RZECZPOSPOLITA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 3129406 POLSKA

(13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int.Cl. 10.04.2015 15777039.7 C07K 16/30 (2006.01) A61K 47/68 (2017.01)

(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 09.01.2019 Europejski Biuletyn Patentowy 2019/02 Urząd Patentowy EP 3129406 B1 Rzeczypospolitej Polskiej

(54) Tytuł wynalazku: Skoniugowane związki zawierające przeciwciała modyfikowane cysteiną

(30) Pierwszeństwo: 11.04.2014 US 201461978481 P

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

15.02.2017 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2017/07

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

31.07.2019 Wiadomości Urzędu Patentowego 2019/07

(73) Uprawniony z patentu:

Medimmune, LLC, Gaithersburg, US

(72) Twórca(y) wynalazku:

CHANGSHOU GAO, Gaithersburg, US GODFREY RAINEY, Gaithersburg, US

CUIHUA GAO, Gaithersburg, US

T3 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Piotr Godlewski JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. K. 3129406 ul. Żelazna 28/30 Sienna Center 00-833 Warszawa

PL/EP

Uwaga:

W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

38032/19/ZWA/PG EP 3 129 406

Skoniugowane związki zawierające przeciwciała modyfikowane cysteiną Opis TŁO [0001] Ujawnienie zapewnia przeciwciała modyfikowane cysteiną i białko fuzyjne Fc oraz związki koniugatowe zawierające takie cząsteczki modyfikowane cysteiną. Takie koniugaty można wykorzystać do zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych. [0002] Zastosowano przeciwciała do diagnozowania i leczenia celowanego pacjentów z chorobami nowotworowymi, immunologicznymi i angiogennymi. Zastosowanie koniugatów przeciwciało-lek (ADC), tj. immunokoniugatów, do miejscowego dostarczania środków cytotoksycznych lub cytostatycznych, tj. leków do zabijania lub hamowania komórek nowotworowych w leczeniu nowotworu (Lambert (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23:1137-1146; Payne (2003) Cancer Cell 3:207-21) teoretycznie umożliwia celowane dostarczanie cząstki leku do guzów, gdzie wiążą się one z celem i mogą być internalizowane powodując wewnątrzkomórkową akumulację w nich, gdzie ogólnoustrojowe podawanie tych nieskoniugowanych środków leczniczych może skutkować niedopuszczalnymi poziomami toksyczności dla normalnych komórek jak również dla komórek guza, które mają zostać wyeliminowane. Wysiłki mające na celu zaprojektowanie i udoskonalenie ADC skupiły się na selektywności przeciwciał monoklonalnych (mAb), a także na właściwościach wiązaniu leku i uwalniania leku (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549). Sposoby te obejmują koniugację przeciwciał z lekami, toksynami, radioizotopami, peptydami, innymi przeciwciałami itp. [0003] Konwencjonalne środki przyłączania, tj. łączenie przez wiązania kowalencyjne, ugrupowania leku do przeciwciała ogólnie prowadzą do heterogenicznej mieszaniny cząsteczek, w której reszty leku są przyłączone w wielu miejscach przeciwciała. Na przykład, leki cytotoksyczne zazwyczaj sprzęga się z przeciwciałami przez często liczne reszty lizyny przeciwciała, wytwarzając heterogenną mieszaninę koniugatu przeciwciało-lek. [0004] Reszty cysteiny wprowadzono do białek technikami inżynierii genetycznej, aby utworzyć wiązania kowalencyjne z ligandami lub utworzyć nowe wewnątrzcząsteczkowe wiązania dwusiarczkowe. Jednakże, zmodyfikowane grupy tiolowe cysteiny, przez mutację różnych reszt aminokwasowych białka do aminokwasów cysteiny, są potencjalnie problematyczne, szczególnie w przypadku niesparowanych (wolnych cystein) reszt lub tych, które są względnie dostępne dla reakcji lub utleniania. Na przykład tworzenie wewnątrzcząsteczkowych lub międzycząsteczkowych disiarczków może powodować agregację białek. Lokalizacja zmodyfikowanej cysteiny może wpływać na dostępność leków podczas koniugacji, co skutkuje niskimi wydajnościami. Wprowadzenie nowych cystein może uczynić przeciwciało nieaktywnym lub spowodować utratę swoistości wiązania do celu z powodu nieprawidłowego fałdowania lub utraty struktury trzeciorzędowej (Zhang et al (2002) Anal. Biochem. 311:1-9). Ponadto, skoniugowane związki mogą mieć słabą stabilność w surowicy, prowadząc do utraty aktywności i degradacji (np. przez degradację proteolityczną lub klirens przeciwciała lub przez hydrolizę ugrupowania leku). Tak więc celem ujawnienia -2-

jest zapewnienie ulepszonych strategii inżynieriiopartych na cysteinach zdolnych do wytwarzania związków koniugatów o zwiększonej stabilności, np. stabilności w surowicy. KRÓTKIE PODSUMOWANIE [0005]Wynalazek zdefiniowano w zastrzeżeniach. [0006] Wynalazek zapewnia zatem związek koniugatowy zawierający przeciwciało zmodyfikowane w oparciu o cysteinę lub białko fuzyjne Fc i co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie, przy czym: (i) domena Fc przeciwciała lub białka fuzyjnego Fc zawiera insercję aminokwasu cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasów jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata; i (ii) przy czym co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie jest skoniugowane z aminokwasem cysteiny wstawionym między pozycjami 239 a 240. [0007] Wynalazek zapewnia również wspomniany koniugat do zastosowania w terapii. [0008] Ujawnienie zapewnia sprzężone związki zawierające przeciwciało modyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc i co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie, przy czym (i) domena Fc przeciwciała lub białko fuzyjne Fc zawiera co najmniej jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy wybrany z cysteinowych substytucji aminokwasowych w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439, insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240 oraz ich kombinacji, przy czym numeracja pozycji aminokwasów jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA); i (ii) przy czym co najmniej jedno ugrupowanie heterologiczne jest skoniugowane z jedną ze zmodyfikowanych cystein. [0009] W niektórych aspektach skoniugowany związek zawiera 2 lub więcej zmodyfikowanych aminokwasów cysteiny. [0010] W niektórych aspektach związki koniugatowe mają wysoką stabilność w surowicy. [0011] W innym aspekcie ujawnienie zapewnia kwasy nukleinowe, wektory i komórki gospodarza do wytwarzania przeciwciał lub białek fuzyjnych Fc mających co najmniej jeden opisany tu zmodyfikowany aminokwas cysteiny. [0012] Inny aspekt ujawnienia zapewnia sposoby wytwarzania związków koniugatowych zawierających przeciwciało zmodyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc i co najmniej jedno ugrupowanie heterologiczne. W jednym przykładzie wykonania heterologiczne ugrupowanie jest lekiem, gdzie lek jest wybrany spośród środków cytotoksycznych, środków chemioterapeutycznych, peptydów, peptydomimetyków, szkieletu białkowego, enzymu, toksyny, radionuklidu, DNA, RNA, siRNA, mikroRNA, kwasu peptydonukleinowego, znacznika fluorescencyjnego lub biotyny. [0013] Inny aspekt ujawnienia zapewnia związki koniugatowe według ujawnienia, przy czym związki koniugatowe są zdolne do internalizacji, gdy są związane z receptorami powierzchni -3-

komórki. W takich aspektach związki koniugatowe według ujawnienia są użyteczne do wewnątrzkomórkowego dostarczania cząsteczek ładunku i/lub środków. [0014] Inny aspekt ujawnienia zapewnia sposoby leczenia, wykrywania i diagnozowania chorób nowotworowych, autoimmunologicznych, zapalnych lub zakaźnych za pomoc związków koniugatowych według ujawnienia. [0015] Inny aspekt ujawnienia zapewnia kompozycje zawierające związki koniugatowe według ujawnienia. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW/FIGUR [0016] FIG. 1A i 1B przedstawiają sekwencje aminokwasowe (odpowiednio SEQ ID NO 15- 18, w kolejności pojawiania się) i numerację odpowiednio regionów CH2 i CH3 łańcuchów ciężkich IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4) zgodnie z indeksem UE przedstawionym przez Kabata (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Reszty, które różnią się od IgG1 są zaciemnione, a miejsca o znanej zmienności allelicznej oznaczono gwiazdką (*). Zaciemnione ramki wskazują kilka miejsc substytucji/insercji cysteiny zidentyfikowanych w przykładzie 1, a strzałki wskazują miejsca substytucji/insercji cysteiny badane pod kątem stabilności w surowicy w zapewnionych tu przykładach. FIG. 2 przedstawia profile chromatografii wykluczania (SEC) odpowiadające związkowi koniugatowemu zawierającemu przeciwciało 1C1 ze zmodyfikowaną cysteiną w pozycji EU 258 (E258C) skoniugowane z Alexa Fluor 488 (AF488) z zastosowaniem chemii maleimidu. Związek koniugatowy był inkubowany z ludzką surowicą (NHS) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Panel A przedstawia inkubację z NHS w dniu 0, panel B przedstawia inkubację z PBS w dniu 0, panel C przedstawia inkubację z NHS po siedmiu dniach, a panel D przedstawia inkubację z PBS po siedmiu dniach. Sygnał przy 280 jest całkowitą zawartością białka w próbce, a sygnał w pozycji 494 jest białkiem skoniugownym z AF488. Tylko niewielka część AF488 została przeniesiona do HSA po siedmiu dniach inkubacji z surowicą. FIG. 3 przedstawia profile chromatografii wykluczania (SEC) odpowiadające związkowi koniugatowemu zawierającemu przeciwciało 1C1 ze zmodyfikowaną cysteiną w pozycji EU 435 (H435C) skoniugowane z Alexa Fluor 488 (AF488) z zastosowaniem chemii maleimidu. Związek koniugatowy był inkubowany z ludzką surowicą (NHS) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Panel A przedstawia inkubację z NHS w dniu 0, panel B przedstawia inkubację z PBS w dniu 0, panel C przedstawia inkubację z NHS po siedmiu dniach, a panel D przedstawia inkubację z PBS po siedmiu dniach. Tylko niewielka część AF488 została przeniesiona do HSA po siedmiu dniach inkubacji z surowicą. -4-

FIG. 4 przedstawia profile chromatografii wykluczania (SEC) odpowiadające związkowi koniugatowemu zawierającemu przeciwciało 1C1 ze zmodyfikowaną cysteiną w pozycji EU 443 (L443C) skoniugowane z Alexa Fluor 488 (AF488) z zastosowaniem chemii maleimidu. Związek koniugatowy był inkubowany z ludzką surowicą (NHS) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Panel A przedstawia inkubację z NHS w dniu 0, panel B przedstawia inkubację z PBS w dniu 0, panel C przedstawia inkubację z NHS po siedmiu dniach, a panel D przedstawia inkubację z PBS po siedmiu dniach. Tylko niewielka część AF488 została przeniesiona do HSA po siedmiu dniach inkubacji z surowicą. FIG. 5 przedstawia profile chromatografii wykluczania (SEC) odpowiadające związkowi koniugatowemu zawierającemu przeciwciało 1C1 ze zmodyfikowaną cysteiną w miejscu insercji w pozycjach EU 239 i 240 (C239ins) skoniugowane z Alexa Fluor 488 (AF488) z zastosowaniem chemii maleimidu. Związek koniugatowy był inkubowany z ludzką surowicą (NHS) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Panel A przedstawia inkubację z NHS w dniu 0, panel B przedstawia inkubację z PBS w dniu 0, panel C przedstawia inkubację z NHS po siedmiu dniach, a panel D przedstawia inkubację z PBS po siedmiu dniach. Tylko niewielka część AF488 została przeniesiona do HSA po siedmiu dniach inkubacji z surowicą. FIG. 6 przedstawia profile chromatografii wykluczania (SEC) odpowiadające związkowi koniugatowemu zawierającemu przeciwciało 1C1 ze zmodyfikowaną cysteiną w pozycji EU 239 (S239C) skoniugowane z Alexa Fluor 488 (AF488) z zastosowaniem chemii maleimidu. Związek koniugatowy był inkubowany z ludzką surowicą (NHS) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Panel A przedstawia inkubację z NHS w dniu 0, panel B przedstawia inkubację z PBS w dniu 0, panel C przedstawia inkubację z NHS po siedmiu dniach, a panel D przedstawia inkubację z PBS po siedmiu dniach. Tylko niewielka część AF488 została przeniesiona do HSA po siedmiu dniach inkubacji z surowicą. FIG. 7 przedstawia profile chromatografii wykluczania (SEC) odpowiadające związkowi koniugatowemu zawierającemu przeciwciało 1C1 ze zmodyfikowaną cysteiną w swoim łańcuchu lekkim (LC) w pozycji EU 205 (LC-V205C), wysoce stabilna mutacja, skoniugowane z Alexa Fluor 488 (AF488) z zastosowaniem chemii maleimidu. Związek koniugatowy był inkubowany z ludzką surowicą (NHS) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Panel A przedstawia inkubację z NHS w dniu 0, panel B przedstawia inkubację z PBS w dniu 0, panel C przedstawia inkubację z NHS po siedmiu dniach, a panel D przedstawia inkubację z PBS po siedmiu dniach. Tylko niewielka część AF488 została przeniesiona do HSA po siedmiu dniach inkubacji z surowicą. FIG. 8 przedstawia profile chromatografii wykluczania (SEC) odpowiadające związkowi koniugatowemu zawierającemu przeciwciało 1C1 ze zmodyfikowaną cysteiną w pozycji EU 289 (T289C), mutacja destabilizująca, skoniugowane z Alexa Fluor 488 (AF488) z zastosowaniem chemii maleimidu. Związek koniugatowy był -5-

inkubowany z ludzką surowicą (NHS) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Panel A przedstawia inkubację z NHS w dniu 0, panel B przedstawia inkubację z PBS w dniu 0, panel C przedstawia inkubację z NHS po siedmiu dniach, a panel D przedstawia inkubację z PBS po siedmiu dniach. Większość A488 została przeniesiona do HSA po siedmiu dniach inkubacji z surowicą. FIG. 9 przedstawia surowe dane (panel A) i dane znormalizowane w odniesieniu do dnia 0 (panel B) odpowiadające danym eksperymentalnym przedstawionym na FIG. 2 do 8. Nowe przeciwciała 1C1 zmodyfikowane cysteiną zawierające mutacje E258C, H435, L443 i C239 i skoniugowane z AF488 były stabilne po 7 dniach inkubacji z surowicą. Stabilność nowo wytworzonych związków była porównywalna z tą dla stabilnego miejsca kontrolnego 1C1-LC-V205C-AF488. Związek koniugatowy 1C1- T289C-AF488 był kontrolą porównawczą miejsca. FIG. 10 pokazuje, że mutacje EU E258C i C239s nie miały wpływu na wiązanie FcRn. FIG. 10A pokazuje, że gdy przeciwciała niosące wskazane mutacje we wskazanych pozycjach są unieruchomione na płytce ELISA, FcRn jest zdolny do wiązania się z podobnym poziomem w porównaniu z przeciwciałem niosącym WT IgG1 Fc. FIG. 10B pokazuje, że gdy przeciwciała niosące wskazane mutacje we wskazanych pozycjach, z lub bez koniugowania z AF488 z zastosowaniem chemii maleimidu, są unieruchomione na płytce ELISA, FcRn jest zdolny do wiązania się z podobnym poziomem w porównaniu z przeciwciałem niosącym WT IgG1 Fc. Pokazane są również tabele przedstawiające wartości LogEC50 dla każdej z krzywych. FIG. 11 przedstawia powinowactwo wiązania przeciwciała mającego region Fc typu dzikiego lub region Fc zmodyfikowany cysteiną do ludzkich receptorów Fc, FcyRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa (obydwa allele 158V i 158F) i FcRn. "N/A" oznacza, że wiązanie było zbyt słabe, aby uzyskać wiarygodne oszacowanie dla KD. Zapewniono wiązanie z FcRn przy pH 6. FIG. 12 przedstawia profile różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) mutacji typu dzikiego (WT), E258C, S239C, C239ins, H435C i Lc-V205C. Profile E258C, S239C i Lc-V205C są podobne do tego dla WT, podczas gdy nowy pik o niższej temperaturze topnienia występuje zarówno dla mutanta C239 jak i H435C. Pokazano również tabelę przedstawiającą wartości Tm1 uzyskane z termogramów DSC. FIG. 13A-C przedstawia cytotoksyczność koniugatów przeciwciało z pojedynczą mutacją Cys-lek (ADC) wywodzących się z przeciwciała 1C1 zawierającego lek cytotoksyczny na bazie aurystatyny na komórkach DU145. Wykreślono krzywe cytotoksyczności dla 1C1-S239C-ADC, 1C1-LC-V205C-ADC, 1C1-E258C-ADC, C1- H435C-ADC, 1C1-239ins-ADC, 1C1-T289C-ADC, 1C1-L443C-ADC, 1C1-ccADC (z zastosowaniem podejścia losowej koniugacji) i 1C1-WT-ADC (pozorna koniugacja) i kontroli negatywnych R347-S239C-ADC. Panel A pokazuje efekt w dniu 0. Panel B pokazuje efekt w dniu 3. Panel C pokazuje efekt w dniu 7. Pokazane są również tabele przedstawiające wartości EC50 dla każdej z krzywych. -6-

FIG. 14A-C przedstawia cytotoksyczność ADC wywodzących się z przeciwciała 1C1 zawierającego dwie zmodyfikowane cysteiny i lek cytotoksyczny na bazie aurystatyny na komórkach DU145. Wykreślono krzywe cytotoksyczności dla 1C1-239ins-E258C- ADC, C1-239ins-H435C-ADC, 1C1-239ins-S442C-ADC, 1C1-FF-E258C-S435C- ADC, 1C1-FF-E258C-S442C-ADC, 1C1-FF-H435C-S442C-ADC (uwaga - "FF" wskazuje, że ten konstrukt zawiera dodatkowe mutacje EU L234F/L235F mające na celu zniesienie funkcji efektorowej mediowanej Fc) i 1C1-T289C-ADC. Panel A pokazuje efekt w dniu 0. Panel B pokazuje efekt w dniu 3. Panel C pokazuje efekt w dniu 7. Pokazane są również tabele przedstawiające wartości EC50 dla każdej z krzywych. SZCZEGÓŁOWY OPIS [0017]Wynalazek zdefiniowano w zastrzeżeniach. [0018] Ujawnienie zapewnia związki koniugatowe zawierające przeciwciała modyfikowane cysteiną i białka fuzyjne Fc, przy czym jedna lub więcej reszt aminokwasowych została podstawiona reaktywnymi resztami cysteiny, a dokładniej, związki koniugatowe o zastosowaniach terapeutycznych lub diagnostycznych. Związki koniugatowe tu ujawnione zawierają przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjne Fc skoniugowane z, na przykład, lekami chemioterapeutycznymi, toksynami, radionuklidami i znacznikami do wykrywania, takimi jak radionuklidy lub fluorofory. Ujawnienie dotyczy również sposobów zastosowania ujawnionych związków koniugatowych do diagnozowania in vitro, in situ, ex vivo i in vivo lub leczenia komórek ssaczych lub powiązanych stanów patologicznych.. [0019] Aby ujawnienie było łatwiejsze do zrozumienia, najpierw zdefiniowano pewne terminy. Dodatkowe definicje przedstawiono w szczegółowym opisie. I. Definicje [0020] Przed szczegółowym opisaniem zapewnionych przykładów wykonania należy zrozumieć, że ujawnienie nie jest ograniczone do określonych kompozycji lub etapów sposobu i jako takie może się różnić. W znaczeniu tu stosowanym i w załączonych zastrzeżeniach, formy liczby pojedynczej obejmują odniesienia do liczby mnogiej, chyba że kontekst wyraźnie wskazuje inaczej. Terminy w liczbie pojedynczej jak również terminy "jeden lub więcej" i "co najmniej jeden" mogą być tu stosowane zamiennie. [0021] Ponadto "i/lub" tam, gdzie jest to stosowane, należy traktować jako konkretne ujawnienie każdej z dwóch określonych cech lub składników z lub bez drugiej. Zatem określenie "i/lub" zastosowane tu w zwrotach takich jak "A i/lub B" ma obejmować "A i B", "A lub B", "A" (samo) i "B" (samo). Podobnie, termin "i/lub" stosowany w wyrażeniu takim jak "A, B i/lub C" ma obejmować każdy z następujących aspektów: A, B i C; A, B lub C; A lub C; A lub B; B lub C; A i C; A i B; B i C; A (samo); B (samo); i C (samo). [0022] O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie stosowane tu terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie, jak powszechnie rozumiane przez znawcę dziedziny, do której należy to ujawnienie. Na przykładConcise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, -7-

Juo, Pei-Show, wyd. 2., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; i Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, zapewnia znawcy ogólny słownik wielu terminów zastosowanych w tym ujawnieniu. [0023]Jednostki, przedrostki i symbole są oznaczone w formie akceptowanej przez międzynarodowy system jednostek (SI). Zakresy liczbowe obejmują liczby definiujące zakres. O ile nie wskazano inaczej, sekwencje aminokwasowe zapisuje się od lewej do prawej w orientacji od aminowego do karboksylowego. Podane tu nagłówki nie są ograniczeniami różnych aspektów, które można uzyskać przez odniesienie do opisu jako całości. Zgodnie z tym określenia zdefiniowane zaraz poniżej są pełniej zdefiniowane przez odniesienie do opisu w całości. [0024] Zrozumiałe jest, że wszędzie tam, gdzie opisane są tu aspekty, z zastosowaniem słowa "zawierający", w innym przypadku zapewnione są analogiczne aspekty opisane terminami "składający się z" i/lub "składający się zasadniczo z". [0025] Aminokwasy są tu określane przez ich powszechnie znane trzyliterowe symbole lub jednoliterowe symbole zalecane przez komisję IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Podobnie nukleotydy są określane przez ich powszechnie akceptowane kody jednoliterowe. [0026] Terminy "przeciwciało" lub "immunoglobulina" stosowane tu zamiennie obejmują całe przeciwciała i dowolny fragment wiążący antygen lub jego pojedyncze łańcuchy. [0027] Typowe przeciwciało zawiera co najmniej dwa ciężkie (H) łańcuchy i dwa lekkie (L) łańcuchy połączone wzajemnie wiązaniami dwusiarczkowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (tutaj w skrócie jako VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech lub czterech domen stałych, CH1, CH2, CH3, CH4. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (tutaj w skrócie jako VL) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, CL. Regiony VH i VL można dalej podzielić na regiony o hiperzmienności, zwane regionami determinującymi komplementarność (CDR), które są przeplatane regionami, które są bardziej konserwatywne, określane jako regiony zrębowe (FW). Każdy VH i VL składa się z trzech CDR i czterech FW, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z antygenem. Stałe regiony przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobuliny z tkankami lub czynnikami gospodarza, w tym różnymi komórkami układu immunologicznego (np. komórkami efektorowymi) i pierwszym komponentem (C1q) klasycznego układu dopełniacza. Przykładowe przeciwciała zmodyfikowane cysteiną według ujawnienia obejmują typowe przeciwciała, białka fuzyjne i konstrukty zawierające przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, na przykład, konstrukt zawierający domenę Fc i scFv kowalencyjnie związany (na przykład poprzez wiązania peptydowe lub poprzez -8-

linkerchemiczny) do N-końca domeny CH2 lub C-końca domeny CH3 łańcucha ciężkiego typowego przeciwciała. [0028] Termin "przeciwciało" oznacza cząsteczkę immunoglobuliny, która rozpoznaje i swoiście wiąże się z celem, takim jak białko, polipeptyd, peptyd, węglowodan, polinukleotyd, lipid lub kombinacje powyższych, poprzez co najmniej jedno miejsce rozpoznawane przez antygen w regionie zmiennym cząsteczki immunoglobuliny. Stosowany tu termin "przeciwciało" obejmuje nienaruszone przeciwciała poliklonalne, nienaruszone przeciwciała monoklonalne, fragmenty przeciwciał (takie jak fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 i Fv), mutanty jednołańcuchowego Fv (scFv), przeciwciała wieloswoiste, takie jak biswoiste przeciwciała wytworzone z co najmniej dwóch nienaruszonych przeciwciał, przeciwciała chimeryczne, humanizowane przeciwciała, ludzkie przeciwciała, białka fuzyjne zawierające część przeciwciała określającą antygen i dowolną inną zmodyfikowaną cząsteczkę immunoglobuliny zawierającą miejsce rozpoznające antygen, o ile przeciwciała wykazują pożądana aktywność biologiczna. Przeciwciało może być dowolnej z pięciu głównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM lub ich podklasy (izotypy) (np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), w oparciu o tożsamość ich domen stałych stałych łańcucha ciężkiego określanych odpowiednio jako alfa, delta, epsilon, gamma i mu. Różne klasy immunoglobulin mają różne i dobrze znane struktury podjednostek i konfiguracje trójwymiarowe. Przeciwciała mogą być nagie lub skoniugowane z innymi cząsteczkami, takimi jak toksyny, radioizotopy itp., aby utworzyć koniugaty przeciwciało-lek (ADC). [0029] Terminy "fragment wiążący antygen" odnoszą się do części nienaruszonego przeciwciała i odnoszą się do regionów zmiennych determinujących antygenowość nienaruszonego przeciwciała. Wiadomo w tej dziedzinie, że czynność wiązania antygenu przeciwciała można przeprowadzić za pomocą fragmentów pełnej długości przeciwciała. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują, nieograniczająco, fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 i fragmenty Fv,przeciwciała liniowe, przeciwciała jednołańcuchowe oraz wieloswoiste przeciwciała utworzone z fragmentów przeciwciał. [0030] "Przeciwciało monoklonalne" dotyczy homogennej populacji przeciwciał zaangażowanej w wysoce swoiste rozpoznawanie i wiązanie pojedynczej determinanty antygenowej lub epitopu. W odróżnieniu od przeciwciał poliklonalnych, które zazwyczaj obejmują różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom antygenowym. [0031] Termin "przeciwciało monoklonalne" obejmuje zarówno nienaruszone jak i pełnej długości przeciwciała monoklonalne, jak również fragmenty przeciwciał (takie jak Fab, Fab', F(ab')2, Fv), mutanty jednołańcuchowe (scFv), białka fuzyjne zawierające częśćprzeciwciała i dowolne inne zmodyfikowane cząsteczki immunoglobuliny zawierająca miejsce rozpoznawania antygenu. Ponadto, "przeciwciało monoklonalne" odnosi się do takich przeciwciał wytworzonych na wiele sposobów, w tym, nieograniczająco, przez hybrydomę, selekcję fagową, ekspresję rekombinowaną i zwierzęta transgeniczne. [0032] Termin "humanizowane przeciwciało" odnosi się do przeciwciała pochodzącego z immunoglobuliny nie pochodzącej od człowieka (np. mysiej), która została zmodyfikowana -9-

tak, aby zawierała minimalną ilość sekwencji innych niż ludzkie (np. mysich). Zazwyczaj humanizowane przeciwciała są ludzkimi immunoglobulinami, w których reszty z regionu determinującego komplementarność (CDR) są zastąpione resztami z CDR gatunku innego niż człowiek (np. mysz, szczur, królik lub chomik), które mają pożądaną swoistość, powinowactwo i możliwości (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). W niektórych przypadkach reszty regionu zrębowego Fv (FW) ludzkiej immunoglobuliny są zastępowane odpowiednimi resztami z przeciwciała pochodzącego z gatunku innego niż człowiek, który ma pożądaną swoistość, powinowactwo i zdolności. [0033] Humanizowane przeciwciało można dalej modyfikować przez substytucję dodatkowych reszt w regionie zrębowym Fv i/lub w obrębie zastąpionych reszt innych niż ludzkie w celu udoskonalenia i zoptymalizowania swoistości, powinowactwa i/lub zdolności przeciwciała. Ogólnie, humanizowane przeciwciało będzie zawierało zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej, a zazwyczaj dwóch lub trzech domen zmiennych zawierających wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony CDR, które odpowiadają immunoglobulinie innej niż ludzka, podczas gdy wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony FR są ludzkie. Humanizowane przeciwciało mogą również zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), typowo ludzkiej immunoglobuliny. Przykłady sposobów stosowanych do generowania przeciwciał humanizowanych opisano w patent US nr 5,225,539; lub 5,639,641. [0034] "Region zmienny" przeciwciała odnosi się do regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała lub regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, zarówno pojedynczo jak i w kombinacji. Regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego składają się z czterech regionów zrębowych (FW) połączonych trzema regionami determinującymi komplementarność (CDR) znanymi również jako regiony hiperzmienne. CDR w każdym łańcuchu są utrzymywane razem w bliskim sąsiedztwie przez regiony FW i, z CDR z drugiego łańcucha, przyczyniają się do tworzenia miejsca wiążącego antygen przeciwciała. Istnieją co najmniej dwie techniki określania CDR: (1) podejście oparte na zmienności międzygatunkowej sekwencji (tj. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (wyd. 5., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); i (2) podejście oparte na badaniach krystalograficznych kompleksów antygen-przeciwciało (Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Ponadto kombinacje tych dwóch podejść są czasami stosowane w dziedzinie do określania CDR. [0035] System numeracji Kabata stosuje się ogólnie w odniesieniu do reszty w domenie zmiennej (w przybliżeniu reszty 1-107 łańcucha lekkiego i reszty 1-113 łańcucha ciężkiego) (np. Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, wyd. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). [0036] Numeracja pozycji aminokwasów jak w Kabacie, odnosi się do systemu numerowania stosowanego do domen zmiennych łańcucha ciężkiego lub domen zmiennych łańcucha lekkiego kompilacji przeciwciał z Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Stosując ten system numerowania rzeczywista liniowa sekwencja aminokwasowa może -10-

zawierać mniej lub dodatkowe aminokwasy odpowiadające skróceniu lub insercji w FW lub CDR domeny zmiennej. Na przykład domena zmienna łańcucha ciężkiego może zawierać insercję pojedynczego aminokwasu (reszta 52a według Kabata) po reszcie 52 H2 i wstawione reszty (np. reszty 82a, 82b i 82c itp. według Kabata) po reszcie 82 FW łańcucha ciężkiego. TABELA 1

Pętla Kabat AbM Chothia

L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56

L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34

(Numeracja Kabata)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32

(Numeracja Chothia)

