RZECZPOSPOLITA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2934093 POLSKA

(13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int.Cl. 20.12.2013 13814963.8 A01H 1/00 (2006.01) A01K 67/033 (2006.01)

(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 12.02.2020 Europejski Biuletyn Patentowy 2020/07 Urząd Patentowy EP 2934093 B1 Rzeczypospolitej Polskiej

(54) Tytuł wynalazku: TRWAŁA TRANSFORMACJA POPULACJI I SPOSÓB OCHRONY BIOLOGICZNEJ Z WYKORZYSTANIEM ZASAD HAPLOINSUFICJENCJI I PODDOMINACJI

(30) Pierwszeństwo: 20.12.2012 GB 201223097 20.12.2012 US 201261740359 P

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

28.10.2015 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2015/44

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

13.07.2020 Wiadomości Urzędu Patentowego 2020/09

(73) Uprawniony z patentu:

Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., München, DE

(72) Twórca(y) wynalazku:

GUY REEVES, Hamburg, DE

T3 FLOYD REED, Kapolei, US

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PATPOL 2934093 KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa

PL/EP

Uwaga:

W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

EP 2 934 093 B1

Opis

DZIEDZINA WYNALAZKU

[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu zmniejszania konkurencyjnego dostosowania (ang. fitness) 5 organizmu eukariotycznego, hemizygotycznego pod względem transgenicznego locus w porównaniu z organizmem eukariotycznym, homozygotycznym pod względem transgenicznego locus, pod warunkiem, że organizm nie jest człowiekiem, obejmującego następujące etapy: (a) zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie, przy czym wspomniane zmniejszenie jest przenoszone przez transgeniczny locus w organizmie; i (b) ratowania zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym 10 wspomniane ratowanie jest przenoszone przez ten sam transgeniczny locus w organizmie, dając organizm, który jest mniej konkurencyjnie pasujący, jeśli jest hemizygotyczny pod względem transgenicznego locus niż jeśli jest homozygotyczny pod względem transgenicznego locus. Ponadto, przewiduje się odpowiednie systemy genetyczne, ich zastosowania i organizmy zmodyfikowane genetycznie.

TŁO WYNALAZKU

15 [0002] Genetyczna poddominacja (ang. underdominance) powstaje, gdy heterozygoty lub hemizygoty wykazują niższy fitnes niż homozygoty. Historycznie, proponowano szereg zastosowań wykorzystujących genetyczną poddominację i obejmują one (i) ochronę biologiczną: ograniczanie niezamierzonej introgresji między organizmami rozmnażającymi się płciowo w środowisku, (ii) transformację populacji: nacisk na pożądane geny o wysokiej częstości w dzikich populacjach organizmów rozmnażających się płciowo oraz 20 (iii) tłumienie wielkości populacji dzikich szkodników: można zastosować sztuczne wprowadzanie dużej liczby homozygot przez kilka pokoleń w celu zmniejszenia wielkości następnego pokolenia dzikiej populacji. Generowanie transgenicznych loci, które charakteryzują się poddominacją, co pozwoliłoby na wdrożenie tych podejść, stanowi technicznie wyzwanie i pozostaje do osiągnięcia w sposób, który pozwala na elastyczność w szerokim zakresie zastosowań i gatunków. 25 [0003] Wykorzystanie poddominacji w ochronie biologicznej rozważano głównie w kontekście ograniczenia przypadkowej introgresji transgenów z odmian roślin zmodyfikowanych genetycznie do dzikich krewnych lub innych odmian roślin uprawnych (patrz np. http://www.isb.vt.edu/articles/feb0603.htm). Wdrożono tylko jednego poddominanta, jednak podejście to jest nieelastyczne, ograniczone do gatunków Brassica i zależne od niezidentyfikowanych genów rozmieszczonych w całym genomie. Przewidziano lub wdrożono 30 wiele innych podejść opartych na ochronie biologicznej, które nie polegają na poddominacji, jednak zastosowana wartość wszystkich tych podejść pozostaje do przetestowania w zastosowaniach komercyjnych. Istnieje silna potrzeba opracowania elastycznych mechanizmów ochrony biologicznej, które nie wpłyną znacząco na wartość agronomiczną odmian roślin (Plant gene containment. 224 (Wiley- Blackwel: 2012). Potrzeba ta jest przede wszystkim ważna w przypadku trzech zastosowań: (1) testowania 35 w terenie nowych roślin doświadczalnych, (2) ułatwiania komercyjnej produkcji niezanieczyszczonych nasion przez sprzedawców oraz (3) komercyjnego sadzenia roślin zmodyfikowanych genetycznie poza szklarnią. [0004] Wykorzystanie poddominacji w transformacji populacji (zwanej także zastępowaniem populacji) zostało zaproponowane przez w 1968 r. przez Curtis, (Nature 218, 368-69 (1968)). W tej publikacji

1

EP 2 934 093 B1

naukowej, Curtis wykorzystał przykład poddominacji, aby pokazać, w jaki sposób geny oporne na chorobę mogą być w zrównoważony sposób kierowane z wysoką częstością do dzikich populacji (nawet jeśli nie są selektywnie korzystne) poprzez wypuszczanie homozygotycznych rodów poddominacyjnych tego samego gatunku. Przewidywano, że geny, które uczyniły owady odpornymi na rozprzestrzenianie chorób na ludzi, 5 zwierzęta gospodarskie i rośliny, mogły zostać skierowane do dzikiej populacji, gdzie mogłyby pozostać w sposób samopodtrzymujący. Zaproponowano szereg podejść w celu osiągnięcia transformacji populacji, które można opisać jako charakteryzujące się poddominacją, ale pozostają do wdrożenia (np. Davis i in. Journal of theoretical biology, 212, 83-98 (2001); i Marshall i Hay, The Journal of heredity, 102, 336-41 (2011)). W populacjach owadów laboratoryjnych wdrożono alternatywne podejścia, które nie są opisane 10 jako polegające na poddominacji, ale żadne nie zostało przetestowane na populacjach dzikich (np. Chen i in., Science 316, 597 (2007) i Windbichler i in., Nature (2011); doi: 10.1038/nature09937). Istnieje zatem wyraźna potrzeba opracowania i ulepszenia systemów transformacji populacji, które mogłyby być wykorzystane do zwalczania chorób, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby pojedynczy system miał idealne właściwości dla wszystkich, bardzo szerokich zakresów potencjalnych zastosowań. Szczególnie 15 cenne byłby opracowanie systemów, które można łatwo przenosić między gatunkami. [0005] Wykorzystanie poddominacji w transformacji populacji rozwija się od lat 40-tych XX wieku. Jeśli hemizygotyczne potomstwo jest częściowo nieżywotne lub bezpłodne, wówczas można zastosować wypuszczanie na dużą skalę odpowiedniego rodu homozygotycznego w celu zmniejszenia wielkości następnej generacji dzikiej populacji. W latach 1960–1980 poczyniono znaczny wysiłek, aby opracować 20 odpowiednie rody poddominacyjne u szerokiej gamy gatunków, stosując rearanżacje chromosomów indukowane napromieniowaniem (Asman i in., Annual Review of Entomology 26, 289-318 (1981). Jednak takie podejście do generowania rodów poddominacyjnych okazało się mało elastyczne i jedynie marginalnie skuteczne i zostało w dużej mierze porzucone. Obecnie, dzikie populacje szkodliwych owadów są tłumione z zastosowaniem masowego wprowadzania osobników wysterylizowanych przez 25 napromieniowanie jako część „techniki wypuszczania sterylnych owadów” w licznych programach zwalczania szkodników na całym świecie (Dyck i in., Sterile Insect Technique. 760; Springer-Verlag: Berlin/Heidelberg, 2005). Pomimo sukcesu tego podejścia, istnieje szereg ograniczeń w zakresie efektywności lub podejść opartych na napromieniowaniu, które można rozwiązać za pomocą rodów transgenicznych. Obejmują one obniżenie kosztów produkcji dużej liczby osobników do wprowadzenia, 30 szczególnie, jeśli wymagane jest sortowanie według płci, oraz potencjalną poprawę w konkurencyjnym fitnesie wypuszczonych osobników. Doprowadziło to do opracowania niewielkiej liczby systemów, które można by zastosować do tłumienia populacji owadów (np. Windbichler i in., PLoS genics 4, (2008) i Fu i in., Nature 23, 453-456 (2005)). Jednak nadal istnieje wyraźna potrzeba dalszego opracowywania i ulepszania systemów tłumienia populacji, ponieważ jest mało prawdopodobne, że pojedynczy system 35 będzie miał idealne właściwości dla szerokiego zakresu potencjalnych zastosowań, które mogą być przydatne. Szczególnie cenny byłby rozwój dalszych systemów, które można łatwo przenosić między gatunkami.

CELE I STRESZCZENIE WYNALAZKU

[0006] Niniejszy wynalazek zaspokaja tę potrzebę i zapewnia środki i sposoby, które pozwalają na 40 obniżenie konkurencyjnego dostosowania organizmu eukariotycznego, hemizygotycznego pod względem

2

EP 2 934 093 B1

locus transgenicznego w porównaniu z organizmem eukariotycznym, homozygotycznym pod względem locus transgenicznego, pod warunkiem, że organizm nie jest człowiekiem. Cel ten jest osiągany sposobem obejmującym następujące etapy: (a) zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie, przy czym wspomniane zmniejszenie jest przenoszone przez transgeniczny locus w 5 organizmie; i (b) ratowanie zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym wspomniany ratunek jest przenoszony przez to samo transgeniczne locus w organizmie, dając organizm, który jest mniej konkurencyjnie dostosowany, jeśli jest hemizygotyczny pod względem transgenicznego locus niż jeśli jest homozygotyczny pod względem transgenicznego locus. [0007] Ten alternatywny typ systemu poddominacji oparty na haploinsuficjencji, który jest zawarty w 10 pojedynczym locus lub regionie genowym, może być rekombinowany na różnych podłożach genetycznych i nie wpływa na strukturę chromosomalną. Nieoczekiwanie, transgeniczna homozygota ma wystarczająco wysokie dostosowanie w porównaniu z homozygotami i hemizygotami typu dzikiego pod względem efektów poddominacji o silnej dynamice. Jak ujawniono w niniejszym opisie, taki system poddominacji oparty na haploinsuficjencji umożliwia skutecznie i stabilnie transformować populacje organizmów rozmnażających 15 się płciowo. [0008] Dostarczona metodyka poddominacji oferuje szereg zalet i ma szeroki zakres potencjalnych zastosowań, co ułatwia zakres, w jakim można ją stosować w wielu gatunkach. Metodologię można na przykład zastosować do ochrony biologicznej w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się genetycznie zmodyfikowanych genów na tradycyjne uprawy lub dzikie gatunki spokrewnione. Dalej opisano, że 20 metodologię poddominacji można stosować jako część strategii transformacji populacji, aby populacje owadów, które są wektorami chorób ludzi, zwierząt gospodarskich lub roślin, uczynić opornymi na przenoszenie chorób. Koncepcję tę można dodatkowo zastosować do wektorów chorób, które nie są owadami, i chorób, które atakują inne gatunki, np. zagrożone gatunki zagrożone przez obce choroby i wektory (Warner, R. E., 1968, Condor 70: 101-120). Poddominację można dodatkowo łączyć z 25 modyfikowanymi systemami kierowanymi genowo, aby poprawić ich właściwości pod względem bezpieczeństwa i odwracalności. Ujawniono ponadto, że zastosowanie poddominacji do transformacji populacji oznacza, że transformacja jest potencjalnie odwracalna w szerokim zakresie realistycznych okoliczności. Zatem, wprowadzenia osobników, które niosą alternatywny allel typu dzikiego w transgenicznym locus w wystarczającej liczbie, mogą ponownie przekroczyć próg częstości alleli i oczekuje 30 się, że allel transgeniczny zostanie całkowicie usunięty z populacji w kolejnych pokoleniach, wraz z powiązanymi genami efektorowymi. Zatem, w razie potrzeby, populację można teoretycznie przywrócić do stanu całkowicie dzikiego. Ponadto oczekuje się, że populacje transformowane zgodnie z obecnie opisaną metodologią poddominacji będą stabilne geograficznie. Rzadkie organizmy migrujące, zarówno do regionu transformowanego, jak i na zewnątrz, będą miały zwykle hemizygotyczne potomstwo o ograniczonym 35 dostosowaniu. W konsekwencji, migrujące allele będą miały tendencję do zanikania poprzez selekcję naturalną, a jeśli wskaźniki migracji będą wystarczająco niskie (Altrock i in., 2010, Journal of Theoretical Biology 267: 62-75), nie wydaje się, że transgeniczny konstrukt rozprzestrzeni się niekontrolowany z populacji na populację. Ujawniono ponadto, że metodologię poddominacji można zastosować w celu poprawy efektywności technik tłumienia populacji, które można zastosować w celu ułatwienia transformacji 40 populacji poprzez zmniejszenie wielkości dzikiej populacji docelowej.

3

EP 2 934 093 B1

[0009] Niniejszy opis ujawnia ponadto, że sposób dodatkowo obejmuje etap wprowadzenia organizmu transgenicznego uzyskanego w etapie (b) do populacji tego samego gatunku, tak że tworzy się ustalany konstrukt transgeniczny z wysoką częstością w locus w populacji. [0010] Niniejszy opis ujawnia ponadto, że sposób dodatkowo obejmuje etap stosowania organizmu 5 transgenicznego uzyskanego w etapie (b) w środowisku obejmującym w przeciwnym razie zdolne do krzyżowania się rozmnażające się płciowo osobniki typu dzikiego organizmu za pomocą którego zmniejsza się konkurencyjne dostosowanie hemizygotycznego potomstwa. [0011] W kolejnym przykładzie, wynalazek ujawnia sposób transformacji populacji organizmów rozmnażających się płciowo, pod warunkiem, że organizm ten nie jest człowiekiem, obejmujący etapy: (a) 10 zmniejszenia ekspresji genu wykazujący haploinsuficjencję w organizmie, przy czym wymienione zmniejszenie jest przenoszone przez transgeniczne locus w organizmie; (b) ratowanie zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym wspomniane ratowanie przenoszone jest przez to samo transgeniczne locus w organizmie, i (c) wprowadzenie organizmów homozygotycznych, uzyskanych w poprzednim etapie, do populacji tego samego gatunku, tak że ustalony jest transgeniczny locus z dużą częstością w populacji. 15 [0012] Niniejszy opis ujawnia ponadto, że wymieniony etap wprowadzania obejmuje wprowadzenie, w jednym lub wielu pokoleniach, wystarczającej względnej liczby organizmów, aby uzyskać w populacji częstość tego samego gatunku większą niż niestabilna częstość równowagi allelicznej przewidywana na podstawie dostosowania konkurencyjnego. [0013] Ujawniony jest również sposób zmniejszania introgresji transgenicznego locus w organizmie do 20 populacji w przeciwnym razie zdolnych do krzyżowania się organizmów rozmnażających się płciowo, pod warunkiem, że ten organizm nie jest człowiekiem, obejmujący etapy: (a) zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie, przy czym wspomniane zmniejszenie jest przenoszone przez transgeniczny locus w organizmie; (b) ratowania zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym wspomniane ratowanie jest przenoszone przez ten sam transgeniczny locus w organizmie; i (c) 25 zastosowania organizmu transgenicznego uzyskanego w etapie (b) w środowisku obejmującym inaczej zdolne do krzyżowania się osobniki typu dzikiego organizmu rozmnażające się płciowo, przy czym dostosowanie konkurencyjne hemizygotycznego potomstwa jest obniżone, zmniejszając w ten sposób szybkość reprodukcji płciowej i/lub żywotność hemizygotycznego potomstwa. [0014] Niniejszy opis ujawnia ponadto sposób zmniejszania wielkości dzikich populacji w przeciwnym razie 30 zdolnych do krzyżowania organizmów rozmnażających się płciowo, pod warunkiem, że wymieniony organizm nie jest człowiekiem, obejmujący etapy: (a) zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie, przy czym wspomniane zmniejszenie jest przenoszone przez transgeniczne locus w organizmie; (b) ratowania zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym wspomniane ratowanie jest przenoszone przez to samo transgeniczne locus w organizmie, i (c) 35 wykorzystania hemizygotycznego organizmu transgenicznego uzyskanego w etapie (b) lub otrzymanej mieszaniny homozygotycznych i hemizygotycznych organizmów transgenicznych w etapie (b) w środowisku obejmującym inaczej zdolne do krzyżowania się osobniki typu dzikiego rozmnażające się płciowo organizmu, przy czym konkurencyjne dostosowanie hemizygotycznego potomstwa jest obniżone, zmniejszając w ten sposób szybkość reprodukcji płciowej i/lub żywotność hemizygotycznego potomstwa.

4

EP 2 934 093 B1

[0015] W korzystnym wykonaniu sposobów zdefiniowanych w niniejszym dokumencie powyżej, wspomniany obniżony konkurencyjny fitness u hemizygotycznego potomstwa oznacza brak żywotności i/lub niepłodność organizmu. [0016] Niniejszy opis ujawnia ponadto, że wymieniony spadek introgresji transgenicznego locus w 5 organizmie, jak wspomniano w niniejszym dokumencie powyżej, oznacza zapobieganie introgresji transgenicznego locus i przy czym obniżenie konkurencyjnego fitnesu hemizygotycznego potomstwa eliminuje lub ogranicza płciową reprodukcję hemizygotycznego potomstwa. [0017] W dalszym korzystnym wykonaniu, to zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję obejmuje dostarczenie środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt genu 10 wykazującego haploinsuficiencję lub produkt ekspresji, lub który specyficznie zakłóca sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. [0018] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, wspomniany środek specyficznie degradujący lub inaktywujący obejmuje siRNA, miRNA, cząsteczkę antysensownego RNA, cząsteczkę antysensownego DNA lub środek przenoszący metylację DNA zależną od RNA. 15 [0019] W innym korzystnym wykonaniu wymienionymi środkami, które specyficznie zakłócają tę sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, są: nukleazy palca cynkowego, nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN), CRISPR lub meganukleaza. [0020] W dalszym korzystnym wykonaniu wspomniane ratowanie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję obejmuje modyfikację sekwencji genu wykazującego haploinsuficjencję. W konkretnym 20 wykonaniu zmodyfikowany gen wykazującego haploinsuficjencję może być oparty na sekwencji ortologicznej lub paralogicznej. Wspomniana modyfikacja genu wykazującego haploinsuficjencję korzystnie obejmuje zapewnienie co najmniej częściowego uratowania środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję; 25 lub zastosowanie sekwencji ortologicznej lub paralogicznej. [0021] W dalszym korzystnym wykonaniu, wspomniane transgeniczne locus zawiera konstrukt charakteryzujący się poddominacją. Wspomniany konstrukt charakteryzujący się poddominacją korzystnie zawiera sekwencję prowadzącą do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie 30 zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. [0022] W dalszym korzystnym wykonaniu sposób według wynalazku obejmuje transformację organizmu konstruktem charakteryzującym się poddominacją zawierającym sekwencję prowadzącą do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego 35 haploinsuficjencję. W szczególnie korzystnym wykonaniu wspomniany konstrukt charakteryzujący się poddominacją zawiera sekwencję prowadzącą do zapewnienia siRNA, miRNA lub antysensownej cząsteczki RNA lub DNA lub ekspresji nukleaz palca cynkowego, nukleazy efektorowej podobnej do aktywatora transkrypcji (TALEN), CRISPR lub aktywności meganukleazy. [0023] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, wymieniona sekwencja prowadząca do dostarczenia 40 środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego 5

EP 2 934 093 B1

haploinsuficjencję, zawiera sekwencje zakłócające oflankowane przez miejsca specyficzne wobec miejsca rozpoznawalnego przez rekombinazę, korzystnie Cre lub FLP, umożliwiając uczynienie nieaktywną wspomnianej sekwencji, która prowadzi do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję. 5 [0024] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, sekwencja prowadząca do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, jest inaktywowana przez ekspozycję in vivo tej rekombinazy, korzystnie Cre lub FLP. [0025] W dalszym korzystnym wykonaniu, konstrukt charakteryzujący się poddominacją dodatkowo 10 zawiera zmodyfikowaną wersję genu wykazującego haploinsuficjencję, który jest oporny na środki, które specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. [0026] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje początkową transformację organizmu niezależnym transgenicznym konstruktem zawierającym zmodyfikowaną wersję genu wykazującego 15 haploinsuficjencję, który jest odporny na środki, które specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, a następnie transformację organizmu konstruktem charakteryzującym się poddominacją zawierającym sekwencję prowadzącą do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego 20 haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu z haploinsuficjencją i gen wykazującego haploinsuficjencję, który obejmuje dostarczenie co najmniej częściowego uratowania środków, które specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. 25 [0027] W innym korzystnym wykonaniu sposób według wynalazku obejmuje kotransformację organizmu niezależnym konstruktem transgenicznym zawierającym zmodyfikowaną wersję genu wykazującego haploinsuficjencję, który jest odporny na środki, przez które dany konstrukt charakteryzujący się poddominacją specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego 30 haploinsuficjencję, oraz konstruktem charakteryzującym się poddominacją zawierającym sekwencję prowadzącą do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję i gen z haploinsuficjencją, który obejmuje dostarczenie przynajmniej częściowe uratowania środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje 35 transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. Sposób może dodatkowo obejmować etapy otrzymywania organizmów homozygotycznych pod względem tego konstruktu charakteryzującego się poddominacją; i usunięcie wspomnianego niezależnego transgenicznego konstruktu przez rekombinację lub segregację chromosomów. 40 [0028] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu ekspresja więcej niż jednego genu wykazującego haploinsuficjencję organizmu może być zmniejszona i uratowana w organizmie. Wspomniane zmniejszenie 6

EP 2 934 093 B1

i uratowanie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję może być korzystnie przenoszone przez pojedynczy transgeniczny locus w organizmie lub przez wiele transgenicznych loci w organizmie. W kolejnym wykonaniu, zmniejszenie ekspresji genu z haploinsuficjencją może być przenoszone przez wiele transgenicznych loci, a wspomniane uratowanie ekspresji genu z haploinsuficjencją może być przenoszone 5 przez pojedynczy transgeniczny locus. [0029] W dalszym korzystnym wykonaniu wspomniane zmniejszanie i ratowanie ekspresji dwóch lub więcej genów wykazującego haploinsuficjencję może być przenoszone przez funkcjonalnie usieciowane transgeniczne loci. Korzystnie, funkcjonalnie połączony locus obejmuje środek do zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję pierwszego genu wykazującego haploinsuficjencję i środek ratujący 10 zdolny do zwiększenia zmniejszonej ekspresji drugiego genu wykazującego haploinsuficjencję w pierwszym transgenicznym locus; i środek do rmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję drugiego genu wykazującego haploinsuficjencję i środek ratujący zdolny do zwiększania zmniejszonej ekspresji pierwszego genu wykazującego haploinsuficjencję w drugim locus transgenicznym. [0030] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wspomniane zmniejszenie ekspresji dwóch lub więcej 15 genów wykazującego haploinsuficjencję jest przenoszone przez jeden transgeniczny locus, przy czym wymienione ratowanie ekspresji dwóch lub większej liczby genów wykazującego haploinsuficjencję jest przenoszone przez dwa lub więcej transgenicznych loci, przy czym wspomniane transgeniczne loci są funkcjonalnie połączone. [0031] W przykładzie, sposób obejmuje etap dodatkowego wprowadzenia do organizmu odrębnego 20 mechanistycznie konstruktu do transformacji populacji. [0032] Korzystne jest, aby konstrukt charakteryzujący się poddominacją, jak wspomniano powyżej w niniejszym dokumencie, dodatkowo zawierał gen efektorowy. Wspomniany gen efektorowy może być korzystnie wybrany z grupy obejmującej gen oporności na wirusa gorączki denga, gen oporności na malarię ludzką, gen oporności na malarię ptasią, gen oporności na wirusa plamistego więdnięcia pomidora, gen 25 oporności na herbicyd, gen owadobójczy, gen odporności na suszę, gen oporności na pasożytnicze nicienie i gen dający lepszą wydajność roślin. [0033] W dalszym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy systemu genetycznego do transformacji zawierającego następujące składniki: (a) środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję; i (b) środek ratujący, zdolny do zwiększenia zmniejszonej ekspresji 30 wspomnianego genu wykazującego haploinsuficjencję, przy czym system genetyczny jest dostarczony jako pojedyncza jednostka transformacyjna i przy czym wspomniane środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i ten środek ratujący są obecne w tym samym transgenicznym locus. [0034] W korzystnym wykonaniu środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego 35 haploinsuficjencję specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję lub specyficznie zaburzają sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. [0035] W innym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku środki specyficznie degradujące lub inaktywujące obejmują siRNA, miRNA, cząsteczkę antysensownego RNA, cząsteczkę antysensownego 40 DNA lub środek przenoszący metylację DNA zależną od RNA.

7

EP 2 934 093 B1

[0036] W innym korzystnym wykonaniu systemu genetycznego środkami, które specyficznie zaburzają sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję są: nukleazy palca cynkowego, nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN), CRISPR lub meganukleaza. [0037] W dalszym korzystnym wykonaniu systemu genetycznego środkiem ratującym jest zmodyfikowana 5 wersja sekwencji genu wykazującego haploinsuficjencję. Korzystnie, zmodyfikowana wersja sekwencji genu wykazującego haploinsuficjencję jest odporna na środki, które specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub które specyficznie zaburzają sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. Jest ponadto korzystne, aby środek ratujący dodatkowo obejmował gen efektorowy. W innym korzystnym wykonaniu systemu 10 genetycznego według niniejszego wynalazku, gen efektorowy jest wybrany z grupy genu oporności na wirusa gorączki denga, genu oporności na ludzką malarię, genu oporności na malarię ptasią, genu oporności na wirusa plamistego więdnięcia pomidora, genu odporności na herbicydy, genu owadobójczego, genu odporności na suszę, genu odporności na pasożytnicze nicienie i genu zapewniającego lepszą wydajność roślin. 15 [0038] W innym szczególnie korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, system genetyczny składa się lub jest dostarczony w postaci ruchomego elementu genetycznego, plazmidu lub egzogennego DNA zdolnego do integracji genomowej. [0039] W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania systemu genetycznego zawierającego następujące składniki: a) środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu 20 wykazującego haploinsuficjencję; oraz b) środek ratujący, zdolny do zwiększenia zmniejszonej ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję wystarczający do transformacji organizmu eukariotycznego, pod warunkiem, że organizmem tym nie jest człowiek, przy czym transformacja jest przeprowadzana jednocześnie i przy czym środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i środek ratujący są obecne w tym samym transgenicznym locus. 25 [0040] W niniejszym opisie ujawniono ponadto zastosowanie systemu genetycznego jak tu określony do zmniejszenia jego introgresji do populacji w przeciwnym razie zdolnych do krzyżowania organizmów rozmnażających się płciowo, pod warunkiem, że tym organizmem nie jest człowiek. [0041] Ujawnione jest również, że spadek w introgresji oznacza zapobieganie introgresji, skutkujące eliminacją lub ograniczeniem rozmnażania płciowego potomstwa hemizygotycznego. 30 [0042] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy genetycznie zmodyfikowanego organizmu eukariotycznego, pod warunkiem, że tym organizmem nie jest człowiek, obejmując (a) środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję; i (b) środek ratujący zdolny do zwiększenia zmniejszonej ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, przy czym organizmem jest organizm potencjalnie rozmnażający się płciowo, przy czym wymienione środki do specyficznego 35 zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i wymieniony środek ratujący są obecne w tym samym transgenicznym locus, a wymienionym organizmem jest roślina lub owad. Korzystnie, wymienione środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję lub specyficznie zaburzają sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. W 40 korzystnym wykonaniu środki specyficznie degradujące lub inaktywujące obejmują siRNA, miRNA, cząsteczkę antysensownego RNA, cząsteczkę antysensownego DNA lub środek przenoszący metylację 8

EP 2 934 093 B1

DNA zależną od RNA. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu środkami, które specyficznie zaburzają sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję są: nukleazy palca cynkowego, nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN), CRISPR lub meganukleaza. Ponadto korzystne jest, aby wymieniony środek ratujący był zmodyfikowaną wersją sekwencji genu wykazującego 5 haploinsuficjencję. W dalszym korzystnym przykładzie wykonania niniejszego wynalazku zmodyfikowana wersja tej sekwencji genu wykazującego haploinsuficjencję jest odporna na środki, które specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu z haploinsuficjencją, lub które specyficznie zaburzają sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. Środek ratujący może, w korzystnym wykonaniu, dodatkowo obejmować gen efektorowy. Gen efektorowy może być korzystnie 10 wybrany z grupy genu oporności na wirus gorączki denga, genu oporności na malarię ludzką, genu oporności na malarię ptasią, genu oporności na wirusa plamistego więdnięcia pomidora, genu odporności na herbicydy, genu owadobójczego, genu odporności na suszę, genu odporności na pasożytnicze nicienie i genu dającego lepszą wydajność roślin. [0043] W dalszym korzystnym wykonaniu dotyczącym organizmu zmodyfikowanego genetycznie, jak 15 zdefiniowany powyżej w niniejszym dokumencie, sekwencja prowadząca do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, zawiera sekwencje zaburzające oflankowane przez miejsca rozpoznawalne specyficzne wobec miejsca dla rekombinazy, korzystnie Cre lub FLP, umożliwiające wytworzenie j sekwencji prowadzącej do dostarczenia 20 środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję. Korzystne jest, aby środki do zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i środek ratujący, zdolny do zwiększenia zmniejszonej ekspresji tego genu wykazującego haploinsuficjencję, były zawarte w konstrukcie charakteryzującym się poddominacją. [0044] W kolejnym wykonaniu genetycznie zmodyfikowany organizm jest homozygotyczny pod względem 25 konstruktu charakteryzującego się poddominacją. W alternatywnym wykonaniu organizm genetycznie zmodyfikowany jest hemizygotyczny pod względem konstruktu charakteryzującego się poddominacją. [0045] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku genetycznie zmodyfikowany organizm ma obniżone dostosowanie konkurencyjne w porównaniu z organizmem homozygotycznym pod względem wymienionego konstruktu charakteryzującego się poddominacją. 30 [0046] W dalszym korzystnym wykonaniu gen wykazujący haploinsuficjencję jak wymieniono powyżej w niniejszym dokumencie, jest genem endogennego cytoplazmatycznego białka rybosomalnego (CRP), czynnika transkrypcyjnego, genem supresorowym guza, genem związanym z funkcją mięśni, genem kodującym białko homeodomenowe lub innym genem z dowodem wskazującym że wykazuje potencjalnie haploinsuficjencję w określonym organizmie. Szczególnie korzystne jest, aby wymienionym genem 35 wykazującym haploinsuficjencję był Rpl14 lub Rpl23aA. [0047] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, organizm, jak wymieniono powyżej w niniejszym dokumencie, jest zwierzęciem przenoszącym chorobę, zwierzęciem wywołującym chorobę lub zwierzęciem hodowlanym, rośliną, grzybem lub pierwotniakiem. [0048] Wymienionym zwierzęciem przenoszącym chorobę jest korzystnie owad, pajęczak. Wymienionym 40 owadem jest korzystnie komar lub mucha. Wymienionym pajęczakiem jest, w korzystnym wykonaniu, kleszcz. Wymienionym gryzoniem jest, w korzystnym wykonaniu szczur lub mysz. 9

EP 2 934 093 B1

[0049] Wymienionym zwierzęciem wywołującym chorobę jest, w korzystnym wykonaniu jest nicień wywołujący chorobę u ludzi, nicień wywołujący chorobę u zwierząt lub nicień wywołujący chorobę u roślin. [0050] Wymienioną rośliną jest, w dalszym korzystnym wykonaniu, roślina rolnicza lub chwast. Korzystną rośliną rolniczą jest roślina uprawna, korzystniej rośliny zbożowe, rośliny okopowe, bulwy, nasiona 5 strączkowe, sorgo lub rośliny strączkowe; lub uprawa roślin cukrowniczych, korzystnie trzcina cukrowa lub burak cukrowy; lub rośliny oleiste, korzystniej rzepak, soja, palma oliwna, krokosz barwierski lub słonecznik. [0051] W kolejnym wykonaniu, roślina szkodnik jest rośliną inwazyjną, rośliną trującą lub rośliną wywołującą reakcje alergiczne u zwierząt, najchętniej u ludzi. [0052] W jeszcze innym wykonaniu, rośliną asą glony, korzystnie glony stosowane w produkcji biopaliw. 10 [0053] Ponadto korzystne jest, aby grzyb, jak wymieniono powyżej w niniejszym dokumencie, był grzybem toksycznym lub grzybem stosowanym w produkcji w bioreaktorze. Grzyb może, w konkretnym wykonaniu, pochodzić z rodzaju Saccharomyces lub Aspergillus.

OPIS FIGUR

[0054] 15 Na Figurze 1 przedstawiono konstrukt charakteryzujący się poddominacją. Pierwszym genem konstruktu jest knock-down RNAi dsRNA (średnio szary) pod kontrolą promotora UAS (czarny). Kieruje w 72-pz ekson 2 endogennego genu typu dzikiego RpL14+ (pozycja cytogenetyczna 66D8). Drugi gen (jasnoszary) konstruktu jest genem ratunkowym RpL14r który jest niewrażliwy na knock-down RNAi. RpL14r stanowi kompletny gen RpL14, w tym wszystkie jego genomowe regiony flankujące i części genów flankujących 20 (biały), w których strategicznie dokonano 14 synonimicznych podstytucji (14*) w eksonie 2. Na Figurze 2 przedstawiono strategię poddominacji haploinsuficyjnego ratowania przed trucizną według wykonań niniejszego wynalazku. Wszystkie muchy są w- na pierwszym chromosomie i mają kierowany aktyną GAL4 zrównoważony w stosunku do CyO dla drugiego chromosomu. Co ważne, insert elementu p aktyna5c-GAL4 jest oznaczony jako mini-biały, więc wszystkie muchy są skutecznie typu dzikiego pod 25 względem bieli. Fig. 2 (A) przedstawia homozygotyczne muchy typu dzikiego (GFP), które mają dwie kopie endogennego genu RpL14 o prawidłowymi poziomami ekspresji. Fig. 2 (B) przedstawia heterozygoty (RFP/GFP){Ud}86, dsRNAi, aktywowane przez układ binarny GAL4-UAS, ukierunkowany na endogenną ekspresję RpL14 knock-down RpL14. Ten knock-down RpL14 jest częściowo ocalony przez kopię ratunkową, RpL14r, która jest zaprojektowana tak, że ma być odporna na dsRNAi. Fig. 2 (C) pokazuje 30 homozygoty (RFP){Ud}86, gdzie obecne są dwie kopie ratunkowe RpL14r, aby przezwyciężyć efekt haploinsuficjencji, mając funkcjonalnie mniej niż dwie kopie ekspresji RpL14. Na Figurze 3 pokazano sekwencję dsRNA RpL14., jej cel RpL14+ i niewrażliwy gen RpL14r. Dalej, przedstawiony jest cały ekson 2 z RpL14. Trzy segmenty biegną nieprzerwanie od 5’ do 3’ od lewej do prawej od segmentów bloku A do linkera do bloku B i są tutaj tylko rozbite i wklejone, aby pomóc w ilustracji. 35 Pierwszy wiersz sekwencji (SEQ ID NO: 15) pokazuje ukierunkowanie RNAi dsRNA RpL14. (sekwencja odwróconego powtórzenia nie jest pokazana). Dwa niesąsiadujące bloki sekwencji są ukierunkowane przez dsRNARpL14. Linker między blokiem A i B jest pozycjonowany arbitralnie i nie ma podobieństwa z żadną inną sekwencją. Pionowe linie pokazują podobieństwo między dsRNA i genami RpL14+ (SEQ ID NO: 16) i RpL14r (SEQ ID NO: 17). Chociaż RpL14+ jest skutecznie ukierunkowany do RNAi, liczba i rozmieszczenie

10

EP 2 934 093 B1

14 synonimicznych mutacji w RpL14r zapobiega temu samemu stopniowi knock-down przez RNAi i ratuje ekspresję RpL14. Figura 4 wyobraża schemat w skali, plazmidu zawierającego pUASattB {Ud}, który wstrzyknięto do zarodków much w celu umieszczenia konstruktu w miejscu docelowym oznaczonym RFP przy użyciu 5 systemu integracji opartego na phiC31. Sekwencja DNA jest podana w dołączonym pliku formatu banku genów. Na Figurze 5 pokazano ilość mRNA RpL14 u dorosłych i larw w stosunku do trzech genów normalizacyjnych. Wysokości słupków wskazują całkowitą ilość RpL14 na podstawie ilościowej PCR z odwrotną transkrypcją opartej na zieleni SYBR, a każdy słupek jest podzielony, aby reprezentować odsetek 10 całkowitego RpL14 eksprymowanego z genu RpL14r w {Ud} 86 (biały) i endogennego genu RpL14+ (czarny), w oparciu o sondy TaqMan specyficzne dla genu. Słupki błędów reprezentują 1 błąd standardowy dla trzech powtórzeń biologicznych. Na Figurze 6 pokazano poziomy genotypowe całkowitej ekspresji mRNA RpL14, bez ekspresji GAL4. Przedstawiona jest ilość mRNA RpL14 u dorosłych męskich genotypów (dwa lewe słupki) i dorosłych samic 15 (2 prawe słupki) przy braku ekspresji Act5C-GAL4, względem trzech genów normalizacyjnych. Wysokości słupków wskazują całkowitą ilość RpL14 na podstawie ilościowej PCR z odwrotną transkrypcją opartej na zieleni SYBR, w tej samej skali, jak pokazano na Fig. 5, a każdy słupek jest podzielony, aby reprezentować odsetek całkowitego RpL14 eksprymowanego z genu RpL14r w {Ud}86 (biały) i endogennego genu RpL14+ (czarny), w oparciu o sondy TaqMan specyficzne dla genu. Słupki błędów reprezentują 1 błąd standardowy 20 dla trzech powtórzeń biologicznych. Na Figurze 7 przedstawiono czas rozwoju jaja do dorosłego oraz przeżycie. Fig. 7 (A) pokazuje łączny ułamek przepoczważania w dorosłych w każdym dniu rozwoju. Samice są oznaczone liniami ciągłymi, a samce liniami przerywanymi. Liczby w legendzie podają średni czas przepoczważania dla każdego genotypu w dniach. Różnica między homozygotami w czasie rozwoju nie jest istotna (samce test 25 Kołmogorowa-Smirnova D = 0,0749, n1 = 674, n2 = 566, P = 0,0634; samice test D KS = 0,0445, n1 = 778, n2 = 715, P = 0,452). Różnica między spulowanymi homozygotami a heterozygotami w czasie rozwoju jest wysoce istotna (test K-S u samców D = 0,272, n1 = 1240, n2 = 966, P = 2,56 × 10-35; samice, test K-S D = 0,292, n1 = 1493, n2 = 1149, P = 1,64 × 10-48). Fig. 7 (B) pokazuje względną obfitość potomstwa z różnych krzyżówek. Kolumny odpowiadają odsetkowi genotypów potomstwa z każdego rodzaju krzyżówki. Etykiety 30 u dołu wskazują genotypy rodzicielskie. Średni odsetek homozygot został ustalony na 1. We wszystkich przypadkach występuje niedobór heterozygot, które przeżywają do przepoczważanie w stosunku do homozygot. Poziomy pasek wskazuje oczekiwany względny odsetek heterozygot. We wszystkich przypadkach niedobór heterozygotyczny jest istotny (od lewej do prawej, d.f. = 2, χ2 = 24,37, P = 5 × 10- 6; df = 1, χ2 = 8,33, P = 0,0039; df = 1, χ2 = 11,34, P = 0,000759; df = 1, χ2 = 4,40, P = 0,0359; df = 1, χ2 35 = 37,68, P <10-6). Na Figurze 8 pokazano eksperymenty populacji {Ud} 86 wykazujące poddominację. Fig. 8 (A) pokazuje wyniki wielopokoleniowych eksperymentów populacyjnych dostarczających zmianę częstości osobników transgenicznych (+/{Ud} 86 i {Ud} 86/{Ud} 86) z różnych częstości początkowych (szare linie). Populacje z wartościami początkowymi wyższymi niż szacowany próg 0,61 (prosta pogrubiona linia przerywana) 40 przechodzą do utrwalenia, podczas gdy te poniżej dają utratę {Ud} 86 (zweryfikowaną przez krzyżówki i PCR we wszystkich 12 populacjach). Linie przerywane wskazują przewidywane trajektorie przy braku dryfu 11

