DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Bidens Pilosa E

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA VEGETAL

ANNY CAROLYNE DA LUZ

DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Bidens pilosa E Tithonia diversifolia NO ESPÍRITO SANTO E RESPOSTAS DO METABOLISMO PRIMÁRIO E SECUNDÁRIO SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE FERTILIZAÇÃO E IRRIGAÇÃO

VITÓRIA - ES

2018

ANNY CAROLYNE DA LUZ

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biologia Vegetal do Centro de Ciências Humanas e Naturais da Universidade Federal do Espírito Santo como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Biologia Vegetal.

Área de concentração: Fisiologia Vegetal.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria do Carmo Pimentel Batitucci

VITÓRIA - ES 2018

[PÁGINA DA FICHA CATALOGRÁFICA]

ANNY CAROLYNE DA LUZ

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal do Centro de Ciências Humanas e Naturais da Universidade Federal do Espírito Santo como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Biologia Vegetal na área de concentração Fisiologia Vegetal.

Aprovada em 22 de março de 2018.

Comissão Examinadora:

______Drª. Maria do Carmo Pimentel Batitucci - PPGBV/UFES Orientadora e Presidente da Comissão

______Dr. Elias Terra Werner- PPGBV/UFES Examinador Interno

______Dr. Jose Aires Ventura - PPGBV/UFES Examinador Interno

______Drª. Sarah Maria Vargas - PPGBAN/UFES Examinadora Externa

______Drª. Rita de Cássia Ribeiro Gonçalves - PPGFAR/UFES Examinadora Externa

“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota.” Theodore Roosevelt

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal do Espírito Santo por possibilitar a realização do meu Doutorado e toda minha formação acadêmica, desde a graduação.

À Fapes pelo financiamento da pesquisa e manutenção da minha bolsa, e pelo seu papel como grande fomentadora da ciência no estado do Espírito Santo.

Aos membros da banca examinadora que aceitaram realizar a avaliação da tese, contribuindo com suas sugestões.

À Do Carmo, minha paciente orientadora, uma mulher inspiradora, exemplo de sensatez e ética neste ambiente acadêmico tão corrompido pela falsa sensação de poder. Sempre disposta a compartilhar tudo que sabe, sem deixar de dar ouvidos as nossas ideias, valorizando a cada um de nós, alunos. E mais que isso, nos defendendo. Do Carmo, obrigada por tudo, pelos ensinamentos profissionais e pessoais, obrigada por reconhecer meus esforços e dedicação, obrigada por acompanhar tudo tão de perto, há 12 anos! Obrigada por me dar o privilégio de ser amiga de uma pessoa tão admirável.

À Irany, a irmã que escolhi, a grande incentivadora da escolha do meu Doutorado, a minha companheira de jornada biológica e minha consultora ad hoc. Obrigada por todas as milhões de dúvidas - com ou sem sentido - que me esclareceu, por todas as horas, dias, meses e anos de bancada, de leitura, releitura de acertos e de erros. Obrigada por me ajudar a trilhar meus caminhos e a tomar as decisões mais difíceis, sendo sempre sincera no que achava que era melhor para mim.

Mainã, a mãe da paciência e da parcimônia, obrigada por me ajudar tanto com afinco e critério. Obrigada por discutir os géis, os pcr’s, os DNAs e choros. Quem disse que o RAPD é simples? Obrigada pela sua amizade e por sua disponibilidade.

Miriele, Jean e Juliana, obrigada por toda ajuda no protocolos que desenvolvemos no laboratório, pelo companheirismo e ouvidos para as minhas perguntas.

À toda nossa equipe de laboratório, Suiany, Monique, Gillian, Crist, Judá, Sávio, Alex, obrigada pelo ambiente fraterno em que vivemos, afinal a gente mora na UFES, e por sempre estarem dispostos à ajudar. Obrigada por tantas conversas e risadas que deixaram mais leves esse período de tanto trabalho.

À todos os laboratórios e equipes que tornaram possível a realização de todas as análises. Ao NGACB e aos professores responsáveis pelo laboratório, onde realizei as amplificações e análises de géis, com a colaboração da bióloga Juliana Justino, muitíssimo competente e paciente. Ao LABIOM, laboratório sob responsabilidade do Professor Alexandre, onde realizei as análises de HPLC com o auxílio das técnicas Caroline e Natércia. Agradeço também ao Leonardo Valandro, pela ajuda com o uso do IRGA.

Agradeço à minha mãe, minha fortaleza, ainda que não entendesse minhas escolhas, me apoiou e me apoia. Sem você, eu não teria possibilidades de chegar até aqui. Obrigada por sempre me colocar de pé, me acalmar e enxugar minhas lágrimas.

Ao meu marido, pela paciência nesses tensos últimos dias, pelo companheirismo e dedicação. E, principalmente, obrigada por entender a minha necessidade de estar ausente em tantos momentos.

RESUMO

Bidens pilosa L. e Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray são plantas da família Asteraceae com distribuição nas regiões tropicais e subtropicais. São plantas utilizadas para diversos fins terapêuticos, principalmente como anti-inflamatória, anti- séptica, hepratoprotetoras e na prevenção do cancêr. As plantas dessa família apresentam um complexo sistema de defesa química, com metabólitos secundários derivados: compostos fenólicos, flavonoides, lactonas serquiterpênicas e poliacetilenos. Estes compostos têm sua produção e acúmulo modificados em resposta às variações ambientais, ontogenéticas e também hereditárias. Assim, é importante controlar e padronizar todas as etapas envolvidas na produção de fitofármacos, desde a seleção do material vegetal inicial, as condições de cultivo, manejo pós-colheita e métodos de extração dos compostos bioativos. Os objetivos deste estudo foram avaliar através de marcadores genéticos, do tipo RAPD, a diversidade genética de diferentes populações de B. pilosa e T. diversifolia. Bem como, analisar como o manejo das condições de crescimento pode influenciar o crescimento, os parâmetros fotossintéticos, a produção de metabólitos secundários, a atividade antioxidante e citotóxica dessas plantas. Bidens pilosa apresentou baixos níveis de similaridade, indicando que o agrupamento encontrado não está apenas relacionado com a localização geográfica, mas, provavelmente, com a dispersão de sementes através de animais e a contaminação de espécies cultivadas com sementes de B. pilosa, o que facilitou o fluxo gênico, possibilitando que as populações de locais distantes fossem agrupadas em um cluster mais próximo devido à sua origem comum. Nas análises de T. diversifolia foram encontrados altos níveis de diversidade genética, não positivamente correlacionado com a proximidade geográfica. Apesar de muitas vezes ser propagada através de estaquia, T. diversifolia se reproduz sexuadamente, com grande número de sementes e apresenta uma abundante variedade de insetos polinizadores, características que contribuem para uma maior variabilidade genética. Em relação ao manejo das condições de crescimento, de modo geral, as aplicações de adubo aumentaram a fotossíntese e a massa seca total nas duas espécies estudadas. Entretanto, as plantas que não receberam adubação, apresentaram os maiores teores de compostos fenólicos e maior atividade antioxidante, o que pode estar relacionado à menor disponibilidade de nitrogênio. Esses resultados indicam que há aumento na

produção de metabólitos secundários quando a fotossíntese líquida decresce, consequência da regulação positiva do ácido chiquímico na via da pentose fosfato. As duas espécies não mostraram atividade citotóxica em linfócitos humanos, por outro lado diminuíram a viabilidade celular em sarcoma 180. Portanto, as análises indicam a possibilidade de se padronizar as formas de manejo no cultivo de Asteraceae, a fim de alcançar altos níveis de compostos fenólicos e de biomassa, atrelando o aumento da eficiência da atividade biológica com o aumento da produtividade. Palavras-chave: RAPD • compostos fenólicos • atividade antioxidante • picão preto • girassol mexicano • fotossíntese • HPLC • MTT • nutrição mineral • déficit hídrico

ABSTRACT

Bidens pilosa L. and Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray are plants of the Asteraceae family with distribution in tropical and subtropical regions. They are plants used for various therapeutic purposes, mainly anti-inflammatory, antiseptic, hepratoprotective and prevention of cancer. The plants of this family present a complex chemical defense system, with derived secondary metabolites: phenolic compounds, flavonoids, serquiterpene lactones and polyacetylenes. These compounds have their production and accumulation modified in response to environmental, ontogenetic and also hereditary variations. Thus, it is important to control and standardize all phases involved in the production of phytopharmaceuticals, from the selection of the initial plant material, the conditions of cultivation, post-harvest management and extraction methods of the bioactive compounds to final product. The objectives of this study were to evaluate using RAPD molecular markers, the genetic diversity of different populations of B. pilosa and T. diversifolia. Also analyze how the management of the growth conditions can influence the growth, the photosynthetic parameters, the production of secondary metabolites, the antioxidant and cytotoxic activity of these plants. B. pilosa presented low levels of similarity, indicating that the grouping found is not only related to the geographic proximity, but probably to the dispersion of seeds through of animals and the contamination of species cultivated with B. pilosa seeds, which facilitated the gene flow, enabling the population of distant sites to be grouped in a closer cluster due to their common origin. In the analyzes of T. diversifolia high levels of genetic diversity were found, not positively correlated with the proximity of geographic locations. Although it is often propagated by cuttings, T. diversifolia reproduces sexually, with a large number of seeds and presents an abundant variety of pollinators insects, characteristics that contribute to a greater variability genetic. Regarding the management of the cultivation conditions, in general, the fertilizer applications increased the photosynthesis and the total dry mass for the two species studied. However, the plants that did not receive fertilization had the highest levels of phenolic compounds and higher antioxidant activity, a result related to the lower availability of nitrogen to no fertilized plants. These results indicate that there is an increase in the production of secondary metabolites when liquid photosynthesis decreases, resulting from the positive regulation of the shikimic acid in the pentose

phosphate pathway. The species did not show cytotoxic activity in human lymphocytes while decreasing cell viability in sarcoma 180. It is important to standardize the management practices in Asteraceae cultivation in order to achieve high levels of phenolic compounds and biomass, linking the increasing of biological activity efficiency with increased productivity. Keywords: RAPD • phenolic compounds • antioxidant activity • black-jack • mexican sunflower • photosynthesis • HPLC • MTT • mineral nutrition • water déficit

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Perspectivas para os sistemas produtivos de plantas medicinais...... 19

Figura 2- Inflorescência, frutos e folhas de Bidens pilosa ...... 23

Figura 3 - Estrutura de poliacetileno de Bidens pilosa ...... 24

Figura 4- Flavonoides de Bidens pilosa...... 25

Figura 5 - Compostos fenólicos de Bidens pilosa ...... 25

Figura 6- Tithonia diversifolia ...... 27

Figura 7 - Metabólitos secundários de Tithonia diversifolia ...... 28

Figura 8 - Principais rotas do metabolismo secundário ...... 30

Figura 11 - Foto de gel de RAPD de amostras Tithonia diversifolia...... 38

Figura 12- Estrutura química da unidade básica do grupo Fenol ...... 40

Figura 13 - Rotas de síntese dos compostos fenólicos...... 41

Figura 14 - Atividade catalisadora da fenilalanina amônia liase ...... 42

Figura 16 - Exemplos de ácidos fenólicos simples ...... 44

Figura 17 - Estruturas químicas de ácidos fenólicos derivados do ácido cinâmico. .. 44

Figura 18 – Cinarina...... 45

Figura 20 - Unidade fundamental de flavonoide ...... 48

Figura 21 - Estrutura química da quercetina ...... 49

Figura 22 - Exemplos de classes de flavonoides ...... 50

Figura 23 - Ácido gálico e ácido elágico ...... 51

Figura 24 - Estrutura química de taninos condensados ...... 52

Figura 25 - Etapas da rota biossíntetica das cumarinas ...... 53

Figura 26 - Estabilização dos radicais livres DPPH• e ABTS• ...... 57

Figura 27 - Redução do complexo TPTZ com Fe3+ ...... 57

Figura 28 - Reação de redução do Fe3+ em Fe2+ ...... 58

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL ...... 15

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 17

2.1. PLANTAS MEDICINAIS: USO TRADICIONAL E PERSPECTIVAS DE PRODUÇÃO ...... 17

2.2. ASTERACEAE ...... 20

2.2.1. Bidens pilosa ...... 22

2.2.2. Tithonia diversifolia ...... 26

2.3. METABOLISMO PRIMÁRIO E SECUNDÁRIO: PROCESSOS INTEGRADOS ...... 29

2.4. DIVERSIDADE GENÉTICA DE PLANTAS MEDICINAIS E RAPD...... 35

2.5. COMPOSTOS FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ...... 40

2.5.1. Ácidos fenólicos ...... 43

2.5.2. Flavonoides ...... 45

2.5.3. Taninos ...... 51

2.5.4. Cumarinas ...... 52

2.6. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ...... 54

3. OBJETIVO GERAL ...... 61

4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 61

CAPÍTULO 1 – GENETIC DIVERSITY OF POPULATIONS OF Bidens pilosa L. AND Tithonia diversifolia HEMSL. AT ESPÍRITO SANTO ...... 63

CAPÍTULO 2 – DIFFERENT GROWTH CONDITIONS ON Bidens pilosa L. INDUCE CHANGES IN THE PHENOLIC COMPOUND CONTENT, BIOMASS, GAS EXCHANGE AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES...... 77

CAPÍTULO 3 - CHANGES ON THE PRIMARY AND SECONDARY METABOLITE ACCUMULATION AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF Tithonia diversifolia UNDER ORGANIC AND INORGANIC FERTILIZER ...... 103

CAPÍTULO 4 – INFLUÊNCIA DE DIFERENTES CONDIÇÕES DE FERTILIZAÇÃO NOS COMPOSTOS FENÓLICOS DE Tithonia diversifolia (HEMSL.) A. GRAY E SEUS EFEITOS CITOTÓXICOS EM LINFÓCITOS HUMANOS E SARCOMA 180 DE CAMUNDONGOS ...... 118

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 139

REFERÊNCIAS ...... 140

ANEXO A - CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DO COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ...... 150

ANEXO B - Parecer consubstanciado de aprovação pela comissão e ética em pesquisa ...... 151

1. INTRODUÇÃO GERAL

O uso de plantas medicinais remonta à 4.600 anos, sendo utilizado até hoje como terapia alternativa, ou até mesmo, como única forma de tratamento ao alcance de determinados grupos sociais. O consumo desses vegetais se dá, principalmente através da coleta e não do plantio, o que pode acarretar em desaparecimento de espécies, além não haver garantia da identificação botânica da planta e da asserção da presença dos compostos bioativos. O cultivo de plantas medicinais pode assegurar a padronização química do material vegetal, constância na sua oferta e certeza da espécie utilizada, aumentando a qualidade e segurança do produto fitoterápico, favorecendo, consequentemente, a aceitação e manutenção dos consumidores. Ademais, o cultivo de plantas medicinais auxilia na manutenção da biodiversidade. Diversas famílias botânicas que apresentam relevância medicinal podem ser cultivadas, entre elas Asteraceae, a qual pertencem as espécies Bidens pilosa e Tithonia diversifolia. Bidens pilosa é uma planta herbácea distribuída por toda zona intertropical do planeta, com diversos usos terapêuticos: atividade antidiabética, antimalárica, antitumoral, anticâncer, antimicrobiana, antioxidante e hepatoprotetora. Suas ações medicinais estão relacionadas à presença de ácidos fenólicos, flavonoides e poliacetilenos. Tithonia diversifolia é uma planta invasora, de porte arbóreo, nativa da América Central e México. É utilizada para o tratamento tradicional de diabetes, malária, mordida de cobra, sarampo, úlcera, diarreias entre outras. Seus principais constituintes químicos, aos quais são atribuídas as suas diversas ações farmacológicas, são os flavonoides, as lactonas sesquiterpências e os ácidos fenólicos. As ações terapêuticas os vegetais são relacionadas às substâncias produzidas por seu metabolismo secundário. Nas plantas, o metabolismo secundário e primário do carbono são interligados e balanceados por diferentes vias metabólicas, como a do ácido chiquímico, a do mevalonato, a via do ácido cítrico e a via de condensação do acetato. Diversas hipóteses tentam explicar o balanço entre o metabolismo secundário e primário, ou seja, as vantagens adaptativas do investimento da planta em defesa vegetal, visto que representam um custo energético. A maior parte delas defende que as concentrações de metabólitos secundários são negativamente correlacionadas com as taxas de crescimento, sendo esta relação entre metabolismo 16

primário e secundário dependente da competição por nutrientes, luz, carboidratos e pela fenilalanina. A produção de metabólitos secundários é o resultado da interação entre processos de síntese, transporte, armazenamento e degradação, controlados pela expressão gênica diferencial. Estes processos são determinados por três fatores principais: características genéticas, estágio de desenvolvimento do vegetal e variações ambientais. Portanto, a caracterização genética e química de espécies vegetais medicinais é importante para conservação dessas espécies e para a adoção de estratégias de seleção, melhoramento e uniformidade no cultivo que resultem em maior produtividade de metabólitos, garantindo matéria-prima padronizada e de qualidade para produção de fitoterápicos. O aumento da busca por terapias alternativas, produtos naturais, nutracêuticos, compostos bioativos de interesse farmacêutico e fitoterápico evidenciam ainda mais a importância de estudos que auxiliam na padronização da produção e acúmulo de metabólitos secundários de ação medicinal por plantas, promovendo a qualidade, segurança e eficácia no uso dessas substâncias.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. PLANTAS MEDICINAIS: USO TRADICIONAL E PERSPECTIVAS DE PRODUÇÃO Há milhares de anos o homem utiliza os recursos vegetais com fins terapêuticos, sendo que a primeira documentação escrita sobre o uso de ervas medicinais data do século 26 a.C., na Mesopotâmia (LONG et al., 2003). A utilização de plantas medicinais na recuperação da saúde tem evoluído ao longo dos tempos, desde as formas mais simples de tratamento tópico até as formas tecnologicamente sofisticadas da fabricação industrial (LORENZI; MATOS, 2002). O aumento do interesse por fitofármacos relaciona-se a vários fatores: contra- indicações e efeitos colaterais ocasionados pelo uso de fármacos sintéticos, dificuldade de acesso aos medicamentos por algumas camadas da população mundial e, até mesmo, a crença popular de que o natural é inofensivo (RATES, 2001). A atenção dirigida pelas autoridades e administrações de saúde para o uso de plantas medicinais aumentou consideravelmente nos últimos anos. Incentivos em investimentos públicos para políticas de uso e desenvolvimento de fármacos à base de plantas medicinais têm sido feitos pela OMS desde 1978, observando-se crescente aceitação da fitoterapia por profissionais de saúde da atenção básica (HOMAR, 2005). No Brasil, o uso das plantas medicinais implica frequentemente, na coleta de espécies em seus locais de ocorrência natural, sejam nativas ou exóticas (MING et al., 2003), o que pode levar ao seu desaparecimento em uma dada região. Somente 8% das espécies vegetais brasileiras existentes foram estudadas em termos de compostos bioativos. Portanto, com a rapidez em que tem ocorrido a extinção das espécies vegetais, um grande número de plantas com ações medicinais podem desaparecer antes de seu valor ser reconhecido (SIMÕES et al., 1999), tornando-se improrrogável o aumento de pesquisas nesta área do conhecimento. É incoerente que plantas medicinais utilizadas em larga escala, quer pela indústria farmacêutica e/ou por programas governamentais, sejam coletadas e não cultivadas. Contudo, essa é caracteristicamente a principal forma de obtenção 18

desses materiais vegetais. Poucas são as iniciativas e experiências no cultivo de espécies medicinais, principalmente, das nativas (MING et al., 2003). Ambientes com reduzida disponibilidade de recursos resultam em plantas que alocam mais substâncias para síntese de compostos fenólicos defensivos contra doenças, insetos ou outras injúrias, ao invés de investirem em crescimento (HERMS, 2002; RIIPI et al., 2002). Isso ajuda a difundir a ideia de que para possuir efeito terapêutico a planta deve ser coletada no seu ambiente natural. O que não é válido, visto que já é bastante comum o cultivo das plantas medicinais como, a sálvia (Salvia officinalis), a camomila (Matricaria recutita), a digitalis (Digitalis lanata), a ipeca (Psychotria ipecacuanha) e o jaborandi (Pilocarpus microphyllus) (MONTANARI, 2002). É importante considerar que as condições ideais para o desenvolvimento e produção de biomassa, nem sempre serão as mais adequadas para a produção de princípios ativos de interesse, pois muitas espécies produzem substâncias bioativas quando submetidas a condições de estresse (SIMÕES et al., 2017). A domesticação e o cultivo de plantas medicinais podem aliar o aumento da sua produção de metabólitos secundários e de sua produtividade. São inúmeras as vantagens do cultivo de plantas medicinais: padronização química do material vegetal, constância na sua oferta, asserção em relação à espécie utilizada - não ocorrendo troca de espécies como poderia haver em uma coleta, redução no risco de extinção, diminuição do desmatamento, entre outras (MING et al., 2003). O processo de domesticação e cultivo está atrelado ao aumento da importância econômica de uma espécie medicinal (Figura 1), favorecendo também, a sua validação terapêutica, segurança de uso e, consequente aumento da demanda e da população beneficiada.

Figura 1- Perspectivas para os sistemas produtivos de plantas medicinais.

TEMPO

MANEJO EXTRATIVISMO SUSTENTADO DOMESTICAÇÃO CULTIVO

1-VALIDAÇÃO CIENTÍFICA DO EFEITO TERAPÊUTICO 2- SEGURANÇA NO USO 3- AUMENTO DA POPULAÇÃO BENEFICIADA 4- CRESCIMENTO DA DEMANDA POR MATÉRIA PRIMA

5- AUMENTO DA IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DA ESPÉCIE Adaptado de: Montanari (2002)

O cultivo relaciona-se às atividades humanas na condução do processo agrícola, como adubação, poda, preparo do solo, irrigação. A domesticação, por sua vez, está ligada à resposta genética de plantas ou animais ao processo agrícola (MONTANARI, 2002). Um dos objetivos da domesticação das plantas medicinais é a seleção de indivíduos que se adaptem às condições de cultivo com alta produção de metabólitos secundários. Ao cultivar uma planta selvagem serão desencadeadas mudanças na estrutura genética da população manejada, através das sucessivas gerações cultivadas. Estas mudanças são uma resposta evolutiva da população, que antes estava sujeita às pressões naturais de seleção e que sob cultivo estão sujeitas a pressões diferentes, causadas pelo homem, aumentando, com isso, o grau de parentesco entre as plantas, tornando-as mais uniformes (PETERS, 1994). Além da importância da manutenção da biodiversidade, vale considerar que o cultivo e domesticação de plantas medicinais aumentam a qualidade e segurança do produto fitoterápico, favorecendo a aceitação e a manutenção dos consumidores. Assim, é importante controlar e padronizar todas as etapas envolvidas na produção de fitofármacos, como a seleção do material vegetal inicial, as condições de cultivo, métodos de extração, e a quantificação de metabolitos secundários ou compostos bioativos no produto final (BOTT et al., 2010) 20

Várias famílias botânicas são consideradas de importância medicinal, entre as quais encontra-se a Asteraceae, a qual pertencem as espécies Bidens pilosa e Tithonia diversifolia, conhecidas por picão-preto e girassol-mexicano, respectivamente (LORENZI ; SOUZA 1999), que são plantas listadas na Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (RENISUS) (BRASIL, 2009).

2.2. ASTERACEAE As Asteraceae encontram-se disseminadas por todos os continentes, exceto Antártica, com representação mais ampla nas regiões temperadas e semi-áridas dos trópicos e subtrópicos (ROQUE; BAUTISTA, 2008), sendo muitas de suas espécies invasoras (BERETTA et al., 2008). Hodgins et al., (2015) sugerem que múltiplas vias evolutivas podem levar à adaptação durante a introdução e disseminação das espécies de Asteraceae nos diferentes ambientes.

Asteraceae é uma da família vegetal bem sucedida, possui cerca de 23.000 espécies e 1.600 gêneros (ANDERBERG et al., 2007) e representa 10% do total da flora de angiospermas (WILSON, 1988). No Brasil, existem aproximadamente 2.000 espécies e 250 gêneros (SOUZA; LORENZI, 2008). Esses números são consequência da alta diversificação de suas espécies, não somente em hábitat e forma de vida, como também nos métodos de polinização e dispersão de sementes (CRONQUIST, 1981).

Seu sucesso evolutivo também é atribuído a um desenvolvido sistema químico de defesa, que inclui a produção combinada de compostos secundários derivados (CRONQUIST, 1988), tais como: terpenoides como as lactonas sesquiterpênicas, alcaloides, fenóis e poliacetilenos. Além de sua importância ecológica, os compostos bioativos de Asteraceae tornam essa família relevante em aspectos bioquímicos, econômicos e farmacológicos (CHADWICK et al., 2013; HEINRICH et al., 1998).

As lactonas sesquiterpênicas são um grupo de metabólitos secundários encontrados em todo o reino Plantae, compreendendo mais de 5.000 compostos conhecidos (WEDGE et al., 2000). No entanto, eles são prevalentes em Asteraceae, onde podem ser encontrados quase de forma ubíqua (PICMAN, 1986) e são considerados marcadores taxonômicos (HRISTOZOV et al., 2007; SEAMAN, 1982; 21

ZDERO; BOHLMANN, 1990), tendo sua produção altamente controlada em nível de tradução (CHADWICK et al., 2013).

As lactonas sequiterpênicas reduzem danos oxidativos, podendo desempenhar um papel significativo na saúde humana. Apresentam potencial para o tratamento de doenças cardiovasculares e câncer, uma vez que sensibilizam células tumorais para tratamentos com drogas convencionais (CHADWICK et al., 2013).

Além das lactonas sesquiterpênicas, outro grande grupo de metabólitos secundários de Asteracerae são os poliacetilenos, que também são considerados marcadores taxônomicos para a família, caracterizando as suas várias tribos por meio de conjuntos individuais de metabólitos de acetileno, especialmente para o complexo de espécies do gênero Bidens (GROMBONE-GUARATINI et al., 2005 KONOVALOV, 2014). Mais de 1.100 tipos de poliacetilenos já foram identificados em plantas desta família (KONOVALOV, 2014). Os compostos de poliacetileno da família Asteraceae possuem efeitos citotóxicos, antimicrobianos, antiinflamatórios, neurotóxicos, fototóxicos (KONOVALOV, 2014).

Os compostos fenólicos também apresentam significativas funções ecológicas e medicinais nestas plantas. Estas substâncias possuem, no mínimo, um anel aromático em que pelo menos um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila. Tais compostos são produzidos por plantas e microorganismos e fazem parte do metabolismo animal, que necessitam obtê-los através da alimentação (SIMÕES et al., 1999).

Os compostos fenólicos são atrativos para animais - tendo função na polinização e dispersão de sementes - apresentam atividade alelopática e protegem as plantas contra os raios UV, insetos, fungos, vírus e bactérias (STRACK, 1997). Além disso, possuem diversas propriedades medicinais: antibacteriana, imuno- regulatória, expectorante, clareadora da pele, hipocolesterolêmica, hepatoprotetora, analgésica e atividade antioxidante (SIMÕES et al., 1999).