H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56

H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102

[0037] Numeracja reszt według Kabata może być określona dla danego przeciwciała przez dopasowanie w regionach homologii sekwencji przeciwciała ze "standardowo" numerowaną sekwencją Kabata. Chothia odnosi się do lokalizacji pętli strukturalnych (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Koniec pętli CDR-H1 Chothia, gdy jest ponumerowany z zastosowaniem konwencji numeracji Kabata, zmienia się między H32 i H34 w zależności od długości pętli (dzieje się tak, ponieważ schemat numeracji Kabata umieszcza insercje w H35A i H35B, jeśli ani 35A ani 35B nie jest obecny, pętla kończy się na 32, jeśli tylko 35A jest obecne, pętla kończy się na 33, jeśli zarówno 35A jak i 35B są obecne, pętla kończy się na 34). Hiperzmienne regiony AbM reprezentują kompromis między CDR Kabata i pętlami strukturalnymi Chothia i są stosowane przez oprogramowanie do modelowania przeciwciał Oxford Molecular's AbM. [0038] IMGT (ImMunoGeneTics) zapewnia również system numerowania regionów zmiennych immunoglobulin, w tym regionów CDR. Patrz np. Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003). System numerowania IMGT opierał się na dopasowaniu ponad 5000 sekwencji, danych strukturalnych i charakteryzowaniu pętli hiperzmiennych i pozwala na łatwe porównanie regionów zmiennych i CDR dla wszystkich gatunków. Zgodnie ze schematem numerowania IMGT, VH-CDR1 znajduje się w pozycjach 26 do 35, VH-CDR2 znajduje się w pozycjach 51 do 57, VH-CDR3 znajduje się w pozycjach 93 do 102, VL-CDR1 -11-

znajduje się w pozycjach 27 do 32, VL-CDR2 znajduje się w pozycjach 50 do 52, a VL-CDR3 znajduje się w pozycjach 89 do 97. [0039] W stosowanym tutaj znaczeniu region Fc obejmuje polipeptydy zawierające region stały przeciwciała, z wyłączeniem pierwszego regionu stałego domeny immunoglobulinowej, i ich fragmenty. Tak więc Fc odnosi się do ostatnich dwóch regionów stałych domen immunoglobulin IgA, IgD i IgG oraz ostatnich trzech regionów stałych domen immunoglobulin IgE i IgM i opcjonalnie do elastycznego regionu zawiasowego N-końcowego wzgledem tych domen. Dla IgA i IgM, region Fc może zawierać łańcuch J. W przypadku IgG, Fc obejmuje domeny immunoglobulin Cgamma2 i Cgamma3 (Cγ2 i Cγ3) i opcjonalnie region zawiasowy między Cgammal (Cγ1) a Cgamma2 (Cγ2). Chociaż granice regionu Fc mogą się zmieniać, region Fc ludzkiego łańcucha ciężkiego IgG jest zwykle zdefiniowany tak, aby zawierał reszty C226 lub P230 na swoim końcu karboksylowym, przy czym numeracja jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Fc może odnosić się do tego regionu oddzielnie lub do tego regionu w kontekście przeciwciała, fragmentu przeciwciała lub białka fuzyjnego Fc. Zaobserwowano polimorfizmy w wielu różnych pozycjach Fc, w tym, nieograniczająco, w pozycjach 270, 272, 312, 315, 356 i 358, jak ponumerowano indeksem EU, a zatem mogą istnieć niewielkie różnice między prezentowaną sekwencją a sekwencjami ze stanu techniki. [0040] Stosowany tu termin "białko fuzyjne Fc" obejmuje białka (np. związki koniugatowe według ujawnienia) zawierające domeny Fc pełnej długości, jak również białka zawierające fragmenty domeny Fc (np. domenę CH2 pełnej długości, domenę CH3 pełnej długości, fragment CH2, fragment CH3 lub ich kombinacje). Białko fuzyjne Fc może również obejmować całość lub część regionu zawiasowego. [0041] Termin "ludzkie przeciwciało" oznacza przeciwciało wytwarzane przez człowieka lub przeciwciało mające sekwencję aminokwasową odpowiadającą przeciwciału wytwarzanemu przez człowieka wytworzonemu z zastosowaniem dowolnej techniki znanej w dziedzinie. Ta definicja ludzkiego przeciwciała obejmuje nienaruszone lub pełnej długości przeciwciała, ich fragmenty i/lub przeciwciała zawierające co najmniej jeden polipeptyd ludzkiego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, jak na przykład przeciwciało zawierające polipeptydy mysiego łańcucha lekkiego i ludzkiego łańcucha ciężkiego. [0042] Termin "przeciwciała chimeryczne" odnosi się do przeciwciał, w których sekwencja aminokwasowa cząsteczki immunoglobuliny pochodzi od dwóch lub więcej gatunków. Typowo region zmienny zarówno z łańcucha lekkiego i ciężkiego odpowiada regionu zmiennego przeciwciała pochodzące od jednego gatunku, u ssaków (np. Np., Myszy, szczura, królika, itd) o pożądanej specyficzności, powinowactwie i zdolności natomiast regiony stałe są homologiczne do sekwencji w przeciwciałach otrzymanych od innego (zazwyczaj człowieka), aby uniknąć wywołania odpowiedzi immunologicznej u tego gatunku. [0043] „Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał” czy „ADCC” odnosi się do formy cytotoksyczności, w której wydzielane Ig związane z receptorami Fc (FcR), obecnych -12-

na niektórych komórkach cytotoksycznych (np. komórki naturalni zabójcy (NK), neutrofile i makrofagi) umożliwia tym cytotoksycznym komórkom efektorowym specyficzne wiązanie do docelowej komórki zawierającej antygen, a następnie zabijają komórkę docelową cytotoksynami. Przeciwciała IgG skierowane na powierzchnię komórek docelowych "uzbrajają" komórki cytotoksyczne i są bezwzględnie wymagane do takiego zabijania. Liza komórki docelowej jest zewnątrzkomórkowa, wymaga bezpośredniego kontaktu między komórkami i nie obejmuje dopełniacza. Uważa się, że oprócz przeciwciał, inne białka zawierające regiony Fc, w szczególności białka fuzyjne Fc, zdolne do specyficznego wiązania się z docelową komórką zawierającą antygen będą zdolne do wywoływania cytotoksyczności komórkowej. Dla uproszczenia, cytotoksyczność komórkowa wynikająca z aktywności białka fuzyjnego Fc jest również określana tutaj jako aktywność ADCC. [0044] Polipeptyd, przeciwciało, polinukleotyd, wektor, komórka lub kompozycja, która jest "wyizolowana", jest polipeptydem, przeciwciałem, polinukleotydem, wektorem, komórką lub kompozycją, która nie występuje w naturze. Wyizolowane polipeptydy, przeciwciała, polinukleotydy, wektory, komórki lub kompozycje obejmują te, które zostały oczyszczone do tego stopnia, że nie występują już w postaci, w której występują w przyrodzie. W niektórych aspektach przeciwciało, polinukleotyd, wektor, komórka lub kompozycja, która jest wyizolowana, jest zasadniczo czysta. [0045] Określenie „osobnik” dotyczy dowolnego zwierzęcia (np. ssaka), w tym, nieograniczająco, ludzi, naczelnych nie będących człowiekiem, gryzoni i tym podobnych, który ma być odbiorcą konkretnego leczenia. Zazwyczaj określenia "osobnik" i "pacjent" mogą być używane zamiennie w odniesieniu do osobnika ludzkiego. [0046] Określenie „kompozycja farmaceutyczna” odnosi się do preparatu, który znajduje się w takiej postaci, aby umożliwić działanie biologiczne składnika aktywnego (np. związek koniugatowy opisano) był skuteczny, i które nie zawiera żadnych dodatkowych części, które są nie do przyjęcia toksyczne dla pacjenta, któremu podawana byłaby kompozycja. Taka kompozycja może zawierać jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek. Taka kompozycja może być sterylna. [0047] "Skuteczna ilość" skoniugowanego związku, jak tu ujawniono, jest ilością wystarczającą do spełnienia określonego celu. "Skuteczną ilość" można określić empirycznie i rutynowo w odniesieniu do określonego celu. [0048] Określenie "terapeutycznie skuteczna ilość" odnosi się do ujawnionej tu ilości koniugatu lub innego leku skutecznego do "leczenia" choroby lub zaburzenia u osobnika lub ssaka. [0049] Słowo "znacznik", w stosowanym tu znaczeniu, odnosi się do wykrywalnego związku lub kompozycji, które są sprzężone bezpośrednio lub pośrednio z ujawnionym tutaj cysteinowym lub jego fragmentem, tak aby wytworzyć "znakowany " koniugat związku. Znacznik może być wykrywalny sam z siebie (np. znaczniki radioizotopowe lub znaczniki fluorescencyjne) lub, w przypadku znacznika enzymatycznego, mogą katalizować chemiczną modyfikację związku lub kompozycji substratu, które są wykrywalne. -13-

[0050] Terminy takie jak "leczenie" lub "leczony" lub "leczyć" odnoszą się do obu (1) środków terapeutycznych, które leczą, spowalniają, łagodzą objawy i/lub zatrzymują postęp rozpoznawanego stanu chorobowego lub zaburzenia i (2) profilaktyczne. lub środki zapobiegawcze, które zapobiegają i/lub spowalniają rozwój docelowego patologicznego stanu lub zaburzenia. Tak więc, osoby wymagające leczenia obejmują osoby już z zaburzeniem; osoby skłonne do zaburzenia; i tym, którym należy zapobiegać. W pewnych aspektach osobnik jest z powodzeniem "leczony" z powodu choroby lub stanu, na przykład raka, zgodnie z metodami niniejszego ujawnienia, jeśli pacjent wykazuje, że: np. całkowitej, częściowej albo przejściowy remisji choroby lub stanu, na przykład, pewnego rodzaju nowotworów. [0051] Terminy "nowotwór", "guz", "nowotworowy" i "nowotwór złośliwy" odnoszą się do lub opisują stan fizjologiczny u ssaków, który typowo charakteryzuje się nieregulowanym wzrostem komórek. Przykłady raków obejmują, ale nie wyłącznie, raka, w tym gruczolakoraki, chłoniaki, blastomy, czerniaki, mięsaki i białaczki. Bardziej szczegółowe przykłady takich nowotworów obejmują raka płaskokomórkowego, drobnokomórkowego raka płuca, niedrobnokomórkowego raka płuc, raka żołądka i jelit, chłoniaka nieziarniczego i śluzu, raka trzustki, glejaka, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka wątroby takiego jako rak wątrobowy i wątrobiak, rak pęcherza, rak piersi (w tym hormonalny rak piersi, patrz e. g., Innes i in.(2006) Br. J. Cancer 94: 1057-1065), raka okrężnicy, raka jelita grubego, raka endometrium, szpiczaka (takiego jak szpiczak mnogi), raka gruczołu ślinowego, raka nerki, takiego jak rak nerkowokomórkowy i guzy Wilmsa, rak podstawnokomórkowy, czerniak, prostata raka, raka sromu, raka tarczycy, raka jąder, raka przełyku, różnych typów raka głowy i szyi oraz nowotworów pochodzenia śluzowego, takich jak, śluzowy rak jajnika, rak dróg żółciowych (wątroba) i rak brodawkowaty nerki. [0052] "Choroba autoimmunologiczna" jest chorobą lub zaburzeniem powstającym i skierowanym przeciwko własnym tkankom lub organom osobnika lub ich współdzieleniu lub manifestacji lub wynikającym z tego stanie. W wielu z tych zaburzeń autoimmunologicznych i zapalnych może istnieć wiele klinicznych i laboratoryjnych markerów, w tym, lecz nie wyłącznie, hipergammaglobulinemia, wysokie poziomy autoprzeciwciał, depozyty kompleksów antygen-przeciwciało w tkankach, korzyści z leczenia kortykosteroidami lub immunosupresyjnymi i limfoidalne agregaty komórkowe w dotkniętych tkankach. Nie ograniczając się do jakiejkolwiek teorii dotyczącej choroby autoimmunologicznej, w której pośredniczy komórka B, uważa się, że komórki B wykazują patogenny wpływ w ludzkich chorobach autoimmunologicznych poprzez wiele mechanistycznych szlaków, w tym wytwarzanie autoprzeciwciał, tworzenie kompleksów immunologicznych, aktywację dendrytów i komórek T, synteza cytokin, bezpośrednie uwalnianie chemokin i dostarczanie nidus dla ektopowej neogenezy. Każda z tych ścieżek może uczestniczyć w różnym stopniu w patologii chorób autoimmunologicznych.Choroba autoimmunologiczna może być chorobą specyficzną dla narządu (tj. Odpowiedź immunologiczna jest specyficznie skierowana przeciwko układowi narządów, takim jak układ hormonalny, układ krwiotwórczy, skóra, układ sercowo-płucny, układ żołądkowo-jelitowy i wątrobowy, układ nerkowy, tarczyca, uszy, układ nerwowo-mięśniowy, centralny układ nerwowy itp.) lub choroba ogólnoustrojowa, która może -14-

wpływać na układy wielu narządów (na przykład toczeń rumieniowaty układowy (SLE), reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie wielomięśniowe itp.). [0053] "Polinukleotyd" lub "kwas nukleinowy", jak tu stosowane zamiennie, odnoszą się do polimerów nukleotydów o dowolnej długości i obejmują DNA i RNA. Nukleotydy mogą być dezoksyrybonukleotydami, rybonukleotydami, zmodyfikowanymi nukleotydami lub zasadami i/lub ich analogami lub dowolnym substratem, który można wprowadzić do polimeru przez polimerazę DNA lub RNA. Polinukleotyd może zawierać zmodyfikowane nukleotydy, takie jak metylowane nukleotydy i ich analogi. Powyższy opis dotyczy wszystkich polinukleotydów, o których tu mowa, w tym RNA i DNA. [0054] Określenie "wektor" oznacza konstrukt, który jest zdolny do dostarczania, iw niektórych aspektach, ekspresji jednego lub większej liczby genów lub sekwencji będących przedmiotem zainteresowania w komórce gospodarza. Przykłady wektorów obejmują, ale nie wyłącznie, wektory wirusowe, wektory ekspresji nagiego DNA lub RNA, wektory plazmidowe, kosmidowe lub fagowe, wektory ekspresyjne DNA lub RNA związane z kationowymi czynnikami kondensującymi, wektory ekspresyjne DNA lub RNA zamknięte w liposomach i pewne. komórki eukariotyczne, takie jak komórki producenta. [0055] Terminy "polipeptyd", "peptyd" i "białko" są tu stosowane zamiennie w odniesieniu do polimerów aminokwasów o dowolnej długości. Polimer może być liniowy lub rozgałęziony, może zawierać modyfikowane aminokwasy i może być przerywany przez aminokwasy. Terminy obejmują również polimer aminokwasowy, który został zmodyfikowany naturalnie lub przez interwencję; na przykład tworzenie wiązań dwusiarczkowych, glikozylację, lipidację, acetylację, fosforylację lub dowolną inną manipulację lub modyfikację, taką jak koniugacja ze składnikiem znacznikowym. Definicja obejmuje również, na przykład, polipeptydy zawierające jeden lub więcej analogów aminokwasów (w tym na przykład nienaturalne aminokwasy itp.), Jak również inne modyfikacje znane w tej dziedzinie. Jest zrozumiałe, że ponieważ polipeptydy według niniejszego ujawnienia są oparte na przeciwciałach, w pewnych aspektach polipeptydy mogą występować jako pojedyncze łańcuchy lub powiązane łańcuchy. [0056] "Rekombinowany" polipeptyd lub białko odnosi się do polipeptydu lub białka wytwarzanego za pomocą technologii rekombinacji DNA. Wytworzone rekombinacyjnie polipeptydy i napowietrzne hodowane komosy rekombinacyjne są pobierane z przeznaczeniem do wytłaczania, w celu ich ujawnienia, pobrania lub przetworzenia. Polipeptydy tu ujawnione można wytwarzać rekombinacyjnie, stosując sposoby znane w tej dziedzinie. Alternatywnie, białka i peptydy ujawnione w opisie można syntetyzować chemicznie. [0057] Określenie "podstawienie aminokwasowe" odnosi się do zastąpienia reszty aminokwasowej obecnej w sekwencji macierzystej inną resztą aminokwasową. Aminokwas może być podstawiony w sekwencji macierzystej, na przykład, za pomocą chemicznej syntezy peptydów lub metodami rekombinacji znanymi w dziedzinie. Odpowiednio, odniesienia do "podstawienia w pozycji X" lub "podstawienia w pozycji X" odnoszą się do podstawienia aminokwasu obecnego w pozycji X alternatywną resztą aminokwasową. Wzorce substytucji mogą być opisane zgodnie ze schematem AXY, w którym A jest kodem jednoliterowym -15-

odpowiadającym aminokwasowi występującemu naturalnie w pozycji X, a A jest podstawieniem reszty aminokwasowej. Odpowiednio, L234F będzie odnosić się do podstawienia aminokwasu leucyny (L) w pozycji 234 fenyloalaniną (F). [0058] Określenie "wstawienie aminokwasu" odnosi się do wprowadzenia nowej reszty aminokwasowej pomiędzy dwiema resztami aminokwasowymi obecnymi w sekwencji macierzystej. Aminokwas można wstawić do sekwencji macierzystej, na przykład, za pomocą chemicznej syntezy peptydów lub metodami rekombinacji znanymi w dziedzinie. Odpowiednio w niniejszym opisie wyrażenie "wstawienie między pozycjami X i Y", w którym X i Y odpowiadają pozycjom aminokwasowym (np. Wstawienie aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 i 240), dotyczy wstawienia aminokwasu Pozycje X i Y, a także insercja w sekwencji kwasu nukleinowego kodonu kodującego aminokwas pomiędzy kodonami kodującymi aminokwasy w pozycjach X i Y. Schematy insercji można opisać zgodnie ze schematem AX-ins, gdzie A jest jednoliterowym kodem odpowiadającym wprowadzonemu aminokwasowi, a X jest położeniem poprzedzającymwstawienie. Odpowiednio, C239iny będą odnosić się do insercji aminokwasu cysteiny (C) po pozycji 239 (tj. Insercji między pozycją 239 i 240). Do C239in można również odnosić się do tego skrótu "239ins". [0059] Terminy "zmodyfikowana cysteina" lub "skonstruowane cysteiną w pozycji.. ." lub ich warianty gramatyczne dotyczą aminokwasu cysteiny (C), który został zmodyfikowany do przeciwciała lub części przeciwciała (np. Fc domena lub jej fragment) i ma tiolową grupę funkcyjną (-SH). II. Związki koniugatowe zawierające zmodyfikowane cysteiny [0060] Ujawnienie zapewnia sprzężone związki zawierające przeciwciało modyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc i co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie, przy czym (i) domena Fc przeciwciała lub białko fuzyjne Fc zawiera co najmniej jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy wybrany z cysteinowych substytucji aminokwasowych w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439, insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240 oraz ich kombinacji, przy czym numeracja pozycji aminokwasów jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA); i (ii) przy czym co najmniej jedno ugrupowanie heterologiczne jest skoniugowane z jedną ze zmodyfikowanych cystein. [0061] W niektórych aspektach zmodyfikowany aminokwas cysteiny jest wybrany z cysteinowych substytucji aminokwasowych w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435, insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240 oraz ich kombinacji. [0062] W innych aspektach zmodyfikowany aminokwas cysteinowy jest wybrany spośród cysteinowych substytucji aminokwasowych w pozycjach aminokwasów 258 lub 435, insercji aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240 oraz ich kombinacji. -16-

[0063] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w jednej lub więcej pozycji tu ujawnionych (np. pozycje 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274; 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240) i opcjonalnie zawierają dodatkowe zmodyfikowane cysteiny w dodatkowych pozycjach odpowiednich do modyfikacji cysteinowych opisanych w dziedzinie, w tym, nieograniczająco, pozycje 239, 248 254, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 440, 441, 442, 443 i 446. [0064] Miejsca odpowiednie do ujawnionej tu modyfikacji cysteinowej zidentyfikowano na przykładowym przeciwciele 1C1. Te pozycje są zlokalizowane w domenach CH2 i CH3 przeciwciała, które są domenami dobrze zachowanymi we wszystkich rodzajach przeciwciał. Miejsca te powinny być szeroko stosowane do innych przeciwciał, bez dalszej potrzeby projektowania strukturalnego lub znajomości swoistych struktur przeciwciał i bez zakłócania właściwości wiązania antygenu właściwych dla domen zmiennych przeciwciała. [0065] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 243 i drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 251 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 253, 258, 264, 269, 271, 272 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 253 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 258, 264, 269, 271, 272 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0066] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 258 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 264, 269, 271, 272 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w -17-

pozycji aminokwasowej 264 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 269, 271, 272 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0067] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 269 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 272 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0068] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 271 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 272 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 272 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0069] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 274 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 280 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0070] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 281 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0071] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 285 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, -18-

402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 288 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 291 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0072] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 293 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 294 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0073] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 296 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 301 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0074] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 307 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 309 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy -19-

w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0075] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 311 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 318 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0076] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 329 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 340 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0077] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 341 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 345 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0078] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 357 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 385, 386, 387, 401, -20-

402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 385 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 386, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0079] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 386 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 387, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 387 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 401, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0080] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 401 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 402, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 402 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 411 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0081] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 411 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 417, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 417 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 433, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. -21-

[0082] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 433 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 435 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 435 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433 lub 439 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. [0083] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 439 i (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433 lub 435 lub insercję aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 a 240. W niektórych przykładach wykonania związek koniugatu zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy wstawiony między pozycjami 239 a 240 oraz (ii) drugi zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439. [0084] W niektórych aspektach związek koniugatowy zawiera co najmniej zmodyfikowaną cysteinę w domenie CH2 i/lub CH3 domeny Fc. W niektórych aspektach związek koniugatowy zawiera (i) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH2, lub (ii) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH3, lub (iii) więcej niż jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH2, lub (iv) więcej niż jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH3, lub (v) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH2 i zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH3, lub (vi) zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH2 i więcej niż jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH3, lub (vii) więcej niż jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH2 i zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH3, lub (viii) więcej niż jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH2 i więcej niż jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH3, przy czym zmodyfikowane aminokwasy cysteinowe są wybrane spośród: -22-

(I) substytucje aminokwasowe cysteiny w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439, insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240; lub (ii) substytucje aminokwasowe cysteiny w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435, insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240; lub (iii) substytucje aminokwasowe w pozycjach aminokwasowych 258 lub 435 lub insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240. [0085] W niektórych aspektach taki więcej niż jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy to dwa, trzy, cztery lub pięć zmodyfikowanych aminokwasów cysteinowych. W niektórych aspektach zmodyfikowane aminokwasy cysteinowe w domenie CH2 znajdują się w pozycjach 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340 lub są wstawione między pozycje 239 a 240. W niektórych aspektach zmodyfikowane aminokwasy cysteinowe w domenie CH2 znajdują się w pozycjach 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329 lub są wstawione między pozycje 239 a 240. W niektórych aspektach zmodyfikowane aminokwasy cysteinowe w domenie CH2 znajdują się w pozycjach 258 lub są wstawione między pozycje 239 a 240. W niektórych aspektach zmodyfikowane aminokwasy cysteinowe w domenie CH3 znajdują się w pozycjach 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439. W niektórych aspektach zmodyfikowane aminokwasy cysteinowe w domenie CH3 znajdują się w pozycjach 385, 387, 433 lub 435. W niektórych aspektach zmodyfikowany aminokwas cysteinowy w domenie CH3 znajduje się w pozycji 435. [0086] W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawiera substytucję aminokwasową cysteiny wybraną z grupy składającej się z F241C, F243C, L251C, I253C, S254C, E258C, V264C, P271C, E272C, K274C, Q274C, D280C, G281C, H285C, K288C, P291C, E293C, E294C, Y296C, F296C, R301C, T307C, L309C, V309C, Q311C, E318C, P329C, K340C, G341C, E345C, E357C, G385C, Q386C, P387C, D401C, G402C, T411C, W417C, H433C, H435C R435C, K439C, insercji aminokwasowej cysteiny między S239 a V240 i ich kombinacji. [0087] W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawiera substytucję aminokwasową cysteiny wybraną z grupy składającej się z F241C, F243C, L251C, I253C, E258C, V264C, P271C, H285C, K288C, P291C, Y296C, F296C, R301C, T307C, L309C, V309C, Q311C, P329C, G385C, P387C, H433C, H435C, insercji aminokwasowej cysteiny między S239 a V240 i ich kombinacji. [0088] W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawiera domenę Fc zawierającą co najmniej jedną zmodyfikowaną cysteinę w domenie CH2 wybranej z substytucji aminokwasowych F241C, F243C, L251C, I253C, S254C, E258C, V264C, P271C, E272C, K274C, Q274C, D280C, G281C, H285C, K288C, P291C, E293C, E294C, Y296C, R301C, -23-

T307C, L309C, V309C, Q311C, E318C, P329C, K340C, insercji aminokwasowej cysteiny między S239 a V240 i ich kombinacji. [0089] W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawiera domenę Fc zawierającą co najmniej jedną zmodyfikowaną cysteinę w domenie CH3 wybranej z substytucji aminokwasowych G341C, E345C, E357C, G385C, Q386C, P387C, D401C, G402C, T411C, W417C, H433C, H435C, R435C, K439C i ich kombinacji. [0090] W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawiera domenę Fc zawierającą co najmniej jedną zmodyfikowaną cysteinę w domenie CH2 wybranej z substytucji aminokwasowych F241C, F243C, L251C, I253C, E258C, V264C, P271C, H285C, K288C, P291C, Y296C, R301C, T307C, L309C, Q311C, P329CC, insercji aminokwasowej cysteiny między S239 a V240 i ich kombinacji. W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawiera domenę Fc zawierającą co najmniej jedną zmodyfikowaną cysteinę w domenie CH3 wybranej z substytucji aminokwasowych G385C, P387C, H433C, H435C i ich kombinacji. [0091] W konkretnych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają domenę Fc zawierającą: (a) cysteinę (C) wstawioną między serynę (S) zlokalizowaną w pozycji 239 a walinę (V) zlokalizowaną w pozycji 240; (b) cysteinę (C) podstawiającą kwas glutaminowy (E) zlokalizowany w pozycji 258; (C) cysteinę (C) podstawiającą histydynę (H) zlokalizowaną w pozycji 435; (b) cysteinę (C) podstawiającą argininę (R) zlokalizowaną w pozycji 435; lub (e) ich kombinację, Przy czym numeracja pozycji aminokwasowych jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. [0092] Znawca dziedziny zrozumie, że ze względu na istnienie wariantów allelicznych, różne aminokwasy w ujawnionych tu pozycjach UE można zastąpić cysteinami. Na przykład w niektórych aspektach cysteina (C) może zastąpić argininę (R) znajdującą się w pozycji 435 w macierzystym przeciwciele lub jego fragmencie, gdy takim macierzystym przeciwciałem jest IgG3. [0093] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają jedną zmodyfikowaną cysteinę wybraną z grupy składającej się z insercji w pozycji 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435 lub insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawierający jedną zmodyfikowaną cysteinę wybraną z grupy składającej się z insercji w pozycji 258, 435 lub insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. -24-

[0094] W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawierający dwie zmodyfikowane cysteiny wybrane z grupy składającej się z insercji w pozycji 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435 lub insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawierający dwie zmodyfikowane cysteiny wybrane z grupy składającej się z insercji w pozycji 258, 435 lub insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. [0095] W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawierający trzy zmodyfikowane cysteiny wybrane z grupy składającej się z insercji w pozycji 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435 lub insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawierający trzy zmodyfikowane cysteiny wybrane z grupy składającej się z insercji w pozycji 258, 435 lub insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. [0096] W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawierający cztery zmodyfikowane cysteiny wybrane z grupy składającej się z insercji w pozycji 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435 lub insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. W niektórych aspektach ujawniony tu związek koniugatowy zawierający cztery zmodyfikowane cysteiny wybrane z grupy składającej się z insercji w pozycji 258, 435 lub insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. [0097] W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera jedną zmodyfikowaną cysteinę w pozycji 258 i drugą zmodyfikowaną cysteinę w pozycji 435. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera jedną zmodyfikowaną cysteinę w pozycji 258 i drugą zmodyfikowaną cysteinę w pozycji 442. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera jedną zmodyfikowaną cysteinę w pozycji 435 i drugą zmodyfikowaną cysteinę w pozycji 442. W niektórych przykładach wykonania związek koniugatu zawiera jedną zmodyfikowaną cysteinę w pozycji 258 i drugą zmodyfikowaną cysteinę między pozycjami 239 a 240. W niektórych przykładach wykonania związek koniugatu zawiera jedną zmodyfikowaną cysteinę w pozycji 435 i drugą zmodyfikowaną cysteinę między pozycjami 239 a 240. W niektórych przykładach wykonania związek koniugatu zawiera jedną zmodyfikowaną cysteinę w pozycji 442 i drugą zmodyfikowaną cysteinę między pozycjami 239 a 240. W niektórych aspektach związek koniugatu zawiera trzy zmodyfikowane cysteiny w pozycjach 258, 435 i 442. W innych przykładach wykonania związek koniugatu zawiera dwie zmodyfikowane cysteiny w pozycjach 258, 435 i trzecią zmodyfikowaną cysteinę między pozycjami 239 a 240. W innych -25-

przykładach wykonania związek koniugatu zawiera dwie zmodyfikowane cysteiny w pozycjach 258 i 442 i trzecią zmodyfikowaną cysteinę między pozycjami 239 a 240. W innych przykładach wykonania związek koniugatu zawiera dwie zmodyfikowane cysteiny w pozycjach 435 i 442 i trzecią zmodyfikowaną cysteinę między pozycjami 239 a 240. W innych przykładach wykonania związek koniugatu zawiera trzy zmodyfikowane cysteiny w pozycjach 258, 435 i 442 i czwartą zmodyfikowaną cysteinę między pozycjami 239 a 240. [0098] W niektórych swoistych aspektach związek koniugatu zawiera przeciwciało modyfikowane cysteiną zawierające parę lub trzy zmodyfikowane cysteiny wybrane spośród: (i) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 258 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (ii) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 289 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (iii) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 339 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (iv) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 435 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (v) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 442 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (vi) pierwszą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 258 przeciwciała macierzystego i drugą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 289 przeciwciała macierzystego; (vii) pierwszą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 258 przeciwciała macierzystego i drugą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 339 przeciwciała macierzystego; (viii) pierwszą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 258 przeciwciała macierzystego i drugą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 435 przeciwciała macierzystego; (ix) pierwszą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 258 przeciwciała macierzystego i drugą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 442 przeciwciała macierzystego; (x) pierwszą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 435 przeciwciała macierzystego i drugą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 289 przeciwciała macierzystego; (xi) pierwszą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 435 przeciwciała macierzystego i drugą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 339 przeciwciała macierzystego; -26-

