“PROPAGACIÓN IN VIVO E IN VITRO DE CINCO ESPECIES DEL GÉNERO Tillandsia EN VÍAS DE EXTINCIÓN Y DE POTENCIAL USO SUSTENTABLE”

Guatemala, julio del año 2011

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (CONCYT) SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (SENACYT) FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (FONACYT FACULTAD DE AGRONOMÍA (FAUSAC) UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA (USAC)

INFORME FINAL

“PROPAGACIÓN IN VIVO E IN VITRO DE CINCO ESPECIES DEL GÉNERO Tillandsia EN VÍAS DE EXTINCIÓN Y DE POTENCIAL USO SUSTENTABLE”

PROYECTO FODECYT No. 04-2006

CARLOS ALFONSO OROZCO CASTILLO, Ph.D. Investigador Principal

GUATEMALA, JULIO DEL AÑO 2011

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.

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INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ph.D. Carlos Alfonso Orozco Castillo

INVESTIGADOR ASOCIADO: Ing. Agr. MSc. Héctor Alfredo Sagastume Mena

INVESTIGADOR ASOCIADO: Ing. Bot. Uwe Martin Herbert Feldhoff Böhm

INVESTIGADORA ASOCIADA: Licda. MSc. Aura Elena Suchini Farfán

INVESTIGADOR ASOCIADO: Ing. Agr. Mak Mílan Cruz Sic

INVESTIGADOR ASOCIADO: Ing. Agr. José Rolando Mansilla Méndez

INVESTIGADOR ASOCIADO: Ing. Agr. Erick Estuardo Calderón Oliva

INVESTIGADOR ASOCIADO: Biólogo Noé Ariel Castillo

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ÍNDICE GENERAL Página LISTA DE ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS………………...... v ÍNDICE DE CUADROS……………………………………...…………...... vi ÍNDICE DE IMÁGENES…...…….……………………………………………... ix ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS………………………………………………….... x ÍNDICE DE GRÁFICAS………………………………………………………… xi RESUMEN…………………………………………………...... xii SUMMARY………………………………………………………………………. xiv PARTE I………………………………………………………………………….. 1 I.1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………… 2 I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………………………. 5 1.2.1 Antecedentes en Guatemala……………………………………………. 5 1.2.2 Justificación del trabajo de investigación…………………………….. 5 I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS……………………………………………….. 6 I.3.1. Objetivos…………………………………………………...... 6 I.3.1.1. General………………………………………………………. 6 I.3.1.2. Específicos…………………………………………...... 6 I.3.2. Hipótesis…………………………………………...... 6 I.4. METODOLOGÍA……………………………………...... 7 I.4.1. Localización del experimento…………………………………...... 7 I.4.2. Material vegetal……………………………………………..……….. 8 I.4.3. Tratamientos……………….……………………………….………… 9 I.4.4. Diseño experimental……...………………………...…………...... 12 I.4.5. Análisis de la información…………………………………….…….. 12 PARTE II…………………………………………………………………………. 13 II.1. MARCO TEÓRICO………………………………………………………… 14 II.1.1. Usos de las Tillandsias………………………………...... 14 II.1.2. Clasificación taxonómica de las Tillandsias...... 14 II.1.3. Comercialización e importancia económica de las Tillandsias... 15 II.1.4. Propagación in vivo de las Tillandsias...... 17 II.1.5. Propagación in vitro de las Tillandsias...... 17 II.1.6. Cultivo de tejidos vegetales……………………………………...... 18 II.1.6.1 Conceptos del cultivo de tejidos vegetales……………... 18 A. Soluciones stock………………………………………….. 18 B. Medio de cultivo…………………………………………... 19 C. Etapas de la propagación in vitro……………………….. 27 D. Explante…………………………………………………… 28 E. Asepsia…………………………………………………….. 29 F. Condiciones ambientales de incubación……………….. 30

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PARTE III………………………………………………………………………… 31 III.1. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...... 32 III.1.1 Propagación in vivo……………………………………………………… 32 III.1.1.1 Tillandsia magnusiana………………………………………… 33 III.1.1.2 Tillandsia pruinosa……………………………………………... 37 III.1.13 Tillandsia streptophylla…………………………………………. 41 III.1.2 Propagación in vitro……………………………………………………… 45 III.1.2.1 Tillandsia pruinosa……………………………………………... 45 III.1.2.2 Tillandsia streptophylla………………………………………… 47 III.1.2.3 Tillandsia caput-medusae……………………………………... 50 III.1.2.4 Tillandsia magnusiana…………………………………………. 58 III.1.2.5 Tillandsia plagiotropica………………………………………… 62 PARTE IV………………………………………………………………………… 68 IV.1. CONCLUSIONES……………………………………………………….... 69 IV.2. RECOMENDACIONES……………………………………….……...... 71 IV.3. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………….…...... 72 IV.4. ANEXOS…………………………………………………………………… 74 PARTE V…………………………………………………………………………. 88 V.1. INFORME FINANCIERO…………………………………………………. 89

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LISTA DE ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS

ANDEVA Análisis de varianza BAP Bencilaminopurina Bioq. Bioquímica CITES Convenio Internacional sobre el Comercio de Especies Amenazadas de Flora y Fauna Silvestre cm Centímetros CONAP Consejo Nacional de Áreas Protegidas CONCYT Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología et al Y colaboradores F Valor estadístico de Fisher FAO Organización para la Agricultura y la Alimentación FODECYT Fondo para el Desarrollo Científico y Tecnológico FONACYT Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología gr. Gramos ICTA Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas Ing.Agr. Ingeniero Agrónomo Licda. Licenciada m metros MS Medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962) msnm Metros sobre el nivel del mar mg/L Miligramos por litro MSc. Magister Scientiae No. Número NS No significativo al 5% de nivel de significancia ONG Organización No Gubernamental PFNM Productos Forestales No Maderables Pr > Fc Probabilidad de encontrar un valor mayor que la F calculada SENACYT Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología T. Tillandsia

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ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 1. Dosis de BAP evaluadas in vivo, según tratamiento…..……. 10

Cuadro 2. Dosis de BAP evaluadas in vitro, según tratamiento………... 11

Cuadro 3. Clasificación taxonómica de las Tillandsias.………………….. 15

Cuadro 4. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo……………………….…..……. 34

Cuadro 5. Prueba de Duncan para la variable número de brotes de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo………………..……… 34

Cuadro 6. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo……………….………..………. 36

Cuadro 7. Prueba de Duncan para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo………………..……… 36

Cuadro 8. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo………………………….……..…... 38

Cuadro 9. Prueba de Duncan para la variable número de brotes de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo……………..……..……... 38

Cuadro 10. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo…………………………………….. 40

Cuadro 11. Prueba de Duncan para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo………………………...…. 40

Cuadro 12. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo………………….…………….. 41

Cuadro 13. Prueba de Duncan para la variable número de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo………………………. 41

Cuadro 14. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo……………………….……….. 43

Cuadro 15. Prueba de Duncan para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo………………………. 44

Cuadro 16. Número de brotes, según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia pruinosa, propagada in vitro….………………………. 45

Cuadro 17. ANDEVA para la variable número de brotes en la especie Tillandsia pruinosa propagada in vitro…………………………………….. 46

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Página Cuadro 18. Altura de brotes (cm) según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vitro……………..……………. 46

Cuadro 19. ANDEVA para la variable altura de brote de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vitro……………………...……………... 47

Cuadro 20. Número de brotes, según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vitro………………..…….. 48

Cuadro 21. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vitro…………………………..……. 49

Cuadro 22. Altura de brotes (cm) según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vitro……………...………. 49

Cuadro 23. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vitro………………..……………… 50

Cuadro 24. Número de brotes, según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro………………..…. 51

Cuadro 25. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro………………..…………… 52

Cuadro 26. Prueba de Duncan para la variable número de brotes de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro…………………... 52

Cuadro 27. Altura de brotes, según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro……………..……. 53

Cuadro 28. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro………………………..…… 54

Cuadro 29. Número de brotes, según repetición y tratamiento, en la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro………………………. 58

Cuadro 30. ANDEVA para la variable número de brotes en la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro………………………………… 59

Cuadro 31. Prueba de Duncan para la variable número de brotes, en la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro……………………. 59

Cuadro 32. Altura de brotes (cm) según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia magnusiana a los seis meses de propagación in vitro ………………………………………………………………………….. 60

Cuadro 33. ANDEVA para la variable altura de brote de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro………………………………… 61

vii

Página

Cuadro 34. Prueba de Duncan para la variable altura de brotes en la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro………………………. 61

Cuadro 35. Número de brotes, según repetición y tratamiento, en la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro……………………… 63

Cuadro 36. ANDEVA para la variable número de brotes en la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro………………………………... 64

Cuadro 37. Prueba de Duncan para la variable número de brotes en la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro……………………… 64

Cuadro 38. Altura de brotes (cm.) por repetición y tratamiento, en la especie Tillandsia plagiotropica luego de transcurridos seis meses de 65 cultivo in vitro………………………………………………………………….

Cuadro 39. ANDEVA para la variable altura de brote en la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro………………………………... 66

Cuadro 40. Prueba de Duncan para la variable altura de brote de la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro……………………… 66

Cuadro 41. Resumen de la ejecución financiera del proyecto………….. 89

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ÍNDICE DE IMAGENES

Página Imagen 1. Plantas de Tillandsia caput-medusae…………………………... 8

Imagen 2. Plantas de Tillandsia pruinosa……………………..……………. 8

Imagen 3. Plantas de Tillandsia magnusiana….…………………………... 9

Imagen 4. Plantas de Tillandsia plagiotropica……………………………… 9

Imagen 5. Plantas de Tillandsia streptophylla……………………………… 9

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ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS Página Fotografía 1. Brote de la especie Tillandsia pruinosa, con dosis de 10 mg/L de BAP, propagada in vivo…...... 39

Fotografía 2. Brote de la especie Tillandsia streptophylla, con dosis de 15 mg/L. de BAP propagada in vivo…………………………….…………… 42

Fotografía 3. Plántulas de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vitro…………………………..………………………………………………….. 47

Fotografía 4. Plántulas de la especie Tillandsia streptophylla, propagada in vitro………………………………..………….……………………………… 50

Fotografía 5. Plántulas recién germinadas de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro……………………..………………….… 55

Fotografía 6. Tratamiento 1 (0 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput-medusae propagadas in vitro...... 55

Fotografía 7. Tratamiento 2 (0.5 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput-medusae propagadas in vitro...... 56

Fotografía 8. Tratamiento 3 (1.0 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput-medusae propagadas in vitro...... 56

Fotografía 9. Tratamiento 4 (1.5 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput-medusae propagadas in vitro...... 57

Fotografía 10. Tratamiento 5 (2.0 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput-medusae propagadas in vitro...... 57

Fotografía 11. Plántulas de Tillandsia magnusiana en propagación in vitro……………………….……………………………………………………... 62

Fotografía 12. Plántulas de Tillandsia magnusiana (izquierda) Tillandsia plagiotrópica (derecha) en crecimiento in vitro…………………….……… 67

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ÍNDICE DE GRÁFICAS

Página Gráfica 1. Número de brotes, según dosis de BAP, para la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo…………………………….…….. 35

Gráfica 2. Altura de brotes, según dosis de BAP, para la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo……………………………..……. 37

Gráfica 3. Número de brotes, según dosis de BAP, de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo………………………………….…… 38

Gráfica 4. Altura de brotes según dosis de BAP, de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo…………………………………….……………. 40

Gráfica 5. Número de brotes según dosis de BAP, de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo.………………….……………... 42

Gráfica 6. Altura de brotes, según dosis de BAP, de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo……………………….…………. 44

Gráfica 7. Número de brotes, según dosis de BAP, de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro………………………………. 52

Gráfica 8. Altura de brotes, según dosis de BAP, de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro………………….…..………. 54

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RESUMEN

Guatemala exporta anualmente millones de especímenes de flora silvestre al extranjero con fines ornamentales. Entre los años 1994 y 2002 Guatemala exportó, en el rubro de flores, plantas, semillas y raíces, 367,292,700 de dólares norteamericanos a diversos países del mundo (Banco de Guatemala, 2005). Entre las especies de mayor demanda se encuentran los “gallitos” (Tillandsia spp.) o “Plantas del Aire”, que pertenecen a la familia Bromeliaceae, con cerca de 2,000 especies. Esta familia está integrada por tres subfamilias: Bromeloideae, Pitcarnioideae y Tillandsoideae. De ellas, la subfamilia Tillandsoideae es la más numerosa con 550 especies descritas, y se distribuyen geográficamente desde el estado de Virginia en los Estados Unidos de América hasta Chile y Argentina (Huertas et al., 1995).

El principal uso actual de las tillandsias es como planta ornamental, sin embargo, existen reportes que en Ecuador se utilizan partes aéreas como antiespasmódico y como medicina para infecciones de los ojos (Ríos y Khan, 1998). Dentro de sus usos medicinales se reporta que las hojas se utilizan en lavados para el reumatismo (Bye, 1985) y como remedio para la tos y bronquitis, sin reportar que parte de la planta se utiliza (González, 1984).

La mayoría de empresas continúan con la sobrecolecta de la naturaleza para utilizarlas para pié de cría o para cumplir con la demanda extranjera. Otro factor que también amenaza y reduce las poblaciones naturales vulnerables en el país es la destrucción de los bosques por el avance de la frontera agrícola. Las tillandsias actualmente se encuentran incluidas en los listados de especies amenazadas de la CITES (Convenio Internacional sobre el Comercio de Especies Amenazadas de Flora y Fauna Silvestre) el cual, protege a especies comercializadas a nivel mundial (Huertas et al., 1995).

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Para continuar con la comercialización de diferentes especies florísticas y, además, manejarlas de forma sustentable, es necesario mejorar los métodos de propagación convencionales in vivo (en invernaderos) y no convencionales in vitro (por medio de cultivo de tejidos en laboratorios especializados), para lo cual es necesario hacer algún tipo de investigación básica, que se plantea en el presente proyecto.

El objetivo general del proyecto fue contribuir al desarrollo de metodologías que permitan la propagación de cinco especies de tillandsias en vías de extinción. Los objetivos específicos fueron: a) determinar el efecto de la bencilaminopurina (BAP) sobre la propagación de tres especies de tillandsias in vivo, a nivel de invernadero, b) determinar el efecto de la bencilaminopurina (BAP) sobre la propagación de cinco especies de tillandsias, a nivel de laboratorio, en cultivo in vitro.

La metodología, de manera sintética, consistió en evaluar cuatro dosis de bencilaminopurina para la propagación in vivo de tres especies de tillandsias. Al mismo tiempo se hizo una evaluación de propagación in vitro, utilizando cinco dosis de bencilaminopurina, en cinco especies de tillandsias.

Al finalizar la investigación se obtuvieron los siguientes resultados: a) Una metodología desarrollada para la propagación in vivo de tres especies de tillandsias en invernadero, b) Una metodología desarrollada para la propagación in vitro de cinco especies de tillandsias a nivel de laboratorio de Biotecnología.

El presente proyecto contribuirá para coadyuvar al uso y manejo sostenible de este recurso natural nativo de la biodiversidad del país, ayudará a la lucha por evitar la extinción de especies en peligro, contribuirá a generar y mantener fuentes alternas de trabajo, diversificar la producción agrícola, generar ingresos de divisas, y consecuentemente, el mejoramiento de la calidad de vida del pequeño y mediano productor de tillandsias.

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SUMMARY

Annualy Guatemala exports millions of specimens of wild flora with ornamental purpouse. Between the years 1994 and 2002 Guatemala exports, including flowers, plants, seeds and roots, US$ 367,292,700 to differents countries around the world (Bank of Guatemala, 2005). Between the mayor demand species are the “gallitos” (Tillandsia spp.) or “Air Plants”. These plants integrate the Bromeliaceae family, with near 2,000 species. This family is formed by three subfamilies: Bromeloideae, Pitcarnioideae y Tillandsoideae. Of them, the subfamily Tillandsoideae is the most numerous with 550 species describes. The geografical distribution begins in Virginia (USA) and ends in Chile and Argentina (Huertas et al., 1995).

The main use of the tillandsias is as ornamental plants, however, in Ecuador reports exist using aerial parts as espasmodic and medicinal use in eyes infections (Ríos y Khan, 1998). Among the medicinal use it reports the use of leaves in washes for reumatism (Bye, 1985) and as medicine for cof and bronquitis without reporting the part of the plant used (González, 1984).

The majority of the comercial enterprises continue with the overcolect from the wild for use as inicial plants or for the satisfaction of the external demand. Another factor that menace and reduce the vulnerable wild populations of the country is the destruction of the forest by the advance of the agriculture border. Rigth now the tillandsias are included in the menace of the CITES list (International Convenium for the Comerce of the Wild Flora and Fauna of Endengerouse Species) who protects comercial species around the world (Huertas et al., 1995).

In order to continue with the comerce of the differents floral species and, in addition, handle it in a sustainible way, is necessary to impruve the methods of in vivo conventional propagation (in greenhouses) and in vitro no conventional

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propagation (by tissue culture in specialized laboratories), it is necessary to do some type of basic research, this is the main objective of the present project.

The general objective of the project was to contribute to the development of methods that permits the propagation of five on extinction way tillandsia species. The specific objectives were: a) determinate the effect of the bencilaminopurine (BAP) on the in vivo propagation of three tillandsia species, at the greenhouse level, b) determinate the effect of the bencilaminopurine (BAP) on the in vitro propagation of five tillandsia species, at the laboratory level.

The methodology, in a sintetic way, consist in evaluate four dose of bencilaminopurine for the in vivo propagation of three tillandsia species. At the same time, was evaluated the in vitro propagation, using five dose of bencilaminopurine, in five tillandsia species.

At the end of the research the results were the following: a) one methodology was developed for the in vivo propagation of three tillandsia species in greenhouse, b) one methodology was developed for the in vitro propagation of five tillandsia species in tissue culture laboratory.

This project will contribute to help to use and sustainable handle of this native natural resource of the our biodiversity of the country, it helps to fight again the extintion of the endengerouse species, will contribute to generate and mantaine fonts of labor, diversificate the agriculture production, generate income foreings and, in consecuence, improve the quality of life of the medium and little tillandsia producer.

