INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

IDENTIFICACIÓN ESTRUCTURAL DE COMPUESTOS MAYORITARIOS EN PLANTAS SILVESTRES DE tenuiflora Benth Y SU ACUMULACIÓN EN CULTIVOS DE RAÍCES in vitro.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORADO EN CIENCIAS EN DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

PRESENTA

YENNY ADRIANA GÓMEZ AGUIRRE

DIRECTORES

GABRIELA TREJO TAPIA ALEJANDRO ZAMILPA ALVAREZ

Yautepec, Morelos, México Diciembre 2011

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Células Vegetales del Departamento de Biotecnología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Gabriela Trejo Tapia y en el Centro de Investigación Biomédica del Sur del Instituto Mexicano del Seguro Social, bajo la dirección del Dr. Alejandro Zamilpa Alvarez.

Para la realización de los estudios se contó con el apoyo económico del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) (No. becario: 215309) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) de la Secretaría de investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20090311, 20100308 y 20110153) y del CONACyT (Proyecto No.100202).

AGRADECIMIENTOS

Expreso sinceros agradecimientos a:

A mis directores: Dr. Gabriela Trejo Tapia. Investigadora del Departamento de Biotecnología. Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi) – Instituto Politécnico Nacional (IPN).

Dr. Alejandro Zamilpa Alvarez. Investigador del Centro de Investigación Biomédica del Sur (CIBIS) - Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS).

Al comité tutorial y revisor: Dr. Antonio Ruperto Jiménez Aparicio. Investigador del Departamento de Biotecnología. CeProBi-IPN.

Dra. Kalina Bermúdez Torres. Investigadora del Departamento de Biotecnología. CeProBi-IPN.

Dr. Federico Castrejón Ayala. Investigador del Departamento de Interacciones Planta-Insecto. CeProBi-IPN.

Dra. Elsa Ventura Zapata. Investigadora del Departamento de Biotecnología. CeProBi-IPN.

Dr. Mario Rodríguez Monroy. Investigador del Departamento de Biotecnología. CeProBi-IPN.

Dr. Manasés González Cortazar. Investigador del CIBIS-MSS.

A mis compañeros y profesores del CeProBi y del CIBIS.

CONTENIDO

Páginas

ÍNDICE DE CUADROS i

ÍNDICE DE FIGURAS iii

LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS v

RESUMEN vi

ABSTRACT vii 1. INTRODUCCIÓN ...... 1

2. ANTECEDENTES...... 3 2.1. Castilleja tenuiflora y su importancia en la medicina tradicional Mexicana ...... 3 2.2. Estudios de fitoquímica y actividades biológicas del género Castilleja ...... 6 2.3. Iridoides glucosilados ...... 11 2.3.1. Biosíntesis de los iridoides glucosilados ...... 12 2.3.2. Actividad biológica de los iridoides glucosilados...... 16 2.4. Feniletanoides glicosilados ...... 17 2.4.1. Biosíntesis de los feniletanoides glicosilados ...... 18 2.4.2. Actividades biológicas de los feniletanoides glicosilados ...... 21 2.5. Cultivos in vitro de raíces ...... 22 2.6. Cultivos de órganos in vitro como fuente de iridoides glucosilados y feniletanoides glicosilados ...... 23 2.7. Antecedentes sobre el cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora ...... 25

3. JUSTIFICACIÓN ...... 26

4. OBJETIVOS ...... 27 4.1. Objetivo general ...... 27 4.2. Objetivos específicos ...... 27

5. MATERIALES Y MÉTODOS ...... 28 5.1. Material vegetal silvestre ...... 28 5.2. Evaluación de protocolos de extracción ...... 29 5.3. Cromatografía de capa fina (CCF) ...... 29

5.4. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de tallo de C. tenuiflora...... 31 5.4.1. Purificación de la fracciones T19 y T22 ...... 33 5.5. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de raíces de C. tenuiflora...... 34 5.5.1. Obtención de la fracción acetónica de raíces ...... 34 5.5.2. Fraccionamiento de la fracción acetónica (F3) de raíces ...... 34 5.5.2.1. Purificación de las fracciones C1 obtenidas de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora ...... 36 5.5.2.2. Purificación de las fracciones C2 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora ...... 37 5.5.2.3. Purificación de la fracción C3 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora ...... 38 5.5.2.4. Purificación de la fracción C4 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora ...... 39 5.6. Cuantificación de aucubina ...... 40 5.7. Cuantificación de verbascósido e isoverbascósido ...... 41 5.8. Cuantificación de apigenina ...... 42 5.9. Inducción de raíces adventicias y cultivo in vitro de C. tenuiflora ...... 43 5.10. Determinación de parámetros cinéticos ...... 44 5.11. Análisis estadístico ...... 45

6. RESULTADOS ...... 46 6.1. Evaluación de protocolos de extracción ...... 46 6.2. Identificación de apigenina en tallos silvestres de C. tenuiflora ...... 48 6.3. Identificación de aucubina y bartsiósido en tallos silvestres de C. tenuiflora ...... 48 6.4. Identificación de feniletanoides glicosilados en raíces silvestres de C. tenuiflora ...... 50 6.5. Cuantificación de aucubina, verbascósido, isoverbascósido y apigenina en plantas silvestres ...... 63 6.6. Inducción de raíces adventicias y cultivos in vitro de C. tenuiflora ...... 64 6.7. Cuantificación de aucubina, verbascósido e isoverbascósido en cultivos in vitro de raíces adventicias de C. tenuiflora ...... 68

7. DISCUSIÓN ...... 71

8. CONCLUSIONES ...... 76

9. PERSPECTIVAS ...... 77

10. LITERATURA CITADA ...... 78

ANEXO 1. Espectro de RMN 1H (400 Hz) del bartsiósido (fracción T19b) 89

ANEXO 2. Espectro de RMN 1H (400 Hz) de la aucubina (fracción T22a) 90

ANEXO 3. Espectro de 1H–1H NOESY (400 Hz) del verbascósido 91

ANEXO 4. Espectro de 1H–13C HSQC (400 Hz) del verbascósido 92

ANEXO 5. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuestos aislados de la fracción C4R2 (posible feniletanoide glicosilado) 93

ANEXO 6. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuestos aislados de la fracción C4R4 (posible feniletanoide glicosilado) 94

ANEXO 7. Cromatograma de HPLC del extracto metanólico del tallo de C. tenuiflora 95

ANEXO 8. Artículo publicado con los resultados de la presente tesis 96

ÍNDICE DE CUADROS

Páginas 1. Usos y forma de preparación de C. tenuiflora en la medicina tradicional 5

2. Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja 7

3. Feniletanoides glicosilados y ácidos fenólicos identificados en el género Castilleja 10

4. Cultivos de raíces peludas y células en suspensión que producen verbascósido 24

5. Peso fresco y peso seco de cada órgano de la planta silvestre de C. tenuiflora 28

6. Fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de tallos silvestres de C. tenuiflora 33

7. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora 36

8. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C1 obtenidas de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora 37

9. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C2 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora 38

10. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C3 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora 39

i

11. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C4 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora 40

12. Sistema de elución utilizado en la separación de iridoides glucosilados por HPLC 41

13. Sistema de elución utilizado en la separación de feniletanoides glicosilados por HPLC 42

14. Sistema de elución utilizado en la separación de apigenina por HPLC 43

15. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de aucubina

(CD3OD) 49

16. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de bartsiósido

(CD3OD) 50

17. Valores de desplazamiento químico del protón y carbón (δ, ppm) de

verbascósido e isoverbascósido (CD3OD) 52

18. Concentración de aucubina, feniletanoides y apigenina en los diferentes órganos de plantas silvestres de C. tenuiflora 64

ii

ÍNDICE DE FIGURAS Páginas 1. Castilleja tenuiflora 4

2. Iridoides 12

3. Propuesta de ruta de biosíntesis de iridoides glucosilados para Scrophularia umbrosa (a), Buddleya albiflora (b), Antirhinum majus (c) 14 y Scrophularia racemosa (d)

4. Estructura general de los feniletanoides 18

5. Propuesta de ruta de biosíntesis de los feniletanoides glicosilados en Olea europea (Oleaceae) y Cintasche deserticola () 20

6. Obtención de la fracción de acetato de etilo de tallo (F2) y aislamiento de flavonoide (T9) e iridoides glucosilados (T19b y T22a) 32

7. Resumen del proceso de purificación del extracto metanólico de raíces de C. tenuiflora 35

8. Cromatografia en capa fina de extractos metanólicos (por 24 h) e infusiones de C. tenuiflora 46

9. Cromatografía en capa fina de extractos metanólicos de plantas silvestres de C. tenuiflora 47

10. Cromatografía en capa fina de compuestos aislados del tallo (Luz UV 365 nm) 48

11. Estructura química de aucubina y bartsiósido aislados de tallos silvestres de C. tenuiflora 49

12. Estructuras químicas de los feniletanoides glicosilados: verbascósido e isoverbascósido aislados de raíces silvestres de C. tenuiflora 51

iii

1 13. Espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido aislado del extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora 53

14. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia de espines de la glucosa 57

15. Expansión del espectro COSY junto a la estructura del verbascósido mostrando la secuencia de espines de la ramnosa 58

16. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia de espines de la aglicona 60

17. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia de espines del anillo benceno éstos compuestos fenólicos 61

18. Espectro del 13C y expansión del espectro HMBC junto a la estructura del verbascósido mostrando la unión del carbono C-9 del ácido cafeico con el hidrogeno H-4 de glucosa 62

19. Expansión del espectro HMBC del verbascósido mostrando la unión del carbono e hidrogeno de glucosa y ramnosa 63

20. Inducción de raíces adventicias in vitro de C. tenuiflora 65

21. Morfología de las raíces adventicias de C. tenuiflora cultivadas in vitro 66

22. Cinética del cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora en medio líquido B5 suplementado con 10 M de AIA, ANA ó sin regulador de crecimiento (control) 67

23. Cromatogramas de CLAR (detección a los 330 nm) de extractos metanólicos de C. tenuiflora 69

24. Producción de feniletanoides glicosilados en raíces adventicias de C. tenuiflora cultivadas en medio líquido B5 suplementado con AIA, ANA ó SRC 70

iv

LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

AIA Ácido indol 3-acético ANA Ácido -naftalenacético BF Biomasa fresca BS Biomasa seca CCF-FN Cromatografía en capa fina en fase normal CCF-FR Cromatografía en capa fina en fase reversa CLAR-FR Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa COSY Correlation spectroscopy δ Desplazamiento químico d Día FG Feniletanoides glicosilados IG Iridoides glucosilados HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HSQC Heteronuclear single quantum correlation MS Metabolitos secundarios NOESY Nuclear overhauser effect spectroscopy

Rf Factor de retención RMN 1H Resonancia magnética nuclear de protón RMN 13C Resonancia magnética nuclear del isótopo de carbono rpm Revoluciones por minutos TFA Trifluoracetic acid td Tiempo de duplicación µ Velocidad específica de crecimiento (días-1) W/m2 Vatios por metro cuadrado

v

RESUMEN

En este estudio, por primera vez se identificaron el verbascósido e isoverbascósido como los principales feniletanoides glicosilados (FG) en plantas silvestres de Castilleja tenuiflora. Se identificaron dos iridoides glucosilados (IG) aucubina y bartsiósido, así como el flavonoide apigenina. Se ha demostrado la actividad biológica de esos compuestos, como anti-inflamatoria, antioxidante y citotóxica, que pueden estar relacionadas con los usos tradicionales de esta planta. Se desarrolló una metodología de separación por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (CLAR-FR) para analizar FG e IG. Se determinó su concentración en diferentes tejidos de plantas silvestres. El verbascósido se acumuló principalmente en raíces e inflorescencias (9.23 y 7.88 mg g-1 de biomasa seca (BS), respectivamente), mientras que el isoverbascósido se acumuló principalmente en las raíces (7.13 mg g-1 BS). Se estableció el cultivo de raíces adventicias in vitro, en el que las raíces se cultivaron en medio B5 con 10 M de ácido indol 3-acético (AIA) ó 10 M de ácido α-naftalenacético (ANA). El mayor rendimiento de biomasa seca fue con la auxina AIA a los 30 días (30 g L-1), éste valor fue de 1.5 y 2.3 veces más alto (P <0,05) que lo obtenido en un medio con ANA o sin regulador de crecimiento (control), respectivamente. Los mayores rendimientos específicos de FG también se obtuvieron utilizando esta auxina; el máximo nivel de verbascósido fue 14.62 mg g-1 BS (438.6 mg L-1) a los 30 días de la cinética y el máximo rendimiento de isoverbascósido fue de 37.32 mg g-1 de BS (522.48 mg L-1) a 23 días de la cinética. El cultivo de raíces adventicias in vitro de C. tenuiflora es un sistema prometedor para que en futuros estudios se amplíe el conocimiento sobre la biosíntesis de los feniletanoides glicosilados.

vi

ABSTRACT

In this study, we identified for the first time verbascoside and isoverbascoside as the major phenylethanoid glycosides (PhGs) in wild of C. tenuiflora. These compounds have proven biological activities, including anti-inflammatory, antioxidant, and cytotoxic activities, which may be related to the traditional uses of this . We developed a reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) procedure to analyze PhGs, and determined their concentrations in various different tissues of wild plants. Verbascoside accumulated mainly in roots and (9.23 and 7.88 mg g-1 dry biomass, respectively), while isoverbascoside accumulated mainly in the roots (7.13 mg g-1 dry biomass). To provide an alternative source of material for production of bioactive compounds, we established in vitro adventitious root cultures in which roots were grown in B5 medium containing either 10 M indole 3-acetic acid (IAA) or 10 M -naphthaleneacetic acid (NAA). The greatest dry biomass yield (30 g L-1) was achieved at 30 days after transfer of roots into IAA- containing medium. The highest specific yields of PhGs were also obtained using this auxin; the maximum level of verbascoside was 14.62 mg g-1 dry root biomass (438.6 mg L-1) at 30 days after root transfer, and the maximum yield of isoverbascoside was 37.32 mg g-1 dry root biomass (522.48 mg L-1) at 23 days after root transfer. Adventitious root cultures of C. tenuiflora are a promising system for further studies on scale-up and phenylethanoid glycosides biosynthesis.

vii

1. INTRODUCCIÓN

Castilleja tenuiflora Benth. (Oronbachaceae antes Scrophulariaceae) es una especie de importancia en la medicina tradicional Mexicana. Se ha descrito su uso para tratar síntomas asociados con el cáncer, enfermedades respiratorias y trastornos gastrointestinales. En la actualidad, la Sociedad Farmacéutica de México la indica como diurético y sialagogo (sustancia que estimula la saliva).

