Archive of SID

فصلنامه علمی پژوهشی محیط زیست جانوری سال دهم، شماره 2، تابستان 1397

فیلوژنی مولکولی براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA

 منا ایزدیان*: گروه تنوع زیستی و ایمنی زیستی، پژوهشکده محیطزیست و توسعه پایدار، سازمان حفاظت محیطزیست  حسین ذوالقرنین: گروه بیولوژی دریا، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر  سیدمحمدباقر نبوی: گروه بیولوژی دریا، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر  آریا اشجعاردالن: گروه زیستشناسی دریا، دانشکده علوم و فنون دریایی، دانشگاه دانشگاه آزاد اسالمی واحد تهران شمال، صندوق پستی: -181 19735  سیامک یوسفیسیاهکلرودی: گروه زیستشناسی، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین- پیشوا، دانشگاه آزاد اسالمی ورامین، ایران

تاریخ دریافت: خرداد 1396 تاریخ پذیرش: شهریور 1396

چکیده در این پژوهش روابط فیلوژنی بین گونههای کالد Vetigastropoda در آبهای ساحلی خلیج فارس مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور از ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA استفاده شد. نمونهبرداری در سالهای 1392 و 1393 در سواحل صخرهای شمال خلیج فارس انجام گرفت و نمونهها مورد شناسایی مورفولوژیک قرار گرفتند. سپس مراحل استخراج DNA، تکثیر قطعه ژنی زیر واحد I سیتوکروم اکسیداز )COI( و 16S rRNA و توالییابی انجام شد. در مجموع تعداد 9 توالی COI و 5 توالی 16S rRNA متعلق به 5 گونه از این کالد

بهدست آمد که این توالیها برای اولین بار از منطقه شمالی خلیجفارس گزارش شده است. آنالیزهای فیلوژنی با استفاده از نرمافزارهای PAUP ،MEGA6 و BEAST و با رسم درختهای فیلوژنی Maximum Parsimony ،Maximum Likelihood و Bayesian صورت گرفت. نتایج نشان داد کالد Vetigastropoda که از نظر ردهبندی سنتی خانوادههای ،Chilodontidae ، و Fissurellidae از این مطالعه را، شامل میشود، مونوفیلتیک نمیباشد. به این ترتیب که گونههای متعلق به خانوادههای Trochidae و Chilodontidae در یک کالد مجزا از گونههای متعلق به دو خانواده Turbinidae و Fissurellidae قرار گرفتند. این مطلب نشان دهنده رابطه غیرخواهری میان این دو گروه بوده که بیانگر تفاوت بین دیدگاه ردهبندی سنتی و ردهبندی مولکولی است. S rRNA COI Vetigastropoda کلمات کلیدی: ، ، 16، فیلوژنی، سواحل صخرهای، خلیجفارس 251 * پست الکترونیکی نویسنده مسئول: [email protected]

www.SID.ir

Archive of SID

ایزدیان و همکاران فیلوژنی مولکولی Vetigastropoda براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA

استفاده نمود. بیش از 70 گونه Vetigastropod متعلق به 13 خانواده و 25

مقدمه زیرخانواده، یک کالد عظیم تشکیل دادند که در مقابل آنها دو کالد تعیین روابط بین گونهای از زمان لینه با مقایسه ویژگیهای برون گونه Neomphalina و Cocculinoidea قرار داشتند. خانواده مورفولوژیک صورت میگرفته است. اگرچه تاکسونومی همچنان بر پایه Seguenziidae که از نظر فیلوژنتیکی بسیار بحث برانگیز است، به-

ویژگیهایمورفولوژیکبناشدهاست،امااطالعاتروبهگسترشمولکولی عنوان یک کالد مشتق شده از Vetigastropoda ظاهر شد و بههمراه

مانند توالییابی نوکلئوتیدی به آشکار کردن روابط فیلوژنی میپردازد. Ventsia ،Adeuomphalus و Xyloskenea از Trochidها، یک کالد

در بین زیستشناسان استفاده از دادههای مولکولی جهت ترسیم حمایت شده را تشکیل دادند. Layton و همکاران )2014( با جمع-

درختهای فیلوژنی اهمیت قابل توجهی پیدا کرده است و مقایسه آوری 2471 نرمتن دریایی کانادا و با استفاده از DNA بارکدینگ، نشانگرهای مولکولی در بین جانداران گوناگون میتواند رابطه فیلوژنی مطالعاتی بر روی الگویهای مختلف ژنتیکی 227 گونه انجام دادند. Lemey )اجدادی( آنها را آشکار کند ) و همکاران، 2009(. از آنجایی آنها نشان دادند که استفاده از توالی COI ابزاری مفید، برای شناسایی که چنین دادههایی )در مقایسه با دادههایی مانند دادههای ریختشناسی( نرمتنان کانادا و نیز برای آشکارکردن چشماندازی بر موقعیتهای کمتر تحت تأثیر نتایج انتخاب قرار میگیرند، بهتر میتوانند روابط احتمالی گونههای مختلف است. واگرایی عمیق درونگونهای در برخی Maddison فیلوژنتیکی واقعی را بازتاب دهند ) ، 1997(. در بین 13 گونهها، جدایی جغرافیایی را بین اجداد آنها در سواحل اقیانوسهای