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PARTE I

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I.1 INTRODUCCIÓN

Además de la madera los bosques producen una multitud de bienes y servicios entre los cuales se pueden mencionar la flora nativa silvestre; diversos productos forrajeros, comestibles, materiales de construcción, artesanales, industriales; así como resinas, gomas y leña, entre otros. Muchos de ellos son usados de manera cotidiana por las poblaciones que habitan el bosque; mientras que algunos otros son vendidos en mercados no totalmente diferenciados y temporales, hacia economías locales o regionales. El valor de éstos bienes, con frecuencia referidos como productos forestales no maderables (PFNM), es sólo una parte del valor del bosque; ya que éste proporciona adicionalmente otros beneficios tales como: servicios ambientales (captura de agua, protección al suelo, captura de carbono, etc.) y la biodiversidad, por mencionar algunos; mismos que rara vez son considerados al realizar un manejo integral del bosque.

Las tillandsias son un tipo de plantas epífitas, que crecen en asociación sobre árboles como: encinos, pinos y otras coníferas. Son plantas lampiñas, cubiertas de escamitas blancas, fruto capsular, alargado dehiscente en tres valvas, que almacenan agua en pequeños bulbos en vez de una roseta basal. Necesitan sol y sustratos ligeros. Generalmente crecen sobre árboles y rocas. Son originarias de América tropical y subtropical (México, Brasil y República Dominicana). Pueden estar tanto en interiores como en exteriores. Se adaptan muy bien a la luz, incluso la luz solar directa. Necesitan riego (sin encharcar) y mojar las hojas dos o tres veces por semana y fertilizante mensualmente durante el verano (Ríos y Khan, 1998).

Las tillandsias pertenecen a la familia Bromeliaceae, con cerca de 2,000 especies. Esta familia está integrada por tres subfamilias: Bromeloideae, Pitcarnioideae y Tillandsoideae. De ellas, la subfamilia Tillandsoideae es la más numerosa con 550 especies descritas. Se distribuyen geográficamente desde el

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estado de Virginia en los Estados Unidos de América hasta Chile y Argentina (Huertas et al., 1995).

El atractivo de estas plantas se debe a que tienen formas muy peculiares, son fáciles de cuidar, no requieren de tierra, maceta, ni mucha humedad y se facilita su transporte. Estas plantas pueden aguantar semanas sin ser regadas o rociadas y en algunas especies los períodos de sequía y humedad alterna, provocan enrollamiento de las hojas, dándoles apariencia “rizada” muy vistosa (Huertas et al., 1995).

Las tillandsias, en su época de floración, nutren a especies de aves, como por ejemplo el colibrí, y a la vez, éstas aves son alimento para otras aves, como por ejemplo el Halcón Pigmeo, de tal manera que al desaparecer estas especies de plantas, están desapareciendo también otras especies de la biodiversidad del país. Las tillandsias almacenan agua, lo que permite que dentro de ellas vivan larvas de insectos, que utilizan las ranas arborícolas para su alimento y estas, a su vez, sirven de alimento a los tecolotes. Esto refleja una perspectiva de impacto ecológico e importancia del proyecto que aquí se presenta (Feldhoff, 2005).

En los últimos años estas plantas han aumentado de popularidad, principalmente en Europa, Asia y Estados Unidos de América, abarcando más de 35 diferentes especies. Las exportaciones reportadas por la Ventanilla Única (CONAP) de tillandsias asciende a más de 25,000 plantas anuales por especie. Los países de mayor importación de dichas especies son: Alemania, Estados Unidos de América, Italia, Holanda, Austria, Bélgica y México. Guatemala se ha constituido en uno de los principales exportadores de estas plantas (Huertas et al., 1995).

Guatemala es uno de los pocos países, a nivel mundial, que comercializa las tillandsias. Guatemala exporta anualmente millones de especímenes de flora

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silvestre al extranjero con fines ornamentales. Entre los años 1994 y 2002 Guatemala exportó, en el rubro de flores, plantas, semillas y raíces, 367,292,700 de dólares norteamericanos a diversos países del mundo (Banco de Guatemala, 2005). Entre las especies de mayor demanda se encuentran los “gallitos” (Tillandsia spp.) o “Plantas del Aire”. Guatemala cuenta con 72 especies del género Tillandsia, de las cuales alrededor de 30 son comerciales.

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes en Guatemala

Según el Banco de Guatemala (2005), para poder exportar tillandsias hacia otros países es necesario estar inscrito en CONAP. Pocas de las empresas inscritas en CONAP han logrado cierto grado de cultivo bajo medios controlados, incluyendo cultivo por medio de semillas, la mayoría de empresas continúan con la sobrecolecta de la naturaleza para utilizarlas para pié de cría o para cumplir con la demanda extranjera. Otro factor que también amenaza y reduce las poblaciones naturales vulnerables en el país es la destrucción de los bosques por el avance de la frontera agrícola. Tal es el caso de especies como Tillandsia caput-medusae, Tillandsia pruinosa, Tillandsia magnusiana, Tillandsia streptophylla y Tillandsia plagiotropica, las cuales actualmente se encuentran incluidas en los listados de especies amenazadas de la CITES (Convenio Internacional sobre el Comercio de Especies Amenazadas de Flora y Fauna Silvestre) el cual, protege a especies comercializadas a nivel mundial (Huertas et al., 1995) y en la lista roja de Flora Silvestre del Consejo Nacional de Áreas Protegidas (CONAP).

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

Para continuar con la comercialización de las diferentes especies de tillandsias y manejarlas de forma sustentable, es necesario mejorar los métodos de propagación convencionales (in vivo, en invernaderos) y no convencionales (in vitro, por medio de Cultivo de Tejidos en laboratorios de Biotecnología), para lo cual es necesario hacer algún tipo de investigación básica. Este proyecto es la fase inicial del trabajo que debe hacerse para tal fin.

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I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

Contribuir al desarrollo de metodologías que permitan la propagación de cinco especies de tillandsias en vías de extinción.

I.3.1.2 Específicos

A. Determinar el efecto de la bencilaminopurina (BAP) sobre la propagación de tres especies de tillandsias in vivo, a nivel de invernadero.

B. Determinar el efecto de la bencilaminopurina (BAP) sobre la propagación de cinco especies de tillandsias, a nivel de laboratorio en cultivo in vitro.

I.3.2 Hipótesis

A.1 La bencilaminopurina (BAP) tiene efecto sobre la propagación de cinco especies de tillandsias in vivo, a nivel de invernadero.

A.2 No existe efecto de la bencilaminopurina en la propagación de cinco especies de Tillandsia in vivo, a nivel de invernadero.

B.1 La bencilaminopurina (BAP) tiene efecto sobre la propagación de cinco especies de tillandsias, a nivel de laboratorio en cultivo in vitro.

B.2 No existe efecto de la bencilaminopurina en la propagación de cinco especies de Tillandsia, a nivel de laboratorio en cultivo in vitro.

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I.4 METODOLOGÍA

I.4.1 Localización del experimento

El trabajo de invernadero se realizó en uno de los invernaderos de la empresa “Clavela del Aire”, ubicada en la aldea Sajcavillá (14º 42’ 28.91” latitud norte y 90º 37’ 9.63” longitud oeste), municipio de San Juan Sacatepéquez, departamento de Guatemala, ubicado en el kilómetro 27.5 carretera a San Raymundo. Sajcavillá se encuentra a una altura de 2,014 metros sobre el nivel del mar, tiene una precipitación pluvial anual de 1,250 mm, una temperatura promedio anual de 20 grados centígrados, una temperatura mínima promedio anual de 15 grados centígrados, una temperatura máxima promedio anual de 27.5 grados centígrados y una humedad relativa promedio anual de 75%.

Una parte del trabajo de investigación in vitro se realizó en el laboratorio de Biotecnología del Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas (ICTA), ubicado en el kilómetro 21.5 carretera al Pacífico, Bárcena, Villa Nueva, Guatemala (14º 31’ 4.97” latitud norte y 90º 36’ 59.26” longitud oeste). El ICTA se encuentra a una altura de 1,453 metros sobre el nivel del mar, tiene una precipitación pluvial anual de 1,250 mm, una temperatura promedio anual de 17.5 grados centígrados, una temperatura mínima promedio anual de 12.5 grados centígrados, una temperatura máxima promedio anual de 27.5 grados centígrados y una humedad relativa promedio anual de 72.5%.

La otra parte del trabajo de investigación in vitro se realizó en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Facultad de Agronomía de la Universidad de San Carlos de Guatemala (14º 35’ 6.79” latitud norte y 90º 33’ 11.81” longitud oeste). La FAUSAC se encuentra a una altura de 1,484 metros sobre el nivel del mar, tiene una precipitación pluvial anual de 1,250 mm, una temperatura media anual de 17.5 grados centígrados, una temperatura mínima promedio anual de 12.5

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grados centígrados, una temperatura máxima promedio anual de 25 grados centígrados y una humedad relativa promedio anual de 75%.

I.4.2 Material vegetal

Se utilizaron cinco especies de tillandsias, todas ellas en vías de extinción, que fueron las siguientes:

 Tillandsia caput-medusae.  Tillandsia pruinosa.  Tillandsia magnusiana.  Tillandsia plagiotropica.  Tillandsia streptophylla.

Imagen 1. Plantas de Tillandsia caput-medusae.

Fuente: Tomado de www.nisc.co.za

Imagen 2. Plantas de Tillandsia pruinosa.

Fuente: Tomado de www.nisc.co.za

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Imagen 3. Plantas de Tillandsia magnusiana.

Fuente: Tomado de www.nisc.co.za

Imagen 4. Plantas de Tillandsia plagiotropica.

Fuente: Tomado de www.nisc.co.za

Imagen 5. Plantas de Tillandsia streptophylla

Fuente: Tomado de www.nisc.co.za

I.4.3 Tratamientos

I.4.3.1 Experimentos en invernadero

A. Se seleccionaron 40 plantas por tratamiento, por cada especie. Todas ellas de características uniformes en peso y número de hojas. Se aceptó una diferencia en peso de ± 1.5 gramos.

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B. En cada planta se seleccionaron únicamente 10 hojas, con su respectivo meristemo. Las plantas tenían, en promedio, 12 hojas, por lo que se descartaron dos hojas superiores.

C. Se procedió a decapitar (con tratamiento químico) todas las plantas para uniformizar su crecimiento. Antes de aplicar el químico la planta permaneció, previamente, 24 horas sin riego. Después de la decapitación la planta permaneció 48 horas sin riego. Posteriormente, se aplicó riego, tres veces por semana, a todos los tratamientos.

D. Catorce días después, se empezó el tratamiento para estimular el crecimiento de los meristemos, con aplicaciones de cuatro dosis de bencilaminopurina (BAP). Las dosis evaluadas se describen en el cuadro 1.

Cuadro 1. Dosis de BAP evaluadas in vivo, según tratamiento.

Tratamiento Dosis de BAP (mg/L.) 1 0 (testigo) 2 5 3 10 4 15 Fuente: FODECYT 04-2006.

E. Los tratamientos se aplicaron tres veces por semana, a la misma hora, durante seis semanas consecutivas. Al tratamiento 1 únicamente se le aplicó agua.

F. Todos los tratamientos se abonaron con un fertilizante foliar. La fertilización se hizo tres veces por semana al mismo tiempo que se hizo la aplicación del riego.

G. Las variables de respuesta en éste experimento fueron las siguientes:

- Número de brotes. - Altura de brotes.

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I.4.3.2 Experimentos in vitro Los principales procedimientos en la fase in vitro fueron los siguientes:

A. Los explantes iniciales para la fase in vitro fueron semilla botánica, provenientes del invernadero de la empresa “Clavela del Aire”, ubicada en San Juan Sacatepéquez.

B. Previo a la siembra de las semillas se procedió a su desinfección, mediante el uso de hipoclorito de calcio al uno por ciento, durante 15 minutos, luego, se lavaron las semillas, tres veces, en agua destilada estéril. Posteriormente, se sumergieron las semillas en alcohol etílico al 70% durante un minuto, y por último, se lavaron tres veces con agua destilada estéril. Finalmente, se procedió a su siembra en el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962), a un cuarto de su concentración original (George, E.F. 1995).

C. Una vez germinadas las semillas (alrededor de un mes) se procedió a la evaluación de los tratamientos para la propagación de las plántulas. Para cada una de las especies se evaluaron cinco tratamientos en la fase in vitro, los cuales se describen en el cuadro 2 (Feldhoff, 2005).

Cuadro 2. Dosis de BAP evaluadas in vitro, según tratamiento.

Tratamiento Dosis de BAP (mg/L.) 1 0 (testigo) 2 0.5 3 1.0 4 1.5 5 2.0 Fuente: FODECYT 04-2006.

D. Por cada tratamiento se sembraron entre 4 y 25 explantes germinados, dependiendo de la disponibilidad de semillas.

E. Las variables de respuesta se midieron cada mes y fueron las siguientes:

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- Número de brotes. - Altura de brotes.

I.4.4 Diseño experimental

En ambos experimentos, tanto el de invernadero como el in vitro, el diseño experimental fue un Diseño Completamente al Azar, con arreglo factorial de los tratamientos. Para cada especie se hizo un experimento por separado. El modelo utilizado fue el siguiente:

Yij = µ + Bi + Є Donde:

Yij = variable de respuesta de la ij-ésima unidad experimental. µ = efecto de la media general de la población.

Bi = efecto de la i-ésima dosis de BAP.

Єij = error asociado a la ij-ésima unidad experimental.

I.4.5 Análisis de la información

Para los datos que se obtuvieron de cada una de las variables de respuesta se hizo una prueba de normalidad por medio de la prueba de Shapiro-Wilk. Para las variables de respuesta que tuvieron una distribución de frecuencia normal se hizo un análisis de varianza (ANDEVA) por medio del programa estadístico SAS. Las variables que resultaron con diferencias estadísticas significativas al 5%, se les hizo una prueba de separación de medias, por medio de la prueba de rango múltiple de Duncan. Finalmente, los resultados se resumieron en cuadros.

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PARTE II

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II.1 MARCO TEÓRICO

II.1.1 Usos de las Tillandsias

El principal uso de las tillandsias es como planta ornamental, sin embargo, existen reportes que en Ecuador se utilizan partes aéreas como antiespasmódico y como medicina para infecciones de los ojos (Ríos y Khan, 1998).

Dentro de sus usos medicinales se reporta que las hojas se utilizan en lavados para el reumatismo (Bye, 1985) y como remedio para la tos y bronquitis, sin reportar que parte de la planta se usa (González, 1984).

II.1.2 Clasificación Taxonómica de las Tillandsias

El género Tillandsia spp. (Bromeliaceae) pertenece a la subfamilia Tillandsioideae. La última revisión taxonómica del género fue realizada por Smith y Downs (1977) para la Flora Neotrópica, en la cual se consideraron siete subgéneros basados en la morfología floral. El género más relacionado con Tillandsia es Vriesea, los que se separan exclusivamente por la ausencia o no, respectivamente, de dos apéndices en forma de lígula sobre la superficie abaxial de los pétalos (Smith y Downs, 1977). Sin embargo, estas consideraciones taxonómicas han generado controversia y discrepancias entre los especialistas (Brown et al. 1993; Grant 1993; Holst 1994; Luther y Sieff, 1994, 1997; Betancur y Jaramillo, 1998). El género Tillandsia contiene aproximadamente 460 especies (Holst, 1994) que se distribuyen desde el sur de los Estados Unidos hasta el norte de Argentina, incluyendo las islas de las Antillas, con un rango altitudinal que va desde el nivel del mar hasta alrededor de los 3,800 msnm. (Smith y Downs, 1977). En Guatemala se encuentra una gran diversidad de especies (alrededor de 69) y están distribuidas por todo el país, la mayoría con potencial para su comercialización especialmente hacia Estados Unidos y Europa

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(Feldhoff, 2005). En el cuadro 3 se describe la más reciente clasificación taxonómica de las tillandsias (García y Betancur, 2002):

Cuadro 3. Clasificación taxonómica de las Tillandsias. Reino Plantae

Phyllum Magnoliophyta

Clase Liliopsida

Orden: Bromeliales

Familia Bromeliaceae

Género Tillandsia

Tillandsia caput-medusae, Tillandsia pruinosa, Tillandsia Especies magnusiana, Tillandsia streptophylla y Tillandsia plagiotropica

Nombres comunes Gallitos, tillandsias, claveles del aire, plantas del aire. Fuente: García y Betancur, 2002.

II.1.3 Comercialización e importancia económica de las Tillandsias

Las tillandsias son de gran relevancia en la vida de las poblaciones humanas que viven, ya sea en el bosque o en las áreas circunvecinas, debido a que obtienen de estos recursos múltiples productos tanto para el autoconsumo, como para la comercialización (Feldhoff, 2005).

La caracterización biológica, económica y social de los productos forestales no maderables es un elemento de vital importancia tanto para los productores y comerciantes, como para los funcionarios relacionados con la administración del bosque, y para el público en general interesado por la diversidad de las especies que cohabitan en el bosque.

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Desde una perspectiva productiva, una caracterización de este tipo debe generar información sobre las especies con uso actual y potencial, su localización, normatividad relacionada con su aprovechamiento; así como algunas peculiaridades de su mercado, todas ellas variables de relevancia para productores y comerciantes.

Por otra parte la caracterización integral de los PFNM coadyuva a difundir el conocimiento sobre la amplia diversidad de especies con usos específicos, en la que se destacan sus requerimientos de hábitat y su biología; además de su estatus, y la percepción actual de su sustentabilidad. La disponibilidad de ésta información para todos los participantes en el manejo del bosque, hace posible plantear estrategias de uso sustentable que conlleven al aprovechamiento integral del ecosistema forestal.

Para elegir las especies con mayor importancia en la región se consideran los siguientes criterios de selección: a) Tener un mercado doméstico bien definido, ya sea a nivel local, regional o nacional, b) Tener un mercado internacional bien definido, aunque no estuviese desarrollado en el ámbito nacional, c) Tener un aprovechamiento lícito, identificado por la autoridad, d) Alta frecuencia de uso en las comunidades locales y/o centros urbanos. Para el primer criterio se considera la demanda y oferta de las especies en los mercados locales y regionales. En el caso del segundo criterio se considera la información disponible, referente al mercado de exportación y de importación, en diversas fuentes tales como FAO, ONG’s y demás organizaciones relacionadas con el uso y manejo de productos forestales no maderables. El aspecto legal del aprovechamiento se determina a través de la información del CONAP, institución que cuenta con registros de las especies recolectadas en orden de importancia por su nivel de uso. Finalmente, la frecuencia de uso se analiza mediante la realización de encuestas y/o entrevistas a recolectores, distribuidores o comercializadores y funcionarios o prestadores de servicios técnicos. Con base en estos criterios se define la lista de especies de mayor importancia.

