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REPUPLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE ABOU BEKR BELKAID TLEMCEN

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE,

[Tapez DESle SCIENCES titre DE LA duTERRE ETdocument] DE L’UNIVERS DEPARTEMENT DE BIOLOGIE [Tapez le sous-titre du document]

Laboratoire de microbiologie appliquée à l’agroalimentaire, au biomédical et à l’environnement « LAMAABE »

THÈSE Présentée En vue de l’obtention du diplôme de Doctorat en Biologie Option : Microbiologie Par

Lotfi GHELLAI

Étude de l’effet de trois huiles essentielles sur la formation de biofilm à Staphylococcus aureus responsable d’infections nosocomiales au C.H.U de Tlemcen

Soutenue le 26/10/2016 devant le jury composé de :

Présidente Boucherit-Otmani Zahia Professeur, Université Tlemcen Directrice de thèse Hassaine Hafida Professeur, Université Tlemcen Codirecteur de thèse Zingg Walter Professeur, Université Genève Examinateur Abdelouahid Djamel E Professeur, Université Tlemcen Examinateur Kahloula Khaled Maître de Conférences Université Saïda

Année universitaire : 2016-2017

En tout premier lieu A mes chers parents pour leur amour…et leur soutien précieux pendant ces longues années de thèse.

A mon épouse ZK pour sa patience et son amour.

A mes frères et sœurs.

A ma belle famille.

A mes Amis frères, en particulier Abdelatif Bouabdelah, Ali Benachou, Ayoub Ougrine et Mohammed Bedi.

A tous les membres du laboratoire LAMAABE.

A tous mes collègues de l’Université.

A tous ceux-ci qu’ils trouvent le témoignage de ma courtoise reconnaissance

‘Dans la vie il n’y a pas une possibilité pour rendre

le possible impossible ! Mais il est possible que l’impossible d’aujourd’hui

soit le possible de demain!’

Remerciements

Je remercie Monsieur le Professeur Boumediène MOUSSA-BOUDJEMAA directeur du laboratoire LAMAABE de m’avoir permis de réaliser ce travail au sein du laboratoire. Mes remerciements s’adressent tout particulièrement à ma directrice de thèse, Madame le Professeur Hafida HASSAINE, de l’Université de Tlemcen, pour son encadrement constant et consciencieux, son engagement et son soutien, ses conseils précieux, dans un domaine aussi passionnant que porteur d’espoir ainsi que pour la pertinence de ses remarques. Je remercie sincèrement mon Codirecteur de thèse, Monsieur le Docteur Walter ZINGG, Service de Prévention et contrôle de l’Infection, Hôpitaux Universitaires de Genève (HUG), pour son soutien moral, son enthousiasme, sa gentillesse, ses conseils avisés et ses encouragements de tous les instants ainsi que pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et offert l’opportunité de progresser dans mes recherches. Je tiens à exprimer ma sincère gratitude à : Madame le Professeur Zahia BOUCHERIT OTMANI, de nous avoir honoré par sa présence en acceptant de présider le jury de cette thèse. Monsieur le Professeur Djamel ABDELWAHID d’avoir accepté, avec toute modestie, d’examiner mon travail de thèse. Monsieur le Docteur Khaled KAHLOULA d’avoir cordialement accepté d’être l’un des examinateurs de cette thèse. Je remercie également : Monsieur le Professeur William KELLEY, Directeur du laboratoire de Microbiologie et Médecine Moléculaire au Centre Médical Universitaire de Genève, de m’avoir accueilli dans son laboratoire. Madame le Docteur Adriana RENZONI pour son aide précieuse, pour sa sympathie exemplaire, son dévouement et son hospitalité. Mes sincères remerciements vont également à Messieurs les Professeurs : Stephan HARBARTH, Didier PITTET et Stéphane EMONET, à Monsieur le Docteur Abdessalam CHERKAOUI et à Monsieur l’Ingénieur Yves MARTIN. Finalement, Je remercie chaleureusement le personnel du CHU de Tlemcen, les membres du laboratoire LAMAABE, les membres du laboratoire de Microbiologie et médecine moléculaire du CMU Genève et toute l’équipe du service de prévention et contrôle de l’infection du HUG, Genève.

Table des matières

Introduction……………………………………………………………………………… 1

Partie I. Synthèse bibliographique……………………...…………………………...... 3 Chapitre I : Infections associées aux soins et S. aureus……………………………….….. 3 1. Infections associées aux soins………………………………………………………….. 3 1.1. Fréquence des infections associées aux soins………………………………………. 3 1.2. Gravité des infections associées aux soins………………………………………..... 4 1.3. Germes impliqués ………………………………………………………………….. 4 2. Staphylococcus aureus…………..……………….………………………….………… 4 2.1. Description……………………..…….…………………………………………...... 4 2.2. Taxinomie…………………...…..…..…………………………………...…….….... 5 2.3. Caractères physiologiques et culturaux……..…………...……………….……….... 6 2.4. Pouvoir pathogène de S. aureus…………………………...…….….……...... 7 2.5. S. aureus associé aux biofilms……………………………….…………………...… 9 2.6. Résistance de S. aureus associé au biofilm ……………………………...... … 9

Chapitre II : Organisation du biofilm chez S. aureus…………..…………………………. 11 1. Composants du biofilm à S. aureus…………………………………………………...... 11 1.1. Microorganisme…………..……………………………………………………….... 11 1.2. Matrice……………………………………………………………………………… 11 1.3. Surface……………………………………………………………………………… 12 2. Bases moléculaires de la formation du biofilm chez S. aureus sur implants médicaux.. 12 2.1. Adhésion aux surfaces abiotiques…………………………………………………... 14 2.1.1. Protéines de surface (Adhésines)……………………………………………… 14 2.1.1.1. MSCRAMM……………………………………………………………… 14 2.1.1.2. Autolysines……………………………………………………………….. 15 2.1.2. Acides teichoïques…………………………………………………………….. 15 2.2. Agrégation intercellulaire…………………………………………………………... 16 2.2.1. Adhésine Intercellulaire Polysaccharidique (PIA)…………………………….. 16 2.2.2. Protéine associée au biofilm (BAP)………………………………………….... 18 2.2.3. Protéines SasG et Pls…………………………………………………………... 18 2.3. Maturation et dispersion……………………………………………………………. 18 3. Communication intercellulaire au sein du biofilm……………………………………... 19 4. Régulation génétique du biofilm chez S. aureus…………………………………………..... 20 5. Lutte contre les biofilms à S. aureus associés aux dispositifs médicaux………………. 22 5.1. Modification de la surface des implants…………………………………………..... 22 5.2. Inhibition ou perturbation de la formation de biofilm……………………………… 23 5.2.1. Substances anti-biofilm………………………………………………………... 23 5.2.2. Quorum sensing……………………………………………………………….. 23 5.2.3. Traitement des biofilms préformés…………………………………………..... 23

Chapitre III : Huiles essentielles et biofilm à S. aureus………….……………………..… 25 1. Généralités sur les huiles essentielles………………………………………………..… 25 2. Composition chimique des huiles essentielles………………………………………..... 26 3. Mode d’action des huiles essentielles………………………………………………...... 28

Partie II. Matériel et Méthodes………………………………...... 30 1. Lieu d’étude………………………………...... 30 2. Prélèvements……………………………………………...... 30 3. Ensemencement et isolement………………………………...... 30 4. Identification des souches………………………………...... 30 4.1. Production de catalase …………………...... 31 4.2. Oxydase………………………………....………………………………...... 31 4.3. Test de Coagulase………………………………....………………………………. 31 4.4. Galerie API 20 STAPH………………………………....………………………… 31 5. Conservation des souches………………………………....…………………………… 31 6. Détection de la production de biofilm chez les souches isolées……………………….. 32 6.1. Méthode de microplaque 96 puits………………………………...... 32 6.1.1. Classification des souches selon leur pouvoir adhérent……………………. 33 6.2. Détection de la production de slime sur milieu rouge Congo……………………. 33 6.3. Identification moléculaire des souches hautement adhérentes …………………… 34 6.3.1. Test d’agglutination au latex Pastorex Staph-Plus…………………………. 34 6.3.2. MALDI-TOF MS………………………………....………………………... 35 6.3.3. Recherche du gène femA………………………………...... 36 7. Etude de l’Antibiorésistance chez les souches de S. aureus…………………………… 36 7.1. Antibiogramme………………………………....………………………………..... 36 7.2. Recherche du gène mecA ………………………………...... 37 8. Etude de l’expression de l’opéron ica (intercellular adhesion locus) chez les souches hautement adhérentes………………………………....………………………………...... 38 8.1. Etablissement des courbes de croissance………………………………...... 38 8.2. Procédure d’extraction de l’ARN total ………………………………...... 38 8.2.1. kit RNeasy Plus Mini………………………………...... 39 8.2.2. Préparation des suspensions bactériennes………………………………...... 39 8.2.3. Extraction d’ARN………………………………...... 40 8.2.4. Mesure de la quantité d’ARN extraite………………………………...... 40 8.3. PCR en temps réel (méthode TaqMan)………………………………...... 41 8.3.1. Kit Eurogentec RT-QP2X-03………………………………...... 42 8.3.2. Procédure de la PCR en temps réel………………………………...... 44 8.4. PCR inverse en temps réel………………………………....……………………… 44 8.4.1. kit Invitrogen Cat no. 11731-023………………………………...... 44 8.4.2. Procédure de la QRT-PCR en temps réel………………………………...... 47 9. Detection du PIA par Dot Blotting ………………………………...... 47 10. Etude de l’effet des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de S. aureus 49 10.1. Matériel végétal………………………………....……………………………….. 49 10.1.1. Eucalyptus globulus………………………………....……………………. 49 10.1.2. Rosmarinus officinalis………………………………....………………….. 50 10.1.3. Thymus capitatus………………………………....……………………….. 51 10.2. Extraction des huiles essentielles ………………………………...... 53 10.3. Effet des huiles essentielles vis-à-vis de S. aureus………………………...... 53 10.3.1. Effet des huiles essentielles vis-à-vis de la forme planctonique de S. aureus…………………………....…………………………………………………...... 53 10.3.2. Effet des huiles essentielles vis-à-vis de la forme sessile de S. aureus…... 54 10.4. Effet de la povidone iodée vis-à-vis de S. aureus………………………...... 55 10.4.1. Effet de la povidone iodée vis-à-vis de la forme planctonique de S. aureus…………....………………………………………………………………...…… 55 10.4.2. Effet de la povidone iodée vis-à-vis de la forme sessile de S. aureus…... 56 10.5. Effet combiné des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de la forme sessile de S. aureus………………………………………………………………… 56

Partie III. Résultats et Discussion………………………………...... 58 1. Prélèvements………………………..……………………....………………………….. 58 2. Analyses microbiologiques ……………………….……………………...... 58 2.1. Isolement des staphylocoques………………………………...... 58 2.2. Sélection des souches de S. aureus………………………………...... 59 2.3. Identification biochimique………………………………...... 60 2.4. Répartition des souches de S. aureus selon différents services…………………. 60 3. Evaluation de la formation du biofilm chez les souches de S. aureus isolées des cathéters………………………………....………………………………...... 61 3.1. Technique de microplaque 96 puits………………………………...... 61 3.2. technique du rouge Congo agar (RCA)………………………………...... 65 4. Identification moléculaire des souches de S. aureus hautement adhérentes…………… 67 4.1. Test d’agglutination au latex………………………………...... 67 4.2. MALDI-TOF MS………………………………....……………………………... 68 4.3. Recherche du gène femA………………………………....……………………… 68 5. Antibiorésistance………………………………....………………………………...... 68 5.1. Antibiogramme………………………………....……………………………….. 68 5.2. Recherche du gène mecA………………………………...... 71 6. Etude de l’expression du gène icaA chez les souches de S. aureus fortement adhérentes………………………………....………………………………...... 72 6.1. Détermination des phases de croissance………………………………...... 72 6.2. Détection de l’opéron ica et niveau d’expression du gène icaA………………… 75 6.2.1. Extraction d’ARN total………………………………...... 75 6.2.2. Détection et quantification du gène icaA……………………...... 76 7. PIA Dot Blotting……………………….……………………....…………………...….. 84 8. Effet antibactérien des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de S. aureus……………………………....…………………………………………….….…. 86 8.1. Extraction des huiles essentielles…………………………………………...... 87 8.2. Effet des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de la forme planctonique de S. aureus………………………..…………………………...... 87 8.3. Effet des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de la forme 89 sessile de S. aureus………………………………...…………………………...... 8.4. Effet des huiles essentielles en combinaison avec la povidone iodée vis-à-vis de la forme sessile de S. aureus…………………………...……………………………… 92

Conclusion ……………………………………………………………………………….. 95 Références ………………………………………………….……………………………. 97 Annexes

Liste des abréviations

Agr Accessory gene regulator AIP autoinducing peptide arl autolysis related locus BAP Biofilm Associated Protein CMB Concentration minimale bactéricide CMI Concentration minimale inhibitrice E Eucalyptus EPS exopolysaccharide FIC Fractional inhibitory concentration FICI Fractional inhibitory concentration index HE Huile essentielle HEE Huile essentielle d’E. globulus HER Huile essentielle de R. officinalis HET Huile essentielle de T. capitatus Ica Intercellular adhesion locus MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time Of Flight CMEB Concentration Minimale Eradicatrice du Biofilm CMIB Concentration Minimale Inhibitrice du Biofilm MRSA méticillin-résistant S.aureus MS Mass Spectrometry MSSA S.aureus sensible à la méticilline MSCRAMM Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules m/z masse/charge PIA Polysaccharide intercellular adhesin PNAG Poly N-acetylglucosamineglycans PVI Povidone iodée QS Quorum sensing R Rosmarinus rbf regulator biofilm formation SarA Staphylococcal accessory regulator T Thymus

Liste des figures

Figure 1 Facteurs de virulence de S. aureus……………………...... 8 Figure 2 Étapes de formation du biofilm chez S. aureus……………………………………. 13 Figure 3 Biofilm de S. aureus formé sur un implant médical……………………………….. 13 Figure 4 Organisation du locus ica et synthèse de l'adhésine intercellulaire polysaccharidique………………………………………………………………….. 17 Figure 5 Mécanisme d’action des molécules du quorum sensing chez S. aureus……….….. 20 Figure 6 Sites d’action des huiles essentielles sur la cellule bactérienne…………………… 29 Figure 7 Principe de la chimie Taqman……………………………………………………... 41 Figure 8 Photographie des feuilles d’Eucalyptus globulus………………………………….. 49 Figure 9 Photographie de Rosmarinus officinalis…………………………………………… 51 Figure 10 Photographie de Thymus capitatus………………………………………………… 52 Figure 11 Staphylococcus aureus : (a) colonies sur gélose Chapman, (b) coloration de Gram ………..……………………………………………………………………... 59 Figure 12 Distribution des souches de S. aureus étudiés dans les différents services du CHU de Tlemcen………………………………………………………………………… 61 Figure 13 Détection de la formation de biofilm par coloration au cristal violet sur microplaque en polypropylène chez 50 souches de S. aureus testées après culture de 24h à 37°C…………………………………………………………………….... 64 Figure 14 Aspect des colonies de S. aureus sur milieu RC (Rouge Congo) ………………… 65 Figure 15 Pourcentage des souches de S. aureus productrices de biofilm ou slime par deux méthodes : A-microplaque 96 puits, B-milieu rouge Congo………………………. 66 Figure 16 Test Pastorex ‘Staph-Plus latex agglutination’ (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France)……………………………………………………………………………... 67 Figure 17 Courbes de croissance de S. aureus incubé sous agitation (200 rpm) à 37°C dans du bouillon cœur cervelle…………………………………………………..…….... 74 Figure 18 Quantification d’ARNm (3 réplicats) des gènes ARN 16S et ica par QRT-PCR en temps réel en phase de croissance exponentielle des souches (LMB20327, LMB20330, LMB20338, LMB20359, Sa113ATCC35556 et Sa113 ica ko tet)………………………………………………………………………………….. 78 Figure 19 Quantification d’ARNm (3 réplicats) des gènes ARN 16S et ica par QRT-PCR en temps réel en phase de croissance stationnaire des souches (LMB20327, LMB20330, LMB20338, LMB20359, Sa113ATCC35556 et Sa113 ica ko tet)………………………………………………………………………………….. 79 Figure 20 Les niveaux d’expression de l’opéron ica chez les souches de S. aureus fortement productrices de biofilm…………………………………………………………….. 81 Figure 21 Résultat de la détection du PIA par Dot Blotting…………………………….…… 85

Liste des tableaux

Tableau 1 Protéines de surface (MSCRAMM) impliquées dans la formation de biofilms chez S. aureus ………………………………………...... 15 Tableau 2 Les principaux gènes régulateurs impliqués dans la formation de biofilms chez S. aureus……………………………………………………………………...... 21 Tableau 3 Les principaux constituants de quelques huiles essentielles à activité antimicrobienne ……………………………………………………………...... 27 Tableau 4 Antibiotiques testés vis-à-vis les souches de S. aureus étudiées……………...... 37 Tableau 5 Mélange réactionnel de la PCR en temps réel (méthode Taqman)…………….... 43 Tableau 6 Composition des mélanges réactionnels 1 et 2 utilisés dans la QRT-PCR en temps réel………………………………………………………………………… 46 Tableau 7 Diamètres d’inhibition (mm) des différents antibiotiques testés vis-à-vis des quatre souches fortement productrices de biofilm.……………….....………….... 69 Tableau 8 Phénotypes de résistance aux antibiotiques testés des quatre souches hautement productrices de biofilm ………………………………………………………….. 70 Tableau 9 Phases de croissance des souches de S. aureus en fonction du temps ………….. 72 Tableau 10 Quantité d’ARN extraite (ng/µL) pendant la phase de croissance exponentielle et stationnaire des souches de S. aureus ………………………………...………. 76 Tableau 11 CMIB et CMEB des HEs et de la PVI vis-à-vis les souches de S. aureus hautement productrices de biofilm. HE : huile essentielle, PVI : povidone iodée, HEE : HE d’E. globulus, HER : HE de R. officinalis, HET: HE de T. capitatus... 90 Tableau 12 Détermination des FICIs des HEs en combinaison avec la PVI contre le biofilm des souches de S. aureus. HE : huile essentielle, PVI : povidone iodée, HEE : HE d’E. globulus, HER : HE de R. officinalis, HET: HE de T. capitatus, FIC : fraction de concentration inhibitrice, FICI : l’index de FIC……………………... 94

INTRODUCTION

Introduction

Staphylococcus aureus est l’une des causes majeures des infections communautaires et nosocomiales. Ce germe est responsable d’infections aigues et chroniques dont la plupart sont dues à sa capacité à adhérer sur les implants médicaux et à former des biofilms. D’après le Centre de coordination de lutte contre les infections nosocomiales, 65% des infections bactériennes sont dues à la présence des biofilms (CCLIN, 2014). En outre, les infections associées aux biofilms constituent un problème majeur en clinique et sont très souvent la cause de l’augmentation de la morbidité et du coût de traitement.

Parallèlement les mauvaises pratiques d’hygiène au cours des étapes précédant l’insertion d’un cathéter pourraient constituer une porte d’entrée pour certains germes dont S. aureus. Au fil des années, plusieurs antiseptiques, telle que la povidone iodée, ont été utilisés dans la décontamination de la peau afin de supprimer ces micro-organismes pathogènes transitoires sur la surface de la peau et réduire la flore résidente à un niveau bas. S. aureus qui, malheureusement, continue à évoluer sa résistance face aux antibiotiques et antiseptiques utilisés en pratique courante, s’engage dans un processus de formation d’une communauté structurée de cellules bactériennes connue sous le nom de biofilm ; à l’intérieur de celui-ci les bactéries développent plusieurs types d’interactions et accroissent leurs résistances aux agents antimicrobiens et aux défenses immunitaires de l’hôte ce qui constitue un véritable problème de santé publique.

Face à cette situation et en tenant compte le nombre limité d’antibiotiques en cours de développement, les recherches s’orientent vers l’exploration des ressources naturelles comme source alternative de molécules antimicrobiennes. Environ 3000 huiles essentielles extraites des hespéridés ou des plantes aromatiques et médicinales sont produites et utilisées de part le monde dans des domaines aussi variés que la cosmétique, la parfumerie, l’agro-alimentaire, la pharmacie et l’aromathérapie [(Baser et Buchbauer, 2009) ; (Fillatre, 2011)].

C’est dans cette optique que s’inscrit notre travail qui a comme objectifs spécifiques :

- l’isolement et l’identification phénotypique d’une collection de souches de S. aureus provenant de cathéters prélevés sur des patients hospitalisés plus de 48h au niveau de différents services du CHU de Tlemcen,

Introduction

- la détection de la formation du biofilm chez ces souches par des méthodes classiques, - la caractérisation et le typage moléculaire des souches fortement productrices de biofilm, - la recherche et étude de l’expression de l’opéron ica (intercellular adhesion locus) et l’adhésine intercellulaire polysaccharidique (PIA) chez les souches fortement productrices de biofilm, - l’étude de l’effet des huiles essentielles de trois plantes aromatiques (Eucalyptus globulus, Rosmarinus officinalis et Thymus capitatus) vis-à-vis de la forme planctonique et sessile de S. aureus, - l’étude de l’effet de la combinaison povidone iodée/huiles essentielles sur le biofilm de S. aureus.

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique

Chapitre I : Infections associées aux soins et S. aureus

1. Infections associées aux soins Une infection est dite associée aux soins si elle survient au cours ou au décours d’une prise en charge d’un patient, et si elle n’était ni présente, ni en incubation au début de sa prise en charge. Lorsque l’état infectieux au début de la prise en charge n’est pas connu précisément, un délai d’au moins 48 heures ou supérieur à la période d’incubation est couramment accepté pour définir une infection associée aux soins. Dans le cas des infections du site opératoire, on considère comme associées aux soins celles survenant dans les 30 jours suivant l’intervention ou s’il y a mise en place d’un implant, d'une prothèse ou d’un matériel prothétique dans l’année qui suit l’intervention (CTINILS, 2007). Les facteurs contribuant à la survenue des infections associées aux soins sont très nombreux et inter-reliés les uns aux autres. Ils peuvent être regroupés en trois grandes rubriques : Les facteurs liés aux malades, les expositions aux risques infectieux liées aux actes diagnostiques et thérapeutiques et les insuffisances dans l’organisation des soins (Vincent- Boulétreau, 2004).

1.1. Fréquence des infections associées aux soins Les données relatives à ce problème ne sont pas disponibles à l’échelle de tous les pays. Quand elles existent, elles sont exprimées soit sous forme de taux de prévalence, soit sous forme de taux ou de densité d’incidence (Hamza, 2003). La fréquence internationale des infections associées aux soins varie de 5 à 10% des hospitalisations (Savey, 2004). Les études réalisées entre 2005 et 2006 en Europe et aux Etats-Unis révélaient que la fréquence des infections associées aux soins variait entre 5 et 15% des patients hospitalisés ; elles peuvent affecter 9 à 37% des patients admis en unités de soins intensifs avec des taux de mortalité bruts de 12% à 80% [(Vincent, 2003) ; (Pittet et al., 2006)]. En France, l’enquête nationale de prévalence réalisée en 2006, rapportait la prévalence des infections associées aux soins à 5,38% (Vincent et al., 2008). Dans la région méditerranéenne, une étude multicentrique menée par l’OMS dans 27 hôpitaux (Algérie, Égypte, Italie, Maroc et Tunisie) a montré que la prévalence des infections nosocomiales est de 10,5 % ; elle est plus élevée dans les centres non universitaires et dans les hôpitaux de taille moyenne (Khouchoua, 2013). Selon une enquête réalisée par Hassaine (2008), le taux de prévalence de patients infectés au CHU de Tlemcen était estimé à 16,85%.

Synthèse bibliographique

1.2. Gravité des infections associées aux soins L’infection associée aux soins (dite dans le passé nosocomiale), est un problème de santé publique majeur qui concerne tant la qualité des soins que les coûts importants pesant sur l'économie du pays (Durand-Zaleski, 2002). Leur incidence étant en hausse, ces infections entraînent des souffrances et des décès qui auraient pu être évités (SCFP, 2009). Les infections associées aux soins les plus graves et les plus meurtrières sont les septicémies, les pneumonies, les infections du tractus gastrointestinal, les infections affectant plusieurs sites, les infections de la peau et des tissus mous et les infections du site opératoire (Fabbro-Peray et al., 2007). Parmi les autres infections associées aux soins courantes, citons les infections des voies urinaires et les infections locales associées à un cathéter (SCFP, 2009).

1.3. Germes impliqués Les microorganismes responsables d’infections associées aux soins appartiennent à la flore hospitalière qui est celle des malades, des soignants et de l’environnement hospitalier. Les bactéries sont responsables d’environ 70% de ces infections ; les espèces les plus souvent en cause, sont par ordre décroissant de fréquence: - Escherichia coli. - Staphylococcus aureus. - Pseudomonas aeruginosa. - Staphylocoques coagulase négative. - Entérobactéries du genre Klebsiella, Enterobacter et Serratia. La fréquence de ces différentes bactéries est variable d’un hôpital à un autre et d’un service à un autre, en fonction de l’écologie bactérienne locale (Chakroun, 2009).

2. Staphylococcus aureus 2.1. Description S.aureus, espèce type du genre Staphylococcus, est plus communément appelée staphylocoque doré ; du grec staphylo, grappe de raisin (apparait en amas à l'examen microscopique), et aureus, doré (pigmentation jaune orange des colonies sur milieu gélosé) (Howard et Kloos, 1987). Les espèces du genre Staphylococcus sont généralement classées en deux groupes sur la base de leur capacité à produire une coagulase libre : les staphylocoques à coagulase 4

Synthèse bibliographique positive (SCP) dont S. aureus, généralement considérés comme pathogènes et les staphylocoques à coagulase négative (SCN), réputés moins dangereux (Pellerin et al., 2010). Le peptidoglycane est le constituant majeur de la paroi cellulaire de S.aureus ; il représente plus de 50% de la masse de la paroi (Waldvogel, 1990). Les acides teichoïques, autres constituants de la paroi contribuent à 40% de la masse de cette dernière (Knox et Wicken, 1973). Près de 90% des souches cliniques de S. aureus possèdent une capsule polysaccharidique qui peut être perdue après culture [(Karakawa et Vann, 1982) ; (Thakker et al., 1998)]. Les staphylocoques sont habituellement associés à la peau, aux glandes cutanées et aux muqueuses des animaux à sang chaud (Pellerin et al., 2010). Chez l’homme, la niche écologique dominante de S. aureus est la partie antérieure du nez (Kluytmans et al., 1997). En effet, 60% des sujets normaux hébergent S. aureus de façon intermittente, 20% sont des porteurs permanents et 20% ne le sont jamais (Kluytmans et al., 1997). S.aureus colonise aussi l’oropharynx, les mains et certaines autres régions du corps, en particulier chaudes et humides (creux axillaire, aisselles et périnée) [(Fauchere et Avril, 2002) ; (Avril et al., 2003) ; (Nauciel, 2005)]. Cependant, ces bactéries très résistantes, une fois éliminées dans le milieu extérieur, sont fréquemment retrouvées dans l’environnement, le sol, les poussières, l’eau et dans certains produits alimentaires (laitages, conserves salées) (Breche et al., 1988).