ژنکدکنندهپروتئین در ژنوممیتوکندریایی،زیرواحدیکژن سیتوکروم اطلس، منجمد شمالی و آرام نشان داد که میتواند بهعلت عصر یخبندان اکسیداز محبوبیت ویژهای برای برآورد روابط میان تاکسونهای نزدیک در پلیستوسن در بخشی از جمعیت آنها رخ داده باشد. در این مطالعه

COI بههمیافته است. با وجود کاربرد وسیع در تعیین قرابت در سطوح سعی شد تا حد امکان از توالییابی ژن 16S rRNA جهت حصول پایین تاکسونومیک، تا حدی برای تعیین روابط عمیقتر فیلوژنتیک اطمینان بیشتر بهره برده شود. این مطالعه همچنین رابطه بین نیز از آن بهره برده شده است. عالوه بر اثبات مفید بودن استفاده از محتوی GC و واگرایی توالی را بین گونههای متجانس مشخص کرد. این ژن در مطالعه نرمتنان گوناگون، دالیلی بر قابلیت توالی COI در

دریافت واگراییهای عمیقتر نیز مشاهده شده است )Elpidio و Hebert،

2003(. با وجود این تقریباً در تمامی مطالعات فیلوژنی همواره از مواد و روشها توالییابی و بررسی ژن دیگری در کنار COI استفاده میشود تا نتایج نمونهبرداری: طی سالهای 92 و 93 نمونهبرداری از بسترهای حاصل محکمتر و قابل استناد باشد. در بسیاری از این مطالعات این صخرهای سواحل شمالی خلیجفارس در زمان حداکثر جزر انجام گرفت.

ژن جانبی Mitochondrial 16S ribosomal RNA( mt16S rRNA( مشخصات ایستگاههای نمونهبرداری در جدول 1 آورده شده است.

میباشد )Quintero-Galvis و Castro، 2013؛ Strong و Bouchet، نمونهها در اتانول 98 درصد فیکس شد و به آزمایشگاه انتقال یافتند. 2013؛ Frey و Vermeij، 2008؛ Donald و همکاران، 2005؛ Collin، موقعیت ایستگاههای نمونهبرداری در شکل 1 نشان داده شده است. 2003؛ Medina و همکاران، Donald .)1999 و همکاران )2005( بر شناسایی مورفولوژیک: جهت شناسایی مورفولوژیک نمونهها از روی کالدوژنز برخی از گونههای خانواده Trochidae در نتیجه حوادث کلیدهای شناسایی شامل: Bosch( Sea Shells of Eastern Arabia و جغرافیایی در جنوب اقیانوس آرام مطالعاتی انجام دادند. آنها در این همکاران، Jones( Sea Shore of Kuwait Persian Gulf ،)1995، 1986(، مطالعه از دو قطعه ژنی میتوکندریایی COI و 16S و یک ژن هستهای Robin( Encyclopedia of Marine Gastropods، 2008( و اطلس actin برای تخمین فیلوژنی برخی از اعضای جنسهای Diloma، نرمتنان خلیج فارس )حسینزادهصحافی و همکاران، 1379( استفاده شد.

Melagraphia و Austrocochlea استفاده کردند. مطالعات فیلوژنی مطالعات مولکولی: پس از شناسایی مورفولوژیک نمونهها، آنها نشان دادکه با وجود حوادث جغرافیایی غیرمحتمل در این استخراج DNA از دو نمونه از هر گونه شناسایی شده، انجام شد.

منطقه، در طول تاریخ تکامل این گروه در چندین موقعیت انتشار بالغین استخراج DNA با استفاده از پودر Chelex و پروتئیناز K صورت

توسط جریانات اقیانوسی رخ داده که منتج به پراکنش وسیع امروزی گرفت. تکثیر قطعه ژنی COI و 16S rRNA پس از ارزیابی کمی و کیفی

آنها گشته است. Kano )2008( فیلوژنی Vetigastropod را با استفاده DNA استخراج شده بهوسیله الکتروفورز و اسپکتروفوتومتر، انجام از روش BI وML بررسی نمود. او در این مطالعه با تکیه بر نمونه- گرفت. پرایمر مورد استفاده در تکثیر قطعه ژنی COI، پرایمر جهانی

برداری وسیع تاکسونومیک، از آنالیزهای مجزا و ترکیبی یک ژن Folmer )1994( و پرایمر مورد استفاده جهت تکثیر ژن 16S rRNA

میتوکندریایی COI و دو ژن هستهای هیستون H3 و 18S rRNA پرایمر Palumbi )1991( بود که مشخصات آنها در جدول 2 آمده است. 252

www.SID.ir Archive of SID

فصلنامه علمی پژوهشی محیط زیست جانوری سال دهم، شماره 2، تابستان 1397

جدول 1: نام و مشخصات ایستگاههای نمونهبرداری جهت تهیه محلول PCR، از یک میکرولیتر )10 نانوگرم( DNA

