Karakterisatie Van Fungale Sporen Via Flowcytometrie

KARAKTERISATIE VAN FUNGALE SPOREN VIA FLOWCYTOMETRIE

Aantal woorden: 21.641

Christof Vercammen Stamnummer: 01103552

Promotor: lic. Tony Ruyssen Tutor: ir. Els Debonne

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de richting Master of Science in de biowetenschappen: voedingsindustrie

Academiejaar: 2018 - 2019

KARAKTERISATIE VAN FUNGALE SPOREN VIA FLOWCYTOMETRIE

Aantal woorden: 21.641

Christof Vercammen Stamnummer: 01103552

Promotor: lic. Tony Ruyssen Tutor: ir. Els Debonne

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de richting Master of Science in de biowetenschappen: voedingsindustrie

Academiejaar: 2018 - 2019

Auteursrechtelijke bescherming

De auteur en promotor geven de toelating deze thesis voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de thesis te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperking van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting van de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze thesis.

The author and promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis.

24/05/2019

Auteur Promotor Christof Vercammen lic. Tony Ruyssen

Tutor ir. Els Debonne

Voorwoord

Bij het realiseren van deze masterproef werd ondersteuning gegeven door meerdere personen waardoor een dankwoord op zijn plaats is.

Allereerst bedank ik mijn tutor ir. Els Debonne voor haar tijd en ondersteuning. Dit vanaf de initiële training in het labo, bij de literatuurstudie en het verdere praktijkgedeelte. Haar tips en richtlijnen waren waardevol voor een goede uitwerking van deze masterproef. Hierbij onthoud ik vooral haar inzet en passie voor haar doctoraat en het thema waarbinnen deze masterproef gekaderd is.

Hierbij bedankt ik ook de promotor lic. Tony Ruyssen voor zijn bijstand om de flowcytometrie goed op te starten alsook voor zijn tips om het onderzoek en het gebruik van flowcytometrie in de goede richting te sturen.

Verder wil ik alle personeel van de masteropleiding “voedingsindustrie” aan de Universiteit Gent bedanken voor hun bijdrage tijdens de vier jaren van deze boeiende opleiding. Dankzij hun inzet en enthousiasme wordt deze opleiding mogelijk gemaakt. Hierbij bedank ik ook ing. Ingrid De Leyn om de studenten de kans te geven om de broodbakkerij zowel in theorie als in praktijk beter te leren kennen. Daarnaast bedank ik ook de andere personeelsleden binnen de onderzoeksgroep graan- en diervoedertechnologie. De verschillende seminars@lunch met hen waren interessant om andere onderwerpen rondom graan en brood meer in detail te bekijken.

Daarnaast wil ik mijn vrienden en medestudenten bedanken voor de toffe momenten en samenwerking tijdens deze opleiding. Wanneer nodig konden wij terugvallen op elkaar en samen maakten we van de studentenjaren een periode waar je met vreugde aan terugdenkt.

Ten slotte wil ik mijn ouders bedanken voor de ondersteuning tijdens mijn studies. Zowel leuke als drukkere momenten kon ik met hen delen, bij vragen of moeilijkheden stonden zij steeds voor mij klaar. Hierbij wil ik specifiek mijn vader bedanken. Je was fier op mij en blijft een rolmodel als doorzetter om te bereiken wat je wilt. Ik kan de afronding van deze opleiding niet meer met je delen maar je kan trots op me zijn pa.

Christof Vercammen Gent, 24 mei 2019

Abstract

Schimmels zoals Penicillium spp. en Aspergillus spp. vormen het grootste probleem bij microbiologisch broodbederf. Om de houdbaarheid van brood te verlengen zonder de organoleptische eigenschappen sterk te beïnvloeden, werkt men met minimale inhiberende concentraties van conserveermiddelen. Dit onderzoek had als doel het in kaart brengen van de invloed van conserveermiddelen op de groei van schimmelsporen door het aanwenden van flowcytometrie en spectrofotometrie. De geschiktheid van flowcytometrie voor volgende doelstellingen werd nagegaan: (1) kwantificatie van sporensuspensies; (2) visualisering van sporenkieming en (3) onderzoek van het effect van zwakke organische zuren. Bij kwantificatie van sporensuspensies werden de resultaten via flowcytometrie, microscopie en uitplating onderling vergeleken. Hieruit werd enerzijds besloten dat flowcytometrie geschikt is voor kwantificatie van de onderzochte schimmels. Anderzijds werd aangetoond dat het voorkomen van schimmelsporen in clusters geen relevante afwijking gaf voor kwantificatie uitgedrukt in log sporen/ml. Voor visualisering van de sporenkieming werden de schimmelsporen in YES medium geïncubeerd waarna resultaten met en zonder kleuring door PI en SYTO 13 werden bekomen. Hieruit kon afgeleid worden dat er indicatoren bestaan die de sporenkieming weergeven en dat kleuring van schimmelsporen meer betrouwbare resultaten levert. Het voorkomen van groei/geen groei kon worden aangetoond via flowcytometrie. Spectrofotometrie bleek echter een minder arbeids- en tijdsintensieve methode te zijn voor onderzoek van de sporenkieming in vergelijking met flowcytometrie. Bovendien kon men via spectrofotometrie predictieve modellen opmaken voor groei/geen groei op basis van de bekomen data.

Kernwoorden: flowcytometrie, spectrofotometrie, kieming schimmelsporen, organisch zuur, antifungale activiteit

Abstract

Moulds such as Penicillium spp. and Aspergillus spp. are the major cause of microbiological bread decay. To prolong the shelf life of bread without greatly influencing organoleptic properties, minimal inhibitory concentrations of preservatives are used. This research aimed to investigate the influence of preservatives on the growth of fungal spores through the use of flow cytometry and spectrophotometry. The suitability of flow cytometry for the following objectives was assessed: (1) quantification of spore suspensions; (2) visualization of spore germination and (3) investigation of the effect of weak organic acids. For quantification of spore suspensions, the results of flow cytometry, microscopy and plating were compared. On the one hand, it could be concluded that flow cytometry is suitable for quantification of the investigated moulds. On the other hand, the presence of fungal spores in clusters did not cause any relevant deviation for quantification expressed in log spores/ml. For visualization of spore germination, the fungal spores were incubated in YES medium, after which results with and without staining by PI and SYTO 13 were obtained. From this it could be deduced that there are indicators showing spore germination and that coloring of fungal spores provides more reliable results. The occurrence of growth/no growth could be demonstrated with flow cytometry. However, spectrophotometry turned out to be a less labor-intensive and time-intensive method for investigating spore germination compared to flow cytometry. Moreover, spectrophotometry enabled the development of predictive models for growth/no growth based on the data obtained.

Keywords: flow cytometry, spectrophotometry, fungal spore germination, organic acid, antifungal activity

Inhoudsopgave

Lijst met afkortingen VI

Lijst met figuren VII

Lijst met tabellen X

Inleiding 1

1 Literatuurstudie 2

1.1 Foodborne fungi – morfologie, systematiek en karakteristieken 2

1.1.1 Indeling, morfolofie en eigenschappen van schimmels 4

1.1.2 Levenscyclus van Ascomycetes 8

1.1.3 Onderzochte schimmels nader bekeken 9

1.1.4 Morfologie van sporen en het kiemingsproces 12

1.2 Fungaal broodbederf en broodconservering 17

1.2.1 Bederf door schimmels 18

1.2.2 Bederf door gisten 18

1.2.3 Algemene werking van organische zuren 19

1.2.4 Voorbeelden van conserveringsmiddelen 21

1.2.5 Overige conserveringsmogelijkheden bij de onderzochte schimmels 24

1.3 Flowcytometrie bij fungaal onderzoek en kleuring van sporen 25

1.3.1 Algemeen principe 25

1.3.2 Dataverwerking en kleuring bij flowcytometrie 27

1.3.3 Gebruikte kleurstoffen en waarnemingen uit de literatuur 31

1.3.4 Andere praktische onderzoeksvoorbeelden 34

2 Materiaal en methoden 35

2.1 Probleem- en doelstelling 35

2.2 Proefopzet 36

2.3 Aanmaak sporenoplossing 38

2.4 Kwantificering van sporensuspensies 38

2.4.1 Thoma telkamer (microscopie) 38

2.4.2 Microbiologische uitplatingen (telplaatmethode) 38

2.4.3 Flowcytometrie 39

III

2.5 Invloed van organische zuren op sporenontkieming 39

2.5.1 Flowcytometrie 39

2.5.2 Microscopie 41

2.5.3 Spectrofotometrie 41

2.6 Statistische verwerking 43

2.6.1 Ontwikkeling van predictieve groei/geen groei modellen 43

3 Resultaten en bespreking 45

3.1 Kwantificering van sporenaantallen 45

3.1.1 Thoma telkamer (microscopie) 45

3.1.2 Microbiologische uitplatingen (telplaatmethode) 45

3.1.3 Flowcytometrie – instellingen, gating, correctie en resultaten 45

3.1.4 Tussentijds besluit: vergelijking van de resultaten via microscopie, uitplating en flowcytometrie 47

3.2 Invloed van organische zuren op sporenontkieming via flowcytometrie 48

3.2.1 Flowcytometrie zonder kleuring van schimmelsporen 48

3.2.2 Flowcytometrie met kleuring van schimmelsporen 56

3.2.3 Microscopie: in kaart brengen van sporenkieming 65

3.2.4 Tussentijds besluit: gebruik van flowcytometrie voor onderzoek van het kiemingsproces van schimmelsporen 68

3.3 Spectrofotometrie 69

3.3.1 Onderzoek van de invloed van zwakke organische zuren op de sporenontkieming via spectrofotometrie 69

3.3.2 Groei/geen groei modellering voor de onderzochte schimmels 72

3.3.3 Tussentijds besluit: gebruik van spectrofotometrie voor onderzoek van het kiemingsproces van schimmelsporen 75

4 Algemene discussie 76

4.1 Sporenkieming bij condities zonder zuur 76

4.2 Gebruik van zwakke organische zuren 77

4.3 Flowcytometrie voor sporenonderzoek van schimmels 78

5 Besluit 80

5.1 Voornaamste bevindingen 80

5.2 Aanbevelingen 80

Bibliografie 82

Bijlagen 91

Lijst met afkortingen

Afkorting Anderstalige betekenis Nederlandse betekenis AA Acetic acid Azijnzuur AN Aspergillus niger Aspergillus niger CaP Calcium propionate Calciumpropionaat CZ Citric acid Citroenzuur FC Flow cytometry Flowcytometrie FL Fluorescence parameter Fluorescentieparameter FSC Forward-scattered light Voorwaarts verstrooid licht HA Undissociated acid Ongedissocieerd zuur Kve Colony-forming units Kolonievormende eenheden LA Lactic acid Melkzuur MAP Modified atmosphere packaging Gemodificeerde atmosfeer verpakking MEA Malt extract agar Moutextract agar MIC Minimum inhibitory concentration Minimale remmende concentratie OD Optical density Optische densiteit PA Propionic acid Propionzuur PBS Phosphate buffered saline Fosfaat gebufferde zoutoplossing PI Propidium iodide Propidium iodide PP Penicillium paneum Penicillium paneum SSC Side-scattered light Zijdelings verstrooid licht tNaC Trisodium citrate Trinatriumcitraat YES Yeast extract sucrose Gistextract sucrose

Lijst met figuren

FIGUUR 1: Levenscyclus van de ascomyceet Neurospora crassa (een broodschimmel) (Campbell et al., 2008)...... 5

FIGUUR 2: Levenscyclus van Eurotiales (schimmelorde binnen de Ascomycetes) met anamorfe en teleomorfe fasen (Samson et al., 2010)...... 9

FIGUUR 3: Conidioforen en conidia van Penicillium paneum (Frisvad & Samson, 2004)...... 10

FIGUUR 4: Conidioforen en conidia van Aspergillus niger (de Hoog, Guarro, Gené, & Figueras, 2000)...... 11

FIGUUR 5: Kieming van sporen van A. niger via (A) lichtmicroscopie en (B) fluorescentiemicroscopie (Van Leeuwen et al., 2013)...... 12

FIGUUR 6: Enkele verschillende vormen waarin fungale sporen voorkomen (Levetin, 2013)...... 13

FIGUUR 7: Schematische weergave van de fungale celwand en celmembraan (Fesel & Zuccaro, 2016)...... 14

FIGUUR 8: Structuur van een spore van Penicillium spp. (Vashishta et al., 2016)...... 15

FIGUUR 9: Het kiemingsproces van Penicillium spp. (Vashishta et al., 2016)...... 16

FIGUUR 10: Migratie en dissociatie van een organisch zuur in een cel (Davidson et al., 2013)...... 20

FIGUUR 11: Mogelijke dissociaties van een zwak zuur en afgeleid zout bij inhibitie (Lallemand Inc., n.d.)...... 20

FIGUUR 12: Vereenvoudigde opstelling van een flowcytometer (Haynes, 1988)...... 26

FIGUUR 13: Partikels gecentreerd in een laminaire stroom (Mandy et al., 1995)...... 26

FIGUUR 14: Verschillende pieken in het FSC-diagram stellen verschillende groepen partikels voor (Day et al., 2002)...... 27

FIGUUR 15: Onderscheid tussen intacte (R1), kiemende (R2), beschadigde (R3) en uitgroeiende (R4) endosporen van Bacillus cereus via kleuring met SYTO 9 (Cronin & Wilkinson, 2007)...... 29

FIGUUR 16: Verschillende voorstellingswijzen voor data bij flowcytometrie (Haynes, 1988)...... 30

FIGUUR 17: Verschuiving van het puntenplot bij kieming van Trichoderma reesei sporen (Bradner & Nevalainen, 2003)...... 31

FIGUUR 18: Frequentiehistogrammen via flowcytometrie bij onderzoek van A. fumigatus (A tot C) en P. brevicompactum (D tot F). S: single (enkelvoudig), P: paired (gepaard) (Prigione et al., 2004)...... 33

VII

FIGUUR 19: Twee pieken (FSC 10 – 100) stellen cellen van S. cerevisiae voor in andere fasen van de celcyclus (Kullman, 2000)...... 34

FIGUUR 20: Schematisch overzicht van de uitgevoerde deelexperimenten binnen de thesis. . 37

FIGUUR 21: Scatterprofielen van P. paneum (links) en A. niger (rechts) verdeeld in zones via gating...... 46

FIGUUR 22: Verschuiving van het scatterplot van P. paneum op t0, t2 en t3 zonder toevoeging van azijnzuur...... 48

FIGUUR 23: Verschillende ligging van scatterplots van P. paneum op t2 zonder toevoeging van azijnzuur...... 49

FIGUUR 24: Vorming van een ruiscluster bij het scatterplot van P. paneum op t0, t2, t4, t29 en t48 zonder toevoeging van azijnzuur...... 49

FIGUUR 25: Ruiscluster bij het scatterplot van P. paneum op t23 afwezig maar aanwezig bij herhaling op t20, zonder toevoeging van azijnzuur...... 50

FIGUUR 26: Uitbreiding van het scatterplot van A. niger op t0, t8, t24, t56 en t77 zonder toevoeging van azijnzuur...... 50

FIGUUR 27: Geen uitbreiding van het scatterplot van A. niger op t0, t24, t30, t48 en t72 zonder toevoeging van azijnzuur...... 51

FIGUUR 28: Grafieken bekomen voor 0 mM toegevoegd azijnzuur op t23 en t29 voor P. paneum...... 51

FIGUUR 29: Grafieken bekomen voor 20 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t20 en t48 voor P. paneum...... 52

FIGUUR 30: Grafieken bekomen voor 30 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t20 en t72 voor P. paneum...... 52

FIGUUR 31: Grafieken bekomen voor staal zonder toegevoegd zuur (pH = 4,75) op t0, t48 en t96 voor P. paneum...... 53

FIGUUR 32: Grafieken bekomen voor 238 mM, 477 mM en 715 mM toegevoegd melkzuur (pH

= 4,75) op t48 (links) en t96 (rechts) voor P. paneum...... 54

FIGUUR 33: Grafieken bekomen voor 0 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t8 en t77 voor A. niger...... 55

FIGUUR 34: Grafieken bekomen voor 20 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t24 en t48 voor A. niger...... 55

FIGUUR 35: Grafieken bekomen voor 50 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t8 en t77 voor A. niger...... 56

FIGUUR 36: Grafieken bekomen voor P. paneum via kleuring en geïncubeerd m.b.v. een warmwaterbad bij 30°C op t0, t3 en t5...... 57

VIII

FIGUUR 37: Grafieken weergegeven in overeenstemming met de kiemende sporen via gating op t5 voor P. paneum geïncubeerd bij 30°C...... 58

FIGUUR 38A: Grafieken bekomen voor A. niger via incuberen in een warmwaterbad bij 30°C, verdunnen in PBS en kleuring met PI en SYTO 13 op t0, t1 en t3,5...... 60

FIGUUR 38B: Grafieken bekomen voor A. niger via incuberen in een warmwaterbad bij 30°C, verdunnen in PBS en kleuring met PI en SYTO 13 op t4,5 en t5,5……………………………....61

FIGUUR 39: Grafieken weergegeven in overeenstemming met het SSC-FSC scatterplot via gating op t4,5 voor A. niger geïncubeerd bij 30°C...... 62

FIGUUR 40: Grafieken bekomen voor P. paneum (T = 30°C), verdunning in PBS en kleuring met PI en SYTO 13, op t0 zonder azijnzuur (a), op t7 zonder azijnzuur (b) en op t7 met 25 mM toegevoegd azijnzuur (c)...... 64

FIGUUR 41: Het kiemingspercentage van P. paneum d.m.v. microscopie tot 50 uur na inoculatie in YES medium (pH = 6,04) met incubatie bij 30°C...... 66

FIGUUR 42: Het kiemingspercentage van A. niger d.m.v. microscopie tot 26 uur na inoculatie in YES medium (pH = 6,04) met incubatie bij 30°C...... 66

FIGUUR 43: Groeicurves bekomen voor P. paneum in aanwezigheid van verschillende zuurconcentraties in YES medium bij pH = 4,75...... 70

FIGUUR 44: Groeicurves bekomen voor A. niger in aanwezigheid van verschillende zuurconcentraties in YES medium bij pH = 4,75...... 71

Lijst met tabellen

TABEL 1: Classificatie van relevante fungi bij broodbederf (Deschuyffeleer et al., 2012)...... 3

TABEL 2: Overzicht terminologie bij fungi...... 4

TABEL 3: Voorbeelden van toepassingen met fluorescentie en bruikbare kleurstoffen (Haynes, 1988)...... 28

TABEL 4: Overzicht van de exacte hoeveelheden voor bereiding van het YES medium ter bepaling van het effect van azijnzuur bij het preliminair onderzoek. CZ: citroenzuur, tNaC: trinatriumcitraat...... 39

TABEL 6: Samenstelling van de 96-well multititerplaten; AA: azijnzuur, LA: melkzuur, PA: propionzuur...... 43

TABEL 7: Kwantificatie van de sporensuspensies via microscopie voor P. paneum (n = 4) en A. niger (n = 3)...... 45

TABEL 8: Kwantificatie van de sporensuspensies via de telplaatmethode voor P. paneum (n = 10) en A. niger (n = 9)...... 45

TABEL 9: Instellingen flowcytometrie voor de onderzochte schimmels...... 46

TABEL 10: Kwantificatie van de sporensuspensies via flowcytometrie (FSC, LOG3) voor P. paneum (n = 30) en A. niger (n = 29)...... 47

TABEL 12: Instellingen flowcytometrie voor de onderzochte schimmels...... 56

TABEL 13: Vergelijking tussen sporenconcentraties volgens de SSC-FSC en FL3-FL1 scatterplots van P. paneum na verdunning met fysiologisch water en kleuring met PI en SYTO 13...... 59

TABEL 14: Vergelijking tussen sporenconcentraties volgens de SSC-FSC en FL3-FL1 scatterplots van A. niger na verdunning met PBS en kleuring met PI en SYTO 13...... 62

TABEL 15: Vergelijking tussen sporenconcentraties volgens de SSC-FSC en FL3-FL1 scatterplots van P. paneum na verdunning met PBS en kleuring met PI en SYTO 13...... 65

TABEL 16: Overzicht van relevante microscopische waarnemingen (10x40) bij het kiemingsproces van P. paneum en A. niger...... 67

Inleiding

Microbieel bederf van brood door bepaalde schimmels, gisten en bacteriën verkort de houdbaarheid van brood. Schimmelgroei vormt het grootste probleem, met Aspergillus spp. en Penicillium spp. als twee voornaamste geslachten. Dit type van broodbederf ontstaat door post- contaminatie na het bakproces. Om de voedselveiligheid te garanderen is het daarom van groot belang om te zorgen dat schimmelsporen niet kunnen kiemen. Omwille van deze reden richt onderzoek zich op verschillende conserveringsmethoden en de ontwikkeling van nieuwe technieken om de aanwezigheid van micro-organismen of sporen zo nauwkeurig en efficiënt mogelijk te bepalen. Reeds bestaande methoden zijn vaak tijdrovend en de bekomen resultaten zijn niet altijd eenduidig te interpreteren.

In deze masterproef werd de groeistart en kiemingsfase van de broodschimmels Penicillium paneum en Aspergillus niger onderzocht. Hierbij werd nagegaan of flowcytometrie een gepaste methode kan zijn om de kieming van de schimmelsporen en het effect van verschillende conserveringstechnieken in kaart te brengen. Om dit te bereiken werd deze masterproef opgedeeld in twee luiken. Het eerste luik omvat de literatuurstudie waarin schimmels, broodbederf, conservering en flowcytometrie aan bod komen. Het tweede luik omvat het praktisch werk met flowcytometrie waarbij verkregen gegevens werden vergeleken met gegevens via microscopie en telplaten voor kwantificering van sporensuspensies. Verder werd via flowcytometrie het effect van zwakke organische zuren op de sporenkieming nagegaan. Daarnaast werden ook metingen van de optische densiteit uitgevoerd voor aanvullende informatie over de sporenkieming waarbij predictieve groei/geen groei modellen werden opgemaakt. Het corpus van deze masterproef sluit uiteindelijk af met een algemene discussie en besluit waarin de voornaamste bevindingen aan bod komen.

1 Literatuurstudie

1.1 Foodborne fungi – morfologie, systematiek en karakteristieken Op basis van de verschillende kenmerken van schimmels maakt men een onderscheid tussen verschillende stammen: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota en Basidiomycota waarbij verdere indelingen in klassen tot en met soorten bestaan (Campbell et al., 2008). Tabel 1 geeft een overzicht van de classificatie van de schimmels Penicillium paneum en Aspergillus niger die gebruikt werden binnen het onderzoek en behorende tot de stam Ascomycota. Hierbij is het onderscheid weergegeven ten opzichte van kalkgisten en schimmels behorende tot andere stammen (Deschuyffeleer, Devlieghere, & Eeckhout, 2012).

In de literatuur verwijst men soms naar schimmels die sporen ongeslachtelijk produceren (met een ongewone of onbekende seksuele fase) met de benaming Deuteromycetes of Fungi Imperfecti als bijkomende onderscheiding (Levetin, 2013; Samson, Houbraken, Thrane, Frisvad, & Andersen, 2010). Hiertoe behoren echter fungi van verschillende klassen, dit is afhankelijk van de specifieke schimmel zelf (bv. Trichoderma, Fusarium). Deze indeling behoort niet tot de classificatie zoals de vernoemde klassen en is bijgevolg niet opgenomen in tabel 1.

Ter vergelijking worden hieronder de groepen Ascomycetes, Basidiomycetes en Zygomycetes besproken volgens de voornaamste kenmerken. Dit met aandacht voor de families en specifieke schimmelsoorten die in het praktijkgedeelte van deze thesis onderzocht werden. Hierna volgt relevante informatie omtrent sporen en sporenkieming.

TABEL 1: Classificatie van relevante fungi bij broodbederf (Deschuyffeleer et al., 2012). Rijk Fungi

Stam Ascomycota Basidiomycota Zygomycota

Substam Pezizomycotina Saccharomycotina (Incertae sedis) Mucoromycotina

Klasse Eurotiomycetes Saccharomycetes Wallemiomycetes (Incertae sedis)

Subklasse Eurotiomycetidae (Incertae sedis) (Incertae sedis) (Incertae sedis)

Orde Eurotiales Saccharomycetales Wallemiales Mucorales

Familie Trichocomaceae Saccharomycetaceae Saccharomycopsidaceae (Incertae sedis) Mucoraceae

Geslacht Penicillium Aspergillus Pichia Hyphopichia Saccharomycopsis Wallemia Mucor Rhizopus

Soort Penicillium Aspergillus Wickerhamomyces Hyphopichia Saccharomycopsis Wallemia sebi Mucor Rhizopus paneum niger anomalus burtonii fibuligera mucedo nigricans

Incertae sedis: het taxon (soort, genus, familie, etc.) is niet te plaatsen in de classificatie.

1.1.1 Indeling, morfolofie en eigenschappen van schimmels Voor de bespreking van de morfologie bestaan verschillende termen met meerdere synoniemen die al dan niet specifiek bij een bepaalde stam binnen de fungi gebruikt worden. Ter verduidelijking worden de belangrijkste termen toegelicht in tabel 2. Figuren 1 – 4 geven een voorstelling van de belangrijkste structuren.

TABEL 2: Overzicht terminologie bij fungi. Ascus Zakachtige structuur waarin ascosporen worden gevormd door Ascomycetes. Ascocarp Vruchtlichaam, omsluit de asci die de ascosporen bevatten bij Ascomycetes. (= ascoma of ascoom) Ascospore Spore gevormd in een ascus bij Ascomycetes. Basidiocarp Vruchtlichaam met veelal een kenmerkende paddenstoelvorm bij Basidiomycetes. Basidiospore Geslachtelijke exospore bij Basidiomycetes. Basidium Knotsvormige cel. Een sporendoosje of sporangium bij Basidiomycetes. Columella Koepelvormige structuur die binnen een sporangium (of aan de top van een sporangiofoor) kan voorkomen. Deze structuur laat uitwisseling van nutriënten toe tussen het protoplasma en de bovenliggende ontwikkelende sporen. Conidiofoor Gespecialiseerde hyfe die uiteindelijk sporen kan vormen bij Ascomycetes. Conidium Synoniem voor een spore. Dikaryotisch Verwijst naar de aanwezigheid van twee haploïde kernen in eenzelfde (hyfe)cel. Fialide Onderdeel aan de top van een conidiofoor, vormt conidia bij Ascomycetes. Gametangium Voortplantingsstructuur die gameten vormt voor seksuele reproductie. Onderscheid: mannelijk antheridium en vrouwelijk ascogonium. Hyfe Draadvormige structuur binnen het draadvormig netwerk (mycelium) waaruit een schimmel bestaat. Luchthyfe Hyfe die weg groeit van de rest van het mycelium en de nutriëntenbron, deze structuur kan een conidiofoor vormen. Merosporangium Sporendoosje aangemaakt aan de top van een hyfe bij Zygomycetes. Metula Steriele cel gevormd uit een vesikel, kan fialiden dragen bij Ascomycetes. Rhizoïde Draadvormige structuur met een vasthechtingsfunctie. Septum Tussenwand, zorgt voor compartimentering zoals bij hyfen indien aanwezig. Sporangium Sporendoosje aangemaakt aan de top van een hyfe bij Zygomycetes. Sporangiofoor Steelvormige structuur die sporangia draagt bij Zygomycetes. Sporangiospoor Spore bij Zygomycetes. Sterigmatum Dunne steel op een basidium, draagt een basidiospore bij Basidiomycetes. Stolon Gespecialiseerde hyfe, horizontale structuur die sporangioforen draagt. Rhizoïden kunnen stolonen aan het substraat hechten. Vesikel Structuur gevormd door een conidiofoor, hieruit ontstaan metulae die op hun (= blaasje) beurt fialiden vormen waaruit ten slotte de conidia ontstaan. Zygosporangium Structuur gevormd door versmelting van twee gameten, hieruit komen sporen (= zygospore) vrij bij Zygomycetes.

