MEMORIA DEL AÑO 2005 INVESTIGACIÓN PROPIA DEL IVICAM

1.- Personal Investigador

Investigadores en plantilla

Dr. Esteban García Romero Juan Luis Chacón Vozmediano Jesús Martínez Gascueña Alfonso González Martínez

Investigadores contratados

Dr. Pedro Miguel Izquierdo Cañas Dr. Sergio Gómez Alonso Dra. Mónica Fernández González

Becarios

Adela Mena Morales Raquel Romero Peces

Titulados y técnicos auxiliares de laboratorio

Luisa María Novillo Moreno Maria Dolores Carmona Zapata Carlos José Mansilla Mansilla Brígido López Caravaca

2.- Proyectos de investigación en desarrollado

Proyecto: Estudio de la biodiversidad de la microbiota láctica presente en la fermentación maloláctica de vinos elaborados en bodegas de Castilla-La Mancha. Subproyecto: Caracterización molecular e identificación de cepas. Investigador Responsable: Dr. D. Pedro Miguel Izquierdo Cañas. Coordinado con: Dra. Da. Mª Llanos Palop Herreros, Facultad de Ciencias Ambientales de la Universidad de Castilla-La Mancha. Financiación externa concedida: 16.500 € para 3 años. Año 2005: 3.300 € Organismo: Consejería de Educación y Ciencia. Nº de Proyecto: PCC-05-003-2

Proyecto: Calificación de vendimias y calidad vitivinícola en Castilla-La Mancha Subproyecto: Efecto de ciertas prácticas enológicas en la calidad polifenólica de uva y vino. Relación con el color y la capacidad antioxidante. Investigador Responsable: Dr. D. Esteban García Romero Coordinado con: Dr. D. Francisco Montero Riquelme Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la Universidad de Castilla-La Mancha. Financiación externa concedida: 29.000 € para 3 años. Año 2005: 4.500 € Organismo: Consejería de Educación y Ciencia.

Título del proyecto: Prospección, Identificación y Preservación de Variedades Tradicionales de Vid (Vitis Vinifera L.) en Castilla-La Mancha (RG04-01) Investigador responsable: D. Jesús Martínez Gascueña Entidades participantes: Instituto De La Vid Y Del Vino De Castilla-La Mancha (JCCM), Instituto Madrileño De Investigaciones Agrarias. (Comunidad De Madrid), Laboratorio Agrario Regional. (JCCM) Entidad financiadora: Instituto de la Vid y el Vino de Castilla-La Mancha Duración, desde: 2004 hasta: Diciembre 2008

Proyecto: “Parámetros fenólicos en uvas del cv. Merlot sometidas a diferentes tratamientos de riego”. Puesta a punto de los métodos en campo y en laboratorio y primer seguimiento efectuado en 2005. Investigadores Responsables: Juan Luis Chacón Vozmediano y Jesús Martínez Gascueña

Proyecto: “Banco de germoplasma de variedades de vid de Castilla-La Mancha: autorizadas, recomendadas y en peligro de extinción” Investigadores Responsables: Mónica Fernández Aragonés y Jesús Martínez Gascueña

3.- Ayudas a Proyectos de Investigación solicitadas

Proyecto: Biodiversidad de la microbiota láctica presente en la fermentación maloláctica de vinos tintos Cencibel elaborados en Castilla-La Mancha en dos vendimias sucesivas. Investigador Responsable: Dr. D. Pedro Miguel Izquierdo Cañas. Coordinado con: Dra. Da. Mª Llanos Palop Herreros, Facultad de Ciencias Ambientales de la Universidad de Castilla-La Mancha. Financiación externa solicitada: 29.734 € Organismo: INIA. Subprograma nacional de conservación de recursos genéticos de interés agroalimentario- recursos microbianos.

Proyecto: Prospección, Identificación y conservación de variedades de vid (Vitis vinifera L.) minoritarias de Castilla la Mancha” (nº expediente PAI-06-0026-7697) Investigador Responsable: Dra. Da. Mónica Fernández González Financiación externa solicitada: 106.271,08 € Organismo: Consejería de Educación y Ciencia de la Junta de Comunidades de Castilla-la Mancha

4.- Otras concesiones de financiación externa

Subvención INIA para la contratación de investigadores en centros públicos de investigación agraria y alimentaria dependientes de las Comunidades Autónomas en el marco de la acción estratégica Recursos y Tecnologías Agrarias del Plan Nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica.

Con este programa se ha contratado por 5 años a los doctores: Mónica Fernández González, Sergio Gómez Alonso y Pedro Miguel Izquierdo Cañas. Los ingresos obtenidos por el IVICAM en este concepto se pueden cuantificar en alrededor de 23.000 € por investigador, lo que hace un total de 69.000 € totales en 2005.

Subvención del INIA para la adquisición de infraestructuras científico-técnicas en el marco del Subprograma Nacional de Recursos y Tecnologías Agrarias en coordinación con las Comunidades Autónomas. Con esta ayuda se ha conseguido la financiación FEDER del 70% del coste de la adquisición de los equipos HPLC y Secuenciador-analizador de ADN

Cantidad concedida: 74.405 €.

Sumando todos los conceptos por los que se ha obtenido ayudas, se concluye que en el año 2005, el equipo de investigación del IVICAM ha conseguido un retorno total de 151.205 €.

5.- Resultados de la Investigación: Tesis Doctorales

Título: Obtención de papel a partir de sarmientos de vid. Doctoranda: Victoria Ángulo Sánchez Directores: Dr. D. Luis Jiménez (Universidad de Córdoba) y Dr. D. Esteban García (IVICAM)

6.- Resultados de la Investigación: Publicaciones

Autores: HERNÁNDEZ-GÓMEZ, L. F; ÚBEDA-IRANZO,J; GARCÍA- ROMERO, E.; BRIONES-PÉREZ, A. Título: Comparative production of different melon distillates: Chemical and sensory analyses. Revista: Food Chemistry, 90, 2005,115-125.

Autores: ANGULO SÁNCHEZ V.; GARCÍA ROMERO, E. Título: Caracterización de la madera de sarmiento de vid con vistas a su aprovechamiento papelero. Revista: Viticultura/Enología Profesional 96 (enero-febrero), 2005, 34-42

Autores: RODRÍGUEZ MONTEALEGRE, R.; GARCÍA ROMERO, E. Título: Actividad antioxidante y composición fenólica en vinos de Castilla-La Mancha. Revista: Alimentaria, Abril 2005, 128-132.

Autores: ROMERO PECES, R.; CHACÓN VOZMEDIANO, J. L.; MARTÍNEZ GASCUEÑA, J.; JIMÉNEZ, J. y GARCÍA ROMERO, E. Título: Fertilidad de la variedad Chardonnay en Castilla-La Mancha Revista: Tecnología del vino, (5) 25, Jul/Ago 2005, 45-49,

Autores: IZQUIERDO CAÑAS, P. M.; GARCÍA ROMERO, E.; MARTÍNEZ GASCUEÑA, J. y CHACÓN VOZMEDIANO, J. L. Título: Cepas comerciales de bacterias lácticas para la inducción de la fermentación maloláctica en vinos tintos Cencibel: eficiencia, implantación e influencia sobre la calidad. Revista: Alimentaria, 368, Nov. 2005, 94-100.

Autores: RODRÍGUEZ MONTEALEGRE, R.; ROMERO PECES, R.; CHACÓN VOZMEDIANO, J. L.; MARTÍNEZ GASCUEÑA, J. y GARCÍA ROMERO, E. Título: Phenolic compounds in skins and seds of ten grape Vitis vinifera varieties grown in warm climate Revista: J. Food Composition and Analysis (aceptado)

Autores: ROMERO PECES, R.; CHACÓN VOZMEDIANO, J. L.; GARCÍA ROMERO, E. y MARTÍNEZ GASCUEÑA, J. Título: Pyrazine contents in four red grape varieties cultivated in a warm climate. Revista: Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin. (aceptado)

7.- Resultados de la Investigación: Congresos

Autores: HERMOSIN, I.; MARTÍN, B.; GALINDO, J.A.; RODRÍGUEZ, R.; GARCÍA, E. Título: Características cromáticas y composición fenólica de vinos tintos Cencibel. Tipo de participación: Póster Congreso: VII Congreso Nacional de Enólogos Lugar celebración: Toledo Fecha: 14-16 abril de 2005

Autores: ROMERO, R.; MENA, A.; MARTÍNEZ, J.; CHACÓN, J. L.; GARCÍA, E. Título: Determinación del índice de área foliar en viñedos (Vitis vinifera L..) cultivados en espaldera. Tipo de participación: Póster Congreso: V Congreso Ibérico de la Sociedad Española de Ciencias Hortícolas Lugar celebración: Oporto Fecha: 25-28 junio de 2005

Autores: ROMERO PECES, R.; CHACÓN VOZMEDIANO, J. L.; MARTÍNEZ GASCUEÑA, J.; GARCÍA ROMERO, E. Título: Influencia de algunas variables climáticas y agronómicas en la composición de las uvas de diferentes variedades tintas Tipo de participación: Póster Congreso: VIII Jornadas Científicas GIENOL Lugar celebración: Palencia Fecha: 1-3 junio de 2005

Autores: HERMOSÍN GUTIÉRREZ I.; MARTÍN GONZÁLEZ, B.; GALINDO FERNÁNDEZ-CHECA, J.A.; RODRÍGUEZ MONTEALEGRE, R.; GARCÍA ROMERO, E. Título: Uvas y vinos de la variedad Cencibel: Color, copigmentación y composición fenólica Tipo de participación: Póster Congreso: VIII Jornadas Científicas GIENOL Lugar celebración: Palencia Fecha: 1-3 junio de 2005

Autores: HERMOSÍN GUTIÉRREZ I.; RODRÍGUEZ MONTEALEGRE, R.; GARCÍA ROMERO, E. Título: Perfiles de flavonoles en uvas y vinos de variedades tintas. Tipo de participación: Póster Congreso: VIII Jornadas Científicas GIENOL Lugar celebración: Palencia Fecha: 1-3 junio de 2005

Autores: HERMOSÍN GUTIÉRREZ I.; LÓPEZ RODRÍGUEZ, C.; RODRÍGUEZ MONTEALEGRE, R.; GARCÍA ROMERO, E. Título: Flavonoles glicósidos y derivados hidroxicinámicos de variedades de uvas blancas Tipo de participación: Póster Congreso: VIII Jornadas Científicas GIENOL Lugar celebración: Palencia Fecha: 1-3 junio de 2005

Autores: HERMOSÍN GUTIÉRREZ I.; GARCÍA ROMERO, E.; GÓMEZ ALONSO, S.; QUINTANAR LARA, A. Título: Flavanols from La Mancha varietal red wines: Content, evolution during ageing, and usefulness as varietal differentation tool Tipo de participación: Póster Congreso: EURO FOOD CHEM XIII Lugar celebración: Hamburg Fecha: 21-23 septiembre 2005

Autores: HERMOSÍN GUTIÉRREZ I.; GARCÍA ROMERO, E.; GÓMEZ ALONSO, S. Título: HPLC Analysis of low molecular phenolics in grape and wine using multidetection and direct injection. Tipo de participación: Póster Congreso: Jornadas de Análisis Instrumental Lugar celebración: Barcelona Fecha: 15-17 noviembre 2005

8.- Resultados de la Investigación: Servicios que pueden ofrecerse al sector

Análisis de virus en plantas de vid

Mediante la técnica de determinación cualitativa ELISA, se han puesto a punto los análisis de los siguientes virus en vid: - Arabis Mosaic Virus (ARMV). Virus del mosaico del arabis. - Grapevine Fleck Virus (GFkV). Virus del jaspeado. - Grapevine Fanleaf Virus (GFLV). Virus del entrenudo corto infeccioso. - Grapevine Leafroll associated virus (GLRaV). Tipos 1, 2 y 3. Virus del enrollado. De estos 4 virus, los tres últimos están considerados como los más frecuentes y los que ocasionan mayores problemas en uvas de vinificación, según los resultados obtenidos en los últimos años relativos a la infección por virus en material vegetal vitícola. La legislación española vigente (Reglamento Técnico de control y Certificación de Plantas de Vivero de Vid, R.D. 208/2003 de 23 de febrero), establece que para conferir la categoría de material vegetal certificado, éste ha de estar libre de los siguientes virus: GFLV, GFkV y GLRaV1 y GLRaV3. Las virosis son la causa de algunas malformaciones en plantas, así como de la disminución de algunos parámetros de calidad en las uvas.

