Superfamiglia Chalcidoidea ( Hymenoptera ) Dott. Francesco Fiume già direttore della Sezione di Biologia, Fisiologia e Difesa e dirigente di ricerca CRA Roma

L’inquadramento tassonomico della superfamiglia Chalcidoidea è di seguito riportato: Natura Mundus Plinius Superdominio: Biota Dominio: Eucariota Whittaker & Margulis,1978 Regno: Animalia Linnaeus 1758 Superphylum Panarthropoda Nielsen 1995 Phylum Arthropoda von Siebold 1848 Subphylum Pancrustacea Zrzavý & Štys, 1997 Superclasse Hexapoda Latreille, 1825 Classe Insecta Linnaeus 1758 Sottoclasse Dicondylia Hennig 1953 Infraclasse Pterygota (Brauer 1885) Lang 1889 Metapterygota Börner 1909 Neoptera Woodworth 1906 Eumetabola Hennig 1953 Holometabola Burmeister 1835 Superordine Hymenopterida Boudreaux 1979 Ordine Hymenoptera Linnaeus 1758 Neohymenoptera Grimaldi & Engel 2005 Subordine Apocrita Gerstaecker 1867 Infraordine Proctotrupomorpha Rasnitsyn 1988 Superfamiglia Chalcidoidea Latreille 1817

I Chalcidoideae rappresentano una superfamiglia di Imenotteri, che raggruppa un gran numero di insetti parassitoidi ed iperparassitoidi. Si stima sia la superfamiglia di insetti più vasta tra tutte: il numero delle specie descritte varia, secondo le fonti, da 19.000 a 25.000. Si stima che il numero reale di specie sia compreso fra 60.000 e 100.0000. I calcididi sono insetti di piccole dimensioni, con il corpo che raramente supera il centimetro di lunghezza: in genere varia da 0,5 mm a 8 mm, ma vi sono anche specie con il corpo lungo appena 0,11 mm, fino ad una un massimo di 45 mm. Ad esempio, il maschio di Dicopomorpha echmepterygis Mockford, 1997 (Hymenoptera : Mymaridae ) è l’insetto più piccolo, in dimensioni del corpo, oggi conosciuto. La pigmentazione delcorpo mostra spesso colori iridescenti o con riflessi metallici. Il capo ha antenne genicolate, cioè piegate ad angolo, composte da meno di 16 antennomeri. Il pronoto non raggiunge lateralmente le tegule (fatta eccezione per specie molto piccole). Le ali sono caratterizzate dall'assenza di pterostigma e dalla venulazione molto ridotta, composta da un solo ramo, da alcuni interpretato come fusione della subcosta con il radio (Sc+R). La nomenclatura adottata è spesso influenzata da questa semplificazione morfologica: il tratto prossimale, detto vena submarginale o vena subcostale, decorre parallelamente al margine anteriore. Nel tratto intermedio, detto vena marginale percorre il margine anteriore, poi si divide, in corrispondenza della zona stigmatica, in due rami: quello anteriore, detto vena postmarginale rappresenta un prolungamento della vena marginale e decorre lungo il margine anteriore; quello posteriore, detto vena radiale o vena stigmale si dirige verso il centro della regione remigante. Le altre venature sono ridotte ad esili tracce. In ragione di questa semplificazione non esiste una suddivisione in cellule vere e proprie. L'ala anteriore è suddivisa in due regioni: • una prossimale, compresa fra la vena submarginale e il tratto prossimale del margine anteriore, corrisponde alla cellula costale, • una distale che si estende per tutta la regione remigante e viene detta disco. Adottando la nomenclatura di maggiore condivisione, la cellula R1, in altri termini quella compresa fra il ramo del radio e il settore radiale, s'interpreterebbe come la cella di forma triangolare, indefinita perché aperta, compresa fra la postmarginale e la stigmale. Come in tutti i terebranti, anche nei calcididi l'ala anteriore è priva del lobo anale. La semplificazione morfologica dell'ala anteriore si ripete poi in quella posteriore. L'addome mostra un gastro non compresso e un peziolo che si collega alla parte distale del propodeo. L'ottavo urotergo è visibile. L'ovopositore non raggiunge dimensioni notevoli (come ad esempio avviene negli Ichneumonoidea), tuttavia è in genere ben visibile sotto l'addome. Lo sviluppo postembrionale passa attraverso 4 o 5 stadi di larva e uno di pupa. La larva di I età è in genere di tipo imenotteriforme, ma possono essere rappresentati anche altri tipi di larve. La larva matura è imenotteriforme. Lo stadio di pupa si svolge in alcuni casi all'interno di un bozzolo di seta, talvolta protetto in parte dagli escrementi della larva, ma nella maggior parte dei Calcidoidi si svolge senza protezione presso le spoglie della vittima. Nonostante le piccole dimensioni giocano un ruolo significativo nell'ecosistema e la loro importanza non deve essere sottovalutata. La maggior parte delle specie sono infatti parassitoidi di uova o stadi preimmaginali di altri insetti (rincoti, lepidotteri, ditteri, Imenotteri e coleotteri) oppure predatrici oofaghe. Sono frequenti anche casi di iperparassitismo. Alcune specie di Calcidoidi sono invece fitofaghe e le larve crescono all'interno di semi, gambi e galle oppure svolgono un complesso ruolo nell'impollinazione di alcune piante in un rapporto di vera e propria simbiosi. Non mancano casi di relazioni trofiche complesse o atipiche, come il passaggio dalla fitofagìa al parassitoidismo o viceversa o l'autoparassitismo. Molte specie di questo gruppo sono utilizzate nei programmi di controllo biologico, tuttavia non va trascurato il ruolo delle popolazioni naturali degli ausiliari nel controllo della dinamica di popolazione di molti importanti fitofagi. Trattandosi di un raggruppamento così vasto per numero e distribuzione geografica e sul quale sono stati avanzati pochi studi, la sistematica dei Calcidoidi risulta tutt'oggi in via di sviluppo, cosicché la posizione di molte specie è ambigua e oggetto di nuove proposte sistematiche. A complicare gli studi si riscontra in alcuni Calcidoidi una propensione all'ibridazione tra specie. In particolare in Aphelinidae e Trichogrammatidae si riscontra la nascita di piccole comunità ibride denominate specie criptiche, irriconoscibili data la fusione degli elementi distintivi delle specie di partenza e spesso anche sessualmente fertili. Alcuni hanno avanzato la creazione di un nuovo taxon per classificare queste "morfo-specie", definite anche come specie fratello, semi-specie, razza, stirpe o biotipo. La scarsa osservazione di questa superfamiglia ha reso inoltre impossibile delineare delle caratteristiche riconoscitive importanti. D'altronde si osserva che una stessa progenie non conserva costanti le proprie caratteristiche, probabilmente perché la morfologia viene influenzata dall'ospite. Ad esempio sì è riscontrato che lo sviluppo in ospiti dalle dimensioni esigue causa la formazione di ocelli più ravvicinati, ovopositori più corti, ecc. Ancora si aggiunge un relativo dimorfismo stagionale (specialmente in Torymidae e Eulophidae ) basato sulle condizioni atmosferiche e sulla temperatura; dimorfismo che può condizionare, ad esempio, una colorazione più scura o più brillante o una variazione della lunghezza alare. Tutt'oggi, le seguenti famiglie sono considerate appartenenti alla superfamiglia Chalcidoidea : 1. Agaonidae Walker, 1846 2. Aphelinidae Thomson, 1876 3. Chalcididae Latreille, 1817 4. Encyrtidae Walker, 1837 5. Eucharitidae Latreille, 1809 6. Eulophidae Westwood, 1829 7. Eupelmidae Walker, 1833

2 8. Eurytomida e Walker, 1832 9. Leucospidae Fabricius, 1775 10. Mymaridae Haliday, 1833 11. Ormyridae Förster, 1856 12. Perilampidae Latreille, 1809 13. Pteromalidae Dalman, 1820 14. Rotoitidae Bou ek & Noyes, 1987 15. Signiphoridae Ashmead, 1880 16. Tanaostigmatidae Howard, 1890 17. Tetracampidae Förster, 1856 18. Torymidae Walker, 1833 19. Trichogrammatidae Haliday & Walker, 1851 Si tratta di ben 19 famiglie alle quali appartengono più di 90 sottofamiglie. Tra le prime la più numerosa è quella degli Eulophidae che comprende circa 4.500 specie, seguita dagli Encyrtidae e Pteromalidae . I calcidoidi sono tra gli insetti più utilizzati per il controllo biologico di organismi dannosi. Le specie impiegate rientrano per lo più nelle famiglie degli Aphelinidae e degli Encyrtidae . Tra gli Aphelinidae il genere Encarsia è tra i parassitoidi maggiormente utilizzati. Molte specie si sono dimostrate utilissime nel controllo biologico di Aleyrodidae (mosche bianche) e Diaspididae (cocciniglie): l' Encarsia perplexa nel controllo dell' Aleurocanthus woglumi nel sud degli USA e nei Caraibi, l' Encarsia smithi nel controllo dell' Aleurocanthus spiniferus e l' Encarsia inaron contro alcuni fitofagi delle querce in California. L'esempio più conosciuto di specie appartenenti al genere Encarsia è tuttavia Encarsia formosa , forse il parassitoide più utilizzato per il controllo biologico in tutto il Mondo. Ha trovato ampio spazio nel controllo dell'Aleurodide delle serre ed è divenuto largamente reperibile anche in commercio. Altri esempi da ricordare sono l' Encarsia berlesei utilizzato per controllare la Cocciniglia bianca del Pesco e l' Encarsia perniciosi contro la Cocciniglia di San José. Tra gli Aphelinidae sono stati largamente utilizzati anche esemplari dei generi Eretmocerus e Aphytis , questi ultimi specialmente per il controllo dei Diaspididae . Le specie della famiglia Encyrtidae hanno rappresentato egualmente una risorsa molto importante nei programmi di controllo biologico, specialmente nelle regioni dai climi più caldi dove sono in grado di adattarsi meglio rispetto agli Aphelinidae. Gli interventi di maggior successo si sono ottenuti nella lotta ai danni provocati dalle cocciniglie, tra cui il più recente e fruttuoso esempio è quello dell' Anagyrus lopezi del Sud America per il controllo del Phenacoccus manihoti . Questa cocciniglia fu scoperta per la prima volta in Congo nel 1973 e nella metà degli anni ottanta è arrivata a coprire quasi l'intera Africa subsahariana minacciando di distruggere la principale fonte di carboidrati di oltre ducecentomila persone. L'A. lopezi fu rilasciato in Nigeria tra i primi anni del 1980 e la fine del 1990 arrivando a controllare completamente l'espansione smisurata del P. manihoti. Il costo totale di questo programma, dal 1988, è arrivato a toccare i 15.000 dollari, ma le stime compensano la spesa valutando un risparmio di più di 250.000 dollari l'anno per i danni evitati alle piantagioni. Un altro programma di controllo biologico che ha dato grandi risultati ma meno conosciuto è quello dei primi degli anni ottanta che ha previsto l'utilizzo del Neodusmetia sangwani per il controllo dell'Antonina graminis nel sud degli Stati Uniti. Con una spesa iniziale di non più 0,2 mila dollari si stima d'aver evitato circa duececentomila dollari annui di danni che avrebbero colpito la foraggicoltura e la zootecnica del Texas. L' Antonina graminis è oggi sotto controllo dal Texas e la Florida al sud del Brasile, sin oltre i confini del Nuovo Mondo. Tra le specie parassitoidi maggiormente utilizzate in Europa è da ricordare il Psyllaephagus pilosus , liberato dal 1993 in Irlanda, Galles e Francia per il controllo della Psilla dell'eucalyptus. Il programma ha dato ottimi risultati tant'è che il Psyllaephagus pilosus è stato di recente introdotto (probabilmente accidentalmente) anche in alcune regioni del Sud America, comprese Perù e Argentina.

3 Nel controllo dei parassiti vegetali sono stati introdotti alcuni calcidoidi fitofagi, come lo pteromalide Trichilogaster acaciaelongifoliae . Questa specie australiana è stata introdotta nel sud dell'Africa nel 1982 per il controllo dell' Acacia longifolia , offrendo anche in questo caso risultati soddisfacenti. Nonostante l'impiego come parassitoidi cataloghi questa superfamiglia fra gli insetti utili, più di 80 specie sono maggiormente conosciute per la loro azione nociva nei confronti dei prodotti agricoli. La maggior parte di questi esemplari appartiene alla famiglia degli Eurytomidae e dei Torymidae. Tra i primi i generi maggiormente conosciuti sono forse i Bruchophagus , che attaccano spesso semi di diversi leguminose, come l'erba medica ( Medicago sativa ); e i Systole , fitofagi di varie Apiaceae utilizzate come spezie (come il coriandolo, Coriandrum sativum ). Per i Chalcidoidea si stima una diversità fino a 500.000 specie morfologicamente distinte, con un numero ancora più elevato di specie criptiche. Tutto ciò fa di questa superfamiglia, probabilmente, il gruppo più eterogeneo di insetti. Molte famiglie di calcididi sono fitofagi (ad esempio tutti gli Agaonidae , alcuni Eurytomidae , Eulophidae , Pteromalidae , Tanaostigmatidae e Torymidae ), ma la maggior parte sono, si sottolinea, sono parassitoidi ed iperparassiti. Attaccano stadi immaturi e adulti di quasi tutti gli ordini di insetti, ma hanno la loro massima diversificazione nei confronti degli emitteri e olometaboli. Poiché l’ospite viene ucciso in relazione allo sviluppo del parassitoide, molte specie di calcididi sono utilizzati con successo come agenti di controllo biologico dei parassiti delle piante coltivate ed ornamentali (ad esempio Aphelinidae e Encyrtidae ). Sia economicamente, sia ecologicamente i calcididi hanno enorme importanza negli ecosistemi naturali e gestiti. Nonostante la loro importanza, la comprensione dei loro rapporti tassonomici ed evolutivi è estremamente ridotta per le loro piccole dimensioni, che rendono i calcididi difficili da raccogliere e studiare, per cui soltanto circa 23.000 specie sono state descritte. Diciannove famiglie sono attualmente riconosciute, per la loro notevole diversità che ha permesso l’individuazione di ben 80-89 sottofamiglie, in molti casi senza consenso circa la loro collocazione di livello superiore. I Chalcidoidea e il loro gruppo parentale Mymarommatoidea fecero la loro prima apparizione in metà dei depositi di ambra del Cretaceo ( Mymaridae ). La maggior parte delle linee ereditarie e parentali esistenti non appaiono fino all'Eocene, suggerendo ciò l’esistenza di un rapidissimo periodo di aumento della radiazione ultravioletta del post-Cretaceo. Tuttavia, la presenza di Eulophidae e Trichogrammatidae nel tardo ambra Cenomaniano spinge, dall'Etiopia, la diversificazione dei calcididi dalla metà del Cretaceo, circa 93-95 Mya ( Million years ago - milione di anni fa, simbolo Ma, unità di misura usata nella scala dei tempi geologici). Albero filogenetico . Un albero filogenetico è un grafico che mostra visivamente la collocazione temporale della separazione fra le linee evolutive che a partire da una data specie ha portato alla formazione di due o più specie diverse attraverso una serie di biforcazioni. In linea di principio anche un'unica linea che indica la successione temporale di una serie di specie è un albero filogenetico, ma all'atto pratico l'interesse predominante è quello di mostrare le relazioni evolutive fra due o più specie esistenti al giorno d'oggi o esistite in passato. Un albero filogenetico propriamente detto deve avere le seguenti caratteristiche: 1. deve avere una radice, che rappresenta l'antenato comune a tutte le specie presenti nell'albero; 2. le specie attualmente esistenti devono essere collocate su un'unica linea, che rappresenta l'epoca attuale; 3. l'albero deve avere una scala temporale di riferimento; 4. le ramificazioni devono essere dicotomiche e devono essere datate; 5. dovrebbero essere indicate, per quanto possibile, le specie estinte che hanno dato origine alle specie attuali. Relazioni fra unità tassonomiche . Se si violano l'una o l'altra delle condizioni precedenti non si ha più un vero e proprio albero filogenetico, ma una rappresentazione parziale, non necessariamente evoluzionistica, delle relazioni esistenti fra le specie (o altre categorie tassonomiche, popolazioni, gruppi sistematici, sequenze di DNA, ecc.) a seconda dei caratteri

