SAMANTHA GONÇALVES DA FONSECA

CARACTERIZAÇÃO E MONITORAMENTO DE POPULAÇÕES DE MICRO- ORGANISMOS NITRIFICANTES EM LODO SALINO PROVENIENTE DE TERMINAL PETROLÍFERO.

CAMPINAS 2015

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Biologia

SAMANTHA GONÇALVES DA FONSECA

CARACTERIZAÇÃO E MONITORAMENTO DE POPULAÇÕES DE MICRO- ORGANISMOS NITRIFICANTES EM LODO SALINO PROVENIENTE DE TERMINAL PETROLÍFERO.

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Genética e Biologia Molecular na área de Genética de Microorganismos.

Orientadora: Dra. Valéria Maia Merzel

Co-orientadora: Profa. Dra. Cynthia Canedo da Silva

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Samantha Gonçalves da Fonseca e orientada pela Dra. Valéria Maia Merzel.

CAMPINAS 2015

Campinas, 17 de Dezembro de 2015.

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Valéria Maia Merzel

Prof. Dr. Tiago Palladino Delforno

Prof. Dr. Wellington Luiz de Araújo

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

"Desistir? Eu já pensei seriamente nisso, mas nunca me levei realmente a sério. É que tem mais chão nos meus olhos do que cansaço nas minhas pernas, mais esperança nos meus passos do que tristeza nos meus ombros, mais estrada no meu coração do que medo na minha cabeça". Geraldo Eustáquio de Souza Agradecimentos

Agradeço imensamente à minha orientadora Dra. Valéria Maia Merzel por toda confiança em meu trabalho, além da amizade, compreensão, paciência e apoio nos momentos difíceis que não foram poucos durante essa trajetória. À Dra. Cynthia Canedo da Silva por sua co-orientação, processos realizados por sua equipe e compartilhamento de dados e instruções. À Petrobrás, representada pela Dra. Maíra Sousa, Dra. Ana Paula Torres e Dr. Rodrigo Souza, pela disponibilidade da amostra e esclarecimentos sobre os processos. À Secretaria de Pós-graduação do Programa em Genética e Biologia Molecular, em especial à Lourdes, pelas instruções e por todo trabalho desempenhado. Ao corpo administrativo e à equipe de manutenção do CPQBA por todas as contribuições, em especial à Sandra pela solicitude e pelo tratamento sempre tão gentil, ao Luiz por todos os atendimentos sempre simpático e amável, e ao Celso por toda disposição e boa vontade.

Ao prestativo e sempre atencioso Dr. Armando Dias (ESALQ - Piracicaba), por toda paciência e ajuda com as padronizações do DGGE. Agradeço imensamente ao Dr. Tiago Palladino pelas análises dos dados obtidos com o sequenciamento massivo, cujo auxílio foi essencial para conclusão deste trabalho. Ao Dr. Rubens Duarte, pela atenção e disponibilidade no esclarecimento de dúvidas e na tentativa de contribuir para soluções dos problemas encontrados com o programa MoThur. Aos professores membros da banca de qualificação, Dr. Fernando Dini Andreotte, Dr. Welington Araújo e Dra. Suzan Pantarotto, e banca prévia Dra. Lucélia Cabral e Dr. Tiago Palladino, o meu muito obrigada pelas valiosas contribuições e sugestões que levaram esse trabalho à sua conclusão. À todos os amigos e colegas da Divisão de Recursos Microbianos, pela convivência harmoniosa, pelas ajudas essenciais, pelo coletivo, pelos encontros de almas, pelos laços sinceros que perdurarão, principalmente à Fabi, Sinhô, Dani, Jujuba, Mary, Naty, Bibis, Tulinho, Jaque, Dai, Babu, Editinha, Fer, Rafa, Paulete, Mi, Bru (Frozinha). Vocês foram e são fundamentais! Pra sempre no coração! À Paty, que me apresentou para uma nova possibilidade, mudando minha vida completamente! Obrigada! Desde os velhos tempos e pra sempre! Ao meu querido esposo Cris, por toda paciência e carinho, por ter segurado a barra comigo, me ajudando e apoiando a cada dificuldade encontrada! Muito obrigada, e que nós tenhamos muitas outras conquistas juntos! Resumo “Caracterização e monitoramento de populações de micro-organismos nitrificantes em lodo salino proveniente de terminal petrolífero”. A indústria petroleira, em seus diferentes processos e unidades, é grande consumidora de água. No processo de separação água-óleo que ocorre nos terminais marítimos aquaviários, é gerada água de produção com altas concentrações de amônia. Lodos ativados são utilizados para remoção do nitrogênio amoniacal e outros poluentes, para que a água retorne para os corpos receptores dentro dos limites estabelecidos pela legislação. O efluente pode chegar aos tanques de tratamento com altas concentrações salinas, o que compromete a nitrificação, principalmente quando está em questão o tratamento da água de produção de campos hipersalinos de exploração. Assim, é de grande importância que os micro-organismos responsáveis pela remoção de nitrogênio amoniacal, sejam caracterizados e monitorados quando submetidos a diferentes concentrações salinas, a fim de que continuem realizando o seu papel transformador neste ambiente. Metodologia: A caracterização da diversidade de bactérias totais e metabolicamente ativas e arqueias totais presente no lodo de sistemas de tratamento de efluentes salinos foi realizada através da construção de biblioteca de DNA que codifica para o gene de RNA ribossomal 16S e também sequenciamento em larga escala via plataforma 454 FLX Roche. Foi realizado também o monitoramento de consórcios microbianos enriquecidos e aclimatados em diferentes concentrações salinas, para os quais observou-se eficiência de nitrificação. O monitoramento foi realizado através da técnica de fingerprint DGGE e também foram feitas bibliotecas de DNA que codifica para o gene de RNA ribossomal 16S a partir dos consórcios aclimatados mais eficientes. Resultados: Tanto nas bibliotecas de DNA que codifica para o gene de RNA ribossomal 16S quanto para sequenciamento em larga escala via plataforma 454, não foram observadas predominância de populações de micro-organismos nitrificantes, porém, dentre os micro-organismos nitrificantes encontrados, há o predominio de bactérias nitrificantes heterotróficas. A maior parte dos micro-organismos encontrados estão relacionados a bactérias não cultiváveis. O monitoramento dos consórcios salinos que apresentaram maior eficiência na nitrificação revelaram a presença de bactérias nitrificantes heterotróficas. Conclusão: O lodo ativado, objeto deste estudo, realiza nitrificação, haja vista os micro-organismos nitrificantes quimioautotróficos e, principalmente, heterotróficos encontrados, associados à presença, em menor quantidade, de Plantomycetes. Os consórcios nitrificantes aclimatados à altas salinidades são dominados por bactérias nitrificantes heterotróficas. Os resultados combinados sugerem que a remoção eficiente da amônia pode ser alcançada quando o lodo ativado é aclimatado com o gradual aumento da concentração salina, fator limitante para a nitrificação, e enriquecido de modo a favorecer a microbiota nitrificante.

Abstract "Characterization and monitoring of nitrifying microorganism populations in saline sludge from oil terminal". The oil industry, in its various processes and units, is a major consumer of water. The water-oil separation process that occurs in marine terminals generates produced water which contains high concentrations of ammonia. Activated sludge (a type of biological treatment) is used to remove ammonia and other pollutants, so that the water returns to nature within the limits set by law. The effluent can reach the treatment tanks with high salt concentrations, which undermines the process of nitrification, especially when it concerns the treatment of produced water from of hypersaline oil fields. Therefore, it is of great importance that the bacteria responsible for ammoniacal nitrogen removal are characterized and monitored when subjected to different salt concentrations in order to continue performing its transforming role in this environment. Methodology: The characterization of the diversity of total bacteria and metabolically active and characterization of the diversity of total archaea present in the sludge of saline wastewater treatment systems has been accomplished through the construction of DNA library encoding the 16S ribosomal RNA gene as well as through large-scale sequencing 454 FLX Roche platform. It was also conducted the monitoring of microbial consortia enriched and acclimated at different salt concentrations, for which the nitrification indices were observed. The monitoring was performed by fingerprint DGGE technique and DNA libraries encoding the 16S ribosomal RNA gene were also made from the acclimated consortia that showed the highest levels of nitrification. Results: In both the DNA library encoding the 16S ribosomal RNA gene and the large-scale sequencing through platform 454, there were no predominance of populations of nitrifying micro-organisms. Among the findings, there is a predominance of heterotrophic nitrifying bacteria. Most of the microorganisms that were found are related to uncultured bacteria. The monitoring of the saline consortia that presented the higher nitrification rates revealed the presence of heterotrophic nitrifying bacteria. Conclusion: The activated sludge, object of this study, presents nitrifying potential, given the nitrifying microorganisms found, chemoautotrophs and especially heterotrophic, associated with the presence, to a lesser extent, of Plantomycetes. The nitrifying consortia acclimated to high salinity are dominated by bacteria with potential heterotrophic nitrification. The combined results suggest that efficient removal of ammonia can be achieved when the activated sludge is acclimatized with the gradual increase of salt concentration, limiting factor for nitrification, and enriched in order to favor the nitrifying microbiota. Lista de Figuras Figura 1: Modelo de Reator em Batelada Sequencial utilizado em terminal petrolífero. Fonte: imagem cedida pela Profa. Dra. Cynthia Canedo Silva - UFV/MG...... 23

Figura 2: Ilustração das etapas do sequenciamento em larga escala na Plataforma 454 Roche. Fonte: Mardis, 2008. Trends in Genetics...... 34

Figura 3: Fluxograma da aclimatação do lodo ativado ...... 47

Figura 4: Distribuição dos clones obtidos através da construção da biblioteca de genes que codificam para o RNAr 16S em filos do Dominio Bacteria ...... 51

Figura 5: Número de clones da biblioteca de genes RNAr 16S pertencentes às sub- ordens e ordens do filo Actinobacteria ...... 52

Figura 6: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de genes RNAr 16S afiliados ao filo Actinobacteria e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank...... 54

Figura 7: Número de clones da biblioteca de genes RNAr 16S pertencentes às diferentes ordens das classes Alfaprotebacteria e Gamaproteobacteria 55

Figura 8: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de genes RNAr 16S afiliados ao filo Proteobacteria e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank...... 58

Figura 9: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de genes RNAr 16S afiliados aos filos Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Deinococcus e o grupo TM7 e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank...... 59

Figura 10: Distribuição dos clones obtidos através da construção da biblioteca de genes que codificam para o RNA ribossomal 16S a partir do RNA total. 60

Figura 11: Número de clones pertencentes às diferentes ordens do filo Proteobacteria ...... 60

Figura 12: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de cDNA 16S afiliados ao filo Proteobacteria e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank...... 64 Figura 13: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de cDNA 16S afiliados aos filos Chlorobi, Bacteroidetes, Actinobacteria, Chloroflexi e Dominio Arqueia, e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank...... 65

Figura 14: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de genes RNAr 16S afiliados ao Dominio Arqueia, e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank...... 66

Figura 15: Curvas de rarefação definidas para diferentes percentuais de similaridade (97% - nível de espécie; 95% - nível de gênero; 80% - nível de filo) com base nos dados de sequencia derivados do pirosequenciamento de amplicons RNAr 16S da amostra de DNA do lodo TEBAR – Dominio Bacteria ...... 69

Figura 16: Distribuição das sequencias obtidas do pirosequenciamento de amplicons do RNA ribossomal 16S a partir do DNAtotal dentre os filos bacterianos. 69

Figura 17: Curvas de rarefação definidas para diferentes percentuais de similaridade (97% - nível de espécie; 95% - nível de gênero; 80% - nível de filo) com base nos dados de sequencia derivados do pirosequenciamento de amplicons RNAr 16S da amostra de cDNA do lodo TEBAR – Dominio Bacteria ...... 76

Figura 18: Distribuição das sequencias obtidas do pirosequenciamento de amplicons do RNA ribossomal 16S a partir do cDNA dentre os filos bacterianos...... 76

Figura 19: Curvas de rarefação definidas para diferentes percentuais de similaridade (97% - nível de espécie; 95% - nível de gênero; 80% - nível de filo) com base nos dados de sequencia derivados do pirosequenciamento de amplicons RNAr 16S da amostra de cDNA do lodo TEBAR – Dominio Arqueia...... 82

Figura 20: DGGE de fragmentos de genes RNAr 16S dos consórcios microbianos nitrificantes aclimatados em diferentes concentrações salinas mas cultivados sem adição de NaCl (Tratamento I) ...... 85

Figura 21: Dendrograma de similaridade (%) da estrutura das comunidades bacterianas dos consórcios submetidos ao Tratamento I gerado por matriz de similaridade, tendo-se utilizado o coeficiente de Jaccard a partir dos dados obtidos por meio de fingerprint por DGGE ...... 86

Figura 22: DGGE de fragmentos de genes RNAr 16S dos consórcios microbianos nitrificantes aclimatados a diferentes concentrações salinas e cultivados com adição de NaCl (Tratamento II)...... 87

Figura 23: Dendrograma de similaridade (%) da estrutura das comunidades bacterianas dos consórcios submetidos ao Tratamento I gerado pela matriz de similaridade, tendo-se utilizado o coeficiente de Jaccard a partir dos dados obtidos por meio de fingerprint por DGGE ...... 87 Lista de Tabelas

Tabela 1: Identificação dos consórcios microbianos aclimatados...... 48

Tabela 2: Resultados do pirosequenciamento da amostra de DNA do lodo ativado TEBAR – Bacteria ...... 68

Tabela 3: Afiliação e abundância das sequencias derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do DNA total do lodo TEBAR – Dominio Bacteria...... 73

Tabela 4: Associação das sequências afiliadas à bactérias não cultiváveis derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do DNA total do lodo TEBAR – Dominio Bacteria ...... 74

Tabela 5: Resultados do pirosequenciamento da amostra de cDNA do lodo ativado TEBAR – Dominio Bacteria ...... 75

Tabela 6: Afiliação e abundância das sequencias derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do cDNA total do lodo TEBAR – Dominio Bacteria ...... 79

Tabela 7: Associação das sequências afiliadas à bactérias não cultiváveis derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do cDNA total do lodo TEBAR – Dominio Bacteria ...... 81

Tabela 8: Resultados do pirosequenciamento da amostra de DNA do lodo ativado TEBAR – Dominio Archaea ...... 82

Tabela 9: Afiliação e abundância das sequencias derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do DNA total do lodo TEBAR – Dominio Archaea...... 83

Tabela 10: Percentagem de remoção de amônia nos consórcios microbianos para os dois diferentes tratamentos (Dados fornecidos pela Prof. Dra. Cynthia Canedo da Silva e equipe - UFV) ...... 84

Tabela 11: Dados sobre as bibliotecas do gene RNA ribossomal 16S construídas para os consórcios micobianos com maiores taxas de nitrificação em diferentes tratamentos ...... 89

Tabela 12: Resultados obtidos com a construção da biblioteca do gene RNAr 16S para os consórcios microbianos com maiores índices de nitrificação submetidos ao Tratamento I ...... 89 Tabela 13: Resultados obtidos com a construção da biblioteca do gene RNAr 16S para os consórcios microbianos com maiores índices de nitrificação submetidos ao Tratamento II...... 90 SUMÁRIO Agradecimentos ...... 6

Resumo ...... 7

Abstract ...... 8

Lista de Figuras ...... 9

Lista de Tabelas ...... 12

SUMÁRIO...... 14

1 INTRODUÇÃO ...... 17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 20

2.1 Água de produção de petróleo ...... 20

2.2 Tratamento de água de produção em terminal aquaviário de petróleo ...... 20

2.3 Bioprocessos de remoção do nitrogênio ...... 23

2.3.1 Micro-organismos e o processo de nitrificação ...... 24 2.4 Compostos nitrogenados no meio ambiente ...... 27

2.4.1 Nitrificação e Salinidade ...... 28 2.5 Análise de comunidades microbianas por meio de técnicas moleculares independentes de cultivo ...... 30

2.5.1 Bibliotecas de genes RNA ribossomal 16S para bactérias e arquéias ..30 2.5.2 Sequenciamento em larga escala - Plataforma 454 FLX Roche ...... 32 2.5.3 Monitoramento da diversidade microbiana através da técnica de DGGE 35 3 OBJETIVOS ...... 37

3.1 Objetivos específicos ...... 37

4 MATERIAL E MÉTODOS...... 38

4.1 Amostra de lodo ativado ...... 38

4.2 Extração de DNA total ...... 38

4.3 Reações de amplificação por PCR a partir do DNA total - Bactérias e Arqueias ...... 39 4.4 Construção das bibliotecas do gene que codifica para o RNAr 16S - DNA de Bacterias e Arqueias ...... 40

4.5 Sequenciamento dos genes RNA ribossomal 16S - Bacterias e Arqueias...41

4.6 Montagem das sequências consenso (contigs) e análise taxonômica ...... 42

4.7 Extração de RNA total ...... 42

4.7.1 Tratamento do RNA com enzima DNAse ...... 43 4.7.2 Síntese de cDNA ...... 43 4.8 Amplificação e construção da biblioteca do gene RNA ribossomal 16S a partir do cDNA ...... 43

4.8.1 Análise das sequencias obtidas via sequenciamento 454 ...... 44 4.8.2 Indices de diversidade e estimadores de riqueza ...... 46 4.9 Aclimatação do lodo ativado e medidas de nitrificação ...... 46

4.10 Monitoramento da diversidade nos consórcios microbianos através da técnica de DGGE ...... 48

4.11 Construção de bibliotecas para o gene RNA ribossomal 16S para consórcios provenientes de lodo aclimatado com as maiores taxas de nitrificação para o Tratamento I (sem adição salina) e para o Tratamento II (com adição de sal) ...... 49

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 51

5.1 Diversidade de bactérias totais no lodo TEBAR ...... 51

5.2 Diversidade de bactérias metabolicamente ativas no lodo TEBAR ...... 59

5.3 Diversidade de arqueias totais no lodo TEBAR ...... 66

5.4 Análise da diversidade microbiana no lodo ativado via sequenciamento plataforma 454 FLX Roche ...... 67

5.4.1 Indices de diversidade e estimadores de riqueza ...... 68 5.4.2 Diversidade de bactérias totais no lodo ativado via sequenciamento de amplicons pela plataforma 454 ...... 68 5.4.3 Diversidade de bactérias metabolicamente ativas no lodo ativado via plataforma 454 ...... 75 5.4.4 Diversidade de arqueias totais no lodo ativado via sequenciamento pela plataforma 454 ...... 81 5.5 Monitoramento da diversidade nos consórcios microbianos ...... 83

5.5.1 Fingerprint dos consórcios por DGGE ...... 84 5.5.2 Identificação dos micro-organismos presentes nos consórcios ...... 88 6 CONCLUSÕES ...... 92

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 93

8 ANEXOS ...... 112 1 INTRODUÇÃO

O Brasil possui 14% dos recursos hídricos mundiais e devido a esta relativa abundância, até alguns anos atrás, não havia grande preocupação do setor industrial com a utilização deste recurso (TUNDISI, 2008). Entretanto, atualmente, há crescente atenção à disponibilidade de água, associada principalmente às alterações na legislação brasileira relativas ao tratamento e pagamento pelo uso da água, em grande parte estipuladas pela ‘Lei das Àguas’ (Lei 9.433, promulgada em janeiro de 1997). Esta lei institui a Política Nacional de Recursos Hídricos e cria o Sistema Nacional de Gerenciamento dos Recursos Hídricos no Brasil. O resultado da implantação dessa cobrança representa um aumento nos custos de produção para o setor industrial. Neste contexto, muitas indústrias vêm buscando meios de reduzir o consumo de água e considerando a possibilidade de tratar seus efluentes antes do descarte em corpos receptores ou mesmo de reutilizar os seus efluentes após serem tratados. No decorrer dos últimos anos, vários tipos de tratamento de efluentes industriais foram desenvolvidos e aperfeiçoados, com a finalidade de atenuar a poluição causada pelo lançamento de águas residuárias industriais em corpos d’água receptores. A indústria petroleira, em seus diferentes processos e unidades, é grande consumidora de água, apresentando elevada relação de volume de água utilizado por volume de petróleo processado (DURAN et al., 2000). Por essa razão, têm feito esforços notáveis para tratamento dos efluentes gerados em seus processos, minimizando consideravelmente o impacto ambiental e reduzindo os custos operacionais. Nas estações de tratamento de águas residuárias das distribuidoras e refinarias brasileiras, ocorrem etapas convencionais de tratamento primário de resíduos (remoção de óleo e sólidos suspensos), seguidas de tratamento secundário, ou seja, tratamento biológico (lagoas aeradas, lodos ativados, dentre outros), para remoção de resíduos orgânicos biodegradáveis (TORRES, 2008). Os tratamentos biológicos permitem tratar grandes volumes de efluentes com custos relativamente baixos e simplicidade operacional (DURAN et al., 2000).