El primer estudio químico de plantas silvestres de C. tenuiflora fue realizado por Jiménez et al. (1995), quienes identificaron en el extracto butanólico de la parte aérea los iridoides glucosilados: bartsiósido, aucubina, shanzhisida, ácido geniposídico y el ácido mussaenosídico. En una investigación reciente, Rosas (2007) demostró que tanto en la parte aérea como en la raíz hay presencia de iridoides. Entre los cuales solo identificó aucubina y bartsiósido.

En el género Castilleja, el verbascósido fue identificado por primera vez en Castilleja integra en 1987 y en 1990 el isoverbascósido sólo se había identificado en Castilleja linariaefolia. Los iridoides glucosilados (IG) del tipo de la aucubina, así como los feniletanoides glicosilados (FG) del tipo de verbascósido son compuestos considerados marcadores taxonómicos y su presencia se encuentra restringida a los ordenes , Scrophulariales, Hippuridales y Oleales. La presencia de estos compuestos en la planta parece deberse a su interacción con microorganismos y el ambiente.

La investigación sobre la biología de la raíz se había visto obstaculizada por la naturaleza de las raíces y la falta de sistemas experimentales adecuados para estudiar la interacción entre raíz-raíz y raíz-microorganismo. Sin embargo, los avances recientes en las raíces que crecen de forma aislada de otros elementos de la rizósfera han facilitado enormemente su estudio, específicamente del metabolismo, fisiología y genética, contribuyendo a la comprensión de este órgano, así como el

1

potencial de los metabolitos derivados de la raíz en términos de su actividad biológica y la manipulación humana.

Los cultivos de tejidos vegetales in vitro, por su grado de especialización y organización celular pueden sintetizar y/o acumular estos metabolitos secundarios, representando una alternativa a la extracción directa de la planta. Previamente, en cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora se acumularon iridoides (biomasa y medio de cultivo), aunque no se elucidaron las estructuras, sólo se identificó aucubina en el sobrenadante.

En el presente trabajo de investigación, se realizó el estudio químico de las raíces y tallos de C. tenuiflora con lo que se logró el aislamiento y elucidación estructural de dos FG: verbascósido e isoverbascósido, los IG: aucubina y bartsiósido y el flavonoide: apigenina. Adicionalmente, se desarrolló la metodología cromatográfica para la cuantificación de estos metabolitos secundarios. Se demostró que las mayores concentraciones de verbascósido e isoverbascósido están en la raíz. Se estableció el cultivo in vitro de raíces adventicias y se analizó la capacidad de producir éstos compuestos.

2

2. ANTECEDENTES

2.1. Castilleja tenuiflora y su importancia en la medicina tradicional Mexicana

El género Castilleja comprende más de 220 especies, son herbáceas anuales o perennes, que se distribuyen principalmente en el continente Americano. En México, considerado centro de dispersión del género, crecen alrededor de 43 especies (Holmgren, 1976). Éste género ha sido recientemente reclasificado de la familia Scrophulariaceae hacia la Orobanchaceae, en base a los análisis filogenéticos moleculares y por sus características hemiparásitas (Thorne, 2000; Wesselingh y van Groenendael, 2005; Egger, 2008; Tank et al., 2009). Éste género ha sido muy estudiado desde el punto de vista ecológico (Roby y Stermitz, 1984b; Mead et al., 1992; Mead et al., 1993; Spasojevic y Suding, 2011) pero poco en el uso medicinal (Moreno-Escobar et al., 2011).

Castilleja tenuiflora se conoce como calzón de indio, cola de borrego, castilleja, coneja, copete de grulla, culano, flor de hielo, garañona, garayona, hierba del cáncer, hierba del golpe, mirto, plumero, saca miel, tetlatlatzo, yerba de la epístola (Argueta et al., 1994; Mondragón y Vibrans, 2005) en dialecto náhuatl "Atzoyatl” (Béjar et al., 2000), en tarahumara “Rosábochi” (Olivas, 1999) y en inglés como "Indian paintbrush". Las sinonimias son Castilleja canescens (se conoce como garañona) y Castilleja angustifolia (Nesom, 1992).

Se distribuye en las zonas montañosas del sur de Estados Unidos y en México, donde se ha registrado principalmente en la zona centro y sur (Nesom, 1992). C. tenuiflora tiene crecimiento herbáceo o subarbustivo, crece abundantemente arriba de los 2000 metros de altitud; en el valle de México se encuentra hasta los 3300 m.s.n.m. Su hábitat son bordes de cultivo y orillas de caminos, junto a coníferas y árboles de encino, en matorrales y pastizales (Figura 1-A).

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La planta crece de 30 cm hasta 1 m aprox. de alto. El tallo es erecto, muy ramificado, con pelos largos y tiesos o rígidos, que llegan a ser blancos a blanco-grisáceo. Las hojas son sésiles y al menos levemente auriculadas (con forma de oreja) en la base, son lineares-lanceoladas, de 1 a 4.5 cm de largo, el ápice es agudo u obtuso, con tricomas suaves ó tiesos y largos, algunas veces glanduloso-pubescentes. La inflorescencia es racemosa, con numerosas flores, pedicelos de 3 a 5 mm de largo, las brácteas son lanceoladas de 1.2 a 4 cm de largo, con ápice agudo, en ocasiones teñido de rojo. Las flores tienen forma de corola de 3 a 4.5 cm de largo, de color anaranjado, ocasionalmente amarilla, gálea verdosa, con pelos simples y muy cortos, de 1.5 a 2 cm de largo; las anteras son de 2 a 3 mm de largo; el estilo es de 3 a 4 cm de largo, estigma bilobulado; cáliz de 2 a 3 cm de largo, lóbulos dentados con pelos largos y tiesos, con el ápice teñido de rojo (Figura 1-B). Los frutos son cápsulas ovoides de 9 a 14 mm de largo (Figura 1-C) y las semillas son elipsoides de 1.8 mm aprox. de largo y de color café (Nesom, 1992). Actualmente no hay reportes sobre la morfología de las raíces de esta especie. En la figura 1-D, se muestra una fotografía de las raíces de C. tenuiflora recolectadas en el estado de Amecameca.

A B C

D

Figura 1. Castilleja tenuiflora. A. Hábitat de C. tenuiflora (flecha señalando plantas en estado de floración). Amecameca, Estado de México. 3500 m.s.n.m. B. Inflorescencia. C. Corte transversal del fruto. D. Raíces. Fotografías (A, B y D) tomadas en Noviembre de 2008 por Gómez-Aguirre, Y. A. y (C) tomada en un estereomicroscopio por Sánchez, J. A.

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En el siglo XVI, el médico y naturalista español Francisco Hernández (1517?-1587) investigó sobre las plantas medicinales en México. Una de las especies que describió fue C. tenuiflora y relató los siguientes usos: antiespasmódico, diurético (sustancia que al ser ingerida provoca eliminación de agua y sodio), enfermedades del estómago, eupéptico (sustancia que facilita la digestión), purifica la sangre y sialagogo (Béjar et al., 2000). En el siglo XX, otros autores también registraron sus usos en la herbolaria mexicana para curar cólicos hepáticos (Martínez, 1969), tratar la anemia, cálculos de la vesícula, colecistitis (inflamación de la pared de la vesícula biliar) y dispepsia (alteración funcional asociada al aparato digestivo) (Cabrera, 1958). También se recomienda para curar tumores (Graham et al., 2000), tratar la esterilidad, problemas gastrointestinales y la cirrosis (Béjar et al., 2000). La Sociedad Farmacéutica de México la indica como diurético y sialagogo (Morales, 1952). En el cuadro 1, se resumen los usos de C. tenuiflora, así como su forma de preparación.

Cuadro 1. Usos y forma de preparación de C. tenuiflora en la medicina tradicional. Uso medicinal Parte Vía de administración Preparación Fertilidad y purificación de N.I. Oral Cocción la sangre Lavados vaginales Hojas Local Cocción Lavado de heridas Planta Local Cocción Heridas internas Planta Oral Cocción Tos Inflorescencia y hojas Oral Cocción Disentería Hojas con Oral Cocción Nervios flores de nochebuena Vómitos (Euphorbia pulcherrima), hojas de altísima (Tanacetum parthenium) y Chocolate pinolillo Retraso ó adelanto Flores Oral Cocción menstrual Esterilidad femenina Afecciones del hígado Ramas Oral Cocción Problemas del riñón Caída del cabello Ramas Local Cocción N.I.: No identificado. Referencia: (http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Gara%C3% B1ona_o_cola_de_borrego&id=7964).

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2.2. Estudios de fitoquímica y actividades biológicas del género Castilleja

El género Castilleja ha sido objeto de diversos estudios químicos con los que se ha logrado el aislamiento y elucidación estructural de iridoides glucosilados (IG) y el feniletanoide glicoslidado (FG) verbascósido, principalmente. Por ejemplo, en C. integra se han identificado IG como catalpol y macfadienósido (5-hidroxicatalpol) (Mead et al., 1993) y el FG verbascósido (Gardner et al., 1987). Mientras que en C. miniata aff. rhexifolia se detectó aucubina, catalpol y bartsiósido, principalmente. En C. linariaefolia se identificaron verbascósido e isoverbascósido (Gardner et al., 1987; Pettit et al., 1990). Hasta el momento sólo se ha identificado el ácido fenólico salidrósido en C. chromosa (Stermitz et al., 1991). Otros compuestos aislados de diversas especies del género Castilleja son presentados en los cuadro 2 y 3.

Las investigaciones sobre C. tenuiflora son pocas; abarcan aspectos fitoquímicos, farmacológicos y biotecnológicos. Uno de los primeros estudios químicos fue realizado por Jiménez et al. (1995), quienes identificaron en un extracto n-butanólico de las partes aéreas, los siguientes iridoides poliacetilados: bartsiósido penta- acetilado, aucubina hexa-acetilada, éster metílico del ácido geniposídico penta- acetilado, éster metílico del ácido mussaenosídico tetra-acetilado y éster metílico de la shanzhisida penta-acetilada (Cuadro 2). Posteriormente, Rosas (2007), demostró mediante cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) y resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C e 1H, que en extractos de acetato de etilo de la parte aérea se acumulan iridoides glucosilados, de los cuales sólo se identificó la aucubina y el bartsiósido.

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Cuadro 2. Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja. Especie Iridoides glucosilados Referencia COOMe C. rhexifolia HO HO HO HO COOMe Roby y Stermitz (1984a)

O O O O O HO O HO O O O glc glc glc glc Aucubina Catalpol Dihidrocornina Penstemonósido C. miniata AcO COOMe COOMe Arslanian et al. (1985)

HO O O HO O O glc glc Aucubina Catalpol Shanzhisidato de metilo 8-epi loganina COOMe COOMe

HO O O O O O HO HO O HO O O O glc glc glc glc Bartsiósido 6- deoxicatalpol Gardósidato de metilo Mussaenósido C. integra COOOH COOMe HO OH Gardner et al. (1987)

O O O O O HO O HO O glc glc glc Shanzhisida Catalpol Adoxósido Macfadienósido HO COOMe COOH COOOH

HO O O O

HO O HO O O glc glc glc Shanzhisidato de metilo 6-- Hidroxiadoxósido Ácido adoxosídico Ácido 8-epi-logánico

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Cuadro 2 (continuación). Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja. Especie Iridoides glucosilados Referencia C. linariifolia COOOH HO COOMe COOH Gardner et al. (1987)

O O O O O O HO O HO O HO O glc glc glc glc Shanzhisida Catalpol Adoxósido Ácido adoxosídico C. wightii HO Oglc COOMe Belofsky y Stermitz (1988) O O O O O glc HO O HO O O glc glc 10-O-trans- Bartsiósido Mussaenósido cinnamoilmelitósido C. sessiliflora MeOCO Oglc HO Oglc Stermitz et al. (1991)

O O

HO O HO O glc glc 6-O-Acetilmelitósido Melitósido Adoxósido Mussaenósido HO COOMe COOH C. foliolosa H

O O O H HO O HO O HO O glc glc glc Aucubina Melitósido Genipósido Ácido geniposídico

C. exilis AcO COOMe COOMe C. minor HO O O

HO O O glc glc Shanzhisidato de metilo 8-epi-loganina Mussaenósido

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Cuadro 2 (continuación). Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja. Especie Iridoides glucosilados Referencia C. purpurea MeOCO Oglc AcO COOMe Stermitz y Pomeroy (1992) O O HO O HO O glc glc 6-O-Acetilmelitósido Shanzhisidato de metilo C. indivisa HO Oglc

O

HO O glc Melitósido C. tenuiflora HO COOH COOMe Jimenez et al. (1995)

O O O O HO O HO glc HO O HO O O glc glc glc Aucubina Bartsiósido Ácido Ácido Shanzhisidato de

geniposídico mussaenosídico metilo

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Cuadro 3. Feniletanoides glicosilados y ácidos fenólicos identificados en el género Castilleja.

Especie Feniletanoides glicosilados Ácidos fenólicos Referencia

OH C. integra OH N.I. Gardner et al. (1987) OH HO O

O O O HO O OH H3C O HO HO OH Verbascósido C. linariaefolia Verbascósido (Acteósido) N.I. Pettit et al. (1990)

HO O OH HO O OH

HO O O O OH HO O HO OH Isoacteósido C. sessiliflora Verbascósido N.I. Stermitz et al. (1991) C. foliolosa Verbascósido N.I. C. exilis Verbascósido N.I. C. minor Verbascósido N.I. C. chromosa Verbascósido

Salidrósido

N.I.: No identificado

Sobre la actividad biológica de C. tenuiflora se han realizado investigaciones acerca de la actividad citotóxica y actividad antioxidante. En el primer caso, los extractos metanólicos obtenidos de plantas colectadas en Ocuitlán (Estado de México), presentaron actividad citotóxica en las líneas de cáncer cérvico-uterino (CaSki) y de mama (MCF7) (Moreno-Escobar et al., 2011). En este estudio no se asoció la actividad biológica con algún compuesto químico en específico. Por otro lado, los extractos metanólicos de las plantas silvestres y órganos cultivados in vitro contienen compuestos con actividad antioxidante, lo cual se demostró mediante modelos in vitro de actividad antirradical (ABTS y DPPH) y de poder reductor (fosfomolibdeno).

