkubationszeit, n = 3, jeweils Triplikate. Datenpunkte sind Mittelwerte ± SEM. (b)

Mittlere inhibitorische Konzentrationen (IC50) von 16 Weihrauchharzpräparaten auf die Zellvitalität. Vergleich mit dem Gesamtmittelwert (average) über Box-Cox- Transformation, ANOVA und post hoc Dunnett-Test. Alle Werte sind Mittelwerte ± SEM. n = 3 für die jeweiligen Weihrauchharzpräparate und n = 16 für den Gesamtmittelwert. * p < 0,05, ** p < 0,01 und *** p < 0,001. (c) Korrelation zwischen der Boswellia- /Lupeolsäure-Zusammensetzung und der Zytotoxizität auf MDA-MB-231-Zellen. Biplot der Hauptkomponentenanalyse (s. auch Abbildung 16) in Verbindung mit einem

Ergebnisse

Der mathematische Zusammenhang zwischen chemischer Zusammensetzung und Wirkung auf MDA-MB-231-Zellen wurde mit Hilfe einer Hauptkomponentenregression (PCR, principal component regression) ermittelt. Dieses Verfahren der multivariaten Regressionsanalyse ist hier besonders hilfreich, da anhand der Ergebnisse der PCA ein hohes Maß an Multikollinearität zu erwarten war. Die Probe FN5 wurde mit Hilfe eines Grubbs- Tests als Ausreißer klassifiziert und von der Regressionsanalyse ausgeschlossen. Die Regressionsanalyse resultierte in folgendem Regressionsmodell:

2 2 IC50(µg/mL) = 31,6 − 0,223 PC1 − 0,668 PC2 + 0,000586 PC1 + 0,00737 PC2 + 0,00166 PC1 × PC2 mit

PC1 = 0,289 [KBA] + 0,115 [LA] + 0,316 [α˗BA] + 0,830 [β˗BA] − 0,026 [AKBA] + 0,056 [ALA] + 0,103 [α˗ABA] + 0,316 [β˗ABA] und

PC2 = −0,115 [KBA] − 0,002 [LA] + 0,008 [α˗BA] − 0,064 [β˗BA] + 0,936 [AKBA] + 0,088 [ALA] + 0,136 [α˗ABA] + 0,285 [β˗ABA] wobei [KBA], [LA], [-BA], [-BA], [AKBA], [ALA], [-ABA] und [-ABA] für die jeweiligen Konzentrationen in µg/mg Probe stehen. 96,5 % der Gesamtstreuung (R2) konnten mit Hilfe des Regressionsmodells erklärt werden. Die Beziehung zwischen den X-Variablen (Gehalte der Boswellia-/Lupeolsäuren) und der Y-Variablen (IC50-Werte der Zellvitalität) ist mit p < 0,001 hochsignifikant. Die angepassten Werte des Regressionsmodells wichen von den experimentellen Werten nur um eine mittlere absolute Differenz von ± 1,0 µg/mL ab (Tabelle 30). Das Regressionsmodell könnte als Hilfsmittel zur Abschätzung der Toxizität von Weihrauchharzpräparaten auf MDA-MB-231-Zellen genutzt werden. Um die Genauigkeit zu erhöhen, sollte der Datensatz jedoch erweitert werden [103]. Die Proben FN9, FN13 und FN16, welche die höchsten Toxizitäten auf die MDA-MB- 231-Zelllinie aufwiesen, wurden hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf zwei weitere dreifach negative Mammakarzinomzelllinien (MDA-MB-453 und CAL-51) untersucht. Auch hier zeigten die Proben bemerkenswerte zytotoxische Effekte mit IC50-Werten zwischen 12,9 und 17,3 µg/mL bei MDA-MB-453-Zellen und IC50-Werten zwischen 3,8 und 4,0 µg/mL bei CAL-51-Zellen (Tabelle 31) [103]. Als Positivkontrolle wurde das Chemotherapeutikum Doxorubicin aus der Wirkstoffgruppe der nicht-halogenierten Anthracycline verwendet. Hinsichtlich der Zellvitalität zeigte Doxorubicin mittlere inhibitorische Konzentrationen von

IC50 = 0,41 µg/mL ± 0,03 µg/mL bei MDA-MB-231, IC50 = 0,26 µg/mL ± 0,02 µg/mL bei

MDA-MB-453 und IC50 = 0,033 µg/mL ± 0,004 µg/mL bei CAL-51 [102, 103].

Ergebnisse

Tabelle 31: Mittlere inhibitorische Konzentrationen (IC50 in µg/mL) von drei ausgewählten Weihrauchharzpräparaten auf die Vitalität der dreifach negativen Mammakarzinomzelllinien MDA-MB-231, MDA-MB-453 und CAL-51. XTT-Analyse, 72 h Inkubationszeit, n = 3, jeweils Triplikate. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 12, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

IC50 [µg/mL] Probe MDA-MB-231 MDA-MB-453 CAL-51 Mean SEM Mean SEM Mean SEM FN9 7,04 0,40 14,47 0,91 3,79 0,29 FN13 6,62 0,62 12,89 0,58 3,85 0,32 FN16 5,99 0,93 17,31 0,51 3,96 0,15

3.6.3 Zytotoxische Effekte von Boswellia- und Lupeolsäuren auf Mammakarzinomzellen in vitro Die Untersuchung der Effekte von Weihrauchharzextrakten und -präparaten auf die Mammakarzinomzelllinie MDA-MD-231 (Kapitel 3.6.1) ergab eine signifikante Korrelation zwischen dem Gesamtgehalt an Boswellia-/Lupeolsäuren und der Zytotoxizität in vitro (Abbildung 26c). Um die Kausalität des Zusammenhangs zu überprüfen, wurde die Zytotoxizität der einzelnen Boswellia-/Lupeolsäuren auf die Zelllinie MDA-MD-231 analysiert. Dabei zeigte sich, dass bei Boswelliasäuren die acetylierte Form aktiver war als die deacetylierte Form (Tabelle 32). Die höchste Zytotoxizität wiesen dabei die acetylierten

Boswelliasäuren -AKBA (IC50 = 6,6 µM), -ABA (IC50 = 7,2 µM) und -ABA

(IC50 = 5,9 µM) auf. -ABA zeigte dabei im Vergleich mit der nicht-kanzerogenen PBMC-

Kontrollgruppe (IC50 = 17,5 µM) einen signifikanten Unterschied hinsichtlich der IC50- Werte (Abbildung 29b). Für -AKBA konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den IC50-Werten festgestellt werden, jedoch ergab sich ein signifikanter Unterschied der Zellvitalität bei einer Probenkonzentration von c = 6 µM. Dies deutete auf eine mögliche Selektivität hinsichtlich des Effekts auf Krebszellen hin. Im Gegensatz zu den Boswelliasäuren war bei der Lupeolsäure die deacetylierte Form (IC50 = 12,3 µM) aktiver als die acetylierte Lupeolsäure (IC50 = 26,9 µM) [103].

Abbildung 29: Konzentrationsabhängige Hemmung der Vitalität von Mammakarzinomzellen (MDA-MB-231) und nicht-kanzerogenen Zellen (PBMC) durch -AKBA (a) und -ABA (b). XTT-Analyse, 72 h Inkubationszeit, n = 3, jeweils Triplikate. Datenpunkte sind Mittelwerte ± SEM. Statische Vergleiche mit Hilfe von Student-t-Test mit * p < 0,05 und ** p < 0,01. Abbildung adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/). 69

Ergebnisse

Tabelle 32: Mittlere inhibitorische Konzentrationen von Boswellia- und Lupeolsäuren auf die Vitalität der dreifach negativen Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231. Acetylierte Boswelliasäuren waren wirksamer als deacetylierte. Lupeolsäure war hingegen in der deacetylierten Form aktiver. XTT-Analyse, 72 h Inkubationszeit, n = 3, jeweils Triplikate. Mittelwerte (mean) ± SEM. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 12, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

IC50 Substanz µg/mL µM Mean SEM Mean SEM -KBA 19,75 2,18 41,96 4,63 -KBA 11,98 0,41 25,45 0,87 LA 5,64 0,09 12,35 0,20 -BA 4,95 0,40 10,84 0,88 -BA 4,25 0,11 9,31 0,24 -AKBA 14,10 1,08 27,50 2,11 -AKBA 3,36 0,11 6,55 0,21 ALA 13,41 0,49 26,89 0,98 -ABA 3,61 0,50 7,24 1,00 -ABA 2,95 0,39 5,91 0,78

3.6.4 Effekte von Weihrauchharzpräparaten und Boswelliasäuren auf xenotransplantierte Mammakarzinome in vivo Um die Wirksamkeit von Weihrauchharzpräparaten und Boswelliasäuren auf Mammakarzinomzellen am lebenden Objekt (in vivo) zu untersuchen, wurde das CAM- Modell verwendet. Dazu wurden MDA-MB-231-Zellen auf die Chorioallantoismembran (CAM) von befruchteten Hühnereiern xenotransplantiert (Abbildung 30a). Für das Experiment wurde das Weihrauchharzpräparat FN16 ausgewählt, da dieses die höchste Zytotoxizität auf MDA-MB-231-Zellen in vitro aufwies. Zusätzlich wurden mit -AKBA und -ABA die Reinsubstanzen untersucht, die ebenfalls die höchsten Effekte in vitro zeigten. DMSO (0,5 %) diente als Negativkontrolle und Doxorubicin als Positivkontrolle. Unter der Behandlung mit dem Weihrauchharzpräparat FN16 konnte eine signifikante, dosisabhängige Reduzierung der Tumorgröße festgestellt werden (Abbildung 30b). Immunhistochemische Untersuchungen der Tumore mit Hilfe der Ki-67- und TUNEL- Färbung ergab, dass FN16 signifikant die Zellproliferation senkte und Apoptose induzierte (Abbildung 30c, d). Auch durch die Behandlung mit -ABA konnte die Tumorgröße verringert werden, während -AKBA keinen signifikanten Effekt auf die Tumorgröße im Vergleich zur Kontrollgruppe aufwies. Jedoch zeigten beide Boswelliasäuren hemmende Wirkung auf die Zellproliferation sowie verstärkte Apoptose. Obwohl Doxorubicin hervorragende Ergebnisse bei der Behandlung von MDA-MB-231-Zellen in vitro aufwies, war seine Wirksamkeit bei einer Konzentration von 1 µM als Positivkontrolle in diesem Versuch nicht zufriedenstellend. Bemerkenswerterweise wurden keine systemisch-

Ergebnisse

toxischen Effekte in den behandelten Gruppen festgestellt, die zum Tod der empfindlichen Hühnerembryos geführt hätten [103].

