4.20 Efeito De Rinf1r Sobre Oligopeptidase B De T. Cruzi a Enzima

Lovato DV Resultados

4.20 Efeito de rINF1R sobre oligopeptidase B de T. cruzi

A enzima oligopeptidase B recombinante foi ensaiada na presença de diferentes concentrações de rINF1R até 0,875 µM, concentração 50 vezes superior a protease. Em nenhuma das condições testadas, rINF1R não inibiu a olipeptidase B.

4.21 Análise da interação proteases e rINF1R por ELISA

A fim de verificar a interação de rINF1R com a cruzaína, a forma recombinante da principal cisteínoprotease de T. cruzi, realizamos experimentos de ELISA nos quais as proteases cruzaína, catepsina L e quimotripsina foram adsorvidas separadamente em placa de 96 poços. Com este experimento verificamos que a ligação de rINF1R a quimotripsina foi dose dependente, esta enzima foi utilizada como controle positivo. Apenas interações fracas foram observadas para a catepsina L e a cruzaina. Esse experimento foi repetido duas vezes, em triplicata (figura 26).

Lovato DV Resultados

Figura 26: Curvas dose resposta da interação de rINF1R com diferentes proteases por ELISA. As enzimas quimotripsina, catepsina L humana e cruzaina foram utilizadas na sensibilização de placas de 96 poços (10 μg/mL). Foram utilizadas diferentes concentrações de rINF1R (0,5 a 5 μM). As reações foram monitoradas em 490 nm.

4.22 Interação de rINF1R – rodamina com o parasita T. cruzi

A fim de verificar a ligação de rINF1R no parasita, a proteína marcada rINF1R-rodamina foi incubada com parasitas T. cruzi formas tripomastigotas na concentração final de aproximadamente 10 µM. Como controle negativo foi utilizada a proteína recombinante Tilipo33, uma lipocalina de glândula salivar de Triatoma infestans, também marcada com rodamina, esta proteína

(Genbank AY366366), foi identificada como transcrito em biblioteca de cDNA de glândulas salivares de Triatoma infestans. Nenhuma marcação foi observada usando Tilipo33-rodamina sendo semelhante aos parasitas

Lovato DV Resultados incubados somente em PBS. No entanto, os parasitas incubados com rINF1R- rodamina apresentaram uma discreta marcação por todo corpo celular, indicando interação da rINF1R com a superfície dos parasitas (figura 27).

Figura 27: Micrografia de fluorescência da marcação obtida pela ligação de rINF1R-rodamina em T. cruzi nas formas tripomastigotas de cultura. FITC = marcação obtida pelo anticorpo policlonal de coelho anti-T. cruzi. RHOD = marcação com proteína ligada a rodamina e controle. A = parasitas incubados com rINF1R-rodamina; B = parasitas incubados com Tilipo33-rodamina e PBS.

Lovato DV Resultados

4.23 Radio-imunoensaio

Este experimento foi realizado na tentativa de verificar a liberação de bradicina pelas enzimas proteolíticas de T. cruzi. Visto que na literatura descreve-se que no processo de invasão celular de T. cruzi ocorre liberação de bradicinina mediada pelas cruzipaínas e sinalização por receptores do tipo B2 os quais são importantes nesse processo (para revisão, Burleigh & Woolsey,

2002). Desta forma, para verificar se rINF1R interfere na liberação de bradicinina pelo parasita T. cruzi (Del Nery ET AL., 1997), utilizamos extrato de tripomastigotas de cultura (1 x 108 parasitas / mL) com diferentes inibidores de proteases em experimentos de radio-imunoensaio para detecção de bradicinina

(Gozzo ET AL., 2002). Foram utilizados os inibidores de proteases rINF1R,

CmPI2 (tipo Kazal), inibidor de subtilisina, HNE e tripsina (Gonzalez ET AL.,

2007), E64, inibidor clássico de cisteínoproteases (Sigma-Aldrich) e BPTI

(Calbiochem), inibidor de tripsina e calicreínas, os mesmos foram incubados por 1 h a 37ºC com o extrato de parasitas. Após a incubação, a bradicinina foi purificada de todos os grupos, e a liberação de bradicinina quantificada por

RIA, mas os valores obtidos foram baixos semelhantes ao controle, sem adição de protease.

4.24 Experimentos de invasão celular de T. cruzi utilizando o inibidor de subtilisina CmPI2

Nos experimentos de invasão celular de T. cruzi foi utilizado o inibidor do tipo Kazal do molusco marinho Cenchritis muricatus, denominado CmPI2

Lovato DV Resultados

(González ET AL., 2007). CmPI2 é um inibidor de tripsina (Ki = 1,1 nM), elastase de neutrófilos (Ki = 2,6 nM) e subtilisina A (Ki = 30 nM), e foi utilizado a fim de comparar sua atividade inibitória no processo de invasão celular por T. cruzi, com os resultados de rINF1R. Neste experimento, verificamos que

CmPI2 também foi capaz de inibir a invasão celular por T. cruzi, mas em menor intensidade que rINF1R, com aproximadamente dez vezes menos eficiência

(figura 28). Paralelamente, também foram utilizados os inibidores SBTI, inibidor clássico do tipo Kunitz vegetal, e BPTI, inibidor clássico do tipo Kunitz animal, sendo que ambos não apresentaram atividade inibitória sobre a invasão celular por T. ‘ nas concentrações de 76 µM.

Figura 28: Atividades inibitórias de invasão de células por T. cruzi forma tripomastigotas de rINF1R (em vermelho) e CmPI2 (em azul). rINF1R foi utilizado nas concentrações de 0,1 - 10 µM. CmPI2 foi utilizado nas concentrações de 3 - 13 µM. Foram realizados dois experimentos independentes, em triplicata.

Lovato DV Discussão

5 Discussão

A seqüência completa do cDNA das infestinas obtida neste trabalho permite concluir que se trata de um dos maiores precursores de inibidores de serinoproteases do tipo Kazal já descrito até o presente momento.

Anteriormente, foram descritos precursores como o LEKTI, com 15 domínios tipo Kazal (Märgert ET AL., 1999), e os ovomucóides de aves (Scott ET AL.,

1987). Em triatomíneos, o primeiro precursor de inibidores tipo Kazal foi descrito em Rhodnius prolixus o qual continha três domínios e foi denominado de rodinina (Friedrich ET AL., 1993). Também foram descritos inibidores tipo

Kazal em Dipetalogaster maximus, o primeiro do gênero purificado de intestino médio de um triatomíneo o qual continha seis domínios (Mende ET AL., 1999).

E recentemente, em Triatoma brasiliensis foi descrito um precursor de inibidores tipo Kazal muito semelhante ao de Triatoma infestans, porém, contendo dois domínios de infestina 1R na porção N-terminal (Araújo ET AL.,

2007).

A sequência de aminoácidos traduzida do precursor das infestinas revela a presença da seqüência de aminoácidos Ala – Glu que indica ser um sinal putativo para liberação dos domínios do precursor, infestina 1R e os demais domínios de infestina 1-2 e 3-4 sugerindo que estes foram originados de processamento pós-traducional e não de splicing alternativo.

O alinhamento dos aminoácidos dos domínios 2R – 3R com os domínios

1 – 2 (Campos ET AL., 2002), mostram identidade de 77% entre si e sítio reativo semelhante o que indica fortemente que os domínios infestina 2R – 3R apresentam atividade inibitória para trombina. A expressão de dois inibidores

Lovato DV Discussão de trombina em um mesmo precursor reforça a idéia de que a inibição de trombina deva ser de extrema importância para a fisiologia do trato intestinal.

Em ovomucóides, já foi descrito que seqüências com alta identidade dentro destes precursores podem ter surgido por duplicações in tandem no gene sendo selecionadas de acordo com a pressão evolutiva sobre a molécula (Scott

ET AL., 1987).

Diferentemente dos demais domínios, a infestina 1R possui dois resíduos de aminoácidos, Leu – Ile, nas posições P1-P1’ do sítio reativo, sugerindo que este inibidor apresenta atividade para proteases diferentes das enzimas tipo tripsina, que hidrolisam preferencialmente para resíduos de aminoácidos positivos como Arg e Lys, grupo de enzimas onde estão incluídas as proteases da coagulação sanguínea. A característica hidrofóbica do sítio reativo de infestina 1R é um fator determinante para não inibir a coagulação sanguínea, resultados confirmados pelos testes de tempo de coagulação TTPA e TP. Por outro lado, infestina 1R mostrou-se um potente inibidor de proteases semelhantes à quimotripsina e subtilisina, enzimas com seletividade para aminoácidos hidrofóbicos. No trato digestivo de hemípteros, não há proteases da família das serinoproteases, mas apenas aspartilproteases e cisteinoproteases as quais são responsáveis pela digestão das proteínas do sangue (Lopes e Terra, 2003). Desta forma, as infestinas não atuam no controle de proteases endógenas do inseto mas no controle de serinoproteases presentes no sangue do hospedeiro vertebrado.

