فیلوژنی مولکولی Vetigastropoda براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S Rrna
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
Archive of SID فصلنامه علمی پژوهشی محیط زیست جانوری سال دهم، شماره 2، تابستان 1397 فیلوژنی مولکولی Vetigastropoda براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA منا ایزدیان*: گروه تنوع زیستی و ایمنی زیستی، پژوهشکده محیطزیست و توسعه پایدار، سازمان حفاظت محیطزیست حسین ذوالقرنین: گروه بیولوژی دریا، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر سیدمحمدباقر نبوی: گروه بیولوژی دریا، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر آریا اشجعاردﻻن: گروه زیستشناسی دریا، دانشکده علوم و فنون دریایی، دانشگاه دانشگاه آزاد اسﻻمی واحد تهران شمال، صندوق پستی: -181 19735 سیامک یوسفیسیاهکلرودی: گروه زیستشناسی، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین- پیشوا، دانشگاه آزاد اسﻻمی ورامین، ایران تاریخ دریافت: خرداد 1396 تاریخ پذیرش: شهریور 1396 چکیده در این پژوهش روابط فیلوژنی بین گونههای کﻻد Vetigastropoda در آبهای ساحلی خلیج فارس مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور از ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA استفاده شد. نمونهبرداری در سالهای 1392 و 1393 در سواحل صخرهای شمال خلیج فارس انجام گرفت و نمونهها مورد شناسایی مورفولوژیک قرار گرفتند. سپس مراحل استخراج DNA، تکثیر قطعه ژنی زیر واحد I سیتوکروم اکسیداز )COI( و 16S rRNA و توالییابی انجام شد. در مجموع تعداد 9 توالی COI و 5 توالی 16S rRNA متعلق به 5 گونه از این کﻻد بهدست آمد که این توالیها برای اولین بار از منطقه شمالی خلیجفارس گزارش شده است. آنالیزهای فیلوژنی با استفاده از نرمافزارهای PAUP ،MEGA6 و BEAST و با رسم درختهای فیلوژنی Maximum Parsimony ،Maximum Likelihood و Bayesian صورت گرفت. نتایج نشان داد کﻻد Vetigastropoda که از نظر ردهبندی سنتی خانوادههای Turbinidae ،Chilodontidae ،Trochidae و Fissurellidae از این مطالعه را، شامل میشود، مونوفیلتیک نمیباشد. به این ترتیب که گونههای متعلق به خانوادههای Trochidae و Chilodontidae در یک کﻻد مجزا از گونههای متعلق به دو خانواده Turbinidae و Fissurellidae قرار گرفتند. این مطلب نشان دهنده رابطه غیرخواهری میان این دو گروه بوده که بیانگر تفاوت بین دیدگاه ردهبندی سنتی و ردهبندی مولکولی است. S rRNA COI Vetigastropoda کلمات کلیدی: ، ، 16، فیلوژنی، سواحل صخرهای، خلیجفارس 251 * پست الکترونیکی نویسنده مسئول: [email protected] www.SID.ir Archive of SID ایزدیان و همکاران فیلوژنی مولکولی Vetigastropoda براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA استفاده نمود. بیش از 70 گونه Vetigastropod متعلق به 13 خانواده و 25 مقدمه زیرخانواده، یک کﻻد عظیم تشکیل دادند که در مقابل آنها دو کﻻد تعیین روابط بین گونهای از زمان لینه با مقایسه ویژگیهای برون گونه Neomphalina و Cocculinoidea قرار داشتند. خانواده مورفولوژیک صورت میگرفته است. اگرچه تاکسونومی همچنان بر پایه Seguenziidae - که از نظر فیلوژنتیکی بسیار بحث برانگیز است، به ویژگیهایمورفولوژیکبناشدهاست،امااطﻻعاتروبهگسترشمولکولی عنوان یک کﻻد مشتق شده از Vetigastropoda ظاهر شد و بههمراه مانند توالییابی نوکلئوتیدی به آشکار کردن روابط فیلوژنی میپردازد. Ventsia ،Adeuomphalus و Xyloskenea از Trochidها، یک کﻻد در بین زیستشناسان استفاده از دادههای مولکولی جهت ترسیم حمایت شده را تشکیل دادند. Layton و همکاران )2014( با جمع- درختهای فیلوژنی اهمیت قابل توجهی پیدا کرده است و مقایسه آوری 2471 نرمتن دریایی کانادا و با استفاده از DNA بارکدینگ، نشانگرهای مولکولی در بین جانداران گوناگون