Badania Nad Wykorzystaniem Myszy Z Wyłączonymi Genami Dla

BADANIA NAD WYKORZYSTANIEM MYSZY Z WYŁĄCZONYMI GENAMI DLA APOLIPOPROTEINY E ORAZ RECEPTORA LDL JAKO MODELU EKSPERYMENTALNEGO W HAMOWANIU PROCESU MIAŻDŻYCOWEGO Katedra Farmakologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego

Kierownik Katedry: Prof, dr hab. med. Ryszard Korbut ROZPRAWY HABILITACYJNE UNIWERSYTETU JAGIELLOŃSKIEGO COLLEGIUM MEDICUM WYDZIAŁ LEKARSKI

JACEK JAWIEŃ

BADANIA NAD WYKORZYSTANIEM MYSZY Z WYŁĄCZONYMI GENAMI DLA APOLIPOPROTEINY E ORAZ RECEPTORA LDL JAKO MODELU EKSPERYMENTALNEGO W HAMOWANIU PROCESU MIAŻDŻYCOWEGO

WYDAWNIC IMO UNIW ERSYTETU JAGIELLOŃSKIEGO Badania były wspierane przez grant Ministerstwa Nauki i Informatyzaeji (MNil) nr 2 P05A 08426.

RECENZENT WYDAWNICZY

Prof, dr hab. n. biot. Ryszard Oliński, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu

PROJEKT OKŁADKI Dorota He Hasz

REDAKTOR Dorota Węgierska

KOREKTOR Barbara Cabala

SKŁAD I ŁAMANIE Regina Wojtylko

ISBN 83-233-2178-7

www. wuj.pl

Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego Redakcja: ul. Michałowskiego 9/2, 31-126 Kraków tel. 012-631-18-81. tel. /fax 012-631-18-83 Dystrybucja: ul. Wrocławska 53. 30-011 Kraków tel. 012-631-01-97. tel. /fax 012-631-01-98 tel. kom. 0506-006-674, e-mail: [email protected]. edu. pl Konto: BPH PBK SA 1V/O Kra ...... 7 8769 Pamięci Moich Rodziców poświęcam

SPIS TREŚCI

SPIS SKRÓTÓW...... 9

1. WSTĘP...... 11 1.1. Wprowadzenie...... 11 1. 2. Miażdżyca - nowe spojrzenie na patogenezę i związane z tym implikacje...... 13 1.3. Leukotrieny...... 16 1.3. 1. Synteza leukotrienów...... 17 1. 3. 2. Rola biologiczna leukotrienów...... 20 1. 3. 3. Leki antyleukotrienowe...... 20 1.4. Jądrowy czynnik transkrypcyjny kappa B (NF-kB)...... 22 1.4. 1. Inhibitory NF-kB...... 22 1. 5. Najnowsze modele eksperymentalne miażdżycy...... 24 1. 5.1. Apolipoproteina E...... 25 1.5. 2. Myszy apoE - knockout...... 25 1. 5. 3. Myszy apoE/LDLR - doubleknockout ...... 26

2. CELE PROJEKTU...... 27

3. MATERIAŁ I METODYKA...... 29 3.1. Zwierzęta i leki...... 29 3.2. Lipoproteiny osocza...... 30 3. 3. Oznaczanie wielkości miażdżycy...... 32 3.3. 1. Metoda „cross-section”...... 32 3. 3. 2. Metoda „en face"...... 38 3.4. Badania immunohistochemiczne...... 39 3. 5. Barwienie skrawków trichromem Massona i orceiną...... 40 3.6. Badania biochemiczne...... 41 3. 7. Analiza statystyczna...... 41

4. WYNIKI...... 43 4.1. Lipidy...... 43 4. 2. Masa myszy...... 44 4. 3. Wielkość miażdżycy...... 44 4.4. Struktura blaszki i jej stabilność...... 45 4. 5. Osoczowe markery zapalenia...... 45 8

5. DYSKUSJA...... 55 5.1. Wstęp...... 55 5. 2. Skrót wyników...... 55 5. 3. Lipidy...... 56 5.4. Masa myszy...... 56 5. 5. Wielkość miażdżycy...... 57 5. 6. Przebudowa blaszki miażdżycowej...... 58 5. 7. Poziom osoczowych markerów zapalenia...... 58 5. 8. Rola leukotrienów w zapaleniu w ścianie naczynia krwionośnego...... 59 5. 9. Blokowanie leukotrienów w miażdżycy...... 60 5. 10. Blokowanie NF-kB w miażdżycy...... 62 5.11. Podsumowanie...... 63

6. WNIOSKI...... 65

7. STRESZCZENIE...... 67

8. SUMMARY...... 69

9. PIŚMIENNICTWO...... 71 SPIS SKRÓTÓW

AA (arachidonic acid) - kwas arachidonowy apoE (apolipoprotein E) - apolipoproteina E CAPE (caffeic acid phenethyl ester) - ester fenyloetylowy kwasu kawowego DKO (double knockout) - wyłączenie dwóch genów ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) - lest immunoenzymatyczny lub immunoenzy- mosorbcyjny FLAP (five lipoxygenase activating protein) - białko aktywujące 5-lipooksygenazę FPLC (fast protein liquid chromatography) - metoda cieczowej chromatografii kolumnowej śred- niociśnieniowej KO (knockout) - wyłączenie (genu) HDL (high density lipoprotein) - lipoproteina o dużej gęstości HO-1 (heme oxygenase-1) - oksygenaza hemowa-1 HPETE (hydroperoxyeicosatetraenoic acid) - kwas hydroperoksyeikozatetraenowy HSP (heat shock protein) - białko szoku cieplnego IDL (intermediate density lipoprotein) - lipoproteina o pośredniej gęstości IFN-y (interferon-gamma) - interferon gamma IkB (nuclearfactor kB inhibitor) - inhibitor czynnika jądrowego kB

IKK (IkB kinases) - kinazy IkB IL (interleukin) - interleukina IRAK (interleukin-1 associated kinase) - kinaza zasocjowana z receptorem dla interleukiny-1 LDL (low density lipoprotein) - lipoproteina o małej gęstości LDLR (LDL receptor) - receptor lipoproteiny o małej gęstości LRP (LDL receptor related protein) - białko związane z receptorem LDL LT - leukotrien LTs - leukotrieny 5-LO (5-lipoxygenase) - 5-lipooksygenaza LPS (lipopolysaccharide) - endotoksyna bakteryjna M-CSF (macrophage colony stimulating factor) - czynnik rozwoju kolonii makrofagów MCP-1 (macrophage chemotactic protein-1) - białko chemotaktyczne dla monocytów MyD88 (myeloid differentiation factor 88) - białko różnicowania szpiku 88 NF-kB (nuclear factor kappa B) - jądrowy czynnik transkrypcyjny kappa B NO (nitric oxide) - tlenek azotu OCT (Optimal Cutting Temperature) - żel mrożeniowy ORO (oil red-O) - czerwień oleista 10 oxLDL (oxidized LDLi - utleniona cząsteczka LDL PBS (phosphate saline buffer} - bufor fosforanowy PDTC (ammonium pyrrilidinethione carbamate} - pirolidynodwutiokarbaminian amonu PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) - jądrowy receptor peroksysomalnego czyn nika proliferacyjnego SMA (smooth muscle actin) - ci-aktyna mięśniówki gładkiej Th (Thelper) - limfocyty T pomocnicze TLR (Toll-like receptor) - receptor Toll-podobny TNF-a (tumor necrosis factor-alpha) - czynnik martwicy nowotworów alfa VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-!) - adhezyna komórek naczyń VLA-4 (very late activating antigen 4) - integryna należąca do podrodziny pi, mająca zdolność wiązania cząsteczki z nadrodziny immunoglobulin znajdującej się na komórkach śródbłonka: VCAM-I VLDL (very low density lipoprotein) - lipoproteina o bardzo małej gęstości 1. WSTĘP

1.1. Wprowadzenie

Projekt jest całkowicie oryginalny. Z wyjątkiem pojedynczych doniesień dotyczą cych działania antagonistów receptora dla LTB4, nikt na świecie nie opisał, jak dotąd, działania przeciwmiażdżycowego leków przeciwleukotrienowych oraz leków hamują cych jądrowy czynnik transkrypcyjny kappa B (NF-kB) w modelu eksperymentalnym miażdżycy: myszy z wyłączonymi genami dla apolipoproteiny E i receptora LDL (apo lipoprotein E/LDL receptor - double knockout mice). Uzyskanie w 1992 roku, za pomocą homologicznej wymiany genów, myszy z wyłą czonym genem dla apolipoproteiny E (apoE - knockout) było prawdziwym przełomem w badaniach nad miażdżycą |353 ] i stanowiło istotny krok w kierunku farmakoterapii aterogenezy.

Niniejsza praca jest tylko w części oparta na następujących artykułach:

1. Jawień J., Gajda M., Rudling M., Mateuszuk Ł., Olszanecki R., Guzik T., Cichocki T„ Chłopicki S., Korbut R. Inhibition of five lipoxygenase activating protein (FLAP) by MK-886 decreases atherosclerosis in apoE/LDLR - double knockout mice. Eur. J. Clin. Invest. 2006; 36: 141-146.

2. Jawień J., Gajda M., Mateuszuk Ł., Olszanecki R., Jakubowski A., Szlachcic A., Korabiowska M., Korbut R. Inhibition of nuclear factor-kappa B attenuates artherosclerosis in apoE/LDLR - double knockout mice. J. Physiol. Pharmacol. 2005; 56: 483^489.

3. Olszanecki R., Jawień J., Gajda M., Mateuszuk Ł., Gębska A., Korabiowska M., Chłopicki S., Korbut R. Effect of curcumin on atherosclerosis in apoE/LDLR - do uble knockout mice. J. Physiol. Pharmacol. 2005; 56: 627-635.

4. Jawień J., Nastałek P., Korbut R. Mouse models of experimental atherosclerosis. J. Physiol. Pharmacol. 2004; 55: 503^517.

Natomiast techniki pracy nad myszami z wyłączonymi genami, jako najnowo cześniejszym obecnie modelem eksperymentalnym miażdżycy, zostały przez autora 12 opanowane w Karolińska Institutct w Sztokholmie, w toku pracy nad następującymi publikacjami:

1. Elhagc R.. Jawień J.. Rudling M., Ljunggren H.G., Takeda K., Akira S., Bayard F.. Hansson G.K. Reduced atherosclerosis in interleukin-18 deficient apolipoprotein E - knockout mice. Cardiovasc. Res. 2003; 59: 234—240.

2. Elhagc R.. Gourdy P., Brouchet L., Jawień J., Fouque M.J., Fievet C., Hue X., Bar- reira Y.. Couloumiers J.C., Arnal J.F., Bayard F. Deleting TCR alpha beta+ or CD4+ T lymphocytes leads to opposite effects on site-specific atherosclerosis in female apolipoprotein E-deficient mice. Am. J. Pathol. 2004; 165: 2013-2018.

3. Elhage R., Gourdy P., Jawień J., Brouchet L., Castano C., Fievet C., Hansson G.K., Arnal J.F., Bayard F. The atheroprotective effect of 17beta-estradiol depends on complex interactions in adaptive immunity. Am. J. Pathol. 2005; 167: 267-274.

Podziękowania

Dziękuję firmie Merck za udostępnienie do badań związków: MK-886 i montelukast. Dziękuję także firmie Bayer za udostępnienie do badań związku BAYxl005. 13

1.2. Miażdżyca - nowe spojrzenie na patogenezę i związane z tym implikacje

Miażdżyca jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności w Europie [254, 279, 346]. Prewencja pierwotna choroby miażdżycowej jest więc obecnie palącym problemem i równocześnie wyzwaniem dla współczesnej farmakologii [243]. Badania nad patogenezą miażdżycy na przełomie wieków wkroczyły w nową fazę. Wiek XX był erą cholesterolu i lipoprotein, z kulminacją w postaci serii przeprowadzo nych na wielką skalę badań klinicznych, ukazujących jednoznacznie, że skorygowanie hipercholesterolemii zmniejszało znacząco zachorowalność i śmiertelność w miażdżycy tętnic wieńcowych [325, 354]. Do końca lat 90. zakładano, że miażdżyca rozwija się jako tzw. odpowiedź na uraz (response to injury hypothesis), powodujący utratę komó rek śródbłonka wyściełających naczynia od wewnątrz [341]. Jednakże późniejsze bada nia wykazały jednoznacznie, że śródbłonek pokrywający wczesne zmiany miażdżycowe w rzeczywistości jest nienaruszony [92]. Miażdżyca była zatem uważana za chorobę zwyrodnieniową [342-344]. Około 15 lat temu badania zaczęły się jednak ogniskować w coraz większym stopniu na wpływie procesu zapalnego na rozwój miażdżycy. W jaki sposób bowiem tętnica odpowiada na hipercholesterolemię i inne potencjalne procesy inicjujące miażdżycę? Zbadano bardzo dokładnie złożone interakcje pomiędzy komórkami ściany naczyń a napływowymi mo- nocytami (przekształcającymi się w makrofagi) oraz limfocytami T, uwalnianie cytokin i czynników wzrostu, a także wpływ interakcji międzykomórkowych na szybkość roz woju zmiany miażdżycowej [169, 247, 345]. Obecnie zatem przeważa nowy pogląd, że istotę miażdżycy stanowi proces zapalny ściany naczyniowej [125, 171, 175, 346, 347]. Podczas gdy odkładanie się miażdżyco wych lipidów i gromadzenie się komórek piankowatych - makrofagów wypełnionych tymi lipidami - w błonie wewnętrznej tętnic jest głównym morfologicznym stygmatem miażdżycy [143, 242, 378|, subtelniejsze zmiany w mikrośrodowisku ściany tętnicy, spowodowane przez napływ komórek zapalnych i miejscowe uwalnianie cytokin oraz innych mediatorów zapalenia są obecnie rozpoznawane jako kluczowe dla aterogenezy czynniki sprawcze [27, 100, 102, 105, 110, 150-156, 161, 202, 219, 222]. Zapalenie występuje jako odpowiedź na czynnik destabilizujący miejscową homeo stazę. Czynnikami powodującymi aktywację makrofagów w ścianie tętnic, poprzez receptor Toll-podobny (Toll-like receptor - TLR), są: utlenione cząsteczki lipoprotein o małej gęstości LDL (Iow density lipoprotein.',) - oxLDL, białko szoku cieplnego 60 (heat shockprotein 60) - HSP60 oraz endotoksyny bakteryjne [177, 267, 274, 276, 277, 317, 369-371, 390, 391, 3931.

Badania nad rozwojem miażdżycy i sformułowanie nowej definicji tej choroby było możliwe między innymi w znaczącym stopniu dzięki stworzeniu na początku lat 90. eksperymentalnego modelu miażdżycy: myszy pozbawionych apolipoproteiny E (apoE - knockout) lub też pozbawionych receptora dla LDL (LDL receptor - knockout) [334].

Pierwszym etapem rozwoju miażdżycy jest dysfunkcja śródbłonka [346]. Dotyczy to przede wszystkim regionów rozgałęzień tętniczych, w których przepływ krwi często nie ma charakteru laminarnego. Stąd predylekcja do rozwoju miażdżycy w tych miejscach. Tu następuje odkładanie się cząsteczek LDL w przestrzeni podśródbłonkowej. Akumu 14 lacja LDL jest zwiększona, gdy poziom surowiczy LDL jest podniesiony. LDL dyfun- duje pasywnie i jej odkładanie się w ścianie naczynia wydaje się wynikać z interakcji pomiędzy apolipoproteiną B cząsteczki LDL a proteoglikanami macierzy [34]. Śródbłonek naczyniowy odgrywa istotną rolę w rozwoju miażdżycy [6, 26, 32,66-71, 103]. W warunkach fizjologicznych komórki śródbłonka naczyń są niezbędne do utrzyma nia hemostazy [45, 119]. Jednakże w odpowiedzi na wiele czynników komórki śródbłonka mogą zmienić swoją funkcję i „przełączyć się” ze stanu przeci wzakrzepowego w prozakrze- powy, jak również zainicjować syntezę i uwalnianie cytokin oraz czynników wzrostu [ 156- -158, 215, 222, 223, 350, 368]. Dysfunkcja śródbłonka jest uważana za podstawę tworze nia się blaszki miażdżycowej, jak również późniejszych poważnych powikłań miażdżycy [50, 128], nawet przy nieobecności bezpośredniego pęknięcia blaszki. Wiele czynników może prowadzić do dysfunkcji śródbłonka oraz miażdżycy: pod niesiony poziom surowiczej LDL, obecność zmienionej LDL, wolne rodniki, nadciś nienie tętnicze, palenie papierosów, cukrzyca, wysoki poziom homocysteiny we krwi, przewlekłe infekcje, endotoksemia oraz niekorzystne podłoże genetyczne [6, 41, 94, 138, 144, 185, 226, 285-288, 296, 361, 367]. Zmiana w przepuszczalności bariery śródbłonkowej jest podstawą rozwoju najwcześ niejszych zmian miażdżycowych. Rekrutacja monocytów do błony wewnętrznej tętnic zachodzi wcześnie, w odpowiedzi na ekspresję śródbłonkowych molekuł adhezyjnych, takich jak adhezyna komórek naczyń (vascular cell adhesion molecule-1 -VCAM-1) [79, 234, 308, 330]. VCAM-1 łączy się ze swoistym receptorem integrynowym nale żącym do podrodziny [31, mającym zdolność wiązania VCAM-1. tj. very late activa ting antigen 4 (VLA-4), obecnym na monocytach i limfocytach, lecz nie na granulocy- tach [31, 79]. Dieta wysokocholesterolowa powoduje wzrost ekspresji VCAM-1 [240]. W tym samym czasie rozpuszczalne substancje, takie jak: białko chemotaktyczne dla monocytów (macrophage chemotactic protein-1 - MCP-1) [74] oraz czynnik rozwoju kolonii makrofagów (macrophage colony stimulating factor - M-CSF), produkowane przez śródbłonek, komórki mięśni gładkich i komórki zapalne, powodują dalszą rekru tację i dojrzewanie monocytów. Na toczący się proces zapalny w ścianie naczynia komórki śródbłonka odpowiadają zwiększoną przepuszczalnością, rekrutacją leukocytów oraz produkcją cytokin. Swoi sta interwencja w te procesy i korekcja czynności śródbłonka mogłyby więc odgrywać ważną rolę terapeutyczną w leczeniu przewlekłego procesu zapalnego, jakim jest miaż dżyca [218]. Udowodniono, że niezmienione cząsteczki LDL są zbyt wolno „pobierane" przez makrofagi, aby spowodować ich przekształcenie w komórki piankowate. Zaproponowa no zatem, że cząsteczka LDL zostaje „zmodyfikowana" w ścianie naczynia. Najbardziej znaczącą modyfikacją jest utlenienie (oksydacja) lipidów [ 140]. W jej wyniku powstaje tzw. minimalnie utleniona (minimally oxidized) cząsteczka LDL. W wyniku powstania tych cząstek, jako „obcych” dla organizmu, następuje reakcja zapalna, przede wszystkim z udziałem monocytów i limfocytów 1129, 313, 416]. Czynnikiem wywołującym zapalenie jest zatem składowanie utlenionych cząstek LDL w przestrzeni podśródbłonkowej [254]. OxLDL może także hamować produkcję tlenku azotu (NO) - mediatora o własnościach przeciwmiażdżycowych [217]. Zanim „minimalnie utleniona” cząsteczka LDL zostanie sfagocytowana przez ma krofagi, musi ulec dalszej modyfikacji do „wysoce utlenionej” (highly oxidized) LDL. 15

Szybki wychwyt tak zmienionych cząstek LDL przez makrofagi zachodzi poprzez tzw. receptory zmiatające (scavenger receptors) [ 3881. Następnym etapem jest „prezentacja antygenu” przez makrofagi limfocytom T. An tygenem tym może być na przykład fragment „strawionej" przez makrofag, utlenionej lipoproteiny LDL (rye. 1). Do zaistnienia interakcji pomiędzy komórkami immunologicznymi konieczna jest obecność na powierzchni makrofagów receptora CD40 oraz jego ligandu CD40L na powierzchni limfocytów T [357]. W wyniku oddziaływania tych komórek następuje odpowiedź immunologiczna typu T helper 1 (komórkowa) lub typu T helper 2 (humo- ralna). Uważa się obecnie, że odpowiedź typu Th 1 i jej mediatory: interferon-gamma (IFN- -y), czynnik martwicy nowotworów (tumor necrosis factor-alpha; TNF-a), interleu kina-1, interleukina-12 oraz interleukina-18 działają przyspieszająco na rozwój miaż dżycy, podczas gdy odpowiedź typu Th2 i jej mediatory: interleukina-4, interleukina-5, interleukina-10 oraz interleukina-13 hamują rozwój miażdżycy [28, 90, 232, 319]. Stąd powstała koncepcja szczepionki, jako leku przeciwko rozwojowi miażdżycy [ 176]. Migracja komórek zapalnych do błony wewnętrznej zachodzi równocześnie z infil tracją tej błony przez lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL), co razem powoduje powsta nie pasm tłuszczowych (fatty streak) - charakterystycznej zmiany patologicznej tętnic, zbudowanej z komórek piankowatych i limfocytów T. Pasma tłuszczowe są obecnie uważane za klasyczną zmianę zapalną. Siły mechaniczne, działające na ścianę tętnicy, odgrywają ważną rolę w ułatwieniu napływu lipoprotein, jak również w powodowaniu typowego dla miażdżycy zgrubienia błony wewnętrznej [142]. Jeśli czynnik przyczy nowy nie zostanie usunięty, odpowiedź zapalna toczy się dalej, stymulując proliferację i napływ komórek mięśni gładkich oraz prowadząc do tworzenia się zmian pośrednich i do przebudowy ścian tętnic. Pasma stopniowo ulegają powiększeniu, z akumulacją ma cierzy wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej. Liczba komórek mięśniówki gładkiej ulega zwiększeniu, zarówno przez podział in situ w obrębie błony wewnętrznej, jak i w wyni ku napływu z błony środkowej [ 148]. Dalszym etapem rozwoju miażdżycy jest powstawanie blaszki miażdżycowej. Na stępuje wówczas zwiększone odkładanie się pozakomórkowego cholesterolu i jego estrów, migracja komórek mięśniówki gładkiej z błony środkowej naczynia (medii) do błony wewnętrznej (intimy), proliferacja tych komórek, wreszcie produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej przez mięśniówkę gładką. Zmiany w wyściółce śródbłonkowej naczyń mogą powodować wzrost blaszki miaż dżycowej poprzez wiele mechanizmów. Zmniejszenie zdolności do tworzenia czynni ków przeciwzakrzepowych (jak prostacyklina i tlenek azotu) sprzyja agregacji płytek krwi i tworzeniu się zakrzepów przyściennych 1108, 123, 179]. Przyczepianie się płytek i ich aktywacja na powierzchni endotelium powodują tworzenie się czynników sprzyja jących migracji komórek mięśniówki gładkiej i rozwojowi blaszki miażdżycowej. Pokrywa włóknista blaszki powstaje pod wpływem: odkładania się i degradacji ma cierzy zewnątrzkomórkowej, proliferacji mięśniówki gładkiej, odkładania się lipidów, infiltracji makrofagów i limfocytów. Stabilna blaszka miażdżycowa najczęściej posiada względnie grubą pokrywę włóknistą, chroniącą jądro lipidowe przed zetknięciem się z krwią. W niestabilnej blaszce obserwuje się duże jądro lipidowe ze względnie cienką pokrywą włóknistą. W obrębie tak zmienionej blaszki czynniki prozapalne produkowa 16 ne przez limfocyty T (jak IFN-y) wydają się odgrywać kluczową rolę, z jednej strony zmniejszając produkcję przez mięśniówkę gładką macierzy zewnątrzkomórkowej, z dru giej zaś strony zwiększając produkcję metaloproteinaz przez makrofagi [139, 242]. W wielu dotychczasowych doniesieniach na temat patogenezy powstawania miażdży cy występowała do niedawna niefortunna tendencja do rozpatrywania tego procesu jako wyłącznie rezultatu zaburzeń lipidowych albo też tylko jako zapalenia. Jest to fałszywa dychotomia. Należy podkreślić, że miażdżyca jest zarówno jednym, jak i drugim. Miażdżyca jest zatem przewlekłą chorobą zapalną, w większości przypadków za początkowaną i rozwijaną pod wpływem hipercholesterolemii. W niedawnym artykule przeglądowym w Naturę Medicine określono hipercholesterolemię oraz zapalenie jako „wspólników przestępstwa” [384[. Koncepcja miażdżycy jako zapalenia ukształtowała się dopiero w ostatnich la tach, lecz obecnie jest już niekwestionowaną zdobyczą nauki, niosącą z sobą okre ślone konsekwencje terapeutyczne [124, 174, 177, 244-247]. W niniejszej pracy skupiono się na dwóch czynnikach, biorących udział w procesie zapalnym: leukotrienach - jako silnych mediatorach zapalenia oraz na transkrypcyjnym czynniku jądrowym kB - kluczowym aktywatorze genów związanych z zapaleniem.

1.3. Leukotrieny

Leukotrieny (LTs) są silnymi mediatorami procesu zapalnego. Enzymy biorące udział w ich syntezie oraz receptory dla leukotrienów odgrywają istotną rolę w zapaleniu.

