UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMAÇÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

FRANCISCO JOSÉ BATISTA DE LIMA JÚNIOR

INVESTIGAÇÃO DA β--FENILETILAMINA SOBRE CONTRATILIDADE DE DIFERENTES ÓRGÃOS ISOLADOS E MECANISMO RESPONSÁVEL POR EFEITO DUAL EM TIRAS ISOLADAS DE FUNDO DE ESTÔMAGO DE RATOS

FORTALEZA – CE

2018

FRANCISCO JOSÉ BATISTA DE LIMA JÚNIOR

INVESTIGAÇÃO DA β-FENILETILAMINA SOBRE CONTRATILIDADE DE DIFERENTES ÓRGÃOS ISOLADOS E MECANISMO RESPONSÁVEL POR EFEITO DUAL EM TIRAS ISOLADAS DE FUNDO DE ESTÔMAGO DE RATOS

Tese de Doutorado submetida à Coordenação do Programa de Pós- Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisisto parcial para obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Área de concentração: Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães

FORTALEZA – CE

2018

FRANCISCO JOSÉ BATISTA DE LIMA JÚNIOR

INVESTIGAÇÃO DA β-FENILETILAMINA SOBRE CONTRATILIDADE DE DIFERENTES ÓRGÃOS ISOLADOS E MECANISMO RESPONSÁVEL POR EFEITO DUAL EM TIRAS ISOLADAS DE FUNDO DE ESTÔMAGO DE RATOS

Tese de Doutorado submetida à Coordenação do Programa de Pós- Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisisto parcial para obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Aprovada em: ____/ ____/ ____

BANCA EXAMINADORA

______Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães - Orientador Universidade Federal do Ceará (UFC)

______Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima Universidade Federal do Ceará (UFC)

______Prof. Dr. Manasses Claudino Fonteles Universidade Federal do Ceará (UFC) - Universidade Estadual do Ceará (UECE)

______Prof. Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento Universidade Estadual do Ceará (UECE)

______Profa. Dra. Cláudia Lúcia Martins da Silva Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) AGRADECIMENTOS

A Deus e Nossa Senhora, os primeiros nomes aos quais recorri nos momentos de desespero.

Aos meus pais, Franzé e Eliezita, pelo suporte, incentivo, amor e orações. Nada do que eu fizer retribuirá á altura o que eles fizeram e tiveram de abdicar em nome da minha educação e de minha irmã.

A minha irmã Carol, que me motiva a sempre dar o melhor de mim, manter-me convicto aos ensinamentos que recebemos em casa e constitui um dos poucos portos seguros que tenho nesse mundo.

A minha esposa Adriana, pelo apoio durante essa empreitada, em todas suas alegrias e dificuldades, e por sempre acreditar no meu potencial.

Ao meu orientador Prof. Dr. Pedro Magalhães, pelos ensinamentos, dedicação com a formação dos seus alunos, amizade e confiança no meu trabalho. Devo agradecê- lo em especial pelo incentivo a docência, mesmo sem eu perceber, quando me colocou para ministrar minha primeira aula prática juntamente com a Dra. Teresinha de Brito ainda em 2007. Da mesma forma, mostrou a importância da dos projetos de extensão dentro da Universidade com as atividades do museu de ciências da UFC, a Seara da Ciência, capazes de revigorar o ânimo do acadêmico mais desestimulado. Todo elogio que eu receber, seja como docente ou pesquisador, será indiretamente dado a ele.

A minha “irmã científica” Dra. Teresinha Brito, que ao mesmo tempo em que aprendeu comigo, ensinou-me, preocupou-se comigo e sempre esteve presente quando eu precisei.

Ao Prof. Dr. Armênio Santos, sempre presente com conselhos, prosas alegres e ao qual eu agradeço pela chance de ter vivenciado uma parte do meu doutorado oversea.

Ao Prof. Dr. Daniel Sifrim pelo acolhimento no Wingate Institute durante seis meses, pelas conversas ricas em conhecimento e ajuda no período distante de casa.

A amiga Juliana Fernandes, sempre disposta ajudar, paciente comigo desde os tempos de faculdade e maior responsável pelo sucesso dos experimentos com células PC12. A amiga Kalinne Gadelha, aluna com brilho no olho pela pesquisa, a qual eu sou eternamente grato pelo apoio, especialmente no início do doutorado, e amizade.

A amiga Tatyanne Linhares, que se juntou ao time no final da minha jornada, sempre cheia de carinho e alegria.

Aos colegas e amigos de Laboratório de Farmacologia do Músculo Liso durante todo esse período, Thiago Brasileiro, Daniel Maia, Emanuella Feitosa, Alfredo Vasconcelos, Gabrieli Bezerra, Hélder Veras, Fernanda Nóbrega, pela convivência agradável e apoio substancial na realização dos experimentos que compõe essa tese.

Aos colegas de departamento e pós-graduação, Rômmulo Siqueira, Klingem Freitas, Lucas Nicolau, Karolina Cavalcante, Jéssica Raquel, Mônica Belém, Camila Meirelles, Carlos Wagner, e todos os outros que não estão citados aqui, mas ajudaram quando preciso e proporcionaram bons momentos de convívio.

Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Farmacologia da UFC, que sempre nos inspiram a seguir a carreira acadêmica de forma apaixonada.

Aos técnicos de laboratório que contribuíram para os resultados presentes nesta tese, em especial Haroldo Pinheiro.

Aos técnicos administrativos da UFC, em especial Célia e Laura do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, sempre atenciosas e pacientes com os alunos.

“Yesterday,

All my troubles seemed so far away.”

(John Lennon / Paul McCartney)

RESUMO

β-feniletilamina (β-FEA) foi considerada por muito tempo um composto simpaticomimético indireto. Com a descoberta de receptores associados a aminas-traço (TAAR) revelou-se uma função como ligante, mas o papel do TAAR em tecidos periféricos ainda não foi solucionado. Procurando por respostas relacionadas ao recrutamento de TAAR, foram comparadas respostas da β-FEA aos agonistas adrenérgicos fenilefrina e isoproterenol. Em baixas concentrações, β-FEA relaxou anéis de aorta previamente contraídos com fenilefrina sem interferência de propranolol. Sob tensão de repouso, β-FEA induziu contração, efeito insensível ao prazosin e observado em altas concentrações. De forma análoga a fenilefrina, β-FEA induziu contrações em hemissecções de baço sensíveis ao prazosin. β-FEA estimulou cronotropismo positivo em átrio direto isolado com potência inferior ao isoproterenol, mas sensível ao propranolol, enquanto em anéis de traqueia induziu relaxamento independente de propranolol. Em tensão basal, tiras de fundo de estômago contraíram em resposta a β- FEA, um efeito que envolve influxo de Ca2+ extracelular. Fenilefrina foi inerte e isoproterenol relaxou tiras de fundo, achados sugestivos as contrações induzidas por β- FEA não envolvia receptores adrenérgicos. Antagonistas serotoninérgicos, mas não o antagonista de TAAR1, inibiram as contrações induzidas por β-FEA em tiras de fundo gástrico. Quando essas tiras foram previamente contraídas com KCl, β-FEA passou a exercer efeitos relaxantes, refratários aos antagonistas serotoninérgicos, mas inibidos pelo inibidor de adenilato ciclase, MDL 12,330A. Portanto, contração de β-FEA em fundo gástrico parece envolver receptores de serotonina, e quando estimulada com elevadas concentrações de KCl, β-FEA induz relaxamento aparentemente pela ativação de TAAR1 e produção de AMPc, confirmando um papel dual para β-FEA na musculatura lisa de fundo gástrico.

Palavras-chave: Aminas traço. Adrenérgico, Receptor associado a amina traço (TAAR). ABSTRACT

STUDY OF β-PHENYLETHYLAMINE ON DIFFERENT ISOLATED ORGANS CONTRATILITY AND MECHANISM FOR DUAL EFFECT ON ISOLATED STRIPS OF RAT STOMACH FUNDUS

β-Phenylethylamine (β-PEA) was considered for a long time an indirect sympathomimetic compound. Cloning of trace amine-associated receptors (TAAR) unmasked β-PEA as neurotransmitter, but the role of TAAR in peripheral tissues is yet unsolved. Searching for a response related to a recruitment of TAAR induced by β- PEA, we compared its effects on rat muscle preparations with those typically elicited by the adrenergic agonists phenylephrine or isoproterenol. At lower concentrations, β-PEA relaxed aortic rings previously contracted with phenylephrine in a propranolol- independent manner. In aortic rings under resting tonus, β-PEA induced contraction, effect insensitive to prazosin and observed only at higher β-PEA concentrations. Like phenylephrine, β-PEA induced prazosin-sensitive contractions in spleen strips. In isolated atrium, β-PEA stimulated atrial chronotropism with a lesser potency than isoproterenol but in a propranolol-dependent manner. In tracheal rings, β-PEA induced relaxation not inhibited by propranolol. Under resting tonus, gastric fundus strips contracted in response to β-PEA, an effect that involved extracellular Ca2+ recruitment. Phenylephrine was inert and isoproterenol was relaxant on fundic strips, findings suggestive that β-PEA-elicited contractions did not involve adrenergic receptors. Antagonists of 5-HT receptors, but not EPPTB, a TAAR1 antagonist, inhibited β-PEA- induced contractions on fundic strips. When fundic strips were previously contracted by KCl, β-PEA exerted relaxant effects refractory to 5-HT antagonists, but inhibited by the adenylyl cyclase inhibitor MDL-12,330A.Thus, β-PEA contracted rat gastric fundus with involvement of 5-HT receptors. Under KCl-elicited stimulus, β-PEA-induced relaxation through activation of TAAR1 signalling via the adenylyl cyclase pathway , suggesting a dual role for β-PEA on gastric fundus smooth muscle.

Keywords: Trace amine. Adrenergic. Trace amine associated receptor (TAAR).

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura química das aminas-traço β-feniletilamina, tiramina, octopamina e triptamina...... 11

Figura 2. Estrutura química das aminas noradrenalina, adrenalina, dopamina e isoproterenol...... 13

Figura 3. Esquema da metodologia de contratilidade de órgão isolado...... 22

Figura 4. Esquema da metodologia de contratilidade de vasos mesentéricos em miógrafo de agulha...... 23

Figura 5. Efeito da β-feniletilamina sobre vasos mesentéricos...... 29

Figura 6. Traçados experimentais da fenilefrina e β-feniletilamina em aorta...... 32

Figura 7. Gráficos com efeitos da β-feniletilamina sobre aorta...... 33

Figura 8. Efeito da β-feniletilamina sobre hemissecções de baço...... 35

Figura 9. Efeito da β-feniletilamina sobre átrio direito...... 38

Figura 10. Efeito da β-feniletilamina sobre anéis de traqueia isolada...... 40

Figura 11. Efeito da β-feniletilamina sobre tiras de fundo de estômago...... 42

Figura 12. Efeito da β-feniletilamina sobre segmentos de íleo...... 44

Figura 13. Influência do Ca2+ extracelular e participação de receptor muscarínico da β- feniletilamina ...... 46

Figura 14. Investigação da participação de Ca2+ extracelular no efeito contrátil da β- feniletilamina...... 48

Figura 15. Participação de canais para Ca2+ operados por estoque em m. liso gástrico.51

Figura 16. Ação do SKF 96365 sobre contrações induzidas por aumento de K+ extracelular ...... 52

Figura 17. Ação do SKF 96365 sobre β-feniletilamina...... 53

Figura 18. Ação da β-feniletilamina sobre contrações induzidas por estimulação de campo elétrico em tiras de fundo de estômago...... 55

Figura 19. Efeito da β-feniletilamina sobre tiras de fundo de estômago em meio a diferentes antagonistas serotoninérgicos ...... 57 Figura 20. Ação da serotonina (5-HT) frente a diferentes antagonistas serotoninérgicos...... 59

Figura 21. Influência da difenidramina sobre o efeito da β-feniletilamina em tiras de fundo de estômago ...... 60

Figura 22. Influência do EPPTB sobre o efeito da β-feniletilamina em tiras de fundo de estômago ...... 61

Figura 23. Ação da β-feniletilamina em tiras de fundo de estômago em meios com concentrações crescentes de K+ ...... 63

Figura 24. Ação da carbamilcololina em tiras de fundo de estômago em meios com concentrações crescentes de K+ ...... 64

Figura 25. Reversão de K+ 80mM com β-feniletilamina na presença de inibidores da guanilato ciclase, adenilato ciclase e antagonistas serotoninérgicos...... 66

Figura 26. Ensaio de citotoxicidade em células PC12 ...... 67

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 11

1.1. Aminas-traço ...... 11 1.2. Receptores de aminas-traço, TAARs...... 14 2. JUSTIFICATIVA ...... 19

3. OBJETIVOS ...... 20

3.1. Objetivo geral ...... 20 3.2. Objetivos específicos ...... 20 4. METODOLOGIA ...... 21

4.1. Animais...... 21 4.2. Soluções e Drogas...... 21 4.3. Contratilidade in vitro...... 22 4.4. Contratilidade de vasos mesentéricos isolados em miógrafo de agulha...... 23 4.5. Análise estatística...... 24 4.6. Protocolos experimentais de contratilidade...... 24 4.6.1. Construção de curvas concentração-efeito sobre tensão de repouso...... 24 4.6.2. Avaliação de efeito inibitório de contrações subsequentes...... 25 4.6.3. Construção de curvas concentração-efeito em preparação pré-contraída...... 25 4.6.4. Experimentos em que foi necessária remoção de Ca2+ extracelular...... 25 4.7. Cultivo de células PC12 e avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT...... 26 5. RESULTADOS ...... 28

5.1. Investigação de efeitos da β-feniletilamina em diferentes tecidos ...... 28 5.1.1. Ação da β-feniletilamina sobre vaso mesentérico isolado...... 28 5.1.2. Efeito da β-feniletilamina sobre anéis de aorta isolados...... 30 5.1.3. Efeito da β-feniletilamina sobre hemissecções de baço...... 34 5.1.4. Efeito sobre cronotropismo de átrio direito isolado...... 36 5.1.5. Efeito relaxante sobre o músculo liso de vias aéreas...... 39 5.1.6. Ação da β-feniletilamina sobre tiras de fundo de estômago isoladas...... 41 5.1.7. Avaliação da β-feniletilamina sobre musculatura longitudinal de íleo isolado. 43 5.2. Investigação do mecanismo envolvido no efeito contrátil da β-feniletilamina sobre tiras isoladas de fundo de estômago ...... 45 5.2.1. Influência do bloqueio de receptores muscarínicos e remoção do Ca2+ extracelular...... 45 5.2.2. Investigação dos canais utilizados para influxo de Ca2+ ...... 47 5.2.3. Estudo do potencial do SKF96365 como bloqueador da entrada de Ca2+ operada por estoque em tiras de fundo de estômago...... 49 5.2.4. Efeito do SKF96365 sobre a entrada de Ca2+ induzida por β-feniletilamina. .. 53 5.2.5. Efeito do β-feniletilamina em contrações induzidas por estimulação de campo elétrico...... 54 5.2.6. Efeito contrátil da β-feniletilamina em presença de antagonistas serotoninérgicos...... 56 5.2.7. Participação de TAARs no efeito contrátil da β-feniletilamina em tiras de fundo de estômago...... 61 5.2.8. Efeito contrátil da β-feniletilamina e carbamilcolina em meio a diferentes concentrações extracelulares de K+...... 62 5.2.9. Reversão de contração induzida por K+ 80 mM com β-feniletilamina na presença de bloqueadores da síntese de nucleotídeos cíclicos e antagonistas serotoninérgicos...... 65 5.3. Avaliação de citotoxicidade em células PC12. pelo ensaio MTT...... 67 6. DISCUSSÃO ...... 68

7. CONCLUSÃO ...... 80

REFERÊNCIAS ...... 82

11

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aminas-traço

β-feniletilamina, também conhecida por β-fenetilamina ou 2-feniletilamina, é estruturalmente composta por anel benzênico ligado a etilamina. Essa substância pode ser incluída no grupo de aminas-traço, aminas biogênicas presentes em baixas concentrações (0,1 – 10 nM) no organismo de humanos e outros mamíferos, principalmente no sistema nervoso central. Além da β-fenetilamina, merecem destaque dentro do grupo das aminas traço: tiramina, octopamina e triptamina (Figura 1). Apesar da baixa concentração circulante em vertebrados, algumas dessas aminas-traço são os principais neurotransmissores em várias espécies de invertebrados (ZUCCHI et al., 2006).

A maior participação de aminas-traço, como a octopamina, na regulação de processos biológicos em invertebrados pode ser estimada comparando as quantidades dessa substância em diferentes tecidos nas diferentes espécies (Tabela 1). Octopamina está presente em concentrações muito superiores nas espécies de invertebrados em comparação a mamíferos, desempenhando a função de neurotransmissor (AXELROD & SAAVEDRA, 1977).

Tabela 1. Quantificação (em ng/g de tecido) de octopamina em diferentes tecidos de diferentes espécies.

Tecido ng/g de tecido Rato coração 47 baço 96 cérebro 23 Cérebro humano hipotálamo 80 Polvo lobo basal superior 4600 Lagosta primeiro feixe nervoso torácico 830 Minhoca gânglio cerebral 7390 Barata Cérebro 3950 Fonte: AXELROD & SAAVEDRA, 1977. 12

Figura 1. Estrutura química das aminas-traço β-feniletilamina, tiramina, octopamina e triptamina.

β-feniletilamina p-tiramina

octopamina triptamina

Fonte: elaborada pelo autor.

As aminas-traço octopamina e tiramina estão envolvidas na sinalização de processos como o controle do movimento (NAGAYA et al., 2002; SARASWATI et al., 2004) e metabolismo (LI et al., 2016) de Drosophila melanogaster, espécie de mosca.

Apesar da função neurotransmissora das aminas-traço em invertebrados, não existe uma equivalência funcional bem definida em mamíferos. Em geral, os efeitos observados com essas substâncias são referidos como simpaticomiméticos (ZUCCHI et al., 2006). A princípio, essas ações simpaticomiméticas especificamente da β- feniletilamina, foram atribuídas principalmente à sua capacidade de modular a liberação neuronal de catecolaminas, tanto pelo aumento de liberação quanto pela inibição de recaptação, ou seja, um efeito essencialmente indireto (BAKER et al., 1976).

