Synthèse Et Évaluation Pharmacologique D'analogues Préactivés De L'ifosfamide

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Synthèse et évaluation pharmacologique d’analogues préactivés de l’ifosfamide : prodrogues et nanoparticules à visée antitumorale Charles Skarbek

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Charles Skarbek. Synthèse et évaluation pharmacologique d’analogues préactivés de l’ifosfamide : prodrogues et nanoparticules à visée antitumorale. Pharmacie galénique. Université Paris Saclay (COmUE), 2017. Français. NNT : 2017SACLS247. tel-01618196

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REMERCIEMENTS

Je voudrais exprimer mes remerciements aux membres du jury, aux rapporteurs : les Maitres de Conférences Joseph Ciccolini et Sylvie Bégu, ainsi qu’aux examinateurs : les professeurs Elias Fattal, Thierry Martens et Nathalie Chaput ainsi que les docteurs Alain Herrera et Emilie Roger, d’avoir accepté de juger mon travail de thèse.

Je souhaite remercier le Dr Lluis Mir, directeur de l’unité UMR CNRS 8203 pour m’avoir accueilli dans son laboratoire « vectorologie et thérapeutiques anticancéreuses » et de m’avoir permis de réaliser mes travaux de thèse après mon stage de Master 2, au cours desquels j’ai pu développer la formulation des dérivés préactivés de l’ifosfamide et réaliser leur évaluation pharmacologique.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au Pr Angelo Paci, mon directeur de thèse, pour m’avoir accueilli dans l’équipe « vectorologie chimique », pour m’avoir offert l’opportunité de travailler sur un projet de recherche scientifique intéressant et pour m’avoir guidé pendant ces années de thèse. Je le remercie de m’avoir transmis ses connaissances en pharmacologie avec pédagogie ainsi que pour m’avoir encouragé pour présenter mes travaux lors de plusieurs congrès internationaux.

J’adresse mes remerciements au Pr Erwan Le Gall pour son accueil au sein de son équipe « électrochimie et synthèse organique » au sein de l’institut de chimie des matériaux Paris Est (UMR CNRS 7182) et de m’avoir permis de réaliser la synthèse des analogues préactivés de l’ifosfamide durant mon stage de master 2 et mes années de thèse.

Je veux adresser un grand merci au Dr Michaël Rivard, maitre de conférences, pour m’avoir transmis tout son savoir dans le domaine de la chimie organique. Je le remercie pour sa grande disponibilité pendant mes expériences de laboratoire. Je le remercie aussi pour sa contribution lors de la rédaction de mon manuscrit.

Je souhaite remercier le Pr Jean-Pierre Benoit ainsi que le Dr Emilie Roger pour leur collaboration et pour la mise en œuvre des travaux d’encapsulation de certains analogues préactivés de l’ifosfamide.

Je voudrais aussi remercier le Pr Nathalie Chaput et les Dr Mélanie Desbois et Dr Sophie Viaud (Laboratoire d’Immunomonitoring en Oncologie, Gustave Roussy) qui m’ont permis d’acquérir une expérience en immunologie lors des travaux sur l’étude de l’effet immunomodulateur de l’ifosfamide. Je remercie aussi plus particulièrement Julia Delahousse qui a participé grandement à cette étude.

Je remercie vivement Alain Deroussent, ingénieur de recherche, qui m’a apporté ses connaissances en chimie analytique et son expertise en spectrométrie de masse. Je le remercie aussi pour sa disponibilité lors de la correction et la rédaction de mes articles ainsi que de mon manuscrit.

J’exprime ma sincère gratitude à l’ensemble de mes collègues de l’équipe « électrochimie et synthèse organique » et plus particulièrement au Dr Anthony Olivier ainsi qu’à Patrice Renevret qui ont tous les deux participé à la réussite de mon projet de recherche.

Je tiens à remercier le Dr Eric Le Cam, Catherine Durieu et Sonia Baconnais (UMR 8126) pour leur collaboration lors de la réalisation de l’étude des nanosystèmes par microscopie électronique à transmission.

Je remercie aussi le Dr Jean-Rémi Bertrand ingénieur de recherche pour avoir obtenu l’analyseur des nanoparticules par diffusion de la lumière.

Je remercie également l’équipe de la « plateforme d’évaluation préclinique » de Gustave Roussy, et plus particulièrement, le Dr Karine Ser Le Roux et Mélanie Polrot pour leur contribution à plusieurs études précliniques chez la souris.

Je remercie tout particulièrement le Dr Estelle Daudigeos-Dubus, Léa Lesueur, Julia Delahousse, Ludivine Le Dret, Antoine Azan, Alexandre Plessier, Atmane Seck pour leur présence, leur écoute, leur aide au quotidien dans le déroulement de mon projet de recherche ainsi que pour leur participation à mon épanouissement au sein du laboratoire.

Je remercie toutes les stagiaires (Aurore, Sandra, Valentine, Déborah, Naïma...) que j’ai pu encadrer lors de mon doctorat et qui ont participé à l’avancement de ce projet de recherche.

Je remercie enfin l’ensemble de l’unité « vectorologie et thérapeutiques anticancéreuses » de Gustave Roussy pour l’ambiance cordiale au sein du laboratoire.

TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS ...... 3

ABREVIATIONS ...... 9

LISTE DES ILLUSTRATIONS ...... 11

1 INTRODUCTION ...... 15

1.1 LES OXAZAPHOSPHORINES, AGENTS ALKYLANTS DE L’ADN ...... 15

1.1.1 Historique du développement des agents alkylants ...... 15

1.1.2 Mécanisme d’action des agents alkylants ...... 16

1.1.3 Généralités sur les oxazaphosphorines ...... 17

1.1.4 L’ifosfamide ...... 18

1.2 LES NANOTECHNOLOGIES ...... 24

1.2.1 Généralités ...... 24

1.2.2 Historique ...... 25

1.2.3 Classification des nanomédecines ...... 25

1.2.4 Classification selon leur composition ...... 28

1.2.5 Utilisation des nanomédicaments en cancérologie ...... 34

1.2.6 Caractérisation des nanomédicaments ...... 38

1.2.7 Propriétés des nanomédicaments ...... 41

1.2.8 Mécanismes de ciblage ...... 45

1.2.9 La nanotoxicologie ...... 48

2 OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THÈSE ...... 53

3 ETAT DE L’ART ...... 57

3.1 STRATÉGIES DE PHARMACOMODULATION ...... 57

3.1.1 Modification du cycle oxazaphosphorine ...... 57

3.1.2 Modification des chaînes latérales ...... 60

3.1.3 Modification de la moutarde alkylante ...... 62

3.2 IMMUNITÉ ET CANCER ...... 67

3.2.1 Généralités ...... 67

3.2.2 L’immunoediting ...... 70

3.2.3 Association chimiothérapie/immunothérapie ...... 72

3.2.4 Effet immunomodulateur des agents cytototoxiques ...... 73

4 RESULTATS ...... 77

4.1 ANALOGUES D’IFOSFAMIDE PREACTIVES PERMETTANT LA LIBERATION DE LA MOUTARDE

ISOPHOSPHORAMIDEE : SYNTHESE ET PREUVE DE CONCEPT ...... 77

4.1.1 Introduction de l’article ...... 77

4.1.2 Discussion de l’article ...... 80

4.2 ANALOGUES D’IFOSFAMIDE POLY-ISOPRENIQUES : AGENTS ANTITUMORAUX PREACTIVES

SOUS LA FORME LIBRE OU NANOPARTICULAIRE ...... 82

4.2.1 Introduction de l’article ...... 82

4.2.2 Discussion de l’article...... 95

4.3 ENCAPSULATION D’ANALOGUES PREACTIVES D’IFOSFAMIDE AU SEIN DE NANOCAPSULES

LIPIDIQUES (NCLS)...... 97

4.3.1 Introduction ...... 97

4.3.2 Etat de l’art ...... 97

4.3.3 Formulation de NCLs de pentanyloxy-ifosfamide (P-IFO) ...... 99

4.3.4 Matériel et méthodes ...... 101

4.3.5 Résultats ...... 103

4.3.6 Discussion...... 105

4.3.7 Conclusion et perspectives ...... 106

4.4 EFFET IMMUNOMODULATEUR DOSE-DEPENDANT DES OXAZAPHOSPHORINES : OPTIMISATION

DE LA COMBINAISON DES EFFETS IMMUNOMODULATEUR ET CYTOTOXIQUE ...... 109

4.4.1 Etat de l’art ...... 109

4.4.2 Abstract ...... 114

4.4.3 Introduction ...... 114

4.4.4 Materials and Methods ...... 116

4.4.5 Results ...... 118

4.4.6 Discussion...... 128

4.4.7 Discussion de l’article ...... 130

5 DISCUSSION GENERALE ...... 132

6 CONCLUSION ...... 136

7 PERSPECTIVES ...... 144

8 REFERENCES ...... 148

ABREVIATIONS

ACR : Acroléine

ADC : Antibody-drug conjugates

ADH : Aldéhyde déshydrogénase

ADN : Acide désoxyribonucléique

Br-IPM : Moutarde bromo-isophosphoramidée

CAA : Chloroacétaldéhyde

CD : Cellules dendritiques

CPA : Cellules présentatrice de l’antigène

CPM : Cyclophosphamide

CYP : Cytochrome P450

DDL : Diffusion dynamique de la lumière

EPR : Enhanced permeability retention

FDA : Food and drug administration

GSH : Glutathion

HO-IFO : 4-hydroxy-ifosfamide

IC50 : Concentration inhibitrice à 50%

IPM : Moutarde isophosphoramidée

LC-MS/MS : Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

MEB : Microscopie électronique à balayage

Mesna : 2-mercaptoéthane sulfonate de sodium

MET : Microscopie électronique à transmission

MTS : (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)

NCLs : Nanocapsules lipidiques

NICs : Nano-immuno combos

NK : Natural killer

NPs : Nanoparticules

PdI : Indice de polydispersité

PEG : Polyéthylène glycol

PLA : Acide polylactique

PLGA : Acide polylactique-co-glycolique

ROS : Reactive oxygen species

SD: Système de délivrance

SLN : Solid lipid nanocapsules

Th : Lymphocytes T helper ou auxilliaire

LISTE DES ILLUSTRATIONS

Figure 1: Structure chimique du gaz moutarde (sulfure de 2,2'-dichlorodiéthyle) ...... 15

Figure 2 : Structure chimique de la chlormétine (2-chloro-N-(2-chloroéthyl)-N-méthyl- éthanamine) ...... 15

Figure 3 : Structure chimique des oxazaphosphorines ...... 15

Figure 4 : Structure chimique du 2-mercaptoéthane sulfonate de sodium ou mesna ...... 22

Figure 5 : Liste non-exhaustive d’applications médicales des nanomédecines (adaptée de [100] ...... 25

Figure 6 : Représentation des trois générations de nanosystèmes [119] ...... 27

Figure 7 : Illustration et exemples de structures 0D, 1D, 2D and 3D (adaptée de [72]) ..... 28

Figure 8 : Représentation de nanosystèmes à base de polymères, (A) nanosphères, (B) micelles polymériques et (C) dendrimères...... 29

Figure 9: Liposomes unilamellaires [129] ...... 30

Figure 10 : Liste des techniques courantes utilisées pour synthétiser des nanosystèmes à base de silice [158] ...... 33

Figure 11: Proportions de nanomédicaments en cours d’essais cliniques en 2016 [188] .. 36

Figure 12 : Schéma des principales voies d'internalisation cellulaire : (A) la phagocytose et les différentes voies d’endocytose (B) (C) (D) et (E) [206] ...... 41

Figure 13 : Les étapes de phagocytose d’un nanosystème [206] ...... 42

Figure 14: Représentation du ciblage actif [235] ...... 47

Figure 15 : Evolution du nombre de publications relatives aux nanotechnologies et à la toxicité des nanotechnologies [242] ...... 48

Figure 16 : Structure chimique d’analogues soufrés du CPM ...... 57

Figure 17 : Numérotation du cycle oxazaphosphorinine ...... 58

Figure 18 : Structure chimique de l’analogue 4-méthyle-cyclophosphamide ...... 58

Figure 19 : Structure chimique du 4-hydropéroxy-ifosfamide (A) et du 4-hydroxy-ifosfamide (B) ...... 59

Figure 20 : Structure chimique du mafosfamide ...... 59

Figure 21 : Exemples de substitutions en position 5 ou 6 ...... 59

Figure 22 : Structure chimique d’analogues polycyclique à jonction [5,6] ...... 60

Figure 23 : Structure chimique d’analogues par remplacement d'halogène(s) ...... 60

Figure 24 : Structure chimique du 7,9-diméthyle-ifosfamide (7,9-diMe-IFO)...... 61

Figure 25 : Structure chimique de l'estramustine ...... 62

Figure 26 : Structure chimique de la bendamustine ...... 63

Figure 27 : Structure chimique du melphalan ...... 63

Figure 28 : Structure chimique du glufosfamide ...... 64

Figure 29 : Structure chimique du sel de trométhamine-palifosfamide ...... 64

Figure 30 : Structure chimique du sel de lysine-palifosfamide ...... 64

Figure 31 : Structure chimique du l’évofosfamide ...... 65

Figure 32 : Cellules de l’immunité innée et adaptative [368] ...... 67

Figure 33 : Représentation d’une nanocapsules lipidique (adaptée de [86]...... 98

Figure 34 : Courbes de survie du P-IFO sous la forme libre (●), encapsulé dans les NCLs (■) ou des NCL non chargées (▲) sur les lignées A673 (A) ou RMS-1 (B) après 72h d’incubation ...... 104

Figure 35 : Cinétique de libération du P-IFO et du HO-IFO à partir des NCLs chargées (n=2) ...... 105

Figure 36: Représentation chimique du cyclophosphamide...... 109

Schéma 1 : Mécanisme de formation de l’aziridinium ...... 16

Schéma 2 : Mécanisme d’alkylation de la moutarde azotée ...... 16

Schéma 3: Métabolisme de l’IFO ...... 20

Schéma 4 : Disciplines entrants en jeux lors du développement de nanomedecament .... 37

Schéma 5 : Principe de la technique de diffusion dynamique de la lumière [200] ...... 39

Schéma 6 : Méthodologie de détermination du potentiel zêta (HORIBA Scientific) ...... 40

Schéma 7 : Les voies d’endocytose [206]...... 43

Schéma 8 : Représentation de l’effet EPR [231] ...... 46

Schéma 9 : Caractéristiques du CPM et de l'IFO ...... 53

Schéma 10: Représentation schématique du projet relatif à la préactivation de l’IFO...... 55

Schéma 11 : Représentation schématique du projet relatif à l’immunomodulation par les oxazaphosphorines ...... 56

Schéma 12 : Métabolisme des analogues 7,9-diMe-IFO ...... 61

Schéma 13 : Représentation de la théorie d' « immunoediting » [387] ...... 70

Schéma 14 : Représentation schématique du projet relatif à la préactivation de l’IFO...... 79

Schéma 15: Représentation schématique du projet relatif à la préactivation de l’IFO...... 94

Schéma 16 : Représentation schématique de la méthode d’inversion de phase (adaptée de [414])...... 99

Schéma 17: Représentation schématique du projet relatif à la préactivation...... 107

Schéma 18 : Etude de l’effet immunomodulateur de l’IFO comparativement au CPM .... 111

Schéma 19 : Mise en évidence de l'effet immunodulateur de l'IFO ...... 130

Schéma 20 : Synthèse d’analogues préactivés de l’ifosfamide ...... 136

Schéma 21 : Synthèse et évaluation pharmacologique in vitro des analogues X-IFO : ... 137

Schéma 22 : Evaluation pharmacologique in vivo de l’analogues G-IFO ...... 139

Schéma 23 : Preuve de concept de l'effet immunomodulateur de l'IFO ...... 141

Schéma 24 : Pégylation et évaluation pharmacologiques des nano-X-IFO ...... 144

Schéma 25 : Combinaison de la méthylation et de la préactivation de l’IFO donnant lieu à de nouveaux analogues de l’IFO ...... 145

Schéma 26 : Stratégies de combinaison de la préactivation et de l’effet immunomodulateur des oxazaphosphorines ...... 146

1 INTRODUCTION

1.1 Les oxazaphosphorines, agents alkylants de l’ADN

Historique du développement des agents alkylants

Lors de la première guerre mondiale (1914-1918), l’armée allemande a mis au point en 1917 un nouveau gaz de combat, le gaz « moutarde », nom caractéristique lié à sa couleur et à son odeur irritante (Figure 1).

Figure 1: Structure chimique du gaz moutarde (sulfure de 2,2'-dichlorodiéthyle)

Les victimes de ce gaz moutarde présentaient, outre les brûlures des voies respiratoires et digestives supérieures, une diminution des éléments figurés du sang, ou leucopénie, pouvant aller jusqu’à des aplasies fatales [1, 2]. Puis, l’utilisation clinique de ces composés cytotoxiques dans les années 1940 marque les débuts des traitements de chimiothérapie anticancéreuse avec la modification structurale du gaz moutarde en chlorméthine (Ledaga™) [3-5] (Figure 2).

Figure 2 : Structure chimique de la chlormétine (2-chloro-N-(2-chloroéthyl)-N-méthyléthanamine)

La chlorméthine est la première moutarde à l’azote à être utilisée dans le traitement de la maladie de Hodgkin [5]. Comme toutes les moutardes à l’azote, la chlorméthine est un agent bisalkylant, porteur de deux chaînes chloroéthyles responsable de la propriété alkylante.

Cependant, sa très grande instabilité en milieu aqueux et sa faible spécificité vis-à-vis des cellules tumorales est un frein à son utilisation. Pour pallier ces inconvénients, il a été envisagé une cyclisation de la moutarde à l’azote, ayant pour finalité la formation d’une prodrogue stable et permettant une libération de l’entité active uniquement après métabolisation. Cette stratégie a servi au développement de la synthèse des oxazaphosphorines dont les principaux représentants sont : le cyclophosphamide (CPM) et l’ifosfamide (IFO) porteurs de deux chaînes, et chloroéthyles ainsi que le trofosfamide porteur de trois chaînes chloroéthyles (Figure 3).

Figure 3 : Structure chimique des oxazaphosphorines

Ces composés anticancéreux représentent un groupe important d’agents alkylants, ayant une activité antinéoplasique, accompagnée d’une activité immunomodulatrice dans le cas du CPM. Ils sont encore très utilisés en clinique, aussi bien en oncologie qu’en hématologie dans le cas du CPM et de l’IFO [6-8], qu’en médecine interne et en rhumatologie pour ses propriétés immunosuppressives dans le cas du CPM [9, 10].

Mécanisme d’action des agents alkylants

Les agents alkylants sont des molécules qui possèdent la propriété d’interagir directement avec les bases de l’ADN. Cette interaction mène à la formation de liaisons covalentes avec généralement l’azote en position 7 de la guanine via la formation d’une substance électrophile. Dans ces composés, ce sont les chaînes chloroéthyles qui sont responsables de l’alkylation via la formation de l’ion aziridinium (Schéma 1).

Schéma 1 : Mécanisme de formation de l’aziridinium

Le mécanisme d’alkylation correspond à une réaction de greffage d’une chaîne alkyle sur un radical accepteur par une liaison covalente correspondant à une réaction de substitution nucléophile d’ordre 2. Une première chaîne chloroéthyle subit une cyclisation avec le départ de l’ion chlorure permettant la formation de l’ion aziridinium (intermédiaire électrophile). Puis, le doublet non-liant de l’azote en position 7 de la guanine réagit ensuite avec l’arizidinium permettant la formation d’une liaison covalente entre l’agent alkylant et l’ADN. La seconde chaîne chloroéthyle subit la même réaction permettant la formation d’une seconde liaison covalente avec l’ADN (Schéma 2).

Schéma 2 : Mécanisme d’alkylation de la moutarde azotée

Ces deux liaisons peuvent être inter-caténaires (entre deux brins complémentaires d’ADN) ou intra- caténaires (dans le même brin d’ADN). La formation de ces liaisons covalentes engendre une rigidité de l’ADN modifiant ainsi sa structure. Ceci a pour conséquence le blocage des processus normaux du fonctionnement de l’ADN, tels que sa réplication et sa transcription. L’alkylation conduit finalement à la mort cellulaire par apoptose [11].

Généralités sur les oxazaphosphorines

Parmi les principaux représentants des oxazaphosphorines (Figure 3), l’IFO et le CPM sont des isomères de position liés à la présence des deux groupements chloroéthyles se trouvant, soit sur les azotes endocyclique et exocyclique dans le cas de l’IFO, soit exclusivement sur l’azote exocyclique dans le cas du CPM, (Figure 3). La première synthèse du CPM a été décrite en 1954 et suivie de sa commercialisation en 1959 par les Laboratoires Asta Medica puis par Baxter Oncology sous le nom d’Endoxan® [12, 13]. Concernant l’IFO, sa première synthèse a été décrite dans les années 1960 suivie de sa commercialisation en France depuis 1977 par les Laboratoires Asta Medica puis Baxter Oncology sous le nom d’Holoxan® [14, 15]. Ces deux composés, en mélange racémique, sont administrés par voie parentérale. De plus, le CPM est aussi administré par voie orale à faible dose (Endoxan® 50mg). Bien qu’il s’agisse d’isomères, ces deux composés présentent des activités différentes liées à leurs métabolismes distincts (Tableau 1).

Tableau 1: Principales caractéristiques différenciant le CPM de l’IFO [11]

L’effet cytotoxique des oxazaphosphorines dépend de leur capacité d’alkylation de l’ADN. Comme prodrogues, elles sont métabolisées principalement dans le foie par les cytochromes P450 (CYP) menant à la formation de la moutarde azotée après oxydation du carbone en position 4 du cycle oxazaphosphorine. Cette moutarde azotée entre ensuite dans le noyau afin de réagir avec les bases de l’ADN, et plus particulièrement l’azote en position 7 de la guanine, par liaison covalente du groupe actif à l’azote de la guanine aboutissant à la formation de ponts inter- ou intra-brins provoquant une toxicité tissulaire et la mort cellulaire [16, 17]. D’autres bases de l’ADN peuvent aussi être ciblées par l’action de la moutarde azotée comme l’azote N-1 et N-3 de l’adénine, l’azote N-3 de la cytosine, et l’oxygène O-6 de la guanine mais elles sont plus rares [18].

L’ifosfamide

1.1.4.1 Présentation

L’IFO possède deux groupements chloroéthyles, l’un sur l’azote exocyclique et l’autre sur l’azote endocyclique (Figure 3). Il est administré par voie parentérale uniquement et est indiqué dans le traitement de divers types de cancers : lymphomes non Hodgkiniens, maladie de Hodgkin en rechute, cancer de l’ovaire, du col utérin et des testicules en rechute, les cancers pulmonaires et des voies aéro-digestives supérieures dont les cancers bronchiques à petites cellules ou non, les sarcomes des tissus mous, les cancers osseux chez l’homme et l’enfant, ainsi que les cancers du sein métastatiques. L’administration s’effectue principalement par voie intraveineuse en perfusion lente (1,5 g/m2/h) en perfusion continue sur 24, 72, 96 heures, et jusqu’à 7 jours. Selon le traitement et l’indication thérapeutique, la posologie est réalisée suivant quatre schémas d’administration, d’après Baxter sur Holoxan_RCP :

1) en association, 1 à 3 g/m²/j par cycles courts de 3 à 5 jours, renouvelables toutes les 3 à 4 semaines avec une dose totale / cycle de 3 à 15 g/m² ;

2) en perfusion continue, sur 24 heures, 5 à 8 g/m², à renouveler toutes les 3 à 4 semaines ;

3) à fortes doses, en perfusion continue, sur 5 jours, 10 g/m², à renouveler toutes les 3 à 4 semaines ;

4) ou à hautes doses, en perfusions répétées sur 6 à 7 jours, la dose maximale tolérée est de 24 g/m², à renouveler toutes les 3 à 4 semaines.

Du fait de la relation entre l’efficacité cytotoxique et la dose administrée, des protocoles dits « hautes doses » ont été développés permettant de surmonter les résistances tumorales [19]. La posologie de ces protocoles peut ainsi atteindre des doses totales de plus de 20 g/m², administrées en 6 à 7 jours, répétées toutes les 3 à 4 semaines.

1.1.4.2 Métabolisme

L’IFO est intrinsèquement inactif : il s’agit d’une prodrogue qui, pour libérer l’entité active, doit subir une activation enzymatique principalement dans le foie par les CYP. Ces enzymes intracellulaires sont situées au sein du réticulum endoplasmique des hépatocytes ainsi que dans toutes les cellules détenant ce type de matériel enzymatique (cellules rénales, cellules du tube digestif…). Cette activation permet la libération de la moutarde isophosphoramidée (IPM) qui constitue la forme active responsable de l’activité alkylante. On distingue deux voies de métabolisme pour l'IFO (Schéma 3).

1) La première, la voie activatrice dite "anabolique", consiste en l’oxydation enzymatique par l’isoforme CYP3A4 en position 4 du cycle de l'IFO conduisant au 4-hydroxy-ifosfamide (HO-IFO), qui est en équilibre avec sa forme tautomère, 4-aldo-Ifosfamide (aldo-IFO). Cependant, cette voie activatrice permet la libération du HO-IFO à hauteur d’environ 10 à 20 % [20]. Deux types de réactions peuvent ensuite avoir lieu :

a) une réaction chimique de type « retro-Michael », à l’origine de la libération de la moutarde isophosphoramidée, correspondant à l’entité active ayant l’activité bisalkylante, accompagnée d’acroléine (ACR), un aldéhyde hautement réactif et responsable d’urotoxicité.

b) une oxydation de l’aldo-IFO par l’aldéhyde déshydrogénase humaine de type 1 (ADH-1) menant au carboxy-ifosfamide (carboxy-IFO) inactif et sans activité alkylante.

2) La deuxième voie de métabolisme, la voie toxicogène dite "catabolique", consiste en l’oxydation des chaînes latérales par les isoformes CYP2B6 et CYP3A4 [21]. Cette voie conduit à la déchloroéthylation de l’IFO en trois métabolites inactifs N-déchloroéthylés, N2-déchloroéthyl- ifosfamide (N2-DCE-IFO), N2,N3-di-déchloroéthyl-ifosfamide (N2,N3-di-DCE-IFO) et N3- déchloroéthyl-ifosfamide (N3-DCE-IFO). Cette déchloéthylation est accompagnée de la production en quantité équimolaire du chloroacétaldéhyde (CAA), qui est responsable de neurotoxicité et de néphrotoxicité [16, 22, 23]. Plus de la moitié de la dose d’IFO administrée subit la voie métabolique de N-déchloroéthylation [20] qui conduit à une libération importante de CAA.

Schéma 3: Métabolisme de l’IFO

L’IFO est peu lié aux protéines plasmatiques et sa distribution tissulaire semble être importante. Dans une étude menée chez l’enfant, il a été montré que les concentrations d’IFO dans le plasma et dans le liquide céphalo-rachidien étaient proches, mais ses métabolites les plus polaires franchissaient moins bien la barrière hémato-encéphalique [22]. Les métabolites de l’IFO sont éliminés par voie urinaire ou se lient définitivement à leurs cibles. Au final, moins de 20% de la dose administrée est retrouvée sous forme inchangée dans les urines [20, 24]. Il est noté que le métabolisme de l’IFO peut être affecté par divers paramètres comme la composition du produit (sous la forme de mélange racémique ou d’énantiomères purs) [25], la dose administrée [26, 27] ainsi que les différences physiologiques des patients (sexe, âge, dysfonctionnement hépatique ou rénal). Comme l’IFO est un produit chiral du fait que le phosphore constitue un centre asymétrique, il est administré en tant que mélange racémique. Les deux énantiomères sont ainsi présents (S-IFO et le R-IFO) avec une distribution égale entre les deux énantiomères. Cependant, la métabolisation des deux énantiomères est différente et donc leur toxicité l’est aussi. Il existe ainsi une préférence énantiosélective pour l’énantiomère S-IFO ayant ainsi un impact sur le métabolisme, la pharmacocinétique et donc sur l’efficacité des deux énantiomères [25, 28, 29].

1.1.4.3 Inconvénients liés au métabolisme de l’IFO

Le métabolisme de l’IFO présente de nombreux inconvénients liés à la variabilité de la voie d’oxydation et aux réactions d’inactivation pouvant influencer son efficacité en clinique.

Faibles hydroxylation et inactivation de l’IFO

Alors même que la réaction d’oxydation du cycle de l’IFO est à l’origine de la libération de l’entité alkylante, le métabolite intermédiaire HO-IFO qui en résulte n’est produit qu’en faible quantité. Ainsi, un taux d’hydroxylation d’environ 10 à 20 % est rapporté, avec une forte variabilité selon les patients, en particulier s’agissant de l’expression des différents isoformes du CYP3A4 [22, 30-33]. Comme indiqué précédemment, après hydroxylation, l’aldo-IFO, peut ensuite libérer le métabolite actif, la moutarde azotée, après avoir subi une réaction de type rétro-Michaël. Dans certains cas, l’aldo-IFO peut, après action de l’ALDH-1, se transformer en un métabolite inactif, le carboxy-IFO [16, 21, 27, 34]. La voie catabolique de l’IFO induit quant à elle une oxydation des chaînes latérales avec production de métabolites déchloroéthylés inactifs. La surexpression de certaines isoformes de CYP favorisant la voie catabolique peut amener à diminuer l’efficacité de l’IFO. Il existe différents isoformes possédant des activités cataboliques plus ou moins fortes et des variations de leurs expressions selon les individus [29, 31]. Cette déchloroéthylation de l’IFO représente 50 à 80 % de la métabolisation de l’IFO et varie selon les individus [11, 23, 30, 35].