W 1938 roku Kellaway, FeldbeFg i Thretwie wykazali, że uczulona tkanka płucna uwalnia pod wpływem antygenu czynnik powodujący powolny i długotrwały skurcz mięśni gładkich oskrzeli. Nazwano go substancją wolno działającą (slow reacting sub stance - SRS), gdyż w przeciwieństwie do histaminy jego działanie jest późniejsze i długotrwałe. W 1958 roku Brocklehurst zbadał dokładnie działanie SRS i zmienił jej nazwę na: „wolno działająca substancja w anahlaksji” (slow reacting substance of anaphylaxis - SRS-A), w celu odróżnienia od innych czynników wywołujących powolny skurcz, np. bradykininy [165, 289, 332]. W końcu, w 1979 roku Bengt Samuelsson z Karolińska Institutet w Sztokholmie udowodnił, że SRS-A składa się z trzech związków nazwanych leukotrienami cystei- nylowymi (LTC4, LTD4, LTE4) (261 ]. Za odkrycie to otrzymał w 1982 roku Nagrodę Nobla [48, 146, 147, 351]. W nazwie „leukotrieny”, człon „leuko” oznacza, że są one wytwarzane przez leu kocyty, „trien” oznacza, że w budowie chemicznej cząsteczek występują kolejno po sobie 3 podwójne wiązania, liczba 4 zaś oznacza, że w całej cząsteczce znajdują się 4 podwójne wiązania. 17

1.3.1. Synteza leukotrienów

Leukotrieny należą do grupy biologicznie czynnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zwanych eikozanoidami. Ich substancją macierzystą jest kwas arachidonowy (AA), 20-węglowy nienasycony kwas tłuszczowy, który wchodzi w skład fosfoli pidów błon komórkowych. Przemieszczenie fosfolipazy A, z cytozolu do błony okołojądrowej, oddzielającej cytoplazmę od jądra komórkowego, zachodzi pod wpływem wielu czynników, między innymi reakcji antygen-przeciwciało, stymulacji fizycznej (zimno, miejscowe zmiany składu i stężenia jonów) oraz bodźca zapalnego. Fosfolipaza katalizuje przy udziale jonów wapnia i ATP uwalnianie kwasu arachidonowego z błon fosfolipidowych [2]. Lipooksygenazy, cytozolowe enzymy odpowiedzialne za syntezę leukotrienów (LTs) z kwasu arachidonowego, występują głównie w leukocytach [35, 37]. Lipook sygenazy są enzymami katalizującymi stereospecyficzną dehydrogenację, a następnie dioksygenację wielonienasyconych kwasów tłuszczowych o strukturze 1,4-cis-pen- tadienowej [165]. 5-lipooksygenaza (5-LO) dodaje grupę hydroksylową do węgla C5 w kwasie arachidonowym. Aktywacja 5-LO wymaga obecności ATP i jonów wapnia. Po połączeniu 5-LO z „białkiem aktywującym 5-lipooksygenazę” (five lipoxygenase activating protein - FLAP) w stabilny kompleks, FLAP prezentuje kwas arachidonowy 5-lipooksygenazie. Kwas 5-hydroperoksyeikozatetraenowy (5-HPETE) jest niestabilnym związkiem ulegającym przemianie pod wpływem peroksydazy glutationowej do kwasu 5-hydro- ksyeikozatetraenowego (5-HETE) lub pod wpływem 5-LO do nietrwałej epoksydowej pochodnej - leukotrienu A4 (LTA4) [305]. Procesy te przebiegają przy obecności jonów wapnia. Przemiana LTA4 może przebiegać dwukierunkowo. Pod wpływem występują cej w cytozolu hydrolazy LTA4 powstaje leukotrien B4 (LTB4). Natomiast pod wpływem syntazy LTC4 [42, 310-312], znajdującej się w błonie jądrowej, do LTA4 przyłączany jest glutation i powstaje leukotrien C4 (LTC4). Glutationo-S-transferaza (syntaza LTC4), podobnie jak FLAP, stanowi integralny element błony jądrowej. Przemieszczenie LTB4 i LTC4z cytoplazmy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej odbywa się przy udziale swo istych przezbłonowych transporterów. W przestrzeni zewnątrzkomórkowej LTC4 ulega przemianie do leukotrienu D4 (LTD4) na drodze odszczepienia kwasu glutationowego przez glutamylotranspeptydazę. Z kolei dipeptydaza cysteinowo-glicynowa odszczepia od LTD4 glicynę, doprowadzając do powstania leukotrienu E4 (LTE4). Przemiany LTC4 do LTD4, a następnie do LTE4 są formą biokonwersji. Najbardziej stabilny jest LTE4. W formie niezmienionej lub jako N-acetylo-LTE4 może być wydalany przez wątrobę oraz nerki. Pomiar stężenia LTE4 w moczu służy do oceny produkcji endogennych leukotrienów.

Etapy syntezy leukotrienów (ryc. 2): 1. Przemieszczenie fosfolipazy A i 5-lipooksygenazy z cytozolu do błony okołojądro wej. 2. Uwalnianie kwasu arachidonowego z błony fosfolipidowej przez fosfolipazę Av 3. Utlenianie kwasu arachidonowego do kwasu 5-hydroperoksyeikozatetraenowego (5-HPETE) pod wpływem 5-lipooksygenazy, połączonej z FLAP (ryc. 3). 18

4. Przekształcenie 5-HPETE do leukotrienu Aq przez 5-lipooksygenazę. 5. Przemiana LTA4 pod wpływem hydrolazy LTA4 do LTBq albo pod wpływem syntazy LTC4 do LTC4. 6. Przemiana LTC4 do LTD4, a następnie do LTE4.

Istotną rolę odgrywa także w organizmie 15-lipooksygenaza (zwana u myszy 12/15- -LO), prowadząca do produkcji lipoksyn [62, 81, 82, 135, 141, 225].

Ryc. 1. Początkowe stadium aterogenezy

Cząsteczki LDL po przedostaniu się przez barierę śródblonkową do przestrzeni podśródbtonkowej zo- stają tam uwięzione i utlenione do oxLDL, w ten sposób stając się dla organizmu obcym antygenem. Komórki piankowate wychwytują cząsteczki oxLDL poprzez receptory zmiatające (scavenger receptors). Cząsteczka oxLDL ulega nadtrawieniu i przekształcona zostaje „przedstawiona” limfocytowi T, rozpo czynając w ten sposób klasyczną reakcję immunologiczną, będącą bodźcem dla odpowiedzi zapalnej (zmodyfikowane z [173]) 19

Ryc. 3. Rola FLAP w syntezie leukotrienów (zmodyfikowane z [121]). B-LT - receptor dla l_TB4; cys-LT - receptor dla leukotrienów cysteinylowych (LTC„, LTDJ; cPLA2 - cytozolowa fosfolipaza A2 20

1.3.2. Rola biologiczna leukotrienów

LTB4 działa chemotaktycznie: najsilniej na neutrofile, znacznie słabiej na eozynofile, stymuluje uwalnianie enzymów lizosomalnych oraz rodników nadtlenkowych przez neutrofile, zwiększa przepuszczalność naczyń (aktywuje przyleganie neutrofilów do ko mórek śródbłonka). Leukotrieny cysteinylowe (peptydoleukotrieny) (LTC4, LTD4, LTE4) kurczą central ne i obwodowe drogi oddechowe, zwiększają nadreaktywność oskrzeli, stymulują wy dzielanie śluzu przez komórki kubkowe oskrzeli, zwiększają przepuszczalność naczyń (powstawanie przesięku i obrzęk błony śluzowej oskrzeli) i śródbłonka (ułatwienie mi gracji komórek zapalnych i nasilenie odpowiedzi zapalnej) oraz działają chemotaktycz nie (LTD4 jest swoistym czynnikiem chemotaktycznym dla eozynofilów) [76, 95, 221, 310, 371-373, 392, 394, 396, 397]. Istnieją dwa typy receptorów dla leukotrienu B4: BLTj-R (w leukocytach, grasicy, śledzionie) i BLT,-R (w jajnikach, wątrobie, leukocytach oraz innych narządach), a tak że dwa typy receptorów dla leukotrienów cysteinylowych: CysLT,-R (w mięśniówce gładkiej, śledzionie, leukocytach) oraz CysLT,-R (w sercu, śledzionie, leukocytach, rdzeniu nadnerczy oraz mózgu).

1.3.3. Leki antyleukotrienowe

Ze względu na miejsce działania leki antyleukotrienowe dzieli się na 4 grupy (ta bela 1). Tabela 1 Podział leków antyleukotrienowych Antagoniści Antagoniści Inhibitory 5-LO Inhibitory FLAP receptora LTD4 receptora LTB4 zileuton - Zyflo MK-886 ablukast U875.302 (A864077)* MK-0591 cinalukast CP-105,696 genleuton BAYx1005 iralukast (CGP45 715) montelukast - Singulair* (MK-476)* pabilukast (SKF 104,353) pranlukast - Onon (ONO 1078)* sulukast tomelukast (LY 171,883) verlukast (MK-679) zafirlukast - Accolate (ICI 204, 219)* MK-571 BAYX7195 BAYx9773 ICI 198,615 FPL 55712 RG 12,525 SKF 106,203 SB 205,312 * preparaty już stosowane w leczeniu 21

MK-886, inhibitor FLAP, to kwas 3-[3-izobutylotio-l-(4-chlorobenzylo)-5-izopro- pylo-lH-indol-2-yl]-2,2-dwumetylopropionowy (ryc. 4).

Ryc. 4. Wzór chemiczny MK-886

BAYxl005, inhibitor FLAP, to kwas R-(-)-2-[4-(chinolino-2-metoksy)fenylo]-2- -cyklopentylooctowy (ryc. 5).

Ryc. 5. Wzór chemiczny BAYx1005

Montelukast (MK-476), selektywny antagonista receptora CysLT,, to sól sodowa kwasu [R-(E)]-1 -[[[ 1 -[3-[2-(7-chloro-2-chinolinylo)-winylo]fenylo]-3-[2-( 1-hydroksy- -l-metyloetylo)-fenylo]-propylo]-tio]-metylo]-cyklopropanooctowego [86, 360, 397] (ryc. 6). 22

Ryc. 6. Wzór chemiczny montelukastu

Związki te zostały już dość dobrze poznane [2, 18, 54, 163, 263, 309, 331, 337, 359, 381, 409]. Inhibitory 5-LO oraz FLAP są obecnie rozpatrywane jako hipotetyczne leki przeciwastmatyczne [199, 200, 202], z wyjątkiem zileutonu, dopuszczonego już do leczenia w Stanach Zjednoczonych.

1.4. Jądrowy czynnik transkrypcyjny kappa B (NF-kB)

W świetle nowej, zapalnej teorii miażdżycy, bardzo dobrym celem terapii mógłby być jądrowy czynnik transkrypcyjny kappa B (NF-kB) (ryc. 7) [19, 20, 36, 75, 166, 189, 275,412].

1.4.1. Inhibitory NF-kB

PDTC - pirolidynodwutiokarbaminian amonu Dwutiokarbaminiany zostały zsyntetyzowane w połowie XIX wieku i od tego cza su znalazły wiele zastosowań w rolnictwie, przemyśle chemicznym i farmaceutycznym [374]. Ich użyteczność w szerokim spektrum działań jest związana z ich własnościami wiążącymi jony metali oraz z własnościami przeciwutleniającymi. Pirolidynodwutio karbaminian amonu (PDTC) jest szeroko używanym inhibitorem czynnika jądrowego kB [23, 358] (ryc. 8). Blokuje on aktywację NF-kB poprzez hamowanie jego dysocjacji od IkB - inhibitora czynnika jądrowego kB [270]. Ponadto PDTC jest silnym induktorem dla oksygenazy hemowej-1 (heme oxygenase-l - HO-1). 23

Ryc. 7. Kaskada sygnałowa, powodująca pobudzenie jądrowego czynnika transkrypcyjnego kappa B (NF-kB)

IL-1RI - receptor I dla interleukiny-1; TLR4 - receptor Toll-podobny typu 4 (dla LPS) [Toll-like receptor]-, MyD88 - białko różnicowania szpiku 88 [myeloid differentiation factor 88]; IRAK - kinaza zasocjowana z receptorem IL-1 [interleukin-1 associated kinase]', TRAF6 - czynnik 6 zasocjowany z receptorem czynnika martwicy nowotworu [tumor necrosis factor receptor associated factor 6]; IKK - kinazy IkB [IkB kinases], IkB - inhibitor czynnika jądrowego kB; NF-kB - czynnik jądrowy kB (zmodyfikowane z [228])

Ryc, 8. Wzór chemiczny PDTC 24

Kurkumina Kurkumina to naturalnie występujący żółty barwnik, izolowany z kłączy rośliny Cur- cuma longa L. (ostryż długi) z rodziny Zingiberaceae (Imbirowate). Jest zaliczana do związków o budowie polifenolowej (ryc. 9). Kurkuminę otrzymuje się poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikową kurkumy, tzn. zmie lonych kłączy naturalnych szczepów Curcuma longa L. W celu otrzymania stężonej kurkuminy w proszku, ekstrakt oczyszcza się poprzez krystalizację. W postaci proszku kłącze kurkuminy (szafran indyjski) było wykorzystywane do poprawiania własności smakowych i barwnikowych żywności, jak również w medycynie ludowej - w leczeniu chorób zapalnych i gojeniu się ran [8]. Jej mechanizm działania jest złożony: jest między innymi inhibitorem czynnika jądrowego kB, hamując działanie IKK (kinaz IkB). Jest także przeciwutleniaczem.

Ryc. 9. Wzór chemiczny kurkuminy

1.5. Najnowsze modele eksperymentalne miażdżycy

Od roku 1992 mysz stała się znakomitym obiektem badań nad miażdżycą, zastępując dotychczasowe modele zwierzęce [89, 98, 99, 201, 220, 273, 303, 322, 334]. Wówczas to bowiem została stworzona, prawie równocześnie w dwóch laboratoriach w Stanach Zjednoczonych, pierwsza linia zwierząt z homologiczną wymianą genów: myszy z wy łączonym genem dla apolipoproteiny E [apolipoprotein E (apoE) - knockout] [318, 320]. Myszy te zostały wkrótce określone jako „wiarygodny i użyteczny, najlepszy - jak dotąd - model zwierzęcy miażdżycy” [266]. Gene targeting - to homologiczna wymiana genów. W procesie tworzenia myszy apoE - knockout [inne nazwy angielskie: apoE nuli lub apoE deficient] następuje za stąpienie prawidłowego genu kodującego apolipoproteinę E przez gen zmutowany, nieprodukujący apolipoproteiny E. Taka mysz, w terminologii polskiej, posiada zatem znokautowany, wyłączony, zerowy lub zinaktywowany gen kodujący apolipoproteinę E. W dalszej części pracy będziemy posługiwać się dla ułatwienia najpopularniejszą nazwą: myszy apoE - knockout (apoE - KO). 25

1.5.1. Apolipoproteins E

Apolipoproteina E (apoE) jest ligandem, odpowiedzialnym za wychwyt z krążenia lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL - very low density lipoproteins), lipoprotein o pośredniej gęstości (IDL - intermediate density lipoproteins), lipoprotein o dużej gę stości (HDL - high density lipoproteins) oraz remnantów chylomikronów [39, 104, 255, 268, 389, 419]. ApoE jest syntetyzowana głównie w hepatocytach, ale jest również wy twarzana w innych komórkach - w makrofagach, komórkach nerwowych i glejowych. Jest obecna w chylomikronach, IDL, VLDL i HDL i pośredniczy w wychwycie wy mienionych lipoprotein w wątrobie, zarówno przez receptor LDL, jak i przez związane z nim białko LRP (LDL receptor related protein). ApoE może również wiązać hepary- nopodobne cząstki proteoglikanowe na powierzchni wszystkich komórek. U człowieka trzy główne allele genu apoE kodują E2, E3 i E4, tj. izoformy różniące się sekwencją w dwóch pozycjach i występujące w populacji ogólnej z częstością odpo wiednio: 0,12, 0,75 i 0,13. ApoE2 wiąże się z receptorem LDL, wykazując przy tym niż sze powinowactwo niż apoE3 lub E4. U osobników homozygotycznych pod względem apoE2 może rozwinąć się ciężka hiperlipidemia (dyslipoproteinemia typu III). U myszy odpowiednikiem takiego stanu jest znokautowanie genu dla apoE.

1.5.2. Myszy apoE - knockout

Pierwszy model eksperymentalny miażdżycy: genetycznie zmieniony szczep myszy apoE - knockout stworzono w roku 1992, poprzez zastosowanie metody rekombinacji homologicznej w komórkach linii zarodkowej (embryonic stem cells) [318, 320, 428]. Tak zmienione komórki wszczepiano do blastocysty myszy szczepu C57BL/6J (wild type), którą zaimplantowano do macicy. Jako potomstwo uzyskano w ten sposób mysz „chimerę”, którą krzyżowano z myszą C57BL/6J, uzyskując w drugim pokoleniu homo- zygotyczne myszy apoE - knockout [30, 56, 64, 145, 255, 339]. „Wybicie” genu dla apoE spowodowało powstanie myszy o fenotypie o całkowitym braku ekspresji apoE, jednakże z zachowaniem płodności i żywotności [40]. Myszy z wyłączonym genem dla apolipoproteiny E, w przeciwieństwie do wszyst kich innych modeli zwierzęcych, rozwijają miażdżycę spontanicznie, bez konieczności stosowania diety wysokocholesterolowej [175, 176, 194, 307]. Najwcześniejsze i naj bardziej zaawansowane zmiany występują w zatokach wieńcowych aorty, należących do tzw. „korzenia aorty” (aortic root), czyli części aorty znajdującej się jeszcze w obrę bie mięśnia serca. Większość modeli miażdżycy rozwija tylko morfologicznie wczesne zmiany [pasma tłuszczowe (fatty streaks) - bez złogów lipidowych pozakomórkowych]. Problem ten rozwiązało stworzenie modelu myszy apoE - knockout, które rozwijają zmiany miaż dżycowe zarówno wczesne, jak i zaawansowane [14, 126, 266, 299, 321]. Wykazano podobieństwo morfologiczne zaawansowanych zmian miażdżycowych u myszy apoE - knockout do zmian u człowieka. Ponadto myszy te rozwijają nadciśnienie tętnicze oraz dysfunkcję komórek śródbłonka [77, 96, 208, 423]. Na diecie niskotłuszczowej i niskocholesterolowej u myszy tych surowiczy poziom cholesterolu wynosi około 494 mg/dl, w porównaniu z 60 mg/dl u niezmienionych my szy C57BL/6J. Już w wieku 10 tygodni u myszy apoE - knockout rozwijają się wczesne 26 zmiany miażdżycowe w części aorty w pobliżu zastawek, mieszczącej się w obrębie mięśnia serca („korzeń aorty” - aortic root], których powierzchnia wynosi około 3157 ± 437 pm2, w porównaniu z 0 ± 0 |im2 u myszy C57BL/6J. W późniejszym wieku zmiany miażdżycowe są bardziej zaawansowane [320]. W zależności od rodzaju eksperymentu autorzy wykorzystują myszy apoE - knockout w wieku od 16 do nawet 60 tygodni życia (zwykle około 24 tygodni) [282, 335]. Stworzenie tego właśnie modelu zmieniło oblicze badań nad patogenezą miażdżycy i umożliwiło między innymi uformowanie nowej definicji miażdżycy jako przewlekłego procesu zapalnego [58, 116, 118, 301, 353, 402].

1.5.3. Myszy apoE/LDLR - double knockout

Gene targeting w zarodkowych komórkach stem cells został również zastosowany do stworzenia myszy z wyłączonym genem dla receptora LDL [LDL receptor (LDLR) - knockout mice] [194].

W późniejszym czasie stworzono model myszy z wyłączonymi genami zarówno dla apolipoproteiny E, jak i receptora LDL [apoE and LDLR - double knockout] (apoE/LDLR - DKO) [195]. Stwierdzono wówczas, że progresja miażdżycy jest większa u myszy apoE/LDLR - DKO niż u myszy apoE - KO [413]. W ten sposób myszy apoE/LDLR - DKO stały się doskonałym i dogodnym modelem do badania przeciwmiażdżycowego działania wielu związków.

Celem sprawdzenia ewentualnego działania badanych substancji na zaawansowane zmiany miażdżycowe w krążeniu wieńcowym, w niniejszej pracy wykorzystano po dwójnie znokautowane myszy: apoE/LDLR - double knockout [195]. Model ten, mimo że jest obecnie najlepszym z dostępnych komercyjnie modeli eksperymentalnych miażdżycy, nie był dotąd zbyt często używany w badaniach, w po równaniu z modelem apoE - single knockout. Spowodowane to było między innymi trudnościami w uzyskaniu tych myszy z firm hodowlanych. Paradoksalnie zatem, w po równaniu z myszami apoE - KO, istnieje stosunkowo niewiele prac dotyczących tego modelu [7, 33, 45, 122, 127, 187, 188, 195, 196, 230, 239, 249, 252, 262, 314, 315, 385, 386, 405]. 2. CELE PROJEKTU

Celem niniejszego projektu badawczego było: 1. Wdrożenie nowego modelu badania leków. 2. Zbadanie 5 leków pod kątem ich własności przeciwmiażdżycowych (ryc. 10).

Ryc. 10. Schemat działań badawczych

3. MATERIAŁ I METODYKA

3.1. Zwierzęta i leki

Sześćdziesiąt żeńskich myszy z wyłączonymi genami dla apolipoproteiny E i re ceptora LDL [apoE/LDLR - DKO] (podzielonych na grupy o liczebności n = 10), o mieszanym podłożu genetycznym C57BL/6J x 129/SvJ [407], zakupiono w firmie Ta- conic (Ejby, Dania) [52]. Myszy te były trzymane w Zwierzętami Wydziału Farmacji Collegium Medicum UJ, w cyklu dobowym (12 h ciemności/12 h światła), w klimaty zowanym pomieszczeniu (22,5 ± 0,5°C, wilgotność 50 ± 5%), przy dostępie do wody i pożywienia ad libitum. W wieku 8 tygodni myszy zostały przestawione na dietę „Western” (Western diet), składającą się z 21% części wagowych tłuszczu oraz 0,15% części wagowych choleste rolu, sporządzoną przez firmę Ssniff (Soest, Niemcy). Grupy eksperymentalne (w każdej n = 10) otrzymywały tę samą dietę, zmieszaną z MK-886 (dar z firmy Merck, Rahway, NJ, USA) w dawce 30 mg dziennie/kg m.c., z BAYxl005 (dar z firmy Bayer, Leverkusen, Niemcy) w dawce 18,75 mg dziennie/kg m.c., z montelukastem (dar z firmy Merck, Rahway, NJ, USA) w dawce 1,25 mg dzien nie/kg m.c., z PDTC (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) w dawce 150 mg dziennie/kg m.c. oraz z kurkuminą (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, Michigan, USA) w dawce 7,5 mg dziennie/kg m.c. Leki te zostały zmieszane z dietą „na zimno” fabrycznie, przez firmę Ssniff (Soest, Niemcy). Dawki powyższych substancji zostały dobrane na podstawie wcześniejszych badań z ich zastosowaniem u myszy [3, 17, 47, 86, 163, 198, 270, 331, 337, 358, 360, 374, 381]. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zaakceptowane przez Komitet Etyczny ds. Badań na Zwierzętach Uniwersytetu Jagiellońskiego.

W wieku 6 miesięcy myszy zostały poddane następującej procedurze [304]: 1. Oznaczenie myszy. 2. Zważenie myszy. 3. Wstrzyknięcie dootrzewnowe 1000 IU Fraxiparyny (Sanofi-Synthelabo, Santea, Francja) 10 minut przed znieczuleniem. 4. Eutanazja pod znieczuleniem dootrzewnowym 10 mg Tiopentalu (Sandoz, Wie deń, Austria), przez dokonanie translokacji rdzenia kręgowego. 5. Rozłożenie za kończyny na deseczce. 30

6. Polanie 70% alkoholem. 7. Rozcięcie skóry od brzucha w górę i otwarcie otrzewnej. 8. Przecięcie opłucnej, okrojenie mostka z dwóch stron i odsunięcie go do góry przez spięcie klemem. 9. Pobranie krwi przez wkłucie do prawej komory serca. 10. Uzyskanie osocza przez wirowanie krwi z prędkością 1000 x g w 4°C przez 10 minut. Następnie składowanie w -80°C. 11. Nacięcie uszka prawego przedsionka. Następnie perfundowanie układu krążenia PBS, nakłuwając igłą strzykawki koniuszek lewej komory, utrzymując stałe ciś nienie 100 mm Hg, aż do „zblednięcia” wątroby. 12. Odcięcie mostka i odsłonięcie grasicy, obustronne przecięcie żeber w celu po szerzenia dojścia. 13. Dalsze czynności wykonywane pod mikroskopem. 14. Wycięcie grasicy, aż do odsłonięcia łuku aorty (ryc. 11) i oczyszczenia go in situ. 15. Odsunięcie lewego płuca i serca na bok. 16. Odsłonięcie aorty piersiowej. 17. Odcięcie aorty piersiowej od kręgosłupa i oczyszczenie jej in situ. 18. Odsłonięcie nerek przez wycięcie jelit i wątroby. 19. Odsłonięcie aorty brzusznej aż do rozdwojenia biodrowego oraz oczyszczenie jej in situ. 20. Przecięcie przepony i połączenie aorty piersiowej i brzusznej w odcinku około- nerkowym. 21. Oczyszczenie aorty in situ przez oddzielenie tłuszczu i przydanki (ryc. 12). 22. Odcięcie aorty tuż przy sercu od góry i za rozdwojeniem biodrowym od dołu (ryc. 13). 23. Zanurzenie wypreparowanej aorty w 4% roztworze formaldehydu w PBS. 24. Rozcięcie wzdłużne aorty. 25. Rozpięcie aorty na płytce woskowej za pomocą bardzo cienkich igiełek (ryc. 14). 26. Wycięcie serca, przekrojenie na pół (ryc. 15) i zanurzenie górnej części z „korze niem aorty” w specjalnej miseczce plastykowej, wypełnionej żelem OCT (podsta wą cięcia do dołu, górna część serca z „korzeniem aorty” w górze) (ryc. 16, 17).

3.2. Lipoproteiny osocza

Całkowity surowiczy poziom cholesterolu i triglicerydów był oznaczany przy uży ciu komercyjnie dostępnego zestawu (Roche Molecular Biochemical, Alameda, CA, USA). Frakcjonowanie lipoprotein zostało przeprowadzone na Uniwersytecie Karoliń ska w Sztokholmie metodą cieczowej chromatografii kolumnowej średniociśnieniowej (fast protein liquid chromatography - FPLC) przy użyciu kolumny mikro-FPLC (30 x 0,32 cm Superose6B Amersham Pharmacia, Uppsala, Szwecja), sprzężonej z systemem separacji on-line i następowym wykrywaniem cholesterolu. Przy każdym oznaczeniu 10 pi osocza wstrzykiwano do kolumny FPLC, a zawartość cholesterolu w lipoproteinach była oznaczana on-line przy użyciu dostępnego komercyj- 31 nie kitu MPR 2 1 442 350 na oznaczenie cholesterolu (Roche, Meylan, Francja), który był w sposób ciągły mieszany z rozdzielonymi lipoproteinami przy szybkości przepływu 40 pl/min. Absorbancja była mierzona przy 500 nm, dane zaś były zbierane co 20 se kund, przy użyciu programu EZChrom software (Scientific Software, SanRamon, CA, USA) [162, 193, 300].