2.2. Taxinomie Du point de vue taxonomique, le genre Staphylococcus appartient au phylum des Firmicutes, à la classe des Bacilli et à l’ordre des Bacillales (Garrity et al., 2007). Le genre Staphylococcus a été classé au sein de la famille des Micrococcaceae avec notamment les genres Micrococcus et Stomatococcus (Pellerin et al., 2010). Ce genre a été récemment déplacé dans une nouvelle famille, les Staphylococcaceae (Schleifer et Bell, 2010). En plus de Staphylococcus, genre le plus important au sein de cette famille bactérienne, il existe quatre autres genres moins connus, Gemella, Jeotgalicoccus, Macrococcus et Salinicoccus (Prescott et al., 2003). A ce jour, le genre Staphylococcus comprend 45 espèces, dont 10 sont divisées en deux sous-espèces ou plus (Euzéby, 2014). Le contenu de G+C des membres du genre Staphylococcus est compris entre 30 et 39% (Pellerin et al., 2010). Les séquences d'ARN ribosomal (ARNr) 16S sont très conservées

Synthèse bibliographique

(90 % à 99 % de similitudes au sein du genre Staphylococcus) ; l'ARNr 16S ne serait donc pas l'outil idéal pour analyser les liens de parenté entre ces espèces. Tandis que, les séquences du gène gap (codant la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase) possèdent 24 % à 96 % de similitudes parmi les espèces de staphylocoques, ce qui constitue un outil alternatif de classification moléculaire basée sur la comparaison phylogénétique de ces gènes. Le genre Staphylococcus comprend 4 groupes principaux :  Groupe I : S. hyicus, S. chromogenes, S. intermedius, S. pseudintermedius et S. delphini.  Groupe II : S. sciuri et S. lentus.  Groupe III : S. haemolyticus, S. xylosus, S. muscae, S. simulans, S. schleiferi, S. carnosus subsp. carnosus, S. caprae et S. felis.  Groupe VI : S. aureus, S. hominis subsp. hominis, S. warneri, S. epidermidis, S. capitis subsp. capitis et S. lugdunensis (Ghebremedhin et al., 2008).

2.3. Caractères physiologiques et culturaux Staphylococcus aureus est comme tous les autres représentants du genre Staphylococcus, un coque à coloration de Gram positive, mesurant de 0,5 à 1,5μ de diamètre [(Fasquelle, 1974) ; (Couture, 1990)]. Le staphylocoque doré est asporulé, immobile et ne possédant pas de capsule visible au microscope optique sauf pour de très rares souches, d'autres forment des colonies mucoïdes et sont entourées d'une pseudocapsule (Le Minor et Veron, 1990). Il est oxydase négative, catalase positive et aéro-anaérobie facultatif ; Une seule sous espèce est anaérobie stricte (S. aureus subsp. anaerobius) (Pellerin et al., 2010). Par ailleurs, les principaux critères d’identification pris en considération sont la production de catalase, la capacité à métaboliser les sucres et la production d’arginine dihydrolase (ADH). Les souches potentiellement pathogènes sont caractérisées par leur aptitude à synthétiser une coagulase dite libre (Brun et al., 2003). S. aureus, S. hyicus et S. intermedius sont les trois représentants majeurs coagulase positive qui ont un rôle déterminant en pathologie humaine et animale. En plus de la coagulase libre, il existe une autre coagulase dite liée ou "clumping factor". Cette protéine fixée à la paroi bactérienne ne peut être diffusible dans le milieu qu’après autolyse [(Jeljaszewicz et al., 1983) ; (Le Minor et Veron, 1990) ; (Avril et al., 2003)].

Synthèse bibliographique

L’ADNase (ou thermonucléase) est une endonucléase thermostable. Il s’agit d’une enzyme relativement spécifique des trois espèces : S. aureus, S. hyicus et S. intermedius. Par contre, la plupart des Staphylocoques dorés non entérotoxiques possèdent une DNAse thermolabile. D’après certaines études il existe une très forte corrélation (99-100% des cas) entre la coagulase et la thermonucléase chez le staphylocoque doré [(Menzies, 1977) ; (Park et al., 1980)]. La phosphatase hydrolysant les différentes molécules phosphatées cellulaires est une autre enzyme caractéristique du staphylocoque doré. Parmi les phosphatases alcalines et acides, seule la phosphatase acide qui est partiellement libérée dans le milieu et peut donc être recherchée (Kloos et al., 1981). Sur milieux solides, S. aureus forme de petites colonies lisses, luisantes, rondes, bombées, opaques et plus ou moins pigmentées en jaune. En milieu liquide, il produit un trouble homogène et parfois un dépôt et un voile en surface (Kloos et Shleifer, 1975). S. aureus peut croître facilement sur les milieux usuels, de même que sur la plupart des milieux favorisant la croissance des autres bactéries à Gram positif. La température optimale de croissance est de 37°C et le pH optimal est de 7,5 mais de grandes variations sont tolérées [(Fasquelle, 1974) ; (Couture, 1990) ; (Le Minor et Veron, 1990)]. Bien que cette espèce soit mésophile, elle peut néanmoins assurer une croissance à une large gamme de températures, généralement entre 7 et 47,8°C (Smith et al., 1983). Certaines espèces du genre Staphylococcus sont capables de vivre dans des environnements hostiles (Pellerin et al., 2010). Les staphylococci sont tolérants vis-à-vis de hautes concentrations en sel, par exemple en bouillon hypersalé à 7% de NaCl et certaines souches peuvent croitre jusqu’à une concentration de 20% de NaCl [(Wilkinson, 1997) ; (Pellerin et al., 2010)].

2.4. Pouvoir pathogène de S. aureus S. aureus étant la première cause d’infections bactériennes à travers le monde (Weems, 2001) est impliqué dans 32 à 44% des infections cutanées et des tissus mous, 20 à 25% des pneumonies et 19 à 25% des bactériémies (Diekema et al., 2001). La peau et la muqueuse représentent une excellente barrière contre l’invasion locale des tissus par S. aureus. Cependant, si l’une des deux barrières est affranchie suite à une intervention chirurgicale ou un traumatisme, S. aureus peut atteindre les tissus sous-jacents (Harris et al., 2002). Les porteurs permanents ont une densité bactérienne plus élevée et un risque plus

Synthèse bibliographique important d’infection (Vandenbergh et Verbrugh, 1999). La figure 1 montre la structure de S. aureus avec les différents constituants contribuant à sa virulence. La transmission des staphylocoques s’effectue essentiellement par contact direct à partir de sujets colonisés ou de lésions staphylococciques ouvertes, cutanées ou muqueuses. La transmission indirecte est plus rare (objets divers, vêtements, literie, etc.) et elle est exceptionnellement aéroportée (Trotot-Voilliot, 2012). S. aureus est un germe ubiquitaire ayant une grande faculté de résistance dans l’environnement inanimé (surfaces, matériel) et peut survivre plusieurs semaines (Davido, 2010). En outre, Sattar et al. (2001) ont montré que la transmission de cette bactérie vers les bouts de doigts à partir de vêtements et literie, couramment utilisés, était plus fréquente quand les mains sont humides. En effet, les mains sont le vecteur principal de transmission interhumaine. S. aureus se disperse dans le milieu environnant par l’intermédiaire des mains après contact de celles-ci avec les fosses nasales et/ou les surfaces contaminées (Davido, 2010).

Figure 1. Facteurs de virulence de S. aureus (Franklin et Lowy, 1998)

Synthèse bibliographique

2.5. S. aureus associé aux biofilms Depuis quelques années, il est apparu que l’importance des biofilms microbiens dans le milieu médical est capitale, puisque 65 % des infections bactériennes chez l’homme impliquent des biofilms (Chicurel, 2000). Ces infections liées aux biofilms impliquent souvent des bactéries de la flore commensale de la peau et des muqueuses comme S. aureus. Les staphylocoques sont responsables de la grande majorité de ce type d’infections [(Costerton et al., 1999) ; (Otto, 2008)]. Les ostéomyélites, les endocardites, les infections des plaies chroniques (notamment chez les diabétiques) et les infections associées aux dispositifs médicaux représentent les principales infections liées à la présence de biofilm de S. aureus (Archer et al., 2011). Les biofilms peuvent se former à la surface ou à l’intérieur de dispositifs médicaux implantés dans l’organisme. Les staphylocoques sont parmi les principaux germes qui peuvent contaminer ces implants médicaux qui sont à l’origine de 82% des infections nosocomiales (Archibald, 1997). Les biofilms peuvent être composés d’une ou plusieurs espèces de microorganismes selon le type de dispositif implanté et la durée d’implantation dans l’organisme du patient. La formation de biofilms dépend de plusieurs facteurs : nombre de cellules présentes, vitesse du flux du liquide dans lequel se trouve le dispositif et propriétés physicochimiques de la surface (Donlan, 2001). Par ailleurs, les infections associées aux biofilms des staphylocoques sont généralement homogènes et non mélangés avec d'autres espèces (Arciola et al., 2005).

2.6. Résistance de S. aureus associé au biofilm Les bactéries sous forme sessiles sont plus résistantes à la réponse immune de l’hôte que leurs congénères planctoniques : l’efficacité de la phagocytose est donc diminuée en présence de biofilms. De plus, les bactéries associées aux biofilms sont 10 à 1000 fois plus résistantes à l’action des agents antimicrobiens que celles sous forme planctonique (Allison et al., 2000). Cette résistance multifactorielle accrue, est liée aux conditions de vie dans le biofilm (hétérogénéité, accès aux nutriments, oxygène etc.) qui modifient les propriétés physiologiques des micro-organismes (Roux et Ghigo, 2006). Ainsi, les propriétés pharmacodynamiques des agents antimicrobiens sont altérées en présence de biofilms, ils sont donc peu efficaces ce qui rend l’infection difficile à traiter (Utili, 2007).

Synthèse bibliographique

Selon certains auteurs, l’insensibilité aux antibiotiques de la famille des β-lactamines pourrait être reliée au faible métabolisme des cellules « slow growth cells » dans les couches profondes du biofilm [(Gilbert et Brown, 1998) ; (Fux et al., 2004) ; (Fux et al., 2005)]. La tolérance des biofilms aux antibiotiques pourrait également être expliquée par la notion de cellules persistantes qui sont des sous-populations très minoritaires de bactéries hyper-résistantes ayant survécu à l’action d’un antibiotique [(Keren et al., 2004) ; (Lewis, 2008) ; (Singh et al.,2009)].

Synthèse bibliographique

Chapitre II : Organisation du biofilm chez S. aureus Généralement, dans les conditions expérimentales les bactéries sous forme libre (planctonique) se multiplient favorablement sur milieux de culture qu’ils soient liquides, semi-solides ou solides, habituellement riches en éléments nutritifs nécessaires à leur croissance. Cette situation, dans le milieu naturel, n’est souvent pas accomplie et ces microorganismes adoptent alors un autre mode de vie en communauté, appelé biofilm. Il est présent dans tous les environnements et est associé à des surfaces biotiques (muqueuses, dents, etc.) ou abiotiques (équipements hospitaliers, dispositifs médicaux, etc.) [(Costerton, 1999) ; (Roux et Ghigo, 2006)]. Le biofilm est défini comme un ensemble de cellules microbiennes agrégées, entourées d’une matrice polymérique autoproduite et pouvant contenir des composants de l’hôte (Hall-Stoodley et al., 2012).

1. Composants du biofilm à S. aureus 1.1. Microorganisme Le biofilm peut être constitué de cellules d’une même espèce microbienne, c’est le biofilm « homogène » ou monomicrobien, cette catégorie est rare dans le milieu naturel. Dans la nature, comme dans le milieu artificiel, la présence d’un microorganisme sur une surface suscite l’adhésion d’autres, on parle alors de biofilm « hétérogène » ou polymicrobien [(Stoodley et al., 1994) ; (Sutherland, 2001)]. Chez les staphylocoques, il est rare de trouver plus d’une souche bactérienne au sein d’un même biofilm. Ceci pourrait s’expliquer par des mécanismes de quorum sensing spécifiques des staphylocoques qui inhiberaient l’expression des facteurs de virulence d’autres bactéries (Arciola et al., 2005). A l’instar d’autres bactéries, l’ensemble des caractéristiques structurales et physicochimiques du biofilm confère à S. aureus qui le compose, des propriétés spécifiques de morphologie, de croissance, de communication entre les cellules et de résistance aux biocides, distinctes de celles des bactéries planctoniques (Roux et Ghigo, 2006).

1.2. Matrice Chez les bactéries, dont S. aureus, cette matrice est formée de biopolymères, généralement polysaccharidiques et protéiques, excrétés à certains moments de leur cycle cellulaire (Virginie, 2008). Cette matrice extracellulaire fortement hydratée, appelée aussi

Synthèse bibliographique couche muqueuse, permet la survie des micro-organismes, favorise leur nutrition et leur développement, surtout en milieu oligotrophe, en piégeant les nutriments (Oliveira, 1992). Le constituant majoritaire de la matrice du biofilm est l’eau, il constitue 95-99% de la masse totale du biofilm [(Costerton et al., 1995) ; (Sutherland, 2001)]. La fraction microbienne représente seulement 2-5%, suivie par les exopolysaccharides (EPS) avec un taux de plus de 2% (Sutherland, 2001). D’autre substances tels que les acides nucléiques (ADN et ARN), les protéines, les lipides, les enzymes, les produits de dégradation et les substances provenant du milieu extérieur, peuvent être présents avec une teneur d’environ 2% de la masse totale de la matrice formant le biofilm [(Sutherland, 2001) ; (Jass et al., 2003)].

1.3. Surface La formation du biofilm à S. aureus peut se produire sur tous les types de surfaces immergées ayant des propriétés physicochimiques très différentes (tissus animaux et végétaux, matières plastiques, verre, acier, etc.) (De Buyser et Hennekinne, 2010). L’adhésion des microorganismes, dont S. aureus, est un phénomène extrêmement complexe influencé par plusieurs facteurs. La charge, l’hydrophobicité ainsi que la rugosité et la configuration physique de la surface des matériaux, en sont des paramètres déterminants à cet égard [(Scheuerman et al., 1998) ; (Gottenbos et al., 2000) ; (Balazs et al., 2003)].

2. Bases moléculaires de la formation du biofilm chez S. aureus sur implants médicaux S. aureus, peut entrer en contact avec des surfaces naturelles (tissus vivants) ou artificiels (implants médicaux) grâce aux différents moyens : diffusion passive résultant des mouvements Browniens, transport passif via le fluide circulant, ou mouvements actifs grâce à des structures telles que les flagelles (Van Loosdrecht et al., 1990). L’affinité avec laquelle la bactérie adhère à un support est influencée à la fois par les caractéristiques du support et les propriétés de surface de la cellule bactérienne. La formation rapide d’un film sur un support contenant des matières organiques entraîne une modification de sa surface et éventuellement une modification de l’affinité des bactéries vis-à-vis de ce support (Figure 2 et 3) (Carpentier et Cerf, 1993).

Synthèse bibliographique

Figure 2. Étapes de formation du biofilm chez S. aureus (Otto, 2012).

Figure 3. Biofilm de S. aureus formé sur un implant médical (Utili et al., 2007).

La formation de biofilms chez les staphylocoques se fait en deux phases : L’attachement initial et l’accumulation [(Mack et al., 1994) ; (Heilmann et al., 1996) ; (von Eiff et al., 1999)]. Le vieillissement d’un biofilm est parfois suivi d’une phase de détachement qui permet aux bactéries de coloniser d’autres sites. Ce phénomène est peu étudié chez les staphylocoques (Planchon, 2006).

Synthèse bibliographique

2.1. Adhésion aux surfaces abiotiques L’attachement initial à un support est la conséquence d’interactions physicochimiques non covalentes entre le support et la bactérie telles que les forces de Van der Waals, électrostatiques, les propriétés acide-base de Lewis et les propriétés hydrophobes/hydrophiles [(Bellon-Fontaine et al., 1996) ; (Briandet, 1999)]. Cette étape initiale de la formation du biofilm par S. aureus fait appel à certains facteurs qui contribuent au pouvoir d’adhésion de cette espèce tels que les protéines de surface et les acides teichoïques.

2.1.1. Protéines de surface (Adhésines) Chez S. aureus, généralement au début d’une infection lorsque la densité cellulaire est faible, l’activité du gène agr (accessory gene regulator) est ralentie et les bactéries produisent certaines protéines telles que les MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) et d’autres adhésines capables de promouvoir l’attachement et l’accumulation du biofilm. L’augmentation de la masse cellulaire est accompagnée d’une forte activité du gène agr, la bactérie réprime alors les gènes codant pour les facteurs de colonisation, et initie la sécrétion d’une variété de toxines et enzymes (telles que les protéases, les lipases, les hyaluronidase, et les nucléases) qui sont impliquées dans la destruction des tissus et/ou le détachement du biofilm (Heilmann et Götz, 2010).

2.1.1.1. MSCRAMM Au niveau moléculaire, l'adhésion des staphylocoques aux surfaces biotiques et abiotiques, est assurée par des protéines de liaison a la matrice extra-cellulaire appelées couramment ‘MSCRAMM’ (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) ou simplement adhésines (Tableau 1). Chaque espèce de staphylocoque possède son propre répertoire d'adhésives, ce qui contribue à la spécificité d'hôte rencontrée chez ces bactéries (Amorena et al., 1994). Ces composés de surface de S. aureus servent de récepteurs aux protéines du plasma (fibrinogène, fibrine, etc.) adsorbées à la surface du matériel médical (cathéters, prothèses, etc.) expliquant ainsi leur colonisation par ce germe (Navarre et Schneewind, 1999). La formation de biofilm se produit aussi lors de l’infection de tissus par l’adhésion bactérienne aux molécules de la matrice extracellulaire de l’hôte (collagène, fibronectine, vitronectine, etc.) (Götz, 2002).

Synthèse bibliographique

Tableau 1. Protéines de surface (MSCRAMM) impliquées dans la formation de biofilms chez S. aureus Protéines Rôle Références Protéine A ou Spa Liaison immunoglobulines (Foster et Hook, 1998) (staphylococcal protein A) IgG et IgM. Liaison facteur de Von Willebrand ClfA (Clumping factor A) Liaison à la chaîne ɣ (Sabat et al., 2003) ClfB (Clumping factor B) fibrinogène

EbpS (Elastin-binding protein) Liaison élastine et (Tristan et al., 2003) tropoélastine solubles FnbpA (Fibronectin-binding Liaison fibronectine (Tristan et al., 2003) ptotein A) FnbpB (Fibronectin-binding ptotein B) Cna (Collagen-binding protein) Liaison collagène (Tristan et al., 2003)

2.1.1.2. Autolysines Les autolysines sont des hydrolases du peptidoglycane. Elles sont responsables du renouvellement de la paroi bactérienne et interviennent dans la division et la lyse cellulaire. De ce fait, elles contribuent à la virulence en facilitant le relarguage de toxines et de composants de la paroi immunologiquement active [(Hell et al., 1998) ; (Heilmann et al., 2003)]. Les autolysines participent également à l’adhésion de la bactérie aux dispositifs médicaux [(Navarre et Schneewind, 1999) ; (Biswas et al., 2006)]. La première autolysine décrite fut Atl, codée par le gène atl chez S. aureus (Oshida et al., 1995).

2.1.2. Acides teichoïques Les acides teichoïques sont des constituants de la paroi cellulaire de S. aureus intervenant dans l’adhésion initiale aux surfaces polaires. Ces acides servent de liaison entre la surface bactérienne et la fibronectine et interviennent aussi dans l’attachement de certaines protéines comme les autolysines (Hussain et al., 2001a). Par ailleurs, la colonisation des surfaces abiotiques par S. aureus dépend de la charge de ses acides teichoïques (Gross et al, 2001). La modification des acides teichoïques peut entraîner des modifications de l’adhésion bactérienne à une surface [(Peschel et al., 1999) ; (Collins et al., 2002)]. 15

Synthèse bibliographique

2.2. Agrégation intercellulaire Cette étape est primordiale au cours de la formation d’un biofilm ; elle se caractérise par l’accumulation des agrégats cellulaires sur la surface colonisée et la production de microcolonies (Heilmann et al., 1997). Les cellules bactériennes se divisent, produisent des exopolysaccharides et conduisent par conséquent à la formation d’un biofilm mature. Parmi les facteurs intervenant dans l’agrégation intercellulaire trois composés de surface sont souvent impliqués : - L’adhésine intercellulaire polysaccharidique (PIA) décrite chez S. epidermidis, S. aureus et S. caprae [(Mack et al., 1996) ; (Cramton et al., 1999) ; (Allignet et al., 2001)]. - La protéine associée au biofilm (BAP) décrite initialement chez des souches de S. aureus d’origine bovine (Cucarella et al., 2001). - Les protéines : SasG (S. aureus surface protein G) et Pls (Plasmine sensitive surface protein) décrites chez S. aureus, [(Roche et al., 2003) ; (Rohde et al., 2005)].

2.2.1. Adhésine Intercellulaire Polysaccharidique (PIA) PIA ou PNAG (Polymeric N-Acetyl-Glucosamine) est l’appellation officielle du slime. Ce polymère, composant majeur de la matrice extracellulaire du biofilm permettant l’adhésion intercellulaire, est produit par S. epidermidis et S. aureus et est constitué de la combinaison de deux polysaccharides [(Dimick et al., 2001) ; (Götz, 2002)] : - N-acétyl-glucosamine est le polysaccharide majeur (˃80%) du PIA. - Polysaccharide mineur (<20%) est structuralement semblable au précédent avec moins de résidus D-glucosaminyl [(Christensen et al., 1990) ; (Baldassarri et al., 1996) ; (Mack et al., 1996)]. D’après sa composition, le PIA est à la fois chargé positivement et négativement et donc peut être lié via des forces ioniques au peptidoglycane ou aux acides teichoïques (Mack et al., 1996). Ce polysaccharide extracellulaire est un élément étroitement lié à la formation du biofilm [(Mack et al., 1996) ; (Ziebuhr et al., 2000)]. La synthèse de ce polysaccharide, dépend de l’expression de l’opéron chromosomique ica (intercellular adhesion locus) qui comporte les quatre gènes de biosynthèse icaA, icaD, icaB et icaC nécessaires pour une expression maximale du PIA et le gène de régulation icaR (Figure 4b) [(Fey et al., 1999) ; (Dobinsky et al., 2003)]. Cet opéron, présent chez la plupart

Synthèse bibliographique des souches cliniques de S. aureus code pour la synthèse de trois protéines membranaires IcaA, IcaD et IcaC ayant une activité enzymatique, et une protéine extracellulaire IcaB (Figure 4a) [(Gerke et al., 1998) ; (Arciola et al., 2001) ; (Fitzpatrick et al., 2005) ; (Fowler et al., 2006) ; (Tu Quoc et al., 2007)].

Figure 4. Organisation du locus ica et synthèse de l'adhésine intercellulaire polysaccharidique (PIA) (Otto, 2009)

Les 4 gènes icaADBC, co-transcrits à partir d’un promoteur unique en amont de icaA, permettent la synthèse du polysaccharide. Le gène icaR est localisé en amont de l’opéron icaADBC et il est transcrit dans le sens opposé aux 4 autres gènes de l’opéron [(Allignet et al., 2001) ; (Conlon et al., 2002a)]. IcaR est un répresseur de transcription de l’opéron ica chez S. caprae, S. epidermidis et S. aureus [(Allignet et al., 2001) ; (Conlon et al., 2002a) ; (Jefferson et al., 2003)].Ces gènes sont régulés par plusieurs protéines. L’association de IcaA à IcaD permet l’activation du N-acetyl glucosamine pour le joindre à une chaine de N-acetyl glucosamine. IcaC est une protéine transmembranaire qui assure le transport de PIA nouvellement synthétisé hors de la cellule et son association au PIA déjà en place. IcaB permet la déacétylation de certains résidus pour permettre une modification de la charge négative en charge positive qui facilite l’interaction avec les supports (Otto, 2009).

Synthèse bibliographique

2.2.2. Protéine Associée au biofilm (BAP) Bap, une protéine de surface identifiée chez les isolats de S. aureus et autres staphylocoques, est impliquée parallèlement dans l’attachement primaire à une surface abiotique, l’adhésion intercellulaire et l’accumulation [(Cucarella et al., 2001) ; (Lasa et Penadés, 2006)]. Les souches de S. aureus hébergeant la protéine Bap sont très adhérentes à des surfaces abiotiques et fortement productrices de biofilms (Cucarella et al., 2001).

2.2.3. Protéines SasG et Pls Ces deux protéines sont des adhésines de surface impliquées dans l’adhérence et la formation de biofilms chez S. aureus. Il a été aussi démontré que les souches qui exprimaient ces protéines pouvaient former un biofilm indépendamment au PIA [(Rohde et al., 2005) ; (Corrigan et al., 2007)].

2.3. Maturation et dispersion Le biofilm atteint finalement une architecture tridimensionnelle avec une structure caractéristique en champignons unis par des filaments [(Costerton, 1995) ; (Clutterbuck, 2007)]. A ce stade, le biofilm est caractérisé par une perte de sensibilité aux défenses immunitaires de l’hôte et aux traitements antimicrobiens qu’ils soient de nature physique ou chimique [(Costerton, 1984) ; (Gray et al., 1984) ; (Duguid et al., 1992) ; (Campanac et al., 2002)]. L’étape de détachement semble être programmée génétiquement, elle faciliterait la dissémination de l’infection et/ou la colonisation d’autres sites [(Wrangstadh et al., 1986) ; (Lee et al., 1996) ; (Allison et al., 1998) ; (Costerton et al., 1999)]. Les enzymes extracellulaires ou les surfactants, en dégradant les différents constituants de la matrice, jouent un rôle important dans le détachement des biofilms à S. aureus. Les protéases, les DNases et le quorum sensing agr, en sont d’autres facteurs favorisant la solubilisation des biofilms staphylococciques. A ceux s’ajoutent certaines conditions environnementales, telle que la carence en glucose dans le milieu environnant [(Boles et Horswill, 2011) ; (McDougald et al., 2012)].

Synthèse bibliographique

3. Communication intercellulaire au sein du biofilm Face à une modification de leur environnement, les bactéries ont besoin de coordonner la réponse de l’ensemble de la population présente en modifiant l’expression d’un grand nombre de gènes (Bassler et Waters, 2005). Ce processus leur permet d’évaluer leur densité de population, de surveiller l'environnement, notamment la présence d'autres bactéries, et de modifier leur comportement à l’échelle de la population en réponse aux changements. On parle alors de quorum sensing qui correspond a un phénomène de communication des bactéries en leur permettant de prendre des « décisions collectives » afin de coordonner leur action (Chambeaud, 2012). Le quorum sensing chez S. aureus a été intensivement étudié et sert de modèle pour étudier celui des autres bactéries à Gram positif (Chambeaud, 2012). Son mécanisme d’action (Figure 5) est gouverné par le locus agr (accessory gene regulator). L'auto-inducteur est un oligopeptide, l’AIP codé par le gène agrD. La maturation et/ou l’exportation de l’AIP à travers la membrane requiert l’activité d’agrB [(Novick et Muir, 1999) ; (Shirtliff et al., 2002)]. Une fois, accumulé dans le milieu extérieur, ce peptide agit comme une molécule de signalisation externe. Les AIP extracellulaires se lient alors à l’agrC qui est une kinase membranaire ce qui entraine l’autophosphorylation de celle-ci et l'activation de la protéine agrA qui active à son tour le phénotype dépendant du quorum sensing, c'est-à-dire la transcription à partir des promoteurs P2 et P3 [(Lina et al., 1998) ; (Dufour et al., 2002)]. Ceci permet la production des ARNII et ARNIII. L'ARNII ayant un rôle de régulation du système, contient les séquences codantes pour agrA, agrD, agrB et agrC. L'ARNIII est l'effecteur du quorum sensing ; il régule l'expression de plus de 70 gènes dont 23 sont des facteurs de virulence connus. Plus précisément, il réduit l'expression des facteurs de virulence impliqués dans les mécanismes d'adhésion et d’échappement au système immunitaire et augmente l'expression des toxines et enzymes. Il est supposé que c'est l'activation du système agr qui permet le passage d'une colonie commensale a une colonie pathogène (Chambeaud, 2012).