4 che si considerano. Tali grafici sono utili come tappe intermedie per la costruzione di una vera filogenesi, e anche come rappresentazioni fini a se stesse della “struttura” esistente in una determinata raccolta di dati (non necessariamente biologici). Dendrogrammi . Le condizioni del dendrogramma sono di seguito elencate:
La violazione della condizione 1 (mancanza della radice), è la più distruttiva per l'idea dell'albero filogenetico.
Come possono due specie non avere un antenato comune?
E tuttavia gli alberi senza radice, meglio detti dendrogrammi, vengono ampiamente utilizzati nella sistematica biologica.
Il termine dendrogramma (letteralmente “grafico ad albero”) è nato e viene soprattutto utilizzato nell'ambito dell'“analisi dei gruppi” ( cluster analysis ), una tecnica della statistica multivariata volta ad individuare, dato un insieme di unità statistiche per le quali sono disponibili una o più serie di
osservazioni, determinati sottoinsiemi (gruppi), le cui unità sono mediamente più simili fra loro di quanto non lo sia ciascuna di esse ad ogni unità degli altri gruppi. Somiglianze versus parentele . I dendrogrammi non sono “evoluzionistici” in linea di principio: se ad esempio si vogliono confrontare fra loro gli stili di vita di un insieme di città, si può certamente arrivare ad un dendrogramma che raggruppa fra loro le città con stili di vita più simili e le separa dagli altri gruppi, ma non ha senso pensare che le città che fanno parte di un dato gruppo siano derivate da una città progenitrice. È in effetti una pretesa della fenetica è che un dendrogramma di unità biologiche rifletterà alla fine, necessariamente, le vere parentele esistenti fra queste unità, se si considera un numero di caratteri sufficientemente grande. Ciò non ha a che fare, tuttavia, con la natura statistica dei dendrogrammi, che registrano solamente le somiglianze per come esse si manifestano nei dati. Si ricorda che la fenetica, in biologia, talvolta indicata come tassonomia numerica o tassimetria, è una tecnica la cui finalità è la classificazione degli organismi sulla base della somiglianza, spesso nella morfologia o in altre caratteristiche osservabili, senza tener conto della filogenia o delle relazioni evolutive. Nella ricerca dei rapporti evolutivi fra le specie, la fenetica è stata in gran parte sostituita dalla cladistica. Tuttavia, alcuni biologi continuano ad usare determinati metodi fenetici come approssimazione ragionevole della filogenia, quando i metodi cladistici risultano informaticamente troppo costosi. Le tecniche fenetiche includono varie forme di raggruppamento, volte a ridurre gradualmente le variazioni mostrate dalle varie popolazioni man mano che si scende di livello. In pratica, si ricorre ad una stima di decine di variabili ed alla loro rappresentazione su grafici tridimensionali da interpretare. La fenetica e la cladistica, essendo state ambedue i metodi proposti contemporaneamente per risolvere il problema delle relazioni fra taxa, vi è sempre stato un acceso dibattito fra sostenitori della fenetica e della cladistica. I nodi vennero al pettine con gli studi sull'ibridazione del DNA che portarono alla classificazione di Sibley-Ahlqist per gli uccelli. Quest'ultima propose nuovi taxa (ad esempio Galloanserae ) che anche le recenti analisi hanno dimostrato corretti, mentre altri (Ciconiiformes o Corvida ) si sono dimostrati errati. Con l'aumento di potenza ed efficienza dell'elettronica, la cladistica si trovò avvantaggiata nella risoluzione dei problemi legati alla filogenetica, in quanto furono reperibili programmi sempre più validi per la risoluzione degli algoritmi cladistici. Le analisi fenetiche non distinguono fra il plesiomorfismo (ereditarietà di tratti provenienti dagli antenati), poiché quest'ultimo filogeneticamente non dà alcuna informazione, ed apomorfismo (tratti evoluti e non ereditati): questo vuol dire che i casi di evoluzione convergente e radiazione adattativa possono inquinare i risultati dello studio. Le analisi fenetiche, infatti, tendono nella maggior parte dei casi a portare all'errore di considerare le cladi basali (dotate di maggiori plesiomorfi) come ordini monofiletici. La fenetica diventa superiore alla cladistica quando ciò che conta è mettere in evidenza la diversità fra i vari taxa,

5 poiché vi è una minore richiesta in termini computativi rispetto a quest'ultima. D'altro canto, al giorno d'oggi gli studiosi utilizzano metodi cladistici anche per ottenere la storia evolutiva dei vari taxa. Cladistica e fenetica, in ogni caso, non si escludono vicendevolmente: specie raggruppate seguendo metodi fenetici, infatti, possono essere sottoposte ad analisi cladistica, in modo da scoprire le esatte relazioni filogenetiche fra le varie specie. Al giorno d'oggi sono molti i sistematici che continuano ad utilizzare metodi fenetici, in particolare per quanto concerne l'assestamento delle specie nei vari taxa. La classificazione di vari taxa separati fra loro solo da differenze minime, infatti, rende difficoltoso un approccio di tipo cladistico. La fenetica trova terreno fertile alla propria applicazione soprattutto in botanica, dove fenomeni genetici peculiari delle piante come il trasferimento orizzontale dei geni od il complesso polipoide rendono gli esami fenetici meno soggetti ad errori (anche se meno accurati) rispetto ad analisi cladistiche. Il fenogramma è un diagramma ad albero che lega dei taxa sulla base di stime ottenute dalla similarità complessiva degli organismi, ossia sulla classificazione fenetica. Alberi filogenetici di sequenze nucleotidiche . Nella genetica delle popolazioni le “unità statistiche” di osservazione sono spesso le popolazioni biologiche e le somiglianze riguardano le frequenze geniche o altri dati genetici, ma l'approccio è generale, e può essere applicato a qualsiasi serie di dati su qualsiasi insieme di oggetti. Con l'esplosione dei dati di sequenze nucleotidiche la costruzione dei dendrogrammi è diventata quasi un obbligo per chi si occupa di biologia molecolare. I dendrogrammi prodotti a partire da sequenze nucleotidiche hanno preso il nome di alberi filogenetici molecolari. I dendrogrammi sono spesso rappresentati allineando le “specie” alla base del grafico. Questa caratteristica dipende dall'algoritmo scelto per l'analisi dei dati e le “specie” non debbono necessariamente essere allineate, ma debbono trovarsi a diversi livelli, come se fossero “appese” alla propria branca, ciascuna delle quali dotata della propria lunghezza all'interno del proprio gruppo. Nei dendrogrammi le branche sono generalmente disegnate in direzione parallela all'asse delle ordinate: ciò genera l'impressione che esista una “radice” da cui discendono tutte le branche. Si tratta,tuttavia, di un'impressione falsa in quanto la lunghezza delle branche è scalata in unità di distanza e l'unica cosa che conta è la lunghezza delle branche, non la loro direzione. Per praticità di lettura le branche sono parallele all'asse delle ordinate, ma potrebbero essere orientate in qualsiasi direzione e il dendrogramma manterrebbe lo stesso significato. Rappresentazioni equivalenti . Può essere difficile cogliere a prima vista l'identità di un dendrogramma disegnato con branche parallelle e un dendrogramma disegnato con branche divergenti deominato dendrogramma radiale” (figura 1)

Figura 1 – Dendrogramma a branche parallele (a sinistra) e a branche divergenti (a destra).

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L' outgroup consente di “spezzare” un dendrogramma, cioè porre la radice, nel segmento che lo collega al nodo da cui si diramano tutte le altre specie. Cladogrammi . Un cladogramma è uno schema non metrico (la lunghezza delle branche non ha significato) che illustra solo le relazioni di parentela fra le specie di interesse. Se un cladogramma è ben costruito, cioè è basato sulle reali omologie esistenti fra le specie, tutte e solo le specie che sono fra loro legate da una discendenza diretta vengono a trovarsi in un dato clade; anche le specie eventualmente esistite nel passato vengono a trovarsi collocate sui nodi terminali. La filogenesi molecolare . I metodi della cladistica hanno trovato negli ultimi 20 anni una applicazione naturale nell'analisi delle sequenze delle macromolecole (DNA e proteine). Una delle grandi rivelazioni della biologia molecolare è stata la scoperta che le sequenze nucleotidiche di molti geni sono sufficientemente conservate nel corso dell'evoluzione, tanto che i geni omologhi, cioè i geni che hanno sequenze simili perché sono derivati da un antenato comune, sono riconoscibili anche attraverso distanze filogenetiche estremamente elevate. Ad esempio, molti geni umani sono indubitabilmente omologhi di geni che si trovano nei nematodi, negli insetti, nelle muffe e nei batteri. La filogenesi molecolare offre due vantaggi fondamentali rispetto agli studi tradizionali basati sulla morfologia: 1. nel comparare fra loro gruppi di organismi molto diversi gli uni dagli altri (per esempio le alghe, i funghi, i vertebrati) è impossibile trovare caratteri morfologici confrontabili, mentre esistono sempre segmenti di DNA omologhi; 2. la comparazione sulla base di somiglianze molecolari è quantitativa per cui è molto difficile esprimere numericamente quanto un riccio di mare possa essere diverso da un lombrico, ma possiamo esprimere facilmente quanto numericamente una sequenza di DNA omologa del genoma dell’uno è diversa da quella dell’altro. Oggi qualunque studio serio di filogenesi non può prescindere dall'analisi del DNA. Algoritmi di calcolo dei dendrogrammi . I metodi di costruzione dei dendrogrammi si possono classificare in due famiglie: 1. quelli basati su matrici di distanza; 2. quelli basati sulla condivisione dei caratteri. Nel primo caso si calcola separatamente la distanza fra tutte le possibili coppie di specie (i metodi di calcolo della distanza sono molteplici per cui bisogna preliminarmente scegliere quello che si ritiene più adatto) e il risultato assume la forma di una matrice quadrata simmetrica con valori positivi fuori dalla diagonale e pari a zero sulla diagonale (la distanza di una specie da se stessa è nulla). Nel secondo caso i caratteri che sono condivisi da una o più specie vengono inclusi nell'analisi uno alla volta, e danno luogo ad una gerarchia di ramificazioni senza che si passi attraverso il calcolo di una distanza. I metodi basati sulle matrici di distanza sono più rapidi, ma trascurano l'informazione sulla condivisione di ciascun singolo carattere. Metodi basati su matrici di distanza: 1) UPGMA . Il metodo più semplice per costruire un dendrogramma, tanto semplice che si può eseguire anche senza calcolatore, è quello detto unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA). Si inizia scegliendo nella matrice la coppia con distanza minima e si traccia la prima dicotomia del dendrogramma unendo le due specie con un segmento la cui lunghezza è pari alla metà della loro distanza. Si prosegue ricalcolando la matrice, ridotta di una unità, in cui quella prima coppia è rappresentata da un'unico gruppo e si individua la nuova coppia con la distanza minima. Si continua iterando il procedimento fino a che la matrice scompare perchè sono rimasti solo gli ultimi due gruppi.

7 Il metodo UPGMA produce dendrogrammi in cui le specie sono necessariamente allineate sulla base. Metodi basati su matrici di distanza: 2) NJ L'approccio dell'algoritmo Neighbor Joining è simile a quello dell'UPGMA, ma la ricerca del “neighbor” (il “vicino”) di ciascuna specie viene effettuata non scegliendo la coppia con distanza minima, ma attraverso un processo di minimizzazione della somma di tutte le distanze fra le specie considerando tutte le coppie possibili. Si inizia con un albero a stella in cui tutte le branche sono della stessa lunghezza, e le diramazioni vengono poi risolte una alla volta. Il risultato finale è un dendrogramma in cui la lunghezza di ciascuna branca è proporzionale alla distanza media di ciascuna specie da tutte le altre. L'algoritmo NJ è considerato un buon compromesso fra velocità di calcolo e accuratezza del risultato, ed è molto utilizzato nella pratica. Questo metodo non è vincolato ad allineare le specie alla base. Metodi basati su matrici di distanza: 3) FM e ME Altri due metodi, quello di Fitch-Margoliash (FM) e quello detto Minimum Evolution (ME) erano stati proposti prima del Neighbor-Joining e sono ancora utilizzati. Sono considerati più accurati di quest'ultimo, ma richiedono molto più tempo di calcolo e all'atto pratico non offrono evidenti vantaggi. Metodi basati sullo stato di caratteri Il calcolo della distanza fra due specie comprime tutta l'informazione disponibile, in genere basata su molti caratteri, in un singolo valore, cosa che fa perdere parte dell'informazione: non è possibile ricostruire i dati originali a partire dalla matrice di distanza. Il vantaggio principale dei metodi basati sulla condivisione dei caratteri consentono l'inferenza sullo stato dei caratteri delle specie ancestrali presenti sui nodi e non perdono informazione, in quanto utilizzano direttamente la matrice originale costituita da m caratteri x n specie. Metodi basati sullo stato dei caratteri: 1) MP Il metodo della massima parsimonia (MP) si basa sull'identificazione della topologia che richiede il numero minimo di cambiamenti di stato per tutti i caratteri. Il metodo analizza tutte le possibili topologie e identifica quella che richiede il numero minimo di sostituzioni. Dato che il numero delle topologie possibili cresce esponenzialmente all'aumento del numero di specie, non è possibile analizzare con questo metodo grandi insiemi di dati (>10-15 specie). Sono stati proposti metodi “euristici” per diminuire il numero delle topologie da calcolare, ma il metodo diventa approssimato. Metodi basati sullo stato dei caratteri: 2) ML Il metodo di Massima Verosimiglianza (ML) valuta tutte le possibili topologie, e sceglie la migliore in base al calcolo della verosimiglianza, che è proporzionale alla probabilità di osservare ciascuna topologia dato uno specifico modello di evoluzione (mutazione/sostituzione). È comparativamente il metodo più lento e computazionalmente intensivo, ed è quindi limitato nel numero di specie che può analizzare, ma è considerato accurato e informativo.

Qui è presentata la prima analisi filogenetica completa delle relazioni all'interno della superfamiglia Chalcidoidea , utilizzando 18SrDNA e le regioni di espansione 28SrDNA D2-D5 campionati attraverso 722 taxa. La diversità della superfamiglia è indirizzata con l'inclusione di 72 sottofamiglie e 343 generi.

Estrazione del DNA, amplificazione e sequenziamento L’estrazione del DNA genomico presso l’Università di Riverside, California (USA) ha seguito una versione modificata del protocollo ChelexH (Walsh et al ., 1991). Sequenze dei primers mediante l’amplificazione PCR delle regioni di amplificazione 18S rDNA e di 28S rDNA D2, D3 e D4+D5 sono indicate nella tabella 1.

8 Le regioni amplificate sono semplici come 18Sa-c, D2, D3 e D4+D5. In alcuni casi, una più breve versione di 18Sb è stata amplificata con primers interni (18Si, tabella 1). L’amplificazione ed il sequenziamento seguiti sono i protocolli attuati presso l’Università di Riverside, California (Heraty et al ., 2004). Il sequenziamento è stato condotto all’ Università di San Diego (Katoh et al ., 2005). Tabella 1 – Sequenze dei primers.

I dati sono stati allineati secondo un modello strutturale secondario, che permette il partizionamento univoco dei dati in regioni conservate e regioni di allineamento ambiguo. Diverse ottimizzazioni dell'allineamento con MAFFT (metodo basato sulla codifica dell’allineamento multiplo in termini di trasformate discrete di Fourier, DFT) vengono analizzati per compensare potenziali artefatti di allineamento e aumentare la risoluzione filogenetica. L’analisi fornisce un nuovo quadro di riferimento per valutare la composizione e le relazioni di grandi gruppi per una migliore comprensione della loro evoluzione. Quando è presente, il supporto bootstrap sulle figure corrisponde generalmente con il supporto in tutte le analisi. Le tabelle di supporto del clade sono una migliore rappresentazione del supporto per la sottofamiglia e gruppi familiari tradizionali (tabella 2) e per alcune relazioni di livello superiore. Quando è presente, il supporto bootstrap delle figure corrisponde generalmente con il supporto (il grado di probabilità) in tutte le analisi. Sorprendentemente, l’impatto della strategia di allineamento (SS o MAFFT) sui risultati è stato minimo, tranne per un leggero aumento del sostegno di vari cladi a tutti i livelli, con l'inclusione del RAA (tabella 3).

9 Tabella 2 – Strategie di allineamento per l’uso di strutture secondarie e allineamenti MAFFT delle regioni del nucleo/ramo ed ambigue (RAA).