Ryc. 11. Odsłonięty tuk aorty 6-miesięcznych myszy kontrolnych apoE/LDLR - DKO (z widoczną biało zabarwioną miażdżycą). Powiększenie x 3

Ryc. 12. Cała aorta wypreparowana

Ryc. 13. Wyizolowana aorta 32

Ryc. 14. Aorta rozpięta na płytce woskowej, gotowa do barwienia Sudanem IV. Widoczne białe plamy miażdżycy

Ryc. 15. Krojenie poprzeczne serca skalpelem. Powiększenie x 3

Ryc. 16. Serce zatopione w OCT w plastykowej foremce

3.3. Oznaczanie wielkości miażdżycy

3.3.1. Metoda „cross-section"

Przecięte poprzecznie serce i znajdujący się w obrębie mięśnia serca początkowy odcinek aorty wstępującej (tzw. „korzeń aorty”) zostały umieszczone w specjalnych pla stykowych foremkach o wymiarach 15 x 15 x 5 mm (cryomolds) (Tissue-Tek, USA), wypełnionych poprzednio po brzeg żelem mrożeniowym OCT (Optimal Cutting Tempe rature) (CellPath, Oxford, UK) (ryc. 16). 33

Ryc. 17. Schemat krojenia poprzecznego serca myszy skalpelem, przed zatopieniem w OCT

Płaszczyzna cięcia (niebieska linia) jest lekko przesunięta zgodnie z ruchem wskazówek zegara w sto sunku do płaszczyzny, jaką wyznacza odległość 1,5 mm od dolnych krawędzi obu uszek (zielona linia). Jest to spowodowane dążeniem do ustawienia płaszczyzny cięcia jak najbardziej zbliżonej do prostopad łej w stosunku do „korzenia aorty”

Foremki te następnie natychmiast zamrożono do temperatury -80°C. Serca umiesz czono w plastykowej foremce, tak aby płaszczyzna cięcia skalpelem dotykała podstawy foremki. Następnie po wyjęciu z zamrażarki dziesięciomikrometrowej grubości skrawki kriostatowe były cięte w kriostacie, w temperaturze -20°C, przy użyciu standaryzowa nego protokołu [400]. Seryjne skrawki z kriostatu (Leica, Jung CM 1800, Niemcy), posiadającego tzw. ru chomą głowicę (niezbędną do uzyskania prawidłowego cięcia poprzecznego aorty pod kątem prostym), cięto z proksymalnego, około 1-milimetrowego odcinka „korzenia aor ty” (ryc. 18). Osiem skrawków zbierano w odstępach 100 pm, rozpoczynając od odległości 100 pm od pojawienia się wszystkich trzech płatków zastawki aortalnej według poniższego protokołu.

Procedura uzyskania obrazu blaszek miażdżycowych w sekcjach poprzecznych początkowego odcinka aorty:

A. Wykonanie sekcji serca myszy, idąc w górę, aż do poziomu dolnego brzegu zasta wek. W momencie dojścia do poziomu początku pierwszej zastawki („punkt zero”), korzystając z ruchomej głowicy, bloczek należy ustawić przestrzennie, tak aby w skrawkach były widoczne równocześnie wszystkie trzy zastawki (ryc. 19). Od tego 34

momentu tnie się w górę co 100 pm (skrawki o grubości 10 pm), aż do wysokości 800 pm powyżej pierwszej sekcji (ryc. 20, 21). Sekcje te muszą być wykonane w kriostacie, ponieważ metodą parafinową wypłuka łoby się lipidy, niezbędne do zobrazowania blaszki miażdżycowej.

B. Po utrwaleniu w 4% paraformaldehydzie (pH 7,0) skrawki barwiono hematoksyliną Meyera oraz czerwienią oleistą [oil red-O (ORO)J (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) według poniższego protokołu.

Utrwalenie skrawków formaldehydem i barwienie hematoksyliną oraz czerwienią oleistą (oil red-O):

1. Stock solution: 0,5-1 g oil red-O (czerwień oleista) w 100 ml isopropanolu (pro panol 2). Roztwór nasycony. 2. „Roztwór roboczy”: 24 ml stock solution + 16 ml wody destylowanej. Pozosta wić na 10-15 minut przed użyciem. 3. Zamrożone sekcje utrwalić w 4% roztworze formaldehydu w PBS (10 minut). 4. Przemyć wodą destylowaną. 5. Zanurzyć w 60% roztworze isopropanolu (1-2 minuty). 6. Zanurzyć w oil red-O na 10-20 minut. 7. Przemyć wodą (5 minut). 8. Hematoksyliną (15-30 sekund). 9. Przemywać w ciepłej wodzie, aż jądra komórkowe staną się niebieskie. 10. Zamknąć preparat w rozpuszczalnym w wodzie medium.

Ryc. 18. Schemat cięcia w kriostacie bloczka OCT z zatopionym sercem myszy

Strzałka wskazuje kierunek cięcia ostrza kriostatu. Linia żółta wskazuje płaszczyznę dotknięcia pierwszej zastawki („punkt zero”). Zaznaczony jest „korzeń aorty”, czyli początkowa część aorty wstępującej, dłu gości około 1 mm, znajdująca się całkowicie w obrębie mięśnia serca

Należy zwrócić uwagę na to, że „korzeń aorty" jest nachylony pod pewnym kątem do początkowej płasz czyzny cięcia. Aby móc kroić korzeń aorty prostopadle do jego przebiegu, w momencie osiągnięcia poprzecznej linii należy rozpocząć manipulacje trójwymiarowe ruchomą głowicą kriostatu 35

Skrawki zabarwione ORO były analizowane pod mikroskopem Olympus BX50 (Olympus, Tokio, Japonia) i użyte do oceny ilościowej. Obrazy z aorty zbierano przy użyciu aparatu cyfrowego Olympus Camedia 5050 i przechowywano jako pliki TIFF o rozdzielczości 1024 x 768 pikseli. Całkowita powierzchnia płytki miażdżycowej była mierzona na każdym szkiełku przy użyciu programu AnalySIS FIVE (Soft Imaging Sy stem, Munster, Niemcy) (ryc. 22) [91, 283, 326, 379, 380]. Dla każdej myszy średnią wielkość powierzchni miażdżycy obliczano z ośmiu od dalonych od siebie o 100 pm skrawków, co w najdokładniejszy sposób odzwierciedla ło powierzchnię przekroju poprzecznego (cross-section) zajętą przez miażdżycę [291, 292, 302].

ściana toru wypływu krwi z lewej komory (początkowo mięsień serca, przechodzący stopniowo budową histologiczną w ścianę aorty)

Ryc. 19. Schemat obrazujący trudności, związane z uzyskaniem w kriostacie cięcia poprzecznego, pro stopadłego do osi aorty

Na różowo zaznaczone są płatki zastawki aortalnej w przekroju poprzecznym. „Punkt zero” oznacza moment, w którym podczas cięcia w kriostacie uwidacznia się początek pierwszego płatka (porównaj ryc. 20 D).

Aby uzyskać cięcia prostopadłe do osi „korzenia aorty", należy zmieniać (pod kontrolą skrawków oglą danych w mikroskopie) płaszczyznę cięcia ostrza kriostatu, tak aby stała się nią „idealna płaszczyzna cięcia” (żółta).

Służy temu specjalna procedura („North South West East") zmiany położenia ruchomej głowicy kriostatu, w zależności od ustawienia przestrzennego uzyskanego „punktu zero” (nieomawiana w niniejszej pracy dla uproszczenia). 36

Ryc. 20. Krojenie mięśnia serca w kriostacie, idąc płaszczyzną ostrza kriostatu od dołu w górę, w kierun ku „korzenia aorty" (porównać z ryc. 18):

A. Początek krojenia - na obrazie widoczny sam mięsień serca.

(Należy pamiętać, że w rzeczywistości podczas krojenia skrawków w kriostacie, pokazane obrazy, widoczne pod mikroskopem, są bezbarwne).

B. Dalsze krojenie - pojawiają się tzw. „robaczki” (worms).

C. „Robaczki” zaczynają formować ściany naczyń - aorty i pnia płucnego.

D. Aorta. Należy zwrócić uwagę na (zaznaczony niebieską strzałką) pojawiający się tzw. „punkt zero" na płatku zastawki w dolnej części ryciny. Od tego momentu należy wykorzystać ruchomość głowicy krio statu i tak nastawić przestrzennie bloczek, aby na przekroju były widoczne wszystkie trzy płatki (aby płaszczyzna cięcia była prostopadła do osi długiej „korzenia aorty").

E. Pierwszy płatek jest wyraźnie widoczny, a pozostałe dwa zaczynają się tworzyć.

F. Trzy płatki zastawki aortalnej w pełni widoczne 37

Ryc. 21. Obraz kolejnych sekcji poprzecznych „korzenia aorty” co 100 pm, licząc od „punktu zero”, w któ rym w cięciu pojawia się pierwszy płatek

Należy zwrócić uwagę na zanikające płatki zastawek aortalnych oraz pojawienie się na przekroju 400 pm tętnicy wieńcowej, która wyżej (700 pm) łączy się z aortą.

Miarą wielkości miażdżycy z każdego serca jest średnia arytmetyczna z 8 kolejnych skrawków aorty, zbieranych co 100 pm, począwszy od „punktu zero" 38

Ryc. 22. Komputerowa ocena wielkości miażdżycy w przekroju poprzecznym „korzenia aorty”. (Widoczna także przecięta poprzecznie tętnica wieńcowa)

3.3.2. Metoda „en face"

Aorty od łuku do rozdwojenia biodrowego były utrwalane w 4% formaldehydzie, otwierane nożyczkami wzdłużnie, przypinane cienkimi igiełkami do płytek woskowych i barwione Sudanem IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), według poniższego pro tokołu: 1. Rozpiąć aortę wyjętą z 4% formaldehydu na płytce za pomocą bardzo małych igiełek (FST, Niemcy). 2. Przepłukać w 70% etanolu przez 5 minut. 3. Barwić w roztworze roboczym (working solution) Sudanu IV (opis poniżej) przez 6 minut. 4. Płukać dwukrotnie w 80% etanolu przez całkowity okres 3 minut. 5. Przechowywać w PBS w lodówce (lub w formaldehydzie dla dłuższego przecho wywania). Roztwór roboczy 5 g Sudan IV 500 ml 70% etanolu 500 ml 100% acetonu Przefiltrować przed użyciem. Powierzchnia zmian miażdżycowych aorty i całkowita powierzchnia aorty były oblicza ne przy użyciu programu LSM Image Browser software (Zeiss, Jena, Germany) (ryc. 23). 39

Ryc. 23. Komputerowa ocena procentowej wielkości miażdżycy w przekroju wzdłużnym aorty:

A - aorta barwiona Sudanem IV: B - całkowita powierzchnia aorty; C - powierzchnia zmian miażdżyco wych

3.4. Badania immunohistochemiczne

Do wykonania potrójnych barwień immunohislochemicznych zostały wykorzystane skrawki aorty wstępującej utrwalone w acetonie i wysuszone. Następnie skrawki były pre- inkubowanc w roztworze 5c/< nieimmunogennej surowicy koziej z dodatkiem 29ł suchego odtłuszczonego mleka w celu wyblokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał. Inku bacje z przeciwciałami pierwotnymi przeprowadzano przez noc w temperaturze pokojowej w następującej kombinacji surowic: skoniugowane z Cy3 przeciwciała mysie przeciwko 40 a-aktynie mięśni gładkich (SMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [rozcieńczenie 1 : 600], szczurze przeciwciała przeciwko mysiemu antygenowi CD68 (Serotec, Oxford, UK) [rozc. 1 : 800] oraz królicze przeciwciała przeciwko antygenowi CD3 (Calbiochem, Darmstadt, Niemcy) [rozc. 1 : 600]. (Cy2 i Cy3 to barwniki karbocyjaninowe.) Po wypłukaniu w buforze PBS zastosowano przeciwciała drugiego rzędu: biotyny- lowaną kozią surowicę przeciwko szczurzym immunoglobulinom oraz kozią surowicę przeciwko króliczym immunoglobulinom skoniugowaną z Cy2 (oba odczynniki z Jack son IR, West Grove, PA, USA). Po wypłukaniu, jako ostatni etap reakcji immunohistochemicznej, skrawki inkubo- wano ze streptawidyną skoniugowaną z aminometylokumaryną (AMCA) (Vector, Bur lingame, CA, USA). Skrawki po ostatecznym wypłukaniu zamykano w glicerolu w PBS o pH 8,6 [435]. Skrawki były oceniane przy użyciu epifluorescencyjnego mikroskopu Olympus BX50, wyposażonego w odpowiednie zestawy filtrów (U-MNG, U-MNIBA, U-MWU), aby uwidocznić odpowiednio czerwoną (Cy3), zieloną (Cy2) oraz niebieską (AMCA) fluorescencję. Obrazy były rejestrowane przy użyciu cyfrowego aparatu fotograficznego Olympus Camedia 5050. W każdym skrawku całkowita powierzchnia zajmowana przez CD68-immunopo- zytywne makrofagi oraz przez a-aktynę była mierzona przy użyciu oprogramowania AnalySIS FIVE (Soft Imaging System, Munster, Niemcy). CD3-immunoreaktywne lim focyty T były zliczane na każdym analizowanym skrawku przez dwóch niezależnych obserwatorów.

3.5. Barwienie skrawków trichromem Massona i orceiną

Skrawki były także barwione trichromem Massona dla uwidocznienia kolagenu, któ ry zabarwia się na zielono, oraz orceiną w celu ukazania włókien sprężystych, barwią cych się na kolor fioletowy.

Metodyka barwienia „trichrome” według Massona-Goldnera: Skrawki uwodniono i barwiono rutynowo w hematoksylinie Ehrlicha. Następnie skrawki były barwione w roztworze 0,1 % pąsu ksylidynowego (Ponceau de xylidine), 0,03% kwaśnej fuksyny i 0,01% azofloksyny przez okres 9 minut. Po wypłukaniu w wo dzie destylowanej skrawki przenoszono do 2% roztworu oranżu G w 4% kwasie fosfo- romolibdenowym, na okres 4 minut. Po wypłukaniu w wodzie destylowanej barwiono w 1% roztworze zieleni jasnej przez 2 minuty. Preparaty wypłukano w wodzie desty lowanej, odwodniono w alkoholu, prześwietlono w ksylenie i zamknięto w niepolarnej żywicy syntetycznej typu Entellan.

Barwienie orceiną: Skrawki po uwodnieniu przebarwiano w 1% roztworze orceiny syntetycznej w 70% alkoholu przez okres 6 godzin. Następnie były one różnicowane pod kontrolą mikrosko pu w zakwaszonym alkoholu. Preparaty wypłukano w wodzie, odwodniono, przeświet lono w ksylenie i zamknięto w niepolarnej żywicy syntetycznej typu Entellan. 41

3.6. Badania biochemiczne

Osoczowy poziom rozpuszczalnej frakcji adhezyn komórek naczyń (soluble vascular cell adhesion molecule-!) sVCAM-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) [80, 250, 330, 356] oraz białka chemotaktycznego dla monocytów (macrophage chemotactic pro tein-!) MCP-1 (BioSource, Camarillo, CA, USA) [309] oznaczano testem immunoen- zymatycznym (ELISA).

3.7. Analiza statystyczna

Wyniki zostały wyrażone jako średnia arytmetyczna ± SEM. Ze względu na brak rozkładu normalnego większości parametrów miażdżycy zostały użyte testy nieparame tryczne. Najpierw test Kruskala-Wallisa został zastosowany do sprawdzenia istnienia różnic między grupami. W przypadku stwierdzenia statystycznie znamiennych różnic nieparametryczny test Manna-Whitneya był używany do analizy danych. W przypadkach występowania rozkładu normalnego parametrów stosowano naj pierw analizę wariancji ANOVA, a następnie test post hoc Duncana. W obu sytuacjach p < 0,05 zostało uznane za statystycznie znamienne.

Obliczenia statystyczne zostały wykonane przy użyciu pakietu statystycznego Stati- stica 6 dla Windows (StatSoft, TX, USA).

4. WYNIKI

4.1. Lipidy

MK-886, BAYxlOO5 oraz montelukast, jak również PDTC i kurkumina nie zmieniły znamiennie poziomu cholesterolu i triglicerydów (tabela 2) oraz profilu lipoproteinowego cholesterolu w osoczu badanych myszy (ryc. 24).

Tabela 2 Poziom całkowitego cholesterolu (TCH) i triglicerydów (TG) w osoczu myszy

Grupa TCH (mmol/l) ± SEM TG (mmol/l) ± SEM

kontrola (n = 10) 26,8 ± 1,3 2,01 ±0,1

leczone MK-886 (n = 10) 25,3 ±1,1 (NS) 1,9 ±0,1 (NS)

leczone BAYx1005 (n = 10) 24,4 ± 0,9 (NS) 1,8 ±0,1 (NS)

leczone montelukastem (n = 10) 28,5 ± 1,0 (NS) 1,75 ±0,1 (NS)

leczone kurkuminą (n = 10) 25,9 ± 1,1 (NS) 1,8 ±0,1 (NS)

leczone PDTC (n = 10) 28,9 ± 1,1 (NS) 1,8 ±0,2 (NS)

NS - brak znamienności statystycznej w stosunku do kontroli 44

4.2. Masa myszy

Masa myszy nie różniła się pomiędzy grupami (tabela 3).

Tabela 3 Masa myszy

Grupa Średnia masa ciała ± SEM (g)

kontrola (n = 10) 45,6 ±0,3

leczone MK-886 (n = 10) 44,8 ±0,4 (NS)

leczone BAYx1005 (n = 10) 46,2 ± 0,5 (NS)

leczone montelukastem (n = 10) 44,5 ±0,3 (NS)

leczone kurkuminą(n = 10) 45,4 ± 0,4 (NS)

leczone PDTC (n = 10) 45,9 ± 0,2 (NS)

NS - brak znamienności statystycznej w stosunku do kontroli

4.3. Wielkość miażdżycy

Aorty różniły się stopniem miażdżycy pomiędzy grupą kontrolną a grupami, któ rym podawano leki. Mierzony metodą „en face” procent całkowitej powierzchni aorty zajętej przez barwione Sudanem IV zmiany wynosił w grupie kontrolnej 25,15 ± 2,9%, podczas gdy w grupie traktowanej MK-886 11,16 ± 0,7%, traktowanej BAYxl005 15,16 ± 1,4%, w grupie otrzymującej montelukast 17,23 ± 1,8%, otrzymującej PDTC 15,63 ± 0,6%, a w grupie otrzymującej kurkuminę 19,2 ± 0,6% (n = 7) (ryc. 25). Metoda „cross-section ujawniła również różnice w powierzchni zmian miażdżyco wych. Liczona w 8 kolejnych skrawkach średnia zmian ± SEM, zajętych przez barwione ORO zmiany wynosiła 455 494 ± 26 477 pm2 w grupie kontrolnej przeciwko 263 042 ± 20 736 pm2 w grupie z podawanym MK-886, 278 107 ± 21 824 pm2 z podawanym BAYxl005, 303 599 ± 22 735 pm2 w grupie otrzymującej kurkuminę, 291 695 ± 30 384 pm2 w grupie otrzymującej PDTC, 299 201 ± 20 373 pm2 zaś w grupie z podawanym montelukastem (n = 10) (ryc. 26, 27) [204, 205, 298]. Wszystkie różnice osiągnęły znamienność statystyczną. 45

4.4. Struktura blaszki i jej stabilność

Badano także zawartość makrofagów, limfocytów T, jak również kolagenu i mięś- niówki gładkiej w blaszkach miażdżycowych, jako wskaźniki stabilności blaszki. Stwierdzono, iż zawartość makrofagów (CD68) była obniżona w blaszkach pocho dzących od myszy leczonych MK-886 (63% v.v 35%; p = 0,007), podczas gdy zawartość kolagenu (4% 7%; p = 0,02) i komórek mięśni gładkich (a-aktyny) (8% v.s 15%; p = 0,03) była zwiększona u leczonych myszy w stosunku do grupy kontrolnej (n = 10 w każdej grupie). Ilość limfocytów T (CD3) była znamiennie niższa w grupie leczonej MK-886 w stosunku do grupy kontrolnej. Podsumowując, blaszki miażdżycowe u myszy traktowanych MK-886 były bardziej stabilne niż u myszy kontrolnych (ryc. 28, 29).

W przypadku BAYxlOO5, montelukastu, PDTC oraz kurkuminy powyższe parame try osiągały wartości pośrednie pomiędzy MK-886 a kontrolą (tabela 4, ryc. 30).

Tabela 4 Skład blaszki miażdżycowej w poszczególnych grupach

CD68 ± SEM kolagen ± a-aktyna ± CD3 ± SEM (% powierzchni SEM SEM Grupa (liczba zajętej przez (% powierzchni) (% powierzchni) komórek/mm2) komórki CD68+) kontrola 63 ±6 4± 1 8±2 27 ±6 leczone MK-886 35 ±4* 7 ±2* 15 ±3* 9 ±4* leczone BAYx1005 42 ±5* 6± 1* 13 ±3* 13 ±5* leczone montelukastem 47 + 5* 4 + 1 (NS) 12 ±3* 17 ±5* leczone kurkuminą 59 ± 6 (NS) 5± 1 (NS) 9 ± 2 (NS) 25 ± 6 (NS) leczone PDTC 46 ±5* 5± 1 (NS) 11 ±3* 21 ±5*

NS - brak znamienności statystycznej w stosunku do kontroli * p < 0,05 w stosunku do kontroli

4.5. Osoczowe markery zapalenia

Jeśli chodzi o poziomy osoczowe sVCAM-l oraz MCP-1, to wartości w każdej z ba danych grup nie różniły się statystycznie znamiennie od grupy kontrolnej (ryc. 31, 32 ). 46

Profil cholesterolu lipoproteinowego

Ryc. 24. Analiza profilu cholesterolu zawartego w poszczególnych frakcjach lipoproteinowych za pomocą metody FPLC

Próbki pochodzą z osocza 24-tygodniowych podwójnie „znokautowanych" myszy kontrolnych oraz kar mionych lekami: MK-886, BAYx1005, montelukastem, PDTC i kurkuminą. (Oryginalne przebiegi, repre zentatywne dla n = 10 eksperymentów) 47

Ryc. 25. Aorty barwione Sudanem IV, pochodzące z grupy kontrolnej oraz z grup traktowanych lekami, u myszy apoE/LDLR - double knockout

Poniżej przedstawiona jest powierzchnia zmian lipidowych (wyrażona jako procent powierzchni całej aor ty) (n = 10 w każdej grupie).

Wyniki są przedstawione jako średnia ± SEM. *p < 0,05 w stosunku do grupy kontrolnej 48

Ryc. 26. Reprezentatywne mikrofotografie ukazujące barwione czerwienią oleistą (pil red-O) zmiany miażdżycowe u myszy apoE/LDLR - double knockout w grupie kontrolnej oraz w grupach leczonych 49 2 pm

powierzchnia

Ryc. 27. Wielkość zmian w korzeniu aorty, wyrażona w pm2, u barwionych ORO 6-miesięcznych myszy apoE/LDLR - double knockout - kontrolnych i leczonych (n = 10 w grupie)

Wyniki są przedstawione jako średnia ± SEM. *p < 0,05 w stosunku do grupy kontrolnej 50

kontrola MK-886

Ryc. 28. Skład blaszki miażdżycowej u 24-tygodniowych myszy leczonych MK-886 w porównaniu z grupą kontrolną Reprezentatywne mikrofotografie, ukazujące zmiany miażdżycowe barwione czerwienią oleistą (oil red-O), a także tńchromem Massona (kolagen na zielono). Immunohistochemiczne barwienie na a-aktynę mięśni gładkich (SMA) oraz na marker makrofagów CD68 (wszystko w powiększeniu x 400) 51

kontrola MK-886

Ryc. 29. Skład blaszki miażdżycowej u 24-tygodniowych myszy leczonych MK-886 w porównaniu z grupą kontrolną

Reprezentatywne mikrofotografie, ukazujące zmiany miażdżycowe barwione czerwienią oleistą (oil red-O), tńchromem Massona (kolagen na zielono) oraz orceiną (wszystko w powiększeniu x 80) kich Reprezentatywne PDTC Ryc. ■

400).

MK-886 PDTC montelukast kontrola

(SMA). 30.