EP 2 934 093 B1

genetycznego i błędu próbkowania, przy szacunkowym maksymalnym prawdopodobieństwie (MLE) parametrów dostosowania przedstawionych w częściach B i C (12). Fig. 8 (B) pokazuje powierzchnię prawdopodobieństwa względnych ocen dostosowania. Dostosowanie wnioskuje się ze zmiany częstości alleli w A; {Ud} 86/{Ud} 86 = 0,71 (0,62-0,81 95% C.I.) i +/{Ud} 86 = 0,22 (0,16-0,28, 95% C.I.) Fig. 8 (C) 5 pokazuje szacunki MLE dostosowania genotypów transgenicznych. Słupki błędów wskazują przedziały ufności oszacowane w części B. Na Figurze 9 zilustrowano związek między całkowitą obfitością mRNA RpL14 dorosłych i ogólnym dostosowaniem w ciągu życia, oszacowany na podstawie zmian częstości alleli między pokoleniami. Zmniejszenie ekspresji jest zgodne ze zmniejszeniem dostosowania. Wykreślone tutaj dane są takie same, 10 jak te zastosowane na Fig. 5 i Fig. 8. Dane dla samców są wykreślane w kwadratach, a dla samic w kołach. Jasnoszary oznacza genotypy +/+, średni szary wskazuje homozygoty {Ud} 86/{Ud} 86, a czarny wskazuje hemizygoty {Ud} 86/+. Dopasowane linie regresji najmniejszych kwadratów dla samców i samic podano wyłącznie w celach ilustracyjnych. Na Figurze 10 przedstawiono dane dotyczące stabilności geograficznej. Figura pokazuje połączone 15 populacje, które są reprezentowane jako koła (jasnoszary dla typu dzikiego i ciemnoszary dla populacji transformowanej {Ud} 86). Jeśli transformowana jest jedna populacja docelowa (środek), migracja może spowodować dwa niepożądane przejścia; upadek transformacji populacji poprzez utratę {Ud}86 z populacji docelowej (po lewej) lub rozprzestrzenienie się {Ud}86 przez transformację sąsiedniej populacji typu dzikiego (po prawej). Dla szybkości migracji 0,065 co pokolenie i przy konfiguracji dostosowania podanej 20 na Fig. 8B; zanikanie może wystąpić tylko wtedy, gdy częstość {Ud}86 spadnie poniżej <0,77; rozprzestrzenianie się może wystąpić tylko wtedy, gdy {Ud}86 osiągnie >0,53 częstości w sąsiadującej populacji typu dzikiego. Symulacje uwzględniające dryf wskazują, że dla populacji powyżej 25 osobników względne prawdopodobieństwo zanikania jest zasadniczo nieskończenie większe niż w przypadku rozprzestrzeniania się. 25 Na Figurze 11 przedstawiono schemat konstruktu {Ud} ukierunkowanego na gen Aradabopsis thaliana RpL23aA i odpowiedni plazmid kontrolny transformacji. S35 = promotor, OCS = terminator, rbcs = terminator i ratunkowy = gen RpL23aA z regionami flankującymi, w których wprowadzono podstawienia synonimiczne. W plazmidzie kontrolnym eksprymowane są tylko białka fluorescencyjne z dwóch promotorów S35, podczas gdy w funkcjonalnym plazmidzie {Ud} eksprymowane są dwa geny miRNA 30 ukierunkowane na dwa regiony RpL23aA. Genem ratunkowym w obu plazmidach jest pełny gen RpL23aA, obejmujący regiony flankujące, gdzie wprowadzono mutacje synonimiczne, aby uczynić go niewrażliwym na knock-down docelowego RNAi (patrz także fig. 12). Lox = miejsca rozpoznawania rekombinazy CRE, które można wykorzystać do usunięcia genu ratunkowego in vivo w celu określenia fenotypu nie ocalonego knock-down przez geny miRNA. 35 Na Figurze 12 przedstawiono dopełnienie ukierunkowanych sekwencji miRNA eksprymowanych w genach miRNA miRNA1 i miRNA2 pokazanych na figurze 11. Sekwencje ukierunkowanego miRNA są podobne, ale nie identyczne z sekwencjami wycelowanymi w RpL23aA, jak opisano w sposobie Schwab i in. The Plant Cell, t. 18, 1121–1133. Pokazano również sekwencję genu ratunkowego, w której mutacje synonimiczne wprowadzono do kopii RpL23aA (ratowanie). Częstotliwość i pozycja synonimicznych 40 mutacji mają na celu uczynienie tego genu niewrażliwym (lub zasadniczo takim) na redukcję przez ukierunkowany miRNA. Pokazana jest również odpowiednia sekwencja RpL23aB, która wykazuje wysoki 12

EP 2 934 093 B1

stopień podobieństwa sekwencji do RpL23aA. Lokalizacja i podobieństwa w sekwencji RpL23aB powinny skutkować ograniczoną wrażliwością na ukierunkowanie miRNA względem RpL23aA.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

[0055] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu zmniejszania konkurencyjnego dopasowania organizmu 5 eukariotycznego hemizygotycznego pod względem locus transgenicznego w porównaniu z organizmem homozygotycznym pod względem locus transgenicznego, pod warunkiem, że organizm nie jest człowiekiem, obejmującego etapy: a) zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie, przy czym zmniejszanie jest przenoszone przez transgeniczny locus w organizmie; i b) ratowania zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym ratowanie jest przenoszone przez ten sam 10 transgeniczny locus w organizmie, dając organizm, który jest mniej konkurencyjnie dopasowany, jeśli jest hemizygotyczny pod względem transgenicznego locus niż homozygotyczny pod względem transgenicznego locus. [0056] Chociaż niniejszy wynalazek zostanie opisany w odniesieniu do konkretnych wykonań, opisu tego nie należy interpretować w sensie ograniczającym. Przed szczegółowym opisaniem przykładowych 15 wykonań niniejszego wynalazku podano definicje ważne dla zrozumienia niniejszego wynalazku. [0057] W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie i załączonych zastrzeżeniach, formy liczby pojedynczej obejmują również odpowiednie formy liczby mnogiej, chyba że kontekst wyraźnie wskazuje inaczej. [0058] W kontekście niniejszego wynalazku, określenia „około” i „w przybliżeniu” oznaczają przedział 20 dokładności, który specjalista w dziedzinie zrozumie, aby nadal zapewniać efekt techniczny danej cechy. Określenie zazwyczaj wskazuje odchylenie od wskazanej wartości liczbowej ± 20%, korzystnie ± 15%, korzystniej ± 10%, a jeszcze korzystniej ± 5%. W niektórych aspektach, określenie „około” może także odnosić się do wartości, która jest większa lub mniejsza o kilka liczb całkowitych, korzystnie o 5, 4, 3, 2 lub 1 w porównaniu z wartością początkową. 25 [0059] Należy rozumieć, że określenie „obejmujący” nie jest ograniczające. Do celów niniejszego wynalazku, określenie „składający się z” jest uważane za korzystne wykonanie określenia „obejmujący”. Jeśli w dalszej części niniejszego dokumentu zdefiniowano grupę obejmującą co najmniej pewną liczbę wykonań, ma to obejmować również grupę, która korzystnie składa się tylko z tych wykonań. Jeżeli określenie „obejmujący” jest stosowane w kontekście sekwencji, w szczególności sekwencji 30 nukleotydowych, określenie to może odnosić się nie tylko do sekwencji wymienionej w liście sekwencji, ale także do jej sekwencji komplementarnej, chyba że z kontekstu wynika inaczej. [0060] Ponadto określenia „pierwszy”, „drugi”, „trzeci” lub „(a)”, „(b)”, „(c)”, „(d)” lub „(i)”, „(ii)”, „(iii)”, „(iv)”, „(v)”, „(vi)”, „(vii)” itp. i tym podobne w opisie i zastrzeżeniach służą do rozróżnienia między podobnymi elementami, a niekoniecznie do opisu porządku sekwencyjnego lub chronologicznego. Należy rozumieć, 35 że tak stosowane określenia są wymienne w odpowiednich okolicznościach i że opisane w niniejszym dokumencie wykonania wynalazku są zdolne do działania w innych sekwencjach niż opisane lub zilustrowane w niniejszym dokumencie. [0061] W przypadku, gdy określenia „pierwszy”, „drugi”, „trzeci” lub „(a)”, „(b)”, „(c)”, „(d)” lub „(i)”, „(ii)”, „(iii)”, „(iv)”, „(v)”, „(vi)”, „(vii)” itd. odnoszą się do etapów sposobu lub zastosowania, nie ma spójności czasowej 40 ani przedziału czasowego między etapami, tj. etapy mogą być przeprowadzane jednocześnie lub mogą

13

EP 2 934 093 B1

istnieć odstępy czasu w sekundach, minutach, godzinach, dniach, tygodniach, miesiącach lub nawet latach między takimi etapami, chyba że w zgłoszeniu lub zastrzeżeniach określonych w niniejszym dokumencie powyżej lub poniżej, podano inaczej. [0062] Należy rozumieć, że niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do konkretnej metodologii, 5 protokołów, białek, bakterii, wektorów, reagentów itp. opisanych w niniejszym dokumencie, ponieważ mogą się one zmieniać. Należy również rozumieć, że terminologia stosowana w niniejszym dokumencie służy wyłącznie opisowi konkretnych wykonań i nie ma na celu ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku, który będzie ograniczony jedynie załączonymi zastrzeżeniami. O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie stosowane w niniejszym dokumencie określenia techniczne i naukowe mają takie same znaczenia, jak 10 powszechnie rozumiane przez przeciętnego specjalistęw dziedzinie. [0063] Jeśli nie zdefiniowano inaczej, określenia użyte w niniejszym dokumencie mogą pochodzić z „A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations), Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. i Kölbl, H. red. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Bazylea, Szwajcaria. O ile nie zdefiniowano inaczej, określenia użyte w kontekście ewolucji lub dziedziczenia mogą pochodzić z Hartl, D. L. i Clark, A. 15 G. Principles of Population Genetics., Sinauer Associates: 1997. [0064] Jak ustalono powyżej, niniejszy wynalazek dotyczy w jednym aspekcie sposobu zmniejszania konkurencyjnego dopasowania organizmu eukariotycznego, hemizygotycznego pod względem locus transgenicznego w porównaniu z organizmem eukariotycznym homozygotycznym pod względem locus transgenicznego, pod warunkiem, że organizm nie jest człowiekiem, obejmującego etapy: (a) zmniejszania 20 ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie, przy czym zmniejszenie jest przenoszone przez transgeniczny locus w organizmie; i (b) ratowania zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym to ratowanie jest przenoszone przez ten sam transgeniczny locus w organizmie, dając organizm, który jest mniej zdolny do konkurowania, jeśli jest hemizygotyczny pod względem transgenicznego locus niż homozygotyczny pod względem transgenicznego locus. 25 [0065] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „dostosowanie konkurencyjne” odnosi się do przeciętnej zdolności organizmów o określonym genotypie do przetrwania i rozmnażania się w środowisku naturalnym. Całkowita utrata dostosowania konkurencyjnego może prowadzić do braku żywotności i/lub bezpłodności organizmu. „Prawidłowe dostosowanie konkurencyjne” w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie odnosi się do przeciętnej zdolności do przeżycia i/lub rozmnażania się u osobników 30 lub organizmów, które nie zawierają konstruktu charakteryzującego się poddominacją według niniejszego wynalazku. „Zmniejszone dostosowanie konkurencyjne” lub stan „mniejszego dostosowania konkurencyjnego” organizmu, odnosi się do zmniejszenia żywotności organizmu i/lub płodności i/lub jego zdolności do przyciągania partnerów i/lub płodności. Takie zmniejszenie może nie być śmiertelne dla organizmu, jednak zmniejsza jego zdolność do przeżycia i/lub reprodukcji. Takie zmniejszenie może 35 obejmować zmniejszenie dostosowania organizmu o około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami w porównaniu do organizmu o prawidłowym dostosowaniu konkurencyjnym, jak zdefiniowano powyżej. Zmniejszenie można zmierzyć, określić lub wywnioskować zgodnie z dowolną odpowiednią procedurą. Na przykład, przeżycie organizmu w środowisku można określić po określonym czasie, np. w granicach 10%, 15%, 20%, 25%, 40 30%, 35%, 40%, 45% 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% typowego okresu pokolenia. Płodność można określić na podstawie liczby potomstwa w porównaniu ze średnią wartością w obrębie gatunku lub grupy osobników 14

EP 2 934 093 B1

gatunku. Względne dostosowanie konkurencyjne genotypów można wywnioskować na podstawie zmian częstości alleli między pokoleniami, np. według Catteruccia i in., Science 299, 2001-2003 (2003), przy użyciu odpowiednich ram statystycznych (np. bazując na Clark i in., Heredity 46, 321-46 (1981)). Dalsze szczegóły można uzyskać z Fig. 8 niniejszego zgłoszenia. Alternatywnie, względne dostosowanie 5 konkurencyjne genotypów można oszacować, mierząc cechy historii życia w jednym pokoleniu, które prawdopodobnie przyczynią się do dostosowania konkurencyjnego. Takie cechy mogą obejmować lub być wybrane spośród płodności, zmienności, masy osobników, atrakcyjności płciowej, liczby wytworzonych gamet, tempa wzrostu i/lub mobilności w jednym pokoleniu. Dalsze szczegóły mogą pochodzić z Irvin i in., PNAS, 101, 891-6 (2004) lub Amenya i in., Insect Molecular Biology 19, 263-269 (2010). 10 [0066] W dalszych konkretnych wykonaniach, redukcja dostosowania konkurencyjnego może również znaleźć odzwierciedlenie w wydajności, wynikach pracy lub produkcji związków lub materiału. Na przykład, roślinę, w szczególności odmianę rośliny, można uznać za mającą zmniejszone dostosowanie konkurencyjne, jeśli wydajność, wyniki pracy lub osiągnięta produkcja zostaną zredukowane. [0067] W kontekście zwierząt, fenotyp powodujący obniżenie konkurencyjnego dostosowania może być 15 spowodowany zmniejszeniem ekspresji przed i po gastrulacji zarodka. W takim scenariuszu, fenotyp może być pokazany na późniejszych etapach. W bardzo konkretnych wykonaniach, sposoby i wykonania, jak opisane w niniejszym dokumencie, wykluczają sposoby, które są wyłącznie zależne od środków zmniejszających ekspresję genów w organizmie, przy czym to zmniejszenie jest przenoszone przez matczyne odkładanie RNA lub białek lub modyfikację DNA, co daje fenotyp letalny zarodka i gdy ekspresja 20 zygotyczna przed zarodkową gastrulacją genów transgenicznych zapewnia ratunek oprzed tym fenotypem letalnym. W szczególności, opisane w niniejszym dokumencie sposoby i wykonania wyraźnie wykluczają sposoby lub podejścia opisane w Chen i in. Science 316, 597 (2007) lub Marshall i in., The Journal of heredity 102, 336-41 (2011). [0068] W dalszych, bardzo specyficznych wykonaniach sposobach lub wykonaniach, jakie opisano w 25 niniejszym dokumencie, wyklucza się sposoby lub podejścia, w których w jednym locus są obecne więcej niż dwa mechanistycznie różne konstrukty transgeniczne, reprezentując różne allele tego samego transgenicznego locus, i gdzie więcej niż jeden allel ma utrzymywać się z umiarkowaną częstością w stabilnej równowadze, w zastosowaniach do transformacji populacji. W szczególności, opisane w niniejszym dokumencie sposoby i wykonania wyraźnie wykluczają sposoby lub podejścia opisane w Davis 30 i in., Journal of theoretical biology, 212, 83-98 (2001). Konkretniej, sposoby i wykonania, jak opisane w niniejszym dokumencie wyraźnie wykluczają sposoby lub podejścia, jak opisane w prawym górnym rogu Ffig. 4 z Davis i in., Journal of theoretical biology, 212, 83-98 (2001). [0069] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „hemizygotyczny dla locus transgenicznego” oznacza, że w organizmie diploidalnym lub poliploidalnym, transgeniczny locus jest obecny tylko z jednym 35 transgenicznym allelem na locus, na genom, na homologiczną parę lub grupę chromosomów. W organizmach poliploidalnych może występować więcej niż jedna para homologicznych chromosomów. W obrębie tej grupy chromosomów, transgeniczny locus może występować tylko z jednym transgenicznym allelem. W przypadku, gdy funkcjonalnie równoważne, ale niehomologiczne pary chromosomów są obecne w organizmie poliploidalnym, transgeniczny locus może występować z jednym transgenicznym allelem 40 tylko w tej grupie chromosomów. W przypadku organizmu diploidalnego, hemizygotyczność dla transgenicznego locus zasadniczo równa się heterozygotyczności dla tego transgenicznego locus. 15

EP 2 934 093 B1

Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „heterozygotyczny dla transgenicznego locus” oznacza, że w organizmie diploidalnym, transgeniczny locus jest obecny tylko z jednym transgenicznym allelem. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „homozygotyczny dla transgenicznego locus” oznacza, że w organizmie diploidalnym lub poliploidalnym, transgeniczny allel jest obecny w określonym locus na obu 5 lub wszystkich kopiach określonego chromosomu. W organizmach poliploidalnych, w których może występować więcej niż jedna para chromosomów homologicznych, określenie homozygotyczny może obejmować sytuacje, w których w transgenicznym locus obecny jest więcej niż jeden transgeniczny allel. Taki allel może być odpowiednio obecny z tyloma kopiami, ile chromosomów jest obecnych w tej grupie. [0070] W przypadku, gdy funkcjonalnie równoważne, ale niehomologiczne pary chromosomów są obecne 10 w organizmie poliploidalnym, określenie homozygotyczny obejmuje sytuacje, w których w transgenicznym locus występuje więcej niż jeden allel transgeniczny. Taki allel może odpowiednio występować z tyloma kopiami, ile chromosomów jest obecnych w tej grupie. [0071] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „chromosomy homologiczne” odnosi się do par chromosomów o w przybliżeniu tej samej długości, pozycji centromeru i wzorze wybarwienia, 15 zawierających geny dla tych samych cech w odpowiednich loci. Zazwyczaj, jeden chromosom homologiczny jest dziedziczony od żeńskiego rodzica organizmu; drugi od męskiego rodzica organizmu. Chromosomy homologiczne zazwyczaj nie są całkowicie identyczne, ale mogą nieść ten sam rodzaj informacji. „Funkcjonalnie równoważny, ale niehomologiczny chromosom” w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie może nieść podobny typ informacji jak chromosom homologiczny, ale może 20 wykazywać różnice w długości, pozycji centromeru, wzorze barwienia i/lub obecności genów w odpowiednich loci. Takie chromosomy są zwykle określane również jako chromosomy homologiczne. Takie chromosomy, które mogą pochodzić z podgenomów rodzicielskich, mogą się zazwyczaj wiernie parować podczas mejozy, co prowadzi do dziedziczenia disomicznego. W konkretnych wykonaniach może wystąpić 4-krotne parowanie prowadzące do dziedziczenia tetrasomicznego lub odpowiedników wyższego rzędu. 25 [0072] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „locus transgeniczny”, odnosi się do miejsca genomowego stabilnej integracji konstruktu charakteryzującego się poddominacją do chromosomu pary homologicznych lub grupy homologicznych chromosomów. Transgeniczny locus może odpowiednio obejmować wszystkie elementy lub sekwencje dostarczone w konstrukcie charakteryzującym się poddominacją, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Allele w tym transgenicznym locus mogą być 30 homozygotyczne, hemizygotyczne/heterozygotyczne lub typu dzikiego. W przypadku genotypu typu dzikiego, nie doszło do insercji transgenicznej. Locus zawierający konstrukt charakteryzujący się poddominacją może, w niektórych wykonaniach, być również cisgeniczny. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „cisgeniczny” oznacza, że locus może zawierać tylko geny lub elementy genetyczne pochodzące od blisko spokrewnionych organizmów lub od organizmów, które w przeciwnym 35 razie mogłyby być hodowane konwencjonalnie. W dalszych wykonaniach locus zawierający konstrukt charakteryzującym się poddominacją może również być wewnątrzgenowy, tj. pochodzący z tego samego genomu, famigeniczny, tj. pochodzący od gatunku z tej samej rodziny lub linegeniczny, tj. pochodzący od gatunku z tej samej linii. W konkretnych wykonaniach wynalazku miejsce genomowe stabilnej integracji konstruktu charakteryzującego się poddominacją do chromosomu pary homologicznych lub grupy 40 homologicznych chromosomów może odbywać się w jednym locus, zapewniając w ten sposób pojedynczy transgeniczny locus w organizmie, lub w wielu loci, zapewniając w ten sposób wiele transgenicznych loci 16

EP 2 934 093 B1

w organizmie. Wiele loci może różnić się pod względem chromosomów, na których się znajdują, np. jeden locus na chromosomie 1, kolejne na chromosomie 2 itd. i/lub pod względem pozycji w chromosomie, np. jeden locus na ramieniu p, inny locus na ramieniu q itd. Niniejszy wynalazek przewiduje również dalsze różnice i wszystkie odpowiednie pozycje lokalizacji w genomie organizmu. 5 [0073] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „allel w transgenicznym locus” odnosi się do wariantów sekwencji w transgenicznym locus. Allele w tym transgenicznym locus mogą być homozygotyczne, hemizygotyczne/heterozygotyczne lub typu dzikiego. Allel typu dzikiego oznacza, że nie ma transgenicznego insertu w miejscu insercji w transgenicznym locus, który jest obecny w homozygotach i hemizygotach. W przypadku diploidalnego genotypu typu dzikiego oba allele typu dzikiego nie mają 10 insercji transgenicznej w miejscu insercji transgenicznego locus. [0074] „Konstrukt charakteryzujący się poddominacją” w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie oznacza konstrukt, który wywołuje poddominację zgodnie ze sposobem według wynalazku. Może zapewniać funkcjonalność lub środki, które umożliwią zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i/lub które zapewniają funkcjonalność lub środki, które umożliwią ratunek zmniejszonej 15 ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję. Konstrukt charakteryzujący się poddominacją może być wintegrowany do genomu organizmu, np. z plazmidu lub dowolnego innego możliwego do przeniesienia elementu genetycznego w celu transformacji organizmu. Integracja może odbywać się w jednej określonej pozycji lub w więcej niż jednej pozycji, co daje wiele kopii na locus. Liczba zintegrowanych konstruktów charakteryzujących się poddominacją może się zmieniać. Na przykład, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej 20 konstruktów charakteryzujących się poddominacją może być transformowanych i/lub może być obecnych w genomie organizmu, np. w odpowiedniej liczbie transgenicznych loci, jak zdefiniowano powyżej, lub w innej liczbie transgenicznych loci. Konstrukty mogą być, na przykład, obecne w jednym transgenicznym locus, np. jako powtórzenia tandemowe lub w dowolnej innej powtarzanej formie, lub mogą być obecne w 2, 3 lub więcej loci w genomie, np. na 2 lub więcej różnych chromosomach. 25 [0075] Konstrukt charakteryzujący się poddominacją może zawierać regiony flankujące na końcu 5’ i/lub 3’, korzystnie na obu końcach, które są homologiczne z regionami genomowymi transformowanego organizmu. Regiony flankujące mogą mieć dowolną odpowiednią długość, np. długość około 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 150, 170, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 nukleotydów lub więcej lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami. Regiony flankujące można wybrać 30 tak, aby integrację modyfikacji genetycznych można było przeprowadzić w sposób specyficzny dla miejsca, np. delecję genu lub elementu genetycznego, modyfikację sekwencji genomowej, rearanżację chromosomów itp. Homologiczne regiony flankujące mogą mieć komplementarność około 100% lub co najmniej 99%, 98%, 97%, 96%, 95 %, 85%, 80% lub 75% lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami, z sekwencją w genomie organizmu, który ma być transformowany. W przypadku lokalizacji na różnych 35 chromosomach, konstrukt charakteryzujący się poddominacją może być dostarczony z różnymi regionami flankującymi, np. regionem flankującym chromosomu A dla konstruktu 1 oraz regionami flankującymi chromosomu B dla konstruktu 2, przy czym konstrukt 1 i 2 zasadniczo różnią się tylko różnymi regionami flankującymi. Skuteczność tych podejść integracyjnych specyficznych dla miejsca można zwiększyć poprzez przejściową indukcję pęknięć podwójnych nici chromosomalnych, np. poprzez ekspresję TALEN 40 lub ZFN ukierunkowaną na zamierzone miejsce integracji.

17

EP 2 934 093 B1

[0076] Konstrukt charakteryzujący się poddominacją może w określonych wykonaniach obejmować tylko funkcjonalność lub środki, które umożliwiają zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję. Konstrukt charakteryzujący się poddominacją może odpowiednio zawierać sekwencję prowadzącą do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu 5 wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. Konstrukt charakteryzujący się poddominacją może, na przykład, zawierać sekwencję prowadzącą do dostarczenia siRNA, miRNA, cząsteczki antysensownego DNA lub antysensownego RNA, lub która umożliwia ekspresję nukleazy swoistej dla sekwencji, takiej jak nukleaza palca cynkowego, CRISPR, aktywność meganukleazy lub 10 TALEN. [0077] Konstrukt charakteryzujący się poddominacją może w alternatywnych wykonaniach obejmować jedynie funkcjonalność lub środki, które umożliwiają ratowanie zmniejszonej ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję. [0078] W dalszych korzystnych wykonaniach konstrukt charakteryzujący się poddominacją może zawierać 15 obie funkcjonalności, tj. funkcjonalność, która pozwala zmniejszyć ekspresję genu wykazującego haploinsuficjencję i funkcjonalność, która pozwala uratować zmniejszoną ekspresję genu wykazującego haploinsuficjencję. Konstrukt charakteryzujący się poddominacją może ponadto zawierać dalsze odpowiednie elementy. Na przykład, mogą być obecne geny lub elementy markerów optycznych lub wizualnych, geny oporności na antybiotyki, geny oporności na herbicydy, elementy promotora, elementy 20 wzmacniające, elementy terminatora itp. [0079] Szczególnie korzystne jest, aby konstrukt charakteryzujący się poddominacją, zawierał oprócz aktywności zmniejszającej i/lub ratującej, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie powyżej, gen efektorowy. Gen efektorowy może być dostarczony w postaci umożliwiającej jego ekspresję i/lub dostarczenie wyrażanego produktu białkowego. Dlatego można dostarczyć odpowiednie elementy 25 pomocnicze, np. element promotora, elementy terminatora, element wzmacniający itp. W niektórych wykonaniach, przewiduje się brak genu efektorowego w konstrukcie charakteryzującym się poddominacją. [0080] W bardzo szczególnym wykonaniu konstrukt charakteryzujący się poddominacją może zawierać sekwencje zaburzające, które umożliwiają inaktywację dowolnej sekwencji konstruktu charakteryzującego się poddominacją dostarczonej w obrębie sekwencji zaburzających lub pomiędzy nimi. Przewidywanymi 30 przykładami takich zaburzających sekwencji są miejsca rozpoznawania specyficzne dla miejsca dla rekombinazy. Miejsca rozpoznawania specyficzne dla miejsca dla rekombinazy mogą, na przykład, być dostarczone na końcu lub w pobliżu końca 5’ i 3’ sekwencji prowadzącej do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, jak określono w niniejszym dokumencie, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA 35 genu wykazującego haploinsuficjencję. [0081] Miejsca rozpoznawania specyficzne dla miejsca dla rekombinazy mogą, w alternatywnych wykonaniach, być dostarczone na końcu lub w pobliżu końca 5’ i 3’ sekwencji prowadzącej do dostarczenia środka, który umożliwia aktywację środków w celu zmniejszenia ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję. Przewiduje się ponadto, że miejsca rozpoznawania specyficzne dla miejsca dla 40 rekombinazy mogą być dostarczone na końcu lub w pobliżu końca 5’ i 3’ sekwencji zawierającej sekwencję prowadzącą do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub inaktywuje transkrypt lub produkt 18

EP 2 934 093 B1

ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję zdefiniowany w niniejszym dokumencie lub specyficznie zaburzający sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, i sekwencję prowadzącą do dostarczenia środka, który umożliwia ratunek zmniejszonej ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję. 5 [0082] Rekombinazy, które można zastosować do aktywacji lub inaktywacji genów obejmują sekwencje między miejscami rozpoznawania specyficznymi dla miejsca, będą znane specjalistom. Zastosowanie dowolnych odpowiednich miejsc rozpoznawania rekombinazy i jej podobnych jest tu przewidziane. Korzystne jest zastosowanie rekombinazy Cre lub rekombinazy FLP i ich odpowiednich miejsc rozpoznawania. Szczególnie korzystne jest stosowanie układów Cre-Lox lub ich pochodnych lub układów 10 FLP-FRT lub ich pochodnych. Przez dostarczanie miejsc rozpoznawania w bezpośredni powtarzany sposób, można uzyskać delecję sekwencji między powtórzeniami. Podobnie, dostarczając inne orientacje lub więcej niż dwa miejsca rozpoznawania mogą być możliwe dalsze wzorce przegrupowania, np. inwersja sekwencji. Dalsze szczegóły mogą pochodzić z Ryder i in. Genetics 167, 797-813 (2004); Golic & Golic Genetics 144, 1693-711 (1996); Ito i in., Development, 771, 761-771 (1997)). 15 [0083] W konkretnych wykonaniach gen rekombinazy może stanowić gen aktywacyjny zgodnie z niniejszym wynalazkiem tj. rekombinaza może prowadzić do aktywacji sekwencji, która specyficznie degraduje lub inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, lub zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. W dalszych konkretnych wykonaniach rekombinazę można także zastosować do celów 20 inaktywacji jednej lub więcej części opisanych w niniejszym dokumencie systemów genetycznych charakteryzujących się poddominacją. [0084] Aktywację lub inaktywację sekwencji, która specyficznie degraduje lub inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, lub która specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, można korzystnie 25 osiągnąć poprzez ekspozycję komórki in vivo na rekombinazę, np. rekombinazę Cre lub rekombinazę FLP. Ekspozycję in vivo można zrealizować dowolnymi odpowiednimi środkami. Rekombinazy do zastosowania w takim podejściu, tj. ekspozycji in vivo mogą być dostarczone na przykład zewnętrznie, np. białka można podawać organizmowi lub komórce lub mogą być dostarczone przez ekspresję wewnętrzną, np. w systemie ekspresyjnym, na plazmidzie lub systemie ekspresyjnym kodowanym genomowo. W dalszych 30 wykonaniach aktywność rekombinazy może być dostarczona z granicami samego konstruktu charakteryzującego się poddominacją, np. w obrębie sekwencji zaburzających lub specyficznych miejsc rozpoznawania rekombinazy na konstrukcie charakteryzującym się poddominacją. Ekspresja rekombinazy może odpowiednio prowadzić do usunięcia objętych nią sekwencji, w tym swojej własnej sekwencji. Ekspozycję in vivo można kontrolować dowolnym odpowiednim mechanizmem kontrolnym, np. poprzez 35 indukowalny promotor, taki jak promotor szoku cieplnego lub promotor indukowany przez związek dietetyczny. [0085] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „typ dziki” odnosi się do oczekiwanych poziomów ekspresji lub konkurencyjnego dostosowania, które mogą być powszechnie spotykane u osobników z gatunku, które nie mają integracji genomowej konstruktu charakteryzującego się poddominacją według 40 niniejszego wynalazku. W przypadku odmian roślin, określenie to może się konkretnie odnosić do oczekiwanych poziomów ekspresji lub konkurencyjnego dostosowania, które prawdopodobnie będą 19

EP 2 934 093 B1

powszechnie spotykane u osobników tej samej odmiany bez konstruktu charakteryzującego się poddominacją według niniejszego wynalazku. [0086] Transgeniczny locus lub pochodne locus, jak wspomniano powyżej mogą obejmować lub być związane z jednym lub więcej genów efektorowych lub mogą nie obejmować lub być związane z genem 5 efektorowym. Można przewidzieć nieobecność genu efektorowego w przypadkach, w których transgeniczny locus per se przekazuje efekt molekularny, np. odporność na choroby wirusowe. Rozumie się, że zdolność niektórych wirusów do replikacji w komórkach może być bardzo wrażliwa na cytoplazmatyczną ekspresję białka rybosomowego (patrz np. Cherry i in., Genes & development, 19, 445- 52 (2005)). Gdy docelowy gen wykazujący haploinsuficjencję odgrywa rolę w redukowaniu przenoszenia 10 choroby, można sobie wyobrazić, że oporność na chorobę może być całkowicie lub częściowo nadawana przez konstrukt charakteryzującym się poddominacją przy braku jakichkolwiek dodatkowych genów efektorowych. Geny efektorowe mogą być również nieobecne w konstrukcie transgenicznym, jeśli gen efektorowy jest obecny w innym locus transgenicznym. Geny efektorowe mogą ponadto być nieobecne w konstrukcie transgenicznym, gdy są stosowane do celów ochrony biologicznej w rodzie odmiany, gdzie 15 cechy agronomiczne są, na przykład, rozmieszczone w innych miejscach niezwiązanych lub słabo związanych z transgenicznym locus. W konkretnym wykonaniu, można to wdrożyć, gdy próbuje się zastosować konstrukt charakteryzujący się poddominacją, aby zapewnić prawdziwą hodowlę konwencjonalnej elitarnej odmiany, gdzie cechy agronomiczne były rozmieszczone w całym genomie często w niezidentyfikowanych loci. W kolejnym przykładzie implementacją może być ochrona biologiczna 20 odmiany, która wcześniej była genetycznie zmodyfikowana, np. przez integrację genomową konstruktu transgenicznego, który nadawał cechę agronomiczną, ale który sam nie wykazywał poddominacji. [0087] Przykłady transgenów, które mogą być zintegrowane z genomami bez użycia konstruktów charakteryzujących się poddominacją lub jako geny efektorowe w kontekście opisanych w niniejszym dokumencie konstruktów charakteryzujących się poddominacją, można zidentyfikować na podstawie 25 dowolnej odpowiedniej bazy danych. Korzystny jest rejestr genów prowadzony w biologicznej izbie rozrachunkowej (BCH) jako część Cartagena Biological Protocol on Biodiversity. Dostęp do bazy danych można na przykład uzyskać za pośrednictwem https://bch.cbd.int/database/gene-registry/. [0088] Przykłady transgenów lub genów efektorowych, które można zintegrować z genomami bez użycia konstruktów charakteryzującym się poddominacjąch lub które można zastosować jako geny efektorowe w 30 kontekście opisanych konstruktów charakteryzujących się poddominacją obejmują (z identyfikacją BCH/numerem dostępu w nawiasach): peptyd 7Crp (BCH ID nr: 46121), dioksygenazę 9-cis- epoksykarotenoidową (NCED) (BCH ID nr: 45879), blok trzech genów (BCH ID nr: 45834), nitrylazę specyficzną dla bromoksynilu (BCH ID nr: 14976), peptyd CP (BCH ID nr: 104319), dużą podjednostkę karboksylazy acetylo-CoA (BCH ID nr: 102613), syntazę acetylomleczanową (ALS) (BCH ID nr: 15177), 35 chimeryczną syntazę acetylomleczanową (ALS) (BCH ID nr: 15164), filaminę A (FLNA) (BCH ID nr: 45847), tioesterazę białka nośnikowego acyl-acyl CIFatB4 (BCH ID nr: 101362), białko E3 (BCH ID nr: 45813), adiponektynę (BCH ID nr: 46072), glukokinazę zależną od ADP (ADP-GK) (BCH ID nr: 45854), syntazę acetohydroksykwasową (BCH ID nr: 48073), toksynę cholery (BCH ID nr: 102896), 5-acylotransferazę antocyjaninową (BCH ID nr: 43794), apyrazę (BCH ID nr: 48365), glukozylotransferazę UDP- 40 glukoza:synapinian (BCH ID nr: 101523), inhibitor rybonukleazy barnazy (BCH ID nr: 14973), beta- laktamazę (BCH ID nr: 14975), desaturazę fitoenową (BCH ID nr: 103621), desaturazę 2 kwasu 20

EP 2 934 093 B1

tłuszczowego (BCH ID nr: 104323), dioksygenazę katecholową (BCH ID nr: 45877), O-metylotransferazę kofeilo-CoA (BCH ID nr: 102123), polipeptyd 1 kompleksu t zawierającego chaperoninę (BCH ID nr: 45914), CDC25 (BCH ID nr: 102013), glikoproteinę (GP) (BCH ID nr: 45851), acetylotransferazę chloramfenikolu (BCH ID nr: 100382), reduktazę cynamoilo-CoA (BCH ID nr: 102122), główny kompleks zgodności 5 tkankowej klasy III (BCH ID nr: 45905), główny kompleks zgodności tkankowej klasy III (BCH ID nr: 45906), główny kompleks zgodności tkankowej klasy III (BCH ID nr: 45907), białko otoczki wirusa plamistości pierścieniowej Odontoglossum (BCH ID nr: 45835), metylazę rybosomalną erytromycyny (BCH ID nr: 45859), metylazę rybosomalną erytromycyny A (BCH ID nr: 45860), peptyd Cryj (BCH ID nr: 102150), białko B wstrząsu zimnego (CSPB) (BCH ID nr: 103065), syntetazę cyjanoficyny (BCH ID nr: 103096), 10 cytochrom b (cyt-b) (BCH ID nr: 45832), metylazę adeninową DNA (BCH ID nr: 15008), nukleozydazę 5’ metylotioadenozyny (BCH ID nr: 45819), nukleozydazę 5’ metylotioadenozyny (MTA) (BCH ID nr: 45820), nukleozydazę 5’ metylotioadenozyny (MTA) (BCH ID nr: 45821), nukleozydazę 5’ metylotioadenozyny (MTA) (BCH ID nr: 45827, BCH ID nr: 45828; BCH ID nr: 45829; BCH ID nr: 45830; BCH ID nr: 45831), syntazę dihydrodipikolinianową (BCH ID nr: 14978), monooksygenazę Dicamba (BCH ID nr: 100728), 15 Doc1/Apc10 (BCH ID nr: 45817), nodD FITA (BCH ID nr: 45912), białko fluorescencyjne DsRed2 (BCH ID nr: 101476), białko E1 (BCH ID nr: 45803), białko E1 (BCH ID nr: 45811), białko E4 (BCH ID nr: 45805), białko E5 (BCH ID nr: 45806), elastynę 100xELP (BCH ID nr: 103553), białko E2 (BCH ID nr: 45812), wydzielane białko A EPEC (BCH ID nr: 45844), czynnik inicjujący 4A (eIF4AI) (BCH ID nr: 46098), czynnik inicjujący 4A (eIF4AIII) (BCH ID nr: 45798), czynnik inicjujący 4A (eIF4AII) (BCH ID nr: 45797), lucyferazę 20 świetlika (BCH ID nr: 104332), hydroksylazę flawonoidową (BCH ID nr: 43793), flawonoid 3’; 5’ hydroksylazę (BCH ID nr: 15010), 20-oksydazę gibereliny (GA) [giberelina; oksydoreduktaza 2- oksoglutaran:tlen (20-hydroksylowanie; utlenianie)] (BCH ID nr: 103517), syntetazę gamma- glutamylocysteinową (GSH) (BCH ID nr: 101271), inhibitor proteazy serynowej (BCH ID nr: 101929), niskiej zawartości kwas fitynowy 1 (BCH ID nr: 103619), glikoproteinę gl (BCH ID nr: 103649), dehydrogenazę 25 gliceraldehydo-3-fosforanową (GAPDH) (BCH ID nr: 45837), podwójny mutant syntazy 5-enolo- pirogronylo-szikimowo-3-fosforanowej (BCH ID nr: 46333), N-acetylotransferazę glifosatową (GAT4621) (BCH ID nr: 48363), białko szoku cieplnego 60 (BCH ID nr: 45842), hormon wzrostu Tilapii (BCH ID nr: 103750), kotwicę heksa-heksydynową (BCH ID nr: 103022), pirofosforylazę fosforylorybozylo-ATP (syntetaza PR-ATP) (BCH ID nr: 46077), sinapoilotransferazę sinapoiloglukoza:cholina (SCT); syntazę 30 synapiny (BCH ID nr: 101519), epoksydazę zeaksantyny (BCH ID nr: 100278), białko E4 (BCH ID nr: 45814), hemaglutyninę (HA) (BCH ID nr: 45883), kryształ białka (BCH ID nr: 102269), skrócone białko Cry 1Ac (BCH ID nr: 103215), białko Cry1Ab/Ac (BCH ID nr: 103109), syntazę 5-enolopirogronylo-szikimowo- 3-fosforanową (BCH ID nr: 45913), transferazę 1-fruktozylową sacharoza:sacharoza (BCH ID nr: 46095), reduktazy azotanowe (BCH ID nr: 46097), białko GIGANTEA (BCH ID nr: 45816), białko Killer 4 (BCH ID 35 nr: 47790), białko L1 (BCH ID nr: 45809), białko L2 (BCH ID nr: 45810), laktoferynę (BCH ID nr: 45794), podjednostkę alfa lucyferazy (BCH ID nr: 100377), podjednostkę beta lucyferazy (BCH ID nr: 100378), białko macierzy (M1) (BCH ID nr: 45881), intyminę (BCH ID nr: 45843), ludzką metalotioneninę 1A (BCH ID nr: 104312), główny kompleks zgodności tkankowej klasa I (BCH ID nr: 45899), główny kompleks zgodności tkankowej klasy II (BCH ID nr: 45900; BCH ID nr: 45903; BCH ID nr: 45904), główny kompleks 40 zgodności tkankowej klasy I (BCH ID nr: 45901; BCH ID nr: 45902), miostatynę (BCH ID nr: 45853), białko fuzyjne (F) wirusa choroby rzekomego pomoru drobiu (BCH ID nr: 48971), NodZ (BCH ID nr: 45910), NoIL 21

EP 2 934 093 B1

(BCH ID nr: 45911), białko niestrukturalne (NS2) (BCH ID nr: 45898), syntazę nopalinową (BCH ID nr: 15171), nukleoproteinę (NP) (BCH ID nr: 45880), galaktozydazę (BCH ID nr: 45875), beta-laktoglobulinę (BCH ID nr: 45848), dekarboksylazę orotydyno-5’-fosforanową (BCH ID nr: 46076), dekarboksylazę orotydyno-5’-fosforanową (BCH ID nr: 46080), białko P2X2 (BCH ID nr: 45878), podjednostkę polimerazy 5 PA (BCH ID nr: 45895), podjednostkę polimerazy PB1 (BCH ID nr: 45886), podjednostkę polimerazy PB2 (BCH ID nr: 45894), fosfofruktokinazę (BCH ID nr: 104350), białko izomerazy fosfomannozy (PMI) (BCH ID nr: 15003), syntazę fitoenu 1 (BCH ID nr: 103620), inhibitor proteinazy II (BCH ID nr: 104338), galektynę- 1 (LGALS1) (BCH ID nr: 45796), poliedrynę (BCH ID nr: 46002), PRP8 (BCH ID nr: 45908), PRP8 (BCH ID nr: 45909), białko E7 (BCH ID nr: 45808), reninę-2 (BCH ID nr: 45815), delta-endotoksynę mCry3A 10 (BCH ID nr: 43634), polimerazę RNA 1 (BCH ID nr: 101870), inhibitor proteinazy jedwabiu 2 (BCH ID nr: 104313), białko Cry1C (BCH ID nr: 103217), syntazę stilbenu (BCH ID nr: 101520), białko Talin (BCH ID nr: 45799), toksoid tężcowy (BCH ID nr: 101618), transaktywator kontrolowany przez tetracyklinę (BCH ID nr: 101475), delta-endotoksynę Cry1Ab (BCH ID nr: 14985), syntazę octanomleczanową (modyfikowana syntetycznie) (BCH ID nr: 100268), transferazę adenylową 3’’(9)-O-aminoglikozydu (BCH ID nr: 15033), 15 syntazę kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego (BCH ID nr: 15014), syntazę kwasu 1-amino- cyklopropano-1-karboksylowego (BCH ID nr: 15012), deaminazę kwasu 1-amino-cyklopropano-1- arboksylowego (BCH ID nr: 15013), syntazę acetohydroksykwasową (syntaza acetylomleczanowa; ALS) (BCH ID nr: 48364), syntazę acetylomleczanową (BCH ID nr: 15007), termostabilną alfa-amylazę (BCH ID nr: 14966), transferazę mykolilową/antygen 85A (BCH ID nr: 45818), fosfotransferazę II aminoglikozydową 20 3 (APH-II) (BCH ID nr: 14967), inhibitor rybonukleazy barstar (BCH ID nr: 14974), enzym rozgałęziający 1 (BCH ID nr: 48366), enzym rozgałęziający 2 (BCH ID nr: 48453), alfa-galaktozyd alfa-2; 6-sialilotransferazę (BCH ID nr: 45800), kazeinę alfa S1 (BCH ID nr: 45795), białko otoczki PLRV (BCH ID nr: 103751), białko otoczki wirusa CMV (BCH ID nr: 15027), białko otoczki wirusa PEMV (CP) (BCH ID nr: 101930), białko otoczki wirusa PPV (BCH ID nr: 104309), białko otoczki wirusa PRSV (CP) (BCH ID nr: 15026), białko 25 otoczki wirusa mozaiki przenoszonej przez ziarno grochu (CP) (BCH ID nr: 101940), białko otoczki wirusa PVY (BCH ID nr: 15020), białko otoczki wirusa WMV-2 (BCH ID nr: 15024), białko otoczki wirusa ZYMV (BCH ID nr: 15025), syntazę 5-enolopirogronylo-szikimowo-3-fosforanową (BCH ID nr: 14979), białko Cry1A.105 (BCH ID nr: 43771), delta-endotoksynę cry1Ac (BCH ID nr: 14986), delta-endotoksynę cry1F (BCH ID nr: 14987), delta-endotoksynę Cry2Ab (BCH ID nr: 14988), kryształ białka Cry2Ae (BCH ID nr: 30 101895), delta-endotoksynę Cry34Ab1 (BCH ID nr: 14994), delta-endotoksynę Cry35Av1 (BCH ID nr: 14995), delta-endotoksynę cry3A (BCH ID nr: 14989), białko Cry3Bb1 (BCH ID nr: 14993), delta- endotoksynę Cry9c (BCH ID nr: 14996), desaturazę acylo-lipidową (BCH ID nr: 102160), białko E2 (BCH ID nr: 45804), białko E6 (BCH ID nr: 45807), endochitynazę (BCH ID nr: 100280), syntazę 5- enolopirogronylo-szikimowo-3-fosforanową (BCH ID nr: 15000; BCH ID nr: 45463; BCH ID nr: 101942), 35 glikoproteinę otoczki wirusa białaczki kotów (BCH ID nr: 45046), białka gag wirusa białaczki kotów (BCH ID nr: 45047), odwrotną transkryptazę wirusa białaczki kotów (BCH ID nr: 45048), 4-reduktazę dihydroflawonolową (BCH ID nr: 15009), N-acetyloglukozaminidazę (BCH ID nr: 45945), gęstości i rozmieszczenia aparatów szparkowych (BCH ID nr: 48460), gęstości i rozmieszczenia aparatów szparkowych (BCH ID nr: 48458), homologi genów odporności regionu Vf (HcrVf) Cladosporium fulvum 40 (BCH ID nr: 103738), N-acetylotransferazę fosfinotrycyny (PAT) (BCH ID nr: 14972), dehydrogenazę kwasu tłuszczowego delta (12) (BCH ID nr: 100267), oksydoreduktazę glifosatową (BCH ID nr: 14998), syntazę 22

