Posición filogenética del género Araracuara Fern-Alons.

Presentado por:

Javier Mauricio Varón López

Universidad Distrital Francisco José de Caldas

Facultad del medio ambiente y recursos naturales

Proyecto curricular de Ingeniería Forestal

Bogotá D.C.

2019 Tabla de contenido

Introducción ...... 4 Objetivo general ...... 7 Objetivos específicos ...... 7 Justificación ...... 7 Marco Teórico ...... 8 La familia Rhamnaceae en Colombia ...... 8 Sistemática de la familia Rhamnaceae ...... 8 Métodos de reconstrucción filogenética basados en caracteres ...... 9 Marcadores moleculares ...... 10 Metodología ...... 11 Datos Morfológicos ...... 12 Análisis de datos ...... 15 Resultados ...... 16 Análisis de datos de rbcL ...... 16 Análisis de datos de trnL-F ...... 16 Análisis de datos de ITS ...... 17 Análisis de datos de cpDNA ...... 17 Análisis molecular (rbcL, trnL-F, ITS) ...... 17 Análisis morfológico ...... 18 Evidencia total ...... 18 Discusión ...... 19 Posición filogenética de Araracuara ...... 20 Conclusiones ...... 21 Bibliografía ...... 22 Anexos ...... 27

Índice de tablas

Tabla 1. Clasificación a nivel de tribu de la familia Rhamnaceae. (Richardson et al. 2000b)...... 4 Tabla 2. Primers y programas utilizados para cada marcador molecular...... 11 Tabla 3. Caracteres utilizados en el análisis morfológico para la familia Rhamnaceae. (Richardson et al. 2000b)...... 12 Tabla 4. Matriz morfológica de las especies con secuencias de ADN para los tres marcadores moleculares...... 13 Tabla 5. Estadísticas para cada conjunto de datos...... 16 Tabla 6. Códigos de acceso de GenBank utilizados en este estudio...... 27 Tabla 7. Modelos empleados para cada uno de los análisis de inferencia bayesiana...... 31

Índice de Figuras

Figura 1. Árbol consenso del análisis de máxima parsimonia (izquierda) y árbol consenso empleando el método de inferencia bayesiana (derecha) basados en la combinación de los marcadores moleculares (rbcL, trnL-F e ITS) y el análisis morfológico...... 19 Figura 2. Árbol consenso del análisis de máxima parsimonia (izquierda) y de inferencia bayesiana (derecha) basados en el marcador molecular rbcL ...... 32 Figura 3. Árbol consenso del análisis de máxima parsimonia (izquierda) y de inferencia bayesiana (derecha) basados en el marcador molecular trnL-F...... 33 Figura 4. Árbol consenso del análisis de máxima parsimonia basado en el marcador ITS.. 34 Figura 5. Árbol consenso empleando el metodo de inferencia bayesiana con el marcador molecular ITS...... 35 Figura 6. Árbol consenso empleando el método de máxima parsimonia (izquierda) y de inferencia bayesiana (derecha) basados en la combinación de los marcadores moleculares rbcL y trnL-F...... 36 Figura 7. Árbol consenso de los análisis de máxima parsimonia (izquierda) e inferencia bayesiana (derecha) basados en la combinación de los marcadores moleculares rbcL, trnL-F e ITS...... 37 Figura 8. Árbol de máxima parsimonia empleando el marcador molecular rbcL...... 38 Figura 9. Árbol MCC empleando el marcador molecular rbcL...... 39 Figura 10. Uno de los 10.000 árboles de máxima parsimonia empleando el marcador molecular trnL-F ...... 40 Figura 11. 11 Árbol MCC empleando el marcador molecular trnL-F...... 41 Figura 12. Uno de los 864 árboles de máxima parsimonia empleando el marcador molecular ITS ...... 42 Figura 13. Árbol MCC empleando el marcador molecular ITS...... 43 Figura 14. Uno de los 720 árboles de máxima parsimonia empleando la combinación de marcadores moleculares del cloroplasto (rbcL, trnL-F)...... 44 Figura 15. Árbol MCC empleando la combinación de marcadores moleculares del cloroplasto (rbcL, trnL-F)...... 45 Figura 16. Uno de los 17 árboles de máxima parsimonia empleando la combinación de marcadores moleculares (rbcL, trnL-F, ITS) ...... 46 Figura 17. Árbol MCC empleando la combinación de marcadores moleculares (rbcL, trnL- F, ITS)...... 47

Posición filogenética del género Araracuara Fern-Alons.

Introducción

Rhamnaceae es una familia que incluye más de 900 especies y 54 géneros, que se distribuyen en todos los continentes, siendo más comunes en las regiones tropicales y subtropicales. Aunque muchas especies crecen en ambientes xerofíticos, hay especies propias de ecosistemas de selva tropical, de bosques de niebla y de sabanas secas (Richardson et al. 2000a, 2000b, Correa et al. 2010). Las especies de Rhamnaceae pueden ser árboles, arbustos y trepadoras principalmente, aunque se presenta una especie herbácea; se caracterizan por los estambres alternos a los sépalos; una característica poco común en las angiospermas (Richardson et al. 2000a). Las hojas en esta familia son simples y alternas, raramente opuestas, se pueden reconocer fácilmente por sus venas secundarias más o menos distantes, paralelas y muy conspicuas, la venación terciaria tiende a ser más o menos paralela y perpendicular a la secundaria. Las flores son pequeñas, hermafroditas o unisexuales, pentámeras o tetrámeras, con un disco bien desarrollado, de ovario supero o ínfero y con un ovulo por lóculo, las flores se encuentran dispuestas en cimas axilares ramificadas y los frutos son pequeños, drupáceos y con un disco redondo en la base (Gentry 1993, Richardson et al. 2000a, 2000b). Las especies propias de climas secos se caracterizan por presentar hábitos tales como arbustos bajos o arboles raquíticos, por poseer hojas reducidas o ausentes, agrupadas al final de las ramas, de consistencia cartácea y con estipulas transformadas en espinas.

La clasificación de la familia Rhamnaceae ha sido estudiada por diferentes autores a lo largo del tiempo. Jussieu (1789) realizó la primera clasificación dentro de la familia, a partir de ahí se segregaron algunos géneros a otras familias y se describieron nuevos géneros (Brougniart, 1827; Endlicher, 1840; Hooker, 1862; Baillon, 1877; Weberbauer, 1895; Suessenguth, 1953). La clasificación aceptada actualmente es la propuesta por Richardson et al., (2000b), quienes clasifican la familia en tres grandes grupos: Rhamnoid, Ampeloziziphoid y Ziziphoid, e incluyen 43 géneros en 11 tribus, mantienendo los géneros Alphitonia, Ceanothus, Colubrina, Emmenosperma, Lasiodiscus y Schistocarpaea en incertae sedis (Tabla 1).

Tabla 1. Clasificación a nivel de tribu de la familia Rhamnaceae. (Richardson et al. 2000b).

Grupo Tribu Géneros Rhamnoid Rhamneae Auerodendron, Berchemia, Berchemiella, Condalia, Dallachya, Karwinskia, Krugiodendron, Reynosia, Rhamnella, Rhamnidium, Rhamnus, Sageretia, Scutia. Maesopsideae Maesopsis Grupo Tribu Géneros Ventilagineae Smythea, Ventilago Ampeloziziphoid Bathiorhamneae Bathiorhamnus Ampelozizipheae Ampeloziziphus Doerfpeldieae Doerfpeldia Ziziphoid Paliureae Paliurus, Ziziphus, Hovenia. Pomaderreae Blackallia, Cryptandra, Pomaderris, Siegfriedia, Spyridium, Trymalium. Phyliceae Nesiota, Noltea, Phylica Colletieae Adolphia, Colletia, Discaria, Kentrothamnus, Retanilla, Trevoa. Gouanieae Alvimiantha, Crumenaria, Gouania, Helinus, Pleuranthodes, Reissekia. Incertae sedis Alphitonia, Ceanothus, Colubrina, Emmenosperma, Lasiodiscus, Schistocarpaea.