Ao longo da segunda metade do séc. XX começaram a surgir diferentes trabalhos descrevendo ações diretas da β-feniletilamina sobre órgãos viscerais, que não poderiam ser explicadas apenas por uma ação indireta Foi demonstrado, por exemplo, que essa substância é capaz de induzir contração em tiras helicoidais de aorta isolada de rato, mesmo que a potência tenha sido inferior a outras aminas, como noradrenalina e dopamina, requerendo concentrações próximas de 1mM para exercer tal efeito (HANSEN et al.,1980). Além disso, demonstrou-se que ela produz efeito cronotrópico 13 positivo em átrio isolado de rato (PESCE E ADLER-GRASCHINSKY, 1983) e induz contração de parênquima pulmonar e broncoconstrição de pulmões perfundidos de cobaias (HAWTHORN et al., 1985).

Talvez influenciados pela subdivisão dos receptores adrenérgicos proposta por Raymond P. Ahlquist no final dos anos 40 (AHLQUIST, 1980), os autores que descreveram os efeitos da β-feniletilamina sem a necessidade da liberação de outras aminas biogênicas, justificavam essas ações simpaticomiméticas devido a uma interação direta sobre receptores α- e β-adrenérgicos. Essa parecia ser a explicação mais plausível com base nas ferramentas utilizadas, como antagonistas adrenérgicos, e no conhecimento disponível até aquele momento. Outro fator que pode ter contribuído para essa interpretação é a própria similaridade estrutural entre a β-feniletilamina e agonistas adrenérgicos clássicos como a noradrenalina e isoproterenol (isoprenalina) (Figura 2).

Figura 2. Estrutura química das aminas noradrenalina, adrenalina, dopamina e isoproterenol.

noradrenalina adrenalina

isoproterenol dopamina Fonte: elaborada pelo autor.

Tiramina e β-feniletilamina também estão presentes em algumas espécies de bactérias, algas e fungos e as rotas bioquímicas mais comuns para sua obtenção consistem na descarboxilação dos aminoácidos tirosina e fenilalanina, respectivamente. 14

Também são encontradas em alimentos como queijo e chocolate, em que podem ser resultantes de fermentação bacteriana, ou, como acontece especificamente com chocolate, resultantes do processo térmico ao qual o cacau é submetido (IRSFELD et al., 2014).

Mesmo em concentrações relativamente baixas quando comparada a outras aminas biogênicas, é importante destacar que essa a ingestão de alimentos ricos em β- feniletilamina podem elevar sua concentração no nosso organismo (IRSFELD et al., 2014). Além disso, o uso de fármacos que inibem a monoaminoxidase B (MAO-B) também pode elevar essas concentrações, considerando que a β-feniletilamina é o substrato preferencial dessa isoforma de MAO (GUIMARÃES & SOARES-DA- SILVA, 1997, LAM et al., 2015).

Um efeito que correlaciona a presença de aminas-traço em alimentos, utilização de inibidores da MAO e observação de efeitos simpaticomiméticos é o “efeito do queijo”. A tiramina presente em alimentos é metabolizada pelas isoformas enzimáticas MAO-A e MAO-B intestinal e hepática, o que normalmente leva a níveis plasmáticos baixos. Essa tiramina remanescente, por sua vez, será recaptada por neurônios pós- ganglionares simpáticos pelo transportador de noradrenalina, mas se a função da MAO nessa célula estiver intacta, ela também será desaminada. A inibição da monoaminoxidase, especialmente por fármacos seletivos para MAO-A como a tranilcipromina, eleva os níveis plasmáticos de tiramina após a ingestão de alimentos ricos nessa substância, o que está associado a efeitos cardiovasculares complexos oscilando entre cronotropismo negativo ou positivo e vasodilatação ou vasopressão. A complexidade dos efeitos cardiovasculares da tiramina se deve a variedade de possíveis mecanismos envolvidos, desde a liberação da noradrenalina estocada em vesículas em todas as terminações pós-sinapticas até a ativação de uma família de receptores próprios de aminas-traço, os TAARs (FINBERG & GILLMAN, 2011).

1.2. Receptores de aminas-traço, TAARs.

Uma nova perspectiva para os efeitos observados com aminas-traço foi aberta no início dos anos 2000 após a descoberta de uma família de receptores acoplados a proteína G ativados por essas substâncias, (TAAR, do inglês trace amine-associated 15 receptors) (BUNZOW et al., 2001; ZUCCHI et al., 2006). Da mesma forma que os receptores das demais aminas biogênicas, os receptores de aminas traço são do tipo acoplado a proteína G pertencentes a Classe A (análogos da Rodopsina). Esses receptores podem ser divididos em dois grupos: TAAR1 a 4, ativados preferencialmente por aminas primárias (RNH2), e TAAR5 a 9, ativados preferencialmente por aminas terciárias (R3N) (FERRERO et al., 2012).

A ativação dos receptores TAAR tem sido tradicionalmente associada a um aumento dos níveis de nucleotídeos cíclicos (LAM et al., 2015). Bunzow et al. (2001), um dos grupos envolvidos na descoberta dos TAARs, explicitaram o aumento dos níveis de AMPc em decorrência da ativação de TAAR1 em células HEK293 (human embryonic kidney). As substâncias utilizadas para avaliação desse efeito de aumento de AMPc incluíam β-feniletilamina, tiramina, 5-HT, dopamina, noradrenalina e diferentes anfetaminas e, apesar de tiramina e β-feniletilamina apresentarem maiores potências farmacológicas, todas foram capazes de produzir efeito. Isso significa que desde suas primeiras descrições, já se assumia a possibilidade de ativação de TAARs por outras aminas que não as aminas-traço.

Acredita-se que a evolução da especificidade ligante-receptor dos TAARs contribuiu para adaptação de mamíferos térios (marsupiais e placentários) à dinâmica do ambiente terrestre, permitindo uma acurada percepção das várias aminas voláteis (EYUN et al., 2016). Por exemplo, a resposta estereotipada de medo e fuga que roedores apresentam ao perceber o odor de predadores carnívoros foi atribuída à percepção de β-feniletilamina, presente em grande quantidade na urina de grandes felinos e produzido de forma mais intensa em carnívoros quando comparada a herbívoros (FERRERO et al., 2011).

Além da importância da interação entre aminas traço e TAARs do epitélio olfatório para quimiorrecepção, o envolvimento desses receptores e seus ligantes em determinados distúrbios do sistema nervoso central também já foram demonstrados. Pacientes com transtorno de déficit de atenção e hiperatividade apresentam níveis reduzidos de β-feniletilamina, e quando tratados com metilfenidato, a melhora dos sintomas normalmente está associada ao aumento dos níveis dessa amina-traço (IRSFELD et al., 2014). 16

TAARs e seus ligantes também estão associados a depressão e esquizofrenia. No que diz respeito a depressão, pacientes depressivos têm níveis reduzidos de β- feniletilamina e a suplementação dessa amina ou fenilalanina (precursor de β- feniletilamina) produz melhora nos sintomas. Além disso, os inibidores da MAO, como a tranilcipromina, utilizados no tratamento da depressão, sabidamente elevam os níveis de aminas-traço no SNC (LAM et al., 2015).

A hipótese melhor aceita para explicar a esquizofrenia é o excesso da transmissão dopaminérgica. Os antipsicóticos comumente empregados no tratamento, antagonistas dopaminérgicos, não apresentam boa eficácia contra os sintomas negativos, como a anedonia, e perda cognitiva. Além disso, esses antagonistas dopaminérgicos podem levar ao desenvolvimento de distúrbios motores devido a inibição da transmissão dopaminérgica nigroestriatal e, especificamente os antipsicóticos de segunda geração, ainda podem levar a ganho de peso e diabetes. Nesse contexto, agonistas TAAR1 (RO5256390 e RO5263397) mostraram promissores efeitos antipsicóticos sem distúrbio motor ou ganho de peso associado, propriedades pró-cognitivas e antidepressivas em modelos pré-clínicos (REVEL et al., 2013).

O TAAR1 aparentemente modula os sistemas serotoninérgico e dopaminérgico no cérebro. Seus ligantes diminuem a liberação de dopamina por neurônios dopaminérgicos o que pode até mesmo reduzir a atividade da via de recompensa (mesolímbica), uma via dopaminérgica, responsável pelos efeitos reforçadores positivos de algumas drogas psicoativas, por exemplo, a cocaína (LAM et al., 2015).

Apesar da inquestionável importância da interação entre aminas-traço e TAARs no SNC, esses receptores também podem ser encontrados em outras partes do corpo. Um estudo publicado por Chiellini et al. (2012) mediu através de PCR em tempo real (quantitativo) a expressão dos nove diferentes tipos de TAAR em diversos órgãos de ratos. A Tabela 2 expressa alguns desses resultados em número de cópias de cDNA/μg de RNA total.

Os resultados de Chiellini et al. (2012) demonstraram a presença de TAARs em diferentes tecidos de ratos, mas vale destacar a densidade elevada de TAAR1 no estômago desses animais em comparação a outros tecidos (Tabela 2). O estômago de humanos também expressa receptores TAAR1 em diferentes regiões, mas aparentemente em maior quantidade no piloro. Alimentos ricos em aminas-traço, como a β- 17

feniletilamina, agem diretamente sobre os TAAR1 na mucosa gástrica e possivelmente modulam a secreção e contrações desse órgão (OHTA et al., 2017).

Tabela 2. Expressão de TAARs em diferentes órgãos de rato.

Tecido Taar1 Taar2 Taar3 Taar4 Taar5 Taar6 Taar7 Taar8 Taar9 Córtex < 10 - < 10 - - - - 65±20 < 10 cerebral Coração < 10 < 10 < 10 < 10 - - - 192±23 - Intestino 11,1 - - < 10 - - - < 10 < 10 Pulmão < 10 - - < 10 < 10 - - 21±1 - Baço < 10 - - 93±4 - - - 12±2 - Estômago 297±44 ------13±1 -

O traço significa “não detectado”, já o valor “< 10” indica sinais detectados abaixo da faixa de linearidade do ensaio (10 cópias de cDNA/μg de RNA total). Fonte: CHIELLINI et al., 2012.

Considerando a distribuição desses receptores, a descrição dos TAARs criou uma nova perspectiva de análise de resultados obtidos com exposição de órgãos viscerais a β-feniletilamina. Até que ponto os efeitos simpaticomiméticos observados até então não seriam resultado da ativação de um TAAR, ao invés da ativação de receptores adrenérgicos? Dois empecilhos dos estudos que se propõem a fazer análises funcionais para responder a essa pergunta são: 1) a escassez de substâncias com seletividade para os TAARs; e 2) diferentemente do que acontece em estudos com células transfectadas com receptores pontuais e específicos, um sistema biológico in natura é rico em estruturas que podem interagir entre si ou com a molécula testada.

Até a presente data, só existe um antagonista seletivo para TAAR1 disponível para compra, o N-(3-Etoxi-fenil)-4-(1-pirrolidinil)-3-(trifluorometil)benzamida, ou simplesmente EPPTB. Sua ação antagonista sobre receptores TAAR1 foi demonstrada inicialmente em estudos eletrofisiológicos com neurônios dopaminérgicos da área tegmental ventral do cérebro de camundongos. Basicamente, a exposição ao EPPTB diminui a taxa de disparos desses neurônios dopaminérgicos de forma semelhante ao que acontece se houver knockout de receptores TAAR1, destacando mais uma vez a importância desse receptor para situações como a esquizofrenia e efeitos de recompensa da cocaína (LAM et al., 2015). 18

A complexidade de efeitos da β-feniletilamina em tecidos periféricos fica evidente ao observarmos suas respostas sobre tecidos vasculares. Broadley et al. (2009) demonstraram em experimentos de perfusão do leito mesentérico, acompanhado do registro de pressão do mesmo, que β-feniletilamina causa quedas de forma dependente de concentração de pressão de perfusão previamente elevada pela infusão de Phe, o que indica ação vasodilatadora. O mesmo trabalho mostra que em preparações de aorta isolada e cobaia, a β-feniletilamina induz vasoconstrição, efeito que não sofreu interferência de prazosina, antagonista α1-adrenérgico. Em 2013, quatro dos autores desse mesmo trabalho de 2009, publicam um novo artigo no European Journal Pharmacology, demonstrando a contração induzida pelas aminas-traço β-feniletilamina, tiramina e octopamina em anéis de aorta isolada de rato, e atribuindo essa resposta vasoconstritora a ativação de TAAR1 (BROADLEY et al., 2013).

Narang et al. (2014), em estudos de contratilidade de vasos mesentéricos, mostraram que β-feniletilamina é capaz de relaxar tecidos pré-contraídos com diferentes agonistas α1-adrenérgicos, dentre os quais se incluía a fenilefrina. Este mesmo trabalho ainda demonstra que a amina-traço em estudo não relaxa pré-contrações induzidas pelo agonista de receptor prostanóide, PGF2α, ou pelo análogo de tromboxano A2, U-46619, concluindo que β-feniletilamina pode se comportar como antagonista α-adrenérgico.

Observando somente os resultados da β-feniletilamina sobre tecidos vasculares a luz da existência de receptores específicos para essa substância, já pode ser observada a dificuldade em estabelecer um mecanismo de ação único para esse tecido. No espaço de tempo de dois anos (2013 e 2014) há autores afirmando efeito vasoconstritor devido ação agonista sobre receptores TAAR1 (BROADLEY et al., 2013) e efeito vasodilatador decorrente de ação antagonista de receptores α-adrenérgico (NARANG et al., 2014).

Portanto, a determinação do mecanismo de ação da β-feniletilamina em diferentes tecidos da periferia encontra como obstáculo a possibilidade de interações com receptores adrenérgicos, que foi a base de explicação dos seus efeitos durante muitos anos, e a possibilidade de interação com uma família de receptores de amina- traço, que ainda requer melhor compreensão.

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2. JUSTIFICATIVA

A investigação do mecanismo de ação da β-feniletilamina em órgãos isolados na periferia pode ajudar na compreensão dos seus efeitos centrais. Fato importante quando se considera a influência de aminas-traço e seus receptores em distúrbios psiquiátricos e mecanismos de dependência de substâncias.

Além disso, um estudo que integre avaliações da β-feniletilamina sobre diferentes tecidos considerando uma potencial interação com receptores adrenérgicos, contudo à luz da existência de receptores próprios para esse ligante, pode revelar aspectos despercebidos em estudos que a avaliaram pontualmente, bem como apontar novas substâncias com capacidade de modular seus efeitos.

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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral  Estudar os efeitos da β-feniletilamina sobre a contratilidade de órgãos isolados dos sistemas cardiovascular, respiratório e gastrintestinal de rato, comparando esses efeitos aos de agonistas adrenérgicos clássicos.

3.2. Objetivos específicos  Executar experimentos em preparações de vaso mesentérico e anéis de aorta no intuito de comparar a β-feniletilamina a agonistas α- e β-adrenérgicos.  Demonstrar os efeitos da β-feniletilamina sobre hemissecções de baço, comparando sua atividade a agonista α-adrenérgico.  Determinar os efeitos da β-feniletilamina sobre cronotropismo de átrio direito isolado e sua possível interação com receptores β-adrenérgicos.  Investigar o efeito da β-feniletilamina sobre musculatura lisa traqueal e buscar entender a participação de receptores adrenérgicos nesse efeito.  Investigar os efeitos e mecanismo de ação da β-feniletilamina sobre a contratilidade de tiras de fundo de estômago isoladas.  Determinar os efeitos da β-feniletilamina sobre a contratilidade de íleo isolado.  Investigar o potencial citotóxico da β-feniletilamina sobre células obtidas de feocromocitoma de ratos (PC12).

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4. METODOLOGIA

4.1. Animais.

Para realização dos experimentos foram utilizados ratos (Rattus novergicus) machos da variedade Wistar, pesando de 190 a 240 g, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC). Os animais receberam água e ração ad libitum e foram aclimatados ao ambiente experimental em ciclos naturais dia/noite de 12 horas de duração cada. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso Animais (CEUA) da UFC sob o número 14/17.

4.2. Soluções e Drogas.

As substâncias de alta pureza requeridas para os protocolos experimentais, como β-feniletilamina, acetilcolina, atropina, verapamil, propranolol, isoproterenol, fenilefrina, ciproheptadina, difenidramina, tetraetilamônio (TEA), procaína, ketanserina, tapsigargina, SKF96365, 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona (ODQ) e MDL- 12,330A foram adquiridas da empresa SIGMA-ALDRICH® (St. Louis, MO, EUA). EPPTB foi adquirido junto a empresa Tocris Bioscience® (Bristol,UK). A solubilização de cada uma das substâncias seguiu a recomendação do fornecedor.

As soluções fisiológicas utilizadas foram:

(1) Solução de Tyrode: NaCl 136 mM, KCl 5 mM, MgCl2 0,98 mM, NaH2PO4 0,36 mM, NaHCO3 11,9 mM, CaCl2 2 mM e Glicose 5,5 mM.

(2) Solução de Krebs-Henseleit: NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, MgSO4 1,2 mM, KH2PO4

1,2 mM, NaHCO3 25 mM, CaCl2 2,5 mM e Glicose 11,1 mM.

Ambas as soluções tiveram o pH ajustado para 7,4 imediatamente antes do início dos experimento. Naqueles experimentos em que foi necessário um meio livre de cálcio, o CaCl2 não foi adicionado à solução durante seu preparo e ainda foi adicionado um agente quelante de cálcio, mais especificamente o etileno glicol-bis (2-aminoetileter)- N,N,N′,N′- ácido tetraacético (EGTA).

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4.3. Contratilidade in vitro.

Os animais foram anestesiados com tribromoetanol (250 mg/Kg) e eutanasiados por exsanguinação antes do início da obtenção de órgãos isolados. Os órgãos de interesse foram cuidadosamente removidos e transferidos para uma placa de Petri contendo solução fisiológica apropriada para o tecido. Nos experimentos com átrio direito e baço foi utilizada solução de Krebs-Henseleit, enquanto os demais tecidos, fundo de estômago, íleo, cólon e traquéia foram imersos com solução de Tyrode.

Figura 3. Esquema da metodologia de contratilidade de órgão isolado.

Fonte: elaborada pelo autor.

Uma vez removido o tecido adjacente, o baço foi dividido em duas partes para montagem. Já para obtenção de tiras do fundo de estômago o órgão teve de ser aberto pela região da pequena curvatura e rebatido para exposição de sua superfície interna e cortado linearmente para obtenção de tiras de aproximadamente 1 cm de comprimento da porção superior. Íleo e cólon foram simplesmente divididos em segmentos de aproximadamente 0,5 cm. Por sua vez, a traquéia foi dividida em segmentos que continham três a quatro anéis traqueais (aproximadamente 0,3 cm). Baço, tiras de fundo de estômago, átrio direito, íleo e cólon foram atados a fios de algodão pelas duas extremidades, enquanto os anéis de traqueia foram presos por triângulos metálicos de modo a captar contrações que estreitam seu lúmen. Todos os tecidos foram conectados pela porção superior a transdutores de força em câmaras para órgãos isolados contendo 23

5 mL de solução fisiológica, pH 7,4, mantida aquecida a 37°C e constantemente aerada com mistura carbogênica (95%O2; 5%CO2) conforme esquematizado na Figura 3 (Radnoti Glass Technology Inc.). A tensão basal aplicada ao tecido foi de 0,5 g para o átrio direito, 0,7 g para o baço e 1 g para os demais. Os sinais gerados pelo transdutor de força foram registrados em um sistema de aquisição computadorizado (LabChart®, ADInstruments, Austrália). Adicionalmente, os tecidos ainda puderam ser estimulados eletricamente com auxílio de um estimulador de campo elétrico (modelo LE12406, Panlab, Espanha).