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II.1.4 Propagación in vivo de las Tillandsias

No se tiene ninguna referencia, ni a nivel nacional ni a nivel mundial, sobre la propagación in vivo de alguna tillandsia, por lo que, en este campo, esta investigación es pionera a nivel mundial.

II.1.5 Propagación in vitro de las Tillandsias

Muy pocos trabajos, a nivel mundial, se han realizado con el género Tillandsia, algunos de los cuales se mencionan a continuación:

Semillas de tres especies de Tillandsia fueron germinadas in vitro y produjeron brotes múltiples en 13 meses de cultivo. Diferentes concentraciones de medio Murashige y Skoog (completo, a la mitad de su concentración, y la mitad de macronutrientes y micronutrientes completos), suplementados con 25 mg/L. de NaFeEDTA, fueron usados para la germinación. Para brotes múltiples el mejor medio de germinación fue usado con diferentes combinaciones de BAP y ANA (reguladores del crecimiento) agregados (0.5/0.5 mg/L. o 1.0/0.5 mg/L.) (Chukwujekwu y Van Staden, 2002).

Un trabajo de micropropagación fue realizado, como un medio de conservación de especies de origen nativo del género Tillandsia spp. para evitar así su extinción, para lo cual se utilizó embriones inmaduros que posteriormente se propagaron in vitro. Con el empleo de ésta técnica una gran cantidad de cultivares de Tillandsia fueron exitosamente cultivados. Ésta técnica también produjo una buena tasa de multiplicación de las plantas regeneradas (Labus y Abel, 2002).

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II.1.6 Cultivo de tejidos vegetales

La técnica de Cultivo de Tejidos Vegetales se define como: el cultivo de células, tejidos y/u órganos extraídos de plantas, que se mantienen bajo condiciones artificiales y permiten producir plantas que poseen todas las características de la planta madre, es decir que es una técnica de propagación vegetativa en condiciones artificiales (Luther, H.E.; Sieff, E. 1994, Smith, L.B.; Downs, R.J. 1977).

El cultivo de tejidos (cultivo in vitro) constituye un método excelente y rápido para propagar plantas. Los medios utilizados se basan en un medio sintético de crecimiento, el cual estimula el crecimiento (D-1935).

Al realizar las metodologías de propagación in vitro, se tiene el precepto de totipotencia de una célula, lo cual se define como la capacidad de desarrollar a un individuo completo, basado en que toda célula contiene la información genética necesaria para poder dar origen a un individuo completo, en el cultivo de tejidos in vitro, se desarrollo al darle aplicación al fenómeno de la totipotencia, que forma parte de la teoría celular actual (Barceló J. G., Nicolás, B. Sabater y R. Sánchez. 1992., González, E.M. 1984).

II.1.6.1 Conceptos del cultivo de tejidos vegetales

A. Soluciones stock El crecimiento de las plántulas in vitro depende de los medios utilizados y por lo tanto de las soluciones preparadas. El medio base utilizado para la presente investigación fue el de Murashige & Skoog (1962); la concentración de sales y vitaminas, así como la preparación de reguladores del crecimiento fueron las adecuadas para el normal crecimiento de las plántulas en las fases de iniciación y multiplicación descritas en la metodología y propuesta en los objetivos mismos.

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La preparación de las soluciones stock se basa en la agrupación de los componentes inorgánicos, macronutrientes, micronutrientes, solución de hierro, myo-inositol, vitaminas así como el regulador del crecimiento bencilaminopurina, a diferentes concentraciones (Hurtado D.V. y M.E. Merino. 1987. Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993).

B. Medio de cultivo

Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo “in vitro” de células, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de embriones, embrioides, organogénesis, micropropagación, etc. Los medios de cultivo tienen una serie de componentes generales y específicos cuya presencia y concentración estará en dependencia del objetivo que se persiga en su utilización (Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993). Así, los medios de cultivo pueden ser líquidos o tener un soporte sólido, tienen sustancias minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares, fitohormonas, etc. También pueden contener por ejemplo extractos naturales, según su finalidad y no todos llevan un complemento completo de todos los factores. Para la presente investigación se utilizó el medio de Murashige y Skoog 1962, completo modificado en combinación del regulador de crecimiento bencilaminopurina. a. Soporte utilizado en le medio de cultivo

Los medios de cultivo pueden ser sólidos y líquidos. En este último caso también puede utilizarse como soporte papel filtro o perlas de cristal. Los medios sólidos o semisólidos según la concentración del soporte, llevarán distintos componentes que tienden a solidificar y mantener el material cultivado en la superficie. Entre las sustancias más utilizadas se encuentra el agar (Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993). El agar solidifica el medio y forma un complejo coloidal con débil poder de retención iónica.

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El agar presenta algunos inconvenientes; el principal consiste en ofrecer una aireación insuficiente que puede afectar el crecimiento de algunos tejidos. Por otra parte, la composición del agar es variable, y a veces mal definida y podría aportar oligoelementos que actúan favorablemente sobre el crecimiento.

La concentración óptima de agar es variable con el origen comercial del agar utilizado y el objetivo del cultivo. Las concentraciones más utilizadas varían entre 6-10 g/L. La consistencia de los medios de cultivo para la siembra de los explantes del género Tillandsia fue sólido, esto con la finalidad de proporcionar soporte (George, E.F. 1995). b. Componentes minerales utilizados

Los componentes minerales esenciales para la vida de las plantas se dividen en: i. Macroelementos: se utilizan en grandes cantidades: carbono, oxígeno, hidrógeno, nitrógeno, fósforo, azufre, potasio, calcio y magnesio. ii. Oligoelementos o microelementos: aunque son necesarios en menor cantidad, juegan un papel esencial en los mecanismos enzimáticos como activadores o constituyentes de las coenzimas. Los principales microelementos son: hierro, cobre, zinc, manganeso, molibdeno, cobalto y boro (George, E.F. 1993).

Las exigencias minerales varían con la especie, la naturaleza del tejido y su estado fisiológico, pero, además, también varían con el método de cultivo y el tipo de organogénesis estudiado. Por ejemplo, los meristemos, y en forma general, los tejidos con actividad metabólica elevada, pueden presentar importantes necesidades en potasio.

En los medios de cultivo se aportan cantidades elevadas de elementos minerales, superiores a las necesidades efectivas de los tejidos. Los problemas que se plantean deben enfocarse en términos de potenciales osmóticos.

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Se han utilizado numerosos medios minerales para el cultivo “in vitro” de tejidos y órganos. Algunos de estos medios de cultivo se han puesto a punto para objetivos muy determinados; por ejemplo, para la multiplicación de especies de Lemna spp., la germinación y cultivo de protocormos de orquídeas, el cultivo de embriones, la neoformación de flores, la androgénesis, etc. (George, E.F. 1993. Hurtado D.V. Y M.E. Merino. 1987).

En los primeros tiempos de la historia de los cultivos “in vitro”, no se efectuaron estudios particulares sobre el medio mineral. Se perseguía la obtención de masas de tejidos no organogénicos que pudieran trasplantarse indefinidamente. Los pioneros de esta técnica utilizaron los medios minerales utilizados en estudios de la nutrición mineral de plantas (en condiciones no asépticas) o de fragmentos de plantas, por ejemplo los medios Knop y White (Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993 ).

En 1962, Murashige y Skoog propusieron un medio para la investigación del crecimiento óptimo de callos de tabaco (Nicotiana tabacum). Este medio es netamente superior a los medios anteriormente usados para iniciar la organogénesis, y particularmente para la neoformación de yemas.

A partir de estos resultados, el medio MS se ha empleado de una manera muy general para todos los tipos de cultivo “in vitro”. Además, puede afirmarse que ha sido la utilización del medio MS junto con el empleo de fitohormonas apropiadas (citokininas y auxinas), lo que ha permitido el éxito de los trabajos sobre organogénesis en cultivo “in vitro” (Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993).

El medio MS está caracterizado, principalmente, por un contenido muy fuerte de + nitrógeno (60 meq/L apróx.) del cual 1/3 está aportado en forma reducida (NH4 ) y por una concentración igualmente elevada en potasio.

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El intento de adaptar más estrechamente la composición de la solución mineral de base al material utilizado y al tipo de cultivo (células aisladas, callo, androgénesis, neoformación de yemas, embriogénesis, etc.) ha llevado a la difusión de un elevado número de medios diferente. Los medios actuales se + distinguen por un elevado contenido en nitrógeno, la presencia de iones NH4 y la inversión de la relación Ca/K, con predominio del potasio. Sin embargo, según la especie y la naturaleza del cultivo, no se pueden determinar las concentraciones óptimas sin realizar ensayos previos, especialmente para el nitrógeno y el potasio (Zryd, J.P. 1988).

Los microelementos resultan indispensables para el crecimiento, intervienen como activadores de sistemas enzimáticos. Se suministran al medio de cultivo bien con el objetivo de evitar cualquier carencia o se utilizan a concentraciones elevadas con el objetivo de provocar una activación del crecimiento. Murashige y Skoog (1962) utilizan un medio con (Mn, Zn y B) en concentraciones elevadas sin toxicidad aparente, otros resultan tóxicos a bajas concentraciones (Cu y Ni). c. Componentes orgánicos

Dentro de los componentes orgánicos de los medios de cultivo tenemos azúcares, vitaminas, aminoácidos, productos orgánicos estimulantes y reguladores del crecimiento. i. Azúcares: Los tejidos y células cultivadas “in vitro” son ampliamente heterótrofos con respecto al carbono debido a la ausencia o insuficiencia de asimilación clorofílica. Luego, resulta indispensable añadir azúcares a los medios de cultivo, siendo los dos más utilizados la sacarosa y la glucosa.

La concentración óptima del azúcar en los medios de cultivo varía entre 20–80 g/L., en dependencia del tipo de cultivo, material vegetal, etc. Los azúcares presentan una acción metabólica y energética (Mroginski, L.A. y Roca, W.M.

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1993). Otros autores vinculan la necesidad de azúcares con problemas osmóticos o de un efecto indirecto sobre el metabolismo de los reguladores endógenos. Se ha demostrado que la galactosa, la lactosa y la rafinosa inhiben la síntesis de auxina en los coleóptilos de avena (Avena sativa L.) por mecanismos no dilucidados (Ankler, 1974). Los inhibidores de la síntesis de auxina estimulan la embriogénesis a partir de masas de tejidos embriogénicos de Citrus sinensis, c.v. Shamouti (Kochba y col., 1978). Igualmente, la galactosa estimula la embriogénesis en forma similar, a partir de masas de tejidos que no habían producido jamás embriones, previamente; plantean la hipótesis de una inhibición por la galactosa para la conversión del indolacetaldehido en AIA. ii. Vitaminas: Las vitaminas favorecen el crecimiento de los tejidos en cultivos “in vitro” y no se excluye que la falta de alguna de ellas pueda ser un factor limitante de los fenómenos de organogénesis.

La tiamina (0.1-1.0 mg/L.) tiene un efecto claro en los medios de cultivo. También se han señalado efectos favorables para el ácido nicotínico, la peridoxina y la riboflavina sobre el crecimiento de los cultivos.

El compuesto que más frecuentemente se añade a los medios de cultivo es el meso-inositol (myo-inositol), se emplea en concentraciones entre 50-500 mg/L. y su efecto se evidencia sobre la proliferación de tejidos y sobre la activación de la organogénesis.

El ácido ascórbico (1-10 mg/L.) y el ácido cítrico (50-100 mg/L.) se utilizan en ocasiones no como vitaminas sino como antioxidantes para evitar el oscurecimiento de determinados tejidos (George, E.F. 1995). iii. Aminoácidos: El aporte de aminoácidos favorece la proliferación de callos, aunque cuando más se acude a los mismos es en las experiencias sobre la organogénesis y en la multiplicación vegetativa in vitro. Las mezclas de

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aminoácidos parecen también presentar efectos sinérgicos estimulando fuertemente la proliferación de callos y la organogénesis. Los efectos obtenidos mediante el aporte de aminoácidos parecen muy variables según la especie y el tipo de morfogénesis estudiada. Hasta el momento no es posible establecer una regla general. iv. Productos orgánicos estimulantes: En los medios de cultivo con frecuencia se han utilizados numerosos productos o extractos naturales de composición variable y no bien definida, con distintos resultados. Entre estos productos pueden citarse:

 Extracto de levadura (0.5 - 1.0 g/L.)  Hidrolizado de caseína (0.5 - 3.0 g/L.)  Peptona  Agua de coco (5 - 15 %)  Albumen inmaduro de maíz  Jugo de plátano, tomate y de naranja  Extractos de diversos hongos  Savia de la vid o de abedul, etc. (George, E.F. 1995).

De ellos, el agua de coco es el más utilizada, cuya composición ha sido estudiada por diferentes autores e inicialmente por Shantz y Steward (1952). Se han detectado diversos componentes que enriquecen los medios de cultivo, entre ellos: vitaminas, aminoácidos y sus amidas, diversos azúcares y sus hexitoles, predominando el inositol y el sorbitol; y reguladores del crecimiento endógenos: auxinas y citokininas (isopenteniladenina). d. Reguladores del crecimiento

Los reguladores del crecimiento y el desarrollo de las plantas actualmente se agrupan en cinco categorías: auxinas, giberelinas, citokininas, ácido abscísico y

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etileno. Además de estas sustancias naturales (reguladores endógenos) existen numerosos productos de síntesis que pueden utilizarse como reguladores del crecimiento en el cultivo in vitro. En los métodos de propagación in vitro se emplean ampliamente las auxinas; en la organogénesis y las aplicaciones a la multiplicación vegetativa está ampliamente ligada a la utilización conjunta de auxinas y citokininas. La importancia de las giberelinas en cultivo in vitro está mucho más restringida. El ABA (ácido abscísico) y los compuestos que desprenden etileno se utilizan con menor frecuencia en casos más específicos (George, E.F. 1995. Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993). i. Auxinas: Son compuestos que tienen un núcleo indólico, éste se sintetiza a partir del aminoácido Triptófano que se sintetiza por la vía Shikímica, la principal auxina es el ácido 3-indolacético (AIA), pero también se pueden emplear el ácido 3-indol propiónico (AIP) y el ácido 3-indol butírico (AIB), aunque son auxinas relativamente débiles. Otros compuestos sintéticos pueden comportarse como auxinas muy débiles (ácido fenilacético) o fuertes: ácido naftalenacético (ANA), el ácido 3 naftoxiacético (NOA), etc. El 2,4 D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) es una auxina muy fuerte.

Las propiedades de las distintas auxinas son diferentes. El AIA es la auxina natural más difundida en las plantas, es ampliamente utilizado en los medios de cultivo pero es sensible a la degradación enzimática (AIA-oxidasa) y a la fotoxidación. El ANA es una auxina fuerte que se utiliza para inducir la rizogénesis, a veces en asociación con el AIB.

El efecto de las auxinas está estrechamente ligado al alargamiento celular, que se explica por sus efectos sobre la celulosa–sintetasa, el aumento de la plasticidad parietal y el aumento de la absorción de agua. Por esta razón una práctica usual es evaluar el efecto auxínico mediante la evaluación del

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incremento del peso fresco de los tejidos. Las auxinas también tienen un efecto marcado sobre la división celular (citocinesis).

Otros efectos auxínicos son: inducen la rizogénesis, pero a su vez indirectamente “inhiben” el crecimiento de las raíces; intervienen en la dominancia apical de las yemas, en el desarrollo del fruto (transformación de las paredes del ovario para formar las paredes del fruto). También inducen la floración de la piña y son responsables de los tropismos de las plantas (George, E.F. 1995). ii. Citokininas: Las citokininas son derivados purínicos, en especial derivados de la adenina, que se han reportado en pequeñas cantidades en el agua de coco, jugo de tomate, extractos de flores, tubérculos y nódulos radicales, en frutos y semillas inmaduras de maíz (zeatina) hidrolizadas de tRNA de plantas o microorganismos, etc.

Entre las citokininas naturales tenemos la zeatina, la isopentenil-adenina (IPA), la dimetil amino-purina, la dihidroxizeatina, la metilzeatina, etc. Son citokininas sintéticas la kinetina (KIN: 6-furfunil aminopurina) el BAP o BA (N-6- bencil aminopurina o N6-benciladenina). Recientemente se ha descrito que la N-6- bencil aminopurina (BAP) o N6-benciladenina (BA) ha sido aislada de plantas y constituye también una citokinina natural.

Además de esas citokininas derivadas de las purinas, han sido descritas otras citokininas no purínicas como el thidiazuron (TDZ) y el CPPU (N-(2-cloro-4- piridil)-N-fenil urea. Estos compuestos tienen una actividad histoquímica muy alta y son muy eficientes en las plantas maderables. En cultivos de tejidos, el BAP y las citokininas sintéticas Kinetina y TDZ (thidiazuron) son las más frecuentemente usadas (Mroginski, L.A. Y Roca, W.M. 1993).

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Las citokininas estimulan la división celular (cariocinesis) en cultivo de tejidos vegetales y tienen un efecto sinérgico en este sentido con las auxinas. Por esta razón, una forma de evaluar un efecto citokinina es mediante el estudio del incremento en peso seco.

Se han reportado otros efectos de las citokininas, por ejemplo: estimulan el alargamiento celular de discos de hojas etioladas; inducen la formación de órganos en una gran variedad de cultivos de tejidos in vitro (morfogénesis); controlan la formación de proplastidios en cloroplastos; mantienen la maquinaria de síntesis de proteínas mediante la regulación de la síntesis del RNA; retrasan la senescencia; etc.

Las citokininas que se usan con mayor frecuencia en los medios de cultivo son: la kinetina (KIN), la 6-bencilaminopurina (BAP), la 2-isopenteniladenina (IP) y la zeatina. El BAP se emplea con frecuencia debido a su gran actividad y su bajo costo. Generalmente las citokininas se evitan o se emplean en dosis muy débiles en los medios de enraizamiento porque presentan un efecto inhibidor sobre la rizogénesis (Barceló J., G. Nicolás, B. Babater y R. Sánchez. 1992).

C. Etapas de la propagación in vitro

Para la ejecución de trabajos in vitro es importante la secuencia de eventos asociados con la multiplicación de material vegetal mediante esta técnica siguiente manera: a. Etapa 0. Acá se selecciona el tipo de material a trabajar, el cual debe de tener las características idóneas para su iniciación en el laboratorio. b. Etapa I. Llamada etapa de iniciación o establecimiento, en la cual se selecciona el tipo de explante a trabajar y se establece como cultivo inicial. c. Etapa II. Acá se multiplica el cultivo, en si son los brotes producidos lo cual dependerá del medio de cultivo para su crecimiento.