نام طول عرض استخراجی، یک میکرولیتر از هر یک از پرایمرها )10 پیکومول(، 0/5 ردیف شهر استان ایستگاه جغرافیایی جغرافیایی میکرولیتر dNTP )10 میلیموالر(، 3/0 میکرولیتر آنزیم Taq پلیمراز ° ʹ ʺ ° ʹ ʺ 1 نیروهوایی بوشهر بوشهر 5u/μ( 93 28 55 80 50 66(، 5/2 میکرولیتر بافر )PCR )10X و یک میکرولیتر MgCl2 2 اسکلهجفره بوشهر بوشهر ʺ44ʹ82°50 ʺ37ʹ97°28 3 تیو بوشهر بوشهر ʺ58ʹ50°82 ʺ13ʹ28°98 )50 میلیموالر( استفاده شد که در نهایت حجم آن با آب مقطر به

Møller McPherson 4 بندررستمی تنگستان بوشهر ʺ81ʹ00°51 ʺ66ʹ28°56 25میکرولیتررساندهشد) و ، 2006(.برنامه تکثیر 5 اولیجنوبی دیر بوشهر ʺ14ʹ51°90 ʺ33ʹ27°83 قطعات ژنی در جدول 3 آمده است. در مواردی که نمونهها از کیفیت ° ʹ ʺ ° ʹ ʺ 6 نایبند عسلویه بوشهر 41 52 67 02 27 42 مناسبی برخوردار نبودند، از روش و مواد دیگری در واکنش زنجیرهای 7 بستانه بندر لنگه هرمزگان ʺ38ʹ99°52 ʺ41ʹ12°27 BSA ساحل پلیمراز استفادهشد. بهطور مثال از ، که در تکثیر ژنهای نرمتنان 8 قشم هرمزگان ʺ37ʹ16°56 ʺ12ʹ54°26 سیمرغ کاربرد دارد، برای رفع عمل محدودکنندهها استفاده شد. محصول PCR 9 قشم قشم هرمزگان ʺ98ʹ56°26 ʺ46ʹ26°93 مورد خالصسازی قرار گرفت و جهت توالی یابی ارسال شد. ثبت توالیها در پایگاه دادهها: به این منظور ابتدا توالیها در سایت Basic Local Alignment Search Tool( BLAST ،NCBI( شد

و با توجه بهمیزان فاصله ژنتیکی از توالیهای نزدیک به آنها و همچنین رسم درخت در این سایت، اقدام به ثبت نمونهها گردید. در ابتدا قالب

خواندن )Fram( توالیهای بهدست آمده، توسط نرمافزار CLC Sequence Knudsen( Viewer v6.5.4 و همکاران، www.clcbio.com( )2012(

تعیین شد. سپس از طریق سایت DDBJ توالیها در پایگاه داده NCBI ثبت گردید. در مجموع 9 توالی COI و 5 توالی 16S خوانا و قابل تحلیل بهدست آمد که این توالیها برای نخستین بار از منطقه خلیج

فارس گزارش شده است. مراحل ثبت توالیهای COI در بانک ژن جهانی به پایان رسیده که شماره دسترسی )Accession number( آنها در سایت www.ncbi.nih.gov در جدول 4 قابل مشاهده است.

شکل 1: موقعیت ایستگاههای نمونهبرداری

جدول 2: نام و توالی پرایمرهای مورد استفاده (Nucleotide Sequence (5’ to 3’) Primer Name (F/R منابع TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCAACAAATCATAAAGATATTGG LCO1490_t1 Folmer CAGGAAACAGCTATGACTAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA HCO2198_t1 ) ، 1994( CGCCTGTTTAACAAAAACAT 16Sar )1991 Palumbi CCGGTCTGAACTCAGATCACGT 16Sbr ) ،

جدول 3: برنامه دمایی زنجیرهای واکنشهای پلیمراز بهکار رفته در تکثیر قطعات ژنی مراحل درجه حرارت C° زمان تعداد چرخه )سیکل( واسرشتهسازی اولیه 94 2 دقیقه 1 واسرشتهسازی )Denaturation( 94 30 ثانیه اتصال )Annealing( 45 30 ثانیه 40 بسط )Extention( 72 1 دقیقه بسط نهایی 72 4 دقیقه 1

253

www.SID.ir Archive of SID

ایزدیان و همکاران فیلوژنی مولکولی Vetigastropoda براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA

جدول 4: شماره دسترسی توالیهای ثبت شده در NCBI بوت استرپ بررسی شدند. آنالیز ML برای توالیهای بهدست آمده با ردیف ژن اسم ثبت شده Accession Number استفاده از نرمافزار Tamura( MEGA6 و همکاران، 2011( و تکرار AB976640.1 Diodora sp. SMBN COI 1 بوت استراپ 1000 انجام شد. به این معنی که 1000 مرتبه درخت AB976638.1 sp. ME COI 2 فیلوژنی رسم و حدود اطمینان کالدها بررسی میگردد. از نرمافزار LC029914.1 Osilinus kotschyi COI Drummond( BEAST v1.8.2 3 و همکاران، 2012( برای تخمین زمان LC154936 coronata COI 4 جدیدترین نیای مشترک Time to the Most Recent Common) LC154939 Priotrochus kotschyi COI 5 Ancestor=TMRCA) برای گرههای مورد نظر در درختهای فیلوژنی LC167490 sp. MI14 COI 6 استفاده شد. این نرمافزار همچنین آنالیز Bayesian MCMC را انجام LC167493 Lunella coronata COI 7 LC167811 Priotrochus kotschyi COI 8 میدهد و قادر است رسم درخت و تعیین زمان واگرایی را بهطور MrBayes LC167814 asper COI 9 همزمان انجام دهد که مزیت این نرمافزار نسبت به نرمافزار

