CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN
TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
CARACTERIZACIÓN CITOGENÉTICA DE GEOFITAS
MEXICANAS CON POTENCIAL ORNAMENTAL
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO
ACADEMICO DE
DOCTOR EN CIENCIA Y
TECNOLOGÍA
EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA
PRESENTA
M.C. JOSÉ MANUEL RODRÍGUEZ DOMÍNGUEZ
GUADALAJARA, JAL. AGOSTO 2016.
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN
TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
CARACTERIZACIÓN CITOGENÉTICA DE GEOFITAS
MEXICANAS CON POTENCIAL ORNAMENTAL
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO
ACADEMICO DE
DOCTOR EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
EN LA ESPECIALIDAD DE
BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA
PRESENTA
M.C. JOSÉ MANUEL RODRÍGUEZ DOMÍNGUEZ
Tutor Académico Tutor en Planta
Dr. Rodrigo Barba González Dr. Ernesto Tapia Campos
GUADALAJARA, JAL. AGOSTO 2016.
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Esta tesis fue relizada bajo la dirección de los Doctores Rodrigo Barba González y Ernesto
Tapia Campos. El trabajo se realizó en el Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C. (CIATEJ, A.C.) en Guadalajara, Jalisco, y con financiamiento de los siguientes proyectos:
1.- "Determinación de compatibilidad reproductiva en el género Eustoma" Número de Proyecto: 183591 Convocatoria: CONVOCATORIA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA BÁSICA 2012 Fondo Sectorial: SEP-CONACYT
2.- CIATEJ 2856-PI-Polianthes/09/MP Proyecto CONACYT Ciencia Básica Clave 84167.
"No os dejéis corromper por un escepticismo estéril y deprimente; no os desalentéis ante la tristeza de ciertas horas que pasan sobre las naciones. Vivid en la serena paz de los laboratorios y las bibliotecas. Preguntáos primero: ¿Qué he hecho por instruirme? Y, después, al ir progresando: ¿Qué he hecho por mi patria? Hasta que llegue el día en que podáis sentir la íntima satisfacción de pensar en que de alguna manera habéis contribuido al progreso y bienestar de la humanidad."
LOUIS PASTEUR
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por darme la oportunidad de vivir, de permitirme concluir una etapa más en mi vida y darme la capacidad de descubrir mediante la investigación científica, los secretos de la naturaleza.
A mi Institución laboral, el Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C. (CIATEJ), especialmente a la Unidad de Biotecnología Vegetal por las facilidades otorgadas para la realización de este trabajo.
Al Dr. Rodrigo Barba y al Dr. Ernesto Tapia por brindarme la oportunidad de realizar este trabajo. Agradezco mucho sus consejos, su invaluable ayuda y su excelente dirección de esta Tesis.
A todos mis compañeros que laboran en la Unidad de Biotecnología Vegetal del CIATEJ, en especial al Dr. Benjamín Rodríguez y a la Dra. Antonia Gutiérrez, por su ayuda y sus consejos durante el proceso experimental de este trabajo.
A todos aquellos estudiantes, investigadores, familiares, amigos, etc., que de alguna u otra manera estuvieron involucrados en mi trabajo de investigación dándome consejos y ayuda, sobre todo cuando los experimentos no iban del todo bien, entre los cuales puedo mencionar a: Gabriel Rincón, Alejandra González, Leida Ríos, Enoc Miranda, Julio Daviña, Guadalupe Palomino, Javier Martínez, Alfredo Corona, Lucina Bobadilla, Chela Macías, Judith, Leonard Slade Lee, Ismael Román, Martha Pérez, Adriana Rodríguez y Lidia Rodríguez, por mencionar a algunos.
DEDICATORIAS
A mi esposa Martha Yolanda, que ha estado conmigo a cada momento de mi vida apoyándome en todas mis investigaciones. Gracias por tus consejos y tu invaluable ayuda al demostrarme que con fe y trabajo nada es imposible de alcanzar.
A mis hijas Adriana Yolanda y Lidia Angélica, quienes han traído grandes alegrías a mi vida y a quienes espero contribuir con mis conocimientos científicos para heredarles un mejor planeta para vivir.
A mi madre Olimpia Domínguez y a la memoria de mi padre Manuel Rodríguez quienes siempre me apoyaron en mis estudios, logrando de esta manera hacer de mí un profesionista resposable.
A mis hermanos Alma y Luis, con quienes he compartido grandes momentos y alegrías.
ÍNDICE GENERAL CONTENIDO PÁGINA ÍNDICE GENERAL…………………………………………………………………....……i ÍNDICE DE CUADROS…………………………………………………………………….v ÍNDICE DE FIGURAS…………………………….…………………………….…...... …..vi RESUMEN……………………………………………………………………….……..…...1 ANTECEDENTES………………………………………………………………….….…....2 DEFINICIÓN DEL TEMA…………………………………………………….………....…4 JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………….…….…….5 OBJETIVOS……………………………………………………………………….…….….6 Objetivo general………………………………………………………....………...... …6 Objetivos particulares………………………………………………………..…….……..6 CAPÍTULO I……………………………………………………………………..……....….7 FUNDAMENTACIÓN……………………………………………………..………....…7 MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………….…………..….…12 Material vegetal…………………………………………………..………..….….….12 Pretratamiento, fijación y tratamiento enzimático………………..……….….….….12 Preparación de suspensión celular………………………………..……….……..….12 Preparación de laminillas…………………………..………………………………..13 Conteo y evaluación de las metafases cromosómicas y análisis estadístico……...…14 RESULTADOS………………………………………………………………………....15 DISCUSIÓN…………………………………………………………………………....17 CONCLUSIONES…………………………………………………………………..….23 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………….…….24 CAPÍTULO II……………………………………………………………..……………….29 a) Polianthes FUNDAMENTACIÓN…………………………………………………………………29 MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………...……….30
Material vegetal y sitios de muestreo………………………………………………..30 Preparaciones cromosómicas……………………………………….……………….30 RESULTADOS………………………………………………………………………....32 DISCUSIÓN……………………………………………………………………………34 b) Sprekelia formosissima FUNDAMENTACIÓN…………………………..……………………………………..36 MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………....38 Material vegetal y sitios de muestreo……………………………………………..…38 Preparaciones cromosómicas………………………………………………………..38 Conteo de cromosomas…………………………………………………...…………39 Medición de parámetros morfológicos…………………………………...………….39 RESULTADOS……………………………………………………………………...….40 DISCUSIÓN……………………………………………………………………………43 c) Hymenocallis howardii FUNDAMENTACIÓN……………………………………………………...………….44 MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………...……….46 Material vegetal y sitios de muestreo………………………….…………………….46 Preparaciones cromosómicas……………………………………………………..…46 Conteo de cromosomas……………………………………………………..……….47 Análisis del cariotipo………………………………………………………………..47 RESULTADOS…………………………………………………………….…………..48 DISCUSIÓN………………………………………………………...………………….50 d) Habranthus longifolius y Zephyranthes sp FUNDAMENTACIÓN…………………………………………………………..……..51 MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………..………..54 Material vegetal y sitios de muestreo………………….………………….…………54 Preparaciones cromosómicas………………………………………………………..54 Conteo de cromosomas…………………………………………………….………..55
RESULTADOS……………………………………………………………..…………..56 DISCUSIÓN…………………………………………………………………...……….57 CONCLUSIONES………………………………………………………..…………….58 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………..………………59 CAPÍTULO III…………………………………………………………………….……….64 FUNDAMENTACIÓN………………………………………………………...……….64 MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………65 Material vegetal………………………………………………………………...……65 Preparaciones cromosómicas………………………………………………………..66 Conteo de cromosomas……………………………………………………...………66 Análisis del cariotipo………………………………………………………...………66 Análisis en progenitores pentaploides……………………………………………….67 Viabilidad de polen………………………………………………………………69 Germinación de polen……………………………………………...…………….69 Viabilidad de óvulos……………………………………………………..………69 Tinción de tubo polínico……………………………………………...………….69 Observación de sacos embrionarios………………………………………...……70 RESULTADOS……………………………………………………………...………….71 Viabilidad de polen y germinación de polen………………………………...………73 Viabilidad de óvulos…………………………………………………………...……73 Tinción de tubo polínico………………………………………………...…………..73 Observación de sacos embrionarios………………………………………..………..76 DISCUSIÓN……………………………………………………………………………77 CONCLUSIONES………………………………………………………...……………80 ANEXO 1………………………………………………………………...……………..81 BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………….………………….82 CAPÍTULO IV…………………………………………………………………….……….84 FUNDAMENTACIÓN……………………………………………………..…………..84
MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………...……………….85 Material vegetal, sitios de muestreo y preparaciones cromosómicas……..……...…85 Aislamiento de plásmidos con ADN ribosomal de trigo……………………………85 Marcaje de las sondas………………………………………………………….……86 Mezcla de fluoróforos para marcaje directo……………………………………..86 Reacción de marcaje de las sondas…………………………………...………….86 Hibridación in situ ……………………………………………………………...……87 Pretratamiento de las laminillas………………………………………………….87 Hibridación con la sonda……………………………………………...………….87 Lavados de astringencia……………………………………………...…………..87 Montaje y contratinción………………………………………………...………..87 Lavado de portaobjetos………………………………………………….……….87 Observación al microscopio……………………………………………..…….....88 Análisis del cariotipo…………………………………………………...………..88 RESULTADOS………………………………………………………………..……….89 DISCUSIÓN………………………………………………………………...………….96 CONCLUSIONES……………………………………………………………..……….98 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………….……99
ÍNDICE DE CUADROS
CUADRO PÁGINA
Cuadro 1. Preparaciones cromosómicas reportadas de especies con diferentes números y tamaños de cromosomas……………………………………………………...…21 Cuadro 2. Propuesta para la clasificación de las plantas de acuerdo al número de cromosomas somáticos que presentan…………………………………………………...22 Cuadro 3. Valores promedio de seis características distintivas de plantas de S. formosissima colectadas en tres poblaciones del Estado de Jalisco……………………....41 Cuadro 4. Sitios de colecta, número cromosómico y nivel de ploidía de las plantas de S. formosissima utilizadas en este estudio……………………………………….65 Cuadro 5. Cruzas intraespecíficas realizadas en citotipos de S. formosissima con diferente nivel de ploidía…………………………………………………………….…65 Cuadro 6. Número de cruzas realizadas, número de cruzas exitosas y promedio de semillas por cápsula obtenidas a partir de las cruzas intraespecíficas de plantas de S. formosissima con diferentes niveles de ploidía……………………………..…71 Cuadro 7. Porcentaje de viabilidad y germinación de polen proveniente de plantas de S. formosissima ……………………………………………………………….…74 Cuadro 8. Descripción de los patrones de ADNr encontrados en plantas de la familia Amaryllidaceae mediante FISH…………………………………………...….97
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA
Figura 1. Diferentes métodos para preparaciones cromosómicas en plantas………………...8 Figura 2. Aparatos, dispositivos, instrumentos y equipos utilizados para la obtención de preparaciones cromosómicas en citogenética………………………………...10 Figura 3. Cromosomas mitóticos obtenidos de diversas especies vegetales………….……11 Figura 4. Comparación de dispersión cromosómica evaluada cualitativamente con cuatro tratamientos en 25 células metafásicas de H. howardii y S. formosissima ………15 Figura 5. Células metafásicas de S. formosissima (2n=120) y de H. howardii (2n=96)…….16 Figura 6. Inflorescencias de plantas de Polianthes…………………………………………30 Figura 7. Células con cromosomas mitóticos de diversas especies de plantas diploides (2n=2x=60) del género Polianthes donde se pueden apreciar los 10 cromosomas grandes y los 50 cromosomas pequeños…………………………….…32, 33 Figura 8. Células con cromosomas mitóticos presentando la constricción secundaria…..…33 Figura 9. Flor de Sprekelia formosissima …………………………………………………..36 Figura 10. Número cromosómico observado en metafases mitóticas de S. formosissima . a) Población “Cocula” 2n=2x=60. b) Población “Autlán” 2n=4x=120. c) Población “Zapopan” 2n=5x=150………………………………………….40 Figura 11. Variaciones en las características tamaño de la flor, longitud del escapo floral, altura de la planta y tamaño de la semilla en plantas de S. formosissima colectadas en tres poblaciones del Estado de Jalisco……………………....42 Figura 12. Flor de Hymenocallis howardii …………………………………………………44 Figura 13. Cromosomas metafásicos de la especie H. howardii con un número cromosómico 2n=96………………………………………………………………………..48 Figura 14. Cariograma de H. howardii ……………………………………………………..49 Figura 15. Flores de Habranthus longifolius y Zephyranthes sp………………………...…52 Figura 16. Células metafásicas mostrando el cariotipo de Zephyranthes sp. (2n=44)…...…56 Figura 17. Número cromosómico observado en metafases mitóticas de H. longifolius ……56 Figura 18. Metodología para analizar las posibles causas de la ausencia de producción de semillas en plantas de S. formosissima pentaploides……………………..…68
Figura 19. Cromosomas metafásicos observados en células de S. formosissima triploide (2n=3x=90)………………………………………………………………….……71 Figura 20. Cariograma de S. formosissima triploide…………………………………….....72 Figura 21. Células metafásicas de S. formosissima producto de cruzas entre plantas pentaploides (2n=5x=150) con plantas tetraploides (2n=4x=120). a) 2n=127 cromosomas. a) 2n=140 cromosomas………………………………………..…73 Figura 22. Viabilidad y germinación de granos de polen proveniente de plantas de S. formosissima ……………………………………………………………….…74 Figura 23. Cápsula y semillas producidas en la cruza de S. formosissima pentaploide ( ) x S. formosissima tetraploide ( )…………………………………...……..75 Figura 24. Tinción de tubos polínicos formándose en dirección del estigma al saco embrionario observados después de 72 hrs de la autofecundación en plantas S. formosissima pentaploide………………………………………………………..75 Figura 25. Análisis de sacos embrionarios en S. formosissima pentaploide………………..76 Figura 26. Obtención de plantas de S. formosissima triploides (3x) a partir de la cruza de plantas diploides (2x) con plantas tetraploides (4x)………………………….77 Figura 27. Obtención de plantas de S. formosissima aneuploides a partir de la cruza de plantas tetraploides (4x) con plantas pentaploides (5x)……………………....79 Figura 28. Sitios de hibridación 45S y 5S de ADN ribosomal de trigo en Zephyranthes sp…………………………………………………………………………….89 Figura 29. Sitios de hibridación 45S y 5S de ADN ribosomal de trigo en Habranthus longifolius ……………………………………………………………………..90 Figura 30. Cariograma de Habranthus longifolius (2n=35 + 1B)…………………………..91 Figura 31. Sitios de hibridación 45S y 5S de ADN ribosomal de trigo en Sprekelia formosissima diploide (2n=2x=60)……………………………………………....92 Figura 32. Sitios de hibridación 45S y 5S de ADN ribosomal de trigo en Sprekelia formosissima pentaploide (2n=5x=150)……………………………………...….92 Figura 33. Cariograma de S. formosissima diploide (2n=2x=60)………………………..…93 Figura 34. Sitios de hibridación 5S y 45S de ADN ribosomal de trigo en H. howardii …………………………………………………………………………………94 Figura 35. Idiograma de H. howardii presentando los loci para ADNr 5S y 45S…………………..95
RESUMEN México posee una gran diversidad de especies de plantas, muchas de las cuales han sido mejoradas genéticamente para ser utilizadas como ornamentales; sin embargo, aún existen muchas especies silvestres con potencial ornamental que podrían ser utilizadas en programas de mejoramiento genético. Entre los principales géneros de geofitas se encuentran Polianthes, Hymenocallis, Zephyranthes, Habranthus, Sprekelia, entre otros, muchos de los cuales incluso pueden llegar a presentar distintos niveles de ploidía. La identificación de cromosomas individuales es una herramienta útil en programas de mejoramiento genético desde la determinación del nivel de ploidía a la introgresión de segmentos cromosómicos en híbridos interespecíficos, para lo cual nos podemos auxiliar con técnicas de citogenética molecular. Sin embargo, para poder realizar este tipo de análisis es indispensable contar con preparaciones cromosómicas que no presenten cromosomas traslapados y que estén libres de citoplasma. La separación de los cromosomas es más difícil en plantas que tienen numerosos cromosomas de gran tamaño, como es el caso de muchas especies poliploides pertenecientes a la familia Amaryllidaceae. El presente trabajo se divide en cuatro capítulos: en el primero se describe una nueva técnica de separación cromosómica útil para especies que tienen cromosomas grandes y numerosos, basado principalmente en la aplicación de ácido acético, vapor e inclinando el cubrobjetos donde se coloca la muestra. En el segundo capítulo se determina el número cromosómico en siete especies del género Polianthes, una especie de Zephyranthes, una de Habranthus, una de Hymenocallys y una de Sprekelia. En el tercer capítulo se realiza la determinación del número cromosómico en plantas obtenidas mediante cruzas intraespecíficas de Sprekelia con diferentes niveles de ploidía. En el cuarto capítulo se utilizan sondas de ADN ribosomal para la identificación de cromosomas individuales en estas plantas.