Effets indésirables / Toxicités

En plus des effets secondaires inhérents aux traitements utilisant les agents alkylants (nausées, vomissements…), l’IFO possède d’autres toxicités spécifiques liées à son métabolisme :

1) une urotoxicité, due à l’ACR libérée concomitamment à la moutarde azotée, et commune à toutes les oxazaphosphorines [16, 36, 37],

2) une néphrotoxicité et une neurotoxicité dues à la libération de CAA en quantité équimolaire avec les composés déchloroéthylés, caractéristiques de l’IFO [18, 23, 24, 31, 38].

Urotoxicité

L’un des freins au développement de l’IFO dans les années 1980 a été l’urotoxicité, due à l’ACR, un des métabolites hépatiques de l’IFO. Celle-ci est caractérisée par une hématurie et des cystites hémorragiques pouvant menacer le pronostic vital du patient. En raison de cette toxicité sévère, l’utilisation de l’IFO a été limitée jusqu’au début des années 1990 [39]. En effet, l’ACR éliminée par voie rénale, présente une urotoxicité obligeant à l’arrêt du traitement. L’ACR est aujourd’hui

neutralisée par la co-administration systématique du 2-mercaptoéthane sulfonate de sodium (mesna, Uromitexan®) (Figure 4) [37, 40].

Figure 4 : Structure chimique du 2-mercaptoéthane sulfonate de sodium ou mesna

Co-administré avec l’IFO, le mesna réagit avec l’ACR conduisant à un composé thio-éther stable et non toxique, facilitant ainsi l’excrétion puis l’élimination de l’ACR tout en neutralisant sa toxicité [39- 43]. Une hydratation adaptée du patient ainsi que l’administration systématique de mesna permet ainsi de prévenir ou diminuer cette urotoxicité rendant possible l’utilisation de l’IFO à hautes doses [6, 19, 44, 45].

Néphrotoxicité

La néphrotoxicité de l’IFO, due à la libération de CAA après oxydation des chaînes latérales, est maintenant bien décrite, tant chez l’adulte que chez l’enfant [46-48]. D’importantes variations interindividuelles sont observées concernant la sévérité, la survenue ainsi que le type d’atteinte de cette toxicité. Les tubules rénaux proximaux représentent la principale cible de cette néphrotoxicité. Elle peut toucher l’ensemble du néphron conduisant à un dysfonctionnement, soit glomérulaire, soit tubulaire, et dans certains cas la combinaison de toutes ces atteintes peut être observées [38, 47- 53]. Le CAA peut aussi induire un syndrome de Fanconi associé à une acidose tubulaire proximale accompagnée de résorption tubulaire [46]. De ce fait, cette néphrotoxicité est un facteur limitant lors de l’utilisation de protocoles hautes doses, notamment chez l’enfant [54-56]. Lors de la métabolisation de l’IFO par la voie catabolique une forte N-déchloroéthylation est observée et une quantité équimolaire de CAA à l’origine de la néphrotoxicité est libérée [49, 57]. Le mode d'action toxique du CAA semble lié à une atteinte du métabolisme énergétique cellulaire par déplétion de la concentration cérébrale en glutathion (GSH) [58]. Contrairement à l’urotoxicité qui peut être contrée via l’administration de mesna, rien ne permet en revanche de prévenir la néphrotoxicité de l’IFO [59]. D’autres molécules, telles que l’amifostine, ont été proposées pour réduire cette néphrotoxicité [59]. La N-acétylcystéine a aussi montré un effet éventuel contre cette toxicité de l’IFO chez l’enfant [60].

Neurotoxicité

L’IFO ainsi que ses métabolites les plus lipophiles (CAA et N-DCE-IFO) ont la possibilité de pénétrer la barrière hémato-encéphalique et, de ce fait, se trouver dans le liquide céphalorachidien en concentration du même ordre que celle observée dans le sang [33, 61]. La présence de ces métabolites en concentration importante provoque des effets toxiques sur le système nerveux central assimilés à une encéphalopathie, qui se caractérise par divers effets secondaires tels qu’un

état épileptique, la dégénération du cortex cérébral, des hallucinations visuelles ou encore une confusion mentale [36, 62, 63]. Cette encéphalopathie peut avoir plusieurs sources, soit un déficit mitochondrial des acides gras menant à l’inhibition du transfert d’électrons aux flavoprotéines [64, 65], soit via l’accumulation du CAA dans le liquide céphalorachidien menant à une neurotoxicité directe caractérisée par une déplétion de GSH au niveau du système nerveux central [36]. Chez certains sujets, cette neurotoxicité centrale impose l’arrêt du traitement et conduit à des échecs thérapeutiques avec très peu d’alternatives. Les conditions précises de survenue de cette neurotoxicité centrale et/ou périphérique d’origine métabolique restent cependant mal définies [23].

Cardiotoxicité

A fortes doses, l’IFO induit une myocardite toxique pouvant aboutir dans certains cas à une nécrose diffuse du cœur. Les observations cliniques peuvent être variables allant de la péricardite à la nécrose du myocarde en passant par l’insuffisance cardiaque [66, 67].

1.2 Les nanotechnologies

Généralités

Le terme de nanotechnologie fait référence à une nouvelle discipline visant à concevoir des objets de taille de l’ordre de l’échelle nanométrique (10-9m). Le préfixe "nano", du grec "nanos" signifiant nain, est associée à diverses disciplines pour faire référence à l’utilisation d’objets dont la taille est de l’ordre du nanomètre, telles que :

1) les nanosciences, qui peuvent être définies comme l'étude des phénomènes et de la manipulation de matériaux à l'échelle atomique et moléculaire ;

2) les nanotechnologies, qui sont liées à la conception, la caractérisation, la production et l'application de structures, dispositifs ou systèmes par contrôle de leur forme et de leur taille au niveau nanométrique ;

3) parmi les nanotechnologies, les nanotechnologies pharmaceutiques et médicales, également appelées nanomédecine, englobent les applications de la nanoscience à la santé sous la forme de nanomatériaux ou nano-objets inertes de taille submicronique ou de dispositifs utilisés pour le traitement, le diagnostic, l'imagerie et l’adressage spécifique au niveau biologique.

A l’échelle du nanomètre, il est possible de concevoir une multitude d’objets tels que : des cristaux, des sphères, des fils et des tubes dont l’utilisation changent le mécanisme d’interaction moléculaire. De nos jours, les nanotechnologies peuvent être employées dans des domaines aussi variés que les matériaux et produits courants (tissus, cosmétiques, etc.) [68-70], l'électronique avec le développement de nano-composites et supports informatiques [71], les applications énergétiques durables (cellules solaires) [72] ainsi que les nanocapteurs [73]. Cependant, le terme de nanotechnologie est largement représenté par ses applications dans le domaine de la santé, l'imagerie médicale, le diagnostic [74, 75] et le traitement du cancer [76-81]. Le développement des nanotechnologies dans le domaine de la pharmacie et pour le traitement de maladies graves est en pleine expansion depuis le début des années 2000 [82, 83]. Ainsi, une multitude de types de nanotechnologies sont mis au point dans le domaine de la médecine, comme le développement de liposomes [84-88], de nanoparticules pour l'administration de médicaments (nanomédicaments) [75, 89-91], ou encore d’agents de contraste pour l’imagerie [92]. Lorsqu'elle est appliquée au domaine de la médecine, plus que la taille de la nanotechnologie, le système de délivrance (SD ou DDS en anglais) du médicament idéal peut être obtenu via l’utilisation de matériaux spécifiques ou d’objets. Ceux-ci ont l’avantage, dans certain cas, d’être biodégradables et également biocompatibles afin de diminuer tout effet indésirable potentiel ou une accumulation toxique dans l’organisme [93].

Historique

L'objectif principal d'un système de délivrance est de permettre une libération des agents thérapeutiques au niveau du site d'action souhaité, à une concentration appropriée et pendant la durée souhaitée. Faraday est considéré comme le premier à avoir découvert à la fin du 19e siècle des objets de taille nanométrique à la suite de ses travaux sur les relations expérimentales de l'or et des autres métaux à la lumière [94]. Puis en 1959, Feynman a donné une conférence à l'American Physical Society décrivant les immenses possibilités offertes par la miniaturisation. Cette conférence est maintenant considérée comme la pierre angulaire de l'invention des nanotechnologies. En outre, ses travaux ont été également récompensés par le prix Nobel de physique en 1965 [95], suivis de la conception de systèmes à libération prolongée des médicaments dans les années 1970 [96]. De nos jours, les applications des nanotechnologies au service de la santé sont en plein essor tant dans le domaine du traitement de maladies tels que le cancer, les troubles inflammatoires et les maladies cardiovasculaires, que dans le domaine du diagnostic [75, 95, 97].

Classification des nanomédecines

Le terme de « nanomédecine » correspond à l'application de la nanotechnologie dans le domaine de la santé. Elle conduit à la conception et à l'utilisation de nanomatériaux ou d’objets finement construits permettant le développement de nouvelles thérapies et de nouveaux produits de diagnostic. Leurs applications sont nombreuses (Figure 5), parmi lesquelles l'administration de médicaments, l'imagerie in vivo ou le diagnostic in vitro [98, 99].

Figure 5 : Liste non-exhaustive d’applications médicales des nanomédecines (adaptée de [100]

Le développement de ces nanomédecines permet une collaboration étroite entre la science fondamentale et l’ingénierie complexe qui intègre la chimie, la physique et la biologie des nanostructures. Les nanomédecines englobent ainsi l’élaboration, le développement et la production de nouvelles architectures nanostructurées, de nanomatériaux fonctionnels et de nanocomposants intelligents possédant des propriétés uniques [68, 101]. L’ensemble des laboratoires de recherche privés ou publics ou des entreprises de pointes ont aujourd'hui consacré de nombreux efforts au développement de ces nanomédecines menant à une révolution dans le domaine de la science et plus particulièrement dans la délivrance des médicaments par vectorisation de ces composés au sein d’un système de délivrance adéquat et donnant lieu aux « nanomédicaments » [102, 103]. Certaines de ces nouvelles nanomédecines sont entrées sur le marché ou en développement, quand bien d'autres sont encore au stade de la recherche. Le potentiel de ces innovations est énorme, mais leurs utilisations à long terme et leurs sécurités / toxicités sont encore inconnues.

La médecine conventionnelle se situe dans l’échelle du submicron et son action est souvent limitée en raison de sa faible spécificité. De ce fait, le développement de nanomédicaments, permet une augmentation de la spécificité d’action du composé et conduit à des progrès significatifs en termes de capacité de passage des différentes barrières biologiques [104]. Les nanomédicaments peuvent être classés selon différentes caractéristiques, telles que la dimensionnalité, la morphologie, la composition, l’homogénéité et l’agglomération.

1.2.3.1 Classification selon la complexité

Les nanomédicaments peuvent être classés selon leur complexité en trois grands types de générations (Figure 6).

Selon cette classification, la première génération décrit des systèmes d'administration de médicaments qui ciblent la lésion par un mécanisme passif utilisant l'effet EPR (Enhanced Permeability and Retention effect) proposé par Maeda [105] . Parmi ceux-ci, nous pouvons citer les liposomes [84, 88], les conjugués polymériques [106-108] ou lipidiques [86, 109], les micelles [110] ou les dendrimères [111, 112]. Cependant, ces produits de première génération se concentrent principalement au niveau du foie en raison de leur adsorption sur les protéines (opsonines) ce qui conduit ensuite à leur reconnaissance par les macrophages du foie. Comme indiqué précédemment, les opsonines qui s’adsorbent sur les nanosystèmes sont à l’origine de la capture hépatique. Pour y remédier, la « décoration » du nanosystème via l’utilisation de polymères hydrophiles et flexibles, tel que le polyéthylène glycol (PEG), permet d’inhiber l’adsorption des opsonines à la surface du nanosystème. Ces systèmes sont dits de deuxième génération. Ceci a mené au développement de nanosystèmes dits « furtifs » n’étant plus reconnus par le système réticulo-endothélial et menant à de nouvelles propriétés, tel qu’un temps de circulation accru. Cette augmentation du temps de circulation (ou du temps de résidence moyen) va ainsi permettre le ciblage passif de la tumeur par

concentration pharmacocinétique [113-115]. Cette deuxième génération peut ensuite évoluer vers des nanosystèmes d’un nouveau type ayant la propriété de cibler spécifiquement un type cellulaire. Cette troisième génération de nanosystèmes, aussi connue sous la dénomination de nanosystème « fonctionnalisé », possède des fonctionnalités avancées telles que :

1) la fixation de fragments de reconnaissance à la surface des nanosystèmes pour permettre une reconnaissance d’un récepteur cible bien identifié [116, 117], ou,

2) la possibilité d'une libération programmée du médicament au niveau de site actif [88, 118].

Figure 6 : Représentation des trois générations de nanosystèmes [119]

Ces générations successives de nanosystèmes sont, pour la plupart, une évolution progressive du nanosystème de première génération associée à une augmentation de sa sophistication.

1.2.3.2 Classification selon la dimension et la morphologie

Tout autant que sa complexité, la forme et la morphologie du nanosystème jouent aussi un rôle important sur ses propriétés intrinsèques. Selon la classification la plus récente [120], les nanosystèmes peuvent être classés en nanostructures de dimension zéro (0D), à une dimension (1D), à deux dimensions (2D) et à trois dimensions (3D) (Figure 7). La structure 0D correspond habituellement aux nanosystèmes dirigés dans les trois directions. Leur forme peut être sphérique (nanoparticules ou nanopores), cubique et polygonique. En ce qui concerne leur taille, elle varie de quelques nanomètres à quelques centaines de nanomètres. Les structures 1D sont des nanosystèmes longs, tels que les nanofils ou les nanotubes. Les nanostructures 2D sont quant à elles en dehors de la gamme nanométrique car elles sont principalement représentées par différents types de nanofilms, tels que les films minces multicouches ou encore les nanofeuilles. Les nanosystèmes 3D sont structurées et composées de plusieurs éléments répétés donnant un objet tridimensionnel final [72].

Figure 7 : Illustration et exemples de structures 0D, 1D, 2D and 3D (adaptée de [72])

Classification selon leur composition

Une dernière méthode de classification, correspondant aussi à la plus utilisée, se réfère à la composition du nanosystème :

1) les nanosystèmes organiques, à base de polymères ou de lipides ;

2) les nanosystèmes inorganiques, majoritairement constitués de composés métalliques.

1.2.4.1 Nanosystèmes organiques

Les nanosystèmes polymériques

Dans la plupart des cas, ces nanosystèmes sont composés de molécules ou blocks amphiphiles polymériques. Leurs avantages potentiels sont la présence d’une composition chimique plus précise, une multivalence de surface adaptée et la création d'une architecture tridimensionnelle définie soit par une macromolécule hydrosoluble synthétique, soit par création d’une nouvelle structure supramoléculaire [106, 107, 121]. Ces nanosystèmes sont souvent composés d'un noyau dans lequel le médicament est solubilisé et d’une couronne ou coquille qui protège le médicament de la dégradation et ce qui permet l’obtention de leur architecture finale. Les principaux représentants de cette classe sont les nanosphères (A), les micelles (B) et les dendrimères (C) (Figure 8).

Figure 8 : Représentation de nanosystèmes à base de polymères, (A) nanosphères, (B) micelles polymériques et (C) dendrimères.

Nanosphères

Ces nanosystèmes sont structurés en deux phases : un noyaux sphérique dans lequel le médicament est physiquement et uniformément dispersé, lui-même entouré d'une enveloppe ou d'un revêtement extérieur [122]. Le noyau est constitué de polymères compacts biocompatibles ou de polyacides tels que l’acide polylactique (PLA) ou l’acide polylactique-co-glycolique (PLGA) [123]. Ce noyau est biodégradable et conduit à des éléments inoffensifs après hydrolyse afin d'éviter l'accumulation de particules ou de molécules toxiques dans l’organisme. L'optimisation de l'utilisation de ces polymères conduit à différents types de propriétés d'encapsulation et de cinétiques de libération [124].

Micelles polymériques

Les micelles polymériques ont un diamètre allant de 10 à 100 nm et sont caractérisées par une structure noyau-enveloppe, formée par l'auto-assemblage de copolymères séquencés amphiphiles dans un environnement aqueux. Le noyau interne est souvent composé de chaînes hydrophobes typiquement composées de polycaprolactone ou d'acide poly-(acide lactique) (PLA) qui créent un espace approprié pour la solubilisation de médicaments lipophiles [125]. En outre, ce noyau interne est entouré d'une couronne composée de blocs hydrophiles. Ceux-ci deviennent très solubles dans l'eau et adoptent une apparence "déployée" qui conduit à divers types de possibilités de conformation [118].

Dendrimères

Les dendrimères sont des macromolécules globulaires de taille monodisperse avec des structures fortement ramifiées. Il existe deux types de structures de base : la première est la structure globulaire avec un noyau central à partir duquel les branches rayonnent. Le deuxième type n'a pas de noyau central et se compose simplement d'une série de polymères fortement ramifiés d'une taille d'environ

10 nm [111, 126]. Les dendrimères sont des nanosystèmes formés par des unités multiples avec des branches terminales fonctionnalisables. Ils peuvent incorporer divers types de composés soit par l'intermédiaire des groupes terminaux pouvant être fonctionnalisés, soit par encapsulation au sein de la cavité centrale, qui est composée de multiples monomères parfaitement ramifiés, généralement de polyaminoamine [111].

1.2.4.2 Les nanosystèmes à base de lipides

Liposomes

Les premiers liposomes ont été découverts dans les années 1960 [127] afin d’améliorer l'accumulation sélective du composés d’intérêt dans les tissus et les sites cellulaires souhaités [87, 128]. Ils correspondent à des vésicules sphériques artificielles biologiquement inertes et faiblement immunogènes. Ils sont formés par une ou plusieurs bicouches lipidiques concentriques composées de molécules amphiphiles qui s’auto-assemblent en milieu aqueux. Les liposomes peuvent être composés de phospholipides naturels ou synthétiques, permettant d’encapsuler des composés polaires dans le compartiment aqueux et apolaires dans la bicouche lipidique (Figure 9).

Figure 9: Liposomes unilamellaires [129]

Ils sont facilement formés à partir de molécules amphiphiles (le plus couramment des phospholipides). Ils sont non toxiques, non immunogènes, naturels et biodégradables [85, 87, 130]. Le Doxil®, premier liposome approuvé par la FDA en 1995, est un liposome pégylé encapsulant de la doxorubicine [131, 132].

La principale difficulté rencontrée lors du développement des liposomes réside dans leur stabilité qui dépend du ratio principe actif / lipide. Idéalement, ce ratio doit être élevé, mais augmenter ce rapport diminue la stabilité des liposomes en milieux aqueux. En général, les liposomes sont lyophilisés pour être conservés sous la forme de poudre, puis solubilisés juste avant utilisation. En

plus des problèmes de stabilité menant à la fuite de principes actifs, les liposomes présentent d’autres inconvénients tels que de faibles taux de chargement en principes actifs lipophiles et le besoin d’utiliser un solvant organique pour leur préparation [129].

Les conjugués médicament-lipides

Les conjugués médicament-lipides ont également été développés dans les années 1990 afin d'obtenir une meilleure charge de médicament pour les composés lipophiles [133, 134]. Cependant, de nos jours, ces systèmes sont principalement utilisés pour l'administration de médicaments hydrophobes possédant une faible hydrosolubilité limitant ainsi leur utilisation [135, 136]. Ils sont conçus en liant le médicament à une fraction lipidique par formation de sel ou par liaison covalente qui conduit au complexe médicament-lipide. Pour générer ces nouveaux composés, la liaison de diverses chaînes lipidiques peut être utilisée. Au cours du développement de ces composés, des chaînes lipidiques de types terpéniques ont pu être utilisées [137-139]. Parmi ces terpènes, l'utilisation du squalène a été largement décrite [137, 140, 141]. Le squalène, triterpène précurseur du cholestérol, est un hydrocarbure biocompatible largement répandu dans la nature et couramment utilisé comme excipient dans de nombreuses préparations pharmaceutiques [137, 142]. Lorsque le squalène est lié par liaison covalente à des composés hydrophiles tels que des agents alkylants, des antibiotiques ou des analogues nucléosidiques, le composé obtenu acquiert la propriété de s'auto-assembler spontanément dans des milieux aqueux pour former des structures nanométriques [89, 143-147]. La conjugaison par greffage chimique du squalène conduit à une augmentation de l'entrée cellulaire du composé grâce à la propriété intrinsèque de la molécule d’auto-assemblage sous la forme de nanoparticules (NPs). Basées sur cette technologie, des NPs de monophosphate de squalènoyl didésoxycytidine testées sur des cellules HIV-1 ont montré une augmentation d’un facteur 2 de l'activité anti-HIV in vitro de la molécule mère. De manière plus intéressante, des NPs d'adénosine squalène ont fourni une neuroprotection après un accident vasculaire cérébral engendrant une lésion de la moelle épinière [148]. De plus, la pégylation de ces NPs de squalène a montré une protection contre la dégradation et l'élimination rapide du plasma [149-151].

Les nanoparticules lipidiques

Les NPs lipidiques font fréquemment référence aux NPs lipidiques solides ou nanocapsules lipidiques solides (SLN), et ont été découvertes dans les années 1990 par séchage par pulvérisation et congélation de « micropellets » lipidiques suivi de leur caractérisation par microscopie électronique [152]. Les SLN sont des systèmes colloïdaux de délivrance de médicaments composés de lipides, d’eau et d’émulsifiants. Les lipides qui les constituent ont la particularité d’être solides à température ambiante et liquide à la température physiologique ce qui a pour but d’empêcher une libération immédiate du composé actif, rendant ainsi difficile sa diffusion à la surface [153]. De plus,

les lipides utilisés pour former le SLN présentent une faible toxicité aiguë et chronique [154]. Elles permettent d’encapsuler une grande variété de principes actifs, hydrophiles ou hydrophobes, ainsi que des peptides ou des protéines [109, 155]. Les avantages les plus importants des SLN par rapport aux autres nanosystèmes à base de lipides sont la libération contrôlée du médicament et la stabilité physique des préparations. Cependant, elles présentent encore certaines limitations telles que la charge limitée de médicament et l'expulsion du médicament pendant le stockage. Dans la plupart des études, les SLN sont administrées par voie intraveineuse avec des résultats probants mais elles peuvent également être un système de délivrance de médicaments par voie orale très prometteur, puisque cette voie d’administration permet d’éviter l’effet de premier passage et mène à une diffusion lente et continue du principe actif [156]. Une des formulations ayant connu un succès commercial est la Mucosolvan retard capsule® permettant la vectorisation de l’ambroxol au sein de nanocapsules lipidiques dans le cadre du traitement de toux et bronchites chroniques [153]. Le principal inconvénient des SLN concerne leur faible taux de chargement en principe actif. Celui-ci dépend fortement de la pureté des lipides utilisés pour la formulation et de l’étape de cristallisation. De plus, une fois les SLN obtenues, les principes actifs peuvent être expulsés de la maille lors du stockage des NPs.

Au sein de ce groupe, nous trouvons aussi les nanocapsules lipidiques (NCLs) qui font référence à des nanocapsules composés de lipides liquides et qui correspondent à une nouvelle technologie mis au point au sein de l’unité de « micro et nanomedecines translationnelles» (MINT, U1066) de l’Université d’Angers dirigée par le professeur Patrick Saulnier et dont la présentation se fera plus tard.

1.2.4.3 Les nanosystèmes inorganiques

Les NPs à base de silice, les NPs magnétiques guidées, les NPs de métaux nobles ou les nanostructures de carbone [157] constituent la majorité des nanosystèmes inorganiques.

Les nanosystèmes à base de silice

Les nanosystèmes à base de silice sont largement utilisés en raison de la possibilité de moduler leur taille, leur porosité et leur forme, ce qui leur permet d'être utilisés dans les domaines de l’imagerie biomédicale, l'intégration comme agents de contraste d'imagerie ou la délivrance contrôlée de médicaments [158-160]. De nombreuses techniques de préparation sont répertoriées permettant la formulation de nanosystèmes avec une gamme étroite de tailles et une composition presque uniforme [158]. Ces techniques conduisent à de nombreux types de nanosystèmes à base de silice tels que les nanosystèmes basiques de silice ou une architecture plus complexe comme les NPs mésoporeuses, les NPs à coquille centrale ou les NPs gravées. De plus, dans d'autres cas, des formes différentes peuvent être obtenues. Diverses techniques peuvent être utilisées pour synthétiser ces nanosystèmes à base de silice (Figure 10).

Figure 10 : Liste des techniques courantes utilisées pour synthétiser des nanosystèmes à base de silice [158]

Les nanosystèmes guidés magnétiques

Louis Néel montre en 1949 qu’en dessous d’une certaine taille, les NPs magnétiques entrent dans un état appelé superparamagnétisme [161]. Ce comportement concerne les NPs d’oxyde de fer possédant un diamètre inférieur à 20 nm et les NPs de fer pur. Lorsqu’elles sont soumises à un champ magnétique extérieur, les NPs peuvent émettre une propriété de magnétisme [162]. Ces nanosystèmes d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPION, pour « superparamagnetic iron oxide nanoparticles ») permettent donc de faire un contraste avec les tissus. Pour ces raisons, les SPION sont utilisées notamment en imagerie par résonance magnétique (IRM). Ils peuvent également être fonctionnalisés par des ligands de ciblage ou être incorporées dans des nanoparticules NPs encapsulant un principe actif, afin de leur apporter un élément d’imagerie [163].

Les « quantum dots », également connus sous le nom de nanocristaux, sont des semi-conducteurs nanométriques qui, en fonction de leur taille, peuvent émettre de la lumière dans toutes les couleurs de l'arc-en-ciel. Ces nanostructures confinent des électrons de bande de conduction, des trous de bande de valence ou des excitons dans les trois directions spatiales. Certains exemples de « quantum dots » sont les nanocristaux semi-conducteurs et les nanocristaux cœur-enveloppe, où il existe une interface entre différents matériaux semi-conducteurs. Ils ont été appliqués en biotechnologie pour le marquage cellulaire et l'imagerie, en particulier dans les études d'imagerie du cancer [164].

Les nanosystèmes à base de carbone

Nous pouvons également trouver des nanosystèmes à base de carbone tels que les fullerènes et les tubes de carbone. Ils se caractérisent par des molécules potentiellement poreuses à base de carbone, en treillis [165]. Les fullerènes sont de forme sphérique tandis que les tubes de carbone sont cylindriques et de forme allongée. Le diamètre d'un tube de carbone peut être de plusieurs nanomètres mais la longueur peut être beaucoup plus grande, jusqu'à plusieurs micromètres, en fonction de son utilisation prévue. Les nanotubes de carbone ont de nombreuses applications en science des matériaux. Cependant, ils ont également trouvé une utilisation dans le domaine de la biomédecine comme porteurs de vaccins, de médicaments et d'autres molécules [166].

Les nanosystèmes à base de métaux nobles

L’utilisation de l’argent ou de l’or dans l’obtention de nanosystèmes est maintenant bien décrite [167, 168]. Elle remonte au 5e siècle avant J.-C., où les NPs d’or, ou « or colloïdal » étaient utilisées pour donner une couleur rouge aux céramiques et aux verres. C’est au cours du 17e siècle que des solutions d’or colloïdales ont été utilisées pour le traitement de diverses maladies [169].

Ces nanosystèmes à base d’or peuvent avoir un diamètre allant de 2 à 200 nm et sont utilisés pour diverses applications biologiques, en imagerie et en photothérapie [167, 169]. Diverses méthodes de synthèse sont possibles, mais la méthode de synthèse la plus répandue est la réduction d’un sel de tétrachloroaurate par du citrate de sodium dans l’eau à 100°C. Les ligands citrates stabilisent les nanoparticules d’or. Ils sont ensuite facilement remplaçables par des ligands thiolés. Des ligands hydrophiles sont nécessaires pour apporter de la stabilité aux nanosystèmes et éviter leur agrégation [170].