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La actividad antioxidante, ha sido asociada con el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides (López-Laredo et al., 2010; Trejo-Tapia et al., 2011). La concentración de estos compuestos depende de la parte de la planta, así como de las condiciones de crecimiento y desarrollo.

2.3. Iridoides glucosilados

Los monoterpenos son productos biosintéticos derivados de dos unidades de isopreno y están distribuidos en una gran variedad de sistemas vivos: plantas, microorganismos e insectos; algunos tienen función específica en el individuo productor y varios presentan actividades biológicas de distinta naturaleza, por ejemplo, atraen polinizadores, son agentes alelopáticos o sustancias de defensa contra depredadores y parásitos (Marcano y Hasegawa, 2002).

Los iridoides son compuestos monoterpénicos de origen vegetal, aunque el primero de ellos: la Iridomirmecina (Figura 2-A), se aisló de la hormiga carnívora australiana Iridomyrmex detectus, de donde toman su nombre. En algunos casos se consideran como marcadores quimiotaxonómicos de algunas familias y se les han encontrado diversas actividades farmacológicas. Algunos iridoides glicosilados producen efectos analgésicos, antiinflamatorios, protectivos, diuréticos, antidiarreicos, sedantes y citotóxicos (Gálvez et al., 2005; Bi et al., 2008; Jeong et al., 2011; Kirmizibekmez et al., 2011; Liu y Wang, 2011). Por otro lado, tienen un papel relevante el mecanismo de defensa en insectos (L'Empereur y Stermitz, 1990a, b).

Los iridoides estructuralmente se caracterizan por tener unidades de isopreno (2- metil-1,3-butadieno), son compuestos que tienen el esqueleto ciclopentanopirano, el cual se forma por un anillo básico de dihidropirano fusionado a un ciclopentano (McMurry, 2004) (Figura 2-B). En función de sus características estructurales, los iridoides se pueden clasificar en: iridoides glicosilados, iridoides simples o no glicosilados, secoiridoides (con el anillo ciclopentano abierto) y bis iridoides. Los glicosilados se encuentran fusionados con un azúcar en el hidroxilo del C-1

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preferentemente. Los iridoides simples tienen un esqueleto iridano con un metil en C- 8 y otro carbono doble en C-4 (Figura 2-B). La división del enlace 7-8 del anillo ciclopentano forma secoiridoides, mientras que los bis iridoides resultan de la dimerización de los iridoides y secoridoides (McMurry, 2004).

A B

Figura 2. Iridoides. A. Primer iridiode aislado: iridomirmecina. B. Sistema de numeración: R= H ó glucosa. (Tomado de Sampaio-Santos y Kaplan, 2001).

La introducción de carbonos, grupos funcionales y dobles enlaces en el esqueleto iridano origina diversas estructuras de iridoides. Algunas variaciones estructurales son la oxidación de los carbonos C-6, C-7, C-8 y C-10, epoxidación del anillo ciclopentano, la introducción de grupos acetoxi y carboxilos, y a veces puede faltar el enlace 7-8 formando parte de otros metabolitos como en el caso de los esqueletos de alcaloides indólicos (seco-iridoides) (McMurry, 2004).

2.3.1. Biosíntesis de los iridoides glucosilados

La biosíntesis de iridoides del tipo de la aucubina ha sido poco estudiada. La mayor parte de las investigaciones se han centrado en la biosíntesis del iridoide secologanina, por su importancia como intermediario de la síntesis de los alcaloides indolterpénicos. De tal forma que la mayoría de las reacciones para la síntesis de los iridoides de este tipo aún no están claramente elucidadas (Oudin et al., 2007).

En las plantas, el isopreno se sintetiza a partir de dos vías diferentes del metabolismo primario, la vía del acetato/ácido mevalónico (MVA), y la vía del 2-C-metil-D-eritrol-4- fosfato (MEP), éstas ocurren en compartimientos diferentes: citosol y plastidio, respectivamente (Lichtenthaler et al., 1997). En experimentos in vivo, donde se han usado marcadores isotópicos para establecer los pasos de la ruta biosintética de los

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iridoides, han establecido como precursor al geraniol pirofosfato. La ciclización del aldehído en un anillo ciclopentano da origen al iridodial y oxidaciones posteriores forman un iridotrial. La forma hemiacetal produce el ácido deoxilogánico (Villaseñor, 2007).

Sampaio-Santos y Kaplan (2001), realizaron una revisión sobre la ruta de biosíntesis de los iridoides del tipo de la aucubina, en distintas familias de plantas, encontrando que dependiendo de la familia e incluso de la especie, la secuencia de los pasos puede cambiar. Adicionalmente, hicieron un experimento marcando con deuterio, el 8-epi-iridodial, 8-epi-iridotrial y el glucósido 8-epi-iridotrial (boschnalosido), los cuales dieron lugar al harpagido y aucubina, también mencionan que el 8-epi-ácido es precursor del antirrhinosido en Antirrhinum majus. Con base en los estudios realizados por éstos autores en especies de Scrophulariaceae: A. majus, Scrophularia umbrosa, Buddleya albiflora y Scrophularia racemosa se propone la ruta de biosíntesis que se presenta en la figura 3.

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Figura 3. Propuesta de ruta de biosíntesis de iridoides glucosilados para Scrophularia umbrosa (a), Buddleya albiflora (b), Antirhinum majus (c) y Scrophularia racemosa (d) (Sampaio-Santos y Kaplan, 2001).

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En cuanto a factores que regulan la biosíntesis de este tipo de iridoides, también existe poca información. Al parecer la biosíntesis de iridoides ocurre en las hojas. Sin embargo, en la raíz de varias especies se ha observado su acumulación y varios reportes apuntan a que es diferencial en los diversos tejidos y órganos de la planta. Por ejemplo, en la raíz de S. ningpoensis (Nguyen et al., 2005) y S. lepidota se identificaron varios iridoides, entre ellos derivados de la aucubina y del catalpol (Tasdemir et al., 2005). En la raíz de plantas silvestres de Scrophularia nodosa, el harpagósido representa el doble (1.6%, base seca) de lo presente en hojas. De manera inversa, la aucubina representa 1.5% (base seca) en hojas y sólo se encuentra en 0.5% en raíz (Sesterhenn et al., 2007).

También se han observado diferencias en la acumulación en plantas in vivo e in vitro. En plantas de A. majus desarrolladas en hidroponía, el iridoide antirrinósido estuvo presente en todos los órganos incluyendo la raíz pero la mayor concentración fue en tallos, yemas y flores. En contraste, el iridoide antirrínido se encontró solo en hojas. Conforme las plantas crecen, el nivel de antirrinósido disminuyó y el del antirrínido aumentó. Los resultados con 14C-antirrinósido sugieren que se trata de un compuesto móvil a través del floema (Beninger et al., 2008). La concentración de harpagósido en la parte aérea y la raíz de plantas micropropagadas de S. yoshimurae fue cinco veces mayor que en la raíz de planta silvestre (Sagare et al., 2001).

En especies de otro género como Plantago lanceolata (Plantaginaceae) se han realizado estudios más amplios, que muestran que el contenido de iridoides está bajo control genético (Adler et al., 1995), puede variar en función de la edad de la hoja y de la planta (Bowers et al., 1993; Darrow y Bowers, 1999), así como de factores abióticos como la luz o del nivel de nutrimentos ó pueden ser inducidos por daño de herbívoros o patógenos (Wurst et al., 2004; Wurst et al., 2010).

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2.3.2. Actividad biológica de los iridoides glucosilados

Desde el punto de vista ecológico, la aucubina y el catalpol, son de los más estudiados. El catalpol sirve como atrayente alimenticio y estimulante de larvas de mariposa a las que protege de pájaros insectívoros debido al sabor amargo que les confiere, por esto los iridoides han sido motivo de estudios ya que en las larvas y mariposas son usados como defensa contra depredadores (Stermitz et al., 1986; Baden et al., 2011; Dobler et al., 2011).

Para interés humano, los iridoides presentan actividades biológicas diversas: antimicrobiana, antitumoral (Wysokinska y Skrzypek, 1992; Gálvez et al., 2005), anti- inflamatoria (Chen et al., 2009; Liu y Wang, 2011), antinociceptivo ó analgésico (Li et al., 2010), neuroprotectora (Jeong et al., 2011), citotóxica (Nguyen et al., 2005) e inmunoestimulante (Mathad et al., 1998).

Los iridoides glicosilados harpágido de 8-O-E-p-metoxicinamoilo, harpágido de 8-O- Z-p-metoxicinamoilo, harpágido de 6`-O-E-p-metoxicinamoilo, harpágido de 6`-O-Z- p-metoxicinamoilo, E-harpagósido, Z-harpagósido y harpágido, aislados de raíces de S. buergeriana, disminuyeron el daño neuronal que fue inducido por glutamato en un cultivo de células corticales de ratas en un intervalo de concentración de 10 M y 100 M. Estos resultados indican un efecto protector ante la neurodegeneración inducida por glutamato en un cultivo primario de células corticales de rata (Kim et al., 2002).

Ahmed et al. (2003) demostraron la actividad anti-diabética y anti-inflamatoria de los IG: escropoliósido-D y el harpagósido-B, respectivamente. Éstos fueron aislados de la parte aérea de Scrophularia deserti (Scrophulariacea). El escropoliósido-D disminuyó en 31.47% los niveles de glucosa en sangre de ratones diabéticos, después de una hora del tratamiento con respecto al nivel inicial. En cuanto a la actividad anti inflamatoria, la evaluación se hizo en ratones, a los cuales se les indujo

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el edema en la pata derecha. El harpagósido-B disminuyó la inflamación en 30% a una dosis de 10 mg/kg después de 3 horas.

En específico, los IG identificados en C. tenuiflora presentan actividades biológicas comprobadas, por ejemplo la aucubina posee propiedades como antioxidante y control de la hiperglicemia (Jin et al., 2008), fotoprotección, prevención del fotoenvejecimiento (Ho et al., 2005a; Ho et al., 2005b), citotóxica (Nguyen et al., 2005), antitumoral (Gálvez et al., 2005; Hung et al., 2008) e inmunoestimulante (Mathad et al., 1998). La aucubina y genipósido presentan actividad citotóxica en las líneas celulares cancerígenas TK-10 (adenocarcinoma renal), MCF-7 (adenocarcinoma de seno) y UACC-62 (Melanoma) (Gálvez et al., 2005).

2.4. Feniletanoides glicosilados

Los FG son fenilpropanoides que también se conocen como glicósidos fenetilalcohol (Inagaki et al., 1991). Son productos naturales solubles en agua que se caracterizan por contener un dihidroxifenetil β-D-glucopiranósido, un ácido fenilpropenóico como un éster (ácido cinámico, ácido p-cumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico) y residuos de monosacáridos (apiosa, ramnosa, glucosa y xilosa, entre otros) (Kawada et al., 2002; Sinaphet et al., 2006) (Figura 4). Estos compuestos se encuentran distribuidos entre plantas del orden Lamiales, que incluye las familias Scrophulariaceae y Orobanchaceae (Scogin, 1992).

Se han identificado alrededor de 150 feniletanoides glicosilados que son producidos por las plantas en respuesta al ataque de insectos y se ha demostrado que hay diferencias en el contenido de estos compuestos en la misma planta y entre poblaciones de la misma especie debido a la variación genética. Por ejemplo, en clones de la especie Plantago lanceolata (Plantaginaceae) se demostró que hay variación genética en la planta y entre poblaciones en cuanto a la producción de verbascósido (feniletanoide glicosilado) (Adler et al., 1995).

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El verbascósido también se conoce como acteósido, kusaginina y orobanchina mientras que su isómero, el isoverbascósido como isoacteósido (Scogin, 1992; Saimaru y Orihara, 2009). Son glicósidos pertenecientes a los fenilpropanoides y constituyen una familia de compuestos orgánicos sintetizados a partir de la fenilalanina. El verbascósido contiene un disacárido constituido por una unidad de glucosa unido a una ramnosa en el C3; la glucosa está esterificada con el ácido cafeico en el C4 y se une a través de un enlace de tipo éter con la unidad de 3,4- dihidroxifenil etanol en el C1 (Figura 4).

Verbascósido

R1=H

R2=ramnosa

Figura 4. Estructura general de los feniletanoides. R1=H y R2= Ramnosa, glucosa, apiosa ó xilosa.

El verbascósido fue aislado por primera vez de Verbascum sinuatum y la estructura completa fue elucidada en Orobanche rapum-genistae, encontrándose que coincidía con la reportada para el acteósido (Andary et al., 1982). Algunas de las plantas en las que está presente el verbascósido son la Hierba Luisa (Aloysia triphylla, Verbenaceae), el gordolobo (V. densiflorum, Scrophulariaceae), el tepozán (Buddleja scordioides y B. cordata, Buddlejaceae), el llantén (Plantago major, Plantaginaceae) ó el cistanche (Cistanche phelipea, Orobanchaceae).

2.4.1. Biosíntesis de los feniletanoides glicosilados

La biosíntesis de FG no ha sido estudiada extensamente. Actualmente existen pocos reportes sobre la ruta de biosíntesis. Aún hay muchas incógnitas por resolver en los pasos individuales de las secuencias biogénicas y se ha detectado más de un camino para llegar a un mismo producto fenólico y ello depende del medio biológico que lo sintetiza.

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Saimaru y Orihara (2009) reportaron la ruta de biosíntesis del acteósido y aislaron cuatro feniletanoides glicosilados (acteósido, isoacteósido, -oxoacteósido, -hidroxi- acteósido) y uno de los precursores (salidrósido) en células en suspensión de Olea europea (Oleaceae). La unidad de hidroxitirosol del acteósido (verbascósido) es sintetizado de la tirosina a través de la dopamina, mientras que la unidad de cafeoil del acteósido es sintetizado de fenilalanina a través del cinamato. La dopamina es incorporada al acteósido a través de la oxidación del correspondiente aldehído, reducción al alcohol y por último una -glicosilación (Figura 5).

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a

Figura 5. Propuesta de ruta de biosíntesis de los feniletanoides glicosilados en Olea europea (Oleaceae) (a) y Cistanche deserticola (Orobanchaceae) (b) (Saimaru y Orihara, 2009; Hu et al., 2011). Pasos desconocidos (- - -).