ANTECEDENTES
México ocupa el cuarto lugar en la flora a nivel mundial, con alrededor de 26,000 especies, muchas de las cuales son utilizadas como alimento, forraje, en las industrias de la perfumería, farmacéutica y como ornamentales; varias de estas especies han sido mejoradas genéticamente para ser utilizadas precisamente con fines ornamentales, algunos ejemplos son los géneros: Ageratum , Begonia , Cosmos , Dahlia , Euphorbia (Nochebuena), Helianthus (Girasol), Sprekelia , Tagetes (Cempoalxochil), Tigridia , Polianthes (Nardo) y Zephyranthes , entre muchos otros. Desafortunadamente, el número de especies utilizadas para esta finalidad es limitado tomando en cuenta la gran diversidad con potencial que existe en el territorio nacional.
Entre la gran diversidad vegetal encontrada en México destacan las geofitas, estas son plantas herbáceas con órganos de almacenamiento subterráneos, los cuales son reservas de carbohidratos, nutrientes, agua y alcaloides. Dentro de las geofitas mexicanas silvestres, destacan las especies Sprekelia formosissima y Milla biflora, así como las especies de los géneros Bessera , Zephyrantes , Hymenocallis y Polianthes entre otras, debido a que sus flores presentan una gran variedad de colores, un gran tamaño o fragancias muy agradables, lo que las convierte en especies con un alto potencial para ser utilizadas como ornamentales. Con estos recursos silvestres, es posible no tan solo desarrollar nuevos cultivares para su preservación, sino también transferir nuevas características de los materiales silvestres a los cultivados, mejorando con ello sus características fenotípicas.
El estudio de los cariotipos es importante para conocer el número cromosómico de las especies, comprender las bases genéticas que apoyan los cruces que se realizan en los programas de mejoramiento genético, así como para inferir el nivel de ploidía de los materiales a utilizar, la presencia de aneuploidías, etc., sin embargo para realizar estos estudios es indispensable contar con preparaciones cromosómicas que presenten una adecuada dispersión cromosómica, sobre todo en especies que presentan numerosos cromosomas; por otra parte, el uso de técnicas de citogenética molecular tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH, por sus siglas en inglés) en el mapeo físico de secuencias de ADN repetitivas en diferentes especies vegetales, ha facilitado la identificación de cromosomas individuales, la organización de genomas, el análisis de híbridos en
programas de mejoramiento genético y estudios evolutivos en plantas facilitando la construcción de cariotipos e idiogramas.
Derivado de lo anterior, en el presente trabajo se desarrolló una técnica para optimizar la separación cromosómica en células de plantas que presentan numerosos cromosomas grandes, se propuso una clasificación de las plantas en base al número cromosómico presente en las células somáticas de las mismas (clasificación que hasta el momento no existía), se determinó el número cromosómico en especies de los géneros Polianthes, Sprekelia, Hymenocallis, Habranthus y Zephyranthes así como en plantas obtenidas mediante cruzas intraespecíficas en citotipos de Sprekelia formosissima y se realizó caracterización citogenética mediante la obtención de cariotipos utilizando marcadores moleculares de ADN ribosomal (ADNr) en Sprekelia formosissima, Hymenocallis howardii, Habranthus longifolius y Zephyranthes sp. Los resultados obtenidos en este trabajo, aportan conocimiento para utilizarse en futuros programas de mejoramiento genético en estas especies, así como en especies que presenten características similares.
DEFINICIÓN DEL TEMA
Es posible desarrollar una técnica para la separación de cromosomas que nos permita determinar el número cromosómico en plantas que presentan numerosos cromosomas grandes, así como en descendencia producto de cruzas intraespecíficas y utilizar sondas de ADNr para realizar la caracterización citogenética en geofitas mexicanas con potencial ornamental mediante el análisis de sus cariotipos.
JUSTIFICACIÓN
Dado el gran potencial ornamental que tienen las geofitas silvestres mexicanas tales como Sprekelia formosissima y las especies de los géneros Zephyranthes , Habranthus, Hymenocallis y Polianthes , es necesario contar con la caracterización citogenética de las mismas a fin de conocer sus números cromosómicos, inferir sus niveles de ploidía, etc.; una herramienta muy útil para este propósito es el uso de técnicas modernas de citogenética molecular tal como la hibridación in situ fluorescente mediante la cual se pueden identificar cromosomas individuales facilitando la construcción de cariotipos e idiogramas. Sin embargo, es necesario contar con preparaciones cromosómicas sin restos de citoplasma y que presenten una adecuada dispersión cromosómica. Debido a que la información disponible acerca de la caracterización citogenética de estas especies es poca o nula, el presente trabajo aporta información de importancia que puede ser utilizada en futuros programas de domesticación y mejoramiento genético.
OBJETIVOS
Objetivo General
Optimizar una técnica para la separación de cromosomas que permita realizar la caracterización citogenética en cuatro especies de plantas de la familia Amaryllidaceae mediante la obtención de cariotipos utilizando marcadores moleculares, así como determinar el número cromosómico en siete especies del género Polianthes y en descendencia proveniente de cruzas intraespecíficas de Sprekelia formosissima con diferentes niveles de ploidía.
Objetivos Particulares
1.1 Desarrollar una técnica que permita optimizar la separación cromosómica en células provenientes de plantas con cromosomas grandes y numerosos. 1.2 Proponer una clasificación de las plantas en base al número de cromosomas somáticos que poseen. 1.3 Determinar el número cromosómico en especies de los géneros Polianthes, Sprekelia, Hymenocallis, Habranthus y Zephyranthes. 1.4 Determinar el número cromosómico en plantas obtenidas mediante cruzas intraespecíficas de Sprekelia formosissima con diferentes niveles de ploidía. 1.5 Realizar la caracterización citogenética mediante la obtención de cariotipos utilizando marcadores moleculares en Sprekelia formosissima, Hymenocallis howardii, Habranthus longifolius y Zephyranthes sp.
CAPÍTULO I
Método para la preparación de laminillas con metafases dispersas de plantas que presntan cromosomas grandes y numerosos
FUNDAMENTACIÓN
La obtención de preparaciones cromosómicas con metafases libres de citoplasma y sin cromosomas traslapados es un factor esencial en estudios citogenéticos tales como conteos cromosómicos, técnicas de bandeo, hibridación in situ, así como para la construcción de cariotipos e idiogramas. En el caso de las plantas, la dificultad para obtener preparaciones de buena calidad se debe principalmente a la presencia de una pared celular rígida lo que hace más difícil la separación de los cromosomas. Básicamente existen tres métodos de preparaciones cromosómicas en plantas:
1. “Squashing” (Belling 1921, Östergen and Heneen 1962, Ahloowalia 1965, Lin 1977, Mirzaghaderi 2010) también conocido como “Aplastamiento” (Figura 1a). 2. “Smearing” (Brown 1966, Kurata and Omura 1978, Rayburn and Gold 1982, Pijnacker and Ferwerda 1984, Kato 1997) también conocido como “Frotis o Extendido Celular” (Figura 1b). 3. “Dropping” (Busch y cols. 1996, Hladilová y cols. 1998, Andras y cols. 1999, Andres and Kuraparthy 2013) también conocido como “Goteo”, “Splash” (Tapia-Pastrana and Mercado Ruaro 2001), “Suspensión” (Chen y cols. 1982) o “Método de protoplastos” (Murata 1983; Mouras y cols. 1986) (Figura 1c).
De estos métodos, los dos últimos se utilizan ampliamente en estudios de citogenética animal y humana (Sharma and Sharma 1980, Popescu y cols. 2000).
Figura 1. Diferentes métodos para preparaciones cromosómicas en plantas. a) “Smear”, “Frotis” o “Extendido celular”. b) “Squash” o “Aplastamiento”. c) “Splash”, “Goteo” o “Dropping”.
Los estudios realizados referentes a la dinámica de la dispersión en preparaciones de cromosomas humanos han demostrado que la humedad relativa, la temperatura y el tiempo de secado son los principales factores que controlan dicha dispersión (Spurbeck y cols. 1996, Hliscs y cols. 1997, Claussen y cols. 2002, Ami y cols. 2014); con base en estos estudios, recientemente se ha desarrollado un método para la obtención de preparaciones cromosómicas de plantas conocido como “SteamDrop” en el cual la aplicación de vapor a las muestras juega un papel esencial en la dispersión cromosómica de varias especies vegetales (Kirov y cols. 2014). Además de estos factores, otros autores han reportado que para una buena dispersión cromosómica, también pueden influir otros tales como: el grado de inclinación del portaobjetos al momento de realizar el goteo así como la altura desde la cual se deja caer la gota (Ahlada y cols. 2005, Qu y cols. 2008), la aplicación de tratamiento hipotónico (Mouras y cols. 1986, Claussen y cols. 2002), la densidad celular (Ahlada y cols. 2005, Kato 1997), la temperatura y humedad en el portaobjetos durante el secado (Henegariu y cols. 2001, Deng y cols. 2003), la cantidad de solución fijadora utilizada (Gui y cols. 2006), el tiempo de hidrólisis del tejido (Busch y cols. 1996, Kato 1997), la presión ejercida sobre el cubreobjetos en la técnica de squash (Powell 1971), entre otros.
Tomando en cuenta todos los factores que pudieran influir para la obtención de preparaciones cromosómicas de calidad, se han fabricado una serie de aparatos (Linkfield y cols. 1967, Powell 1971, Berrios 1994, Ahlada y cols. 2005, Qu y cols. 2008), equipo (Yamada y cols. 1992, Gersen 2013), microdispositivos (Vedarethinam y cols. 2010, Shah y cols. 2011,
Kwasny y cols. 2014) e incluso una sala con condiciones ambientales adecuadas para lograr este propósito (Lundsteen and Lind 1985) (Figura 2).
Debido a que las diferentes especies de plantas pueden tener variaciones en el número y el tamaño de los cromosomas, así como en los componentes intracelulares, ha sido difícil establecer un protocolo estándar que se aplique a la mayoría de las especies vegetales por lo que resulta más difícil obtener buenas preparaciones de unas especies que de otras. Por esta razón, algunos investigadores han mencionado que el método para la obtención de preparaciones cromosómicas de buena calidad es considerado un arte mas que una ciencia (Barch y cols. 1997, Kwasny y cols. 2014); esto ha propiciado que se hayan desarrollado u optimizado diferentes técnicas para determinados géneros o especies de plantas: Rosa (Ma y cols. 1996), Acacia y Prosopis (Bukhari 1997), Musa (Doležel y cols. 1998, Bakry and Shepherd 2008), Solanum (Chen and Li 2005), Passiflora (Souza y cols. 2010), Prunus avium (Javanmard y cols. 2013), Paspalum quadrifarium (Speranza y cols. 2003), Nicotiana plumbaginifolia (Mouras y cols. 1986), Gossypium hirsutum (Andres and Kuraparthy 2013), Prosopis laevigata (Tapia-Pastrana and Mercado Ruaro 2001), Zea mays (Lin 1977, De Carvalho and Saraiva LS 1993, Kato 1997), Melandrium album (Hladilová y cols. 1998), Conyza bonariensis (de Paula and Pinto-Maglio 2015), entre otras.
Con respecto al tamaño y al número de cromosomas, la mayoría de los métodos propuestos (independientemente de la técnica utilizada) se han desarrollado para obtener preparaciones de buena calidad para especies que poseen: pocos cromosomas pequeños (Mouras y cols. 1986, Kato 1999, Souza y cols. 2010, Javanmard y cols. 2013) (Figura 3a), numerosos cromosomas pequeños (Andras y cols. 1999, Speranza y cols. 2003, Andres and Kuraparthy 2013, de Paula and Pinto-Maglio 2015) (Figura 3b) o bien, pocos cromosomas grandes (Östergren and Heneen 1962, Murata 1983, Busch y cols. 1996) (Figura 3c). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una técnica para la preparación de laminillas de buena calidad en Sprekelia formosissima (2n=120) e Hymenocallis howardii (2n=96), especies poliploides pertenecientes a la familia Amaryllidaceae que poseen una gran cantidad de cromosomas grandes. Este es el primer reporte respecto al número cromosómico para H. howardii . Además, se propone una clasificación de las plantas según el número de cromosomas somáticos que presentan.
Figura 2. Aparatos, dispositivos, instrumentos y equipos utilizados para la obtención de preparaciones cromosómicas en citogenética. a) Micro prensa para preparaciones citológicas (Larter and Ikonen, 1977). b) Prensa de pellets para el extendido de cromosomas (Powell, 1971). c) Dispositivo para el aplastamiento de núcleos y cromosomas (Berrios, 1994). d) Dispositivo para realizar goteo de suspensiones celulares que permite ajustar la altura del goteo y el ángulo de la laminilla (Qu y cols., 2008). e) Aparato para el aplastamiento de preparaciones cromosómicas (Linkfield y cols., 1967). f) Prototipo de un dispositivo para el goteo de preparaciones cromosómicas que permite ajustar la altura del goteo y el ángulo de la laminilla (Ahlada Rao y cols., 2005). g) Dispositivo de microfluidos miniaturizado para producir metafases dispersas por “splashing” el cual se ensambla a un dispositivo microFISH que permite un protocolo optimizado de metafases para FISH en un chip con más de 20 veces la reducción en el volumen de los reactivos utilizados (Vedarethinam y cols., 2010). h) Dispositivo con una cámara de expansión integrada para cultivar, arrestar y fijar células en metafase seguido por un protocolo de dispersión cromosómica por “splashing” para análisis mediante FISH (Shah y cols., 2011). i) Dispositivo semi-cerrado con una cámara de microfluidos provista de orificios de perfusión que facilitan la evaporación de la solución fijadora, lo que produce dispersión cromosómica (Kwasny y cols., 2014). j) Equipo para realizar la preparación semiautomática de laminillas cromosómicas, basado en sistemas de control de la temperatura y la humedad mediante termomódulos (Yamada y cols., 1992). K y l) Equipos dispersores de metafases HANABI-PIV automatizado y HANABI no automatizado; la temperatura, humedad, y el flujo de aire se introducen y rápidamente se estabilizan de manera que cuando preparaciones de cromosomas se colocan en portaobjetos, se secan de una manera constante y reproducible. El equipo HANABI-PIV puede procesar hasta 96 laminillas por corrida (Transgenomic, Inc., USA). m) Cámara de secado citogenético Thermotron CDS-5, la cual provee una temperatura óptima y una humedad ambiental adecuadas requeridas para obtener dispersiones cromosómicas ideales; la cámara permite que la persona realice y procese las muestras una por una (©Thermotron Inc., USA).
Figura 3. Cromosomas mitóticos obtenidos de diversas especies vegetales. a) Prunus avium 2n=2x=16, especie que presenta pocos cromosomas pequeños. b) Lycopersicon esculentum (+) L. peruvianum 2n=6x=72, híbrido somático que presenta numerosos cromosomas pequeños. c) Hordeum vulgare 2n=2x=14, especie que presenta pocos cromosomas grandes. Barra=10µm. (Fuente: a) Javanmard y cols. 2013; b) Andras y cols. 1999; c) Busch y cols. 1996).
MATERIALES Y METODOS
Material Vegetal
Se utilizaron ápices radiculares obtenidos a partir de bulbos de plantas de Sprekelia formosissima y de Hymenocallis howardii pertenecientes a una colección in vivo del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, Asociación Civil (CIATEJ, A.C.); las plantas de S. formosissima se colectaron en el tramo carretero Autlán- La Huerta, Jalisco, mientras que las de H. howardii se colectaron en el “volcán de Tequila”, municipio de Tequila, Jalisco. La técnica utilizada para la obtención de metafases mitóticas se describe a continuación:
Pretratamiento, fijación y tratamiento enzimático
1.- Se colectaronon ápices radiculares de alrededor de 1 cm de longitud y se colocaron en una solución de -bromonaphtaleno (1:1000 en solución acuosa) a 4° C durante 48 h.
2.- Los ápices se removieron de la solución de -bromonaphtaleno, se agregó la solución fijadora fría de metanol:ácido acético (3:1) reciénentemente preparada y se almacenar a 4° C durante 24 h.
3.- Los ápices radiculares se lavaron durante 10 min en agua mQ (agua que ha sido purificada utilizando un cartucho de intercambio iónico).
4.- Se cortaron los meristemos y se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 0.65 ml con buffer de citrato 10 mM (pH 4.5) durante 10 min (el tejido meristemático es claramente visible como una región blanca opaca o blanca lechosa).
5.- Se eliminó el buffer de citrato y se colocaron 50 µl de mezcla enzimática conteniendo 0.2% (w/v) de pectiolasa Y23, 0.2% (w/v) de celulasa RS y 0.2% (w/v) de citohelicasa en solución 10 mM de buffer de citrato (pH 4.5).
6.- Se incubaron los meristemos radiculares a 37° C durante 3-3.5 h (el tiempo de digestión enzimática debe ajustarse de acuerdo al diámetro de la raíz).
Preparación de suspensión celular (de acuerdo al protocolo descrito por Kirov y cols. 2014, solamente cambiando etanol por metanol)
1.- En un agitador vórtex, se agitaron los tubos de microcentrífuga con los meristemos digeridos a fin de obtener una suspensión celular (las partículas grandes no digeridas se retiraron cuidadosamente succionándose de la suspensión mediante una pipeta Pasteur).
2.- Se agregaron 600 µl de agua destilada y se mezclaron.
3.- Posteriormente se centrifugaron a 10,000 rpm durante 45 s.
4.- Se removió el sobrenadante utilizando una pipeta Pasteur o una micropipeta.