(xii) pierwszą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 435 przeciwciała macierzystego i drugą cysteinową substytucję aminokwasową w pozycji 442 przeciwciała macierzystego; (xiii) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 258 i 289 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (xiv) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 258 i 339 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (xv) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 258 i 435 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (xvi) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 258 i 442 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (xvii) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 289 i 339 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; (xviii) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 339 i 435 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; i (xix) cysteinowe substytucje aminokwasowe w pozycji 435 i 442 przeciwciała macierzystego i insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240 przeciwciała macierzystego; Przy czym numeracja pozycji aminokwasowych jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. [0099] Znawca dziedziny zrozumie, że w niektórych aspektach modyfikacja pojedynczej reszty cysteinowej w określonej pozycji często powoduje prezentację dwóch reszt cysteinowych w takiej pozycji w powstałym przeciwciele lub białku fuzyjnym Fc z powodu homodimerycznej natury cząsteczek zawierających region Fc. W niektórych aspektach regiony Fc koniugatu można różnicowo modyfikować za pomocą mutacji, aby: promować i/lub utrzymywać heterodimeryzację (np. mutacje chimeryczne, mutacje komplementarne, mutacje typu lock i dock, mutacje typu knobs into holes, mutacje z modyfikacją domeny typu wymiana nici (ang. strand-exchange) (SEED)) mutacje itp.); zmieniać okres półtrwania (np. zwiększać wiązanie FcRn). Odpowiednio, związek koniugatowy można modyfikować w celu utworzenia heterodimeru zawierającego na przykład jedną modyfikowaną cysteinę w jednym regionie Fc lub jego fragmencie w określonej ujawnionej tu pozycji (np. cysteina w pozycji 258) i jedną zmodyfikowaną cysteinę w drugim regionie lub fragmencie Fc w innej ujawnionej tu pozycji (np. zmodyfikowana cysteina w pozycji 435). To samo dotyczy aspektów, w których region Fc -27-

zawiera dwie, trzy lub cztery zmodyfikowane cysteiny w ujawnionych tu swoistych pozycjach. Podobnie, oba regiony Fc mogą zawierać różną liczbę zmodyfikowanych cystein w konkretnych ujawnionych tu pozycjach, na przykład, jeden region Fc może zawierać jedną, dwie, trzy lub cztery zmodyfikowane cysteiny, podczas gdy drugi region Fc może nie zawierać zmodyfikowanych cystein, lub jedną, dwie, trzy lub cztery zmodyfikowane cysteiny w ujawnionych tu swoistych pozycjach. [0100] Ujawnione tu zmodyfikowane cysteiny wprowadzają grupy tiolowe, które mogą być stosowane do derywatyzacji z różnymi heterologicznymi cząsteczkami (np. do generowania reagentów diagnostycznych, do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek, w celu dodania ugrupowań, które mogą poprawić biodostępność przeciwciała macierzystego, lub w celu dodania różnych ugrupowań wiążących antygen, aby wytworzyć na przykład przeciwciała biswoiste). W związku z tym, modyfikacja jednej lub więcej cystein w ujawnionych powyżej pozycjach UE może skutkować związkami z jedną lub więcej heterologicznych cząsteczek zajmujących wszystkie wprowadzone grupy tiolowe lub związki koniugatowe, w których jedna lub więcej grup tiolowych jest dostępna dla dodatkowych koniugacji. Tak więc, w niektórych aspektach związki koniugatowe zawierają co najmniej jeden, co najmniej dwa, co najmniej trzy, co najmniej cztery, co najmniej pięć, co najmniej sześć, co najmniej siedem, co najmniej osiem, co najmniej dziewięć, co najmniej dziesięć, co najmniej 11, co najmniej 12, co najmniej 13, co najmniej 14, co najmniej 15 lub co najmniej 16 grup tiolowych do koniugowania z heterologiczną cząsteczką. W niektórych aspektach związek koniugatowy zawiera więcej niż 16 grup tiolowych do koniugowania z heterologiczną cząsteczką. [0101] W niektórych aspektach 1, 2, 3 lub 4 aminokwasy cysteinowe są modyfikowane w pozycjach UE wskazanych na FIG. 1 i 2. W niektórych aspektach inne cysteiny można modyfikować w dodatkowych opisanych w dziedzinie pozycjach w UE odpowiednich dla zmodyfikowanej cysteiny. W niektórych aspektach inne aminokwasy można modyfikować w dodatkowych pozycjach UE ujawnionych w dziedzinie. Odpowiednio, w niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają ponadto co najmniej jedną zmodyfikowaną resztę cysteinową wybraną z substytucji aminokwasowych cysteiny w pozycjach aminokwasowych 239, 248, 254, 273, 279, 282, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 440, 441, 442, 443 i 446. [0102] Dowolna forma przeciwciała lub jego fragmentu zawierająca domenę CH2 i/lub CH3 może być zmodyfikowana, jak tu ujawniono, tj. może być zmutowana. Na przykład, macierzysty fragment przeciwciała Fc można zmodyfikować, aby utworzyć fragment Fc ze zmodyfikowaną cysteiną. Podobnie, macierzyste przeciwciało monoklonalne może być zmodyfikowane cysteiną, jak tu ujawniono. Ujawnione tu sposoby projektowania, selekcji i wytwarzania i sposoby znane w dziedzinie umożliwiają wytwarzanie przeciwciał ze zmodyfikowanymi cysteinami w ujawnionych tu pozycjach UE, a ponadto łączenie związków koniugatowych, takich jak związki koniugatowe przeciwciało-lek (ADC) z cząsteczkami leków w wyznaczonych, zaprojektowanych, selektywnych miejscach. Zmodyfikowane reszty -28-

cysteinowe umożliwiają swoistą koniugację heterologicznego ugrupowania, na przykład ugrupowania leku, poprzez grupę reaktywną względem tiolu, taką jak maleimid lub haloacetyl. [0103] Odpowiednio,ujawnienie zapewnia sposób wytwarzania związku koniugatowego obejmujący poddanie reakcji co najmniej jednej zmodyfikowanej grupy cysteinowej przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc z heterologicznym ugrupowaniem, przy czym domena Fc przeciwciała lub białko fuzyjne Fc zawiera co najmniej jeden zmodyfikowany aminokwas cysteinowy wybrany z cysteinowych substytucji aminokwasowych w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439, insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240 oraz ich kombinacji, przy czym numeracja pozycji aminokwasów jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. W niektórych aspektach zmodyfikowany aminokwas cysteiny jest wybrany z cysteinowych substytucji aminokwasowych w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435, insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240 oraz ich kombinacji. W innych aspektach zmodyfikowany aminokwas cysteinowy jest wybrany spośródsubstytucji aminokwasowych cysteiny w pozycjach aminokwasów 258 lub 435, insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami, 239 a 240 oraz ich kombinacji. [0104] W niektórych aspektach wydajność koniugacji, na zmodyfikowanej cysteinie w pozycji aminokwasowej wybranej spośród 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435, 439 i insercji aminokwasowej cysteiny między pozycjami 239 a 240, gdzie numeracja pozycji aminokwasowych jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata, wynosi co najmniej około 40%, co najmniej około 45%, co najmniej około 50%, co najmniej 55%, co najmniej około 60%, co najmniej około 65%, co najmniej około 70%, co najmniej około 75%, co najmniej około 80%, co najmniej około 85%, co najmniej 90%, co najmniej około 95% lub co najmniej około 100 w% uzyskanej podczas reakcji zmodyfikowanej grupy cysteinowej z porównywalnym przeciwciałem zmodyfikowanym cysteiną lub białkiem fuzyjnym Fc z heterologicznym ugrupowaniem mającym substytucję aminokwasową cysteiny w pozycji aminokwasowej 289, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem UE przedstawionym przez Kabata. [0105] W niektórych aspektach wydajność koniugacji wynosi co najmniej 50% uzyskanej podczas reakcji reakcji zmodyfikowanej grupy cysteinowej z porównywalnym przeciwciałem zmodyfikowanym cysteiną lub białkiem fuzyjnym Fc z heterologicznym ugrupowaniem mającym substytucję aminokwasową cysteiny w pozycji aminokwasowej 289, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem UE przedstawionym przez Kabata. W niektórych aspektach wydajność koniugacji wynosi co najmniej 80% uzyskanej podczas reakcji reakcji zmodyfikowanej grupy cysteinowej z porównywalnym przeciwciałem zmodyfikowanym cysteiną lub białkiem fuzyjnym Fc z heterologicznym ugrupowaniem mającym substytucję aminokwasową cysteiny w pozycji aminokwasowej 289, przy czym -29-

numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem UE przedstawionym przez Kabata. W innych aspektach wydajność koniugacji wynosi więcej niż 100% uzyskanej podczas reakcji reakcji zmodyfikowanej grupy cysteinowej z porównywalnym przeciwciałem zmodyfikowanym cysteiną lub białkiem fuzyjnym Fc z heterologicznym ugrupowaniem mającym substytucję aminokwasową cysteiny w pozycji aminokwasowej 289, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem UE przedstawionym przez Kabata. [0106] W pewnych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe można wytworzyć zgodnie z następującym ogólnym sposobem: (i) mutageneza, np. przez ukierunkowaną mutagenezę, co najmniej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej przeciwciało lub białko fuzyjne Fc z pomocą (a) zastąpienia co najmniej jednego kodonu w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439 kodonem kodującym aminokwas cysteinowych (C) lub wstawienia kodonu kodującego cysteinę (C) między kodony kodujące aminokwasy w pozycjach 239 i 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata; lub (b) zastąpienia co najmniej jednego kodonu w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435 kodonem kodującym aminokwas cysteinowych (C) lub wstawienia kodonu kodującego cysteinę (C) między kodony kodujące aminokwasy w pozycjach 239 i 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata; lub (c) zastąpienia co najmniej jednego kodonu w pozycji aminokwasowej 258 lub 435 kodonem kodującym aminokwas cysteinowych (C) lub wstawienia kodonu kodującego cysteinę (C) między kodony kodujące aminokwasy w pozycjach 239 i 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata; (ii) ekspresja przeciwciała ze zmodyfikowaną cysteiną lub białka fuzyjnego Fc; (iii) izolowanie przeciwciała ze zmodyfikowaną cysteiną lub białka fuzyjnego Fc; i (iv) poddanie reakcji co najmniej jednej zmodyfikowanej grupy cysteinowej przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc z heterologicznym ugrupowaniem. [0107] W pewnych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe można wytworzyć zgodnie z następującym ogólnym sposobem: (i) funkcjonalne łączące sekwencji kwasu nukleinowego kodującego region zmienny łańcucha ciężkiego lub heterologiczne białko z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą białko regionu Fc, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białko regionu Fc zawiera: -30-

(a) co najmniej kodon kodujący cysteinę w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439, lub wstawiony między kodony kodujące aminokwas w pozycjach 239 i 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata; lub (b) co najmniej kodon kodujący cysteinę w pozycji aminokwasowej 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435, lub wstawiony między kodony kodujące aminokwas w pozycjach między kodony kodujące aminokwasy w pozycjach 239 i 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata; lub (c) co najmniej kodon kodujący cysteinę w pozycji aminokwasowej 258 lub 435, lub wstawiony między kodony kodujące aminokwas w pozycjach między kodony kodujące aminokwasy w pozycjach 239 i 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata (ii) ekspresja przeciwciała ze zmodyfikowaną cysteiną lub białka fuzyjnego Fc; (iii) izolowanie przeciwciała ze zmodyfikowaną cysteiną lub białka fuzyjnego Fc; i (iv) poddanie reakcji co najmniej jednej zmodyfikowanej grupy cysteinowej przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc z heterologicznym ugrupowaniem. [0108] W niektórych aspektach około 25%, około 30%, około 35%, około 40%, około 45%, około 50%, około 55%, około 60%, około 65%, około 70%, około 75%, około 80% %, około 85% lub około 95% heterologicznego ugrupowania chemicznie skoniugowanego ze zmodyfikowaną cysteiną w pozycji aminokwasowej wybranej spośród 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 439 i insercja aminokwasowa cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasów jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata, jest nienaruszona po 3 dniach inkubacji z surowicą. W niektórych aspektach co najmniej 70% heterologicznego ugrupowania skoniugowanego chemicznie pozostaje nienaruszone po 3 dniach inkubacji z surowicą. W niektórych aspektach około 25%, około 30%, około 35%, około 40%, około 45%, około 50%, około 55%, około 60%, około 65%, około 70%, około 75%, około 80% %, około 85% lub około 95% heterologicznego ugrupowania skoniugowanego chemicznie pozostaje nienaruszone po 7 dniach inkubacji z surowicą. W innych aspektach co najmniej 70% heterologicznego ugrupowania skoniugowanego chemicznie pozostaje nienaruszone po 7 dniach inkubacji z surowicą. [0109] W niektórych aspektach około 25%, około 30%, około 35%, około 40%, około 45%, około 50%, około 55%, około 60%, około 65%, około 70%, około 75%, około 80% %, około 85% lub około 95% heterologicznego ugrupowania chemicznie skoniugowanego ze zmodyfikowaną cysteiną w pozycji aminokwasowej wybranej spośród 258, 435 i insercja aminokwasowa cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji -31-

aminokwasów jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata, jest nienaruszona po 3 dniach inkubacji z surowicą. W niektórych aspektach co najmniej 70% heterologicznego ugrupowania skoniugowanego chemicznie pozostaje nienaruszone po 3 dniach inkubacji z surowicą. W niektórych aspektach około 25%, około 30%, około 35%, około 40%, około 45%, około 50%, około 55%, około 60%, około 65%, około 70%, około 75%, około 80% %, około 85% lub około 95% heterologicznego ugrupowania skoniugowanego chemicznie pozostaje nienaruszone po 7 dniach inkubacji z surowicą. W innych aspektach co najmniej 70% heterologicznego ugrupowania skoniugowanego chemicznie pozostaje nienaruszone po 7 dniach inkubacji z surowicą. [0110] W niektórych aspektach związki koniugatowe zawierające heterologiczne ugrupowanie chemicznie skoniugowane ze modyfikowaną cysteiną w pozycji aminokwasowej wybranej spośród 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 439 i insercja aminokwasowa cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasów jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata, wykazują utratę aktywności mniejszą niż około 5%, około 10%, około 20%, około 25%, około 30%, około 35%, około 40%, około 45% lub około 50% w okresie 3 dni po inkubacji z surowicą. W niektórych aspektach związki koniugatowe wykazują utratę aktywności mniejszą niż około 5%, około 10%, około 20%, około 25%, około 30%, około 35%, około 40%, około 45% lub około 50% w okresie 7 dni, gdy są inkubowane z surowicą. W innych aspektach związki koniugatowe wykazują utratę aktywności mniejszą niż około 50% w okresie 7 dni, gdy są inkubowane z surowicą. [0111] W niektórych aspektach związki koniugatowe zawierające heterologiczne ugrupowanie chemicznie skoniugowane ze modyfikowaną cysteiną w pozycji aminokwasowej wybranej spośród 258, 435 i insercja aminokwasowa cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasów jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata, wykazują utratę aktywności mniejszą niż około 5%, około 10%, około 20%, około 25%, około 30%, około 35%, około 40%, około 45% lub około 50% w okresie 3 dni po inkubacji z surowicą. W niektórych aspektach związki koniugatowe wykazują utratę aktywności mniejszą niż około 5%, około 10%, około 20%, około 25%, około 30%, około 35%, około 40%, około 45% lub około 50% w okresie 7 dni, gdy są inkubowane z surowicą. W innych aspektach związki koniugatowe wykazują utratę aktywności mniejszą niż około 50% w okresie 7 dni, gdy są inkubowane z surowicą. [0112] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie chemicznie skoniugowane ze zmodyfikowaną cysteiną. W innych aspektach związek koniugatowy zawiera co najmniej dwa, co najmniej trzy, lub co najmniej 4 heterologiczne ugrupowania, przy czym co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie jest skoniugowane ze zmodyfikowaną cysteiną. W innych aspektach związek koniugatowy zawiera co najmniej dwa, co najmniej trzy, lub co najmniej 4 heterologiczne ugrupowania, przy czym każde z heterologicznych ugrupowań jest skoniugowane ze zmodyfikowaną cysteiną. W niektórych aspektach związek koniugatowy zawiera co najmniej 6, 8, 10, 12, 14, 16 lub więcej -32-

heterologicznych ugrupowań, przy czym co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie jest skoniugowane ze zmodyfikowaną cysteiną. W innych aspektach związek koniugatowy zawiera co najmniej 6, 8, 10, 12, 14, 16 lub więcej heterologicznych ugrupowań, przy czym każde z heterologicznych ugrupowań jest skoniugowane ze zmodyfikowaną cysteiną. W niektórych aspektach wszystkie heterologiczne ugrupowania są identyczne. W innych aspektach co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie różni się od reszty. [0113] W niektórych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc jest częścią przeciwciała monoklonalnego, przeciwciała biswoistego, przeciwciała wieloswoistego, przeciwciała chimerycznego, przeciwciała ludzkiego lub przeciwciała humanizowanego. [0114] W niektórych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc jest domeną Fc IgG lub jej fragmentem. W niektórych aspektach taka domena Fc IgG lub jej fragment jest ludzka. W niektórych aspektach IgG jest izotypem ludzkiej IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4 lub jej fragmentem. W niektórych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc nie zawiera CH2 pełnej długości. W innych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc nie zawiera domeny CH3 pełnej długości/domeny CH4 pełnej długości. W niektórych aspektach białko fuzyjne Fc zawiera polipeptyd, który mediuje wiązanie z celem. Na przykład białko fuzyjne Fc może zawierać domenę wiążącą antygen, wybraną z grupy składającej się z (a) scFv; (b) diaciała; (c) fragment Fd; (d) fragment Fv; (; (e) fragment F(ab')2 i (f) fragment F(ab). [0115] W niektórych aspektach przeciwciało zmodyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc może zawierać Fab, Fab', F(ab')2, Fd, jednołańcuchowy Fv lub scFv, połączony za pomocą dwusiarczku Fv, domenę V-NAR, IgNar, intraciało, IgGΔCH2, miniciało, F(ab')3, tetraciało, 2 triaciało, diaciało, przeciwciało jednodomenowe, DVD-Ig, mAb , (scFv)2 lub scFv-Fc. [0116] W niektórych aspektach białko fuzyjne Fc obejmuje rusztowanie białkowe (np. rusztowanie pochodzące z tenascyny lub fibronektyny) lub mimetyczne przeciwciało. W innych aspektach białko fuzyjne Fc zawiera polipeptyd wybrany z grupy składającej się z (a) liganda, (b) enzymu, (c) części receptora wiążącej ligand i (d) białka adhezyjnego. [0117] W innych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc jest zmutowaną domeną Fc. Liczne mutacje w domenie Fc zostały opisane w literaturze. Na przykład mutacje domeny Fc opisano w publikacjach PCT nr WO2012/064733, WO2013/093809, WO2008/070593, and WO1996/014339; publikacjach US nr US2007/0269369, US2007/0111260 i US2010/0297103; i patencie US nr 7855275. W niektórych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc zawiera co najmniej jedną niewystępującą naturalnie resztę aminokwasową wybraną z grupy składającej się z 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 2341, 234V, 234F 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 2351, 235V, 235F, 236E, 239A, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 2401, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y 241 E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T 255L, 256E, 256M, 2621, 262A, 262T, 262E, 2631, 263A, 263T, 263M, 264L, -33-

2641, 264W, 264T 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 2651, 265L, 265H, 265T 2661, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 2961, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H 2981, 298T, 298F, 2991, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 3051, 313F, 316D, 325Q, 325L, 3251, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 3281, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 3301, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 3311, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D,332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y i 443W, przy czym numeracja pozycji aminokwasowych jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. [0118] W niektórych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc ma zmniejszone wiązanie z receptorem Fc w celu zmniejszenia cytotoksyczności, np. poprzez ADCC. W niektórych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc ma zwiększone wiązanie z receptorem Fc w celu zwiększenia cytotoksyczności, np. poprzez ADCC. [0119] Pewne modyfikacje mogą zapewnić pożądane funkcje efektorowe lub okres półtrwania w surowicy. Gdy pożądane jest wyeliminowanie lub zredukowanie funkcji efektorowej, aby zminimalizować efekty uboczne lub komplikacje terapeutyczne, można zastosować pewne inne regiony Fc. Region Fc przeciwciał i białek fuzyjnych Fc można zmodyfikować w celu zwiększenia powinowactwa wiązania z FcRn, a zatem wydłużenia okresu półtrwania w surowicy. Odpowiednio, w niektórych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc ma zmniejszone wiązanie z receptorem Fc FcRn. [0120] W niektórych aspektach domena Fc przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc zawiera niewystępującą naturalnie resztę aminokwasową redukującą ADCC w jednej lub więcej pozycji wybranych z grupy składającej się z 234, 235, 236, 237, 238, 239 240, 241, 243, 244, 245,247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 i 443 numerowane zgodnie z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. Liczne swoiste mutacje zdolne do zmniejszenia aktywności ADCC przeciwciała są znane w dziedzinie i obejmują, na przykład 234F, 235E, 235F, 235Q (lub 235Y), 239A, 332Q, 331S i ich kombinacje. Patrz na przykład mutacje opisane w WO8807089, WO9958572, WO9951642, WO2012175751, WO2011149999, WO2011066 501, WO2000042072, WO2011120134. Przeciwciała o zmniejszonej funkcji efektorowej ADCC obejmują również te z substytucją jednej lub więcej reszt 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 regionu Fc (patent US nr 6,737,056). Takie mutanty Fc obejmują także mutanty Fc z substytucjami w dwóch lub więcej pozycjach aminokwasowych 265, 269, 270, 297 i 327, w tym mutant Fc z substytucjami reszt 265 i 297 do alaninę (patent US nr 7,332,581). Opcjonalnie można włączyć mutacje, które zmniejszają zarówno ADCC jak i CDC. (a) Heterologiczne ugrupowania -34-

[0121] Przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjne Fc ujawnione w opisie mogą być sprzężone z dowolnym heterologicznym ugrupowaniem, które może być kowalencyjnie przyłączone do przeciwciała skonstruowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc poprzez reaktywną grupę tiolową cysteiny. W przykładowym aspekcie, skoniugowany związek zawiera przeciwciało modyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc i heterologiczne ugrupowanie, przy czym heterologiczne ugrupowanie jest przyłączone do przeciwciała fuzyjnego cysteiny lub białka fuzyjnego Fc przez jedną lub więcej inżynierowanych cystein. W niektórych aspektach, jeden lub więcej linkerów jest wstawionych pomiędzy heterologiczne ugrupowanie i skonstruowane cysteiną przeciwciało lub białko fuzyjne Fc. Odpowiednio, skoniugowany związek według niniejszego ujawnienia można przedstawić wzorem CEP-(L-H)p, w którym CEP oznacza białko modyfikowane cysteiną (tj. przeciwciało lub białko fuzyjne Fc), L oznacza linker, H oznacza heterologiczne ugrupowanie, ip wynosi 1, 2, 3 lub 4. Liczba heterologicznych ugrupowań, które mogą być sprzężone poprzez grupę tiolową zmodyfikowanej cysteiny z wytworzonym cysteiną przeciwciałem lub białkiem fuzyjnym Fc, jest ograniczona przez liczbę wprowadzonych reszt cysteinowych. jak ujawniono w niniejszym dokumencie. Odpowiednio, poprzedni wzór odnosi się do związków koniugatów, w których przeciwciało skonstruowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc zawiera 1, 2, 3 lub 4 zmodyfikowane aminokwasy cysteinowe. [0122] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedno ugrupowanie heterologiczne skoniugowane z jedną ze skonstruowanych cystein, w których takie heterologiczne ugrupowanie jest toksyną, lekiem, radionuklidem, immunomodulatorem, cytokiną, limfokiną, chemokiną, czynnikiem wzrostu, czynnikiem martwicy nowotworu, hormonem. antagonista hormonu, enzym, oligonukleotyd, DNA, RNA, siRNA, RNAi, mikroRNA, peptydowy kwas nukleinowy, fotoaktywny środek terapeutyczny, czynnik antyangiogenny, czynnik proapoptotyczny, nienaturalny aminokwas, peptyd, lipid, węglowodan, cząsteczka rusztowania znacznik fluorescencyjny, peptyd wizualizacyjny, biotyna, przedłużacz pół-trwania w surowicy, znacznik wychwytu, czynnik chelatujący, stałe podłoże lub ich kombinacja. Skonstruowane tu cysteiny można sprzęgać z dowolnym heterologicznym ugrupowaniem, które może być kowalencyjnie przyłączone do reaktywnej grupy tiolowej cysteiny (Singh i wsp. (2002) Anal. Biochem. 304: 147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manuał, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.; Lundblad RL (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, wyd. CRC Press, Boca Raton, F la.). [0123] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie sprzężone z jedną z cystein modyfikowanych metodami inżynierii, w których takie heterologiczne ugrupowanie jest lekiem. W niektórych wykonaniach, lek jest iperyt azotowy, etylenoiminy pochodnej, sulfoniany alkilowe, nitrozomocznik, gemcytabina, triazen, analog kwasu foliowego, antracykliny, taksan, inhibitor COX-2, pirymidyny analog purynyanalogowy, antybiotyk, inhibitor enzymu, epipodofilotoksyna, platyna kompleks koordynacyjny, alkaloid Vinca, podstawiony mocznik, pochodna metylohydrazyny, supresant kory nadnerczy, antagonista hormonu, endostatyna, taksol,kamptotecyna, SN-38, doksorubicyna, analog doksorubicyny, antymetabolit, czynnik alkilujący, antymitotyczny, czynnik antyangiogenny, inhibitor kinazy tyrozynowej, inhibitor mTOR, inhibitor białka szoku -35-

cieplnego (HSP90), inhibitorproteosomu, inhibitor HDAC, czynnik proapoptotyczny, metotreksat, CPT-11 lub ich kombinacja, i gdzie sprzężenie odbywa się w jednej z cystein modyfikowanych metodami inżynierii. W szczególnych aspektach lekiem jest amifostyna, cisplatyna, dakarbazyna, daktynomycyna, mechloretamina, streptozocyna, cyklofosfamid, karmustyna, lomustyna, doksorubicyna lipowa, gemcytabina, daunorubicyna, daunorubicyna. lipo, prokarbazyna, mitomycyna, cytarabina, etopozyd, metotreksat, 5-fluorouracyl, winblastyna, winkrystyna, bleomycyna, paklitaksel, docetaksel, aldesleukina, asparaginaza, busulfan, karboplatyna, kladrybina, 10-hydroksy-7-etylo-kamptotecyna (SN38), gefitynib, dakarbazynę,floksurydynę, fludarabinę, hydroksymocznik, ifosfamid, idarubicynę, mesna, interferon alfa, interferon beta, irinotecan, mitoksantron, topotekan, leuprolid, megestrol, melfalan, merkaptopurynę, plikamycynę, mitotan, pegaspargazę,pentostatynę, pipobroman, plikamycynę, streptozocyna, tamoksifen, tenipozyd, testolakton, tioguanina, tiotepa, iperyt uracylowy, winorelbina, inhibitory aromatazy chlorambucylu i ich kombinacje. [0124] W niektórych aspektach lek jest aurystatyną (patenty US nr 5,635,483; 5780588), na przykład MMAE (monometylo-aurystatyna E) lub MMAF (monometylowa aurystatyna F). W innych aspektach lek jest dolastatyną lubdolastatyną peptydowy analog lub pochodna. Dolastatyny oraz aurystatyny wykazano zakłócają dynamikę mikrotubul, hydrolizę GTP oraz jądrowy i podział komórkowy (Woyke et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 45:3580- 3584 (2001)) i wykazują aktywność przeciwnowotworową (patent US nr 5,663,149). Dolastatyny czy aurystatyny ugrupowaniem leku może być przyłączona do związku przez sprzężoną z N (aminowy) lub koniec C (karboksylowy) peptydowegougrupowania leku (patrz np. W02002088172). [0125] W innych aspektach lek jest maitanzynoidem. W niektórych aspektach maitanzynoid to N 2'-deacetylo-N2'-(3-merkapto-1-oksopropylo)-maitazyna (DM1), N 2'-deacetylo-N2'-(4- merkapto-1-oksopentylo)-maitazyna (DM3) lub N 2'-deacetylo-N2'(4-metylo-4-merkapto-1- oksopentylo)-maitazyna (DM4). Maitanzynoidy są mitotycznymi inhibitorami, które działają przez hamowanie polimeryzacji tubuliny. Maytansine została po raz pierwszy wyizolowana z wschodnioafrykańskiego krzewu Maytenus serrata (patent US nr 3 896 111). Następnie stwierdzono, że niektóre drobnoustroje wytwarzają również maitanzynoidy, takie jak majtanzynol i estry C-3 majtanzynolu (patent US nr 4,151,042). Syntetyczny majtanzynol oraz jego pochodne i analogi ujawniono, na przykład, w patentach US nr 4 137 230; 4 248 870; 4,256,746; 4 260 608; 4,265,814; 4 294 757; 4,307,016; 4 308 268; 4 308 269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4 331 598; 4,361,650; 4,364,866; 4424219; 4 450 254; 4,362,663; i 4,371,533. [0126] Maitanzynoidowe reszty leku są atrakcyjnymi ugrupowaniami leku w koniugatach przeciwciało-lek, ponieważ są one: (i) względnie dostępne do otrzymywania w wyniku fermentacji lub modyfikacji chemicznej, derywatyzacji produktów fermentacji, (ii) nadające się do derywatyzacji z grupami funkcyjnymi odpowiednimi do sprzęgania przez disulfid. linkery do przeciwciał, (iii) stabilne w osoczu i (iv) skuteczne wobec różnych linii komórek nowotworowych. Koniugaty zawierające maitanzynoidy, sposoby ich wytwarzania i ich zastosowanie terapeutyczne ujawniono, na przykład w patentach US nr 5 208 -36-