EP 2 934 093 B1

skrobi związaną z granulkami skrobi (BCH ID nr: 48072), białko zielonej fluorescencji (BCH ID nr: 45846), HSP70 (BCH ID nr: 101614; BCH ID nr: 45839; BCH ID nr: 45916), transporter sacharozy Hordeum vulgare (BCH ID nr: 45917), transporter sacharozy 1 Hordeum vulgare (HvSUT1) (BCH ID nr: 101594), fosfotransferazę higromycyny B (BCH ID nr: 100292; BCH ID nr: 14991), białka fuzyjne podjednostek alfa 5 i beta lucyferazy (BCH ID nr: 103755), LuxA; LuxB; LuxC; LuxD; LuxE (BCH ID nr: 45874), białko macierzy (M2) (BCH ID nr: 45882), białko major Spidroin I (BCH ID nr: 48455), białko major Spidroin II (BCH ID nr: 48456), kinazę białkową PK (BCH ID nr: 103650), białko Cry2Ab2 (BCH ID nr: 43772), lipoksygenazę 3 (BCH ID nr: 48030), neuraminidazę (NA) (BCH ID nr: 45885), białko niestrukturalne (NS1) (BCH ID nr: 45896), fosfotransferazę neomycyny II (BCH ID nr: 15001), fosforybozylotransferazę kwasu chinolinowego 10 (QPT) (BCH ID nr: 15416), polimerazę RNA zależną od replikazy/RNA [wirus liściozwoju ziemniaka] (BCH ID nr: 15019), helikazę (BCH ID nr: 15018), N-acetylotransferazę fosfinotrycyny (PAT) (BCH ID nr: 15002), mio-inozytolo-heksakisfosforano-3-fosfohydrolazę (3-fitaza) (BCH ID nr: 15378), poligalakturonazę (BCH ID nr: 15015), fibrynogen (BCH ID nr: 45801), glikoproteinę (BCH ID nr: 100344), białko czerwonej fluorescencji (BCH ID nr: 103740), gen oporności 1 (BCH ID nr: 41317; BCH ID nr: 102164; BCH ID nr: 15 102155), gen oporności 2 (BCH ID nr: 41318), gen oporności 3 (BCH ID nr: 102165)), hydrolazę S- adenozylometioniny (BCH ID nr: 15387), hydrolazę S-adenozylometioniny (SAM) (BCH ID nr: 15017), scFvBA11 (BCH ID nr: 103024), syntetyczne białko jedwabiu pająka (BCH ID nr: 48457), tioesterazę (TE) (BCH ID nr: 15005), beta-glukuronidazę (BCH ID nr: 46004), permeazę aminokwasową 1 (BCH ID nr: 48368), wegetatywne białko insektycydowe 3A (BCH ID nr: 14990), białko kapsydowe VP60 (BCH ID nr: 20 102024), czynnik transkrypcyjny WRKY45 (BCH ID nr: 103726), alfa-hordotioninę (BCH ID nr: 46091), polipeptyd 1 kompleksu t zawierającego chaperoninę (BCH ID nr: 45840; BCH ID nr: 45915), endo-(1; 3-1; 4)-beta-glukanazę (BCH ID nr: 100274), białko telAB (BCH ID nr: 103758), białko kilA (BCH ID nr: 103757), dużą podjednostkę karboksylazy rybulozo-bisfosforanowej (rbcL) miejsca wiązania rybosomów (BCH ID nr: 102611), translokowany receptor intyminy (BCH ID nr: 45845), insulinę (BCH ID nr: 102337), 25 wegetatywne białko owadobójcze 3Aa20 (BCH ID nr: 100887) i dehydrogenazę gliceraldehydo-3- fosforanową (GAPDH) (BCH ID nr: 45836; BCH ID nr: 45838). [0089] W niektórych wykonaniach transgeniczny locus może być fizycznie połączony z genem efektorowym, który może być częścią lub pododcinkiem cząsteczki kwasu nukleinowego, która ma być wprowadzona do organizmu lub wstawiona do genomu organizmu. W innych wykonaniach transgeniczny 30 locus może nie być fizycznie połączony lub słabo związany z genem efektorowym lub z interesującą cechą agronomiczną. Gen efektorowy można odpowiednio, na przykład, dostarczyć na innym chromosomie lub w innej, niepowiązanej pozycji w genomie, np. pochodzi z listy genów efektorowych podanej powyżej. [0090] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „gen efektorowy” odnosi się do dowolnego genu lub jednostki ulegającej ekspresji, która nadaje fenotypowo wykrywalny efekt w organizmie lub grupie 35 organizmów. Taki gen efektorowy może dostarczyć efektu, na przykład, w odniesieniu do właściwości biochemicznych organizmu lub jego komórek, np. dostarczenie lub ograniczenie lub zniesienie aktywności enzymatycznej, zapewnienie interfejsów interakcji z czynnikami regulacyjnymi, ekspresję nowych genów lub nowe wzorce ekspresji genów endogennych. Gen efektorowy może ponadto wywierać wpływ na organizm w odniesieniu do podatności na chorobę, np. odporność na chorobę lub oporność na chorobę, 40 lub alternatywnie zwiększoną podatność na choroby. Na przykład, można dostarczyć odporność na infekcje wirusowe, infekcje bakteryjne, infekcje pierwotniakami, infekcje grzybicze lub infekcje nicieniami. 23

EP 2 934 093 B1

[0091] Dalszymi przykładami przewidywanych efektów są cechy agronomiczne, np. cecha prowadząca do wzrostu plonowania rośliny, odporności na wpływy środowiska, takie jak temperatura, stres solny, zaopatrzenie w wodę, zaopatrzenie w azot itp. Korzystnymi genami efektorowymi są: gen oporności na wirusa gorączki denga, gen oporności na malarię ludzką, gen oporności na malarię ptasią, gen oporności 5 na wirusa plamistego więdnięcia pomidora, gen odporności na herbicydy, gen owadobójczy, gen odporności na suszę, gen odporności na pasożytnicze nicienie i gen dający lepszą wydajność rośliny. [0092] Korzystnymi genami oporności na malarię ludzką są geny kodujące peptydy, takie jak TP10 (kodujący peptyd o sekwencji AGYLLGKINLKALAALAKKIL; SEQ ID NO: 1), Angll (kodujący peptyd o sekwencji peptydowej, DRVYIHPF; SEQ ID NO: 2) lub geny kodujące przeciwciała jednołańcuchowe, takie 10 jak m1C3 (numer dostępu GenBank HQ315886), m4B7 (numer dostępu GenBank HQ315885) lub m2A10 (numer dostępu GenBank HQ315884). Korzystnym genem oporności na malarię ptaków jest gen kodujący peptyd taki jak Angll (obejmujący sekwencję DRVYIHPF (SEQ ID NO: 2) jak wspomniano powyżej). [0093] Do stosowania w organizmach roślinnych niniejszy wynalazek korzystnie przewiduje zastosowanie jednego lub więcej genów efektorowych lub transgenów wybranych z grupy obejmującej: peptyd 7Crp (BCH 15 ID nr: 46121), dioksygenazę 9-cis-epoksykarotenoidową (NCED) (BCH ID nr: 45879), blok trzech genów (BCH ID nr: 45834), nitrylazę specyficzną dla bromoksynilu (BCH ID nr: 14976), peptyd CP (BCH ID nr: 104319), dużą podjednostka karboksylazy acetylo-CoA (BCH ID nr: 102613), syntazę acetylomleczanową (ALS) (BCH ID nr: 15177), chimeryczną syntazę acetylomleczanową (ALS) (BCH ID nr: 15164), filaminę A (FLNA) (BCH ID nr: 45847), tioesterazę białka nośnikowego acyl-acyl CIFatB4 (BCH ID nr: 101362), białko 20 E3 (BCH ID nr: 45813), adiponektynę (BCH ID nr: 46072), glukokinazę zależną od ADP (ADP-GK) (BCH ID nr: 45854), syntazę acetohydroksykwasową (BCH ID nr: 48073), toksynę cholery (BCH ID nr: 102896), 5-acylotransferazę antocyjanową (BCH ID nr: 43794), apyrazę (BCH ID nr: 48365), glukozylotransferazę UDP-glukoza:synapinian (BCH ID nr: 101523), inhibitor rybonukleazy barnaza (BCH ID nr: 14973), beta- laktamazę (BCH ID nr: 14975), desaturazę fitoenową (BCH ID nr: 103621), desaturazę kwasu 25 tłuszczowego 2 (BCH ID nr: 104323), dioksygenazę katecholową (BCH ID nr: 45877), O-metylotransferazę kofeilo- Co A (BCH ID nr: 102123), polipeptyd 1 kompleksu t zawierający chaperoninę (BCH ID nr: 45914), CDC25 (BCH ID nr: 102013), glikoproteinę (GP) (BCH ID nr: 45851), acetylotransferazę chloramfenikolową (BCH ID nr: 100382), reduktazę cynamoilo-Co A (BCH ID nr: 102122), główny kompleks zgodności tkankowej klasa III (BCH ID nr: 45905), główny kompleks zgodności tkankowej klasa III (BCH ID nr: 45906), 30 główny kompleks zgodności tkankowej klasa III (BCH ID nr: 45907), białko otoczki wirusa plamistości pierścieniowej Odontoglossum (BCH ID nr: 45835), metylazę rybosomalną na erytromycynę (BCH ID nr: 45859), metylazę rybosomalną na erytromycynę A (BCH ID nr: 45860), peptyd Cryj (BCH ID nr: 102150), białko szoku zimnego (CSPB) (BCH ID nr: 103065), syntetazę cyjanoficyny (BCH ID nr: 103096), cytochrom b (cyt-b) (BCH ID nr: 45832), metylazę adeninową DNA (BCH ID nr: 15008), nukleozydazę 35 5’metylotioadenozyny (BCH ID nr: 45819), nukleozydazę 5’metylotioadenozyny (MTA) (BCH ID nr: 45820), nukleozydazę 5’metylotioadenozyny (MTA) (BCH ID nr: 45821), nukleozydazę 5’metylotioadenozyny (MTA) (BCH ID nr: 45827, BCH ID nr: 45828; BCH ID nr: 45829; BCH ID nr: 45830; BCH ID nr: 45831), syntazę dihydrodipikolinianową (BCH ID nr: 14978), monooksygenazę Dicamba (BCH ID nr: 100728), Doc1/Apc10 (BCH ID nr: 45817), nodD FITA (BCH ID nr: 45912), białko fluorescencyjne DsRed2 (BCH ID 40 nr: 101476), białko E1 (BCH ID nr: 45803), białko E1 (BCH ID nr: 45811), białko E4 (BCH ID nr: 45805), białko E5 (BCH ID nr: 45806), elastynę 100xELP (BCH ID nr: 103553), białko E2 (BCH ID nr: 45812), 24

EP 2 934 093 B1

wydzielane białko A EPEC (BCH ID nr: 45844), czynnik inicjujący 4A (elF4Al) (BCH ID nr: 46098), czynnik inicjujący 4A (eIF4AIII) (BCH ID nr: 45798), czynnik inicjujący 4A (eIF4AII) (BCH ID nr: 45797), lucyferazę świetlika (BCH ID nr: 104332), hydroksylazę flawonoidową (BCH ID nr: 43793), hydroksylazę flawonoidową 3’;5’ (BCH ID nr: 15010), 20-oksydazę gibereliny (GA) [giberelina; oksydoreduktaza 2-oksoglutaran:tlen 5 (20-hydroksylowanie; utlenianie)] (BCH ID nr: 103517), syntetazę gamma-glutamylocysteinową (GSH) (BCH ID nr: 101271), inhibitor proteazy serynowej (BCH ID nr: 101929), niską zawartość kwasu fitynowego 1 (BCH ID nr: 103619), glikoproteinę gl (BCH ID nr: 103649), dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (GAPDH) (BCH ID nr: 45837), podwójny mutant syntazy 5-enolopirogronianoszikimowo-3-fosforanu (BCH ID nr: 46333), N-acetylotransferazę glifosatową (GAT4621) (BCH ID nr: 48363), białko szoku cieplnego 60 10 (BCH ID nr: 45842), hormon wzrostu Tilapii (BCH ID nr: 103750), kotwicę heksaheksydynową (BCH ID nr: 103022), pirofosforylazę pirofosforylo-ATP (syntetaza PR-ATP) (BCH ID nr: 46077), sinapoilotransferazę sinapoiloglukoza:cholina (SCT); syntazę sinapiny (BCH ID nr: 101519), epoksydazę zeaksantyny (BCH ID nr: 100278), białko E4 (BCH ID nr: 45814), hemaglutyninę (HA) (BCH ID nr: 45883), kryształ białka (BCH ID nr: 102269), skrócone białko Cry 1Ac (BCH ID nr: 103215), białko Cry1Ab/Ac (BCH ID nr: 103109), 15 syntazę 5-enolopirogronylo-szikimowo-3-fosforanową (BCH ID nr: 45913), transferazę fruktozylową 1 sacharoza:sacharoza (BCH ID nr: 46095), reduktazy azotanowe (BCH ID nr: 46097), białko GIGANTEA (BCH ID nr: 45816), białko Killer 4 (BCH ID nr: 47790), białko L1 (BCH ID nr: 45809), białko L2 (BCH ID nr: 45810), laktoferynę (BCH ID nr: 45794), podjednostką alfa lucyferazy (BCH ID nr: 100377), podjednostkę beta lucyferazy (BCH ID nr: 100378), białko macierzy (M1) (BCH ID nr: 45881), intyminę 20 (BCH ID nr: 45843), ludzką metalotioneninę 1A (BCH ID nr: 104312), główny kompleks zgodności tkankowej klasy I (BCH ID nr: 45899), główny kompleks zgodności tkankowej klasy II (BCH ID nr: 45900; BCH ID nr: 45903; BCH ID nr: 45904), główny kompleks zgodności tkankowej klasy I (BCH ID nr: 45901; BCH ID nr: 45902), miostatynę (BCH ID nr: 45853), białko fuzyjne wirusa choroby rzekomego pomoru drobiu (BCH ID nr: 48971), NodZ (BCH ID nr: 45910), NolL (BCH ID nr: 45911), białko niestrukturalne 25 (NS2) (BCH ID nr: 45898), syntazę nopalinową (BCH ID nr: 15171), nukleoproteinę (NP) (BCH ID nr: 45880), galaktozydazę (BCH ID nr: 45875), beta-laktoglobulinę (BCH ID nr: 45848), dekarboksylazę orotydyno-5’-fosforanu (BCH ID nr: 46076), dekarboksylazę orotydyno-5’-fosforanową (BCH ID nr: 46080), białko P2X2 (BCH ID nr: 45878), podjednostkę polimerazy PA (BCH ID nr: 45895), podjednostkę polimerazy PB1 (BCH ID nr: 45886), podjednostkę polimerazy PB2 (BCH ID nr: 45894), fosfofruktokinazę 30 (BCH ID nr: 104350), białko izomerazy fosfomannozowej (PMI) (BCH ID nr: 15003), syntazę fitoenu 1 (BCH ID nr: 103620), inhibitor proteinazy II (BCH ID nr: 104338), galektynę-1 (LGALS1) (BCH ID nr: 45796), poliedrynę (BCH ID nr: 46002), PRP8 (BCH ID nr: 45908), PRP8 (BCH ID nr: 45909), białko E7 (BCH ID nr: 45808), reninę-2 (BCH ID nr: 45815), delta-endotoksynę mCry3A (BCH ID nr: 43634), polimerazę RNA 1 (BCH ID nr: 101870), inhibitor proteinazy jedwabiu 2 (BCH ID nr: 104313), białko Cry1C (BCH ID nr: 35 103217), syntazę stilbenową (BCH ID nr: 101520), białko talin (BCH ID nr: 45799), anatoksynę tężcową (BCH ID nr: 101618), transaktywator kontrolowany przez tetracyklinę (BCH ID nr: 101475), delta- endotoksynę Cry1Ab (BCH ID nr: 14985), syntazę octanomleczanową (zmodyfikowana syntetycznie) (BCH ID nr: 100268), transferazę adenylową 3’’(9)-O-aminoglikozydu (BCH ID nr: 15033), syntazę kwasu 1- aminocyklopropano-1-karboksylowego (BCH ID nr: 15014), syntazę kwasu 1-amino-cyklopropano-1- 40 karboksylowego (BCH ID nr: 15012), deaminazę kwasu 1-amino-cyklopropano-1-arboksylowego (BCH ID nr: 15013), syntazę acetohydroksykwasową (syntaza acetylomleczanowa; ALS) (BCH ID nr: 48364), 25

EP 2 934 093 B1

syntazę acetylomleczanową (BCH ID nr: 15007), termostabilną alfa-amylazę (BCH ID nr: 14966), transferazę mykolilową/antygen 85A (BCH ID nr: 45818), fosfotransferazę aminoglikozydową 3 (APH-II) (BCH ID nr: 14967), inhibitor rybonukleazy barstar (BCH ID nr: 14974), enzym rozgałęziający 1 (BCH ID nr: 48366), enzym rozgałęziający 2 (BCH ID nr: 48453), alfa-galaktozyd alfa-2; 6-sialilotransferazę (BCH 5 ID nr: 45800), kazeinę alfa S1 (BCH ID nr: 45795), białko otoczki PLRV (BCH ID nr: 103751), białko otoczki wirusa CMV (BCH ID nr: 15027), białko otoczki wirusa PEMV (CP) (BCH ID nr: 101930), białko otoczki wirusa PPV (BCH ID nr: 104309), białko otoczki wirusoa PRSV (CP) (BCH ID nr: 15026), białko otoczki wirusa mozaiki przenoszonej przez ziarno grochu (CP) (BCH ID nr: 101940), białko otoczki wirusa PVY (BCH ID nr: 15020), białko otoczki wirusa WMV-2 (BCH ID nr: 15024), białko otoczki wirusa ZYMV (BCH 10 ID nr: 15025), syntazę 5-enolopirogronyloszikimowo-3-fosforanową (BCH ID nr: 14979), białko Cry1A.105 (BCH ID nr: 43771), delta-endotoksynę cry1Ac (BCH ID nr: 14986), delta-endotoksynę cry1F (BCH ID nr: 14987), delta-endotoksynę Cry2Ab (BCH ID nr: 14988), kryształ białka Cry2Ae (BCH ID nr: 101895), delta- endotoksynę Cry34Ab1 (BCH ID nr: 14994), delta-endotoksynę Cry35Av1 (BCH ID nr: 14995), delta- endotoksynę cry3A (BCH ID nr: 14989), białko Cry3Bb1 (BCH ID nr: 14993), delta-endotoksynę Cry9c 15 (BCH ID nr: 14996), desaturazę acylo-lipidową (BCH ID nr: 102160), białko E2 (BCH ID nr: 45804), białko E6 (BCH ID nr: 45807), endochitynazę (BCH ID nr: 100280), syntazę 5-enolopirogronylo-szikimowo-3- fosforanową (BCH ID nr: 15000; BCH ID nr: 45463; BCH ID nr: 101942), glikoproteinę otoczki wirusa białaczki kotów (BCH ID nr: 45046), białko gag wirusa białaczki kotów (BCH ID nr: 45047), odwrotną transkryptazę wirusa białaczki kotów (BCH ID nr: 45048), 4-reduktazę dihydroflawonolową (BCH ID nr: 20 15009), N-acetyloglukozaminidazę (BCH ID nr: 45945), gęstości i rozmieszczenia aparatów szparkowych (BCH ID nr: 48460), gęstości i rozmieszczenia aparatów szparkowych (BCH ID nr: 48458), homologi genów odporności regionu Vf Cladosporium fulvum (HcrVf) (BCH ID nr: 103738), N-acetylotransferazę fosfinotrycyny (PAT) (BCH ID nr: 14972), dehydrogenazę kwasową delta (12) (BCH ID nr: 100267), oksydoreduktazę glifosatową (BCH ID nr: 14998), syntazę skrobi związaną z granulami skrobi (BCH ID nr: 25 48072), białko zielonej fluorescencji (BCH ID nr: 45846), HSP70 (BCH ID nr: 101614; BCH ID nr: 45839; BCH ID nr: 45916), transporter sacharozy w Hordeum vulgare (BCH ID nr: 45917), transporter 1 sacharozy w Hordeum vulgare (HvSUT1) (BCH ID nr: 101594), fosfotransferazę higromycyny B (BCH ID nr: 100292; BCH ID nr: 14991), białka fuzyjne podjednostek alfa i beta lucyferazy (BCH ID nr: 103755), LuxA; LuxB; LuxC; LuxD; LuxE (BCH ID nr: 45874), białko macierzy (M2) (BCH ID nr: 45882), białko major Spidroin I 30 (BCH ID nr: 48455), białko major Spidroin II (BCH ID nr: 48456), kinazę białkową PK (BCH ID nr: 103650), białko Cry2Ab2 (BCH ID nr: 43772), lipoksygenazę 3 (BCH ID nr: 48030), neuraminidazę (NA) (BCH ID nr: 45885), białko niestrukturalne (NS1) (BCH ID nr: 45896), fosfotransferazę neomycyny II (BCH ID nr: 15001), fosforybozylotransferazę kwasu chinolinowego (QPT) (BCH ID nr: 15416), polimerazę RNA zależną od replikazy/RNA [wirus liściozwoju ziemniaka] (BCH ID nr: 15019), helikazę (BCH ID nr: 15018), 35 N-acetylotransferazę fosfinotrycyny (PAT) (BCH ID nr: 15002), mio-inozytolo-heksakisfosforano-3- fosfohydrolazę (3-fitaza) (BCH ID nr: 15378), poligalakturonazę (BCH ID nr: 15015), fibrynogen (BCH ID nr: 45801), glikoproteinę (BCH ID nr: 100344), białko czerwonej fluorescencji (BCH ID nr: 103740), gen oporności 1 (BCH ID nr: 41317; BCH ID nr: 102164; BCH ID nr: 102155), gen oporności 2 (BCH ID nr: 41318), gen oporności 3 (BCH ID nr: 102165)), hydrolazę S-adenozylometioniny (BCH ID nr: 15387), 40 hydrolazę S-adenozylometioniny (SAM) (BCH ID nr: 15017), scFvBA11 (BCH ID nr: 103024), syntetyczne białko jedwabiu pająka (BCH ID nr: 48457), tioesterazę (TE) (BCH ID nr: 15005), beta-glukuronidazę (BCH 26

EP 2 934 093 B1

ID nr: 46004), permeazę aminokwasową 1 (BCH ID nr: 48368), wegetatywne białko owadobójcze 3A (BCH ID nr: 14990), białko kapsydowe VP60 (BCH ID nr: 102024), czynnik transkrypcyjny WRKY45 (BCH ID nr: 103726), alfa-hordotioninę (BCH ID nr: 46091), polipeptyd 1 kompleksu t zawierającego chaperoninę (BCH ID nr: 45840; BCH ID nr: 45915), endo-(1;3-1;4)-beta-glukanazę (BCH ID nr: 100274), białko telAB (BCH 5 ID nr: 103758), białko kilA (BCH ID nr: 103757), dużą podjednostkę karboksylazy rybulozo-bisfosforanowej (rbcL) miejsca wiązania rybosomów (BCH ID nr: 102611), translokowany receptor intyminy (BCH ID nr: 45845), insulinę (BCH ID nr: 102337), wegetatywne białko owadobójcze 3Aa20 (BCH ID nr: 100887) i dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (GAPDH) (BCH ID nr: 45836; BCH ID nr: 45838). [0094] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „gen wykazującego haploinsuficjencję” odnosi się 10 do genu lub grupy genów paralogicznych, które są zasadniczo funkcjonalnie zbędne, które są obecne w genomie organizmu, w którym obniżenie poziomu ekspresji w stosunku do sytuacji typu dzikiego powoduje fenotyp skutkujący obniżeniem konkurencyjnego dostosowania i gdzie ten fenotyp może być tylko częściowo uratowany przez pojedynczy allel transgeniczny, w tym pojedynczą kopię lub wiele kopii ratujących genu wykazującego haploinsuficjencję, np. jeden lub więcej konstruktów charakteryzujących się 15 poddominacją. Przydatność genu wykazującego haploinsuficjencję dla podejścia przewidzianego w niniejszym dokumencie może być testowana w dowolnym odpowiednim doświadczeniu lub oparta na dowolnej odpowiedniej sytuacji molekularnej. Na przykład, dane doświadczalne, które można wykorzystać do wskazania genu lub paralogicznej rodziny funkcjonalnie zbędnych genów jako odpowiednio wykazujących haploinsuficjencję. Takie dane doświadczalne mogą obejmować dane fenotypowe z 20 heterozygot, mutacji zerowych, mutacji hipomorficznych, alleli o niskiej ekspresji, aneuploidów chromosomalnych i delecji chromosomalnych. Dalsze techniki, które mogą tłumić określone geny lub rodziny genów, chociaż zwiększają degradację mRNA lub hamują translację mRNA, mogą również dostarczyć dowodu na poparcie haploinsuficjencji. Dane sugerujące haploinsuficjencję u jednego gatunku mogą wskazywać na haploinsuficjencję w homologicznych genach u innych gatunków i mogą być 25 odpowiednio wykorzystane jako punkt wyjścia dla odpowiednich doświadczeń. [0095] Haploinsuficjencję można uznać w niektórych wykonaniach za dominujący efekt dawkowania fenotypu powstającego, gdy występuje tylko normalny poziom ekspresji z jednej kopii genu, np. jeśli pojedyncza kopia genu jest niewystarczająca do utrzymania stanu ekspresji typu dzikiego. Haploinsuficjencja jest na przykład związana z niektórymi składnikami białkowymi, które tworzą rybosomy. 30 Rybosomy zazwyczaj zawierają -60-80 składników białkowych u różnych gatunków, oznaczonych jako cytoplazmatyczne białka rybosomalne (CRP) lub mitochondrialne białka rybosomalne (MRP). Mutacje prowadzące do utraty funkcji CRP mogą zazwyczaj powodować fenotyp o zredukowanym dostosowaniu, np. fenotyp Minute, gdy jest hemizygotyczny lub heterozygotyczny i może być śmiertelny jako homozygota. U Drosophila melanogaster ten fenotyp może wiązać się z dłuższym czasem rozwoju, cieńszą szczeciną 35 oraz zmniejszeniem żywotności i płodności, co, jak się zakłada, wynika z obniżenia tempa produkcji białka (patrz także Marygold i in. 2007, Genome Biol. 8: R216), a także kilka wad morfologicznych. Haploinsuficjencja związana z cytoplazmatycznymi białkami rybosomalnymi może występować w wielu różnych organizmach i została opisana w szerokim zakresie gatunków rozmnażających się płciowo, w tym u ludzi (patrz Gazda, H. T. i in., 2004, Br. J. Haematol. 127: 105-113.), myszy (patrz Oliver i in., 2004, 40 Development 131: 3907-3920), danio pręgowanego (patrz Amsterdam i in., 2004, PLoS Biol. 2: E139),

27

EP 2 934 093 B1

rośliny Arabodopsis thaliana (patrz Weijers i in., 2001, Development 128: 4289-4299) oraz u drożdży (patrz Deutschbauer i in., 2005, Genetics 169: 1915-1925). [0096] Haploinsuficjencja może, oprócz loci CRP, obejmować również lub być związana z kilkoma innymi genami w kilku organizmach. Przykłady genów wykazujących haploinsuficjencję, przewidzianych w 5 niniejszym wynalazku, podano w poniższej tabeli 1:

Tabela 1

Królestwo Gatunki Geny Odniesienie Inne Odniesienie CRP geny

Zwierząt Caenorhabditis elegans (nicień) gld-1 Jones i Schdel 1995

Drosophile melanogaster 64 CRP Marygold i in. Mlc-2 Warmke i in. 1992 (muszka owocowa) 2007

Nasonia vitripennis (osa) ho Pultz i in. 2000

Tribollum castaneum (chrząszcz MXP Shippy i in. 2000 mączny)

Felis sylvestris (kot) CRX Menotti-Raymond i in. 2010

Canis lupus (pies) T Haworth i in. 2001

Mesocricetus auratus (chomik) Wh Hodgkinson i in. 1998

Mus musculus (mysz) RpL24 Oliver i in. 2004 DII4 Krebs i in. 2004

Rattus norvegicus (szczur) TSC2 Habib i in. 2008

Homo sapiens (człowiek) RpS19 Choesmel i in. Nkx 2-1 Pohlenz i in. 2002 2007

Macaca Mulatta (makak) TCOF1 Przedstawia i in. 2006

Danio rerio (danio pręgowany) 11 CRP Amsterdam i in. 2004

Grzyby Aspergillus nidulans (pleśń) prpA Sermighini i in. 2006

Candida albicans (drożdże CBK1 Uhl i in. 2003 jelitowe)

Saccharomyces cerevisiae 72 CRP Deutschbauer i TLC1 Mozdy i Cech (drożdże piwowarskie) in. 2005 2006

28

EP 2 934 093 B1

Królestwo Gatunki Geny Odniesienie Inne Odniesienie CRP geny

Schizosaccharomyces pombe 8 CRP Kim i in. 2010 taf12 Kim i in. 2010 (drożdże rozszczepkowe)

Rośliny Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik AtRpS Weijers i in. 2001 ERL2 Pillitteri i in. 2007 Thala) 5a/b

Pisum sativum (groszek) CRY1 Platten i in. 2005

Solanum lycopersicum (pomidor) CRY1 Weller i in. 2001

[0097] Dalsze przewidywane przykłady genów wykazującego haploinsuficjencję obejmują czynnik transkrypcyjny (dalsze szczegóły można uzyskać z Seidman i Seidman, 2002, The Journal of Clinical Investigation, 109: 451–455); gen supresorowy guza, dalsze szczegóły można uzyskać od Santarosa i Ashworth, 2004, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer 1654: 105-122); gen związany 5 z funkcją mięśni lub gen kodujący białko homeodomenowe (dalsze szczegóły można uzyskać od Cook i in., 2012, Genome Biology 13: R21). [0098] Szczególnie przewidywane przykłady genów wykazującego haploinsuficjencję, które można zastosować w kontekście niniejszego wynalazku, obejmują geny Drosophila melanogaster RPL36, RPL35, RPL17, RPS6, RPL37A, RPS19A, RPS5A, RPS10B, DPP, RPL37A, RPL36A, RPS13, RPL7, RPL9, 10 RPL24, RPL31, RPS11, RPS15, RPL18A, RPL11, RPL23, RPL12A, RPL39A, RPL23A, RPL8, RPL28, RPL18, RPL14, RPS4, RPL10, RPL35A, RPL13A, RPL34B, SU(VAR) 3-9, ABD-B, RPS3, RPL27, RPL4, RPS8, RPL32, RPS7, RPL6, N, HUPB, RUN, S, PKD2, B, MHC, LOK, VG, NP/CG34350C, PCL, BSD, DLL, KR, MTRM, PC, SCR, TM2, ACT88F, UBX, DL, BNL, H, E, P53, MLC2. Przewidziane są również homologi tych genów u innych gatunków. W korzystnymi wykonaniu, sposób zmniejszania 15 konkurencyjnego dostosowania organizmu, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, można przeprowadzić u Drosophila melangoster na podstawie jednego lub większej liczby tych genów wykazujących haploinsuficjencję. W dalszych wykonaniach, sposób zmniejszania dostosowania konkurencyjnego organizmu, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, można przeprowadzić w innym organizmie, np. u muchy, owada lub stawonoga, na podstawie homologu jednego lub większej liczby tych 20 genów wykazujących haploinsuficjencję. [0099] W kolejnych wykonaniach genem wykazującym haploinsuficjencję według niniejszego wynalazku może być gen wybrany z listy genów Homo sapiens TP73, DFFB, KCNAB2, CHD5, CAMTA1, PINK1, SAM68, KCNQ4, GLUT1, MYH, FOXE3, HUD, INK4C, NFIA, CCN1, ABCA4, WNT2B, ADAR, ATP1A2, MPZ, MYOC, HRPT2, LRH-1, IRF6, PROX1, TP53BP2, NLRP3, ID2, MYCN, GCKR, SPAST, MSH6, 25 FSHR, SPR, PAX8, SMADIP1, SCN1A, HOXD13, COL3A1, SLC40A1, SATB2, SUMO1, BMPR2, XRCC5, PAX3, STK25, CHL1, SRGAP3, VHL, GHRL, PPARG, SRG3, RASSF1A, TKT, MITF, FOXP1, ROBO1,DIRC2, ATP2C, FOXL2, ATR, SI, TERC, SOX2, OPA1, TFRC, FGFR3, LETM1, SH3BP2, MSX1, RBPJ, PHOX2B, ENAM, MAPK10, PKD2, SNCA, RIEG, ANK2, MAD2L1, PLK4, FBXW7, TERT, SEMA5, GDNF, FGF10, PIK3R1, APC, RAD50, SMAD5, EGR1, TCOF1, NPM1, NKX2-5, MSX2, NSD1, FOXC1, 30 DSP, EEF1E1, TNXA, TNX, HMGA1, RUNX2, CD2AP, ELOVL4, NT5E, SIM1, COL10A1, PARK2, TWIST, GLI3, GCK, FKBP6, ELN, LIMK1, RFC2, GTF3, GTF2I, NCF1, KRIT1, COL1A2, SHFM1, RELN, FOXP2, 29

EP 2 934 093 B1

CAV1, ST7, BRAF, SHH, HLXB9, GATA4, NKX3-1, FGFR1, CHD7, CSN5, EYA1, TRPS1, DMRT1, DMRT2, MLLT3, ARF, CDKN2B, BAG1, PAX5, GCNT1, ROR2, PTCH1, NR5A1, LMX1B, ENG, TSC1, COL5A1, NOTCH1, EHMT1,KLF6, GATA3, ANX7, PTEN, PAX2, FGF8, BUB3, CDKN1C, NUP98, PAX6, WT1, EXT2, ALX4, FEN1, SF1, FGF3, FZD4, ATM, H2AX, FLI1, NFRKB, PHB2, ETV6, CDKN1B, 5 COL2A1,KRT5, MYF6, IGF1, SERCA2, TBX5, TBX3, HNF1A, BRCA2, FKHR, RB1, ZIC2, LIG4, COCH, NPAS3, NKX2-1, PAX9, BMP4, GCH1, SIX6, RAD51B, BCL11B, SPRED1, BUBR1, DLL4, FBN1 ALDH1A2, TPM1, P450SCC, BLM, COUP-TFII, SOX8, TSC2, PKD1, CBP, SOCS1, PRM2, PRM1, ABCC6, ERAF, SALL1, CBFB, CTCF, WWOX, FOXF1, FOXC2, YWHAE, HIC1, HIC1, LIS1, P53, PMP22, COPS3, RAI1, TOP3A, SHMT1, RNF135, NF1, SUZ12, MEL-18, KLHL10, STAT5B, STAT5A, BECN1, 10 BRCA1, PGRN, MAPT, CSH1, POLG2, PRKAR1A, SOX9, NHERF1, FSCN2, DSG1,DSG2, TCF4, FECH, MC4R, GALR1, SALL3, LKB1, PNPLA6, RYR1, TGFB1, RPS19, DMPK, CRX, PRPF31, JAG1, PAX1, GDF5, HNF4A, SALL4, MC3R, RAE1, GNAS, EDN3, KCNQ2,SOX18,SLC5A3, RUNX1, DYRK1A, COL6A1, PRODH, DGCR2, HIRA, TBX1, COMT, RTN4R, PCQAP, LZTR1, INI1, MYH9, SOX10, FBLN1, PPARA, PROSAP2, SHOX, P2RY8, NLGN4X, TRAPPC2, RPS4X i CSF2RA. Przewidziane są również 15 homologi tych genów u innych gatunków. W korzystnym wykonaniu, sposób zmniejszania dostosowania konkurencyjnej organizmu, jak zdefiniowano w niniejszym opisie, można przeprowadzić u ssaka lub zwierzęcia wyższego na podstawie jednego lub więcej genów wykazujących haploinsuficjencję, lub na podstawie homologu jednego lub większej liczby tych genów wykazujących haploinsuficjencję. [0100] W dodatkowej grupie wykonań, genem wykazującego haploinsuficjencję według niniejszego 20 wynalazku może być gen wybrany z listy genów Arabidopsis thaliana RPSaA, RPSaB, RPS2A, RPS2B, RPS2C, RPS2D, RPS3A, RPS3B, RPS3C, RPS3aA, RPS3aB, RPS4A, RPS4B, RPS4C, RPS4D, RPS5A, RPS5B, RPS6A, RPS6B, RPS7A, RPS7B, RPS7C, RPS8A, RPS8B, RPS9A, RPS9B, RPS9C, RPS10A, RPS10B, RPS10C, RPS11A, RPS11B, RPS11C, RPS12A, RPS13B(A), RPS14A, RPS14B, RPS14C, RPS15A, RPS15B, RPS15C, RPS15D, RPS15E, RPS15F, RPS15aA, RPS15aB, RPS15aC, RPS15aD, 25 RPS15aE, RPS15aF, RPS16A RPS16B, RPS16C, RPS17A, RPS17B, RPS17C, RPS17D, RPS18A(A), RPS18B(B), RPS18C(C), RPS19A, RPS19B, RPS19C, RPS20A, RPS20B, RPS20C, RPS21A, RPS21B, RPS21C, RPS23A, RPS23B, RPS24A, RPS24B, RPS25A, RPS25B, RPS25C, RPS25D, RPS25E, RPS26B, RPS26A, RPS26C, RPS27A(C), RPS27B(A), RPS27D(B), RPS27aA, RPS27aB, RPS27aC, RPS28A, RPS28B, RPS28C, RPS29A, RPS29B, RPS29C, RPS29D, RPS30A PRS30B, RPS30C, RPP0A, 30 RPP0B, RPP0C, RPP1A, RPP1B, RPP1C, RPP2A, RPP2B, RPP2C, RPP2D, RPP2E, RPP3A, RPP3B, RPL3A(1), RPL3B(2), RPL3C, RPL4A, RPL4B, RPL4C, RPL4D, RPL5A,, RPL5B, RPL5C, RPL6A, RPL6B, RPL6C, RPL7A, RPL7B, RPL7C, RPL7D, RPL7aA, RPL7aB, RPL8A, RPL8B, RPL8C, RPL9A, RPL9B, RPL9C, RPL9D, RPL10A, RPL10B, RPL10C, RPL10 aA, RPL10aB, RPL10aC, RPL11A(A),RPL11B, RPL11C(B), RPL11D, RPL12A, RPL12B, RPL12C, RPL13A, RPL13B, RPL13C, RPL13D, RPL13aA, 35 RPL13aB, RPL13aC, RPL13aD, RPL14A, RPL14B, RPL15A, RPL15B, RPL17A, RPL17B, RPL18A, RPL18B, RPL18C, RPL18aC, PRL18aA, RPL18 aB, RPL18aC, RPL19A, RPL19B, RPL19C, RPL21A, RPL21B, RPL21C, RPL21D, RPL21E, RPL21F, RPL22A, RPL22B, RPL22C, RPL23A, RPL23B, RPL23C, RPL23aA(2), RPL23aB(3), RPL24A, RPL24B, RPL26A, RPL26B, RPL27A, RPL27B, RPL27C, RPL27aA RPL27aB, RPL27aC, RPL28A, RPL28B, RPL28C, RPL29A, RPL29B, RPL30A, RPL30B, RPL30C, 40 RPL31A, RPL31B, RPL31C, RPL32A, RPL32B, RPL34A, RPL34B, RPL34C, RPL35A, RPL35B, RPL35C, RPL35D, RPL35aA, RPL35aB, RPL35aC, RPL35aD, RPL36A, RPL36B, RPL36C, colRPL36aA, RPL36aB, 30