Confronto tra struttura secondaria e allineamenti generati algoritmicamente. Due aspetti importanti del set di dati ci ha portato a confrontare i risultati ottenuti con varie strategie di allineamento. In primo luogo, è considerato esatto l’allineamento dei rami di base dell’albero e delle regioni del nucleo; tuttavia le imprecisioni del modello di struttura secondaria portano ad alcuni allineamenti locali che potrebbero non essere basati sull’ottimale ed esatto abbinamento di modifiche di base compensative. In secondo luogo, la distribuzione e la dimensione di RAAs sono variabili nell’attraversare i Chalcidoidea . Per una tale ed ampia matrice, per effetto di un allineamento a vista di queste altamente variabili regioni di gruppi tassonomici lontani parenti è difficile da giustificare. Però, questi RAA possono essere localmente informativo (Heraty et al., 2011; Burks et al., 2011) e, pertanto, si preferisce non escluderli dalle analisi. Per testare diverse ottimizzazioni dell’allineamento della struttura secondaria e l'impatto del RAA, sono state create due sottomatrici: una che comprende l’albero di base e l’altra che include le regioni di ambiguo allineamento. Le strutture derivate delle sottomatrici del nucleo secondario (SS) sono state create mediante rimozione manuale delle regioni di allineamento ambiguo (RAA), lasciando solo le eliche strutturalmente allineate, regioni centrali, e blocchi conservati. Come accennato in precedenza, non tutti i cicli sono altamente variabili e regioni non accoppiate tra cui alcuni loops trovati nel nucleo, sono stati mantenuti nelle sottomatrici SS. La seconda sottomatrice (RAAs) comprende le regioni di allineamento ambiguo sensu lato (RAAs, REC, RSCs e blocchi senza nome). 77 regioni d'allineamento ambiguo iniziale è stato identificato. Dove RECs ed i loro primers appaiati delimita un RAA, i blocchi sono stati concatenati. Inoltre, REC 4 H3q, RAA 24 loop 9, REC 4 'H3q', e 25 RAA sono stati concatenati in un unico blocco. La concatenazione ha ridotto il numero di regioni RAA isolate da 77 a 55. Ognuna di queste regioni è

10 stato allineata indipendente e reinserita nella corrispondente regione del geneper ciascuno dei seguenti dataset. Sedici dataset sono stati costruiti da queste sottomatrici (tabella 2) che possono essere raggruppate in quattro categorie: 1) sottomatrice SS senza RAA; 2-7) SS combinata con l’algoritmo allineato RAAs; 8-10) Sottomatrice SS dell’algoritmo allineato senza RAA; 11-13) Sottomatrice SS dell’algoritmo allineato e RAAs dell’algoritmo allineato e, infine, 14-16) Dataset dell’algoritmo allineato, in cui le sottomatrici SS e RAA non sono state trattate separatamente, ma con ciascuna delle 6 regioni del gene isolate individualmente ed allineate indipendentemente algoritmamente. Allineamenti automatici sono stati effettuati con MAFFT (Katoh et al ., 2002; Katoh et al ., 2005; Katoh et Toh, 2008). Sia il server online (v.6) e il programma scaricabile (v.6.244b) sono stati usati per creare allineamenti iniziali che utilizzano i seguenti algoritmi MAFFT: E-INS-i, G-INS-i e L-INS-i. Allineamenti per ogni partizione (regione di nucleo e ciascuna delle 55 regioni di allineamento ambiguo preso autonomamente) sono stati generati utilizzando le impostazioni predefinite (penalità del divariodi apertura = 1,53 e valore di offset = 0,00). Gli RAA sono stati allineati con e senza un albero guida che è stato generato utilizzando il dataset SSNR (nucleo senza RAA). Lo scopo di utilizzo di un albero guida è stato quello di ottimizzare gli allineamenti locali per ciascuna delle RAA all'interno di ingranaggi terminali dei taxa riconosciuti, indipendentemente raggruppati attraverso l'analisi SSNR, allineando così i vicini più prossimi, al contrario allinendo i taxa più disparate attraverso l'intero dataset senza alcun raggruppamento preliminare. Analisi di massima probabilità (ML) del dataset sono state condotte con RAxML v.7.2.7, utilizzando un modello partizionato GTR + (Stamatakis et al ., 2008) sul cluster TeraGrid, attraverso il portale V2.2 CIPRES (Miller et a l., 2010). Sono stati utilizzati 1.000 repliche del rapido bootstrap (BS) per ogni corsa, con i primi test, utilizzando il criterio autoMRE (Pattengale et al ., 2010) che mostra 350 BS adeguate. Un'approssimazione GTRCAT di modelli è stato utilizzato per ML bootstrapping (Stamatakis, 2006). Dieci analisi RAxML sono state effettuate utilizzando diversi gruppi di partenza, seguiti dalla ottimizzazione dell’analisi di massima probablità per trovare l'albero con il miglior punteggio. I 10 alberi ottenuti sono stati utilizzati per generare un albero di consenso rigoroso che è stato convertito ad un albero guida MAFFT leggibile con il newick2mafft.rb. Questo albero guida è stato implementato in allineamenti MAFFT delle RAA isolate, utilizzando gli algoritmi E-INS-i, G-INS-i e L-INS-i (SSGE, SSGG e SSGL, tabella 2).

Partizionamento del dataset Le sequenze sono state suddivise in sei regioni del gene 18Sa, 18Sb, 18Sc, D2, D3 e D4 + D5 +, con ogni partizione comprendente le loro rispettive regioni RAA allineate. Le partizioni 18Sa-c erano definite semplicemente come la regione in sequenza, comprensiva dei primers usati. Le regioni di espansione 28S rDNA sono contigui, essendo delimitate su entrambi i lati da sequenza del nucleo, amplificate dalla reazione di PCR. La decisione su dove definire la fine del D2 e la partenza di D3 e allo stesso modo, la fine di D3 e l’inizio di D4 + D5, è stato arbitrariamente fatto cadere sulle regioni del nucleo tra le regioni di espansione. L'elica H1a' (UUUCAGG), è stato assegnata per marcare la fine di D2; mentre l’anonimo, il non appaiato blocco di sequenza (AC), che segue l’elica H1a' e l’elica H563 (CCGU) marcano l'inizio di D3. Helix H812 (CCCUCC) è stata assegnata per marcare la fine di D3, mentre l’anonimo, non abbinato blocco di sequenza (GAAG), che segue l’elica H812 e precede l’elica H822 (UUUCC), marca l'inizio di D4 + D5.

11 Tabella 3 - Sintesi dei cladi tradizionali all'interno della superfamiglia Chalcidoidea , diversità del campione e il sostegno dai vari set di dati ed analisi.

tabella 3 continua

12 tabella 3 continua

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Abbreviazioni dei dataset indicati nella tabella 3. La regola di maggioranza RAxML (MJR) è un consenso tra tutti le 16 sottomatrici. Valori di supporto sono le percentuali di bootstrap . Il numero di cladi con supporto positivo si riassume per tutti cladi sia con un + (presenza) o supporto numerico; par = parafiletico; - = non monofiletico. La diversità stimata (generi/specie) dopo i nomi di gruppo familiare da Noyes. Taxa rappresentato da un singolo OTU o incertae sedis sono stati considerati non applicabili (n/a) per il supporto del clade. Abbreviationi del dataset della tabella 1. RAxML majority rule (MJR è un consenso tra tutte le 16 sottomatrici.. I valori di supporto sono in percentuale di bootstrap. Il numero di cladi con supporto positivo sono riassunti per tutti i cladi con un + (presenza) o supporto numerico; par = parafiletico; – = non parafiletico. La diversità stimata (generi/specie) dopo i nomi di gruppo familiare da Noyes, 2000. I taxa rappresentati da un singolo OTU o incertae sedis sono stati considerati non applicabili (n/a) per il supporto clade. a = senza Agaonidae Gruppo 4 ( Wiebesia e Blastophaga R1757); b = senza Azotinae o Eretmocerus ; c = senza Akapalinae e Philomidinae ; d = senza Trisecodes ; e = escludendo Buresium ; f = includendo Idioporus ; g = escludendo Idioporus ; h = escludendo Cynipencyrtus ; i = escludendo Diplesiostigma . Ad eccezione di tutti gli allineamenti dei dati (senza partizione della sottomatrice), ognuno dei 55 blocchi di RAA sono stati allineati indipendentemente e reinseriti nella partizione del gene idonea per l'analisi. E-INS-i, G-INS-i e L-LINS-i sono opzioni di allineamento MAFFT. Il migliore punteggio di RAxML è stato ottenuto da 10 prove indipendenti utilizzando CIPRES v.2.0. Il numero di siti informativi e senza informative e di giusti steps sono stati calcolati in PAUP 4.0* per ogni albero risultante, utilizzando il dataset SSME.

Analisi filogenetiche Le analisi della massima parsimonia (MP) ed i boot-strapping (BS = sequenza di istruzioni per il caricamento iniziale) associati sono stati condotti su 16 database con RAxML v.7.2.7 usando un

14 modello di partizione sul cluster Teragrid, Abe (Pfeiffer et Stamatakis, 2010) via portale CIPRESS V2.2 (Miller M. et al ., 2010). Un’ approssimazione del GTRCAT dei modelli è stata utilizzata per il bootstrapping di ML (Stamatakis, 2009). Per adattare la variazione dei parametri in corse separate (Regier et al ., 2009), 10 analisi sono state condotte utilizzando diversi numeri di semi e 1000 repliche di rapidi bootstrap (BS), con l'albero con il miglior punteggio dei test di verosimiglianza (BKL) scelto tra questi set. Per il confronto di strategie di allineamenti, sono stati esaminati il numero di informative di parsimonia e di siti di disinformative, la lunghezza totale ed il numero di cambi di step mappati con PAUP 4.0* (Swofford, 2002) su ogni albero, utilizzando il dataset SSME. I dataset SSME è stato scelto per le analisi di parsimonia, perché forniva ciò che sono considerati essere i risultati ottimali in termini di ritenzione del clade ed uso delle sottomatrici SS e RAA. Le analisi di parsimonia del dataset SSME sono state condotte con TNT v.1.1 (Goloboff et al ., 2003; Goloboff et a l., 2008). Ricerche euristiche sono state eseguite utilizzando una ricerca di tecnologia nuova con le impostazioni predefinite, fatta eccezione per l'utilizzo di una ricerca settoriale, probabilità del 5% con il 50 iterazioni, deriva dell’albero di 50 cicli, fusione albero di fusione di 5 turni e miglior colpo di punteggio di 10 volte, seguito mediante scambio al compimento su tutti gli alberi trovati. Supporti nodali sono stati calcolati utilizzando 1000 repliche di bootstrap standard. Il bootstrap costituisce una serie di elementi e funzioni per il web-design personalizzabili raccolti in un unico strumento. Quando si progetta un sito web con “bootstrap”, gli sviluppatori possono scegliere quali elementi utilizzare. Cosa ancora più importante, gli sviluppatori possono avere la certezza che gli elementi scelti non saranno in conflitto tra di loro. Per essere coerenti con l’interpretazione della percentuale di bootstrap (BS), viene usata la seguente scala: • una percentuale bootstrap 90% è considerata molto alta, • 80-89% alta, • 70-79% moderata, • 50-70% bassa. Per rapporti migliori, ogni taxon include un prefisso che è l'abbreviazione di gruppo-famiglia (tabella 3) ed un suffisso che rappresenta il codice del voucher del DNA e le lettere corrispondenti alle regioni del gene sequenziato, che sono le tre regioni 18S (TUV), 28S-D2 (x), D3 (y) e D4-5 (z).

Modelli di allineamento, lunghezza dell’albero e supporto del clade . La sintesi dei 16 set di dati generati dai due sottomatrici sono presentati nella tabella 2. La regione del nucleo (SS) è stata di 2.996 bp di lunghezza e solo leggermente più corta dell’allineamento del MAFFT degli stessi dati (3.024-3.025 bp), con le differenze accumulate soprattutto nella regione 28S D2. L'applicazione dell’albero guida al RAA ha prodotto l'allineamento più lungo (4.369- 4.536 bp) con il maggiore impatto sulla lunghezza delle regioni 28S D2 e D3. L’applicazione dell'albero guida ha notevolmente aumentato il numero dei siti informativi di parsimonia (1.675- 1.773 bp), il numero di siti non informativi (autapomorfici) siti (550-565 bp) ed ha avuto il maggiore impatto sulla lunghezza dell'albero utilizzando il dataset SSME come misura, pari a 32.220-32.236 gradini (tabella 2). Giova ricordare che in cladistica, l' autapomorfia (dal greco , "proprio", , "da" e , "forma") è un tratto derivato che è unico per ogni gruppo terminale. Un carattere autapomorfo non è presente nei parenti più vicini del gruppo terminale e non è presente nei progenitori ancestrali comuni. L'autapomorfia è perciò un carattere apomorfo esclusivo, poiché comparso come tale nella sola linea filetica che esso rappresenta. Un esempio sono le appendici segmentali, appaiate ed articolate caratteristiche degli artropodi (figura 2).

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Figura 2 – Linee filetiche che mostrano la plesiomorfia, la sinapomorfia e l’autapomorfia

La sinapomorfia (dal greco , syn = insieme ά , apo = da , morphe = forma, carattere) è un carattere derivato (figura 2), cioè un carattere nuovo condiviso; utile per ricostruire gli alberi filogenetici), mette insieme la maggior parte dei membri dei Chalcidoidea prendendo in considerazione: 1. l’esposizione del prepetto, 2. il posizionamento dello spiracolo mesotoracico sul margine laterale del mesoscuto, le nervature dell’ala quali le vene submarginale, marginae, stigmale, postmarginale, 3. la presenza dei sensilli della piastra multiporosa su uno o più dei flagellomeri antennali. Le analisi molecolari stabiliscono che i Chalcidoidea sono un gruppo monofiletico inserito all'interno del gruppo monofiletico Proctotrupomorpha e, come gruppo sorella, all’interno dei Diaprioidea o Mymarommatoidea , anche se Sharanowski et al . propongono, come gruppo sorella in alternativa, i Ceraphronoidea . Le evidenze morfologiche e molecolari, entrambe, pongono i Mymaridae come gruppo sorella del resto dei Chalcidoidea . Qualche ipotesi intuitiva dei rapporti all'interno della superfamiglia Chalcidoidea sono state proposte sulla base di una giustificazione morfologica limitata. Tuttavia, per i rapporti all'interno dei Chalcidoide a, non c'è stata che un'analisi cladistica morfologica basata su una o poche famiglie. Qualche analisi molecolare ha affrontato ampiamente i rapporti in tutta la superfamiglia, ma queste analisi hanno usato relativamente troppi pochi taxa per rappresentare un gruppo così eterogeneo. La plesiomorfia (dal greco η , pl sio = vicino , morphè = forma) è definita la presenza, in organismi appartenenti a specie diverse, di un carattere ancestrale che rappresenta una evoluzione innovativa in comune (figura 2). La presenza di una plesiomorfia non dà molte informazioni sul grado di parentela di due specie. In cladistica sono più significative le apomorfie, cioè i caratteri che consentono di stabilire il momento del distacco di una specie dal ceppo ancestrale comune. La simplesiomorfia (dal greco , syn = insieme η , pl síos = vicino , morphé = forma) in cladistica è un carattere primitivo condiviso tra due o più taxa, ma che è presente anche in altri taxa che hanno un antico antenato comune con il taxon in questione. Una stretta relazione filogenetica può essere affermata solo in base ad una sinapomorfia, ovvero la condivisione in esclusiva di un carattere derivato ereditato da un antico antenato comune. Riprendendo il discorso, I RAAs dei MAFFT allineati senza un albero guida sono state aggiunte sia alla regione del nucleo (SSME, SSMG e SSML), sia all'allineamento del MAFFT della regione del nucleo (MEME, MGMG e MLML). Utilizzando le modifiche dello stato mappato e la metrica di SSME, il nucleo + i dataset dei RAAs senza albero guida ha prodotto le più corte tipologie dell’albero (31.951-31.957 steps). Sia la lunghezza degli allineamento e il miglior punteggio RAxML differivano pochissimo nelle diverse varianti MAFFT di ogni modello di allineamento. L'allineamento del MAFFT di tutti i dati, senza riguardo alla partizione (MESR, MGSR e MLSR) ha prodotto un allineamento di lunghezza intermedia (4.099-4.139 bp).