1.1.1.1 Ascomycetes: Penicillium spp. en Aspergillus spp. Schimmels die behoren tot de Ascomycetes worden gekenmerkt door een gesepteerd en haploïd vegetatief mycelium. Daarnaast worden bij seksuele reproductie (figuur 1) sporen gevormd in zakachtige asci waardoor men ook de benaming zakjeszwammen gebruikt. Verschillende Ascomycetes zijn plantenpathogenen maar kunnen ook voorkomen als reducenten van dood organisch materiaal, leven symbiotisch met algen of cyanobacteriën in korstmossen en kunnen leiden tot voedselbederf. Voorbeelden van bekende geslachten die tot deze groep horen zijn: Aspergillus en Penicillium (Campbell et al., 2008; Samson et al., 2010).

FIGUUR 1: Levenscyclus van de ascomyceet Neurospora crassa (een broodschimmel) (Campbell et al., 2008).

A. Aspergillus spp. Schimmelkolonies van het geslacht Aspergillus worden gekenmerkt door een snelle groei en een hoge dichtheid aan conidioforen met een onvertakte steel met veelal hyfen zonder septa. De schimmelkleur kan variëren van wit, roze, geel, bruin tot zwart afhankelijk van de soort maar ook tijdens de ontwikkeling is kleurverandering mogelijk. Het conidiofoor bestaat uit een vesikel (blaasje), fialiden (vormen conidia), conidia (sporen) en soms metulae (steriele cellen). De conidia komen in ketens compact of divergent voor, hun oppervlak is glad of ruw en ze kunnen een glazig (hyaline) uitzicht hebben of pigment bevatten (Samson et al., 2010).

Er bestaan ruim 180 verschillende soorten. Meerdere soorten zorgen voor bederf of zijn ziekteverwekkend voor dieren of planten. Kenmerkend hierbij is de productie van mycotoxines zoals aflatoxine, ochratoxine of sterigmatocystine. Daarnaast worden verschillende soorten voor industriële toepassingen gebruikt zoals bij fermentatie of voor de productie van organische zuren of andere componenten. Enkele bekende schimmels binnen dit geslacht zijn A. fumigatus, A. clavatus, A. flavus, A. niger en A. parasiticus (Samson et al., 2010).

B. Penicillium spp. Schimmelkolonies van het geslacht Penicillium worden eveneens gekenmerkt door een snelle groei. Ze kleuren wit tot een groene tint wat kan veranderen tijdens de ontwikkeling. De conidioforen kunnen zich ontwikkelen op hyfen vanuit het substraat (fluweelachtig uitzicht), vanuit luchthyfen (wollig uitzicht) of vanuit een gebundelde vorm van hyfen. Een conidiofoor heeft een glazig (hyaline) uitzicht, heeft een glad tot ruw oppervlak en komt alleenstaand of gebundeld voor. Elke conidiofoor heeft een steel die eindigt in een krans van (flesvormige) fialiden maar zijvertakkingen zijn mogelijk. De conidia komen in ketens compact of divergent voor. Hun vorm is sferisch, ellipsoïdaal, cilindrisch of fusiform en ze hebben een glazig (hyaline) tot groenkleurig uitzicht met een gladde tot ruwe wand (Samson et al., 2010).

Penicillium kan men zowel op voeding als binnenshuis aantreffen maar komt hoofzakelijk in de bodem voor. Verschillende soorten produceren mycotoxines zoals ochratoxine maar elke soort heeft specifieke groeicondities en specifieke productie van secundaire metabolieten. Enkele bekende schimmels binnen dit geslacht zijn P. roqueforti, P. chrysogenum, P. camemberti, P. paneum en P. viridicatum (Samson et al., 2010).

1.1.1.2 Basidiomycetes Binnen de groep van de Basidiomycetes behoren fungi die men classificeert binnen de stam Basidiomycota. Deze stam omvat o.a. verschillende mutualistische of parasitaire schimmels bij planten (roest en smut), reducenten die goed lignine afbreken, bepaalde voedselbedervers zoals Wallemia sebi op brood, schimmels die paddenstoelen vormen en puffballs die sporen vanuit het vruchtlichaam vrijstellen in een sporenwolk (Campbell et al., 2008; Vashishta, Sinha, & Kumar, 2016).

Voor seksuele reproductie van Basidiomycetes moet er haploïd mycelium met verschillend mating type samenkomen en aanleiding geven tot plasmogamie. Hieruit ontstaat mycelium dat typisch langdurig dikaryotisch is met de vorming van septa zoals bij Ascomycetes, het haploïd mycelium heeft hierna geen rol meer. Het dikaryotisch mycelium groeit verder met de vorming van basidiocarpen (veelal paddenstoelvormige vruchtlichamen) onder invloed van omgevingsfactoren (Campbell et al., 2008; Vashishta et al., 2016).

Elk basidiocarp draagt een groot aantal basidia op kieuwen waarin karyogamie leidt tot de vorming van twee diploïde kernen gevolgd door meiose waardoor vier haploïde kernen ontstaan per basidium. Het basidium (sporendoosje of sporangium) is een kenmerkende knotsvormige cel bij Basidiomycetes. Elk basidium vorm vier aanhangsels waarin telkens een van de haploïde kernen terechtkomt. Zo ontstaan vier exosporen (basidiosporen) op sterigmata (dunne steeltjes die ontstaan door insnoeringen) op elk basidium. Deze sporen worden uiteindelijk vrijgesteld aan de lucht en via de wind verspreid. Een vrijgestelde spore kan in een gunstig milieu kiemen waardoor nieuw haploïd mycelium ontstaat waarbij de cyclus zich herhaalt (Campbell et al., 2008; Vashishta et al., 2016).

1.1.1.3 Zygomycetes Kenmerkend voor Zygomycetes is het coenocytisch (veelkernig) mycelium, septa worden enkel gevormd om specifieke organen zoals sporangia te scheiden (regio’s waar reproductieve cellen ontstaan) en bij ouder mycelium. Verder kunnen stolonen voorkomen, dit zijn gespecialiseerde hyfen die sporangioforen dragen en via rhizoïden aan het substraat kunnen gehecht zijn (Campbell et al., 2008; Samson et al., 2010).

Verschillende Zygomycetes zijn saprofyt (voeden zich met dood materiaal), maar kunnen ook voorkomen bij levende fungi, dieren of planten (parasitair of commensaal). Bij levensmiddelen zoals brood en fruit kunnen Zygomycetes leiden tot bederf. Voorbeelden van bekende geslachten die tot deze groep horen zijn: Rhizopus, Absidia en Mucor waarbij sommige soorten zorgen voor voedselbederf of industrieel gebruikt worden zoals voor de productie van organische zuren (Campbell et al., 2008; Samson et al., 2010).

De voortplanting kan zowel seksueel als aseksueel plaatsvinden. Voor aseksuele reproductie worden haploïde sporangiosporen endogeen in sferisch of pyriforme sporangia (sporendoosjes, al dan niet met columella) of merosporangia aangemaakt aan de toppen van (rechtopstaande) hyfen. Na ontwikkeling worden de sporen vrijgesteld aan de lucht. Indien sporen op bijvoorbeeld een vochtig levensmiddel belanden, kunnen deze kiemen en nieuw mycelium vormen (Campbell et al., 2008; Samson et al., 2010).

In niet ideale omstandigheden zoals bij gebrek aan voedingsstoffen kan seksuele reproductie plaatsvinden. Hiervoor kunnen twee meerkernige gametangia samensmelten afkomstig van hyfen met een verschillend mating type van verschillend mycelium. Hierdoor ontstaat een dikwandig zygosporangium (zygospore) met ondersteuning aan weerszijden door suspensors via hyfen. Bij betere omgevingsomstandigheden vormt de zygospore een sporangium, deze stelt haploïde sporen vrij die nieuw mycelium kunnen vormen na kieming (Campbell et al., 2008; Samson et al., 2010).

1.1.2 Levenscyclus van Ascomycetes De voortplanting bij Ascomycetes (figuur 1) kan zowel seksueel als aseksueel plaatsvinden. De exacte structuren of processen kunnen variëren bij bepaalde groepen maar verschillende zaken blijven overeenkomen zoals hieronder besproken via de levenscyclus van de broodschimmel Neurospora crassa (Campbell et al., 2008).

1.1.2.1 Aseksuele reproductie Voor aseksuele reproductie (anamorf stadium) worden haploïde conidia (sporen) gevormd. Deze conidia ontstaan niet in sporangia maar extern en veelal in clusters of ketens uit conidioforen van het vegetatief mycelium. Na verspreiding via de lucht kunnen deze sporen nieuw vegetatief mycelium vormen (Campbell et al., 2008; Samson et al., 2010).

1.1.2.2 Seksuele reproductie Voor seksuele reproductie (teleomorf stadium) kunnen conidia versmelten met hyfen of hyfen onderling van mycelium met een verschillend mating type (plasmogamie). Zo ontstaan dikaryotische cellen waaruit meerdere asci gevormd worden gevolgd door versmelting van de twee haploïde nuclei (karyogamie). Algemeen zijn de nuclei afkomstig van verschillende gametangia (mannelijk antheridium en vrouwelijk ascogonium) (Campbell et al., 2008; Samson et al., 2010). Wanneer seksuele reproductie mogelijk is binnen eenzelfde mycelium of vegetatief lichaam dan is de schimmel homothallisch, in geval van heterothallisch mycelium zijn twee verschillende mycelia betrokken van compatibele stammen (Krijgsheld et al., 2013). Relevant bij de onderzochte schimmels is de benaming Eurotium wat verwijst naar het teleomorf stadium (seksuele reproductie) van Aspergillus (Deschuyffeleer et al., 2012). In tegenstelling tot Zygomycetes hebben Ascomycetes een langere dikaryote fase waarbij meerdere asci ontstaan. Hierbij verlopen de verschillende recombinaties onafhankelijk van elkaar waardoor sporen bekomen worden waaruit schimmels kunnen ontstaan die genetisch niet identiek zijn. Dit geeft voor de schimmel een grotere aanleiding tot diversiteit (Campbell et al., 2008). Bij Ascomycetes worden de sporenvormende asci ingesloten in ascomata of ascocarpen (vruchtlichamen). Dit is duidelijk waarneembaar bij Eurotiales, een schimmelorde binnen de Ascomycetes waartoe Penicillium en Aspergillus behoren (figuur 2). De vruchtlichamen kunnen afzonderlijk of geaggregeerd voorkomen in of op stroma (een geheel van vegetatieve hyfen), in holtes in dit stroma of vanuit kussenachtige structuren (pseudothecia). Binnen de asci worden via meiose en mitose (tot acht) ascosporen gevormd die na vrijgave kunnen uitgroeien tot vegetatief mycelium (Campbell et al., 2008; Samson et al., 2010).

FIGUUR 2: Levenscyclus van Eurotiales (schimmelorde binnen de Ascomycetes) met anamorfe en teleomorfe fasen (Samson et al., 2010).

1.1.3 Onderzochte schimmels nader bekeken Voor het praktijkgedeelte van deze thesis werden twee specifieke schimmels gebruikt, deze komen hieronder aan bod.

1.1.3.1 Penicillium paneum Frisvad P. paneum (figuur 3) is een snelgroeiende schimmel die men kan aantreffen op o.a. roggebrood en bakkersgist. De kolonies zijn initieel wit gekleurd, maar worden uiteindelijk groen. De conidiosporen zijn groen, sferisch met een gladde wand, hebben een grootte van 3,5 tot 5 µm en komen in losse kolommen voor bij de conidioforen, De conidioforen hebben een glazig (hyaline) uitzicht en zijn vertakt. De steel heeft een ruw tot wratachtig oppervlak, de metulae zijn cilindervormig met een ruwe wand en dragen elks vier tot zeven cilindervormige fialiden. Deze schimmel produceert de mycotoxines botryodiploidine en patuline (Frisvad & Samson, 2004; Samson et al., 2010). De productie van mycotoxines vindt plaats bij sterke uitgroei van de schimmel waardoor broodbederf visueel merkbaar is en bijgevolg consumptie onwaarschijnlijk is (Cauvain, 2015).

FIGUUR 3: Conidioforen en conidia van Penicillium paneum (Frisvad & Samson, 2004).

Geschikte condities voor vegetatieve groei van P. paneum zijn: - temperatuurbereik: 20 – 30°C met een optimum rond 23 – 25°C (dos Santos, Chaves, & Sant’Ana, 2017); - pH bereik: groei bij ruim pH bereik (1,5 – 11,0) kenmerkend voor schimmels (Devlieghere, 2017); - wateractiviteit: > 0,90 (Debonne et al., data niet gepubliceerd).

P. paneum kan echter nog groeien onder stresscondities, zoals een lagere temperatuur, zuur milieu of bij een hoge CO2-concentratie (Chitarra, Abee, Rombouts, Posthumus, & Dijksterhuis, 2004).

Via onderzoek werd het effect van de temperatuur (15 – 30°C) en wateractiviteit (0,75 – 0,90) met onderlinge interactie onderzocht op de groeisnelheid van mycelium van Penicillium spp. (P. aurantiogriseum, P. chrysogenum, P. corylophilum). Hieruit concludeerde men dat de minimale wateractiviteit voor groei 0,85 tot 0,90 bedraagt en afhankelijk is van de temperatuur. Optimale waarden voor wateractiviteit en pH verschillen echter per species en kunnen zelfs variëren per onderzoek volgens de eigenschappen van gebruikte voedingsmedia (Abellana, Sanchis, & Ramos, 2001).

Men kan dus geen exacte waarden voor groeicondities overnemen via verwante species. Dit geldt ook voor andere geslachten zoals Aspergillus spp. waarbij bijvoorbeeld de optimale groeitemperatuur ruim 10°C kan variëren tussen verschillende species (Krijgsheld et al., 2013).

1.1.3.2 Aspergillus niger van Tieghem Aspergillus niger (figuur 4) is een snelgroeiende schimmel en komt o.a. voor op maïs en bij broodbederf. Het produceert de metabolieten en mycotoxines malformine, fumonisine B2, fumonisine B4 en ochratoxine A. Deze schimmel kleurt initieel wit en wordt uiteindelijk zwart. De steel van de conidioforen is glad, lang, ruw en staat radiaal gericht. De vesikels zijn sferisch, de metulae zijn cilindervormig en dragen fialiden. De conidiosporen zijn sferisch met een grootte van 3,5 tot 4,5 µm en hebben een ruwe zwarte wand (de Hoog, Guarro, Gené, & Figueras, 2000; Nielsen, Mogensen, Johansen, Larsen, & Frisvad, 2009; Samson et al., 2010).

FIGUUR 4: Conidioforen en conidia van Aspergillus niger (de Hoog, Guarro, Gené, & Figueras, 2000).

Geschikte condities voor vegetatieve groei van A. niger zijn: - temperatuurbereik: 6 – 47°C met een optimum bij 35 – 37°C; - pH-bereik: 1,5 – 9,8 met een optimum rond 6,0; - wateractiviteit: minimaal 0,77 en optimaal bij 0,97; - relatieve vochtigheid: minimaal 88 – 89% en optimaal bij 96 – 98% (Krijgsheld et al., 2013).

Voor aseksuele reproductie vormt A. niger twee types luchthyfen die weg groeien van de rest van het mycelium en de nutriëntenbron. Het eerste type is dun (2 – 3 µm) terwijl het tweede type dikker is (6 – 7 µm), deze structuren vormen conidioforen (Adams, Wieser, & Yu, 1998; Krijgsheld et al., 2013). Een conidiofoor vormt een vesikel, hieruit ontstaan metulae die op hun beurt fialiden vormen waaruit ten slotte de conidia ontstaan in ketens (Krijgsheld et al., 2013).

Voor seksuele reproductie kan Aspergillus zowel homothallisch of heterothallisch zijn (Krijgsheld et al., 2013). Specifiek voor A. niger werd dit nog niet beschreven. Bij ongeveer een derde van de beschreven Aspergillus soorten is een seksuele reproductie bekend (Geiser, 2009). Hierbij ontstaat het ascocarp met asci die elk acht ascosporen bevatten (Dyer & O’Gorman, 2012). Uit analyse van genoomsequenties blijkt echter dat vrijwel alle Aspergillus soorten zich seksueel moeten kunnen reproduceren (Dyer & Paoletti, 2005).

Uit onderzoek blijkt dat de sporenkieming in geval van A. niger (figuur 5) optimaal verloopt tussen 30 – 34°C waarbij ≥ 70% kieming mogelijk is binnen zes uur na inoculatie bij een relatief vochtgehalte boven 81% en een pH rond 4,5 (Abdel-Rahim & Arbab, 1985; Van Leeuwen et al., 2013). De sporen hebben een dikke gelaagde celwand waarbij de buitenste laag bij kieming wordt afgestoten (Tiedt, 1993).

FIGUUR 5: Kieming van sporen van A. niger via (A) lichtmicroscopie en (B) fluorescentiemicroscopie (Van Leeuwen et al., 2013).

1.1.4 Morfologie van sporen en het kiemingsproces 1.1.4.1 Morfologie van sporen Conidia van schimmels kunnen onderling verschillen qua vorm en zijn al dan niet gesepteerd (figuur 6). Bepaalde conidia zijn o.a. sferisch, elliptisch, asymmetrisch, citroenvormig, tonvormig, gebogen of piramidevormig (pyriform). Het buitenoppervlak kan glad of ruw zijn. Ook de kleur kan verschillen zoals groen, geel, zwart of bleek. Algemeen zijn de conidia verantwoordelijk voor de typische kleur van een schimmelcultuur (Vashishta et al., 2016). De meeste sporen ontstaan via aseksuele reproductie en worden ook mitosporen genoemd (Levetin, 2013).

FIGUUR 6: Enkele verschillende vormen waarin fungale sporen voorkomen (Levetin, 2013).

Schimmelsporen vertonen structurele gelijkenissen met de cellulaire structuur van andere schimmelcellen maar deze structuur is niet identiek. Schimmels zijn eukaryotisch en het celmembraan is opgebouwd uit een fosfolipide bilayer met hierin perifere en integrale eiwitten met functies zoals transport. Kenmerkend hierbij is de aanwezigheid van sterolen (Audenaert, 2015; Fesel & Zuccaro, 2016).

De celwand van een fungale cel (figuur 7) bevat hoofdzakelijk chitine (chitosan bij Zygomycota) en verder glucanen en mannanen maar geen peptidoglycaanstructuur. De microfibrillen (bestaande uit β-glucanen, chitine of chitosan) zijn hierbij ingebed in een glycoproteïnematrix waarin hydrofobe eiwitten (hydrofobines) kunnen aangetroffen worden. Verder kunnen bepaalde (overlevings-)structuren zoals sporen ook melanine bevatten wat zorgt voor een verhoogde resistentie tegen o.a. enzymatische lyse, UV-straling en uitdroging (Audenaert, 2015; Bowman & Free, 2006; Fesel & Zuccaro, 2016).

FIGUUR 7: Schematische weergave van de fungale celwand en celmembraan (Fesel & Zuccaro, 2016).

Bij de celwand van een schimmelspore van Penicillium spp. (figuur 8) heeft men een gepigmenteerde celwand waarbij men het exine (dikke laag) en het intine (dunne laag) kan onderscheiden. Via elektronenmicroscopie kan men echter minstens drie lagen onderscheiden.

De buitenste laag (W1) heeft een onregelmatige, golvende contour en is elektronendicht. Onder deze laag worden soms lege ruimtes aangetroffen. De tweede laag van de celwand (W2) is dunner, minder elektronendicht en heeft een regelmatigere contour. Deze laag gaat over in een derde dikkere laag (W3) die elektronentransparant is. In sommige gevallen treft men een vierde laag (W4) aan die iets elektronendichter is dan de vorige laag. Onder de celwand is het celmembraan aanwezig. Binnenin de spore bevinden zich verschillende organellen en structuren waaronder de mitochondriën, ribosomen, soms een vacuole, oliebolletjes en de kern met een tweelagig, poreus membraan. Bij kieming breekt de buitenste laag van de celwand

(W1), de onderliggende lagen en het celmembraan breiden zich hierbij uit voor de vorming van de kiembuis (Vashishta et al., 2016).

Bij Aspergillus spp. is de structuur gelijkaardig. Binnen de celwand onderscheid men de epispore (buitenlaag) en endospore (binnenlaag). De gladde epispore wordt stekelig bij een oudere spore. Via elektronenmicroscopie onderscheid men drie lagen zoals bij Penicillium spp. (Vashishta et al., 2016). In de sporencelwand van bijvoorbeeld Aspergillus fumigatus zijn o.a. α- en β-glucaan, chitine, galactomannaan, melanine en eiwitten verbonden aan het polysacharideskelet aanwezig (Hohl & Feldmesser, 2007).

FIGUUR 8: Structuur van een spore van Penicillium spp. (Vashishta et al., 2016).

1.1.4.2 Het kiemingsproces Schimmels kunnen zich verspreiden d.m.v. sporen via water, lucht en andere wegen. Hierbij zijn de conidia dormant en vertonen ze hogere resistentie tegen uitwendige factoren zoals wateractiviteit, temperatuur, UV-straling en het effect van zuurstofradicalen. Kieming doorbreekt deze dormantie wanneer de sporen worden blootgesteld aan een gunstig milieu via bijvoorbeeld water, lucht, anorganische zouten, aminozuren en/of fermenteerbare suikers (Osherov & May, 2001; Thanh, Rombouts, & Nout, 2005; Van Leeuwen et al., 2013).

Bij de start van de sporenkieming (figuur 9) worden trehalose (disacharide) en mannitol (polyol) afgebroken (D’Enfert et al., 1999; Dijksterhuis, Nijsse, Hoekstra, & Golovina, 2007; Fillinger et al., 2001; Ruijter et al., 2003; Thevelein, 1996; Witteveen & Visser, 1995). Dit leidt tot de vorming van glycerol en is een indicator van glycolyse (D’Enfert, 1997).

Een kiemende spore ondergaat isotropische groei (zwelling) door de opname van water. Dit leidt tot verschillende verschijnselen in de spore: (1) daling van de viscositeit in het cytoplasma; (2) heroriëntering van moleculen in de spore voor de vorming van een nieuwe celmembraan- en wand; (3) stijging van de metabolische activiteit via respiratie en synthese van DNA, RNA en eiwitten; en (4) toename van het aantal antigenen aan het oppervlak van de kiemende spore. Deze laatste kan gedetecteerd worden d.m.v. flowcytometrie (FC) waarbij merkers kunnen gebruikt worden die binden met de antilichamen (Bartnicki-Garcia & Lippman, 1977; Mirkes, 1974; Momany, 2002; Osherov & May, 2001; Rydjord, Namork, Nygaard, Wiker, & Hetland, 2007; Van Leeuwen et al., 2013; Van Leeuwen, Van Doorn, Golovina, Stark, & Dijksterhuis, 2010).

FIGUUR 9: Het kiemingsproces van Penicillium spp. (Vashishta et al., 2016). A: gezwollen spore, B: vorming van de kiembuis, C: vorming van een primair septum.

Na de zwelling van de spore ontstaat een kiembuis via gepolariseerde groei. Hiervoor maakt de kiemende spore gebruik van o.a. het cytoskelet, vesikeltransport, merkereiwitten, signaalpathways en andere complexen of moleculen zoals Rho GTPase (D’Enfert, 1997; Harris, 2006; Harris & Momany, 2004; Momany, 2002). Daarnaast verandert de samenstelling van het plasmamembraan met toename van sterolen (Van Leeuwen, Smant, de Boer, & Dijksterhuis, 2008).

Bij de verdere kieming neemt de groeisnelheid van de kiembuis toe en bereikt de top van de kiembuis een optimale werking, gekenmerkt door endocytose, exocytose en de aanwezigheid van de Spitzenkörper aan het uiteinde van de schimmeldraad wat van belang is voor de groei en morfogenese van een schimmel (Kohli, Galati, Boudier, Roberson, & Philippsen, 2008; Taheri-Talesh et al., 2008). Door de vorming van verschillende vertakkingen en de fusie van verschillende hyfen ontstaat uiteindelijk het mycelium (Glass, Rasmussen, Roca, & Read, 2004).

1.1.4.3 Invloed van zelfinhibitoren op het kiemingsproces Het hoofddoel van zelfinhibitoren is het uitstellen van sporenkieming tot na de verspreiding van de schimmelsporen. Zo kan er nieuw mycelium ontstaan buiten de regio waar de sporen werden gevormd (Chitarra et al., 2004). Daarnaast komen zelfinhibitoren voor in de celwand van sporen (Gottlieb, 1973). Ook verwijdering van de zelfinhibitoren is mogelijk door wassen met water (Boysen, Skouboe, Frisvad, & Rossen, 1996; Mau, Beelman, & Ziegler, 1992). Via onderzoek werd reeds het remmend effect van verschillende verbindingen op de ontwikkeling van schimmels onderzocht. Een voorbeeld is een bacteriële verbinding geproduceerd door Bacillus subtilis gelijkend op een iturine-verbinding. Hiervan werd de antifungale werking reeds aangetoond m.b.v. flowcytometrie bij conidia van A. niger en P. roqueforti waarbij deze verbinding de kieming van sporen voorkomt alsook verdere schimmelgroei. Een ander voorbeeld van een zelfinhibitor is 1-octeen-3-ol bij P. paneum (Chitarra et al., 2003). Uit onderzoek van Chitarra et al. (2004) kon geconcludeerd worden dat P. paneum sporen in een geconcentreerde suspensie slecht kiemen door de invloed van een vluchtige, hittebestendige zelfinhibitor. De component verantwoordelijk voor dit verschijnsel werd geïdentificeerd als 1- octeen-3-ol met een reversibel effect bij elk stadium van de sporenkieming (zwelling en vorming van de kiembuis). Deze verbinding remt ook de groei van mycelium van P. paneum en andere geslachten der schimmels (Chitarra et al., 2004). Verschillende voedsel gerelateerde schimmelsoorten die 1-octeen-3-ol produceren behoren tot de geslachten Penicillium, Aspergillus, Alternaria en Fusarium maar niet alle species behorende tot deze geslachten produceren deze verbinding (Bacon, Sussman, & Paul, 1973; Blum, Beier, & Gross, 1987; Luppens, Barbaras, Breeuwer, Rombouts, & Abee, 2003).

1.2 Fungaal broodbederf en broodconservering Schimmelonderzoek is van groot belang in de voedingssector, ondermeer in de sector van broodproducten. Na het bakproces dragen verschillende processen bij aan het broodbederf waaronder retrogradatie of fysicochemisch bederf en microbiologisch bederf door schimmels, gisten en bacteriën (Lainez, Vergara, & Bárcenas, 2008). Schimmels zijn algemeen de grootste oorzaak van broodbederf (Saranraj & Geetha, 2012). Dit werd reeds aangetoond voor de periode van 1987 tot 1990. Van het totale broodbederf werd 15% veroorzaakt door gisten wat beduidend lager ligt i.v.m. 25% bederf door bacteriën en 60% bederf door schimmels zoals Penicillium spp. en Aspergillus niger (Cauvain, 2015; Legan, 1993; Legan & Voysey, 1991). De aard van het bederf is afhankelijk van verschillende factoren waaronder: temperatuur, pH, vochtgehalte, wateractiviteit (aw), besmettingsgraad en het soort micro-organisme. Onder een aw-waarde van 0,60 is er algemeen geen groei van micro-organismen (De Leyn, 2018; Karaoglu, Kotancilar, & Gurses, 2005). De wateractiviteit heeft algemeen een grotere invloed op de groei van broodschimmels dan de pH (Suhr & Nielsen, 2004). In deze masterproef zal uitsluitend verder ingegaan worden op broodbederf door schimmels en gisten.

