Jana Šimková

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE

HPLC analýza extraktů Orobanche gracilis Bakalářská práce Jana Šimková

VEDOUCÍ PRÁCE: PharmDr. Marie Valentová, Ph.D. BRNO 2013

Bibliografický záznam

Autor: Jana Šimková

Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita

Ústav Biochemie

Název práce: HPLC analýza extraktů Orobanche gracilis

Studijní program: Biochemie

Studijní obor: Biochemie

Vedoucí práce: PharmDr. Marie Valentová, Ph.D.

Akademický rok: 2013

Počet stran: 54

Klíčová slova: Orobanche gracilis, Orobanchaceae, fenylpropanoidy, fenylethanoidní glykosidy, akteosid (verbaskosid), krenatosid (orobanchosid)

Bibliographic Entry

Author: Jana Šimková

Faculty of Science, Masaryk University

Department of Biochemistry

Title of Thesis: HPLC analysis of extracts from Orobanche gracilis

Degree Programme: Biochemistry

Field of Study: Biochemistry

Supervisor: PharmDr. Marie Valentová, Ph.D.

Academic Year: 2013

Number of Pages: 54

Keywords: Orobanche gracilis, Orobanchaceae, phenylpropanoids, phenylethanoid glycosides, acteoside (verbascoside), crenatoside (orobanchoside)

Abstrakt

Rostliny rodu Orobanche jsou využívány v lidovém léčitelství a u mnoha z nich byly prokázány farmakologické účinky (O. rapum-genistae, O. crenata, O. hederae atd.). Z obsahových látek jsou v rámci celého rodu významné především fenylethanoidní a fenylpropanoidní deriváty s významnou antioxidační a antiflogistickou aktivitou. Rostlina Orobanche gracilis nebyla dosud z fytochemického hlediska blíže zkoumána, proto jsme se na ni v rámci této práce zaměřili. Po provedení HPLC a MS analýzy rostlinných extraktů a porovnáním s knihovnou spekter bylo potvrzeno, že tato bylina obsahuje jako majoritní látky akteosid a krenatosid. Jedná se o fenylpropanoidní glykosidy (PhGs), u kterých byla již dříve prokázána biologická aktivita.

Abstract

Plants of Orobanche genus are used in traditional medicine and in lots of them pharmacological effects were approved (O. rapum-genistae, O. crenata, O. hederae etc.). Important secondary metabolites of this genus are phenylethanoid and phenylpropanoid derivatives with significant antioxidant and anti-inflammatory activity. Orobanche gracilis has not been examinated from phytochemical viewpoint yet, therefore we decided to investigate this plant closer in this thesis. After HPLC and MS analysis of plant extracts and comparison with spectral library it was confirmed that this herb contains mixture of acteoside and crenatoside as the main constituents. These compounds belong to the group of phenylpropanoid glycosides (PhGs), in which biological activity was proved previously.

Poděkování

Na tomto místě bych chtěla poděkovat paní doktorce Marii Valentové za trpělivé vedení, cenné rady a pomoc při vypracovávání této bakalářské práce. Velké poděkování patří rovněž mé rodině a přátelům za podporu během mých studií.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svou bakalářskou práci vypracovala samostatně a s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány

Brno 9. května 2013 ......

Jana Šimková

OBSAH

1. Úvod ...... 9 2. Čeleď Orobanchaceae (Zárazovité)...... 10 2.1. Zástupci ...... 11 2.2. Euphrasia rostkoviana (Světlík lékařský) ...... 11 2.3. Rod Orobanche ...... 13 2.3.1. Orobanche gracilis (Záraza štíhlá) ...... 13 2.3.2. Využití zárazy v lidovém léčitelství ...... 14 3. Obsahové látky ...... 15 3.1. Seskviterpeny ...... 15 3.2. Iridoidy ...... 15 3.3. Flavonoidy ...... 16 3.4. Charakteristika fenylpropanoidů ...... 16 3.5. Fenylethanoidní glykosidy ...... 17 3.5.1. Akteosid ...... 22 3.5.2. Krenatosid (Orobanchosid) ...... 22 3.6. Biosyntéza fenylethanoidů ...... 23 4. Biologická aktivita ...... 24 4.1. Biologická aktivita látek izolovaných z rostlin rodu Orobanche ...... 24 4.2. Účinky akteosidu ...... 25 4.3. Kombinovaný účinek akteosidu a krenatosidu ...... 26 5. Cíl práce ...... 27 6. Materiál a instrumentace ...... 28 6.1. Rostlinný materiál ...... 28 6.2. Instrumentace ...... 28 6.3. Chemikálie ...... 28 7. Metody ...... 29 7.1. Příprava rostlinného materiálu ...... 29 7.2. Extrakce ...... 29 7.3. Centrifugace ...... 30 7.4. HPLC analýza extraktů ...... 30 7.5. Hmotnostní spektrometrie (MS) ...... 32 8. Výsledky a diskuze ...... 33

8.1. Porovnání extraktů z různých rostlinných částí ...... 34 8.2. Porovnání extrakčních metod u nadzemních částí ...... 42 8.3. Vyhodnocení MS analýzy ...... 48 9. Závěr ...... 49 10. Summary ...... 50 11. Seznam použité literatury ...... 51

1. ÚVOD

Léčivé rostliny provázejí lidstvo již od počátků jeho historie. Na jejich léčebné účinky spoléhali pravěcí šamani, lidoví léčitelé i významní starověcí lékaři a zakladatelé evropské medicíny jako Hippokratés, Galénos či římský vojenský lékař Dioskúridés, autor významného díla o léčivech De materia medica. S příchodem novověku došlo k velkému rozvoji získávání léčivých látek z rostlin (morfin z opia, chinin z kůry chinovníku či amygdalin z mandlí) a následně se z nich izolované látky staly inspirací pro syntézu léčiv chemických. Po etapě chemických léčiv se dnes moderní medicína a farmacie opět začínají orientovat jak na ověřování léčivých účinků rostlin již po staletí užívaných v lidové medicíně, tak na výzkum rostlin dosud opomíjených. Zárazu štíhlou (Orobanche gracilis) lze zařadit do skupiny druhé, u které je potenciální účinek teprve zkoumán.

Jak praví stará lidová moudrost: „Není na světě bylina, která by na něco nebyla.“ Proto jsem se v této práci zaměřila na výzkum této z farmakognostického hlediska jistě velmi zajímavé rostliny.

2. ČELEĎ OROBANCHACEAE (ZÁRAZOVITÉ)

Říše: Plantae (rostliny) Podříše: Tracheobionta (cévnaté rostliny) Oddělení: Magnoliophyta (krytosemenné) Třída: Rosopsida (vyšší dvouděložné) Řád: Lamiales (hluchavkotvaré)

Zárazovité jsou vyšší dvouděložné rostliny, které patří do řádu Lamiales (hluchavkotvaré). Rozšíření je kosmopolitní, nejvíce druhů se vyskytuje v mírném a subtropickém pásu severní polokoule [1].

Obr. č. 1: Mapa výskytu zástupců z čeledi Orobanchaceae [1]

Jsou to hemiparazitické (poloparazitické) až holoparazitické (pravé parazitické) byliny, které jsou opatřené specializovanými orgány, tzv. haustorii, jejichž pomocí se přisávají ke kořenům hostitelské rostliny. Zelené hemiparazitické druhy obsahují chlorofyl, haustoria proto zasahují jen do dřevní části cévního svazku hostitele. Holoparazitické druhy vykazují absenci chlorofylu, jsou tedy nezelené a získávání živin je u nich zcela závislé na příjmu od hostitele, proto haustoria musí vést až do lýkové části cévního svazku. Haustorium může být jedno velké (holoparazité) nebo se vyskytuje více menších (hemiparazité). Hostitelé často bývají pro jednotlivé druhy specifičtí. Typická je přítomnost trichomů, nejčastěji jednoduchých. Listy jsou střídavé či protistojné, jednoduché, ale často zpeřeně laločnaté až dělené. U parazitických druhů bývají zredukovány na šupiny. Palisty se nevyskytují. Květenství je nejčastěji hroznovité, občas je zredukováno pouze na jeden květ. Květy jsou oboupohlavné a souměrné, rozdělené na kalich a korunu, které jsou shodně srostlé z pěti lístků. Koruna je dvoupyská, semeník je svrchní, srostlý ze dvou plodolistů. Tyčinky jsou 4, někdy je přítomné páté straminódium. Plodem je tobolka s velkým množstvím hranatých semen [2].

2.1. ZÁSTUPCI

Doposud bylo v čeledi Orobanchaceae popsáno 2060 zástupců z 99 různých rodů [1]. Dříve byli zelení hemiparazité řazeni do čeledi Scrophulariaceae (krtičníkovité). Patří mezi ně například rod Melampyrum, černýš, který se na našem území vyskytuje poměrně hojně a je nápadný svými modrofialovými listeny a jasně žlutými korunními lístky. Další rod Rhinanthus, kokrhel, parazituje na travách a Rhinanthus minor, kokrhelík menší, je charakteristický svými žlutými květy a nafouknutým kalichem. Nejznámější je Euphrasia rostkoviana, světlík lékařský, který parazituje převážně na kořenech trav a ostřic [2].

Mezi zárazovité byly vždy řazeny obligátně parazitické druhy. Například rod Orobanche, záraza, nebo Lathraea, podbílek. Vůbec nejrozšířenějším rodem celé čeledi je rod Pedicularis, všivec, u něhož je předpokládáno 600 až 800 zástupců [2].

2.2. EUPHRASIA ROSTKOVIANA (SVĚTLÍK LÉKAŘSKÝ)

Světlík lékařský je jednoletá hemiparazitická bylina, vysoká 5 až 30 cm. Jde o poměrně běžný plevel luk a pastvin. Lodyha je přímá a bohatě větvená. Listy jsou přisedlé a pokryté žlaznatými trichomy. Květy jsou bílé s fialovými proužky a žlutou skvrnou na spodním členěném pysku. Jsou uspořádané v klasech s listeny. Doba květu je od května do října [3].

Obr. č. 2: Světlík lékařský (Euphrasia rostkoviana) [4]

Bylina roste takřka v celé Evropě od severního Středomoří až po Ural [3]. Uvádí se až 180 druhů, jejich počet je ovšem ovlivněn různým přístupem k taxonomii [5]. Na našem území se vyskytuje od nížin až po horské oblasti [3, 6].

Předmětem sběru je kvetoucí nať. V lidovém léčitelství se droga využívá jako metabolikum, ke snížení krevního tlaku, častěji pak jako antiflogistikum a adstringens [5].

Další tradované využití je například při zánětu horních cest dýchacích, alergiích, alergické rýmě, kašli, bolestech v uších, epilepsii, bolesti hlavy, zánětech či žloutence [6]. Nejznámější je ovšem užití světlíku při očních nemocech: při bolestech z přetížení očí (uplatněno i ve veterinární medicíně), zánětu spojivek i očních víček, ječném zrnu, slzení, zeleném zákalu atd. Pro tyto účely se užívá vnitřně i zevně jako odvar k omývání nebo obklad ze spařené drogy [7].

Užití světlíku jako oftalmologika je nejznámější indikací, ovšem vyvstává problém při zajištění sterility přípravku, která je pro oční užití vysoce důležitá. U světlíku nebyly pozorovány žádné nežádoucí účinky, interakce ani kontraindikace. Jde tedy o neškodnou bylinu, kterou lze užívat dlouhodobě a preventivně [6].

Nejznámější účinnou látkou je iridoidní glykosid aukubin [5, 6]. Mezi další iridoidní monoterpeny patří veronikosid, katalpol, eufrosid a eurostosid. Dalšími obsahovými látkami jsou lignany (dehydrokoniferyl-glukosid), flavonoidy (apigenin- galaktosid, luteolin-galaktosid), třísloviny, deriváty kyseliny kávové (eukovosid) [5], hořčiny, kumariny, silice, polyfenoly a minerální látky s obsahem mědi a hořčíku [6].