16 Analisi filogenetiche . Una sintesi di cladi supportati attraverso sei dei 16 analisi è presentato nelle tabelle 3 e 4, con una sintesi minore del 50% del supporto dei consensi della regola della maggioranza (MJR) in tutti i migliori probabili 16 conosciuti (BKL) alberi RAxML. È presentato l'albero BKL dal risultato SSME RAxML (figura 3), con l'avvertenza che questo rappresenta solo una sintesi delle relazioni che si trovano all'interno della superfamiglia dei Chalcidoidea . Le tabelle di supporto del clade sono una migliore rappresentazione del supporto per la tradizionale sottofamiglia e gruppi familiari (tabella 3) e per alcune relazioni di livello superiore (tabella 4). Quando è presente, il supporto bootstrap sulla figura 3 generalmente corrisponde con il supporto di tutte le analisi. Sorprendentemente, c'era ben poco impatto della strategia di allineamento (SS o MAFFT) sui risultati, tranne un leggero aumento nel supporto per i vari cladi a tutti i livelli compresi gli RAAs (nucleo e RAA, tabella 3, tabella 4). Interessante notare che gli allineamenti automatizzati (MAFFT) di tutti i dati sono stati paragonabili nei supporto del clade a qualsiasi strategia dell'allineamento diviso basato sul riconoscimento dei dati del nucleo e dei rami dell’albero. C'era un leggero migliore supporto del clade con G-INS-i se applicato ai dati che includono gli RAAs. Informatività di RAAs. All'interno 28S e 18S, si verificano differenze strutturali distinte ra le regioni RAA per i gruppi esterni, Mymaridae e i restanti taxa dei Chalcidoidea . Ad esempio, RAA (11) mostra un profilo di aumento del numero di basi e una diminuzione del grado di conservazione per Chalcidoidea a confronto agli ordini dei gruppi esterni (tabella 2). Alternativamente, RAA (15) si riduce a un singolo nucleotide per Chalcidoidea , con l'esclusione dei Mymaridae. All'interno della stessa regione, RAA (4) mostra un leggero ma più sottile aumento per Chalcidoidea escluso i Mymaridae basato su un rispettivo aumento di una base 4 (RSC 4), ed un aumento consistente di un profilo AT o GT (RSC 4’). Questi cambiamenti strutturali supportano siala monofilia dei Chalcidoidea e un rapporto di gruppo sorella tra i Mymaridae ed i restanti Chalcidoidea . Nessun profilo RAA è stato osservato aggiungere un supporto per le relazioni nei taxa dei gruppi esterni. Tuttavia all'interno dei Chalcidoidea , cambiamenti addizionali strutturali all'interno di regioni variabili aggiungere il supporto ad alcuni relazioni (cioè, un aumento 18S loop (4) nei Perilampidae e Eucharitidae e delezione di una regione variabile contigua (RAA 23-25) negli Eulophinae + Tetrastichinae ). Sei regioni variabili in Agaonidae dimostrano una sostanziale crescita dimensionale, sia attraverso, sia all'interno della famiglia, che li distinguono da tutti gli altri Chalcidoidea. Le diverse dimensioni delle regioni variabili potrebbero avere il maggiore impatto sui risultati del dataset e contrastare l'inclusione o l'esclusione di RAAs, o l’allinemento dei MAFFT senza riferimento alla struttura del nucleo SS. Tuttavia, nel complesso non è sembrato esserci impatto con tutti i risultati che supportano consistentemente la monofilia dei Chalcidoidea e le loro relazioni con un gruppo sorella compreso trai Mymaridae ed i restanti Chalcidoidea . L’inclusione del RAAs contribuisce alla monofilia di Encyrtinae , Entedoninae e Entiinae (tabella 1). La loro inclusione aumenta il supporto di BS per un numero di cladi,che comprende gli Agaoninae Gruppo 4, Encyrtidae , Eulophinae , Rileyinae , Lyciscini , Eunotini , Signiphoridae e Megastigminae (tabelle 1). All’alto livello di gruppo, l'inclusione delle regioni RAA fornisce un maggiore sostegno per gli Eucharitidae + Perilampidae e per il genere Jambiya come per il gruppo sorella degli Eucharitidae . In nessun caso l'inclusione di risultato RAAs determina una riduzione sostanziale del supporto per un clade. Relazioni filogenetiche . I rapporti tra le analisi di 16 ML sono stati gli stessi, indipendentemente dal metodo di allineamento o l'inclusione o l'esclusione di RAA (figura 3, tabella 1, tabella 2). L'analisi della parsimonia del dataset SSME ha prodotto più di 10.000 alberi di 31.607 passi (RI = 0,62); tuttavia il rigoroso consenso è stato ottimale, in accordo generale con la probabilità. I rapporti tra tutte le analisi ML nel complesso sono stati gli stessi indipendentemente dal metodo di allineamento o dall'inclusione o esclusione di RAAs (figura 1 e tabella 1). L'analisi del SSME dataset.

17 Le relazioni del gruppo esterno favoriscono generalmente un Diaprioidea parafiletico come gruppo laterale dei Chalcidoidea (figura 1, A), ma in alcuni casi i Mymarommatoidea sono proposti come gruppo sorella. Un nucleo di Proctotrupomorpha , clade dei Proctotrupoidea sensu stricto , i Diaprioidea , i Mymarommatoidea ed i Chalcidoidea sono stati supportati in tutti i risultati. Sia i Ceraphronoidea e sia i Platygastroidea sono stati lontani parenti in tutte le analisi. I Chalcidoidea sono stati sempre monofiletici con una forte attendibilità, come è stato un rapporto tra gruppi quello dei Mymaridae il restante restante gruppo dei Chalcidoidea (tabella 4, D). Chiloe micropteron ( Rotoitidae ) è stato sempre ritenuto, nei risultati di probabilità, come il gruppo sorella dei restanti Chalcidoidea , escluso i Mymaridae (MJR 94%) ma, con il supporto bootstrap, solo nei risultati SSGE (BS 76). Tuttavia, nei risultati del metodo di parsimonia, Chiloe era profondamente annidato all'interno dei Chalcidoidea . Relazioni all'interno dei Chalcidoidea sono state altamente variabili lungo l’asse principale dell'albero e dovrebbe essere considerato come un’ampia politomia, ma con il supporto costante e talvolta forte per molti taxa e raggruppamenti tradizionali come la famiglia, sottofamiglia, e livelli di tribù (tabella 1). Vi è a volte una mancanza di supporto per le famiglie che possono essere definite da diverse sinapomorfie giustificabili quali quella dei C halcididae e c'è consistente supporto per qualche altra famiglie come quella degli Eulophidae che si basano su quello che potrebbe essere considerata come la perdita debole o caratteristiche riduttive (Gibson et al ., 1999). Confronti di strategie di allineamento . Nel complesso, c'è poco impatto dell'applicazione di differenti allineamenti di MAFFT sia alla regioni RAA, il nucleo dei dati della struttura secondaria, o per le diverse regioni del gene senza riferimento alla struttura secondaria. Questo è ottimista per il futuro inserimento di nuovi taxa a questo insieme di dati in cui si può evitare l’approccio di alta intensità di lavoro di dover allineare nuovi taxa a questo modello di struttura secondaria esistente. L'inclusione di RAAs ha contribuito al sostegno della monofilia e del clade per un certo numero di taxa ed anche un maggiore sostegno a livelli più alti. Inoltre, differenze strutturali presenti in vari RAAs (tabella 3) forniscono un chiaro supporto per i Chalcidoidea , una relazione a livello di gruppo-sorelle tra Mymaridae ed altri Chalcidoidea , e per alcuni dei gruppi di alto livello all'interno dei Chalcidoidea . Chiaramente, RAAs forniscono un segnale filogenetico e la loro inclusione nelle analisi è garantita nonostante alcuni autori raccomandano la completa (Swofford DL e Olsen GJ, 1990) o parziale (Letsch et Kjer, 2011) eliminazione di queste regioni. Relazioni dell’outgroup . Come è noto l’outgroup è una specie che per alcuni motivi si è separata filogeneticamente prima di tutte le altre e che consente di “spezzare” un dendrogramma, cioè porre la radice, nel segmento che lo collega al nodo da cui si diramano tutte le altre specie. Sia i Mymarommatoidea sia i Diaprioidea sono stati trovati essere gruppo-sorella dei Chalcidoidea . Questi risultati sono stati equivoci come i risultati ottenuti da una recente analisi degli Imenotteri usata per più estesi e numerosi dati molecolari provenienti da quattro regioni geniche e dati quasi completi 28S e 18S (Heraty, 2011). I dati molecolari di entrambi gli studi sostengono chiaramente un gruppo monofiletico dei Diaprioidea , Mymarommatoidea e Chalcidoidea all'interno dei Proctotrupomorpha . Con l'inclusione di dati morfologici in un'analisi combinata, Mymarommatoidea è il gruppo sorella dei Chalcidoidea (Sharkey, 2011), come ipotizzato da Gibson (1986). Purtroppo, la biologia dei Mymarommatoidea rimane sconosciuta, rendendo difficile il confronto con i Chalcidoidea .

Relazioni filogenetiche all'interno dei Chalcidoidea I Chalcidoidea sono ben definiti come gruppo monofiletico. Mymaridae sono fortemente definiti come gruppo monofiletico e così il gruppo sorella dei rimanenti Chalcidoidea . Questa ipotesi è stata proposta prima da Gibson (1986) su base morfologica, e motivata da Heraty et al ., 2011 e Sharkey et al ., 2011. Chiloe micropteron (Rotoitida e) è stato il gruppo sorella dei rimanenti Chalcidoidea in tutti i risultati di verosimiglianza, ma senza utilizzare la metodologia della parsimonia. Con un più ampio campionamento del gene, Heraty et al ., 2011 ottennero le stesse relazioni nelle analisi di

18 probabilità dei dati allineata ad occhio e con la tecnica della parsimonia solo nei dati allineati visivamente. Mymaridae e Mymarommatidae sono entrambi comuni nei depositi di ambra nella prima metà del Cretaceo (Yoshimoto CM (1975; Heraty JM e Darling DC (2009); Schmidt AR,, 1010) sostenendo, così, la loro origine precoce e le relazioni con il gruppo-sorella. I Rotoitidae sono sconosciuti in tutti i depositi fossili, ma ha un potenziale profilo arcaico di distribuzione, con generi conosciuti solo in Nuova Zelanda e nel sud del Cile (Heraty JM e Darling DC, 2009), suggerendo un’origine nel Cretaceo tardivo (McLoughlin S, 2001). Dopo i Rotoitidae , i rapporti all'interno dei Chalcidoidea diventano vaghi. La spina dorsale della struttura dei Chalcidoidea ha poco supporto con i gruppi tassonomici di spostamento nelle diverse analisi dalla base ad un posto più apicale nella topologia. Come pure, ci sono pochi relazioni di gruppo sorella coerente sostenuto tra i livelli di gruppi elevati. Una delle poche relazioni che possono essere provate sulla base della morfologia delle larve, Eucharitidae + Perilampidae (Heraty JM, Darling DC, 1984), si verifica in alcuni, ma non in tutti i risultati e non ha il supporto della metodica del bootstrap. Questo non è semplicemente un artefatto del dataset ribosomiale. Simili risultati, con scarso supporto dell’asse dorsale dell’albero filogenetico, sono stati trovati anche da Desjardins et al ., 2007, che ha impiegato 4 geni codificanti proteine nucleari e molto meno taxa. Si è recuperato il supporto per molti tradizionali gruppi di livello superiore all'interno dei Chalcidoidea , per lo più a livello di sottofamiglia e tribù, ma anche per un paio di diversi gruppi a livello di famiglia, come gli Agaonidae , Eulophidae , Eucharitidae e Trichogrammatidae . Si è recuperato un consistente supporto per un nuovo complesso di pteromaloidi, che è una miscela di gruppi sottofamiglia morfologicamente ben distinti. Per alcuni dei gruppi tradizionalmente ben supportati come i Chalcididae , la maggior parte dei taxa inclusi sono risultati monofiletici soltanto per un'analisi. Un simile e raro raggruppamento è stato anche trovato per un gruppo monofiletico Signiphoridae + Azotinae . Sono stati trovati alcuni taxa che non potevano essere collocati all'interno di qualsiasi tradizionale gruppo di livello superiore. C'era anche qualche singolo taxa che si è imposto al suo collocamento, quali Diplesiostigma , Cynipencyrtus e Idioporus . È interessante notare che Idioporus è anche difficile da collocare su base morfologica, anche se nessuno Perilampidae (probabilità su base ML) o Rotoitidae (probabilità su base parsimonia) sono stati mai proposti per costituire la base di uno studio morfologico effettuato da LaSalle et al ., 1997 I Calesinae sono attualmente incertae sedis entro i Chalcidoidea (Mottern et al ., 2011), ed i risultati non offrono alcun gruppo sorella potenziale per questo clade. Pteromalidae , come previsto, è polifiletico e influisce notevolmente la composizione e le relazioni di altri taxa. Alcune informazioni storiche sulle relazioni per ciascun gruppo familiare seguono. Un esame più dettagliato della classificazione, della storia e della biologia possono essere trovati in Gibson et al ., 1999 e Hanson P et Gauld ID, 1995. Agaonidae . Gli Agaoninae e gli Sycophaginae (così come gli Idarninae ), una volta inclusi nei Torymidae , sono stati spostati ad Agaonidae da Bou ek (Bou ek, 1988). Agaonidae , sensu lato , sono stati compresi negli Agaoninae , Epichrysomallinae , Otitesellinae , Sycoecinae , Sycophaginae e Sycoryctinae (Bou ek, 1977). Bou ek notato che non c'erano (Bou ek, 1988) caratteri morfologici unici per definire gli Agaonidae sensu lato, ha limitato la famiglia al gruppo di impollinazione degli Agaoninae ed ha suggerito una relazione con il gruppo-sorella degli Agaoninae + Sycophaginae . Grissell (1995) ha suggerito che gli Agaonidae (in senso lato) possono formare un clade derivato all’interno dei Torymidae . Rasplus et al. (1998) ha revisionato gli Agaonidae , dopo aver stabilito che non era monofiletico, limitando la famiglia con l’inclusione dei soli Agaoninae ( Agaonidae sensu stricto ). Cruaud et al . (2010) ha analizzato i rapporti all'interno degli Agaonidae sensu stricto ed ha proposto fino a quattro sottofamiglie quali Tetrapusinae , il gruppo 4 degli Agaoninae (potenziale sottofamiglia), Blastophaginae e Agaoninae , ma con gli ultimi due gruppi probabilmente inclusi nell’unica sottofamiglia degli Agaoninae .

19 Agaonidae ( sensu stricto ) è risultato monofiletico in tutte le analisi con valori di probabilità BS del 100% e di parsimonia del 97%. I Tetrapusinae sono stati recuperati con un BS del 100% in tutte le analisi (tabella 1) e sono stati considerati gruppo-sorella nel rimanente gruppo degli Agaoninae , come riportato in Cruaud et al . (2010), o nidificato all'interno Agaonidae . (tabella 2). Il gruppo 4 degli Agaonidae è risultato monofiletico in tutte le analisi di verosimiglianza, ma non in quelle di parsimonia. I Kradibiinae non sono mai stati recuperati come gruppo monofiletico, anche se entrambi i generi appartenenti Kradibia e Ceratosolen , sono risultati, ciascuno, monofiletico. Gli Agaoninae sono risultati parafiletici in tutte le analisi dei Blastophaginae , ma un gruppo monofiletico di Agaonidae + Blastophaginae , escluso il gruppo 4 degli Agaonidae è stato recuperato nella maggior parte dei risultati con basso supporto (tabella 2). Nessuna delle altre sottofamiglie in precedenza incluse negli Agaonidae sono state collocate vicino agli Agaonidae, anche se il dataset SSNR (solo il nucleo) dei Sycophaginae sono stati posti come il gruppo sorella di Agaonidae, ma senza il supporto bootstrap. Aphelinidae . Woolley (1967) ha suggerito che la monofilia degli Aphelinidae non era certa e, pertanto, ha notato la tendenza storica di raggruppare tutti i parassitoidi degli adulti e degli stadi ninfali degli Hemiptera negli Aphelinidae , senza una comprensione delle relazioni. Attualmente, la maggior parte degli autori riconoscono che gli Aphelinidae possono essere parafiletici se non polifiletici (Gibson et al ., 1999; Campbell et al., 2000; Heraty et al ., 1997). I caratteri che uniscono gli Aphelinidae possono anche non essere apomorfici [Hayat, 1985; Hayat, 1998). Sulla base di soli pochi taxa, gli Aphelinidae erano parafiletici nelle analisi molecolari di Campbell et a l. (2000). Autori precedenti hanno posto gli aphelinids all'interno delle diverse famiglie, tra le quali gli Eulophidae (Ashmead, 1904); Muesebeck, 1951), gli Encyrtidae (Girault, 1915; Gordh, 1979), gli Pteromalidae (Hayat, 1985) o come una famiglia distinta (Compere et Annecke, 1961). Rosen e DeBach (1990) hanno osservato che gli Aphelinidae condividono affinità morfologiche sia con gli Encyrtidae (in particolare con riferimento alla forma della mesopleura ed alla struttura degli speroni protibiali e mesotibiali) e gli Eulophidae (per la morfologia degli scleriti toracici e la segmentazione antennale). Gibson (1989) ha ipotizzato una relazione Aphelinidae + Signiphoridae sulla base della struttura della piastra mesotrocanterica e del metasterno, un rapporto proposto anche da Domenichini (1954). Woolley (1988) ha trovato forti evidenze morfologiche che unisce Azotinae + Signiphoridae . Compere e Annecke (1961) e Rosen e Debach (1990) hanno considerato gli Aphelinidae essere più strettamente legati ai Signiphoridae ed Encyrtidae . Viggiani e Battaglia (1984) ha osservato che gli Aphelinidae sono morfologicamente più affini agli Eulophidae ed ai Trichogrammatidae . I rapporti all'interno degli Aphelinidae sono altrettanto, se non di più, complessi (Hayat, 1998; Ashmead, 1904; Yasnosh, 1976; Khan et Shafee 1980; Erdös, 1964; De Santis, 1946; Ferrière, 1965; Ghesquière, 1955; Hayat, 1985; Mercet, 1929; Nikol’scaya et Yasnosh, 1966; Shafee et Khan, 1978). Uno studio degli Aphelinidae (Hayat, 1998) riconosce le seguenti sottofamiglie e tribù: • Aphelininae (tribù Aphelinini , Aphytini , Eretmocerini ed Eutrichosomellini ), • Eriaphytinae , • Azotinae , • Coccophaginae (tribù Coccophagini , Physcini e Pteroptricini ), • Eriaporinae ed • Euryischiinae . Noyes (2011) utilizza gli Eretmocerinae , Hayat (1998) esclude i Calesinae dagli Aphelinidae . I risultati ottenuti avvalorano l'idea che gli Aphelinidae non sono monofiletici (figure 3, A÷F). Nella migliore delle ipotesi, le due sottofamiglie degli Aphelininae (escluso Eretmocerus ) + Coccophaginae sono monofiletiche nelle analisi SSNR. Gli Aphelininae , Azotinae ( Ablerus Howard 1894), Eretmocerinae (Eretmocerus Haldeman 1850) ed Euryischiinae sono stati inclusi con fortissimo sostegno BS in tutte le analisi (tabella 3). La