Abbildung 30: Weihrauchharzpräparate und Boswelliasäuren hemmen die Zellproliferation und das Tumorwachstum und induzieren Apoptose bei dreifach negativen Mammakarzinomen. MDA-MB-231-Zellen wurden auf die Chorioallantoismembran (CAM) von befruchteten Hühnereiern xenotransplantiert und an drei aufeinander folgenden Tagen topisch behandelt. Als Testsubstanzen dienten das Weihrauchharzpräparat FN16 (5 µg/mL und 10 µg/mL), die Boswelliasäuren -AKBA und -ABA (je 10 µM) sowie Doxorubicin (1 µM) und DMSO (0,5 %) als Kontrollgruppen. (a) Erste Reihe: Photographien der Tumore direkt nach der Entnahme. Zweite Reihe: Hämatoxylin-Eosin- Färbung (HE) zur Visualisierung von Tumorgewebe. Dritte Reihe: Anfärbung des Proliferationsmarkers Ki-67 (rot). Vierte Reihe: Anfärbung apoptotischer Zellen mit Hilfe der TUNEL-Methode (braun). (b) FN16 und -ABA reduzieren die Tumorgröße. (c) FN16, β-AKBA und -ABA hemmen die Zellproliferation. (d) FN16, β-AKBA und -ABA induzieren Apoptose. Alle Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 4. Vergleich mit Kontrollgruppe über Kruskal-Wallis-Test und post hoc Dunn-Test mit * p < 0,05, ** p < 0,01 und *** p < 0,001. Abbildung adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 14, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Ergebnisse

3.7 Untersuchung von Korrelationen 3.7.1 Korrelation zwischen chemischer Zusammensetzung und Wirkung auf die Zytokinausschüttung Die Untersuchung der Wirkung von Weihrauchharzpräparaten auf die Zytokinausschüttung deutete auf einen Zusammenhang zwischen dem Effekt und der Boswellia-/Lupeolsäuren-Zusammensetzung hin. Weihrauchharzpräparate mit einem hohen Gesamtgehalt an Boswellia- und Lupeolsäuren hatten einen größeren Einfluss auf die Hemmung der Zytokinausschüttung als Präparate, die einen geringeren Gehalt aufwiesen. Daher wurden die Korrelationen zwischen den Gehalten der einzelnen Boswellia- und Lupeolsäuren und der Zytokinausschüttung untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass sowohl der Gesamtgehalt an Boswellia-/Lupeolsäuren als auch besonders die Gehalte an acetylierten Boswellia-/Lupeolsäuren ALA, -ABA und -ABA mit der Hemmung von TNF-, IL-6, IL-8 und IL-10 korrelieren (Tabelle 33). AKBA zeigte hingegen die geringsten Korrelationen. Aufgrund des ungewöhnlich hohen AKBA-Gehaltes der Probe FN8 könnte diese als Ausreißer elimiert werden (Grubbs- Test). Durch diese Maßnahme würden sich signifikante Korrelationen zwischen den AKBA- Gehalten der übrigen Proben (n = 15) und den entsprechenden Zytokinausschüttungen ergeben: p = 0,007 für TNF-, p < 0,001 für IL-1, p = 0,011 für IL-6, p = 0,006 für IL-8 und p = 0,001 für IL-10. Die Effekte auf die einzelnen Zytokine korrelieren untereinander ebenso signifikant, wobei IL-1 die niedrigsten Korrelationen aufwies (Abbildung 31) [103].

Tabelle 33: Korrelationen zwischen den Gehalten an Boswellia-/Lupeolsäuren und der Hemmung der Zytokinausschüttung aus PBMC durch Weihrauchharzpräparate. Spearman- Korrelation mit Korrelationskoeffizient R und * p < 0,05, ** p < 0,01 und *** p < 0,001. n = 16. Tabelle adaptiert aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 9, © 2019, CC- BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Substanz / TNF- IL-1 IL-6 IL-8 IL-10 Zytokin R p R p R p R p R p KBA -0,621 * -0,241 > 0,05 -0,744 *** -0,665 ** -0,656 ** LA -0,621 ** -0,341 > 0,05 -0,832 *** -0,791 *** -0,765 *** -BA -0,721 ** -0,356 > 0,05 -0,815 *** -0,774 *** -0,774 *** -BA -0,709 *** -0,359 > 0,05 -0,850 *** -0,815 *** -0,794 *** AKBA -0,735 * -0,714 ** -0,430 > 0,05 -0,530 * -0,511 * ALA -0,537 *** -0,784 *** -0,884 *** -0,890 *** -0,918 *** -ABA -0,867 *** -0,797 *** -0,891 *** -0,897 *** -0,932 *** -ABA -0,879 *** -0,447 > 0,05 -0,932 *** -0,903 *** -0,900 *** S(BAs/LAs) -0,847 *** -0,318 > 0,05 -0,835 *** -0,818 *** -0,785 *** TNF- 0,612 * 0,959 *** 0,968 *** 0,944 *** IL-1 0,535 * 0,600 * 0,624 ** IL-6 0,976 *** 0,947 *** IL-8 0,947 ***

Ergebnisse

3.7.2 Korrelation zwischen chemischer Zusammensetzung und zytotoxischer Wirkung auf Mammakarzinomzellen Die Untersuchung der Wirkung von Weihrauchharzextrakten (Probe # 1 - 40) unterschiedlicher Boswellia-Spezies auf dreifach negative Mammakarzinomzellen zeigte, dass Extrakte mit vergleichsweise hohen Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalten auch einen stärkeren zytotoxischen Effekt auf die Zellen hatten (s. Kapitel 3.6.1). Dabei konnte eine signifikante Korrelation zwischen den mittleren inhibitorischen Konzentrationen auf die Zelllinie MDA-MB-231 und dem Gesamtgehalt an Boswellia-/Lupeolsäuren festgestellt werden (Spearman-Korrelation, p = 0,003, n = 40, s. auch Abbildung 26). Die Untersuchung der Zytotoxizität der einzelnen Substanzen bestätigte die Kausalität des Zusammenhangs (s. Kapitel 3.6.3). Die Korrelationsanalyse zwischen den Konzentrationen der einzelnen Inhaltstoffe und der Zytotoxizität der Extrakte zeigte besonders hohe Spearman- Korrelationen für die acetylierten Substanzen ALA (p = 0,0004), -ABA (p = 0,002) und -ABA (p = 0,0001). Auch die deacetylierten Komponenten LA (p = 0,008) und -BA (p = 0,022) wiesen signifikante Korrelationen auf. Die Korrelationen von KBA, -BA und AKBA erwiesen sich als nicht signifikant (p > 0,05) [102]. Die Korrelationsanalyse der Ergebnisse der Weihrauchharzpräparate (FN 1 - 16) führte zu noch eindeutigeren Ergebnissen. Mit Ausnahme von AKBA zeigten sowohl der Gesamtgehalt als auch die Gehalte aller einzelnen Boswellia-/Lupeolsäuren hochsignifikante Korrelationen (p < 0,001) mit der Zytotoxizität auf MDA-MB-231-Zellen (Abbildung 31). -ABA wies dabei den höchsten Korrelationskoeffizienten (R = -0,942) auf.

Abbildung 31: Korrelationen zwischen den Gehalten an Boswellia-/Lupeolsäuren in Weihrauchharzpräparaten, deren Wirkung auf die Zytokinausschüttung aus PBMC und

ihre Zytotoxizität auf die Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 (IC50). Spearman- Korrelation, n = 16. Zelleninhalt oben: jeweiliger Korrelationskoeffizient R. Zelleninhalt unten: jeweiliger Signifikanzwert p. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], Supplementary materials, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Ergebnisse

3.7.3 Korrelation zwischen der Zytokinausschüttung aus LPS- stimulierten PBMC und der zytotoxischen Wirkung auf Mammakarzinomzellen Zusätzlich zur Korrelationsanalyse zwischen den Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalten und der Zytokinausschüttung bzw. der Zytotoxizität wurden auch die Korrelationen zwischen den Effekten untersucht. Die Analyse ergab hochsignifikante Korrelationen zwischen dem Effekt der Weihrauchharzpräparate auf die Ausschüttung der Zytokine TNF-, IL-6, IL-8, IL-10 und der mittleren inhibitorischen Konzentration auf die Vitalität von MDA-MB-231- Zellen (Abbildung 31). Die Ausschüttung von IL-1 korrelierte mit der Ausschüttung der anderen Zytokine und den IC50-Werten zwar signifikant, jedoch mit deutlich niedrigeren Korrelationskoeffizienten. Diese Ergebnisse verdeutlichen noch einmal, dass die Weihrauchharzpräparate mit den höchsten Gehalten an Boswellia- und Lupeolsäuren nicht nur die stärkste Hemmung auf die Zytokinausschüttung aus PBMC erzielten, sondern auch die höchste Zytotoxizität auf MDA-MB-231-Zellen in vitro zeigten (Abbildung 32) [103].

Abbildung 32: Heatmap zur Darstellung des Zusammenhangs zwischen den Gehalten an Boswellia-/Lupeolsäuren von Weihrauchharzpräparaten (FN) und deren Effekte auf die Zytokinexpression bzw. deren zytotoxische Wirkung auf die Mammakarzinomzelllinie

MDA-MB-231 (IC50). Die Clusteranalyse der Objekte (FN 1-16) wurde mit Hilfe von standardisierten Variablen, euklidischen Abständen und vollständiger Kopplung berechnet. Die Clusteranalyse der Variablen (Gehalte an Boswellia-/Lupeolsäuren, Ausschüttung der

einzelnen Zytokine und IC50-Werte) wurde mit den Abständen der Korrelationskoeffizienten und vollständiger Kopplung durchgeführt. Alle Werte sind standardisiert, die Effekte sind zusätzlich invertiert. +1 bedeutet hoher Gehalt der entsprechenden Boswellia-/Lupeolsäure im Weihrauchharzpräparat bzw. hoher Effekt des Weihrauchharzpräparats. -1 bedeutet dementsprechend niedriger Gehalt bzw. niedriger Effekt. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [103], S. 13, © 2019, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Diskussion