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d. Etapa III. Etapa en la cual se evidencia el enraizamiento de los explantes, la finalidad es producir una planta autótrofa que pueda sobrevivir a las condiciones ambientales deferentes a las del laboratorio. Generalmente, las condiciones del medio de cultivo están asociadas a cada una de las etapas, en la cual las modificaciones y aplicaciones de los reguladores del crecimiento inciden en el crecimiento de los explantes. e. Etapa IV. Transferencia final de las plántulas, a condiciones de invernadero (Mroginski, L.A. Y Roca, W.M. 1993).

Las etapas que comprendió el presente trabajo de investigación en el género Tillandsia fueron las 0, I y II, siendo la etapa II, la enmarcada en los objetivos propuestos.

D. Explante

Es una parte de un tejido o de un órgano que se aísla del resto de la planta con fines de cultivo. La selección del explante puede hacerse teniendo en cuenta el sistema de propagación de la planta.

La elección de un explante apropiado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos; en primera instancia, dicha elección esta determinada por el objeto perseguido y la especie vegetal utilizada. En el caso de especies propagadas vegetativamente, los brotes jóvenes y los ápices meristemáticos han sido generalmente la fuente de los explantes (Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993).

En base al objetivo de la presente investigación el explante utilizado fue la semilla propia de las especies trabajadas, las cuales se germinaron en el medio de cultivo específico para su crecimiento. El crecimiento de los explantes para su evaluación en las concentraciones de BAP, se realizaron ligeros cambios en la

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composición de los medios, especialmente en el tipo de regulador de crecimiento.

La respuesta de los explantes cultivados in vitro pueden variar notablemente con el desarrollo y edad ontogénica. El éxito de la obtención de las plantulas in vitro depende en gran medida de su estado de desarrollo al momento de su cultivo, la propagación de la mayoría de las especies requiere de la utilización de explantes provenientes de materiales juveniles.

El tamaño del explante es otro aspecto que se debe tomar encuenta para el establecimiento de los cultivos, cuanto más grande sea, mayores son las posibilidades de sobrevivencia dentro del medio de cultivo, aunque trae riesgos de contaminación con microorganismos. El efecto del tamaño del explante puede apreciarse en cualquier sistema de cultivo e independientemente de la fuente de donde proviene dicho explante (Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993).

E. Asepsia

La asociación explante-medio y las condiciones físicas en que normalmente se incuban los cultivos conforman un ambiente propicio para la proliferación de los microorganismos (bacterias, hongos) los cuales pueden provocar la muerte de los cultivos, así como competir con el explante por el medio de cultivo o modificarlo, el evitar las contaminaciones con microorganismos es un aspecto básico que se debe de tener en cuenta para el éxito, no solamente en el establecimiento de los cultivos si no también en su incubación y manipulación. Es difícil lograr cultivos complemtamente estériles en el estricto sentido de la palabra, un ejemplo clásico, es probable que los virus presentes en el explante persistan en los cultivos, esta salvedad para establecer los cultivos asépticos es conveniente o necesario: a) trabajar en amibientes adecuados; b) esterilizar los medios de cultivo; c) desinfectar superficialmente los explantes, liberándolos de

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bacterias y hongos exógenos y d) realizar los cultivos de acuerdo a las normas de asepsia. Para la desinfección se pueden utilizar una variedad de productos químicos, pero en la actualidad es casi generalizado el empleo de alcohol al 70% y de hipoclorito de calcio al 1%, así como bactericidas, funguicidas y acaricidas. En algunos casos es importante agregar un tensoactivo, como el Tween-20 a una concentaración 0.01 al 0.1%, es conveniente agitar (80-150 rpm) el explante conjuntamente con la solución desinfectante. Luego se hace necesario remover los restos del producto, mediante varios lavados con agua destilada estéril y operando en la cámara de transferencia, y como mínino tres lavados (Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993).

F. Condiciones ambientales de incubación

Se hace necesario que los cultivos sean incubados en ambientes controlados, por lo menos en lo que se refiere a la luz y a la temperatura; estos factores han sido poco estudiados y la poca información existente es fragmentaria.

Las respuestas morfológicas pueden ser alteradas por la temperatura de incubación, así como la calidad, intesidad y duración de la luz. Generalemente para el establecimiento de los cultivos, se hace necesario una fuente luminosa compuesta de lámparas fluorescentes (del tipo luz de día) y lámparas incandescentes que brinden entre 1,000 y 4,000 lux de iluminación. Comúnmente se utiliza un ciclo de fotoperíodo/escoperíodo de 16/8 horas; la temperatura debe de ser de 25 ± 2 ºC, la misma en este rango se considera adecuada (Mroginski, L.A. y Roca, W.M. 1993).

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PARTE III

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III.1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los experimentos se dividieron en dos tipos, experimentos in vivo (en invernadero) y experimentos in vitro (en laboratorio de Biotecnología). A continuación se presentan los resultados obtenidos en cada uno de los tipos de experimentos.

III.1.1 Propagación in vivo

Esta investigación se realizó en dos fases: la primera consistió en una etapa de estímulo floral para la posterior decapitación y de ésta manera estimular a la planta a emitir brotes laterales, y una segunda fase, que se refiere a la etapa de inducción del crecimiento de las yemas laterales, donde se evaluó el efecto de la bencilaminopurina en las tres especies de tillandsias, siendo éstas: Tillandsia pruinosa, Tillandsia magnusiana y Tillandsia streptophylla. Los resultados se analizaron separadamente por cada especie.

Para la inducción de la floración se utilizó etileno en su nombre comercial Ethrel. Esto fue utilizado con la finalidad de que las tillandsias se prepararan, biológicamente, para producir hijuelos, por medio de su proceso biológico normal, que consiste en que después de producir la espiga floral, la planta estimula las yemas laterales para el crecimiento de hijuelos, por lo que si se desea que la planta esté en condiciones de emitir brotes laterales antes de su ciclo normal, se tiene que utilizar el etileno.

Se aplicó el etileno durante tres días, en los cuales no se aplicó riego. Esto con la finalidad de que la planta sufriera de leves quemaduras y así se llegara a un estado de e strés, por lo que la planta se vió obligada a emitir la espiga floral. Durante esta etapa no se aplicó fertilizante foliar, debido a que la planta estuvo pasando por una etapa de estrés y la misma no estaba en la disponibilidad de

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asimilarlos, además, el fertilizante se aplica diluido en riego y en esta etapa no estaba indicado.

La variedad que mayor estrés sufrió, al momento de la aplicación del etileno, fue la Tillandsia magnusiana. El tiempo a floración, después de aplicado el etileno, fue de un mes, presentándose una floración uniforme en todas las especies de tillandsias en evaluación. Fue entonces cuando se le eliminó manualmente la espiga floral que estaba en crecimiento, con la finalidad de que la planta no desperdiciara nutrientes en floración.

Cabe mencionar que si no se lleva a cabo la decapitación, es mas tardado el proceso de crecimiento de los meristemos. El escoger plantas que hayan emitido la espiga floral anteriormente hace que la flor se desarrolle en los meristemos laterales causando deformaciones.

A las 28 semanas después del inicio de las aplicaciones de BAP se hicieron las evaluaciones de los tratamientos. A continuación se presentan los resultados por especie y por variable de respuesta.

III.1.1.1 Tillandsia magnusiana

A. Número de brotes

En el cuadro 4 se presenta el análisis de varianza para la variable de respuesta número de brotes emitidos por la planta. En el mismo se observa que hubo diferencias significativas. En el caso de la Tillandsia magnusiana, se considera que el mejor tratamiento fue 15 mg/L. de BAP, con él se consiguió un mayor número de brotes después del corte de la planta madre, superando en 56% al testigo y en 25% al segundo mejor tratamiento (cuadro 5). Los tratamientos de 5 mg/L. y el testigo no presentaron diferencias estadísticamente. El promedio de 17.2 brotes por planta, indica el alto potencial que ésta planta tiene para ser

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explotada comercialmente, o bien para reintroducirla en su hábitat. Sin embargo, el alto número de brotes hace que los mismos salgan débiles y de poco tamaño, pero esto no es un inconveniente, debido a la alta recuperación de los mismos en las mesas de cultivo. En la gráfica 1, se puede apreciar que existe una tendencia a que a mayor dosis de BAP se producen más brotes, por lo que se recomienda evaluar dosis más altas que 15 mg/L. de BAP, pues existe la posibilidad potencial de mejorar los resultados encontrados en ésta investigación.

Cuadro 4. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo. Grados F Fuente de Suma de Cuadrados F de Tabulado Variación Cuadrados Medios Calculado Libertad (5%)

Tratamientos 3 908.47 302.8233 16.80* 3.24

Error 16 288.448 18.028

Total 19 1196.918 Coeficiente de variación = 39% * = diferencia significativa al 5%

Fuente: FODECYT 04-2006.

Cuadro 5. Prueba de Duncan para la variable número de brotes de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo. Tratamiento Prueba de Duncan Número de Brotes (mg/L de BAP) (al 5%)

15 17.2 a

10 9.8 b

5 1.5 c

0 0.7 c

Fuente: FODECYT 04-2006.

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Gráfica 1. Número de brotes según dosis de BAP, de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo.

18 16 14 12 10 8 6

4 Númerode Brotes 2 0 0 5 10 15 Dosis de BAP (mg/L)

Fuente: FODECYT 04-2006.

B. Altura de brotes

En el cuadro 6, se presenta el análisis de varianza para la variable de respuesta altura de brotes emitidos por la planta. En el mismo se observa que hubo diferencias significativas entre tratamientos pues el valor de F calculado (4.48) es mayor que el valor de la F tabulada (3.24). El mejor tratamiento fue el de 5 mg/L, siendo el resto iguales entre si (cuadro 7). A pesar de que el tratamiento de 15 mg/L. fue el que tuvo la media más baja, se considera como una segunda opción pues no existe diferencias significativas entre todos los tratamientos (excluyendo al de 5 mg/L). En el caso de la Tillandsia magnusiana, a partir de dos centímetros, se considera que una planta no dependerá de la planta madre y se dice que es apta para que siga su crecimiento en las mesas de cultivo con un adecuado plan de fertilización hasta que lleguen al punto de exportación. Como la media del tratamiento con 15 mg/L supera los dos centímetros, se le

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sigue considerando como una buena opción para producir hijuelos, debido a que lo que interesa en este estudio es aumentar la cantidad de brotes en cada planta. En la gráfica 2 se puede observar que existe una clara tendencia de que mientras más BAP sea aplicado mayor es la disminución en la altura de los brotes.

Cuadro 6. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo. Grados F Fuente de Suma de Cuadrados de F Calculada Tabulada Variación Cuadrados Medios Libertad (5%)

Tratamientos 3 4.6626 1.5542 4.48* 3.24

Error 16 5.5504 0.3469

Total. 19 10.2130 Coeficiente de variación = 39% * = diferencia significativa al 5%

Fuente: FODECYT 04-2006.

Cuadro 7. Prueba de Duncan para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo. Tratamiento Altura de Brotes Prueba de Duncan

(mg/L de BAP) (cm) (al 5%)

5 3.5 a

10 2.7 b

0 2.6 b

15 2.1 b

Fuente: FODECYT 04-2006.

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Gráfica 2. Altura de brotes según dosis de BAP, de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vivo.

3.5

3

2.5

Altura de Altura Brotes (cm) 2 0 5 10 15 Dosis de BAP (mg/L)

Fuente: FODECYT 04-2006.

III.1.1.2 Tillandsia pruinosa

A. Número de brotes

El análisis de varianza para la variable de respuesta número de brotes, presentó diferencias significativas entre tratamientos, pues el valor de la F calculada (94.74) es mayor que el valor de la F de tabla (3.24) al 5% de nivel de significancia (cuadro 8). Se considera que el mejor tratamiento fue 15 mg/L. de BAP, pues con él se consiguió un mayor número de brotes supervivientes después del corte de la planta madre, superando en 30% al testigo y en 7% al segundo mejor tratamiento. Los tratamientos de 5 mg/L. y el testigo no presentaron diferencias estadísticamente (cuadro 9). En la gráfica 3 se puede observar una tendencia clara de que a medida que se incrementa la dosis de BAP también se incrementa el número de brotes, por lo que se recomienda evaluar dosis mayores que 15 mg/L. de BAP para establecer hasta donde es posible incrementar el número de brotes.

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Cuadro 8. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo. Grados F Fuente de Suma de Cuadrados F de Tabulada Variación Cuadrados Medios Calculada Libertad (5%) Tratamientos 3 67.360 22.4533 94.74* 3.24 Error 16 3.792 0.2370 Total. 19 71.152 Coeficiente de variación = 20% * = diferencia significativa al 5%

Fuente: FODECYT 04-2006.

Cuadro 9. Prueba de Duncan para la variable número de brotes de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo. Tratamiento Prueba de Duncan Número de Brotes (mg/L de BAP) (al 5%) 15 5.8 a 10 4.8 b 5 1.9 c 0 1.6 c

Fuente: FODECYT 04-2006.

Gráfica 3. Número de brotes según dosis de BAP, de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo.

6

5

4

3

2 Númerode Brotes 1 0 5 10 15 Dosis de BAP (mg/L)

Fuente: FODECYT 04-2006.

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Fotografía 1. Brote de la especie Tillandsia pruinosa, con dosis de 10 mg/L. de BAP, propagada in vivo.

Fuente: FODECYT 04-2006.

B. Altura de brotes

El ANDEVA para la variable altura de brotes, mostró diferencia significativa entre tratamientos a un nivel del 5% (cuadro 10). De acuerdo con la prueba de Duncan al 5% (cuadro 11), el nivel con 0 mg/L. (testigo), presentó la mayor altura de brotes. En segundo lugar le sigue la dosis de 5 mg/L. Estadísticamente las dosis de 10 y 15 mg/L. son iguales entre sí. Al igual que la Tillandsia magnusiana, la Tillandsia pruinosa logra desarrollarse en mesas de cultivo a partir de los dos centímetros. El nivel de 15 mg/L. de BAP, aunque fue el que más brotes obtuvo, no alcanzó a llegar a la altura mínima para ser cultivado en las mesas de crecimiento (1.7 cm), por lo que se toma una segunda opción que sería el nivel 10 mg/L. que alcanza los dos centímetros necesarios para su posterior desarrollo. En la gráfica 4 se puede apreciar una tendencia bien clara en cuanto a que a mayor cantidad de BAP aplicada disminuye la altura de los brotes.

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Cuadro 10. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo. Grados Fuente de Suma de Cuadrados F F Tabulada de Variación Cuadrados Medios Calculada (5%) Libertad Tratamientos 3 2.5371 0.8457 24.40* 3.24 Error 16 0.5546 0.0347 Total. 19 3.0917 Coeficiente de variación = 19% * = diferencia significativa al 5%

Fuente: FODECYT 04-2006.

Cuadro 11. Prueba de Duncan para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo. Tratamiento Altura de Brotes Prueba de Duncan (mg/L de BAP) (cm) (al 5%) 0 2.7 a 5 2.4 b 10 2.0 c 15 1.7 c

Fuente: FODECYT 04-2006.

Grafica 4. Altura de brotes según dosis de BAP, de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vivo.

3

2.5

2

Altura de Brotes (cm) Brotes de Altura 1.5 0 5 10 15 Dosis de BAP (mg/L)

Fuente: FODECYT 04-2006.

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III.1.1.3 Tillandsia streptophylla

A. Número de brotes

Según el ANDEVA (cuadro 12), existieron diferencias estadísticas significativas entre tratamientos, debido a que la F calculada (19.62) es mayor que la F tabulada (3.24) al 5% de nivel de significancia, por lo que se realizó la prueba de separación de medias múltiple de Duncan. Según la prueba de Duncan (cuadro 13) se considera que el mejor tratamiento fue 15 mg/L. de BAP, pues con él se consiguió un mayor numero de brotes después del corte de la planta madre, superando en 31% al testigo y en 12% al segundo mejor tratamiento. El resto de los tratamientos (10 mg/L. de BAP, 5 mg/L. de BAP y testigo) no presentaron diferencias estadísticamente superior a la de 15 mg/L.

Cuadro 12. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo. Grados F Fuente de Suma de Cuadrados F de Tabulada Variación Cuadrados Medios Calculada Libertad (5%) Tratamientos 3 48.96 16.32 19.62* 3.24 Error 16 13.312 0.832 Total. 19 62.272 Coeficiente de variación = 37% * = diferencia significativa al 5%

Fuente: FODECYT 04-2006.

Cuadro 13. Prueba de Duncan para la variable número de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo. Tratamiento Prueba de Duncan Número de Brotes (mg/L. de BAP) (al 5%) 15 5.7 a 10 4.0 b 5 3.0 b 0 1.4 c Fuente: FODECYT 04-2006.

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Gráfica 5. Número de brotes según dosis de BAP, de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo. 6

5

4

3

BrotesNúmerode 2

1 0 5 10 15

Dosis de BAP (mg/L) Fuente: FODECYT 04-2006.

Fotografía 2. Brote de la especie Tillandsia streptophylla, con dosis de 15 mg/L. de BAP propagada in vivo.

Fuente: FODECYT 04-2006.

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B. Altura de brotes

En el cuadro 14 se presenta el ANDEVA para la variable de respuesta altura de brotes, en el que se observa que existen diferencias significativas entre tratamientos, pues la F calculada (70.86) es mayor que la F tabulada (3.24), al 5% de nivel de significancia. Según la prueba de Duncan al 5% (cuadro 15) todos los tratamientos son diferentes entre sí, estadísticamente, por lo que el mejor tratamiento fue el testigo (0 mg/L. de BAP), siguiendo el de 5 mg/L. de BAP, y en último lugar el de 15 mg/L. A pesar de que el tratamiento 15 mg/L. de BAP fue el que obtuvo la media más baja, sobrepasa los tres centímetros que requiere la Tillandsia streptophylla para continuar el crecimiento en las mesas de trabajo hasta alcanzar el tamaño adecuado para la exportación, por lo que se considera como una opción viable para producir hijos. En la gráfica 6 se puede observar que a medida que se incrementa la dosis de BAP, disminuye la altura de los brotes.

Cuadro 14. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo. Grados F Fuente de Suma de Cuadrado F de Tabulada Variación Cuadrados s Medios Calculada Libertad (5%)

Tratamientos 3 12.9640 4.3213 70.86* 3.24

Error 16 0.9757 0.0610

Total 19 13.9397 Coeficiente de variación = 5% * = diferencia significativa al 5%

Fuente: FODECYT 04-2006.