El género Araracuara es monotípico y fue descrito recientemente (Fernández-Alonso & Arbeláez, 2008). Su nombre hace referencia a la región de Araracuara en el departamento de Caquetá, en donde es una especie endémica y altamente abundante en las mesetas de arenisca de los afloramientos rocosos de Monochoa y Chiribiquete. El epíteto vetusta, que significa “viejo”, hace referencia a que esta especie se considera primitiva dentro de la familia Rhamnaceae, además crece en el escudo guayanés el cual es considerado una de las formaciones geológicas más antiguas en el mundo (Fernández-Alonso & Arbeláez, 2008). Araracuara vetusta presenta adaptaciones características de plantas propias de ambientes secos, aunque puede encontrarse en sitios donde la precipitación anual puede alcanzar los 3000 mm y el periodo seco solo ocurre entre Diciembre y Febrero (Duivenvoorden & Lips. 1991). La especie en general presenta un hábito arbustivo raquítico y escleromórfico de aspecto monótono debido a la ausencia de suelo, ubicándose en sustratos de rocas erosionadas o depresiones de arenas blancas.

Fernández-Alonso & Arbeláez (2008) consideraron a Araracuara como un género relictico dentro de la familia, con caracteres únicos que no se encuentran en ningún otro género, tales como el hábito de árbol raquítico poco ramificado y con fascículos de hojas terminales perennes. Sin embargo, al mismo tiempo Araracuara presenta características similares a las encontradas en otros grupos de la familia. Las inflorescencias constituidas por cimas dispuestas en amplios tirsos se presentan en la tribu Ampelozizypeae, las flores con ovario semiínfero y disco nectarífero adnado al ovario y al hipanto se presentan en la tribu Paliurae y en los géneros de ubicación incierta Colubrina y Lasiodiscus. Del mismo modo, los frutos capsulares triloculares, con dehiscencia explosiva, tienen semejanza a los de los géneros Ampelozizyphus, Colubrina y Noltea.

Considerando los caracteres mencionados, el género Araracuara no tendría lugar dentro de ninguna de las 11 tribus reconocidas por Richardson et al. (2000b), por lo que Fernández- Alonso & Arbeláez (2008) lo catalogan dentro del grupo “incertae sedis” junto con los géneros que previamente se encontraban en este grupo: Alphitonia, Ceanothus, Colubrina, Emmenosperma, Lasiodiscus y Schistocarpaea. Así como el género Jaffrea, postulado a partir de especies reubicadas del género Alphitonia (Hopkins et al. 2015). De estos géneros, Fernández-Alonso & Arbeláez (2008) consideran a Colubrina y Lasiodiscus como los más afines a Araracuara.

Objetivo general

Posicionar filogenéticamente el género Araracuara dentro de la familia Rhamnaceae

Objetivos específicos

• Evaluar la monofilia del género Araracuara • Evaluar las relaciones de parentesco del género Araracuara

Justificación

La sistemática es una disciplina que proporciona herramientas que ayudan al reconocimiento de patrones bióticos que reflejan las relaciones genealógicas de los organismos (Eldredge & Cracraft 1980), además de la importancia intelectual obvia de este campo, la sistemática constituye la base de todos los demás campos de la biología comparativa, es decir ésta disciplina proporciona el marco por el cual los profesionales de las ciencias biológicas comunican la información acerca de los organismos. La sistemática vegetal se basa en los principios básicos de la biología comparada y la taxonomía práctica, por tal motivo es importante poseer una base general de dichos principios, en especial porque la filogenia y los avances en biología molecular han generado nuevas tendencias en el campo de la taxonomía proporcionando nuevas oportunidades de investigación.

La investigación en Sistemática Filogenética es importante ya que permite entender y analizar la historia evolutiva de los seres vivos a través de la evidencia proporcionada por sus características. El estudio de la filogenia de Araracuara proveerá información que será útil para la formulación de hipótesis acerca de su historia evolutiva. El género Araracuara fue descrito años después de la última clasificación realizada para la familia Rhamnaceae, por lo que se desconoce a qué tribu pertenece, o si es necesario proponer una nueva tribu para el género, y cuáles son sus parientes más cercanos. Se ha sugerido que Araracuara es un género “relíctico” dentro de las Rhamnaceae, pero no existe evidencia filogenética que soporte esta hipótesis, y que permita evaluar si realmente es uno de los linajes más basales de la familia, o de la tribu en la que se encuentra. Adicionalmente, la posición filogenética del género permitirá evaluar con nuevos argumentos la prioridad de establecer planes para su conservación.

Marco Teórico

La familia Rhamnaceae en Colombia

De acuerdo con Tortosa (2016), en Colombia se encuentran 31 especies de la familia Rhamnaceae agrupadas en 11 géneros. Ampelozizyphus con una sola especie, A. amazonicus es una planta de hábito trepador distribuida en el Amazonas y el Pacífico. Colubrina con cuatro especies arbóreas y arbustivas distribuidas en la región Andina, Caribe y Amazonia. Condalia con una sola especie endémica de la sabana cundiboyacense: C. thomasiana un árbol de porte raquítico y poco común. Gouania, el género con mayor cantidad de especies, las diez registradas tienen hábito trepador, se encuentran distribuidas en las cinco regiones biogeográficas del país, pero principalmente en la Amazonia y la Orinoquía. Karwinskia con una sola especie, K. colombiana un árbol de bajo porte, endémico de las llanuras del Caribe. Krugiodendron con una sola especie, K. ferreum es un árbol de porte mediano distribuido desde Estados Unidos a Colombia a lo largo de las islas del Caribe. Rhamnus con cuatro géneros distribuidos en la cordillera Andina y la Serranía de la Macarena, siendo junto con Condalia, los géneros que alcanzan mayor altitud en metros sobre el nivel del mar. Sageretia con una sola especie S. elegans, una especie de hábito trepador distribuida y cultivada en la zona Andina. Scutia con una sola especie S. colombiana, endémica de la cordillera Andina. Ziziphus con seis especies de árboles, arbustos y una especie trepadora distribuidas en la Amazonia, las llanuras del Caribe, los valles y las cordilleras Andinas y el pacífico.

Sistemática de la familia Rhamnaceae

Rhamnaceae se encuentra bien soportada como familia gracias al estudio hecho por Richardson et al. (2000a) en el cual encontraron que la familia se conforma por 11 tribus, además de un grupo de especies que no pueden ser agrupadas en ninguna de las tribus a partir de los análisis con los marcadores rbcL y trnL-F por lo que se agrupan provisionalmente como “incertae sedis”. A nivel de tribu existen diversos estudios enfocados en tribus endémicas de Australia e islas del pacífico. Kellerman (2002) realizó un estudio preliminar de especies australianas usando y comparando los marcadores moleculares ITS y trnL-F. La tribu Pomaderreae fue analizada mediante el marcador ITS en cuyo caso solo el género Stenanthemum no obtuvo un amplio soporte dentro del clado (Kellerman et al. 2005). Kellerman & Udovicic (2007) realizaron un análisis para Pomaderreae, usando el marcador molecular trnL-F. De igual forma Aegesen et al. (2005) realizaron un análisis filogenético para la tribu Colletiae la cual cuenta con géneros distribuidos en los Andes suramericanos, en Australia y en Nueva Zelanda, a partir de datos combinados de morfología y trnL-F.