Segundo o sistema de classificação proposto por Anderberg et al., (2007), Asteraceae é dividida em 2 subfamílias (Lacticoideae e Asteroideae) e 17 tribos, das quais, 8 são da primeira (Lactuceae, Mutisieae, Eremothamanceae, Arctotideae, Carduceae, Vernonieae, Liabeae e Eupatorieae) e 9 são da segunda subfamília 22

(Senecioneae, Tageteae, Heliantheae, Inuleae, Anthemideae, Ursineae, Calenduleae, Cotuleae e Astereae) .

Relações taxonômicas têm sido propostas dentro da tribo Heliantheae, bem como com outras tribos, tendo como base sua composição de metabólitos secundários (CHRISTENSEN; LAM, 1991; JENSEN; SÖRENSEN; LARSEN, 1961). O interesse nesses compostos vai além da quimiotaxonomia, as atividades biológicas das substâncias predominantes na tribo são crescentemente investigadas (ARIDOAN, 2006). Bidens pilosa e Tithonia diversifolia são duas espécies da família Asteraceae, com interesse medicinal, que pertencem à tribo Heliantheae (FERNANDES; RITTER, 2009; MOURA; ROQUE, 2014).

2.2.1. Bidens pilosa O gênero Bidens é composto por cerca de 230 espécies de porte herbáceo, a maioria com hábitos ruderais, distribuídos ao longo de toda a zona intertropical do planeta (LORENZI, 2000). Suas espécies apresentam diversos usos: antitérmico, analgésico, hepatoprotetor (JÄGER; HUTCHINGS; VAN STADEN, 1996; MORTON, 1981), contra tumores de mama, espleno esclerose, dores de garganta, problemas de estômago e asma (HARTWELL, 1982; REDL; DAVIS; BAUER, 1992), ação anti- inflamatória (REDL et al., 1994) e antiulcerogênica (DE LA LASTRA et al., 1994).

Bidens pilosa L., conhecida popularmente como picão-preto, é uma erva pequena, anual, com altura de 50 a 130 cm, com inflorescências em capítulos terminais com flores tubulares e radiadas, frutos são aquênios, alongados de cor preta e ganchos aderentes em uma das extremidades (Figura 2A) ramificada desde a base, possui talos tetragonais, é glabra, apresenta folhas opostas, pecioladas, bordas serrilhadas (Figura 2B) e (LORENZI; MATOS, 2002).

Figura 2- Inflorescência, frutos (A) e folhas (B) de Bidens pilosa.

A B

Fonte: Flora of Kaxil Kiuic

Bidens pilosa possui seis variedades, sendo que três destas ocorrem no Brasil: pilosa, minor e radiata (SHERFF, 1937). Juntamente à análise das características morfológicas, a identificação de B. pilosa pode ser realizada através da quimiotaxonomia e da caracterização molecular (CHIEN et al., 2009).

Em todo o mundo, Bidens pilosa tem uma longa tradição na medicina popular para tratamento de várias doenças, sendo utilizados diversos tipos de preparações a partir das diferentes partes do vegetal (XUAN; KHANH, 2016).

As ações terapêuticas de B. pilosa estão geralmente associadas à presença de compostos fenólicos, como os flavonoides, e também aos poliacetilenos, ambos abundantes em nesta espécie (SILVA et al., 2011; UBILLAS et al., 2009; WANG et al., 2010). É conhecida sua atividade antidiabética (CHIEN et al., 2009) antitumoral (KVIECINSKI et al., 2008), anticâncer (KUMARI et al., 2009), antimicrobiana (CORTÉS-ROJAS et al., 2013), antimalárica (ANDRADE-NETO et al., 2004; KUMARI et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2004), hepatoprotetora (KVIECINSKI et al., 2011), antioxidante (KRISHNAIAH et al., 2011). E, é usada para o tratamento da icterícia, condição certificada pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) (BRASIL, 2010).

Já foram isolados 34 compostos acetilenos de Bidens pilosa, seno os poliacetilenos com 13 carbonos os mais frequentes (BOHLMANN; BURKHARDT; ZDERO, 1973; CHRISTENSEN; LAM, 1991; TOWERS; WAT, 1978; WAT et al., 24

1979), dentre estes o mais representativo é o 1-fenilepta-1,3,5-tri-ino (Figura 3), um composto foto-ativado que absorve radiação ultravioleta e está presente em folhas, caules e raízes (JENSEN; SÖRENSEN; LARSEN, 1961; TOWERS; WAT, 1978; WAT; JOHNS; TOWERS, 1980; WAT et al., 1979). Também foi isolado de B. pilosa um grupo de poliacetilenos glicosídeos, que são portadores de um radical de glicose ou ramose, através de uma ligação -O- glicosídica (GANJEWALA et al., 2008; MEYER, 2002).

Figura 3 - Estrutura de poliacetileno de Bidens pilosa (1-fenilepta-1,3,5-tri-ino)

O perfil de flavonoides de B. pilosa inclui auronas, chalconas, flavanonas, flavonas e flavonóis com uma ampla variedade nos padrões de O-metilação e glicosilações (BOHM; STUESSY, 2001). Entre as flavonas e flavonóis encontrados em B. pilosa, a maior parte deles são glicosídeos de apigenina, luteolina, kaempferol e quercetina (Figura 4) (BOHM; STUESSY, 2001; XUAN; KHANH, 2016).

Figura 4- Flavonoides de Bidens pilosa. (A) Apigenina 7-O-glucosídeo, (B) 2-(3,4-Dihidroxifenil)-5,7- dihidroxi-4H-1-benzopiran-4-ona (luteolina), (C) Kaempferol-3-O-β-D-glucopiranósido e (D) Quercetina-3,6,3’-trimetil-eter-7-O-훽-glucosídeo.

A B

C D

Muitos outros compostos são encontrados em Bidens pilosa, entre eles vale destacar os hidrocarbonetos aromáticos simples, dos quais derivam os ácidos vanílico, salicílico e protocatecuico, bem como os fenilpropanóides e seus ácidos fenólicos derivados: ácido coumárico, ferúlico, clorogênico, tânico, gálico e cafeoilquínico (Figura 5) (DEBA et al., 2007; XUAN; KHANH, 2016). São também descritos para a espécie os seguintes metabólitos da via do mevalônico: esteróis, monoterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos e sesquiterpenos (ARROYO et al., 2008; ARROYO; BONILLA; BARREDA, 2010; ATTA; MOUNEIR, 2005; SILVA et al., 2011; XUAN; KHANH, 2016).

Figura 5 - Compostos fenólicos de Bidens pilosa: (A) Ácido Clorogênico e (B) Ácido Gálico.

A B

Os metabólitos secundários de Bidens pilosa podem apresentar variações por diversos fatores bióticos ou abióticos. CORTÉS-ROJAS et al. (2013) mostraram que 26

espécimes de B. pilosa, de seis localidades, apresentaram diferenças nos perfis cromatográficos, na atividade antioxidante e nos teores totais de taninos e flavonoides, com forte correlação entre esses teores e a atividade antioxidante. Além disso, ANDRADE-NETO et al., (2004), observaram que a atividade antimalárica in vitro de B. pilosa apresentou significativa variação em relação à época em as plantas eram coletadas, sendo afetadas pelas condições do solo e estação seca ou chuvosa. Com o exposto, torna-se evidente a importância da análise de condições de cultivo que induzam a maior produção de metabólitos secundários com ação biológica em Bidens pilosa.

2.2.2. Tithonia diversifolia O gênero Tithonia, assim como Bidens, pertence à tribo Heliantheae, é nativo do México e América Central (CHAGAS-PAULA, et al., 2012) e compreende 13 espécies (BARUAH et al., 1979; KUO; CHEN, 1998; PEREIRA et al., 1997; PÉREZ, A.L.C.; LARA, M.O.; DE VIVAR, 1992). As espécies deste gênero são anuais ou perenes, e podem ser herbáceas, arbustivas ou árvores. Uma característica importante dessas plantas são suas inflorescências, na maior parte das vezes solitárias, hermafroditas e com corola amarela (CHAGAS-PAULA, et al.,2012). Neste gênero, os constituintes químicos principais são lactonas sesquiterpênicas, diterpenos e flavonoides (AMBRÓSIO et al., 2008; CHAGAS-PAULA et al., 2012; YEMELE BOUBERTE et al., 2006), sendo sua espécie mais estudada a Tithonia diversifolia, com aproximadamente 150 compostos isolados (CHAGAS-PAULA, et al., 2012).

Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray é conhecida como girassol mexicano, margaridão, mão-de-deus, entre outros nomes populares. É uma planta invasora, nativa da América Central e México, podendo atingir entre 1,2 e 5 metros, apresenta folhas simples alternadas, pecioladas, com 7 a 20 cm de comprimento e com 4 a 20 cm de largura, bordas serreadas e face abaxial vilosa. Suas flores são capítulos terminais solitários, com brácteas amarelo alaranjadas de 3 a 6 cm de extensão (Figura 6). Pode ser anual, bianual ou perene, dependendo de seu habitat (AKINOLA et al., 2000; ALVES; ROQUE, 2016; KATTO; SALAZAR, 1995).

Figura 6- Tithonia diversifolia. (A) Visão geral da planta com capítulos. (B) Detalhes da inflorescência e as folhas acuminadas e serreadas.

A B

Fonte: Plant Systematics

Na natureza, esta espécie se propaga por meio de sementes, podendo ser propagada também por estaquia, tolera condições de acidez do solo, apresenta rápido crescimento, baixa demanda por nutrientes e possui alta produtividade de biomassa (KATTO; SALAZAR, 1995).

Uma planta invasora, como T. diversifolia, pode apresentar vantagem frente às espécies nativas na comunidade invadida, em virtude de seus compostos secundários (ALLSTADT et al., 2012; WEIDENHAMER; CALLAWAY, 2010), que podem agir como agentes alelopáticos inibitórios (LI et al., 1993).

Tithonia diversifolia é amplamente utilizada em países da América Central, América do Sul, África e Ásia para o tratamento tradicional de doenças e enfermidades como diabetes, malária, mordida de cobra, sarampo, úlcera gástrica, diarreias, cólicas menstruais e feridas (AJAO; MOTEETEE, 2017). Muitas dessas ações biológicas já foram validadas cientificamente, por exemplo: ação tóxica ao protozoário causador da malária, antidiarreica, hepatoprotetora, preventiva contra o câncer, antiespasmódica, antidiabética, antiviral, citotóxica contra células tumorais, anti-inflamatória, inseticida e repelente (CHAGAS-PAULA, et al., 2012). Da mesma forma, é descrito que algumas doses e preparos dessa planta podem ser tóxicos (PASSONI et al., 2013). Além de medicinal, esta espécie é usada como ornamental, forrageira e, também, na fitorremediação e adubação do solo (CHAGAS-PAULA, et al., 2012; RIBEIRO et al., 2016; AJAO; MOTEETEE, 2017). 28

Os principais constituintes químicos de Tithonia diversifolia pertencem às classes das lactonas sesquiterpênicas, flavonoides (CHAGAS-PAULA et al., 2012) e compostos fenólicos derivados do ácido trans-cinâmico, principalmente o ácido cafeoilquínico (Figura 7) (ZHAO et al., 2012b).

Figura 7 - Metabólitos secundários de Tithonia diversifolia. (A) Lactona sesquiterpênica (tagitinin F-3- O-metil éter). (B) Luteolina. (C) Derivado de Ácido cafeoilquínico de Tithonia diversifolia (ácido 3,5- dicafeoilquínico).

A B

Alcaloides, flavonoides, fenóis, saponinas, taninos e terpenos são mais proeminentes nas folhas de Tithonia diversifolia, mas também ocorrem em suas raízes e caules (OLAYINKA; RAIYEMO; ETEJERE, 2015). Além das diferenças de produtividade e armazenamento de compostos secundários nos diferentes órgãos de T. diversifolia, outros fatores, como estádio de desenvolvimento vegetal e variações ambientais afetam o metabolismo dessas substâncias.

Em estudo de metabolômica com plantas de T. diversifolia de duas localidades, durante 24 meses, houve um padrão sazonal de produção metabólitos (açúcares, lactonas sesquiterpênicas e compostos fenólicos), correlacionado com a quantidade de precipitação e as mudanças de temperatura ao longo do período. Entretanto, nas inflorescências e raízes, a distribuição dos metabólitos foi principalmente afetada pela variação de alguns nutrientes do solo, como cálcio, magnésio, fósforo, potássio e cobre (SAMPAIO; EDRADA-EBEL; DA COSTA (2016). Esses resultados ressaltam 29

a influência das variações ambientais na produção de compostos bioativos em T. diversifolia, bem como a importância da investigação de fatores intrínsecos da planta que também atuem sobre essa produção. Assim, pesquisas que avaliem as condições de cultivo desta espécie resultando em maior rendimento de substâncias com ação medicinal são de grande relevância.

2.3. METABOLISMO PRIMÁRIO E SECUNDÁRIO: PROCESSOS INTEGRADOS Metabolismo é o conjunto de reações químicas que continuamente estão ocorrendo em cada célula. A presença de enzimas específicas garante a direção dessas reações, estabelecendo rotas metabólicas. Os compostos químicos formados, degradados, ou simplesmente transformados, são chamados de metabólitos e as reações enzimáticas envolvidas são, respectivamente, designadas como anabólicas, catabólicas ou de biotransformação (BARBOSA, 1994). Essas reações visam, primariamente, atender às exigências fundamentais da célula: energia (ATP), poder redutor (NADPH) e biossíntese das macromoléculas celulares (SIMÕES et al., 2017). Nos vegetais, todos os componentes orgânicos produzidos são divididos em metabólitos primários e secundários. Os primários possuem função estrutural, plástica e de armazenamento de energia como, os aminoácidos, ácidos graxos, carboidratos, proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos. Já os metabólitos secundários são, geralmente, definidos como moléculas orgânicas que não têm função direta na fotossíntese, respiração, transporte celular, translocação, assimilação de nutrientes ou síntese de proteínas, lipídeos e carboidratos. São característicos de um determinado grupo vegetal, enquanto os metabólitos primários estão distribuídos por todo o reino vegetal (TAIZ; ZEIGER, 2009). A fotossíntese fornece as unidades orgânicas básicas das quais dependem as plantas. A respiração, com seu metabolismo do carbono associado, libera a energia armazenada nos compostos de carbono para o uso celular. Ao mesmo tempo esses processos geram diversos precursores para as diferentes vias metabólicas (TAIZ; ZEIGER, 2009). Dessa forma, o metabolismo primário e secundário do carbono são interligados e balanceados por meio de diferentes rotas de síntese (Figura 8).

Figura 8 - Principais rotas do metabolismo secundário e suas inter-relações com o metabolismo primário

Fonte: TAIZ; ZEIGER (2009)

Através do metabolismo da glicose são formados praticamente todos os metabólitos primários e secundários. Ao longo da glicólise, da rota das pentoses- fosfato e do ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs), a glicose é convertida em moléculas em eritrose-4-fosfato ou fosfoenolpiruvato, as primeiras da via do ácido chiquímico, a qual origina os metabólitos secundários aromáticos (alcalóides indólicos, quinolínicos, isoquinolínicos, ligninas e lignanas, fenóis, cumarinas e taninos hidrossolúveis). Além disso, após sucessivas oxidações, a glicose pode ser convertida em acetil-coenzima A (Figura 9) (LEMOS, 2011; SIMÕES et al., 2017). A acetil-coenzima A (acetil-CoA) pode seguir em três diferentes vias: a) a do ciclo do ácido cítrico, em que serão formados os alcalóides pirrolidínicos, tropânicos, pirrolizidínicos, piperidínicos e quinolizidínicos; b) a via do mevalonato, que originará os terpenóides, fenóis e os esteróis e; c) a via da condensação do acetato, na qual são formados os derivados do acetato (LEMOS, 2011; SIMÕES et al., 2017). As 31

rotas de produção de metabólitos secundários pelas vias do ácido chiquímico e da acetil-coenzima A são mostradas na Figura 9.

Figura 9 - Síntese dos metabólitos secundários a partir da glicose.

Fonte: SIMÕES et al. (1999)

Os metabólitos secundários têm as funções ecológicas de proteção contra herbívoros e patógenos, atrativa de polinizadores e dispersores de sementes, competição planta-planta (alelopatia) e nas simbioses planta-microorganismo (TAIZ; ZEIGER, 2009). A produção dessas substâncias representa um custo energético para as plantas que, muitas vezes, determina menor investimento em crescimento. Para explicar essa competição por carbono e nitrogênio entre metabolismo primário e secundário, ou seja, para explicar a alocação de recursos na produção de metabólitos secundários diante das pressões ambientais sofridas pelos vegetais, já foram elaboradas diversas hipóteses (ATSATT; O’DOWD, 1976; BRYANT; CHAPIN; KLEIN, 1983; COLEY; BRYANT; CHAPIN, 1985; HERMS; MATTSON, 1992; LEVIN; YORK, 1978; MCKEY, 1979; RHOADES; CATES, 1976; TUOMI et al., 1984; WHITE, 1974). A maior parte delas defende que as concentrações de metabólitos secundários são negativamente correlacionadas com as taxas de crescimento das plantas e diretamente correlacionadas com seus mecanismos de defesa (HERMS; MATTSON, 1992). 32

A hipótese de Herms e Mattson (1992), teoria do crescimento/diferenciação, propõe que plantas com menor disponibilidade de recursos investem mais na diferenciação celular em detrimento do crescimento. Essa diferenciação inclui a produção de metabólitos secundários para defesa vegetal. Assim, a distribuição dos recursos entre os processos de crescimento e diferenciação se daria de acordo com o gradiente de recursos disponíveis no ambiente. A hipótese do balanço carbono/nitrogênio (C/N) sugere que a disponibilidade de luz pode influenciar na razão entre esses dois elementos nas plantas, afetando o metabolismo secundário. Assim, em ambientes com pouca luminosidade o balanço C/N seria reduzido, devido à limitação na assimilação de carbono durante a fotossíntese, diminuindo a concentração de compostos secundários baseados em carbono (compostos fenólicos, ligninas e terpeno), pois esse recurso seria alocado para o crescimento. Diferentemente, em ambientes com maior disponibilidade de luz, as plantas apresentariam maiores concentrações de metabólitos de defesa baseados em carbono, em detrimento daqueles baseados em nitrogênio (BRYANT; CHAPIN; KLEIN, 1983). A hipótese de disponibilidade de recursos (COLEY; BRYANT; CHAPIN, 1985) pressupõe que plantas quando em ambientes com limitação dos nutrientes, irão investir mais em mecanismos de defesa, via metabólitos secundários, para minimizar a perda de tecidos devido a condições como a herbivoria, por exemplo. Esta hipótese sugere que o nível de investimento em defesa aumenta à medida que as taxas de crescimento potenciais se tornem mais limitadas, devido à baixa disponibilidade de recursos, uma vez que tal situação aumenta o valor relativo destes recursos. A hipótese da competição de proteínas (JONES; HARTLEY, 1999) postula que há uma concorrência nas vias metabólicas das plantas voltadas para a produção de compostos fotossintéticos versus as vias de compostos de defesa. Para esses autores, a síntese de proteínas e de fenilpropanoides, precursores de compostos fenólicos, competem por um recurso comum e limitado, a fenilalanina, que é um ponto de ramificação no final da via do ácido chiquímico localizada entre metabolismo primário e secundário. Em condições de baixa disponibilidade de nutrientes, as demandas de proteínas para crescimento são reduzidas, aumentando a incorporação de fenilalanina na síntese de compostos fenólicos, elevando a concentração destes compostos. 33

Portanto, o trade-off entre defesa e crescimento depende não apenas da competição por nutrientes, luz e carboidratos disponíveis, mas também da concorrência pela fenilalanina (GAYLER et al., 2008). Ainda que a maioria das teorias de alocação de recursos para produção de metabólitos secundários se adequem a sistemas específicos a partir dos quais foram postuladas, essas teorias se complementam em explicar de diferentes formas as vantagens adaptativas do investimento da planta em defesa vegetal. A produção de metabólitos secundários é o resultado da interação entre processos de síntese, transporte, armazenamento e degradação, sendo cada um desses processos controlados pela expressão gênica diferencial, assim são influenciados por três fatores principais: hereditariedade, ontogenia e meio ambiente (Figura 10) (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1996; WINK, 1990).

Figura 10 - Principais Fatores que influenciam a produção e acúmulo dos metabólitos secundários

Adaptado de: GOBBO-NETO; LOPES (2007)

Dentre os fatores ambientais, a disponibilidade hídrica afeta a fotossíntese, a condutância estomática, a mobilização de reservas, o crescimento e desenvolvimento dos vegetais, podendo levar a alterações no seu metabolismo 34

secundário (HSIAO, 1973; SALISBURY; ROSS, 1985). Assim, a produção de metabólitos secundários pode responder de forma específica ao excesso ou escassez de água em cada espécie vegetal, sendo que algumas podem nem apresentar variações no acúmulo de metabólitos em decorrência desta disponibilidade (GOBBO-NETO; LOPES, 2007a). Estudos sobre as distintas respostas ao déficit hídrico demonstram que tal condição pode aumentar a síntese de glicosídeos cianogênicos, glucosinolatos (BLUA; HANSCOM; COLLIER, 1988), de alguns terpenoides (LOKAR et al., 1987), antocianinas (JUNG, 2004) e alcaloides (HÖFT; VERPOORTE; BECK, 1996). Já em relação aos compostos fenólicos não foram estabelecidas relações claras entre o estresse hídrico e a concentração dessas substâncias (ANDRE et al., 2009; ATKINSON et al., 2011; HERMS; MATTSON, 1992). Em Solanum lycopersicum, a análise do conteúdo de compostos fenólicos demonstrou pequena ou nenhuma alteração na concentração de flavonoides em seus frutos como resultado do estresse hídrico (ATKINSON et al., 2011). Já em cultivares de Solanum tuberosum houve uma redução drástica nos polifenóis sob condições de seca, demonstrada por variações altamente dependentes dos cultivares avaliados (ANDRE et al., 2009). Isso reforça a visão de que o status hídrico da planta influencia de formas diferentes o processo de acumulação de compostos fenólicos relacionados ao estresse nesses organismos. Em relação aos nutrientes, são poucos os estudos que relacionam a disponibilidade no solo e concentração de nutrientes nas plantas com os seus efeitos sobre o metabolismo secundário. O que é estabelecido é que suas ações não são uniformes em todas as espécies (GOBBO-NETO; LOPES, 2007a). Embora, sejam conhecidas hipóteses como a do balanço entre carbono/nitrogênio, que relacionam a disponibilidade de nitrogênio e o acúmulo de compostos secundários baseados em carbono, como os compostos fenólicos, (BRYANT; CHAPIN; KLEIN, 1983) e a hipótese de competição por proteínas (WRIGHT et al., 2010). Estudos prévios descrevem essa variação na concentração de compostos fenólicos em morango, tomate e espinheira-do-mar, cultivados com o uso de diferentes fertilizantes (HEINÄAHO; PUSENIUS; JULKUNEN-TIITTO, 2006; TOOR; SAVAGE; HEEB, 2006; WANG; MILLNER, 2009). Os micronutrientes atuam em muitas das reações bioquímicas de síntese de compostos fenólicos na rota do ácido chiquímico (KIRKBY; RÖMHELD, 2007). Um 35

exemplo é o manganês, que exerce um papel primordial na ativação de várias enzimas envolvidas no ciclo do ácido cítrico, na via do ácido chiquímico e na via biossintética dos isoprenoides (LIDON; HENRIQUES, 1993). Outro elemento, o cobre, tem sua ação no metabolismo secundário relacionada à estrutura das enzimas polifenoloxidase, ascorbato oxidase e diamino oxidase, que ocorrem nas paredes celulares e atuam nas vias biossintéticas de compostos fenólicos, quinonas, lignina e fitoalexinas. A deficiência de cobre diminui a atividade dessas enzimas, levando ao acúmulo de fenóis e à diminuição da lignificação, o que torna as plantas mais suscetíveis aos patógenos (KIRKBY; RÖMHELD, 2007). O boro exerce função na membrana plasmática dos vegetais, em tecidos com baixas concentrações deste micronutriente a atividade da ATPase e as taxas de absorção de íons são diminuídas, tornando as membranas permeáveis. Este efeito pode estar relacionado às mudanças no metabolismo dos fenóis nas paredes celulares associadas com essa deficiência. Sob condições de deficiência de boro, a via da pentose fosfato torna-se meio predominante de degradação dos carboidratos, levando ao aumento da formação de compostos fenólicos pela via do ácido chiquímico. O consequente acúmulo de fenóis e o aumento da atividade da polifenoloxidase determina a produção de compostos intermediários altamente reativos, tais como as quinonas. Estes compostos intensificam a produção de radicais superóxido, que por sua vez danificam as membranas em decorrência da peroxidação de lipídeos (KIRKBY; RÖMHELD, 2007). Além da influência exercida pelos fatores abióticos, na produção e acúmulo de metabólitos secundários, as características genéticas são determinantes neste processo.