Com o objetivo de confirmar a presença da infestina 1R nativa no estômago de Triatoma infestans, foi feito um extrato bruto de intestino médio e neste foram detectadas duas atividades inibitórias diferentes para HNE. O

Lovato DV Discussão inibidor infestina 1R nativo foi purificado confirmando a sua presença no inseto como um único domínio tipo Kazal com aproximadamente 6,0 kDa. O seqüenciamento N-terminal da proteína pura mostrou que a predição do peptídeo sinal do precursor das infestinas utilizando o programa SignalP

(Nielsen ET AL., 1997) estava correta.

Durante o processo de purificação da infestina 1R nativa, foi isolado outro inibidor de HNE eluído com menor tempo de retenção na coluna Sephasil

Peptide C8, que apresentou seqüência N-terminal de aminoácidos diferente da infestina 1R, mas os resultados não foram suficientes para a sua classificação.

No entanto, devido a baixa massa molecular de 4,2 kDa e alta estabilidade da proteína, que resistiu a cromatografia de fase reversa, sugerimos que trata-se de um membro de uma nova família de inibidores de proteases descrita principalmente em artrópodes denominada de Pacifastina (Simonet ET AL.,

2003). A presença desses dois inibidores potentes de elastase de neutrófilos em trato digestivo de T. infestans pode ser uma necessidade desse inseto em bloquear esta enzima. A elastase de neutrófilos está diretamente ligada à ativação de neutrófilos sendo liberada no momento da injúria tecidual e inflamação aguda (Ogura ET AL., 1999) que podem estar relacionadas à aquisição de sangue durante a alimentação desse inseto. Estes inibidores de elastase podem proteger o inseto de proteólise descontrolada que aumentaria a resposta oxidativa dos neutrófilos (Kusner e King, 1989) e conseqüentemente o número de moléculas nocivas no intestino médio. O sangue contém muitas espécies reativas de oxigênio provenientes do grupo heme da hemoglobina as quais são tóxicas e necessitam de controle nos animais hematófagos. No barbeiro Rhodnius prolixus, foi descrita uma via de detoxificação de heme para

Lovato DV Discussão impedir o dano oxidativo (Oliveira ET AL., 1999). Estas informações permitem sugerir que as infestinas são inibidores de diversas proteases presentes no sangue, que tem grande potencial de danificar o trato digestivo do inseto.

Para os estudos de infestina 1R, foi necessário obter grandes quantidades dessa proteína, para isto foram utilizados as expressões heterólogas em levedura Pichia pastoris e em bactéria E. coli. Os inibidores expressos nos dois sistemas apresentaram constantes inibitórias semelhantes indicando serem semelhantes estruturalmente. Os níveis de infestina 1R recombinante (rINF1R) foram muito semelhantes também, mas optou-se pela expressão em E. coli por ser um processo mais rápido. Também se optou por não utilizar cromatografia de afinidade em quimotripsina-Sepharose já que nesse caso, a protease poderia hidrolisar o inibidor recombinante, como foi confirmado por um experimento piloto, por SDS-PAGE e cromatografia de fase reversa com a presença de vários picos proteicos com o mesmo N-terminal de rINF1R. Outra vantagem na expressão em bactéria foi que após o choque osmótico, a amostra pode ser aplicada em cromatografia de troca iônica, ao contrário do sobrenadante de cultura de P. pastoris que necessitaria de um processo de diálise para remover o excesso de sais. A rINF1R mostrou-se pouco estável em baixas concentrações iônicas, portanto durante a diálise as perdas de atividade inibitória foram outra dificuldade que nos levou a expressar esta proteína em bactéria.

Com a proteína recombinante purificada, foram realizados vários experimentos a fim de se entender a função biológica de infestina 1R. Pela característica peculiar de ser um forte inibidor de proteases como quimotripsina e subtilisina, procuramos avaliar o efeito de rINF1R sobre proteases do tipo

Lovato DV Discussão subtilisina de fungos entomopatogênicos como Metarhizium anisopliae. Esses fungos expressam enzimas como fatores de virulência para invadirem diferentes artrópodes (St. Leger ET AL., 1996). Além de quitinases para degradar o exoesqueleto, proteases semelhantes à subtilisina e tripsina, denominadas PR1 e PR2 proteases, respectivamente, são altamente expressas quando o fungo encontra-se em contato com a cutícula do inseto

(Freimoser ET AL., 2003). Portanto, estas proteases devem ser bloqueadas quando um organismo precisa se defender destes patógenos (Fröbius ET AL.,

2000). Verificamos que rINF1R não apresentou atividade inibitória sobre as proteases PR1 e PR2 produzidas pelo fungo M. anisopliae. Os fungos entomopatogênicos já foram descritos na literatura como forma de controle de triatomíneos, especialmente em regiões peridomiciliares (Luz ET AL., 1998).

Provavelmente, INF1R não foi selecionada para proteases de fungo entomopatogênicos como M. anisopliae que infecta seus hospedeiros penetrando pela cutícula e não por via oral. Alguns fungos são conhecidos como componentes da flora intestinal de triatomíneos e estes são raramente patogênicos para os seus hospedeiros (Moraes ET AL., 2001). Outros inibidores potentes para proteases de M. anisopliae foram caracterizados no carrapato bovino Boophilus microplus, BmSI-7 e BmSI-8 os quais foram os primeiros inibidores da família TIL a apresentarem esta atividade contra proteases fatores de virulência de entomopatógenos (Sasaki ET AL., 2008).

A expressão de infestina 1R no intestino médio de barbeiro T. infestans e sua potente ação bloqueadora de invasão do parasita T. cruzi sugerem que possa existir uma interação entre o inibidor nativo e o parasita no intestino médio do barbeiro. Alguns trabalhos já mostraram a presença de proteínas no

Lovato DV Discussão trato digestivo de insetos envolvidas na relação de parasitas com seus respectivos vetores, algumas moléculas com papel determinante na competência vetorial destes insetos (Blandin ET AL., 2004; Kamhawi ET AL.,

2004). A indicação de que rINF1R liga-se aos parasitas nas formas tripomastigotas de cultura também fortalece esta hipótese. Outros experimentos deverão ser realizados para provar estas sugestões como o silenciamento do precursor das infestinas seguido de infecção com sangue contendo T. cruzi e análise de parasitemia no trato digestivo, viabilidade dos insetos e estudos histológicos.

Por algum tempo, foi sugerido por alguns pesquisadores que

Trypanosoma cruzi pudesse não se restringir ao trato digestivo do inseto

(Lacombe, 1980; Ribeiro e Camargo, 1982; Lacombe e Santos, 1984; Lacombe e Ortrud, 1987). Porém, posteriormente estes estudos não foram continuados e outros estudos sugeriram que possivelmente aqueles dados foram oriundos de artefatos de técnicas de microscopia ou de lesões causadas nos insetos anteriores às análises e também que o parasita não seria capaz de crescer e se desenvolver na hemocele devido o sistema imune do inseto (Azambuja ET

AL., 1999). Questões como essas reforçam que a biologia das interações entre

T. cruzi e os diferentes vetores necessita de mais estudos.

O efeito observado utilizando o peptídeo sintético 1RSFTI indica que a região do sítio reativo de infestina 1R é a responsável pela atividade inibitória da invasão dos parasitas. Sugestão reforçada com os experimentos utilizando o rINF1R desnaturado, ou seja o efeito inibitório da invasão está relacionado à proteína ativa. Esses resultados descartam a possibilidade do efeito de rINF1R sobre a invasão ser inespecífico e aleatório já que depende de proteína ativa e,

Lovato DV Discussão especialmente, da região do sítio reativo na correta conformação estrutural.

Esses resultados revelam a molécula SFTI-1 como uma ferramenta promissora para o desenho de drogas no tratamento da doença de Chagas baseado, por exemplo, na estrutura de inibidores de proteases que inibem enzimas de T. cruzi (Qi ET AL., 2005).