5.- Se añadieron 600 µl of metanol y se mezcló.
6.- Nuevamente se centrifugó a 11,000 rpm durante 30 s.
7.-Se removió el sobrenadante invirtiendo el tubo de microcentrífuga.
8.- Finalmente se resuspendió el botón en 20-100 µl of metanol, dependiendo de la concentración celular (la suspensión celular puede almacenarse por largos periodos de tiempo a -20° C).
Preparación de laminillas
1.- En una campana de extracción, se colocaron 7-10 µl de suspensión celular sobre un portaobjetos limpio colocado a un ángulo de alrededor de 45° y cubierto con una delgada capa de ácido acético glacial.
2.- Inmediatamente se agregaron dos gotas (100 µl) de ácido acético glacial y se esperó hasta que la superficie adquierió una apariencia granular, debido a la evaporación del ácido acético.
3.- Posteriormente se colocaron las laminillas cara hacia abajo en contacto con el vapor producido en un baño maría a 55° C durante 3-5 s.
4.- Se agregó una gota (50 µl) de ácido acético glacial.
5.- Finalmente, se secaron las laminillas con un flujo de aire (por ejemplo, utilizando un ventilador de mesa).
Conteo y evaluación de las metafases cromosómicas y análisis estadístico
A fin de evaluar la eficacia de la nueva técnica en la separación de cromosomas, se realizó una comparación junto con los tratamientos ya reportados de Squash, SteamDrop simple (20 µl de solución fijadora etanol:ácido acético 3:1) y SteamDrop doble (20 µl de solución fijadora etanol:ácido acético 3:1 y 6 µl de solución fijadora etanol:ácido acético 1:1) (Kirov y cols., 2014) en las raíces obtenidas de un total de siete plantas de cada una de las dos especies. Todas las preparaciones se tiñieron con 1 µg ml -1 de solución DAPI (4’,6- diamidino-2-phenylindole) y la evaluación de las células en metafase se realizó de forma cualitativa en 100 metafases (25 por cada tratamiento). Las preparaciones se clasificaron en cuatro categorías: 0) metafase con cromosomas totalmente traslapados; 1) metafase con al menos 10% de cromosomas no traslapados; 2) metafase con aproximadamente el 50% de sus cromosomas traslapados; 3) metafase con cromosomas totalmente dispersos o cuando menos el 10% de cromosomas traslapados, pero fácilmente contables sin esfuerzo considerable (siendo ésta la categoría óptima para el conteo cromosómico). Los datos se analizaron utilizando métodos de estadística no paramétrica (prueba de Kruskal-Wallis y prueba de la mediana de Mood) con un nivel de confianza del 95%.
Para realizar el conteo del número de cromosomas, las cinco mejores metafases de S. formosissima y de H. howardii se fotografiaron en un microscopio Leica DM5500B-CS modelo TCS SPE, utilizando un láser de excitación a 405 nm, y una ventana de detección entre 415 y 480 nm.
Las imágenes se capturaron utilizando el software LASX (Leica Microsystems) con un formato de 1024 x 1024 pixeles. Alrededor de 500 células fueron evaluadas para calcular el índice mitótico en cada preparación (un total de 5,000 células en diez preparaciones de cada especie) mediante la la fórmula IM = (Número de células en mitosis / Total de células) x 100.
RESULTADOS
Se encontró diferencia estadística significativa (p<0.05) entre los tratamientos, presentándose una mayor cantidad de dispersión cromosómica en la técnica propuesta en este trabajo con respecto a las técnicas de Squash, SteamDrop simple (SteamDrop1) y SteamDrop doble (SteamDrop2). Además de lo anterior, las preparaciones obtenidas mediante esta nueva técnica, generaron una gran cantidad de metafases mitóticas con dispersiones cromosómicas de buena calidad (categoría 3) en ambas especies, cuyo número de células metafásicas fue superior a las de las otras categorías, demostrando la efectividad de la técnica (Figura 4). Los resultados del análisis de la dispersión cromosómica fueron muy similares tanto en S. formosissima como en H. howardii . Por otra parte, el índice mitótico fue ligeramente superior en S. formosissima (10.0%) en comparación con H. howardii (7.4%).
En las metafases evaluadas con categoría 3 en las dos especies estudiadas, se observó que las metafases no presentaron restos de citoplasma y mantenían la morfología de los cromosomas, esto aunado a una buena dispersión de los mismos, facilitaron su conteo, pudiéndose determinar el número cromosómico en ambas especies: S. formosissima 2n=120 e H. howardii 2n=96 (Figura 5A y 5B).
Figura 4. Comparación de dispersión cromosómica evaluada cualitativamente con cuatro tratamientos en 25 células metafásicas de H. howardii y S. formosissima . Medianas con la misma letra no son significativamente diferentes ( =0.05) de acuerdo a la prueba de la mediana de Mood.
Figura 5. Células metafásicas de S. formosissima (2n=120) (a) y de H. howardii (2n=96) (b). Barra=10µm.
DISCUSIÓN
La principal dificultad para la dispersión cromosómica en especies que poseen numerosos cromosomas grandes (8-10 µm o más) es que, debido a su longitud, sus brazos se traslapan evitando la dispersión de los mismos y por tanto, dificultan su conteo. Es bien sabido que la exposición prolongada de los tejidos a arrestadores mitóticos produce una sobrecondensación de los cromosomas (Schwarzacher and Leitch 1994), al igual que lo hace la exposición a bajas temperaturas (Bukhari 1997). El tiempo de exposición puede variar dependiendo del tipo de tejido, el tipo de arrestador mitótico utilizado y la concentración del mismo; Koyani and Saiyad (2011) obtuvieron una considerable reducción en la longitud de cromosomas humanos al exponerlos a 10 µg/mL de colchicina durante 4 h, mientras que, de Salazar e Fernandes y cols. (2013) lograron una sobrecondensación cromosómica utilizando 0.5 µg/mL de colcemid durante 48 h. Por otra parte, se ha demostrado que otras sustancias químicas tales como los carbamatos son altamente efectivas en la condensación de cromosomas, pues en algunas especies disminuyen hasta un 25% de su longitud, sin embargo, su uso prolongado puede llegar a destruirlos (Mann and Storey 1966). Rao y cols. (1977) sugieren que altas concentraciones de metabolitos dentro del citoplasma pueden incrementar la condensación de cromosomas mitóticos, la cual cambia en las diferentes fases del ciclo celular. Contrariamente, Rønne y cols. (1979) encontraron que un aumento en el tiempo de exposición en solución fijadora, resulta en un incremento en la longitud de los cromosomas. Experimentos preliminares realizados en nuestro laboratorio (datos no presentados) determinaron que la exposición de ápices radiculares a una solución de -bromonaftaleno al 0.1% durante 48 h a 4° C redujo considerablemente la longitud de los cromosomas, facilitando su dispersión al momento de realizar las preparaciones y reduciendo al mínimo el traslape de los mismos, razón por la cual se decidió utilizar estas condiciones en este estudio.
Con respecto al tratamiento con solución hipotónica, aún cuando es un paso esencial para la preparación de laminillas de buena calidad en citogenética animal y humana, su uso en citogenética vegetal se reporta en pocos estudios (Mouras y cols. 1986, Busch y cols. 1996, Tapia-Pastrana and Mercado-Ruaro 2001); las diferencias entre las células animales y vegetales respecto al requerimiento de solución hipotónica, posiblemente se debe a diferencias inherentes en las presiones osmóticas celulares (Geber and Schweizer 1988). En
nuestra investigación no se utilizó ningún tratamiento de choque hipotónico, ya que experimentos anteriores realizados en nuestro laboratorio con KCl 75 mM, demostraron que su uso no es un factor que contribuya a la dispersión cromosómica en Sprekelia formosissima (Rodríguez-Domínguez y cols. 2013). En contraste con lo reportado para citogenética humana, donde se ha demostrado que, si bien el choque hipotónico no influye en el hinchamiento de la célula, éste es necesario ya que sitúa a los cromosomas en la periferia de la célula favoreciendo su dispersión (Claussen y cols. 2002). De igual manera Bukhari (1997) obtuvo una buena dispersión cromosómica solo en las muestras provenientes de ápices radiculares tratados con KCl 75 mM por 10 min para Acacia y Prosopis , por lo que su uso puede ser dependiente de la especie vegetal utilizada.
La solución fijadora más ampliamente utilizada es preparada con alcohol:ácido acético (en proporción 3:1) donde el alcohol puede ser metanol o bien etanol; en la técnica propuesta se decidió utilizar solución fijadora metanol:ácido acético, ya que de acuerdo a De Carvalho and Saraiva (1993), ésta solución permite una mejor preservación de la estructura y morfología cromosómica comparada a la fijación con etanol:ácido acético además, de acuerdo a los resultados obtenidos por Andras y cols. (1999), la solución fijadora con metanol fue más eficiente para lisar las células dispersando fragmentos de citoplasma y separando a los cromosomas. En la técnica de goteo, la calidad de la dispersión se debe principalmente a la evaporación de la solución fijadora, la cual está altamente influenciada por las condiciones ambientales como la humedad, la temperatura y el tiempo de secado de la muestra (Spurbeck y cols. 1996); el metanol se evapora primero por lo que el ácido acético (el cual es altamente higroscópico) reacciona con el agua del medio ambiente y con las proteínas celulares produciendo un hinchamiento de la célula favoreciendo de esta manera la dispersión cromosómica (Claussen y cols. 2002, Ami y cols. 2014). En la técnica de “SteamDrop” descrita por Kirov y cols. (2014), el vapor producido por un baño maría proveyó la humedad y la temperatura necesarias para lograr la dispersión cromosómica en diversas especies vegetales. De acuerdo a las investigaciones realizadas por Hliscs y cols. (1997), la dispersión de las metafases debido a la evaporación de la solución fijadora es un proceso lento el cual conduce al alargamiento de los cromosomas, mientras que la evaporación rápida no permite que se alarguen, además de esto, el secado lento de las laminillas puede producir una sobredispersión de los mismos ocasionando que muchos de ellos se pierdan (Kirov y cols.
2014). Por otra parte, de acuerdo con Spurbeck (1996), el secado rápido hace que la célula no alcance un diámetro suficientemente grande lo que genera una metafase compacta con cromosomas traslapados; debido a que las especies vegetales utilizadas en nuestro estudio presentaban numerosos cromosomas grandes, para evitar estos inconvenientes, la gota de suspensión celular se colocó sobre un portaobjetos bañado con una solución de ácido acético puro a fin de que ayudara a eliminar completamente todos los restos de citoplasma y así lograr una buena dispersión cromosómica. Sin embargo, la evaporación de la suspensión fue demasiado rápida generando una alta densidad celular que impidió ver metafases individuales; para resolver este problema, el portaobjetos se colocó con una inclinación de 45° con lo cual se logró una buena dispersión de la gota de suspensión celular, estos resultados concuerdan con los reportados por Ahlada y cols (2005), Qu y cols. (2008) y Kuo y cols. (2016) quienes encontraron que la inclinación del portaobjetos es un factor que favorece la dispersión celular y por tanto la dispersión cromosómica. Por el contrario, de acuerdo con los resultados obtenidos por Deng y cols. (2003), la inclinación del portaobjetos no es un factor que contribuya significativamente a la dispersión cromosómica como tampoco lo es la altura desde la cual se deja caer la gota, ya que ésta sólo ayuda a distribuir mas equitativamente las células sobre la superficie de la laminilla (Henegariu y cols. 2001). Al igual que estos investigadores, en este trabajo se observó que la altura tampoco es un factor clave, ya que se obtienen buenas dispersiones cromosómicas independientemente si la suspensión celular se realizó desde una altura determinada o simplemente se colocó sobre la superficie del portaobjetos tocando su superficie con la punta de la micropipeta. Además de agregar ácido acético puro, las laminillas se colocaron sobre un baño maría de manera similar a la descrita por Kirov y cols. (2014) y nuevamente se agregó ácido acético puro, todo esto a fin de asegurar una excelente dispersión cromosómica, ya que como se mencionó anteriormente, el incremento en la concentración de ácido acético es un factor importante en la obtención de metafases de buena calidad con cromosomas dispersos (Hlics y cols. 1997). Si bien el ácido acético diluido (45%, 60%, 70%) se utiliza para eliminar los restos de citoplasma, y éste no daña la estructura y morfología de los cromosomas (De Carvalho and Saraiva 1993), algunos autores han reportado que los ácidos en general pueden afectar a la estructura de las proteínas celulares, las histonas, y el DNA ocasionando depurinación del mismo (Hladilová y cols. 1998, Ma y cols. 1996); de acuerdo a los estudios realizados por
Ami y cols. (2014), el ácido acético causa pérdida de conformación estructural de las proteínas ocasionando la formación de agregados proteicos, procesos ocasionados probablemente por la variación del pH hacia valores ácidos; por otra parte, sugieren que el ácido acético afecta al ácido desoxirribonucleico presentándose ADN en conformación Z. Debido a que en la técnica que proponemos los cromosomas se encuentran en contacto directo con ácido acético puro (glacial), es probable que se presenten alteraciones a nivel histonas y a nivel ADN, sin embargo dichos efectos no fueron evaluados ya que nuestro objetivo sólo era la obtención de la dispersión cromosómica a fin de realizar el conteo de los mismos.
Respecto al tamaño y número de cromosomas, para las plantas que presentan pocos cromosomas es muy fácil lograr su separación prácticamente por cualquier técnica e independientemente de cual sea su tamaño, obteniendo preparaciones de buena calidad. En contraste, para plantas con un gran número de cromosomas (plantas poliploides), si estos son pequeños se torna relativamente fácil su separación, mientras que si son grandes es demasiado difícil lograr separarlos. En el Cuadro 1 se presentan algunos ejemplos.
Sin embargo, cuando los números cromosómicos son demasiado elevados, la separación se hace más difícil y, por ende, su conteo se reporta muchas veces sólo como valores aproximados. En este estudio logramos obtener preparaciones metafásicas de buena calidad, libres de citoplasma y con una excelente dispersión cromosómica en plantas poliploides de la familia Amaryllidaceae con numerosos cromosomas grandes (2n>90) ( S. formosissima e H. howardii ). Reportes previos han mostrado la dificultad en el conteo de cromosomas en plantas poliploides de S. formosissima, en los trabajos realizados por Rodríguez-Domínguez y cols. (2013) y Tapia-Campos y cols. (2013) se muestran metafases con varios cromosomas aún traslapados, por otra parte, Price y cols. (1972) reportan solamente un valor aproximado (S. formosissima 2n=ca 120), lo cual se debe precisamente a la dificultad para separar cromosomas en especies poliploides con cromosomas numerosos.
Cuadro 1. Preparaciones cromosómicas reportadas de especies con diferentes números y tamaños de cromosomas. Especie reportada Número y tamaño Técnica utilizada Referencia de cromosomas para separación Passiflora cacaoensis, P. Pocos y pequeños Dropping Souza y cols. 2010 gerdneri, P. gardneri x P. gibertii (2 n=18) Prunus avium (2n=16) Pocos y pequeños Squashing Javanmard y cols. 2013 Zea mays (2n=20) Pocos y pequeños Smearing De Carvalho and Saraiva 1993 Rosa wichuraiana (2n=14) Pocos y pequeños Steamdrop Kirov y cols. 2014 Hordeum vulgare (2n=14) Pocos y grandes Dropping Busch y cols. 1996 Lolium perenne (2n=14) Pocos y grandes Squashing Ahloowalia 1965 Allium cepa (2n=16) Pocos y grandes Steamdrop Kirov y cols. 2014 Hybrid Lycopersicon Muchos y pequeños Dropping Andras y cols. 1999 esculentum (+) x Lycopersicon peruvianum (2n=6x=72) Spirodela polyrrhiza Muchos y pequeños Dropping Geber and Schweizer (2n=80) 1988 Oncidium pubes (2n=84) Muchos y pequeños Squashing Daviña y cols. 2009 Pteris pellucidifolia Muchos y pequeños Squashing Huang y cols. 2011 (2n=3x=87) Asplenium dareoides Muchos y pequeños Squashing Jara-Seguel y cols. (2n=4x=144) 2006 Zephyranthes brazosensis Muchos y grandes Squashing Greizerstein 1987 (2n=72) Hippeastrum puniceum Muchos y grandes Squashing Poggio y cols. 2014 (2n=6x=66) Hymenocallis harrisiana Muchos y grandes No Mencionada Jee and Vijayavalli (2n=74) 1999
Roa and Guerra (2015) clasificaron los cromosomas por tamaño en tres categorías: pequeños (<3 m), medianos (3-6 m) y grandes (> 6 m), de esta manera podemos hablar de plantas que presentan cromosomas pequeños, medianos o grandes, sin embargo no existe literatura que mencione alguna clasificación de las plantas con base en el número de cromosomas, aun cuando en varios trabajos se mencionan plantas con pocos o muchos, no hay un estándar para definir qué cantidad se debe considerar pocos o muchos cromosomas, algunos ejemplos se dan en el Cuadro 1. Por razones de uniformidad y consistencia de la terminología, proponemos una clasificación de plantas basada en el número de cromosomas somáticos (independientemente del nivel de ploidía) la cual se presenta en el Cuadro 2.
Cuadro 2. Propuesta para la clasificación de las plantas de acuerdo al número de cromosomas somáticos que presentan.