CH3

H3C CH3

O CH3 HO O

HO Obr. č. 3: Vzorec aukubinu

Experimentálně byl prokázán ochranný účinek aukubinu na jaterní buňky proti působení různých chemikálií, včetně amanitinu – nebezpečného jedu muchomůrky zelené. Dále aukubin vykazuje inhibiční efekt proti viru hepatitidy B. U flavonoidní frakce byl prokázán antimykotický efekt (inhibice vulvovaginální kandidózy) a také byl u extraktu ověřen účinek hypoglykemický [6].

2.3. ROD OROBANCHE

Rod Orobanche, záraza, patří mezi pravé nezelené parazity. Vyskytují se v mírném až subtropickém pásu severní polokoule, hlavně v Evropě [2, 8]. Zatím bylo popsáno 150 druhů [14], na našem území se uvádí 13 [6], přičemž každý druh má většinou specifického hostitele. Dělí se na monofágní druhy, které mají jen jednoho hostitele (například Orobanche flava, záraza devětsilová, parazituje na rodu Petasites, devětsil [2]) a dále na oligofágní druhy, které mohou parazitovat na více hostitelích [2, 8]. Pro přežití těchto velmi specializovaných rostlin je nutná vysoká produkce velmi malých semen. Jedna rostlina je schopná vytvořit desítky až stovky tisíc velice lehkých semen [2, 8]. Klíčení semen je indukováno látkami, které se tvoří v kořeni hostitele a působí do vzdálenosti několika milimetrů. Nejprve ze semene vyrůstá tenký, nitkovitý prokaulom, ten se napojí na kořen hostitele a vytvoří malý hlízovitý útvar, který se brzy změní v primární haustorium a z něj vyrůstají stonky [8].

Dříve patřily zárazy mezi místní a nepříjemné plevely, ale v dnešní době s novými způsoby obhospodařování polí se staly velmi nezvyklými a naopak ohroženými.

Nejznámější jsou Orobanche alba (záraza bílá), Orobanche flava (záraza devětsilová), Orobanche minor (záraza menší), Orobanche elatior (záraza vyšší) či Orobanche purpurea (záraza nachová) [2].

2.3.1. OROBANCHE GRACILIS (ZÁRAZA ŠTÍHLÁ)

Záraza štíhlá je vytrvalá bylina vysoká 15 až 40 cm, načervenalá nebo zbarvená do purpurova. Listy jsou střídavé, šupinovité. Květní klas je vejčitý a hustý, později válcovitý a podlouhlý. Korunní lístky jsou dvoupyské, na bázi žluté, v horní části přecházejí v sytě červenou až purpurovou. Typické jsou nápadné trichomy [9].

Druh je rozšířený především v severní Africe a jižní Evropě. Nalezneme jej i ve střední Evropě, ale v České republice je nepůvodní. Přechodně zavlečený je v jižních Čechách. Roste v nížinách či na nízkých pahorkatinách na slunných a suchých místech. Rostlina je vázána na hostitele z čeledi Fabaceae, bobovité [9].

Obr. č. 4: Záraza štíhlá (Orobanche gracilis) [10]

2.3.2. VYUŽITÍ ZÁRAZY V LIDOVÉM LÉČITELSTVÍ

Dnes jsou rostliny rodu Orobanchaceae prakticky zapomenuté a pro léčebné účely nevyužívané, ovšem existují záznamy o používání v tradiční medicíně. Orobanche major (záraza velká) se například užívala ve středověké Evropě v lidovém léčitelství k odstraňování močových a ledvinových kamenů, a to v podobě odvaru ve víně. Údajně se jednalo o velmi hořké adstringens. K vnějšímu použití sloužila šťáva z drogy k léčbě vředů a boláků. Odvar z květních klasů se pro změnu využíval k čištění pleti a proti černým a modrým pigmentovým skvrnám či pihám [11]. Na našem území se podle záznamu z Českého herbáře z roku 1899 používal kořen zárazy proti kolice, nadýmání a na rány. Květy se naopak užívaly na nemoci nervového charakteru a proti křečovým stavům u dětí [12].

3. OBSAHOVÉ LÁTKY

Až do roku 1982 byly za jediné sekundární metabolity obsažené v rostlinách z čeledi Orobanchaceae považovány seskviterpeny, iridoidní glykosidy a byl zaznamenán i obsah flavonoidů [13, 14]. Pozdější fytochemické studie poukázaly také na přítomnost esterů kyseliny kávové, nazývaných fenylpropanoidní glykosidy [14]. Dalšími potvrzenými obsahovými látkami jsou polyfenoly, fenolické kyseliny a fytosteroly [6].

Jelikož je Orobanche parazitická rostlina, dokáže kromě produkce vlastních metabolitů ukládat ve svém těle i látky přijaté od hostitelské rostliny. Tento fenomén je velice dobře známý ve vztahu hmyz – rostlina, ale typ této interakce mezi dvěma rostlinami je prozkoumán méně [14]. Pro rod Orobanche byla například prokázána přítomnost mastných kyselin (olejová, linolová) a tokochromanolů (tokoferoly) v semenech některých druhů [15]. U Orobanche rapum-genistae bylo pozorováno čerpání chinolizidinových alkaloidů z Cytisus scoparius, u Orobanche ramosa čerpání kanabinoidů z Cannabis sativa a u Orobanche hederae ukládání mastných kyselin a polyacetylenů z hostitele, kterým je Hedera helix [14].

3.1. SESKVITERPENY

Seskviterpeny řadíme mezi terpenoidy, které představují největší skupinu sekundárních metabolitů v přírodě [16, 17]. Biosynteticky se tvoří z kyseliny octové přes kyselinu mevalonovou a isopentenyldifosfát (ekvivalent isoprenu). Samotné

seskviterpeny (C15) vznikají štěpením a cyklizací farnesyldifosfátu. Mohou být acyklické, monocyklické i vícecyklické. Mezi aromatické seskviterpeny řadíme tmavomodré olejovité azuleny, které se v podobě redukovaných proazulenů vyskytují v mnoha léčivých rostlinách (např. v heřmánku). Projevují hojivé a antiseptické účinky [17].

3.2. IRIDOIDY

Iridoidy představují nejméně 500 přírodních sloučenin, přičemž 300 z nich tvoří iridoidní glykosidy. Sloučeniny jsou tvořeny pětičlenným cyklem napojeným na šestičlenný heterocyklus obsahující acetálovou vazbu. Iridoidní monoterpeny nalezneme ve všech rostlinných částech, většinou v podobě ve vodě rozpustných glykosidů [16]. V rostlině vznikají z geranyldifosfátu přes enolformu iridodialu [17].

H H

OH O CHO O H C H OH 3 H3C OR Iridodial Iridoid

Obr. č. 5: Přeměna iridodialu na iridoidy

3.3. FLAVONOIDY

Flavonoidy jsou v přírodě velmi rozšířená rostlinná barviva (žlutá až oranžová barva květů, plodů a listů), která se ukládají ve vakuolách. Mají většinou charakter glykosidů, odvozují se od benzopyranu (chromanu), na který se v poloze C-2 (vzácněji C-3) váže fenyl [17]. Hydroxyderiváty jsou více hydrofilní a rozpustné v buněčné šťávě, zatímco methoxyderiváty jsou lipofilnější a nalezneme je v silicích [16]. Flavonoidy se dělí dle oxidačního stupně centrálního kruhu. Nejčastější jsou anthokyany (vzniklé redukcí flavonoidů), flavonoly (kvercetin z révy a rutin z pohanky či routy) a flavony (apiin z petržele či heřmánku) [17]. Nejznámější vlastností flavonoidů jsou jejich venoprotektivní, protizánětlivé a antioxidační schopnosti [18].

3.4. CHARAKTERISTIKA FENYLPROPANOIDŮ

Fenylpropanoidy jsou velkou a důležitou skupinou přírodních produktů. Jsou to aromatické sloučeniny, deriváty kyseliny šikimové (vedle kumarinů, flavonoidů a tříslovin) [16, 19]. Struktura většiny těchto sloučenin je založena na kyselině skořicové nebo p-kumarové [16].

Tabulka I: Kyseliny, ze kterých se odvozují struktury fenylpropanoidů

Kyselina Název Kyselina skořicová Kyselina p-kumarová šikimová COOH O COOH Vzorec OH HO OH HO OH

Společným znakem fenylpropanoidů je přítomnost jednoho či více C6-C3 fragmentů, kdy C6 poukazuje na přítomnost benzenového jádra (fenyl-) a C3 zase na tříuhlíkatý řetězec (propan) [16, 19]. Pro svou značnou různorodost se ovšem dělí do několika skupin v závislosti na svém složení. [19]

1. Jednoduché fenylpropanoidy a) Skořicové alkoholy (cinnamoylalkoholy) a jejich deriváty (ethery, glykosidy) b) Skořicová kyselina a její deriváty (estery, glykosidy) c) Amidy kyseliny skořicové d) Aldehydy kyseliny skořicové e) Fenylpropany

2. Složené fenylpropanoidy a) Fenylpropanoidní glykosidy založené na fenylethanech b) Oxidačně spojené produkty (lipoidy): flavolignany, xantholignany, kumarinolignany, alkaloidolignany, neolignany, lignany

3. Biogeneticky příbuzné fenylpropanoidy a) Flavonoidy b) Kumariny

Fenylpropanoidní sloučeniny nalezneme ve velkém množství rostlinných čeledí. Jejich hojný výskyt byl prokázán například pro čeledi Asteraceae (Hvězdnicovité), Crassulaceae (Tlusticovité) [19, 20], Araliaceae (Aralkovité) [19], Scrophulariaceae (Krtičníkovité), Salicaceae (Vrbovité), Plantaginaceae (Jitrocelovité) [18, 19, 20], Thymelaeaceae (Vrabečnicovité) [18], Lamiaceae (Hluchavkovité), Oleaceae (Olivovníkovité) či Orobanchaceae (Zárazovité) [19, 20, 21].

3.5. FENYLETHANOIDNÍ GLYKOSIDY

Fenylethanoidní glykosidy (PhGs) lze rovněž pojmenovat fenylpropanoidní glykosidy založené na fenylethanech [19]. Jsou to ve vodě rozpustné přírodní sloučeniny, které jsou stejně jako celá nadřazená skupina fenylpropanoidů vysoce rozšířené, a byly izolovány z mnoha léčivých rostlin [20, 21]. První zmínka o těchto sloučeninách pochází až z roku 1950, kdy byl z Echinacea augustifolia (Asteraceae) izolován echinakosid [20].

Strukturně jde o sloučeniny, které jsou tvořeny zbytkem kyseliny skořicové, která je esterovou vazbou připojena k β-glukopyranose. Glykosidickou vazbou je ke glukose navázán hydroxyfenyl(ethyl) a rovněž může docházet k vazbě dalších cukrů, jako jsou rhamnosa, xylosa, apiosa atd. [20, 21].

Tabulka II.: Monosacharidy zastoupené ve fenylethanoidech

Název Vzorec OH Glukosa HO O HO OH OH HO O Xylosa HO OH OH H3C O OH Rhamnosa HO

HO OH O Apiosa OH OH

OH OH

Fenylethanoidní glykosidy jsou klasifikovány podle počtu a typu cukrů obsažených v jejich molekule. Fenylethanoidní monosacharidy obsahují ve své molekule vždy glukopyranosu a mezi nejčastější na cukr vázané aromatické skupiny patří kyselina kávová a kyselina gallová, přičemž tyto aglykony mohou být i modifikovány [20]. Řadí se sem například kalceolariosid A a B z Calceolaria hypericina (Calceolariaceae), které vykazují antimikrobiální aktivitu, nebo antioxidačně účinné plantaginosidy A-F z Plantago asiatica (Plantaginaceae) [21].