Synthèse bibliographique

Figure 5. Mécanisme d’action des molécules du quorum sensing chez S. aureus

(Antunes et al., 2010).

4. Régulation génétique du biofilm chez S. aureus Les gènes codants pour les déterminants moléculaires intervenant dans la formation des biofilms de S. aureus et leur virulence sont gouvernés par un réseau complexe de régulation qui fonctionne en rapport avec le milieu environnant (nutriments, oxygène, etc.) et les signaux de communication intercellulaires (quorum sensing). Les systèmes régulateurs chez S. aureus sont gouvernés principalement par deux loci (Tableau 2) : l’opéron sar (staphylococcal accessory regulator) et l’opéron agr (accessory gene regulator) (Pratten et al., 2001). Ces systèmes sont només ‘accessoires’ car ils sont activés à certaines phases de la croissance cellulaire ou lors de certaines conditions environnementales sans être essentiels à la croissance cellulaire. D’autres régulateurs à deux composantes existent chez S. aureus tels que le système arlRS (autolysis related locus) et le système sarAR [(Liang et al., 2005) ; (Toledo-Arana et al., 2005)]. σB (sigmaB) et rbf (regulator biofilm formation), en sont d’autres régulateurs de transcription intervenant dans la formation de biofilms.

Synthèse bibliographique

Tableau 2. Les principaux gènes régulateurs impliqués dans la formation de biofilms chez S. aureus Gènes régulateurs Fonction Références [(Novick et 1993) ; (Vuong et Agr (Accessory Régulateur accessoire général des al., 2000) ; (Dunman et al., gene regulator) protéines de surface et des facteurs 2001) ; (Novick, 2003) ; de virulence (Chan et al., 2004)] sarA Répresseur de protéines de surface, [(Heinrichs et al., 1996) ; sarS protéases (Tegmark et al., 2000) ; sarT Active la transcription de spa (Schmidt et al., 2001)] SarR Répresseur de hla Régulateur négatif de Sar arlRS Régule l’autolyse et les protéines de (Fournier et al., 2001) surface Activé en phase stationnaire ou dans des conditions de stress [(Kullik et al., 1998) ; Régulateur de transcription d’ica (Nicholas et al., 1999) ; SigmaB Généralement antagonisme avec (Bischoff et al., 2001) ; (σB) agr (Nair et al., 2003)] Régule positivement : clumping factor, fibronectin-binding protein A et coagulase. Régule négativement : α et β hemolysine, enterotoxine B IcaR Régulateur négatif du locus ica (Ziebuhr et al., 1999) Régulateur d’une protéine Rbf impliquée dans la formation de (Lim et al., 2004) biofilm. Induction de la formation de biofilm par NaCl et glucose

Synthèse bibliographique

5. Lutte contre les biofilms à S. aureus associés aux dispositifs médicaux La prévention et la lutte contre la formation des biofilms dans le secteur médical est la source de nombreux travaux, notamment ceux qui concernent la prévention des infections associées aux dispositifs médicaux. Les infections chroniques et nosocomiales associées au développement d’un biofilm à S. aureus sur les implants médicaux sont plus difficiles à traiter; le traitement classique consiste au remplacement plus fréquent de ces implants et une antibiothérapie long-terme adéquate. Cependant, ces traitements sont coûteux, longs et nécessitent plusieurs interventions sur le patient [(Burin Des Roziers, 2002) ; (von Eiff et al., 2008)]. Les recherches portant sur la lutte contre la formation de biofilms peuvent être divisées en deux domaines (Chen et al., 2013) : - La modification de la surface des implants utilisés dans des dispositifs médicaux pour les rendre résistants à la formation de biofilm. Ces polymères sont soit modifiés de manière à les rendre antiadhésifs, soit imprégnés d’antibiotiques ou d’agents antimicrobiens (sels de métaux, argent, cuivre, etc.). - L’inhibition ou la perturbation de la formation du biofilm par certaines molécules et enzymes.

5.1. Modification de la surface des implants Pour empêcher l’adhésion de S. aureus sur les surfaces des implants médicaux, de nouvelles stratégies thérapeutiques sont envisagées, comme le traitement par diverses molécules et la modification des propriétés physicochimiques de la surface des implants [(Brady, 2008) ; (Boks et al., 2009) ; (Tang et al., 2009) ; (Truong et al., 2010) ; (Xu et Siedlecki, 2012)]. Parmi les systèmes les plus répandus, on peut citer quelques exemples :  Les cathéters imprégnés d’antibiotiques et/ou d’antiseptiques ont été utilisés telles que la vancomycine, minocycline–rifampicine, chlorhéxidine. Ces cathéters se sont avérés significativement efficace contre le biofilm staphylococcique [(Antoci et al., 2008) ; (De Carvallo, 2012) ; (Esposito et al., 2013)]. Cependant, ce type de cathéters peut favoriser l’apparition de souches résistantes [(Hoffman et al., 2005) ; (Niel-Weise et al., 2007) ; (Casey et al., 2008)].

Synthèse bibliographique

 Les implants recouverts par adsorption d’une couche de furanones, semblent avoir un effet inhibiteur significatif contre le biofilm staphylococcique (Gottenbos et al., 2002).  Les cathéters revêtus par l’organosélénium ou l’acide selenocyanatodiacetic (SCAA) utilisés en hémodialyse se sont avérés efficaces contre la formation de biofilms de S. aureus (Tran et al., 2012).

5.2. Inhibition ou perturbation de la formation du biofilm 5.2.1. Substances anti-biofilm Le citrate de sodium est utilisé en raison de ses propriétés antimicrobiennes puissantes sans risque de résistance. Les concentrations supérieures à 0,5-4% préviennent in vitro la formation du biofilm par S. aureus mais ne détruisent pas un biofilm préformé. D’autres anticoagulants tel que l’acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) peuvent minimiser le développement des biofilms de S. aureus (Shanks et al., 2006).

5.2.2. Quorum sensing (QS) Le système du quorum sensing joue un rôle important au sein des biofilms de S. aureus. Des mutations au niveau des gènes impliqués dans ce système peuvent provoquer un changement de la sensibilité d’un biofilm vis-à-vis d’un antibiotique. L’inhibition de certaines molécules intervenant dans le quorum sensing peut prévenir des infections liées aux biofilms de S. aureus (Balaban et al., 2007). Il a été démontré que l’activation du gène agr (accessory genes regulator) par l’ajout de phéromones AIP (autoinducing peptide) exogènes intervenant dans le système QS, aboutit à la maturation puis la dislocation du biofilm et par conséquent la transformation des cellules de forme sessile en une forme planctonique (Boles et Horswill, 2008).

5.2.3. Traitement des biofilms préformés Généralement, les antibiotiques sont très peu efficaces contre les biofilms et les symptômes peuvent réapparaître après le traitement (Roux et Ghigo, 2006). Par ailleurs, certains antibiotiques telles que la tigécycline, la rifampicine, la daptomycine, l’amikacine et

Synthèse bibliographique la ciprofloxacine, ont fait l’objet de plusieurs recherches portant sur la lutte contre les biofilms à S. aureus [(Murphy et al., 2000) ; (Abbanat et al., 2003) ; (Raad et al., 2007) ; (Smith et al., 2009) ; (Singh et al., 2010)]. Certaines enzymes sont susceptibles de perturber l’intégrité physique de la matrice du biofilm staphylococcique. La dispersine B, l’ADNase, la lysostaphine, la Protéinase K, la trypsine et la Cellobiose déshydrogénase sont parmi les enzymes les plus étudiées [(Wu et al., 2003) ; (Kaplan et al., 2004) ; (Ramasubbu et al., 2005) ; (Chaignon et al., 2007) ; (Boles et Horswill, 2008) ; (Izano et al., 2008) ; (Lauderdale et al., 2010) ; (Lauderdale et al., 2010) ; (Thallinger et al., 2014)]. De nouvelles méthodes curatives se développent actuellement pour limiter la contamination des surfaces utilisant les potentialités bactéricides intéressantes de certains antimicrobiens naturels. Parmi ces antimicrobiens se trouvent les composés aromatiques d’huiles essentielles, des acides et certains sels (Dubois-Brissonnet et al., 2006a).

Synthèse bibliographique

Chapitre III : Huiles essentielles et biofilm à S. aureus Les antibiotiques sont en effet très peu efficaces contre les biofilms et les symptômes peuvent réapparaître après l’arrêt du traitement (Roux et Ghigo, 2006). D’où l’intérêt sans cesse croissant de chercher de nouveaux composés pouvant agir soit directement sur les microorganismes, soit indirectement en inhibant un ou plusieurs mécanismes de résistance. De nouvelles molécules bioactives peuvent être recherchées dans certaines plantes médicinales, car celles-ci constituent une source potentielle de composés antimicrobiens et/ou inhibiteurs des mécanismes de résistances aux antibiotiques (Okusa-Ndjolo, 2012). En effet, les plantes synthétisent plus de 100 000 petites molécules (MM < 500 Da) dotées pour la plupart d’une activité antibiotique. En général, cette activité est inférieure à celle exercée par les antibiotiques d’origine microbienne [(Tegos et al., 2002) ; (Lewis et Ausubel, 2006)].

1. Généralités sur les huiles essentielles D’un point de vue réglementaire, selon la pharmacopée européenne, une huile essentielle (HE) est « un produit odorant, généralement de composition complexe, obtenu à partir d’une matière végétale botaniquement définie, soit par entrainement à la vapeur d’eau, soit par distillation sèche, soit par un procédé mécanique approprié sans chauffage. L’huile essentielle est le plus souvent séparée de la phase aqueuse par un procédé physique n’entraînant pas de changement significatif de sa composition ». Les huiles essentielles appelées encore « essences » ou « essences aromatiques végétales » sont volatiles et de consistance huileuse [(Balz, 1986) ; (Lardry et Haberkorn, 2003)]. Les HE sont des métabolites secondaires produits par les plantes comme moyen de défense contre les ravageurs phytophages (Cseke et Kaufman 1999). L’utilisation des arômes pour soigner n’est pas une technique récente. Dans toutes les civilisations de l’antiquité la mention des arômes était présente pour des usages religieux, cosmétiques, mais aussi thérapeutiques (Lardry et Haberkorn, 2007). En Afrique, la médecine traditionnelle utilise depuis des temps immémoriaux des plantes médicinales et aromatiques [(Roulier, 1990) ; (Pénoël, 1991)]. La première mise en évidence de l’action des huiles essentielles contre les bactéries a été réalisée en 1881 par Delacroix (Boyle, 1955). Depuis, de nombreuses huiles ont été qualifiées pour leur effet antibactérien (Burt, 2004).

Synthèse bibliographique

2. Composition chimique des huiles essentielles L’étude de la composition chimique des HE est généralement effectuée par chromatographie en phase gazeuse (CPG) et par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) (Salzer, 1977). La résonance magnétique nucléaire (RMN) peut également être utilisée pour identifier les constituants des huiles essentielles (Tomi et al., 1995). Chaque HE se compose de plusieurs éléments biochimiques parfois très nombreux, qui tous ensembles, déterminent ses propriétés thérapeutiques. Il s’agit de liaisons d’hydrocarbures classées selon leurs caractéristiques en différentes classes comme les monoterpénols, les sesquiterpénols, les monoterpènes, les sesquiterpènes, les esters, les aldéhydes, les oxydes, les phénols, les coumarines, les cétones ou d’autres encore qui n’apparaissent que sous forme de traces (Werner, 2002). Beaucoup d’HE recèlent un constituant chimique majoritaire (Tableau 3), sorte de « race chimique » appelé « chémotype» (Lardry et Haberkorn, 2007). La plupart des composants des HE sont inclus dans deux groupes : les terpénoïdes et les phénylpropanoïdes, les deux sont synthétisés à travers deux voies métaboliques séparées [(Calsamiglia et al., 2007) ; (Amlan et Patra, 2010)].  Les terpénoïdes représentent le groupe le plus diversifié dont 25 000 métabolites secondaires sont connus. Ils dérivent d’une structure de base à cinq carbones (C5H8), communément appelée isoprène. Selon le nombre répétitif de cette unité, les terpénoïdes sont classés en : monoterpénoïdes (C10), sesquiterpénoïdes (C15) et diterpénoïdes (C20). Dans la composition de la plupart des huiles essentielles les monoterpénoïdes et les sesquiterpénoïdes forment la majeure partie [(Calsamiglia et al., 2007) ; (Benchaar et al., 2008)].  Les phénylpropanoïdes ou composés phénoliques sont moins fréquents par rapport aux terpénoïdes. Ils sont biosynthétisés à partir des acides aminés aromatiques que sont la phénylalanine et la tyrosine. Les phénylpropanoïdes sont constitués d’une chaine carbonée liée à un noyau aromatique à six atomes de carbones (Sangwan et al., 2001). Parmi ce groupe se trouvent les aldéhydes (cinnamaldéhyde), les alcools (alcool cinnamique), les phénols (chavicol, eugenol) et les dérivés méthoxy (anethol, estragol) ou methylène dioxy (myristicine, safrol) (Bruneton, 1999).

Synthèse bibliographique

Les terpénoïdes et les phénylpropanoïdes confèrent aux huiles essentielles leurs propriétés antibactériennes. Généralement les molécules oxygénées sont plus actives que les molécules hydrocarbonées. Les composés phénoliques, comme le thymol, le carvacrol et l’eugénol ont une forte activité antibactérienne. Les alcools sont légèrement moins actifs que les composés phénoliques et carbonylés mais leur activité antibactérienne est plus élevée que celle générée par les éthers et les molécules hydrocarbonées (Kalemba et Kunicka, 2003).

Tableau 3. Les principaux constituants de quelques huiles essentielles à activité antimicrobienne Plante Composés majoritaires de l’HE Référence

Rosmarinus officinalis 1,8-cinéole 3 à 89% (Burt, 2004) α-pinène 2 à 25% Acétate de bornyle 0 à 17% Camphore 2 à 14%

Eucalyptus globulus 1,8-cinéole 45.4% (Tyagi et Malik, 2011) Limonène 17.8% p-cymène 9.5% γ-terpinène 8.8% α-pinène 4.2% α-terpinéole 3.4% Thymus capitatus Carvacrol 62 à 83% (Bounatirou et al., 2007) p-cymène 5 à 17% γ-terpinène 2 à 14% β-caryophyllène 1 à 4%)

Synthèse bibliographique

3. Mode d’action des huiles essentielles Certains composés d’origine végétale, contenues en particulier dans les huiles essentielles, ont déjà montré des propriétés antimicrobiennes ; ces composés agissent suivant plusieurs mécanismes : (i) formation de complexes avec des macromolécules telles que les protéines et les polysaccharides inhibant ainsi leurs fonctions (polyphénols), (ii) rupture de membranes microbiennes (flavonoïdes lipophiles, terpénoïdes, défensines), (iii) inhibition de l’adhésion des protéines microbiennes aux récepteurs polysaccharidiques de l’hôte (polypeptides) (Okusa-Ndjolo, 2012). Les études portant sur le criblage des activités antimicrobiennes des HE sont nombreuses mais peu sont celles qui s’intéressent aux modes d’action de ces substances. Les HE agissent aussi bien sur les bactéries Gram positif que sur les bactéries Gram négatif. Toutefois, les bactéries Gram négatif paraissent généralement moins sensibles à leur action et ceci est directement lié à la structure de leur paroi cellulaire qui représente une barrière capable de diminuer la perméabilité des composés hydrophobes [(Burt, 2004) ; (Calsamiglia et al., 2007)]. En effet, certains chercheurs ont montré que la puissance de l’action des HE varie selon leurs constituants majoritaires, et que le mode d’action est principalement lié au profil chimique largement diversifié des constituants de chaque HE [(De Buochberg et al., 1976) ; (Kandil et al., 1994) ; (Harkenthal et al., 1999) ; (Cox et al., 2000)]. Le mode d’action des huiles essentielles sur les cellules bactériennes n’est pas clairement élucidé [(Kalemba et Kunicka, 2003) ; (Burt, 2004)]. Compte-tenu la composition complexe des HE, leur activité serait due à plusieurs mécanismes d’action différents, liés à la nature chimique de ces composés impliquant ainsi différentes cibles cellulaires [(Skandamis et al., 2001) ; (Carson et al., 2002) ; (Burt, 2004)]. La principale caractéristique des molécules présentes dans les huiles essentielles est leur hydrophobicité. Etant donné qu’elles sont lipophiles, ces molécules peuvent pénétrer la double couche phospholipidique (Figure 6) ; leur accumulation entre les phospholipides provoque alors une déstabilisation de la structure et une augmentation de la perméabilité membranaire (Sikkema et al., 1994) ce qui entraine un changement de conformation et un mauvais fonctionnement de la membrane cellulaire, perturbant ainsi le transport membranaires des substances nutritives [(Sikkema et al., 1994) ; (Ultee et al., 1999)].

Synthèse bibliographique

Ces modifications sont à l’origine d’une fuite d’ions et de composés intracellulaires [(Carson et al., 2002) ; (Ultee et al., 2002)]. Si la perte de matériel est trop importante ou si les éléments cytoplasmiques relargués sont indispensables à la survie de la bactérie, cela entraîne la mort cellulaire. D’autres mécanismes d’action sont liés à la coagulation des constituants cellulaires par la dénaturation des protéines (Gustafson et Bowen, 1997).

Figure 6. Sites d’action des huiles essentielles sur la cellule bactérienne (Burt, 2004)

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Matériel et Méthodes

Partie II. Matériel et Méthodes 1. Lieu d’étude Notre étude a été réalisée au laboratoire de Microbiologie Appliquée à l'Agroalimentaire, au Biomédical et à l’Environnement (LAMAABE) de l’université de Tlemcen. Les analyses moléculaires ont été effectuées dans le Laboratoire de Microbiologie Clinique (Service des Maladies Infectieuses des Hôpitaux Universitaires de Genève, Suisse), le laboratoire de Microbiologie et Médecine moléculaire (Centre Médical Universitaire de Genève, Suisse) et le laboratoire de Prévention et contrôle de l’Infection (SPCI, Hôpitaux Universitaires de Genève, Suisse).

2. Prélèvements Sur une période allant du mois d’Avril 2009 au mois de Septembre 2011, des cathéters prélevés sur des patients (enfants, femmes et hommes) hospitalisés pendant plus de 48 h au service de Néonatologie, de Neurologie, de Pneumologie, de Pédiatrie, de Médecine interne et de Dermatologie du CHU de Tlemcen, ont été examinés. Ces cathéters ont été soigneusement prélevés dans des conditions d’asepsie, placés individuellement dans des tubes en verre stériles puis transportés au laboratoire pour être analysés.

3. Ensemencement et isolement Selon la technique de Brun-Buisson et al. (1987), l’extrémité distale des cathéters a été coupée puis placée dans des tubes contenant du bouillon cœur-cervelle (BHI) et incubée pendant 24 h à 37°C. Dans le but d’une sélection des staphylocoques, un volume de 100µL de chacun des tubes présentant un trouble était ensemencé par étalement en surface du milieu Chapman puis incubé à 37°C pendant 24 à 48h.

4. Identification des souches Les colonies de petite taille, punctiformes, de couleur jaunâtre et fermentant le mannitol ont été soumises à un examen microscopique pour mettre en évidence la forme des cellules, le mode de groupement et le type de Gram. Ensuite, les souches ont été identifiées sur la base des tests phénotypiques suivants :

Matériel et Méthodes

4.1. Production de catalase Ce test permet de différencier les staphylocoques des streptocoques. La catalase est produite par les bactéries à métabolisme respiratoire qui peuvent décomposer le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau avec dégagement d’O2 sous forme gazeuse.

4.2. Oxydase Les cytochromes sont des protéines intervenant dans les mécanismes d’oxydoréduction. Les cytochromes de type ‘c’ sont détectés par le test de l’oxydase. L’absence de l’oxydase chez le genre Staphylococcus permet de le différencier des genres Kocuria, Micrococcus, Macrococcus et Arthrobacter [(Kloos et Schleifer, 1986) ; (Brun et Bes, 2000)].

4.3. Test de Coagulase La coagulase est une protéine extracellulaire qui se lie à la prothrombine de l’hôte. La thrombine ainsi activée transforme le fibrinogène en fibrine. C’est la base du test de la coagulase (Brun et al., 2003). La mise en évidence de cette enzyme est un des critères d'identification de Staphylococcus aureus.

4.4. Galerie API 20 STAPH (BioMérieux®) Cette galerie repose sur le même principe que les techniques biochimiques conventionnelles d’identification des bactéries. Elle se présente sous forme de 20 microtubes prêts à l’emploi contenant le substrat lyophilisé nécessaire aux différents tests biochimiques. Les substrats reconstitués suivant les recommandations du fabricant, sont examinés après incubation à 37°C pendant 24 h ; les réactions produites sont révélées par des virages colorés spontanés ou par l'addition de réactifs. La lecture de ces réactions se fait à l'aide de la matrice d’identification des staphylocoques établie par Cavalla (2003) en utilisant le tableur Excel.

5. Conservation des souches Toutes les souches de S. aureus identifiées ont été conservées en double réplique, sur gélose nutritive inclinée à +4°C et dans du bouillon nutritif à 15% (v/v) glycérol à – 20°C. Ce dernier étant recommandé pour une bonne conservation à long terme des souches bactériennes.

Matériel et Méthodes

6. Détection de la production de biofilm chez les souches isolées Cette partie de l’expérimentation a porté sur la détection de la formation de biofilm chez les souches cliniques de S. aureus identifiée dans cette étude. En l’occurrence, deux méthodes ont été employées : la technique de microplaque 96 puits par coloration au cristal violet et la méthode par ensemencement sur milieu rouge Congo agar (RCA).

6.1. Méthode de microplaque 96 puits Les isolats de S. aureus ont été testés pour leur aptitude à former le biofilm par la technique quantitative de microplaque dite aussi méthode TCP (Tissue Culture Plate). Le protocole employé a été inspiré des travaux de Christensen et al. (1985) avec quelques modifications. Des colonies de S. aureus de 18 à 24 h sur milieu gélose nutritive sont inoculées dans des tubes contenant 3mL de bouillon cœur cervelle 1% (m/v) glucose. Après incubation des tubes pendant 24 h à 37°C, des dilutions appropriées sont effectuées dans du bouillon cœur cervelle afin d’obtenir une suspension bactérienne équivalente à 108 UFC/mL par l’ajustement de l’absorbance à 0,08-0,13 à une longueur d’onde de 630 nm. Des puits stériles de la microplaque sont remplis avec 200 µL de cette suspension bactérienne. Les puits de la colonne 12 servant de contrôle, sont remplis avec 200µL de bouillon cœur cervelle à 1% glucose stérile sans suspension bactérienne. Après incubation à 37°C pendant 24 h en conditions statiques, les puits de la microplaque sont vidés de leur contenu puis lavés quatre fois consécutives avec 200µL d’une solution 1×PBS (phosphate buffered saline) pH 7,2 pour éliminer les cellules planctoniques. Les microplaques renversées sont couvertes de papier absorbant et laissées sécher à température ambiante pendant 15 minutes (Broschat et al., 2005). Les cellules bactériennes adhérentes à la paroi interne des puits et formant le biofilm sont fixées à l’aide d’une solution d’acétate de sodium 2% (m/v) puis colorées par le cristal violet 0.1% (m/v) [(Borucki et al., 2003) ; (Mathur et al., 2006)]. Après 15 minutes, la solution de cristal violet est éliminée et les puits sont lavés trois fois avec 1×PBS afin d’éliminer toute trace de colorant non fixé. Enfin, les puits sont remplis de nouveau avec 200µL d’une solution d’éthanol (95%) pour libérer le colorant fixé au sein des cellules emprisonnées dans le biofilm ainsi formé.

Matériel et Méthodes

Les densités optiques (DO) de tous les puits sont déterminées par l’intermédiaire d’un lecteur d’absorbance pour microplaques (modèle EL×800) à une longueur d’onde de 630 nm. Afin de minimiser les erreurs dues à l’expérimentation, dans chaque série la valeur moyenne de DO obtenue des huit puits de contrôle de la colonne 12 est soustraite de la valeur moyenne de DO de chacune des souches testées.

6.1.1. Classification des souches selon leur pouvoir adhérent Le lecteur d’absorbance pour microplaques utilisé dans notre étude a un pouvoir de détection de DO qui s’étend entre 0 et 3. Selon les travaux de Christensen et al. (1985) réalisés sur des staphyloques coagulase-négatifs par la méthode de microplaque, les souches, compte tenu leur pouvoir adhérent, ont été classées en trois catégories: non adhérentes, faiblement adhérentes et hautement adhérentes. Cependant, nos souches cliniques on été classées en quatre catégories (Stepanovic et al., 2000) : Souche non adhérente : DO < DOc Souche faiblement adhérente : DOc < DO < 2 x DOc Souche modérément adhérente : 2 x DOc < DO < 4 x DOc Souche hautement adhérente : DO ˃ 4 x DOc Avec: DOc (cut-off DO) correspond à la somme entre la moyenne de DO des puits contrôles et le triple de son écart type. Des valeurs moyennes de DO et écart-types ont été calculées par le

tableur Excel.

6.2. Détection de la production de slime sur milieu rouge Congo Cette technique qualitative consistant à l’ensemencement des souches testées pour leur capacité à produire le biofilm sur milieu rouge Congo (Freeman et al., 1989), est une autre méthode indirecte qui permet de distinguer entre les souches de S. aureus productrices de slime et celles qui n’en produisent pas, en se basant sur la comparaison de la couleur de leurs colonies.

Matériel et Méthodes

Les souches testées sont ensemencées par stries en surface du milieu rouge Congo coulé en boites de Pétri. Les boites sont alors incubées en aérobiose pendant 24 à 48 heures à 37°C et ensuite pendant une nuit à température ambiante [(Ziebuhr et al., 1997) ; (Diemond- Hernández et al., 2010)]. Les colonies des souches non productrices de slime sont de couleur rose, tandis que celles qui ont la capacité à produire le slime sont de couleur grise légèrement noire à noire foncée [(Arciola et al., 2006) ; (Liberto et al., 2009)].

6.3. Identification moléculaire des souches hautement adhérentes Parmi les souches criblées pour leur capacité à produire du biofilm, celles qui se sont avérées hautement adhérentes par la technique de microplaque, ont été identifiées par le test d’agglutination, la technique MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation- Time Of Flight Mass Spectrometry) et la recherche du gène femA. Cette identification moléculaire permet de confirmer l’appartenance des souches à l’espèce aureus. Cette partie expérimentale a été réalisée dans le Laboratoire de Microbiologie Clinique, Service des Maladies Infectieuses des Hôpitaux Universitaires de Genève (HUG).

6.3.1. Test d’agglutination Le test d'agglutination est une méthode préliminaire rapide pour l’identification de l’espèce S. aureus (Felten et al., 1995). Le principe de ce test consiste en une détection simultanée de trois constituants chez ce microorganisme (facteur de liaison au fibrinogène ou coagulase liée ‘clumping factor’, protéine A, antigènes capsulaires de type 5 et 8) [réactif Pastorex® Staph Plus (Sanofi Diagnostics Pasteur)]. Après avoir déposé une goutte de suspension dense de la souche testée dans deux cercles de la carte jetable Pastorex, une goutte du réactif latex est déposée dans l’un des deux cercles et une goutte du contrôle négatif dans l’autre cercle de la carte jetable. La présence de S. aureus entraîne l'apparition, en moins de 30 secondes, d'une hémagglutination massive, visible à l'œil nu. En l'absence de coagulase liée, de protéine A et des antigènes capsulaires de type 5 et 8, on n'observe aucune agglutination.