EP 2 934 093 B1

RPL37A, RPL37B, RPL37C, RPL37aA, RPL37aB, RPL37aC, RPL38A, RPL38B, RPL39A, RPL39B, RPL39C, RPL40A, RPL40B, RPL41A, RPL41B, RPL41C, RPL41D, RPL41E, RPL41F i RPL41G. Przewidziane są również homologi tych genów u innych gatunków. W korzystnym wykonaniu sposób zmniejszania dostosowania konkurencyjnego organizmu, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, 5 można przeprowadzić u Arabidopsis thaliana na podstawie jednego lub więkcej tych genów z wykazujących haploinsuficjencję. W dalszych wykonaniach sposób zmniejszania konkurencyjnego dostosowania organizmu, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, można przeprowadzić w innym organizmie, np. w innej roślinie, na podstawie homologu jednego lub więcej tych genów wykazujących haploinsuficjencję. Szczególnie korzystne jest zastosowanie genu RpL14 wykazującego haploinsuficjencję (o numerze 10 dostępu HomoloGene: 68375) lub Rpl 23aA (o numerze dostępu HomoloGene: 110453). [0101] W pierwszym etapie sposobu zmniejszania konkurencyjnego dopasowania organizmu według wynalazku ekspresja genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie jest zmniejszana. Zmniejszanie może być zmniejszaniem normalnej lub typowej ekspresji jednego typu genu wykazującego haploinsuficjencję o wartość około 10% 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 15 97%, 98%, 99% lub 100% u hemizygot. [0102] Korzystne jest, aby to zmniejszanie zachodziło w co najmniej podzbiorze komórek, które są wrażliwe na haploinsuficjencję, co może przyczynić się do fenotypu zmniejszającego dostosowanie. Rozumie się, że w niektórych wykonaniach nie wszystkie komórki są wrażliwe na haploinsuficjencję. Na przykład z uwagi na ograniczony charakter opisanych fenotypów np. mutacji Minute u Drosophila, zakłada się, że podzbiór 20 komórek może doświadczać deficytu w syntezie białek i przyczyniać się do szkodliwego fenotypu, podczas gdy inne komórki mogą nie doświadczać takiego deficytu. Odpowiednie techniki i podejścia do rozróżnienia między tymi grupami komórek będą znane specjalistom. Tkanki, które mogą doświadczać haploinsuficjencji, można zidentyfikować przy użyciu standardowych metod, np. ekspresji mRNA, tak jak testy analizy Northern i/lub poddane translacji polipeptydy można badać za pomocą testów analizy Western 25 lub barwienia Coomassie, lub doświadczeń izotopowych w trybie wychwytywania impulsów. Dalsze szczegóły i dodatkowe testy mogą pochodzić z zakwalifikowanych podręczników, np. od Aupodel i in., wyd, 2007, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork. Rolę, jaką mogą odgrywać dowolne tkanki zidentyfikowane jako wrażliwe na haploinsuficjencję w fenotypach potencjalnie zmniejszających dostosowanie, można zbadać, stosując szereg standardowych metod pomiaru 30 dostosowania konkurencyjnego genotypów w rodzaju doświadczenia wielopokoleniowego opisanego w Przykładzie 5, przy szczególnym ukierunkowaniu haploinsuficjencji na typy komórek kandydujących. Ukierunkowanie specyficznie na tkankę można osiągnąć poprzez umieszczenie genów zmniejszających ekspresję genu wykazującego haploinsuficjencję pod kontrolą promotorów specyficznych dla tkanki. [0103] Przez prawidłową lub typową ekspresję genu wykazującego haploinsuficjencję rozumie się 35 ekspresję genu wykazującego haploinsuficjencję w typowej sytuacji fizjologicznej, bez wpływu czynników stresowych lub zakłóceń wzrostu lub hamowania. Zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję może być zapewnione na wszystkich odpowiednich poziomach ekspresji. Ponadto, przewiduje się stosowanie więcej niż jednego genu wykazującego haploinsuficjencję na raz, tj. do przeprowadzenia sposobu według niniejszego wynalazku. Na przykład, można zmniejszyć 2, 3, 4, 5, 6, 7, 40 8, 9, 10 lub więcej genów wykazujących haploinsuficjencję pod względem ich aktywności lub

31

EP 2 934 093 B1

funkcjonalności, zgodnie z zasadami wymienionymi w niniejszym dokumencie, np. w tym samym czasie lub w sposób rozłożony w czasie. [0104] Zmniejszenie może opierać się na przykład na trwałej modyfikacji wszystkich kopii genomowych genu z wykazującego haploinsuficjencję. Przykładem takiej modyfikacji jest delecja, częściowa delecja lub 5 modyfikacja funkcjonalna wszystkich kopii genomowych genu wykazującego haploinsuficjencję. Ponadto, mogą być modyfikowane elementy genetyczne niezbędne do funkcjonowania genu wykazującego haploinsuficjencję, takie jak promotor, miejsce wiązania czynnika transkrypcyjnego, wzmacniacz lub terminator, w taki sposób, że gen wykazującego haploinsuficjencję nie jest już eksprymowany lub jego ekspresja jest zmniejszona. W korzystnych wykonaniach zmniejszenie ekspresji jest specyficzne, tj. jest 10 ukierunkowane i nieprzypadkowe w odniesieniu do genu wykazującego haploinsuficjencję, którego ekspresja powinna zostać zmniejszona. To specyficzne zmniejszenie zasadniczo wyklucza losowe zmniejszenie ekspresji na podstawie mutagenezy losowej lub mutagenezy insercyjnej. [0105] W konkretnych wykonaniach wynalazku zmniejszenie może być oparte na obecności pojedynczego transgenicznego locus, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. W kolejnym wykonaniu zmniejszenie 15 może opierać się na wielu transgenicznych loci, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. [0106] Funkcjonalna modyfikacja genu wykazującego haploinsuficjencję może być oparta na wprowadzeniu kodonów stop, wpływając w ten sposób na translację lub dostarczając skrócony rodzaj białka. Alternatywnie, do genu wykazującego haploinsuficjencję można wprowadzić modyfikację sekwencji kodującej. Taka modyfikacja może, na przykład, prowadzić do wymiany jednego, dwóch, trzech lub więcej 20 aminokwasów w jednym, dwóch, trzech lub więcej różnych miejscach sekwencji kodującej. Te wymiany aminokwasów mogą następnie zapobiegać interakcji kodowanego białka z innymi czynnikami, np. innymi białkami, czynnikami lub strukturami komórkowymi. Korzystne jest, aby modyfikacja sekwencji kodującej prowadziła do zmniejszenia lub całkowitego zniesienia funkcjonalności genu typu dzikiego z haploinsuficjencją. Wyboru takich miejsc docelowych modyfikacji można dokonać w zależności od 25 informacji strukturalnych lub funkcjonalnych genu wykazującego haploinsuficjencję. Alternatywnie, znaczenie funkcjonalne można wywnioskować na podstawie stopnia zakonserwowania filogenetycznego na poziomie stosowanej sekwencji reszt aminokwasowych. Takie informacje będą znane specjaliście lub można je uzyskać z odpowiedniej literatury lub źródeł z baz danych. Przykładami odpowiednich baz danych są NCBI: Homologene, NCBI: Genbank lub EBI: swiss-prot. 30 [0107] W korzystnym wykonaniu zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję może opierać się na środkach, które specyficznie zaburzają sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencjęą. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „specyficznie zaburzać” oznacza, że jednostka jest w stanie trwale modyfikować sekwencję DNA genu, w szczególności sekwencję genomową genu lub dowolną kopię pozagenomową genu, w sposób specyficzny dla sekwencji. Ta specyficzność 35 może być dostarczona przez jeden lub więcej motywów sekwencji, które są obecne tylko w docelowym genie wykazującego haploinsuficjencję (unikalny motyw sekwencji), np. we wszystkich allelach genów wykazujących haploinsuficjencję w komórce lub w genomie organizmu. Motywy sekwencji, w specjalnych wykonaniach, mogą być ponadto obecne w sekwencjach ortologicznych lub paralogowych genu wykazującego haploinsuficjencję. W korzystnym wykonaniu, takie motywy sekwencji mogą być obecne 40 tylko w jednym genie lub mogą występować w nie więcej niż dwóch genach, chyba że są częścią funkcjonalnie zbędnej rodziny genów. Motywy sekwencji, które można zastosować do takiego podejścia, 32

EP 2 934 093 B1

mogą mieć dowolną odpowiednią długość. Długość można zdefiniować zgodnie z wielkością i zmiennością genomu organizmu, w którym ma zostać przeprowadzone zakłócenie. Zazwyczaj można stosować motywy sekwencji od około 4 nukleotydów do około 150 nukleotydów. Użyteczność motywu sekwencji można dalej sprawdzić i zweryfikować poprzez porównanie z informacjami z bazy danych, np. dostępnymi informacjami 5 genomowymi na temat docelowego organizmu. Zaburzenie może prowadzić do całkowitego lub częściowego braku aktywności genu wykazującego haploinsuficjencję. Brak aktywności może być oparty na braku samego białka, np. z powodu braku ekspresji, trudnościach z translacją, szybkiej degradacji itp. lub może być oparty na dostarczaniu białek o zmienionych właściwościach, np. właściwościach wiązania, aktywności enzymatycznej, właściwościach lokalizacji itp. Konkretne zaburzenie może być, w konkretnych 10 wykonaniach, zaburzeniem przemijającym, np. zaburzeniem, które można odwrócić przez dalszą modyfikację genu wykazującego haploinsuficjencję. [0108] Korzystne przykłady środków, które są w stanie specyficznie zaburzać sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, obejmują nukleazę palca cynkowego (ZFN), CRISPR, meganukleazę i TALEN (nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji). 15 [0109] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „nukleaza palca cynkowego” odnosi się do sztucznych enzymów restrykcyjnych, które zazwyczaj wytwarza się przez połączenie domeny wiążącej DNA palca cynkowego z domeną cięcia DNA. Domeny palca cynkowego można korzystnie konstruować lub modyfikować w celu ukierunkowania na dowolną żądaną sekwencję DNA, tj. sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję według niniejszego wynalazku. Takie metody inżynieryjne będą znane 20 specjaliście w tej dziedzinie lub można je uzyskać z odpowiednich źródeł literaturowych, takich jak Bae i in., 2003, Nat Biotechnol, 21, 275-80; Wright i in., 2006, Nature Protocols, 1, 1637-1652.) [0110] Zazwyczaj nieswoista domena cięcia z endonukleaz restrykcyjnych typu II, np. z FokI, może być stosowana jako domena cięcia w ZFN. Ponieważ ta domena cięcia dimeryzuje w celu rozcięcia DNA, zazwyczaj konieczna jest para ZFN do celowania w niepalindromiczne miejsca DNA. ZFN przewidywane 25 w niniejszym wynalazku mogą ponadto obejmować fuzję niespecyficznego cięcia z końcem C każdej domeny palca cynkowego. Na przykład, aby umożliwić dwóm domenom cięcia na dimeryzację i rozcięcie DNA, zwykle konieczne są dwa pojedyncze ZFN do wiązania przeciwnych nici DNA z końcami C dostarczonymi w określonej odległości. Należy rozumieć, że sekwencje linkerowe między domeną palca cynkowego a domeną cięcia mogą wymagać, aby koniec 5’ każdego miejsca wiązania był oddzielony o 30 około 5 do 7 pz. Niniejszy wynalazek przewiduje dowolną odpowiednią postać lub wariant ZNF, np. klasyczne fuzje Fokl lub zoptymalizowaną wersję Fokl, a także enzymy ze zmodyfikowanymi interfejsami dimeryzacji, ulepszoną funkcjonalnością wiązania, lub warianty, które są w stanie dostarczyć gatunki heterodimeryczne. Dalsze szczegóły byłyby znane specjaliście lub mogą pochodzić z odpowiednich źródeł literaturowych, takich jak Bitinaite i in. PNAS, 95, 10570-10575 (1998); lub Szczepek i in., Nature 35 biotechnology 25, 786-93 (2007). [0111] „Meganukleazy” są rozumiane jako endodeoksyrybonukleazy, które zazwyczaj mają miejsce rozpoznawania w postaci dwuniciowych sekwencji DNA zawierających około 12 do 40 nukleotydów. Meganukleazy zwykle działają jako molekularne nożyce DNA, które zapewniają możliwość eliminacji lub modyfikacji sekwencji w sposób specyficzny dla sekwencji. Przykłady odpowiednich meganukleaz 40 obejmują endonukleazy intronowe i endonukleazy inteinowe. Sekwencja rozpoznająca meganukleazy może być modyfikowana przez inżynierię genetyczną lub białkową w celu ukierunkowania na dowolną 33

EP 2 934 093 B1

żądaną sekwencję DNA, tj. sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję według niniejszego wynalazku. W celu zapewnienia specyficzności sekwencji, specyficzność istniejących meganukleaz może być modyfikowana poprzez wprowadzenie zmiany do sekwencji aminokwasowej, a następnie selekcję funkcjonalnych białek. Alternatywnie, domeny białkowe z różnych enzymów mogą być łączone z 5 nukleazami, w wyniku czego powstają meganukleazy chimeryczne. Takie meganukleazy chimeryczne mogą mieć, na przykład, nowe miejsce rozpoznawania złożone z połowy miejsca meganukleazy i połowy miejsca białka. W kolejnych wykonaniach oba podejścia można łączyć, tj. modyfikację sekwencji wiążącej meganukleazę i fuzję z domeną białkową z innego enzymu. Meganukleazy do zastosowania w kontekście niniejszego wynalazku można dostarczyć, na przykład, na podstawie technologii stanowiącej własność 10 Cellectis, tj. opartej na domenach białkowych z homodimerycznej meganukleazy I-CreI, jak również z innych rusztowań meganukleaz. Dalsze odpowiednie meganukleazy można konstruować zgodnie z technologią dostarczoną przez Precision Biosciences, np. platformę Directed Nuclease Editor (DNE). Dalsze szczegóły, w szczególności w odniesieniu do możliwości modyfikacji meganukleaz, byłyby znane specjalistom lub mogą pochodzić z odpowiednich źródeł literaturowych, takich jak Gao i in., The Plant 15 journal for cell and molecular biology, 61, 176-87 (2010). [0112] Szczególnie korzystne jest zastosowanie systemu TALEN (nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji), tj. sztucznego enzymu restrykcyjnego, który jest wytwarzany przez fuzję domeny wiążącej DNA efektora TAL z domeną cięcia DNA. Efektory TAL są białkami, które są zazwyczaj wydzielane przez bakterie Xanthomonas lub gatunki pokrewne, lub które z nich opochodzą i zostały 20 zmodyfikowane. Domena wiążąca DNA efektora TAL może zawierać wysoce konserwatywną sekwencję, np. około sekwencję 33-34 aminokwasową, z wyjątkiem 12 i 13 aminokwasów, które są wysoce zmienne (powtórzenia o 2 zmiennych resztach lub RVD) i zazwyczaj wykazują silną korelację ze specyficznym rozpoznawaniem nukleotydów. Na podstawie tej zasady domeny wiążące DNA można konstruować, wybierając kombinację powtarzalnych segmentów zawierających RVD odpowiadające sekwencji DNA 25 genu wykazującego haploinsuficjencję. Domena cięcia TALEN DNA może pochodzić z odpowiednich nukleaz. Na przykład, domenę cięcia DNA z endonukleazy Fokl lub z wariantów endonukleazy Fokl można zastosować do konstruowania nukleaz hybrydowych. TALEN można korzystnie dostarczać jako osobne jednostki ze względu na specyfikę domeny Fokl, która działa jako dimer. W konkretnych wykonaniach, liczbę reszt aminokwasowych między domeną wiążącą DNA TALEN i domeną cięcia Fokl oraz liczbę zasad 30 między dwoma poszczególnymi miejscami wiążącymi TALEN można modyfikować lub optymalizować zgodnie z sekwencją DNA genu wykazującego haploinsuficjencję w celu dostarczenia wysokiego poziomu aktywności. TALEN lub składniki TALEN można korzystnie konstruować lub modyfikować w celu ukierunkowania na dowolną żądaną sekwencję DNA, tj. sekwencję DNA genu z wykazującego haploinsuficjencję według niniejszego wynalazku. Taką inżynierię może przeprowadzić zgodnie z 35 odpowiednimi metodologiami, np. Zhang i in., Nature Biotechnology, 1-6 (2011) lub Reyon i in., Nature Biotechnology, 30, 460-465 (2012). [0113] Niniejszy wynalazek przewiduje ponadto zastosowanie CRISPR (krótkie regularnie rozproszone, pogrupowane powtórzenia palindromowe). CRISPR można wykorzystać do zmniejszenia ekspresji określonych genów (lub grup lub podobnych genów). Zazwyczaj osiąga się to poprzez ekspresję 40 jednoniciowego RNA oprócz genu CRISPR. Technika zwykle polega na ekspresji genu CRISPR, takiego jak CAS9, oprócz sekwencji przewodników RNA (patrz na przykład Cong i in. DOI: 1013: 34

EP 2 934 093 B1

10.1126/science.1231143). Dwie nici rozcięte mogą być ukierunkowane na określone sekwencje przy użyciu ekspresji odpowiednich flankujących sekwencji przewodników RNA. W ten sposób rozcięcie chromosomów może lokalnie wzmocnić mutagenezę. To z kolei może przyczynić się do zmniejszenia prawidłowej ekspresji genów. Alternatywnie, do rozcięcia mRNA można zastosować ekspresję CRISPR, 5 tym samym zmniejszając ekspresję. W korzystnym wykonaniu sekwencje przewodnika RNA i ekspresja genu CRISPR (np. CAS9) mogą być włączone jako część konstruktu {Ud}, np. konstruktu opisanego w niniejszym dokumencie. Zmniejszenie może alternatywnie opierać się na ingerencji w transkrypt genu wykazującego haploinsuficjencję. Na przykład, transkrypt mRNA genu wykazującego haploinsuficjencję może być rozpoznany i inaktywowany lub zdegradowany zgodnie z odpowiednimi sposobami znanymi 10 specjalistom w dziedzinie. [0114] W korzystnym wykonaniu zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję może być oparte na środkach, które specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt genu wykazującego haploinsuficjencję. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje” oznacza, że jednostka lub środek jest zdolny do rozpoznawania i inaktywacji 15 gatunku sekwencji mRNA odpowiadających genowi wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Inaktywacja lub degradacja może być całkowitym zniszczeniem, degradacją lub degeneracją cząsteczki mRNA lub może być częściową degradacją lub destrukcją cząsteczki mRNA prowadzącą do zniesienia lub zapobiegania (potencjalnej) aktywności translacyjnej opartej na cząsteczce mRNA. W kolejnych wykonaniach sekwencję mRNA można inaktywować przez obróbkę, modyfikację, 20 przegrupowanie, relokalizację, przechowywanie lub inną aktywność wykonywaną na cząsteczce mRNA, co również prowadzi do zniesienia lub zapobiegania (potencjalnej) aktywności translacyjnej opartej na cząsteczce mRNA. Specyficzność może być dostarczona przez jeden lub więcej motywów sekwencji, które są obecne w transkrypcie (transkryptach) tylko genu wykazującego haploinsuficjencję (unikalny motyw sekwencji). Motywy sekwencji mogą być ponadto, w konkretnych wykonaniach obecne w transkryptach 25 ortologów lub paralogów genu wykazującego haploinsuficjencję. W korzystnym wykonaniu takie motywy sekwencji mogą występować tylko w jednym gatunku transkryptu lub mogą występować w nie więcej niż dwóch gatunkach transkryptu. Motywy sekwencji, które można zastosować do takiego podejścia, mogą mieć dowolną odpowiednią długość. Długość można zdefiniować zgodnie z wybranym podejściem molekularnym, organizmem, w którym zachodzi inaktywacja, obecnością i złożonością transkryptomu, 30 parametrami fizjologicznymi itp. Degradacja lub inhibicja transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję może prowadzić do całkowitego lub częściowego braku aktywności genu wykazującego haploinsuficjencję. Korzystne jest, aby aktywność genu wykazującego haploinsuficjencję była całkowicie nieobecna. Specyficzna inaktywacja transkryptów może być w niektórych wykonaniach inaktywacją przejściową, np. inaktywacją, którą można zatrzymać, wstrzymać lub zakończyć w organizmie, co prowadzi do dostarczenia 35 nowych transkryptów po zakończeniu inaktywacji. [0115] Korzystne przykłady środków, które są zdolne do specyficznej degradacji lub bezpośredniej inaktywacji transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję obejmują cząsteczkę siRNA, cząsteczkę miRNA, cząsteczkę antysensownego kwasu nukleinowego, np. cząsteczkę RNA lub DNA lub czynnik, który przenosi metylację DNA zależną od RNA. 40 [0116] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „siRNA” odnosi się do określonego rodzaju cząsteczki antysensownej, mianowicie małych hamujących dupleksów RNA, które indukują szlak 35

EP 2 934 093 B1

interferencji RNA (RNAi). Cząsteczki te mogą mieć różną długość i mogą mieć długość od około 18 do 28 nukleotydów, np. mają długość 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 lub 28 nukleotydów. Korzystnie cząsteczka ma długość 21, 22 lub 23 nukleotydów. Cząsteczka siRNA według niniejszego wynalazku może zawierać różne stopnie komplementarności do docelowego mRNA, korzystnie w nici antysensownej. siRNA 5 mogą mieć niesparowane zasady nawisowe na końcu 5’ lub 3’ nici sensownej i/lub nici antysensownej. Określenie „siRNA” obejmuje również dupleksy dwóch oddzielnych nici, a także pojedyncze nici, które mogą tworzyć struktury spinki do włosów zawierające region dupleksu. Korzystnie, siRNA może być dwuniciowy, gdzie dwuniciowa cząsteczka siRNA zawiera pierwszą i drugą nić, każda nić cząsteczki siRNA ma długość około 18 do około 23 nukleotydów, pierwsza nić cząsteczki siRNA zawiera sekwencję 10 nukleotydową mającą wystarczającą komplementarność z docelowym RNA poprzez interferencję RNA, a druga nić tej cząsteczki siRNA zawiera sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do pierwszej nici. Metody projektowania odpowiednich siRNA skierowanych na dany transkrypt docelowy, tj. transkrypt genu wykazującego haploinsuficjencję, są znane specjalistom w tej dziedzinie, np. z Elbashir i in., 2001, Genes Dev. 15, 188-200. Korzystne są również siRNA przeciw transkryptowi genu wykazującego 15 haploinsuficjencję, które są dostarczane w postaci krótkich RNA o strukturze spinki do włosów. Takie krótkie RNA o strukturze spinki do włosów mogą być wytwarzane lub projektowane zgodnie z dowolnym odpowiednim sposobem lub techniką znaną specjaliście w dziedzinie. Na przykład, narzędzie takie jak to dostępne na stronie http://www.molgyn.kgu.de/genesilencer/genesilencer.html (Kappel i in., Nature Protocols, 2007, 2 (12): 3257-69), można zastosować do zaprojektowania specyficznych cząsteczek 20 hnRNA transkryptów genu wykazującego haploinsuficjencję. Krótki RNA o strukturze spinki do włosów lub cząsteczka kodująca krótką cząsteczkę RNA o strukturze spinki do włosów mogą obejmować pierwszą rekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, zawierającą co najmniej pierwszą sekwencję odpowiadającą odcinkowi transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję i co najmniej drugą sekwencję odpowiadającą odwrotnemu dopełnieniu wymienionej pierwszej sekwencji. Długość może obejmować od 25 17 do 25 nukleotydów, korzystnie od 18 do 22, korzystniej 19 nukleotydów. Dodatkowo lub ewentualnie, między dwoma odcinkami sekwencji kwasu nukleinowego może być obecna sekwencja pętli. Ta sekwencja pętli może mieć długość od około 6 do 12 nukleotydów, korzystnie długość 9 nukleotydów. Ponadto, krótki RNA o strukturze spinki do włosów lub cząsteczka kodująca krótki RNA o strukturze spinki do włosów może zawierać sygnał terminatora i/lub sekwencje zawierające miejsca restrykcyjne dla endonukleaz. Co 30 najmniej pierwsza sekwencja odpowiadająca transkryptowi genu wykazującego haploinsuficjencję i co najmniej druga sekwencja odpowiadająca odwrotnemu dopełnieniu tej pierwszej sekwencji może być albo całkowicie komplementarna do sekwencji transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję lub jej odwrotnego dopełnienia, lub sekwencje mogą zawierać jedno lub więcej niedopasowań, np 1, 2, 3, 4 lub 5 niedopasowań. 35 [0117] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „miRNA” lub „mikroRNA” odnosi się do krótkiej jednoniciowej cząsteczki RNA o długości zazwyczaj 18–27 nukleotydów, która reguluje ekspresję genów. miRNA są zazwyczaj kodowane przez geny, z których DNA są one transkrybowane, ale nie ulegają translacji do białka. W kontekście naturalnym, miRNA są najpierw transkrybowane jako pierwotne transkrypty lub pri-miRNA z czapeczką i ogonem poli-A i obrabiane do krótkich 70-nukleotydowych struktur 40 łodyga-pętla znanych jako pre-miRNA w jądrze komórkowym. Ta obróbka jest przeprowadzana u zwierząt przez kompleks białkowy znany jako kompleks mikroprocesorowy, składający się z nukleazy Drosha i 36

EP 2 934 093 B1

białka wiążącego dwuniciowy RNA Pasha. Te pre-miRNA są następnie obrabiane do dojrzałych miRNA w cytoplazmie przez interakcję z endonukleazą Dicer, która również inicjuje tworzenie się kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC). Uważa się, że ten kompleks jest odpowiedzialny za wyciszenie genu obserwowane z powodu ekspresji miRNA i interferencji RNA. Zarówno nić sensowna, jak i nić 5 antysensowna DNA mogą działać jako matryce, dając początek miRNA. Zwykle, wydajna obróbka pri- miRNA przez Drosha wymaga obecności wydłużonego jednoniciowego RNA na obu końcach 3’ i 5’ cząsteczki spinki do włosów. Te motywy ssRNA mogą mieć różny skład, a ich długość ma duże znaczenie, jeśli obróbka ma w ogóle mieć miejsce. Ogólnie, kompleks Drosha rozcina cząsteczkę RNA około 22 nukleotydów od pętli końcowej. Pre-miRNA mogą nie mieć idealnej dwuniciowej struktury RNA (dsRNA) 10 zwieńczonej pętlą końcową. Kiedy Dicer rozcina łodygę-pętlę pre-miRNA, powstają zwykle dwie komplementarne krótkie cząsteczki RNA, ale tylko jedna jest zintegrowana z kompleksem RISC. Ta nić jest znana jako nić prowadząca i jest zazwyczaj wybierana przez białko argonautę, katalitycznie aktywną RNazę w kompleksie RISC, na podstawie stabilności końca 5’. Pozostała nić, znana jako nić przeciw- prowadząca lub nić pasażera, jest zazwyczaj rozkładana jako podstrat kompleksu RISC. Po integracji z 15 aktywnym kompleksem RISC, miRNA mogą parować zasady z komplementarnymi cząsteczkami mRNA i hamować translację lub mogą indukować degradację mRNA przez katalitycznie aktywnych członków kompleksu RISC, np. białka argonautów. [0118] Dojrzałe cząsteczki miRNA są zazwyczaj co najmniej częściowo komplementarne do transkryptów genu wykazującego haploinsuficjencję według niniejszego wynalazku. Korzystnie, miRNA przewidziane w 20 niniejszym wynalazku mogą być identyfikowalne i/lub możliwe do uzyskania zgodnie z testami i sposobami opisanymi w Hüttenhofer i Vogel, 2006, NAR, 34 (2): 635–646. Mogą one być na przykład w 100% komplementarne do ich sekwencji docelowych, tj. transkryptów genów wykazujących haploinsuficjencję. Alternatywnie, mogą mieć 1, 2 lub 3 niedopasowania, np. na końcowych resztach lub w środkowej części cząsteczki. Cząsteczki miRNA według niniejszego wynalazku mogą mieć długość od około 18 do 27 25 nukleotydów, np. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 lub 27 nukleotydów. Korzystne są 21- do 23-merami. miRNA wykazujące 100% komplementarności można korzystnie zastosować do degradacji transkryptów genów z haploinsuficjencją według niniejszego wynalazku, podczas gdy miRNA wykazujące mniej niż 100% komplementarności można korzystnie zastosować do blokowania procesów translacyjnych. [0119] Określenie „cząsteczka antysensowna” odnosi się do kwasu nukleinowego, który jest co najmniej 30 częściowo komplementarny do transkryptu genu wykazujących haploinsuficjencję zdefiniowanego w niniejszym dokumencie. Cząsteczka antysensowna według wynalazku może zawierać, na przykład, sekwencję komplementarną do co najmniej części transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję zdefiniowanego w niniejszym dokumencie. Cząsteczki antysensowne mogą ponadto być komplementarne do sekwencji regionu kodującego transkrypt genu wykazującego haploinsuficjencję lub komplementarne 35 do transkrybowanego nie podlegającego translacji regionu transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję. Komplementarny dsRNA, z którego może pochodzić cząsteczka prowadząca RNAi, może mieć różne długości, np. od około 21 do 1000 pz, korzystnie około 21, 40, 100, 200, 300 lub 1000 pz lub więcej, lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami. Te dsRNA można odpowiednio przetwarzać różnymi szlakami na katalitycznie aktywną RNazę w kompleksie RISC. 40 [0120] Korzystne jest, aby cząsteczka antysensowna była komplementarna do transkrybowanego poddanego translacji lub transkrybowanego nie ulegającego translacji regionu transkryptu genu 37

EP 2 934 093 B1

wykazującego haploinsuficjencję. Zasadniczo, cząsteczki antysensowne można stosować do kontrolowania ekspresji genów za pomocą antysensownego DNA lub RNA lub poprzez tworzenie potrójnej helisy. Antysensowna cząsteczka według wynalazku może zazwyczaj zawierać sekwencję, która jest komplementarna do co najmniej części transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję. Absolutna 5 komplementarność, choć preferowana, nie jest niezbędna. Sekwencja „komplementarna do co najmniej części transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję”, o której mowa w niniejszym dokumencie, oznacza sekwencję mającą wystarczającą komplementarność, aby móc hybrydyzować z transkryptem, tworząc w ten sposób stabilną formację dupleks-tripleks. Zdolność do hybrydyzacji będzie zależeć zarówno od stopnia komplementarności, jak i długości antysensownego kwasu nukleinowego. Ogólnie, im większy 10 hybrydyzujący kwas nukleinowy, tym może zawierać więcej niedopasowań zasad z transkryptem i nadal tworzyć stabilny dupleks lub tripleks. Specjalista w dziedzinie będzie wiedział, jak określić dopuszczalny stopień niedopasowania, za pomocą standardowych procedur, w celu ustalenia temperatury topnienia hybrydyzowanego kompleksu. Cząsteczka antysensowna może ponadto być komplementarna do dowolnej części mRNA eksprymowanego przez docelowy gen. Korzystnie, można stosować cząsteczki 15 antysensowne komplementarne do końca 5’ transkryptu, np. nieulegająca translacji sekwencja 5’ aż do kodonu inicjującego AUG włącznie w lub do inhibicji translokacji. W dalszym korzystnym wykonaniu, można również stosować sekwencje komplementarne do nieulegających translacji 3’ sekwencji transkryptów. [0121] Cząsteczką antysensowną według niniejszego wynalazku może być DNA lub RNA lub ich mieszaniny chimeryczne lub pochodne lub ich zmodyfikowane wersje, jednoniciowe lub dwuniciowe. 20 [0122] Określenie „czynnik przenoszący metylację DNA kierowaną przez RNA” odnosi się do kwasu nukleinowego, który jest zdolny do wyciszenia genu wykazującego haploinsuficjencję zgodnie z procesem epigenetycznym. Metylacja DNA kierowana przez RNA lub RdDM jest zazwyczaj obecna w komórkach roślinnych i zwierzęcych i może być przenoszona przez krótkie dwuniciowe cząsteczki RNA lub dsRNA. Te RNA są zazwyczaj obrabiane przez komórkę i mogą prowadzić do metylacji komplementarnych loci 25 genomowych, a tym samym zaburzać transkrypcję z tych loci poprzez interakcję z resztami histonowymi. [0123] W dalszym szczególnym wykonaniu wynalazku, środkiem, który specyficznie degraduje lub inaktywuje transkrypt genu wykazującego haploinsuficjencję, może być katalityczny RNA lub rybozym. Określenie „katalityczny RNA” lub „rybozym” odnosi się do niekodującej cząsteczki RNA, która jest zdolna do specyficznego wiązania się z docelowym mRNA, tj. transkryptem genu wykazującego 30 haploinsuficjencję, raz cięcia lub degradacji wymienionego docelowego mRNA. Zazwyczaj rybozymy rozcinają mRNA w specyficznych dla miejsca sekwencjach rozpoznawania i można je projektować, konstruować i stosować do niszczenia transkryptów genów wykazujących haploinsuficjencję według niniejszego wynalazku. Przewidywanym przykładem rybozymu jest rybozym „Hammerhead”. Rybozymy Hammerhead zazwyczaj przecinają mRNA w miejscach podyktowanych przez regiony flankujące, które 35 tworzą komplementarne pary zasad z docelowym mRNA. Konstrukcja i produkcja rybozymów Hammerhead jest znana w stanie techniki i opisana w Haseloff i Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591. Korzystnie, rybozym może być tak skonstruowany tak, aby miejsce rozpoznania cięcia było zlokalizowane w pobliżu końca 5’ transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję. [0124] W kolejnym alternatywnym wykonaniu zmniejszenie ekspresji genu wykazującego 40 haploinsuficjencję w organizmie może opierać się na interferencji z eksprymowanym produktem białkowym genu wykazującego haploinsuficjencję. Na przykład, niniejszy wynalazek przewiduje wszelkie odpowiednie 38

EP 2 934 093 B1

środki, o których wiadomo, że zaburzają obecność i/lub ilość eksprymowanego produktu białkowego genu z haploinsuficjencją. Takie środki mogłyby być, na przykład, antagonistą eksprymowanego produktu białkowego genu z haploinsuficjencją. Przykłady odpowiednich antagonistów obejmują związek bezpośrednio lub pośrednio hamujący lub modulujący aktywność eksprymowanego produktu białkowego 5 genu z haploinsuficjencją, dominujący negatywny wariant eksprymowanego produktu białkowego genu z haploinsuficjencją, aptamer specyficzny dla eksprymowanego produktu białkowego genu z haploinsuficjencją, przeciwciało lub intrabody przeciwko eksprymowanemu produktowi białkowemu genu z haploinsuficjencją, lub małą cząsteczkę zdolną do specyficznego wiązania się z eksprymowanym produktem białkowym genu z haploinsuficjencją. 10 [0125] „Związek bezpośrednio hamujący lub modulujący aktywność eksprymowanego produktu białkowego genu z haploinsuficjencją” może być dowolnym związkiem, który jest zdolny do zmniejszania aktywności eksprymowanego produktu białkowego genu z haploinsuficjencją, i który bezpośrednio oddziałuje, np. przez wiązanie do eksprymowanego produktu białkowego genu z haploinsuficjencją. Taki związek może na przykład być interaktorem, który ma negatywny wpływ na aktywność katalityczną 15 produktu białkowego genu z haploinsuficjencją, np. przez utrudnianie dalszej interakcji lub wiązania powierzchni lub kieszeni. [0126] „Związek pośrednio hamujący lub modulujący aktywność eksprymowanego produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję” może być dowolnym związkiem, który jest zdolny do redukowania aktywności eksprymowanego produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję poprzez 20 interakcję z bezpośrednim interaktorem produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję lub przez pośredni szlak roboczy nie obejmujący interakcji z produktem białkowym genu z haploinsuficjencją. Przykłady takich interaktorów obejmują aktywności enzymatyczne degradujące aktywatory produktów białkowych genu wykazującego haploinsuficjencję lub białka zdolne do wiązania i wygaszania aktywatorów produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję. Alternatywnie, takie interaktory mogą 25 pozytywnie modulować aktywności prowadzące do degradacji produktu białkowego genu z haploinsuficjencją, np. proteinaz. [0127] „Dominujący negatywny wariant eksprymowanego produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję” może być białkiem zawierającym modyfikację antymorficzną, która niekorzystnie wpływa na eksprymowany produkt białkowy genu wykazującego haploinsuficjencję. Zazwyczaj, 30 dominujące negatywne zachowanie może wystąpić, jeśli wariant antymorficzny może oddziaływać z eksprymowanym produktem białkowym genu wykazującego haploinsuficjencję, ale blokuje pewien aspekt jego funkcji. Takie warianty mogą na przykład zawierać lub nie zawierać specyficznych domen eksprymowanego produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję, np. jednej lub więcej domen wchodzących w interakcje białko-białko lub dimeryzacyjnych, domen składania kompleksu, jednej lub 35 więcej domen związanych z błoną itp. Jest to szczególnie ważne w białku, które działa jako dimer lub multimer. Jeśli na przykład jedna część tego kompleksu białkowego jest zmutowana w jakimś funkcjonalnym aspekcie multimeru, ale nadal jest zdolna do utworzenia multimeru, może mieć dominujący wpływ na inne części typu dzikiego kompleksu i wpływ negatywny, jeśli mutacja uniemożliwia kompleksowi wykonywanie jego normalnej funkcji. Postać dominująca-negatywna może na przykład specyficznie 40 blokować działanie eksprymowanego produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję, z którego został uzyskany. 39

EP 2 934 093 B1

[0128] „Aptamer specyficzny dla eksprymowanego produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję” może być krótkim peptydem zdolnym do interakcji i specyficznego wiązania z eksprymowanym produktem białkowym genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Taki aptamer peptydowy może zawierać zmienną pętlę peptydową, obejmującą 5 na przykład 10 do 20 aminokwasów. W kontekście niniejszego wynalazku, aptamer peptydowy może być korzystnie przyłączony na jednym lub obu końcach do struktury rusztowania. Struktura rusztowania może być dowolną cząsteczką, korzystnie białkiem, które ma dobre właściwości rozpuszczalności i zwartości. Odpowiednie cząsteczki rusztowania byłyby znane specjalistom w tej dziedzinie. Korzystną cząsteczką rusztowania, do zastosowania w kontekście niniejszego wynalazku, jest białko bakteryjne, tioredoksyna A. 10 [0129] „Przeciwciało przeciwko eksprymowanemu produktowi białkowemu genu wykazującego haploinsuficjencję” może być dowolną cząsteczką immunoglobuliny i immunologicznie aktywnymi częściami cząsteczki immunoglobuliny, tj. cząsteczkami zawierającymi miejsce wiązania antygenu, które immunospecyficznie wiąże antygen lub epitop obecny na produkcie białkowym genu wykazującego haploinsuficjencję. Cząsteczki immunoglobulin mogą być cząsteczkami immunoglobuliny dowolnego typu 15 (np. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klasy (np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) lub podklasy. Takie przeciwciało może być przeciwciałem monoklonalnym, wielospecyficznym, ludzkim, humanizowanym lub chimerycznym, przeciwciałem jednołańcuchowym, fragmentem Fab, fragmentem Fab', diciałem lub fragmentami wiążącymi epitop dowolnego z powyższych. W korzystnym wykonaniu przeciwciało wiążące antygen lub epitop obecny na produkcie białkowym genu z haploinsuficjencją jest zdolne do zakłócania 20 aktywności lub funkcji związanego produktu białkowego. Taką interferencją może być na przykład zmniejszenie aktywności, inhibicja aktywności, odchylenie od normalnej lokalizacji, inhibicja lub zmniejszenie interakcji z innymi białkami, degradacja, częściowa degradacja itp. [0130] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „intraciało przeciwko eksprymowanemu produktowi białkowemu genu wykazującego haploinsuficjencję” oznacza przeciwciało, które działa w 25 komórce. Intraciało korzystnie modyfikuje się do lokalizacji wewnątrzkomórkowej. W niektórych wykonaniach, intraciała mogą wykazywać specjalne zmiany, takie jak modyfikacja domen VL immunoglobuliny pod kątem hiperstabilności, zapewnienie odporności na redukujące środowisko wewnątrzkomórkowe, lub ekspresja jako białko fuzyjne z białkiem wiążącym maltozę lub innymi stabilnymi białkami wewnątrzkomórkowymi. W kolejnych wykonaniach, intraciało może być przeciwciałem 30 jednołańcuchowym (scFv). W korzystnym wykonaniu intraciało wiążące antygen lub epitop obecny na produkcie białkowym genu wykazującego haploinsuficjencję jest zdolne do zakłócania aktywności lub funkcji związanego produktu białkowego. Taką interferencją może być na przykład zredukowanie aktywności, inhibicja aktywności, odchylenie od normalnej lokalizacji, inhibicja lub redukcja interakcji z innymi białkami, degradacja, częściowa degradacja itp. 35 [0131] Określenie „mała cząsteczka zdolna do swoistego wiązania z eksprymowanym produktem białkowym genu wykazującego haploinsuficjencję”, stosowane w kontekście niniejszego wynalazku, odnosi się do małego związku organicznego, który jest korzystnie biologicznie aktywny, tj. biomolekuły, ale korzystnie nie jest polimerem, i który wiąże się z eksprymowanym produktem białkowym genu wykazującego haploinsuficjencję. Taki związek organiczny może mieć dowolną odpowiednią postać lub 40 właściwość chemiczną. Związek jest korzystnie związkiem naturalnym, np. wtórnym metabolitem, który może być wytwarzany i/lub modyfikowany na podstawie szlaków genetycznych/biochemicznych obecnych 40