Tabulka III: Kyseliny zastoupené ve fenylethanoidech

Název Kyselina skořicová Kyselina kávová Kyselina gallová O OH O O HO Vzorec OH OH

HO OH HO OH

Disacharidy se dále dělí dle povahy cukru připojeného na glukose. Častá je vazba α-L-rhamnosy přes C-3´uhlík glukosy [20]. U jiných podobných sloučenin může docházet ke spojení hydroxyfenylmethylové části v 1,4-dioxanový kruh, např. krenatosid z Orobanche crenata (Orobanchaceae) [20, 22, 23].

OH Esterová vazba HO OH O OH OH

O O Zbytek kyseliny kávové O OH Glykosidická vazba H3C O HO

HO OH Cukerné složky

Obrázek č. 6: Příklad struktury typického fenylethanoidu (akteosid) s vyznačenými základními složkami molekuly

Nejběžnější skupinou fenylethanoidních glykosidů jsou trisacharidy, které obsahují rhamnosu jako druhou cukernou jednotku, přičemž ta může být vázána buď k C-3´nebo C-6´uhlíku glukosy [20]. Vazba přes C-6´ je typická například pro mussatiosid I, II a III izolované z rodu Mussatia (Bignoniaceae) [20, 21]. Třetí jednotkou bývá glukosa, xylosa, arabinosa, apiosa, lyxosa či rhamnosa. Nejčastějšími aromatickými aglykony, které se napojují hlavně na uhlík C-4´, jsou kyselina kávová, ferulová a skořicová. Byl však zaznamenán i výskyt kyseliny gallové a vanilinové [20].

Některé PhGs obsahují jako základní cukernou jednotku místo glukosy rhamnosu. Dále mezi fenylethanoidní glykosidy patří sloučeniny, které obsahují cyklický hemiketál typický pro iridoidy [20, 21]. Řadíme sem například oleurosid, který byl izolován z Olea europaea nebo oleoechinakosid ze Syringa reticulata (Oleaceae) [21].

Tabulka IV: Klasifikace fenylethoidních glykosidů

Skupina PhGs Příklady Monosacharidy Jednoduché Salidrosid Plantainosid A,B Kalceolariosid A, B S 1-hydroxy-4oxo-2,5- Eutigosid B, C cyklohexadienovou skupinou S cyklohexylethylovou skupinou Rengyosid A, B, C S hydroxyfenyethylovou Ibotanolid B, C skupinou (vázanou přes 4-OH skupinu) Disacharidy S α-L-rhamnosou vázanou přes Akteosid, C-3´ 2´-O-acetylakteosid Bez α-Lrhamnosy vázané přes Forsythosid A, D, E C-3´ S fenylethylem tvořícím 1,4- Krenatosid dioxanový kruh Dekafeoylkrenatosid Trisacharidy S α-L-rhamnosou vázanou přes Arenariosid C-3´ Brandiosid Feliposid S α-L-rhamnosou vázanou přes Mussatiosid I, II, III C-6´ PhGs s odlišnou základní jednotkou než je glukosa Magnolosid A, B, C

PhGs podobné s iridoidy (obsahující cyklický Oleoakteosid hemiketál) Oleoechinakosid

V názvosloví jednotlivých látek dochází k mnoha neshodám a nedorozuměním vlivem odlišného pojmenování stejné sloučeniny různými autory. Například v roce 1963 byl z Verbascum sinuatum (Scrophulariaceae) izolován verbaskosid, ale nebyla určena jeho struktura. V roce 1966 byla z rostliny Syringa vulgaris (Oleaceae) izolována sloučenina akteosid, u které bylo stanoveno, že se jedná o β-(3´,4´- dihydroxyfenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-(4-O-kafeoyl)-glukopyranosid. Až v roce 1982 bylo zjištěno, že jsou obě sloučeniny totožné. Další označení této sloučeniny jsou kusaginin a orobanchin. Dnes je všeobecně upřednostňován název akteosid [20].

Další desinterpretace a problémy s názvoslovím nalezneme u sloučenin orobanchosid a oraposid. Chemický název orobanchosidu je β–hydroxy-β-(3´,4´- dihydroxyfenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-(4-O-kafeoyl)- glukopyranosid. Molekula oraposidu má shodnou molekulovou hmotnost s orobanchosidem (622,57), liší se přítomností 1,4-dioxanového kruhu. Ten vzniká napojením hydroxyfenylethylové části přes éterovou vazbu na glukosu. Navíc bylo potvrzeno, že krenatosid, který byl později izolovaný z Orobanche crenata,

20 má stejnou strukturu jako oraposid. Srovnáním 13C NMR spekter všech tří sloučenin bylo zjištěno, že se jedná o jednu a tu samou strukturu s chemickým názvem 1´,2´- [β-(3,4-dihydroxyphenyl)-α,β-dioxoethanol]-4´-O-kafeoyl-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1→3)-O- β-D-glukopyranosid [22, 23].

OH HO

OH O HO OH OH OH O O O OH O O O O HO O OH O H3C O O HO

HO H3C O OH HO HO OH Orobanchosid HO OH (původní Oraposid/orobanchosid/ struktura) krenatosid Obr. č. 7: Srovnání původně předpokládané struktury orobanchosidu a oraposidu (krenatosidu)

Tabulka V: Zastoupení fenylpropanoidních (fenylethanoidních) glykosidů v různých rostlinách rodu Orobanche

Druh Sloučenina Orobanche arenaria Arenariosid Feliposid Orobanche rapud-genistae Akteosid Krenatosid / Orobanchosid Orobanche crenata Akteosid Krenatosid / Orobanchosid Dekafeoylkrenatosid Orobanche hederae Akteosid Krenatosid / Orobanchosid Orobanche ramosa Brandiosid 2´-O-acetylakteosid Akteosid

Z uvedené tabulky vyplývá, že nejběžnější fenylpropanoidní glykosid akteosid (zjištěný ve více než 75 druzích) [13] je typický i pro rod Orobanche. Až na Orobanche arenaria byl izolován ze všech uvedených druhů. Krenatosid (orobanchosid) byl izolován z O. rapum-genistae, O. crenata a O. hederae. Ostatní sloučeniny jsou svým výskytem specifické jen pro dané druhy, např. dekafeoylkrenatosid pro O. crenata, či areneriosid pro O. arenaria.

3.5.1. AKTEOSID Sloučenina je tvořena disacharidovou jednotkou složenou z glukosy a rhamnosy, jednou molekulou kyseliny kávové a 3,4-dihydroxy(fenyl)ethanolem, který je ke glukose připojen éterickou vazbou [24].

Tabulka VI: Přehled základních chemických informací o akteosidu [24, 25]

Název Akteosid (verbaskosid, orobanchin, kusaginin) Molekulová 624,587 hmotnost

Sumární vzorec C29H36O15 OH

HO OH

O OH OH

O O Strukturní vzorec O O OH

H3C O HO

HO OH β–(3´,4´-dihydroxyfenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→3) –β-D-(4- Chemický název O-kafeoyl)-glukopyranosid

3.5.2. KRENATOSID (OROBANCHOSID) Krenatosid (orobanchosid) má strukturu téměř totožnou s akteosidem. Liší se přítomností 1,4-dioxanového kruhu, na který se přímo váže 3,4-dihydroxyfenyl [22].

Tabulka VII: Přehled základních chemických informací o krenatosidu (orobanchosidu) [22, 26]

Název Krenatosid (orobanchosid, oraposid) Molekulová 622,571 hmotnost

Sumární vzorec C29H34O15 OH HO

O OH O O Strukturní vzorec O O O H3C O HO

HO OH HO OH 1´,2´-[β(3,4-dihydroxyphenyl)-α,β-dioxoethanol]-4´-O-kafeoyl-O-α- Chemický název L-rhamnopyranosyl-(1→3)-O- β-D-glukopyranosid

3.6. BIOSYNTÉZA FENYLETHANOIDŮ

Při výzkumu syntézy akteosidu v olivovníku evropském (Olea europaea) bylo zjištěno, že hydroxytyrosolová (hydroxyfenylethanolová) jednotka je biosyntetizována z aminokyseliny tyrosinu a to přes dopamin, který vznikl dekarboxylací DOPA [20, 27]. Dopamin je posléze inkorporován do akteosidu oxidací na odpovídající aldehyd, následnou redukcí na alkohol (hydroxytyrosol) a nakonec β-glykosylací. Tato cesta byla sledována u Olea europaea. Přímou dekarboxylací tyrosinu může vznikat tyramin, který je následně přes p-hydroxyfenylacetaldehyd a tyrosol (p-hydroxyfenylethanol) inkorporován do salidrosidu. Salidrosid je jednoduchý fenylethanoidní glykosid, který může být rovněž včleněn do molekuly akteosidu [27]. Tato cesta byla zaznamenána u Rhodiola sachalinensis a Syringa vulgaris [20, 27]. Kafeoylová (fenylpropanoidní) část akteosidu je naopak syntetizována z fenylalaninu přes kyselinu skořicovou [27]. Eliminace amoniaku z fenylalaninu je katalyzována enzymem fenylalanin amoniak lyasou (PAL) [16, 28].

COOH COOH X NH2 NH2 HO Fenylalanin tyrosin

NH2 HO COOH COOH

NH2 HO HO tyramin DOPA Kyselina skořicová

OH HO NH2

COOH HO HO Tyrosol Dopamin HO Kyselina p-kumarová

HO OH OGlc

HO COOH HO HO Hydroxytyrosol Salidrosid HO Kyselina kávová

HO OH

O OH H OH O O H O H O H OH H Rha akteosid

Obr. č. 8: Biosyntéza akteosidu [27]

4. BIOLOGICKÁ AKTIVITA

Mezi fenylethanoidy nalezneme velké množství látek, u kterých byla zkoumána a také potvrzena biologická aktivita. Velké množství těchto sloučenin během farmakologických testů prokázalo své antibakteriální, cytotoxické, antioxidační a imunomodulační účinky a také schopnost enzymové inhibice. Například jionosid C inhibuje 5-lipoxygenasu a může být tedy potenciálně využit jako antialergické a protizánětlivé agens [20], zatímco jionosid D má aktivitu antioxidační [29]. Z dalších zajímavých vlastnosti vykazovaly významnou protinádorovou aktivitu eutigosid B a C izolované z listů rostliny Eurya tigang (Theaceae – čajovníkovité) [20]. U E. emarginata by navíc ověřen cytotoxický účinek na buňky promyelocytární leukémie [30]. U zmiňované rostliny byla rovněž ověřována protizánětlivá aktivita eutigosidu B [31, 32] a C [31]. Přímo v čeledi Orobanchaceae byla pozorována protistresová aktivita u látek cistanosid A, B a echinakosid, izolovaných z rostliny Cistanche salsa, přičemž u poslední jmenované byla rovněž aktivita antivirová či antihepatotoxická [20].

U některých fenylethanoidů byl zkoumán i vliv struktury na biologický účinek dané sloučeny. Bylo například zjištěno, že nejúčinnějšími antioxidanty jsou ty, které ve svém skeletu obsahují ortho-dihydroxyfenylovou skupinu. Antimikrobiální a antibakteriální aktivita některých sloučenin je zase spojována s přítomností fenolické skupiny. Vychází se z předpokladu, že vlastní úlohou těchto PhGs pro rostlinu je ochrana před houbovými a virovými nákazami. U sloučenin izolovaných z hojivého pletiva a napadených kořenů Rehmannia glutinosa var. purpurea (Scrophulariace) se předpokládá, že jsou vylučovány v závislosti na stresu, kterému je rostlina vystavena [20]. Tyto látky napomáhají i obranným mechanismům člověka a zvyšují odolnost proti stresorům z vnějšího prostředí [33].