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Cuadro 15. Prueba de Duncan para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo. Tratamiento Altura de Brotes Prueba de Duncan

(mg/L de BAP) (cm) (al 5%)

0 5.8 a

5 5.3 b

10 4.6 c

15 3.6 d

Fuente: FODECYT 04-2006.

Gráfica 6. Altura de brotes, según dosis de BAP, de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vivo.

6

5.5

5

4.5

Altura de Altura Brotes (cm) 4

3.5 0 5 10 15 Dosis de BAP (mg/L)

Fuente: FODECYT 04-2006.

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III.1.2 Propagación in vitro

III.1.2.1 Tillandsia pruinosa

A. Número de brotes

En el cuadro 16 se muestran el número de brotes formados en los diferentes tratamientos en la especie Tillandsia pruinosa luego de transcurridos seis meses. Al realizar el ANDEVA de los datos vemos que no hay diferencia significativa entre los diferentes tratamientos utilizados (cuadro 17), debido a que el valor de F calculado es menor que el valor de F tabulado, por lo que se rechaza la hipótesis nula.

Cuadro 16. Número de brotes, por tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vitro. Tratamiento (mg/L. de BAP) Repetición 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1 0 1 0 1 0 2 2 0 1 0 0 3 0 0 0 0 0 4 3 0 1 1 0 5 0 0 0 0 0 6 2 1 0 0 0 7 0 0 2 0 0 8 1 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 10 1 0 0 0 1 11 2 0 0 0 0 12 0 0 1 1 0 13 1 1 0 0 0 14 0 1 0 0 0 15 3 0 0 2 0 16 2 0 0 0 0 17 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 2 19 0 0 0 0 0 20 5 1 0 0 0 21 3 1 0 0 0 22 1 0 0 0 0 23 0 0 0 2 0 24 2 0 0 0 0 25 1 0 0 0 0 Fuente: FODECYT 04-2006.

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Cuadro 17. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vitro. Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F F Tabulada Variación Libertad Cuadrados Medios Calculada (al 5%) Tratamientos 4 0.0238 0.0060 0.0060 NS 2.45 Error 120 119.2307 0.9936 Total 124 119.2545 Fuente: FODECYT 04-2006.

B. Altura de brotes

El cuadro 18 muestra los datos correspondiente a la altura de brotes de la especie Tillandsia pruinosa en los diferentes tratamientos luego de transcurridos seis meses. El ANDEVA de los datos nos indica que no existe una diferencia significativa entre los diferentes tratamientos utilizados (cuadro 19).

Cuadro 18. Altura de brotes (cm) según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vitro. Tratamiento (mg/L. de BAP) Repetición 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1 0.0 0.4 0.2 0.2 0.4 2 0.5 0.3 0.5 0.8 0.3 3 1.3 0.1 0.3 0.2 0.1 4 0.9 0.5 0.4 0.9 0.5 5 0.7 0.4 0.2 0.2 0.4 6 1.5 0.2 0.3 0.3 0.2 7 1.3 0.3 0.2 0.2 0.3 8 0.0 0.3 0.2 0.1 0.3 9 1.0 0.3 0.0 0.0 0.3 10 0.3 0.3 0.0 0.0 0.3 11 1.6 0.2 0.2 0.1 0.2 12 1.5 0.1 0.2 0.3 0.1 13 1.0 0.2 0.0 0.0 0.2 14 1.8 0.4 0.1 0.6 0.4 15 0.2 0.3 0.0 0.2 0.3 16 0.7 0.1 0.0 0.3 0.1 17 0.0 0.2 0.4 0.1 0.2 18 0.8 0.1 0.0 0.0 0.1 19 0.7 0.0 0.6 0.2 0.0 20 0.3 0.0 0.6 0.3 0.0 21 0.8 0.3 0.6 0.0 0.3 22 0.6 0.2 0.4 0.6 0.2 23 0.8 0.0 0.0 0.2 0.0 24 1.1 0.6 0.2 0.3 0.6 25 1.0 0.2 0.3 0.5 0.2 Fuente: FODECYT 04-2006.

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Cuadro 19. ANDEVA para la variable altura de brote de la especie Tillandsia pruinosa propagada in vitro. F Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F Tabulada Variación Libertad Cuadrados Medios Calculada (al 5%)

Tratamientos 4 0.0651 0.0163 0.017 NS 2.45

Error 120 117.9135 0.9826

Total 124 119.9135 NS = no significativo al 5% de nivel de significancia Fuente: FODECYT 04-2006.

Fotografía 3. Plántulas de la especie Tillandsia pruinosa propagadas in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

III.1.2.2 Tillandsia streptophylla

A. Número de brotes

El cuadro 20 muestra el número de brotes en la especie Tillandsia streptophylla en los diferentes tratamientos utilizados luego de transcurridos seis meses. El ANDEVA (cuadro 21) del número de brotes desarrollados en ésta especie nos

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indica que no existe una diferencia significativa entre los diferentes tratamientos utilizados, debido a que el valor de F calculado es menor que el valor de la F de tabla, por lo que se acepta la hipótesis nula de no diferencia entre tratamientos.

Cuadro 20. Número de brotes según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vitro. Tratamiento (mg/L.) Repetición 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1 0 0 15 20 0 2 0 1 30 0 1 3 0 5 2 1 10 4 0 10 7 15 0 5 0 0 1 2 0 6 0 20 1 25 0 7 2 5 0 0 15 8 0 0 2 0 0 9 3 10 10 0 0 10 0 0 5 2 0 11 1 10 10 0 0 12 0 0 0 0 0 13 5 0 2 0 15 14 5 7 0 0 2 15 0 1 5 3 0 16 0 10 2 0 0 17 1 0 2 6 0 18 65 5 0 0 0 19 15 0 20 0 4 20 4 0 2 1 0 21 0 20 0 0 5 22 0 5 0 0 0 23 0 11 6 0 0 24 0 10 0 5 0 25 5 0 0 0 0 Promedios 4.2 5.2 4.9 3.2 2.1 Fuente: FODECYT 04-2006.

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Cuadro 21. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vitro. Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F F Tabulada Variación Libertad Cuadrados Medios Calculada (al 5%) Tratamientos 4 5.37 E-32 1.34E-32 1.34E-32 NS 2.45 Error 120 120.0059 1.0000 Total 124 120.0059

Fuente: FODECYT 04-2006.

B. Altura de brotes

La altura de brotes de Tillandsia streptophylla, a los seis meses en los diferentes tratamientos, se muestra en el cuadro 22. El ANDEVA nos indica que no existe diferencia entre tratamientos (cuadro 23).

Cuadro 22. Altura de brotes (cm) según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vitro. Tratamientos (mg/L.) Repetición 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1 0.0 0.1 0.0 0.0 0.4 2 0.2 0.3 0.0 0.7 0.4 3 0.7 1.5 0.9 0.4 0.3 4 0.8 0.0 0.4 0.0 0.2 5 0.6 0.9 0.2 1.0 1.1 6 0.9 0.0 0.2 0.0 0.2 7 0.9 0.4 1.2 0.4 0.0 8 0.7 1.6 0.6 1.1 0.3 9 0.0 0.0 0.0 1.0 1.0 10 0.4 0.2 0.2 0.1 0.8 11 0.6 0.0 0.0 0.9 0.8 12 1.6 0.4 0.8 0.5 0.3 13 0.2 1.2 0.5 0.5 0.0 14 0.9 0.0 0.6 0.8 0.7 15 3.2 0.6 0.5 0.0 1.4 16 0.0 0.7 1.1 0.2 0.9 17 0.6 1.0 0.6 0.3 0.6 18 0.0 0.3 1.8 1.1 1.0 19 0.0 1.8 0.0 1.2 0.0 20 0.1 0.6 1.1 0.4 1.8 21 0.7 0.0 0.9 1.3 0.0 22 1.4 0.4 0.9 2.1 0.8 23 1.1 0.0 0.3 0.4 3.5 24 1.5 0.4 2.0 0.3 2.0 25 0.1 0.6 2.0 2.2 0.6 Promedios 0.7 0.5 0.7 0.7 0.8

Fuente: FODECYT 04-2006.

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Cuadro 23. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vitro. F Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F Calculada Tabulada Variación Libertad Cuadrados Medios (al 5%)

Tratamientos 4 1.2E-30 2.972E-31 1.188E-31 NS 2.45

Error 120 300.308 2.5026

Total 124 300.308 NS = no significativo al 5% de nivel de significancia

Fuente: FODECYT 04-2006.

Fotografía 4. Plántula de la especie Tillandsia streptophylla propagada in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

III.1.2.3 Tillandsia caput-medusae

Los datos fueron tomados a los 60 días después de la siembra in vitro.

A. Número de brotes

Los datos de laboratorio del número de brotes obtenidos por tratamiento y repetición se presentan en el cuadro 24.

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El ANDEVA (cuadro 25) detectó diferencias entre tratamientos por lo que se procedió a hacer una separación de medias por medio de la prueba de rango múltiple de Duncan (cuadro 26). La prueba de Duncan nos indica que los dos mejores tratamientos fueron cuando se aplicó 1.0 y 1.5 mg/L. de BAP, con lo cual se obtienen 22.2 y 18.5 brotes por planta en 60 días. Si no se aplica BAP (tratamiento testigo) se obtienen 2.0 brotes por planta en 60 días.

De acuerdo con la gráfica 7, se observa que, aparentemente, la respuesta de esta especie a la aplicación de BAP sigue una curva de tendencia cuadrática, cuyo máximo es 1.0 mg/L. de BAP, dosis que produce el mayor número de brotes, no existiendo una tendencia que indique lo contrario.

Cuadro 24. Número de brotes según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro. Tratamiento Repetición Número de Brotes (mg/L. de BAP) 1 2 2 3 0 3 1 4 2 1 15 2 18 0.5 3 18 4 18 1 21 2 18 1.0 3 24 4 26 1 12 2 18 1.5 3 22 4 22 1 14 2 15 2.0 3 10 4 8 Fuente: FODECYT 04-2006.

- 51 -

Cuadro 25. ANDEVA para la variable número de brotes de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro. Fuente de Grados de Suma de F Calculada Pr > Fc Variación Libertad Cuadrados Tratamientos 4 989.30 25.54** 0.0001 Error 15 145.25 Total 19 1134.55 Pr > Fc = probabilidad de encontrar un valor mayor que la F calculada ** = altamente significativo (< 1%) Coeficiente de variación = 21.7%.

Fuente: FODECYT 04-2006.

Cuadro 26. Prueba de Duncan para la variable número de brotes de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro. Tratamiento Prueba de Duncan Número de Brotes (mg/L. de BAP) (al 5%) 1.0 22.2 a 1.5 18.5 a b 0.5 17.2 b 2.0 11.7 c 0.0 2.0 d

Fuente: FODECYT 04-2006.

Gráfica 7. Número de brotes, según dosis de BAP, de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro.

24 20 16 12 8 4 0

Número de Brotes deNúmero 0 0.5 1 1.5 2 Dosis de BAP (mg/L)

Fuente: FODECYT 04-2006.

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B. Altura de brotes

Las alturas de brotes que se obtuvieron en la especie Tillandsia caput-medusae, para cada repetición y tratamiento se presentan en el cuadro 27.

El ANDEVA (cuadro 28) no detectó diferencias entre tratamientos a un nivel de significancia del 5%. Las alturas de brotes, cuyas diferencias a nivel de cultivo in vitro se consideran irrelevantes, variaron entre 2.2 y 2.5 cm (gráfica 8).

Cuadro 27. Altura de brotes, según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro. Tratamiento Altura de Brotes Promedio por Repetición Tratamiento (mg/L de BAP) (cm) (cm) 1 2.1 2 2.5 0 2.4 3 2.5 4 2.5 1 2.2 2 2.2 0.5 2.2 3 2.3 4 2.1 1 2.1 2 2.0 1.0 2.2 3 2.5 4 2.4 1 2.5 2 2.5 1.5 2.5 3 2.5 4 2.6 1 2.5 2 2.2 2.0 2.3 3 2.3 4 2.1 Fuente: FODECYT 04-2006.

- 53 -

Cuadro 28. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro. Fuente de Grados de Suma de F Calculada Pr > Fc Variación Libertad Cuadrados

Tratamientos 4 0.277 2.56 NS 0.0812

Error 15 0.405

Total 19 0.682 Pr>Fc = probabilidad de encontrar un valor mayor que la F calculada NS = no significativo al 5% de nivel de significancia Coeficiente de variación = 7.0%.

Fuente: FODECYT 04-2006.

Gráfica 8. Altura de brotes, según dosis de BAP, de la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro.

3

2.5

2

1.5

1 Altura de Altura Brotes (cm) 0.5

0 0 0.5 1 1.5 2 Dosis de BAP (mg/L)

Fuente: FODECYT 04-2006.

- 54 -

Fotografía 5. Plántulas recién germinadas de la especie Tillandsia caput- medusae propagada in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

Fotografía 6. Tratamiento 1 (0 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput- medusae propagada in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

- 55 -

Fotografía 7. Tratamiento 2 (0.5 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

Fotografía 8. Tratamiento 3 (1.0 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

- 56 -

Fotografía 9. Tratamiento 4 (1.5 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

Fotografía 10. Tratamiento 5 (2.0 mg/L. de BAP) en la especie Tillandsia caput-medusae propagada in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

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III.1.2.4 Tillandsia magnusiana A. Número de brotes

En el cuadro 29 se muestran el número de brotes formados en los diferentes tratamientos en la especie Tillandsia magnusiana luego de transcurridos seis meses.

Cuadro 29. Número de brotes según tratamiento y repetición, en la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro. Tratamiento (mg/L. de BAP) Repetición 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1 1 3 2 5 5 2 2 2 3 6 4 3 0 1 1 3 4 4 1 2 3 5 3 5 2 3 2 3 3 6 2 3 4 5 5 7 2 2 4 6 5 8 1 3 4 5 5 9 2 1 3 4 3 10 2 3 5 3 5 11 1 2 2 3 3 12 0 2 2 4 4 13 0 1 2 4 3 14 1 2 3 3 4 15 2 3 4 5 5 16 1 2 2 3 4 17 2 2 3 3 4 18 1 3 3 4 3 19 1 3 2 5 3 20 2 3 4 5 5 21 2 2 3 4 5 22 1 2 3 3 4 23 0 2 3 4 4 24 1 2 2 6 4 25 1 3 4 5 6 Fuente: FODECYT 04-2006.

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El ANDEVA (cuadro 30) detectó diferencias significativas entre los diferentes tratamientos utilizados. Previo al ANDEVA se realizó una trasformación de los datos utilizando raíz cuadrada [Y’ = √(Y+1)].

Cuadro 30. ANDEVA para la variable número de brotes en la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro. Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F Pr > Fc Variación Libertad Cuadrados Medios Calculada Tratamientos 4 18.3073 4.5768 46.60 0.0001 Error 120 11.7851 0.0982 Total 124 30.0925 Coeficiente de variación = 19%

La probabilidad de encontrar un valor mayor que la F calculada fue de 0.0001, lo cual es altamente significativo, por lo tanto se acepta la hipótesis alterna, la bencilaminopurina (BAP) tiene efecto sobre la propagación de la especie Tillandsia magnusiana en cultivo in vitro. Para determinación el mejor tratamiento que induce una mayor producción de brotes, fue necesario realizar una prueba de separación de medias para lo cual se utilizó la prueba de Duncan a un 5% de nivel de significancia. El cuadro 31 nos indica que los mejores tratamientos que induce a la proliferación de brotes son utilizando 1.5 y 2.0 mg/L. de BAP, pero con fines de reducir costos el mejor se considera el tratamiento con 1.5 mg/L. de BAP, con una media de 2.0 brotes producidos.

Cuadro 31. Prueba de Duncan para la variable número de brotes, en la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro. Tratamiento Agrupación Duncan Número de Brotes (mg/L. de BAP) al 5% 1.5 2.0 a 2.0 2.0 a 1.0 1.7 b 0.5 1.5 b 0.0 1.0 b Fuente: FODECYT 04-2006.

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B. Altura de brotes

El cuadro 32 muestra los datos correspondientes al crecimiento, en centímetros, en los diferentes tratamientos luego de transcurridos seis meses.

Cuadro 32. Altura de brotes (cm.) según tratamiento y repetición, de la especie Tillandsia magnusiana a los seis meses de propagación in vitro. Tratamiento (mg/L. de BAP) Repetición 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1 1.2 0.8 0.7 0.3 0.2 2 0.9 1.0 0.6 0.3 0.6 3 1.5 0.9 1.0 0.4 0.5 4 0.7 0.8 0.8 0.2 0.5 5 0.8 0.6 0.7 0.5 0.4 6 0.9 0.5 0.8 0.1 0.3 7 0.6 0.9 0.9 0.1 0.2 8 1.0 1.1 1.0 0.1 0.3 9 0.6 1.1 0.6 0.3 0.4 10 0.9 0.4 0.2 0.2 0.3 11 1.3 0.8 0.8 0.3 0.4 12 1.7 0.4 0.5 0.3 0.4 13 1.9 1.2 0.6 0.4 0.4 14 1.2 0.5 0.4 0.3 0.3 15 1.4 1.1 0.9 0.4 0.2 16 0.9 0.9 0.6 0.1 0.5 17 0.9 0.8 0.9 0.2 0.2 18 1.1 0.5 0.5 0.1 0.2 19 1.2 0.8 0.6 0.2 0.3 20 0.9 0.6 0.5 0.1 0.2 21 0.8 1.0 0.8 0.4 0.3 22 0.9 0.9 0.9 0.3 0.5 23 1.6 1.5 0.6 0.2 0.2 24 1.2 0.9 0.5 0.2 0.3 25 1.1 0.6 0.6 0.2 0.2 Fuente: FODECYT 04-2006.

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El ANDEVA (cuadro 33) detectó que existen diferencias significativas entre los diferentes tratamientos utilizados. La probabilidad de encontrar un valor mayor que la F calculada fue de 0.0001, lo cual es altamente significativo, por lo tanto se acepta la hipótesis alterna, la bencilaminopurina (BAP) tiene efecto sobre la propagación de la especie Tillandsia magnusiana en cultivo in vitro. Para determinación el mejor tratamiento que induce una mayor altura de brotes, fue necesario realizar una prueba de separación de medias para lo cual se utilizó la prueba de Duncan a un 5% de nivel de significancia. En el cuadro 34 se indica que el tratamiento que induce al mayor crecimiento de las plántulas es sin aplicar BAP (0.0 mg/L. de BAP), con una media de 1.1 cm. de altura de brote. Se observa una tendencia de que a mayor concentración de BAP aplicado se reduce la altura de brote, como es el caso de los tratamientos con 2.0 y 1.5 mg/L. de BAP.