020, 5,416,064 i patent europejski EP0425235B1; Liu i wsp., Proc. Natl. Natl. Acad. Sci.USA 93: 8618-8623 (1996) (opisane immunokoniugaty zawierające maytansinoid oznaczony jako DM1); i Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992). [0127] Związki koniugatowe maitanzynoidu można wytworzyć przez chemiczne połączenie przeciwciała z cząsteczką maitanzynoidu bez istotnego zmniejszenia aktywności biologicznej przeciwciała lub cząsteczki maitanzynoidu. Patrz na przykład patent US nr 5 208 020. Średnio 3-4 cząsteczki maitanzynoidu skoniugowane na cząsteczkę przeciwciała wykazało skuteczność w zwiększaniu cytotoksyczności komórek docelowych bez negatywnego wpływu na funkcję lub rozpuszczalność przeciwciała, chociaż oczekuje się, że nawet jedna cząsteczka toksyny/przeciwciała zwiększy cytotoksyczność w stosunku do zastosowania nagie przeciwciało. Maitanzynoidy są dobrze znane w dziedzinie i można je syntetyzować znanymi technikami lub izolować z naturalnych źródeł. Odpowiednie maitanzynoidy ujawniono, na przykład w patencie US nr 5 208 020. Przykładowe ugrupowania leku maitanzynoidu obejmują te mające zmodyfikowany pierścień aromatyczny, takie jak: C-19-dechloro (patent US nr 4 256 746) wytworzony przez redukcję ansamytocyny P2 przez wodorek litowo - glinowy); C-20- hydroksy (lub C-20-demetylo) +/- C-19-dechloro (patenty USA 4,361,650 i 4, 307, 016) (wytworzone przez demetylację z użyciem Streptomyces lub Actinomyces lub dechlorowanie z użyciem LAH); i C-20-demetoksy, C-20-acyloksy (-OCOR), +/- dechloro (patent US nr 4 294 757) (otrzymany przez acylowanie przy użyciu chlorków acylu). i te, które mają modyfikacje w innych pozycjach. Przykładowe ugrupowania leku maitanzynoidu obejmują również modyfikacje, takie jak: C-9-SH (patent US nr 4424219) (wytworzony w reakcji maytansinolu z H2S lub P2S5); C-14-alkoksymetyl (demetoksy/CH2OR) (patent US nr 4 331 598); C-14-hydroksymetyl lub acyloksymetyl (CH2OH lub CH2OAc) (patent US nr 4,450,254) (przygotowany z Nocardia); C-15-hydroksy/acyloksy (patent US nr 4,364,866) (wytworzony przez konwersję maytansinolu przez Streptomyces); C-15-metoksy (patenty US nr 4,313,946) i 4,315,929) (izolowany z Trewii nudlflora); C-18-N- demetyl (Patenty US nr 4,362,663 i 4,322,348) (wytworzony przez demetylację maytansinolu przez Streptomyces); i 4,5-deoksy (patent US nr 4,371,533) (wytworzony przez redukcję maytansinolu przez trichlorek tytanu/LAH). Wiele pozycji na temat związków maitanzyny jest użytecznych jako pozycja wiązania, w zależności od rodzaju połączenia. Na przykład, dla utworzenia wiązania estrowego, pozycja C-3 mająca grupę hydroksylową, pozycja C-14 zmodyfikowana hydroksymetylem, pozycja C-15 zmodyfikowana grupą hydroksylową i pozycja C-20 mająca grupę hydroksylową są wszystkie odpowiedni. [0128] W niektórych aspektach lekiem jest kalicheamycyna. Rodzina antybiotyków kalicheamicynowych charakteryzuje się zdolne do wytwarzania w dwuniciowym DNA w stężeniach sub-pikomolowych. W celu przygotowania koniugatów z rodziny kalicheamycyny patrz np. patenty US nr 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5770701, 5770710, 5,773,001, 5,877,296. Strukturalne analogi kalicheamicyny, które można stosować, obejmują, ale nie są ograniczone do, y 1I, a 2i a 3i, N-acetylo-y 1i, PSAG i θ 11 (Hinman et al, Cancer Research 53:. 3336-3342 (1993), Lode i wsp., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) i wyżej wymienione patenty USA na American Cyanamid). -37-

[0129] W niektórych aspektach lek to tubulizyna. Tubulizyny należą do klasy produktów naturalnych wyizolowanych z gatunków bakterii śluzowych (Sasse et al., J. Antibiot. 53:879- 885 (2000)). Jako środki oddziałujące na cytoszkielet, tubulidyny są truciznami mitotycznymi, które hamują polimeryzację tubuliny i prowadzą do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy (Steinmetz et al., Chem.Int. red. 43:4888-4892 (2004); Khalil et al., ChemBioChem. 7:678-683 (2006); Kaur et al., Biochem. J. 396: 235-242 (2006)). Tubulidyny są niezwykle silnymi cząsteczkami cytotoksycznymi, przekraczającymi hamowanie wzrostu komórek wszelkich klinicznie istotnych tradycyjnych chemioterapeutyków, e. np., epotilony, paklitaksel i winblastynę. Ponadto są one skuteczne w przypadku linii komórkowych opornych na wiele leków (Domling et al., Mol. Diversity 9:141-147 (2005)). Związki te wykazują testowane na panelu linii komórek nowotworowych z IC50 wysoką cytotoksyczność wartości w zakresie niskiego pikomola; w związku z tym są one interesujące jako leki przeciwnowotworowe. Patrz np. WO2012019123. Koniugaty tubuluzyny ujawniono np. w patencie US nr 7,776,814. [0130] W niektórych aspektach lek jest pirolobenzodiazepiną (PBD). PBD są stosunkowo małymi cząsteczkami, a niektóre z nich mają zdolność rozpoznawania i kowalencyjnego wiązania się ze specyficznymi sekwencjami w mniejszym rowku DNA, a zatem wykazują działanie antybiotykowe/przeciwnowotworowe. Szereg PBD i ich pochodnych jest znanych w dziedzinie, na przykład dimerów PBD (np. SJG-136 lub SG2000), nienasyconych C2 dimerów PBD, dimerówpirolobenzodiazepiny zawierających podstawienia C2 arylem (np. SG2285), dimeru PBD pro- lek aktywowany przez hydrolizę (np. SG2285) i polipirol- PBD (np. SG2274). PBD są także dostępne w WO 2000/012507, WO 2007/039752, WO 2005/110423, WO 2005/085251 i WO 2005/040170 i patent US nr 7612062. [0131] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedną heterologiczną cząsteczkę skoniugowaną z jedną z cystein modyfikowanych metodami inżynierii, w której takim heterologicznym ugrupowaniem jest toksyna. W niektórych aspektach, toksyny zawiera na przykład, abryna, brucyna, cykutoksyna, błonicy, toksyna jadu kiełbasianego, toksyna shiga, toksyna, endotoksyny, toksyny tężca, toksyny krztuśca, toksyny wąglika, toksyny cholery,falcarinol, alfa toksyny, geldanamycyna, geloninę, lotaustralin, rycyna, strychnina, tetrodotoksyna, saponina, rybonukleaza (RNaza), DNaza I, Staphylococcal enterotoksyna-A, białko przeciwwirusowe pokularyzowane, Pseudomonas egzotoksyna, Endotoksyna Pseudomonas lub ich kombinacja. W innych aspektach toksyna zawiera na przykład łańcuch modeccyny A, alfa- sarcynę, Aleurytów fordii, białka diantyny, białka Phytolaca americana białka (PAPI, PAPII i PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, Saponaria officinalis Inhibitor, mitożelinę, restryktocynę, fenomycynę, neomycynę, trichoteceny, lub ich kombinacji. Patrz na przykład WO1993/021232. [0132] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedną heterologiczną część sprzężoną z jedną z cystein modyfikowanych metodami inżynierii, w której takie heterologiczne ugrupowanie jest czynnikiem chelatującym. W niektórych aspektach środek chelatujący to na przykład DTPA, EC, DMSA, EDTA, Cy-EDTA, EDTMP, DTPA, CyDTPA, Cy2DTPA, BOPTA, DTPA-MA, DTPA-BA, DTPMP, DOTA, TRITA, TETA, DOTMA, DOTA-MA, HP-DO3A, pNB-DOTA, DOTP, DOTMP, DOTEP, DOTPP, -38-

DOTBzP, DOTPME, HEDP, DTTP, N3S triamidotiol, DADS, MAMA, DADT, N2S4 diaminotetratiol, N2P2 ditiol-bisfosfina, kwas 6-hydrazynokonikotynowy, oksym propylenoaminy, tetraamina, cyklam lub ich kombinacja. [0133] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie skoniugowane z jedną ze zmodyfikowanych cystein, przy czym takim heterologicznym ugrupowaniem jest radionuklid. W niektórych aspektach radionuklidem jest na przykład chrom (51Cr), kobalt (57Co), fluor (18F), gadolin (153Gd, 159Gd), german (68Ge), holmium (166Ho), ind (115In, 113In, 112In, 111In), jod (131I, 125I, 123I, 121I), lantan (140La), lutet (177Lu), mangan (54Mn), molibden (99Mo), pallad (103Pd), fosfor (32P), prazeodym (142Pr), promet (149Pm), ren (186Re, 188Re), rod (105Rh), ruten (97Ru), samar (153Sm), skand (47Sc), selen (75Se), stront (85Sr), siarka (35S), technet (99Tc), tal (201Tl), cyna (113Sn, 117Sn), tryt (3H), ksenon (133Xe), iterb (169Yb, 175Yb), itr (90Y), cynk (65Zn) lub ich kombinacją. W niektórych szczególnych aspektach radionuklid jest przyłączony do związku sprzężonego przez środek chelatujący. [0134] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie sprzężone z jedną z cystein modyfikowanych metodami inżynierii, przy czym takie heterologiczne ugrupowanie jest surowcem wydłużającym okres półtrwania w surowicy. W niektórych specyficznych aspektach, przedłużacz w fazie rozrodczej w surowicy obejmuje, na przykład, albuminę, polipeptyd wiążący albuminę, PAS, podjednostkę β peptydu C-końcowego (CTP) ludzkiej kosmówkowej gonadotropiny, glikol polietylenowy (PEG), hydroksyetyloskrobię (HES), XTEN, małe cząsteczki wiążące albuminę lub ich kombinację. [0135] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedną heterologiczną cząsteczkę skoniugowaną z jedną z cystein modyfikowanych metodami inżynierii, przy czym takie heterologiczne ugrupowanie jest znacznikiem wizualizacji. Etykiety do wizualizacji obejmują, bez ograniczeń, chromofor, fluorofor, białko fluorescencyjne, fosforyzujący barwnik, tandemowy barwnik, cząstkę, hapten, enzym, radioizotop lub ich kombinację. [0136] W niektórych aspektach etykieta wizualizacji jest peptydem wizualizacji. W niektórych aspektach peptyd wizualizacyjny umożliwia wizualizację lub lokalizację związku koniugatowego in vitro, in vivo, ex vivo lub dowolną ich kombinację. W niektórych aspektach, peptydem do wizualizacji jest peptyd akceptorowy biotyny, peptyd akceptorowy kwasu liponowego, białko fluorescencyjne, peptyd zawierający cysteinę do ligacji barwnika biarsenowego lub do sprzęgania metastabilnego technetu, peptyd do sprzęgania klatratów europu do energii rezonansu fluorescencji. oparte na przekazywaniu (FRET) testy zbliżeniowe lub dowolne ich kombinacje. W niektórych aspektach białkiem fluorescencyjnym jest zielone białko fluorescencyjne (GFP), czerwone białko fluorescencyjne (RFP), białko fluorescencyjne (YFP), wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP), wzmocnione białko fluorescencyjne (EYFP) lub dowolne ich połączenie. W niektórych aspektach białkiem fluorescencyjnym jest fikobiliproteina lub jej pochodna. Białka fluorescencyjne, w szczególności fikobiliproteiny, są przydatne do tworzenia znakowanych tandemowo barwników odczynniki do znakowania. Te barwniki tandemowe zawierają białko fluorescencyjne i fluorofor w celu uzyskania większego -39-

przesunięcia stów, gdzie widma emisji są dalej przesunięte od długości fali widm absorpcyjnych białka fluorescencyjnego. Może to być skuteczne w wykrywaniu małej ilości celu w próbce, w której emitowane światło fluorescencyjne jest maksymalnie zoptymalizowane, innymi słowy, małe lub żadne z emitowanego światła nie jest reabsorbowane przez białko fluorescencyjne. Aby to zadziałało, białko fluorescencyjne i fluorofor działają jako para przenosząca energię, w której białko fluorescencyjne emituje przy długości fali, którą absorbuje fluorofor, i następnie fluorofor emituje światło o długości fali większej od białek fluorescencyjnych, niż można by uzyskać tylko z białko fluorescencyjne. Funkcjonalną kombinacją mogą być fikobiliproteiny i fluorofory sulforodaminowe lub sulfonowane fluorofory cyjaninowe znane w tej dziedzinie. Fluorofor czasami działa jako donor energii, a białko fluorescencyjne jest akceptorem energii. [0137] W innych aspektach, biarsenowy barwnik to 4',5'-bis(1,3,2-ditiioarsolan-2- ylo)fluoresceina (FlAsH). W niektórych aspektach, biotyna peptydowy akceptor ułatwia sprzęganie awidyną - i reagenty na bazie streptawidyną. W niektórych aspektach, peptyd akceptorowy kwasu liponowego ułatwia koniugację sond reagujących z tiolem ze związanym kwasem liponowym lub bezpośrednią ligacją fluorescencyjnych analogów kwasu liponowego. [0138] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie skoniugowane z jedną z cystein modyfikowanych metodami inżynierii, przy czym takie heterologiczne ugrupowanie jest znacznikiem fluorescencyjnym. W niektórych wykonaniach, znacznik fluorescencyjny obejmuje barwnik typu fluoresceiny, rodaminę, barwnik typu, dansyl -rodzaj barwnik, barwnik lizamino typu a, barwnik cyjaninowy typu, barwnikfikoerytryna typu a, barwnikiem Texas Red typ lub dowolną ich kombinację. Fluorofory odpowiednie do koniugacji z przeciwciałami modyfikowanymi cysteiną lub białkami fuzyjnymi Fc ujawnionymi w niniejszym opisie obejmują, bez ograniczeń; piren (w tym dowolny z odpowiednich związków pochodnych), antracen, naftalen, akrydyna, stilben, indol lub benzindol, oksazol lub benzoksazol, tiazol lub benzotiazol, 4-amino-7-nitrobenzen-2 oksa-1,3-diazol (NBD), cyjaninę (w tym wszelkie odpowiednie związki), karbocyjaninę (w tym wszelkie odpowiednie związki), karbostyryl, porfirynę, salicylan, antranilan, azulen, perylen, pirydynę, chinolinowy, A borapolyazaindacene (włącznie z odpowiednich związków), A ksanten (włącznie z odpowiednich związków), oksazyny (włącznie z odpowiednich związków) lub benzoksazyna, A carbazine (włącznie z odpowiednich związków), A phenalenone, kumaryną (w tym odpowiednie ujawnione związki),benzofuran (w tym odpowiednie związki) i benzofenalenon (w tym wszelkie odpowiednie związki) i ich pochodne. W niniejszym opisie oksazyny obejmują rezorafiny (w tym wszelkie odpowiednie związki), aminooksazynony, diaminooksazynyi ich benzo-podstawione analogi lub dowolną ich kombinację. [0139] W niektórych aspektach, fluorofory skoniugowane z przeciwciałami modyfikowanymi cysteiną lub białkami fuzyjnymi Fc ujawnionymi w niniejszym dokumencie obejmują ksanten (rodan, rodaminę, fluoresceinę i jej pochodne)kumarynę, cyjaninę, piren, oksazynę, borapolazainodacen lub dowolną ich kombinację. W niektórych przykładach wykonania takimi fluoroforami są sulfonowane ksantyny, fluorowane ksantyny, sulfonowane kumaryny, fluorowane kumaryny, sulfonowane cyjany lub dowolne ich kombinacje. Objęte są również -40-

barwniki sprzedawane pod nazwami handlowymi i ogólnie znane jako ALEXA FLUOR®, DYLIGHT®, CY DYES®, BODIPY®, OREGON GREEN®, PACIFIC BLUE®, IRDYES®, FAM®, FITC® i ROX®. [0140] Wybór fluoroforu przyłączonego do przeciwciał modyfikowanych cysteiną lub ujawnionych tu białek fuzyjnych Fc będzie determinował właściwości absorpcji i emisji fluorescencji koniugatu. Fizyczne właściwości znacznika fluoroforu, które mogą być stosowane, obejmują, ale nie wyłącznie, charakterystykę spektralną (absorpcja, emisja i przesunięcie soku), intensywność fluorescencji, czas życia, polaryzację i szybkość fotowybielania lub ich kombinację. Wszystkie te właściwości fizyczne można wykorzystać do odróżnienia jednego fluoroforu od drugiego, a tym samym umożliwiają analizę multipleksową. W pewnych aspektach fluorofor ma maksimum absorpcji przy długości fali większej niż 480 nm. W niektórych aspektach fluorofor absorbuje przy lub w pobliżu 488 nm do 514 nm (szczególnie odpowiedni do wzbudzania przez moc wyjściową źródła wzbudzania laserem argon-jon) lub w pobliżu 546 nm (szczególnie odpowiedni do wzbudzenia lampą rtęciową). W niektórych aspektach. fluorofor może emitować w obszarze NIR (obszar bliskiej podczerwieni) do zastosowań w tkankach lub całych organizmach. Inne pożądane właściwości znacznika fluorescencyjnego mogą obejmować przepuszczalność komórki i niską toksyczność, na przykład, jeśli znakowanie przeciwciała ma być przeprowadzone w komórce lub organizmie (np. Żywym zwierzęciu). W niektórych specyficznych aspektach znacznikiem fluorescencyjnym jest Alexim Fluor 488 C5-maleimid. [0141] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie sprzężone z jedną z cystein modyfikowanych metodami inżynierii, przy czym takie heterologiczne ugrupowanie jest znacznikiem wychwytującym. W niektórych aspektach znacznikiem wychwytującym jest biotyna lub znacznik His6 (SEQ ID NO: 1). Biotyna jest przydatna, ponieważ może działać w układzie enzymatycznym, aby dalej amplifikować wykrywalny sygnał, i może również działać jako znacznik do zastosowania w chromatografii powinowactwa do celów izolacji. Do celów detekcji można zastosować koniugat enzymatyczny, który wykazuje powinowactwo do biotyny, taki jakawidyna - HPP. Następnie można dodać substrat peroksydazy, aby wytworzyć wykrywalny sygnał. Oprócz biotyny można stosować inne hapteny, w tym hormony, leki występujące naturalnie i syntetyczne, zanieczyszczenia, alergeny, cząsteczki efektorowe, czynniki wzrostu, chemokiny, cytokiny, limfokiny, aminokwasy, peptydy, półprodukty chemiczne, nukleotydy i tym podobne. [0142] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedną heterologiczną cząsteczkę skoniugowaną z jedną z cystein modyfikowanych metodami inżynierii, w której takim heterologicznym ugrupowaniem jest enzym. Enzymy są skutecznymi znacznikami, ponieważ można uzyskać amplifikację wykrywalnego sygnału, co powoduje zwiększoną czułość testu. Sam enzym często nie daje wykrywalnej odpowiedzi, ale działa w celu rozbicia substratu, gdy kontaktuje się z nim odpowiedni substrat, tak że skonwertowany substrat wytwarza sygnał fluorescencyjny, kolorymetryczny lub luminescencyjny. Enzymy wzmacniają wykrywalny sygnał, ponieważ jeden enzym na odczynniku doznakowania może -41-

spowodować przekształcenie wielu substratów w wykrywalny sygnał. Substrat enzymu dobiera się tak, aby uzyskać mierzalny produkt, np. Kolorymetryczny, fluorescencyjny lub chemiluminescencyjny. Takie substraty są szeroko stosowane w dziedzinie i są znane w tej dziedzinie. [0143] W niektórych przykładach wykonania, kombinacja kolorymetryczna lub fluorogenna substratu i enzymu wykorzystuje oksydoreduktazy, takie jak peroksydaza chrzanowa i substrat, taki jak 3,3'-diaminobenzydyna (DAB) i 3-amino-9-etylokarbazol (AEC), które dają odróżniający kolor (brązowy i czerwony, odpowiednio). Inne substraty oksydoreduktazy kolorymetrycznej, które dają wykrywalne produkty obejmują, ale nie wyłącznie: kwas 2,2- azyno-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy) (ABTS), o-fenylenodiaminę (OPD), 3,3',5,5'- tetrametylobenzydyna (TMB), o-dianizydyna, kwas 5-aminosalicylowy, 4-chloro-1-naftol. Fluorogenne substraty obejmują, ale nie wyłącznie, kwas homowanilinowy lub kwas 4- hydroksy-3-metoksyfenylooctowy, zredukowane fenoksazyny i zredukowane benzotiazyny, w tym odczynnik Amplex® Red i jego odmiany oraz zredukowane dihydroksanteny, w tym dihydrofluoresceiny i dihydroroaminy, w tymdihydrorodaminę 123. Substraty peroksydazy które są tyramidami stanowią unikalną klasę substratów peroksydazy, ponieważ mogą być wykrywane wewnętrznie przed działaniem enzymu, ale są "utrwalone na miejscu" przez działanie peroksydazy w procesie opisanym jako amplifikacja sygnału tyramku (TSA). Te substraty są szeroko wykorzystywane do znakowania celów w próbkach, które są komórkami, tkankami lub macierzami do ich późniejszego wykrywania za pomocą mikroskopii, cytometrii przepływowej, skanowania optycznego i fluorometrii. [0144] Kolorymetryczne (i w niektórych przypadkach fluorogenne) połączenie substratu i enzymu czasami wykorzystuje enzym fosfatazowy, taki jak kwaśna fosfataza, fosfataza alkaliczna lub rekombinowana wersja takiej fosfatazy w połączeniu z kolorymetrycznym substratem, takim jak 5-bromo-6-chloro. Fosforan 3-indolilu (BCIP), fosforan 6-chloro-3- indolilu, fosforan 5-bromo-6-chloro-3-indolilowy, fosforan p- nitrofenylu lub fosforan o- nitrofenylu lub fluorogennysubstrat taki jak 4- fosforan metyloumbeliferylu, fosforan 6,8- difluoro-7-hydroksy-4-metylokumaryny (DiFMUP, panetn US nr 5,830,912), difosforanu fluoresceiny, fosforanu 3-O- metylofluoresceiny, fosforanu rezoru, fosforanu 9H-(l,3-dichloro- 9,9-dimetyloakrydyn-2-on-7-ylu) (fosforanu DDAO) lub ELF97, ELF 39 lub pokrewne fosforany. [0145] Glikozydazy, w szczególności beta-galaktozydaza, beta- glukuronidaza i beta- glukozydaza, są dodatkowymi odpowiednimi enzymami. Odpowiednie substraty kolorymetryczne obejmują, między innymi, 5-bromo-4-chloro-3-indolilowy beta-D- galaktopiranozyd (X-gal) i podobny indolil. galaktozydy, glukozydy i glukuronidy, o- nitrofenylo beta-D- galaktopiranozyd (ONPG) i p- nitrofenylo beta-D- galaktopiranozyd. W niektórych przykładach wykonania substraty fluorogenneobejmują rezutafinę beta-D- galaktopiranozyd, digalaktozyd fluoresceiny (FDG), diglukuronid fluoresceiny i ich warianty strukturalne, 4-metyloumbeliferylo-beta-D- galaktopiranozyd, karboksyumbelliferylo -beta-D- galaktopiranozyd i fluorowane kumaryny beta-D- galaktopiranozydy. -42-

[0146] Dodatkowe enzymy obejmują, ale nie wyłącznie, hydrolazy, takie jak cholinoesterazy i peptydazy, oksydazy, takie jak oksydaza glukozowa i oksydazy cytochromowe, i reduktazy, dla których znane są odpowiednie substraty. [0147] Enzymy i ich odpowiednie substraty, które wytwarzają chemiluminescencję są użyteczne w niektórych testach. Obejmują one, między innymi, naturalne i rekombinowane postacie lucyferaz i ekworyny. Podłoża chemiluminescencjiprodukującego dla fosfatazy, glikozydaz i oksydazy, takie jak te, które zawierają stałe dioksetany, estry luminolu, isoluminol i akrydyniowym są dodatkowo wydajność. [0148] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe zawierają co najmniej jedną heterologiczną cząsteczkę skoniugowaną z jedną z cystein modyfikowanych metodami inżynierii, w której takim heterologicznym ugrupowaniem jest kwas nukleinowy. Kwas nukleinowy może być wybrany z grupy składającej się z DNA, RNA, krótkiego interferującego RNA (siRNA), mikroRNA, mimetyków typu spinki do włosów lub kwasów nukleinowych, takich jak peptydowe kwasy nukleinowe. W pewnych aspektach sprzężony kwas nukleinowy ma co najmniej 10, co najmniej 20, co najmniej 30, co najmniej 40, co najmniej 50, co najmniej 60 co najmniej 100, co najmniej 200, co najmniej 500, co najmniej 1000, co najmniej 5000 lub więcej par zasad. Skoniugowany kwas nukleinowy może być jednoniciowy. W różnych aspektach skoniugowany kwas nukleinowy może być dwuniciowy. W niektórych aspektach skoniugowany kwas nukleinowy koduje otwartą ramkę odczytu. W niektórych aspektach otwarta ramka odczytu kodowana przez skoniugowany kwas nukleinowy odpowiada białku wywołującemu apoptozę, wirusowemu białku, enzymowi lub białku supresorowemu guza. Techniki dostarczania takich kwasów nukleinowych do komórek są znane w tej dziedzinie. (b) Linkery [0149] W niektórych aspektach, heterologiczne ugrupowanie sprzęga się z jedną ze skonstruowanych cystein za pośrednictwem linkera. W stosowanym tu kontekście, termin "linker" odnosi się do sekwencji peptydu lub polipeptydu (np. Syntetycznego peptydu lub sekwencji polipeptydowej) lub niepeptydowego linkera, dla którego jego główną funkcją jest połączenie heterologicznego ugrupowania z przeciwciałem modyfikowanym cysteiną. lub białko fuzyjne Fc poprzez grupę tiolową zmodyfikowanej cysteiny. W niektórych aspektach linker może być obecny pomiędzy dowolnymi dwoma heterologicznymi ugrupowaniami lub nie-linkerowymi elementami sprzężonych związków według niniejszego ujawnienia. Na przykład, jeden lub więcej linkerów może być obecnych pomiędzy skonstruowanym cysteiną przeciwciałem lub białkiem fuzyjnym Fc a heterologicznym ugrupowaniem lub pomiędzy pierwszym heterologicznym ugrupowaniem i drugim heterologicznym ugrupowaniem. W niektórych aspektach dwa lub więcej linkerów można łączyć w tandemie. Gdy w koniugacie ujawniono tu wiele linkerów, każdy z linkerów może być taki sam lub różny. Ogólnie, linkery zapewniają elastyczność koniugatu. Linkery nie są zazwyczaj cięte, a zatem w niektórych aspektach linker jest nieusuwalnym linkeryem. Jednak w niektórych przykładach wykonania takie cięcie może być pożądane. Odpowiednio, w niektórych aspektach linker może zawierać jedno lub więcej miejsc rozszczepialnych proteazą, które mogą być zlokalizowane w obrębie sekwencji linkera lub otaczać linker na dowolnym końcu sekwencji łączącej. -43-

[0150] W niektórych aspektach, skoniugowany związek zawiera niepeptydowy linker. W innych aspektach, linker składa się z niepeptydowego linkera. W niektórych aspektach niepeptydowy linker obejmuje np. Maleimido caproyl (MC),val-cit, MC- val-cit, MC-val-cit- PABC, Mal-PEG2C2, Mal-PEG3C2 Mal-PEG6C2, maleimidopropanoil (MP), metoksyl glikol polietylenowy (MPEG), sukcynoimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (SMCC), MBS (m-maleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynoimidowe), 4- sukcyinimidyloksycarbonylo-alfa-metylo-alfa-(2-pirydyloditio)toluen (SMPT), sukcynoimidylo-6-[3-(2-pirydyloditio)-propionoamido]heksanian (LC-SPDP), BMPEO, SPP, sukcynoimidylo 4-(p-maleimidofenylo)maślan (SMPB), N-sukcynimidylo-S-acetylotiooctan (SATA), N-sukcynimidylo(4-jodoacetylo)aminobenzonian (SIAB) lub dowolna ich kombinacja. Patrz np. patent US nr 7 375 078. [0151] W niektórych aspektach związek koniugatowy zawiera linker peptydowy. W niektórych aspektach linker składa się z linkera peptydowego. W niektórych aspektach linker peptydowy zawiera co najmniej dwa aminokwasy, co najmniej trzy, co najmniej cztery, co najmniej pięć, co najmniej 10, co najmniej 20, co najmniej 30, co najmniej 40, co najmniej 50, co najmniej 60 co najmniej 70, co najmniej 80, co najmniej 90 lub co najmniej 100 aminokwasów. W innych aspektach linker peptydowy zawiera co najmniej 200, co najmniej 300, co najmniej 400, co najmniej 500, co najmniej 600, co najmniej 700, co najmniej 800, co najmniej 900 lub co najmniej 1000 aminokwasów. W jeszcze innych aspektach linker peptydowy może zawierać co najmniej około 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 lub 2000 aminokwasów. Linker peptydowy może zawierać 1-5 aminokwasów, 1-10 aminokwasów, 1-20 aminokwasów, 10-50 aminokwasów, 50-100 aminokwasów, 100-200 aminokwasów, 200-300 aminokwasów, 300-400 aminokwasy, 400-500 aminokwasów, 500-600 aminokwasów, 600-700 aminokwasów, 700-800 aminokwasów, 800-900 aminokwasów lub 900-1000 aminokwasów. [0152] Przykłady linkerów peptydowych są dobrze znane w dziedzinie, na przykład linkery peptydowe według wzoru [(Gly)x-Sery]z, gdzie x wynosi 1 do 4, y oznacza 0 lub 1, a z wynosi od 1 do 50 (SEQ ID NO: 2). W jednym aspekcie linker peptydowy zawiera sekwencję Gn, gdzie n może być liczbą całkowitą od 1 do 100 (SEQ ID NO 3). W konkretnym aspekcie sekwencja linkera peptydowego to GGGG (SEQ ID NO: 4). Linker peptydowy może zawierać sekwencję

(GA)n (SEQ ID NO: 5). Linker peptydowy może zawierać sekwencję (GGS)n (SEQ ID NO: 6). W innych aspektach linker peptydowy zawiera sekwencję (GGGS)n (SEQ ID NO: 7). W innych aspektach linker peptydowy zawiera sekwencję (GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO: 8). W tych przypadkach n może być liczbą całkowitą od 1-100. W innych przypadkach n może być liczbą całkowitą od 1-20, tj. 1, 2, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20. Przykłady linkerów obejmują, nieograniczająco, GGG, SGGSGGS (SEQ ID NO: 9), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 10), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 12) lub GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13). W innych aspektach linker jest sekwencją poli-G (GGGG)n, gdzie n może być liczbą całkowitą od 1-100 (SEQ ID NO: 14). -44-