L montelukastem

Potrójne =

lumen na

CD3

barwienie (światło mikrofotografie

marker

porównaniu naczynia)

immunohistochemiczne

limfocytów

ukazujące

grupą

oraz

immunohistochemiczne

kontrolną

marker

blaszek

makrofagów

miażdżycowych

barwienie

CD68

(wszystko myszy

«-aktynę

leczonych

powiększeniu

mięśni

MK-886,

gład

53 (ng/ml)

sVCAM-1

9 . Poziom sVCAM-1 w osoczu w badanych grupach

[pg/ml]

MCP-1

Ryc. 32. Poziom MCP-1 w osoczu w badanych grupach

5. DYSKUSJA

5.1. Wstęp

Na mysich modelach eksperymentalnych miażdżycy: apoE - knockout lub LDL re ceptor - knockout przebadano dotąd wpływ licznych grup leków na aterogenezę. Zba dano między innymi wpływ na rozwój miażdżycy: niesterydowych leków przeciwzapal nych [22, 46, 60, 83, 284, 295, 306, 336, 348, 427], związków działających na jądrowy receptor peroksysomalnego czynnika proliferacyjnego (PPAR) [112, 130, 237,434], czy też substancji związanych z metabolizmem tlenku azotu [5, 63, 107, 260, 293]. Ważnych obserwacji dokonano w dziedzinie leków związanych z osią renina-angiotensyna-aldo- steron [9, 55, 59, 85, 87, 88, 106, 109, 182-184, 213, 214, 217, 236, 257, 259, 323, 352, 363]. Przeprowadzono także wiele badań dotyczących antyoksydantów, przy okazji sta wiając we właściwym świetle niejednoznaczne skutki działania tych związków u ludzi [10, 24, 29, 38, 72, 78, 84, 181, 211, 271, 290, 324, 328, 399, 403, 414, 415, 426, 429]. Bardzo ciekawym przyczynkiem do ewentualnej farmakoterapii miażdżycy były bada nia nad blokerami endoteliny [13, 21, 51, 113, 197]. Sprawdzano także wpływ na rozwój miażdżycy substancji leczących cukrzycę [44, 61, 231, 235, 316, 362]. Badano również działanie magnezu [333, 364-366] oraz żelaza [216, 233]. Ani hodowle komórkowe, ani badania kliniczne nie pozwalają wykonać wstępnych prób nowych możliwości terapeutycznych leków. Niedawno napisano, że stworzenie myszy z homologiczną wymianą genów (gene-targeted) było prawdziwym przełomem w badaniach nad leczeniem miażdżycy [353, 382]. Jednakże udoskonalony model: myszy z wyłączonymi genami dla apolipoproteiny E i receptora LDL (apoE/LDLR - double knockout) wykorzystano, jak dotąd, zaledwie w kilku badaniach nad potencjałem przeciwmiażdżycowym leków [51, 65, 132, 187, 207, 208, 229, 404, 421].

5.2. Skrót wyników

W niniejszym badaniu zastosowano model myszy: apoE/LDLR - double knockout. U eksperymentalnych myszy z zastosowaną homologiczną wymianą genów (gene- -targeted) karmionych wysokocholesterolową dietą „Western” (Western diet), blaszki 56 miażdżycowe są większe niż u tych samych myszy karmionych zwykłą dietą (chow diet). Ponadto zmiany rozwijają się znacznie szybciej [282]. Dlatego też w niniejszej pracy wybrano dietę „Western” do karmienia myszy. Tabela 5 pokazuje skrótowe omó wienie uzyskanych wyników.

Tabela 5 Podsumowanie uzyskanych wyników

MK-886 BAYx1005 montelukast PDTC kurkumina

hamowanie miażdżycy +++ +++ + ++ + wzrost stabilności blaszki +++ +++ + ++ - zmiana profilu lipoproteinowe - - - - - go cholesterolu obniżenie poziomu osoczo - - - - - wego MCP-1 i sVCAM-1 zmiana masy ciała - - - - -

5.3. Lipidy

Ani poziom całkowity osoczowego cholesterolu i triglicerydów, ani profil lipoproteinowy cholesterolu nie zmieniły się pod wpływem leków. Jest to bardzo cenna infor macja, gdyż daje ona pewność, iż ewentualne działanie przeciwmiażdżycowe leku nie jest na pewno związane z obniżeniem poziomu cholesterolu i triglicerydów, czy też ze zmianą profilu lipoproteinowego cholesterolu.

5.4. Masa myszy

Masa badanych myszy była większa od masy 6-miesięcznych myszy karmionych normalną dietą (chow diet). Jednakże nie było różnicy pomiędzy grupami, co świadczy o tym, że leki nie wpływały na masę ciała, a dodatek leku w paszy nie powodował utraty apetytu. 57

5.5. Wielkość miażdżycy

Wszystkie badane leki powodowały statystycznie znamienne hamowanie miażdży cy, choć w różnym stopniu. Najsilniej przeciwmiażdżycowo działał MK-886, następnie BAYxl005, potem PDTC, dalej montelukast, a najsłabiej kurkumina. Nasuwa się pytanie: dlaczego montelukast - bloker receptora dla leukotrienów cysteinylowych działał słabiej od blokerów FLAP: MK-886 i BAYxl005? Odpowiedzią może być schemat (ryc. 33).

Ryc. 33. Próba wyjaśnienia mniejszej siły działania przeciwmiażdżycowego montelukastu w stosunku do MK-886 i BAYx1005

Montelukast blokuje „łańcuch leukotrienowy", hamując tylko działanie leukotrienów cysteinylowych na ich receptory, nie ma natomiast żadnego wpływu na prozapalne działanie LTB4. Natomiast MK-886 i BAYx1005 hamują wysoko „łańcuch leukotrienowy”, uniemożliwiając produkcję wszystkich leukotrienów, zarówno cysteinylowych, jak i leukotrienu B4. AA- kwas arachidonowy; 5-HPETE - kwas 5-hydroperoksyeikozatetraenowy

Jak wynika z rysunku, całkowicie poza „zasięgiem” działania montelukastu jest LTB4, który ma bardzo duże działanie prozapalne. Jest on silnym czynnikiem chemotaktycznym zarówno dla neutrofilów, jak i makrofagów. W neutrofilach powoduje on 58 wzrost ekspresji błonowych cząstek odpowiedzialnych za adhezję, zwiększa produkcję wolnych rodników i uwalnianie enzymów z ziarnistości. W makrofagach i limfocytach natomiast pobudza proliferację i uwalnianie cytokin. LTB4 jest ważnym przekaźnikiem we wszystkich typach zapalenia. Występuje w wy siękach zapalnych i w tkankach wielu procesów zapalnych, takich jak: reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczyca i wrzodziejące zapalenie jelita grubego. W aterogenezie rola LTBJest również istotna. Już w 1988 roku, dekadę przed oficjalnym uznaniem teorii zapalnej miażdżycy [346], opisano wytwarzanie leukotrienu B4 w blaszce miaż dżycowej [93]. W 2002 roku potwierdzono na myszach apoE - knockout, że podawanie antagonisty receptora dla LTB4 powoduje zmniejszenie zmian miażdżycowych [4, 340]. Na rolę LTB4 w miażdżycy, poprzez zależne od NF-kB receptory BLT^ wskazuje nie dawne doniesienie Back i wsp. [13]. Samo zablokowanie receptorów dla leukotrienów cysteinylowych przez montelukast również skutkuje, choć w mniejszym stopniu, hamowaniem tworzenia się blaszki miażdżycowej. W 2003 roku Lótzer i wsp. wskazali, że pochodzące z makrofagów leukotrieny cysteinylowe aktywują receptory leukotrienowe podczas aterogenezy [251]. Leukotrieny cysteinylowe są czynnikami powodującymi skurcz mięśni oskrzelowych i rozkurcz większości naczyń krwionośnych, z wyjątkiem naczyń wieńcowych (w któ rych wywołują skurcz). Należy pamiętać, że receptory dla peptydoleukotrienów znajdują się na licznych komórkach w obrębie blaszki miażdżycowej: na komórkach śródbłonka, limfocytach T, makrofagach, mastocytach i mięśniówce gładkiej [42].

5.6. Przebudowa blaszki miażdżycowej

Tak zwana „stabilizacja blaszki miażdżycowej” polega na spadku ilości makrofagów, komórek piankowatych oraz limfocytów T w blaszce, a wzroście ilości komórek mięś- niówki gładkiej oraz kolagenu, tworzących pokrywę blaszki. Stabilizacja jest bardzo istotnym czynnikiem, zmniejszającym ryzyko pęknięcia blaszki i następowych powi kłań zakrzepowych. Zmniejszona ilość kolagenu, komórek mięśni gładkich, jak również zwiększona infiltracja makrofagów i limfocytów T jest związana z tendencją do pękania blaszki miażdżycowej [248]. W niniejszym badaniu wszystkie leki, z wyjątkiem kurkuminy, stabilizowały blasz kę, choć w różnym stopniu - w takiej samej kolejności, jak przy hamowaniu rozwoju miażdżycy.

5.7. Poziom osoczowych markerów zapalenia

Pomimo oczekiwań, poziomy surowicze sVCAM-l oraz MCP-1 nie zmieniały się znamiennie pod wpływem leków. Przyczyną tego może być fakt, że zastosowana w pra cy dieta „Western” często zaburza delikatną siatkę cytokin, działających w procesie ate rogenezy [174]. 59

5.8. Rola leukotrienów w zapaleniu w ścianie naczynia krwionośnego

Miażdżyca jest przewlekłą chorobą zapalną [346, 347]. Teoria zapalna miażdżycy stała się nie tylko istotnym osiągnięciem badawczym w jej poznaniu, lecz również prze łomem koncepcyjnym, pozwalającym na nowe spojrzenie na problem prewencji i terapii tej choroby [57, 144, 145, 211, 321].

Leukotrieny odgrywają bardzo istotną rolę w każdym typie zapalenia rozgrywające go się w ścianie naczynia krwionośnego (ryc. 34). Zdolność do wytwarzania leukotrienów zależy od obecności w komórce kluczo wych enzymów uczestniczących w biosyntezie tych związków. Ponieważ występowa nie 5-lipooksygenazy (5-LO) i białka FLAP ogranicza się do komórek wywodzących się ze szpiku kostnego (mastocyty, eozynofile, monocyty, bazofile, makrofagi, neutrofile), stanowią one tzw. pierwotne źródło leukotrienów. Poszczególne komórki różnią się rodzajem i liczbą produkowanych leukotrienów. Większość wytwarza znaczące ilości LTB4 albo LTC4, ale nie obu tych substancji jedno cześnie. Eozynofile i mastocyty syntetyzują głównie LTC4, neutrofile zaś - LTB4.

Ryc. 34. Prozapalna rola leukotrienów w ścianie naczynia krwionośnego 60

Monocyty i makrofagi syntetyzują zarówno LTB4, jak i LTC4 (makrofagi ludzkie częściej syntetyzują LTB4, natomiast mysie - LTC4). Bazofile ludzkie uwalniają głównie LTB4 (po stymulacji swoistym alergenem mogą także wytwarzać LTC4). Należy także pamiętać, że istnieją komórki, które chociaż nie zawierają 5-lipooksygenazy (5-LO), mogą również syntetyzować leukotrieny, aczkolwiek w znacznie mniejszych ilościach. Jest to możliwe dzięki obecności w nich syntazy LTC4 lub hydrolazy LTA4. Komórki śródbłonka i płytki krwi mogą wytwarzać leukotrieny z LTA4 dzięki synta- zie LTC4. Z kolei erytrocyty i limfocyty T zawierają hydrolazę A4 i mogą syntetyzować LTB4, wykorzystując zewnątrzkomórkowy LTA4, pochodzący z komórek, w których wy stępuje 5-LO. Proces ten nazywany jest „syntezą transcelulamą” („przezkomórkową”) (ryc. 34).

Ponieważ miażdżyca jest obecnie uznawana za proces zapalny, naturalne jest zwró cenie uwagi na tak silne mediatory zapalenia, jakimi są leukotrieny, tym bardziej że są one wszechobecne w ścianie naczynia ulegającej procesowi zapalnemu, a ich źródłem mogą być różne komórki.

5.9. Blokowanie leukotrienów w miażdżycy

5-lipooksygenaza (5-LO) [101, 133, 134, 159, 210, 280] jest enzymem, który po zadziałaniu odpowiedniego bodźca przemieszcza się z cytoplazmy do błony okołojądro- wej, gdzie łączy się z białkiem, stanowiącym integralny element błony jądrowej, zwa nym „białkiem aktywującym 5-lipooksygenazę” (FLAP - five lipoxygenase activating protein). Jest ono niezbędne do syntezy leukotrienów w nieuszkodzonych komórkach [47, 121, 149,418].

W zapaleniu istotną rolę odgrywają silne mediatory, jakimi są leukotrieny. W 2002 roku Mehrabian i wsp. zidentyfikowali 5-lipooksygenazę jako główny gen, decydu jący o podatności na miażdżycę u myszy [264]. Rok później doniesiono, że mutacje regionu kodującego 5-lipooksygenazę powodujące spadek jej funkcji, wywołują miaż- dżycoopomość u niektórych szczepów myszy [224, 329]. Spanbroek i wsp. wykazali, że u ludzi podczas procesu miażdżycowego następuje wzrost ekspresji ścieżki enzy matycznej 5-lipooksygenazy [375]. 5-LO została zatem zidentyfikowana jako enzym odgrywający istotną rolę w aterogenezie, zarówno w mysim modelu miażdżycy, jak i u ludzi [115, 265]. Także wiele innych badań z udziałem myszy z homologiczną wy mianą genów (gene-targeted) wskazuje na istotną rolę szlaku leukotrienowego w rozwo ju miażdżycy [82, 136, 137, 141, 192, 430, 431] (ryc. 35).

Rola FLAP w aterogenezie u człowieka została ostatnio udowodniona przez Hel- gadottir i wsp. [186], którzy wykazali, że polimorfizm genetyczny FLAP jest związa ny z zawałem serca oraz udarem mózgu poprzez zwiększenie produkcji leukotrienów, a tym samym nasilenie procesu zapalnego w ścianie naczynia krwionośnego. 61

Ryc. 35. Hipotetyczne działanie leukotrienów, produkowanych przez makrofagi/komórki piankowate/ko- mórki dendrytyczne, na komórki w blaszce miażdżycowej (zmodyfikowane z [251])

BLT,-R - receptor o dużym powinowactwie dla LTB4; BLT2-R - receptor o małym powinowactwie do l_TB4; CysLT,-R oraz CysLT2-R - receptory dla leukotrienów cysteinylowych

Powyższe doniesienia spowodowały sformułowanie hipotezy, że leki blokujące synte zę i działanie leukotrienów powinny hamować miażdżycę [82, 95, 178, 376, 383, 411]. I rzeczywiście, w niniejszej pracy po raz pierwszy udowodniono, iż hamowanie czynności FLAP poprzez MK-886 oraz BAYxl005, a także blokowanie receptora leukotrienowego przez montelukast powoduje hamowanie aterogenezy w eksperymental nym modelu miażdżycy: u myszy ze zinaktywowanymi genami dla apolipoproteiny E i receptora LDL. Leukotrieny, jako silne mediatory zapalenia, odgrywają ponadto rolę w stabilności blaszki miażdżycowej. W niniejszej pracy wykazano, że MK-886, w mniejszym stop niu BAYxl005, a w najmniejszym montelukast, nie tylko zmniejszają rozległość zmian miażdżycowych, lecz również powodują zwiększenie stabilności blaszki. Przykładowo, MK-886 zwiększyła barwienie blaszek na kolagen, jak również na a-aktynę komórek mięśni gładkich. W przeciwieństwie do tego proporcja powierzchni blaszki barwionej na marker makrofagowy CD68 oraz liczba limfocytów T była niższa u zwierząt leczonych MK-886. 62

5.10. Blokowanie NF-kB w miażdżycy

W świetle zapalnej teorii powstawania miażdżycy wielu autorów wskazuje na jądro wy czynnik transkrypcyjny NF-kB jako istotny w przyszłości cel hamowania aterogenezy [13, 228, 274, 406]. Regulowane przez NF-kB geny kodują białka związane z szybką odpowiedzią na patogen lub stres, jak cytokiny [TNF-a, interleukina-1 (1L-1), IL-2, IL-6, IL-8, białka chemotaktyczne], receptory cytokinowe, molekuły adhezyjne (VCAM-1, ICAM-1, se- lektyna-E), hematopoetyczne czynniki wzrostu i inne składniki odpowiedzi ostrej fazy [15, 16, 25, 49, 97, 180, 212, 238, 241, 377, 422, 424]. Także indukowalna syntaza tlenku azotu (iNOS) zależy od genów kontrolowanych przez NF-kB.

W niniejszej pracy zastosowano dwa związki, których działanie polega na hamo waniu NF-kB: PDTC i kurkuminę (ryc. 36). Oba te związki zmniejszały aterogenezę, choć kurkumina w słabszym stopniu. PDTC powoduje także wzrost stabilności płytki w porównaniu z kontrolą. Kurkumina nie wykazuje jednak takiego działania.

Krytycznym momentem w aterogenezie jest infiltracja komórek zapalnych do ścia ny naczynia [346]. Adhezyna komórek naczyń (vascular celi adhesión molecule-1 - VCAM-1) odgrywa tutaj rolę kluczową, pośrednicząc w wiązaniu się leukocytów do komórek śródbłonka [120]. Okazuje się, że PDTC wyraźnie hamuje indukowaną przez cytokiny ekspresję genu dla VCAM-1 w hodowli ludzkich komórek śródbłonka [374]. PDTC jest także silnym induktorem dla oksygenazy hemowej-1. Wykazano z kolei, że indukcja HO-1 zapobiega śródbłonkowej nadekspresji molekuł adhezyjnych i nastę powemu rozwojowi miażdżycy po przeszczepie naczynia u myszy [168], a jej nieobec ność zaostrza proces miażdżycowy u myszy [425].

Chociaż mechanizm molekularnego działania kurkuminy nie jest do końca zrozu miały, w szeregu doświadczeń wykazano, że posiada ona własności antyoksydacyjne, przeciwzapalne i przeciwnowotworowe [3, 8, 114]. Powstało zatem pytanie, czy kurku-

NF-kB

------PDTC

Ryc. 36. Działanie PDTC oraz kurkuminy 63 mina może hamować zapalną komponentę miażdżycy, tak jak np. flawonoidy [131, 297, 338]. Naturalnie występujące związki polifenolowe prezentują bowiem szerokie spek trum aktywności biologicznych [269] i mogą reprezentować obiecującą grupę związków przeciwmiażdżycowych [258, 417]. Przykładowo, flawonoidy chronią LDL przed utle nieniem [10], nasilają bioaktywność pochodzącego ze śródbłonka tlenku azotu [410], hamują aktywację śródbłonka [57] oraz agregację płytek [349]. Te wyżej wymienione mechanizmy mogłyby być odpowiedzialne także za przeciwmiażdżycowe działanie kurkuminy. Ostatnio wykazano, że pochodne kurkuminy zmniejszają formowanie się aortalnych pasm tłuszczowych (fatty streak) u królików karmionych dietą bogatą w cholesterol [281, 327]. Jednakże model ten ma wiele ograniczeń i, jak dotąd, nie ma żadnych danych do tyczących ewentualnego przeciwmiażdżycowego potencjału kurkuminy w najnowszych modelach eksperymentalnych miażdżycy [201]. Niedawno wykazano u myszy apoE - knockout, że doustna suplementacja estrem fenyloetylowym kwasu kawowego (caffeic acid phenethyl ester - CAPE), substancją podobną do kurkuminy, powoduje zmniejsze nie miażdżycy w związku z hamowaniem NF-kB [190]. Także sama kurkumina hamo wała aktywność NF-kB w stymulowanych komórkach śródbłonka [53, 164]. Inny ewentualny mechanizm, odpowiedzialny za przeciwmiażdżycowe działanie kurkuminy, mógłby zależeć od indukowania przez nią HO-1, silnego przeciwutlenia- jącego i naczynioochronnego enzymu [1, 17, 191, 355]. Indukcja HO-1 powodowała u myszy apoE - knockout zahamowanie rozwoju miażdżycy [209, 425]. Wykazano tak że, że kurkumina może indukować HO-1 w komórkach śródbłonka in vitro [278].

Pojawia się pytanie: dlaczego kurkumina hamuje miażdżycę znacznie słabiej od PDTC i nie powoduje, w przeciwieństwie do PDTC, wzrostu stabilności blaszki? Otóż należy pamiętać, iż kurkumina jest nietoksycznym, naturalnym produktem roślinnym o stosunkowo słabym działaniu, PDTC zaś związkiem syntetycznym - silnym inhibito rem NF-kB. Jako taki wywołuje on większe od kurkuminy działanie hamujące na proces zapalny.

5.11. Podsumowanie

Niniejsze badanie jest pierwszym doniesieniem, w którym wykazano na ekspery mentalnym modelu zwierzęcym miażdżycy pozytywny skutek farmakologicznego ha mowania „białka aktywującego 5-lipooksygenazę” (FLAP), blokowania receptora dla leukotrienów cysteinylowych, a także inhibicji jądrowego czynnika transkrypcyjnego kappa B (NF-kB).

6. WNIOSKI

1. Potwierdzając nową teorię aterogenezy, hamowanie procesu zapalnego u myszy z wyłączonymi genami dla apolipoproteiny E oraz receptora LDL zmniejsza miaż dżycę oraz zwiększa stabilność blaszki miażdżycowej.

2. Zahamowanie produkcji, jak również działania leukotrienów powoduje osłabienie procesu miażdżycowego. Hamowanie produkcji jest jednak skuteczniejsze niż samo blokowanie receptorów dla leukotrienów cysteinylowych.

3. Inhibicja działania kluczowego w procesie zapalnym białka - czynnika jądrowego kB (NF-kB) zmniejsza aterogenezę.

4. Myszy z wyłączonymi dwoma genami: dla apolipoproteiny E oraz dla receptora LDL (apoE/LDLR - double knockout), karmione przez 4 miesiące wysokocholesterolową dietą „Western”, są doskonałym narzędziem badawczym do sprawdzania wpływu leków na proces powstawania miażdżycy.

7. STRESZCZENIE

Ostatnie badania nad patogenezą miażdżycy wykazały kluczowe znaczenie procesu zapalnego, w tym działania leukotrienów oraz NF-kB, w powstawaniu i rozwoju miaż dżycy. Hipoteza robocza niniejszej pracy zakładała, że związki znoszące biologiczne działanie leukotrienów (MK-886, BAYxl005 i montelukast) oraz hamujące działanie NF-kB (PDTC i kurkumina) będą hamować rozwój zmian miażdżycowych. Badania prowadzone były na unikatowym modelu zwierzęcym miażdżycy: myszach z wyłą czonymi genami dla apolipoproteiny E i receptora LDL (myszy apoE/LDLR - double knockouf). Sześćdziesiąt żeńskich myszy z wyłączonymi genami dla apolipoproteiny E i recep tora LDL (podzielonych na grupy o liczebności n = 10), o mieszanym podłożu genetycz nym C57BL/6J x 129/SvJ, w wieku 8 tygodni przestawiono na dietę „Western” (Western diet), składającą się z 21% części wagowych tłuszczu oraz 0,15% części wagowych cholesterolu. Grupy eksperymentalne (w każdej n = 10) otrzymywały tę samą dietę, zmieszaną z: MK-886 w dawce 30 mg dziennie/kg m.c., BAYxl005 w dawce 18,75 mg dziennie/kg m.c., montelukastem w dawce 1,25 mg dziennie/kg m.c., PDTC w dawce 150 mg dziennie/kg m.c. oraz kurkuminą w dawce 7,5 mg dziennie/kg m.c. W wieku 6 miesięcy wszystkie myszy poddano eutanazji i pobrano od nich osocze, serca i wypreparowane aorty. Metodą cieczowej chromatografii kolumnowej średnio- ciśnieniowej (FPLC) zmierzono profil lipoproteinowy cholesterolu w osoczu, metoda mi „en face” i „cross-section” zaś wielkość miażdżycy. Badano także budowę blaszek miażdżycowych, mierząc zawartość mięśniówki gładkiej, kolagenu, makrofagów i lim focytów T. Aorty różniły się stopniem miażdżycy pomiędzy grupą kontrolną a grupami, którym podawano leki. Mierzony metodą „en face" procent całkowitej powierzchni aorty zajętej przez barwione Sudanem IV zmiany wynosił w grupie kontrolnej 25,15 ± 2,9%, podczas gdy w grupie traktowanej MK-886 11,16 ± 0,7%, traktowanej BAYxl005 15,16 ± 1,4%, w grupie otrzymującej montelukast 17,23 ± 1,8%, otrzymującej PDTC 15,63 ± 0,6%, w grupie otrzymującej kurkuminę zaś 19,2 ± 0,6%. Metoda „cross-section” dla „korzeni aorty” ujawniła również różnicę w powierzchni zmian miażdżycowych. Liczona w 8 kolejnych skrawkach średnia zmian ± SEM, uzy skanych przez barwienie czerwienią oleistą (oil red-0) wynosiła 455 494 ± 26 477 pm2 w grupie kontrolnej przeciwko 263 042 ± 20 736 pm2 w grupie z podawanym MK-886, 278 107 ± 21 824 pm2 z podawanym BAYxl005, 303 599 ± 22 735 pm2 w grupie otrzy mującej kurkuminę, 291 695 ± 30 384 pm2 w grupie otrzymującej PDTC, 299 201 ± 68

20 373 pin2 zaś w grupie z podawanym montelukastem. Wszystkie te różnice osiągnęły znamienność statystyczną. Związki te również nie zmieniały profilu lipoproteinowego cholesterolu w osoczu. Wykazano także, że wszystkie leki (z wyjątkiem kurkuminy) podnoszą stabilność blaszki miażdżycowej, zmniejszając w niej zawartość makrofagów i limfocytów T, a zwiększając zawartość kolagenu i komórek mięśni gładkich. Niniejsze badanie jest pierwszym doniesieniem, w którym wykazano na modelu eks perymentalnym pozytywny wpływ farmakologicznego hamowania FLAP, receptora dla leukotrienów cysteinylowych oraz NF-kB na proces aterogenezy. 8. SUMMARY

ApoE/LDLR - double knockout mice, as a model of pharmacological inhibition of atherogenesis