2.4. DIVERSIDADE GENÉTICA DE PLANTAS MEDICINAIS E RAPD A análise genética de plantas medicinais é importante não apenas para sua domesticação, mas também para sua conservação e manejo eficiente (CARVALHO et al., 2009), uma vez que a qualidade do produto fitoterápico final é resultado da interação entre as técnicas de cultivo adotadas na produção das plantas medicinais com as características genéticas da população. Isto torna relevante que os indivíduos que compõem a população a ser cultivada possuam similaridade genética, a fim de facilitar o manejo e obter matéria prima quimicamente 36

homogênea, garantindo a qualidade necessária para a viabilização comercial da técnica da produção (MONTANARI, 2002). Assim como a influência de fatores abióticos e do estádio de desenvolvimento do vegetal, a diversidade genética também é um fator determinante na da produção e acúmulo diferencial de metabólitos vegetais (BEN EL HADJ ALI; GUETAT; BOUSSAID, 2012; FACANALI et al., 2015; MEISSNER et al., 2015; ŠAMEC et al., 2015). Portanto, a análise da distância genética entre indivíduos é ferramenta importante no estudo de populações e útil para os estudos de avaliação da divergência genética de espécies vegetais medicinais, tanto para o estabelecimento das estratégias de melhoramento de espécies vegetais, quanto para sua conservação (CARVALHO et al., 2009). Além disso, o estudo genético de espécies de plantas medicinais pode estabelecer marcadores que possibilitem autenticar e rastrear a origem da matéria-prima para fitomedicamentos (PERCIFIELD et al., 2007). Estudos que comparam a variação química e genética de plantas medicinais frequentemente utilizam técnicas de quantificação de teores metabólitos secundários e análises de marcadores moleculares, como os de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (BEN EL HADJ ALI; GUETAT; BOUSSAID, 2012; FACANALI et al., 2015; MEISSNER et al., 2015; ŠAMEC et al., 2015). Essas pesquisas têm a finalidade de avaliar a fonte de variação na produção e acúmulo de dos compostos químicos vegetais. Šamec et al., (2015) analisaram a variabilidade genética e fitoquímica, através de marcadores RAPD e da quantificação de compostos fenólicos, de seis populações de Teucrium arduini L., com resultados que sugerem uma maior influência do meio ambiente na acumulação de compostos fenólicos, quando comparada à influência dos fatores genéticos daquela espécie, nas condições avaliadas pelo grupo. Já em um estudo com análises de marcadores RAPD e caracterização de compostos químicos por HPLC de Ocimum selloi Benth., coletado no sul e sudeste do Brasil, foi observado que a variação da composição de óleo essencial entre as diferentes populações não ocorreu devido ao estado fisiológico da planta ou condições de fertilidade do solo, mas sim pela interação do genótipo com os fatores ambientais intrínsecos de cada região geográfica, revelando a importância do fator genético nas principais diferenças entre as populações (FACANALI et al., 2015). 37

Pesquisas como esta, demonstram a importância da caracterização genética e química das diferentes populações de uma mesma espécie de planta medicinal, tanto para sua conservação e preservação, como também para programas de seleção e melhoramento genético com a finalidade de produzir matéria-prima padronizada e de qualidade para a produção de fitoterápicos. O uso de marcadores moleculares auxilia no fornecimento de informações sobre o material genético (DNA) (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Entre as técnicas mais utilizadas para caracterização genética de espécies, em que se desconhecem maiores informações moleculares, encontram-se os marcadores do tipo RAPD (VIDAL et al., 2006), que são uma importante ferramenta de biotecnologia com grande uso na agricultura (HOFFMANN; BARROSO, 2006). Esse procedimento foi desenvolvido simultânea e independentemente por Welsh; Mcclelland, (1990) e Williams et al., (1990). As vantagens de utilização de marcadores do tipo RAPD frente a outros incluem a possibilidade de analisar um maior número de amostras por unidade de tempo, o uso de um mesmo conjunto de primers em qualquer espécie, o custo por amostra normalmente menor e os procedimentos simples (HOFFMANN; BARROSO, 2006). Além disso, é desnecessário o conhecimento prévio sobre a sequência de nucleotídeos da espécie a ser estudada (LACERDA; ACEDO; LOVATO, 2002). Contudo, o RAPD apresenta a desvantagem de ser de baixa reprodutibilidade de um laboratório para outro, o que dificulta a comparação de dados obtidos em diferentes locais (MILACH, 1998). O RAPD é uma técnica in vitro que consiste na amplificação de DNA genômico por PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando primers de seqüência arbitrária com cerca 10 nucleotídeos, tamanho suficientemente pequeno para que uma sequência aleatória encontre, em qualquer genoma, duas sequências complementares na posição necessária e haja duplicação do DNA (HOFFMANN; BARROSO, 2006). Frequentemente, apenas um primer é utilizado em cada reação, tendo este um conteúdo entre 50 e 70% de das bases nitrogenadas guanina e citosina (FRITSCH; RIESEBERG, 1996). As informações fornecidas pela análise de um único primer marcador RAPD são insuficientes, sendo preciso analisar diversos primers, a fim de gerar um conjunto de resultados úteis (WILLIAMS et al., 1993). O polimorfismo entre os indivíduos é analisado pelo perfil eletroforético dos produtos 38

de amplificação obtidos pela utilização dos mesmos primers e condições de reação (HOFFMANN; BARROSO, 2006). Uma vez estabelecida a caracterização molecular de um conjunto de genótipos através de marcadores moleculares, torna-se possível avaliar a diversidade genética entre eles, por meio de estimativas da diversidade, que podem ser obtidas por métodos de verificação da similaridade ou da distância existente entre os grupos, com o emprego de diversos coeficientes para este fim (HOFFMANN; BARROSO, 2006), sendo os resultados agrupados em uma matriz utilizada na construção de dendogramas (CRUZ; CARNEIRO, 2003). Os marcadores moleculares geram variáveis qualitativas binárias, caracterizadas pela presença ou ausência da uma marca, no caso do RAPD a banda (Figura 11). Nesse caso, os estados do caráter são designados por zeros (0) e uns (1) (DUNN; EVERRIT, 1980), o número 1 indica a presença da banda e 0, a ausência (SKROCH; TIVANG; NIENHUIS, 1992). Genótipos que possuam maior coincidência de presenças e/ou ausências das bandas serão considerados mais similares entre si. A partir dessas variáveis é possível se obter uma matriz de similaridades (ou distância) entre os genótipos analisados e realizar seu agrupamento.

Figura 9 - Foto de gel de RAPD de amostras de DNA Tithonia diversifolia de diferentes localidades, amplificadas com único primer, através de PCR.

COL COL COL COL MF MF MF MF VIA VIA VIA VIA VIT VIT VIT VIT ST ST ST ST

Fonte: Anny Carolyne da Luz

Após o estabelecimento de uma matriz de dados padronizados, são utilizados coeficientes de dissimilaridade ou similaridade para quantificar o quanto os indivíduos são parecidos ou não. Os coeficientes de similaridade para dados binários são fundamentados na comparação entre o número de atributos comuns para um par de objetos e o número total de atributos envolvidos (MEYER, 2002). Os coeficientes de similaridade podem ser divididos em dois grupos: os que consideram a ausência conjunta e aqueles que não a consideram. Esta 39

característica é importante para marcadores RAPD, pois a ausência de banda amplificada em dois genótipos não significa, necessariamente, similaridade entre eles (DUARTE; SANTOS; MELO, 1999). Um coeficiente amplamente utilizado é o de Jaccard, que compara o número de presenças de bandas comuns e o número total de bandas envolvidas, excluindo o número de ausências conjuntas (MEYER, 2002). É frequente o uso do coeficiente de Jaccard para populações dentro de uma mesma espécie(ALFENAS, 1998), este juntamente ao coeficiente de Sorensen-Dice, são os mais utilizados para estudos de variabilidade genética em espécies medicinais (CARVALHO et al., 2009). A análise de agrupamentos se destaca como método estatístico para o estudo de marcadores moleculares por não exigir pressuposição inicial quanto à distribuição de probabilidades (MEYER, 2002). As técnicas de agrupamentos têm por objetivo agrupar indivíduos mais semelhantes em uma mesma classe. De forma geral, o número de classes a ser formado não é conhecido inicialmente (MANLY, 1994). Uma das formas de agrupar os resultados obtidos pelos marcadores moleculares é o uso de dendrogramas, nos quais o primeiro passo a ser executado é o cálculo das medidas de dissimilaridade, ou similaridade, entre todos os pares possíveis de indivíduos, formando grupos por processos aglomerativos ou divisivos (MEYER, 2002). Nesses processos, são estabelecidos, arbitrariamente, os centros dos grupos, e cada indivíduo é agrupado em relação ao centro mais próximo. Novos centros são calculados e cada indivíduo se move para o grupo cujo centro seja mais próximo de si. O processo continua até que haja estabilidade nos grupos (DUNN, G.; EVERRIT, 1980; MANLY, 1994). Entre os diversos métodos de ligação existentes, um dos mais utilizados é o UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages) (DUARTE; SANTOS; MELO, 1999). O UPGMA é um método aglomerativo de ligação média baseado em média aritmética: os coeficientes de similaridade, ou dissimilaridade, médios entre o indivíduo a ser agrupado e os indivíduos do grupo já existente são calculados. É um método ponderado, que atribui pesos iguais a todos os ramos do dendrograma, sendo o número de indivíduos que compõem cada ramo não considerado (BUSSAB; MIAZAKI; ANDRADE, 1990). É o algoritmo mais comum nos estudos de divergência genética (DUARTE; SANTOS; MELO, 1999). Nele as relações são identificadas em ordem de similaridade e o dendograma é construído a partir das duas unidades mais similares, tratando-se como uma unidade, 40

posteriormente a outra unidade com maior similaridade é identificada e assim por diante (MEYER, 2002). Este tem sido o método mais utilizado para caracterização de diversidade genética em plantas medicinais (CARVALHO et al., 2009). A técnica de RAPD é adequada para a análise de variabilidade genética em Asteraceae, visto que B. pilosa e T. diversifolia são espécies com poucas informações genéticas descritas, assim a utilização de pequenos primers de sequência arbitrária é ideal. É uma metodologia compatível com uma gama de análises multivariadas que permitem a análise de parâmetros genéticos entre populações. Além disso, seus resultados permitem a comparação desses fatores de diversidade genética com caracteres de diversidade química e morfológica.

2.5. COMPOSTOS FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE Os compostos fenólicos são substâncias que contêm um grupo fenol: um anel aromático com uma hidroxila funcional (Figura 12). Representam cerca de 10.000 compostos de grande diversidade química e diversas funções nos vegetais (TAIZ; ZEIGER, 2009).

Figura 10- Estrutura química da unidade básica do grupo Fenol.

São sintetizados por diferentes vias metabólicas (Figura 13), sendo nas plantas mais expressiva a rota do ácido chiquímico (TAIZ; ZEIGER, 2009). Essas rotas biossintéticas, que não estão presentes em animais, formam os aminoácidos aromáticos essenciais, fenilalanina e triptofano (SIMÕES et al., 2017). As classes mais abundantes de compostos fenólicos são derivadas da fenilalanina, aminoácido aromático sintetizado na rota do ácido chiquímico (TAIZ; ZEIGER, 2009), que é formado pela condensação entre o fosfoenolpiruvato e a eritrose-4-fosfato, dois metabólitos da glicose (SIMÕES et al., 2017).

Figura 11 - Rotas de síntese dos compostos fenólicos.

Fonte: Lincon; Taiz (2009)

A reação catalisada pela enzima fenilalanina amônia liase (PAL) gera, por meio da eliminação de uma molécula de amônia da fenilalanina, o ácido trans-cinâmico, a partir do qual diversos compostos fenólicos são formados (Figura 14) (TAIZ; ZEIGER, 2009).

Figura 12 - Atividade catalisadora da fenilalanina amônia liase (PAL) formando diferentes metabólitos secundários vegetais.

Adaptado de: Lemos (2011)

O ácido trans-cinâmico e o ácido p-cumárico, formados a partir da reação catalisada pela PAL e da sequência de reações seguintes a esta que consistem na adição de mais hidroxilas e outros substituintes, são chamados fenilpropanóides, compostos por um anel aromático e uma cadeia lateral de três carbonos (TAIZ; ZEIGER, 2009). A via do ácido chiquímico, através da ação da PAL, forma alguns dos metabólitos secundários de maior interesse medicinal: ácidos fenólicos, flavonoides, taninos e cumarinas. A atividade da PAL é afetada por diversos fatores ambientais. Baixa disponibilidade de nutrientes, pouca luminosidade e também infecções fúngicas estimulam sua síntese, o que resulta em um aumento dos compostos fenólicos. Sua regulação é dada, provavelmente, durante a transcrição (TAIZ; ZEIGER, 2009). Os compostos fenólicos não são formados apenas pela via do ácido chiquímico, mas também pela via do acetato, a partir da acetil-coenzima A e a malonil-coenzima A; os flavonoides, por exemplo, são formados por compostos provenientes das duas rotas (Figura 15). Cada uma das rotas de biogênese determina o padrão de substituição do composto fenólico resultante, como é o caso da rota do ácido chiquímico, por meio da qual se obtém compostos com grupos 43

hidroxila em posição orto, formados a partir do ácido cinâmico. Já pela via do ácido malônico são originados compostos com grupos hidroxila em posição meta. Dessa forma, os vegetais podem produzir um mesmo composto secundário a partir de intermediários alternativos (SIMÕES et al., 2017).

Figura 15 - Via metabólica de produção da Hispidulina um flavonoide originado do chiquimato, via ácido chiquímico, e do Malonil - Coenzima A, via do acetato.

Fonte: KARAM et al. (2013)

Os compostos fenólicos são classificados em grupos, de acordo com o seu esqueleto básico de carbonos, alguns deles são: fenóis simples (C6), ácidos fenólicos/benzoicos (C6-C1), ácidos cinâmicos e cumarinas (C6-C3), flavonoides e isoflavonoides (C6-C3-C6), diflavonoides (C6-C3-C6)2, taninos hidrolisáveis (C6-

C1)n, taninos condensados (C6-C3-C6)n (SIMÕES et al., 2017).

2.5.1. Ácidos fenólicos Os ácidos fenólicos têm como característica um anel benzênico, com um ou mais grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos hidroxila e/ou metoxila e 44

outros substituintes na molécula (Figura 16) (SOARES, 2002), radicais que os conferem poder redutor antioxidante (ANGELO; JORGE, 2007).

Figura 13 - Exemplos de ácidos fenólicos simples, com um anel benzênico.

Os ácidos fenólicos são divididos em duas classes: os ácidos hidroxibenzoicos e os hidroxicinâmicos (D ARCHIVIO et al., 2007). Os primeiros são componentes dos taninos hidrolisáveis e menos abundantes nos vegetais consumidos pelos humanos (MANACH et al., 2004). Por outro lado, os ácidos hidroxicinâmicos estão presentes em vários alimentos e bebidas de origem vegetal, na forma livre ou esterificada, como no tomate, cerveja café, erva mate, maçã, ameixa e outras frutas, crucíferas, cereais, entre outros (BOURNE; RICE-EVANS, 1998; CLIFFORD, 1999). Os derivados do ácido cinâmico mais encontrados na natureza apresentam conformação trans e são mais estáveis que os ácidos que apresentam conformação cis. Quatro derivados do ácido cinâmico são largamente distribuídos no reino vegetal: ácido p-cumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico e ácido sinápico (Figura 17) (SIMÕES et al., 2017).

Figura 14 - Estruturas químicas de ácidos fenólicos derivados do ácido cinâmico.

Dentre os derivados dos ésteres do ácido cinâmico, destaca-se o ácido clorogênico. Esse ácido é um derivado do ácido cafeico, e constitui-se, na verdade, em uma mistura de derivados 3,4-, 3,5- e 4,5-dicafeoilquínicos. A cinarina é um ácido clorogênico (ácido 1,3-O-dicafeiolquínico) muito comum em Asteraceae (Figura 18) (SIMÕES et al., 1999).

Figura 15 – Cinarina (ácido 1,3-O-dicafeiolquínico), ácido clorogênico frequente em Asteraceae.

Alguns ácidos fenólicos são reconhecidamente antioxidantes, como o ácido clorogênico, ácido cafeico e ácido ferúlico (SIMÕES et al., 1999, 2017). A atividade antioxidante desses compostos é relacionada às suas propriedades redutoras inerentes de sua estrutura química. Tais características desempenham um papel importante na quelação de metais de transição e na redução de radicais livres, atuando na iniciação e na propagação do processo oxidativo (SOARES, 2002).

2.5.2. Flavonoides Os flavonoides são distribuídos amplamente no reino vegetal, presentes em frutas, folhas, sementes e em outras partes da planta na forma de glicosídios/heterosídeos (conjugado a açúcares) ou agliconas (forma livre) (HARBORNE; BAXTER; MOSS, 1998), representam um dos mais importantes e diversificados grupos fenólicos (SIMÕES et al., 2017). Diversas funções nas plantas são atribuídas aos flavonoides, como: proteção contra raios ultravioleta, herbívoros e patógenos, atração de polinizadores e dispersores de sementes, antioxidante, controle da ação de hormônios vegetais, ação alelopática, inibição de enzimas e interação com microorganismos fixadores de nitrogênio (SIMÕES et al., 1999). Seus efeitos benéficos à saúde são relacionados 46

às propriedades antioxidantes e quelantes significativas (HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002). Constituem uma classe de polifenóis, substâncias originadas na via dos fenilpropanóides que apresentam um ou mais núcleos aromáticos contendo substituintes hidroxilados e/ou seus derivados (ésteres, metoxilas, glicosídeos e outros). Os flavonoides são formados a partir da via do ácido chiquímico e da Acetil- CoA (Figura 19) e são constituídos de dois anéis aromáticos (A e B) ligados por uma cadeia de três carbonos, o anel A é oriundo do acetato, via ácido malônico, e o anel B é proveniente da via do ácido chiquímico (Figura 20) (SIMÕES et al., 1999, 2017).

Figura 19 - Biossíntese de flavonoides a partir de Acetil-CoA e Ácido Chiquímico.

Fonte: SIMÕES et al. (1999)

Figura 16 - Unidade fundamental de flavonoide, sua numeração e identificação de seus anéis.

Variações em substituições do anel C levam à diferenciação dos flavonoides em flavonóis, flavonas, flavanonas, flavanóis (catequinas), isoflavonas e antocianidinas. Também podem ocorrer substituições nos anéis A e B simultaneamente, originando outros compostos dentro de cada classe de flavonoides (HOLLMAN; KATAN, 1999). Os flavonoides atuam como antioxidantes primários, sendo as flavonas e os flavonóis as classes mais encontradas nas plantas. O estado de oxidação da cadeia heterocíclica dos flavonoides determina as várias atividades biológicas relacionadas a esse metabólito secundário, como: atividade antiinflamatória, antitumoral, agregação plaquetária, redução da fragilidade e permeabilidade capilar, inibição na destruição do colágeno e redução na incidência de doenças cardiovasculares (PEREIRA; CARDOSO, 2012). O arranjo espacial dos substituintes no anel é o principal fator na atividade antioxidante dos flavonoides. Bem como a maioria dos outros polifenois que possuem atividade antioxidante, tanto a conFiguração como o número total de grupos hidroxila influenciam substancialmente vários mecanismos de atividade antioxidante (BURDA; OLESZEK, 2001; CAO; SOFIC; PRIOR, 1997; HAENEN et al., 1997; SEKHER PANNALA et al., 2001). Assim, grupos hidroxílicos múltiplos conferem à molécula de flavonoide atividade antioxidante, quelante e prooxidante. Essa capacidade de eliminação de radicais livres por radicais hidroxila, altamente reativos, é dada pela seguinte reação (Equação1): ∙ ∙ F-OH + R → F-O + RH (1) ∙ Onde F representa um flavonoide e R representa um radical livre. A conFiguração de hidroxilas do anel B é o mais importante determinante da eliminação de espécies reativas de oxigênio EROS (BURDA; OLESZEK, 2001; 49

HAENEN et al., 1997; SEKHER PANNALA et al., 2001). As hidroxilas no anel B doam hidrogênio e um elétron aos radicais hidroxil, peroxil e peroxinitrito, neutralizando-os e dando origem a um radical flavonoide relativamente estável (CAO; SOFIC; PRIOR, 1997). Os diversos tipos de flavonoides existentes são categotizados em diferentes classes, de acordo com suas características químicas e sintéticas (SIMÕES et al., 2017). As flavonas e os flavonois são aqueles que têm substituição de hidrogênio por uma hidroxila na posição C-3. São frequentemente oxigenados, e também possuem outros radicais como: hidroxilas, metoxilas, acilas, metilenos, isoprenos, piranos, furanos. As flavonas são derivadas da 2-fenilcromona sendo a apegenina e a luteolina as mais abundantes dos vegetais. Já os flavonóis originam-se a partir da 3- hidróxi-2-fenilcromona, deste grupo os mais encontrados em plantas são quercetina, galangina, canferol e miricetina. Os heterosídeos flavonoídicos, flavonóis associados a dissacarídeos ou trissacarídeos, mais comuns são o 3-rutinosídeo quercetina (rutina) e o 7-glicosídeo luteolina (SIMÕES et al., 2017). Dentre os flavonois, a quercetina é relevante devido à sua superior ação na inibição de danos oxidativos induzidos por metais e por não-metais, o que é parcialmente atribuído ao seu radical substituinte 3-OH livre (Figura 21) (ARORA; NAIR; STRASBURG, 1998; RATTY; DAS, 1988).

Figura 17 - Estrutura química da quercetina, mostrando o radical substituinte 3-OH livre.

Quando a ligação entre o açúcar e flavonoide é feita entre os carbonos C-1 do açúcar e um ou dois carbonos do anel A do flavonoide (sempre nos carbonos 6 e/ou 8), o composto formado é classificado em flavonoide c-heterosídeo, sendo a principal característica química desse grupo, a resistência à hidrólise ácida. 50

Flavonoides c-heterosídeos derivados de flavonas são identificados ainda em: flavanonas, chalconas, isoflavonas, proantocianidinas, entre outros (SIMÕES et al., 2017). As flavanonas são intermediários biossintéticos da maioria das classes de flavonoides e se caracterizam pela ligação simples entre os carbonos 2 e 3 em seu núcleo fundamental hidrogenado. Alguns exemplos de flavanonas frequentes em vegetais são a hesperedina, naringenina e naringina (SIMÕES et al., 2017). Os isoflavonoides (isoflavonas, isoflavanonas, isoflavenos) são caracterizados por uma cadeia arila-C3-arila, do tipo difenil-1,2-propano, alguns dos representantes mais comuns são a daidzeína, a genisteína e o cumestrol. Ao contrário das outras classes de flavonoides, sua distribuição taxonômica é restrita, sendo grande parte dos isoflavonoides relacionados à ação de fitoalexinas (SIMÕES et al., 2017). A Figura 22 mostra alguns exemplos dos diversos tipos de flavonoides e seus respectivos radicais de substituição.

Figura 18 - Exemplos de classes de flavonoides com sua estrutura principal e seus radicais de substituição.

Quase todos os vegetais apresentam algum tipo de flavonoide, o que dificulta a associação exclusiva destes compostos com uma determinada atividade farmacológica. De fato, os humanos ingerem muitos gramas de flavonoides todos os dias, ao ingerirem em frutas, verduras, grãos e vinhos, por exemplo. Entretanto, não há comprovação cientifica de que estes compostos sejam essenciais à saúde do homem. Embora possam apresentar efeitos mutagênicos e tóxicos, os flavonoides 51

são, em geral, considerados benéficos à saúde, com indicação de diversas propriedades medicinais e farmacológicas (SIMÕES et al., 2017).

2.5.3. Taninos Taninos vegetais são polifenóis naturais, derivados do ácido benzoico, de considerável interesse devido a sua habilidade de ligar-se a proteínas e metais (LAGE, 2009) e podem ser classificados em taninos hidrolisáveis e taninos condensados. Os taninos podem ser oxidados em quinonas, as quais formam ligações covalentes com alguns grupos funcionais das proteínas, principalmente os grupos sulfídricos da cisteína e amino da lisina, formando complexos irreversíveis, que ocorrem na planta quando seus tecidos são danificados, por auto-oxidação ou oxidação catalisada por enzimas (SGARBIERI, 1996; SIMÕES et al., 1999). A complexação entre taninos e proteínas é determinante para sua ação nas plantas, como fator de controle de insetos, fungos e bactérias (NOZELLA, 2001; SIMÕES et al., 1999). Além de potentes inibidores de enzimas, os taninos são responsáveis pela adstringência de muitos frutos e outros vegetais (SIMÕES et al., 1999). Os taninos hidrolisáveis possuem um poliol central cujas hidroxilas são esterificadas com o ácido tânico. Os galactaninos, um grupo de taninos hidrolisáveis, são formados a partir da ligação entre moléculas de ácido gálico. Já os elagitaninos resultam da hidrólise ácida das ligações éster de resíduos do ácido gálico, que se reagem espontaneamente em ácido elágico (Figura 23) (NOZELLA, 2001; SIMÕES et al., 2017).

Figura 19 - Ácido gálico e ácido elágico, precursores dos taninos hidrolisáveis.

Os taninos condensados são oligômeros e polímeros formados pela condensação de grupos flavan-3-ols (catequina) ou flavan-3,4-diols (leucoantocianidina), são também chamados proantocianidinas (Figura 24) (NOZELLA, 2001; SILVA, M. R.; SILVA, 1999; SIMÕES et al., 2017).

Figura 20 - Estrutura química de taninos condensados flavan-3-ol (catequina) e flavan-3,4- diol (leucoantocianidina).

Os taninos hidrolisáveis, após hidrólise, produzem carboidratos e ácidos fenólicos como os ácidos gálico, caféico, elágico e tânico (NOZELLA, 2001; SILVA, M. R.; SILVA, 1999). Por outro lado, os taninos condensados são resistentes à hidrólise (NOZELLA, 2001; SILVA, M. R.; SILVA, 1999). Possuem diversos usos medicinais: tratamento de feridas, hipertensão, hemorragias, inflamações, queimaduras, entre outros. Essas ações podem ser relacionadas com três características principais desses compostos: a complexação com íons metálicos, a atividade antioxidante e sequestradora de radicais livres e a capacidade de ligação com macromoléculas (PANSERA et al., 2003; SIMÕES et al., 2017). Devido à ação redutora dos taninos, estudos com radicais antioxidantes indicam sua relevância na prevenção e no tratamento de doenças degenerativas (SIMÕES et al., 2017)

2.5.4. Cumarinas As cumarinas podem ser encontradas em vegetais, fungos e bactérias, sendo amplamente distribuídas entre as angiospermas, especialmente nas famílias: 53

Apiaceae, Rutaceae, Asteraceae, Leguminosae, Oleaceae, Moraceae e Thymeleaceae (SIMÕES et al., 1999). Quimicamente, seu representante mais simples é a 1,2-benzopirona, exceto esta, todas as outras cumarinas apresentam um grupo hidroxila na posição 7. São derivadas da fenilalanina e um dos seus primeiros precursores é o ácido cinâmico (Figura 25) (SIMÕES et al., 1999).

Figura 21 - Etapas da rota biossíntetica das cumarinas a partir do Ácido Chiquímico. A hidroxilação orto da cadeia lateral do ácido cinâmico catalisada pela enzima trans-cinamato-4-hidroxilase (a). A o- glicosilação do ácido o-cumárico (b). Uma isomerização cis/trans da dupla ligação da cadeia lateral (c). A lactonização do ácido o-cumárico por ação enzimática e na presença de calor (d).

Fonte: Czelusniak et al., (2012)

Nas plantas, as cumarinas possuem ações reguladoras do crescimento (PEREIRA et al., 2000), alelopática, proteção contra herbivoria, atração de polinizadores, controle da perda de água e da temperatura (SOUZA et al., 2011). As cumarinas apresentam diversas atividades biológicas, como: bronquiodilatadora, expectorante, anti-neoplásica, efeito narcótico, hemostático, sedativo, espasmalítico, anticoagulante, analgésico, regulador hormonal, vaso dilatador, inibidor da carcinogênese (PEREIRA et al., 2000; SOUZA et al., 2011). Além disso, apresentam ação imunossupressora e antialérgica, com efeitos no tratamento de asma em camundongos (MARINHO et al., 2004). É de relevante 54

importância farmacêutica, pois apresenta baixa toxicidade para mamíferos (SIMÕES et al., 1999).