[0153] W jednym aspekcie linker peptydowy jest syntetyczny, tj. nie występujące w naturze. W jednym z aspektów, linker peptydowy obejmuje peptydy (lub polipeptydy) (np. peptydami występującymi lub nie występującymi naturalnie), które zawierają sekwencję aminokwasową, która łączy lub genetycznie topi pierwszy liniowy sekwencję aminokwasową z drugą sekwencją liniowego aminokwasów, do których nie jest naturalnie połączona lub genetycznie zespolona w przyrodzie. Na przykład, w jednym aspekcie, peptyd linkerowy mogą stanowić niewystępujące naturalnie występujące polipeptydy, które są zmodyfikowane formy naturalnie występujących polipeptydów (np. zawierający mutację, takich jak dodawanie, substytucji lub delecji). W innym aspekcie linker peptydowy może zawierać niewystępujące naturalnie aminokwasy. W innym aspekcie linker peptydowy może zawierać naturalnie występujące aminokwasy występujące w liniowej sekwencji, która nie występuje w przyrodzie. W jeszcze innym aspekcie linker peptydowy może zawierać naturalnie występującą sekwencję polipeptydową. III. Inżynieria cysteinowa przeciwciał i białek fuzyjnych Fc [0154] W niektórych aspektach, koniugatowy związek zawiera przeciwciało lub białko fuzyjne Fc, które specyficznie wiąże się z co najmniej jednym celem. W niektórych aspektach, przeciwciało inżynierii cysteiny lub białko fuzyjne Fc może wiązać się z więcej niż jednym celem. W niektórych aspektach, przeciwciało modyfikowane cysteiną zachowuje zdolność wiązania antygenu przeciwciała macierzystego odpowiednika. Zatem ujawnione tu przeciwciało modyfikowane cysteiną może być zdolne do wiązania, korzystnie specyficznie, antygenów. Takie antygeny obejmują, na przykład, antygeny nowotworowe antigen (TAA), białka receptora na powierzchni komórki, jak i inne cząsteczki powierzchniowe komórki, białka transmembranowe, białka sygnalizacyjne, przeżycie komórki czynniki regulacyjne, proliferacja komórek czynniki regulacyjne, cząsteczki związane z (na przykład znane lub podejrzewa się, że przyczynia się on funkcjonalnie do) rozwoju lub różnicowania tkanki, limfokin, cytokin, cząsteczek zaangażowanych w regulację cyklu komórkowego, cząsteczek zaangażowanych w waskulogenezę i cząsteczek związanych (na przykład, znanych lub podejrzewanych o przyczynianie się funkcjonalnie) do angiogenezy. Antygen guza antigen może być czynnik różnicowania klastra (czyli białko CD). Antygen, do którego zdolne jest wiązanie przeciwciała modyfikowanego cysteiną, może być członkiem podzbioru jednej z wyżej wymienionych kategorii. [0155] W niektórych aspektach związek koniugatowy zawiera przeciwciało lub białko fuzyjne Fc, które specyficznie wiąże się z co najmniej jednym celem i co najmniej jedną heterologiczną cząstką, która specyficznie wiąże się z co najmniej jednym drugim celem. W niektórych aspektach, przeciwciało poddane obróbce cysteiną lub białko fuzyjne Fc i heterologiczne ugrupowanie mogą wiązać się z tym samym celem. W innych aspektach, przeciwciało inżynierii cysteiny lub białko fuzyjne Fc i heterologiczne ugrupowanie mogą wiązać się z różnymi celami. Tak więc, w niektórych aspektach, związki koniugatowe są monospecyficzne. W innych aspektach, związki koniugatowe są dwuswoiste, trójspecyficzne,tetrasyficzne, itd. W innych aspektach, związki koniugatowe są wielospecyficzne. W niektórych aspektach związki koniugatowe są jednowartościowe, -45-

dwuwartościowe, trójwartościowe, czterowartościowe itd. W jeszcze innych aspektach związki koniugatowe są wielowartościowe. W specyficznych aspektach, przeciwciała modyfikowane cysteiną i białka fuzyjne Fc i pochodne związki koniugatowe są dwuwartościowe, np. Skonstruowany związek przeciwciała obejmuje dwa różne specyficzne miejsca wiążące antygen lub zmodyfikowane białko fuzyjne Fc zawiera dwie różne domeny wiążące się do celu. W konkretnych aspektach, przeciwciała modyfikowane cysteiną i ich fragmenty oraz pochodne związki koniugatowe są dwuspecyficzne, tj. cząsteczka może swoiście wiązać się z dwoma różnymi antygenami (np. dwa różne epitopy na tych samych lub różnych cząsteczkach). W niektórych specyficznych aspektach, przeciwciała modyfikowane cysteiną i ich fragmenty oraz pochodne związki koniugatowe są dwuswoiste i czterowartościowe, e. np., pochodzący od przeciwciała macierzystego, zawierającego cztery miejsca wiążące antygen, które są zdolne do wiązania się z dwóch różnych antygenów (np. dwóch różnych epitopów na tych samych lub różnych cząsteczek). [0156] Niniejsze ujawnienie dostarcza test do wykrywania wiązania przeciwciała fuzyjnego modyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc tu ujawnionego, lub ujawnionego tu skoniugowanego związku do komórki docelowej, obejmującego: (a) eksponowanie komórek na wytworzone cysteiny przeciwciało lub białko fuzyjne Fc lub koniugat; i (b) określenie zakresu wiązania przeciwciała zmodyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc lub koniugatu z komórkami docelowymi. [0157] Zdolność wiązania celu przeciwciała modyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc ujawnionego w niniejszym dokumencie lub pochodnego związku koniugatu ujawnionego w niniejszym dokumencie dla celu można określić eksperymentalnie stosując dowolną odpowiednią metodę dobrze znaną w dziedzinie, na przykład, cytometrii przepływowej, test immunoenzymatyczny (ELISA) albo testu radioimmunologicznego (RIA) lub kinetyka (np. analizy BIAcore™). Można również łatwo zastosować bezpośrednie testy wiązania, jak również konkurencyjne formaty wiązania. Patrz na przykład Berzofsky et al., "Antibody- Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); I TAM opisane sposoby. Zmierzona powinowactwo interakcji danego przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjnego Fc lub pochodną związku ujawnionego tu koniugatu z docelową może się zmieniać, jeśli mierzona w różnych warunkach (np. stężenia soli, pH, temperatura, itp). [0158] Praktycznie każda cząsteczka może być specyficznie związana i/lub włączona w związek koniugatu zawierający przeciwciało skonstruowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc i heterologiczne ugrupowanie. W niektórych aspektach członkowie (receptor lub ligand) nadrodziny TNF, jak również podjednostki, domeny, motywy i epitopy białek należących do tej rodziny białek są specyficznie związane i/lub włączane do związku koniugatu. Nadrodzina TNF zawiera liczne cząsteczki, w tym między innymi czynnik martwicy nowotworów alfa ("TNF-alfa"), czynnik martwicy nowotworów beta ("TNF-beta"), limfotoksyna -alfa ("LT- -46-

alfa"), Ligand CD30, ligand CD27, ligand CD40, ligand 4-1 BB, ligand Apo-1 (również określany jako ligand Fas lub ligand CD95), ligand Apo-2 (określany również jako TRAIL), ligand Apo-3 (również określany jako jako TWEAK), osteoprotegeryna (OPG), APRIL, ligand RANK (określany również jako TRANCE), TALL-1 (określany również jako BlyS, BAFF lub THANK), DR4, DR5 (znany również jako Apo-2, TRAIL- R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 lub KILLER), DR6, DcR1, DcR2, DcR3 (znanego również jako TR6 lub M68), CAR1, HVEM (znanego również jako ATAR lub TR2), GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, CD30, LTBr, receptor 4-1BB i TR9. [0159] W niektórych aspektach związek koniugatowy swoiście wiąże się z i/lub zawiera jedną lub więcej cząsteczek, jak również podjednostki, domeny, motywy i epitopy cząsteczek wybranych z grupy składającej się z T4, ABL, ABCF1, ACVR1, ACVR1 B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, ADORA2A, agrekanu, AGR2, AICDA, AIF1, AIGI, AKAP1, AKAP2, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOC1, AR, aromatazy, ATX, AX1, AZGP1 (cynk-a-glikoproteina), B7.1, B7.2, B7-H1, BAD, BAFF, BAG1, BAI1, BCR, BCL2, BCL6, BDNF, BLNK, BLR1 (MDR15), BlyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1 (plektyna), BRCA1, C19orflO (IL27w), C3, C4A, C5, C5R1, CANT1, CASP1, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCL1 (1-309), CCLI1 (eotaksyna), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (mcc-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MEP-2), SLC, eksodus-2, CCL22(MDC/STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2/eotaksyna-2), CCL25 (TECK), CCL26(eotaksyna-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIPIb), CCL5(RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCRI (CKR1/HM145), CCR2 (mcp-IRB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR- L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1), CCR8 (CMKBR8/TERI/CKR-L1), CCR9 (GPR-9- 6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR),CD164, CD19, CDIC, CD20, CD200, CD22, CD24, CD28, CD3, CD33, CD35, CD37, CD38, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD52, CD69, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CD8, CD80, CD81, CD83, CD86, CD137, CDH1 (Ekadheryna), CDH10, CDH12, CDH13, CDH18,CDH19, CDH20, CDH5, CDH7, CDH8, CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7,CDK9, CDKN1A (p21Wap1/Cip1),CDKN1B (p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A (p161NK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CERI, CHGA, CHGB, chitynza, CHST10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, CLDN3, CLDN7 (klaudyna-7), CLN3, CLU (clasteryna), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CNR1, COL18A1, COLIA1, COL4A3, COL6A1, CR2, Cripto, CRP, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CTL8, CTNNB1 (b-catenina), CTSB (catepsyna B), CX3CL1 (SCYD1), CX3CR1 (V28), CXCL1 (GRO1), CXCL10 (IP-IO), CXCLI1 (I-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), CYB5, CYC1, CYSLTR1, DAB21P, DES, DKFZp451J0118, DNCL1, DPP4, E2F1, Engel, Edge, Fennel, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, Enola, ENO2, ENO3, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, -47-

EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, EPHRIN-A1, EPHRIN-A2, EPHRINA3, EPHRIN-A4, EPHRIN-A5, EPHRIN-A6, EPHRIN-B1, EPHRIN- B2, EPHRIN-B3, EPHB4, EPG, ERBB2 (Her-2), EREG, ERK8, reseptora estrogenu, Earl, ESR2, F3 (TF), FADD, farnezylotransferazy, FasL, FASNf, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1 (aFGF), FGF10, FGF1 1, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8, FGF9, FGFR3, FIGF (VEGFD), FILI(EPSILON), FBL1 (ZETA), FLJ12584, FLJ25530, FLRT1 (fibronectyna), FLT1, FLT-3, FOS, FOSLI(FRA-1), FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GD2, GDF5, GFI1, GGT1, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCC10 (C10), GRP, GSN (gelsolina), GSTP1, HAVCR2, HDAC, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, Hedgehog, HGF, HIF1A, HIP1, histaminy i receptorów histaminowych, HLA-A, HLA-DRA, HM74, HMOX1, HSP90, HUMCYT2A, ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4, 1FNA5, EFNA6, BFNA7, IFNB1, IFNgamma, IFNW1, IGBP1, IGF1, IGFIR, IGF2, IGFBP2, 1GFBP3, IGFBP6, DL-1, ILIO, ILIORA, ILIORB, IL- 1, IL1R1 (CD121a), IL1R2(CD121b), ILIRA, IL-2, IL2RA (CD25), IL2RB(CD122), IL2RG(CD132), IL-4, IL-4R(CD123), IL-5, IL5RA(CD125), IL3RB(CD131), IL-6, IL6RA, (CD126), IR6RB(CD130), IL-7, IL7RA(CD127), IL-8, CXCR1 (IL8RA), CXCR2, (IL8RB/CD128), IL-9, IL9R (CD129), IL-10, IL10RA(CD210), IL10RB(CDW210B), IL-11, IL11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, 1L16, IL17, IL17A, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, ILIA, ILIB, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, DL1F9, ILIHYI, ILIR1, IL1R2, ILIRAP, ILIRAPLI, IL1RAPL2, IL1 RL1, IL1 RL2, ILIRN, IL2, IL20, IL20RA, IL21 R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23, DL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4, 1L4R, IL6ST (glikoproteina 130), ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, 1TGA3, ITGA6 (integryna a6), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (integryna 134), JAG1, JAK1, JAK3, JTB, JUN, K6HF, KAI1, KDR, KITLG, KLF5 (GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19 (keratyna 19), KRT2A, KRTHB6 (swoista dla włosów keratyna typu II), LAMA5, LEP (leptyna), Lingo-p75, Lingo-Troy, LPS, LTA (TNF- b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, MACMARCKS, MAG lub Omgp, MAP2K7 (c- Jun), MCP-1, MDK, MIB1, midkiny, MIF, MISRII, MJP-2,MK, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3 (metalotionektyna-UI), mTOR, MTSS1, MUC1 (mucyna), MYC, MYD88, NCK2, neurokanu, NFKBI, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgRNogo66, (Nogo), NgR-p75, NgR-Troy, NMEI (NM23A), NOTCH, NOTCH1, NOX5, NPPB, NROB1, NROB2, NRID1, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR112, NR113, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRP1, NRP2, NT5E, NTN4, ODZ1, OPRDI, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, PCA3, PCDGF, PCNA, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, peg-asparaginazy, PF4 (CXCL4), PGF, PGR, fosfakanu, PIAS2, kinazy PI3, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG, PLXDCI, PKC, PKC-beta, PPBP (CXCL7), PPID, PR1, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PTAFR, PTEN, PTGS2 (COX-2), -48-

PTN, RAC2 (P21Rac2), RANK, ligandu RANK, RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFI10 (ZNF144), Ron, ROBO2, RXR, S100A2, SCGB 1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mammaglobina 2), SCGB2A2 (mammaglobina 1), SCYE1 (śródbłonkowa cytokina aktywująca monocyty), SDF2,SERPENA1, SERPINA3, SERPINB5 (maspina), SERPINEI (PA1-I), SERPINFI, SHIP-1, SHIP-2, SHB1, SHB2, SHBG, SfcAZ, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPP1, SPRR1B (Sprl), ST6GAL1, STAB1, STAT6, STEAP, STEAP2, TB4R2, TBX21, TCP10, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFBII1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, THIL, THBS1 (trombospondyna-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIMP3, czynnik tkankowy, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TNF, TNFa, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSFI1A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF10 (TRAIL), TNFSF1 1 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, TNFSF4 (OX40 ligand), TNFSF5 (ligand CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligand CD27), TNFSF8 (ligand CD30), TNFSF9 (ligand 4-1BB), TOLLIP, receptorów podobnych do Toll, TOP2A (topoizomeraza lia), TP53, TPM1, TPM2,TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, TRKA, TREM1, TREM2, TRPC6, TSLP, TWEAK, tyrozynazy, uPAR, VEGF, VEGFB, VEGFC, wersykanu, VHL C5, VLA-4, Wnt-1, XCL1 (limfotaktyna), XCL2 (SCM-Ib), XCRI (GPR5/CCXCR1), YY1 i ZFPM2. [0160] W niektórych aspektach, koniugatowy związek zawiera przeciwciało lub białko fuzyjne Fc lub heterologiczne ugrupowanie, które specyficznie wiąże się i/lub zawiera jedną lub więcej cząsteczek niebiałkowych, na przykład kwas nukleinowy (np. DNA). lub RNA), lipid, glikolipidu, polisacharydu, itd. W niektórych aspektach, związek koniugat zawiera przeciwciało modyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc, lub heterologiczną cząsteczkę, która specyficznie wiąże się z i/lub zawiera guza antigen antygen glikolipidowy, jak również podjednostki, domeny, motywy i epitopy tego samego; patrz np. US Pat. nr 5 091 178). [0161] W niektórych aspektach, skoniugowany związek zawiera przeciwciało lub białko fuzyjne Fc zawierające domenę (np. Domenę wiążącą epitop lub domenę ligandu), która konkuruje z ligandami o wiązanie PDGFRalfa, PDGFRbeta, PDGF, VEGF, VEGF-A, VEGF- B, VEGF-C. VEGF-D, VEGFE, VEGFF, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FGF, FGF2, HGF, KDR, fit-1, FLK-1 Ang-2, Ang-1, PLGF, CEA, CXCL13, Baff IL-21, CCL21, TNF-alfa, CXCL12, SDF-1, bFGF, MAC-1, IL23p19, FPR, IGFBP4, CXCR3, TLR4, CXCR2, EphA2, EphA4, EphrinB2, EGFR (ErbB1), HER2 (ErbB2 lub p185neu), HER3 (ErbB3), HER4 ErbB4 lub tyro2), SC1, LRP5, LRP6, RAGE, Nav1.7, GLP1, RSV, białko F RSV, białko HA grypy, białko grypy NA, HMGB1, CD16, CD19, CD20, CD21, CD28, CD32, CD32b, CD64, CD79, CD22, ICAM-1, FGFR1, FGFR2, HDGF, EphB4, GITR, 13-amyloid, hMPV, PIV-1, PIV-2, OX40L, IGFBP3, cMet, PD- 1, PLGF,nefrolysin, CTD, IL-18, IL-6, CXCL-13, IL-1R1, IL-15, IL-4R, IgE, PA1-1, NGF, EphA2, CEA, uPARt, DLL-4, av136, a5131, receptor interferonu typu I i typ II. CD19, ICOS, IL-17, czynnik II, Hsp90, IGF, CD19, GM-CSFR, PIV-3, CMV, IL-13, IL-9 i EBV. -49-

[0162] W niektórych aspektach związek koniugatowy zawiera przeciwciało lub białko fuzyjne Fc, które wiąże się z tym samym celem, co przeciwciało wybrane z grupy obejmującej abagakomab, abatacept (znany również jako ORENCIA®),abciximab (znany również jako REOPRO? c7E3 Fab), adalimumab (znany również jako HUMIRA®), adekatumumab, alemtuzumab (znany również jako CAMPATH®, MabCampath lub Campath-1H), altumomab, afelimomab, anatumomabmafenaton, anetumumab, anuksyzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atlizumab, atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab (znany również jako SIMULECT®), bavituximab, bectumomab (znany również jako LYMPHOSCAN®), belimumab (znany również jako LYMPHO-STAT-B®), bertilimumab, besilesomab bewacizumab (znany również jako Avastin®) biciromab brallobarbital, biwatuzumab mertansyna, campath, kanakinumab (znany również jako ACZ885), kantuzumab mertansine, Capromab (znany również jako PROSTASCINT®), katumaksomab (znany również jako REMOVAB®), cedelizumab (znany również jako CIMZIA®), certolizumab pegol, cetuksymab (znany również jako ERBITUX®), klenoliksymab, dacetuzumab, dakliximab, daklizumab (znany również jako ZENAPAX®), denosumab (znany również jako AMG 162), detumomab, dorlimomab aritox, dorlixizumab, duntumumab, durimulumab,durmulumab, ecromeximab, ekulizumab (znany również jako SOLIRIS®) edobacomab, edrekolomab (znany również jako Mab17-1A, PANOREX®), efalizumab (znany również jako Raptiva®) efungumab (znany także jako MYCOGRAB®),elsilimomab, enlimomab pegol, epitumomab cituxetan, efalizumab, epitumomab, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab (znany również jako REXOMUN®), etanercept (znany również jako ENBREL®), etaracizumab (znany również jakoetaratuzumab, VITAX1N®, ABEGRINTM), exbivirumab, fanolesomab (znany również jako NEUTROSPEC®), faralimomab, felvizumab, fontolizumab (znany również jako HUZAF®), galiximab, gantenerumab, gavilimomab (znany również jako ABXCBL®), gemtuzumab ozogamicyna (znany również jako MYLOTARG®), golimumab (znany również jako CNTO 148), gomiliksimab, ibalizumab (znany również jako TNX-355), ibritumomab tiuxetan (znany również jako ZEVALIN®), igovomab, imciromab, infliksymab (znany również jako REMICADE®), inolimomab, inotuzumab ozogamycyna, ipilimumab (znany również jako MDX-010, MDX-101), iratumumab, keliksymab, labetuzumab, lemalesomab,lebrilizumab, lerdelimumab, lekxatumumab (znany również jako HGS-ETR2, ETR2-ST01), lekskumumab, libiwirumab, lintuzumab, lucatumumab, lumiliksymab, mapatumumab (znany również jako HGSETR1, TRM-1), maslimomab,matuzumab (znany również jako EMD72000), mepolizumab (znany również jako BOSATRIA®), metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, morolimumab, motawizumab (znany również jako NUMAXTM), muromonab(znany również jako OKT3), nacolomab tafenatox, naptumomab estafenaton, natalizumab (znany również jako TYSABRI®, ANTEGREN®), nebakumab, nerelimomab, nimotuzumab (znany również jako THERACIM hR3®, THERA-CIM-hR3®, THERALOC®), nofetumomab merpentan (znany również jako VERLUMA®), ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, omalizumab (znany również jako XOLAIR®), oregovomab (znany również jako OVAREX®), oteliksizumab,pagibaksymab, paliwizumab (znany również jako SYNAGIS®), panitumumab (znany również jako jako ABX-EGF, VECTIBIX®), pascolizumab, pemtumomab (znany również jako THERAGYN®), pertuzumab (znany -50-

również jako 2C4, OMNITARG®), pekselizumab, pintumomab, priliksimab, pritumumab, ranibizumab (znany również jako LUCENTIS®), raksibakumab, regawirumab, reslizumab, rytuksymab (znany również jako RITUXAN®, MabTHERA®), rovelizumab, ruplizumab, satumomab, sewirumab, sibrotuzumab, siplizumab (znany również jako MEDI-507), sontuzumab, stamulumab (znany również jako MYO-029), sulesomab (znany również jako LEUKOSCAN®), tacatuzumab tetraxetan,tadocizumab, talizumab, taplitumomab paprox, tefibazumab (znany również jako AUREX1S®), telimomab aritox, teneliximab, teplizumab, ticilimumab, tokilizumab (znany również jako ACTEMRA®) toralizumab, tositumomab, trastuzumab (znany również jako HERCEPTIN®) tremelimumab (znany również jako CP- 675206), celmoleukina celmoleukin, tuvirumab, urtoxazumab, ustekinumab (znany również jako CNTO 1275), vapaliximab, weltuzumab, vepalimomab,visilizumab (znany również jako NUVION®), volociximab (znany również jako M200), wotumumab (znany również jako HUMASPECT®), zalutumumab, zanolimumab (znany również jako HuMAX-CD4), ziralimumab lub zolimomab aritox. W niektórych aspektach, koniugatowy związek zawiera przeciwciało modyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc zawierające region wiążący antygen z przeciwciała wybranego z poprzedniej listy przeciwciał. [0163] Koniugaty związków ujawnione w niniejszym dokumencie mogą specyficznie wiązać się i/lub włączać cząsteczki z wielu źródeł, na przykład, wirusowych, bakteryjnych (np. Mykoplazm), grzybowych lub zwierzęcych celów. W niektórych przypadkach cząsteczką zwierzęcą jest ludzka cząsteczka. W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe mogą specyficznie wiązać się i/lub włączać cząsteczki z pasożytów (np. Grzybów, bakterii, nemotodów itp.). W niektórych aspektach cząsteczka jest antygenem. Odpowiednio, w niektórych aspektach, skoniugowany związek może być ukierunkowany na antygen bakteryjny, a heterologiczne ugrupowanie jest środkiem przeciwbakteryjnym. W innych aspektach celem jest wirusowy antygen, a heterologiczne ugrupowanie jest środkiem antywirusowym. W jeszcze innych aspektach, skoniugowany związek może być ukierunkowany na antygen nowotworowy (np. Ludzki antygen nowotworowy), a heterologiczne ugrupowanie jest środkiem przeciwnowotworowym. W niektórych aspektach koniugat może kierować na antygen grzybowy, a heterologiczne ugrupowanie jest środkiem przeciwgrzybiczym. W niektórych aspektach koniugat może kierować na antygen pasożyta, a część heterologiczna jest środkiem przeciwpasożytniczym. W innych aspektach, skoniugowany związek może być skierowany na antygen mykoplazmatyczny, a heterologiczne ugrupowanie jest środkiemprzeciwgrzybowym. W niektórych aspektach skoniugowany związek może być ukierunkowany na antygen różnicujący lub zgodności tkankowej, a heterologiczne ugrupowanie jest czynnikiem cytotoksycznym. Przeciwciała modyfikowane cysteiną i białka fuzyjne Fc obejmujące ujawnione mutacje cysteinowe (podstawienia w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439, wstawienie aminokwasu cysteiny między pozycjami 239 i 240 i ich dowolnymi kombinacjami) i ewentualnie jedną lub większą liczbą mutacji cysteinowych w dodatkowych pozycjach odpowiednich do inżynierii cysteinowej opisanych w dziedzinie (np. substytucje w pozycjach aminokwasowych 239, 248, 254, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, -51-

297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 440, 441, 442, 443 i 446) można wytwarzać zgodnie ze sposobami znanymi w dziedzinie. Patrz np. patent US nr 4 816 567.

[0164] Kwasy nukleinowe, np. DNA, kodujące ujawnione mutacje cysteinowe można wytwarzać różnymi metodami znanymi w dziedzinie. Metody te obejmują, między innymi, wytwarzanie przez ukierunkowaną (lub za pomocą oligonukleotydów) mutagenezę, mutagenezę PCR i mutagenezę kasetową wcześniej przygotowanego DNA kodującego polipeptyd. Warianty rekombinowanych przeciwciał i białek fuzyjnych Fc można skonstruować również przez manipulację fragmentami restrykcyjnymi lub przez wydłużenie zachodzące na siebie PCR z syntetycznymi oligonukleotydami. Mutagenne startery kodują zamiennik (y) kodonu cysteiny. Standardowe techniki mutagenezy można zastosować do generowania DNA kodującego takie zmutowane przeciwciała modyfikowane cysteiną i białka fuzyjne Fc. Ogólne wytyczne można znaleźć w Sambrook et al Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; i Ausubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York, N.Y., 1993.

[0165] Mutageneza ukierunkowana to jedna z metod przygotowania wariantów substytucyjnych, tj. Zmutowanych białek. Ta technika jest dobrze znana w dziedzinie (patrz na przykład Carter (1985) et al Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; i Kunkel et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488). W skrócie, przy przeprowadzaniu ukierunkowanej mutagenezy DNA, wyjściowy DNA jest zmieniany przez najpierw hybrydyzację oligonukleotydu kodującego pożądaną mutację z pojedynczą nicią takiego wyjściowego DNA. Po hybrydyzacji stosuje się polimerazę DNA do syntezy całej drugiej nici, stosując hybrydyzowany oligonukleotyd jako starter i stosując pojedynczą nić wyjściowego DNA jako matrycę. Tak więc, oligonukleotyd kodujący pożądaną mutację włącza się do otrzymanego dwuniciowego DNA. Mutagenezę ukierunkowaną można przeprowadzić w genie ekspresjonującym białko do mutagenezy w plazmidzie ekspresyjnym, a uzyskany plazmid można zsekwencjonować w celu potwierdzenia wprowadzenia pożądanych mutacji zastępujących cysteinę (Liu et al (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260). Sterowane stronami protokoły i formaty, w tym te dostępne w handlu, np. Zestaw do ukierunkowanej mutagenezy QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA).

[0166] Mutageneza PCR jest również odpowiednia do tworzenia wariantów sekwencji aminokwasowej wyjściowego polipeptydu. Patrz Higuchi, (1990) in PCR Protocols, str. 177- 183, Academic Press; Ito et al (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; i Vallette et al (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733. Pokrótce, gdy małe ilości matrycowego DNA są stosowane jako materiał wyjściowy w PCR, startery, które różnią się nieznacznie w sekwencji od odpowiadającego regionu w szablonowym DNA, mogą być stosowane do generowania stosunkowo dużych ilości określonego fragmentu DNA, który różni się od sekwencji szablonu. tylko w miejscach, w których startery różnią się od matrycy. -52-

[0167] Inny sposób przygotowania wariantów, mutagenezy kasetowej, oparty jest na technice opisanej przez Wells i wsp. (1985) Gene 34: 315-323. Materiałem wyjściowym jest plazmid (lub inny wektor) zawierający wyjściowy polipeptyd DNA do zmutowania. Kodon(y) w początkowym DNA, który ma ulec mutacji, są identyfikowane. Musi istnieć unikalne miejsce endonukleazy restrykcyjnej po każdej stronie zidentyfikowanego miejsca (miejsc) mutacji. Jeśli nie istnieją takie miejsca restrykcyjne, można je wytworzyć przy użyciu opisanej powyżej metody mutagenezy za pośrednictwem oligonukleotydów, aby wprowadzić je w odpowiednich miejscach w wyjściowym DNA polipeptydu. Plazmidowy DNA wycina się w tych miejscach w celu linearyzacji. Dwuniciowy oligonukleotyd kodujący sekwencję DNA między miejscami restrykcyjnymi, ale zawierający pożądaną mutację (y), syntetyzuje się, stosując standardowe procedury, w których dwie nici oligonukleotydu syntetyzuje się oddzielnie, a następnie hybrydyzuje razem, stosując standardowe techniki. Ten dwuniciowy oligonukleotyd jest określany jako kaseta. Ta kaseta jest zaprojektowana tak, aby miała końce 5 'i 3', które są kompatybilne z końcami linearyzowanego plazmidu, tak że może być bezpośrednio zligowany z plazmidem. Ten plazmid zawiera teraz zmutowaną sekwencję DNA. Zmutowany DNA zawierający kodowane zamienniki cysteiny można potwierdzić przez sekwencjonowanie DNA.

[0168] Pojedyncze mutacje są również generowane przez ukierunkowaną mutagenezę oligonukleotydów z zastosowaniem dwuniciowego plazmidowego DNA jako matrycy za pomocą mutagenezy opartej na PCR (Sambrook i Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 3.; Zoller et al (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M. J. i Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500).

[0169] Polinukleotyd(y) kodujący przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjne Fc według niniejszego ujawnienia mogą być dalej modyfikowane na wiele różnych sposobów z zastosowaniem technologii rekombinacji DNA. W niektórych aspektach, domeny stałe łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała, na przykład mysiego przeciwciała monoklonalnego, mogą być podstawione (1) dla tych regionów, na przykład, ludzkiego przeciwciała, aby wytworzyć chimeryczne przeciwciało lub (2). dla polipeptydu nieimmunoglobulinowego w celu wytworzenia przeciwciała fuzyjnego. W niektórych aspektach regiony stałe są skracane lub usuwane w celu wytworzenia pożądanego fragmentu przeciwciała monoklonalnego. Mechagenezę ukierunkowaną lub o dużej gęstości regionu zmiennego można stosować do optymalizacji swoistości, powinowactwa itp. przeciwciała monoklonalnego.

[0170] Ludzkie przeciwciała można wytworzyć bezpośrednio, stosując różne techniki znane w tej dziedzinie. Unieśmiertelnione unieśmiertelnione ludzkie limfocyty B in vitro lub wyizolowane od immunizowanego osobnika, który wytwarza przeciwciało skierowane przeciwko docelowemu antygenowi, może być generowane (patrz np. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol. 147:86-95 (1991); i patent US nr 57, 37373). Jeden lub więcej cDNA kodujących przeciwciało w unieśmiertelnionym limfocycie B można następnie przygotować i wstawić do wektora -53-

ekspresyjnego i/lub heterologicznej komórki gospodarza w celu ekspresji nienaturalnie występującej rekombinowanej wersji przeciwciała.