Sotelo Huelsenbeck Ronquist ) و ، 2003( میباشد ) و همکاران، رسم درخت فیلوژنی: کلیه توالیها در فرمت FASTA، جهت 2009(. جهت تنظیم ساعت مولکولی، پس از بررسی منابع موجود، از Substitutional Rates استفاده در نرمافزار Molecular Evolutionary Genetics ( MEGA6 نرخ جایگزینی ) ( 35/0 تا 2/1 درصد در میلیون Donald Tamura( )Analysis و همکاران، 2011( و در فرمت Nexus، جهت سال در این آنالیزها استفاده شد ) و همکاران، 2005(. آنالیز برای 30 میلیون نسل اجرا و در هر 1000 مرحله نمونهگیری انجام شد. استفاده در نرمافزارهای Bayesian Evolutionary Analysis ( BEAST

Drummond( )Sampling Trees و همکاران، 2012( و PAUP

)Swofford، 2003( مرتب شدند. جهت همردیف کردن )Alignment( نتایج توالیها از نرمافزارهای Thompson( Clustal W و همکاران، 1994( پس از شناسایی مورفولوژیک، مشخص شد که نمونهها متعلق به و Larsson( AliView، 2014( استفاده شد. پس از همردیفی توسط پنج گونه Lunella ،Euchelus asper ،Trochus sp.2 ،Trochus sp.1 نرمافزار توالیها بهصورت چشمی مجدداً همردیف شدند. بهعلت کم بودن coronata و Diodora funiculate هستند. نمونههای HoSp8 و تعداد indelها در قطعه ژنی COI ردیف کردن میتواند توسط چشم BuAu54 بهعنوان گونه Lunella coronata، نمونههای HoWi17، نیز انجام شود )Haase و Zielske، 2015(. آنالیز فیلوژنی با استفاده HoWi23 و BuAu26 بهعنوان جنس Trochus sp.1، نمونههای از روشهای بیشینه صرفهجویی )Maximum Parsimony(، بیشینه BuSp7 و BuAu32 بهعنوان گونه Euchelus asper، نمونه BuAu48 احتمال )Maximum Likelihood( و Bayesian انجام شد. پیش از انجام بهعنوان جنس Trochus sp.2 و نمونه BuSp5 بهعنوان جنس Diodora آنالیزهایML ،MP و BI، با استفاده از برنامه MrModeltest v2.3 funiculata شناسایی شدند. از نمونههای متعلق به این کالد 9 توالی )Nylander، 2004( و براساس معیار اطالعاتی Akaike ( AIC COI بهدست آمد. درخت فیلوژنی رسم شده از این توالیها نشان داد Information Criterion( و AICc مدلهای مناسب برای دادههای که نمونه BuSp7 بیشترین شباهت را با گونه Monodonta australis مورد نظر، انتخاب شدند )Nylander، 2004(. طبق این آزمون مدل دارد )ارزش بوتاسترپ MP=100 ،ML=97 و احتمال پسین 1(، ولی Rodriguez( GTR+I+G و همکاران، 1990( برای دادههای این پژوهش کامالً با آن منطبق نیست. نمونه BuAu32 نیز بیشترین شباهت را با انتخاب شد. آنالیز MP برای دادهها بههمراه توالیهای مرجع با استفاده گونه Herpetopoma pauperculus داشت، اما اختالف زیادی بین آنها از نرمافزار Phylogenetic Analysis Using Parsimony( PAUP( مشاهده شد )ارزش بوت استرپ MP=100 ،ML=98 و احتمال پسین نسخه Swofford( 4b10، 2003( انجام گرفت. این نرمافزار که نرمافزار 1(. نمونه BuAu48 درحالیکه بیشترین شباهت را با گونههای تخصصی برای رسم درختهای MP است، پرکاربردترین بسته نرمافزاری مختلف از جنس Trochus نشان داد، با هیچیک از آنها گروه برای رسم درختهای تکاملی میباشد )Swofford، 2003(. برای انجام مونوفیلتیک تشکیل نداد. نمونه BuAu26 که متعلق به استان بوشهر آنالیزها از الگوریتم مبادله شاخه به شاخه روش دونیمهسازی درخت بود با دو نمونه دیگر که از استان هرمزگان جمعآوری شده بود، مقدار و اتصال مجدد )TBR=Tree-Bisection-Reconnection( و روش جزئی اختالف نشان داد )ارزش بوت استرپ MP=100 ،ML=100 و جستجوی اکتشافی )heuristic search( استفاده شد که بهصورت تصادفی احتمال پسین 1(. در عین حال مقداری تفاوت بین این دو نمونه که 100 توالی اضافی را نیز بررسی میکند. کالدهای MP با 1000 تکرار از استانهای بوشهر و هرمزگان جمعآوری شده بودند، مشاهده شد. 254

www.SID.ir Archive of SID

فصلنامه علمی پژوهشی محیط زیست جانوری سال دهم، شماره 2، تابستان 1397

نمونه BuSp5 با گونههای مختلف جنس Diodora یک کالد مجزا درختهای رسم شده برای این کالد در شکلهای 2، 3 و 4 نمایش تشکیل داد )ارزش بوت استرپMP=94 ،ML=100 و احتمال پسین داده شده است. 1( و بیشترین شباهت را با گونه Diodora singaporensis نشان داد.