2.6. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE Os antioxidantes são compostos químicos de vasta aplicabilidade, estão presentes em diversos vegetais consumidos pelo homem, e são empregados na indústria farmacêutica, alimentar, de plásticos, óleos entre outras. Podem ser definidos como substâncias que presentes em baixas concentrações, comparativamente ao substrato oxidável, impedem ou retardam a oxidação deste substrato (MIGUEL, 2007), sendo classificados de acordo com a presença ou ausência de ação enzimática. As enzimas antioxidantes removem espécies reativas ao oxigênio e/ou ao nitrogênio, ou seja, são capazes de bloquear a iniciação da oxidação. Já os antioxidantes não-enzimáticos são moléculas que interagem com as espécies reativas e são consumidos durante a reação. Os antioxidantes naturais, como os compostos fenólicos, e os sintéticos são classificados como não-enzimáticos (MOREIRA; MANCINI-FILHO, 2004). Os compostos antioxidantes são ainda classificados, de acordo com seu modo de ação, em primários e secundários. Os primários atuam interrompendo a cadeia da reação através da doação de elétrons ou hidrogênio aos radicais livres. Os antioxidantes secundários agem retardando a iniciação da auto-oxidação, por mecanismos como a complexação de metais, o sequestro de oxigênio, a decomposição de hidroperóxidos formando espécie não-radical, a absorção da radiação ultravioleta e a desativação de oxigênio singleto (ADEGOKE et al., 1998).

O oxigênio, em sua forma molecular (O2), é o principal aceptor biológico de elétrons e tem papel fundamental nas funções celulares. Entretanto, junto às propriedades benéficas do O2 ocorre a formação inadvertida das espécies reativas -• • de oxigênio (EROS), como o superóxido (O2 ), o peróxido de hidrogênio (H2O2 ) e o radical hidroxila (OH-•). As EROS podem ser uma ameaça grave ou causa de morte de células aeróbicas (SCANDALIOS, 2005). •- • O Superóxido de Oxigênio (O2 ), o peróxido de hidrogênio (H2O2 ) e o radical hidroxila (OH•-) são produzidos por sucessivas reduções univalentes do oxigênio (Equações de 2 à 5) (SMIRNOFF, 1993): 55

- •- O2 +e O2 (2) •- - + • O2 + e + H H2O2 (3) • - + •- H2O2 + e + H OH + H2O (4)

•- - + OH + e + H H2O (5)

As EROS são capazes de oxidar proteínas celulares, ácidos nucleicos e lipídios, contribuindo para o envelhecimento celular (JUAN; PALLARDÓ; VIÑA, 2000), mutagênese (TAKABE, 2001), carcinogênese (KAWANISHI; HIRAKU; OIKAWA, 2001) e doenças cardíacas (KHAN; BASEER, 2000). Possivelmente, por meio da desestabilização das membranas (MORA et al., 1990), danos no DNA e oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (TAKABE, 2001). Logo, antioxidantes que reduzam o risco de desenvolvimento de doenças causadas por reações oxidativas em sistemas biológicos são de grande relevância (NAMIKI, 1990; RAMARATHNAM et al., 1995; SIMÕES et al., 2017). Apesar de serem muito efetivos e estáveis, os antioxidantes sintéticos apresentam o uso restrito em muitos países, devido à possibilidade de causarem efeitos indesejáveis em enzimas de vários órgãos humanos. Por outro lado, há grande interesse na pesquisa por antioxidantes naturais, que sejam seguros para o consumo humano (ZANUTTO et al., 2014). Nas plantas, a maior parte dos antioxidantes isolados são polifenóis (DEBA et al., 2007). Estes compostos interagem, preferencialmente, com o radical peroxil, que é o radical mais prevalente na autoxidação e possui menor energia que outros radicais, o que favorece o sequestro do seu hidrogênio (DECKER, 1998). O radical resultante, fenoxil, pode reagir com outro radical peroxil, formando um composto que poderá originar novos radicais, por ação da luz ultravioleta e temperaturas elevadas, comprometendo a eficiência do antioxidante. Esta eficiência é determinada pelos grupos funcionais presentes no composto fenólico, pela posição que ocupam no anel aromático, bem como, pelo tamanho da cadeia desses grupos (MADHAVI; DESHPANDE; SALUNKHE, 1995; SHAHIDI; JANITHA; WANASUNDARA, 1992). Alguns compostos fenólicos isolados de B. pilosa, como ácidos dicafeoilquínicos e flavonoides, são descritos como potentes antioxidantes (CHIANG et al., 2004). Essa ação antioxidante foi mostrada em um estudo com extrato bruto de B. pilosa e sua fração acetato de etila, no qual os níveis de atividade antioxidante foram tão altos que exerceram ação hepatoprotetora (KVIECINSKI et al., 2011). 56

Há um interesse crescente nos efeitos protetores dos compostos naturais de origem vegetal contra os danos causados pelas espécies reativas de oxigênio. Neste contexto, muitos experimentos in vitro são realizados para testar a atividade antioxidante de uma dada substância, sendo seguidos da avaliação de atividade antioxidante in vivo. A maioria dos métodos avaliativos in vitro envolve a inibição de diferentes radicais livres (ARUOMA, 2003; DEBA et al., 2007; FRANKEL; MEYER, 2000; SANCHEZ-MORENO, 2002), que podem ser baseados: a) na captura do radical peroxila: ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) e TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential); b) no poder de redução do metal: FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) e CUPRAC (Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity); c) na captura do radical hidroxila: método de desoxirribose; d) na captura de radical orgânico: ABTS•+ (2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina- 6-sulfônico)) e DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazila); e) na quantificação de produtos formados durante a peroxidação lipídica: TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive Substances), oxidação de LDL (Low Density Lipoprotein) e co-oxidação do β-caroteno. As metodologias DPPH•, o ABTS•+ e o FRAP são muito utilizadas na determinação da atividade antioxidante de produtos naturais e alimentos, devido a sua relativa simplicidade como método: reação de oxi-redução entre o oxidante e o antioxidante (TOMEI; SALVADOR, 2007). Os mecanismos envolvidos nos métodos ABTS•+ e DPPH• são semelhantes, sendo ambos baseados na geração de radicais e em mudanças nos espectros de absorção do radical livre decorrente de sua redução. O ABTS•+ é aplicável aos sistemas antioxidantes hidrofílicos e lipofílicos, enquanto o DPPH• aos sistemas hidrofóbicos (TEOW et al., 2007). A Figura 26 mostra a reação de redução dos radicais livre DPPH• (A) e ABTS•+ (B). Entretanto o método do ABTS•+ é mais sensível que o DPPH•, uma vez que este apresenta um impedimento estérico para que o radical OH de um grupo fenol neutralize seu nitrogênio radicalar centralizado entre os grupos alquila (ALISI et al., 2012).

Figura 22 - Estabilização dos radicais livres por antioxidantes, DPPH• (A) (RUFINO et al., 2007b) e ABTS•+ (B). A

Fonte: RUFINO et al. (2007a); RUFINO et al. (2007b).

O teste FRAP é um ensaio de capacidade antioxidante que se baseia na habilidade do antioxidante testado em reduzir o íon Fe3+ em Fe2+ no solvente TPTZ (2,4,6- tripiridil-s-triazina), formando um complexo Fe2+-TPTZ azul intenso (Figura 27) (RUFINO et al., 2006).

Figura 23 - Redução do complexo TPTZ com Fe3+ por ação de um antioxidante

Fonte: Rufino et al. (2006)

A capacidade de quelar metais também tem sido utilizada na avaliação da dos componentes de extratos vegetais em sequestrar os íons metálicos livres, que são catalisadores importantes para a geração de radicais hidroxílicos altamente reativos através da reação de Fenton (equação 6) nos sistemas in vivo e in vitro (HARZALLAH et al., 2016; WONG et al., 2015).

2+ 3+ • - Fe + H2O2 → Fe + OH + OH (6) 58

A Figura 28 exemplifica o resultado de uma reação de redução de Fe3+ em Fe2+ pela ação antioxidante do extrato hidroalcóolico de T. diversifolia, sendo a coloração final de cor roxa dada pela formação do complexo ferrozina-Fe2+. Os agentes quelantes quando presentes em uma amostra não permitem a formação deste complexo, resultando na diminuição da absorbância com uma coloração mais clara (BARROS, 2012).

Figura 24 - Reação de redução do Fe3+ em Fe2+ pela ação antioxidante do extrato de T. diversifolia.

Fonte: Anny Carolyne da Luz

Uma vez que fatores ambientais e intrínsecos das plantas afetam a sua produção de metabólitos secundários, consequentemente, a ação antioxidante desses vegetais também é modulada por esses fatores. Da mesma forma, a utilização de diferentes métodos de extração e solventes poderão favorecer a obtenção de uma ou outra classe de compostos secundários, o que também influenciará na resposta antioxidante. Em estudos com espécimes de Bidens pilosa coletados em seis locais do estado de Minas Gerais, utilizando diferentes métodos de análise e partes da planta (folha/flor, caule e raiz) foi demonstrado que o extrato constituído de folha/flor apresentou melhor atividade antioxidante, avaliada pelo método DPPH, quando comparado com os extratos de raiz e de caule, com a maior atividade antioxidante, obtida com o uso do método de extração por maceração dinâmica. Essa pesquisa 59

também demonstrou que a atividade antioxidante está diretamente relacionada à concentração de compostos fenólicos do extrato (CORTÉS-ROJAS et al., 2013). Lee et al., 2013 também demonstraram correlação entre a atividade antioxidante, avaliada pelos testes DPPH e ABTS, e o teor total de fenóis e flavonoides em Bidens pilosa. Além disso, o mesmo estudo demonstrou que o extrato metanólico de Bidens pilosa apresentou maior poder redutor no teste FRAP que o padrão utilizado (Trolox), sendo este resultado relacionado com a abundante quantidade do composto fenólico ácido 3,5-dicafeoilquínico, na planta. Kviecinski et al., (2011) também descreveram, com uso do DPPH, maior atividade antioxidante para a fração acetato de etila das partes aéreas de B. pilosa e identificaram maior quantidade de compostos fenólicos nesta fração pelo método Folin-ciocalteu. Além disso, os extratos etanólico e acetato de etila/etanólico, da planta inteira de Bidens pilosa suprimiram a hemólise oxidativa e a peroxidação lipídica e proteica em eritrócitos humanos, induzida pelo radical peroxil. Os extratos também impediram o declínio da atividade da superóxido dismutase (SOD) e a depleção de glutationa citosólica (GSH) e ATP nos eritrócitos, indicando propriedades protetoras antioxidantes de B. pilosa (YANG et al., 2006). Com base no exposto, os estudos in vitro demonstram que a espécie Bidens pilosa apresenta uma significativa ação antioxidante. Essa atividade é maior em extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e acetato de etila preparados, principalmente, com a planta inteira (BRASIL, 2015). Da mesma forma que Bidens pilosa, Tithonia diversifolia também possui atividade antioxidante relevante. Em investigação com os extratos etanólico e aquoso das folhas de T. diversifolia foi demostrada com uso do teste do DPPH, uma capacidade antioxidante, de forma dose dependente, para os extratos aquoso e etanólico (CASTILO et al., 2016). Bem como, no teste do ABTS, o extrato aquoso de T. diversifolia mostrou resultados antioxidantes equivalentes ao do padrão n- acetilcisteína (HIRANSAI et al., 2016). Também é descrita a atividade antioxidante das frações acetato de etila e butanólica de T. diversifolia frente aos testes DPPH e FRAP, correlacionada ao teor total de compostos fenólicos (PANTOJA; COLMENARES; ISAZA, 2017). Di Giacomo et al., (2015) compararam os teores de compostos fenólicos e flavonoides dos extratos aquoso, metanólico e diclorometano de Tithonia diversifolia, 60

bem como sua capacidade antioxidante. E, demonstraram que o extrato aquoso, que teve os maiores teores de fenóis e flavonoides, também apresentou a melhor atividade antioxidante entre os três extratos testados. Além disso, foi observado que quando incubado junto ao plasma sanguíneo de um doador saudável, o extrato aquoso causou uma significativa inibição da formação de hidroperóxidos de lipídeos. A literatura mostra que Bidens pilosa e Tithonia diversifolia são plantas exibem propriedades de promoção da saúde, através de sua capacidade antioxidante e potencial proteção dos sistemas celulares contra danos de estresse oxidativo. Sendo estas relacionadas com seus metabólitos secundários, principalmente os compostos fenólicos. Pesquisas que visem promover e padronizar a produção desses compostos, por meio de cultivo e seleção de genótipos, são de grande valor cientifico/farmacológico/tecnológico/medicinal.

3. OBJETIVO GERAL

Avaliar a diversidade genética de Bidens pilosa e Tithonia diversifolia em populações de diferentes regiões do Espírito Santo, comparar as respostas do metabolismo primário e secundário dessas espécies sob diferentes condições de adubação e irrigação, além de analisar os efeitos de seus extratos sobre viabilidade celular de linfócitos humanos e de Sarcoma 180 de roedores.

4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Analisar a diversidade genética, por meio de marcadores RAPD, de duas espécies da família Asteraceae (Bidens pilosa L. e Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray.), de diferentes populações do Espírito Santo;  Investigar as respostas de metabolismo primário de Bidens pilosa frente a diferentes condições de adubação (orgânico, químico e controle) e de irrigação (irrigado e suspensão da rega), utilizando parâmetros fotossintéticos e de biomassa;  Comparar as respostas de metabolismo primário de Tithonia diversifolia submetidas às condições de adubação orgânica, química e controle, através de parâmetros fotossintéticos, de biomassa e área foliar;  Verificar a influência das condições de cultivo impostas à Bidens pilosa e Tithonia diversifolia, sobre os seus teores totais de compostos fenólicos (flavonoides, taninos e fenóis);  Avaliar a atividade antioxidante (DPPH, ABTS; FRAP e atividade quelante do Fe+2) das duas espécies de Asteraceae, expostas a diferentes condições de cultivo;  Relacionar a variação dos teores totais de compostos fenólicos com a atividade antioxidante das duas espécies de Asteraceae, submetidas às diferentes condições de adubação e irrigação;  Quantificar e comparar as concentrações de cumarina luteolina, quercetina, rutina e ácido clorogênico de diferentes frações do extrato hidroalcoólico de 62

Bidens pilosa e Tithonia diversifolia, provenientes de plantas submetidas às diferentes condições de cultivo, em HPLC;  Avaliar a viabilidade celular de linfócitos humanos e de Sarcoma 180 de roedores, expostos aos extratos de Bidens pilosa e Tithonia diversifolia derivados de plantas submetidas às diferentes condições de cultivo, por meio do método MTT;  Relacionar os índices de viabilidade celular com as diferentes concentrações de luteolina, quercertina, rutina, ácido clorogênico e cumarina.

CAPÍTULO 1 – GENETIC DIVERSITY OF POPULATIONS OF Bidens pilosa L. AND Tithonia diversifolia HEMSL. AT ESPÍRITO SANTO

RESUMO: Bidens pilosa e Tithonia diversifolia são duas plantas medicinais da família Asteraceae, distribuídas por toda região tropical e subtropical do planeta, com uso fitoterápico bem difundido contra diversas enfermidades: malária, inflamações, diarreias, diabetes, câncer, entre outras. As características químicas dos vegetais, bem como seus efeitos sobre a saúde humana, podem ser alterados por influência e fatores genéticos, ambientais e ontogenéticos. A técnica do RAPD produz marcadores capazes de determinar a similaridade genética entre populações da mesma espécie, análise importante na conservação, domesticação e manejo de plantas medicinais. O objetivo deste trabalho foi comparar a diversidade genética entre diferentes populações de B. pilosa e entre diferentes populações de T. diversifolia no estado do Espírito Santo. As análises mostraram baixa similaridade entre as populações de B. pilosa estudadas, assim como entre as populações de T. diversifolia. Em ambas as espécies os grupamentos formados não foram correspondentes às distâncias geográficas entre os locais de coleta. Esse resultado é relacionado às formas de reprodução e propagação destas espécies, que contribuem para alta diversidade genética. Assim, como é esperado em espécies ruderais, essas espécies apresentam alta diversidade genética entre as populações, o que contribui para o sucesso de seu estabelecimento em diferentes regiões. Para produção de fitoterápicos é importante a escolha de um genótipo, a fim de que o fator genético não provoque alterações significantes na matéria-prima.

PALAVRAS-CHAVE: picão-preto, girassol mexicano, RAPD, marcador molecular, plantas medicinais.

ABSTRACT: Bidens pilosa and Tithonia diversifolia are two medicinal plants of the family Asteraceae, distributed throughout the tropical and subtropical regions of the planet, with widespread phytotherapeutic use against various diseases: malaria, inflammation, diarrhea, diabetes, cancer, among others. The chemical characteristics of plants, as well as their effects on human health, can be altered by influence and genetic, environmental and ontogenetic factors. The RAPD technique produces markers capable of determining genetic similarity between populations from same species, an important analysis in the conservation, domestication and management of medicinal plants. The objective of this work was to compare the genetic diversity among different populations of B. pilosa and among different populations of T. diversifolia in the state of Espírito Santo. The analyzes showed low similarity between the populations of B. pilosa studied, as well as among the populations of T. diversifolia. In both species, the groupings formed did not correspond to the geographical distances among the collection locations. These results are related to the ways of reproduction and propagation of these species, which contributes to high genetic diversity. Thus, as expected for ruderal species, these species present high genetic diversity among populations, which contributes to the success of their establishment in different regions. For the production of phytotherapy products is important to choose a genotype, in order to avoid that the genetic factor cause significant changes in the raw material.

KEYWORDS: black-jack, mexican sunflower, RAPD, molecular marker, medicinal plants.

1. INTRODUCTION

Asteraceae is one of the most successful plant families, accounting for around 23.000 species and 1.600 genera (ANDERBERG et al., 2007), representing 10% of the total flora of angiosperms (WILSON, 1988). In Brazil, there are approximately 2.000 species and 250 genera (SOUZA; LORENZI, 2008). They are spread throughout all continents, except Antarctica (ROQUE; BAUTISTA, 2008), and many of their species are invasive (BERETTA et al., 2008). Hodgins et al. (2015) suggest that multiple evolutionary pathways may lead to adaptation during the introduction and dissemination of Asteraceae species in different environments.

Heliantheae is one of the tribes of the Asteraceae family (ANDERBERG et al., 2007) which presents several secondary metabolites, whose biological activities are increasingly investigated, as well as important for chemotaxonomy (ARIDOAN, 2006). Bidens pilosa and Tithonia diversifolia are two species of the family Asteraceae, with medicinal interest, which belong to the Heliantheae tribe (FERNANDES; RITTER, 2009; MOURA; ROQUE, 2014).

Bidens pilosa L. (Asteraceae), is a species of annual cycle, autogamous, popularly known as black jack, is an herbaceous plant from South America widely distributed across temperate and tropical regions (ABDOU et al., 2010). This specie is used in traditional medicine for treatment of inflammation, allergy, diabetes, cancer, hepatitis and among others disorders (BARTOLOME et al., 2013). B. pilosa is a species with high genetic variability, caused by a significant cross-pollination rate, which entails to reduced genetic similarity between genotypes (VIDAL et al., 2007).

Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray (Asteraceae), a perennial shrub, is native from Mexico and grows in parts of Africa, Australia, Asia and other parts of America. Their extracts are traditionally used in the treatment of diabetes, diarrhea, menstrual cramps, malaria, hematomas, hepatitis, hepatomas and wound healing (CHAGAS- PAULA et al., 2012).

It is known that the phytochemical compounds in the same species varies according factors ontogenetic, environmental and genetics (CHIRINOS et al., 2013; TLILI et al., 2014), which may affect their biological properties. Differences among populations can be established by several markers, among them the RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), a dominant marker, has been successfully used to 67

analyze the genetic diversity of natural populations (ALI et al., 2012; SINGH et. al, 2012; FACANALI et. al, 2015). The RAPD technique produces molecular markers through the use of small primers with arbitrary sequences and, because of that, is a method often useful for investigating species which had not been described genetically. This technique is fast and shows a high potential to detect polymorphism, even when small amount of genomic DNA is available (LACERDA et al., 2002). Furthermore, is able to detect changes in coding and noncoding regions (GAJERA et al., 2010; KATSIOTIS et al., 2009; LIN et al., 2009). Thereby, the RAPD provide a convenient and rapid tool in assessing genetic differences between genotypes, even at a lower intraspecific taxonomic level (GAD et al., 2013).

Genetic analysis of medicinal plants is important for their domestication, conservation and efficient management (CARVALHO et al., 2009), since the quality of the final phytotherapy product is the result of the interaction between the cultivation techniques adopted in the production of medicinal plants, with the genetic characteristics of the population. This makes it relevant that the individuals which compose the population to be cultivated possess genetic similarity, in order to facilitate the management and to obtain chemically homogeneous raw material, guaranteeing the necessary quality for their commercial viability (MONTANARI, 2002).

Thus, the objective of this work was to compare genetically different populations of two species of medicinal plants: Bidens pilosa and Tithonia diversifolia.

2. MATERIAL AND METHODS

2.1. PLANT MATERIAL

2.1.1. Bidens pilosa L.

The aerial parts of ten Bidens pilosa adult specimens were randomly selected and collected at four localities of Southeastern Brazil region: Afonso Cláudio (AC) (41º 09ʹ 58.57ʺ W; 20º 15ʹ 07.33ʺS), Barra de São Francisco (BSF) (40º 54ʹ 51.9ʺ W; 18º 44ʹ 43.9ʺ S), Cariacica (CA) (40º 23' 54.0'' W; 20º 17' 28.5'' S) and Muniz Freire (MF) (41º 25ʹ 22.593ʺ W; 20º 31ʹ 38.1008ʺ S). Specimens were identified, for all localizations, by the VIES herbarium of the Universidade Federal do Espírito Santo (voucher numbers: 41242, 23026, 23029 and 23030). 68

2.1.2. Tithonia diversifolia Hemsl.

The aerial parts of ten Tithonia diversifolia adult specimens were randomly selected and collected at five localities of Southeastern Brazil: Colatina (COL) ( 19º 30’ 08.2” S; 40º 36’ 40.7” W), Muniz Freire (MF) (20º 28’ 09.9” S; 41º 24’ 14.7” W), Santa Teresa (ST) ( 19º 95’ 389”; 40º 55’ 783”W), Viana (VIA) (20º 25’ 23.184” S; 40º 28’ 37.2828” W) and Vitória (VIT) (20º 16’ 30.4716” S; 40º 18’ 17.5284” W). A voucher specimen (VIES 35297) was deposited in the Central Herbarium of Universidade Federal do Espírito Santo/VIES, Brazil.

2.2. GENETIC ANALYSIS USING RAPD MARKERS

Extraction of genomic DNA was based on the protocol described by Doyle (1987). For this analysis, 100 mg of pools of 10 plants from each locality, previously frozen, were ground in liquid nitrogen with polyvinylpolypyrrolidone. The obtained powder was mixed with 1mL of CTAB (Cetyl Trimethylammonium Bromide) extraction buffer (2% CTAB, 1.4M NaCl, 100mM Tris-HCl pH 8, 20mM EDTA pH 8), β- mercaptoethanol and proteinase-K, incubated for 30 min at 65ºC. After cooling, 500μL chloroform:isoamyl alcohol (24:1) was added and centrifuged for 5 min at 12000 RPM. This procedure was repeated twice. The supernatant was treated with RNAse A (10μg. μL-1), at 37º C for 30 min. DNA precipitation was performed with 0.6% (v/v) of cold isopropanol. The formed pellet was washed with 70% ethanol, dried at room temperature and resuspended in 100μL of Tris-EDTA pH 8 (TE buffer). Four replicates of DNA extraction were made from each leaf pool of the localities. DNA concentration was evaluated spectrophotometrically by NanoDrop 3300 (Thermo Scientific) and the quality of the DNA was checked by electrophoresis on a 1% agarose gel stained with GelRedTM (BIOTIUMTM).

Initial PCR reactions were performed using thirty-two random decamer primers from the Operon Technology-USA. For Bidens pilosa, Twenty-one primers (OPAD- 01, OPAD-08, OPAD-10, OPAD-17, OPAD-18, OPD-04, OPD-18, OPG-19, OPI-14, OPI-19, OPI-20, OPE-06, OPE-11, OPE-12,OPP-05, OPP-06, OPP-08, OPP-09, OPP-10, OPF-18, OPF-20) have been selected on the basis of the good resolution and the polymorphism of bands. For Tithonia diversifolia, seventeen primers (OPAD- 69

01, OPAD-08, OPAD-10, OPAD-17, OPAD-18, OPD-04, OPD-18, OPG-19, OPI-14, OPI-19, OPI-20, OPE-06, OPE-09, OPE-12, OPP-05, OPP-06, OPP-08) were selected.

Each PCR reaction was performed in 25µL reaction volume containing 25 ng

DNA template, 5 µl de 5x reaction buffer, 2.5 µL 25mM MgCl2, 0.5 µl 10mM dNTP, 1.25U Taq and 0.3 µL (10 µM) of specific primer, in Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Apllied BiosystemsTM). The PCR cycles following the conditions: 94◦C for 3 min, 40 cycles of desnaturation at 94◦C for 1 min, annealing at 35◦C for 1 min and extension at 72◦C for 2 min. After the cycles, the samples were submitted to a final extension step at 72◦C for 10 min. Amplification products were separated on 2% agarose gel in TBE buffer (1x), stained with GelRedTM (BIOTIUMTM), visualized under UV light and recorded using a transilluminator LPIX-TOUCH (Loccus Biotecnologia, Brazil).

2.3. STATISTICAL ANALYSIS

For RAPD analysis, bands were scored as either present (1) or absent (0). The scored RAPD markers were converted into a binomial matrix. From these data, the genetic proximity was estimated applying Jaccard similarity coefficient, only polymorphic loci were used. Clustering analysis was conducted using the Unweighted Pair Group Method Arithmetic Average (UPGMA) method, using XLSTAT (version 2016.05.33324) for Windows (Addinsoft, New York, USA).

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. BIDENS PILOSA L.

The twenty-one selected primers generated 111 discernible and reproducible DNA polymorphic fragments. The amplified bands ranged between 100 and 2000bp. The UPGMA cluster analysis of the Jaccard’s similarity coefficient generated a dendogram demonstrating the overall genetic relationship among the populations. Two groups were formed and there was low similarity between them (10.3%). In the groups, the lowest genetic similarity was found between populations MF and AC (33.3 %) and highest between BSF and CA (58.1 %), as shows in Fig. 1. 70

Fig. 1. Dendrogram showing genetic variability between four Bidens pilosa populations determined by RAPD markers. BSF, Barra de São Francisco; CA, Cariacica; MF, Muniz Freire; AC, Afonso Claudio.

0 0.1 0.2 0.3

0.4 0.5

Similarity 0.6 0.7 0.8 0.9

CA AC MF BSF

Levels of similarity between BSF and CA and between MF and AF (Fig. 1), shows that the populations are relatively different. These values are close to those obtained with analyzes of other ruderal species. For example, for Bidens pilosa and B. subalternans, collected in southern and central-western Brazil, the average coefficient of genetic similarity was low, ranging from 22% to 50%, respectively (HERNANDEZ, 2004). For B. pilosa populations collected in the state of Paraná, the average genetic similarity was 37% (VIDAL et al., 2005). For Euphorbia heterophylla, from the state of Rio Grande do Sul, 40% similarity was found (WINKLER et al., 2003). However, Eichornia crassipes has a high genetic similarity, close to 90%, which is explained by the vegetative propagation of this species, which excludes the possibility of genetic recombination (CARDOSO et al., 2002).