Análisis de aminas biógenas en vinos

Las aminas biógenas son compuestos orgánicos derivados de la actividad biológica que frecuentemente aparecen en el vino, y otros alimentos fermentados, como consecuencia de la fermentación, especialmente la fermentación maloláctica, y pueden producir efectos adversos en la salud de los consumidores. Esto ha llevado a que algunos países impongan límites al contenido en aminas biógenas de los alimentos y se exija su análisis durante las transacciones comerciales. Recientemente en el IVICAM se ha puesto a punto un método que permite la determinación del contenido en aminoácidos y aminas biógenas del vino mediante HPLC. El método desarrollado permite la determinación de 24 aminoácios y las aminas biógenas: histamina, agmatina, espermidina, tiramina, putrescina, triptamina, cadaverina, fenil-etilamina e isoamilamina.

Análisis genético de levaduras y bacterias.

Mediante técnicas moleculares (RAPD-PCR, ADN mitocondrial y PFGE) podemos distinguir aislados de levaduras y bacterias lácticas a nivel de género y especie y a nivel de cepa. Esto nos permite diferenciar las cepas implicadas en cada proceso, y utilizarlo para llevar a cabo estudios de selección e implantación de cada una de estas cepas.

Análisis genético de variedades de vid y portainjertos

En el IVICAM, desde Septiembre de 2005, se ofrece un servicio al sector de Identificación de variedades de vid, a partir de muestras de hojas jóvenes o de sarmientos de vid, mediante el análisis de marcadores moleculares de ADN. Las muestras recibidas, se analizan y los resultados se comparan, con los que almacenamos en nuestro banco de datos, o con los que aparecen en la bibliografía. Se determina así, la variedad de vid a la que pertenece la muestra recibida, la existencia de posibles sinonimias o la detección de variedades que nunca hasta ahora habían sido descritas.

9.- Actividad docente de los investigadores

Cursos impartidos

Microbiología del Vino en Castilla-La Mancha, dirigido a técnicos y profesionales del sector en la región, realizado en las dependencias del IVICAM de Tomelloso (Ciudad Real), 14, 15 y 16 de Junio de 2005.

Elaboración de Vinos en Castilla-La Mancha: 24, 25 y 26 de mayo de 2005.

Viticultura, Enología y Marketing del vino: 20, 21 y 22 de septiembre de 2005.

Curso de Cata de Vinos (nivel básico).

Conferencias “Adaptación de nuevas variedades en Castilla-La Mancha”en el curso “Nuevas variedades de vid” organizado por UCAMAN en Tomelloso. 10.- Resúmenes de las actividades realizadas en cada proyecto.

10. 1. EFECTO DE CIERTAS PRÁCTICAS ENOLÓGICAS EN LA CALIDAD POLIFENÓLICA DE UVA Y VINO. RELACIÓN CON EL COLOR Y LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE.

Introducción

En Castilla-La Mancha, reconocida como la primera región del mundo con respecto a extensión de viñedo y a producción de vino (según datos estadísticos de la Consejería de Agricultura de 2003: 566.587 Has y 3.610.274 Tn de uva, lo que supone un 50.44 y un 48.35% respecto de la extensión y producción nacionales respectivamente), el sector vitivinícola es uno de los pilares de la economía a lo que hay que añadir la importancia social e incluso medioambiental (en lo que atañe a la vid como elemento definitorio del paisaje castellano-manchego).

El consumo de vino sin embargo decrece año a año y el mercado se transforma: disminuyen las ventas de vinos “corrientes” y aumentan las de vinos de calidad, más de los tintos que de los blancos (Lauroba y Domínguez, 1999). La mayoría de las bodegas de la región así lo tienen entendido y han invertido en medios técnicos que propicien la obtención de vinos con un mayor valor añadido, en especial tintos de crianza, reserva y gran reserva. La administración, por su parte, ha apoyado al sector mediante los planes de reconversión del viñedo con los que se ha logrado que se sustituyeran vides de variedades blancas poco apreciadas por otras, en general tintas, de mayor prestigio; fundamentalmente Cencibel (o Tempranillo) aunque también foráneas como Cabernet Sauvignon, Merlot o Syrah (o Shiraz)

Estos cambios han propiciado que los enólogos se encuentran con nuevos problemas, sobre todo en lo relacionado con la extracción del color durante la vinificación y con la estructura polifenólica de los vinos tintos, que condiciona en gran medida las posibilidades de obtener vinos de crianza y envejecimiento con unas características organolépticas (en especial el color y astringencia) que no muestren una evolución muy acusada en un intervalo de tiempo corto-medio. Varias son las causas:

- Cepas jóvenes cuyas producciones presentan poco potencial polifenólico - Plantaciones en espaldera y regadío con producciones que no llegan a alcanzar los contenidos polifenólicos que podrían esperarse de la variedad. - Variedades como la Bobal o Garnacha que históricamente sólo han sido empleadas para la producción de vinos rosados y ahora se intentan revalorizar mediante la producción de vinos tintos.

Siendo todos los anteriores hechos constatables, un problema subyacente es que la transformación de las plantaciones y el cambio en las prácticas vitícolas no se han acompañado del correspondiente estudio del potencial fenólico y de la forma en cómo moldearlo a las necesidades de concentración y estabilidad de los vinos tintos de calidad. El simple traspaso de las técnicas vitivinícolas de las zonas de donde se han importado los nuevos conceptos no es aceptable por diferencias fundamentales como es el clima de nuestra región, diferenciado al de otras regiones españolas (Rioja, Ribera, Penedés) o extranjeras (Bourdeos, Montpellier,...).

La elaboración de vinos tintos jóvenes exige que éstos tengan alta intensidad colorante y tonalidades rojo-púrpuras, pero que no sean excesivamente astringentes; en cambio, para la elaboración de vinos tintos que se vayan a someter a crianza y envejecimiento, se requiere que éstos posean una estructura polifenólica suficientemente robusta como para resistir los lentos procesos oxidativos de la crianza, así como que las transformaciones que sufre la materia colorante del vino no afecten de forma acelerada a la intensidad y a la tonalidad del color. Por esta razón, a la hora de elaborar un vino tinto, no basta con conocer el potencial fenólico de la uva empleada como materia prima, sino que además es preciso conocer los mecanismos que gobiernan la transferencia de los compuestos fenólicos, que son las sustancias responsables del color y de la aptitud para la crianza de los vinos tintos, desde la uva hasta el vino durante la vinificación.

Es muy conocido por los enólogos el hecho de que las uvas con más color no dan lugar necesariamente a los vinos de mayor intensidad colorante, y son muchas las decepciones relacionadas con vinos jóvenes con una alta intensidad colorante inicial que disminuye rápida e inexorablemente en los meses siguientes. Algunos autores han sugerido (Boulton, 2001) que, para tener una visión más exacta de los procesos en que está implicada la materia colorante del vino durante su transferencia desde la uva al vino durante la vinificación, y posteriormente en el vino durante su crianza y envejecimiento, debe prestarse más atención a un fenómeno denominado copigmentación (Figura 1).

Figura 1. Influencia del pH (rango de 1 a 7) en el color de una disolución de monoglucósido de malvidina. Izquierda sin copigmento; Derecha con copigmento.

Los complejos de copigmentación los forman los antocianos monómeros originales de la uva, con otras sustancias también presentes en la uva (llamadas copigmentos o cofactores, normalmente otros compuestos fenólicos incoloros). Estos complejos de copigmentación son muy estables y ayudarían a incrementar el porcentaje de transferencia de antocianos de la uva al vino. Al ser tan estables los complejos de copigmentación, los antocianos se ven protegidos en ellos de los fenómenos que pueden degradarlos (por ejemplo, su oxidación o su hidrólisis) o transformarlos en pigmentos más o menos polimerizados. A la luz de esta nueva visión del fenómeno de transferencia de color durante la vinificación, se hace necesario evaluar el potencial fenólico de las uvas tintas no sólo desde la perspectiva de su contenido en antocianos, sino también considerar la cantidad de cofactores presentes en las uvas que podrían aumentar su porcentaje de transferencia y su estabilidad posterior en el vino. De este modo, pueden sugerirse nuevas estrategias para aumentar la intensidad y la estabilidad del color de los vinos tintos: desde el punto de vista de la viticultura, investigar qué factores culturales permiten conseguir las uvas con el mayor potencial fenólico, no sólo por contenido en antocianos, sino también en copigmentos; desde el punto de vista enológico se puede proponer que aquellas vendimias que tengan un alto contenido en antocianos pero bajo contenido en copigmentos, puedan suplementarse con más copigmentos, para favorecer la formación de complejos de copigmentación. En este último sentido, el suplemento en copigmentos podría ser suministrado mediante la cofermentación de las uvas con bajo contenido en copigmentos con otras ricas en éstos. Las uvas ricas en copigmentos podrían ser a su vez de la misma variedad o de distinta variedad.

Objetivos

- Estudiar el potencial fenólico de variedades autóctonas de vid cultivadas en Castilla-La Mancha. El primer año se estudiarán las variedades Bobal, Garnacha y Garnacha Tintorera.

- Evaluar el efecto de la adición de un 10 y 20% de variedad mejorante (cofermentación) sobre la extracción de color durante la fermentación de variedades autóctonas de uva, así como su incidencia en la estabilidad del color a lo largo del tiempo.

Actividades Realizadas o en Proceso

1. Vendimia

Se realizó cuando las uvas alcanzaron una maduración tecnológica óptima (grado alcohólico probable en torno a 13%), procurando coger sólo aquellas uvas que mostraban un correcto estado sanitario. Se realizaron dos tipos de vendimia:

- Estudio del potencial fenólico. Se tomaron doce muestras de cada una de las variedades objeto de estudio. Para ello se visitaron las zonas típicas de cultivo de cada una de las variedades: Garnacha en la D.O. Mentrida; Bobal en la D.O. Ribera del Jucar y Garnacha Tintorera en la D.O. Almansa.

- Elaboración de Vinos. Vendimia de uvas de la pareja de cofermentación Cencibel y Syrah y vendimia para uvas de la segunda pareja de cofermentación Bobal y Cabernet Sauvignon.

2. Análisis de las uvas

Con el análisis de las uvas se estudia el potencial polifenólico de partida existente en los hollejos, en las semillas y en la pulpa-mosto de cada una de las variedades. Ello nos permite conocer posteriormente la aportación de cada una de estas partes al contenido de compuestos fenólicos del vino final. El caso particular del análisis de la pulpa es ligeramente más complejo, dado que no es sencillo separar hollejos y semillas dejando ésta intacta, sin que haya pérdidas de su contenido en mosto, o sin que se produzcan oxidaciones de los compuestos de interés. Por ello se analiza por separado hollejo, pepitas y uva entera, obteniéndose los datos de contenido de polifenoles en pulpa-mosto por diferencia de la última con las otras dos.