1.2.1 Bederf door schimmels Door de intrinsieke eigenschappen van brood waaronder de wateractiviteit (0,93 – 0,96), gecombineerd met extrinsieke factoren zoals een bewaartemperatuur rond 20 – 30°C, is dit levensmiddel geschikt voor de groei van verschillende schimmels die zorgen voor bederf (dos Santos et al., 2017). De korst heeft na het bakproces initieel een lage wateractiviteit (0,55) maar deze stijgt door vochtmigratie vanuit het kruim waarbij na reeds twee uur een aw-waarde van 0,83 mogelijk is (Primo-Martín et al., 2006).

Penicillium spp., Aspergillus spp. en Eurotium spp. zijn hierbij de voornaamste geslachten van schimmels die leiden tot broodbederf (International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMFS), 2005; Pitt & Hocking, 2009). Verder zijn Cladosporium spp., Monilia sitophilia, Mucor spp., Neurospora spp. en Rhizopus spp. bekende broodbedervers (Abellana et al., 2001; Beuchat, 1987; Cauvain, 2015; Saranraj & Geetha, 2012; Suhr & Nielsen, 2004). Bij het bakken worden vegetatieve schimmels en schimmelsporen thermisch geïnactiveerd (Beuchat, 1987; Legan, 1993; Smith, Daifas, El-Khoury, Koukoutsis, & El-Khoury, 2004). Echter, een kerntemperatuur van 100°C wordt bij het bakken van brood niet steeds bereikt, waardoor overleving van schimmelsporen en bacteriële sporen niet uitgesloten is (De Leyn, 2018). De grootste aanleiding tot bederf is echter post-contaminatie na het bakken dewelke mogelijk is tijdens het koelen, snijden of verpakken waarbij o.a. de atmosfeer en gebruikte apparaten potentiële besmettingsbronnen zijn (Beuchat, 1987; De Leyn, 2018; Deschuyffeleer et al., 2012; Legan, 1993; Smith et al., 2004).

1.2.2 Bederf door gisten Bederf door gisten komt voor bij half-afgebakken brood dat onder gemodificeerde atmosfeer verpakt bewaard wordt (MAP) (Deschuyffeleer et al., 2012). Gisten die leiden tot broodbederf kan men opdelen in filamenteuze gisten en osmofiele gisten (Legan & Voysey, 1991; Saranraj & Geetha, 2012). Tot de eerste groep behoort het gistachtige krijtschimmel Saccharomycopsis fibuligera, deze veroorzaakt chalky bread gekenmerkt door witte, krijtachtige vlekken aan het oppervlak (Beuchat, 1987; Cauvain, 2015; Frazier, Westoff, & Vanitha, 1971; Saranraj & Geetha, 2012; Suhr & Nielsen, 2004). Een ander voorbeeld is de kalkgist Hyphopichia burtonii die een wit draadvormig netwerk produceert (Cauvain & Young, 2007; Saranraj & Sivasakthivelan, 2015). Algemeen is broodbederf door krijtgisten gekenmerkt door stofachtige vlekken op brood (Deschuyffeleer et al., 2011). Dit visueel waarneembaar bederf komt voor bij producten met een hoge wateractiviteit. Kalkgisten zijn echter xerofiel en osmotolerant waardoor ze zich kunnen ontwikkelen in een milieu met lage wateractiviteit en hoge osmolariteit zoals allerhande bakkerijproducten (Legan & Voysey, 1991). Osmofiele gisten zoals bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) zorgen voor fermentatie van het brood wat leidt tot een afwijkende geur (alcohol- of estergeur) (Cauvain, 2015; Saranraj & Geetha, 2012). Dit bederf komt voor bij producten met een lage wateractiviteit en een lange houdbaarheid waarbij gasvorming kan leiden tot uitzetting van de verpakking (Legan & Voysey, 1991).

1.2.3 Algemene werking van organische zuren Het toevoegen van organische zuren in brood valt volgens de wetgeving onder het gebruik van additieven zoals beschreven door verordening (EG) nr. 1129/2011. Pas wanneer een specifiek conserveringsmiddel werd goedgekeurd kan men deze als additief toevoegen. Doorgaans zijn organische zuren en afgeleide zouten de meest courante conserveringsmiddelen die gebruikt worden in brood. Men kan twee groepen onderscheiden, namelijk de voedingszuren (o.a. melkzuur en azijnzuur) en de conserveringszuren (o.a. propionzuur en sorbinezuur). De maxima die vermeld worden in de wetgeving gelden voor de zuren in vrije vorm en zijn van toepassing per zuur of gecombineerd met de bijhorende afgeleide zouten (Europese Unie (EU), 2011). Hieronder komt het algemeen effect en mechanisme van zwakke zuren aan bod (een zwak zuur is een zuur dat in water niet volledig ioniseert, maar een pH-afhankelijke dissociatie vertoont), gevolgd door een bespreking van gebruikte concentraties en bijhorende informatie over enkele andere relevante conserveringsstrategieën.

Het antifungaal effect van organische zuren kan verklaard worden door het verstoren van het metabolisme, het denatureren van eiwitten met verstoring van verschillende enzymsystemen of het beschadigen van het membraan waarbij het elektronentransportsysteem en transport van moleculen niet meer optimaal functioneren. Hierbij zijn verschillende factoren van tel zoals de zuurtegraad, de samenstelling van het levensmiddel, het vochtgehalte, de aanwezigheid van andere additieven, temperatuur en verdere productiestappen (Davidson, Taylor, & Schmidt, 2013; Sofos & Busta, 1981).

Algemeen kan men stellen dat het antifungaal effect verschillend is afhankelijk van de schimmel en dat te lage concentraties geen antifungaal effect hebben doordat schimmels, zoals Penicillium spp. en Aspergillus spp., mogelijks de verbinding kunnen metaboliseren (bijvoorbeeld als koolstofbron) of vermoedelijk een andere manier hebben om homeostase te behouden (Marín, Guynot, Sanchis, Arbonés, & Ramos, 2002; Sofos & Busta, 1981).

De verschillende effecten van voedingszuren zoals azijnzuur en melkzuur zijn vaak moeilijk specifiek te beschrijven door de complexe interacties met verschillende verbindingen geproduceerd tijdens de kieming en groei van schimmels waarbij soms synergetische effecten optreden. Daarnaast beschikken verschillende schimmels mogelijks over andere mogelijkheden om het metabolisme aan te passen onder invloed van stresscondities (Gerez, Torino, Rollán, & Font de Valdez, 2009). Algemeen kan wel gesteld worden dat de kiemingsfase het gevoeligste moment is voor het effect van organische zuren (Gerez et al., 2009; Przybylski & Bullerman, 1980).

De conserverende werking van een zwak zuur kan verklaard worden via de verlaging van de intracellulaire pH. Een ongedissocieerd zuur is lipofiel en kan diffunderen doorheen het celmembraan (figuren 10 en 11). Eenmaal in het relatief neutraal cytoplasma dissocieert het

zuur waarbij protonen en anionen vrijkomen. De ionen kunnen niet terug doorheen het membraan diffunderen wat leidt tot accumulatie waarbij de zuurtegraad daalt. De lagere intracellulaire pH remt het metabolisme via inhibitie van enzymen betrokken bij mechanismen zoals de glycolyse. Wanneer protonen via actief transport worden verwijderd uit de fungale cel kan dit eveneens leiden tot verhoogd ATP gebruik met remming van de groei (Davidson et al., 2013; Lallemand Inc., n.d.; Marín et al., 2002).

Naast het pH-effect is er ook interactie tussen het membraan en de vetoplosbare, ongedissocieerde vorm van een zwak zuur. Dit heeft een invloed op het membraantransport en verhoogt de niet-specifieke membraanpermeabiliteit. Op deze manier kan de passieve instroom van protonen worden gestimuleerd (Piper, Calderon, Hatzixanthis, & Mollapour, 2001; Sá- Correia, Salgueiro, Viegas, & Novais, 1989; Teixeira, Duque, & Sá-Correia, 2007). Interactie tussen organische zuren en het membraan kan eveneens leiden tot specifieke verstoring van transporteiwitten wat leidt tot inhibitie van de fungale cel (Paul & Hirshfield, 2003).

Naast het pH-effect en interactie met het membraan kunnen nog andere mechanismen voorkomen, al dan niet specifiek bij bepaalde conserveringsmiddelen zoals verderop besproken. Een mogelijk mechanisme is de opstapeling van anionen in het cytoplasma na dissociatie van de zuren. Dit kan mogelijks leiden tot achteruitgang van de functionaliteit van eiwitten en nucleïnezuren, daarnaast kan ook de osmolariteit en metabolische interferentie toenemen (Cherrington, Hinton, & Chopra, 1990; Davidson et al., 2013; Russell, 1992).

FIGUUR 10: Migratie en dissociatie van een FIGUUR 11: Mogelijke dissociaties van een zwak zuur en organisch zuur in een cel (Davidson et al., 2013). afgeleid zout bij inhibitie (Lallemand Inc., n.d.).

De zuurtegraad is bepalend voor het antifungaal effect van een zwak zuur of afgeleid zout (figuren 10 en 11) zoals men kan aantonen voor calciumpropionaat met onderstaand reactiemechanisme (Lallemand Inc., n.d.).:

2+ − Deelreactie 1: 퐶푎(푝푟표푝푖표푛푎푎푡)2 ↔ 퐶푎 + 2 푝푟표푝푖표푛푎푎푡

− − Deelreactie 2: 2 푝푟표푝푖표푛푎푎푡 + 2 퐻2푂 ↔ 2 푝푟표푝푖표푛푧푢푢푟 + 2 푂퐻

Door controle van de pH kan men controleren hoeveel propionzuur ontstaat en dus het antifungaal effect. Hierbij is de pKa-waarde een referentie bij gebruik van zwakke zuren om de zuurtegraad aan te passen mits hierbij de verhouding afgeleid zout/zuur exact ½ bedraagt. Bij een pH lager dan de pKa-waarde bekomt men een grotere hoeveelheid ongedissocieerd zuur wat het antifungaal effect bevordert (Deschuyffeleer et al., 2012; Lallemand Inc., n.d.).

1.2.4 Voorbeelden van conserveringsmiddelen 1.2.4.1 Propionzuur en afgeleide zouten Volgens de Europese wetgeving (Verordening (EU) Nr. 1129/2011) mag men propionzuur

(E280, pKa 4.87) en afgeleide zouten (propionaten, E281 – E283) toevoegen aan brood. Dit bedraagt 1000 mg/kg voor voorverpakt brood, 2000 mg/kg voor brood met verlaagde energetische waarde, gedeeltelijk gebakken of voorverpakt brood en 3000 mg/kg voor voorverpakt gesneden brood en roggebrood.

Het antifungaal effect van propionzuur zoals reeds werd besproken, is zwakker dan van sorbinezuur (Saranraj & Geetha, 2012; Suhr & Nielsen, 2004). Het gebruik van calciumpropionaat heeft echter een minder nadelig effect op de gist gebruikt voor het rijzen van het brood (Beuchat, 1987; Katsinis, Rigas, & Doulia, 2008).

Voor het effect zijn zowel de concentratie van het additief als de pH van belang. Algemeen gebruikt men voor conservering 0,1% propionzuur of 0,2% calciumpropionaat (Suhr & Nielsen, 2004). Men heeft een voorkeur voor het zout om schimmels af te remmen wegens de betere oplosbaarheid in water, hierbij werd een optimaal antifungaal effect vastgesteld bij een pH lager dan 5,5 (Legan & Voysey, 1991; Saranraj & Geetha, 2012; Smith et al., 2004; Suhr & Nielsen, 2004). Bij lagere concentraties kan het antifungaal effect van propionzuur bij bepaalde fungi verhinderd worden door verschillende membraantransportsystemen zoals door enzymen behorende tot het ATP-bindend cassette systeem of proton-antiporters waarbij propionaat en protonen uit de cel worden verwijderd (Lourenço, Ascenso, & Sá-Correia, 2011).

1.2.4.2 Sorbinezuur en afgeleide zouten

Sorbinezuur (E200, pKa 4.74) en afgeleide zouten (sorbaten, E202 – E203) mogen volgens de Europese wetgeving (Verordening (EU) Nr. 1129/2011) toegevoegd worden aan voorverpakt gesneden brood en roggebrood, gedeeltelijk gebakken, voorverpakte bakkerijproducten en brood met verlaagde energetische waarde tot maximum 2000 mg/kg. Voor broodconservering gebruikt men wateroplosbare sorbaten waarbij de concentratie en pH het antifungaal effect beïnvloeden. Sorbinezuur remt de groei van schimmels, gisten en bacteriën. Gebruik van sorbinezuur heeft echter een nadelige invloed op gist wat het rijzen van het brood verstoort (Legan & Voysey, 1991; Saranraj & Geetha, 2012; Smith et al., 2004). In de bakkerijsector gebruikt men een concentratie van 0,001% – 0,3% maximum om de smaak niet negatief te beïnvloeden waarbij het effect het hoogst is bij 0,125% – 0,3%. Men kan echter een synergetisch effect bekomen door toevoeging van citroenzuur, calcium- en natriumpropionaat en natriumchloride (Saranraj & Geetha, 2012). De optimale werking van sorbinezuur vereist hierbij een pH van maximum 6 – 6,5 (Suhr & Nielsen, 2004).

Een mogelijke verklaring van het effect van sorbaat is de inhibitie van dehydrogenasen die betrokken zijn bij de β-oxidatie van vetzuren via opstapeling van α,β-onverzadigde vetzuren (Melnick, Luckmann, & Gooding, 1954). Mogelijks kan sorbinezuur sulfhydryl-enzymen inhiberen door een additiereactie met de thiolgroep van cysteïne of door complexvorming (Whitaker, 1959; York & Vaughn, 1964). Andere bronnen wijzen echter op nog andere systemen waarbij er geen consensus is over de exacte aard van de interactie tussen het zuur of afgeleid zout en enzymen zoals katalase (Sofos & Busta, 1981). In vergelijking met propionaat wordt het hoger antifungaal effect van sorbaat ook gelinkt aan het onverzadigd karakter van deze verbinding (Suhr & Nielsen, 2004).

1.2.4.3 Ethanol Het gebruik van ethanol kan de groei van schimmels remmen door gebruik van een 0,5 – 2% ethanol-oplossing waarmee men de buitenoppervlakte van het brood besproeit (Berni & Scaramuzza, 2013; Cauvain & Young, 2007; Legan & Voysey, 1991). Het conserverend effect wijkt echter af voor kalkgisten bij een lage concentratie (1%) (Legan & Voysey, 1991). Onderzoek toont aan dat een concentratie van 2% (m/m) of hoger nodig is voor een goed antifungaal effect, afhankelijk van de schimmel (Deschuyffeleer et al., 2012). Bijvoorbeeld voor Penicillium spp. en Aspergillus niger is de minimale inhiberende concentratie (MIC) respectievelijk 5 – 5,5% en 4% (v/v) (Berni & Scaramuzza, 2013; Kalathenos & Russell, 2003). Vanaf een concentratie van 1% is er echter een negatieve invloed waarneembaar op sensorisch vlak (Cauvain & Young, 2007). Voor een optimaal antifungaal effect gebruikt men beter een combinatie met gebruik van bijvoorbeeld calciumpropionaat waarbij lagere concentraties (0,2 – 0,3%) bruikbaar zijn afhankelijk van de gewenste houdbaarheid (Katsinis et al., 2008).

1.2.4.4 Azijnzuur en afgeleide zouten Azijnzuur (E260, pKa 4.75) en acetaten (E261 – E263) mogen volgens de Europese wetgeving (Verordening (EU) Nr. 1129/2011) quantum satis toegevoegd worden aan Frans brood (Pain courant Français) en brood uitsluitend bereid via tarwebloem, water, gist of bakpoeder en zout. Azijnzuur remt eveneens de schimmelgroei maar het effect is te zwak vergeleken met propionzuur (Smith et al., 2004). Een concentratie van 2% azijnzuur heeft een volledig groei- inhiberend effect op verschillende schimmels maar niet alle schimmelsoorten zijn even gevoelig. Mits azijnzuur ook de smaak negatief kan beïnvloeden, dient men de minimale inhiberende concentratie te bepalen in combinatie met andere conserveringsstrategieën, afhankelijk van het levensmiddel. Verder onderzoek heeft hierbij voor verschillende gisten zoals Pichia anomala aangetoond dat azijnzuur op zich een beperkt tot geen antifungaal effect heeft bij pH = 5 en concentraties ≤ 1,50% (v/v) die de smaak niet te sterk beïnvloeden (Deschuyffeleer et al., 2012).

Het behouden van de interne homeostase bij fungi kan mogelijks verklaard worden door een lagere permeabiliteit voor het ongedissocieerd zuur, een hogere buffercapaciteit van het cytosol en/of voldoende energiereserve voor de werking van H+-ATPase van het plasmamembraan (Arneborg, Jespersen, & Jakobsen, 2000; Vermeulen et al., 2008).

1.2.4.5 Melkzuur en lactaat Voor melkzuur (E270, pKa 3.86) en lactaat (E325 – E327) gelden dezelfde wettelijke voorwaarden zoals voor azijnzuur. Er werd reeds proefondervindelijk aangetoond dat het gebruik van melkzuur ter vervanging van azijnzuur de groei van gist zoals Zygosaccharomyces bailii kan bevorderen. Het effect op verschillende schimmels voor conservering werd echter nog niet uitvoerig onderzocht (Vermeulen et al., 2008). In vergelijking met azijnzuur werd daarentegen reeds aangetoond dat men bij een lage zuurtegraad zoals pH 3,5 een tienvoudig hogere concentratie melkzuur nodig heeft om hetzelfde antifungaal effect te bekomen (Gerez et al., 2009). Onderzoek door Deschuyffeleer et al. (2012) toonde aan dat een concentratie >0,3% melkzuur een antifungaal effect heeft op Eurotium spp. Hierbij werd bevestigd dat het effect en de minimale inhiberende concentratie sterk varieert afhankelijk van de schimmel. Hierbij bleek ook dat het percentage ongedissocieerd zuur voor azijnzuur en melkzuur bij eenzelfde pH weinig verschilt. Gezien het groot verschil in antifungaal effect kan men vermoeden dat het inhibitie-mechanisme verschillend is. Een mogelijke verklaring is dat bepaalde schimmels zoals Eurotium spp. melkzuur bij lagere concentraties kunnen metaboliseren waardoor er geen antifungaal maar een stimulerend effect is op de schimmelgroei (Deschuyffeleer, Devlieghere, & Eeckhout, 2012).

Bij gebruik van azijnzuur en melkzuur bestaat eveneens de mogelijkheid dat een bufferpaar ontstaat wat een sterke daling van de zuurtegraad met het bijhorend antifungaal effect voorkomt. Wanneer protonen uit de fungale cel worden getransporteerd kunnen deze via

gedissocieerde anionen terug ongedissocieerde zuren vormen die de cel binnendringen. Dit verklaart algemeen dat de gebruikte concentraties het antifungaal effect beïnvloeden (Thomas, Hynes, & Ingledew, 2002).

1.2.4.6 Bicarbonaat Natrium- en ammoniumwaterstofcarbonaat (E500i & E503ii) kunnen volgens de Europese wetgeving (Verordening (EU) Nr. 1129/2011) quantum satis gebruikt worden als rijsmiddel bij broodproductie en beschikken over antifungale eigenschappen (Deschuyffeleer et al., 2012). Uit onderzoek blijkt een concentratie van 1% (m/m) ammoniumbicarbonaat en < 2% natriumbicarbonaat te leiden tot complete inhibitie van schimmelgroei bij Fusarium spp. en Aspergillus spp. zonder sterke afwijking van de smaak (Samapundo et al., 2007). Het antifungaal effect bij bakkerijproducten werd nog niet uitvoerig onderzocht. Voor enkele gisten werd echter aangetoond dat een concentratie tot 2% reeds een gewenst antifungaal effect heeft in combinatie met MAP (Deschuyffeleer et al., 2012).

Voor het mechanisme van inhibitie bestaan verschillende theorieën. Een mogelijke verklaring voor de grotere inhibitie door ammoniumbicarbonaat t.o.v. natriumbicarbonaat is het ontstaan + van NH3 uit NH4 na de dissociatie van het zout. Dit zorgt voor een versterkt antifungaal effect bovenop het initiële pH-effect (Punja & Grogan, 1982; Samapundo et al., 2007).

1.2.5 Overige conserveringsmogelijkheden bij de onderzochte schimmels Naast de bekende zuren en andere conserveringsmiddelen zoals ethanol, blijft men onderzoek uitvoeren om andere geschikte conserveringsmiddelen en hun bruikbaarheid te achterhalen. Uit onderzoek blijkt het gebruik van fermentaten ter vervanging van calciumpropionaat geschikt te zijn voor de groei-inhibitie van P. paneum. Hierbij is het antifungaal effect groter bij een lagere pH maar zonder fermentaat heeft de pH (4,5 – 6,5) geen waarneembare invloed. Hierbij werd aangetoond dat P. paneum een grotere tolerantie vertoont voor zowel calciumpropionaat en fermentaten vergeleken met. P. chrysogenum. In dit onderzoek kon in-vitro groei-inhibitie van P. paneum via fermentaten bekomen worden voor enkele dagen tot twee weken bij pH = 4,5 (Samapundo, Devlieghere, Vroman, & Eeckhout, 2017). Onderzoek toonde eveneens aan dat Aspergillus spp. (in-vitro) gevoelig blijkt te zijn voor de antifungale werking van essentiële oliën zoals afkomstig van Origanum vulgare L. (wilde marjolein) en Rosmarinus officinalis L. (rozemarijn) (Carmo, Lima, & De Souza, 2008; Teodoro, de Barros Fernandes, Botrel, Borges, & de Souza, 2014). Daarnaast werd een hogere gevoeligheid van A. niger aangetoond voor thymol (MIC: 20,14 – 23,80 mg/L) (Marei & Abdelgaleil, 2012). Essentiële oliën afkomstig van laurier, kaneelblad, kruidnagel, citroengras en tijm zijn in staat om de groei van A. niger volledig te remmen, ongeacht de wateractiviteit (Guynot et al., 2003). Bij onderzoek met A. niger en Penicillium spp. werd het conserverend effect van zout en zout vervangende stoffen nagegaan. Het antifungaal effect is zowel afhankelijk van de stof en de schimmel. A. niger is algemeen het gevoeligst voor NaCl (langste lag fase gevolgd door de traagste schimmelgroei).

Dit zou inhouden dat de vervanging van NaCl door de onderzochte zoutvervangers waarschijnlijk zou leiden tot producten met verminderde microbiële stabiliteit voor A. niger (Samapundo, Deschuyffeleer, Van Laere, De Leyn, & Devlieghere, 2010).

1.3 Flowcytometrie bij fungaal onderzoek en kleuring van sporen Voor onderzoek van sporen zijn verschillende methodes mogelijk. Bij microscopie kan men het aantal sporen individueel tellen met behulp van een Thoma of Bürker telkamer. Deze methode is echter tijdrovend, vooral wanneer een groter aantal stalen moet worden onderzocht. Bij telplaten kan men de schimmel laten groeien op een nutriëntenrijk medium na kieming van sporen uit een sporensuspensie. Deze methode is eenvoudig maar is eveneens tijdrovend wanneer men meerdere stalen gaat onderzoeken. Door het groeien op het medium kan men bovendien niet onmiddellijk een resultaat bekomen voor de sporenconcentratie. Een bijkomend nadeel is dat men geen onderscheid kan maken tussen kolonies die ontstaan zijn uit een individuele spore of uit een cluster van twee of drie sporen waardoor men een afwijkend resultaat kan bekomen. Bovendien geldt er dat niet alle schimmels via telplaten kunnen onderzocht worden doordat de beschikbare media niet aan alle noden voor groei voldoen. Verder kan de groei van schimmels variëren op verschillende groeimedia wat een aandachtspunt is bij onderzoek van een staal met sporen van verschillende geslachten van schimmels. Ten slotte is het via een groeimedium niet mogelijk om dode of niet-levensvatbare cellen op te kweken voor kwantificatie terwijl dode schimmelstructuren wel allergenen of mycotoxines kunnen bevatten. Via flowcytometrie kunnen dode of niet-levensvatbare cellen wel waargenomen en geteld worden waarbij een onderscheid mogelijk is door kleuring. Vanuit deze invalshoek werd flowcytometrie als methode gekozen voor het onderzoek binnen deze masterproef, de nodige theoretische informatie komt hieronder aan bod.

1.3.1 Algemeen principe Flowcytometrie werd vroeger hoofdzakelijk gebruikt voor onderzoek en klinische toepassingen, maar heeft nu een brede waaier aan toepassingen zoals het bepalen van de concentratie aan cellen, detectie of diagnose van specifieke cellen, onderzoek van levensvatbaarheid, het nagaan van de celactiviteit en controle van de celmembraanintegriteit (Haynes, 1988; Mandy, Bergeron, & Minkus, 1995). Flowcytometrie maakt gewoonlijk gebruik van een laser voor monochromatisch en gecollimeerd licht (figuur 12) gericht op een dunne vloeistofstroom (figuur 13) wat leidt tot interactie met de aanwezige partikels in deze vloeistofstroom. Deze interactie kan vervolgens leiden tot voorwaartse en zijdelingse lichtverstrooiing wat men kan registreren door het gebruik van o.a. lenzen, fotonenvermenigvuldigers en detectoren. Verder kan fluorescentie gedetecteerd worden met gebruik van de nodige kleurstoffen (Haynes, 1988; Mandy et al., 1995; Shapiro, 2003). Deze zaken worden verder besproken in 1.3.2.

FIGUUR 12: Vereenvoudigde opstelling van een flowcytometer (Haynes, 1988).

FIGUUR 13: Partikels gecentreerd in een laminaire stroom (Mandy et al., 1995).

1.3.2 Dataverwerking en kleuring bij flowcytometrie Bij flowcytometrie kunnen verschillende parameters onderzocht worden. Om betrouwbare resultaten te bekomen moet er per onderzocht staal als richtlijn minstens 105 telbare cellen aanwezig zijn (Kullman, 2000). Bij een (verdund) staal van 1 ml wenst men dus een concentratie van 5 log cellen of sporen per ml.

In het geval van forward scatter (FSC) of voorwaartse lichtverstrooiing geeft de meting informatie over de grootte van de partikels. Dit kan men weergeven via een FSC-diagram. Meerdere pieken (figuur 14) geven aan dat er meerdere types partikels aanwezig zijn waarvan de grootte duidelijk te onderscheiden is zoals sporen van verschillende schimmels of bacteriën en pollen (Allman, 1992; Bradner & Nevalainen, 2003; Day, Kell, & Griffith, 2002; Haynes, 1988; Shapiro, 2003). Wanneer het verschil in grootte echter te beperkt is kan er overlap van pieken voorkomen. Om onderscheid beter mogelijk te maken kan men werken met kleurstoffen en puntenplots (Day et al., 2002).

FIGUUR 14: Verschillende pieken in het FSC-diagram stellen verschillende groepen partikels voor (Day et al., 2002).

Side scatter (SSC) of zijdelingse lichtverstrooiing onder een hoek van 90° t.o.v. de uitgezonden lichtbundel, is eveneens afhankelijk van de partikelgrootte, maar ook refractie heeft hier een grote invloed zodat men partikels van gelijkaardige grootte maar verschillende interne refractie- eigenschappen kan onderscheiden. In dit geval zorgen partikels met een hogere interne granulariteit (dus meer interne structuren) voor meer zijdelingse lichtverstrooiing (Allman, 1992; Bradner & Nevalainen, 2003; Haynes, 1988; Shapiro, 2003).