Apesar dos anticorpos anti-rINF1R não reconhecerem os domínios de infestina e mesmo a infestina 1R nativa em extratos de intestino médio, a produção de anticorpos anti-rINF1R foi importante para verificarmos a interação do inibidor ao parasita T. cruzi. rINF1R liga-se aos parasitas nas formas tripomastigotas de cultura, mas não as formas epimastigotas. Utilizando rINF1R conjugada com rodamina, foi possível verificar marcação de tripomastigotas confirmando os resultados obtidos com a rINF1R e os anticorpos policlonais anti-rINF1R.

Por outro lado, rINF1R interferiu no crescimento das formas epimastigotas de T. cruzi. Alguns trabalhos demonstram que inibidores sintéticos de cisteínoproteases inibem o crescimento destas formas de T. cruzi e a expressão elevada de proteases desta classe aumentam as taxas de crescimento e metaciclogênese (Tomas ET AL., 1997; Yong ET AL., 2000).

Surpreendentemente, o inibidor E64 apresentou efeito significativamente menor ao de rINF1R apesar da alta concentração utilizada nesses experimentos. Até o presente momento, não foram descritos inibidores protéicos de proteases que interferissem no crescimento de epimastigotas. Estes resultados mostram que, apesar de rINF1R não se ligar diretamente ao parasita epimastigota, ele é capaz de interferir na sua fisiologia.

Lovato DV Discussão

Alguns trabalhos mostram que inibidores de proteases semelhantes às infestinas podem estar envolvidos na resposta imunológica inata de insetos.

Lehane e colaboradores (2003) mostraram que aproximadamente onze inibidores de proteases putativos tem expressão alterada em intestino da mosca Glossina morsitans morsitans, vetor da tripanossomíase africana, quando alimentadas com sangue contendo bactérias Gram-negativas e

Trypanosoma brucei (Lehane ET AL., 2003). Dentre estas moléculas, foi identificado um inibidor de protease putativo homólogo ao precursor das infestinas com aproximadamente 450 bp (E value de 7e-06). Recentemente, também foi demonstrado que inibidor de proteases semelhantes às infestinas tem expressão aumentada em intestino médio de insetos R. prolixus quando bactérias são injetadas na hemocele desse inseto (Ursic-Bedoya e

Lowenberger, 2006).

A variação da expressão do precursor das infestinas após a alimentação com sangue analisada por qPCR sugere que a quantidade destes inibidores deve ser alta no inicial da alimentação para que rapidamente ocorra o bloqueio da coagulação sanguínea no trato digestivo. No entanto, o perfil de expressão de infestinas apresentou diferenças quando foram utilizados alimentador artificial e alimentação em camundongos anestesiados. Acreditamos que a diferença possa estar relacionada principalmente a presença de citrato no sangue utilizado em alimentadores artificiais para evitar a coagulação sanguínea. Mesmo com essas diferenças, foi possível confirmar a queda da expressão de infestinas em torno de 24 h após alimentação e retomada dos níveis iniciais após quatorze dias reforçando a hipótese do papel destes transcritos na aquisição e estocagem inicial do sangue.

Lovato DV Discussão

Comparando a expressão das infestinas após a alimentação de sangue contendo lisado de T. cruzi, verificamos que apenas após o tempo de 12 h, a expressão de infestinas está aumentada em relação aos níveis normais. Estes resultados indicam que a expressão das infestinas pode ter sido alterada devido à presença de componentes do parasita sendo possivelmente por

PAMPS (Pathogen associated molecular patterns) que são moléculas fortemente conservadas em patógenos com função essencial de organismos multicelulares na imunidade inata ativando a defesa do organismo (Teixeira ET

AL., 2002). Mucinas de parasitas, LPS e peptideoglicanos de bactérias podem ativar o sistema imune do hospedeiro dentre esse processo, a expressão de diferentes proteínas e peptídeos antimicrobianos (Kurata ET AL., 2006). Para a comprovação desses papéis, outros experimentos necessitam ser realizados.

Verificamos que o transcrito das infestinas está presente em todas as etapas do desenvolvimento de T. infestans desde o 1º instar. Também verificamos a ausência de transcritos de infestina no corpo gorduroso, tecido importante para o sistema imune e para a reprodução. Estes resultados reforçam a sugestão da importância destes inibidores de proteases no trato digestivo destes hemípteros. Recentemente, foi demonstrada por interferência de RNA a importância de transcrito com alta similaridade a infestina em Triatoma brasiliensis denominado brasiliensina (Araújo ET AL., 2007). Os resultados mostraram que animais silenciados se alimentaram 39% menos de sangue em relação aos controles sugerindo que a atividade anticoagulante é importante para a aquisição de sangue (Araújo ET AL., 2007). Entretanto vale lembrar que ao contrário das demais infestinas, rINF1R não inibe a coagulação sanguínea

Lovato DV Discussão medida pelos experimentos de tempo de trombina e tempo de tromboplastina parcial ativada (Campos ET AL., 2002; Campos ET AL., 2004).

O potente efeito inibitório de rINF1R sobre a invasão de T. cruzi em cultura de células e o efeito dose-dependente de rINF1R sobre a invasão sugere a especificidade do evento e que exista um ligante específico para o inibidor no processo. Alguns experimentos foram realizados a fim de melhor entender o efeito de rINF1R na invasão. O efeito da pré-incubação de rINF1R com o parasita antes do momento da invasão sugere que o inibidor interage fortemente com T. cruzi, pois a inibição permanece após a retirada de rINF1R, ou seja, o efeito não se deve a interação de rINF1R com proteases secretadas pelo parasita no meio de cultura. Paralelamente, foram feitos experimentos para verificar a toxicidade de rINF1R sobre os parasitas, a capacidade de tripomastigotas transformar-se em epimastigotas e se multiplicar após incubação com rINF1R, confirmam a não toxicidade deste inibidor ao parasitas.

As células hospedeiras também não foram afetadas por rINF1R, esses resultados confirmam que rINF1R não foi tóxico para ambas as células.

A invasão de T. cruzi é composta por uma série de eventos nos quais diferentes moléculas dentre elas as proteases cruzipaína e oligopeptidase B estão envolvidas para mobilização de íons cálcio e vesículas das células hospedeiras (para revisão Yoshida, 2006). Após verificarmos o efeito de rINF1R na invasão por tripomastigotas de cultura, essas proteases foram sugeridas como possíveis alvos. Até o presente momento, nossos resultados sugerem que rINF1R deve interagir com cruzipaínas apesar de não inibi-las.

Utilizando cromatografia de afinidade em rINF1R-Sepharose purificamos proteínas com atividades proteolíticas dos extratos das formas tripomastigotas

Lovato DV Discussão e epimastigotas. A inibição total das atividades proteolíticas purificadas em coluna de rINF1R-Sepharose por E64 confirmou as sugestões de que rINF1R é capaz de se ligar à proteases da família das cisteinoproteases apesar de não inibir a atividade proteolítica destas enzimas sobre substratos fluorogênicos. A atividade proteolítica eluída da coluna rINF1R-Sepharose apresenta características de enzimas semelhantes as cruzipaínas como pH ótimo = 5,0 e ativação com DTT (Del Nery ET AL., 1997). Utilizando a forma recombinante da cruzipaína, a cruzaína (Eakin ET AL., 1997), verificarmos a ligação de rINF1R

à cruzaína em ensaio de ELISA.

Verificamos também que a protease oligopeptidase B não é inibida por rINF1R. Estes resultados sugerem que a protease oligopeptidase B não deve interagir com rINF1R e o efeito de inibição da invasão de T. cruzi não envolve esta oligopeptidase B.

Estes resultados sugerem que a interação entre rINF1R e cisteinoproteases de T. cruzi não ocorra de forma canônica com o sítio catalítico, mas que interfere na sua atividade pela interação com outras regiões destas enzimas inibindo a hidrólise de substratos naturais, que não tem o mesmo acesso que substratos peptídicos devido ao tamanho destas moléculas.

Como descrito na literatura, a cruzipaína é capaz de liberar bradicinina do cininogênio de alta massa molecular, evento importante para a sinalização da invasão pela mediação de receptores B2 (Del Nery ET AL., 1997), no entanto, neste trabalho não foi possível verificar a liberação de bradicinina por extratos de T. cruzi nas formas tripomastigotas.