Una vez en el laboratorio la muestra representativa de la vendimia se somete al siguiente protocolo: - A una parte se le separa el hollejo y las pepitas, lavándose ambos con agua desionizada y secándose entre papel de filtro para su posterior extracción y análisis. - A otra porción de uvas se les separa el pedicelo lo más cuidadosamente posible para evitar pérdidas de mosto, se lavará superficialmente con agua y se secarán para ser sometidas completas al mismo procedimiento de extracción y análisis.

3. Fermentaciones a escala de laboratorio

Tras la toma de muestra para su análisis, la vendimia se despalilla y estruja.

Las fermentaciones y cofermentaciones se llevan a cabo mezclando las partes proporcionales de mosto y hollejo de cada una de las variedades.

Se tomará una alícuota del mosto obtenido para el análisis de sus parámetros enológicos convencionales (pH, acidez total, ácido málico, glucosa, fructosa,...).

Las fermentaciones se llevan a cabo con un estricto control de temperatura a 22ºC mediante siembra de levadura VN seleccionada por el IVICAM y comercializada por Lallemand. Se añade SO2 (100 ppm) en forma de metabisulfito sódico y se toman muestras sucesivas del mosto en fermentación para realizar su seguimiento mediante el análisis de glucosa y fructosa. Las fermentaciones se realizan con maceración hasta agotamiento de azúcares.

Terminada la fermentación alcohólica los vinos se separan por escurrido. Tras trasegar, se siembra un cultivo de bacterias lácticas comerciales (Lactobacter SP1; Laffort) a fin de que se produzca la fermentación maloláctica. La fermentación maloláctica se monitoriza por análisis enzimático, y una vez finalizada se toma una muestra de vino para su análisis.

A continuación, y para no desvirtuar la composición fenólica de los vinos, éstos se filtran a través de lana de vidrio y directamente se embotellarán para su envejecimiento, sin aplicar ningún tratamiento de clarificación o de estabilización.

En los ensayos de cofermentación las variedades utilizadas se vinifican también por separado para evidenciar los efectos de esta práctica. De las variedades cofermentadas aquella que muestra mayor potencial fenólico en la uva se considera la variedad mejorante (Syrah y Cabernet Sauvignon) y es añadida a la de menor potencial fenólico (Sensible y Bobal) en distintas proporciones (inicialmente se ha decidido probar con 10 y 20%). Terminada la fermentación maloláctica de las variedades por separado se prepararán mezclas de vinos con las mismas proporciones utilizadas en la cofermentación, que posteriormente seguirán el mismo protocolo de almacenamiento y análisis. De esta forma, dispondremos de vinos 4 monovarietales, 4 vinos cofermentados y 4 mezclas de vinos monovarietales. Todas las elaboraciones u mezclas se realizan por duplicado.

Una vez terminados y embotellados, los vinos se llevan a bodega de donde se tomarán muestras para análisis cada mes durante los primeros seis meses y cada dos meses hasta llegar a dos años.

4. Análisis en Curso

4.1. Análisis de compuestos fenólicos para los extractos de uvas y los vinos:

− Polifenoles Totales y Antocianos Totales por el método espectrofotométrico UV-VIS (adaptación del método de Glories tal como se describe en Hermosín Gutiérrez, 2003) − Taninos y e Intensidad de Astringencia (Ribéreau-Gayon y col., 2000; Llaudy y col., 2004) − Compuestos fenólicos individuales por HPLC, con multidetección a varias longitudes de onda. A continuación se resumen los aspectos más importantes de este método que ha sido optimizado recientemente por investigadores del IVICAM y en estos momentos está en fase de publicación. El método propuesto permite el análisis de los comuestos fenólicos de uva y vino empleando dos detectores UV-Vis de diodos en línea y fluorescencia conectados en serie. Para lograr una buena separación cromatográfica se emplea un gradiente ternario que combina cambios de polaridad con cambios en el pH de la fase movil. El cambio de pH de la fase movil desde 2,6 hasta 1,5 permite la elución de los antocianos en la forma catión flavilio. Por otra parte, el empleo del detector de fluorescencia permite una disminución notable en el límite de detección de los flavonoles y al mismo tiempo elimina una serie de interferencias de otros compuestos fenólicos que en otro caso deberían ser eliminados mediante técnicas de fraccionamiento que son largas y tediosas.

Usando este método ha sido posible separar, identificar y cuantificar hasta 48 compuestos fenólicos en una sola inyección. Entre estos 48 compuestos se encuentran: 2 ácidos benzoicos, 9 ácidos cinámicos, el GRP (Grape Reaction Product), 7 flavan-3-oles, 12 flavonoles, 15 antocianos y 2 estilbenos. Los estudios realizados sobre la exactitud, precisión y límites de detección del método indican su validez ya que los límites de detección son inferiores en todos los casos, excepto para los ácidos gálico y protocatéquico y el 3- glucosido de malvidina, a 1 mg/l y los coeficientes de variación en el análisis replicado de 10 muestras son inferiores al 5 %, lo que indica una buena repetibilidad.

4.2. Análisis del porcentaje de antocianos copigmentados (Boulton, 1996) como describe Hermosín Gutierrez (2003).

4.3. Características cromáticas de los vinos

− Métodos convencionales utilizados en bodega (OIV): Intensidad Colorante y Tonalidad − Parámetros del Sistema CIELAB: Método simplificado para vinos (Ayala y col., 1999). 4.4. Determinación sensorial de la astringencia. La determinación de la astringencia de los distintos vinos elaborados se lleva a cabo tanto por un panel de catadores entrenados como por el método instrumental antes mencionado (4.2.).

4.5. Análisis convencionales de los vinos (acidez, pH, grado alcohólico, SO2, etc) mediante los métodos de la OIV, a los que añadiremos las determinaciones de acetaldehído y ácido pirúvico (métodos enzimáticos de Sigma-Aldrich).

mAU

300 idin-3-G e Malv

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0

-36 25 30 35 40 45 50

Minutes

Figura 2: Cromatograma HPLC de antocianos de un hollejo Cencibel

mAU Figura 2: Cromatograma HPLC de antocianos de un hollejo Cencibel

30

25 glucuronide n-3- i n-3-glucoside

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20 Quercet Myricet

e Quercetin-3-glucoside d i s o 15 in-3-glucoside noside noside i i erol-3-glucoside

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i Kaempf

Quercet Quercet Kaempf orhamnet Kaempf s Quercet

I 5 Myricetin

0 -1 40 50 60 70 Minutes Figura 3: Cromatograma HPLC de flavonoles de un hollejo Cencibel

10. 2. ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD DE LA MICROBIOTA LÁCTICA PRESENTE EN LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA DE VINOS TINTOS ELABORADOS EN BODEGAS DE CASTILLA-LA MANCHA: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y TECNOLÓGICA PARA LA SELECCIÓN DE CEPAS.

Objetivos del proyecto

Caracterización molécular, enológica y tecnológica de la microbiota láctica que participa en la fermentación maloláctica espontánea en los vinos tintos Cencibel elaborados en Castilla-La Mancha, con el propósito de seleccionar cepas autóctonas que presenten interés para el sector y que aseguren un:

- Control eficiente de la fermentación maloláctica al utilizar cepas de bacterias lácticas seleccionadas a partir de la flora autóctona, bien adaptadas a las condiciones ecológicas y climáticas y a las características de los vinos de la región. - La obten ción de vinos higiénicos de calidad manteniendo las características organolépticas propias de estos vinos, mediante la selección de cepas poco o nada productoras de aminas biógenas y carbamato de etilo.

Selección de muestras

Para llevar a cabo este proyecto, se han elegido en primer lugar 9 bodegas de Castilla-La Mancha, representativas de las distintas zonas de producción de la Región:

- Bodegas Illana de Pozoamargo (Cuenca) - Bodegas La Cerca de Casarrubios del Monte (Toledo) - Bodegas Lozano de Villarrobledo (Albacete) - Bodegas y Viñedos Muñoz de Ocaña (Toledo) - Cooperativa Provedo de Villarrubia de los Ojos (Ciudad Real) - Cooperativa Virgen de las Viñas de Tomelloso (Ciudad Real) - Dehesa del Carrizal de Retuerta del Bullaque (Ciudad Real) - Finca Marisánchez de Valdepeñas (Ciudad Real) y - Videma S.A.T. de Madrigueras (Albacete).

En cada una de estas bodegas se han seleccionado dos elaboraciones de vino tinto Cencibel.

Analisis de parámetros físico-químicos

En cada una de las elaboraciones estudiadas se realizó una toma de muestra inicial cuando los vinos estaban finalizando la fermentación alcohólica y otra muestra en los mismos vinos tras la fermentación maloláctica. En cada una de estas muestras se han determinado los parámetros físico-químicos convencionales, los parámetros de color, compuestos volátiles mayoritarios y minoritarios y antocianos.

En la tabla 1 se presentan algunos datos relativos al mosto de partida, días de encubado y duración de la fermentación maloláctica.

Tabla 1: Valores medios, desviación estándar, valor máximo y mínimo de algunos parámetros enólogicos importantes. Media SD Máximo Mínimo Grado Baumé 13,29 0,31 13,73 12,74

Densidad en el descube 996,99 7,02 1.013,80 991,00

Duración del encubado (días) 9,25 5,11 20,00 3,00

Duración FML (días) 18,88 8,59 37,00 7,00

En la tabla 2 se reflejan algunos de los parámetros analíticos determinados en los vinos estudiados. Es de destacar el aumento moderado de acidez volátil en los vinos, produciéndose en la etapa final de la fermentación maloláctica por el consumo del ácido cítrico, que como puede observarse llega a valores próximos a cero al final de la fermentación maloláctica.

Tabla 2: Valores medios, desviación estándar y valores máximos y mínimos de algunos de los parámetros analíticos determinados en los 18 vinos estudiados. Vinos final fermentación alcoholica Vinos final fermentación maloláctica

Media SD Máximo Mínimo Media SD Máximo Mínimo

Grado alcohólico 13,45 0,44 14,43 12,91 13,57 0,48 14,55 12,94 Acidez total1 5,86 1,12 7,70 3,93 5,04 1,01 7,11 3,37 pH 3,65 0,16 3,89 3,37 3,81 0,22 4,08 3,47 Acidez volátil2 0,29 0,08 0,45 0,18 0,42 0,09 0,53 0,27 Acido málico3 2,01 0,31 2,42 1,27 0,20 0,09 0,34 0,00 Acido láctico3 0,35 0,20 0,76 0,11 1,65 0,27 1,96 1,07 Acido cítrico3 0,28 0,07 0,38 0,09 0,06 0,09 0,26 0,00 Acido pirúvico4 55 20,14 87 8 42 18,21 79 19 Glicerina3 11 0,88 12 9 11 0,80 13 10 Nitrógeno4 103 11,87 122 80 112 1833 161 84 Antocianos libres5 750 174,98 1.056 471 635 134,19 912 397 Catequinas6 401 83,66 570 279 405 104,47 564 282 Taninos3 3,32 0,94 4,80 1,40 3,79 0,79 5,00 2,80 Polifenoles totales4 1.285 229,46 1.687 1.040 1.274 181,32 1.733 1.059 Intensidad colorante 9,92 2,59 14,51 6,17 8,87 2,82 13,90 5,05 Tonalidad 0,53 0,09 0,71 0,38 0,58 0,11 0,86 0,33 Acetaldehido4 11,1 3,06 14,8 4,1 2,9 1,11 4,6 1,1 Acetato de etilo4 63,9 17,26 94,7 26,9 62,5 16,85 88,7 24,1 Metanol4 122,5 31,22 171,8 61,5 127,1 23,73 145,4 57,0 Diacetilo 4 2,2 0,66 3,1 0,9 3,7 1,32 7,2 2,1 Isobutanol4 42,3 8,07 54,5 28,8 42,9 5,04 47,2 31,6 Acetato de isoamilo4 3,0 2,22 7,7 0,4 2,6 1,89 6,7 0,1 1-butanol4 1,2 0,29 2,1 0,9 1,3 0,32 2,2 0,9 Alcoholes isoamílicos4 218,9 31,98 246,7 140,9 224,1 32,94 261,2 142,4 Acetoina4 1,5 0,62 3,1 0,7 3,7 3,417 10,5 0,4 Lactato de etilo4 4,5 5,30 19,0 0,9 36,9 12,85 67,4 21,4 1 g/L ácido tartárico; 2 g/L ácido acético; 3 g/L; 4 mg/L; 5 mg/L malvidina; 6 mg/L catequina

Es importante también destacar la disminución del contenido en antocianos libres y en la intensidad colorante de los vinos, disminuyendo este último parámetro en aproximadamente una unidad de media en los vinos estudiados. En cuanto a los polifenoles totales se ha observado una escasa variación entre el final de la fermentación alcoholica y maloláctica.