20 sottofamiglia Coccophaginae è monofiletia nella maggior parte delle analisi probabilità (94%), ma la specie Coccobius Ratzeburg 1852 è stata esclusa dagli altri taxa nei risultati dell’analisi di parsimonia (tabella 3). Nella maggior parte dei casi, le tribù afelinine Aphelinini (Aphelinus Dalman 1820), Aphytini , ed Eutrichosomellini (tutti Aphelininae ) sono monofiletiche, sebbene gli Eutrichosomellini spesso rendono gli Aphytini parafiletici. All'interno della sottofamiglia Coccophaginae , Coccophagus Westwood 1833 costantemente rende parafiletici gli Pteroptricini . All'interno degli Pteroptricini , Encarsia Förster 1878 è costantemente reso parafiletico da Dirphys Howard 1915. Non c'era un taxon gruppo-sorella consistente o plausibile per gli Aphelininae o Coccophaginae . Nella maggioranza delle analisi, Euryischiinae è la sorella di Cecidellis Hansson 2005 sp. (Coelocybinae: Pteromalidae ), che può essere giustificata morfologicamente (RGB). Il monogenetico Eretmocerinae è monofiletico con un forte sostegno in tutti i risultati, ma non ha associazione con altri taxa di afelinidi. Azotinae sono sempre monofiletici, con il supporto bootstrap del 100%, con gli ex membri di Azotus rendendo il genere Ablerus parafiletico, il quale è un risultato atteso. Gli Azotinae sono il gruppo sorella dei Trichogrammatidae nei risultati di probabilità, ma senza il supporto bootstrap (tabella 4). La monofilia di Azotinae + Signiphoridae è sostenuta da diversi sinapomorfie morfologiche (Wolley, 1988), ma questo gruppo è stato recuperato solo nei risultati analitici di parsimonia (tabella 4). Calesinae (famiglia non inquadrata ). Il genere Cales ( Calesinae ) è stato escluso dagli Aphelinidae e lasciato non inquadrato nei Chalcidoidea da Hayat (1993). Mottern et a l. (2011) hanno rivisto i Calesinae e discusso l’unica morfologia ed i potenziali rapporti con vari taxa, compresi gli Aphelinidae , Eretmocerinae , Eulophidae , Mymaridae e Trichogrammatidae . Il gruppo Calesinae è monofiletico alla probabilità del 100% con il supporto BS in tutte le analisi (figura 3, F). Incluso nell’analisi vi sono due specie morfologicamente e geograficamente distinte, Cales berryi Mottern et Heraty 2011, il cui areale di distribuzione è la Nuova Zelanda e Cales noaki Hoeward 1907, distribuito in Sud America, in particolare in Cile. Questo stesso modello di distribuzione è stato usato come argomento per il posizionamento arcaico dei Rotoitidae . Sebbene il genere Cales Howard 1907 era intermedio tra i Mymaridae ed altri Chalcidoidea (Campbell et al ., 2000), è stato sempre ben annidato all'interno dei Chalcidoidea in tutti i risultati analitici. Nessun outgroups consistente sono stato identificati in uno qualsiasi dei risultati. Chalcididae . Bou ek et Halstead (1997) hanno osservato che la classificazione dei Chalcididae è cambiata poco nel corso degli anni. La relazione di un gruppo-sorella con i Leucospidae o addirittura l'inserimento dei Leucospidae entro i Chalcididae è stata suggerita da Gibson (1990; 1993). La monofilia dei Chalcididae non è stata precedentemente messa in dubbio ed è in gran parte basata su quattro sinapomorfie morfologiche (Wijesekara, 1997; Gibson, 1999). Classificazioni tradizionali hanno incluso i Chalcidinae con le tribù, Chalcidini , Cratocentrini , Phasgonophorini e talvolta Brachymeriini , con altre sottofamiglie tra cui Dirhininae , Epitraninae , Haltichellinae e Smicromorphinae (Bou ek, 1988; Delvare,1992). In un’analisi filogenetica della famiglia, Wijesekara (1997) ha proposto che gli Smicromorphinae sono stati nidificati all'interno dei Chalcidinae , con Chalcidinae includendo il gruppo sorella degli Smicromorphinae al gruppo restante dei calcididi, seguita da una sequenza dei Cratocentrinae , Brachymeriinae ( Brachymeriini + Phasgonophorini ) e, infine, Dirhininae ( Dirhinini + Epitranini ) + Haltichellinae ( Haltichellini + Hybothoracini ). Noyes (2011) non ha riconosciuto i Brachymeriinae , che è la convenzione seguita nel presente documento. I Chalcididae non erano monofiletici in nessuna delle analisi. L’analisi MENR ha attribuito l'approssimazione più vicina ad un monofiletico Chalcididae, con un raggruppamento di Dirhinus (Dirhininae ), Epitranus ( Epitraninae ), Chalcidinae , Brachymeria Westwood 1832 (Brachymeriinae ), Phasgonophorini e Trigonura (Cratocentrini ). Però, questo gruppo comprendeva sorprendentemente anche due sottofamiglie di pteromalidi ( Macromesinae e

21 Leptofoeninae ), esclusi Cratocentrus e Acanthochalcis (Cratocentrini). Altrimenti, i vari gruppi erano incoerenti nel loro raggruppamento in altre analisi. Al livello sottofamiglia, Epitraninae , Dirhininae e Haltichellinae erano tutti monofiletici con un fortissimo sostegno dei BS (tabella 3). Smicromorphinae ha incluso solo un unico taxon che era indipendente dagli altri calcididi o raggruppata con i Cratocentrini o Phasgonophorini , ma mai con Chalcidini , come proposto da Wijesekara. La sottofamiglia Chalcidinae non é mai stata considerata monofiletica, ma le tribù Brachymeriini , Chalcidini e Phasgonophorini avevano tutte un sostegno molto elevato BS attraverso tutte le analisi (tabella 3). È interessante notare che i nostri rappresentanti del Vecchio Mondo di Chalcis rendono il genere Conura diffuso nel Nuovo Mondo parafiletico in tutte le analisi. Mentre la monofilia di Haltichellinae è stata sostenuta in tutte le analisi, la monofilia delle due tribù, Haltichellini e Hybothoracini , è variata. I risultati non offrono molta risoluzione per i rapporti all'interno dei Chalcididae , ma offre il supporto per il riconoscimento di Brachymeriinae , Dirhininae , Epitraninae , Chalcidinae (come i Chalcidini ), Haltichellinae e Smicromorphinae . Entrambi i Phasgonophorini e i Cratocentrini sono meno facilmente posizionato e non è stato possibile recuperare la monofilia dei Cratocentrini (Trigonura e Acanthochalcis + Cratocentrus ) in una qualsiasi delle analisi. Leucospidae non sono mai stat raggruppati con nessuna delle famiglie dei Chalcididae e ciò contraddice le ipotesi che essi sono il gruppo sorella dei Chalcididae , o che potrebbero rendere i Chalcididae un gruppo parafiletico. Encyrtidae . La monofilia degli Encyrtidae non è in discussione e vi è una forte evidenza morfologica per sostenere questa famiglia (Noyes, 1997). Una relazione dei gruppi-sorelle Encyrtidae + Tanaostigmatidae è stato spesso proposto, con questo clade nell'essere a sua volta sorella agli Eupelmidae (Gibson, 1989; Noyes, 1997; LaSalle, 1987; LaSalle e Noyes, 1985). Noyes, 1997 ha seguito la divisione degli Encyrtidae nelle sottofamiglie dei Tetracneminae e Encyrtinae (Triapitzin, 1973; Triapitzin, 1989) ed ha osservato che, mentre i Tetracneminae sono senza dubbio monofiletici, gli Encyrtinae possono rappresentare un assemblaggio parafiletico. Gli Encyrtidae erano monofiletici attraverso tutte le analisi con RAA, con un sostegno BS da moderato a molto forte (tabella 3). I Tetracneminae erano monofiletici con un sostegno probabilistico da moderato a molto forte attraverso la maggior parte delle analisi, con gli Encyrtinae formanti sia un parafiletico, sia un monofiletico gruppo sorella. Le straordinarie lunghezze delle branche dell’albero dendrometrico trovate all'interno degli Encyrtidae (figura 2C) si verificano nei risultati sia di SS sia di SS + RAA analisi, e quindi non sono semplicemente il risultato di avere diversi taxa con lunghi inserti RAA. I risultati mai hanno avallato una stretta relazione con i Cynipencyrtus , Tanaostigmatidae o una qualsiasi delle sottofamiglie degli eupelmidi. Eucharitidae . Diverse caratteristiche morfologiche sostengono la monofilia degli Eucharitidae (Heraty, 2002). Sulla base del primo stadio larvale (planidium), Heraty e Darling, 1984, hanno proposto un gemellaggio per gli Eucharitidae ed i Perilampidae . Sulla base delle prove molecolari e morfologiche, i Gollumiellinae formano il gruppo sorella degli Oraseminae + gli Eucharitinae ((Heraty e Darling, 2009; Herat, Hawks, Kostecki e Carmichael, 2004). Akapalinae e Philomidinae erano proposti come appartenenti agli Eucharitidae da Bou ek, 1988. I Philomidinae condividono le larve planidiali con gli Eucharitidae (Darling, 1992), ma gli stadi immaturi degli Akapalinae sono sconosciuti. Eucharitidae sensu stricto (Gollumiellinae , Oraseminae ed Eucharitinae ) sono risultati essere monofiletici, con il 100% di significanza BS in tutte le analisi. Akapalinae sono raggruppati con i Perilampinae in tutti i risultati, ma, come il gruppo sorella degli Eucharitidae , nelle analisi di parsimonia. I Philomidinae non sono mai stati raggruppati con gli Eucharitidae . Mentre gli Eucharitinae sono stati sempre con forza molto sostenuto, gli Oraseminae sono stati solo occasionalmente parafiletici agli Eucharitinae . I Gollumiellinae sono stati parafiletici solo nelle analisi di parsimonia. La monofilia dei Psilocharitini (generi Psilocharis e Neolosbanus ) non

22 è supportata, similmente ai risultati di altri studi molecolari (Heraty, Hawks, Kostecki e Carmichael, 2004). Un gruppo sorella degli Eucharitidae + Perilampidae è stato recuperato nella maggior parte delle analisi di stima dei parametri del modello statistico che comprendeva RAAs ed anche nelle analisi di parsimonia (tabella 4). Tuttavia, senza il supporto bootstrap , il supporto morfologico per questo gruppo si basa sulla presenza di uno sclerotizzato primo stadio di larva planidiale (Heraty e Darling, 1984; Darling, 1992) ed è stato posto qualche grado di confidenza nei risultati che ne sostengono la loro monofilia. Con l'inclusione dei Philomidinae in questo gruppo, si potrebbe sostenere una singola origine delle larve planidiali all'interno dei Chalcidoidea (figura 4). Tuttavia, i risultati di parsimonia sostengono il gruppo Perilampidae + Eucharitidae come monofiletico, senza i Philomidinae , che sono stati raggruppati, invece, con alcuni Phasgonophorini (Chalcididae ) e Rileyinae ( Eurytomidae ). Eulophidae . La monofilia degli Eulophida e generalmente non è stata contestata, anche se il supporto morfologico si basa quasi interamente sulla riduzione dei carattere (Burks, Heraty, Gebiola e Hansson, 2011). Basato in gran parte sull’evidenza molecolare, gli Elasmidae sono entrati in sinonimia con gli Eulophidae come indicato da Gauthier, LaSalle, Quicke e Godfray, 2000. Ad un livello superiore, Schauff, LaSalle e Coote, 1997 hanno suggerito un raggruppamento di Eulophidae , Elasmidae e Trichogrammatidae , ma gli autori fanno notare che non c'era una forte e sufficiente evidenza per una tale relazione. È stato suggerito che gli Eulophinae rappresentano il gruppo di base delle quattro sottofamiglie a causa delle loro ''caratteristiche meno specializzate'' (Schauff, LaSalle e Coote, 1997). In un'analisi combinata, Burks, Heraty, Gebiola e Hansson, 2011 hanno proposto che gli Eulophinae + Tetrastichinae rappresentano il gruppo sorella di (Opheliminae + Entiinae ) + Entedoninae . I soli Eulophidae , provvisti di tarsi 3-segmentati, il genere Trisecodes , è stato rimosso dagli Entedoninae e posto come incertae sedis entro gli Eulophidae (Burks, Heraty, Gebiola e Hansson, 2011). Gli Euderomphalini , il gruppo dei parassitoidi della mosca bianca ( Trialeurodes vaporariorum Westwood 1856), costituivano il gruppo sorella agli Entedonini (negli Entedoninae ), mentre Gumovsky (2002) era contrario alla loro collocazione negli Entiinae . Gli Eulophidae erano monofiletici con un forte, fino a molto forte significanza in tutte le analisi (figura 3D; tabella 3), ma con l’esclusione del genere Trisecodes , che in tutte le analisi era il gruppo sorella di taxa al di fuori Eulophidae . La significanza è stata sempre molto alta per i Tetrastichinae ed aumentata con l'inserimento di RAA per Entedoninae , Entiinae ed Eulophinae . Come proposto dal Gauthier, LaSalle, Quickee Godfray (2000), Elasus (ex Elasmidae ) è stata sempre nidificato all'interno degli Eulophinae . Come pure, Tetrastichinae e Eulophinae (compreso il genere Elasmus ) ha una delezione di una unica regione variabile contigua (RAA 23-25). Perthiola ( Anselmellini ) è stato sempre il gruppo sorella Ophelimus con elevata probabilità bootstrap. Gli Anselmellini sono stati collocati al di fuori degli Eulophinae da Gauthier, LaSalle, Quicke e Godfray (2000). Con l'aggiunta della risoluzione derivata dall’analisi RAA, Perthiola + Opheliminae raggruppati insieme con gli Entiinae (54% di probabilità nell’analisi di confronto dei modelli e della parsimonia; tabella 4) o con Entedoninae . Senza le analisi RAA, questi quattro gruppi sono monofiletici ma il problema non è risolto. I risultati supportano l'ipotesi delle relazioni suggeriteda Burks, Heraty, Gebiola e Hansson (2011) e dimostrano la potenziale inclusione degli Anselmellini all'interno degli Opheliminae . L'esclusione di Trisecodes dagli Eulophidae , come proposto da Burks et al . (2011), è giustificata. Questo genere è stato di solito collocato (81% di probabilità e di parsimonia), ma senza una forte significanza, come nel caso del gruppo sorella dei Tetracampinae (escluso il genere Diplesiostigma ) e non è mai stato raggruppato con gli altri Eulophidae . È importante sottolineare che non vi era alcuna relazione per gli Eulophidae con qualsiasi delle sottofamiglie degli afelinidi, incluso i Calesinae che hanno molte caratteristiche simili riduttive (Mottern, Heraty e Hartop 2011). Le analisi senza RAA (SSNR, MENR) ha consentito di dare credito ad un cladecostituito da Eulophidae + (Azotinae + Trichogrammatidae ), ma per il resto non