میتواند رابطه فیلوژنی مطالعاتی بر روی الگویهای مختلف ژنتیکی 227 گونه انجام دادند. Lemey )اجدادی( آنها را آشکار کند ) و همکاران، 2009(. از آنجایی آنها نشان دادند که استفاده از توالی COI ابزاری مفید، برای شناسایی که چنین دادههایی )در مقایسه با دادههایی مانند دادههای ریختشناسی( نرمتنان کانادا و نیز برای آشکارکردن چشماندازی بر موقعیتهای کمتر تحت تأثیر نتایج انتخاب قرار میگیرند، بهتر میتوانند روابط احتمالی گونههای مختلف است. واگرایی عمیق درونگونهای در برخی Maddison فیلوژنتیکی واقعی را بازتاب دهند ) ، 1997(. در بین 13 گونهها، جدایی جغرافیایی را بین اجداد آنها در سواحل اقیانوسهای ژنکدکنندهپروتئین در ژنوممیتوکندریایی،زیرواحدیکژن سیتوکروم اطلس، منجمد شمالی و آرام نشان داد که میتواند بهعلت عصر یخبندان اکسیداز محبوبیت ویژهای برای برآورد روابط میان تاکسونهای نزدیک در پلیستوسن در بخشی از جمعیت آنها رخ داده باشد. در این مطالعه COI بههمیافته است. با وجود کاربرد وسیع در تعیین قرابت در سطوح سعی شد تا حد امکان از توالییابی ژن 16S rRNA جهت حصول پایین تاکسونومیک، تا حدی برای تعیین روابط عمیقتر فیلوژنتیک اطمینان بیشتر بهره برده شود. این مطالعه همچنین رابطه بین نیز از آن بهره برده شده است. عﻻوه بر اثبات مفید بودن استفاده از محتوی GC و واگرایی توالی را بین گونههای متجانس مشخص کرد. این ژن در مطالعه نرمتنان گوناگون، دﻻیلی بر قابلیت توالی COI در دریافت واگراییهای عمیقتر نیز مشاهده شده است )Elpidio و Hebert، 2003(. با وجود این تقریباً در تمامی مطالعات فیلوژنی همواره از مواد و روشها توالییابی و بررسی ژن دیگری در کنار COI استفاده میشود تا نتایج نمونهبرداری: طی سالهای 92 و 93 نمونهبرداری از بسترهای حاصل محکمتر و قابل استناد باشد. در بسیاری از این مطالعات این صخرهای سواحل شمالی خلیجفارس در زمان حداکثر جزر انجام گرفت. ژن جانبی Mitochondrial 16S ribosomal RNA( mt16S rRNA( مشخصات ایستگاههای نمونهبرداری در جدول 1 آورده شده است. میباشد )Quintero-Galvis و Castro، 2013؛ Strong و Bouchet، نمونهها در اتانول 98 درصد فیکس شد و به آزمایشگاه انتقال یافتند. 2013؛ Frey و Vermeij، 2008؛ Donald و همکاران، 2005؛ Collin، موقعیت ایستگاههای نمونهبرداری در شکل 1 نشان داده شده است. 2003؛ Medina و همکاران، Donald .)1999 و همکاران )2005( بر شناسایی مورفولوژیک: جهت شناسایی مورفولوژیک نمونهها از روی کﻻدوژنز برخی از گونههای خانواده Trochidae در نتیجه حوادث کلیدهای شناسایی شامل: Bosch( Sea Shells of Eastern Arabia و جغرافیایی در جنوب اقیانوس آرام مطالعاتی انجام دادند. آنها در این همکاران، Jones( Sea Shore of Kuwait Persian Gulf ،)1995، 1986(، مطالعه از دو قطعه ژنی میتوکندریایی COI و 16S و یک ژن هستهای Robin( Encyclopedia of Marine Gastropods، 2008( و اطلس actin برای تخمین فیلوژنی برخی از اعضای جنسهای Diloma، نرمتنان خلیج فارس )حسینزادهصحافی و همکاران، 1379( استفاده شد. Melagraphia و Austrocochlea استفاده کردند. مطالعات فیلوژنی مطالعات مولکولی: پس از شناسایی مورفولوژیک نمونهها، آنها نشان دادکه با وجود حوادث جغرافیایی غیرمحتمل در این استخراج DNA از دو نمونه از هر گونه شناسایی شده، انجام شد. منطقه، در طول تاریخ تکامل این گروه در چندین موقعیت انتشار بالغین استخراج DNA با استفاده از پودر Chelex و پروتئیناز K صورت توسط جریانات اقیانوسی رخ داده که منتج به پراکنش وسیع امروزی گرفت. تکثیر قطعه ژنی COI و 16S rRNA پس از ارزیابی کمی و کیفی آنها گشته است. Kano )2008( فیلوژنی Vetigastropod را با استفاده DNA استخراج شده بهوسیله الکتروفورز و اسپکتروفوتومتر، انجام از روش BI وML بررسی نمود. او در این مطالعه با تکیه بر نمونه- گرفت. پرایمر مورد استفاده در تکثیر قطعه ژنی