Clasificación Número Ejemplos reportados cromosómico Plantas con un número de Colpodium versicolor (2n=2x=4) cromosomas muy bajo. 2n ≤ 20 Allium cepa (2n=2x=16) Zea mays (2n=2x=20) Plantas con un número de Sinapis alba (2n=2x=24) cromosomas bajo. 2n > 20 ≤ 40 Helianthus annuus (2n=2x=34) Glycine max (2n=2x=40) Plantas con un número de Tritucum aestivum (2n=6x=42) cromosomas alto. 2n > 40 ≤ 80 Gossypium hirsutum (2n=4x=52) Solanum nigrum (2n=6x=72) Plantas con un número de Pteris pellucidifolia (2n=3x=87) cromosomas muy alto. 2n > 80 Asplenium dareoides (2n=4x=144) Cystopteris sp. (2n=6x=252)
Estos hallazgos demostraron que la técnica propuesta produce excelentes resultados en la obtención de preparaciones mitóticas libres de citoplasma y con cromosomas dispersos de plantas poliploides que presentan numerosos cromosomas grandes, como es el caso de S. formosissima (2n=120) e H. howardii (2n=96), por lo que podría aplicarse a otras especies con características cromosómicas similares. Además, es importante señalar que este trabajo es el primer reporte del número cromosómico para H. howardii .
CONCLUSIONES
Se desarrolló una técnica para optimizar la separación cromosómica en células provenientes de plantas con cromosomas grandes y numerosos tales como Sprekelia formosissima (2n=120) e Hymenocallis howardii (2n=96), la cual tiene pasos principales: a) pretratamiento para producir condensación cromosómica, b) goteo en laminillas inclinadas y cubiertas con una capa de ácido acético glacial y c) aplicación de vapor.
Se propuso una clasificación de las plantas en base al número de cromosomas somáticos que poseen, en cuatro categorías: a) Plantas con un número de cromosomas muy bajo (2n ≤ 20), b) Plantas con un número de cromosomas bajo ( 2n > 20 ≤ 40 ), c) Plantas con un número de cromosomas alto (2n > 40 ≤ 80) y d) Plantas con un número de cromosomas muy alto ( 2n > 80).
Se determinó por primera vez el número cromosómico para la especie Hymenocallis howardii (2n=96).
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CAPÍTULO II
Determinación del número cromosómico en especies de los géneros Polianthes , Sprekelia , Hymenocallis , Habranthus y Zephyranthes . a) Polianthes
FUNDAMENTACIÓN
De acuerdo al sistema de clasificación para la filogenia de las angiospermas APG III (2009), el género Polianthes pertenece a la familia Asparagaceae y a la subfamilia Agavoidea; es endémico de México y se distribuye desde Chihuahua y Tamaulipas hasta el norte de Oaxaca (Solano y Feria, 2007). El número de especies de este género ha variado en función de los criterios utilizados para su delimitación; de este modo, Rose (1903) reconoció 12 especies, Espejo y López (1992) 15, García-Mendoza y Galván (1995) 13 y Solano y Feria (2007) 14 especies y 16 taxa. De todas las especies incluidas en este género, Polianthes tuberosa es la única que se utiliza con fines ornamentales como flor de corte y en la industria de la perfumería.
Estudios citológicos realizados en la especie Polianthes tuberosa var. “simple”, han demostrado que ésta tiene un número cromosómico básico x=30 presentando un cariotipo bimodal consistente en cinco pares de cromosomas grandes y 25 cromosomas pequeños (Behera y Sen, 1999; Jayasree y cols. 2001), mientras que Polianthes tuberosa var. “doble” presenta un número variable: 2n=54 (Lin y Shen, 2004) y 2n=50 (Schiva y Lanteri, 1984). Respecto a otras especies del género Polianthes , se han reportado 2n=58 para P. howardii (Lin y Shen, 2004) y 2n=60 para P. geminiflora (Sato, 1942). No existen reportes acerca del número cromosómico en otras especies del género Polianthes . El objetivo del presente trabajo fue determinar el número cromosómico de cinco especies silvestres y dos variedades de una especie cultivada del género Polianthes colectadas en cuatro diferentes Estados de la República Mexicana.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y sitios de muestreo:
Se utilizaron ápices radiculares obtenidos a partir de bulbos de plantas de seis especies del género Polianthes pertenecientes a una colección in vivo del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, Asociación Civil (CIATEJ, A.C.). Las plantas estudiadas se colectaron en cuatro diferentes Estados de la República Mexicana: P. howardii (población silvestre localizada en Colima), P. geminiflora var. geminiflora , P. montana , P. zapopanensis y P. pringlei (poblaciones silvestres localizadas en Jalisco), P. tuberosa var. doble (población cultivada en Mazatepec, Morelos) y P. tuberosa var . simple (población cultivada en Tantoyuca, Veracruz) (Figura 6).
Figura 6. Inflorescencias de plantas de Polianthes. a) P. howardii . b) P. montana . c) P. zapopanensis . d) P. pringlei. e) P. tuberosa var. “simple”. f) P. tuberosa var. “doble”.
Preparaciones cromosómicas:
Las preparaciones cromosómicas se realizaron por dos técnicas: Squash tradicional y el método reportado por Rodríguez-Domínguez y cols. (en prensa y descrito en el Capítulo I de este documento). En el pretratamiento para la técnica de Squash, los ápices radiculares fueron tratados con 8-hidroxiquinoleína (0.02 M) durante 4 horas a temperatura ambiente, posteriormente se fijaron en una solución 3:1 de metanol:ácido acético y se almacenaron a - 20° C hasta su uso posterior. El pretratamiento de acuerdo a la segunda técnica se basa en el
pretratamiento de los ápices radiculares en solución de -bromonaftaleno (0.1%) durante 48 h a 4° C y fijadas en solución de metanol:ácido acético (3:1) durante 24 h a 4° C.
Los ápices radiculares se cortaron a una longitud de 1 mm y se lavaron con agua mili-Q seguidos de un lavado en solución buffer de citrato (10 mM citrato trisódico y 10 mM ácido cítrico, pH 4.5), ambos lavados se realizaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron en una mezcla enzimática (1% celulasa RS, 1% pectoliasa Y23 y 1% citohelicasa disueltas en 10mM de buffer de citrato pH 4.5) durante 90 minutos a 37° C. Una vez digeridos, para la técnica de Squash, los ápices radiculares se colocaron sobre portaobjetos, se tiñeron con aceorceína al 2% y se observaron al microscopio; para la otra técnica se realizó la obtención de la suspensión celular mediante agitación en vortex, se realizó un lavado con agua destilada, se centrifugó a 10,000 rpm por 45 s, se hizo un lavado con metanol, luego se centrifugó a 11,000 rpm por 30 s y se resuspendió el botón celular en 100 µl de metanol. Finalmente, en una campana de extracción, se colocaron 10 µl de suspensión celular sobre un portaobjetos cubierto con una capa de ácido acético puro e inclinado con un ángulo de 45 grados, se agregaron dos gotas de ácido acético puro, se expuso la laminilla cara abajo al vapor de un baño maría a 55° C durante 5 s, se agregó una gota de ácido acético puro y se dejó secar al aire; las muestras se tiñeron con aceorceína al 2% o con 1 µg ml -1 de solución DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) y se observaron al microscopio.
Las cinco mejores metafases de cada especie se fotografiaron en un fotomicroscopio Leica DMRA2 (Leica Microsystems, Germany) equipado con iluminación epifluorescente y acoplado a una Cámara Evolution QEi (Media-Cybernetics).
RESULTADOS
El conteo cromosómico para todas las especies analizadas fue de 2n=2x=60 con un cariotipo bimodal de diez cromosomas grandes y 50 pequeños (Figura 7). En algunos cromosomas grandes en todas las especies analizadas, se pudo apreciar una constricción secundaria característica (Figura 8).
Figura 7. Células con cromosomas mitóticos de diversas especies de plantas diploides (2n=2x=60) del género Polianthes donde se pueden apreciar los 10 cromosomas grandes y los 50 cromosomas pequeños. a y b ) P. howardii. c y d ) P. montana. e) P. geminiflora var. geminiflora. f) P. pringlei . G y h ) P. zapopanensis i) P. tuberosa var. doble. j) P. tuberosa var. simple. a, b, c, e, f, g, h, i ) Tinción con acetorceína. d, h ) Tinción con DAPI. a, e, f, j ) Técnica Squash. b, c, d, g, h, i ) Técnica SteamDrop modificada por Rodríguez-Domínguez y cols. (en prensa). Barra=5µm.
Figura 8. Células con cromosomas mitóticos presentando la constricción secundaria (flechas). a) P. howardii. b) P. geminiflora var. geminiflora . Barra=5µm.
DISCUSIÓN
El número cromosómico 2n=60 para todas las especies de Polianthes reportadas en este estudio, coincide con resultados reportados anteriormente para P. tuberosa var. “simple” (Behera y Sen, 1999; Jayasree y cols. 2001) y para P. geminiflora (Sato, 1942). Por el contrario, Schiva y Lanteri (1984) reportaron un número cromosómico 2n=50 para P. tuberosa var. “doble”, mientras que Lin y Shen (2004) reportaron 2n=54 y 2n=58 para P. tuberosa var. “doble” y P. howardii respectivamente, lo cual pudiera deberse a la presencia de diferentes citotipos presentes en estas especies. Por otra parte, es importante señalar que este es el primer reporte para el número cromosómico de las especies P. montana , P. zapopanensis y P. pringlei .De igual manera, ya se habían reportado resultados respecto al número cromosómico 2n=60 en otras especies de la subfamilia Agavoidea, principalmente en plantas de los géneros Agave y Yucca (Moreno-Salazar y cols., 2007; Palomino y cols., 2010; Watkins, 1936). Es importante resaltar que aun cuando el nivel de ploidía más común encontrado en estas especies es la diploide (2n=2x=60), existen algunos reportes de diferentes niveles de ploidía principalmente en Agave . Palomino y cols. (2005 y 2008) reportaron un citotipo de A. angustifolia triploide (2n=3x=90) y dos cultivares de A. tequilana (cult. “Bermejo” y cult. “Chato”) triploide (2n=3x=90) y tetraploide (2n=4x=120) respectivamente; por otra parte, Lingling y cols. (2009) reportaron diversos niveles de ploidía en varias especies e híbridos dentro de este género los cuales comprendían desde tetraploides hasta pentaploides. Con respecto a plantas aneuploides, los mismos autores reportaron aneuploidías en diversas especies de Agave; por otra parte, Ruvalcaba-Ruiz y cols. (2012) reportaron la inducción in vitro de una planta trisómica de Agave tequilana Weber var. azul mediante tratamiento con para-fluorofenilalanina, mientras que Bindhani y cols. (2004) obtuvieron diversos tipos de nulisomías en Polianthes tuberosa var. “simple” con variantes de 2n=47, 52, 55, 58, cuya variabilidad en el número de cromosomas pudiera ser debido a los subcultivos realizados in vitro tal y como ha sido reportado para otras especies tales como Pisum sativum y Madhuca indica (Mukhopadhyay y cols., 2000; Sarkar y cols., 2001).
Un hallazgo que resulta interesante es la presencia de cromosomas con constricciones secundarias en prácticamente todas las especies de Polianthes analizadas en este trabajo, las
cuales ya habían sido reportadas en diversas especies del género Agave (Moreno-Salazar y cols., 2007; Palomino y cols., 2005, 2008, 2010; Gómez-Rodríguez y cols. 2013).
Los resultados de este trabajo demuestran que las plantas del género Polianthes presentan una similitud en cariotipo con las plantas de los géneros Agave y Yucca , más que con otras especies de la misma subfamilia. Estos estudios serán de utilidad para posteriores trabajos de mejoramiento genético en las variedades de Poliantes tuberosa comerciales, y en las mismas especies silvestres las cuales presentan un amplio potencial para ser utilizadas como ornamentales.
b) Sprekelia formosissima
FUNDAMENTACIÓN
Sprekelia Heist, es un género de plantas silvestres, monocotiledóneas, perennes, bulbosas y de consistencia herbácea pertenecientes a la familia Amaryllidaceae; comúnmente se les conoce como “Lirio Azteca” o “Lirio de Santiago” (Figura 9). El color rojo escarlata intenso y la forma de sus flores, hacen que estas tengan un gran potencial para utilizarse como ornamentales, ya sea como flor de corte, flor en maceta o paisajismo en parques y jardines (Leszczyñska-Borys y Borys, 2001). El género se encuentra distribuido en gran parte del territorio mexicano, reportándose también para Guatemala (López-Ferrari and Espejo-Serna, 2002). Aun cuando en la literatura se han mencionado varias especies, tales como S. formosissima , S. howardii , S. karwinskii , S. clintiae (un sinónimo para S. glauca ), entre otras, se considera un género monotípico, siendo Sprekelia formosissima la única especie perteneciente a este género (Flory, 1977; Sánchez, 1979; Tapia-Campos y cols., 2012), por lo tanto, se considera que las otras especies mencionadas podrían ser variantes de la misma.
Figura 9. Flor de Sprekelia formosissima .
Con respecto al número de cromosomas somáticos en esta especie, estudios citogenéticos han demostrado que presenta un número variable (2n=60, 120, 150, 180) con un número básico x=30 (Bose and Flory, 1965); los valores más comúnmente reportados son 2n=60 y 2n=120 (Sivarajan, 1991), por lo que al parecer pudiera tratarse de plantas con diferentes niveles de ploidía. El objetivo del presente trabajo fue determinar el número cromosómico de S. formosissima proveniente de colectas realizadas en tres poblaciones del Estado de Jalisco, México.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y sitios de muestreo:
Se utilizaron ápices radiculares obtenidos a partir de bulbos de plantas de Sprekelia formosissima pertenecientes a una colección in vivo del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, Asociación Civil (CIATEJ, A.C.); los ejemplares se colectaron en tres poblaciones pertenecientes al Estado de Jalisco, México, una de ellas localizada en el tramo carretero Villa Corona-Cocula (la cual se denominó “Cocula”), otra en el tramo carretero Autlán-La Huerta (la cual se denominó “Autlán”) y una tercera cultivada en el jardín de una vivienda particular ubicada dentro de la Zona Metropolitana de Guadalajara, específicamente dentro del Municipio de Zapopan (la cual se denominó “Zapopan”); el trabajo se realizó en diez ejemplares de cada una de las tres poblaciones, los bulbos se colocaron en un contenedor con sustrato húmedo de Peat Moss:vermiculita (7:3) con el objetivo de que generaran raíces.
Preparaciones cromosómicas :
La obtención de los cromosomas metafásicos se realizó mediante el método reportado por Rodríguez-Domínguez y cols. (en prensa y descrito en el Capítulo I de este documento), el cual se basa en el pretratamiento de los ápices radiculares en solución de -bromonaftaleno (0.1%) durante 48 h a 4° C y fijadas en solución de metanol:ácido acético (3:1) durante 24 h a 4° C. Posteriormente los ápices fueron lavados con agua mili-Q, macerados en una mezcla enzimática conteniendo 0.2% (w/v) de pectiolasa Y23, 0.2% (w/v) de celulasa RS y 0.2% (w/v) de citohelicasa en solución 10 mM de buffer de citrato (10 mM citrato trisódico y 10 mM ácido cítrico, pH 4.5) e incubados a 37° C durante 3 h. Posteriormente se realizó la obtención de la suspensión celular mediante agitación en vortex, se realizó un lavado con agua destilada, se centrifugó a 10,000 rpm por 45 s, se hizo un lavado con metanol, luego se centrifugó a 11,000 rpm por 30 s y se resuspendió el botón celular en 100 µl de metanol. Finalmente, en una campana de extracción, se colocaron 10 µl de suspensión celular sobre un portaobjetos cubierto con una capa de ácido acético puro e inclinado con un ángulo de 45 grados, se agregaron dos gotas de ácido acético puro, se expuso la laminilla cara abajo al vapor de un baño maría a 55° C durante 5 s, se agregó una gota de ácido acético puro y se dejó secar al aire.
Conteo de cromosomas:
Para realizar el conteo del número de cromosomas, las cinco mejores metafases obtenidas de los ejemplares de S. formosissima de cada una de las tres poblaciones analizadas, se fotografiaron en microscopía de contraste de fases en un microscopio Leica DMRA2 (Leica Microsystems, Germany) equipado con iluminación epifluorescente y acoplado a una Cámara Evolution QEi (Media-Cybernetics).
Medición de parámetros morfológicos:
Se realizaron mediciones de la altura de la planta, diámetro del bulbo, longitud de la hoja, longitud del escapo floral y ancho de los tépalos de la flor en diez plantas adultas de cada una de las tres poblaciones a fin de relacionarlos con su número cromosómico; también se midió el tamaño de las semillas (veinte semillas por individuo) en las plantas provenientes de las regiones “Cocula” y “Autlán” que fueron las únicas en que se presentaron.
RESULTADOS
Las plantas colectadas en cada una de las tres poblaciones presentaron diferente número de cromosomas, los valores encontrados fueron 2n=60, 2n=120 y 2n=150 para las poblaciones “Cocula”, “Autlán” y “Zapopan” respectivamente (Figuras 1 a, b, c). Cabe destacar que esta especie presenta un gran cromosoma fácilmente distinguible (cromosoma no. 1), el cual se observó en todas las preparaciones metafásicas obtenidas y donde el número de cromosomas encontrados se relacionó con el nivel de ploidía de la planta (Figura 10).