17 Neste sentido, tratamentos biológicos vêm mostrando ser uma próspera tecnologia para eficiente limpeza de efluentes, contribuindo para o descarte de águas tratadas e respeitando os índices seguros para o ambiente e a legislação vigente. Aliado a isto, a baixa eficiência, o elevado custo e a complexidade operacional dos tratamentos físico-químicos existentes têm estimulado a aplicação intensiva do tratamento biológico nas indústrias de modo geral (TORRES, 2008). Os terminais marítimos aquaviários de petróleo, que são responsáveis pela recepção, armazenamento e distribuição de petróleo oriundo das plataformas, são grandes produtores de efluentes contaminados. Com o petróleo extraído, existe uma grande quantidade de água associada que precisa ser separada antes da distribuição para as refinarias, denominada água de produção. A mistura petróleo/água fica armazenada em tanques para separação por decantação, o óleo é bombeado para as refinarias e a água de produção é submetida a tratamento para remoção dos poluentes. Os efluentes oriundos da separação água/óleo contêm elevados teores de nitrogênio, que devido ao seu alto número de estados de oxidação, pode existir em meio aquoso sob quatro formas: nitrogênio molecular (N2), nitrito (NO2), nitrato (NO3) + e nitrogênio amoniacal (NH3 e/ou NH4 ). O elemento nitrogênio é de fundamental importância à base da cadeia alimentar aquática por conta da biofixação desempenhada por organismos planctônicos presentes nos corpos hídricos, que incorporam este elemento em diversas proteínas e também no material genético. No entanto, despejos de águas residuais contendo altas taxas de nitrogênio podem ser tóxicos à vida aquática, causando depleção de oxigênio e eutrofização no meio ambiente (SPERLING, 1996). Excessos de compostos nitrogenados podem ser removidos por vários processos físico-químicos, por tratamentos biológicos ou a combinação entre ambos. A remoção biológica, além de mais eficiente é economicamente viável, por essa razão tem sido amplamente adotada em detrimento aos processos físico-químicos (AHN, 2006) . Os processos biológicos de remoção de nitrogênio são denominados nitrificação (autotrófica e heterotrófica) e desnitrificação. A nitrificação é o processo biológico chave na remoção do nitrogênio. Consiste na oxidação do íon amônio em duas fases: na primeira é transformado em nitrito, e numa segunda etapa o nitrito é 18 oxidado a nitrato. A desnitrificação é o processo de conversão de nitrato em nitrogênio gasoso (N2) que, a priori, ocorre em anaerobiose (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005). Há vários gêneros de bactérias que são capazes de realizar esta transformação. Ambos os processos são susceptíveis a um grande número de interferentes, como pH, temperatura, salinidade, concentração de oxigênio dissolvido e amônia, que podem inibir o crescimento e a ação dos micro-organismos responsáveis pelo processo de nitrificação (ALEEM, 1970). Além das bactérias citadas, é possível que a remoção de compostos nitrogenados seja realizada por bactérias anaeróbias amônia-oxidantes, que são capazes de oxidar a amônia a nitrito e reduzir nitrito produzindo o gás nitrogênio

(N2), num processo denominado Anammox (Oxidação anaeróbia da amônia) (SONTHIPHAND; HALL; NEUFELD, 2014). Além desses micro-organismos, estudos identificaram arqueias que realizam de forma eficiente a nitrificação (SAUDER et al., 2011). Os efluentes produzidos pelos terminais aquaviários de petróleo podem chegar aos tanques de tratamento com altas concentrações salinas, principalmente no caso do tratamento da água de produção de campos hipersalinos de exploração. Assim, é de grande importância que os micro-organismos responsáveis pela remoção de nitrogênio amoniacal sejam caracterizados e monitorados quando submetidos a diferentes concentrações salinas, a fim de que continuem realizando o seu papel transformador no ambiente. Este trabalho teve como objetivos realizar a caracterização e monitoramento dos micro-organismos presentes em lodos ativados de tratamento de efluentes salinos por meio de técnicas independentes de cultivo para o entendimento da dinâmica e diversidade dos micro-organismos nitrificantes presentes neste lodo.

19 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Água de produção de petróleo A produção de petróleo é acompanhada de significativa produção de água, conhecida como ‘água de produção’ ou ‘água produzida’, sendo o rejeito de maior volume em todo o processo de exploração e produção de petróleo (VIEIRA; CAMMAROTA; SÉRVULO, 2004). A água de produção é composta primariamente pela água de formação, naturalmente presente na formação geológica onde se realiza a prospecção do petróleo, somada à água de injeção empregada em processos secundários de recuperação de petróleo (HOLDWAY, 2002). Durante a vida útil de um poço de petróleo, o volume de água de produção pode chegar a exceder dez vezes o volume de produção de óleo bruto extraído (HENDERSON et al., 1999). Um campo de petróleo recente produz pouca água de produção, devido à maior disponibilidade de petróleo bruto, que requer menor pressão (proveniente da injeção de água) para ser extraído. Entretanto, à medida que a vida econômica dos poços vai se esgotando, o volume de água gerado no processo de extração pode aumentar em até 90% (ALI et al., 1998 e THOMAS, 2004). Esta produção excessiva de água se tornou uma das maiores preocupações nas indústrias petrolíferas. As águas de produção são efluentes complexos, de salinidade elevada, cuja composição pode variar amplamente, dependendo de alguns fatores como: tipo de campo de extração, idade, origem, qualidade do petróleo bruto e procedimento de extração. Os compostos que normalmente compõem esta água são: óleo disperso e dissolvido; sais minerais dissolvidos; sólidos oriundos da corrosão; graxas e asfaltenos; produtos químicos adicionados para prevenir e/ou tratar problemas operacionais, como biocidas, anti-incrustantes, anti-espumantes e inibidores de corrosão; e gases dissolvidos (STEPHENSON, 1992).

2.2 Tratamento de água de produção em terminal aquaviário de petróleo Os sistemas para o tratamento de efluentes em terminais aquaviários de petróleo são projetados com a combinação de diferentes metodologias, visando atingir maior eficiência na separação e degradação dos contaminantes da água. 20 Entretanto, todos os processos com potencial aplicação no tratamento da água de produção geram subprodutos que necessitam de posterior processamento e descarte, de acordo com critérios de proteção ambiental e saúde pública (GUERRA; ANGELIS, 2009). O TEBAR, Terminal Marítimo Almirante Barroso, inaugurado em 1969, é hoje o maior terminal de transferência de petróleo do país. Está localizado no Canal de São Sebastião e é administrado pela Transpetro/Petrobrás. No TEBAR não há processamento ou refino de óleo. O que ocorre é a recepção do petróleo transportado por navios provenientes dos poços de produção, armazenamento e bombeamento para as refinarias. O terminal em questão é responsável pelo abastecimento, via oleodutos, das refinarias de Cubatão (RPBC), Capuava (RECAP), São José dos Campos (REVAP) e Paulínia (REPLAN), movimentando cerca de 4 milhões de litros de petróleo/mês com uma vazão média de 200 litros/hora de efluentes tratados e descartados através de dois emissários submarinos de polietileno de alta densidade (FORTIS et al., 2007). Junto ao petróleo, há naturalmente uma parcela de água associada que precisa ser separada antes da distribuição. Mesmo que grande parte desta água seja separada do petróleo ainda nas plataformas, o óleo extraído ainda tem cerca de 1% de água (GUERRA; ANGELIS, 2009). No terminal, essa mistura petróleo/água fica armazenada em tanques para separação por decantação: o óleo é bombeado para as refinarias e a água é submetida a tratamento para remoção dos poluentes. A geração mensal de água de produção no TEBAR é em torno de 15.000 m3 (GUERRA; ANGELIS, 2009). Esta água residuária possui altas concentrações de amônia, além de ser caracterizada como efluente denso devido à alta concentração de sais (FORTIS et al., 2007), devido à água de injeção utilizada ser proveniente do mar. Há tendência do aumento deste teor salino quando consideradas extrações realizadas em reservas petrolíferas hipersalinas, como no pré-sal. A água de produção que chega à estação de tratamento de efluentes do TEBAR tem concentração de nitrogênio amoniacal de 108,15 ± 23,90 mg/L. O processo biológico usado no tratamento dos efluentes do TEBAR é um tipo de lodo ativado chamado de Reator em Batelada Sequencial (RBS), ilustrado na Figura 1. Esta é uma boa alternativa de tratamento de águas de 21 produção devido às áreas ocupadas pelas unidades de tratamento serem relativamente pequenas, por proporcionar redução de custos em relação aos processos contínuos e possibilidade de remoção conjunta de matéria carbonácea e de nutrientes como o fósforo e o nitrogênio em um único ciclo de operação (MORGENROTH; WILDERER, 1998; SHEKER; ARIS; SHIEH, 1993; VAN LOOSDRECHT; JETTEN, 1998). Os SBRs são conhecidos por serem particularmente robustos e por suportarem condições extremas, com a incorporação alternada de períodos aeróbios e anaeróbios de modo a englobar os processos de nitrificação e desnitrificação, e têm frequentemente sido empregados para tratar águas residuais salinas (WANG et al., 2015). De modo suscinto, o que ocorre com a água de produção que chega à Estação de Tratamento de Efluentes do TEBAR, passa inicialmente por um processo de estocagem que visa a decatação para primeira etapa remoção do óleo bruto restante. Em seguida, passará por flotadores, onde haverá a remoção de partículas sólidas e coloidais. Nesse ponto, o efluente recebe o nome de ‘clarificado’ e seguirá para tanques de equalização, onde haverá, principalmente, controle do pH, uniformização da concentração de oxigênio dissolvido e também equalização caudal. De lá, o efluente segue para tratamento em reatores biológicos, o ponto em que ocorre remoção da amônia via lodo ativado, e de outros compostos como por exemplo, hidrocarbonetos. No sistema de Reator em Batelada Sequencial, o processo consiste em se provocar o desenvolvimento de uma cultura microbiológica na forma de flocos (lodos ativados) em um tanque de aeração, que é alimentado pelo efluente a tratar. Neste tanque, a aeração tem por finalidade proporcionar oxigênio aos micro-organismos e evitar a deposição dos flocos bacterianos e os misturar homogeneamente ao efluente. Essa mistura é chamada de “licor”. O oxigênio necessário ao crescimento biológico é introduzido através de um sistema de aeração mecânica. O licor é enviado continuamente a um decantador, destinado a separar o efluente tratado do lodo. O lodo é recirculado ao tanque de aeração a fim de manter a concentração de microorganismos dentro de uma proporção em relação à carga orgânica afluente. O sobrenadante do decantador é o efluente tratado, pronto para descarte ao corpo receptor. O excesso de lodo, decorrente do crescimento biológico, é extraído. do sistema sempre que a concentração do licor ultrapassa os valores de projeto. Este lodo pode ser

22 espessado e desidratado, para outros usos ou para descarte, recebendo nessa etapa da denominação de lodo inorgânico. (SPERLING, 1996). Após o tratamento biológico, o efluente segue para remoção de outros agentes poluentes, até ser descartado no mar via emissários submarinos, dentro dos padrões exigidos pela legislação atual.

Figura 1: Modelo de Reator em Batelada Sequencial utilizado em terminal petrolífero. Fonte: imagem cedida pela Profa. Dra. Cynthia Canedo Silva - UFV/MG.

2.3 Bioprocessos de remoção do nitrogênio

O nitrogênio molecular (N2) perfaz cerca de 80% da atmosfera terrestre, sendo um elemento necessário para todos os organismos por estar relacionado à síntese de proteínas, ácidos nucléicos e outros compostos nitrogenados vitais. Este elemento químico é também dotado de alta energia de ligação, tendo como consequência a dificuldade do nitrogênio molecular de reagir facilmente com as demais substâncias e, sob condições normais de temperatura e pressão, é relativamente inerte à maioria dos reagentes. Em seu ciclo natural, o nitrogênio

23 altera-se em várias formas e estados de oxidação (RUSSELL; SANIOTO, 1982). No meio aquático, o nitrogênio pode existir em quatro dessas formas: nitrogênio - - + molecular (N2), nitrito (NO2 ), nitrato (NO3 ) e nitrogênio amoniacal (NH3 e NH4 ). Alguns processos são capazes de provocar transformações no estado de oxidação do nitrogênio, e são conhecidos como fixação, amonificação, nitrificação e desnitrificação. Esses processos fazem parte do ciclo biológico do nitrogênio e são dependentes de atividade microbiana (LENS; POL, 2000) apud (PHILIPS, 2008). Nos processos de tratamento de efluentes das refinarias, o nitrogênio amoniacal é removido durante os tratamentos secundários, que consistem na biodegradação de compostos orgânicos pela biomassa microbiana, chamada de lodo. Os micro-organismos presentes nesse lodo promovem a remoção do nitrogênio através dos processos de nitrificação e desnitrificação. Assim a remoção de nitrogênio é realizada em duas etapas. A primeira é a nitrificação, processo autotrófico em que a amônia é oxidada e convertida a nitrato. A segunda etapa é a desnitrificação, processo anaeróbico em que o nitrato é convertido a nitrogênio molecular por bactérias de vários gêneros, tais como: Pseudomonas, Paracoccus, Flavobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Thauera, dentre outros (KOREN; GOULD; BÉDARD, 2000). Há ainda uma etapa recentemente adicionada ao ciclo biológico do nitrogênio conhecida como ANAMMOX (Oxidação Anaeróbia de Amônia), em que amônia e nitrito são convertidos anaerobicamente a nitrogênio gasoso (N2), com produção de biomassa a partir de CO2 (SLIEKERS et al., 2002). Neste item será dada particular ênfase à nitrificação, pois é nesse processo que ocorre a oxidação da amônia até nitrato.

2.3.1 Micro-organismos e o processo de nitrificação A nitrificação é um processo chave no ciclo global do nitrogênio e ocorre em grande diversidade de ambientes (FRANCIS et al., 2005). A nitrificação ocorre naturalmente quando bactérias quimioautotróficas oxidam formas reduzidas de + - - nitrogênio inorgânico (NH4 e NH3) a nitrito (NO2 ) e nitrato (NO3 ), reações que são catalisadas por dois tipos distintos de bactérias: Bactérias Oxidadoras de Amônia e Bactérias Oxidadoras de Nitrito. Estas reações são recursos metabólicos para que

24 as bactérias obtenham energia para crescimento e manutenção celular (MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004). Na primeira fase do processo, a amônia é oxidada a nitrito. Na segunda etapa, o nitrito é oxidado a nitrato (SCHMIDT et al., 2002). Como mais comumente relatado, a primeira fase pode ser realizada por bactérias dos gêneros Nitrosomonas, Nitrosospira e Nitrosolobus, e a segunda etapa, por bactérias dos gêneros Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospira e Nitrospina (RASCHE; HYMAN; ARP, 1990) e (SCHMIDT et al., 2002). Esse processo biológico ocorre em condições de aerobiose (SCHMIDT et al., 2003). Embora morfologicamente distintas estas bactérias exibem estreita relação filogenética, com exceção do gênero Nitrospira, que constitui seu próprio filo Nitrospirae, enquanto os demais gêneros pertencem ao filo Proteobacteria, divididas entre as classes Betaproteobacteria e Gamaproteobacteria (MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004). As bactérias nitrificantes são organismos sensíveis e extremamente susceptíveis a um grande número de inibidores. Uma variada gama de agentes físico-químicos pode inibir o crescimento e a ação desses organismos, tais como pH, temperatura, salinidade, presença de compostos orgânicos e inorgânicos (TEIXEIRA, 2006). As bactérias autotróficas amônia-oxidantes dispõem de uma enzima essencial para o processo de nitrificação, denominada amônia mono-oxigenase (AMO). Esta enzima é codificada pelo operon AMO, constituído pelos genes: amoA, amoB e amoC, responsáveis por codificar as três subunidades que a constituem. A sequência dos genes do operon AMO foi inicialmente estudada em bactérias amônia-oxidantes da classe Betaproteobacteria, em micro-organismos isolados do solo e água doce. Atualmente há também estudos de bactérias amônia-oxidantes das classes Beta e Gamaproteobacteria isoladas de ambientes marinhos, como Nitrosococcus oceani e Nitrosomonas europaea (ALZERRECA; NORTON; KLOTZ, 2006). Há algum tempo acreditava-se que a nitrificação estava restrita às bactérias, sobretudo às do filo Proteobacteria, e que o processo era essencialmente quimioautotrófico mediado por um conjunto de micro-organismos. No entanto, há relatos de gêneros de bactérias heterotróficas capazes de realizar de nitrificação, em que a amônia pode ser oxidada a hidroxilamina, ácido dihidroxâmico e nitrito.

