Carlos Costa Ioc Mest 2018.Pdf
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MINISTÉRIO DA SAÚDE FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ INSTITUTO OSWALDO CRUZ Mestrado no Programa de Pós-Graduação Biologia Computacional e Sistemas GENOMA MITOCONDRIAL DE SIMULIUM SPP. E ONCHOCERCA VOLVULUS DA AMAZÔNIA BRASILEIRA CARLOS HENRIQUE AGUIAR COSTA Rio de Janeiro Março de 2018 INSTITUTO OSWALDO CRUZ Programa de Pós-Graduação em Biologia Computacional e Sistemas Carlos Henrique Aguiar Costa Genoma mitocondrial de Simulium spp. e Onchocerca volvulus na Amazônia brasileira Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Computacional e Sistemas Orientador: Dr(a). Ana Carolina Paulo Vicente RIO DE JANEIRO Março de 2018 INSTITUTO OSWALDO CRUZ Programa de Pós-Graduação em Biologia Computacional e Sistemas CARLOS HENRIQUE AGUIAR COSTA Genoma mitocondrial de Simulium spp. e Onchocerca volvulus na Amazônia brasileira Orientadora: Dra. Ana Carolina Paulo Vicente Aprovado em: 22/03/2018 Examinadores: Prof. Dr. Thiago Estevam Parente Martins - IOC/FIOCRUZ (Presidente) Prof. Dr. Adeilton Alves Brandão - IOC/FIOCRUZ Prof. Dr. André Elias Rodrigues Soares - LNCC/RJ Prof. Dr. Marcos Paulo Catanho de Souza - IOC/FIOCRUZ Prof. Drª. Nicole de Miranda Scherer - INCA/RJ RIO DE JANEIRO Março de 2018 "Para minha família" I AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais, Felício e Perina, e aos meus irmãos, Angelo, Angélica e Rosângela, por sempre me apoiarem nos meus projetos e sonhos, sempre me mantendo com o pé no chão e a cabeça erguida, me ensinando meus valores éticos e morais. À minha orientadora, Ana Carolina Paulo Vicente, pela oportunidade de desenvolver este projeto junto ao grupo do Laboratório de Genética Molecular e Microorganismos. Aos meus colegas de laboratório: Liliane, Sérgio, Fernanda e Érica. Por todo apoio dentro e fora de laboratório. Ao pessoal do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD, pelo apoio direto e indireto na realização deste projeto. Aos membros da coordenação da Pós-Graduação em Biologia Computacional e Sistemas, pela ajuda e atenção durante esses dois anos de Mestrado. À agência de fomento, Capes, por financiar este projeto. II INSTITUTO OSWALDO CRUZ GENOMA MITOCONDRIAL DE SIMULIUM SPP. E ONCHOCERCA VOLVULUS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA RESUMO DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM BIOLOGIA COMPUTACIONAL E SISTEMAS CARLOS HENRIQUE AGUIAR COSTA As espécies de simulídeos são vetores de filárias, como as do gênero Onchocerca e Mansonella, que são os agentes etiológicos da oncocercose e mansonellose, respectivamente. Essas duas filárias ocorrem na região Amazônica brasileira e são transmitidas pelas seguintes espécies de vetores: Simulium incrustatum, S. limbatum, S. oyapockense, S. exiguum, S. guianense, e S. roraimense. As espécies de Simulium tem sido designada com base em caracteres morfológicos, os quais, em alguns casos, não são bem discriminativos. Recentemente, o gene mitocondrial Citocromo c-oxidase 1 (CO1) e a região nuclear Internal Transcribed Spacer (ITS) tem sido utilizados para descriminar espécies e definir populações dentro deste gênero. Entretanto, existe um grande gap acerca da informação genética de Simulium, o qual é considerado a linha de base para estudos ecológicos e populacionais. Considerando este cenário, nosso objetivo foi aplicar a metagenômica para recuperar genomas mitocondriais de amostras brasileiras S. incrustatum e S. oyapockense do foco de oncocercose e também a informação genética a respeito de seus microbiomas. O DNA total de dez simulídeos, morfologicamente identificados como S. incrustatum (3) e S. oyapockense (7) foram sequenciados randomicamente na plataforma Illumina HiSeq 2500. Nós recuperamos dez genomas mitocondriais com cobertura média de 15,591 bp e conteúdo médio de GC de 22,94 %, apresentando o mesmo conteúdo gênico e em sintenia. Baseado nestes mitogenomas, no gene mitocondrial CO1, e também na região nuclear (ITS), realizamos análises filogenéticas que mostraram a presença de três espécies conhecidas dentre as amostras: S. incrustatum, S. oyapockense e S. guianense, e também um grupo de amostras pertencentes à Simulium spp. Nós também recuperamos um genoma mitocondrial de Onchocerca volvulus da amostra aqui identificada como S. guianense. Análises filogenéticas baseadas neste genoma mitocondrial mostraram sua relação próxima com uma O. volvulus de um caso clínico da Amazônia brasileira. Análises taxonômicas do microbioma dos simulídeos revelaram Proteobacteria e Ascomycota como os filos mais abundantes. A análise funcional revelou que a família de enzimas das Transcriptases Reversas são as mais abundantes. Portanto, nós contribuímos com informação genética original