4.4. Contratilidade de vasos mesentéricos isolados em miógrafo de agulha.

Após anestesia seguida de eutanásia, conforme descrito no item anterior, foram retirados segmentos de vasos mesentéricos nas proximidades das alças intestinais. Esse procedimento foi executado com auxílio de estereomicroscópio em placa de Petri contendo solução fisiológica de Krebs-Henseleit. Pequenos vasos (2 mm de comprimento) correspondentes à segunda ramificação da artéria mesentérica superior foram cuidadosamente retirados (quatro anéis por animal). Os anéis foram montados horizontalmente no miógrafo de agulha modelo 610M-DMT (DMT, Aahaus, Dinamarca) passando-se dois fios de tungstênio (40 μm de diâmetro), um preso a um micrômetro para ajuste de tensão, e outro a um transdutor de força para medida de força isométrica expressa em mN (Figura 4).

Figura 4. Esquema da metodologia de contratilidade de vasos mesentéricos em miógrafo de agulha.

Fonte: elaborada pelo autor. 24

4.5. Análise estatística.

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M) acompanhados do número de observações experimentais (n), ou seja, número de tecidos isolados utilizados. O valor de CE50, concentração responsável por 50% do efeito máximo observado, foi obtido por interpolação semi-logarítmica e expresso como média geométrica e intervalo de confiança de 95%.

A significância estatística foi considerada quando a probabilidade da ocorrência da hipótese de nulidade foi menor que 5% (p<0,05). A significância dos resultados foi avaliada por teste de Mann-Whitney ou análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias. Quando a análise de variância revelou diferença estatística segui-se um teste de múltipla comparação de Holm-Sidak, um teste mais sensível que os testes de Tukey e Bonferroni, segundo o software utilizado. O programa que executou esses testes foi o SigmaStat (Systat Software Inc, USA) e para confecção de gráficos utilizou-se o SigmaPlot (Systat Software Inc, USA).

4.6. Protocolos experimentais de contratilidade.

Os protocolos experimentais variaram de acordo com o tecido testado e a pergunta específica a que se pretendia responder. A sequência de adições de cada protocolo é brevemente descrita na seção de resultados e discussão junto ao respectivo resultado, mas estão listadas a seguir de forma genérica as abordagens empregadas nos resultados.

4.6.1. Construção de curvas concentração-efeito sobre tensão de repouso.

Nesses protocolos a substância testada é simplesmente adicionada a solução fisiológica na cuba de modo a obter concentrações conhecidas. Nos protocolos apresentados no presente trabalho, essas concentrações foram produzidas de maneira cumulativa, ou seja, adicionou-se uma concentração e a seguinte foi obtida pela adição de quantidade suficiente da substância para completá-la.

Com finalidade de normalizar as respostas, e estabelecer um critério de comparação entre diferentes abordagens, é estabelecida uma resposta de referência, por exemplo, o efeito de determinada substância pode ser expresso em percentual de um 25 estímulo prévio com aumento da concentração extracelular de K+ para 60mM. Esse artifício foi utilizado para experimentos em aorta, baço, fundo de estômago e íleo.

4.6.2. Avaliação de efeito inibitório de contrações subsequentes.

Esse protocolo foi utilizado apenas em vasos mesentéricos. Basicamente, é adicionada uma concentração da substância teste antes da adição de outra que se deseja saber se sofre interferência da primeira. A construção é feita com exposição a concentrações cada vez maiores da substância teste e uma concentração fixa daquela que será adicionada em sequência. A cada combinação de concentração do pretenso inibidor e substância a ser inibida, a preparação tem sua solução fisiológica renovada. Nessa situação, a substância conhecida é adicionada em um primeiro momento sem a presença de nenhuma outra para servir de referência, assim fica clara a capacidade da substância teste que é adicionada a seguir de interferir nessa resposta.

4.6.3. Construção de curvas concentração-efeito em preparação pré-contraída.

Já nesses protocolos a substância testada foi adicionada a cuba durante a vigência de um estímulo prévio com outra droga capaz de induzir contração, mais precisamente no plateau dessa resposta. Normalmente, a concentração da substância empregada para induzir essa pré-contração é aquela capaz de induzir um efeito submáximo. Desse modo, foi possível verificar a capacidade da substância teste em induzir uma resposta relaxante, naturalmente, sem descartar a possibilidade de ausência de efeito ou indução de contração adicional. Mais uma vez, as adições ocorreram de forma cumulativa.

A resposta de referência para normalização e quantificação dessas curvas concentração-efeito foi, na maior parte dos experimentos, o próprio estímulo utilizado na pré-contração. A única exceção aconteceu no gráfico em que curvas concentração- efeito a β-feniletilamina foram construídas após pré-contrações com diferentes concentrações de K+, o que exigiu outra referência que fosse comum a todos os experimentos.

4.6.4. Experimentos em que foi necessária remoção de Ca2+ extracelular.

Em protocolos que se fez necessária a ausência de Ca2+ no meio extracelular, a solução fisiológica era preparada sem a adição de CaCl2, e além disso foi adicionado o quelante de Ca2+ EGTA. 26

Em uma série específica de experimentos com tiras isoladas de fundo de estômago, foi necessário depletar os estoques intracelulares de Ca2+. O método utilizado para isso consistiu na estimulação por repetidas vezes da preparação com agonista muscarínico carbamilcolina (CCh) em um meio livre de Ca2+. Quando não era verificada mais nenhuma resposta contrátil mediante adição de CCh, assumia-se que o

IP3 (trifosfato de inositol) produzido pela ligação do agonista ao receptor muscarínico não conseguia mais disponibilizar Ca2+ no citossol devido a depleção dos estoques. Depois de conseguir esse estado, foi adicionado as preparações tapsigargina, um agente capaz de bloquear a SERCA (sarcoplasmic endoplasmic reticulum calcium ATPase), estrutura na membrana do retículo responsável pela reestocagem de Ca2+.

4.7. Cultivo de células PC12 e avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT.

Células de feocromocitoma de rato, PC12, foram adquiridas junto ao Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ, BR) e cultivadas em garrafas apropriadas (75 cm2) no meio Ham F12 suplementado com 2,5% de soro fetal bovino, 15% de soro de cavalo e 1% de mistura antibiótica (penicilina/estreptomicina). As células foram mantidas em estufa a 37°C, 5% de CO2 e o crescimento foi acompanhado com auxílio de microscópio invertido. Ao atingirem a confluência próxima a 80%, as células foram tripsinizadas e distribuídas em iguais quantidades em placas de 96 poços.

Uma vez nas placas, foram adicionados aos poços combinações de concentrações crescentes de β-feniletilamina (1, 10, 30, 100, 300 e 600 μM) ou de 6- hidróxi-dopamina (6-OH-DA, 25, 50, 100, 200 e 400 μM). Uma parte dos poços recebeu apenas os respectivos veículos utilizados na solubilização das substâncias (controles). Depois dessa adição, as células permaneceram na estufa em condições normais por 24 horas.

Em seguida, procedeu-se com o ensaio MTT de citotoxicidade, em que se avalia a capacidade da enzima succinato desidrogenase de células viáveis em converter o brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) em cristais de formazam, saindo então de uma coloração amarelada para cor púrpura. Dessa forma, por meio de uma análise colorimétrica, avalia-se a densidade de células viáveis em cada poço, ou a citotoxicidade relativa induzida pelas substâncias utilizadas. Passadas 24 27 horas de incubação com β-feniletilamina ou 6-OH-DA, o meio foi substituído por outro contendo 10% de MTT, que permaneceu por 3 horas. Após esse período, o sobrenadante foi novamente retirado e foi adicionado 150 μL de DMSO puro em cada poço para induzir a lise celular e exposição do formazan produzido no interior das células. Após uma breve agitação das placas, a absorbância foi aferida em leitor de microplacas a 540 nm. Os resultados obtidos foram expressos de maneira relativa em percentual de viabilidade celular comparada aos poços que não receberam qualquer tratamento. 28

5. RESULTADOS

5.1. Investigação de efeitos da β-feniletilamina em diferentes tecidos

5.1.1. Ação da β-feniletilamina sobre vaso mesentérico isolado.

O efeito vascular da β-feniletilamina foi investigado em artérias mesentéricas isoladas. Após a montagem e período de estabilização apropriado, as preparações foram pré-contraídas pelo aumento da concentração extracelular de K+ para 60mM, e ao atingir o plateau seguiu-se a adição de ACh 1μM. O relaxamento médio induzido pela ACh foi 26,6±7,1% (n=10) da pré-contração com K+ 60mM. O protocolo em si consistiu de estímulo com fenilefrina (Phe) 10μM a ser tomado como referência e repetição desse mesmo estímulo em duas condições: sem adição de qualquer outra substância (controle) ou na presença de concentrações crescentes de β-feniletilamina (1 - 600μM) conforme mostrado na Figura 5A.

No grupo controle não houve alterações significativas das respostas contráteis ao decorrer das repetições com médias oscilando dentro do intervalo de 93 a 102% (n=5; p>0,05 ANOVA), por outro lado, a adição prévia de β-feniletilamina (1 - 600μM) produziu inibição dependente de concentração com valor de CE50 de 92,60 [48,40 – 136,8]μM (n=10). O gráfico com as médias dos grupos está representado na Figura 5B.

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Figura 5. Efeito da β-feniletilamina sobre vasos mesentéricos.

A

B 100

M) 80 

60 * 40

20

Contração (% Phe 10 Phe (% Contração Controle (n=5) -feniletilamina (n=10) 0

1 10 100 1000

-feniletilamina (M) (A) Traçado experimental mostrando efeito de sucessivas contrações induzidas por fenilefrina (Phe) 10μM na ausência (parte superior) ou presença de concentrações crescentes de β-feniletilamina (1 - 600μM – parte inferior) em vasos mesentéricos isolados. (B) Gráfico com percentuais de resposta à Phe 10μM executada previamente em cada canal. Enquanto um grupo recebeu concentrações crescentes de β- feniletilamina (1 - 600μM) antes de cada estímulo, outro recebeu apenas as adições de Phe 10μM em momentos equivalentes sem adição prévia de qualquer substância (controle). *, primeira concentração estatisticamente menor quando comparada à contração de referência, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

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5.1.2. Efeito da β-feniletilamina sobre anéis de aorta isolados.

No intuito de obter uma resposta contrátil reconhecidamente mediada pela ativação de receptores α-adrenérgicos, foi construída uma curva concentração-efeito à Phe (1nM - 100μM) em preparações de anéis isolados de aorta (Figura 6A), que resultou em contração com CE50 de 0,10[0,02 – 0,19] μM e efeito máximo equivalente à 121,9 ± 3,3% de uma contração prévia com K+ 60mM (n=5), observado já na concentração de 10μM (Figura 7A). Essa resposta é decorrente da ativação de receptores α1D-adrenérgicos (DOCHERTY, 2010). Quando o antagonista adrenérgico prazosina (10nM) foi adicionado à cuba antes da construção de uma nova curva à Phe (10nM - 300μM), houve uma redução significativa da resposta (p<0,05, ANOVA pós- teste de Holm-Sidak), onde o novo efeito máximo observado na concentração de 300μM foi apenas 76,6 ± 16,7% de K+ 60mM (n=6, Figura 7A).

Quando foi construída curva concentração-efeito à β-feniletilamina (10nM – 3mM) em anéis isolados de aorta também foi observada contração, no entanto foram necessárias concentrações superiores àquelas empregadas com Phe (Figura 6B). O efeito máximo observado com β-feniletilamina ocorreu na maior concentração utilizada (3mM) e foi 112,0 ± 9,3% de K+ 60mM (n=8), contudo, a adição prévia de prazosina 10nM foi incapaz de interferir com essa resposta (p>0,05, ANOVA), e o efeito máximo nessa condição foi de 146,0 ± 9,6% (n=5, Figura 7B).

Mudando a perspectiva dos protocolos experimentais, a preparação foi pré- contraída com Phe 1μM, seguido de adições de concentrações crescentes e cumulativas de isoproterenol (1nM - 100μM), empregado como substância reconhecidamente capaz de relaxar a preparação através da participação de receptores β-adrenérgicos (Figura 6C), ou β-feniletilamina (1 - 300μM, Figura 6D), nosso objeto de estudo.

Isoproterenol produziu relaxamento dependente de concentração com CE50 de 0,51[0,28 – 0,74] μM, e inibição máxima até 12,5 ± 6,9% da contração inicial com Phe 1 μM na concentração de 10μM (n=6), ou seja, relaxamento de 87,5%. A adição prévia do antagonista β-adrenérgico, propranolol 1 μM, aumentou significativamente o valor de CE50 para 6,82 [4,02 – 9,63] μM (p<0,05, Mann-Whitney test), com a nova inibição máxima de 3,0 ± 6,9% residuais da Phe 1 μM somente na concentração de 100μM (n=6, Figura 7C). 31

Quando a β-feniletilamina (1 - 300μM) foi adicionada após pré-contração de Phe

1 μM também foi visualizado relaxamento. A CE50 para esse efeito foi 91,2 [69,0- 113,8] μM e o máximo relaxamento observado reduziu a tensão a 24,7 ± 3,7% (n=15) da contração inicial de Phe 1 μM. Mesmo com a adição prévia de propranolol 5 μM, não houve alterações significativas desse relaxamento (p>0,05, ANOVA), onde a CE50 foi 92,8 [64,0-121,6] μM e o efeito máximo deixando apenas 19,8 ± 2,7% (n=5) residuais da contração induzida por Phe 1μM (Figura 7D).

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Figura 6. Traçados experimentais da fenilefrina e β-feniletilamina em aorta.

A

B

C

D

Traçados experimentais mostrando curvas concentração-efeito à fenilefrina (Phe, 0,001 - 100μM) em (A), ou β-feniletilamina (10 - 3000μM) em (B), adicionadas em tensão de repouso de anéis de aorta isoladas. Logo abaixo, são representados traçados experimentais mostrando pré-contração com Phe 1μM seguida de curva concentração- efeito ao isoproterenol (0,001 - 100μM) em (C), ou β-feniletilamina (1 - 300μM) em (D).

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Figura 7. Gráficos com efeitos da β-feniletilamina sobre aorta.

A 160 Phe (n=5) B 160 Praz 10nM + Phe (n=6) -feniletilamina (n=8) Praz 10 nM + -feniletilamina (n=5) 120 120 60mM) + 60mM) + 80 * 80 * 40 40 Contração (% K (% Contração

* * K (% Contração 0 0

0,001 0,01 0,1 1 10 100 10 30 100 300 1000 3000

Phe (M) -feniletilamina (M)

C D 100 * 100 M) M) 

80  80 60 * 60 40 40 20

Contração (% Phe 1 Phe (% Contração 20

Isoproterenol (n=6) Phe 1 (% Contração -feniletilamina (n=15) 0 Propranolol 1M + Isoproterenol (n=6) Propranolol 5M + -feniletilamina (n=5) 0 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1 3 10 30 100 300

Isoproterenol (M) -feniletilamina (M)

(A) Gráfico com respostas contráteis de anéis de aorta isoladas decorrentes da adição de fenilefrina (0,001 - 300μM) na ausência ou presença de prazosina 10nM. (B) Gráfico com respostas contráteis de anéis de aorta isoladas decorrentes da adição de β- feniletilamina (1 - 600μM) na ausência ou presença de prazosina 10nM. (C) Gráfico mostrando efeito de curva concentração-efeito ao isoproterenol (1nM - 100μM) sobre pré-contração induzida por Phe 1μM na ausência ou presença de propranolol 1μM em anéis de aorta. (D) Efeito da adição de concentrações crescentes de β-feniletilamina (1 - 300μM) sobre pré-contração induzida por Phe 1μM na ausência e na presença de propranolol 5μM em anéis de aorta. *, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

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5.1.3. Efeito da β-feniletilamina sobre hemissecções de baço.

A princípio foi construída uma curva concentração-efeito à Phe (0,01 - 300μM) sobre o tônus de repouso do baço, o que resultou em contrações bem definidas e sustentadas (Figura 8A) com valor de CE50 3,4[1,9 – 4,8] μM e efeito máximo equivalente a 137,2 ± 19,7% de estímulo prévio com K+ 80mM (n=5). Assumindo a participação de receptores α1B para a resposta encontrada (ABOUD et al., 1993; CHIN et al., 2013; ALEXANDRE et al., 2016), uma nova curva à Phe (0,01 - 1000μM) foi confeccionada em presença do antagonista α1-adrenérgico, prazosina 10 nM. Na presença desse agente o valor de CE50 da Phe aumentou para 31,1[21,2 – 40,9]μM (p<0,05, teste de Mann-Whitney) sem alterar, no entanto, o efeito máximo, agora de 151,6±13,9% (n=6; Figura 8B).

O passo seguinte foi a adição cumulativa de concentrações crescentes de β- feniletilamina (1 - 600μM), o que resultou em contração de magnitude inferior a observada com Phe (Figura 8A). O máximo de contração foi observado na concentração de 100μM com valor equivalente a 62,8±9,8% de resposta prévia com K+ 80mM, observando-se uma CE50 de 27,4 [10,2 – 44,7] μM (n=5). No intuito de estabelecer um paralelo com o efeito induzido pela Phe, a mesma concentração de prazosina (10nM) foi empregada no efeito da β-feniletilamina. Dessa vez, ao invés de um deslocamento típico de antagonismo competitivo ocorreu uma com redução significativa da resposta contrátil e valor de efeito máximo de 23,9±2,9% (n=6; p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak; Figura 8C).

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Figura 8. Efeito da β-feniletilamina sobre hemissecções de baço.