EP 2 934 093 B1

w komórce, lub który może być dostarczony do komórki. W korzystnym wykonaniu, mała cząsteczka wiążąca się z produktem białkowym genu wykazującego haploinsuficjencję może zakłócać aktywność lub funkcję związanego produktu białkowego. Taką interferencją może być na przykład zredukowanie aktywności, inhibicja aktywności, odchylenie od normalnej lokalizacji, inhibicja lub zredukowanie interakcji 5 z innymi białkami, degradacja, częściowa degradacja itp. Sposoby i techniki identyfikacji i otrzymywania małych cząsteczek a także testy do testowania małych cząsteczek są znane specjalistom w tej dziedzinie. [0132] Metodologia według niniejszego wynalazku wymaga, aby wymienione środki zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie były przenoszone przez transgeniczny locus w samym organizmie. W związku z tym, dowolny środek, który specyficznie degraduje lub inaktywuje transkrypt genu 10 wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano powyżej, dowolny środek, który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję i/lub jakikolwiek środek, który zaburza ekspresję produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję, może być dostarczony poprzez transgeniczny locus w organizmie. Na przykład, cząsteczki RNA lub DNA, jakie opisano w niniejszym dokumencie, można dostarczyć poprzez odpowiednie konstrukty ekspresyjne obecne we wymienionym transgenicznym locus. 15 Konstrukt ekspresyjny może, na przykład, zawierać elementy kontrolne pozwalające regulować ekspresję dowolnego z gatunków RNA lub DNA wymienionych w niniejszym dokumencie powyżej. Regulację można na przykład przeprowadzić poprzez elementy promotorowe funkcjonalnie połączone z kasetami ekspresyjnymi lub modułami ekspresyjnymi dla siRNA, miRNA, antysensownego RNA lub DNA, dsRNA, nukleaz, np. ZFN, TALEN, CRISPR lub meganukleazy, lub związki proteinowe bezpośrednio lub pośrednio 20 hamujące lub modulujące aktywność eksprymowanego produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję, warianty dominujące negatywne eksprymowanych produktów białkowych genu wykazującego haploinsuficjencję, aptamery specyficzne dla eksprymowanego produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję, przeciwciała lub intraciała przeciwko eksprymowanemu produktowi białkowemu genu wykazującego haploinsuficjencję lub mała cząsteczka zdolna do swoistego wiązania się 25 z eksprymowanym produktem białkowym genu wykazującego haploinsuficjencję. Taka regulacja może na przykład opierać się na promotorach, które można kontrolować za pomocą różnych parametrów, takich jak obecność metabolitów lub małych cząsteczek, pH, temperatura, światło, obecność czynników wzrostu itp. Zakłada się również, że promotory są konstytutywnie aktywne. W przypadku gatunków RNA, które mają być generowane, moduły ekspresyjne mogą zapewniać odpowiednie struktury linkerowe umożliwiające 30 wytwarzanie zapętlonych lub dwuniciowych cząsteczek RNA, miejsc wiązania polimerazy RNA, wewnętrznych miejsc wiązania lub cięcia itp. W przypadku konstruktów ekspresyjnych dla białek lub polipeptydów lub peptydów można dostarczyć dowolny odpowiedni element do wzmocnienia transkrypcji i/lub translacji sekwencji kodującej, np. rybosomalne miejsca wejścia, miejsce wiązania czynnika transkrypcyjnego itp. Przeciwciała mogą być na przykład eksprymowane w sposób jedno- lub wielogenowy. 35 W celu dostarczenia małych cząsteczek może być eksprymowany jeden lub większa liczba członków szlaków syntetycznych, np. heterologicznych lub homologicznych szlaków syntetycznych. [0133] W dalszych wykonaniach wynalazku, środki do zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie można dostarczyć w sposób dwu- lub wieloetapowy. Na przykład, transgeniczny locus może dostarczyć aktywność prowadzącą do dostarczenia DNA, RNA, białka lub 40 małych cząsteczek. Transgeniczny locus może dodatkowo dostarczyć dodatkową aktywność, która jest zdolna do modyfikowania wymienionego wcześniej wygenerowanego DNA, RNA, białka lub małych 41

EP 2 934 093 B1

cząsteczek. Ta modyfikacja może prowadzić do zwiększenia jego funkcji, zmiany celu, zmiany zdolności do interakcji. Kasety ekspresyjne mogą ponadto zawierać regiony terminatora, regiony niezbędne do integracji genomowej i/lub regiony niezbędne do uniknięcia wyciszenia genomu. [0134] Sekwencje kodujące białko można ponadto dostosować w zakresie ich wykorzystania kodonu do 5 przeważającego wykorzystania kodonów w organizmie, gatunku, klasie, rzędzie lub rodzinie, w której są wykorzystywane. Adaptacja wykorzystania kodonów może być na przykład adaptacją wykorzystania monokodonu, tj. adaptacją częstości wykorzystania pojedynczych kodonów wśród wszystkich eksprymowanych genów lub wśród 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% lub 60% najczęściej eksprymowanych genów. Alternatywnie, adaptacja wykorzystania kodonu może być adaptacją wykorzystania di-kodonu, tj. 10 adaptacją do częstości wykorzystania kombinacji dwóch kolejnych kodonów wśród wszystkich eksprymowanych genów lub między 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% lub 60% najczęściej eksprymowanych genów. Takie wykorzystanie di-kodonów może być pomocne w unikaniu obecności motywów sekwencji, które mogą mieć szkodliwy wpływ na transkrypcję genu, np. sekwencji kryptycznych terminacji lub degradacji RNA itp. 15 [0135] W dalszych konkretnych wykonaniach, aktywność, która prowadzi do redukcji ekspresji genu z haploinsuficjencją w organizmie, może być dostarczona jako związek zewnętrzny, który ma być podawany komórce lub organizmowi, ale który nie rozwija swojej funkcji przed aktywacją lub modyfikacją. Aktywację lub modyfikację można przeprowadzić sposobami opisanymi powyżej, np. poprzez białko lub kwas nukleinowy, który ulega ekspresji poprzez transgeniczny locus, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. 20 Na przykład, zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haplooinsuficjencję w organizmie można zainicjować poprzez podanie do komórki lub organizmu związku prekursorowego, który nie jest w stanie oddziaływać z transkryptem genu wykazującego haploinsuficjencję lub eksprymowanym produktem białkowym, i wymaga modyfikacji przez aktywność zapewnianą przez transgeniczny locus, np., etap cięcia enzymatycznego, konwersję enzymatyczną i tym podobne. 25 [0136] W drugim etapie sposobu zmniejszania dostosowania konkurencyjnego organizmu w hemizygotach według wynalazku, zostaje uratowana zmniejszona ekspresja genu z haploinsuficjencją w organizmie. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „ratowanie” oznacza, że zapewniona jest aktywność, która zasadniczo czyni komórkę lub organizm co najmniej częściowo odpornym na tłumienie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w hemizygotach, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, i całkowicie 30 ratuje w homozygotach. Stosowanie określenia „ratowanie” obejmuje wszelkie przypadki, w których genetyczne zjawiska transwekcji przyczyniają się do ratowania konkurencyjnego fenotypu zmniejszającego dostosowanie konkurencyjne u homozygot. [0137] Dostarczenie co najmniej częściowej oporności lub częściowego ratowania wobec tłumienia ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję oznacza, że powstaje sytuacja, w której całkowita 35 aktywność lub funkcjonalność genu wykazującego haploinsuficjencję nie jest lub już nie jest dłużej zmniejszana, albo nie jest lub już nie jest dłużej istotnie zmniejszana. Na przykład, aktywność lub funkcjonalność sytuacji ekspresji ratunkowej w odniesieniu do sytuacji ekspresji typu dzikiego może mieścić się w zakresie około co najmniej 20% 30% 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% lub 90% lub dowolnej wartości pomiędzy tymi wartościami sytuacji ekspresji typu dzikiego w co najmniej 40 niektórych komórkach wrażliwych na haploinsuficjencję, które przyczyniają się do fenotypu redukcji dostosowania konkurencyjnego, tj. sytuacji, w której obecna jest aktywność lub funkcjonalność typu 42

EP 2 934 093 B1

dzikiego, jeśli ratowanie jest dostarczone przez hemizygotyczny, np heterozygotyczny transgeniczny locus. Aktywność lub funkcjonalność sytuacji ekspresji ratunkowej w odniesieniu do sytuacji ekspresji typu dzikiego może mieścić się w zakresie co najmniej około 30% 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85% lub 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% lub więcej lub dowolnej 5 wartości pomiędzy lub dowolnej wartości pomiędzy tymi wartościami sytuacji ekspresji typu dzikiego, tj. sytuacji, w której obecna jest aktywność lub funkcjonalność typu dzikiego, jeśli ratowanie jest dostarczone przez homozygotyczny transgeniczny locus. Ocalenie lub sytuacja ekspresji typu dzikiego odpowiednio odnosi się do ekspresji wszystkich kopii genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie, w tym kopii odpornych, które są częścią konstruktu charakteryzującego się poddominacją. Można to na przykład 10 zmierzyć w testach wykrywania transkryptu, testach aktywności enzymatycznej, poprzez wykrywanie obecności kompleksów strukturalnych w komórce lub dowolnym innym odpowiednim podejściem. [0138] Liczba kopii genu ratunkowego na genom może wynosić jedną lub więcej. Liczba kopii może się różnić w zależności od konfiguracji genetycznej organizmu, mechanizmu ratunkowego, właściwości ekspresji w miejscu wstawienia transgenicznego locus, ploidii organizmu lub liczby paralogicznych genów 15 w genomie organizmu lub innych odpowiednich parametrów, w szczególności hemizygotyczności lub homozygotyczności organizmu pod względem transgenicznego locus, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Na przykład, w organizmie diploidalnym jeden zdefiniowany w niniejszym dokumencie transgeniczny allel, który może zawierać pojedynczą kopię genu ratunkowego, może występować w sytuacji hemizygotycznej, lub w organizmie diploidalnym dwa zdefiniowane w niniejszym dokumencie 20 transgeniczne loci, które mogą obejmować każdą pojedynczą kopię genu ratunkowego mogą być obecne w sytuacji homozygotycznej. Ponadto, przewiduje się organizmy diploidalne z więcej niż jednym genem ratunkowym na transgeniczny locus. [0139] W organizmie poliploidalnym, np. w organizmie tetraploidalnym, układ hemizygotyczny może obejmować obecność 1, 2 lub 3 transgenicznych alleli w locus, podczas gdy układ homozygotyczny może 25 obejmować obecność 4 transgenicznych alleli w locus. Te transgeniczne allele mogą zawierać jedną lub więcej niż jedną kopię genu ratunkowego. [0140] W dalszych konkretnych wykonaniach wynalazku druga lub kolejna kopia genu ratunkowego może być obecna w drugiej lub dalszej pozycji w genomie organizmu. Dokładną liczbę kopii genu ratunkowego w locus transgenicznym można korzystnie ustalić empirycznie, np. w zależności od właściwości 30 ekspresyjnych pozycji integracji transgenicznego locus, ploidii organizmu, liczby genów paralogicznych w genomie, które są zasadniczo funkcjonalnie zbędne itp. [0141] W niektórych wykonaniach, ratowanie może prowadzić do całkowitego przywrócenia aktywności lub funkcjonalności typu dzikiego genu wykazującego haploinsuficjencję, którego ekspresja została zmniejszona w początkowym etapie, jak zdefiniowano powyżej. W dalszych wykonaniach, ratowanie może 35 prowadzić do częściowego przywrócenia aktywności lub funkcjonalności typu dzikiego genu wykazującego haploinsuficjencję, którego ekspresja została zmniejszona w początkowym etapie, jak zdefiniowano powyżej, np. przywrócenia około 20% 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% w co najmniej niektórych komórkach wrażliwych na haploinsuficjencję, które przyczyniają się do fenotypu zmniejszonego dostosowania konkurencyjnego w hemizygotach, lub 40 większej lub dowolnej wartości pomiędzy tymi wartościami aktywności lub funkcjonalności typu dzikiego

43

EP 2 934 093 B1

genu wykazującego haploinsuficjencję, którego ekspresja została zmniejszona w etapie początkowym, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie powyżej. [0142] Ratowanie może być dostarczone, na przykład, przez modyfikację genu wykazującego haploinsuficjencję, którego ekspresja została zmniejszona w etapie początkowym, jak zdefiniowano 5 powyżej, lub przez dostarczenie genu ratunkowego. [0143] Określenie „gen ratunkowy” w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, odnosi się do kopii genu wykazującego haploinsuficjencję, który może obejmować flankujące regiony regulatorowe i który został zmodyfikowany tak, aby uczynić go odpornym na supresję ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Zapewnienie przynajmniej częściowego 10 ratowania w stosunku do tłumienia ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję może korzystnie odbywać się bez zmniejszenia jego funkcjonalności lub bez istotnego zmniejszenia jego funkcjonalności. Na przykład, funkcjonalność genu ratunkowego w odniesieniu do allelu typu dzikiego może być w zakresie około co najmniej 5% 10% 20% 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% lub dowolnej wartości pomiędzy tymi wartościami aktywności lub 15 funkcjonalności typu dzikiego w komórkach, które są wrażliwe na haploinsuficjencję. W jednym wykonaniu, w którym jeden nieparalogiczny locus z haploinsuficjencją, korzystnie nie rodzina genów zasadniczo funkcjonalnie zbędnych genów wykazujących haploinsuficjencję, jest ukierunkowany w diploidzie z pojedynczego locus charakteryzującego się poddominacją, przewiduje się, że funkcjonalność ratowania na transgeniczny allel nie przekroczy około 200% funkcjonalności allelu typu dzikiego w docelowym locus 20 wykazującym haploinsuficjencję. Rozumie się, że taki efekt zapewnia deficyt funkcjonalności w hemizygotach w porównaniu z homozygotami, co leży u podstaw poddominacji. [0144] W dalszych wykonaniach, celem może być rodzina genowa zasadniczo funkcjonalnie zbędnych genów wykazujących haploinsuficjencję lub organizm może być poliploidalny. W takich sytuacjach funkcjonalność ratowania na allel transgeniczny może przyjąć dowolną wartość względnej funkcjonalności 25 w odniesieniu do wszystkich alleli typu dzikiego w rodzinie genowej, która może być w zakresie od co najmniej 5% do 190%, np. 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% lub dowolnej wartości pomiędzy tymi wartościami aktywności lub funkcjonalności typu dzikiego w komórkach, które są wrażliwe na haploinsuficjencję. Funkcjonalność można na przykład zmierzyć w jednostkach aktywności enzymatycznej, obecności 30 kompleksów strukturalnych w komórce lub dowolnym innym odpowiednim podejściem. [0145] Liczba kopii genu ratunkowego na genom może wynosić jeden lub więcej na genom haploidalny i może, w niektórych wykonaniach, znajdować się w więcej niż jednym transgenicznym locus. Liczba kopii genu ratunkowego, który może być częścią konstruktu transgenicznego, może się różnić w zależności od konfiguracji genetycznej organizmu, mechanizmu ratunkowego, właściwości ekspresyjnych w miejscu 35 wstawienia transgenicznego locus, ploidii organizmu lub liczby paralogicznych genów w genomie organizmu, lub innych odpowiednich parametrów. Na przykład, w organizmie diploidalnym zdefiniowany w niniejszym dokumencie transgeniczny locus może obejmować pojedynczy locus ze zmienną liczbą kopii locus transgenicznego. W organizmie poliploidalnym, np. organizmie tetraploidalnym, może istnieć więcej niż jeden transgeniczny locus ukierunkowany na lub ratujący tę samą grupę genów wykazujących 40 haploinsuficjencję. W dalszych wykonaniach, aktywność ratująca genu może być podzielona na wiele transgenicznych loci. Na przykład, druga lub kolejna kopia genu ratunkowego lub aktywność ratująca może 44

EP 2 934 093 B1

być obecna w drugim lub dalszym locus w genomie organizmu. Dokładną liczbę kopii genu ratunkowego lub aktywności ratującej w locus transgenicznym można korzystnie określić empirycznie, np. w zależności od właściwości ekspresyjnych pozycji integracji transgenicznego locus, ploidii organizmu, liczby genów paralogicznych w genomie, które są zasadniczo funkcjonalnie zbędne itp. 5 [0146] Modyfikacja genu wykazującego haploinsuficjencję w celu umożliwienia odzyskania zmniejszonej ekspresji może być modyfikacją sekwencji genomowej genu wykazującego haploinsuficjencję. Modyfikacja może być, na przykład, modyfikacją pierwotnej sekwencji genu wykazującego haploinsuficjencję przez mutację, która nie ma efektu fenotypowego, tj. prowadzi do tej samej sekwencji aminokwasowej. Przewidziane są również mutacje, które prowadzą do innej sekwencji aminokwasowej, która dostarcza 10 podobną lub równoważną aktywność lub funkcjonalność jak oryginalna lub sekwencja aminokwasowa typu dzikiego. Zmniejszenie aktywności lub funkcjonalności typu dzikiego na allel poprzez modyfikację do około 50%, 60%, 70%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% jest również przewidziane w bardzo konkretnym wykonaniu niniejszego wynalazku. Korzystne jest stosowanie mutacji synonimicznych, które nie zmieniają sekwencji aminokwasowej typu dzikiego. Takie mutacje mogą być przeprowadzane we wszystkich 15 kodonach lub w części kodonów lub tylko w jednym, dwóch, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 lub większej liczbie kodonów genu wykazującego haploinsuficjencję. Mutacje można dostarczyć w jednym miejscu w otwartej ramce odczytu genu wykazującego haploinsuficjencję lub w 2, 3, 4, 5, 6, 7 lub więcej miejscach w otwartej ramce odczytu genu wykazującego haploinsuficjencję. W dalszych wykonaniach, mutacje mogą być również obecne w niekodujących 20 regionach genu wykazującego haploinsuficjencję, np. w regionie nie podlegającym translacji 3’, w regionie nie podlegającym translacji 5’ lub w obu. Mutacje mogą być dostarczone w jednym miejscu w niekodujących regionach genu z haploinsuficjencją lub w 2, 3, 4, 5, 6, 7 lub większej liczbie miejsc w niekodującym regionie (regionach) genu wykazującego haploinsuficjencję. Przewiduje się także kombinację mutacji w obu sektorach genu wykazującego haploinsuficjencję. 25 [0147] Modyfikacja może ponadto być modyfikacją synonimiczną zgodnie z dowolną możliwością synonimicznego kodowania aminokwasów zgodnie z kodem genetycznym organizmu, który ma być wykorzystany. W dalszych wykonaniach modyfikacja może być modyfikacją synonimiczną, która opiera się na korzystnym wykorzystaniu kodonów w organizmie, który ma być wykorzystany. Modyfikacja sekwencji pierwotnej lub sekwencji genomowej genu wykazującego haploinsuficjencję może prowadzić do unikania 30 lub braku miejsc rozpoznawania dla środków, które specyficznie degradują transkrypty genów, lub które zaburzają sekwencje DNA, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. [0148] Na przykład, modyfikacja ratująca gen wykazujący haploinsuficjencję, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, może prowadzić do uniknięcia wiązania cząsteczek antysensownego siRNA, miRNA itp. do transkryptu genu wykazującego haploinsuficjencję, zapobiegając w ten sposób degradacji 35 tego transkryptu. Alternatywnie, modyfikacja ratująca gen wykazujący haploinsuficjencję, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, może prowadzić do zapobiegania rozpoznawaniu i/lub wiązaniu nukleaz, takich jak ZNF, meganukleaza, CRISPR lub TALEN, unikając w ten sposób modyfikacji genomowej podstawowej sekwencji pierwszorzędowej. W kolejnej alternatywie, modyfikacja ratująca może prowadzić do zmiany sekwencji aminokwasowej eksprymowanego produktu białkowego genu wykazującego haploinsuficjencję, 40 który może nie być dłużej rozpoznawany i/lub hamowany i/lub zakłócany przez jednostki takie jak aptamery, przeciwciała, intraciała, małe cząsteczki, warianty dominujące negatywnie itp., jak zdefiniowano powyżej. 45

EP 2 934 093 B1

Na przykład, modyfikowane mogą być epitopy, modyfikowane mogą być funkcjonalnie nieistotne domeny interakcji, modyfikowane mogą być funkcjonalnie nieistotne interfejsy itp. [0149] W konkretnych wykonaniach działanie ratujące może być dostarczone przez sekwencję ortologiczną lub paralogiczną genu wykazującego haploinsuficjencjęą, który jest funkcjonalnie 5 równoważny, ale jest wystarczająco rozbieżny na poziomie sekwencji, aby był niewrażliwy na supresję. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „sekwencja ortologiczna” oznacza sekwencje pochodzące z genów obecnych w różnych gatunkach, które powstały w wyniku pionowego zejścia z jednego genu ostatniego wspólnego przodka. Sekwencja ortologiczna korzystnie ma taką samą aktywność jak sekwencja typu dzikiego w organizmie lub ma aktywność podobną do sekwencji typu dzikiego w organizmie i/lub która 10 może uzupełniać brakującą aktywność typu dzikiego. Sekwencja ortologiczna może wykazywać modyfikacje na poziomie sekwencji pierwszorzędowej, tj. na poziomie sekwencji DNA lub genomowej, co może uczynić ją odporną na jakąkolwiek aktywność redukującą, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Podobnie, sekwencja ortologiczna może wykazywać modyfikacje na poziomie aminokwasów, zachowując zasadniczo aktywność typu dzikiego swojego homologu typu dzikiego, co może uczynić ją 15 odporną na dowolną aktywność redukującą, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „sekwencja paralogiczna” odnosi się do sekwencji homologicznych, które zostały oddzielone przez duplikację genu. Sekwencja paralogiczna korzystnie ma taką samą aktywność jak sekwencja typu dzikiego w organizmie lub ma aktywność podobną do sekwencji typu dzikiego w organizmie i/lub która może uzupełniać brakującą aktywność typu dzikiego. Sekwencja 20 paralogiczna może wykazywać modyfikacje na poziomie sekwencji pierwszorzędowej, tj. na poziomie sekwencji DNA lub genomowej, co może uczynić ją odporną na dowolną aktywność redukującą, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Podobnie, sekwencja paralogiczna może wykazywać modyfikacje na poziomie aminokwasów, zachowując zasadniczo aktywność typu dzikiego swojego homologu typu dzikiego, co może uczynić ją odporną na dowolną aktywność redukującą, jak zdefiniowano w niniejszym 25 dokumencie. [0150] Gen ratunkowy lub aktywność ratującą, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, można zapewnić w dowolnym odpowiednim miejscu w organizmie. Aktywność można na przykład dostarczyć w konstrukcie, który jest genomowo zintegrowany z organizmem. Korzystne jest, aby gen ratunkowy lub aktywność ratująca była dostarczana organizmowi na konstrukcie charakteryzującym się poddominacją, 30 jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Organizm może odpowiednio mieć locus transgeniczny zawierający konstrukt charakteryzujący się poddominacją obejmujący co najmniej aktywność ratującą lub gen ratunkowy i środki do zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie. Ponadto może obejmować jeden lub więcej genów efektorowych, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. 35 [0151] W wykonaniach, w których 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej genów wykazujących haploinsuficjencję ma zmniejszoną aktywność lub funkcjonalność zgodnie z zasadami wymienionymi w niniejszym dokumencie, np. ich aktywność lub funkcjonalność zmniejszone w tym samym czasie lub w sposób rozłożony w czasie, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej genów wykazujących haploinsuficjencję można uratować w organizmie, jak opisano w niniejszym dokumencie. 40 [0152] W wykonaniach wynalazku, w których zmniejszenie aktywności lub funkcjonalności jednego lub więcej genów wykazujących haploinsuficjencję opiera się na obecności pojedynczego transgenicznego 46

EP 2 934 093 B1

locus, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, ratowanie może również opierać się na pojedynczym transgenicznym locus, tj. tym samym transgenicznym locus jaki zastosowano do zmniejszenia aktywności. W alternatywnych wykonaniach, w których zmniejszenie aktywności lub funkcjonalności jednego lub więcej genów wykazujących haploinsuficjencję opiera się na obecności więcej niż jednego transgenicznego locus, 5 np. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, ratowanie może również opierać się na więcej niż jednym transgenicznym locus, np. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 loci transgenicznych, np. tej samej liczbie i sekwencji transgenicznego locus, jak stosowana do zmniejszania aktywności, lub innej liczbie i sekwencji transgenicznych loci. [0153] W kolejnym wykonaniu zmniejszenie aktywności lub funkcjonalności jednego lub więcej genów 10 wykazujących haploinsuficjencję może opierać się na obecności więcej niż jednego transgenicznego locus, np. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej transgenicznych loci, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, a ratowanie może być oparte na pojedynczym transgenicznym locus, np. jednym z loci transgenicznych zastosowanych do zmniejszenia aktywności lub innego transgenicznego locus. [0154] Korzystne jest, aby zmniejszenie ekspresji genu z haploinsuficjencją i ratowanie ekspresji genu z 15 haploinsuficjencją było przenoszone przez fizycznie połączone transgeniczne loci. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „fizycznie połączony” oznacza, że aktywności zmniejszające i ratujące są dostarczane w bezpośredniej bliskości w transgenicznym locus, np. w odległości około 50 nt, 100 nt, 150 nt, 300 nt, 500 nt, 1000 nt, 5000 nt lub 10000 nt lub dowolnej wartości pomiędzy tymi wartościami. [0155] Szczególnie korzystne jest, aby zmniejszanie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i 20 ratowanie ekspresji tego genu wykazującego haploinsuficjencję było przenoszone przez funkcjonalnie usieciowane transgeniczne loci. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „funkcjonalnie usieciowany” oznacza, że działania zmniejszające i ratujące są dostarczane w różnych loci transgenicznych. Funkcjonalne sieciowanie między transgenicznymi loci można dostarczyć w dowolnej odpowiedniej postaci. W konkretnym wykonaniu niniejszego wynalazku, wymienione funkcjonalne wiązanie 25 może mieć taką postać, że powiązane loci obejmują środki do zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję z pierwszego genu wykazującego haploinsuficjencję oraz środek ratujący zdolny do zwiększania ekspresji drugiego genu wykazującego haploinsuficjencję w pierwszym locus transgenicznym; i środki do zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję z drugiego genu z haploinsuficjencją i środek ratujący zdolny do zwiększenia zmniejszonej ekspresji pierwszego genu 30 wykazującego haploinsuficjencję w drugim locus transgenicznym. Takie funkcjonalne usieciowanie dwóch lub więcej różnych genów wykazujących haploinsuficjencję i odpowiadające im aktywności zmniejszające i ratujące mogą potencjalnie zwiększyć skuteczność podejść poddominacyjnych, mających na celu ochronę biologiczną, transformację populacji i/lub tłumienie populacji. Rozumie się, że w przeciwieństwie do konstruktów poddominacyjnych, które nie są funkcjonalnie usieciowane, w funkcjonalnie usieciowanych 35 konstruktach możliwe jest wytworzenie np. poprzez działanie mejotycznej rekombinacji i segregacji chromosomalnej, genotypów nie ratowanych, w których ekspresja haploinsuficjencji jest zmniejszona przez działanie transgenicznego locus i nie zapewnia się ratunku z jakiegokolwiek transgenicznego locus. W korzystnym wykonaniu fenotypem genotypów nie ratowanych może być zarodkowa letalność lub bezpłodność. Ten nie ratowany fenotyp może być mechanistycznie odrębny od szczegółowo opisanego w 40 niniejszym dokumencie hemizygotycznego fenotypu zmniejszającego dostosowanie konkurencyjne, podczas gdy ten drugi opiera się na skuteczności haploinsuficjencji, ten pierwszy nie. W konkretnym 47

EP 2 934 093 B1

wykonaniu, fenotyp z haploinsuficjencją i nie ocalony może działać wspólnie w całym pokoleniu po pokoleniu F2 krzyżówek u osobników posiadających allele typu dzikiego, w niektórych lub we wszystkich loci transgenicznych. Dalsze szczegóły można uzyskać z przykładu 10, którego zawartość lub części tej zawartości należy uważać za wykonanie wynalazku. Przewidziane są również podobne dostarczenia dla 5 krzyżówek dla więcej niż dwóch genów wykazujących haploinsuficjencję. Na przykład, w transgenicznym locus 1 dostarczony jest środek do zmniejszania haploinsuficiencji genu 1 i środek do ratowania genu 3 wykazującego haploinsuficjencję, w transgenicznym locus 2 środek zmniejszania haploinsuficiencji genu 2 i środek do ratowania genu 1 z haploinsuficjencją, a w locus transgenicznym 3 środek do zmniejszania haploinsuficiencji genu 3 i środki do ratowania genu 2 wykazującego haploinsuficiencję lub dowolne 10 odmiany powyższych itp. [0156] W dalszym korzystnym wykonaniu, zmniejszenie ekspresji dwóch lub więcej genów wykazujących haploinsuficjencję może być przenoszone przez jeden transgeniczny locus, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, a ratowanie ekspresji tych dwóch lub więcej genów wykazujących haploinsuficjencję może być przenoszone przez dwa lub większą liczbę transgenicznych loci, gdzie wymienione transgeniczne loci 15 są funkcjonalnie usieciowane. [0157] W kolejnym konkretnym wykonaniu, zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i jego ratowanie, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, można połączyć z zastosowaniem mechanistycznie odrębnego systemu transformacji populacji. Na przykład, do organizmu według wynalazku można dodatkowo wprowadzić mechanistycznie odrębny konstrukt transformacyjny. 20 Mechanistycznie odrębny konstrukt transformacyjny może ponadto zawierać gen efektorowy, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. [0158] Przykładami odrębnych mechanistycznie systemów transformacji, które są przewidziane przez niniejszy wynalazek, jest system Medea (matczyny dominujący efekt zatrzymania zarodka), jak opisano w Lorenzen i in., 2008, PNAS, 105 (29): 10085-10089, system HEG opisany przez Windbichler i in. Nature 25 473, 212–215 (2011 r). Burt, Proceedings. Biological sciences/The Royal Society 270, 921-8 (2003) lub system Wolbachia opisany przez Sinkins i in. Nature 7, 427–435 (2006)) lub inne systemy, takie jak system opisany przez Huang i in., Insect biochemistry and molecular biology 37, 1054-63 (2007) lub jakikolwiek inny system, w tym system, który może zostać opracowany w przyszłości. [0159] Dostarczenie środków, które zmniejszają ekspresję genu wykazującego haploinsuficjencję w 30 organizmach, i środków, które ratują zmniejszoną ekspresję w organizmie można przeprowadzić zgodnie z dowolnym odpowiednim sposobem wprowadzania genetycznego lub molekularnego. Na przykład środki, które zmniejszają ekspresję genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmach, i środki, które ratują zmniejszoną ekspresję w organizmie, mogą być wprowadzone do komórki lub organizmu, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, jako konstrukty lub jednostki kwasu nukleinowego. Specjalista będzie znał 35 odpowiednie sposoby wprowadzania. Sposoby wprowadzania mogą być dostosowane do organizmu lub klasy lub organizmów, w których są stosowane i mogą się odpowiednio różnić. Na przykład, takie wprowadzenie można przeprowadzić przez transfekcję, np. transfekcję za pośrednictwem DEAE- dekstranu, elektroporacji, mikroiniekcji, infekcji wektorem wirusowym lub bakteriofagowym zawierającym sekwencje kwasu nukleinowego, fuzji komórkowej, transferu genów za pośrednictwem chromosomów, 40 transferu genów za pośrednictwem mikrokomórek, transfekcji kationowej za pośrednictwem lipidów, fuzji sferoplastów itp. Dalsze techniki wprowadzania rozważane w niniejszym wynalazku obejmują 48

EP 2 934 093 B1

kontaktowanie z defektywnymi lub atenuowanymi retrowirusami, bombardowanie mikrocząstkami, zastosowanie powłoczek z lipidami lub receptorami na powierzchni komórki lub środkami transfekującymi, zastosowanie kapsułkowania w liposomach, mikrocząstkach lub mikrokapsułkach, na przykład przez podawanie ich w połączeniu z peptydem, o którym wiadomo, że wchodzi do jądra, lub przez podawanie go 5 w połączeniu z ligandem poddanym endocytozie za pośrednictwem receptora. Zazwyczaj, wektor plazmidowy jest wprowadzany do osadu, takiego jak osad fosforanu wapnia lub w kompleksie z naładowanym lipidem. Jeśli wektor jest wirusem, korzystnie można go opakować in vitro przy użyciu odpowiedniej linii komórek opakowujących, a następnie transdukować do komórek gospodarza. Te i liczne dalsze techniki są znane w dziedzinie wprowadzania cząsteczek kwasu nukleinowego lub wektorów do 10 komórek i mogą być stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Po wprowadzeniu kwasu nukleinowego, modyfikowane komórki można pozostawić do wzrostu w odpowiednich warunkach znanych specjalistom w tej dziedzinie, np. przez 1-2 dni w wzbogaconej pożywce, a następnie są one przełączane na pożywki selektywne. Odpowiednie pożywki hodowlane i warunki dla wyżej opisanych komórek gospodarza i wektorów są znane w dziedzinie. Wektor plazmidowy zawierający konstrukt 15 charakteryzującym się poddominacją i widoczny marker fenotypowy można, na przykład, poddać mikroiniekcji do wczesnego zarodka lub różnych zwierząt. Po procedurach normalnej lub wzmocnionej opieki potomstwo zarodków poddanych iniekcji może być badane przesiewowo pod kątem widocznego markera fenotypowego lub obecności odpowiedniego markera genetycznego. Te i liczne dalsze techniki są znane w dziedzinie wprowadzania cząsteczek kwasu nukleinowego lub wektorów do genomów zwierząt 20 i mogą być stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem. [0160] Obecność wprowadzonych elementów można kontrolować licznymi standardowymi metodami, np. testami ekspresji genów lub testami trawienia i hybrydyzacji genomowej, technikami amplifikacji, takimi jak PCR itp., które bedą znane specjalistom w tej dziedzinie. Na przykład, transkrypcję wprowadzonego kwasu nukleinowego można przetestować w testach analizy Nothern i/lub obecność polipeptydów odpowiednio 25 poddanych translacji można przetestować za pomocą testów analizy Western. Dalsze szczegóły i dodatkowe testy mogą pochodzić z specjalistycznych podręczników, np. od Aupodel i in., wyd, 2007, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork. [0161] W jednym wykonaniu wynalazku, organizm według wynalazku może być transformowany konstruktem charakteryzującym się poddominacją, jak tu zdefiniowano, zawierającym sekwencję 30 prowadzącą do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zakłóca sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję; i dodatkowo obejmującym zmodyfikowaną wersję genu wykazującego haploinsuficjencję, który jest odporny na środki, które specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który 35 specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencją, jak zdefiniowano powyżej. Obecność wprowadzonego konstruktu w docelowym organizmie, np. w genomie docelowego organizmu, można testować za pomocą testów trawienia i hybrydyzacji genomów lub technik amplifikacji specyficznych dla danego miejsca lub genu. Kontrola wyniku wprowadzenia może ponadto obejmować kontrolę liczby wprowadzonych konstruktów, np. sprawdzenie, czy konstrukt jest obecny jako pojedyncza czy wielokrotna 40 kopia i/lub czy konstrukt jest obecny w kontekście hemizygotycznym (np. tylko na jednym lub pojedynczym chromosomie) czy w kontekście homozygotycznym (np. na dwóch lub wszystkich chromosomach). 49

EP 2 934 093 B1

Odpowiednie organizmy zawierające wprowadzony konstrukt w żądanej ilości i/lub w żądanym miejscu mogą być wybrane do kolejnych zastosowań lub etapów sposobu. [0162] W kolejnym wykonaniu organizm według wynalazku jest początkowo transformowany niezależnym konstruktem transgenicznym zawierającym zmodyfikowaną wersję genu wykazującego haploinsuficjencję, 5 który jest odporny na środki, które specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt genu wykazującego haploinsuficjencję lub produkt ekspresji, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano powyżej. Obecność wprowadzonego konstruktu można badać za pomocą testów trawienia genomowego i testów hybrydyzacji lub technik amplifikacji specyficznych dla miejsca lub genu. Kontrola wyniku wprowadzenia może ponadto obejmować kontrolę 10 liczby wprowadzonych konstruktów, np. sprawdzenie, czy konstrukt jest obecny jako kopia pojedyncza czy wielokrotna i/lub czy konstrukt jest obecny w kontekście hemizygotycznym (np. tylko na jednym lub pojedynczym chromosomie) czy w kontekście homozygotycznym (np. na dwóch lub wszystkich chromosomach). Odpowiednie organizmy zawierające wprowadzony konstrukt w żądanej ilości i/lub w żądanym miejscu mogą być wybrane do kolejnych etapów transformacji. Takim kolejnym etapem 15 transformacji może być transformacja organizmu konstruktem charakteryzującym się poddominacją, jak tu zdefiniowano, zawierającym sekwencję prowadzącą do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano powyżej; oraz genu wykazującego haploinsuficjencję, który obejmuje przynajmniej częściowe ratowanie 20 środków, które specyficznie degradują lub bezpośrednio inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zakłóca sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano powyżej. Podejście to ma tę zaletę, że na przykład po ustanowieniu jedynego skutecznego surowca „ratunkowego” (ang. rescue stock) można go zastosować do wszystkich kolejnych prób umieszczenia kompletnego konstruktu charakteryzującego się poddominacją 25 zawierającego zarówno gen ratunkowy, jak i sposób zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję. [0163] Obecność drugiego wprowadzonego konstruktu można przetestować za pomocą testów trawienia genomowego i testów hybrydyzacji lub technikami amplifikacji specyficznymi dla miejsca lub genu. Wynik tego drugiego etapu transformacji można również kontrolować, np. zgodnie z metodami opisanymi 30 powyżej. Kontrola może ponadto obejmować kontrolę liczby wprowadzonych konstruktów, np. sprawdzenie, czy konstrukt jest obecny jako kopia pojedyncza czy wielokrotna i/lub czy konstrukt jest obecny w kontekście hemizygotycznym (np. tylko na jednym lub pojedynczym chromosomie) czy w kontekście homozygotycznym (np. na dwóch lub wszystkich chromosomach). Odpowiednie organizmy zawierające drugi wprowadzony konstrukt w żądanej ilości i/lub w żądanym miejscu mogą być wybrane do 35 kolejnych zastosowań lub dodatkowych etapów sposobu, jak opisano w niniejszym dokumencie. [0164] W kolejnym wykonaniu organizm według wynalazku może być kotransformowany niezależnym konstruktem transgenicznym zawierającym zmodyfikowaną wersję genu wykazującego haploinsuficjencję, który jest oporny na środki, za pomocą których dany konstrukt charakteryzujący się poddominacją specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt genu wykazującego haploinsuficjencję lub 40 produkt ekspresji, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano powyżej, oraz z konstruktem charakteryzującym się poddominacją zawierającym 50

EP 2 934 093 B1

sekwencję prowadzącą do dostarczenia środka, który specyficznie degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję; oraz genu wykazującego haploinsuficjencję, który obejmuje przynajmniej częściowe ratowanie środków, które specyficznie degradują lub bezpośrednio 5 inaktywują transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencją. Kotransformację można przeprowadzić przy użyciu dwóch różnych jednostek transformacji, takich jak plazmidy lub wektory wirusowe itp. Specjalista w dziedzinie zna odpowiednie sposoby kotransformacji komórek lub zarodków. Te sposoby mogą korzystnie odpowiadać standardowym protokołom, z tym wyjątkiem, że stosuje się mieszaninę 10 większej ilości plazmidów, np. dwóch plazmidów. Obecność kotransformowanych konstruktów w docelowym organizmie, np. w genomie docelowego organizmu można testować za pomocą testów trawienia i hybrydyzacji genomów lub technik amplifikacji specyficznych dla danego miejsca lub genu. Kontrola wyniku wprowadzenia może ponadto obejmować kontrolę liczby wprowadzonych konstruktów, np. sprawdzenie, czy konstrukt jest obecny jako kopia pojedyncza czy wielokrotna i/lub czy konstrukt jest 15 obecny w kontekście hemizygotycznym (np. tylko na jednym lub pojedynczym chromosomie) czy w kontekście homozygotycznym (np. na dwóch lub wszystkich chromosomach). Odpowiednie organizmy zawierające kotransformowane konstrukty w żądanej ilości i/lub w żądanym miejscu mogą być wybrane do kolejnych zastosowań lub etapów sposobu. Podejście to ma tę zaletę, że może stanowić szybszą drogę doświadczalną niż wcześniejsze ustanowienie surowców wyłącznie ratunkowych, które można następnie 20 wstrzyknąć. [0165] Transformację lub wprowadzenie, jak wspomniano powyżej, można przeprowadzić w jednym organizmie. W jednym organizmie transformację lub wprowadzenie można przeprowadzić w jednej komórce lub w wielu komórkach, np. w określonych tkankach, takich jak tkanka regeneracyjna itp. W dalszym wykonaniu, transformację lub wprowadzenie, jak wspomniano powyżej, można przeprowadzić w 25 grupie organizmów, np. populacji organizmów gatunku. Przewiduje się również transformację organizmów więcej niż jednego gatunku, np. gatunków blisko spokrewnionych, a nawet gatunków niespokrewnionych. Liczba członków transformowanej grupy może być różna i zależeć od parametrów, takich jak wielkość organizmu, zastosowanie technik transformacji, schemat reprodukcji organizmu i czas itp. Transformację można dalej przeprowadzić w takiej grupie albo jeden raz albo więcej niż jeden raz, np. 2, 3, 4 lub 5 razy 30 itd. jeśli pierwsza, 2-ga, 3-cia itd. runda transformacji nie daje pożądanego wprowadzenia konstruktu charakteryzującego się poddominacją, jak tu opisano. [0166] W korzystnym wykonaniu wynalazku, metodologia transformacji lub wprowadzania, jak opisana powyżej, może ponadto obejmować etap uzyskania organizmu, który jest homozygotyczny pod względem wprowadzonego konstruktu, np. wprowadzonego konstruktu charakteryzującego się poddominacją lub 35 odpowiednio ustalonego transgenicznego locus. Taki etap może obejmować selekcję organizmu homozygotycznego, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, lub rozdział organizmów homozygotycznych i hemizyogicznych, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. [0167] W kolejnym wykonaniu, odpowiednio otrzymane organizmy homozygotyczne można dalej modyfikować przez usunięcie niezależnego konstruktu transgenicznego, jak tu wspomniany, tj. konstruktu 40 transgenicznego zawierającego zmodyfikowaną wersję genu wykazującego haploinsuficjencję, który jest odporny na środki, za pomocą których dany konstrukt charakteryzujący się poddominacją specyficznie 51