Although atherosclerosis was previously thought to be mainly a degenerative disease, it is now well ascertained that its pathogenesis is inflammatory. In the light of recent findings, leukotrienes and 5-lipoxygenase, as well as five lipoxygenase activating protein (FLAP) have an important role in atherogenesis. The similar situation occurs with NF-kB which is a pivotal factor in inflammation. The working hypothesis was: antileukotriene drugs (FLAP inhibitors - MK-886 and BAYxl005 and LTs receptor antagonist - montelukast) as well as anti-NF-KB drugs (PDTC and curcumin) ameliorate the development of atherosclerotic lesions. As the experimental research model, genetically changed mice strain of apolipoprotein E (apoE) & LDL receptor - double knockout mouse (apoE/LDLR - DKO) was used. 60 female 8-week-old apoE/LDLR - DKO mice (in each group n = 10), on mixed genetic background C57BL/6J x 129/SvJ were fed by Western diet (consisting of 21% of fat by weight and 0.15% of cholesterol by weight). Experimental groups (in each n = 10) received the same diet, mixed with: MK-886 in a dose of 30 mg/day/kg b.w., BAYxl005 in a dose of 18.75 mg/day/kg b.w., montelukast in a dose of 1.25 mg/day/kg b.w., PDTC in a dose of 150 mg/day/kg b.w. and curcumin in a dose of 7.5 mg/day/kg b.w. At the age of 24 weeks these mice were sacrificed and plasma, hearts as well as aor tas were taken. By FPLC cholesterol lipoprotein profile was estimated and by “en face" and “cross-section” methods atherosclerotic lesions in whole aorta and in the root of aorta were estimated. Moreover, composition of the plaques was estimated, by measur ing numer of macrophages, T lymphocytes, and estimation of smooth muscle cells and collagen content. Aortas differed in the degree of atherosclerosis between control group and experi mental groups. Measured by “en face” method, the percentage of occupied by Sudan IV - stained surfaces were: 25.15 ± 2.9% in control group, whereas in MK-886 - treated group 11.16 ± 0.7%, in BAYxl005 group 15.16 ± 1.4%, in montelukast group 17.23 ± 1.8%, in PDTC group 15.63 ± 0.6%, and in curcumin group 19.2 ± 0.6%. “Cross-section” of aortic roots revealed the difference in atherosclerotic lesions. Measured in 8 consecutive sections mean surfaces ± SEM, occupied by oil red-0 stained changes were: 455 494 ± 26 477 pm2 in control group versus 263 042 ± 20 736 pm2 in 70

MK-886 - treated group, 278 107 ± 21 824 pm2 in BAYxl005 group, 303 599 ± 22 735 pm2 in curcumin group, 291 695 ± 30 384 pm2 in PDTC group, and 299 201 ± 20 373 pm2 in montelukast group. All the differences were statistically significant. Finally, it was shown that all above drugs (except curcumin) may increase plaque sta bility by decreasing number of macrophages and T lymphocytes and increasing collagen and smooth muscle cells plaque content. To sum up, it was described for the first time that in apoE/LDLR - double knockout mice inhibition of five lipoxygenase activating protein (FLAP) by MK-886 or BAYxl005, cysteinyl leukotrienes receptors by montelukast, as well as NF-kB by PDTC or curcumin ameliorates atherogenesis. 9. PIŚMIENNICTWO

1. Abraham N.G., Kappas A. Heme oxygenase and the cardiovascular-renal system. Free Radic. Biol. Med. 2005; 39: 1-25. 2. Adamek L., Bochenek G. Leki antyleukotrienowe. Medycyna Praktyczna-portal dla lekarzy (on-line) 2001. 3. Aggarwal B.B., Kumar A., Bharti A.C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Res. 2003; 23 (1A): 363-398. 4. Aiello R.J., Bourassa P.A., Lindsey S., Weng W., Freeman A., Showed H.J. Leukotriene B4 receptor antagonism reduces monocytic foam cells in mice. Arterioscler. Thromh. Vase. Biol. 2002; 22: 443^449. 5. Aji W., Ravalli S., Szabolcs M., Jiang X.C., Sciacca R.R., Michler R.E., Cannon P.J. L-Arginine prevents xanthoma development and inhibits atherosclerosis in LDL receptor knockout mice. Circulation 1997; 95: 430-437. 6. Anderson T.J. Nitric oxide, atherosclerosis and the clinical relevance of endothelial dysfunc tion. Heart Fail. Rev. 2003; 8: 71-86. 7. Andreasson A.C., Abt M., Jonsson-Rylander A.C. Confocal scanning laser microscopy mea surements of atherosclerotic lesions in mice aorta. A fast evaluation method for volume de terminations. Atherosclerosis 2005; 179: 35—42. 8. Araujo C.C., Leon L.L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2001:96: 723-728. 9. Arnal J.F., Castano C., Maupas E., Mugniot A., Darblade B., Gourdy P., Michel J.B., Bayard F. Omapatrilat, a dual angiotensin-converting enzyme and neutral endopeptidase inhibitor, prevents fatty streak deposit in apolipoprotein E - deficient mice. Atherosclerosis 2001; 155: 291-295. 10. Aviram M., Fuhrman B. Wine flavonoids protect against LDL oxidation and atherosclerosis. Ann. NY Acad. Sci. 2002; 957: 146-161. 11. Aviram M., Dornfeld L., Kaplan M., Coleman R., Gaitini D.. Nitecki S., Hofman A., Ro- senblat M., Volkova N., Presser D., Attias J., Hayek T.. Fuhrman B. Pomegranate juice flavonoids inhibit low-density lipoprotein oxidation and cardiovascular diseases: studies in atherosclerotic mice and in humans. Drugs Exptl. Clin. Res. 2002; 28: 49-62. 12. Babaei S., Picard P., Ravandi A., Monge J.C., Lee T.C.. Cernacek P., Stewart D.J. Blockade of endothelin receptors markedly reduces atherosclerosis in LDL receptor deficient mice: role of endothelin in macrophage foam cell formation. Cardiovasc. Res. 2000; 48: 158-167. 13. Back M., Bu D., Branstrom R., Sheikine Y.. Yan Z.Q., Hansson G.K. Leukotriene B4 signal ing through NF-xB-dependent BLT, receptors on vascular smooth muscle cells in atheroscle rosis and intimal hyperplasia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005; 102: 17501-17506. 14. Badimon L. Atherosclerosis and thrombosis: lessons from animal models. Throtnb. Haemost. 2001; 86: 356-365. 72

15. Baeuerle P.A., Baltimore D. NF-kB: ten years after. Cel! 1996; 87: 13-20. 16. Baldwin A.S. Jr. The NF-kappa B and 1 kappa B proteins: new discoveries and insights. Anntt. Rev. Immunol. 1996: 14: 649-683. 17. Balogun E.. Hoque M.. Gong P., Killeen E.. Green C.J., Foresti R., Alam J., Motterlini R. Curcumin activates the heme oxygenase-1 gene via regulation of Nrf2 and the antioxidant responsive element. Biochem. J. 2003; 371 (Pt 3): 887-895. 18. Banneberg G., Dahlen S.E.. Luijerink M., Lundqvist G., Morgenstern R. Leukotriene C4 is a tight-binding inhibitor of microsomal glutathione transferase-1. J. Biol. Chem. 1999; 274: 1994-1999. 19. Barnes P.J., Karin M. Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription factor in chronic inflam matory diseases. N. Engl. J. Med. 1997; 336: 1066-1071. 20. Barnes P.J., Adcock I.M. NF-kappa B: a pivotal role in asthma and a new target for therapy. Trends Pharmacol. Sei. 1997; 18: 46-50. 21. Barton M., Haudenschild C.C., d’Uscio L.V., Shaw S., Munter K., LuscherT.F. Endothelin ETa receptor blockade restores NO-mediated endothelial function and inhibits atherosclero sis in apolipoprotein E - deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: 14367-14372. 22. Bea F., Blessing E., Bennett B.J.. Kuo C.C.. Campbell L.A.. Kreuzer J.. Rosenfeld M.E. Chronic inhibition of cyclooxygenase-2 does not alter plaque composition in a mouse model of advanced unstable atherosclerosis. Cardiovasc. Res. 2003; 60: 198-204. 23. Beauparlant P., Hiscott J. Biological and biochemical inhibitors of the NF-kappa B/Rel pro teins and cytokine synthesis. Cytokine Growth Factor Rev. 1996; 7: 175-190. 24. Benson G.M.. Schiffelers R., Nicols C.. Latcham J., Vidgeon-Hart M., Toseland C.D.N., Su ckling K.E.. Groot P.H.E. Effect of probucol on serum lipids, atherosclerosis and toxicology in fat-fed LDL receptor - deficient mice. Atherosclerosis 1998; 141: 237-247. 25. Bereta J., Cohen M.C.. Bereta M. Stimulatory effect of ouabain on VCAM-1 and iNOS ex pression in murine endothelial cells: involvement of NF-kappa B. FEBS Lett. 1995; 377: 21-25. 26. Berk B.C., Abe J.I., Min W., Surapisitchat J., Yan C. Endothelial atheroprotective and anti inflammatory mechanisms. Ann. NY Acad. Sci. 2001; 947: 93-109. 27. Berliner J.A.. Navab M.. Fogelman A.M., Frank J.S., Demer L.L., Edwards P.A.. Watson A.D.. Lusis A.J. Atherosclerosis: basic mechanisms. Oxidation, inflammation, and genetics. Circulation 1995; 91: 2488-2496. 28. Binder C.J., Chang M.K., Shaw P.X., Miller Y.I., Hartvigsen K., Dewan A., Witztum J.L. Innate and acquired immunity in atherogenesis. Nat. Med. 2002; 8: 1218-1226. 29. Bird D.A., Tangirala R.K., Fruebis J., Steinberg D., Witztum J.L., Palinski W. Effect of pro bucol on LDL oxidation and atherosclerosis in LDL receptor - deficient mice. J. Lipid. Res. 1998; 39: 1079-1090. 30. Bishop J. Ssaki transgeniczne. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001: 232-246. 31. Bochner B.S., Luscinskas F.W., Gimbrone M.A., Newman W., Sterbinsky S.A., Derse- -Anthony C.P., Klunk D.. Schleimer R.P. Adhesion of human basophils, eosinophils, and neutrophils to interleukin-1-activated human vascular endothelial cells: contribution of endo-- thelial cell adhesion molecules. J. Exp. Med. 1991: 173: 1553-1557. 32. Bonetti P.O., Lerman L.O., Lerman A. Endothelial dysfunction: a marker of atherosclerotic risk. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: 168-175. 33. Bonthu S., Heistad D.D., Chappell D.A.. Lamping K.G., Faraci F.M. Atherosclerosis, vascu lar remodeling, and impairment of endothelium - dependent relaxation in genetically altered hyperlipidemic mice. Arterioscler. Thromh. Vase. Biol. 1997; 17: 2333-2340. 34. Boren J., Olin K., Lee I.. Chait A., Wight T.N., Innerarity T.L. Identification of the princi pal proteoglycan-binding site in LDL. A single-point mutation in apo-BlOO severly affects proteoglycan interaction without affecting LDL receptor binding. J. Clin. Invest. 1998; 101: 2658-2664. 73

35. Borgeat P., Samuelsson B. Arachidonic acid metabolism in polymorphonuclear leukocytes: unstable intermediate in formation of dihydroxy acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979: 76: 3213-3217. 36. Brand K., Page S., Rogler G., Bartsch A., Brandl R.. Knuechel R., Page M., Kaltschmidt C., Baeuerle P.A., Neumeier D. Activated transcription factor nuclear factor-kappa B is present in the atherosclerotic lesion. J. Clin. Invest. 1996; 97: 1715-1722. 37. Brash A.R. Lipoxygenases: occurrence, functions, catalysis, and acquisition of substrate. J. Biol. Chem. 1999; 274: 23679-23682. 38. Braun A., Zhang S., Miettinen H.E., Ebrahim S., Holm T.M., Vasile E., Post M.J., Yoerger D.M., Picard M.H., Krieger J.L., Andrews N.C., Simons M., Krieger M. Probucol prevents early coronary heart disease and death in the high - density lipoprotein receptor SR-Bl/apolipoprotein E - double knockout mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100; 7283-7288. 39. Breslow J.L. Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 8314. 40. Breslow J.L. Mouse models of atherosclerosis. Science 1996; 272: 685-688. 41. Briner V.A., Luscher T.F. Role of vascular endothelial abnormalities in clinical medicine: atherosclerosis, hypertension, diabetes and endotoxemia. Adv. Intern. Med. 1994; 39: 1-22. 42. Brink C., Dahlen S.E., Drazen J., Evans J.F., Hay D.W., Nicosia S., Serhan C.N., Shimizu T., Yokomizo T. International Union of Pharmacology XXXVII. Nomenclature for leukotriene and lipoxin receptors. Pharmacol. Rev. 2003; 55: 195-227. 43. Bryan Jr R.M., Steenberg M.L., Marrelli S.P. Role of endothelium in shear stress - induced constrictions in rat middle cerebral artery. Stroke 2001; 32: 1394-1400. 44. Bucciarelli L.G., Wendt T., Qu W., Lu Y., Lalla E., Rong L.L., Goova M.T.. Moser B.. Kislinger T., Lee D.C., Kashyap Y., Stern D.M., Schmidt A.M. RAGE blockade stabilizes established atherosclerosis in diabetic apolipoprotein E - null mice. Circulation 2002; 106: 2827-2935. 45. Bunderson M., Brooks D.M., Walker D.L., Rosenfeld M E.. Coffin J.D., Beall H.D. Arsenic exposure exacerbates atherosclerotic plaque formation and increases nilrotyrosine and leu kotriene biosynthesis. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2004; 201: 32-39. 46. Burleigh M.E., Babaev V.R.. Oates J.A.. Harris R.C.. Gautam S., Riendeau D., Marnelt L.J., Morrow J.D., Fazio S., Linton M.F. Cyclooxygenase-2 promotes early atherosclerotic lesion formation in LDL receptor - deficient mice. Circulation 2002; 105: 1816-1823. 47. Byrum R.S., Goulet J.L., Griffiths R.J., Koller B.H. Role of the 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP) in murine acute inflammatory responses. J. Exp. Med. 1997; 185: 1065— 1075. 48. Byrum R.S., Goulet J.L., Snouwaert J.N., Griffiths R.J., Koller B.H. Determination of the contribution of cysteinyl leukotrienes and leukotriene B4 in acute inflammatory responses using 5-lipoxygenase- and leukotriene A4 hydrolase - deficient mice. J. Immunol. 1999: 163: 6810-6809. 49. Caamano J., Hunter C.A. NF-kappaB family of transcription factors: central regulators of innate and adaptive immune functions. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15: 414—429. 50. Caillaud D., Galinier M., Elba/. M., Carrie D., Puel J., Fauvel J.M.. Arnal J.F. Atherosclero sis: the role of nitric oxide. Presse Med. 2001; 30: 41^14. 51. Caligiuri G., Levy B., Pernow J., Thoren P., Hansson G.K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999; 96:6920-6924. 52. Caligiuri G., Nicoletti A., Zhou X., Tornberg 1., Hansson G.K. Effects of sex and age on athe rosclerosis and autoimmunity in apoE - deficient mice. Atherosclerosis 1999; 145: 301-308. 53. Calixto J.B., Otuki M.F., Santos A.R.S. Anti-inflammatory compounds of plant origin. Part 1. Action on arachidonic acid pathway, nitric oxide and nuclear factor kB (NF-kB). Planta Med. 2003; 69; 973-983. 74

54. Cannetti C.A., Leung B.P., Culshaw S., Mclnnes I.B., Cunha F.Q., Liew F.Y. IL-18 enhances collagen-induced arthritis by recruiting neutrophils via TNF-a and leukotriene Bq. J. Immu nol. 2003; 171: 1009-1015. 55. Candido R., Jandeleit-Dahm K.A., Cao Z., Nesteroff S.P., Burns W.C., Twigg S.M., Dilley R.J., Cooper M.E., Allen T.J. Prevention of accelerated atherosclerosis by angiotensin - con verting enzyme inhibition in diabetic apolipoprotein E - deficient mice. Circulation 2002; 106: 246-253. 56. Capecchi M.R. Generating mice with targeted mutations. Nature. Med. 2001; 7: 1086-1090. 57. Carluccio M.A., Siculella L., Ancora M.A., Massaro M., Scoditti E., Storelli C., Visioli F., Distante A., De Caterina R. Olive oil and red wine antioxidant polyphenols inhibit endothe lial activation: antiatherogenic properties of Mediterranean diet phytochemicals. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: 622-629. 58. Carmeliet P., Moons L., Collen D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, athero sclerosis and hemostasis. Cardiovasc. Res. 1998; 39: 8-33. 59. Cassis L.A., Helton M.J., Howatt D.A., King V.L., Daugherty A. Aldosterone does not me diate angiotensin II - induced atherosclerosis and abdominal aortic aneurysms. Br. J. Phar macol. 2005; 144: 443^148. 60. Cayatte A.J., Du Y., Oliver-Krasinski J., Lavielle G., Verbeuren T.J., Cohen R.A. The throm boxane receptor antagonist SI8886 but not aspirin inhibits atherogenesis in apoE - deficient mice. Evidence that eicosanoids other than thromboxane contribute to atherosclerosis. Arte rioscler Thromb. Vase. Biol. 2000; 20: 1724-1728. 61. Cefalu W.T., Wang Z.Q.. Schneider D.J., Absher P.M.. Baldor L.C., Taatjes D.J., Sobel B.E. Effects of insulin sensitizers on plaque vulnerability associated with elevated lipid content in atheroma in apoE - knockout mice. Acta Diabetol. 2004; 41: 25-31. 62. Chanez P.. Bonnans C., Chavis C., Vachier I. 15-lipoxygenase: a Janus enzyme? Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2002; 27: 655-658. 63. Chen J.. Kuhlencordt P.. Urano F., Ichinose H., Astern J., Huang P.L. Effects of chronic treat ment with L-Arginine on atherosclerosis in apoE knockout and apoE/inducible NO synthase double-knockout mice. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: 97-103. 64. Chien K.R. Genes and physiology: molecular physiology in genetically engineered animals. In: Perspectives series: molecular medicine in genetically engineered animals. J. Clin. Invest. 1996:97: 901-909. 65. Chiwata T., Aragane K., Fujinami K., Kojima K., Ishibashi S., Yamada N., Kusunoki J. Di rect effect of an acyl-CoA: cholesterol acyltransferase inhibitor, F-1394, on atherosclerosis in apolipoprotein E and low density lipoprotein receptor double knockout mice. Br. J. Pharma col. 2001; 133: 1005-1012. 66. Chlopicki S., Gryglewski R.J. The endothelium-dependent and the endothelium-independent vasodilators in the isolated, perfused guinea pig heart. J. Physiol. Pharmacol. 1992; 43: 353— 365. 67. Chlopicki S., Gryglewski R.J. Nitric oxide is a major mediator in reactive hyperaemia evoked by a brief coronary occlusion in the guinea pig heart. Eur. J. Pharmacol. 1993; 241: 117- 120. 68. Chlopicki S., Bartus J.B.. Gryglewski R.J. Hypoxic pulmonary vasoconstriction in isolated blood-perfused rat lung; modulation by thromboxane A2, platelet-activating factor, cysteinyl leukotrienes and endothelin-1. Pol. J. Pharmacol. 2002; 54: 433^441. 69. Chlopicki S. Srodblonek w farmakoterapii atherothrombosis. Kardiologia Polska 2003; 59: 62-69. 70. Chlopicki S. Zapalenie srodbfonka w atherothrombosis. Kardiologia po Dyplomie 2005; 4: 77-88. 71. Chlopicki S. Farmakologia srodblonka w atherothrombosis. Kardiologiapo Dyplomie 2005; 4: 60-68. 75

72. Chyu K.Y., Babbidge S.M., Zhao X., Dandillaya R., Rietveld A.G., Yano J., Dimayuga P., Cer- cek B., Shah P.K. Differentia] effects of green tea-derived catechin on developing versus estab lished atherosclerosis in apolipoprotein E - null mice. Circulation 2004; 109: 2448-2453. 73. Clark L.T. Vascular inflammation as a therapeutic target for prevention of cardiovascular disease. Curr. Atheroscler. Rep. 2002; 4: 77-81. 74. Collins R.G., Velji R., Guevara N.V., Hicks M.J., Chan L., Beaudet A.L. P-selectin and intercellular adhesion molecule (ICAM-1) deficiency substantially protects against athero sclerosis in apolipoprotein E - deficient mice. J. Exp. Med. 2000; 191: 189-194. 75. Collins T., Cybulsky M.I. NF-kB: a pivotal mediator or innocent bystander in atherogenesis? J. Clin. Invest. 2001; 107: 255-264. 76. Cowburn A.S., Sladek K., Soja J., Adamek L., Nizankowska E., Szczeklik A., Lam B.K., Penrose J.F., Austen F.K.. Holgate S.T., Sampson A.P. Overexpression of leukotriene C4 synthase in bronchial biopsies from patients with aspirin-intolerant asthma. J. Clin. Invest. 1998; 101: 834-846. 77. Crauwels H.M., Van Hove C.E., Holvoet P.. Herman A.G.. Bult H. Plaque-associated endo thelial dysfunction in apolipoprotein E - deficient mice on a regular diet. Effect of human apolipoprotein Al. Cardiovasc. Res. 2003; 59: 189-199. 78. Crawford R.S., Kirk E.A., Rosenfeld M.E., LeBoeuf R.C., Chait A. Dietary antioxidants in hibit development of fatty streak lesions in the LDL receptor - deficient mouse. Arterioscler. Thromh. Vase. Biol. 1998; 18: 1506-1513. 79. Cybulsky M.I., Fries J.W.U., Williams A.J., Sultan P., Eddy R., Byers M., Shows T., Gimbro- ne M.A., Collins T. Gene structure, chromosomal location, and basis for alternative mRNA splicing of the human VCAM-1 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88: 7859-7863. 80. Cybulsky M.I., Iiyama K., Li H., Zhu S., Chen M., Iiyama M., Davis V., Gutierrez-Ramos J.C., Connelly P.W., Milstone D.S. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J. Clin. Invest. 2001; 107: 1255-1262. 81. Cyrus T., Witztum J.L., Rader D.J., Tangirala R., Fazio S., Linton M.F.. Funk C.D. Disrup tion of the 12/15-lipoxygenase gene diminishes atherosclerosis in apoE - deficient mice. J. Clin. Invest. 1999; 103: 1597-1604. 82. Cyrus T., Pratico D., Zhao L., Witztum J.L., Rader D.J., Rokach J., FitzGerald G.A.. Funk C.D. Absence of 12/15-lipoxygenase expression decreases lipid peroxidation and atheroge nesis in apolipoprotein E - deficient mice. Circulation 2001; 103: 2277-2282. 83. Cyrus T., Sung S., Zhao L., Funk C.D., Tang S., Pratico D. Effect of low-dose aspirin on vascular inflammation, plaque stability, and atherogenesis in low-density lipoprotein receptor - deficient mice. Circulation 2002; 106: 1282-1287. 84. Cyrus T., Yao Y., Rokach J., Tang L.X., Pratico D. Vitamin E reduces progression of athe rosclerosis in low-density lipoprotein receptor - deficient mice with established vascular le sions. Circulation 2003; 107: 521-523. 85. Da Cunha V., Tham D.M., Martin-McNulty B., Deng G.. Ho J.J., Wilson D.W., Rutledge J.C., Vergona R., Sullivan M.E., Wang Y.X. Enalapril attenuates angiotensin II - induced atherosclerosis and vascular inflammation. Atherosclerosis 2005; 178: 9-17. 86. Dahlen S.E., Malmstrom K.. Nizankowska E., Dahlen B., Kuna P.. Kowalski M., Lumry W.R., Picado C., Stevenson D.D., Bousquet J., Pauwels R., Holgate S.T.. Shahane A., Zhang J., Reiss T.F., Szczeklik A. Improvement of aspirin-intolerant asthma by montelukast, a leu kotriene antagonist: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002; 165: 9-14. 87. Daugherty A., Cassis L. Chronic angiotensin II infusion promotes atherogenesis in low den sity lipoprotein receptor -I- mice. Ann. NY Acad. Sci. 1999; 892: 108-118. 88. Daugherty A., Manning M.W., Cassis L.A. Antagonism of AT2 receptors augments angio tensin II - induced abdominal aortic aneurysms and atherosclerosis. Br. J. Pharmacol. 2001; 134: 865-870. 76