25 Exemplos desses micro-organismos são bactérias do gênero Arthrobacter (VERSTRAETE; ALEXANDER, 1972), algumas espécies dos gêneros Streptomyces, Proteus, Pseudomonas (KUENEN; ROBERTSON, 1988) e do gênero Bacillus (KIM et al., 2005). Robertson et al. (1988) descrevem a bactéria heterotrófica Paracoccus denitrificans com potencial concomitante de nitrificação e desnitrificação em condições de aerobiose. Além disso, muitos estudos recentes apontam outros micro-organismos com potencial de nitrificação, como as bactérias que realizam a oxidação anaeróbia da amônia (Anammox) e, ainda, as arqueias nitrificantes. O Dominio Archaea foi oficialmente separado do Dominio Bacteria em 1990 (WOESE; KANDLER; WHEELIS, 1990). Foram incialmente descritas como micro-organismos capazes de sobreviver em condições extremas (zonas abissais, fontes termais, fendas vulcânicas, águas hipersalinas, zonas abissais, pH extremo, entre outros), sendo que sua adaptação a esses ambientes é resultado da seleção de componentes celulares e estratégias bioquímicas que lhes permitem lidar com condições drásticas, frequentemente presentes nos processos industriais e biotecnológicos (DE CHAMPDORÉ et al., 2007). Atualmente, graças às técnicas independentes de cultivo, é possível afirmar que as arqueias estão amplamente presentes nos mais diversos ambientes, não necessariamente extremos, e representam uma fração considerável da diversidade de micro-organismos em ecossistemas aquáticos e terrestres, além de possuírem grande importância nos ciclos biogeoquímicos globais (KÖNNEKE et al., 2005). A primeira indicação do envolvimento de arqueias na oxidação da amônia se deu quando regiões gênicas semelhantes aos genes amo, presentes no operon AMO, anteriormente observado em bactérias, foram detectadas no sequenciamento do genoma de arqueias presentes em ambiente marinho (VENTER et al., 2004) e também no solo (SCHLEPER; JURGENS; JONUSCHEIT, 2005). A descoberta das arqueias nitrificantes desfez a visão “bacteriocêntrica” que havia sobre a nitrificação e se destaca como um exemplo da complexidade fascinante de micro-organismos envolvidos em ciclos biogeoquímicos (HATZENPICHLER, 2012).

26 Todas as recentes descobertas ilustram o fato de que nossa compreensão atual acerca da profundidade e amplitude de micro-organismos oxidantes de amônia é ainda incompleta (BERNHARD et al., 2010).

2.4 Compostos nitrogenados no meio ambiente O CONAMA, Conselho Nacional do Meio Ambiente, é o órgão federal responsável pela legislação ambiental brasileira. Segundo descrito, a Resolução 357 de 17 de março de 2005 e Resolução 430 de 13 de maio de 2011, dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes, e dá outras providências (CONAMA, 2005). Nesta resolução, os padrões de lançamentos de efluentes estão descritos no Artigo 34, parágrafo 5°, que determina a quantidade máxima de nitrogênio amoniacal de 20,0 mg/L para qualquer efluente descartado, não havendo regulamentação para descarte de nitrogênio total. Embora essa não seja uma preocupação do CONAMA, alguns estados brasileiros, em sua legislação ambiental, fixam o limite máximo de descarte de efluentes contendo nitrogênio total. O índice máximo estabelecido pelo estado de Santa Catarina, por exemplo, é de até 10 mg/L de nitrogênio total presente em efluentes descartados em lagos, lagoas, rios, mares e estuários (PHILIPS, 2008). Esta é uma importante medida, uma vez que o nitrogênio pode assumir grande número de estados de oxidação, formando variados compostos que podem comprometer seriamente o ambiente. Quando não há tratamento adequado dos resíduos nitrogenados, sejam eles provenientes de despejos domésticos, agrícolas ou industriais, o nitrogênio em elevadas concentrações nos ambientes aquáticos pode levar a um processo chamado eutrofização. Este fenômeno é causado pelo excesso de nutrientes, compostos nitrogenados em associação ao fósforo, que provocam um aumento excessivo de organismos como algas, que como consequência, permitem o desenvolvimento dos consumidores primários e de outros elementos da teia alimentar. O aumento desta biomassa pode levar a uma diminuição do oxigênio dissolvido, provocando a morte e decomposição de muitos organismos, resultando na diminuição da qualidade da água e causando alterações no ecossistema (TORTORA, FUNKE, CASE, 2005).

27 2.4.1 Nitrificação e Salinidade A água residuária proveniente da separação petróleo/água de produção nos terminais aquaviários possui altas concentrações de amônia, além de ser caracterizada como efluente denso devido à alta concentração salina (FORTIS et al., 2007). Em virtude de novas tecnologias de extração de petróleo, a tendência é que a água de produção chegue às estações de tratamento de efluente com índices ainda mais elevados de salinidade. Há um grande interesse em compreender a ecologia dos micro- organismos nitrificantes, pois o processo de nitrificação é o gargalo na remoção biológica de nitrogênio em tratamentos de águas residuárias. As causas de um desempenho abaixo do ideal ou mesmo da ausência do processo de nitrificação nem sempre são claras (MOUSSA et al., 2006). Micro-organismos nitrificantes são susceptíveis a uma série de fatores como pH, temperatura, concentração de oxigênio dissolvido, substrato disponível e salinidade. Altos teores salinos afetam o metabolismo e atividade das bactérias nitrificantes, reduzindo o crescimento microbiano e as taxas de oxidação de amônia. Além disso, a salinidade afeta diretamente a solubilidade do oxigênio e a taxa de transferência desse gás no meio líquido, o que pode levar à limitação do processo de nitrificação (BASSIN et al., 2012). Neste contexto, os efeitos prejudiciais do sal sobre a nitrificação têm sido objeto de muitos estudos (BASSIN et al., 2012; DINÇER; KARGI, 1999 e LI; YANG; ZHOU, 2011). Segundo estudos de Dinçer e Kargi (1999), concentrações de sal acima de 2% acarretam reduções significativas no desempenho dos processos de nitrificação e desnitrificação. Moussa e colaboradores (2006) observaram que tanto micro-organismos amônia-oxidantes quanto nitrato-oxidantes, tiveram o metabolismo quase completamente inibido na concentração de 40 g/L de NaCl. Em Campos e colaboradores (2002), o sistema de nitrificação estudado tornou-se completamente ineficiente em concentrações salinas maiores que 525 mM, devido ao efeito de inibição mista de sal e amônia. Na literatura há divergências sobre a concentração salina limitante ao processo de nitrificação. Isto se deve ao fato desse processo estar relacionado a fatores como: método de aclimatação, tipos de micro-organismos, sucesso de

28 adaptação e fase de crescimento da microbiota. De qualquer modo, os primeiros relatos de comprometimentos da nitrificação se dão quando há concentração salina em torno de 5%, concentração a partir da qual começa a ocorrer diminuição da diversidade de populações nitrificantes (CAMPOS et al., 2002, MOUSSA et al., 2006, GROMMEN et al, 2005). Altos teores salinos presentes no efluente podem ainda, afetar a estrutura e as características de sedimentação dos flocos de micro- organismos constituintes dos lodos ativados, e a solubilidade do oxigênio e sua taxa de transferência em meio líquido, tornando-o um fator limitante. O aumento da diversidade de micro-organismos em sistemas de tratamento de águas residuárias é recomendado para propiciar consórcios microbianos mais resistentes à perturbações (NOGUEIRA et al., 2002). Vários autores citam a adaptação da biomassa dos lodos ativados como o fator chave para melhorar o desempenho da nitrificação (BASSIN; DEZOTTI; SANT’ANNA, 2011, CAMPOS et al., 2002, MOUSSA et al., 2006). Variados fenômenos têm sido propostos para explicar esta fase, como por exemplo, a ocorrência de um processo de seleção e multiplicação dos micro-organismos. O tempo necessário para que a adaptação ocorra a contento depende da fonte de biomassa utilizada, temperatura, pH, concentração de oxigênio dissolvido, idade do lodo e do substrato (CORDI et al., 2008). A adaptação dos micro-organismos pode ser realizada de dois modos: 1) adaptação por clonagem de gene, cuja prática é centrada para culturas puras, e adaptação natural, que é mais utilizada em processos biológicos (WENDEROTH et al., 2003). Uma das formas de adaptação natural é a aclimatação do lodo ativado, que consiste em oferecer condições para que populações específicas de micro-organismos se sobressaiam. Panswad e Anan (1999) observaram que a salinidade provocou perda de 30% a 55% da atividade nitrificante em lodo não adaptado, em comparação ao lodo aclimatado, durante o tratamento de águas residuárias provenientes de esgoto doméstico. Para este estudo, com o intuito de selecionar os micro-organismos responsáveis pelo processo de nitrificação em condições salinas, foi realizada a aclimatação do lodo ativado e seu posterior enriquecimento com nutrientes que favorecessem a microbiota nitrificante.

29 2.5 Análise de comunidades microbianas por meio de técnicas moleculares independentes de cultivo O estudo da diversidade em comunidades microbianas levanta questões sobre a composição, estrutura e estabilidade das populações, assim como sobre a atividade e função dos micro-organismos que a compõem. Os métodos utilizados para o estudo das comunidades de micro-organismos presentes em lodos ativados podem ser independentes ou dependentes de cultivo. O primeiro método é o mais indicado, pois é estimado que seja possível a recuperação de no máximo 15% da microbiota presente no lodo através de técnicas baseadas em cultivo (AMANN et al., 1996). Embora as técnicas de cultivo tenham sido aprimoradas e tenham permitido a recuperação in vitro de um número crescente de micro-organismos não cultivados (LEADBETTER, 2003), o conhecimento sobre sua ecologia permanece ainda insuficiente para cultivar a maioria deles. Mesmo técnicas dependentes e independentes de cultivo sendo complementares, a aplicação de técnicas independentes de cultivo são importantes ferramentas utilizadas em biotecnologia e foram essenciais a esse estudo para esclarecimento da microbiota presente em lodo ativado proveniente dos reatores de terminal petrolífero.

2.5.1 Bibliotecas de genes RNA ribossomal 16S para bactérias e arquéias Metodologias moleculares desenvolvidas nas últimas décadas (extração de ácidos nucleicos, amplificação por reação da polimerase em cadeia (PCR), clonagem e seqüenciamento de DNA, têm sido otimizadas e adaptadas para superar as limitações impostas pela abordagem clássica de estudo de populações microbianas, evitando o isolamento e cultivo dos micro-organismos. A utilização destas metodologias vem permitindo mudanças significativas na perspectiva da diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos grupos de organismos, nunca antes cultivados (HUGENHOLTZ; GOEBEL; PACE, 1998). O desenvolvimento dessas técnicas permite que os micro-organismos sejam detectados, identificados e enumerados através da análise de genes. Embora, a princípio, qualquer gene possa ser usado, o gene para o RNAr 16S é uma excelente molécula marcadora para este propósito, uma vez que está presente em todos os organismos, apresenta regiões conservadas assim como regiões variadas, o que

30 torna possível o desenho de primers com diferentes níveis de especificidade, tem informação de sequência suficiente para inferência filogenética, e está presente em grande número nas células, o que facilita sua detecção. Além disso, um grande número de sequências estão disponíveis atualmente em bases de dados de livre acesso, tais como Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e Ribossomal Database Project, (http://rdp.cme.msu.edu/html), os maiores repositórios de informações biológicas existentes. O gene RNAr 16S é dividido em nove regiões variáveis (V1-V9), dentre as quais, as regiões V2, V4 e V6 são as mais utilizadas para afiliação filogenética (NEEFS et al., 1990). A combinação de regiões variáveis e parcialmente conservadas é uma boa estratégia para a realização de análises em diferentes profundidades filogenéticas (HAMADY; KNIGHT, 2009 apud DELFORNO, 2014). Grande parte dos estudos de ecologia microbiana molecular realizada até agora empregou o sequenciamento de fragmentos de DNAr 16S clonados para explorar a diversidade microbiana. Diferentes estratégias de clonagem e construção de bibliotecas podem ser empregadas: clonagem por “shotgun” de fragmentos de DNA em bacteriófago lambda (SCHMIDT; DELONG; PACE, 1991), clonagem de fragmentos de cDNA, obtidos após transcrição do RNAr 16S em cDNA (WARD et al., 1992), clonagem de fragmentos de DNAr 16S ou de genes funcionais amplificados por PCR (FUHRMAN; MCCALLUM; DAVIS, 1993). Os fragmentos de DNAr 16S, produzidos por qualquer uma das estratégias descritas acima, são ligados em um vetor de clonagem adequado e introduzidos em células hospedeiras de E. coli. A seguir, a suspensão de células de E. coli é plaqueada numa densidade que permita a formação de colônias individuais. Este conjunto de células de E. coli contendo, cada uma, um inserto de DNAr 16S individual é o que se chama de banco (biblioteca) de clones, a partir do qual os fragmentos de DNAr 16S inseridos podem ser sequenciados. O sequenciamento dos insertos, seguido por análise comparativa de sequência, revela a afiliação filogenética do micro-organismo presente na amostra ambiental. Uma vantagem importante é que a informação completa da sequência de DNAr 16S de todos os micro-organismos no ambiente é recuperada e pode ser depositada em bases de dados, permitindo que estudos futuros, relacionados ou não, sejam realizados por outros autores. 31 Usando a estratégia de clonagem, diferentes micro-organismos foram, pela primeira vez, identificados. Os resultados destes estudos levaram à conclusão de que as técnicas existentes de cultivo eram ineficientes para isolar estas espécies e que a diversidade genética de micro-organismos na natureza é muito maior do que se imaginava. Bibliotecas de genes RNAr 16S foram utilizadas no estudo de Liu et al. (2011) a fim de obter informações sobre a diversidade da comunidade microbiana de sedimentos lixiviados. As análises filogenéticas revelaram grande variedade de micro-organismos degradadores de poluentes, dentre os quais alguns envolvidos na oxidação de amônia. No estudo conduzido por Wells e colaboradores (2009), a técnica independente de cultivo foi aplicada para monitoramento da diversidade e correlações da dinâmica entre linhagens de bactérias amônio-oxidantes que constituem o lodo ativado de biorreatores durante os períodos de nitrificação estável. As bibliotecas genicas constituem, portanto, uma importante ferramenta para conhecer a estrutura e composição de comunidades microbianas em sistemas de tratamento de efluentes, permitindo avaliar a influencia de parâmetros físico- quimicos na eficiência do processo e fornecendo subsídios para otimizar as condições de operação.

2.5.2 Sequenciamento em larga escala - Plataforma 454 FLX Roche O final do século 20 foi marcado por uma revolução no domínio da biologia molecular graças à inovação das técnicas de sequenciamento. No início da década de 70, foram desenvolvidas as primeiras tecnologias de sequenciamento por Maxam & Gilbert, que tinham como base o uso de substâncias químicas promovendo o rompimento da molécula de DNA em nucleotídeos específicos. Em 1977, Sanger propôs o sequenciamento chamado de ‘método dos didesoxinucleotídeos’ (KREUZER; MASSEY, 1996). A técnica de sequenciamento de Sanger é baseada na síntese de uma nova molécula de DNA com a incorporação de nucleotídeos comuns (desoxinucleotídeos - dNTPs) e didesoxinucleotídeos (ddNTPs). Quando os ddNTPs são aleatoriamente incorporados, não há mais extensão do fragmento. Portanto, as moléculas de ddNTPs são terminadores de

32 cadeia que eram, inicialmente, marcados radioativamente. Hoje em dia, são marcados por fluoróforos. O método de Sanger foi automatizado na segunda metade da década de 80, o que aumentou incrivelmente as possibilidades de pesquisas genéticas via sequenciamento de DNA, continuou a ser aprimorado e é amplamente utilizado até hoje. No entanto, com a intenção de atender outras demandas (como em medicina diagnóstica e preventiva, estudos de biodiversidade, sequenciamento de genomas completos, etc), ganhar tempo no preparo de amostras e diminuir custos, outras tecnologias de sequenciamento, denominadas de tecnologias de sequenciamento de nova geração, começaram a ser comercializadas a partir de 2005 e estão evoluindo rapidamente. Todas essas tecnologias promovem o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida. O sistema 454 FLX da Roche, também chamado de pirosequenciador, foi a primeira plataforma de sequenciamento de nova geração a ser comercializada e ainda há ampla utilização desta técnica em todo o mundo. Pirosequenciamento é um método de síntese enzimática que, a grosso modo, pode ser dividido em três etapas: (a) preparo da amostra, (b) PCR em emulsão e (c) sequenciamento Figura 2. Na etapa (a) o DNA é fragmentado aleatoriamente e ligado a adaptadores A e B em suas extremidades. Os fragmentos A/B são selecionados para o sequenciamento. Na etapa (b) os fragmentos são ligados a microesferas magnéticas por meio do pareamento com sequências curtas complementares presentes na superfície das microesferas. Apenas um único tipo de fragmento se liga a uma determinada microesfera. As microesferas são capturadas individualmente em gotículas oleosas onde a PCR em emulsão ocorre. Milhares de cópias do fragmento alvo são produzidas nessa fase. As microesferas ligadas às sequências alvo de fita simples são capturadas individualmente em poços no suporte de sequenciamento. A seguir, na etapa (c), as reações de sequenciamento ocorrerão em cada poço, para um único tipo de fragmento ligado à microesfera, não havendo, portanto, competição por reagentes com outros fragmentos da biblioteca. Nesta etapa, são fornecidos os reagentes para a reação de pirosequenciamento, baseado na detecção do pirofosfato (PPi) durante a síntese de uma molécula de DNA. As quatro enzimas incluídas no sistema de pirosequenciamento são:

33 fragmento Klenow da DNA polimerase I, ATP sulfurilase, luciferase e apirase. A reação depende também de três substratos enzimáticos: adenosina fosfossulfato (APS), d-luciferina e um molde de DNA contendo um iniciador, que serve como material de partida para a DNA polimerase I. Os quatro nucleotídeos vão sendo adicionados um de cada vez, de forma cíclica. Todas as vezes que um nucleotídeo é incorporado pela DNA polimerase I, ocorre liberação de uma molécula de pirofosfato, então se inicia uma cascata enzimática que é finalizada quando a d- luciferina, pela ação da luciferase, é convertida em oxiluciferina. Neste momento há a emissão de um sinal de luz. O sinal de luz emitido é identificado a cada base incorporada, em cada poço de sequenciamento, sendo captado por uma câmera CCD (charge-coupled device) acoplada ao sistema. O sinal florescente gerado é proporcional à quantidade de nucleotídeos que são incorporados (AHMADIAN; EHN; HOBER, 2006, DELFORNO, 2014 e CARVALHO; SILVA, 2010).

Figura 2: Ilustração das etapas do sequenciamento em larga escala na Plataforma 454 Roche. Fonte: Mardis, 2008. Trends in Genetics.