EP 2 934 093 B1

degraduje lub bezpośrednio inaktywuje transkrypt lub produkt ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, lub który specyficznie zaburza sekwencję DNA genu wykazującego haploinsuficjencję. Takie usunięcie można osiągnąć przez rekombinację chromosomową lub segregację. Rekombinacja chromosomowa może, na przykład, opierać się na zastosowaniu rekombinazy specyficznej dla miejsca, 5 takiej jak Cre lub FLP i obecności pokrewnych miejsc rozpoznawania Cre lub FLP lub dowolnej innej odpowiedniej rekombinazy na flankach niezależnego konstruktu. W dalszych wykonaniach, usuwanie można przeprowadzić przez segregację, tj. poprzez powtarzane rundy rozmnażania płciowego i selekcji pod kątem braku niezależnego konstruktu. Może to być na przykład ułatwione przez odpowiednie markery wizualne lub genetyczne występujące w różnych badanych loci, umożliwiając równoczesną selekcję 10 przeciwko konstruktom ratowniczym tylko w każdym pokoleniu i dla loci charakteryzujących się poddominacją. [0168] Po przeprowadzeniu zmniejszenia ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie i odzyskaniu zmniejszonej ekspresji, jak tu opisano, np. w oparciu o procedurę transformacji, jak zdefiniowano powyżej, uzyskuje się organizm lub grupę organizmów, które są mniej dopasowane 15 konkurencyjnie, jeśli są hemizygotyczne wobec transgenicznego locus niż jeśli są homozygotyczne wobec transgenicznego locus. W związku z tym, otrzymany organizm może być homozygotyczny wobec transgenicznego locus lub hemizygotyczny wobec transgenicznego locus. Dostarczanie homozygotycznych lub hemizygotycznych osobników może być kontrolowane przez dostosowanie procedury transformacji genetycznej. Na przykład, wysoka wydajność transformacji konstruktów 20 charakteryzującym się poddominacją do organizmu może prowadzić do homozygotycznej sytuacji genetycznej lub wprowadzenia dwóch lub więcej alleli konstruktu charakteryzującego się poddominacją do genomu, w tym samym położeniu. W związku z tym, korzystne jest stosowanie określonych systemów miejsc docelowych, np. systemu opartego na rekombinazach PhiC31, Cre lub FLP (dalsze szczegóły można uzyskać z Nimmo i in., Insect molecular biology, 15, 129-36 (2006); lub z Bischof i in., PNAS, 104, 25 3312-7 (2007)). Takie podejście może korzystnie zapewnić bezpośrednie generowanie rodów homozygotycznych bez przejściowej potrzeby wytwarzania hemizygot. [0169] W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, sposób zdefiniowany w niniejszym dokumencie powyżej, obejmujący zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencją w organizmie i ratowanie zmniejszonej ekspresji, dając w ten sposób organizm, który ma gorsze dopasowanie 30 konkurencyjne, jeśli jest hemizygotyczny wobec transgenicznego locus niż jeśli homozygotyczny wobec wymienionego locus, może dodatkowo obejmować etap selekcji organizmów homozygotycznych. Taki etap selekcji można przeprowadzić na podstawie dopasowania konkurencyjnego, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, co prowadzi do wad żywotności i/lub ostatecznej eliminacji organizmów hemizygotycznych. Selekcja rodów całkowicie homozygotycznych może być jeszcze łatwiejsza dzięki zastosowaniu 35 odpowiednich markerów genetycznych lub widocznych. Szczególną właściwość konstruktów, charakteryzującym się poddominacją, do wyeliminowania alleli typu dzikiego w locus transgenicznym, gdy częstość konstruktu charakteryzującego się poddominacją przekroczy niestabilną częstość równowagi allelicznej, można korzystnie wykorzystać jako metodę szybkiego i skutecznego ustalenia homozygoty. Takie podejście można na przykład zastosować jako alternatywę dla sposobu wyboru rodzin utworzonych 40 z krzyżówek pojedynczych par lub samozapylenia, w których przez dwa kolejne pokolenia wzór dziedziczenia markerów informacyjnych jest zgodny z osobnikiem lub osobnikami założycielskimi, które są 52

EP 2 934 093 B1

homozygotyczne. Odpowiednie markery w takich sposobach mogą obejmować obserwację różnic wzrostu lub innych różnic fenotypowych, które wskazują na homozygotyczność lub hemizygotyczność. Ponadto, zakładane są podejścia detekcji molekularnej, które mogą na przykład być powiązane z genami efektorowymi, takimi jak markery wizualne lub markery barwne itp. Obecność określonego koloru lub jego 5 intensywności może dostarczyć informacji o homozygotyczności i/lub hemizygotyczności pojedynczego organizmu. Obecność i ilość transgenicznego locus i/lub jego identyczność można dodatkowo określić za pomocą analizy molekularnej, np. techniki hybrydyzacji DNA, podejścia do amplifikacji DNA lub RNA, np. na podstawie reakcji łańcuchowej polimerazy lub przez określenie cechy fenotypowej na podstawie genów lub elementów markerów optycznych lub wizualnych, genów oporności na antybiotyki, genów oporności na 10 herbicydy zawartych w konstruktach transgenicznych. Organizmy uzyskane zgodnie ze sposobem zdefiniowanym w niniejszym dokumencie powyżej, np. z dalszym etapem separacji homozygotycznej/hemizygotycznej lub bez, można zastosować do późniejszego umożliwiającego krzyżowanie rozmnażania płciowego w tej grupie organizmów. Może to prowadzić do dalszego dostarczenia osobników homozygotycznych lub hemizygotycznych. 15 [0170] W niektórych zastosowaniach sposobu, może być korzystne uzyskanie i wykorzystanie organizmów homozygotycznych pod względem transgenicznego locus. Takie organizmy wykazują prawidłowe lub przywrócone dostosowanie konkurencyjne w porównaniu do organizmów typu dzikiego i mogą prowadzić do hemizygotycznych lub heterozygotycznych potomków w następnym pokoleniu, jeśli zostaną skojarzone z organizmami typu dzikiego, co prowadzi do rozmnażania płciowego. Do innych zastosowań tego sposobu 20 może być korzystne uzyskanie i wykorzystanie organizmów homozygotycznych lub hemizygotycznych w transgenicznym locus. Wprowadzanie osobników hemizygotycznych w celu zastosowania tłumienia wielkości populacji można korzystnie stosować w sytuacjach, w których fenotyp zmniejszania konkurencyjnego dopasowania ogranicza się w dużej mierze do zmniejszenia płodności. [0171] W niniejszym dokumencie ujawniono, że organizm możliwy do otrzymania zgodnie ze sposobem 25 zdefiniowanym powyżej, w szczególności możliwy do otrzymania przez zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie i ratowanie zmniejszonej ekspresji, dając organizm, który ma gorsze dostosowanie konkurencyjne, jeśli jest hemizygotyczny wobec transgenicznego locus niż jeśli jest homozygotyczny wobec tego locus, może zostać wprowadzony do populacji tego samego gatunku. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „populacja tego samego gatunku” oznacza grupę 30 osobników zdolnych do krzyżowania, które uważa się za należące do tej samej grupy taksonomicznej. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „w innym wypadku zdolny do krzyżowania” opisuje grupy osobników, które z wyjątkiem efektu dowolnego transgenicznego locus zintegrowanego z ich genomem byłyby zasadniczo zdolne do krzyżowania i zdolne do produkowania żywotnego i konkurencyjnego potomstwa przy znacznych regularnościach. 35 [0172] Ujawniono ponadto, że dążenie do tłumienia wielkości populacji docelowej populacja lub grup populacji mogą mieć dowolną wielkość. Liczba osobników może zależeć od liczby, stosunku płci i/lub dostosowania konkurencyjnego osobników transgenicznych, które można udostępnić do wprowadzenia. Współczynniki wprowadzania transgenicznych osobników:dzikich wynoszące więcej niż 1:1, 10:1, 100:1 lub 1000:1 lub więcej, lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami, mogą być konieczne dla wielu 40 kolejnych pokoleń.

53

EP 2 934 093 B1

[0173] Ujawniono tu również, że gdy celem jest transformacja populacji, docelowa populacja lub grupy populacji mogą teoretycznie mieć dowolną wielkość. Przydatność populacji docelowych może zależeć od gatunku, jego pokolenia lub czasu reprodukcji oraz wskaźnika migracji między populacjami docelowymi i innymi niż docelowe. Na przykład, populacje, które wykazują średni wskaźnik emigracji do dowolnej 5 populacji niebędącej celem, wynoszący około 0,1%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10% lub 20%, najprawdopodobniej ograniczą dużą częstotliwość rozprzestrzeniania się konstruktu charakteryzującego się poddominacją na sąsiadujące populacje niebędące celem. Na przykład populacje, które wykazują średni wskaźnik imigracji netto z populacji niedocelowych typu dzikiego wynoszący około lub mniej niż 0,1%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10% lub 20%, byłyby bardziej stabilne, utrzymując konstrukt charakteryzujący 10 się poddominacją z wysoką częstością w populacjach docelowych. Aby w przybliżeniu obliczyć liczbę osobników, które należy wprowadzić w celu transformacji populacji, można zastosować dowolną odpowiednią metodologię. Korzystne jest stosowanie równania 1, jak wymieniono w przykładzie 5. Równanie 1 z przykładu 5 można również zastosować do obliczenia przybliżonej liczby osobników typu dzikiego, które byłyby potrzebne do wprowadzenia w już transformowanej populacji w celu usunięcia 15 poddominacyjnych konstruktów transgenicznych. Aby w przybliżeniu obliczyć stabilność geograficzną transformacji populacji pod względem zdolności do ograniczenia obecności o wysokiej częstości loci z poddominacją, korzystne jest zastosowanie równań 2 do 12 z przykładu 5. Alternatywnie, mogą być wykorzystane ich pochodne lub dowolna inna odpowiednia metodologia znana specjalistom. [0174] Jak ujawniono dalej w niniejszym dokumencie, organizm, który ma być wprowadzony, może być 20 hemizygotyczny wobec transgenicznego locus lub homozygotyczny wobec transgenicznego locus, jak tu zdefiniowano powyżej. Opisano również wprowadzanie mieszaniny organizmów homozygotycznych i hemizygotycznych. Wprowadzanie takich organizmów może prowadzić do ustalenia w populacji transgenicznego locus o dużej częstością. [0175] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „ustalenie transgenicznego locus” oznacza, że 25 transgeniczny locus jest utrzymywany w populacji przy wysokiej zrównoważonej częstości transgenicznych alleli w transgenicznym locus, bliskiej 100% lub co najmniej 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 85%, 80% lub 75% lub dowolnej wartości pomiędzy tymi wartościami. Ta równowaga wysokiej częstości ma się utrzymywać do momentu wymarcia populacji lub transformacja populacji zostanie celowo odwrócona przez wprowadzenie wystarczającej liczby osobników typu dzikiego w ciągu jednego lub kolejnych pokoleń, aby 30 przekroczyć próg transformacji populacji allelicznej lub jeśli imigracja do transformowanej populacji przez osobniki typu dzikiego wystarcza w jednym lub kolejnych pokoleniach, aby przekroczyć próg transformacji populacji allelicznej. Utrata transformacji populacji we wszystkich tych przypadkach oznacza, że populacja powraca do pierwotnego stanu dzikiego w odniesieniu do transgenicznych loci. [0176] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „wysoka częstość w populacji” oznacza, że 35 transgeniczny locus lub genomowo wstawiony konstrukt charakteryzujący się poddominacją występuje w populacji w około 100% lub co najmniej 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 85%, 80% lub 75% lub dowolnej wartości pomiędzy tymi wartościami. [0177] W niniejszym opisie ujawniono ponadto, że wprowadzanie organizmów w celu transformacji populacji można przeprowadzić tylko raz lub można je przeprowadzać fazami lub etapami, obejmującymi 40 wiele kolejnych pokoleń, np. po pierwszym wprowadzeniu może nastąpić drugie wprowadzanie po 1 tygodniu, 2 tygodniach, 3 tygodniach, 4 tygodniach, 2 miesiącach, 3 miesiącach, 4 miesiącach, 5 54

EP 2 934 093 B1

miesiącach, 6 miesiącach, 7 miesiącach, 8 miesiącach, 9 miesiącach, 10 miesiącach, 11 miesiącach, 12 miesiącach, 1,5 roku, 2 latach itd. lub w dowolnym punkcie czasowym między tymi punktami czasowymi, w zależności od czasu pokolenia docelowego organizmu. Wprowadzanie organizmów można dalej prowadzić w sposób ciągły, np. codziennie lub co drugi dzień przez określony czas, np. przez 1 tydzień, 2 5 tygodnie, 3 tygodnie, 4 tygodnie, 2 miesiące, 3, miesiące, 4 miesiące, 5 miesięcy, 6 miesięcy, 7 miesięcy, 8 miesięcy, 9 miesięcy, 10 miesięcy, 11 miesięcy, 12 miesięcy itp. Równania podane w przykładzie 5 dostarczają pewnych przybliżeń progów niestabilnych alleli, które będą musiały zostać pokonane, aby osiągnąć transformację lub odwrócenie populacji. W okresach wyjątkowo wysokiej migracji lub lokalnego wymierania populacji i ponownej kolonizacji w niektórych okolicznościach może być pożądane tymczasowe 10 wznowienie wprowadzania. [0178] Wprowadzanie organizmów można przeprowadzić podczas jednego pokolenia organizmu lub podczas więcej niż jednego pokolenia, np. podczas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej pokoleń. [0179] Ujawniono ponadto, że liczba wprowadzonych organizmów zależy od kilku parametrów, takich jak sam organizm, jego gatunek, jego rola i zachowanie ekologiczne, tempo reprodukcji, czas pokolenia, 15 mobilność organizmów, wielkość statycznej dzikiej populacji, geograficzne rozprzestrzenianie się organizmów, zdolność organizmów do krzyżowania, klimat, średnie temperatury, pory roku itp. Specjalista może przeprowadzić dostosowanie wartości wprowadzania do jednego lub więcej z tych parametrów. W jednym przykładzie, wprowadzanie można przeprowadzić z wystarczającą liczbą osobników transgenicznych, aby uzyskać w populacji tego samego gatunku częstość większą niż niestabilna 20 równowaga częstości allelicznej przewidywana na podstawie konkurencyjnego dostosowania. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „niestabilna równowaga częstości allelicznej przewidywana na podstawie konkurencyjnego dostosowania” oznacza, że oczekuje się, że częstości alleli populacji zaczynające się poniżej tego punktu będą się zmniejszać w czasie, z powodu selekcji naturalnej. Oczekuje się, że częstości alleli zaczynające się powyżej tego punktu będą rosły w czasie z powodu naturalnej 25 selekcji (dalsze szczegóły można otrzymać z Fisher, 1922, Proc. Roy. Soc. Edynburg 42: 321–341; Wright, 1931, Genetics 16: 97-159; Wright, 1941, The American Naturalist 75: 513-522; Wiener, 1942, Science 96: 407-408; lub Li, 1955, Am. Nat. 89: 281–295). Ten punkt krytyczny jest znany jako „niestabilny próg” częstości alleli. Próg częstości alleli dla transformacji populacji można obliczyć dla izolowanej populacji przy użyciu dowolnej odpowiedniej metodologii, korzystnie przy użyciu równania 1 przedstawionego w 30 przykładzie 5. Na podstawie obliczonej przybliżonej niestabilnego progu częstości allelu można opracować strategię wprowadzania, która minimalizuje praktyczne zasoby niezbędne do dokonania transformacji populacji. [0180] Ujawniono ponadto, że sposób zdefiniowany powyżej może dodatkowo obejmować etap stosowania organizmu możliwego do uzyskania zgodnie ze sposobem zdefiniowanym powyżej, w 35 szczególności możliwego do uzyskania przez zmniejszenie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie i ratowanie zmniejszonej ekspresji, uzyskując organizm, który ma gorsze dostosowanie konkurencyjne, jeśli jest hemizygotyczny wobec transgenicznego locus, niż jeśli jest homozygotyczny wobec tego locus, a zatem jest transgeniczny, w środowisku, które obejmuje w przeciwnym razie zdolne do krzyżowania, rozmnażające się płciowo osobniki typu dzikiego tego organizmu. 40 Takie zastosowanie oznacza ostateczne skojarzenie organizmu transgenicznego z organizmami typu dzikiego. Korzystne jest stosowanie organizmów homozygotycznych, np. uzyskanych i wybranych zgodnie 55

EP 2 934 093 B1

z powyższymi sposobami opisanymi dla tego podejścia. Kojarzenie z organizmami typu dzikiego może dostarczyć hemizygotyczne potomstwo, które ma zmniejszone konkurencyjne dostosowanie w porównaniu z homozygotycznym potomstwem. Konkurencyjne dostosowanie hemizygotycznego organizmu transgenicznego może odpowiednio wynosić około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 5 80% lub 85% lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami, odpowiedniego organizmu typu dzikiego. W kolejnych wykonaniach konkurencyjne dostosowanie hemizygotycznego organizmu transgenicznego może odpowiednio wynosić około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%; 80% lub 85% lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami, odpowiedniego homozygotycznego organizmu transgenicznego. Względne konkurencyjne dostosowanie genotypów można na przykład wywnioskować 10 ze zmian częstości alleli między pokoleniami (patrz Catteruccia & Godfray Science 299, 2001-2003 (2003)) przy użyciu odpowiednich ram statystycznych (dalsze szczegóły można uzyskać na podstawie Clark i in., Heredity 46, 321-46 (1981) lub z fig. 8 zgłoszenia). Alternatywnie, względne konkurencyjne dostosowanie genotypów można oszacować, mierząc cechy historii życia w jednym pokoleniu, które prawdopodobnie przyczynią się do konkurencyjnego dostosowania. Takie cechy mogą obejmować płodność, zmienność, 15 wagę osobników, atrakcyjność płciową, liczbę generowanych gamet, wskaźniki wzrostu i/lub mobilność w jednym pokoleniu (dalsze szczegóły można uzyskać na podstawie Irvin i in., PNAS, 101, 891-6 (2004); lub Amenya i in., Insect Molecular Biology, 19, 263-269 (2010)). [0181] W korzystnych wykonaniach, zmniejszone dostosowanie konkurencyjne oznacza zmniejszoną żywotność i/lub zmniejszoną płodność organizmu. Na przykład, żywotność hemizygotycznego organizmu 20 transgenicznego można zmniejszyć o wartość około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, lub 85% lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami odpowiedniego organizmu typu dzikiego, lub żywotność hemizygotycznego organizmu transgenicznego można zmniejszyć o wartość około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 85% lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami odpowiedniego homozygotycznego organizmu transgenicznego. Płodność hemizygotycznego 25 organizmu transgenicznego można zniejszyć o około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 85 % lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami, odpowiedniego organizmu typu dzikiego lub płodność hemizygotycznego organizmu transgenicznego można zmniejszyć o wartość około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 85% lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami, odpowiedniego homozygotycznego organizmu transgenicznego. W niektórych wykonaniach, 30 zmniejszenie żywotności i płodności może występować w tym samym czasie lub w tym samym organizmie. [0182] Względną płodność lub żywotność genotypów można na przykład oszacować przy użyciu standardowych technik biologicznych opisanych w Irvin i in., PNAS, 101, 891-6 (2004) lub Amenya i in., Insect Molecular Biology, 19, 263-269 (2010). [0183] W bardzo konkretnym wykonaniu, zmniejszenie dostosowania konkurencyjnego w organizmie 35 hemizygotycznym nie musi obejmować znacznego zmniejszenia średniej żywotności. W kolejnym bardzo specyficznym wykonaniu zmniejszenie dostosowania konkurencyjnego w organizmie hemizygotycznym obejmuje znaczne zmniejszenie średniej płodności. Można sobie wyobrazić, że dostosowanie konkurencyjne może zostać znacznie zmniejszone przez obniżenie atrakcyjności płciowej, np. poprzez zakłócenie wtórnych cech seksualnych używanych przy wyborze partnera. 40 [0184] Ujawniono ponadto sposób transformacji populacji organizmów rozmnażających się płciowo, pod warunkiem, że wymieniony organizm nie jest człowiekiem, obejmujący etapy: (a) zmniejszenia ekspresji 56

EP 2 934 093 B1

genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie, przy czym zamniejszenie jest przenoszone przez transgeniczny locus w organizmie, jak zdefiniowano tu powyżej; (b) ratowania zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym ratowanie przenoszone jest przez ten sam transgeniczny locus w organizmie, jak zdefiniowano tu powyżej, oraz (c) wprowadzania organizmów homozygotycznych uzyskanych w 5 poprzednim etapie do populacji tego samego gatunku, tak że transgeniczny locus jest ustalany z dużą częstością w populacji. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „transformacja populacji” odnosi się do procesu, w którym poprzez zamierzone wprowadzenie masy osobników zawierających transgeniczny locus w celu zwiększenia częstości transgenicznego locus w kolejnych pokoleniach w przewidywalny sposób, dopóki nie zostanie on stabilnie utrzymany w docelowej populacji z wysoką 10 częstością, np. częstością o wysokiej częstości równowagi transgenicznych alleli w transgenicznym locus wynoszącej około 100% lub co najmniej 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 85%, 80% lub 75% lub dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami. [0185] W konkretnych przykładach, transformację populacji można osiągnąć przez przekroczenie progowej częstości transgenicznego locus, jak tu opisano, w populacji docelowej. Częstość progowa może na 15 przykład być większa niż 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 lub 0,9 lub więcej, gdy nie jest połączona z innymi systemami transformacji populacji. Organizm homozygotyczny, który ma być zastosowany, może być wybrany lub oddzielony od organizmów hemizygotycznych zgodnie z etapami sposobu, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie powyżej. Transformacja populacji może zatem skutkować zastąpieniem populacji, tj. zastąpieniem organizmów typu dzikiego organizmami homozygotycznymi lub hemizygotycznymi wobec 20 transgenicznego locus, jak tu opisano. Transformację populacji można osiągnąć na przykład poprzez masowe wprowadzenie osobników niosących transgeniczne loci. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „masowe wprowadzanie” oznacza, że jest wprowadzane co najmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 200%, 300%, 1000% lub więcej, lub dowolna wartość pomiędzy tymi wartościami, obecnej liczby osobników typu dzikiego z danej populacji. To masowe wprowadzenie można wykonać raz 25 lub więcej niż raz, np. 2, 3, 4, 5, 6, 7 lub więcej razy. Wprowadzenie można przeprowadzić podczas jednego pokolenia lub podczas wielu pokoleń i można je zaaranżować podczas faz lub ram czasowych, jak zdefiniowano powyżej. Wprowadzanie może być jednopłciowe, korzystnie tylko męskie, lub stanowić mieszaninę obu płci w różnych proporcjach. [0186] Ponadto, w niniejszym dokumencie ujawniono sposób redukowania wielkości dzikiej populacji w 30 przeciwnym razie zdolnych do krzyżowania się organizmów rozmnażających się płciowo, pod warunkiem, że ten organizm nie jest człowiekiem, obejmujący etapy: (a) zredukowania ekspresji genu z haploinsuficjencją w organizmie, w którym wymieniona redukcja jest przenoszona przez transgeniczny locus w organizmie; (b) ratowania zredukowanej ekspresji w organizmie, gdzie wymienione ratowanie przenoszone jest przez ten sam transgeniczny locus w organizmie, i (c) przy użyciu hemizygotycznego 35 organizmu transgenicznego uzyskanego w etapie (b) lub otrzymanej mieszaniny homozygotycznych i hemizygotycznych organizmów transgenicznych w etapie (b) w środowisku obejmującym w przeciwnym razie zdolne do krzyżowania się osobniki rozmnażające się płciowo dzikiego typu organizmu, gdzie fitnes konkurencyjny hemizygotycznego potomstwa jest zredukowany. Wprowadzanie może być tej samej płci, korzystnie tylko męskie, lub stanowić mieszankę obu płci w różnych proporcjach. Stosowane w niniejszym 40 dokumencie określenie „populacja dzika” oznacza, że osobniki objęte tą populacją nie obejmują ani nie

57

EP 2 934 093 B1

zawierają transgenicznego locus lub konstruktu charakteryzującego się poddominacją, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Takie osobniki są uważane za osobniki typu dzikiego lub organizmy typu dzikiego. [0187] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „zmniejszenie wielkości” takich dzikich populacji odnosi się do względnego zmniejszenia liczby członków o określonym genotypie, np. genotypie 5 niezawierającym transgenicznego locus, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, podczas gdy ogólna liczba osobników gatunku zawierających genotypy transgeniczne i nietransgeniczne nie może być zmieniona ani zwiększona. Możliwe jest również zmniejszenie ogólnej liczby osobników gatunku zawierającego genotypy transgeniczne i nietransgeniczne, które jest jednak mniejsze lub mniej wyraźne niż zmniejszenie liczby osobników typu dzikiego. Zmniejszenie populacji dzikiej według tego aspektu 10 wynalazku może być zmniejszeniem o 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% lub więcej lub dowolną wartością pomiędzy tymi wartościami, w porównaniu z liczbą osobników typu dzikiego przed wykonaniem sposobu lub w porównaniu z dziką populacją, na którą nie oddziaływano lub do której nie zostały wprowadzone żadne osobniki transgeniczne. W niektórych przypadkach, stopień supresji może wynosić 100%, co powoduje lokalne wyginięcie populacji docelowej. 15 Wprowadzanie może być jednopłciowe, korzystnie tylko męskie, lub stanowić mieszaninę obu płci w różnych proporcjach. [0188] W innym przykładzie tłumienia populacji, homozygotyczne i/lub hemizygotyczne osobniki transgeniczne mogą być wprowadzane na obszary nieznanej zdolnej do krzyżowania się populacji typu dzikiego. Ujawniony jest taki etap, który należy wykonać w ramach programu prewencyjnego 20 wprowadzania w celu zmniejszenia potencjału dzikich populacji do osiedlenia się w obszarze ryzyka lub wrażliwym. [0189] Zmniejszenie populacji dzikiej osobników może opierać się na redukcji rozmnażania płciowego osobników hemizygotycznych wobec transgenicznego locus, jak tu zdefiniowano. Redukcja rozmnażania płciowego może być spowodowana zmniejszeniem ogólnego dostosowania, np. z powodu częściowego 25 ratowania genu wykazującego haploinsuficjencję, jak tu zdefiniowano powyżej. Organizmem stosowanym w tym sposobie jest hemizygotyczny organizm transgeniczny lub mieszanina homozygotycznych i hemizygotycznych organizmów transgenicznych. Wprowadzenie osobników hemizygotycznych w celu zastosowania supresji wielkości populacji jest szczególnie przewidziane, gdzie fenotyp zmniejszający dostosowanie konkurencyjne ogranicza się w dużej mierze do zredukowania 30 płodności. Korzystne jest wprowadzanie transgenicznych organizmów homozygotycznych. [0190] Ujawniono ponadto, że częstość transgenicznego locus w sposobie transformacji populacji lub sposobie zmniejszania wielkości dzikiej populacji może wzrosnąć podczas wprowadzania i/lub po wprowadzeniu poszczególnych organizmów, jak tu zdefiniowano. [0191] W kolejnym przykładzie, w niniejszym wynalazku ujawniono sposób zmniejszania introgresji 35 transgenicznego locus w organizmie do populacji w przeciwnym razie zdolnych do krzyżowania organizmów rozmnażających się płciowo, pod warunkiem, że wymieniony organizm nie jest istotą ludzką, obejmujący następujące etapy: (a) zmniejszanie ekspresji genu wykzaującego haploinsuficjencję w organizmie, przy czym zmniejszenie jest przenoszone przez transgeniczny locus w organizmie; (b) ratowanie zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym ratowanie jest przenoszone przez ten sam 40 transgeniczny locus w organizmie, i (c) stosowanie organizmu transgenicznego uzyskanego w etapie (b) w środowisku obejmującym w przeciwnym razie zdolne do krzyżowania się osobniki rozmnażające się 58

EP 2 934 093 B1

płciowo organizmu typu dzikiego, przy czym dostosowanie konkurencyjne hemizygotycznego potomstwa jest zmniejszone, zmniejszając w ten sposób szybkość rozmnażania płciowego i/lub żywotność hemizygotycznego potomstwa. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „zmniejszanie introgresji transgenicznego locus w populacji w przeciwnym razie zdolnych do krzyżowania się organizmów 5 rozmnażających się płciowo” oznacza, że częstość transgenicznego locus w populacji w przeciwnym razie zdolnych do krzyżowania się organizmów rozmnażających się drogą płciową jest zmniejszona poniżej poziomu, który byłby oczekiwany dla cechy neutralnej, cechy wybiórczo korzystnej lub wybiórczo szkodliwej, lub cechy, która nie ma wpływu na dostosowanie konkurencyjne organizmu w środowisku. Zmniejszenie introgresji jest korzystnie osiągane przez fakt, że transgeniczny locus prowadzi do 10 zmniejszenia dostosowania konkurencyjnego, jeśli jest obecny w organizmie w sposób hemizygotyczny. W przypadku organizmów diploidalnych, transgeniczny locus prowadziłby do zmniejszenia dostosowania konkurencyjnego, jeśli występuje w sposób heterozygotyczny, tj. jako tylko jedna kopia lub allel. [0192] Zastosowanie organizmu może obejmować sadzenie homozygotycznych transgenicznych osobników charakteryzujących się poddominacją w strefach buforowych, np. wokół roślin krzyżujących się 15 niekrewniaczo, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się osobników w buforze, jednocześnie ograniczając możliwość introgresji w kolejnych pokoleniach ze względu na zmniejszone dostosowanie konkurencyjne hemizygot w następnych pokoleniach. To zastosowanie jest szczególnie przydatne w powstrzymywaniu niezamierzonego krzyżowania się niekrewniaczego roślin genetycznie zmodyfikowanych. [0193] Zmniejszeniem konkurencyjnego dostosowania hemizygotycznego potomstwa może być na 20 przykład zmniejszenie o około 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% lub, korzystnie 100%, lub o dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami, konkurencyjnego dostosowania odpowiedniego organizmu typu dzikiego lub odpowiedniego homozygotycznego organizmu transgenicznego. W korzystnych wykonaniach, zmniejszone konkurencyjne dostosowanie oznacza zmniejszoną żywotność i/lub zmniejszoną płodność organizmu. Na przykład, żywotność hemizygotycznego organizmu transgenicznego można zmniejszyć o 25 wartość około 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% lub, korzystnie 100%, lub dowolną wartość pomiędzy nimi, wartości dla odpowiedniego organizmu typu dzikiego lub odpowiedniego homozygotycznego organizmu transgenicznego. Płodność organizmu hemizygotycznego może być zmniejszona o wartość około 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% lub 100% lub o dowolną wartość pomiędzy tymi wartościami, dla odpowiedniego organizmu typu dzikiego lub odpowiedniego homozygotycznego organizmu 30 transgenicznego. Ujawniono ponadto, że zmniejszone konkurencyjne dostosowanie w kontekście sposobu zmniejszania introgresji transgenicznego locus do populacji w przeciwnym razie zdolnych do krzyżowania się organizmów rozmnażających się płciowo, jak tu opisano, może również być lub może dawać całkowitą nieżywotność potomstwa, oraz/lub całkowitą niepłodność potomstwa. Można to zaobserwować w dowolnej odpowiedniej fazie wzrostu. W przypadku braku żywotności można wykryć brak potomstwa. W przypadku 35 bezpłodności można punktować zapłodnione zygoty. [0194] W jeszcze innym przykładzie, spadek introgresji transgenicznego locus w organizmie jest zapobieganiem introgresji transgenicznego locus do populacji w innym razie zdolnych do krzyżowania się osobników rozmnażających się płciowo organizmu typu dzikiego. Zmniejszenie konkurencyjnego dostosowania może odpowiednio wyeliminować żywotność potomstwa. 40 [0195] W alternatywnym przykładzie, można wyeliminować możliwość rozmnażania się płciowego hemizygotycznego potomstwa. Hemizygotyczne potomstwo może, na przykład, wykazywać normalny lub 59

EP 2 934 093 B1

zdrowy wzrost lub zachowanie przetrwania w środowisku, ale może nie być w stanie rozmnażać się w obrębie swojej populacji lub z jakąkolwiek inną populacją typu dzikiego lub homozygotycznym lub hemizygotycznym osobnikiem tego gatunku lub z innymi gatunkami. Takie zachowanie może być na przykład spowodowane zmniejszeniem zdolności roślin hemizygotycznych do generowania żywotnego 5 pyłku lub zalążków lub podtrzymywania rozwoju nasion. Mutacje genów CRP wykazujących haploinsuficjencję genów w roślinach mogą na przykład skutkować zredukowaniem żywotności pyłku i zalążków, np. odpowiednio o 70% i 50%, oprócz zredukowania produkcji nasion (dalsze szczegóły można uzyskać na podstawie Weijers i in., Cell 4299, 4289-4299 (2001); lub Degenhardt, Plant physiology, 147, 128-42 (2008)). 10 [0196] W dalszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy systemu genetycznego, który obejmuje (a) środki do specyficznego redukowania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję zdefiniowanego w niniejszym dokumencie powyżej; i (b) środek ratujący, zdolny do zwiększenia zmniejszonej ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano powyżej w niniejszym dokumencie, gdzie system genetyczny jest dostarczony jako pojedyncza jednostka transformacyjna i gdzie wymienione środki do 15 specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i wymieniony środek ratujący, są obecne w tym samym transgenicznym locus. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „specyficzne zmniejszanie” odnosi się do ukierunkowanego, nieprzypadkowego podejścia do genu z haploinsuficjencją. Określenie to wyklucza podejścia do zmniejszania ekspresji, które są oparte na modyfikacjach losowych, takich jak mutageneza losowa, lub podejścia insercyjne, które na przykład 20 przypadkowo trafiają w gen wykazujący haploinsuficjencję. Takie podejścia są uważane za niespecyficzne i dlatego nie mogą być uwzględnione w ramach stosowanej kategorii. W szczególności, mutagenezy losowe lub podejścia insercyjne mają tendencję do modyfikowania sekwencji genomowych nie tylko w jednej pozycji, ale często w kilku pozycjach, co prowadzi do nieprzewidywalnych implikacji genetycznych, co do których nie można oczekiwać, że zostaną specjalnie ratowane przez ekspresję określonego genu 25 ratunkowego lub specyficznych genów ratowniczych. System genetyczny jest dostarczany jako pojedyncza jednostka transformacji, tj. jako jednostka, którą można wprowadzić jako pojedynczą cząsteczkę do organizmu docelowego. Cząsteczki mogą być dowolnym odpowiednim nośnikiem do wprowadzania, takim jak mobilny element genetyczny, plazmidowy DNA, wektor wirusowy lub kaseta insercji genomowej lub egzogenny DNA zdolny do integracji genomowej. Nośnik może być kolisty lub liniowy, np. zlinearyzowany 30 przez cięcie enzymem restrykcyjnym lub ścięty przez siły fizyczne. Ruchomym elementem genetycznym może być na przykład transpozon, który jest zdolny do wstawienia w dowolnym lub uprzednio określonym miejscu w genomie organizmu. Ten transpozon może zawierać jeden lub więcej konstruktów charakteryzującym się poddominacją, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Przykłady odpowiednich transpozonów obejmują transpozony DNA, takie jak Sleeping Beauty lub ich pochodne, Ac/Ds lub ich 35 pochodne, elementy P lub ich pochodne, elementy mariner lub ich pochodne, Tc1 lub Tc3 lub ich pochodne, elementy piggyback, elementy Minos lub retrotranspozony, takie jak jako Ty1 lub jego pochodne. Ponadto można zastosować różne zdefiniowane systemy miejsc docelowych oparte na rekombinazach PhiC31, Cre lub FLP z odpowiednimi plazmidami do zintegrowania ich w określonych pozycjach w genomie (dalsze szczegóły można uzyskać z Nimmo i in., Insect molecular biology, 15, 129-36 (2006); lub Bischof i in., 40 PNAS, 104, 3312-7 (2007)).

60

EP 2 934 093 B1

[0197] Ponadto ujawniono zastosowanie systemu genetycznego, jak opisano powyżej, do transformacji populacji organizmu. Transformacja populacji może być zasadniczo przeprowadzona, jak nakreślono w niniejszym dokumencie powyżej, w kontekście wprowadzenia konstruktów charakteryzującym się poddominacją do organizmu. Transformację można przeprowadzić w wielu organizmach lub w populacji 5 organizmów. Tę mnogość organizmów lub populację organizmów opisuje się jako należące do tego samego gatunku. [0198] W dalszym korzystnym wykonaniu system genetyczny według wynalazku można zastosować do ustanowienia środków zmniejszających ekspresję genu z haploinsuficjencją w organizmie i do ustanowienia środka ratującego zdolnego do zwiększenia zredukowanej ekspresji genu z 10 haploinsuficjencją w organizmie. System genetyczny można korzystnie zastosować do ustalenia aktywności zmniejszających i ratujących w postaci homozygotycznej w organizmie. W związku z tym, uzyskany organizm może ponadto prowadzić do ustanowienia systemu genetycznego o wysokiej częstości w populacji organizmu. [0199] Ujawniono ponadto, że system genetyczny według wynalazku może być stosowany do zmniejszania 15 własnej introgresji w populacji w przeciwnym razie zdolnych do krzyżowania się organizmów rozmnażających się płciowo. System genetyczny można odpowiednio dostarczony w organizmie, który w przeciwnym razie jest zdolny do krzyżowania i rozmnaża się płciowo z innymi organizmami tego samego gatunku. System genetyczny może być korzystnie dostarczony w postaci homozygotycznej w organizmie. W oparciu o zmniejszone dostosowanie konkurencyjne hemizygotycznego potomstwa organizmu 20 zawierającego system genetyczny, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie, można osiągnąć introgresję systemu genetycznego do populacji osobników nietransformowanych. Na przykład, organizmy typu dzikiego, które kojarzą się z organizmami zawierającymi zdefiniowany w niniejszym dokumencie system genetyczny, mogą mieć zmniejszone dostosowanie konkurencyjne, np. być niezdolne do życia i/lub niepłodne lub mieć zmniejszoną żywotność i/lub zmniejszoną płodność. Takie organizmy nie mogą 25 przyczyniać się do rozprzestrzeniania się systemu genetycznego na dalsze potomstwo i tym samym introgresji systemu genetycznego do dzikiej populacji. W konkretnym wykonaniu, system genetyczny zdefiniowany w niniejszym dokumencie może być stosowany do zapobiegania introgresji samego systemu genetycznego do populacji organizmów typu dzikiego poprzez eliminację lub ograniczenie rozmnażania płciowego hemizygotycznego potomstwa. Taka eliminacja lub ograniczenie może być oparte na efektach 30 spowodowanych przez jeden lub więcej genów wykazujących haploinsuficjencję lub na skutek efektów opartych na jednym lub więcej genach efektorowych, które mogą być dostarczone razem z systemem genetycznym, jak opisano powyżej. [0200] W jeszcze innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy genetycznie zmodyfikowanego organizmu eukariotycznego, pod warunkiem, że ten organizm nie jest człowiekiem, obejmującego (a) środki do 35 specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, jak zdefiniowano powyżej; i (b) środek ratujący, zdolny do zwiększenia zmniejszonej ekspresji tego genu wykazującego haploinsuficjencję, przy czym organizm jest organizmem potencjalnie rozmnażającym się płciowo, a wymienione środki do specyficznego redukowania ekspresji genu z haploinsuficjencją i wymieniony środek ratujący są obecne w tym samym transgenicznym locus, i przy czym ten organizm jest rośliną lub owadem. 40 Określenie „specyficzne zmniejszenie” stosowane w tym kontekście należy rozumieć zgodnie z definicją podaną powyżej. W konkretnym wykonaniu organizm genetycznie zmodyfikowany nie jest istotą ludzką. W 61

EP 2 934 093 B1

dalszym konkretnym wykonaniu genetycznie zmodyfikowane organizmy można uzyskać lub są możliwe do uzyskania, przeprowadzając sposób zmniejszania dostosowania konkurencyjnego organizmu, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. Genetycznie zmodyfikowany organizm według wynalazku może być homozygotyczny pod względem jednego lub większej liczby konstruktów charakteryzującym się 5 poddominacją, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. W kolejnym wykonaniu, organizm genetycznie zmodyfikowany może być hemizygotyczny w stosunku do jednego lub większej liczby konstruktów charakteryzującym się poddominacją, jak zdefiniowano w niniejszym dokumencie. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu genetycznie zmodyfikowany organizm będący hemizygotycznym wobec jednego lub większej liczby konstruktów charakteryzującym się poddominacją, jak zdefiniowano w niniejszym 10 dokumencie, może mieć zmniejszone dostosowanie konkurencyjne w porównaniu z organizmem homozygotycznym pod względem konstruktu charakteryzującego się poddominacją według wynalazku. [0201] Organizm, jaki wymieniono powyżej w niniejszym dokumencie, np. organizm, za pomocą którego przeprowadzane są sposoby według wynalazku, lub organizm genetycznie zmodyfikowany objęty niniejszym wynalazkiem może być dowolnym odpowiednim organizmem znanym specjaliście. Przykłady 15 takich organizmów obejmują zwierzęta, rośliny, grzyby lub pierwotniaki. Spośród zwierząt, preferowane są zwierzęta przenoszące choroby, zwierzęta wywołujące choroby i zwierzęta hodowlane. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „zwierzę przenoszące chorobę” odnosi się do dowolnego zwierzęcia, które przenosi chorobę z jednego gospodarza na drugiego. Taka choroba może być odzwierzęca, np. choroba ludzi, lub choroba roślin. Przykładami takich zwierząt są owady, pajęczaki lub gryzonie. Wśród 20 owadów preferowany jest komar lub mucha. Szczególnie preferowane są owady przenoszące choroby roślin, np. Mszyca grochowa, Agromyzidae Sp., Anthomyiidae Sp., konik polny, mszyca kapuściana, Cacopsylla melanoneura, skoczek, pospolity brązowy konik polny, Culmicole, CurculionidaeE, Eumetopina flavipes, Frankliniella occidentalis, Frankliniella triticiG, Strzelczyk szklanoskrzydły, miodówka, stonka, skoczek, wełnowiec, mucha melonowa, Molytinae, Pegomya hyoscyami, smolik, Pissodes strobi, Pissodini, 25 planthopper, Pseudococcus viburni, Psylla piri, Rosaria Rhabdophaga, Rhynchophorus palmarum, Scaphoideus Titanus, Scirtothrips dorsalis, mączlik srebrnoskrzydły, Nasionnicowate, Thripidae, wciornastek melona, Cetynie większy, Mszyca cytrusowa, owad z rodziny zgarbkowatych, Triozidae. Przewidziane są również owady przenoszące choroby zwierząt, np. Aedes sp., Anopheles sp., Calliphoridae sp., Culex Sp., Glossinidae sp., Haemagogus sp., Hippelates sp., Ixodoidea sp., 30 Phlebotomus sp., Rhodnius sp., Simuliinae sp., Simuliini sp., Simulium sp.lub Triatoma sp. [0202] Preferowanym pajęczakiem jest kleszcz. Gryzoniem może być szczur lub mysz. W dalszym wykonaniu, zwierzęciem powodującym chorobę może być nicień powodujący chorobę ludzi, nicień powodujący chorobę zwierząt lub nicień powodujący chorobę roślin. Przykłady takich nicieni obejmują Ancylostoma sp., Aphelenchoides sp., Ascari sp., Bursaphelenchus sp., Ditylenchus sp., Enterobius sp., 35 Globodera sp., Heterodera sp., Longidorus sp., Meloidogyne sp., Nacobbus sp., Pratylenchus sp., Toxocara sp., Trichodorus sp., Trichuris sp., Tylenchulus sp. i Xiphinema sp. [0203] W kolejnym szczególnie korzystnym wykonaniu wymienionym organizmem jest roślina rolnicza. Rośliną rolniczą może być każda roślina, która jest wykorzystywana przez ludzi do celów rolniczych. Przykłady obejmują rośliny podstawowe, np. roślina zbóżowa, rośliny okopowe, bulwy, nasiona strączkowe 40 lub rośliny strączkowe; lub uprawę roślin cukrowniczych lub rośliny oleiste, np. palma oleista lub krokosz barwierski. Szczególnie korzystnymi przykładami roślin rolniczych są lucerna, anturium, jabłko, osika, 62

EP 2 934 093 B1

bakteria (ang. Bacterium), bahia pospolita, banan, jęczmień, burak, belladonna, trawa bermudzka, jagoda, lnicznik siewny, marchew, maniok, cykoria, chryzantema, Clavibacter, kukurydza, bawełna, modrak, żurawina, ogórek, bakłażan, lnianka, mieczyk, winogrono, grejpfrut, winorośl, gwajula, sałata, melon, miskant, cebula, papaja, groch, orzechy ziemne, pelargonia, pieprz, mięta pieprzowa, persymona, petunia, 5 śliwka, topola, ziemniak, Pseudomonas, rzepak, Rhizobium, ryż, krokosz, sorgo, soja, kabaczek, truskawka, burak cukrowy, trzcina cukrowa, słonecznik, ambrowiec pospolity, proso rózgowe, tytoń, pomidor, orzech włoski, arbuz lub pszenica. [0204] W dalszym wykonaniu, rośliną może być roślina szkodnik. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „roślina szkodnik” odnosi się do rośliny, która jest uważana za przeszkodę w rolniczych lub 10 ogrodniczych wysiłkach człowieka. Przewidywane przykłady roślin szkodników obejmują Acmena smithii, Ailanthus altissima, Akebia quinata, Alternanthera philoxeroides, Anredera cordifolia, Araujia sericifera, Aristea ecklonii, Arundo donax, Asparagus asparagoides, Asparagus densiflorus, Asparagus scanduna, Berberis, Berberis, Cardiospermum grandiflorum, Cardiospermum halicacabum, Carpobrotus edulis, Celastrus orbiculatus, Ceratophyllum demersum, Cestrum parqui, Chrysanthemoides monilifera, Clematis 15 flammula, Clematis vitalba, Cobaea scandens, Cortadotia Cypulamulaonataa, Cortaderia Cymatulaa, oronataa lignosus, Drosera capensis, Eccremocarpus scaber, Egeria densa, Ehrharta villosa, Eichhornia crassipes, Eomecon chionantha, Equisetum, Eragrostis curvula, Erigeron karvinskianus, Euonymus japonicas, Ficus rubiginosa, Fuchsia boliviana, Galeobdolon luteum, Gunnera tinctoria, Gymnocoronis spilanthoides, Hedygium flavescens, Hedychium gardnerianum, Heracleum mantegazzianum, Hieracium, 20 Homalanthus populifoliusm, Homeria collina, Houttuynia cordata, Hydrilla verticillata, Hydrocleys nymphoides, Hypericum androsaemum, Ipomoea indica, Iris pseudacorus, Jasminum humile, Lagarosiphon major, Lantana camara, Ligustrum lucidum, Lilium formosanum, Lonicera japonica, Ludwigia peploides podsp. Montevidensis, Lythrum salicaria, Macfadyena unguis-cati, Menyanthes trifoliate, Myoporum insulare, Myrica faya, Myricaria germanica, Myriophyllum aquaticum, Nassella, Nephrolepis 25 cordifolia, Nuphar lutea, Nymphaea Mexicana, Nymphoides geminate, Nymphoides peltata, Ochna serrulata, Osmunda regalis, Panicum maximum, Passiflora caerulea, Passiflora tarminiana, Passiflora tripartite, Pennisetum, Phragmites australis, Pinus contorta, Pistia stratiotes, Pittosporum undulatum, Plectranthus ciliates, Polygala myrtifolia, Potamogeton perfoliatus, Prunus serotina, Pyracantha angustifolia, Reynoutria japonica, Reynoutria sachalinensis, Rhamnus alaternus, Rhododendron ponticum, 30 Sagittaria montevidensis, Sagittaria platyphylla, Sagittaria sagittifolia, Salix cinerea, Salix fragilis, Salvinia molesta, Schinus terebinthifolius, Schoenoplectus californicus, Selaginella kraussiana, Solanum marginatum, Solanum mauritianum, Tradescantia fluminensis, Tropaeolum speciosum, Tussilago farfara, Typha latifolia, Utricularia arenaria, Utricularia gibba, Utricularia livida, Utricularia sandersonii, Vallisneria gigantean, Vallisneria spiralis, Zantedeschia i Zizania latifolia. 35 [0205] W dalszym korzystnym wykonaniu rośliną jest glon. Przewidywane przykłady glonów w kontekście niniejszego wynalazku obejmują wielkomorszcz. Szczególnie korzystne są glony do produkcji biopaliw, takie jak Botryococcus braunii, Gracilaria, Pleurochrysis carterae, Sargassum, Ankistrodesmus, Botryococcus braunii, Chlorella protothecoides, Cyclotella, Dunaliella tertiolecta, Hantzschia, Nannochloris, Nannochloropsis, Nitzschia, Phaeodactylum tricornutum, Scenedesmus, Stichococcus, Tetraselmis 40 suecica, Thalassiosira pseudonana, Crypthecodinium cohnii, Neochloris oleoabundans i Schiochytrium.