Figura 10. Número cromosómico observado en metafases mitóticas de S. formosissima . a) Población “Cocula” 2n=2x=60. b) Población “Autlán” 2n=4x=120. c) Población “Zapopan” 2n=5x=150. Las flechas rojas señalan los cromosomas más grandes. Barra=10µm.
En el Cuadro 3 se presentan los promedios de las mediciones realizadas en planta, bulbo, hoja, escapo floral, tépalos de la flor y semilla obtenidos en diez plantas de cada población, donde se aprecia que el tamaño de los mismos también fue diferente entre las poblaciones, encontrándose la relación de que, conforme se incrementa el número cromosómico en las plantas, se incrementa el tamaño de los parámetros medidos.
En la Figura 11 se aprecian algunas variaciones características en plantas de S. formosissima colectadas en las tres diferentes poblaciones.
Cuadro 3. Valores promedio de seis características distintivas de plantas de S. formosissima colectadas en tres poblaciones del Estado de Jalisco.
Localidad Cocula Autlán Zapopan Altura de la planta (cm) 40.5 63.4 77.2 Diámetro del bulbo (cm) 7.5 11.6 18.5 Longitud de la hoja (cm) 30.3 47.1 60.7 Longitud del escapo floral (cm) 19.5 26.1 35.8 Relación largo/ancho de semilla 1.42 1.55 N/A Ancho de los tépalos de la flor (cm) Tépalo 1 0.7 2.4 2.9 Tépalo 2 0.5 1.5 2.0 Tépalo 3 0.7 2.1 2.9 Tépalo 4 0.5 1.4 2.5 Tépalo 5 0.7 2.1 2.9 Tépalo 6 0.5 1.5 2.0
Figura 11. Variaciones en las características tamaño de la flor, longitud del escapo floral, altura de la planta y tamaño de la semilla en plantas de S. formosissima colectadas en tres poblaciones del Estado de Jalisco. a), d), g1) y h) “Cocula”. b), e), g2) y i) “Autlán”. c), f) y g3) “Zapopan”. a) - g) Escala=30 cm.
DISCUSIÓN
De acuerdo al reporte de Bose y Flory (1965), S. formosissima presenta diferentes números cromosómicos con un número básico x=30, tomando como referencia dicho dato, los niveles de ploidía de las plantas analizadas en el presente trabajo serían diploide (2n=2x=60) para la población “Cocula”, tetraploide (2n=4x=120) para la población “Autlán” y pentaploide (2n=5x=150) para la población “Zapopan”. Además, otro factor que confirma esta aseveración, es la ausencia de la producción de semillas en las plantas de la población “Zapopan”, ya que es bien sabido que plantas con niveles de ploidía impares son estériles o altamente infértiles debido a que sus gametos y descendencia son aneuploides (Griffiths y col., 1999). Por otra parte, estos resultados demuestran una relación directa entre el incremento del número cromosómico y el incremento en el tamaño de la planta, bulbo, hoja, flor, polen, semilla y cápsula. Esto coincide con lo reportado por Flory (1977), quien menciona que conforme se incrementa el número cromosómico en esta especie, existe un aparente y obvio incremento en el tamaño de sus flores.
Con respecto al número cromosómico de S. formosissima , existen varios reportes que indican que este es muy variable, encontrándose que su número oscila entre 27 y 180 (Koul y Langar, 1995); por otra parte, Sato (1938) reportó 2n=117, mientras que Moorkejea (1955) reportó 2n=116, y aunque es probable que hayan analizado ejemplares aneuploides, también cabe la posibilidad que estos investigadores hayan presentado dificultades en el conteo de los cromosomas debido al gran número y tamaño de los mismos y que posiblemente sus ejemplares hayan sido en realidad tetraploides (2n=4x=120). Esta situación se compara con reportes donde mencionan que el número cromosómico en esta especie se indican sólo como valores aproximados 2n=ca. 120 (Price y col., 1972), 2n=ca. 120, 2n=ca. 150, 2n=ca. 180 donde su número oscila entre 118-124, 148-155 y 164-178 respectivamente (Bose y Flory, 1970), entre otros. En el presente estudio se logró superar los problemas de conteo a través de la aplicación de la técnica reportada por Rodríguez-Domínguez y cols. (en prensa y descrito en el Capítulo I de este documento), mediante la cual se logra una condensación de los cromosomas reduciendo su tamaño lo que evita el traslape de los mismos, así como el uso de ácido acético puro lo que favorece su dispersión facilitando de esta manera su conteo.
c) Hymenocallis howardii
FUNDAMENTACIÓN
Hymenocallis Salisb. (del griego “membrana hermosa”), es un género de plantas monocotiledóneas, herbáceas, perennes y bulbosas que presentan flores blancas (algunas de ellas con fragancia) pertenecientes a la familia Amaryllidaceae, comúnmente se les conoce como “Lily araña” (Figura 12). El género comprende entre 50 y 60 especies, las cuales se distribuyen en el sureste y centro de los Estados Unidos de América, islas del Caribe, México, Centroamérica y noreste de Sudamérica, presentando su mayor riqueza en Mesoamérica (Sealy, 1954; Flory, 1978; Meerow y Snijman, 1998; Meerow y cols., 2002; Smith y Flory, 2002). México posee el más alto número de especies del género: 32, muchas de ellas endémicas (Tapia-Campos y cols., 2012).
Figura 12. Flor de Hymenocallis howardii.
Respecto al número cromosómico del género, éste se ha reportado como 2n=2x=46 y 2n=2x=40; sin embargo, muchas accesiones aneuploides que han sido estudiadas presentan una desviación de estos números, de manera que se han reportado números cromosómicos que van desde 2n=38 hasta 2n=110 (Smith y Flory, 1990; Nagao y Takusagawa, 1932). Se ha sugerido que la poliploidía y la aneuploidía han contribuido significativamente a la evolución de los cromosomas en Hymenocallis de manera que el valor n=23 es el número básico secundario derivado para el género (Jee and Vijayavalli, 1999). El objetivo del presente trabajo fue determinar el número cromosómico de Hymenocallis howardii provenientes de colectas realizadas en el municipio de Tequila Jalisco, México.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y sitios de muestreo:
Se utilizaron ápices radiculares obtenidos a partir de bulbos de plantas de Hymenocallis howardii pertenecientes a una colección in vivo del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, Asociación Civil (CIATEJ, A.C.); los ejemplares de H. howardii se colectaron en una población en el volcán de Tequila, ubicado en el municipio de Tequila Jalisco. El trabajo se realizó en diez ejemplares, los bulbos se colocaron en un contenedor con sustrato húmedo de Peat Moss:vermiculita (7:3) con el objetivo de que generaran raíces.
Preparaciones cromosómicas :
La obtención de los cromosomas metafásicos se realizó mediante el método reportado por Rodríguez-Domínguez y cols. (en prensa y descrito en el Capítulo I de este documento), el cual se basa en el pretratamiento de los ápices radiculares en solución de -bromonaftaleno (0.1%) durante 48 h a 4° C y fijadas en solución de metanol:ácido acético (3:1) durante 24 h a 4° C. Posteriormente los ápices fueron lavados con agua mili-Q, macerados en una mezcla enzimática conteniendo 0.2% (w/v) de pectiolasa Y23, 0.2% (w/v) de celulasa RS y 0.2% (w/v) de citohelicasa en solución 10 mM de buffer de citrato (10 mM citrato trisódico y 10 mM ácido cítrico, pH 4.5) e incubados a 37° C durante 3 h. Posteriormente se realizó la obtención de la suspensión celular mediante agitación en vortex, se realizó un lavado con agua destilada, se centrifugó a 10,000 rpm por 45 s, se hizo un lavado con metanol, luego se centrifugó a 11,000 rpm por 30 s y se resuspendió el botón celular en 100 µl de metanol. Finalmente, en una campana de extracción, se colocaron 10 µl de suspensión celular sobre un portaobjetos cubierto con una capa de ácido acético puro e inclinado con un ángulo de 45 grados, se agregaron dos gotas de ácido acético puro, se expuso la laminilla cara abajo al vapor de un baño maría a 55° C durante 5 s, se agregó una gota de ácido acético puro y se dejó secar al aire tiñéndose posteriormente con 1 µg ml -1 de solución DAPI (4’,6-diamidino- 2-phenylindole) y se observaron al microscopio.
Conteo de cromosomas:
Para realizar el conteo del número de cromosomas, las cinco mejores metafases obtenidas, se fotografiaron en microscopía de contraste de fases en un microscopio Leica DMRA2 (Leica Microsystems, Germany) equipado con iluminación epifluorescente y acoplado a una Cámara Evolution QEi (Media-Cybernetics).
Análisis del cariotipo:
Las mediciones de los cromosomas se realizaron utilizando el software MicroMeasure (Reeves, 2001) versión 3.3; se clasificaron tomando como base la metodología de Levan y cols. (1964) y se realizó el cariograma, la homología cromosómica se asignó de acuerdo a las similitudes en longitud, morfología y posición del centrómero. El número de cromosomas homólogos se asignó secuencialmente conforme a la reducción en el tamaño de los mismos (de mayor a menor). El índice de asimetría (TF%) se obtuvo siguiendo el procedimiento de Gupta y Gupta (1978) de acuerdo a la siguiente fórmula:
3µ≠°¥Ø≤©° §• ¨° ¨ØÆß©¥µ§ §• ¨Ø≥ ¢≤°∫Ø≥ £Ø≤¥Ø≥ 8 3µ≠°¥Ø≤©° §• ¨° ¨ØÆß©¥µ§ ¥Ø¥°¨ §• ¥Ø§Ø≥ ¨Ø≥ £≤Ø≠Ø≥Ø≠°≥
RESULTADOS
Los conteos cromosómicos en células metafásicas mostraron un total de 96 cromosomas (Figura 13) los cuales fueron metacéntricos (m), submetacéntricos (sm), subtelocéntricos (st) y telocéntricos (t) con una fórmula cariotípica 76m + 12sm + 4st + 4t correspondiendo al tipo simétrico, debido a la predominancia de cromosomas m y sm.
Figura 13 . Cromosomas metafásicos de la especie H. howardii con un número cromosómico 2n=96. Barra=10µm.
A partir de los cromosomas metafásicos fotografiados en la figura 13 se realizó el cariograma (Figura 14) donde se aprecia que se trata de una especie tetraploide (2n=4x=96) con un valor x=24.
El índice de asimetría obtenido fue de 38.45.
Figura 14 . Cariograma de H. howardii . Dado el número básico x=24, se infiere que se trata de una especie tetraploide con cuatro grupos de cromosomas homólogos 2n=4x=96. Los cromosomas se agrupan de acuerdo a la clasificación de Levan y cols. (1964).
DISCUSIÓN
De acuerdo con este estudio, H. howardii presentó un número cromosómico 2n=96, siendo este el primer reporte para la determinación del número cromosómico en esta especie. El número cromosómico para el género Hymenocallis ha sido reportado para la mayoría de las especies con un 2n=40 y 46; sin embargo, muchas accesiones aneuploides que han sido reportadas presentan una derivación de estos números. H. henryae Traub. posee un número cromosómico de 2n=2x=38, el cual es el número cromosómico más bajo reportado para el género (Smith y Flory, 1990); por otra parte, el número más alto reportado es de 2n=110 para la especie H. rotata (Nagao y Takusagawa, 1932), la cual es posible que sea poliploide, ya que existen otros estudios para dicha especie donde reportan números cromosómicos 2n=40, 44, 46 y 48 (Flory, 1975; Flory 1976; Vijayavalli y Mathew, 1990; Jee y Vijayavalli, 1999). Aun cuando el número básico reportado para la mayoría de las especies comprendidas en este género es x=20, 23, podemos inferir que H. howardii es una especie tetraploide con un número básico x=24; esto concuerda con otras investigaciones en las cuales se reportan números cromosómicos múltiplos de dicho número básico, por ejemplo, para Hymenocallis sonorensis (Flory, 1976), Hymenocallis godfreyi (Smith y Darst, 1994), entre otros, donde reportan un número 2n=48. Tomando como base la clasificación cromosómica utilizando la metodología de Levan y cols. (1964), puede facilitarse la identificación de cromosomas individuales siempre y cuando se presente un Índice de Asimetría alto (TF% < 0.25), para el caso de H. howardii se presentó un TF% = 38.45 indicando un bajo índice de asimetría, es decir, muchos cromosomas se parecen entre sí. Todo esto aunado a que posiblemente se trata de una especie poliploide, dificulta la identificación de cromosomas individuales, teniendo que recurrir por tanto a otros métodos, tales como técnicas de citogenética molecular.
d) Habranthus longifolius y Zephyranthes sp
FUNDAMENTACIÓN
Zephyranthes Herb. es un género de plantas monocotiledóneas, perennes, bulbosas y de consistencia herbácea que pertenecen a la familia Amarillidaceae (tribu Hippeastreae). Comprende alrededor de 90 especies, de las cuales al menos 37 son nativas de México y muchas de estas son endémicas (Tapia-Campos y cols., 2012). Algunas de las especies clasificadas anteriormente dentro del género Zephyranthes se han transferido a otros géneros de la misma tribu Hippeastreae, tales como Habranthus Herb., Pyrolirion Herb. y Aidema Ravenna; sin embargo, los límites genéricos dentro de este grupo de plantas no están del todo claros (Sealy, 1937; Uphof, 1946; Traub, 1958; Huzinker, 1967; Ravenna, 1971; Arroyo, 1990; Arroyo y Leuenberger, 1996; López-Ferrari y Espejo-Serna, 2002; Ravenna, 2003); algunas diferencias sutiles entre los géneros, según menciona Fernández-Alonso y Groenendijk (2004), se basan en las características de la espata, la posición de la flor (erecta, suberecta o declinada), la simetría/asimetría de la corola (algunas veces no muy obvia), la inserción de los filamentos de la antera ya sea en la base del tubo de la corola ( Habranthus ) o arriba del tubo ( Zephyranthes ), el número de diferentes longitudes de filamentos de anteras (dos o cuatro, con las anteras lineales a arqueadas), el estilo declinado o recurvado, y el número de semillas por lóculo en la cápsula. Las especies del género Zephyranthes junto con las del género Habranthus se conocen comúnmente como “Lily de lluvia” debido a que las flores aparecen después de las primeras lluvias (Knox, 2009) (Figura 15).
La mayoría de las especies de Habranthus reconocidas presentan números cromosómicos 2n=12 o números similares mientras que las especies reconocidas de Zephyranthes presentan un número 2n=24 o múltiplos de éste (Oliveira 2006). Sin embargo, se ha reportado que el número cromosómico en este último género presenta un número cromosómico muy variable, con conteos que van desde 2n=10 en Z. seubertii (Daviña, 2001) hasta 2n=200 en un híbrido horticultural (Flory y Smith, 1980), encontrándose como número básico x=6 y 7 (Flory, 1968); sin embargo, se han sugerido otros valores como número básico. Naranjo (1974) ha postulado un valor x=10 en base a su trabajo con Z. minima (2n=20), por otra parte, Daviña y Fernández (1987) han encontrado especies de Zephyranthes con números cromosómicos
Figura 15. Flores de Habranthus longifolius (a y c) y Zephyranthes sp (b y d).
2n=30, 40 y 50 sugiriendo un número básico x=5, con lo cual el x=10 propuesto por Naranjo (1974) sería un poliploide derivado. La gran variabilidad en los números cromosómicos se debe principalmente a eventos de poliploidía, aneuploidía y disploidía, así como a la presencia de cromosomas B, los cuales aparecen frecuentemente en el género Zephyranthes (Greizerstein y Naranjo 1987; Felix y cols. 2008); este último también se ha reportado en
especies del género Habranthus (Felix y cols. 2011). Con base en esto, se puede decir que ambos géneros varían considerablemente en términos de números cromosómicos, por lo que se consideran como géneros polibásicos con x=5, 6 y 7 para Zephyranthes (Daviña y Fernández, 1989; Darlington y Wylie, 1955) y x=6, 7, 9, 11, 13 y 15 para Habranthus (Naranjo, 1969). El objetivo del presente trabajo fue determinar el número cromosómico de Habranthus longifolius y Zephyranthes sp provenientes de colectas realizadas en el Estado de Jalisco, México.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y sitios de muestreo:
Se utilizaron ápices radiculares obtenidos a partir de bulbos de plantas de Habranthus longifolius y Zephyranthes sp pertenecientes a una colección in vivo del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, Asociación Civil (CIATEJ, A.C.); ambas especies fueron colectadas en poblaciones silvestres ubicadas en el municipio de Lagos de Moreno, Jalisco; el trabajo se realizó en diez ejemplares de cada una de las dos poblaciones, los bulbos se colocaron en un contenedor con sustrato húmedo de Peat Moss:vermiculita (7:3) con el objetivo de que generaran raíces.