B. pilosa is a autogamous species, display up to 10% of cross-fertilization and reproduces by seeds (SUN AND GARDERS, 1990). It’s distributed in all the cultivable regions of many countries and a single plant can produce 3.000 viable seeds (KISSMANN; GROTH, 1999). These characteristics ensure high genetic variability of this species. The low level of similarity observed in the two clusters formed, indicate that clustering is not only related with the proximity of geographic locations. Possibly, seed dispersal through migratory birds or another animals 71

(zoochory) and with cultivated species seeds contaminated with B. pilosa facilitated gene flow by seed (VIDAL et al. 2007), making possible that population from distant locations were grouped into a closer cluster due to their common origin. Vidal et al. (2006) also found high genetic variability among Bidens gender of plants from the same population. Lamego et al. (2006) and Vidal et al. (2007) founded low genetic similarity of B. pilosa from different populations.

3.2. TITHONIA DIVERSIFOLIA HEMSL.

The seventeen selected primers generated 57 discernible and reproducible DNA fragments, which 34 were polymorphic. The amplified bands ranged between 100 and 2000 bp. The UPGMA cluster analysis of the Jaccard’s similarity coefficient generated a dendogram for T. diversifolia samples that shows ST has lower genetic similarity to other populations 12%, with highest genetic similarity found between MF and VIA 89%, indicating high levels of genetic diversity and that clustering is not positively correlated with the proximity of geographical locations, as shown in Fig. 2. Comparisons of genetic diversity among populations of T. diversifolia from Mexico also showed high genetic diversity (DEL VAL DIAZ et al., 2017). In the same way, Jing et al. (2012) found high genetic diversity among populations of Tithonia diversifolia from China.

Fig. 2. RAPD based dendrogram. ST: Santa Teresa; VIT: Vitória; COL: Colatina; MF: Muniz Freire; VIA: Viana.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Similarity 0,6

0,7

0,8

0,9

1 ST VIT COL MF VIA

Genetic diversity is one of the most important attributes for the species or populations enabling adaptation to new situations. T. diversifolia has been described as an invasive plant that can establish itself in different ecosystems (MUOGHALU, 2008). T. diversifolia reproduce sexually and vegetatively, produces large numbers of seeds and presents a high diversity of pollinating insects (MUOGHALU; CHUBA, 2005), characteristics that could certainly contribute to a greater genetic variability. Besides that, in well-established species, the majority of the variability is concentrated between the populations (GAUER; CAVALLI-MOLINA, 2000).

This comparative molecular analyses of four B. pilosa and of five T. diversifolia populations from Espírito Santo-Brazil, corroborates with the studies that indicate that ruderal species present high genetic diversity, which contributes to their establishment in several environments. The present study assumes significance as it provides valuable information on the pattern of genetic variation existing in these medicinally important species, being important for the production of herbal medicines the choice of a genotype, in order that the genetic factor does not cause significant alterations in the raw material.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work is an integral part of the project financed by FAPES. The authors thank for the doctoral scholarship granted by FAPES an CAPES.

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CAPÍTULO 2 – DIFFERENT GROWTH CONDITIONS ON Bidens pilosa L. INDUCE CHANGES IN THE PHENOLIC COMPOUND CONTENT, BIOMASS, GAS EXCHANGE AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES

Após revisão da língua inglesa, e considerações da banca examinadora, este artigo será submetido à revista: Journal of Agricultural and Food Chemistry Print Edition ISSN: 0021-8561 Web Edition ISSN:1520-5118

1 Different plant management conditions on Bidens pilosa L. induce changes in the

2 phenolic compound content, biomass, gas exchange and antioxidant activities

3 Anny Carolyne da Luz*, Irany Rodrigues Pretti, Mainã Mantovanelli da Mota, Maria do

4 Carmo Pimentel Batitucci.

5 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo, Av. Fernando

6 Ferrari 514, Goiabeiras, 29075-910, Vitória, ES, Brazil. 55 27 4009-7251.

7 [email protected]

26 ABSTRACT:

27 The effect of management on the production of secondary metabolites in plants has been

28 proposed as a mechanism for improving their antioxidant potential. In this study, the impact

29 of fertilization conditions (chemical fertilizer, cattle manure and no fertilizer), in addition to

30 water deficit, on the physiological responses of Bidens pilosa was investigated. Plants

31 fertilized with cattle manure, as the organic fertilizer, and irrigated showed high levels of

32 biomass and gas exchange, whereas irrigated and unfertilized plants had the highest content of

33 phenolic compounds and antioxidant activity, although low biomass. The production of

34 secondary metabolites was up-regulated when photosynthesis decreased. The correlation of

35 81% between manganese in leaves and total tannin content reinforces the importance of

36 studying growing conditions of medicinal plants. Once manganese is a micronutrient that acts

37 in the shikimic acid pathway, plays an important role in secondary metabolism, consequently

38 increasing the antioxidant potential of the medicinal plant. Our results demonstrate that

39 phenolic levels and antioxidant activity of Bidens pilosa can be manipulated through fertilizer

40 and irrigation management, with the goal of finding the best management combination for

41 achieving higher phenolic concentration, stronger antioxidant activity and a good harvest.

42 KEYWORDS: Black-jack, phenolic compounds, water deficit, fertilizer, nutrients,

43 photosynthesis, antioxidant.

51 INTRODUCTION

52 Bidens pilosa L. (Asteraceae) is an annual plant and originates from South America.

53 However, it is now widely distributed in most pantropical areas of the world1. Phytochemical

54 studies identified phenylpropanoid glucosides, diterpenes, polyacetylenes, flavonoids and

55 flavone glycosides as bioactive components from this plant that present several biological

56 activities, such as antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory, antiseptic, hepatoprotective,

57 antimalarial, antihipertensive and hypoglycemic effects and properties that can contribute to

58 the for treatment of jaudince1,2.

59 Diverse secondary metabolites, such as phenolic compounds, possess antioxidant

60 activity and may help protect cells against oxidative damage caused by free radicals and

61 reactive oxygen species (ROS)3. In the cells, the reactions mediated by ROS, protect them

62 from oxidative stress and stabilize redox homeostasis. However, when the pro-

63 oxidant/antioxidant ratio is imbalanced towards ROS production, oxidative stress occurs,

64 which is associated with several diseases4.

65 Secondary metabolites represent a chemical interface between plants and the

66 environment. Therefore, variations in the total content and the relative proportions of

67 secondary metabolites in plants are frequently affected by abiotic factors5, such as water

68 availability, light intensity, carbon dioxide levels, temperature and fertilization. Thus, the

69 biomass and the concentration of secondary metabolites depend on the growing conditions

70 and management practices, in order to generate standardized and good quality raw material.

71 Considering quality to be one of the main factors related to consumer acceptance and

72 sustainability in the market, it is important to strictly control and standardize all the stages

73 involved in the production of phytopharmaceutical preparations, such as the selection of the

74 starting plant material, cultivation, fertilization, irrigation, extraction conditions, and the

75 quantification of secondary metabolites or bioactive compounds in the final product 6.

76 The supply and availability of nutrients is the most important factor for higher

77 productivity among the various plant cultivation practices, for which both chemical fertilizers

78 and organic fertilizers are used. Chemical fertilizers are often based on combinations of

79 nitrogen, phosphorus and potassium nutrients. Nitrogen (N), phosphorus (P) and potassium

80 (K) are essential nutrients which are limiting for plant 7. Nitrogen is the mineral element that

81 plants require in the greatest amounts. It serves as a constituent of many plant cell

82 components, including amino acids, proteins, and nucleic acids 8. Phosphorus is important in

83 energy storage reactions or in maintaining structural integrity, present in plant tissues as

84 phosphate covalently bound to an organic molecule, such as the sugar-phosphate

85 intermediates of respiration and photosynthesis, and is also a component of nucleic acids,

86 phospholipids, and ATP8. Potassium is an important enzyme cofactor and plays a central role

87 in several metabolic processes, such as turgor driven movements, membrane polarization,

88 regulation of osmotic potentials, and protein biosynthesis9.

89 Organic fertilizers, such cattle manure, constitute strategic alternatives for increased

90 yield and reduction in production costs, contributing to the balanced supply of macro and

91 micronutrients10,11.

92 Besides being a determinant factor in productivity, the mineral nutrients influence the

93 production of secondary metabolites, source of antioxidants, abundant in medicinal plants.

94 Natural antioxidants have received great attention, as they are effective free radical

95 scavengers and are less toxic than synthetic antioxidants12.

96 There are several tests for evaluating the antioxidant potential of plant extracts. The

97 majority of the experiments for testing antioxidant activity in vitro are defined as inhibition

98 methods involving free radicals13. The purpose of this study was to investigate the effects of

99 different management strategies on B. pilosa primary and secondary metabolism and the

100 antioxidant activity of the plant.

101 MATERIALS AND METHODS

102 Plant material and growth conditions. Seeds of B. pilosa were collected in Afonso

103 Claudio (Espírito Santo - Brazil), a voucher specimen was identified by the VIES herbarium

104 of the Universidade Federal do Espírito Santo (VIES 41242), and germinated in pots

105 containing organic soil (pH 6.4) in a greenhouse located in Cariacica (Espírito Santo - Brazil).

106 Pots were brought to field capacity and regularly watered by weight, with no drainage from

107 the pots. The treatments carried out were: control (organic soil), fertilizer (N-P-K 4:14:8 at 0.3

108 g.Kg-1 soil) and organic (cattle manure at 125 g.Kg-1 soil). The experimental design was

109 completely randomized with 20 replicates per treatment. At 120 days after planting, in 10

110 replications per treatment irrigation was suspended until the water potential reached -4 MPa.

111 Therefore, six treatments were established: irrigated control (IC), dry control (DC), irrigated

112 fertilizer (IF), dry fertilizer (DF), irrigated organic (IO) and dry organic (DO).

113 At 130 days after planting, in the pre-flowering stage, gas exchange measurements

114 were performed. The plants were collected for growth measures and to prepare the

115 hydroalcoholic extract. The potting soil for each treatment was collected, and also the leaves,

116 for chemical analysis of nutrients.

117 Determination of total dry mass. The total dry mass (TDM) of plant material was

118 measured after drying in an oven at 45ºC, until a constant weight was obtained.

−2 −1 119 Gas Exchange Parameters. Net photosynthesis (A, expressed in μmol CO2 m s ),

−2 −1 −2 −1 120 stomatal conductance (gs, mmol H2O m s ), transpiration (E, mmol H2O m s ), and

-1 121 internal concentration of carbon (Ci, μmol CO2 mol ) were determined using a closed infra-

122 red gas analyzer, LICOR 6400 Portable Photosynthesis System (IRGA, Licor Inc., USA).

123 Measurement was performed within the time period 08:00h-11:00h, using fully expanded

-1 124 young leaves, maintaining the air temperature at 27 °C, CO2 concentration at 400 μmol mol

125 and photosynthetic photon flux density (PPFD) at 1000 μmol m-2s-1. Moreover, instantaneous

−1 126 water use efficiency (A/E, μmol CO2 mmol H2O) was calculated from the gas exchange

127 measurements14,15.

128 Hydroalcoholic extract. The dry aerial parts of ten plants of B. pilosa, from each

129 treatment, were powdered and macerated with aqueous ethanol 70% at a ratio of 5:1 (v/w) by

130 72 h, at room temperature. The process was repeated twice to extract the maximum

131 constituents. The resulting solutions were then filtered with filter paper to remove the

132 particles and concentrated using a vacuum evaporator TE-210 (TECNAL, Brazil) to obtain

133 the hydroalcoholic extracts of the B. pilosa (HEB) for each of six growth treatments.

134 Total phenolic content (TPC). Total phenolic content (TPC) was measured according

135 to the Folin-Ciocalteu method16. Ethanol solution of HEB at 500 μg.mL-1 (20 μL) was added

136 to 100 μL of Folin-Ciocalteau reagent diluted in distilled water (1:10) (v:v). After 5 min, 80

137 μL of Na2CO3 (7.5%) was added and the plate kept in the dark at room temperature for 2 h.

138 The absorbance was measured at 750 nm with a spectrophotometric microplate reader (Epoch

139 Microplate Spectrophotometer – BioTek). Concentrations of gallic acid were 12.5, 25, 50,

140 100, 250, 500 and 1000 μg.mL-1. Ethanol was used as the blank. TPC was expressed as gallic

141 acid equivalent per gram of dry weight (mg GAE.g-1 d.w.), compared with a calibration curve

142 of gallic acid y = 0.0054x + 0.1122 R² = 0.9992. For each sample, three replications were

143 performed.

144 Total tannin content (TTC). Total tannin content (TTC) was determined according to

145 Folin-Denis method17 with a few modifications. Ethanol solution of HEB 500 μg.mL-1

146 (500μL) was added to 500 μL of Folin-Denis reagent. After 3 min, 500 μL of Na2CO3

147 solution (8%) was added, mixed and incubated for 2 h. The mixture was then centrifuged at

148 2000 rpm for 5 min and the absorbance measured at 725 nm. Tannic acid (12.5, 25, 50, 100,

149 500 and 1000 μ.mL-1) was used to calculate the standard y = 0.0067x + 0.2727 R² = 0.9721

150 and the results were expressed as tannic acid equivalents per gram of dry weight (mg TA.g-1

151 d.w.). Ethanol was used as a blank. For each sample, three replications were performed.

152 Total flavonoid content (TFC). Total flavonoid content (TFC) was quantified using

153 the colorimetric method with aluminum chloride18. In sealed tubes, 1500 μL of a 2%

154 methanol solution of AlCl3⋅6H2O was added to 500 μL of methanol solution of HEB 500

155 μg.mL-1 and then kept in the dark for 10 min at room temperature. Concentrations of

156 quercetin used to establish the standard curve of flavonoids were 7.8, 15.62, 31.25, 62.5, 125,

-1 157 250 and 500 µg.mL . Absorbance was read at 430 nm. Methanolic AlCl3 was used as the

158 blank and each measurement was performed in triplicate. TFC in extract was expressed as

159 quercetin equivalent per gram of dry weight (mg QE.g-1 DW), compared with a calibration

160 curve of quercetin y = 0.0189x + 0.1364 R² = 0.9966.

161 Free radical scavenging activity using the DPPH assay. In order to measure the

162 radical scavenging activity of 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 19, HEB samples and

163 standard (ascorbic acid) were diluted in methanol (15.62, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 and 1000

164 μg.mL-1 ). Methanolic DPPH solution (0.3 mM, 200 μL) was added to 100 μL of the test

165 solution. After 30 min at room temperature in the dark, the absorbance was measured at 517

166 nm using a spectrophotometric microplate reader. A decrease in the absorbance indicates an

167 increase in the scavenging activity. The test was conducted in triplicate and the percentage

168 inhibition of DPPH was calculated as follows: % inhibition of DPPH = [(Abs0 – Abs1) /Abs0]

169 × 100, where Abs0 = absorbance of control and Abs1 = absorbance of the sample. Methanol

170 was used as the blank and DPPH solution plus methanol was used as the negative control.

-1 171 Results were expressed as the EC50 value (μg.mL ), that is the effective concentration of

172 antioxidant agent required to scavenge 50% of DPPH.

173 Free radical scavenging activity using the ABTS assay. The ABTS [2,2′-azino-

174 bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt] assay20 was performed using a

175 solution prepared by mixing 5 mL of ABTS+ (7 mM) with 88 μL of potassium persulfate (2.5

176 mM). The solution was incubated before use in the dark at room temperature for 16 h. The

177 solution was then diluted with ethanol to absorbance value of 0.700 (± 0.05) at 734 nm.

178 ABTS+ solution (200μL) was mixed with 40 μL of the test solutions: HEB samples and

179 standard (Trolox) at concentrations of 15.62, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 and 1000 μg.mL-1.

180 The decrease in absorbance was measured at 734 nm after incubation for 6 min. The test was

181 conducted in triplicate and the scavenging activity was determined using the following

+ 182 formula: % scavenging of ABTS = [(Abs0 – Abs1) / Abs0] × 100, where Abs0 = absorbance

183 of control and Abs1 = absorbance of the sample. Ethanol was used as the blank and ABTS-

184 potassium persulfate solution plus ethanol was used as the negative control. Results were

-1 185 expressed as the EC50 value (μg.mL ).

186 Chelating activity with Fe2+ ions. The chelating activity21 of HEB with ferrous ions

187 was measured using 1 mL of HEB methanolic solution (15.62, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 and

-1 188 1000 μg.mL ) added to 50 μL of FeCl2 solution (2 mM) and 200 μL of ferrozine (5 mM), and

189 incubated at room temperature for 10 min. The absorbance was recorded at 562 nm in

190 microplate reader. Chelating activity was calculated as follows: chelating activity (%) =

2+ 191 [(Abs0 – Abs1) / Abs0] × 100, where Abs0 is the absorbance of the ferrozine-Fe complex and

-1 192 Abs1 is the absorbance of the sample. Results were expressed as the EC50 value (μg.mL ).

193 EDTA was used as the positive control. The assay was carried out in triplicate.

194 Ferric reducing antioxidant power assay (FRAP). The total antioxidant power of

195 the extracts were determined using the FRAP method22. The FRAP reagent was prepared

196 immediately prior to use, using 25 mL of 0.3 M acetate buffer, 2.5 mL of 10 mM 2,4,6-Tri(2-

197 pyridyl)-s-triazine (TPTZ) and 2.5 mL of 20 mM ferric chloride. 30 μL of HEB ethanolic

198 solution (15.62, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 and 1000 μg.mL-1) plus 90 μL of distilled water

199 were incubated with 900 μL of the FRAP reagent for 30 min at 37 °C in the dark. The

200 absorbance of the ferrous-TPTZ complex was recorded at 595 nm. The standard curve was

201 constructed using FeSO4 at concentrations of 250, 500, 1000, 1.500 and 2000 μM. Results

-1 202 were expressed as the EC50 value (μg.mL ). Each assay was carried out in triplicate.

203 Statistical analysis. The data were expressed as mean ± standard error (SE).

204 Statistical analysis was performed using ASSISTAT version 7.7 beta software (Assistat

205 Software, Campina Grande, Paraíba, Brasil.) Data were subjected to one-way analysis of

206 variance and means were compared using Tukey’s test at 5% of probability. The Pearson

207 linear correlation coefficient and Principal Component Analysis (PCA) were performed

208 employing XLSTAT for Windows (Addinsoft, New York, USA), using all the six treatments

209 IC, DC, IF, DF, IO and DO.

210 RESULTS AND DISCUSSION

211 Effects of water deficit. Table 1 presents the chemical characteristics of the soil pots

212 for the different the treatments. Considering the base saturation percentages shown, all of

213 them up to 50%, the soils from the three treatments can be classified as eutrophic23.

214

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225 Table 1. Chemical characteristics of control, organic and fertilizer soil pots. 226 Attributes Control Organic Fertilizer 227 Phosphorus(1) ( g.kg-1) 0.110 0.1310 0.098 228 Potassium(1) ( g.kg-1) 0.270 0.390 0.410 229 Sulfur(2) ( g.kg-1) 0,012 0.013 0.019 230 Calcium(3) ( g.kg-1) 2.457 2.652 2.262 231 Magnesium(3) ( g.kg-1) 0.390 0.897 0.468 232 Organic matter(4) (dag.kg-1) 3.10 4.30 2.90 233 Iron(1) ( g.kg-1) 0.160 0.118 0.163 234 Zinc(1) ( g.kg-1) 0.125 0.106 0.105 235 236 Copper(1) ( g.kg-1) 0.0021 0.0007 0.0015

237 (1) -1 238 Manganese ( g.kg ) 0.124 0.157 0.143 239 240 Boron(5) ( g.kg-1) 0.00076 0.00059 0.00067 241

242 Sodium(1) ( g.kg-1) 0.140 0.170 0.160 243 244 245 Base Saturation (%) 89.60 90.80 89.70 246

247 pH (H O) 8.00 7.90 7.90 248 2 249 (1) -1 -1 250 Extracted with HCI 0.05 mol.L and H2SO4 0.025 mol.L , (2) -1 (3) 251 extracted with Ca(H2PO4)2 0.01 mol.L , extracted with -1 (4) -1 252 KCI 1mol.L , Oxidation with: Na2Cr2O72H2O 4 mol.L and -1 (5) 253 H2SO4 10 mol.L , extraction with BaCI2 2H2O 0.125%. 254

255 For nutrients to be available in the soil it is necessary to have water for the

256 mineralization of macro- and micro-nutrients and organic matter23. Water deficit directly

257 affects soil nutrient absorption, as shown in Table 2. Comparing the chemical analysis of the

258 leaves for each treatment, nutrient absorption was lower in the non-irrigated plants than in the

259 irrigated plants.

260

261 Table 2. Chemical analysis of Bidens pilosa leaves from different treatments.

IC DC IO DO IF DF

Nitrogen(1) (g.kg-1) 30.10 21.00 29.12 29.19 22.05 18.41

Phosphorus(2)(g.kg-1) 6.00 5.12 5.46 3.79 6.96 5.63

Potassium(2) (g.kg-1) 43.75 26.88 37.50 23.75 34.38 31.25

Calcium(2) (g.kg-1) 29.64 19.65 16.22 25.83 28.39 20.28

Magnesium(2)(g.kg-1) 6.88 5.31 3.75 6.50 7.19 4.06

Sulfur(2) (g.kg-1) 4.87 2.68 4.50 2.12 6.01 4.13

Iron2 (g.kg-1) 0,89 0,61 0,99 0,54 0,91 0,71

Zinc(2) (g.kg-1) 0,52 0,54 0,60 0,41 0,12 0,40

Copper(2) (g.kg-1) 0,25 0,20 0,23 0,15 0,25 0,18

Manganese(2) (g.kg-1) 0,67 0,43 0,55 0,46 0,77 0,42

Boro(3) (g.kg-1) 0,85 0,80 0,82 0,90 0,10 0,90

262 Irrigated Control (IC), Dry Control (DC), Irrigated Organic (IO), Dry Organic (DO), 263 Irrigated Fertilizer (IF), Dry Fertilizer (DF). 264 (1) Hot acid digestion, (2) Nitro-perchloric digestion, (3) Dry digestion 265

266 The leaf gas exchange in B. pilosa plants shows differences between the treatments

267 (Table 3). Plants grown under IO conditions showed high values for net photosynthesis (A),

268 stomatal conductance (gs) and transpiration (E). E and A are entirely related to gs, as gs

8 269 reflects the inflow and outflow of water and CO2 from stomates .

270 IO treatment showed an increase in gs of up to 57% compared to the other treatments,

271 and the reduction in gs values with all other treatments was accompanied by a decrease in E.

24 272 The relationship between gs and E has been described previously for B. pilosa . However, the

273 increase in gs observed with organic cultivation may be related to the known effect of bovine

274 manure on transpiration, as this fertilizer stimulates the action of proteins and organic solutes

275 in stomatal opening25.

276 Table 3. Effects of different growth conditions on Total Dry Mass, Net photosynthesis, Stomatal 277 conductance, Transpiration, Intercellular CO2 and Instantaneous water use efficiency of Bidens pilosa IC DC IO DO IF DF

TDM (g) 3.67 ± 0.57b 1.76 ± 0.25b 10.34 ± 2.09a 5.78 ± 1.03b 2.03 ± 0.24b 3.75 ± 0.71b

-2 -1 b ab a c a ab A (μmol CO2 m s ) 8.54 ± 0.50 9.38 ± 0.37 10.56 ± 0.25 6.25 ± 0.46 10.74 ± 0.2 9.51 ± 0.16

-2 -1 abc ab a c abc bc gs (mol H2O m s ) 0.27 ± 0.04 0.28 ± 0.04 0.33 ± 0.05 0.14 ± 0.02 0.25 ± 0.02 0.19 ± 0.01

-2 -1 ab ab a c ab bc E (mmol H2O m s ) 2.30 ± 0.18 2.67 ± 0.17 2.84 ± 0.16 1.66 ± 0.17 2.74 ± 0.07 2.18 ± 0.06

-1 306.36 ± 317.54 ± 309.00 ± 298.21 ± 309.11 ± Ci (μmol CO2 mol ) 300.54 ± 2.06a 5.33a 4.11a 5.44a 6.10a 3.31a

-1 a a a a a a A/E [µmol CO2 (mmol H2O) ] 4.18 ± 0.18 3.81 ± 0.19 4.03 ± 0.17 4.46 ± 0.28 4.01 ± 0.12 4.46 ± 0.09

278 Total dry mass (TDM), Net photosynthesis (A), Stomatal conductance (gs), Intercellular CO2 (Ci), Transpiration (E), Instantaneous water use 279 efficiency (A/E). 280 Irrigated Control (IC), Dry Control (DC), Irrigated Fertilizer (IF), Dry Fertilizer (DF), Irrigated Organic (IO), Dry Organic (DO). 281 All the values shown are mean ± SE (triplicate); SE: standard error; 282 Different letters in the same line indicate statistically significant differences using ANOVA and Tukey’s test (ρ ≤ 0.05). 283

284 Ci is a physiological characteristic dependent on edaphic conditions, availability of

285 water and light, although the CO2 concentration in the mesophyll is characteristic of each

286 species26. In the current study, the different growth conditions to which B. pilosa was

287 subjected did not significantly affect the concentrations of Ci.

288 The A/E ratio refers to the efficiency of E, that is the amount of water transpired for

24 289 CO2 fixation; the increase in A implies water loss by E . There was no statistical difference

290 between the treatments in the A/E ratio.

291 There were no differences between Ci and A/E in the treatments. In addition,

292 treatments without irrigation did not always present the lowest values of E and gs,

293 demonstrating that absence of irrigation had few effects on gas exchange parameters.

294 Phenolic compounds and biomass relations. The analysis of phenolic compound

295 content showed no differences in TPC values between treatments (Table 4). However, in the

296 control treatment, both the tannin content and the flavonoid content were higher with irrigated

297 conditions than with dry conditions. For the growth in organic conditions, there was no

298 difference in tannin content, when considering the irrigation conditions. Though, the

299 flavonoid content was lower with irrigated condition than with water-deficient condition. The

300 treatment with NPK fertilizer resulted in higher tannin content with irrigated condition,

301 although no significant differences in the flavonoid content. The IC treatment presented the

302 highest levels of TTC and TFC.