Naast lichtverstrooiing kan men fluorescentie detecteren. Dit kan men zijdelings meten met gebruik van een filter om zijdelingse lichtverstrooiing tegen te houden. Hierbij gebruikt men kleurstoffen (fluorochromen) om partikels van elkaar te onderscheiden. Naast fluorescentie kan autofluorescentie optreden bij ongekleurde partikels maar het bijhorende signaal is veelal verwaarloosbaar t.o.v. het fluorescentiesignaal. Welke informatie men bekomt is afhankelijk van de gebruikte kleurstoffen en de toepassing. Enkele voorbeelden van kleurstoffen staan weergegeven in tabel 3 (Haynes, 1988). Via fluorochromen kunnen allerhande cellulaire parameters gemeten of geanalyseerd worden rondom DNA, RNA, eiwitten, intracellulaire pH, membraanpotentiaal, membraanintegriteit, specifieke enzymen, oppervlakte-antigenen, lipiden, oppervlaktesuikers, enz. (Allman, 1992; Shapiro, 2003).

Bij kleuring kan men een onderscheid maken tussen diverse fluorescentieparameters (FL). Bij de CyFlow SL (Partec) met 25 mW 488 nm laser onderscheid men de FL 1, staat voor het groene spectrum, FL 2 voor het oranje-geel spectrum en FL 3 voor het rood spectrum. Wanneer fungale sporen gekleurd worden, zal dit leiden tot fluorescentie met een bijhorend signaal gedetecteerd door de flowcytometer. Het signaal en welke fluorescentieparameter van tel is, is afhankelijk van de gebruikte kleurstoffen en de eigenschappen van de sporen (Bradner & Nevalainen, 2003; Shapiro, 2003). Hierbij kan men met behulp van kleurstoffen via een puntplot (figuur 15) een onderscheid maken tussen sporen of cellen in een andere toestand zoals levend, kiemend of beschadigd (Cronin & Wilkinson, 2007).

TABEL 3: Voorbeelden van toepassingen met fluorescentie en bruikbare kleurstoffen (Haynes, 1988). Toepassing Kleurstof of merker DNA-inhoud - Propidium iodide (PI) - Hoechst 33258 - DAPI - Mithramycine - Hoechst 33342 - Acridine-oranje (AO) - Ethidiumbromide (EB) RNA-inhoud - Acridine-oranje (AO) - Pyronine Y - Thioflavine T Basencompositie - Hoechst 33258 - Chromomycine A3 - Olivomycine - Hoechst 33342 - Distamycine A Eiwitten - FITC - SR 101 - Fluorescamine Energietransfer - Hoechst 33258 / EB - Fluoresceïne / - Mithramycine / PI Rhodamine Levensvatbaarheid - Propidium iodide (PI) - Fluoresceïne diacetaat - AO / EB Membraanpotentiaal - Cyanine kleurstoffen - Oxonol kleurstoffen Antilichaamconjugatie - Fluoresceïne - Rhodamine - Phycoerythrine isothiocyanaat (FITC) isothiocyanaat (RITC) - FITC avidine

FIGUUR 15: Onderscheid tussen intacte (R1), kiemende (R2), beschadigde (R3) en uitgroeiende (R4) endosporen van Bacillus cereus via kleuring met SYTO 9 (Cronin & Wilkinson, 2007).

Samengevat kan de bekomen data bij flowcytometrie dus via een computerprogramma visueel weergegeven worden (figuur 16). Een eerste optie is het histogram (1) zoals reeds werd besproken. In het geval van meerdere pieken bij zowel voorwaartse als zijdelingse lichtverstrooiing als gevolg van de aanwezigheid van verschillende partikels weet men echter niet welke groepen samen horen. Om dit probleem op te lossen is het puntplot (dot-plot) (2) een tweede optie waarbij de data gecorreleerd weergegeven worden. In het gegeven voorbeeld (figuur 16) ziet men bijvoorbeeld dat de partikels met een grotere voorwaartse lichtverstrooiing eveneens een grotere zijdelingse lichtverstrooiing vertonen. Om een betere voorstelling te hebben voor het aantal cellen is het contourplot (3) een derde optie waarbij elke contourlijn voor een gelijk aantal cellen staat. Als vierde optie kan men dit ook driedimensionaal voorstellen (isometrisch) (4) waarbij een hogere piek een hoger aantal cellen voorstelt (Haynes, 1988; Kullman, 2000; Shapiro, 2003).

Voor verdere verwerking van de data past men gating toe via een puntplot. Hiermee kan men differentiëren tussen verschillende groepen en een specifieke puntengroep analyseren. Praktisch gezien gaat men bij het puntplot zoals voor voorwaartse en zijdelingse lichtverstrooiing de gewenste puntengroep insluiten binnen een polygoon (figuur 17) (Mandy et al., 1995; Shapiro, 2003).

FIGUUR 16: Verschillende voorstellingswijzen voor data bij flowcytometrie (Haynes, 1988).

Uit onderzoek blijkt dat men voor verschillende schimmels subpopulaties kan onderscheiden via flowcytometrie wat kan wijzen op sporen in een verschillend ontwikkelingsstadium of kiemingsfase (Allman, 1992). Dit werd reeds aangetoond in onderzoek door Bradner & Nevalainen (2003). Hieruit blijkt dat flowcytometrie met gebruik van fluorescente kleurstoffen een gepaste techniek is om kieming en vroege ontwikkeling op te volgen zoals aangetoond via Penicillium, Phoma en Trichoderma. Het is mogelijk om de ontwikkeling van de sporen op te volgen waarbij kieming duidelijk is via SSC en als gevolg van de vormverandering. In het puntenplot met SSC i.f.v. FSC (of omgekeerd) kan men de kieming duidelijker waarnemen door een verschuiving van de puntenwolk (figuur 17) (Bradner & Nevalainen, 2003).

FIGUUR 17: Verschuiving van het puntenplot bij kieming van Trichoderma reesei sporen (Bradner & Nevalainen, 2003).

1.3.3 Gebruikte kleurstoffen en waarnemingen uit de literatuur Zoals weergegeven in tabel 3 en in 1.3.4 dient de onderzoeker de gepaste kleurstoffen te gebruiken op basis van het uit te voeren onderzoek. Bij deze masterproef worden de kleurstoffen propidium iodide (PI) & SYTO 13 gebruikt voor onderzoek van de sporenkieming.

1.3.3.1 Propidium iodide (PI) PI is een rood fluorochroom bruikbaar bij flowcytometrie voor snelle beoordeling van de levensvatbaarheid van allerhande celtypes. PI is positief geladen en kleurt negatief geladen sporen. PI kan echter niet vrij doorheen het membraan diffunderen. Bij membranen van beschadigde, gestresseerde of dode cellen of sporen is dit wel mogelijk waardoor deze kleurstof geschikt is als kleuring of tegenkleuring bij een andere kleurstof. Op deze manier kan men de rode fluorescentie verbeteren wat waarneembaar is via kleuringsparameter FL 3 (Brul, Nussbaum, & Dielbandhoesing, 1997; Chitarra et al., 2003; Invitrogen, 2006; Kullman, 2000). Op basis van de intensiteit van de fluorescentie laat dit eveneens toe om sporen van verschillende schimmelsoorten van elkaar te onderscheiden via flowcytometrie waarbij men verschillende pieken in het diagram kan bekomen, hiermee heeft men ook een maat voor de relatieve hoeveelheid kernmateriaal (Gourmet, Gray, & Rayburn, 1997).

In het onderzoek door Brul, Nussbaum & Dielbandhoesing (1997) met gebruik van CDFD/PI werden duidelijke verschillen waargenomen tussen het aantal gekleurde schimmelsporen en het aantal kolonievormende eenheden. Dit bemoeilijkt het bepalen van de correlatie tussen kleuring

en kieming. Als mogelijke verklaringen hiervoor geeft men aan dat vele sporen samenblijven in pellets wat de telling bemoeilijkt. Daarnaast kan het voorkomen dat de sporen in eenzelfde sporensuspensie een ander ontwikkelingsniveau hebben. Dit is o.a. het geval voor schimmels van het geslacht Aspergillus waarbij sporen in lange ketens ontstaan waardoor een spore die loskomt mogelijks andere metabolische eigenschappen en fysische kenmerken heeft dan een jongere spore dicht bij de fialide van de schimmel. Via dit onderzoek werd verder geconcludeerd dat PI gepast is als indicator voor de afwezigheid van groeipotentieel.

Onderzoek door Prigione, Lingua & Marchisio (2004) toonde aan dat flowcytometrie met gebruik van PI een preciezere en meer betrouwbare kwantificatiemethode is dan epifluorescentiemicroscopie. Bij het onderzoek van Aspergillus fumigatus en Penicillium brevicompactum werd er voor beide schimmels via microscopie waargenomen dat de sporen clusters vormden ondanks voorgaande stappen zoals meermaals op en neer pipetteren in de verdunde sporensuspensie. Via flowcytometrie kon men de enkele en gekoppelde sporen onderscheiden als afzonderlijke pieken in het FSC-frequentiehistogram (figuur 18: A en D). Via het frequentiehistogram voor rode fluorescentie lukte dit enkel voor A. fumigatus (figuur 18B en 18E). Via SSC was dit onderscheid niet waarneembaar (figuur 18: C en F). Voor een nauwkeurigere kwantificatie van de schimmelsporen berekende men de som van de integraal van de eerste piek en het dubbel van de integraal van de tweede piek (die staat voor gekoppelde sporen) via de FSC-frequentiehistogrammen. Deze waarnemingen werden door Prigione et al. (2004) echter bekomen via gesimuleerde monsters na het oogsten van sporen afkomstig van schimmels gegroeid op malt extract agar (MEA). Na herhaling van het onderzoek met luchtmonsters, verkreeg men geen gelijkaardige waarnemingen. Hierbij was de heterogeniteit van microscopische luchtpartikels te groot om enkele en gepaarde sporen te onderscheiden. Via puntwolken door combinatie van FSC, SSC of FL 3 had men eveneens te veel signaalruis om de schimmel algemeen te onderscheiden (Prigione, Lingua, & Marchisio, 2004).

1.3.3.2 SYTO SYTO is een fluorochroom die kan binden met zowel DNA en RNA. Er bestaan verschillende varianten (aangegeven via getallen) overeenkomende met verschillende kleuren (o.a. blauw, groen, oranje en rood). Zowel de kleurstofvariant en de aanwezigheid van DNA of RNA bepalen de golflengten voor maximale absorptie/emissie waarbij de intrinsieke emissie door de ongebonden kleurstof verwaarloosbaar is. De varianten van SYTO verschillen onderling op basis van celpermeabiliteit, fluorescentieversterking na binding met nucleïnezuren, excitatie- en emissiespectra, DNA/RNA-selectiviteit en bindingsaffiniteit. SYTO kleurt echter niet enkel kernmateriaal zoals de kleurstof DAPI maar kleurt ook het cytoplasma en mitochondriën (LifeTechnologies, 2014).

FIGUUR 18: Frequentiehistogrammen via flowcytometrie bij onderzoek van A. fumigatus (A tot C) en P. brevicompactum (D tot F). S: single (enkelvoudig), P: paired (gepaard) (Prigione et al., 2004).

SYTO kan vrij in alle cellen binnengaan ongeacht de aanwezigheid van een intact celmembraan zodat er geen onderscheid ontstaat tussen levende of dode cellen of sporen. Uit experimentele waarnemingen blijkt enerzijds dat SYTO geschikt is voor onderzoek via flowcytometrie, anderzijds blijkt dat de verhouding SYTO 9/PI geen invloed heeft op het aantal gekleurde sporen (conidia van Fusarium solani) uit een gemengde sporensuspensie (Vanhauteghem et al., 2017).

Uit onderzoek door Cronin & Wilkinson (2007) bleek SYTO 9 endosporen van Bacillus cereus te kleuren waarbij kiemende sporen een grotere permeabiliteit vertonen (figuur 15). Hierbij concludeerde men dat er een duidelijke correlatie bestaat tussen flowcytometrie en de telplaatmethode voor het bepalen van het percentage kiemende sporen. Eveneens kon men via flowcytometrie het percentage kiemende sporen op verschillende tijdstippen bepalen mits gebruik van bijkomende stoffen. Daarnaast werd via kleuring met SYTO 9 reeds aangetoond dat het mogelijk is om B. cereus sporen te onderscheiden in clusters. Dit kan men bijvoorbeeld waarnemen via het puntenplot met SSC i.f.v. FL 1 met clusters voor dode, dormante en kiemende sporen (Cronin & Wilkinson, 2007). Eveneens werd via onderzoek aangetoond dat SYTO 16 geschikt is voor het kleuren van schimmelsporen (Palková, Váchová, Valer, & Preckel, 2004). Onderzoek door Day, Kell & Griffith (2002) toonde aan dat verschillende varianten van SYTO gebruikt kunnen worden om verschillende schimmelsporen te kleuren. Hieruit bleek echter dat de sporen van Penicillium door SYTO minder goed worden gekleurd waardoor een hogere concentratie kleurstof nodig is. Deze kleurstof kan hierbij het onderscheid t.o.v. andere sporen verduidelijken.

1.3.4 Andere praktische onderzoeksvoorbeelden Via flowcytometrie kan men voor schimmels meer analyseren dan de grootte of granulariteit van sporen. Een beknopte selectie aan voorbeelden hieronder illustreert dit.

• Analyse van de metabolische activiteit: via dihydroethidium en hexidium iodide kan men de kieming van sporen en de vroege vorming van hyfen op niet-destructieve wijze opvolgen (Bradner & Nevalainen, 2003). • Controle bij een fungicidale behandeling: met PI, CDFDA en FUN-1 kan men de levensvatbaarheid van sporen of cellen nagaan. Bijvoorbeeld positief geladen PI bindt met DNA en RNA maar kan enkel doorheen het membraan van gestresseerde, beschadigde of dode cellen (Brul et al., 1997; Marr, Koudadoust, Black, & Balajee, 2001). Meer recent werd het gebruik van PI beschreven voor onderzoek van de levensvatbaarheid van Fusariumsporen uit metaalbewerkingsvloeistoffen (Vanhauteghem et al., 2017). • Analyse van partikels in lucht en aerosol: door gebruik van AO, PI, YOPRO-1 en CTC kan men de aanwezigheid en levensvatbaarheid van fungi in aerosol nagaan op basis van de metabolische activiteit en membraanintegriteit (Chen & Li, 2005). Als alternatief kan men Calcofluor White gebruiken voor het kleuren van de celwand van fungi (Liang et al., 2013). Eveneens kan men sporangia grotendeels van andere partikels zoals pollen differentiëren via Calcofluor white (Day et al., 2002). • Analyse van de kern-DNA-inhoud: m.b.v. DAPI(SR101), PI en het gebruik van een standaard als referentie (bv. conidia van Trichophaea hemisphaerioides) kan men de DNA-inhoud van fungi kwantitatief bepalen. Ook kan men een onderscheid maken tussen cellen in een andere fase van de celcyclus (figuur 19) (Kullman, 2000).

FIGUUR 19: Twee pieken (FSC 10 – 100) stellen cellen van S. cerevisiae voor in andere fasen van de celcyclus (Kullman, 2000).

2 Materiaal en methoden

2.1 Probleem- en doelstelling In deze masterproef werd het potentieel van flowcytometrie (FC) om de kieming van schimmelsporen op te volgen onderzocht. Onder meer de invloed van verschillende factoren zoals schimmelspecies, pH, tijd en de concentratie van zwakke organische zuren werden opgenomen in dit onderzoek. Ter controle werden eveneens validatie-experimenten uitgevoerd via microscopie en standaard microbiologische uitplatingen. Het gebruik van flowcytometrie werd eveneens gekoppeld aan metingen van de optische densiteit voor onderzoek van de lagfase tot de sporenkieming.

Via deze masterproef werd getracht een antwoord te zoeken op de volgende onderzoeksvragen en doelstellingen:

1) Is flowcytometrie een geschikte techniek voor … ? a. kwantificatie van sporensuspensies voor verschillende schimmelgeslachten; b. het visualiseren van de sporenkieming via scatterplots zonder of met kleuring; c. het effect van conserveringstechnieken op de sporenkieming in kaart te brengen. 2) De rol van pH op de activiteit van zwakke organische zuren/voedingszuren werd in kaart gebracht via flowcytometrie en spectrofotometrie.

Het nagaan van de geschiktheid van flowcytometrie om sporenontkieming in kaart te brengen, ging gepaard met een vergelijkende studie tussen verschillende andere standaardmethodes voor de kwantificatie van sporensuspensies (cfr. Thoma telkamer en microbiologische uitplatingen). Bovendien wenste men in deze studie na te gaan wat de rol was van de pH op het antifungale effect van verschillende voedingszuren. Hiervoor werden zowel metingen van de optische densiteit als flowcytometrie gebruikt. Binnen het kader van conserveringsmiddelen is de functie van de pH voor voedingszuren van belang. De pH bepaalt de mate van activiteit van zwakke zuren via de dissociatiegraad van het zuur. Hoe dichter de omgevings-pH aanleunt bij de pKa- waarde van het zuur, hoe groter de concentratie ongedissocieerd zuur aanwezig in oplossing. Enkel de ongedissocieerde vorm is in staat om door het celmembraan van bacteriën en schimmels te diffunderen en bijgevolg een conserverende werking uit te voeren.

2.2 Proefopzet Figuur 20 geeft een schematisch overzicht van de verschillende deelexperimenten die werden uitgevoerd. Binnen dit onderzoek kan men een indeling maken in (a) kwantificering van sporensuspensies en (b) onderzoek van de invloed van zwakke organische zuren op de kieming van schimmelsporen. Bij kwantificering van sporensuspensies werd de sporenconcentratie bepaald door middel van flowcytometrie, standaard microbiologische uitplating en microscopie voor Penicillium paneum en Aspergillus niger om het gebruik van flowcytometrie als gepaste methode te valideren.

Bij het onderzoek van de invloed van zwakke organische zuren werd eerst preliminair onderzoek uitgevoerd met flowcytometrie en spectrofotometrie om na te gaan wat een geschikt bereik aan concentraties was voor de zuren in combinatie met een gepaste sporenconcentratie voor optische densiteitsmeting zodat een stijging van het signaal zo duidelijk mogelijk zichtbaar was.

Op basis van deze en voorgaande resultaten binnen het onderzoek van Debonne et al. (data niet gepubliceerd) werden gepaste toegevoegde zuurconcentraties berekend voor overeenkomstige actieve concentraties van azijnzuur, melkzuur en propionzuur. Hiermee werden zes deelexperimenten met metingen van de optische densiteit opgesteld waarbij de invloed van de pH op het effect van de zwakke organische zuren bij sporenkieming werd onderzocht voor beide schimmels. Flowcytometrie werd hierbij niet over dezelfde tijdsspanne uitgevoerd doordat deze methode niet geschikt bleek te zijn wanneer de schimmelsporen reeds grotere kiembuizen hebben gevormd.

Ten slotte werd de sporenkieming van beide schimmels onderzocht in combinatie met kleuring met PI en SYTO 13 via flowcytometrie gedurende de eerste uren na inoculatie. Dit in een poging om de beginnende sporenkieming in kaart te brengen. Hiervoor werd eerst getest of dit mogelijk was met P. paneum en A. niger zonder toevoeging van azijnzuur. Hierna werd dit onderzoek uitgebreid voor P. paneum met toevoeging van azijnzuur. Verder werd nagegaan of er een mogelijke invloed was van de verdunningsvloeistof, of er een mogelijke onderschatting was volgens het aantal gekleurde sporen (log/ml) en of de detectie van gekiemde sporen volgens flowcytometrie en microscopie overeenkwamen.

Onderzoek naar de kieming van schimmelsporen Penicillium paneum (PP) en Aspergillus niger (AN) a) Kwantificering van sporensuspensies b) Invloed van zwakke organische zuren op de kieming van schimmelsporen Via verschillende methodes Preliminair onderzoek Invloed van pH Flowcytometrie (FC) met kleuring Flowcytometrie Test 1 Test 1 + 4 Test 1

PP en AN PP; pH = 6,04; aw = 0,96; T = 25°C PP; pH = 4,75; aw = 0,96 en T = 25°C PP; pH = 6,04; aw = 0,96 en T = 30°C

AN; pH = 4,75; aw = 0,96 en T = 25°C

FC met azijnzuur: Azijnzuur, melkzuur en propionzuur FC met PI en SYTO 13 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 mM FC en spectrofotometrie Spectrofotometrie met azijnzuur: 0, 25, 50, 100, 200 mM Microbiologische uitplating Test 2 Test 2 + 5 Test 2

PP en AN PP en AN PP; pH = 5,40; aw = 0,96 en T = 25°C PP; pH = 6,04; aw = 0,96 en T = 30°C

MEA; pH = 6,04 en aw = 0,96 YES; pH = 6,04; aw = 0,96; T = 25°C AN; pH = 5,40; aw = 0,96 en T = 25°C

FC met azijnzuur: Azijnzuur, melkzuur en propionzuur FC met azijnzuur, PI en SYTO 13 0, 50, 100, 200 mM Spectrofotometrie Microscopie Spectrofotometrie met azijnzuur: 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40 mM Microscopie Test 3 Test 3 + 6 Test 3

PP en AN PP en AN PP; pH = 6,04; aw = 0,96 en T = 25°C AN; pH = 6,04; aw = 0,96 en T = 30°C

Thoma telkamer YES; pH = 6,04; aw = 0,96; T = 25°C AN; pH = 6,04; aw = 0,96 en T = 25°C

FC met azijnzuur: Azijnzuur en propionzuur FC met PI en SYTO 13 0, 10, 20, 30, 40 mM Spectrofotometrie Microscopie Spectrofotometrie met azijnzuur: 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40 mM

FIGUUR 20: Schematisch overzicht van de uitgevoerde deelexperimenten binnen de thesis.

2.3 Aanmaak sporenoplossing Gedurende zeven dagen werden de schimmels Penicillium paneum Frisvad (IHEM 6652) en Aspergillus niger (P1118) opgekweekt bij 26°C op malt extract agar (MEA) (Oxoid, VK) platen (drie platen per schimmel). Voor het oogsten van de sporen werd 5 ml steriele Tween 80 (polyoxyethyleensorbitaan mono-oleaat, Merck, Duitsland)-wateroplossing (1g Tween 80 per liter gedestilleerd water) op de volgroeide petriplaat gepipetteerd waarna de sporen werden los geschraapt met een steriele spatel. De Tween 80-oplossing met schimmelsporen werd vervolgens in een steriele falconbuis gepipetteerd waarin vooraf een steriele wattenprop als filter werd aangebracht. Deze procedure voor het oogsten werd driemaal uitgevoerd per plaat. Na het oogsten en het verwijderen van de wattenprop werd de falconbuis gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 8000 tpm en 4°C. Na het verwijderen van het supernatans werd de pellet door middel van vortexen opgelost in 25 ml Tween 80-PBS oplossing (1g Tween 80 en 10 tabletten PBS per liter gedestilleerd water) (Fosfaat gebufferde zoutoplossing, Oxoid, VK). Na herhaling van de centrifugatiestap en het verwijderen van het supernatans werd de pellet opgelost in PBS-oplossing (10 tabletten per liter gedestilleerd water) door middel van vortexen. Na een laatste centrifugatiestap werd de pellet opnieuw opgelost in PBS-oplossing. Hierna werd de concentratie van de sporenoplossing bepaald via microscopie aan de hand van een Thoma telkamer om nadien verdunningen met de gewenste concentratie schimmelsporen te kunnen aanmaken.

2.4 Kwantificering van sporensuspensies 2.4.1 Thoma telkamer (microscopie) Met behulp van een lichtmicroscoop (Olympus BH2 lichtmicroscoop, VS) werd de concentratie van de sporensuspensie bepaald aan de hand van een Thoma telkamer. Daarnaast werden voor de onderzochte schimmels ook microscopische beelden gemaakt om de morfologie van de sporen voor en tijdens het kiemingsproces in kaart te brengen.

2.4.2 Microbiologische uitplatingen (telplaatmethode) Kwantificering van sporensuspensies via flowcytometrie werd gecombineerd met uitplatingen om een idee te krijgen van de concentratie schimmelsporen in de onverdunde sporensuspensie. Verdunningen -4 tot -6 werden uitgeplaat (strijkplaten, 0.1 ml) op MEA voedingsbodems en geïncubeerd bij 25°C gedurende drie dagen. Vervolgens werden de platen geteld waarbij het aantal kolonievormende eenheden tot 300 kve per plaat als telbaar werd beschouwd.

Een benadering van de sporenconcentratie in de onverdunde sporensuspensie werd bekomen via vergelijking (1):

10푣푒푟푑푢푛푛푖푛푔푠푓푎푐푡표푟 푆푡푟푖푗푘푝푙푎푎푡: # 푘푣푒/푝푙푎푎푡 ∗ (1) 0,1

Hierbij was de verdunningsfactor gelijk aan -4, -5 of -6 voor respectievelijk de verdunningen 10−4, 10−5 en 10−6 van de oorspronkelijke sporensuspensie. Een schimmelspot kon meerdere sporen omvatten als deze dicht bij elkaar ontkiemden. Door voldoende te verdunnen konden spots ontstaan uit individuele sporen wel waargenomen worden.

2.4.3 Flowcytometrie Er werd gebruik gemaakt van verdunde sporensuspensies (5,5 log sporen per ml). Het onderzoek via flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van de CyFlow SL (Partec, Duitsland) met 25 mW 488 nm laser en FloMax software (versie 2.4d, Partec, Duitsland). Om verstopping van het toestel door hyfemateriaal te voorkomen, werd per onverdund staal 2 ml gefiltreerd met een 50 µm filter in een proefbuis. Vervolgens werden verdunningen aangemaakt met behulp van membraangefiltreerd fysiologisch water (8,5 g NaCl per liter gedestilleerd water). Hiervoor werd 100 µl van het prefiltraat of een voorgaande verdunning met 900 µl fysiologisch water aangevuld. Hierbij werden epjes gebruikt die vooraf werden geautoclaveerd (15 minuten bij 121°C). Bij het opstarten van het onderzoek met behulp van flowcytometrie werden eerst de nodige instellingen bepaald voor beide schimmels zoals beschreven in het hoofdstuk resultaten en bespreking (3.1.3).

Voor vergelijking van de resultaten bekomen door middel van flowcytometrie, microscopie en uitplating werden 1/100 en 1/1000 verdunningen gemaakt van de originele sporensuspensie voor flowcytometrie via verdunningsreeksen.

2.5 Invloed van organische zuren op sporenontkieming 2.5.1 Flowcytometrie 2.5.1.1 Aanmaak YES medium

Er werd gebruik gemaakt van een YES/buffermengsel met wateractiviteit (aw) = 0,96 en pH = 6,04. Het yeast extract sucrose medium (YES) werd gebruikt gebaseerd op het onderzoek door Medina et al. (2012). Het medium bevatte 20 g/l gistextract (Oxoid, VK), 150 g/l sucrose

(Tiense suiker, België) en 0,5 g/l magnesiumsulfaat (Ucb). De aw werd geregeld via toevoeging van glycerol (tweevoudig gedestilleerd 99.5%, VWR Chemicals) en de zuurtegraad werd gebufferd via het gebruik van citroenzuur (CZ, Lamers & Pleugers B.V.) en trinatriumcitraat (tNaC, Merck). Het medium werd geautoclaveerd gedurende 15 minuten bij 121°C (tabel 4). Vervolgens werd het YES medium verdeeld in steriele falconbuizen met elk 20 ml medium. (Medina, Lambert, & Magan, 2012) TABEL 4: Overzicht van de exacte hoeveelheden voor bereiding van het YES medium ter bepaling van het effect van azijnzuur bij het preliminair onderzoek. CZ: citroenzuur, tNaC: trinatriumcitraat. pH m CZ m tNaC V H2O m glycerol m gistextract m sucrose m MgSO4 (g) (g) (ml) (g) (g) (g) (mg) 6,04 0,31 3,54 170 12,47 3,40 25,50 174,05

2.5.1.2 Inoculatie en incubatie In het onderzoek werden falconbuizen gevuld met 20 ml YES/buffermengsel en geïnoculeerd met schimmelsporen van P. paneum. Dit werd gericht op een sporenconcentratie van 5,5 log sporen per ml in de -1 verdunning. De falconbuizen werden bewaard in een incubator (Memmert, Duitsland) bij 25°C waarbij een meting werd uitgevoerd van de -1 verdunning op het tijdstip van inoculatie en vervolgens op twee uur en drie uur na inoculatie. Dit werd herhaald voor beide onderzochte schimmels met metingen tot tachtig uur en zesennegentig uur na inoculatie.