A

B C Phe (n=5) -feniletilamina (n=5) 160 160 Praz 10nM + Phe (n=6) Praz 10 nM + -feniletilamina (n=6)

120 120 80mM) 80mM) + +

80 80 * 40 40 * * Contração (% K (% Contração Contração (% K (% Contração * * * 0 0

0,01 0,1 1 10 100 1000 1 10 100 1000

Phe (M) -feniletilamina (M)

(A) Traçado experimental mostrando curvas concentração-efeito à fenilefrina (0,01 - 300μM - parte superior) ou β-feniletilamina (1 - 600μM – parte inferior) em hemissecções de baço isoladas. (B) Gráfico com respostas contráteis de hemissecções de baço isoladas decorrentes da adição de fenilefrina (0,01 - 1000μM) na ausência ou presença de prazosina 10nM. (C) Gráfico com respostas contráteis de hemissecções de baço isoladas decorrentes da adição de β-feniletilamina (1 - 600μM) na ausência ou presença de prazosina 10nM. *, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

36

5.1.4. Efeito sobre cronotropismo de átrio direito isolado.

O átrio direito ao ser montado no sistema de contratilidade permite a observação de contrações espontâneas, aqui tratadas como batimentos por minuto (bpm), decorrentes de potenciais de ação gerados por células auto-excitáveis características do nó sino-atrial. Em nossas condições experimentais, a frequência basal de contrações foi de 274,2 ± 16,6 bpm, enquanto a amplitude ficou em 165,4 ± 34,7 mg (n=5). A adição de β-feniletilamina à preparação de átrio direito foi capaz de induzir um aumento transiente de amplitude acompanhado de um aumento sustentado da frequência de contrações, como pode ser observado pela adição da concentração de 10μM mostrada no traçado experimental da Figura 9A. Dada a importância do nó sino-atrial para determinação da frequência cardíaca e a maior estabilidade desse parâmetro nos efeitos observados, o número de bpm foi o parâmetro escolhido como efeito a ser quantificado nesses experimentos.

A elevação da frequência de bpm devido à adição cumulativa de β-feniletilamina

(0,01 - 100μM) teve uma CE50 de 2,16 [1,50 – 2,82] μM, enquanto o máximo aumento observado foi equivalente a 45,7±6,08% da frequência basal (n=5, Figura 9B). Com intuito de estabelecer um paralelo com substância capaz de induzir o mesmo efeito cronotrópico positivo, adicionou-se cumulativamente o agonista β-adrenérgico isoproterenol (0,1 – 100nM). Como esperado para uma substância dessa classe farmacológica, isoproterenol elevou a frequência de eventos contráteis, onde a CE50 foi 5,71 [1,13 – 13,2] nM e o efeito máximo de 46,4±7,50% da frequência basal (n=5, Figura 6B). Utilizado também como controle, mas agora de substância capaz de induzir cronotropismo negativo, também foi construída curva concentração-efeito (1nM - 100μM) à acetilcolina (ACh), reconhecidamente capaz de reduzir a frequência cardíaca pela ativação de receptores muscarínicos M2. Como pode ser observado na Figura 9B, ACh reduz o número de bpm em 37,8±6,00% (n=5) da frequência basal na concentração mais alta utilizada (100μM).

O antagonista β-adrenérgico propranolol foi utilizado para avaliar a dependência desses receptores no efeito da β-feniletilamina sobre o átrio isolado. A princípio, propranolol 10nM foi adicionado ao banho e foi construída uma curva concentração- efeito ao isoproterenol (1 – 1000nM), o que resultou em deslocamento da curva à direita com CE50 de 104 [32,2 – 249]nM, valor significativamente maior (aproximadamente em 37

20 vezes) do que aquele observado na ausência de propranolol (p<0,05, teste de Mann- Whitney). Em outro protocolo, essa mesma concentração do antagonista β-adrenérgico foi empregada antes da adição cumulativa de β-feniletilamina (0,01 - 100μM) e CE50 obtida foi de 6,64 [1,08 – 12,2]μM, valor significativamente maior do que o obtido na ausência (p<0,05, Mann-Whitney test). Apesar das diferenças de CE50, propranolol 10nM foi incapaz de alterar os valores de efeito máximo obtidos com ambas as substâncias (Figura 9B).

38

Figura 9. Efeito da β-feniletilamina sobre átrio direito.

A

B 60

40

20 # #

0

Isoproterenol (n=5) -20 Frequencia (% do basal) do (% Frequencia Propranolol 10nM + Isoproterenol (n=5) -feniletilamina (n=5) Propranolol 10nM + -feniletilamina (n=5) -40 Acetilcolina (n=5)

0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100

Substância (M) (A) Traçado experimental de átrio isolado de rato durante adição de 10μM de β- feniletilamina com a respectiva derivação da frequência de eventos contráteis em batimentos por minuto (BPM). (B) Gráfico demonstrando o efeito da adição cumulativa de isoproterenol, β-feniletilamina – sozinhos ou em presença de propranolol 10nM – e acetilcolina sobre a frequência basal de eventos contráteis espontâneos de átrio isolado. #, p<0,05: teste Mann-Whitney. 39

5.1.5. Efeito relaxante sobre o músculo liso de vias aéreas.

Com intuito de investigar os possíveis efeitos da β-feniletilamina sobre as vias aéreas, foram realizados protocolos em segmentos isolados de traquéia de ratos. A princípio, foi construída uma curva concentração-efeito dessa substância (0,1 - 1000μM) sobre tensão de repouso desses tecidos, sem a obtenção de qualquer resposta contrátil significativa (n=5; p>0,05, ANOVA). Em seguida, investigou-se o efeito dessa mesma curva de β-feniletilamina sobre preparações pré-contraídas com o agonista muscarínico carbamilcolina (CCh) 1μM (traçado superior da Figura 10A). Além disso, adição cumulativa de isoproterenol (0,1nM - 100μM) sobre a pré-contração de CCh também foi feita para estabelecer paralelo com os experimentos feitos em aorta isolada e para servir como controle experimental de substância capaz de induzir relaxamento pela ativação de receptores β-adrenérgicos (traçados inferiores da Figura 10A).

Em nosso modelo experimental de traquéia isolada de rato, β-feniletilamina promoveu completo relaxamento do estímulo com CCh empregado com CE50 de 256,6 [194,4 - 314,8]μM (n=9; Figura 10C). Esse relaxamento não foi afetado pela adição prévia de propranolol 1μM (n=6; p>0,05, ANOVA), mas significativamente inibido pela presença de TEA 0,1mM, bloqueador inespecífico de canais de K+ (n=7; p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak), conforme exposto na Figura 10C.

Já o isoproterenol, apesar de também induzir relaxamento, atingiu um efeito máximo de apenas 37,3±4,80% (n=6) na concentração de 1μM (Figura 10B), ou seja, sem conseguir total reversão da contração de CCh. A adição prévia de propranolol 1μM deslocou significativamente a curva para direita (p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm- Sidak), onde apenas na concentração de 100μM foi registrado valor semelhante ao efeito máximo descrito anteriormente, 40,4±8,63% (n=6, Figura 10B). O fato do isoproterenol não produzir reversão total da pré-contração por CCh em traqueia de ratos já está bem descrito, Vornanen, ainda em 1982, descreveu um efeito máximo de apenas 21% em condições semelhantes as empregadas no presente trabalho, no entanto mostrou que esse valor aumenta a medida que se avança na árvore brônquica, 45% nos brônquios e 92% nos bronquíolos.

40

Figura 10. Efeito da β-feniletilamina sobre anéis de traqueia isolada.

A

B C 100 * 100

M) 80 80 * M)  

60 60 * 40 40 20 -feniletilamina (n=9)

Tensão (% CCh 1 CCh (% Tensão Isoproterenol (n=6)

20 1 CCh (% Tensão Propanolol 1M + -feniletilamina (n=6) Propanolol 1M + Isoproterenol (n=6) 0 TEA 0,1mM + -feniletilamina(n=7)

0 -20 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100 0,1 1 10 100 1000 Isoproterenol (M) -feniletilamina (M) (A) Traçados experimentais mostrando curvas concentração-efeito à β-feniletilamina ou isoproterenol sobre pré-contração com carbamilcolina (CCh) 1μM em segmentos de traqueia isolados. A diferença entre os dois traçados inferiores, onde são mostradas curvas ao isoproterenol, é que um se encontra na ausência e outro na presença de propranolol 1μM. (B) Gráfico mostrando efeito de curva concentração-efeito ao isoproterenol (0,1nM - 100μM) sobre pré-contração induzida por CCh 1μM na ausência ou presença de propranolol 1μM em traqueia isolada. (C) Efeito da adição de concentrações crescentes de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) sobre pré-contração induzida por CCh 1μM na ausência e na presença de propranolol 1μM ou TEA 0,1mM em traqueia isolada. *, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

41

5.1.6. Ação da β-feniletilamina sobre tiras de fundo de estômago isoladas.

Em preparações de tiras de fundo de estômago isoladas foram confeccionadas curvas concentração-efeito à β-feniletilamina (0,1 – 1000 μM), fenilefrina (Phe, 10 nM – 300 μM) e isoproterenol (1 nM – 100 μM). Dois traçados experimentais típicos, um de β-feniletilamina e outro de isoproterenol, estão representados na Figura 11A.

A adição cumulativa sobre o tônus basal de tiras isoladas de fundo de estômago de β-feniletilamina promoveu contração, cuja máxima concentração utilizada resultou em uma resposta equivalente a 73,1±6,4% de uma contração induzida por K+ 60mM (n=9; Figura 12B). Por outro lado, a adição de Phe não induziu alterações significativas do tônus basal das tiras de fundo de estômago (p>0,05, ANOVA), oscilando entre relaxamentos de até 2,2% e contrações de até 6,3% (n=9, Figura 11B). E, por fim, isoproterenol induziu um relaxamento consistente sobre a tensão basal desse tecido com

CE50 de 0,36 [0,03 - 0,70] μM e relaxamento máximo equivalente, em valores de tensão, a 31,2 ± 5,2% de uma resposta de K+ 60mM (n=6, Figura 11B).

42

Figura 11. Efeito da β-feniletilamina sobre tiras de fundo de estômago.

A

B 80 -feniletilamina (n=9) Fenilefrina (n=9) 60 Isoproterenol (n=6) 40 60mM) +

20 #

0

Contração (% K (% Contração -20

-40 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000

Concentração (M)

(A) Traçados experimentais mostrando adição cumulativa de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) ou isoproterenol (1 nM – 100 μM) sobre o tônus basal de tiras de fundo de estômago isoladas. (B) Gráfico com respostas contráteis de fundo de estômago isolado decorrentes da adição de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM), fenilefrina (10 nM – 300 μM) ou isoproterenol (1nM – 100 μM). #, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

43

5.1.7. Avaliação da β-feniletilamina sobre musculatura longitudinal de íleo isolado.

Outro segmento do trato gastrintestinal testado foi o íleo. Além de consistir em avaliação dos efeitos da β-feniletilamina sobre segmento mais distal do trato, possui atividade espontânea mais característica que o fundo de estômago (Figura 12A). A adição cumulativa de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) não produziu alterações significativas de tensão (n=6; p>0,05, ANOVA), ao passo que ACh (0,01 - 100μM), empregada como controle positivo, induziu contração com efeito máximo de + 97,2±13,5% de contração prévia com K 60mM e CE50 de 0,90[0,20 – 1,60]μM (n=6). Adicionalmente também foi feita curva concentração-efeito a 5-HT (0,01 - 100μM), outra amina biogênica de grande importância no trato gastrintestinal. A 5-HT induz contração em íleo isolado de ratos, efeito sensível a utilização de antagonistas 5-HT2, 5-

HT3 e 5-HT4 (Lobo et al., 2011). No presente trabalho foi possível verificar esse efeito contrátil positivo e o efeito máximo atingido foi de 23,1±13,6% (n=6; Figura 12B).

É possível ver três patamares diferentes de resposta sobre a tensão de íleo isolado (p<0,05, ANOVA pós-teste Holm-Sidak), a contração bem definida e intensa do agonista muscarínico ACh, uma contração de menor intensidade induzida por 5-HT, e, por fim, ausência de efeito com a adição de β-feniletilamina (Figura 12B).

Apesar das alterações de tensão induzidas por ACh e 5-HT, nenhuma das três substâncias testadas, incluindo a β-feniletilamina, alterou de forma significativa a frequência de contrações espontâneas (p>0,05, ANOVA; Figura 11C). Outro parâmetro quantificado nesse mesmo experimento foi a variação da amplitude média das contrações espontâneas em função da adição dessas três substâncias. Enquanto 5-HT e β-feniletilamina não alteraram a amplitude dessas contrações de forma consistente, a elevação de tônus causada pela ACh foi acompanhada de uma redução desses eventos contráteis característicos (p<0,05, ANOVA pós-teste Holm-Sidak; Figura 12D), provavelmente porque o tônus já se encontrava tão elevado que não havia margem para extensas contrações e relaxamentos.

44

Figura 12. Efeito da β-feniletilamina sobre segmentos de íleo.

A

120 B -feniletilamina (n=6) C 120 5-HT (n=6) 100 acetilcolina (n=6)

80 100 60mM) + 60 # 40

(% do basal) do (% 80 20 20 -feniletilamina (n=6) Tensão (% de K de (% Tensão 5-HT (n=¨6) 0 acetilcolina (n=6) Frequência de contrações espontâneas espontâneas contrações de Frequência

-20 0 0,01 0,1 1 10 100 1000 0,01 0,1 1 10 100 1000 Substância (M) Substância (M)

D 140

120

100

80 # 60 (% do basal) do (%

40 -feniletilamina (n=6) 20 5-HT (n=6) Amplitude das contrações espontâneas espontâneas contrações das Amplitude acetilcolina (n=6) 0 0,01 0,1 1 10 100 1000 Substância (M)

(A) Traçado experimental demonstrando curva concentração-efeito à β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) sobre a tensão de repouso de íleo isolado. Curvas concentração efeito à β-feniletilamina (0,1 - 1000μM), 5-HT (0,01 - 100μM) e ACh (0,01 - 100μM) foram realizadas sobre tônus basal de íleo isolado e dos traçados foram extraídas as mudanças de tensão média em percentual de contração prévia de K+ 60mM (B), freqüência de contrações espontâneas (C) e amplitude dessas contrações (D), sendo esses dois últimos expressos em percentual do valor inicial. 45

5.2. Investigação do mecanismo envolvido no efeito contrátil da β-feniletilamina sobre tiras isoladas de fundo de estômago

5.2.1. Influência do bloqueio de receptores muscarínicos e remoção do Ca2+ extracelular. Quando adicionada de forma cumulativa sobre o tônus basal de tiras isoladas de fundo de estômago, β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) promoveu contração dependente de concentração (p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm Sidak) e a máxima concentração utilizada resultou em uma contração equivalente a 73,1±6,4% de uma contração induzida por K+ 60mM (n=9; Figura 13). Esse comportamento não foi alterado pela adição prévia de atropina 1μM, antagonista muscarínico (n=5; p>0,05, ANOVA), e nessa condição a maior concentração de β-feniletilamina induziu contração de 69,8±10,9% de K+ 60mM. Por outro lado, a confecção da mesma curva concentração- efeito em um meio livre de Ca2+, contendo ainda o agente quelante de Ca2+ EGTA 0,5mM, aboliu a contração induzida por β-feniletilamina (n=5; p<0,05, ANOVA pós- teste de Holm-Sidak; Figura 13).

46

Figura 13. Influência do Ca2+ extracelular e participação de receptor muscarínico da β- feniletilamina

A

100 B -feniletilamina (n=9) atropina 1mM M + -feniletilamina (n=5) 2+ 80 Zero Ca c/ EGTA 0,5mM + -feniletilamina (n=5)

60 60mM) +

40 * #

Tensão (% K (% Tensão 20

0

0,1 1 10 100 1000 -feniletilamina (M)

(A) Traçados experimentais mostrando adição cumulativa de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) sobre o tônus basal de tiras de fundo de estômago isoladas em meio normal (superior) ou livre de Ca2+ contendo EGTA 0,5mM (inferior). (B) Gráfico com respostas contráteis de fundo de estômago isolado decorrentes da adição de β- feniletilamina (0,1 - 1000μM) em meio normal, ou zero Ca2+ contendo EGTA 0,5mM, ou com adição prévia de atropina 1μM. *, primeira concentração estatisticamente significativa, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak. #, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

47

5.2.2. Investigação dos canais utilizados para influxo de Ca2+

Considerando a dependência do cálcio extracelular no efeito contrátil da β- feniletilamina, foi estabelecido um protocolo demonstrado na Figura 14A. A adição de β-feniletilamina (300μM) ocorreu em meio livre de Ca2+ adicionado de 0,5mM de

EGTA, e em seguida foi adicionado CaCl2 de forma cumulativa (0,1 – 10mM). A contração resultante da adição de CaCl2 atingiu um efeito máximo de 42,8±11,6% de uma contração prévia de K+ 60mM (n=7), que foi significativamente reduzida pela adição prévia do bloqueador de canais para cálcio operados por voltagem (VOCC), verapamil 10μM, para um valor máximo de 14,9±9% (n=7; p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak; Figura 14B).

2+ Utilizando acetilcolina 3μM em meio livre de Ca , a adição de CaCl2 em seguida também induziu contração, cujo efeito máximo foi de 53,0 ± 12,7% de uma contração de K+ 60mM (n=7). Semelhante ao que ocorreu com a β-feniletilamina, a presença de verapamil 10μM reduziu significativamente este efeito para 22,2 ± 4,7% (n=8; p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak; Figura 14B). A resposta mediada por ACh abre canais para cálcio operados por receptor (ROCC) e VOCC, por isso a adição 2+ de verapamil é incapaz de abolir a resposta contrátil pela adição de CaCl2, pois o Ca ainda pode acessar o meio intracelular pelos ROCC. Também existe diferença estatística entre ambos os grupos pré-tratados com verapamil, ou seja, a curva resultante da adição de CaCl2 na presença de verapamil e ACh é estatisticamente maior que aquela feita na presença de verapamil e β-feniletilamina (p<0,05, ANOVA Holm Sidak).

O protocolo realizado a seguir foi executado substituindo o CaCl2 por BaCl2, onde primeiro foi adicionado β-feniletilamina (300μM) seguida de curva de BaCl2 (0,1 – 10mM) em meio livre de Ca2+ contendo EGTA 0,5mM. O Ba2+ é um íon pouco permeável a ROCC, mas capaz de participar da contração de forma análoga ao Ca2+ (BASTOS et al., 2009). Nessa condição, o efeito máximo observado foi 90,8%±12,8% de uma contração de K+ 60mM (n=7), no entanto a adição prévia de verapamil (10μM) aboliu esse efeito para 1,1±0,6% (n=6; p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak; Figura 14C). Esse resultado, juntamente com os anteriores, reforça a ideia da participação preferencial dos VOCC para contração induzida por β-feniletilamina, mas ainda não descarta a participação de outros tipos, como os próprios ROCC e os canais para cálcio operados por estoque (SOCC). 48

Figura 14. Investigação da participação de Ca2+ extracelular no efeito contrátil da β- feniletilamina.