preenchendo parte do viés a respeito das espécies de Simulium associadas ao foco brasileiro de oncocercose. III INSTITUTO OSWALDO CRUZ MITOCHONDRIAL GENOME OF SIMULIUM SPP. AND ONCHOCERCA VOLVULUS FROM BRAZILIAN AMAZON ABSTRACT MASTER DISSERTATION THESIS IN BIOLOGIA COMPUTACIONAL CARLOS HENRIQUE AGUIAR COSTA Simulium species are filarial vectors, such as those from Onchocerca and Mansonella genus that are the etiological agents of onchocerciasis and mansonelliasis, respectively. These two filariasis occur in the Brazilian Amazon region and are transmitted by the following vector species: Simulium incrustatum, S. limbatum, S. oyapockense, S. exiguum, S. guianense, and S. roraimense. Simulium species have been assigned based on morphological characters, which are not well discriminative in some cases. Recently, the mitochondrial gene Cytochrome c-oxidase 1 (CO1) and the nuclear Internal Transcribed Spacer (ITS) have been used to discriminate species and define populations within this genus. However, there is an enormous gap concerning Simulium genetic information, which is the base line for population and ecological studies. Considering this scenario, our aim was to apply metagenomics to recover mitochondrial genomes from S. incrustatum and S. oyapockense samples of the Brazilian onchocerciasis focus as well as the genetic information concerning their microbiome. Total DNA from ten simuliids morphologically identified as S. oyapockense (7) and S. incrustatum (3) were shotgun sequenced in the Illumina HiSeq 2500 Platform. We recovered ten simuliids mitochondrial genomes with an average length of 15,591 bp, and an average GC content of 22.94%, presenting the same gene content and synteny. Based on these mitogenomes, the CO1 mitochondrial gene, and the nuclear region (ITS) we performed phylogenetic analyses that showed the presence of three known species among the samples: S. incrustatum, S. oyapockense and S. guianense, and a group of samples belonging to Simulium spp. We also recovered an O. volvulus mitochondrial genome from the sample identified here as S. guianense. Phylogenetic analysis based on this mitochondrial genome showed its close relationship with a clinical O. volvulus from the Brazilian Amazon region. Taxonomic analysis of the simuliids microbiome revealed Proteobacteria and Ascomycota as the most abundant phyla. Functional analysis showed that Reverse Transcriptase was the most abundant protein family. Therefore, we contributed with original genetic information filling part of the gap concerning the Simulium species associated to the Brazilian Onchocerciasis focus. IV ÍNDICE RESUMO ................................................................................................................................... III ABSTRACT ............................................................................................................................... IV 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 1 1.1. Simulídeos ........................................................................................................... 2 1.3. Endossimbiontes de Insetos e Nemátodos............................................................. 3 1.3.1. Endosimbionte Wolbachia em simulídeos ..................................................... 5 1.4. Espécies de Simulium spp. no foco Amazônico de Oncocercose ............................ 5 1.5. Abordagens genética na identificação de simulídeos ............................................ 5 1.5.1. Sequências de genomas mitocondriais de simulídeos .................................... 6 1.6. Sequenciamento de Alto Desempenho (HTS) e Metagenômica............................. 6 1.7. Controle de qualidade de dados de sequenciamento ............................................ 6 1.8. Mapeamento e Identificação Taxonômica das reads. ........................................... 7 1.9. Montagem de genomas ........................................................................................ 8 1.10. Anotação de Genomas ...................................................................................... 9 1.10.1. Anotação de Metagenomas ........................................................................... 9 2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 11 2.1. Objetivo Geral ................................................................................................... 11 2.2. Objetivo Específico ............................................................................................ 11 3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................. 12 3.1. Obtenção das amostras de Simulium oyapockense e Simulium incrustatum infectadas com filárias .................................................................................................