[0171] Ponadto ujawnione tu przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjne Fc mogą być wybrane z biblioteki fagowej, gdzie ta biblioteka fagowa ekspresjonuje ludzkie przeciwciała lub ich fragmenty jako białka fuzyjne z heterologicznymi białkami fagowymi, jak opisano, na przykład, w Vaughan i wsp., Nat. Biotechnologia. 14: 309-314 (1996); Sheets i wsp., Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. 95: 6157-6162 (1998); Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991), ti Marks i wsp., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)). Techniki wytwarzania i użycia bibliotek fagowych nazw i także w patencie US nr 5 969 108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6555313; 6,582,915; 6,593,081; 6300,064; 6,653,068; 6,706,484; ja 7264963. [0172] W niektórych aspektach, przeciwciało inżynierii cysteiny lub białko fuzyjne Fc według ujawnienia może być humanizowanym przeciwciałem. Można również stosować sposoby inżynierii, humanizowania lub resurfowania przeciwciał innych niż ludzkie lub ludzkie i są one dobrze znane w dziedzinie. Humanizowane, ponownie eksponowane lub podobnie skonstruowane przeciwciało może mieć jedną lub więcej reszt aminokwasowych ze źródła, które nie jest człowiekiem, np., Ale nie wyłącznie, myszy, szczura, królika, naczelnego innego niż człowiek lub innego ssaka. Te nie-ludzkie reszty aminokwasowe są zastąpione przez reszty, które są często określane jako reszty "importowane", które są zazwyczaj pobierane ze zmiennej "importowanej", stałej lub innej domeny znanej sekwencji ludzkiej. Takie importowane sekwencje można stosować do zmniejszania immunogenności lub zmniejszania, wzmacniania lub modyfikowania wiązania, powinowactwa, szybkości wiązania, szybkości dysocjacji, awidności, specyficzności, okresu półtrwania lub jakiejkolwiek innej odpowiedniej cechy, jak jest to znane w tej dziedzinie. Humanizację, zmianę nawierzchni lub inżynierię przeciwciał lub ich fragmentów ujawnionych w niniejszym dokumencie można przeprowadzić przy użyciu dowolnej znanej metody, takiej jak, ale nie wyłącznie, opisanych w: Damschroder i wsp., Mol. Immunol. 44: 3049-3060 (2007); Jones i wsp., Naturę 321: 522 (1986); Riechmann i wsp., Naturę 332: 323 (1988); Verhoeyen i wsp., Science 239: 1534 (1988)), Sims i wsp., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter i wsp., Proc. Natl. Natl. Acad. Sci.USA 89: 4285 (1992); Presta i wsp., J. Immunol. 151: 2623 (1993), patenty USA nr 5,639,641, 5 723 323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5 723 323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5 225 539; 4,816,567, 7,557,189; 7,538,195; ja 7,342,110; W090/14443; W090/14424; W090/14430; W02005/042743; W02006/102095 ja EP229246. IV. Ekspresja i oczyszczanie przeciwciał modyfikowanych cysteiną i białek fuzyjnych Fc [0173] W niektórych aspektach, niniejsze ujawnienie dostarcza polinukleotydy zawierające sekwencje kwasu nukleinowego, które kodują przeciwciała skonstruowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc, w tym ujawnione mutacje cysteinowe (substytucje w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271). 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402 411, 417, 433, 435 lub -54-

439, wstawianie aminokwasów cysteiny pomiędzy pozycjami 239 i 240, i dowolne ich kombinacje). Te polinukleotydy mogą występować w postaci RNA lub w postaci DNA. DNA obejmuje cDNA, genomowe DNA i syntetyczne DNA; i mogą być dwuniciowe lub jednoniciowe, a jeśli jednoniciowe mogą być nicią kodującą lub nicią niekodującą (antysensowną). W niektórych aspektach DNA jest cDNA, który jest stosowany do produkcji nie występującego naturalnie rekombinowanego przeciwciała modyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc. [0174] W niektórych aspektach, polinukleotydy są izolowane. W niektórych aspektach, polinukleotydy są zasadniczo czyste. W niektórych aspektach polinukleotydy zawierają sekwencję kodującą dojrzały polipeptyd połączony w tej samej ramce odczytu z polinukleotydem (naturalnym lub heterologicznym), który pomaga, na przykład, w ekspresji i sekrecji polipeptydu z komórki gospodarza (np. sekwencja liderowa, która działa jako sekwencja sekrecyjna do kontrolowania transportu polipeptydu z komórki). Polipeptyd mający sekwencję liderową jest prebiałkiem i może mieć sekwencję liderową rozszczepioną przez komórkę gospodarza w celu utworzenia dojrzałej postaci polipeptydu. W niektórych aspektach polinukleotydy są zmienione w celu optymalizacji wykorzystania kodonów dla pewnej komórki gospodarza. [0175] W niektórych aspektach polinukleotydy zawierają sekwencję kodującą dojrzałe przeciwciało modyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc poddane fuzji w tej samej ramce odczytu z heterologiczną sekwencją markerową, która umożliwia, na przykład, oczyszczanie kodowanego polipeptydu. Na przykład, sekwencja markerowa może być znacznikiem heksa- histydynowym (SEQ ID NO: 1) dostarczanym przez wektor pQE-9 w celu zapewnienia oczyszczenia dojrzałego polipeptydu połączonego z markerem w przypadku gospodarza bakteryjnego lub markera sekwencją może być znacznik hemaglutyniny (HA) pochodzący z białka hemaglutyniny wirusa grypy, gdy stosuje się gospodarza będącego ssakiem (np.komórki COS-7). [0176] Polinukleotydy mogą zawierać zmiany w regionach kodujących, niekodujących regionach lub w obu. W niektórych aspektach te warianty polinukleotydowe zawierają zmiany, które powodują ciche substytucje, addycje lub delecje, ale nie zmieniają właściwości lub aktywności kodowanego polipeptydu. W niektórych aspektach warianty polinukleotydowe są wytwarzane przez ciche substytucje ze względu na degenerację kodu genetycznego. Wersje polinukleotydowe mogą być również produkowane z różnych powodów, na przykład, w celu optymalizacji ekspresji kodonów dla konkretnego gospodarza (zmiana kodonów w ludzkim mRNA na preferowany przez gospodarza bakteryjnego, taki jak E. coli). [0177] W niektórych aspektach, polinukleotyd kodujący wytworzone cysteiny przeciwciało lub białko fuzyjne Fc ujawnione w niniejszym dokumencie można skonstruować za pomocą syntezy chemicznej z zastosowaniem syntetyzatora oligonukleotydów. Takie oligonukleotydy można zaprojektować w oparciu o sekwencję aminokwasów pożądanego polipeptydu i selekcję tych kodonów, które są uprzywilejowane w komórce gospodarza, w której wytwarzany będzie rekombinowany polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Do syntezy wyizolowanej sekwencji polinukleotydowej kodującej wyizolowany polipeptyd będący przedmiotem -55-

zainteresowania można zastosować standardowe metody. Na przykład kompletną sekwencję aminokwasową można zastosować do skonstruowania genu z translacją wsteczną. Ponadto można zsyntetyzować oligomer DNA zawierający sekwencję nukleotydową kodującą konkretny wyizolowany polipeptyd.Na przykład kilka małych oligonukleotydów kodujących części pożądanego polipeptydu można zsyntetyzować, a następnie zligować. Poszczególne oligonukleotydy zazwyczaj zawierają nawisy 5' lub 3' do komplementarnego składania. [0178] Przedstawiono także wektory i komórki zawierające opisane tu polinukleotydy. Po złożeniu (przez syntezę, ukierunkowaną mutagenezę lub inną metodę), sekwencje polinukleotydowe kodujące konkretny izolowany polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania (np. Przeciwciało modyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc) można wstawić do wektora ekspresyjnego i funkcjonalnie połączyć z sekwencja kontrolująca ekspresję odpowiednia do ekspresji białka w pożądanym gospodarzu. Prawidłowy montaż można potwierdzić przez sekwencjonowanie nukleotydów, mapowanie restrykcyjne i ekspresję biologicznie czynnego polipeptydu w odpowiednim gospodarzu. Jak dobrze wiadomo w dziedzinie, aby uzyskać wysoki poziom ekspresji transfekowanego genu w gospodarzu, gen musi być funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontrolującymi ekspresję transkrypcji i translacji, które są funkcjonalne w wybranym gospodarzu ekspresyjnym. [0179] W niektórych aspektach rekombinowane wektory ekspresyjne są stosowane do amplifikacji i ekspresji DNA kodującego przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjne Fc tu ujawnione. Rekombinowane wektory ekspresyjne są replikowalnymi konstruktami DNA, które zawierają syntetyczne lub pochodzące z cDNA fragmenty DNA kodujące, na przykład, łańcuch polipeptydowy przeciwciała anty-HER2 lub jego fragment wiążący antygen, funkcjonalnie połączony z odpowiednimi transkrypcyjnymi lub translacyjnymi elementami regulatorowymi pochodzącymi od ssaków. genów drobnoustrojów, wirusów lub owadów. Jednostka transkrypcyjna na ogół zawiera zespół (1) elementu lub elementów genetycznych pełniących regulatorową rolę w ekspresji genów, na przykład, promotory lub wzmacniacze transkrypcyjne, (2) sekwencję strukturalną lub kodującą, która jest transkrybowana do mRNA i ulega translacji na białko, i (3) odpowiednie sekwencje inicjacji i zakończenia transkrypcji i translacji, jak opisano szczegółowo poniżej. Takie elementy regulatorowe mogą zawierać sekwencję operatora do kontrolowania transkrypcji. Można zastosować szeroką gamę kombinacji gospodarz/wektor ekspresji. Przydatne wektory ekspresyjne dla gospodarzy eukariotycznych obejmują, na przykład, wektory zawierające sekwencje kontrolujące ekspresję z SV40, bydlęcego wirusa brodawczaka, adenowirusa i wirusa cytomegalii. Użyteczne wektory ekspresyjne dla gospodarzy bakteryjnych obejmują znane plazmidy bakteryjne, takie jak plazmidy z E coli, tym pCR 1, pBR322, pMB9 i ich pochodne, plazmidy szerszego zakresu gospodarzy, takie jak M13 i jednoniciowe nitkowatych fagów DNA. [0180] Odpowiednie komórki gospodarza do ekspresji przeciwciał modyfikowanych cysteiną lub białek fuzyjnych Fc obejmują komórki prokariotyczne, drożdżowe, owadzie lub wyższe eukariotyczne pod kontrolą odpowiednich promotorów.Prokarionty obejmują na przykład organizmy Gram-ujemne lub Gram-dodatnie E coli lub pałeczki. Wyższe komórki -56-

eukariotyczne obejmują ustalone linie komórkowe pochodzenia ssaczego, jak opisano poniżej. Można również zastosować systemy translacji bez komórek. Odpowiednie wektory do klonowania i ekspresji do stosowania z komórkowymi gospodarzami bakteryjnymi, grzybowymi, drożdżowymi i ssaczymi opisano Pouwels i in. (Cloning Vectors: A Laboratory Manuał, Elsevier, NY, 1985). Można znaleźć dodatkowe informacje dotyczące metod produkcji białka, w tym produkcji przeciwciał, np. w publikacji US nr 2008/0187954, patentach US nr 6,413,746 i 6 660 501 i międzynarodowej publikacji nr WO 04009823. [0181] Różne układy hodowli komórek ssaczych lub owadzich można również korzystnie stosować do ekspresji rekombinowanych przeciwciał modyfikowanych cysteiną lub białek fuzyjnych Fc według niniejszego ujawnienia. Ekspresję zrekombinowanych białek w komórkach ssaków można przeprowadzić, ponieważ takie białka są generalnie prawidłowo fałdowane, odpowiednio zmodyfikowane i całkowicie funkcjonalne. Przykłady odpowiednich ssaczych linii komórkowych gospodarza obejmują HEK-293 i HEK-293T, linie COS-7 komórek nerki małpy, opisane przez Gluzman (Celi 23: 175, 1981) i inne linie komórkowe obejmujące, na przykład, komórki L, C127, 3T3, linie komórkowe jajnika chomika chińskiego (CHO), NSO, HeLa i BHK. Ssacze wektory ekspresyjne mogą zawierać nietransskrybowane elementy, takie jak miejsce początku replikacji, odpowiedni promotor i wzmacniacz połączony z genem, który ma być eksprymowany, i inne sekwencjeniepeptydkujące flankujące 5 'lub 3' i sekwencje nietranslacyjne 5' lub 3', takie jak konieczne. miejsca wiązania rybosomu, miejsce poliadenylacji, miejsca składania donorowego i akceptorowego oraz sekwencje terminacji transkrypcji. Systemybakulowirusów do produkcji heterologicznych białek w komórkach owadzich są recenzowane przez Luckow & Summers, BioTechnology 6:47 (1988). [0182] Przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjne Fc wytwarzane przez transformowany gospodarz można oczyszczać zgodnie z dowolną odpowiednią metodą. Takie standardowe metody obejmują chromatografię (np. Wymianę jonową, powinowactwo i chromatografię kolumnową), wirowanie, różnicową rozpuszczalność lub dowolną inną standardową techniką oczyszczania białka. Znaczniki powinowactwa, takie jak heksahistydyna (SEQ ID NO: 1), domena wiążąca maltozę, sekwencja płaszcza wirusa grypy i transferaza S-glutationu mogą być przyłączone do białka, aby umożliwić łatwe oczyszczanie przez przepuszczenie przez odpowiednią kolumnę powinowactwa. Izolowane białka można również scharakteryzować fizycznie za pomocą takich technik, jak proteoliza, jądrowy rezonans magnetyczny i krystalografia rentgenowska. [0183] Na przykład supernatanty z układów, które wydzielają rekombinowane białko do pożywki hodowlanej, można najpierw zatężyć, stosując dostępny w handlu filtr do zatężania białka, na przykład jednostkę do ultrafiltracji Amicon lub Millipore Pellicon. Po etapie zatężania koncentrat można nanieść na odpowiednią matrycę do oczyszczania. W niektórych aspektach można stosować żywicę anionowymienną, na przykład matrycę lub substrat zawierający boczne grupydietyloaminoetylowe (DEAE). Matrycami mogą być akryloamid, agaroza, dekstran, celuloza lub inne typy powszechnie stosowane do oczyszczania białek. W niektórych aspektach można zastosować etap wymiany kationów. Odpowiednie wymieniacze -57-

kationowe obejmują różne nierozpuszczalne matryce zawierające grupy sulfopropylowe lub karboksymetylowe. [0184] Dodatkowo, lub ewentualnie, można zastosować jedną lub więcej wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) z użyciem hydrofobowych ośrodków RP-HPLC, np. Żelu krzemionkowego z przyłączoną grupą metylową lub innymi grupami alifatycznymi, w celu dalszego oczyszczenia zmodyfikowanej cysteiny. przeciwciało lub jego fragment. Niektóre lub wszystkie z powyższych etapów oczyszczania, w różnych kombinacjach, można również zastosować do uzyskania homogennego rekombinowanego białka. [0185] Rekombinowane przeciwciało wytworzone przez cysteinę lub białko fuzyjne Fc wytworzone w hodowli można wyizolować, na przykład, przez początkową ekstrakcję z peletek komórkowych, a następnie jedną lub więcej etapów zatężania, wysalania, wymiany jonowej lub chromatografii wykluczania zależnego od wielkości. Wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) można stosować do końcowych etapów oczyszczania. Komórki stosowane w ekspresji zrekombinowanego białka można rozrywać dowolną dogodną metodą, w tym cyklem zamrażania i rozmrażania, sonikacją, mechanicznym rozrywaniem lub użyciem czynników lizujących komórki. Sposoby znane w sprawie ochrony patentowej US nr US2008/0312425, US2008/0177048 i US2009/0187005 V. Koniugacja cząsteczek heterologicznych do przeciwciał modyfikowanych cysteiną i białek fuzyjnych Fc [0186] Przeciwciała modyfikowane cysteiną i fuzja Fc, w tym ujawnione mutacje cysteinowe (substytucje w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439, wstawienie aminokwasu cysteiny pomiędzy pozycje 239 i 240, i dowolne ich kombinacje) mogą być specyficznie ukierunkowane na miejsce i wydajnie sprzęgane z co najmniej jednym heterologicznym ugrupowaniem za pomocą reagentów reagujących z tiolami. W niektórych aspektach, sprzężenie ugrupowania heterologicznego może zachodzić przy grupie tiolowej zapewnionej przez co najmniej jedną zmodyfikowaną resztę cysteinową w jednej lub większej liczbie pozycji tu ujawnionych (np. Pozycje 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271; 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402 411, 417, 433, 435 lub 439 lub wstawienie aminokwasu cysteinowego między pozycjami 239 i 240) i ewentualnie co najmniej jedną zmodyfikowaną resztę cysteinową w jednej lub w wielu pozycjach znanych w dziedzinie (np. Pozycje 239, 248, 254, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 440, 441, 442, 443 i 446). [0187] Różne sposoby sprzęgania heterologicznego ugrupowania z modyfikowaną resztą cysteiny są znane w tej dziedzinie. Odczynniki do takiej koniugacji zazwyczaj mają funkcjonalność reaktywną, która może reagować bezpośrednio z cysteinowym tiolem cysteiny (np. Zmodyfikowana cysteina csteine według wynalazku) z wytworzeniem koniugatu związku -58-

lub z odczynnikiem łączącym z wytworzeniem pośredniego znacznika linkera, lub z białkiem linkerowym z wytworzeniem związku koniugatowego. W przypadku linkerowej reakcji chemii organicznej, warunki i odczynniki, które mogą być stosowane, obejmują, ale nie wyłącznie: reakcję grupy cysteinowej z odczynnikiem łączącym, z wytworzeniem pośredniego linkera białkowego, przez wiązanie kowalencyjne, a następnie reakcję z aktywowanym ugrupowaniem heterologicznym; oraz reakcję grupy nukleofilowej heterologicznego ugrupowania z odczynnikiem łączącym, z wytworzeniem heterologicznego związku pośredniczącego cząsteczki, poprzez wiązanie kowalencyjne, a następnie reakcję z grupą cysteiny (np. zmodyfikowaną cysteiną według wynalazku). [0188] W niektórych aspektach, dwufunkcyjne linkery są użyteczne w niniejszym wynalazku. Na przykład, dwufunkcyjny linker zawiera grupę modyfikującą tiol dla kowalencyjnego wiązania z resztą (resztami) cysteiny i co najmniej jedną resztę przyłączającą (np. Drugą modyfikację tiolową) dla kowalencyjnego lub niekowalencyjnego wiązania z koniugatem. Różne białka i związki (i linkery) można stosować do wytwarzania związku według wynalazku. Tiolowe grupy cysteinowe są nukleofilowe i zdolne do reagowania z wytworzeniem wiązań kowalencyjnych z grupami elektrofilowymi na odczynnikach linkerowych lub pośrednich związkach-linkerach lub lekach obejmujących: (i) aktywne estry, takie jak estry NHS, estry HOBt, halomrówczany i halogenki kwasowe; (ii) halogenki alkilowe i benzylowe, takie jak haloacetamidy; (iii) grupy aldehydowe, ketonowe, karboksylowe i maleimidowe; i (iv) disulfidy, w tym pirydyl disulfidy, poprzez wymianęsiarczków. Grupy nukleofilowe na heterologicznym ugrupowaniu lub linkeru obejmują, ale nie wyłącznie, grupę aminową, tiolową, hydroksylową, hydrazydową, oksymową, hydrazynową, tiosemikarbazonową, karboksylową hydrazyny i grupyarylohydrazydowe zdolne do reakcji z wytworzeniem wiązań kowalencyjnych z grupami elektrofilowymi na ugrupowaniach linkerowych i linkeru. odczynniki. W niektórych aspektach odczynniki do znakowania obejmują maleimid, haloacetyl,jodoacetamid ester sukcynimidylowy, izotiocyjanian, chlorek sulfonylu, 2,6- dichlorotriazynyl, [0189] Wydajność koniugacji cząsteczki hetero -logu do przeciwciała modyfikowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc tu ujawnionego można określić przez ocenę obecności wolnych tioli pozostałych po reakcji koniugacji. Obecność wolnych grup tiolowych można określić za pomocą różnych technik akceptowanych w dziedzinie sztuki. W niektórych aspektach, niniejszy sposób zapewnia wydajne sprzęganie ugrupowania heterologicznego, w którym wydajność koniugacji wynosi co najmniej 5%, co najmniej 10%, co najmniej 15%, co najmniej 20%, co najmniej 25%, co najmniej 30%, co przynajmniej 35%, co najmniej 40%, co najmniej 45%, co najmniej 50%, co najmniej 55%, co najmniej 60%, co najmniej 70%, co najmniej 75%, co najmniej 80%, co najmniej 85% co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 98% lub więcej, mierzone poziomem wolnych grup tiolowych pozostających po reakcji sprzęgania. [0190] W niektórych aspektach, niniejszy sposób zapewnia sprzężenie ugrupowania heterologicznego z ujawnionym tu cysteinowym białkiem fuzyjnym lub białkiem fuzyjnym Fc, zawierającym wolne reszty cysteiny, które zawierają zablokowane lub zakryte grupy -59-

sulfhydrylowe. Takie czapki obejmują białka, peptydy, jony i inne materiały, które oddziałują z grupą sulfhydrylową i zapobiegają lub hamują tworzenie się koniugatu. W niektórych aspektach ujawnione tu przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjne Fc mogą wymagać odkorkowania przed reakcją koniugacji. W konkretnych aspektach, przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjne Fc są niepokryte i wykazują wolną grupę sulfhydrylową zdolną do koniugacji. W specyficznych aspektach ujawnione tu przeciwciała cysteinowe lub białka fuzyjne Fc poddaje się reakcji wiązania, która nie zakłóca ani nie przestawia naturalnie występujących wiązań dwusiarczkowych. [0191] W niektórych aspektach, ujawnione tu przeciwciała modyfikowane cysteiną lub białka fuzyjne Fc można poddawać reakcjom sprzęgania, w których skon- dukowane przeciwciało lub białko fuzyjne Fc obecne w cysteinie występuje w stężeniu co najmniej 1 mg/ml, co najmniej 2 mg/ml, co najmniej 3 mg/ml, co najmniej 4 mg/ml, co najmniej 5 mg/ml lub więcej. [0192] Odczynnikiem reagującym z tiolem może być, na przykład, wielofunkcyjny odczynnik łączący, odczynnik do oznaczania wychwytu (tj. Powinowactwa) (np. Odczynnik biotyna- linker), znacznik wykrywający (np. Odczynnik fluoroforowy), immobilizacja w fazie stałej. odczynnik (np. SEPHAROSE ™, polistyren lub szkło) lub pośrednik lek-linker. Jednym z przykładów odczynnika reagującego z tiolem jest N-etylo maleimid (NEM). W przykładowym aspekcie, reakcja przeciwciała skonstruowanego cysteiną lub białka fuzyjnego Fc z wielofunkcyjnym odczynnikiem łączącym zapewnia pośredni związek koniugatu z funkcjonalizowanym linkeryem, który można następnie poddać reakcji z heterologicznym ugrupowaniem (np. ugrupowaniem leku).

[0193] Takie podejście można zastosować do koniugacji innych środków reaktywnych z tiolem, w których grupą reaktywną jest na przykład maleimid, jodoacetamid, pirydyl. disiarczek, haloacetyl, jodoacetamid ester sukcynimidylowy (np. NHS, N- hydroksysukcynimid), izotiocyjanian, chlorek sulfonylu, 2,6-dichlorotriazynyl, pentafluorofenyl i fosforamidyt lub inny partner reaktywny w tiolach (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, str. 40-55, 643- 671).

[0194] Odpowiednio, ujawnione tutaj przeciwciało lub białko fuzyjne Fc skoniugowane z zastosowaniem znanych w dziedzinie metod sprzęgania tiolowego do co najmniej jednego heterologicznego ugrupowania, takiego jak toksyna, lek, radionuklid, immunomodulator, cytokina, limfokina, chemokina, czynnik wzrostu czynnik martwicy nowotworów, hormony, antagonisty hormonów, enzymów, oligonukleotyd DNA, RNA, siRNA, RNAi, mikroRNA, peptydowego kwasu nukleinowego światłoczuły środek terapeutyczny, środek przeciw- angiogenny, proapoptotyczne agenta nienaturalny aminokwas, peptyd cząsteczka lipidowa, węglowodanowa, rusztowania, znacznik fluorescencyjny, peptyd wizualizacyjny, biotyna, rozcieńczalnik półtrwania w surowicy, znacznik wychwytu, czynnik chelatujący, podłoże stałe -60-

lub ich kombinacja, przy czym koniugacja występuje w jednej z cystein modyfikowanych metodami inżynierii. VI. Kompozycje farmaceutyczne [0195] Niniejsze ujawnienie dostarcza formulacje zawierające co najmniej jeden skoniugowany związek ujawniony w niniejszym dokumencie sformułowany razem z rozcieńczalnikiem, nośnikiem lub zaróbką. Niniejsze ujawnienie zapewnia również kompozycje farmaceutyczne zawierające co najmniej jeden związek koniugatu ujawniony w niniejszym dokumencie sformułowany razem z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem, nośnikiem lub zaróbką. Takie preparaty lub kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać jedną lub kombinację, na przykład, ale nie wyłącznie, dwóch lub więcej różnych koniugatów. Na przykład ujawniona tu formulacja lub kompozycja farmaceutyczna może zawierać kombinację sprzężonych związków, które wiążą się z różnymi celami, np. Różnymi epitopami, lub które mają komplementarne aktywności. [0196] W celu wytworzenia kompozycji farmaceutycznych lub sterylnych, w tym ujawnionego tu związku koniugatu, skoniugowany związek można zmieszać z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką. Formulacje środków terapeutycznych i diagnostycznych można wytworzyć przez zmieszanie z fizjologicznie dopuszczalnymi nośnikami, zaróbkami lub stabilizatorami w postaci np. Liofilizowanych proszków, zawiesin, roztworów wodnych, lotionów lub zawiesin. [0197] Kompozycje farmaceutyczne zawierające ujawnione tu związki koniugatowe można również podawać w terapii skojarzonej, takiej jak w połączeniu z innymi środkami. Na przykład, terapia skojarzona może obejmować ujawniony tu skoniugowany związek w połączeniu z co najmniej jedną inną terapią, w której terapia może być chirurgią, immunoterapią, chemioterapią, radioterapią lub terapią lekową. [0198] Związki farmaceutyczne mogą zawierać jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Przykłady takich soli obejmują sole addycyjne z kwasami i sole addycyjne z zasadami. Sole addycyjne z kwasami obejmują sole pochodzące od nietoksycznych kwasów nieorganicznych, takich jak kwas chlorowodorowy, azotowy, fosforowy, siarkowy, bromowodorowy, jodowodorowy, fosforowy i tym podobne, jak również z nietoksycznych kwasów organicznych, takich jak alifatyczne kwasy mono- i dikarboksylowe, alkanoil podstawiony fenylem. kwasy, hydroksyl kwasy alkanowe, kwasy aromatyczne, alifatyczne i aromatyczne kwasy sulfonowe i tym podobne. Sole addycyjne z zasadami obejmują sole pochodzące od metali ziem alkalicznych, takich jak sód, potas, magnez, wapń i tym podobne, a także nietoksyczne aminy organiczne, takie jak N, N'- dibenzyloetylenodiamina, N- metyloglukamina, chloroprokaina, cholina, dietanoloamina., etylenodiamina,prokaina i tym podobne. [0199] Kompozycja farmaceutyczna może również zawierać farmaceutycznie dopuszczalny przeciwutleniacz. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych przeciwutleniaczy obejmują: (1) rozpuszczalne w wodzie przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, wodorosiarczan sodu, pirosiarczyn sodu, siarczyn sodu i podobne; (2) antyutleniacze -61-

rozpuszczalne w oleju, takie jak palmitynian askorbylu, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowanyhydroksytoluen (BHT), lecytyna, galusan propylu, alfa-tokoferol i tym podobne; i (3) metalowe czynniki chelatujące, takie jak kwas cytrynowy, etylenodiamina kwas tetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy, kwas fosforowy i tym podobne. [0200] Przykłady odpowiednich wodnych i niewodnych nośników, które można stosować w ujawnionych tu kompozycjach farmaceutycznych, obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy i tym podobne), i odpowiednie ich mieszaniny, oleje roślinne, takie jak oleje roślinne, jako oliwa z oliwek i wstrzykiwane organiczne estry, takie jak oleinian etylu. Właściwą płynność można utrzymać, na przykład, przez zastosowanie materiałów powlekających, takich jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. [0201] Te kompozycje farmaceutyczne mogą także zawierać adiuwanty, takie jak środki konserwujące, środki zwilżające, środki emulgujące i środki dyspergujące. Zapobieganie obecności mikroorganizmów można zapewnić zarówno przez procedury sterylizacji, jak i przez włączenie różnych środków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych, na przykład, parabenu, chlorobutanolu, fenolu kwasu sorbowego i podobnych. Może być również pożądane włączenie do kompozycji środków izotonicznych, takich jak cukry, chlorek sodu i tym podobne. Ponadto, przedłużone wchłanianie wstrzykiwalnej postaci farmaceutycznej można uzyskać przez włączenie środków opóźniających absorpcję, takich jak glin monostearynian iżelatyna. [0202] Kompozycje farmaceutyczne mogą być sterylne i stabilne w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycję można formułować jako roztwór, mikroemulsję, liposom lub inną uporządkowaną strukturę odpowiednią do wysokiego stężenia leku. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub ośrodek dyspersyjny zawierający na przykład wodę, etanol, poliol (na przykład glicerol, glikol propylenowy i ciekły glikol polietylenowy i tym podobne) i odpowiednie ich mieszaniny. Właściwą płynność można utrzymać, na przykład, przez zastosowanie powłoki, takiej jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach może być odpowiednie włączenie do kompozycji środków izotonicznych, na przykład cukrów, poli-alkoholi, takich jak mannitol, sorbitol lub chlorek sodu. Przedłużoną absorpcję kompozycji do wstrzykiwania można uzyskać przez włączenie do kompozycji środka opóźniającego wchłanianie, na przykład soli monostearynianu i żelatyny. [0203] Sterylne roztwory do wstrzykiwania można wytworzyć przez wprowadzenie związku aktywnego w wymaganej ilości w odpowiednim rozpuszczalniku z jednym lub kombinacją składników wymienionych powyżej, w razie potrzeby, po czym następuje mikrofiltracja sterylizacyjna. Ogólnie, dyspersje wytwarza się przez włączenie związku czynnego do jałowego nośnika, który zawiera podstawowy ośrodek dyspersyjny i wymagane inne składniki z wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do wytwarzania jałowych roztworów do wstrzykiwania, odpowiednie sposoby wytwarzania obejmują suszenie -62-

próżniowe i liofilizację (liofilizacja), które dają proszek składnika czynnego plus dowolny dodatkowy pożądany składnik z wcześniej wyjałowionego przez filtrację roztworu. [0204] W jednym aspekcie, niniejsze kompozycje są formulacjami wolnymi od pirogenów, które są zasadniczo wolne od endotoksyn i/lub pokrewnych substancji pirogennych. Endotoksyny obejmują toksyny zamknięte wewnątrz drobnoustroju i uwalniane, gdy drobnoustroje ulegają rozpadowi lub giną. Substancje pirogenne obejmują również indukujące gorączkę, termostabilne substancje (glikoproteiny) z zewnętrznej błony bakterii i innych mikroorganizmów. Obie te substancje mogą wywoływać gorączkę, niedociśnienie i wstrząs, jeśli są podawane ludziom. Ze względu na potencjalne szkodliwe działanie, nawet niewielkie ilości endotoksyn można odpowiednio usunąć z podawanych dożylnie farmaceutycznych roztworów leków. Urząd ds. Żywności i Leków ("FDA") wyznaczył górną granicę 5 jednostek endotoksyny (EU) na dawkę na kilogram masy ciała w ciągu jednej godziny na podanie dożylne. Gdy podaje się białka lecznicze w ilościach kilkuset lub tysięcy miligramów na kilogram masy ciała, można nawet odpowiednio usunąć śladowe ilości endotoksyny. [0205] W aspekcie, poziomy endotoksyny i pirogenu w kompozycji są mniejsze niż 10 EU/mg, mniej niż 5 EU/mg, mniej niż 1 EU/mg, mniej niż 0,1 EU/mg, mniej niż 0,01 EU/mg lub mniej niż 0,001 EU/mg. W pewnych przykładach wykonania poziomy endotoksyny i pirogenu w kompozycji są mniejsze niż około 10 EU/mg, mniej niż około 5 EU/mg, mniej niż około 1 EU/mg lub mniej niż około 0,1 EU/mg, mniej niż około 0,01 EU/mg lub mniej niż około 0,001 EU/mg. VII. Sposoby diagnostyczne [0206] W niektórych aspektach można stosować przedstawione tu związki koniugatowe in vivo i/lub in vitro do testów diagnostycznych. Takie testy diagnostyczne obejmują, na przykład, (i) wykrywanie obecności lub nieobecności choroby lub zaburzenia, (ii) monitorowanie lub prognozowanie rozwoju lub postępu choroby lub zaburzenia (takiego jak, ale nie wyłącznie, rak), (iii.) procedury badań klinicznych, takie jak określanie skuteczności określonej terapii, lub (iv) identyfikacja kandydatów na pacjentów do określonego leczenia. [0207] W niektórych aspektach ujawnione tu technologie zapewniają sposoby określania obecności docelowej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w próbce podejrzewanej o zawieranie takiej cząsteczki. W niektórych aspektach sposób obejmuje ekspozycję próbki na ujawniony tu związek koniugatowy i określenie wiązania koniugatu z docelową cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania w próbce, gdzie wiązanie związku koniugatowego do docelowej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w próbce wskazuje na obecność docelowej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w próbce. W niektórych aspektach próbka jest próbką biologiczną. W niektórych aspektach próbka biologiczna pochodzi od ssaka doświadczającego lub podejrzewanego o występowanie choroby lub zaburzenia związanego z docelową cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. -63-