Utilisation des nanomédicaments en cancérologie

Selon l'organisation mondiale de la santé, les maladies les plus meurtrières sont les maladies cardiovasculaires, le cancer et le diabète. Ainsi, le cancer représentant la deuxième maladie la plus mortelle dans les pays développés est en continuelle croissance. Les traitements classiques contre le cancer reposent sur la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie [171]. Bien que les agents antitumoraux présentent une grande efficacité dans leur domaine d’action et de traitement, ils doivent encore être administrés à une dose élevée pour obtenir une concentration appropriée au niveau du site d'action et ainsi assurer leur efficacité thérapeutique. Plus radicalement, les traitements de chimiothérapie, réagissent rapidement avec les cellules normales en division de par leur faible spécificité et sont à l'origine de divers effets secondaires toxiques [172-174]. Ce manque de spécificité induit une diminution de la concentration du médicament au niveau de la cible ainsi qu’une faible accumulation au niveau de la tumeur et, par conséquent, la réduction de l'efficacité du

traitement. Cette diminution de l'efficacité peut également conduire, dans certains cas, à la récidive de la maladie. Pour prévenir ces toxicités et améliorer l'efficacité et la spécificité de la chimiothérapie, le développement d'agents chimiothérapeutiques ciblés est apparu ces dernières décennies [82, 175, 176]. De nos jours, le développement de nanomédicaments contribue à la renaissance d’une multitude de composés (petites molécules, protéines, acides nucléiques, etc.) dont l’administration n’a pas pu se faire du fait de problème de solubilité (insolubles ou peu solubles dans l'eau) ou d’un manque de spécificité vis-à-vis de leur cible [151, 177-186]. Ainsi, l’utilisation de ces nanosystèmes permet de réduire les toxicités causées par l’administration de doses élevés. Elle permet aussi de diminuer les fluctuations de concentrations plasmatiques en principe actif en contrôlant la libération du principe actif au cours du temps. Ce contrôle permet d’assurer une concentration quasi constante, ce qui, à terme pourrait permettre une réduction ou un fractionnement des doses à administrer, celles-ci étant souvent responsable de la toxicité. Toutefois, parmi ces nanomédicaments, un faible nombre ont réussi à obtenir l'approbation de la FDA, parmi lesquels nous retrouvons les préparations Doxil® ou Myocet®, correspondant à de la doxorubicine encapsulée au sein de liposomes pégylés ou non, ou encore l’Abraxane® correspondant au couplage du paclitaxel à de l’albumine (Tableau 2).

Tableau 2 : Nanomédicaments utilisés en clinique pour le traitement du cancer [100]

De plus, une multitude de nouveaux nanomédicaments sont en cours d’évaluation dans le cadre d’essais cliniques [187, 188] (Figure 11).

Figure 11: Proportions de nanomédicaments en cours d’essais cliniques en 2016 [188]

Ainsi, l’oncologie est devenue l’un des domaines prioritaires de ces nanomédecines [189] mettant en collaboration une diversité disciplines scientifiques [76] (Schéma 4).

Schéma 4 : Disciplines entrants en jeux lors du développement de nanomedecament

Le développement de ces nanomédicaments a pour objectif de réduire la toxicité et d'améliorer la biodisponibilité ainsi que la spécificité permettant d’optimiser l’index thérapeutique du médicament de base et de ce fait la qualité de vie du patient. Cette approche permet également d’augmenter le temps de demi-vie du médicament en réduisant l'immunogénicité et en diminuant le métabolisme du médicament par la vectorisation de celui-ci afin de le protéger. Aujourd'hui, tous les domaines de la recherche, industrielle ou universitaire, ont compris l’importance de ces nouvelles entités, ce qui a conduit au développement de nouvelles formes de nanomédicaments. En outre, ceux-ci peuvent montrer de nombreux avantages apportés par leurs caractéristiques spécifiques :

1) la taille du nanomédicament peut être modulée afin de tirer profit du ciblage passif par l’intermédiaire de l’effet EPR;

2) la surface de celui-ci peut être modifiée afin d’apporter de la spécificité par un ciblage actif ;

3) le contrôle et la durabilité du médicament par le transport vers le site d'action contribuent à sa libération progressive au cours du temps au niveau de la cible, permettant ainsi d’atteindre une efficacité thérapeutique accrue accompagnée d’effets secondaires réduits ;

4) la charge de médicament, correspondant au processus d'incorporation du médicament au sein du nanosystème est optimale. Ainsi, plus cette charge est élevée, plus la dose à administrer peut-être diminuée permettant la réduction des effets secondaires ;

5) le greffage de ligands à la surface du nanosystème peut être effectué afin de permettre un ciblage spécifique d’un récepteur connu, pour assurer le guidage du nanosystème directement vers le site d'action par reconnaissance de récepteur ligand ;

6) le nanosystème peut être utilisé pour divers types de voies d'administration, y compris par voie orale et parentérale ;

A ce jour, de nombreux composés anticancéreux ont pu vivre une seconde vie grâce à leur développement sous la forme de nanosystèmes. Cette stratégie a ainsi permis une diminution de la cardiotoxicité de la doxorubicine lors de vectorisation au sein de liposome dans le cas du Caelyx® [190]. Dans la majorité des cas, ces nouveaux nanosystèmes ont permis d’accroitre considérablement la biodisponibilité ainsi que l’efficacité de la molécule mère, permettant ainsi de diminuer la dose administrée celle-ci étant, pour la plupart des cas, responsable de l’ensemble des effets secondaires toxiques [183, 191, 192].

Si, les nanomédicaments présentent de nombreux avantages, ils ont aussi leurs limitations [193- 195]. Ils sont de petite taille et de grande surface, ce qui peut conduire à une fusion ou à une agrégation conduisant à des nanosystèmes plus grands menant à la perte de certaines de leurs propriétés [196].

Caractérisation des nanomédicaments

D’une façon générale, les dimensions de ces nanosystèmes correspondent au diamètre géométrique, mesuré directement par microscopie électronique à transmission ou à balayage (MET ou MEB). En milieu aqueux, le nanosystème est recouvert d’une couche de solvatation formée d’espèces qui agissent comme solvant selon la charge et la taille du nanosystème, mais également selon la nature des solutés [197, 198]. Cette couche influence le mouvement brownien du nanosystème, c’est-à-dire le mouvement aléatoire celui-ci lors de son immersion dans un fluide ; elle est prise en compte dans le calcul du diamètre hydrodynamique du nanosystème. Le diamètre hydrodynamique correspond ainsi au diamètre d'une sphère théorique qui aurait le même coefficient de diffusion que la particule considérée. Il est évalué grâce à la technique de diffusion dynamique de la lumière (DDL, ou Dynamic Light Scattering - DLS en anglais) et correspond à la taille du nanosystème que va appréhender la cellule [199].

1.2.6.1 Caractérisation par diffusion dynamique de la lumière (DDL)

La technique de diffusion dynamique de la lumière permet de mesurer le diamètre de particules en suspension pouvant atteindre quelques centaines de nanomètres (nm) ainsi que leur charge [200]. En effet, en solution colloïdale, les particules rencontrent un faisceau laser et le dispersent dans toutes les directions. L’intensité du faisceau dispersé fluctue en fonction du temps en raison du mouvement brownien des particules. Grâce à un photomultiplicateur, l’appareil détecte les photons et analyse ces variations d’intensité pour donner les coefficients de diffusion des particules. Ces

coefficients permettent de calculer le diamètre hydrodynamique de la particule par l’équation de Stokes-Einstein [199, 201]. Le schéma général est présenté dans la figure ci-dessous (Schéma 5).

Schéma 5 : Principe de la technique de diffusion dynamique de la lumière [200]

Lors de ce travail de thèse, la caractérisation du diamètre hydrodynamique des nanosystèmes élaborés a été réalisée sur un appareil de mesure NanoBrook 90Plus PALS (Brookaven, NY, USA) associé à un logiciel dédié. Celui-ci a aussi permis d’évaluer le potentiel zêta (ζ) qui correspond au potentiel électrique mesuré au niveau du diamètre hydrodynamique de la particule en suspension, c’est à dire au niveau du plan de cisaillement (limite entre les parties de la solution qui se déplacent avec et sans la particule).

Le potentiel zêta représente la charge globale que la particule acquiert grâce aux ions qui l’entourent quand elle est en solution lui permettant d’atteindre la neutralité dans la solution. D’une façon générale, plus la valeur absolue de ce paramètre est élevée, plus la charge de la particule s’intensifie (négativement lorsque le potentiel zêta est négatif et inversement), apportant ainsi aux nanosystèmes leur stabilité en générant un effet répulsif lorsque deux particules se rapprochent. A l’inverse, au fur et à mesure que la valeur absolue de ce paramètre diminue, le nanosystème devient de moins en moins chargé diminuant de ce fait l’effet répulsif et menant souvent à l’agrégation voire à la fusion de plusieurs particules entre elles. Par conséquent, le potentiel zêta est un bon indicateur des interactions entre particules et donc de la stabilité colloïdale. Une suspension est considérée stable lorsque son ζ > ±30 mV.

Le schéma représentant la technique permettant la détermination du potentiel zêta d’une suspension de nanoparticules est présenté ci-dessous (Schéma 6).

Schéma 6 : Méthodologie de détermination du potentiel zêta (HORIBA Scientific)

La détermination de la taille et de la charge est ainsi primordiale pour pouvoir anticiper les interactions possibles avec la cellule. Ainsi, il a été démontré que ces paramètres pouvaient avoir un effet de lien direct sur l’internalisation de celle-ci [202-204].

1.2.6.2 Caractérisation par microscopie électronique à transmission

La caractérisation de nanosystèmes par microscopie électronique à transmission est primordiale afin de valider les autres techniques de caractérisation des nanosystèmes synthétisés ou formulés. Cette technique permet de déterminer la taille exacte, la distribution de tailles ainsi que la morphologie du nanosystème.

Le microscope électronique à transmission se compose d’une colonne sous vide, d’une source d’électrons (canon à électrons), de diaphragmes, de lentilles électromagnétiques, d’un écran fluorescent et d’un système d’acquisition de signaux (caméra CCD dans la plupart des cas). Lors de sa caractérisation, l’échantillon est déposé sur une grille de carbone qui est ensuite bombardée par un faisceau d'électrons. Ce faisceau d’électrons passe alors par une série de lentilles, dont le rôle est de régler la taille et l’angle d’incidence du faisceau. Celui-ci atteint alors l’échantillon, dont une première image est produite par la lentille objectif. Après avoir traversé celle-ci, le faisceau continue son chemin à travers une autre série de lentilles pour finalement atteindre les lentilles projectrices qui vont agrandir l’image ou le cliché de diffraction formé et le projeter sur le détecteur qui permet la visualisation de l’objet observé [205].

Propriétés des nanomédicaments

1.2.7.1 Interactions nanosystème / cellule

Comprendre les mécanismes d’entrée (internalisation) ainsi que les interactions des nanosystèmes avec les cellules permet un meilleur contrôle de leur internalisation, mais aussi de leur biodistribution et permet, de ce fait, de prédire les effets toxiques potentiels de ces nanosystèmes. De plus, le développement de nanomédicaments, nécessite des recherches approfondies sur le moyen de délivrer de manière spécifique les entités actives au niveau de leur cible pour le diagnostic ou le traitement de maladies ciblées.

Les voies d’internalisation des nanosystèmes sont généralement divisées en deux catégories : la phagocytose et l’endocytose (Figure 12) [204, 206, 207].

Figure 12 : Schéma des principales voies d'internalisation cellulaire : (A) la phagocytose et les différentes voies d’endocytose (B) (C) (D) et (E) [206]

La phagocytose

La phagocytose est un mécanisme préférentiellement utilisé par les cellules spécialisées, dites cellules phagocytaires comme les macrophages/monocytes, les neutrophiles et les cellules dendritiques. Généralement, des particules de taille supérieure à 1µm induisent une activation de la réponse phagocytaire menant à leur ingestion et leur élimination.

Dans le cas des nanoparticules (NPs), la phagocytose se déroule en trois étapes [208] (Figure 13) :

1) reconnaissance des NPs dans le sang par opsonisation,

2) adhésion de ces NPs aux macrophages par reconnaissance ligands récepteurs, ce qui va initier un signal intracellulaire et déclencher le processus de phagocytose, induisant une réorganisation cytosquelétique d’actine et l’englobement de la NPs pour former une vacuole intracellulaire (le phagosome) ;

3) ingestion puis digestion de la NP menées par l’action des lysosomes qui vont fusionner le phagosome et le phagolysosome conduisant à la dégradation de la NP.

Figure 13 : Les étapes de phagocytose d’un nanosystème [206]

L’opsonisation est un processus important qui survient avant la phagocytose et qui consiste en l’adsorption de protéines sériques, les opsonines, à la surface des NPs pour les rendre « visibles et reconnaissables » par les macrophages. Ces opsonines sont majoritairement composées d’immunoglobulines (IgG et IgM) et de protéines du système du complément (Cγ, C4, C5) ainsi que d’autres protéines sériques. Cette opsonisation a lieu dans le sang rapidement après l’administration des NPs par voie intraveineuse [209].

Cette étape de phagocytose est un frein pour le développement de NPs de première génération car celles-ci sont considérées comme éléments étrangers et sont donc rapidement détruites par phagocytose [210].

L’endocytose

Le phénomène d’endocytose englobe une multitude de voies d’internalisation (Schéma 7). La voie d’internalisation dépendante de la clathrine a longtemps été considérée comme la voie majoritaire faisant appel aux récepteurs transmembranaires. Cependant, de nouvelles voies ont étayé les connaissances dans ce domaine. Parmi ces voies alternatives, citons : la voie d’endocytose indépendante de la clathrine, la voie dépendante de la cavéoline ainsi que la pinocytose (micro ou macropinocytose) [211].

Schéma 7 : Les voies d’endocytose [206]

L’endocytose dépendante de la clathrine

Lors de l’internalisation par cette voie, l’endocytose se fait dans des régions riches en triskèles de clathrine et en molécules d’adaptation. Il y a alors invagination du nanosystème par assemblage spontané de clathrine provoquant l’inflexion de la membrane et la création d’une vésicule contenant le nanosystème. Cette vésicule à clathrine véhicule le nanosystème en son cœur permettant ainsi l’internalisation de celui-ci [212]. Dans certains cas, les triskèles de clathrine peuvent s’auto- assembler pour former des cages de clathrine [213, 214] (Schéma 7).

L’endocytose dépendante des cavéoles

Les cavéoles sont des invaginations périformes de petite taille. Elles permettent le transport de substances du plasma vers les tissus à travers l’endothélium. Elles sont formées par auto- assemblage de cavéoline. Le mécanisme d’endocytose dépendante des cavéoles est semblable à celui dépendant des clathrines. L’internalisation s’effectue via l’invagination du nanosystème et la formation d’une vésicule cavéolaire. Cependant, cette voie d’internalisation est moins utilisée par les cellules par comparaison à l’endocytose clathrine dépendante. Les vésicules une fois dans le milieu

cytosolique sont maturées vers l’obtention d’endosome qui après action des enzymes lactiques sont dégradées permettant la libération de leur contenu (Schéma 7) [204, 207, 215-218].

La macropinocytose.

La macropinocytose correspond à l’entré cellulaire du nanosystème grâce à la formation de vésicules hétérogènes de grandes tailles formées principalement par des inductions de facteurs de croissances ou d’agents mitogènes. L’invagination du nanosystème suit un mécanisme semblable de celui de la phagocytose et fait intervenir des fibres d’actine [206, 211, 219].

D’une façon générale, la pinocytose et la phagocytose sont les voies d’internalisation des macromolécules de taille de l’ordre du micron. Les voies d’endocytose dépendante aux clathrines ou aux cavéoles sont activées lors de l’internalisation de systèmes dont la taille est de l’ordre de quelques centaines de nanomètres [217].

1.2.7.2 Influence de la taille et de la charge du nanosytème

La taille et la charge du nanosystème influent sur son interaction avec les membranes cellulaires et par la même occasion sur son internalisation. Les nanosystèmes ayant un diamètre entre 50 et 200 nm sont généralement absorbés plus rapidement par les cellules que ceux qui sont plus larges [220].

La taille

La taille du nanosystème est un paramètre déterminant au regard des phénomènes d’internalisation intracellulaire et de la taille des vésicules formées [196, 221-223]. Bien que la majorité des nanosystèmes puisse être internalisée par les cellules, différentes études tendent à démontrer que ces dernières privilégient l’internalisation des nanosystèmes dont le diamètre est compris entre 20 et 200 nm [224]. Cette internalisation préférentielle vis-à-vis des nanosystèmes de petite taille est due à la taille des fosses enduites de clathrine et des invaginations de membrane cavéolaire (50- 200 nm de diamètre) [207, 214]. Dans le cas de nanosystèmes de plus petites tailles, inférieures à 25 nm, une accumulation d’un grand nombre de ces nanosystèmes est nécessaire pour induire l'endocytose à médiation par la voie dépendante des clathrines et des cavéoles, et, dans certains cas, la pinocytose est le mécanisme préféré pour l'absorption. Concernant les nanosystèmes de taille plus importante, supérieures à 200nm, l’absorption se fait essentiellement par macropinocytose et peu via les voies dépendantes des clathrines ou cavéoles [225].

La forme

La forme du nanosystème, qu’elle soit sphérique, fibreuse, tubulaire, circulaire ou plane, semble également conditionner leurs effets biologiques [226]. Ainsi, il a été suggéré que les nanosystèmes sphériques étaient plus facilement internalisés que les nanosystèmes tubulaires [220]. Cependant, il semblerait que cette facilité soit dépendante du type de cellule étudié. Il a été démontré que sur une culture de cellules HeLa (cancer du col de l’utérus), les nanosystèmes tubulaires offraient une meilleure internalisation, comparativement aux nanosystèmes sphériques [196, 227].

La charge

La charge électrique globale, caractérisée par le potentiel zêta du nanosystème, peut, elle aussi, avoir une forte influence sur l’internalisation. Ce potentiel zêta étant en effet relié à la mobilité électrophorétique du nanosystème en solution. Cette charge peut avoir un impact sur l’internalisation du nanosystème par la cellule, car il modifie les interactions électrostatiques entre le nanosystème et la cellule. L’étude de la relation entre l’internalisation du nanosystème et de sa charge est largement décrite dans la littérature. Ainsi, une étude sur l’internalisation de nanoparticules chargées positivement et négativement sur une culture de cellules Caco-2 a permis de mettre en évidence une internalisation plus rapide des nanoparticules négatives [202]. De plus, une étude réalisée par microscopie confocale a montré que la charge globale de surface du nanosystème pouvait moduler le parcours intracellulaire de celui-ci. Ainsi, les nanosystèmes de charge positive ont été retrouvés autour du noyau de la cellule tandis que ceux chargés négativement ont été détectés dans les lysosomes [228]. D’une façon générale, la charge globale du nanosystème est importante pour garantir son hydrophilie et ainsi conditionner sa dispersibilité et interactivité cellulaire notamment pour des applications en tant que nanomédicament.

Mécanismes de ciblage

1.2.8.1 Ciblage passif

Dans le cas du cancer, il est connu que les vaisseaux de la tumeur présentent des interstices entre les cellules endothéliales qui permettent l’approvisionnement important en nutriments nécessaires à la croissance rapide de la tumeur. Cette structure anormale des vaisseaux engendre une fuite importante des composés plasmatiques, comme les macromolécules, les nanoparticules ou les particules lipidiques, vers la tumeur. De plus, du fait de la déficience du système lymphatique dans les tissus tumoraux, les composés plasmatiques s’accumulent dans la tumeur [224, 229-231]. Ce phénomène, appelé effet EPR (« Enhanced Permeability and Retention »), est mis à profit pour permettre la libération de composés thérapeutiques au sein des tumeurs solides par auto-

agglutination du nanosystème au niveau des interstices entre les cellules endothéliales tumorales (Schéma 8). Ce phénomène est appelé « le ciblage passif » des tumeurs.

Schéma 8 : Représentation de l’effet EPR [231]

Les composés thérapeutiques de taille appropriée peuvent traverser les vaisseaux perméabilisés mais aussi s’accumuler dans le compartiment où se situe la tumeur permettant de ce fait d’accroitre la concentration de l’entité active au niveau de la tumeur [232]. Ce ciblage passif est possible avec des composés stables, non agrégés, furtifs et présentant un temps de circulation suffisamment long ou une libération retardée pour conduire à l’accumulation du composé dans les tumeurs. Il nécessite aussi que les composés aient une taille appropriée et qui ne soit pas trop petite [221]. En effet, l’effet EPR est négligeable pour les petites molécules qui peuvent se redistribuer dans la circulation sanguine par diffusion et/ou par convection et sont éliminées préférentiellement par voie rénale [230]. Enfin, la taille de la tumeur est un paramètre important. L’effet EPR est plus marqué dans les tumeurs de petite taille, ce qui est probablement lié à une plus grande densité des vaisseaux par rapport aux tumeurs de grande taille présentant une région vasculaire [233].

Cependant, ce ciblage passif est devenu trop limité ce qui a conduit au développement d’une approche alternative, le ciblage actif, permettant d’augmenter la complexité des nanosystèmes mais surtout une meilleure spécificité pour la cible.

1.2.8.2 Ciblage actif

Afin d’améliorer l’accumulation des nanosystèmes au niveau du site d’action, leur surface peut être fonctionnalisée par des ligands de ciblage spécifique (anticorps, protéines, peptides, aptamères ou

saccharides par exemple), de manière à favoriser leur adhésion aux cellules tumorales [92, 234, 235] (Figure 14).

Figure 14: Représentation du ciblage actif [235]

Le ciblage actif permet ainsi de cibler spécifiquement un récepteur bien connu en incorporant un ligand spécifique à celui-ci au sein du nanosystème. Une multitude de récepteurs peuvent ainsi être sélectionnée pour apporter une spécificité aux nanosystèmes. Pour ce faire, la cible doit être facilement accessible et être exposée à la surface de la cellule et si possible en contact avec la circulation sanguine afin de maximiser l’interaction du ligand avec son récepteur lorsque les nanosystèmes décorés passent dans le flux sanguin. La cible doit être surexprimée au niveau tumoral ou spécifique à la tumeur et avoir une forte affinité et sélectivité pour le ligand. Ainsi, une multitude de récepteurs peuvent être ciblés dans le domaine du traitement du cancer [128, 236, 237]. Les intégrines, par exemple, sont des récepteurs spécifiques de l’angiogenèse qui sont surexprimées par les cellules de l’endothélium vasculaire au cours de la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins. Celle-ci reconnaissent spécifiquement une courte séquence peptidique composé d’arginine – glycine – acide aspartique (RGD) [238-241].

La nanotoxicologie

Répondant aux interrogations soulevées par l’utilisation exponentielle des nanotechnologies, la nanotoxicologie permet l’évaluation de l’impact et des risques associés à l’utilisation de nanosystèmes sur l’environnement et la santé (Figure 15).

Figure 15 : Evolution du nombre de publications relatives aux nanotechnologies et à la toxicité des nanotechnologies [242]

Le terme de nanotoxicologie a été utilisé pour la première fois en 2004 [243] puis 2005 [244] pour caractériser la sous-catégorie correspondant à l’étude toxicologique des problèmes susceptibles d’être provoqués par les nanoparticules ou nanosystèmes d’une façon plus générale. A ce jour, peu d’études ont mis en évidence un risque avéré lié à l’utilisation de nanotechnologies. Ainsi, l’état d’avancement des nanosciences et des nanotechnologies ne permet pas encore de connaître et de bien évaluer ces risques [245]. De ce fait, la tendance est de minimiser ces risques, en rapport à la vaste étendue des applications possibles et envisagées. Il n’en demeure pas moins que ce problème est de plus en plus soulevé au sein de la communauté scientifique depuis une décennie avec la publication d’articles étudiant cette problématique depuis les années 90 [242].

La nanotoxicologie correspond à l'étude spécifique de la toxicité des nanotechnologies sur les systèmes vivants, poursuivant ainsi plusieurs buts :

1) le développement de modèle d’études pour connaître les facteurs influant sur la fréquence et la gravité des effets biologiques des nanoparticules,

2) la caractérisation de ces effets biologiques [246].

Ainsi, divers types d’exposition aux nanoparticules sont possibles.

1.2.9.1 Types d’exposition

Il est considéré que les nanoparticules peuvent rentrer au contact direct de l’organisme par l’intermédiaire de trois voies : les voies respiratoire, cutanée, et digestive [247]. D’autres voies d’exposition telles que les voies parentérales (intraveineuse, intramusculaire) sont aussi à considérer dans le cadre du développement de nanomédicaments. Enfin, les produits manufacturés ou contenant des nanomatériaux, tels que les vêtements ainsi que les produits cosmétiques, pourraient libérer des nanomatériaux par contact avec la peau [68]. Quel que soit le type d’exposition, la toxicité est principalement liée aux caractéristiques intrinsèques de la nanotechnologie.

1.2.9.2 Caractéristiques influençant la nanotoxicité

La taille du nanosystème joue un rôle primordial dans la toxicité. Lors d’une exposition par voie aérienne par exemple, plus les nanosystèmes sont de petite taille, plus leur progression dans les voies bronchiques est accentuée, avec, dans certains cas, une atteinte au nivau des alvéoles pulmonaires [248, 249]. De même, dans le cas d’une exposition par voie cutanée, la faible taille des particules peut favoriser leur passage à travers la couche cornée, soit par voie inter- ou intracellulaire, soit via les pores dans glandes cutanées et follicules pileux. Leur progression dans l’épiderme puis le derme serait ainsi facilitée, jusqu’à atteindre la circulation sanguine [250]. La taille influe aussi sur le phénomène d’internalisation du nanosystème au niveau cellulaire, et ainsi, elle peut jouer un rôle déterminant dans la toxicité prenant en compte la cinétique d’internalisation ainsi que l’interaction avec les protéines [251]. Aussi, la forme ainsi que la surface du nanosystème jouent un rôle important dans l’internalisation. Enfin, la composition du nanosystème joue, elle aussi, un rôle dans la toxicité, à l’image des nanosystèmes inorganiques, et plus particulièrement à base de composés inorganiques (nanotubes de carbone), qui s’avèrent plus toxiques comparativement aux autres types de composition telles que les nanosystèmes organiques à base de composés biocompatibles [252, 253].

1.2.9.3 Mécanisme de nanotoxicité

Les récentes études sur la toxicité des nanotechnologies ont permis de révéler certains des mécanismes de toxicité. Ainsi, certains nanosystèmes induisent des réponses cellulaires tandis que d’autres semblent biologiquement inertes [254]. Le principal mécanisme menant à cette toxicité est le stress oxydant, via la production de dérivés réactifs de l’oxygène (DRO) [255]. La production de ces dérivés même en faible quantités au niveau mitochondriale sont associés à des perturbations de l’équilibre naturel existant entre les espèces pro- et anti-oxydantes (hémostasie redox). Un déséquilibre en faveur des espèces pro-oxydantes peut mener à la sénescence ou encore à la mort

cellulaire [256-258]. Les nanomatériaux métalliques peuvent participer à la formation de quantités importantes d’espèces réactives de l’oxygène et/ou induire une production excessive de ces espèces par les cellules du fait de leur nature chimique [253]. Ces molécules sont d’une grande réactivité biologique et peuvent endommager la paroi des cellules par peroxydation lipidique, ce qui peut induire des réactions d’inflammation, voire de la fibrose [259]. Elles peuvent également léser l’ADN cellulaire et participer à des processus génotoxiques responsables à terme de risques cancérigènes [260, 261]. D’une façon générale, les nanosystèmes issus de composés inorganiques présentent le plus de toxicité, à l’image des nanotubes de carbone corrélés aux les toxicités pulmonaires [262-264]. Toutefois, il a été constaté qu’il ne suffisait pas de connaître la composition du nanosystème pour prédire la toxicité de sa forme finale. L’un des enjeux fondamentaux de l’étude de la nanotoxicologie est donc d’aller au-delà, pour permettre une étude approfondie de la toxicité de chaque nanosystème.

Malgré le nombre croissant de publications spécialisées dans l’étude de la toxicité de chacune des classes de nanosystème sur l’environnement et l’organisme, les lacunes quant aux connaissances en nanotoxicologie sont élevées [265]. L’absence d’essais standardisés dans ce domaine permettant des études comparatives dans le monde reste encore à ce jour un facteur limitant dans l’obtention de données ou de références sur ce sujet. La fabrication ainsi que l’utilisation de produits journaliers contenant ce type de matériaux sont en pleine expansion apportant ainsi un risque important à la population exposée à ces nanosystèmes. Il est ainsi primordial de définir des normes relatives à la toxicité de ceux-ci, et d’autant plus, les conditions générales de sécurité du personnel menant les études dans le cadre de cette nouvelles réglementation [266, 267]. Dans cette optique, l’Agence national de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail (ANSES) a publié un rapport relatif à l’évaluation biologique des dispositifs médicaux contenant des nanomatériaux (Février 2011 - ref : DTABAB101115931) suivie d’un second rapport concernant l’évaluation des risques liés aux nanomatériaux (Avril 2014, autosaisine n° 201-SA-0273). Ce dernier a permis de mettre en évidence les avancés dans ce domaine ainsi que la mise à jour des dernières recommandations. En somme, il apparait clairement que le développement de méthodes permettant une caractérisation plus fine des nanomatériaux est nécessaire afin de comprendre les mécanismes physicochimiques mis en jeux dans la nanotoxicologie. Ainsi la standardisation des méthodes d’évaluation semble être la pierre angulaire de cette discipline [268-270].