Cuadro 33. ANDEVA para la variable altura de brotes de la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro. Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F Pr > Fc Variación Libertad Cuadrados Medios Calculada

Tratamientos 4 12.1133 3.0283 59.88 0.0001

Error 120 6.0688 0.0506

Total 124 18.1821 Coeficiente de variación = 35%

Cuadro 34. Prueba de Duncan para la variable altura de brotes en la especie Tillandsia magnusiana propagada in vitro. Tratamiento Altura de Brote Agrupación Duncan (mg/L. de BAP) (cm.) (al 5%) 0.0 1.1 a

0.5 0.8 b

1.0 0.4 b

2.0 0.3 c

1.5 0.2 c

Fuente: FODECYT 04-2006.

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Fotografía 11. Plántulas de Tillandsia magnusiana en propagación in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

III.1.2.5 Tillandsia plagiotropica

A. Número de brotes

En el cuadro 35 se muestran los resultados obtenidos para la variable de respuesta número de brotes formados en los diferentes tratamientos en la especie Tillandsia plagiotropica luego de transcurridos seis meses de cultivo in vitro.

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Cuadro 35. Número de brotes según tratamiento y repetición, en la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro.

Tratamiento (mg/L. de BAP) Repetición 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1 0 1 2 4 5 2 1 2 3 1 2 3 0 1 1 2 1 4 1 2 3 5 2 5 2 2 2 2 3 6 0 1 3 1 5 7 2 2 4 3 1 8 1 2 1 2 5 9 0 1 3 1 2 10 2 1 2 2 5 11 1 2 1 1 2 12 0 2 1 2 4 13 0 0 2 2 3 14 1 2 1 3 4 15 1 3 2 5 1 16 1 1 1 2 2 17 2 2 1 1 4 18 1 3 2 4 3 19 1 1 1 3 2 20 0 2 0 4 5 21 2 2 1 3 3 22 1 2 1 2 2 23 0 1 3 3 4 24 1 2 1 5 2 25 1 3 2 4 3

Fuente: FODECYT 04-2006.

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El ANDEVA (cuadro 36) detectó diferencias significativas entre los diferentes tratamientos utilizados. Previo al análisis de los datos se realizó una trasformación de los datos utilizando raíz cuadrada [Y’ = √(Y+1)]. La probabilidad de encontrar un valor mayor que la F calculada fue altamente significativa (0.0001), por lo tanto se acepta la hipótesis alterna de que el BAP tiene efecto sobre la propagación in vitro de la especie Tillandsia plagiotropica. Para determinar las diferencias entre tratamientos se hizo una prueba de separación de medias por medio de la prueba de Duncan, con un nivel de significancia del 5% (cuadro 37). En el cuadro 37 se observa que todos los tratamientos superaron al testigo y que los dos mejores tratamientos fueron al utilizar 2.0 y 1.5 mg/L. de BAP, produciendo 1.7 y 1.6 brotes, respectivamente.

Cuadro 36. ANDEVA para la variable número de brotes en la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro. Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F Pr > Fc Variación Libertad Cuadrados Medios Calculada

Tratamientos 4 13.0550 3.2637 17.29 0.0001

Error 120 22.6505 0.1888

Total 124 35.7055 Coeficiente de variación = 33% Fuente: FODECYT 04-2006.

Cuadro 37. Prueba de Duncan para la variable número de brotes en la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro. Tratamiento Agrupación Duncan Número de Brotes (mg/L. de BAP) (al 5%)

2.0 1.7 a

1.5 1.6 a b

0.5 1.3 b

1.0 1.3 b

0.0 0.8 c Fuente: FODECYT 04-2006.

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B. Altura de brotes

El cuadro 38 muestra los datos correspondiente a la altura de brotes, en centímetros, de la especie Tillandsia plagiotropica en los diferentes tratamientos luego de transcurridos seis meses de cultivo in vitro.

Cuadro 38. Altura de brotes (cm.) por tratamiento y repetición, en la especie Tillandsia plagiotropica luego de transcurridos seis meses de cultivo in vitro. Tratamiento (mg/L. de BAP) Repetición 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1 0.6 0.2 0.6 0.2 0.0 2 0.5 0.0 0.5 0.5 0.2 3 0.8 0.4 0.8 0.3 0.5 4 0.7 0.8 0.4 0.0 0.4 5 0.5 0.6 0.7 0.4 0.4 6 0.9 0.6 0.4 0.4 0.1 7 0.6 0.5 0.3 0.3 0.4 8 1.0 1.1 1.0 0.3 0.1 9 0.8 1.1 0.5 0.5 0.3 10 0.6 0.4 0.6 0.3 0.1 11 0.7 0.6 0.7 0.4 0.3 12 0.9 0.4 0.8 0.4 0.1 13 0.8 0.8 0.6 0.4 0.4 14 0.6 0.5 0.5 0.4 0.3 15 0.7 0.8 0.7 0.1 0.4 16 0.6 0.9 0.7 0.3 0.5 17 0.5 0.6 0.6 0.4 0.3 18 0.6 0.5 0.7 0.1 0.2 19 0.9 0.7 0.6 0.4 0.3 20 1.0 0.6 0.9 0.2 0.1 21 0.7 0.6 0.6 0.3 0.2 22 0.8 0.9 0.8 0.2 0.5 23 0.9 0.8 0.4 0.3 0.3 24 1.0 0.9 0.7 0.2 0.3 25 0.9 0.5 0.5 0.2 0.2 Fuente: FODECYT 04-2006.

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El ANDEVA (cuadro 39) detectó diferencias entre los tratamientos evaluados, debido a que la probabilidad (0.0001) fue altamente significativa, por lo tanto se acepta la hipótesis alterna de que el BAP tiene efecto sobre la altura de brotes de la Tillandsia plagiotropica en cultivo in vitro. Para hacer una separación de las medias se utilizó la prueba de Duncan, a un 5% de nivel de significancia. El cuadro 40, indica que los tratamientos que produjeron una mayor altura de brotes fueron los que contenían 0.0, 0.5 y 1.0 mg/L. de BAP, mientras que los tratamientos que produjeron una menor altura de brotes fueron los tratamientos 4 y 5 (1.5 y 2.0 mg/L. de BAP.) Al igual que con las otras especies se observó una tendencia de que a mayor concentración de BAP aplicado se reduce la altura de los brotes.

Cuadro 39. ANDEVA para la variable altura de brote en la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro. Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F Pr > Fc Variación Libertad Cuadrados Medios Calculada

Tratamientos 4 4.5339 1.1335 36.11 0.0001

Error 120 3.7672 0.0314

Total 124 8.3011 Coeficiente de variación = 34% Fuente: FODECYT 04-2006.

Cuadro 40. Prueba de Duncan para la variable altura de brote de la especie Tillandsia plagiotropica propagada in vitro. Tratamiento Altura de Brote Agrupación Duncan (mg/L. de BAP) (cm.) (al 5%)

0.0 0.7 a

0.5 0.6 a

1.0 0.6 a

1.5 0.3 b

2.0 0.3 b Fuente: FODECYT 04-2006.

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Fotografía 12. Plántulas de Tillandsia magnusiana (izquierda) y Tillandsia plagiotropica (derecha) en crecimiento in vitro.

Fuente: FODECYT 04-2006.

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PARTE IV

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IV.1 CONCLUSIONES

Bajo las condiciones en las que se llevaron a cabo los experimentos, y después del análisis de los resultados, el trabajo de investigación contribuye al desarrollo de las metodologías que permiten la propagación del género Tillandsia, por lo anterior se concluye lo siguiente:

IV.1.1 Propagación in vivo

A. La dosis de 15 miligramos por litro de bencilaminopurina (BAP), presentó el promedio más alto de número de brotes en las tres especies de tillandsias evaluadas (Tillandsia pruinosa, Tillandsia magnusiana y Tillandsia streptophylla). El número de brotes promedio fue de 17.2 brotes para Tillandsia magnusiana, 5.8 brotes para Tillandsia pruinosa y de 5.7 para Tillandsia streptophylla.

B. Una tendencia encontrada en todas las especies fue que a mayor dosis de BAP se producían mayor número de brotes.

C. Las dosis de bencilaminopurina (BAP) que producen las mayores alturas de brotes, según la especie fueron: Tillandsia magnusiana, cinco miligramos por litro; para Tillandsia pruinosa, cero miligramos por litro (testigo); y para Tillandsia streptophylla, cero miligramos por litro (testigo). Una tendencia encontrada en todas las especies fue que a mayor dosis de bencilaminopurina (BAP) se producía una menor altura de brotes.

D. Considerando el número de brotes y su altura, al mismo tiempo, se estima que los mejores tratamientos para la propagación in vivo de las tres especies de tillandsias en estudio fueron las siguientes: para Tillandsia pruinosa, 10 miligramos por litro de bencilaminopurina (BAP); para Tillandsia magnusiana, 15 miligramos por litro de BAP; y para Tillandsia streptophylla, 15 miligramos por litro de BAP.

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E. La bencilaminopurina tiene efecto en la propagación de las plántulas del género Tillandsia a nivel de invernadero, por lo tanto se acepta la hipótesis planteada.

IV.1.2 Propagación in vitro

A. En las especies Tillandsia pruinosa y Tillandsia streptophylla no se encontró efecto de la bencilaminopurina (BAP) sobre la inducción de brotes ni sobre la altura de los mismos.

B. La mejor dosis para la propagación in vitro de Tillandsia caput-medusae, es la de un miligramo de bencilaminopurina por litro de medio de cultivo, obteniéndose 22 brotes por planta en dos meses. No se encontró efecto de la aplicación de bencilaminopurina sobre la altura de los brotes en esta especie.

C. Para la especie Tillandsia magnusiana las mejores dosis para la propagación in vitro fueron 1.5 y 2.0 miligramos de bencilaminopurina por litro de medio de cultivo, obteniéndose 2.0 brotes por planta en seis meses, en ambas dosis.

D. Para la especie Tillandsia plagiotropica las mejores dosis para la propagación in vitro fueron 1.5 y 2.0 miligramos de bencilaminopurina por litro de medio de cultivo, obteniéndose 1.6 y 1.7 brotes por planta en seis meses, respectivamente.

E. En base al análisis estadístico para las especies de Tillandsia caput- medusae, Tillandsia magnusiana y Tillandsia plagiotrópica se acepta la hipótesis, debido a que la bencilaminopurina tiene efecto en la inducción de brotes y altura de las plántulas, a excepción de Tillandsia pruinosa y Tillandsia streptophylla.

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IV.2 RECOMENDACIONES

Con base en los resultados obtenidos y la experiencia adquirida se recomienda lo siguiente:

IV.2.1 Propagación in vivo

A. Evaluar dosis más altas a 15 miligramos por litro de BAP para determinar si es posible incrementar el número de brotes en las tres especies estudiadas.

B. Realizar investigaciones con dosis de fertilizantes en las tillandsias evaluadas para probar una mejora en las alturas de brotes, tanto en mesas de crecimiento, como en madres reproductoras.

C. Aumentar el tiempo de espera de la planta madre reproductora en la fase de inducción floral para que se estabilice fisiológicamente.

IV.2.2 Propagación in vitro

A. Para las especies Tillandsia magnusiana y Tillandsia plagiotropica se recomienda evaluar dosis mayores que 2.0 miligramos por litro de bencilaminopurina.

B. Para la inducción de brotes en Tillandsia pruinosa se recomienda utilizar el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962), a un cuarto de su concentración original, sin bencilaminopurina (BAP).

C. Para la propagación in vitro de Tillandsia caput-medusae se recomienda emplear el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962), con adición de un miligramo por litro de bencilaminopurina, puesto que con este tratamiento se obtienen 22 brotes por planta, a los 60 días después de la siembra in vitro.

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IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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- 72 -

14. HURTADO D.V. Y M.E. MERINO. 1987. “Cultivo de Tejidos Vegetales”. Ed Trillas SA., México DF 232 p.

15. HOLST, B. K. 1994. Checklist of Venezuelan Bromeliaceae with notes on species distribution by state and levels of endemism. Selbyana 15: 132-149.

16. HUERTAS, G.M.; DIX, M.; TOLEDO, E.; BAUER, L. 1995. Manual de identificación de 22 especies guatemaltecas del género Tillandsia de potencial uso sustentable. Fideicomiso para la Conservación en Guatemala, Centro de Estudios Ambientales, Universidad del Valle de Guatemala. 70 p.

17. LABUS-SCHNEIDER, F.O.; ABEL, W.O. 2002. Regeneration of Tillandsia through immature embryo culture. ISHS Acta Horticulturae 289: International Symposium on Plant Biotechnology and its Contribution to Plant Development, Multiplication and Improvement http://www.actahort.org/books/289/289_24.htm.

18. LUTHER, H.E.; SIEFF, E. 1994. De rebus Bromeliacearum I. Selbyana 15(1): 9-93.

19. ______. 1997. De rebus Bromeliacearum II. Selbyana 18(1): 103-148.

20. MROGINSKI, L.A. Y ROCA, W.M. 1993. Cultivo de Tejidos en la Agricultura, Fundamentos y Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT. Colombia.

21. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15:473- 497.

22. ROCA, W.M., CASSAVA, EN: SHARP, W.R.; EVANS, D.A., AMIRATO, R.V. y YAMADA, Y. 1984. Handbook of plant cell culture. V. 2, p. 269-301.

23. SMITH, L.B.; DOWNS, R.J. 1977. Tillandsioideae (Bromeliaceae). Flora Neotropica 14(2): 663-1492.

24. TORRES A. Y L. STYER. 1990. “Técnicas e aplicacoes da cultura de tecidos de plantas”. ABCTP/EMBRAPA, Brasilia, 433 p.

25. ZRYD J.P. 1988. “Culture de Cellules, Tissus et Organes Vegetaux. Fondements Theoriques et utilisations practiques”. Presses Polytechniques Romandes, CH – 1015 Lausanne, 258 p.

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IV.4 ANEXOS

ANEXO I. Datos originales de la propagación in vivo (en invernadero) y programa utilizado para el análisis estadístico con SAS.

Tratamiento Altura de Brotes Especie Repetición Número de Brotes (mg/L de BAP) (cm)

Pruinosa 1 0 0 0 Pruinosa 2 0 2 3.6 Pruinosa 3 0 2 3.5 Pruinosa 4 0 1 3.2 Pruinosa 5 0 2 4 Pruinosa 6 0 1 3.2 Pruinosa 7 0 2 2.9 Pruinosa 8 0 2 2.5 Pruinosa 9 0 1 3.1 Pruinosa 10 0 2 3.1 Pruinosa 11 0 2 2.9 Pruinosa 12 0 1 2.5 Pruinosa 13 0 1 2.1 Pruinosa 14 0 2 3 Pruinosa 15 0 2 2.4 Pruinosa 16 0 2 2.5 Pruinosa 17 0 2 3 Pruinosa 18 0 1 2.4 Pruinosa 19 0 1 2.3 Pruinosa 20 0 2 3 Pruinosa 21 0 1 1.9 Pruinosa 22 0 1 2.1 Pruinosa 23 0 2 2 Pruinosa 24 0 2 2.4 Pruinosa 25 0 2 2.9 Pruinosa 1 5 2 2.6 Pruinosa 2 5 2 2.5 Pruinosa 3 5 1 2.3 Pruinosa 4 5 3 2.1 Pruinosa 5 5 1 3 Pruinosa 6 5 3 2.9 Pruinosa 7 5 1 2.5 Pruinosa 8 5 3 2.7 Pruinosa 9 5 1 2.6 Pruinosa 10 5 1 2 Pruinosa 11 5 4 1.6 Pruinosa 12 5 2 1.9 Pruinosa 13 5 3 2 Pruinosa 14 5 1 3 Pruinosa 15 5 2 2.5 Pruinosa 16 5 2 2.4 Pruinosa 17 5 1 2.4 Pruinosa 18 5 1 2.5 Pruinosa 19 5 2 2 Pruinosa 20 5 2 3 Pruinosa 21 5 2 2.1 Pruinosa 22 5 2 2.2 Pruinosa 23 5 2 2.1 Pruinosa 24 5 1 2.5 Pruinosa 25 5 2 2.4 Pruinosa 1 10 3 1.9 Pruinosa 2 10 3 1.8 Pruinosa 3 10 4 2.1 Pruinosa 4 10 6 2.1 Pruinosa 5 10 3 2.3

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Pruinosa 6 10 4 1.9 Pruinosa 7 10 5 1.5 Pruinosa 8 10 6 1.9 Pruinosa 9 10 4 2 Pruinosa 10 10 5 2.6 Pruinosa 11 10 6 2.5 Pruinosa 12 10 6 2.1 Pruinosa 13 10 6 2.2 Pruinosa 14 10 4 2.5 Pruinosa 15 10 5 1.4 Pruinosa 16 10 0 1.5 Pruinosa 17 10 8 2 Pruinosa 18 10 4 2.1 Pruinosa 19 10 5 2.4 Pruinosa 20 10 5 1.5 Pruinosa 21 10 4 2.3 Pruinosa 22 10 5 2.1 Pruinosa 23 10 6 2 Pruinosa 24 10 6 1.9 Pruinosa 25 10 8 1.4 Pruinosa 1 15 6 1.2 Pruinosa 2 15 6 1.5 Pruinosa 3 15 9 1.6 Pruinosa 4 15 3 1.2 Pruinosa 5 15 5 1.8 Pruinosa 6 15 4 1.3 Pruinosa 7 15 4 1.5 Pruinosa 8 15 6 2 Pruinosa 9 15 8 2.2 Pruinosa 10 15 6 1.5 Pruinosa 11 15 6 2.3 Pruinosa 12 15 9 2 Pruinosa 13 15 5 1.5 Pruinosa 14 15 6 1.6 Pruinosa 15 15 7 1.5 Pruinosa 16 15 5 1.4 Pruinosa 17 15 5 1.9 Pruinosa 18 15 5 2 Pruinosa 19 15 6 1.8 Pruinosa 20 15 6 1.7 Pruinosa 21 15 6 1.6 Pruinosa 22 15 9 2 Pruinosa 23 15 8 2.4 Pruinosa 24 15 1 2.6 Pruinosa 25 15 4 1.2 Streptophylla 1 0 0 5.2 Streptophylla 2 0 1 6 Streptophylla 3 0 1 6.1 Streptophylla 4 0 1 5.8 Streptophylla 5 0 2 5.9 Streptophylla 6 0 2 5.8 Streptophylla 7 0 1 6 Streptophylla 8 0 2 5.4 Streptophylla 9 0 0 5.9 Streptophylla 10 0 2 5.3 Streptophylla 11 0 3 6.2 Streptophylla 12 0 1 6.1 Streptophylla 13 0 2 5.9 Streptophylla 14 0 2 5.6 Streptophylla 15 0 2 6 Streptophylla 16 0 2 5.8 Streptophylla 17 0 1 5.4 Streptophylla 18 0 1 4 Streptophylla 19 0 1 6 Streptophylla 20 0 3 6.2 Streptophylla 21 0 0 5.7