شکل2: درخت ML رسم شده با توالی قطعه ژنی COI برای کالد Vetigastropod

255

www.SID.ir Archive of SID

ایزدیان و همکاران فیلوژنی مولکولی Vetigastropoda براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA

شکل 3: درخت MP رسم شده با توالی قطعه ژنی COI برای کالد Vetigastropod

با استفاده از نرمافزار BEAST قدمت نزدیکترین نیای مشترک است. زمان واگرایی کالد Diodora به 72/25 میلیون سال پیش گونههای مورد بررسی در کالد Vetigastropoda، 3428/68 میلیون بازمیگردد و 11/19 میلیون سال پیش زمان اشتقاق در کالد سال پیش تخمین زده شد. زمان انشعاب دو خانواده Lunella Chilodontidae است. بههمین ترتیب زمان برآورد شده برای ریشه درخت و Trochidae، 32/36 میلیون سال پیش برآورد شد و نیای مشترک 207 میلیون سال پیش میباشد )شکل 4(. خانواده Trochidae در حدود 67/28 میلیون سال پیش میزیسته

256

www.SID.ir Archive of SID

فصلنامه علمی پژوهشی محیط زیست جانوری سال دهم، شماره 2، تابستان 1397

شکل 4: درخت BI رسم شده با توالی قطعه ژنی COI برای کالد Vetigastropod

از این کالد 5 توالی 16S rRNAبهدست آمد. نتایج حاصل از تفاوت زیادی با همه آنها نشان داد. توالی 16S rRNAنمونهBuAu26 بررسی ژن 16S rRNAنیز نمونه BuAu32 را با گونه Herpetopoma نیز همانند توالی COI تطابق زیادی با چند توالی از گونه Osilinus pauperculus دارای نیای مشترک نشان داد )ارزش بوتاسترپ kotchyi ،ML=98 نشان داد. نمونههای HoSp8 و BuAu54 در بررسی توالی

MP=100(. برای ژن16S rRNA نیز هیچ توالی از گونه 16S rRNA Euchelus asper همانند توالی COI کامالً با گونه Lunella coronata در بانک وجود نداشت. در بررسی ژن 16S rRNAنیز مانندCOI نمونه مطابق بودند. درختهای رسم شده برای این کالد در شکلهای 5 و

BuAu48 با گونههای مختلف Trochus در یک کالد قرار گرفت، ولی 6 نمایش داده شده است.

257

www.SID.ir Archive of SID

ایزدیان و همکاران فیلوژنی مولکولی Vetigastropoda براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA

شکل 5: درخت ML رسم شده با توالی قطعه ژنی 16S rRNA برای کالد Vetigastropod

شکل 6: درخت MP رسم شده با توالی قطعه ژنی 16S rRNA برای کالد Vetigastropod

به این ترتیب که نمونههای HoWi23 ،HoWi17 و BuAu26 که در

بحث مطالعات مورفولوژیک تنها تا حد جنس، Trochus، شناسایی شدند، Vetigastropod در بررسی مولکولی نمونههای متعلق به کالد ، در بررسی مولکولی تا حد گونه مورد شناسایی قرار گرفتند، بهطوری بهعلت تنوع باالی گونهها و همچنین شباهت ظاهری بسیار زیاد آنها، که با داشتن تطابق کامل با توالی گونه Osilinus kotchyi از بحرین در برخی موارد تفاوتهایی با مطالعات مورفولوژیک دیده شد که نشان بهعنوان این گونه معرفی میشوند. این تطابق با ارزش بوت استرپ و دهنده راهگشایی این روشها در مورد گونههایی با شباهت باال میباشد. 258

www.SID.ir Archive of SID

فصلنامه علمی پژوهشی محیط زیست جانوری سال دهم، شماره 2، تابستان 1397

احتمال پسین باال حمایت میشود )شکلهای 2، 3 و 4(. تفاوت اندک دهنده تعلق این نمونه به جنس Monodonta باشد. از سوی دیگر در نمونه متعلق به استان بوشهر با دو نمونه استان هرمزگان بهعلت نمونه BuAu32 با اعضای خانواده Chilodontidae در یک کالد قرار فاصله جغرافیایی طبیعی مینماید. اختالف در اسامی عنوان شده در گرفت که نشاندهنده تفاوت فاحش بیان این دو نمونه به ظاهر مشابه مطالعات موفولوژیک و مولکولی بهعلت شباهت بسیار زیاد اعضاء این میباشد )شکلهای 2، 3 و 4(. مطالعات مورفولوژیک، نمونه BuAu48 خانواده و همچنین تغییر اسامی میباشد. در این مورد کمک شایانی را با توجه به اینکه تنها یک نمونه کوچک از این مورد در کل مراحل که بررسیهای مولکولی به شناسایی گونهها میکنند کامالً آشکار نمونهبرداری یافت شد، تنها تا حد جنس Trochus شناسایی کرده است و بهعلت تطابق زیاد نمونهها با گونه Osilinus kotchyi، از دو بود. با وجود آنکه مطالعات مولکولی نیز نتوانست شناسایی آن را کشور بحرین و امارات متحده عربی، حمایت بسیار باالی بوتاسترپ روشنتر سازد، در عین حال شباهت آن را با اعضاء این جنس تایید و احتمال پسین و یکسان بودن نتایج هر دو نشانگر COI و S کرد و احتمال پدید آمدن گونهای جدید از این جنس را نیز مطرح