A

-feniletilamina 300M (n=7) B 80 verapamil 10M + -feniletilamina 300M (n=7) C 120 -feniletilamina 300M (n=7) ACh 3M (n=7) verapamil 10M + -feniletilamina 300M (n=6) verapamil 10M + ACh 3M (n=8) 100 60

80 60mM) 60mM) + 40 + 60

# # 40 20 Tensão (% K (% Tensão Tensão (% K (% Tensão 20

0 0

0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 2+ Ca (mM) Ba2+ (mM)

(A) Os traçados experimentais destacados nesse painel consistiram de mudança para meio livre de Ca2+, seguido de adição de β-feniletilamina 300μM em ausência (superior) ou presença (inferior) de verapamil 10μM e concluído com curvas ao CaCl2 (0,1 – 10mM) em tiras de fundo de estômago isolado. (B) Gráfico com médias de respostas ao aumento gradativo da concentração de Ca2+ em meio inicialmente livre desse cátion e contendo EGTA 0,5mM sob quatro condições diferentes: mediante adição prévia de β- feniletilamina 300μM ou acetilcolina (ACh) 3μM, e ambas substâncias também em presença de verapamil 10μM. (C) Gráfico com médias de respostas ao aumento gradativo da concentração de Ba2+ em meio livre de Ca2+ e contendo EGTA 0,5mM em presença apenas de β-feniletilamina 300μM ou dessa mesma substância acompanhada de verapamil 10μM. #, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak. 49

5.2.3. Estudo do potencial do SKF96365 como bloqueador da entrada de Ca2+ operada por estoque em tiras de fundo de estômago.

Considerando o potencial do SKF96365 para bloquear SOCC (BENCZE et al. (2015), essa substância foi empregada no presente trabalho para investigar a capacidade da β-feniletilamina em abrir esses canais para exercer seu efeito contrátil. Primeiro foi necessário executar protocolo para avaliar a resposta mediada pela abertura de SOCC em fundo de estômago isolado, conseguida artificialmente por meio da depleção dos estoques intracelulares de Ca2+ seguida de reapresentação no meio extracelular a cátion bivalente (Ca2+ ou Ba2+) na ausência de qualquer outro estímulo, conforme esquematizado na Figura 14A. A contração induzida pela simples reapresentação a Ca2+ 2,5mM em tecidos cujos estoques intracelulares de Ca2+ haviam sido esgotados foi 55,2±9,4% de K+ 60mM (n=7, Figura 15B).

Entendendo que a entrada de Ca2+ na célula muscular lisa por uma via SOCC pode levar a despolarização da membrana, surge a possibilidade da abertura adicional de VOCC e a necessidade de avaliar sua potencial contribuição na contração observada. Foram, então, utilizadas abordagens para avaliar a participação dessa entrada operada por voltagem. Quando o estímulo mediante reapresentação de Ca2+ 2,5mM ocorreu em presença de verapamil, houve redução semelhante e significativa da resposta (p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak) nas concentrações de 1μM, 19,4±2,4% (n=6), e 10μM, 18,6±5,9% (n=6). Ainda no intuito de complementar essa informação, foi adicionado Ba2+ 2,5mM após a depleção dos estoques, obtendo-se uma resposta contrátil de 28,6±4,6% (n=5), resposta abolida pela prévia adição de verapamil 10μM, 1,1±0,4% (n=5; p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak; Figura 15B). A conjunção dessas informações sugere que a entrada capacitativa de Ca2+ nessa preparação de fundo de estômago, provavelmente, envolve participação de SOCC e VOCC de forma simultânea, e não apenas consecutiva.

O passo seguinte consistiu na avaliação de como o SKF96365 age sobre a resposta SOCC em tiras de fundo de estômago. Primeiro, adicionou-se SKF96365 5μM antes da reapresentação de Ca2+ 2,5mM, o que reduziu a resposta sem significância estatística para 49,6±8,8% (n=7, p>0,05, ANOVA). No entanto, quando empregado 20μM de SKF96365, a resposta sofreu significativa redução para 5,6±3,0% (n=7, p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak; Figura 15B). Tendo em vista que verapamil 50 foi incapaz de inibir por completo a contração induzida por Ca2+ da mesma forma que o SKF96365 20μM, no entanto aboliu a resposta induzida por Ba2+, supõe-se que a resposta induzida por Ca2+ depende da abertura de VOCC e SOCC. Dessa forma, apenas a utilização de SKF96365 20μM foi capaz de inibir o influxo de Ca2+ por ambos. Para reforçar essa idéia, verapamil 10μM foi utilizado junto ao SKF96365 20μM para comparação com respostas previamente obtidas na presença apenas de verapamil. Mais uma vez, foi observada resposta com baixa amplitude de apenas 4,8±2,5% (n=7; Figura 15B).

51

Figura 15. Participação de canais para Ca2+ operados por estoque em m. liso gástrico.

A

B 70 *

60

50 60mM) + 40 *

30

20 Tensão (% K (% Tensão

10

0 SKF 96365 5M 20M 20M

Verapamil 1M 10M 10M 10M

(n=7) (n=7) (n=7) (n=6) (n=6) (n=6) (n=5) (n=5) 2+ 2+ Ca Ba (A) Traçado experimental mostrando tiras de fundo de estômago expostas a sucessivos estímulos com carbamilcolina (CCh) 1μM em meio livre de Ca2+ contendo EGTA 0,5mM até não ser possível observar contração, entendido aqui como depleção de estoques intracelulares de Ca2+, seguido de adição de Ca2+ 2,5mM (superior) ou Ba2+ 2,5mM (inferior) na presença de tapsigargina 1μM. (B) Gráfico com resultados obtidos a partir da adição de Ca2+ 2,5mM ou Ba2+ 2,5mM em tiras isoladas de fundo de estômago cujos estoques intracelulares foram previamente esgotados. No momento da adição o meio estava livre de Ca2+ e continha EGTA 0,5mM e tapsigargina 1μM, porém, os grupos variaram desde ausência de outras substância - colunas em preto - até a presença concomitante de SKF 96365 (5 ou 20μM) ou verapamil (1 ou 10μM) – colunas brancas. *, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak. 52

Apesar dos experimentos de entrada capacitativa de Ca2+ sugerirem que o SKF96365 bloqueia seletivamente canais para Ca2+ a depender da concentração empregada, um protocolo mostrando o bloqueio VOCC de forma mais clara ainda foi necessário. Para isso, adicionaram-se três combinações em um meio livre de Ca2+ contendo EGTA 0,5mM: 1) K+ 60mM, 2) SKF96365 5μM e K+ 60mM, e 3) SKF96365 + 20μM e K 60mM. Em seguida, foi construída uma curva cumulativa com CaCl2 (0,1 – 10mM) em que os tecidos que receberam apenas K+ 60mM chegaram a um efeito máximo de 132,1±7,5% (n=7; Figura 16) de contração controle induzida antes do início do protocolo também por K+ 60mM. A presença de SKF96365 5μM não promoveu alteração significativa da resposta, obtendo-se efeito máximo de 120,3±10,9% (n=7), no entanto 20μM dessa substância reduziu significativamente a resposta, que atingiu máximo de 48,0±18,2% (n=5; p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak; Figura 16).

Figura 16. Ação do SKF 96365 sobre contrações induzidas por aumento de K+ extracelular

K+ 60mM (n=7) + 160 SKF 96365 5M + K 60mM (n=7) SKF 96365 20M + K+ 60mM (n=5)

120 60mM) 60mM)

+ # 80

40 Tensão (% K (% Tensão

0

0 2 4 6 8 10 +2 Ca (mM)

Gráfico com respostas ao aumento cumulativo da concentração de Ca2+ em meio inicialmente livre desse cátion contendo EGTA 0,5mM e K+ na concentração de 60mM na ausência ou presença de SKF 96365 (5 ou 20μM).

53

5.2.4. Efeito do SKF96365 sobre a entrada de Ca2+ induzida por β-feniletilamina.

Ainda em meio livre de Ca2+ contendo EGTA, foi adicionado β-feniletilamina 300μM na ausência ou presença de SKF96365 (5 ou 20μM) e depois confeccionada curva ao CaCl2 (0,1 – 10mM). A curva executada na presença apenas de β- feniletilamina 300μM mostrou efeito máximo de 42,8±11,6% de uma contração prévia de K+ 60mM (n=7; Figura 17), mas as concentrações de SKF96365 5μM e 20μM a inibiram significativamente, resultando em 21,8±5,3% (n=8) e 21,8±6,3%, respectivamente (n=9; Figura 17; ambos p<0,05, ANOVA pós-teste Holm-Sidak). Esse resultado reforça a participação de VOCC para contração induzida por β-feniletilamina quando se observa o efeito da concentração de 20μM, mas também mostra a dependência de outras estruturas sensíveis à presença de SKF96365 na concentração de 5μM.

Figura 17. Ação do SKF 96365 sobre β-feniletilamina.

80 -feniletilamina 300mM (n=7) SKF 96365 5M + -feniletilamina 300mM (n=8) SKF 96365 20M + b-feniletilamina 300M (n=9) 60 60mM) 60mM)

+ 40 #

20 Tensão (% K (% Tensão

0

0 2 4 6 8 10

Ca+2 (mM)

Gráfico com respostas ao aumento cumulativo da concentração de Ca2+ em meio inicialmente livre desse cátion contendo EGTA 0,5mM e β-feniletilamina 300μM na ausência ou presença de SKF 96365 (5 ou 20μM). #, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

54

5.2.5. Efeito do β-feniletilamina em contrações induzidas por estimulação de campo elétrico. Respostas evocadas por estimulação por campo elétrico em tiras de fundo de estômago isoladas são resultado da liberação de diferentes neurotransmissores (BATISTA-LIMA et al., 2017). Quando estimulado com pulsos de 30V e duração de 1ms cada, frequência de 10Hz e train durando 8s, o resultado foi uma contração de 3,8±0,9g (n=9). A adição de concentrações crescentes de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) elevou o tônus de forma semelhante aos resultados mostrados previamente, mas agora o protocolo incluiu a estimulação elétrica descrita entre as concentrações empregadas (Figura 17A). Tomando o valor basal anterior a primeira estimulação como referência para todas as demais, as estimulações na presença de β-feniletilamina tiveram picos gradativamente maiores que aquele conseguido na ausência (controle, assumido como 100% individualmente em cada canal). Os valores obtidos com diferença estatística (p<0,05, ANOVA pós-teste Holm-Sidak) ocorreram nas concentrações de 10μM (114,6±3,7%), 100μM (124,5±4,5%) e 1000μM (125,6±5,1%; n=9; Figura 18B).

A primeira vista, β-feniletilamina parece potencializar a resposta contrátil evocada por estimulação elétrica, no entanto essa substância é capaz de elevar a tensão per se, o que demanda uma análise mais criteriosa dos traçados. Ainda utilizando como referência a contração induzida pela estimulação na ausência de β-feniletilamina (100%), o efeito da adição dessa substância produz respostas contráteis estatisticamente significativas (p<0,05, ANOVA pós-teste Holm-Sidak) nas concentrações de 100μM (21,1±4,1%) e 1000μM (29,8±7,0%; Figura 18B).

55

Figura 18. Ação da β-feniletilamina sobre contrações induzidas por estimulação de campo elétrico em tiras de fundo de estômago

A

Estimulação elétrica B 140 Tônus basal * * 120 *

100

80

60

40 * *

% da estimulação elétrica controle elétrica estimulação da % 20

0 Controle 0,1 1 10 100 1000

-feniletilamina (M)

(A) Traçado experimental mostrando estimulações por campo elétrico (pulsos de 1ms e 30V, frequência 10Hz e trains de 8s) na ausência e presença de concentrações crescentes de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM). Os tracejados horizontais definem os limites inferior e superior da resposta de estimulação na ausência de β-feniletilamina (controle), enquanto os dois pequenos traços verticais chamam atenção para o incremento do tônus basal induzido pela β-feniletilamina e o pico mais elevado da contração induzida pelo estímulo de campo elétrico. (B) Gráfico com resultados da subtração dos picos de contração a cada estimulação por campo elétrico pelo valor basal anterior a primeira estimulação (barras pretas); e variação de tensão induzida pela adição de β-feniletilamina (barras brancas). Os dados estão expressos em percentual da estimulação controle. *, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak. 56

5.2.6. Efeito contrátil da β-feniletilamina em presença de antagonistas serotoninérgicos. A contração induzida pela adição cumulativa de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) em fundo de estômago foi testada na presença de ciproheptadina 100nM (Figura 19A). A ciproheptadina, descrito como antialérgico capaz de bloquear receptores para histamina, também bloqueia receptores 5-HT1 e 5-HT2 (LIN et al., 2014). A presença desse agente inibiu de forma significativa a contração induzida por β-feniletilamina, onde o valor de efeito máximo obtido foi apenas 19,4±7,5% na concentração de 1000μM (n=7; p<0,05, ANOVA pós-teste Holm-Sidak; Figura 19B). Apesar do resultado aparentemente promissor, o caráter antagonista inespecífico da ciproheptadina limita a conclusão a participação de um receptor histaminérgico, serotoninérgico ou outro análogo a estes para o efeito observado.

Tendo em vista que a contração induzida por 5-HT em fundo de estômago de ratos atua mediante 5-HT2, foram empregados dois antagonistas mais específicos que a ciproheptadina sobre o efeito contrátil da β-feniletilamina. O primeiro foi um antagonista 5-HT3, ondansetrona 1μM, que reduziu significativamente a resposta máxima induzida por β-feniletilamina para 43,4±5,5% (n=7; Figura 19B); efeito semelhante ao segundo, um antagonista 5-HT2, ketanserina 1μM, cuja resposta máxima atingida correspondeu a 48,3±7,1% (n=7, ambos p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm- Sidak; Figura 19B).

57

Figura 19. Efeito da β-feniletilamina sobre tiras de fundo de estômago em meio a diferentes antagonistas serotoninérgicos

A

B 100 -feniletilamina (n=9) -feniletilamina + ciproheptadina 100nM (n=7) 80 -feniletilamina + ondansetrona 1M (n=7) -feniletilamina + ketanserina 1M (n=7)

60 60mM) + # 40

Tensão (% K (% Tensão 20

0

0,1 1 10 100 1000

-feniletilamina (M)

(A) Traçados experimentais mostrando adição cumulativa de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) sobre o tônus basal de tiras de fundo de estômago isoladas na ausência (superior) ou presença de ciproheptadina 100nM (inferior). (B) Gráfico com respostas contráteis de fundo de estômago isolado decorrentes da adição de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) na ausência de qualquer outra substância ou com adição prévia de ciproheptadina 100nM, ondansetrona 1μM ou ketanserina 1μM. #, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

58

Apesar dos mecanismos de 5-HT e das substâncias utilizadas até aqui como antagonistas dos receptores para 5-HT serem bem descritos na literatura, optou-se por estabelecer um paralelo entre os efeitos de β-feniletilamina e 5-HT em fundo de estômago dentro das condições experimentais utilizadas. O primeiro passo foi construir uma curva concentração efeito a 5-HT (0,01 - 100μM), que resultou em contração com + CE50 de 0,18[0,04 – 0,38] μM e efeito máximo 90,6±19,6% de contração prévia com K 60mM (n=7; Figura 20B). Interessante ressaltar que o traçado experimental obtido, com aumento da amplitude das contrações espontâneas acompanhado do incremento de tônus (Figura 16A), teve perfil diferente daquele obtido pela adição de β-feniletilamina.

Os antagonistas ciproheptadina, ondansetrona e ketanserina empregados anteriormente com β-feniletilamina, foram utilizados novamente antes da adição da curva de 5-HT. A adição prévia de ciproheptadina 100nM reduziu significativamente a contração induzida por 5-HT (Figura 20A) com efeito máximo de 40,0±8,3% (n=7; p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak). Por outro lado, ondansetrona 1μM, antagonista 5-HT3, não alterou de forma significativa o perfil contrátil da curva concentração-efeito à 5-HT (n=7; p>0,05, ANOVA), enquanto ketanserina 1μM reduziu essa resposta para um efeito máximo de apenas 37,9±3,8% (n=6; p<0,05, ANOVA pós- teste Holm-Sidak; Figura 20B).

59

Figura 20. Ação da serotonina (5-HT) frente a diferentes antagonistas serotoninérgicos.

A

B 120 5-HT (n=7) 5-HT + Ciproheptadina 100nM (n=7) 5-HT + Ondansetrona 1M (n=7) 100 5-HT + Ketanserina 1uM (n=6)

80 60mM) + 60 #

40 Tensão (% K (% Tensão 20

0

0,01 0,1 1 10 100 5-HT (M)

(A) Traçados experimentais mostrando adição cumulativa de serotonina (5-HT, 0,01 - 100μM) sobre o tônus basal de tiras de fundo de estômago isoladas na presença (superior) ou ausência de ciproheptadina 100nM (inferior). (B) Gráfico com respostas contráteis de fundo de estômago isolado decorrentes da adição de 5-HT (0,01 - 100μM) na ausência de qualquer outra substância ou com adição prévia de ciproheptadina 100nM, ondansetrona 1μM ou ketanserina 1μM. #, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

60

Como ciproheptadina também bloqueia receptores H1, foi utilizado difenidramina 10μM, antagonista mais específico para esse subtipo de receptor (YAO et al., 2014). A adição desse antagonista antes da curva concentração-efeito a β- feniletilamina foi incapaz de alterar de forma significativa a contração induzida por ela, chegando a um efeito máximo de 55,6±4,7% (n=8; p>0,05, ANOVA; Figura 21).

Figura 21. Influência da difenidramina sobre o efeito da β-feniletilamina em tiras de fundo de estômago

100

-feniletilamina (n=9) 80 difenidramina 10 M + -feniletilamina (n=8)

60 60mM) +

40

Tensão (% K (% Tensão 20

0

0,1 1 10 100 1000 -feniletilamina (M)

Gráfico com respostas contráteis de fundo de estômago isolado decorrentes da adição de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) em ausência ou presença de difenidramina 10μM. p>0,05: ANOVA.

61

5.2.7. Participação de TAARs no efeito contrátil da β-feniletilamina em tiras de fundo de estômago. A ativação de receptor TAAR para o efeito contrátil induzido pela β- feniletilamina foi investigada mediante adição prévia do antagonista TAAR1 EPPTB 50μM (n=7). A presença desse antagonista não alterou a contração induzida por β- feniletilamina (0,1 - 1mM (p>0,05, ANOVA Figura 22).