Voor het onderzoek van schimmelsporen van P. paneum na kleuring werd geïncubeerd via een warmwaterbad bij 30°C om kieming te stimuleren. Voor metingen om het half uur tot vijf uur na inoculatie werd bij de -1 verdunning van het geïnoculeerd YES/buffer-mengsel 20 µl PI en 20 µl SYTO 13 toegevoegd gevolgd door 15 minuten incubatie bij 30°C. Daarna werd de meting via flowcytometrie uitgevoerd. Dit werd voor P. paneum en A. niger herhaald met metingen tot respectievelijk achtenhalf uur en elf uur na inoculatie met verdunning in PBS (aangemaakt zoals besproken bij 2.3). Hierbij werd ook het effect van het verdunningsmedium op de alignering van de fluorescentiecluster in scatterplots nagegaan.

2.5.1.3 Onderzoek van het kiemingsproces Doorheen het onderzoek werd er met verschillende concentraties toegevoegd azijnzuur (glaciaal, ACS, 99.7+%, VWR Chemicals) gewerkt om (1) een bovengrens te vinden voor wel of geen kieming van schimmelsporen en (2) te onderzoeken hoe het kiemingsproces via flowcytometrie kon aangetoond worden. Voor het preliminair onderzoek met P. paneum werden concentraties 0, 50, 100, 150, 200, 250 en 300 mM toegevoegd azijnzuur gebruikt. Bij de eerste herhaling voor beide schimmels werden concentraties 0, 50, 100 en 200 mM toegevoegd azijnzuur gebruikt. Bij de tweede herhaling waren dit concentraties 0, 10, 20, 30 en 40 mM toegevoegd azijnzuur.

In combinatie met meting van de optische densiteit werd voor deelexperiment 1 (pH = 4,75) met verschillende zwakke organische zuren bij verschillende actieve zuurconcentraties het effect op de sporenkieming onderzocht (2.5.3). Voor flowcytometrie werkte men opnieuw met een concentratie van 6,5 log sporen per ml in de falconbuizen.

Voor het onderzoek van schimmelsporen van P. paneum na kleuring werd initieel geen azijnzuur toegevoegd. Bij herhaling werd azijnzuur toegevoegd voor het bekomen van ongedissocieerde (actieve) zuurconcentraties 0, 25, 50 en 100 mM vooraf inoculatie volgens het principe besproken bij 2.5.3. Op basis van voorgaande resultaten voor P. paneum en spectrofotometrie werd voor A. niger echter besloten geen azijnzuur toe te voegen. Hierbij lag de aandacht bij het waarnemen van de start van het kiemingsproces via flowcytometrie.

2.5.2 Microscopie Tijdens het onderzoek werd het kiemingspercentage volgens flowcytometrie met behulp van de kleuring vergeleken met het kiemingspercentage waargenomen bij microscopie zonder kleuring. Hiervoor werd telkens 50 µl uit de falconbuis zonder filtratie op een Thoma- draagglaasje overgebracht en werden minstens 150 sporen geteld en geëvalueerd op kieming. Tijdens periodes waarin geen tellingen konden worden uitgevoerd, werden de falconbuizen overgebracht in ijswater in de koelkast om het kiemingsproces tijdelijk te onderbreken.

2.5.3 Spectrofotometrie Door middel van spectrofotometrie kan men groei van micro-organismen in een (semi-) vloeibaar medium opvolgen in de tijd. Naarmate de schimmel groeit, zal de optische densiteit toenemen. Uitzetting van de optische densiteit in functie van de tijd maakte het in dit onderzoek mogelijk om een idee te krijgen van de groei van schimmelsporen en de ontwikkelingsfase waarbij vanaf het kiemingsproces een toename van de optische densiteit werd verwacht.

Voor spectrofotometrie werd opnieuw YES/buffer-mengsel aangemaakt volgens hetzelfde principe zoals besproken bij 2.5.1.1. Afhankelijk van de proefopzet werden bepaalde hoeveelheden zwak organisch zuur toegevoegd, gevolgd door inoculatie met schimmelsporen en vortexen na elke toevoeging. Ten slotte werden de wells gevuld en werd de plaat afgesloten met een breath-easy film (Sigma-Aldrich, VS). De optische densiteit werd door middel van puntmetingen op welbepaalde tijdstippen gemeten met behulp van de Multiscan Ascent 96/384 plate reader (Thermo Labsystems, VS). Het initiële OD-signaal werd gericht op 0,12 waarbij een afwijkende waarde kon wijzen op (1) een fout tijdens het inoculeren of (2) invloed van het toegevoegde zuur bij hogere hoeveelheden. De exacte zuurtegraad en wateractiviteit werden gecontroleerd aan de hand van de pH-meter 301 device (Hanna Instruments, Portugal) en de

LabMaster-Aw (Novasina, Intermesa, België).

Algemeen werden wells in een 96-well multititerplaat met 150 µl geïnoculeerd medium gevuld, telkens 4 wells per kolom. Hierbij kwam een kolom met een proefbuis met schroefdop overeen met hierin een bepaalde concentratie van een zwak organisch zuur zoals verderop besproken. Hiernaast werden per deelexperiment twee kolommen als negatieve en positieve controle gebruikt (niet geïnoculeerd medium en geïnoculeerd medium zonder toegevoegd zuur). De absorbantie bij 595 nm werd gedurende maximum driehonderd uur na inoculatie opgevolgd.

2.5.3.1 Onderzoek van de invloed van pH op het effect van zwakke organische zuren Tijdens het preliminair onderzoek van P. paneum via spectrofotometrie werden concentraties

0, 25, 50, 100 en 200 mM toegevoegd azijnzuur gebruikt bij 25°C; pH = 6,04 en aw = 0,96. Dit met een sporenconcentratie gericht op 6,5 log per ml na inoculatie. Bij herhaling voor beide onderzochte schimmels waren dit concentraties 0, 5, 10, 15, 20, 30 en 40 mM toegevoegd azijnzuur. Op basis hiervan werden zes deelexperimenten opgesteld voor onderzoek van de

kieming van P. paneum en A. niger bij aw = 0,96; T = 25°C en pH = 4,75; 5,40 en 6,04. De gebruikte hoeveelheden van de toegevoegde componenten voor het YES medium worden weergegeven in tabel 5. Na toevoeging van de nodige zuren werd hierbij geïnoculeerd gericht op een sporenconcentratie van 4,5 log per ml.

TABEL 5: Overzicht van de exacte hoeveelheden voor bereiding van de media ter bepaling van het effect van de pH op de activiteit van de gebruikte zuren. CZ: citroenzuur, tNaC: trinatriumcitraat. pH m CZ m tNaC V H2O m glycerol m gistextract m sucrose m MgSO4 (g) (g) (ml) (g) (g) (g) (mg) 4,75 2,10 3,21 350 25,67 7,00 52,50 358,34 5,40 1,40 5,25 6,04 0,64 7,29

2.5.3.2 Berekening van de actieve concentraties zwak organisch zuur Het effect van azijnzuur (glaciaal, ACS, 99.7+%, VWR Chemicals), melkzuur (90,2 % AnalaR NORMAPUR, VWR Chemicals) en propionzuur werd onderzocht bij pH = 4,75; 5,40 en 6,04. Propionzuur werd toegevoegd onder de vorm van het beter oplosbare calciumpropionaat (CaP, Sigma-Aldrich, VS). Bij alle berekeningen en vermeldde percentages werd rekening gehouden met de omrekening van calciumpropionaat naar propionzuur. De concentratiegebieden voor deze drie zuren werden opgesteld op basis van eerdere onderzoeksresultaten door Debonne et al. (data niet gepubliceerd). Voor azijnzuur is dit 0, 100, 200 en 300 mM voor P. paneum en een factor 10 lager voor A. niger. In geval van melkzuur is dit 0, 100, 200 en 300 mM voor beide schimmels. Voor propionzuur is dit ten slotte 0, 10, 20 en 30 mM voor beide schimmels.

Deze concentraties werden aangepast voor de zes deelexperimenten. Om exact te weten welke concentraties men fysiek diende toe te voegen en wat de bijhorende concentraties actief zuur waren, heeft men op basis van de pH, pKa en zuurconcentratie een omrekening uitgevoerd. Bijlage 1 geeft een overzicht weer van de toegevoegde concentraties van de zuren met de bijhorende actieve concentraties tussen haakjes. Op basis van enerzijds de dichtheid en moleculaire massa van de gebruikte zuren en anderzijds de gebruikte volumes in de proefbuizen (voor OD-meting) en falconbuizen (voor flowcytometrie), werden de toe te voegen hoeveelheden van de zuren berekend. Op basis van de gebruikte controles en de concentratiegebieden (bijlage 1) had men per deelexperiment een 96-well multititerplaat met elf kolommen zoals weergegeven in tabel 6.

TABEL 6: Samenstelling van de 96-well multititerplaten; AA: azijnzuur, LA: melkzuur, PA: propionzuur. Kolom Inhoud (150 µL per well) 1 YES medium, niet-geïnoculeerd (negatieve controle) 2 YES medium, geïnoculeerd (positieve controle) 3 Inhoud van proefbuis 2: AA concentratie 2 4 Inhoud van proefbuis 3: AA concentratie 3 5 Inhoud van proefbuis 4: AA concentratie 4 6 Inhoud van proefbuis 5: LA concentratie 2 7 Inhoud van proefbuis 6: LA concentratie 3 8 Inhoud van proefbuis 7: LA concentratie 4 9 Inhoud van proefbuis 8: PA concentratie 2 10 Inhoud van proefbuis 9: PA concentratie 3 11 Inhoud van proefbuis 10: PA concentratie 4

2.6 Statistische verwerking Algemeen werd de data bekomen via flowcytometrie, spectrofotometrie en microscopie bijgehouden met behulp van Excel met waar relevant berekening van het gemiddelde en de standaarddeviatie. Relevante waarden en figuren uit Excel met verdere verwerking door middel van SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) en Matlab worden weergegeven bij de resultaten en bespreking.

2.6.1 Ontwikkeling van predictieve groei/geen groei modellen De groei/geen groei data verkregen via spectrofotometrie werden gebruikt om twee predictieve groei/geen groei modellen te ontwikkelen voor zowel P. paneum en A. niger met aw = 0,96 en T = 25°C als vaste waarden. De modellen werden uitgewerkt op basis van de actieve concentratie azijnzuur of propionzuur en incubatietijd als variabelen. Melkzuur kon een stimulerend effect hebben en werd bijgevolg niet gebruikt voor modellering. Vergelijkbaar met de methode door Vermeulen, Daelman, Van Steenkiste, & Devlieghere (2012) en geoptimaliseerd door Debonne et al. (2019) werd een logistisch regressiemodel gebruikt om de data te beschrijven. De vergelijking van de modellen bestaat uit een polynoom (rechterzijde) en logit (p) = ln(p/(1-p)) (linkerzijde) met p de kans op groei. De vergelijking (2) voor de modellen kan algemeen weergegeven worden als:

2 2 푙표푔푖푡(푝) = 푏0 + 푏1 ∗ 푐표푛푐 + 푏2 ∗ 푡푖푗푑 + 푏3 ∗ 푐표푛푐 + 푏4 ∗ 푡푖푗푑 + 푏5 ∗ 푐표푛푐 ∗ 푡푖푗푑 (2)

In deze vergelijking stellen bi (i = 0, …, 5) de parameters voor die moeten geschat worden met als variabelen conc (concentratie van het ongedissocieerd (actief) zuur uitgedrukt in mM) en tijd (incubatietijd uitgedrukt in dagen). Het fitten van de modellen werd uitgevoerd in SPSS Statistics 25 (SPSS, Inc., Chicago, IL, VS) met behulp van lineaire logistische regressie volgens de procedure beschreven door Vermeulen et al. (2007). Dit impliceert dat de hoofdeffecten

werden gedwongen om in de uiteindelijke modelvergelijking te blijven, ongeacht hun p-waarde. De kwadratische en interactie-termen werden geselecteerd door de terugwaartse stapsgewijze procedure (backward linear regression) gebaseerd op de significantie van het waarschijnlijkheids-ratio criterium (p = 0,001). Het opbouwen van de modellen werd gestopt wanneer er geen variabelen voldeden aan de criteria voor toevoeging of verwijdering. De voorspelde groei/geen groei interfaces werden geplot in Matlab 9.3 (The Mathworks, Inc., Natick, MA, VS). Goodness-of-fit tests die werden uitgevoerd zijn: (1) Nagelkerke R², (2) ROC-curve (receiver operating characteristic) c-waardestatistieken en (3) de mate van overeenstemming tussen observaties en voorspellingen (dos Santos et al., 2018). (Debonne et al., 2019; Vermeulen, Daelman, Van Steenkiste, & Devlieghere, 2012; Vermeulen et al., 2007)

3 Resultaten en bespreking

3.1 Kwantificering van sporenaantallen Het doel bij het kwantificeren van sporensuspensies van Penicillium paneum en Aspergillus niger was het nagaan of de flowcytometer nauwkeurig en betrouwbaar de concentratie schimmelsporen in een suspensie kon bepalen. Ter controle werden de bekomen resultaten vergeleken met de resultaten via uitplating en microscopie.

3.1.1 Thoma telkamer (microscopie) Ter controle werden enkele tellingen uitgevoerd van het prefiltraat. Hieruit bleek dat de gebruikte filter de sporen niet in grote mate weerhield noch aanleiding gaf tot een afwijkende waarde (bv. een verschil groter dan 0,3 log sporen per ml). De resultaten met hun standaarddeviatie bekomen via microscopie zijn weergegeven in tabel 7.

TABEL 7: Kwantificatie van de sporensuspensies via microscopie voor P. paneum (n = 4) en A. niger (n = 3). Schimmel Gemiddelde concentratie Gemiddelde concentratie (sporen/ml) (log/ml) Penicillium paneum (1,3 ± 0,3) ∗ 108 8,1 ± 0,1 Aspergillus niger (1,1 ± 0,2) ∗ 108 8,0 ± 0,1

3.1.2 Microbiologische uitplatingen (telplaatmethode) De gebruikte sporensuspensies voor flowcytometrie werden d.m.v. de verdunningsreeks onderzocht via uitplating op MEA voedingsbodems. De resultaten zijn weergegeven in tabel 8. Voor vergelijking van de waarden voor de sporenconcentraties werd een afwijking voor de telplaatmethode verwacht doordat enkel levensvatbare sporen aanleiding geven tot telbare kolonies. Dit in tegenstelling tot microscopie en flowcytometrie waarbij dit onderscheid niet werd gemaakt voor bepaling van de totale sporenconcentratie van de sporensuspensie.

TABEL 8: Kwantificatie van de sporensuspensies via de telplaatmethode voor P. paneum (n = 10) en A. niger (n = 9). Schimmel Gemiddelde concentratie Gemiddelde concentratie (sporen/ml) (log/ml) Penicillium paneum (3,1 ± 1,8) ∗ 107 7,4 ± 0,4 Aspergillus niger (2,3 ± 0,8) ∗ 107 7,3 ± 0,2

3.1.3 Flowcytometrie – instellingen, gating, correctie en resultaten De flowcytometer kan tijdens metingen triggeren op verschillende parameters (FSC, SSC, FL1, FL2 of FL3) waarbij men de instellingen voor de gain, schaal (lineair, log 3 of log 4), z-level (filter voor ruis) en meetsnelheid (speed) kan aanpassen. Om de data te kunnen interpreteren werd eerst nagegaan welke instellingen leidden tot nauwkeurige en duidelijke resultaten voor

algemeen gebruik binnen dit onderzoek. Op basis van de bekomen testresultaten en voorgaand onderzoek werden de instellingen ingesteld zoals weergegeven in tabel 9.

TABEL 9: Instellingen flowcytometrie voor de onderzochte schimmels. Schimmel Trigger FSC gain SSC gain Schaal Speed z-lvl Penicillium paneum FSC 221 227,5 log 3 2,3 2 Aspergillus niger FSC 231 232,5 log 3 2,1 2

Via deze instellingen kon een duidelijk scatterprofiel bekomen worden om gating mogelijk te maken. Hierbij waren subclusters onderscheidbaar (twee zones) door individueel gedetecteerde sporen en sporen gedetecteerd in kleine groepen (hoofdzakelijk koppels). Figuur 21 toont een voorbeeld van de scatterprofielen van P. Paneum en A. niger.

Op de horizontale as staat de forward scatter (FSC) en op de verticale as de side scatter (SSC). Deze scatterprofielen geven naast de sporen ook ruis weer (hoofdzakelijk links onderaan). Ruis kan afkomstig zijn van de meting via het toestel (luchtbellen versterken dit effect) of van het staal zoals via de verdunningsvloeistof, het verdund medium of mogelijks kleinere partikels afkomstig van de geoogste schimmels.

FIGUUR 21: Scatterprofielen van P. paneum (links) en A. niger (rechts) verdeeld in zones via gating.

Ruis werd waargenomen dichtbij de assen en mocht niet meegeteld worden. Daarom werden de clusters afgebakend in zones via gating waarbij de absolute count (sporen/ml) voor zowel de volledige cluster en de subclusters werd bepaald. Algemeen kwamen de sporen in suspensie enkelvoudig voor (subcluster 2). Sommige sporen konden echter samenblijven in kettingen of groepen van twee of meerdere sporen (subcluster 1). Deze werden bij flowcytometrie als een geheel geteld wat mogelijks leidde tot een meetfout. Om hiermee rekening te houden werd de totale sporenconcentratie berekend op basis van de absolute counts van de subclusters. Via flowcytometrie kon men niet exact bepalen uit hoeveel sporen de kettingen of groepen bestonden (subcluster 1), volgens microscopie waren er doorgaans twee gekoppelde sporen.

Vandaar dat de totale sporenconcentraties (tabel 10) bepaald werden via de som van de sporenconcentratie in subcluster 2 en het dubbel van de sporenconcentratie in subcluster 1. Tijdens individuele metingen werden voor beide schimmels waarden bekomen waaruit bleek dat ruim 10% van de gedetecteerde sporen in groepen voorkwamen voor de verdunningen -2 en -3. Bij meerdere metingen en uitdrukking van de sporenconcentratie in log/ml bleek dit geen significante invloed te hebben op het eindresultaat.

TABEL 10: Kwantificatie van de sporensuspensies via flowcytometrie (FSC, LOG3) voor P. paneum (n = 30) en A. niger (n = 29). Schimmel Gemiddelde concentratie Gemiddelde gecorrigeerde concentratie (log/ml) (log/ml) P. paneum 7,7 ± 0,2 7,7 ± 0,1 A. niger 7,6 ± 0,1 7,6 ± 0,1

3.1.4 Tussentijds besluit: vergelijking van de resultaten via microscopie, uitplating en flowcytometrie Uit tabel 11 kan men afleiden dat de bekomen waarden via flowcytometrie deze via microscopie en uitplating benaderen. Zoals verwacht liggen de waarden via uitplating lager mits dormante of niet levensvatbare sporen geen aanleiding geven tot uitgroei. Verder heeft flowcytometrie het voordeel sneller metingen mogelijk te maken met een kleinere standaarddeviatie bij herhaalde metingen t.o.v. uitplating.

Men kan dus besluiten dat flowcytometrie een geschikte methode is voor kwantificatie en onderzoek van sporen afkomstig van Penicillium paneum en Aspergillus niger. Hoewel er bij individuele metingen een beperkte fout mogelijk is door de aanwezigheid van gekoppelde sporen, heeft dit geen significante invloed op de uiteindelijke sporenconcentratie uitgedrukt in log/ml op basis van meerdere metingen.

TABEL 11: Vergelijking van de resultaten voor kwantificatie via microscopie, telplaatmethode en flowcytometrie voor P. paneum (respectievelijk n = 4; 10; 30) en A. niger (respectievelijk n = 3; 9; 29). Schimmel Thoma telkamer Uitplating Flowcytometrie gemiddelde gemiddelde gemiddelde concentratie concentratie concentratie (log/ml) (log/ml) (log/ml) Penicillium paneum 8,1 ± 0,1 7,4 ± 0,4 7,7 ± 0,2 Aspergillus niger 8,0 ± 0,1 7,3 ± 0,2 7,6 ± 0,1

3.2 Invloed van organische zuren op sporenontkieming via flowcytometrie In eerdere studies van Debonne et al. (data niet gepubliceerd) werd de antifungale activiteit van melkzuur, azijnzuur en propionzuur onderzocht. Zo zijn resultaten van de ongedissocieerde concentratie van melkzuur en azijnzuur bekend voor de schimmels Penicillium paneum en Aspergillus niger (P. paneum: 150 – 200 mM azijnzuur en > 200 mM melkzuur; A. niger: 20 – 25 mM azijnzuur en > 200 mM melkzuur).

3.2.1 Flowcytometrie zonder kleuring van schimmelsporen 3.2.1.1 Kieming van schimmelsporen in blanco medium Een eerste moeilijkheid was dat er op basis van de literatuur vooraf geen zekerheid was over hoe de sporenkieming uit de bekomen figuren ging kunnen worden afgeleid. Verschillende instellingen zoals de gain of gebruikte schaal, alsook verschillende schimmels geven immers aanleiding tot verschillende figuren. Waarneembare veranderingen van de FSC of SSC histogrammen waren enerzijds het ontstaan van nieuwe pieken, anderzijds het verbreden van een reeds bestaande piek. Bovendien konden veranderingen bij het SSC-FSC scatterplot waargenomen worden zoals verschuivingen, vervormingen of uitbreiding van de originele cluster ten opzichte van de figuren bij inoculatie (t0). Bijlage 2 geeft een weergave van metingen bij t0 en stalen zonder inoculatie met schimmelsporen.

A. Veranderingen waargenomen bij het SSC-FSC scatterplot voor P. paneum

Uit figuur 22 kan men afleiden dat het scatterplot van P. paneum (t0, t2 en t3, tijd uitgedrukt in uur na inoculatie bij pH = 6,04 en T = 25°C) als geheel kon verschuiven zonder dat dit een blijvende verandering was. Figuur 23 geeft een meting weer waaruit blijkt dat het scatterprofiel een licht afwijkende ligging kon hebben bij herhaalde analyse van hetzelfde staal op hetzelfde tijdstip (t2). Bij andere metingen bleek een dergelijke verschuiving voor opeenvolgende tijdstippen zich niet steeds voor te doen. Een beperkt verschillende ligging van het scatterprofiel als geheel is voor P. paneum bijgevolg geen betrouwbare indicatie voor het begin van de sporenkieming.

t0 t2 t3

FIGUUR 22: Verschuiving van het scatterplot van P. paneum op t0, t2 en t3 zonder toevoeging van azijnzuur.

FIGUUR 23: Verschillende ligging van scatterplots van P. paneum op t2 zonder toevoeging van azijnzuur.

Naast een verschuiving werden er na enige tijd grotere ruisclusters waargenomen zoals weergegeven op figuur 24. Gezien deze cluster zich uitbreidde naar de linkerbenedenhoek, wees dit op een toename van het aantal gedetecteerde componenten kleiner dan de schimmelsporen. Dit waren vermoedelijk componenten vrijgesteld door de schimmelsporen tijdens het kiemingsproces zoals fragmenten afkomstig van de sporenwand. Verder werd bij de hoofdcluster een beperkte uitbreiding waargenomen wat op kieming kon wijzen.

t0 t2 t4

t29 t48

FIGUUR 24: Vorming van een ruiscluster bij het scatterplot van P. paneum op t0, t2, t4, t29 en t48 zonder toevoeging van azijnzuur.

Bij herhalingen bleek echter dat de ruiscluster niet steeds werd waargenomen zoals weergegeven op figuur 25 voor t23 en t20. Daarbij bleek de grootte van deze ruiscluster ook vrij variabel. Dit is op zich dus niet steeds een betrouwbare indicatie voor de sporenkieming. Bij latere tijdstippen (zoals t96) was deze ruiscluster groot en consistent waarneembaar maar mits de schimmelgroei ook zichtbaar aanwezig was bij het staal, waren dergelijke metingen in principe overbodig.

t23 t20

FIGUUR 25: Ruiscluster bij het scatterplot van P. paneum op t23 afwezig maar aanwezig bij herhaling op t20, zonder toevoeging van azijnzuur.

B. Veranderingen waargenomen bij het SSC-FSC scatterplot voor A. niger Sequentiële metingen werden eveneens uitgevoerd voor A. niger (pH = 6,04 en T = 25°C). Zoals weergegeven op figuur 26 werd een verandering van de vorm van de hoofdcluster waargenomen, gepaard met een uitbreiding naar de rechterbovenhoek voor t0, t8, t24, t56 en t77. Deze verandering kon wijzen op kieming van de schimmelsporen.

t0 t8 t24

t56 t77

FIGUUR 26: Uitbreiding van het scatterplot van A. niger op t0, t8, t24, t56 en t77 zonder toevoeging van azijnzuur.

Bij herhaling zoals weergegeven door figuur 27, bleek de uitbreiding naar de rechterbovenhoek niet steeds duidelijk voor te komen voor t0, t24, t30, t48 en t72. De vorm van de hoofdcluster bleek voor detectie van het kiemingsproces dus een betere indicator te zijn.

t0 t24 t30

t48 t72

FIGUUR 27: Geen uitbreiding van het scatterplot van A. niger op t0, t24, t30, t48 en t72 zonder toevoeging van azijnzuur.

3.2.1.2 Invloed van organische zuren op de kieming van schimmelsporen A. Onderzoek van de sporenkieming van P. paneum bij toevoeging van azijnzuur en andere zwakke organische zuren Het effect van azijnzuur (0 – 300 mM) op de kieming van P. paneum sporen in YES medium (pH = 6,04 en T = 25°C) werd onderzocht. Men kon aantonen dat toevoeging van azijnzuur niet zorgt voor een bijkomende verandering van de bekomen grafieken bij t0. Door kieming van P. paneum sporen tussen t23 en t29 werd een nieuwe ruiscluster waargenomen. Dit ging gepaard met het ontstaan van een tweede kleine SSC piek, een beperkte verbreding van de FSC piek en een lichte vervorming van de SSC-FSC hoofdcluster zoals weergegeven in figuur 28.

t23 t29

FIGUUR 28: Grafieken bekomen voor 0 mM toegevoegd azijnzuur op t23 en t29 voor P. paneum.

Uit verder onderzoek werd afgeleid dat 50 mM toegevoegd azijnzuur een bovengrens was waarboven geen sporenkieming werd waargenomen binnen het onderzochte tijdsinterval. Hierbij bleek sporenkieming mogelijk te zijn tot een toegevoegde concentratie van 20 mM zoals weergegeven op figuur 29. Voor een toegevoegde concentratie azijnzuur vanaf 30 mM was dit minder duidelijk tot niet waarneembaar zoals weergegeven door figuur 30.

t0 t20 t48

FIGUUR 29: Grafieken bekomen voor 20 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t20 en t48 voor P. paneum.

t0 t20 t72

FIGUUR 30: Grafieken bekomen voor 30 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t20 en t72 voor P. paneum.