Em comparação às demais tecnologias de sequenciamento de segunda geração, a plataforma 454 é uma das que produz as maiores leituras (300 - 800 pb) e por isso tem sido utilizada, inclusive, para o sequenciamento de genomas de

34 bactérias, vírus e até de alguns eucariotos (WICKER et al., 2008). Pelo fato de não envolver clonagem bacteriana, a representação do genoma é bem mais fiel, de forma que sequências difíceis de clonar podem ser acessadas (CARVALHO; SILVA, 2010). O pirosequencimento é um bom recurso para estudo da diversidade genética, seja por metagenômica ou por pool de amplicons do gene RNAr 16S. Neste estudo, a metodologia utilizada foi via pool de amplicons do gene RNAr 16S. A escolha de primers para esta finalidade segue o mesmo princípio do sequenciamento das regiões do gene RNAr 16S via método de Sanger. Um grande número de trabalhos relata o bom desempenho da técnica de pirosequenciamento para caracterização da microbiota de lodos ativados relacionados ao tratamento de efluentes de origens diversas, utilizando-se amplicons do gene rRNA 16S. Em Lee; Kang & Park (2015), comunidades bacterianas constituintes de lodo ativado presente em um biorreator para tratamento de efluentes provenientes de esgoto doméstico, foram identificadas, via pirosequenciamento, em quatro diferentes plantas e períodos para posterior comparação. Os resultados evidenciaram uma comunidade altamente complexa, com grande diversidade foi possível concluir sobre a diferença de composição e dinâmica entre as amostras de lodo ativado que foram comparadas. Em outro estudo, o pirosequenciamento do gene RNAr 16S foi aplicado a fim de proporcionar uma melhor compreensão sobre a estabilidade da diversidade microbiana total presente em lodo ativado, quando este era submetido a diferentes parâmetros ambientais e operacionais (BAGCHI et al., 2015). Em um interessante estudo comparativo entre arqueias (AOA) e bactérias amônia oxidativas presentes em lodo ativado utilizado em tratamento de efluentes domésticos, o pirosequenciamento do gene RNAr 16S foi realizado para arqueias e bactérias com o intuito de avaliar quais eram os micro-organismos presentes que estavam relacionados à nitrificação (DING et al., 2015).

2.5.3 Monitoramento da diversidade microbiana através da técnica de DGGE A técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) é uma metodologia que permite a separação de fragmentos de DNA de mesmo tamanho,

35 porém com sequências de nucleotídeos diferentes, baseando-se na mobilidade eletroforética da molécula de DNA parcialmente desnaturada em géis de poliacrilamida com gradiente crescente de agentes desnaturantes (uréia e formamida). A separação dos produtos de PCR (fragmentos de DNA) se dá de acordo com suas sequências de pares de bases, e não de acordo com os tamanhos dos fragmentos de DNA, como a maioria das técnicas de fingerprint genético (OLIVEIRA, 2008). A técnica de DGGE foi introduzida no campo da genética microbiana no início da década de 90. É especialmente útil para a investigação da dinâmica de populações microbianas em função de variações ambientais ou de condições operacionais de um sistema (FERRIS; MUYZER; WARD, 1996). É amplamente empregada para monitoramento de comunidades microbianas presentes em lodos ativados utilizados em tratamento biológico de efluentes ou de esgoto industrial e doméstico, em solos, biofilmes, biorreatores, e também possibilita a análise de várias amostras simultaneamente. Esta técnica também se mostrou eficiente para o monitoramento de comunidade bacteriana em diferentes gradientes de salinidade, como observado por Boujelben et al. (2012). Este trabalho analisou a dinâmica de comunidades microbianas de lagoas hipersalinas pela amplificação de fragmentos do gene RNAr 16S seguido por DGGE e representou um passo adiante no estudo da dinâmica da comunidade procariótica em ambientes hipersalinos. O DGGE já foi empregado para estudos da dinâmica de bactérias nitrificantes através de amplificação de fragmentos do gene amoA. Nicolaisen e Ramsing (2002) avaliaram a estabilidade e estrutura da comunidade de bactérias amônio-oxidantes sob diferentes perturbações ambientais. Os autores reportaram que esta técnica produziu resultados confiáveis para investigação da diversidade de bactérias amônio-oxidantes em diferentes condições ambientais, e que ainda apresentou a vantagem da análise de grande quantidade de amostras em curto espaço de tempo.

36 3 OBJETIVOS

Caracterizar comunidades microbianas nitrificantes em condições halofílicas, por meio de técnicas moleculares independentes de cultivo, para aplicação futura em biorremediação de efluentes salinos.

3.1 Objetivos específicos - Caracterização da diversidade microbiana total e metabolicamente ativa presente no lodo de sistemas de tratamento de efluentes salinos através da construção de bibliotecas de DNA e cDNA do gene RNA ribossomal 16S; - Monitoramento e caracterização da diversidade microbiana total e de micro-organismos nitrificantes durante o processo de aclimatação do lodo a altas concentrações salinas pelo emprego da técnica de DGGE.

37 4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Amostra de lodo ativado Foram coletados 2 litros de lodo proveniente do sistema de tratamento de lodos ativados do Terminal de São Sebastião (SP). A amostra foi acondicionada em galão de plástico à temperatura ambiente e transportada até o laboratório. O lodo foi aliquotado em três frascos tipo Falcon com aproximadamente 15 mL de lodo e acondicionado a -20°C para futuras extrações de ácidos nucléicos.

4.2 Extração de DNA total A extração de DNA foi realizada segundo protocolo estabelecido combinando os métodos de Großkopf et al. (1998) e Neria-Gonzáles et al. (2006). Utilizou-se para tal 4 mL de amostra fracionados em 4 microtubos. O material foi centrifugado e os pellets obtidos suspensos em 1 mL de tampão PBS. A suspensão foi adicionada de 100 µL de lisozima (C=100 mg/mL). Os microtubos foram mantidos a 37ºC durante 60 minutos com agitação manual a cada 10 minutos. Foram adicionados 50 µL da enzima proteinase K (C=10 mg/mL) e 200 µL de SDS a 10%, e procedeu-se nova incubação a 60ºC durante 60 minutos, com agitação manual a cada 10 minutos. A partir daí, os frascos foram submetidos a três ciclos “freeze- thaw” (ciclos de 2 min a 65ºC, alternados por 2 min em nitrogênio líquido), de forma a promover a lise mecânica das paredes celulares microbianas. A seguir o conteúdo de cada um dos microtubos foi dividido e então adicionou-se igual volume (cerca de 675 µL) de fenol saturado em Tris-HCl (pH 8,0). Após centrifugação, a fase superior aquosa foi transferida para novo microtubo ao qual adicionou-se clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Após extração, a fase superior foi transferida para novo microtubo de 1,5 mL e precipitada com 10% v/v de NaCl 5 M (cerca de 50 µL) e 2 volumes de etanol absoluto gelado (cerca de 1,0 mL). Após precipitação do DNA, o pellet foi lavado por 3 vezes com etanol 70% gelado. Depois de seco a 28°C, o DNA foi suspenso em 100 µL de água MilliQ esterilizada e estocado em freezer a -20ºC. A integridade e concentração do DNA foram avaliados através de eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com 0,02 µL/mL SYBR Safe 10.000x in DMSO (Invitrogen).

38 4.3 Reações de amplificação por PCR a partir do DNA total - Bactérias e Arqueias Após extração do DNA da comunidade microbiana das amostras de lodo, procedeu-se com a reação de PCR para amplificação do gene RNAr 16S do Dominio Bacteria utilizando o par de primers 10f (5’- GAG TTT GAT CCT GGC TCA G -3’) e 1100r (5’- AGG GTT GCG CTC GTT G -3’) (LANE et al., 1985). As reações de PCR foram realizadas para um volume final de 25 µL contendo tampão de PCR

(Invitrogen) 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM (ou 200 μM) de dNTP Mix (Invitrogen), 0,5 μM de cada primer, 2,0 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen), e 5,0 μL da amostra de DNA (~50 ng de DNA). A amplificação foi realizada em um termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystem) e o programa de amplificação utilizado consistiu de 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos a 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto e 72°C por 3 minutos; e 1 ciclo de extensão final a 72°C por 3 minutos. A amplificação do gene RNAr 16S foi confirmada em géis de agarose 1%, corados com 0,02 µL/mL SYBR Safe 10.000X in DMSO (Invitrogen), posteriormente visualizados no equipamento Image Quant LAS 4.000 GE. Foram feitas tentativas de amplificação via PCR gene-específico utilizando-se os primers que codificam para a região A do gene amo em bactérias do filo Proteobacteria. Para tanto, foram utilizados os primers CTO189Af e CTO684r descritos por Kowalchuk et al. (1997), nas condições realizadas no mesmo estudo. A amplificação do gene RNAr 16S de arqueias foi feita através do uso de primers distintos daqueles usados para bactérias, específicos para regiões conservadas da sequencia de organismos pertencentes ao Dominio Archaea: Arc 344f (5’-TCGCGCCTGCTGCICCCCCGT-3’) (RASKIN et al., 1994) e Arc 1400r (5’- CGGCGAATTCGTGCAAGGAGCAGGGAC-3’ (KUDO et al., 1997). Foram utilizadas alíquotas de 50 ng de DNA em diluições de 50 ng/uL. As reações de PCR foram realizadas para um volume final de 25 µL para cada uma das diluições e continham tampão de PCR (Invitrogen) 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 μM de dNTP Mix (Invitrogen), 0,5 μM de cada primer, 2,0 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen), e 5,0 μL da amostra de DNA, e o programa de amplificação utilizado consistiu de 1 ciclo a 94°C por 2 minutos; 10 ciclos a 94°C por 30 segundos, 65°C por 30 segundos, 72°C por 2 minutos, 25 ciclos a 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por

39 2 minutos e 1 ciclo de extensão final a 72°C por 3 minutos. A amplificação foi realizada em um termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystem). Em adição, foram feitas tentativas de amplificação via PCR gene- específico para construção de biblioteca utilizando-se os primers que codificam para a região A do gene amo em arqueias nitrificantes. Para tanto, foram utilizados os primers Arch amoA-f (5’-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3), e Arch amoA-r (5’- GCGGCCATCCATCTGTATGT) (FRANCIS et al., 2005). Foram utilizadas alíquotas de 50 ng de DNA em diluições de 25 ng/uL, 10ng/uL, 1ng/uL e 0,1 ng/uL. As reações de PCR foram realizadas para um volume final de 25 µL para cada uma das diluições e continham tampão de PCR (Invitrogen) 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 μM de dNTP Mix (Invitrogen), 0,5 μM de cada primer, 2,0 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen), e 5,0 μL da amostra de DNA, e o programa de amplificação utilizado consistiu de 1 ciclo a 95°C por 5 minutos; 30 ciclos a 94°C por 45 segundos, 53°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto e 1 ciclo de extensão final a 72°C por 15 minutos, segundo protocolo descrito em (FRANCIS et al., 2005). A amplificação foi realizada em um termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystem).

4.4 Construção das bibliotecas do gene que codifica para o RNAr 16S - DNA de Bacterias e Arqueias Após amplificação do DNA total extraído, foi realizada a construção de bibliotecas de fragmentos do gene RNAr 16S tanto para bactérias quanto para arqueias. Assim, os amplicons obtidos com os primers específicos para cada grupo de micro-organismos, foram purificados separadamente em coluna Illustra GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE HealthCare). Os passos a seguir, foram realizados do mesmo modo tanto para bactérias quanto para arqueias. Foi realizada verificação do conteúdo purificado em gel de agarose 1% e os resultados foram visualizados no equipamento Image Quant LAS 4.000 GE. Os fragmentos de DNAr 16S purificados, foram ligados em vetor pGEM-T (pGEM-T Easy Vector System, Promega), segundo as especificações do fabricante. Para transformação, foram utilizados 40 µL de células hospedeiras eletrocompetentes caseiras (Escherichia coli DH5α) e 1 µL da reação de ligação. As células hospedeiras foram transformadas por eletroporação, com aplicação de pulso de 1.8 KV, utilizando-se o eletroporador

40 Celljet Uno (Hybaid). As células transformadas foram plaqueadas em meio LA (Luria- Bertani Agar: triptona bacteriológica 10g/L, extrato de levedura 5g/L, NaCl 5g/L, ágar bacteriológico 15g/L) adicionado de ampicilina (80 µg/mL), 5-bromo-4-chloro-3- indolyl--D-galactopyranosideo (XGal) e 0,5 mM de isopropyl--D- thiogalactopyranosideo (IPTG). As placas foram incubadas a 37°C por 16 h. Os clones positivos (colônias brancas) foram selecionados e inoculados em microplacas de 2 mL contendo meio LB (Luria-Bertani broth) + ampicilina (100 µL/mL) e incubados a 37ºC com agitação (100 rpm) por 24 h. Após crescimento, 2 uL de cada cultura de clone foram utilizados para reação de amplificação e 50 µL de cada cultura foram preservados em glicerol 50% e armazenados a -80°C.

4.5 Sequenciamento dos genes RNA ribossomal 16S - Bacterias e Arqueias Para a reação de amplificação dos fragmentos obtidos a partir da clonagem tanto de bactérias quanto de arqueias, foram utilizados os primers universais M13 forward (5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’) e reverse (5’- TTTCAC ACA GGA AAC AGC TATGAC-3’), procedimento realizado para obtenção do fragmento do gene RNAr 16S inserido no vetor para posterior sequenciamento automatizado. As reações de amplificação foram realizadas em volumes 50 µL contendo 2 µL do cultivo do clone; 0,4 µM de cada primer; 0,2 mM do mix de dNTPs (Invitrogen); 2 U da enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen); 1X do tampão da enzima (Invitrogen) e 1,5 mM de MgCl2. O programa de amplificação consistiu em uma etapa de desnaturação inicial a 94 ºC por 3 min, 40 ciclos de 20 s de desnaturação a 94 ºC, 20 s de anelamento a 60 ºC e 1,5 min de extensão a 72 ºC. As amplificações foram feitas em termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystem). Os produtos de PCR foram aplicados em gel de agarose 1,0 % corado com 0,02 µL/mL SYBR Safe 10.000X in DMSO (Invitrogen) com a finalidade de se confirmar o tamanho do fragmento esperado. Os fragmentos correspondentes ao gene RNAr 16S foram purificados em placa Illustra GFX™ 96 PCR Purification Kit (GE HealthCare). As amostras dos clones devidamente quantificadas em gel de agarose 1,2% corado com 0,02 µL/mL SYBR Safe 10.000X in DMSO (Invitrogen) foram então diluídas para a concentração de 10 ng/uL, quantidade indicada para reação de sequenciamento pelo fabricante do sistema de sequenciamento por

41 eletroforese capilar Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzers. As reações de sequenciamento foram realizadas segundo especificações do sistema ABI: Big DyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied BioSystems), tampão Save Money

(Tris-HCl 0,1 M, MgCl2 0,5 mM), 3,2 pmols dos primers. Os primers usados para sequenciamento dos clones obidos para a biblioteca à partir do DNA total de bactérias foram o 10f (5’- GAG TTT GAT CCT GGC TCA G -3’) e o 1100r (5’- AGG GTT GCG CTC GTT G -3’) (LANE et al., 1985). Os primers usados para sequenciamento dos clones obidos para a biblioteca à partir do DNA total de arquéias foram Arc 344f (5’-TCGCGCCTGCTGCICCCCCGT-3’) (RASKIN et al., 1994) e Arc 1400r (5’-CGGCGAATTCGTGCAAGGAGCAGGGAC-3’ (KUDO et al., 1997).

4.6 Montagem das sequências consenso (contigs) e análise taxonômica As sequências parciais do gene RNAr 16S obtidas com cada primer (10f e 1100r para bactérias e Arc344f e Arc1400r para arqueias) foram montadas em um contig (sequência única combinando os diferentes fragmentos obtidos) com ajuda do programa phredPhrap (EWING et al., 1998) e comparadas com as sequências de RNAr 16S de organismos representados nas bases de dados Genbank (http://www.ncbi.nem.nih.gov) e RDP (Ribosomal Database Project, Wisconsin, USA, http://www.http://rdp.cme.msu.edu/), usando as rotinas BLASTn e SequenceMatch, respectivamente. Foram então selecionadas sequências de organismos tipos relacionados ao organismo desconhecido para realização das análises filogenéticas. As sequências foram alinhadas utilizando o programa CLUSTAL X (THOMPSON et al., 1997) e analisadas com o software MEGA v. 5 (TAMURA et al., 2013). As matrizes de distância evolutiva foram calculadas com o modelo de Kimura 2 p (1980) e a construção da árvore filogenética a partir das distâncias evolutivas foi feita pelo método de Neighbor-Joining (SAITOU; NEI, 1987) com valores de “bootstrap” calculados a partir de 1.000 replicatas, utilizando as rotinas incluídas no software MEGA.

4.7 Extração de RNA total A extração de RNA total foi realizada com o kit Trizol Plus RNA Purification Ambion (Invitrogen) segundo recomendações do fabricante. Cerca de 42 0,5 g de amostra de lodo foram utilizadas para a extração do RNA. O procedimento foi feito em duplicata.

4.7.1 Tratamento do RNA com enzima DNAse Foram utilizados para esse tratamento 6,0 µL da solução de RNA ao qual foram adicionados os seguintes reagentes: 6,0 µL de tampão DNAse 10X, 1,0 µL de DNAse I e o volume final da reação foi completado para 15,0 µL com água DEPC (Invitrogen). As amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 15 min e adicionadas de 1,0 µL de EDTA 25 mM, seguido de incubação a 65 °C por 10 min para inativação da DNAse I. Para confirmação da eficiência do tratamento, foi feita a verificação em gel de agarose 1,0% corado com 0,02 µL/mL SYBR Safe 10.000X in DMSO (Invitrogen). Este procedimento tem a finalidade de eliminar possíveis resquícios de DNA presentes na amostra.

4.7.2 Síntese de cDNA Para síntese do cDNA foi utilizado o kit Thermoscript RT-PCR System (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. Para tanto foram utilizados 1,0 µL do primer hexâmero randômico (50 ng/µL), 1,5 μg de RNA (desnaturado pela incubação a 65 ºC por 5 min), 2,0 µL de dNTP mix (10 mM) e água DEPC (quantidade suficiente para 12,0 µL). Para cada reação de síntese de cDNA, foi preparado um mix contendo 4,0 μL do tampão de reação (5X), 1,0 μL de DTT (0,1 M), 1,0 μL de RNase OUT TM, 1,0 μL do ThermoscriptTM RT (15U/μL) e 1,0 μL de água DEPC.

4.8 Amplificação e construção da biblioteca do gene RNA ribossomal 16S a partir do cDNA Após obtenção do cDNA, os procedimentos para amplificação e obtenção da biblioteca de RNAr 16S foram realizados como descrito anteriormente nos itens 4.3 e 4.4. Posteriormente foi realizada a purificação em placa Illustra GFX™ 96 PCR Purification Kit (GE HealthCare). O sequenciamento se deu conforme descrito nos itens 4.5 e 4.6. A montagem das sequências consenso e análise taxonômica foram feitas do modo descrito no item 4.6.

43 O sequenciamento em larga escala por meio do pirosequenciamento via plataforma 454 FLX - Roche para amostras de DNA e cDNA, tendo como alvo organismos pertencentes aos Dominios Bacteria e Archaea, foi realizado pelo prestador de serviço MR DNA Molecular Research LP, Shallowater, Texas - USA (www.mrdnalab.com). A amostra de DNA enviada foi obtida conforme descrito no item 4.2, no entanto foi purificada com o kit Ultra Clean Gel Spin DNA Extraction (MoBio), atendendo às recomendações do prestador de serviços, que também solicitou que a amostra fosse enviada em concentração mínima de 20 ng/uL. Para as análises de cDNA, foi enviado o RNA em concentração mínima de 20 ng/uL, uma vez que não foi possível a conversão do RNA extraído em cDNA através da metodologia descrita no item 4.7.2. Esta impossibilidade ocorreu, provavelmente, por conta da idade da amostra, que é uma limitação do kit Thermoscript RT-PCR System (Invitrogen), segundo descrito no manual que acompanha o produto. Foi solicitado então que fosse feita a tentativa de conversão pela equipe do prestador de serviços MR DNA Molecular Research. Para o sequenciamento, foi utilizado o equipamento 454 FLX Roche Titanium. Para bactérias, foram utilizados os primers 27modf (5’- GTNTTACNGCGGCKGCTG-3’) e ill519modr (5’-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3’), que abrangem as regiões V1 a V4 do gene RNAr, e para arqueias foram utilizados os primers Arch349f (5’- GYGCASCAGKCGMGAAW-3’) e Arch806r (5’-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3’), que compreendem as regiões V3 a V5. Os primers forward de cada par possuíam barcodes.