Preparaciones cromosómicas :
La obtención de los cromosomas metafásicos se realizó mediante el método reportado por Rodríguez-Domínguez y cols. (en prensa y descrito en el Capítulo I de este documento), el cual se basa en el pretratamiento de los ápices radiculares en solución de -bromonaftaleno (0.1%) durante 48 h a 4° C y fijadas en solución de metanol:ácido acético (3:1) durante 24 h a 4° C. Posteriormente los ápices fueron lavados con agua mili-Q, macerados en una mezcla enzimática conteniendo 0.2% (w/v) de pectiolasa Y23, 0.2% (w/v) de celulasa RS y 0.2% (w/v) de citohelicasa en solución 10 mM de buffer de citrato (10 mM citrato trisódico y 10 mM ácido cítrico, pH 4.5) e incubados a 37° C durante 3 h. Posteriormente se realizó la obtención de la suspensión celular mediante agitación en vortex, se realizó un lavado con agua destilada, se centrifugó a 10,000 rpm por 45 s, se hizo un lavado con metanol, luego se centrifugó a 11,000 rpm por 30 s y se resuspendió el botón celular en 100 µl de metanol. Finalmente, en una campana de extracción, se colocaron 10 µl de suspensión celular sobre un portaobjetos cubierto con una capa de ácido acético puro e inclinado con un ángulo de 45 grados, se agregaron dos gotas de ácido acético puro, se expuso la laminilla cara abajo al vapor de un baño maría a 55° C durante 5 s, se agregó una gota de ácido acético puro y se dejó secar al aire. Las laminillas se observaron ya sea sin tinción (en microscopía de fases), o bien teñidas con acetorceína al 2% o con 1 µg ml -1 de solución DAPI (4’,6-diamidino-2- phenylindole) y se observaron al microscopio.
Conteo de cromosomas:
Para realizar el conteo del número de cromosomas, las cinco mejores metafases obtenidas de los ejemplares de Habranthus longifolius y Zephyranthes sp de cada una de las poblaciones analizadas, se fotografiaron en un microscopio Leica DMRA2 (Leica Microsystems, Germany) equipado con iluminación epifluorescente y acoplado a una Cámara Evolution QEi (Media-Cybernetics).
RESULTADOS
Los conteos cromosómicos en células metafásicas provenientes de ápices radiculares en Zephyranthes sp. Mostraron un número cromosómico 2n=44 (Figura 16), mientras que en H. longifolius se presentaron células metafásicas con número cromosómico variable en la misma planta, en donde fue característica la presencia o ausencia de cromosomas B: 2n=34, 34 + 1B, 34 + 2B, 35 + 1B, 35 + 2B, 36, 36 + 1B y 36 + 2B (Figura 17).
Figura 16 . Células metafásicas mostrando el cariotipo de Zephyranthes sp. (2n=44). Barra=10µm.
Figura 17 . Número cromosómico observado en metafases mitóticas de H. longifolius . Las flechas rojas señalan los cromosomas B. a) 2n=35 + 1B b) 2n=35 + 2B. Barra=10µm.
DISCUSIÓN
Aun cuando en los estudios realizados por Greizerstein y Naranjo (1987), y Felix y cols. (2008) se han reportado gran cantidad de aneuploidías y cromosomas B en especies del género Zephyranthes , en nuestro estudio encontramos un número cromosómico fijo (en todas las células) para la especie de Zephyranthes analizada: 2n=44 y en ninguna célula se observó la presencia de cromosomas B. Este número cromosómico coincide con el reportado para algunos ejemplares de Zephyranthes longifolia (Coe, 1954). Por otra parte, también se han reportado aneuploidías y cromosomas B en especies del género Habranthus (Felix y cols., 2011), esto coincide con la especie H. longifolius aquí reportada, en donde se encontraron números cromosómicos que variaron desde 34 hasta 36, con presencia o ausencia de cromosomas B. Tomando en cuenta los números cromosómicos básicos reportados x=5, 6 y 7 para Zephyranthes y x=6, 7, 9, 11, 13 y 15 para Habranthus , podríamos concluir que ambas especies utilizadas en nuestro estudio son aneuploides; sin embargo, una característica de estas especies es que cuando se autopolinizan, siempre producen semillas viables. Resultados similares han sido reportados para Zephyranthes drummondii (Coe, 1953), donde al realizar un estudio citológico de la reproducción en esta especie, los análisis de la microsporogénesis revelaron varias anormalidades tales como cromosomas precoces, puentes y fragmentos, no disyunciones y eliminaciones cromosómicas, y a pesar de todas estas irregularidades observadas, la fertilidad del polen fue alrededor del 91%.
A fin de tener más información sobre los cromosomas en todas estas especies, se analizaron mediante técnicas de citogenética molecular, las cuales se presentan en el Capítulo 4 de este documento.
CONCLUSIONES
Se determinó el número cromosómico y el nivel de ploidía en cinco especies silvestres y dos variedades cultivadas del género Polianthes : P. howardii , P. montana , P. geminiflora var. geminiflora , P. pringlei , P. zapopanensis , P. tuberosa var. doble y P. tuberosa var. simple, el cual fue el mismo para todas las especies, (2n=2x=60).
Se determinó el número cromosómico y el nivel de ploidía en plantas de Sprekelia formosissima colectadas en tres localidades del estado de Jalisco, determinándose que se trata de tres citotipos con diferente nivel de ploidía: citotipo diploide de S. formosissima (2n=2x=60), citotipo tetraploide de S. formosissima (2n=4x=120) y citotipo pentaploide de S. formosissima (2n=5x=150).
Se analizó la relación existente entre los diferentes niveles de ploidía de S. formosissima y los caracteres morfológicos de las plantas concluyéndose que conforme se incrementa el nivel de ploidía, también se incrementa el tamaño de los caracteres morfológicos.
Se determinó el número cromosómico y se infirió el nivel de ploidía en plantas de Hymenocallis howardii el cual fue 2n=4x=96.
Se determinó el número cromosómico en Zephyranthes sp. El cual fue 2n=44.
Se analizó el número cromosómico en la especie Habranthus longifolius , determinándose que presenta un número cromosómico variable en la misma planta, en donde fue característica la presencia o ausencia de cromosomas B: 2n=34, 34 + 1B, 34 + 2B, 35 + 1B, 35 + 2B, 36, 36 + 1B y 36 + 2B.
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CAPÍTULO III
Determinación del número cromosómico en plantas obtenidas mediante cruzas intraespecíficas de Sprekelia formosissima con diferentes niveles de ploidía y análisis para detectar incompatibilidad reproductiva en S. formosissima pentaploide.
FUNDAMENTACIÓN
Sprekelia formosissima es una especie que fácilmente se puede hibridar mediante cruzas intraespecíficas como intergenéricas; las primeras han dado lugar a variedades tales como “Oasis”, “Andrea”, “Terciopelo”, “Julia” y “Anna” (SNICS, 2014), así como a la variedad “Orient Red”, entre otras; esta última se considera uno de los mejores cultivares comerciales, ya que florece a principios de la temporada de lluvias y es capaz de florecer de nuevo en el otoño (Howard, 2001). Respecto a los híbridos intergenéricos se han reportado cruzas con los géneros Habranthus , Hippeastrum y Zephyranthes , tales como Sprekelia x Habranthus = x Sprekanthus Traub (Cage 1969, 1972, Ellenbecker, 1975); Hippeastrum x Sprekelia = x Hippeastrelia del cual se comercializa el clon conocido como “Mystique” (Howard, 2001); Hippeastralia 'Mystique' x Sprekelia , ( H. papilio (Ravenna) Van Scheepen x H. fragrantissimum (Cárdenas) Meerow) x Sprekelia formosissima (Fellers, 1998) y Sprekelia formosissima x Zephyranthes traubii = x Sprekelianthes Lehmiller, híbrido cuyas características se asemejan a Sprekelia , pero su tamaño se reduce a casi la mitad del tamaño de la misma (Lehmiller, 2003-2004). Se ha mencionado que la relativa facilidad de hibridación en Sprekelia con estos géneros, se debe a su proximidad taxonómica; Meerow y col., (1999) agrupan al género Sprekelia en la tribu Hippeastreae junto con Habranthus , Zephyranthes , Hippeastrum , Rhodophiala y Traubia .
En la mayoría de los trabajos reportados en la generación de híbridos de S. formosissima tanto intraespecíficos como intergenéricos, no se reporta el número cromosómico o el nivel de ploidía ni de los parentales ni de la descendencia, por lo que el objetivo de este trabajo fue determinar del número cromosómico en híbridos obtenidos mediante cruzas intraespecíficas de S. formosissima con diferentes niveles de ploidía, ya que en algunos casos, esto nos puede dar una idea del número cromosómico o el nivel de polidía que podría esperarse en la descendencia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal:
Se utilizaron tres citotipos de Sprekelia formosissima pertenecientes a una colección in vivo del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, Asociación Civil (CIATEJ, A.C.), estas plantas presentaron diferentes números cromosómicos y, por ende, diferentes niveles de ploidía (Reportadas en el Capítulo II de este documento). Los ejemplares fueron colectados en tres poblaciones pertenecientes al Estado de Jalisco, México y que se describen en el Cuadro 4, con estas plantas se realizaron diversas cruzas intraespecíficas, las cuales se presentan en el Cuadro 5; las semillas que se obtuvieron en las cruzas exitosas se germinaron tanto in vitro (en medio de cultivo 1/10 MS), como en charola con sustrato húmedo de Peat Moss:vermiculita (7:3) con el objetivo de que generaran raíces.
Cuadro 4. Sitios de colecta, número cromosómico y nivel de ploidía de las plantas de S. formosissima utilizadas en este estudio.
SITIO DE NOMENCLATURA NÚMERO NIVEL DE COLECTA CROMOSÓMICO PLOIDÍA Tramo carretero Sprekelia formosissima 2n=2x=60 Diploide Cocula-Villa Corona “Cocula” Tramo carretero Sprekelia formosissima 2n=4x=120 Tetraploide Autlán-La Huerta “Autlán” Jardín de vivienda Sprekelia formosissima 2n=5x=150 Pentaploide particular en “Zapopan” Zapopan
Cuadro 5. Cruzas intraespecíficas realizadas en citotipos de S. formosissima con diferente nivel de ploidía.
Cruza realizada Diploide ( ) x Tetraploide ( ) Diploide ( ) x Pentaploide ( ) Tetraploide ( ) x Diploide ( ) Tetraploide ( ) x Pentaploide ( ) Pentaploide ( ) x Diploide ( ) Pentaploide ( ) x Tetraploide ( )
Preparaciones cromosómicas :
Se utilizaron los ápices radiculares obtenidos a partir de diez plántulas provenientes de las semillas germinadas tanto in vitro como en charola. La obtención de los cromosomas metafásicos se realizó mediante el método reportado por Rodríguez-Domínguez y cols. (en prensa y descrito en el Capítulo I de este documento), el cual se basa en el pretratamiento de los ápices radiculares en solución de -bromonaftaleno (0.1%) durante 48 h a 4° C y fijadas en solución de metanol:ácido acético (3:1) durante 24 h a 4° C. Posteriormente los ápices fueron lavados con agua mili-Q, macerados en una mezcla enzimática conteniendo 0.2% (w/v) de pectiolasa Y23, 0.2% (w/v) de celulasa RS y 0.2% (w/v) de citohelicasa en solución 10 mM de buffer de citrato (10 mM citrato trisódico y 10 mM ácido cítrico, pH 4.5) e incubados a 37° C durante 3 h. Posteriormente se realizó la obtención de la suspensión celular mediante agitación en vortex, se realizó un lavado con agua destilada, se centrifugó a 10,000 rpm por 45 s, se hizo un lavado con metanol, luego se centrifugó a 11,000 rpm por 30 s y se resuspendió el botón celular en 100 µl de metanol. Finalmente, en una campana de extracción, se colocaron 10 µl de suspensión celular sobre un portaobjetos cubierto con una capa de ácido acético puro e inclinado con un ángulo de 45 grados, se agregaron dos gotas de ácido acético puro, se expuso la laminilla cara abajo al vapor de un baño maría a 55° C durante 5 s, se agregó una gota de ácido acético puro y se dejó secar al aire; las muestras se tiñeron con aceorceína al 2% o con 1 µg ml -1 de solución DAPI (4’,6-diamidino-2- phenylindole) y se observaron al microscopio.
Conteo de cromosomas:
Las cinco mejores metafases de cada cruza exitosa se fotografiaron en un fotomicroscopio Leica DMRA2 (Leica Microsystems, Germany) equipado con iluminación epifluorescente y acoplado a una Cámara Evolution QEi (Media-Cybernetics).
Análisis del cariotipo:
Las mediciones de los cromosomas se realizaron utilizando el software MicroMeasure (Reeves, 2001) versión 3.3, clasificándolos tomando como base la metodología de Levan y cols. (1964) y se realizó el cariograma, la homología cromosómica se asignó de acuerdo a las similitudes en longitud, morfología y posición del centrómero. El número de cromosomas
homólogos se asignó secuencialmente conforme a la reducción en el tamaño de los mismos (de mayor a menor). El índice de asimetría (TF%) se obtuvo siguiendo el procedimiento de Gupta y Gupta (1978) de acuerdo a la siguiente fórmula:
3µ≠°¥Ø≤©° §• ¨° ¨ØÆß©¥µ§ §• ¨Ø≥ ¢≤°∫Ø≥ £Ø≤¥Ø≥ 8 3µ≠°¥Ø≤©° §• ¨° ¨ØÆß©¥µ§ ¥Ø¥°¨ §• ¥Ø§Ø≥ ¨Ø≥ £≤Ø≠Ø≥Ø≠°≥
Análisis en progenitores pentaploides:
Dado que, de acuerdo a la literatura, las plantas con niveles de ploidía impares son estériles o altamente infértiles (Griffiths, y col., 1999), se realizó la siguiente metodología para determinar la posible o posibles causas de la no formación de semilla en las plantas pentaploides (Figura 18).
Figura 18. Metodología para analizar las posibles causas de la ausencia de producción de semillas en plantas de S. formosissima pentaploides.
a) Viabilidad de polen:
El polen fue colectado en cinco plantas de S. formosissima después de la antesis y se transfirió a portaobjetos utilizando la misma antera como aplicador; enseguida se tiñeron los granos de polen con una solución de azul de anilina al 1% en lactofenol (Hauser y Morrison, 1964) preparada de acuerdo a Maneval (1936) (Anexo 1), registrándose el porcentaje de granos de polen viables (teñidos de color azul intenso). A fin de comparar la viabilidad de los granos de polen, este mismo procedimiento se realizó en cinco plantas diploides y cinco tetraploides de la misma especie (plantas que sí produjeron semillas). b) Germinación de polen:
De igual manera que en el experimento para viabilidad de polen, el polen fue colectado en cinco plantas de S. formosissima después de la antesis y se dispersó en la superficie del medio de cultivo para germinación contenido en cajas de Petri utilizando la misma antera como aplicador, registrándose el porcentaje de granos de polen que germinaron. Un grano de polen se consideró viable cuando produjo un tubo más largo que el diámetro del grano (Roberts y cols., 1983). El medio de cultivo utilizado se describe en el Anexo 1. A fin de comparar la germinación de los granos de polen, este mismo experimento se realizó en cinco plantas diploides y cinco tetraploides de la misma especie (plantas que sí produjeron semillas). c) Viabilidad de óvulos:
La viabilidad de los óvulos se determinó a través de fecundación cruzada de plantas pentaploides ( ) con plantas tetraploides ( ) o bien de plantas pentaploides ( ) con plantas diploides ( ). d) Tinción de tubo polínico:
La tinción del tubo polínico se realizó de acuerdo a la técnica con lactoglicerina y que consiste en los siguientes pasos: Se colectaron los pistilos (incluido todo el ovario) y se almacenaron en un tubo conteniendo una solución de lactogicerina (Anexo 1). Después se enjuagaron tres veces en agua mQ para eliminar la lactoglicerina superficial. Para ablandar el tejido se incubaron a 60° C durante 1 ½ horas en solución
de hidróxido de potasio 1 N y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta el día siguiente. Al día siguiente se enjuagaron los pistilos tres veces con agua mQ, y se colocaron en un portaobjetos (dado que el pistilo era muy largo, se cortó en varios segmentos y cada segmento se colocó en otro portaobjetos identificando las partes superior e inferior del mismo). Se realizó una pequeña incisión longitudinal para permitir la introducción de la tinción, y se agregaron unas gotas de azul de anilina, se dispersó sobre el pistilo y se removió el excedente de tinción utilizando un papel filtro. Se cubrió la muestra con un cubreobjetos de 24 x 50, se aplastó el pistilo de manera homogénea, con cuidado, aplicando presión con los dedos y se selló el portaobjetos con esmalte para uñas para preservar la muestra. Las muestras se observaron bajo luz ultravioleta en el microscopio. El azul de anilina tiñó la calosa del tubo polínico observándose de color azul-verde. e) Observación de sacos embrionarios:
Con la ayuda de pinzas, bisturí y un microscopio estereoscópico, se realizó una disección de ovarios en plantas auopolinizadas de S. formosissima pentaploides; se extrajeron las semillas inmaduras y se aisló el saco embrionario para buscar los embriones y el endospermo.
RESULTADOS En el Cuadro 6 se observa el número de cruzas exitosas obtenidas a partir de las cruzas intraespecíficas de plantas de S. formosissima con diferentes niveles de ploidía:
Cuadro 6. Número de cruzas realizadas, número de cruzas exitosas y promedio de semillas por cápsula obtenidas a partir de las cruzas intraespecíficas de plantas de S. formosissima con diferentes niveles de ploidía.