Lovato DV Discussão

O efeito de rINF1R juntamente com E64 na invasão de células por T. cruzi foi ligeiramente maior que os observados com inibidores separadamente, mostrando que não houve potencialização do efeito inibitório sugerindo que as proteólises envolvidas possam estar organizadas de forma linear e não por cascata de ativações múltiplas.

Com o objetivo de purificar os ligantes de T. cruzi para o inibidor rINF1R, utilizamos a técnica de imunoprecipitação com os anticorpos anti-rINF1R produzidos por camundongos, os resultados não mostraram ligação específica de nenhuma proteína a rINF1R.

Com a constatação do efeito inibitório de rINF1R sobre a invasão de T. cruzi em cultura de células, vários ensaios cinéticos foram realizados a fim de verificar o efeito de diferentes inibidores de protease sobre a atividade proteolítica presente no extrato de T. cruzi. Os resultados sugerem que o parasita possui uma série de enzimas proteolíticas de diferentes classes já que diferentes inibidores de protease foram capazes de reduzir estas atividades.

Devido à atividade proteolítica majoritária de cisteínoproteases, o inibidor E-64 foi usado em conjunto com demais moléculas a fim de remover possíveis interferências na inibição de proteases de outras classes. O quelante EDTA e o inibidor de subtilisina BmSI-7 foram claramente capazes de inibir parcialmente a atividade proteolítica do extrato de T. cruzi sugerindo que neste estejam presentes proteases que dependem de metal para sua catálise, como metaloproteases, e proteases semelhantes a subtilisina, respectivamente.

Acreditamos que nestas condições, os inibidores tipo Kazal rINF1R e

CmPI2 não mostraram atividade inibitória por causa de sua estrutura menos estável, mais suscetível a perda de folding e hidrólise por outras proteases não

Lovato DV Discussão inibidas comparadas a BmSI-7 que, ao contrário, pertence a uma família de inibidores de protease, família TIL, anteriormente denominada família Ascaris, que apresenta alta estabilidade estrutural mantendo-se ativo mesmo após serem submetidos a altas temperaturas, agentes desnaturantes e hidrólise de diferentes proteases (Bernard e Peanasky, 1993). Levando em conta os dados anteriores da coluna de rINF1R-Sepharose e a interação do inibidor com proteases diferentes de serinoproteases, por ELISA confirmamos que rINF1R liga-se a cruzaína, catepsina L e quimotripsina, sendo mais específico para esta última enzima. Desta forma, a interação de rINF1R com cisteínoproteases como catepsina L e cruzaína também não pode ser descartado, mesmo o rINF1R não inibindo este tipo de proteases.

Em T. cruzi, além das cruzipaínas e oligopeptidase B, já foram descritas proteases da classe das metaloproteases e seus respectivos homólogos em T. brucei e Leishmania (Lowndes ET AL., 1996; Cuevas ET AL., 2003), mas, até o presente momento, nenhuma protease semelhante à subtilisina. Nossos dados sugerem que proteases semelhantes à subtilisina possam estar envolvidas no processo de invasão celular por T. cruzi. Por esta razão, realizamos ensaios de invasão na presença de CmPI2 o qual foi capaz de reduzir a invasão de forma proporcional a sua constante inibitória para subtilisina quando comparada a rINF1R. Este resultado corroboram dados anteriores utilizando o inibidor TiEI que apresenta constantes inibitórias semelhante a rINF1R, com exceção da inibição de subtilisina e também não interferiu na invasão de T. cruzi.

A hipótese de que uma atividade proteolítica semelhante à subtilisina deve ser importante para invasão de T. cruzi é reforçada com análise do genoma do parasita e identificamos algumas seqüências para proteases

Lovato DV Discussão preditas similares a subtilisinas anotadas no genoma de T. cruzi como XP

806372.1, XP 815303.1, XP 809835.1 e XP 816111.1, no entanto algumas dúvidas surgem quando genes homólogos foram encontrados também em T. brucei. Atualmente, estamos continuando este projeto na tentativa de confirmar o papel de inibidores de subtilisinas na invasão de células por T. cruzi.

Lovato DV Resumo

6 Resumo

As infestinas são inibidores de serinoproteases do tipo Kazal encontrados no intestino médio anterior do barbeiro Triatoma infestans

(Hemiptera: Reduviidae), um dos principais vetores da doença de Chagas.

Neste trabalho, o cDNA do precursor das infestinas foi clonado mostrando a presença de um peptídeo sinal hipotético e sete domínios de inibidores de proteases do tipo Kazal sendo quatro correspondentes as infestinas 1-2 e infestina 3-4, e três novos domínios. Por análise em Northern blot, foi confirmada a síntese de apenas um transcrito de infestina 1-7, de aproximadamente 1800 pb, no intestino médio anterior do inseto. Os três novos domínios de infestina foram denominados de infestina 1R, 2R e 3R. As infestinas 2R-3R são 77% idênticas em seqüência de aminoácidos a infestina

1-2. Em contraste as demais infestinas, a infestina 1R apresenta duas características diferentes marcantes: 1) aminoácido hidrofóbico na posição P1 do sítio reativo do inibidor e, 2) ser processado como um domínio único do tipo

Kazal de acordo com predição. Estas duas características foram demonstradas experimentalmente pela purificação da infestina 1R nativa de intestino de T. infestans a qual inibiu elastase de neutrófilos, quimotripsina e subtilisina A e a análise por espectroscopia de massas confirmou o processamento como um

único domínio do tipo Kazal. A infestina 1R recombinante foi expressa em bactéria E. coli e apresentou a mesma constante de dissociação para elastase de neutrófilos em relação a proteína nativa. rINF1R também foi capaz de inibir subtilisina A, quimotripsina e proteinase K, mas não foi capaz de inibir trombina nem os ensaios de coagulação (TP e TTPA). Procurando pela função biológica

Lovato DV Resumo de infestina 1R e atividades biológicas da molécula, verificamos que a forma recombinante foi capaz de interagir com o parasita da doença de Chagas

Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) ligando-se as formas tripomastigotas de T. cruzi e interferiu na invasão de células epiteliais em cultura. Na concentração final de 10 µM, rINF1R bloqueou completamente a invasão e, na mesma concentração, foi capaz de inibir o crescimento das formas epimastigotas em cultura. Para elucidar qual região de rINF1R era responsável por esta atividade, um peptídeo cíclico contendo a região do sítio reativo de rINF1R baseado na estrutura de SFTI-1 (Sun Flower Trypsin Inhibitor

1) denominado 1RSFTI foi sintetizado o qual também foi capaz de interferir na invasão celular de T. cruzi. Ensaios de invasão de células LLCMK2 por T. cruzi cepa Y utilizando diferentes inibidores de proteases sugerem que atividade proteolítica do tipo subtilisina pode ser importante para a invasão de células por

T. cruzi. O perfil de expressão do precursor das infestinas alimentando artificialmente com sangue humano contendo extrato das formas tripomastigotas de T. cruzi mostrou aumento de expressão de duas vezes após

12 h em relação aos que se alimentaram apenas com sangue nas mesmas condições.

Lovato DV Abstract

7 Abstract

Infestins are Kazal-type serine proteinase inhibitors found in the midgut of the Chagas' disease vector, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae). In the present work, we cloned the full-length cDNA of infestins' precursor. The translated cDNA predicted a polypeptide containing a signal peptide and seven

Kazal-type domains, four domains from infestin 1-2 and infestin 3-4, and three new domains. Northern blot analysis confirmed that infestins are synthesized in a single transcript (approximately 1,800 bp) in the insect’s anterior midgut. The three new Kazal domains were named infestin 1R, 2R and 3R. Infestin 2R-3R has 77% amino acid sequence identity to infestin 1-2. In contrast, infestin 1R presented two important different characteristics when compared to the other infestins: 1) a hydrophobic amino acid residue at P1 position in the inhibitor reactive site and 2) a prediction to be processed as a single Kazal domain.

These two characteristics were experimentally demonstrated by the purification of native infestin 1R from T. infestans midgut. Native infestin 1R was shown to be processed as a single Kazal domain by mass spectrometry and it was able to inhibit neutrophil elastase, subtilisin A and chymotrypsin. To further characterize infestin 1R inhibitory activity, it was expressed as a recombinant protein in bacteria E. coli. Recombinant infestin 1R inhibited neutrophil elastase with the same Ki of the native inhibitor. Moreover, it inhibited subtilisin A, chymotrypsin and proteinase K but did inhibit neither thrombin nor coagulation assays. Looking for infestin 1R biological function and molecular activities, we also demonstrate that it interacts with the parasite of Chagas' disease

Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae). It binds to

Lovato DV Abstract trypomastigotes forms and impairs the invasion of epithelial culture cells.