4. Diskussion Schon seit vielen Jahrhunderten dient Weihrauchharz der Boswellia-Bäume nicht nur rituellen Handlungen, sondern wird auch für medizinische Zwecke verwendet. Erste medizinische Anwendungen lassen sich bis in das 16. Jahrhundert vor Christus zurückverfolgen [2]. Sowohl Ärzte der ayurvedischen als auch der griechisch-römischen Antike wussten die therapeutischen Eigenschaften des Weihrauchharzes zu schätzen [1]. So wurde das Wissen über die entzündungshemmende, analgetische und antibiotische Wirkung des Weihrauchharzes über viele Jahrhunderte in der indischen, afrikanischen, arabischen und chinesischen Volksmedizin weitergegeben [3, 95]. Interessanterweise wurde Weihrauchharz schon damals bei Symptomen eingesetzt, die mit chronisch-entzündlichen Krankheiten und Krebserkrankungen in Zusammenhang stehen [1, 2, 4]. Erst seit Ende des 20. Jahrhunderts untersucht die moderne Medizin und Wissenschaft intensiv die Wirkmechanismen von Weihrauchharz und seinen Inhaltsstoffen. Weihrauchharz ist ein Vielstoffgemisch aus Harzen, ätherischen Ölen, Gummen und Schleimstoffen [37, 110]. Bei Untersuchungen der entzündungshemmenden Wirkung von Extrakten des indischen Weihrauchharzes (B. serrata) Anfang der 1990er-Jahre kristallisierten sich die enthaltenen Boswelliasäuren als pharmakologisch interessanteste Stoffgruppe heraus [59, 61, 62]. Boswelliasäuren gehören zur Gruppe der pentazyklischen Triterpensäuren und wurden erstmals im Jahr 1932 aus Weihrauchharz isoliert [31]. In den Folgejahren wurden weitere Triterpenoide wie Lupeol, Amyrin, Lupeolsäuren und Tirucallensäuren im Weihrauchharz entdeckt [26, 27, 32-34]. Als charakteristische Stoffgruppe behielten jedoch Boswellia- und Lupeolsäuren ihr Alleinstellungsmerkmal, da diese bisher ausschließlich in der Gattung Boswellia und dem daraus gewonnen Weihrauchharz nachgewiesen werden konnten [39, 111]. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl an Wirkmechanismen von Weihrauchharzextrakten und der darin enthaltenen Boswellia- und Lupeolsäuren aufgeklärt und postuliert. Historisch zählt die Interaktion von Boswelliasäuren mit dem Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) und der daraus resultierenden Hemmung der Leukotrienbiosynthese zu den ersten molekular identifizierten Mechanismen [59, 61, 62]. Der Wirkmechanismus konnte jedoch bis heute nicht in vivo bestätigt werden und es bleibt fraglich, ob eine ausreichend hohe Plasmakonzentration erreicht werden kann, um 5-LO direkt zu inhibieren [63]. Parallel zur Erforschung der entzündungshemmenden Wirkung wurde die Zytotoxizität von Weihrauchharzen und deren Inhaltstoffen auf zahlreiche Krebszelllinien untersucht, wie z. B. Leukämiezellen, Leberkarzinomzellen, Glioblastomzellen, Kolonkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Melanomzellen und Pankreaskarzinomzellen [45, 95]. Als ein sehr interessanter molekularer Angriffspunkt von Boswelliasäuren stellte sich die Hemmung der Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-B durch Interaktion mit dem Enzym IB-Kinase (IKK) heraus. NF-B ist für die Expression von sowohl proinflammatorischen Proteinen als auch von Wachstumsfaktoren verantwortlich [67]. Die hemmende Wirkung von Boswelliasäuren auf NF-B erklärt somit sowohl die antiinflammatorische als auch die antitumorale Wirkung von Weihrauchharzen. Zudem konnte dieser Mechanismus bereits in mehreren Studien in vivo bestätigt werden [68-70]. Darüber hinaus reguliert NF-B u. a. die 75

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Genexpression der Enzyme Phospholipase A2 (PLA2) und 5-LO und dadurch indirekt die Leukotrienbiosynthese [58]. In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche weitere Wirkmechanismen und molekulare Angriffspunkte von Boswellia- und Lupeolsäuren identifiziert [14, 42, 45, 46]. Zudem wurde in mehreren klinischen Studien an Patienten gezeigt, dass Weihrauchharzextrakte ein potentielles Therapeutikum bei der Behandlung von chronischen Darmentzündungen, Asthma bronchiale, Osteoarthritis und sogar Hirntumoren darstellen [71-77, 79, 81, 82, 86, 97, 98]. Interessanterweise konnten dabei im Gegensatz zur Standardtherapie keine oder nur leichte Nebenwirkungen, wie Störungen des Magen-Darm- Traktes, beobachtet werden [72, 73, 81, 82]. Ein großes Problem bei der Behandlung mit Weihrauchharzpräparaten stellt die schlechte Bioverfügbarkeit von Boswellia- und Lupeolsäuren dar. Sterk et al. konnten in einer Studie zeigen, dass die Einnahme von Weihrauchharzpräparaten in Verbindung mit einer gleichzeitigen Nahrungsaufnahme die Bioverfügbarkeit von Boswelliasäuren signifikant steigert. Dieser Effekt wurde dadurch erklärt, dass bei der Verdauung, insbesondere von fettreichen Mahlzeiten, verstärkt Gallensäuren sezerniert werden, welche die Resorption von Boswelliasäuren begünstigen. Alternative Ansätze sind die Herstellung von Formulierungen mit Lösungsvermittlern wie Lecithin und Polysorbat 80 [112, 113]. Solche Beimischungen sind jedoch mit Vorbehalten zu betrachten, da z. B. Polysorbat 80 im Mausversuch bei längerer Einnahme wiederrum zu chronischen Darmentzündungen führte [114]. Im folgenden Diskussionsteil werden die Ergebnisse dieser Arbeit interpretiert und in den Kontext des aktuellen Stands der Wissenschaft eingeordnet. Die als Grundlage dienenden Ergebnisse sind größtenteils bereits in eigenen Publikationen veröffentlicht (Schmiech et al., Molecules, 2019 [102]; Schmiech et al., Nutrients, 2019 [103]; Schmiech et al., Molecules, 2021 [104]). Dieser Urheberrechtsvermerk bezieht sich demnach auf alle eigenen Ergebnisse in den Kapiteln 4.1 - 4.8.

4.1 Extraktion potentiell bioaktiver Stoffgruppen aus Weihrauchharzen Das Rohharz des Boswellia-Baumes besteht zu 5 - 9 % aus ätherischem Öl, 15 - 20 % Harzsäuren und 25 - 30 % etherunlöslichen Bestandteilen (Gummen, Polysacharide) [2, 28]. Da es sich bei Weihrauchharz um ein Naturprodukt handelt, sind im Rohharz oft Verunreinigungen wie Holz- und Rindenrückstände sowie kleinere Steine zu finden. Eine Extraktion zur Abtrennung von Verunreinigungen und Anreicherung der potentiell biomedizinisch interessanten Fraktionen ist daher unerlässlich. Im Jahr 2003 verglichen Büchele et al. verschiedene Lösungsmittel zur Extraktion von Weihrauchharz, wobei sich u. a. Methanol (MeOH) als hervorragendes Extraktionsmittel herausstellte [28]. In der hier durchgeführten Studie wurde bei der Entwicklung eines neuen Extraktionsverfahrens MeOH verwendet, da es neben seinen sehr guten Lösungseigenschaften, eine optimale Kompatibilität mit dem chromatographischen System auf Basis der Umkehrphasentrennung gewährleistet. Um thermolabile Inhaltstoffe nicht zu zerstören, wurde bewusst auf eine Soxhlet-Extraktion verzichtet und ein schonendes, aber

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dennoch erschöpfendes Extraktionsverfahren bei Raumtemperatur entwickelt. Eine repetitive, dreimalige Extraktion im Substrat-Lösungsmittel-Verhältnis 1/8 (w/v) wies eine relative Extraktionseffizienz von 99,6 % auf. Analysen mit Hilfe von HPLC-MS/MS zeigten, dass 99,95 % der im Weihrauchharz enthalten Boswellia- und Lupeolsäuren extrahiert wurden. Das Verfahren wurde aufgrund dieser Kennzahlen als erschöpfend angesehen. Zum Zweck der chemischen Analyse und biomedizinischer Untersuchung wurden insgesamt 41 verschiedene Weihrauchharzproben neun unterschiedlicher Boswellia-Spezies extrahiert. Die durchschnittliche Extraktionsausbeute betrug 65,4 % (w/w). Dies entspricht dem prozentualen Anteil von 55 - 66 % Reinharz im Rohharz, der in der Literatur beschrieben wird [2, 42]. Interessanterweise war die Extraktionsausbeute bei Weihrauchharz der Spezies B. frereana mit 88,8 % signifikant überdurchschnittlich. Die höhere Ausbeute kann dadurch erklärt werden, dass Harze der Spezies B. frereana einen geringeren Anteil an Gummen d. h. alkohol-unlöslichen Polysacchariden besitzen [6]. Um selektiv einzelne Substanzgruppen zu untersuchen, wurde ein Extrakt fraktioniert. Auf diese Weise konnten saure Inhaltstoffe wie Boswellia- und Lupeolsäuren beträchtlich angereichert werden.

4.2 Quantifizierung von Boswellia- und Lupeolsäuren Zur Quantifizierung von Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharz wurde eine hochsensitive, nachweisstarke und genaue Methode unter Verwendung der Hochleistungs- flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit der Tandem-Massenspektromtrie (HPLC- MS/MS) entwickelt. Die Methodenentwicklung fokussierte sich auf die pentazyklischen Triterpensäuren -Boswelliasäure (-BA), 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA), -Boswelliasäure (-BA), 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA), 11-Keto-β- boswelliasäure (-KBA), 3-O-Acetyl-11-keto-β-boswelliasäure (-AKBA), Lupeolsäure (LA) und Acetyl-lupeolsäure (ALA). Weitere Boswelliasäuren, die nachweislich nur in sehr geringen Mengen vorkommen, wurden nicht mit in die Methodenentwicklung aufgenommen [9, 28]. Eine besondere Herausforderung bei der selektiven Analyse von pentazyklischen Triterpenoiden wie Boswellia- und Lupeolsäuren besteht in der Ähnlichkeit ihrer chemischen Strukturen. Daraus resultiert eine entsprechend ähnliche Wechselwirkung mit dem chromatographischen Trennsystem, was wiederum die Trennung erschwert [9]. Zudem sind -Boswelliasäure, -Boswelliasäure und Lupeolsäure sowie deren acetylierte Formen Konstitutionsisomere und weisen somit identische molare Massen auf. Auch bei stoßinduzierter Fragmentierung im Massenspektrometer zerfallen diese Triterpenoide zu Produkt-Ionen mit derselben Masse [115]. Zur selektiven Quantifizierung der einzelnen Boswellia- und Lupeolsäuren ist eine ausreichende chromatographische Trennung daher unabdingbar. Trotz der komplexen Problemstellung konnte die Elutionszeit im Vergleich zu früheren Methoden durch Optimierung der Trennparameter sowie der Verwendung von stationären Phasen mit kleinerem Partikeldurchmesser deutlich verbessert werden. Die Analysenzeit wurde von 66 - 100 min [7, 28, 37, 115] auf 30 min erheblich verkürzt, was einen höheren