De los resultados obtenidos en cuanto a los compuestos volátiles, es interesante observar la disminución considerable del contenido en acetaldehído en los vinos estudiados como consecuencia de la fermentación maloláctica. El aumento del contenido en lactato de etilo, acetoina y diacetilo, este último aporta a los vinos notas de complejidad aromática, con sus toques de mantequilla, que resultan rancios e indeseables cuando superan 5-7 mg/L, en los vinos estudiados los valores obtenidos para el diacetilo están muy por debajo de estos límites.

Análisis de Aminas Biógenas y Aminoácidos

Uno de los aspectos esenciales de este proyecto es la determinación cuali y cuantitativa de las aminas biógenas en las muestras de vino tomadas en las distintas bodegas para así poder evaluar la incidencia de la fermentación maloláctica en este importante factor higiénico de los vinos.

Para poder realizar esta determinación el Laboratorio de Análisis Químico del IVICAM ha desarrollado un método para el análisis conjunto de las aminas biógenas, los aminoácidos y el ión amonio en vinos basado en otro inicialmente descrito para el análisis de hidrolizados de proteínas y otras muestras biológicas. El protocolo consiste en la separación mediante HPLC en fase reversa de las aminoenonas formadas por reacción de los aminoácidos, las aminas biógenas y el ión amonio con el agente derivatizante etoximetilenmalonato de dietilo (EMMDE).

La separación cromatográfica se lleva a cabo en columna Ace® 5 C:18-HL (25 cm x 4.6 mm) termostatizada a 16 ºC, mediante gradiente binario (fase A, tampón acetato 25 mM, pH = 5.8; fase B, mezcla 80:20 de acetonitrilo y metanol). Para la detección se emplea un detector UV-Vis monitorizando a 280 y 300 nm. En las condiciones propuestas se separan, identifican y cuantifican 36 compuestos en una sola inyección : 27 aminoácidos (incluyendo el patrón interno), el ión amonio y 8 aminas biógenas (ver figura 1).

Las ventajas del método de análisis propuesto son: derivatización directa de los vinos, sin preparación previa; cuantificación simultánea de 27 aminoácidos, 8 aminas biógenas y el ión amonio; empleo del detector UV-Vis, el más habitual en cualquier laboratorio; no interferencia en el cromatograma del exceso de agente derivatizante; límites de detección por debajo de 0.40 mg/l entre los aminoácidos, y de 0.07 g/l entre las aminas biógenas.

AU 1.00 na olina r Cadaverina P Glutámico

Lisina Ornitina

Putresci Ac. Arginina

GABA

0.75

-Alanina α na i reonina T ilam

oam Valina

Is 0.50

ina

Isoleucina Glic

Leucina

Tirosina ilalanina m na i e Ac. Aspártico F Tiramina ilam t

Serina Triptofano Histamina Asparagina

0.25 nile -Alanina

e β F Cisteina

a idina Agmatina idina n Triptamina i t

n rm o

i His o t pe i e rolina n Es P M o

P.I. Espermina Glutamina m A HO-

0.00 10 20 30 40 50 60 70 80 Minutos Figura 1: Cromatograma HPLC de los derivados EMMDE de aminoácidos y aminas biógenas.

Aislamientos de bacterias lácticas

1.- Obtención de una colección de bacterias lácticas aisladas en vinos de Castilla- La Mancha

Los aislamientos de las bacterias lácticas se han realizado en todos los vinos estudiados en cuatro momentos distintos, uno al final de la fermentación alcoholica y los tres restantes al inicio, mitad y final de la fermentación maloláctica.

Para llevar a cabo el aislamiento se han utilizado los medios de cultivos recomendados en la bibliografía (MLO y MRS), obteniéndose una colección de bacterias lácticas integrada por unos 1200 aislados.

2.- Evolución de las poblaciones de bacterias lácticas y levaduras.

En la figura 2 se observa la evolución de la población de levaduras y bacterias lácticas desde el inicio hasta el final de la fermentación maloláctica, como puede observarse, inicialmente la población bacteriana es muy baja del orden de 1,00E+02 u.f.c./mL (unidades formadoras de colonias por ml), esta población va aumentando progresivamente en detrimento de la población levaduriforme que va disminuyendo, hasta que llega el momento en el cual se inicia la degradación del ácido málico en ácido láctico.

Figura 2: Evolución de la población de levaduras y bacterias lácticas durante la FML, en una de las elaboraciones estudiadas.

1,00E+08

1,00E+07

1,00E+06

1,00E+05 u.f.c./mL 1,00E+04

1,00E+03

1,00E+02 0 182832 Días de fermentación

Levaduras Bacterias lácticas

Identificación de los aislados a nivel de cepa

Para llevar a cabo la identificación de cada uno de los aislados a nivel de cepa, ha sido necesario emplear métodos de biología molécular. La técnica elegida ha sido la RAPD-PCR, que esta basada en la amplificación de fragmentos de ADN, mediante el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o y cebadores o “primers” de secuencia arbitraria, que hibridan en distintos sitios repartidos aleatoriamente en todo el genoma. Los polimorfismos producidos se denominan marcadores RAPD y son utilizables como marcadores genéticos y taxonómicos en este tipo de organismos, constituyendo una herramienta muy útil y fiable de identificación .

En la Figura 3 se observa los distintos perfiles obtenidos para cepas de Oenococcus oeni, aisladas en uno de los vinos al finalizar la fermentación alcohólica.

Figura 3: Perfiles RAPD-PCR obtenidos en los inicios de la FML

La Figura 4 muestra los perfiles RAPD-PCR de las cepas aisladas en un vino al final de la fermentación maloláctica, como se puede observar en la misma, existe una menor diversidad genética, encontrándose un perfil dominante, bien adaptado al medio y que por tanto ha de ser el responsable del proceso.

Figura 4: Perfiles RAPD-PCR obtenidos en la etapa final de la FML

10.3. CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE VARIEDADES DE VID TRADICIONALES EN CASTILLA-LA MANCHA (ESPAÑA).

1. INTRODUCCIÓN.

En la actualidad, la distribución del viñedo en España muestra una gran concentración en la región central, siendo Castilla-La Mancha la Región que más superficie dedica a su cultivo. Sus casi 600.000 Ha representan cerca del 52 % de la superficie total dedicada a la vid en nuestro país y en torno al 8% de la mundial., pudiendo representar sus producciones ciertos años hasta un 10 % del total de vino del mundo.

Las tendencias en el consumo de vinos están cambiando en los últimos tiempos: hay un descenso continuado del consumo de vino corriente, que está siendo sustituido por el de vinos diferenciados, dotados de mejores virtudes organolépticas.

Una de las premisas para conseguir esa diferenciación, quizás la más conspicua, está relacionada con el material vegetal elegido, con la variedad de vid utilizada; ésta otorga al vino una personalidad y carácter propios, que podrán ser modulados en función de los otros parámetros de la cadena vitivinícola: manejo cultural, madurez de la uva, tecnología enológica empleada, etc.

Nuestro patrimonio vitícola está constituido por unas cuantas decenas de variedades, la mayoría de las cuales están siendo sometidas a una importante presión selectiva: sólo algunos cultivares selectos, muchos de ellos foráneos, se están beneficiando de las ayudas de la reconversión del viñedo y, con frecuencia, a costa de variedades autóctonas, minoritarias. Algunas de ellas, cuyas superficies no han dejado de disminuir en las últimas décadas, pueden situarse en poco tiempo al borde de la extinción, estando afectadas ya por una importante pérdida de diversidad genética. Y esto, antes de haber podido conocer realmente sus potenciales agronómico y enológico.

Por todo ello, con este proyecto se pretende prospectar el viñedo castellano-manchego selectiva y metódicamente, fundamentalmente el referido a cultivares minoritarios que sean singulares, o que corran peligro de desaparición. El material vitícola encontrado, será identificado mediante métodos moleculares, usando microsatélites, y caracterizado usando descriptores ampelográficos y ampelométricos. Además se estudiará su estado sanitario y, por último, se recogerá y se conservará de forma adecuada.

Todo ello permitirá formar una colección varietal de referencia para la Región, donde estén representados los cultivares de vid autóctonos de Castilla la Mancha, perfectamente identificados y clasificados.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1. Prospección selectiva y metódica del viñedo

La enorme superficie dedicada en nuestra región al cultivo de vid hace forzoso el establecimiento de unos criterios de selección de los territorios a prospectar. Consideramos, en principio, que un rico patrimonio varietal contrastado (análisis de registros vitícolas y de la información obtenida de las Oficinas Comarcales Agrarias) resulta una condición interesante; siendo también preferentes las situaciones geográficas marginales y las zonas de paso a otras regiones, es decir, lugares con escaso desarrollo del sector vitivinícola, pero donde el cultivo se ha mantenido de forma tradicional. La forma de hacerlo consistió en la ejecución de salidas planeadas, bien preparadas previamente utilizando las fuentes de información disponibles: documentos bibliográficos, registros vitícolas, datos de las OCAs y CRDOs castellanomanchegos y referencias de particulares o de empresas vitivinícolas.

Se han visitado parcelas o, en su caso, las cepas correspondientes a los cultivares que resulten de interés: minoritarios, conocidos por el equipo investigador; minoritarios, desconocidos por el equipo investigador aunque de procedencia sospechosa (que ha podido ser traído recientemente, en las últimas décadas, de otras regiones peninsulares o extranjeras) y, por último, cultivares minoritarios que podrían ser singulares, incluido ecotipos autóctonos de ciertas variedades mayoritarias (tempranillo, garnacha tinta, monastrell, etc.)

Durante los años 2004 y 2005 se prospectó el territorio abarcado por una serie de poblaciones dispersas por la orla suroccidental de la Serranía de Cuenca, donde la vid resulta un cultivo marginal frecuentemente compuesto por parcelas plurivarietales. En concreto, se recorrieron los términos municipales de Sacedón, en la provincia de Guadalajara, y de Arrancacepas, Ribatajada, Villar de Olalla, Villaverde y Pasaconsol, Campillo de Altobuey, Aliaguilla y Casillas de Ranera en la provincia de Cuenca. La prospección se hizo de la mano de agentes de extensión agraria, bodegueros de cooperativas vitivinícolas y de agricultores, según los casos.

2.2. Caracterización genética.

La identificación de las accesiones se realizó mediante técnicas de biología molecular que se fundamentan en el uso de marcadores moleculares, moléculas indicadoras directas del genotipo de los cultivares.