Número de Número de de semillas por Cruza realizada cruzas cruzas exitosas cápsula realizadas Diploide ( ) x Tetraploide ( ) 6 5 34.6 Diploide ( ) x Pentaploide ( ) 3 0 ------Tetraploide ( ) x Diploide ( ) 1 0 ------Tetraploide ( ) x Pentaploide ( ) 3 1 31.0 Pentaploide ( ) x Diploide ( ) 3 0 ------Pentaploide ( ) x Tetraploide ( ) 6 6 61.7
A partir de las cruzas de plantas diploides (2n=2x=60) con plantas tetraploides (2n=4x=120) se obtuvieron plantas triploides (2n=3x=90). Como se mencionó anteriormente (capítulo 2 de este documento), en S. formosissima es característica la presencia de un gran cromosoma fácilmente distinguible (cromosoma no. 1), del cual aparecen tres copias en los cromosomas obtenidos en el análisis de las plantas triploides obtenidas (Figura 19).
Figura 19. Cromosomas metafásicos observados en células de S. formosissima triploide (2n=3x=90). Las flechas rojas señalan los cromosomas grandes y características de la especie. Barra=10µm.
En la Figura 20 se presenta el cariograma para esta especie, donde se observa que se presentan 30 grupos distintos de cromosomas (90 cromosomas en total), con una fórmula cariotípica 14m + 16sm correspondiendo al tipo simétrico, debido a la predominancia de cromosomas m y sm.
Figura 20 . Cariograma de S. formosissima triploide. Dado el número básico reportado x=30, se concluye que se trata de una especie triploide con tres grupos de cromosomas homólogos 2n=3x=90.
El TF% obtenido fue de 32.43 indicando un bajo índice de asimetría, es decir que muchos cromosomas se parecen entre sí.
Por otra parte, a partir de las cruzas de plantas pentaploides (2n=5x=150) con plantas tetraploides (2n=4x=120) se obtuvieron plantas con números cromosómicos variables (aneuploides), los números cromosómicos de las metafases analizadas variaban desde 2n=127 hasta 2n=140 en promedio (Figura 21).
Figura 21. Células metafásicas de S. formosissima producto de cruzas entre plantas pentaploides (2n=5x=150) con plantas tetraploides (2n=4x=120). a) 2n=127 cromosomas. a) 2n=140 cromosomas. Barra=10µm. Con respecto al análisis de los parentales pentaploides, dado que todas estas plantas produjeron polen, se procedió a realizar los análisis propuestos en la metodología obteniéndose los siguientes resultados:
Viabilidad de polen y germinación de polen: En la Figura 22 se muestran la viabilidad y la germinación de granos de polen y en el Cuadro 7 se muestran los porcentajes de dicha viabilidad y germinación. Los análisis se realizaron en plantas de S. formosissima de cada nivel de ploidía a fin de tener resultados comparativos.
Viabilidad de óvulos: Solamente se pudo determinar por la formación de semillas en la cruza Pentaploide ( ) x Tetraploide ( ), ya que, de seis cruzas realizadas, las seis produjeron cápsula y por consiguiente semillas (Cuadro 6 y Figura 23).
Tinción de tubo polínico: Se analizó la penetración de los tubos polínicos mediante tinción en autopolinización de cinco plantas de S. formosissima pentaploide (Figura 24), donde se pudo observar al microscopio que los tubos polínicos llegaban hasta el saco embrionario; no se logró observar si los tubos polínicos llegaban hasta el óvulo, ya que el tejido del ovario no permitió su observación debido a su gran espesor.
Figura 22. Viabilidad y germinación de granos de polen proveniente de plantas de S. formosissima . En a, b y c se observa la viabilidad del polen. En d, e y f se indica la germinación del polen. a) y d) S. formosissima diploide. b) y e) S. formosissima tetraploide. c) y f) S. formosissima pentaploide. PNV = Polen no viable; PV = Polen viable; PNG = Polen no germinado; PG = Polen germinado. Barra=300µm.
Cuadro 7. Porcentaje de viabilidad y germinación de polen proveniente de plantas de S. formosissima . La viabilidad se determinó por conteo en 1000 granos de polen y la germinación en 100 granos de polen. Nivel de ploidía Viabilidad de polen Germinación de polen S. formosissima 93.4 % 80 % pentaploide S. formosissima 98.4 % 91 % tetraploide S. formosissima diploide 99.4 % 97 %
Figura 23. Cápsula y semillas producidas en la cruza de S. formosissima pentaploide ( ) x S. formosissima tetraploide ( ).
Figura 24. Tinción de tubos polínicos formándose en dirección del estigma al saco embrionario (derecha a izquierda) observados después de 72 hrs de la autofecundación en plantas S. formosissima pentaploide. Se aprecian los restos de calosa que se desprenden al irse formando los tubos polínicos (flechas blancas). Barra=100µm.
Observación de sacos embrionarios: Ninguno de los sacos embrionarios extraídos de las semillas inmaduras presentes en las cápsulas, presentaron embriones ni endospermo, su apariencia fue de un saco vacío en el 100% de las muestras analizadas al microscopio (Figura 25).
Figura 25. Análisis de sacos embrionarios en S. formosissima pentaploide. a) Parte exterior de la cápsula. b) Corte en la cápsula mostrando las semillas inmaduras (flecha). c) Semillas inmaduras. d) Saco embrionario aislado de una semilla inmadura, nótese la apariencia de “bolsa vacía” (flecha).
DISCUSIÓN La obtención de plantas triploides de S. formosissima se confirmó mediante el conteo del número cromosómico (2n=3x=90) donde además resulta muy evidente la presencia de los tres cromosomas grandes e inconfundibles, los cuales fueron el cromosoma no. 1 de acuerdo a la clasificación de Levan y cols. (1964) (Figura 19); además del conteo cromosómico realizado en los parentales (diploide y tetraploide), con este análisis se comprueba que los gametos producidos por las plantas diploides deben de ser monoploides mientras que los producidos por las plantas tetraploides serían diploides (Figura 26) tal y como se producen por ejemplo las sandías triploides (sandías sin semilla).
Figura 26. Obtención de plantas de S. formosissima triploides (3x) a partir de la cruza de plantas diploides (2x) con plantas tetraploides (4x).
Al momento de redactar el presente documento, las plantas triploides de Sprekelia estaban muy pequeñas y por lo tanto aún no habían florecido, pero se espera que el tamaño de la planta y de la flor sea intermedio entre los tamaños de las plantas diploides y tetraploides, según lo mencionado en el Cuadro 3 del capítulo 2 de este documento y de acuerdo a lo reportado por Flory (1977), que afirma que entre mayor sea el nivel de ploidía en esta especie, mayor será el tamaño de sus flores. Por otra parte, dado que estas plantas presentan un nivel de ploidía impar es probable que no formen semillas (al menos en autopolinización) al igual que las plantas pentaploides estudiadas en este trabajo, aunque para otras especies no necesariamente ocurra esto, por ejemplo, Barba-González y cols., (2006) reportaron que híbridos triploides en el género Lilium, fueron capaces de producir progenie, sin embargo, el número cromosómico de la progenie fue, en algunos casos, aneuploide, debido a la producción de polen con números cromosómicos impares. Con respecto a las plantas de S. formosissima pentaploides, es probable que exista algún tipo de incompatibilidad reproductiva, ya que, en las autopolinizaciones realizadas, no se produjeron semillas aun cuando la viabilidad y la germinación del polen fueron altas (93.4% y 80% respectivamente (Cuadro 7), hubo formación de tubo polínico hasta el ovario (figura 24) y algunos óvulos fueron fértiles (lo que se demostró al realizar cruzas de plantas Pentaploides ( ) x Tetraploides ( ), donde sí hubo producción de semillas). Otro hecho que apoya la incopatibilidad reproductiva es el análisis realizado en las semillas inmaduras producto de la autopolinización en estas plantas, cuyos sacos embrionarios no presentaron ni embriones ni endospermo (Figura 25); por otra parte, de acuerdo a los conteos cromosómicos realizados en la progenie de las cruzas de plantas pentaploides x plantas tetraploides (independientemente de quien actúo como parental masculino o femenino), éstos resultaron con diversas aneuploidías (Figura 21), por lo cual se infiere que la posible producción de gametos con posibles números impares de cromosomas en los parentales pentaploides podría deberse a anormalidades en diferentes estados meióticos y postmeióticos y que estas alteraciones podrían ser las responsables de la aparición de progenie aneuploide (Figura 27). Esto concuerda con Piven y cols., (2001) quienes proponen que la baja fertilidad presente en henequén ( Agave furcroydes ) podría deberse precisamente a alteraciones que afectan la meiosis durante la formación de gametofitos tanto masculinos como femeninos, dada la la
naturaleza poliploide de esta especie (2n=5x=150), y dichas alteraciones podrían ser las responsables de la alta esterilidad de los granos de polen en henequén (66.4%).
Figura 27. Obtención de plantas de S. formosissima aneuploides a partir de la cruza de plantas tetraploides (4x) con plantas pentaploides (5x).
CONCLUSIONES
Se determinó el número cromosómico y el nivel de ploidía en plantas de Sprekelia formosissima descendientes de cruzas de plantas tetraploides x plantas diploides concluyéndose que presentaron un nivel de ploidía triploide, con un número cromosómico 2n=3x=90.
Se determinó el número cromosómico en plantas de S. formosissima descendientes de cruzas de plantas tetraploides x plantas pentaploides concluyéndose que presentaron diversas aneuploidías, con números cromosómicos 2n=127 y 2n=140.
Se analizaron las posibles causas de ausencia en la producción de semillas en plantas pentaploides de S. formosissima concluyéndose que la incompatibilidad reproductiva no se debe a viabilidad del polen o del óvulo, por lo que se propone realizar más estudios para determinar la o las causas de dicha incompatibilidad.
ANEXO 1
Solución de anilina al 1% en lactofenol
Fenol 20 ml Ácido láctico 20 ml Glicerina 40 ml Agua destilada 20 ml Azul de anilina 1 g
Medio de cultivo para germinación de Polen
Sacarosa 102 g/L Ácido bórico 20 mg/L Nitrato de Calcio 288 mg/L Agar 5 g/L
Solución para tinción de tubo polínico
Lactoglicerina:
Agua mQ, Glicerol, Acido Láctico 1 : 2 : 1
Azul de anilina (50 ml, 4° C)
K2HPO 4 1M 20.85 ml KH 2PO 4 1M 4.15 ml Azul de anilina (0.1%) 0.025 g Glicerol 25 ml
BIBLIOGRAFÍA
Barba-González R, Van Silfhout AA, Visser RGF, Ramanna MS, Van Tuyl JM (2006) Progenies of allotriploidsof Oriental x Asiatic lilies ( Lilium ) examined by GISH analysis. Euphytica 151: 243-250. Howard TM (2001) Bulbs for warm climates (1 st Edn), University of Texas Press, Texas, USA. 288 pp. Cage JM (1969) Bigeneric hybrid of Sprekelia and Habranthus. Pl Life 25: 27-78. Cage JM (1972) Chromosome number and growth habit of Sprekeanthus Cagei. Pl Life 28: 72. Ellenbecker (1975) Geographical distribution of the Amaryllidaceae. Pl Life 31: 37-49. Fellers JD (1998) Progeny of Hippeastrum papilio . Herbertia 53: 129-144. Flory WS (1977) Overview of chromosomal evolution in the Amaryllidaceae. Nucleus 20: 70-88. Griffiths AJF, Gelbart WM, Miller JH, Lewontin RC (1999) Changes in Chromosome Number. In: Modern Genetic Analysis. New York: W. H. Freeman;. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21229/ Gupta R, Gupta PK (1978) Karyotypic studies in the genus Crotalaria Linn. Cytologia 43: 357-369. Hauser EJP, Morrison JH (1964) The cytochemical reduction of nitro blue tetrazolium as an index of pollen viability. Am J Bot 51: 748-752. Lehmiller DJ (2003-2004) A new nothogeneric taxon: x Sprekelianthes (Amaryllidaceae). Herbertia 58: 123-126. Levan A, Fredga K, Sandberg AA (1964) Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas 52: 201-220. Maneval WE (1936) Lacto-phenol preparations. Stain Tech 11: 9-11. Meerow AW, Fay MF, Guy CL, Li Q-B, Zaman FQ, Chase MW (1999) Systematics of Amaryllidaceae based on cladistic analysis of plastid rcbL and trnL-F sequence data. Am J Bot 86: 1325-1345. Piven NM, Barredo-Pool FA, Borges-Argáez IC, Herrera-Alamillo MA, Mayo- Mosqueda A, Herrera-Herrera JL, Robert ML (2001) Reproductive biology of henequen ( Agave fourcroydes ) and its wild ancestor Agave angustifolia (Agavaceae). I. Gametophyte development. Am J Bot 88: 1966-1976. Reeves A (2001) MicroMeasure: a new computer program for the collection and analysis of cytogenetic data. Genome 44: 439-443.
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CAPÍTULO IV
Mapeo físico de ADN ribosomal 5S y 45S en Sprekelia formosissima , Hymenocallis howardii , Habranthus longifolius y Zephyranthes sp mediante hibridación in situ fluorescente (FISH)
FUNDAMENTACIÓN
La técnica de Hibridación in situ fluorescente (FISH) ha llegado a ser una herramienta muy útil para la detección de ADN específico en el genoma de los organismos; dentro de esta técnica, los genes que codifican el ARN ribosomal 5S (ADNr 5S) y los que codifican el ARN ribosomal 18S-5.8S-26S (ADNr 45S) se utilizan comúnmente como marcadores para el mapeo físico de cromosomas de plantas debido al alto número de copias de unidades repetidas, posición específica en los cromosomas y secuencias altamente conservadas (Liu y Davis, 2011). Los genes de ARN ribosomal 45S se encuentran agrupados en arreglos en tándem de unidades repetidas de genes 18S, 5.8S y 26S, secuencias espaciadoras internas que se transcriben (ITS) y secuencias espaciadoras externas que no se transcriben (NTS), con un tamaño aproximado de 7.5-18.5 Kb en plantas (Mizuochi y cols., 2007). Los genes de ARN ribosomal 5S también se encuentran en repeticiones en tándem con un tamaño aproximado de 0.2-0.9 Kb, con una región altamente conservada (120 pb de longitud) separada por una secuencia NTS (Specht y cols., 1997). El mapeo físico de ADNr se ha realizado en muchas plantas tales como maíz (Li y Arumuganathan, 2001), orquídeas (Cabral y cols., 2006), Crotalaria juncea (Mondin y cols., 2007), Agave (Robert y cols., 2008; Gómez-Rodríguez y cols., 2013), espárrago (Deng y cols., 2012), Lilium distichum (Hwang y cols., 2015), entre otras.
Existen muy pocos trabajos realizados en plantas de la familia Amaryllidaceae utilizando técnicas modernas de citogenética molecular tales como la hibridación in situ fluorescente. El objetivo de este estudio fue el mapeo físico de ADN ribosomal 5S y 45S en plantas de esta familia botánica, tales como: Sprekelia formosissima , Hymenocallis howardii , Habranthus longifolius y Zephyranthes sp.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal, sitios de muestreo y preparaciones cromosómicas:
El material vegetal que se utilizó en el presente estudio, provino de plantas pertenecientes a una colección in vivo del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, Asociación Civil (CIATEJ, A.C.); las especies y los sitios de colecta son los mencionados en el capítulo II de este trabajo. El pretratamiento de los ápices radiculares y las preparaciones cromosómicas se realizaron siguiendo la técnica reportada en el capítulo I también de este trabajo.
Aislamiento de plásmidos con ADN ribosomal de trigo:
Se utilizaron sondas de ADN ribosomal 45S y 5S de Triticum aestivum , los cuales se encuentran en los clones pTa71 y pTa794 respectivamente (Gerlach y Bedbrook, 1979; Gerlach y Dyer 1980), estos fueron donados por Hans de Jong del Departamento de Genética de la Universidad de Wageningen en los Países Bajos. Las cepas pTa71 y pTa794 fueron cultivadas durante 24 horas en agitación constante (225 rpm) a 37° C en medio LB adicionado con 0.1 mg/ml de ampicilina. El aislamiento de los ADN ribosomales de trigo se realizó utilizando el kit High Pure Plasmid Isolation (Roche) de acuerdo a las instrucciones del proveedor: 4 ml del medio de cultivo inoculado fueron transferidos a tubos falcon de 15 ml y se centrifugaron a 9,000 rpm durante 1 minuto, y se descartó el sobrenadante; se agregaron 250 µl de buffer de suspensión y se transfirieron a un tubo eppendorf de 1.5 ml, se añadieron 250 µl de buffer de lisis y se mezclaron por inmersión, posteriormente se incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente y se agregaron 350 µl de buffer de unión y se incubaron durante 5 minutos en hielo; una vez transcurrido el tiempo, se centrifugaron a 13,000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a una membrana de filtración y se centrifugó a 13,000 rpm por 1 minuto; la membrana se transfirió a un nuevo tubo y se añadieron 500 µl de buffer de lavado I, nuevamente se centrifugó a 13,000 rpm por 1 minuto, se transfirió la columna a un nuevo tubo y se agregaron 700 µl de buffer de lavado II; se centrifugó a 13,000 rpm por 1 minuto seguido de una nueva centrifugación a 13,000 por 1 minuto para secar la membrana, la cual se transfirió a un tubo eppendorf de 1.5 ml, se agregaron 100 µl de buffer de elución y se centrifugó a 13,000 rpm durante 1 minuto.