Figura 22. Influência do EPPTB sobre o efeito da β-feniletilamina em tiras de fundo de estômago 60mM) + Tensão (% K (% Tensão

β-feniletilamina

Gráfico com respostas contráteis de fundo de estômago isolado decorrentes da adição de β-feniletilamina (●, 0,1 - 1000μM) em ausência ou presença de EPPTB (○) 50μM. #, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

62

5.2.8. Efeito contrátil da β-feniletilamina e carbamilcolina em meio a diferentes concentrações extracelulares de K+. Outro protocolo executado foi a confecção da curva concentração-efeito a β- feniletilamina em meios com concentrações extracelulares crescentes de K+. À princípio valeu-se da curva já executada em solução normal, que contêm 5mM desse íon em sua composição. Em seguida, a concentração de K+ foi elevada para 40mM, 50mM, 60mM ou 80mM e então foi construída a curva a β-feniletilamina (Figura 23A). Os variações obtidas pela deflexão positiva ou negativa dos traçados foram expressas em percentual de resposta de K+ 60mM feita antes do início do protocolo.

Como já foi mostrado anteriormente, se adicionado em meio normal (5mM), β- feniletilamina produz contração dependente de concentração com efeito máximo de 73,1±6,4% (n=9) registrado na concentração de 1000μM. Apesar de não mostrar diferença significativa (p>0,05, ANOVA), essa mesma curva realizada sobre 40mM de K+ extracelular já mostrou tendência a redução, onde o efeito máximo foi de 46,9±8,4% (n=6) já na concentração de 300μM. A partir da concentração de 50mM de K+ extracelular o efeito contrátil da β-feniletilamina é progressivamente reduzido com diferença estatística (p<0,05, ANOVA pós-teste Holm-Sidak). Em meio com 50mM ainda é visualizado contração com efeito máximo de 22,8±4,2% (n=7) na concentração de 100μM, no entanto a adição de β-feniletilamina sobre as concentrações de 60mM e 80mM induziu deflexões negativas do traçado com valores máximos de relaxamento de 25,0±3,2% (n=7) e 47,9±6,0% (n=7), respectivamente (Figura 23B).

63

Figura 23. Ação da β-feniletilamina em tiras de fundo de estômago em meios com concentrações crescentes de K+

A

80 B K+ 5mM (n=9) K+ 40mM (n=6) 60 K+ 50mM (n=7) K+ 60mM (n=7) 40 K+ 80mM (n=7)

20

60mM #

+ 0

% K % -20

-40

-60

0,1 1 10 100 1000

-feniletilamina (M)

(A) Traçados experimentais de fundo de estômago isolado demonstrando protocolo em que curvas concentração-efeito à β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) são construídas em presença de diferentes concentrações de K+ extracelular (5, 40 e 80mM). (B) Gráfico com médias ± E.P.M. resultantes da adição de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) em concentrações crescentes de K+ (5 – 80mM) em tiras isoladas de fundo de estômago. #, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

64

Em seguida, o mesmo protocolo foi repetido substituindo a β-feniletilamina pelo agonista colinérgico carbamilcolina (CCh, 0,1 – 10 μM) em meios com contrações de 5 mM, 40 mM e 80 mM de K+. Mas, ao contrário do que aconteceu com a β- feniletilamina, CCh produziu apenas contração, atingindo efeitos máximos de 147,5 ± 13,0 % (n=8) em meio com 5 mM de K+; 144,2 ± 15,2 % (n=4) em meio com 40 mM de K+; e 78,5 ± 8,3 % (n=8) em meio com 80 mM de K+ (Figura 24).

Figura 24. Ação da carbamilcololina em tiras de fundo de estômago em meios com concentrações crescentes de K+

K+ 5mM (n=8) 160 K+ 40mM (n=4)

+ 120 K 80mM (n=8)

80 60mM

+ 40 % K % 0

-40

0,1 1 10

CCh (M) Gráfico com médias ± E.P.M. resultantes da adição de carbamilcolina (0,1 - 10μM) em concentrações crescentes de K+ (5 – 80mM) em tiras isoladas de fundo de estômago. 65

5.2.9. Reversão de contração induzida por K+ 80 mM com β-feniletilamina na presença de bloqueadores da síntese de nucleotídeos cíclicos e antagonistas serotoninérgicos. Por fim, uma curva de β-feniletilamina (0,1 – 1000 μM) foi novamente construída sobre um meio pré-contraído com K+ 80 mM. Mais uma vez, pode ser constatado um relaxamento preparação com efeito máximo na última concentração equivalente a 48,7 ± 4,6 % (n=9) de uma contração controle realizada previamente. A adição prévia de ODQ 10 μM, inibidor da guanilato ciclase, não interferiu de forma significativa nesse efeito (p > 0,05 ANOVA); contudo MDL 12,330A 7 μM, inibidor da adenilato ciclase, reduziu esse efeito de forma significativa, agora com relaxamento máximo de 33,2 ± 3,8 % (n=7, p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak, Figura 25A).

Por outro lado, a adição prévia dos antagonistas serotoninérgicos ciproheptadina 100nM, ketanserina 1μM e ondansetrona 1μM deslocou a curva de relaxamento da β- feniletilamina para a esquerda de forma significativa (p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak, Figura 25B), ou seja, potencializou esse efeito relaxante induzido por β- feniletilamina nessa condição.

66

Figura 25. Reversão de K+ 80mM com β-feniletilamina na presença de inibidores da guanilato ciclase, adenilato ciclase e antagonistas serotoninérgicos.

0 A

-20 * 60mM

+ -40 + % K % Controle K 80mM ODQ -60 MDL 12,330A

0,1 1 10 100 1000 -feniletilamina (M)

B 0

-20 ** **

60mM * + -40 Controle K+ 80mM ** % K % Ciproheptadina *

-60 Ketanserina Ondansetrona *

0,1 1 10 100 1000

-feniletilamina (M) (A) Gráfico com médias ± E.P.M. resultantes da adição de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) em meio contendo K+ (80mM) na ausência (controle) e presença de ODQ 10μM e MDL 12,330A 7 μM em tiras isoladas de fundo de estômago. (B) Gráfico com médias ± E.P.M. resultantes da adição de β-feniletilamina (0,1 - 1000μM) em meio contendo K+ (80mM) na ausência (controle) e presença dos antagonistas serotoninérgicos ciproheptadina 100nM, ketanserina 1μM e ondansetrona 1μM em tiras isoladas de fundo de estômago. *, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak.

67

5.3. Avaliação de citotoxicidade em células PC12. pelo ensaio MTT.

No ensaio de MTT foi investigada a capacidade da β-feniletilamina em induzir efeito citotóxico em células PC12, estabelecendo-se uma comparação com a 6-hidróxi- dopamina (6-OH-DA). Todas as médias foram obtidas a partir de triplicatas realizadas em dias diferentes.

A 6-OH-DA induziu redução da quantidade de células viáveis de maneira dependente de concentração com valores de 37,0 ± 2,0 % de células viáveis na concentração de 400 μM até 80,0 ± 4,7 % na concentração de 25 μM (Figura 23, p<0,05, ANOVA pós-teste de Holm-Sidak).

A β-feniletilamina, por outro lado, não produziu alterações consistentes na viabilidade celular, com valores oscilando entre 103,9 ± 4,3 % a 119,0 ± 7,7 % do seu respectivo controle (Figura 23, p>0,05, ANOVA).

Figura 26. Ensaio de citotoxicidade em células PC12

140

120

100 * 80 * 60 *

% de viabilidade de % * 40 *

20

0

-feniletilamina 600 300 100 30 10 1 6-OH-DA 400 200 100 50 25

Gráfico com efeitos da β-feniletilamina e 6-hidróxi-dopamina (6-OH-DA) sobre a viabilidade de células PC12. *, p<0,05: ANOVA pós-teste de Holm-Sidak. 68

6. DISCUSSÃO

Optou-se por vasos mesentéricos e anéis de aorta isolada para investigação dos efeitos vasculares da β-feniletilamina, o que permitiu uma comparação dos resultados obtidos com diversos trabalhos que utilizaram técnicas equivalentes (BROADLEY et al. 2009; FEHLER et al., 2010; BROADLEY et al. 2013; NARANG et al., 2014).

Especificamente em vasos mesentéricos, Narang et al. (2014) mostraram que β- feniletilamina é capaz de relaxar tecidos pré-contraídos com fenilefrina (Phe), agonista

α1-adrenérgico, com valor de CE50 67,7 μM, um efeito inibitório reproduzido neste trabalho com CE50 de 92,6 μM. Broadley et al. (2009) também demonstraram, em experimentos de perfusão e registro de pressão do leito mesentérico, que β- feniletilamina causa quedas de forma dependente de concentração de pressão de perfusão previamente elevada pela infusão de Phe, o que indica ação vasodilatadora. Portanto, o resultado encontrado é compatível com o antagonismo alfa-adrenérgico proposto por Narang et al. (2014) como uma das possíveis formas de modular contração do músculo liso vascular.

Nos resultados obtidos com aorta isolada mostrados nesse trabalho fica visível a capacidade da β-feniletilamina em uma faixa de concentração até 300μM (0,3mM) de relaxar pré-contrações de Phe, mesmo efeito conseguido com isoproterenol, um agonista β-adrenérgico. No entanto, o efeito vasorrelaxante da β-feniletilamina não sofreu qualquer modificação com a presença de propranolol 5 μM. Sabendo que 1 μM de propranolol é capaz de deslocar a curva de relaxamento do isoproterenol, é aceitável afirmar que o relaxamento induzido pela β-feniletilamina independe de receptores β- adrenérgicos.

Contudo, os resultados em anéis de aorta não se resumiram a um efeito relaxante. Ainda em 1980, Hansen et al. já haviam demonstrado que a β-feniletilamina é capaz de induzir contração em tiras helicoidais de aorta isolada de rato, mesmo que a potência tenha sido inferior a outras aminas, como noradrenalina e dopamina, requerendo concentrações próximas de 1mM para exercer tal efeito. A resposta vasoconstritora em anéis de aorta foi demonstrada novamente em estudos mais recentes, adicionalmente demonstrou-se que a presença de prazosina, antagonista α1-adrenérgico, não interfere nesse efeito e aortas de rato expressam TAAR1, o receptor que 69 provavelmente está envolvido nessa resposta (BROADLEY et al. 2009; FEHLER et al., 2010; BROADLEY et al. 2013).

Os experimentos desenvolvidos em aorta isolada também demonstraram contração com a adição de concentrações crescentes de β-feniletilamina sobre a tensão de repouso, efeito visível em concentrações próximas a 1 mM ou superiores. Esse efeito não foi modificado pela presença de prazosina. Com isso, pode ser demarcada uma linha de separação entre os efeitos vasorrelaxantes e vasoconstritores da β- feniletilamina em torno de 0,3 mM. Concentrações inferiores a esse valor são capazes de exercer relaxamento de contrações induzidas por Phe, e valores superiores induzem contração independente da ativação de receptores α-adrenérgicos.

Até o momento, parece lógico atribuir a contração induzida por β-feniletilamina em aorta isolada à ativação de TAAR1 (FEHLER et al., 2010, BROADLEY et al. 2013), porém isso vai de encontro ao conceito de que a ativação dos TAARs aumenta os níveis de AMPc intracelular (BUNZOW et al., 2001), o que implicaria em efeito relaxante na musculatura lisa vascular. Logo, deve-se assumir que a via de transdução intracelular não envolveria aumento de AMPc nesse efeito, além disso, a possibilidade de que o comportamento em células musculares lisas vasculares não seja o mesmo das células HEK293 transfectadas com receptores TAAR1, onde foi demonstrado o aumento do AMPc. Nessas células, os TAARs estão superexpressos e talvez sejam forçados a acoplar-se à adenililciclase. Considerando o efeito contrátil bem estabelecido, pode ser que os receptores de amina traço nativos em aorta de ratos sejam acoplados à proteína Gq (BROADLEY et al., 2013).

Foram conduzidos experimentos com hemissecções de baço de ratos no presente trabalho. O baço é essencial para o sistema imune, mas também contém um volume expressivo de sangue rico em hemácias que é liberado em reposta atividades como o mergulho em mamíferos terrestres e aquáticos, e para isso é necessária a redução de volume total do órgão (BAKOVIĆ et al., 2003). Essa redução de volume tecidual esplênico, entendida aqui como contração, foi uma das ferramentas utilizadas na diferenciação dos subtipos de receptores α1-adrenérgicos (HAN et al., 1987) e desde então é empregada classicamente como resposta ativada por receptores α1B (ABOUD et al., 1993; CHIN et al., 2013; ALEXANDRE et al., 2016). 70

Aboud et al. (1993) demonstraram a contração induzida por Phe em baço isolado de rato com o valor de pD2 5,37 (equivalente a CE50 de aproximadamente 4,3μM), valor próximo da CE50 de 3,4 μM encontrada no presente trabalho. Além disso, a presença de prazosina deslocou a curva concentração-efeito de Phe para direita, como esperado para um antagonista competitivo. A mesma concentração de prazosina utilizada (10 nM) foi capaz de deslocar curva concentração-efeito de noradrenalina em preparações de baço de forma semelhante (CHIN et al., 2013).

Ao observar os efeitos da β-feniletilamina sobre as hemissecções de baço, duas informações devem ser destacadas. Primeiro, β-feniletilamina induziu contração em faixa de concentração inferior a 0,3 mM. Segundo, diferente do que aconteceu nas contrações induzidas em aorta, prazosina interfere com esse efeito. Especificamente com relação a influência da prazosina sobre o efeito da β-feniletilamina, verificou-se uma redução de efeito máximo e não o deslocamento característico de um antagonista competitivo. Uma possível interpretação para esse resultado é assumir que os efeitos induzidos por Phe e β-feniletilamina em baço são mediados por receptores diferentes. O receptor ativado por Phe é reconhecidamente o α1B, passível de sofrer antagonismo competitivo com prazosina (ABOUD et al., 1993; CHIN et al., 2013; ALEXANDRE et al., 2016), enquanto tudo que podemos afirmar com relação ao receptor ativado pela β- feniletilamina é que prazosina atua como antagonista não-competitivo.

Um candidato a receptor ativado por β-feniletilamina no baço é o TAAR4.

Segundo Chiellini et al. (2012), a expressão de TAAR4 é pelo menos 10 vezes maior que TAAR1 no baço de ratos (Tabela 1), e segundo Ferrero et al. (2012) ambos os receptores são preferencialmente ativados por aminas primárias como a β- feniletilamina. Com as evidências que se dispõem neste trabalho não é possível afirmar que realmente se trata do TAAR4, porém, caso isso seja verdade, está de acordo com o fato da prazosina não ter interferido com o efeito da β-feniletilamina em aorta, pois nesse tecido a densidade de TAAR1 é superior a de TAAR4 (FEHLER et al., 2010).

Em um período que ainda se buscava confirmar o mecanismo do efeito hipotensor do propranolol, Dunlop e Shanks (1969) mostraram aumento de frequência cardíaca em resposta a administração i.v. de feniletilamina 0,5mg/Kg em cães anestesiados, utilizando-a no intuito de obter uma ação indireta devido a liberação de noradrenalina das terminações nervosas, único mecanismo aceito até então. Os autores, 71 além de demonstrar o cronotropismo positivo da feniletilamina in vivo, mostraram que animais previamente tratados com propranolol tinham esse aumento de frequência reduzido.

Pesce e Adler-Graschinsky (1983), por sua vez, demonstraram o efeito cronotrópico positivo da β-feniletilamina sobre átrio isolado de ratos, onde tecidos partiam de valores basais próximos a 260bpm e aumentavam em até 145bpm após adições cumulativas dessa molécula. O valor de –logCE50 descrito pelos autores foi

6,01, o que corresponde a uma CE50 próxima a 1μM. O efeito cronotrópico da β- feniletilamina foi replicado neste trabalho com valor aproximado de CE50, 2,16 μM.

Em outro estudo, agora com coração isolado de rato sob perfusão, β- feniletilamina induziu aumento de frequência de batimentos superior a outras aminas- traço como tiramina, octopamina e triptamina. Além disso, foi relatado que a β- feniletilamina aumentou aproximadamente 55% da frequência basal na concentração de 100 μM (FRASCARELLI et al., 2008), mesma concentração na qual foi visualizado efeito máximo de 45,7% no presente estudo.

Além dos efeitos cronotrópicos positivos já demonstrados após administração in vivo, em preparações de coração isolado e preparações de átrio isolado, Calvert et al. (2015) chegaram a conclusão semelhante mensurando oscilações de cálcio citosólico por método de fluorescência em uma linhagem celular de cardiomiócitos. Os autores demonstraram que a exposição dessas células a concentrações de até 8μg/mL (aproximadamente 50μM) elevava a frequência de oscilações (bpm), e quando expostas a concentrações mais elevadas (40 e 80μg/mL) o efeito se invertia passando a reduzir a frequência de bpm.

Com base no que foi exposto, é inquestionável a capacidade da β-feniletilamina em induzir cronotropismo positivo (DUNLOP & SHANKS, 1969; PESCE & ADLER- GRASCHINSKY, 1983; FRASCARELLI et al., 2008; CALVERT et al., 2015). No presente trabalho, esse efeito cronotrópico positivo foi aquele que apresentou maior potência farmacológica quando comparado aos demais, mas provavelmente o maior ganho dessa abordagem tenha sido a comparação com o isoproterenol em um contexto de bloqueio β-adrenérgico com propranolol. 72

O isoproterenol, como esperado para um agonista β-adrenérgico, elevou a frequência de contrações do átrio direito por meio da ativação desse receptor, fato que fica evidente com o desvio à direita da curva concentração-efeito na presença do antagonista β-adrenérgico propranolol. Esse antagonista, na concentração de 10 nM aumentou em aproximadamente 20 vezes a CE50 do isoproterenol, sem alterar, contudo, o efeito máximo. Quando a mesma concentração do antagonista, propranolol 10 nM, foi adicionada antes das curvas concentração-efeito à β-feniletilamina, foi possível verificar um deslocamento para a direita, porém, bem mais discreto que aquele evidenciado com isoproterenol, um aumento de aproximadamente 3 vezes da CE50.

Tendo em vista que antagonistas farmacológicos não são capazes de ativar receptores e levar a respostas celulares, sua atividade é medida através da afinidade aos receptores e consequente habilidade em interferir na resposta dos agonistas. Dessa maneira, seria esperado um deslocamento equivalente nas curvas de isoproterenol e β- feniletilamina para uma mesma concentração de propranolol, caso esse antagonista estivesse bloqueando o mesmo receptor em ambas as situações (BRUNTON, 2012). Portanto, uma possível razão para essa influência diferenciada do propranolol sobre as curvas de isoproterenol e β-feniletilamina seria o fato dessas substâncias estarem ativando receptores diferentes: o primeiro com maior afinidade pelo propranolol, nesse caso o receptor β-adrenérgico ativado pelo isoproterenol; e o segundo, com menor afinidade pelo propranolol e ativado pela β-feniletilamina.