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2.4.2. Actividades biológicas de los feniletanoides glicosilados

Los FG son compuestos naturales, absorbibles por las células intestinales (Cardinali et al., 2010; Cardinali et al., 2011) y tienen un amplio espectro de actividades biológicas (in vitro e in vivo) (Dembitsky, 2005). Por ejemplo, el verbascósido elimina efectivamente los radicales libres e inhibe la colinesterasa (Shindo et al., 2008; Martin et al., 2009; Kahraman et al., 2010; Georgiev et al., 2011a). Es un potente agente anti-inflamatorio, ya que inhibe la acumulación de moléculas pro-inflamatorias tales como el óxido nítrico y citocinas, junto con la expresión de las ciclo-oxigenasas (COX-1 y COX-2) (Gyurkovska et al., 2011).

El verbascósido también presenta efectos vasodilatadores en la aorta torácica aislada de rata (Yoshikawa et al., 2006); actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus, al afectar la síntesis de proteínas (Avila et al., 1999) y presenta actividad anti-hiperalgésica (Isacchi et al., 2011). El isoverbascósido presenta una fuerte actividad sobre los radicales libres (Kim et al., 2009; Martin et al., 2009; Arthur et al., 2011), inhibe la proliferación celular maligna y revierte las características fenotípicas de la línea celular de cáncer gástrico MGC803 (Chen et al., 2002).

El verbascósido e isoverbascósido presentaron actividad in vitro contra el virus respiratorio sincitial, que provoca infecciones en los pulmones y en las vías respiratorias y es la principal causa de enfermedades respiratorias en los niños pequeños (Kernan et al., 1998) y contra el virus del herpes simplex HSV-1 y HSV-2, que es una enfermedad infecciosa inflamatoria de tipo vírico, que se caracteriza por la aparición de lesiones cutáneas formadas por pequeñas vesículas agrupadas en racimo y rodeadas de un halo rojo (Martins et al., 2009). También éstos FG mostraron un efecto hepatoprotector en un modelo in vivo (Morikawa et al., 2010) y son citotóxicos porque inhiben la proliferación de las células HL-60 de leucemia promielocítica (Pettit et al., 1990) y el melanoma murino B16F10 (Nagao et al., 2001).

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Este tipo de compuestos poli activos, tales como los FG están siendo intensamente buscados para el tratamiento de procesos patológicos como la inflamación o las enfermedades crónicas (por ejemplo, artritis reumatoide y la enfermedad de Alzheimer) (Georgiev et al., 2011a; Gyurkovska et al., 2011) siendo atractivos para la industria de los alimentos y farmacéutica (Georgiev et al., 2010; Cardinali et al., 2011; Stancheva et al., 2011).

2.5. Cultivos in vitro de raíces

La raíz constituye un órgano vegetativo importante de las plantas vasculares, situada normalmente por debajo del suelo que desempeña varias funciones, como proporcionar agua, nutrimentos, anclaje y soporte a la parte aérea de la planta. Sin embargo, también se ha observado que cumple un papel muy importante en la biosíntesis y acumulación de diversos metabolitos secundarios (Bais et al., 2001). Los cultivos de tejidos vegetales in vitro, por su grado de especialización y organización celular pueden sintetizar y/o acumular metabolitos secundarios de interés farmacológico, representando una alternativa a la extracción directa de la planta (Matkowski, 2008; Lubbe y Verpoorte, 2011).

En cultivo in vitro, el desarrollo del cultivo de raíces resulta tanto de la formación de raíz laterales como de su elongación. Las raíces laterales se originan del primordio de la raíz, luego hay crecimiento del primordium y emergencia. El crecimiento de la punta es lineal y puede ser medido en unidades de longitud por tiempo. En el cultivo de raíces el incremento en biomasa exponencial resulta de la formación de la raíz lateral y un consecuente incremento exponencial en el número de puntas alargadas (Dodds y Roberts, 1985).

Existen dos tipos principales de cultivos de raíces. El primero, son los cultivos de raíces “no transformadas”, éstas son obtenidas de forma tradicional con o sin regulador de crecimiento (auxina). Las auxinas que se usan son: ácido indolbutírico

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(IBA) y ácido 3-indolacético (AIA). La respuesta a las auxinas es el efecto en la elongación, la estimulación de la formación de las raíces laterales y la liberación del etileno estimulada por la auxina (Fukaki et al., 2007; Ivanchenko et al., 2008). El segundo tipo de cultivos de raíces son las “transformadas” ó “raíces peludas”, las cuales resultan de la infección y la posterior transformación genética de tejidos vegetales por el patógeno bacteriano del suelo: Agrobacterium rhizogenes. La transformación ofrece células que proliferan hacia el crecimiento de raíz. En cualquiera de los dos tipos de cultivo, las raíces se obtienen por la inoculación de las puntas en medio líquido, éstas pueden obtenerse de las raíces de las plántulas germinadas in vitro ó de raíces inducidas de otro tejido de la planta, callos ó agregados celulares (Dodds y Roberts, 1985).

2.6. Cultivos de órganos in vitro como fuente de iridoides glucosilados y feniletanoides glicosilados

Los cultivos de órganos y células vegetales son una fuente alternativa para la producción de compuestos químicos, tales como FG (Georgiev et al., 2011b; Stancheva et al., 2011) e IG (Sesterhenn et al., 2007; Grabkowska et al., 2010; Trejo- Tapia et al., 2011). Éstas técnicas son útiles para la propagación y conservación de germoplasma y por lo tanto representan una forma de proteger la biodiversidad de las plantas (Lubbe y Verpoorte, 2011; Sarasan et al., 2011).

Los reportes de cultivo in vitro en las familias Scrophulariaceae u Orobanchaceae son escasos (Cuadro 4). Por ejemplo, el cultivo de raíces peludas de Verbascum xanthophoeniceum (Scrophulariaceae) acumuló 12.82 g L-1 del FG verbascósido (Georgiev et al., 2011c), ésta concentración fue mayor a la reportada para el cultivo de raíces peludas de Paulownia tomentosa (1 g L-1) (Scrophulariaceae) (Wysokinska y Rozga, 1998). En callos y suspensiones de Penstemon serrulatus (Plantaginaceae, antes Scrophulariaceae) la producción de los FG penstémido y serrulatolósido fue mayor (2-4% base seca) que en hojas (3 y 1.4% en base seca, respectivamente). Por otro lado, en cultivos de raíces adventicias de Cormus capitata (Corniaceae) se

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identificaron los IG ácido 6--dihidrocórmico y ácido 6--dihidrocórmico (Tanaka et al., 2001). En otra familia como Pediacelaea, las raíces transformadas de Harpagophytum procumbes producen IG (Grabkowska et al., 2010).

La producción de FG en general, ha sido de interés en las últimas 3 décadas. En particular, el verbascósido por las actividades biológicas que se han demostrado. La producción de verbascósido en cultivos tejidos y células en suspensión es una alternativa a la explotación de las especies silvestres. En el cuadro 4, se muestra la producción del verbascósido mediante técnicas biotecnológicas.

Cuadro 4. Cultivos de raíces peludas y células en suspensión que producen verbascósido. . Familia/especie Sistema Verbascósido Referencia Scrophulariaceae Raíces peludas 12.82 g L-1 Georgiev et al. (2011c) Verbascum xanthophoeniceum

Pedialaceae Células en suspensión 445.44 mg L-1 Georgiev et al. (2011b) Harpagophytum procumbens Células en suspensión 517. 3 mg L-1 Stancheva et al. (2011) Raíces peludas 56.84 mg L-1 Grabkowska et al. (2010) Buddlejaceae Células en suspensión 116 mg g-1 Estrada-Zúñiga et al. Buddleja cordata (2009)

Verbenaceae Raíces peludas 3.64 mg g-1 Dhakulkar et al. (2005) Gmelina arborea

Orobanchaceae Células en suspensión 9 mg g-1 BS Ouyang et al. (2003) Cistanche deserticola Callos 10.7% (w/w) Lu y Mei (2003) 1.65 g g-1 BS

Acanthaceae Células en suspensión 15.1 % Nezbedová et al. (1999) Aphelandra sp.

Plantaginaceae Células en suspensión cis y trans Skrzypek y Wysokinska (antes Scrophulariaceae) 6.1 g L-1 (1999) Penstemon serrulatus

Scrophulariacea Raíces peludas 1 g L-1 Wysokinska y Rozga Paulownia tomentosa (1998)

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2.7. Antecedentes sobre el cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora

Además de ser una fuente alternativa de compuestos bioactivos en los cultivos in vitro de C. tenuiflora, también puede ser útil para la investigación sobre la bioquímica de esta especie. Como parte de la investigación sobre la conservación y manejo sostenible de especies de plantas medicinales, en el CeProBi se han estado realizando trabajos sobre varios aspectos de biotecnología en C. tenuiflora, incluyendo el establecimiento de cultivos in vitro y análisis de su composición química y actividad biológica (Salcedo-Morales et al., 2009; Martínez-Bonfil et al., 2011; Trejo- Tapia et al., 2011).

Rosas (2007) estableció cultivos in vitro de raíces de C. tenuiflora a partir de raíces adventicias formadas de manera indirecta (vía callo) en explantes de hojas de plantas silvestres. La inducción de los callos rizogénicos ocurrió en medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) con 10 µM de la auxina ácido -naftalenacético (ANA). El cultivo de raíces se estableció cuando las raíces de los callos rizogénicos se transfirieron a medio MS líquido sin reguladores de crecimiento. Bajo las condiciones de cultivo evaluadas, en el día 28 se alcanzó la concentración de biomasa máxima (25.141 g L-1) con un td de 19 días. El análisis fitoquímico mostró que los cultivos de raíces acumularon aucubina y otros iridoides no identificados aún (Rosas, 2007). Por lo tanto, el cultivo de raíces in vitro de C. tenuiflora es una alternativa potencial para la producción principios activos para uso medicinal.

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3. JUSTIFICACIÓN

Castilleja tenuiflora Benth. (Orobanchaceae antes Scrophulariaceae) es una especie de importancia en la medicina tradicional Mexicana, se ha usado para tratar síntomas asociados con el cáncer, enfermedades respiratorias y trastornos gastrointestinales; en la actualidad, la Sociedad Farmacéutica de México la indica como diurético y sialagogo. Se desconoce cuáles son los compuestos mayoritarios en las plantas silvestres de ésta especie, por lo que es importante desarrollar una metodología para aislarlos. Por otro lado, la limitada disponibilidad de fuentes naturales, hace que los métodos biotecnológicos utilizados para la producción de metabolitos secundarios de plantas, se hayan establecido firmemente por el alto valor económico. Por lo tanto, el cultivo de raíces in vitro de C. tenuiflora es una alternativa sustentable para la producción de iridoides y feniletanoides glicosilados, los cuales son compuestos con un potencial uso como principios activos para uso farmacéutico.

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4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Identificar estructuralmente los compuestos mayoritarios en plantas silvestres de Castilleja tenuiflora Benth. y evaluar su acumulación en cultivos de raíces in vitro.

4.2. Objetivos específicos

 Aislar e identificar estructuralmente los compuestos mayoritarios en plantas silvestres de C. tenuiflora.

 Evaluar el efecto de auxinas para la producción de raíces in vitro de C. tenuiflora y caracterizar su comportamiento cinético.

 Determinar la concentración de los compuestos mayoritarios en plantas silvestres y en las raíces in vitro de C. tenuiflora.

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5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Material vegetal silvestre

La colecta de plantas completas de C. tenuiflora en estado de floración, se realizó en Noviembre de 2008. Se tomaron 49 plantas de una población silvestre en Amecameca, Estado de México, México (coordenadas: N 19º 04’ 18.1”, W 98º 42’ 01.9”; altitud: 3500 m.s.n.m.). Se tomó un ejemplar de la población para identificar la especie y depositarlo en el herbario (registro HUMO13234) de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos (UAEM), México.

Las plantas se separaron en inflorescencias, raíces y tallos con hojas; inmediatamente se registró el peso de la biomasa en fresco. El proceso de secado fue a temperatura ambiente bajo sombra por 2 semanas, una vez secas las hojas, se separaron de los tallos, para así obtener el peso de la biomasa de cada órgano (Cuadro 5) y después se trituró en un molino granulador de cuchillas con un tamiz de 4 mm (PulvexMR Plastic, modelo 95). Las condiciones de almacenamiento fueron a temperatura ambiente y en oscuridad.

Cuadro 5. Peso fresco y peso seco de cada órgano de la planta silvestre de C. tenuiflora.

Órgano Antes de la molienda Después de la molienda Peso fresco (g) Peso seco (g) Peso seco (g) Inflorescencia 160.30 31.28 30 Hojas - - 597 Tallos - - 1319 Raíces 889.24 358 350.09

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5.2. Evaluación de protocolos de extracción

Se evaluaron tres métodos de extracción, en todos los casos se utilizaron 2 g del material vegetal seco de C. tenuiflora. En el primero, se maceraron raíces e inflorescencia (por separado) con 250 mL de metanol por 24 h a temperatura ambiente. En el segundo, se preparó una infusión, la cual se realizó de la siguiente manera: se calentaron 250 mL de agua a 60ºC, posteriormente se agregó el material seco, ya sea raíces ó inflorescencias y se dejó reposar por una hora. En el tercero, se realizó una maceración del material vegetal seco (raíces, hojas, tallos e inflorescencias) con 40 mL de metanol por 30 min a 60oC en baño María. Terminados los tiempos de extracción, se filtró para eliminar residuos sólidos. En el caso de los extractos metanólicos, el disolvente se eliminó mediante un proceso de destilación a presión reducida en un rota-evaporador (Büchi®-490; Büchi, Suiza) a 50ºC. Con el propósito de conocer el perfil de los compuestos presentes en la infusión y los extractos, se realizó una cromatografía en capa fina y se compararon con aucubina (iridoide).

El rendimiento de los extractos metanólicos se obtuvo por la diferencia de pesos entre matraz vacío y matraz con extracto seco; 10 mL del extracto acuoso, se congelaron a -70 ºC y se liofilizaron (Liofilizadora LABCONCO, freeze dryer 18). Se utilizó el proceso de diferencia de peso entre el matraz con el producto liofilizado y el matraz sin extracto y se calculó el rendimiento. Todos los extractos se almacenaron a -18ºC en oscuridad hasta su análisis.

5.3. Cromatografía de capa fina (CCF)

La CCF fue el método de elección para llevar a cabo el análisis de rutina de los extractos, fracciones, compuestos puros y para optimizar la fase móvil de la cromatografía en columna abierta.