Otros estudios se han enfocado en análisis por grupos geográficamente similares con el fin de evaluar la especiación (Onstein et al. 2015). En este análisis se incluyó la mayor cantidad de marcadores usados hasta el momento, varios de los cuales no habían sido utilizados para la familia Rhamnaceae: seis marcadores del cloroplasto (matK, trnL-F, rbcL, psbA, ndfH, rpl16) y un marcador del núcleo (ITS). Otros estudios han utilizado análisis filogenéticos para confirmar la afinidad entre géneros de la misma familia, por ejemplo: Granitites y Alphitonia (Fay et al. 2001), o para discriminar entre especies del mismo género. Hopkins et al. (2015) propuso el género Jaffrea al reubicar dos especies pertenecientes al género Alphitonia a partir de los marcadores trnL-F y rbcL. Jeong et al. (1997) corroboró que el género Ceanothus es monofilético al usar los marcadores rbcL y ndfH. Richardson et al. (2001) realizó el análisis filogenético de especies endémicas de diferentes islas pertenecientes al género Phylica mediante el uso de los marcadores ITS y trnL-F. Por último, Kellerman et al. (2005) propusieron la rehabilitación del género Ochetophila al encontrar que el género Discaria es polifilético mediante estudios previos morfológicos para la tribu Colletiae (Aegesen 1999) y datos moleculares usando el marcador trnL-F.

Métodos de reconstrucción filogenética basados en caracteres

En el modelo de máxima parsimonia (MP) se usan supuestos previos sobre los caracteres que se utilizan como fuente de información, asumiendo que cualquier carácter heredable es una homología potencial (Grandcolas et al. 2001). Debido a esto todos los caracteres se tratan de la misma manera, es decir poseen la misma influencia al momento de inferir los arboles filogenéticos debido a que no se pueden identificar homoplasias a priori (Peña 2011). En MP se prefieren las hipótesis más sencillas puesto que son más probables que las complejas, las hipótesis ad hoc (Navaja de Occam) deben evitarse siempre (Suarez & Caballero 1999). Tiene como ventaja ser el modelo de más fácil interpretación y no requerir un modelo de evolución, sin embargo, puede dar resultados erróneos si hay homoplasias, además se justifica con argumentos filosóficos y no estadísticos (Suarez & Caballeros 1999).

El método de Inferencia Bayesiana (IB) se basa en modelos de evolución molecular, donde se tienen en cuenta conocimientos a priori a cerca de los caracteres, especialmente cuando son secuencias de nucleótidos de ADN (Peña 2011). El método de Inferencia Bayesiana (IB) estima la probabilidad de qué tan bien los arboles filogenéticos son explicados por la matriz de caracteres, la IB demanda menos capacidad computacional y es más rápida que otros análisis estadísticos debido al uso del algoritmo conocido como Markov Chain Monte Carlo (MCMC) el cual permite realizar búsquedas a través de un número menor de árboles según sus valores de probabilidad posterior (Huelsenbeck & Rannala, 1997).

Aunque estos dos métodos son ampliamente utilizados no son efectivos en todas las circunstancias, debido a esto se puede dudar sobre qué método escoger para el análisis de datos. En este caso se puede utilizar un método conciliatorio empleando los dos métodos y corroborando si las topologías de los árboles son concordantes, en cuyo caso la hipótesis filogenética se considera robusta, en caso contrario se debe tener discreción al discutir las relaciones filogenéticas de los nodos discordantes (Kolaczkowski & Thornton, 2004).

Marcadores moleculares

Un marcador molecular es una secuencia de ADN que por sí solo o en combinación con otros marcadores puede ser físicamente localizada dentro del genoma de un organismo. Una de las características de los marcadores moleculares es que son específicos para especies o grupos taxonómicos mayores, lo que los hace herramientas útiles para el estudio de individuos o poblaciones. Los marcadores moleculares son muy utilizados en muchos campos de la biología, entre los cuales la evolución, la ecología, la medicina, y los estudios en biodiversidad han sido los más beneficiados (Karp & Edwards, 1997).

Actualmente son varias las técnicas que permiten conocer el comportamiento o el estado de genes dentro de las poblaciones naturales, de forma directa mediante estudios de ADN o indirecta a partir de análisis de proteínas (Alcántara, 2007). Cada marcador molecular puede ser distinguido de los demás por su capacidad de detectar polimorfismos en loci únicos o múltiples siendo de tipo dominante o codominante (Simpson, 1997). La mayor parte del ADN se encuentra contenido en el núcleo de la célula, el ADN se encuentra empaquetado y asociado a proteínas histonas conformando los cromosomas. El ADN nuclear contiene regiones únicas de una sola copia, se considera que los organismos diploides tienen dos copias de cada locus en los pares homólogos de los cromosomas (Stansfield, 1992). En los organismos fotosintéticos con cloroplastos existe un tipo de ADN considerado como muy conservado puesto que se trata del mismo genoma desde las hepáticas hasta las plantas superiores, cada cloroplasto contiene varias regiones nucleotidicas (Alcántara, 2007). El genoma mitocondrial es muy variable en tamaño y longitud según la especie, se considera que la mayoría del ADN mitocondrial no codifica en plantas y hongos (Brown et al., 1979). Las moléculas de cloroplasto y mitocondria son importantes para trazar historias filogeográficas y de estructura poblacional genética porque son de herencia uniparental y no recombinan (Alcántara, 2007), además permiten inferir cambios en la dispersión entre especies (Dirienzo & Wilson, 1991).

La secuenciación de Araracuara se realizó con base en dos marcadores del cloroplasto; rbcL (codificante) y trnL-F (espaciador intergénico no codificante) así como el marcador del núcleo ITS (ITS2). Debido a que la tasa de evolución del ADN ribosomal (núcleo) diverge más rápido que la del cloroplasto es que se ha usado más a nivel taxonómico de género y secciones los espaciadores ITS 1 e ITS 2 (Baldwin, 1993) mientras que el ADN mitocondrial al presentar una tasa evolutiva más lenta se ha usado para determinar relaciones entre familias cercanas o subfamilias (Barker et al, 1995).

Metodología

Extracción, amplificación y secuenciación de ADN

El ADN se obtuvo a partir de tejido foliar deshidratado en sílica gel de dos individuos procedentes del municipio de Solano-Caquetá, cuyos especímenes botánicos fueron procesados y depositados en la colección del Herbario Forestal (UDBC) de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (UDBC 031271 y UDBC 031282). La técnica de extracción utilizada fue el método CTAB (Doyle & Doyle, 1990) con modificaciones en la preparación del buffer de lisis celular al cual se le agregó NaCl 5M, EDTA 20mM (PH=8) y Tris HCl 100 mM (PH=8) de acuerdo al protocolo del Laboratorio del Real Jardín Botánico de Edimburgo (Clark & Hollingsworth, 2011).

Se amplificaron dos regiones del cloroplasto (rbcL y trnL-F) y una del núcleo (ITS2). La master mix para la amplificación de ADN consta de ddH2O (13,7 ul), DMSO (1,25 ul), BSA (0,25 ul), 10x buffer (2,5 ul), MgCl2 (2,0 ul), 10mM DNTP ´s (2,0 ul), 10 uM primer F (1,0 ul), 10 uM primer R (1,0 ul), polimerasa (0,3 ul), ADN (1 ul). Para la amplificación del marcador rbcL se utilizaron los primers rbcLa-f (5´- ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAAG - 3´) (Levin, 2003) y rbclajf634-r (5´-GAA ACG GTC TCT CCA ACG CAT-3´) (Fakezas, 2008). El marcador trnL-F fue amplificado utilizando los primers trnF-R (5´-GAT TTG AAC TGG TGA CAC GAG-3´) y trnL (5´- AAA ATC GTG AGG GTT CAA GTC - 3´) (Onstein, 2015). Las condiciones de PCR para los marcadores del cloroplasto fueron: 94 °C por 4 min, 35 ciclos de 94°C por 30 seg, 55 °C por 30 seg 72°C por 1 min, extensión final a 72°C por 10 min. Para la amplificación del marcador ITS2 se utilizaron los primers ITS2- S2F (5´-ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT -3´) (Chen et al., 2010) e ITS4 (5´- TCC TCC GCC TTA TTG ATA TGC -3´) (White et al., 1990). Las condiciones de PCR para el marcador del núcleo fueron 94°C por 5 min, 35 ciclos de 94°C por 30 seg, 56 °C por 30 seg 72°C por 45 seg, extensión final a 72°C por 10 min. (tabla 2).