Analoog aan deelexperiment 1 met meting van de optische densiteit bij pH = 4,75 en T = 25°C (2.5.3) werd het effect van verschillende zwakke organische zuren op de sporenkieming onderzocht. De concentraties toegevoegd zuur waren 118, 238, 354 mM azijnzuur, 238, 477, 715 mM melkzuur en 12, 23, 34 mM propionzuur. Metingen werden uitgevoerd op het moment van inoculatie en vervolgens achtenveertig en zesennegentig uur nadien.

In geval van geen zuurtoevoeging werd in tegenstelling tot wat werd verwacht, geen duidelijke indicatie van sporenkieming waargenomen zoals weergegeven door figuur 31. Hierbij viel een kleine bijkomende SSC piek op rechts van de verwachte piek. Prefiltratie weerhield mogelijks sporen met langere kiembuizen. Het is bijgevolg aangeraden om bij flowcytometrie frequenter metingen uit te voeren dan bij spectrofotometrie.

t0 t48 t96

FIGUUR 31: Grafieken bekomen voor staal zonder toegevoegd zuur (pH = 4,75) op t0, t48 en t96 voor P. paneum.

Voor de geteste concentraties azijnzuur en propionzuur werd hetzelfde waargenomen zoals bij de stalen zonder toegevoegd zuur. In geval van melkzuur ontstond een bijkomende, linkse SSC piek die men kan linken aan de ontstane ruiscluster zoals weergegeven door figuur 32. Daarnaast nam de kleine rechtse piek duidelijk toe qua grootte t.o.v. de originele SSC piek. Deze kan gelinkt worden aan de duidelijker verschenen subcluster in de rechterbovenhoek van het SSC-FSC diagram. Hieruit kan men algemeen afleiden dat melkzuur bij de beschouwde concentraties en tijdsinterval de sporenkieming niet volledig onderdrukte.

238 mM 238 mM

477 mM 477 mM

715 mM 715 mM

FIGUUR 32: Grafieken bekomen voor 238 mM, 477 mM en 715 mM toegevoegd melkzuur (pH = 4,75) op t48

(links) en t96 (rechts) voor P. paneum.

B. Onderzoek van de sporenkieming van A. niger bij toevoeging van azijnzuur Voor A. niger werd het voorgaande experiment met gebruik van azijnzuur (pH = 6,04 en T = 25°C) herhaald. Voor het staal zonder azijnzuur werd naast de vormverandering van de hoofdcluster bij het SSC-FSC scatterplot eveneens een duidelijke verbreding van de FSC piek waargenomen rond t8 zoals weergegeven door figuur 33. Een ruiscluster of het ontstaan van een tweede SSC piek werd echter niet waargenomen. Vanaf t24 tot t77 werd bij de FSC piek een stapsgewijze terugkeer naar een smalle piek maar met een brede basis waargenomen. Een mogelijke verklaring is dat door prefiltratie de sporen met langere kiembuizen werden weerhouden met de vormverandering van de FSC piek als gevolg.

t0 t8 t77

FIGUUR 33: Grafieken bekomen voor 0 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t8 en t77 voor A. niger.

Voor A. niger met 10 en 20 mM toegevoegd azijnzuur werden dezelfde indicaties waargenomen die kunnen wijzen op sporenkieming zoals weergegeven door figuur 34. Bij 30 en 40 mM werden deze indicaties minder prominent waargenomen. Vanaf 50 mM toegevoegd azijnzuur werd geen duidelijk verschijnsel waargenomen dat kon wijzen op sporenkieming naast een beperkte breedtewijziging van de FSC piek bij 50 mM toegevoegd azijnzuur zoals weergegeven door figuur 35. Via micoscopie ter controle werd geen indicatie voor sporenkieming bij 50 mM toegevoegd azijnzuur waargenomen bij afronding van deze proefopzet.

t0 t24 t48

FIGUUR 34: Grafieken bekomen voor 20 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t24 en t48 voor A. niger.

t0 t8 t77

FIGUUR 35: Grafieken bekomen voor 50 mM toegevoegd azijnzuur op t0, t8 en t77 voor A. niger.

3.2.2 Flowcytometrie met kleuring van schimmelsporen 3.2.2.1 Kieming van schimmelsporen in blanco medium, met kleuring A. Kieming van P. paneum schimmelsporen in blanco medium, met kleuring Voor onderzoek van de sporenkieming van P. paneum met kleuring door PI en SYTO 13 werd niet geïnoculeerd YES medium (pH = 6,04) als referentie gebruikt (bijlage 3). Hierbij werd de incubatie uitgevoerd bij 30°C in een warmwaterbad wat leidde tot versnelling van het kiemingsproces. De gebruikte instellingen werden verder geoptimaliseerd voor kleuring en worden weergegeven in tabel 12.

TABEL 12: Instellingen flowcytometrie voor de onderzochte schimmels. Penicillium paneum Aspergillus niger Trigger FSC FSC FSC gain en schaal 226 – log 3 231 – log 3 SSC gain en schaal 232,5 – log 3 232,5 – log 3 FL1 gain en schaal 423 – log 4 423 – log 4 FL2 gain en schaal 353,4 – log 4 353,4 – log 4 FL3 gain en schaal 394 – log 4 394 – log 4 Speed 2 2,1 z-lvl 2 2

Via kleuring kon het begin van het kiemingsproces van P. paneum waargenomen worden via verschillende indicatoren zoals weergegeven door figuur 36 voor t0, t3 en t5. Allereerst werd er een verschuiving van een FSC piek waargenomen die zich rechts afsplitste t.o.v. de originele piek (a). Bij het SSC-FSC scatterplot scheidde er zich een nieuwe subcluster af die zichtbaar werd rechts ten opzichte van de oorspronkelijke hoofdcluster (b). Bij de grafieken op basis van de fluorescentieparameters werden ten slotte verschillende veranderingen van de scatterplots waargenomen (FL3-FL1 en FL2-FSC). Het begin van deze verschijnselen werd waargenomen vanaf drie uur na inoculatie.

t5 a b

FIGUUR 36: Grafieken bekomen voor P. paneum via kleuring en geïncubeerd m.b.v. een warmwaterbad bij 30°C op t0, t3 en t5.

Om meer zekerheid te bekomen over de waargenomen veranderingen bij P. paneum, werden gating en de functie apply to histogram toegepast. Allereerst werd de subzone die de gekoppelde sporen voorstelde via gating onderzocht. Hieruit bleek dat de gekoppelde sporen bij t0 geen grote invloed hadden op de bekomen grafieken. Via hetzelfde principe werd aangetoond dat de nieuw waargenomen cluster in het SSC-FSC scatterplot overeenkwam met de andere waargenomen veranderingen tussen drie uur en vijf uur na inoculatie zoals weergegeven door figuur 37.

FIGUUR 37: Grafieken weergegeven in overeenstemming met de kiemende sporen via gating op t5 voor P. paneum geïncubeerd bij 30°C.

Ter controle van de kleuring van de schimmelsporen werd hierbij gating toegepast bij de volledige SSC-FSC en FL3-FL1 scatterplots. De bekomen sporenconcentraties berekend op basis van de absolute counts door deze gatings worden weergegeven in tabel 13. Voor het kleuringspercentage werd de sporenconcentratie via het FL3-FL1 scatterplot vergeleken met de sporenconcentratie via het SSC-FSC scatterplot. Algemeen kon men besluiten dat de kleuring van schimmelsporen mogelijk was voor visualisering van het kiemingsproces.

TABEL 13: Vergelijking tussen sporenconcentraties volgens de SSC-FSC en FL3-FL1 scatterplots van P. paneum na verdunning met fysiologisch water en kleuring met PI en SYTO 13. Tijdstip Sporenconcentratie Sporenconcentratie Percentage volgens het SSC-FSC volgens het FL3-FL1 kleuring scatterplot (log/ml) scatterplot (log/ml) (%)

푡0 5,2 5,2 100

푡0,5 5,2 5,2 100

푡1 5,2 5,2 100

푡1,5 5,2 5,2 100

푡2 5,2 5,2 100

푡2,5 5,1 5,1 100

푡3 5,2 5,2 100

푡3,5 5,2 5,2 100

푡4 5,2 5,2 100

B. Kieming van A. niger schimmelsporen in blanco medium, met kleuring Voor A. niger werd dit onderzoek (pH = 6,04) herhaald met verdunning in PBS zonder toevoeging van azijnzuur. Bijlage 4 geeft de figuren weer voor zuiver PBS en YES medium verdund (-1) in PBS onderzocht na kleuring met PI en SYTO 13 als referenties. Uit het onderzoek bleek dat PBS een geschikte verdunningsvloeistof was met duidelijke weergave van de scatterplots. In dit geval werd een langzame verbreding van de FSC piek waargenomen en een vergroting van de cluster bij het SSC-FSC scatterplot. Rond vierenhalf uur na inoculatie werden eveneens verschuivingen van de clusters waargenomen bij de FL1-SSC, FL3-FL1 en FL2-FSC scatterplots. Deze waarnemingen waren een indicatie van het beginnend kiemingsproces en worden weergegeven door figuren 38A en 38B.

t3,5

FIGUUR 38A: Grafieken bekomen voor A. niger via incuberen in een warmwaterbad bij 30°C, verdunnen in PBS en kleuring met PI en SYTO 13 op t0, t1 en t3,5.

t4,5

t5,5

FIGUUR 38B: Grafieken bekomen voor A. niger via incuberen in een warmwaterbad bij 30°C, verdunnen in PBS en kleuring met PI en SYTO 13 op t4,5 en t5,5.

Om meer zekerheid te bekomen over de waargenomen veranderingen bij A. niger, werden gating en de functie apply to histogram toegepast. Allereerst werd de subzone die de gekoppelde sporen voorstelde via gating onderzocht. Hieruit bleek dat de gekoppelde sporen bij t0 geen grote invloed hadden op de bekomen grafieken. Via hetzelfde principe werd aangetoond dat de cluster met gewijzigde vorm in het SSC-FSC scatterplot bleef overeenkomen met de drie gewijzigde scatterplots op basis van de fluorescentieparameters vanaf vierenhalf uur na inoculatie zoals weergegeven door figuur 39.

FIGUUR 39: Grafieken weergegeven in overeenstemming met het SSC-FSC scatterplot via gating op t4,5 voor A. niger geïncubeerd bij 30°C.

Ter controle van de kleuring van de schimmelsporen werd gating toegepast bij de volledige SSC-FSC en FL3-FL1 scatterplots. De bekomen sporenconcentraties berekend op basis van de absolute counts door deze gatings staan weergegeven in tabel 14. Voor A. niger verliep de kleuring minder vlot. Volgens de absolute counts was 72% voor A. niger het laagste kleuringspercentage terwijl dit voor P. paneum nooit lager lag dan 95% ongeacht het verdunningsmedium.

TABEL 14: Vergelijking tussen sporenconcentraties volgens de SSC-FSC en FL3-FL1 scatterplots van A. niger na verdunning met PBS en kleuring met PI en SYTO 13. Tijdstip Sporenconcentratie Sporenconcentratie Percentage volgens het SSC-FSC volgens het FL3-FL1 kleuring scatterplot (log/ml) scatterplot (log/ml) (%)

푡1 5,3 5,1 96

푡1,5 5,3 5,2 98

푡3 5,3 5,2 98

푡3,5 5,3 5,2 98

푡4 5,3 5,2 98

푡4,5 5,3 5,3 100

푡5 5,3 5,3 100

푡5,5 5,3 5,2 98

3.2.2.2 Onderzoek van de sporenkieming van P. paneum in aanwezigheid van azijnzuur, met kleuring Het voorgaande onderzoek (pH = 6,04) met incubatie in het warmwaterbad (T = 30°C) en kleuring werd voor P. paneum herhaald met gebruik van PBS als verdunningsvloeistof en met toevoeging van azijnzuur. Uit het onderzoek bleek dat PBS een geschikte verdunningsvloeistof was met duidelijke weergave van de scatterplots. Zonder toevoeging van azijnzuur werden dezelfde veranderingen waargenomen bij de histogrammen en scatterplots zoals reeds besproken (3.2.2.1) voor P. paneum vanaf t3. Door gebruik van 25 mM en hogere concentraties toegevoegd azijnzuur kwamen deze veranderingen niet meer voor binnen het beschouwde tijdsinterval zoals weergegeven door figuur 40.

Ter controle werd opnieuw het principe van gating en apply to histogram toegepast. Opnieuw bleek dat de aanwezigheid van gekoppelde sporen geen grote invloed had op de bekomen figuren. Verder kwamen de waargenomen veranderingen bij het staal zonder azijnzuur terug overeen met het ontstaan van de nieuwe cluster in het SSC-FSC scatterplot.

Daarnaast werd ter controle van de kleuring van de schimmelsporen opnieuw gating toegepast bij de volledige SSC-FSC en FL3-FL1 scatterplots. De bekomen sporenconcentraties berekend op basis van de absolute counts door deze gatings staan weergegeven in tabel 15. Algemeen kan men besluiten dat de kleuring van sporen mogelijk was voor visualisering van het kiemingsproces bij verdunnen in PBS in plaats van fysiologisch water.

TABEL 15: Vergelijking tussen sporenconcentraties volgens de SSC-FSC en FL3-FL1 scatterplots van P. paneum na verdunning met PBS en kleuring met PI en SYTO 13. Tijdstip Sporenconcentratie Sporenconcentratie Percentage volgens het SSC-FSC volgens het FL3-FL1 kleuring scatterplot (log/ml) scatterplot (log/ml) (%)

푡0 5,2 5,2 100

푡2 5,3 5,3 100

푡3 5,2 5,2 100

푡4 5,3 5,3 100

푡5 5,2 5,2 100

푡7 5,2 5,2 100

푡8,5 5,3 5,3 100

3.2.3 Microscopie: in kaart brengen van sporenkieming Door middel van microscopie werd het kiemingspercentage van de sporen in YES medium (pH = 6,04) onderzocht tijdens incubatie in het warmwaterbad bij 30°C. Figuren 41 en 42 geven een overzicht van het kiemingspercentage voor beide schimmels. Vanaf vier uur na inoculatie werd het kiemingsproces bij beide schimmels opgemerkt in afwezigheid van zuur terwijl dit via flowcytometrie rond hetzelfde tijdstip was of tot een uur vroeger.

Voor P. paneum werd duidelijk dat kiemende sporen opzwollen en hierbij een lichtere kleur verkregen voordat de vorming van de kiembuis werd waargenomen (tabel 16). Sporen van A. niger kregen een lichtere kleur met donkere stippen wat vermoedelijk structuren op de sporenwand waren. De sporen van A. niger zwollen op waarbij de gekleurde structuren zich aan eenzelfde kant of aan weerszijden van de spore begaven. Dit kan verklaard worden door afstoting van de buitenste laag van de celwand zoals beschreven door Tiedt (1993).

Wat voor A. niger echter opviel was de relatief trage stijging van het kiemingspercentage gedurende de eerste twaalf uur na inoculatie mits een kiemingspercentage boven 60% binnen twaalf uur na inoculatie mogelijk is afhankelijk van o.a. het gebruikte voedingsmedium en de temperatuur (Sathishkumar et al., 2014). In geval van P. paneum steeg het kiemingspercentage tot 33% waarna stagnatie werd waargenomen tot ruim 50 uur na inoculatie. Dit week sterk af van andere waarnemingen uit onderzoek door Debonne et al. (data niet gepubliceerd). De gebruikte testomstandigheden zoals de pH, temperatuur en groeimedium zijn een mogelijke oorzaak mits een kiemingspercentage rond 90% binnen 10 uur na inoculatie mogelijk is (Chitarra et al., 2004). Dat de kiemende sporen een te lichte kleur verkregen om nog duidelijk waar te kunnen nemen in het YES medium is een andere mogelijke verklaring.

100%

80%

60%

40%

20% % kieming kieming % d.m.v. microscoop

0% 0 10 20 30 40 50 60 Incubatietijd (uur)

FIGUUR 41: Het kiemingspercentage van P. paneum d.m.v. microscopie tot 50 uur na inoculatie in YES medium (pH = 6,04) met incubatie bij 30°C.

100%

80%

60%

40%

20% % kieming kieming % d.m.v. microscoop

0% 0 5 10 15 20 25 30 Incubatietijd (uur)

FIGUUR 42: Het kiemingspercentage van A. niger d.m.v. microscopie tot 26 uur na inoculatie in YES medium (pH = 6,04) met incubatie bij 30°C.

TABEL 16: Overzicht van relevante microscopische waarnemingen (10x40) bij het kiemingsproces van P. paneum en A. niger. Schimmel en momentopname Voorbeelden microscopisch beeld Penicillium paneum

P. paneum zonder incubatie. De sporen zijn klein en donkergrijs gekleurd in YES medium.

P. paneum tijdens incubatie. Initieel gaan bepaalde sporen opzwellen en een lichtere kleur vertonen.

P. paneum met kiembuisvorming.

Aspergillus niger

A. niger zonder incubatie. De sporen zijn klein en zwart gekleurd in YES medium.

A. niger tijdens incubatie. Bepaalde sporen vertonen op een plek een doorzichtig deel aan de buitenkant.

A. niger tijdens incubatie. De sporen vertonen zwelling en een doorzichtig deel waaruit de kiembuis ontstaat.

A. niger met kiembuisvorming.

3.2.4 Tussentijds besluit: gebruik van flowcytometrie voor onderzoek van het kiemingsproces van schimmelsporen Uit de waarnemingen via flowcytometrie kan besloten worden dat het moeilijk is om op voorhand te voorspellen welke veranderingen er zich kunnen voordoen zonder resultaten uit de literatuur met dezelfde proefopzet en meetinstellingen. De resultaten kunnen immers verschillen per schimmelspecies en zijn naast de instellingen ook afhankelijk van de incubatiemethode. Verder is het belangrijk om voldoende frequent metingen uit te voeren om mogelijke veranderingen in de bekomen histogrammen en scatterplots te kunnen opmerken.

Voor P. paneum geïncubeerd in YES medium (pH = 6,04 en T = 25°C) zonder zuur kan de ligging van het scatterplot een beperkte opwaartse verschuiving vertonen zonder indicatie van sporenkieming bij herhaalde en sequentiële metingen. Een indicator van het kiemingsproces is het ontstaan van een ruiscluster in de linkerbenedenhoek van het SSC-FSC scatterplot gepaard met een beperkte uitbreiding van de hoofdcluster wat werd waargenomen vanaf t20 – t29 na inoculatie. Dit gaat gepaard met het ontstaan van een SSC piek links van de originele SSC piek en verbreding van de FSC piek. Met gebruik van azijnzuur werd sporenkieming waargenomen tot een toegevoegde concentratie van 20 mM, dit bij t48. Vanaf 30 mM toegevoegd azijnzuur werd dit minder duidelijk, vanaf 50 mM toegevoegd azijnzuur werd geen sporenkieming waargenomen binnen het beschouwde tijdsinterval.

Voor A. niger geïncubeerd in YES medium (pH = 6,04 en T = 25°C) zonder zuur komt een uitbreiding van de hoofdcluster naar de rechterbovenhoek van het SSC-FSC scatterplot (vanaf t8) niet steeds voor. Een verbreding van de hoofdcluster evenwijdig met de FSC-as (rond t8 – t24) is een betrouwbaardere indicatie voor sporenkieming. Een ruiscluster of het ontstaan van een tweede linkse SSC piek komt echter niet voor zoals bij P. paneum. Met gebruik van azijnzuur werd sporenkieming waargenomen tot een toegevoegde concentratie van 20 mM, dit bij t24. Bij 30 en 40 mM toegevoegd azijnzuur werden deze indicaties minder prominent waargenomen. Vanaf 50 mM toegevoegd azijnzuur werd geen sporenkieming waargenomen binnen het beschouwde tijdsinterval.

Door kleuring met PI en SYTO 13 en gebruik van een warmwaterbad met incubatie bij 30°C, kan kieming in afwezigheid van azijnzuur waargenomen worden voor P. paneum en A. niger respectievelijk tussen t3 – t8 en rond t4,5. Dit wijst op een gestimuleerde sporenkieming bij 30°C en betere warmteoverdracht. Daarnaast zijn de indicatoren die wijzen op sporenkieming duidelijker waarneembaar zoals via verschuivingen binnen de scatterplots op basis van de fluorescentieparameters. Hierbij dient men er zich van bewust te zijn dat flowcytometrie soms sneller aanwijzingen voor sporenkieming weergeeft dan dat men kieming via andere methoden zoals lichtmicroscopie kan waarnemen. Toevoeging van een zwak organisch zuur verlengt echter de lagfase waardoor men sequentiële metingen moet blijven uitvoeren over een voldoende lang tijdsinterval voor informatie rondom verlenging van de lagfase.

3.3 Spectrofotometrie Sporenkieming werd ook in kaart gebracht door gebruik te maken van de YES-methode (Debonne et al., 2019). Deze methode geeft de tijd weer tot een schimmelspore uitgroeit tot driemaal de initiële diameter van de spore (groeifasen: zwelling, hyfegroei, vorming mycelium). Voor de metingen komt dit overeen met een stijging van het OD-signaal met 0,1 als threshold. Het verloop van de OD-curve na deze stijging is van minder belang.

3.3.1 Onderzoek van de invloed van zwakke organische zuren op de sporenontkieming via spectrofotometrie Voor het opmaken van predictieve groei/geen groei modellen voor P. paneum en A. niger, werd de groei van beide schimmels in YES medium opgevolgd. Media met drie verschillende pH- waarden en met toevoeging van verschillende actieve (ongedissocieerde) concentraties zuur berekend op basis van de gemeten pH werden aangemaakt. Voor P. paneum waren de actieve concentraties: azijnzuur (51 – 300 mM), melkzuur (27 – 83 mM) en propionzuur (6 – 30 mM). Voor A. niger waren de actieve concentraties: azijnzuur (5 – 30 mM), melkzuur (27 – 125 mM) en propionzuur (6 – 30 mM). Hogere actieve zuurconcentraties (bijlage 1) werden achterwege gelaten wegens een te groot effect op het OD-achtergrondsignaal of te grote nodige hoeveelheden (zoals melkzuur bij pH = 6,04). Dit met als constante waarden T = 25°C en:

푎푤 = 0,963 ± 0,004 (푛 = 8)

푝퐻1 = 4,75 ± 0,01 (푛 = 6)

푝퐻2 = 5,40 ± 0,02 (푛 = 6)

푝퐻3 = 6,04 ± 0,01 (푛 = 6)

Gebaseerd op voorgaande resultaten en eerder onderzoek door Debonne et al. (2019) werd algemeen een achtergrondsignaal van 0,12 bekomen van het YES medium met een sporenconcentratie van 4,5 log sporen per ml. Zuurtoevoeging kon dit signaal en bijgevolg het startpunt van de groeicurves beïnvloeden.

Uit figuur 43 kan men afleiden dat P. paneum bij pH = 4,75 een langere lagfase had bij toenemende concentraties ongedissocieerd zuur (HA), behalve voor melkzuur zoals te zien volgens de stijgende curves na t0. Bij pH 5,40 en 6,04 werden gelijkaardige verschijnselen waargenomen voor de lagfase binnen 300 uur na inoculatie (bijlage 5). Zonder zuurtoevoeging bij pH 4,75 – 6,04 werd groei steeds gedetecteerd tussen 68 – 92 uur na inoculatie (stijging van het OD-signaal met 0,1 of hoger). Algemeen werd bij de actieve concentraties azijnzuur (AA) vanaf 51 mM (pH 5,40) geen groei waargenomen. Een uitzondering hierop was de OD-stijging bij 59 mM (pH 4,75) met groei na 193 uur. Via toevoeging van melkzuur (LA) werd bij 27 mM (pH 4,75) geen verandering van de lagfase waargenomen. Toevoeging van meer melkzuur (pH

4,75 – 6,04) gaf aanleiding tot troebeler medium en bijgevolg vals positieve resultaten. Hierdoor werden geen conclusies gevormd i.v.m. de lagfase. In geval van propionzuur (PA) werd bij alle onderzochte actieve concentraties (pH 4,75 – 6,04) OD-stijging waargenomen. Bij 6 – 7 mM was het effect verwaarloosbaar mits OD-stijging werd vastgesteld tussen 68 – 92 uur na inoculatie (pH 4,75 – 5,40). Door verhoging van de actieve concentratie kon de lagfase verlengd worden tot 164 uur bij 20 mM (pH 4,75) en tot 212 – 235 uur bij 17 mM (pH 5,40). Bij pH 6,04 werd een OD-stijging waargenomen binnen 20 uur na inoculatie in aanwezigheid van propionzuur (10 – 30 mM). Echter, dit waren vals positieve resultaten te wijten aan het vertroebelen van het medium.

2,0

1,8

1,6 Negatieve controle 1,4 Positieve controle AA 59 mM HA 1,2 AA 119 mM HA 1,0 AA 177 mM HA LA 27 mM HA 0,8

LA 54 mM HA O.D. O.D. signaal (595 nm) 0,6 LA 82 mM HA PA 7 mM HA 0,4 PA 13 mM HA 0,2 PA 20 mM HA

0,0 0 50 100 150 200 250 300 Incubatietijd (uren)

FIGUUR 43: Groeicurves bekomen voor P. paneum in aanwezigheid van verschillende zuurconcentraties in YES medium bij pH = 4,75.

Uit figuur 44 kan men afleiden dat A. niger bij pH = 4,75 eveneens een langere lagfase had bij toenemende concentraties ongedissocieerd zuur (HA) behalve voor melkzuur. Bij pH 5,40 en 6,04 werden gelijkaardige verschijnselen waargenomen voor de lagfase binnen 300 uur na inoculatie (bijlage 5). Zonder zuurtoevoeging bij pH 4,75 – 6,04 werd groei steeds gedetecteerd tussen 44 – 70 uur na inoculatie (stijging van het OD-signaal met 0,1 of hoger). Algemeen werd bij de actieve concentraties azijnzuur (AA) groei waargenomen tot 12 mM (pH 4,75 – 6,04), vanaf 16 mM (pH 5,40) werd geen groei vastgesteld. Een uitzondering hierop was geen groei waargenomen bij 10 mM bij pH 6,04. De verlenging van de lagfase was variabel volgens de pH. Bij pH 4,75 werd voor 6 en 12 mM groei waargenomen respectievelijk tussen 44 – 69 uur

en tussen 91 – 116 uur na inoculatie. Bij pH 5,40 werd voor 5 en 10 mM groei waargenomen respectievelijk tussen 70 – 97 uur en tussen 165 – 189 uur na inoculatie. Via toevoeging van melkzuur (LA) werd bij ≤ 54 mM (pH 4,75 – 5,40) geen verandering van de lagfase waargenomen. Toevoeging van meer melkzuur gaf aanleiding tot troebeler medium en bijgevolg vals positieve resultaten. Hierdoor werden geen conclusies gevormd i.v.m. de lagfase. In geval van propionzuur (PA) werd bij alle onderzochte actieve concentraties (pH 4,75 – 5,40) verlenging van de lagfase waargenomen. Groei werd ten vroegste waargenomen tussen 91 – 121 uur na inoculatie bij 6 – 7 mM (pH 4,75 – 5,40). Voor 11 – 20 mM (pH 4,75 – 5,40) werd algemeen geen groei waargenomen behalve voor 13 mM tussen 237 – 264 uur (pH 4,75). Bij pH 6,04 werd groei waargenomen binnen 20 uur na inoculatie in aanwezigheid van propionzuur (10 – 30 mM). Dit waren vals positieve resultaten te wijten aan het vertroebelen van het medium.