16rRNA در هر سه نوع درخت رسم شده، جای شبههای باقی نمی- ساخت. هیچ توالی از گونه Diodora funiculate که بررسی مورفولوژیک،

ماند. در مورد دو نمونه HoSp8 و BuAu54 مطالعات مورفولوژیک و نمونه BuSp5 را متعلق به آن دانسته بود، در بانک ژن وجود نداشت

مولکولی، نتایج یکسان داشت و این نمونهها با توالیهای گونه Lunella و نتیجتاً درخت فیلوژنی رسم شده تنها توانست قرار گرفتن این نمونه

coronata از کشور امارات و منطقه اقیانوسی هند و آرام مطابقت با گونههای مختلف این جنس در یک کالد مجزا را تایید نماید )شکلهای داشت. تفاوت اندک بین این دو نمونه بهعلت تفاوت در محلهای 2، 3 و 4(. بهعلت تنوع و درعین حال شباهت زیاد اعضاء این کالد، نمونهبرداری که متعلق به دو استان متفاوت بودند، میباشد. در این انجام مطالعات بیشتر برای شناسایی دقیقتر آنها ضروری بهنظر مورد توالیهای استخراج شده از بانک ژن برای نشانگر 16S rRNA میرسد. مطالعات گذشته اثبات کرده است که نمیتوان تنها با اکتفا موارد دیگری را نیز آشکار ساخت. به این ترتیب که برای این نشانگر به یک قطعه ژنی، محدوده گونهها را کامالً مشخص کرد و دو قطعه و این گونه، توالیهایی از کشورهای هند، پاکستان، عمان و تانزانیا در ژنی میتوکندریایی COI و 16S rRNA در کنار یکدیگر نشانگرهای

بانک ژن وجود داشت که از آنهای برای مقایسه و بررسی خاستگاه قابلی جهت تفکیک گونهای شکمپایان هستند )Quintero-Galvis و

این گونه استفاده شد. نتایج نشان داد که گونه L. coronata از ایران Castro، 2013؛ Strong و Bouchet، 2013؛ Frey و Vermeij، 2008؛ بههمراه توالیهای این گونه از کشورهای اماراتمتحده عربی، پاکستان Donald و همکاران، 2005؛ Collin، 2003؛ Medina و همکاران، و هند، با مقداری تفاوت از توالیهای این گونه از کشورهای عمان و 1999(. در مطالعه حاضر نیز هر دو قطعه میتوکندریایی در شناسایی تانزانیا، در یک کالد قرار گرفتند و نشان داده شد که منشاء این گونه شکمپایان تا سطح گونه کارآمد عمل کردند و در پارهای موارد که در ایران از جمعیت این گونه در سواحل شرقی اقیانوس هند یعنی ابهاماتی باقی ماند بهعلت کافی نبودن اطالعات و توالیهای مناسب کشورهای هند و پاکستان میباشد. این نتایج با ارزش بوتاسترپ و در بانک ژن، جهت مقایسه و بررسی بیشتر بود. در این پژوهش سه احتمال پسین باال حمایت میشود )شکلهای 2، 3، 4، 5 و 6(. نوع درخت MP ،Ml و BI برای همه نمونهها رسم شد و آنالیزهای از سوی دیگر، بررسیهای مولکولی در مورد نمونههای BuSp7 مولکولی در همه موارد نتایج یکسانی نشان داد. همچنین در مورد و BuAu32، که مطالعات مورفولوژیک بیان میکرد که هر دو آنها تمامی گونهها نتایج مشابهی از بررسی نشانگرهای COI و 16S rRNA متعلق به گونه Euchelus asper میباشند، تفاوتی میان آنها نشان حاصل شد و تفاوتی در توپولوژی درختهای فیلوژنی رسم شده و نیز داد. از آنجایی که هیچ توالی حتی از جنس Euchelus برای هیچیک نتایجی که از تفسیر آنها استنباط شد، مشاهده نشد. باال بودن از دو نشانگر مورد استفاده در این مطالعه، در بانک ژن وجود نداشت، شاخصهای حمایتی گرههای پایه در آنالیزهای انجام شده، اثباتی بر از گونههای نزدیک دیگر برای مقایسه و رسم درخت استفاده شد که آن است که قطعه ژنی COI، نشانگری مطلوب برای ارزیابی و حل هیچیک از آنها با این دو نمونه منطبق نبود. عالوه بر این موقعیت فرضیههای تکاملی میباشد )Frey و Vermeij، 2008؛ Remigio و این دو نمونه بر روی درخت فیلوژنی تفاوت فاحشی بین آنها، که از Hebert، 2003(. آنالیزهای حاصل از نرمافزار BEAST نشان داد که نظر موفولوژیک شباهت بسیاری داشتند، نشان داد. بهطوریکه نمونه نیای مشترک کالد Vetigastropoda در اوایل دوره زمین شناسی BuSp7 با گونههای مختلف جنس Monodonta متعلق به خانواده پالئوسن )Paleocen( میزیسته است. در گزارشهای پیشین نیز این