63

EP 2 934 093 B1

[0206] W dalszym korzystnym wykonaniu organizmem jest grzyb, np. toksyczny grzyb lub grzyb stosowany w produkcji w bioreaktorze. Przykłady grzybów do zastosowania w kontekście niniejszego wynalazku pochodzą z rodzaju Saccharomyces lub Aspergillus. [0207] Poniższe przykłady i rysunki podano w celach ilustracyjnych. Zrozumiałe jest zatem, że przykładów 5 i figur nie należy interpretować jako ograniczających. Specjalista w tej dziedzinie będzie w stanie przewidzieć dalsze modyfikacje zasad określonych w niniejszym dokumencie.

PRZYKŁADY

Przykład 1

[0208] Endogennym genem wykazującym haploinsuficjencję będącym celem w opisanym konstrukcie jest 10 RpL14 (lokalizacja cytogenetyczna 66D8), który koduje cytoplazmatyczne białko rybosomalne (CRP). Heterozygotyczne mutacje w RpL14 dają klasyczny silny fenotyp Minute z opóźnionym rozwojem, cienką szczeciną i obniżoną płodnością samic (Sæbøe-Larssen i in., 1997 Molecular and General Genetics 255: 141-151). Knock-down (RpL14.dsRNA) stanowi odwrócone powtórzenie dsRNA, ukierunkowujące RNAi do 67 pz endogennego mRNA RpL14 typu dzikiego (RpL14+). Ratunkowy (RpL14r) jest kompletną kopią 15 genu RpL14 typu dzikiego (w tym jego promotor i regiony flankujące), w którym wprowadzono 14 synonimicznych mutacji w regionie 67bp ukierunkowany do RNAi przez dsRNA RpL14 (opisane bardziej szczegółowo poniżej). Liczba i pozycja zmian synonimicznych zapewnia, że wszystkie fragmenty siRNA o wielkości około 21 pz, które zgodnie z przewidywaniami będą wytwarzane przez białka Dicer do ukierunkowania do RNAi, zawierają co najmniej 3 niedopasowania. Plazmid do transformacji genetycznej 20 łączący oba geny (patrz fig. 1) został zintegrowany w oznaczonym przez RFP miejscu docelowym attP/φC31 na chromosomie trzecim (lokalizacja cytogenetyczna 86Fb; Bischof, 2007, PNAS, 104: 3312-7), w wyniku czego powstaje genotyp M{3x-P3-RFP, {attR, w+mC, RpL14r, UAS-RpL14.dsRNA}}86Fb określany jako {Ud}86 (sufiks 86 oznacza lokalizację genomową wstawki). Aby doprowadzić do konstytutywnej ekspresji knock-down’u UAS-RNAi, wybrano drugi sterownik chromosomu Actin5c-GAL4, P{w+mC=Act5C- 25 GAL4}25FO1.

Opracowanie knock-down dsRNAi.RpL14 dla RpL14+

[0209] Gen RpL14 (FBgn0017579 lub CG6253) został wybrany jako reprezentatywny gen CRP, który wcześniej opisano jako wykazujący silny fenotyp Minute (Sæbøe-Larssen i in., 1997, Molecular and General Genetics 255: 141-151). Był to pierwszy gen wybrany do opracowania tego podejścia. 30 [0210] Aby zidentyfikować region RpL14 o wielkości około 70 pz do celowania za pomocą knock-down RNAi zastosowano następujące cztery kryteria wobec sekwencji mRNA typu dzikiego: (1) brak przewidywanych efektów błędnego wycelowania (ustawienie domyślne z „Off-Target Size” ustawionym na 16 pz, http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl), (2) brak regionów z dużą liczbą nie- zdegenerowanych kodonów ATG lub TGG, (3) cel musi być obecny we wszystkich wariantach 35 alternatywnego składania, a (4) region wykazuje wysoki stopień dostępności strukturalnej (zgodnie z domyślnymi ustawieniami S-Fold, http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/sirna.pl). Po zastosowaniu tych kryteriów nie było możliwe skierowanie na pojedynczego ciągły regionu, dlatego wybrano dwa nieciągłe regiony (zwane blokami A i B); oba bloki znajdowały się w eksonie 2. Sekwencję dsRNA RpL14. pokazano na fig. 3. Blok A ma 41 pz (celowanie w 3L: 8594414..8594454 z RpL14+), a blok B ma długość 31 pz

64

EP 2 934 093 B1

(celowanie w 3L: 8594485..8594515 z RpL14+). Krótki linker zawierający KpnI został wstawiony między blok A i B po sprawdzeniu, że linker nie spowodował żadnych przewidywanych efektów błędnego celowania. [0211] Odwrócone powtórzenie sekwencji celującej zostało złożone i wklonowane do plazmidu pUASattB 5 (Genbank: EF362409; Bischof, 2007, PNAS 104: 3312-7) w miejscu wielokrotnego klonowania, poniżej promotora UAS. SURE 2, do transformacji bakteryjnej zastosowano superkompetentne komórki E. coli (Agilent Techologies), aby zapewnić stabilność krótkiej struktury spinki do włosów. Skuteczność dsRNA RpL14. w celowaniu w RpL14+ wykazano doświadczalnie przy użyciu much transformowanych {UAS-RpL14.dsRNA} krzyżowanych wraz ze sterownikiem GAL4: (w*; P{w+mC=GAL4- 10 ninaE.GMR}12, który powodował martwicze plamy oka, y1 w* P{w+mC=GAL4-Act5C(FRT.CD2).P}D który powodował letalność, i w*; P{w+mC=GAL4-ey.H}3-8, który powodował pojawienie się nieprzeobrażonych osobników dorosłych bez głowy (patrz Enerly i in., 2003, Gene 320: 41-48).

Opracowanie ratunkowego RpL14r

[0212] Region RpL14 amplifikowano przy użyciu Phusion Taq (Finnzyme) z DNA sporządzonego z 15 referencyjnego materiału wyjściowego genomu (Bloomington Stock: 2057, y [1]; Gr22b[1] Gr22d[1] cn[1] CG33964 [R4.2] bw[1] sp[1]; LysC[1] MstProx[1] GsfD5[1] Rh6[1]). Dokonano tego przy użyciu następujących starterów NotI -5’-TATGCGGCCGCttgattagtttcctggccactt (SEQ ID NO: 3) i EcoRI-5’- TATGAATTCaaggcataagagctttgaatcg (SEQ ID NO: 4). Doprowadziło to do amplifikacji 3L: 8593592..8596494. Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo, że regiony regulacyjne RpL14 zostały 20 włączone, fragmenty genów flankujących również włączono w produkcie PCR (fig. 1). Endogenny fragment RpL14 wklonowano w miejsce HindIII bezpośrednio powyżej promotora UAS w plazmidzie pUASattB już zawierającym sekwencję UAS-RpL14.dsRNA, opisaną powyżej (patrz fig. 4). Pełna sekwencja plazmidowego DNA jest podana w dołączonym pliku w formacie banku genów. [0213] 14 synonimicznych mutacji, które nadawały niewrażliwość RpL14r do ukierunkowania RNAi 25 wprowadzono do eksonu 2, przez syntezę nowej sekwencji (DNA2.0, Inc., https://www.dna20.com/). Następnie wligowano to do plazmidu w miejscu odpowiedniej sekwencji typu dzikiego, stosując standardowe techniki klonowania. 14 synonimicznych mutacji zostało rozprowadzonych, aby zapewnić, że każde 21 pz obejmuje conajmniej 3 synonimiczne niedopasowania z mRNA RpL14r. W miarę możliwości, wprowadzone mutacje zachowały tę samą równowagę między korzystnymi i niekorzystnymi kodonami D. 30 melanogaster. [0214] Transformanty linii zarodkowej D. melanogaster zostały wygenerowane przez wstawienie plazmidu {Ud} (patrz fig. 4) do miejsca docelowego 86Fb (3R:7634329) za pomocą BestGene, Inc. (http://www.thebestgene.com/) przy użyciu systemu integracji attP/φC31 (Bischof, 2007, PNAS, 104: 3312- 7). 35 [0215] Niewrażliwość RpL14r do ukierunkowania RNAi wykazano przez jego zdolność do ratowania letalności UAS-RpL14.dsRNA w obecności ekspresji GAL4-Act5C. Konstrukt ten zastosowano następnie we wszystkich kolejnych doświadczeniach. Ekspresję genu ratunkowego potwierdzono u dorosłych, stosując RT-qPCR specyficzną dla alleli (patrz Przykład 2) zarówno w obecności, jak i przy braku GAL4 (patrz odpowiednio Fig. 5 i Fig. 6).

40 Generowanie krzyżowanych rodów transgenicznych 65

EP 2 934 093 B1

[0216] Wygenerowano dwa czerwonookie rody do kolejnych doświadczeń, w celu zbadania silnej poddominacji: w*; {Act5C-GAL4}/ CyO; {Ud}86/{Ud}86 i w*; {Act5C-GAL4}/ CyO: +/+. Linie Drosophila, które są wysoce homozygotyczne i utrzymywane w laboratorium przez kilka pokoleń, mogą mieć znacznie obniżone dostosowanie i szybko akumulować dodatkowe szkodliwe mutacje w całym genomie (Seager i 5 in., 1982, Genetics 102: 485-502; Wallace, 1956, J. Genetics 54: 280-293). Aby zapewnić rzetelny test poddominacji, oba rody początkowo zostały skrzyżowane niekrewniaczo przez 3 pokolenia z rodem mieszanym złożonym z linii pochodzących z całego świata. [0217] Transformanty heterozygotyczne {Ud} (y1 w*; M{3x-P3-RFP, {attR, w+mC, RpL14r, UAS- RpL14.dsRNA}}86Fb/+) zostały skrzyżowane niekrewniaczo z mieszanym asortymentem następujących 10 dziko pozyskiwanych rodów, które wytworzono jako białookie, w1118, przez ustanowienie ich z potomstwa

w F2 z krzyżówki wstecznej rodzicielskiej żeńskiej, liniami typu dzikiego są Bloomington rasa 3848, CO3 (NY, USA); Bloomington rasa 3885, Wild 5A (GA, USA); Aquadro lab, B96 (Pekin, Chiny) i 9 linii Isofemale utworzonych w 2009 roku (z Plön i Kilonii, Niemcy). Osobniki transformowane w+mC pozostawiono przy częstości <0,3 (aby zmaksymalizować rekombinację z chromosomami typu dzikiego) przez >3 pokolenia 15 do masowej rekombinacji. Po 4-tym pokoleniu osobniki y*, RFP, w+ mC wybrano do krzyżówek przedstawionych w następującym schemacie: Krzyżówki wykonano wzajemnie z jak największą możliwą liczbą osobników (>10), aby zmaksymalizować naturalne różnice w końcowych rodach. Krzyżówki 1 i 2 są wykonywane równolegle, a potomstwo służy do zapoczątkowania krzyżówki 3.

20 Krzyżówka 1

w [*]; T(2;3)ap[Xa], ap[Xa]/CyO; TM3, Sb[1] (Bloomington 2475) X w[*]; +; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86/+ (krzyżowane niekrewniaczo heterozygoty {Ud}86) Wybrać ap+, w+, RFP, Cy-, Sb- uzyskując potomstwo 25 w [*]; +/CyO; M{3x-P3-RFP, w [+mC], {Ud}} 86/TM3, Sb[1]

Krzyżówka 2

y[1] w[*]; P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1/CyO, y[+] (Bloomington 4414) X w[*]; T(2;3)ap[Xa], ap[Xa]/CyO; TM3, Sb[1] (Bloomington 2475) 30 Wybrać y+, ap+, w+, RFP, Cy-, Sb- uzyskując potomstwo w[*]; T(2;3)ap[Xa], ap[Xa]/P{w [+mC]=Act5C-GAL4}25FO1; +/TM3, Sb[1]

Krzyżówka 3

w[*]; +/CyO; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86/TM3, Sb[1] (potomstwo krzyżówki 1) X 35 w[*]; T(2;3) ap[Xa], ap[Xa]/P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1; +/TM3, Sb[1] (potomstwo krzyżówki 2) Wybrać Cy-, RFP, uzyskując potomstwo w[*]; P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1/CyO; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86/TM3, Sb[1] i w[*]; P{w [+mC]=Act5C-GAL4}25FO1/CyO; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86/+ 66

EP 2 934 093 B1

[0218] Ta ostatnia krzyżówka daje dwa typy heterozygot trzeciego chromosomu. {Ud}86 ze stabilizatorem TM3 i {Ud}86 z chromosomem typu dzikiego. W następnych pokoleniach wybierano opcję Sb-, aby usunąć stabilizator. Homozygoty typu dzikiego chromosomu trzeciego +/+ i homozygoty {Ud}/{Ud} są wybierane (przez wybranie opcji za i przeciw RFP) w celu zainicjowania następujących doświadczeń. 5 [0219] Pełnymi genotypami wynikowymi są w[*]; P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1/CyO; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86 i w[*]; P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1/CyO; + [0220] Ponieważ genotypy różnią się tylko na trzecim chromosomie, wskazany jest tylko genotyp trzeciego 10 chromosomu w innym miejscu w tekście. Należy zauważyć, że promotor kierujący act5c, można użyć do bezpośredniego kierowania RNAi i wygenerowania poddominacji w pojedynczej kasecie (act5c- RpL14.dsRNA, RpL14r), ale użyliśmy tu binarnego systemu GAL4/UAS, aby mieć elastyczność w testowaniu efektów różnych wzorców ekspresji.

Hodowla much

15 [0221] W tym i poniższych przykładach, wszystkie muchy trzymano na standardowych podłożach (http: //flystocks.bio.indiana.edu/FlyWork/media-recipes/bloomfood.htm) w inkubatorze o temperaturze 24°C w cyklu jasność/ciemność 14:10 godzin. Zastosowano 50-ml fiolki lub 300-ml butelki, jak podano poniżej, zawierające pokarm. Kiedy muchy dodawano do nowego pojemnika, na powierzchnię pokarmu dodano drożdże, aby stymulować składanie jaj. Kiedy dorosłe osobniki zostały usunięte z butelki, dodano dwa 20 kimwipes™ w celu zredukowania liczby zgonów wśród dorosłych (od utknięcia w płynnym jedzeniu).

Epi-fluorescencyjne genotypowanie much

[0222] W tym i poniższych przykładach przeprowadzono genotypowanie much badając fluorescencję RFP genu 3x-P3-RFP w miejscu docelowym {Ud}86. Oceny fluorescencji dokonano na epi-fluorescencyjnym mikroskopie Leica MZ10 F ze źródłem światła Leica EL 6000 w zaciemnionym pomieszczeniu. Muchy lekko

+ 25 uśpiono za pomocą CO2. Wszystkie muchy miały czerwone oczy, w . Ocena RFP w oku była niewiarygodna z powodu wygaszenia; jednak wykorzystując muszki z przyoczkami +/+ można było je pewnie odróżnić od much +/{Ud}86 lub {Ud}86/{Ud}86. Do oceny RFP zastosowano zestaw filtrów Leica-dsRED (wzbudzenie 545/30 nm, emisja 620/60 nm). W przypadku doświadczeń wymagających identyfikacji wszystkich trzech genotypów ekspresja 3x-P3-GFP mogłaby być oceniana współdominująco wraz z RFP poprzez dodatkowe 30 zastosowanie zestawu filtrów Leica-GFP2 (wzbudzenie 480/40 nm, emisja 510 nm).

Przykład 2

Określanie poziomów ekspresji genów za pomocą ilościowej RT-PCR

[0223] Łączne ilości mRNA RpL14 i współczynniki transkrypcji endogennego RpL14+ do konstruktu ratunkowego RpL14r oceniono za pomocą dwuetapowej ilościowej PCR z odwrotną transkrypcją (RT- 35 qPCR). RNA wyizolowano od 10 dorosłych much dla każdej płci lub 10 nieseksowanych larw stadium L3 przy użyciu Trizolu (Invitrogen) i traktowano DNAzą przy użyciu zestawu PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen). Jakość RNA oceniono za pomocą spektrofotometru NanoDrop, a do syntezy cDNA zastosowano 100 ng RNA przy użyciu zestawu do syntezy cDNA Maxima First Strand do RT-qPCR (Fermentas). 1 µl powstałej

67

EP 2 934 093 B1

mieszaniny reakcyjnej wykorzystano jako matrycę dla qPCR, stosując TaqMan Fast Master Mix (Applied Biosystems) dla względnych współczynników, lub SYBR Green Fast Master Mix (Applied Biosystems) dla całkowitych poziomów mRNA RpL14. Każdą próbkę przeprowadzono w trzech powtórzeniach na maszynie ABI 7900HT (Applied Biosystems). 5 Zarówno produkty PCR typu dzikiego, jak i ratunkowe amplifikowano przy użyciu tej samej pary starterów, leżącej ponad granicą intron-ekson; 5’-TCTTTCCGGTTAGCGTCAT (SEQ ID NO: 5); 5’- CGCCAGTCAGAGGACCAT (SEQ ID NO: 6). [0224] Ekspresję transkryptów typu dzikiego i ratunkowego wykryto za pomocą sond TaqMan MGB (Applied Biosystems) znakowanych FAM (typ dziki) i VIC (ratunkowy). Obie sondy miały ten sam skład 10 zasad, ale różniły się dwiema zasadami, umożliwiając specyficzne wykrywanie transkryptów typu dzikiego i ratunkowych oraz ułatwiając obliczanie stosunków ekspresji; sonda FAM-TTGCCAAGGCCTCCGC-MGB typu dzikiego (SEQ ID NO: 7); sonda ratująca VIC-TCGCCAAAGCCTCCGC-MGB (SEQ ID NO: 8). [0225] Do normalizacji sygnału qPCR zastosowano metodę GeNorm (patrz Vandesompele i in., 2002 Genome Biology 3: 1-12) i wykorzystano 8 genów (wybranych przez Chintapalli i in., 2007, Nature Genetics 15 39: 715-20) jako zestaw do normalizacji reakcji qPCR. Geny te przetestowano pod kątem stabilności ekspresji w opisanych warunkach doświadczalnych (u larw i dorosłych dla wszystkich genotypów) w seryjnych 10-log rozcieńczeniach matrycy cDNA. Trzy z tych genów, FBgn0032882, FBgn0039259 i FBgn0002021, zidentyfikowano jako najmniej zmienne u much i zastosowano do obliczenia współczynnika normalizacji. Poziomy mRNA RpL14 są eksprymowane w stosunku do znormalizowanej średniej 20 geometrycznej trzech genów normalizacyjnych. [0226] W obu genotypach transgenicznych można było zaobserwować indukowaną RNAi specyficznym wobec locus redukcję mRNA RpL14+ typu dzikiego (patrz fig. 5). U dorosłych samców i samic heterozygoty miały najniższą całkowitą ilość RpL14. Występowały jednak uderzające różnice w zakresie zmniejszenia RpL14+ między samcami i samicami, gdzie samce {Ud}86/{Ud}86 miały znacznie mniej łącznego mRNA 25 RpL14 w porównaniu do samic (patrz fig. 5). Larwy L3 nie były seksowane i nie wiadomo, czy istnieją również duże różnice w poziomach ekspresji między larwami męskimi i żeńskimi, więc larw nie można na tę chwilę wiarygodnie wykorzystać do oszacowania względnych poziomów ekspresji genotypu; jednak larwy weryfikują, czy ekspresja knock-down RNAi i ratująca funkcjonuje w stadium L3.

Przykład 3

30 {Ud}86 Wpływ na cechy historii życia

[0227] Biorąc pod uwagę znaczne obniżenie dostosowania heterozygot i plejotropowy wpływ hipomorfów CRP (patrz S. J. Marygold i in., 2007 Genome Biology 8: R216; Sæbøe-Larssen, S. i in., 1997 Molecular and General Genetics 255: 141-151), zbadano historię życia i cechy morfologiczne, które mogą korelować z tym genotypem. Nie zaobserwowano jawnych nieprawidłowości morfologicznych w żadnym z genotypów 35 {Ud}86. Co ciekawe, heterozygoty nie wykazują krótkich i cienkich szczecin, które są charakterystyczną cechą fenotypu Minute RpL14 i większości mutacji CRP D. melanogaster. Jednak, podobnie jak fenotypy Minute, heterozygoty wykazywały czas rozwoju wydłużony o około 20 godzin (patrz fig. 7A, P <1x10-30), podczas gdy homozygoty {Ud}86/{Ud}86 nie wykazały istotnych różnic w porównaniu z homozygotami typu dzikiego (doświadczenia opisane poniżej). Ponadto nie zaobserwowano różnicy w suchej masie między 40 dorosłymi z trzech genotypów (samce, F = 0,55, p = 0,591; samice, F = 1,34, p = 0,298). Względna 68

EP 2 934 093 B1

żywotność heterozygotycznego genotypu od jaja do dorosłego była o 20% - 50% niższa niż homozygot (patrz fig. 7B); samo to jednak nie wystarcza do pełnego wyjaśnienia zmniejszenia w dostosowaniu o 70– 80% w całym cyklu życiowym w porównaniu z homozygotami (patrz fig. 8C; przykład 4) i sugeruje negatywny wpływ dodatkowych czynników w cyklu życiowym u hemizygot {Ud}86/+. 5 [0228] W celu dokładniejszego oszacowania czasu rozwoju i odejścia rozwoju od jaja do dorosłego (z powodu różnic w żywotności) od oczekiwanych stosunków Mendla między trzema genotypami, utworzono linię z ekspresją GFP z miejsca insertu cytologicznego 86Fb jako pełnomocnika (ang. proxy) dla typu dzikiego (patrz fig. 2). Rasa GFP miała genotyp w[*]; CyO/ P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1; M{{3x-P3- GFP}}86Fb i został on wygenerowany z modyfikacji plazmidu (pGFP-lox-attB_12.gb.1) dostarczonego 10 przez dr Johannesa Bischofa (Uniwersytet w Zurychu). Rody {Ud}86 RFP i GFP krzyżowano między sobą przez >6 pokoleń masowo, przed doświadczeniem, aby pomóc w ujednoliceniu tła genetycznego i zapewnić pewną naturalną zmienność genetyczną na każdym tle chromosomalnym. [0229] W tym doświadczeniu zastosowano fiolki, a krzyżówki ustawiono zgodnie z typami rodzicielskimi wskazanymi na fig. 7B. Muchy rodzicielskie przenoszono do nowych fiolek każdego dnia, w sumie przez 15 10 dni, i zliczano uzyskane wynikowe, nowo zamykające się potomstwo, pod względem płci i obecność/nieobecność RFP/GFP, każdego dnia przez kolejne 25 dni. Dane podano w poniższej tabeli 2.

Tabela 2: Dane z doświadczeń dotyczących czasu rozwoju i żywotności genotypu. Liczby potomstwa z różnych rodzajów krzyżówek przedstawione na fig. 7B podano poniżej. Dziewięcioro potomstwa z zaobserwowanymi genotypami, które nie były możliwe w konfiguracji krzyżowej, podkreślono i 20 pogrubiono. Zostały one wykorzystane do oszacowania poziomu błędu genotypowania i zostały wyłączone ze wszystkich innych obliczeń. Żeński rodzic jest wymieniony jako pierwszy. Męskie potomstwo jest oznaczone „m”, a żeńskie „f”.

{Ud}86/+ × {Ud}86/+

Dzień 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

+/+ m 0 50 103 68 29 24 10 9 0 3 1 1 0

{Ud}86/+ m 0 8 122 107 84 52 46 24 6 5 2 0 0

{Ud}86/{Ud}86 m 0 39 94 63 22 26 14 12 3 0 0 2 0

+/+ f 2 82 81 52 36 25 14 9 4 4 1 0 0

{Ud}86/+ f 0 28 144 124 84 78 47 16 8 1 3 1 0

{Ud}86/{Ud}86 f 0 85 103 68 37 21 16 4 2 3 0 0 0

+/+ × {Ud}86/+

Dzień 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

+/+ m 0 3 60 105 38 17 4 2 1 3 0 0 0

{Ud}86/+ m 0 0 23 49 62 27 12 3 2 2 1 0 0

{Ud}86/{Ud}86 m 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

69

EP 2 934 093 B1

{Ud}86/+ × {Ud}86/+

+/+ f 0 11 115 98 38 6 2 3 2 1 0 0 0

{Ud}86/+ f 0 1 22 106 60 26 16 5 1 2 0 1 0

{Ud}86/{Ud}86 f 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

{Ud}86/{Ud}86 × {Ud}86/+

Dzień 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

+/+ m 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

{Ud}86/+ m 0 0 18 43 43 29 12 2 0 0 0 0 0

{Ud}86/{Ud}86 m 0 10 65 72 25 11 6 0 0 0 0 0 0

+/+ f 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

{Ud}86/+ f 0 0 12 75 55 34 9 1 1 0 0 1 0

{Ud}86/{Ud}86 f 0 11 96 91 26 7 7 0 1 0 0 0 0

{Ud}86/+ × +/+

Dzień 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

+/+ m 0 0 21 49 13 1 1 0 0 1 0 0 0

{Ud}86/+ m 0 0 2 22 33 14 2 1 0 0 0 1 0

{Ud}86/{Ud}86 m 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 0 0 0

+/+ f 0 0 52 52 9 0 2 0 0 0 1 0 0

{Ud}86/+ f 0 0 4 42 26 11 3 1 0 0 0 0 0

{Ud}86/{Ud}86 f 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0

{Ud}86/+ × {Ud}86/{Ud}86

Dzień 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

+/+ m 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

{Ud}86/+ m 0 0 11 24 11 5 3 1 1 0 0 0 0

{Ud}86/{Ud}86 m 0 3 43 31 6 8 4 2 1 0 0 0 0

+/+ f 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0

{Ud}86/+ f 0 0 16 17 16 5 7 1 0 0 0 0 0

{Ud}86/{Ud}86 f 0 11 64 26 19 9 3 2 1 0 0 0 0

[0230] Wsteczne krzyżówki rodzicielskie heterozygotyczne do homozygotycznych umożliwiły oszacowanie częstotliwości błędnej punktacji genotypu. Fiolki dla każdej krzyżówki otrzymały identyfikator 5 alfanumeryczny, a potomstwo było zliczane „ślepo” każdego dnia bez znajomości krzyżówki rodzicielskiej. 70

EP 2 934 093 B1

W sumie, wykryto 9 potomków z genotypami nie umożliwionymi przez krzyżówkę (np. homozygotyczne potomstwo RFP/RFP od rodziców GFP/RFP x GFP/GFP) z 2,636 potomstwa z krzyżówek, w których można wykryć tego rodzaju błędy. Zakładając, że połowa błędnych wyników genotypów jest wykrywalna (pozostała część mieści się w dozwolonej kategorii genotypu dla konkretnego krzyżówki), przewidywany 5 współczynnik błędu genotypowania wynosi 0,68%. W najgorszym przypadku, w którym wszystkie błędy genotypowania pomijają heterozygoty jako genotypy homozygotyczne, współczynnik ten nie jest wystarczająco duży, aby wyjaśnić redukcję heterozygot w obserwowanych danych bez różnic dostosowania między genotypami (fig. 7B).

Sucha masa

10 [0231] Pięć zbiorów 10 jednodniowych dorosłych much każdej płci i genotypu zamrożono przez noc, a następnie suszono w suszarce przez sześć godzin w temperaturze 30°C. Muchy ważono partiami po 10, w celu uzyskania dokładniejszych pomiarów. Dane te podano w poniższej tabeli 3. Tabela 3: Dane suchej masy. Suche masy w gramach dla partii 10 much ważonych jednocześnie dla każdej płci, powtórzenia i genotypu.

Genotyp samice {Ud}86/{Ud}86 {Ud}86/+ +/+

Powtórzenie 1 0,0031 0,0032 0,0031

Powtórzenie 2 0,0030 0,0031 0,0032

Powtórzenie 3 0,0037 0,0030 0,0032

Powtórzenie 4 0,0033 0,0038 0,0031

Powtórzenie 5 0,0033 0,0034 0,0026

Średnia 0,00328 0,0033 0,00304

Genotyp samców {Ud}86/{Ud}86 {Ud}86/+ +/+

Powtórzenie 1 0,0020 0,0022 0,0022

Powtórzenie 2 0,0022 0,0023 0,0023

Powtórzenie 3 0,0024 0,0022 0,0025

Powtórzenie 4 0,0026 0,0028 0,0022

Powtórzenie 5 0,0024 0,0026 0,0022

Średnia 0,00232 0,00242 0,00228

15 Przykład 4

Doświadczenia populacyjne

[0232] Aby przetestować zależne od częstości utrwalenie alleli, które jest diagnostyczne dla poddominacji, zainicjowano powtórzone butelki poprzez zakres częstości. Zliczono genotypy w każdym pokoleniu

71

EP 2 934 093 B1

wykorzystując dominującą fluorescencję markera 3x-P3-RFP, który jest częścią miejsca docelowego stosowanego w {Ud}86. [0233] Doświadczenie mierzące zmianę częstości alleli w wielu pokoleniach zostało zainicjowane z 20 skojarzonymi samicami z wyżej wyhodowanych homozygotycznych ras o częstości początkowej 5 wynoszącej 20%, 50% lub 80% {Ud}86/{Ud}86. Tym już skojarzonym samicom umożliwiono składanie jaj w fiolkach przez trzy dni, a następnie usunięto. Te homozygotyczne samice rodzicielskie zostały nazwane G0. Celem tego pokolenia było zminimalizowanie prawdopodobieństwa, że różnice w stanie lub dojrzałości pomiędzy rodami nie wpłyną silnie na początkowe częstości. Następne pokolenie, G1 jest genotypowo identyczne z rodzicami w pokoleniu G0, ale warunki rozwoju larw są lepiej kontrolowane. Z fiolki zebrano 10 do 100 dorosłych G1, oceniono pod kątem płci i RFP przy użyciu mikroskopii epi-fluorescencyjnej, a następnie umożliwiono składanie jaj w nowej butelce, przez 3 dni przed usunięciem. Po 12 dodatkowych dniach rozwoju larw zebrano do (w przybliżeniu) 100 potomków G2 oceniano pod kątem płci i RFP i wprowadzono do butelki na trzy dni. Ta sekwencja została powtórzona dla wszystkich kolejnych pokoleń. Pokolenie G2 jest pierwszym, w którym obecne są heterozygoty, a zatem jest to pierwsze pokolenie, w 15 którym można wykryć efekt poddominacji. Dlatego pokolenie 2 jest pierwszym pokoleniem pokazanym na fig. 8A. [0234] Czas składania jaj, 3 dni i odstęp między pokoleniami 15 dni, od momentu początkowego dodania much do każdej butelki, wybrano w celu zmaksymalizowania liczebności populacji i zminimalizowania możliwych skutków opóźnienia rozwojowego, tj. równowagi między genotypami wcześnie 20 przeobrażającymi się ginącymi w pokarmie, a więc podkreślonymi i podkreślonymi genotypami później przeobrażającymi się. Wykorzystanie krzywej czasu rozwoju, fig. 7A, w najgorszym przypadku (100% przeżycia genotypu homozygotycznego), spowodowałoby to jedynie względną utratę 7% oczekiwanych genotypów heterozygotycznych, co nie jest wystarczające, aby wyjaśnić 78% zmniejszenie dostosowania oszacowanego dla heterozygot. 25 [0235] Strategia oceniania markera RFP w celu wywnioskowania częstości {Ud}86 przyjmuje minimalne założenia dotyczące dostosowania (zakłada proporcje Hardy-Weinberga przy braku selekcji). Częstość {Ud}86 została oszacowana jako p = 1-√(R-/n)., gdzie R- jest frakcją osobników dorosłych nieposiadających RFP, a n oznacza całkowitą liczbę punktów (wykreślone na fig. 8A). Dane podano w poniższej tabeli 4:

Tabela 4: Dane z wielopokoleniowych doświadczeń populacyjnych. W tabeli podano liczby RFP 30 dodatnich (RFP+) i RFP ujemnych (RFP-), samców (m) i samic (f) w każdym pokoleniu. Tylko pokolenia 2-7, w których heterozygoty mogły być obecne przez cały cykl życia, były wykorzystywane do wykreślenia i wnioskowania o dostosowaniu. W drugim pokoleniu, linia G została założona z samic z linii A po usunięciu ich z linii A, linia H została założona z B, I z C, J z D, K z E i L z F w ten sam sposób. Podano również szacunkową częstość insertu {Ud}86 wraz z całkowitą liczbą ocenianych dorosłych. Ocenianie 35 zostało przerwane w powtórzeniach, które osiągnęły widoczną utratę lub utrwalenia przez dwa kolejne pokolenia.

Powtórzenie A

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0 0 8 0 8 0,5 16

72

EP 2 934 093 B1

Powtórzenie A

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

1 17 13 6 10 0,652174 46

2 44 29 18 5 0,510527 96

3 33 34 20 13 0,425544 100

4 16 32 28 25 0,275602 101

5 15 15 37 33 0,16334 100

6 3 6 50 43 0,045136 102

7 2 0 50 48 0,010051 100

Powtórzenie B

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0 0 12 0 3 0,8 15

1 21 37 6 5 0,84058 69

2 41 45 9 5 0,625834 100

3 45 49 3 3 0,755051 100

4 58 48 1 0 0,903326 107

5 38 64 0 0 1 102

6 49 53 0 1 0,901467 103

7 47 54 0 0 1 101

Powtórzenie C

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0 0 3 0 12 0,2 15

1 8 4 16 22 0,24 50

2 18 19 31 32 0,206275 100

3 8 3 39 51 0,056025 101

4 4 1 53 42 0,025321 100

5 3 0 44 53 0,015114 100

6 0 0 60 44 0 104

7 0 0 55 43 0 98

73

EP 2 934 093 B1

Powtórzenie C

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

Powtórzenie D

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0 0 8 0 8 0,5 16

1 6 10 17 12 0,355556 45

2 30 33 18 19 0,391724 100

3 20 18 26 36 0,212599 100

4 19 15 29 37 0,187596 100

5 1 4 48 50 0,024574 103

6 1 0 49 48 0,005115 98

7 0 0 47 55 0 102

Powtórzenie E

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba zdobytych punktów

0 0 12 0 3 0,8 15

1 6 11 2 0 0,894737 19

2 47 49 2 2 0,8 100

3 48 49 1 2 0,826795 100

4 48 52 0 0 1 100

5 45 44 0 0 1 89

6

7

Powtórzenie F

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0 0 3 0 12 0,2 15

1 6 3 14 16 0,230769 39

2 14 12 42 33 0,138273 101

3 3 1 46 50 0,020204 100

4 0 0 42 58 0 100

5 0 0 48 52 0 100

74

EP 2 934 093 B1

Powtórzenie E

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba zdobytych punktów

6

7

Powtórzenie G.

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0

1

2 44 29 18 5 0,510527 96

3 32 44 9 10 0,552786 95

4 38 34 16 16 0,4453 104

5 43 36 16 9 0,50971 104

6 17 50 4 29 0,425544 100

7 16 17 32 33 0,185589 98

Powtórzenie H

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0

1

2 41 45 9 5 0,625834 100

3 39 59 2 0 0,858579 100

4 50 53 0 0 1 103

5 58 40 0 0 1 98

6

7

Powtórzenie I

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0

1

2 18 19 31 32 0,206275 100

3 4 4 57 35 0,040834 100

75

EP 2 934 093 B1

Powtórzenie I

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

4 2 0 41 60 0,009756 103

5 3 0 44 54 0,014963 101

6 0 0 45 52 0 97

7 0 0 48 53 0 101

Powtórzenie J

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0

1

2 30 33 18 19 0,391724 100

3 14 30 27 30 0,248763 101

4 14 24 26 36 0,212599 100

5 15 13 40 35 0,14668 103

6 13 7 46 36 0,103383 102

7 4 5 49 50 0,042573 108

Powtórzenie K

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0

1

2 47 49 2 2 0,8 100

3 37 61 1 0 0,899496 99

4 48 58 1 0 0,903326 107

5 38 62 0 0 1 100

6 50 50 0 0 1 100

7

Powtórzenie L

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

0

76

EP 2 934 093 B1

Powtórzenie K

Pokolenie RFP+ m RFP+ f RFP- m RFP- f Częstość {Ud86} liczba punktów

1

2 14 12 42 33 0,138273 101

3 10 0 54 36 0,051317 100

4 0 1 46 53 0,005013 100

5 0 0 38 62 0 100

6 0 0 44 56 0 100

7

[0236] Ramy maksymalnego prawdopodobieństwa (minimalizacja statystyki G; patrz Clark i in., 1981, Heredity 46: 321-46) wykorzystano do analizy liczby samców i samic z RFP oraz bez RFP między pokoleniami w oparciu o siatkę wartości dostosowania transgenicznych homozygotycznych i 5 heterozygotycznych. Zmiany częstości między pokoleniami i między powtórzeniami uznano za niezależne, umożliwiające pomnożenie względnych prawdopodobieństw w celu wygenerowania złożonej powierzchni prawdopodobieństwa. Przedziały ufności obliczono przy użyciu standardowej aproksymacji χ2 dla powierzchni prawdopodobieństwa (wykreślonych na fig. 8B), tj. przy założeniu, że błędy mają rozkład normalny.