Los procesos de extracción y amplificación se realizaron en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital. La secuenciación se realizó en Macrogen, Korea, a través de Biodiagnostica s.a.s.

Tabla 2. Primers y programas utilizados para cada marcador molecular.

Marcador Primer Programa Secuencia 5´ - 3´ Referencia ATG TCA CCA 94°C por 4 min, 35 ciclos de rbcLa-f CAA ACA GAG Levin, 2003 94°C por 30 seg, 55 °C por ACT AAAG rbcL 30 seg 72 °C por 1 min, GAA ACG GTC rbcLajf extensión final a 72 °C por Fakezas, TCT CCA ACG 634-r 10 min 2008 CAT Marcador Primer Programa Secuencia 5´ - 3´ Referencia GAT TTG AAC 94°C por 4 min, 35 ciclos de trnF-R TGG TGA CAC Onstein, 2015 94°C por 30 seg, 55 °C por GAG trnL-F 30 seg 72 °C por 1 min, AAA ATC GTG extensión final a 72 °C por trnL AGG GTT CAA Onstein, 2015 10 min GTC ITS2- 94 °C por 5 min, 35 ciclos de ATG CGA TAC Chen et al., S2F 94°C por 30 seg, 56°C por TTG GTG TGA AT 2010. ITS2 30 seg, 72 °C por 45 seg, TCC TCC GCC White et al., ITS4 extensión final a 72 °C por TTA TTG ATA 1990 10 min TGC

Datos Morfológicos

Se utilizaron los mismos 18 caracteres usados por Richardson et al., (2000b), considerados diagnósticos para identificar géneros o tribus. La información morfológica de especies adicionales se obtuvo mediante revisión de información secundaria de Bartish et al. (2002), Hopkins et al. (2015) y Fernández-Alonso & Arbeláez (2008). Por último, los géneros Elaeagnus e Hippophae se incluyeron para ser utilizados en este análisis como grupos externos debido a la estrecha relación de las familias Elaeagnaceae y Rhamnaceae. En la tabla 3 se presentan los caracteres morfológicos utilizados en el análisis y sus respectivos estados. La matriz de datos morfológicos se presenta en la tabla 4.

Tabla 3. Caracteres utilizados en el análisis morfológico para la familia Rhamnaceae. (Richardson et al. 2000b).

Carácter Estado del carácter 1. Adjunta al receptáculo después de la dehiscencia 1. Semilla 2. Desprendida del receptáculo después de la dehiscencia 1.Presencia del disco 2. Presencia o ausencia del disco 2. Ausencia del disco 1. Unido al tubo del cáliz y al ovario 3. Posición del disco 2. Unido al tubo del cáliz o libre 3. Unido únicamente al ovario 1. Revoluto 4. Margen de la hoja 2. No revoluto 1. Presente 5. Fijación de nitrógeno 2. Ausente 1. Usualmente 3 6. Numero de lóculos por ovario 2. 2 o 4 3. 1 Carácter Estado del carácter 1. Presente 7. Endospermo 2. Ausente 1. Capsula 8. Fruto 2. Carnoso 3. Samara 1. Palmada 9. Venación de la hoja 2. Pinnada 1. Presencia 10. Tricomas estrellados 2. Ausencia 1. Ausente 11. Fruto con alas longitudinales 2. Presente 1. Ausente 12. Fruto con ala apical 2. Presente 1. Supero 13. Posición del ovario 2. Semi- ínfero 3. Ínfero 1. Árboles o arbustos 14. Hábito 2. Trepador o herbáceo 1. Alternas 15. Posición de las hojas 2. Opuestas 3. Verticiladas 1. Presencia 16. Zarcillos 2. Ausencia 1. Presencia 17. Quilla del cáliz 2. Ausencia 1. Haplostémono 18. Arreglo de las partes florales 2. No Haplostémono

Tabla 4. Matriz morfológica de las especies con secuencias de ADN para los tres marcadores moleculares.

Especie Número del carácter 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Elaeagnus angustifolia 2 2 ¿ 2 1 3 1 ¿ 2 1 1 1 3 1 1 2 2 2 Hippophae salicifolia 2 2 ¿ 2 1 3 1 ¿ 2 1 1 1 3 1 1 2 2 2 Alphitonia aff incana 1 1 1 2 2 2 1 1 2 2 1 1 3 1 1 2 1 1 Berchemia discolor 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 Ceanothus cordulatus 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 2 2 1 1 Ceanothus pumilus 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 2 2 1 1 Araracuara vetusta 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 1 1 2 1 1 2 1 1 Colubrina asiática 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 1 1 3 1 1 2 1 1 Colubrina reclinata 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 1 1 3 1 1 2 1 1 Condalia mycrophylla 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 3 2 1 1 Crumenaria erecta 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 2 1 3 2 1 2 1 1 Especie Número del carácter 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Emmenosperma 2 1 1 2 2 2 1 1 2 2 1 1 3 1 2 2 1 1 alphitonioides Granitites intangendus 2 1 1 2 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 2 1 1 Helinus integrifolius 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 2 1 3 2 1 1 1 1 Hovenia dulcis 2 1 1 2 2 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 2 1 1 Jaffrea xerocarpa 1 1 1 2 2 2 1 1 2 2 2 1 3 1 1 1 1 1 Karwinskia 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 1 1 1 2 2 1 1 humboldtiana Krugiodendron ferreum 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 1 ¿ 1 1 2 1 1 Lasiodiscus 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 1 1 3 1 2 2 1 1 mildbraedii Paliurus spina christii 2 1 1 2 2 2 2 2 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 Nesiota elíptica 2 1 1 1 2 1 1 1 2 2 1 1 3 1 2 2 1 1 Noltea africana 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 1 1 2 1 1 2 1 1 Trichocephalus 2 1 1 1 2 1 1 1 2 2 1 1 3 1 1 2 1 1 stipularis Phylica nítida 2 1 1 1 2 1 1 1 2 2 1 1 3 1 1 2 1 1 Phylica paniculata 2 1 1 1 2 1 1 1 2 2 1 1 3 1 1 2 1 1 Phylica polifolia 2 1 1 1 2 1 1 1 2 2 1 1 3 1 1 2 1 1 Pomaderris rugosa 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 2 1 1 Reissekia smilacina 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 2 1 3 2 1 1 1 1 Rhamnella 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 1 3 1 1 2 1 1 franguloides Rhamnidium 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 2 2 1 1 elaeocarpum Rhamnus crenata 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 Rhamnus lycioides 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 Rhamnus prinoides 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 Sageretia thea 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 1 3 1 2 2 1 1 Schistocarpaea 2 1 ¿ ¿ 2 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 johnsonii Scutia buxifolia 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 Siegfriedia 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 3 1 2 2 1 1 darwinioides Spyridium globulosum 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 3 1 1 2 1 1 Stenanthemum 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 3 1 1 2 1 1 complicatum Trymalium floribundum 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 3 1 1 2 1 1 Trymalium ledifolium 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 3 1 1 2 1 1 Ziziphus calophylla 2 1 1 2 2 2 2 2 1 2 1 1 2 1 3 2 1 1 Ziziphus mauritiana 2 1 1 2 2 2 2 2 1 2 1 1 2 1 3 2 1 1 Ziziphus rugosa 2 1 1 2 2 2 2 2 1 2 1 1 2 1 3 2 1 1 Ziziphus spina christii 2 1 1 2 2 2 2 2 1 2 1 1 2 1 3 2 1 1

Análisis de datos

Se partió de un alineamiento previo para la familia Rhamnaceae efectuado por Onstein et al. (2015), el cual fue alineado mediante el programa Se-Al v. 2.0a11 y luego refinado de forma manual en Geneious v. 5 .6. De igual forma se incluyeron secuencias de otras especies descargadas de la plataforma GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) con el objetivo de incluir géneros adicionales a los muestreados en el último análisis filogenético realizado para la familia (Richardson et al. 2000a), y también para obtener la mayor cantidad de géneros con secuencias de los tres marcadores moleculares utilizados en este estudio. Los números de acceso de GenBank de las especies utilizadas se muestran en la tabla 6. Las secuencias obtenidas de Araracuara así como las descargadas de GenBank fueron alineadas en conjunto con el alineamiento previo realizado por Onstein et al. (2015) en la plataforma BioEdit V.7.2.5 (Hall, 1999).