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Probendurchsatz erlaubt. Durch die hochsensitive tandem-massenspektrometrische Detektion der Produkt-Ionen konnten zudem Nachweisgrenzen zwischen 0,7 ng und 1,9 ng je mg Probe erreicht werden. Die Einführung von Maslinsäure als internen Standard gewährleistet eine präzise Bestimmung trotz der komplexen biologischen Matrix von Boswellia-Harzen und ermöglicht auch zukünftige Anwendungen wie die Bestimmung von Plasmaspiegeln. Dafür war bisher eine sehr aufwendige Probenvorbereitung notwendig [37]. Zur Verifizierung der entwickelten Methode wurde diese hinsichtlich Vergleichs- und Wiederholpräzision, Empfindlichkeit, Richtigkeit und Wiederfindung nach DIN 32645 [105] validiert. Mit Hilfe der entwickelten und validierten Methode wurden die Gehalte an Boswellia- und Lupeolsäuren in 41 Weihrauchharzextrakten und 16 Weihrauchharzpräparaten bestimmt. Mit Hilfe der zuvor ermittelten Extraktionsausbeuten war es möglich die Gehalte in Bezug auf die ursprüngliche Weihrauchharzprobe anzugeben. Der Gesamtgehalt an Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzen variierte dabei je nach Spezies zwischen 0 % und 25,3 % (w/w). Die individuelle Zusammensetzung der einzelnen Proben konnte genutzt werden, um zwischen unterschiedlichen Spezies und Herkunftsregionen zu unterscheiden (Kapitel 4.5). Die Analyse von 16 Weihrauchharzpräparaten ergab Gesamtgehalte zwischen 0,4 % und 35,7 % (w/w) Boswellia- und Lupeolsäuren. Dies entsprach einem Gehalt zwischen 3,5 mg und 157,3 mg Boswellia- und Lupeolsäuren je Kapsel oder Tablette. Die Produkte Sallaki© und H15©, die als Prüfpräparate für die meisten klinischen Studien mit Weihrauchharzpräparaten dienten [23, 71, 72, 76, 97], konnten sich hinsichtlich des Gesamtgehalt an Boswellia- und Lupeolsäuren nur im Mittelfeld platzieren. Die in der Literatur beschriebene Boswelliasäure-Zusammensetzung dieser Produkte [110] konnten durch die Analysen bestätigt werden. Boswelliasäure-Gehalte von über 80 %, mit denen einige Hersteller werben, konnten hingegen nicht bestätigt werden. Eine Erklärung dafür ist, dass der Boswelliasäure-Gehalt zumeist über nicht-wässrige Titration mit Kaliummethanolat bestimmt wird [116]. Bei dieser Methode werden nicht nur Boswelliasäuren erfasst, sondern vielmehr alle sauren Inhaltstoffe, was systematisch zu überhöhten Werten führt. Im Gegensatz dazu detektiert die hier entwickelte Methode selektiv und hochspezifisch individuelle Boswellia- und Lupeolsäuren, um eine exakte Quantifizierung zu gewährleisten.

4.3 Charakterisierung einer neuen Boswelliasäure: 11-Keto-- boswelliasäure (-KBA) Boswelliasäuren kommen in zwei verschiedenen Strukturtypen vor: dem Oleanan-Typ, von dem sich alle -Boswelliasäuren ableiten und dem Ursan-Typ, von dem sich alle -Boswelliasäuren ableiten. Die entsprechenden Boswelliasäuren sind somit Konstitutionsisomere, die sich allein durch die Stellung von zwei Methylgruppen unterscheiden [26, 27]. Lange Zeit wurde angenommen, dass 11-Keto-boswelliasäuren nur in Form von -Boswelliasäuren existieren [39]. Daher wird in der Literatur sehr oft von KBA und AKBA

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gesprochen, obwohl explizit die -Isomere -KBA und -AKBA gemeint sind [42, 45, 46, 48, 63]. Dies ist darin begründet, dass fast alle chromatographischen Trennmethoden zur Quantifizierung und Isolierung von Boswelliasäuren auf C18-Phasen basieren und damit die Konstitutionsisomere von KBA und AKBA nicht getrennt werden konnten [7-9, 28, 37, 102, 103, 115]. Erst 70 Jahre nach der Entdeckung der ersten Boswelliasäuren konnte im Jahr 2005 von Büchele et al. nachgewiesen werden, dass neben -AKBA auch das -Isomer -AKBA existiert [40, 41]. Ausschlaggebend für die erfolgreiche chromatographische Trennung der beiden Isomere war die Verwendung von stationären Phasen mit Pentafluorphenylgruppen (PFP). PFP-Gruppen weisen im Vergleich zu herkömmlichen C18-Gruppen bessere Eigenschaften hinsichtlich Dipol-Dipol-Wechselwirkung, --Wechselwirkung und Elektronen-Donor-Akzeptor-Wechselwirkung auf [117, 118]. Infolge der Entdeckung von -AKBA wurde postuliert, dass auch ein -Isomer der KBA existieren müsste, da die Biosynthese von -AKBA über den Vorläufer -KBA erfolgen muss [39]. Im Zuge dieses Projektes war es nun erstmals möglich -KBA direkt zu charakterisieren und dessen Vorkommen in Weihrauchharz nachzuweisen. Für die Methodenentwicklung wurde zunächst -KBA durch Deacetylierung aus -AKBA synthetisiert, aufgereinigt und mittels Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) strukturell charakterisiert. Anschließend konnte mit Hilfe statistischer Versuchsplanung (DoE) unter Verwendung eines orthogonalen 3-faktoriellen zentral zusammengesetzten Versuchsplans eine Methode entwickelt werden, die erstmals die chromatographische Trennung von -KBA und -KBA erlaubte. Dadurch wurde eine selektive Quantifizierung der KBA-Isomere ermöglicht. Erste Messungen in Harzen der Spezies B. sacra und B. serrata zeigten, dass -KBA ca. 4 - 5 % des Gesamtgehaltes an KBA ausmachen.

4.4 Chemische Zusammensetzung ätherischer Öle aus Weihrauchharzen Zusätzlich zur methanolischen Extraktion wurde durch Wasserdampfdestillation das ätherische Öl aus Weihrauchharzen acht verschiedener Spezies gewonnen. Der Anteil an ätherischem Öl in Weihrauchharz variierte dabei zwischen 1,2 % und 9,7 % (w/w). Die Proben wurden anschließend gaschromatographisch untersucht um ihre Mono- und Diterpenoid-Zusammensetzungen zu vergleichen. Die Analysen ergaben, dass das ätherische Öl der Spezies B. serrata 41,4 % Myrcen enthielt. Solch eine hohe Konzentration an Myrcen in Harzen von B. serrata ist eher ungewöhnlich [24, 119]. Der Gehalt ist dabei nicht unbedenklich, da die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC, International Agency for Research on Cancer) Myrcen im Jahr 2017 als potentiell krebserregend eingestuft hat [120, 121]. Zudem enthielt das ätherische Öl der Spezies B. serrata als einzige Probe 6,0 % Methylchavicol (Estragol), das im Verdacht steht sowohl potentiell genotoxisch als auch krebserregend zu sein [122-124]. Interessanterweise konnte in allen Proben das Monoterpen Hashishen (5,5-Dimethyl-1- vinylbicyclo-[2.1.1]-hexan) nachgewiesen werden. Hashishen konnte bisher ausschließlich

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in Haschisch, dem Harz der Cannabispflanze gefunden werden und entsteht während der Gewinnung von Haschisch durch photochemische Reaktion von Myrcen [125]. Eine derartige Reaktion ist auch bei der Ernte von Weihrauchharzen denkbar. Bestärkt wird diese Annahme dadurch, dass die Probe (B. serrata) mit dem höchsten Gehalt an Hashishen auch den höchsten Gehalt an Myrcen enthielt. Die gaschromatographische Untersuchung zeigte, dass in keinem der ätherischen Öle die Triterpenoide -Amyrin, -Amyrin und Lupeol enthalten waren. Ebenso führten Analysen mittels HPLC-MS/MS zu dem Ergebnis, dass die ätherischen Öle keine nachweisbaren oder nur Spuren von Boswellia- und Lupeolsäuren enthielten. Ein weiteres pharmakologisch interessantes Terpenoid in Weihrauchharz ist das Cembranoid-Diterpen Incensol sowie die acetylierte Form Incensol-acetat. Diese Substanzen zeigten in Studien eine potentiell antiinflammatorische, antidepressive und anxiolytische Wirkung [17, 18, 126]. Die höchsten Gehalte an Incensol und Incensol-acetat wurden laut Literatur in Weihrauchharzen der Spezies B. papyrifera nachgewiesen [127]. Die gaschromatographische Analyse führte zum gleichen Ergebnis, dass nämlich von allen untersuchten ätherischen Ölen die Probe aus B. papyrifera den höchsten Gehalt an Incensol aufwies. Die in der Literatur beschriebenen Gehalte an Incensol in ätherischen Ölen variieren stark [17]. Dies lässt darauf schließen, dass die Prozessparameter der Wasserdampfdestillation großen Einfluss auf den Gehalt an höheren Terpenoiden wie Incensol, Amyrin und Boswelliasäuren in ätherischen Ölen haben.

4.5 Chemotaxonomische Unterscheidung verschiedener Boswellia-Spezies Der Gattung Boswellia wird heute in ca. 25 verschiedene Spezies eingeteilt, wobei von vier Stammpflanzen ausgegangen wird: B. sacra, B. carterii, B. serrata und B. frereana [1, 2]. Bei der taxonomischen und botanischen Zuordnung einzelner Spezies gibt es jedoch seit jeher Uneinigkeiten. Am deutlichsten wird diese Problematik am Beispiel der Spezies B. sacra und B. carterii. Die arabische Stammpflanze B. sacra wurde 1867 durch Friedrich August Flückiger benannt [2]. Bereits im Jahr 1870 wurde sie von George Birdwood in B. carterii umbenannt [16]. Frank Nigel Hepper differenzierte 1969 die beiden Spezies in B. sacra Flück. als arabische Stammpflanze und B. carterii Birdw. als afrikanische Stammpflanze [128]. Bis heute wird diskutiert, ob es sich bei B. sacra und B. carterii um eine oder zwei verschiedene Spezies handelt [7-11, 115]. Ähnlich verhält es sich bei anderen Boswellia-Spezies. Gründe dafür sind die Überlappung der Verbreitungsgebiete sowie die oft schwierigen ökonomischen und politischen Situationen in den Anbauländern, was eine botanische Bestimmung erschwert [12]. Neben einer bislang ausstehenden pflanzlichen Genotypisierung könnte die Chemotaxonomie einen alternativen Ansatz bieten, d. h. eine Klassifizierung auf Grundlage der biochemischen Zusammensetzung sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe [129]. Im Zuge dieses Projektes wurden insgesamt 41 Weihrauchharzproben neun verschiedener Boswellia-Spezies mittels HPLC-MS/MS hinsichtlich ihrer Triterpenoid-Zusammensetzung untersucht. Der daraus resultierende Datensatz wurde mit Hilfe multivariater Datenanalyse ausgewertet, um Muster und