23 ci sono stati outgroups consistenti e mai nessun gruppo che sono stati precedentemente proposti in letteratura. Eupelmidae . Mentre esiste una forte significatività morfologica per la la monofilia di ciascuna delle tre sottofamiglie degli Eupelmidae , è stato proposto che la famiglia potrebbe rappresentare un grado piuttosto che un clade (Gibson, Heraty e Woolley, 1999; Gibson, 1989; Gibson 1993; Gibson, 2008). Il grado è stato preso in considerazione per includere gli Encyrtidae ed i Tanaostigmatidae , e potenzialmente gli Aphelinidae , che condividono tutti un Acropleuron ampliato ed altre caratteristiche associate; tuttavia, vi è anche una possibilità di includere relazioni più vicine ad una o più sottofamiglie dei Cleonyminae (Pteromalidae ), come indicato da Gibson (1989). Gli Eupelmidae non sono mai stati considerati monofiletico. Anche le sua sottofamiglie dei Calosotinae , Eupelminae , e Neanastatinae erano quasi mai monofiletico. Il dataset SSME ha fornito, in uno dei rari casi, risultati in cui i Neanastatinae sono monofiletici (figura 3A), ma negli stessi risultati, sia i Calosotinae , sia gli Eupelminae sono due volte monofiletici in diverse parti dell'albero (figure 3C, 3D, 3E, 3F). Gli Eupelminae sono risultati monofiletici in alcune analisi, tra cui entrambi i set di dati che non includevano RAAS (tabella 3). Calosotinae non sono mai risultati monofiletici, con il raggruppamento dei generi Calosota e Balcha distanti dai generi Archaeopelma , Licrooides ed Eusandalum . Nessuno degli Eupelmidae è stato mai raggruppato con i Tanaostigmatidae o gli Encyrtidae . Eurytomidae . La monofilia degli Eurytomidae è stata recentemente posta in discussione in quanto definiscono la famiglia non essendo sinapomorfici (Gates, 2008). Infatti, le analisi molecolari di Campbell, Heraty, Rasplus, Chan, Steffen-Campbell et al . (2000) e Chen, Xiao, Fu e Huang (2004) e le analisi morfologiche di Lotfalizadeh Lotfalizadeh, Delvare e Rasplus (2007) non sono riuscite a recuperare un gruppo di Eurytomidae monofiletico. Stage e Snelling (1986) hanno riconosciuto gli Heimbrinae , Rileyinae ed Eurytominae , con quest'ultimo tra cui i Buresiinae precedentemente rilevato. Chen et al . (2004) hanno proposto di elevare i Rileyinae allo stato di famiglia, mentre Lotfalizadeh et al . (2007) hanno riscontrato i Rileyinae consistere di due cladi di taxa non parenti, estranei ( Rileya e Macrorileya + Buresium ). Le indagini molecolari e morfologiche hanno trovato il genere Eurytoma essere polifiletico (Chen Y et al., 2004; Lotfalizadeh et al ., 2007). Gli Eurytomidae non furono mai ritrovato come monofiletico in una qualsiasi analisi. Tuttavia, Eurytominae (escluso il genere Buresium ) dimostarono essere monofiletici in tutte le analisi ad altissima probabilità (tabella 3). Il genere Rileya ( Rileyinae ) risultò monofiletico in tutte le analisi, ma la probabilità risultò altissima solo quando le analisi RAA furono effettuate. Entrambi i generi Heimbra ( Heimbrinae ) e Buresium ( Eurytominae ) mai furono raggruppati con gli altri generi di Eurytomid . Non sono stati identificati outgroups logici. Leucospidae . I Leucospidae sono generalmente riconosciuti come un gruppo monofiletico di quattro generi strettamente correlati ai Chalcididae (Wijesekara, 1997; Bou ek, 1974). Tuttavia, i caratteri proposti per sostenere la monofilia dei questi quattro generi combinati nei Leucospidae sono tutti problematici e potenzialmente convergenti (Gibson, Heraty e Woolley, (999; Bou ek, 1974). I Leucospida e erano considerati monofiletici e ciò era supportato dal 90% di probabilità attraverso tutte le analisi. Una specie di Micrapion (Sud Africa) ha reso costantemente Leucospis (rappresentanza in tutto il mondo) parafiletico. Nessuna stretta associazione è stata trovata con i Chalcididae . Mymaridae . Anche se c'era qualche dubbio sulla monofilia dei Mymaridae (Annecke e Doutt, 1961) [106], la famiglia è stata ben consolidata sulla base della morfologia e di prove molecolari (Schauff, 1984; Huber, 1997; Campbell, Heraty, Rasplus, Chan K, Steffen-Campbell et al ., 2000). Huber (1997) ha osservato che la classificazione dei Mymaridae è instabile e le sottofamiglie dei Mymaridae sono state abbandonate ed i generi raggruppati in base al loro numero di segmenti tarsali. Gibson (1986) è stato il primo a proporre la prova morfologica che i Mymaridae potrebbe essere il gruppo sorella dei rimanenti Chalcidoidea , ma senza risoluzione chiara e confermata.

24 I Mymaridae sono risultati essere monofiletici in tutte le analisi con una probabilità molto alta (figura. 1, tabella 3). Il gruppo con i tarsi 4-segmentati, rappresentato di generi Borneomymar , Gonatocerus , Litus e Ooctonus , è stato costantemente monofiletico attraverso tutte le analisi con una probabilità da moderata ad alta (tabella 4). I restanti generi Acmopolynema , Anagrus , Anaphes , Australomymar , Ceratanaphes , Erythmelus , Eubroncus , Mymar e Stethynium , costituirono il gruppo con il tarso 5-segmentato. Questo gruppo è supportato nella maggior parte dalle analisi (88% di probabilità), con una probabilità BS che ha oscillato da moderata a forteo solo quando le analisi RAA erano incluse. Non c'era alcun supporto per i Mymarinae o gli Alaptinae . Gli Eubronchinae erano monofiletici, ma questo era rappresentato solo da un singolo genere. I Mymaridae erano fortemente supportato come il gruppo sorella dei rimanenti Chalcidoidea , in tutte le analisi. Ormyridae . Hanson (1992; 1997) ha osservato che lo stato ed i rapporti di Ormyridae sono incerti. I membri della famiglia sono stati compresi come sottofamiglia negli Pteromalidae (Burks, (1979), i Torymidae (Bou ek, Watsham e Wiebes, 1981), o come propria famiglia (Bou ek, 1988). I due generi, Ormyrus e Ormyrulus , sono risultati essere monofiletici in tutte le analisi, ma con una probabilità BS oscillante tra bassa a molto alta (figura 3). Nel 56% di probabilità delle analisi, tutte basate sull'impiego dell’ allineamento del nucleo SS e con o senza RAA, è risultato una relazione del group-sorella con i Moranila ( Pteromalidae : Eunotinae : Moranilini ), ma per il resto non c'erano coerenti associazioni di outgroup e mai nessuna stretta associazione con una delle sottofamiglie dei torymidi. Perilampidae . I limiti dei perilampidae non sono chiari, con u inserimento variabile delle sottofamiglie dei Chrysolampinae , Philomidinae e Perilampinae , e trattamento di ciascuno o di tutti i gruppi come una famiglia o sottofamiglia separata di Pteromalidae (Gibson, Heraty e Woolley; 1999; Gibson, 1993; Darling, 1997. Il genere Akapala ( Akapalinae ) è stato inizialmente posto negli Perilampidae , ma in seguito trasferito negli Eucharitidae (Bou ek, 1988). Più recentemente, il genere Jambiya è stato descritto ed incluso all'interno dei Perilampidae , ma una associazione con i Chrysolampinae o i Perilampinae non potrebbe essere fatta (Heraty e Darling, 2007). Il genere Jambiya possiede un ovopositore allargato, la qualcosa è anche una caratteristica basale degli Eucharitidae ed una relazione con quella famiglia non può essere respinta. Un rapporto proposto tra Perilampidae , Philomidinae ed Eucharitidae si basa sulla presenza di una larva planidiale (Heraty e Darling, 1984; Darling, 1992). Nei risultati delle analisi di verosimiglianza, i Perilampidae sensu stricto ( Chrysolampinae + Perilampinae ) non è stato mai ritrovato. Con l’esclusione delle analisi RAA, una famiglia Perilampidae monofiletica è stata recuperata con bassa probabilità, includendo i Chrysolampinae (67-73% di probabilità nelle analisi BS), i Perilampinae (96-98% BS), gli Akapalinae , i Philomidinae ed il genere Jambiya . Questo gruppo ha anche incluso il genere Idioporus (Pteromalidae : Eunotinae : Eunotini ). In queste analisi, gli Eucharitidae ed i Perilampidae non risultarono essere monofiletici. Con l'inclusione delle analisi RAA, i risultati sono stati più variabili, ma spesso hanno consentito di recuperare i Perilampidae e gli Eucharitidae come monofiletici, il genere Jambiya come gruppo-sorella degli Eucharitidae , ma ancora una volta con i Philomidinae , gli Akapalinae ed il genere Idioporus annidati all'interno di un parafiletico o monofiletico Perilampidae , ma ancora con ciascun monofiletico Chrysolampinae e Perilampinae (figura 3E). Un monofiletico Perilampidae ( Chrysolampinae + Perilampinae ) è stato recuperato soltanto nell'analisi della parsimonia. Questi risultati hanno anche sostenuto il genere Jambiya come il gruppo sorella degli Akapalinae + Eucharitidae . I Philomidinae sono stati lontanamente posizionato con i Phasgonophorini ( Chalcididae ) ed i Rileyinae ( Eurytomidae ). Così, mentre gli Eucharitidae sono ben sostenuti, c’è il supporto in conflitto per la definizione dei Perilampidae ed un'associazione definitiva con gli Eucharitidae . Pteromalidae . Gli Pteromalidae sono essenzialmente uno “scarico” per gruppi presumibilmente monofiletici che non possono essere assegnati alle famiglie consolidate e che mancano dello stato di famiglia, secondo il loro diritto (Gibson, Heraty e Woolley, 1999). Qui, riconosciamo le 30 sottofamiglie di Noyes (2011), nonché le sottofamiglie associate ( Otitesellinae , Sycoecinae e

25 Sycoryctinae ) dei tre non-impollinatori del fico assegnati ai Pteromalidae o sistemati come incertae sedis ( Epichrysomallinae e Sycophaginae ) da Rasplus et al . (1998). Storicamente, molte sottofamiglie di pteromalidi sono state elevate allo stato di famiglia, solo per riprendere ancora una volta lo stato di sottofamiglia entro i Pteromalidae (Gibson, Heraty e Woolley, 1999). Non c'è stato alcuna analisi morfologica completa della famiglia. Le analisi molecolare hanno suffragato il concetto di un assemblaggio polifiletico, ma anche gli studi più completi hanno dimostrato relativamente pochi taxa attraverso tutta lo stettro della famiglia (Campbell, Heraty, Rasplus, Chan, Steffen-Campbell et al ., 2000; Desjardins, Regier e Mitter, 2007). Sono state campionate 25 di queste 36 sottofamiglie e, dove possibile esaminare un campione più ampio all'interno dei gruppi (tabella 3). La discussione seguente è limitata a raggruppamenti o risultati significativi. In particolare, molti dei taxa sono “quasi” monofiletici, spesso con l'esclusione di uno o più taxa, e molti di questi casi dovranno essere valutati altrove. L’attesa era che gli Pteromalidae fossero polifiletici (Gibson, Heraty e Woolley, 1999; Noyes, 1990), e mai sono stati individuati come monofiletici. Diverse sottofamiglie erano polifiletiche e con un’elevata probabilità considerate tali attraverso tutte le analisi, compresi i Ceinae (Spalangiopelta ), Cerocephalinae , Epichrysomallinae , Panstenoninae ( Panstenon ), Pteromalinae , Spalangiinae ( Spalangia ) e Sycophagina e. In nessun caso si riscontra un aumento del grado di probabilità con l’aggiunta delle analisi RAA. Interessante è il nuovo raggruppamento degli pteromalidi, sottofamiglie Cratominae ( Cratomus ), Miscogastrinae (tranne il genere Nodisoplata ), Otitesellinae , Panstenoninae , Pteromalinae , Sycoecinae ( Diaziella ) e Sycoryctinae . Questo raggruppamento si riscontra in tutte le analisi, compreso l’analisi di parsimonia, ma senza il supporto bootstrap . Un clade dei Miscogastrinae e Pteromalinae è risultato fortemente significativo nelle analisi effettuate da Desjardins et al . (2007), ma nessuna delle altre sottofamiglie è stata inclusa come parte di questo studio. Questo “complesso di pteromalidi” si distingue per la peculiare piccola quantità di divergenza molecolare ed elevata complessità morfologica, soprattutto per le sottofamiglie dei non-impollinatori del fico quali gli Otitesellinae ed i Sycoryctinae . La bassa divergenza e stabilità riscontrata attraverso varie analisi suggeriscono che le sottofamiglie di questo gruppo potrebbero alla fine essere messe in sinonimia sotto la sottofamiglia degli Pteromalinae . Il posizionamento tassonomico del genere Nodisoplata Graham, 1969, che era collocato al di fuori di questo complesso, deve essere riconsiderato.Le due altre sottofamiglie associate al binomio simbiotico fico-insetto, Epichrysomallinae e Sycophaginae , sono risultate monofiletiche, ma non associate ad alcun taxon coerente. In un’analisi senza RAA (SSNR), i Sycophaginae rappresentarono il gruppo sorella deglii Agaonidae , ma senza il supporto dell’analisi BS. Questo risultato è stato proposto da Copland e King (1973). Coelocybinae , Ormocerinae , Pireninae e Pteromalinae non sono risultati monofiletici. I Cleonyminae sono polifiletici. In tutte le analisi, Cleonymini e Lyciscin i sono monofiletici con scarsa probabilità in tutte le analisi, con i Lyciscini che guadagno una maggiore probabilità a seguito dall’inclusione delle analisi di RAA. I Chalcedectini (Chalcedectus) manifestano rapporti variabili, ma mai con altri Cleonyminae . Gli Ooderini ( Oodera) hanno rapporti di gruppo-sorella variabile dai Leucospidae agli Encyrtidae e, in due occasioni, con i Lyciscini . I Cratominae (Cratomus ) hanno relazioni variabili, come risulta da tutte le analisi, ma spesso nel complesso dei pteromalidi si verifica quanto suggerito dagli studi della loro morfologia. I Diparinae non erano mai stati considerati monofiletici, come riscontrato anche da Desjardins et al . (2007). Gli Eunotinae non sono mai stati trovati monofiletici e le tribù dei Moranilini e Tomocerodini , ciascuna rappresentata da un unico taxon, sono stati alleati incoerenti di altre famiglie. Gli Eunotinaei sono monofiletici, con una elevata probabilità, in tutte le analisi. Sorprendentemente, i Leptofoeninae , che hanno un forte sostegno su base morfologica, non sono mai stati riscontrati monofiletici. Gli Ormocerinae non sono mai stati considerati monofiletici. I Sycoryctinae e gli Otitesellinae sono costantemente polifiletici e questo dato è un risultato sostenuto dallo studio della morfologia (Rasplus, Kerdelhue, Clainche e Mondor, 1998). All'interno degli Otitesellinae , le

26 due specie del genere Grasseiana formano un gruppo monofiletico, mentre Heterandrium sp. e Otitesella sp. sono stati alleati incoerente con altri taxa. I Panstenoninae sono stati nidificati all'interno degli Pteromalinae . I Pireninae e gli Pteromalinae non sono mai stati monofiletici. Gli Spalangiinae sono sempre stati considerati monofiletici, ma non sono mai stati recuperati con un gruppo-sorella coerente. Per gli Pteromalidae , i risultati sono simili a quelli stabiliti da Desjardins et al. ((2007) sulla base di un'analisi di quattro geni codificanti proteine. La famiglia è polifiletica come la maggior parte dei Chalcidoidea e pochi di gli assemblaggi di livello superiore che possono essere raggruppati con coerenza con altri gruppi pteromalidi o chalcidoidi. Rotoitidae . Nella loro descrizione della famiglia, Bou ek e Noyes (1987) hanno osservato che i Rotoitidae possono costituire il gruppo sorella dei Tetracampidae ed Eulophidae . Altre potenziali associazioni hanno incluso gli Eulophidae , i Mymaridae , i Trichogrammatidae ed i Tetracampidae (Noyes 1990; Gibson, 1990). Sulla base di un'analisi della distribuzione e della morfologia dell’ovipositore, Gibson e Huber (2000) hanno concluso che i Rotoitidae potrebbero essere il secondo più ancestrale nella stirpe dei Chalcidoidea , dopo i Mymarida e, ma hanno anche osservato che le caratteristiche dell'antenna e del mesosoma sono in contrasto con questa conclusione. I Rotoitidae sono rappresentati da una specie, Chiloe micropteron . Tutte le analisi statistiche, tranne una, sono state basali per considerare i Rotoitidae monofiletici, come sorella ai restanti Chalcidoidea, dopo i Mymaridae. I risultati sono variabili e piazzano i Rotoitidae come gruppo- sorella dei Mymaridae , quindi ancora all'interno della superfamiglia. I risultati dell’analisi di parsimonia hanno nidificato il genere Chiloe all'interno dei Chalcidoidea come gruppo-sorella del genere Idioporus ( Eunotinae : Eunotini ) in un clade con i Systolomorpha ( Pteromalidae : Ormocerinae : Melanosomellini ) e Trichogrammatidae . Nessuna caratteristica morfologica sarebbe a favore di questa ipotesi alternativa. Signiphoridae . Ci sono pochi dubbi sulla monofilia dei Signiphoridae ; tuttavia, i Thysaninae possono essere parafiletici rispetto ai Signiphorinae (Woolley, 1997; 1988). Gibson (1989) ha suggerito un rapporto tra Signiphoridae ed Aphelinidae , o dei membri all'interno degli Aphelinidae . Woolley (1988) ha proposto un gruppo-sorella Signiphoridae + Azotinae fondato (Domenichini, 1954): • sulla base di una clava antennale non segmentata; • sulla presenza di un epiproctodeo posteriore al sintergo (ultimo tergite del metasoma) in tutte le femmine degli Azotinae e dei Signiphoridae ; • sull’esistenza di apodemi sporgenti in avanti dagli angoli anterolaterali degli sterniti 3, 4, 5 e 6 del metasoma delle femmine. Pedata e Viggiani (1991) alludono ad una relazione azotini + signiphoridi con la scoperta dei tubercoli al di sopra degli spiracoli nel terzo stadio larvale di Ablerus perspeciosus e Signiphora flavella . Signiphoridae e Signiphorinae ( Signiphora ) sono entrambi monofiletici con probabilità molto forte a seguito di tutte le analisi (tabella 3). I Thysaninae sono parafiletici in tutti i risultati delle analisi. Il posizionamento del genere Clytina è stato sconcertante, con Clytina giraudi che rende il genere Chartocerus parafiletico in tutte le analisi, mentre Clytina sp. D1023 è stato costantemente gruppo- sorella del genere Thysanus . Signiphoridae non sono stati collocati con gli Azotinae , o con qualsiasi outgroup logico, in tutte le analisi. In queste analisi, Azotinae è stato costantemente il gruppo sorella dei Trichogrammatidae . Tuttavia, con l'analisi di parsimonia, Azotinae e Signiphoridae sono monofiletici e non hanno fatto gruppo con i Ttrichogrammatidae . Tanaostigmatidae . I Tanaostigmatidae sensu LaSalle (1987) sono un gruppo monofiletico distinto. LaSalle e Noyes (1985) trasferirono il genere Cynipencyrtus dagli Encyrtidae ai Tanaostigmatidae , notando che questo genere era morfologicamente e biologicamente distinto da altri membri della famiglia. Si è sostenuto che Cynipencyrtus potrebbe essere sorella agli Encyrtidae , o sorella ai Tanaostigmatidae + Encyrtidae , o sorella soltanto ai Tanaostigmatidae (Gibson, Heraty e Woolley, 1999; Gibson, 1989; 2008). Vi è una forte supporto morfologico per la monofilia del