El análisis de Máxima Parsimonia (MP) se realizó mediante la combinación del software Winclada (Nixon, 2002) y NONA (Goloboff, 1996) eliminando del análisis los caracteres que no eran informativos. Los árboles para cada marcador molecular se obtuvieron a partir de un análisis heurístico con un máximo de 10.000 árboles, un numero de réplicas de 1.000, comenzando con 5 árboles por cada replica, y con una estrategia de búsqueda Multiple TBR + TBR (mult*max*). Los demás criterios fueron establecidos por defecto. Por último, se generó un árbol de consenso estricto en cada análisis realizado. Con el fin de determinar el soporte de los clados se realizó un análisis de bootstrap con 1000 réplicas, 5 búsquedas por replica, comenzando por un árbol. Se consideró que un clado no presentó soporte cuando el valor era inferior al 50%, soporte débil cuando el valor se encontraba entre 51-69%, buen soporte cuando el valor se encontraba entre 70-94% y un fuerte soporte cuando el valor era superior al 95%.

El análisis de inferencia bayesiana se realizó mediante el método MCMC (Simulación Monte Carlo mediante cadenas Markov) con el uso del programa MrBayes v.3.2.6 por medio de la plataforma CIPRES Science Gateaway. De igual manera se utilizó dicha plataforma para seleccionar el modelo evolutivo que mejor se ajustara a los datos a través del programa JModelTest2 v 2.1.6 (Darriba et al., 2012) utilizando el criterio de información de Akaike (AIC). Los modelos obtenidos se muestran en el anexo tabla 7. El árbol utilizado para el análisis correspondió a un árbol consenso en donde se considera que una probabilidad posterior > 0.95 representa un clado con un buen soporte. De igual forma se generó el árbol MCC (máximum clade credibility) haciendo uso de la herramienta TreeAnnotator v1.10.4 del programa BEAST v.1.10.4 (Suchard M,A et al. 2018). El método de máxima credibilidad asigna a cada clado un puntaje basado en la fracción de veces que aparece en el conjunto de árboles muestreados y el producto de estos puntajes se toma como el puntaje del árbol. El árbol con la puntuación mas alta es el árbol de máxima credibilidad. Resultados

La tabla 5 muestra las estadísticas del análisis de Máxima Parsimonia realizadas para cada conjunto de datos incluyendo: número de especies, numero de caracteres, numero de caracteres informativos, numero de árboles generados, longitud de ramas, índice de consistencia e índice de retención. Los mismos valores de número de especies, número de caracteres y caracteres informativos aplican para el análisis de Inferencia Bayesiana.

Tabla 5. Estadísticas para cada conjunto de datos.

Estadísticas rbcL trnL- cpDNA ITS Molecular Morfología Evidencia F total Número de 76 126 67 114 45 45 45 especies Número de 1391 1167 2559 815 3227 18 3246 caracteres Caracteres 223 310 480 437 665 17 682 informativos Número de 11000 10000 721 4033 18 10000 10 árboles Longitud de 749 838 1394 3289 2506 103 2546 ramas Índice de 39 56 46 28 42 19 43 consistencia Índice de 74 84 71 64 60 31 61 retención

Análisis de datos de rbcL

Los análisis de máxima parsimonia y de inferencia bayesiana se realizaron con secuencias de 76 especies (7 outgroups) con un total de 223 caracteres informativos. El análisis de máxima parsimonia (Figura 2 y Figura 8) muestra que Araracuara se encuentra dentro del grupo Ziziphoid, pero no hay suficiente resolución para poder evaluar los géneros más cercanamente emparentados. El análisis de inferencia bayesiana (Figura 2.) y de máxima credibilidad (Figura 9.) muestran que los géneros Araracuara y Colubrina constituyen un grupo monofilético bien soportado (PP=0.82), probablemente hermano de Lasiodiscus, aunque esta relación no se encuentra bien soportada (PP=0.68).

Análisis de datos de trnL-F

Los análisis de máxima parsimonia y de inferencia bayesiana (Figura 3.) se realizaron con secuencias de 126 especies (ocho outgroups) con un total de 437 caracteres informativos. Tanto el análisis de máxima parsimonia como de inferencia bayesiana muestran a Araracuara y Colubrina como géneros hermanos, formando un grupo monofilético con muy buen soporte estadístico (BO= 96, PP=1) al igual que en en el de máxima credibilidad (PP=0,99) (Figura 10.) formando parte del grupo Ziziphoid. Los géneros de ubicación incierta Emmenosperma y Jaffrea conforman un clado monofilético muy bien soportado (BO=95, PP=1), al igual que Alphitonia y Granitites (BO=86, PP=1).

Análisis de datos de ITS

Los análisis de máxima parsimonia (Figura 4 y 12.) e inferencia bayesiana (Figura 5.) se realizaron con secuencias de 114 especies (cinco outgroups) con un total de 437 caracteres informativos. El análisis de máxima parsimonia muestra a los géneros Araracuara y Colubrina como un grupo monofilético con buen soporte (BO=76, PP=1). El árbol de máxima credibilidad (Figura 13.) presenta un PP=0,93 para el clado conformado por Araracuara y Colubrina. El marcador ITS no presenta buena resolución en la base del grupo interno, así que no se pueden observar los tres grandes grupos de la familia. Se puede destacar que el género Ziziphus es polifilético, mientras que la tribu Paliurae no se encuentra contenida en el clado Ziziphoid.

Análisis de datos de cpDNA

Al combinar los datos de los marcadores rbcL y trnL-F disminuyó el número de secuencias a 67 especies (6 outgroups) pero se incrementa el número de caracteres informativos a 480. Los análisis de máxima parsimonia y de inferencia bayesiana (Figura 6 y Figura 14) ubican a los géneros Araracuara y Colubrina como un grupo monofilético bien soportado (BO=98, PP=1). El análisis de inferencia bayesiana y el de máxima credibilidad ubican al género Lasiodiscus dentro del mismo clado que los géneros Araracuara y Colubrina aunque con un muy bajo soporte (PP=0,58) siendo Lasiodiscus la especie basal en el clado.

Análisis molecular (rbcL, trnL-F, ITS)

La combinación de los tres marcadores moleculares disminuyó a 45 el total de especies analizadas (2 outgroups) con un total de 665 caracteres informativos. Los análisis de máxima parsimonia y de inferencia bayesiana muestran un muy buen soporte para el clado conformado por los géneros Araracuara y Colubrina (BO=96, PP=1) (Figura 7 y Figura 16). Dentro del gran grupo Ziziphoid pero sin resolución que permita ver con cuál de las otras tribus de este clado se encuentra más emparentada. El árbol de máxima credibilidad (Figura 17.) también presenta un buen soporte para el clado conformado por Araracuara y Colubrina (pp=0,99) en este análisis se observa que dicho clado esta emparentado con la tribu Phyliceae y Pomaderreae, así como con los géneros de ubicación incierta Alphitonia, Ceanothus,Emmenosperma, Granitites, Jaffrea y Schistocarpaea.