Matériel et Méthodes

6.3.2. MALDI-TOF MS La technique d’identification par spectrométrie de masse, MALDI-TOF, est parmi les méthodes moléculaires actuellement utilisées avec succès dans le domaine de l’identification des microorganismes dont S. aureus [(Tonolla et al., 2010) ; (Benagli et al., 2011)]. La spectrométrie de masse consiste à séparer et identifier des molécules (protéines membranaires et ribosomales) selon leur masse et leur charge. Elle permet d’ioniser des molécules de grande taille, peu volatiles et sensibles à la chaleur sans les dégrader (Bienvenut et al., 2002). Une colonie bactérienne est mélangée à la matrice (eau, acide sinapinique et acétonitrile) sur une lame d’acier. Le mélange obtenu est appelé spot ou cible. Dans une atmosphère sous vide de l'appareil (MALDI-TOF MS Système Bruker), les molécules de la cible subissent une ionisation douce par une source de laser UV (337 nm). Les ions séparés en fonction du rapport masse/charge (m/z) sont détectés par un analyseur à Temps de Vol (TOF) Qui mesure le temps mis pour que les différentes particules atteignent le détecteur. Une fois l’ion arrivé au détecteur, le signal est amplifié et envoyé à un ordinateur qui traite les données et donne les résultats sous forme de spectres (Suh et Limbach, 2004). L'identification d'un spectre inconnu est réalisée à l'aide d'un algorithme de reconnaissance utilisant les positions de pics, leurs intensités autant que leurs fréquences d'apparition (Cariello, 2012). Ces spectres sont comparés et alignés avec ceux de références puis une évaluation est faite en se basant sur une valeur dite score. Le logiciel génère automatiquement les listes des pics à partir de tous les spectres et extrait les pics typiques qui sont présents dans les spectres d'une seule espèce. Dans cette technique l’identification d’une espèce est décrite en fonction du score obtenu par le logiciel. Si le score est compris entre : 0.000 et 1.699 : le degré de confiance est insuffisant pour l’identification ; 1.700 et 1.999 : l’identification au genre est probable ; 2.000 et 2.299 : l’identification du genre est sécurisée mais l’identification à l’espèce est probable ; 2.300 et 3.000 : l’identification à l’espèce est d’une forte probabilité (Suh et Limbach, 2004).

Matériel et Méthodes

6.3.3. Recherche du gène femA La recherche du gène femA chez les souches de Staphylococcus étudiées a été confiée à l’équipe du Laboratoire de Microbiologie Clinique, Service des Maladies Infectieuses des Hôpitaux Universitaires de Genève (HUG). Le gène femA codant pour une protéine cytoplasmique est habituellement recherché par PCR chez les souches de S. aureus à des fins d’identification et de spécificité de l’espèce [(Unal et al., 1992) ; (Yamashita et Kagawa, 1992) ; (Vannuffel et al.,1995)].

7. Etude de l’Antibiorésistance chez les souches de S. aureus L’évaluation de l’antibiorésistance des souches hautement productrices de biofilm, sélectionnées parmi l’ensemble des isolats étudiés de S. aureus, a été réalisée par un antibiogramme et la recherche du gène mecA responsable de la résistance à la méticilline.

7.1. Antibiogramme La sensibilité des souches de S. aureus aux antibiotiques a été déterminée par la méthode de diffusion en milieu gélosé de Mueller-Hinton selon les recommandations du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI, 2008). S. aureus ATCC 25923 a été utilisée comme souche de contrôle. Le milieu Mueller-Hinton (MH) après avoir été ensemencé par une suspension bactérienne de densité optique 0,08 à 0,13 à 625 nm ou d’une opacité équivalente à 0,5 McFarland (108 UFC/mL), les disques d’antibiotiques (Tableau 4) sont appliqués sur la surface. Les diamètres des zones d’inhibition sont mesurés après incubation de 18-24 h à 37°C en aérobiose. Les résultats sont comparés aux valeurs critiques figurant dans la table de lecture (Annexe 13), puis la bactérie est classée dans l’une des catégories suivantes : sensible, intermédiaire ou résistante.

Matériel et Méthodes

Tableau 4. Antibiotiques testés vis-à-vis les souches de S. aureus étudiées (Fantin, 2002)

Famille Antibiotique Charge du disque

Bétalactamines Pénicilline 10 UI Oxacilline 5 µg

Carbapénèmes Imipéneme 10 µg

Quinolones Ofloxacine 5 µg

Aminosides Gentamicine 10 µg

Amikacine 10 µg

Macrolides Erythromycine 15 µg

Glycopeptides Vancomycine 30 µg Rifamycines Rifampicine 30 µg Acide fusidique 10 µg Tétracycline 30 µg Fosfomycine 50 µg Chloramphénicol 30 µg

7.2. Recherche du gène mecA La recherche du gène mecA par amplification génique reste la méthode de référence pour l’identification des souches résistantes à la méticilline (Chan et al., 2003). La résistance à la méticilline est principalement due à la production d’une nouvelle PLP (proteine liant la penicilline) qui est la PLP2a ayant une affinité diminuée pour les beta- lactamines. Cette PLP2a est une transpeptidase qui peut catalyser à elle seule l’assemblage du peptidoglycane lorsque les autres PLP sont saturées par les beta-lactamines [(Garner et al., 1988) ; (Berger-Bachi, 1999)]. La PLP2a est codée par le gène mecA situé dans un grand fragment d’ADN chromosomique appelé mecDNA, retrouvé uniquement chez les souches résistantes à la méticilline et intégré au niveau d’un site spécifique [(Berthelot et al., 2001) ; (Hisata et al., 2005)].

Matériel et Méthodes

8. Etude de l’expression de l’opéron ica (intercellular adhesion locus) chez les souches hautement adhérentes La formation du biofilm dépend de l’expression de l’opéron chromosomique ica, qui comporte les quatre gènes de biosynthèse icaADBC nécessaires pour une expression maximale du PIA (Adhésine intercellulaire polysaccharidique) et le gène de régulation icaR [(Fey et al., 1999) ; (Dobinsky et al., 2003)]. Dans notre étude, les souches de S. aureus les plus performantes de part leur capacité à produire le biofilm ont été assujetties à une analyse quantitative de l’expression du gène ica par QRT-PCR en Temps Réel. Cette partie du travail a été effectuée dans le Laboratoire de Microbiologie et Médecine moléculaire du Centre Médical Universitaire de Genève. S. aureus Sa113 (ATCC35556) et son mutant Sa113 ica ko tet, ont été utilisés comme souches de contrôle (Cramton et al., 1999) ; la première souche étant connue par sa capacité à produire le biofilm tandis que la deuxième est une souche mutante, dépourvue du locus ica. Cette partie expérimentale vise à mettre en évidence le gène ica et déterminer son taux d’expression pendant la phase de croissance exponentielle et stationnaire chez les souches avérées hautement formatrices de biofilm. Pour ce faire, les souches étudiées y compris celles du contrôle ont été d’abord soumises à un suivi sur milieu liquide afin de déterminer leurs phases de croissance.

8.1. Etablissement des courbes de croissance Afin d’établir les courbes de croissance des souches de S. aureus étudiées, on s’est inspiré des travaux de Renzoni et al. (2006). Les souches inoculées dans du bouillon cœur cervelle ont été incubées à 37°C sous agitation à 200 rpm. Les mesures de densités optiques (DO) ont été effectuées toutes les 30 minutes à l’aide d’un spectrophotomètre 600nm. Les valeurs de DO en fonction du temps ont été représentées sous forme de courbes de croissance.

8.2. Procédure d’extraction de l’ARN total Les souches avérées comme ayant une forte capacité à produire le biofilm y compris celles du contrôle ont été soumises à une extraction de l’ARN total en se basant sur le protocole de RNeasy Plus Mini Kit Cat No 74134 Qiagen. L’expérimentation a été répétée trois fois consécutives.

Matériel et Méthodes

8.2.1. kit RNeasy Plus Mini Le kit RNeasy Plus Mini renferme les solutions suivantes : -Tampon RPE (lavage). -Tampon RW1 (lavage). -Tampon RLT (lyse cellulaire). -Eau exempte de RNase. -Tubes de collection (2 mL et 1,5 mL). -Colonnes gDNA Eliminator (gDNA Eliminator Mini Spin column). -Colonnes RNeasy (RNeasy Mini Spin Column). Avant de commencer les étapes de l’extraction, les solutions suivantes doivent être préalablement préparées : -Une solution d’éthanol à 70%. -Une solution de Tris EDTA (TE) 1X. -Une solution de 200 µg/mL lysostaphine (Ambicin; Applied Microbiology, Tarrytown, NY) dans du TE 1X. -Ajouter 4 volumes d’éthanol (96-100%) au tampon RPE. -Ajouter le β-mercaptoéthanol (β-ME) au tampon RLT à raison de 10µL de β-ME par 1mL de tampon RLT . -Préparer la solution de DNase Qiagen DNase Kit (Cat.No79254) en ajoutant 10µL de DNase à 70µL de tampon RDD, laisser à température ambiante pendant 30min.

8.2.2. Préparation des suspensions bactériennes Les souches étudiées, après avoir été cultivées à 37°C pendant 24h dans du bouillon cœur cervelle (BHI), sont diluées (1/100) dans 3mL de bouillon BHI puis incubées à 37°C sous agitation (200 rpm). Au temps ‘t’ correspondant à la phase de croissance exponentielle ou stationnaire, 0,5 mL de la subculture est soumis à une centrifugation pendant 5 minutes à 8000 rpm ; le culot est ensuite lavé à l’aide d’une solution de Tris EDTA 1X par centrifugation à 8000 rpm pendant 5 min puis conservé à -20°C jusqu’à utilisation ultérieure. Pour chaque souche on dispose de deux culots, l’un obtenu pendant la phase exponentielle de la croissance et l’autre pendant la phase stationnaire de croissance.

Matériel et Méthodes

8.2.3. Extraction d’ARN Le culot bactérien contenu dans un tube eppendorf est dissout dans 100 µL Tris EDTA renfermant 200 µg/mL de lysostaphine ; le tube est laissé pendant 10min dans un bloc chauffant à 37°C puis un volume de 350µL du tampon RLT est ajouté. Après homogénéisation du mélange, le lysat est transféré dans une colonne QIAshredder Spin et centrifugé pendant 2min à 13000 rpm. Le filtrat obtenu est introduit dans une colonne gDNA eliminator spin puis centrifugé à 10000 rpm pendant 30sec ; la colonne est éliminée et le filtrat est mélangé à 450µL d’éthanol (70%) par pipetages successifs. Le mélange de 700µL est transféré dans une colonne RNeasy plus mini spin puis centrifugé à 10000 rpm pendant 30sec. Après avoir jeté le filtrat, un volume de 500µL du tampon RW1 est ajouté dans la colonne RNeasy puis centrifugé pendant 30 sec à 10000 rpm. La colonne est placée dans un autre tube de collection, un volume de 80µL d’une solution de DNase est ajouté. Après 30min à température ambiante, la colonne est centrifugée pendant 30 sec à 10000 rpm, le filtrat est alors éliminé, 500 µL du tampon RW1 est introduit dans la colonne qui est ensuite centrifugée à 10000 rpm pendant 30 sec. La colonne est lavée par ajout de 500 µL du tampon RPE et centrifugée à 10 000 rpm pendant 30 sec. Cette étape est répétée avec une centrifugation de 13000 rpm pendant 2min pour bien sécher la membrane de la colonne RNeasy. La colonne subit une autre centrifugation à 13000 rpm pendant 1min pour éliminer toute trace d’éthanol puis 50µL d’eau exempte d’ARNase est ajoutée. Une centrifugation à 10000 rpm/1min est effectuée. Le filtrat obtenu représentant l’aliquot d’ARN est conservé à -80°C jusqu’à utilisation ultérieure.

8.2.4. Mesure de la quantité d’ARN extraite Les différents aliquots d’ARN des deux phases de la croissance exponentielle et stationnaire des souches étudiées, sont soumis à la mesure de densité optique DO à 260 nm par un spectrophotomètre (NanoDrop ND-1000). Cet appareil est connecté à un ordinateur muni d’un logiciel qui permet le traitement des données. La quantité d’ARN est alors exprimée en ng/µL. Les aliquots d’ARN sont ensuite dilués dans un volume de 100-200µL d’eau distillée stérile pour obtenir une concentration d’ARN de 0,8 ng/µL.

Matériel et Méthodes

8.3. PCR en temps réel (méthode Taqman) Cette étape qui précède la PCR inverse est essentielle afin de vérifier l’absence de toute trace d’ADN pouvant être présent dans les échantillons d’ARN à analyser [(Renzoni et al., 2004) ; (Li et al., 2005)]. La méthode Taqman permet d’obtenir un signal fluorescent à partir d’une sonde bi- marquée appelée « sonde Taqman » et dont l’augmentation de fluorescence est proportionnelle au produit de PCR. La sonde est marquée en 5’ par un fluorophore appelé ‘reporter’ et en 3’ par un autre type de fluorophore appelé ‘quencher’. La technologie Taqman (Figure 7) est basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser la sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape d’hybridation/élongation de la PCR (Poitras et Houde, 2002). L’émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque étape d’élongation pour chacun des cycles par un système de lecture intégré à l’appareil de PCR en temps réel qui permet de suivre l’augmentation de la quantité d’ADN amplifié durant la réaction (Bustin, 2000).

Sonde TaqMan Sonde hydrolysée avec suppresseur ADN double brin cible

Sonde hydrolysée avec fluorochrome stimulé Amplicon Amorce

Figure 7. Principe de la chimie Taqman (Elyse, 2002)

Matériel et Méthodes

8.3.1. Kit Eurogentec RT-QP2X-03 Le kit renferme les réactifs figurant dans le tableau 5 ci-dessous. Les séquences des amorces (Eurogentec) utilisées dans cette partie sont les suivantes :

 Amorce sens (SigB F) : 4862F 5’AAATTAGCAGTCATTAACCCATTCG3’  Amorce anti-sens (SigB R) : 4962R 5’ACAAAATCCTTCTCTGCTGCC3’  Sonde (SigB P) : 4900T 5’-[FAM]-AAAAGGTGTGATTTATCCGCATCCACCAG3’

La sonde est marquée par la 6-carboxyfluorescéine (6-FAM) à la terminaison 5’ et par la 6-carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) à l’extrémité 3’ de la séquence nucléotidique. 6-FAM est Un fluorochrome émetteur ‘reporter’ TAMRA est un fluorochrome suppresseur ‘quencher’ Le tampon (Tableau 5) contient : les quatre désoxyribonucléotides (dNTPs), l’ADN polymérase (HotGoldStar), Uracile-N Glycosylase, MgCl2 (5 mM concentration finale), et des stabilisants.

Matériel et Méthodes

Tableau 5. Mélange réactionnel de la PCR en temps réel (méthode Taqman)

Réactifs stock Concentration Concentration µL/puit µL/n puits ou dilution à finale/puit ex. n=70 utiliser

1.Tampon 2x 1x 7,5 525 (2xPCR Master mix for Probe assays)

2.H2O 1,6 112

3. SigB F 100µM 5µM 0,2 µM 0,6 42

4. SigB R 100µM 5µM 0,2 µM 0,6 42

5. SigB P 100µM 5µM 0,1 µM 0,3 21

Volume final 10,6 742

6. ARN 4ng 5

Volume 15 final/puit

Programme pour machine 2min 50°C 10min 95°C 39 cycles 15sec 95°C 30sec 60°C 50°C

Matériel et Méthodes

8.3.2. Procédure de la PCR en temps réel Un volume de 10 µL du mélange réactionnel composé de constituants 1 à 5 (tableau 5) est introduit en double dans les puits (y compris ceux du contrôle négatif) d’une plaque à PCR 96 puits. Un volume de 5µL d’ARN (0,8ng/µL) est ajouté dans les puits cibles tandis que ceux du contrôle négatif reçoivent 5µL d’eau distillée stérile. La plaque est couverte par un film adhésif pour éviter l’évaporation au cours des cycles de la PCR puis soumise à une centrifugation au Mégafuge (1.0R Heraeus) pendant 1min à une vitesse de 1000 rpm ; elle est ensuite placée dans le thermocycleur BIO-RAD (C1000TM Thermal Cycler, CFX96TM Real- Time System) et le logiciel de l’appareil permet par conséquent de détecter l’évolution de l’amplification de l’ADN dans chaque échantillon. Les résultats sont représentés sous forme de courbes ayant une allure d’une sigmoïde. NB : La manipulation doit s’effectuer impérativement sous la hotte et les réactifs utilisés ainsi que les échantillons d’ARN doivent être maintenus dans la glace tout au long de l’expérimentation.

8.4. PCR inverse en temps réel Le niveau de l’expression du gène ica durant les deux phases (exponentielle et stationnaire) chez les souches étudiées, a été déterminé par la PCR inverse quantitative ou QRT-PCR (Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) en temps réel. Le principe consiste en une PCR réalisée sur l’ADN complémentaire (ADNc) obtenu par rétro-transcription (ou transcription inverse) de l’ARN messager (ARNm) contenant le gène recherché (dans ce cas le gène ica). Cette transcription inverse est possible grâce à l’action d’une enzyme dite ADN polymérase ARN dépendante.

8.4.1. kit Invitrogen Cat no. 11731-023 Le kit renferme les réactifs figurant dans le tableau 6 ci-dessous. Les amorces et sondes utilisées dans cette partie expérimentale, nous ont été aimablement fournies par le laboratoire de recherche en génomique de l’hôpital universitaire de Genève, Suisse. Celles de l’opéron ica ont été conçues par le logiciel PrimerExpress 3.0 (Applied Biosystems), tandis que celles de l’ARN 16S ont été conçues par Eurogentec (Seraing, Belgium).

Matériel et Méthodes

 Amorce sens (IcaA F) : 5’GCCATGTGTTGGATGTTGGTT 3’  Amorce anti-sens (IcaA R) : 5’ CCCCTTGAGCCCATCTCA 3’  Sonde (IcaA P) : 5’-[FAM]-CGTTGCTTCCAAAGACCTCCCAATGTTT-3’

 Amorce sens (S16 F): 551F 5’GGCAAGCGTTATCCGGAATT3’  Amorce anti-sens (S16 R): 651R 5’GTTTCCAATGACCCTCCACG3’  Sonde (S16 P): 573T 5’-[FAM]-CCTACGCGCGCTTTACGCCCA3’

Le tampon (Tableau 6) est constitué d'un système propriétaire optimisé pour la transcription inverse et l’amplification PCR, il contient : 6 mM MgSO4, 0.4 mM de chacun des quatre désoxyribonucléotides (dNTPs), et des stabilisants.

Matériel et Méthodes

Tableau 6. Composition des mélanges réactionnels 1 et 2 utilisés dans la QRT-PCR en temps réel

Réactif Stock Concentration Final/puit µL/puit µL/n ou dilution à puits utiliser ex. n=46

Mélange réactionnel 1

1.H20 0,625 28,8

2.Tampon (ThermoScript 2x 1x 7,5 345 Reaction Mix)

3.S16 R 100 µM 5 µM 0,2 µM 0,6 27,6 4.S16 F 100 µM 5 µM 0,2 µM 0,6 27,6 5.S16 P 100 µM 5 µM 0,1 µM 0,3 13,8

6.TheroScript Plus/Platinium 0,075 3,5 Taq Enzyme Mix

Volume de MM 10 460 7.Aliquot ARN (5µL) 4ng 5 V final/puit 15

Mélange réactionnel 2

1.H20 0,325 15

2. Tampon (ThermoScript 2x 1x 7,5 345 Reaction Mix)

3.Ica A R 100 µM 5 µM 0,2 µM 0,6 27,6 4.Ica A F 100 µM 5 µM 0,2 µM 0,6 27,6 5.Ica A T 100 µM 5 µM 0,2 µM 0,6 27,6

6.TheroScript Plus/Platinium 0,075 3,5 Taq Enzyme Mix

Volume de MM 10 460 7.Aliquot ARN (5µL) 4ng 5 V final/puit 15

Matériel et Méthodes

8.4.2. Procédure de la QRT-PCR en temps réel Cette manipulation doit être effectuée dans les mêmes conditions que celle de la PCR en temps réel citées précédemment. La normalisation du niveau d’expression du gène cible (icaA) pendant la phase exponentielle et stationnaire de croissance chez les différentes souches étudiées, a été effectuée sur la base de leurs niveaux d'ARNr 16S [(Vaudaux et al., 2002) ; (Renzoni et al., 2004) ; (Li et al., 2005)]. Ce gène de référence, présent dans l’échantillon, est quantifié en même temps que le gène ciblé ; la concentration de ce dernier est alors normalisée par rapport à celle du gène de référence. Les mélanges réactionnels 1 et 2 constitués des éléments 1 à 6 du tableau 6 sont individuellement préparés dans deux tubes eppendorf. Un volume de 10 µL de chacun des deux mélanges 1 (cas du gène ARNr 16S) et 2 (cas du gène icaA) sont introduits dans les puits (y compris ceux du contrôle négatif) d’une plaque à PCR 96 puits. 5µL d’ARN (0.8ng/µL) est ajouté dans les puits cibles tandis que ceux du contrôle reçoivent 5µL d’eau distillée stérile ; la plaque à PCR est couverte par un film adhésif puis centrifugée au mégafuge (1.0R Heraeus) pendant 1min à une vitesse de 1000 rpm. La plaque est ensuite placée dans le thermocycleur BIO-RAD (C1000TM Thermal Cycler, CFX96TM Real-Time System). Le logiciel de l’appareil permet de détecter l’évolution de l’amplification du gène cible et de l’ARNr 16S dans chaque échantillon et les résultats sont représentés sous forme de courbes ayant une allure d’une sigmoïde.

9. Détection du PIA par Dot Blotting Cette partie de notre étude a été réalisée dans le Laboratoire de Prévention et Contrôle de l’Infection (SPCI) des Hôpitaux Universitaire de Genève. Le PIA (Adhésine Intercellulaire Polysaccharidique) ou slime est considéré parmi les facteurs intervenant dans l’agrégation intercellulaire pendant la deuxième étape de la formation du biofilm chez S. aureus. Ce polysaccharide extracellulaire est sous la dépendance du gène ica. Dans notre étude, le PIA a été mis en évidence chez les souches hautement adhérentes (LMB20327, LMB20330, LMB20338 et LMB20359) par la méthode Dot Blotting inspirée des travaux de Tu Quoc et al. (2007).

Matériel et Méthodes

Cette méthode se base sur une réaction immunologique sur membrane de nirocellulose; en présence des anticorps spécifiques anti-PIA et les anticorps secondaires (marqués par une enzyme: HRP ‘horseradish peroxydase’) reconnaissant le domaine constant des immunoglobulines G (IgG), la HRP peut catalyser la réaction chimique en présence du substrat Supersignal West Pico (pierce) et produire, par conséquent, une lumière dite chemiluminescence. Une culture de 24h/37°C (conditions statiques) dans le bouillon Trypticase soja (TSB) est diluée 1 :100 dans 2mL TSB. Après incubation à 37°C pendant 6h, la culture diluée est centrifugée pendant 5min à 2000 rpm puis le culot obtenu est lavé une fois par le tampon TBS (Tris Buffered Saline) ; après centrifugation à 2000 rpm pendant 5min le culot est suspendu dans 1mL TBS. La suspension est alors filtrée par une seringue 5µm (Sartorius) et la densité optique est mesurée à 600 nm. Les dilutions suivantes sont effectuées : 10-1, 10-2, 2.10-2 et 4.10-2 puis des spots de 50µL de chaque dilution sont appliqués sur une membrane de nitrocellulose suivant le manuel de ‘BioDot microfiltration apparatus de BioRad 4.1.1-4.1.10’. La membrane est rincée dans 100µL TBS, séchée sur papier buvard puis fixée à 80°C pendant 30min. La membrane est ensuite soumise à une coloration par Ponceau S pendant 10 min sous agitation légère. Après avoir été rincée dans le TBS, la membrane est maintenue pendant 1h sous agitation dans une solution de TTBS (TBS contenant : 3% Skim Milk et 0,02% Tween 20) puis incubée à température ambiante pendant 1h dans le TTBS (2% m/v albumine du serum bovin) supplémenté avec l’anticorps anti-PIA (Rabbit polyclonal anti-PIA) dilué 3000 fois. Après deux rinçages dans le TTBS pendant 10min, la membrane est incubée dans du TTBS contenant l’anticorps (Goat Anti Rabbit IgG HRP) dilué 3000 fois. La membrane est rincée 3 fois dans du TTBS pendant 10min puis développée avec le substrat ‘Super Signal West Pico chemiluminescent’ (Thermo Scientific n°34080). NB : Les deux souches Sa113 (ATCC35556) et son mutant Sa113 ica ko tet, nous ont servi comme souches de contrôle positif et négatif, respectivement.

Matériel et Méthodes

10. Étude de l’effet des huiles essentielles et de la povidone iodée sur S. aureus La povidone-iodée (PVI) apparait souvent parmi les composés antiseptiques les plus employés dans le milieu hospitalier en raison de son efficacité antibactérienne approuvée vis- à-vis un bon nombre de microorganismes (Guzel et al., 2009). Cependant, dans certaines conditions son effet antibactérien peut rapidement diminuer après contact avec la matière organique présente sur la peau [(Messager et al., 2001) ; (Reimer et al., 2002)]. Les huiles essentielles semblent activer la pénétration et améliorer la rétention des médicaments à usage local à l’intérieur de la peau [(Fang et al, 2004) ; (Biruss et al, 2007)]. C’est dans cet objectif que nous avons tenté d’étudier l’effet des huiles essentielles et de la povidone iodée, seules et en combinaison, sur la forme planctonique et sessile des souches de S. aureus. Avant de citer les différentes démarches de cette partie expérimentale, il apparait judicieux de donner une brève description du matériel végétal utilisé dans cette étude.

10.1. Matériel végétal 10.1.1. Eucalyptus globulus L’eucalyptus (Figure 8) est presque totalement endémique de l’Australie où il constitue 90% des forêts naturelles. Cet arbre exotique a été introduit en Algérie vers 1856 par Ramel. Le genre Eucalyptus (700 espèces au total) possède des capacités de survie et de croissance exceptionnelles. Leur feuillage est persistant et l’absence de dormance hivernale permet une croissance continue tant que les conditions climatiques sont favorables.

Figure 8. Photographie des feuilles d’Eucalyptus globulus

Matériel et Méthodes

Le mot « eucalyptus » vient du grec : eu « bon » et kalyptos « couvrir », car les pétales et sépales sont soudés. L’autre nom est « gommier » qui fait allusion à la gomme résineuse rouge que les arbres exsudent quand ils sont blessés. Son habitat consiste en général en des sols acides et humides. Les eucalyptus sont des angiospermes dicotylédones de la famille des Myrtacées. La principale classification est celle de Pryor et Johnson (1971) qui définissent sept sous-genres (Corymbia, Blakella, Eudesmia, Gaubaea, Idiogenes, Monocalyptus et Symphyomyrtus). Un huitième sous-genre (Telocalyptus) a été suggéré par Johnson (1976). Plus récemment, les sous-genres Corymbia et Blakella ont été formellement séparés du reste des Eucalyptus et placés dans un nouveau genre Corymbia (Hill et Johnson, 1995). Actuellement, les eucalyptus sont répartis dans les genres Eucalyptus, Corymbia et Angophora. Le genre Eucalyptus comprend principalement les sous-genres des Symphyomyrtus et des Monocalyptus qui contiennent la plupart des espèces cultivées.