303

304 Table 4. Content of phenolic compounds in Bidens pilosa under different growth conditions. IC DC IO DO IF DF TPC (mg GAE.g-1d.w.) 52.64 ± 5.08ª 47.95 ± 2.55ª 55.11 ± 2.99ª 51.96 ± 0.26ª 59.43 ± 3.55ª 37.83 ± 1.62ª TTC (mg TA.g-1d.w.) 63.37 ± 1.72ª 27.05 ± 1.00d 36.96 ± 0.95c 40.09 ± 1.13c 49.64 ± 1.58b 22.48 ± 1.05d TFC (mg QE.g-1d.w.) 24.86 ± 0.20a 19.04 ± 0.87bc 13.36 ± 0.67d 21.65 ± 0.58b 17.77 ± 0.73c 19.01 ± 0.49bc 305 Total phenolic content (TPC), Total tannin content (TTC), Total flavonoid content (TFC). 306 Irrigated Control (IC), Dry Control (DC), Irrigated Fertilizer (IF), Dry Fertilizer (DF), Irrigated Organic (IO), Dry Organic (DO). 307 All the values are expressed as mean + SE (triplicate); SE: standard error. Different letters in the same row indicate statistically significant differences, using ANOVA and Tukey’s test (ρ ≤ 0.05)

308 B. pilosa presented high averages of TDM and gas exchange parameters (Table 3) with

309 the IO treatment. Under these conditions there was good availability of nutrients in the soil

310 (Table 1), as well as good absorption of the nutrients by the leaves (Table 2). However, the IC

311 growth conditions, with lower mean values in the parameters of gas exchange and TDM than

312 IO, presented the highest TTC and TFC values (Table 4). A similar result was reported with

313 Orthosiphon stimaneus and Labisia pumila; the production of secondary metabolites was up-

314 regulated when photosynthesis decreased27,28. This was probably a result of the low net

315 photosynthetic activity leading to up-regulation of shikimic acid in the pentose phosphate

316 pathway. Previous studies27,28 already described that plants under low light levels had reduced

317 net photosynthesis due to accumulation of non-structural carbohydrate in the leaves, that is

318 usually related to an impairment of net photosynthesis and to up-regulation of secondary

319 metabolite production.

320 The results of the current study indicate that B. pilosa does not present over

321 accumulation of phenolic compounds as a way to enhance tolerance to drought stress.

322 Analysis of phenolic compound content in Solanum lycopersicum29 also found a little or no

323 change in flavonoid concentration in the tomato fruits as a result of water stress. Some

324 cultivars of Solanum tuberosum showed a drastic reduction in polyphenols under drought

325 conditions, demonstrated by highly cultivar-dependent variations30. This reinforces the view

326 that the water status of the plant does not always affect the process of stress-related

327 accumulation of phenolic compounds in plants.

328 An evaluation of these data was carried out using PCA to investigate similarities and

329 differences between the treatments, TDM, A and phenolics content to identify the factors

330 influencing each one, as shown in Figure 1.

331

Biplot (axes F1 and F2: 74,28 %)

2.5 TPC 2 TTC IF 1.5 IO IC 1 TDM A 0.5 0

-0.5 DO TFC F2 (33,65 %) (33,65 F2 -1 DC -1.5 -2 DF -2.5 -3 -2 -1 0 1 2 3 F1 (40,63 %) 332

333 Figure 1. Principal component analysis (PCA), biplot, scores and loading plots. Based on different 334 phenolic compounds analyzed in HEB, TDM (Total Dry Mass) and A (Net photosynthesis). 335

336 The PCA (Figure 1) showed that the first component accounted for 40.63% of the total

337 variance (74.28), while the second component accounted for 33.65%. The PCA plots

338 indicated that PC1 was dominated by the following variables: A, TDM and TFC; while PC2

339 was dominated by TPC and TTC. These results indicate that TPC and TTC and the IC

340 treatment are strongly correlated with each other. On the other hand, A and TDM are

341 correlated with the IO treatment.

342 Many theories exist concerning the differences observed in plant secondary

343 metabolism due to abiotic or biotic factors. The resource availability hypothesis31 presupposes

344 that slower-growing plants in nutrient-limited environments will invest in greater defenses

345 (secondary metabolites) to minimize tissue loss due to herbivory. This hypothesis suggests

346 that level of defense investment increases as potential growth rates become more limited by

347 resource availability, since this increases the relative value of limited resources.

348 The results for B. pilosa under the conditions tested in this study corroborate the

349 resource availability hypothesis: the IC treatment generated plants with low TDM and the

350 highest levels of the secondary metabolites analyzed, while IO treatment resulted in the

351 highest TDM content and low content of phenolic compounds.

352 Antioxidant activity. The results for the HEB from different growth condition in the

-1 353 ABTS, DPPH, chelating activity and FRAP assays are shown as EC50 values (μg.mL ) in

354 Table 5. A lower EC50 value indicates a higher ability of the extract to act as a scavenger,

355 while higher EC50 value indicates lower ability of the extract to achieve 50% scavenging

356 activity.

357 The mechanisms involved in the ABTS and DPPH methods are similar and based on

358 changes in the absorption spectra of the free radical because of the reduction. ABTS is

359 applicable to hydrophilic and lipophilic antioxidant systems, whereas DPPH works better in

360 hydrophobic systems32. Furthermore, it should be considered that steric effects might play a

361 fundamental role in the reaction with DPPH. For an efficient radical quenching reaction, the

362 phenolic OH group has to approach the nitrogen centred radical of DPPH. Thus, in the case of

363 large ortho alkyl groups, the energy barrier increase due to steric encumbrance

364 counterbalances the positive electron-releasing radical-stabilizing effect33. For the ABTS

365 assay, the scavenging activity of IC was significantly higher among the treatments. The IC

366 treatment also showed stronger radical scavenging activity in the DPPH assay (Table 5).

367 The FRAP test is an antioxidant capacity assay that is based on the ability of the

368 antioxidant to reduce Fe3+ to Fe2+ in TPTZ solvent, forming an intense blue Fe2+-TPTZ

369 complex22. The reducing power obtained with samples from IC and IF treatments were higher

370 than with others treatments.

371 These results are related to the high TFC and TTC values found in HEB from IC

372 conditions being indicative that phenolic compounds and tannins greatly contributed to their

373 antioxidant activity.

374 Chelating activity has been used to determine the ability of components in plant

375 extracts to sequester the free metal ions, which are important catalysts for the generation of

376 highly reactive hydroxyl radicals via the Fenton reaction in both in vivo and in vitro

377 systems34,35. Flavonoid hydroxyl groups may capture metal ions and this ability depends on

378 the availability and orientation of functional groups34.

379 The analysis of chelating activity of HEB reveals that leaves from the DC treatment

380 had the higher antioxidant activity, following by IC (Table 5). The specificity of the different

381 flavonoids in terms of their chelating activity is reflected in the diverse results of this assay,

382 since each treatment may have stimulated the production of flavonoids with different

383 chemicals structures, in addition to the significant variations in TFC (Table 4).

384

385

386

387

388

389

390

391

392 Table 5. Antioxidant activities of Bidens pilosa under different growth conditions. IC DC IO DO IF DF Trolox AA EDTA FeSO4 ABTS EC 352.40 ± 400.54 ± 458.04 ± 464.06 ± 565.14 ± 428.90 ± 99.99 50 (μg.mL-1) 16.84c 13.05bc 1.93b 21.14b 16.16a 17.49b ± 0.25d

DPPH EC 222.57 ± 415.43 ± 598.71 ± 339.32 ± 388.19 ± 392.07 ± 16.46 50 (μg.mL-1) 2.83d 12.11b 6.43a 21.33c 8.15bc 6.01b ± 1.11e

Chelating activity 501.79 ± 226.12 ± 778.07 ± 942.47 ± 1248.96 ± 748.62 ± 19.71 ± EC 50 2.40d 0.29e 3.52c 2.60b 27.96a 6.88c 0.32f (μg.mL-1)

FRAP EC 1419.63 ± 1952.18 ± 2258.12 ± 1900.33 ± 1550.17 ± 2156.01 ± 391.76 50 (μg.mL-1) 42.36c 22.84ab 70.92a 138.62b 23.17c 39.85ab ± 4.22d

393 Irrigated Control (IC), Dry Control (DC), Irrigated Fertilizer (IF), Dry Fertilizer (DF), Irrigated Organic (IO), Dry Organic (DO). 394 All the values are shown as mean ± SE (triplicate); SE: standard error. 395 Different letters in the same line indicate statistically significant differences, using ANOVA and Tukey’s test (ρ ≤ 0.05) 396 397 398 Explorative analyses. The total contents of phenolic compounds, tannins and

399 flavonoids were not significantly correlated with nutrients, except for a positive correlation

400 between Mn in leaves and TTC (Table 6).

401 Table 6. Pearson correlation analysis between phenolic compound content and leaf nutrients TPC TTC TFC N P K Ca Mg S Fe Zn Cu Mn B

TPC 1 TTC 0.680 1 TFC -0.149 0.492 1 N 0.551 0.647 0.217 1 P 0.278 0.362 -0.158 -0.318 1 K 0.299 0.661 0.081 0.361 0.661 1 Ca 0.389 0.791 0.745 0.243 0.268 0.243 1 Mg 0.549 0.740 0.646 0.249 0.183 0.071 0.940 1 S 0.394 0.491 -0.192 -0.079 0.943 0.760 0.307 0.177 1 Fe 0.505 0.493 -0.375 0.261 0.742 0.867 0.026 -0.065 0.867 1 Zn 0.687 0.366 -0.303 -0.185 0.743 0.228 0.358 0.456 0.720 0.520 1 Cu 0.569 0.629 -0.112 0.151 0.851 0.846 0.267 0.244 0.850 0.879 0.644 1 Mn 0.764 0.817 0.069 0.254 0.754 0.653 0.645 0.624 0.835 0.722 0.810 0.833 1 B 0.332 0.265 0.004 -0.274 0.488 -0.032 0.573 0.531 0.540 0.155 0.737 0.172 0.597 1 402 Total phenolic content (TPC), Total tannin content (TTC), Total flavonoid content (TFC), Nitrogen (N), Phosphorus (P), 403 Potassium (K), Calcium (Ca), Magnesium (Mg), Sulfur (S), Iron (Fe), Zinc (Zn), Copper (Cu), Manganese (Mn), Boron 404 (B). Values represent Pearson's coefficient of correlation (p ≤ 0.05 considered significant, shown in bold). 405

406 The protein competition hypothesis36 postulates concurrence in the metabolic

407 pathways of plants for the production of photosynthetic vs. defense compounds. The synthesis

408 of proteins and phenylpropanoids, precursors of phenolic compounds, competes for a common

409 and limited resource, phenylalanine, which is a branch point at the end of the shikimic acid

410 pathway located between primary and secondary metabolism. Therefore, the growth-defense

411 trade-off depends not only on competition for available carbohydrates, but also on

412 competition for phenylalanine37.

413 Manganese exerts a primary role in the activation of several enzymes involved in the

414 tricarboxylic acid cycle, in the shikimic acid pathway and in the biosynthetic pathway of

415 isoprenoids38. Conditions of high soil organic matter content determine lower concentrations

416 of Mn in the plant39. Results presented in Table 1 and Table 2 indicate that organic

417 cultivation, with cattle manure, leads to a higher concentration of organic matter in the soil, as

418 well as a lower concentration of Mn in the leaves. On the other hand, a lower amount of

419 organic matter in the soil and higher concentrations of Mn in the leaves were reported with the

420 irrigated treatments IC and IF. These results, associated with the positive correlation between

421 Mn in leaves and TTC, confirm the previously mentioned protein competition theory (Table

422 6).

423 Correlations between TPC, TTC, TFC and antioxidant activity assays are presented in

424 Table 7.

425

426

427

428

429 Table 7. Pearson correlation analysis between phenolic compound content and antioxidant activities ABTS DPPH Ch FRAP TPC TTC TFC

ABTS 1 DPPH 0.362 1 Ch 0.871 0.109 1 FRAP 0.006 0.783 -0.128 1 TPC 0.482 0.092 0.437 -0.477 1 TTC -0.035 -0.539 0.217 -0.843 0.680 1

TFC -0.517 -0.974 -0.253 -0.685 -0.149 0.492 1 430 Total phenolic content (TPC), Total tannin content (TTC), Total flavonoid content (TFC); 431 Values represent Pearson's coefficient of correlation (p ≤ 0.05 considered significant, shown in bold). 432

433 Plant polyphenols can act as reducing agents, hydrogen donating antioxidants, singlet

434 oxygen quenchers and, in some cases, metal chelators40. 'For that reason, plant antioxidant

435 properties have been attributed to their polyphenol constituents41,42. The significant

436 correlations demonstrated between TFC with DPPH and TTC with FRAP are consistent with

437 the antioxidant action of these phenolic compounds, found in high amounts in plants grown in

438 IC conditions.

439 Therefore, primary and secondary metabolite profiles of B. pilosa can be improved

440 through the selection of appropriate management practices, with the purpose of increasing the

441 biomass or the content of phenolic compounds and, consequently, their antioxidant activity.

442 The present study demonstrates a workable system for obtaining consistent and high

443 levels of phenolics in leaves of B. pilosa for phytopharmaceutical use. We have shown that

444 extracts from irrigated control plants, not only produce higher yields of polyphenolics, but

445 also possess higher antioxidant capacity, as compared with the other growth conditions. It is

446 necessary to emphasize the native condition of the seeds used for this study. These seeds were

447 collected from specimens found in a natural environment, without any management and

448 exposed to adversities to which a herbaceous plant must be resistant in order to survive. The

449 native condition of the seeds may have considerable significance for quality control that is

450 needed for the preparation of other herbal medicines sold as herbal supplements. Genetic

451 improvement and development of Bidens pilosa cultivars may be the target of future studies.

452 ACKNOWLEDGMENT

453 The authors thank Jean Vencioneck Dutra for proof reading the manuscript and

454 Leonardo Valandro Zanetti by supporting the gas exchange measures.

455 SUPPORTING INFORMATION DESCRIPTION

456 This work is an integral part of the project Phytochemical, mutagenic and

457 antimutagenic prospection of Bidens pilosa and Tithonia diversifolia, financed by FAPES,

458 EDITAL FAPES N° 007/2014, UNIVERSAL Nº 0422/2015.

459

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CAPÍTULO 3 - CHANGES ON THE PRIMARY AND SECONDARY METABOLITE ACCUMULATION AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF Tithonia diversifolia UNDER ORGANIC AND INORGANIC FERTILIZER

Após revisão da língua inglesa, e considerações da banca examinadora, este artigo será submetido à revista: Molecules ISSN: 1420-3049.

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1 Article 2 Changes on the Primary and Secondary Metabolite 3 Accumulation and Antioxidant Activity of Tithonia 4 diversifolia Under Organic and Inorganic Fertilizer

5 Anny Carolyne da Luz 1*, Irany Rodrigues Pretti 1, Mainã Mantovanelli da Mota 1 and Maria do 6 Carmo Pimentel Batitucci 1

7 1 Universidade Federal do Espírito Santo, Avenida Fernado Ferrari, 514, Vitória, Zip Code 29075910, Espírito 8 Santo, Brazil; [email protected] 9 * Correspondence: [email protected]; Tel.: +55-27-4009-2589 10 Received: date; Accepted: date; Published: date

11 Abstract: Tithonia diversifolia is a medicinal species with several biological actions: hepatoprotective, 12 antioxidant, anti-inflammatory, chemoprotective and antidiabetic. These medicinal actions are 13 attributed to their phenolic compounds and sesquiterpene lactones. The variation in the production 14 of secondary metabolites in plants occurs as an adaptive response to the biotic and abiotic factors to 15 which the plant is exposed. The objective of this work was to relate the primary and secondary 16 metabolism of T. diversifolia to the conditions of organic fertilization (cattle manure), chemical 17 fertilization (NPK 4:14:8) and without fertilization. Also, to evaluate the contents of phenolic 18 compounds and antioxidant activity. Fertilizer applications increased net photosynthesis and total 19 dry mass of T. diversifolia plants. The plants that received organic fertilization had higher total phenol 20 and tannin contents, and higher antioxidant activity, than plants that received chemical fertilization. 21 However, the plants of T. diversifolia that did not receive fertilization presented total phenols and 22 tannins up to 90% higher than the other treatments, and also had a significantly higher antioxidant 23 activity. Thus, it is possible to standardize the management practices in the cultivation of T. 24 diversifolia in order to achieve the best productivity, seeking high levels of phenolic compounds and 25 biomass.

26 Keywords: phenolic compounds; tannin; photosynthesis; macronutrients, micronutrients, DPPH, 27 ABTS, FRAP, Chelating activity with Fe2+. 28

29 1. Introduction 30 Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray, known as Mexican sunflower, is a shrub plant and belongs 31 to the family Asteraceae. It originated in Mexico and Central America [1], and is a representative 32 example of a plant species that can adapt to different types of environment [2]. It is widely distributed 33 around the world, and considered an invasive species in several tropical and sub-tropical areas of 34 America, Africa and Asia [3–5]. 35 The most reported chemical constituents of T. diversifolia belong to the class of sesquiterpene 36 lactones, flavonoids [4] and other phenolic substances [6], such as trans-cinnamic acid derivatives [7]. 37 Recent studies have shown that extracts and secondary metabolites isolated from T. diversifolia 38 exhibited interesting biological activities, such as anti-inflammatory [8,9], antimalarial [10], cytotoxic 39 [11], gastro-protective [12], antimicrobial [13,14], preventive for cancer [15] and antihyperglycemic 40 [16,17]. The roles of plants in disease prevention and treatment have been attributed, in part, to the 41 antioxidant properties of their metabolites, such as phenolic constituents. These compounds are 42 effective antioxidants in vitro, and thus might contribute significantly to the protective effects in vivo 43 [18]. 105

44 Plant secondary metabolites are synthesized by differing biochemical pathways, and are 45 susceptible to environmental influences, diseases, plant growth stages and herbivory, and act as a 46 chemical interface between the plant and its environment through an adaptive response. Thus, these 47 abiotic and biotic factors determine variations in the production and contents of plant metabolites 48 [2,19]. 49 Various forms of management may be sources of variation in the levels, and types, of plant 50 metabolites, such as the use of fertilizers [20]. The supply and availability of nutrients is the most 51 important factor for higher productivity among the various plant cultivation practices. Furthermore, 52 fertilization has been reported to have an influence on the phyto-nutritional quality of crops [21]. 53 The character of nutrients released by different fertilizers, and their absorption by plants, can lead 54 to changes in carbon/nitrogen ratios and, consequently, to the production of secondary metabolites 55 [22]. The relation between fertilizers and the phenolic compounds production is a highly relevant 56 issue [23]. Previous studies have observed phenolic variation in strawberry, tomato and sea buckthorn 57 berry grown with different fertilizers [24–26]. Research has shown [21] that inorganic fertilizers reduce 58 the antioxidant levels, while organic fertilizers enhance antioxidant content in plants. 59 Nitrogen (N), phosphorous (P) and potassium (K) are the most limiting factors in crop 60 production [27]. In the last decades, NPK mineral fertilizer has been supplied to crops with massive 61 doses [28]. Organic fertilizers, such cattle manure, constitute an alternative for increased yield of 62 harvest, besides contributing to the balanced supply of macro and micronutrients [29]. Thus, an 63 understanding of the action of these fertilizers on the secondary metabolism and antioxidant potential 64 of medicinal plants is important. 65 The objective of this research was to evaluate the effects of three different fertilization conditions 66 on the primary and secondary metabolism of Tithonia diversifolia and the antioxidant properties of this 67 plant. Therefore, organic fertilizer (cattle manure) was compared with inorganic fertilizer (NPK 4:14:8) 68 and an unfertilized control on the biomass, gas exchange parameters, accumulation of phenolics and 69 antioxidant activity in T. diversifolia.

70 2. Results and Discussion

71 2.1. Effects of fertilizers on Plant Photosynthetic Parameters and Total Dry Mass

72 Table 1 presents the chemical characteristics of the soil pots for the different treatments. 73 Considering the base saturation percentages shown, all of them up to 50%, the soils from the three 74 treatments can be classified as eutrophic [30,31]. Furthermore, in all treatments, the pH of soil is 75 alkaline (pH> 7).

76 The soil that received the organic cattle manure treatment (“Organic”) presented the highest 77 levels of phosphorus, potassium, sulfur, magnesium, organic matter, iron, zinc, manganese, boron and 78 sodium. The elements calcium and copper were found in higher concentration in the soil that was 79 fertilized with N:P:K (4:14:8) (“Fertilizer”).

106

86 87 Table 1. Chemical characterization of control, organic and fertilizer soil pots. Attributes Control Organic Fertilizer

Phosphorus(1) (g.kg-1) 0.090 0.146 0.131

Potassium(1) (g.kg-1) 0.260 0.840 0.220

Sulfur(2) (g.kg-1) 0.010 0.076 0.033

Calcium(3) (g.kg-1) 2.652 2.496 3.315

Magnesium(3) (g.kg-1) 0.390 1.443 0.390

Organic matter(4) (dag.kg-1) 2.60 6.50 2.60

Iron(1) (g.kg-1) 0.108 0.124 0.112

Zinc(1) (g.kg-1) 0.0094 0.0146 0.0111

Copper(1) (g.kg-1) 0.0012 0.0004 0.0017

Manganese(1) (g.kg-1) 0.139 0.149 0.134

Boron(5) (g.kg-1) 0.00052 0.00097 0.00073

Sodium(1) (g.kg-1) 0.130 0.640 0.110

Base Saturation (%) 89.10 92.60 89.00

pH (H2O) 8.20 7.40 7.80

88 (1)Extracted with HCI 0.05 mol/L and H2SO4 0.025 mol/L, 89 (2)Extracted with Ca(H2PO4)2 0.01 mol/L, (3)extracted with 90 KCI 1mol/L, (4)Oxidation with: Na2Cr2O72H2O 4 mol/L and 91 H2SO4 10 mol/L, (5)extraction with BaCI2 2H2O 0.125%.

92 The comparison of the chemical analysis of the leaves from T. diversifolia shows a higher 93 concentration of the macronutrients phosphorus and potassium in the control sample, as shown in 94 Table 2. This treatment also had the highest concentrations of the micronutrients magnesium, sulfur, 95 iron and copper. The micronutrients zinc and boron were found in higher concentrations in the leaves 96 of T. diversifolia submitted to the organic treatment. The nitrogen and the manganese were found to be 97 more concentrated in plants treated with the NPK fertilizer.

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105 Table 2. Chemical analysis of Tithonia diversifolia leaves from of control, organic and fertilizer treatments.

Control Organic Fertilizer

Nitrogen(1) (g.kg-1) 24.01 29.40 39.48

Phosphorus(2) (g.kg-1) 4.23 3.33 2.49

Potassium(2) (g.kg-1) 31.25 26.25 24.38

Calcium(2) (g.kg-1) 45.17 24.87 32.34

Magnesium(2) (g.kg-1) 9.13 7.20 4.88

Sulfur(2) (g.kg-1) 5.80 3.87 3.75

Iron(2) (g.kg-1) 0.69 0.44 0.38

Zinc(2) (g.kg-1) 0.12 0.89 0.53

Copper(2) (g.kg-1) 0.21 0.18 0.12

Manganese(2) (g.kg-1) 0.66 0.68 0.95

Boro(3) (g.kg-1) 0.14 0.15 0.11

106 (1) Hot acid digestion, (2) Nitro-perchloric digestion, (3) Dry digestion 107 108 The soil that had the organic treatment had higher macro and micronutrient concentrations than 109 the other treatments, most of the time. The result of the leaf chemical analysis showed that the 110 concentration of these substances was often higher in the leaves of the control treatment plants. 111 The absorption of nutrients by plants is complex and determined by several factors, and pH is the 112 main one among them. Although in all treatments the soil was alkaline, in the control, the pH was the 113 highest. The alkalinity of the soil can lead to an increase in the levels of calcium, magnesium and 114 potassium [32], and decrease the availability of boron, copper, iron, manganese and zinc [31,33]. 115 In addition to the pH, the type of fertilizer used can also cause variation in the availability of 116 some nutrients. In corn, for example, phosphate fertilization causes a decrease in zinc content, while 117 nitrogen fertilization may lead to a lack of copper, iron, manganese and zinc [34]. Furthermore, high 118 levels of potassium can induce zinc deficiency [34]. In this study it was observed that the T. diversifolia 119 plants from the control presented the highest levels of potassium and phosphorus and the lowest 120 content of zinc. 121 The leaf gas exchange in T.diversifolia plants shows some differences between the treatments 122 (Table 3). Plants grown with NPK fertilizer showed high values for net photosynthesis (A). While the 123 plants submitted to the control treatment presented higher intercellular CO2 (Ci) and lower rates of 124 intrinsic water use efficiency (A/gs), instantaneous water use efficiency (A/E) and instantaneous 125 carboxilation efficiency (A/Ci). The stomatal conductance (gs), transpiration (E) and leaf-to-air vapor 126 pressure differences (VpdL) did not show statistical differences between treatments. 127 E, VpdL and A are entirely related to gs. The stomatal opening provides a low resistance route for 128 the diffusion movement of the gases, and also for the loss of water through transpiration, so that gs 129 reflects the inflow and outflow of water and CO2 from stomates [35]. The E depends directly on VpdL,

108

130 thus representing the difference of the air and water vapor saturation pressure inside the leaf. This is 131 controlled by the temperature of the leaf, and the vapor pressure of air, which is controlled by the 132 temperature and humidity of the air surrounding the leaf [35]. 133 134 Table 3. Effects of different fertilization conditions on total dry mass, leaf area, net photosynthesis, stomatal 135 conductance, transpiration, leaf-to-air vapor pressure differences, intercellular co2, intrinsic water use efficiency, 136 instantaneous water use efficiency and Instantaneous carboxilation efficiency of Tithonia diversifolia. Control Organic Fertilizer

TDM (g) 5.13 ± 1.29b 21.08 ± 0.62a 18.72 ± 1.48a

LA (cm2) 122.08 ± 26.32 b 483.52 ± 102.25 a 504.18 ± 117.15 a

A (μmol CO2 m-2 s-1) 13.00 ± 0.51c 15.01 ± 0.28b 17.00 ± 0.39a

gs (mol H2O m-2 s-1) 0.21 ± 0.00a 0.19 ± 0.01a 0.20 ± 0.01a

Ci (μmol CO2 mol-1) 275.06 ± 5.78a 242.42 ± 5.51b 226.30 ± 6.36b

E (mmol H2O m-2 s-1) 3.46 ± 0.05a 3.17 ± 0.06a 3.34 ± 0.12a

VpdL (kPa) 1.69 ± 0.01a 1.73 ± 0.02a 1.73 ± 0.02a

A/gs [µmol CO2 (mmolH2O)-1] 65.15 ± 3.40b 84.80 ± 3.37a 93.99 ± 4.08a

A/E [µmol CO2 (mmolH2O)-1] 3.83 ± 0.18b 4.84 ± 0.14a 5.35 ± 0.17a

A/Ci [(μmol CO2 m-2 s-1)/ (μmol CO2 mol-1)] 0.05 ± 0.00c 0.06 ± 0.00b 0.08 ± 0.00a

137 Total dry mass (TDM), leaf area (LA), net photosynthesis (A), stomatal conductance (gs), intercellular CO2 (Ci), 138 transpiration (E), leaf-to-air vapor pressure differences (VpdL), intrinsic water use efficiency (A/gs), instantaneous 139 water use efficiency (A/E) and instantaneous carboxilation efficiency (A/Ci). All the values shown are mean ± SE 140 (triplicate); SE: standard error. Different letters in the same line indicate statistically significant differences using 141 ANOVA and Tukey’s test (ρ ≤ 0.05). 142 143 Though the plants of T. diversifolia submitted to the control treatment had the highest Ci, they had 144 the lowest value of A. Since there were no statistical differences between gs, E and Vpdl, the higher Ci 145 in the control treatment plants can be explained by their smaller leaf area (Table 3), since smaller 146 leaves present reduced resistance of the boundary layer to CO2 diffusion and water; that is, facilitating 147 the entry of CO2 into the plant. For most plants, CO2 has rapid internal diffusion after passing through 148 the stomata. Thus, the limitations to the photosynthetic performance inside the leaf are imposed by 149 factors other than the internal CO2 concentration. Although the NPK fertilizer treatment did not 150 present the highest Ci, it was the one that had the highest A, which resulted in a higher A/Ci index, 151 that reflect the metabolic efficiency of CO2 fixation in photosynthesis, and the role of the enzyme 152 Rubisco [35]. 153 The best photosynthetic performance of the plants from the NPK fertilizer treatment may also be 154 related to the higher concentration of nitrogen in the leaves of T. diversifolia, since nitrogen is closely 155 linked to the carboxylation efficiency of the Rubisco enzyme [35,36]. In addition, the leaves of T. 156 diversifolia from the NPK fertilizer treatment showed the highest concentration of manganese, an ionic 157 micronutrient that plays a key role in the photosynthetic apparatus [37], namely in the water-splitting 158 system associated with photosystem II, ATP synthesis [38] and Rubisco carboxylase reactions [35].