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Zusammenhänge zu erkennen. Aufgrund der chemischen Analysen und statistischen Auswertungen konnten die Weihrauchharzproben erfolgreich in unterschiedliche Gruppen eingeteilt werden. Weihrauchharze der Spezies B. serrata (Indien) zeigten ein charakteristisches Verhältnis zwischen acetylierten und deacetylierten Boswellia- und Lupeolsäuren. Und zwar verhältnismäßig mehr deacetylierte Inhaltstoffe als acetylierte. Interessanterweise ist die Zusammensetzung von Harzen der Spezies B. sacra (Oman) dazu komplementär: mehr acetylierte Substanzen als deacetylierte. Die Harzzusammensetzungen von B. papyrifera (u. a. Äthiopien) und B. dalzielli (Westafrika) erschienen zunächst sehr ähnlich zu der Zusammensetzung von B. sacra. Proben der Spezies B. dalzielli konnten jedoch aufgrund ihrer herausragend hohen AKBA-Gehalte eindeutig von B. sacra abgegrenzt werden. Weihrauchharz der Spezies B. papyrifera konnte hingegen mit Hilfe der Gaschromatographie aufgrund seines einzigartigen Gehalts an Oktanol und Oktanolacetat abgegrenzt werden [130]. Die erst kürzlich entdeckte Spezies B. occulta, die nur in einem sehr kleinen Gebiet in Nordsomalia verbreitet ist, wies ebenso eine große Ähnlichkeit hinsichtlich der Boswellia- und Lupeolsäure-Zusammensetzung zu B. sacra auf. Botanisch sollen die beiden Spezies eng verwandt sein [20]. Es wurde jedoch publiziert, dass das ätherische Öl aus B. occulta einen einzigartig hohen Gehalt an Methoxydekan enthält [21, 22]. B. frereana (Somalia) wächst als einzige Boswellia-Spezies bevorzugt auf felsigem Grund und enthält keine nachweisbaren Mengen an Boswellia- und Lupeolsäuren. Diese Tatsache sowie die weiche Konsistenz des goldgelben Harzes und der überdurchschnittlich hohe Anteil an Reinharz grenzen B. frereana von allen anderen Boswellia-Arten eindeutig ab [6]. Ein Hauptbestandteil des Harzes von B. frereana sind die Triterpenoide Lupeol und Epi-Lupeol [7], es enthält jedoch keine entsprechenden Säuren. Eine mögliche Ursache der Abwesenheit von Boswellia- und Lupeolsäuren in B. frereana könnte ein nicht vorhandenes Gen für das Enzym sein, welches für die Biosynthese der Säurefunktionalität verantwortlich ist [39]. Die Harze der Spezies B. neglecta (Kenia) und B. rivae (Ogaden-Region in Äthiopien) wiesen charakteristischerweise sehr geringe Gehalte an Boswellia- und Lupeolsäuren auf. Sie unterschieden sich jedoch markant vom Weihrauchharz der Spezies B. frereana durch die dunkle Färbung und die sehr harte, spröde Konsistenz des Harzes. Die gaschromatographische Untersuchung zeigte zudem einen deutlich geringeren Gehalt an -Thujen im ätherischen Öl aus B. neglecta und B. rivae im Vergleich zu B. frereana. Es wurde vermutet, dass bei der Ernte von B. neglecta und B. rivae möglicherweise unwissentlich Harze von Myrrhe-Bäumen (Commiphora spp.) untergemischt werden, welche bei hohen Temperaturen miteinander verschmelzen [6, 19]. Harze der Spezies B. neglecta aus Nordsomalia (Puntland und Somaliland) unterscheiden sich hingegen von B. neglecta aus Kenia. Das Harz des somalischen B. neglecta hatte eine charakteristische Zusammensetzung mit einem sehr hohen Anteil an deacetylierten Boswellia- und Lupeolsäuren bei gleichzeitig sehr geringem Gehalt an KBA. Bei Proben der Spezies B. carterii konnte kein charakteristisches Muster erkannt werden. Alle Proben der Spezies B. carterii konnten jedoch eindeutig anhand der Boswellia-

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und Lupeolsäure-Zusammensetzung von Proben der Spezies B. sacra unterschieden werden. Darüber hinaus führten die Untersuchungen der ätherischen Öle in der vorliegenden Studie sowie einer Studie von Woolley et al. [11] zu dem gleichlautenden Ergebnis, dass sich nämlich B. sacra und B. carterii im Gehalt an -Pinen, para-Cymen und Limonen eindeutig unterscheiden. Diese Tatsachen sind starke Argumente für die These, dass es sich bei B. sacra und B. carterii um unterschiedliche Spezies handelt. Die hohe Artenvielfalt in und rund um Somalia sowie die sehr unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen der B.-carterii-Proben lässt spekulieren, ob B. carterii eventuell in weitere, bisher unbekannte Spezies zu unterteilen ist. Bestärkt wird diese Vermutung durch die erst kürzlich entdeckten Bäume der Spezies B. occulta, die zuvor der Spezies B. carterii bzw. B. sacra zugeordnet wurden [20-22]. Auf Grundlage der Analysenergebnisse konnte eine Formel aufgestellt werden, die es ermöglicht unbekannte Weihrauchharzproben zu klassifizieren. Für den sog. Boswellia- Index (Bosi) ist die Analyse von nur drei Boswelliasäuren notwendig, die jeweils kommerziell erhältlich sind. Die daraus resultierende Kennzahl gibt einen ersten Anhaltspunkt aus welcher Spezies und aus welcher Region die unbekannte Probe stammt. Um die Vorhersage aussagekräftiger und genauer zu machen, wäre ein größerer Datensatz von Vorteil.

4.6 Immunregulatorische Effekte von Weihrauchharzpräparaten In Deutschland gibt es kein zugelassenes weihrauchharz-basiertes Phytopharmakon, obwohl es zahlreiche rationale Hinweise auf Wirksamkeit gibt und Weihrauchharz seit Jahrhunderten traditionell angewendet wird. Auf ärztliche Anweisung können jedoch weihrauchharzhaltige Arzneimittel aus Indien importiert werden [4]. Alternativ dazu dürfen approbierte Pharmazeuten gemäß den Anforderungen des Europäischen Arzneibuchs aus Extrakten des indischen Weihrauchharzes in begrenzten Mengen Defekturarzneimittel herstellen und vertreiben [23]. Den größten Marktanteil an Weihrauchharzpräparaten besitzen jedoch Produkte, die als Nahrungsergänzungsmittel vertrieben werden [51]. Solche Nahrungsergänzungsmittel benötigen keine Arzneimittelzulassung, sondern werden rechtlich als Lebensmittel eingestuft. Die weltweite Nachfrage an Nahrungsergänzungsmitteln ist enorm und stetig steigend. Eine Marktanalyse im Jahr 2019 ergab einen globalen Marktanteil 123 Milliarden US-Dollar, mit einer prognostizierten jährlichen Wachstumsrate von 8,2 % [131]. Mangelnde Überwachung und der Einsatz von nicht standardisierten Extrakten resultieren jedoch in Produkten mit sehr unterschiedlichen Wirkstoffgehalten und damit in einer nicht abzuschätzenden Wirksamkeit [51]. Um die immunregulatorischen Eigenschaften von Weihrauchpräparaten zu untersuchen und zu vergleichen, wurde ein LPS-induzierter, akuter Entzündungsprozess in humanem Vollblut imitiert und mit 16 unterschiedlichen Weihrauchharzpräparaten behandelt. Im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe konnte eine signifikante Hemmung der Ausschüttung des proinflammatorischen Schlüsselzytokins TNF- beobachtet werden. Die in den Weihrauchharzpräparaten enthaltenen Boswelliasäuren interagieren mit dem Enzym IB-Kinase (IKK), wodurch der Transkriptionsfaktor NF-B inaktiv bleibt und demzufolge

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die TNF--Expression gehemmt wird [70]. Interessanterweise wurde zusätzlich eine gehemmte Ausschüttung des antiinflammatorischen Zytokins IL-10 beobachtet. Die Aufgabe von IL-10 besteht darin, Entzündungsprozesse einzugrenzen, indem es der unkontrollierten Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie TNF- entgegenwirkt [132]. Jedoch wird die IL-10-Produktion ebenso von TNF- beeinflusst. Ausschlaggebend ist die zeitliche Abfolge der Zytokinausschüttung. Während große Mengen an proinflammatorischen Zytokinen wie IL-1, IL-6, IL-8 und TNF- bereits 4 - 8 Stunden nach Stimulation mit LPS freigesetzt werden, erreicht die Freisetzung des antiinflammatorischen Zytokins IL-10 erst nach 24 - 48 Stunden ihr Maximum [133]. In den Experimenten dieser Studie fand die Zytokin-Quantifizierung 18 Stunden nach LPS- Stimulation statt. Zudem konnte in einer Studie von Wanidworanun und Strober gezeigt werden, dass TNF--Antikörper die Freisetzung von IL-10 um 50 - 75 % reduzieren können [134]. Antikörper gegen andere Zytokine hatten hingegen keinen Einfluss auf die IL-10-Freisetzung. Dies lässt darauf schließen, dass überwiegend TNF- für die Freisetzung von IL-10 verantwortlich ist. Daher erklärt eine durch Boswelliasäuren gehemmte Produktion von TNF- eine daraus resultierende gehemmte Ausschüttung an IL-10.

Die starke Bindungsaffinität von Boswelliasäuren an Albumin [63] ließ eine genauere, vergleichende Untersuchung der immunregulatorischen Eigenschaften der einzelnen Präparate nicht zu. Aus diesem diesem Grund wurden für weitere Experimente isolierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) verwendet. PBMC bestehen hauptsächlich aus Lymphozyten und Monozyten, die für die Produktion von Zytokinen verantwortlich sind [135]. Fünf der 16 untersuchten Präparate konnten die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine TNF-, IL-6 und IL-8 im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant senken. Darunter waren alle Präparate, die einen Gesamtgehalt an Boswellia- und Lupeolsäuren > 30 % (> 300 µg/mg) und/oder einen Gehalt an -ABA > 36 µg/mg aufwiesen. Interessanterweise gehörten zu diesen fünf Produkten alle drei untersuchten Defekturarzneimittel. Weihrauchharzpräparate mit geringeren Gehalten an Boswellia- und Lupeolsäuren zeigten deutlich schwächere Effekte auf die Zytokinausschüttung, Präparate mit sehr geringen Gehalten verstärkten sogar die Ausschüttung zusätzlich. Fraglich ist, ob Präparate, welche die Zytokinausschüttung verstärkten, möglicherweise mit bakteriellen Produkten verunreinigt waren oder ob Boswelliasäuren in zu geringer Konzentration proinflammatorische Effekte verursachen. So wurde beispielsweise in einer Studie beobachtet, dass Boswelliasäuren in sehr geringen Konzentrationen die Leukotriensynthese in vitro nicht hemmen, sondern verstärken [136]. Eine Korrelationsanalyse zwischen den Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalten und den Effekten auf die Zytokinausschüttung zeigte einen hochsignifikanten Zusammenhang zwischen dem Gesamtgehalt und der hemmenden Wirkung auf TNF-, IL-6, IL-8 und IL- 10. Bei der Untersuchung der Korrelationen hinsichtlich der einzelnen Inhaltstoffe fanden sich für die acetylierten Stoffe ALA, -ABA und -ABA die höchsten Korrelationskoeffizienten. Sowohl diese Tatsachte als auch die Ergebnisse früherer Studien deuten darauf hin, dass acetylierte Boswellia- und Lupeolsäuren den größten Einfluss auf die Zytokinausschüttung aufweisen [29, 68-70].