[0208] Na przykład, wykrywanie wiązania ujawnionego tu związku koniugatu do docelowej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania (np. Cel na powierzchni komórki) można osiągnąć przez: (a) wystawienie badanej próbki (np. komórek) na związek koniugatu, ewentualnie wraz z próbką kontrolną w warunkach, które pozwalają na tworzenie kompleksu między koniugatem związku i docelową cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania; i (b) określenie zakresu wiązania koniugatu z docelową cząsteczką. [0209] Koniugaty związków ujawnione w niniejszym dokumencie można stosować w sposobie wykrywania chorób lub zaburzeń nowotworowych, autoimmunologicznych, zapalnych lub zakaźnych u osobnika potrzebującego tego, przy czym sposób obejmuje podawanie osobnikowi związku koniugatu. Tworzenie kompleksu między koniugatem związku a celem można wykryć, np. Przy użyciu testu ELISA. Podczas stosowania próbki kontrolnej wraz z próbką testową, kompleks można wykryć w obu próbkach i każda statystycznie znacząca różnica w tworzeniu kompleksów między próbkami wskazuje na obecność docelowej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w badanej próbce. [0210] W niektórych aspektach ujawniony tu skoniugowany związek może być stosowany do wykrywania nadekspresji lub amplifikacji docelowej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania przy użyciu testu diagnostycznego in vivo. W niektórych aspektach, koniugatowy związek dodaje się do próbki, w której skoniugowany związek wiąże docelową cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania, która ma być wykrywana i jest znakowany wykrywalnym znacznikiem (np. Radioaktywnym izotopem lub znacznikiem fluorescencyjnym) i zewnętrznie skanuje pacjenta w celu lokalizacji etykieta. Testy FISH, takie jak INFORM™ (sprzedawany przez Ventana, Ariz.) Lub PATHVISION™ (Vysis, III.) Można przeprowadzać na utrwalonej w formalinie tkance zatopionej w parafinie w celu określenia zakresu (jeśli w ogóle) nadekspresji celu cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania, na przykład, w guzie. [0211] W pewnych aspektach ujawniony tu skoniugowany związek może być stosowany w sposobie diagnozowania zaburzenia proliferacji komórek związanego ze wzrostem liczby komórek eksprymujących docelową cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania. W niektórych aspektach sposób obejmuje kontaktowanie komórek testowych w próbce biologicznej ze związkiem tu ujawnionym; określanie poziomu docelowej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w komórkach testowych w próbce poprzez wykrywanie wiązania ujawnionego tu związku koniugatu; i porównanie poziomu związku koniugatu związanego z komórkami w próbce kontrolnej, gdzie poziom związku związanego z koniugatem jest znormalizowany do cząsteczki liczby komórek wyrażających zainteresowanie w próbkach testowych i kontrolnych, i gdzie wyższy poziom związku koniugatu związany w próbka testowa w porównaniu z próbką kontrolną wskazuje na obecność zaburzenia proliferacji komórek związanego z komórkami eksprymującymi docelową cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania. -64-

[0212] W pewnych aspektach ujawniony tu skoniugowany związek może być stosowany w metodzie wykrywania rozpuszczalnej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w krwi lub surowicy. W niektórych aspektach, sposób obejmuje kontaktowanie badanej próbki krwi lub surowicy od ssaka podejrzanego o doświadczanie zaburzenia związanego z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania ze skoniugowanym związkiem tu ujawnionym i wykrywanie wzrostu rozpuszczalnej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w badanej próbce w stosunku do próbka kontrolna krwi lub surowicy od zdrowego ssaka. W niektórych aspektach, metoda wykrywania jest użyteczna jako metoda diagnozowania zaburzenia związanego ze wzrostem rozpuszczalnej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w krwi lub surowicy ssaka. [0213] W pewnych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe można stosować jako biomarkery obrazujące i sondy za pomocą różnych metod i technik obrazowania biomedycznego i molekularnego, takich jak: (i) MRI (obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego); (ii) MicroCT (tomografia komputerowa); (iii) SPECT (tomografia komputerowa emisji pojedynczego fotonu); (iv) PET (pozytronowa tomografia emisyjna) (patrz Chen i wsp. (2004) Bioconjugate Chem. 15: 41-49); (v) bioluminescencja; (vi) fluorescencja; i (vii) ultradźwięki. Immunoscintigraphy to procedura obrazowania polegająca na podawaniu pacjentom będącym zwierzęciem lub człowiekiem związków pochodzących od przeciwciał znakowanych substancjami promieniotwórczymi i wykonuje się zdjęcie miejsc w ciele, w których zlokalizowane jest przeciwciało (patent USA nr 6,528,624). Biomarkery obrazowania można obiektywnie zmierzyć i ocenić jako wskaźnik normalnych procesów biologicznych, procesów patogennych lub reakcji farmakologicznych na interwencję terapeutyczną. Biomarkery obrazowania mogą dostarczać farmakodynamicznej (terapeutycznej) informacji terapeutycznej o: (i) ekspresji docelowego białka, (ii) wiązaniu terapeutyku z docelowym białkiem, tj. Selektywności i (iii) danych farmakokinetycznych dotyczących klirensu i okresu półtrwania. VIII. Sposoby leczenia [0214] Niniejsze ujawnienie dostarcza również sposób leczenia chorób lub zaburzeń nowotworowych, autoimmunologicznych, zapalnych lub zakaźnych u osobnika, który tego wymaga, obejmujący podawanie osobnikowi ujawnionego tu koniugatu związku. W niektórych aspektach sposób obejmuje ponadto podawanie dodatkowej terapii, przy czym dodatkową terapią jest na przykład chemioterapia, terapia biologiczna, immunoterapia, radioterapia, terapia hormonalna i chirurgia.Dostarcza się również sposób dostarczania heterologicznego ugrupowania, na przykład środka terapeutycznego, do komórki, obejmującego traktowanie komórki ujawnionym tu związkiem koniugatowym. W niektórych aspektach koniugat może być internalizowany przez komórkę. [0215] W różnych aspektach ujawniony tu skoniugowany związek można podawać komórkom, na przykład komórkom nowotworowym. Biologicznym efektem koniugatu może być np. Śmierć komórki, zahamowanie proliferacji komórek, brak efektu, zmiany w morfologii komórki lub zmiany we wzroście temperatury w piwnicy. W niektórych aspektach, -65-

skoniugowany związek zawiera wykrywalny znacznik, jak opisano powyżej. W niektórych aspektach znacznik wskazuje lokalizacjęantygenu nowotworowego w komórce. [0216] W pewnych aspektach związek koniugatu można podawać osobnikowi potrzebującemu leczenia. W różnych aspektach związek koniugatowy przenosi lek lub toksynę ukierunkowaną na antygen nowotworowy. W niektórych aspektach związek koniugatowy przenosi wykrywalny znacznik, dzięki któremu można zidentyfikować lub zlokalizować cel, np. Antygen. Niektóre elementy obejmują wykrywanie działaniu biologicznym, na przykład, środki lecznicze wpływają związku koniugatu. W niektórych aspektach stan pacjenta może być monitorowany. Medyczną dawkę skoniugowanego związku można regulować w odpowiedzi na monitorowanie. [0217] Związki koniugatowe tu ujawnione i zawierające je kompozycje są przydatne do wielu celów, na przykład, jako środki lecznicze do zapobiegania, leczenia lub leczenia szerokiego zakresu chronicznych i ostrych chorób i zaburzeń, w tym, ale nie wyłącznie, zaburzeń autoimmunologicznych i/lub zapalnych. zaburzenia hiperproliferacyjne, takie jak łagodne lub złośliwe nowotwory, białaczka i nowotwory układu limfatycznego; choroby zakaźne, w tym choroby wirusowe, bakteryjne i grzybicze. W niektórych aspektach ujawnione tu kompozycje i sposoby można stosować z jedną lub więcej konwencjonalnych terapii, które stosuje się do zapobiegania, leczenia lub leczenia powyższych chorób i zaburzeń. Ponadto, w niektórych aspektach ujawniono sposoby zastosowania ujawnionych tu związków koniugatów do inaktywacji różnych czynników zakaźnych, takich jak wirusy, grzyby, drobnoustroje eukariotyczne i bakterie. [0218] Dostarczono również, w niektórych aspektach, sposoby stosowania ujawnionych tu związków koniugatów i zawierające je kompozycje, które zmniejszają populację komórek. W jednym aspekcie, stosowane tu sposoby można stosować do usuwania następujących typów komórek: eozynofila, bazofila, neutrofila, komórki T, komórki B, komórki tucznej, monocytów, komórki śródbłonka i komórki nowotworowej. [0219] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe i zawierające je kompozycje mogą być również użyteczne w diagnozowaniu i wykrywaniu chorób ich objawów. W niektórych aspektach kompozycje mogą być użyteczne w monitorowaniu postępu choroby. W różnych aspektach, kompozycje mogą być użyteczne w monitorowaniu schematów leczenia. W pewnych aspektach kompozycje są przydatne do diagnozy w ex vivo aplikacja, taka jak zestaw diagnostyczny. [0220] W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe i zawierające je kompozycje mogą celować w antygeny jako receptory na powierzchni komórki, które internalizują. W niektórych aspektach docelowy antygen jest antygenem zewnątrzkomórkowym. W niektórych aspektach celem jest antygen wewnątrzjądrowy. W niektórych aspektach ujawnione tu związki koniugatowe, po związaniu, ulegają internalizacji do komórek, w których internalizacja wynosi co najmniej około 10%, co najmniej około 20%, co najmniej około 30%, co najmniej około 40%, co najmniej około 50%, przynajmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około 80% lub co najmniej około 90%, co najmniej około 100%, co najmniej około 1 10%, co -66-

najmniej około 130%, co najmniej około 140% najmniej około 150%, co najmniej około 160% lub co najmniej około 170% więcej niż przeciwciała kontrolne. [0221] W niektórych przykładach wykonania ujawnione tu skoniugowane związki, po związaniu, internalizują się w komórki, w których internalizacja wynosi 1-10%, 10-20%, 20- 30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60 -70%, 70-80%, 80-90%, 90-100%, 100-110%, 110-120%, 120-130%, 130-140%, 140-150%, 150-160%, 160 -170% lub więcej niż przeciwciała kontrolne. IX. Zestawy [0222] Ujawnienie dostarcza także artykuły do produkcji, np. zestawy, które zawierają ujawniony tu związek koniugatowy, który można zastosować do przeprowadzenia opisanych tutaj sposobów. W niektórych aspektach zestaw zawiera co najmniej jeden oczyszczony związek koniugatu w jednym lub większej liczbie pojemników. W niektórych aspektach zestawy zawierają wszystkie składniki niezbędne i/lub wystarczające do przeprowadzenia testu wykrywającego, w tym wszystkie kontrole, wskazówki do wykonywania testów i, na przykład, wszelkie niezbędne oprogramowanie do analizy i prezentacji wyników. Specjalista w dziedzinie łatwo rozpozna, że ujawnione tu związki koniugatowe można łatwo wprowadzić do jednego z ustalonych formatów zestawów, które są dobrze znane w dziedzinie. W niektórych aspektach zestaw zawiera pojemnik i etykietę lub ulotkę dołączoną do opakowania lub związane z pojemnikiem. Odpowiednie pojemniki obejmują, na przykład, butelki, fiolki, strzykawki, blistry itp. Pojemniki mogą być uformowane z różnych materiałów, takich jak szkło lub plastik. W niektórych aspektach pojemnik może zawierać kompozycję zawierającą ujawniony tu skoniugowany związek, który jest skuteczny w leczeniu określonej choroby lub stanu i może mieć sterylny port dostępu (na przykład pojemnik może być workiem do roztworu dożylnego lub fiolką z korkiem; dający się przebić igłą do iniekcji podskórnej). Etykieta lub ulotka informacyjna może wskazywać, że kompozycję stosuje się do leczenia wybranego stanu, takiego jak rak. Alternatywnie lub dodatkowo, zestaw może ponadto zawierać drugi (lub trzeci) pojemnik zawierający farmaceutycznie dopuszczalny bufor, taki jak bakteriostatyczna woda do wstrzykiwań (BWFI), sól fizjologiczna buforowana fosforanem, roztwór Ringera i roztwór dekstrozy. Zestaw może ponadto zawierać inne materiały pożądane z punktu widzenia komercyjnego i użytkownika, w tym inne bufory, rozcieńczalniki, filtry, igły i strzykawki. [0223] Poniższe przykłady podano w celu zilustrowania, a nie ograniczenia. Przykłady Przykład 1 Fc Cysteine Scanning [0224] 187 aminokwasów regionu Fc zostało indywidualnie zmutowanych do cysteiny z zastosowaniem mutagenezy QuikChange. Poziomy ekspresji i agregacji zostały zbadane w systemie wysokosprawnej transfekcji i ekspresji o wysokiej przepustowości na małą skalę. Skuteczność koniugacji badano początkowo sposobem wysokosprawnej, zautomatyzowanej koniugacji w fazie stałej, za pomocą urządzenia PhyNexus Micro-Extractor Automated i -67-

znormalizowano dla wydajności koniugacji Fc-T289. (Fc-T289C ma w tym teście skuteczność koniugacji wyższą niż 95%). [0225] Przeprowadzono ręcznie koniugację z fazą ciekłą na średnią skalę w celu potwierdzenia skuteczności koniugacji mutacji, które miały skuteczność koniugacji co najmniej około 50% tej obserwowanej dla T289C. Mutanty Fc eksprymowano w wytrząsanych kolbach i oznaczano poziom ekspresji w kondycjonowanych podłożach. Mutanty Fc oczyszczono na białku A i za pomocą SEC analizowano poziom agregacji. [0226] Tabela 2 przedstawia dane dotyczące koniugacji i ekspresji na małą skalę dla mutantów mających skuteczność koniugacji wynoszącą co najmniej 50% wartości obserwowanej dla T289C w sposobie Phynexus. Skuteczność koniugacji >100% pogrubiono i podkreślono; 80- 100% podkreślono; 50-80% to zwykły tekst. Klony o skuteczności koniugacji mniejszej niż 50% nie zostały pokazane. W tabeli 3 przedstawiono również wydajności koniugacji wybranych mutantów, co określono za pomocą ręcznej koniugacji w fazie ciekłej. Tabele 3 przedstawia poziom ekspresji i procent zawartości monomeru dla wybranych mutantów. [0227] Skuteczność koniugacji E258C i H435C z AF488 również zmierzono za pomocą spektrometrii mas i porównano z wydajnością wcześniej zgłoszonych mutacji Fc S239C, T289C i mutacji łańcucha lekkiego V205C (określanej tutaj jako LC-V205C). Jak podsumowano w tabeli 4, wszystkie mutacje mają skuteczność koniugacji prawie 100% (DAR = 2 oznacza 100% koniugację). Przeciwciało typu dzikiego włącza się jako kontrolę negatywną (tj. bez zmodyfikowanych reszt cysteinowych). [0228] Jak można zaobserwować na podstawie tych badań, cysteiny wprowadzone do większości miejsc przedstawionych w poniższej tabeli 2 mają wydajność koniugacji co najmniej ~ 50 i są dobrze eksprymowane. Miejsca te mogą być przydatne do wytwarzania koniugatów przeciwciała lub białka fuzyjnego Fc. W szczególności, zmodyfikowane cysteiny w wielu pozycjach, w tym 258, 274, 286, 289, 291, 293, 296, 318, 329, 340, 341, 342, 345, 401, 415, 433, 435 i 443, wykazują bardzo wysoką wydajność koniugacji w jednym lub obu formatach testu i są dobrze eksprymowane. Wykorzystanie zmodyfikowanych reszt cysteinowych w jednym lub więcej z tych miejsc jest rozważane dla wydajnego wytwarzania swoistych miejscowo koniugatów przeciwciała lub białka fuzyjnego Fc. TABELA 2: Podsumowanie badań efektywności koniugacji

Koniugacja z Ekspresja 96- Koniugacja ręczna Domena Pozycja Mutacja zastosowaniem studzienkowa % T289C Phynexus % T289C (Octet) mg/l

CH2 241 F241C 66,3 100,1 229

CH2 243 F243C 64,1 115,4 211

CH2 246 K246C 68,0 104,2 209,5

CH2 251 L251C 52,3 N/D 232,5 -68-

Koniugacja z Ekspresja 96- Koniugacja ręczna Domena Pozycja Mutacja zastosowaniem studzienkowa % T289C Phynexus % T289C (Octet) mg/l

CH2 253 1253C 57,2 N/D 105,5

CH2 254 S254C 101,2 90,6 193,5

CH2 258 E258C 114,3 143,4 120,5

CH2 264 V264C 85,6 148 239

CH2 269 E269C 115,6 123,5 234

CH2 271 P271C 107,9 101,2 189

CH2 272 E272C 122,6 130 177,5

CH2 274 K274C 95,4 146,8 198

CH2 280 D280C 67,0 niska ekspresja 69

CH2 281 G281C 107,6 141,7 N/D

CH2 283 E283C 100,9 90,6 183

CH2 284 V284C 62,4 125,5 246,5

CH2 285 H285C 78,2 176 249

CH2 286 N286C 123,6 123,2 236

CH2 288 K288C 86,0 128,1 193

CH2 291 P291C 128,8 138 192

CH2 293 E293C 104,6 120 176

CH2 294 E294C 76,9 90,6 212,5

CH2 296 Y296C 118,1 130,8 215,5

CH2 299 T299C 53,1 N/D 167

CH2 301 R301C 62,2 130,5 253

CH2 307 T307C 50,8 N/D 189 -69-

Koniugacja z Ekspresja 96- Koniugacja ręczna Domena Pozycja Mutacja zastosowaniem studzienkowa % T289C Phynexus % T289C (Octet) mg/l

niski % CH2 309 L309C 84,7 220 monomerów

CH2 311 Q311C 55,2 N/D 192

CH2 318 E318C 97,5 104 236,5

CH2 329 P329C 90,4 122,6 203

CH2 340 K340C 95,0 123,6 220

CH3 341 G341C 124,3 146,5 116,5

CH3 342 Q342C 117,1 126 107,5

CH3 345 E345C 123,7 121,2 122

CH3 355 R355C 91,3 85,5 122

CH3 357 E357C 58,5 65,4 128

CH3 358 L358C 51,8 79,5 120,5

CH3 375 S375C 61,3 72,0 123,5

CH3 385 G385C 77,2 125,2 195

CH3 386 Q386C 69,0 129,4 176

CH3 387 P387C 53,4 105,9 236

CH3 390 N390C 78,5 126,4 N/D

CH3 401 D401C 106,6 93,8 149,3

CH3 402 G402C 78,0 86,4 201,5

CH3 411 T411C 53,9 N/D 146,3

CH3 413 D413C 93,2 44,9 153,3 -70-

Koniugacja z Ekspresja 96- Koniugacja ręczna Domena Pozycja Mutacja zastosowaniem studzienkowa % T289C Phynexus % T289C (Octet) mg/l

CH3 415 S415C 121,6 95,6 109,8

CH3 417 W417C 57,3 32,5 88,1

CH3 418 Q418C 71,8 91,0 117,3

CH3 433 H433C 84,8 136,5 166

CH3 435 H435C 51,2 118,5 79

CH3 439 K439C 93,7 77,7 162

CH3 443 L443C 90,5 94,3 175

TABELA 3. poziom ekspresji i procent zawartości monomeru dla wybranych mutantów.

% Mutant Ekspresja (mg/ml) % monomeru Mutant Ekspresja (mg/ml) monomeru

1C1-WT 130 96,3 Q342C 85 95,8

S254C 107 76,4 E345C 113 96,4

E258C 152 95,4 R355C 122 95,9

V264C 216 94,7 L358C 87,8 95

E269C 130 94,4 S375C 101,5 96

P271C 131 94,5 G385C 87,2 72

E272C 113 81 Q386C 98,7 88

K274C 110 91,8 P387C 57,9 67

E283C 120 96 N390C 89,5 96

H285C 150 86,4 D401C 140 77

N286C 150 88,1 G402C 76,3 88

K288C 105 93,9 T411C 116,4 95 -71-

% Mutant Ekspresja (mg/ml) % monomeru Mutant Ekspresja (mg/ml) monomeru

P291C 97 73 D413C 79,4 82

E293C 125 85,7 S415C 59,4 51

E294C 173 80,7 W417C 138 94

Y296C 115 90,3 Q418C 58,7 91

R329C 109 95 H433C 84,9 66

L309C 137 40,2 H435C 91,9 90

E318C 131 95,5 K439C 103,5 98

K340C 111 95,4 L443C 98,4 96

G341C 187 92,4

TABELA 4: Efektywność koniugacji mierzona spektrometrią masową

Ab-koniugat DAR (IgG) + stosunek 2 leków (IgG)

1C1-E258C-AF488 2,04 98% (HC)

1C1-H435C-AF488 1,98 96% (HC)

1C1-S239C-AF488 1,98 96% (HC)

1C1-LC-V205C-AF488 2,06 99% (LC)

1C1-T289C-AF488 2,00 94% (HC)

Przykład 2 Mutanty insercyjne i wstępne badanie przesiewowe stabilności w surowicy [0229] Oprócz substytucji cysteinowych opisanych w przykładzie 1, wytworzono dwa mutanty insercyjne, w których reszta cysteinowa została wstawiona między reszty 239 i 240 (oznaczony C239ins) lub między reszty 238 i 239 (oznaczony 238ins). C239ins wykazywał wydajność koniugacji porównywalną z T289C (patrz tabela 6 i dane niepokazane). Było to nieoczekiwane, ponieważ skuteczność koniugacji mutacji V240C była bardzo niska (tylko ~ 11%). [0230] Zbadano stabilność w surowicy kilku z tych wariantów. W początkowych testach stabilności, Alexa Fluor 488 C5-maleimid (AFF488) sprzężono z wybranymi miejscami jako surogat leku w celu ułatwienia analizy. Próbki inkubowano ze standardową surowicą ludzką -72-

(NHS) lub buforem PBS przez 3-7 dni. W celu monitorowania stabilności koniugatów zawierających AFF488 po inkubacji z NHS lub PBS zastosowano test fluorescencyjnej chromatografii wykluczania (SEC). Do oszacowania stabilności zastosowano procent fluorescencji pozostającej w piku IgG. W przypadku próbek inkubowanych z ludzką surowicą procent AF488 przeniesionego do albuminy ludzkiej surowicy (HSA), dominującego biorcy wymiany leku w surowicy, można mierzyć bezpośrednio jako procent sygnału w piku HSA. Figury 2-8 przedstawiają odpowiednio profile SEC dla mutantów E258C, H435C, L443C, C239ins, S239C, LC-V205C i T289C i obejmują próbki inkubowane z NHS (panele A i C) i PBS (panele B i D) w dniu 0. (panele A i B) i dniu 7. (panele C i D). Wyniki tych badań przedstawiono na figurze 9 i zestawiono w tabeli 5. [0231] Stwierdzono, że cztery miejsca koniugacji (E258C, H435C, L443C i C239ins) w tych badaniach miały co najmniej 70% związku koniugatowego w stanie nienaruszonym po 7 dniach inkubacji w surowicy, podobnie do stabilności obserwowanej dla kilku przeciwciał obejmujących wcześniej znalezione mutacje LC -V205C i S239C (patrz TABELA 5). TABELA 5: Stabilność wybranych mutantów Cys skoniugowanych z AF488 7 dni inkubacji z surowicą

Ab-koniugat Utrzymany IgG-AF488% (dzień 7.) HSA-AF488%

1C1-E258C-AF488 81,48 14,2

1C1-H435C-AF488 89,92 9,01

1C1-L443C-AF488 83,83 13,14

1C1-239ins-AF488 75,77 17,0

1C1-S239C-AF488 77,05 17,6

1C1-LC-V205C-AF488 89,53 9,04

1C1-T289C-AF488 45,48 41,76

Przykład 3 Wiązanie receptora Fc i pomiary stabilności termicznej [0232] Zbadano wiązanie kilku mutantów z różnymi receptorami Fc. E258C, S239C, C239ins i LC-V205C wiążące się z FcRn były porównywalne do typu dzikiego (WT) w teście ELISA (figura 10A). Ponadto wiązanie E258C, LC-V205C i S239C do FcRn było zasadniczo takie samo po koniugacji z A488 (figura 10B). Dane te wskazują, że te mutacje, nawet skoniugowane z lekiem, nie mają wpływu na wiązanie FcRn. Z kolei mutacja H435C zniosła wiązanie FcRn (dane niepokazane), co odpowiada wcześniej zgłoszonym obserwacjom, że dodatnio naładowana reszta w pozycji EU 435 jest wymagana do wiązania FcRn. -73-

[0233] Przeprowadzono analizę BIACORE w celu określenia powinowactwa potrójnej mutacji C239ins, S442C i L234F/S239A/S442C dla ludzkich receptorów Fc, FcyRI, FcyRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa (zarówno dla alleli 158V jak i 158F) i FcRn. Dane przedstawione na figurze 11 pokazują, że C239w zredukowała wiązanie z FcyRI, zniosła wiązanie z FcyRIIa, FcγRIIb, FcyRIIIa (zarówno dla alleli 158V jak i 158F), ale miały nieznaczny wpływ na wiązanie FcRn. Natomiast S442C miał niewielki wpływ na wiązanie z jakimkolwiek testowanym receptorem Fc. Zgodnie z oczekiwaniem dodanie L234F i S239A, mutacji zgłoszonych jako zmniejszające wiązanie do pewnych FcyR, spowodowało znaczne zmniejszenie wiązania z FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa (zarówno dla alleli 158V jak i 158F). Tak więc mutacja C239ins może być szczególnie użyteczna do generowania swoistych miejscowo koniugatów przeciwciała lub fuzji Fc, gdy funkcja efektorowa jest niepożądana. [0234] Różnicową kalorymetrię skaningową (DSC) zastosowano do zbadania stabilności termicznej E258C, S239C, LC-V205C, C239ins i H435C w porównaniu z typem dzikim (WT). Jak pokazano na figurze 12, profile DSC mutacji E258C, S239C i Lc-V205C były w zasadzie takie same jak WT, wskazując, że te mutacje nie wpływają na termostabilność modelu 1C1 IgG1 zmierzonego za pomocą DSC. Nowy niższy pik topnienia pojawia się zarówno dla C239in jak i H435C, jednakże Tm1 jest nadal powyżej 60°C dla obu mutacji wskazując na jedynie minimalny wpływ na stabilność termiczną dla tych mutacji. Przykład 4 Stabilność w surowicy koniugatów pojedynczej mutacji z toksyną - cytotoksyczność [0235] Koniugaty 1C1-Fc-mutant Cys: 2 leki/Ab badano pod kątem stabilności w surowicy w teście cytotoksyczności: 1C1-S239C, 1C1-E258C, 1C1-H435C, 1C1-L443C, 1C1-LC-V205C, 1C1-239ins i 1C1-T289C. Testowano również kontrolę 1C1-ccADC -6 leków/Ab przygotowaną z zastosowaniem klasycznej koniugacji, kontrolę negatywną dla R347-S239C dla testu cytotoksyczności i 1C1-WT - działającą jako nieskoniugowana. Każdy koniugat przeciwciało-lek (ADC) zawiera toksynę opartą na aurystatynie. [0236] Jak pokazano w tabeli 6, każdy z mutantów cys ma wydajność koniugacji 88-98%, w przeciwieństwie do typu dzikiego wykazuje koniugację tła tylko 2%. ADC inkubowano z surowicą przez 0, 3 lub 7 dni i testowano na cytotoksyczność jak opisano w przykładzie 6 poniżej. Krzywe cytotoksyczności dla każdej pojedynczej mutacji i kontroli przedstawiono na figurach 13A, B i C (odpowiednio dni 0., 3. i 7.). Wartości EC50 podano również w tabelach poniżej wykresów. Wszystkie dane z tego badania zestawiono w tabeli 7 i przedstawiono krotność utraty EC50 w dniu 3. i 7. [0237] 1C1-E258C-ADC, 1C1-H435C-ADC, 1C1-L443C-ADC i 1C1-239ins-ADC, były stabilne po inkubacji w surowicy i porównywalne z innymi miejscami, które były stabilne w surowicy (np. LC-V205C), gdy zostały połączone za pomocą chemii maleimidu. EC50 tych mutacji zostało zachowane, nawet po 7. dniach inkubacji w surowicy. 1C1-T289C-ADC stracił trochę aktywności. Patrz tabela 7. Podobne badania przeprowadzono z zastosowaniem 1C1- 238-ins-ADC, jednak ta mutacja wykazywała utratę EC50 większą niż 6,25-krotność w ciągu 7. -74-

dni (dane niepokazane) wskazując, że koniugaty wykorzystujące chemię maleimidu w tym miejscu nie są stabilne i szybko tracą aktywność po inkubacji w surowicy. [0238] Cztery miejsca zmodyfikowanej cysteiny w regionie Fc znajdujące się w pozycjach UE 258, 435 i 443 (E258C, H435C, L443C), a także nowo zmodyfikowane miejsce insercji znajdujące się między pozycjami EU 239 a 240 (239ins) zostały zidentyfikowane jako wysoce dostępne dla koniugacji i o przykładnej stabilności w surowicy. TABELA 6: Efekt koniugacji mutanta 1C1-Fc-Cys

Pozycja Spektrometria masowa

1C1-S239C 97%

1C1-E258C 97%

1C1-T289C 92%

1C1-H435C 88%

1C1-L443C 97%

1C1-LC-V205C 98%

1C1-239ins 96%

R347-S239C 97%

1C1-WT 2%

TABELA 7: EC50 dla 1C1-pojedyncza mutacja Cys-ADC na komórkach DU145 i utrata cytotoksyczności po inkubacji z surowicą.