159 2.2 Total Phenol, Tanin Contents and Antioxidant Activity 160 Despite T. diversifolia plants from the NPK fertilizer treatment having the highest productivity in 161 terms of biomass and photosynthesis, the plants with the control treatment had higher content of 162 phenolics and better antioxidant activity.

109

163 The total content of phenolic compounds was affected by the fertilizations conditions (Table 4). 164 HET (hydroalcoholic extract from Tithonia diversifolia) from the control treatment showed higher 165 averages in all analyses, for total phenols content (TPC) and total tannins content (TTC). In the 166 analysis of TPC, the HET from the control and organic treatments presented total contents up to 74% 167 higher than the HET from the NPK fertilizer treatment. The TTC was greater in HET from control 168 treatment, followed by HET from the organic treatment and finally from the NPK fertilizer treatment; 169 however, the latter presented TTC up to 89% smaller than the others. 170 171 Table 4. Content of phenolic compounds of Tithonia diversifolia under different cultivation conditions. Control Organic Fertilizer TPC (mg GAE.g-1d.w.) 108.19 ± 2.75a 94.86 ± 4.65a 27.46 ± 1.22b TTC (mg TA.g-1d.w.) 143.37 ± 4.0a 114.72 ± 1.08b 14.92 ± 1.15c 172 Total phenols content (TPC); Total tannins content (TTC). 173 All the values are expressed as mean + SE (triplicate); SE: standard error. 174 Different letters in the same rows indicate statistically significant differences, 175 ANOVA, test-Tukey (ρ ≤ 0.05) 176 177 When comparing HET from the organic treatment with HET from the NPK fertilizer treatment, 178 the organic fertilizer was efficient in accumulating TPC and TTC (Table 4). This result can be 179 attributed to large amounts of carbon-rich organic matter in the organic fertilizer [39,40] that increase 180 the carbon-based secondary metabolites production (phenolic compounds in general). This occurs due 181 to a greater availability of phenyl alanine, which is the precursor for carbon-based secondary 182 metabolites [41]. Previous studies have also observed that higher phenolic concentrations occur in 183 organically fertilized in tomatoes [25], marionberry [42] , strawberry [43] and jujube [23]. 184 However, the T. diversifolia plants that presented the highest levels of TPC and TTC were those 185 from the control treatment. Plants grown in the local natural environment resulted in higher phenolic 186 content compared to the NPK fertilizer treatments; however, their yields reduced substantially [23]. 187 This was due to the fact that soils that were not fertilized, even infertile soil, induced an unfavorable 188 growing environment. The plant then allocates more resources to synthesize defensive phenolics to 189 protect limited nutrient resources from diseases, insects or other injuries [44,45]. 190 When comparing the average of TDM and net photosynthesis (Table 3) of the control and the 191 other two treatments that received fertilization, it is evident in which treatment had a higher allocation 192 of resources for the production of phenolic compounds, or for growth. The organic and NPK fertilizer 193 treatments had the highest photosynthetic rates and highest mean TDM, while the control presented 194 the lowest indices in these parameters. On the other hand, the control had the highest levels of TPC 195 and TTC among the treatments. This suggests that the decrease in biomass accumulation was related 196 to an increase in the concentration of total phenolics, which is reinforced by the strong negative 197 correlation between photosynthesis with TPC (R2= -0.932) and TTC (R2= -0.952), as shown in Table 6. 198 This result indicates that there was a trade-off between growth and secondary metabolism. 199 This allocation of resources for the synthesis of phenolic compounds, carbon-based secondary 200 metabolites, occurs because the production of secondary metabolites was up-regulated in low 201 nitrogen fertilization [46]. The T. diversifolia plants from the control and from the organic treatment 202 presented the lowest levels of nitrogen in their leaves (Table 2). When photosynthetic performance is 203 suppressed under insufficient nitrogen supply, as noted in the control, recycling of the enzymatic 204 nitrogen required for secondary metabolism may occur, resulting in a possible increase in secondary 205 metabolites [47]. 206 Moreover, similar results was reported for Orthosiphon stimaneus [48] and Labisia pumila [49]. The 207 increase in the production of secondary metabolites when photosynthesis decreased was associated to 208 the fact that the low net photosynthetic activity led to up-regulation of shikimic acid in the pentose 209 phosphate pathway. Previous studies [48,49] already described that plants under low light levels had 210 reduced net photosynthesis due to accumulation of non-structural carbohydrate in the leaves, which is

110

211 usually related to an impairment of net photosynthesis and to up-regulation of secondary metabolite 212 production. 213 The results for the HET from different cultivation conditions in the ABTS, DPPH, chelating 214 activity and FRAP assays are shown as EC50 values (μg.mL-1) in Table 5. A lower EC50 value indicates a 215 higher ability of the extract to act as a scavenger, while higher EC50 value indicates lower ability of the 216 extract to achieve 50% scavenging activity. 217 218 Table 5. Antioxidant activities of Tithonia diversifolia under different cultivation conditions. Control Organic Fertilizer Trolox AA EDTA FeSO4 ABTS EC50 324.49 ± 448.37 ± 783.25 ± 99.98 ±

(μg.mL-1) 13.84c 35.24b 23.01a 28.18d

DPPH 16.46 EC50 271.05 ± 465.78 ± 866.58 ± ± (μg.mL-1) 6.49c 9.67b 24.28a 1.36d

Chelatin g activity 578.09 ± 719.80 ± 821.07 ± 19.71 ± EC50 4.23c 0.62b 5.45a 0.39d (μg.mL-1)

FRAP EC50 775.18 ± 789.39 ± 3303.27 ± 391.76

(μg.mL-1) 6.81b 10.72b 121.13a ± 5.16c

219 All the values are shown as mean ± SE (triplicate); SE: standard error. Different letters in the same line indicate 220 statistically significant differences, ANOVA, test-Tukey (ρ ≤ 0.05). 221 222 Each test performed involves mechanisms based on changes in the absorption spectra of the free 223 radical because of the reduction. ABTS is applicable to hydrophilic and lipophilic antioxidant systems, 224 whereas DPPH works better in hydrophobic [50]. Furthermore, However, it should be considered that 225 steric effects might play a fundamental role in the reaction with DPPH. For an efficient radical 226 quenching reaction, the phenolic OH group has to approach the nitrogen centred radical of DPPH. 227 Thus, in the case of large ortho alkyl groups, the energy barrier increase due to steric encumbrance 228 counterbalances the positive electron-releasing radical-stabilizing effect [51]. The FRAP test is an 229 antioxidant capacity assay that is based on the ability of the antioxidant to reduce Fe3+ to Fe2+ in TPTZ 230 solvent, forming an intense blue Fe2+-TPTZ complex [52]. Chelating activity has been used to 231 determine the ability of components in plant extracts to sequester free metal ions, which are important 232 catalysts for the generation of highly reactive hydroxyl radicals via the Fenton reaction in both in vivo 233 and in vitro systems [53]. 234 The HET from the control showed significantly lower EC50 averages in all antioxidant assays 235 performed (Table 5). Among the treatments that received fertilizers, the organic treatment presented 236 better antioxidant activity, EC50 averages up to 76% lower, than the NPK fertilizer treatment. 237 The best HET performance of the plants from the control, in all of the antioxidant tests carried out 238 in this study, was related to their higher content of phenolic compounds, as a consequence of the 239 lower concentration of nitrogen in their leaves. Table 6 shows the high correlation between TPC and 240 TTC and the antioxidant tests performed. In this case, the correlation is negative because the results of 241 the antioxidant tests are expressed in EC50. Plant polyphenols can act as reducing agents, hydrogen 242 donating antioxidants, singlet oxygen quenchers and, in some cases, metal chelators [54]. For that 243 reason, plant antioxidant properties have been attributed to their polyphenol constituents [18,55].

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244 In a study with Labisia pumila [56] grown under different fertilization conditions, the reducing 245 ability was highest in DPPH tests, FRAP and chelating activity was found under organic fertilization. 246 This result had a high correlation with total phenolics and flavonoids, which was found in higher 247 concentrations in said study, and also for the organic cultivation condition. 248 249 Table 6. Pearson correlation analysis between phenolic compound content, antioxidant activities and net 250 photosynthesis (A). DPPH ABTS Ch FRAP TPC TTC Photo (A)

DPPH 1

ABTS 0.998 1

Ch 0.957 0.938 1

FRAP 0.949 0.967 0.817 1

TPC -0985 -0.994 -0.894 -0.989 1

TTC -0.994 -0.999 -0.919 -0.978 0.998 1

Photo (A) 0.980 0.966 0.996 0.867 -0.932 -0.952 1 251 Total phenolic content (TPC), total tannin content (TTC), chelating activity (Ch); net photosynthesis [Photo (A)]. 252 Values represent Pearson's coefficient of correlation were not significant (p ≤ 0.05). 253 254 Considering quality to be one of the main factors related to consumer acceptance and 255 sustainability in the market, it is important to strictly control and standardize all of the stages involved 256 in the production of phytopharmaceutical preparations, such as the selection of the starting plant 257 material, cultivation, extraction conditions, and the quantification of secondary metabolites or 258 bioactive compounds in the final product [57]. Our results demonstrate that phenolic levels and 259 antioxidant activity of Tithonia diversifolia can be manipulated through fertilizer management, with 260 contrasting responses in relation to productivity, photosynthesis, phenol content and antioxidant 261 activity.

262 3. Materials and Methods

263 3.1. Plant material and management conditions 264 Seeds of T. diversifolia were collected in Santa Teresa (Espírito Santo - Brazil), a voucher specimen 265 was identified by the VIES herbarium of the Universidade Federal do Espírito Santo (VIES 35297), and 266 germinated in pots containing organic soil (pH 6.4) in a greenhouse located in Cariacica (Espírito 267 Santo - Brazil). Pots were brought to field capacity and regularly watered by weight, with no drainage 268 from the pots. The treatments carried out were: control (organic soil), fertilizer (N-P-K 4:14:8 at 0.3 269 g.Kg-1 soil) and organic (cattle manure at 125 g.Kg-1 soil). The experimental design was completely 270 randomized with ten replicates per treatment. At 107 days after planting, in the pre-flowering stage, 271 gas exchange measurements were performed. The plants were collected for growth measurements 272 and to prepare the hydroalcoholic extract. The potting soil for each treatment was collected, and also 273 the leaves, for chemical analysis of nutrients.

274 3.2. Determination of Leaf Area

275 Leaf area was measured through the leaf disc method [58]. The fresh leaves of ten plants from 276 each treatment were weighed, and then the discs were withdrawn from the basal portion of the leaf 277 only with fine veins. Ten discs with previously known area (1.76 cm2) were randomly removed and 278 the leaves and their weight were determined. The leaf area was estimated by the formula LA= LM x 279 DA/DM, where LA is the leaf area estimated from the method, LM is the leaf fresh mass, DA is the 280 disc area and DM is the disc fresh mass).

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281 3.3. Determination of total dry mass 282 The total dry mass (TDM) of plant material was measured after drying in an oven at 45 ºC until a 283 constant weight was obtained.

284 3.4. Gas Exchange Parameters

285 Net photosynthesis (A, expressed in μmol CO2 m−2 s−1), stomatal conductance (gs, mmol H2O 286 m−2s−1), transpiration (E, mmol H2O m−2 s−1) and internal concentration of carbon (Ci, μmol CO2 mol-1) 287 were determined using a closed infra-red gas analyzer, LICOR 6400 Portable Photosynthesis System 288 (IRGA, Licor Inc., USA). Measurement was performed within the time period 08:00h-11:00h, using 289 fully expanded young leaves, maintaining the air temperature at 27 °C, CO2 concentration at 400 μmol 290 mol-1 and photosynthetic photon flux density (PPFD) at 1000 μmol m-2s-1. Moreover, instantaneous 291 water use efficiency (A/E, μmol CO2 mmol−1 H2O) was calculated from the gas exchange 292 measurements [59,60].

293 3.5. Hydroalcoholic extract 294 The dry aerial parts of ten plants T. diversifolia, from each treatment, were powdered and 295 macerated with aqueous 70% ethanol at a ratio of 5:1 (v/w) by 72 h, at room temperature. The process 296 was repeated twice to extract the maximum constituents. The resulting solutions were then filtered 297 with filter paper to remove the particles and concentrated using a vacuum evaporator TE-210 298 (TECNAL, Brazil) to obtain the hydroalcoholic extracts of the Tithonia diversifolia (HET) for each of 299 three cultivation treatments.

300 3.6. Total phenolic content (TPC) 301 Total phenolic content (TPC) was measured according to the Folin-Ciocalteu method [61]. 302 Ethanol solution of HET at 500 μg.mL-1 (20 μL) was added to 100 μL of Folin-Ciocalteau reagent 303 diluted in distilled water (1:10) (v:v). After 5 min, 80 μL of Na2CO3 (7.5%) was added and the plate 304 kept in the dark at room temperature for 2 h. The absorbance was measured at 750 nm with a 305 spectrophotometric microplate reader (Epoch Microplate Spectrophotometer – BioTek). 306 Concentrations of gallic acid were 12.5, 25, 50, 100, 250, 500 and 1000 μg.mL-1. Ethanol was used as the 307 blank. TPC was expressed as gallic acid equivalent per gram of dry weight (mg GAE.g-1 d.w.), 308 compared with a calibration curve of gallic acid y = 0.0054x + 0.1122 R² = 0.9992. For each sample, three 309 replications were performed.

310 3.7. Total tannin content (TTC) 311 Total tannin content (TTC) was determined according to Folin-Denis method [62] with a few 312 modifications. Ethanol solution of 500 μg.mL-1 HET (500μL) was added to 500 μL of Folin-Denis 313 reagent. After 3 min, 500 μL of Na2CO3 solution (8%) was added, mixed and incubated for 2 h. The 314 mixture was then centrifuged at 2000 rpm for 5 min and the absorbance measured at 725 nm. Tannic 315 acid (12.5, 25, 50, 100, 500 and 1000 μ.mL-1) was used to calculate the standard y = 0.0067x + 0.2727 R² = 316 0.9721 and the results were expressed as tannic acid equivalents per gram of dry weight (mg TA.g-1 317 d.w.). Ethanol was used as a blank. For each sample, three replications were performed.

318 3.8. Free radical scavenging activity using the DPPH assay 319 In order to measure the radical scavenging activity of 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) [63], 320 HET samples and standard (ascorbic acid) were diluted in methanol (15.62, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 321 and 1000 μg.mL-1 ). Methanolic DPPH solution (0.3 mM, 200 μL) was added to 100 μL of the test 322 solution. After 30 min at room temperature in the dark, the absorbance was measured at 517 nm using 323 a spectrophotometric microplate reader. A decrease in the absorbance indicates an increase in the 324 scavenging activity. The test was conducted in triplicate and the percentage inhibition of DPPH was 325 calculated as follows: % inhibition of DPPH = [(Abs0 – Abs1) /Abs0] × 100, where Abs0 = absorbance of

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326 control and Abs1 = absorbance of the sample. Methanol was used as the blank, and DPPH solution 327 plus methanol was used as the negative control. Results were expressed as the EC50 value (μg.mL-1), as 328 that is the effective concentration of antioxidant agent required to scavenge 50% of DPPH.

329 3.9. Free radical scavenging activity using the ABTS assay. 330 The ABTS [2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt] assay [64] 331 was performed using a solution prepared by mixing 5 mL of ABTS+ (7 mM) with 88 μL of potassium 332 persulfate (2.5 mM). The solution was incubated before use in the dark at room temperature for 16 h. 333 The solution was then diluted with ethanol to absorbance value of 0.700 (± 0.05) at 734 nm. ABTS+ 334 solution (200μL) was mixed with 40 μL of the test solutions: HET samples and standard (Trolox) at 335 concentrations of 15.62, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 and 1000 μg.mL-1. The decrease in absorbance was 336 measured at 734 nm after incubation for 6 min. The test was conducted in triplicate and the 337 scavenging activity was determined using the following formula: % scavenging of ABTS+ = [(Abs0 – 338 Abs1) / Abs0] × 100, where Abs0 = absorbance of control and Abs1 = absorbance of the sample. Ethanol 339 was used as the blank and ABTS-potassium persulfate solution plus ethanol was used as the negative 340 control. Results were expressed as the EC50 value (μg.mL-1).

341 3.10. Chelating activity with Fe2+ ions. 342 The chelating activity [65] of HET with ferrous ions was measured using 1 mL of HET methanolic 343 solution (15.62, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 and 1000 μg.mL-1) added to 50 μL of FeCl2 solution (2 mM) 344 and 200 μL of ferrozine (5 mM), and incubated at room temperature for ten 10 min. The absorbance 345 was recorded at 562 nm in microplate reader. Chelating activity was calculated as follows: chelating 346 activity (%) = [(Abs0 – Abs1) / Abs0] × 100, where Abs0 is the absorbance of the ferrozine-Fe2+ complex 347 and Abs1 is the absorbance of the sample. Results were expressed as the EC50 value (μg.mL-1). EDTA 348 was used as the positive control. The assay was carried out in triplicate.

349 3.11. Ferric reducing antioxidant power assay (FRAP). 350 The total antioxidant power of the extracts were determined using the FRAP method [52]. The 351 FRAP reagent was prepared immediately prior to use, using 25 mL of 0.3 M acetate buffer, 2.5 mL of 352 10 mM 2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) and 2.5 mL of 20 mM ferric chloride. 30 μL of HET 353 ethanolic solution (15.62, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 and 1000 μg.mL-1) plus 90 μL of distilled water were 354 incubated with 900 μL of the FRAP reagent for 30 min at 37 °C in the dark. The absorbance of the 355 ferrous-TPTZ complex was recorded at 595 nm. The standard curve was constructed using FeSO4 at 356 concentrations of 250, 500, 1000, 1.500 and 2000 μM. Results were expressed as the EC50 value (μg.mL- 357 1). Each assay was carried out in triplicate.

358 3.12. Statistical analysis. 359 The data were expressed as mean ± standard error (SE). Statistical analysis was performed using 360 ASSISTAT version 7.7 beta software (Assistat Software, Campina Grande, Paraíba, Brasil.) Data were 361 subjected to one-way analysis of variance and means were compared using Tukey’s test at 5% of 362 probability. The Pearson linear correlation coefficient were performed using XLSTAT for Windows 363 (Addinsoft, New York, USA). 364 Acknowledgments: This work is an integral part of the project Phytochemical, mutagenic and antimutagenic 365 prospection of Bidens pilosa and Tithonia diversifolia, financed by FAPES, EDITAL FAPES N° 007/2014, 366 UNIVERSAL Nº 0422/2015. The authors thank Leonardo Valandro Zanetti by supporting the gas exchange 367 measures. 368 Author Contributions: Anny Carolyne da Luz and Maria do Carmo Pimentel Batitucci conceived and designed 369 the experiments; Anny Carolyne da Luz, Irany Rodrigues Pretti and Mainã Mantovanelli da Mota performed the 370 experiments; Anny Carolyne da Luz and Maria do Carmo Pimentel Batitucci analyzed the data; Anny Carolyne 371 da Luz, Maria do Carmo Pimentel Batitucci, Irany Rodrigues Pretti and Mainã MAntovanelli da Mota wrote the 372 paper. All authors read and approved the final manuscript.

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373 Conflicts of Interest: The authors declare not conflict of interest.

374 References 375 1. Játem-Lásser, A., Ricardi, M.S., Adamo, G. Herbal traditional medicine of Venezuelan Andes: 376 an ethnopharmacological study. Phyther. Res. 1998, 12, 53–59. 377 2. Sampaio, B. L.; Edrada-Ebel, R.; Da Costa, F. B. Effect of the environment on the secondary 378 metabolic profile of Tithonia diversifolia: A model for environmental metabolomics of plants. 379 Sci. Rep. 2016, 6, 1–11, doi:10.1038/srep29265. 380 3. Passoni, F. D.; Oliveira, R. B.; Chagas-Paula, D. A.; Gobbo-Neto, L.; Da Costa, F. B. Repeated- 381 dose toxicological studies of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. gray and identification of the 382 toxic compounds. J. Ethnopharmacol. 2013, 147, 389–394, doi:10.1016/j.jep.2013.03.024. 383 4. Chagas-Paula, D.A., Oliveira, R.B., Rocha, B.A., Da Costa, F. B. Ethnobotany, chemistry, and 384 biological activities of the genus Tithonia (Asteraceae). Chem. Biodivers. 2012, 9, 210–235. 385 5. Moronkola, D. O.; Ogunwande, I. A.; Walker, T. M.; Setzer, W. N.; Oyewole, I. O. Identification 386 of the main volatile compounds in the leaf and flower of Tithonia diversifolia (Hemsl) Gray. J. 387 Nat. Med. 2007, 61, 63–66, doi:10.1007/s11418-006-0019-5. 388 6. Li, H. H.; Inoue, M.; Nishimura, H.; Mizutani, J.; Tsuzuki, E. Interactions oftrans-cinnamic acid, 389 its related phenolic allelochemicals, and abscisic acid in seedling growth and seed germination 390 of lettuce. J. Chem. Ecol. 1993, 19, 1775–1787, doi:10.1007/BF00982307. 391 7. Zhao, G. J.; Xi, Z. X.; Chen, W. S.; Li, X.; Sun, L.; Sun, L. N. Chemical constituents from Tithonia 392 diversifolia and their chemotaxonomic significance. Biochem. Syst. Ecol. 2012, 44, 250–254, 393 doi:10.1016/j.bse.2012.06.019. 394 8. Owoyele, V. B., Wuraola, C. O., Soladoye, A. O. & Olaleye, S. B. Studies on the anti- 395 inflammatory and analgesic properties of Tithonia diversifolia leaf extract. J. Ethnopharmacol. 396 2004, 90, 317–321, doi:10.1016/j.jep.2003.10.010. 397 9. Chagas-Paula, D. A.; Oliveira, R. B. de; da Silva, V. C.; Gobbo-Neto, L.; Gasparoto, T. H.; 398 Campanelli, A. P.; Faccioli, L. H.; Da Costa, F. B. Chlorogenic acids from Tithonia diversifolia 399 demonstrate better anti-inflammatory effect than indomethacin and its sesquiterpene 400 lactones. J. Ethnopharmacol. 2011, 136, 355–362, doi:10.1016/j.jep.2011.04.067. 401 10. O., Oyewole I., Ibidapo, C. A., Moronkola, D. O., Oduola, A. O.O., A. G.; N.A., and O. J. Anti- 402 malarial and repellent activities of Tithonia diversifolia (Hemsl.) leaf extracts. J. Med. Plants 403 Res. 2008, 2, 171–175. 404 11. Kuroda M, Yokosuka A, Kobayashi R, Jitsuno M, Kando H, Nosaka K, Ishii H, Yamori T, M. Y. 405 Sesquiterpenoids and flavonoids from the aerial parts of Tithonia diversifolia and their 406 cytotoxic activity. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2007, 55, 1240–1244. 407 12. Moronkola, D. O.; Ogunwande, I. A.; Walker, T. M.; Setzer, W. N.; Oyewole, I. O.; Sánchez- 408 Mendoza, M. E.; Reyes-Ramírez, A.; Cruz Antonio, L.; Martínez Jiménez, L.; Rodríguez-Silverio, 409 J.; Arrieta, J. Bioassay-guided isolation of an anti-ulcer compound, tagitinin C, from Tithonia 410 diversifolia: role of nitric oxide, prostaglandins and sulfhydryls. Molecules 2011, 16, 665–674, 411 doi:10.3390/molecules16010665. 412 13. Liasu, M.O. and Ayandele, A. Antimicrobial activity of aqueous and ethanolic extracts from 413 Tithonia diversifolia and Bryum coronatum collected from Ogbomoso, Oyo state, Nigeria. Adv. 414 Nat. Appl. Sci. 2008, 2, 2008. 415 14. Obafemi, C., Sulaimon, T., Akinpelu, D. & Olugbade, T. Antimicrobial activity of extracts and a 416 germacranolidetype sesquiterpene lactone from Tithonia diversifolia leaf extract. African J. 417 Biotechnol. 2006, 5, 1254–1258. 418 15. Gu JQ, Gills JJ, Park EJ, Mata-Greenwood E, Hawthorne ME, Axelrod F, Chavez PI, Fong HH, 419 Mehta RG, Pezzuto JM, K. A. Sesquiterpenoids from Tithonia diversifolia with potential cancer 420 chemopreventive activity. J. Nat. Prod. 2002, 65, 532–536. 421 16. Zhao, G.; Li, X.; Chen, W.; Xi, Z.; Sun, L. Three new sesquiterpenes from Tithonia diversifolia 422 and their anti-hyperglycemic activity. Fitoterapia 2012, 83, 1590–1597,

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Após revisão da língua inglesa, e considerações da banca examinadora, este artigo será submetido à revista: Revista Brasileira de Plantas medicinais (ISSN: ISSN 1516-0572 versão impressão - ISSN 1983-084X versão on-line).

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Influência de diferentes condições de fertilização nos compostos fenólicos de

Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray e seus efeitos citotóxicos em linfócitos

humanos e sarcoma 180 de camundongos

*DA LUZ, AC1; PRETTI, IR1; MOTA, MM1; DUTRA, JCV1; BATITUCCI, MCP1.

1Universidade Federal do Espírito Santo, Av. Fernando Ferrari 514, 29075 - 910,

Vitória, ES, Brazil.