Kleinau et al. ( 2011) replicaram o aumento de AMPc em decorrência da exposição à tiramina e β-feniletilamina em células HEK293 transfectadas com TAAR1 demonstrado por Bunzow et al. (2001). Adicionalmente, esse mesmo trabalho trouxe uma nova abordagem com células transfectadas com receptores β1- ou β2-adrenérgicos. A construção de curvas concentração-efeito ao isoproterenol em células com ambos os receptores β também produziu aumento de AMPc, o que não ocorreu com a utilização das aminas-traço. Esse reultado desencoraja a ideia de que β-feniletilamina possa ativar receptores β-adrenérgicos. Apesar da ausência de efeito em células com receptores β- adrenérgicos, a presença das aminas-traço em curvas ao isoproterenol reduziu o efeito deste agonista, sendo a β-feniletilamina classificada pelos autores como um antagonista alostérico (não-competitivo) desses receptores. 73

Recorrendo mais uma vez aos resultados de Chiellini et al. (2012), o coração de ratos expressa uma quantidade pelo menos 20 vezes superior de TAAR8 em relação aos demais subtipos (Tabela 1). Portanto, o TAAR8 se apresenta como um potencial alvo de aminas-traço no tecido cardíaco, e, com base nos resultados encontrados, o propranolol provavelmente apresenta afinidade por esse receptor, interferindo nos efeitos cronotrópicos positivos da β-feniletilamina.

Já a ausência de resposta contrátil obtida com a adição de β-feniletilamina sobre a tensão de repouso de anéis de traqueia isolada contraria o achado de Hawthorn et al. (1985), em que β-feniletilamina, adicionada a preparações de tiras do parênquima pulmonar de cobaias em tensão de repouso, induziu um efeito bifásico. Primeiro um relaxamento até concentração próxima a 10μM, seguido de contração. Além disso, mostraram que a mesma curva em presença de propranolol 1μM perdia a primeira fase de relaxamento e potencializava o efeito de contração, tanto pelo aumento do efeito máximo como pela redução de CE50. A diferença entre os resultados do presente estudo e aqueles descritos por Hawthorn et al. (1985) provavelmente se devem a diferença entre espécies e, o que é mais importante, a diferença entre os segmentos utilizados em cada abordagem.

Curiosamente, a eficácia da β-feniletilamina em induzir efeito relaxante em traqueia isolada pré-contraída com carbamilcolina foi superior a observada com isoproterenol. Outra diferença foi a capacidade do propranolol em interferir no relaxamento induzido pelo isoproterenol, mas a mesma concentração dessa antagonista não modificar o relaxamento induzido pela β-feniletilamina. Essas diferenças aliadas aos achados previamente descritos para o átrio tornam a possibilidade de ativação do receptor β-adrenérgico pela β-feniletilamina ainda menos plausível.

Apesar e não ter informações suficientes para sugerir o receptor ou a via intracelular envolvidas no relaxamento induzido pela β-feniletilamina, foi possível detectar a dependência de canais para K+ para esse efeito, mediante a utilização do bloqueador de canais para K+ inespecífico tetraetilamônio (TEA).

Os experimentos desenvolvidos com segmentos do trato gastrintestinal receberam uma atenção especial por diferentes motivos, mas pode ser destacada a presença de aminas-traço em alimentos (IRSFELD et al., 2014), o que implica em 74 potencial exposição direta desse sistema a concentrações mais elevadas do que as observadas fisiologicamente.Os resultados apresentados dão suporte a hipótese que β- feniletilamina exógena pode alterar movimentos peristálticos do estômago. Na verdade, o tratamento via oral por gavagem com agonista seletivo TAAR1, RO5166017 prolongou o tempo de esvaziamento gástrico em camundongos C57BL/6J (RAAB et al., 2015).Outro motivo, ainda mais relevante, e que definiu o avanço do estudo com tiras de fundo de estômago, foi o fato de o efeito contrátil em fundo de estômago estar na contramão dos efeitos observados com fenilefrina e isoproterenol. Enquanto em todos os outros tecidos os efeitos da β-feniletilamina poderiam ser diretamente comparados a fenilefrina ou isoproterenol, no fundo de estômago ela induziu contração, ao passo que fenilefrina não induziu efeito relevante e o isoproterenol produziu relaxamento. Essa ação não-simpaticomimética chamou a atenção e fez com que o fundo de estômago recebesse atenção maior no desenvolvimento do trabalho.

Os dois tecidos do trato gastrointestinal escolhidos para serem estudados foram o fundo de estômago e o íleo. A β-feniletilamina em fundo de estômago revelou contração com uma potência farmacológica intermediária, nem tão alta quanto aquela observada com átrio e nem tão baixa quanto a observada com aorta. Os resultados com íleo, por outro lado não mostraram qualquer indício de resposta na faixa de concentração testada (até 1 mM). A confiabilidade das preparações de íleo foi assegurada por meio de curva concentração efeito a acetilcolina, que induziu contração dependente de concentração, portanto, β-feniletilamina simplesmente não foi capaz de induzir resposta nos experimentos realizados.

Broadley et al. (2009) fizeram experimentos em íleo isolado de cobaias e descreveram contração em resposta a exposição a β-feniletilamina, no entanto esse efeito foi conseguido em concentrações elevadas e a CE30 apresentada foi de aproximadamente 0,7mM.

Com o início da investigação dos efeitos da β-feniletilamina em fundo de estômago, foi verificada a possível participação de receptores muscarínicos para esse efeito. Como foi demonstrado, atropina não interferiu na contração induzida por β- feniletilamina. Broadley et al. (2009) em seus experimentos com β-feniletilamina em segmentos isolados de íleo de cobaias relataram não haver interferência por fentolamina 75

(antagonista α-adrenérgico), ou propranolol, ou atropina – todos utilizados na concentração de 1μM.

Considerando a dependência de Ca2+ extracelular para contração da musculatura lisa gástrica (BATISTA-LIMA et al., 2017), foi avaliada a dependência desse íon advindo do meio extracelular para o efeito contrátil da β-feniletilamina. A remoção do Ca2+ do meio extracelular aboliu o efeito contrátil da β-feniletilamina, indicando pouca ou nenhuma participação do Ca2+ presente no retículo sarcoplasmático. A pergunta seguinte envolveu a via que esse íon utiliza para acessar o domínio intracelular.

Os protocolos que consistiam em reapresentação ao Ca2+ em forma de curva cumulativa após estímulo com β-feniletilamina ou acetilcolina reafirmaram a necessidade desse cátion no meio extracelular para que exista a contração. Contudo, foi a combinação desse protocolo com a utilização de verapamil que indicou a participação de canais para Ca2+ operados por voltagem (VOCC) nesse influxo. Quando foi empregado o Ba2+, cuja entrada é seletiva pelos VOCC, em substituição ao Ca2+, a participação desses canais ficou ainda mais evidente. Quando o perfil de resposta ao Ca2+ da β-feniletilamina é comparado ao da acetilcolina, pode ser observada uma resposta residual da acetilcolina devido a abertura de canais para Ca2+ operados por receptor (ROCC). Considerando a inexistência dessa resposta residual da curva ao Ca2+ na resposta a β-feniletilamina, parece pouco provável que essa molécula utilize os ROCC.

O terceiro grupo de canais iônicos para Ca2+ a ser considerado foram os canais para Ca2+ operados por estoque (SOCC). O retículo sarcoplasmático funciona como estoque e fonte de Ca2+ para a célula. Um dos processos de sinalização em que participa determina a entrada de Ca2+ extracelular através da “entrada de Ca2+ operada por estoque” ou “entrada capacitativa de Ca2+” onde estoques baixos facilitam a entrada de Ca2+ para seu reabastecimento (LAPORTE et al., 2004; PUTNEY, 2011). Algumas abordagens farmacológicas tem sido utilizadas para investigar essa entrada capacitativa em musculatura lisa, especialmente vascular, dentre elas a utilização de bloqueadores dos canais que medeiam esse tipo de influxo de Ca2+. Bencze et al. (2015) mostrou que esses canais provavelmente também estão envolvidos em respostas induzidas por agonistas em segmentos de artéria femoral de ratos utilizando os seguintes bloqueadores: 2-aminoetoxidifenil borato, ácido flufenâmico e SKF96365. 76

Dispondo do SKF96365, foi avaliada a resposta mediada por SOCC em musculatura lisa gástrica antes mesmo de iniciar os experimentos com β-feniletilamina. Nesses experimentos em tira de estômago isolada, os efeitos envolvendo verapamil e Ba2+ favoreceram a ideia de que a resposta contrátil induzida mediante reapresentação de Ca2+ após sua depleção nos estoques intracelulares também envolve participação de VOCC. Nesse ponto, o SKF96365 5 μM não afetou essa resposta significativamente, mas ao ser elevada sua concentração para 20 μM foi verificada a máxima inibição nesse protocolo de reapresentação ao Ca2+. A inibição conseguida com SKF96365 20 μM sugeriu um bloqueio além dos VOCC, provavelmente, uma inibição tanto de VOCC quanto de SOCC.

No protocolo seguinte, com a adição de K+ em meio livre de Ca2+ e reapresentação do Ca2+ em forma de curva, a contração visualizada é fruto de uma despolarização de membrana conseguida artificialmente pela alteração do potencial eletroquímico para o K+. Em outras palavras, essa contração depende, primordialmente, da abertura de VOCC decorrente da despolarização (RIBEIRO-FILHO et al., 2012). Portanto, SKF96365 5μM não apresentou efetividade no bloqueio VOCC, ao passo que o aumento da sua concentração para 20μM bloqueou esses canais. Apesar de não constituir objetivo do presente trabalho, o melhor entendimento do SKF96365 conferiu maior segurança para utilização dessa ferramenta farmacológica posteriormente.

Quando o protocolo de curva de Ca2+ foi retomado com a combinação de SKF96365 e β-feniletilamina, verificou-se que mesmo a concentração de 5 μM desse bloqueador foi capaz de inibir a resposta contrátil da β-feniletilamina. Isso pode ser entendido como a dependência de outra estrutura que permita o influxo de Ca2+ na célula e, diferentemente do VOCC, seja sensível ao bloqueio por baixas concentrações do SKF96365.

O caráter inespecífico do SKF96365 é conhecido desde o início da sua utilização nos anos 90. Merritt et al. (1990) o descreveu prioritariamente como uma opção de bloqueador ROCC com CI50 próxima a 10μM, no entanto já assumia pouca seletividade devido ao fato de também inibir a entrada por VOCC. A entrada de Ca2+ operada por receptor é uma importante fonte de influxo do meio extracelular. O mecanismo tanto pode ocorrer pela passagem através do próprio receptor-canal, como ocorre com os receptores de glutamato (ex.: AMPA), como pode ser por correntes catiônicas em canais 77 operados por segundos mensageiros (BERNA-ERRO et al., 2012). Mais recentemente foi demonstrado por Cheng et al. (2016) que SKF96365 10μM também é capaz de inibir correntes de canais para Ca2+ tipo-L (voltagem dependentes) e canais retificadores de K+ em nó atrioventricular de coelhos.

A capacidade de inibir múltiplos canais permeáveis a cátions dificultou um pouco a interpretação dos resultados do SKF96365. No entanto, o emprego dessa substância no presente trabalho reforçou a idéia da participação dos VOCC na contração induzida por β-feniletilamina em fundo de estômago, além de uma aparente dependência adicional de outras estruturas permeáveis a Ca2+ e sensíveis ao bloqueio com SKF96365.

Com base nos resultados obtidos com estimulação de campo elétrico em tiras de fundo de estômago, pode-se concluir que β-feniletilamina não modifica a contração induzida por estimulação elétrica, mas tem a capacidade se somar a essa resposta. A estimulação por campo elétrico induz contração, principalmente por meio da liberação local de acetilcolina, de tal maneira que essa resposta pode ser abolida por atropina (BATISTA-LIMA et al., 2017). O resultado observado, portanto, é um incremento do tônus resultante da “soma” da contribuição da β-feniletilamina com a estimulação de campo elétrico, e não uma potencialização da resposta induzida por essa estimulação.

Continuando na busca do mecanismo envolvido na contração induzida pela β- feniletilamina, outra amina biogênica reguladora da atividade motora do trato gastrintestinal foi considerada. A serotonina (5-HT) induz contração em tiras isoladas de fundo de estômago de rato, prioritariamente pela ativação de receptores 5-HT2 (FIGUEROA et al., 2009; KOMADA & YANO, 2007). Apesar da cadeia cíclica das estruturas de 5-HT e β-feniletilamina serem diferentes, os dois compartilham a mesma estrutura na sua porção alifática, onde se encontra a função amina. Apesar da diferença estrutural, o fato de ambos induzirem contração em fundo de estômago levou a investigação de receptores serotoninérgicos.

O princípio dos resultados com 5-HT foi semelhante ao que vinha sendo feito com os agonistas adrenérgicos em outros tecidos. Foi estabelecido um efeito induzido paralelamente por β-feniletilamina e 5-HT, e nesse contexto foram inseridas as mesmas concentrações em ambos de antagonistas conhecidos dos receptores serotoninérgicos. 78

Ciproheptadina, antagonista inespecífico de receptores 5-HT, e ketanserina, antagonista específico de 5-HT2 inibiram tanto a resposta induzida por 5-HT quanto a contração induzida por β-feniletilamina, sugerindo que os efeitos contráteis da β-feniletilamina envolvem o recrutamento de receptores de 5-HT. Glennnon et al. (1980), descreveram baixa afinidade da β-feniletilamina por receptores serotoninérgicos em fundo gástrico, ao passo que serotonina é considerada agonista parcial do receptor TAAR1 (BUNZOW et al., 2001). Os antagonistas do receptor 5-HT2A, ketanserina e ritanserina, aboliram o efeito vasoconstritor de outro ligante de TAAR1, triptamina, em vasos mesentéricos (ANWAR et al., 2012). Por outro lado, a magnitude de contrações induzidas por β- feniletilamina não foi alterada pela presença de EPPTB, indicando que o recrutamento de TAAR1 não estimula comportamento contrátil em células musculares lisas gástricas.

Adicionalmente, foi executado experimento com difenidramina, antagonista de receptor H1, que não apresentou nenhum indício de que o receptor histaminérgico pudesse estar envolvido no efeito da β-feniletilamina.

Nos experimentos em que houve aumento da concentração extracelular de K+, a tendência desse cátion ao efluxo é reduzida, o que resulta em despolarização da membrana e consequente abertura de VOCC. Dessa maneira, a β-feniletilamina perdeu a capacidade de induzir contração em fundo de estômago devido ao aumento de K+ extracelular, provavelmente, devido ao uso comum dos dois estímulos dos VOCC. Surpreendentemente, esse protocolo demonstrou um efeito relaxante induzido pela β- feniletilamina em presença de concentrações elevadas de K+. Esse resultado chama a atenção, pois revela a existência de uma rota intracelular que é suplantada pelo mecanismo envolvido no influxo de Ca2+. O efeito dessa via que leva ao relaxamento da musculatura lisa gástrica só se torna visível com a saturação do mecanismo envolvido na contração.

O efeito relaxante da β-feniletilamina em preparações de fundo gástrico previamente estimuladas com K+ 80 mM dificilmente deve-se ao recrutamento de receptores serotoninérgicos porque nem ciproheptadina, nem ketanserina comprometeram essa resposta relaxante. Na verdade, a presença desses antagonistas serotoninérgicos aumentou o relaxamento induzido pela β-feniletilamina, sugerindo que ocorreu um efeito excitatório concomitante via receptores 5-HT nas tiras de fundo gástrico. 79

O mecanismo celular tradicionalmente relacionado ao TAAR1 está associado ao aumento de AMPc no interior das células (BUNZOW et al., 2001; LAM et al., 2015).

Além disso, Chiellini et al. (2012) demonstraram uma expressão elevada de TAAR1 em fundo de estômago de ratos, o que torna a possibilidade do efeito relaxante observado ser decorrente, pelo menos em parte, da ativação desse receptor.

Suspeitando que esse efeito provavelmente passa pela produção intracelular de nucleotídeos cíclicos, curvas à β-feniletilamina foram realizadas em meio com elevada concentração extracelular de K+ na presença dos inibidores de guanilato ciclase, ODQ, ou adenilato ciclase, MDL12,330A. Apenas o inibidor da adenilato ciclase limitou esse efeito relaxante, sugerindo que pode ser intermediado pelo aumento de AMPc, e reforçando a ideia de que os efeitos relaxantes da β-feniletilamina sejam via TAAR1.

Por fim, a necessidade de concentrações de β-feniletilamina superiores as concentrações observadas fisiologicamente trouxe a tona a preocupação com possíveis efeitos tóxicos, especialmente sobre o sistema nervoso central, local com maior atenção para essa substância até o momento (BERRY et al., 2017). Se por um lado, agonistas TAAR parecem ter uma perspectiva interessante para tratamento da esquizofrenia e depressão, níveis elevados de β-feniletilamina tem sido associados a degeneração de neurônios dopaminérgicos nigroestriatais em pacientes com doença de Parkinson (MIURA, 2000). Portanto, foi escolhido um modelo de dano induzido por 6-hidróxi- dopamina (6-OH-DA) em células de feocromocitoma adrenal de ratos (PC12) para avaliar os possíveis efeitos citotóxicos da β-feniletilamina. O propósito nesse ponto do estudo foi comparar a β-feniletilamina com 6-OH-DA nesse modelo que é considerado um modelo de doença de Parkinson (PARK et al., 2017). Enquanto 6-OH-DA induziu morte celular, equivalente a neurodegeneração, β-feniletilamina não mostrou nenhuma alteração significativa, ou mesmo tendência a efeito citotóxico sobre essas células.

80

7. CONCLUSÃO

A amina traço β-feniletilamina possui, na maior parte dos tecidos estudados, efeitos similares aos de agonistas α- ou β-adrenérgicos, no entanto seus efeitos não podem explicados pela simples interação com esses receptores. Um tecido que não demonstrou ação equivalente a de agonistas adrenérgicos foi o fundo de estômago, cujo efeito contrátil se diferenciou de agonista α- e β-adrenérgico.

Em preparações vasculares, a β-feniletilamina apresentou efeito dual a depender da faixa de concentração. Induziu efeito inibitório em concentrações mais baixas, o que parece ser devido a um antagonismo α-adrenérgico; enquanto concentrações mais elevadas levam a contração independente do receptor α-adrenérgico, talvez mediada por

TAAR1.