4.8.1 Análise das sequencias obtidas via sequenciamento 454 As análises das sequencias obtidas via sequenciamento pela plataforma 454 foram feitas em etapas. Primeiramente foi realizado o processamento inicial das sequencias para filtragem de qualidade e tamanho das sequências, feito através das ferramentas disponíveis no site Ribossomal Database Project Pipeline (https://pyro.cme.msu.edu) (COLE et al., 2014) e em RDP’s FunGene, (http://fungene.cme.msu.edu/) (FISH et al., 2013). Em seguida, a remoção das quimeras foi feita utilizando-se Decipher Find Chimeras

44 (http://decipher.cee.wisc.edu/), (WRIGHT; YILMAZ; NOGUERA, 2012). A remoção das quimeras foi realizada uma vez que estas são moléculas híbridas que podem ser falsamente interpretadas como novos organismos, inflando a diversidade. O alinhamento das sequencias foi realizado pela ferramenta Secondary structure aware INFERNAL aligner (https://pyro.cme.msu.edu/aligner/form.spr) (NAWROCKI; EDDY, 2007). Para determinação do número de OTUs (operacional taxonomic units), de modo que as sequencias fossem agrupadas em função da porcentagem de similaridade entre elas, foi utilizada a ferramenta Complete Linkage Clustering (https://pyro.cme.msu.edu/cluster/form/spr). Na etapa de obtenção dos índices para curva de rarefação, a ferramenta utilizada foi Rarefaction (https://pyro.cme.msu.edu/cluster/rarefaction/spr). Este passo é necessário para que sejam analisados a cobertura e o esforço amostral da diversidade nas amostras. Para cálculo da medida de alfa diversidade, foi utilizado o programa PAST (http://www.folk.uio.no/past/index_old.html; (HAMMER; HARPER; RYAN, 2001). A medida de alfa diversidade está relacionada com a diversidade intra-amostral, e permite responder quantas espécies estão presentes na amostra (riqueza) e como elas estão distribuídas (equitabilidade). A alfa diversidade está dividida em índices que possibilitam avaliar a riqueza, a abundância relativa de cada espécie e também estimadores de riqueza relacionados com o número total de espécie na amostra (DELFORNO, 2014). Para selecionar a sequencia mais representativa de cada OTU, foi utilizada a ferramenta Representative Sequence (presente em http://pyro.cme.msu.edu/). A classificação taxonômica das sequencias representativas de cada OTU foi feita com a ferramenta RDP-Classifier (https://rdp.cme.msu.edu/classifier.jsp). É importante destacar que as sequências foram agrupadas em OTUs com três porcentagens de similaridade: 80% (cutoff usado para nível de filo); 95% (nível de gênero) e 97% (nível de espécie). Para a construção das curvas de rarefação foram utilizados os três percentuais citados, enquanto que para as análises taxonômicas e de diversidade a porcentagem de similaridade utilizada foi de 97%.

45 4.8.2 Indices de diversidade e estimadores de riqueza Os índices de diversidade referem-se tanto ao número de diferentes espécies biológicas quanto à abundância relativa (equitabilidade) dessas espécies. Os estimadores de riqueza referem-se a algoritmos que estimam, com base no numero observado de espécies na amostra, o número total de espécies em um ambiente (DELFORNO, 2014). Para este estudo foram considerados o índice de Shannon, para diversidade, e Chao 1 como estimador de riqueza. O índice de Shannon é fortemente influenciado pela riqueza: quanto maior o índice, maior o número de taxa na comunidade microbiana. O índice de Chao estima a riqueza total utilizando o número de espécies representadas por apenas um indivíduo (singletons), e o número de espécies com apenas dois indíviduos (doubletons) na amostra (DELFORNO, 2014). A curva de rarefação é utilizada para avaliar a cobertura da amostra, ou seja, indicar se a amostragem realizada foi suficiente para cobrir o número de espécies total da comunidade (DELFORNO, 2014). Ela fornece um gráfico com o número acumulado de espécies encontradas em função do esforço amostral, neste caso, o número de sequências obtidas. A cobertura completa do conjunto de dados é esperada quando a curva atinge um platô.

4.9 Aclimatação do lodo ativado e medidas de nitrificação Alíquotas do lodo TEBAR foram aclimatadas com gradual adição de cloreto de sódio (NaCl), até que fosse atingida a concentração salina de 20%. Os lodos aclimatados foram cultivados em dois diferentes meios, R2A (Difco Ref: 1826-

17) e MOD (NaCl 5%, MgSO4.7H2O 100 mg/L, CaCl2.H2O 36 mg/L, KCl 200mg/L, NaBr 24 mg/L, peptona protease 500 mg/L, extrato de levedura 1000 mg/L, glicose

100 mg/L, traços de NaHCO, traços de FeCl.6H2O) contendo concentrações de NaCl variando de 6% a 20%. Foram construídos oito consórcios microbianos, cada um contendo uma alíquota de 2,5 mL dos consórcios aclimatados crescidos em meio R2A, somados a 2,5 mL do mesmo consórcio aclimatado crescido em meio MOD. Esta mistura obedeceu às mesmas concentrações salinas, totalizando 5,0 mL de inóculo para cada consórcio (Tabela 1). Tais consórcios foram submetidos a dois tratamentos: Tratamento I): inoculação em frascos tipo Erlenmeyer de 250 mL, contendo 50 mL do meio de cultivo para bactérias nitrificantes (ZHENG et al., 2012)

46 sem adição de sal, e Tratamento II): meio de cultivo utilizado no primeiro tratamento, acrescido gradativamente de NaCl. O detalhamento deste procedimento está na figura 3.

Figura 3: Fluxograma da aclimatação do lodo ativado.

A quantidade de sal adicionada para cada consórcio foi idêntica à o lodo foi aclimatado anteriormente antes da formação dos pools, conforme descrito na Tabela 1.

47 Tabela 1: Identificação dos consórcios microbianos aclimatados.

Identificação dos 2,5 mL lodo aclimatado em 2,5 mL lodo aclimatado em consórcios R2A MOD 1 6% 6% 2 8% 8% 3 10% 10% 4 12% 12% 5 14% 14% 6 16% 16% 7 18% 18% 8 20% 20%

As medidas da remoção de amônia foram realizadas pela equipe da Profa. Dra. Cynthia Canedo da Silva (Universidade Federal de Viçosa – UFV). Para tal, foi empregado o método colorimétrico segundo a metodologia proposta por Chaney e Marbach (1962). As análises foram realizadas em microplacas de 96 poços, contendo em cada poço: 5 µl de cada cultura mista de cada tratamento, 100 µl de reagente de fenol (50 g de fenol sólido, 0,25 g de nitroprussiato de sódio diluídos em água destilada) e 100 µl de reagente de hipoclorito (25 g de NaOH, 16,9 ml de hipoclorito de sódio a 5% diluídos em em água destilada). As placas foram incubas por 20 minutos a 39 °C, e então a absorvância foi lida no comprimento de onda de 630 nm no espectrofotômetro Multiskan GO (Thermo Scientific). Como controle positivo, foi adicionado 5 µl de lodo ativado cultivado em meio para micro- organismos nitrificantes, e como negativo, foi adicionado 5 µl de meio para micro- organismos nitrificantes sem inóculo. Para todos os consórcios, as medidas de nitrificação foram realizadas à partir da concentração inicial de nitrogênio amoniacal de 660 mg/L.

4.10 Monitoramento da diversidade nos consórcios microbianos através da técnica de DGGE A diversidade total das bactérias nos consórcios microbianos aclimatados sem e com adição de NaCl foi avaliada e comparada através da técnica de fingerprint genético Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Para isto, o DNA obtido dos consórcios foi submetido à amplificação parcial do gene RNAr 16S

48 utilizando-se o par de primers 968f-GC Clamp (5’-GCAACGCGAAGAACCTTAC-3’) e 1401r (5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’) (HEUER et al., 1997). A PCR foi feita com alíquotas de 50 ng de DNA e em triplicata para cada amostra. Cada reação de PCR foi feita em um volume final de 50 μL, nas mesmas condições e utilizando- se dos mesmos equipamentos descritos no item 4.3. O sistema utilizado para técnica de DGGE foi o Ingeny UPhor (Ingeny, Holanda), em gel com gradiente de desnaturação de 30-65%, condição otimizada para as amostras em questão. A eletroforese foi realizada em 16 horas a 100 V. O gel foi corado com SYBR Safe 10.000X in DMSO (Invitrogen) e depois visualizado e fotografado no sistema Image Quant LAS 4.000 GE. Para o monitoramento de arqueias possivelmente presentes, foi utilizado o par de primers ARC344f (5’-TCGCGCCTGCTGCICCCCGT-3’) e ARC915r (5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’) nas condições descritas por Raskin et al. (1994). No intuito de monitorar micro-organismos com potencial nitrificante, foram realizadas também tentativas de amplificação gene-específica para bactérias amônia oxidantes do filo Proteobacteria com os primers CTO189Af e CTO684r (KOWALCHUK et al., 1997) nas condições descritas em Dias et al., (2012), e amplificação gene-específica para arqueias com os primers CrenamoA23f e CrenamoA616r, nas condições descritas por Tourna et al. (2008). Os dendrogramas de similaridade para verificação da estrutura das comunidades bacterianas dos consórcios avaliados, foram feitos a partir de ferramentas disponíveis no Software Bionumerics (Apllied Maths), utilizando-se o coeficiente de Jaccard.

4.11 Construção de bibliotecas para o gene RNA ribossomal 16S para consórcios provenientes de lodo aclimatado com as maiores taxas de nitrificação para o Tratamento I (sem adição salina) e para o Tratamento II (com adição de sal) Com base nos resultados obtidos pela equipe da Dra. Cynthia Canedo da Silva na UFV, foram construídas bibliotecas do gene RNAr 16S para os quatro consórcios que apresentaram os maiores índices de nitrificação em cada um dos

49 tratamentos, através de metodologia idêntica à descrita anteriormente para a construção da biblioteca do gene RNAr 16S das bactérias presentes no lodo ativado sem aclimatação (itens 4.2 a 4.6).

50 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Diversidade de bactérias totais no lodo TEBAR Foram obtidos 165 clones com a construção da biblioteca do gene que codifica para o RNAr 16S a partir do DNA total extraído das amostras de lodo ativado provenientes do Terminal de São Sebastião. As buscas por similaridade usando a ferramenta Blast-n da base de dados do Genbank revelou que dentre os 165 clones, 70,3% pertenceram ao filo Actinobacteria, 23,7% ao filo Proteobacteria, 2,42% ao filo Bacteroidetes e o restante aos filos Deinococcus, Chloroflexi e ao grupo TM7, conforme ilustrado na Figura 4. n° de clones

Actinobacteria (111) Proteobacteria (39) Bacteroidetes (4) Deinococcus (3) Chloroflexi (1) TM7 (1) Uncultured Bacteria (6)

Figura 4: Distribuição dos clones obtidos através da construção da biblioteca de genes que codificam para o RNAr 16S em filos do Dominio Bacteria.

A análise dos clones relacionados ao filo Actinobacteria demonstrou que a maioria deles foi relacionada a clones representantes de bactérias ambientais não- cultivadas pertencentes à sub-classe Acidimicrobidae. A análise nos bancos de dados Genbank e RDP, utilizando filtro para a exclusão de micro-organismos não- cultivados, revelou que esses clones assemelham-se (com porcentagens baixas de similaridade) à bactéria Aciditerrimonas ferrireducens, redutora de íon férrico, acidófila e com crescimento ótimo a 50°C (ITOH et al., 2011). Segundo Militon et al. (2010), outros micro-organismos desta sub-classe mostraram-se altamente ativos

51 durante a etapa aeróbica do processo de biorremediação de solo contaminado de uma região industrial, sugerindo que tenham importante papel na reestruturação de ecossistemas. Da mesma forma, espécies da sub-classe Acidimicrobineae, também representada na biblioteca em estudo (Figura 5), têm se mostrado relacionadas a processos de biorremediação, como Ilumatobacter fluminis, isolada de sedimento de estuário marinho (MATSUMOTO et al., 2009), e Iamia majanohamensis, isolada da superfície de pepinos-do-mar (KURAHASHI et al., 2009). Já os clones pertencentes às demais sub-ordens e à ordem Nitriliruptorales, representadas na Figura 5, estão relacionados a diversos processos biológicos como compostagem, biodegradação e biorremediação, conforme descritos em Militon et al. (2010), Partanen et al. (2010) e Alonso-Gutiérrez et al. (2011).

Figura 5: Número de clones da biblioteca de genes RNAr 16S pertencentes às sub-ordens e ordens do filo Actinobacteria.

A análise filogenética (Figura 6) corrobora os dados já citados e inclui a identificação de alguns clones. O clone 67(C12P4), melhor representante entre 7 OTUs, apresentou alta similaridade com a linhagem tipo da espécie Nitriliruptor alkaliphilus, bactéria moderadamente halotolerante capaz de utilizar nitrilas alifáticas

52 (─C ≡ N) C3 e C6, grupos orgânicos que servem como fonte de carbono e nitrogênio para produção de energia. A hidrólise de nitrila por bactérias do gênero Nitriliruptor, tem como um dos produtos metabólicos a amônia (SOROKIN et al., 2009). O clone 41 (B8P2) também apresentou resultado de alta similaridade com a linhagem tipo da espécie Dietzia aerolata, cujo artigo de descrição da espécie não cita atividade nitrificante e nem resistência à salinidade (KÄMPFER et al., 2010). O clone 120(F9P1) apresentou 99% de similaridade de sequência com a linhagem tipo de Nocardioides pyridinolyticus, capaz de reduzir nitrato a nitrito, ou seja, está relacionada à etapa de desnitrificação. A literatura não menciona testes de resistência à salinidade para este micro-organismo (YOON et al., 1997).

53

Figura 6: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de genes RNAr 16S afiliados ao filo Actinobacteria e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank.

54

Em relação ao filo Proteobacteria, 89,7% dos clones representantes deste filo foram afiliados à classe Alfaproteobacteria. Destes, 57% mostraram-se relacionados a micro-organismos pertencentes à ordem Rhodobacterales, e o restante dividiu-se entre as ordens Rhizobiales, Sphingomonadales e micro- organismos não-cultivados. Os outros 10,3% dos clones de proteobacterias mostraram-se afiliados à classe Gamaproteobacteria (Figura 7).

Figura 7: Número de clones da biblioteca de genes RNAr 16S pertencentes às diferentes ordens das classes Alfaprotebacteria e Gamaproteobacteria.

Na classe Alfaproteobacteria, a ordem Rhodobacterales foi a mais abundante, sendo os clones 23(A10P4) (melhor representante entre 5 OTUs) e 74(D4P1) identificados como representantes da espécie Roseovarius pacificus, conforme demostra a análise filogenética na Figura 8. Esta espécie foi primeiramente isolada de sedimento de águas profundas do Oceano Pacífico Ocidental e é constituída de bactérias halofílicas porém não relacionadas à nitrificação (WANG; TAN; SHAO, 2009) (WANG; TAN; SHAO, 2009). Os clones 20(A9P1) (melhor representante entre 4 OTUs) e 44(B10P1) não tiveram sua taxonomia definida, embora tenham apresentado alta porcentagem de similaridade

55 em busca no banco de dados Genbank e RDP com a linhagem tipo de Oceanicola pacificus, ficando entre esta espécie, isolada inicialmente de consórcio de bactérias marinhas relacionadas com a degradação de pireno (YUAN et al., 2009), e a espécie Lutimaribacter saemankumensis (Figura 8), bactéria halofílica que cresce em concentrações de até 11% de NaCl e anaerobicamente em meio de cultura suplementado com nitrato (YOON et al., 2009). Os clones 78(D7P1) e 154(H6P2) (melhor representante entre 3 OTUs), apresentaram proximidade filogenética com a linhagem tipo da espécie Oceaniovalibus guishaninsula (JCM 17765T), cuja solicitação de validação da espécie ainda está pendente (http://www.bacterio.cict.fr/nonvalid.html). O artigo de descrição desta nova espécie a relata como bactéria halofílica e desnitrificante (LIU et al., 2012). Dentro da ordem Rhizobiales, o clone 58(C7P1) apresentou 99% de similaridade com a linhagem tipo de Afifella pfennigii, dado confirmado pela análise filogenética, em que este clone agrupou-se com boostrap robusto de 97% com a linhagem tipo de Afifella pfennigii, sendo possível a identificação taxonômica deste clone em nível de espécie. Afifella pfennigii é basonímia de Rhodobium pfennigii, micro-organismo que cresce em faixas de concentração de 0-5% de NaCl e que são capazes de redução assimilatória de sulfato e fixação de nitrogênio (CAUMETTE et al., 2007). Ainda na classe Alfaproteobacteria, os clones 112(F4P2) e 124(F11P1) apresentaram alta porcentagem de similaridade com as linhagens tipo das espécies Porphyrobacter tepidarius e Erythrobacter gaetbuli, ambas da famíllia Erythrobacteraceae. A análise filogenética não permitiu definir a identificação de ambos os clones em nível de espécie, e estes foram identificados como Erythrobacter sp. (Figura 8). O gênero Erythrobacter é constituído de micro- organismos essencialmente marinhos (SHIBA; SIMIDU, 1982). A espécie Erythrobacter gaetbuli, com a qual os clones mais se assemelharam, é constituída de bactérias nitrato-redutoras, mas não há relatos sobre nitrificação (YOON; OH; PARK, 2005). De modo geral, os demais clones filogeneticamente próximos a organismos não cultivados da classe Alfaproteobacteria foram relacionados a ambientes marinhos (Auclair et al., 2010 e Long; Azam, 2001), e alguns deles 56 associados a ambientes alcalinos (COURADEAU et al., 2011), além de vários terem sido relacionados à biodegradação de diversos compostos poluentes (HUNTER; MILLS; KOSTKA, 2006), (RIVIÈRE et al., 2009) e (MOU; HODSON; MORAN, 2007). A classe Gamaproteobacteria foi representada apenas pela ordem Chromatiales, em que há possivelmente representantes de duas famílias: Halothiobacillaceae e Ectothiorhodospiraceae. A primeira foi representada por clones relacionados a micro-organismos não-cultivados, que em busca no banco de dados GenBank e RDP apresentaram 90% de similaridade com representantes do gênero Halothiobacillus, composto de micro-organismos moderadamente halofílicos (SOROKIN et al., 2006). Entretanto, na análise filogenética (Figura 8), o clone 4(A2P4) mostrou-se filogeneticamente distante deste gênero. A segunda família, Ectothiorhodospiraceae, foi representada pelo clone 16(A7P3) identificado como a espécie de bactéria de ambiente marinho quimioautotrófica nitrito-oxidante e halofílica Nitrococcus mobilis (Figura 8), ou seja, diretamente ligada ao processo de nitrificação (TESKE et al., 1994; WATSON; WATERBURY, 1971). Os demais clones mostraram-se afiliados a micro-organismos não cultivados relacionados a ambientes alcalinos e de alta salinidade (VALENZUELA-ENCINAS et al., 2009; COURADEAU et al., 2011). Para os demais clones, a análise filogenética não permitiu a identificação taxonômica, como pode ser observado na Figura 9. No entanto, os clones relacionados aos filos Bacteroidetes, Chloroflexi, Deinococcus, e ao grupo TM7, apresentaram porcentagens de similaridade alta com micro-organismos não cultivados provenientes de estudos de amostras ambientais.