4.1. BIOLOGICKÁ AKTIVITA LÁTEK IZOLOVANÝCH Z ROSTLIN RODU OROBANCHE

Nejvýraznější vlastností fenylethanoidních glykosidů izolovaných z rodu Orobanche je jejich antioxidační aktivita [19, 32]. Při výzkumu obsahových látek izolovaných z O. caerulescens byl tento účinek pozorován u akteosidu, isoakteosidu, krenatosidu, caerulescenosidu a dalších PhGs. Tyto sloučeniny vykazovaly antioxidační aktivitu vůči LDL (low density lipoprotein), jehož zvýšená koncentrace v krvi způsobuje usazování cholesterolu v cévních stěnách, a je tedy významným činitelem při vzniku aterosklerózy. Antioxidační aktivita fenylpropanoidů byla porovnávána i s účinkem resveratrolu, známým fenolickým antioxidantem izolovaným z hroznového vína. Bylo prokázáno, že všechny zmíněné molekuly byly oproti

24 resveratrolu účinnější jak v délce působení, tak i v míře potlačení oxidačního efektu [34].

U Orobanche cernua byla pozorována výrazná antibakteriální aktivita. Protože se jedná o holoparazitickou rostlinu, je schopna akumulovat určité speciální metabolity, které jí umožňují získávání živin z hostitelské rostliny. Předpokládá se, že některé z těchto látek mohou být aktivní proti patogenním bakteriím. Extrakt jevil účinek proti grampozitivním bakteriím jako Streptococcus spp. či Staphylococcus spp., ten byl srovnatelný s některými antibiotiky (např. cefotaxim, tobramycin) [35].

U 2´-O-acetylakteosidu izolovaného z O. ramosa byl prokázán inhibiční účinek proti 5-lipoxygenase a aldosa-reduktase [20].

4.2. ÚČINKY AKTEOSIDU

Akteosid je látka, která byla izolovaná téměř ze všech doposud zkoumaných rostlin rodu Orobanche. Zároveň se jedná o fenylpropanoidní glykosid se snad nejširším spektrem účinku, a proto jsou jeho vlastnosti intenzivně zkoumány. Jak již bylo uvedeno výše, u akteosidu byl pozorován silný antioxidační efekt [20, 36, 37]. Tato sloučenina vykazuje protektivní účinek proti oxidaci membránových lipidů a vůči poškození endoteliální funkce způsobené volnými radikály. Minimalizuje ztrátu životaschopnosti buněk způsobenou hydroxylovými radikály a v testech s 1,1-difenyl- 2-pikrylhydrazylem (DPPH) se jeví jako účinný scavenger radikálů, což může být klíčem k mechanismu, který přispívá k jeho cytoprotektivnímu účinku a vede ke snižování rizika aterosklerózy [21, 36]. Toto zhášení radikálů bylo větší než u referenčních antioxidačních molekul jako jsou α-tokoferol (vitamín E), vitamín C, probukol (antihyperlipidemické léčivo) a resveratrol [36].

Akteosid dále vykazuje výrazný protizánětlivý účinek [38, 39, 40] tím, že působí inhibičně na lipopolysachardy (LPS)-indukovanou syntézu prostaglandinu

E2 a oxidu dusnatého NO [38, 39]. Byl zkoumán i inhibiční vliv na uvolňování histaminu [39].

Další vlastností akteosidu je analgetický a slabě sedativní účinek [41]. Akteosid inhibuje proteinkinasu C (PKC), působí cytotoxicky [20], hepatoprotektivně [42], antifungálně [43], neuroprotektivně [44], protinárodově [45] a antihypertenzivně [37]. Vasokonstrikční aktivita je způsobena inhibicí produkce a uvolňování endoteliálního oxidu dusnatého [46].

4.3. KOMBINOVANÝ ÚČINEK AKTEOSIDU A KRENATOSIDU

Směs těchto dvou fenylethanoidů, jejíž výskyt je typický právě pro rod Orobanche, vykazovala účinky podobné antipsychotickým (neuroleptickým), dále byl zaznamenán účinek antihepatotoxický, imunosupresivní, antihypertenzivní [20] či analgetický [19, 21]. Klinické testy poukázaly na to, že se tyto cukerné estery chovají jako antagonisté působení DOPA [20, 24], prekurzoru neurotransmiteru dopaminu, a vykazují ochrannou aktivitu proti poklesu sexuálních funkcí a schopnosti učení u myší. Jsou rovněž schopné inhibice aldosa-reduktasy, což může snižovat výskyt katarakty a sekundárních neuropatií u diabetiků [20].

5. CÍL PRÁCE

Záměrem této práce bylo provést důkladnou literární rešerši o rostlinách rodu Orobanche, jejich používání v lidové medicíně, obsahových látkách charakteristických pro tento rod a jejich biologické aktivitě potenciálně uplatnitelné v moderní medicíně.

Praktická část se pak orientovala na extrakty z rostliny Orobanche gracilis a jejich následnou analýzu pomocí HPLC-DAD a LC-MS. Byl sledován vliv rostlinné části, ze které extrakt pocházel (květ, stonek, kořen), a extrakčních podmínek (modifikace teploty a času) na kvalitativní i kvantitativní zastoupení jednotlivých látek extraktu.

6. MATERIÁL A INSTRUMENTACE

6.1. ROSTLINNÝ MATERIÁL

Rostliny Orobanche gracilis byly nasbírány v červenci 2012 na březích řeky Ammer v okolí Oberammergau (Německo) a byly identifikovány doc. Milanem Žemličkou, CSc., z Farmaceutické fakulty VFU Brno. Rostliny byly usušeny při teplotě do 35 °C.

6.2. INSTRUMENTACE

Mikrovlnný extraktor: Start E (Milestone, Itálie)

Centrifuga: Sigma 2K15 (Sigma Laborzentrifugen, Německo)

HPLC chromatograf: Agilent 1100 HPLC system, DAD UV/Vis (Agilent Technologies, USA), kolona Eclipse XDB – C18, 50 x 2,1 mm, velikost částic 1,8 μm

Hmotnostní spektrometr: Agilent HP 1100 LC/MSD Trap VL Series, electrospray ionisation (Hewlett Packard, USA)

Systém čištění vody: Aqua MAXTM – ULTRA 370 série Agua MAXTM – BASIC 360 série (Young Lin, Korea)

6.3. CHEMIKÁLIE

Chemikálie pro extrakci:

Methanol p.a. (Penta)

Chemikálie pro HPLC:

Acetonitril pro HPLC (Sigma-Aldrich)

Kyselina mravenčí 98 % p.a. (Sigma-Aldrich) – pro přípravu 2% roztoku kyseliny mravenčí

Deionizovaná voda

7. METODY

7.1. PŘÍPRAVA ROSTLINNÉHO MATERIÁLU

Nejprve se rostlinný materiál rozdělil na jednotlivé části, a to na květy, stonky a kořeny. Květy se obraly ze stonku, stonek s kořenem bylo potřeba rozstříhat na menší kousky (± 1 cm). Každou rostlinnou část bylo navíc potřeba rozdělit na dva díly, kdy jeden byl ponechán v původní podobě a druhý byl rozpráškován v mlýnku.

Z důvodu porovnatelnosti extraktů byla pro přípravu jednotlivých extraktů použita jednotná navážka 2 g rostlinného materiálu, která byla extrahována 20 ml methanolu. Přesné navážky a jim odpovídající množství methanolu shrnuje následující tabulka.

Tabulka VIII.: Navážené množství dané rostlinné části a jemu odpovídající objem rozpouštědla

Objem Stupeň Část rostliny Hmotnost [g] methanolu rozdrobení [ml] Celý 2,045 20,45 Kořen Drcený 1,872 18,72 Celý 2,068 20,68 Květ Drcený 2,016 20,16 Celý 2,002 20,02 Stonek Drcený 1,922 19,22

7.2. EXTRAKCE

Extrakce je analytická metoda sloužící k izolaci látek na základě přechodu složky přes fázové rozhraní dvou navzájem nemísitelných látek [47]. Při získávání přírodních látek se často využívá extrakce z tuhých látek pomocí kapalného rozpouštědla. Extrakce je závislá na teplotě, ovšem ne lineárně. Dalším limitujícím faktorem extrakce je difúze, proto se při ní uplatňuje Fickův zákon. Z tohoto zákona vyplývá, že extrakce je závislá na povaze rozpouštědla i látek (lipofilní látky/ nepolární rozpouštědlo, hydrofilní látky/ polární rozpouštědlo). Dále závisí na tloušťce difúzní vrstvy (nepřímo) a velikosti plochy, přes kterou difúze probíhá (přímo). Z těchto důvodů je pro zvýšení účinnosti prospěšné rozdrobení a rozemletí materiálu. Důležité je narušení tzv. matrix efektu, což je soubor fyzikálních a chemických sil, které váží obsahové látky v rostlině. Tento efekt se taktéž snižuje rozdrcením a rozemletím.

Extrakce rostlinného materiálu z Orobanche gracilis byla prováděna v mikrovlnném extraktoru Start E (Milestone) za standardních podmínek pro všech šest vzorků, které byly rozděleny podle části rostliny a stupně rozdrobení. Posléze byly modifikacemi standardních podmínek provedeny další extrakce, jejichž účelem bylo stanovení vlivu těchto změn na účinnost extrakce. Vliv změny podmínek extrakce byl sledován pouze u celých nedrcených stonků. V tabulce jsou shrnuty podmínky jednotlivých extrakčních metod.

Tabulka IX: Metody extrakce a jim odpovídající podmínky

Číslo Teplota Čas Měnič napětí metody [oC] [min] MW [W] 1 90 5 + 10 500/1000 (referenční) 2 60 5 + 10 500/1000 3 110 5 + 10 500/1000 4 130 5 + 10 500/1000 5 90 5 + 20 500/1000

Referenční metoda (číslo 1) má teplotu stanovenu na 90oC. Čas extrakce je 5 + 10 minut, což znamená, že 5 minut dochází k ohřevu na požadovanou teplotu a po dalších 10 minut extrakce probíhá za této teploty. Poslední parametr měnič napětí MW je nastaven na 500/1000 W. Jak vyplývá z tabulky, nejvýznamnějším měnícím se faktorem je teplota. U druhé metody je teplota snížena na 60oC a u dalších dvou naopak zvýšena na 110 a 130oC. U poslední metody je teplota zachována, ale mění se čas trvání extrakce z 10 na 20 minut.

7.3. CENTRIFUGACE

Centrifugace slouží k oddělení částic na základě odstředivé síly. Extrakty byly odstřeďovány po dobu 5 minut při teplotě 20 C a při zrychlení 9000 x g, a to za účelem vyčištění kapalného vzorku od pevných částic.

7.4. HPLC ANALÝZA EXTRAKTŮ

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (z angl. high performance liquid chromatography) je analytická separační metoda, která je založena na rozdílné afinitě a tedy i distribuci látek mezi dvě fáze – mobilní a stacionární [47, 48]. Vysoké

účinnosti je dosaženo vysokotlakými čerpadly. Zvýšený tlak poté umožňuje vysoké průtoky mobilní fáze, použití kratších kolon a velmi jemných částic sorbentu [47]. Pro separaci látek ze všech extraktů byla použita tzv. gradientová eluce, kdy je mobilní fáze vícesložková a poměr jednotlivých složek se v čase mění [48]. Tato metoda zlepšuje rozdělení složitějších směsí a zvyšuje citlivost, díky které lze sledovat i látky o velmi nízké koncentraci.

K detekci byl využit DAD detektor (Diode Array detektor) [47]. Jedná se o spektrofotometrický detektor, který absorbuje záření v UV/VIS oblasti, tedy vlnové délky od 190 do 800 nm. Umožňuje simultánně snímat celé spektrum v každém okamžiku a následnou tvorbu 3D chromatogramu [48].

Použita byla metoda IFL-V1NM.M s průtokem 0,250 ml za minutu. Doba trvání analýzy byla 40 minut plus 5 minut post time. Před prvním měřením byla kolona promývána 100%-ním acetonitrilem (MeCN). Poté bylo provedeno první měření, při kterém byla ovšem naměřena příliš vysoká maxima píků (1200 mAU) a proto byl vzorek naředěn v poměru 1:5 (200 μl vzorku smícháno s 800 μl methanolu).