27 clade Tanaostigmatidae + Encyrtidae , ma il supporto diventa più debole per l'inclusione degli Eupelmidae all'interno di questo gruppo (Gibson et al ., 1999). I Tanaostigmatidae sensu stricto (senza il genere Cynipencyrtus ) è stato sempre monofiletico con un’alta probabilità. Il genere Cynipencyrtus è stato variamente vicino agli altri taxa nelle diverse analisi e i tanaostigmatidi non sono mai stati il gruppo-sorella degli Encyrtida e. Questo disparato gruppo può essere un artefatto dell'analisi più grande, che ha consentito di recuperare i Tanaostigmatidae + ( Cynipencyrtus + Encyrtidae ) ad uno studio con un campione più piccolo e più selettivo dei taxa Tetracampidae . I Tetracampidae probabilmente rappresentano un assemblaggio polifiletico con tre sottofamiglie esistenti (Gumovsky e Perkovsky, 2005). Vi è una notevole argomentazione per il posizionamento delle diverse sottofamiglie come gli Aphelinidae , gli Eulophidae o i Pteromalidae (Gibson et al ., 1999; Bou ek, 1988; LaSalle, Polaszek, Noyes e Zolnerowich, 1997). Tetracampidae non sono mai risultati monofiletici nelle analisi. Escludendo i Diplesiostigma , i Tetracampinae sono monofiletici con un’alta probabilità. Diplesiostigma è variato nel posizionamento in ogni analisi, ma ciò non si è mai verificato con altri Tetracampidae . I due rappresentanti dei Mongolocampinae e Platynocheilinae sono raggruppati in un gruppo monofiletico in tutte le analisi, ad altissimo supporto, e la maggior probabilità dei risultati li ha raggruppati con gli Eunotini (Pteromalidae : Eunotinae ; escluso il genere Idioporus ), ma con bassa probabilità. Torymidae . Il posizionamento dei Torymidae è incerto, ed è stato proposto che la famiglia sia dall'interno dei pteromalidi (Grissell, 1997). Storicamente, i Torymidae hanno incluso gli Agaoninae ed i Sycophaginae (= Idarninae ), che sono stati rimossi da Bou ek (1988). I Torymidae sono stati rivisti da Grissell (1995) e comprendono solo due sottofamiglie, la gran parte dei fitofagi Megastigminae ed i Toryminae , con quest'ultimo diviso in sette tribù tra cui gli Erimerinae precedentemente rilevato, i Monodontomerinae ed i Thaumatotorymina e e diversi taxa come incertae sedis . Campbell et al . (2000) non sono riusciti a trovare un gruppo monofiletico, nonostante quello che e Gibson et al . (1999) hanno affermato circa il forte supporto morfologico per la famiglia. I Torymidae non sono mai stati monofiletici nelle analisi, ma i Megastigminae ed i Toryminae erano monofiletici con un sostegno molto forte (tabella 3). Il supporto per le tribù all'interno dei Toryminae era variabile. I torymini erano monofiletico con bassa fino a molto altaprobabilità a tutte le analisi tranne quella della parsimonia e i Podagrionini erano monofiletici per lo più con scarso sostegno (62% di probabilità alle analisi) o parafiletici. I Monodontomerini erano monofiletici con un forte supporto bootstrap in tutte le analisi, ma con l’inclusione del genere Zaglyptonotus e l'esclusione del genere Chrysochalcissa quali cluster nel profondo dei Microdontomerini . Il genere Echthrodape (Toryminae incertae sedis ) è stato precedentemente posto negli Eucharitidae e Perilampidae e poi Torymidae da Grissell (1995). Questo genere è stato recuperato come il gruppo-sorella dei Microdontomerini . Gli esemplari di Glyphomerus non posizionati sono rimasti spiazzati all'interno dei Toryminae senza particolare associazione con altre tribù. I due rappresentanti dei Palachiini sono stati raggruppati con i Torymoidini o con i Podagrionini , ma mai insieme. Nessuno dei gruppi sembravano risentire l'inclusione o l'esclusione o l’analisi RAA. Nessun gruppo-sorella logico è stato identificati per entrambe le sottofamiglie. Trichogrammatidae . I Trichogrammatidae sono ben definiti e, secondo Bou ek e Noyes (1987), è forse l'unica famiglia monotetica dei Chalcidoidea . Owen et al . (2007) hanno valutato gruppi di livello superiore e rapporti generici basati su prove molecolari e morfologiche e riconobbero un gruppo chiaramente parafiletico dei Trichogrammatinae e monofiletico degli Oligositinae . Dei gruppi campionati, il genere Ceratogramma ( Trichogrammatinae ; tribù spiazzata) è stato riconosciuto come gruppo-sorella dei rimanenti Trichogrammatidae . I Trichogrammatidae sono monofiletici in quasi tutte le analisi (il 94% degli alberi consenso MJR), ma con basso supporto BS nella probabilità che analizza soltanto dopo l'inserimento di

28 RAA. Ceratogramma era la sorella per i restanti Trichogrammatidae in tutti i risultati, tranne che per una analisi, quando essa è stata esclusa dal famiglia (tabella 3, SSNR). I rapporti interni rispecchiano quelli di Owen et al . (2007). Trichogrammatidae è sorella agli Azotinae in tutte le analisi di parsimonia che li ha posti come gruppo-sorella aii generi Idioporus , Rotoita e Systolomorpha .

Considerazioni sulla filogenetica dei Chalcidoidea Probabilmente, l’effetto di un rapido evento radioattivo costituisce la causa della diversità della superfamiglia dei Chalcidoidea (Regier, Zwick, Cummings, Kawahara, Cho et al ., 2009; Banks e Whitfield, 2006). I Mymaridae furono i primi ad apparire nella prima metà Cretaceo (Heraty e Darling, 2009). Sulla base di quello che sembra essere dei validi fossili di Eulophidae e di Ttrichogrammatidae , ci sono rilevamenti di chalcidoidi di livello superiore solo nella seconda metà dei depositi del Cretaceo (Schmidt, Perrichot, Svojtka, Anderson, Belete et al ., 2010), con rilievi della stessa età oltre che dei Mymaridae più discutibili (Heraty e Darling, 2009). La diversificazione delle famiglie di Chalcidoidea , fino a quando nell'Eocene non compaiono i depositi di ambra dell’Oligocene e del Miocene, che consentono di rilevare i generi moderni comuni (Heraty e Darling, 2009). I chalcidoidi sono per lo più parassitoidi, e dei loro gruppi di ospiti sono negli Hemiptera ed Holometabola tutti subendo una radiazione esplosiva durante lo stesso periodo, alla fine del Cretaceo, con un intervento di diversificazione di questi ospiti non inaspettata (Grimaldi e Engel, 2005). Utilizzando una serie di geni codificanti per proteine nucleari, ma con un numero minore di taxa, Desjardins et al . (2007) hanno trovato risultati simili che hanno mostrato una debole colonna portante delle relazioni tra loro gruppi di chalcidoidi campionati. Dato uno scenario di radiazione esplosiva dei Chalcidoidea durante un periodo di tempo relativamente breve, può essere difficile da individuare le relazioni di gruppo più alto con la fiducia di confidenza (Banks e Whitfield, 2006). Tuttavia, gli elementi dendrometrici che sono stati recuperati possono aiutare a valutare alcuni scenari in un contesto di gruppi che sono costantemente supportati e i loro rapporti sulle varie topologie dell’albero. Questi risultati molecolari forniscono un’unica prospettiva per l'esame delle relazioni ed ipotesi di evoluzione dei chalcidoidi, soprattutto in un gruppo incline alla convergenza morfologica. Bisogna chiedersi qual è il modo ancestrale di associazione degli ospiti per i Chalcidoidea. Bou ek (1988) ha proposto i Cleonyminae o qualche altro parassitoide di un insetto fitofago del legno per avere le forme più ancestrali, ipotizzando che i fitofagi potrebbero essere plesiomorfici per la superfamiglia. Quest'ultima ipotesi è basata sull’osservazione che le specie di fitofagi tendono ad essere primitive all'interno dei rispettivi gruppi. Il posizionamento dei Chalcidoidea come gruppo sorella ai Diaprioidea o ai Proctotrupoidea sensu stricto ed il posizionamento del gruppo sorella basale dei Mymaridae consente di argomentare contro l'ipotesi di Bou ek di un fitofago antenato. Inoltre, i gruppi fitofagi sono sparsi attraverso la struttura dendrologica e quasi mai basale all'interno di una particolare linea parentale, come nel caso di un Opheliminae formante galle derivato dall’interno degli Eulophidae o dei Megastigminae che si alimenta di semi, che sono lontanamente posizionati dal loro gruppo-sorella proposto, i Toryminae (figura 4). Noyes (1990) ha sostenuto un gruppo monofiletico dei Mymaridae + ( Rotoitidae + Tetracampidae ) come gruppo-sorella alla restante superfamiglia dei Chalcidoidea . I risultati supportano relativamente questa ipotesi, ponendo i Mymaridae ed i Rotoitidae alla base dell'albero dei chalcidoidi (figura 3A), ma con un diverso ordine filogenetico e con i Tetracampidae polifiletici e collocati più distalmente sulle varie topologie. L’evidenza morfologica sostiene un rapporto gruppo-sorella tra i Mymaridae e i restanti Chalcidoidea (Gibson, 1986; 1990; Heraty, Woolley e Darling, 1997). I risultati delle analisi più complete di Imenotteri (Heraty, Ronquist, Carpenter, Hawks, Schulmeister et al ., 2011; Sharkey, Carpenter, Vilhelmsen, Heraty, Dowling et al ., 2011) fortemente sostengono questa ipotesi. Analisi effettuate propongono i Rotoitidae come il gruppo sorella dei rimanenti Chalcidoidea dopo i Mymaridae .

29 I Mymaridae sono praticamente tutti i parassitoidi di uova, soprattutto di auchenorrinchi, eterotteri e coleotteri (Huber, 1986). La sola eccezione conosciuta riguarda due specie del genere Stethynium che attaccano larve di Ophelimus Haliday 1844 appartenente agli Eulophidae (Huber, Mendel, Protasov e LaSalle, 2006). Stethynium ophelimi è stato incluso nell’analisi e la sua collocazione derivata all'interno della famiglia suggerisce una derivazione secondaria di parassitismo larvale (figura. 3A). Il parassitismo delle uova dei fitofagi è probabilmente la caratteristica ancestrale dei Mymaridae . Per i rimanenti Chalcidoidea , il parassitismo delle uova si verifica per tutti i Ttrichogrammatidae e per pochi altri taxa diffusa (figura 4). Nessun risultato colloca questi chalcidoidi parassitoidi di uova vicino alla radice dei Chalcidoidea . La domanda che ci si pone è se sia possibile che il parassitoide di uova possa essere ancestrale per la superfamiglia. I Mymarommatoidea possono essere parassitoidi di uova di Psocoptera (Huber, Gibson, Bauer, Liu e Gates, 2008). Le piccole dimensioni del corpo dei Rotoitidae suggerisce che essi potrebbero essere anche parassitoidi di uova, ma non è noto nemmeno un ospite sospetto per questo gruppo (Gibson, Heraty e Woolley, 1999). Diaprioidea sono parassitoidi principalmente larvali di larve o pupe di mosca con pochi taxa iperparasiti sopra Dryinidae o Formicidae (Masner, 1995); nessuno è parassitoidi di uova. Anche se i Mymarommatoidea sono risolti come gruppo-sorella dei Chalcidoidea (solo in alcuni dei nostri risultati), la biologia di questi e dei Rotoitidae avrà bisogno di essere risolta prima di poter considerare con fiducia il parassitismo dell’uovo come un tratto basale per la superfamiglia. Associata ad un estrema diversità di uso dell’ospite, la morfologia larvale è estremamente varia nei Chalcidoidea (Parker, 1924)). Due tipi di sviluppo ipermetamorfico si verificano negli imenotteri (Pinto, 2003). Il tipo 2 prevede la deposizione a distanza dall’ospite di una larva planidiforme sclerotizzato di primo stadio che si trasforma successivamente in stadi di una tipica larva imenopteriforme a forma di sacco, debolmente sclerotizzata. All'interno degli imenotteri, questo si verifica solo in un genere di Ichneumonidae ( Euceros ), di Perilampidae (compresi i Philomidinae ) e di Eucharitidae (Darling, 1992). Anche se non accertato in tutte le analisi, i risultati offrono un supporto sufficiente per lo sviluppo di questo singolo tratto all'interno dei Chalcidoidea (fiura. 4). Un'altra caratteristica importante è l'uso di sternorinchi sessili come ospite all'interno dei Chalcidoidea , che alla fine porta alla loro importanza nei programmi di controllo biologico. La mappatura del parassitismo degli sternorinchi, sia come parassitoidi primari , sia come iperparasitoidi, nella migliore delle ipotesi mostra una generale dispersione nell’uso degli ospiti, che suggerisce più turni di accoglienza indipendenti a questo gruppo. Probabilmente più significativa è la mancanza di raggruppamento in qualsiasi analisi degli Encyrtidae e degli Aphelinidae , sottofamiglie Aphelininae , Azotinae , Coccophaginae , Eretmocerinae ed Euryischiinae , che nel passato sono stati trattati come una sola famiglia (Gordh, 1979). I risultati suggeriscono che alcuni caratteri associati con successo all’impiego degli ospiti degli sternorinchi sono indipendenti ed in particolare all'interno degli Aphelinidae , non deve essere considerata come legati filogeneticamente. Questo è anche importante quando si considera la sola origine eteronoma, o l'uso di un ospite alternativo per sesso diverso, che si verifica solo nei Coccophaginae monofiletici (figura 4). I risultati rappresentano le molte analisi filogenetiche più complete delle relazioni dei Chalcidoidea basate solo sui dati molecolari. La monofilia di molti gruppi tradizionali è supportata, e l’allineamento della struttura secondaria e del set dei dati saranno utili per gli studi futuri. Molti cambiamenti alla classificazione più alta di taxa all'interno dei Chalcidoidea sono suggeriti da questi risultati. Tuttavia, qualsiasi giudizio su queste modifiche, fino alla sicurezza dei risultati delle analisi morfologiche e molecolari combinate è considerato riservato.