COI، پرایمر جهانی برداری وسیع تاکسونومیک، از آنالیزهای مجزا و ترکیبی یک ژن Folmer )1994( و پرایمر مورد استفاده جهت تکثیر ژن 16S rRNA میتوکندریایی COI و دو ژن هستهای هیستون H3 و 18S rRNA پرایمر Palumbi )1991( بود که مشخصات آنها در جدول 2 آمده است. 252 www.SID.ir Archive of SID فصلنامه علمی پژوهشی محیط زیست جانوری سال دهم، شماره 2، تابستان 1397 جدول 1: نام و مشخصات ایستگاههای نمونهبرداری جهت تهیه محلول PCR، از یک میکرولیتر )10 نانوگرم( DNA نام طول عرض استخراجی، یک میکرولیتر از هر یک از پرایمرها )10 پیکومول(، 0/5 ردیف شهر استان ایستگاه جغرافیایی جغرافیایی میکرولیتر dNTP )10 میلیموﻻر(، 3/0 میکرولیتر آنزیم Taq پلیمراز ° ʹ ʺ ° ʹ ʺ 1 نیروهوایی بوشهر بوشهر 5u/μ( 93 28 55 80 50 66(، 5/2 میکرولیتر بافر )PCR )10X و یک میکرولیتر MgCl2 2 اسکلهجفره بوشهر بوشهر ʺ44ʹ82°50 ʺ37ʹ97°28 3 تیو بوشهر بوشهر ʺ58ʹ50°82 ʺ13ʹ28°98 )50 میلیموﻻر( استفاده شد که در نهایت حجم آن با آب مقطر به Møller McPherson 4 بندررستمی تنگستان بوشهر ʺ81ʹ00°51 ʺ66ʹ28°56 25میکرولیتررساندهشد) و ، 2006(.برنامه تکثیر 5 اولیجنوبی دیر بوشهر ʺ14ʹ51°90 ʺ33ʹ27°83 قطعات ژنی در جدول 3 آمده است. در مواردی که نمونهها از کیفیت ° ʹ ʺ ° ʹ ʺ 6 نایبند عسلویه بوشهر 41 52 67 02 27 42 مناسبی برخوردار نبودند، از روش و مواد دیگری در واکنش زنجیرهای 7 بستانه بندر لنگه هرمزگان ʺ38ʹ99°52 ʺ41ʹ12°27 BSA ساحل پلیمراز استفادهشد. بهطور مثال از ، که در تکثیر ژنهای نرمتنان 8 قشم هرمزگان ʺ37ʹ16°56 ʺ12ʹ54°26 سیمرغ کاربرد دارد، برای رفع عمل محدودکنندهها استفاده شد. محصول PCR 9 قشم قشم هرمزگان ʺ98ʹ56°26 ʺ46ʹ26°93 مورد خالصسازی قرار گرفت و جهت توالی یابی ارسال شد. ثبت توالیها در پایگاه دادهها: به این منظور ابتدا توالیها در سایت Basic Local Alignment Search Tool( BLAST ،NCBI( شد و با توجه بهمیزان فاصله ژنتیکی از توالیهای نزدیک به آنها و همچنین رسم درخت در این سایت، اقدام به ثبت نمونهها گردید. در ابتدا قالب خواندن )Fram( توالیهای بهدست آمده، توسط نرمافزار CLC Sequence )www.clcbio.com Knudsen Viewer v6.5.4 ) و همکاران، 2012( ) تعیین شد. سپس از طریق سایت DDBJ توالیها در پایگاه داده NCBI ثبت گردید. در مجموع 9 توالی COI و 5 توالی 16S خوانا و قابل تحلیل بهدست آمد که این توالیها برای نخستین بار از منطقه خلیج فارس گزارش شده است. مراحل ثبت توالیهای COI در بانک ژن جهانی به پایان رسیده که شماره دسترسی )Accession number( آنها در سایت www.ncbi.nih.gov در جدول 4 قابل مشاهده است. شکل 1: موقعیت ایستگاههای نمونهبرداری جدول 2: نام و توالی پرایمرهای مورد استفاده (Nucleotide Sequence (5’ to 3’) Primer Name (F/R منابع TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCAACAAATCATAAAGATATTGG LCO1490_t1 Folmer CAGGAAACAGCTATGACTAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA HCO2198_t1 ) ، 1994( CGCCTGTTTAACAAAAACAT 16Sar )1991 Palumbi CCGGTCTGAACTCAGATCACGT 16Sbr ) ، جدول 3: برنامه دمایی زنجیرهای واکنشهای پلیمراز بهکار رفته در تکثیر قطعات ژنی مراحل درجه حرارت C° زمان تعداد چرخه )سیکل( واسرشتهسازی اولیه 94 2 دقیقه 1 واسرشتهسازی )Denaturation( 94 30 ثانیه اتصال )Annealing( 45 30 ثانیه 40 بسط )Extention( 72 1 دقیقه بسط نهایی 72 4 دقیقه 1 253 www.SID.ir Archive of SID ایزدیان و همکاران فیلوژنی مولکولی Vetigastropoda براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA جدول 4: شماره دسترسی توالیهای ثبت شده در NCBI بوت استرپ بررسی شدند. آنالیز ML برای توالیهای بهدست آمده با ردیف ژن اسم ثبت شده Accession Number استفاده از نرمافزار Tamura( MEGA6 و همکاران، 2011( و تکرار AB976640.1 Diodora sp.