- 75 -

Streptophylla 22 0 0 5.9 Streptophylla 23 0 1 6.2 Streptophylla 24 0 0 5.4 Streptophylla 25 0 3 5.3 Streptophylla 1 5 3 5.2 Streptophylla 2 5 3 5.9 Streptophylla 3 5 4 5.4 Streptophylla 4 5 5 5.5 Streptophylla 5 5 5 5.4 Streptophylla 6 5 3 5.6 Streptophylla 7 5 7 5.4 Streptophylla 8 5 4 5.1 Streptophylla 9 5 5 6 Streptophylla 10 5 5 5 Streptophylla 11 5 4 5.4 Streptophylla 12 5 6 6.1 Streptophylla 13 5 1 5.2 Streptophylla 14 5 3 4 Streptophylla 15 5 1 5.4 Streptophylla 16 5 2 5.1 Streptophylla 17 5 2 5.6 Streptophylla 18 5 1 5.2 Streptophylla 19 5 1 5.4 Streptophylla 20 5 2 4.6 Streptophylla 21 5 2 5.1 Streptophylla 22 5 2 5.4 Streptophylla 23 5 2 5.3 Streptophylla 24 5 2 5.2 Streptophylla 25 5 1 5.1 Streptophylla 1 10 1 4.2 Streptophylla 2 10 5 5 Streptophylla 3 10 4 4.3 Streptophylla 4 10 6 4.2 Streptophylla 5 10 4 5 Streptophylla 6 10 6 5.2 Streptophylla 7 10 2 5 Streptophylla 8 10 4 4.3 Streptophylla 9 10 3 4.1 Streptophylla 10 10 2 4.5 Streptophylla 11 10 3 5 Streptophylla 12 10 6 5.2 Streptophylla 13 10 4 5 Streptophylla 14 10 4 4.9 Streptophylla 15 10 2 4.8 Streptophylla 16 10 7 4.7 Streptophylla 17 10 5 4.3 Streptophylla 18 10 2 4.2 Streptophylla 19 10 7 4.2 Streptophylla 20 10 5 4.1 Streptophylla 21 10 2 5 Streptophylla 22 10 6 4.8 Streptophylla 23 10 3 4.7 Streptophylla 24 10 4 4 Streptophylla 25 10 3 5.3 Streptophylla 1 15 10 4.6 Streptophylla 2 15 8 4.5 Streptophylla 3 15 10 3.9 Streptophylla 4 15 4 4.2 Streptophylla 5 15 0 4 Streptophylla 6 15 3 3.2 Streptophylla 7 15 8 3.5 Streptophylla 8 15 9 4 Streptophylla 9 15 2 3.1 Streptophylla 10 15 7 3.5 Streptophylla 11 15 3 3.4 Streptophylla 12 15 6 3.4

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Streptophylla 13 15 3 3.5 Streptophylla 14 15 6 4 Streptophylla 15 15 4 3.1 Streptophylla 16 15 2 4.2 Streptophylla 17 15 13 3.1 Streptophylla 18 15 2 2.5 Streptophylla 19 15 6 4 Streptophylla 20 15 4 4.2 Streptophylla 21 15 8 3 Streptophylla 22 15 7 4 Streptophylla 23 15 7 3.2 Streptophylla 24 15 4 3.7 Streptophylla 25 15 6 2.9 Magnusiana 1 0 1 6 Magnusiana 2 0 1 5 Magnusiana 3 0 0 0 Magnusiana 4 0 1 6 Magnusiana 5 0 0 0 Magnusiana 6 0 1 5.1 Magnusiana 7 0 1 5.2 Magnusiana 8 0 0 0 Magnusiana 9 0 1 6 Magnusiana 10 0 0 0 Magnusiana 11 0 2 4.3 Magnusiana 12 0 0 0 Magnusiana 13 0 3 5.3 Magnusiana 14 0 0 0 Magnusiana 15 0 1 5.7 Magnusiana 16 0 0 0 Magnusiana 17 0 1 5.9 Magnusiana 18 0 0 0 Magnusiana 19 0 2 6.2 Magnusiana 20 0 0 0 Magnusiana 21 0 0 0 Magnusiana 22 0 2 5.6 Magnusiana 23 0 0 0 Magnusiana 24 0 0 0 Magnusiana 25 0 0 0 Magnusiana 1 5 2 4.3 Magnusiana 2 5 1 3.9 Magnusiana 3 5 1 4.6 Magnusiana 4 5 1 4.3 Magnusiana 5 5 0 0 Magnusiana 6 5 3 3.8 Magnusiana 7 5 0 0 Magnusiana 8 5 1 4.2 Magnusiana 9 5 0 0 Magnusiana 10 5 1 4.1 Magnusiana 11 5 2 3.9 Magnusiana 12 5 2 4.7 Magnusiana 13 5 2 3.4 Magnusiana 14 5 1 4.5 Magnusiana 15 5 2 3.6 Magnusiana 16 5 2 4.1 Magnusiana 17 5 1 3.9 Magnusiana 18 5 1 3.2 Magnusiana 19 5 1 4.3 Magnusiana 20 5 2 3.5 Magnusiana 21 5 5 3.8 Magnusiana 22 5 2 4.2 Magnusiana 23 5 2 4.2 Magnusiana 24 5 2 3.2 Magnusiana 25 5 1 3.5 Magnusiana 1 10 11 2.75 Magnusiana 2 10 16 2.8 Magnusiana 3 10 6 2.9

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Magnusiana 4 10 5 2.3 Magnusiana 5 10 7 4 Magnusiana 6 10 15 2.6 Magnusiana 7 10 12 3 Magnusiana 8 10 17 2.5 Magnusiana 9 10 10 2.3 Magnusiana 10 10 8 2.4 Magnusiana 11 10 10 2.4 Magnusiana 12 10 6 3 Magnusiana 13 10 4 2.9 Magnusiana 14 10 6 3 Magnusiana 15 10 10 2.5 Magnusiana 16 10 12 2.4 Magnusiana 17 10 5 2.9 Magnusiana 18 10 8 3.1 Magnusiana 19 10 14 2.4 Magnusiana 20 10 6 2.5 Magnusiana 21 10 11 2.4 Magnusiana 22 10 15 2.8 Magnusiana 23 10 11 2.9 Magnusiana 24 10 13 2.1 Magnusiana 25 10 8 3 Magnusiana 1 15 6 2.5 Magnusiana 2 15 34 1.1 Magnusiana 3 15 6 3 Magnusiana 4 15 5 3 Magnusiana 5 15 7 2.9 Magnusiana 6 15 24 1.2 Magnusiana 7 15 18 1.9 Magnusiana 8 15 33 1.9 Magnusiana 9 15 32 1.5 Magnusiana 10 15 24 2 Magnusiana 11 15 7 2.2 Magnusiana 12 15 6 2.1 Magnusiana 13 15 4 3 Magnusiana 14 15 6 2.2 Magnusiana 15 15 10 1.9 Magnusiana 16 15 19 1.7 Magnusiana 17 15 15 1.8 Magnusiana 18 15 27 2.1 Magnusiana 19 15 22 2.2 Magnusiana 20 15 6 3 Magnusiana 21 15 21 2.5 Magnusiana 22 15 24 2.4 Magnusiana 23 15 10 2.6 Magnusiana 24 15 34 1.2 Magnusiana 25 15 30 1.5

Programa SAS utilizado:

OPTIONS LS=64 PS=65 NODATE; DATA TILLANDS; INPUT ESPECIE $ REPETI BAP NUM_BRO ALT_BRO; CARDS; datos . . . ; PROC SORT; BY ESPECIE; PROC ANOVA; BY ESPECIE;

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CLASSES BAP; MODEL NUM_BRO ALT_BRO = BAP; MEANS BAP / DUNCAN; RUN;

ANEXO II. Datos originales de la propagación in vitro (en laboratorio) y programa utilizado para el análisis estadístico con SAS.

Tratamiento Altura de Brotes Especie Repetición Número de Brotes (mg/L de BAP) (cm)

Pruinosa 1 0.0 0 0.0 Pruinosa 2 0.0 2 0.5 Pruinosa 3 0.0 0 1.3 Pruinosa 4 0.0 3 0.9 Pruinosa 5 0.0 0 0.7 Pruinosa 6 0.0 2 1.5 Pruinosa 7 0.0 0 1.3 Pruinosa 8 0.0 1 0.0 Pruinosa 9 0.0 0 1.0 Pruinosa 10 0.0 1 0.3 Pruinosa 11 0.0 2 1.6 Pruinosa 12 0.0 0 1.5 Pruinosa 13 0.0 1 1.0 Pruinosa 14 0.0 0 1.8 Pruinosa 15 0.0 3 0.2 Pruinosa 16 0.0 2 0.7 Pruinosa 17 0.0 0 0.0 Pruinosa 18 0.0 0 0.8 Pruinosa 19 0.0 0 0.7 Pruinosa 20 0.0 5 0.3 Pruinosa 21 0.0 3 0.8 Pruinosa 22 0.0 1 0.6 Pruinosa 23 0.0 0 0.8 Pruinosa 24 0.0 2 1.1 Pruinosa 25 0.0 1 1.0 Pruinosa 1 0.5 1 0.4 Pruinosa 2 0.5 0 0.3 Pruinosa 3 0.5 0 0.1 Pruinosa 4 0.5 0 0.5 Pruinosa 5 0.5 0 0.4 Pruinosa 6 0.5 1 0.2 Pruinosa 7 0.5 0 0.3 Pruinosa 8 0.5 0 0.3 Pruinosa 9 0.5 0 0.3 Pruinosa 10 0.5 0 0.3 Pruinosa 11 0.5 0 0.2 Pruinosa 12 0.5 0 0.1 Pruinosa 13 0.5 1 0.2 Pruinosa 14 0.5 1 0.4 Pruinosa 15 0.5 0 0.3 Pruinosa 16 0.5 0 0.1 Pruinosa 17 0.5 0 0.2 Pruinosa 18 0.5 0 0.1 Pruinosa 19 0.5 0 0.0 Pruinosa 20 0.5 1 0.0 Pruinosa 21 0.5 1 0.3 Pruinosa 22 0.5 0 0.2 Pruinosa 23 0.5 0 0.0 Pruinosa 24 0.5 0 0.6 Pruinosa 25 0.5 0 0.2 Pruinosa 1 1.0 0 0.2 Pruinosa 2 1.0 1 0.5

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Pruinosa 3 1.0 0 0.3 Pruinosa 4 1.0 1 0.4 Pruinosa 5 1.0 0 0.2 Pruinosa 6 1.0 0 0.3 Pruinosa 7 1.0 2 0.2 Pruinosa 8 1.0 0 0.2 Pruinosa 9 1.0 0 0.0 Pruinosa 10 1.0 0 0.0 Pruinosa 11 1.0 0 0.2 Pruinosa 12 1.0 1 0.2 Pruinosa 13 1.0 0 0.0 Pruinosa 14 1.0 0 0.1 Pruinosa 15 1.0 0 0.0 Pruinosa 16 1.0 0 0.0 Pruinosa 17 1.0 0 0.4 Pruinosa 18 1.0 0 0.0 Pruinosa 19 1.0 0 0.6 Pruinosa 20 1.0 0 0.6 Pruinosa 21 1.0 0 0.6 Pruinosa 22 1.0 0 0.4 Pruinosa 23 1.0 0 0.0 Pruinosa 24 1.0 0 0.2 Pruinosa 25 1.0 0 0.3 Pruinosa 1 1.5 1 0.2 Pruinosa 2 1.5 0 0.8 Pruinosa 3 1.5 0 0.2 Pruinosa 4 1.5 1 0.9 Pruinosa 5 1.5 0 0.2 Pruinosa 6 1.5 0 0.3 Pruinosa 7 1.5 0 0.2 Pruinosa 8 1.5 0 0.1 Pruinosa 9 1.5 0 0.0 Pruinosa 10 1.5 0 0.0 Pruinosa 11 1.5 0 0.1 Pruinosa 12 1.5 1 0.3 Pruinosa 13 1.5 0 0.0 Pruinosa 14 1.5 0 0.6 Pruinosa 15 1.5 2 0.2 Pruinosa 16 1.5 0 0.3 Pruinosa 17 1.5 0 0.1 Pruinosa 18 1.5 0 0.0 Pruinosa 19 1.5 0 0.2 Pruinosa 20 1.5 0 0.3 Pruinosa 21 1.5 0 0.0 Pruinosa 22 1.5 0 0.6 Pruinosa 23 1.5 2 0.2 Pruinosa 24 1.5 0 0.3 Pruinosa 25 1.5 0 0.5 Pruinosa 1 2.0 0 0.4 Pruinosa 2 2.0 0 0.3 Pruinosa 3 2.0 0 0.1 Pruinosa 4 2.0 0 0.5 Pruinosa 5 2.0 0 0.4 Pruinosa 6 2.0 0 0.2 Pruinosa 7 2.0 0 0.3 Pruinosa 8 2.0 0 0.3 Pruinosa 9 2.0 0 0.3 Pruinosa 10 2.0 1 0.3 Pruinosa 11 2.0 0 0.2 Pruinosa 12 2.0 0 0.1 Pruinosa 13 2.0 0 0.2 Pruinosa 14 2.0 0 0.4 Pruinosa 15 2.0 0 0.3 Pruinosa 16 2.0 0 0.1 Pruinosa 17 2.0 0 0.2 Pruinosa 18 2.0 2 0.1

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Pruinosa 19 2.0 0 0.0 Pruinosa 20 2.0 0 0.0 Pruinosa 21 2.0 0 0.3 Pruinosa 22 2.0 0 0.2 Pruinosa 23 2.0 0 0.0 Pruinosa 24 2.0 0 0.6 Pruinosa 25 2.0 0 0.2 Streptophylla 1 0.0 0 0.0 Streptophylla 2 0.0 0 0.2 Streptophylla 3 0.0 0 0.7 Streptophylla 4 0.0 0 0.8 Streptophylla 5 0.0 0 0.6 Streptophylla 6 0.0 0 0.9 Streptophylla 7 0.0 2 0.9 Streptophylla 8 0.0 0 0.7 Streptophylla 9 0.0 3 0.0 Streptophylla 10 0.0 0 0.4 Streptophylla 11 0.0 1 0.6 Streptophylla 12 0.0 0 1.6 Streptophylla 13 0.0 5 0.2 Streptophylla 14 0.0 5 0.9 Streptophylla 15 0.0 0 3.2 Streptophylla 16 0.0 0 0.0 Streptophylla 17 0.0 1 0.6 Streptophylla 18 0.0 65 0.0 Streptophylla 19 0.0 15 0.0 Streptophylla 20 0.0 4 0.1 Streptophylla 21 0.0 0 0.7 Streptophylla 22 0.0 0 1.4 Streptophylla 23 0.0 0 1.1 Streptophylla 24 0.0 0 1.5 Streptophylla 25 0.0 5 0.1 Streptophylla 1 0.5 0 0.1 Streptophylla 2 0.5 1 0.3 Streptophylla 3 0.5 5 1.5 Streptophylla 4 0.5 10 0.0 Streptophylla 5 0.5 0 0.9 Streptophylla 6 0.5 20 0.0 Streptophylla 7 0.5 5 0.4 Streptophylla 8 0.5 0 1.6 Streptophylla 9 0.5 10 0.0 Streptophylla 10 0.5 0 0.2 Streptophylla 11 0.5 10 0.0 Streptophylla 12 0.5 0 0.4 Streptophylla 13 0.5 0 1.2 Streptophylla 14 0.5 7 0.0 Streptophylla 15 0.5 1 0.6 Streptophylla 16 0.5 10 0.7 Streptophylla 17 0.5 0 1.0 Streptophylla 18 0.5 5 0.3 Streptophylla 19 0.5 0 1.8 Streptophylla 20 0.5 0 0.6 Streptophylla 21 0.5 20 0.0 Streptophylla 22 0.5 5 0.4 Streptophylla 23 0.5 11 0.0 Streptophylla 24 0.5 10 0.4 Streptophylla 25 0.5 0 0.6 Streptophylla 1 1.0 15 0.0 Streptophylla 2 1.0 30 0.0 Streptophylla 3 1.0 2 0.9 Streptophylla 4 1.0 7 0.4 Streptophylla 5 1.0 1 0.2 Streptophylla 6 1.0 1 0.2 Streptophylla 7 1.0 0 1.2 Streptophylla 8 1.0 2 0.6 Streptophylla 9 1.0 10 0.0