Po prvním měření byla rovněž pozměněna metoda a to tím, že byl prodloužen post time z původních 5 minut na 10, aby bylo lépe zajištěno ustálení podmínek před dalším měřením. Upravená metoda byla pojmenována IFL-V1NMP.M

Následující dvě tabulky přehledně shrnují základní podmínky, při kterých byla analýza uskutečněna.

Tabulka X: Základní parametry metody IFL-V1NMP.M

Průtok 0,250 ml/min Doba měření (stop 40 min time) Post time 10 min Rozpouštědla A 0 % MeOH (solventy) B 10 % MeCN C 90 % HCOOH D 0 % - Limitní tlaky Maximum 400 Bar Maximum 0 Bar Nástřik 1 μl

Tabulka č. XI: Popis gradientu metody IFL-V1NMP.M

Čas Maximální % B % C Průtok[ml/min] [min] tlak [Bar] 1 0,00 10,0 90,0 0,250 400

2 36,00 100,0 0,0 0,250 400 3 40,00 100,0 0,0 0,250 400

Byla použita kolona Eclipse XDB – C18 o délce 50 mm a průměru 2,1 mm. Velikost částic sorbentu byla 1,8 μm. Nástřik vzorku měl objem 1 μl.

7.5. HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE (MS)

Hmotnostní spektrometrie (z angl. Mass spectrometry, MS) je fyzikálně chemická analytická metoda, která slouží k určování molekulové hmotnosti a napomáhá k identifikaci struktury látky. Složky vzorku jsou ionizací převedeny na nabité částice – ionty. Ty se navzájem separují podle podílu hmotnosti a náboje daného fragmentu (m/z). Molekula je často ionizací převedena nejprve na molekulový ion a ten se posléze fragmentuje na fragmentové ionty [47].

Pro získání MS spekter byl použit hmotnostní spektrometr Agilent HP 1100

LC/MSD Trap VL Series s ionizací elektrosprejem (ESI), průtok sušicího plynu (N2) 10 l/min, tlak 40 psi, sušící teplota 350 °C, gradientová eluce s mobilní fází ze směsi acetonitrilu a 40 mM kyseliny mravenčí (z 10 % acetonitrilu v 0. minutě na 100 % acetonitrilu v 35. minutě, pak dalších 5 minut promývání 100 % acetonitrilu, průtok 0,25 μl/min), kolona Eclipse XDB-C18, 50 x 2,1 mm, velikost částic 1,8 μm. Spektra byla měřena v negativním módu.

8. VÝSLEDKY A DISKUZE

Z jednotlivých částí Orobanche gracilis (květu, stonku a podzemní části) byly získány methanolické extrakty a ty byly na základě HPLC analýzy navzájem srovnávány. Byl sledován výskyt jednotlivých látek v konkrétních rostlinných částech, a to z hlediska kvalitativního i kvantitativního. Dále byl sledován vliv různých faktorů na účinnost extrakce - stupeň rozdrobení, délka trvání extrakce, snížení či naopak zvýšení teploty.

U všech získaných extraktů bylo měřeno HPLC-DAD a chromatogramy byly vyhodnoceny při vlnové délce 280 a 350 nm. Zásadními parametry, které se na chromatogramu sledovaly, byly retenční čas (Rt/min), DAD spektrum, absolutní plocha pod křivkou (AUC) a procentuální poměr plochy daného píku vztažený vůči celkové ploše pod všemi píky (% AUC).

Sledované sloučeniny měly velice podobné spektrální profily, kdy se jejich maxima nacházela při vlnových délkách v oblasti 202, 222 a 330 nm. Je to způsobené tím, že charakter látek je velmi podobný.

Podle výsledků HPLC-DAD a LC-MS se u všech získaných extraktů vyskytovaly čtyři majoritní látky v různém procentuálním zastoupení. Retenční časy jednotlivých látek jsou pro různé vzorky podobné, při použité metodě se sledované látky na chromatogramu vyskytovaly v 7. - 11. minutě. Byly sledovány tři až čtyři dominantní látky, pouze extrakt získaný při teplotě 130oC obsahoval další (pátou) dominantní látku s retenčním časem 10,54 min. Průměrný retenční čas pro první dominantní látku je 8,05 min, pro druhou 8,66 min, pro třetí 9,27 min a pro čtvrtou 9,68 min.

Na následujících stránkách jsou uvedeny získané chromatogramy při 350 nm. Chromatogramy při 280 nm byly velmi podobné, proto v této práci uvedeny nejsou. Pro každý extrakt jsou navíc zhotoveny tabulky, které zaznamenávají již zmiňované

sledované parametry (Rt, MS neg, λ max., AUC, % AUC a % AUC stonku celého).

8.1. POROVNÁNÍ EXTRAKTŮ Z RŮZNÝCH ROSTLINNÝCH ČÁSTÍ 1. Květ celý

Chromatogram extraktu z květu (celého) O. gracilis při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OR-GRAC-000004.D)

Norm. 8.011

250

9.652 8.599 200

150

100

9.234

7.252

10.328

0.649

7.625

10.985

10.575 10.802

11.404

11.294

11.524

10.182 11.953

6.978

8.419

0.987

6.815

1.651 2.034 0 5.712

0 5 10 15 20 25 30 35 min

*D AD 1, 9.228 (50.6 m AU , - ) R ef=9.148 & 9.454 of O R -G R AC -000004.D Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků: m A U *D AD 1, 8.601 (513 m40 AU , - ) R ef=8.481 & 8.921 of O R -G R AC -000004.D m A U

30 400 DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OR-GRAC-000004.D) 20 300 Norm. 10

200 8.011

100 0 200 300 400 500 600 nm

250 200 300 400 500 600 nm *D AD 1, 8.015 (570 m AU , - ) R ef=7.894 & 8.228 of O R -G R AC -000004.D

m A U 9.652

500 8.599 *D AD 1, 9.655 (491 m AU , - ) R ef=9.495 & 9.894 of O R -G R AC -000004.D 200 400 m A U

300 400

200 150 300 100

0 200

200 300 400 500 600 nm

100 100

200 300 400 500 600 nm

9.234

7.252

10.328

7.625

10.575 10.802

10.182

6.978 8.419 0 6.815 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 min

Tabulka XII: Sledované parametry z chromatogramu extraktu z květu (celého) O. gracilis:

% AUC Označení MS neg Rt (min) λ (nm) AUC % AUC stonku píku (m/z) max celého Og/kv-c/1 8,011 623,3 202, 222, 330 1946,7 28,1 86,0

Og/kv-c/2 8,599 621,0 202, 222, 330 1430,1 20,7 236,8

Og/kv-c/3 9,234 695,0 202, 222, 330 202,8 2,9 236,4

Og/kv-c/4 9,652 665,4 202, 220, 330 1531,1 22,1 114,8

2. Květ drcený

Chromatogram extraktu z květu (drceného) O. gracilis při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OR-GRAC-000005.D)

Norm. 8.007

200

8.590 9.636 150

100

7.271 9.219

8.793

0.652

10.297

10.961

7.626 10.786

10.550 11.274 11.377

11.503

11.935

10.157

6.993

8.415

8.288

6.837 1.047 0 1.773

0 5 10 15 20 25 30 35 min Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků:

*D AD 1, 9.642 (392 m AU , - ) R ef=9.548 & 10.002 of O R -G R AC -000005.D *D AD 1, 8.588 (457 m AU , - ) R ef=8.468 & 8.868 of O R -G R AC -000005.D m A U m A U DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OR-GRAC-000005.D) 350 400 Norm. 300

300 250

*D AD 1, 8.002 (516 m AU , - ) R ef=7.855 & 8.282 of O R -G8.007 R AC -000005.D 200 m A U 200 150

100 200 400 100 50 300

0 0 8.590 200 300 400 500 600 nm 200 300 400 500 600 nm

200 9.636

150 100

200 300 400 500 600 nm

100

7.271 9.219

8.793

10.297

10.786

7.626

10.550

10.157

6.993

8.415 8.288 0 6.837

6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 min

Tabulka XIII: Sledované parametry z chromatogramu extraktu z květu (drceného) O. gracilis:

% AUC Označení MS neg Rt (min) λ (nm) AUC % AUC stonku píku (m/z) max celého Og/kv-d/1 8,007 623,2 202, 222, 330 1576,5 27,6 69,6

Og/kv-d/2 8,590 621,3 202, 222, 330 1116,4 19,6 184,8

Og/kv-d/3 9,219 695,1 202, 222, 330 175,3 3,1 204,3

Og/kv-d/4 9,636 665,3 200, 220, 330 1129,0 19,8 84,7

3. Stonek celý

Chromatogram extraktu ze stonku (celého) O. gracilis při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MAC121118 2012-11-19 13-35-22\OR-GRAC--000009.D) Norm.

350 8.004

300

250 9.640 200

150

100 8.596

10.302

0.649

8.812

9.232

7.625

10.550 11.294

10.756

11.866 12.071

6.986

8.417

1.031

7.270 7.369 0 6.831

0 5 10 15 20 25 30 35 min Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků:

*D AD 1, 9.634 (466 m AU , - ) R ef=9.474 & 9.821 of O R -G R AC --000009.D m A U *D AD 1, 8.594 (279 m AU , - ) R ef=8.448 & 8.768 of O R -G R AC --000009.D DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MAC121118 2012-11-19 13-35-22\OR-GRAC--000009.D) m A U 400 Norm. 250 350 *D AD 1, 8.008 (615 m AU , - ) R ef=7.821 & 8.354 of O R -G R AC --000009.D

m A U 200 300 8.004

500 150 200 300 400 100

100 300 50

200 250 0 0

100 200 300 400 500 600 nm 200 300 400 500 600 nm 9.640 200 0 200 300 400 500 600 nm

150

100 8.596

10.302

8.812

9.232

7.625

10.550

10.756

6.986

8.417

7.270 7.369 0 6.831

6 7 8 9 10 min

Tabulka XIV:Sledované parametry z chromatogramu extraktu ze stonku (celého) O. gracilis:

% AUC Označení MS neg Rt (min) λ (nm) AUC % AUC stonku píku (m/z) max celého Og/st-c/1 8,004 623,3 202, 222, 330 2264,8 44,4 100

Og/st-c/2 8,596 621,3 200, 222, 330 604 11,8 100

Og/st-c/3 9,232 695,0 202, 222, 330 85,8 1,7 100

Og/st-c/4 9,640 665,3 200, 220, 330 1333,3 26,1 100

4. Stonek drcený

Chromatogram extraktu ze stonku (drceného) O. gracilis při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MAC121118 2012-11-19 13-35-22\OR-GRAC--000008.D)

Norm. 7.993

400 9.635 300

200 8.587

100

10.304

9.227

8.801

0.651

11.303

10.768

10.555 11.870 12.078

10.961

7.616

10.168

12.530

6.973

1.045 8.409

6.815 7.365

4.894 7.258 0 5.153

0 5 10 15 20 25 30 35 min Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků: *D AD 1, 9.638 (589 m AU , - ) R ef=9.465 & 9.878 of O R -G R AC --000008.D *D AD 1, 8.585 (472 m AU , - ) R ef=8.412 & 8.878 of O R -G R AC --000008.D m A U m A U DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MAC121118 2012-11-19 13-35-22\OR-GRAC--000008.D) 500 Norm. 400 *D AD 1, 7.998 (758 m AU , - ) R ef=7.865 & 8.252 of O R -G R AC --000008.D 400 300

m A U 7.993

700 300 200 400 600 200 500 100 100 400

300 0 0 9.635 200 300 400 500 600 nm 200 300 400 500 600 nm 300 200 100

200 300 400 500 600 nm

200 8.587

100

10.304

9.227

8.801

10.768

10.555

10.961

7.616

10.168

6.973

8.409

6.815 7.365 0 7.258

6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 min

Tabulka XV: Sledované parametry z chromatogramu extraktu ze stonku (drceného) O. gracilis:

% AUC Označení MS neg Rt (min) λ (nm) AUC % AUC stonku píku (m/z) max celého Og/st-d/1 7,993 623,3 204, 222, 330 3107,8 38,1 137,2

Og/st-d/2 8,587 621,4 202, 222, 330 1164,9 14,3 192,9

Og/st-d/3 9,227 695,0 202, 222, 330 173,2 2,1 201,9

Og/st-d/4 9,635 665,3 202, 222, 330 2071,5 25,4 155,4

5. Kořen celý

Chromatogram extraktu z kořene (celého) O. gracilis při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MAC121118 2012-11-19 13-35-22\OR-GRAC--000007.D) Norm.