 Classification dans la systématique botanique Synonymes : Gommier bleu, Eucalyptus globulus, Arbre à fièvre, Eucalyptus officinal. Règne : Plantae Division : Magnoliophyta Classe : Magnoliopsida - Dicotylédones Sous –classe : Rosidae Ordre : Myrtales Famille : Myrtaceae Genre : Eucalyptus Espèce : globulus Nom botanique : Eucalyptus globulus, Labill. Les noms vernaculaires : Kafor, Calitouss (le nom le plus connu en Algérie).

10.1.2. Rosmarinus officinalis Le romarin (Figure 9) est une plante herbacée. C'est un arbuste à feuilles persistantes et à nombreux rameaux pouvant atteindre 2 m de haut, les feuilles sessiles et opposées sont étroites et coriaces, à bords enroulés en dessous, vertes à la face supérieure, velues et blanchâtres à la face inférieure. Les fleurs sont réunies en cymes axillaires plus ou moins

Matériel et Méthodes contractées, simulant souvent des verticilles ou encore condensées au sommet de tige et simulant des épis (Messaili, 1995). Rosmarinus officinalis se répartit tout au long de la mer méditerranéenne et l’Europe d’où son nom « Rose de la mer » "Ros" "Marinus" (Guinochet, 1973).

 Classification dans la systématique botanique (Quezel et Santa, 1963) Embranchement : Phanérogames ou Spermaphytes Sous-embranchement : Angiospermes Classe : Eudicots Sous-classe : Gamopétales Ordre : Lamiales Famille : Lamiacées Genre : Rosmarinus Espèce : Rosmarinus officinalis (L.) Noms vernaculaires : Romarin, En arabe: Elyazir ou Iklil El djabel.

Figure 9. Photographie de Rosmarinus officinalis

10.1.3. Thymus capitatus Le nom Thymus proviendrait aussi bien du latin «parfumer» que du grec «courage». Le genre Thymus est l’un des 250 genres les plus diversifiés de la famille des labiées (Naghibi et al., 2005). Selon Dob et al. (2006), il existe prés de 350 espèces de thym réparties entre l’Europe, l’Asie de l’ouest et la méditerranée. C’est un arbuste qui est très répandu dans le Nord de l’Afrique (Algérie, Libye, Maroc et Tunisie). Il pousse également sur les montagnes d’Ethiopie et d’Arabie du sud ouest en passant par la péninsule du Sinaï en

Matériel et Méthodes

Egypte ainsi qu’en Sibérie et en Europe Nordique (Mebarki, 2010). Cependant, la plupart des espèces se concentrent dans le pourtour du bassin Méditerranéen [(Morales, 1997) ; (Salgueiro et al., 1997) ; (Pedersen, 2000)]. En Algérie, le genre Thymus regroupe 12 espèces : Thymus fontanesii, Thymus commutatus (Ball.), Thymus dreatensis, Thymus numidicus, Thymus guyonii, Thymus lanceolatus, Thymus pallidus, Thymus glandulosus, Thymus hirtus, Thymus algeriensis, Thymus ciliatus, et Thymus capitatus (L.) (Figure 10) (Quezel et Santa, 1963).

 Classification dans la systématique botanique (Quezel et Santa, 1963) Embranchement : Phanérogames ou Spermaphytes Sous-embranchement : Angiospermes Classe : Eudicots Sous-classe : Astéridées Ordre : Lamiales Famille : Lamiacées Genre : Thymus Espèce : Thymus capitatus (L.) Noms vernaculaires : en français : Thym, En arabe : Zaateur [(Quezel et Santa, 1963) ; (Kabouche et al.,2005)].

Figure 10. Photographie de Thymus capitatus

Matériel et Méthodes

10.2. Extraction des huiles essentielles Les huiles essentielles d’Eucalyptus globulus, Rosmarinus officinalis et Thymus capitatus ont été extraites des parties aériennes de ces plantes par hydrodistillation. L’extraction a été réalisée dans le Laboratoire « LAMAABE » de l’Université de Tlemcen. La récolte des trois plantes, E. globulus, R. officinalis et T. capitatus, a été faite à Lala Setti, Imama et Ouchba, respectivement. Les feuilles de la plante d’E. globulus et les plantes toutes entières sans racines de T. captatus et R. officinalis sont maintenues dans un endroit sec et aéré, à l’abri des rayons solaires Un mélange de 1400 mL d’eau distillée et 100 g de matériel végétal séché est hydrodistillé dans un Clevenger durant 3h. L’huile essentielle obtenue est conservée à + 4°C jusqu’à utilisation ultérieure. Le rendement (pourcentage) en huile essentielle a été exprimé par la formule suivante :

R = (p / m). 100 R : rendement en huiles essentielles exprimé en % p : volume d’huile essentielle en millilitre. m : masse du matériel végétal en gramme.

10.3. Effet des huiles essentielles vis-à-vis de S. aureus 10.3.1. Effet des huiles essentielles vis-à-vis de la forme planctonique de S. aureus Dans cette partie expérimentale, on a essayé d’évaluer l’effet des trois huiles essentielles extraites, sur la croissance sous forme planctonique de tous les isolats cliniques de S. aureus sélectionnés dans cette étude. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) ainsi que les concentrations minimales bactéricides (CMB), ont été déterminées par la méthode de micro-dilution sur microplaques 96 puits selon les recommandations du Comité national pour les normes de laboratoire cliniques (NCCLS, 1993) avec quelques modifications. Les huiles essentielles ont été testées à des concentrations allant de 4 à 0,003g/L. Leur solubilisation a été réalisée grâce à la présence d’une concentration de 2 % Tween 80 (Sigma- Aldrich). Le Tween 80 a été préalablement testé aux concentrations utilisées et s’est avéré sans aucun effet sur la croissance des souches de S. aureus étudiées.

Matériel et Méthodes

Les puits d’une microplaque 96 puits, contiennent chacun, 100µL d’huile essentielle testée (4 à 0,003g/L) et 100µL de la suspension bactérienne de la souche testée (105 UFC/mL), diluée dans du bouillon Mueller-Hinton (BMH). Les puits de la colonne 12 renfermant 200µL de la suspension bactérienne sans huile essentielle, servent de contrôle positif. Les microplaques sont ensuite incubées en aérobiose à 37°C pendant 18-24 h. La CMI est alors visuellement déterminée comme étant la plus petite concentration dont on note l’absence de toute croissance bactérienne après l’incubation. Après la lecture des CMI, les CMB ont été déterminées en inoculant le contenu total (200µL) de chacun des puits dans des tubes contenant 6 mL du milieu Letheen à 1% (w/v) d’agar en surfusion. Les tubes fermés et inclinés sont maintenus à température ambiante pendant 15min puis incubés à 37°C pendant 24 h. Les CMB correspondent aux concentrations dont on ne constate aucune croissance visuelle à l’œil nu après l’incubation.

10.3.2. Effet des huiles essentielles vis-à-vis de la forme sessile de S. aureus L’effet des huiles essentielles a été déterminé sur la forme sessile des souches de S. aureus hautement adhérentes. Les concentrations minimales inhibitrices du biofilm (CMIB) et concentrations minimales éradicatrices du biofilm (CMEB) ont été déterminées selon les protocoles décrits par Nostro et al. (2007) et Hendry et al. (2009). Tous les puits d’une microplaque 96 puits, refermant le biofilm des souches de S. aureus étudiées (comme décrit précédemment), sont lavés avec 200 µL de PBS stérile afin d’éliminer toute trace de cellules planctoniques. Une série de dilutions des huiles essentielles a été effectuée dans du bouillon Mueller- Hinton afin d’obtenir des concentrations allant de 4 à 0,03 g/L. Les puits de la microplaque sont remplis de 200 µL du bouillon Mueller-Hinton contenant une concentration appropriée d’huile essentielle testée. Les puits de la colonne 12 servant de contrôle, sont remplis uniquement d’eau physiologique stérile. Tous les puits renferment une concentration finale de 2 % Tween 80. La microplaque incubée à 37°C en aérobiose pendant 18-24 h est ensuite vidée et lavée une seule fois avec du PBS. Les puits sont remplis de nouveau avec 200 µL de PBS et la microplaque est soumise à une sonication à 50 Hz pendant 30 minutes à température ambiante.

Matériel et Méthodes

Le contenu de chacun des puits de la microplaque, dont on constate l’absence de croissance bactérienne, est récupéré en frottant les parois internes du puit par la pointe de l’embout d’une micropipette. La suspension ainsi aspirée est inoculée dans 6 mL du milieu Letheen 1% agar en surfusion contenu dans des tubes à vis. Ces derniers après avoir été inclinés, sont incubés à 37°C pendant 18-24 h. La CMIB correspond à la plus petite concentration d’huile essentielle aboutissant à une croissance inférieure ou égale à celle obtenue dans le puit contrôle (biofilm + eau physiologique), tandis que la CMEB correspond à la plus petite concentration d’huile essentielle aboutissant à un arrêt de toute croissance visible à l’œil nu sur le milieu gélosé employé.

10.4. Effet de la povidone iodée vis-à-vis de S. aureus 10.4.1. Effet de la povidone iodée vis-à-vis de la forme planctonique de S. aureus La povidone iodée (Sigma-Aldrich) utilisée dans cette étude a été testée à une gamme de concentrations allant de 65,53 à 0,06 g/L. L’effet de la povidone iodée sur la forme planctonique de S. aureus a été réalisé selon les recommandations du Comité national pour les Normes de Laboratoire cliniques (NCCLS, 1993). Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) et les concentrations minimales bactéricides (CMB), ont été déterminées par la technique de micro-dilution sur microplaques 96 puits. Les puits d’une microplaque 96 puits, contiennent chacun, 100µL de la povidone iodée testée à des concentrations allant de 65,53 à 0,06 g/L et 100µL de la suspension bactérienne de la souche testée (105 UFC/mL) diluée dans du bouillon Mueller-Hinton (BMH). Les puits de la colonne 12 renfermant 200µL de la suspension bactérienne sans povidone iodée, servent de contrôle positif. Les microplaques sont ensuite incubées en aérobiose à 37°C pendant 18- 24 h. La CMI est alors visuellement déterminée comme étant la plus petite concentration dont on note l’absence de toute croissance bactérienne après incubation. Après la lecture des CMI, les CMB ont été déterminées en inoculant le contenu total (200µL) de chacun des puits dans des tubes contenant 6 mL du milieu Letheen à 1% (w/v) d’agar en surfusion. Les tubes fermés et inclinés sont maintenus à température ambiante pendant quelques minutes puis incubés à 37°C / 24 h. Les CMB correspondent aux concentrations dont on constate l’absence de toute croissance visuelle à l’œil nu après incubation.

Matériel et Méthodes

10.4.2. Effet de la povidone iodée vis-à-vis de la forme sessile de S. aureus Les CMIBs et CMEBs ont été déterminées selon le protocole décrit par Hendry et al. (2009). Tous les puits d’une microplaque 96 puits, refermant le biofilm des souches de S. aureus (comme décrit précédemment), sont lavés avec 200 µL de PBS stérile afin d’éliminer toute trace de cellules planctoniques. Une série de dilutions de la solution de povidone iodée a été effectuée dans du bouillon Mueller-Hinton afin d’obtenir des concentrations allant de 65,53 à 0,006 g/L. Les puits de la microplaque sont remplis de 200 µL du bouillon Mueller-Hinton contenant une concentration appropriée de povidone iodée et les puits de la colonne 12 (contrôle) sont remplis uniquement d’eau physiologique stérile. La microplaque incubée à 37°C en aérobiose pendant 18-24 h est ensuite vidée et lavée une seule fois avec du PBS. Les puits sont remplis de nouveau avec 200 µL de PBS et la microplaque est soumise à une sonication à 50 Hz pendant 30 minutes à température ambiante. Le contenu de chacun des puits de la microplaque dont on note l’absence de croissance bactérienne est récupéré. La suspension ainsi aspirée est inoculée dans 6 mL du milieu Letheen 1% agar en surfusion contenu dans des tubes à vis. Ces derniers après avoir été inclinés, sont incubés à 37°C pendant 18-24 h. La CMI correspond à la plus petite concentration de la povidone iodée aboutissant à une croissance égale ou inférieure à celle obtenue dans le puit contrôle (biofilm + eau physiologique), tandis que la CMB correspond à la plus petite concentration de la povidone iodée aboutissant à un arrêt de toute croissance visible à l’œil nu sur le milieu gélosé employé.

10.5. Effet combiné des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de la forme sessile de S. aureus L’étude de l’effet de la combinaison huile essentielle/povidone iodée sur la forme sessile des souches de S. aureus hautement adhérentes a été effectuée par la méthode d’échiquier, sur microplaque 96 puits. Le protocole utilisé dans cette étude a été inspiré des travaux de Hendry et al. (2009).

Matériel et Méthodes

Une microplaque contenant du biofilm de la souche testée tel qu’a été décrit précédemment, est soumise à un lavage par PBS stérile (200 µL par puit). La solution de la povidone iodée est répartie horizontalement sur la microplaque à raison de 100 µL par puit à des concentrations décroissantes (concentrations finales : 32,76 à 0,06 g/L), alors que l’huile essentielle est répartie dans le sens opposé, c'est-à-dire verticalement, à raison de 100 µL par puit à des concentrations décroissantes (concentrations finales : 4 à 0,03 g/L). Les colonnes 11 et 12 renferment du biofilm dans de l’eau physiologique et du bouillon Mueller-Hinton seul, respectivement. La microplaque est incubée à 37°C en aérobiose pendant 18 - 24 h. Les CMIBs et CMEBs de chacun des agents antibactériens en combinaison, sont alors déterminées comme il a été précédemment indiqué. L’effet synergique, antagoniste ou encore indifférent de chacune des trois huiles essentielles testées en combinaison avec la povidone iodée, a été défini par la formule suivante (White et al., 1996) :

FICI = (FIC de PVI) + (FIC d’HE)

FIC = CMI de l’agent antimicrobien en combinaison / CMI de l’agent antimicrobien seul. Dont : FIC : Fraction de concentration inhibitrice. FICI : Index de FIC.

Effet antagoniste : FICI > 4.0. Effet synergique : FICI ≤ 0.5. Effet Indifférent : 0.5

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Résultats et Discussion

Partie III. Résultats et Discussion

1. Prélèvements

Sur une période de 30 mois, un nombre total de 362 cathéters a été prélevé sur des patients (150 enfants, 120 femmes et 92 hommes) hospitalisés pendant plus de 48 heures au niveau de différents services du CHU de Tlemcen (Néonatologie, Neurologie, Pneumologie, Pédiatrie, Médecine interne et Dermatologie). Concernant les informations sur le sexe, l’âge et la durée d’hospitalisation des patients étudiés (Annexe 2), nous n’avons pu retenir, en partie, que celles de la collection des 50 souches de S. aureus. Ceci était dû, d’une part au nombre élevé des prélèvements, et d’autre part à un manque des données concernant certains patients.

2. Analyses microbiologiques 2.1. Isolement des staphylocoques Sur 362 cathéters prélevés, nous avons pu isoler 240 souches de Staphylococcus, sur la base des critères d’identification suivants : - Aspect des colonies sur milieu Chapman : Après 24 à 48 heures à 37°C en aérobiose, la présence d’une culture permet d'orienter l'identification vers le genre Staphylococcus. Généralement S. aureus développe des colonies de petites taille punctiformes de couleur jaune doré avec décoloration nette du milieu en jaune ce qui reflète le caractère mannitol + (Figure 11a). Les autres espèces de Staphylococcus développent des colonies en général plus petites, mannitol + ou -. - Aspect microscopique des cellules et type de Gram (Figure 12b) : les staphylocoques sont des cocci Gram positif immobiles et asporulés. Ils peuvent être isolés, regroupées en diplocoques ou en amas. Les amas sont les plus caractéristiques du genre Staphylococcus. - Présence d’une catalase : Les Staphylocoques sont catalase positive, à l’exception de S. aureus subsp. anaerobius, S.capitis et S. saccharolyticus qui sont catalase négative [(Kloos et Bannerman, 1994) ; (PHE, 2014)]. - Absence de l’oxydase : La plupart des espèces du genre Staphylococcus sont oxydase négative à l’exception de S. sciuri, S. lentus et S. vitulinus. [(Kloos et Schleifer, 1986) ; (Brun et Bes, 2000)].

Résultats et Discussion

a b

10µm

Figure 11. Staphylococcus aureus : (a) colonies sur gélose Chapman, (b) coloration de Gram (la photographie a été rapprochée)

La sélection de souches de S. aureus parmi les 240 staphylocoques isolés, a été faite par la recherche d’une coagulase dite libre et d’une production d'acide à partir du mannitol.

2.2. Sélection des souches de S. aureus S. aureus est le représentant majeur coagulase positive ayant un rôle déterminant en pathologie humaine. Neanmoins, le test de coagulase peut etre soumis à un certain nombre de variations qui peuvent influencer les résultats (Myrick et Ellner, 1982). Des résultats faussement positifs peuvent être associés à certains plasmas, et des réactions faussement négatifs ou faussement positifs peuvent se produire après 24 h d’incubation [(Sperber et Tatini, 1975) ; (Kloos et Smith, 1980) ; (Stephan et al., 2004)]. En outre, parmi les staphylocoques plusieurs espèces peuvent produire, en aérobiose, de l'acide à partir du mannitol à l’exeption de S. aureus qui peut le produire en anaérobiose (Buchanan et Gibbons, 1974). Sur les 240 staphylocoques isolés dans cette étude, seuls 76 souches étaient coagulase positive et donc appartiennent probablement à l’espece S. aureus.

Résultats et Discussion

2.3. Identification biochimique L’identification biochimique par galerie API 20 STAPH des 76 souches (coagulase positive) nous a permis d’obtenir leur profil numérique ou biotype, 2 souches appartiennent à l’espece S. xylosus, 1 souche de S. haemolyticus, S. lentus et S. hyicus (Annexe 1) et 71 sont des espèces de S. aureus, représentés particulièrement par deux biotypes 6736153 (33,8%) et 6336153 (31%). Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans des études antérieures réalisées au CHU de Tlemcen, dont le biotype 6736153 de S. aureus était le plus dominant [(Rebiahi et al., 2011) ; (Kara Terki et al., 2013) ; (Khadir et al., 2013)]. Les souches à biotype 6336153 étaient présentes sur les cathéters provenant des différents services, notamment le service de néonatologie. Cette propagation pourrait être reliée, d’une part à l’environnement hospitalier et d’autre part aux malades et soignants. Les patients porteurs d’un nombre élevé de S. aureus courent un risque trois à six fois supérieur de contracter une infection associée aux soins avec ce micro-organisme que les patients non porteurs ou porteurs d’une faible quantité de ce germe [(Luzar et al., 1990) ; (Nouwen et al., 2006)]. Plus de 80% des infections associées aux soins, liées à S. aureus sont causées par les germes dont est porteur le patient lui-même (Wertheim et al., 2004). Les cathéters sont considérés parmi les implants médicaux à risque par rapport au développement d’infections associées aux soins (Klevens, 2005). Les microorganismes en cause émanent de la microflore cutanée du patient, de la microflore exogène du personnel hospitalier, ou encore d’environnements contaminés. Ces agents opportunistes sont susceptibles d’atteindre le cathéter par migration à partir de la peau le long de la partie externe du cathéter. S. aureus est l’un des microorganismes les plus fréquemment isolés.

2.4. Répartition des souches de S. aureus selon différents services Les 71 souches de S. aureus identifiées dans les differents services se répartissaient par ordre décroissant sur les services de néonatologie 37 (52,11%) puis ceux de pneumologie 13 (18,30%), de médecine interne 8 (11,26%), de pédiatrie 8 (11,26%), Neurologie 4 (5,63%) et de dermatologie 1 (1,40%) (Figure 12).

Résultats et Discussion

Nous avons constaté que les souches de S. aureus étaient isoléés à partir de tous des services étudiés de l’hôpital et principalement présentes dans les cathéters provenant du service de néonatologie. Ceci constitue un danger potentiel pour les sujets hospitalisés dans ce service et pourrait les exposer aux infections nosocomiales au cas où les mesures préventives nécessaires ne sont pas prises en charge. Le service de néonatologie étant considéré comme une unité de soins à risque puisque les individus qui y sont admis font tous partie de la population immunodéprimée. Les infections nosocomiales bactériennes représentent une préoccupation majeure en néonatologie. En France, la prévalence a été estimée à 7,2% (Sarlangue et al., 1998). Une étude épidémiologique réalisée à Casablanca avait montré une prévalence de 21,9% (Hmamouchi et al., 2005). Par ailleurs, selon une autre étude réalisée par Gayvallet-Montredon et al. (2002), la fréquence des bactériémies nosocomiales était la plus élevée en unité néonatale de soins intensifs (44.8%).

Figure 12. Distribution des souches de S. aureus étudiés sur différents services du CHU de Tlemcen.

Résultats et Discussion

3. Evaluation de la formation du biofilm chez les souches de S. aureus isolées des cathéters 3.1. Technique de microplaque 96 puits Dans cette partie, seul un nombre de 50 isolats cliniques de S. aureus biochimiquement identifiés ont été selectionés afin de tester leur capacité à produire du biofilm in vitro. Ceci par la méthode quantitative de coloration au cristal violet sur microplaque 96 puits en polypropylène. Les souches choisies sont celles pour lesquelles on avait à notre disposition un maximum de données sur leur provenance (service, sexe et âge du patient, durée du cathéter) (Annexe 2). Les valeurs moyennes de densités optiques (DO) obtenues (Annexe 3) par le lecteur d’absorbance pour microplaques (modèle EL×800) ont été converties en histogrammes sur Excel (figure 13). La valeur moyenne des puits de control (sans biofilm) qui est égale à 0,08 a été soustraite des DO moyennes de chacune des souches testées. D’après l’analyse des histogrammes par comparaison des différentes valeurs moyennes de DO obtenues par rapport au DOc (DOc =0.20), nous avons pu établir les intervalles suivants : Souche non adhérente : DO < 0,2 Souche faiblement adhérente : 0,2 < DO < 0,4 Souche modérément adhérente : 0,4 < DO < 0,8 Souche hautement adhérente : DO ˃ 0,8 Sur le nombre total de 50 souches de S. aureus, il s’est avéré que 34 (68%), étaient biofilm positif dont 20(40%), 10 (20%) et 4(8%) étaient faiblement adhérentes, modérément et fortement adhérentes, respectivement. Les autres souches 16 (32%) étaient non adhérentes. Ces résultats sont comparables avec ceux obtenus par Namvar et al. (2013) portant sur la détection de biofilm par la méthode de microplaque, 35 (58%) des souches de S. aureus étaient formatrices de biofilm contre 25 (42%) souches biofilm négatif. Parmi les 34 souches de S. aureus biofilm positif, 28 (82,35%) étaient isolées du service de néonatologie. Les quatre souches de S. aureus qui se sont avérées hautement adhérentes provenaient des services suivants : pédiatrie pour LMB20327, pneumologie pour LMB20330 et néonatologie pour LMB20338 et LMB20359.

Résultats et Discussion

En se basant sur ces résultats, nous avons constaté que le service de néonatologie est potentiellement exposé aux risques dus aux infections sur cathéter et associées à staphylocoque doré étant donné que les souches de S. aureus dans cette étude étaient majoritairement mises en évidence dans ce service ; d’autant plus 82,35% de ces souches étaient susceptible de former le biofilm. D’après Donlan (2008), la colonisation bactérienne peut avoir lieu dans les 24 heures suivant la pose du cathéter ; selon ce même auteur, au contact du flux sanguin, la surface du cathéter se recouvre alors d’un film protéique (fibronectine, laminine, fibrine) qui est susceptible de modifier les propriétés physico-chimiques de la surface du cathéter et favoriser la formation de biofilm 3 jours après sa pose. Dans notre étude, les 50 souches de S. aureus isolées et identifiées proviennent de cathéters (d’une durée supérieure ou égale à 7 jours) prélevés sur des patients de différents sexes et tranches d’âge. De nombreux facteurs, notamment la température élevée, le choc osmotique, la faible teneur en oxygène, l'éthanol, le glucose, la glucosamine, la N-acétylglucosamine, les auto- inducteurs, et des concentrations sub-inhibitrices de certains antibiotiques ont été identifiés comme étant des paramètres influençant l'expression de PIA (Adhésine Intercellulaire Polysaccharidique) in vitro [(Mack et al., 1992) ; (Gerke et al., 1998) ; (Rachid et al.,2000a,b) ; (Knobloch et al., 2001) ; (Conlon et al., 2002a,b) ; (Götz, 2002) ; (Dobinsky et al., 2003) ; (Zhang et al., 2011) ; (Yu et al., 2012)]. Effectivement selon Mack et al. (1992), le glucose semble induire l'étape d'agrégation multicellulaire de la formation de biofilm. Récemment, un nouvel opéron, gbaAB (glucose induced biofilm accessory gene), a été identifié. Cet opéron est étroitement impliqué dans la formation du biofilm (l’étape de l’agrégation multicellulaire) chez S. aureus NCTC8325 (You et al., 2014).

Résultats & Discussion Résultats

DO ˃ 0,8 hautement adhérente 0,4 < DO < 0,8 modérément adhérente

0,2 < DO < 0,4 faiblement adhérente DO < 0,2 non adhérente

Figure 13. Détection de la formation de biofilm par coloration au cristal violet sur microplaque en polypropylène chez 50 souches de S. aureus testées après culture de 24h à 37°C.

Résultats & Discussion

3.2. Technique du rouge Congo agar (RCA) La capacité à former du biofilm chez les souches étudiées, a été caractérisée par une autre méthode souvent employée afin de mettre en évidence d’éventuelle production de slime par les staphylocoques. Cette méthode qualitative se base sur le caractère phénotypique des souches ensemencées sur milieu rouge Congo (Figure 14). Les résultats obtenus nous ont permis de constater que parmi les 50 souches de S. aureus seules 10 (20%) étaient susceptibles de produire du slime (Figure 15).

Figure 14. Aspect des colonies de S. aureus sur milieu RC (Rouge Congo). A : souche slime (+), B : souche slime (-)

Selon certains auteurs, la classification des staphylocoques ensemencés sur milieu rouge Congo est rendue possible, en comparant la couleur des colonies : une couleur rose indique l’absence de biofilm et une couleur noire avec une consistance sèche indique la présence de biofilm ; tandis qu’une couleur rose avec un noircissement au centre de la colonie correspond aux souches faiblement productrices de biofilm alors que les colonies d’une couleur noire et lisses indiquent que les souches sont intermédiairement productrices de biofilm [(Freeman et al., 1989) ; (Mathur et al., 2006)].

Résultats & Discussion

Comme indiqué plus haut, 20% des souches de S. aureus testées sont productrices de slime sur milieu rouge Congo contre 68% de souches biofilm positif par la méthode de microplaque. Ces résultats sont en opposition avec ceux obtenus dans d’autres études réalisées précédemment au niveau de notre laboratoire [(Bellifa et al., 2013) ; (Kara Terki et al., 2013)]. La technique de microplaque 96 puits semble être la méthode de criblage la plus fiable, sensible, précise et reproductible, pour la détection de la formation de biofilm chez les staphylocoques [(Mathur et al., 2006) ; (Hassan et al., 2011)]. Cette technique, bien qu’elle est très utile pour montrer que les souches sont biofilm- positif ou biofilm-négatif et distinguer entre celles qui sont faiblement, modérément ou fortement adhérentes, il est important de reconnaître que les niveaux absolus de biofilm produit par une souche peuvent varier considérablement entre les expériences ce qui signifie que le protocole utilisé devrait être strictement respecté (Waters et al., 2014).

Figure 15. Pourcentage des souches de S. aureus productrices de biofilm ou slime par deux méthodes : A-microplaque 96 puits, B-milieu rouge Congo.