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Streptophylla 10 1.0 5 0.2 Streptophylla 11 1.0 10 0.0 Streptophylla 12 1.0 0 0.8 Streptophylla 13 1.0 2 0.5 Streptophylla 14 1.0 0 0.6 Streptophylla 15 1.0 5 0.5 Streptophylla 16 1.0 2 1.1 Streptophylla 17 1.0 2 0.6 Streptophylla 18 1.0 0 1.8 Streptophylla 19 1.0 20 0.0 Streptophylla 20 1.0 2 1.1 Streptophylla 21 1.0 0 0.9 Streptophylla 22 1.0 0 0.9 Streptophylla 23 1.0 6 0.3 Streptophylla 24 1.0 0 2.0 Streptophylla 25 1.0 0 2.0 Streptophylla 1 1.5 20 0.0 Streptophylla 2 1.5 0 0.7 Streptophylla 3 1.5 1 0.4 Streptophylla 4 1.5 15 0.0 Streptophylla 5 1.5 2 1.0 Streptophylla 6 1.5 25 0.0 Streptophylla 7 1.5 0 0.4 Streptophylla 8 1.5 0 1.1 Streptophylla 9 1.5 0 1.0 Streptophylla 10 1.5 2 0.1 Streptophylla 11 1.5 0 0.9 Streptophylla 12 1.5 0 0.5 Streptophylla 13 1.5 0 0.5 Streptophylla 14 1.5 0 0.8 Streptophylla 15 1.5 3 0.0 Streptophylla 16 1.5 0 0.2 Streptophylla 17 1.5 6 0.3 Streptophylla 18 1.5 0 1.1 Streptophylla 19 1.5 0 1.2 Streptophylla 20 1.5 1 0.4 Streptophylla 21 1.5 0 1.3 Streptophylla 22 1.5 0 2.1 Streptophylla 23 1.5 0 0.4 Streptophylla 24 1.5 5 0.3 Streptophylla 25 1.5 0 2.2 Streptophylla 1 2.0 0 0.4 Streptophylla 2 2.0 1 0.4 Streptophylla 3 2.0 10 0.3 Streptophylla 4 2.0 0 0.2 Streptophylla 5 2.0 0 1.1 Streptophylla 6 2.0 0 0.2 Streptophylla 7 2.0 15 0.0 Streptophylla 8 2.0 0 0.3 Streptophylla 9 2.0 0 1.0 Streptophylla 10 2.0 0 0.8 Streptophylla 11 2.0 0 0.8 Streptophylla 12 2.0 0 0.3 Streptophylla 13 2.0 15 0.0 Streptophylla 14 2.0 2 0.7 Streptophylla 15 2.0 0 1.4 Streptophylla 16 2.0 0 0.9 Streptophylla 17 2.0 0 0.6 Streptophylla 18 2.0 0 1.0 Streptophylla 19 2.0 4 0.0 Streptophylla 20 2.0 0 1.8 Streptophylla 21 2.0 5 0.0 Streptophylla 22 2.0 0 0.8 Streptophylla 23 2.0 0 3.5 Streptophylla 24 2.0 0 2.0 Streptophylla 25 2.0 0 0.6

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Caput-medusae 1 0.0 2 2.1 Caput-medusae 2 0.0 3 2.5 Caput-medusae 3 0.0 1 2.5 Caput-medusae 4 0.0 2 2.5 Caput-medusae 1 0.5 15 2.2 Caput-medusae 2 0.5 18 2.2 Caput-medusae 3 0.5 18 2.3 Caput-medusae 4 0.5 18 2.1 Caput-medusae 1 1.0 21 2.1 Caput-medusae 2 1.0 18 2.0 Caput-medusae 3 1.0 24 2.5 Caput-medusae 4 1.0 26 2.4 Caput-medusae 1 1.5 12 2.5 Caput-medusae 2 1.5 18 2.5 Caput-medusae 3 1.5 22 2.5 Caput-medusae 4 1.5 22 2.6 Caput-medusae 1 2.0 14 2.5 Caput-medusae 2 2.0 15 2.2 Caput-medusae 3 2.0 10 2.3 Caput-medusae 4 2.0 8 2.1 Magnusiana 1 0.0 1 1.2 Magnusiana 2 0.0 2 0.9 Magnusiana 3 0.0 0 1.5 Magnusiana 4 0.0 1 0.7 Magnusiana 5 0.0 2 0.8 Magnusiana 6 0.0 2 0.9 Magnusiana 7 0.0 2 0.6 Magnusiana 8 0.0 1 1.0 Magnusiana 9 0.0 2 0.6 Magnusiana 10 0.0 2 0.9 Magnusiana 11 0.0 1 1.3 Magnusiana 12 0.0 0 1.7 Magnusiana 13 0.0 0 1.9 Magnusiana 14 0.0 1 1.2 Magnusiana 15 0.0 2 1.4 Magnusiana 16 0.0 1 0.9 Magnusiana 17 0.0 2 0.9 Magnusiana 18 0.0 1 1.1 Magnusiana 19 0.0 1 1.2 Magnusiana 20 0.0 2 0.9 Magnusiana 21 0.0 2 0.8 Magnusiana 22 0.0 1 0.9 Magnusiana 23 0.0 0 1.6 Magnusiana 24 0.0 1 1.2 Magnusiana 25 0.0 1 1.1 Magnusiana 1 0.5 3 0.8 Magnusiana 2 0.5 2 1.0 Magnusiana 3 0.5 1 0.9 Magnusiana 4 0.5 2 0.8 Magnusiana 5 0.5 3 0.6 Magnusiana 6 0.5 3 0.5 Magnusiana 7 0.5 2 0.9 Magnusiana 8 0.5 3 1.1 Magnusiana 9 0.5 1 1.1 Magnusiana 10 0.5 3 0.4 Magnusiana 11 0.5 2 0.8 Magnusiana 12 0.5 2 0.4 Magnusiana 13 0.5 1 1.2 Magnusiana 14 0.5 2 0.5 Magnusiana 15 0.5 3 1.1 Magnusiana 16 0.5 2 0.9 Magnusiana 17 0.5 2 0.8 Magnusiana 18 0.5 3 0.5 Magnusiana 19 0.5 3 0.8 Magnusiana 20 0.5 3 0.6 Magnusiana 21 0.5 2 1.0

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Magnusiana 22 0.5 2 0.9 Magnusiana 23 0.5 2 1.5 Magnusiana 24 0.5 2 0.9 Magnusiana 25 0.5 3 0.6 Magnusiana 1 1.0 2 0.7 Magnusiana 2 1.0 3 0.6 Magnusiana 3 1.0 1 1.0 Magnusiana 4 1.0 3 0.8 Magnusiana 5 1.0 2 0.7 Magnusiana 6 1.0 4 0.8 Magnusiana 7 1.0 4 0.9 Magnusiana 8 1.0 4 1.0 Magnusiana 9 1.0 3 0.6 Magnusiana 10 1.0 5 0.2 Magnusiana 11 1.0 2 0.8 Magnusiana 12 1.0 2 0.5 Magnusiana 13 1.0 2 0.6 Magnusiana 14 1.0 3 0.4 Magnusiana 15 1.0 4 0.9 Magnusiana 16 1.0 2 0.6 Magnusiana 17 1.0 3 0.9 Magnusiana 18 1.0 3 0.5 Magnusiana 19 1.0 2 0.6 Magnusiana 20 1.0 4 0.5 Magnusiana 21 1.0 3 0.8 Magnusiana 22 1.0 3 0.9 Magnusiana 23 1.0 3 0.6 Magnusiana 24 1.0 2 0.5 Magnusiana 25 1.0 4 0.6 Magnusiana 1 1.5 5 0.3 Magnusiana 2 1.5 6 0.3 Magnusiana 3 1.5 3 0.4 Magnusiana 4 1.5 5 0.2 Magnusiana 5 1.5 3 0.5 Magnusiana 6 1.5 5 0.1 Magnusiana 7 1.5 6 0.1 Magnusiana 8 1.5 5 0.1 Magnusiana 9 1.5 4 0.3 Magnusiana 10 1.5 3 0.2 Magnusiana 11 1.5 3 0.3 Magnusiana 12 1.5 4 0.3 Magnusiana 13 1.5 4 0.4 Magnusiana 14 1.5 3 0.3 Magnusiana 15 1.5 5 0.4 Magnusiana 16 1.5 3 0.1 Magnusiana 17 1.5 3 0.2 Magnusiana 18 1.5 4 0.1 Magnusiana 19 1.5 5 0.2 Magnusiana 20 1.5 5 0.1 Magnusiana 21 1.5 4 0.4 Magnusiana 22 1.5 3 0.3 Magnusiana 23 1.5 4 0.2 Magnusiana 24 1.5 6 0.2 Magnusiana 25 1.5 5 0.2 Magnusiana 1 2.0 5 0.2 Magnusiana 2 2.0 4 0.6 Magnusiana 3 2.0 4 0.5 Magnusiana 4 2.0 3 0.5 Magnusiana 5 2.0 3 0.4 Magnusiana 6 2.0 5 0.3 Magnusiana 7 2.0 5 0.2 Magnusiana 8 2.0 5 0.3 Magnusiana 9 2.0 3 0.4 Magnusiana 10 2.0 5 0.3 Magnusiana 11 2.0 3 0.4 Magnusiana 12 2.0 4 0.4

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Magnusiana 13 2.0 3 0.4 Magnusiana 14 2.0 4 0.3 Magnusiana 15 2.0 5 0.2 Magnusiana 16 2.0 4 0.5 Magnusiana 17 2.0 4 0.2 Magnusiana 18 2.0 3 0.2 Magnusiana 19 2.0 3 0.3 Magnusiana 20 2.0 5 0.2 Magnusiana 21 2.0 5 0.3 Magnusiana 22 2.0 4 0.5 Magnusiana 23 2.0 4 0.2 Magnusiana 24 2.0 4 0.3 Magnusiana 25 2.0 6 0.2 Plagiotropica 1 0.0 0 0.6 Plagiotropica 2 0.0 1 0.5 Plagiotropica 3 0.0 0 0.8 Plagiotropica 4 0.0 1 0.7 Plagiotropica 5 0.0 2 0.5 Plagiotropica 6 0.0 0 0.9 Plagiotropica 7 0.0 2 0.6 Plagiotropica 8 0.0 1 1.0 Plagiotropica 9 0.0 0 0.8 Plagiotropica 10 0.0 2 0.6 Plagiotropica 11 0.0 1 0.7 Plagiotropica 12 0.0 0 0.9 Plagiotropica 13 0.0 0 0.8 Plagiotropica 14 0.0 1 0.6 Plagiotropica 15 0.0 1 0.7 Plagiotropica 16 0.0 1 0.6 Plagiotropica 17 0.0 2 0.5 Plagiotropica 18 0.0 1 0.6 Plagiotropica 19 0.0 1 0.9 Plagiotropica 20 0.0 0 1.0 Plagiotropica 21 0.0 2 0.7 Plagiotropica 22 0.0 1 0.8 Plagiotropica 23 0.0 0 0.9 Plagiotropica 24 0.0 1 1.0 Plagiotropica 25 0.0 1 0.9 Plagiotropica 1 0.5 1 0.2 Plagiotropica 2 0.5 2 0.0 Plagiotropica 3 0.5 1 0.4 Plagiotropica 4 0.5 2 0.8 Plagiotropica 5 0.5 2 0.6 Plagiotropica 6 0.5 1 0.6 Plagiotropica 7 0.5 2 0.5 Plagiotropica 8 0.5 2 1.1 Plagiotropica 9 0.5 1 1.1 Plagiotropica 10 0.5 1 0.4 Plagiotropica 11 0.5 2 0.6 Plagiotropica 12 0.5 2 0.4 Plagiotropica 13 0.5 0 0.8 Plagiotropica 14 0.5 2 0.5 Plagiotropica 15 0.5 3 0.8 Plagiotropica 16 0.5 1 0.9 Plagiotropica 17 0.5 2 0.6 Plagiotropica 18 0.5 3 0.5 Plagiotropica 19 0.5 1 0.7 Plagiotropica 20 0.5 2 0.6 Plagiotropica 21 0.5 2 0.6 Plagiotropica 22 0.5 2 0.9 Plagiotropica 23 0.5 1 0.8 Plagiotropica 24 0.5 2 0.9 Plagiotropica 25 0.5 3 0.5 Plagiotropica 1 1.0 2 0.6 Plagiotropica 2 1.0 3 0.5 Plagiotropica 3 1.0 1 0.8

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Plagiotropica 4 1.0 3 0.4 Plagiotropica 5 1.0 2 0.7 Plagiotropica 6 1.0 3 0.4 Plagiotropica 7 1.0 4 0.3 Plagiotropica 8 1.0 1 1.0 Plagiotropica 9 1.0 3 0.5 Plagiotropica 10 1.0 2 0.6 Plagiotropica 11 1.0 1 0.7 Plagiotropica 12 1.0 1 0.8 Plagiotropica 13 1.0 2 0.6 Plagiotropica 14 1.0 1 0.5 Plagiotropica 15 1.0 2 0.7 Plagiotropica 16 1.0 1 0.7 Plagiotropica 17 1.0 1 0.6 Plagiotropica 18 1.0 2 0.7 Plagiotropica 19 1.0 1 0.6 Plagiotropica 20 1.0 0 0.9 Plagiotropica 21 1.0 1 0.6 Plagiotropica 22 1.0 1 0.8 Plagiotropica 23 1.0 3 0.4 Plagiotropica 24 1.0 1 0.7 Plagiotropica 25 1.0 2 0.5 Plagiotropica 1 1.5 4 0.2 Plagiotropica 2 1.5 1 0.5 Plagiotropica 3 1.5 2 0.3 Plagiotropica 4 1.5 5 0.0 Plagiotropica 5 1.5 2 0.4 Plagiotropica 6 1.5 1 0.4 Plagiotropica 7 1.5 3 0.3 Plagiotropica 8 1.5 2 0.3 Plagiotropica 9 1.5 1 0.5 Plagiotropica 10 1.5 2 0.3 Plagiotropica 11 1.5 1 0.4 Plagiotropica 12 1.5 2 0.4 Plagiotropica 13 1.5 2 0.4 Plagiotropica 14 1.5 3 0.4 Plagiotropica 15 1.5 5 0.1 Plagiotropica 16 1.5 2 0.3 Plagiotropica 17 1.5 1 0.4 Plagiotropica 18 1.5 4 0.1 Plagiotropica 19 1.5 3 0.4 Plagiotropica 20 1.5 4 0.2 Plagiotropica 21 1.5 3 0.3 Plagiotropica 22 1.5 2 0.2 Plagiotropica 23 1.5 3 0.3 Plagiotropica 24 1.5 5 0.2 Plagiotropica 25 1.5 4 0.2 Plagiotropica 1 2.0 5 0.0 Plagiotropica 2 2.0 2 0.2 Plagiotropica 3 2.0 1 0.5 Plagiotropica 4 2.0 2 0.4 Plagiotropica 5 2.0 3 0.4 Plagiotropica 6 2.0 5 0.1 Plagiotropica 7 2.0 1 0.4 Plagiotropica 8 2.0 5 0.1 Plagiotropica 9 2.0 2 0.3 Plagiotropica 10 2.0 5 0.1 Plagiotropica 11 2.0 2 0.3 Plagiotropica 12 2.0 4 0.1 Plagiotropica 13 2.0 3 0.4 Plagiotropica 14 2.0 4 0.3 Plagiotropica 15 2.0 1 0.4 Plagiotropica 16 2.0 2 0.5 Plagiotropica 17 2.0 4 0.3 Plagiotropica 18 2.0 3 0.2 Plagiotropica 19 2.0 2 0.3

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Plagiotropica 20 2.0 5 0.1 Plagiotropica 21 2.0 3 0.2 Plagiotropica 22 2.0 2 0.5 Plagiotropica 23 2.0 4 0.3 Plagiotropica 24 2.0 2 0.3 Plagiotropica 25 2.0 3 0.2

Programa SAS utilizado:

OPTIONS LS=64 PS=65 NODATE; DATA TILLANDS; INPUT ESPECIE $ REPETI BAP NUM_BRO ALT_BRO; CARDS; datos . . . ; PROC SORT; BY ESPECIE; PROC ANOVA; BY ESPECIE; CLASSES BAP; MODEL NUM_BRO ALT_BRO = BAP; MEANS BAP / DUNCAN; RUN;

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PARTE V

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V.1 INFORME FINANCIERO

Cuadro 41. Resumen de la ejecución financiera del proyecto. AD-R-0013 NOVENA CONVOCATORIA LINEA FODECYT PROPAGACIÓN IN VIVO E IN VITRO DE CINCO ESPECIES DE GÉNERO

Nombre del Proyecto: TILLANDSIA EN VÍAS DE EXTINCIÓN Y DE POTENCIAL USO SUSTENTABLE.

Numero del Proyecto: 004-2006 Investigador Principal: DR. CARLOS OROZCO CASTILLO Monto Autorizado: Q165,660.00 PRÓRROGA AL 31/08/2007 Fecha de Inicio y Finalización: 15 MESES DEL 03/03/2006 AL 03/06/2007 TRANSFERENCIA En Ejecución Asignación Grupo Renglón Nombre del Gasto Pendiente de Presupuestaria Menos (-) Mas (+) Ejecutado Ejecutar

1 SERVICIOS NO PERSONALES 031 JORNALES Q 14,336.00 Q 14,336.00 Q -

ESTUDIOS, INVESTIGACIONES Y 181 PROYECTOS DE FACTIBILIDAD Q 110,000.00 Q12,250.00 Q 97,750.00 Q - IMPRESIÓN, ENCUADERNACIÓN Y 122 REPRODUCCION Q 5,000.00 Q 3,086.00 Q 1,914.00 Q - 133 VIÁTICOS EN EL INTERIOR Q 3,200.00 Q6,400.00 Q 9,600.00 Q - 141 TRANSPORTE DE PERSONAS Q 6,400.00 Q 6,400.00 Q - MANTENIMIENTO Y REPARACIÓN DE EQUIPO MÉDICO-SANITARIO Y DE 163 LABORATORIO Q 5,000.00 Q 5,000.00 Q - 2 MATERIALES Y SUMINISTROS PRODUCTOS FORESTALES, MADERA, 214 CORCHO Y SUS MANUFACTURAS Q 756.00 Q 750.00 Q 6.00 ELEMENTOS Y COMPUESTOS 261 QUÍMICOS Q 13,936.00 Q 13,936.00 Q - 262 COMBUSTIBLES Y LUBRICANTES Q 3,000.00 Q1,250.00 Q 4,250.00 Q - 263 ABONOS Y FERTILIZANTES Q 520.00 Q 520.00 Q - INSECTICIDAS, FUMIGANTES Y 264 SIMILARES Q 1,500.00 Q 1,500.00 Q - PRODUCTOS PLÁSTICOS, NYLON, 268 VINIL Y PVC. Q 400.00 Q 400.00 Q - 289 OTROS PRODUCTOS METÁLICOS Q 250.00 Q 250.00 Q - 291 ÚTILES DE OFICINA Q 38.00 Q 38.00 Q -

3 PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E INTANGIBLES MAQUINARIA Y EQUIPO DE 321 PRODUCCIÓN Q 600.00 Q 600.00 Q - (-) GASTOS ADMINISTRATIVOS (10%) Q 15,060.00 Q 15,060.00 Q - TOTAL Q 165,660.00 Q 21,986.00 Q 21,986.00 Q 165,654.00 Q 6.00

Q 150,594.00 Monto Autorizado Q 165,660.00 Disponibilidad: Q 6.00 ( -) Ejecutado Q 165,654.00 Sub-total Q 6.00 ( -) Apertura de Caja Chica Total por Ejecutar Q 6.00 Fuente: FODECYT 04-2006

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