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Se utilizaron placas de cromatofolios de aluminio recubiertas de silica gel 60 F254 (Fase normal, 1.05554.001, Merck®) y como fase móvil una serie de mezclas isocráticas de cloroformo (CHCl3)/Metanol (MeOH) (95:5, 90:10, 85:15 ó 70:30 v/v, según la muestra a tratar) según la polaridad de las muestras analizadas. También se utilizaron cromatofolios de aluminio recubiertos de silica gel 60 RP-18 F254S (Fase reversa, 1.05559.0001, Merck®) y como fase móvil una serie de mezclas isocráticas de agua/acetonitrilo. Las placas se analizaron con una lámpara de luz ultravioleta (UVGL-58, UVP, Cambridge, UK) a 254 y 365 nm antes y después del tratamiento con reveladores químicos.

Para la detección de iridoides y feniletanoides se utilizó como agente cromogénico la solución denominada HS. La cual contiene 0.5 mg de 4-hidroxibenzaldehido (Merck®), 90 mL de etanol y 10 mL de ácido sulfúrico. La coloración azul Copenhague y café indicó la presencia de iridoides y, el magenta y amarillo ocre indicó feniletanoides. Con esta mezcla también se detectan componentes de aceites esenciales y saponinas al obtener colores lavanda, rosa y púrpura (Wagner et al., 1996). En cuanto a flavonoides, se utilizó como agente cromogénico la solución denominada NP/PEG, que contenía 5 mL de difenilboriloxietilamina, 200 mg de polietilenglicol y 35 mL de etanol (Wagner et al., 1996). Después de aplicar el revelador, las placas se colocaron en una parrilla a 90ºC durante 5 s y se observaron en una cámara de luz ultravioleta (UV) a 365 nm. Finalmente, para cada compuesto se determinaron los factores de retención (Rf) mediante la ecuación 1.

Distancia recorrida por el soluto____ Rf = (1) Distancia recorrida por el disolvente

La aucubina (Sigma-Aldrich, ≥99.0% HPLC) y la apigenina (Sigma-Aldrich, ≥95.0% HPLC) se utilizaron como estándares de referencia.

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5.4. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de tallo de C. tenuiflora.

Para realizar el aislamiento e identificación de los compuestos mayoritarios, se maceración en metanol de 1300 g de tallos secos y molidos de C. tenuiflora. Después de concentrar el extracto metanólico por destilación a presión reducida, se obtuvieron 21.9 g de un extracto color marrón. Se tomaron 17 g de éste extracto al que se adicionaron 200 mL de acetato de etilo y se puso en baño María a 50ºC durante una hora. La parte soluble en el acetato de etilo se filtró y concentró por destilación a presión reducida (F1). La parte insoluble (precipitado color marrón) fue nuevamente re-suspendida en una solución de mayor polaridad (acetato de etilo/metanol 7:3). La suspensión se mezcló en un baño ultrasónico (Bransonic® 1510, Branson), se filtró y concentró a sequedad mediante rota-evaporador y posteriormente se liofilizó. Con este proceso se obtuvieron 13 g (F2).

En la figura 6 se muestra el resumen del aislamiento de aucubina y bartsiosido, a partir de la fracción de acetato de etilo del tallo (F2), ésta fracción se purificó mediante un proceso de cromatografía en columna abierta (40 cm de altura x 4 cm de diámetro interno). La columna fue empacada con 90 g de silica gel 60 (Merck) y la fase móvil consistió en una mezcla de cloroformo, acetona y metanol en el siguiente orden y proporciones: Cloroformo 100%, cloroformo/acetona 95:15, 90:10, 85:15, cloroformo/acetona/metanol 85:15:5 y metanol 100% (cuadro 6). De esta manera, la fracción F2 se separó en 92 fracciones y con los resultados de los factores de retención obtenidos en la CCF se agruparon en 30 fracciones que contenían compuestos químicos de polaridad semejante.

Se analizó la fracción T9, ya que la CCF indicó la presencia de un compuesto mayoritario. De la misma manera se analizaron las fracciones T19 y T22 y se realizó un proceso de purificación descrito en el siguiente inciso.

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Figura 6. Obtención de la fracción de acetato de etilo de tallo (F2) y aislamiento de flavonoide (T9) e iridoides glucosilados (T19b y T22a).

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Cuadro 6. Fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de tallos silvestres de C. tenuiflora.

SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES FRACCIONES CLAVE COLECTADAS REUNIDAS Cloroformo 100% 1-21 1-4 T1 5-7 T2 8-12 T3 13-17 T4 18-19 T5 Cloroformo-Acetona 95:15 22-31 20-23 T6 24-26 T7 27-30 T8 Cloroformo-Acetona 90:10 32-38 31-33 T9 34-35 T10 36-37 T11 Cloroformo-Acetona 85-15 39-57 38-39 T12 40-42 T13 43-49 T14 50-53 T15 54-55 T16 56-58 T17 Cloroformo- Acetona- Metanol 85:15:5 58-89 59-60 T18 61-62 T19 63-65 T20 66-67 T21 68-69 T22 70 T23 71 T24 72-74 T25 75 T26 76-77 T27 78 T28 79-89 T29 Metanol 100% 90-92 90-92 T30

5.4.1. Purificación de la fracciones T19 y T22

La fracción T19 (505 mg) se suspendió en cloroformo, se concentró y se obtuvo una fracción sólida a la cual se le agregó cloroformo/metanol (80:20). Este procedimiento se realizó dos veces con la fracción sólida, como se indica en la figura 6. En este proceso, la sub-fracción soluble T19b (26 mg) se concentró y posteriormente se separó el compuesto por cromatografía preparativa (Cromatoplacas HPTLC, 5 x 5 cm, Silica gel 60 F254, precortado de 10 x 10 cm, Merck, Alemania).

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La fracción T22 (649 mg) se suspendió en cloroformo y se obtuvo una fracción sólida que se re-suspendió con cloroformo/metanol (80:20; 70:30 y metanol 100%) y al final del proceso se obtuvo la fracción T22a (265 mg), como se muestra en la figura 6. Los compuestos aislados en estas fracciones se identificaron por RMN de 1H (400 MHz).

5.5. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de raíces de C. tenuiflora

5.5.1. Obtención de la fracción acetónica de raíces

Se realizó una extracción metanólica de raíz silvestre (160 g) a 60ºC en baño María por 30 min, se filtró y el disolvente fue eliminado mediante un proceso de destilación a presión reducida en un rota-evaporador a 50ºC. El peso del extracto fue de 7.2 g, al que se le adicionó cloroformo (600 mL) para obtener la fracción menos polar (F1, 1 g, 13.88%); se filtró y al precipitado (F2, 6.2 g, 86.12%) se le adicionó 600 mL de acetona. Esta suspensión fue depositada durante un minuto en un baño ultrasónico a temperatura ambiente para incrementar la solubilidad. Después de haber filtrado la fracción soluble en acetona, ésta fue concentrada por destilación a presión reducida obteniendo 1.6 g (F3, 22.2%). El precipitado fue secado a alto vacío (F4, 4.6 g, 63.88%) (Figura 7).

5.5.2. Fraccionamiento de la fracción acetónica (F3) de raíces

Se realizó un fraccionamiento de F3 (1.6 g) mediante una cromatografía en columna abierta (40 cm de alto y 4 cm de diámetro) previamente empacada con silica gel 60 (40 g). Se eluyó con disolventes de polaridad creciente (Cloroformo 100%, cloroformo/acetona 97:33, 90:10, 85:15, cloroformo/metanol 95:50, 80:20, 70:30 y metanol 100%), se recolectaron 50 mL de cada fracción. En la cuadro 7, se muestra la cantidad de fracciones recolectadas en cada sistema de elución y la agrupación de éstas se realizó en base a la similitud de los compuestos observados en la CCF con

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su respectiva clave. Se identificó por RMN de 1H y 13C del compuesto aislado de la fracción R19’. Se obtuvo un precipitado blanco (soluble en cloroformo).

En la figura 7, se resume la purificación que se explica en los siguientes incisos.

Figura 7. Resumen del proceso de purificación del extracto metanólico de raíces de C. tenuiflora.

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Cuadro 7. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora. SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES FRACCIONES REUNIDAS CLAVE COLECTADAS Cloroformo 100% 1-23 1 R1 2 R2 3-4 R3 5-7 R4 8-9 R5 10 R6 1 R7 12 R8 13-15 R9 Cloroformo-Acetona 97:33 24-35 16-22 R10 Cloroformo-Acetona 90:10 36-45 23-64 R11 Cloroformo-Acetona 85:15 46-73 65-71 R12 Cloroformo- Metanol 95:5 74-86 72-81 R13 Cloroformo-Metanol 8:2 87-117 82-90 R14 91 R15 R15’ 92-93 R16 94 R17 Cloroformo-Metanol 7:3 118-121 95-118 R18 119 R19 R19’ 120-122 R20 Metanol 100% 122-132 123-132 R21

5.5.2.1. Purificación de las fracciones C1 obtenidas de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora Las fracciones R4, R7 y R10 (263 mg) se reunieron y se denominaron C1, fueron purificadas en una columna abierta de fase reversa (RP18), utilizando un sistema de elución: agua (5% de ácido trifluoracético, TFA)-acetonitrilo. Las fracciones obtenidas fueron 52, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas en la cromatografía en capa fina, obteniendo así 7 fracciones, como se indica en el cuadro 8.

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Cuadro 8. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C1 obtenidas de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.

SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES FRACCIONES REUNIDAS CLAVE COLECTADAS Agua (TFA)-Acetonitrilo 80:20 1-27 1 C1R1 Agua (TFA)-Acetonitrilo 7:3 28-44 2-3 C1R2 Metanol 100% 45-52 4-27 C1R3 28-29 C1R4 30-33 C1R5 34-46 C1R6 46-52 C1R7

5.5.2.2. Purificación de las fracciones C2 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora La fracción R14 (419 mg) denominada C2, se suspendió en metanol formando una fase soluble y otra sólida (que se disolvió con cloroformo-metanol) con la cual se hizo el fraccionamiento mediante una columna abierta de fase reversa (RP18), utilizando un sistema de elución: agua (TFA)-acetonitrilo. Las fracciones obtenidas fueron 41, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas en la cromatografía en capa fina, obteniendo así 15 fracciones, como se indica en el cuadro 9. Las fracciones 5 a 7 son de color amarillo, las demás no presentaron color en el momento de recolectar las fracciones.

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Cuadro 9. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C2 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.

SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES FRACCIONES REUNIDAS CLAVE COLECTADAS Agua (TFA)-Acetonitrilo 80:20 1-10 1-4 C2R1 Agua (TFA)-Acetonitrilo 7:3 11-40 5-6 C2R2 Metanol 100% 41 7-9 C2R3 10-12 C2R4 13 C2R5 14-15 C2R6 16 C2R7 17-19 C2R8 20-21 C2R9 22 C2R10 23-25 C2R11 26 C2R12 27-28 C2R13 29-40 C2R14 41 C2R15

5.5.2.3. Purificación de la fracción C3 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora

La fracción R16 (0.26 g) denominada C3, se disolvió en metanol. Se realizó una CCF-FR, en un sistema de elución con agua (TFA)-acetonitrilo 8:2. Posteriormente fue gradualmente incrementándose la cantidad de acetonitrilo. Las fracciones obtenidas fueron 51, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas en CCF, obteniendo así 12 fracciones (Cuadro 10). La fracción C3R3 (95 mg) se analizó por cromatografía líquida de alta resolución y se identificaron por comparación de espectros de RMN de muestras de referencia y/o con datos de RMN consultado en la literatura. Los espectros de RMN 1H y 13C fueron obtenidos en un equipo Varian Innova de 400 MHz, se utilizó cloroformo deuterado (CDCl3) y metanol deuterado (DMSO) como disolventes y tetrametilsilano como referencia interna. Esta técnica espectroscópica nos permitió determinar el contenido total de hidrógenos y carbonos que constituyen a las moléculas que se elucidaron. Los valores de desplazamiento químico (δ) expresados en partes por millón (ppm), así como las

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intensidades de las señales permitieron descifrar el tipo de grupos funcionales a los que se encuentra unido cada Carbono o Hidrógeno. Para esto se analizaron los experimentos: COSY que es la correlación de núcleos de la misma especie protón- protón, NOESY es la correlación de núcleos a través del espacio, HMQC es la correlación de núcleos heteronucleares por su desplazamiento químico a un enlace de distancia, HSQC es la correlación heteronuclear a un enlace de distancia y HMBC es la correlación heteronuclear a dos y tres enlaces de distancia.

Cuadro 10. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C3 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.

SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES FRACCIONES REUNIDAS CLAVE COLECTADAS Agua (TFA)-Acetonitrilo 80:20 1-27 1-4 C3R1 Agua (TFA)-Acetonitrilo 7:3 28-44 5-7 C3R2 Metanol 100% 45-51 8 C3R3 9 C3R4 10 C3R5 11 C3R6 12-15 C3R7 16-23 C3R8 24 C3R9 25 C3R10 26 C3R11 27-51 C3R12

5.5.2.4. Purificación de la fracción C4 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora

La fracción R18 (0.23 g) denominada C4, se disolvió en metanol. Se realizó una CCF-FR, en un sistema de elución con agua (TFA)-acetonitrilo 80:20 y posteriormente se incrementó la cantidad de acetonitrilo. Las fracciones obtenidas fueron 27, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas en CCF, obteniendo así 8 fracciones (Cuadro 11). Las fracciones C4R2 (21 mg) y C4R4 (12.8 mg) se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución y RMN 1H.

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Cuadro 11. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C4 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.

SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES FRACCIONES REUNIDAS CLAVE COLECTADAS Agua (TFA)-Acetonitrilo 80:20 1-8 1-3 C4R1 Agua (TFA)-Acetonitrilo 7:3 9-25 4-7 C4R2 Metanol 100% 26-27 8-9 C4R3 10-12 C4R4 13-14 C4R5 15 C4R6 16-17 C4R7 19-27 C4R8

5.6. Cuantificación de aucubina

La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) se utilizó para analizar los extractos y las fracciones, guiar la separación de compuestos en los procesos de aislamiento, optimizar las condiciones para los procesos de cromatografía de mediana presión y verificar la pureza de los productos aislados.

La cuantificación de aucubina en los extractos metanólicos de cada órgano de plantas silvestres (inflorescencias, hojas, tallos y raíces) de C. tenuilfora y los cultivos de raíces adventicias in vitro, se llevó acabo mediante la ecuación y=7575.9x + 248079 (R2=99958), la cual se obtuvo de una curva de regresión linear de áreas obtenidas de las concentraciones (900, 450, 225 y 112 μg mL-1) del estándar analítico, en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Waters, Delta Prep. 4000), provisto con un detector de índice de refracción y un detector de arreglo de diodos. Se utilizó una columna Lichrosphere RP-18 (250 x 4 mm, 5 μm, Merck) empacada con material de fase reversa. La elución se llevó a cabo utilizando agua- acetonitrilo 97:3 (A) y acetonitrilo (D) (Cuadro 12), aplicando un flujo constante de 1 mL min-1. El volumen de inyección fue de 20 μL y el tiempo de corrida de 32 min con una longitud de onda de 205 nm.