*[email protected]

RESUMO: Tithonia diversifolia é uma planta amplamente utilizada para diversos fins terapêuticos como tratamento de malária, diabetes, inflamações entre outros. Seu uso é difundido nas Américas Central e do Sul, Ásia e África. Esta espécie possui metabólitos secundários com ações antioxidantes e anticarcinogênicas, como os

ácidos fenólicos, flavonoides e lactonas sesquiterpênicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de três condições de fertilização (adubo orgânico, NPK 4:14:8 e controle sem adubação) na produção de ácido clorogênico, rutina, quercetina, luteolina, taninos e cumarina em Tithonia diversifolia, através de análises em HPLC e, também, avaliar a as suas frações orgânicas em linfócitos humanos e células de sarcoma 180 de camundongos, por meio do teste de viabilidade celular MTT. O tratamento Controle apresentou as maiores concentrações dos compostos fenólicos analisados, bem como foi menos citotóxico para os linfócitos humanos do que para as células de sarcoma 180. Esses resultados favorecem o desenvolvimento de estudos que promovam o melhoramento das condições de cultivo de T. diversifolia para o uso medicinal.

PALAVRAS-CHAVE: viabilidade celular, disponibilidade de nutrientes, MTT, HPLC.

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ABSTRACT: Influence of different fertilization conditions on the phenolic compounds of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray and their cytotoxic effects on human lymphocytes and mouse sarcoma 180 ascites cells. Tithonia diversifolia is a plant widely used for various therapeutic purposes, such as malaria treatment, diabetes, inflammation, among others. Its use is widespread at Central and South America, Asia and Africa. This species has secondary metabolites with antioxidant and anticarcinogenic actions, such as phenolic acids, flavonoids and sesquiterpene lactones. The aim of this work was to evaluate the influence of three fertilization conditions (cattle manure, NPK 4:14:8 and organic soil) of the production of chlorogenic acid, rutin, quercetin, luteolin, tannins and coumarin in Tithonia diversifolia by HPLC and also to evaluate the cytotoxicity of their organic fractions in human lymphocytes and mouse sarcoma 180 ascites cells, by MTT cell viability assay. The control treatment showed the highest concentrations of phenolic compounds analyzed, as well as being less cytotoxic for human lymphocytes than for sarcoma cells 180. These results contribute to the development of studies that promote the enhacement of culture conditions of T. diversifolia for medicinal use.

KEY WORDS: cell viability, nutrients availability, MTT, HPLC.

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INTRODUCTION

Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray is a plant of Asteraceae family, known as mexican sunflower, daisy, hand-of-god, among other popular names. It is an invasive plant, native from Central America and Mexico (AKINOLA et al., 2000;

ALVES; ROQUE, 2016; KATTO; SALAZAR, 1995). It is a plant is widely used at countries of Central America, South America, Africa and Asia for the traditional treatment of diseases like diabetes, malaria, snake bite, measles, gastric ulcer, diarrhea, menstrual cramps and wounds (AJAO; MOTEETEE, 2017). The major chemical constituents of T. diversifolia belong to the classes of sesquiterpene lactones, flavonoids (CHAGAS-PAULA et al., 2012) and phenolic compounds derived from trans-cinnamic acid, mainly caffeoylquinic acid, which forms chlorogenic acid

(ZHAO et al., 2012). Alkaloids, flavonoids, phenols, saponins, tannins and terpenes are more prominent in the leaves of Tithonia diversifolia, but also occur in their roots and stems (OLAYINKA; RAIYEMO; ETEJERE, 2015). In addition to the differences in the productivity and storage of secondary compounds in the different organs of T. diversifolia, other factors, such as the stage of plant development and environmental factors, like the availability of nutrients in the soil, affect the metabolism of these substances (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

Phenolic compounds have been reported for interfere at the initiation, promotion and progression of cancer. They might lead to the modulation of proteins in diverse pathways and require the integration of different signals for the final chemopreventive or therapeutic effect (Merino et al., 2015; Ramos, 2008).

Considering that the environmental and intrinsic factors of plants affect their production of secondary metabolites, consequently, the biological action of these plants is also modulated by these factors.

122

Polyphenols can affect the overall process of carcinogenesis by several mechanisms and their effects could depend of tissue or cell type, and may have different responses at high or low doses. This cytotoxic action on cancer cells, as well as healthy cells, can be evaluated by several cellular viability tests (RAMOS,

2008). Among the tests used to evaluate the cell viability: Neutral red, LDH leakage,

MTT and the protein assays are the most used. The neutral red and the MTT assay are more relevant since have been described as the most sensitive cytotoxicity assays. Thus, these tests, based on mitochondrial respiratory activity, might be used to detect early signs of toxicity following exposure to a mitochondrial toxicant

(FOTAKIS; TIMBRELL, 2006), as compounds that inhibit mitochondrial respiration, generating reactive oxygen species in the mitochondria, that promotes the damage mitochondrial components (MARULLO et al., 2013).

The MTT (3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide) is a yellow tetrazolium salt, water soluble, that is converted to formazan, purple and insoluble in water. This conversion reaction is mediated by the cleavage of the tetrazolium ring by succinate dehydrogenase in the mitochondria, as well as, it can be mediated by NADH or NADPH within the cells and out of mitochondria (Fotakis and Timbrell, 2006; Moraes et al., 2016).

The objective of this study was to evaluate the influence of three fertilization conditions on the production of phenolic compounds in Tithonia diversifolia, by HPLC analyses, and the cytotoxic activity of these substances in human lymphocytes and mouse sarcoma 180 ascites cells.

123

MATERIAL AND METHOD

Plant material and management conditions

Seeds of T. diversifolia were collected in Santa Teresa (Espírito Santo -

Brazil), a voucher specimen was identified by the VIES herbarium of the

Universidade Federal do Espírito Santo (VIES 35297), and germinated in pots containing organic soil (pH 6.4) in a greenhouse located in Cariacica (Espírito Santo -

Brazil). Pots were brought to field capacity and regularly watered by weight, with no drainage from the pots. The treatments carried out were: Control (organic soil),

Fertilizer (N-P-K 4:14:8 at 0.3 g.Kg-1 soil) and Organic (cattle manure at 125 g.Kg-1 soil). The experimental design was completely randomized with ten replicates per treatment. At 107 days after planting, in the pre-flowering stage the plants were collected to prepare the hydroalcoholic extract. Plant leaves and soil of each treatment were collected and conducted to the chemical analysis of nutrients.

Hydroalcoholic extract

The dry aerial parts of ten plants of T. diversifolia, from each treatment, were powdered and macerated with aqueous 70% ethanol at a ratio of 5:1 (v/w) by 72 h, at room temperature. Thereafter, the supernatant was removed and the same powder was submitted to a new maceration with 70% ethanol. After 72 h, the supernatant was removed and the powder was macerated one more time for 72 h, totaling 3 maceration steps. The resulting solutions were then filtered with filter paper to remove the particles and concentrated using a vacuum evaporator TE-210 (TECNAL,

Brazil) to obtain the hydroalcoholic the three extracts of the Tithonia diversifolia

(HET) from each of cultivation treatments.

124

Crude hydroalcoholic extract fractionation

In order to prepare the fractions were used solvents with increasing polarity

(SHAHRAKI et al., 2016). 0.5 g of the HET from each cultivation condition was suspended in 50 mL of distilled water and transferred to a decanter funnel. The aqueous solution was fractionated with different solvents by applying the liquid-liquid partition method with increasing polarity solvents (hexane, dichloromethane, ethyl acetate and butanol) (DORMAN; HILTUNEN, 2004). The n-hexane (50 mL) solvent was added to the funnel, and the n-hexane fraction was partitioned. In the next step, the remaining of the solvent in the decanter funnel was combined with dichloromethane solvent, and the dichloromethane fraction was then extracted.

Subsequently, the remaining solvent from the previous steps was mixed with ethyl acetate, and the ethyl acetate fraction was extracted. At the end, n-butanol solvent was added to the funnel for obtain n-butanol fractions. All fractionates were collected separately and dried at room temperature.

Instrumentation

Instrumentation of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) analyses were carried using on a Shimadzu HPLC system (Shimadzu Corporation,

Kyoto, Japan) with solvent delivery system of two pumps (Model LC–20AT,

Prominence Liquid Chromatograph, Shimadzu), column oven (Model CTO-20A), UV detector (Model SPD–20A, Prominence Diode Array Detector, Shimadzu) and degasifier (DGU-20A5). Data collection and integration was accomplished using LC

Solutions, 1.25 version software. Separation was achieved with on a C18 reverse phase column ZORBAX Eclipse XDB®, Agilent (4.6 mm x 250 mm, 5µm) equipped

125

with a guard column of same packing material. The mobile phase were filtered through 0.45 μm membrane filter (Millipore) and then degassed by ultrasonic bath prior to use. Experiments and analyses involving HPLC were performed in the

Laboratory of Biomolecular Analysis (LABIOM) at the Federal University of Espírito

Santo, Vitória-ES, Brazil.

HPLC conditions

The methanol solution of ethyl acetate fraction was used to detect flavonoids and dichloromethane fraction to detect tannins and coumarins. HPLC assay for flavonoids detection was carried out using an isocratic elution with a flow rate of 1 mL.min-1, the column temperature was set to 40ºC, a mobile phase of methanol and

2% phosphoric acid (pH 2.60) (40%:60% v/v) and a detection wavelength of 350 nm.

The injection volume was 20 µL of each solution and the total run time was 20 minutes for each injection. Identification of flavonoids was performed by comparing their retention times (RT) and spectra with those of known standards: chlorogenic acid, rutin, quercetin and luteolin (Sigma-Aldrich, USA). Chromatographic peaks in the samples were identified on the basis of the standards retention time. Amounts of flavonoids were calculated using a calibration curve equation for each standard.

Tannin detection was performed using a mobile phase with 0.1% acid formic solution

(Solvent A) and methanol (Solvent B), the flow rate was adjusted to 0.7 mL.min-1 and the column was maintained at 40°C. A gradient elution was carried by varying the proportion of solvent B to solvent A, according to the following gradient: 0–15 min,

15% to 33% B; 15–17 min, 33% to 15% B; 17–22 min, 15% B. The injection volume was kept at 20 μL and a detection wavelength of 270 nm. The quantification of the sample was measured by comparing their retention times and spectra with the

126

standard, gallic acid (Vetec, Brazil) (ROSS; BETA; ARNTFIELD, 2009). For the detection of coumarins, the isocratic mobile phase of acetonitrile and water

(40%:60% v/v) was used, with flow rate of 1 mL.min-1 at 274 nm and column temperature was adjusted at 30ºC. The injection volume was 10 µL of solution and the total run time was 10 minutes for each injection. Samples quantifications were measured by comparing RT and spectrum of the samples with the standard, coumarin (Sigma-Aldrich, USA) (CELEGHINI; VILEGAS; LANÇAS, 2001). All data are presented as averages of triplicate measurements.

Cell culture

Human lymphocytes were obtained from peripheral blood sample of a healthy nonsmoking volunteer with informed consent, aged between 20 to 30 years, without any history of recent disease, exposures to radiation or drug use and without alcohol ingestion thirty days prior blood donating. The lymphocytes were isolated by the method Ficoll® Paque Plus (Sigma–Aldrich) gradient, as recommended by manufacturer with minimal modifications. All protocols involved were approved by the

Research Ethical Committee of UFES (certificate 2.333.879).

Mouse sarcoma 180 ascites cells (S180) were acquired from Banco de

Células do Rio de Janeiro. S180 cells were incubated in Mus musculus mouse. The protocols were approved by the Ethics Committee for the Use of Animals (CEUA /

UFES) under process number 89/2015.

The cells (lymphocytes and S180) were cultured with RPMI 1640 (Cultilab) supplemented with antibiotic gentamicin (50 mg.L-1) and antifungal amphotericin B (2

-1 mg.L ), 20% fetal bovine serum (Gibco) at 37 °C and CO2 5% saturation.

127

MTT assay

The assay of MTT was performed to assess cell viability. The cells (human lymphocytes and S180) were plated in 96-well plates with 2x105 cells in each well and treated with different concentrations of Control, Organic and Fertilizer HET: 2.5,

5.0, 10.0, 25.0, 50.0 and 100 μg.mL-1, in a RPMI 1640 medium for 48 h at 37 °C in

-1 5% CO2. After exposure, the medium was removed and MTT (5 mg.mL of stock in

PBS) was added (20 μL/well), and cells were incubated for an additional 3 h with

MTT. The absorbance was measured at 595 nm in a microplate reader. The experiment was performed in triplicate and the results were expressed as relative percentage of cell viability in comparison to the control, calculated with the following equation:

% Cell viability = (Abssample / Abscontrol) x 100

2.8. Statistical analysis

All results were expressed as the means ± standard error. For HPLC, cytotoxicity assays, were performed ANOVA followed Test Tukey (p < 0.05) using

ASSISTAT version 7.7 beta software (Assistat Software, Campina Grande, Paraíba,

Brazil).

RESULTS AND DISCUSSION

The chemical characteristics of the soil pots for the different treatments are presented in table 1. Considering the base saturation percentages up to 50%, the soils from the three treatments can be classified as eutrophic (PREZOTTI;

GUARÇONI, 2013; RONQUIM, 2010). Furthermore, in all treatments, the pH of soil is alkaline (pH> 7).

128

The elements calcium and copper were found in higher concentration in the soil with Fertilizer. The soil of Organic treatment presented the highest levels of phosphorus, potassium, sulfur, magnesium, organic matter, iron, zinc, manganese, boron and sodium.

TABLE 1. Chemical characters of soil pots Attributes Control Organic Fertilizer

Phosphorus(1) (g.kg-1) 0.090 0.146 0.131 Potassium(1) (g.kg-1) 0.260 0.840 0.220 Sulfur(2) (g.kg-1) 0.010 0.076 0.033 Calcium(3) (g.kg-1) 2.652 2.496 3.315 Magnesium(3) (g.kg-1) 0.390 1.443 0.390 Organic matter(4) (dag.kg-1) 2.60 6.50 2.60 Iron(1) (g.kg-1) 0.108 0.124 0.112 Zinc(1) (g.kg-1) 0.0094 0.0146 0.0111 Copper(1) (g.kg-1) 0.0012 0.0004 0.0017 Manganese(1) (g.kg-1) 0.139 0.149 0.134 Boron(5) (g.kg-1) 0.00052 0.00097 0.00073 Sodium(1) (g.kg-1) 0.130 0.640 0.110 Base Saturation (%) 89.10 92.60 89.00

pH (H2O) 8.20 7.40 7.80 (1) -1 -1 (2) Extracted with HCI 0.05 mol.L and H2SO4 0.025 mol.L , Extracted with Ca(H2PO4)2 0.01 -1 (3) -1 (4) -1 mol.L , extracted with CI 1mol.L , Oxidation with: Na2Cr2O72H2O 4 mol.L and H2SO4 10 -1 (5) mol.L , extraction with BaCI2 2H2O 0.125%.

The chemical analysis of the leaves from T. diversifolia shows a highest concentration of the macronutrients phosphorus and potassium and of the micronutrients magnesium, sulfur, iron and copper, in the Control treatment (table 2).

The leaves from Organic treatment presented the higher concentrations of the micronutrients zinc and boron. The leaves of plants from fertilizer treatment had shown nitrogen and the manganese at higher levels.

129

TABLE 2. Tithonia diversifolia leaves chemical analysis data. Control Organic Fertilizer

Nitrogen(1) (g.kg-1) 24.01 29.40 39.48 Phosphorus(2) (g.kg-1) 4.23 3.33 2.49 Potassium(2) (g.kg-1) 31.25 26.25 24.38 Calcium(2) (g.kg-1) 45.17 24.87 32.34 Magnesium(2) (g.kg-1) 9.13 7.20 4.88 Sulfur(2) (g.kg-1) 5.80 3.87 3.75 Iron(2) (g.kg-1) 0.69 0.44 0.38 Zinc(2) (g.kg-1) 0.12 0.89 0.53 Copper(2) (g.kg-1) 0.21 0.18 0.12 Manganese(2) (g.kg-1) 0.66 0.68 0.95 Boron(3) (g.kg-1) 0.14 0.15 0.11 (1) Hot acid digestion, (2) Nitro-perchloric digestion, (3) Dry digestion

Six phenolic compounds (chlorogenic acid, rutin, quercetin, luteolin, gallic acid and coumarin) were identified and quantified in samples of Tithonia diversifolia under different cultivation conditions. The quantification of flavonoids was performed based on spectra and retention time, as follows: chlorogenic acid (RT = 2.954 min), rutin

(RT = 5.502 min), quercetin (RT = 14.111 min) and luteolin (RT = 17.200 min) (Figure

1a). For tannins quantification, were used the spectra and retention time of gallic acid

(RT = 7.558 min) (Figure 1b) and the quantification of coumarins was based on the retention time and on spectrum of the coumarin (RT = 6.593 min) (Figure 1c).

130

2 0 0 a

4 5 ,9 2

) 1 5 0

(

t 1 0 0

s n

e 0 t 0 2 2

n 5 0 0 1 , I 5 1 7 , 1 1 5 , 4 1

0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 T im e (m in )

2 0 0 8 5 ,5 7 b

) 1 5 0

(

t 1 0 0

e t

n 5 0 I

0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4

T im e (m in )

3 9 ,5 6 3 0 0 c

2 5 0 )

V 2 0 0

(

t 1 5 0

i s

n 1 0 0

t n I 5 0

0 2 4 6 8 1 0

T im e (m in )

FIGURE 1. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) cromatrograms of phenolic compounds in the HET fractions. Profile obtained for flavonoids (a): chlorogenic acid (RT: 2,954), rutin (RT: 5.502), quercetin (RT: 14.111), luteolin (RT: 17.200); profile obtained for tannins (b): gallic acid (RT: 7.558); and profile obtained for coumarin (c) (RT: 6.593).

131

The amount of these substances varied significantly between the treatments, except for quercetin that was not detected. The Control treatment showed the highest concentrations of all quantified substances (Table 3).

TABLE 3. Total phenolic compounds of Tithonia diversifolia under different cultivation conditions using HPLC-DAD Control Organic Fertilizer

Chlorogenic acid (μg.mL-1) 90.82 ± 6.04a 5.34 ± 0.37b 3.05 ± 0.19b Rutin (μg.mL-1) 928.41 ± 68.02a 58.59 ± 7.97b 20.84 ± 0.68b Quercetin (μg.mL-1) nd nd Nd Luteolin (μg.mL-1) 8.35 ± 0.48a 3.52 ± 0.21b 4.13 ± 0.16b Coumarin (μg.mL-1) 0.90 ± 0.03a 0.36 ± 0.01c 0.80 ± 0.04ab Gallic acid (μg.mL-1) 8.20 ± 0.12a 7.62 ± 0.15b 4.62 ± 0.03c All the values shown are mean ± SE (triplicate); SE: standard error; nd: not detected; Different letters in the same line indicate statistically significant differences using ANOVA and Tukey’s test (ρ ≤ 0.05).

From the ethyl acetate fraction of HET, quantification of chlorogenic acid and flavonoids was performed simultaneously and was obtained good separation for the peaks. The rutin showed the highest compound concentrations among the treatments, with concentration of 928.41 μg.mL-1 in the treatment Control, the highest concentration between all metabolites in all treatments studied. The chlorogenic acid also showed higher concentration in the treatment Control (90.82 μg.mL-1), representing a concentration 30 times higher than the other treatments. Although luteolin also had its highest concentration in Control treatment, the difference in concentrations between treatments showed a lower proportion, varying from 8.35

μg.mL-1 to 3.52 μg.mL-1.

The quantification of coumarins and tannins, performed from the dichloromethane fraction of HET, also showed the highest concentrations of these

132

compounds in the Control treatment, with a coumarin concentration differing from

0.90 μg.mL-1 to 0.36 μg.mL-1, and of gallic acid from 8.20 μg.mL-1 to 4.62 μg.mL-1.

The highest amount of phenolic compounds detected in the HET from the

Control treatment is related to the availability of nutrients in the soil of this treatment, which presented, predominantly, lower concentrations of the nutrients analyzed, in spite of having higher levels of some of the nutrients in the leaf.

Studies that relate soil availability and nutrient concentration in plants with their effects on secondary metabolism are rare, however is established is that their actions are not uniform in all species (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Despite the lack of studies, hypotheses such as carbon/nitrogen balance, which associated the availability of nitrogen and the accumulation of carbon-based secondary compounds

(BRYANT; CHAPIN; KLEIN, 1983). In addition, the hypothesis of protein competition

(JONES; HARTLEY, 1999) posits competition in plant metabolic pathways for the production of photosynthetic compounds versus defense compounds. The synthesis of proteins and phenylpropanoids, precursors of phenolic compounds, compete for a common and limited resource, the phenylalanine, which is a branching point at the end of the shikimic acid pathway, located between primary and secondary metabolism. Under conditions of low nutrient availability, the demands of protein for growth are reduced, increasing the incorporation of phenylalanine in the synthesis of phenolic compounds, increasing the concentration of these compounds.

Some studies describe this variation in the concentration of phenolic compounds in relation to the availability of nutrients in the soil. For Labisia pumila

Benth was observed that the application of organic fertilizer enhanced the production of total phenolics, flavonoids, ascorbic acid, saponin and gluthathione content, compared to the use of inorganic fertilizer. The antioxidant activity was also highest

133

in plants cultivated with organic fertilizer, indicating that, for this species, the use of chicken dung can enhance the production of secondary metabolites and improve antioxidant activity (IBRAHIM et al., 2013).

In a study with Ziziphus jujube Mill the application of organic fertilizer appeared to enhance their phenolics and antioxidant activity accumulation, compared to conventional fertilized Z. jujube. Inorganic fertilization supplemented with potassium as an individual nutrient improved the accumulation of phenolics, which demonstrate that phenolics levels and antioxidant activity of Z. jujube can be manipulated through fertilizer management, for this species (WU et al., 2013).

Lombardo et al., (2015) demonstrated that providing a balanced supply of nitrogen, phosphorus and potassium (NPK) via fertilizer application can enhance the nutraceutical value of globe artichoke [Cynara cardunculus var. scolymus (L.) Fiori], although this effect is modulated by both: genetic factors and soil type.

MTT assay is a cell viability test used to determine cytotoxicity upon exposure to toxic substances and It has been used to verify the viability of human lymphocytes

(SAGRILLO et al., 2015; SINHA et al., 2014) and mouse sarcoma 180 cells exposed to natural products (JANA et al., 2014; MORAES et al., 2016). The enzymatic reduction of tetrazolium salts (MTT) is related to the survival of cells that are metabolically active after exposure to the test substance. In this study, the cytotoxicity of Tithonia diversolia was investigated in vitro by MTT assay in both cell lines, human lymphocytes and S180. The cell lines were exposed to the hydroalcoholic extract of T. diversifolia 50 μg/mL from the different cultivation condition for 48h.

The Tithonia diversifolia hydroalcoholic extract reduced the viability of S180, the HET from the Control treatment being the most effective in inducing S180 cell

134

death, with only 32.59% viable cells (figure 2). On the other hand, for human lymphocytes, the HETs were not cytotoxic, presenting the viability percentage in this cell line around 70%

8 0 a a b L y m p h o c y te s S 1 8 0 c e lls

y 6 0 A A

i v

4 0

l l

e B

% 2 0

0 C o n tro l O rg a n ic F e rtiliz e r

FIGURE 2. The effect of HET from different cultivation condition on the viability in lymphocytes human and S180 cells at 50 μg.mL-1 for 48h. All the values shown are mean ± SE (triplicate); SE: standard error; Different small letters indicate statistically significant differences between Lymphocytes cells. Different capital letters indicate statistically significant differences between S180 cells. Using ANOVA and Tukey’s test (ρ ≤ 0.05).

The higher cytotoxic activity of the HETs on the cancer cell line than on the healthy cell line may be related to the flavonoids, since these compounds can trigger apoptosis through modulation of a number of key elements in cellular signal transduction pathways linked to apoptosis in cancer cells (RAMOS, 2008). The highest cytotoxicity was observed in S180 cells exposed to HET from the Control treatment, which also showed the highest concentrations of flavonoids.

Other studies also point out that the effects of phenolic compounds are specific, as carcinogenic cells demonstrate higher sensitivity than normal cells when incubated with this substance (PEREIRA et al., 2015; RAMOS, 2008). In Asteraceae the cytotoxic activity of the flavonoids in tumor cells has been described in several studies (LEITE et al., 2016; SONODA et al., 2004). Gu et al. (2002) tested the

135

chemotherapeutic potential of sesquiterpenes isolated from T. diversifolia and found that compounds displayed significant antiproliferative activity. It also evaluated the cytotoxic effect of aqueous extract of T. diversifolia in mouse cancer cells RAW264.7 and human peripheral blood mononuclear cells through the mitochondrial respiration method using MTT, and there was greater cytotoxic activity on the cancer cell line

(HIRANSAI et al., 2016).

Das et al., (2009) demonstrated that flavonoids induced apoptosis in human glioblastoma T98G and U87MG cells via multiple mechanisms including increase in

ROS production, activation of kinases, down regulation of survival pathways and inflammatory factors, and activation death receptor and mitochondrial pathways.

Without affecting, however, the normal astrocytes, indicating their selective action for controlling glioblastoma. This is particularly appealing for the therapeutic use of phenolic compounds, since currently a major obstacle in cancer therapy is extensive drug toxicity to the normal cells.

This research has demonstrated secondary metabolites levels and biological activity of Tithonia diversifolia are influenced by fertilizer management, for achieving higher phenolic concentration and stronger cytotoxic effect against the cancerous cells. Important results for the development of future studies that aimed at improve the management conditions of T. diversifolia for medicinal use.

ACKNOWLEDGEMENT

This work is an integral part of the project Phytochemical, mutagenic and antimutagenic prospection of Bidens pilosa and Tithonia diversifolia, financed by

FAPES, EDITAL FAPES N° 007/2014, UNIVERSAL Nº 0422/2015. The authors are grateful for the availability of the use of LABIOM and Professor Alexandre M. C

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Santos and the techniques Caroline O. Maia and Natércia C. Alves for the assistance in the manipulation of the HPLC.

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138

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139

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

 A similaridade genética observada entre as populações de Bidens pilosa e Tithonia diversifolia não correspondem apenas à localização geográfica, podendo estar relacionada às formas de reprodução, polinização e dispersão de sementes dessas plantas;  Os resultados encontrados com o uso dos marcadores RAPD, mostram a importância da análise da diversidade entre as populações na produção de metabólitos secundários e atividades biológicas, sendo primordial para a seleção e cultivo de plantas medicinais;  O déficit hídrico não determinou alterações relevantes na produção de metabólitos secundários em Bidens pilosa.  As condições de fertilização influenciaram a produção e acúmulo de compostos fenólicos em T. diversifolia e B. pilosa e, consequentemente, a atividade biológica dessas plantas;  Diferentes condições de crescimento podem ser utilizadas a fim de aumentar a produção de metabólitos secundários de importância farmacológica e, também aumentar a biomassa de B. pilosa e T. diversifolia.

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ANEXO A - Certificado de aprovação do comissão de ética no uso de animais

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ANEXO B - Parecer consubstanciado de aprovação pela comissão e ética em pesquisa

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