30 Tabella 4 - Relazioni di gruppo superiore sostenute attraverso varie analisi.

Segue la figura 3 (distinta in 7 parti) che rappresenta l’albero filogenetico ottenuto dall’allineamento della struttura secondaria dei dati e l'allineamento E-INS-i di RAA (3917 allineato; SSME). Le parti della figura 3 sono indicate con le lettere dell’alfabeto: A. che include i Ceraphronoidea , Platygastroidea , Cynipoidea , Proctotrupoidea , Diaprioidea , Mymarommatoidea , Mymaridae , Rotoitidae , Neanastatinae , Azotinae , Trichogrammatidae . B. Trichogrammatidae , Diparinae , Tanaostigmatidae , Chalcidinae , Epichrysomallinae , Eurytominae , Signiphoridae , Epitraninae , Cleonyminae : Cleonymini , Tetracampinae . C. Haltichellinae , Chalcidinae : Chalcidini ; Encyrtidae : Tetracneminae (ENT) e Ecyrtinae (ENE); Ormyridae , Diparinae , Cleonyminae : Lyciscini ; Eretmocerinae , Megastigminae , Tetracampidae , Eunotinae , Eupelminae , Aphelininae . D. Ceinae , Eupelminae , Sycophaginae , Eulophidae , complesso dei pteromaloidi: Cratominae (PT08), Myscogastrinae (PT16), Otitesellinae (PT18), Panstenoninae (PT19), Pteromalinae (PT21), Sycoecinae (PT23), Sycoryctinae (PT25); Calosotinae , Leptofoeninae e Smicromorphinae , Dirhininae . E. Gollumiellinae , Eucharitidae , Oraseminae , Eucharitinae , Calosotinae , Toryminae : Monodontomerini (TOTN), Palachini (TOTP), Torymoidini (TOTY), incerta sedis (TOTI). F. Toryminae : Microdontomerini (TOTM), Palachini (TOTP), Padagrionini (TOTO), Torymini (TOTT), Torymoidini (TOTY), incerta sedis (TOTI); Coccophaginae , Leucoaspidae , Heimbrinae , Eupelminae , Chalcidinae , Calesinae , Rileynae , Spalangiinae . G. Tetrapusinae , Blastophaginae , Kradibinae , Agaoninae , Blastophaginae , Agoninae , Agaonidae .

31 Figura 3 - Albero filogenetico ottenuto dall’allineamento della struttura secondaria dei dati e l'allineamento E-INS-i di RAA (3917 allineato; SSME).

Figura 3A - Ceraphronoidea , Platygastroidea , Cynipoidea , Proctotrupoidea , Diaprioidea , Mymarommatoidea , Mymaridae , Rotoitidae , Neanastatinae , Azotinae , Trichogrammatidae .

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Figura 3B – Trichogrammatidae , Diparinae , Tanaostigmatidae , Chalcidinae , Epichrysomallinae , Eurytominae , Signiphoridae , Epitraninae , Cleonyminae : Cleonymini , Tetracampinae .

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Figura 3C - Haltichellinae , Chalcidinae : Chalcidini ; Encyrtidae : Tetracneminae (ENT) e Ecyrtinae (ENE); Ormyridae , Diparinae , Cleonyminae : Lyciscini ; Eretmocerinae , Megastigminae , Tetracampidae , Eunotinae , Eupelminae , Aphelininae .

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Figura 3D – Ceinae , Eupelminae , Sycophaginae , Eulophidae , complesso dei pteromaloidi: Cratominae (PT08), Myscogastrinae (PT16), Otitesellinae (PT18), Panstenoninae (PT19), Pteromalinae (PT21), Sycoecinae (PT23), Sycoryctinae (PT25); Calosotinae , Leptofoeninae e Smicromorphinae , Dirhininae .

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Figura 3E – Gollumiellinae , Eucharitidae , Oraseminae , Eucharitinae , Calosotinae , Toryminae : Monodontomerini (TOTN), Palachini (TOTP), Torymoidini (TOTY), incerta sedis (TOTI).

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Figura 3F – Toryminae : Microdontomerini (TOTM), Palachini (TOTP), Padagrionini (TOTO), Torymini (TOTT), Torymoidini (TOTY), incerta sedis (TOTI); Coccophaginae , Leucoaspidae , Heimbrinae , Eupelminae , Chalcidinae , Calesinae , Rileynae , Spalangiinae .

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Figura 3G – Inquadramento della famiglia Agaonidae nell’albero filogenetico e posizioni delle sottofamiglie: Tetrapusinae , Blastophaginae , Kradibinae , Agaoninae .

38 Tabella 5 – . Esempi di sostegno strutturale da due sezioni di 28S-D2 (indicata con barre) per outgroups ed un campionamento di Chalcidoidea . RAA (11) mostra un aumento del numero di nucleotidi ed una diminuzione del grado di conservazione per i Chalcidoidea , compreso i Mymaridae (evidenziati). In tutti i Chalcidoidea escluso i Mymaridae , RAA (15) subisce una drastica riduzione di 1 o nessun nucleotide e RAA (4) mostra un leggero aumento delle dimensioni. L'allineamento al confine intorno a RAA (15) dimostra l’esistenza di variazioni compensative nelle eliche 3m, 3n e 3o.

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Figura 4 – Cinque caratteri della storia vitale mappati su albero verosimile SSME. I quadrati colorati si riferiscono alla presenza di un carattere in un clade, ma non in un membro campionato nello studio.

40 Le analisi RAxML con semi di 38652 e 1000 rbs repliche di bootstrap (supporto> 50% sopra i rami). Filogramma dell'intero albero sulla sinistra colorato per abbinare il riquadro. I nomi dei taxa con il prefisso che indica la classificazione (tabella 1) e il suffisso che indica numero di voucher del DNA e delle regioni del gene inclusi per 18Sa-c (TUV) e D2 (x), D3 (y) e D4-5 (z). Famiglie monofiletiche indicate da ombreggiatura grigia; famiglie polifiletiche come diversi Pteromalidae sono indicati secondo la legenda del colore. Notizie storiche Le prime specie di Chalcididae sono state descritte da Fabricius a partire da individui raccolti in America e oltre 20 dei nomi di queste specie sono ora ancora validi. Nel XIX secolo i principali Autori sono F. Walker, ET Cresson e P. Cameron, a parte relativamente poche descrizioni di M. Spinola, T. Say, J.O. Westwood, B.D. Walsh, F.G. Sanborn, A. Costa, C.V. Riley ed altri. Nel XIX secolo molte specie americane sono state classificate in Chalcis Fabricius 1787 e Smiera Spinola 1811 (o Smicra Spinola, 1837); Chalcis successivamente contenente specie ora appartenenti al genere Brachymeria , quest'ultima con specie in seguito trasferite in gran parte a Spilochalcis ed attualmente a Conura Spinola.1837. Poche specie sono state collocate in Phasgonophora Westwood, Notaspidium Della Torre 1837 (ora Notaspis Walker 1834), Trigonura Sichel 1866, Haltichella Spinola 1811 (o Halticella Stephens 1829), dopo Kirby (1883) anche in Stypiura Kirby 1883 e molti altri, tra cui uno in Acanthochalcis Cameron 1884. Quando Thomson (1876) pubblicò la prima parte del suo 'Pteromalini' (= attualmente Chalcidoidea ) il suo lavoro della Scandinavia, anche se soprattutto in latino, fu presto riconosciuto come una pietra miliare nella ricerca dei calcidoidi, anche in America. Howard prima (1885a) ha fornito una chiave a tre generi, ma presto (1885b) ha esteso il numero a sette (8 con Podagrion Spinola 1811). Ha portato in uso il nome Spilochalcis Thomson 1875, come un genere separato da Smicra (= Chalcis ) e Chalcis (ora Brachymeria Westwood 1832), sebbene Walker nel 1871 e, nel 1872 Cresson, ancora hanno usato il termine Smicra per una miscela dei primi due generi. Questo sviluppo ha incoraggiato in particolare il collega di Howard WH Ashmead, per studiare con forza soprattutto gli imenotteri chalcidi americani, giungendo alla sua grande opera scientifica (1904a), sulla classificazione della superfamiglia, con brevi chiavi per l’identificazione di tutti i generi del mondo. Il suo lavoro è stato poi presto ripubblicato in tedesco da Schmiedeknecht (1909), con poche modifiche tassonomiche. La Classificazione di Ashmead (1904a) ha incoraggiato alcuni nuovi studenti in molti Paesi, ma presto ha anche portato a qualche delusione (ad esempio Girault, in Bou ek, 1988) quando molte lacune inevitabili in un lavoro così grandioso divennero evidenti. Ashmead introdusse almeno 16 nuovi nomi generici dei quali oggi solo due rimangono validi, Melanosmicra Ashmead 1904 e Schwarzella Ashmead 1904; gli altri sono per lo più sinonimi di Conura Spinola 1837, diversi nomi di Kirby sono anche i sinonimi. Il periodo post-Ashmeadian, in realtà la maggior parte del secolo XX, ha portato ottimi studi sul genere Brachymeria del Nord America, prima da Crawford (1910b, sotto Chalcis ), poi di Brachymeria e Trigonura e di Chalcidini e poi da Burks (1936b, 1940, 1959, 1960b ) e di Stypiura e Parastypiura da Steffan (1973), poi importanti cataloghi delle specie neartiche (Peck, 1951, 1973, Burks, 1979), e delle specie neotropicali (De Santis, 1967, 1979, 1980 e 1981), ma altrimenti solo piccoli contributi tassonomici o biologici. La classificazione supragenerica non è cambiata molto da quando Ashmead, ad eccezione per i gruppi maggiori ha cambiato nome. Più di recente l'ex sottofamiglia Brachymeriinae Mani 1938 fu declassata da Boutek (1988a) ad una tribù di Chalcidinae . Il New World Chalcididae , rispetto a quello palaeotropicale, sembra essere più povera di generi ma alcuni di essi mostrano una maggiore plasticità nelle specie. Questo è vero soprattutto per Conura , Brachymeria e Notaspidium . Brachymeria ha molte decine di specie anche nel Vecchio Continente, ma in America la varietà di forme intragenerica è numericamente molto più elevato. Conura e Notaspidium sono rappresentati solo da poche specie nell'emisfero orientale, ma per moltissime specie nelle Americhe, in particolare Conura , che sembra avere centinaia di specie. Questo spettro sembra suggerire che l'origine della famiglia potrebbe essere nel Vecchio Mondo, da dove solo

41 poche forme, in qualche modo, hanno raggiunto l'emisfero occidentale, probabilmente in diverse occasioni ed alcune di loro sono esplose in un enorme numero di specie, non trovando una significativa competizione nell’ambito del gran numero di nicchie ecologiche disponibili. Bou ek Z, Delvare G (1992) hanno ritenuto opportuno rivedere brevemente alcune conoscenze delle specie in ogni genere della superfamiglia dei Chalcidoidea e di commentare le forme eccezionali incontrate. In alcuni casi hanno ritenuto che solo le descrizioni di alcune specie accompagnate con disegni sarebbe stato utile ad illustrare la gamma di varietà. Anche durante lo studio sono state scoperte una serie di nuove sinonimie ed opportunità. Gli stessi Autori hanno costruito una chiave analitica il cui lato pratico è dato dalla preferenza nella scelta dei caratteri su caratteristiche che devono riflettere i valori filogenetici che, tuttavia, non sono facili da vedere o da valutare I Calcidoidi e la lotta biologica I Calcidoidi sono tra gli insetti maggiormente utilizzati per il controllo biologico di organismi dannosi. Oltre 800 singole specie sono state impiegate ed associate in programmi di controllo biologico. Le specie impiegate rientrano per lo più nelle famiglie degli Aphelinidae e degli Encyrtidae . Tra gli Aphelinidae il genere Encarsia Foerster 1878 è tra i parassitoidi maggiormente utilizzati. Molte specie si sono dimostrate utilissime nel controllo biologico di Aleyrodidae (mosche bianche) e Diaspididae (cocciniglie): l’Encarsia formosa Gahan 1924 per il controllo della mosca bianca delle serre ( Trialeurodes vaporariorum Westwood 1840), l' Encarsia perplexa Huang e Polaszek 1998 nel controllo dell'Aleurocanthus woglumi Ashby 1915 nel sud degli USA e nei Caraibi, l' Encarsia smithi Silvestri 1926 nel controllo dell' Aleurocanthus spiniferus Quaintance 1903 e l' Encarsia inaron Walker 1839 contro alcuni fitofagi delle querce in California. L'esempio più conosciuto di specie appartenenti al genere Encarsia è tuttavia Encarsia formosa , forse il parassitoide più utilizzato per il controllo biologico in tutto il Mondo. Ha trovato ampio spazio nel controllo dell'Aleurodide delle serre ed è divenuto largamente reperibile anche in commercio. Altri esempi da ricordare sono l' Encarsia berlesei Howard 1906, utilizzata per controllare la cocciniglia bianca del pesco e l' Encarsia perniciosi Tower 1913, contro la cocciniglia di San José. Tra gli Aphelinidae sono stati largamente utilizzati anche esemplari dei generi Eretmocerus Haldeman 1850 e Aphytis Howard 1900, questi ultimi specialmente per il controllo dei Diaspididae . Le specie della famiglia Encyrtidae hanno rappresentato egualmente una risorsa molto importante nei programmi di controllo biologico, specialmente nelle regioni dai climi più caldi dove sono in grado di adattarsi meglio rispetto agli Aphelinidae . Gli interventi di maggior successo si sono ottenuti nella lotta ai danni provocati dalle cocciniglie, tra cui il più recente e fruttuoso esempio è quello dell' Anagyrus lopezi De Santis 1964 del Sud America per il controllo del Phenacoccus manihoti Matile-Ferrero 1977. Questa cocciniglia fu scoperta per la prima volta in Congo nel 1973 e nella metà degli anni ottanta è arrivata a coprire quasi l'intera Africa subsahariana minacciando di distruggere la principale fonte di carboidrati di oltre ducecentomila persone. L' Anagyrus lopezi fu rilasciato in Nigeria tra i primi anni del 1980 e la fine del 1990 arrivando a controllare completamente l'espansione smisurata del Phenacoccus manihoti . Il costo totale di questo programma, dal 1988, è arrivato a toccare i 15.000 dollari ma le stime compensano la spesa, valutando un risparmio di più di 250.000 dollari l'anno per i danni evitati alle colture. Un altro programma di controllo biologico che ha dato grandi risultati ma meno conosciuto è quello dei primi degli anni ottanta che ha previsto l'utilizzo del Neodusmetia sangwani Subba Rao 1957, per il controllo dell' Antonina graminis Maskell 1897, nel sud degli Stati Uniti. Con una spesa iniziale di non più 0,2 mila dollari si stima d'aver evitato circa duececentomila dollari annui di danni che avrebbero colpito la foraggicoltura e la zootecnica del Texas. L 'Antonina graminis è oggi sotto controllo dal Texas alla Florida al sud del Brasile, sin oltre i confini del Nuovo Mondo. Tra le specie parassitoidi maggiormente utilizzate in Europa è da ricordare il Psyllaephagus pilosus Noyes 1988, liberato dal 1993 in Irlanda, Galles e Francia per il controllo della psilla

42 dell'eucalyptus. Il programma ha dato ottimi risultati tant'è che il Psyllaephagus pilosus è stato di recente introdotto (probabilmente accidentalmente) anche in alcune regioni del Sud America, comprese Perù e Argentina. Nel controllo dei parassiti vegetali sono stati introdotti alcuni calcidoidi fitofagi, come lo Pteromalide Trichilogaster acaciaelongifoliae Froggatt 1892. Questa specie australiana è stata introdotta nel sud dell'Africa nel 1982 per il controllo dell' Acacia longifolia , offrendo anche in questo caso risultati soddisfacenti. Nonostante l'impiego come parassitoidi consideri questa superfamiglia fra gli insetti utili, più di 80 specie sono maggiormente conosciute per la loro azione nociva nei confronti dei prodotti agricoli. La maggior parte di questi esemplari appartiene alla famiglia degli Eurytomidae e dei Torymidae . Tra i primi i generi maggiormente conosciuti sono forse fitofagi del genere Bruchophagus Ashmead 1888, che attaccano spesso semi di diverse leguminose, come l'erba medica ( Medicago sativa ); ed i Systole Walker 1832, fitofagi di varie Apiaceae utilizzate come spezie (come il coriandolo, Coriandrum sativum ). Conclusioni La superfamiglia Chalcidoidea è un raggruppamento così vasto per numero e distribuzione geografica e sul quale sono stati avanzati pochi studi, per cui la lotro sistematica risulta tutt'oggi in via di sviluppo, cosicché la posizione di molte specie è ambigua ed oggetto di nuove proposte sistematiche. A complicare gli studi si riscontra in alcuni calcidoidi una propensione all'ibridazione tra specie. In particolare in Aphelinidae e Trichogrammatidae si riscontra la nascita di piccole comunità ibride denominate specie criptiche, irriconoscibili data la fusione degli elementi distintivi delle specie di partenza e spesso anche sessualmente fertili. Alcuni hanno avanzato la creazione di un nuovo taxon per classificare queste "morfo-specie", definite anche come specie fratello, semi-specie, razza, stirpe o biotipo. La scarsa osservazione di questa superfamiglia ha reso inoltre impossibile delineare delle caratteristiche riconoscitive importanti. D'altronde si osserva che una stessa progenie non conserva costanti le proprie caratteristiche, probabilmente perché la morfologia viene influenzata dall'ospite. Ad esempio sì è riscontrato che lo sviluppo in ospiti dalle dimensioni esigue causa la formazione di ocelli più ravvicinati, ovopositori più corti ed altri caratteri differenziati. Inoltre, un relativo dimorfismo stagionale (specialmente nei Torymidae ed Eulophidae ) basato sulle condizioni atmosferiche e sulla temperatura può condizionare, ad esempio, una colorazione più scura o più brillante o una variazione della lunghezza alare.

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