Résultats & Discussion

4. Identification moléculaire des souches de S. aureus fortement adhérentes Les 4 souches de S. aureus (LMB20327, LMB20330, LMB20338 et LMB20359) reconnues fortement adhérentes parmi la collection de 50 isolats, ont été soumises à une identification moléculaire afin de confirmer leur appartenance à l’espèce S. aureus.

4.1. Test d’agglutination au latex (Chang et Huang, 1993) Le test d’agglutination au latex qui consiste à la mise en évidence du récepteur au fibrinogène (clumping factor), la protéine A et l’antigène de capsule, est une méthode fiable pour l'identification de S. aureus dans le laboratoire clinique (Myrick et Ellner, 1982). La protéine A est un constituant spécifique de S. aureus (Forsgren, 1970). Cette protéine est liée d’une manière covalente au peptidoglycane de la paroi cellulaire (Sjoquist et al., 1972). Le résultat du test d’agglutination au latex (Figure 16) s’est avéré positif pour les quatre souches de S. aureus fortement productrices de biofilm et coagulase positive. Myrick et Ellner, (1982) ont montré une concordance entre les tests de coagulase et l'agglutination au latex dans 9o% des souches testées.

Figure 16. Test Pastorex ‘Staph-Plus latex agglutination’ (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France)

Résultats & Discussion

La protéine A est détectable chez plus de 90% des souches de S. aureus. Cette protéine qui est un antigène spécifique associé au peptidoglycane se lie au fragment Fc des immunoglobulines et inhibe la phagocytose [(Kloos et Lambe, 1991) ; (Mendes, 2005)]. Ce test d’agglutination permet de détecter simultanément la coagulase liée (récepteur de paroi se liant au fibrinogène) et la protéine A (antigène spécifique se fixant sur le fragment Fc des immunoglobulines humaines) de Staphylococcus aureus (Kloos et Lambe, 1991). Deux facteurs distincts sont impliqués de manière indépendante, la coagulase liée et la coagulase libre. Environ 97% des isolats humains de S. aureus possèdent les deux facteurs ; les proportions des souches ne présentant pas l’un des facteurs sont à peu près égales. Plus de 95% des souches humaines de S. aureus produisent la protéine A, indépendamment du facteur d’agglutination ou de la staphylocoagulase, qu’elle soit associée aux cellules et/ou extracellulaire (Jeljaszewicz et Switalski, 1983).

4.2. MALDI-TOF MS Actuellement, les méthodes moléculaires représentent le moyen le plus fiable et précis pour l’identification des microorganismes dont S. aureus. Les résultats d’identification ainsi que les spectres obtenus pour chacune de ces souches (LMB20327, LMB20330, LMB20338 et LMB20359), sont regroupés en Annexes 5 à 14. Les résultats de la technique MALDI-TOF MS confirment que les quatre souches testées ont été correctement identifiées au niveau de l'espèce avec un score > 2.300.

4.3. Recherche du gène femA Selon les résultats obtenus, les quatre souches hautement adhérentes (LMB20327, LMB20330, LMB20338 et LMB20359) possèdent le gène femA. La présence de ce gène témoigne et ratifie l’appartenance de ces souches à l’espèce S. aureus.

5. Antibiorésistance 5.1. Antibiogramme Pour caractériser phénotypiquement les quatre souches fortement productrices de biofilm, nous avons étudié leur sensibilité vis-à-vis de 14 antibiotiques les plus couramment utilisés en milieu hospitalier. Les résultats de l’antibiogramme sur milieu gélosé de Mueller

Résultats & Discussion

Hinton sont représentés dans l’annexe 16 et les diamètres d’inhibition des différents antibiotiques testés sont regroupés dans le tableau 7.

Tableau 7. Diamètres d’inhibition (mm) des différents antibiotiques testés vis-à-vis des quatre souches fortement productrices de biofilm.

Antibiotique LMB20327 LMB20330 LMB20338 LMB20359

Pénicilline 13 14 30 40

Oxacilline 22 21 30 30

Imipéneme 50 50 50 50

Ofloxacine 29 28 28 27

Acide nalidixique 11 - 12 12

Gentamicine 22 22 22 22

Amikacine 20 20 20 20

Erythromycine - - 30 29

Vancomycine 17 17 16 17

Rifampicine 35 36 34 35

Acide fusidique 29 28 29 30

Tétracycline 17 26 27 27

Fosfomycine 32 36 34 32

Chloramphénicol 25 24 25 26

Résultats & Discussion

Conformément aux recommandations du Comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie (CASFM) et du ‘Clinical and Laboratory Standards Institute’ (CLSI), les souches ont été classée dans l’une des catégories cliniques suivantes : sensible (S), intermédiaire (I) et résistante (R) (Tableau 8).

Tableau 8. Phénotypes de résistance aux antibiotiques testés des quatre souches hautement productrices de biofilm.

Antibiotiques LMB20327 LMB20330 LMB20338 LMB20359

Pénicilline R R S S

Oxacilline S S S S

Imipéneme S S S S

Ofloxacine S S S S

Gentamicine S S S S

Amikacine S S S S

Erythromycine R R S S

Vancomycine S S S S

Acide fusidique S S S S

Tétracycline I S S S

Fosfomycine S S S S

Chloramphénicol S S S S

Résultats & Discussion

Selon les tableaux 7 et 8 les quatre souches se sont avérées sensibles à la gamme d’antibiotiques testés, à l’exception des souches : LMB20327 et LMB20330 qui représentaient un phénotype résistant à la pénicilline et l’érythromycine. Ceci est en accord avec d’autres études menées sur des souches de S. aureus isolées du CHU de Tlemcen dont la majorité était résistante à la pénicilline et l’érythromycine [(Rebiahi et al., 2011) ; (Kara Terki et al., 2013)]. De même, la souche LMB20327 représentait une résistance intermédiaire vis-à-vis de la tétracycline. Un autre caractère qui mérite d’être souligné est la résistance hétérogène de la souche LMB20338 vis-à-vis de la pénicilline qui s’est traduite par la présence de quelques colonies dans la zone d’inhibition (Annexe 16).

5.2. Recherche du gène mecA Le diagnostic de certitude de la méticillino-résistance repose sur la détection du gène mecA. Malheureusement, selon Daurel et Leclercq. (2008) ce test ne peut pas être effectué facilement en routine. Selon nos résultats les quatre souches de S. aureus hautement productrices de biofilm sont dépourvues du gène mecA. Ce gène code pour la protéine de liaison aux pénicillines PLP2a qui est une cible pour les bêtalactamines ce qui rend les souches, possédant ce gène, résistantes à la méticilline (SARM) (Leclercq, 2002).

Résultats & Discussion

6. Étude de l’expression du gène icaA chez les souches de S. aureus fortement adhérentes Cette partie expérimentale nous a permis de mettre en évidence non seulement la présence du gène ica (intercellular adhesion locus), mais également de connaitre à quel moment de la croissance (exponentielle ou stationnaire) celui-ci est le mieux exprimé et déterminer son taux d’expression chez les souches étudiées pendant les deux phases de croissance.

6.1. Détermination des phases de croissance Les mesures de densités optiques effectuées sur les souches de S. aureus, inoculées dans du bouillon cœur cervelle et incubées sous agitation à 200 rpm, nous ont permis d’établir leurs courbes de croissance par le logiciel ‘GraphPad Prism’ et déterminer leurs phases de croissance (Figure 17). Ces courbes représentent la progression de la biomasse bactérienne par sa contribution à la densité optique (DO) du milieu en fonction du temps indiqué en minutes. Les courbes suivent le profil d’une sigmoïde avec une phase de latence d’environ 3h, une phase de croissance exponentielle à partir de 4h en moyenne et une phase stationnaire (Tableau 9).

Tableau 9. Phases de croissance des souches de S. aureus en fonction du temps

Souches Phase de latence Phase exponentielle Phase stationnaire

LMB20327 0h - 3h 4h – 6h >6h

LMB20330 0h - 3h 4h – 6h >6h

LMB20338 0h - 3h 4h – 7h 30min >7h 30min

LMB20359 0h - 3h 4h – 8h >8h

Sa113(ATCC35556) 0h - 3h 3h 30min – 6h >6h

Sa113 ica ko tet 0h - 3h 30min 4h 30min – 8h >8h

Résultats & Discussion

L’ajustement des courbes avec le modèle polynomial a permit l’obtention des coefficients de détermination appelés aussi coefficients de corrélation linéaire ou R2 (r squared) suivants : 0,981 pour LMB20327, 0,983 pour LMB20330, 0,984 pour LMB20338, 0,991 pour LMB20359, 0,951 pour Sa113(ATCC35556) et 0,991 pour Sa113 ica ko tet. Les résultats obtenus dans notre étude étaient relativement comparables à ceux obtenus par les travaux de Dassy et Fournier (1996) et Lindqvist (2006) qui ont porté sur l’étude des paramètres de croissance chez S. aureus à partir des données de densités optiques et la détermination des différentes phases de croissance. Néanmoins les conditions expérimentales dans notre étude n’étaient pas les mêmes que ceux des autres études. Ces conditions concernent en particulier : milieu de culture, conditions et durée d’incubation, longueur d’onde pour la mesure de DO.

Résultats & Discussion

Figure 17. Courbes de croissance de S. aureus incubé sous agitation

(200 rpm) à 37°C dans du bouillon cœur cervelle.

Résultats & Discussion

6.2. Détection de l’opéron ica et niveau d’expression du gène icaA 6.2.1. Extraction d’ARN total L’ARN total des souches de S. aureus étudiées a été extrait au cours de la phase exponentielle (après 4h à 5h) et pendant la phase stationnaire (8h à 9h). Nos échantillons d’ARN analysés par PCR (méthode Taqman) sont exempts de toute trace d’ADN. Chacune des souches étudiées est représentée par trois réplicats provenant de colonies distinctes, les quantités d’ARN obtenues des différents aliquots d’ARN des deux phases de la croissance, exponentielle et stationnaire, sont regroupées dans le tableau 10. Les quantités d’ARN obtenues sont largement suffisantes pour préparer des aliquots de 200µL contenant une concentration d’ARN de 0,8ng/µL. On note que la quantité d’ARN extraite est plus importante en phase de croissance stationnaire que pendant la phase exponentielle chez les souches LMB20327, LMB20330, Sa113 (ATCC35556) et Sa113 ica ko tet, ceci peut être du aux conditions de l’expérimentation et n’affectera pas les résultats des étapes ultérieures de la détection de l’opéron ica par QRT-PCR car la quantité d’ARN utilisée a été ajustée à 4ng pour tous les essais.

Résultats & Discussion

Tableau 10. Quantité d’ARN extraite (ng/µL) pendant la phase de croissance exponentielle et stationnaire des souches de S. aureus Souches Phase exponentielle Phase stationnaire LMB20327 82.3 448.6 56.7 424.8 22.8 267.4

LMB20330 307.9 234.1 32.7 328.8 49.8 442.7

LMB20338 357.4 202 277.8 228.7 116.4 221.2

LMB20359 121.5 45.6 147.7 37 112.2 7.5

Sa113 (ATCC35556) 11.5 24.5 17.8 29 5.3 29.4

Sa113 ica ko tet 42 317

6.2.2. Détection et quantification du gène icaA Ninin et al. (2006) ont montré que lorsqu’une souche possède le gène ica, les 4 gènes ica A, D, B et C sont toujours présents; nous avons donc recherché seulement le gène icaA chez les souches de cette étude. La détection de l’opéron ica et l’évaluation du niveau d’expression du gène icaA durant les deux phases de croissance, exponentielle et stationnaire, ont été réalisées par QRT- PCR (Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) en temps réel. Cette technique consiste en une PCR réalisée sur l’ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription inverse de l’ARNm du gène icaA recherché chez les souches de S. aureus

Résultats & Discussion

étudiées. Pour chaque PCR, nous avons utilisé comme témoin interne d’extraction une amplification d’ADN de la sous-unité ribosomale 16S qui représente un bon témoin du niveau de transcription. La souche Sa113 (ATCC35556) représentait le témoin positif pour l’opéron ica tandis que la souche Sa113 (ica ko tet) représentait le témoin négatif. Les axes des ordonnées des figures 18 et 19 représentent les valeurs de fluorescence qui sont enregistrées au cours de chaque cycle de PCR et reflètent la quantité d’amplicons produits en un point précis au cours de la réaction. Trois courbes sont obtenues pour chacune des souches examinées en triplicata. La quantité de matrices à amplifier au départ de la réaction PCR, est inversement proportionnel au nombre de cycle requis pour atteindre un point où le signal d’émission de fluorescence sera significativement plus élevé que le bruit de fond. Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct ou threshold cycle). Cette valeur du cycle seuil peut être exprimée quantitativement par comparaison avec les valeurs du Ct générées avec des matrices de quantification connues. La première augmentation significative de la quantité d’amplicons est en corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice cible (Elyse, 2002).

Résultats & Discussion

Réplicat 1

ARN 16S Fluorescence

icaA

Cycles

Réplicat 2

ARN 16S

Fluorescence

icaA

Cycles

Réplicat 3

Fluorescence ARN 16S

icaA

Cycles Figure 18. Quantification d’ARNm (3 réplicats) des gènes ARN 16S et ica par QRT-PCR en temps réel en phase de croissance exponentielle des souches (LMB20327, LMB20330,

LMB20338, LMB20359, Sa113ATCC35556 et Sa113 ica ko tet)

Résultats & Discussion

Réplicat 1

ARN 16S

Fluorescence

icaA

Cycles Réplicat 2

Fluorescence ARN 16S

icaA

Cycles Réplicat 3

Fluorescence ARN 16S

icaA

Cycles Figure 19. Quantification d’ARNm (3 réplicats) des gènes ARN 16S et ica par QRT-PCR en temps réel en phase de croissance stationnaire des souches (LMB20327, LMB20330,

LMB20338, LMB20359, Sa113ATCC35556 et Sa113 ica ko tet) 79

Résultats & Discussion

Le gène de référence ARNr 16S présent dans l’échantillon est quantifié en même temps que le gène ica, la concentration de ce dernier étant ensuite normalisé par rapport à celle connue du témoin interne dont l’expression est constante. D’après les résultats (Figures 18 et 19) convertis en histogrammes de la figure 20, nous avons constaté la présence de l’opéron ica chez les quatre souches testées (LMB20327, LMB20330, LMB20338 et LMB20359). La comparaison du taux d’ARNm du gène icaA, chez les souches étudiées, a été faite par rapport au témoin positif (Sa113 ATCC35556) considéré comme ayant un taux de production de 100%. Ce taux varie significativement chez les souches testées pendant la phase de croissance exponentielle. Il est inférieur d’environ 22%, 61% et 87% chez les souches LMB20330 (service de pneumologie), LMB20338 (service de néonatologie) et LMB20359 (service de néonatologie), respectivement. Cependant, le pourcentage détecté d’ARNm du gène icaA est d’environ deux fois supérieur chez la souche LMB20327 (service de pédiatrie) que celui du témoin positif. Par ailleurs, pendant la phase de croissance stationnaire le pourcentage en ARNm du gène icaA des quatre souches étudiées diminue considérablement par rapport à la phase de croissance exponentielle. Il est d’environ 3 fois, 5 fois, 6 fois et 11 fois inférieur chez les souches LMB20359, LMB20338, LMB20327 et LMB20330, respectivement.

Résultats & Discussion

Figure 20. Les niveaux d’expression de l’opéron ica chez les souches de S. aureus fortement productrices de biofilm.

Dans cette étude, les quatre souches (hautement formatrices de biofilm) isolées à partir des cathéters prélevés sur des patients hospitalisés pendant une durée équivalente ou supérieure à 7 jours, possèdent le gène icaA. Ce résultat est en accord avec les données de la littérature où il a été montré que le gène icaA était plus fréquemment présent chez les microorganismes provenant de cathéters prélevés sur des patients hospitalisés pendant une semaine (Namvar et al., 2013). Les quatre souches qui possèdent l’opéron ica se sont aussi avérées productrices de slime ou PIA (adhésine intercellulaire polysaccharidique) sur milieu rouge Congo. Ces résultats s’accordent avec ceux de Touati et al. (2007) qui confirment la présence de l’opéron ica chez toutes les souches productrices de slime, et son absence chez les souches slime négatif. Tout comme S. epidermidis ; S. aureus produit le slime surtout pendant la phase post-

Résultats & Discussion exponentielle de croissance [(Bayston et Rodgers, 1990) ; (Deighton et Borland, 1993) ; (Dassy et Fournier, 1996)]. L’opéron ica est présent chez 80 à 90% des souches cliniques de Staphylococcus alors que seulement 5 à 30% des isolats saprophytes le possèdent [(Ziebuhr et al., 1997) ; (Frerbourg et al., 2000) ]. En effet, certains auteurs estiment que le gène ica peut être un meilleur marqueur de la pathogénicité d’une souche que la capacité à se multiplier et à former un biofilm (Galdbart et al., 2000). En fait, cette capacité à produire le biofilm peut ne pas être détectée en raison de sa variation avec la phase de croissance, les microorganismes synthétisant plus d’exopolysaccharides pendant la phase stationnaire que durant la phase de croissance exponentielle, et de l’influence des conditions environnementales (Cho et al., 2002). Plusieurs études menées sur S. aureus s’accordent à dire que la production des exopolysaccharides est faible en phase de croissance exponentielle puis maximale en phase post-exponentielle [(Dassy et Fournier, 1996) ; (Cunnion et al., 2001)]. Selon les résultats obtenus (Figure 20), il semble que le gène ica est exprimé surtout et essentiellement pendant la phase exponentielle de croissance chez les quatre souches de S. aureus testées. Au cours de la phase stationnaire de croissance le niveau d’expression était faible. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Beenken et al. (2005) et Resch et al. (2005). L’adhésine intercellulaire polysaccharidique (PIA) ou slime, codée par l’opéron ica est un élément important dans la formation du biofilm mais pas indispensable. Selon une étude réalisée par Arciola et al. (2001), les souches de S. aureus isolées de cathéters et refermant le gène icaA étaient aptes à produire le slime. D’après Cramton et al. (1999), lorsque S. aureus est dépourvu de son opéron ica, il devient incapable de former le PIA et le biofilm in vitro. Cependant, selon d’autres études plus récentes, S. aureus est capable de produire du biofilm avec des voies indépendantes du PIA comme en témoignent certaines souches contenant l’opéron ica mais ne produisant pas de biofilm (Higashi et Sullam, 2006). D’autres auteurs ont montré qu’une mutation ou une absence du locus ica chez des isolats cliniques de S. aureus n’affectait pas la formation de biofilm [(Fitzpatrick et al., 2005) ; (Toledo-Arana et al., 2005) ; (Kogan et al., 2006)]. Par ailleurs, le locus agr (accessory gene regulator), qui est activé en phase de croissance post-exponentielle, semble influencer la formation de biofilm chez S. aureus bien que l’expression du PIA ne soit pas sous le control de ce locus (Vuong et al., 2000).

Résultats & Discussion

L’opéron ica est hautement régulé chez S. aureus et il est requis pour l’adhésion est l’amorcement de la formation du biofilm ; les gènes ica sont hautement exprimés seulement au début de la formation d’un biofilm (Resch et al., 2005). Les produits de ces gènes ont une longue demi-vie et par conséquent, l’expression de ces gènes pourrait ne pas être nécessaire une fois que les cellules sont fixées à la surface, la formation de biofilm a commencé, et la croissance cellulaire est retardée en raison de l'épuisement des nutriments (Dobinsky et al., 2003). En effet, l’expression d’icaA seule, induit une faible activité enzymatique, mais la coexpression parallèle des deux gènes icaA et icaD provoque une augmentation significative de l’activité et semble être corrélée à l’expression phénotypique des polysaccharides cellulaires (Gerke et al., 1998). Le gène icaR est un répresseur de transcription de l’opéron ica chez S. caprae, S. epidermidis et S. aureus [(Allignet et al., 2001) ; (Conlon et al., 2002a) ; (Jefferson et al., 2003)]. Ce gène est localisé en amont de l’opéron icaADBC et il est transcrit dans le sens opposé aux 4 autres gènes de l’opéron [(Allignet et al., 2001) ; (Conlon et al., 2002a)]. La régulation de l'expression des gènes ica est complexe et dépend de nombreux facteurs (Moretro et al., 2003). Le glucose est l’un des facteurs qui a été intensément étudié chez S. aureus. En présence de glucose, on constate une augmentation de la transcription d’ica responsable en partie de l’augmentation de la synthèse du PIA ; en absence de glucose, icaR jouerait un rôle dans la suppression de la production du PIA [(Conlon et al., 2002a) ; (Conlon et al., 2002b)]. Dans notre étude le bouillon cœur cervelle utilisé contenant une teneur de 0,2% glucose semble influencer le taux élevé d’expression du gène ica constaté au cours de la phase exponentielle de croissance. Ce résultat corrèle avec celui de Dobinsky et al. (2003) qui ont montré que l'expression d’ica chez S. epidermidis est stimulée par la présence de glucose dans la phase exponentielle, mais est inhibée par la présence de glucose dans la phase stationnaire. En effet, selon d’autres études effectuées dans notre laboratoire la présence du glucose influence positivement la formation du biofilm chez S. aureus et Acinetobacter baumannii [(Kara Terki et al., 2013) ; (M’Hamedi et al., 2014)]. D’autre facteurs tels que la température élevée (≥45°C), l’éthanol (≥4%) et le chlorure de sodium à forte concentration (≥10%) peuvent réprimer l’expression d’icaR, qui de ce fait, n’inhibe plus l’opéron ica [(Conlon et al., 2002a) ; (Conlon et al., 2002b)].

Résultats & Discussion

Chez les staphylocoques, les connaissances scientifiques actuelles sur les systèmes régulateurs de biofilm sont encore limitées (Dobinsky et al., 2003). Certes, le gène ica est un élément clé dans la formation de biofilm, notamment chez S. aureus, mais les fonctions attribuées à ce gène, n’ont pas encore été toutes élucidées. Dans une étude effectuée par Cramton et al. (1999), le locus ica était présent chez toutes les souches de S. aureus testées alors que seulement une minorité de ces souches était susceptible de former le biofilm. D’après Moretro et al. (2003), la haute prévalence du locus ica parmi les souches de staphylocoques biofilm-négatifs dont S. aureus, a été expliquée par le faible niveau d’expression du gène ica chez ces souches, mais aussi par la présence, probablement, d’autres mécanismes inconnus impliqués dans la formation de biofilm. Selon McKenney et al. (1999) l'expression du locus ica est étroitement régulée chez S. aureus et est préférentiellement exprimé dans des conditions in vivo. A cet égard, nous avons tenté de confirmer la présence du PIA chez les quatre souches caractérisées dans cette étude, par la méthode immunologique Dot Blotting.

7. PIA Dot Blotting L’expression du gène ica ainsi que la synthèse du polysaccharide PIA sont importants pour l’initiation de l’adhésion et la formation de biofilm chez les staphylocoques [(Gerke et al., 1998) ; (Cramton et al., 1999) ; (Götz, 2002)]. En effet, S. aureus produit plusieurs molécules intervenant dans l’adhésion (PIA, protéine associée au biofilm, et d’autres adhésines) et permettant à la cellule bactérienne de s’agripper aux différentes surfaces (Cucarella et al., 2002). L’adhésine intercellulaire polysaccharidique (PIA) a été décrite dans plusieurs études comme étant un composant jouant un rôle crucial dans la formation de biofilm et la virulence dans les cas d’infections systémiques et celles associées aux implants [(Fluckiger et al., 2005) ; (Kropec et al., 2005)]. Bien que répandue dans de nombreuses souches cliniques de Staphylococcus, la production du PIA n’est pas toujours en corrélation avec la formation de biofilm, et en fait, dans certains systèmes modèles, le locus ica peut être supprimé sans affecter de manière significative la formation de biofilm in vitro ou in vivo (Beenken et al., 2005). Dans notre étude, les résultats obtenus par analyse semi-quantitative Dot Blotting, illustrés par la figure 21, montrent et confirment la présence du PIA chez les quatre souches testées (LMB20327, LMB20330, LMB20338 et LMB20359).

Résultats & Discussion

Le taux du polysaccharide PIA a été valorisé par simple comparaison de l’intensité des spots obtenus chez les souches testées dans notre étude avec ceux de la souche du control négatif. En conséquence, ces résultats, nous ont permis de confirmer que les quatre souches possédant le gène ica, forment le biofilm par voie dépendante du PIA.

+ - + + + +

Sa113 (ATCC35556) LMB20327 tet ica ko Sa113 LMB20330 LMB20338 LMB20359

Figure 21. Résultat de la détection du PIA par Dot Blotting

Résultats et Discussion

8. Effet antibactérien des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de S. aureus Bien que l’insertion d’un cathéter chez une personne hospitalisée soit souvent précédée d’un acte de décontamination de la peau, les infections sur cathéter qui sont l’une des formes cliniques d’infections associées aux soins, restent un véritable problème préoccupant de santé. En fait, la peau ne peut pas être entièrement stérilisée car environ 20% de la flore résidente est au-delà de la portée des solutions antiseptiques [(Sebben, 1983) ; (Mackenzie, 1988)]. Le but de la préparation chirurgicale de la peau avec des antiseptiques est de supprimer les micro-organismes pathogènes transitoires sur la surface de la peau et de réduire la flore résidente à un niveau bas (Guzel et al., 2009). Au fil des années, un grand nombre de substances a été utilisé dans la préparation de la peau tels que le phénol, l'iode, l’éthanol, l’isopropanol, le merthiolate, l’hexachlorophène, des composés d'ammonium quaternaire, l’iodophore, la chlorhexidine et l’octénidine dichlorhydrate / phénoxyéthanol [(Ayliffe, 1984) ; (Mannion et al., 1989) ; (Langer et al., 2004)]. Cependant, la Chlorhexidine et la povidone-iodée (PVI) sont privilégiées parmi les autres composés antiseptiques en raison de leur bonne efficacité pour la décontamination de la peau (Guzel et al., 2009). La PVI a une activité bactéricide rapide, mais cette activité peut rapidement diminuer après contact avec la matière organique présente sur la peau [(Messager et al., 2001) ; (Reimer et al., 2002)].Cette situation engendre un besoin de trouver de nouveaux composés antimicrobiens pouvant améliorer l’action de cet antiseptique. Les plantes médicinales constituent une source potentielle de substances antimicrobiennes dont les huiles essentielles (HEs). Selon certaines études effectuées sur les huiles essentielles, il a été montré que ces dernières agissent comme activateurs de la pénétration et améliorent la rétention des médicaments à usage local à l’intérieur de la peau [(Fang et al., 2004) ; (Biruss et al., 2007)]. Ceci justifie notre choix pour les huiles essentielles testé dans cette étude, d’une part pour leur pouvoir antimicrobien contre la forme planctonique et sessile de S. aureus et d’autre part pour l’effet en combinaison avec la povidone iodée sur l’état biofilm de ce microorganisme.