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Der überwiegende Teil aller Studien (in vitro und in vivo) sowie alle bis zum heutigen Tag publizierten klinischen Studien mit Bezug auf die entzündungshemmende Wirkung von Weihrauch wurden mit Extrakten des indischen Weihrauchharzes (B. serrata) durchgeführt [14, 42, 46, 59, 71-76, 79-82]. Weihrauchharz der Spezies B. serrata beinhaltet jedoch überwiegend deacetylierte Boswellia- und Lupeolsäuren. Auf Grundlage der hier vorgelegten Daten wäre Weihrauchharz der Spezies B. sacra aus dem Oman besser geeignet. Dieses hat zwar einen gleichhohen Gesamtgehalt an Boswellia- und Lupeolsäuren, hinsichtlich der Zusammensetzung überwiegen jedoch die acetylierten Komponenten. Eines der untersuchten Weihrauchharzpräparate (FN 10) enthielt laut Hersteller zwar Weihrauchharz der Spezies B. sacra. Jedoch war der Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalt dieses Präparats deutlich unterdurchschnittlich. Somit war das Präparat vergleichsweise minderwertig und konnte nicht direkt mit anderen Präparaten verglichen werden. Ziel einer weiterführenden, komparativen Studie sollte daher der Vergleich der immunregulatorischen Eigenschaften von hochwertigen, vergleichbaren Weihrauchharzextrakten aus B. serrata und B. sacra sein. Obwohl die Wirkung von Weihrauchharzextrakten und Boswelliasäuren in vitro und in vivo in Tiermodellen bereits eingehender untersucht wurde [14, 42, 46, 95], ist über die Pharmakokinetik vergleichsweise weniger bekannt. Sterk et al. untersuchten 2005 die Pharmakokinetik von Boswelliasäuren im Zusammenhang mit Nahrungsaufnahme [137]. Wenn man z. B. den Plasmaspiegel von β-BA nach einmaliger Einnahme von 786 mg eines weihrauchharzhaltigen Prüfpräparats betrachtet, wurde eine Maximalkonzentration (cmax) von 1,1 µg/mL β-BA ermittelt. In einer weiteren Studie bei der Patienten mit Hirntumoren, die über zehn Tage täglich mit 4 x 786 mg eines Weihrauchharzpräparats behandelt worden waren, konnten Plasmakonzentrationen von 4,6 µg/mL (10,1 µmol/L) β-BA gemessen werden [37]. In der hier durchgeführten In-vitro-Studie mit LPS-stimulierten PBMC betrug die β-BA-Konzentration je nach Weihrauchharzpräparat maximal 1,2 µg/mL (FN9). Die untersuchten Konzentrationen befanden sich demzufolge im Bereich therapeutisch erreichbarer Plasmaspiegel. In einer weiterführenden, künftigen Studie könnten Probanden Weihrauchharzextrakte verabreicht und anschließend nach unterschiedlichen Zeitpunkten der Einfluss auf die Zytokinausschüttung ex vivo untersucht werden. Ein dearartiges Experiment könnte weitere Informationen über die erreichbaren Plasmakonzentrationen an Boswellia- und Lupeolsäuren und daraus resultierende immunregulatorische Effekte liefern. Im Vergleich zu früheren Quantifizierungsmethoden von Boswelliasäuren [37, 137] können mit der hier entwickelten Methode unter Verwendung eines internen Standards und massenspektrometrischer Detektion genauere Konzentrationen ermittelt werden. Zusätzlich könnten im Urin der Probanden die Konzentration von Prostaglandin-E2-Metaboliten und Leukotrien E4 bestimmt werden, um den Effekt von Boswelliasäuren auf die menschliche Arachidonsäurekaskade in vivo zu untersuchen [63, 65, 136, 138].

4.7 Zytotoxische Effekte auf humane Mammakarzinomzellen in vitro und in vivo Das Mammakarzinom ist mit 24,2 % aller Krebserkrankungen die häufigste Krebsart bei Frauen und repräsentierte im Jahre 2018 15,0 % aller krebsinduzierten Todesursachen

Diskussion

bei Frauen [139]. Dreifach negativer Brustkrebs (TNBC, triple-negative breast cancer) macht ca. 15 % aller Brustkrebserkrankung aus und ist ein besonders aggressiver und stark metastasierender Subtyp, an dem besonders häufig junge Frauen erkranken [140]. Die Therapie von TNBC ist besonders erschwert, da diese Tumorart für gezielte Therapieansätze keine therapierelevanten Östrogenrezeptoren (ER), Progesteronrezeptoren (PR) oder humane epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren (HER2) exprimiert [141]. Daher weist TBNC unter allen Brustkrebs-Subtypen die schlechtesten Prognosen auf [142]. Im Jahr 2011 beobachteten Suhail et al., dass das ätherische Öl aus dem Harz von B. sacra bei Mammakarzinomzellen in vitro die Zellvitalität reduziert [90]. Interessanterweise konnten in dem verwendeten ätherischen Öl hohe Konzentrationen an Boswelliasäuren nachgewiesen werden. Dies ist für ätherische Öle, die mit Hilfe von Wasserdampfdestillation aus Weihrauch gewonnen werden, äußerst ungewöhnlich [24]. Im Rahmen der hier durchgeführten Studie wurde der Effekt eines methanolischen Extrakts aus Weihrauchharz der Spezies B. sacra auf die dreifach negative Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 in vitro untersucht. Das Extrakt inhibierte konzentrationsabhängig die Vitalität der Krebszellen mit einer IC50 von 7,9 µg/mL. Der Effekt des Extrakts auf die nicht-kanzerogenen Zellen der Kontrollgruppe (PBMC) war deutlich geringer, was als ein erster Hinweis auf Selektivität gedeutet werden kann. Um weiter einzugrenzen, welche Stoffgruppe für den zytotoxischen Effekt auf Mammakarzinomzellen verantwortlich ist, wurde das Extrakt in verschiedene Fraktionen aufgetrennt sowie ein ätherisches Öl des Weihrauchharzes abdestilliert. Die Fraktion, in der saure Komponenten wie Boswellia- und Lupeolsäuren angereichert wurden, zeigte mit einer IC50 = 6,0 µg/mL die stärkste vitalitätshemmende Wirkung an MDA-MB- 231-Zellen. Das ätherische Öl, das überwiegend aus Monoterpenoiden besteht und keine nachweisbaren Mengen an Boswellia- und Lupeolsäuren enthielt, zeigte hingegen mit einer IC50 = 25,2 µg/mL den geringsten Effekt auf die Zellvitalität. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass der von Suhail et al. beobachtete Effekt [90] auf die Wirkung von Triterpensäuren wie Boswellia- und Lupeolsäuren zurückzuführen ist. Daraufhin wurden insgesamt 40 Extrakte aus Weihrauchharzen acht unterschiedlicher Spezies hinsichtlich ihrer zytotoxischen Effekte auf MDA-MB-231-Zellen untersucht. Dabei zeigten Weihrauchharzextrakte aus B. sacra mit einer durchschnittlichen IC50 von 8,3 µg/mL die höchste Zytotoxizität. Harzextrakte der Spezies B. frereana hingegen, die nachweislich keine Boswellia- und Lupeolsäuren oder andere Triterpenoide mit Säurefunktionalität enthielten [7, 102], wiesen im Vergleich zu anderen Weihrauchharzproben die schwächste Zytotoxizität auf. Bemerkenswert ist jedoch, dass die Extrakte aus Harzen von B. frereana mit einer durchschnittlichen IC50 von 15,9 µg/mL trotzdem einen Effekt auf die Vitalität der Mammakarzinomzelllinie hatten. Harz von B. frereana enthält im Gegensatz zu allen anderen Boswellia-Spezies zwar keine Triterpensäuren, dafür jedoch neutrale Triterpenoide wie Lupeol und Epi-Lupeol [7]. Diese Substanzen besitzen wie Boswellia- /Lupeolsäuren entzündungshemmende und anticancerogene Eigenschaften und interagieren teilweise an denselben molekularen Angriffspunkten wie z. B. NF-B [29, 88]. Neben der Untersuchung der immunregulatorischen Eigenschaften von weihrauchharzhaltigen Importarzneimitteln, Defekturarzneimitteln und

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Nahrungsergänzungsmitteln wurden diese auch hinsichtlich ihrer potentiellen Zytotoxizität auf Mammakarzinomzellen in vitro untersucht. Interessanterweise zeigten die fünf Produkte, die die stärkste Hemmung auf die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen aufwiesen, auch die höchste Zytotoxizität auf MDA-MB-231-Zellen. Mit Hilfe der Hauptkomponentenregression (PCR) konnte aus den Ergebnissen ein mathematisches Modell entwickelt werden, das es erlaubt, die Zytotoxizität von Weihrauchharzpräparaten auf MDA-MB-231-Zellen auf Grundlage der individuellen Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalte zu prognostizieren. Der beobachtete zytotoxische Effekt wurde zusätzlich erfolgreich an zwei weiteren TNBC-Zelllinien (MDA-MB-453 und CAL-51) bestätigt. Die Untersuchung der Korrelation zwischen den Gehalten an Boswellia- und Lupeolsäuren und der Zytotoxizität auf MDA-MB-231-Zellen ergab sowohl bei den selbst hergestellten Harzextrakten als auch bei den kommerziellen Präparaten signifikante Zusammenhänge. Neben der hochsignifikanten Korrelation der IC50-Werte für die Zellvitalität und dem Gesamtgehalt an Boswellia-/Lupeolsäuren zeigten die acetylierten Komponenten ALA, -ABA und -ABA besonders hohe Korrelationskoeffizienten. Die Untersuchung der zytotoxischen Effekte reiner Boswellia- und Lupeolsäuren bestätigte die Kausalität der Korrelationsanalyse und zeigte, dass acetylierte Boswelliasäuren im Vergleich zu deacetylierten Boswelliasäuren wirksamer sind. Als besonders zytotoxisch erwiesen sich

-AKBA, -ABA und -ABA mit IC50-Werten zwischen 5,9 und 7,2 µM. Dies entspricht den Beobachtungen früherer Studien, die besonders acetylierte Boswelliasäuren als biologisch aktiv identifizierten [68-70, 91]. So konnte gezeigt werden, dass acetylierte Boswelliasäuren z. B. in gleicher Weise wie die Chemotherapeutika Podophyllotoxin und Camptothecin die Aktivität von menschlichen Topoisomerasen hemmen [91]. Zudem hemmten insbesonders acetylierte Boswelliasäuren die Aktivierung von NF-B [68-70]. Lupeolsäuren hingegen wirkten in ihrer deacetylierten Form zytotoxischer auf MDA-MB- 231-Zellen als in ihrer respektiven acetylierten Form. Im Gegensatz zu Boswelliasäuren wurde die Wirksamkeit von Lupeolsäure mit der Hemmung der AKT-Kinase in Zusammenhang gebracht [29]. Die Antitumor-Wirksamkeit von Weihrauchharzextrakten und Boswelliasäuren wurde in vivo mit Hilfe des CAM-Modells untersucht. Hierzu wurden humane Mammakarzinomzellen auf die Chorioallantoismembran (CAM) von befruchteten Hühnereiern xenotransplantiert. Die sich daraus entwickelten Tumore wurden topisch mit dem Weihrauchharzpräparat (FN 16), das sich in vitro am wirksamsten erwies sowie den Reinsubstanzen -ABA und -AKBA behandelt. Durch die Behandlung mit dem Weihrauchharzpräparat konnte sowohl eine signifikante dosisabhängige Reduzierung der Proliferation und der Tumorgröße als auch eine Aktivierung der Apoptose beobachtet werden. Die gleichen Effekte erzielte die Behandlung mit -ABA, während für -AKBA keine signifikante Reduzierung der Tumorgröße festgestellt werden konnte. Das CAM- Modell stellt ein einfach zugängliches Tiermodell zur Untersuchung der Antitumor- Wirksamkeit am lebenden Objekt dar. Zu den Vorteilen des CAM-Modells zählt, dass die Embryonen noch kein vollständiges lymphatisches System ausgebildet haben und somit immunologisch eine Xenotransplantation zulassen [143]. Zudem stellen die Blutgefäße der

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CAM ein optimales Umfeld für das Wachstum und die Angiogense von Tumoren zur Verfügung [144]. Begrenzt wird die Aussagekraft des Modells jedoch durch die topische Behandlung und sollte daher in fortführenden Studien durch z. B. systemische Verabreichung an Mäusen ausgeweitet werden [109]. Als Positivkontrolle wurde das Anthracyclin Doxorubicin verwendet, welches als Chemotherapeutikum zur Behandlung von Mammakarzinomen angewandt wird [109]. Bemerkenswert ist dabei, dass die mittlere inhibitorische Konzentration von Doxorubicin auf die Zelllinie MDA-MB-231 in vitro im Vergleich zur Boswelliasäure -ABA nur um den Faktor sieben geringer war. In vivo zeigte β-ABA (c = 10 µM) im Vergleich zur Doxorubicin-behandelten Gruppe (c = 1 µM) bessere therapeutische Effekte hinsichtlich Proliferation, Apoptoseinduktion und Tumorwachstum. Dabei ist erwähnenswert, dass für Boswelliaextrakte keine bis lediglich leichte Nebenwirkungen bekannt geworden sind, während die unerwünschten Arzneimittelwirkungen von Doxorubicin schwere Nephro- und Kardiotoxizität umfassen [145-147].