El empleo de los microsatélites nucleares como marcadores, técnica profusamente utilizada en los últimos tiempos, permite la identificación de variedades de vid más allá de cualquier duda y contribuye a profundizar en los conocimientos sobre sus orígenes. Asimismo, constituye la técnica más reproducible y la que presenta una mejor interpretación genética (existen amplias bases de datos publicadas con los genotipos de diferentes variedades).

Se ha empleado la metodología de This et al., (2004) que, de acuerdo con lo establecido en el proyecto GENRES 081 de la Unión Europea, proclama el uso de los microsatélites: VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62 y VrZAG79. El tamaño de los alelos obtenidos se determinaron mediante electroforesis capilar utilizando un secuenciador automático ABIPRISM 310, en la figura 1, se recoge un ejemplo de un electroforegrama. Después de la puesta a punto de las condiciones de amplificación y de electroforesis y de contrastar nuestros datos con los de diversas publicaciones para variedades comunes, los tamaños de los amplificados se calcularon y expresaron en pares de bases. Para evitar errores de manejo, de cada muestra se realizaron un mínimo de dos amplificaciones independientes realizadas sobre ADN de distinta extracción.

Figura 1. Electroforegrama correspondiente a la variedad De gallo (4). Aparecen los 6 microsatelites analizados. De menor a mayor tamaño: VVS2, VVMD27, ZAG69, VVMD5, VVMD7 y ZAG79. En naranja el marcador Genescan-500 LIZTM (Applied Biosystems).

2.3. Caracterización ampelográfica.

Las descripciones se han llevado a cabo en distintas etapas del desarrollo vegetativo de la planta, de acuerdo con las directrices establecidas por la O.I.V. (1984). Se muestran estos datos en la siguiente relación:

ÓRGANO FECHA DE DESCRIPCIÓN LUGAR DE DESCRIPCION Pámpano joven Mediados de mayo En laboratorio* Pámpano Primeros de junio En campo Zarcillos Primeros de junio En campo Hoja joven Mediados de mayo En laboratorio* Hoja adulta Mediados de julio En campo y laboratorio* Racimo Primeros de septiembre En campo Baya Primeros de septiembre En laboratorio*

(*) Las descripciones efectuadas en el laboratorio, se realizaron en estado fresco el mismo día de muestreo, para evitar pérdida de información, debida al manejo del material.

Para las determinaciones ampelográficas se tomaron 10 muestras por accesión en los diferentes órganos, excepto en el caso de la baya que se muestrearon 40 bayas maduras por variedad. Los caracteres descritos, escogidos de acuerdo con la selección de descriptores O.I.V. realizada por el IMIDRA (Comunidad de Madrid), se relacionan en la Tabla 1.

Tabla 1.- Descriptores O.I.V. empleados para la caracterización morfológica.

OIV CARÁCTER NIVEL DE EXPRESIÓN distribución de la pigmentación antociánica de la 1·2·3 002 Pámpano Joven extremidad intensidad pigmentación antociánica pelos tumbados 1·3·5·7·9 003 Pámpano Joven extremidad 004 Pámpano Joven densidad pelos tumbados extremidad 1·3·5·7·9 051 Hoja joven color del haz de la 4ª hoja 1·2·3·4 053 Hoja joven densidad pelos tumbados entre nervios en el envés hoja 1·3·5·7·9 006 Pámpano porte 1·3·5·7·9 007 Pámpano color cara dorsal entrenudos 1·2·3 008 Pámpano color cara ventral entrenudos 1·2·3 009 Pámpano color cara dorsal nudos 1·2·3 010 Pámpano color cara ventral nudos 1·2·3 015 Pámpano pigmentación antociánica de las brácteas de las yemas 1·5·9 017 Zarcillos longitud 1·3·5·7·9 065 Hoja adulta tamaño 2·4·6·8 067 Hoja adulta forma del limbo 1·2·3·4·5 068 Hoja adulta número lóbulos 1·2·3·4·5 070 Hoja adulta Pigmentación antociánica nervios principales del haz 1·2·3·4 072 Hoja adulta abultamientos del limbo 1·2 074 Hoja adulta perfil 1·2·3·4·5 075 Hoja adulta hinchazón del haz 1·3·5·7·9 076 Hoja adulta forma de los dientes 1·2·3·4·5 079 Hoja adulta apertura del seno peciolar 1·2·3·4·5·6 080 Hoja adulta forma de la base seno peciolar 1·2·3 081-1 Hoja adulta presencia de un diente en el seno peciolar 1:2 O81-2 Hoja adulta base del seno peciolar limitada por la nervadura 1·2·3 082 Hoja adulta grado de apertura del seno lateral 1·2·3·4 O83-1 Hoja adulta forma de la base de los senos laterales superiores 1·2·3 083-2 Hoja adulta presencia de un diente en el seno lateral superior 1·2 084 Hoja adulta densidad de pelos tumbados entre los nervios del envés 1·3·5·7·9 087 Hoja adulta densidad pelos erguidos en los nervios principales envés 1·3·5·7·9 202 Racimo longitud 1·3·5·7·9 203 Racimo anchura 1·3·5·7·9 204 Racimo compacidad 1·3·5·7·9 206 Racimo longitud del pedúnculo 1·3·5·7·9 208 Racimo forma del racimo 1·2·3 209 Racimo número de alas 1·2·3·4 220- 1·3·5·7·9 221 Baya longitud-anchura 223 Baya forma 1·2·3·4·5·6·7·8 225 Baya color de epidermis 1·2·3·4·5·6 230 Baya coloración pulpa 1·2 236 Baya sabores particulares 1·2·3·4·5 241 Baya presencia de pepitas 1·2·3 503 Baya peso de una baya 1·3·5·7·9 (*) Se indica sólo el rango de niveles de expresión, para más detalle ver OIV (1984)

2.4. Estudio del estado sanitario de las cepas seleccionadas.

De los individuos seleccionados y marcados, se tomó muestra de madera de poda en invierno para el estudio de su estado sanitario, mediante test serológico ELISA para entrenudo corto (GFLV), enrrollado (GLRaV) y jaspeado (GFkV).

2.5. Recolección y aislamiento en contenedor del material seleccionado.

Se recogieron sarmientos de las distintas accesiones en el momento de la poda y se conservaron en refrigeración hasta su uso.

En el momento oportuno, se tomaron estaquillas con dos o tres nudos, se sumergieron en una solución de ácido indolbutírico para favorecer el enraizamiento y se plantaron sobre sustrato vermiculita en semilleros. Se mantuvieron en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad hasta su brotación. Las plantas obtenidas se transplantaron a macetas de plástico con perlita-arena-turba (1:1:1), y se mantuvieron en invernadero regadas periódicamente. Pensamos que éste podrá constituir, en principio, suficiente material de reserva para atender las necesidades que puedan plantearse a la hora del establecimiento de las accesiones en campo.

3. RESULTADOS.

3.1. Prospección selectiva y metódica del viñedo.

Hasta el momento se han prospectado 73 accesiones de vid Vitis Vinifera, algunas de las cuales pertenecen a variedades autorizadas, otras son recomendadas y el resto son desconocidas y aparecen con la denominación local. En la tabla 2 se recogen las accesiones, la denominación local, el color de la baya y la procedencia de las mismas.

Tabla 2. Accesiones prospectadas en Castilla La Mancha. ACCESION NOMBRE VARIEDAD LOCALIDAD (PROVINCIA) BGVCLM0001 Derechero T Sacedón (GU) BGVCLM0002 De la Panga R Sacedón (GU) BGVCLM0003 Malvar B Sacedón (GU) BGVCLM0004 De Gallo B Tomelloso (CR) BGVCLM0005 Gordera Manchega B Sacedón (GU) BGVCLM0006 Crujidera T Sacedón (GU) BGVCLM0007 Colgadera T Campillo de Altobuey (CU) BGVCLM0008 Teta de Vaca B Campillo de Altobuey (CU) BGVCLM0009 Blanca pequeña B Campillo de Altobuey (CU) BGVCLM0010 Tardana B Campillo de Altobuey (CU) BGVCLM0011 Coloraillo Gordo R Campillo de Altobuey (CU) BGVCLM0012 Coloraillo Pequeño R Campillo de Altobuey (CU) BGVCLM0013 Churriago T Villaverde y Pasaconsol (CU) BGVCLM0014 Tinto fino T Villaverde y Pasaconsol (CU) BGVCLM0015 Granadera T Villaverde y Pasaconsol (CU) BGVCLM0016 Moravia dulce T Villaverde y Pasaconsol (CU) BGVCLM0017 Marisancho B Villaverde y Pasaconsol (CU) BGVCLM0018 Blanca B Villaverde y Pasaconsol (CU) BGVCLM0019 Uva de Planta B Aliaguilla (CU) BGVCLM0020 Botón de Gallo R Aliaguilla (CU) BGVCLM0021 Tardana B Aliaguilla (CU) BGVCLM0022 Botón de Gallo B Casillas de Ranera (CU) BGVCLM0023 Bobal blanca B Casillas de Ranera (CU) BGVCLM0024 Planta fina B Casillas de Ranera (CU) BGVCLM0025 Botón de Gallo R Casillas de Ranera (CU) BGVCLM0026 Garnacha T Arrancacepas (CU) BGVCLM0027 Aris B Arrancacepas (CU) BGVCLM0028 Negra T Ribatajada (CU) BGVCLM0029 Tinta de Villar de Olalla T Ribatajada (CU) BGVCLM0030 Gordera B Villar de Olalla (CU) BGVCLM0031 Albillo B Villar de Olalla (CU) BGVCLM0032 Moscatel B Villar de Olalla (CU) BGVCLM0033 Torrontés B Villar de Olalla (CU) BGVCLM0034 Gordal B Villar de Olalla (CU) BGVCLM0035 Gordera Roja T Villar de Olalla (CU) BGVCLM0036 Teta de Vaca T Villar de Olalla (CU) BGVCLM0037 Desconocida T Villar de Olalla (CU) BGVCLM0038 Coloraillo R Madrigueras (AB) BGVCLM0039 Moravia Dulce T Madrigueras (AB) BGVCLM0040 Moravia Agria T Madrigueras (AB) BGVCLM0041 Moscatel B Villar de Olalla (CU) BGVCLM0042 Tinto Basto T Dosbarrios (TO) BGVCLM0043 Malvar B Dosbarrios (TO) BGVCLM0044 Coloraillo R Casasimarro (CU) BGVCLM0045 Machina R Casasimarro (CU) BGVCLM0046 Pintailla R Casasimarro (CU) BGVCLM0047 Moravia Agria T Casasimarro (CU) BGVCLM0048 Rucial R Casasimarro (CU) BGVCLM0049 Moravia Agria T Villagarcia del Llano (AB) BGVCLM0050 Moravia Dulce T Cañaveras (CU) BGVCLM0051 Gallera Dorada R Arrancacepas (CU) BGVCLM0052 Gallera Negra T Arrancacepas (CU) BGVCLM0053 Coloraillo R Arrancacepas (CU) BGVCLM0054 Gordera Negra T Arrancacepas (CU) BGVCLM0055 Moravio T San Clemente (CU) BGVCLM0056 Bobal T Campillo de Altobuey (CU) BGVCLM0057 Frasco T Madrigueras (AB) BGVCLM0058 Rojal R Madrigueras (AB) BGVCLM0059 Desconocida B Ribatajada (CU) BGVCLM0060 Desconocida B Ribatajada (CU) BGVCLM0061 Airén B Ribatajada (CU) BGVCLM0062 Botón de gallo T Arrancacepas (CU) BGVCLM0063 Gordera Manchega B Arrancacepas (CU) BGVCLM0064 Flamenca T Aliaguilla (CU) BGVCLM0065 Albillo B Ribatajada (CU) BGVCLM0066 Rojal R Casas de Fernando Alonso (CU) BGVCLM0067 Rompetinajas B Casas de Fernando Alonso (CU) BGVCLM0068 Tortosí R Casas de Fernando Alonso (CU) BGVCLM0069 Botón de Gallo B Arrancacepas (CU) BGVCLM0070 Moscatel grano menudo B Casas de Haro (CU) BGVCLM0071 Pasera B Casas de Haro (CU) BGVCLM0072 Moscatel grano menudo B Casas de Haro (CU) BGVCLM0073 Chelva B Tomelloso (CR) * B. Blanca, R. Rosada, T. Tinta. CU. Cuenca, GU. Guadalajara, AB. Albacete, CR. Ciudad Real, TO. Toledo.