Résultats et Discussion

8.1. Extraction des huiles essentielles Les résultats obtenus, donnent un rendement en huiles essentielles extraites par hydrodistillation de 0,75 % (v/p) pour E. globulus, 1,20 % (v/p) pour R. officinalis et 1,90 % (v/p) pour T. capitatus. Selon d’autres travaux ultérieurs réalisés dans notre laboratoire ces rendements étaient variables mais comparables a ceux de la littérature ainsi qu’à ceux obtenu dans cette étude ; des rendements en huiles essentielles de 3.8 % (Elaissi et al., 2011) et 1,96% (Khadir, 2014) pour E. globulus, 1,62% (Benbelaid et al., 2014) et 0,6% (Miguel et al., 2005) pour T. capitatus. L’hydrodistillation est la technique d’extraction des HEs la plus simple et qui est considérée comme une méthode référencielle. Les conditions opératoires et, notamment, la durée de distillation ont une influence considérable sur le rendement et la composition de l’huile essentielle. C’est pourquoi sont développés, aujourd’hui, des modèles mathématiques qui permettent d’optimiser au mieux ces conditions afin de produire des huiles essentielles de manière reproductible [(Cerpa et al., 2008) ; (Cassel et al., 2009)]. De plus, l’origine géographique, le climat, le sol, la période de récolte ou bien encore les pratiques agriculturales, peuvent avoir une influence directe sur la composition chimique d’une huile essentielle (Baser et Buchbauer, 2009). En fait, ces paramètres n’ont pas été pris en considération dans notre étude puisqu’ils ne faisaient pas partie de notre objectif.

8.2. Effet des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de la forme planctonique de S. aureus Les concentrations minimales inhibitrices (CMIs) et bactéricides (CMBs) des trois HEs ainsi que la povidone iodée contre la croissance planctonique des cinquante isolats de S. aureus identifiés, ont été déterminées par la méthode des microdilutions en milieu liquide sur des plaques 96 puits en polypropylène. Les valeurs de CMI et CMB obtenues sont regroupées dans le tableau de l’annexe 18. Pour les huiles essentielles d’E. globulus (HEE), R. officinalis (HER) et T. capitatus (HET), les CMI contre les souches testées variaient de 0,06 à 1 g/L, 0,12 à 2 g/L et de 0,12 à 1 g/L, respectivement. La CMB de l’HEE, l’HET et l’HER a pu atteindre une valeur de 4 g/L contre les souches LMB20308, LMB20326 et LMB20318, et LMB20308 et LMB20334, respectivement.

Résultats et Discussion

Ces résultats permettent d’attribuer une meilleure efficacité antibactérienne à l’HE d’E. globulus suivie par T. capitatus puis R. officinalis contre la croissance planctonique des souches de S. aureus. En effet, nos résultats concordent en partie avec ceux obtenus par Ait- Ouazzou et al. (2011) qui ont mis en évidence une bonne activité bactériostatique et bactéricide, selon un ordre croissant, de T. algeriensis, E. globulus et R. officinalis, contre sept bactéries pathogènes et d’altération dont S. aureus. Par ailleurs, selon les travaux de Van Vuuren et al. (2007) qui ont porté sur l’effet antimicrobien de 1,8-cineole, il semble que ce constituant majeur de l’HE d’E. globulus, a un faible effet sur S. aureus avec des CMI de 8 mg/mL. D’autres recherches portant sur l’étude de l’efficacité antimicrobienne de ces huiles essentielles, ont été rapportées dans la littérature. Les HEs d’Eucalyptus [(Akbari et al., 2007) ; (Cermelli et al., 2008) ; (Gil et al., 2010) ; (Tyagi et al., 2011 ; (Bachir-Raho et Benali, 2012)], du romarin [(Hussain et al., 2010) ; (Lima et al., 2013)] ainsi que le thyme [(Fan et Chen, 2001) ; (Bounatirou et al., 2007) ; (Ebrahimi et al., 2008) ; (Ehivet et al., 2011) ; (Fadli et al., 2012)], semblent avoir un bon effet antibactérien contre certaines bactéries Gram positif, y compris S. aureus, et Gram négatif. Par ailleurs, l’effet inhibiteur des HEs contre les bactéries selon leur type de Gram est controversé (Ehivet et al., 2011). Généralement et selon certains auteurs, les bactéries Gram positif sont plus susceptibles à l’action des HEs que les bactéries Gram négatif (Delaquis et al., 2002). Dans une autre étude réalisée par Ouattara et al. (1997), aucune différence significative entre la sensibilité des bactéries Gram positif et Gram négatif vis-à-vis des HEs n’a été constatée après 24 h, néanmoins après 48h les Gram négatif étaient plus vulnérables que les Gram positif. Ceci peut être expliqué par la structure des bactéries Gram négatif qui possèdent en plus une membrane supplémentaire dite externe leur conférant une surface hautement hydrophile et jouant le rôle d’une barrière contre la diffusion des molécules hydrophobiques [(Ultee et al., 1999) ; (Tian et al., 2008) ]. Sans cette membrane externe, les bactéries Gram négatif deviennent plus perméables aux agents antimicrobiens (Burt, 2004). Certains critères caractérisent les HEs comme substances alternatives dans le domaine de lutte contre certaines bactéries nosocomiales tel que S. aureus. Parmi ces critères on peut citer les plus importants :

Résultats et Discussion

- un large spectre d’activité antimicrobienne : les HEs peuvent être antifongiques, antibactériennes et antivirales (Thormar, 2011). - la non spécificité du mécanisme d’action : les HEs agissent d’une façon non ciblée sur la fragilisation et la déstabilisation des membranes cytoplasmiques des cellules procaryotes (Burt, 2004). - les HEs, à l’image des antiseptiques, sont susceptibles d’agir sur les microorganismes pendant toutes les phases de la multiplication microbienne (Thormar, 2011). La povidone iodée connue sous le nom de Bétadine® est un antiseptique qui a une activité bactéricide sur plusieurs pathogènes, y compris le staphylocoque doré résistant à la méticilline (Aslan Guzel, 2009). Selon les résultats obtenus dans notre étude, cet antiseptique a montré une activité antibactérienne sur les cinquante souches de S. aureus testées en culture planctonique avec des concentrations minimales inhibitrices (CMI) comprises entre 2,04 et 8,19 g/L. Tandis que, la concentration minimale bactéricide (CMB) de la PVI était de 8,19 g/L vis-à-vis de toutes les souches. Il a été rapporté dans la littérature que l’efficacité antiseptique de la povidone iodée est attribuée principalement à l'iode libre ou disponible qu’elle contient (Rutala, 1996). L’iode est lentement libéré et délivré à la surface de la cellule bactérienne où il pénètre à travers la membrane cellulaire et inactive les protéines cytoplasmiques, les acides gras et les nucléotides (Durani et Leaper, 2008).

8.3. Effet des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de la forme sessile de S. aureus Comme il était déjà évoqué dans la synthèse bibliographique, les bactéries dont S. aureus, lorsqu’elles sont en biofilm, deviennent moins vulnérables vis-à-vis d’une large gamme d’agents antimicrobiens d’où l’intérêt de tester ces huiles ainsi que la povidone iodée sur la forme sessile des souches de S. aureus. Dans cette étude, les souches ayant fait l’objet de ces tests sont celles qui se sont avérées hautement productrices de biofilm, LMB20327, LMB20330, LMB20338 et LMB20359. A cet égard, les concentrations minimales inhibitrices du biofilm (CMIBs) et éradicatrices du biofilm (CMEBs) de la PVI et des HEs ont été déterminées par la méthode de microdilutions sur plaque 96 puits (Tableau 11).

Résultats et Discussion

Tableau 11. CMIB et CMEB des HEs et de la PVI vis-à-vis les souches de S. aureus hautement productrices de biofilm. HE : huile essentielle, PVI : povidone iodée, HEE : HE d’E. globulus, HER : HE de R. officinalis, HET: HE de T. capitatus

Souches Agent antibactérien CMIB (g/L) CMEB (g/L)

PVI 8,19 65,53 HEE 1 >4 LMB20327 HER 1 >4 HET 1 >4

PVI 16,38 65,53 HEE 0,5 1 LMB20330 HER 2 >4 HET 0,5 >2

PVI 4,09 65,53 HEE 0,25 >4 LMB20338 HER 0,25 >4 HET 0,5 >4

PVI 8,19 65,53 HEE 0,5 >4 LMB20359 HER 1 4 HET 0,5 >4

PVI 1,02 8,19 HEE 1 >4 S.aureus ATCC HER 0,25 >4 25923 HET 2 >4

PVI 8,19 65,53 HEE 1 >4 SARM ATCC 43300 HER 2 2 HET 0,5 4

PVI 16,38 65,53 HEE 1 >4 SARM ATCC 33591 HER 2 >4 HET 0,5 2

Résultats et Discussion

D’après les résultats obtenus dans cette étude, on a constaté que les valeurs des CMIBs et CMEBs sont significativement supérieures que celles obtenues contre les mêmes souches lorsqu’elles sont cultivées sous forme planctonique. Les CMIBs de la PVI variaient entre 4,09 et 16,38 g/L tandis que les CMEB atteignaient une valeur de 65.53 g/L vis-à-vis des quatre souches précédemment citées. Quant aux huiles essentielles, la même constatation a été soulevée à propos des valeurs de CMIBs et CMEBs qui augmentent considérablement ; on a pu noter des valeurs de CMIBs de 0,25 à 1 g/L pour l’HEE, 0,25 à 2 g/L pour l’HER et 0,5 à 2 g/L pour l’HET ; alors que généralement, la CMEB de ces huiles vis à vis des quatre souches testées, a été supérieures à 4 g/L. Cette différence constatée entre les concentrations inhibitrices et éradicatrices/bactéricides des agents antimicrobiens tels que les huiles essentielles, testés sur la forme sessile (biofilm) et la forme libre (planctonique) de certaines souches microbiennes a déjà été rapporté dans d’autres études citées dans la littérature [(Christensen et al., 1994) ; (Johansen et al., 1997) ; (Olson et al., 2002) ; (Saginur et al., 2006)]. Cependant, la résistance accrue des souches microbiennes en biofilm, n’est pas absolue car cette résistance, dépend aussi et en partie, de la nature de la substance antimicrobienne employée. Selon une étude réalisée sur des cellules planctoniques et sur des cellules adhérentes à l’acier inoxydable, dans le cas du thymol, les bactéries adhérentes sont légèrement plus résistantes (P<0,05) que les bactéries en suspension ; tandis que pour l’eugénol et le carvacrol (composé majoritaire de l’HE de T. capitatus), elles ne montrent pas de résistance accrue par rapport à leurs homologues planctoniques (Dubois-Brissonnet et al., 2006a). Selon ces mêmes auteurs ces bactéries adhérentes ne formaient qu’une mono-couche de cellules et il ne s’agissait donc pas d’un biofilm structuré. Par opposition, à l’étude de Karpanen et al., (2008) le thymol exercerait une activité plus importante contre S. epidermidis en biofilm par rapport à la forme planctonique. Selon une étude réalisée par Al-Shuneigat et al. (2005), les staphylocoques en biofilm semblent être plus susceptibles à une formule à base d’huiles essentielles que ceux sous forme planctonique. Récemment, une étude portant sur l’effet inhibiteur de l’extrait de Ginkgo biloba et de l’acide ginkgolique était très prometteuse vis-à-vis le biofilm à S. aureus (Lee et al., 2014).

Résultats et Discussion

Selon les résultats obtenus dans notre étude, il semblerait que les deux substances testées (HE et PVI) soient, relativement, plus actives sur la forme planctonique des souches de S. aureus que la forme sessile. Ceci peut être expliqués par le fait que les souches ayant servies à ces tests étaient les plus performantes de point de vue formation de biofilm produisant des quantités importantes d’adhésines intercellulaires polysaccharidiques (PIA) ; de plus les tests ont été effectués sur des biofilms matures de 24h ayant une structure complexe avec des polysaccharides chargés négativement qui peuvent jouer un rôle dans la protection des cellules bactérienne contre les agents antimicrobiens. Les HEs étant hydrophobes peuvent être retenues dans cette couche polysaccharidique.

8.4. Effet des huiles essentielles en combinaison avec la povidone iodée vis-à-vis de la forme sessile de S. aureus Dans notre étude le choix de la combinaison entre la povidone iodée et les huiles essentielles était guidé par le fait que, d’une part cet antiseptique est utilisé par excellence au niveau de nos structures sanitaires, notamment au CHU de Tlemcen, d’autre part les plantes ciblées pour leurs huiles essentielles sont largement disponible dans notre région. Il est reconnu que les huiles essentielles sont, généralement, plus efficaces contre les bactéries de type Gram positif dont fait partie S. aureus (Delaquis et al., 2002). Nous avons essayeé de rechercher dans cette étude d’eventuelles synergies entre la povidone iodée et les huiles extraites, et de déterminer l’index FIC (fractional inhibitory concentration) (tableau 12). Suite aux résultats obtenus dans cette étude, les index de FIC de toutes les huiles essentielles testées en combinaison avec la PVI se sont avérés inférieurs à 0,5. Ceci indique un effet synergique contre le biofilm à S. aureus. D’après les travaux de Karpanen et al. (2008), l’huile essentielle d’Eucalyptus en particulier, semble exercer une activité antimicrobienne synergique contre le biofilm à S. epidermidis, lorsqu’elle est combinée avec la chlorhéxidine digluconate. A notre connaissance, aucune étude n’est disponible dans la littérature portant sur l’étude de l’effet combiné des huiles, choisies dans ce travail, contre le biofilm à S. aureus.

Résultats et Discussion

A ce jour, peu sont les études portant sur l’effet des huiles essentielles en combinaison avec certains antiseptiques à usage local telle que la povidone iodée. De ce fait, la compréhension du mécanisme d’action d’une telle combinaison, reste encore limitée. Par ailleurs, dans la littérature il existe un bon nombre de travaux sur l’effet des HEs d’E. globulus, T. capitatus et R. officinalis, combinées avec les huiles essentielles d’autres plantes [(Al-Shuneigat et al., 2005) ; (De Azeredo et al., 2011)] ou d’autres agents antimicrobiens tels que les antibiotiques [(Jarrar et al., 2010) ; (Fadli et al., 2012)], les acides organiques (Dimitrijevic et al., 2007); (Jayasena et Jo, 2013)], la chlorhéxidine digluconate [(Karpanen et al., 2008) ; (Hendry et al., 2009)], etc. La povidone iodée possède une activité bactéricide contre une large gamme de bactéries pathogènes, y compris les S. aureus résistants à la méticilline. [(O'Shaughnessy et al., 1991) ; (McLure et Gordon, 1992) ; (Block et al., 2000) ; (Ellenhorn et al., 2005) ; (Robins et al., 2005)]. Selon une étude réalisée par Markum et Baillie (2012), l’emploi de la povidone iodée combinée avec l’HE d’arbre de thé (Melaleuca alternifolia) chez les enfants atteints de molluscum contagiosum, a permis de réduire plus de 90% des lésions chez 16 parmi les 19 patients. Cette combinaison s’est effectuée sur des biofilms matures de 24 h et qui selon les résultats précédents, sont composés d’une bonne quantité de polysaccharides (PIA) hydrophiles, pouvant ainsi protéger les bactéries contre l’action des HE qui sont hydrophobes. L’efficacité de la povidone iodée qui est un complexe hydrophile peut diminuer en présence de matières organiques. Selon des études citées dans la littérature, les HE semblent exercer un effet activateur sur la pénétration, l’amélioration et la rétention des médicaments à usage local à l’intérieur de la peau [(Fang et al., 2004) ; (Biruss et al., 2007)]. Ceci peut expliquer, en partie les résultats, obtenus dans notre étude, de l’effet synergique des huiles essentielles en combinaison avec la povidone iodée contre le biofilm de S. aureus. Par conséquent, nous suggérons que les HEs testés et la PVI agissent mieux et réciproquement quand elles sont employées en combinaison.

Résultats et Discussion

Tableau 12. Détermination des FICIs des HEs en combinaison avec la PVI contre le biofilm des souches de S. aureus. HE : huile essentielle, PVI : povidone iodée, HEE : HE d’E. globulus, HER : HE de R. officinalis, HET: HE de T. capitatus, FIC : fraction de concentration inhibitrice, FICI : l’index de FIC

Culture en CMIB de la PVI CMIB de l’HE biofilm des (g/L) (g/L) Agent FIC de FIC de FICI Résultat Souches antibactérien la PVI l’ HE

Combinée Seule Combinée Seule

LMB20327 EOE+PVI 0.06 8.19 0.007 0.03 1 0.03 0.037 Synergie EOR+PVI 0.06 8.19 0.007 0.03 1 0.03 0.037 Synergie EOT+PVI 0.06 8.19 0.007 0.03 1 0.03 0.037 Synergie

LMB20330 EOE+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.25 0.12 0.134 Synergie

EOR+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.50 0.06 0.074 Synergie

EOT+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.25 0.12 0.134 Synergie

EOE+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.25 0.12 0.135 Synergie LMB20338 EOR+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.25 0.12 0.135 Synergie

EOT+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.5 0.06 0.075 Synergie

LMB20359 EOE+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.12 0.25 0.264 Synergie EOR+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.50 0.06 0.074 Synergie

EOT+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.25 0.12 0.134 Synergie

S.aureus EOE+PVI 0.06 1.02 0.058 0.03 1 0.03 0.092 Synergie

ATCC 25923 EOR+PVI 0.06 1.02 0.058 0.03 0.25 0.12 0.182 Synergie EOT+PVI 0.06 1.02 0.058 0.03 2 0.01 0.072 Synergie

MRSA EOE+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.12 0.25 0.264 Synergie ATCC 43300 EOR+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.50 0.06 0.074 Synergie

EOT+PVI 0.06 4.09 0.014 0.03 0.25 0.12 0.134 Synergie

MRSA EOE+PVI 0.06 8.19 0.007 0.03 0.25 0.12 0.127 Synergie ATCC 33591 EOR+PVI 0.06 8.19 0.007 0.03 0.25 0.12 0.127 Synergie EOT+PVI 0.06 8.19 0.007 0.03 0.25 0.12 0.127 Synergie

CONCLUSION

Conclusion

Durant une période d’étude de 30 mois nous avons pu examiner 362 cathéters prélevés sur des patients (150 enfants, 120 femmes et 92 hommes) hospitalisés pendant plus de 48 heures au service de Néonatologie, de Neurologie, de Pneumologie, de Pédiatrie, de Médecine interne et de Dermatologie du Centre Hospitalier Universitaire de Tlemcen, 240 souches du genre Staphylococcus ont été identifiées par des méthodes conventionnelles de microbiologie classique. 76 souches étaient coagulase positive dont 71 S. aureus, 2 S. xylosus, S. haemolyticus, S. lentus et S. hyicus. Le plus grand nombre de souches de S. aureus a été obtenu au niveau du service de néonatologie avec un taux de 52,11% suivi par les autres services : pneumologie (18,30%), médecine interne et pédiatrie (11,26%), Neurologie (5,63%) et dermatologie (1,40%). Selon la méthode de microplaque 96 puits, sur les 50 souches de S. aureus retenues, 34 (68%) se sont révélées biofilm positif dont 20(40%), 10 (20%) et 4(8%) étaient faiblement adhérentes, modérément et fortement adhérentes, respectivement. Cependant, selon les résultats obtenus par la technique qualitative du rouge Congo agar (RCA), parmi les 50 souches de S. aureus seules 10 (20%) étaient susceptibles de produire le slime. Les 4 souches de S. aureus (LMB20327, LMB20330, LMB20338 et LMB20359) fortement adhérentes ont été phénotypiquement et génotypiquement caractérisées. L’identification de ces souches a été confirmée par le test d’agglutination au latex et la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation- Time Of Flight). Les quatre souches identifiées à l’échelle de l'espèce avec un bon score (> 2.300) ont donné une réaction positive pour l’agglutination et possédaient le gène femA. Les résultats obtenus nous ont permis de confirmer que les souches LMB20327 et LMB20330 étaient résistantes à la pénicilline et l’érythromycine alors qu’aucune des quatre souches n’était résistante à la méticilline vu l’absence du gène mecA. La méthode QRT-PCR (Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) en temps réel a mis en évidence la présence de l’opéron ica chez les quatre souches testées. Le taux d’ARNm du gène icaA variait significativement pendant la phase de croissance exponentielle. Ce taux était deux fois supérieur chez la souche LMB20327 (isolée du service de pédiatrie) mais relativement inférieur chez les autres souches par rapport au témoin positif. Cependant, au cours de la phase stationnaire de croissance ce taux diminuait

Conclusion considérablement par rapport à la phase de croissance exponentielle. En outre, l’adhésine intercellulaire polysaccharidique (PIA) était détectée chez les quatre souches par l’analyse Dot blotting. Notre étude a été ciblée sur S. aureus qui est un germe pathogène opportuniste responsable d’infections nosocomiales et fréquemment isolé dans différents services au CHU de Tlemcen ; le choix de ce microorganisme a aussi été guidé par le fait que ce type bactérien et généralement plus vulnérable à l’action des huiles essentielles, comme cela a déjà été décrit dans la littérature. Les résultats des concentrations minimales inhibitrices (CMIs) nous ont permis d’attribuer une meilleure activité antibactérienne à l’huile essentielle d’E. globulus (CMI : 0,06 à 1 g/L) suivie par T. capitatus (CMI : 0,12 à 2 g/L) puis R. officinalis (CMI : 0,12 à 1 g/L) contre la croissance planctonique des souches de S. aureus. Les CMIs de la povidone iodée sur ces souches étaient comprises entre 2,04 et 8,19 g/L. Les valeurs des concentrations minimales inhibitrices du biofilm (CMIBs) étaient significativement supérieures que les CMIs obtenues contre les mêmes souches lorsqu’elles étaient cultivées sous forme planctonique. Nous avons enregistré des valeurs de 4,09 à 16,38 g/L pour la PVI, 0,25 à 1 g/L pour l’HE d’E. globulus, 0,25 à 2 g/L pour l’HE de R. officinalis et 0,5 à 2 g/L pour l’HE de T. capitatus. L’effet synergique peut être exploité pour réduire la dose de l’antiseptique, et en minimiser ces effets indésirables. Selon les résultats obtenus, les index de FIC (fraction de concentration inhibitrice) de toutes les HEs testées en combinaison avec la PVI se sont avérés inférieurs à 0,5. Ceci indique un effet synergique contre le biofilm à S. aureus. Pour améliorer la compréhension de ces mécanismes et appréhender le problème posé par le biofilm de ce microorganisme, un travail plus approfondi, impliquant les molécules actives des huiles essentielles testées ainsi qu’une application in vivo de la povidone iodée combinée avec ces huiles, devra être entrepris. De plus, la caractérisation d’autres mécanismes intervenant au cours de la formation de biofilm chez S. aureus, semble être une bonne piste de recherche pour enrichir les connaissances dans ce domaine et mieux maitriser le processus de formation de biofilm qui, aujourd’hui, continue a exercer son rôle néfaste, notamment associé aux infections sur dispositifs médicaux.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Références

Abbanat D, Macielag M, Bush K (2003). Novel antibacterial agents for the treatment of serious Gram-positive infections. Expert Opin. Invest. Drugs. 12: 379–399. Ait-Ouazzou A, Lorán S, Bakkali M, Laglaoui A, Rota C, Herrera A, Pagán R, Conchello P (2011). Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils of Thymus algeriensis, Eucalyptus globulus and Rosmarinus officinalis from Morocco. J Sci Food Agric. 91 (14):2643-51. Akbari M, Haghi G, Kazempour N, Mahboobi M (2007). Antimicrobial activity of Respitol-B contain menthol and eucalyptus oil with mentofin, menthol, eucalyptus oil. Iranian Journal of Medical Microbiology 1: 39-45 [Persian]. Burt S (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods - a review. Int J Food Microbiol. 94: 223-253. Allignet J, Aubert S, Dyke KG, El Solh N (2001). Staphylococcus caprae strains carry determinants known to be involved in pathogenicity: a gene encoding an autolysinbinding fibronectin and the ica operon involved in biofilm formation. Infect Immun. 69: 712-718. Allison DG, Ruiz B, SanJose C, Jaspe A, Gilbert P (1998). Extracellular products as mediators of the formation and detachment of Pseudomonas fluorescens biofilms. FEMS Microbiol Lett. 167: 179-184. Allison DG, McBain AJ, Gilbert P (2000). Biofilms: problems of control. In: Community Structure and Co-operation in Biofilms (Eds. Allison, D, Gilbert, P, Lappin-Scott, HM and Wilson, M), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 309–327. Al-Shuneigat J, Cox SD, Markham JL (2005). Effects of a topical essential oil-containing formulation on biofilm-forming coagulase-negative staphylococci. Lett Appl Microbiol. 41: 52–5. Amlan K and Patra JS (2010). A new perspective on the use of plant secondary metabolites to inhibit methanogenesis in the rumen. Phytochemistry. 71 : 1198–1222. Amorena B, Albizu L, Baselga R (1994). Use of liposome-immunopotentiated exopolysaccharide as a component of an ovine mastitis staphylococcal vaccine. Vaccine 12: 243–249. Antoci V,Adams CS, Parvizi J, Davidson HM, Composto RJ, Freeman TA, Wickstrom E, Ducheyne P, Jungkind D, Shapiro IM, et al. (2008).The inhibition of Staphylococcus epidermidis biofilm formation by vancomycin-modified titanium alloy and implications for the treatment of periprosthetic infection. Biomaterials. 29 :4684–4690. Antunes LCM, Ferreira RBR, Buckner MMC, Finlay BB (2010). Quorum sensing in bacterial virulence. Microbiology. 156: 2271-2282. Archer NK, Mazaitis MJ, Costerton JW, Leid JG, Powers ME, Shirtliff ME (2011). Staphylococcus aureus biofilms: properties, regulation, and roles in human disease. Virulence. 2: 445-459. Archibald LK and Gaynes RP (1997). Hospital acquired infections in the United States: The importance of interhospital comparisons. Nosocomial Inf. 11: 245-255. Arciola CR, Baldassarri L, Montanaro L (2001). Presence of icaA and icaD genes and slime production in a collection of staphylococcal strains from catheter-associated infections. J Clin Microbiol. 39(6):2151-2156. Arciola CR, Campoccia D, Baldassarri L, Donati ME, Pirini V, Gamberini S, Montanaro L (2006). Detection of biofilm formation in Staphylococcus epidermidis from implant infections. Comparison of a PCR-method that recognizes the presence of ica genes with two classic phenotypic methods. Journal of Biomedical Materials Research A. 76(2):425–430.

Références

Arciola CR, An YH, Campoccia D, Donati ME, Montanaro L (2005). Etiology of implant orthopedic infections: a survey on 1027 clinical isolates. Int J Artif Organs. 28:1091-100. Aslan Guzel MD, Tuncer Ozekinci MD, Umit Ozkan MD, Yusuf Celik PhD, Adnan Ceviz MD, Deniz Belen MD (2009). Evaluation of the skin flora after chlorhexidine and povidone-iodine preparation in neurosurgical practice. Surgical Neurology. 71 :207–210. Avril JL, Dabernat H, Denis F, Monteil H (2003). Bactériologie clinique. 3ème édition. ellipses, Paris. 8-28. Ayliffe GA (1984). Surgical scrub and skin disinfection. Infect Control. 5:23-7.