250 8.070

200

150

100 8.644

9.679

0.654

8.855

9.359

10.339

7.702 10.970

10.490 10.186 0 1.101

0 5 10 15 20 25 30 35 min Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MAC121118 2012-11-19 13-35-22\OR-GRAC--000007.D)*D AD 1, 8.641 (224 m AU , - ) R ef=8.468 & 9.001 of O R -G R AC --000007.D Norm. *D AD 1, 8.068 (531 m AU , - ) R ef=7.908 & 8.401 of O R -G R AC --000007.Dm A U 250 m A U 200 500 8.070 175 *D AD 1, 9.681 (118 m AU , - ) R ef=9.548 & 9.881 of O R -G R AC --000007.D

150 m A U 400 125 100 100 300 200 75 80

200 50 60 25

100 0 40 150 200 300 400 500 600 nm 0 20

200 300 400 500 600 nm 0

200 300 400 500 600 nm

100 8.644

9.679

8.855

9.359

10.339

7.702

10.970 10.490 0 10.186

7 8 9 10 11 min

Tabulka XVI: Sledované parametry z chromatogramu extraktu z kořene (celého) O. gracilis:

% AUC Označení MS neg Rt (min) λ (nm) AUC % AUC stonku píku (m/z) max celého Og/ko-c/1 8,070 623,2 202, 222, 330 1596,4 54,6 70,5

Og/ko-c/2 8,644 621,4 200, 222, 330 437,8 15,0 72,0

Og/ko-c/3 9,359 695,1 202, 222, 330 40,6 1,4 47,0

Og/ko-c/4 9,679 665,2 200, 220, 330 258,9 8,9 19,1

6. Kořen drcený

Chromatogram extraktu z kořene (drceného) O. gracilis při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OR-GRAC-000006.D)

Norm. 7.974

400

300

200 8.565

100

9.621

0.651 8.778

9.304 10.335

10.145 10.457 10.945

7.602 10.791 1.044 0 6.822

0 5 10 15 20 25 30 35 min Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OR-GRAC-000006.D) *D AD 1, 8.561 (410 m AU , - ) R ef=8.374 & 8.961 of O R -G R AC -000006.D m A U Norm. 350

450 7.974 300

250 *D AD 1, 9.627 (172 m AU , - ) R ef=9.507 & 9.841 of O R -G R AC -000006.D 400 200 m A U *D AD 1, 7.974 (745 m AU , - ) R ef=7.761 & 8.254 of O R -G R AC -000006.D 160 m A U 150 700 140 350 100 120 600 50 100 500 300 0 80 400 200 300 400 500 600 nm 60

300 40 250 20 200 0 200 100 200 300 400 500 600 nm 0

200 300 400 500 600 nm 150 8.565

100 9.621

8.778

9.304

10.335

10.145 10.457

10.945

7.602

10.791 6.822 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 min

Tabulka XVII:Sledované parametry z chromatogramu extraktu z kořene (drceného) O. gracilis:

% AUC Označení MS neg Rt (min) λ (nm) AUC % AUC stonku píku (m/z) max celého Og/ko-d/1 7,974 623,3 204, 222, 330 2990,6 60,7 132,0

Og/ko-d/2 8,778 621,4 202, 222, 330 939,2 19,0 155,5

Og/ko-d/3 9,304 695,0 202, 222, 330 59,2 1,2 69,0

Og/ko-d/4 9,621 665,3 200, 220, 330 397,5 8,1 29,8

Ze získaných výsledků a z níže uvedeného grafu č. 1 můžeme vyčíst, jaké bylo procentuální zastoupení látek v extraktu z jednotlivých částí rostliny. Ve všech částech byla v extraktu nejvíce zastoupena látka č. 1, u kořene dokonce velice výraznou nadpoloviční většinou. V kořeni byla druhou nejčetnější sloučeninou látka č. 2, zatímco u zbylých částí to byla látka č. 4. Látka č. 3 se vyskytovala jen v nepatrném množství.

Graf č. 1: Porovnání % AUC mezi jednotlivými částmi rostliny

50 látka 1 40 látka 2

% AUC % 30 látka 3 20 látka 4

0 Květ c květ d stonek c stonek d kořen c kořen d

Množství jednotlivých látek ve stonku celém byla použita jako referenční hodnoty, se kterými byly porovnávány další části. Bylo tedy sledováno, zda extrakty obsahovaly více či méně jednotlivých látek v porovnání s extraktem ze stonku celého. Zkoumal se i vliv rozdrobnění (práškování) na množství extrahované látky. V grafu č. 2 můžeme sledovat, že pro stonek i kořen mělo rozdrobnění pozitivní vliv na nárůst absolutního množství extrahovaných látek. Tento výsledek byl očekávaný, protože rozdrobněním se zvyšuje povrch a naopak snižuje šířka difúzní vrstvy, což vede ke zvýšení účinnosti extrakce. Překvapujícím se může jevit snížení účinnosti při rozdrobnění, které bylo pozorováno u květu. Tento pokles mohl být způsoben tím, že květy rostliny jsou již samy o sobě velmi jemné a rozdrobněním byla získána příliš prašná hmota tvořená drobnými částečkami. Ty mohly v rozpouštědle vytvořit „bláto“, ze kterého byla extrakce naopak snížena.

Z hlediska absolutního množství byla látka č. 1 nejvíce zastoupena v rozdrceném stonku, ale druhé nejvyšší zastoupené v rozdrceném kořeni bylo menší jen o velmi málo. Látka č. 2 a látka č. 3 byly nejčetnější v květu (nedrceném) a látky č. 4 bylo nejvíce v drceném stonku. V literatuře nebyly nalezeny údaje o zastoupení fenylethanoidních glykosidů v závislosti na jednotlivých rostlinných částech.

Graf č. 2: Porovnání % AUC jednotlivých částí rostlin k % AUC stonku celého

250

200

150 látka 1 látka 2 100 látka 3

látka 4 % AUC stonku AUC % celého 50

0 Květ c květ d stonek c stonek d kořen c kořen d

8.2. POROVNÁNÍ EXTRAKČNÍCH METOD U NADZEMNÍCH ČÁSTÍ A) Stonek (celý) extrahovaný při teplotě 60oC

Chromatogram extraktu ze stonku O. gracilis (extrahovaného při 60oC) při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OROB-GRAC000008.D) Norm.

175 8.104

150

125 9.687 100

75 8.671

0.651

10.350

8.870

10.977

10.576

9.366

9.285

7.735 7.129 0 1.095

0 5 10 15 20 25 30 35 min

Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OROB-GRAC000008.D) Norm. *D AD 1, 8.110 (465 m AU , - ) R ef=7.990 & 8.390 of O R O B-G R AC 000008.D *D AD 1, 8.670 (226 m AU , - ) R ef=8.563 & 8.857 of O R O B-G R AC 000008.D*D AD 1, 9.683 (305 m AU , - ) R ef=9.523 & 9.963 of O R O B-G R AC 000008.D 175 m A U m A U 8.104 m A U

200 400 250 175

150 150 200 300 125

100 150

200 75 125 100 50

25 50 100 9.687 0 100 0 200 300 400 500 600 nm 0 200 300 400 500 600 nm

200 300 400 500 600 nm

75 8.671

10.350

8.870

10.977

10.576

9.366

9.285 7.735 0 7.129

6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 min Tabulka XVIII: Sledované parametry z chromatogramu extraktu ze stonku O. gracilis extrahovaného při 60 C:

% AUC Označení MS neg Rt (min) λ (nm) AUC % AUC stonku píku (m/z) max celého Og/sB-c/1 8,014 623, 2 200, 220, 330 1087,7 40,8 48,0

Og/sB-c/2 8,671 621,1 200, 220, 330 413,2 15,5 68,4

Og/sB-c/3 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d

Og/sB-c/4 9,687 665,2 200, 220, 330 645,2 15,5 48,4

B) Stonek (celý) extrahovaný při teplotě 110oC

Chromatogram extraktu ze stonku O. gracilis (extrahovaného při 110oC) při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MACH121125 2012-11-26 10-45-16\OROB-GRAC100009.D) Norm.

400 8.096

350

300

250 9.703

200

150 8.673

100

10.379

0.653

9.291

7.734

11.010 11.393

10.609 10.821

10.217

11.893 12.096

1.102 7.128

7.407

6.986 5.351 0 1.901

0 5 10 15 20 25 30 35 min

Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků:

*D AD 1, 8.676 (422 m AU , - ) R ef=8.529 & 8.929 of O R O B-G R AC 100009.D *D AD 1, 9.703 (536 m AU , - ) R ef=9.569 & 10.009 of O R O B-G R AC 100009.D DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MACH121125 2012-11-26 10-45-16\OROB-GRAC100009.D) m A U *D AD 1, 8.102 (715 m AU , - ) R ef=7.983 & 8.436 of O R O B-G R AC 100009.D m A U 400 Norm. m A U 500 350

400 600 8.096 300 400

500 250 300 200 350 400 150 200 300 100 300 200 100 50 100 0 0 250 0 200 300 400 500 600 nm 200 300 400 500 600 nm nm 200 300 400 500 600 9.703

200

150 8.673

100

10.379

9.291

7.734

11.010

10.609 10.821

10.217

7.128 7.407 0 6.986

7 8 9 10 min Tabulka XIX: Sledované parametry z chromatogramu extraktu ze stonku O. gracilis extrahovaného při 110oC:

% AUC Označení Rt (min) MS neg (m/z) λ (nm) AUC % AUC stonku píku max celého Og/sC-c/1 8,096 623,1 202, 222, 330 2591,2 42,9 114,4

Og/sC-c/2 8,673 621,0 202, 222, 330 913,2 15,1 151,2

Og/sC-c/3 9,291 695,1 202, 222, 330 85,7 1,4 99,9

Og/sC-c/4 9,703 665,1 200, 220, 330 1427,3 23,6 107,1

C) Stonek (celý) extrahovaný při 130oC

Chromatogram extraktu ze stonku O. gracilis (extrahovaného při 130oC) při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OR-GRA-130ST006.D)

mAU 8.269

400

300

9.859 8.849

200

100 10.538 7.905 0 6 8 10 12 14 16 18 min

Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků: *DAD1, 9.855 (189 m AU, - ) Ref=9.762 & 9.909 of OR-GRA-130ST006.D m A U *DAD1, 8.842 (425 m AU, - ) Ref=8.695 & 9.909 of OR-GRA-130ST006.D 175 m A U DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\OR-GRA-130ST006.D) 400 150 350 mAU 125 300 100

*DAD1, 8.269 (873 m AU, - ) Ref=8.189 & 9.909 of OR-GRA-130ST006.D 8.269 250 m A U 75

800 200 50 400 700 150 25 600 100

0 500 50 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 nm 400 0

300 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 nm 300 *DAD1, 10.536 (231 m AU, - ) Ref=10.482 & 10.656 of OR-GRA-130ST006.D 200 m A U

100 200

9.859 8.849 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 nm 200 150

100

100 10.538

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 nm 7.905 0 6 7 8 9 10 11 min Na tomto chromatogramu lze dobře sledovat přítomnost pátého píku (Rt 10,538 mn), který se u ostatních extraktů nevyskytuje.