4.8 Weihrauchharzextrakte und Boswelliasäuren als potentielle Therapeutika bei chronischen Entzündungen und malignen Tumoren Chronische Entzündungen und die Entstehung von malignen Tumoren stehen im engen Zusammenhang. Weltweit können 25 % aller Krebserkrankungen auf vorangegangene chronische Infektionen und Entzündungen zurückgeführt werden [148]. Damit haben Patienten, die an chronischen Entzündungen leiden ein deutlich erhöhtes Risiko an Neoplasien zu erkranken. Insbesondere die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-B und die resultierende Zytokin-Produktion von tumorassoziierten Immunzellen sind ausschlaggebend für das Tumorwachstum, die maligne Transformation, Invasion und Metastasierung [85]. Entsprechend beugt die Behandlung mit entzündungshemmenden Medikamenten der Entstehung von Krebs vor und senkt demzufolge das Krebsrisiko [149]. Interessanterweise wirken Boswelliasäuren an genau diesem molekularen Schnittpunkt zwischen chronischer Entzündung und Krebserkrankung. Durch die Interaktion von Boswelliasäuren mit IKK wird sowohl die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen als auch von Wachstumsfaktoren gehemmt, deren Expression bekannterweise durch NF-κB reguliert wird [68, 70]. Die in der vorliegenden Studie gewonnen Ergebnisse zeigen, dass die Gehalte an Boswellia- und Lupeolsäuren mit der Hemmung von proinflammatorischen Zytokinen und der Zytotoxizität auf Mammakarzinomzellen korrelieren. Zudem korrelieren auch die zytokinregulatorischen Effekte mit den zytotoxischen Effekten. Somit stellen Weihrauchharzextrakte und die darin enthaltenen Boswellia- und Lupeolsäuren nicht nur eine alternative Medikation für chronische Entzündungskrankheiten dar, sondern auch eine potentielle Möglichkeit zur Prävention und Behandlung von Tumorerkrankungen. In mehreren klinischen Studien konnte der therapeutische Effekt von Weihrauchharzextrakten nicht nur auf chronische Entzündungskrankheiten, sondern auch auf die Behandlung von Hirntumoren gezeigt werden. Ähnliche Effekte von

Diskussion

Weihrauchharzextrakten konnten zudem gegenüber einer Vielzahl von Krebszelllinien in vitro und in vivo festgestellt werden [45]. Das lässt darauf schließen, dass eine potentielle Antitumor-Wirksamkeit unabhängig von betroffenen Geweben vorliegt. Der in dieser Studie erforschte Effekt auf Mammakarzinome sollte zunächst in Säugetierversuchen und anschließend in klinischen Studien weiter untersucht werden. In klinischen Studien stellt das Vorenthalten eines wirksamen Therapeutikums zur Untersuchung eines potentiell wirksamen Testpräparats eine besonders schwierige ethische Fragestellung dar. Kontrollierte Studien, bei denen der Effekt von Weihrauchharzpräparaten in Verbindung mit einer Strahlentherapie [86] oder im Sinne eines Heilversuches bei „austherapierten“ Patienten untersucht wird, wären daher eine ethisch vertretbare Alternative.

Zusammenfassung

5. Zusammenfassung Schon seit vielen Jahrhunderten ist das Weihrauchharz der Boswellia-Bäume aufgrund seiner entzündungshemmenden, analgetischen, antibiotischen und potentiell antitumoralen Wirkung in der traditionellen Medizin vieler Kulturen hochgeschätzt. Durch intensive Forschung konnten Ende des 20. Jahrhunderts Boswellia- und Lupeolsäuren als die pharmakologisch wirksamsten Inhaltsstoffe identifiziert werden. Der Gehalt und die Zusammensetzung an Boswellia- und Lupeolsäuren, die zur Klasse der pentazyklischen Triterpenoiden gehören, variieren stark in den ca. 25 bekannten Boswellia-Spezies. Zudem hat die Weiterverarbeitung zu therapeutischen Präparaten einen immensen Einfluss auf die chemische Zusammensetzung. Daher wurde eine neuartige, hochsensitive und exakte Methode entwickelt, die es erlaubte mit Hilfe von HPLC-MS/MS selektiv Boswellia- und Lupeolsäuren zu quantifizieren und somit individuelle Zusammensetzungen zu bestimmen. Das entwickelte Verfahren ist dabei schneller und nachweisstärker als alle früheren Methoden. Die Kombination aus Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Tandem- Massenspektrometrie (MS/MS) sowie die Verwendung von internen Standards ermöglicht eine exakte und selektive Quantifizierung auch in komplexen biologischen Matrizes. Dadurch ist auch ein Einsatz in zukünftigen klinischen Studien gewährleistet, wobei die notwendige Probenvorbereitung im Vergleich zu früheren Methoden deutlich geringeren Aufwand erfordert. Durch Kombination der entwickelten Analysenmethode mit multivariaten Statistikverfahren konnten in 41 Weihrauchharzproben spezifische Muster in der Boswellia- und Lupeolsäure-Zusammensetzung nachgewiesen werden. Diese Muster ermöglichten eine chemotaxonomische Differenzierung zwischen verschiedenen Boswellia-Spezies. Dadurch ergibt sich die Option, die botanische Klassifizierung, die aufgrund von politischen, ökonomischen und geographischen Bedingungen in den Anbaugebieten oftmals erschwert ist, durch aussagefähige chemische Analysen zu ergänzen. Auf Basis dieser Daten konnte bereits eine Formel entwickelt werden, die es erlaubt mit der Analyse von lediglich drei Boswelliasäuren eine Kennzahl zur Klassifizierung von Weihrauchharzproben zu ermitteln. Darüber hinaus wurde eine neue Boswelliasäure, die 11-Keto--boswelliasäure (-KBA), charakterisiert und in Weihrauchharzen nachgewiesen. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass neben der 11-Keto--boswelliasäure (-KBA) auch das entsprechende -Konstitutionsisomer existiert. Aufgrund nicht vorhandener Arzneimittelzulassungen für Weihrauchharzpräparate in Deutschland, ist die Qualität der erhältlichen Produkte sehr variabel und deren Wirkung für den Endverbraucher nicht abschätzbar. Die Untersuchung von 16 Weihrauchharzpräparaten ergab immense Unterschiede hinsichtlich des Wirkstoffgehalts mit Gesamtgehalten zwischen 3,5 mg und 157,3 mg Boswellia- und Lupeolsäuren je Kapsel. Um die immunregulatorischen Eigenschaften der Weihrauchharzpräparate zu vergleichen, wurde der Effekt auf die Zytokinausschüttung an LPS-stimuliertem, humanem Vollblut und daraus isolierten Immunzellen untersucht. Präparate mit einem hohen Gehalt an Boswellia- und

Zusammenfassung

Lupeolsäuren konnten die Ausschüttung der potenten proinflammatorischen Zytokine TNF-, IL-6 und IL-8 signifikant senken, während Präparate mit sehr geringem Gehalt die Zytokinausschüttung evtl. sogar weiter verstärkten. Zusätzlich zur immunregulatorischen Wirkung wurde der Effekt von 40 Weihrauchharzextrakten, 16 Weihrauchharzpräparaten und zehn Boswellia- und Lupeolsäuren auf therapieresistente, dreifach negative Mammakarzinomzelllinien in vitro untersucht. Die Untersuchungen zeigten bemerkenswerte antiproliferative Eigenschaften auf die Zelllinien MDA-MB-231, MDA-MB-453 und CAL-51. Mit Hilfe von Korrelationsanalysen wurden vor allem die acetylierten Bestandteile Acetyl-lupeolsäure (ALA), 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA) und 3-O-Acetyl--boswelliasäure (-ABA) als besonders aktive Wirkkomponenten identifiziert. Proliferationsanalysen unter Behandlung mit Reinsubstanzen verifizierten darüber hinaus die Kausalität der beobachteten Korrelationen. Um die Antitumor-Wirkung von Weihrauchharzpräparaten und Boswelliasäuren in vivo zu untersuchen, wurden MDA-MB-231-Zellen auf die Chorioallantoismembran (CAM) von befruchteten Hühnereiern xenotransplantiert. Durch dieses Experiment konnte erstmal gezeigt werden, dass Weihrauchharzpräparate mit hohem Gehalt an Boswellia- und Lupeolsäuren das Tumorwachstum und die Proliferation von Mammakarzinomen in vivo signifikant hemmen sowie Apoptose induzierten. Dieselben Effekte konnten durch Behandlung mit der reinen Boswelliasäure -ABA erzielt werden. Bemerkenswerterweise konnte unter der Behandlung mit diesen Naturstoffen keine systemische Toxizität an den empfindlichen Hühnerembryonen beobachtet werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sich die spezifischen Zusammensetzungen von Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzen zur chemotaxonomischen Unterscheidung von Boswellia-Spezies eignen. Kommerzielle Weihrauchharzpräparate unterscheiden sich sehr stark hinsichtlich des Gehalts an Triterpenoiden sowie im Hinblick auf ihre immunregulatorischen Eigenschaften. Jedoch können hochwertige Weihrauchharzpräparate die Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen hemmen. Darüber hinaus zeigen Weihrauchharzextrakte und Weihrauchharzpräparate in vitro und in vivo antiproliferative und zytotoxische Effekte auf dreifach negative Mammakarzinomzellen. Wünschenswerte immunregulatorische und zytotoxische Eigenschaften korrelieren dabei insbesondere mit den Gehalten an acetylierten Boswelliasäuren. Obwohl für Weihrauchharzpräparate zumeist indisches Weihrauchharz (B. serrata) verwendet wird, würde auf Grundlage der vorliegenden Studie arabisches Weihrauchharz (B. sacra) eine bessere Triterpenoid-Zusammensetzung bereitstellen. Die stärksten therapeutischen Effekte zeigte die Boswelliasäure -ABA. Daher sollte -ABA sowohl zur Standardisierung oder Normierung von Weihrauchharzpräparaten als auch für die Entwicklung potentieller Therapeutika in Betracht gezogen werden.