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Cuadro 12. Sistema de elución utilizado en la separación de iridoides glucosilados por HPLC. Tiempo (min) A (%) D (%) 0 100 0 8 100 0 9 80 20 10 80 20 11 70 30 15 70 30 16 40 60 23 20 80 25 20 80 26 0 100 28 0 100 29 100 0 32 100 0

5.7. Cuantificación de verbascósido e isoverbascósido

La cuantificación de los feniletanoides glicosilados verbascósido e isoverbascósido en extractos metanólicos de cada órgano de plantas silvestres (inflorescencias, hojas, tallos y raíces) de C. tenuilfora y los cultivos de raíces adventicias in vitro, se llevó acabo mediante la ecuación y=22144x - 1614443 (R2=99965), la cual se obtuvo de una curva de regresión linear de áreas obtenidas de las concentraciones (500, 250, 125 y 62.5 μg mL-1) del verbascósido aislado en el presente trabajo (≥94.0% HPLC), en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Waters, Delta Prep. 4000), provisto con un detector de índice de refracción y un detector de arreglo de diodos. Se utilizó una columna Lichrosphere RP-18 (250 x 4 mm, 5 μm, Merck) empacada con material de fase reversa. La elución se llevo a cabo utilizando agua-acetonitrilo 97:3 (A) y acetonitrilo (B) (Cuadro 13), aplicando un flujo constante de 1 mL min-1. El volumen de inyección fue de 20 μL y el tiempo de corrida de 17 min con una longitud de onda de 330 nm.

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Cuadro 13. Sistema de elución utilizado en la separación de feniletanoides glicosilados por HPLC. Tiempo (min) A (%) B (%) 0 100 0 2 77 23 3 77 23 11 70 30 13 70 30 14 0 100 15 0 100 16 100 0 17 100 0

5.8. Cuantificación de apigenina

La cuantificación de apigenina (flavona) en extractos metanólicos de cada órgano de plantas silvestres (inflorescencia, Hoja, tallos y raíces) de C. tenuilfora, se realizó con la ecuación y=70832x + 785112 (R2=99941), la cual se obtuvo de una curva de regresión linear de las áreas obtenidas de las diferentes concentraciones (400, 200, 100, 50 y 25 μg mL-1) del estándar de apigenina, en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Waters, Delta Prep. 4000), provisto con un detector de índice de refracción y un detector de arreglo de diodos. Se utilizó una columna LiChroCART® RP-18e (125 x 4 mm, 5 μm, Merck) empacada con material de fase reversa. La elución se llevo a cabo utilizando agua (A) y acetonitrilo (B) (Cuadro 14), aplicando un flujo constante de 1 mL min-1. El volumen de inyección fue de 20 μL y el tiempo de corrida de 28 min con una longitud de onda de 365 nm.

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Cuadro 14. Sistema de elución utilizado en la separación de apigenina por HPLC. Tiempo (min) A (%) D (%) 0 100 0 2 100 0 3 90 10 5 90 10 8 80 20 9 70 30 11 70 30 12 60 40 16 60 40 17 30 70 19 30 70 20 10 90 21 10 90 22 0 100 24 0 100 26 100 0 28 100 0

5.9. Inducción de raíces adventicias y cultivo in vitro de C. tenuiflora

Se utilizaron brotes in vitro de C. tenuiflora de 14 días de edad como fuente de explantes (Salcedo-Morales et al., 2009). Los cultivos in vitro de raíces se iniciaron a partir de los explantes de hojas en medio de cultivo B5 (Gamborg et al., 1968) semisólido suplementado con 30 g L-1 de sacarosa, 10 M de ácido α-naftalenacético (ANA) y 8 g L-1 de agar (Trejo-Tapia et al., 2011). El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de la esterilización. Después de la inducción, las raíces fueron transferidas a matraces Erlenmeyer de 50 mL con 10 mL de medio líquido B5 libre de auxina y las raíces se subcultivaron cada 8 días durante 6 meses. Los cultivos se incubaron en la oscuridad en un agitador rotatorio (120 rpm) a 25 ± 2°C.

Para los experimentos, se transfirieron segmentos de punta de raíces (1 cm de longitud) a matraces Erlenmeyer de 50 ml con 10 mL de medio líquido B5

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suplementado con 10 M de ácido indol-3-acético (AIA), 10 M ANA, 10 M de indol- 3-butírico (IBA) ó sin auxina (control). Cada semana se recolectaron raíces a partir de tres matraces Erlenmeyer individuales, hasta los 37 días de cultivo. Para determinar la biomasa, las raíces obtenidas en cada matraz Erlenmeyer, se liofilizaron y se pesaron para obtener la biomasa seca (BS). Para el análisis químico, las raíces liofilizadas se molieron hasta un polvo fino y se procesaron como se describe en la sección 5.2. Se realizaron observaciones microscópicas en un microscopio estereoscópico (modelo SMZ1500, Nikon Instruments Inc., Japón) con zoom de 0.75. Las imágenes digitales se capturaron con una cámara de 3 CCD RealView (Dage- MTI, Michigan, EE.UU.).

5.10. Determinación de parámetros cinéticos

A partir de los resultados de la cinética de crecimiento, se calcularon la velocidad específica de crecimiento (μ, días-1), el tiempo de duplicación (td, días) y el índice de crecimiento (IC) de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

μ = ln (XF/X0) / t (2) td = ln 2 / μ (3)

Donde X0 y XF son las cantidades de biomasa de raíces al inicio y al final del intervalo de período del cultivo (g L-1), respectivamente; t es el intervalo de tiempo de cultivo (días), td es el tiempo de duplicación (días) y μ es la tasa de crecimiento específico (día -1).

El índice de crecimiento se calculó de la siguiente manera:

IG = (XF-X0) / X0 (4)

donde XF y X0 son la biomasa de raíces final e inicial, respectivamente.

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5.11. Análisis estadístico

Los datos se analizaron por ANOVA de una sola vía, y la prueba de Holm-Sidak se utilizó para las comparaciones múltiples entre las medias. El nivel de significancia para todas las pruebas estadísticas fue de 5%. Los análisis estadísticos se realizaron con SigmaPlot para Windows versión 11.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA, EE.UU.).

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6. RESULTADOS

6.1. Evaluación de protocolos de extracción

La figura 8 muestra la CCF de los extractos metanólicos de inflorescencias y raíces en comparación con la aucubina (estándar analítico) revelada con el HS. Las bandas de color café indicaron la presencia de aucubina, demostrandose que este tipo de compuesto puede ser extraído con los tres procesos de extracción evaluados. En la infusión se obtuvieron rendimientos de 15.75% en raíces y 47.7% en inflorescencias. Con metanol por 24 h los rendimientos fueron 11.17% para raíces y 33.85% para inflorescencias.

A B C D E Figura 8. Cromatografia en capa fina de extractos metanólicos (por 24 h) e infusiones de C. tenuiflora. A. Infusión de raíces; B. Extracto metanólico de raíces; C. Aucubina; D. Infusión de inflorescencias; E. Extracto metanólico de inflorescencias. Revelador HS. CCF fase normal. Fase móvil: CHCl3/MeOH/H2O 7:2.5:0.5.

Debido a que la maceración con metanol nos permitió obtener el mismo perfil de iridoides que una infusión pero sin la extracción exhaustiva de productos del metabolismo primario, se decidió utilizar metanol para el análisis químico en todos los órganos colectados de la planta, así como la extracción en baño María, porque ésta se realiza en corto tiempo (30 min).

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En la figura 9, se muestran CCF de los extractos metanólicos de inflorescencia, hojas, tallos y raíces obtenidos en baño María a 60ºC por 30 min. Al comparar los perfiles de los compuestos entre órganos, podemos observar una banda que produce fluorescencia de color azul en todos los extractos cuando la placa fue expuesta a luz UV (365 nm) (Figura 9-A). Éstos compuestos se aislaron e identificaron por RMN 1H y 13C, por lo cual esta fluorescencia azul indicó la presencia de feniletanoides glicosilados. Al revelar la placa con HS se observó una banda amarillo ocre en todos los organos de la planta (Rf 0.3) la cual coincide con el Rf de la aucubina (Auc) (Figura 9-B); ésta banda se observó mas intensa en las inflorescencias y raíces. Se obtuvieron bandas de color azul Copenhague en todos los extractos, lo cual indicó la presencia de otros iridoides menos polares que la aucubina (Rf 0.6). En la figura 9-C, se observa la CCF revelada con el reactivo difenilboriloxietilamina en polietilenglicol (NP/PEG); las bandas de color amarillo indican la presencia de flavonoides, principalmente en inflorescencia, hojas y raíces. En base a esta información, se procedió a fraccionar el extracto metanólico de tallos porque está constituido principalmente por iridoides y el extracto metanólico de raíces para aislar los feniletanoides glicosilados.

A B C

Rf 0.6

I H Auc T R I H Auc T R I H Auc T R

Figura 9. Cromatografía en capa fina de extractos metanólicos de plantas silvestres de C. tenuiflora. Maceración con metanol a 60oC en baño María por 30 min. A. CCF en luz UV 365 nm. B. CCF revelada con HS. C. CCF revelada con NP/PEG. I: Inflorescencia, H: Hojas, Auc:

Aucubina, T: Tallos, R: Raíces. CCF de fase normal. Fase móvil: CHCl3 – MeOH–H2O 7:2.5:0.5.

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6.2. Identificación de apigenina en tallos silvestres de C. tenuiflora

En la figura 10, se comprueba la presencia de apigenina aislada en la fracción T9 (16 mg). La cual se obtuvo a partir de la fracción de acetato de etilo de tallos (Figura 7). Se analizó por cromatografía líquida de alta resolución (Anexo 7) y se comparó con el estándar analítico de apigenina, la cual tuvo un tiempo de retención de 15.23 min (λ= 225, 267.5 y 338,6 nm).

A B C Figura 10. Cromatografía en capa fina de compuestos aislados del tallo (Luz UV 365 nm). A. Fracción FT9; B. Mezcla apigenina/fracción FT9. C. Apigenina. CCF de fase normal. Revelada con NP/PEG. Fase móvil: CHCl3/MeOH 8:2.

6.3. Identificación de aucubina y bartsiósido en tallos silvestres de C. tenuiflora

Se obtuvieron las fracciones T19b y T22a a partir de la purificación de la fracción de acetato de etilo de tallos de C. tenuiflora. En los cuadros 15 y 16 se muestran los desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento obtenidas mediante el análisis de los datos espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) de las fracciones T19b y T22a, respectivamente. Estos resultados se compararon con datos previamente reportados para iridoides (Boros y Stermitz, 1990) lo que permitió confirmar que corresponden al bartsiósido y aucubina, respectivamente. La diferencia principal entre éstos iridoides glucosilados corresponde al hidroxilo ubicado en la posición 6 (Figura 11).

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Figura 11. Estructura química de aucubina y bartsiósido aislados de tallos silvestres de C. tenuiflora.

Cuadro 15. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de aucubinaa

(CD3OD).

Posición del b Aucubina carbono 1 1 H (J) teórico H (J) experimental

(ACD/HNMR) 1 5.24 2

3 6.16 6.30 (dd 1.6, 6.4)

4 5.04 5.08 (dd 3.6, 6.4)

5 2.85 2.88 (6.8) 6 4.50 4.43 (dd 2, 3.2) 7 6.04 5.7 ( d 2) 8 9 3.11 10 4.25 4.32 (d 15.6)

Glucosa 1 4.70 4.67 (d 7.6) 2 3.44 3.42 (8.8) 3 3.53 3.61 (2)

4 3.03

5 3.60

6 3.69 3.66 (d 5.2) 3.85 3.87 (d 2.4)

aDatos en 1H (400 MHz) b Ver Fig. 11 para la numeración Entre paréntesis está la multiplicidad y constante de acoplamiento (J, valores en Hz)

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Cuadro 16. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de bartsiósidoa

(CD3OD). Posición del Bartsiósido carbonob 1H (J) teórico 1H (J) experimental (ACD/HNMR) 1 5.24 5.14 (d 6.4) 2 3 6.29 6.26 (dd 2,1.6) 4 4.93 4.68 (d 5.2) 5 3.75 3.69 (d 7.2) 6 2.1 2.08 (dd 1.6) 7 5.7 5.7 (d 1.2) 8 9 2.55 2.62 (dd 16.4,16.4) 10 4.23 4.16 (d 14.4) 4.28 4.27 (d 14)

Glucosa 1 4.7 4.66 (d 4.8) 2 3.44 3.43 (3.2) 3 3.52 3.48 4 3.09 2.9 5 3.6 3.6 6 3.7 3.8 3.85 3.8 a Datos en 1H (400 MHz) b Ver Fig. 11 para la numeración Entre paréntesis está la multiplicidad y constante de acoplamiento (J, valores en Hz)

6.4. Identificación de feniletanoides glicosilados en raíces silvestres de C. tenuiflora

A partir de la purificación de la fracción acetónica de las raíces, se obtuvo la fracción C3R3. En el cuadro 15 se muestran los desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento de la fracción C3R3 obtenidas por RMN de 1H (500 and 300 MHz, respectivamente) y 13C (125 and 75 MHz, respectivamente), además se analizaron los espectros de 1H–1H COSY (Figura 13-17), 1H–1H NOESY, 1H–13C HSQC (Anexo 4 y 5) y 1H–13C HMBC (Figura 19), con los cuales se asignaron los protones y carbonos de la molécula estudiada. Estos resultados también fueron comparados con

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datos previamente descritos (Andary et al., 1982; Li et al., 2005) y se confirmó la presencia del verbascósido aislado de las raíces silvestres de C. tenuiflora.

Del primer fraccionamiento de la fracción acetónica de las raíces se aisló de la fracción R19’ un precipitado blanco (soluble en cloroformo), el cual se analizó por RMN de 1H y 13C y se identificó como isoverbascósido. La diferencia principal entre el verbascósido y el isoverbascósido es la ubicación del ácido cafeico en la molécula de glucosa (resaltado en negritas en el cuadro 17).

Figura 12. Estructuras químicas de los feniletanoides glicosilados: verbascósido e isoverbascósido aislados de raíces silvestres de C. tenuiflora.