Recombinant infestin1R (rINF1R) was able to completely block T. cruzi invasion of culture cells with 10 µM concentration. In the same concentration, rINF1R also decreased the growth of T. cruzi epimastigotes forms in culture media. To elucidate which region of rINF1R may be responsible for this activity, we synthesized a cyclic peptide containing the reactive site of infestin 1R into the structure of Sun Flower Trypsin Inhibitor (SFTI-1) as scaffold. The new cyclic peptide, called 1RSFTI, also impairs T. cruzi invasion. Our results with different protease inhibitors suggest that a subtilisin-like activity is very important to T. cruzi cell invasion in LLCMK2 – Y strain model. We also analyzed infestins precursor expression after artificial blood meal with human blood containing trypomastigotes extracts. Insects fed with parasite extracts showed a two-fold increased level of infestin expression after 12 h.

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Lovato DV Apêndices

Apêndice

Trabalho publicado no período:

Lovato DV, Nicolau de Campos IT, Amino R, Tanaka AS

Biochimie

2006, 88(6): 673-81.

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Biochimie 88 (2006) 673–681 www.elsevier.com/locate/biochi

The full-length cDNA of anticoagulant protein infestin revealed a novel releasable Kazal domain, a neutrophil elastase inhibitor lacking anticoagulant activity

Diogo Ventura Lovato, Ivan Torres Nicolau de Campos, RogerioAmino, Aparecida Sadae Tanaka*

Department of Biochemistry, Universidade Federal de São Paulo–Escola Paulista de Medicina, Rua Tres de Maio 100, 04044-020 São Paulo, Brazil

Received 30 August 2005; accepted 29 November 2005 Available online 19 January 2006 This work was supported by: FAPESP – Proc. 02/13960-8 and CNPq (Brazil)

Abstract Infestins are Kazal-type serine proteinase inhibitors found in the midgut of the Chagas’ disease vector, Triatoma infestans. In previous studies, we characterized two double-headed infestins with potent anticoagulant activity; infestin 1–2, which inhibits thrombin and infestin 3–4, a factor XIIa inhibitor. In the present work, we have cloned the full-length cDNA of infestins’ precursor. The translated cDNA predicted a polypeptide containing a signal peptide and seven Kazal-type domains, four domains from infestin 1–2 and infestin 3–4, and three new domains. Northern blot analysis confirmed that infestins are synthesized in a single transcript (~1800 bp) in the insect midgut, but not in salivary glands. Based on the cDNA sequence, the three new Kazal domains were named infestin 1R, 2R and 3R. Infestin 2R-3R has 77% amino acid sequence identity to infestin 1–2 and the same basic amino acid residue at P1 position in the inhibitory reactive site suggesting that these two proteins have a similar inhibitory specificity. In contrast, infestin 1R has two different characteristics when compared to the other infestins: i) a hydrophobic amino acid residue at P1 position in the inhibitory reactive site and ii) a prediction to be processed as a single Kazal domain. These two characteristics were experimentally demonstrated by the purification of native infestin 1R from T. infestans midgut. Native infestin 1R was shown to be processed as a single Kazal domain by mass spectrometry and it was able to inhibit neutrophil elastase, subtilisin A and chymotrypsin. To further characterize infestin 1R inhibitory activity, it was expressed as a recombinant protein in bacteria. Recombinant infestin 1R inhibited neutrophil elastase with the same Ki of the native inhibitor. Moreover, it inhibited subtilisin A, chymotrypsin and proteinase K but did inhibit neither thrombin nor coagulation assays. In conclusion, unlike the other described infestins, infestin 1R did not present anticoagulant activity and is processed as a single Kazal domain with inhibitory specificity towards proteases that hydrolyze peptide bonds after hydrophobic amino acid residues. © 2006 Elsevier SAS. All rights reserved.

Keywords: Serine proteinase inhibitor; Multidomain; Blood sucking; Subtilisin inhibitor; Elastase inhibitor; Triatoma infestans

1. Introduction due to their importance in maintaining fluidity of the blood meal in the insects’ digestive tract [2,3]. Thrombin inhibitors Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) is an anthropo- are composed of two, non-classical, tandem repeated Kazal- philic and exclusively hematophagous insect. It is also one of type domains that are encoded by a gene containing more than the most important vectors for the protozoan parasite Trypano- six Kazal-type domains transcribed on the same mRNA mole- soma cruzi, which is responsible for Chagas’ disease in Latin cule. These inhibitors are then processed by an unknown post America. Three potent thrombin inhibitors of the Kazal-type transcriptional and proteolytic mechanism. family have been previously described in kissing bugs (Triato- In a previous study, we described recombinant infestins en- minae) [1–3]. They are believed to be expressed in the midgut coded by a cDNA fragment containing four non-classical Ka- zal-type domains, named infestins 1, 2, 3 and 4, expressed in the T. infestans midgut. Infestins 1–2 interfered with blood coa- * Corresponding author. Tel.: +55 11 5576 4444; fax: +55 11 5572 3006. gulation by inhibiting thrombin activity [3]; infestin 4 pre- E-mail address: [email protected] (A.S. Tanaka). sented high specificity for the blood coagulation factor XIIa,

0300-9084/$ - see front matter © 2006 Elsevier SAS. All rights reserved. doi:10.1016/j.biochi.2005.11.011 674 D.V. Lovato et al. / Biochimie 88 (2006) 673–681 showing an important role in the control of the hosts’ blood 3.4.21.64) was purchased by Life Technologies (NY, USA). coagulation [4]. Chromogenic substrates: S2484 (Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNa), Several Kazal-type family members have previously been S2238 (HD–Phe–Pip–Arg–pNa), were purchased from Chro- described to be present in the vertebrate and invertebrate ani- mogenix (Mölndal, Sweden). Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa was mals. The role of Kazal-type inhibitors is not always known. obtained from Fluka (Steinheim, Switzerland) and Subtilisin Rhodniin [1] and infestin 1–2 [3] are anticoagulants; however, A Substrate I (Boc-Gly-Gly-Leu-pNa) was purchased from the physiological roles of bdellin B-3 [5] and LDTI (Leech Calbiochem (La Jolla, CA, USA). N-α-tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa derived tryptase inhibitor) [6] are not completely understood. was obtained from Pentapharm (Basel, Switzerland). Kazal-type family members have several common structural The oligonucleotides: INFESTINSP (5′–ATG AGG TAT features: a ‘canonical’ binding loop [7], a conserved cysteine CTA CTG TTG CTA GGA TTG–3′), INFESTINCT (5′–TCA distribution pattern, a typical VCGxD sequence [8], two to AAA CTG TTC AAC ATC GCT GCG CTG–3′), 5PAR17N- three α-helices connected by turns and a short, three-stranded coI (5′–GGC CAT GGC CGA GAA AAA GGA TCC ACC– antiparallel β-sheet [6]. Some invertebrates Kazal-type inhibi- 3′) and PICINF1R (5′–GCG GCC GCT CAC TCT ACT TCT tors, such as LDTI, rhodniin, bdellin B-3 and infestin 1–2 [1,3, TGT TC–3′) were synthesized by Invitrogen (Sao Paulo, Bra- 5,9], are identified as non-classical Kazal-type inhibitors [5]. zil). All these molecules can be differentiated by the presence of only one amino acid residue between the first and second cy- 2.2. Full-length infestin cloning and sequencing analysis steine residue, in contrast to seven or more amino acid residues in the classical Kazal-type inhibitors. Total RNA extraction, cDNA first strand synthesis, oligonu- Classical and non-classical Kazal-type inhibitors can be sin- cleotide constructions for gene walking and RT-PCR were per- gle or multi-domain proteins. Multi-domain proteins, with do- formed according to the 5’ RACE System manufacture’s in- mains linked in tandem by loops of variable lengths, are more structions (Invitrogen). The 5’ region of the infestin gene was common. For example, a four Kazal-type domain precursor in amplified by PCR using UAP primer (Invitrogen) and IN- crayfish [10], human LEKTI precursor (lympho-epithelial Ka- F2DREV (GSP2 primer) [3]. PCR products were purified and zal-type-related inhibitor) containing 15 domains [11], rhodniin cloned using pGEM-T Easy System (Promega). Several clones with three domains and dipetalogastin with six domains from were sequenced and analyzed for similarity to several Kazal- Rhodnius prolixus [1] and Dipetalogaster maximus [2], respec- type inhibitors using the BLAST program [16]. A clone con- tively. taining the 5’ region of the infestin gene with a signal peptide Serine proteinases are divided into two families: the chymo- was determined using the prediction program SignalP V2.0 trypsin and subtilisin families [12]. Their catalytic activity is [17]. The full-length infestin gene was amplified by PCR using provided by a charged system composed of a well-conserved 5’ RACE cDNA first strand preparation as template and the catalytic triad containing aspartic acid, serine and histidine primers INFESTINSP and INFESTINCT. The complete gene amino acid residues. These two families evolved through inde- was cloned into pGEM-T Easy vector and the complete nu- pendent convergent evolution, which can include blood coagu- cleotide sequence determined. Alignments were performed lation proteinases and subtilisins from various Bacillus species. using the ClustalW program [18]. Serine proteinases from both families can be inhibited by classical Kazal-type inhibitors such as turkey ovomucoid third do- 2.3. Northern blot main [13] and the non-classical Kazal-type inhibitor, NcPI-S, from the protozoan Neospora caninum [14]. To this present Total RNA (5 mg) was extracted from T. infestans midgut date, no subtilisin inhibitors have been characterized from in- and D1/D2 salivary glands using TRIzol solution (Invitrogen) ’ sects midgut; however, an inhibitory activity was identified in according to manufacturers’ instructions. Total RNA was ap- the cockroach Nauphoeta cinerea midgut [15]. plied to a 1% agarose gel containing formaldehyde and subse- In this study, we described the full-length cDNA of infestin quently transferred to a nitrocellulose membrane and hybri- and the characterization of infestin 1R, a subtilisin A and elas- dized to INF1-4 labeled with γ-dCTP for 16 h at 42 °C. After tase inhibitor from hematophagous insect midgut. hybridization, the membrane was washed and exposed to X-ray film. 2. Materials and methods 2.4. Infestin 1R cloning, expression and purification 2.1. Materials Based on the signal peptide prediction [17], Kazal pattern Proteolytic enzymes: human neutrophil elastase (EC [19] and other infestin sequences [3], infestin 1R (INF1R) 3.4.21.37), subtilisin A (EC 3.4.21.62) and bovine chymotryp- was defined from nucleotides 127–315 of the infestin cDNA, sin (EC 3.4.21.1) were provided by Calbiochem (La Jolla, CA, complete nucleotide sequence. Infestin 1R cDNA fragment USA). Bovine thrombin (EC 3.4.21.5), bovine trypsin (EC was cloned into the pET-26b vector (Novagen) using the full- 3.4.21.4) and porcine pancreatic elastase (EC 3.4.21.36) were length infestin gene as template and sense and anti-sense oli- obtained from Sigma (St Louis, MO, USA). Proteinase K (EC gonucleotides (5PAR17NcoI and PICINF1R) containing the D.V. Lovato et al. / Biochimie 88 (2006) 673–681 675