89. Daugherty A. Mouse models of atherosclerosis. Am. J. Med. Sei. 2002; 323: 3-10. 90. Daugherty A., Rateri D.L. T lymphocytes in atherosclerosis. The Yin-Yang of Thl and Th2 influence on lesion formation. Circ. Res. 2002; 90: 1039-1040. 91. Daugherty A., Whitman S.C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol. Biol. 2003; 209: 293-309. 92. Davies P.F.. Reidy M.A., Goode T.B., Bowyer D.E. Scanning electron microscopy in the evaluation of endothelial integrity of the fatty lesion in atherosclerosis. Atherosclerosis 1976; 25: 125-130. 93. De Caterina R., Mazzone A., Giannessi D., Sicari R., Pelosi W., Lazzerini G., Azzara’ A., Forder R., Carey F., Caruso D.G., Mosca F. Leukotriene B^ production in human athero sclerotic plaques. Biomed. Biochiiit^itJfU^S; 47: S182—S185. 94. De Caterina R. Endothelial dysfunctions: common denominators in vascular disease. Curr. Opin. Lipidol. 2000; 11: 9-23. 95. De Caterina R., Zampolli A. From asthma to atherosclerosis - 5-lipoxygenase, leukotrienes, and inflammation. N. Engl. J. Med. 2004; 350: 4—7. 96. Deckert V., Lizard G., Duverger N.. Athias A., Palleau V., Emmanuel F., Moisant M., Gambert P., Lallemant C., Lagrost L. Impairment of endothelium-dependent arterial relaxa tion by high-fat feeding in apoE - deficient mice: toward normalization by human apoA-I expression. Circulation 1999; 100: 1230-1235. 97. De Martin R., Hoeth M.. Hofer-Warbinek R., Schmid J.A. The transcription factor NF- -kappa B and the regulation of vascular cell function. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000; 20: E83-E88. 98. Dembińska-Kieć A.. Gryglewska T., Żmuda A., Gryglewski R.J. The generation of prosta cyclin by arteries and by the coronary vascular bed is reduced in experimental atherosclero sis in rabbits. Prostaglandins 1977; 14: 1025-1034. 99. Dembińska-Kieć A., Rucker W., Schonhofer P.S. Effects of dipyridamole in experimental atherosclerosis. Action on PGI,. platelet aggregation and atherosclerotic plaque formation. Atherosclerosis 1979: 33: 315-327. 100. Dembińska-Kieć A.. Korbut R., Bieroń K., Kostka-Trąbka E., Gryglewski RJ. Beta-Pyri- dylcarbinol (Ronicol) releases a prostacyclin-like substance into arterial blood of patients with arteriosclerosis obliterans. Pharmacol. Res. Commun. 1983; 15: 377-385. 101. Dembińska-Kieć A., Korbut R., Żmuda A., Kostka-Trąbka E., Simmet T.. Peskar B.A. For mation of lipoxygenase and cyclooxygenase metabolites of arachidonic acid by brain tissue. Biomed. Biochim. Acta 1984; 43: S222-S226. 102. Dembińska-Kieć A., Gryglewski R.J. Contribution of arachidonic acid metabolites to athe rosclerosis. Wien Klin. Wochenschr. 1986; 98: 198-206. 103. Dembińska-Kieć A., Żmuda A., Gryglewski R.J. pH-dependent release of EDRF from rab bit aortic endothelium. Pol. J. Pharmacol. Pharm. 1990; 42: 265-274. 104. Dembińska-Kieć A., Kawecka-Jaszcz K., Kwaśniak M.. Guevara L, Pankiewicz J., Mal- czewska-Malec M., Iwanejko J., Hartwich J., Zdzienicka A., Stochmal A., Leszczyńska- -Gołąbek 1. ApoE isoforms, insulin output and plasma lipid levels in essential hypertension. Eur. J. Clin. Invest. 1998; 28: 95-99. 105. Dembińska-Kieć A. Miażdżyca tętnic. W: Choroba niedokrwienna serca. Pod redakcją Lesz ka Gieca i Marii Trusz-Gluzy. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1999: 12-31. 106. De Nigris F.. D’Armiento F.P.. Somma P.. Casini A., Andreini I., Sarlo F., Mansueto G., De Rosa G., Bonaduce D.. Condorelli M., Napoli C. Chronic treatment with sulfhydryl angiotensin - converting enzyme inhibitors reduce susceptibility of plasma LDL to in vitro oxidation, formation of oxidation-specific epitopes in the arterial wall, and atherogenesis in apolipoprotein E - knockout mice. Int. J. Cardiol. 2001; 81: 107-115. 107. De Nigris F.. Lerman L.O., Ignarro S.W., Sica G., Lerman A., Palinski W., Ignarro L.J.. Napoli C. Beneficial effects of antioxidants and L-arginine on oxidation-sensitive gene ex 77

pression and endothelial NO synthase activity at sites of disturbed shear stress. Proc. Natl. Acad Sci. USA 2003; 100: 1420-1425. 108. Diodati J.G., Dakak N., Gilligan D.M., Quyyumi A.A. Effect of atherosclerosis on endothe lium-dependent inhibition of platelet activation in humans. Circulation 1998; 98: 17-24. 109. Doi F., Martin G., Staels B., Mares A.M., Cazaubon C., Nisato D., Bidouard J.P., Janiak P., Schaeffer P., Herbert J.M. Angiotensin ATI receptor antagonist irbesartan decreases lesion size, chemokine expression, and macrophage accumulation in apolipoprotein E - deficient mice. J. Cardiova.se. Pharmacol. 2001; 38: 395—405. 110. Dong Z.M., Chapman S.M., Brown A.A., Frenette P.S., Hynes R.O., Wagner D.D. The combined role of P- and E-selectin in atherosclerosis. J. Clin. Invest. 1998; 102: 145— 152. 111. Dube L.M., Swanson L.J., Awni W.M., Ochs R.F., Bell R.L., Carter G.W. Zileuton: the first leukotriene synthesis inhibitor for use in the management of chronic asthma. In: Five- -Hpoxygena.seproducts in asthma. Drazen J.M., Dahlen S.E., Lee T.H., eds. Marcel Dekker, Inc., New York 1998: 391—428. 112. Duez H., Chao Y.S., Hernandez M., Torpier G., Poulain P., Mundt S., Mallat Z., Teissier E., Burton C.A., Tedgui A., Fruchart J.C., Fievet C., Wright S.D., Staels B. Reduction of atherosclerosis by the peroxisome proliferator-activated receptor a agonist fenofibrate in mice. J. Biol. Chem. 2002; 277: 48051-18057. 113. D’Uscio L.V., Barton M., Shaw S., Luscher T.F. Chronic ET receptor blockade prevents endothelial dysfunction of small arteries in apolipoprotein E - deficient mice. Cardiova.se. Res. 2002; 53: 487-195. 114. Duvoix A., Blasius R., Delhalle S., Schnekenburger M.. Morceau T.. Henry E.. Dicato M.. Diederich M. Chemopreventive and therapeutic effects of curcumin. Cancer Lett. 2005: 223: 181-190. 115. Dwyer J.H., Allayee H., Dwyer K.M., Fan J., Wu H., Mar R., Lusis A.J., Mahrabian M. Arachidonate 5-lipoxygenase promoter genotype, dietary arachidonic acid, and atheroscle rosis. N. Engl. J. Med. 2004; 350: 29-37. 116. Elhage R., Jawień J., Rudling M.. Ljunggren H.G.. Takeda K., Akira S., Bayard F., Hansson G.K. Reduced atherosclerosis in interleukin-18 deficient apolipoprotein E- knockout mice. Cardiova.se. Res. 2003: 59: 234-240. 117. Elhage R., Gourdy P., Brouchet L.. Jawień J., Fouque M.J.. Fievet C., Hue X., Barreira Y.. Couloumiers J.C., Arnal J.F., Bayard F. Deleting TCR alpha beta+ or CD+ T lymphocytes leads to opposite effects on site-specific atherosclerosis in female apolipoprotein E - defi cient mice. Am. J. Pathol. 2004; 165: 2013-2018. 118. Elhage R., Gourdy P., Jawień J., Brouchet L., Castano C., Fievet C., Hansson G.K., Arnal J.F., Bayard F. The atheroprotective effect of 17p-estradiol depends on complex interac tions in adaptive immunity. Am. J. Pathol. 2005; 167: 267-274. 1 19. Enderle M.D., Pfohl M., Kellerman N„ Haering H.U., Hoffmeister H.M. Endothelial func tion. variables of fibrynolysis and coagulation in smokers and healthy controls. Haemostasis 2000; 30: 149-158. 120. Eriksson E.E., Xie X., Werr J., Thoren P.. Lindbom L. Direct viewing of atherosclerosis in vivo: plaque invasion by leukocytes is initiated by the endothelial selectins. FASEBJ. 2001; 15: 1149-1157. 121. Evans J.F. 5-lipoxygenase and 5-lipoxygcnase - activating protein. In: Five-lipoxygenase products in asthma. Drazen J.M., Dahlen S.E.. Lee T.H., eds. Marcel Dekker, Inc.. New York 1998: 11-32. 122. Ezzahiri R., Stassen F.R.M.. Kurvers H.A.J.M.. van Paul M.M.L.. Kitslaar P.J.E.H.M.. Bruggeman C.A. Chlamydia pneumoniae infection induces an unstable atherosclerotic plaque phenotype in LDL-receptor, apoE double knockout mice. Em: J. Ease. Endova.sc. Surg. 2003; 26: 88-95. 78

123. Falk E., Fernandez-Ortiz A. Role of thrombosis in atherosclerosis and its complications. Am. J. Cardio/. 1995; 75: 3B-11B. 124. Fan J., Watanabe T. Inflammatory reaction in the pathogenesis of atherosclerosis. J. Athero- scler. Thromb. 2003; 10: 63-71. 125. Farmer J.A., Torre-Amione G. Atherosclerosis and inflammation. Curr. Atheroscler. Rep. 2002; 4: 92-98. 126. Fazio S., Lee Y.L., Ji Z.S., Rail S.C. Jr. Type III hyperlipoproteinemic phenotype in trans genic mice expressing dysfunctional apolipoprotein E. J. Clin. Invest. 1993; 92: 1497-503. 127. Fazio S., Babaev V.R., Burleigh M.E., Major A.S., Hasty A.H., Linton M.F. Physiological expression of macrophage apoE in the artery wall reduces atherosclerosis in severely hyper- lipidemice mice. J. Lipid. Res. 2002; 43: 1602-1609. 128. Forgione M.A., Leopold J.A., Loscalzo J. Roles of endothelial dysfunction in coronary artery disease. Curr. Opin. Cardiol. 2000; 15: 409—415. 129. Fredrikson G.N., Soderberg I., Lindholm M., Dimayuga P., Chyu K.Y., Shah P.K., Nilsson J. Inhibition of atherosclerosis in apoE - null mice by immunization with apoB - 100 pep tide sequences. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: 879-884. 130. Fu T., Kashireddy P., Borensztajn J. The PPARy agonist ciprofibrate severely aggravates hypercholesterolemia and accelerates the development of atherosclerosis of mice lacking apolipoprotein E. Biochem. J. 2003; 373: 941-947. 131. Fuhrman B., Aviram M. Flavonoids protect LDL from oxidation and attenuate atheroscle rosis. Curr Opin. Lipidol. 2001; 12: 41—48. 132. Fukao H., ljiri Y.. Miura M., Hashimoto M., Yamashita T.. Fukunaga C., Oiwa K., Kawai Y., Suwa M., Yamamoto J. Effect of trans-resveratrol on the thrombogenicity and atherogenicity in apolipoprotein E - deficient and low-density lipoprotein receptor - deficient mice. Blood Coagul. Fibrinolysis 2004; 15: 441^446. 133. Funk C.D.. Chen X.S.. Irvin C.G., Tu Y.P., Sheller J.R. The role of 5-lipoxygenase products in a mouse model of allergic airway inflammation. In: Eicosanoids, aspirin, and asthma. Szczeklik A., Gryglewski R.J., Vane J.R., eds. Marcel Dekker, Inc., New York 1998: 187— 200. 134. Funk C.D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science 2001; 294: 1871-1875. 135. Funk C.D., Cyrus T. 12/15-lipoxygenase, oxidative modification of LDL and atherogenesis. Trends Cardiovasc. Med. 2001; 11: 116-124. 136. Funk C.D., Chen X.S., Johnson E.N., Zhao L. Lipoxygenase genes and their targeted dis ruption. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002; 68-69: 303-312. 137. Funk C.D. Leukotriene modifiers as potential therapeutics for cardiovascular disease. Na ture 2005; 4: 664-672. 138. Gackowski D., Kruszewski M., Jawieri A., Ciecierski M., Oliriski R. Further evidence that oxidative stress may be a risk factor responsible for the development of atherosclerosis. Free Radic. Biol. Med. 2001; 31: 542-547. 139. Galis Z.S., Muszynski M., Sukhova G.K., Simon-Morrissey E., Libby P. Enhanced expres sion of vascular matrix metalloproteinases induced in vitro by cytokines and in regions of human atherosclerotic lesions. Ann. NY Acad. Sci. 1995; 748: 501-507. 140. Gaut J.P., Heinecke J.W. Mechanisms for oxidizing low-density lipoprotein. Insights from patterns of oxidation products in the artery wall and from mouse models of atherosclerosis. Trends Cardiovasc. Med. 2001; 11: 103-112. 141. George J., Afek A., Shaish A., Levkovitz H., Bloom N., Cyrus T., Zhao L., Funk C.D., Sigal E., Harats D. 12/15-Lipoxygenase gene disruption attenuates atherogenesis in LDL receptor - deficient mice. Circulation 2001; 104: 1646-1650. 142. Gimbrone M.A., Topper J.N., Nagel T., Anderson K.R., Garcia-Cardena G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Ann. N Y Acad. Sci. 2000; 748: 501— 507. 79

143. Glass C.K., Witztum J.L. Atherosclerosis: the road ahead. Cell 2001; 104: 503-516. 144. Goldboult U., Neufeld H.N. Genetic aspects of arteriosclerosis. Arteriosclerosis 1988; 6: 357-377. 145. Goldstein J.L. Laskers for 2001: knockout mice and test-tube babies. Nat. Med. 2001; 7: 1079-1080. 146. Goulet J.L., Snouwaert J.N., Latour A.M., Coffman T.M., Koller B.H. Altered inflamma tory responses in leukotriene - deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91: 12852— 12856. 147. Goulet J.L., Byrum R.S., Key M.L., Nguyen M., Wagoner V.A., Koller B.H. Genetic fac tors determine the contribution of leukotrienes to acute inflammatory responses. J. Immu nol. 2000; 164: 4899^907. 148. Gorski D.H., Walsh K. Mitogen-responsive nuclear factors that mediate growth control signals in vascular myocytes. Cardiovasc. Res. 1995; 30: 585-592. 149. Griffiths R.J., Smith M.A., Roach M.L., Stock J.L., Stam EJ., Milici A.J., Scampoli D.N., Eskra J.D., Byrum R.S., Koller B.H., McNeish J.D. Collagen-induced arthritis is reduced in 5-lipoxygenase-activating protein - deficient mice. J. Exp. Med. 1997; 185: 1123-1129. 150. Gryglewski R.J., Korbut R., Ocetkiewicz A. Generation of prostacyclin by lungs in vivo and its release into the arterial circulation. Nature 1978; 273: 765-767. 151. Gryglewski R.J., Dembińska-Kieć A., Korbut R. A possible role of thromboxane A2 (TXA2) and prostacyclin (PGI2) in circulation. Acta Biol. Med. Ger. 1978; 37: 715-723. 152. Gryglewski R.J., Szczeklik A. Inhibition of prostacyclin formation by lipid peroxides in the arterial wall: hypothetical step in development of atherosclerosis. Mater Med. Pol. 1978; 10: 338-341. 153. Gryglewski R.J. Prostaglandins, platelets, and atherosclerosis. CRC Crit. Rev. Biochem. 1980; 7: 291-338. 154. Gryglewski R.J., Szczeklik A., Żygulska-Mach H., Kostka-Trąbka E. Prostacyclin and vas cular disease. Philos. Trans. R. Soc. Land. B. Biol. Sci. 1981; 294: 383-388. 155. Gryglewski R.J., Szczeklik A. Prostacyclin in the treatment of atherosclerosis obliterans and other vascular diseases. Adv. Exp. Med. Biol. 1984; 164: 211-213. 156. Gryglewski R.J.. Palmer R.M., Moncada S. Superoxide anion is involved in the breakdown of endothelium-derived vascular relaxing factor. Nature 1986; 320: 454-456. 157. Gryglewski R.J., Chłopicki S., Swięs J., Niezabitowski P. Prostacyclin, nitric oxide, and atherosclerosis. Ann. NY Acad. Sci. 1995; 748: 194-206. 158. Gryglewski R.J. Interactions between endothelial mediators. Pharmacol. Toxicol. 1995; 77: 1-9. 159. Gryglewski R.J., Korbut R., Uracz W., Maliński T. Crossroads of L-arginine/arachidonate metabolism. Thromb. Haemost. 1997; 78: 191-194. 160. Gryglewski R.J., Kostka-Trąbka E.. Dembińska-Kieć A., Korbut R. Prostacyclin and athe rosclerosis-experimental and clinical approaches. Adv. Exp. Med. Biol. 1988: 243: 21-29. 161. Gu L., Okada Y., Clinton S.K.. Sukhova G.K., Libby P., Rollins B.J. Absence of monocyte chemoattractant protein-1 reduces atherosclerosis in low-density lipoprotein receptor - de ficient mice. Mol. Cell. 1998; 2: 275-281. 162. Gullberg H., Rudling M., Forrest D., Angelin B., Vennstrom B. Thyroid hormone receptor beta-deficient mice show complete loss of normal cholesterol 7a-hydroxylase (CYP7A) response to thyroid hormone but display enhanced resistance to dietary cholesterol. Mol. Endocrinol. 2000; 14: 1739-1749. 163. Gunning W.T., Kramer P.M., Steele V.E., Pereira M.A. Chemoprevention by lipoxygenase and leukotriene pathway inhibitors of vinyl carbamate - induced lung tumors in mice. Can cer Res. 2002; 62: 4199^1201. 164. Gupta B., Ghosh B. Curcuma longa inhibits TNF-alpha induced expression of adhesion molecules on human umbilical vein endothelial cells, ¡nt. J. lmmunopharmacol. 1999; 21: 745-757. 80

165. Haeggstrom J.Z., Samuelsson B. Overview of the 5-lipoxygenase pathway. In: Drazen J.M., Dahlen S.E.. Lee T.H.. eds. Five-lipoxygenase products in asthma. Marcel Dekker, Inc., New York 1998:1-6. 166. Hajra L., Evans A.I.. Chen M.. Hyduk S.J., Collins T., Cybulsky M.I. The NF-kappa B signal transduction pathway in aortic endothelial cells is primed for activation in regions predis posed to atherosclerotic lesion formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 9052-9057. 167. Hamilton A.L.. Watson R.M., Wyile G., O’Byrne P.M. Attenuation of early and late phase allergen-induced bronchoconstriction in asthmatic subjects by a 5-lipoxygenase activating protein antagonist, BAYxl005. Thorax 1997; 52: 348-354. 168. Hancock W.W.. Buelow R., Sayegh H., Turka LA. Antibody-induced transplant atheroscle rosis is prevented by graft expression of anti-oxidant and anti-apoptotic genes. Nat. Med. 1998;4: 1392-1396. 169. Hansson G.K., Holm J., Jonasson L. Detection of activated T lymphocytes in the human atherosclerotic plaque. Am. J. Pathol. 1989; 135: 169-175. 170. Hansson G.K., Stemme S., Paulsson G., Zhou X., Bruzelius M., Caligiuri G., Nicoletti A., Sirsjo A., Wuttge D., Yan Z.Q. Autoimmunity in atherosclerosis. In: Atherosclerosis XI. Jacotot B., Mathe D., Fruchart J.C., eds. Elsevier, Singapore 1998: 979-983. 171. Hansson G.K. Inflammation and immune response in atherosclerosis. Cun: Atheroscler. Rep. 1999; 1: 150-155. 172. Hansson G.K. Inflammation, injury and atherosclerosis - the Russell Ross Memorial Lec ture. In: Atherosclerosis XII. Stemme S., Olsson A.G., eds. Elsevier, London 2000; 53-66. 173. Hansson G.K., Nilsson J. Pathogenesis of atherosclerosis. In: Cardiology. Crawford M.K., DiMarco J.P., eds. Mosby International Ltd., London 2001: 1.1.-1.12. 174. Hansson G.K. Immune mechanisms in atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Kase. Biol. 2001; 21: 1876-1890. 175. Hansson G.K., Libby P.. Schonbeck U.. Yan Z.Q. Innate and adaptive immunity in the pathogenesis of atherosclerosis. Circ. Res. 2002; 91: 281-291. 176. Hansson G.K. Vaccination against atherosclerosis: science or fiction? Circulation 2002; 106: 1599-1601. 177. Hansson G.K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N. Engl. J. Med. 2005; 352: 1685-1695. 178. Harats D., Shaish A., George J., Mulkins M., Kurihara H., Levkovitz H., Sigal E. Overex pression of 15-lipoxygenase in vascular endothelium accelerates early atherosclerosis in LDL receptor- deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000; 20: 2100-2105. 179. Hasenstab D., Lea H., Hart C.E., Lok S., Clowes A.W. Tissue factor overexpression in rat arterial neointima models thrombosis and progression of advanced atherosclerosis. Circula tion 2000; 101: 2651-2657. 180. Hatada E.N., Krappmann D., Scheidereit C. NF-kappaB and the innate immune response. Curr. Opin. Immunol. 2000; 12: 52-58. 181. Hayek T., Fuhrman B., Vaya J., Rosenblat M., Belinky P., Coleman R., Elis A., Aviram M. Reduced progression of atherosclerosis in apolipoprotein E - deficient mice following con sumption of red wine, or its polyphenols quercetin or cachectin, is associated with reduced susceptibility of LDL to oxidation and aggregation. Atheroscler. Thromb. Vase. Biol. 1997; 17: 2744-2752. 182. Hayek T., Attias J., Smith J., Breslow J.L., Keidar S. Antiatherosclerotic and antioxidative effects of captopril in apolipoprotein E - deficient mice. J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998; 31: 540-544. 183. Hayek T., Attias J., Coleman R., Brodsky S., Smith J., Breslow J.L., Keidar S. The angio tensin - converting enzyme inhibitor, fosinopril, and the angiotensin II receptor antagonist, losartan, inhibit LDL oxidation and attenuate atherosclerosis independent of lowering blood pressure in apolipoprotein E - deficient mice. Cardiovasc. Res. 1999; 44: 579-587. 81

184. Hayek T., Kaplan M., Raz A., Keidar S., Coleman R., Aviram M. Ramipril administration to atherosclerotic mice reduces oxidized low-density lipoprotein uptake by their macro phages and blocks the progression of atherosclerosis. Atherosclerosis 2002; 161: 65-74. 185. Heitzer T., Yla-Herttuala S., Luoma J., Kurz S., Munzel T., Just H., Olschewski M., Drexler H. Cigarette smoking potentiates endothelial dysfunction of forearm resistance vessels in patients with hypercholesterolemia. Role of oxidized LDL. Circulation 1996; 93: 1346— 1353. 186. Helgadottir A., Manolescu A., Thorleifsson G., Gretarsdottir S., Jonsdottir H., Thorsteins- dottir U., Samani N.J., Gudmundsson G., Grant S.F., Thorgeirsson G., Sveinbjornsdottir S., Valdimarsson E.M., Matthiasson S.E., Johannsson H., Gudmundsdottir O., Gurney M.E., Sainz J.. Thorhallsdottir M., Andresdottir M., Frigge M.L., Topol E.J., Kong A., Gudna- son V., Hakonarson H., Gulcher J.R., Stefansson K. The gene encoding 5-lipoxygenase activating protein confers risk of myocardial infarction and stroke. Nat. Genet. 2004; 36: 233-239. 187. Hemdahl A.L., Falk E., Thoren P., Hansson G.K. Thrombin inhibitor reduces myocardial infarction in apoE' x LDLR ' mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2004; 287: H872- H877. 188. Hemdahl A.L., Gabrielsen A., Zhu C., Eriksson P., Hedin U., Kastrup J., Thoren P.. Hans- son G.K. Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in atherosclerosis and myocardial infarction. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2006; 26: 136-142. 189. Hishikawa K., Nakaki T. NF-kB as a good therapeutic target for cardiovascular disease. Heart Drug 2002; 2: 303-311. 190. Hishikawa K., Nakaki T., Fujita T. Oral flavonoid supplementation attenuates atheroscle rosis development in apolipoprotein E - deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005; 25: 442^146. 191. Hoekstra K.A., Godin D.V., Cheng K.M. Protective role of heme oxygenase in the blood vessel wall during atherogenesis. Bioehem. Cell. Biol. 2004; 82: 351-359. 192. Huo Y., Zhao L., Hyman M.C., Shashkin P., Harry B.L., Burcin T., Forlow S.B., Stark M.A., Smith D.F., Clarke S., Srinivasan S., Hedrick C.C., Pratico D., Witztum J.L., Nadler J.L., Funk C.D., Ley K. Critical role of macrophage 12/15-lipoxygenase for atherosclerosis in apolipoprotein E - deficient mice. Circulation 2004; 110: 2024—2031. 193. Innis-Whitehouse W., Li X., Brown W.V., Le N.A. An efficient chromatographic system for lipoprotein fractionation using whole plasma. J. Lipid. Res. 1998; 39: 679-690. 194. Ishibashi S., Brown M.S., Goldstein J.L., Gerard R.D., Hammer R.E., Herz J. Hypercholes terolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus- -mediated gene delivery. J. Clin. Invest. 1993; 92: 883-893. 195. Ishibashi S., Herz J., Maeda N., Goldstein J.L., Brown M.S. The two-receptor model of lipoprotein clearance: test of the hypothesis in “knockout” mice lacking the low density lipoprotein receptor, apolipoprotein E, or both proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:4431-4435. 196. Ishibashi S., Perrey S., Chen Z., Osuga J., Shimada M., Ohashi K., Harada K., Yazaki Y., Yamada N. Role of the low density lipoprotein (LDL) receptor pathway in the metabolism of chylomicron remnants. J. Biol. Chem. 1996; 271: 22422-22427. 197. IwasaS., Fan J., Miyauchi T., Watanabe T. Blockade ofendothelin receptors reduces diet-in duced hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E - deficient mice. Patho- biology 2001; 69: 1-10. 198. Janssen Y.M., Sen C.K. Nuclear factor kappa B activity in response to oxidants and antioxi dants. Methods Enzymol. 1999; 300: 363-374. 199. Jawień J., Chłopicki S., Olszanecki R., Lorkowska B., Gryglewski R.J. Eosinophil-epithe lial cell interaction augments cysteinyl leukotrienes synthesis. J. Physiol. Pharmacol. 2002; 53: 127-132. 82