57

Figura 8: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de genes RNAr 16S afiliados ao filo Proteobacteria e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank.

58

Figura 9: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de genes RNAr 16S afiliados aos filos Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Deinococcus e o grupo TM7 e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank.

5.2 Diversidade de bactérias metabolicamente ativas no lodo TEBAR Para a biblioteca de genes RNAr 16S derivada do cDNA, obtido a partir do RNA extraído da amostra de lodo, foi necessária a confirmação do tamanho esperado do fragmento clonado, devido ao grande número de amplicons inespecíficos. Essa particularidade pode ter se dado pelo fato de no momento da obtenção do cDNA terem sido utilizados primers randômicos. Foi obtido um total de 148 clones para a biblioteca do gene RNAr 16S a partir do RNA total extraído das amostras de lodo ativado provenientes do Terminal de São Sebastião. As buscas por similaridade usando a ferramenta Blast-n da base de dados do Genbank revelou 47,3% dos clones pertenceram ao filo Proteobacteria, 20,3% ao filo Chlorobi, 3,4% ao filo Bacteroidetes, 2,0% ao filo Actinobacteria, 0,7% ao filo Chloroflexi (Figura 10). Os demais clones (25% do total) mostraram-se relacionados a bactérias não cultiváveis e também a organismos não cultiváveis. 59 Curiosamente, 1,3% dos clones estão afiliados ao Dominio Archaea, que será discutido a seguir.

Figura 10: Distribuição dos clones obtidos através da construção da biblioteca de genes que codificam para o RNA ribossomal 16S a partir do RNA total.

A análise dos clones relacionados ao filo Proteobacteria demonstrou que 50% deles está afiliada à classe Gamaproteobacteria, em sua maioria pertencentes à ordem Chromatiales, e 50% deles a Alfaproteobacteria, com representantes das ordens Sphingomonadales, Rhizobiales, Rhodobacterales.

Figura 11: Número de clones pertencentes às diferentes ordens do filo Proteobacteria. 60

A reconstrução filogenética dos clones pertencentes ao filo Proteobacteria (Figura 12) revelou que maioria dos clones afiliados a Gamaproteobacteria está relacionada a bactérias marinhas não cultiváveis encontradas em um sistema hidrotermal submarino com altos teores de metano e enxofre (HIRAYAMA et al., 2007). Quatro clones mostraram-se relacionados a Nitrococcus mobilis, bactéria de ambiente marinho quimioautotrófica, nitrito-oxidante e halofílica, também encontrada entre os clones da biblioteca de genes RNAr 16S do lodo a partir do DNA total. Ainda dentre as gamaproteobacterias, há um clone relacionado à bactéria Thiohalobacter thiocyanaticus, halofílica, obrigatoriamente quimioautotrófica, sulfito- oxidante, isolada de um lago hipersalino siberiano (SOROKIN et al., 2010). Dentre as alfaproteobacterias, a maioria dos clones está relacionada a bactérias não cultiváveis de ambiente marinho (Figura 10 e Figura 11). Há clones afiliados à ordem Rhizobiales, em que apenas um deles, o 8(A4P4), apresentou 99% de similaridade em busca feita no banco de dados com a espécie Tepidamorphus gemmatus, cuja linhagem tipo foi isolada de águas termais, ou seja, é um micro-organismo termófilo, estritamente aeróbio, redutor de nitrato a nitrito, mas sem propriedades nitrificantes descritas até o momento (ALBUQUERQUE et al., 2010). Para os clones afiliados à ordem Sphingomonadales, há alta similaridade de seis clones, em que a melhor sequencia é representada pelo clone 87(E2P4), a sequencia da linhagem tipo de Porphyrobacter tepidarius, e pelo clone 80(D10P2) que além dessa, também apresentou alta similaridade à sequencia da linhagem tipo de Erythrobacter gaetbuli. Ambas as espécies pertencem à famíllia Erythrobacteraceae, já discutida anteriormente com relação aos organismos representados na biblioteca de genes RNAr 16S a partir do DNA total (comunidade total de bactérias presente no lodo). Ainda na ordem Sphingomonadales, três clones (representados pelo clone com melhor sequencia 23(B1P4), apresentaram alta porcentagem de similaridade com a espécie Novosphingobium naphthalenivorans, micro-organismo estritamente aeróbio, quimiorganotrófico que realiza a degradação do naftaleno e reduz nitrato a nitrito, mas não há relato de propriedades nitrificantes. A espécie tipo de N. naphthalenivorans foi isolada de sedimento contaminado com policlorados e dioxina (SUZUKI; HIRAISHI, 2007).

61 Dentre os cinco clones afilados à ordem Rhodobacterales, dois deles, 95(E9P1) e 76(D8P1), apresentaram 99% similaridade nos bancos de dados com as espécies Maricaulis parjimensis e Maricaulis virginensis, bactérias halofilicas estritas, sem característica de nitrificação. As linhagens tipo de ambas foram isoladas de águas marinhas profundas em uma região hidrotermal (ABRAHAM et al., 2002). Os demais clones estão relacionados a bactérias marinhas não cultiváveis. Trinta dos clones foram afiliados ao filo Chlorobi e reunidos em uma única OTU. São bactérias não cultiváveis relacionadas à comunidade microbiana monitorada durante o processo de bioestimulação com oxigênio no tratamento de solo contaminado com petróleo (MILITON et al., 2010). Para o filo Bacteroidetes (Figura 13) foram afilados 5 clones em que dois deles, 124(G7P2) e 83(D11P5), apresentaram alta porcentagem de similaridade com a espécie Lewinella cohaerens, isolada de ambiente marinho, moderadamente halofílica, não utiliza nitrato como fonte de nitrogênio e para a qual não há relatos de atividade nitrificante (SLY; TAGHAVIT; FEGAN, 1998). Um achado interessante afiliado a Bacteroidetes são dois clones, 41(B11P1) e 156(E3P3) que estão relacionados a um estudo de comunidades bacterianas associadas à ciclagem de carbono e nitrogênio em sedimentos de plataforma sedimentar marinha, embora o estudo tenha encontrado baixa diversidade e estabilidade desses micro-organismos (HUNTER; MILLS; KOSTKA, 2006) . O filo Actinobacteria, que apresentou o maior número de clones afiliados no caso da biblioteca de genes RNAr 16S do lodo a partir do DNA total, teve somente três representantes na biblioteca de cDNA: 9(A5P1), clone que apresentou 99% de similaridade com a espécie Mycobacterium poriferae de acordo com pesquisa na base de dados GenBank e cuja análise filogenética confirmou os resultados das buscas em um agrupamento coeso e suportado pelo valor de re-amostragem de 88% com a linhagem tipo de Mycobacterium poriferae, bactéria halofílica isolada de esponjas e que não tem metabolismo relacionado ao processo de nitrificação (PADGITT; MOSHIER, 1987). Há também os clones 57(C7P5) e 61(C10P5), mas não há descrição de ambos sobre qualquer relação com o metabolismo de amônia, nitritos e nitratos.

62 Curiosamente, dois dos clones para esta biblioteca, foram relacionados ao domínio Archaea, são eles: 62(C11P2) e 16(A9P4), sendo que o primeiro é o melhor representante desta OTU, por apresentar a sequencia de melhor qualidade, segundo o programa MoThur. Esses clones apresentaram 99% de similaridade com a arqueia nitrificante Candidatus Nitrosoarchaeum limnia, dado corroborado pela análise filogenética que recuperou a melhor sequencia representante 62(C11P2), em um agrupamento coeso e suportado pelo valor de re-amostragem de 100% com a linhagem tipo para Candidatus Nitrosoarchaeum limnia, pertencente ao filo Thaumarcheota cujos representantes são todas arqueias marinhas e nitrificantes (BLAINEY et al., 2011).

63

Figura 12: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de cDNA 16S afiliados ao filo Proteobacteria e sequências de linhagens de micro- organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank.

64 84 29 (B5P4) (1 clone) Uncultured bacterium clone TX1A39 (FJ152592) Candidatus Nitrosoarchaeum limnia clone SFB1H04T1511 (KC357825) 100 62 (C11P2) (2 clones) Uncultured bacterium clonenbw424f04c1 (GQ093336) Uncultured bacterium clone P0X3b1B11 (EU491366) 98 93 (E7P2) (1 clone) 19 (A12P2) (1 clone) 21 (B1P1) (1 clone)

100 57 (C7P5) (1 clone) Uncultured Actinobacteridae bacterium clone BPSL312 (HQ857731)

100 61 (C10P5) (1 clone) Propionibacterium acnes KPA171202 (NR074675)

97 Mycobacterium iranicum CCUG52297 (JQ886106) T 100 Mycobacterium poriferae ATCC 35087 (JN627177) 88 9 (A5P1) (1 clone) 105 (F5P2) (1 clone) 100 Uncultured Bacteroidetes bacterium clone NdGal51 (FJ752808)

78 41 (B11P1) (1 clone) 70 Uncultured Bacteroidetes bacterium clone SC148 (DQ289924) 99 10 (A5P2) (1 clone) Uncultured bacterium clone OTU045 Xeno (AB694299)

100 112 (F8P4) (2 clones) Uncultured bacterium clone Del10081C10 (JF261974)

83 28 (B5P1) (1 clone) Uncultured bacterium cloneSi071 (FR851686) 100

72 Lewinella cohaerens clone B110AF4611038 (KF228160) 99 124 (G7P2) (2 clones)

100 Uncultured Chloroflexi PRTBB8482 (HM798921) 4 (A3P1) (1 clone) Uncultured bacterium clone FFCH9620 (EU134263) 100 64 (C12P2) (1 clone)

Uncultured Chlorobi bacterium clone AMOD12 (AM935163)

100 74 (D7P2) (30 clones)

100 Uncultured organism clone SBXZ4883 (JN436065) 110 (F8P1) (1 clone)

100 Uncultured bacterium clonencd2252e07c1 (JF187856) 30 (B6P1) (1 clone) Uncultured organism clone SBYT3375 (JN479559) 100 65 (D2P2) (1 clone) Uncultured bacterium clone MBIOS20 (EU369136) 100 55 (C7P2) (2 clones) Uncultured deep-sea bacterium cloneUlrdd128 (AM998316) 100 145 (H11P1) (1 clone)

0.05 Figura 13: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de cDNA 16S afiliados aos filos Chlorobi, Bacteroidetes, Actinobacteria, Chloroflexi e Dominio Arqueia, e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank.

65 5.3 Diversidade de arqueias totais no lodo TEBAR Com base nos resultados observados na biblioteca de genes RNAr 16S obtida a partir do RNA extraído da amostra de lodo, em que dois clones foram identificados como micro-organismos pertencentes ao Dominio Archaea, os estudos foram conduzidos no sentido de buscar novos micro-organismos que poderiam ser os responsáveis pelo processo de nitrificação. Por esta razão, foi construída uma biblioteca de genes RNAr 16S para o Dominio Archaea. Devido à baixa variabilidade esperada, foram sequenciados 48 clones. A comparação das sequencias com os bancos de dados RDP e Genbank demonstrou que todos os micro-organismos pertencem ao filo Euryarchaeota, e estão divididos em duas classes. A maioria dos clones (45) foi afiliada à classe Methanomicrobia, ordem Methanosarcinales, sendo que o clone D4, melhor representante entre 44 OTUs, apresentou 99% de similaridade com a espécie Methanosaeta harundinacea, e o clone F2, apresentou 99% de similaridade com as espécies Methanolobus profundi e Methanolobus zinderi. O clone E2, pertenceu à classe Methanobacteria, e em consulta aos bancos de dados, observou-se que apresenta 99% de similaridade com a linhagem tipo da espécie Methanobacterium beijingense. A análise filogenética confirmou os resultados das buscas em bancos de dados (Figura 14). Todas as espécies de arqueias encontradas com este estudo estão relacionadas ao metabolismo do metano, sem relatos de atividades nitrificantes (MA, 2005, MA, 2006 e MOCHIMARU et al., 2009) .

F2 (1 clone) 99 Methanolobus profundi DSM21213T (AB370245) Methanolobus zinderi DSM21339T (EU711413) D4 (45 clones) 99 T Methanosaeta harundinacea JCM13211 (AY817738) E2 (1 clone)

100 Methanobacterium beijingense DSM15999T (AY350742)

0.02

Figura 14: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial dos clones da biblioteca de genes RNAr 16S afiliados ao Dominio Arqueia, e sequências de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados RDP e Genbank.

66 Todos os micro-organismos citados são metanogênicos, sendo que houve predominância do gênero Methanosaeta, arqueias obrigatoriamente anaeróbias, metanogênicas que utilizam ácido acético e acetato como fonte de carbono, produzindo quantidades equimolares de metano e gás carbônico. Há também espécies metanotróficas pertencentes ao gênero Methanosaeta (PATEL; SPROTT, 1990). Arqueias do gênero Methanolobus são metanotróficas, estritamente anaeróbias (MOCHIMARU et al., 2009). Arqueias do gênero Methanobacterium são anaerobias estritas, metanogênicas, utilizando para sintese do metano, H2 e CO2 (BALCH et al., 1979). Grande parte das espécies descritas nos gêneros citados foi isolada de ambiente marinho. Nenhuma das espécies têm relação conhecida com metabolismo da amônia. As tentativas de amplificação via PCR gene-específico utilizando-se os primers Arch amoA-f (5’-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3) e Arch amoA-r (5’- GCGGCCATCCATCTGTATGT) (FRANCIS et al., 2005), análogos a regiões conservadas que flanqueiam a subunidade A do gene amo em arqueias marinhas nitrificantes, não foram bem sucedidas, mesmo após diversas reações com alterações na concentração do MgCl2, temperatura de anelamento e adição de BSA, alterações comumente realizadas na tentativa de otimização da reação. Como não havia um controle positivo para essas reações, não foi possível compreender se houve algum problema no momento da amplificação ou se de fato não há arqueias que possuam o gene amo na amostra em estudo. A pouca informação disponível na literatura sobre primers específicos para esses micro-organismos, devido ao fato de pertencerem a um filo relativamente recente, também é um fator que dificulta a otimização das amplificações.

5.4 Análise da diversidade microbiana no lodo ativado via sequenciamento plataforma 454 FLX Roche

O sequenciamento massivo de amplicons a partir do lodo ativado do TEBAR foi realizado no intuito de confirmar os resultados obtidos para as bibliotecas do gene RNA ribossomal 16S a partir do DNA e cDNA - Dominio Bacteria e Archaea, uma vez que não foram observados números representativos de micro-organismos nitrificantes por esta abordagem.

67 5.4.1 Indices de diversidade e estimadores de riqueza Os dados de sequenciamento massivo de amplicons RNAr 16S do Dominio Bacteria para as amostras de DNA e RNA total e do Dominio Archaea para a amostra de DNA total do lodo TEBAR confirmaram os resultados anteriormente obtidos das bibliotecas genicas sequenciadas no equipamento ABI 3500XL.

5.4.2 Diversidade de bactérias totais no lodo ativado via sequenciamento de amplicons pela plataforma 454 Os dados gerados a partir do sequenciamento massivo de amplicons do RNAr 16S obtidos do DNA total extraído das amostras de lodo ativado provenientes do TEBAR somaram 7.382 sequencias, das quais foram descartadas 2.033 por consequência da filtragem com parâmetros para qualidade das bases, tamanho da sequência, presença de bases ambíguas e remoção de quimeras. Os demais dados obtidos a partir das análises do pirosequenciamento podem ser observados na

Tabela 2.

Tabela 2: Resultados do pirosequenciamento da amostra de DNA do lodo ativado TEBAR – Bacteria.

Total de sequencias (dados brutos) 9.415 Total de sequências (dados filtrados) 7.382 Tamanho médio das sequências (pb) 438 Total de OTUs observadas 632

Estimador de riqueza Chao 1 940 ± 90 Índice de diversidade Shannon_H 4,79 ± 0,06

As curvas de rarefação demonstram que, para o nível de similaridade de 97% entre as sequencias (nível de espécie), não foi atingido um platô, mesmo com o número elevado de sequências obtidas. Ou seja, a cobertura total da diversidade de espécies no lodo não foi atingida. No entanto, 62,36% das sequências foram atribuídas a bactérias não cultiváveis (Tabela 3), o que sugere que o aumento do esforço amostral resultará em novas OTUs desconhecidas, o que não trará informação relevante para o estudo. Além disso, para as curvas de rarefação com 95% de similaridade (nível de gênero) e 80% de similaridade (nível de filo), nota-se tendência à formação de platô ou a saturação, sendo possível afirmar, portanto, que 68 para nível de gênero e filo, o esforço amostral foi suficiente para cobrir a diversidade (Figura 15).

Figura 15: Curvas de rarefação definidas para diferentes percentuais de similaridade (97% - nível de espécie; 95% - nível de gênero; 80% - nível de filo) com base nos dados de sequencia derivados do pirosequenciamento de amplicons RNAr 16S da amostra de DNA do lodo TEBAR – Dominio Bacteria.

As análises do conjunto de dados por ferramentas do RDP revelaram 634 OTUs, para as quais há predomínio de bactérias do filo Proteobacteria (60%), seguido do filo Actinobacteria (25%), e 5% de bactérias não cultiváveis. Cerca de 10% das sequencias foram afiliadas aos filos Deinococcus, Bacteroidetes, Planctomycetes, Chloroflexi e Candidatus Saccharibacteria, e menos de 0,5% das sequencias foram afiliadas aos filos Firmicutes, Hydrogenedentes, Verrucomicrobia e Spirochaetes (Figura 16).

Figura 16: Distribuição das sequencias obtidas do pirosequenciamento de amplicons do RNA ribossomal 16S a partir do DNAtotal dentre os filos bacterianos.