Ce chapitre nous a permis de mettre en évidence que les oxazaphosphorines sont des composés antitumoraux montrant encore leur efficacité en clinique de nos jours [9, 271], bien qu’ils aient un index thérapeutique restreint et cela plus particulièrement dans le cas l’IFO [50, 272-275]. Le développement croissant de stratégies de vectorisation de « vieux » médicament via l’administration de ceux-ci au sein de nanosystèmes a permis une nouvelle approche thérapeutique permettant d’apporter une spécificité thérapeutique à certains composés qui en étaient dépourvus [276-281]. Dans certains cas, la vectorisation d’anciens agents anticancéreux a pu mener à une modification de la voie d’administration, de la voie IV à la voie orale, permettant ainsi l’amélioration du confort du patient [191, 282, 283].

De nombreux travaux de recherche ont déjà été menés au cours des dernières années ayant pour objectif l’amélioration de l’index thérapeutique de l’IFO soit par modification chimique de la molécule ou par vectorisation de l’IFO lui-même [284-287]. Dans notre cas, nous avons initié de nouvelles méthodologies permettant la synthèse et la formulation de dérivés préactivés de l’ifosfamide sous la forme de nanosystèmes. Cette stratégie, qui a été l’objectif de ces travaux de thèse, seront développées dans la suite de ce manuscrit.

2 OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THÈSE

Comme cela a été mentionné puis développé précédemment, les oxazaphosphorines sont encore très utilisées dans le traitement de divers types de cancers et reste, à ce jour, des composés thérapeutiques montrant une forte activité dans le traitement du cancer que ce soit en traitement seul [6, 9, 288], en traitement combiné avec d’autres agents antitumoraux [7, 8, 271, 289] ou encore avec des anticorps monoclonaux lors d’essais de phases cliniques [290]. Dans le cas de l’IFO, bien qu’il soit utilisé en routine en clinique, il présente des inconvénients liés à son métabolisme et aux problèmes de toxicité qui en émane [55, 275, 291, 292]. Dans le cas du cyclophosphamide, celui-ci est un agent antitumoral ayant un index thérapeutique bien meilleur que celui de l’IFO et possède en complément de son effet antitumoral, un effet immunomodulateur [293-297] (Schéma 9).

OXAZAPHOSPHORINES

Oncologie – Hématologie Oncologie Dose: 50 to 20 mg/m2 Dose: 1,5 to 3 g/m2 Maladies inflammatoires TOXICITE +++ Dose: 75 – 150 mg/j

 Cytotoxique Cytotoxique Immunomodulateur Immunomodulateur

Schéma 9 : Caractéristiques du CPM et de l'IFO

Afin de supprimer ou de limiter les toxicités de l’IFO, ce travail de thèse s’est consacré au développement d’une stratégie de pharmacomodulation ayant pour objectif d’accroître la libération du composé HO-IFO par la conception de composés préactivés en position 4. La préactivation de cette position a déjà fait l’objet de nombreux travaux ayant permis de synthétiser des molécules actives ne nécessitant pas l’action de CYP.

Dans notre cas, les travaux de recherche initiés précédemment ont porté sur :

1) la préactivation de l’IFO en position 4 par oxydation anodique de l’IFO donnant lieu à la méthoxylation sélective du carbone en position 4 et permettant l’obtention d’un précurseur préactivé correspondant à la forme biomimétique du HO-IFO [298], et ;

2) la mise en œuvre d’une méthodologie de greffage de dérivés squaléniques dans cette même position par le Dr J. Caron [299] et le Dr H. Chapuis (Projet ANR NanoSqualOnc (Program P2N Grant N° M Nano-00301)).

L’ensemble de ces travaux ont donné lieu à un premier brevet d’invention [300].

Ce travail de thèse a ainsi eu pour objectifs la synthèse de nouveaux dérivés préactivés de l’IFO, de leur formulation sous la forme de nanosystèmes suivi de leur évaluation pharmacologique (Schéma 10).

Le premier objectif était d’optimiser le protocole d’oxydation anodique de l’IFO suivi de la synthèse de nouveaux composés préactivés par greffage de différentes chaînes en position 4. Ce travail a permis de réaliser la synthèse d’une série de composés préactivés de l’IFO avec des chaînes de longueurs comprises entre 1 et 30 carbones, celles-ci possédant ou non des motifs insaturés.

Le second objectif fut de développer des formulations permettant l’obtention de nanosystèmes à partir des composés précédemment obtenus. D’une part, les composés préactivés avec des chaînes longues (C10-C30) insaturées de type terpénique ont démontré la propriété de s’auto-assembler spontanément en phase aqueuse grâce à leurs caractéristiques intrinsèques. D’autre part, les composés préactivés par des chaînes saturées courtes (C1-C10), n’ayant pas cette propriété d’auto- assemblage, ont bénéficié de la capacité d’être encapsulé au sein de nanocapsules lipidiques développées par l’unité de « micro et nanomedecines translationnelles» (MINT, U1066) de l’Université d’Angers. Les nanocapsules lipidiques ont ainsi été formulées puis caractérisées au sein de cette même unité.

Ensuite, l’objectif final a été de réaliser l’évaluation pharmacologique de l’ensemble des composés synthétisés préactivés de l’IFO sous leurs formes libres ou nanoparticulaires. Parmi ces nouveaux dérivés préactivés de l’IFO, nous avons pu réaliser l’étude pharmacologique (in vivo) plus approfondie du composé géranyloxy-ifosfamide (G-IFO) que ce soit sous la forme libre ou nanoparticulaire et dont la synthèse a fait l’objet d’un brevet d’invention [301].

 Nécessite une métabolisation (prodrogue)  Faible libération de l'entité active (<20%)  Protocoles hautes doses  Toxicités dues au métabolisme IFO  Absence de spécificité

Pharmacomodulation 1

PREACTIVATION  Aucune bioactivation nécessaire  Libération accrue du métabolite actif (>95%)  Diminution des doses administrées (à confirmer)  Diminution des toxicités spécifiques (à confirmer) R-O-IFO  Amélioration de la spécificité (effet EPR) (à confirmer) R-X-IFO

Chaînes saturées courtes Chaînes insaturées (terpéniques) C1  C10 C10  C30

R-X = géranyloxy R = CH3 farnesyloxy C5H11 squalényloxy C10H21 mercaptosqualényloxy

Absence de propriétés Propriétés d'auto-assemblage d'auto-assemblage en milieu aqueux

Encapsulation au sein de Formulation sous formes de nanocapsules lipidiques (NCLs) nanoparticules terpéniques (NPTs)

Nanocapsules lipidiques R-X-IFO formes libres Nanoparticules terpéniques (NCLs) (FLs) (NPTs)

R-X-IFO R-X-IFO R=C10-C30 R=C1-C10

3 2

EVALUATION PHARMACOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE: Optimisation formulation Stabilité colloïdale Stabilité chimique Etude de libération Evaluation in vitro

Détermination IC50 Evaluation in vivo Pharmacocinétique Efficacité Dose maximale tolérée

Schéma 10: Représentation schématique du projet relatif à la préactivation de l’IFO. (1) Préactivation de l’IFO, (2) conception et évaluation pharmacologique des nanoparticules terpéniques, (3) conception et évaluation pharmacologique des nanocapsules lipidiques

Enfin, en complément de ces objectifs, le dernier axe de ce projet a été de réaliser l’étude du potentiel effet immunomodulateur de l’IFO en comparaison au cyclophosphamide (Schéma 11). Cela dans la perspective d’une utilisation de cette propriété particulière des oxazaphosphorines qui, avec l’avancement des progrès de l’immunothérapie en cancérologie, peut se révéler intéressante à explorer.

X-OXAZAPHOSPHORINES (X-OXAZA) OXAZAPHOSPHORINES Oncologie – Hématologie Dose: 50 to 20 mg/m2 Maladies inflammatoires Dose: 75 – 150 mg/j

Cytotoxique Immunomodulateur

Oncologie Dose: 1,5 to 3 g/m2 TOXICITE +++

 Cytotoxique  Immunomodulateur

ETUDE DU POTENTIEL EFFET IMMUNOMODULATEUR DE L’IFO vs le CPM

Etude de l’effet de la déplétion des Etude de l’effet immunomodumateur Etude de l’effet immunomodumateur Lymphocytes T sur l’activité de l’IFO en absence de tumeur de l’IFO en présence de tumeur antitumorale de l’IFO

Effet de la tumeur sur l’expression des Effet immunomodulateur de Preuve de concept de l’effet cellules immunitaires? l’IFO ? immunomodulateur de l’IFO? Dose d’IFO immunomodulatrice? Schéma 11 : Représentation schématique du projet relatif à l’immunomodulation par les oxazaphosphorines

3 ETAT DE L’ART

3.1 Stratégies de pharmacomodulation

Les oxazaphosphorines (IFO, CPM et trofosfamide) sont des prodrogues issues de la cyclisation de la moutarde alkylante. Celles-ci sont ensuite transportées sous la forme inactive, puis métabolisées pour libérer l’entité active et ainsi améliorer l’index thérapeutique des moutardes alkylantes [274]. Cependant, elles restent sujettes à diverses limitations (métabolisme, toxicité due au CAA…). Afin d’y remédier, plusieurs stratégies ont été développées, comme l’administration de composés de détoxification, ou encore la co-administration d’inhibiteurs spécifiques des CYP responsables du métabolisme des chaînes latérales de l’IFO. D’autres stratégies ont tenté de réduire la formation et la libération du CAA [38, 59], cependant elles se sont révélées inefficaces. Par contre, le développement de nouveaux analogues prenant en compte les relations structure / activité pourrait être une solution. Ainsi, des stratégies de pharmacomodulation ont été mises au point par modifications chimiques et / ou structurales de l’IFO et du CPM ou directement des moutardes alkylantes [16, 272].

Dans ce contexte de pharmacomodulation, des nouveaux dérivés de l’IFO, du CPM ou des moutardes alkylantes ont pu être élaborés par modifications soit :

- du cycle,

- des chaînes latérales,

- de la moutarde alkylante.

Modification du cycle oxazaphosphorine

3.1.1.1 Modification des hétéroatomes du cycle

Des modifications du cycle oxazaphosphorine sur des positions non oxydées lors du métabolisme de la molécule ont d’abord été étudiées par remplacement d’un ou de plusieurs hétéroatomes du cycle [302]. Parmi les composés synthétisés, deux composés ont montré une activité in vivo (Figure 16).

Figure 16 : Structure chimique d’analogues soufrés du CPM

3.1.1.2 Substitutions des carbones du cycle

Etant donné la structure du cycle des oxazaphosphorines, les carbones en positions 4, 5 et 6 sont ceux qui peuvent être modifiés (Figure 17).

Figure 17 : Numérotation du cycle oxazaphosphorinine

Ainsi, des substitutions dans ces positions ont permis de mettre au point un grand nombre d’analogues.

Modification du carbone en position 4

La position 4 correspond à la position oxydée par les CYP lors de la métabolisation des oxazaphosphorines. La substitution de ce carbone par un groupement méthyle a été étudiée dans un premier temps afin d’étudier la gêne stérique apportée par la présence du groupement méthyle sur la cinétique de déchloroéthylation (Figure 18).

Figure 18 : Structure chimique de l’analogue 4-méthyle-cyclophosphamide

La présence de ce groupement provoque une modification de la conformation du cycle avec un changement de position de l’oxygène exocyclique de la position axiale à la position équatoriale [303], provoquant la chute de l’activité du produit. Cette diminution d’activité est vraisemblablement due à la nouvelle configuration et plus particulièrement à l’impossibilité d’oxyder la position 4 menant à la libération de l’entité hydroxylée active. D’autres substitutions ont aussi été évaluées telles que la substitution de cette position à l’aide de groupements aryles [304]. Une autre approche permettant l’obtention d’analogues préactivés via l’activation de la position 4 a été développée menant à l’obtention de deux composés en série IFO et CPM, les dérivés 4-hydroperoxy [305] et 4-hydroxy [306] (Figure 19).

Figure 19 : Structure chimique du 4-hydropéroxy-ifosfamide (A) et du 4-hydroxy-ifosfamide (B)

Ces composés permettent de disposer des composés directement activés, ne nécessitant donc plus l’étape de métabolisation et contournant, de ce fait, les variabilités inter-individuelles et intra- individuelles. D’autre substitutions sur cette position ont aussi été développées utilisant des chaînes mercaptoalcanes (HS-R-X, R=(CH2)n) porteuses de groupements fonctionnels (X=COOH, OH ou

SO3H) [307]. Parmi les composés préactivés à l’aide de groupement de type mercapto, le mafosfamide (Figure 20), créé par greffage de la molécule 2-mercaptoéthanesulfonate (mesna) en position 4 du cyclophosphamide, est celui ayant montré le plus d’intérêt et de potentiel [308, 309].

Figure 20 : Structure chimique du mafosfamide

Le greffage du mesna en position 4 permet ainsi la libération concomitante de la moutarde alkylante et du mesna. A ce jour, une étude clinique de phase I a montré des résultats probants ayant permis de déterminer les doses à administrer pour une étude clinique de phase II, non menée à ce jour [310].

Modification en position 5 et / ou 6

Les substitutions par des groupements méthyles [311], par un atome de brome [312], par un groupement trifluorométhyle [313] à la place d’un seul ou de plusieurs atomes d’hydrogène des carbones en position 5 et / ou 6 ont aussi été étudiées [313] (Figure 21). Cependant, aucun de ces composés n’a démontré des résultats particulièrement intéressants.

Figure 21 : Exemples de substitutions en position 5 ou 6

La synthèse d’autres composés capables d’augmenter l’oxydabilité du cycle ont aussi été menées. Pour cela, l’utilisation des cycles benzénique, tétrahydrofurane ou encore tétrahydropyrane a donné lieu à des analogues polycycliques à jonction [5,6] [314, 315] (Figure 22).

Figure 22 : Structure chimique d’analogues polycyclique à jonction [5,6]

Enfin, la substitution de stéroïdes en position 6 a aussi été étudiée afin d’améliorer la spécificité de la molécule en ciblant les récepteurs stéroïdes des cellules tumorales [316]. Cependant, ces composés n’ont montré aucun gain d’activité par comparaison à la molécule de référence (IFO).

En conclusion, mis à part le cas du mafosfamide, les analogues substitués en position 4, 5 ou 6, n’ont pas montré de résultats convaincants sur le gain d’activité ou d’index thérapeutique.

Modification des chaînes latérales

Afin d’éviter l’oxydation des chaînes latérales des oxazaphosphorines, leurs substitutions ont été envisagées.

3.1.2.1 Modification par remplacement de l’halogène

La première stratégie fut d’étudier l’importance de l’halogène situé à l’extrémité des chaînes latérales. Ainsi, le remplacement d’un seul ou des deux atomes de chlore par le brome ou encore la modification d’un des atomes de chlore par d’autres substituants a été effectué (Figure 23) [317].

Figure 23 : Structure chimique d’analogues par remplacement d'halogène(s)

Cette stratégie a permis de développer de nouvelles moutardes alkylantes possédant des activités modulées selon le groupement modifié. Ces analogues n’ont montré aucune amélioration en termes d’effet thérapeutique en comparaison à la moutarde de référence issus de l’IFO [318].

3.1.2.2 Méthylation des chaînes latérales

Comme nous l’avons décrit précédemment, la principale cause de toxicité des oxazaphosphorines est l’oxydation des chaînes latérales lors du métabolisme. De ce fait, afin de diminuer la toxicité de l’IFO et plus particulièrement afin de contrer la libération du CAA, notre équipe a développé la synthèse totale de composés diméthylés par greffage d’un groupement méthyle en position 7 et 9 de l’IFO. Ceci a permis d’obtenir des analogues diméthyle-ifosfamide (diMe-IFO) (Figure 24).

Figure 24 : Structure chimique du 7,9-diméthyle-ifosfamide (7,9-diMe-IFO)

Cette stratégie a pour objectif une diminution de l’oxydabilité des positions en α des atomes d’azote, due à la gêne stérique apportée par la présence des groupements méthyles et par conséquent, de limiter la production de CAA [319]. De plus, le métabolisme de ces analogues mène à la libération de nouvelles moutardes azotées ayant des activités alkylantes amplifiées due à leur modification structurale (moutardes diméthylées). Il est à noter que lorsque l’oxydation survient malgré tout sur les positions 7 et 9, celle-ci conduit à la libération de la monochloroacétone (MCA) et non plus du CAA (Schéma 12).

Schéma 12 : Métabolisme des analogues 7,9-diMe-IFO

Ces méthylations génèrent deux nouveaux centres asymétriques menant à une multitude de couples de diastéréoisomères. L’évaluation pharmacologique de ces composés a permis de mettre en évidence le couple de diastéréoiosomères le plus actif (7S,9R-diMe-IFO). En outre, les moutardes diméthylées ainsi formées ont montré une activité alkylante fortement augmentée en comparaison avec la moutarde de référence [286, 320]. Cette dernière observation a pu être confirmée en effectuant la détermination de l’efficacité du composé 7S,9R-diMe-IFO qui a permis d’observer un gain d’efficacité à dose équivalente en comparaison à l’IFO.

Modification de la moutarde alkylante

La modification de la moutarde alkylante a permis le développement de molécules aux activités biologiques bénéfiques. Au vu de la structure chimique et de l’absence du cycle oxazaphosphorine, ces analogues ne nécessitent aucune étape de métabolisation et ils ne libèrent donc aucun métabolite toxique (CAA et ACR). Ceci permet de contourner les mécanismes de résistances dus aux ADHs [272, 321, 322].

3.1.3.1 L’estramustine

L’estramustine (Estracyt®) correspond à la conjugaison de la moutarde phosphoramide avec l’estradiol via un pont carbamate (Figure 25).

Figure 25 : Structure chimique de l'estramustine

Ce composé a reçu son homologation par la FDA en 1981 dans le cadre du traitement des cancers prostatiques métastatiques [323]. L’estramustine a été développé afin de permettre un ciblage spécifique des récepteurs œstrogéniques pour une indication dans le traitement du cancer prostatique hormonorésistant via la combinaison de l’activité antinéoplasique et l’hormonothérapie [324]. Depuis l’obtention de son homologation, des essais cliniques sont en cours afin de déterminer son efficacité dans ce même type de cancer lors de traitements combinés avec d’autres composés, tels que l’épirubicine [325], la vinblastine [326, 327], l’étoposide [328] ou plus récemment le docétaxel et la prédnisolone [329].

3.1.3.2 La bendamustine

La bendamustine (Levact®) correspond à la conjugaison de la moutarde phosphoramide sur un noyau de type benzimidazole (Figure 26)

Figure 26 : Structure chimique de la bendamustine

La structure de la bendamustine lui confère une similarité avec les bases de l’ADN grâce à la présence du noyau benzimidazole. Des essais cliniques ont été menés afin d’établir son efficacité dans le traitement des lymphomes non-hodgkiniens [330-332], les leucémies lymphoïdes chroniques [333-335] et les cancers solides [336-339]. Faisant suite à des résultats probants dans le traitement des leucémies et des lymphomes non-hodgkiniens en utilisation seule ou en combinaison, ce traitement a été approuvé (2008) pour le traitement des leucémies et des lymphomes non-Hodgkiniens [340].

3.1.3.3 Le melphalan

Le melphalan (Alkaran®) correspond au couplage de la moutarde phosphoramide au noyau aromatique de la phénylalanine (Figure 27).

Figure 27 : Structure chimique du melphalan

La présence de l’acide aminé apporte la spécificité requise répondant à l’hyperactivité métabolique des cellules tumorales. Le melphalan est indiqué pour le traitement des myélomes [341, 342]. Il est encore utilisé en clinique 60 ans après son développement grâce à certaines de ses propriétés pharmacologiques intéressantes et il est maintenant indiqué en association avec d’autres composés anticancéreux notamment en pédiatrie dans les neuroblastomes afin d’accroître la réponse au traitement [343, 344].

3.1.3.4 Le glufosfamide

Le glufosfamide est obtenu par couplage du ß-D-glucose à la moutarde isophosphoramidée (Figure 28).

Figure 28 : Structure chimique du glufosfamide

Le glufosfamide (D-19575) correspond à la première molécule obtenue par couplage du glucose avec une molécule antitumorale [345]. Le choix du couplage de la moutarde azotée au glucose a été basé sur le fait que la tumeur utilise une quantité importante de glucose pour sa croissance. Ce couplage apporte aussi la stabilisation de la moutarde azotée et permet une hypothétique distribution facilitée par le système de transporteurs au glucose [346, 347]. Son activité a été étudiée in vitro et in vivo [345, 348], des essais cliniques de phase I, II et III ont ensuite été menés montrant une activité dans le traitement de divers types de cancers tels que le cancer du pancréas [349, 350], les tumeurs solides [351] et les cancers du sein [352]. A ce jour, des essais in vitro sont encore en cours pour le traitement du cancer de la prostate en combinaison avec le docétaxel par exemple [353].

3.1.3.5 Le palifosfamide.

Le palifosfamide (Ziomafos™ ou Zio-201) est un dérivé stabilisé de la moutarde isophosphoramidée sous différentes formes de sels soit de trométhamine (Figure 29) ou de lysine (Figure 30).

Figure 29 : Structure chimique du sel de trométhamine-palifosfamide

Figure 30 : Structure chimique du sel de lysine-palifosfamide

Le palifosfamide est principalement utilisé dans le traitement des sarcomes des tissus mous [354- 356]. Des résultats précliniques probants ont été obtenus sur des lignées cellulaires ou des modèles

xénogreffés de divers types en traitement seul [321] puis en combinaison avec d’autres composés antitumoraux [357] permettant un développement en phases cliniques. Lors des essais cliniques de phase I et II, le palifosfamide a démontré une efficacité équivalente ou supérieure à celle de l’IFO [354]. Lors de la phase III, la combinaison du palifosfamide et de la doxorubicine a été évaluée. Cependant, lors de cette étude, la combinaison doxorubicine-palifosfamide a montré peu de bénéfices en comparaison avec la combinaison doxorubicine-placebo [358, 359] menant à l’interruption du développement du composé.

3.1.3.6 L’évofosfamide

L’évofosfamide (TH-302) correspond à la vectorisation de la moutarde bromo-isophosphoramide (Br-IMP) par greffage sur un noyau de type nitro-imidazole (Figure 31).

Figure 31 : Structure chimique du l’évofosfamide

Ce composé a la particularité d’être résistant à la métabolisation hépatique et permet de libérer la Br-IPM après réduction par les réductases intracellulaires dans un contexte d’hypoxie sévère, permettant ainsi un ciblage des compartiments hypoxiques de la tumeur [360]. L’évofosfamide a fait l’objet d’études précliniques in vitro et in vivo sur divers types de cancers en traitement seul [361- 363] ou combiné avec la gemcitabine et le nab-paclitaxel [364] ou en combinaison unique avec la gemcitabine [360]. Des essais cliniques de phase I, II et III ont été réalisés, soit en traitement seul, soit en combinaison avec d’autres agents antitumoraux [365-367]. Cependant, ces essais cliniques n’ont pas permis de mettre en évidence un réel gain thérapeutique en comparaison aux traitements thérapeutiques actuels déjà utilisés, justifiant l’arrêt du développement de cette molécule à ce stade.

3.2 Immunité et cancer

Généralités

Le système immunitaire fait référence à l’ensemble des mécanismes de défense par lequel l’organisme se défend contre les agressions d’agents étrangers, le plus souvent infectieux, susceptible de menacer son bon fonctionnement ou sa survie. Les cellules immunitaires communiquent entre elles : soit par contact (interaction récepteurs-ligands) soit à distance par l’intermédiaire de molécules sécrétées (interaction récepteurs-médiateurs). Ces molécules sécrétées sont les cytokines et regroupent les lymphokines, les monokines et les chimiokines. Le système immunitaire joue un rôle important dans la prévention des infections menant à leur éradication et empêchant la prolifération tumorale. Cette prévention est déclenchée par des signaux de dangers initiées par la reconnaissance spécifique des molécules et/ou antigènes comme étant des corps étrangers (appelées molécules ou antigène du non-soi). Ainsi, l’organisme dispose de deux types de système de défense : l’immunité dite innée et l’immunité dite adaptative dont chacune regroupent des cellules ayant des types d’action spécifiques [368] (Figure 32).

Figure 32 : Cellules de l’immunité innée et adaptative [368]

3.2.1.1 Immunité innée

L’immunité innée, ou encore appelée naturelle ou naïve, est la première ligne de défense vis-à-vis des agents infectieux et pathogènes qui nous entourent. Elle correspond à une réponse constitutive d’action immédiate et non spécifique de l’agent pathogène. Elle est mise en place en attendant que l’immunité acquise devienne opérationnelle et repose principalement sur la distinction entre le soi et le non soi [369, 370]. Elle est représentée par l’ensemble des cellules capables de réagir à un stimulus précis, qui peut être partagé par de nombreux types de menaces, et qui n’ont besoin que de peu de stimulation avant d’être efficaces. Son activation constitue la réponse inflammatoire. Elle

compte dans ses rangs des cellules myéloïdes phagocytaires, capables de prendre en charge les débris, les particules et les cellules mourantes, mais également de gérer les réactions inflammatoires. Il s’agit des granulocytes (basophiles, éosinophiles et neutrophiles) et des macrophages, ainsi que les cellules présentatrices de l’antigène (CPA), dont les cellules dendritiques (CD ou dendritic cells - DC). Parmi les acteurs de l’immunité innée se trouvent également des cellules lymphoïdes, capables de réagir très vite face à une cellule vivante anormale : les lymphocytes tueurs naturels (natural killer - NK) [368, 371-373].

3.2.1.2 Immunité adaptative

L’immunité adaptative (ou acquise) est initiée plus tardivement et est spécifique du non soi. Elle représente l’ensemble des mécanismes qui s’éduquent face à la menace de manière dépendante d’un antigène. Cette réponse, spécifique de l’antigène, fait intervenir les lymphocytes qui sont porteurs d’un seul type de récepteur capable de reconnaitre un déterminant antigénique précis. Cette réponse est limitée dans le temps à l’éradication de l’agent étranger dont elle garde la mémoire. Ces cellules lymphocytaires sont réparties en deux populations : les lymphocytes B et les lymphocytes T.

Les lymphocytes B

Les lymphocytes B qui caractérisent la réponse immunitaire humorale, sont capables de réagir à un antigène natif, c’est à dire de détecter une conformation tridimensionnelle. Une fois sélectionnés par leur antigène, ils sont stimulés menant à leur multiplication rapide et permettant l’obtention d’une armée de cellules identiques et porteuses du même récepteur spécifique de l’antigène. Après maturation, ces cellules deviennent des plasmocytes capables de produire de grandes quantités d’anticorps spécifiques de l’antigène et responsable de l’élimination [374, 375].

Les lymphocytes T

Les lymphocytes T caractérisent la réponse immunitaire cellulaire. Cette population est séparée en deux sous populations, les lymphocytes T effecteurs et les lymphocytes T régulateurs.

Les lymphocytes T effecteurs

Les lymphocytes T « effecteurs » assurent des fonctions spécialisées telle que la sécrétion de cytokines, l’aide aux lymphocytes B dans la fonction humorale dans le cas des lymphocytes CD4+ ou encore une activité cytotoxique dans le cas les lymphocytes T CD8+.

Les lymphocytes effecteurs de phénotype CD4

Les lymphocytes effecteurs de phénotype CD4, ou lymphocytes T auxiliaires (T helper-TH) sont capables de réagir à un antigène présenté dans les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH-II). Leur rôle principal est d’aider la mise en place d’une réponse immunitaire efficace et durable ou encore aux lyphocytes B dans la fonction humorale. En effet, ils aident les lymphocytes B dans la production d’anticorps et induise les macrophages dans le recrutement de basophiles neutrophiles et éosinophiles au niveau de l’infection et de l’inflammation provoquant ainsi une sécrétion locale de chimiokines et cytokines menant à l’action de réponse immunitaire. Ils se divisent en trois sous-populations caractérisées par des profils de sécrétion de cytokines différents [376, 377] :

1) la sous population TH-1 qui sécrète de l’interleukine-2 (IL-2) et de l’interféron-gamma (IFN), intervient principalement dans des fonctions à médiation cellulaire telles que l’hypersensibilité retardée ou l’activation des lymphocytes cytotoxiques ;

2) la sous population TH-2 qui sécrète de l’interleukine-4 (IL-4), de l’interleukine-5 (IL-5) et de l’interleukine-10 (IL-10), est principalement initié dans la réponse humorale en activant les lymphocytes B.

La sous population TH-17 est caractérisée par la sécrétion de l’interleukine-17 (IL-17) qui possède diverses actions telles que la lutte contre certains infections (bactérienne et fongiques) [378] mais également dans des pathologies inflammatoires auto-immunes (telle l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale [379].