NcoI and NotI restriction enzyme sites, respectively. For with 0.1% TFA solution. The proteins were eluted with a 10– INF1R expression, Escherichia coli BL21 SI (Invitrogen) was 100% acetonitrile linear gradient in 0.1% TFA, flow rate of transformed with the pET-26b/INF1R construction. A single 1 ml/min, at room temperature for 60 min. The purified protein colony was grown in TB–kanamycin (15 μg/ml) medium with N-terminal amino acid sequence was determined by Edman shaking at 200 rpm, overnight at 37 °C. The culture was further degradation in a Sequenator model PPSQ-23 (Shimadzu, Ja- diluted ten times its volume with TB–kanamycin medium and pan). incubated as previously described, until OD600 = 1.0. Protein expression was then induced by the addition of 0.3 M NaCl 2.7. Native infestin 1R mass spectrometry and incubated as before for 16 h. Afterwards, cells were har- vested and the periplasmic fraction was obtained according to the pET System manual. Periplasmatic fraction was applied on Mass spectrometry was carried out on Micromass TofSpec- a HiTrap Q FF (5 ml) column connected to an ÄKTA System E mass spectrometer (Manchester, UK) operating in linear (Amersham Biotech) and the proteins eluted with a NaCl linear mode using MALDI-TOF. Proteins molecular masses were cal- gradient (0–0.7 M). The fractions collected containing subtili- culated from the m/z peaks in the charge-distribution profiles of sin inhibitory activity were analyzed by SDS-PAGE [20] and the multiply charged ions. by HPLC reverse phase chromatography using a Sephasil Pep- tide C18 column (Amersham Biotech). 3. Results

2.5. Recombinant infestin 1R (rINF1R) inhibitory 3.1. Full-length infestin cDNA cloning and analysis characterization

′ The inhibitory activity of rINF1R towards different serine The full-length infestin cDNA was obtained by 5 RACE proteinases was determined by measuring residual hydrolytic PCR performed using the INF2DREV oligonucleotide as the activity after pre-incubation of each enzyme with rINF1R be- GSP (gene-specific antisense oligonucleotide). DNA fragments fore the addition of chromogenic substrates. Dissociation con- of 700 and 1000 bp were amplified and the 700 bp fragment stants for different proteinases [21], were determined by en- cloned into pGEM-T Easy vector. Its nucleotide sequence was zyme incubation with rINF1R at different concentrations analyzed by BLASTX [23] and translated to amino acid se- using 0.1 M Tris–HCl buffer pH 8.0, 0.15 M NaCl, 0.1% Tri- quence contained three new infestin Kazal-type domains and ton X-100. The only exceptions were proteinase K and subtili- a predicted signal peptide according to the SignalP V2.0 pro- sin A where 0.1 M Tris–HCl buffer pH 8.6 containing 0.1% gram [17]. PCR was then performed with oligonucleotides IN- Triton X-100 was used. Chromogenic substrates: S2484 for hu- FESTINSP (for predicted signal peptide) and INFESTINCT man neutrophil elastase and porcine pancreatic elastase, S2238 (for C-terminal) resulting in a 1200 bp DNA fragment, which for bovine thrombin, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa for bovine was cloned and sequenced (Fig. 1A). The complete infestin chymotrypsin and proteinase K, subtilisin A Substrate I for cDNA (GenBank accession number DQ309461) encodes three subtilisin A and N-α-tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa for bovine trypsin. new Kazal-type domains upstream of infestin 1-4 domains pre- Apparent Ki values were calculated by fitting the steady-state viously described [3] (Fig. 1B). Infestins transcription was ana- velocities to the equation for tight-binding inhibitors model, lyzed in the anterior midgut and salivary glands D1/D2 of using non-linear regression analysis [22]. T. infestans by Northern blot. A single transcript (1800 bp) was observed in total mRNA from the midgut, but no tran- 2.6. Native infestin 1R purification scripts were found in total mRNA from the salivary glands (Fig. 1C). These results confirmed the specific expression of Three hundred and seventy anterior midguts were homoge- infestin cDNA in the midgut and also demonstrated that infes- nized in 25 ml of 50 mM Tris–HCl, pH 8.0 containing 0.3 M tins are not expressed as alternatively spliced products or by NaCl at 4 °C. The extract was centrifuged at 15,700 × g for different genes, but are encoded as a precursor protein pro- 60 min at 4 °C and the supernatant was filtered through a cessed after translation. 0.22 μm membrane. The filtrate was applied to a chymotryp- The alignment of the complete amino acid sequences from sin–Sepharose affinity column (5 ml) prepared with TLCK the infestin domains (Fig. 2A) and the neighbor-joining tree treated chymotrypsin from bovine pancreas (Sigma-Aldrich) (Fig. 2B) showed lower similarity in the first domain, named according to the manufacturer’s instructions (Amersham infestin 1R (INF1R), than the other infestins. The reactive site Bioscience). The column was washed with 50 mM Tris–HCl of infestin 1R presented highly variable regions, with residues buffer, pH 8.0 containing 0.3 M NaCl, active material was Leu and Ile at positions P1 and P1′, respectively (Fig. 2A). The eluted with 0.5 M KCl, pH 2.0, and immediately neutralized putative thrombin inhibitor, infestin 2R-3R (INF2-3R), pre- with 1.0 M Tris–HCl, pH 8.0. Eluted fractions containing elas- sented high similarity to infestin 1-2, with 77% identity. The tase inhibitory activity were pooled and lyophilized. The con- neighbor-joining tree of infestin domains demonstrates high si- centrated material was applied to a reverse phase column Se- milarity between double-headed infestins 2R-3R and 1-2 phasil Peptide C8 (Amersham Bioscience) pre-equilibrated (Fig. 2B). 676 D.V. Lovato et al. / Biochimie 88 (2006) 673–681