Trochidae در یک کالد مجزا از نمونه BuAu32 قرار گرفت. از آنجایی کالد به عنوان کالد حاوی گونههای اجدادی مطرح شده است

که نمونه BuSp7 با هیچیک از گونههای این جنس تطابق کافی نداشت، )Remigio و Hebert، 2003(. در مطالعه حاضر نیز با استفاده از آنالیز تنها میتوان این احتمال را متصور شد که این موقعیت میتواند نشان Bayesian عمر تقریبی این کالد در حدود 68 میلیون سال پیش 259

www.SID.ir Archive of SID

ایزدیان و همکاران فیلوژنی مولکولی Vetigastropoda براساس ژنهای میتوکندریایی COI و 16S rRNA

cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan بهدست آمد که از قدیمیترین کالدهای شکمپایان خلیج فارس .invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology Vol. 3, pp: 294-299. Frey, M. and Vermeij, G.J., 2008. Molecular phylogenies محسوب میشود. اما در درختی که برای تمامی نمونههای مختلف and historical biogeography of a circumtropical group of .8 gastropods: implications for regional diversity patterns in the BI شکمپایان خلیج فارس با روش رسم شد، نتایج دیگری نیز حاصل .marine tropics. Mol. Phyl. Evol. Vol. 48, pp: 1067-1086 9. Geiger, D.L. and Thacker, C.R., 2005. Molecular phylogeny شد که بسیار شایان توجه میباشد. در این درخت مشخص شد که کالد ,of Vetigastropoda reveals non-monophyletic Scissurellidae , and Fissurelloidea. Moll Res. Vol. 25, pp: 47-55. Haase, M. and Zielske, S., 2015. Molecular phylogeny and a Trochidae Vetigastropoda که از نظر ردهبندی سنتی خانوادههای ، modified approach of character-based barcoding refining the .10 of New Caledonian freshwater gastropods. Fissurellidae Turbinidae Chilodontidae ، و از این مطالعه را شامل .Molecular Phylogenetics and Evolution. Vol. 89, pp: 171-181 11. Jones, D.A., 1986. A field guide to the sea shores of Kuwait میشود، مونوفیلتیک نمیباشد. به این ترتیب که گونههای متعلق به ,and the Persian Gulf. University of Kuwait Blandford Press Poole, Kuwait. 192 p.

Kano, Y., 2008. Vetigastropod phylogeny and a new concept Chilodontidae Trochidae خانوادههای و دریککالدمجزا ازگونههای of Seguenzioidea: independent evolution of copulatory organs .12 in the deep-sea habitats. Zoologica Scripta. Vol. 37, pp: 1-21. Fissurellidae Turbinidae متعلق به دو خانواده و قرار گرفتند. این ;.Knudsen, B.; Knudsen, T.; Flensborg, M.; Sandmann, H 13. Heltzen, M.; Andersen, A.; Dickenson, M.; Bardram, J.; مطلب نشاندهنده رابطه غیرخواهری میان این دو گروه بوده که نشان ;.Steffensen, P.J.; Mønsted, S.; Lauritzen, T.; Forsberg, R Thanbichler, A.; Bendtsen, J.D.; Görlitz, L.; Rasmussen,