2,0

1,8

1,6 Negatieve controle 1,4 Positieve controle AA 6 mM HA 1,2 AA 12 mM HA 1,0 AA 18 mM HA LA 27 mM HA 0,8

LA 54 mM HA O.D. O.D. signaal (595 nm) 0,6 LA 82 mM HA PA 7 mM HA 0,4 PA 13 mM HA PA 20 mM HA 0,2

0,0 0 50 100 150 200 250 300 Incubatietijd (uren)

FIGUUR 44: Groeicurves bekomen voor A. niger in aanwezigheid van verschillende zuurconcentraties in YES medium bij pH = 4,75.

3.3.2 Groei/geen groei modellering voor de onderzochte schimmels Groei/geen groei modellen werden opgemaakt volgens de methode door Debonne et al. (2019) voor P. paneum en A. niger in aanwezigheid van ongedissocieerd (HA) azijnzuur of propionzuur. Melkzuur werd achterwege gelaten mits dit zuur de sporenkieming mogelijks kon stimuleren en mits hoge concentraties melkzuur zorgden voor vals positieve groeiresultaten te wijten aan de vertroebeling van het medium. Voor propionzuur werd enkel de data verwerkt die werd bekomen via metingen bij pH = 4,75 en 5,40 mits bij pH = 6,04 afwijkende resultaten werden bekomen met o.a. sterke vertroebeling van het staal door toevoeging van een grotere hoeveelheid calciumpropionaat. De bekomen ranges van de concentraties actief zuur (HA) zijn voor P. paneum 0 – 300 mM azijnzuur en 0 – 20 mM propionzuur. Voor A. niger zijn dit 0 – 18 mM azijnzuur en 0 – 20 mM propionzuur.

De geschatte parameters van de modellen en de goodness-of-fit statistieken staan opgesomd in tabel 17 voor P. paneum en tabel 18 voor A. niger. De modellen worden weergegeven door figuur 45. Op basis hiervan kon men handmatig de minimale inhiberende concentraties (MIC) van ongedissocieerd azijnzuur en propionzuur in YES medium na 300 uur incubatie bij 25°C afleiden (tabel 19). Bij de opgemaakte modellen merkt men een dalend gedeelte van de curves in geval van azijnzuur, dit is een intrinsieke fout van het model.

Algemeen kon men besluiten dat de onderzochte schimmels volgens de deelexperimenten ongeveer even gevoelig waren voor propionzuur, gevoeliger waren voor propionzuur dan voor azijnzuur en dat A. niger een grotere gevoeligheid vertoonde voor azijnzuur in vergelijking met P. paneum.

TABEL 17: Modelfactoren met hun geschatte waarde met standaarddeviatie en goodness-of-fit statistieken van de groei/geen groei modellen voor P. paneum in aanwezigheid van niet gedissocieerd azijnzuur of propionzuur. Azijnzuur Propionzuur Factoren Geschatte waarde p-waarde Geschatte waarde p-waarde Concentratie −0,131 ± 0,021 < 0,001 −0,268 ± 0,110 0,015 Tijd 3,126 ± 0,599 < 0,001 2,117 ± 0,348 < 0,001 Tijd*Tijd −0,170 ± 0,037 < 0,001 ns Concentratie* ns 0,017 ± 0,007 0,014 Concentratie Concentratie*Tijd ns −0,085 ± 0,020 < 0,001 Constante −7,729 ± 1,582 < 0,001 −5,577 ± 1,035 < 0,001 Statistieken Nagelkerke R² 0,899 0,806 c-waarde 0,992 ± 0,002 0,968 ± 0,007 (ROC-curve) % correct 97,1 88,8 voorspeld ns: niet significant; de factor concentratie stelt hier de actieve (ongedissocieerde) concentratie van het zuur voor.

TABEL 18: Modelfactoren met hun geschatte waarde met standaarddeviatie en goodness-of-fit statistieken van de groei/geen groei modellen voor A. niger in aanwezigheid van niet gedissocieerd azijnzuur of propionzuur. Azijnzuur Propionzuur Parameters Geschatte waarde p-waarde Geschatte waarde p-waarde Concentratie −0,310 ± 0,108 0,004 −0,834 ± 0,111 < 0,001 Tijd 2,474 ± 0,307 < 0,001 2,500 ± 0,437 < 0,001 Concentratie*Tijd −0,033 ± 0,017 0,045 ns Tijd*Tijd −0,126 ± 0,023 < 0,001 −0,105 ± 0,026 < 0,001 Constante −5,118 ± 0,780 < 0,001 −5,558 ± 1,179 < 0,001 Statistieken Nagelkerke R² 0,790 0,875 c-waarde 0,960 ± 0,007 0,986 ± 0,004 (ROC-curve) % correct 85,4 93,8 voorspeld ns: niet significant; de factor concentratie stelt hier de actieve (ongedissocieerde) concentratie van het zuur voor.

FIGUUR 45: In-vitro groei/geen groei modellen voor P. paneum (bovenaan) en A. niger (onderaan) in YES medium in aanwezigheid van bepaalde concentraties (mM) niet gedissocieerd azijnzuur (links) of propionzuur (rechts), geïncubeerd bij 25°C. De krommen stellen het logistisch regressiemodel voor ter voorspelling: p = 0,9 (volle lijn), p = 0,5 (onderbroken lijn) en p = 0,1 (stippellijn).

TABEL 19: Minimale inhiberende concentraties van ongedissocieerd azijnzuur en propionzuur in YES medium na 300 uur incubatie bij 25°C, handmatig afgeleid uit de groei/geen groei modellen, uitgedrukt in functie van de voorspellingslimieten (p = 0,9 en 0,1). Penicillium paneum Aspergillus niger Azijnzuur p = 0,9 35 mM p = 0,9 8 mM p = 0,1 68 mM p = 0,1 15 mM Propionzuur p = 0,9 15 mM p = 0,9 8 mM p = 0,1 21 mM p = 0,1 14 mM

3.3.3 Tussentijds besluit: gebruik van spectrofotometrie voor onderzoek van het kiemingsproces van schimmelsporen Via de opgestelde groeicurves en modellen kan men algemeen besluiten dat spectrofotometrie een geschikte methode is voor statistische verwerking en onderzoek van de lagfase bij sporenkieming met een beperkte nodige arbeid. Door bij de YES-methode rekening te houden met de dissociatie van de toegevoegde zuren in functie van de pH, kan men correcter de bekomen resultaten rapporteren.

Voor de onderzochte schimmels kan men algemeen concluderen dat het effect van de toegevoegde zuren naast de concentratie ook afhankelijk is van de schimmelspecies en de pH. Voor beide schimmels bleek de pH (4,75 – 6,04) op zich echter geen duidelijke invloed te hebben mits groei bij de positieve controles (zonder zuur) rond dezelfde tijdstippen werd waargenomen. Men kan dus besluiten dat de pH geen rechtstreekse invloed uitoefent op de groei van deze twee broodschimmels, maar wel een onmiskenbaar effect heeft op de activatie van zwakke organische zuren. Bijgevolg is de pH zeer belangrijk binnen het kader van conservering.

Voor P. paneum werd geen groei waargenomen vanaf een actieve concentratie van 51 mM azijnzuur (uitgezonderd groei bij 59 mM azijnzuur bij pH = 4,75 na 193 uur). Voor propionzuur werd een verlenging van de lagfase waargenomen tot 212 – 235 uur na inoculatie bij een actieve concentratie van 17 mM (pH = 5,40). Bij melkzuur werden vals positieve resultaten bekomen door vertroebeling van het medium. Bij onderzoek van A. niger werd geen groei waargenomen vanaf een actieve concentratie van 16 mM azijnzuur (pH = 5,40). Voor propionzuur werd, naast een verlenging van de lagfase tot 237 – 264 uur na inoculatie bij een actieve concentratie van 13 mM (pH = 4,75), algemeen geen groei waargenomen vanaf een actieve concentratie van 11 mM (pH = 5,40). Voor melkzuur werden opnieuw vals positieve resultaten bekomen.

De bekomen resultaten (lagfase en concentratie) zonder zuur en bij toevoeging van azijnzuur kunnen vergeleken worden met de resultaten via flowcytometrie. Dit komt aan bod bij de algemene discussie.

4 Algemene discussie

4.1 Sporenkieming bij condities zonder zuur Volgens de literatuur vertoont Aspergillus niger optimale groei bij 35 – 37°C, pH = 6 en wateractiviteit = 0,97 (Krijgsheld et al., 2013). Optimale condities voor sporenkieming kunnen enigszins variëren zoals voor A. niger bij 30 – 34°C en een pH rond 4,5 met ≥ 70% kieming binnen zes uur na inoculatie (Abdel-Rahim & Arbab, 1985; Van Leeuwen et al., 2013). Penicillium paneum vertoont optimale groei bij 23 – 25°C, pH binnen 1,5 – 11,0 en wateractiviteit > 0,90 (Devlieghere, 2017; dos Santos, Chaves, & Sant’Ana, 2017) waarbij optimale waarden voor wateractiviteit en pH kunnen variëren per onderzoek voor Penicillium spp. volgens de eigenschappen van de gebruikte voedingsmedia (Abellana et al., 2001). De gebruikte testomstandigheden beïnvloeden ook het kiemingsproces, afhankelijk van de proefopzet is een kiemingspercentage rond 90% binnen 10 uur na inoculatie mogelijk (Chitarra et al., 2004). Door middel van flowcytometrie werd in deze masterproef aangetoond dat de sporen van beide schimmels sneller kiemen bij 30°C dan bij 25°C in het YES medium (pH = 6,04). In dit medium vertonen beide schimmels bij 30°C een tragere stijging van het kiemingspercentage (opgevolgd via microscopie) in vergelijking met andere onderzoeksresultaten. Een mogelijke oorzaak zijn de gebruikte testomstandigheden zoals de pH, temperatuur en groeimedium (Chitarra et al., 2004; Sathishkumar et al., 2014). In beide gevallen vertonen de schimmelsporen isotropische groei (zwelling) gevolgd door vorming van de sporenkiembuis zoals besproken door Van Leeuwen et al. (2013) en Vashishta et al. (2016). Kenmerkend bij A. niger is de afstoting van de buitenste laag van de celwand zoals beschreven door Tiedt (1993). Bij P. paneum breekt de buitenste laag van de celwand bij sporenkieming. De onderliggende lagen en het celmembraan breiden zich hierbij uit voor de vorming van de kiembuis (Vashishta et al., 2016).

In vergelijking met microscopie kan men via flowcytometrie het begin van de sporenkieming vroeger detecteren. Bij metingen met flowcytometrie (T = 30 °C, met kleuring) werd de kieming van P. paneum en A. niger respectievelijk tussen 3 – 8 uur en rond 4,5 uur na inoculatie waargenomen. Bij 25°C (zonder kleuring) werd sporenkieming respectievelijk tussen 20 – 29 uur en tussen 8 – 24 uur na inoculatie waargenomen. Verder kon ook uit de optische densiteit- metingen sporenkieming/groei worden vastgelegd respectievelijk tussen 68 – 92 uur en tussen 44 – 70 uur na inoculatie (T = 25°C). Wanneer men het begin van de sporenkieming in YES medium onderzoekt via optische densiteit, dan blijkt de pH (4,5 – 6,0) geen rechtstreekse invloed te hebben op de groei van P. paneum en A. niger. Algemeen heeft de wateractiviteit een grotere invloed op de groei van broodschimmels dan de pH (Suhr & Nielsen, 2004).

4.2 Gebruik van zwakke organische zuren Naast de eigenschappen van het voedingsmedium en de meetmethode hebben andere factoren een invloed op de sporenkieming. Zo kan een voldoende hoge sporenconcentratie van P. paneum de sporenkieming afremmen door vorming van de zelfinhibitor 1-octeen-3-ol (Chitarra et al., 2004). Bij een sporenconcentratie van 6,5 log/ml vormt dit geen probleem en kan men gepaste metingen uitvoeren via flowcytometrie zoals aangetoond in deze masterproef. De sporenkieming kan verder onderdrukt worden door toevoeging van zwakke organische zuren zoals azijnzuur, melkzuur en propionzuur. Volgens de literatuur kan dit effect variëren volgens de schimmelspecies. Zoals aangetoond via de bekomen predictieve modellen werd dit duidelijk waargenomen voor azijnzuur bij onderzoek van P. paneum en A. niger in deze masterproef. Dit kan doordat deze verbindingen mogelijks gemetaboliseerd worden of doordat de schimmels een andere methode hebben om de homeostase te behouden (Gerez et al., 2009; Marín et al., 2002; Sofos & Busta, 1981).

Volgens de literatuur heeft propionzuur een zwakker antifungaal effect dan sorbinezuur dewelke doorgaans vaak in bakkerijproducten wordt toegepast (Saranraj & Geetha, 2012; Suhr & Nielsen, 2004). Azijnzuur heeft een zwakker antifungaal effect dan propionzuur (Smith et al., 2004). Voor conservering gebruikt men algemeen 0,1% propionzuur of 0,2% calciumpropionaat (Suhr & Nielsen, 2004) waarbij lagere concentraties kunnen leiden tot verlies van het antifungaal effect (Lourenço et al., 2011). 2% azijnzuur heeft voor verschillende schimmels een volledig groei-inhiberend effect maar niet alle schimmelsoorten zijn even gevoelig (Deschuyffeleer et al., 2012). Via de resultaten uit deze masterproef bij pH = 6,04 en T = 25°C werd via flowcytometrie sporenkieming van P. paneum en A. niger waargenomen tot een toegevoegde concentratie van 20 mM azijnzuur. Vanaf een toegevoegde concentratie van 30 mM azijnzuur werd de kieming minder duidelijk of prominent waargenomen, vanaf 50 mM werd geen kieming waargenomen binnen het beschouwde tijdsinterval (tot 80 – 96 uur na inoculatie). Bij pH = 6,04 heeft azijnzuur een dissociatiepercentage van 94,7 %. Voor P. paneum zijn er geen vergelijkbare gegevens voor overeenkomstige actieve concentraties azijnzuur gebruikt via spectrofotometrie. Voor A. niger werd bij pH = 6,04 geen groei waargenomen via spectrofotometrie vanaf een actieve concentratie van 10 mM azijnzuur. Bij pH 4,75 – 5,40 werd groei waargenomen via spectrofotometrie bij actieve concentratie 5 – 6 mM azijnzuur tussen 44 – 97 uur na inoculatie wat wijst op een beperkte tot geen verlenging van de lagfase. Een mogelijke verklaring voor dit verschil is een snelle kieming van de schimmelsporen van A. niger tussen 80 – 97 uur na inoculatie waardoor de kieming via flowcytometrie (nagegaan tot 80 uur na inoculatie) niet werd waargenomen.

Voor melkzuur is enerzijds een tienvoudig hogere concentratie nodig bij een lagere zuurtegraad zoals pH = 3,5 voor een gelijkaardig antifungaal effect zoals bij andere zuren (Gerez et al., 2009). Anderzijds kunnen bepaalde schimmels melkzuur metaboliseren waardoor een

groeistimulerend effect mogelijk is (Deschuyffeleer, Devlieghere, & Eeckhout, 2012). Via flowcytometrie werd in deze masterproef waargenomen dat lagere concentraties melkzuur de sporenkieming niet afremmen maar mogelijks kunnen stimuleren. Daarnaast werden via spectrofotometrie bij hogere actieve concentraties melkzuur vals positieve resultaten bekomen door vertroebeling van het medium.

4.3 Flowcytometrie voor sporenonderzoek van schimmels Volgens verschillende bronnen kunnen schimmelsporen gedetecteerd worden via flowcytometrie (Allman, 1992; Bradner & Nevalainen, 2003; Brul et al., 1997; Chen & Li, 2005; Day et al., 2002; Gourmet et al., 1997; Kullman, 2000; Liang et al., 2013; Marr et al., 2001; Morris, Boddy, & Allman, 1992; Prigione et al., 2004; Vanhauteghem et al., 2017). De resultaten in deze masterproef tonen aan dat kwantificatie van sporensuspensies via flowcytometrie de resultaten via microscopie en uitplating goed benadert. Via flowcytometrie kan men bovendien sneller resultaten bekomen met een kleinere standaarddeviatie dan via de telplaatmethode.

Volgens de literatuur kan een onderscheid gemaakt worden tussen partikels zoals schimmelsporen van verschillende groottes via verschillende pieken in het FSC- frequentiehistogram. Om onderscheid beter mogelijk te maken kan men werken met kleurstoffen en puntenplots (Day et al., 2002). Hierbij is soms een onderscheid mogelijk tussen individuele en gekoppelde sporen op basis van de bekomen frequentiehistogrammen en scatterplots. Indien dit mogelijk is via het FSC-frequentiehistogram dan kan men sporensuspensies kwantificeren zoals aangetoond door Prigione et al. (2004) via de som van de integraal van de piek voor de individuele sporen en het dubbel van de integraal van de piek van de gekoppelde sporen. Uit dit onderzoek bleek dit niet mogelijk te zijn via het SSC- frequentiehistogram. De grafieken bekomen via flowcytometrie binnen deze masterproef tonen aan dat een onderscheid tussen individuele en gekoppelde sporen kan gemaakt worden via het SSC-FSC scatterplot. Dit onderscheid is echter niet steeds waarneembaar via de FSC- en SSC- frequentiehistogrammen. De herrekende sporenconcentraties in log per ml tonen daarentegen aan dat dit geen significant verschil uitmaakt.

Volgens Allman (1992) en Bradner & Nevalainen (2003) kan men voor schimmels subpopulaties onderscheiden wat mogelijks wijst op sporen in een verschillend ontwikkelingsstadium of kiemingsfase. Door Bradner & Nevalainen (2003) werd aangetoond dat een volledige cluster in het SSC-FSC scatterplot kan verschuiven volgens de FSC-as door hogere FSC-waarden bij kieming van schimmelsporen. Daarnaast werd beschreven door Kullman (2000) dat men fungale cellen zoals van S. cerevisiae in een verschillende fase van de celcyclus kan onderscheiden door verschillende FSC pieken. De grafieken bekomen via flowcytometrie binnen deze masterproef tonen aan dat een volledige verschuiving van de cluster in het SSC-FSC scatterplot of het ontstaan van bepaalde pieken in de

frequentiehistogrammen niet steeds waarneembaar is. De veranderingen die wijzen op sporenkieming zijn afhankelijk van de onderzochte schimmel en omvatten o.a. vormverandering en het ontstaan of de afscheiding van nieuwe pieken of clusters bij de frequentiehistogrammen en scatterplots. Dit is echter ook afhankelijk van de incubatiemethode en het gebruik van kleurstoffen.

Verder werd er door Cronin & Wilkinson (2007) aangetoond dat men op basis van de fluorescentieparameters een onderscheid kan maken tussen sporen of cellen (zoals B. cereus endosporen) in een andere toestand zoals levend, kiemend of beschadigd door een andere ligging van de clusters in de scatterplots. De figuren in de masterproef bevestigen dit voor schimmelsporen waarbij voor kiemende schimmelsporen verschuivingen binnen de scatterplots op basis van de fluorescentieparameters werden waargenomen. Daarnaast werd door Mandy et al. (1995) en Shapiro (2003) beschreven dat men via gating kan differentiëren tussen verschillende groepen om een specifieke puntengroep te analyseren. Volgens de resultaten uit deze masterproef is dit niet steeds mogelijk via gating van clusters doordat er bij bepaalde scatterplots enkel vormveranderingen of verschuivingen van volledige clusters plaatsvinden binnen een bepaalde tijdsduur na inoculatie. Hierbij kan men wel gating bij de frequentiehistogrammen overwegen indien nieuwe pieken werden waargenomen.

5 Besluit

5.1 Voornaamste bevindingen In deze masterproef werd onderzocht of flowcytometrie een geschikte techniek is voor kwantificatie van sporensuspensies voor verschillende schimmelgeslachten. Dit werd duidelijk aangetoond in vergelijking met microscopie en telplaten. Verder werd aangetoond dat men via flowcytometrie de sporenkieming kan visualiseren via frequentiehistogrammen en scatterplots. Gebruik van een warmwaterbad en kleuring van de schimmelsporen met PI en SYTO 13 kunnen hierbij zorgen voor duidelijkere indicaties rondom kieming/geen kieming. Referenties zijn hierbij nodig mits visualisering van het kiemingsproces afhankelijk is van de onderzochte schimmel en de testomstandigheden zoals temperatuur, kleuring en gebruikte stoffen of media. Ten slotte werd het effect van conserveringstechnieken op de sporenkieming in kaart gebracht. Hierbij bleek de YES-methode door Debonne et al. (2019) via spectrofotometrie geschikt te zijn voor het opmaken van predictieve modellen op basis van de bekomen groeicurves. De zuurtegraad van het medium had geen duidelijke rechtstreekse invloed op de sporenkieming voor pH 4,75 – 6,04. Een indirecte invloed werd echter duidelijk bij toevoeging van zuren doordat de pH bepalend is voor de dissociatiegraad en bijgevolg het antifungaal effect van de zuren.

Bij vergelijking van flowcytometrie en spectrofotometrie kan men algemeen stellen dat geen van beide methoden beter is dan de andere voor onderzoek van schimmelsporen. Men dient de methode te kiezen volgens de gegevens die men wenst en de beschikbare middelen. Spectrofotometrie is eenvoudiger uitvoerbaar en levert eenduidige resultaten die geschikt zijn voor dataverwerking en het opmaken van predictieve modellen. Flowcytometrie vergt meer voorbereidende stappen, frequentere metingen om mogelijke verschijnselen te kunnen waarnemen en meer kennis voor interpretatie van de bekomen figuren. Deze methode heeft via kleuring en de verschillende instellingen meer mogelijkheden voor het onderscheiden van cellen en sporen van een verschillende aard of in een verschillende toestand zoals intact, beschadigd, zwellend of groeiend.

5.2 Aanbevelingen De resultaten van deze masterproef geven niet zozeer aanleiding tot aanbevelingen voor conservering, maar wel voor verder onderzoek. Allereerst is het aangeraden om zuurconcentraties om te rekenen tot de actieve zuurconcentraties op basis van de zuurtegraad indien mogelijk. Dit kan vergelijking van resultaten bij verschillende proefopstellingen vereenvoudigen. Voor gelijkaardig onderzoek met gebruik van flowcytometrie en spectrofotometrie kan men enerzijds meerdere verschillende zuurconcentraties aanwenden. Bijvoorbeeld lagere concentraties azijnzuur of andere concentraties melkzuur bij onderzoek van P. paneum via spectrofotometrie. Anderzijds kan men ook kiezen om het effect van andere stoffen via deze methodes te onderzoeken zoals sorbinezuur, bicarbonaat, fermentaten en

andere alternatieven voor conservering van brood. Indien mogelijk kan een nieuwe proefopzet gebruikt worden om een duidelijk verband te leggen tussen de resultaten via flowcytometrie en spectrofotometrie.

Voor onderzoek van de sporenkieming van P. paneum en A. niger kunnen nog andere media onderzocht worden. Hierbij kan men verder nagaan welke proefopstelling beter de sporenkieming bij brood nabootst op vlak van verlenging van de lagfase. Daarnaast kan onderzocht worden wat gepaste staalvoorbereidingen van verschillende broodtypes met schimmelsporen zijn voor onderzoek via flowcytometrie of spectrofotometrie. Hierbij zal men rekening moeten houden met bemoeilijking van het onderzoek door andere partikels zoals reeds gekend is voor onderzoek van luchtstalen met verschillende types schimmelsporen en pollen.

Ten slotte kan men de samenstelling van verschillende schimmelklassen gerelateerd aan de concentratie steroïden in het membraan onderzoeken. Hierbij kan men nagaan of er een verschil bestaat tussen schimmelklassen en een mogelijk effect op de gevoeligheid van schimmels voor conservering. Daarnaast kan men onderzoeken of de veranderingen waargenomen via flowcytometrie die wijzen op sporenkieming eigen zijn aan het genus van de schimmel zoals Penicillium spp. en Aspergillus spp. ofwel afhankelijk zijn van het species zelf.

Bibliografie

Abdel-Rahim, A. M., & Arbab, H. A. (1985). Factors affecting spore germination in Aspergillus niger. Mycopathologia, 89(2), 75–79.

Abellana, M., Sanchis, V., & Ramos, A. J. (2001). Effect of water activity and temperature on growth of three Penicillium species and Aspergillus flavus on a sponge cake analogue. International Journal of Food Microbiology, 71(2–3), 151–157.

Adams, T. H., Wieser, J. K., & Yu, J. H. (1998). Asexual sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(1), 35–54.

Allman, R. (1992). Characterisation of fungal spores using flow cytometry. Mycological Research, 96(12), 1016–1018.

Arneborg, N., Jespersen, L., & Jakobsen, M. (2000). Individual cells of Saccharomyces cerevisiae and Zygosaccharomyces bailii exhibit different short-term intracellular pH responses to acetic acid. Archives of Microbiology, 174(1–2), 125–128.

Audenaert, K. (2015). Celbiologie. Gent: Universiteit Gent. Faculteit Bio- ingenieurswetenschappen.

Bacon, C. W., Sussman, A. S., & Paul, A. G. (1973). Identification of a self-inhibitor from spores of Dictyostelium discoideum. Journal of Bacteriology, 113(2), 1061–1063.

Bartnicki-Garcia, S., & Lippman, E. (1977). Polarization of cell wall synthesis during spore germination of Mucor rouxii. Experimental Mycology, 1(3), 230–040.

Berni, E., & Scaramuzza, N. (2013). Effect of ethanol on growth of Chrysonilia sitophila ('the red bread mould’) and Hyphopichia burtonii ('the chalky mould’) in sliced bread. Letters in Applied Microbiology, 57(4), 344–349.

Beuchat, L. R. (1987). Food and beverage mycology (Second edition). New York: Van Nostrand Reinhold. Springer Science & Business Media.

Blum, H., Beier, H., & Gross, H. J. (1987). Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis, 8(2), 93–99.

Bowman, S. M., & Free, S. J. (2006). The structure and synthesis of the fungal cell wall. BioEssays, 28(8), 799–808.

Boysen, M., Skouboe, P., Frisvad, J. C., & Rossen, L. (1996). Reclassification of the Penicillium roqueforti group into three species on the basis of molecular genetic and biochemical profiles. Microbiology, 142(3), 541–549.

Bradner, J. R., & Nevalainen, K. M. H. (2003). Metabolic activity in filamentous fungi can be analysed by flow cytometry. Journal of Microbiological Methods, 54(2), 193–201.

Brul, S., Nussbaum, J., & Dielbandhoesing, S. K. (1997). Fluorescent probes for wall porosity and membrane integrity in filamentous fungi. Journal of Microbiological Methods, 28(3), 169–178.

Campbell, N. A., Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., & Jackson, R. B. (2008). Biology (Eighth edition). London: Pearson Education, Inc.

Carmo, E. S., Lima, E. D. O., & De Souza, E. L. (2008). The potential of Origanum vulgare L. (Lamiaceae) essential oil in inhibiting the growth of some food-related Aspergillus species. Brazilian Journal of Microbiology, 39(2), 362–367.

Cauvain, S. (2015). Technology of breadmaking. Technology of breadmaking (Third edition). Cham: Springer International Publishing.

Cauvain, S., & Young, L. (2007). Technology of breadmaking (Second edition). New York: Springer Science & Business Media, LLC.

Chen, P. S., & Li, C. S. (2005). Sampling performance for bioaerosols by flow cytometry with fluorochrome. Aerosol Science and Technology, 39(3), 231–237.

Cherrington, C. A., Hinton, M., & Chopra, I. (1990). Effect of short‐chain organic acids on macromolecular synthesis in Escherichia coli. Journal of Applied Bacteriology, 68(1), 69– 74.