Les lymphocytes effecteurs de phénotypage CD8

Les lymphocytes effecteurs de phénotypage CD8 sont dits cytotoxiques et ont donc une activité cytotoxique. Ils sont capables de détruire des cellules cibles qui présentent des antigènes spécifiques présentes dans les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité, de classe I (CMH-I) [380]. Ils permettent aussi la mémoire immunitaire, qui permettra à l’organisme qui a survécu à la menace de la combattre plus efficacement si elle se reproduit [376].

Les lymphocytes régulateurs

Les lymphocytes régulateurs (Treg) sont des lymphocytes CD4 reconnaissant mieux le soi et de ce fait échappent aux filtres thymique et médullaire. Cette population concerne 1 à 2% des lymphocytes CD4 circulant et ont un rôle important dans la tolérance périphérique [381].

L’immunoediting

L’idée selon laquelle le système immunitaire est impliqué dans la lutte contre les cellules tumorales n’est pas nouvelle [382], et est souvent sujette à polémique de nos jours [383, 384]. Cette défense de la part du système immunitaire fait référence à la théorie de l’immunoediting des cancers, ou théorie des 3 E (élimination équilibre et échappement) [385-387] (Schéma 13) selon laquelle le phénotype immunogène d’une tumeur est constamment façonné par des contraintes immunologiques environnantes [373].

Schéma 13 : Représentation de la théorie d' « immunoediting » [387]

3.2.2.1 L’élimination

Lors de cette première phase, divers mécanismes sont mis en jeu engageant des réactions de l’immunité innée et adaptative agissant ensemble afin de détecter et éliminer les cellules tumorales émergeantes avant la formation d’une tumeur détectable. Les mécanismes impliqués dans la détection des cellules tumorales par le système immunitaire ne sont pas encore élucidés. Au cours de cette phase, différents acteurs du système immunitaire sont recrutés au niveau tumoral afin de limiter son développement. Cette phase d’élimination a lieu en quatre étapes [388] :

1) la reconnaissance des cellules tumorales par les cellules de l’immunité innée. Cette étape induit la sécrétion de signaux pro-inflammatoire et la migration de cellules NK, de macrophages et de cellules dendritiques, l’ensemble menant à la sécrétion d’IFN.

2) la maturation et migration des cellules dendritiques et sécrétion de IFN provoquant une cytotoxicité limitée via une action antiproliférative et anti-angiogénique menant à l’apoptose.

3) L’excrétion de lymphocytes T spécifiques de la tumeur menant u recrutement de macrophage et de cellules NK infiltrantes conduisant à la sécrétion d’IL-12 et d’IFN qui éliminent les cellules tumorales par activation de mécanismes cytotoxiques tels que la production de reactive oxygen species (ROS) ou encore de la perforine.

4) le maintien de l’atmosphère cytokinique et lymphocytaire au niveau du site tumoral afin d’assurer un maintien de l’action.

Une fois éliminées, une phase d’équilibre se met en place entre le système immunitaire et les variants tumoraux.

3.2.2.2 L’équilibre

Les variants tumoraux n’ayant pas été éliminés pendant la phase d’élimination entrent dans une phase d’équilibre dynamique. Lors de cette phase, une pression immunitaire constante va être exercée sur la tumeur, empêchant le développement de la tumeur mais ne permettant pas son éradication. Les variants tumoraux les plus résistants vont subir de nombreuses mutations génétiques menant à l’obtention d’un clone résistant aux attaques du système immunitaire provoquant la modification des caractéristiques de la tumeur. Cette période d’équilibre correspond à une période de latence pouvant être très longue et s’étaler sur plusieurs années. C’est le concept d’édition de la tumeur par l’immunité [389].

3.2.2.3 L’échappement

Lors de la phase finale, après l’échec de la plupart des mécanismes entrant en jeu dans l’élimination des cellules tumorales, celle-ci entrent dans une phase d’échappement. Les variants tumoraux ayant

survécus et ayant acquis une insensibilité à la détection et/ou à l’élimination par le système immunitaire reprennent leur phase de croissance incontrôlée aboutissant au développement du cancer [385].

Association chimiothérapie/immunothérapie

Depuis toujours, les études menées permettant de mettre en évidence les effets cytotoxiques et antitumoraux des agents chimiothérapeutiques sur des modèles immunodéprimés montrent principalement un mode d’action autonome. Celle-ci se faisant par induction de la mort cellulaire en impactant sur l’ADN, l’ARN ou les protéines impliquées dans la division cellulaire. Des études récentes ont permis de mettre en évidence que le succès de ces agents ne dépend pas essentiellement de leur mode d’action cytotoxique mais repose également sur la contribution du système immunitaire [390]. La première observation de cette implication a été montrée avec la gemcitabine. Ainsi, il a été démontré que celle-ci inhibait la croissance tumorale et que cette inhibition était corrélée avec l’immunogénicité in vivo. Cette hypothèse a ensuite été confirmée par la perte d’efficacité antitumorale chez des souris dépourvues de lymphocytes T [391]. Le cyclophosphamide a ensuite été étudié permettant de mettre en évidence la participation du système immunitaire dans son effet antitumoral [296, 297, 392, 393].

D’une façon générale, cette réponse immune antitumorale pourrait reposer sur la combinaison de plusieurs mécanismes :

1) certains agents chimiothérapeutiques induisent la mort cellulaire immunogénétique des tumeurs via la libération de molécules médiatrices telle que l’ATP conduisant à une augmentation des cellules présentatrices de l’antigène associées aux tumeurs [394] ;

2) la lymphopénie, engendrée par le traitement, peut conduire à une prolifération homéostatique menant à l’expansion de ces cellules (IL-17 et IL-15) suivie d’une dérégulation au sein de la famille des lymphocytes T. Dans ce cas, cette dérégulation suggère une action direct de l’agent sur l’activation des lymphocytes T [395] ;

3) l’agent chimiothérapeutique pourrait stimuler indirectement le recrutement des cellules effectrices spécifiques de la tumeur menant à l’augmentation de l’expression des chimiokines dans la tumeur engendrant l’augmentation de l’infiltration des lymphocytes T [396].

L’ensemble de ces observations montre l’implication du système immunitaire dans la réussite de la chimiothérapie [397]. Ainsi, un intérêt grandissant est apparu récemment en oncologie pour la mise en œuvre de traitement associant la chimiothérapie et l’immunothérapie [398-400].

Effet immunomodulateur des agents cytototoxiques

La chimiothérapie conventionnelle est connue comme étant une modalité majeure pour le traitement du cancer et permettant un taux de réponse important. Lors du traitement par chimiothérapie d’un patient atteint d’un cancer, celle-ci agit seule et a tendance à détruire non seulement les cellules tumorales, mais également d’autres cellules à prolifération rapide (les cellules épithéliales, les cellules des follicules pileux ou les cellules hématopoïétiques) menant à des effets secondaires nombreux et invalidants. Cette action toxique sur ces cellules, exclu toute action bénéfique du système immunitaire lors de la chimiothérapie, l’objectif étant d’obtenir le traitement du patient, par administration d’agents antitumoraux à hautes doses afin de profiter au mieux de l’effet toxique direct sur la tumeur.

L’action positive du système immunitaire lors du traitement du cancer est déjà connue et a récemment été mis en évidence pour certain agents antitumoraux. Ainsi, une hypothèse courante est que des effets régulateurs et inhibiteurs de l’immunité prennent le pas sur l’activité cytotoxique lors du développement des tumeurs, considérant que la sensibilisation du système immunitaire a bien eu lieu, mais que l’immunosuppression induite par la tumeur la masque.

Dans le cas du cancer, il semble naturellement plus intéressant pour le patient qu’il existe une réaction de type TH-1 dirigée contre les cellules tumorales. Ainsi, la présence de lymphocytes T effecteurs CD8 cytotoxiques est cliniquement associée à une meilleure survie et une dissémination réduite dans les cancers colorectaux [401, 402].

Cependant, dans le cas de certains agents antitumoraux, cette forte réponse au traitement suggère que l’efficacité thérapeutique observée compte en partie sur la capacité de l’agent chimiothérapique à interagir avec le système immunitaire [403].

A ce jour, une multitude de composés sont à l’étude pour leur effet sur le système immunitaire [404]. C’est le cas du cyclophosophamide qui, à faibles doses, permet d’inhiber les lymphocytes T régulateurs [405] ou encore la gemcitabine qui a un rôle dans l’inhibition des cellules myéloïdes suppressives [406]. Ces composés de chimiothérapie anticancéreuse permettraient de diminuer l’influence des phénomènes inhibiteurs, révélant ainsi l’action antitumorale spontanée du système immunitaire (Tableau 3).

Tableau 3: Liste non exhaustive d'agents thérapeutiques immunomodulateurs [404]

Dans le cas précis du CPM, qui fait partie de la famille des oxazaphosphorines, ses propriétés immunomodulatrices peuvent être variables selon la dose à laquelle il est utilisé. Ainsi, à forte doses, ils possèdent des propriétés immunosuppressives et myéloablatives dans le cas des allo- et auto- greffes de moelle osseuse. A faibles doses, il est aussi indiqué dans le traitement de maladies auto- immunes [9]. Dans le cas de protocole métronomique, il possède des effets angiogéniques et des propriétés immunostimulantes lui permettant d’agir sur un large panel de cellules de l’immunité [288, 407].

L’effet immunomodulateur du CPM est connu [294, 408-410]. Nous nous sommes donc intéressés lors de nos travaux aux propriétés immunomodulatrices de l’IFO dans la perspective de l’évaluation de nos composés préactivés.

4 RESULTATS

4.1 Analogues d’ifosfamide préactivés permettant la libération de la moutarde isophosphoramidée : synthèse et preuve de concept

Introduction de l’article

Dans cette première partie, notre premier objectif était de proposer une stratégie de pharmacomodulation permettant d’effectuer spécifiquement la préactivation de l’IFO dans la position oxydée par les CYP lors de son métabolisme. Cette stratégie a été initiée par l’équipe en 2001 [298] par la mise en œuvre de la préactivation de l’IFO par une réaction d’oxydation anodique. Cette technique a permis de mettre au point un protocole permettant de synthétiser la forme biomimétique du HO-IFO par synthèse électrochimique du méthoxy-IFO (MeO-IFO) à partir de l’ifosfamide. Celui- ci est obtenu par greffage spécifique du groupement méthoxy (MeO) en position 4 du cycle oxazaphosphorine, position oxydée in vivo lors du métabolisme de l’IFO. Notre objectif fut ensuite de mettre au point un protocole permettant la modification du vecteur préactivant l’IFO et ainsi obtenir un large éventail d’analogues préactivés de l’IFO. Ce panel de composés a été obtenu par échange du groupement méthyle par une variété de chaînes aliphatiques, saturées ou insaturées, comportant 1 à 30 carbones (C1 à C30). Une fois préactivés, ces analogues ont montré une activité cytotoxique en absence d’enzyme CYP et permettent ainsi de conduire, après une réaction d’hydrolyse, à la libération du HO-IFO, précurseur de l’entité responsable de l'activité alkylante (moutarde isophosphoramidée). La longueur de la chaîne alkyle ainsi que sa nature ont un rôle dans la vitesse de cette libération.

Ces composés ont été évalués in vitro sur des lignées cellulaires cancéreuses humaines pour évaluer leur activité cytotoxique par détermination de leur viabilité cellulaire en l'absence de CYP. En outre, dans certains cas, les composés préactivés acquièrent la propriété de s'auto-assembler dans l’eau sous la forme de nanoparticules qui ont été caractérisées par diffusion de lumière dynamique et microscopie électronique à transmission.

Nous présentons cette méthode réalisée pour la conception des composés préactivés de l’IFO et leurs évaluations in vitro ainsi que l’étude de la cinétique de libération de l’entité HO-IFO à partir des composés préactivés, ayant permis la validation de la preuve de concept de préactivation in vitro.

Pre-activated oxazaphosphorines designed for isophosphoramide mustard delivery as bulk form or nano-assemblies: synthesis and proof of concept.

Charles Skarbek1,2,3, Lea L. Lesueur1,2,3, Hubert Chapuis4, Alain Deroussent1,2,3, Catherine Pioche– Durieu5, Aurore Daville1,2,3, Joachim Caron4, Michael Rivard6, Thierry Martens6, Jean-Rémi Bertrand1,2,3, Eric Le Cam5, Gilles Vassal1,2,3, Patrick Couvreur4, Didier Desmaele4 and Angelo Paci1,2,3,7,8.

(1) Université Paris-Sud, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (2) Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (3) Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (4) Université Paris-Sud, Institut Galien, UMR 8612, Châtenay-Malabry, France-92296; (5) CNRS UMR8126, Université Paris Sud 11, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France-94805 ; (6) Université Paris Est Créteil, Institut de Chimie et des Matériaux Paris-Est (ICMPE), UMR 7182, Thiais, France-94320; (7) Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris, Département de Pharmacologie et d'Analyse du Médicament, Villejuif, France- 94805 ; (8) Département de Pharmacie Clinique et de Pharmacocinétique, Université Paris Sud , Université Paris-Saclay, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, France-92296.

Publié dans Journal of Medicinal Chemistry. 2015, 58, 705-717

 Nécessite une métabolisation (prodrogue)  Faible libération de l'entité active (<20%)  Protocoles hautes doses  Toxicités dues au métabolisme IFO  Absence de spécificité

Pharmacomodulation 1

Chaînes saturées courtes Chaînes insaturées (terpéniques) C1  C10 C10  C30

R-X = géranyloxy R = CH3 farnesyloxy C5H11 squalényloxy C10H21 mercaptosqualényloxy

Absence de propriétés Propriétés d'auto-assemblage d'auto-assemblage en milieu aqueux

Encapsulation au sein de Formulation sous formes de nanocapsules lipidiques (NCLs) nanoparticules terpéniques (NPTs)

Nanocapsules lipidiques R-X-IFO formes libres Nanoparticules terpéniques (NCLs) (FLs) (NPTs)

R-X-IFO R-X-IFO R=C10-C30 R=C1-C10

3 2

EVALUATION PHARMACOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE:

Optimisation formulation Stabilité colloïdale Stabilité chimique Etude de libération Evaluation in vitro

Détermination IC50 Evaluation in vivo Pharmacocinétique Efficacité Dose maximale tolérée

Schéma 14 : Représentation schématique du projet relatif à la préactivation de l’IFO. Etape 1 : préactivation de l’IFO

Discussion de l’article

Cette première partie nous a permis de concevoir et de synthétiser des analogues préactivés de l’IFO grâce au couplage de chaînes aliphatiques sur la position oxydée lors du métabolisme de l’IFO, et donnant lieu à la synthèse de sept analogues préactivés de l’IFO. L’activité cytotoxique de ces analogues a été menée sur deux lignées cellulaires cancéreuses humaines en comparaison à celle du HO-IFO. L’ensemble des analogues se sont montrés actifs en absence de CYP in vitro permettant de mettre en évidence la preuve de concept de préactivation. L’activité de l’IFO en présence de CYP n’a pas montré de résultats cohérents du fait du cumul de l’activité du HO-IFO à celle des deux métabolites toxiques : l’ACR et le CAA, l’activité des analogues a donc été comparée à celle de l’HO- IFO obtenu par réduction du HOO-IFO [411] et non par métabolisation de l’IFO en présence de CYP. La caractérisation des composés terpéniques capables de s’auto-assembler a pu être réalisée par DDL et par MET permettant la détermination de leur diamètre. Au vue de leur taille, ces nanoparticules sont susceptibles de profiter du de ciblage passif de la tumeur par l’intermédiaire de l’effet EPR [412]. L’étude ex vivo de la libération de l’entité clef (HO-IFO) dans le plasma de souris a permis de valider la preuve de concept de préactivation. Préalablement à cette étude, nous avons développé et validé la méthode de quantification simultanée du HO-IFO et des analogues préactivés de l’IFO par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) [413] qui a été appliquée pour doser les composés lors de cette étude de libération.

Ces composés ainsi conçus peuvent être répertoriés en deux groupes (Schéma 14) :

1) le premier, correspondant aux analogues n’ayant pas la propriété de s’auto-assembler sous la forme de nanoparticules et correspondant à une préactivation avec des vecteurs alkyles saturés de taille entre C1 et C10. Ces analogues n’ont pas de propriétés spécifiques de nanosystèmes, mais représentent des composés préactivés doués d’activité cytotoxique démontré in vitro qui nécessite d’être formulés pour permettre une action in vivo. Ainsi, nous avons choisi de les encapsuler au sein de nanocapsules lipidiques afin de leur apporter une protection de la dégradation, mais surtout, cette encapsulation permettra d’évoluer vers de nanosystèmes de petites tailles (environ 50nm) [414, 415] qui comme le premier groupe profiterait de la propriété de ciblage pour une spécificité d’action.

2) le second, regroupe les analogues obtenus avec des vecteurs alkyles insaturés et de types terpéniques de tailles allant de C10 à C30. Dans ce cas, ces analogues peuvent s’auto- assembler sous la forme de nanoparticules. Cette propriété innovante permet un ciblage passif et ouvre le chemin à de nouveaux développements tels que la pégylation et l’optimisation vers des nanosystèmes de deuxième et troisième génération et dans le même temps une amélioration potentielle de leur spécificité d’action.

4.2 Analogues d’ifosfamide poly-isopréniques : agents antitumoraux preactivés sous la forme libre ou nanoparticulaire

Introduction de l’article

Dans cette partie, nous avons étudié les analogues obtenus par couplage de chaînes alkyles insaturés et de types terpéniques de tailles allant de C10 à C30 : le géranyloxy-ifosfamide (G-IFO), le farnésyloxy-ifosfamide (F-IFO) et le squalénoxy-ifosfamide (SQ-IFO). L’étude du composé Squalène-thio-ifosfamide (SQ-thio-IFO) ayant été arrêtée du fait de l’utilisation de chrome lors de sa synthèse [416]. Ces composés ont montré la propriété de s’auto-assembler sous la forme de nanoparticules en phase aqueuse. Ainsi, nous avons étudié l’activité in vitro de ces nanoparticules sur un panel de lignées cellulaires, puis nous avons cherché à mettre en évidence l’avantage de cette formulation sur la stabilité chimique des composés en comparaison avec leurs formes libres. De plus, la stabilité colloïdale de ces nanoparticules a été étudiée. Faisant suite à ces résultats, nous avons sélectionné le composé montrant les résultats les plus intéressant pour la mise en place d’essais in vivo.

Nous présentons ici la méthodologie utilisée pour la formulation des composés terpéniques sous la forme de nanoparticules, leurs évaluations in vitro sur un panel complet de lignées cellulaires tumorales d’origine humaines, leurs caractérisations et stabilités colloïdales suivie de l’effet de la formulation sur la stabilité chimique des composés préactivés. Des études pharmacocinétique in vivo préalable à l’étude pharmacotoxicologique préclinique en conditions GMP, telles que la détermination de la dose maximale tolérée, ont ensuite été menées sur le meilleur candidat potentiel parmi les composés préactivés de l’IFO, le G-IFO.

Poly-isoprenylated ifosfamide analogs: preactivated antitumor agents as free formulation or nanoassemblies

Charles SKARBEK1,2,3, Julia DELAHOUSSE1,2,3,7, Catherine PIOCHE–DURIEU4, Sonia BACONNAIS4, Alain DEROUSSENT1,2,3, Michael RIVARD5, Didier DESMAELE6, Thierry MARTENS5, Eric LE CAM4, Patrick COUVREUR6, Angelo PACI1,2,3,7,8.

(1) Université Paris-Sud, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (2) Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (3) Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (4) CNRS UMR8126, Université Paris Sud 11, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France-94805 ; (5) Université Paris Est Créteil, Institut de Chimie et des Matériaux Paris-Est (ICMPE), UMR 7182, Thiais, France-94320; (6) Université Paris-Sud, Institut Galien, UMR 8612, Châtenay-Malabry, France-92296; (7) Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris, Département de Pharmacologie et d'Analyse du Médicament, Villejuif, France-94805 ; (8) Département de Pharmacie Clinique et de Pharmacocinétique, Université Paris Sud , Université Paris-Saclay, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, France-92296.

Publié dans International Journal of Pharmaceutics.

 Nécessite une métabolisation (prodrogue)  Faible libération de l'entité active (<20%)  Protocoles hautes doses  Toxicités dues au métabolisme IFO  Absence de spécificité

Pharmacomodulation 1

Chaînes saturées courtes Chaînes insaturées (terpéniques) C1  C10 C10  C30

R-X = géranyloxy R = CH3 farnesyloxy C5H11 squalényloxy C10H21 mercaptosqualényloxy

Absence de propriétés Propriétés d'auto-assemblage d'auto-assemblage en milieu aqueux

Encapsulation au sein de Formulation sous formes de nanocapsules lipidiques (NCLs) nanoparticules terpéniques (NPTs)

Nanocapsules lipidiques R-X-IFO formes libres Nanoparticules terpéniques (NCLs) (FLs) (NPTs)

R-X-IFO R-X-IFO R=C10-C30 R=C1-C10

3 2

EVALUATION PHARMACOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE:

Optimisation formulation Stabilité colloïdale Stabilité chimique Etude de libération Evaluation in vitro

Détermination IC50 Evaluation in vivo Pharmacocinétique  Efficacité Dose maximale tolérée

Schéma 15: Représentation schématique du projet relatif à la préactivation de l’IFO. Etape 2 : Conception et évaluation pharmacologique des NPTs

Discussion de l’article.

Dans cette partie, nous nous sommes intéressés à l’étude des composés terpéniques : le géranyloxy-ifosfamide (G-IFO), le farnésyloxy-ifosfamide (F-IFO) et le squalényloxy-ifosfamide (SQ- IFO) (Schéma 15). L’évaluation de l’activité cytotoxique de ces composés nous a permis de confirmer la preuve de concept de préactivation de ces composés sur un panel de lignées cellulaires cancéreuses. L’étude de la stabilité colloïdale des suspensions de nanoparticules ainsi que de la stabilité chimique de celles-ci en comparaison à leurs formes libres respectives, nous a permis de mettre en évidence des différences selon les composés étudiés et surtout en fonction de la chaîne couplée. Ainsi, une relation importante entre la longueur de la chaîne et la stabilité des nanoparticules obtenues a été observée. D’une façon générale, il a été observé que plus la chaîne utilisée est longue, meilleure est la stabilité du produit sous la forme libre. A l’inverse, plus la chaîne utilisée est courte et plus la formulation sous la forme nanoparticulaire montre son intérêt pour la stabilité colloïdale. Au vu des résultats in vitro et de la stabilité colloïdale et chimique, le produit G- IFO semble le meilleur candidat pour un développement préclinique complet préalable à son éventuel évaluation clinique. Ce composé a fait l’objet d’un dépôt spécifique de brevet d’invention [301].

Son étude sur le plan in vivo nous a permis d’obtenir des données intéressantes quant à la libération du HO-IFO au cours de l’étude pharmacocinétique mais aussi sur le mode d’administration à envisager. Au cours de cette étude, nous avons étudié l’importance de la voie d’administration, la voie intraveineuse versus la voie intrapéritonéale, ainsi que l’effet de la formulation, forme libre versus la forme nanoparticulaire, sur la cinétique de libération de l’IFO, du G-IFO et du HO-IFO. Nous avons pu observer une différence notable entre les concentrations plasmatiques de l’IFO et du G-IFO (forme libre et nanoparticulaire) selon la voie d’administration utilisée. Ainsi, il semblerait que la voie intraveineuse soit responsable d’une meilleure exposition plasmatique avec une augmentation d’un facteur 2 de l’AUC de l’IFO entre la voies IV et IP. Concernant le G-IFO, les AUCs obtenues montrent un réel gain de l’utilisation de la voie IV, et cela plus particulièrement dans le cas l’injection du G-IFO sous la forme libre. En ce qui concerne la cinétique de libération du HO-IFO à partir de l’IFO ou du G-IFO, celle-ci est variable selon le composé étudié, avec une transformation de l’ordre de 11 à 15% selon la voie d’administration dans le cas de l’IFO. Concernant le G-IFO, une libération accrue du HO-IFO a été observée avec une transformation à comprise entre 60 et 80% selon la voie d’administration. Au vu de ces résultats probants, l’administration du G-IFO sous la forme libre par voie IV a été privilégiée pour la détermination de la dose maximale tolérée. S’en est suivi une étude d’efficacité à la dose maximale tolérée, cependant celle-ci s’est avérée non concluante. L’administration du G-IFO sous sa forme libre par voie IV a mené à une nécrose prononcée au niveau du point d’injection laissant croire à une accumulation au niveau du point d’injection menant à une faible exposition. Ainsi, bien que les résultats aient été encourageants lors

de l’étude pharmacocinétique, l’injection à hautes doses du produit G-IFO sous la forme libre par la voie IV ne semble pas appropriée.

Afin de répondre à cette problématique, des essais de formulation de nanoparticules pégylées sont en cours. Il est connu que les nanoparticules « nues » sont rapidement excrétées du fait de leurs opsonisation, ainsi, le fait de pégylés celles-ci permet de les rendre « furtives » permettant ainsi d’optimiser leurs caractéristiques pharmacolgiques [417, 418], de ce fait, la furtivité peut ainsi permettre une augmentation de l’exposition lors de l’administration dans le cas des nanoparticules. Concernant la forme libre, des études d’efficacité par administration répétées de doses plus faibles pourrait être envisagées ou l’administration à l’aide d’une perfusion permettant une diffusion lente du produit afin de limiter l’effet d’agglutination au niveau du point d’injection.

Enfin, l’intérêt du G-IFO réside dans sa capacité à montrer une activité cytotoxique tant sous sa forme libre que sous sa forme nanoparticulaire. Dans les deux cas, une formulation pharmaceutique de type GMP est nécessaire pour poursuivre le développement préclinique voire clinique. Ces étapes sont actuellement discutées dans un environnement entrepreneurial.

4.3 Encapsulation d’analogues préactivés d’ifosfamide au sein de NanoCapsules Lipidiques (NCLs).

Introduction

Dans cette partie, nous nous sommes intéressés à l’étude des analogues n’ayant pas la possibilité de s’auto-assembler sous la forme de nanoparticules : le méthoxy-ifosfamide (MeO-IFO) et le pentanyloxy-ifosfamide (P-IFO). Ces analogues ne possèdent pas la propriété spécifique de s’auto- assembler sous la forme de nanoparticules, nous avons donc étudié leur encapsulation au sein de nanocapsules lipidiques (NCLs) afin de les protéger contre l’hydrolyse menant à la libération du HO- IFO, mais surtout dans le but de les vectoriser sous la forme de nanosystèmes de petites tailles (environ 50nm). Cette vectorisation leur permettrait ainsi, comme pour le premier groupe, de profiter de la propriété de ciblage vis-à-vis des cellules tumorales par effet EPR et ainsi apporter une spécificité. Pour ce faire, une collaboration a été initiée avec l’unité « micro et nanomedecines translationnelles» (MINT, U1066) de l’Université d’Angers dirigée par le professeur Patrick Saulnier afin de pouvoir mettre en œuvre l’encapsulation de ces composés.

Etat de l’art

Comme indiqué précédemment, parmi les nanosystèmes de type lipidique (page 28), nous trouvons les nanocapsules lipidiques (NCLs ; ou lipid nanocapsules – LNCs). Ce système de délivrance de médicament a été inventé et mis au point au sein de l’unité « micro et nanomedecines translationnelles» (MINT, U1066) de l’Université d’Angers et a fait l’objet d’un brevet d’invention [419].

Ces NCLs sont généralement constituées (Figure 33) [86]:

1) d’une partie lipidique : constituée principalement de triglycérides,

2) d’une coque constituée de tensioactifs (polyéthylène glycol hydroxystéararte)

3) d’une partie aqueuse : constituée d’eau milliQ additionné de chlorure de sodium

4) de surfactants non-ionique : telle que de la lécithine de soja.

Figure 33 : Représentation d’une nanocapsules lipidique (adaptée de [86]

Ces différents constituants sont approuvés par la FDA pour une utilisation orale, topique et parentérale. De plus, chacun des constituants utilisé joue un rôle primordial dans la formulation et a ainsi une influence directe sur le résultat final tant sur la stabilité que sur la taille des NCLs obtenues (Tableau 4).

Tableau 4 : Influences des constituants sur la formulation finale des NCLs [86]

Ces NCLs permettent d’encapsuler le composé d’intérêt au sein des NCLs menant à la protection du médicament de l’hydrolyse. De plus l’encapsulation permet l’obtention d’un nanomédicament apportant ainsi de la spécificité à la molécule dans le but d’un ciblage des cellules tumorales. La formulation de ces NCLs repose sur la technique d’inversion de phase qui permet l’obtention de nanocapsules à partir d’émulsion. La méthodologie générale consiste à chauffer l’ensemble des constituants (principe actif, phase lipidique, phase aqueuse et surfactants) sous agitation, puis, plusieurs cycles de chauffage / refroidissement sont effectués permettant des inversions de phases d’une émulsion huile dans l’eau et eau dans l’huile. Une dernière étape, permet la formation de la suspension de NCLs finale par dilution en additionnant de l’eau à 4°C (Schéma 16). Cette addition est effectuée à la température d’inversion de phase, correspondant à la température à laquelle une microémulsion est observée [420].