Marcaje de las sondas:
Mezcla de fluoróforos para marcaje directo: Se prepararon dos mezclas (de 50 µl c/u) de fluoróforo para marcaje directo a una concentración 5x mezclando los siguientes reactivos (Roche Applied Science):
Para marcar la sonda 45 S Volumen Reactivo Concentración 5 µl dATP Dilución 1:40, 2.5 mM 5 µl dCTP Dilución 1:40, 2.5 mM 5 µl dGTP Dilución 1:40, 2.5 mM 3.4 µl dTTP Dilución 1:40, 2.5 mM 4 µl Tetra-metil-rodamina-5-dUTP No diluido, 1 mM Agua mQ hasta ajustar a un volumen final de x µl 50 µl
Para marcar la sonda 5 S Volumen Reactivo Concentración 5 µl dATP Dilución 1:40, 2.5 mM 5 µl dCTP Dilución 1:40, 2.5 mM 5 µl dGTP Dilución 1:40, 2.5 mM 3.4 µl dTTP Dilución 1:40, 2.5 mM 4 µl Fluoresceína-12-dUTP No diluido, 1 mM Agua mQ hasta ajustar a un volumen final de x µl 50 µl
Reacción de marcaje de las sondas: Se tomó 1 µg de ADN ribosomal 5S de trigo, 4 µl de la mezcla 5x de fluoróforo marcado con Fluoresceína-12-dUTP, 4 µl de Nick Translation Mix y agua mQ suficiente para obtener un volumen final de 20 µl.
Se tomó 1 µg de ADN ribosomal 45S de trigo, 4 µl de la mezcla 5x de fluoróforo marcado con Tetra-metil-rodamina-5-dUTP, 4 µl de Nick Translation Mix y agua mQ suficiente para obtener un volumen final de 20 µl.
Ambas soluciones se mezclaron y se centrifugaron brevemente y se incubaron a 15° C durante 90 minutos, finalmente se detuvo la reacción agregando 1 µl de EDTA 0.5 M (pH 8.0) y se calentó a 65° C durante 10 minutos.
Hibridación in situ:
Pretratamiento de las laminillas: Los portaobjetos con las preparaciones cromosómicas se incubaron en una cámara húmeda a 37° C durante toda la noche. Al día siguiente, los portaobjetos fueron pre-tratados con RNasa A a una concentración de 100 g/ml (1:100) en buffer 2x SSC e incubados en una cámara húmeda a 37° C durante 1 hora. Posteriormente se lavaron las laminillas en buffer 2x SSC tres veces durante cinco minutos y se incubaron en HCl 0.01M durante 2 min para después colocarles una solución de pepsina (5 g/ml) incubándolas en una cámara húmeda a 37° C durante 10 minutos. Enseguida se lavaron con agua mili Q por dos minutos y con buffer 2x SSC durante 5 minuto (dos veces), se incubaron en paraformaldehido (4%) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron nuevamente con buffer 2x SSC durante 5 minuto (dos veces). Finalmente se deshidrataron secuencialmente en etanol al 70%, 90% y absoluto durante 3 minutos en cada paso y se secaron al aire.
Hibridación con la sonda: La hibridación se realizó utilizando una mezcla de 20× SSC, formamida, 50% de dextrán sulfato sódico, 10% de dodecil sulfato de sodio, 25-50 ng/placa de sonda de ADN. El ADN se desnaturalizó calentando la mezcla de hibridación a 70° C durante 10 minutos y colocándola inmediatamente en hielo durante al menos 10 minutos. A cada preparación se añadieron 40 l de mezcla de hibridación, se desnaturalizaron a 80° C durante 5 minutos y se hibridaron durante toda la noche a 37° C en una cámara húmeda.
Lavados de astringencia: Las preparaciones se lavaron en buffer 2x SSC a 37° C durante 5 minutos (tres veces), en buffer 0.1x SSC a 42° C durante 10 minutos (tres veces) y por último en buffer 2x SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos (tres veces).
Montaje y contratinción: Los cromosomas fueron contra-teñidos con 1 g/ml de DAPI (4,6- diamidino-2-fenilindol) y se colocó una gota de medio de montaje específico para fluorescencia (VectaShield, Vector Laboratories). Después del montaje, las laminillas se almacenaron a 4° C hasta su uso posterior.
Lavado de portaobjetos: Para poder realizar una nueva hibridación utilizando otra sonda en los portaobjetos que contenían las células donde previamente se había realizado una hibridación, se efectuaron lavados que consistían en limpiar el exceso de aceite de inmersión
del portaobjetos con un solvente compuesto de etanol y acetona; después los portaobjetos se incubaron a 37° C por 10 minutos para reducir la viscosidad del medio de montaje (Vectashield); enseguida se removió el cubreobjetos con mucho cuidado y los portaobjetos fueron lavados tres veces en buffer de detección (4x SSC conteniendo 0.2% v/v de Tween 20), el primer lavado fue de 5 minutos y el segundo y tercer lavado de 30 minutos cada uno; consecuentemente se efectuaron dos lavados en 2x SSC por 5 minutos a temperatura ambiente; finalmente, se deshidrataron los portaobjetos con tres lavados de 3 minutos cada uno en etanol al 70%, 90% y absoluto y se dejaron secar al aire. Después fueron nuevamente utilizados para una nueva hibridación con los pasos anteriormente descritos.
Observación al microscopio: Las preparaciones se observaron en un microscopio Leica DMRA2 (Leica Microsystems, Germany) equipado con iluminación epifluorescente y acoplado a una Cámara Evolution QEi (Media-Cybernetics) y las imágenes se analizaron con el software Image-Pro (Media-Cybernetics) y se fotografiaron las cinco mejores metafases de cada especie: Se realizó una toma con el filtro para la detección del DAPI, posteriormente se cambió de filtro para visualizar la sonda 5S y se volvió a fotografiar, por último se cambió nuevamente de filtro a fin de visualizar la sonda 45S y se volvió a fotografiar, creando al final una imagen compuesta.
Análisis del cariotipo:
Las mediciones de los cromosomas se realizaron utilizando el software MicroMeasure (Reeves, 2001) versión 3.3, se clasificaron tomando como base la metodología de Levan y cols. (1964) y se realizó el cariograma, la homología cromosómica se asignó de acuerdo a las similitudes en longitud, morfología y posición del centrómero. El número de cromosomas homólogos se asignó secuencialmente conforme a la reducción en el tamaño de los mismos (de mayor a menor). El índice de asimetría (TF%) se obtuvo siguiendo el procedimiento de Gupta y Gupta (1978) de acuerdo a la siguiente fórmula:
3µ≠°¥Ø≤©° §• ¨° ¨ØÆß©¥µ§ §• ¨Ø≥ ¢≤°∫Ø≥ £Ø≤¥Ø≥ 8 3µ≠°¥Ø≤©° §• ¨° ¨ØÆß©¥µ§ ¥Ø¥°¨ §• ¥Ø§Ø≥ ¨Ø≥ £≤Ø≠Ø≥Ø≠°≥
RESULTADOS
En Zephyranthes sp se muestran dos sitios de hibridación 45S en posición telomérica en dos cromosomas, mientras que para 5S se presentan cinco sitios de hibridación en posiciones telomérica y subtelomérica (Figura 28). De igual manera en Habranthus longifolius se encontraron dos sitios de hibridación 45S en posición telomérica, sin embargo, los sitios de hibridación para 5S fueron variables, encontrándose en algunas metafases cuatro sitios, mientras que en otras se encontraron solamente tres, encontrándose también tanto en posición telomérica como subtelomérica (Figura 29). En la Figura 30 se presenta el cariograma correspondiente a la Figura 29a (2n=35 + 1B) con una fórmula cariotípica 22m + 11sm + 3st correspondiendo al tipo simétrico, debido a la predominancia de cromosomas m y sm.
El TF% obtenido fue de 38.90 indicando un bajo índice de asimetría, es decir que muchos cromosomas se parecen entre sí.
Figura 28 . Sitios de hibridación 45S (rojo, puntas de flechas) y 5S (verde, flechas) de ADN ribosomal de trigo en Zephyranthes sp. Barra=10µm.
Figura 29 . Sitios de hibridación 45S (rojo, puntas de flechas) y 5S (verde, flechas) de ADN ribosomal de trigo en Habranthus longifolius . a) 2n=35 + 1B b) 2n=35 + 2B. c) 2n=36 + 1B. Barra=10µm.
Figura 30. Cariograma de Habranthus longifolius (2n=35 + 1B) construido a partir de la metafase presentada en la Figura 29a. Las flechas indican los cromosomas con señales 5S débiles.
Con respecto a Sprekelia formosissima , las células metafásicas provenientes de plantas diploides (2n=2x=60) presentaron cuatro sitios de hibridación 45S en posiciones telomérica, subtelomérica y subcentromérica y seis sitios de hibridación 5S en posiciones telomérica, subtelomérica, subcentromérica y pericentromérica (Figura 31). Por otra parte, las células metafásicas provenientes de plantas pentaploides (2n=5x=150), presentaron cinco sitios de hibridación 45S en posiciones telomérica y subtelomérica y cinco sitios de hibridación 5S en posiciones subtelomérica, subcentromérica y pericentromérica (Figura 32). En la Figura 33 se muestra el cariograma de S. formosissima diploide, donde se observa que se presentan 30 grupos distintos de cromosomas (60 cromosomas en total), con una fórmula cariotípica 13m + 16sm + 1st correspondiendo al tipo simétrico, debido a la predominancia de cromosomas m y sm.
El TF% obtenido fue de 36.72 indicando un bajo índice de asimetría, es decir que muchos cromosomas se parecen entre sí.
Figura 31 . Sitios de hibridación 45S (rojo, puntas de flechas) y 5S (verde, flechas) de ADN ribosomal de trigo en Sprekelia formosissima diploide (2n=2x=60). Barra=10µm.
Figura 32 . Sitios de hibridación 45S (rojo, puntas de flechas) y 5S (verde, flechas) de ADN ribosomal de trigo en Sprekelia formosissima pentaploide (2n=5x=150). Barra=10µm.
Figura 33. Cariograma de S. formosissima diploide (2n=2x=60). Los sitios de hibridación 45S se presentan en dos pares cromosómicos, mientras que los sitios de hibridación 5S se presentan en tres pares cromosómicos.
Finalmente, en la especie Hymenocallis howardii se encontraron dos sitios de hibridación 45S en posición telomérica y seis para 5S de igual manera en posición telomérica (Figura 34). Para los experimentos de hibridación en esta especie, solamente se utilizó Tetra-metil- rodamina-5-dUTP para marcar ambas sondas de ADN ribosomal (45S y 5S) realizándose un lavado de las laminillas entre una hibridación y la siguiente; a fin de poder diferenciar más fácilmente los resultados, los sitios de hibridación 5S (Figura 34a, c y e) se presentan con un tinte en color rojo mientras que los sitios de hibridación 45S se presentan en un tinte de color verde (Figura 34b, d y f).
Las señales obtenidas con FISH se muestran en el idiograma propuesto en la Figura 35, donde es posible observar las posiciones de las sondas 45S y 5S.
Figura 34 . Sitios de hibridación 5S (rojo, flechas) y 45S (verde, puntas de flechas) de ADN ribosomal de trigo en H. howardii . a) , c) y e) Hibridación con la sonda 5S. b) , d) y f) Hibridación con la sonda 45S. Barra=10µm.
Figura 35 . Idiograma de H. howardii presentando los loci para ADNr 5S (rojo) y 45S (verde). La señal 45S se presenta en dos cromosomas del grupo cinco mientras que la señal 5S se presenta en dos cromosomas de los grupos cuatro, diez y doce.
DISCUSIÓN En las plantas analizadas en este estudio, la gran mayoría de las señales de ADN ribosomal 5S y 45S se presentaron en regiones terminales de los cromosomas, solamente para Sprekelia formosissima el sitio 45S se presentó tanto en regiones terminales como subterminales y el número de copias fue variable para ambas señales (Cuadro 8). De acuerdo a la investigación realizada por Roa y Guerra (2010), en angiospermas el número de loci más frecuente de ADNr 45S (en 749 especies pertenecientes a 175 géneros) indican que es de dos o cuatro por cariotipo diploide y que generalmente se ubican en regiones terminales de los cromosomas, encontrándose más frecuentemente en los brazos cortos de los mismos. En las especies analizadas en nuestro trabajo, solamente en Habranthus longifolius la señal 45S se ubicó en los brazos largos de los cromosomas (Figura 30); respecto al sitio 5S, este se detectó en los brazos cortos de los cromosomas en las especies Hymenocallis howardii y Sprekelia formosissima , mientras que en Habranthus longifolius se detectó en los brazos largos, y en Zephyranthes sp se ubicó en los brazos largos en algunos cromosomas y en los brazos cortos en otros. Aun cuando los sitios de localización y el número de copias de los loci 5S y 45S presentan una gran variación, es probable que no esté relacionado con el nivel de ploidía como se ha sugerido en algunos estudios (Weiss Schneeweiss y Schneeweiss 2013), esto coincide con nuestros resultados en la especie S. formosissima en donde en las plantas diploides se detectaron cuatro sitios 45S y seis sitios 5S, mientras que en las pentaploides se detectaron cinco sitios 45S y cinco sitios 5S (Cuadro 8); de igual manera pueden existir diferente número de señales en especies que tienen un mismo nivel de ploidía dependiendo del origen de la sonda que se utiliza, por ejemplo, García (2015) reportó para Sprekelia diploide ocho sitios 45S y nueve sitios 5S utilizando sondas de ADN ribosomal de Tragopogon , mientras que en este trabajo sólo se detectaron cuatro sitios 45S y seis sitios 5S para la Sprekelia formosissima diploide analizada utilizando sondas de ADN ribosomal de Triticum aestivum , por lo que pudieran existir diferencias de acuerdo al origen de la sonda utilizada; por otra parte, es importante señalar que aun cuando García (2015) menciona la especie analizada como Sprekelia howardii, consideramos que en realidad se trata de S. formosissima, ya que Sprekelia es considerado un género monotípico).
Cuadro 8. Descripción de los patrones de ADNr encontrados en plantas de la familia Amaryllidaceae mediante FISH (t = telomérica, st = subtelomérica, sc = subcentromérica, pc = pericentromérica).
Número de sitios de ADNr Posiciones de los Especie 2n sitios de ADNr 45S 5S 45S 5S Señal Señal Señal Señal fuerte débil fuerte débil Hymenocallis howardii 96 (4x) 2 0 4 2 t T Sprekelia formosissima 60 (2x) 4 0 6 0 t, st, sc t, st, sc, pc Sprekelia formosissima 150 (5x) 2 3 2 3 t, st st, sc, pc Habranthus longifolius 35 + 1 B 2 0 2 2 t t, st Zephyranthes sp 44 2 0 3 2 t t, st
También se detectaron diferencias en los tamaños de las señales aun cuando se encontraban en cromosomas homólogos, siendo más evidente por ejemplo en el sitio 45S de H. howardii , lo cual puede deberse a la existencia de diferente número de copias en cada cromosoma. En todas las especies analizadas en nuestro estudio, se presentaron menor cantidad de señales 45S respecto a señales 5S, lo cual pudiera explicarse ya que los loci 45S de ADNr son en general más propensos a experimentar homogenización rápida, silenciamiento, y pérdida de loci, especialmente en poliploides (Clarkson y cols., 2005; Kova ík y cols., 2005; Weiss- Schneeweiss y cols., 2008; Kotseruba y cols., 2010). Por otra parte, el número de cromosomas individuales identificados en las especies analizadas en este estudio fue relativamente bajo, posiblemente debido a que la mayoría de las especies estudiadas son poliploides (excepto la S. formosissima de una población), a la variabilidad en el número de copias de sitios 45S y 5S y a que todas presentaron un bajo índice de asimetría lo que hace que muchos cromosomas se parezcan siendo imposible diferenciarlos solo por su tamaño. La especie donde se pudo identificar el mayor número de cromosomas fue S. formosissima diploide (2n=2x =60), donde se identificaron dos pares cromosómicos gracias a la sonda 45S, tres pares gracias a la sonda 5S y un par (cromosoma no. 1) debido a su inconfundible gran tamaño (Figura 33).
CONCLUSIONES
Se realizó la caracterización citogenética mediante la obtención de cariotipos utilizando marcadores moleculares de ADNr en plantas de Sprekelia formosissima, Hymenocallis howardii, Habranthus longifolius y Zephyranthes sp., encontrándose una gran variedad de señales para ambas sondas.
Para el caso de S. formosissima se observó que el número de señales en el citotipo pentaploide no corresponde a un múltiplo del número de señales presente en el citotipo diploide, por lo que se concluye, que al menos para las sondas de ADNr de trigo utilizadas en este trabajo, el nivel de ploidía de S. formosissima no está relacionado con el número de señales observadas.
Para el caso de S. formosissima diploide se pudieron identificar dos pares cromosómicos gracias a los sitios de hibridación de la sonda 45S, tres pares cromosómicos gracias a los sitios de hibridacón de 5S y un par cromosómico gracias a su inconfundible gran tamaño, por lo que se pudieron identificar un total de seis pares cromosómicos, proponiéndose la creación de más sondas a fin de poder identificar el total de pares cromosómicos en un futuro.
BIBLIOGRAFÍA
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