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Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Boswellia-Bäume und Weihrauchharzernte...... 1 Abbildung 2: Verbreitungsgebiet der Gattung Boswellia und ihrer unterschiedlichen Arten...... 2 Abbildung 3: Unterschiede in Morphologie und Färbung von Weihrauchharzen...... 5 Abbildung 4: Beispiele für Mono- und Diterpenoide in Weihrauchharz...... 7 Abbildung 5: Chemische Strukturen von pentazyklischen Triterpenoiden...... 8 Abbildung 6: Chemische Strukturen von Boswellia- und Lupeolsäuren...... 9 Abbildung 7: iosynthese von -Boswelliasäuren...... 11 Abbildung 8: Einfluss von Boswelliasäuren auf die Arachidonsäurekaskade...... 14 Abbildung 9: Boswelliasäuren hemmen die Genexpression proinflammatorischer Proteine durch Interaktion mit dem Enzym IB-Kinase (IKK)...... 15 Abbildung 10: Molekulare Angriffspunkte von Weihrauchharzextrakten und Boswelliasäuren...... 19 Abbildung 11: Wasserdampfdestillation von Weihrauchharz...... 26 Abbildung 12: Methanolische Extraktion von Weihrauchharzen...... 34 Abbildung 13: HPLC-DAD-MS/MS-Chromatogramme...... 37 Abbildung 14: Multivariate statistische Analyse der Triterpenoid-Zusammensetzung in Weihrauchharzproben...... 44 Abbildung 15: Ergänzender Biplot der Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit Darstellung der dritten Hauptkomponente PC3...... 45 Abbildung 16: Untersuchung von Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharz- präparaten mittels HPLC-DAD-MS/MS und multivariater Statistik. ... 49 Abbildung 17: Synthese zur Herstellung von 11-Keto--boswelliasäure (-KBA). ... 50 Abbildung 18: Massenspektren von -KBA...... 51 Abbildung 19: Struktur und wichtige Korrelationen von -KBA ...... 52 Abbildung 20: Eindimensionale NMR-Spektren von -KBA...... 53 Abbildung 21: 2D-heteronuklear- und 2D-homonuklear-korrelierte NMR-Spektren von -KBA...... 54 Abbildung 22: Designs von zentral zusammengesetzten Versuchsplänen...... 56 Abbildung 23: Darstellung der Effekte des statistischen Versuchsplans...... 57 Abbildung 24: Chromatographische Trennung von KBA und AKBA auf unterschiedlichen Trennsäulen...... 58 Abbildung 25: Effekte von Weihrauchharzpräparaten (FN) auf die Zytokinausschüttung von LPS-stimuliertem Vollblut und PBMC...... 62

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 26: Zytotoxizität von Weihrauchharzextrakten auf die humane, dreifach negative Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231...... 64 Abbildung 27: Zytotoxizität spezieller Extraktfraktionen von Probe # 1 (B. sacra, Superior Hojari) auf MDA-MB-231-Zellen...... 65 Abbildung 28: Zytotoxizität von Weihrauchharzpräparaten (FN) auf die humane, dreifach negative Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231...... 67 Abbildung 29: Konzentrationsabhängige Hemmung der Vitalität von Mammakarzinomzellen (MDA-MB-231) und nicht-kanzerogenen Zellen (PBMC) durch -AKBA (a) und -ABA (b)...... 69 Abbildung 30: Weihrauchharzpräparate und Boswelliasäuren hemmen die Zellproliferation und das Tumorwachstum und induzieren Apoptose bei dreifach negativen Mammakarzinomen...... 71 Abbildung 31: Korrelationen zwischen den Gehalten an Boswellia-/Lupeolsäuren in Weihrauchharzpräparaten, deren Wirkung auf die Zytokinausschüttung aus PBMC und ihre Zytotoxizität auf die Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 (IC50)...... 73 Abbildung 32: Heatmap zur Darstellung des Zusammenhangs zwischen den Gehalten an Boswellia-/Lupeolsäuren von Weihrauchharzpräparaten (FN) und deren Effekte auf die Zytokinexpression bzw. deren zytotoxische Wirkung auf die Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 (IC50)...... 74 Abbildung 33: 1H-NMR-Spektrum von α-KBA ...... 109

Abbildung 34: 1H-1H -COSY-Spektrum (correlated spectroscopy) von -KBA...... 110

Abbildung 35: 1H-1H-ROESY-Spektrum (rotating frame overhauser enhancement spectroscopy) von -KBA...... 111 Abbildung 36: 1H-13C-HSQC-Spektrum (heteronuclear single quantum coherence spectroscopy) von -KBA...... 112 Abbildung 37: 1H-13C-HMBC-Spektrum (heteronuclear multiple bond correlation) von -KBA...... 113

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Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Bezugsquellen von pentazyklischen Triterpensäuren...... 22 Tabelle 2: Verwendete Chemikalien und Lösungsmittel...... 22 Tabelle 3: Untersuchte Weihrauchharzproben...... 23 Tabelle 4: Untersuchte Weihrauchharzpräparate...... 24 Tabelle 5: Verwendete Zelllinien...... 25 Tabelle 6: Verwendete Geräte...... 25 Tabelle 7: Verwendete Software...... 25 Tabelle 8: Elutionsgradient der semipräparativen Aufreinigung von -KBA...... 27 Tabelle 9: Elutionsgradient der C18-HPLC-Methode...... 28 Tabelle 10: Parameter der massenspektrometrischen Methode...... 28 Tabelle 11: Elutionsgradient der PFP-HPLC-Methode...... 29 Tabelle 12: Verwendetet GC-Instrumente und Methodenparameter...... 30 Tabelle 13: Durchschnittliche Extraktionsausbeuten ...... 33 Tabelle 14: Massenübergänge und Retentionszeiten der Analyten und des internen Standards...... 37 Tabelle 15: Validierungskennzahlen der HPLC-MS/MS-Methode: Kalibrierfunktionen, Nachweis- und Bestimmungsgrenzen...... 38 Tabelle 16: Validierungskennzahlen der HPLC-MS/MS-Methode: Präzision und Wiederfindung...... 38 Tabelle 17: Quantifizierung von Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharzextrakten mit Hilfe von HPLC-MS/MS...... 39 Tabelle 18: Boswellia- und Lupeolsäure-Gehalte in Weihrauchharzen verschiedener Boswellia-Spezies...... 41

Tabelle 19: Charakteristische Boswellia-Indizes (Bosi) von Weihrauchharzproben. ... 46 Tabelle 20: Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalte in speziellen Fraktionen von B. sacra. . 47 Tabelle 21: Boswellia-/Lupeolsäure-Gehalte in ätherischen Ölen verschiedener Boswellia-Spezies...... 47 Tabelle 22: Konzentrationen an Boswellia- und Lupeolsäuren in Weihrauchharz- präparaten...... 48 Tabelle 23: Gehalte an Boswellia- und Lupeolsäuren je Kapsel bzw. Tablette...... 50 Tabelle 24: Chemische Verschiebungen für -KBA in DMSO-d6...... 52 Tabelle 25: Versuchsplan mit Leveleinstellungen der Variablen ...... 56 Tabelle 26: Analysenergebnisse der gaschromatographischen Untersuchung ätherischer Öle verschiedener Boswellia-Spezies...... 59

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Tabellenverzeichnis

Tabelle 27: Effekte von Weihrauchharzpräparaten (FN, frankincense nutraceuticals) auf die Ausschüttung von TNF- und IL-10 in LPS-stimuliertem humanen Vollblut...... 60 Tabelle 28: Effekte von Weihrauchharzpräparaten (FN) auf die Zytokinausschüttung aus LPS-stimulierten PBMC...... 61

Tabelle 29: Mittlere inhibitorische Konzentrationen (IC50 in µg/mL) von Weihrauchharzextrakten auf die Vitalität der humanen, dreifach negativen Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 in vitro...... 63

Tabelle 30: Mittlere inhibitorische Konzentrationen (IC50 in µg/mL) von 16 Weihrauchharzpräparaten (FN) auf die Vitalität der Mamakarzinomzelllinie MDA-MB-231...... 66

Tabelle 31: Mittlere inhibitorische Konzentrationen (IC50 in µg/mL) von drei ausgewählten Weihrauchharzpräparaten auf die Vitalität der dreifach negativen Mammakarzinomzelllinien MDA-MB-231, MDA-MB-453 und CAL-51...... 69 Tabelle 32: Mittlere inhibitorische Konzentrationen von Boswellia- und Lupeolsäuren auf die Vitalität der dreifach negativen Mammakarzinomzelllinie MDA- MB-231...... 70 Tabelle 33: Korrelationen zwischen den Gehalten an Boswellia-/Lupeolsäuren und der Hemmung der Zytokinausschüttung aus PBMC durch Weihrauchharzpräparate...... 72

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Anhang

Abbildung 33: 1H-NMR-Spektrum von α-KBA (b) im Vergleich zu 1H-1H-SELTOCSY

(selective total correlation spectroscopy), Transmitterfrequenz auf dH 3,77 Hz (H-3, a)

bzw. dH 5,47 Hz (H-12, c). Letzteres zeigt ungewöhnlich weitreichende Korrelationen über vier bis sieben Bindungen, welche durch NOE-Transfer verursacht wurden. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], Supplementary materials, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

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Anhang

Abbildung 34: 1H-1H -COSY-Spektrum (correlated spectroscopy) von -KBA. Skalare 1H-1H-Kopplungen über mindestens zwei Bindungen. (a) Vollständiges Spektrum. (b) Vergrößerter Ausschnitt. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], Supplementary materials, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

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Anhang

Abbildung 35: 1H-1H-ROESY-Spektrum (rotating frame overhauser enhancement spectroscopy) von -KBA. Kopplungen von räumlich benachbarten Protonen. (a) Vollständiges Spektrum. (b) Vergrößerter Ausschnitt. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], Supplementary materials, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

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Anhang

Abbildung 36: 1H-13C-HSQC-Spektrum (heteronuclear single quantum coherence spectroscopy) von -KBA. 1H-13C-Kopplungen über eine Bindung. (a) Vollständiges Spektrum. (b) Vergrößerter Ausschnitt. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], Supplementary materials, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/ licenses/by/4.0/).

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Anhang

Abbildung 37: 1H-13C-HMBC-Spektrum (heteronuclear multiple bond correlation) von -KBA. 1H-13C-Kopplungen über mehr als eine Bindung. (a) Vollständiges Spektrum. (b) Vergrößerter Ausschnitt. Abbildung aus eigener Publikation (Schmiech et al. [104], Supplementary materials, © 2021, CC-BY 4.0, creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

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Danksagung

- Danksagung aus Gründen des Datenschutzes entfernt -

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Danksagung

- Danksagung aus Gründen des Datenschutzes entfernt -

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Lebenslauf