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Cuadro 17. Valores de desplazamiento químico del protón y carbón (δ, ppm) de a b verbascósido e isoverbascósido (CD3OD). Posición del Verbascósido Isoverbascósido carbonoc 1H (J) 13C 1H (J) 13C Aglicona 1 131.5 131.4 2 6.69 (d,2) 117.1 6.68 (d,2.1) 117.1 3 146.1 146.1 4 144.6 144.7 5 6.66 (d,8) 116.3 6.66 (d,7.5) 116.3 6 6.55 (dd,2,8) 121.2 6.55 (dd,2.4,7.8) 121.2 7 2.76 (ddd,3.5,7,14), 36.5 2.78 (m), 36.6 2.80 (ddd,3,7,14) 2.78 (m) 8 3.71 (ddd,6.5,7,8), 72.2 3.68 (m), 72.2 4.04 (ddd,3,6.5,8) 3.72 (m) Glucosa 1 4.36 (d,8) 104.2 4.36 (d,8.1) 104.3 2 3.38 (dd,9.5,7.5) 76.2 3.35 (m) 76.3 3 3.81 (t,9.3) 81.6 3.81 (t,10.5,3) 78.1 4 4.91 (t,9.5) 70.6 3.4-3.5 (m) 70.4 5 3.52 (m) 76.0 3.60 (m) 76.0 6 3.54 (m), 62.3 4.46 (m), 65.1 3.60 (d,10) 4.28 (m) Ácido cafeico 1’ 127.6 127.6 2’ 7.04 (d,2) 115.2 7.04 (d,2.1) 115.2 3’ 146.8 146.8 4’ 149.7 149.8 5’ 6.77 (d,8) 116.5 6.76 (d,8.1) 116.5 6’ 6.95 (dd,2,8) 123.1 6.96 (dd,2.7,8.1) 123.2 7’ 7.58 (d,16) 148.0 7.59 (d,16.2) 148.0 8’ 6.26 (d,16) 114.7 6.26 (d,15.9) 114.7 9’ 168.2 167.9 Ramnosa 1 5.18 (d,2) 103.0 5.173 (s) 102.2 2 3.91 (dd,2,3) 72.3 3.90 (m) 72.3 3 3.56 (dd,3,9.5) 70.4 3.567 (m) 70.4 4 3.28 (t,9.5) 73.8 3.5-3.8 (m) 73.8 5 3.55 (m) 72.0 4.00 (m) 72.0 6 1.08 (d,6) 18.4 1.17 (d,6) 18.0 a Datos en 1H (500 MHz) y 13C (125 MHz) b Datos en 1H (300 MHz) y 13C (75 MHz) c Ver Fig. 12 para la numeración Entre paréntesis está la multiplicidad y constante de acoplamiento (J, valores en Hz)

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1 Figura 13. Espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido aislado del extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protones del ácido cafeico y la aglicona; Amarillo: protón de la ramnosa.

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1 Figura 13 (continuación). Espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido aislado del extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protones de la aglicona; Amarillo: protones de glucosa y ramnosa.

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1 Figura 13 (continuación). Espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido aislado del extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protón de la aglicona; Amarillo: protones de glucosa y ramnosa.

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1 Figura 13 (continuación). Espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido aislado del extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protón de la aglicona; Amarillo: protón de la ramnosa.

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Se utilizó el experimento 1H-1H COSY para identificar el tipo y orientación espacial de los azúcares presentes en el compuesto aislado (fracción C3R3). Se identificó el protón anomérico (H-1) desplazado a 4.36 ppm con una constante de acoplamiento J= 8.0 Hz que correlaciona con una señal desplazada a 3.38 ppm (J= 9.5, 7.5 Hz) identificada como el H-2. La correlación de este protón con la señal presente en 3.81 ppm (J= 9.3) nos mostró la ubicación del H-3 de este azúcar. Los protones H-4, H-5, H6a y H6b de este azúcar fueron ubicados mediante el mismo tipo de correlaciones mostradas en la figura 14. Tanto los desplazamientos químicos como las constantes de acoplamiento de este azúcar corresponden a una molécula de β-D-glucopiranosa.

Figura 14. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia de espines de la glucosa.

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La molécula de α-L-ramnopiranosa fue determinada mediante el mismo tipo de correlación entre el acoplamiento vecinal del protón anomérico ubicado en 5.18 ppm (J= 2.0 Hz) con la señal presente en 3.91 ppm (J=2, 3Hz) que correlaciona a su vez con la señal dd ubicada en 3.3 ppm (J=3, 9.5). Las señales correspondientes a H-4, H-5 y el metilo de la α-L-ramnopiranosa fueron ubicadas en 3.28 (J= 9.5 Hz), 3.55 (m) y 1.08 (J=6.0 Hz) ppm respectivamente (Figura 15).

Figura 15. Expansión del espectro COSY junto a la estructura del verbascósido mostrando la secuencia de espines de la ramnosa.

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Figura 15 (continuación). Expansión del espectro COSY junto a la estructura del verbascósido mostrando la secuencia de espines de la ramnosa.

La molécula de la aglicona se determinó mediante el experimento 1H-1H COSY (Figura 16 y 17). Se identificó la correlación entre el acoplamiento vecinal del hidrógeno H-8a (3.71 ppm, J= 6.5, 7, 8) y H-8b (4.04 ppm, J= 3, 6.5, 8) con el H-7 desplazado a 2.8 ppm (J= 3, 7, 14). Los protones H-2, H-5, H6 de los anillos benceno de la aglicona y el ácido cafeico se ubicaron mediante el mismo tipo de correlaciones mostradas en la figura 16.

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Figura 16. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia de espines de la aglicona.

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Figura 17. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia de espines del anillo benceno éstos compuestos fenólicos.

Los espectros de 13C RMN (Figura 18) del compuesto aislado en la fracción C3R3 indicaron la presencia de 29 señales, de las cuales seis carbonos corresponden para la β-D-glucopiranosa, seis para la α-L-ramnopiranosa, ocho para el feniletanoide y nueve del ácido cafeico, de los cuales uno corresponde a un carbonilo C-9’ (δ 168.2). La unión entre el ácido cafeico y la glucosa se determinó mediante el espectro de HMBC (Figura 18) al observar que el H-4 de la glucosa (J = 9.5 Hz) presenta una correlación con el C-9’ (δ 168.2) a dos ligaduras. De la misma manera se determinó la union entre el hidrógeno H-8 (J = 6.5, 7, 8 Hz) del feniletanoide y el carbon C-1 (δ 104.2) de la glucosa.

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La unión interglicosídica se determinó mediante el espectro HMBC (Figura 19) al observar que el hidrógeno H-3 (J= 9.3) de la glucosa presenta correlación con el carbono C-1 (δ 103.0) de la ramnosa.

Figura 18. Espectro del 13C y expansión del espectro HMBC junto a la estructura del verbascósido mostrando la unión del carbono C-9 del ácido cafeico con el hidrogeno H-4 de glucosa.

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Figura 19. Expansión del espectro HMBC del verbascósido mostrando la unión del carbono e hidrogeno de glucosa y ramnosa

Las fracciones 30 hasta 35, que se denominó C4, obtenidas de la fracción acetónica de las raíces, al analizarse por CCF revelaron compuestos menos polares que el verbascósido (una banda es de color amarillo ocre). Se analizaron por RMN 1H la fracción C4R2 y C4R4 (Anexo 5 y 6). Los espectros demostraron la posible presencia de otro feniletanoide glicosilado mezclado con otros compuestos, que no permitieron la identificación.

6.5. Cuantificación de aucubina, verbascósido, isoverbascósido y apigenina en plantas silvestres

El establecimiento de una metodología de análisis cuantitativo por HPLC utilizando los productos comerciales (aucubina y apigenina), así como los productos aislados

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verbascósido e isoverbascósido como estándares permitieron obtener curvas de calibración adecuadas R2=0.99, 0.99, 0.99 y 0.99, respectivamente. En el cuadro 18 se presenta la concentración de aucubina, verbascósido, isoverbascosido y apigenina en diferentes órganos de las plantas silvestres. La concentración de aucubina varió entre 0.81 ± 0 (hojas) y 22.69 ± 1.29 (raíces) mg g-1 BS. El verbascósido se acumuló principalmente en las raíces e inflorescencias (9.23 ± 0.07 y 7.88 ± 0.01 mg g-1 BS, respectivamente) y el isoverbascósido fue abundante en las raíces (7.13 ± 0.07 mg g-1 BS). Las hojas y tallos acumularon bajas concentraciones de éstos dos FG. La apigenina se acumuló principalmente en las hojas y no se detectó en las raíces. Como la raíz fue el principal órgano de acumulación de la acubina y los FG, se estableció el cultivo de raíces in vitro de C. tenuiflora y se determinó su capacidad de sintetizar dichos compuestos.

Cuadro 18. Concentración de aucubina, feniletanoides y apigenina en los diferentes órganos de plantas silvestres de C. tenuiflora.

Órgano de la planta Aucubina Verbascósido Isoverbascósido Apigenina Raíces 22.69 ± 1.29 9.23 ± 0.07 7.13 ± 0.07 N.D. Tallos 1.59 ± 0.08 0.39 ± 0.07 0.35 ± 0.01 0.05 ± 0.04 Hojas 0.81 ± 0 0.54 ± 0.01 0.42 ± 0.01 1.60 ± 0.004 Inflorescencias 14.01 ± 0.25 7.88 ± 0.01 0.52 ± 0.01 0.02 ± 0.001 La concentración de los compuestos químicos se reporta en mg g-1 biomasa seca. Los valores son la media ± error estándar de tres determinaciones.

6.6. Inducción de raíces adventicias y cultivos in vitro de C. tenuiflora

La rizogénesis indirecta se observó sobre la superficie de los explantes de hoja después de una semana de cultivo, en el medio B5 suplementado con 10 M de ANA. A los 21 días, las raíces adventicias se desarrollaron completamente (Figura 20-A). Las raíces adventicias se transfirieron a medio líquido B5 sin regulador de crecimiento (SRC), donde se observó crecimiento y desarrollo de raíces laterales (Figura 20-B); para el mantenimiento del cultivo se renovó el medio de cultivo cada 8

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días. En medio con IBA (24.6 μM) a los 30 días de cultivo, los explantes de raíz se oxidaron y el medio se tornó café (Figura 20-C). En el medio SRC se formaron brotes (Figura 20-D).

C D

Figura 20. Inducción de raíces adventicias in vitro de C. tenuiflora. A. Formación de raíces adventicias en explantes de hoja después de 21 días de estar en contacto con medio de cultivo B5 suplementado con 10 μM de ANA. B. Raíces adventicias subcultivadas cada 8 días en medio líquido B5, sin regulador de crecimiento. C. Raíces en medio B5 con IBA (24.6 μM) a los 30 días. D. Formación de brotes en raíces crecidas durante 30 días en medio B5 sin regulador de crecimiento. Barras=1 cm.

En la figura 21, se observa la morfología de las raíces laterales obtenidas en medios que contienen AIA, ANA y sin regulador de crecimiento. El AIA promovió hinchamiento y callogénesis en los explante y posteriormente la formación de raíces laterales de color amarillo pálido (Figura 21-A), éstas raíces se alargaron a través del tiempo (Figura 21-B). Por el contrario, en el medio con ANA, las raíces fueron inicialmente verdes y desarrollaron pocas raíces laterales (Figura 21-B), pero a los 30 días también se observó un desarrollo de raíces laterales, además de alargarse, éstas a su vez generaron nuevas raíces laterales (Figura 21-C). En un medio libre de

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auxinas, hubo elongación en lugar de desarrollo de las raíces laterales y el grado de desarrollo de raíces fue menor que el observado en el medio que contiene auxina (Figura 21-D y 21-E). Al final del período de cultivo en el medio SRC, se formaron brotes y en las raíces se desarrollaron protuberancias (Figura 21-F). Estos resultados indican que las auxinas afectan la morfología de las raíces de C. tenuiflora cultivadas in vitro.

Figura 21. Morfología de las raíces adventicias de C. tenuiflora cultivadas in vitro. A – C – E. A los 9 días, inducción de raíces en medio liquido B5; A. 10 μM AIA, C. 10 μM ANA y E. sin regulador de crecimiento. B – D – F. A los 30 días, crecimiento y desarrollo de raíces laterales en medio liquido B5; B. 10 μM AIA, D. 10 μM ANA y F. sin regulador de crecimiento. Las flechas señalan las “protuberancias” en las raíces que crecieron en medio liquido B5 sin regulador de crecimiento. Barras=1 cm.

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En la figura 22, se muestra el comportamiento cinético de cultivos in vitro de raíces de C. tenuiflora. En la primera semana del cultivo, la biomasa seca de las raíces fue similar entre todos los tratamientos. Entre los 9 y 30 días, hubo un aumento exponencial de la biomasa en el medio con AIA ó ANA. La velocidad específica de crecimento (μ) en el medio con AIA fue de 0.92 días-1, mientras que en el medio con ANA fue de 1.01 días-1. El mayor rendimiento de biomasa seca fue con la auxina AIA a los 30 días (30 g L-1). Este valor fue de 1.5 y 2.3 veces más alto (P <0,05) que lo obtenido en un medio con ANA o sin regulador de crecimiento (control), respectivamente. Al final del periodo del cultivo (37 días), las raíces cultivadas en el medio de cultivo con AIA mostraron el índice de crecimiento más alto (74). En el medio sin regulador de crecimiento, se formaron brotes a los 30 días. Al final del período de cultivo, la biomasa de raíces secas en el medio SRC fue similar a la de las raíces en el medio que contenía ANA (16 g L-1).

Figura 22. Cinética del cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora en medio líquido B5 suplementado con 10 M de AIA ó ANA ó sin regulador de crecimiento (control), según sea el tratamiento. Los valores son la media  error estándar de tres determinaciones.

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6.7. Cuantificación de aucubina, verbascósido e isoverbascósido en cultivos in vitro de raíces adventicias de C. tenuiflora

El análisis por HPLC confirmó que los cultivos de raíces C. tenuiflora acumularon verbascósido e isoverbascósido (Figura 23-A), los cuales son los principales FG que se identificaron en las raíces de plantas silvestres C. tenuiflora (Fig. 23-B). El perfil de HPLC sugirió que el isoverbascósido es el FG mayoritario en cultivos de raíces in vitro, mientras que el verbascósido se acumuló principalmente en las raíces silvestres.