Schéma 16 : Représentation schématique de la méthode d’inversion de phase (adaptée de [414])

Cette technique d’encapsulation a permis, depuis son invention, l’encapsulation de nombreux composés lipophiles peu solubles tels que le méthotrexate [421], le paclitaxel [422-424], l’erlotinib [192, 425] , la miltéfosine [276] ect…[86].

Une fois le composé encapsulé au sein de NCLs, différentes études peuvent être menées pour mettre en évidence l’intérêt de l’encapsulation sur l’effet thérapeutique en comparaison à la molécule libre [424, 426-428].

Formulation de NCLs de pentanyloxy-ifosfamide (P-IFO)

Les travaux effectués menant au développement et à la validation d’une formulation permettant l’encapsulation de dérivés préactivés de l’ifosfamide au sein de NCLs ont été effectués dans l’unité de « micro et nanomedecines translationnelles» (MINT, U1066) dans le cadre de stages de Master 1 de C. Haury et Master 2 d’H. Gondé sous la direction du Dr Emilie Roger. La formulation de ces NCLs a été effectuée par la méthode d’inversion de phase [86]. Ces travaux ont été initiés dans le but d’encapsuler les dérivés préactivés de l’ifosfamide ne possédant pas la propriété de s’auto- assembler sous la forme de nanoparticules. Ainsi, les dérivés méthoxy-ifosfamide (MeO-IFO) puis pentanyloxy-ifosfamide (P-IFO) ont été étudiés. La détermination de l’excipient lipidique le plus favorable à la solubilisation du produit et montrant une faible dégradation de celui-ci a d’abord été

effectuée. Cette étude a permis de sélectionner le Pécéol® comme étant le meilleur excipient huileux permettant la solubilisation du P-IFO. Dans le cas du MeO-IFO, aucun excipient ne s’est montré probant et la dégradation du produit a été observée menant à l’abandon de son développement. Des plans d’études de mise au point et d’optimisation de la formulation ont ensuite été effectués afin de déterminer la composition optimale permettant l’encapsulation du P-IFO. La formulation optimisée est composée d’un mélange de six excipients : le glycérol mono-oléate (Pécéol®), un mélange de phosphatidylcholine et de phosphatidyléthanolamine (Lipoid®S75), des triglycérides à chaînes moyennes de type triglycérides capryc et caprylique (Labrafac®WL 1349), un surfactant composé de polyéthylène glycol 660 et de polyéthylène glycol hydroxystéarate (Kolliphor®HS 15), du chlorure de sodium (NaCl) ainsi que de l’eau milliQ®. La composition est détaillée dans le tableau ci-dessous (Tableau 5).

Tableau 5 : Composition optimisée pour la formulation de NCLs non chargées Excipients Proportion massique (%) Masse (mg) Pécéol® 11,7 120,0 Lipoid®S75 0,7 6,70 Labrafac® WL 1349 26,9 276,00 Kolliphor® HS 15 24,7 253,00 NaCl 1,8 18,75 Eau milliQ® 34,2 351,00

La procédure générale de formulation de ces NCLs est comme suit. Dans un premier temps, le lipoid®S75 est solubilisé dans le Labrafac® par chauffage. Puis le Péceol® est ajouté au mélange refroidi, celui-ci est ensuite chauffé afin de permettre le mélange du Péceol®. Enfin, après refroidissement, le Kolliphor®HS 15, le NaCl et l’eau milliQ® sont ajoutés. Ce mélange est soumis à trois cycles de chauffage-refroidissement entre 50 °C et 30 °C. Lors du dernier cycle, un choc irréversible est induit par addition d’eau milliQ® à 4 °C. Cette étape permet l’obtention des NCLs. Après 5 minutes d’agitation, la suspension obtenue est filtrée sur un filtre 0.2µm afin d’éliminer les composants résiduels [429].

Dans le cas des NCLs chargées, le P-IFO est préalablement solubilisé dans le Péceol® à sa concentration de saturation (190 mg/g). Afin de garantir la bonne solubilisation du P-IFO, le mélange (P-IFO/Pécéol®) est vortéxé pendant 5 minutes puis placé dans un bain à ultrasons pendant une heure.

Les NCLs (non chargées ou chargées en P-IFO) ainsi formées ont été caractérisées par la technique de diffusion dynamique de la lumière, de plus, la quantité de P-IFO présent dans la suspension de NCLs a été dosée par LC-MS/MS afin de de déterminer le taux et le rendement d’encapsulation (Tableau 6).

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Tableau 6 : Caractéristiques des NCLs non chargées et chargées [429] Taux Rendement Diamètre PdI d’encapsulation d’encapsulation moyen (nm) (mg/mL) (%) NCLs non chargées 48.8 ± 1.0 0.07 ± 0.01 NA NA (n=6) NCLs chargées (n=3) 47.2 ± 0.7 0.08 ± 0.01 8.42 ± 1.05 80 ± 9

4.3.3.1 Evaluation de la cytotoxicité et de la cinétique de libération des NCLs chargées de P-IFO

Une fois l’optimisation de la formulation des NCLs (chargées ou non) terminée par l’unité de « micro et nanomedecines translationnelles» (MINT, U1066) de l’Université d’Angers, nous avons pu effectuer l’évaluation de leur cytotoxicité sur deux lignées cellulaires cancéreuses, suivie de l’étude de la cinétique de libération du P-IFO à partir des NCLs au sein l’UMR8203.

Matériel et méthodes

4.3.4.1 Réactifs et produits

L’hydroxy-ifosfamide (HO-IFO) a été obtenu par réduction de l’hydroperoxy-ifosfamide (HOO-IFO) commercialisé par Niomech (Bielefeld, Germany) avec une pureté de 99%. Le pentanyloxy- ifosfamide (P-IFO) et le 13,17-dimethyloctanyloxyifosfamide (DMO-IFO) ont été synthétisés avec une pureté de 99% au sein de l’institut de chimie des matériaux Paris Est [416], leurs structures ont été déterminées par RMN 31P, 1H and13C et leur pureté par spectrométrie de masse haute résolution. L’hydrochlorure de semicarbazide, (SCZ), l’héxaméthylphosphoramide (HMP), le tert-butyl méthyl éther (MTBE), l’acétonitrile LC-MS grade, le polysorbate 80 (Tween 80®) et les membranes de dialyse (Spectra-Por® Float-A-Lyzer® 100kDa) ont été fournis par Sigma–Aldrich (St Louis, MO, USA). Pour la culture cellulaire, les milieux Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM), Roswell Park memorial institute medium (RPMI), le sérum de veau fœtal et les antibiotiques (pénicilline, streptomycine) ont été fournis par Gibco (Paisley, UK). Le réactif MTS ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)) a été fourni par Promega (Charbonnières-les-Bains, France). Enfin, les NCLs non chargées et chargées ont été réalisées par l’unité de micro et nanomédecine Translationnelle (MINT) de l’Université d’Angers ( Dr E. Roger).

4.3.4.2 Lignées cellulaires

Les modèles cellulaires utilisés pour cette étude sont les lignées A673 (sarcome d’Ewing) et RMS- 1 (Rhabdomyosarcome). Ces cellules ont été sélectionnées car elles correspondent aux lignées sur lesquelles nous avons fait nos études préliminaires. Elles sont sensibles à l’IFO et sont utilisées en

101

routine au sein de notre équipe lors des essais in vitro. Les cellules sont cultivées à 37 °C en présence de 5 % de CO2 et avec une hygrométrie de 95%. Les milieux utilisés sont les milieux DMEM ou RPMI additionnés de 10 % de sérum de veau fœtale et 1 % d’antibiotiques (100 U/mL pénicilline et 100 µg/mL streptomycine).

4.3.4.3 Etude de viabilité cellulaire in vitro

L’activité cytotoxique des composés P-IFO (sous la forme libres et encapsulé dans les NCLs) et des NCLs non chargées a été étudiée à l’aide de la méthode MTS permettant la détermination de la viabilité cellulaire. Les cellules sont ensemencées dans des plaques 96 puits par addition de 100 L de cellules à une concentration de 5.103 cellules /mL, les plaques sont ensuite incubées à 37°C en présence de 5% de CO2 et une hygrométrie de 95%. Après une nuit d’incubation, les cellules sont traitées par addition de 100 L du produit à étudier (P-IFO sous la forme libre, NCLs chargées en P-IFO ou NCLs non chargées) à différentes concentrations (0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 200 M de p-IFO, les NCLs non chargées sont ajouté aux mêmes dilutions que les NCLs de P-IFO). Après 72 h d’incubation, 20 L (1/10) du réactif MTS sont ajoutés dans chaque puits. Selon la lignée cellulaire étudiée, un temps d’incubation de 2 à 5 h est nécessaire afin d’obtenir une densité optique optimale ensuite mesurée à la longueur d’onde de 490 nm (longueur d’onde du formazan, molécule libérée lors de réduction du MTS par les cellules). Les cellules non-traitées sont utilisées comme témoin négatif. Chaque concentration est testée en sixplicata (n=6). La concentration inhibant 50% de la prolifération cellulaire (IC50) est ensuite déterminée graphiquement à l’aide du logiciel Prism 5™ (Graph Pad Software Inc, San Diego, CA, USA).

4.3.4.4 Mise en place de la cinétique de libération

L’étude de la cinétique de libération du P-IFO encapsulé dans les NCLs a été effectuée après dépôt des NCLs dans un boudin de dialyse lui-même introduit dans un milieu de réception. Brièvement, 600 L de NCLs chargées ont été introduits dans un boudin de dialyse celui-ci est ensuite introduit dans 250 mL de PBS 1X, de Tween 80 pure et d’une solution de semicarbazide à 2M (89/1/10 ; v/v/v). L’ensemble étant maintenu à 37°C et sous légère agitation tout au long de l’étude. Aux différents temps étudiés lors de la cinétique (0 ; 0,5 ; 1 ; 2 ; 3 ; 4 ; 6 et 24 h), une prise d’essai de 100 L est prélevée au sein du milieu de réception et remplacée par le même volume de milieu frais. De plus, une prise d’essais de 20 L de la suspension de NCLs est prélevée au temps T = 0 et à T24 h, afin de déterminer la concentration initiale. Cette cinétique a été effectuée en duplicata, sur deux suspensions de NCLs (n=2) indépendantes. Les prises d’essais ont été extraites avec 1 mL de tert-butyl méthyl éther (TBME) après addition de 200 L d’étalon interne (300ng/mL du mélange HMP/DMO). Après homogénéisation au vortex et centrifugation 30 s à 10 000 rpm, un volume de

102

950 L de surnageant est prélevé été évaporé puis le résidu obtenu a été repris dans la phase mobile. La quantification des produits a ensuite été effectuée selon la méthode LC-MS/MS développée par notre équipe [413]. Brièvement, les analyse ont été menées sur un système LC- MS/MS composé d’une chaîne HPLC 1100 séries (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) contenant une colonne de type Uptisphere® C18 (100 mm × 2.1 mm i.d., taille de particule 5 µm) (Interchim, Montluçon, France). La séparation a été effectuée en mode isocratique à un débit de 0.25 mL/min à l’aide d’une phase mobile composée d’ACN et d’un tampon d’acétate d’ammonium à une concentration de 10 mM (pH=5.5) (95/5, v/v). Le temps d’analyse permettant la séparation de l’ensemble des composés a été de 3.5 min. Avant chaque échantillon, l’auto sampler a été rincé à l’aide d’une injection d’ACN. La détection de chaque composé a été menée à l’aide d’un spectromètre de masse triple quadripôle QuattroLC® (Waters, Manchester, UK) opérant en mode electrospray positif en utilisant les transitions MRM suivantes : m/z 347 → 259 pour le P-IFO et m/z 334 → 221 pour le SCZ-O-IFO (correspondant au HO-IFO dérivé) 180 → 135 pour HMP (Etalon

Interne1), 347 → 259 pour le DMO-IFO (Etalon Interne2). Les analyses ont été menées avec un temps Dwell de 0.2ms, l’énergie de collision a été optimisée selon le composé, la tension de cône et du capillaire a été réglée à 25 et 3500 V. Enfin, la température de la source et du gaz de désolvatation a été réglée à 90 et 250 °C, le gaz de collision (Ar) a été réglé à 1.2 10-3 mbar. Les données ont ensuite été analysées à l’aide du logiciel Masslynx™.

Résultats

4.3.5.1 Etude de viabilité cellulaire in vitro

L’évaluation de l’activité cytotoxique du P-IFO (sous la forme libre et sous la forme de NCLs) ainsi que des NCLs non chargées a été effectuée par détermination graphique de leurs IC50 (concentration inhibant 50 % de la croissance cellulaire) à partir de leurs courbes de survie respectives (Figure 34).

A) B) ) ) 1 0 0

% 1 0 0

(

i a

a 7 5 l

l 7 5

c 5 0

5 0 é

l i i I C = 5 .1 ± 1 .9 µ M

l I C 5 0 = 1 6 .6 ± 3 .3 µ M 5 0

a b I C = 1 4 .5 ± 2 .1 µ M i 2 5 I C 5 0 = 9 .5 ± 2 .1 µ M

a 2 5 5 0

v i

v I C 5 0 = 2 3 .4 ± 6 .1 µ M I C 5 0 = 6 7 .0 ± 2 .0 µ M 0 0 0 .1 1 1 0 1 0 0 0 .1 1 1 0 1 0 0 C o n c e n t r a t io n s ( µ M ) C o n c e n t r a t io n s ( µ M )

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Figure 34 : Courbes de survie du P-IFO sous la forme libre (●), encapsulé dans les NCLs (■) ou des NCL non chargées (▲) sur les lignées A673 (A) ou RMS-1 (B) après 72h d’incubation

Lors de l’évaluation de l’activité cytotoxique des dérivés préactivés de l’IFO, nous avons établis qu’un produit est considéré comme active quand sa valeur d’IC50 est inférieur à 50 µM. Une IC50 de 16.6 ± 3.3 µM et 5.1 ± 1.9 µM a été obtenue sur les lignées A673 et RMS-1, respectivement pour le P-

IFO sous sa forme libre. Pour la formulation du P-IFO sous la forme de NCLs des valeurs IC50 de 14.5 ± 2.1 µM et 9.5 ± 2.1 ont été obtenues sur les lignées A673 et RMS-1, respectivement. Les NCLs non chargées, quant à elles n’ont montrées aucune activité sur la lignée A673 (67.0± 2.0 µM), mais une IC50 de 23.4± 6.1 µM sur la lignée RMS-1 témoin d’une activité cytotoxique. Sur la lignée A673, aucune différence significative de cytotoxicité a été observée entre la forme libre et la forme NCLs. En revanche, sur la lignée RMS-1, les NCLs ont montré une diminution de l’activité avec une

IC50 divisée par un facteur 2 avec des valeurs d’IC50 différentes entre les formulations libres et NCLs. Concernant l’évaluation des NCLs non chargées, nous n’avons observé aucune activité cytotoxique sur la lignée A673 au vu de sa valeur d’IC50 de 67.0± 2.0 µM, cependant cette formulation présente une cytotoxicité relative sur la lignée RMS-1 avec une valeur d’IC50= 23.4 ± 6.1 µM.

4.3.5.2 Etude de libération du P-IFO à partir des NCLs

La quantification du p-IFO et OH-IDFO dans les suspensions de NCLs utilisées pour cette étude (F1 et F2) au temps T0 a montré la présence du composé HO-IFO synonyme de dégradation du P-IFO, celle-ci ayant été évaluée à environ 50% (Tableau 7).

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Tableau 7 : Quantification des composés P-IFO et HO-IFO contenu dans les suspensions de NCLs au temps T=0 Concentration théorique Concentration molaire (mg/mL) P-IFO HO-IFO Total P-IFO F1 F2 F1 F2 F1 F2 F1 F2 12,4 12,2 11,8 10,4 24,2 22,6 8,4 7,8

Les concentrations quantifiées de P-IFO et HO-IFO ont été normalisées et exprimées en pourcentage par rapport à leurs concentrations initiales au temps T0 (Figure 35)

0 6 0

i t

r 4 0 a

p H O -IF O

)

(

g a

t 2 0 P -IF O

u o

P 0 0 6 1 2 1 8 2 4 3 0 te m p s (h )

Figure 35 : Cinétique de libération du P-IFO et du HO-IFO à partir des NCLs chargées (n=2)

Ces résultats montrent une libération rapide du HO-IFO. Cette libération rapide est expliquée par la présence d’HO-IFO dans la suspension de NCLs de départ. Concernant la cinétique de libération du P-IFO, nous observons une libération progressive au cours du temps. De plus, une diminution de la quantité de P-IFO et HO-IFO au point tardif de 24 heures est observée, cette diminution peut être expliquée par une transformation en entités non quantifiées.

Discussion

Les travaux de formulation entrepris au sein de l’unité de « micro et nanomedecines translationnelles » (MINT, U1066) de l’Université d’Angers ont donné lieu à la mise au point d’une formulation optimisée permettant l’encapsulation du P-IFO au sein de NCLs. L’évaluation de la cytotoxicité de ces NCLs a montré une activité de celle-ci sur deux lignées cellulaires sensibles à l’IFO. Ces activités qui sont de l’ordre de 20 µM son semblable à celle obtenues avec le HO-IFO sur ces mêmes lignées cellulaires (résultats non présentés). Cependant une activité de l’ordre de 20 µM a été observée sur la lignée RMS-1 dans le cas des NCLs non chargées. Cette toxicité correspondant à une suspension de NCLs non chargées diluées à 0.16% dans le milieu et peut être imputé aux constituants rentrants dans la composition des NCLs. Les résultats de l’évaluation de

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l’activité cytotoxique des NCLs chargées en P-IFO permettent de confirmer l’activité du composé après encapsulation au sein des NCLs.

Concernant la cinétique de libération du P-IFO à partir des NCLs, celle-ci est progressive dans le temps avec une cinétique de libération prolongée et graduelle dans le temps. Ces résultats sont cohérents avec la littérature et nos attentes et montre bien l’effet bénéfique de l’encapsulation de composés d’intérêt au sein de NCLs [415, 430]. Néanmoins, lors de cette étude, la présence d’HO- IFO dans les suspensions de NCLs utilisée a biaisé la cinétique de libération du composé HO-IFO. La libération rapide d’HO-IFO a pu être expliquée par la présence d’HO-IFO non encapsulé au sein de la suspension de départ, celui-ci ayant ainsi diffusé directement dans le milieu de libération ce qui pourrait expliquer sa très forte libération lors des temps précoces.

Conclusion et perspectives

La stratégie de préactivation de l’IFO permettant l’obtention d’analogues préactivés a montré des résultats probants puisque tous ces composés ont montré une activité en l’absence de matériel enzymatique, validant ainsi le concept de préactivation [416]. Le fait de pouvoir encapsuler ces dérivés préactivés ouvre la voie au développement de ces molécules en tant que potentiels nanomédicaments. De plus, l’obtention d’une forme protégée et de taille du nanomètre pourrait mener à une spécificité tumorale [431, 432]. Cette spécificité améliorée, accompagnée de la libération graduelle du produit, pourrait permettre une augmentation de l’exposition du produit dans le compartiment tumoral et, de ce fait, une amélioration de l’index thérapeutique de l’IFO [284, 433, 434].

Les travaux entrepris jusqu’ici concernant l’encapsulation du P-IFO sous la forme de NCLs ont permis l’obtention de résultats préliminaires cohérents par rapport à nos attentes (Schéma 17). L’étude de la cinétique de libération du P-IFO à partir des NCLs ainsi que la dégradation du P-IFO en HO-IFO devront être reproduites afin de confirmer ces premiers résultats. Une étude cinétique de stabilité des NCLs chargées en P-IFO en quantifiant les composés P-IFO et son produit actif HO- IFO pourra être réalisée pour déterminer leurs conditions de conservation. Enfin, des études d’efficacité in vivo permettront d’étudier l’efficacité antitumorale des NCLs chargées en P-IFO comparativement à l’IFO et au P-IFO sous sa forme libre.

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 Nécessite une métabolisation (prodrogue)  Faible libération de l'entité active (<20%)  Protocoles hautes doses  Toxicités dues au métabolisme IFO  Absence de spécificité

Pharmacomodulation 1

Chaînes saturées courtes Chaînes insaturées (terpéniques) C1  C10 C10  C30

R-X = géranyloxy R = CH (NA) 3 farnesyloxy  C H 5 11 squalényloxy  C H 10 21 mercaptosqualényloxy

Absence de propriétés Propriétés d'auto-assemblage d'auto-assemblage en milieu aqueux

Encapsulation au sein de Formulation sous formes de nanocapsules lipidiques (NCLs) nanoparticules terpéniques (NPTs)

Nanocapsules lipidiques R-X-IFO formes libres Nanoparticules terpéniques (NCLs) (FLs) (NPTs)

R-X-IFO R-X-IFO R=C10-C30 R=C1-C5

3 2

EVALUATION PHARMACOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE:

Optimisation formulation Stabilité colloïdale Stabilité chimique Etude de libération Evaluation in vitro

Détermination IC50 Evaluation in vivo  Pharmacocinétique  Efficacité  Dose maximale tolérée

Schéma 17: Représentation schématique du projet relatif à la préactivation. Etape 3 : Conception et évaluation pharmacologique des NCLs

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108

4.4 Effet immunomodulateur dose-dépendant des oxazaphosphorines : optimisation de la combinaison des effets immunomodulateur et cytotoxique

Etat de l’art

Le cyclophosphamide (CPM) est un isomère de position de l’IFO, possédant lui aussi deux chaînes chloroéthyles qui sont ici, liées à l’azote exocyclique (Figure 36).

Figure 36: Représentation chimique du cyclophosphamide

Le CPM est indiqué dans le traitement de divers types de cancers : cancers ovariens, bronchiques à petites cellules, de la vessie, des sarcomes, des neuroblastomes, les lymphomes malins hodgkiniens et non hodgkiniens, ainsi qu’en situation métastatique des adénocarcinomes mammaires [24]. Il est principalement administré par voie parentérale, cependant la voie orale est utilisée dans le traitement des affections auto-immunes. Comme pour l’IFO, l’effet thérapeutique du CPM est corrélé avec la dose administrée. Son métabolisme est quant à lui différent de celui de l’IFO, engendrant des posologies plus faibles que celle de l’IFO [16, 21, 273]. En 1988, Awwad et North [435] puis, Browder et al [436] en 2000 ont étudié l’effet thérapeutique du CPM à faibles doses à l’aide de schéma d’administration de doses métronomiques. Leurs travaux ont permis de mettre en évidence un double effet du CPM lors de ces schémas avec l’obtention d’un effet immunomodulateur et anti-angiogénique. Ainsi, l’efficacité du CPM administré à faible dose serait due aux modulations qu’il exerce sur le micro-environnement tumoral. Au niveau in vitro, il a été démontré que le CPM agissait de façon différente selon le type cellulaire. Ainsi, à faibles doses, le CPM agit sur les cellules endothéliales participant de ce fait à l’effet anti-angiogénique, tandis qu’à fortes doses, il agit directement sur les lignées de fibroblastes ou cancéreuses [437]. Depuis, un grand nombre d’études ont été menés en phase préclinique (in vivo) ou clinique (essais clinique) afin de mettre en évidence les mécanismes physiopathologiques mis en jeux [293, 295, 297, 392, 393, 408, 438]. D’une façon générale, il semblerait que le CPM à faible dose ait une action sur le microenvironnement tumoral plus que sur les cellules cancéreuses elles-mêmes. A l’inverse, lors de schémas d’administrations à fortes doses les cellules cancéreuses sont les premières touchées [439].

Concernant l’IFO, et malgré sa proximité structurale avec le CPM, très peu d’études scientifiques ont traité de son potentiel effet sur l’immunité à faible dose. Il a ainsi été démontré que l’IFO aurait

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une activité sur les lymphocytes du sang périphérique par diminution des concentrations en glutathion intracellulaire. Le glutathion est une molécule qui intervient dans les processus de détoxification par réaction de sa fonction thiol avec des molécules toxiques telles que les « reactive oxygen species » (ROS), ainsi la diminution de sa concentration intracellulaire résulte dans l’impossibilité des lymphocytes à finir le cycle cellulaire. Cette déplétion des concentrations en glutathion peut aussi induire un stress menant à la phosphorylation de la protéine HSP27 qui intervient, elle aussi, dans l’équilibre cellulaire et la prise en charge des ROS [440, 441]. La diminution des concentrations intracellulaires joue aussi un rôle dans l’expression de cytokines telles que l’interféron gamma et l’IL-2, toutes les deux ayant un rôle important dans la réponse immunitaire [442, 443]. Malgré cela, aucune étude complète visant à étudier l’activité immunomodulatrice de l’IFO n’a été menée à ce jour. Ainsi, étant donné les résultats existants pour le CPM, nous avons réalisé des expériences afin de déterminer les caractéristiques immunomodulatrices de l’IFO par comparaison au CPM afin de déterminer l’influence de l’IFO sur le système immunitaire dans la perspective de leur utilisation dans une stratégie duale d’effet cytotoxique et/ou immunomodulatrice (Schéma 18).

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X-OXAZAPHOSPHORINES (X-OXAZA) OXAZAPHOSPHORINES Oncologie – Hématologie Dose: 50 to 20 mg/m2 Maladies inflammatoires Dose: 75 – 150 mg/j

Cytotoxique Immunomodulateur

Oncologie Dose: 1,5 to 3 g/m2 TOXICITE +++

 Cytotoxique  Immunomodulateur

ETUDE DU POTENTIEL EFFET IMMUNOMODULATEUR DE L’IFO vs le CPM

Effet de la tumeur sur l’expression des Effet immunomodulateur de Preuve de concept de l’effet cellules immunitaires? l’IFO ? immunomodulateur de l’IFO? Dose d’IFO immunomodulatrice? Schéma 18 : Etude de l’effet immunomodulateur de l’IFO comparativement au CPM

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Dose-dependent immunomodulatory effect of ifosfamide: fine tuning of immune and cytotoxic effects.

Julia Delahousse1,2,3,4, Charles Skarbek1,2,3, Mélanie Desbois5,6,7 ,8¶, Nathalie Chaput5,6,7,8*¶, Angelo Paci1,2,3,4,9*

(1) Université Paris-Sud, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (2) Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (3) Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (4) Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris, Département de Pharmacologie et d'Analyse du Médicament, Villejuif, France-94805 ; (5) Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris, Laboratoire d’immunomonitoring en oncologie, Villejuif, F-94805, France ; (6) CNRS,UMS 3655 Villejuif, F-94805, France (7) INSERM, US23, Villejuif, France-94805 ; (8) Université Paris-Sud , Université Paris-Saclay, Faculté de Médecine, Le Kremlin Bicêtre, 94276, France (9) Département de Pharmacie Clinique et de Pharmacocinétique, Université Paris-Sud , Université Paris-Saclay, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, France- 92296.

Soumis dans Journal of Immunology

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Abstract

Oxazaphosphorines (cyclophosphamide CPA, ifosfamide IFO) are antineoplasic agents widely used to treat various cancers and are still the corner stone of several polychemotherapy protocols. Cyclophosphamide (CPA) is an isomeric form of IFO and differs chemically from IFO in the localization of one of the chloroethyl group. Many studies described the immunomodulatory properties of CPA. Indeed, low dose of CPA is known to enhance the immune defenses particularly promoting differentiation of T cells toward Th1/Th17. However, in vitro studies suggest that IFO could rather inhibit IFN secretion by T cells. The similar structure of CPA and IFO leads us to explore immunomodulatory effect of IFO in vivo in mice. Studies on a murine fibrosarcoma mouse model showed a dose-dependent effect of IFO towards Th1 and Th17 polarization. Antitumor activity of low dose IFO (150 mg/kg) was abolished in mice depleted in CD4+ and CD8+ T cells. These results display the significant effect of IFO in vivo on adaptive T cell immunity in naive and tumor-bearing mice. IFO is thus characterized by a bimodal mechanism of antitumor action; low-dose schedules should be preferred in association with immunotherapy in the presence of immunogenic tumor, while dose escalation finds better utility in polychemotherapy protocols where a conventional direct cytotoxic anticancer effect is needed.

Introduction

Tumor microenvironment plays an important role in tumor process. Indeed, endothelial cells and stroma, infiltrating immune cells contribute to the tumor progression or to the tumor remission. Besides, the tumor stroma has a key role defining a hostile tumor environment with the production of immunosuppressive factors and the recruitment of immune suppressive cells [444]. Tumor cells also provide mediators of immune escape through the secretion of immunosuppressive factors such as transforming growth factor-beta (TGF-β) and through the expression of ligands for immune checkpoints as well as establishing an immune tolerance. Targeting the tumor cell environment seems to be a promising strategy to increase efficiency of “old” chemotherapy agents. Immune checkpoint inhibitors such as anti-PD-1, anti-PD-L1 and anti-CTLA-4 have also proved their efficacy in many tumors such as melanoma [445] and non-small-cell lung cancer treatment [446]. Today, the combination of immunotherapy and conventional cancer therapy provides new and innovative antitumor strategies [400, 447].