10 Potwierdzenie homozygotyczności rodów

[0237] Homozygotyczność replikacji, która miała utrwalony lub utracony konstrukt {Ud}86 w doświadczeniu populacyjnym, została potwierdzona przez skrzyżowanie dużej liczby (n = >30) samców testerowych z dziewiczymi samicami (z rodu dziewiczego w[1118] I, Dp(2;Y)G., P{w[+mC]=hs-hid}Y) i ustalenie, czy całe potomstwo wykazywało fluorescencję RFP, czy całe nie wykazywało fluorescencji. Zastosowano również 15 następujące startery dla ekstrakcji DNA pojedynczej muchy 5’-gggccaaagtgtaaataactgg-3’ (SEQ ID NO: 9) i 5’-aaaatgtccattactttggtgct-3’ (SEQ ID NO: 10), w wyniku czego otrzymano produkt PCR o długości 136 pz (3R: 7634237.. 7634372) identyfikujący obecność trzeciego chromosomu typu dzikiego (+) i teoretyczny produkt o wielkości >10 kb dla {Ud}86. Obecność {Ud}86 można potwierdzić, stosując 5’- actttccttccgatggacct-3’ (SEQ ID NO: 11) i 5’-aatgaccaccgtctttcagc-3’ (SEQ ID NO: 12), co daje produkt PCR 20 o wielkości 135 pz z genu RFP. Genotypowanie PCR przez multipleksowanie obu zestawów starterów nie zostało wykonane, ponieważ okazało się to niewiarygodne. [0238] Podsumowując, na figurze 8A pokazano stały i szybki wzrost częstości {Ud}86, gdy jest powyżej częstości progowej (szacowanej na 0,61) i odpowiedni spadek, gdy jest poniżej niej. Eliminacja albo + albo {Ud}86 w oparciu w dużej mierze o jego początkową częstość pokazuje nieodłączną odwracalność 25 transformacji populacji poddominacyjnych, a także leży u podstaw samoograniczającej przestrzennie natury transformacji populacji poddominacyjnych. Stosując metodę największego prawdopodobieństwa, względne dostosowanie trzech genotypów oszacowano na +/+ = 1, +/{Ud}86 = 0,22, {Ud}86/{Ud}86 = 0,71 (fig. 8B i 8C). Zmniejszone dostosowanie wśród genotypów jest zgodne ze zmianami całkowitej liczebności 77

EP 2 934 093 B1

mRNA na poziomie RpL14 (fig. 9). Te wartości dostosowania reprezentują system silnie poddominacyjny, w którym jeśli allel {Ud}86 ma powyżej 61% w populacji, przewiduje się, że deterministycznie (przy braku stochastyczności) przejdzie do utrwalenia. Biorąc pod uwagę 3x-P3-RFP jako gen efektorowy, wykazaliśmy, że konstrukt {Ud}86 jest zdolny do stabilnej transformacji populacji, aby niosła marker do 5 produkcji białka czerwonej fluorescencyji. [0239] Z powodu ponad 3-krotnego zmniejszenia w dostosowaniu heterozygot +/{Ud}86 w porównaniu z homozygotami {Ud}86/{Ud}86 (patrz fig. 8C), oczekuje się, że {Ud} będzie dobrze przystosowany do utrwalenia nawet silnie szkodliwych połączonych genów efektorowych i pozostając poddominacyjnym (patrz Scott i in., 2002, Science 298: 117-9).

10 Przykład 5

Stabilność geograficzna i dynamika transformacji populacji charakteryzującej się poddominacją

[0240] Oceniono optymalne strategie wprowadzania w Altrock i in., 2011 PLoS Computational Biology, 7: e1002260 i Altrock i in., 2010 Journal of Theoretical Biology, 267: 62-75 pod względem prostego, ale znaczącego wzorca geograficznego. Poniżej, przedstawiono analizę ilościową właściwości stabilności 15 geograficznej transformacji populacji charakteryzującej się poddominacją, za pomocą konstruktów {Ud}. Wskazane metody matematyczne służą jako ilościowe uzasadnienie omawianych w niniejszym dokumencie właściwości stabilności geograficznej. [0241] Zakłada się, że transformacja populacji docelowej została już osiągnięta i interesujący jest potencjał systemów dalszego rozprzestrzeniania się {Ud} w porównaniu z możliwością całkowitej utraty {Ud}. 20 Matematyczny model ewolucyjny opiera się na genotypowych parametrach dostosowania, wskaźnikach migracji między sąsiednimi populacjami i wielkości populacji, które określają wewnętrzną skalę czasową procesu wyginięcia. [0242] W jednym locus, dwa allele modelują genotypowe wartości dostosowania, które determinują dynamikę populacji opisanego układu i 25

[0243] Do wyników analizy i symulacji wykorzystano oszacowania dostosowania MLE genotypów transgenicznych (patrz fig. 8 (C)):

i

[0244] Przy losowym kojarzeniu (losowe połączenie gamet) zakłada się, że osobniki diploidalne 30 przechodzą przez oczekiwania Hardy'ego-Weinberga przed selekcją, a zatem opisują system populacji w kategoriach pojedynczych alleli (patrz Altrock i in., 2010 Journal of Theoretical Biology, 267: 62-75; Hartl i Clark, Principles of Population Genetics A. D. Sinauer, wyd. (Sinauer Associates, 1997), str. 1. 542). Próg częstości transformacji populacji docelowej, pomijając migrację, wynosi

(równ. 1)

35 który determinuje niestabilną równowagę dynamiki ewolucyjnej.

78

EP 2 934 093 B1

[0245] Biorąc pod uwagę, że populacja docelowa została stransformowana, można oszacować dwie dalsze progowe częstości alleli, uwzględniając migrację gamet przed kojarzeniem. Po pierwsze, można obliczyć aproksymację dla progu do transformacji populacji sąsiedniej, przy założeniu, że nie ma to wpływu na populację docelową. Po drugie, można aproksymować próg transformacji populacji docelowej z powrotem 5 do dzikiego typu, ze względu na migrantów z sąsiednich dzikich populacji,. [0246] W przypadku dynamiki migracja selekcja, oczekiwane alleliczne wartości dostosowania są dotknięte przez szybkość migracji na pokolenie (lub dowolną inną jednostkę czasu), ale genotypowe wartości dostosowania pozostają stałe. Odsetek imigrantów w danej populacji przed kojarzeniem jest podany jako m. Oczekiwane alleliczne wartości dostosowania zależą od częstości alleli, a tym samym od szybkości 10 migracji. Przy założeniu Hardy-Weinberga wszystkie wartości dostosowania można wyrazić jako częstość

{Ud}: pT. w populacji docelowej, oraz pN. w populacji sąsiedniej. Dla allelu typu dzikiego + (równ. 2)

Podobnie, w przypadku allelu konstrutu poddominacyjnego {Ud}

(równ. 3)

15 [0247] W drugiej kolejności równań (2) i (3) zauważalna jest istotna asymetria wpływu migracji na średnie wartości dostosowania dwóch alleli, co ostatecznie prowadzi do asymetrii opisanej na fig. 10. Średnie dostosowanie populacji w populacji docelowej wynosi

(równ. 4)

[0248] Dzięki funkcjom dostosowania (2), (3) i (4) można opisać czasową zmianę częstości allelu {Ud} w

20 populacji docelowej, ΔpT. i w populacji sąsiedniej, ΔpN., na etap czasowy Δt (zazwyczaj jedno pokolenie) (patrz Altrock i in., 2011 PLoS Computational Biology, 7: e1002260; Altrock i in., 2010, Journal of Theoretical Biology, 267: 62-75; Hartl i Clark, Principles of Population Genetics A. D. Sinauer, wyd. (Sinauer Associates, 1997), str. 1. 542),

(równ. 5)

25 Następnie równanie dla ΔpN. przez wymianę pN. i pT.,

(równ. 6)

[0249] Stosuje się dwa równania dla ewolucyjnej dynamiki częstości {Ud} w populacjach docelowych i sąsiednich (równania 5 i 6) uzyskując ilościowe oszacowania właściwości bistabilnych oraz stabilności geograficznej w nieskończenie dużych populacjach, fig. 8 i 10. Obliczenie progów stosowanych na fig. 10 30 wynika następnie ze znalezienia pierwiastków

i

[0250] Do wstecznej transformacji populacja docelowa z powodu imigracji z sąsiednich populacji, pT. musi

być poniżej pN., tj., zwiększa częstość typu dzikiego od 0 do 1-ρT.. W dzikich populacjach, ρN. jest progiem do transformowania pojedynczej sąsiedniej populacji z powodu emigracji z transformowanego celu. 35 Poniżej, ustawiono stałe dostosowanie homozygot typu dzikiego na jeden, wszystkie pozostałe wartości

dostosowania podano w pojęciach względnych, W+/+ = 1. 79

EP 2 934 093 B1

[0251] Dzięki temu, progi mogą mieć następującą postać:

(równ. 7)

(równ. 8)

z

(równ. 9) 5

(równ. 10)

i

(równ. 11)

10

(równ. 12)

[0252] Mogą być tylko sensowne wyniki, jak długo bT., i bN. są nieujemne, co dotyczy migracji poniżej progów krytycznych. Gdy migracja zbliża się do zera, oba progi zbliżają się do dobrze znanego progu w

populacjach izolowanych, równanie (1). Staje się to również oczywiste, że ρN. ≤ ρT. dla migracji poniżej 15 krytycznych granic. Ta asymetria jest odpowiedzialna za samoograniczającą się właściwość: utrata jest bardziej prawdopodobna niż rozprzestrzenianie (patrz Altrock i in., 2011, PLoS Computational Biology, 7: e1002260). [0253] Równań (2), (3) i (4) można również użyć do matematycznego modelowania dynamiki stochastycznej w populacjach skończonych, stosując podejście Morana lub Wrighta-Fishera (patrz Altrock 20 i in., 2011, PLoS Computational Biology, 7: e1002260i Altrock i in., 2010, Journal of Theoretical Biology, 267: 62-75). Takie symulacje ujawniają również, że tylko wielkości populacji orozmiarze poniżej 102 mają realną szansę, że może wystąpić niepożądane rozprzestrzenienie się na sąsiednie populacje.

Przykład 6

[0254] Obecnie istnieją tylko dwa systemy transformacji populacji, które zadziałały w doświadczeniach 25 laboratoryjnych: matczyny system ratowania przed trucizną zwany Medea i system endonukleazy samonaprowadzającej zwany HEG. Jako pojedyncze locus, ani Medea, ani HEG nie osiągnęły całkowitego utrwalenia w populacjach doświadczalnych, przy częstości równowagi alleli typu dzikiego pozostających na poziomie około 0,1 dla Medea (patrz fig. 1F w Chen i in., 2007, Science, 316: 597-600) i >0,1 dla HEG (uzupełniająca fig. 5 w Windbichler i in., 2011, Nature, 473, 212-215), podczas gdy osiągnięto całkowite 30 utrwalenie dla {Ud}86 (fig. 8A). Potencjalnym problemem jest to, że utrzymujące się allele typu dzikiego mogłyby ułatwić selekcję pod kątem odporności przez owada na właściwości ‘drive’ HEG lub Medea lub przez patogen na połączony gen oporności na chorobę (patrz Scott i in., 2002, Science 298: 117-9).

80

EP 2 934 093 B1

Przedstawione w niniejszym dokumencie podejście poddominacji pozwala uniknąć tego powikłania poprzez szybkie wyeliminowanie wszystkich alleli typu dzikiego w populacji (patrz na przykład fig. 8A). [0255] Inicjacja transformacji populacji charakteryzujących się poddominacją jest bardziej zasobochłonnym podejściem niż w przypadku HEG lub Medea, gdzie można wprowadzić bardzo małą liczbę osobników, a 5 modyfikacja genetyczna atakuje od niskich częstości; dla {Ud}86 wymagałoby to znacznie większej liczby, aby przekroczyć częstość alleli 0,61 w dzikiej populacji (patrz fig. 8A). Jednak przewidywane rozmiary wprowadzania są znacznie mniejsze niż te z powodzeniem stosowane w technikach ze sterylnymi owadami (które mogą być >10 razy większe niż liczebność populacji dzikiej). Ponadto w sytuacjach, w których cenna jest kontrola przestrzenna lub możliwość odwołania (ang. recallability), fig. 10 ilustruje zakres stabilności 10 geograficznej {Ud}86, którą może wykazywać nawet przy znacznych poziomach migracji. Oczywistymi kandydatami do transformacji {Ud} są komary Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti i Anopheles stephensi, gdzie opracowano geny oporności na gorączkę denga, malarię ludzką i malarię ptasią (patrz Isaacs i in., 2011., PLoS Pathogens 7: e1002017; Jasinskiene i in., 2007, The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 76: 1072-8; i Franz i in., 2006, PNAS, 103: 4198-203).

15 Przykład 7

{Ud} w roślinach

[0256] Oprócz transformacji populacji owadów konstrukty {Ud} mają również inne zastosowania o wysokiej wartości, na przykład w ograniczaniu niepożądanego krzyżowania się genetycznie zmodyfikowanych odmian roślin przy jednoczesnym zachowaniu plonów i możliwości dla rolników oszczędzania nasion z roku 20 na rok (patrz Hills i in., 2007, Trends in Plant Science, 12: 177-83). [0257] Fakt, że sucha masa i morfologia much {Ud}86/{Ud}86 były nieodróżnialne od typu dzikiego, sugeruje, że możliwe byłoby opracowanie plazmidów transformacyjnych linii zarodkowej dla roślin, które nie wpływałyby negatywnie na plony. Jeśli transformacja linii zarodkowej rutynowo wykorzystywała plazmidy charakteryzujące się poddominacją, krzyżowanie niekrewniacze może spowodować, że rośliny 25 hybrydowe będą w bardzo złej kondycji lub będą martwe. W terenie ograniczyłoby to hybrydyzację różnych genetycznie zmodyfikowanych odmian roślin uprawianych obok siebie i kontrolowałoby hybrydyzację z dzikimi krewnymi lub uprawami niemodyfikowanymi genetycznie, w tym odmianami tradycyjnymi. Może to również pozwolić na bardziej efektywne utrzymywanie czystych rodów hodowlanych, ponieważ niechciane krzyżówki zostałyby stłumione. Ponadto użytecznym opracowaniem u roślin jest ograniczenie ekspresji 30 {Ud} do korzeni, tak aby była zahamowana konkurencja komórkowa w linii zarodkowej, która może sprzyjać mutacjom, które zakłócają system {Ud}.

Przykład 8

{Ud} i nukleazy zmodyfikowane

[0258] Fakt, że RpL14 był pierwszym genem wybranym do opracowania tej techniki sugeruje, że takie 35 podejście można łatwo zastosować w innych nie modelowych organizmach. Haploinsuficjencja i szkodliwy charakter mutacji CRP jest dobrze zachowany w szerokim zakresie ewolucyjnym dzięki licznym przykładom u grzybów, Arabidopsis, Drosophila, danio pręgowanego, ludzi i myszy (patrz tabela 1). W konsekwencji, CRP powinny reprezentować bogate źródło genów, które potencjalnie mogą być celem konstruktów {Ud} w każdym organizmie eukariotycznym rozmnażającym się płciowo. 81

EP 2 934 093 B1

[0259] Alternatywnie do celowania w mRNA genów wykazujących haploinsuficjencję przez RNAi, możliwe jest również celowanie w ich chromosomalny DNA przy użyciu nukleaz palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowej podobnej do aktywatora transkrypcji (TALEN), CRISPR lub meganukleaz. Są to syntetyczne endonukleazy restrykcyjne, w których można skonstruować rozpoznawaną sekwencję. Te syntetyczne 5 nukleazy mogą być użyte do zmian ekspresji typu knock-down, poprzez indukcję zerowych mutacji w genach wykazujących haploinsuficjencję, poprzez niehomologiczne łączenie końców naprawy pęknięć podwójnych nici chromosomalnych indukowanych przez ZFN, TALEN, CRISPR lub meganukleazy (np. ukierunkowane na miejsca inicjacji transkrypcji). Kopia ratunkowa znów byłaby niewrażliwa na celowanie ze względu na wprowadzenie łagodnych mutacji, tym razem w miejscu rozpoznawania przez nukleazę. 10 Oprócz zwiększenia przewidywalności i skuteczności celowania, zastosowanie ZFN, TALEN, CRISPR lub meganukleaz może mieć potencjał do dalszego zmniejszenia utraty dostosowania u homozygot {Ud}/{Ud}. Wreszcie, zastosowanie ZFN, TALEN, CRISPR lub meganukleaz rozszerza podejście {Ud} na organizmy płciowe, u których ukierunkowanie do RNAi jest nieskuteczne.

Przykład 9

15 {Ud} i przeciwdziałanie efektowi kolonii

[0260] Konstrukty {Ud} mają również potencjał przezwyciężenia problemu wspólnego dla wielu programów obejmujących długookresowe masowe wprowadzanie owadów, szczególnie genetycznie zmodyfikowanych. Jest to wyraźne zmniejszenie dostosowania wprowadzonych osobników z powodu selekcji pod względem fenotypów, które są korzystne dla utrzymania kolonii, ale które są szkodliwe po 20 wprowadzeniu do środowiska. Gromadzenie się szkodliwych alleli w małych populacjach w niewoli może się również przyczyniać, a chów wsobny związany z długotrwałym utrzymaniem kolonii zaostrzać te efekty. Ciągłe krzyżowanie niekrewniacze kolonii ze złapanymi dzikimi osobnikami przy jednoczesnym zachowaniu homozygotyczności w transgenicznym locus u wprowadzanych osobników jest zasadniczo niepraktyczne. Jednak kolonie charakteryzujące się poddominacją można łatwo utrzymać jako w pełni 25 krzyżowane niekrewniaczo, dodając procent dziko złapanych osobników co pokolenie znacznie poniżej progowej częstości wymaganej do transformacji. Homozygotyczne osobniki przeznaczone do wprowadzenia mogą pochodzić z podkolonii utrzymywanych przez niewielką liczbę pokoleń, bez dodatku złapanych osobników dzikich, które stałyby się zasadniczo homozygotyczne w locus {Ud}. To zmniejszenie dostosowania kolonii prawdopodobnie nie zagroziłoby krótkookresowym wprowadzeniom koniecznym dla 30 podejść transformacji populacji, ale prawdopodobnie wpłynie to na długookresowe tłumienie wielkości populacji owadów przy użyciu transgenicznej techniki sterylnych owadów (SIT). Zastosowanie konstruktów transformacji linii zarodkowej {Ud} byłoby niezwykle cenne w utrzymywaniu długookresowego dostosowania tego rodzaju kolonii.

Przykład 10

35 Funkcjonalne sieciowanie loci charakteryzujących się poddominacją

[0261] Podejście poddominacyjne funkcjonalnego sieciowania opiera się na obecności następujących elementów: P1 = gen 1 wykazujący haploinsuficjencję zmniejszający truciznę P2 = gen 2 wykazujący haploinsuficjencję zmniejszający truciznę (inny niż gen 1) 82

EP 2 934 093 B1

R1 = gen ratunkowy 1 R2 = gen ratunkowy 2 [0262] W jednej konfiguracji, dwa funkcjonalnie niezależne loci charakteryzujące się poddominacją na różnych chromosomach w tym samym genomie są przedstawione wzorem: 5 {P1, R1}; {P2, R2} [0263] W tej konfiguracji, gen ratunkowy i trucizna są fizycznie połączone w każdym locus, podczas gdy loci nie są funkcjonalnie usieciowane. [0264] Osobniki homozygotyczne dla obu loci są kojarzone z typem dzikim, jak przedstawiono poniżej:

ród osobniki dzikie

fenotyp wykazujący haploinsuficjencję (1 i 2)

10 [0265] Potomstwo jest kojarzone, chociaż fenotyp nie jest w 100% letalny ani niepłodny, z żadnym genotypem. Wynik tego kojarzenia pokazano poniżej: {P1, R1}/{P1, R1}; {P2, R2}/+ fenotyp wykazujący haploinsuficjencję (2)

{P1, R1}/{P1, R1}; +/+ fenotyp ratunkowy typu dzikiego

{P1, R1}/{P1, R1}; {P2, R2}/{P2, R2} fenotyp ratunkowy typu dzikiego

{P1, R1}/+; {P2, R2}/+ fenotyp wykazujący haploinsuficjencję (1 i 2)

{P1, R1}/+; +/+ fenotyp wykazujący haploinsuficjencję (1)

{P1, R1}/+; {P2, R2}/{P2, R2} fenotyp wykazujący haploinsuficjencję (1)

+/+; {P2, R2}/+ fenotyp wykazujący haploinsuficjencję (2)

+/+; +/+ typ dziki

+/+; {P2, R2}/{P2, R2} fenotyp ratunkowy typu dzikiego

[0266] W alternatywnym podejściu, dwa loci są funkcjonalnie usieciowane:

{P1, R2}/{P1, R2}; {P2, R1}/{P2, R1}

15 [0267] Osobniki homozygotyczne pod względem obu loci są kojarzone z typem dzikim zgodnie z następującym schematem: ród osobniki dzikie

{P1, R2}/{P1, R2}; {P2, R1}/{P2, R1} X +/+; +/+

↓

{P1, R2}/+; {P2, R1}/+ fenotyp wykazujący haploinsuficjencję (1 i 2)

83

EP 2 934 093 B1

[0268] Potomstwo jest kojarzone, chociaż fenotyp nie jest w 100% letalny ani niepłodny, z dowolnym genotypem. Wynik tego kojarzenia w kolejnych pokoleniach pokazano poniżej: {P1, R2}/{P1, R2}; {P2, R1}/+ fenotyp w wykazujący haploinsuficjencję (1)

{P1, R2}/{P1, R2}; +/+ LETALNY (bez R1)

{P1, R2}/{P1, R2}; {P2, R1}/{P2, R1} fenotyp ratunkowy typu dzikiego

{P1, R2}/+; {P2, R1}/+ fenotyp wykazujący haploinsuficjencję (1 + 2)

{P1, R2}/+; +/+ LETALNY (noR1)

{P1, R2}/+; {P2, R1}/{P2, R1} fenotyp z haploinsuficjencją (2)

+/+; {P2, R1}/+ LETALNY (noR2)

+/+; +/+ typ dziki

+/+; {P2, R1}/{P2, R1} LETALNY (noR2)

Ponieważ w konfiguracji funkcjonalnie usieciowanej introgresja lub transformacja populacji zależą zarówno od haploinsuficjencji, jak i letalności, drugie podejście z usieciowanymi P1, R2 i P2, R1 jest bardzo wydajne, w szczególności w przypadku: (1) OCHRONY BIOLOGICZNEJ, ponieważ każdy uciekinier F1 ma tylko 1 genotyp z 9, gdzie mają one dostosowanie dzikiego typu. W podejściu nieusieciowanym 4 na 9 genotypów ma dostosowanie typu dzikiego (w oparciu wyłącznie na haploinsuficjencji). (2) TŁUMIENIA WIELKOŚCI POPULACJI DZIKIEJ, ponieważ każdy uciekinier F1 ma zmniejszoną żywotność. (3) TRANSFORMACJI POPULACJI, ponieważ opiera się ona na dwóch różnych mechanizmach, mianowicie na haploinsuficjencji i nie ratowanym zatruciu.

Przykład 11

Poddominacja u roślin wykorzystujących TALEN i miRNA lub inne mechanizmy celujące

5 [0269] Powodzenie doświadczalnego podejścia do wykazania poddominacji polega na znalezieniu insercji {Ud}, które powodują fenotyp z silną haploinsuficjencją jako heterozygoty, ale nie są one tak ciężkie, że wszystkie rośliny są nie żywotne lub niepłodne. Ten fenotyp należy następnie zasadniczo uratować, w niektórych lub wszystkich roślinach homozygotycznych, pod względem insercji. Właściwy moment powodzenia zależeć będzie od zbadania wystarczającej liczby miejsc do insercji, aby znaleźć te, które 10 wykazują poddominację. Nie oczekuje się, że insercje tandemowe >3 będą wykazywać poddominację ze względu na nadmierną liczbę kopii ratunkowych dla haploinsuficjencji. Wiadomo, że transformacja plazmidem T zapewnia dużą liczbę kopii tandemowych. W niektórych okolicznościach, również wielokrotne insercje mogą okazać się poddominacyjne.

84

EP 2 934 093 B1

[0270] Doświadczenie mające na celu identyfikację insercji poddominacyjnych w roślinach przeprowadzany jest przy użyciu odmian zgodnie z następującym schematem:

Kąpiel roślin w {Ud}plazmid Ti z markerem selekcji antybiotyku A 3-4 tygodnie

Selekcja antybiotykiem A

Wybór roślin ze szkodliwym fenotypem 6-8 tygodni

Pozostawienie połowy sztuk Krzyżówka połowy sztuk roślin z rodem dzikiego roślin do samozapylenia typu z antybiotykiem B

Selekcja antybiotykiem A Stosowanie selekcji antybiotykiem A i B

6-8 tygodni Jeśli współczynnik kiełkowania samozapylonych roślin jest zgodny z homozygotycz- (T2 skrzyżowane nością, wtedy ocena fenotypu krzyżówek T2 i ocena fenotypu T3 samozapylone)

Tablica oczekiwań odnośnie insercji poddominacyjnych zakładając pełną żywotność wszystkich genotypów i pełną penetrację fenotypu szkodliwego

T2 (samozapylone sztuki T1) T2 (skrzyżowane T1) T3+ (skrzyżowane T2→samozapylone) Brak selekcji antybiotykowej

FenotypFenotyp 10 100%0% dostosow. fitness Fenotypy 100% Fenotyp 50% dostosw. +/+ i {Ud}/{Ud} {Ud}/{Ud} – trzymać jako ród szkodliwe {Ud}/+ Fenotyp 50% szkodliwy {Ud}/+

Wcześnie w pokoleniu T2 (13-16 tygodni) możemy mieć mocne wskazanie, czy insercje poddominacyjne {Ud} zostały odzyskane (potwierdzone przez T+) Wykorzystać liście pokolenia T2 do analizy insercji liczby kopii i analizy jakiejkolwiek ekspresji genu Będą potrzebne kontrole fenotypu +/+ w T2 i T3

[0271] Nieprawidłowy fenotyp opisano w odniesieniu do roślin dzikiego typu lub roślin kontrolnych w 5 kategoriach właściwości, które mogą wpływać na konkurencyjne dostosowanie roślin (na przykład płodność, tempo wzrostu, tolerancja na stres). Stopień ratowania fenotypowego jest opisany w kategoriach względnego zredukowania nasilenia nieprawidłowego fenotypu i/lub dostosowania konkurencyjnego heterozygot w stosunku do homozygot. [0272] Szczególnie cenne będą inserty, w których cechy agronomiczne, takie jak tolerancja na stres oraz 10 plonowanie, nie ulegają negatywnemu wpływowi u homozygot, podczas gdy heterozygoty doświadczają znacznej utraty dostosowania konkurencyjnego. Jeśli częstość nieprawidłowego fenotypu jest znacznie zmniejszona w pokoleniu T2 w porównaniu do pokolenia T1, wskazuje to na insert charakteryzujący się poddominacją.

Przykład 12

15 Generowanie plazmidów Entry do doświadczenia TALEN

[0273] W celu implementacji podejścia poddominacji opartego na TALEN, konstrukt TALEN jest bezpośrednio klonowany do wektorów Entry, ponieważ TALEN nie mogą być amplifikowane poprzez PCR i nie mogą być dostarczane w wektorze Gateway (plazmid 1 i 3). [0274] Plazmid 2 jest również montowany bezpośrednio w wektorze Entry, ponieważ trzeba wprowadzić 3 20 fragmenty. TALEN1 i TALEN2 są połówkami tego samego białka. Klonowanie odbywa się w normalnych komórkach. 85

EP 2 934 093 B1

[0275] Konstrukcję plazmidu przeprowadza się zgodnie z następującą tablicą:

Nazwa 1 2(jai) 3 plazmidu

Plazmidy TALEN 1 Terminator PCR z MIGS3.1 (Kan), 731 pz TALEN 2 produkt źródłowe produkt trawienia (Amp) - trawienia (Amp) - RE 5500 pz RE 5500 pz

Źródło Ratunkowy (RpL23aA, w tym wszystkie sekwencje regulacyjne, ale z dokonanymi około 15 zmianami synonimicznymi, będzie flankować z miejscami Cre/lox w celu wyrzucenia ratunku w plazmidzie i PCR in vivo (Amp) 2500 pz

Plazmidy R35S → PCR z MIGS3.1 (Kan!), 841 pz źródłowe

Plazmidy pENTR L1-L4 pENTR R4R3 pENTR L3-L2 źródłowe

produkt PCR (Kan), 2570 PCR (Kan) 2535 pz PCR (Kan!), 2551 trawienia pz pz DPI

metoda Fragmenty PCR Geneart 4 fragmenty lub (7, jeśli jednocześnie Fragmenty klonowania Genart 2 składany jest ratunkowy) Genart 2

Selekcja Niebiesko biały Kan Kan

Kan Wrażliwość na spektynomycynę Wrażliwość na tetracyklinę

Prowadzi do L1-TALEN1-L4 R4-Terminator-Rescue-Pro → -R3 L3-TALEN2-L2

Generowanie plazmidów Entry do doświadczenia miRNA i markerów fluorescencyjnych [0276] Do doświadczeń miRNA dostarczane są plazmidy dla dwóch różnych miRNA 5 (TTACTTACCAGTTATAGGCAT (SEQ ID NO: 13) i TGTAAGCCTCACGTAAGGCTA (SEQ ID NO: 14)). Konstrukcję plazmidu dla doświadczeń miRNA i markerów fluorescencyjnych przeprowadza się zgodnie z następującą tabelą:

Nazwa plazmidu 4 5 6

Źródło Fragment syntezowany przez B3-mCitrine-B2 PCRattb B1-mCherry-B4 B1 miRNA-B4 pMD146 # PCRattb MD143

86

EP 2 934 093 B1

Nazwa plazmidu 4 5 6

identyfikatory pDONR 221 P1-P4 x pDONR 221 P1-P4 plazmidowe

Pełna nazwa wektora pENTR L1-miRNA-L4 pENTR L3-L2 pENTR L1-L4 Entry

metoda klonowania Gateway BP clonasell Gateway BP clonasell Gateway BP clonasell

Wybór ccdB ccdB ccdB

Kan Kan Kan

Prowadzi do L1-miRNA-L4 pENTR L3 mCitrine NLS pENTR L1 mCitrine L2 NLS L4

Reakcja LR Gateway (3 fragmenty)

[0277] Wektor docelowy MIGS3.1 (gdzie gen miR173 został usunięty przez trawienie BamHI i ponowne ligowanie) konstruuje się zgodnie z następującym schematem: promotor) 35s → -attR1 - attR2 rbcs

Selekcja ccdB, selekcja Bar u roślin

doświadczenie ostatecznie Plazmidy stosowane w LR TALEN

miRNA

Kontrola trucizny dla Każdy z powyższych plazmidów wystawiany na każdego konstruktu (czy działanie rekombinazy Cre. Czy można również wykonać in vivo korzystając z TALEN i miRNA powodują fenotyp dominujący)

Kontrola ratunku dla wszystkich doświadczeń (czy sam ratunkowy powoduje fenotyp dominujący) 5

Przykład 13

Generowanie plazmidów do eksperymentu ukierunkowanego na miRNA

[0278] W celu wdrożenia podejścia poddominancji miRNA, wygenerowano plazmid przy użyciu standardowych laboratoryjnych procedur klonowania. 10 Konstrukcję plazmidu przeprowadza się stosując standardowe techniki klonowania. Jak pokazano na figurze 11, dwa geny miRNA nadmiarowo celują w części mRNA RpL23aA Aradabopsis thaliana. Zostaje on uratowany przez jedną kompletną kopię genu RpL23aA, do której wprowadzono mutacje synonimiczne, 87

EP 2 934 093 B1

aby uczynić go zasadniczo niewrażliwym na zmianę typu knock-down przez ekspresję miRNA (fig. 12). Sekwencje docelowe i celujące można wybrać przy użyciu różnych procedur selekcji. Zastosowane w niniejszym dokumencie podejście miRNA jest zgodne z podejściem Schwab i in. The Plant Cell, tom. 18, 1121–1133.

5 WYKAZ SEKWENCJI

[0279]

<110 >Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.

<120>TRWAŁA TRANSFORMACJA POPULACJI I SPOSÓB OCHRONY BIOLOGICZNEJ Z WYKORZYSTANIEM ZASAD HAPLOINSUFICJENCJI I PODDOMINACJI

10 <130 >M 10746/OL

<150 >GB 1223097.5 <151 >2012-12-20

<150 >US 61/740359 <151 >2012-12-20

15 <160 >25

<170 >PatentIn, wersja 3.5

<210 >1 <211 >21 <212 >PRT 20 <213 >Sekwencja sztuczna

<220> <223 >Chimeryczny peptyd pochodzący z sekwencji Vespula lewisii i Homo sapiens

<400 >1

25 <210 >2 <211 >8 <212 >PRT <213 >Homo sapiens

<400 >2

30

<210 >3 <211 >33 88

EP 2 934 093 B1

<212 >DNA <213 >Sekwencja sztuczna

<220> <223 >Starter

5 <400 >3 tatgcggccg cttgattagt ttcctggcca ctt 33

<210 >4 <211 >31 <212 >DNA 10 <213 >Sekwencja sztuczna

<220> <223 >Starter

<400 >4 tatgaattca aggcataaga gctttgaatc g 31

15 <210 >5 <211 >19 <212 >DNA <213 >Sekwencja sztuczna

<220> 20 <223 >Starter

<400 >5 tctttccggt tagcgtcat 19

<210 >6 <211 >18 25 <212 >DNA <213 >Sekwencja sztuczna

<220> <223 >Starter

<400 >6 30 cgccagtcag aggaccat 18

<210 >7 <211 >16 <212 >DNA <213 >Sekwencja sztuczna

35 <220> <223 >Sonda

89

EP 2 934 093 B1

<220> <221 >Inna struktura <222 >(1)..(1) <223 >Obejmuje wydłużenie FAM na końcu 5’

5 <400 >7 ttgccaaggc ctccgc 16

<210 >8 <211 >16 <212 >DNA 10 <213 >Sekwencja sztuczna

<220> <223 >Sonda

<220> <221 >Inna struktura 15 <222 >(1)..(1) <223 >Obejmuje wydłużenie VIC na końcu 5’

<400 >8 tcgccaaagc ctccgc 16

<210 >9 20 <211 >22 <212 >DNA <213 >Sekwencja sztuczna

<220> <223 >Starter

25 <400 >9 gggccaaagt gtaaataact gg 22

<210 >10 <211 >23 <212 >DNA 30 <213 >Sekwencja sztuczna

<220> <223 >Starter

<400 >10 aaaatgtcca ttactttggt gct 23

35 <210 >11 <211 >20

90

EP 2 934 093 B1

<212 >DNA <213 >Sekwencja sztuczna

<220> <223 >Starter

5 <400 >11 actttccttc cgatggacct 20

<210 >12 <211 >20 <212 >DNA 10 <213 >Sekwencja sztuczna

<220> <223 >Starter

<400 >12 aatgaccacc gtctttcagc 20

15 <210 >13 <211 >21 <212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster

<400 >13 20 ttacttacca gttataggca t 21

<210 >14 <211 >21 <212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster

25 <400 >14 tgtaagcctc acgtaaggct a 21

<210 >15 <211 >80 <212 >DNA 30 <213 >Drosophila melanogaster

<400 >15

<210 >16 <211 >102 35 <212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster 91

EP 2 934 093 B1

<400 >16

<210 >17 <211 >102 5 <212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster

<400 >17

<210 >18 10 <211 >21 <212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster

<400 >18 atgcctataa ctggtaagta a 21

15 <210 >19 <211 >21 <212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster

<400 >19 20 aagcctagaa ctggtaagta c 21

<210 >20 <211 >21 <212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster

25 <400 >20 aagccacgta ccggaaagta c 21

<210 >21 <211 >21 <212 >DNA 30 <213 >Drosophila melanogaster

<400 >21 gttcctagaa agcctaagta c 21

<210 >22 <211 >21

92

EP 2 934 093 B1

<212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster

<400 >22 tagccttacg tgaggcttac a 21

5 <210 >23 <211 >21 <212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster

<400 >23 10 aaggcttacg tgaggcttac a 21

<210 >24 <211 >21 <212 >DNA <213 >Drosophila melanogaster

15 <400 >24 aaggcttatg ttaggttgac a 21

<210 >25 <211 >21 <212 >DNA 20 <213 >Drosophila melanogaster

<400 >25 aaggcgtatg tgaggttgac t 21

25 Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób zmniejszania dostosowania konkurencyjnego organizmu eukariotycznego hemizygotycznego wobec locus transgenicznego w porównaniu do organizmu eukariotycznego homozygotycznego wobec locus transgenicznego, pod warunkiem, że organizm nie jest człowiekiem, obejmujący następujące etapy:

(a) zmniejszanie ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję w organizmie, przy czym 30 zmniejszenie jest przenoszone przez transgeniczny locus w organizmie; i (b) ratowanie zmniejszonej ekspresji w organizmie, przy czym ratowanie jest przenoszone przez ten sam transgeniczny locus w organizmie;

dając organizm, który odznacza się gorszym dostosowaniem konkurencyjnym, jeśli jest hemizygotyczny wobec transgenicznego locus, niż jeśli jest homozygotyczny wobec transgenicznego locus.

35 2. System genetyczny do transformacji obejmujący następujące elementy:

(a) środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję; i 93

EP 2 934 093 B1

(b) środek ratujący zdolny do zwiększania zmniejszonej ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, przy czym system genetyczny jest dostarczony jako pojedyncza jednostka transformacji i przy czym wymienione środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i wymieniony środek ratujący są obecne w tym samym 5 transgenicznym locus.

3. Zastosowanie systemu genetycznego obejmującego następujące elementy:

(a) środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję; i (b) środek ratujący, zdolny do zwiększania zmniejszonej ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję, wystarczający do transformacji organizmu eukariotycznego, pod warunkiem, że 10 organizm nie jest człowiekiem, przy czym transformacja jest przeprowadzana jednocześnie i przy czym środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i wymieniony środek ratujący są obecne w tym samym transgenicznym locus.

4. Genetycznie zmodyfikowany organizm eukariotyczny, pod warunkiem, że ten organizm nie jest istotą ludzką, obejmujący

15 (a) środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję; i (b) środek ratujący zdolny do zwiększania zmniejszonej ekspresji tego genu wykazującego haploinsuficjencję, przy czym wymieniony organizm jest organizmem potencjalnie rozmnażającym się płciowo, przy czym środki do specyficznego zmniejszania ekspresji genu wykazującego haploinsuficjencję i środek ratujący są obecne w tym samym transgenicznym locus i przy czym 20 wymienionym organizmem jest roślina lub owad.

5. Sposób według zastrzeżenia 1, system genetyczny według zastrzeżenia 2, zastosowanie według zastrzeżenia 3 lub organizm zmodyfikowany genetycznie według zastrzeżenia 4, w którym genem wykazującym haploinsuficjencję jest gen endogennego cytoplazmatycznego białka rybosomalnego (CRP), czynnika transkrypcyjnego, gen supresorowy guza, gen związany z funkcją mięśni, gen kodujący białko 25 homeodomeny lub inny gen z dowodami wskazującymi, że potencjalnie wykazuje haploinsuficjencję w określonym organizmie, korzystnie Rpl14 lub Rpl23aA. 6. Sposób według zastrzeżenia 1 lub 5, system genetyczny według zastrzeżenia 2 lub 5 lub zastosowanie według zastrzeżenia 3 lub 5, w których wymienionym organizmem jest zwierzę przenoszące chorobę, zwierzę wywołujące chorobę lub zwierzę hodowlane, lub roślina, lub grzyb, lub pierwotniak. 30 7. Sposób, system genetyczny, zastosowanie lub organizm zmodyfikowany genetycznie według zastrzeżenia 4, 5 lub 6, w których wymienioną rośliną jest roślina rolnicza, taka jak roślina uprawna, korzystniej roślina zbożowa, roślina okopowa, bulwy, nasiona strączkowe, sorgo lub rośliny strączkowe; lub roślina cukrownicza, korzystnie trzcina cukrowa lub burak cukrowy; lub rośliny oleiste, korzystniej rzepak, soja, palma oliwna, krokosz barwierski lub słonecznik; lub uprawa roślin oleistych, korzystnie 35 rzepaku, soji, palmy olejowej, krokosza barwierskiego lub słonecznika; lub roślina szkodnik, taka jak roślina inwazyjna, roślina trująca lub roślina wywołująca reakcje alergiczne u zwierząt, zwłaszcza u ludzi.

94

EP 2 934 093 B1

FIGURY

FIGURA 1

95

EP 2 934 093 B1

FIGURA 2

Chromosom

Hemizygoty „heterozygoty”

Homozygoty Homozygoty genetycznie modyfikowane typu „dzikiego” typu

96

EP 2 934 093 B1

FIGURA 3

Blok A

Blok B

97

EP 2 934 093 B1

FIGURA 4

markerbiały

14 mutacji synonimicznych

Ratunkowy

98

EP 2 934 093 B1

FIGURA 5

normalizujących

Dorosłe samce Dorosłe samice Larwy L3 Krotność zmiany poziomu mRNA Rpl14 w stosunku do zbioru genów genów zbioru do stosunku w Rpl14 mRNA poziomu zmiany Krotność (nieseksowane)

99

EP 2 934 093 B1

FIGURA 6

100

EP 2 934 093 B1

FIGURA 7

Samice Średnia

Łącznyudział Samce

Dzień przeobrażenia

dział U

Matczyne: Ojcowskie : Gentyp rodzicielski

101

EP 2 934 093 B1

Wyniki Przewidyw

Równow.

Częstość {Ud}86 Częstość

Pokolenia

e

i

n

a

w

o

heterozygot

s

o

e

Fitnes Fitnes i

t

s

n

a

o

D

w

o

s

Fitnes homozygot Fitnes

o

t

s

o D

Dopasowanie heterozygot Genotyp

5

102

EP 2 934 093 B1

FIGURA 9

14

RpL

ączna ekspresja ekspresja ączna Ł

Dopasowanie (płeć uśredniona)

103

EP 2 934 093 B1

FIGURA 10

się w w się

Rozprzestrzenianie sąsiedniej transformacji celu typu dzikiego populacji

Populacja docelowa docelowa Populacja transformowana trwale

Upadek do typu dzikiego do Upadek

104

EP 2 934 093 B1

FIGURA 11

A)

miRNA (celuje w 2 sekwencje w w sekwencje 2 w (celuje endogennym RpL23a

Kontrola

ratunek ratunek

105

EP 2 934 093 B1

FIGURA 12

wrażliwy niewrażliwy Ratunkowy

wrażliwy niewrażliwy Ratunkowy

106

EP 2 934 093 B1

ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE

Ta lista odniesień cytowana przez wnioskodawcę służy wyłącznie wygodzie czytelnika. Nie stanowi części europejskiego dokumentu patentowego. Mimo że dołożono wszelkich starań, aby opracować odniesienia, nie można wykluczyć błędów ani pominięć, a EPO nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym zakresie.

5 Dokumenty patentowe cytowane w opisie

• GB1223097A [0279] • US61740359B [0279]

Literatura niepatentowa cytowana w opisie

107

EP 2 934 093 B1

108