Tabulka XX:Sledované parametry z chromatogramu extraktu ze stonku O. gracilis extrahovaného při 130oC:

% AUC Označení Rt (min) MS neg (m/z) λ (nm) AUC % AUC stonku píku max celého Og/sD-c/1 8,269 623,2 206,224,330 2112,1 29,5 93,3 Og/sD-c/2 8,849 621,0 202,222,328 1880,9 26,3 311,4 Og/sD-c/3 9,405 n. d. n. d. 87,4 1,2 101,9 Og/sD-c/4 9,859 665,2 202,222,328 1212,9 16,9 91,0 Og/sD-c/5 10,538 665,1 202,220,326 852,6 11,9 n. d.

D) Stonek (celý) extrahovaný při teplotě 90 oC po dobu 20 minut

Chromatogram extraktu ze stonku O. gracilis (extrahovaného 20 minut) při 350 nm:

DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MACH121125 2012-11-26 10-45-16\OROB-GRAC100010.D)

Norm. 8.039

350

300

250 9.675

200

150 8.630 100

0.649

10.358

9.260

11.004

10.594 10.804 11.399

7.664 8.832

10.201

12.092

7.032

1.037

7.319 7.405 0 6.880

0 5 10 15 20 25 30 35 min

Detail chromatogramu a DAD spektra jednotlivých píků:

*D AD 1, 8.633 (361 m AU , - ) R ef=8.513 & 8.886 of O R O B-G R AC 100010.D DAD1 B, Sig=350,16 Ref=700,100 (JANAS\MACH121125 2012-11-26 10-45-16\OROB-GRAC100010.D) m A U 350 Norm. *D AD 1, 9.673 (531 m AU , - ) R ef=9.539 & 9.939 of O R O B-G R AC 100010.D 300 m A U 500

8.039 250

200 400 *D AD 1, 8.033 (708 m AU , - ) R ef=7.899 & 8.353 of O R O B-G R AC 100010.D 350 m A U 150 300 600 100

50 200 300 500 0 400 100 200 300 400 500 600 nm 300 0 250 200 200 300 400 500 600 nm

100 9.675

200 0 200 300 400 500 600 nm

150 8.630 100

10.358

9.260

11.004

10.594 10.804

7.664 8.832

10.201

7.032

7.319 7.405 0 6.880

6 7 8 9 10 min

Tabulka XXI: Sledované parametry z chromatogramu extraktu ze stonku z O. gracilis extrahovaného 20 minut:

% AUC Označení Rt (min) MS neg (m/z) λ (nm) AUC % AUC stonku píku max celého Og/sE-c/1 8,039 623,2 202, 222, 330 2513,2 46,0 111,0

Og/sE-c/2 8,630 621,0 200, 220, 330 729 13,3 120,7

Og/sE-c/3 9,260 695,1 202, 222, 330 68,8 1,3 80,2

Og/sE-c/4 9,675 665,2 200, 220, 330 1378,1 25,2 103,4

Tato část analýzy výsledků byla zaměřena na vliv pozměnění metod na zastoupení jednotlivých látek (absolutní i poměrové). Z grafu č. 3 lze vyčíst, že při všech modifikacích je opět dominantní látkou zastoupenou v extraktu látka č. 1. Při poklesu teploty na 60oC se sníží účinnost extrakce natolik, že například látka č. 3 se podle HPLC v takto získaném extraktu vůbec nevyskytuje, zatímco při zvýšení teploty na 130oC byl naopak zaznamenán výskyt látky zcela nové. Ovšem množství látky č. 1 je v porovnání s jinými extrakcemi sníženo.

Graf č. 3: Porovnání % AUC stonku celého extrahovaného za odlišných podmínek

50 45 40 35 látka 1

30 látka 2 25 látka 3 % AUC % 20 15 látka 4 10 látka 5 5 0 60 oC 90 oC 110 oC 130 oC 20 min

Graf č. 4 shrnuje vliv teploty a prodloužení doby extrakce na absolutní koncentraci dané sloučeniny. Snížení teploty na 60oC pro extrakci nelze doporučit, protože dochází ke snížení množství jednotlivých vyextrahovaných látek, takže úspora energie by nevedla vlivem nízké účinnosti ke snižování celkových nákladů.

Pro extrakci látky č. 1 (akteosidu – viz kap. 8.3.) zvyšování teploty nevedlo k výraznému nárůstu účinnosti (při teplotě 130oC zřejmě dochází k rozkladu a tím ke snížení obsahu látky č. 1). Ani prodloužení doby nepřineslo výrazné zlepšení extrakce látky č. 1. Proto je dle mého mínění extrakce při 90oC po dobu 5+10 minut pro získání látky č. 1 nevhodnější.

U látky č. 2 (krenatosidu) je zajímavé sledovat výrazný nárůst koncentrace vlivem vzrůstající teploty. Při 130oC je toto zvýšení dokonce trojnásobné, proto lze tuto teplotu doporučit pro potřebu získání právě této složky z rostliny.

Při snaze získat v co nejlepší kvalitě směs majoritních látek č. 1 a 2 (akteosid a krenatosid) se jeví jako nejlepší extrakce při 110oC, protože celková účinnost extrakce těchto dvou látek je mírně zvýšena.

Dvojnásobné prodloužení doby izolace nemá na nárůst výtěžku příliš velký vliv, proto je vzhledem k vyšší spotřebě energií zbytečné.

Graf č. 4: Porovnání % AUC při modifikovaných metodách s % AUC stonku celého extrahovaného při 90oC

350

300

250 látka 1 200 látka 2 150 látka 3

100 látka 4 % AUC stonku AUC % celého

0 60 oC 90 oC 110 oC 130 oC 20 min

8.3. VYHODNOCENÍ MS ANALÝZY

Všechny extrakty z Orobanche gracilis byly podrobeny MS analýze za účelem zjištění molekulových hmotností obsažených látek a jejich fragmentace. Získané hmotnostní spektrum sloučenin bylo poté porovnáváno se spektry látek z knihovny spekter a s údaji v literatuře.

Podle získaných výsledků se u všech měřených extraktů vyskytovaly čtyři majoritní látky. Z výsledků LC-MS a z fragmentace jednotlivých látek vyplývá, že látka č. 1 (Rt 8,05 min) má molekulovou hmotnost 624 a při porovnání s údaji v literatuře by mohlo jít o akteosid (= verbaskosid, Mr 624,59), který byl již dříve popsán v mnoha druzích rodu Orobanche (např. O. caerulescens [34], O. rapum- genistae [13, 20, 24, 49, 50], O. crenata [13, 20] a také v Cistanche tubulosa, Orobanchaceae) [20, 51]. Látka č. 2 (Rt 8,66 min) má molekulovou hmotnost 622 a podle dostupných údajů by se mohlo jednat o krenatosid (= oraposid = orobanchosid, Mr 622,57), který byl izolovaný pod názvem orobanchosid např. z O. rapum-genistae [20] a O. hederae [20]. Pod názvem krenatosid byl již dříve popsán v O. caerulescens [34] či O. crenata [20]. Látka č. 3 (Rt 9,27 min) má molekulovou hmotnost 696 a v literatuře nebyla nalezena podobnost. Fragmentace této sloučeniny odpovídá fragmentaci fenylethanoidních glykosidů, není však možné nyní vyslovit žádné další předpoklady o struktuře této látky. Navíc se ve všech rostlinných částech vyskytovala jen v nepatrném množství (od 1,2 % v drceném kořeni po 3,1 % v drceném květu), proto její přínos pro případnou biologickou aktivitu extraktu z Orobanche gracilis pravděpodobně nebude příliš významný. Látka č. 4 (Rt 9,68 min) má molekulovou hmotnost 666 a při porovnání s literaturou by se mohlo jednat o 2´-acetylakteosid (Mr 666,62) dříve izolovaný z Orobanche ramosa [20], dále pak z Cistanche tubulosa [20, 51], C. sinensis [52] a C. salsa [20] (Orobanchaceae), nebo tubulosid B (Mr 666,62) dříve izolovaný z Cistanche tubulosa [51].

Pro potvrzení struktury těchto látek je však potřeba využít další identifikační metody, např. jednotlivé látky izolovat a poté identifikovat pomocí NMR a rentgenové strukturní analýzy.

9. ZÁVĚR

Tato práce se zabývá přípravou extraktů z jednotlivých rostlinných částí Orobanche gracilis a jejich fytochemickou analýzou. Analýza byla provedena pomocí HPLC-DAD a LC-MS porovnáním s knihovnou spekter a údaji v literatuře. Podařilo se ověřit, že stejně jako většina rostlin rodu Orobanchaceae, tak i Orobanche gracilis obsahuje ve svém extraktu směs fenylethanoidních glykosidů, především akteosidu a krenatosidu/orobanchosidu. Akteosid tvoří nejvýraznější složku extraktu ve všech rostlinných částech této rostliny. Nejvíce této látky se podařilo prokázat v extraktu z drceného stonku, o něco nižší množství bylo v extraktu z drceného kořene a výrazně nejméně akteosidu bylo v extraktu z květů.

V rámci práce bylo také zkoumáno ovlivnění extrakce při změnách doby a teploty extrakce. Ze srovnání různých podmínek extrakce lze vyvodit, že pro extrakci fenylethanoidních glykosidů je metoda extrakce při 90oC vhodnou kombinací účinnosti a spotřeby. Při snížení teploty na 60oC dochází ke snížení účinku na polovinu. Pří zvýšení teploty na 130oC se sice získá přibližně trojnásobné množství krenatosidu, ale množství akteosidu se naopak snižuje. Doporučit lze mimo 90oC i teplotu 110oC vzhledem k účinnosti extrakce akteosidu i krenatosidu. Prodloužení doby extrakce nepřináší žádné výhody, nevýhodou je vyšší energetická náročnost a tedy použití delší doby extrakce je neekonomické.

10. SUMMARY

This thesis deals with preparation of extracts from individual plant parts of Orobanche gracilis and their fytochemical analysis. The analysis was done using HPLC-DAD and LC-MS by comparison with spectral library and literature data. We confirmed the hypothesis that Orobanche gracilis, as well as most plants of Orobanchaceae, contains in its extracts mixture of phenylethanoid glycosides, mainly acteoside and crenatoside/orobanchoside. Acteoside presents the most common extract constituent in all parts of this plant. The largest amount was proved in the extract from pulverized stem, slightly lower amount was in the extract from pulverized roots and the lowest amount was found in the extract from flowers.

Within this work also influence of changes in extraction time and temperature were evaluated. From comparison of various extraction conditions we can conclude that extraction carried out in 90oC is suitable combination of effectiveness and energy consumption. Using temperature of 60oC reduces effectivity of extraction to approximately 50%. Using increased temperature of 130oC we can gain approximately three times higher amounts of crenatoside but the amount of acteoside is lowered. Apart from 90oC also temperature of 130oC can be recommended for its effectiveness of acteoside and crenatoside extraction. On the contrary, extraction time elongation does not bring any advantages and is more energy consuming and so uneconomical.

11. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

[1] STEVENS, P. F. Angiosperm Phylogeny Website. Version 12. In: mobot.org [online]. 2001 onwards [ cit. 2013-02-09]. Dostupné z : http://www.mobot.org/MOBOT/Research/APweb/welcome.html [2] MÁRTONFI, P. Systematika cievnatých rastlín, 3. Vyd. Košice: Univerzita P. J. Šafárika, 2007. 220 s. ISBN 978-80-7097-694-4. s. 176 [3] KRÁSA, P. Euphrasia rostkoviana Hayne – světlík lékařský/ očianka Rostkovova. In: Botany.cz [online]. 2007 [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://botany.cz/cs/euphrasia-rostkoviana/ [4] HAYNOLD, B. Euphrasia rostkoviana 250807.jpg. In: wikimedia.org [online]. 2007 [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Euphrasia_rostkoviana_250807.jpg [5] JAHODÁŘ L. Léčivé rostliny v současné medicíně (co Mattioli ještě nevěděl). 1. vyd. Praha: Havlíček Bain Team, 2010. 233 s. ISBN 978-80-87109-22-9. s. 135, 150 [6] KRESÁNEK, J., DUGAS, D. Príručný atlas liečivých rástlín. 1.vyd. Martin: Osveta, 1985. 320 s. s. 112 [7] DUGAS D. 500 nejlepších receptů lidové medicíny (bylinkový receptář od nejstarších časů po současnost). Ostrava: Knižní expres, 2007. 247 s. ISBN: 978-80-7347-036-4. s. 167 [8] KOCIÁN, P. Orobanchaceae – Zárazovité. In: kvetenacr.cz [online]. 2003-2013 [cit. 2013-01-22]. Dostupné z: http://www.kvetenacr.cz/celed.asp?IDceled=72 [9] ELIÁŠ, P. Orobanche gracilis Sm. – záraza štíhlá / záraza útlá. In: Botany.cz [online]. 2007. [cit. 2013-01-22]. Dostupné z: http://botany.cz/cs/orobanche-gracilis/ [10] HAYNOLD, B. Orobanche gracilis 160705.jpg. In: wikimedia.org [online]. 2005 [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://species.wikimedia.org/wiki/File:Orobanche_gracilis_160705.jpg [11] Orobanche – The Broomrapes. In: wssa.net [online]. [cit. 2013-01-19]. Dostupné z: http://www.wssa.net/wp/wp-content/themes/WSSA/WorldOfWeeds/orobanche.html [12] Záraza (Orobanche) - dr. K. V., Český herbář, nakladatelství Alois Hynek, Praha, 1899. In: wendys.cz [online]. [cit. 2013-01-19]. Dostupné z: http://botanika.wendys.cz/cherbar/heslo.php?747 [13] SERAFINI, M., FABIO, A. d., FODDAI, S., BALLERO, M., POLI, F. The occurrence of phenylpropanoid glycosides in Italian Orobanche spp. Biochemical Systematics and Ecology, 1995, Vol. 23, No. 7-8, pp. 855-858 [14] SAREEDENCHAI, V., ZIDORN, CH. Sequestration of polyacetylenes by the parasite Orobanche hederae (Orobanchaceae) from its host Hedera helix (Araliaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 2008, Vol. 36, No. 10, pp. 772-776 [15] VELASCO, L., GOFFMAN, F. D., PUJADAS – SALVA, A. J. Fatty acids and tocochromanols in seeds of Orobanche. Phytochemistry, 2000, Vol. 54, pp. 295-300

[16] SEIGLER, D. S. Plant secondary metabolism. New York: Kluwer Academic Publishers, 1998. 756 s. ISBN: 978-1-4615-4913-0. s. 106-107, 151-152, 312, 353 [17] MACHOLÁN, L. Sekundární metabolity. 2. doplněné vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2003. 150 s. ISBN: 80-210-3068-2. s. 76-78, 88, 91-92, 139 [18] BRUNETON, J. Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. 2. vyd. Paris: Lavoisier Publishing, 1999. 1119 s [19] KURKIN, V. A. Phenylpropanoids from medicinal plants: distribution, classification, structural analysis, and biological aktivity. Chemistry of Natural Compounds, 2003, Vol. 39, No. 2, pp.123-153 [20] JIMÉNEZ, C., RIGUERA, R. Phenylethanoid glycosides in plants: Structure and biological activity. Natural Product Reports, 1994, Vol. 11, No. 6, pp. 591-606 [21] DEMBITSKY, V. M. Astonishing diversity of natural surfactants: 5. Biologically active glycosides of aromatic metabolites. Lipids, 2005, Vol. 40, No. 9, pp. 869-900 [22] ANDARY, C., WYLDE, R., MAURY, L., HEITZ, A., DUBOURG, A., NISHIBE, S. X – RAY analysis and extrended NMR study of oraposide. Phytochemistry, 1994, Vol. 37, No. 3, pp. 855 – 857 [23] NISHIBE, S., TAMAYAMA, Y., SASAHARA, M., ANDARY, C. A phenylethanoid glycoside from Plantago Asiatica. Phytochemistry, 1994, Vol. 38, No. 3, pp. 741-743 [24] ANDARY, C., WYLDE, R., LAFFITE, C., PRIVAT, G., WINTERNITZ, F. Structures of verbascoside and orobanchoside, caffeic acid sugar esters from Orobanche rapum-genistae. Phytochemistry, 1982, Vol. 21, No. 5, pp. 1123-1127 [25] Acteoside – Compound Summary. In: nih.gov [online]. [cit. 2013-04-07]. Dostupné z: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5281800&loc=ec_rcs [26] Crenatoside – Compound Summary. In: nih.gov [online]. [cit. 2013-04-07]. Dostupné z: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=6441894 [27] SAIMARU, H., ORIHARA, Y. Biosynthesis of acteoside in cultured cells of Olea europaea. Journal of Natural Medicines, 2009, Vol. 64, pp. 139-145 [28] DEWICK, P. M. The biosynthesis of shikimate metabolites. Natural Product Reports, 1988, Vol. 5, pp. 263-290 [29] CHAE, S., KIM, J. S., KANG, K. A., BU, H. D., LEE, Y., HYUN, J. W., KANG, S. S. Antioxidant activity of jionoside D from Clerodendron trichotomum. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2004, Vol. 27, No. 10, pp.1504-1508 [30] PARK, S. Y., YANG, H. C., MOON, J. Y., LEE, N. H., KIM, S. J.,KANG, J. H., LEE, Y. K., PARK, D. B., YOO, E. S., KANG, H. K. The cytotoxicity of eutigosides from Eurya emarginata against HL-60 promyelocytic leukemia cells. Archives of Pharmacal Research, 2005, Vol 28, No. 9, pp. 1047-1052 [31] LEE, H. J., OH, T. H., YOON, W. J., KANG, G. J., YANG, E. J., PARK, S. S., LEE, N. H., KANG, H. K., YOO, E. S. Eutigoside C inhibits the production of inflammatory mediators (NO, PGE(2), IL-.6) by down-regulating NF-kappaB and MAP kinase activity in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2008, Vol. 60, No. 7, pp. 917- 924

[32] PARK, S. Y., LEE, H. J, YOON, W. J., KANG, G. J., MOON, J. Y., LEE, N. H., KIM, S. J., KANG, H. K., YOO, E. S. Inhibitory effects of eutigosides isolated from Eurya emarginata on the inflammatory mediators in RAW264.7 cells. Archives of Pharmacal Research, 2005, Vol. 28, No. 11, pp. 1244-1250 [33] CHUNG, I. M., KIM, J. J., LIM, J. D., YU CH. Y., KIM, S. H., HAHN, S. J. Comparison of resveratrol, SOD activity, phenolic compounds and free amino acids in Rehmannia glutinosa under temperature and water stress. Environmental and Experimental Botany, 2006, Vol. 56, No. 1, pp. 44-53 [34] LIN, L. C., CHIOU, W. F., CHOU, C. J. Phenylpropanoid glycosides from Orobanche caerulescens. Planta Medica, 2004, Vol. 70, No. 1, pp. 50-53 [35] SAADOUN, I., HAMEED, K. M. Antibacterial activity of Orobanche cernua extract. Journal of Basic Microbiology, 1999, Vol. 39 , No. 5-6, pp. 377-380 [36] CHIOU, W. F., LIN, L. C., CHEN, C. F. Acteoside protects endothelial cells against free radical-induced oxidative stress. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2004, Vol. 56, No. 6, pp. 743-748 [37] CHEN, CH. H., LIN, Y. S., CHIEN, M. Y., HOU, W. CH., HU, M. L. Antioxidant and antihypertensive activities of acteoside and its analogs. Botanical Studies, 2012, Vol. 53, pp. 421-429 [38] KIM, K. H., KIM, S., JUNG, M. Y., HAM, I. H., WHANG, W. K. Anti- inflammatory phenylpropanoid glycosides from Clerodendron trichotomum leaves. Archives of Pharmacal Research, 2009, Vol. 32, No. 1, pp. 7-13 [39] LEE, J. H., LEE, J. Y., KANG, H. S., JEONG, CH. H., MOON, H., WHANG, W. K. The effect of acteoside on histamine release and arachidonic acid release in RBL-2H3 mast cells. Archives of Pharmacal Research, 2006, Vol. 29, No. 6, pp. 508-513 [40] SCHAPOVAL, E. E., VARGAS, M. R. W. de, CHAVES, C. G., BRIDI, R., ZUANAZZI, J. A., HENRIQUES, A. T. Antiinflammatory and antinociceptive activities of extracts and isolated compounds from Stachytarpheta cayennensis. Journal of Ethnopharmacology, 1998, Vol. 60, No. 1, pp. 53-59 [41] NAKAMURA, T., OKUYAMA, E., TSUKADA, A., YAMAZAKI, M., SATAKE, M., NISHIBE, S., DEYAMA, T., MORIYA, A., MARUNO, M., NISHIMURA, H. Acteoside as the analgesic principle of cedron (Lippia triphylla), a Peruvian medicinal plant. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1997, Vol. 45, No. 3, pp. 499-504 [42] MORIKAWA, T., PAN, Y., NINOMIYA, K., IMURA, K., MATSUDA, H., YOSHIKAWA, M., YUAN, D., MURAOKA, O. Acylated phenylethanoid oligoglycosides with hepatoprotective activity from the desert plant Cistanche tubulosa. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 18, No. 5, pp. 1882-1890 [43] OYOUROU, J. N., COMBRINCK, S., REGNIER, T., MARSTON, A. Purification, stability and antifungal activity of verbascoside from Lippia javanica and Lantana camara leaf extracts. Industrial Crops and Products, 2013, Vol. 43, pp. 820- 826 [44] KOO, K. A., SUNG, S. H., PARK, J. H., KIM, S. H., LEE, K. Y., KIM, Y. CH. In vitro neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides from Callicarpa dichotoma. Planta Medica, 2005, Vol. 71, No. 8, pp. 778-780

[45] ZHOU, B. N., BAHLER, B. D., HOFMANN, G. A., MATTERN, M. R., JOHNSON, R. K., KINGSTON, D. G. I. Phenylethanoid glycosides from Digitalis purpurea and Penstemon linarioides with PKCα-Inhibitory activity. Journal of Natural Products, 1998, Vol. 61, No. 11, pp. 1410-1412 [46] TAM, W. Y., CHEN, Z. Y., HE, Z. D., YAO, X., LAU, CH. W., HUANG, Y. Enhancement of contraction of rat mesenteric artery by acteoside: Role of endothelial nitric oxide. Journal of Natural Products, 2002, Vol. 65, No. 7, pp. 990-995 [47] KLOUDA, P. Moderní analytické metody. 2. vyd. Ostrava: Nakladatelství Pavel Klouda, 2003. 132 s. ISBN: 80-90-2155-1-3. s. 25-26,43, 50 [48] DOUŠA, M. HPLC. CZ. In: hplc.cz [online]. 1999-2013 [cit. 2013-04-22]. Dostupné z: http://hplc.cz/ [49] TERYOKHIN, E. S. Weed broomrapes, systematics, ontogenesis, biology, evolution. Annals of Botany, 1997, pp. 243 [50] LEUGNEROVÁ, G. Orobanche flava Mert. ex F. W. Schultz - záraza devětsilová/záraza červenožltá. In: Botany.cz [online]. 2007 [cit. 2012-08-13]. Dostupné z: http://botany.cz/cs/orobanche-flava/ [51] YOSHIKAWA, M., MATSUDA, H., MORIKAWA, T., XIE, H., NAKAMURA, S., MURAOKA, O. Phenylethanoid oligoglycosides and acetylated oligosugars with vasorelaxant activity from Cistanche tubulosa. Bioorganic and Medical Chemistry, 2006, Vol.22, No. 14, pp. 7468-7475. [52] TU, P. F., SHI, H. M., SONG Z. H., JIANG, Y., ZHAO, Y. Y. Chemical constituents of Cistanche sinensis. Journal of Asian Natural Products Research, 2007, Vol. 1, No. 9, pp. 79-84.