EC50 (ng/ml) Utrata EC50 (krotność)

ADC Dzień 0 Dzień 3 Dzień 7 Dzień 3 Dzień 7

1C1-S239C-ADC 47,4 72,1 75,6 1,52 1,59

1C1-LC-V205C-ADC 47,2 37,8 42,2 0,80 0,89

1C1-T289C-ADC 78,3 181,7 199,3 2,32 2,55

1C1-E258C-ADC 59 48,9 53,9 0,83 0,91

1C1-H435C-ADC 70,1 75,7 95,2 1,08 1,36 -75-

EC50 (ng/ml) Utrata EC50 (krotność)

ADC Dzień 0 Dzień 3 Dzień 7 Dzień 3 Dzień 7

1C1-239ins-ACD 60,9 84,3 91 1,38 1,49

1C1-L443C-ADC 52 54 51,2 1,04 0,98

1C1-ccADC 8,3 15,8 24 1,90 2,89

Przykład 5 Stabilność w surowicy koniugatów podwójnej mutacji z toksyną - cytotoksyczność [0239] W niektórych zastosowaniach może być pożądane posiadanie więcej niż dwóch leków na przeciwciało (to znaczy DAR 4 lub więcej). Opisane powyżej mutacje Cys badano w różnych kombinacjach ze sobą i/lub z innymi mutacjami, w tym w niektórych przypadkach mutacjami L234F-L235F (oznaczonymi "FF") w celu zniesienia funkcji efektorowej za pośrednictwem Fc i badano pod kątem stabilności w surowicy z zastosowaniem testu cytotoksyczności opisanego w przykładzie 6. Mutanty 1C1-Fc-2Cys i koniugaty: Koniugaty 4 leki/Ab badano pod kątem stabilności w surowicy w teście cytotoksyczności: 1C1-239ins- E258C, 1C1-239ins-H435C, 1C1-239ins-S442C, 1C1-FF-E258C-H435C, 1C1-FF-E258C- S442C i 1C1-FF-H435C-S442C. Uwzględniono również porównawczy 1C1-T289C - 2 leki/Abi kontrolę negatywną R347-S239C- 2 leki/Ab dla testu cytotoksyczności. Wszystkie ADC zawierają toksynę opartą na aurystatynie skoniugowaną z zastosowaniem chemii maleimidu. [0240] Jak pokazano w tabeli 8, każdy z mutantów cys ma wydajność koniugacji ~92-100%. ADC inkubowano z surowicą przez 0, 3 lub 7 dni i testowano na cytotoksyczność jak opisano w przykładzie 6 poniżej. Krzywe cytotoksyczności dla każdej kombinowanej mutacji i kontroli przedstawiono na figurach 14A, B i C (odpowiednio dni 0., 3. i 7.). Wartości EC50 podano również w tabelach poniżej wykresów. Wszystkie dane z tego badania zestawiono w tabeli 7 i przedstawiono krotność utraty EC50 w dniu 3. i 7. [0241] Wszystkie testowane 1C1-podwójny mutant Cys ADC były stabilne po inkubacji z surowicą. EC50 zostało utrzymane, szczególnie po 7 dniach inkubacji z surowicą. 1C1-T289C- ADC stracił trochę aktywności. Patrz TABELA 9. TABELA 8: Efekt koniugacji mutanta 1C1-Fc-Cys

Pozycja-koniugat za pomoc spektrometrii masowej

1C1-239ins-E258C-ADC ∼100%

1C1-239ins-H435C-ADC ∼100%

1C1-239ins-S442C-ADC ∼100% -76-

Pozycja-koniugat za pomoc spektrometrii masowej

1C1-FF-E258C-H435C-ADC ∼100%

1C1-FF-E258C-S442C-ADC ∼100%

1C1-FF-H435C-S442C-ADC ∼100%

1C1-T289C-ADC ∼92%

TABELA 9: EC50 dla 1C1-podwójny mutant Cys-ADC na komórkach DU145 i utrata cytotoksyczności po inkubacji z surowicą.

EC50 Utrata EC50 (krotność)

ADC Dzień 0 Dzień 3 Dzień 7 Dzień 3 Dzień 7

1C1-239ins-E258C-ADC 25,2 32,43 25,87 1,29 1,03

1C1-239ins-H435C-ADC 32,79 44,75 41,84 1,36 1,28

1C1-239ins-S442C-ADC 46,01 47,94 35,11 1,04 0,76

1C1-FF-E258C-H435C- ADC 34,91 43,41 41,96 1,24 1,20

1C1-FF-E258C-S442C- ADC 31,7 44,21 30,66 1,39 0,97

1C1-FF-H435C-S442C- ADC 35,69 48,12 40,67 1,35 1,14

1C1-T289C-ADC 85 402,6 243,4 4,74 2,86

Przykład 6 Materiały i sposoby [0242] Mutacja cysteinowa Fc: Ciężki łańcuch ludzkiej IgG1 zawierający przeciwciało 1C1 wklonowano do wektora zpojedynczą kasetą - pOE (MedImmune LLC) dla wygody mutagenezy. 187 aminokwasów we fragmencie Fc zmutowano indywidualnie do cysteiny za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej z zastosowaniem zestawu QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) w formacie 96- studzienkowej płytki zgodnie z instrukcją producenta. Mutację cysteinową w każdej pozycji potwierdzono przez sekwencjonowanie. Podobną metodologię zastosowano do generowania mutacji insercyjnych cysteiny. -77-

[0243] Wysokowydajna transfekcja i ekspresja na małą skalę: łańcuch kappa 1C1 wklonowano do wektora pOE-kappa (MedImmune LLC), DNA wektora łańcucha kappa 1C1 i wektora łańcucha ciężkiego 1C1 (typu dzikiego lub ze zmutowaną cysteiną) kotransfekowano do komórek 293F (Life Technologies, Grand Island, NY) w 96-studzienkowych płytkach, podłoże kondycjonowane (CM) zawierające eksprymowane przeciwciało 1C1 zebrano w dniu 5. po transfekcji, stężenie przeciwciała w CM określono za pomocą Octet stosując standardową krzywą wygenerowaną z oczyszczonym przeciwciałem 1C1 WT, ekspresję analizowano również za pomocą żelu białkowego w celu oszacowania poziomu agregacji. [0244] Wysokowydajna automatyczna swoista wobec miejsca koniugacja w fazie stałej: Alexa Fluor 488 C5-maleimid (Life Technologies Grand Island, NY) został zastosowany jako surogat ładunku leku w celu ułatwienia analizy. Wysokowydajną automatyczną koniugację przeprowadzono za pomocą urządzenia PhyNexus Micro-Extractor Automated (MEA) (PhyNexus, Inc., San Jose, CA). Przeciwciało 1C1 w CM wychwycono na immobilizowanym białku A w Phynexus Pipet Tips, zredukowanym przez tris(2- karboksyetylo)fosfinę (TCEP) (Thermo Scientific, Rockford, IL) w celu usunięcia wychwyconej cysteiny, utlenionej przez kwas dehydroaskorbinowy (dhAA) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), aby ponownie utworzyć wewnątrzłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe przeciwciała i skoniugować z 10-krotnym nadmiarem molowym Alexa Fluor 488 C5- maleimidu. Reakcję zatrzymywano N-acetylo-L-cysteiną (NAC) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), skoniugowane przeciwciało eluowano za pomocą buforu elucyjnego IgG. [0245] Analiza efektywności koniugacji: 1C1-T289C, który ma wydajność koniugacji wyższą niż 95% według analizy spektrometrem mas, wybrano jako kontrolę porównawczą koniugacji. Skuteczność koniugacji analizowano za pomocą fluorescencyjnej SEC, T289C- AF488 zastosowano do uzyskania krzywej standardowej: różne ilości T289C-AF488 wprowadzono do HPLC-SEC z detektorem fluorescencyjnym (Ex = 494, Em = 519). Wartość pola powierzchni pod krzywą (AUC) przy 280 nm (jako oś X) i 494 nm (jako oś Y) zastosowano do utworzenia krzywej standardowej. Krzywa standardowa była liniowa, R2 jest bardzo zbliżone do 1. 25 ul zmutowanego 1C1-AF488 załadowano na kolumnę SEC, wartości pola 280 i 494 każdej próbki zastosowano do obliczenia wydajności koniugacji z zastosowaniem krzywej standardowej T289C-AF488. Skuteczność koniugacji wykazano jako % koniugacji T289C, pewną wydajność koniugacji mutanta mierzono również za pomocą spektrometrii masowej i dobrze one korelowały. [0246] Ekspresja na średnią skalę i ręczna koniugacja: Przeprowadzono ręczną koniugację w celu potwierdzenia skuteczności koniugacji. Mutanty 1C1-Fc o ponad 50% wzorcowego poziomu koniugacji T289C ze sposobu zautomatyzowanej koniugacji w fazie stałej eksprymowano w komórkach 293F w kolbach do wytrząsania, a poziom ekspresji w kondycjonowanym podłożu mierzono za pomocą HPLC z białkiem A. Mutanty 1C1-Fc oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa z białkiem A, a poziom agregacji analizowano za pomocą SEC. W celu ręcznej koniugacji, 2 mg mutantów 1C1-Fc redukowano w 50 mM TCEP w 37°C przez 3 h, aby odbezpieczyć zmodyfikowane cysteiny, po czym przeprowadzono ekstensywną dializę w buforze koniugacyjnym (PBS + 1 mM EDTA, pH 7,2) -78-

w celu usunięcia wolnej cysteiny, a następnie utleniano w 50 mM dhAA w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, aby ponownie utworzyć wewnątrzłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe. Materiał ten koniugowano z 8-krotnym nadmiarem molowym Alexa Fluor 488 C5-maleimidu w temperaturze pokojowej przez 1 h, reakcję zatrzymano N-acetylo-L-cysteiną (NAC), wolny niesprzężony AF488 usunięto przez rozcieńczanie i zatężanie próbek przez 3 cykle w koncentratorze wirówkowym, skoniugowane mutanty 1C1-Fc zatężono do końcowej objętości 0,3-0,5 ml, stężenie białka mierzono za pomocą nano-kropli. Skuteczność koniugacji mierzono za pomocą fluor SEC i spektroskopii masowej. [0247] Inkubacja ADC w surowicy w celu określenia stabilności: 100 ug skoniugowanych z AF488 mutantów 1C1-Fc w 50 ul PBS (20% końcowej objętości) zmieszano z 200 ul standardowej ludzkiej surowicy lub PBS (80% końcowej objętości). Po filtracji, 10 ul mieszaniny załadowano na kolumnę HPLC fluor SEC, aby uzyskać kontrolne profile fluorescencji w dniu 0.inkubacji w surowicy. Resztę każdej mieszaniny inkubowano w 37°C przez 3 dni i 7 dni. Profile fluorescencyjne otrzymano w taki sam sposób, jak próbki z dnia 0. Stabilność surowicy analizowano dzieląc pik fluorescencji (obszar) koniugatu przeciwciało-lek (ADC) przez całkowitą fluorescencję (obszar), aby uzyskać procent fluorescencji ADC dla każdego punktu czasowego. % fluorescencji pozostający w piku IgG w dniu 0., dniach 3. i dniach 7. została wykorzystana do oszacowania stabilności. Nowy pik fluorescencji w obszarze albuminy ludzkiej surowicy (HSA) zaobserwowano dla próbek 3 dniowych i 7 dniowych inkubacji w surowicy. Ten pik obliczono w celu oszacowania procentu koniugatów przeniesionych do HSA. [0248] ELISA dla wiązania FcRn: Półstudzienkowe płytki ELISA pokryto 5 ug/ml każdego mutanta 1C1 Fc-Cys w 4°C przez noc, przemyto PBST, pH 5,8 i blokowano buforem blokującym ryba-żelatyna, pH 5,8 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

0,02-100 ug/ml FcRn-biotyna (rozcieńczonej w buforze do blokowania ryba-żelatyna, pH 5,8, całkowita ilość rozcieńczeń - 11) dodano do studzienek i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Płytki przemyto PBST, pH 5,8, dodano streptawidynę-HRP i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 40 minut, ELISA rozwinięto za pomocą TMB i zatrzymano za pomocą 0,2N H2SO4. OD450 mierzono za pomocą czytnika wielowarstwowego EnVision 2104 (PerkinElmer, Waltham, MA), EC50 analizowano za pomocą oprogramowania Prism 5, stosując log (agonista) w odpowiedzi na zmienne nachylenia jako model (GraphPad Software, San Diego, CA). [0249] Pomiar stałych wiązania FcγR w stanie równowagi: Stałe wiązania (KD) dla wiązania IgG z hFcyR zmierzono na urządzeniu ProteOn XPR36. W skrócie, przeciwciała unieruchomiono w wysokiej gęstości na czipie czujnika GLC, stosując standardową chemię sprzęgania aminowego, jak nakreślono przez producenta urządzenia. Końcowa gęstość powierzchniowa IgG wynosiła około 3000 RU. Referencyjna kuweta przepływowa została również przygotowana na tym chipie czujnika przy użyciu identycznego protokołu immobilizacji minus IgG. Roztwory podstawowe każdego hFcyR wytworzono przy 4000 nM, 16 000 nM lub 32000 nM w buforze dla urządzenia (buforowany fosforanem roztwór soli -79-

[PBS]/Tween/bufor kwasu etylenodiaminotetraoctowego [EDTA] zawierający 50 mM fosforanu, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA i 0,005% Tween-20), a następnie seryjnie rozcieńczono (1:3) w tym samym buforze, aby uzyskać pożądane serie stężeń dla każdego receptora: 1,82 nM-4,000 nM (hFcγRI), 197,5 nM-16,000 nM (hFcyRIIA), 395,1 nM-16,000 nM (hFcγRIIb), 21,9 nM-16,000 nM (hFcγRIIIA-158V) i 395-32,000 mM (hFcγRIIIA-158F). Każde stężenie FcγR wstrzykiwano na obie powierzchnie komórkowe, IgG 5T4-108-maia i referencyjne, przy szybkości przepływu 25 μl/min przez 8 min, podczas których zbierano dane dotyczące wiązania. Pomiędzy wstrzyknięciami powierzchnie regenerowano (tj. usuwano związane FcγR) za pomocą 60-sekundowego strzałów 5 mM HCl. Kilka wstrzyknięć buforu było również przeplatanych w całej serii wstrzyknięć. Później, jedno z tych wstrzyknięć buforowych wraz z danymi z komórek referencyjnych zastosowano do skorygowania danych wiązania dla jakichkolwiek artefaktów iniekcyjnych (np. nieswoiste wiązanie) za pomocą techniki zwykle określanej jako "podwójne odniesienie" (Myszka, 1999). Po zebraniu wszystkich danych wiązania uśredniono poszczególne zestawy danych pod kątem wiązania (odpowiedź w równowadze [Req]) w każdym stężeniu (C), a następnie dopasowano do wykresu izoterm wiązania 1:1 (Req vs. C). Następnie, stałe równowagi wiązania, KD, zostały wyprowadzone przy użyciu oprogramowania ewaluacyjnego dostawcy, wersja 3.1.0.6. [0250] Pomiar stałych wiązania w równowadze Ludzkie białko FcRn; Powinowactwo (KD) dla wiązania IgG z ludzkim białkiem FcRn (huFcRn) zmierzono na urządzeniu ProteOn XPR36. W skrócie, przeciwciała unieruchomiono w wysokiej gęstości na czipie czujnika GLC, stosując standardową chemię sprzęgania aminowego, jak opisano powyżej. Roztwory podstawowe białka huFcRn wytworzono przy 3000 nM w buforze dla urządzenia (50 mM bufor na bazie fosforanu sodu, pH 6, zawierający 150 mM NaCl i 0,05% Tween-20), a następnie seryjnie rozcieńczono (3:1) do 1,37 nM w tym samym buforze. Każde stężenie FcRn sekwencyjnie wstrzykiwano na powierzchnie komórkowe IgG 5T4-108-maia i odniesienia, połączonych szeregowo, przy prędkości przepływu 25 μl/min przez 16 min. Zebrano dane dla wiązania, a następnie 60-sekundowe wstrzyknięcie 50 mM buforu fosforanu sodu, pH 7,4, zawierającego 150 mM NaCl i 0,05% Tween 20 między wstrzyknięciami każdego receptora lub samego buforu, w celu regeneracji powierzchni IgG (tj. usunięcia związanego białka FcRn). Kilka wstrzyknięć buforu było również przeplatanych w całej serii wstrzyknięć. Później, jedno z tych wstrzyknięć buforowych referencyjnych zastosowano wraz z danymi z komórek do skorygowania danych wiązania dla jakichkolwiek artefaktów iniekcyjnych (np. nieswoiste wiązanie) za pomocą "podwójnego odniesienia" (Myszka, 1999). Po zebraniu wszystkich danych wiązania uśredniono poszczególne zestawy danych pod kątem wiązania (Req) w każdym stężeniu (C), a następnie dopasowano do wykresu izoterm wiązania 1:1 (Req vs. C). Następnie, stałe równowagi wiązania, KD, zostały wyprowadzone przy użyciu oprogramowania ewaluacyjnego dostawcy - BIA, wersja 4.1. [0251] Pomiar stabilności termicznej: Profile rozfałdowywania termicznego mutantów 1C1 Fc-Cys mierzono za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (VP-DSC, MicroCal, LLC, Northampton, MA), 0,503 ml mutanta 1C1 Fc-Cys przy stężeniu 1 mg/ml w 25 mM buforu histydynowego, pH 6,0 ładowano do komory, skanowano z szybkością 1°C/min od 20°C do -80-

110°C. Punkty środkowe przejścia (wartości Tm) z danych termogramu określono przy użyciu modelu nie-dwustopniowego w oprogramowaniu Origin 7 dostarczonym przez producenta. [0252] Koniugacja z toksyną: 2 mg każdego mutanta 1C1 Fc-Cys i wzorcowego mutanta kontrolnego skoniugowano ręcznie z toksyną 1 lub toksyną 2, stosując ten sam sposób co dla koniugacji z opisanym powyżej AF488. Wolny lek usunięto za pomocą chromatografii cieczowej CHT typu II (Ceramic Hydroxyapatite), eluowano gradientem 0-2 M NaCl w 10 mM buforze fosforanowym, pH 7,0. Pik monomerycznego ADC zebrano i dializowano w 25 mM histydynie, pH 6,0 plus 7% sacharoza i zatężono do 0,3 do 0,5 ml. Skuteczność koniugacji analizowano za pomocą spektrometrii masowej. [0253] Test cytotoksyczności w celu określenia stabilności ADC w surowicy: inkubacja surowicy ADC została ustalona w taki sam sposób jak opisano powyżej. Komórki DU-145 wysiano na płytki 96-studzienkowe o białych ścianach (VWR, Radnor, PA): 2000 komórek w 80 ul/studzienkę i hodowano przez noc w inkubatorze 37°C z 5% CO2. Próbki ADC-surowica rozcieńczono do 0,004-80 ug/ml za pomocą podłoża hodowlanego, 20 ul rozcieńczonej ADC- surowica dodano w 80 μl komórek, w trzech powtórzeniach. Końcowe stężenia ADC w hodowli wynosiły 0,0008 do 16ug/ml, komórki inkubowano w inkubatorze przez kolejne 3 dni, a żywotne komórki oznaczano przy użyciu zestawu CellTiter-Glo Luminesecent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI). Sygnał luminescencyjny mierzono za pomocą czytnika wielowarstwowego EnVision 2104 (PerkinElmer, Waltham, MA) i EC50 dla zabijania komórek analizowano za pomocą oprogramowania Prism 5, stosując log (agonista) w odpowiedzi na zmienne nachylenia jako model (GraphPad Software, San Diego, CA). [0254] Powyższy opis konkretnych przykładów wykonania jest wystarczający, aby umożliwić innym, stosując wiedzę znawcy, łatwą modyfikację i/lub przystosowanie do różnych zastosowań takich konkretnych przykładów wykonania, bez zbędnego eksperymentowania, bez odchodzenia od ogólnych przedstawionych tutaj koncepcji. Wynalazek zdefiniowano w zastrzeżeniach.

-81-

Zastrzeżenia patentowe 1. Związek koniugatowy zawierający przeciwciało zmodyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc i co najmniej jedno ugrupowanie heterologiczne, przy czym: (i) domena Fc przeciwciała lub białka fuzyjnego Fc zawiera insercję aminokwasową cysteiny między pozycjami 239 a 240, przy czym numeracja pozycji aminokwasowych jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata; i (ii) przy czym co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie jest skoniugowane z aminokwasem cysteinowym wstawionym między pozycje 239 i 240. 2. Związek koniugatowy według zastrzeżenia 1 zawierający ponadto jedną lub więcej zmodyfikowanych cystein w pozycjach 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 lub 439, przy czym numeracja pozycji aminokwasowej jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. 3. Związek koniugatowy według zastrzeżenia 2, przy czym zmodyfikowany aminokwas cysteinowy jest wybrany z substytucji aminokwasowych cysteiny w pozycjach aminokwasowych 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 lub 435 i ich kombinacjach. 4. Związek koniugatowy według zastrzeżenia 2, przy czym zmodyfikowany aminokwas cysteinowy jest wybrany z substytucji aminokwasowych cysteiny w pozycjach aminokwasowych 258 lub 435 i ich kombinacjach. 5. Związek koniugatowy według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 4 zawierający: (a) cysteinę (C) wstawioną między serynę (S) zlokalizowaną w pozycji 239 i walinę (V) zlokalizowaną w pozycji 240; i (a) cysteinę (C) podstawiającą kwas glutaminowy (E) zlokalizowany w pozycji 258; (b) cysteinę (C) podstawiającą histydynę (H) zlokalizowaną w pozycji 435; (c) cysteinę (C) podstawiającą argininę (R) zlokalizowaną w pozycji 435; lub (d) ich kombinację, przy czym numeracja pozycji aminokwasowych jest zgodna z indeksem EU przedstawionym przez Kabata. 6. Związek koniugatowy według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 5, przy czym domena Fc zawiera ponadto co najmniej jedną zmodyfikowaną resztę cysteinową wybraną z substytucji aminokwasowych cysteiny w pozycjach aminokwasowych 239, 248, 254, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 440, 441, 442, 443 i 446. 7. Związek koniugatowy według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 6, przy czym każde z heterologicznych ugrupowań jest skoniugowane ze zmodyfikowaną cysteiną. -82-

8. Związek koniugatowy według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 7, przy czym domena Fc przeciwciała lub białka fuzyjnego Fc jest ludzką domeną Fc IgG, opcjonalnie wybraną z grupy składającej się z domeny Fc IgG z IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. 9. Związek koniugatowy według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 8, przy czym białko fuzyjne Fc zawiera domenę wiążącą antygen wybraną z grupy składającej się z: (a) scFv; (b) diaciała; (c) fragmentu Fd; (d) fragmentu Fv; (e) fragmentu F(ab')2; i (f) fragmentu F(ab). 10. Związek koniugatowy według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 8, przy czym przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne, przeciwciało biswoiste, przeciwciało wieloswoiste, przeciwciało chimeryczne, przeciwciało ludzkie lub przeciwciało humanizowane. 11. Związek koniugatowy według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 10, przy czym co najmniej jedno heterologiczne ugrupowanie jest toksyną, lekiem, radionuklidem, immunomodulatorem, cytokiną, limfokiną, chemokiną, czynnikiem wzrostu, czynnikiem martwicy nowotworu, hormonem, antagonistą hormonu, enzymem, oligonukleotydem, DNA, RNA, siRNA, RNAi, mikroRNA, peptydowym kwasem nukleinowym, fotoaktywnym środkiem terapeutycznym, środkiem antyangiogennym, środkiem proapoptotycznym, nienaturalnym aminokwasem, peptydem, lipidem, węglowodanem, cząsteczką rusztowania, znacznikiem fluorescencyjnym, peptydem do uwidaczniania, biotyną, środkiem przedłużającym okres półtrwania w surowicy, znacznikiem wychwytu, środkiem chelatujący, stałym podłożem lub ich kombinacją, i przy czym koniugacja zachodzi na jednej ze zmodyfikowanych cystein. 12. Związek koniugatowy według zastrzeżenia 11, przy czym lek jest aurystatyną, tubulyzyną, pirolobenzodiazepiną (PBD) lub maitanzynoidem. 13. Związek koniugatowy według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 12, przy czym przeciwciało zmodyfikowane cysteiną lub białko fuzyjne Fc swoiście wiąże się z co najmniej jednym celem. 14. Związek koniugatowy według zastrzeżenia 13, przy czym celem jest antygen nowotworowy, a heterologiczne ugrupowanie jest środkiem przeciwnowotworowym. 15. Związek koniugatowy według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 14 do zastosowania w terapii.

-83-

-84-

-85-

-86-

-87-

-88-

-89-

-90-

-91-

-92-

-93-

-94-

-95-

-96-

-97-

-98-

-99-

-100-

-101-

-102-

-103-

-104-

-105-

-106-

LISTA SEKWENCJI <110> MEDIMMUNE, LLC < 120> SPRZĘŻONE ZWIĄZKI ZAWIERAJĄCE PRZECIWCIAŁA MODYFIKOWANE CYSTEINĄ <130> CYS-115WO1 <140> PCT/US2015/025237 <141> 2015-04-10 < 150> 61/ 978 481 <151> 11.04.2014 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny znacznik 6xHis <400> 1

<210> 2 <211> 250 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(9) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Może być obecny lub nie <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(14) <223> Ten region może obejmować -4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(19) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(24) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(29) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(34) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(39) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(44) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(49) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50)

<223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(54) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(59) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(64) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(69) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(74) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(79) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(84) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85)..(85) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (86)..(89) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(94) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(99) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(104) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(109) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(114) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne<220> <221> MISC_FEATURE <222> (115)..(115) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (116)..(119) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (120)..(120) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (121)..(124) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (125)..(125) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (126)..(129) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (130)..(130) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (131)..(134) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (135)..(135) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (136)..(139) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (140)..(140) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (141)..(144) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (145)..(145) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (146)..(149) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (150)..(150) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (151)..(154) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (155)..(155)

<223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (156)..(159) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne<220> <221> MISC_FEATURE <222> (160)..(160) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (161)..(164) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (165)..(165) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (166)..(169) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (170)..(170) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(174) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być

nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (175)..(175) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (176)..(179) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne<220> <221> MISC_FEATURE <222> (180)..(180) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (181)..(184) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (185)..(185) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (186)..(189) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (190)..(190)

<223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (191)..(194) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (195)..(195) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (196)..(199) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (200)..(200) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (201)..(204) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (205)..(205) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (206)..(209) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (210)..(210) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (211)..(214) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (215)..(215) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (216)..(219) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (220)..(220) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (221)..(224) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne<220> <221> MISC_FEATURE <222> (225)..(225) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (226)..(229) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne<220> <221> MISC_FEATURE <222> (230)..(230) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (231)..(234) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (235)..(235) <223> Może być obecny lub nie

<220> <221> MISC_FEATURE

<222> (236)..(239) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (240)..(240) <223> Może być obecny lub nie <220> <221> MISC_FEATURE <222> (241)..(244) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (245)..(245) <223> Może być obecny lub nie <220> <221> MISC_FEATURE <222> (246)..(249) <223> Ten region może obejmować 1-4 reszty, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (250)..(250) <223> Może być obecny lub nie <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(250) <223> Sekwencja ta może obejmować 1-50 powtarzających się jednostek "(Gly)x-(Ser)y", gdzie x wynosi od 1 do 4, y oznacza 0 lub 1

<220> <223> Patrz opis jak złożono dla szczegółowego opisu substytucji i korzystnych przykładów

wykonania <400> 2

<210> 3

<211> 100 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(100) <223> Ta sekwencja może obejmować 1-100 reszt, przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <400> 3

<210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd <400> 4

<210> 5

<211> 200 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(200) <223> Ta sekwencja może obejmować 1-100 powtarzających się jednostek "Gly Ala", przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <400> 5

<210> 6 <211> 300 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) -. (300) <223> Ta sekwencja może obejmować 1-100 powtarzających się jednostek "Gly Gly Ses", przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<400> 6

<210> 7 <211> 400 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(400) <223> Ta sekwencja może obejmować 1-100 powtarzających się jednostek "Gly Gly Gly Ser", przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <400> 7

<210> 8 <211> 800 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(300) <223> Ten region może obejmować 1-100 powtarzających się jednostek "Gly Gly Ser", przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <220> <221> MISC_FEATURE <222> (301)..(800) <223> Ten region może obejmować 1-100 powtarzających się jednostek "Gly Gly Gly Gly Ser", przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne

<400> 8

<210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd <400> 9

<210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd <400> 10

<210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd <400> 11

<210> 12 a211> 18 a212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd <400> 12

<210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd <400> 13 <210> 14 <211> 400 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(400)

<223> Ta sekwencja może obejmować 1-100 powtarzających się jednostek "Gly Gly Gly Gly", przy czym niektóre pozycje mogą być nieobecne <400> 14

<210> 15 <211> 217 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<400> 15

<210> 16 <211> 216 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<400> 16

<210> 17 <211> 217 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

<220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<400> 17

<210> 18 <211> 217 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd

<400> 18