69

Embora a Figura 16 apresente somente 5% das sequencias afiliadas a bactérias não cultiváveis, no banco de dados RDP algumas sequências são depositadas como micro-organismos não cultiváveis pertencentes a filos definidos. Por essa razão, as bactérias não cultiváveis são predominantes nas análises em nível de gênero. As demais sequências foram afiliadas a 91 gêneros distintos descritos na Tabela 3. Os dados obtidos com o sequenciamento massivo corroboram os dados obtidos com o sequenciamento de bibliotecas gênicas realizado no equipamento ABI 3500XL (sequenciamento de Sanger). Grande parte dos micro-organismos encontrados dentre os 165 clones obtidos no sequenciamento de Sanger, foi observada no pirosequenciamento, como aqueles já discutidos no item 5.1, pertencentes aos gêneros Iamia, Ilumatobacter, Afifella, Nitrococcus, Nitriliruptor, Roseovarius, Nocardioides, Dietzia, Aciditerrimonas, Rhodococcus, Gracilimonas, Nitratireductor e Salisaeta. O maior número de sequências, desconsiderando-se as bactérias não cultiváveis, foi afiliado ao gênero Iamia (12,77% das sequencias), já discutido no item 5.1, seguido por bactérias do gênero Donghicola (3,32% das sequências), gênero descrito recentemente em que as espécies tipo foram isoladas de ambiente marinho, mas não há relatos de metabolismo relacionado à oxidação da amônia (primeira fase da nitrificação) ou de nitrito (segunda fase da nitrificação), (HAMEED et al., 2014). Ao gênero Truepera, 2,44% das sequências foram afiliadas. Este gênero inclui uma única espécie, Truepera radiovictrix, bactéria alcalifílica, resistente à salinidade, com temperatura ótima de 50°C para crescimento, embora seja bastante versátil e cresça entre 20°C e 60°C e em ausência de sal. Não há relatos do processo de nitrificação em seu metabolismo. Este gênero pertencente ao filo Deinococcus-Thermus e está em processo de validação (ALBUQUERQUE et al., 2005). Sequencias em baixa abundância (1,58%) foram afiliadas ao gênero Afifella, já discutido no item 5.1, e ao filo Saccharibacteria, anteriormente conhecido como Divisão TM7, um filo onipresente em solos, sedimentos, águas residuais e

70 animais, bem como em amostras clínicas (FERRARI et al., 2014). Por ser ‘incertae sedis’, fica caracterizada a impossibilidade de estabelecer a posição exata do táxon, sendo assim, não é possível fazer afirmações a respeito da tolerância salina e do potencial de nitrificação para os filotipos afiliados a esse grupo. Cerca de 1,21% das sequências foi afiliada ao gênero Phycisphaera, bactérias anaeróbias facultativas, halofílicas, isoladas pela primeira vez de algas marinhas, com potecial desnitrificante, uma vez que reduzem nitrato a nitrito. Fazem parte do filo Plantomycetes, mas não do grupo capaz de realizar a oxidação anaeróbia da amônia (anammox) (FUKUNAGA et al., 2009). Com metabolismo relacionado à nitrificação foram encontrados 1,15% dos filotipos afiliados ao gênero Nitrococcus e 0,75% deles afiliados ao gênero Aminobacter. O potencial nitrificante das bactérias autotróficas do gênero Nitrococcus é amplamente conhecido, sendo que esta bactéria está envolvida na segunda etapa do processo, oxidação do nitrito a nitrato. As bactérias aeróbias do gênero Aminobacter são capazes de utilizar a amônia como fonte de nitrogênio, ou seja, podem ser consideradas como nitrificantes heterotróficas e são moderadamente resistentes à salinidade (URAKAMI et al., 1992 e KAMPFER et al., 2002). Ainda, alguns gêneros encontrados em abundância baixa (0,5%) possuem também o potencial de nitrificação heterotrófica, como Marinobacter, Paracoccus e Halomonas (Tabela 3) (ZHENG et al., 2012, SIDDAVATTAM et al., 2011, GUO et al., 2013) e portanto, podem estar contribuindo para o processo de nitrificação no lodo. A distribuição completa dos filotipos obtidos através do pirosequenciamento dentre os gêneros bacterianos pode ser observada na Tabela 3. Os dados obtidos com ambas as ferramentas, bibliotecas gênicas e pirosequenciamento, demonstraram que não há predomínio de bactérias reconhecidamente nitrificantes. Não obstante, muitos gêneros com capacidade de nitrificação heterotrófica foram observados, como Paracoccus, Marinobacter, Halomonas Uma possibilidade para explicar a baixa ocorrência desses micro- organismos é que a comunidade microbiana presente no lodo não passou pela aclimatação e nem pelo enriquecimento com meio de cultura que favorecesse o crescimento da microbiota nitrificante. É possível observar, no entanto, grande

71 número de micro-organismos tolerantes à salinidade e relacionados ao processo de biorremediação. Outra possibilidade é a de que esteja ocorrendo nitrificação heterotrófica por micro-organismos que ainda não tem seu metabolismo completamente conhecido, ou mesmo por alguns dos membros da maioria (62%) não cultivável e ainda não identificada. O sequenciamento das bibliotecas gênicas mostrou que cerca de 70% dos clones foram afiliados ao filo Actinobacteria, enquanto que a maioria dos filotipos obtidos com o pirosequenciamento mostrou-se afiliada ao filo Proteobacteria. Isso pode ter ocorrido devido ao fato de que muitos clones foram afiliados a bactérias não cultiváveis do filo Actinobacteria, ou, mais provavelmente, devido ao fato do número de clones obtidos com o primeiro sequenciamento não ter sido suficiente para cobrir a diversidade microbiana da amostra, levando à sub-representatividade dos membros menos abundantes.

72 Tabela 3: Afiliação e abundância das sequencias derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do DNA total do lodo TEBAR – Dominio Bacteria.

Soma de Nº Soma de Abun. Soma de Nº Soma de Abun. Gêneros Gêneros de Seq Relativa de Seq Relativa 0_unclassified 3759 62,359% Microbacterium 5 0,083% Iamia 770 12,774% Pseudenhygromyxa 5 0,083% Donghicola 200 3,318% Rhodococcus 5 0,083% Ilumatobacter 182 3,019% Huaishuia 4 0,066% Truepera 147 2,439% Maritimibacter 4 0,066% Afifella 95 1,576% Georgenia 3 0,050% Saccharibacteria_genera _incertae_sedis 95 1,576% Leucobacter 3 0,050% Phycisphaera 73 1,211% Levilinea 3 0,050% Nitrococcus 69 1,145% Thermovum 3 0,050% Nitriliruptor 55 0,912% Camelimonas 2 0,033% Aminobacter 45 0,747% Conexibacter 2 0,033% Tepidamorphus 34 0,564% Cryobacterium 2 0,033% Oceanicola 25 0,415% Leucothrix 2 0,033% Rhodopirellula 25 0,415% Lutibaculum 2 0,033% Chelativorans 24 0,398% Methylonatrum 2 0,033% Litorilinea 24 0,398% Mycobacterium 2 0,033% Roseovarius 24 0,398% Oceanibulbus 2 0,033% Bellilinea 19 0,315% Pseudaminobacter 2 0,033% Sphaerobacter 19 0,315% Pseudonocardia 2 0,033% Marinobacter 18 0,299% Roseibacillus 2 0,033% Filomicrobium 17 0,282% Ruegeria 2 0,033% Lutimaribacter 16 0,265% Sulfurospirillum 2 0,033% Nocardioides 15 0,249% Thiohalobacter 2 0,033% Paracoccus 15 0,249% Acetobacterium 1 0,017% Haliscomenobacter 13 0,216% Acidithiobacillus 1 0,017% Marinicella 12 0,199% Alkalibacter 1 0,017% Bauldia 11 0,182% Alterococcus 1 0,017% Blastopirellula 11 0,182% Amorphus 1 0,017% Candidatus Hydrogeneden 11 0,182% Caminicella 1 0,017% Halothiobacillus 10 0,166% Coxiella 1 0,017% Caldilinea 9 0,149% Garciella 1 0,017% Planctomyces 9 0,149% Gracilimonas 1 0,017% Roseibacterium 9 0,149% Longilinea 1 0,017% Haliea 8 0,133% Mycoplana 1 0,017% Thioprofundum 8 0,133% Natronocella 1 0,017% Dietzia 7 0,116% Nautella 1 0,017% Euzebya 7 0,116% Nitratireductor 1 0,017% Halomonas 7 0,116% Pirellula 1 0,017% Aciditerrimonas 6 0,100% Pontibaca 1 0,017% Altererythrobacter 6 0,100% Poseidonocella 1 0,017% Lewinella 6 0,100% Rhodobacter 1 0,017% Loktanella 6 0,100% Salisaeta 1 0,017% Stappia 6 0,100% Sedimenticola 1 0,017% Aquisphaera 5 0,083% Solirubrobacter 1 0,017% Gordonia 5 0,083% Sphingobium 1 0,017% Legionella 5 0,083% Spirochaeta 1 0,017%

73 Foram analisadas à parte, as sequências afiliadas à bactérias não cultáveis, que perfazem a maioria, ou seja, cerca de 63% do total de sequências obtidas. Esta análise foi realizada com o intuito de verificar se o processo de nitrificação poderia ser atribuído a algum micro-organismo ainda não descrito que tivesse presente de modo maciço na amostra de lodo. No entanto, observou-se que o processo de nitrificação não pode ser atribuído aos micro-organismos não cultiváveis, uma vez que as 3.759 sequências estão distribuídas em 400 OTUs distintas (Tabela 4).

Tabela 4: Associação das sequências afiliadas à bactérias não cultiváveis derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do DNA total do lodo TEBAR – Dominio Bacteria.

74

5.4.3 Diversidade de bactérias metabolicamente ativas no lodo ativado via plataforma 454 O pirosequenciamento de amplicons RNAr 16S derivados do RNA total extraído das amostras de lodo ativado provenientes do TEBAR resultou em 19.108 sequencias, das quais foram descartadas 3.565 por consequência da filtragem com parâmetros para qualidade das bases, tamanho da sequência, presença de bases ambígua e remoção de quimeras. Os demais dados obtidos a partir das análises do pirosequenciamento podem ser observados na Tabela 5. Esta análise foi realizada com a finalidade de caracterizar as populações de bactérias metabolicamente ativas na amostra de lodo ativado.

Tabela 5: Resultados do pirosequenciamento da amostra de cDNA do lodo ativado TEBAR – Dominio Bacteria.

Total de sequências (dados brutos) 19.108 Total de sequências (dados filtrados) 15.400 Tamanho médio das sequências (pb) 436 Total de OTUs observadas 386

Estimador de riqueza Chao 1 538 ± 51 Índice de diversidade Shannon_H 3,47 ± 0,05

A análise das curvas de rarefação (Figura 17) demonstra que para o nível de similaridade de sequencia de 97% (nível de espécie), há tendência de formação de platô, mas novas espécies poderiam ainda ser encontradas, numa taxa relativamente baixa, com o sequenciamento de maior profundidade. Isto é corroborado pelo valor encontrado com o estimador de riqueza Chao, que estimou a existência de 538 espécies de bactérias na amostra. Para as curvas de rarefação em 95% de similaridade (nível de gênero) e 80% de similaridade (nível de filo), nota- se a formação de platô. Neste caso, o esforço amostral foi suficiente para cobrir a diversidade da amostra até nível de gênero.

75

Figura 17: Curvas de rarefação definidas para diferentes percentuais de similaridade (97% - nível de espécie; 95% - nível de gênero; 80% - nível de filo) com base nos dados de sequencia derivados do pirosequenciamento de amplicons RNAr 16S da amostra de cDNA do lodo TEBAR – Dominio Bacteria.

As análises via ferramentas do RDP revelaram 386 OTUs, com predomínio de bactérias do filo Bacteroidetes com 36% das sequencias afiliadas, seguido do filo Proteobacteria, com 31% de sequencias afiliadas, e cerca de 25% foram afiliados a bactérias não cultiváveis (Figura 18). Cerca de 9% dos filotipos tiveram a afiliação dividida entre os filos Actinobacteria, Plantomycetes, Chloroflexi e Parcubacteria, e menos de 1% dos filotipos foram afiliadas aos filos Candidatus Saccharibacteria incertae sedis, Firmicutes e Deinococcus-Thermus (Figura 18).

Figura 18: Distribuição das sequencias obtidas do pirosequenciamento de amplicons do RNA ribossomal 16S a partir do cDNA dentre os filos bacterianos.

76 Embora o gráfico da Figura 18 apresente 25% das sequencias afiliadas a bactérias não cultiváveis, no banco de dados RDP algumas sequências são depositadas como micro-organismos não cultiváveis pertencentes a filos definidos, o que faz com que as bactérias não cultiváveis sejam predominantes nas análises em nível de gênero. As demais sequências foram afiliadas a 37 gêneros distintos descritos na Tabela 6. Os dados obtidos com o sequenciamento massivo mostram resultados semelhantes àqueles obtidos com o sequenciamento realizado no equipamento ABI 3500XL. Grande parte dos micro-organismos encontrados dentre os 148 clones obtidos no sequenciamento de Sanger, foi observada no pirosequenciamento, como os já discutidos no item 5.2, pertencentes aos gêneros Tepidamorphus, Nitrococcus, Lewinella e Thiohalobacter. Em ambas as abordagens, a maioria das sequênciasfoi afiliada a bactérias não cultiváveis (76%). Em segundo lugar, estão os filotipos afilados ao gênero Marinobacter (4,8%). A este gênero pertencem espécies extremamente halotolerantes, com algumas espécies de potencial desnitrificante, como Marinobacter hydrocarbonoclasticus, isoladas pela primeira vez da água do Mar Mediterrâneo, em região próxima a uma refinaria de petróleo. Esta espécie é aeróbica, mas pode crescer anaerobicamente na presença de nitrato (GAUTHIER et al., 1992). O gênero Marinobacter inclui várias espécies recentemente identificadas para as quais ainda não se tem conhecimento detalhado sobre o metabolismo (BAGHERI et al., 2013 e NG et al., 2014). No entanto, uma dessas descobertas recentes mostra que estirpes do gênero Marinobacter podem realizar concomitantemente a desnitrificação e a nitrificação, em aerobiose, metabolizando a amônia em nitrogênio gasoso, com grande eficiência neste processo. Este mesmo estudo sugere que esta descoberta pode ser aplicada na remoção de azoto das águas residuais de elevada salinidade (ZHENG et al., 2012). O gênero Iamia mostrou-se o segundo abundância (4,3%), depois das bactérias não cultiváveis. Não há relatos até o momento de potencial nitrificante da única espécie pertencente a este gênero, Iamia majanohamensis, no entanto, esta bactéria estritamente aeróbia, isolada inicialmente de epiderme de pepino do mar, é capaz de reduzir nitrato a nitrogênio molecular (KURAHASHI et al., 2009). 77 Cerca de 2,04% das sequencias foi afiliada ao gênero Tepidamorphus, que inclui apenas uma espécie, Tepidamorphus gemmatus, já descrita no item 5.2. As sequências afiliadas a bactérias do gênero Halomonas totalizaram 3,8%. Estas bactérias apresentam grande resistência a altas concentrações salinas, sendo que a maioria das espécies é desnitrificante e anaeróbia facultativa (VREELAND et al., 1980). Em estudos mais recentes, foi descrita a espécie Halomonas campisalis, capaz de realizar, em aerobiose, nitrificação heterotrófica e desnitrificação ao mesmo tempo. Apresenta tolerância à concentração salina de até 20% e amplo potencial para ser utilizada em tratamento de efluentes salinos (GUO et al., 2013). Os gêneros Phycisphaera, Nitrococcus, Lewinella e Roseovarius já foram discutidos nos itens 5.3.1, 5.2 e 5.1. Destes, a atividade de nitrificação autotrófica é conhecida para o gênero Nitrococcus. Sequências associadas ao gênero Salisaeta, com uma única espécie representante, Salisaeta longa, somam 0,98%. São bactérias que suportam ambientes hipersalinos com até 20% de NaCl, e exigem concentração salina mínima de 5%. São aeróbias, heterotróficas, mas sem relatos de ação nitrificante ou desnitrificante (VAISMAN; OREN, 2009). O filo Chloroflexi foi representado por 0,67% das sequencias, que se mostraram relacionadas ao gênero Bellilinea. A única espécie do gênero é Bellilinea caldifistulae, bactéria estritamente anaeróbia, isolada inicialmente de consórcio de lodo ativado com potencial degradador de propionato. São termofilicas e não tem potencial de nitrificação (YAMADA et al., 2007). A composição completa dos filotipos obtidos através do pirosequenciamento pode ser observada na Tabela 6.

78 Tabela 6: Afiliação e abundância das sequencias derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do cDNA total do lodo TEBAR – Dominio Bacteria.

Soma de Soma de Abun. Soma de Soma de Abun. Gêneros Gêneros Nº de Seq Relativa Nº de Seq Relativa 0_unclassified 10290 75,991% Haliscomenobacter 8 0,059% Marinobacter 651 4,808% Pusillimonas 8 0,059% Iamia 592 4,372% Ilumatobacter 7 0,052% Halomonas 514 3,796% Sphingomonas 5 0,037% Tepidamorphus 276 2,038% Aggregatibacter 4 0,030% Phycisphaera 223 1,647% Lutimaribacter 4 0,030% Nitrococcus 182 1,344% Modicisalibacter 4 0,030% Lewinella 153 1,130% Alkalispirillum 3 0,022% Roseovarius 148 1,093% Cryobacterium 3 0,022% Salisaeta 132 0,975% Diaphorobacter 3 0,022% Bellilinea 91 0,672% Truepera 3 0,022% Parcubacteria_genera_ 90 0,665% Campylobacter 2 0,015% incertae_sedis Lutibaculum 34 0,251% Capnocytophaga 2 0,015% Oceanicola 34 0,251% Donghicola 2 0,015% Saccharibacteria_genera_ 24 0,177% Marinomonas 2 0,015% incertae_sedis Bauldia 21 0,155% Thiohalobacter 2 0,015% Cucumibacter 12 0,089% Fodinibius 1 0,007% Marinicella 9 0,066% Prevotella 1 0,007% Shewanella 1 0,007%

O pirosequenciamento de amplicons do gene RNAr 16S a partir do cDNA foi realizado com o intuito de verificar quais são os micro-organismos metabolicamente ativos presentes no lodo ativado utilizado na etapa de remoção de amônia e de outros componentes existentes na água de produção. Como mencionado anteriormente, foram encontradas sequencias afiliadas a Nitrococcus, bactérias relacionadas à segunda etapa da nitrificação. A detecção destas sequências, ainda que em baixa abundância, denota que estes micro-organismos estão ativos no lodo e nos dá indícios de que a primeira fase da nitrificação (redução de amônia a nitrito) esteja sendo realizada heterotroficamente por outros micro- organismos presentes, como por exemplo, Marinobacter ou Halomonas campisali. Em adição, dentre as sequencias representantes de bactérias metabolicamente ativas estão 10.290 afiliadas a micro-organismos não cultiváveis, cujo metabolismo ainda não é conhecido, e que podem ter potencial nitrificante. O lodo ativado não está somente relacionado à remoção da amônia, então é possível que outras substâncias estejam sendo degradadas, favorecendo a seleção de outros grupos de micro-organismos. A diferença de predominância de

79 filos entre as duas abordagens utilizadas para avaliar a diversidade microbiana no lodo poderia ser explicada pelo baixo esforço amostral, ou seja, o numero de clones analisado com a abordagem de bibliotecas genicas associada ao sequenciamento de Sanger foi insuficiente para revelar toda a diversidade de filos e sua abundancia relativa na amostra. Assim como no item 5.4.2, a maior parte das sequências foram afiliadas às bactérias não cultiváveis, somando 76% do total de sequências obtidas para biblioteca via sequenciamento massivo para verificação das bactérias metabolicamente ativas. Esta análise também foi realizada com o intuito de verificar se o processo de nitrificação poderia ser atribuído a algum micro-organismo ainda não descrito que tivesse presente de modo maciço na amostra de lodo. No entanto, observou-se que o processo de nitrificação não pode ser atribuído aos micro-organismos não cultiváveis, uma vez que as 10.290 sequências estão distribuídas em 272 OTUs distintas (Tabela 7).