Análisis morfológico

El análisis morfológico de los métodos de inferencia bayesiana y máxima verosimilitud no muestra resolución alguna entre los géneros de la familia.

Evidencia total

La figura 1 muestra el resultado de la combinación de datos moleculares y morfológicos, árboles que presentan la misma tendencia a la encontrada en el análisis molecular (Figura 7). Los análisis de máxima parsimonia y de inferencia bayesiana muestran un muy buen soporte para el clado conformado por Araracuara y Colubrina (BO=97, PP=1). Se observan dos de los tres grupos definidos para la familia por Richardson et al. (2010). La ausencia del grupo Ampelozizyphoid en este análisis se debe a la falta de secuencias con el marcador ITS para los géneros Bathiorhamnus, Ampelozizyphus y Doerfpeldia. Los resultados de los análisis de máxima parsimonia e inferencia bayesiana y son concluyentes en ubicar a Araracuara dentro de un grupo monofilético junto al género Colubrina. Araracuara se encuentra dentro del grupo Ziziphoid emparentado con las tribus Gouanieae, Pomaderreae, Colletieae, Phyliceae y Paliureae, aunque sin resolución que permita evaluar cuál es la tribu hermana de este clado. Figura 1.

Fig 1. Árbol consenso del análisis de máxima parsimonia (izquierda) y árbol consenso empleando el método de inferencia bayesiana (derecha) basados en la combinación de los marcadores moleculares (rbcL, trnL-F e ITS) y el análisis morfológico. Los valores de Bootstrap se muestran encima de las ramas (Longitud de ramas 2546, índice de consistencia 43, índice de retención 61) (izquierda). Los valores de probabilidad posterior se muestran encima de las ramas (derecha). * Se muestran Araracuara y Colubrina conformando un clado monofilético.

Discusión

Monofilia de Araracuara

Este estudio incluyó por primera vez el género Araracuara en un análisis filogenético. Los análisis que combinaron toda la evidencia (Figuras 1 y 2) agruparon las dos especies de Colubrina analizadas en un clado hermano de Araracuara, corroborando su estatus como un género diferente a Colubrina. Es interesante notar que la mayoría de las diferencias morfológicas entre los dos géneros se encuentran en los caracteres vegetativos, siendo Colubrina un género de árboles o arbustos muy ramificados mientras que Araracuara posee un hábito de arbolito monocaule y raquítico con hojas agrupadas en fascículos terminales y glándulas en la zona media del peciolo, una característica que no se asemeja a ningún otro miembro de la familia Rhamnaceae. Araracuara presenta hojas siempre alternas y con una venación pinada, mientras que Colubrina tiene especies con hojas opuestas o alternas y de igual forma puede presentar venación tanto pinada como basal. Las flores en ambos géneros son muy similares, sin embargo, Araracuara presenta flores agrupadas en largos tirsos paniculiformes mientras que Colubrina tiene las flores dispuestas en tirsos cortos sésiles, o con peciolos cortos y umbeladas.

Posición filogenética de Araracuara

Los resultados del análisis de los marcadores moleculares combinados (Figuras 1 y 2) son concluyentes en agrupar a Araracuara con Colubrina dentro de un grupo monofilético con soportes muy robustos: ADN del cloroplasto (BO=98, PP=1) y ADN molecular (BO=96, PP=1). El uso del análisis morfológico no resulto tener ningún cambio significativo en el resultado total (BO=97, PP=1). Este estudio permite corroborar la presunción realizada por Fernández-Alonso & Arbeláez (2008) quienes consideraron que Araracuara es afín al género de ubicación incierta Colubrina debido a la gran semejanza presente en muchos de los caracteres reproductivos, especialmente las flores con ovario semi-infero, el disco nectarífero adnado al hipanto, así como los frutos capsulares triloculares con dehiscencia explosiva

De igual forma en la descripción del género Araracuara Fernández-Alonso & Arbeláez (2008) definen las afinidades de éste con otros géneros: con Ampelozizyphus, Gouania, Pomaderris y Emmenosperma por las inflorescencias constituidas por cimas dispuestas en tirsos paniculiformes. Con algunos géneros de las tribus Paliureae y Pomaderreae, así como los géneros Ventilago, Ampeloziziphus, Alphitonia, Colubrina, y Lasiodiscus por la presencia de flores con ovario semiínfero y disco nectarífero adnado al ovario y al hipanto, así como con los géneros Ampelozizyphus, Colubrina y Noltea por la presencia de frutos capsulares triloculares con dehiscencia explosiva. Los resultados moleculares muestran que de las especies afines citadas por Fernández-Alonso & Arbeláez (2008), las menos emparentadas con Araracuara son Ventilago y Ampelozizyphus, la primera de ellas perteneciendo al gran grupo Rhamnoide y la segunda al gran grupo Ampelozizyphoid. Por otro lado, los géneros Alphitonia, Colubrina, Lasiodiscus, y Noltea, así como los miembros de las tribus Paliureae y Pomaderreae se ubican dentro del clado Ziziphoid al igual que Araracuara.

El género Colubrina se considera estrechamente relacionado con el género Lasiodiscus especialmente por las flores con ovario semi-infero y el disco nectarífero adnado al hipanto (Johnston, 1971). Sin embargo, únicamente los análisis de Inferencia bayesiana con el marcador rbcL y la combinación de marcadores del cloroplasto muestran soporte, aunque muy bajo como para evidenciar que el género Lasiodiscus se encuentra en el mismo grupo monofilético con Araracuara y Colubrina (PP=68, PP=59 respectivamente) (Anexo ¿). Resultados similares obtuvo Richardson et al. (2000a) con un BO<50% por lo que aún no existe evidencia suficiente que permita reconocer a Lasiodiscus dentro del mismo grupo monofilético con Araracuara y Colubrina.

El clado conformado por Araracuara y Colubrina se encuentra contenido dentro del gran grupo Ziziphoid. Tanto en el análisis de MP como en el de IB se puede observar que la tribu Gouanieae es basal en este grupo. En el análisis de IB se observa a la tribu Paliureae como basal en el subclado donde se encuentran las tribus Pomaderreae y Phyliceae, así como el clado conformado por Araracuara y Colubrina y los géneros de ubicación incierta Alphitonia, Ceanothus, Emmenosperma, Granitites, Jaffrea, Lasiodiscus y Schistocarpeae.

Los resultados obtenidos en este estudio son en su mayoría congruentes con los análisis filogenéticos previamente publicados para la familia Rhamnaceae (Richardson et al. 2000b, Onstein, R. 2015, Hauenschild et al. 2016), lo cual se podría esperar teniendo en cuenta que se utilizaron muchas de las secuencias generadas en los estudios mencionados.

Conclusiones

El análisis filogenético realizado en este estudio es congruente con la clasificación realizada por Richardson et al. (2000b) así como los análisis realizados para la familia Rhamnaceae por otros autores (Onstein, R. 2015, Hauenschild et al. 2016) en donde se puede observar la división de la familia Rhamnaceae en 3 grandes grupos; Rhamnoid, Ampeloziziphoid y Ziziphoid. De igual forma que en los anteriores estudios los géneros Alphitonia, Ceanothus, Emmenosperma, Granitites, Jaffrea, Lasiodiscus y Schistocarpeae se mantienen en incertae sedis debido a su posición ambigua dentro del análisis molecular.

El análisis estadístico empleando caracteres morfológicos resulta ser deficiente para discernir relaciones dentro de la familia Rhamnaceae. Entre los marcadores moleculares empleados en este estudio ITS muestra mayor utilidad para encontrar relaciones de parentesco a nivel de tribu y de género, seguido por trnL-F y por último por rbcL. Sin embargo, la combinación de los marcadores del cloroplasto demuestra ser muy útil para hallar relaciones de parentesco dentro de las tribus.