Fig. 1. A. Infestin cDNA nucleotide sequence and its translated amino acid sequence (GenBank accession number DQ309461). The arrow indicates predicted signal peptidase cleavage site. The oligonucleotide sequence region of INFESTINSP, INF2DREV and INFESTINCT are underlined, respectively. Putative polyadenylation signals are black boxed. The Ala-Glu amino acids between infestins are underlined and italicized. B. Diagram of full length infestin cDNA representing predicted signal peptide (SP) in dashed box and respective Kazal-type domains with reactive site P1-P1′ amino acid residues in gray scale boxes. The arrows represent the primers INF2DREV, INFESTINSP and INFESTINCT used in 5′ RACE and cloning. The Ala-Glu amino acids between infestins indicate probable cleavage site for full length infestin processing. C. Northern blot of midgut (1) and salivary glands D1/D2 (2) from T. infestans in kilobases (kb). 3.2. Recombinant infestin 1R expression inhibitory activity, were pooled and applied to reverse phase and characterization chromatography on a Sephasil Peptide C18 column, resulting in a major protein peak (Fig. 3C). This fraction presented a Infestin 1R, expressed by E. coli BL21 SI, was purified 7 kDa single protein band in SDS-PAGE corresponding to from a bacterial periplasmic fraction using two chromato- rINF1R (Fig. 3B). graphic steps. Firstly, the periplasmic fraction was submitted Purified rINF1R inhibited the following serine proteinases: to ion exchange chromatography on a HiTrap Q column and subtilisin A, neutrophil elastase, chymotrypsin and proteinase the elastase neutrophil inhibitory activity was eluted at 0.3 M K. Presenting no inhibitory effect towards trypsin, thrombin or NaCl (Fig. 3A). Then, the collected fractions, containing the porcine pancreatic elastase (Table 1). D.V. Lovato et al. / Biochimie 88 (2006) 673–681 677

Fig. 2. A. Comparison of the infestins’ seven domain amino acid sequences. ClustalW program version 1.82 was used at EMBL-EBI [18]. The arrow indicates the reactive site predicted by comparison with other Kazal-type inhibitors. Identical amino acid residues in all domains are black boxed. The amino acid residues which appeared in at least four infestin domains are gray boxed. B. Neighbor-joining tree of infestins domains based on ClustalW multiple alignment.

Fig. 3. Purification of rINF1R. A. Ion-exchange chromatography on HiTrap Q. Sample: perisplasmic fraction from induced E. coli. The protein elution was performed with a NaCl linear gradient (0–0.7 M) (B). Black bar indicates inhibitory activity toward subtilisin and human neutrophil elastase. B. SDS-PAGE (15%) of rINF1R purified by HiTrap Q. 1. Kaleidoscope Prestained Standards (Bio Rad). 2. rINF1R purified on HiTrap Q under denaturing conditions. C. Reverse phase chromatography of purified rINF1R on Sephasil Peptide C18 column. Sample: rINF1R purified on HiTrap Q column. The protein elution was performed with acetonitrile linear gradient (0–90%) in 0.1% TFA (B). Black bar indicates inhibitory activity toward subtilisin and human neutrophil elastase. 678 D.V. Lovato et al. / Biochimie 88 (2006) 673–681

Table 1 ose and Sephasil Peptide C8, respectively. Reverse phase Dissociation constants (Ki) of infestin 1R for different serine proteinases chromatography showed two inhibitory peaks (Fig. 4) which Enzymes INF1R were subjected to automatic amino acid sequencing. These i K (nM) peaks presented the amino acid sequence corresponding to Human neutrophil elastase 0.5* infestin 1R. The molecular mass of active peaks was obtained Subtilisin 2.9 by MALDI-TOF showing the molecular mass of 5876 and Chymotrypsin 6.0 6032 Da (Fig. 4) indicating that these peaks corresponded to Proteinase K 94.7 Thrombin n.i. a single domain infestin 1R. The slight molecular mass differ- Porcine pancreatic elastase n.i. ence could be due to the action of carboxypeptidase or poly- Trypsin n.i. morphic gene expression. The native infestin 1R inhibits neu- *: Ki value for recombinant and native infestin 1R. No other dissociation con- trophil elastase as rINF1R with dissociation constant of stants were determinated for native infestin 1R. n.i.: not inhibited. 0.5 nM and also inhibits subtilisin and chymotrypsin but rINF1R did not interfere in the clotting time assays such as due to the low protein concentration, no other Ki values were activated partial thromboplastin (APTT) and prothrombin determined for native infestin 1R. time (PT) assays (data not shown). This infestin domain is unique as it does not present anticoagulant activity, even 3.4. Infestin 1R reactive site amino acid sequence analysis though it is expressed by the same gene as the other anticoagulant infestins. Infestin 1R is present as a single Kazal-type domain in T. infestans midgut with high inhibitory activity to subtilisin 3.3. Native infestin 1R purification and characterization and elastase, in contrast to the other infestins. Our findings generated a query. Why is rINF1R a very efficient inhibitor We also found inhibitory activity toward human neutrophil for subtilisin A and neutrophil elastase whilst expressed by elastase in T. infestans midgut extract. This activity was pur- the same precursor gene as proteinase inhibitors with antic- ified in two chromatography steps on chymotrypsin–Sephar- oagulant activities? An alignment of several subtilisin inhibi-

Fig. 4. Purification of native infestin 1R. A. Reverse-phase chromatography of native infestin 1R on Sephasil Peptide C8 column. The inhibitor from affinity chromatography was applied on a C8 column and the proteins eluted by an acetonitrile linear gradient (0–90%) in 0.1% TFA (B). The arrow indicates infestin 1R partial N-terminal amino acid sequence. Black bar indicates the inhibitory activity toward human neutrophil elastase. 1 and 2: Infestin 1R samples analyzed by mass spectrometry MALDI-TOF. The purified infestin 1R molecular masses were determined on a Micromass TofSpec-E mass spectrometer operating in linear mode using MALDI-TOF. D.V. Lovato et al. / Biochimie 88 (2006) 673–681 679