80 Tabela 7: Associação das sequências afiliadas à bactérias não cultiváveis derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do cDNA total do lodo TEBAR – Dominio Bacteria

5.4.4 Diversidade de arqueias totais no lodo ativado via sequenciamento pela plataforma 454 O pirosequenciamento de amplicons do gene RNAr 16S de arqueias a partir do DNA total extraído das amostras de lodo ativado provenientes do TEBAR gerou um total de 4.636 sequencias, das quais foram descartadas 1.024 por serem sequências afiliadas ao Dominio Bacteria.

81 Tabela 8: Resultados do pirosequenciamento da amostra de DNA do lodo ativado TEBAR – Dominio Archaea. Total de sequencias (dados brutos) 7418 Total de sequências (dados filtrados) 4637 Tamanho médio das sequências (pb) 410 Total de OTUs observadas 315

Estimador de riqueza Chao 1 583 ± 68 Índice de diversidade Shannon_H 3,99 ± 0,06

As curvas de rarefação (Figura 19) mostram que, para os níveis de similaridade de sequencia de 97% (nível de espécie) e 95% (nível de gênero), há a tendência de formação de platô. A análise de um maior número de sequencias poderia levar à observação de um maior número de OTUs, principalmente me nível de espécie, mas possivelmente em uma taxa muito baixa. Para a curva de rarefação com 80% de similaridade (nível de filo), nota-se formação de platô, sendo possível afirmar que o esforço amostral foi suficiente para cobrir a diversidade de filos da amostra.

Figura 19: Curvas de rarefação definidas para diferentes percentuais de similaridade (97% - nível de espécie; 95% - nível de gênero; 80% - nível de filo) com base nos dados de sequencia derivados do pirosequenciamento de amplicons RNAr 16S da amostra de cDNA do lodo TEBAR – Dominio Arqueia.

As análises via ferramentas do RDP revelaram 315 OTUs divididas em 6 gêneros (Tabela 9), com predomínio de arquéias do gênero Methanosaeta (97,2%).

82 As demais sequências, aproximadamente 3% do total, afiliaram-se com os gêneros Methanobacterium, Methanolobus, Methanofollis e Methanococcoides, além de arqueias não classificadas. Para estes gêneros de arqueias não há metabolismo relacionado à amônia conhecido até o momento, conforme já descrito no item 5.3.

Tabela 9: Afiliação e abundância das sequencias derivadas do pirosequenciamento de amplicons do RNAr 16S a partir do DNA total do lodo TEBAR – Dominio Archaea.

Soma do n° de Soma de abun. Gêneros sequencias Relativa Methanosaeta 3511 97,2% Methanobacterium 83 2,3% Unclassified 13 0,4% Methanococcoides 3 0,1% Methanofollis 1 0,0% Methanolobus 1 0,0%

A presença absoluta de gêneros de arqueias metanogênicas se dá em virtude do lodo ativado ser utilizado para remoção biológica de outros compostos além da amônia, e também indica que, provavelmente, a nitrificação não está sendo realizada por arqueias. O fato de algumas sequências obtidas com a abordagem de bibliotecas gênicas serem afiliadas à espécie em descrição Candidatus Nitrosoarchaeum limnia, pertencente ao filo Thaumarchaeota (em que todas as arqueias são nitrificantes marinhas (BROCHIER-ARMANET et al., 2008), sugeriu que a nitrificação poderia estar sendo realizada por esses micro-organismos, o que deu nova amplitude a este estudo. No entanto, não foram detectadas sequencias representativas de arqueias pertencentes ao filo Thaumarchaeota com a abordagem de pirosequenciamento.

5.5 Monitoramento da diversidade nos consórcios microbianos Para monitoramento da diversidade dos consórcios microbianos aclimatados, foram escolhidos os quatro consórcios que apresentaram os maiores índices de nitrificação, conforme descrito na .

83 Tabela 10, ou seja, foram monitorados e caracterizados os consórcios aclimatados a 12%, 14%, 16% e 18% de teor de salinidade submetidos ao Tratamento I e também os consórcios aclimatados a 6%, 10%, 12% e 20% de teor de salinidade submetidos ao Tratamento II.

Tabela 10: Percentagem de remoção de amônia nos consórcios microbianos para os dois diferentes tratamentos (Dados fornecidos pela Prof. Dra. Cynthia Canedo da Silva e equipe - UFV). Tempo de incubação: 120 dias Consórcios microbianos % de remoção de amônia % de remoção de amônia aclimatados Tratamento I (sem sal ) Tratamento II (Com Sal ) 6% 73,59 69,74 8% 64,34 32,92 10% 73,62 69,30 12% 88,16 68,09 14% 85,72 43,20 16% 92,67 51,18 18% 84,20 56,52 20% 81,43 63,24

5.5.1 Fingerprint dos consórcios por DGGE Os resultados obtidos a partir da técnica de DGGE para as triplicatas dos consórcios microbianos submetidos ao Tratamento I podem ser observados na Figura 20, seguido por seu respectivo dendrograma, estimado utilizando-se coeficiente de Jaccard (Figura 21).

84 1) Marcador 100bp 2) 06% Sem adição NaCl 3) 06% Sem adição NaCl 4) 06% Sem adição NaCl 5) 08% Sem adição NaCl 6) 08% Sem adição NaCl 7) 08% Sem adição NaCl 8) 10% Sem adição NaCl 9) 10% Sem adição NaCl 10) 10% Sem adição NaCl 11) 12% Sem adição NaCl 12) 12% Sem adição NaCl 13) 12% Sem adição NaCl 14) 14% Sem adição NaCl 15) 14% Sem adição NaCl 16) 14% Sem adição NaCl 17) 16% Sem adição NaCl 18) 16% Sem adição NaCl 19) 16% Sem adição NaCl 20) 18% Sem adição NaCl 21) 18% Sem adição NaCl 22) 18% Sem adição NaCl 23) 20% Sem adição NaCl 24) 20% Sem adição NaCl 25) 20% Sem adição NaCl 26) Marcador 100bp

Figura 20: DGGE de fragmentos de genes RNAr 16S dos consórcios microbianos nitrificantes aclimatados em diferentes concentrações salinas mas cultivados sem adição de NaCl (Tratamento I).

85

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 10

12%_a 12%_b 12%_c 10%_a 10%_c 10%_b 6%_a 6%_b 6%_c 14%_a 14%_b 14%_c 8%_a 8%_b 8%_c 16%_a 16%_b 16%_c 20%_a 20%_b 20%_c 18%_a 18%_b 18%_c

Figura 21: Dendrograma de similaridade (%) da estrutura das comunidades bacterianas dos consórcios submetidos ao Tratamento I gerado por matriz de similaridade, tendo-se utilizado o coeficiente de Jaccard a partir dos dados obtidos por meio de fingerprint por DGGE.

Os resultados obtidos à partir da técnica de DGGE para as triplicatas dos consórcios microbianos submetidos ao Tratamento II podem ser observados na Figura 22, seguido por seu respectivo dendrograma, estimado utilizando-se coeficiente de Jaccard via Software Bionumerics Applied-Maths (Figura 23).

86 1) Marcador 100bp 2) 06% Com adição NaCl 3) 06% Com adição NaCl 4) 06% Com adição NaCl 5) 08% Com adição NaCl 6) 08% Com adição NaCl 7) 08% Com adição NaCl 8) 10% Com adição NaCl 9) 10% Com adição NaCl 10) 10% Com adição NaCl 11) 12% Com adição NaCl 12) 12% Com adição NaCl 13) 12% Com adição NaCl 14) 14% Com adição NaCl 15) 14% Com adição NaCl 16) 14% Com adição NaCl 17) 16% Com adição NaCl 18) 16% Com adição NaCl 19) 16% Com adição NaCl 20) 18% Com adição NaCl 21) 18% Com adição NaCl 22) 18% Com adição NaCl 23) 20% Com adição NaCl 24) 20% Com adição NaCl 25) 20% Com adição NaCl 26) Marcador 100bp

Figura 22: DGGE de fragmentos de genes RNAr 16S dos consórcios microbianos nitrificantes aclimatados a diferentes concentrações salinas e cultivados com adição de NaCl (Tratamento II).

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 0 Sal026%_b_CS 6%_c_CS Sal03 8%_a_CS Sal04 Sal058%_b_CS

Sal068%_c_CS Sal1012%_a_CS Sal1112%_b_CS 12%_c_CS Sal12 6%_a_CS Sal01 Sal1816%_c_CS Sal1918%_a_CS Sal0710%_a_CS Sal0810%_b_CS 10%_c_CS Sal09 Sal1414%_b_CS Sal1514%_c_CS Sal1716%_b_CS Sal1314%_a_CS Sal1616%_a_CS

Sal2118%_c_CS Sal2220%_a_CS Sal2018%_b_CS S2a0%l2_3b_CS Sal2420%_c_CS

Figura 23: Dendrograma de similaridade (%) da estrutura das comunidades bacterianas dos consórcios submetidos ao Tratamento I gerado pela matriz de similaridade, tendo-se utilizado o coeficiente de Jaccard a partir dos dados obtidos por meio de fingerprint por DGGE.

87 Com base nos perfis observados para os consórcios microbianos aclimatados em ambos os géis (Figura 20 e Figura 21, para Tratamento I, e Figura 22 e Figura 23 para Tratamento II), é possível afirmar que embora a diversidade observada tenha sido baixa, as populações aclimatadas em diferentes salinidades foram distintas. As populações foram muito semelhantes para os consórcios nitrificantes aclimatados a 18% e 20% e cultivados sem sal, para os consórcios aclimatados de 14% a 20% e cultivados com sal, de acordo com o observado nos dendrogramas. Porém, devido ao fato de que alguns amplicons podem parar de migrar na mesma posição no gel de DGGE em função do conteúdo GC similar, ou mesmo pelo fato de que um mesmo micro-organismo pode produzir mais de uma banda no gel, em função de apresentarem mais de uma cópia do gene RNA ribossomal 16S, o DGGE não é a ferramenta mais indicada para identificação dos membros de comunidades microbianas. Em adição, é sabido que esta técnica é capaz de revelar apenas as populações mais dominantes, em torno de 1 a 10% da comunidade (OLIVEIRA, 2008). Devido a essas limitações da técnica de DGGE, a análise detalhada de composição de cada um dos consórcios que apresentaram as maiores taxas de nitrificação foi realizada através da construção de bibliotecas de genes de RNAr 16S.

5.5.2 Identificação dos micro-organismos presentes nos consórcios Foram construídas oito bibliotecas com 48 clones para cada uma delas, sendo que desses 48, optou-se pelo sequenciamento inicial de 12. Se fosse observada grande diversidade, mais clones seriam sequenciados. A descrição das bibliotecas e o número de clones obtidos estão descritos na Tabela 11.

88

Tabela 11: Dados sobre as bibliotecas do gene RNA ribossomal 16S construídas para os consórcios micobianos com maiores taxas de nitrificação em diferentes tratamentos.

Teor de salinidade % de remoção de amônia n° de clones 12% 88,16 12 14% 85,72 12 Tratamento I 16% 92,67 12 18% 84,20 12 6% 69,74 12 10% 69,30 11 Tratamento II 12% 68,09 11 20% 63,24 11

Os resultados obtidos para cada um dos consórcios estão descritos na Tabela 12 a seguir. Observa-se baixa diversidade em ambos os tratamentos, com a presença de um ou dois micro-organismos para cada consórcio, o que confirma os resultados do fingerprint por DGGE.

Tabela 12: Resultados obtidos com a construção da biblioteca do gene RNAr 16S para os consórcios microbianos com maiores índices de nitrificação submetidos ao Tratamento I.

Consórcios % similaridade n° de aclimatados (bancos de Melhor hit (Linhagens tipo) clones (Tratamento I) dados) Nitratireductor aquibiodomus (DSM 15645T) 09 99 T 12% Nitratireductor kimnyeongensis (JCM 14851 ) 03 99 Brevibacterium casei (DSM 20657T) Nitratireductor aquibiodomus (DSM 15645T) 11 99 T 14% Nitratireductor kimnyeongensis (JCM 14851 ) 01 99 Brevibacterium casei (DSM 20657T) Nitratireductor aquibiodomus (DSM 15645T) 01 99 Nitratireductor kimnyeongensis (JCM 14851T)

T 16% 07 100 Paracoccus denitrificans (DSM 413 ) 01 96 Methylobacterium zatmanii (DSM 5688T) 03 99 Caulobacter leidyi (DSM 4733T) 18% 12 100 Paracoccus denitrificans (DSM 413T)

89

Tabela 13: Resultados obtidos com a construção da biblioteca do gene RNAr 16S para os consórcios microbianos com maiores índices de nitrificação submetidos ao Tratamento II.

Consórcios % similaridade n° de aclimatados (bancos de Melhor Hit (Linhagens tipo) clones (Tratamento II) dados) Nitratireductor aquibiodomus (DSM 15645T) 6% 12 99 T Nitratireductor kimnyeongensis (JCM 14851 ) Nitratireductor aquibiodomus (DSM 15645T)/ 10% 11 99 T Nitratireductor kimnyeongensis (JCM 14851 ) 08 100 Paracoccus denitrificans (DSM 413T) 12% 03 96 Methylobacterium zatmanii (DSM 5688T) 20% 11 100 Paracoccus denitrificans (DSM 413T)

Organismos relacionados às bactérias Nitratireductor aquibiodomus e Nitratireductor kimnyeongensis foram encontrados em quase todos os consórcios nitrificantes investigados. Estas espécies são filogeneticamente próximas e, portanto, a análise parcial do gene RNAr 16S não permitiu discriminar a identificação dos clones em nível de espécie. A bactéria Nitratireductor aquibiodomus reduz nitrato a nitrito, ou seja, participa do processo de desnitrificação, mas não reduz nitrito a nitrogênio molecular. É halofílica, tolera concentrações acima de 5% de NaCl, porém é capaz de crescer sem sal (LABBÉ; PARENT; VILLEMUR, 2004). Nitratireductor kimnyeongensis é também uma bactéria halofílica, resistente a altas concentrações salinas, porém sem atividade nitrificante (KANG; YANG; LEE, 2009). Organismos relacionados às espécies Brevibacterium casei, Caulobacter leidyi e Methylobacterium zatmanii foram também encontrados em alguns consórcios nitrificantes (aclimatados a 12, 14 e 16% de sal). Brevibacterium casei também não está relacionada ao processo de nitrificação (COLLINS et al., 1983), assim como Caulobacter leidyi (ABRAHAM et al., 2002) e Methylobacterium zatmanii, que não apresentam características de nitrificação em seu metabolismo, no entanto, estão relacionadas a tratamentos de efluentes (RICE et al., 2000 e GREEN; BOUSFIELD; HOOD, 1988). O gênero bacteriano Paracoccus é composto de organismos metabolicamente versáteis com diversas capacidades de degradação e potenciais aplicações industriais e ambientais para a biorremediação. Paracoccus denitrificans

90 é uma bactéria gram negativa que está relacionada ao processo de desnitrificação, convertendo nitrato a nitrogênio molecular, entretanto o artigo de descrição dessa espécie (KELLY et al., 2006) não faz menções à oxidação da amônia ou nitrito. Por outro lado, há estudos que apontam outras propriedades desta espécie. Segundo Siddavattam et al., (2011), organismos desta espécie são capazes de prosperar sem dificuldades em condições aeróbias e anaeróbias e de se desenvolver em meios de cultura salinos desprovidos de qualquer fonte tradicional de carbono e enriquecido com N,N dimetilformamida, sendo que P. denitrificans degrada esta substância comumente encontrada em resíduos industriais e de mineração. Em adição, Robertson et al. (1988) descreveram esta espécie como micro-organismo nitrificante e desnitrificante em condições aeróbias . Este estudo mostra a eficiência do processo de remoção da amônia pela bactéria Paracoccus denitrificans, sinônimo heterotipico de Thiosphaera pantotropha (List of Nomenclature Euzeby - http://www.bacterio.net/thiosphaera.html). O processo de remoção da amônia observado nos consórcios submetidos ao Tratamento I com concentrações salinas de 16% e 18%, e nos consórcios submetidos ao Tratamento II om concentrações salinas 12% e 20%, pode ser atribuído à presença do micro-organismo P. denitrificans. A dominância de representantes desta espécie nos consórcios citados corrobora esta hipótese, uma vez que as medidas de remoção da amônia nos consórcios previamente aclimatados, realizadas pela equipe da Dra. Cynthia na Universidade Federal de Viçosa, mostrou grande eficiência. Os resultados produzidos neste estudo e pela equipe da UFV, se mostram complementares, comprovando o potencial nitrificante do lodo ativado. Para os demais consórcios (12% e 14% Tratamento I e 6% e 10% Tratamento II) não foi observada a ocorrência de Paracoccus denitrificans, no entanto os mesmos apresentaram índices elevados de remoção de amônia. É provável que os 12 clones sequenciados neste estudo tenham sido insuficientes para detectar a presença deste micro-organismo. Outra possibilidade, é que as espécies Nitratireductor aquibiodomus e Nitratireductor kimnyeongensis, descritas recentemente e presentes nos quatro consórcios, ainda não têm seu metabolismo completamente revelado, podendo ser micro-organismos relacionados à nitrificação heterotrófica.

91 6 CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos foi possível concluir que:

• O lodo ativado, objeto deste estudo, é capaz de realizar nitrificação, haja vista os micro-organismos nitrificantes quimioautotróficos e, principalmente, heterotróficos encontrados, associados à presença, em menor quantidade, de Plantomycetes, micro-organismos que podem realizar o processo anammox.

• Os consórcios nitrificantes aclimatados a altas salinidades são dominados por bactérias com potencial de nitrificação heterotrófica, dado corroborado pelos ótimos índices de nitrificação mensurados pela equipe da UFV. Os resultados combinados sugerem que a remoção eficiente da amônia pode ser alcançada quando o lodo ativado é aclimatado com o gradual aumento da concentração salina, fator limitante para a nitrificação, e enriquecido de modo a favorecer a microbiota nitrificante.

• A grande parcela de bactérias não cultiváveis, observada através do pirosequenciamento de amplicons de genes RNAr 16S a partir de amostras de DNA e RNA total extraídos do lodo, tem seu metabolismo desconhecido, não sendo descartada a possibilidade de estarem relacionadas ao processo de remoção da amônia, uma vez que, descobertas recentes ilustram o fato de que nossa compreensão atual acerca da profundidade e amplitude de micro-organismos oxidantes de amônia, é ainda incompleta.

92 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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