El análisis filogenético de la combinación de marcadores del cloroplasto y el núcleo confirman la afinidad entre el género Araracuara, endémico de la región que lleva su mismo nombre en la Amazonía Colombiana, con el género de distribución pantropical Colubrina. Estos géneros a pesar de presentar características diferentes a nivel vegetativo son muy similares en cuanto a características reproductivas: Ambos géneros poseen flores con ovario semi-infero y disco nectarífero adnado al hipanto, así como frutos capsulares triloculares con dehiscencia explosiva. Por último, los resultados son concluyentes para afirmar que Araracuara y Colubrina forman un clado dentro del grupo Ziziphoid dando origen a la 12 tribu para la familia Rhamnaceae.

Esta tribu presenta como características principales ser árboles o arbustos, armados o inermes de hojas simples, opuestas o agrupadas en fascículos terminales con glándulas en la base de la hoja o en la zona media de los peciolos, con venación pinada o basal y con presencia de estipulas. Inflorescencias cimosas en tirsos axilares o terminales con pedúnculos largos o sésiles. Raramente solitarias. Flores pentámeras con estambres opuestos a los pétalos y alojados en ellos, con ovario semiínfero trilocular y disco nectarífero carnoso adnado al ovario y al hipanto. Frutos en capsula globosa tricoca con dehiscencia irregular y explosiva.

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Anexos

Tabla 6. Códigos de acceso de GenBank utilizados en este estudio.

Especie rbcL ITS trnL-F Adolphia_californica AF048973.1 Adolphia_infesta AJ390055.1 KP299387 Alphitonia_aff_incana AJ390049.1 AF328830.1 KP299388 Ampelozizyphus_amazonicus AJ390037.1 AJ390341.1 Araracuara vetusta Pendiente Pendiente Pendiente Especie rbcL ITS trnL-F Araracuara vetusta Pendiente Barbeya_oleoides AJ225788.1 AJ225795.1 Bathiorhamnus_cryptophorus AJ390036.1 AJ390340.1 Berchemia_discolor AJ225786.1 AY626455.1 AJ225793.1 Berchemia_racemosa JN900290.1 KP299389 Blackallia_biloba AY911558.1 EF528505.1 Berchemiella yunnanensis KX527174.1 Ceanothus_caeruleus AF328835.1 AJ225798.1 Ceanothus_cordulatus U78904.1 AF048905.1 HQ325601.1 Ceanothus_pumilus U78905.1 HQ325379.1 HQ325602.1 Ceanothus_purpureus HQ325380.1 Ceanothus_sanguineus U06795.1 AF048928.1 Ceanothus_sonomensis AF048969.1 Ceanothus_spinosus HQ325343.1 Ceanothus_thyrsiflorus U59827.1 HQ325345.1 Ceanothus_tomentosus HQ325347.1 Ceanothus_velutinus HQ325349.1 Ceanothus_verrocosus HQ325383.1 Colletia_hystrix AY460409.1 KP299390 Colletia_paradoxa

Colletia_spinosa KP299391 Colletia_ulicina U59819.1 AJ390364.1 Colubrina_asiatica AJ390047.1 AF328831.1 AJ390350.1 Colubrina_reclinata AJ390065.1 AF328832.1 AJ390370.1 Colubrina_glandulosa KR083065.1 Colubrina_oppositifolia KR083066.1 Colubrina californica MF963934.1 Condalia_microphylla AJ390032.1 AY626456.1 AJ390334.1 Crumenaria_erecta AJ390042.1 HQ325385.1 AJ390346.1 Cryptandra_alpina AY911540.1 EF528488.1 Cryptandra_connata AY911561.1 EF528503.1 Cryptandra_micrantha AY911544.1 EF528493.1 Cryptandra_myriantha AJ390060.1 AY911552.1 AJ390360.1 Cryptandra_nola AY911548.1 EF528496.1 Cryptandra_pungens AY911551.1 EF528497.1 Dallachya_vitiensis JN900300.1 JN900333.1 Dirachma_socotrana AJ225789.1 AJ225796.1 Discaria_chacaye AF307911.1 AJ225797.1 Discaria_toumatou AF307912.1 AY642150.1 Especie rbcL ITS trnL-F Doerpfeldia_cubensis AJ390038.1 AJ390342.1 Elaeagnus_angustifolia U17038.1 DQ838727.1 Elaeagnus_bockii JF317484.1 Emmenosperma_alphitonioides AJ390048.1 HQ340159.1 AJ390351.1 Frangula_alnus AY626450.1 AY626429.1 Frangula_azorica HM850010.1 Frangula_betulifolia AY626445.1 AY626424.1 Frangula_californica AY626442.1 AF348565.1 Frangula_purshiana AY626430.1 AY626411.1 Frangula_rupestris KP299392 Gouania_mauritiana AJ390040.1 AJ390344.1 Granitites_intangendus AJ306539.1 HQ340160.1 AJ306540.1 Helinus_integrifolius AJ390043.1 HQ325386.1 AJ390347.1 Hippophae_neurocarpa JF941944.1 HM769680.1 Hippophae_salicifolia U59821.1 KJ844023.1 HM769681.1 Hovenia_acerba KP299393 KP299394 Hovenia_dulcis AJ390039.1 DQ146607.1 Hovenia_trichocarpa DQ146608.1 DQ146565.1 Karwinskia_humboldtiana AJ390031.1 JN900297.1 JN900327.1 Kentrothamnus weddellianus AY642152.1 Krugiodendron_ferreum AJ390028.1 JN900298.1 AJ390331.1 Lasiodiscus_mildbraedii AJ390050.1 AF328833.1 AJ390353.1 Maesopsis_eminii AJ390034.1 AJ390336.1 Nesiota_elliptica AJ225783.1 AF328823.1 KP299395 Noltea_africana AJ390054.1 AF328822.1 KC633945.1 Paliurus_hemsleyanus DQ146609.1 DQ146567.1 Paliurus_ramosissimus DQ146612.1 DQ146568.1 Paliurus_spina_christi AJ390051.1 DQ146613.1 AJ390354.1 Papistylus_grandiflorus AY911559.1 EF528504.1 Phylica_arborea GQ248666.1 AF328801.1 AF327603.1 Phylica_cryptandroides KP299482 KP299408 KP299439 Phylica_nitida AJ390053.1 AF328821.1 Phylica_paniculata GQ248667.1 AF328808.1 AF327606.1 Phylica_polifolia AJ225784.1 AF328805.1 AJ390373.1 Phylica_pubescens AF328814.1 Y16771.1 Phylica_pulchella KP299524 KP299447 Especie rbcL ITS trnL-F Phylica_spicata AF328816.1 AF327616.1 Phylica_trachyphylla KP299536 KP299460