Conventional antitumor chemotherapy is described as direct cytotoxic agent used for targeting the DNA integrity (alkylating agents), the DNA and RNA synthesis (anti-metabolites, cytotoxic antibiotics), the DNA replication (topoisomerase inhibitors) or cytosolic compound (anti-microtubule agents). Next to this direct cytotoxicity, recent works have provided evidences that conventional antitumor chemotherapy could act through antitumor immune-based mechanisms [447]. Indeed,

114

some conventional chemotherapies can stimulate the immune system by induction of a transient lymphodepletion of regulatory T cells (Treg), by subverting immunosuppressive mechanism or exerting stimulatory activities on immune cells [448]. Anticancer alkylating drugs such as cyclophosphamide (CPA) have a direct cytotoxicity through DNA-binding and an indirect antitumor effect at low dose through the activation of antitumor immunity. Many reports have demonstrated the immunomodulatory effects of CPA through different mechanisms such as Treg cells depletion or inactivation [295, 393, 449-452], the increase of proinflammatory cytokines such as IFN and IL-17 [410, 453], the modulation of myeloid cells toward an inflammatory status [454]. More recently, it has been suggested that induction of pathogenic Th17 cells was the consequence of the modulation of intestinal microbiota composition in tumor-bearing mice [392].

Oxazaphophorines, mainly represented by CPA and ifosfamide (IFO) belong to the alkylating nitrogen mustard family, they are widely used as cytoreductive drugs in clinical regimens to treat several cancers from soft-tissue tumors to lymphomas and they are involved in many polychemotherapy protocols. For IFO, dose regimens range from 1 000 to 12 000 mg/m2/day in humans [6, 45] and 200 to 300 mg/kg in tumor-bearing mice [455] when used as cytotoxic agent; for CPA dose range from 200 to 1 000 mg/ m2/day in human [456, 457] and from 100 to 250 mg/kg in tumor-bearing mice [458-460]. IFO is an isomeric form of CPA and differs chemically from CPA in the localization of one of the chloroethyl group (Figure 1). Studies have suggested that less myelosuppression in IFO-treated patients may have advantages over CPA in combination therapy [461-463]. Few publications deal with the influence of IFO on the immune system and contrary to CPA most in vitro studies have reported a negative impact of IFO on immunity. Lind et al. showed in 1989 that IFO and its metabolites (Hydroxy-IFO and chloroacetaldehyde) decrease the intracellular- glutathione (GSH) concentration in patient’s lymphocytes treated with IFO at 5 g/m2 [464]. GSH is the major intracellular thiol reductant that acts as protector against oxidative injury, thus GSH decrease affect survival, proliferation and functions of lymphocytes. In 1993, Issels et al. confirmed in vitro that IFO could diminish GSH in lymphocyte [440] and in 1995, Multhoff and colleagues showed that IFO could decrease the cytotoxic activity of T cells in vitro [465]. More recently, Kuppner et al. suggested that IFO could decrease IFN-production by T cells [443]. To our knowledge no study has explored the immunomodulatory activity of IFO in vivo. In the current study, we examined the capacity of IFO to modulate T cell polarization in naive mice and tumor-bearing mice. We demonstrated, contrary to previous reported in vitro studies, that IFO i) favors Th1 and Th17 polarization in vivo in mice at low dose and ii) low dose IFO-induced antitumor effect in mice was T cell-dependent.

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Materials and Methods

4.4.4.1 Chemical agents and reagents

Cyclophosphamide (CPA) (Endoxan; Baxter) and ifosfamide (IFO) (Holoxan; Baxter) were provided by Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris. Drugs are dissolved in NaCl 0.9%. Monoclonal anti-CD4 (GK1.5), anti-CD8α (53-6.72) and their isotype control rIgG2a (2A3) for in vivo experiments were purchased from BioXCell (West Lebanon, NH, USA) and dissolved in Phosphate-buffered saline (PBS). Monoclonal antibodies (mAbs) used for flow cytometry analysis are described in Table S1.

Table S1. Antibodies used for flow cytometry experiments Antigen Species Clone Fluorochrome Supplier CD45 mouse 30-F11 FITC BD biosciences CD3e mouse 145-2C11 APC-Cy7 BD biosciences CD4 mouse RM4-5 PC7 BD biosciences CD8α mouse 53-6.7 APC-R700 BD biosciences CD45 mouse 1D3 FITC BD biosciences FoxP3 mouse FJK-16s APC eBioscience CD25 mouse PC61 PE BD biosciences CD19 mouse 6D5 BV421 BD biosciences

4.4.4.2 Mice and tumor cell line

7-8 weeks-old female C57BL/6 mice (mean body weight, 20g) were purchased from Harlan Laboratories (Gannat, France). Animals were used in pathogen-free conditions. MCA205 fibrosarcoma cells (syngenic from C57Bl/6 mice) were kindly provided by Dr Yamazaki Takahiro

(INSERM U1015, Gustave Roussy, Villejuif, France). They were harvested at 37°C under 5% CO2 in GibcoTM RPMI 1640 medium (Paisley, UK) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Paisley, UK) and 2mM L-glutamine (Invitrogen, USA). All animal experiments were carried out in compliance with French and European laws and regulations and by the CEEA26 Ethic committee and the ministry of national education, higher education and research and carried out under conditions established by the European Community (Directive 2010/63/2015-038).

4.4.4.3 Tumor model and tumor inoculation in mice

MCA205 is an immunogenic tumor model. 8.105 tumor cells were inoculated subcutaneously (s.c.) in the right flank of C57Bl/6 mice on D0. Mice received a single intraperitoneal (i.p.) injection of CPA

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at 100 mg/kg, IFO at 100, 150, 200 or 300 mg/kg or NaCl 0.9% (20mL/kg) when the tumor volume reach a size between 50 and 500 mm3 (V (mm3) = width2 (mm2) x length (mm)/2). For T cell depletion, mice received 200 µg/mouse i.p. injections of anti-CD8α (clone 53-6.72) and/or anti-CD4 (clone GK1.5) or their isotype control rIgG2a (clone 2A3) on Days(D)-3, D0, D+3 then once a week, D0 being the day of tumor inoculation. Tumor size was followed-up three times a week by measuring the length and width using a caliper. The tumor growth was estimated by the tumor growth delay (TGD) as the difference in the median times (in days) required for tumors to reach five times their initial size between treated and control mice. In all experiments, mice were euthanized when the tumor volume ≥ 2 cm3 or boundary points were reached according to the French and European laws and regulations for the use of mice for scientific purposes.

4.4.4.4 Flow cytometry analysis

Female C57BL/6 mice of 7 to 8 weeks were randomly assigned to the different treatment groups. Six groups of mice were evaluated including an untreated control group receiving the vehicle and four to five treated groups with IFO at the dose of 100, 150, 200 and 300 mg/kg and CPA at 100 mg/kg. Both drugs were dissolved in a solution of NaCl 0.9%. The administrations were performed by a single i.p. injection with a volume of 20mL/kg. Seven days post treatment, the mice were sacrificed and spleens were collected. After lysis of red blood cells with ammonium chloride (NH₄Cl) splenic viable cells were quantified with Trypan Blue with Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Before staining, Fc-receptors were blocked for 15 min at 4°C using anti-CD16/32 functional grade purified antibodies (eBioscience, Paris, France). Cells were incubated for 30 min at 4°C with antibodies for cell surface staining. For FoxP3 staining, cells were fixed and permeabilized after cell surface staining according to the FoxP3 kit protocol (eBioscience, Paris, France). Samples were acquired on 10-colors Gallios cytometer (Beckman Coulter, Villepinte, France). Analyses were performed using Kaluza software 1.3 (Beckman Coulter). Leucocytes were identified by the use of FITC- conjugated anti-mouse CD45. T and B lymphocytes were identified using APC-Cy7-conjugated anti- mouse CD3 and BV421-conjugated anti-mouse CD19 respectively. CD4+ and CD8+ T cells were separated using PE-Cy7-conjugated anti-mouse CD4 and APC-R700-conjugated anti-mouse CD8a staining among CD3 positive cells, respectively. Finally, Treg cells were stained using APC- conjugated anti-mouse FoxP3 staining among CD3+CD4+ T cells.

4.4.4.5 Cytokine assay

From spleen cells, a total of 2.105 cells per well were incubated in 96 well Nunc MaxiSorp® plates (eBioscience) precoated with anti-CD3ε mAbs (clone 145-2C11, 10µg/mL); eBioscience) and/or anti- CD28 mAbs (clone 37.57, 2µg/mL; BD Pharmingen). The supernatants were assayed after 48 hours

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incubation 37°C under 5% CO2 using Cytokine concentrations were quantified in the supernatant using a Bio-Plex™ Mouse Cytokine Standard 23-Plex, Group I Assay (bio rad, M60009RDPD). The panel was comprised of the following cytokines and chemokines: eotaxin, Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF), Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor (GM-CSF), interferon gamma (IFN), interleukin (IL)-1α (IL-1α), IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL- 12p40, IL-12p70, IL-13, IL-17A, Keratinocyte Chemoattractant (KC), Macrophage Chemotactic Protein-1 (MCP-1), Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1alpha (MIP-1α), MIP-1β, Regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) and Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α). Results were analyzed using Bio-Plex Manager Software V 6.1 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Selection of cytokine and chemokines that were significantly regulated after IFO treatment in mice allowed us to reduce the monitoring to IFN, IL-17A and IL-6. These three cytokines were then quantified using mouse IL-17A ELISA Ready-SET-Go® (eBiosciences), Mouse IFN ELISA Set (BD Biosciences) and Mouse IL-6 ELISA Set (BD Biosciences).

4.4.4.6 Statistical analysis

Data were analyzed with Microsoft Excel® (Microsoft Co., Redmont, WA, USA), Prism™ 5.0 and 6.0 software (GraphPad San Diego, CA, USA). All results are expressed as mean ± standard error of mean or median with range. Correlations between cytokines were estimated with Spearman correlation coefficient. Statistically significant differences were analyzed using the non-parametric Mann-Whitney test or the non-parametric Kruskall-Wallis test to compare more than two independent groups, and Spearman’s rank correlation. A p-value smaller than 0.05 was considered to be statistically significant. Significant p values were annotated as follows *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

Results

4.4.5.1 No reduction of T cells in naïve mice was observed at 100 and 150 mg/kg IFO.

In non-tumor bearing C57BL/6 mice the immunomodulotory effect of IFO in spleen was studied seven days post-treatment after a single i.p. injection of increasing doses of IFO from 100 mg/kg to 200 mg/kg. T and B cells proportion and counts were compared to the negative control (NaCl 0.9%). Seven days after treatment no clear diminution of absolute number of splenocytes could be observed except for a slight decrease with IFO at 100 mg/kg compared to the control group (Figure S1). CPA at 100 mg/kg induced a clear diminution of B cell counts and percentages (Figure S1 and S2). For CD4+ and CD8+ T cells CPA at 100 mg/kg did not affect neither cell counts nor percentages (Figure S1 and S2) with a trend to decrease the number of Treg cells even though not significant (Figure

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S1). In mice treated with IFO, the decrease of B cells was dose-dependent with a slight decrease in percentages and counts at 150 mg/kg compared to control group (Figure S1 and S2) while a profound B cell lymphopenia was observed at 200 mg/kg (Figure S1 and Figure S2). For CD4+ and CD8+ T cells IFO at 100 and 150 mg/kg did not affect cell counts (Figure S1) while 200 mg/kg induced a significant diminution of T cell counts particularly CD4+ T cells and Treg cells but no diminution of CD8+ T cells could be depicted (Figure S1).

Altogether, these data indicate that seven days after IFO treatment at 200 mg/kg B and T cell lymphopenia is observed contrary to IFO 100 or 150 mg/kg in vivo in naive mice.

Figure S1. IFO and CPA have dose-dependent effect on humoral cells and cellular T cells subsets on non-tumor-bearing mouse.

C57Bl/6 were injected with a single i.p. injection of IFO (100 or 150 or 200 mg/kg) or CPA (100 mg/kg) or control NaCl 0.9%. Seven days later, mice are sacrified and spleens were collected. Lymphocytes were detected by flow cytometer after mechanic dissociation of the spleen. (A) Absolute number of splenocytes in the spleen. (B) Absolute number of B cells. (C) Absolute number of T cells. (D) Absolute number of CD8+ T cells. (E) Absolute number of CD4+ T cells. (F) Absolute number of CD4+ CD25+ FoxP3+ T cells. Graphs depict data of 2 (C) or 3 (A, B, D, E, F) pooled independent experiments and each pool corresponds to 5 mice. The median values with range are presented. Statistical analysis using the Kruskall-Wallis test indicated significant differences at 95% CI. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

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Figure S2. IFO and CPA have dose-dependent influence on the distribution of B cells and T cells subsets in naive mice.

C57Bl/6 were injected with a single i.p. injection of IFO (100 or 150 or 200 mg/kg) or CPA (100 mg/kg) or control NaCl 0.9%. Seven days later, mice are sacrificed and spleens were collected. Lymphocytes were detected in the spleen by flow cytometer after mechanic dissociation. (A) Absolute number of splenocytes. (B) Percentage of B cells among CD45+ cells. (C) As is B but T cells. (D) Percentage of CD8+ T cells among CD3+ T cells. (E) As is D but CD4+ T cells. (F) Percentage of Treg cells among CD4+ T cells. Graphs depict data from three (A,B,F) or two (C,D,E) pooled independent (5 mice per experiment). Median values with range are presented. Statistical analysis using the Kruskall-Wallis test indicated significant differences at 95% CI. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

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TCR-driven cytokine release after treatment of naïve mice with escalating dose of IFO

In a previous work, we have shown that CPA at 100 mg/kg could increase the TCR-driven cytokine release in naïve and tumor-bearing mice [296]. We carried out similar experiments in mice treated with escalating doses of IFO in naive mice. Splenocytes were collected 7 days post-treatment and stimulated with plastic-bound anti-CD3ε plus or minus soluble anti-CD28 mAbs to determine the TCR-driven cytokine profile. MultiPlex® analysis revealed that IFN, IL-17A and IL-6 were significantly increased after treatments (Figure 1). As expected the negative control displayed weak cytokine secretions of IFN, IL-17A and IL-6 while in the group of mice treated with CPA at 100 mg/kg an increase of TCR-driven IFN, IL-17A and IL-6 was detected. Regarding the IFO groups, an increase of TCR-driven IFN, IL-17A and IL-6 was also observed after CD3ε stimulation and CD3ε /CD28 co-stimulation (Figure 1).

Figure 1. IFO and CPA induce IFN, IL-17A and IL-6 production in naive mice.

(A) CPA chemical structure. (B) IFO chemical structure. (C-H) C57Bl/6 were injected with a single i.p. injection of IFO (100 or 150 or 200 mg/kg) or CPA (100 mg/kg) or NaCl 0.9%. Seven days later, mice were sacrificed and spleens were collected and incubated with anti-CD3ε (C-E) +/- anti-CD28 (F-H) for 48h at 37°C. Supernatants were collected and the concentrations of IFN (C,F), IL-17A (D,G) and IL-6 (E,H) were determined by ELISA. Graphs depict data from three (C,F) or two (D,G,E,H) pooled experiments with n= 5 mice per experiment. Median and range are shown. Statistical analysis using Kruskal-Wallis test indicated significant differences at 95% CI. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

4.4.5.2 Low dose IFO could delay tumor growth in C57BL/6 mice

In mice many reports have shown using xenografted tumor models that 300 mg/kg of IFO was mandatory to observe antitumor activity. We assessed the antitumor activity of escalating doses of

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IFO (100, 150, 200 and 300 mg/kg) and of CPA (100 mg/kg) in the immune competent MCA205- bearing C57Bl/6 mice. As shown in Figure 2, and as expected, significant reduction of the tumor growth was observed for CPA at 100 mg/kg; for IFO we observed a significant delay of tumor growth from 150 mg/kg. Higher doses (200 and 300 mg/Kg) had also a potent antitumor activity albeit no significant differences could be observed between 150, 200 or 300 mg/kg in MCA205-bearing C57Bl/6 mice (Figure 2B). Tumor growth delay (TGD) was increased in a dose-dependent manner being significant even at a low dose such as 150 mg/kg (Figure 2C). Altogether these data suggest that IFO is able to delay tumor growth even with a single low dose.

Figure 2 : Low dose IFO could delay tumor-growth in WT mice.

MCA205 tumor-bearing mice were treated with a single i.p. injection of IFO (100 ; 150 ; 200 ; 300 mg/kg) or CPA (100 mg/kg) or NaCl 0.9%. (A) Tumor volume was measured every 3 days; VDi corresponds to the tumor volume the day of treatment initiation and VDt correspond to the tumor volume on each measurement day for each mouse. VDt to VDi ratio (VDt/VDi) according to treatment groups (n=12 per group) is depicted. One representative experiment out of two independent experiments is shown. (B) VDt/VDi according treatment

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groups from two pooled experiments (n=8 to 12 mice per group). Graph depicts the mean ± SEM.. (C) Time to reach 5xVDi and tumor growth delay (TGD). Graph shows median with range ; two experiments were pooled (n=8 to 12 mice per group). Mice were sacrificed when they reached boundary points, as described in Methods. Statistical analysis using Kruskal-Wallis test indicated significant differences at 95% CI. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

4.4.5.3 No reduction of T cells in tumor-bearing naïve mice after a single injection of 150 mg/kg IFO.

As in naive mice, T and B cells proportion and counts were compared to the control group (NaCl 0.9%) seven days after a single i.p. injection of CPA (100 mg/kg) and escalating doses of IFO. No clear diminution of absolute number or proportions of splenocytes could be observed except for IFO at 300 mg/kg (Figure 3A and Figure S3A). Significant diminution of B cell counts and percentages was observed in all groups (Figure 3B and Figure S3B). Only high doses of IFO (200 and 300 mg/kg) impacted numbers and proportions of T cells (Figure 3C-3F and Figure S3C-3F). IFO 100 and 150 mg/kg and CPA 100 mg/kg did not affect neither T cell counts nor percentages (Figure 3C- 3F and Figure S3C-3F). Altogether, these data indicate that no T cell lymphopenia is observed with low dose IFO 100 or 150 mg/kg contrary to IFO 200 or 300 mg/kg in vivo in tumor-bearing mice.

Figure 3 : No T cell depletion with low dose IFO in tumor-bearing mice.

C57Bl/6 were injected with a single i.p. injection of IFO (100, 150, 200 and 300 mg/kg) or CPA (100 mg/kg) or NaCl 0.9%. Seven days later, mice are sacrificed and spleens were collected. Lymphocytes were detected in the spleen after mechanic dissociation using flow cytometry methods. (A) Absolute number of splenocytes. (B) As is A but B cells. (C) As in A but T cells. (D) As is A but CD8+ T cells. (E) As is A but CD4+ T cells. (F) As is A but Treg cells. Graphs depict data from two pooled independent experiments (n=12 mice/group). Median values with range are presented. Statistical analysis using Kruskal-Wallis test indicated significant differences at 95% CI. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

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Figure S3. IFO and CPA have dose-dependent influence on the distribution of B cells and T cells subsets in tumor-bearing mice.

C57Bl/6 were injected with a single i.p. injection of IFO (100 or 150 or 200 mg/kg) or CPA (100 mg/kg) or control NaCl 0.9%. Seven days later, mice are sacrificed and spleens were collected. Lymphocytes were detected in the spleen by flow cytometer after mechanic dissociation. (A) Absolute number of splenocytes. (B) Percentage of B cells among CD45+ cells. (C) As is B but T + + + cells. (D) Percentage of CD8 T cells among CD3 T cells. (E) As is D but CD4 T cells. (F) Percentage of Treg cells among CD4+ T cells. Graphs depict data from three pooled independent experiments (6-8 mice per experiment). Median values with range are presented. Statistical analysis using the Kruskall-Wallis test indicated significant differences at 95% CI. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

4.4.5.4 IFO induced TCR-driven IL-17A, IFN and IL-6 in tumor-bearing mice.

As for naive mice, we examined T cell polarization after TCR engagement in MCA205 tumor-bearing mice. As shown in Figure 4, IFO 200 and 300 mg/kg failed to induce TCR-driven cytokine release except for IL-6 even though diminished at 300 mg/kg reminiscent of a profound T cell depletion in these mice. For 100 and 150 mg/kg where no T cell lymphopenia was observed, significant TCR- driven IL-17A, IFNγ and IL-6 were detected. As expected CPA 100 mg/Kg could also induced TCR- driven IL-17A, IFNγ and IL-6 in tumor-bearing mice. Unexpectedly IFO 150 mg/kg induced higher TCR-driven IL-17 and IL-6 than CPA 100 mg/kg. Since IL-6 and IL-17A levels were higher in IFO 150 mg/kg and IL-6 have been implicated in Th17 differentiation [466], we hypothesized that these cytokines could be associated. Indeed we observed a clear correlation between IL-6 and IL-17A concentration after TCR engagement at 150 mg/kg (Figure 5D). In groups where IL-17A, IFNγ and IL-6 were significantly increased after TCR stimulation (CPA 100 mg/kg; IFO 100 and 150 mg/kg), note that in IFO 150 mg/kg treated-groups IL-17A, IFNγ and IL-6 were highly correlated suggested

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a co-regulation after TCR-engagement (Figure 5B-D-F), while no correlation could be observed for IFO (not shown) and CPA at 100 mg/kg (Figure 5A-C-E).

Figure 4. Low dose IFO induced TCR-driven IFN, IL-17A and IL-6 in tumor-bearing mice.

MCA205 tumor-bearing mice were injected with a single i.p. injection of IFO (100 or 150, 200 or 300 mg/kg), CPA (100 mg/kg) or NaCl 0.9%. Seven days later, mice were sacrificed and spleens were collected and incubated with anti-CD3ε (A-C) +/- anti-CD28 (D-F) for 48h at 37°C. Supernatants were harvested and concentrations of IFN (A, D), IL-17A (B, E) and IL-6 (C, F) were analyzed by ELISA. Graphs depict data from two pooled experiments (6-8 mice per experiment). Medians with range are shown. Statistical analysis using Kruskal-Wallis indicated significant differences at 95% CI..*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

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Figure 5. IFO 150 mg/kg induced IFN, IL-17A and IL-6 correlation in tumor-bearing mice, not CPA 100 mg/kg

MCA205 tumor-bearing mice were injected with a single i.p. injection of CPA 100 mg/kg (A,C,E) and IFO 150 mg/kg (B,D,F). Seven days later, mice were sacrificed and spleens were collected and incubated with anti- CD3ε and anti-CD28 (A-F) for 48h at 37°C. Supernatants were harvested and concentrations of IFN, IL-17A and IL-6 were analyzed by ELISA. (A,B) Correlation between IL-6 and IFN secretions. (C,D) Correlation between IL-6 and IL-17A secretions. (E,F) Correlation between IFN and IL-17A secretions. Graphs depict data from two pooled experiments (6-8 mice per experiment). Spearmans’s rho indicated the relationship between the two variables. Statistical analysis using Spearman’s rank correlation indicated significant differences at 95% CI..*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

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4.4.5.5 CD4+ and CD8+ T cells are mandatory for IFO 150 mg/kg antitumor effect.

IFO 150 mg/kg demonstrated a significant antitumor effect in MCA205-bearing mice (Figure 2). As shown in Figure 6, and as expected, significant reduction of the tumor growth was observed for non- depleted mice; for CD4+ T cells depleted mice and CD8+ T cells depleted mice we observed a decrease of the antitumor effect of IFO at 150 mg/kg. Antitumor efficacy of IFO 150 mg/kg was abolished in mice depleted with both CD4+ and CD8+ T cells. Altogether these data indicate that at low dose of IFO (150 mg/kg) T cells are mandatory to observe tumor growth delay.

Figure 6 : CD4+ and CD8+ T cells depletion inhibit antitumor effect of IFO at 150 mg/kg.

MCA205 tumor-bearing mice were depleted in CD4+ and CD8+ T cells, and treated with a single i.p. injections of IFO 150 mg/kg. (A) Tumor volume was measured every 3 days; VDi corresponds to the tumor volume the day of treatment initiation and VDt corresponds to the tumor volume on each measurement day for each mouse. VDt to VDi ratio (VDt/VDi) according treatment groups from pooled mice (n=6 per group) is depicted. Graph depicts the mean ± SEM. (B) Time to reach 5xVDi and tumor growth delay (TGD). Graph shows median with range; one experiment (n=6 per group). Mice were sacrificed when they reached boundary points, as described in Methods. Statistical analysis using Kruskall-Wallis test indicated significant differences at 95% CI. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

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Discussion

Since its introduction in 1958, CPA is widely used as antitumor agent but myelosuppresion is the dose-limiting toxicity of CPA. IFO, an isomeric form of CPA, has been developed in the early 1970s in order to overcome this side-effect. Actually, IFO and CPA are prodrugs requiring bioactivation by hepatic enzymes leading to their respective cytotoxic metabolites, isophosphoramide mustard and phosphoramide mustard. They share a common metabolic pathway but IFO metabolism occurs at a slower rate and leads to 3 times less of alkylating mustard compared to CPA [16, 467]. This difference in metabolization modifies the toxicity profile of oxazaphosphorines and offers a decrease of myelosuppression after IFO administration. For treatment of cancers such as soft tissue sarcomas, the use of IFO is preferred to CPA [462].

In the present study, we scrutinized immune modifications following i.p. injection of IFO in mice. B cells population seemed very affected by oxazaphosphorines even at low dose (100 mg/kg) underlining high sensitivity of B cells to the direct killing of these cytotoxic agents as previously reported [407]. The presence or absence of tumor does not affect the fate of B cells after IFO or CPA injection. B cells decrease could be an advantage in the perspective of combination of oxazaphosphorine with immunotherapy. Immune checkpoint inhibitors such as antibodies anti-PD1, anti-PDL1 and anti-CTLA4 have frequent adverse effects leading to immune-related adverse events (irAEs). Some of these irAEs are the consequence of auto-antibodies production [468]. Nowadays, the corticoids administration is the main treatment for serious irAEs with interruption of immunotherapy in most of the case. Thus combining immune checkpoint to oxazaphosphorine could lead to less frequent reactivation of auto-reactive B cells but could synergize for antitumor activity.

IFO at low doses (100 and 150 mg/kg) did not affect numbers or proportion of CD4+ and CD8+ T cells in naive and tumor-bearing mice. We have shown that IFO at 100 and 150 mg/kg could up- regulate the production of IFN, IL-17 and IL-6 after TCR stimulation with IFO 150 mg/kg being more potent. At higher doses, no significant IFN, IL-17 and IL-6 induction was observed due to profound diminution of T cells. Interestingly, compared to CPA at 100 mg/kg, IFO 150 mg/kg induced stronger secretion of IFN, IL-17 and IL-6. IL-6 has been shown to skew Treg differentiation into non- suppressive proinflammatory Th17 cells [469, 470]; at 150 mg/kg significant correlation between IL- 17A and IL-6 secretions (not observed for CPA) suggests that IL-6 could play a key role toward Th17 differentiation. For CPA at 100 mg/kg, Treg differentiation into non-suppressive proinflammatory Th17 cells was not observed [410] but rather modification of gut microbiota composition was demonstrated as mandatory for CPA-induced Th17 differentiation [392]. In this study, CPA induced the translocation of bacteria into secondary lymphoid organs that could stimulate the generation of a Th17 cells. 100 mg/kg of CPA induced the disruption of the intestinal barrier accompanied by increased intestinal permeability and translocation of commensal bacteria [392]. In our study, we could not find any correlation between IL-6 and IL-17A after CPA treatment suggesting as in previous

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study that Th17 induction might not rely on IL-6-driven Th17 polarization from Treg cells. These data suggest that Th17 induction after IFO at 150 mg/kg could rely on a different mechanism compared to CPA at 100 mg/kg. In our study the source of IL-6 is not clearly determined since we stimulated splenocytes and not purified T cells. IL-6 is a proinflammatory cytokine produce by several cell type including myeloid cells. IFO is less myelotoxic than CPA [462], thus we cannot exclude that higher number of myeloid cells recovered after IFO treatment compared to CPA even at low dose. Myeloid cells secrete large amounts of proinflammatory cytokine such as IL-6 after IFN triggering [471], thus it is not inconceivable to find higher amounts of IL-6 compared to CPA. The levels of IL-6 could make the difference as suggested in a model of murine arthritis; low levels of secreted IL-6 could favor Treg cells while higher amounts of IL-6 could favor Th17 cells as compared to Treg cells [472]. Interestedly IFN was also correlated with IL-6 and IL-17A after IFO treatment at 150 mg/kg (contrary to CPA 100 mg/kg). The roles of Th17 cells depend strongly on the context of the ongoing cytokine environment [473]. IL-17A associated with IFN production show a proinflammatory environment with a better antitumor activity after a single low dose of CPA [392, 410]. Moreover IL-17A seems to play a key role in the antitumor efficacy of immune checkpoint inhibitors since a recent observation suggested the loss of tumor response by IL-17 blockade [474] and support the hypothesis of synergy anti-PD1 and IFO at low dose. Altogether, this study showed the importance of the well-balanced administrated dose that will favor or not T cell activation and that IFO low dose is a promising candidate that should synergize with immunotherapy.