Chitarra, G. S., Breeuwer, P., Nout, M. J. R., Van Aelst, A. C., Rombouts, F. M., & Abee, T. (2003). An antifungal compound produced by Bacillus subtilis YM 10-20 inhibits germination of Penicillium roqueforti conidiospores. Journal of Applied Microbiology, 94(2), 159–166.

Chitarra, G. S., Abee, T., Rombouts, F. M., Posthumus, M. A., & Dijksterhuis, J. (2004). Germination of Penicillium paneum conidia is regulated by 1-Octen-3-ol, a volatile self- inhibitor. Applied and Environmental Microbiology, 70(5), 2823–2829.

Cronin, U. P., & Wilkinson, M. G. (2007). The use of flow cytometry to study the germination of Bacillus cereus endospores. Cytometry Part A, 71A(3), 143–153.

D’Enfert, C. (1997). Fungal spore germination: insights from the molecular genetics of Aspergillus nidulans and Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology, 21(2), 163– 172.

D’Enfert, C., Bonini, B. M., Zapella, P. D. A., Fontalne, T., Da Silva, A. M., & Terenzi, H. F. (1999). Neutral trehalases catalyse intracellular trehalose breakdown in the filamentous fungi Aspergillus nidulans and Neurospora crassa. Molecular Microbiology, 32(3), 471– 483.

Davidson, M. P., Taylor, M. T., & Schmidt, S. E. (2013). Chemical preservatives and natural antimicrobial compounds. In M. P. Doyle & R. L. Buchanan (Eds.), Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers (Fourth edition, pp. 765–801). Wachington, DC: ASM Press.

Day, J., Kell, D. B., & Griffith, G. W. (2002). Differentiation of Phytophthora infestans sporangia from other airborne biological particles by flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology, 68(1), 37–45. de Hoog, G. S., Guarro, J., Gené, J., & Figueras, M. J. (2000). Atlas of clinical fungi (Second edition). Utrecht: Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS).

De Leyn, I. (2018). Graantechnologie: theorie en oefeningen. Gent: Universiteit Gent. Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen.

Debonne, E., Vermeulen, A., Van Bockstaele, F., Soljic, I., Eeckhout, M., & Devlieghere, F. (2019). Growth/no-growth models of in-vitro growth of Penicillium paneum as a function of thyme essential oil, pH, aw, temperature. Food Microbiology, 83, 9–17.

Deschuyffeleer, N., Audenaert, K., Samapundo, S., Ameye, S., Eeckhout, M., & Devlieghere, F. (2011). Identification and characterization of yeasts causing chalk mould defects on par- baked bread. Food Microbiology, 28(5), 1019–1027.

Deschuyffeleer, N., Devlieghere, F., & Eeckhout, M. (2012). Alternative techniques for the prevention of spoilage of industrial bakery products by fungi based upon predictive modelling (Diss. doct. applied biological sciences). UGent. Faculty of Bioscience Engineering. Department of food safety and food quality. Geraadpleegd via http://lib.ugent.be/catalog/rug01:001961657

Devlieghere, F. (2017). Levensmiddelenmicrobiologie en– conservering. Gent: Universiteit Gent. Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen.

Dijksterhuis, J., Nijsse, J., Hoekstra, F. A., & Golovina, E. A. (2007). High viscosity and anisotropy characterize the cytoplasm of fungal dormant stress-resistant spores. Eukaryotic Cell, 6(2), 157–170. dos Santos, J. L. P., Chaves, R. D., & Sant’Ana, A. S. (2017). Estimation of growth parameters of six different fungal species for selection of strains to be used in challenge tests of bakery products. Food Bioscience, 20, 62–66. dos Santos, J. L. P., Silva, B. S., Furtado, M. M., Morassi, L. L. P., Vermeulen, A., & Sant’Ana, A. S. (2018). The application of growth-no growth models to directly assess the stability of wholemeal multigrain bread towards Penicillium paneum LMQA-002 and Paecilomyces variotii LMQA-001. LWT - Food Science and Technology, 97, 231–237.

Dyer, P. S., & O’Gorman, C. M. (2012). Sexual development and cryptic sexuality in fungi: insights from Aspergillus species. FEMS Microbiology Reviews, 36(1), 165–192.

Dyer, P. S., & Paoletti, M. (2005). Reproduction in Aspergillus fumigatus: sexuality in a supposedly asexual species? Medical Mycology, 43, S7–S14.

Europese Unie (EU). (2011). Verordening (EU) Nr. 1129/2011 Van de Commissie van 11 november 2011 tot wijziging van bijlage II bij Verordening (EG) nr. 1333/2008 van het Europees Parlement en de Raad door opstelling van een EU-lijst van levensmiddelenadditieven. Publicatieblad van de Europese Unie.

Fesel, P. H., & Zuccaro, A. (2016). β-glucan: crucial component of the fungal cell wall and elusive MAMP in plants. Fungal Genetics and Biology, 90, 53–60.

Fillinger, S., Chaveroche, M. K., van Dijck, P., de Vries, R., Ruijter, G., Thevelein, J., & D’Enfert, C. (2001). Trehalose is required for the acquisition of tolerance to a variety of stresses in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Microbiology, 147, 1851–1862.

Frazier, W. C., Westoff, D. C., & Vanitha, K. N. (1971). Food microbiology (Fifth edition). New York: McGraw-Hill Education.

Frisvad, J. C., & Samson, R. A. (2004). Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus Penicillium: a guide to identification of food and air-borne terverticillate Penicillia and their mycotoxins. Studies in Mycology, 49, 1–173.

Geiser, D. M. (2009). Sexual structures in Aspergillus: morphology, importance and genomics. Medical Mycology, 47, S21–S26.

Gerez, C. L., Torino, M. I., Rollán, G., & Font de Valdez, G. (2009). Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties. Food Control, 20(2), 144– 148.

Glass, N. L., Rasmussen, C., Roca, M. G., & Read, N. D. (2004). Hyphal homing, fusion and mycelial interconnectedness. Trends in Microbiology, 12(3), 135–141.

Gottlieb, D. (1973). Endogenous inhibitors of spore germination. Phytopathology, 63, 1326– 1327.

Gourmet, C., Gray, L. E., & Rayburn, A. L. (1997). Flow cytometric analysis of conidia of fungi isolated from soybean vascular tissue. Journal of Phytopathology, 145(8–9), 405– 408.

Guynot, M. E., Ramos, A. J., Setó, L., Purroy, P., Sanchis, V., & Marín, S. (2003). Antifungal activity of volatile compounds generated by essential oils against fungi commonly causing deterioration of bakery products. Journal of Applied Microbiology, 94(5), 893–899.

Harris, S. D. (2006). Cell polarity in filamentous fungi: shaping the mold. International Review of Cytology, 251, 41–77.

Harris, S. D., & Momany, M. (2004). Polarity in filamentous fungi: moving beyond the yeast paradigm. Fungal Genetics and Biology, 41(4), 391–400.

Haynes, J. L. (1988). Principles of flow cytometry. Cytometry. Supplement: The Journal of the Society for Analytical Cytology, 3, 7–17.

Hohl, T. M., & Feldmesser, M. (2007). Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryotic Cell, 6(11), 1953–1963.

International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMFS). (2005). Microorganisms in foods 6: microbial ecology of food commodities (Second edition). New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers.

Invitrogen. (2006). Propidium iodide nucleic acid stain. Thermo Fisher Scientific. Geraadpleegd op 17 november 2018, via https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P1304MP

Kalathenos, P., & Russell, N. J. (2003). Ethanol as a food preservative. In N. J. Russel & G. W. Gould (Eds.), Food Preservatives (pp. 196–217). Boston: Springer, Boston, MA.

Karaoglu, M. M., Kotancilar, H. G., & Gurses, M. (2005). Microbiological characteristics of part-baked white pan bread during storage. International Journal of Food Properties, 8(2), 355–365.

Katsinis, G., Rigas, F., & Doulia, D. (2008). Synergistic effect of chemical preservatives with ethanol on the microbial shelf life of bread by factorial design. International Journal of Food Science and Technology, 43(3), 208–215.

Kohli, M., Galati, V., Boudier, K., Roberson, R. W., & Philippsen, P. (2008). Growth-speed- correlated localization of exocyst and polarisome components in growth zones of Ashbya gossypii hyphal tips. Journal of Cell Science, 121(23), 3878–3889.

Krijgsheld, P., Bleichrodt, R., van Veluw, G. J., Wang, F., Müller, W. H., Dijksterhuis, J., & Wösten, H. A. B. (2013). Development in Aspergillus. Studies in Mycology, 74(1), 1–29.

Kullman, B. (2000). Application of flow cytometry for estimation of nuclear DNA content in fungi. Folia Cryptogamica Estonica, 36, 31–46.

Lainez, E., Vergara, F., & Bárcenas, M. E. (2008). Quality and microbial stability of partially baked bread during refrigerated storage. Journal of Food Engineering, 89(4), 414–418.

Lallemand Inc. (n.d.). Lallemand baking update: a guide to baking preservatives. Lallemand Inc. Geraadpleegd via http://www.lallemand.com/BakerYeastNA/eng/PDFs/LBU PDF FILES/1_5PRESV.PDF

Legan, J. D. (1993). Mould spoilage of bread: the problem and some solutions. International Biodeterioration and Biodegradation, 32(1–3), 33–53.

Legan, J. D., & Voysey, P. A. (1991). Yeast spoilage of bakery products and ingredients. Journal of Applied Bacteriology, 70(5), 361–371.

Levetin, E. (2013). Session 1202: basic aeroallergen course - Fungal spore morphology. Tulsa (Oklahoma): The University of Tulsa. Geraadpleegd via https://aaaai.confex.com/aaaai/2013/recordingredirect.cgi/oid/Handout356/Spore morphology Presentation.pdf

Liang, L., Engling, G., Cheng, Y., Duan, F., Du, Z., & He, K. (2013). Rapid detection and quantification of fungal spores in the urban atmosphere by flow cytometry. Journal of Aerosol Science, 66, 179–186.

LifeTechnologies. (2014). SYTO green-fluorescent nucleic acid stains. Thermo Fisher Scientific. Geraadpleegd op 17 november 2018, via https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S7575

Lourenço, A. B., Ascenso, J. R., & Sá-Correia, I. (2011). Metabolic insights into the yeast response to propionic acid based on high resolution 1H NMR spectroscopy. Metabolomics, 7(4), 457–468.

Luppens, S. B. I., Barbaras, B., Breeuwer, P., Rombouts, F. M., & Abee, T. (2003). Selection of fluorescent probes for flow cytometric viability assessment of Listeria monocytogenes exposed to membrane-active and oxidizing disinfectants. Journal of Food Protection, 66(8), 1393–1401.

Mandy, F. F., Bergeron, M., & Minkus, T. (1995). Principles of flow cytometry. Transfusion Science, 16(4), 303–314.

Marei, G. I. K., & Abdelgaleil, S. A. M. (2012). Comparative antifungal activities and biochemical effects of monoterpenes on plant pathogenic fungi. Pesticide Biochemistry and Physiology, 103(1), 56–61.

Marín, S., Guynot, M. E., Sanchis, V., Arbonés, J., & Ramos, A. J. (2002). Aspergillus flavus, Aspergillus niger, and Penicillium corylophilum spoilage prevention of bakery products by means of weak-acid preservatives. Journal of Food Science, 67(6), 2271–2277.

Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M., & Balajee, S. A. (2001). Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia: new flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 8(6), 1240–1247.

Mau, J. L., Beelman, R. B., & Ziegler, G. R. (1992). Effect of 10-oxo-trans-8-decenoic acid on growth of Agaricus bisporus. Phytochemistry, 31(12), 4059–4064.

Medina, A., Lambert, R. J. W., & Magan, N. (2012). Rapid throughput analysis of filamentous fungal growth using turbidimetric measurements with the Bioscreen C: a tool for screening antifungal compounds. Fungal Biology, 116(1), 161–169.

Melnick, D., Luckmann, F. H., & Gooding, C. M. (1954). Sorbic acid as a fungistatic agent for foods. VI. Metabolic degradation of sorbic acid in cheese by molds and the mechanism of mold inhibition. Journal of Food Science, 19(16), 44–58.

Mirkes, P. E. (1974). Polysomes, ribonucleic acid, and protein synthesis during germination of Neurospora crassa conidia. Journal of Bacteriology, 117(1), 196–202.

Momany, M. (2002). Polarity in filamentous fungi: establishment, maintenance and new axes. Current Opinion in Microbiology, 5(6), 580–585.

Morris, C. W., Boddy, L., & Allman, R. (1992). Identification of basidiomycete spores by neural network analysis of flow cytometry data. Mycological Research, 96(8), 697–701.

Nielsen, K. F., Mogensen, J. M., Johansen, M., Larsen, T. O., & Frisvad, J. C. (2009). Review of secondary metabolites and mycotoxins from the Aspergillus niger group. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 395(5), 1225–1242.

Osherov, N., & May, G. S. (2001). The molecular mechanisms of conidial germination. FEMS Microbiology Letters, 199(2), 153–160.

Palková, Z., Váchová, L., Valer, M., & Preckel, T. (2004). Single-cell analysis of yeast, mammalian cells, and fungal spores with a microfluidic pressure-driven chip-based system. Cytometry Part A, 59A(2), 246–253.

Paul, B., & Hirshfield, I. (2003). The effect of acid treatment on survival and protein expression of a laboratory K-12 strain Escherichia coli. Research in Microbiology, 154(2), 115–121.

Piper, P., Calderon, C. O., Hatzixanthis, K., & Mollapour, M. (2001). Weak acid adaptation: the stress response that confers yeasts with resistance to organic acid food preservatives. Microbiology, 147, 2635–2642.

Pitt, J. I., & Hocking, A. D. (2009). Fungi and food spoilage. Fungi and Food Spoilage (Third edition). New York: Springer-Verlag New York Inc.

Prigione, V., Lingua, G., & Marchisio, V. F. (2004). Development and use of flow cytometry for detection of airborne fungi. Applied and Environmental Microbiology, 70(3), 1360– 1365.

Primo-Martín, C., Pijpekamp, A. van de, Vliet, T. van, de Jongh, H. H. J., Plijter, J. J., & Hamer, R. J. (2006). The role of the gluten network in the crispness of bread crust. Journal of Cereal Science, 43(3), 342–352.

Przybylski, K. S., & Bullerman, L. B. (1980). Influence of sorbic acid on viability and ATP content of conidia of Aspergillus parasiticus. Journal of Food Science, 45(2), 375-376.

Punja, Z. K., & Grogan, R. G. (1982). Effects of inorganic salts, carbonate-bicarbonate anions, ammonia, and the modifying influence of pH on sclerotial germination of Sclerotium rolfsii. Phytopathology, 72(6), 635–639.

Ruijter, G. J. G., Bax, M., Patel, H., Flitter, S. J., Van De Vondervoort, P. J. I., De Vries, R. P., & Vankuyk, P. A., Visser, J. (2003). Mannitol is required for stress tolerance in Aspergillus niger conidiospores. Eukaryotic Cell, 2(4), 690–698.

Russell, J. B. (1992). Another explanation for the toxicity of fermentation acids at low pH: anion accumulation versus uncoupling. Journal of Applied Bacteriology, 73(5), 363–370.

Rydjord, B., Namork, E., Nygaard, U. C., Wiker, H. G., & Hetland, G. (2007). Quantification and characterisation of IgG binding to mould spores by flow cytometry and scanning electron microscopy. Journal of Immunological Methods, 323(2), 123–131.

Sá-Correia, I., Salgueiro, S. P., Viegas, C. A., & Novais, J. M. (1989). Leakage induced by ethanol, octanoic and decanoic acids in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 5, 123–127.

Samapundo, S., Deschuyffeleer, N., Van Laere, D., De Leyn, I., & Devlieghere, F. (2010). Effect of NaCl reduction and replacement on the growth of fungi important to the spoilage of bread. Food Microbiology, 27(6), 749–756.

Samapundo, S., Devlieghere, F., De Meulenaer, B., Lamboni, Y., Osei-Nimoh, D., & Debevere, J. M. (2007). Interaction of water activity and bicarbonate salts in the inhibition of growth and mycotoxin production by Fusarium and Aspergillus species of importance to corn. International Journal of Food Microbiology, 116(2), 266–274.

Samapundo, S., Devlieghere, F., Vroman, A., & Eeckhout, M. (2017). Antifungal activity of fermentates and their potential to replace propionate in bread. LWT - Food Science and Technology, 76(Part A), 101–107.

Samson, R., Houbraken, J., Thrane, U., Frisvad, J. C., & Andersen, B. (2010). Food and indoor fungi. Utrecht: CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre.

Saranraj, P., & Geetha, M. (2012). Microbial spoilage of bakery products and its control by preservatives. International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives, 3(1), 38– 48.

Saranraj, P., & Sivasakthivelan, P. (2015). Microorganisms involved in spoilage of bread and its control measures. In C. M. Rosell, J. Bajerska, & A. F. El Sheikha (Eds.), Bread and its fortification: nutrition and health benefits (Thirteenth edition, pp. 132–149). New York: CRC Press, Taylor & Francis Inc.

Sathishkumar, Y., Velmurugan, N., Lee, H. M., Rajagopal, K., Im, C. K., & Lee, Y. S. (2014). Effect of low shear modeled microgravity on phenotypic and central chitin metabolism in the filamentous fungi Aspergillus niger and Penicillium chrysogenum. Antonie Van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, 106(2), 197–209.

Shapiro, H. M. (2003). Practical flow cytometry (Fourth edition). Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons Inc.

Smith, J. P., Daifas, D. P., El-Khoury, W., Koukoutsis, J., & El-Khoury, A. (2004). Shelf life and safety concerns of bakery products - A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44(1), 19–55.

Sofos, J. N., & Busta, F. F. (1981). Antimicrobial activity of sorbate. Journal of Food Protection, 44(8), 614–622.

Suhr, K. I., & Nielsen, P. V. (2004). Effect of weak acid preservatives on growth of bakery product spoilage fungi at different water activities and pH values. International Journal of Food Microbiology, 95(1), 67–78.

Taheri-Talesh, N., Horio, T., Araujo-Bazán, L., Dou, X., Espeso, E. A., Peñalva, M. A., Osmani, S. A., & Oakley, B. R. (2008). The tip growth apparatus of Aspergillus nidulans. Molecular Biology of the Cell, 19(4), 1439–1449.

Teixeira, M. C., Duque, P., & Sá-Correia, I. (2007). Environmental genomics: mechanistic insights into toxicity of and resistance to the herbicide 2,4-D. Trends in Biotechnology, 25(8), 363–370.

Teodoro, R. A. R., de Barros Fernandes, R. V., Botrel, D. A., Borges, S. V., & de Souza, A. U. (2014). Characterization of microencapsulated rosemary essential oil and its antimicrobial effect on fresh dough. Food and Bioprocess Technology, 7(9), 2560–2569.

Thanh, N. V., Rombouts, F. M., & Nout, M. J. R. (2005). Effect of individual amino acids and glucose on activation and germination of Rhizopus oligosporus sporangiospores in tempe starter. Journal of Applied Microbiology, 99(5), 1204–1214.

Thevelein, J. M. (1996). Regulation of trehalose metabolism and its relevance to cell growth and function. In Biochemistry and Molecular Biology (Volume 3, pp. 395–420). Berlin: Springer.

Thomas, K. C., Hynes, S. H., & Ingledew, W. M. (2002). Influence of medium buffering capacity on inhibition of Saccharomyces cerevisiae growth by acetic and lactic acids. Applied and Environmental Microbiology, 68(4), 1616–1623.

Tiedt, L. R. (1993). An electron microscope study of conidiogenesis and wall formation of conidia of Aspergillus niger. Mycological Research, 97(12), 1459–1462.

Van Leeuwen, M. R., Krijgsheld, P., Bleichrodt, R., Menke, H., Stam, H., Stark, J., Wösten, H. A. B., & Dijksterhuis, J. (2013). Germination of conidia of Aspergillus niger is accompanied by major changes in RNA profiles. Studies in Mycology, 74(1), 59–70.

Van Leeuwen, M. R., Smant, W., de Boer, W., & Dijksterhuis, J. (2008). Filipin is a reliable in situ marker of ergosterol in the plasma membrane of germinating conidia (spores) of Penicillium discolor and stains intensively at the site of germ tube formation. Journal of Microbiological Methods, 74(2–3), 64–73.

Van Leeuwen, M. R., Van Doorn, T. M., Golovina, E. A., Stark, J., & Dijksterhuis, J. (2010). Water- and air-distributed conidia differ in sterol content and cytoplasmic microviscosity. Applied and Environmental Microbiology, 76(1), 366–369.

Vanhauteghem, D., Demeyere, K., Callaert, N., Boelaert, A., Haesaert, G., Audenaert, K., & Meyer, E. (2017). Flow cytometry is a powerful tool for assessment of the viability of fungal conidia in metalworking fluids. Applied and Environmental Microbiology, 83(16), 1–11.

Vashishta, B. R., Sinha, A. K., & Kumar, A. (2016). Botany for degree students - Fungi (Revised edition). New Delhi, India: S. Chand & Company Pvt. Ltd.

Vermeulen, A., Daelman, J., Van Steenkiste, J., & Devlieghere, F. (2012). Screening of different stress factors and development of growth/no growth models for Zygosaccharomyces rouxii in modified Sabouraud medium, mimicking intermediate moisture foods (IMF). Food Microbiology, 32(2), 389–396.

Vermeulen, A., Dang, T. D. T., Geeraerd, A. H., Bernaerts, K., Debevere, J., Van Impe, J., & Devlieghere, F. (2008). Modelling the unexpected effect of acetic and lactic acid in combination with pH and awon the growth/no growth interface of Zygosaccharomyces bailii. International Journal of Food Microbiology, 124(1), 79–90.

Vermeulen, A., Gysemans, K. P. M., Bernaerts, K., Geeraerd, A. H., Van Impe, J. F., Debevere, J., & Devlieghere, F. (2007). Influence of pH, water activity and acetic acid concentration on Listeria monocytogenes at 7°C: data collection for the development of a growth/no growth model. International Journal of Food Microbiology, 114(3), 332–341.

Whitaker, J. R. (1959). Inhibition of sulfhydryl enzymes with sorbic acid. Journal of Food Science, 24(1), 37–43.

Witteveen, C. F. B., & Visser, J. (1995). Polyol pools in Aspergillus niger. FEMS Microbiology Letters, 134(1), 57–62.

York, G. K., & Vaughn, R. H. (1964). Mechanisms in the inhibition of microorganisms by sorbic acid. Journal of Bacteriology, 88(2), 411–417.

Bijlagen

Bijlage 1

TABEL 20: Toegevoegde concentraties van de gebruikte zuren en de overeenkomstige actieve concentraties. Penicillium paneum pH 4,75 Zuur % dissociatie Conc 2 (mM) Conc 3 (mM) Conc 4 (mM) AA 50,0 118 (59) 238 (119) 354 (177) LA 88,6 238 (27) 477 (54) 715 (82) PA 42,0 12 (7) 23 (13) 34 (20) pH 5,40 Zuur % dissociatie Conc 2 (mM) Conc 3 (mM) Conc 4 (mM) AA 81,7 280 (51) 558 (102) 834 (197) LA 97,2 1480 (42) 2970 (83) 4440 (125) PA 76,4 25 (6) 47 (11) 70 (17) pH 6,04 % dissociatie Conc 2 (mM) Conc 3 (mM) Conc 4 (mM) AA 94,7 1890 (100) 3760 (200) 5650 (300) LA 99,3 14000 (100) 27800 (200) 41600 (300) PA 92,8 140 (10) 280 (20) 420 (30) Aspergillus niger pH 4,75 zuur % dissociatie Conc 2 (mM) Conc 3 (mM) Conc 4 (mM) AA 50,0 12 (6) 24 (12) 36 (18) LA 88,6 238 (27) 477 (54) 715 (82) PA 42,0 12 (7) 23 (13) 34 (20) pH 5,40 % dissociatie Conc 2 (mM) Conc 3 (mM) Conc 4 (mM) AA 81,7 28 (5) 56 (10) 85 (16) LA 97,2 1480 (42) 2970 (83) 4440 (125) PA 76,4 25 (6) 47 (11) 70 (17) pH 6,04 % dissociatie Conc 2 (mM) Conc 3 (mM) Conc 4 (mM) AA 94,7 190 (10) 380 (20) 565 (30) LA 99,3 14000 (100) 27800 (200) 41600 (300) PA 92,8 140 (10) 280 (20) 420 (30)

Bijlage 2

FIGUUR 46: Grafieken voor Penicillium paneum op t0.

FIGUUR 47: Grafieken voor Aspergillus niger op t0.

FIGUUR 48: Grafieken voor niet geïnoculeerd fysiologisch water.

FIGUUR 49: Grafieken voor niet geïnoculeerd YES medium verdund in fysiologisch water (1/10).

Bijlage 3

FIGUUR 50: Grafieken voor niet geïnoculeerd YES medium bij onderzoek van het kiemingsproces via kleuring met PI en SYTO 13.

iii

Bijlage 4

FIGUUR 51: Grafieken voor zuiver PBS (bovenaan) en YES medium verdund in PBS (1/10) (onderaan) via kleuring met PI en SYTO 13.

Bijlage 5

1,0

0,9

0,8 Negatieve controle 0,7 Positieve controle

0,6 AA 51 mM HA AA 102 mM HA 0,5 AA 197 mM HA 0,4 LA 42 mM HA

O.D. O.D. signaal (595 nm) 0,3 LA 83 mM HA PA 6 mM HA 0,2 PA 11 mM HA 0,1 PA 17 mM HA

0,0 0 50 100 150 200 250 300 Incubatietijd (uren)

FIGUUR 52: Groeicurves bekomen voor P. paneum in aanwezigheid van verschillende actieve zuurconcentraties in YES medium bij pH = 5,40.

1,6

1,4

1,2

1,0 Netagieve controle 0,8 Positieve controle AA 100 mM 0,6

AA 200 mM O.D. O.D. signaal (595 nm) AA 300 mM 0,4

0,2

0,0 0 50 100 150 200 250 300 Incubatietijd (uren)

FIGUUR 53: Groeicurves bekomen voor P. paneum in aanwezigheid van verschillende actieve concentraties azijnzuur in YES medium bij pH = 6,04.

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4 Negatieve controle 1,2 Positieve controle 1,0 PA 10 mM

0,8 PA 20 mM O.D. O.D. signaal (595 nm) 0,6 PA 30 mM

0,4

0,2

0,0 0 50 100 150 200 250 300 Incubatietijd (uren)

FIGUUR 54: Groeicurves bekomen voor P. paneum in aanwezigheid van verschillende actieve concentraties propionzuur in YES medium bij pH = 6,04.

2,0

1,8

1,6 Netagieve controle

1,4 Positieve controle AA 5 mM HA 1,2 AA 10 mM HA 1,0 AA 16 mM HA LA 42 mM HA 0,8

LA 83 mM HA O.D. O.D. signaal (595 nm) 0,6 LA 125 mM HA PA 6 mM HA 0,4 PA 11 mM HA 0,2 PA 17 mM HA

0,0 0 50 100 150 200 250 Incubatietijd (uren)

FIGUUR 55: Groeicurves bekomen voor A. niger in aanwezigheid van verschillende actieve zuurconcentraties in YES medium bij pH = 5,40.

2,2

2,0

1,8

1,6 Negatieve controle 1,4 Positieve controle 1,2 AA 10 mM HA

1,0 AA 20 mM HA AA 30 mM HA 0,8

O.D. O.D. signaal (595 nm) PA 10 mM HA 0,6 PA 20 mM HA 0,4 PA 30 mM HA

0,2

0,0 0 50 100 150 200 250 300 Incubatietijd (uren)

FIGUUR 56: Groeicurves bekomen voor A. niger in aanwezigheid van verschillende actieve zuurconcentraties in YES medium bij pH = 6,04.

vii

viii