En los cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora, las raíces que crecieron en medio suplementado con AIA contenía la mayor concentración específica de FG (Figura 24). La concentración máxima de verbascósido fue 14.62 mg g-1 biomasa seca (438.6 mg L-1) y se obtuvo a los 30 días del cultivo (Figura 24-A). Esto fueron dos veces mayor (P <0,05) que la concentración máxima en el control (7.13 mg g-1, que corresponde a 92.69 mg L-1 a los 23 días). En el medio que contenía ANA, las raíces acumularon bajos niveles de verbascósido (1,09 mg g-1 biomasa seca). Las raíces cultivadas en un medio que contenía AIA mostraron el mayor rendimiento específico de isoverbascósido (Figura 24-B) con una concentración máxima de 37.32 mg g-1 a los 23 días (522.48 mg L-1). Este valor fue cinco veces mayor (P <0,05) que el máximo en el control (7.27 mg g-1 correspondiente a 91 mg L-1) y seis veces mayor (P <0,05) que en medio con ANA (6.61 mg g-1 correspondientes a 132.2 mg L-1). Los niveles de trazas de verbascósido e isoverbascósido también fueron detectados en el medio de cultivo, pero la concentración fue inferior a la mínima detectada por el método HPLC (datos no mostrados). Así como verbascósido e isoverbascósido, las raíces de C. tenuiflora también acumularon otros feniletanoides glicosilados que podrían ser identificados en futuras investigaciones.

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Figura 23. Cromatogramas de CLAR (detección a los 330 nm) de extractos metanólicos de C. tenuiflora. A. Extractos de raíces adventicias cultivadas in vitro en medio líquido B5 suplementado con AIA, después de 30 días. B. Extractos de raíces silvestres. Picos: (1) Verbascósido. (2) Isoverbascósido. Cuadro insertado: espectro de absorción UV de 1 y 2.

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A

B

Figura 24. Producción de feniletanoides glicosilados en raíces adventicias de C. tenuiflora cultivadas en medio líquido B5 suplementado con AIA, ANA ó SRC. A. Verbascósido. B. Isoverbascósido. Los valores son la media  error estándar de tres determinaciones.

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7. DISCUSIÓN

Este trabajo de investigación se realizó el estudio químico de las raíces y tallos de material vegetal silvestre de C. tenuiflora. La elucidación estructural de los compuestos mayoritarios (iridoides en los tallos y feniletanoides en las raíces) nos permitió utilizarlos como referencia para el desarrollo de metodologías de análisis cualitativo y cuantitativo por CCF y CLAR, respectivamente. Estos procesos cromatográficos fueron indispensables para realizar el estudio comparativo de constitución química entre el material vegetal silvestre y el material obtenido por cultivo in vitro. El fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de las raíces y la posterior purificación de algunas fracciones de este proceso generó el aislamiento de dos compuestos que al ser analizados por RMN de 1H y 13C fueron identificados como los feniletanoides glicosilados: verbascósido e isoverbascósido. El mismo tipo de procesos cromatográficos y espectroscópicos realizados sobre el extracto metanólico de los tallos de esta especie vegetal (material vegetal silvestre) y sus componentes mayoritarios generó el aislamiento y elucidación estructural de los iridoides acubina y batsiósido así como del flavonoide apigenina. Estos compuestos se distribuyen de forma desigual entre los diferentes órganos de la planta. En las raíces se acumula principalmente aucubina y feniletanoides glicosilados, siendo la aucubina mayoritaria. En la hoja se encuentra la mayor concentración de apigenina.

La tecnología in vitro ofrece varias ventajas, entre las cuales está la de extraer y purificar de manera simple, compuestos químicos con calidad estándar a partir de materia vegetal que crece con independencia de los factores climáticos, libre de microorganismos y con menor variabilidad comparada con las plantas silvestres (Lubbe y Verpoorte, 2011). Por lo tanto, se estableció el cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora utilizando diferentes auxinas (ANA y AIA) y se cuantificaron los IG y FG. Los cultivos de raíces adventicias producen niveles más altos de FG que las

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plantas silvestres pero concentraciones menores de aucubina. Las raíces cultivadas en medio que contiene AIA, acumularon las mayores concentraciones de FG.

Los feniletanoides glucosilados son marcadores taxonómicos de las plantas en el orden Lamiales, que incluye la familia Orobanchaceae (Scogin, 1992). La presencia de éstos compuestos puede estar restringida debido a que el alcohol 3,4- dihidroxifenetil (hidroxitirosol) de los FG es raro entre los metabolitos secundarios (Saimaru y Orihara, 2009). En el género Castilleja, el verbascósido ha sido reportado en Castilleja integra (Gardner et al., 1987), mientras que el verbascósido e isoverbascósido fueron reportados en Castilleja linariaefolia (Pettit et al., 1990). En las plantas silvestres de C. tenuiflora, la mayor concentración de verbascósido se encontró en la raíz, seguido de las inflorescencias, mientras que isoverbascósido se encuentra casi exclusivamente en la raíz.

La distribución espacial del verbascósido y del isoverbascósido en los órganos de C. tenuiflora puede ser el resultado de la regulación genética, como se observa para los compuestos fenólicos en las especies relacionadas. En Cistanche deserticola (Orobanchaceae), la expresión del gen CdPAL1 se correlacionó con la acumulación de compuestos fenólicos totales en las flores, tallos y raíces (Hu et al., 2011). La expresión de CdPAL1 fue mayor en las flores que en la raíz, y el nivel de expresión mayor en las flores se asoció con su alto contenido de compuestos fenólicos. Se han realizado estudios sobre la biosíntesis de FG en C. deserticola donde se demostró que la fracción cafeoil es biosintetizada a partir de la fenilalanina a través de la vía de cinamato y el alcohol 3,4-dihidroxifenetil es biosintetizado de la tirosina (Ouyang et al., 2005; Hu et al., 2011), otro estudio realizado en Olea europaea (Oleaceae) concuerda con esta propuesta de ruta de biosíntesis (Saimaru y Orihara, 2009). Por lo tanto, la PAL puede ser una enzima clave en la biosíntesis de los FG en Castilleja. Actualmente no hay reportes sobre la biosíntesis de éstos compuestos en Castilleja.

En la Biblioteca Digital de Medicina Tradicional Mexicana (2009), mencionan que las inflorescencias y ramas de C. tenuiflora se usan como infusión. La identificación de

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verbascósido en las inflorescencias de C. tenuiflora puede estar asociada con su uso en los remedios tradicionales para el tratamiento de enfermedades respiratorias (tos, por ejemplo), inflamación del intestino y dolencias gástricas (por ejemplo, colitis y cólicos hepáticos) (Béjar et al., 2000; Nazemiyeh et al., 2008; Mazzon et al., 2009; Esposito et al., 2010; Singh et al., 2010).

Las auxinas exógenas fueron necesarias para la inducción de raíces en el cultivo in vitro de C. tenuiflora, también es el caso de otras especies estrechamente relacionadas, tales como Ocimum sactum L. (Lamiaceae) (Shilpa et al., 2010) y Lavandula pedunculata (Lamiaceae) (Zuzarte et al., 2010). La necesidad de auxinas exógenas para la inducción de raíces pudo ser debida a la ausencia de primordios en aquellas raíces que crecieron en medio de cultivo libre de auxinas por una síntesis insuficiente de hormonas endógenas (Kim et al., 2003). Aunque el AIA y ANA indujeron la formación de raíces laterales y un aumento en la biomasa de raíces, la mejor respuesta de C. tenuiflora se logró con la auxina AIA. Como se reportó en otros trabajos, los efectos de las auxinas exógenas sobre la morfología y el crecimiento de los cultivos de raíces dependen de factores como el genotipo, la fuente de explante, el medio de cultivo, entre otros (Sorin et al., 2005; Aloni et al., 2006; Fukaki et al., 2007). Por ejemplo, ANA inhibió el desarrollo de las raíces laterales en el cultivo de raíces de Hypericum perforatum (Hyperiaceae) (Cui et al., 2010). En Cichorium litybus (Asteraceae), la mayor velocidad de enraizamiento se obtuvo mediante una combinación de ANA e IBA (Nandagopal y Ranjitha-Kumari, 2007), en lugar de las auxinas solas. En los cultivos de raíces transformadas de Rehmannia glutinosa (Scrophulariaceae), AIA fue más efectivo que el ANA ó IBA para promover el crecimiento (Hwang, 2005).

Las protuberancias que se observaron en las raíces de C. tenuiflora que crecieron en medio libre de auxinas, podría suponerse que son haustorios, órganos que están especializados para la fijación y la penetración de las raíces hospederas, que han sido reportados en cultivos in vitro de raíces en especies estrechamente

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relacionadas, tales como la hemiparásita Triphysaria versicolor (Orobanchaceae) (Tomilov et al., 2005).

Los cultivos de raíces adventicias de C. tenuiflora acumularon verbascósido e isoverbascósido en medio libre de auxina y en medio con AIA, mientras que ANA parece afectar adversamente el metabolismo relacionado con la producción de FG. Sin embargo, la concentración de aucubina fue menor a 0.1 mg g-1 BS. Este es uno de los pocos reportes en donde los cultivos de tejidos in vitro producen mayores cantidades de verbascósido e isoverbascósido que sus contrapartes, las plantas silvestres (Wysokinska y Rozga, 1998; Estrada-Zúñiga et al., 2009; Stancheva et al., 2011). El ANA influye negativamente en la acumulación de algunos metabolitos secundarios, incluyendo compuestos fenólicos en los cultivos de raíces de H. perforatum (Cui et al., 2010), las naftoquinonas en Impatiens balsamina (Balsaminaceae) (Sakunphueak y Panichayupakaranant, 2010) y saponinas de Panax ginseng (Araliaceae) (Kim et al., 2003). En otros estudios, el ANA influyó positivamente en la acumulación de plumbagina (naftoquinona) en cultivos de raíces peludas de Plumbago indica (Plumbaginaceae) (Gangopadhyay et al., 2011). Del mismo modo, el AIA afectó positivamente la acumulación de la rutina (flavonoide) en las raíces adventicias de Morus alba (Lee et al., 2011). Los diferentes efectos de las auxinas en el metabolismo secundario en los cultivos de raíces también se asocian con cambios en la especialización y la morfología celular (Kim et al., 2003; Cui et al., 2010).

La acumulación de feniletanoides glicosilados en cultivos de raíces adventicias de C. tenuiflora está asociado con el crecimiento. Esto también se reportó en los cultivos de células en suspensión de Buddleja cordata (Estrada-Zúñiga et al., 2009) y Harpagophytum procumbens (Georgiev et al., 2011b; Stancheva et al., 2011). El rendimiento volumétrico del verbascosido (438.6 mg L-1) a partir de cultivos de raíces adventicias de C. tenuiflora fueron mayores a los reportados para los cultivos de raíces transformadas de Gmelina arborea (Verbenaceae) [3.64 mg L-1] (Dhakulkar et al., 2005), H. procumbens (Pedaliaceae) [56.84 mg L-1] (Grabkowska et al., 2010) y

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Verbascum xanthophoeniceum (Scrophulariaceae) [298.83 mg L-1] (Georgiev et al., 2011c) e inferior a lo reportado en Paulownia tomentosa (Scrophulariaceae) [1 g L-1] (Wysokinska y Rozga, 1998).

La concentración de verbascósido fue mayor en las plantas silvestres, mientras que el isoverbascósido fue el principal compuesto en el cultivo de raíces adventicias. Estas diferencias entre plantas silvestres y cultivos in vitro se han observado también en otros sistemas, por ejemplo, el clon de HP-3 de las raíces peludas de H. procumbens (Pedaliaceae) (Grabkowska et al., 2010) y las raíces peludas de V. xanthophoeniceum (Georgiev et al., 2011c). Los cultivos de raíces adventicias de C. tenuiflora ofrecen buenas perspectivas para ampliar aún más la capacidad de obtener grandes cantidades de biomasa de raíces de C. tenuiflora en medio que contiene AIA, los tiempos de duplicación cortos y altos rendimientos de FG. Este sistema también podría utilizarse para identificar otros feniletanoides glicosilados y se podrían utilizarse en otras aplicaciones de la biotecnología, tales como la transformación genética de las raíces para mejorar los rendimientos de los FG.

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8. CONCLUSIONES

Los feniletanoides mayoritarios se aislaron e identificaron estructuralmente como verbascósido e isoverbascósido en el extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora.

Los iridoides mayoritarios se aislaron e identificaron como aucubina y bartsiósido en el extracto metanólico de tallos silvestres de C. tenuiflora.

Se desarrollaron metodologías de análisis cuantitativo para iridoides y feniletanoides glicosilados.

Se desarrolló un sistema de cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora. El AIA fue el regulador de crecimiento que indujo mayor desarrollo y crecimiento de raíces adventicias y en esta condición se obtuvo la mayor acumulación de verbascósido e isoverbascósido.

Los cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora acumulan principalmente los feniletanoides glicosilados verbascósido e isoverbascósido en mayor cantidad que las raíces silvestres. Sin embargo, los cultivos in vitro acumulan aucubina en menor cantidad que la planta silvestre.

En la planta silvestre, el verbascósido y la aucubina se acumularon principalmente en raíces e inflorescencias, mientras que el isoverbascósido en las raíces y la apigenina en las hojas.

Los cultivos in vitro de raíces de C. tenuiflora representan una fuente alternativa para la producción de compuestos bioactivos como aucubina, verbascósido e isoverbascósido.

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9. PERSPECTIVAS

Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que los cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora son fuente de verbascósido e isoverbascósido. Se propone, continuar con el estudio químico de esta especie y realizar pruebas farmacológicas de las fracciones aisladas y de los extractos completos, así como también iniciar con estudios para elucidar la ruta de biosíntesis y la función de los fenieltanoides en C. tenuiflora.

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ANEXO 1. Espectro de RMN 1H (400 Hz) del bartsiósido (T19b)

89

ANEXO 2. Espectro de RMN 1H (400 Hz) de la aucubina (fracción T22a)

90

ANEXO 3. Espectro de 1H–1H NOESY (400 Hz) del verbascósido

91

ANEXO 4. Espectro de 1H–13C HSQC (400 Hz) del verbascósido

92

ANEXO 5. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuestos aislados de la fracción C4R2 (posible feniletanoide glicosilado)

93

ANEXO 6. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuesto aislado de la fracción C4R4 (posible feniletanoide glicosilado)

94

ANEXO 7. Cromatograma de HPLC del extracto metanolico del tallo de C. tenuiflora

Apigenina

95

ANEXO 8. Artículo publicado con los resultados de la presente tesis

96