J.; Tordrup, D.; Værum, M.; Ravn, M.N.; Hachenberg, C.; دهنده تفاوت بین دیدگاهردهبندیسنتی و ردهبندی مولکولی است. ,Fisker, E.; Dekker, P.; de Meza, J.; Hein, A.M.K.; Sinding J.B.; Quorning, J.; Hvam, K.; Mikkelsen, S.; Liboriussen, Thacker Geiger و )2005( نیز که بر روی فیلوژنی مولکولی کالد ,P.; Grydholt, J.; Handberg, H.; Bundgaard, M.; Joecker A.; Simonsen, M.; Nielsen, P.R.L.; Joecker, A.; Fleischer, Vetigastropoda مطالعاتی انجام دادند، بیان داشتند که خانوادههای P.; Jakobsen, J.; Juul, S.; Appelt, U.; Fejes, A. and Christensen, A.S., 2012. CLC sequence viewer, 6.7.1. CLC bio. Larsson, A., 2014. AliView: a fast and lightweight alignment Fissurellidae Trochidae و مونوفیلتیک نیستند که با نتایج مطالعه ,viewer and editor for large datasets, Bioinformatics. Vol. 30 .14 No. 22, pp: 3276-3278. حاضر یکسان است. نکته دیگر در مورد این دو کالد آن است که Layton, K.; Martel, A.L. and Hebert, P.D.N., 2014. Patterns 15. of DNA Barcode Variation in Canadian Marine Molluscs. خانوادههای Turbinidae و Fissurellidae که در ردهبندی سنتی متعلق .PLoS One. Vol. 9, No. 4, pp: 1-9 Lemey, P.; Salemi, M. and Vandamme, A.M., 2009. The 16. Phylogenetic Handbook a Practical Approach to Phylogenetic Cycloneritimorpha Vetigastropoda به کالد هستند با اعضاء کالد Analysis and Hypothesis Testing. Cambridge University Press. Second Edition. 750 p. نزدیکتر بوده و با آنها دارای نیای مشترک میباشند. در این پژوهش .Maddison, W.P., 1997. Gene Trees in Trees 17. Systematic Biology. Vol. 46, No. 3, pp: 523-536. دو نوع درخت MP ،ML و BI برای نمونهها رسم شد و آنالیزهای McPherson, M.J. and Møller, S.G., 2006. PCR Second 18. Edition. Taylor & Francis Group. Second edition. 292 p. Medina, M.; Weil, E. and Szmant, A.M., 1999. Examination مولکولینتایجیکسانینشان داد. همچنین در مورد تمامی گونهها نتایج of the Montastraea annularis species complex using ITS and .19 COI sequences. Mar Biotechnol. Vol. 1, pp: 89-97. S rRNA COI مشابهی از بررسی نشانگرهای و 16 حاصل شد و تفاوتی Nylander, J.A.A., 2004. MrModeltest v2. Program distributed 20. by the author. Evolutionary Biology Centre, Uppsala در توپولوژی درختهای فیلوژنی رسم شده و نیز نتایجی که از تفسیر .University, Sweden 21. Palumbi, S.R.; Martin, A.; Romano, S.; McMillan, W.O.; Stice, L. and Grabowski, G., 1991. The Simple Fool's Guide آنها استنباطشد، مشاهده نشد. باالبودنشاخصهایحمایتیگرههای .to PCR, Version 2.0. Privately published, Univ. Hawaii Quintero-Galvis, J. and Castro, L.R., 2013. Molecular COI پایه در آنالیزهای انجام شده، اثباتی بر آن است که قطعه ژنی ، (phylogeny of the Neritidae (: Neritimorpha .22 based on the mitochondrial genes cytochrome oxidase I نشانگری مطلوب برای ارزیابی و حل فرضیههای تکاملی میباشد .and 16S rRNA. Acta biol. Colomb. Vol. 18, pp: 307-318 Remigio, E.A. and Hebert, P.D.N., 2003. Testing the utility 23. of partial COI sequences for phylogenetic estimates of Hebert Remigio Vermeij Frey ) و ، 2008؛ و ، gastropod relationships. Mol. Phylogent. Evol. Vol. 29, .)2003 pp: 641-647. Robin, A., 2008. Encyclopedia of Marine Gastropods, Ed. 24. IKAN Unterwasser Archive, ConchBooks. 480 p. Rodríguez, F.; Oliver, J.F.; Marín, A. and Medina, 25. J.R. 1990. The general stochastic model of nucleotide منابع .substitution. J Theor Biol. Vol. 142, pp: 485-501 1. حسینزادهصحافی، ه.؛ دقوقی، ب. و رامشی، ح.، 1379. اطلس :Ronquist, F. and Huelsenbeck, J.P., 2003. MRBAYES3 .26 نرمتنان خلیج فارس. موسسه تحقیقات شیالت ایران. .Bayesian phylogenetic inference under mixed models Bioinformatics. Vol. 19, pp: 1572-1574. Bosch, D.; Dance, S.P.; Moolenbeek, R. and Oliver, 27. Sotelo, G.; Morán, P. and Posada, D., 2009. Molecular 2. P.G., 1995. Seashells of Eastern Arabia Motivate phylogeny and biogeographic history of the European Maja Publishing. pp: 24-186. spider crabs (Decapoda, Majidae). Molecular Phylogenetics Collin, R., 2003. Phylogenetic relationships among and Evolution. Doi:10.1016/j.ympev. 2009.05.009. 3. calyptraeid gastropods and their implications for the 28. Strong, E.E. and Bouchet, P., 2013. Cryptic yet colorful: biogeography of speciation. Systematic Biology. Vol. 52, anatomy and relationships of a new genus of Cerithiidae No. 5, pp: 618-640. (Caenogastropoda, Cerithioidea) from coral reef drop-offs. Donald, K.M.; Kennedy, M. and Spencer, G.S., 2005. Invertebrate Biology. Vol. 132, No. 4, pp: 326-351. 4. Cladogenesis as the result of long-distance rafting events in 29. Swofford, D.L., 2003. PAUP. Phylogenetic Analysis Using South Pacific Topshells (Gastropoda, Trochidae). Parsimony (and Other Methods). Version 4. Sinauer Evolution. Vol. 59, No. 8, pp: 1701-1711. Associates, Sunderland, Massachusetts. Drummond, A.J.; Suchard, M.A.; Xie, D. and Rambaut, 30. Tamura, K.; Peterson, D.; Peterson, N.; Stecher, G.; Nei, 5. A., 2012. Bayesian phylogenetics with BEAUti and the M. and Kumar, S., 2011. MEGA5: molecular evolutionary BEAST 1.7 Molecular Biology and Evolution. Vol. 29, genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary pp: 1969-1973. distance, and maximum parsimony methods. Molecular Elpidio, A.R. and Hebert, P.D.N., 2003. Testing the utility of Biology and Evolution. Vol. 28, pp: 2731-2739. 6. partial COI sequences for phylogenetic estimates of gastropod 31. Thompson, J.D.; Higgins, D.G. and Gibson, T.J., 1994. relationships. Molecular Phylogenetics and Evolution. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive Vol. 29, pp: 641-647. multiple sequence alignment through sequence weighting, Folmer, O.; Black, M.; Hoeh, W.; Lutz, R. and Vrijenhoek, position-specific gap penalties and weight matrix choice. 7. R., 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial Nucleic Acids Res. Vol. 22, pp: 4673-4680. 260

www.SID.ir