200. Jawień J. A new insight into aspirin-induced asthma. Eur. J. Clin. Invest. 2002; 32: 134-138. 201. Jawień J., Nastałek P., Korbut R. Mouse models of experimental atherosclerosis. J. Physiol. Pharmacol. 2004; 55: 503-517. 202. Jawień J., Olszanecki R., Lorkowska B., Korbut R. Effect of aspirin on cysteinyl leuko trienes production by eosinophils co-cultured with epithelial cells. J. Physiol. Pharmacol. 2004; 55: 765-772. 203. Jawień J. Tiklopidyna - jej działanie i właściwości. ICN Polfa, Rzeszów 2004. 204. Jawień J., Gajda M., Mateuszuk Ł., Olszanecki R., Jakubowski A., Szlachcic A., Kora- biowska M., Korbut R. Inhibition of nuclear factor-kappaB attenuates artherosclerosis in apoE/LDLR - double knockout mice. J. Physiol. Pharmacol. 2005; 56: 483-489. 205. Jawień J., Gajda M., Rudling M., Mateuszuk Ł., Olszanecki R., Guzik T., Cichocki T., Chłopicki S., Korbut R. Inhibition of five lipoxygenase activating protein (FLAP) by MK- -886 decreases atherosclerosis in apoE/LDLR - double knockout mice. Eur. J. Clin. Invest. 2006; 36: 141-146. 206. Jiang F., Gibson A.P., Dusting G.J. Endothelial dysfunction induced by oxidized low-den sity lipoproteins in isolated mouse aorta: a comparison with apolipoprotein E - deficient mice. Eur. J. Pharmacol. 2001; 424: 141-149. 207. Jiang J., Thoren P., Caligiuri G., Hansson G.K., Pernow J. Enhanced phenylephrine-in duced rhythmic activity in the atherosclerotic mouse aorta via an increase in opening of K channels: relation to Kv channels and nitric oxide. Br. J. Pharmacol. 1999; 128: 637- 646. 208. Jiang J., Valen G.. Tokuno S., Thoren P., Pernow J. Endothelial dysfunction in atheroscle rotic mice: improved relaxation by combined supplementation with L-arginine-tetrahydro- biopterin and enhanced vasoconstriction by endothelin. Br. J. Pharmacol. 2000; 131:1255- 1261. 209. Juan S.H.. Lee T.S.. Tseng K.W., Liou J.Y., Shyue S.K., Wu K.K., Chau L.Y. Adenovirus- -mediated heme oxygenase-1 gene transfer inhibits the development of atherosclerosis in apolipoprotein E - deficient mice. Circulation 2001; 104: 15 19-1525. 210. Jutel M. Mastocyty. W: Choroby alergiczne i astma. Pod red. J. Małolepszego, Wyd. I. Volumed. Wrocław 1996: 45-56. 211. Kaplan M., Hayek T., Raz A., Coleman R., Dornfeld L., Vaya J., Aviram M. Pomegra nate juice supplementation to atherosclerotic mice reduces macrophage lipid peroxidation, cellular cholesterol accumulation and development of atherosclerosis. J. Nutr. 2001; 131: 2082-2089. 212. Karin M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene 1999; 18: 6867-6874. 213. Keidar S., Attias J., Smith J., Breslow J.L., Hayek T. The angiotensin-II receptor antagonist, losartan, inhibits LDL lipid peroxidation and atherosclerosis in apolipoprotein E - deficient mice. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997; 236: 622-625. 214. Keidar S., Attias J., Coleman R., Wirth K., Scholkens B., Hayek T. Attenuation of atheroscle rosis in apolipoprotein E - deficient mice by ramipril is dissociated from its antihypertensive effect and from potentiation of bradykinin. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2000; 35: 64—72. 215. Kieć-Wilk B., Wybrańska I.. Malczewska-Malec M., Leszczyńska-Gołąbek L., Partyka L., Niedbal S., Jabrocka A., Dembińska-Kieć/i. Correlation of the -3826A >G polymorphism in the promoter of the uncoupling protein 1 gene with obesity and metabolic disorders in obese families from southern Poland. J. Physiol. Pharmacol. 2002; 53: 477^490. 216. Kirk E.A., Heinecke J.W., LeBoeuf R.C. Iron overload diminishes atherosclerosis in apoE -deficient mice. J. Clin. Invest. 2001; 107: 1545-1553. 217. Knowles J.W., Reddick R.L., Jennette J.C., Shesely E.G., Smithies O., Maeda N. Enhanced atherosclerosis and kidney dysfunction in eNOS(-/-) apoE(-/-) mice are ameliorated by enalapril treatment. J. Clin. Invest. 2000; 105: 451 -458. 83

218. Koning G.A., Schiffelers R.M., Storm G. Endothelial cells at inflammatory sites as target for therapeutic intervention. Endothelium 2002; 9: 161-171. 219. Korbut R., Moncada S. Prostacyclin (PGI2) and thromboxane A2 interaction in vivo. Regu lation by aspirin and relationship with anti-thrombotic therapy. Thromb. Res. 1978; 13: 489-500. 220. Korbut R., Żmuda A., Basista M., Gryglewski R.J. Eicosanoid balance at early stages of experimental atherosclerosis. Its relationship with plasma fibrinolytic activity and platelet aggregation. Agents Actions Suppl. 1986; 20: 225-236. 221. Korbut R., Trąbka-Janik E., Gryglewski R.J. Cytoprotection of human polymorphonuclear leukocytes by stimulators of adenylate and guanylate cyclases. Eur. J. Pharmacol. 1989; 165: 171-172. 222. Korbut R., Ocetkiewicz A., Dąbroś W., Gryglewski R.J. A biological method for studying the interaction between platelets and vascular endothelium. Thromb. Res. 1990; 57: 361— 370. 223. Korbut R.A., Adamek-Guzik T., Madej J., Korbut R. Endothelial secretogogues and de formability of erythrocytes. J. Physiol. Pharmacol. 2002; 53(4 Pt 1): 655-665. 224. Kühn H., Walther M., Kuban R.J. Mammalian arachidonate 15-lipoxygenases structure, function, and biological implications. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002; 68-69: 263-290. 225. Kühn H., Anton M., Gerth C., Habenicht A. Amino acid differences in the deduced 5-lipoxygenase sequence of CAST atherosclerosis-resistance mice confer impaired activi ty when introduced into the human ortholog. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: 1072-1076. 226. Kullo J.J., Gau G.T., Tajik A.J. Novel risk factors for atherosclerosis. Mayo Clin. Proc. 2000; 75: 369-380. 227. Kuna P. Patomechanizm astmy oskrzelowej ze szczególnym uwzględnieniem roli leukotrie- nów. W: Leki przeciwleukotrienowe przełom w leczeniu astmy. Medycyna po Dyplomie, wydanie specjalne. Warszawa 1997: 1-11. 228. Kutuk O., Basaga H. Inflammation meets oxidation: NF-kB as a mediator of initial lesion development in atherosclerosis. TRENDS Mol. Med. 2003; 9: 549-557. 229. Lamping K.G., Nuno D.W., Chappell D.A., Faraci F.M. Agonist-specific impairment of coronary vascular function in genetically altered, hyperlipidemic mice. Am. J. Physiol. 1999; 276: R1023-1029. 230. Langheinrich A.C., Michniewicz A., Sedding D.G., Walker G., Beighley P.E., Rau W.S.. Bohle R.M., Ritman E.L. Correlation of vasa vasorum neovascularization and plaque pro gression in aortas of apolipoprotein E-/- / low density lipoprotein -I- double knockout mice. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2006; 26: 347-352. 231. Lassila M., Allen T.J., Cao Z., Thalias V., Jandeleit-Dahm K.A.. Candido R., Cooper M.E. Imatinib attenuates diabetes-associated atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2004: 24: 935-942. 232. Laurat E., Poirier B., Tupin E., Caligiuri G., Hansson G.K., Bariety J., Nicoletti A. In vivo downregulation ofT helper cell 1 immune responses reduces alherogenesis in apolipopro tein E - knockout mice. Circulation 2001; 104: 197-202. 233. Lee T.S., Shiao M.S., Pan C.C., Chau L.Y. Iron-deficient diet reduces atherosclerotic le sions in apoE - deficient mice. Circulation 1999; 99: 1222-1229. 234. Lefer D.J., Granger D.N. Monocyte rolling in early atherogenesis. Vital role in lesion deve lopment. Circ. Res. 1999; 84: 1353-1355. 235. Levi Z., Shaish A., Yacov N.. Levkovitz FL. Trestman S., Gerber Y., Cohen H., Dvir A.. Rhachmani R., Ravid M., Harats D. Rosiglitazone (PPARy-agonist) attenuates atherogenesis with no effect on hyperglycaemia in a combined diabetes-atherosclerosis mouse model. Diabetes Obes. Metab. 2003; 5: 45-50. 84

236. Levy Z., Dvir A., Shaish A., Trestman S., Cohen H., Levkovietz H., Rhachmani R., Ravid M., Harats D. Omapatrilat, an angiotensin - converting enzyme and neutral endopeptidase inhibitor, attenuates early atherosclerosis in diabetic and in nondiabetic low-density lipo protein receptor - deficient mice. Int. J. Exp. Diabetes Res. 2003; 4: 59-64. 237. Li A.C., Brown K.K., Silvestre M.J., Willson T.M., Palinski W., Glass C.K. Peroxisome proliferator-activated receptor y ligands inhibit development of atherosclerosis in LDL re ceptor-deficient mice. J. Clin. Invest. 2000; 106: 523-531. 238. Li D., Saldeen T., Romeo F, Mehta J.L. Oxidized LDL upregulates angiotensin II type 1 receptor expression in cultured human coronary artery endothelial cells: the potential role of transcription factor NF-kappaB. Circulation 2000; 102: 1970-1976. 239. Li G., Tokuno S., Tahepold P., Vaage J., Lowbeer C., Valen G. Preconditioning protects the severely atherosclerotic mouse heart. Ann. Thorac. Surg. 2001; 71: 1296-1304. 240. Li H., Cybulsky M.I., Gimbrone M.A., Libby P. An atherogenic diet rapidly induces VCAM-1, a cytokine-regulatable mononuclear leukocyte adhesion molecule, in rabbit aor tic endothelium. Arterioscl. Thromb. 1993; 13: 197-204. 241. Li Q., Verma I.M. NF-kappaB regulation in the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2: 725-734. 242. Libby P., Geng Y.J., Aikawa M., Schoenbeck U., Mach F., Clinton S.K., Sukhova G.K., Lee R.T. Macrophages and atherosclerotic plaque stability. Curr. Opin. Lipidol. 1996; 7: 330-335. 243. Libby P. Miażdżyca. W: Interna Harrisona. Fauci A.S., Braunwald E., Isselbacher KJ., Wilson J.D., Martin J.B., Kasper D.L., Hauser S.L., Longo D.L., eds. Wyd. XIV (tłumacze nie polskie). Wydawnictwo Czelej, Lublin 1998, tom III: 2501-2511. 244. Libby P. Changing concepts of atherogenesis. J. Intern. Med. 2000; 247: 349-358. 245. Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 2002; 420: 868-874. 246. Libby P. Atherosclerosis: the new view. Sci. Am. 2002; 286: 46-55. 247. Libby P.. Ridker P.M., Maseri A. Inflammation and atherosclerosis. Circulation 2002; 105: 1135-1143. 248. Libby P., Aikawa M. Stabilization of atherosclerotic plaques: new mechanisms and clinical targets. Nat. Med. 2002, 8: 1257-1262. 249. Lippmann M., Gordon T., Chen L.C. Effects of subchronic exposures to concentrated am bient particles in mice: IX. Integral assessment and human health implications of subchronic exposures of mice to CAPs. Inhal. Toxicol. 2005; 17: 255-261. 250. Litwin J.A. Metody immunoenzymatyczne. W: Immunocytochemia. Pod redakcją Macieja Żabia. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa 1990: 65-91. 251. Lótzer K., Spanbroek R., Hildner M., Urbach A., Heller R., Bretschneider E., Galczenski H., Evans J.F., Habenicht AJ.R. Differential leukotriene receptor expression and calcium responses in endothelial cells and macrophages indicate 5-lipoxygenase - dependent circuits of inflammation and atherogenesis. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: e32-e36. 252. Lowbeer C., Forsberg A.M., Tokuno S.. Hemdahl A.L., Gustafsson S.A., Valen G. Cardiac troponin T content in heart and skeletal muscle and in blood samples from apoE/LDL recep tor-double knockout mice. Clin. Chim. Acta. 2004; 344: 73-78. 253. Ludewig B., Zinkernagel R.M., Hengartner H. Arterial inflammation and atherosclerosis. Trends Cardiovasc. Med. 2002; 12: 154-159. 254. Lusis A J. Atherosclerosis. Nature 2000; 407: 233-241. 255. Mahley R.W. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science 1998; 240: 622-630. 256. Mak T.W., Penninger J.M., Ohashi P.S. Knockout mice: a paradigm shift in modern im munology. Nat. Rev. Immunol. 2001; 1: 11-19. 257. Makaritsis K.P., Gavras H., Du Y., Chobanian A.V., Brecher P. o^-adrenergic plus an giotensin receptor blockade reduces atherosclerosis in apolipoprotein E - deficient mice. Hypertension 1998; 32: 1044-1048. 85

258. Manach C., Mazur A., Scalbert A. Polyphenols and prevention of cardiovascular diseases. Curr. Opin. Lipidol. 2005; 16: 77-84. 259. Martin G., Doi F., Mares A.M., Berezowski V., Staels B., Hum D.W., Schaeffer P., Herbert J. M. Lesion progression in apoE - deficient mice: implication of chemokines and effect of the ATI angiotensin II receptor antagonist irbesartan. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2004; 43: 191-199. 260. Maxwell A.J., Ho H.V., Le C.Q., Lin P.S., Bernstein D., Cooke J.P. L-Arginine enhances aerobic exercise capacity in association with augmented nitric oxide production. J. Appl. Physiol. 2001;90: 933-938. 261. McGiff J.C., Balazy M. Pathways of arachidonate metabolism. In: Eicosanoids, aspirin, and asthma. Szczeklik A., Gryglewski R.J., Vane J.R., eds. Marcel Dekker, Inc., New York 1998: 25—44. 262. McGillicuddy C.J., Carrier M.J., Weiberg P.D. Distribution of lipid deposits around aortic branches of mice lacking LDL receptors and apolipoprotein E. Arterioscler. Thromb. Ease. Biol. 2001; 21: 1220-1225. 263. Medeiros A.I., Sa-Nunes A., Soares E.G., Peres C.M., Silva C.L., Faccioli L.H. Blockade of endogenous leukotrienes exacerbates pulmonary histoplasmosis. Infect. Immun. 2004: 1637-1644. 264. Mehrabian M., Allayee H., Wong J., Shih W., Wang X.P., Shaposhnik Z., Funk C.D., Lusis A.J. Identification of 5-lipoxygenase as a major gene contributing to atherosclerosis suscep tibility in mice. Circ. Res. 2002; 91: 120-126. 265. Mehrabian M., Allayee H. 5-lipoxygenase and atherosclerosis. Curr. Opin. Lipidol. 2003; 14: 447^157. 266. Meir K.S., Leitersdorf E. Atherosclerosis in the apolipoprotein E - deficient mouse. A de cade of progress. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2004; 24: 1006-1014. 267. Memon R.A., Staprans 1., Noor M., Holleran W.M., Uchida Y., Moser A.H., Feingold K. R., Grunfeld C. Infection and inflammation induce LDL oxidation in vivo. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000; 20: 1536-1542. 268. Michajlik A., Bartniowska E. Lipidy i lipoproteiny osoeza. Wydanie I. Wydawnictwo Le- karskie PZWL, Warszawa 1999: 70-73. 269. Middleton E. Jr, Kandaswami C., Theoharides T.C. The effects of plant flavonoids on mam malian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol. Rev. 2000; 52: 673-751. 270. Moellering D., McAndrew J., Jo H., Darley-Usmar V.M. Effects of pyrrolidine dithiocar bamate on endothelial cells: protection against oxidative stress. Free Rad. Biol. Med. 2000; 28: 1532-1537. 271. Moghadasian M.H., McManus B.M., Godin D.V., Rodrigues B., Frohlich J.J. Proathero- genic and antiatherogenic effects of probucol and phytosterols in apolipoprotein E - defi cient mice. Possible mechanisms of action. Circulation 1999; 99: 1733-1739. 272. Moghadasian M.H., McManus B.M., Nguyen L.B., Shefer S., Nadji M., Godin D.V., Green T.J., Hill J., Yang Y., Scudamore C.H., Frohlich J.J. Pathophysiology of apolipoprotein E deficiency in mice: relevance to apoE - related disorders in humans. FASEB J. 2001; 15: 2623-2630. 273. Moghadasian M.H. Experimental atherosclerosis: a historical overview. Life Sei. 2002; 70: 855-865. 274. Monaco C., Paleolog E. Nuclear factor kappaB: a potential therapeutic target in atheroscle rosis and thrombosis. Cardiovasc. Res. 2004; 61: 671-682. 275. Monaco C., Andreakos E., Kiriakidis S., Mauri C., Foxwell B., Chehrie N., Paleolog E., Feldman M. Canonical pathway of nuclear factor kB activation selectively regulates proin- flammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101: 5634-5639. 86

276. Moncada S., Korbut R. Dipyridamole and other phosphodiesterase inhibitors act as anti thrombotic agents by potentiating endogenous prostacyclin. Lancet 1978; 1: 1286-1289. 277. Moncada S., Korbut R., Bunting S., Vane J.R. Prostacyclin is a circulating hormone. Nature 1978; 273: 767-768. 278. Motterlini R., Foresti R., Bassi R., Green C.J. Curcumin, an antioxidant and anti-inflam matory agent, induces heme oxygenase-1 and protects endothelial cells against oxidative stress. Free Radie. Biol. Med. 2000; 28: 1303-1312. 279. Murray C.J.L., Lopez A.D. Mortality by cause for eight regions of the world: Global burden of disease study. Lancet 1997; 349: 1269-1276. 280. Mutschler E., Geisslinger G., Kroemer H.K., Schafer-Korting M. Substancje szlaku lipooksygenazy. W: Farmakologia i Toksykologia. Mutschler E., ed. Wyd. 1 polskie pod red. Andrzeja Danysza. Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner, Wroclaw 2001: 469- 489. 281. Naito M., Wu X., Nomura H., Kodama M., Kato Y., Kato Y., Osawa T. The protective effects of tetrahydrocurcumin on oxidative stress in cholesterol-fed rabbits. J. Atheroscler. Thromb. 2002; 9: 243-250. 282. Nakashima Y., Plump A.S., Raines E.W., Breslow J.L., Ross R. ApoE - deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler. Thromh. 1994; 14: 133-140. 283. Napoli C., Palinski W., Di Minno G.. D’Armiento F.P.. Determination of atherogenesis in apolipoprotein E - knockout mice. Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 2000; 10: 209-215. 284. Napoli C., Ackah E., De Nigris F.. Del Soldato P., D’Armiento F.P., Crimi E., Condorelli M., Sessa W.C. Chronic treatment with nitric oxide - releasing aspirin reduces plasma low- -density lipoprotein oxidation and oxidative stress, arterial oxidation - specific epitopes, and atherogenesis in hypercholesterolemic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 12467-12470. 285. Naruszewicz M. Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis. Advances in science and personal observations. Kardiol. Pol. 1989; 32: 27-34. 286. Naruszewicz M. Oxidative modification of lipoproteins - impact on atherosclerosis. Can. J. Cardiol. 1991; 7: VII-V1II. 287. Naruszewicz M. Homocysteine: a risk factor for atherosclerosis. Neurol. Neurochir. Pol. 2000; 34: 637-643. 288. Naruszewicz M., Daniewski M., Nowicka G., Kozłowska-Wojciechowska M. Trans-unsa- turated fatty acids and acrylamide in food as potential atherosclerosis progression factors. Based on own studies. Acta Microbiol. Pol. 2003; 52 Suppl: 75-81. 289. Nasser S.N.S., Lee T.H. Cysteinyl-leukotriene receptor antagonism and 5-lipoxygenase in- hibiton in asthma. In: Five-lipoxvgenaseproducts in asthma. Drazen J.M., Dahlen S.E., Lee T.H., eds. Marcel Dekker, Inc., New York 1998: 283-306. 290. Neuzil J., Christison J.K., lheanacho E., Fragonas J.C., Zammit V., Hunt N.H.. Stocker R. Radical-induced lipoprotein and plasma lipid oxidation in normal and apolipoprotein E gene knockout (apoE-/-) mice: apoE-/- mouse as a model for testing the role of tocopherol- -mediated peroxidation in atherogenesis. J. Lipid. Res. 1998; 39: 354-368. 291. Nicoletti A., Kaveri S., Caligiuri G., Bariety J., Hansson G.K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apoE - knockout mice. J. Clin. Invest. 1998; 102: 910-918. 292. Nicoletti A., Paulsson G., Caligiuri G., Zhou X., Hansson G.K. Induction of neonatal tole rance to oxidized lipoprotein reduces atherosclerosis in apoE - knockout mice. Mol. Med. 2000; 6: 283-290. 293. Niebauer J., Maxwell A.J., Lin P.S., Wang D., Tsao P.S., Cooke J.P. NOS inhibition accele rates atherogenesis: reversal by exercise. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2003; 285: H535-H540. 87

294. Nygard O., Nordrehaug J.E., Refsum H., Ueland P.M., Farstad M., Vollset S.E. Plasma homocysteine levels and mortality in patients with coronary artery disease. N. Engl. J. Med. 1997; 337: 230-236. 295. Olesen M., Kwong E., Meztli A., Kontny F., Seljeflot 1., Arnesen H., Lyngdorf L., Falk E. No effect of cyclooxygenase inhibition on plaque size in atherosclerosis-prone mice. Scand. Cardiovasc. J. 2002; 36: 362-367. 296. Oliriski R., Gackowski D., Foksiriski M., Rozalski R., Roszkowski K., Jaruga P. Oxidative DNA damage: assessment of the role in carcinogenesis, atherosclerosis, and acquired im munodeficiency syndrome. Free Radic. Biol. Med. 2002; 33: 192-200. 297. Olszanecki R., G^bska A., Kozlovski V.I., Gryglewski R.J. Flavonoids and nitric oxide synthase. J. Physiol. Pharmacol. 2002; 53: 571-584. 298. Olszanecki R., Jawieri J., Gajda M., Mateuszuk L., G?bska A., Korabiowska M., Chlopicki S., Korbut R. Effect of curcumin on atherosclerosis in apoE/LDLR - double knockout mice. J. Physiol. Pharmacol. 2005; 56: 627-635. 299. O’Neill T.P. Apolipoprotein E - deficient mouse model of human atherosclerosis. Toxicol. Pathol. 1997; 25: 20-21. 300. Ordovas J.M., Osgood D. Preparative isolation of plasma lipoproteins using fast protein liquid chromatography (FPLC). Methods Mol. Biol. 1998; 110: 105-111. 301. Osada J., Joven J., Maeda N. The value of apolipoprotein E - knockout mice for studying the effects of dietary fat and cholesterol on atherogenesis. Curr. Opin. Lipidol. 2000; 11: 25-29. 302. Paigen B., Morrow A., Holmes P.A., Mitchell D., Williams R.A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis 1987; 68: 231-240. 303. Paigen B., Plump A.S, Rubin E.M. The mouse as a model for human cardiovascular disease and hyperlipidemia. Curr. Opin. Lipidol. 1994; 5: 258-264. 304. Palinski W., Ord V.A., Plump A.S., Breslow J.L., Steinberg D., Witztum J.L. ApoE - de ficient mice are a model of lipoprotein oxidation in atherogenesis. Demonstration of oxi dation - specific epitopes in lesions and high titers of autoantibodies to malondialdehyde - lysine in serum. Arterioscler. Thromh. 1994; 14: 605-616. 305. Patel N.S., Cuzzocrea S., Chatterjee P.K., Di Paola R., Sautebin L., Britti D., Thiemermann C. Reduction of renal ischemia-reperfusion injury in 5-lipoxygenase knockout mice and by the 5-lipoxygenase inhibitor zileuton. Mol. Pharmacol. 2004; 66: 220-227. 306. Paul A., Calleja L., Camps J., Osada J., Vilella E., Ferre N., Mayayo E., Joven J. The con tinuous administration of aspirin attenuates atherosclerosis in apolipoprotein E - deficient mice. Life Sci. 2000; 68: 457^-65. 307. Paulsson G., Zhou X., Tornquist E., Hansson G.K. Oligoclonal T cell expansions in athe rosclerotic lesions of apolipoprotein E - deficient mice. Arterioscler. Thromh. Case. Biol. 2000; 20: 10-17. 308. Pearson T.A., Mensah G.A., Alexander R.W., Anderson J.L., Cannon R.O. 3rd, Criqui M., Fadi Y.Y., Fortmann S.P., Hong Y., Myers G.L., Rifai N., Smith S.C. Jr, Taubert K., Tracy R.P., Vinicor F. Markers of inflammation and cardiovascular disease: application to clinical and public health practice: A statement for healthcare professionals from the Centers for Disease Control and Prevention and the American Heart Association. Circulation 2003; 107: 499-511. 309. Peluzio M.C.G., Miguel E. Jr, Drumond T.C., Cesar G.C., Santiago H.C., Teixeira M.M., Vieira E.C., Arantes R.M.E., Alvarez-Leite J.I. Monocyte chemoattractant protein-1 in volvement in the a-tocopherol-induced reduction of atherosclerotic lesions in apolipopro tein E - knockout mice. Br. J. Nutr. 2003; 90: 3-11. 310. Penrose J.F., Austen K.F. Leukotriene C4 synthase: a pivotal enzyme in the biosynthesis of cysteinyl leukotrienes. In: Five-lipoxygenaseproducts in asthma. Drazen J.M., Dahlen S.E., Lee T.H., eds. Marcel Dekker, Inc., New York 1998: 33-50. 88

311. Penrose J.F. LTC4 synthase. Enzymology, biochemistry, and molecular characterization. Clin. Rev. Allergy. Immunol. 1999; 17: 133-152. 312. Penrose J.F., Austen K.F. The biochemical, molecular, and genomic aspects of leukotriene C4 synthase. Proc. Assoc. Am. Physicians. 1999; 111: 537-546. 313. Pentikainen M.O., Óórni K.. Ala-Korpela M., Kovanen P.T. Modified LDL-trigger of athe rosclerosis and inflammation in the arterial intima. J. Intern. Med. 2000; 247: 359-370. 314. Persson L., Boren J., Robertson A.K., Wallenius V., Hansson G.K., Pekna M. Lack of complement factor C3, but not factor B, increases hyperlipidemia and atherosclerosis in apolipoprotein E' low density lipoprotein'' mice. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2004; 24: 1062-1067. 315. Persson L., Boren J., Nicoletti A., Hansson G.K., Pekna M. Immunoglobulin treatment re duces atherosclerosis in apolipoprotein E' low-density lipoprotein receptor'' mice via the complement system. Clin. Exp. Immunol. 2005; 142: 441—445. 316. Phillips J.W., Barringhaus K.G., Sanders J.M., Yang Z., Chen M., Hesselbacher S., Czarnik A.C., Ley K., Nadler J., Sarembock I.J. Rosglitazone reduces the accelerated neointima formation after arterial injury in a mouse injury model of type 2 diabetes. Circulation 2003; 108: 1994-1999. 317. Phipps R.P. Atherosclerosis: the emerging role of inflammation and the CD40-CD40L sys tem. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 6930-6932. 318. Piedrahita J.A., Zhang S.H., Hagaman J.R., Oliver P.M., Maeda N. Generation of mice car rying a mutant apolipoprotein E gene inactivated by gene targeting in embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 4471-4475. 319. Pinderski L.J., Fischbein M.P., Subbanagounder G., Fishbein M.C., Kubo N., Cheroutre H.. Curtiss L.K., Berliner J.A., Boisvert W.A. Overexpression of interleukin-10 by activated T lymphocytes inhibits atherosclerosis in LDL receptor - deficient mice by altering lympho cyte and macrophage phenotypes. Circ. Res. 2002; 90: 1064—1071. 320. Plump A.S., Smith J.D., Hayek T., Aalto-Setala K., Walsh A., Verstuyft J.G., Rubin E.M., Breslow J.L. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E - defi cient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell 1992; 71: 343-353. 321. Plump A.S., Breslow J.L. Apolipoprotein E and the apolipoprotein E - deficient mouse. Annu. Rev. Nutr. 1995; 15: 495-518. 322. Plump A. Atherosclerosis and the mouse: a decade of experience. Ann. Med. 1997; 29: 193-198 323. Pons S., Hagege A., Fornes P., Gervais M., Giudicelli J.F., Richer C. Effects of angioten sin II type 1 receptor blockade in apoE - deficient mice with post-ischemic heart failure. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2003; 42: 17-23. 324. Pratico D., Tangirala R.K., Rader D.J., Rokach J., Fitzgerald G.A. Vitamin E suppresses isoprostane generation in vivo and reduces atherosclerosis in apoE - deficient mice. Nature Med. 1998; 4: 1189-1192. 325. Prevention of cardiovascular events and death with pravastatin in patients with coronary heart disease and a broad range of initial cholesterol levels. The Long-Term Intervention with Pravastatin in Ischaemic Disease (LIPID) Study Group. N. Engl. J. Med. 1998; 339: 1349-1357. 326. Purcell-Huynh D.A., Farese R.V. Jr, Johnson D.F., Flynn L.M., Pierotti V., Newland D.L., Linton M.F., Sanan D.A., Young S.G. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high - fat diet. J. Clin. Invest. 1995; 95: 2246-2257. 327. Quiles J.L., Mesa M.D., Ramirez-Tortosa C.L., Aguilera C.M., Battino M., Gil A., Ramirez- -Tortosa M.C. Curcuma longa extract supplementation reduces oxidative stress and attenu ates aortic fatty streak development in rabbits. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2002; 22: 1225-1231. 89