teins from insect midgut, originated not by alternative splicing but by a post-translational mechanism. Amino acid alignments and neighbor-joining tree analysis demonstrate a high similarity between infestin 1-2 and 2R-3R. Based on these results, infestin 2R-3R is predicted as a thrombin inhibitor. The expression of these two double-headed Ka- zal-type domains in the same cDNA fragment reinforced the importance of thrombin inhibition in this blood feeding insects’ midgut. These domains might be the result of an in tandem duplication of a common ancestor with subsequent mutations, as can be observed in ovomucoid proteinase inhibitors [24]. The major difference between infestin 1R and other infestin domains is the lack of anti-hemostatic activity, as confirmed by prothrombin time (PT) and activated partial throm- Fig. 5. Comparison of the amino acid composition of reactive sites (P5–P5′)of boplastin time (APTT) experiments. The INF1R different different subtilisin inhibitors from animal (A), vegetal (B) and bacterial (C) inhibitory activity can be partially explained by the presence sources. INF1R: infestin 1R; CRAY1 and CRAY2: crayfish P. leniusculus Kazal-type inhibitor domains one and two (X79512); EGLINC: Hirudo of the hydrophobic amino acid residue, Leu, at the P1 position medicinalis eglin C (P01051); OMTKY3: turkey ovomucoid third domain in contrast to the basic amino acid residues in the same posi- (P01004); NcPI-S: Neospora caninum proteinase inhibitor (AY099026); MPI: tion of infestin domains 1, 2R, 3 and 4, respectively (Fig. 2A). maize proteinase inhibitor (X69972); CI-1B: barley Hordeum vulgare This corroborates basic amino acid residues as essential for chymotrypsin inhibitor 1B (P16063); CI-2A: barley Hordeum vulgare substrate recognition of trypsin-like proteinases, including chymotrypsin inhibitor 2A (P01053); TI-1: tomato type 1 inhibitor (P05118); PI-1: potato type 1 inhibitor (P08454); SSI: S. albogriseolus subtilisin inhibitor blood-clotting enzymes [25,26]. The INF1R inhibitory selec- (P01006); SIL-15: S. bikiniensis subtilisin inhibitor (Q9R645); SIL-4: tivity for subtilisin A, neutrophil elastase and chymotrypsin is S. lavendulae subtilisin inhibitor (P29609); SLPI: S. lividans proteinase the first to be characterized from a hematophagous insect mid- inhibitor (AAB23598). gut. We therefore ask whether INF1R is important for meal tor reactive site regions was performed (Fig. 5). Amino acid acquisition and storage. Our intriguing data suggest that alignment showed the Leu residue as the preferential amino INF1R, encoded by the anticoagulant infestin cDNA, could acid residue at position P1 in subtilisin inhibitors, but Met and be an adaptation used to control hazardous enzymes from mi- Asp amino acid residues also appear in this position. Hydro- croorganisms acquired in the blood meal. Elpidina et al. [15] phobic amino acid residues in position P1 have an important identified two subtilisin inhibitors from cockroach Nauphoeta structural feature for the inhibitor and subtilisin like enzyme cinerea midgut and suggested a role in endogenous proteinase interactions. Subtilisin inhibitors have been described in bac- control. This suggestion cannot be considered for INF1R be- teria, plants and animal tissues (Fig. 5), but INF1R is the first cause serine proteinase activity was not found in the Hemi- subtilisin inhibitor isolated from the midgut of a hematopha- ptera intestinal tract. Only aspartic proteinase and cysteine gous insect. proteinase activities were described [27]. In an attempt to un- derstand INF1R selectivity, its reactive site was aligned to other subtilisin inhibitors showing that the Leu residue is re- 4. Discussion placed by a Met residue in many of the inhibitors (Fig. 5). Horn et al. [28] showed that the residues Leu, Ala, Pro and Thr at positions, P1, P4, P5 and P2 of ovomucoid turkey third In this work, we described the full-length infestin cDNA domain (OMTKY3) contained the main, buried surface area cloning and sequencing and also the expression, purification in complexes with the subtilisin Carlsberg. Comparison of and characterization of infestin 1R. Our results demonstrated INF1R and OMTKY3 reactive sites demonstrated that only that infestin is the longest Kazal-type proteinase inhibitor pre- the Leu residue at position P1 was identical and the Val resi- cursor yet described in triatomines. The infestins precursor due at position P4 was substituted with an Ala residue. The seems to be similar to rhodniin and dipetalogastin precursors presence of these residues in INF1R may allow a strong inter- but has more Kazal-type domains. action with subtilisin (Ki = 2.9 nM). However, subtilisin inhi- An interesting finding was the presence of an Ala-Glu ami- bition with NcPI-S was stronger than that of INF1R (Ki no acid sequence between some infestin domains (Fig. 1B). 0.28 nM). Like OMTKY3, NcPI-S contains Glu and Tyr at This sequence is predicted to be the signal peptide cleavage positions P1′ and P2′, suggesting the importance of these re- site suggesting possible cleavage signal sequences in the sidues at these positions. Instead of a Leu residue at the P1 loops, possibly responsible for releasing infestin domains position, NcPI-S had a Met residue, which was the second from the precursor. This hypothesis could explain the fact that most common amino acid present at this position in subtilisin infestin 1-2 [3], 3-4 [4] and 1R were obtained as native pro- inhibitors. This Met residue allows NcPI-S to inhibit subtilisin 680 D.V. Lovato et al. / Biochimie 88 (2006) 673–681 and trypsin, with higher dissociation constant for the latter [4] I.T. Campos, A.M. Tanaka-Azevedo, A.S. Tanaka, Identification and enzyme [14]. characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae), FEBS Lett. 577 INF1R could also have a regulatory role with enzymes (2004) 512–516. such as neutrophil elastase which is released in injury and is [5] E. Fink, H. Rehm, C. Gippner, W. Bode, M. Eulitz, W. Machleidt, H. described as an important neutrophil priming factor in verte- Fritz, The primary structure of bdellin B-3 from the leech Hirudo med- brate animals [29]. In blood feeding insects, elastase could be icinalis. Bdellin B-3 is a compact proteinase inhibitor of a "non-classi- released from neutrophils during meal acquisition. Thus, in- cal" Kazal type. It is present in the leech in a high molecular mass form, Biol. Chem. Hoppe Seyler 367 (1986) 1235–1242. hibition by INF1R may protect the insect midgut from uncon- [6] P. Muhlhahn, M. Czisch, R. Morenweiser, B. Habermann, R.A. Engh, trolled proteolysis. Elastase also increases the superoxide re- C.P. Sommerhoff, E.A. Auerswald, T.A. Holak, Structure of leech de- sponse [30], which is harmful to the insect midgut. rived tryptase inhibitor (LDTI-C) in solution, FEBS Lett. 355 (1994) Hematophagous insects, such as Rhodnius prolixus, detoxify 290–296. haem from a blood meal because it generates reactive oxygen [7] W. Bode, R. Huber, Natural protein proteinase inhibitors and their in- – species that damage biological molecules, especially cell teraction with proteinases, Eur. J. Biochem. 204 (1992) 433 451. [8] B. Schlott, J. Wohnert, C. Icke, M. Hartmann, R. Ramachandran, K. membrane phospholipids [31]. A neutrophil elastase inhibitor, H. Guhrs, E. Glusa, J. Flemming, M. Gorlach, F. Grosse, O. Ohlens- called sivelestat, attenuated in vivo neutrophil priming [32] chlager, Interaction of Kazal-type inhibitor domains with serine protei- suggesting a possible role in the control of neutrophil inges- nases: biochemical and structural studies, J. Mol. Biol. 318 (2002) 533– tion. Further characterization of INF1R could reveal a specific 546. role for this broad range, proteinase inhibitor in the [9] C.P. Sommerhoff, C. Sollner, R. Mentele, G.P. Piechottka, E. A. Auerswald, H. Fritz, A Kazal-type inhibitor of human mast cell tryp- T. infestans midgut. tase: isolation from the medical leech Hirudo medicinalis, characteriza- Infestins seem to be efficiently selected for inhibition of tion, and sequence analysis, Biol. Chem. Hoppe Seyler 375 (1994) blood coagulation proteinases, the only exception being 685–694. INF1R whose role is still unclear. Based on the reactive site [10] M.W. Johansson, P. Keyser, K. Soderhall, Purification and cDNA clon- amino acid sequences and rINF1R inhibitory spectrum eva- ing of a four-domain Kazal proteinase inhibitor from crayfish blood cells, Eur. J. Biochem. 223 (1994) 389–394. luation, we propose that INF1R has more than one physiolo- [11] H.J. Magert, L. Standker, P. Kreutzmann, H.D. Zucht, M. Reinecke, C. gical target proteinase. P. Sommerhoff, H. Fritz, W.G. Forssmann, LEKTI, a novel 15-domain type of human serine proteinase inhibitor, J. Biol. Chem. 274 (1999) 21499–21502. Acknowledgments [12] N.D. Rawlings, A.J. Barrett, Families of serine peptidases, Methods En- zymol. 244 (1994) 19–61. [13] W. Ardelt, M. Laskowski Jr., Turkey ovomucoid third domain inhibits We thank Dr. Izaura Y. Hirata and Dr. Maria A. Juliano of eight different serine proteinases of varied specificity on the same.. Departamento de Biofisica, UNIFESP-EPM (Brazil) for per- Leu18-Glu19.. reactive site, Biochemistry 24 (1985) 5313–5320. forming amino acid sequencing and mass spectrometric ex- [14] S. Bruno, V.G. Duschak, B. Ledesma, M. Ferella, B. Andersson, E. periments, respectively. We thank Dr. Anita M. Tanaka-Aze- A. Guarnera, S.O. Angel, Identification and characterization of serine vedo of Laboratório de Fisiologia, Instituto Butantan (Brazil) proteinase inhibitors from Neospora caninum, Mol. Biochem. Parasitol. – for performing prothrombin time (PT) and activated partial 136 (2004) 101 107. [15] E.N. Elpidina, K.S. Vinokurov, Y.A. Rudenskaya, Y.E. Dunaevsky, D. thromboplastin time (APTT) experiments. This work was sup- P. Zhuzhikov, Proteinase inhibitors in Nauphoeta cinerea midgut, Arch. ported by grants from the Fundação de Amparo a Pesquisa do Insect Biochem. Physiol. 48 (2001) 217–222. Estado de São Paulo (FAPESP Proc. no. 02/13960-8) and [16] S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. 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