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Discussion de l’article

L’ifosfamide, isomère de position du cyclophosphamide, montre, un effet immunomodulateur à faible dose. Les études menées sur des souris immunocompétentes porteuses ou non de tumeurs ont permis de mettre en évidence cet effet immunodulateur tant sur la sécrétion des cellules lymphocytaires que sur la sécrétion de cytokines spécifique. De plus, un effet direct des lymphocytes T CD4 et CD8 a été observé sur l’efficacité antitumorale de l’IFO. L’étude de la distribution des cellules lymphocytaires après injection de doses croissantes d’IFO a permis de mettre en évidence une relation dose / réponse sur la population des lymphocytes B. Celle-ci montre une modulation de la réponse sur l’immunité humorale diminuant ainsi l’excrétion d’anticorps. Concernant les lymphocytes T, leur distribution n’a pas été modifiée de façon significative. L’étude de la modulation de l’expression des cytokines ; interleukine-17 (IL-17), interféron gamma (IFN) et interleukine-6 (IL- 6) a permis de mettre en évidence une augmentation de la sécrétion des deux dernières conduisant à une réponse immunitaire cellulaire de type Th1 et permettant ainsi la production de lymphocytes T et une augmentation de la réponse immunitaire tumorale. Cette affirmation a pu être validée par l’étude de la dose 150 mg/kg sur des souris dont nous avons effectué la déplétion des lymphocytes CD4+ et CD8+. Cette expérience a montré qu’en absence de ces lymphocytes, l’effet antitumoral de l’IFO est perdu. Cela a ainsi permis de mettre en évidence le rôle des lymphocytes T dans la réponse antitumorale de l’IFO à faibles doses (Schéma 19).

X-OXAZAPHOSPHORINES (X-OXAZA) OXAZAPHOSPHORINES Oncologie – Hématologie Dose: 50 to 20 mg/m2 Maladies inflammatoires Dose: 75 – 150 mg/j

Cytotoxique Immunomodulateur

Oncologie Dose: 1,5 to 3 g/m2 TOXICITE +++

 Cytotoxique Immunomodulateur

150 mg/kg Perte d’efficacité après IFO immunomodulateur Dose d’IFO immunomodulatrice déplétion des lymphocytes T Schéma 19 : Mise en évidence de l'effet immunodulateur de l'IFO

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5 DISCUSSION GENERALE

Ce projet s’inscrit dans le cadre de l’optimisation de l’index thérapeutique d’agents anticancéreux au moyen de la vectorisation. Nous nous sommes ainsi intéressés au développement de nouveaux analogues d’oxazaphosphorines qui sont utilisés depuis plusieurs décennies malgré des index thérapeutiques étroits notamment en oncopédiatrie [274]. Au cours de ces travaux de thèse, et dans la continuité des travaux déjà entrepris au sein de notre équipe [299, 475, 476], nous avons pu mettre en œuvre une stratégie de pharmacomodulation de l’IFO. Celle-ci, ayant pour but final de diminuer voire d’empêcher la libération des métabolites toxiques, notamment le CAA, libérés lors de la métabolisation de l’IFO et dans le but d’optimiser l’index thérapeutique général de celui-ci. Cette pharmacomodulation a été menée en deux étapes :

1) La première étape est la modification chimique de la structure de l’IFO. Les modulations de la structure chimique permettant le greffage de peptides, de lipides, ou encore d’anticorps, à des agents thérapeutiques peu sélectifs ont fait leurs preuves. Celles-ci permettent d’accroître l’activité antitumorale des composés princeps [477] . Par exemple, le greffage du temozolomide à une molécule de transport complexe a permis d’accroitre son activité in vitro d’un facteur 10 sur des lignées de glioblastome multiforme [478]. Lors de nos travaux, nous avons effectué la modification chimique de l’IFO par oxydation anodique et par greffage au niveau de la position 4 du cycle oxazaphosphorine. Cette modification chimique, apportée au niveau du carbone intracyclique, oxydé lors du métabolisme, devait permettre de s’affranchir de l’étape de métabolisation responsable de la toxicité due à la libération du CAA [50, 479]. Comme indiqué précédemment (chapitre 3.1), une diversité de modification chimique des oxazaphosphorines ont été réalisées, donnant lieu à de nouveaux composés, parmi lesquels peu ont eu un développement clinique [310, 359, 365, 366]. Plus récemment, le couplage de noyaux quinazolines à la moutarde phosphoramidée a permis de mettre en évidence un panel de composés montrant des efficacités accrues accompagnée de doses maximales tolérées élevées [480]. Dans notre cas, nous avons réalisé la synthèse de sept analogues préactivés de l’IFO ; par greffage de chaînes alcooliques saturées ou non, comportant 1 à 30 carbones après oxydation anodique de l’IFO ; le méthoxy-ifosfamide (MeO-IFO), le pentanyloxy-ifosfamide (P-IFO), le diméthyloctanyloxy-ifosfamide (DMO-IFO), le géranyloxy- ifosfamide (G-IFO), le farnésyloxy-ifosfamide (F-IFO), le squalényloxy-ifosfamide (SQ-IFO) et le squalène-thio-ifosfamide (SQ-thio-IFO).

2) La seconde étape correspond à l’adressage de ces composés pour en améliorer la spécificité vis-à-vis de la tumeur par le biais de la vectorisation sous la forme de nanosystèmes. Divers agents anticancéreux ont ainsi pu profiter de la vectorisation sous la forme de nanosystèmes

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par le biais de modifications chimiques [281]. A l’image du greffage de chaînes polyisopréniques, telle que le géraniol et le farnésol [139, 481], ou encore le squalène [138, 145, 482]. Ce type de chaînes greffées confèrent, des propriétés d’auto-assemblage permettant une vectorisation de la molécule sous la forme de nanoparticules et d’envisager d’augmenter la spécificité d’action. Dans le cas de ces composés, ce sont les propriétés physico-chimiques intrinsèques à la molécule qui permettent l’obtention de la forme nanoparticulaire. Cette propriété permet ainsi d’obtenir une charge en principe actif optimale. Il a pu être démontré que ce type de composés, ayant la propriété de s’auto-assembler en phase aqueuse, a permis un ciblage passif de la tumeur augmentant ainsi la spécificité de la molécule pour sa cible [235, 483-485]. D’autres agents ont aussi pu être vectorisés au sein de liposomes, c’est le cas de la doxorubicine qui a permis le développement clinique et la commercialisation du Caelyx® après encapsulation au sein de liposomes pégylés [486]. Celui-ci est aujourd’hui très utilisé en oncologie grâce à l’amélioration notable de l’index thérapeutique, notamment par modification de sa pharmacocinétique limitant grandement la cardiotoxicité de la doxorubincine [190, 487, 488]. Au sein de notre panel de composés préactivés, les analogues présentant la propriété de s’auto-assembler sont ceux greffés à l’aide ce type de chaînes terpéniques (G-IFO, F-IFO, SQ-IFO et SQ-thio-IFO). Les autres, correspondant aux composés alkyles linéaires saturés (MeO-IFO et P-IFO), ne possédant pas cette propriété d’auto-assemblage, ont fait l’objet d’essais d’encapsulation au sein de nanocapsules lipidiques (NCLs) en collaboration avec le Dr Emilie Roger de l’unité de « micro et nanomedecines translationnelles» (MINT, U1066) de l’Université d’Angers. Dans ce cas, le composé est encapsulé au sein du système avec comme corollaire la diminution de la charge globale du nanosystème en composé actif.

L’ensemble de ces analogues sous leur forme libre ou nanoparticulaire a montré une activité cytotoxique en absence de matériel enzymatique sur de nombreuses lignées cancéreuses humaines, permettant ainsi la validation de la preuve de concept de préactivation.

Du fait de sa faible métabolisation, l‘IFO possède une efficacité antitumorale chez la souris xénogreffée à une dose d’environ 300 mg/kg [455]. Dans le cas de la préactivation de l’IFO, selon la longueur de la chaîne greffée, les molécules obtenues possèdent une masse moléculaire supérieure ce qui engendre l’augmentation de la quantité de produit à administrer pour obtenir une dose équivalente à celle de l’IFO. Prenant en considération cet inconvénient et au vu de l’activité cytotoxique accrue du G-IFO sous sa forme nanoparticulaire, nous l’avons choisi comme composé le plus prometteur. Ainsi, des études in vivo plus complètes ont été effectuées spécifiquement sur ce composé. L’étude des paramètres pharmacocinétiques du G-IFO nous a permis de mettre en évidence la voie d’administration intraveineuse comme étant la plus avantageuse. Dans le cadre des études d’efficacité in vivo de ce composé, il s’est avéré que la concentration maximale que nous pouvions obtenir sous la forme nanoparticulaire permettant l’obtention de nanoparticules de taille adéquate (200 nm) et ayant un indice de polydispersité faible (<0,2) était de 4 mg/mL. Cette

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concentration ne permet donc qu’une administration à la dose de 25 mg/kg équivalent IFO. Celle-ci n’a donc montré aucune efficacité que ce soit pour le G-IFO ou l’IFO. A cette concentration, 12 injections auraient été nécessaires pour atteindre la dose efficace d’IFO (300 mg/kg). La faisabilité de ce nombre important d’injections sur une période courte nous a conduit à poursuivre l’étude du G-IFO sous la forme libre par administration intrapéritonéale ou intraveineuse. Il s’est avéré que cette formulation n’a pas été optimale pour l’injection par voie intraveineuse puisqu’elle menait à une nécrose rapide au point d’injection, ce qui est probablement due à une libération rapide et importante du HO-IFO au point d’injection. Nous n’avons donc pas pu poursuivre un protocole d’injections réitérées par voie intraveineuse. Ces observations nous ont donc amenés à étudier l’efficacité du G- IFO sous sa forme libre par injections répétées intrapéritonéales afin de valider la preuve de concept in vivo de l’efficacité du G-IFO.

Afin de remédier au problème engendré par l’utilisation de nanoparticules (NPs) « nues », jouant un rôle sur l’exposition du produit, une optimisation de la formulation sous la forme de nanoparticules de G-IFO est en cours via la pégylation de ces NPs afin de les rendre furtives et d’améliorer leur spécificité. Ainsi, il a été démontré que la formulation de NPs pégylés permettait une augmentation de l’exposition du composé après administration influençant, de ce fait, l’efficacité [223, 489]. Dans le cas de NPs pégylés, celles-ci ne sont plus reconnues par les opsonines et sont ainsi rendues furtives, permettant donc une amélioration des paramètres pharmacologiques (pharmacocinétique, biodistribution…) et d’accroître ainsi l’efficacité du composé [490]. Une fois ces NPs rendues furtives, des études in vivo de pharmacocinétique, de biodistribution, d’efficacité sur des souris xénogreffées ainsi que des études complémentaires de toxicités précliniques pourront être effectuées. Enfin, des études in vitro au niveau cellulaire, telles que des essais d’internalisation, pourront être menées afin d’étudier les mécanismes d’entrée des NPs dans la cellule.

Concernant l’encapsulation du P-IFO, sa formulation sous la forme de nanocapsules lipidiques (NCLs) a été optimisée et validée [429]. Les NCLs chargées en P-IFO ont montré des activités cytotoxiques semblables à celles obtenues pour le composé sous la forme libre. De plus, une étude de la cinétique de libération du P-IFO à partir des NCLs chargées a démontré une libération lente et continue du produit permettant de prévoir des résultats similaires in vivo. Des études complémentaires sont prévues afin d’étudier l’efficacité de ces NCLs sur des souris xénogreffées. De plus, une étude pharmacocinétique pourrait aussi être envisagée afin de pouvoir comparer la libération ainsi que l’exposition du P-IFO sous sa forme libre et sous sa forme NCLs. Enfin, cette nouvelle formulation pourrait être bénéfique pour d’autres analogues préactivés de l’IFO qui ne possèdent pas la propriété de s’auto-assembler seuls sous la forme de nanomédicaments.

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Enfin, dans la perspective d’une utilisation de ces X-Oxaza dans une stratégie à la fois immunomodulatrice et cytototoxique, l’effet immunomodulateur de l’IFO a été étudié en comparaison à celui du CPM. Bien que de nombreuses études aient été menées afin de mettre en évidence l’effet immunomodulateur du CPM, aucune n’a étudié le potentiel effet immunomodulateur de son isomère de position : l’IFO. Notre étude a permis mettre en évidence les propriétés immunomodulatrices de celui-ci. Comme son isomère de position du CPM, l’IFO pourrait lui aussi profiter de son effet immunomodulateur pour élargir le champ de son utilisation en clinique. La première étape a consisté en la description fine des propriétés immunomodulatices de l’IFO selon la dose utilisée. Elle fait l’objet d’une publication soumis à Journal of Immunology. Cette étude chez la souris sera prochainement étendue aux analogues X-Oxaza, dont le G-IFO et le F-IFO, afin d’appréhender la modulation des effets cytotoxiques et immunomodulateurs de ces composés.

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6 CONCLUSION

A l’initiation de ce projet, nous voulions développer des analogues préactivés de l’ifosfamide permettant de contrer la problématique de métabolisme de l’IFO à l’origine de la libération d’entités toxiques. Pour ce faire, un panel d’analogues préactivés de l’IFO a été synthétisé dans la continuité des travaux initiés par le Pr Paci [298] et le Dr Caron [299] (Schéma 20).

 Nécessite une métabolisation (prodrogue)  Faible libération de l'entité active (<20%)  Protocoles hautes doses  Toxicités dues au métabolisme IFO  Absence de spécificité

Pharmacomodulation

Geranyloxy-IFO SQ-IFO

Methoxy-IFO Pentanyloxy-IFO Farnesyloxy-IFO

Dimethyloctanyloxy-IFO SQ-thio-IFO

Schéma 20 : Synthèse d’analogues préactivés de l’ifosfamide

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 Nécessite une métabolisation (prodrogue)  Faible libération de l'entité active (<20%)  Protocoles hautes doses  Toxicités dues au métabolisme IFO  Absence de spécificité

Pharmacomodulation 1

Chaînes saturées courtes Chaînes insaturées (terpéniques) C1  C10 C10  C30

R-X = géranyloxy R = CH3 farnesyloxy C5H11 squalényloxy C10H21 mercaptosqualényloxy

Encapsulation au sein de Formulation sous formes de nanocapsules lipidiques (NCLs) nanoparticules terpéniques (NPTs)

Nanocapsules lipidiques R-X-IFO formes libres Nanoparticules terpéniques (NCLs) (FLs) (NPTs)

R-X-IFO R=C10-C30

3 2

EVALUATION PHARMACEUTIQUE ET PHARMACOLOGIQUE:

Optimisation formulation Stabilité colloïdale Stabilité chimique Etude de libération Evaluation in vitro Détermination IC 50 Schéma 21 : Synthèse et évaluation pharmacologique in vitro des analogues X-IFO :

(1) Préactivation de l’IFO, (2) conception et évaluation pharmacologique des nanoparticules terpéniques, (3) conception et évaluation pharmacologique des nanocapsules lipidiques

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L’ensemble des analogues synthétisés ont pu être répertoriés en deux groupes :

1) Le premier comprenant les analogues obtenus avec des vecteurs alkyles insaturés de types terpéniques comprenant 10 à 30 carbones et ayant la particularité de s’auto-assembler sous la forme de NPs. Cette vectorisation sous la forme de nanomédicaments permettrait un ciblage passif de la tumeur.

2) Le second concerne des analogues couplés à des vecteurs alkyles saturés comprenant 1 à 10 carbones et ne présentant pas de propriétés d’auto-assemblage. Parmi ceux-ci, le méthoxy- ifosfamide (MeO-IFO) et le pentanyloxy-ifosfamide (P-IFO) ont été étudiés dans le cadre d’une stratégie d’encapsulation au sein de NCLs afin de leur apporter une protection vis-à-vis de la dégradation et des propriétés de ciblage. Hélas, parmi ces deux composés, seul le P-IFO a pu être encapsulé, le MeO-IFO, quant à lui, s’est révélé trop instable pour permettre de mener à bien l’ensemble des étapes de formulation permettant son encapsulation au sein de NCLs.

Les données de cytotoxicité cellulaire de l’ensemble ces analogues sous leurs formes libres et vectorisées ont été obtenues sur un panel de lignées tumorales, nous permettant ainsi de valider la preuve de concept de préactivation (Schéma 21).

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Geranyloxy-IFO 2 Geranyloxy-IFO NPs

EVALUATION PHARMACOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE:

Evaluation in vivo  Pharmacocinétique  Dose maximale tolérée  Efficacité  Biodistribution

Schéma 22 : Evaluation pharmacologique in vivo de l’analogues G-IFO

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Ces premiers résultats ont pu être présentés dans plusieurs congrès internationaux par voie d’affichage (3rd conference on innovation in drug delivery, 2013, Pise (IT); rencontres internationales de chimie thérapeutique (RICT), 2014, Rouen (FR); French-Japanese symposium (FJS), 2014, Lyon (FR)) ainsi que lors de communications orales (Pharmacology and molecular mechanisms of the european organization for research and treatment of cancer (PAAM-EORTC), 2015, Marseille (FR) et 3ème congrès annuel de la Société française de nanomédecine (SfNano), 2016, Paris (FR)).

Au vu des résultats obtenus in vitro, l’analogue G-IFO semble, à ce stade, être le meilleur candidat, justifiant son évaluation pharmacologique in vivo. Celle-ci, nous a permis d’obtenir des données pharmacocinétiques ainsi que la dose maximale tolérée pour sa forme libre (Schéma 22). Ces derniers résultats ont été présentés lors de congrès internationaux par voie d’affichage (American Association for Cancer Research (AACR), 2016, Nouvelle-Orléans (USA)) ou par communication orale (3ème congrès annuel de la Société française de nanomédecine (SfNano), 2016, Paris (FR)).

Concernant les études de biodistribution, d’efficacité, ou encore, de détermination de la dose maximale tolérée des formes vectorisées, ces études sont en cours dans le cadre des travaux de thèse de Julia Delahousse.

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- OXAZA Preuve de l’effet Preuvel’effet de  immunomodulateur X desimmunomodulateur

)

OXAZA - X OXAZA OXAZA immunomodulatrice - cellules immunitaires? immunitaires? cellules EFFET IMMUNOMODULATEUR EFFET OXAZAPHOSPHORINES OXAZAPHOSPHORINES (  - Effet de la tumeur sur l’expression des l’expression tumeur desur Effet la Dose d’X Dose X  OXAZA OXAZA - X Effet immunomodulateur immunomodulateur des Effet  Perte d’efficacité d’efficacité Perteaprès

déplétion T déplétion lymphocytesdes :Preuve concept de l'effet de immunomodulateur l'IFO de

23 immunomodulatrice 150 mg/kg mg/kg 150 Oncologie Cytotoxique TOXICITE +++ TOXICITE mmunomodulateur  I

Dose: 1,5 1,5 g/m Dose:to 3 Schéma  EFFET IMMUNOMODULATEUR EFFET Dose d’IFO d’IFO Dose  OXAZAPHOSPHORINES 2 IFO immunomodulateur IFO 150 mg/j 150 Hématologie – – Cytotoxique  Immunomodulateur Dose: 75Dose: Dose: 50 to mg/m to 20 50 Dose:  Maladies inflammatoires inflammatoires Maladies Oncologie Oncologie EFFET IMMUNOMODULATEUR EFFET 

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Enfin, et dans la perspective d’une stratégie duale de combinaison avec l’immunothérapie, nous avons réalisé une étude complémentaire comparative de l’effet immunomodulateur des oxazaphosphorines. Comme isomère de l’IFO, le CPM a montré une activité sur le système immunitaire à la dose de 100 mg/kg, nous avons ainsi étudié à faibles doses, entre 100 et 200 mg/kg, l’effet immunomodulateur de l’IFO, sur le système immunitaire en comparaison avec la dose immunomodulatrice du CPM. Notre étude sur un modèle de souris portant un fibrosarcome murin a montré un effet dose-dépendant de l’IFO, via une modulation de la sécrétion de cytokines reflétant une polarisation Th1 / Th17. En outre, nous avons montré que l'activité antitumorale de l’IFO, à la dose de 150 mg/kg, a été supprimée chez des souris dont la population des lymphocytes T CD4+ et CD8+ a été appauvrie (déplétion) (Schéma 23). Ces résultats montrent l'effet significatif de l'IFO sur la réponse immunitaire cellulaire contre les tumeurs ainsi que le rôle du système immunitaire dans la réponse antitumorale.

142

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7 PERSPECTIVES

D’autres études seront poursuivies au cours de ce projet aussi bien dans le domaine de l’immunothérapie, que celui de la synthèse de nouvelles entités actives ou encore de la vectorisation d’analogues d’oxazaphosphorines préactivées.

Dans le cas de l’ifosfamide, nous poursuivront les essais de formulation sur l’ensemble des composés (G-IFO, F-IFO et SQ-IFO) afin de permettre l’obtention d’une suspension de NPs stables et furtives par l’apport de composés pégylés, notamment, ou de surfactants. Pour cela, l’étude se fera par co-précipitation de ces composés en présence de composés pégylés dans des proportions variables afin de permettre la détermination de la meilleure formulation pour chaque composé étudié. En parallèle, des études de stabilité physico-chimique seront menées, en termes de stabilité colloïdale (par mesure de la taille des nanosystèmes par DDL et par MET) et de stabilité chimique (par quantification des composés X-IFO et HO-IFO par dosage LC-MS/MS) de la suspension nanoparticulaire. Puis, des essais de cytotoxicité cellulaire in vitro et d’internalisation pourront être menés avec les formulations les plus probantes. Une fois cette formulation optimisée pour chacun des composés, des études complètes de pharmacocinétique et de biodistribution permettant la détermination des paramètres pharmacologiques de chaque formulation seront réalisées. Enfin, des études d’efficacité in vivo et de toxicologie préclinique (détermination de la dose maximale tolérée) seront ensuite menées afin de mettre en évidence le gain de la préactivation et de la vectorisation de l’IFO en termes d’optimisation de l’index thérapeutique (Schéma 24).

 Nécessite une métabolisation (prodrogue)  Faible libération de l'entité active (<20%)  Protocoles hautes doses  Toxicités dues au métabolisme IFO  Absence de spécificité

Pharmacomodulation

PEGYLATION ET APPORT Nanocapsules lipidiques Nanoparticules terpéniques DE FURTIVITE AUX (NCLs) (NPTs) NANOSYSTÈMES

EVALUATION PHARMACOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE:

 Evaluation in vivo  Stabilité colloïdale Pharmacocinétique  Stabilité chimique  Evaluation in vitro Biodistribution  Cinétique de libération Détermination IC 50 Dose maximale tolérée  Internalisation cellulaire Efficacité Schéma 24 : Pégylation et évaluation pharmacologiques des nano-X-IFO

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La stratégie de méthylation des chaînes latérales de l’IFO entrepris dans notre équipe dans les années 2000 a permis de synthétiser et sélectionner un composé né de la méthylation des chaînes latérales en position 7 et 9 de l’IFO (7S,9R-diMe-IFO) [475, 476]. Cette modification structurale a permis de diminuer l’oxydabilité des chaines latérales de l’IFO. De plus, ce composé a montré une activité accrue sur des lignées cellulaires cancéreuses en comparaison avec l’IFO ainsi qu’une cinétique d’alkylation plus rapide dans le cas des moutardes diméthylées en comparaison aux moutardes issues de l’IFO [286, 475]. Son efficacité in vivo a démontré une meilleure efficacité comparativement à l’IFO à la même dose. Dans le cas de ce composé, la stratégie de préactivation lui sera appliquée permettant la combinaison de ces deux stratégies (méthylation et préactivation) et l’obtention de nouveaux dérivés préactivés diméthylés cumulant le gain d’efficacité des moutardes diméthylées et la libération rapide de l’entité active sans métabolisation préalable. De plus, ces derniers pourraient profiter de la stratégie de vectorisation (auto-assemblage ou encapsulation) sous la forme de nanomédicaments apportant, de ce fait, une spécificité avec un ciblage tumoral (Schéma 25).

 Nécessite une métabolisation (prodrogue)  Faible libération de l'entité active (<20%)  Protocoles hautes doses  Toxicités dues au métabolisme IFO  Absence de spécificité

1ère Pharmacomodulation

 Moutardes diméthylées plus actives  Gain d’efficacité in vivo  Métabolisation nécessaire  Toxicités (libération de MCA) 7S,9R diMe-IFO  Absence de spécificité

2nde Pharmacomodulation

PREACTIVATION  Aucune bioactivation nécessaire  Libération accrue du métabolite actif (>95%)  Diminution des doses administrées (à confirmer)  Diminution des toxicités spécifiques (à confirmer) R-O-diMe-IFO R-X-diMeIFO  Amélioration de la spécificité (effet EPR) (à confirmer)

Nanocapsules lipidiques R-X-diMe-IFO formes libres Nanoparticules terpéniques (NCLs) (FLs) (NPTs)

R-X-diMe- R-X-diMe-IFO IFO R=C1-C10 R=C10-C30

EVALUATION PHARMACOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE

Schéma 25 : Combinaison de la méthylation et de la préactivation de l’IFO donnant lieu à de nouveaux analogues de l’IFO

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Enfin, la combinaison de la préactivation accompagnée de l’effet immunomodulateur de ces analogues pourrait conduire au développement de nouveaux dérivés d’oxazaphosphorines montrant une synergie antitumorale des effets antiprolifératifs et immunomodulateurs (Schéma 26).

Schéma 26 : Stratégies de combinaison de la préactivation et de l’effet immunomodulateur des oxazaphosphorines

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8 REFERENCES

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Titre : Synthèse et évaluation pharmacologique d’analogues préactivés de l’ifosfamide : prodrogues et nanoparticules à visée antitumorale

Mots clés : Oxazaphosphorines, Pharmacomodulation, Vectorisation, Immunomodulation.

Résumé : L’ifosfamide (IFO) et le cyclophosphamide constituant des vecteurs de 1ère (CPM) sont des oxazaphosphorines, prodrogues génération.Ceux-ci continuent d’être nécessitant une bioactivation pour être actif. Dans le cas développés afin de leur conférer une de l’IFO, sa biotransformation conduit à une faible spécificité par ciblage passif ou actif. libération du composé hydroxylé actif accompagnée Par ailleurs, le CPM est connu pour son d’effets secondaires toxiques. Des analogues préactivés activité sur le système immunitaire à de l’IFO avec des chaines C1-C30 saturées ou non ont été faible dose. Au vue de la proximité développés, afin de contourner ces toxicités liées à la structurale entre l’IFO et le CPM, nous voie toxicogène du métabolisme. Dans le cadre de la avons étudié l’effet immunomodulateur de stratégie de pharmacomodulation de l’IFO, l’évaluation l’IFO à faibles doses, en comparaison à la cytotoxique de ces composés synthétisés a été réalisée dose immunomodulatrice du CPM. in vitro sur des lignées cellulaires cancéreuses humaines. Une étude in vivo du Géranyloxy-IFO, un La combinaison de ces deux stratégies candidat potentiel, a démontré un meilleur profil (préactivation / effet immunomodulateur) pharmacocinétique pour le G-IFO comparativement à pourrait conduire au développement de l’IFO. Ces analogues ont ensuite été vectorisés sous nouveaux dérivés démontrant une forme de nano-systèmes, soit par auto-assemblage ou synergie antitumorale des effets antiproli- par encapsulation lipidique fératifs et immunomodulateurs.

Title: Synthesis and pharmacological evaluation of preactivated ifosfamide analogs: prodrugs and nanoparticles designed against cancer.

Keywords : Immunomodulation, Oxazaphosphorines, Pharmacomodulation, Vectorization

Abstract: Ifosfamide (IFO) and cyclophosphamide They are still under investigation in order (CPM) are oxazaphosphorines, prodrugs requiring to bring specificity by passive or active bioactivation to be active. Regarding IFO, its targeting. biotransformation leads to a low release of the active Furthermore, CPM is known for having an hydroxylated compound with associated toxic side activity on the immune system at low effects. Preactivated IFO analogs with saturated or dose. Due to the structural proximity of unsaturated C1-C30 chains have been developed to IFO and CPM, we fulfilled studies to circumvent these toxicities related to the toxicogenic highlight the effect of IFO on the immune pathway of metabolism. As part of IFO's pharmaco- system at low dose in comparison to the modulation strategy, the cytotoxic evaluation of these immunomodulatory dose of CPM. compounds, synthesized by engraftment of poly- isoprenyloxy chains, was carried out in vitro on human The combination of these two strategies cancer cell lines. In vivo study of the lead shows the (preactivation & immunomodulatory ef- better pharmacokinetic profil of Geranyloxy-IFO fect) could lead to the development of compared to IFO. These analogs were then vectorized novel derivatives showing a synergic as nanosystems, either by self-assembly or by lipidic antitumor effect combining antiproli- encapsulation leading to 1st generation nanosystems. ferative and immunomodulatory effects

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