O baço contraiu em resposta a fenilefrina, agonista α-adrenérgico, e apesar da β- feniletilamina também ter induzido contração, a magnitude da resposta foi inferior a fenilefrina. Outra diferença foi com relação ao uso do antagonista α-adrenérgico prazosina que promoveu antagonismo tipicamente competitivo na resposta da fenilefrina, ao passo que induziu antagonismo não-competitivo na β-feniletilamina.

Já em preparações de átrio direito isolado, β-feniletilamina aumentou a frequência de eventos contráteis espontâneos de forma dependente de concentração. Esse cronotropismo positivo, semelhante ao de uma ativação β-adrenérgica, não sofreu influência do antagonista β-adrenérgico propranolol com a mesma intensidade que é encontrada em resposta induzida por isoproterenol. Isso provavelmente se deve a uma ativação de receptor diferente do β-adrenérgico pela β-feniletilamina.

Em musculatura lisa traqueal, β-feniletilamina relaxa de pré-contrações induzidas por agonista muscarínico através de mecanismo independente de receptores β-adrenérgico, mas dependente da abertura de canais de potássio.

Ao ser adicionada sobre tensão de repouso de tiras de fundo de estômago, β- feniletilamina induziu contração, diferente do que aconteceu com fenilefrina e isoproterenol. Esse efeito não envolve ativação muscarínica e depende do influxo de Ca2+ do meio extracelular principalmente por canais para Ca2+ operados por voltagem. 81

O aspecto diferenciado dos resultados em fundo de estômago levou a uma investigação mais aprofundada que revelou uma provável participação de receptores serotoninérgicos para contração induzida por β-feniletilamina. Além disso, em meio com elevada concentração extracelular de K+, foi verificado um efeito relaxante dependente da produção de AMPc provavelmente mediado por ativação de receptores

TAAR1. Essa diferença de efeitos provavelmente deve-se a uma dualidade de sinalização das estruturas ativadas na membrana da célula muscular lisa gástrica.

Preparações de íleo não apresentaram efeito contrátil em resposta a β- feniletilamina na faixa de concentração testada.

Em modelo de Parkinson com células PC12, β-feniletilamina não apresentou efeito citotóxico no teste do MTT dentro da faixa de concentrações testada.

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REFERÊNCIAS

ABOUD, R.; SHAFII, M.; DOCHERTY, J. R. Investigation of the subtypes of alpha 1- adrenoceptor mediating contractions of rat aorta, vas deferens and spleen. Br J Pharmacol, v. 109, p. 80-7, 1993.

AHLQUIST, R. P. Historical perspective. Classification of adrenoreceptors. J Auton Pharmacol. v.1, 101-6, 1980.

ALEXANDRE, E. C.; KIGUTI, L. R.; CALMASINI, F. B.; SILVA, F. H.; DA SILVA, K. P.; FERREIRA, R.; RIBEIRO, C. A.; MÓNICA, F. Z.; PUPO, A. S.; ANTUNES, E. Mirabegron relaxes urethral smooth muscle by a dual mechanism involving β3 - adrenoceptor activation and α1-adrenoceptor blockade. Br J Pharmacol, v. 173, p. 415- 28, 2016.

ANWAR, M. A.; FORD, W. R.; BROADLEY, K. J.; HERBERT, A. A. Vasoconstrictor and vasodilator responses to tryptamine of rat-isolated perfused mesentery: comparison with tyramine and β-phenylethylamine. Br J Pharmacol. v. 165, p. 2191-202, 2012.

AXELROD, J.; SAAVEDRA, J. M. Octopamine. Nature v. 265, p. 501-4, 1977.

BAKER, G. B.; RAITERI, M.; BERTOLLINI, A.; DEL CARMINE, R. Interaction of beta-phenethylamine with dopamine and noradrenaline in the central nervous system of the rat. J Pharm Pharmacol, v. 28, p. 456-7, 1976.

BAKOVIĆ, D.; VALIC, Z.; ETEROVIĆ, D.; VUKOVIC, I.; OBAD, A.; MARINOVIĆ-TERZIĆ, I.; DUJIĆ, Z. Spleen volume and blood flow response to repeated breath-hold apneas. J Appl Physiol, v. 95, p. 1460-6, 2003.

BASTOS, V. P.; BRITO, T. S.; LIMA, F. J.; PINHO, J. P.; LAHLOU, S.; ABREU MATOS, F. J.; SANTOS, A. A.; CALDAS MAGALHÃES, P.J. Inhibitory effect of 1,8-cineole on guinea-pig airway challenged with ovalbumin involves a preferential action on electromechanical coupling. Clin Exp Pharmacol Physiol, v. 36, p. 1120-6, 2009.

BATISTA-LIMA, F. J.; GADELHA, K. K. L.; OLIVEIRA, D. M.; VASCONCELOS, T. B.; BRITO, T. S.; MAGALHÃES, P. J. C. A simple laboratory exercise with rat isolated esophagus and stomach fundus to reveal functional differences between striated and smooth muscle cells. Adv Physiol Educ. v. 41, p. 291-297, 2017.

BENCZE, M.; BEHULIAK, M.; VAVŘÍNOVÁ, A.; ZICHA J. Broad-range TRP channel inhibitors (2-APB, flufenamic acid, SKF-96365) affect differently contraction of resistance and conduit femoral arteries of rat. Eur J Pharmacol, v. 765, p. 533-40, 2015.

BERNA-ERRO, A.; REDONDO, P. C.; ROSADO, J. A. Store-operated Ca(2+) entry. Adv Exp Med Biol, v. 740, p. 349-82, 2012. 83

BERRY, M. D.; GAINETDINOV, R. R.; HOENER, M. C.; SHAHID, M. Pharmacology of human trace amine-associated receptors: Therapeutic opportunities and challenges. Pharmacol Ther. v. 180, p. 161-180, 2017.

BROADLEY, K. J.; AKHTAR ANWAR, M.; HERBERT, A. A.; FEHLER, M.; JONES, E. M.; DAVIES, W. E.; KIDD, E. J.; FORD, W. R. Effects of dietary amines on the gut and its vasculature. Br J Nutr, v. 101, p. 1645-52, 2009.

BROADLEY, K. J.; FEHLER, M.; FORD, W. R.; KIDD, E. J. Functional evaluation of the receptors mediating vasoconstriction of rat aorta by trace amines and amphetamines. Eur J Pharmacol, v. 715, p. 370-80, 2013.

BRUNTON, LAURENCE L. ((org)). As bases farmacológicas da terapêutica de Goodman & Gilman. 12. ed. Rio de Janeiro, RJ: McGraw-Hill, 2012.

BUNZOW, J. R.; SONDERS, M.S.; ARTTAMANGKUL, S.; HARRISON, L. M.; ZHANG, G.; QUIGLEY, D. I.; DARLAND, T.; SUCHLAND, K. L., PASUMAMULA, S.; KENNEDY, J. L.; OLSON, S. B.; MAGENIS, R. E.; AMARA, S. G.; GRANDY, D. K. Amphetamine, 3,4-methylenedioxymethamphetamine, lysergic acid diethylamide, and metabolites of the catecholamine neurotransmitters are agonists of a rat trace amine receptor. Mol Pharmacol, v. 60, p. 1181-8, 2001.

CALVERT, R.; VOHRA, S.; FERGUSON, M.; WIESENFELD, P. A beating heart cell model to predict cardiotoxicity: effects of the dietary supplement ingredients higenamine, phenylethylamine, ephedrine and caffeine. Food Chem Toxicol, v. 78, p. 207-13, 2015.

CHENG, H.; CURTIS, A. E.; FELLINGHAM, C.; HANCOX, J. C. Multiple ion channel block by the cation channel inhibitor SKF-96365 in myocytes from the rabbit atrioventricular node. Physiol Rep, v. 4, e12819, 2016.

CHIELLINI, G.; ERBA, P.; CARNICELLI, V.; MANFREDI, C.; FRASCARELLI, S.; GHELARDONI, S.; MARIANI, G.; ZUCCHI, R. Distribution of exogenous [125I]-3- iodothyronamine in mouse in vivo: relationship with trace amine-associated receptors. J Endocrinol. v. 213, p. 223-30, 2012.

CHIN, J. L.; AIDEN MCCORMICK, P.; DOCHERTY, J. R. Effects of portal hypertension on contractility of rat spleen. Eur J Pharmacol, v. 721, p. 1-4, 2013.

DOCHERTY, J. R. Subtypes of functional alpha1-adrenoceptor. Cell Mol Life Sci. v. 67, p. 405-17, 2010.

DUNLOP, D.; SHANKS, R. G. Inhibition of the carotid sinus reflex by the chronic administration of propranolol. Br J Pharmacol, v. 36, p. 132-43, 1969.

EYUN S. I.; MORIYAMA, H.; HOFFMANN, F. G.; MORIYAMA, E. N. Molecular Evolution and Functional Divergence of Trace Amine-Associated Receptors. PLoS One, v. 11, e0151023, 2016. 84

FEHLER, M.; BROADLEY, K. J.; FORD, W. R.; KIDD, E. J. Identification of trace- amine-associated receptors (TAAR) in the rat aorta and their role in vasoconstriction by β-phenylethylamine. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, v. 382, p. 385-98. 2010.

FERRERO, D. M.; LEMON, J. K.; FLUEGGE, D.; PASHKOVSKI, S. L.; KORZAN, W. J.; DATTA, S. R.; SPEHR, M.; FENDT, M.; LIBERLES, S. D. Detection and avoidance of a carnivore odor by prey. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 108, p. 11235-40, 2011.

FERRERO, D. M.; WACKER, D.; ROQUE, M. A.; BALDWIN, M. W.; STEVENS, R. C.; LIBERLES, S. D. Agonists for 13 trace amine-associated receptors provide insight into the molecular basis of odor selectivity. ACS Chem Biol, v. 7, p. 1184-9, 2012.

FIGUEROA, K. W.; MARTIN, G. R.; PULIDO-RIOS, M. T. 5-Hydroxytryptamine receptor assays. Curr Protoc Pharmacol, Capítulo 4, Unidade 4.19, 2009.

FINBERG, J. P.; GILLMAN, K. Selective inhibitors of monoamine oxidase type B and the "cheese effect". Int Rev Neurobiol. v. 100, p. 169-90, 2011.

FRASCARELLI, S.; GHELARDONI, S.; CHIELLINI, G.; VARGIU, R.; RONCA- TESTONI, S.; SCANLAN, T. S.; GRANDY, D. K.; ZUCCHI, R. Cardiac effects of trace amines: pharmacological characterization of trace amine-associated receptors. Eur J Pharmacol. v. 587, p. 231-6, 2008.

GLENNON, R. A.; LIEBOWITZ, S. M.; ANDERSON, G. M, 3RD. Serotonin receptor affinities of psychoactive phenalkylamine analogues. J Med Chem. v. 23, p. 294-9, 1980.

GUIMARÃES, J. T.; SOARES-DA-SILVA, P. Unusual pattern of beta- phenylethylamine deamination in the rat heart. Biochem Soc Trans. v. 25, S622, 1997.

HAWTHORN, M. H.; BROADLEY, K. J.; GIBBON, C. J. Examination of the bronchoconstrictor response of guinea-pig isolated lung to beta-phenylethylamine. Gen Pharmacol, v. 16, p. 371-8, 1985.

HAN, C.; ABEL, P. W.; MINNEMAN, K. P. Alpha 1-adrenoceptor subtypes linked to different mechanisms for increasing intracellular Ca2+ in smooth muscle. Nature, v. 329, p. 333-5, 1987.

HANSEN, T. R.; GREENBERG, J.; MOSNAIM, A. D. Direct effect of phenylethylamine upon isolated rat aortic strip. Eur J Pharmacol, v. 63, p. 95-101, 1980.

IRSFELD, M.; SPADAFORE, M.; PRÜß, B. M. β-phenylethylamine, a small molecule with a large impact. Webmedcentral, v. 4, pii: 4409, 2013. 85

KLEINAU, G.; PRATZKA, J.; NÜRNBERG, D.; GRÜTERS, A.; FÜHRER-SAKEL, D.; KRUDE, H.; KÖHRLE, J.; SCHÖNEBERG, T.; BIEBERMANN, H. Differential modulation of Beta-adrenergic receptor signaling by trace amine-associated receptor 1 agonists. PLoS One, v. 6, e27073, 2011.

KOMADA, T.; YANO, S. Pharmacological characterization of 5-Hydroxytryptamine- receptor subtypes in circular muscle from the rat stomach. Biol Pharm Bull, v. 30, p. 508-13, 2007.

LAM, V. M.; ESPINOZA, S.; GERASIMOV, A. S.; GAINETDINOV, R. R.; SALAHPOUR, A. In-vivo pharmacology of Trace-Amine Associated Receptor 1. Eur J Pharmacol, v. 763, p. 136-42, 2015.

LAPORTE, R.; HUI, A.; LAHER, I. Pharmacological modulation of sarcoplasmic reticulum function in smooth muscle. Pharmacol Rev, v. 56, p. 439-513, 2004. LI, Y.; HOFFMANN, J.; LI, Y.; STEPHANO, F.; BRUCHHAUS, I.; FINK, C.; ROEDER, T. Octopamine controls starvation resistance, life span and metabolic traits in Drosophila. Sci Rep. v. 6, 35359, 2016.

LIN, O. A.; KARIM, Z. A.; VEMANA, H. P.; ESPINOSA, E. V.; KHASAWNEH, F. T. The antidepressant 5-HT2A receptor antagonists pizotifen and cyproheptadine inhibit serotonin-enhanced platelet function. PLoS One, v. 9, e87026, 2014.

LOBO, S. B.; DENYER, M.; BRITLAND, S.; JAVID, F. A. The involvement of the serotonergic transmission system in neonatal and adult rat ileum contractility varies with age. Pharmacology, v. 88, p. 225-32, 2011.

MERRITT, J. E.; ARMSTRONG, W. P.; BENHAM, C. D.; HALLAM, T. J.; JACOB, R.; JAXA-CHAMIEC, A.; LEIGH, B. K.; MCCARTHY, S. A.; MOORES, K. E.; RINK, T. J. SK&F 96365, a novel inhibitor of receptor-mediated calcium entry. Biochem J, v. 271, p. 515-22, 1990.

MIURA, Y. Plasma beta-phenylethylamine in Parkinson's disease. Kurume Med J. v. 47, p. 267-72, 2000.

NAGAYA, Y.; KUTSUKAKE, M.; CHIGUSA, S. I.; KOMATSU, A. A trace amine, tyramine, functions as a neuromodulator in Drosophila melanogaster. Neurosci Lett, v. 329, p. 324-8, 2002.

NARANG, D.; KERR, P. M.; LUNN, S. E.; BEAUDRY, R.; SIGURDSON, J.; LALIES, M. D.; HUDSON, A. L.; LIGHT, P. E.; HOLT, A.; PLANE, F. Modulation of resistance artery tone by the trace amine β-phenylethylamine: dual indirect sympathomimetic and α1-adrenoceptor blocking actions. J Pharmacol Exp Ther, v. 351, p. 164-71, 2014.

OHTA, H.; TAKEBE, Y.; MURAKAMI, Y.; TAKAHAMA, Y.; MORIMURA, S. Tyramine and β-phenylethylamine, from fermented food products, as agonists for the 86 human trace amine-associated receptor 1 (hTAAR1) in the stomach. Biosci Biotechnol Biochem. v.81, p. 1002-1006, 2017.

PARK, H. J.; LEE, K. S.; ZHAO, T. T.; LEE, K. E.; LEE, M. K. Effects of asarinin on dopamine biosynthesis and 6-hydroxydopamine-induced cytotoxicity in PC12 cells. Arch Pharm Res. v. 40, p. 631-639, 2017.

PESCE, G.; ADLER-GRASCHINSKY, E. Comparison of the effects of beta- phenylethylamine and d-amphetamine on rat isolated atria. J Pharmacol Exp Ther, v. 227, p. 205-14, 1983.

PUTNEY, J. W. Origins of the concept of store-operated calcium entry. Front Biosci (Schol Ed), v. 3, p. 980-4, 2011.

RAAB, S.; WANG, H.; UHLES, S.; COLE, N.; ALVAREZ-SANCHEZ, R.; KÜNNECKE, B.; ULLMER, C.; MATILE, H.; BEDOUCHA, M.; NORCROSS, R. D.; OTTAWAY-PARKER, N.; PEREZ-TILVE, D.; CONDE KNAPE, K.; TSCHÖP, M. H.; HOENER, M. C.; SEWING, S. Incretin-like effects of small molecule trace amine- associated receptor 1 agonists. Mol Metab. v. 5, p. 47-56, 2015.

REVEL, F. G.; MOREAU, J. L.; POUZET, B; MORY, R.; BRADAIA, A.; BUCHY, D.; METZLER, V.; CHABOZ, S.; GROEBKE ZBINDEN, K.; GALLEY, G.; NORCROSS, R. D.; TUERCK, D.; BRUNS, A.; MORAIRTY, S. R.; KILDUFF, T. S.; WALLACE, T. L.; RISTERUCCI, C.; WETTSTEIN, J. G.; HOENER, M. C. A new perspective for schizophrenia: TAAR1 agonists reveal antipsychotic- and antidepressant-like activity, improve cognition and control body weight. Mol Psychiatry. v. 18, p. 543-56, 2013.

RIBEIRO-FILHO, H. V.; BRITO, T. S.; LIMA, F. J.; PINHO, J. P.; SOUSA, D. F.; SILVA, M. T.; DE SIQUEIRA, R. J.; COSKER, F.; BASTOS, V. P.; SANTOS, A. A., MAGALHÃES, P. J. Talking about bioelectrical potentials using rings of the mesenteric artery without glass micropipettes. Adv Physiol Educ, v. 36, p. 336-44, 2012.

SARASWATI, S.; FOX, L. E.; SOLL, D. R.; WU, C. F. Tyramine and octopamine have opposite effects on the locomotion of Drosophila larvae. J Neurobiol. v. 58, p. 425-41, 2004.

VORNANEN, M. Adrenergic responses in different sections of rat airways. Acta Physiol Scand, v. 114, p. 587-91, 1982.

YAO, Q. Y.; CHEN, D. P.; YE, D. M.; DIAO, Y. P.; LIN, Y. Modulatory effects of taurine on jejunal contractility. Braz J Med Biol Res, v. 47, p. 1068-74, 2014.

ZUCCHI, R.; CHIELLINI, G.; SCANLAN, T. S.; GRANDY, D. K. Trace amine- associated receptors and their ligands. Br J Pharmacol, v. 149, p. 967-78, 2006.