3.2. Caracterización genética.

Las 73 accesiones produjeron 39 perfiles alélicos distintos cuando se analizaron las 6 regiones microsatélites. Los resultados obtenidos aplicando el programa Identity 1.0. de Wagner y Sefc (1999), se han resumido en la figura 2, en la que se recogen el tamaño de los alelos encontrados y sus frecuencias de aparición en el conjunto de las muestras para cada uno de los seis microsatélites estudiados, y en la tabla 3 se recogen los parámetros genéticos de los seis loci microsatélites analizados para la muestra estudiada en este trabajo.

En todos los casos hay que tener en cuenta que algunas de las muestras analizadas resultaron redundantes (coincidían tanto en la denominación que recibían en sus lugares de procedencia como en sus perfiles genéticos), por lo que algunos parámetros genéticos y las frecuencias de aparición de algunos alelos, pueden estar sobreestimadas.

VVS2 VVMD5 VVMD 7

0,25 0,35 0,5 0,3 0,2 0,4 0,25 0,1 5 0,2 0,3 0,1 5 0,1 0,2 0,1 0,05 0,1 0,05 0 0 0

VVMD 27 ZAG62 ZAG79

0,35 0,6 0,35

0,3 0,5 0,3 0,25 0,25 0,4 0,2 0,2 0,3 0,1 5 0,1 5 0,2 0,1 0,1 0,05 0,1 0,05 0 0 0 236 pb 242 pb 246 pb 248 pb 250 pb 254 pb 256 pb 258 pb 260 pb 1 75 pb 1 77 pb 1 79 pb 1 81 pb 1 85 pb 1 90 pb 1 84 pb 1 86 pb 1 90 pb 1 92 pb 1 94 pb 1 98 pb 200 pb 202 pb

Figura 2. Tamaño de alelos observados en pares de bases en abcisas y frecuencias alélicas en ordenadas para cada microsatélite.

El número total de alelos para cada locus varía entre 10 para VVS2 y 6 para VVMD27, con un total de 49 alelos para todos los loci y una media de 8 alelos por locus. En la figura 2, se observa que las mayores frecuencias alélicas se han encontrado en VVMD7-236 y ZAG62-186, superiores a un 45%. Sólo 9 alelos mostraron frecuencias superiores al 20%, y 16 alelos fueron relativamente infrecuentes (menos de un 5%) . Tabla 3, Parámetros genéticos de los seis microsatélites analizados: Ao, Nº de alelos, He, Heterocigosidad esperada, Ho, Heterocigosidad observada, Fr, Frecuencia de alelos nulos, PEP. Poder de discriminación y PI, Probabilidad de identidad.

Locus NºAO He Ho Fr PEP PI VVS2 10 0,800 0,890 -0,050 0,620 0,115 VVMD5 9 0,844 0,959 -0,062 0,686 0,082 VVMD7 7 0,691 0,767 -0,045 0,454 0,235 VVMD27 6 0,801 0,836 -0,019 0,610 0,122 ZAG62 8 0,721 0,767 -0,027 0,529 0,151 ZAG79 9 0,779 0,836 -0,032 0,578 0,145 Total 49 0,995 5,937x10-6 Media 8,167 0,773 0,843 -0,039

Los seis microsatelites utilizados en nuestra muestra reflejan un elevado poder de discriminación (99,5%) y una baja probabilidad de encontrar diferentes individuos con el mismo perfil genético para los 6 loci (PI. 5,9x10-6), por lo que los genotipos idénticos pueden ser considerados sinonimias. Esto confirma la idoneidad del sistema para la identificación genética.

La comparación de los perfiles genéticos de las 73 accesiones analizadas entre si, con los de las recogidas en la bibliografía consultada (Martín et al 2003), y con la base de datos propia elaborada con las variedades autorizadas y recomendadas de Castilla la Mancha, que se encuentran en campo en el IVICAM, permite extraer las siguientes conclusiones:

Redundancias: 17 de las accesiones analizadas correspondían con la misma denominación local y coincidieron en sus perfiles genéticos, por lo que se trata de muestras repetidas. Rojal (58, 66), Gordera Manchega (5, 63), Albillo (31, 65), Boton de gallo (25, 69), Moravia agria (40, 47, 49), Moravia dulce (16, 50), Moscatel (32, 41), Moscatel de grano menudo (70, 72), Tardana (10, 21).

Sinonimias: 46 de las plantas analizadas coincidían en sus perfiles genéticos, pero no en su denominación local, siendo algunas de ellas sinonimias de otras recogidas en la bibliografía de referencia y/o de las variedades autorizadas y recomendadas de Castilla La Mancha (Tabla 2).

Homonimias: 15 de las variedades analizadas coincidieron en la denominación, pero no en el perfil genético, como Coloraillo (44, 53 y 11, 12), Moravia dulce (39), Malvar (3), Moscatel (32, 41), Botón de gallo (20, 22, 25, 62 y 69), Teta de vaca (8) y Torrontes (33).

Por último, entre las 73 muestras analizadas encontramos 17 perfiles genéticos únicos. 13 de ellos estuvieron presentes en una única accesión Bobal blanca (23), Boton de gallo (22), Coloraillos (44 y 53), Flamenca (64), Gallera Negra (52), Desconocida (37, 60), Moravia dulce (39), Pintailla (46), Teta de vaca (36) y Tinto fino (14) , 3 de ellos presentes en dos muestras cada uno Churriago (13) y Tinta de Villar de Olalla (29), Moscatel (32, 41) y Gordera Negra (54) y Roja (35) y 1 fue un perfil común para 3 accesiones Botón de gallo (25 y 69) y Gallera dorada (51). Tabla 4. Sinonimias encontradas entre las variedades estudiadas, así como la denominación dada por otros autores para los mismos perfiles genéticos.

Sinonimias encontradas entre las variedades estudiadas Denominación correcta Malvar (3), Blanca (18) y Airen (61) Airen1,2 Planta fina (24) y Pasera (71) Planta fina1 Moravio (55) y Bobal (56) Bobal1,2 Botón de gallo (62) Sinsó1 De la Panga (2) y Boton de Gallo (20) Teta de vaca1 Boton de Gallo (25, 69), Gallera dorada (51) Gallera dorada3 Negra (28) Tempranillo1, Cencibel2 Churriago (13) y Tinto de Villar de Olalla (29) Churriago3 Coloraillo Gordo (11), Coloraillo Pequeño (12), Machina (45), Rojal (58, Rojal1,2 66) y Tortosi (68) Chelva (73) Mantúo1 Garnacha (26) y Tinto basto (42) Garnacha1,2 Blanca pequeña (9) y Marisancho (17) Pardillo1,2 De Gallo (4), Uva de planta (19) y Teta de Vaca (8) Beba1 Crujidera (6), Colgadera (7), Moravia dulce (16,50) y Rucial (48) Brujidera1, Moravia dulce2 Gordera Roja (35) y Gordera Negra (54) Gordera Negra3 Derechero (1) Ariño1 Granadera (15) y Frasco (57) Tinto Velasco1,2 Albillo (31, 65) Albillo Mayor1 Gordera Manchega (5, 63), Gordera (30), Gordal (34) y Rompetinajas Corazón de Cabrito1 (67) Aris (27) Torrontes (33) Alarije1, Aris2 1 Denominación posible según la bibliografía consultada (Martín et al 2003) 2 Denominación según la base de datos propia elaborada con las variedades autorizadas y recomendadas de Castilla la Mancha. 3 Denominación propuesta

3.3. Caracterización ampelográfica.

De las 73 accesiones localizadas y recogidas hasta el momento (Tabla 2), sólo se han descrito morfológicamente 52, debido a que las restantes se han localizado en invierno o no se han podido describir por diversas causas; arranque del material, material en mal estado por inclemencias meteorológicas, falta de tiempo para llegar a todos los lugares en la época apropiada, etc., por lo que no se incluyen en los resultados. No obstante, este es un trabajo pendiente que se continuará en el momento apropiado.

Con las 52 accesiones descritas morfológicamente hasta el momento, se elaboró una matriz donde se recogieron los resultados de los caracteres morfológicos de la tabla 1, obteniendo el dendrograma representado en la figura 3, usando el método de agrupamientos UPGMA (unweighted pair-group method análisis). Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS.

Algunos de los resultados obtenidos mediante análisis genético, se han confirmado mediante ampelografía. Sin embargo, algunas de las variedades genéticamente idénticas, son claramente distintas ampelográficamente, como Gordera (30) y Gordera manchega (6), Gordal (34); Gallera dorada (51) y Botón de gallo (25); De la Panga (2) y Botón de gallo (20). También, se encuentran casos de variedades genéticamente distintas pero morfológicamente cercanas, como por ejemplo, Tinto fino (14) con Tinto basto (42), Garnacha (26).

La identidad de dos plantas en un número suficiente de microsatélites permite asegurar casi sin posibilidad de error que tienen un origen común. La conclusión habitual es que estas plantas pertenecen a la misma variedad o a variedades sinónimas. En raras ocasiones, una mutación en una variedad produce cambios en uno o varios caracteres agronómicos sobresalientes que hacen que pueda ser considerada una variedad diferente a la original. Estas mutaciones en general no son detectables mediante el análisis de ADN, puesto que afectan a una porción ínfima del genoma. Por ejemplo, en el caso del Tinto de la Pámpana blanca no se puede hablar de sinonimia de Tinto Velasco, dadas las diferencias morfológicas y agronómicas encontradas, que indican que se trata de una variedad distinta. Sin embargo, presenta una identidad genotípica en el análisis de microsatélites (Muñoz-Organero et al. 2002).

Por ello, es necesario complementar ambos estudios, a menos hasta que se consigan reunir en un mismo lugar y por tanto bajo las mismas condiciones ambientales, todas las variedades que se vayan prospectando en las distintas zonas de nuestra región, con objeto de evitar pérdida de información genética o morfológica.

Finalmente, indicar que, por las causas ya señaladas, el número de accesiones incluidas en ambos análisis no es el mismo, de modo, que es imposible que las muestras se agrupen exactamente igual.

Figura 3. Dendrograma que representa las relaciones morfológicas entre las accesiones estudiadas (construido a partir de la matriz de distancias de los datos ampelográficos usando el método de agrupamientos UPGMA).

La caracterización morfológica de cada una de las accesiones se ha completado con fotografías de los diferentes órganos descritos. En la figura 4, se incluyen a modo de ejemplo las fotografías realizadas de la sumidad, hoja adulta y racimo de la variedad Colgadera (7).

a b

c Figura 4. Fotografias de a) sumidad, b) racimo yc) hoja adulta envés y haz de la variedad Colgadera (7). 3.4. Estudio del estado sanitario de las cepas seleccionadas

Aunque hasta el momento hay 73 accesiones prospectadas, sólo se ha estudiado la presencia de virosis en 56 de ellas, debido a que se han eliminado aquellas accesiones que eran redundantes o sinonimias de otras, y por lo tanto de poco interés para su conservación. Se han analizado un total de 138 muestras debido a que de cada accesión se tomaron 2 o 3 cepas distintas.