Phylica_villosa KP299537 KP299461 KP299541 KP299464 Phylica_wittebergensis Pleuranthodes_hillebrandii AJ390045.1 KP299465 Polianthion_wichurae AY911554.1 EF528501.1 Pomaderris_angustifolia AY911568.1 EF528518.1 Pomaderris_elliptica AY911570.1 EF528519.1 Pomaderris_phylicifolia EF528520.1 Pomaderris_rugosa AJ390063.1 AF328826.1 AJ390363.1 Pomaderris_tropica AY911569.1 EF528517.1 Reissekia_smilacina AJ390041.1 DQ146614.1 AJ390345.1 Retanilla_trinervia AJ390056.1 AY642154.1 Reynosia_uncinata AJ390029.1 AJ390339.1 Rhamnella_franguloides AJ390027.1 AY626454.1 AJ390330.1 Rhamnidium_elaeocarpum AJ390030.1 AY626452.1 AJ390332.1 Rhamnus_alaternus AY626435.1 AY626416.1 Rhamnus_alnifolia EU676975.1 Rhamnus_alpina AY626438.1 AY626417.1 Rhamnus_cathartica L13189.2 AY626436.1 Rhamnus_crenata HQ427242.1 AY626443.1 AY626422.1 Rhamnus_fallax KP299542 KP299466 Rhamnus_glandulosa AY626446.1 AY626425.1 Rhamnus_lycioides AJ390070.1 AY626437.1 AJ390374.1 Rhamnus_prinoides AM235104.1 AY626432.1 AY626413.1 Rhamnus_pumila AY626433.1 AY626414.1 Rhamnus_utilis JF317492.1 Sageretia_thea AJ225785.1 AY626453.1 AJ225792.1 Schistocarpaea_johnsonii AJ390046.1 AY911539.1 AJ390349.1 Scutia_buxifolia AJ390033.1 AY626451.1 AJ390335.1 Shepherdia_argentea AJ225787.1 AJ390372.1 Shepherdia_canadensis U17039.1 GQ245525.1 Siegfriedia_darwinioides AJ390064.1 AF328827.1 EF528507.1 Spyridium_burragorang AY911594.1 EF528536.1 Spyridium_buxifolium AY911595.1 EF528508.1 Spyridium_eriocephalum AY911581.1 EF528522.1 Spyridium_globulosum AJ390058.1 AF328828.1 EF528529.1 Stenanthemum_centrale AY911605.1 EF528544.1 Especie rbcL ITS trnL-F Stenanthemum_complicatum AJ390059.1 AY911599.1 EF528539.1 Stenanthemum_humile AY911600.1 EF528540.1 Stenanthemum_petraeum AY911601.1 EF528541.1 Stenanthemum_pomaderroides AJ390057.1 AJ251690.1 Trichocephalus_stipularis AM235105.1 KP299545.1 KP299470.1 KY047623.1 Trevoa quinquenervia AY642155.1

Trymalium_angustifolium AY911580.1 EF528548.1 Trymalium_elachophyllum AY911576.1 EF528547.1 Trymalium_floribundum AJ390062.1 AY911578.1 AJ390362.1 Trymalium_ledifolium AJ390061.1 AF328829.1 EF528551.1 Trymalium_monospermum AY911577.1 EF528546.1 Trymalium_wayi AY911562.1 EF528509.1 Ventilago_viminalis AJ390035.1 AJ390337.1 Ziziphus_acidojujuba DQ146572.1 DQ146528.1 Ziziphus_amole HQ325595.1 DQ146579.1 DQ146535.1 Ziziphus_calophylla HQ325597.1 DQ146580.1 DQ146536.1 Ziziphus_lotus DQ146587.1 DQ146543.1 Ziziphus_mauritiana HQ325598.1 DQ146589.1 DQ146545.1 Ziziphus_ornata AJ390052.1 AJ390355.1 Ziziphus_rivularis JF265667.1 Ziziphus_rugosa HQ325599.1 DQ146601.1 DQ146557.1 Ziziphus_spina_christi HQ325596.1 DQ146604.1 DQ146558.1

Tabla 7. Modelos empleados para cada uno de los análisis de inferencia bayesiana.

rbcL trnL-F ITS cp DNA Molecular Total Model = Model = Model = Model = Model = Model = 012313+I+G 012310+G+ TIM3+I+G 012343+G+ 012340+I+G 012340+I+G +F F F +F +F partition = partition partition partition = partition = partition = 012313 = 012310 = 012032 012343 012340 012340 -lnL = -lnL = -lnL = -lnL = -lnL = -lnL = 7597.2865 8155.2260 15791.996 14269.9366 19773.6665 20059.1461 7 K = 158 K = 257 K = 234 K = 140 K = 97 K = 97

Figura 2

Fig.2 Árbol consenso del análisis de máxima parsimonia (izquierda) y de inferencia bayesiana (derecha) basados en el marcador molecular rbcL Los valores de bootstrap se muestran encima de las ramas. (Longitud de ramas 746, índice de consistencia 39, índice de retención 74). Los valores de probabilidad posterior se muestran encima de las ramas (derecha) Figura 3.

Fig 3. Árbol consenso del análisis de máxima parsimonia (izquierda) y de inferencia bayesiana (derecha) basados en el marcador molecular trnL-F. Los valores de bootstrap (izquierda) se muestran encima de las ramas. (Longitud de ramas 838, indice de consistencia 56, índice de retención 84). Los valores de probabilidad posterior se muestran encima de las ramas (derecha)

Figura 4.

Fig .4 Árbol consenso del análisis de máxima parsimonia basado en el marcador ITS. Los valores de bootstrap se muestran encima de las ramas. (Longitud de ramas 3289, indice de consistencia 28, indice de retencion 64). Figura 5.

Fig 5. Árbol consenso empleando el metodo de inferencia bayesiana con el marcador molecular ITS. Los valores de probabilidad posterior se muestran encima de las ramas. Figura 6.

Fig 6. Árbol consenso empleando el método de máxima parsimonia (izquierda) y de inferencia bayesiana (derecha) basados en la combinación de los marcadores moleculares rbcL y trnL-F. Los valores de bootstrap (izquierda) se muestran encima de las ramas. (Longitud de ramas 1394, indice de consistencia 46, índice de retención 71). Los valores de probabilidad posterior se muestran encima de las ramas (derecha). Figura 7.

Fig 7. Árbol consenso de los análisis de máxima parsimonia (izquierda) e inferencia bayesiana (derecha) basados en la combinación de los marcadores moleculares rbcL, trnL-F e ITS. Los valores de Bootstrap Izquierda) se muestran encima de las ramas (Longitud de ramas 2546, índice de consistencia 43, índice de retención 61). Los valores de probabilidad posterior se muestran encima de las ramas (derecha). * Se muestran Araracuara y Colubrina conformando un clado monofilético.

Figura 8.

Fig.8 Uno de los 10.000 árboles de máxima parsimonia empleando el marcador molecular rbcL. Los valores de bootstrap se muestran encima de las ramas. Las flechas negras indican los nodos que colapsan en el árbol consenso. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara. Figura 9.

Fig 9. Árbol MCC empleando el marcador molecular rbcL. Los valores de Probabilidad Posterior se muestran encima de las ramas. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara

Figura 10.

Fig. 10 Uno de los 10.000 árboles de máxima parsimonia empleando el marcador molecular trnL-F . Los valores de bootstrap se muestran encima de las ramas. Las flechas negras indican los nodos que colapsan en el árbol consenso. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara. Figura 11.

Fig. 11 Árbol MCC empleando el marcador molecular trnL-F. Los valores de Probabilidad Posterior se muestran encima de las ramas. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara

Figura 12.

Fig. 12 Uno de los 864 árboles de máxima parsimonia empleando el marcador molecular ITS Los valores de bootstrap se muestran encima de las ramas. Las flechas negras indican los nodos que colapsan en el árbol consenso. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara.

Figura 13.

Fig. 13 Árbol MCC empleando el marcador molecular ITS. Los valores de Probabilidad Posterior se muestran encima de las ramas. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara

Figura 14.

Fig. 14 Uno de los 720 árboles de máxima parsimonia empleando la combinación de marcadores moleculares del cloroplasto (rbcL, trnL-F). Los valores de bootstrap se muestran encima de las ramas. Las flechas negras indican los nodos que colapsan en el árbol consenso. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara. Figura 15.

Fig 15 Árbol MCC empleando la combinación de marcadores moleculares del cloroplasto (rbcL, trnL-F). Los valores de Probabilidad Posterior se muestran encima de las ramas. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara

Figura 16.

Fig. 16 Uno de los 17 árboles de máxima parsimonia empleando la combinación de marcadores moleculares (rbcL, trnL-F, ITS) Los valores de bootstrap se muestran encima de las ramas. Las flechas negras indican los nodos que colapsan en el árbol consenso. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara.

Figura 17.

Fig. 17 Árbol MCC empleando la combinación de marcadores moleculares (rbcL, trnL-F, ITS). Los valores de Probabilidad Posterior se muestran encima de las ramas. El rectángulo rojo indica el posicionamiento de Araracuara