328. Qureshi A. A., Salser W.A., Parmar R., Emeson E.E. Novel tocotrienols of rice bran inhibit atherosclerotic lesions in C57BL/6 apoE - deficient mice. J. Nutr. 2001; 131: 2606-2618. 329. Radmark O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes. Mediators also of atherosclerotic inflam mation. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: 1140-1142. 330. Ramos C.L., Huo Y., Jung U., Ghosh S., Manka D.R., Sarembock I.J., Ley K. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1 - dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E - deficient mice. Circ. Res. 1999; 84: 1237— 1244. 331. Ramos C.L., Canetti C., Souto J.T.. Silva J.S., Hogaboam C.M., Ferreira S.H., Cunha F.Q. MIP-la [CCL3] acting on the CCR1 receptor mediates neutrophil migration in immune in flammation via sequential release of TNF-a and LTBq. J. Leukoc. Biol. 2005; 78: 167-177. 332. Rang H.P., Dale M.M., Ritter J.M. Mediatory zapalenia i reakcji alergicznych. W: Farma kologia kliniczna. Redakcja naukowa wydania polskiego: Marian Wielosz. Wydawnictwo Czelej, Lublin 2001: 210-212. 333. Ravn H.B., Korsholm T.L., Falk E. Oral magnesium supplementation induces favorable antiatherogenic changes in apoE - deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2001; 21: 858-862. 334. Reardon C.A., Getz G.S. Mouse models of atherosclerosis. Curr. Opin. Lipid. 2001; 12: 167-173. 335. Reddick R.L., Zhang S.H., Maeda N. Atherosclerosis in mice lacking apoE. Evaluation of lesional development and progression. Arterioscler. Thromb. 1994; 14: 141-147. 336. Reis E.D., Roque M., Dansky H., Fallon J.T., Badimon JJ, Cordon-Cardo C., Shiff S.J., Fisher E.A. Sulindac inhibits neointimal formation after arterial injury in wild-type and apolipoprotein E - deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 12764-12769. 337. Rioux N.. Castonguay A. Inhibitors of lipoxygenase: a new class of cancer chemopreven tive agents. Carcinogenesis 1998; 1393-1400. 338. Robak J., Gryglewski RJ. Bioactivity of flavonoids. Pol. J. Pharmacol. 1996; 48: 555- 564. 339. Robbins J. Gene targeting. The precise manipulation of the mammalian genome. Circ. Res. 1993;73: 3-9. 340. Rosenfeld M.E. Leukocyte recruitment into developing atherosclerotic lesions. The com plex interaction between multiple molecules keeps getting more complex. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2002; 22: 361-363. 341. Ross R., Glomset J.A. The pathogenesis of atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 1976; 295: 369-377. 342. Ross R., Glomset J., Harker L. Response to injury and atherogenesis. Am. J. Pathol. 1977; 86: 675-684. 343. Ross R., Faggiotto A., Bowen-Pope D., Raines E. The role of endothelial injury and platelet and macrophage interactions in atherosclerosis. Circulation 1984; 70: 77-82. 344. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis - an update. N. Engl. J. Med. 1986; 314: 488- 500. 345. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993; 362: 801-809. 346. Ross R. Atherosclerosis - an inflammatory disease. N. Eng. J. Med. 1999; 340: 115-126. 347. Ross R. Atherosclerosis is an inflammatory disease. Am. Heart J. 1999; 138: S419-S420. 348. Rott D., Zhu J., Bumett M.S., Zhou Y.F., Zalles-Ganley A., Ogunmakinwa J., Epstein S.E. Effects of MF-Tricyclic, a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, on atherosclerosis progres sion and susceptibility to cytomegalovirus replication in apolipoprotein E - knockout mice. J. Am. Coll. Cardiol. 2003; 41: 1812-1819. 349. Ruf J.C. Wine and polyphenols related to platelet aggregation and atherothrombosis. Drugs Exp. Clin. Res. 1999; 25: 125-131. 90

350. Russo G., Leopold J.A., Loscalzo J. Vasoactive substances: nitric oxide and endothelial dysfunction in atherosclerosis. Pascal. Pharmacol. 2002; 38: 259-269. 351. Sala A., Zarini S., Bolla M. Leukotrienes: lipid bioeffectors of inflammatory reactions. Bio chemistry (Mose.) 1998; 63: 84-92. 352. Saraff K., Babamusta F., Cassis L.A., Daugherty A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin Il-infused, apolipoprotein E - deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: 1621-1626. 353. Savla U. At the heart of atherosclerosis. Nature Med. 2002; 8: 1209. 354. Scandinavian Simvastatin Survival Study Group. Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease: The Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S). Lancet 1994; 344: 1383-1389. 355. Scapagnini G., Foresti R., Calabrese V., Stella A.M.G., Green C.J., Motterlini R. Caffeic acid phenethyl ester and curcumin: a novel class of heme oxygenase-1 inducers. Mol. Phar macol. 2002; 3: 554-561. 356. Schmidt A., Goepfert C., Feitsma K., Buddecke E. Lovastatin-stimulated superinduction of E-selectin, 1CAM-1 and VCAM-1 in TNF-a activated human vascular endothelial cells. Atherosclerosis 2002; 164: 57-64. 357. Schonbeck U., Sukhova G.K., Shimizu K.. Mach F., Libby P. Inhibition of CD40 signaling limits evolution of established atherosclerosis in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 7458-7463. 358. Schreck R., Meier B.. Mannel D.N., Droge W., Baeuerle P.A. Dithiocarbamates as po tent inhibitors of nuclear factor kappa B activation in intact cells. J. Exp. Med. 1992; 175: 1181-1194. 359. Schultz M.J., Wijnholds J., Peppelenbosch M.P., Vervoordeldonk M.J., Speelman P., van Deventer S.J., Borst P., van der Poll T. Mice lacking the multidrug resistance protein 1 are resistant to Streptococcus pneumoniae - induced pneumonia. J. Immunol. 2001; 166: 4059-1064. 360. Seidenberg B.C.. Reiss T.F. Montelukast - an antileukotriene treatment for asthma: chang ing the asthma-treatment paradigm. In: Five-lipoxygenaseproducts in asthma. Drazen J.M., Dahlen S.E., Lee T.H., eds. Marcel Dekker, Inc., New York 1998: 327-346. 361. Shah P.K. Link between infection and atherosclerosis. Who are the culprits: viruses, bacte ria, both, or neither? Circulation 2001; 103: 5-6. 362. Shamir R., Shehadeh N., Rosenblat M., Eshach-Adiv O., Coleman R., Kaplan M., Hamoud S., Lischinsky S., Hayek T. Oral insulin supplementation attenuates atherosclerosis pro gression in apolipoprotein E - deficient mice. Atheroscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: 104-110. 363. Sharabi Y., Grossman E., Sherer Y., Shaish A., Levkovitz H., Bitzur R., Harats D. The ef fect of renin - angiotensin axis inhibition on early atherogenesis in LDL-receptor - deficient mice. Pathobiol. 2000; 68: 270-274. 364. Sherer Y., Shaish A., Levkovitz H., Keren P., Janackovic Z., Shoenfeld Y., Harats D. Mag nesium fortification of drinking water suppresses atherogenesis in male LDL-receptor - de ficient mice. Pathobiol. 1999; 67: 207-213. 365. Sherer Y., Shoenfeld Y.. Shaish A., Levkovitz H., Bitzur R., Harats D. Suppression of atherogenesis in female low - density lipoprotein receptor knockout mice following magne sium fortification of drinking water: the importance of diet. Pathobiol. 2000; 68: 93-98. 366. Sherer Y., Bitzur R., Cohen H., Shaish A., Varon D., Shoenfeld Y., Harats D. Mecha nisms of action of the anti-atherogenic effect of magnesium: lessons from a mouse model. Magnes. Res. 2001; 14: 173-179. 367. Shi W., Haberland M.E., Jien M.L., Shih D.M., Lusis A.J. Endothelial responses to oxidized lipoproteins determine genetic susceptibility to atherosclerosis in mice. Circulation 2000; 102: 75-81. 91

368. Shimokawa H. Primary endothelial dysfunction: atherosclerosis. J. Mol. Cell. Cardiol. 1999; 31: 23-37. 369. Shishehbor M.H., Bhatt D.L. Inflammation and atherosclerosis. Curr. Atheroscler. Rep. 2004; 6: 131-139. 370. Skâlen K., Gustafsson M., Rydberg E.K., Hulten L.M., Wiklund O.. Innerarity T.L.. Bo ren J. Subendothelial retension of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature 2002; 417: 750-754. 371. Sladek K., Dworski R., Fitzgerald G.A.. Buitkus K.L., Block F.J., Marney S.R. Jr, Sheller J.R. Allergen-stimulated release of thromboxane A2 and leukotriene E4 in humans. Effect of indomethacin. Am. Rev. Respir. Dis. 1990; 141: 1441-1445. 372. Sladek K., Sheller J.R., FitzGerald G.A.. Morrow J.D., Roberts L.J. 2nd. Formation of PGD2 after allergen inhalation in atopic asthmatics. Adv. Prostaglandin. Thromboxane. Leukot. Res. 1991; 21 A: 433-436. 373. Sladek K., Szczeklik A. Cysteinyl leukotrienes overproduction and mast cell activation in aspirin-provoked bronchospasm in asthma. Eur. Respir. J. 1993; 6: 391-399. 374. Somers P.K., Medford R.M., Saxena (J. Dithiocarbamates: effects on lipid hydroperoxides and vascular inflammatory gene expression. Free Rad. Biol. Med. 2000; 28: 1532-1537. 375. Spanbroek R., Grabner R., Lotzer K., Hildner M., Urbach A., Ruhling K., Moos M.P.W., Kaiser B., Cohnert T.U., Wahlens T., Zieske A.. Plenz G., Robenek H., Salbach P., Kuhn H.. Radmark O., Samuelsson B., Habenicht A.J.R. Expanding expression of the 5-lipoxygenase pathway within the arterial wall during human atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003; 100: 1238-1243. 376. Spanbroek R.. Habenicht A.J. The potential role of antileukotriene drugs in atherosclerosis. Drug News Perspect 2003; 16: 485—489. 377. Stancovski I., Baltimore D. NF-kappaB activation: the I kappaB kinase revealed? Cell 1997; 91: 299-302. 378. Stary H.C. Evolution and progression of atherosclerotic lesions in coronary arteries of chil dren and young adults. Arteriosclerosis 1989; 9: 119-132. 379. Stary H.C., Chandler A.B.. Glagov S., Guyton J.R., Insull W. Jr. Rosenfeld M.E.. Schaffer S.A.. Schwartz C.J., Wagner W.D., Wissler R.W. A definition of initial, fatty streak, and in termediate lesions of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. Arterioscler Thromh. 1994; 14: 840-856. 380. Stary H.C., Chandler A.B., Dinsmore R.E., Fuster V., Glagov S., Insull W. Jr, Rosenfeld M.E.. Schwartz C.J.. Wagner W.D.. Wissler R.W. A definition of advanced types of athero sclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis. A report from the Com mittee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. Arterioscler. Thromh. Vase. Biol. 1995; 15: 1512-1531. 381. Steele V.E., Holmes C.A., Hawk E.T., Kopelovich L., Lubet R.A.. Crowell J.A.. Sigman C.C., Kelloff G.J. Lipoxygenase inhibitors as potential cancer chemopreventives. Cancer Epidemiol. Biomarkers. Prev. 1999; 8: 467—483. 382. Stein Y., Stein O. Does therapeutic intervention achieve slowing of progression or bona fide regression of atherosclerotic lesions? Arterioscler. Thromh. Vase. Biol. 2001; 21: 183— 188. 383. Steinberg D. At last, direct evidence that lipoxygenases play a role in atherogenesis. J. Clin. Invest. 1999; 103: 1487-1488. 384. Steinberg D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as part ners in crime. Nat. Med. 2002; 8: 1211-1217. 385. Strom A.. Ahlqvist E., Franzen A., Heinegard D., Hultgardh-Nilsson A. Extracellular ma trix components in atherosclerotic arteries of apoE/LDL receptor - deficient mice: an im munohistochemical study. Histol. Histopathol. 2004; 19: 337-347. 92

386. Strom A., Franzen A., Wangnerud C., Knutsson A.K., Heinegard D., Hultgardh-Nilsson A. Altered vascular remodeling in osteopontin-deficient atherosclerotic mice. J. Vase. Res. 2004; 41: 314-322. 387. Suda O., Tsutsui M., Morishita T., Tanimoto A., Horiuchi M., Tasaki H., Huang P.L., Sa- saguri Y., Yanagihara N., Nakashima Y. Long-term treatment with N'’-nitro-L-arginine methyl ester causes arteriosclerotic coronary lesions in endothelial nitric oxide synthase -deficient mice. Circulation 2002; 106: 1729-1735. 388. Suzuki H., Kurihara Y., Takeya M., Kamada N., Kataoka M., Jishage K., Ueda O., Sakagu- chi H., Higashi T., Suzuki T., Takashima Y., Kawabe Y., Cynshi O., Wada Y., Honda M., Kurihara H., Aburatani H., Doi T., Matsumoto A., Azuma S., Noda T., Toyoda Y., Itakura H., Yazaki Y., Kodama T. A role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptibility to infection. Nature 1997; 386: 292-296. 389. Szafran H., Knapik-Czajka M. Podstawy biochemiczne gospodarki lipidowej organizmu człowieka. Collegium Medicum UJ, Kraków 1994: 23-24. 390. Szczeklik A., Gryglewski R.J., Niżankowski R., Skawiński S., Głuszko P., Korbut R. Pro stacyclin therapy in peripheral arterial disease. Thromb. Res. 1980; 19: 191-199. 391. Szczeklik A. Prostacyclin and atherosclerosis. Triangle 1980; 19: 61-67. 392. Szczeklik A. Asthma, aspirin and leukotrienes. Bull. Eur. Physiopathol. Respir. 1983; 19: 531-538. 393. Szczeklik A., Gryglewski R.J., Sładek K., Kostka-Trąbka E., Żmuda A. Dihomo-gamma- -linolenic acid in patients with atherosclerosis: effects on platelet aggregation, plasma lipids and low-density lipoprotein-induced inhibition of prostacyclin generation. Thromb. Hae- most. 1984; 51: 186-188. 394. Szczeklik A.. Jawień J., Stadler B.M., Radwan J., Piwowarska W., Dziatkowiak A. Possible relationship between interleukin-6 and response of immunoglobulin E to surgical trauma. Ann. NY Acad. Sei. 1995; 762: 477^179. 395. Szczeklik A., Mastalerz L., Niżankowska E., Sanak M. Montelukast for persistent asthma. Lancet 2001; 358: 1456-1457. 396. Szczeklik A., Niżankowska E., Mastalerz L., Bochenek G. Myocardial ischemia possibly mediated by cysteinyl leukotrienes. J. Allergy Clin. Immunol. 2002; 109: 572-573. 397. Szczeklik A., Sanak M., Niżankowska-Mogilnicka E., Kiełbasa B. Aspirin intolerance and the cyclooxygenase-leukotriene pathways. Curr. Opin. Pulm. Med. 2004; 10: 51-56. 398. Tamminen M., Mottino G., Qiao J.H., Breslow J.L., Frank J.S. Ultrastructure of early lip id accumulation in apoE - deficient mice. Arterioscl. Thromb. Vase. Biol. 1999; 19: 847- 853. 399. Tangirala R.K., Casanada F., Miller E., Witztum J.L., Steinberg D., Palinski W. Effect of the antioxidant N,N’ - diphenyl 1,4-phenylenediamine (DPPD) on atherosclerosis in apoE - deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1995; 15: 1625-1630. 400. Tangirala R.K., Rubin E.M., Palinski W. Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor - deficient and apolipoprotein E - deficient mice. J. Lipid. Res. 1995; 36; 2320-2328. 401. Tatoń J. Miażdżyca. Zapobieganie w praktyce lekarskiej. Wydanie I. Wydawnictwo Lekar skie PZWL, Warszawa 1996: 83-84. 402. Tenger C., Sudenborg A., Jawień J., Zhou X. IL-18 accelerates atherosclerosis accompanied by elevation of IFN-gamma and CXCL16 expression independently of T cells. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005; 25: 791-796. 403. Thomas S.R., Leichtweis S B., Pettersson K., Croft K.D., Mori T.A., Brown A.J., Stocker R. Dietary cosupplementation with vitamin E and coenzyme Q|0 inhibits atherosclerosis in apolipoprotein E gene knockout mice. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2001; 21: 585- 593. 93

404. Tokuno S., Thoren P., Lowbeer C., Valen G. The role of nitric oxide in ischaemia/reperfusion injury of isolated hearts from severely atherosclerotic mice. Life Sci. 2001; 69: 2067- 2080. 405. Tokuno S., Hinokiyama K., Tokuno K., Lowbeer C., Hansson L.O., Valen G. Spontaneous ischemic events in the brain and heart adapt the hearts of severely atherosclerotic mice to ischemia. Arterioscler. Thromb. Kase. Biol. 2002; 22: 995-1001. 406. Valen G., Yan Z.Q., Hansson G.K. Nuclear factor kappa-B and the heart. J. Am. Coll. Car diol. 2001; 38: 307-314. 407. van Ree J.H., van den Broek W.J., Dahlmans V.E., Wieringa B., Frants R.R., Havekes L. M., Hofker M.H. Variability in cholesterol content in serum and aortic tissue in apolipo protein E - deficient mice is comparable in inbred (129/Sv) and outbred (mixed 129/Sv and C57BL/6) mice. Atherosclerosis 1995; 118: 165-167. 408. Veniant M.M., Sullivan M.A., Kim S.K., Ambroziak P., Chu A., Wilson M.D., Hellerstein M. K., Rudel L.L., Walzem R.L., Young S.G. Defining the atherogenicity of large and small lipoproteins containing apolipoprotein B 100. J. Clin. Invest. 2000; 106: 1501-1510. 409. Voelkel N.F., Tuder RM., Wade K., Hóper M., Lepley R.A., Goulet J.L., Koller B.H., Fitzpatrick F. Inhibition of 5-lipoxygenase - activating protein (FLAP) reduces pulmonary vascular reactivity and pulmonary hypertension in hypoxic rats. J. Clin. Invest. 1996; 97: 2491-2498. 410. Wallerath T., Deckert G., Ternes T., Anderson H., Li H., Witte K., Forstermann U. Resve ratrol, a polyphenolic phytoalexin present in red wine, enhances expression and activity of endothelial nitric oxide synthase. Circulation 2002; 106: 1652-1658. 411. Wickelgren I. Gene suggests asthma drugs may ease cardiovascular inflammation. Science 2004; 303: 941. 412. Wilson S.H., Best P.J., Edwards W.D., Holmes D.R. Jr, Carlson P.J.. Celermajer D.S.. Ler- man A. Nuclear factor-kappaB immunoreactivity is present in human coronary plaque and enhanced in patients with unstable angina pectoris. Atherosclerosis 2002; 160: 147-153. 413. Witting P.K., Pettersson K., Ostlund-Lindqvist A.M., Westerlund C.. Eriksson A.W., Stocker R. Inhibition by a coantioxidant of aortic lipoprotein lipid peroxidation and athe rosclerosis in apolipoprotein E and low density lipoprotein receptor gene double knockout mice. FASEB J. 1999; 13: 667-675. 414. Witting P.K., Pettersson K., Letters J., Stocker R. Site-specific antiatherogenic effect of probucol in apolipoprotein E - deficient mice. Arterioscler. Thromb. Ease. Biol. 2000; 20: e26-e33. 415. Witting P.K., Pettersson K., Letters J., Stocker R. Anti-atherogenic effect of coenzyme Qlh in apolipoprotein E gene knockout mice. Free Radical Biol. Med. 2000; 29: 295-305. 416. Witztum J.L., Steinberg D. Role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesis. J. Clin. Invest. 1991; 88: 1785-1792. 417. Woodman O.L., Chan E.C. Vascular and anti-oxidant actions of flavonols and flavones. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2004; 21: 786-790. 418. Wu X., Biswal S.S., Kehrer J.P. Roles of 5-lipoxygenase activating protein in cell prolifera tion and apoptosis. Cell Biol. Toxicol. 2003; 19: 135-143. 419. Wybrańska I., Kwaśniak M. Biochemia kliniczna i diagnostyka zaburzeń gospodarki li pidowej. W: Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Pod redakcją Aldony Dembińskiej-Kieć i Jerzego W. Naskalskiego. Wydanie II. Wydawnictwo Urban & Partner, Wrocław 2002: 329-387. 420. Yaghoubi M., Oliver-Krasinski J., Cayatte A.J., Cohen R.A. Decreased sensitivity to ni tric oxide in the aorta of severely hypercholesterolemic apolipoprotein E - deficient mice. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2000; 36: 751-757. 421. Yamashita T., Oda E., Sano T., Yamashita T., Ijiru Y., Giddings J.C., Yamamoto J. Varying the ration of dietary n-6/n-3 polyunsaturated fatty acids alters the tendency to thrombosis 94

and progress of atherosclerosis in apoE' LDLR' double knockout mouse. Thromb. Res. 2005; 116: 393-401. 422. Yan Z.Q.. Sirsjö A., Bochaton-Piallat M.L., Gabbiani G., Hansson G.K. Augmented expres sion of inducible NO synthase in vascular smooth muscle cells during aging is associated with enhanced NF-kappaB activation. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999; 19: 2854- 2862. 423. Yang R., Powell-Braxton L., Ogaoawara A.K., Dybdal N., Bunting S., Ohneda O., Jin H. Hypertension and endothelial dysfunction in apolipoprotein E - knockout mice. Arterio scler. Thromb. Vase. Biol. 1999; 19: 2762-2768. 424. Ye R.D. Regulation of nuclear factor kappaB activation by G-protein-coupled receptors. J. Leukoc. Biol. 2001; 70: 839-848. 425. Yet S.F., Layne M.D., Liu X., Chen Y.H., Ith B.. Sibinga N.E., Perrella M.A. Absence of heme oxygenase-1 exacerbates atherosclerotic lesion formation and vascular remodeling. FASEBJ. 2003; 17: 1759-1761. 426. Yoshikawa T., Shimano H., Chen Z., Ishibashi S.. Yamada N. Effects of probucol on athe rosclerosis of apoE - deficient or LDL receptor - deficient mice. Horm. Metab. Res. 2001; 33: 472-479. 427. Yu J., Rudic R.D., Sessa W.C. Nitric oxide - releasing aspirin decreases vascular injury by reducing inflammation and promoting apoptosis. Labor. Invest. 2002; 82: 825-832. 428. Zhang S.H., Reddick R.L., Piedrahitta A., Maeda N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science 1992; 258: 468—471. 429. Zhang S.H., Reddick R.L., Avdievich E.. Surles L.K.. Jones R.G., Reynolds J.B., Quarfordt S.H, Maeda N. Paradoxical enhancement of atherosclerosis by probucol treatment in apoli poprotein E - deficient mice. J. Clin. Invest. 1997; 99: 2858-2866. 430. Zhao L., Funk C.D. Lipoxygenase pathways in atherogenesis. Trends Cardiovasc. Med. 2004; 14: 191-195. 431. Zhao L., Moos M.P., Grabner R., Pedrono F., Fan J., Kaiser B., John N.. Schmidt S., Span- broek R.. Lotzer K., Huang L., Cui J., Rader D.J., Evans J.F., Habenicht A.J., Funk C.D. The 5-lipoxygenase pathway promotes pathogenesis of hyperlipidemia-dependent aortic aneurysm. Nat. Med. 2004; 10: 966-973. 432. Zhou X., Hansson G.K. Vaccination and atherosclerosis. Curr. Atheroscler. Rep. 2004; 6: 158-164. 433. Zingarelli B., Sheehan M., Wong H.R. Nuclear factor-кВ as a therapeutic target in critical care medicine. Crit. Care Med. 2003; 31 (suppl.): S105-S111. 434. Zuckerman S.H., Kauffman R.F., Evans G.F. Peroxisome proliferator-activated receptor a.y coagonist LY465608 inhibits macrophage activation and atherosclerosis in apolipoprotein E - knockout mice. Lipids 2002; 37: 487—494. 435. Żeromski J. Metody immunofluorescencyjne. W: Immnnocytochemia. Pod redakcją Macie ja Żabia. Państwowe Wydawnictwo Naukowe. Warszawa 1990: 92-120.