La incidencia de virus para el total de las 138 muestras estudiadas se recoge en la tabla 5, Siendo el virus GFKV jaspeado el que se encontró en mayor proporción, en segundo lugar el GLRaV2 enrollado tipo 2, seguido de los GFLV entrenudo corto y GLRaV3 con un porcentaje en torno al 10% y el GLRaV1 con una incidencia inferior al 3%.

Tabla 5. Incidencia de los principales virus en las variedades minoritarias.

Virus Porcentaje GFLV: entrenudo corto infeccioso 10,37 GFkV: jaspeado 17,39 GLRaV1: enrollado (tipo 1) 2,22 GLRaV2: enrollado (tipo 2) 14,81 GLRaV3: enrollado (tipo 3) 10,37 ArMV: mosaico del arabis 0

De las 56 accesiones estudiadas, 40 tenían al menos una cepa sana, totalmente libre de virus, que sería interesante como material de reserva para el establecimiento en campo, y 16 que estaban infectadas con alguno de los virus estudiados, por lo que antes de plantarlas en el campo, habría que llevar a cabo un programa de saneamiento, mediante su cultivo in vitro.

Hasta el momento se mantienen en invernadero 6 plantas de cada una de las accesiones libres de virus, con el fin de establecerlas en campo, y otras 6 de las infectadas con virus, separadas físicamente de las sanas, a la espera de su saneamiento mediante su cultivo in vitro.

4. BIBLIOGRAFÍA - Martin JP, Borrego J, Cabello F, Ortiz JM (2003). Characterization of Spanish grapevine cultivar diversity using sequence-tagged microsatellite site markers. Genome. 46(1):10-8. - Muñoz-Organero, G.; Borrego, J.; Martín, J.P.; Rodríguez-Torres, I.; Ibáñez, J. Y Cabello, F. (2002). Tinto de la Pámpana Blanca y Tinto Velasco. Dos variedades de vid emparentadas. Viticultura y Enología Profesional. 82: 15-25. - O.I.V. (1984). Codes des caractères descriptifs des variétes et espéces de Vitis. Dedon A. Paris. - This P, Jung A, Boccacci P, Borrego J, Botta R, Costantini L, Crespan M, Dangl GS, Eisenheld C, Ferreira-Monteiro F, Grando S, Ibanez J, Lacombe T, Laucou V, Magalhaes R, Meredith CP, Milani N, Peterlunger E, Regner F, Zulini L, Maul E (2004). Development of a standard set of microsatellite reference alleles for identification of grape cultivars. Theor Appl Genet. 109(7):1448-58. - Wagner HW, Sefc KM (1999) IDENTITY 1.0. Centre for Applied Genetics, University of Agricultural Sciences Vienna, Austria

10.4. Parámetros fenólicos en uvas del cv. Merlot sometidas a diferentes tratamientos de riego. Puesta a punto de los métodos en campo y en laboratorio y primer seguimiento efectuado en 2005.

Objetivos

1º.- Conocer la respuesta productiva del cv. Merlot a diferentes regímenes de riego deficitario. 2º.- Definir esos regímenes según los déficits hídricos del cultivo determinados por el potencial hídrico foliar de base, Ψb. 3º.- Seguir la evolución en la síntesis y acumulación de las diferentes familias de fenoles en la uva entre el cierre del racimo y la madurez. 4º.- Comparar la composición fenólica de la producción de los diferentes tratamientos y establecer las diferencias.

Labores realizadas

El desarrollo del proyecto, presente en la agenda del servicio de investigación del IVICAM, ha representado una primera toma de contacto de nuestro equipo con el tema de la respuesta de la vid al estres hídrico. A partir del análisis de los datos obtenidos, y de la experiencia acumulada, se elaborará próximamente un protocolo experimental adaptado, a desarrollar durante los próximos 2-3 años.

El ensayo se desarrolló en una parcela cultivada con la variedad Merlot injertada sobre Fercal, de 4 años de edad, situada en el término de Argamasilla de Alba y perteneciente a la firma ALTOSA de Tomelloso.

Foto 1.- Variedad Merlot. Detalle de los órganos aéreos

En referencia a las labores realizadas en 2005, los siguientes puntos pueden ser considerados como resumen. • Se eligió el cv. Merlot como variedad de referencia, por su amplia difusión a nivel mundial y su prestigio como materia prima para elaboraciones destinadas a envejecimiento. • También se seleccionó el terroir manchego por excelencia: la llanura. Caracterizada por su extrema horizontalidad, fruto de un doble proceso de sedimentación detrítico y químico, presenta como rasgo particular la viva incidencia de fenómenos de encostramiento en el perfil del suelo y, en consecuencia, el gran desarrollo de los calcisoles pétricos.

Fotos 2 y 3.- Llanura manchega en el término de Argamasilla de Alba, lugar donde se sitúa la parcela. Detalle del corte de un perfil edafológico en un Calcisol pétrico.

• Un total de 4 tratamientos de riego deficitario con 2 repeticiones cada uno, a razón de 64 cepas dispuestas en un hilo por repetición.

T-1: 100% ETd, controlando el riego para alcanzar una integral de estrés hídrico, - Iψb, en torno a 110 Bares x día. En total unos 132 mm. añadidos como media.

T-2: 100% ETd y 50% ETd a partir del envero, controlando el riego para alcanzar una integral de estrés hídrico, -Iψb, en torno a 130Bares x día. En total unos 117 mm. añadidos como media.

T-3: 75% ETd y 50% ETd a partir del envero, controlando el riego para alcanzar una integral de estrés hídrico, -Iψb, en torno a 150Bares x día . En total unos 93 mm. añadidos como media.

T-4: 50% ETd, controlando el riego para alcanzar una integral de estrés hídrico, - Iψb, en torno a 220Bares x día . En total unos 70 mm. añadidos como media.

Un 5º tratamiento, el T-0, diseñado como los anteriores, propuesto por la empresa propietaria del viñedo.

• Los cálculos de ETd se hicieron diariamente, según las recomendaciones de riego dadas por el SIAR para el viñedo de Cencibel cultivado en espaldera en la zona. • Entre la floración y la madurez se aplicaron en total 20 sesiones de riego en cada tratamiento, espaciadas 3-4 dias entre el 17 de junio y el 16 de agosto y con dotaciones siempre ligeramente superiores a la Etd acumulada entre riegos. • Se hicieron medidas del potencial hídrico foliar de base (Ψb) con cámara de presión en cada uno de los tratamientos: en total 33 días entre el 3 de junio y el 16 de agosto. Cada dato de Ψb computado está constituido por la media de 8-10 medidas efectuadas en otras tantas hojas por cada tratamiento. Todas y cada una de las medidas fueron efectuadas, sin excepción, antes de la salida del sol. Foto 5.- Medidas de Ψb con cámara de presión tipo Scholander.

• Ya mediada la maduración se efectuaron medidas del índice LAI de área foliar y de la superficie foliar expuesta en cada tratamiento y repetición.

Foto 6.- Medidas de LAI con medidor de área foliar

Foto 7.- Medidas de Superficie foliar expuesta por medio de fotografía digital.

• Se efectuó un seguimiento del peso de la uva, y de la composición fenólica de hollejos y pepitas por separado, sobre un total de 7 muestreos de cada tratamiento y repetición, a razón de uno por semana entre el cierre del racimo y la madurez. • En el momento de la recolección se determinaron algunos parámetros agronómicos: peso de la vendimia por cepa, nº de racimos, peso medio del racimo y peso de 200 granos, así como otros de naturaleza físico-química para estimar diferencias de calidad en el fruto: parámetros convencionales, parámetros de la madurez fenólica y compuestos volátiles minoritarios. • Por último, se elaboraron microvinificaciones de cada tratamiento y repetición, que fueron posteriormente valoradas físico-química y organolépticamente.

Resultados obtenidos En la tabla 1 se muestran las medias de algunas variables agronómicas que expresan la distinta respuesta productiva del cultivo al régimen hídrico. Se aprecia un incremento de la producción con el riego, así como un aumento del peso unitario de las bayas y del racimo. Pequeñas diferencias en la entidad de la cubierta vegetal, que se expresan aquí por m. lineal de espaldera en los índices LAI (área foliar) y SA (superficie expuesta), se detectan entre los tratamientos; se deben, sin duda, a las condiciones impuestas por los distintos regímenes hídricos. En ningún caso se obtiene una relación SA/P equilibrada, debido fundamentalmente a un exceso de producción.

Producción Peso del Racimos/ Peso del LAI SA Relación -Iψb Kg/ha. grano (g) cepa racimo (g) m2/ml m2/ml SA/P Mpa.xdia T 13378 1.14 30,4 158,46 8,10 3,12 0,78 4,45 R-0 TR-1 12558 1.08 25,0 179,95 4,87 2,58 0,68 10,95 TR-2 12289 1.04 25,1 176,21 4,98 2,50 0,68 13,16 TR-3 10975 0.99 25,6 155,25 4,63 2,41 0,73 14,81 TR-4 8994 0.96 24,9 131,79 4,17 2,27 0,84 22,2 Tabla 1.- Respuesta agronómica al régimen hídrico. Valores medios de los parámetros agronómicos controlados.

Las medidas efectuadas de potencial hídrico foliar de base, Ψb, han permitido reconstruir una evolución del estrés hídrico en cada tratamiento de riego entre la floración y la recolección (fig. 1). Además, el cómputo de los datos diarios posibilitó la definición de una integral de estrés hídrico entre la floración y la madurez, -Iψb, que nos ha permitido evaluar las diferencias en la entidad de ese estres debidas a los tratamientos (tabla 1). Fecha y o un un un l ul ul ul o g ma un un j j j u j j j g ago a 5- -j -j 5- 2 1 8 1 22- 29- 6-j 13- 20- 27- 3-a 10- 17- 0

-0,1

-0,2

-0,3

-0,4

-0,5

-0,6 (Mpas.)

b -0,7 Ψ -0,8

-0,9 Floración Envero -1

-1,1

-1,2

T-4 T-3 T-2 T-1 T-0

Figura 1.- Itinerario hídrico seguido por los tratamientos: evolución diaria del Ψb.

Fruto del seguimiento del peso de la uva y de sus distintas fracciones, hollejos y pepitas, entre el cierre del racimo y la madurez son las figuras 2,3 y 4.

El punto de inflexión se sitúa a mediados de julio, unos días antes del envero, momento en que tiene lugar un incremento acelerado del peso de la uva, en general mayor cuanto mayor es la irrigación. Algo parecido ocurre con el peso de los hollejos y y, en sentido contrario, con las pepitas aunque, en estos casos, no aparezcan claras diferencias

240 230 220 210 200 190 180 170 160 150 140 Peso 200 granos 130 120 110 100 04-jul 09-jul 14-jul 19-jul 24-jul 29-jul 03- 08- 13- 18- Fig. 2.- Incremento ago ago ago ago Fecha del peso de las uvas en los distintos T0 T1 T2 T3 T4 tratamientos.

50,0

200 45,0 e

s d 40,0 esco r

nos 35,0 s f gra 30,0 llejo o

h 25,0

Peso 20,0 04-jul 09-jul 14-jul 19-jul 24-jul 29-jul 03- 08- 13- 18- Fecha ago ago ago ago

T0 T1 T2 T3 T4 Figuras 3 y 4.- Evolución del peso de los hollejos 19 y de las pepitas según 18 los tratamientos. 17 16 15

granos 14 13 12 Peso de las pepitas 200 11 04-jul 09-jul 14-jul 19-jul 24-jul 29-jul 03- 08- 13- 18- Fecha ago ago ago ago

T0 T1 T2 T3 T4

En la figuras 5, 6 y 7 se muestran los cambios en la composición de distintas familias de fenoles en los hollejos entre el cierre del racimo y la madurez.

) 1400 1200 1000 800 600 400 200

Antocianos (mg/kg uva 0 04-jul 09-jul 14-jul 19-jul 24-jul 29-jul 03- 08- 13- 18- ago ago ago ago Fecha Figura 5.- Evolución de los antocianos según los T0 T1 T2 T3 T4 tratamientos.

Como comentario general podría decirse que los tratamientos más estresantes indujeron un mayor incremento en la síntesis, y una mayor presencia, de polifenoles en el hollejo, especialmente de las fracciones antociánica y flavonólica. 1800

) 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 04-jul 09-jul 14-jul 19-jul 24-jul 29-jul 03- 08- 13- 18- Polifenoles totales (mg/kg uva ago ago ago ago Fecha T0 T1 T2 T3 T4 Figuras 6 y 7.- Evolución de los polifenoles totales y de la 80 fracción flavonólica en los 70 diferentes tratamientos. 60 50 40 30 20 10

Flavonoles (mg/kg uva) 0 04-jul 09-jul 14-jul 19-jul 24-jul 29-jul 03- 08- 13- 18- ago ago ago ago Fe cha

T0 T1 T2 T3 T4

Dado que contamos con finas medidas de estrés ( -Iψb) y de algunas variables productivas ( LAI, SA, Producción, Peso medio del grano, ...), estos parámetros fueron confrontados entre sí y con otros, determinados en las uvas en la madurez (ºBaumé, acidez total, antocianos totales, IPT, etc.). Algunas de las consecuencias más importantes que hemos podido extraer se resumen a continuación: • El estrés limita la producción (figura 8). El coeficiente de correlación muestral entre la producción (P por m. lineal de espaldera) y la -Iψb, teniendo en cuenta cada repetición, es de 0.936, siendo la regresión significativa para cualquier nivel de significación. La reducción de la producción entre tratamientos extremos se acerca al 35 % de la cosecha.

4,50

4,00 y = -0,0766x + 4,4961 R2 = 0,8754 (R = 0,936) 3,50 espaldera) .

3,00

2,50

Producción (kg/m 2,00 Fig 8.- Correlación producción 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 estrés hídrico. -Iψb (Mpasxdia)

• El peso unitario de la uva depende del nivel de estrés hídrico, -Iψb, soportado por la planta y, sobre todo, de la entidad de la vegetación expuesta ( SA), que a su vez está mayoritariamente regulada por aquel.

y = 0,2027x + 0,5182 1,2 R = 0,803 1,15 1,1 1,05 1 0,95 0,9

Peso del grano (g.) 0,85 0,8 Fig 9.- Correlación entre el 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3 3,1 3,2 3,3 peso unitario de la baya y la SA (m2/m espaldera) superficie foliar expuesta.

• El valor de Antocianos totales obtenido según el método de la madurez fenólica está regulado por la vegetación, vaya esta expresada como LAI o como SA. El valor del coeficiente de correlación muestral en este caso es de 0.971. Introduciendo el factor estrés, -Iψb, en el sistema se gana ligeramente en la explicación de la variabilidad del contenido en antocianos. El coeficiente de correlación múltiple alcanza un valor de 0.976.

1200 y = 1338,3- 74,13 LAI+ 4,19 -IΨb R = 0,976 1100

1000

900

800 Fig 10.- Correlación Antocianos totales múltiple entre la cantidad 700 de antocianos el estrés 700 800 900 1000 1100 1200 hídrico y la entidad de la vegetación. -IΨb-LAI

• De la misma manera, el índice de polifenoles totales (IPT) obtenido en los macerados a pH =1 ( método de la madurez fenólica) está regulado por los mismos factores estrés, -Iψb, y LAI, aunque en este caso la explicación de la variabilidad es inferior. El coeficiente de correlación múltiple alcanza un valor de 0.850.

110 100 90 y = -94+ 14,73 LAI+ 6 -IΨb R = 0,850 80 70

IPT (pH=1) 60 Fig 11.- Correlación 50 múltiple entre los polifenoles totales el 40 estrés hídrico y la entidad 40 50 60 70 80 90 100 110 de la vegetación. -IΨb-LAI

• El contenido en flavonoles queda muy bien explicado por el nivel de estrés , -Iψb, alcanzándose una R de 0.942 si se introduce también como variable explicativa el índice SA/P, que relaciona la superficie externa con la producción.

120 y = -203,28+ 4,81 -IΨb+ 242,6 SA/P R = 0,942 100

80

60

Flavonoles 40

20 Fig 12.- Correlación múltiple entre los 0 flavonoles el estrés 0 20406080100120 hídrico y la relación -IΨb-SA/P SA/P.

• Como ocurría anteriormente con los flavonoles, los taninos también dependen íntimamente de los niveles de estrés, -Iψb, y de la relación SA/P. Ambas variables, juntas, son capaces de explicar más de un 97% de la variabilidad en el contenido en taninos.

5,000 y = -203,28+ 4,81 -IΨb+ 242,6 SA/P 4,500 R = 0,973 4,000 3,500 3,000

Taninos 2,500 2,000 1,500 Fig 13.- Correlación múltiple entre los 1,000 taninos, el estrés 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 4,500 5,000 hídrico y la relación -IΨb-SA/P SA/P.

• Por ultimo, comentar la gran ligazón entre el índice de polimerización de los taninos (expresado por la relación Ddmach/taninos) y el nivel de estrés, -Iψb. El coeficiente de correlación muestral teniendo en cuenta cada repetición, es de 0.931, siendo la regresión significativa para cualquier nivel de significación. Cuanto más estresada la planta, menor es la relación Ddmach/taninos y, por tanto, mayor es su índice de polimerización.

140

120 y = -5,1047x + 154,47

s 100 R = 0,931 o n i 80

60 MACH/tan

D 40 d 20 Fig. 14.- Correlación entre el índice de polimerización 0 de los taninos y el estrés 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 hídrico. -IΨb

Resumiendo, podría decirse que la producción, tanto desde el punto de vista cuantitativo como cualitativo, estuvo muy influida por los niveles de estrés hídrico soportados por las plantas. Las diferencias de cosecha habidas entre los tratamientos y los distintos niveles de expresión manifestados por las diferentes familias de polifenoles así lo atestiguan.

Otros parámetros analizados en las uvas fueron los compuestos volátiles minoritarios que son los responsables del aroma. Algunos de los resultados más relevantes que se obtuvieron fueron los siguientes:

Monoterpenos

12

10

8

6

4

2 Fig.15.-Concentración

Concentración (ug/Kg de uva) 0 media de los diferentes linalol alfa-terpineol citronellol nerol geraniol monoterpenos en las uvas según el TR0 TR1 TR2 TR3 TR4 tratamiento.

Precursores

8 7

rea 6 P.I.) a 5 ón (A 4 o/Are t s 3 2 mpue oncentraci o C c 1 Fig. 16.- Concentración 0 media de los diferentes TR0 TR1 TR2 TR3 TR4 precursores en las uvas según el tratamiento. hidroxicitronellol hidroxilinalol 1,9-nonanodiol 1,10-decanodiol

Las concentraciones de hidroxicitronellol e hidroxilinalol están multiplicadas por 1000.

El monoterpeno que se encontró en mayor concentración fue el geraniol (6,36 ug/Kg de uva), seguido de citronellol (1,81 ug/Kg de uva) y nerol (1,59 ug/Kg de uva). El tratamiento más favorable fue el TR0, seguido del TR1.

En cuanto a los precursores, los compuestos más abundantes fueron el 1,9- nonanodiol (4,10 ud area compuesto/area P.I.) y el 1,10-decanodiol (3,89 ud area compuesto/area P.I.).

Total monoterpenos

20 18 16 14 12 10 8 6 4 Fig. 17.- Contenido total 2 medio de monoterpenos Concentración (ug/Kg de uva) 0 en las uvas de los TR0 TR1 TR2 TR3 TR4 diferentes tratamientos.

Total precursores ) . I 14 Area P. / 12

esto 10 u

mp 8

6 (Area co

n 4 ó

2 Fig. 18.- Contenido total traci medio de precursores en cen 0 n las uvas de los diferentes

Co TR0 TR1 TR2 TR3 TR4 tratamientos.

De los diferentes tratamientos, el más favorable en cuanto al contenido en monoterpenos resultó ser el TR0, seguido del TR2 y el TR3. En lo que respecta a precursores, el tratamiento más favorable fue el TR2, seguido del TR3 y el TR1.

Total fenoles

140 ) a 120 uv

de 100 g

80 ón (ug/K

i 60 c a

tr 40 n e 20 onc Fig. 19.- Contenido total C 0 medio de fenoles en las TR0 TR1 TR2 TR3 TR4 uvas de los diferentes tratamientos.

Los fenoles son otra familia importante de compuestos aromáticos. Se encontraron 8, de los cuales los más abundantes fueron la vainillina (56,0 ug/Kg de uva), la acetovainillona ( 6,70 ug/Kg de uva) y el fenol (4,80 ug/Kg de uva). El tratamiento con mayor contenido en compuestos fenólicos fue el TR2, seguido del TR0.

De estos resultados se deduce que los compuestos responsables del aroma en las uvas, se ven influenciados por el estrés hídrico al que se someten las plantas. Que el TR0 y el TR2 hayan resultado los tratamientos más favorables desde el punto de vista aromático puede deberse a dos motivos:

- En el TR0, a la mayor superficie foliar, ya que en nuestra latitud las altas temperaturas que se producen durante la maduración de la uva disminuyen la síntesis de compuestos volátiles; por tanto al estar más protegidos los racimos, la concentración de los compuestos aromáticos sería mayor. - En el TR2, puede ser debido a que el régimen hídrico elegido para este tratamiento fue el más adecuado para la síntesis de este tipo de compuestos.

Se establecieron correlaciones entre los compuestos volátiles minoritarios y los parámetros agronómicos. En la Tabla 2, se observan algunos de los resultados que se obtuvieron.

Tabla 2.- Coeficientes de correlación de Pearson más significativos entre compuestos volátiles en las uvas y datos agronómicos. citronellol α-terpineol geraniol a. bencílico 2-feniletanol ac. geránico vain. metilo % de huecos - 0,813** - 0,635* - 0,797** - 0,809** - 0,678* - 0,862** % racimos exteriores - 0,708* - 0,669* - 0,707* - 0,642* - 0,663* - 0,766** % racimos interiores 0, 637* 0,633* 0,664* Peso vendimia / ml espaldera 0,663* 0,855** 0,705* Anchura media espaldera 0,645* 0,655* 0,652* 0,640* 0,717* S.A. / ml espaldera 0,697* 0,744* 0,703* 0,702* 0,748* S.I. / ml espaldera 0,701* 0,696* 0,704* 0,685* 0,763* L.A.I. 0,710* 0,713* 0,711* 0,700* 0,765

* Correlación estadísticamente significativa al nivel 0,01. ** Correlación estadísticamente significativa al nivel 0,05.

En la tabla 2, aparecen reflejados coeficientes de correlación significativos entre los compuestos volátiles y algunos de los parámetros agronómicos. Se observa que los compuestos aromáticos dependen tanto de la cantidad de vegetación de la espaldera como de su distribución. Cuanto mayor es la cantidad de superficie foliar, menos expuestos están los racimos y mayor es la concentración de estos compuestos, lo que puede ser debido a que durante la maduración, las temperaturas elevadas dificultan su síntesis. También se aprecia que algunos compuestos aumentan con la producción, lo que indica que si no se sobrepasan ciertos límites, la calidad desde el punto de vista aromático aromático no tiene por qué verse afectada.