Bayston R, Rodgers J (1990). Production of extra-cellular slime by Staphylococcus epidermidis during stationary phase of growth: its association with adherence to implantable devices. J. Clin. Pathol. 43:866–870. Bachir-Raho G and Benali M (2012). Antibacterial activity of the essential oils from the leaves of Eucalyptus globulus against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 739-742. Balaban N, Cirioni O, Giacometti A, Ghiselli R, Braunstrin JB, Silvestri C (2007). Treatment of Staphylococcus aureus biofilm infection by the quorum sensing inhibitor RIP. Antimicrob Agents Ch. 51: 2226–2229. Balazs DJ, Triandafillu K, Chevolot Y, Aronsson B– O, Harms H, Descouts P, Mathieu HJ (2003). Surface modification of PVC endotracheal tubes by oxygen glow discharge to reduce bacterial adhesion. Surf Interf Anal. 35: 301-309. Baldassari L, Donnelli G, Geiosia A, Vooglino MC (1996). Purification and characterization of the staphylococcal slimeassociated antigen and its occurrence among Staphylococcus epidermidis clinical isolates. Infect Immun. 64: 3410–3415. Balz R (1986). Les huiles essentielles. Éditions Crest, Eygluy-L’escoulin. Baser KHC and Buchbauer G (2009). Handbook of Essential Oils: Science, Technology, and Applications; Taylor and Francis. Bassler BL and Waters CM (2005). Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol. 21: 319-346 Beenken KE, Blevins JS, Smeltzer MS (2003). Mutation of sarA in Staphylococcus aureus limits biofilm formation. Infect. Immun. 71:4206– 4211. Bellon-Fontaine MN, Rault J, Van Oss CJ (1996). Microbial adhesion to solvents: a novel method to determine the eletron-donor/electron-acceptor or Lewis acid-base properties of microbial cells. In Colloids and Surfaces B, Biointerfaces, pp.47-53. Bellifa S, Hassaine H, Balestrino D, Charbonnel N, M’hamedi I, Terki IK, M Lchachi, W Didi, Forestier C (2013). Evaluation of biofilm formation of Klebsiella pneumoniae isolated from medical devices at the University Hospital of Tlemcen, Algeria. African Journal of Microbiology Research, 7(49) : 5558-5564. Benagli C, Rossi V, Dolina M, Tonolla M, Petrini O (2011). Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for the identification of clinically relevant bacteria .PLoS One. Jan. 25:6(1): e16424. Benbelaid F, Khadir A, Abdoune MA, Bendahou M, Muselli A, Costa J (2014). Antimicrobial activity of some essential oils against oral multidrug–resistant Enterococcus faecalis in both planktonic and biofilm state. Asian Pac. J. Trop. Biomed. 4(6): 463–472. Benchaar C, Calsamiglia S, Chaves AV, Fraser GR, Colombatto D, McAllister TA et al. (2008). Plant-derived essential oils in ruminant nutrition and production. Animal Feed Science and Technology. 145 : 209–228. Berger-Bachi B (1999). Genetic basis of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Cell Mol Life Sci. 56:764-770.

Références

Berthelot P, Grattard F, Patural H, Ros A, Jelassi-Saoudin H, Pozzetto B, Teyssier G, Lucht F (2001). Nosocomial colonization of premature babies with Klebsiella oxytoca: probable role of enteral feeding procedure in transmission and control of the outbreak with the use of gloves. Infect Control Hosp Epidemiol. 22:148-151. Bienvenut WV, Deon C, Pasquarello C, Campbell JM, Sanchez JC, Vestal ML, Hochstrasser DF (2002). Matrix-assisted Laser Desorption/ionization-tandem Mass Spectrometry with High Resolution and Sensitivity for Identification and Characterization of Proteins. Proteomic. 2(7):868-876. Biruss B, Kahliq H, Valenta C (2007). Evaluation of an eucalyptus oil containing topical drug delivery system for selected steroid hormones. Int J Pharm. 328: 142–51. Bischoff M, Entenza JM, Giachino P (2001). Influence of a functional sigB operon on the global regulators sar and agr in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 183: 5171-5179. Biswas R, Voggu L, Simon UK, Hentschel P, Thumm G, Gotz F (2006). Activity of the major staphylococcal autolysin Atl. FEMS Microbiol. Lett. 259: 260-268. Block C, Robenshtok E, Simhon A (2000). Evaluation of chlorhexidine and povidone iodine activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant Enterococcus faecalis using a surface test. J Hosp Infect. 46:147-52. Boks NP, Kaper HJ, Norde W, van der Mei HC, Busscher HJ (2009). Mobile and immobile adhesion of staphylococcal strains to hydrophilic and hydrophobic surfaces. J. Colloid Interface Sci. 331: 60–64. Boles BR and Horswill AR (2011). Staphylococcal biofilm disassembly. Trends in microbiology. 19: 449-455. Boles BR and Horswill AR (2008). agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathogens 4: e1000053. Borucki MK, Peppin JD, White D, Loge F, Call DR (2003). Variation in Biofilm Formation among Strains of Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 69:7336- 7342. Bounatirou S, Smiti S, Miguel MG, Faleiro L, Rejeb MN, Neffati M, Costa MM, Figueiredo AC, Barroso JG, Pedro LG (2007). Chemical composition, antioxidant and antibacterial activities of the essential oils isolated from Tunisian Thymus capitatus Hoff. et Link. Food Chemistry. 105 : 146–155. Boyle W (1955). Spices and essential oils as preservatives. Am. Perfurmer Essent. Oil Rev. 66:25-28. Brady RA, Leid JG, Calhoun JH et al. (2008). Osteomyelitis and the role of biofilms in chronic infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 52: 13- 22. Breche P, Gaillard J, Simonet M (1988). Collection de la biologie à la clinique. Bactériologie“ Bactéries des infections humaines” Flammarion Médecine-Sciences, Paris. 267-277. Briandet R, Meylheuc T, Maher C, Bellon-Fontaine MN (1999). Listeria monocytogenes Scott A: cell surface charge, hydrophobicity, and electron donor and acceptor characteristics under different environmental growth conditions. Appl Environ Microbiol. 65 : 5328-5333. Broschat SL, Call DR, Kuhn EA, Loge FJ (2005). Comparison of the reflectance and Crystal Violet assays for measurement of biofilm formation by Enterococcus. Biofilms. 2:177- 181. Brun-Buisson C, Abrouk F, Legrand P, Huet Y, Larabi S, Rapin M (1987). Diagnosis of central venous catheter-related sepsis. Critical level of quantitative tip cultures. Archives of Internal Medicine. 147:873–877. Brun Y and Bes M (2000). Staphylococcus. In Précis de bactériologie clinique, Eds Freney J., Renaud F., Hansen W., Bollet C., ESKA. pp.783-830.

Références

Brun Y, Bes M, Vandenesch F (2003). Actualités permanentes en bactériologie clinique. 55p. Bruneton J (1999). Pharmacognosie: Phytochimie, plantes médicinales; 3e éd.; Tech.& Doc./Lavoisier. Buchanan RE and Gibbons NE (1974). Bergey's manual of determinative bacteriology, 8th ed. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md. Burin Des Roziers MPCM (2002). Les biofilms. Th. Doct. Ecole nationale vétérinaire d’Alfort. Paris, France. Burt S (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods a review. Int. J. Food Microbiol. 94: 223-253. Bustin SA (2000). Absolute quantification of mRNA using realtime reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 25: 169-193.

Calsamiglia S, Busquet M, Cardozo PW, Castillejos L, Ferret A (2007). Invited review: Essential oils as modifiers of rumen microbial fermentation. Journal of Dairy Science. 90 : 2580–2595. Campanac C (2002). Biofilms bactériens, intérêt dans l’évaluation de l’activité détergent, approche des facteurs impliqués dans la formation et la résistance finale. Thèse, Université Paul Sabatier ; Toulouse ; France. Cariello C (2012). La spectrométrie de masse MALDI-TOF et le diagnostic microbiologique. Travail de diplôme. ICHV. Laboratoire de microbiologie, Sion. Carpentier B and Cerf O (1993). Biofilms and their consequences with particular reference to hygiene in the food industry. J Appl Bacteriol. 75: 499-511. Carson CF, Mee BJ, Riley TV (2002). Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined par time-kill, lysis, leakage and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1914-1920. Casey AL, Mermel LA, Nightingale P, Elliott TS (2008). Antimicrobial central venous catheters in adults: A systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 8: 763–776. CASFM, 2010. Comité de l’antibiogramme de la societe francaise de microbiologie. 15. Cassel E, Vargas RMF, Martinez N, Lorenzo D, Dellacassa E (2009). Industrial Crops & Products. 29 :171-176. CCLIN (Centre de coordination de lutte contre les infections nosocomiales de l’interrégion Nord). (Page consultée le 21 juillet 2014) : les infection nosocomiales. (http://www.cclinparisnord.org/) Cermelli C, Fabio A, Fabio G, Quaglio P (2008). Effect of Eucalyptus essential oil on respiratory bacteria and viruses. Curr Microbiol. 56:89-92. Cerpa MG, Mato RB, Jose Cocero M (2008). Modeling steam distillation of essential oils: Application to lavandin super oil. AIChE Journal. 54 (4): 909-917. Chaignon P et al. (2007). Susceptibility of staphylococcal biofilms to enzymatic treatments depends on their chemical composition. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75:125–132. Chakroun M (2009). Infections associée aux soins : Aspects cliniques. In Hygiène hospitalière et lutte contre les infections associées aux soins. Les risques infectieux en milieu de soins. 2 : 27-36 Chambeaud F(2012). Les Staphylocoques en pathologie cutannée chez le chien: Connaissances actuelles, Th. doct., Campus Veterinaire de Lyon, France. Chan R, Molassiotis A, Chan E, Chan V, Ho B, Lai CY, Lam P, Shit F, Yiu I (2003). Nurses’ knowledge of and compliance with universal precautions in an acute care hospital. Int J Nurs Stud. 39:157-163.

Références

Chan C, Burrows LL, Deber CM (2004). Helix induction in antimicrobial peptides by alginate in biofilms. J Biol Chem. 279: 38749–3854. Chang TC and Huang SH (1993). Evalution of a latex agglutination test for rapid identification of Staphylococcus aureus. Journal Food Protection. 56: 759–762. Chen M, Yu Q, Sun H (2013). Novel Strategies for the Prevention and Treatment of BiofilmRelated Infections. Int. J. Mol. Sci. 14 : 18488-18501. Chicurel M (2000). Bacterial biofilms and infections. Slimebusters. Nature. 408: 284-6. Cho S, Naber K, Hacker J, Ziebuhr W (2002). Detection of the ica ADBC gene cluster and biofilm formation in Staphylococcus epidermidis isolates from catheter-related urinary tract infections. Int J antimicrob Agent. 19:570-575. Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, Baddour LM, Barrett FF, Melton DM, Beachey EH (1985). Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. J. Clin. Microbiol. 22:996-1006. Christensen GD, Baldassarri L, Simpson WA (1994). Colonization of medical devices by coagulase-negative staphylococci. In: Bisno AL, Waldvogel FA, eds. Infections Associated With Indwelling Medical Devices, Second Edition. Washington, DC: American Society for Microbiology. 45–78. Christensensen GD, Baddour LM, Madison BM, Parisi JL, Abraham SN & Hasty DL (1990). Colonial morphology of staphylococci on Memphis agar; phase variation of slime production, resistance to b lactam antibiotics, and virulence. J Clin Microbiol. 22: 996–1006. CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (2008). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eighteenth Informational Supplement. CLSI document M100-S18 (ISBN 1-56238-653-0). Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA. Clutterbuck AL,Woods EJ, et al. (2007). Biofilms and their relevance to veterinary medicine. Vet Microbiol. 121 (1-2): 1-17. Collins LV, Kristian SA, Weidenmaier C, Faigle M, Van Kessel KP, Van Strijp JA, Gotz F. Neumeister B, Peschel A (2002). Staphylococcus aureus strains lacking D-alanine modifications of teichoic acids are highly susceptible to human neutrophil killing and are virulence attenuated in mice. J Infect Dis. 186: 214-219. Conlon KM, Humphreys H, O'Gara JP (2002a). icaR encodes a transcriptional repressor involved in environmental regulation of ica operon expression and biofilm formation in Staphylococcus epidermidis. J Bacteriol. 184: 4400-4408. Conlon KM, Humphreys H, O'Gara JP (2002b). Regulation of icaR gene expression in Staphylococcus epidermidis. FEMS Microbiol Lett. 216: 171-177. Corrigan RM, Rigby D, Hadley P et Foster TJ (2007). The role of Staphylococcus aureus surface protein SasG in adherence and biofilm formation. Microbiol. 153: 2435-2446. Costerton JW, Lewandowski Z, Caldwell DE, Korber DR (1995). Lappin-Scott H.M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49: 711-45. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP (1999). Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Sci. 284: 1318-1322. Costerton JW (1984). The formation of biocide-resistant biofilms in industrial, natural, and medical system. Dev Ind Microbiol. 25: 363-372. Costerton JW (1995). Overview of microbial biofilms. J. Ind. Microbiol. 15: 137-140. Couture B (1990). Bactériologie médicale «Etude et méthodes d’identification des bactéries aérobies et facultatives d’intérêt médical». Vigot, Paris. 15-32.

Références

Cox SD Mann CM, Markham JL, Bell HC, Gustafson JE, Warmington JR, Wyllie SG (2000). The mode of antimicrobial action of essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). J. Appl. Microbiol. 88 (1): 170-175. Cramton SE, Gerke C, Schnell NF, Nichols WW, Gotz F (1999). The intercellular adhesion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation. Infect Immun. 67: 5427-5433. Cseke LJ and Kaufman PB (1999). How and why these compounds are synthesized by plants. Pages 37-90 in P.B. Kaufman, L.J. Cseke, S. Warber, J.A. Duke et H.L. Brielmann (eds.), Natural Products from Plants. CRC Press, Boca Raton, FL. Cucarella C, Solano C, Valle J, Amorena B, Lasa I, Penades JR (2001). Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm formation. J Bacteriol. 183 : 2888- 2896. Cucarella C, Tormo MA, Knecht E, Amorena B, Lasa I, Foster TJ, Penades JR (2002). Expression of the biofilm-associated protein interferes with host protein receptors of Staphylococcus aureus and alters the infective process. Infect. Immun. 70:3180–3186. Cunnion KM, Lee JC, Frank MM (2001). Capsule Production and Growth Phase Influence Binding of Complement to Staphylococcus aureus. Infect Immun. 69: 6796–803.

Dassy B and Fournier JM (1996). Respiratory Activity Is Essential for Post-Exponential- Phase Production of Type 5 Capsular Polysaccharide by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 64(7): 2408–2414. Daurel C and Leclercq R (2008). L’antibiogramme de Staphylococcus aureus. Revue Francophone des Laboratoires. 407 :81-90. Davido B (2010). Etude de la prise en charge ambulatoire des infections cutanées communautaires à staphylocoque doré, Faculté de médecine Paris 7, France. De Azeredo GA, Stamford TLM, Nunes PC, Gome Neto NJ, de Oliveira MEG, de Souza EL (2011). Combined application of essential oils from Origanum vulgare L. and Rosmarinus officinalis L. to inhibit bacteria and autochthonous microflora associated with minimally processed vegetables. Food Research International. 44 : 1541–1548. De Buochberg MS, Allegrini S, Bessiere C, Attisso M, Passet J, Granger R (1976). Propriétés microbiologiques des huiles essentielles de chimiotypes de Thymus vulgaris linnaeus. Rivista. Italiana. E.P.P.O.S. 58: 527-536. De Buyser ML and Hennekinne JA (2010). Culture en laboratoire, méthodes d’isolement et de détection. Larpent JP, le Loir Y, Gautier M. Staphylococcus aureus. Editions Tec & Doc. Paris : Lavoisier, p. 65-112. De Carvallo CCCR (2012). New idea for an old problem. Rec. Patents Biotechnol. 6: 13-22. Deighton M and Borland R (1993). Regulation of slime production in Staphylococcus epidermidis by iron limitation. Infect. Immun. 61:4473–4479. Delaquis PJ, Stanich K, Girard B, Mazza G (2002). Antimicrobial of individual and mixed fraction of dill, cilantro, coriander and eucalyptus essential oils. Inter. J. of Food Microbiology. 74: 101-109. Diekema DJ, Pfaller MA, Schmitz FJ, Smayevsky J, Bell J, Jones RN, Beach M (2001). Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada, Latin America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-1999. Clin Infect Dis. 32 (2): S114-132. Diemond-Hernández B, Solórzano-Santos F, Leaños-Miranda B, Peregrino-Bejarano L, Miranda-Novales G (2010). Production of icaADBC-encoded polysaccharide intercellular

Références adhesin and therapeutic failure in pediatric patients with staphylococcal device-related infections. BMC Infectious Diseases. 10: 68. Dimick JB, Pelz RK, Consunji R, Swoboda SM, Hendrix CW, Lipsett PA (2001). Increased resource use associated with catheter-related bloodstream infection in the surgical intensive care unit. Arch Surg. 136: 229–234. Dimitrijevic SI, Mihajlovski KR, Antonovic DG, Milanovic-Stevanovic MR, Mijin DZ (2007). A study of the synergistic antilisterial effects of a sub-lethal dose of lactic acid and essential oils from Thymus vulgaris L., Rosmarinus officinalis L. and Origanum vulgare L. Food Chemistry. 104: 774–782. Dob T, Darhmane D, Benabdelkader T, Chelghoum TC (2006). Studies on the essential oils and antimicrobial activity of Thymus algeriensis Boiss. Int. J. Aromatherapy. 16:95-100. Dobinsky S, Kiel K, Rohde H, Bartscht K, Knobloch J-M, Horstkotte MA, et al. (2003). Glucose-related dissociation between icaADBC transcription and biofilm expression by Staphylococcus epidermidis: Evidence for an additional factor required for Polysaccharide Intercellular Adhesin synthesis. J Bacteriol. 185(9):2879–86. Donlan RM (2001). Biofilms and device-associated infections. Emerg. Infect. Dis. 7: 277- 281. Donlan RM (2008). Biofilms on central venous catheters: is eradication possible? Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322: 133-161. Dubois-Brissonnet F, Dietrich C, Bellon-Fontaine MN (2006a). Resistance of planktonic and adherent-cells of Salmonella Typhimurium to natural antimicrobials. Symposium Salmonella and Salmonellosis. 10-12 may 2006. Saint-Malo (France). sous presse. Dufour P, Jarraud S, Vandenesch F, Greenland T, Novick RP, Bes M, Etienne J, Lina G (2002). High genetic variability of the agr locus in Staphylococcus species. J Bacteriol. 184 : 1180-1186. Dunman PM, Murphy E, Haney S, Palacios D, Tucker-Kellogg G, Wu S, Brown EL, Zagursky RJ, Shlaes D, Projan SJ (2001). Transcription profiling-based identification of Staphylococcus aureus genes regulated by the agr and/or sarA loci. Journal of Bacteriology. 183: 7341-7353. Duguid IG, Evans E, Brown MR, Gilbert P (1992). Effect of biofilm culture upon the susceptibility of Staphylococcus epidermidis to tobramycin. J Antimicrob Chemother. 30: 803-810. Durand-Zaleski I, Chaix C, Brun-Buisson C (2002). Le coût des infections liées aux soins. In : Les infections liées aux soins médicaux. Jean Carlet. ADSP n° 38. Durani P and Leaper D (2008). Povidone-iodine: use in hand disinfection, skin preparation and antiseptic irrigation. Int Wound J. 5:376-87.

Ebrahimi SN, Hadian J, Mirjalili MH, Sonboli A and Yousefzadi M (2008). Essential oil composition and antibacterial activity of Thymus caramanicus at different phenological stages. Food Chem. 110: 927-931. Ehivet FE, Min B, Park MK, Oh JH (2011). Characterization and antimicrobial activity of sweet potato starch based edible film containing origanum (Thymus capitatus) oil. J Food Sci. 76(1):C178-84. Elaissi A, Medini H, Khouja ML, Simmonds M, Lynen F, Farhat F, Chemli R, Harzallah-Skhiri F (2011). Variation in Volatile Leaf Oils of Five Eucalyptus Species Harvested from Jbel Abderrahman Arboreta (Tunisia). chemistry & biodiversity. 8 : 352-361. Ellenhorn JD, Smith DD, Schwarz RE (2005). Paint-only is equivalent to scrub-and-paint in preoperative preparation of abdominal surgery sites. J Am Coll Surg. 201:737-41.

Références

Elyse P (2002). La PCR en temps réel: principes et applications. Biology and Biotechnology. 2-11. Esposito S, Purrello SM, Bonnet E, Novelli A, Tripodi F, Pascale R, Unal S, Milkovich G (2013). Central venous catheter-related biofilm infections: An up-to-date focus on meticillinresistant Staphylococcus aureus. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 1 :71–78. Euzéby JP (2014). List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature (http://www.bacterio.net) (Page consultée le 12 juillet 2014).

Fabbro-Peray P, Sotto A, Defez C, Cazaban M, Molinari L, Pinède M, Mahamat A, Daurès JP (2007). «Mortality attributable to nosocomial infection: A cohort of patients with and without nosocomial infection in a French University Hospital ». Infection Control and Hospital Epidemiology. Vol. 28(3):265-272; Health Protection Agency (octobre 2007). Surveillance of Healthcare Associated Infections Report 2007. Fadli M, Saad A, Sayadi S, Chevalier J, Mezrioui NE, Pagès JM, Hassani L (2012). Antibacterial activity of Thymus maroccanus and Thymus broussonetii essential oils against nosocomial infection – bacteria and their synergistic potential with antibiotics. Phytomedicine. 19 : 464– 471. Fan M and Chen J (2001). Studies on antimicrobial activity of extracts from thyme. Wei Sheng Wu Xue Bao. 41: 499-504. Fang JY, Leu YL, Hwang TL, Cheng HC (2004). Essential oils from sweet basil (Ocimum basilicum) as novel enhancers to accelerate transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 27: 1819–25. Fantin B (2002). Les nouveaux antistaphylococciques. Ann Fr Anesth Réanim. 21 : 424-30. Fasquelle R (1974). Eléments de bactériologie médicale 9ème édition. Flammarion, Paris. 27-36. Fauchere JL and Avril JL (2002). Bactériologie générale et médicale. ellipses, Paris. 213- 217. Felten A, Lepage E, Lagrange P (1995). Analyse critique des tests de dépistage rapide de Staphylococcus aureus, Pastorex StaphPlus, Slidex Staph-Kit et Staph Aureus dans les isolats cliniques. Path. Biol. 43(5) : 471-476. Fey PD, Ulphani JS, Götz F, Heilmann C, Mack D, Rupp ME (1999). Characterization of the relationship between Polysaccharide Intercellular Adhesin and hemagglutination in Staphylococcus epidermidis. J Infect Dis. 179:1561–4. Fillatre Y (2011). Développement d’une méthode d’analyse multi-résidus dans les huiles essentielles par couplage de la chromatographie liquide avec la spectrométrie de masse en mode tandem. Thèse doc. Ecole doctorale matières, molécules, matériaux des pays de Loire. Université d’Angers, France. Fitzpatrick F, Humphreys H, O'Gara, JP (2005). Evidence for icaADBCindependent biofilm development mechanism in methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates. J Clin Microbiol. 43 : 1973-1976. Fluckiger U, Ulrich M, Steinhuber A, Doring G, Mack D, Landmann R, Goerke C, Wol C (2005). Biofilm formation, icaADBC transcription, and polysaccharide intercellular adhesin synthesis by staphylococci in a devicerelated infection model. Infect. Immun. 73:1811–1819. Forsgren A (1970). Significance of protein A production by staphylococci. Infect Immun. 2:672–3. Foster TJ and Hook M (1998). Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus. Trends Microbiol. 6: 484-488.

Références

Fournier B, Klier A, Rapoport G (2001). The two-component system ArlS–ArlR is a regulator of virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 41: 247– 261. Fowler VG Jr, Boucher HW, Corey GR, et al. (2006). Daptomycin versus standard therapy for bacteremia and endocarditis caused by Staphylococcus aureus. N Engl J Med. 355:653– 65. Franklin D and Lowy MD (1998). Staphylococcus aureus Infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8): 520-532. Frerbourg NB, Lefebvre S, Baert S, Lemeland JF (2000). PCR based assay for discrimination between invasive and contaminating staphylococci. J Clin Microbiol. 38(2):877–80. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT (1989). New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J. Clin. Pathol. 42: 872-874. Fux CA, Wilson S, Stoodley P (2004). Detachment characteristics and oxacillin resistance of Staphyloccocus aureus biofilm emboli in an in vitro catheter infection model. J Bacteriol. 186(14):4486-91. Fux CA, Costerton JW, Stewart PS, Stoodley P (2005). Survival strategies of infectious biofilms. Trends in microbiology. 13: 34-40.

Galdbart J, Allignet J, Tung H, Ryden C, Solh NE (2000). Screening for Staphylococcus epidermidis markers discriminating between skin-flora strains and those responsible for infections of joint prostheses. J Infect Dis. 182:351-355. Garner JS, Jarvis WR, Emori TG, Horan TC, Hughes JM (1988). CDC definitions for nosocomial infections. Am J Infect Control. 16:128-140. Garrity GM, Lilburn TG, Cole JR, Harrison SH, Euzéby J, Tindall BJ (2007). Taxonomic Outline of the Bacteria and Archaea, Release 7.7 March 6, 2007 Part 9- the Bacteria: Phylum Firmicutes: Class “Bacilli”. Gayvallet-Montredon N, Sauvestre C, Bergeret M, Gendrel D, Raymond J (2002). Bactériémies nosocomiales en pédiatrie. Arch péditr. 7 :679-84. Gerke C, Kraft A, Süssmuth R, Schweitzer O, Götz F (1998). Characterization of the N- acetylglucosaminyltransferase activity involved in the biosynthesis of the Staphylococcus epidermidis polysaccharide intercellular adhesin. J. Biol. Chem. 273:18586–18593. Ghebremedhin B, Layer F, Konig W, Konig B (2008). Genetic classification and distinguishing of Staphylococcus species based on different partial gap, 16S rRNA, hsp60, rpoB, sodA, and tuf gene sequences. Journal of Clinical Microbiology. 46: 1019-1025. Gil L, Tadesse W, Tolosana E, López R (2010). Eucalyptus species management, history, status and trends in Ethiopia. Proceedings from the Congress held in Addis Ababa. September 15th-17th,2010. Gilbert P and Brown MR (1998). Biofilms and beta-lactam activity. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 41: 571-572. Gottenbos B, van der Mei HC, Busscher HJ (2000). Initial adhesion and surface growth of Staphylococcus epidermidis and Pseudomonas aeruginosa on biomedical polymers. J Biomed Mater Res. 50: 208-214. Gottenbos B, van der Mei HC, Klatter F, Nieuwenhuis P, Busscher HJ (2002). In vitro and in vivoantimicrobial activity of covalently coupled quaternary ammonium silane coatings on silicone rubber. Biomaterials. 23: 1417–1423. Götz F (2002). Staphylococcus and biofilms. Mol Microbiol. 43: 1367-1378. Gray ED, Peters G, Verstegen M (1984). Effect of extracellular slime substance from Staphylococcus epidermidis adhesion on human cellular response. Lancet. 18: 365-367.

Références

Gross M, Cramton SE, Gotz F, Peschel A (2001). Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect Immun. 69 : 3423-3426. Guinochet T (1973). Phytosociologie, Ed. Masson, France, 227p. Guzel A, Ozekinci T, Ozkan U, Celik Y, Ceviz A, Belen D (2009). Evaluation of the skin flora after chlorhexidine and povidone-iodine preparation in neurosurgical practice. Surgical Neurology. 71 : 207–21. Gustafson RH and Bowen RE (1997). Antibiotic use in animal agriculture. Journal of Applied Microbiology. 83 : 531–541.

Hall-Stoodley L, Stoodley P, Kathju S, Høiby N, Moser C, Costerton JW, Motter A, Bjarnsholt T (2012). Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. Fed. Europ. Microbiol. 65 :127–145. Hamza R (2003). L’infection hospitalière : épidémiologie, surveillance et prévention. Edité par le Ministère de la Santé Publique – Direction de l’hygiène du Milieu et de la Protection de l’Environnement. Harkenthal M, Reichling J, Geiss HK, Saller R (1999). Comparative study on the in vitro antibacterial activity of Australian tea tree oil, cajuput, oil, niaouli oil, manuka oil, Kanuka oil, and eucalyptus oil. Pharmazie. 54(6): 460-463. Harris LG, Foster SJ, Richards RG (2002). An Introduction to Staphylococcus aureus, and techniques for identifying and quantifyings adhesins in relation to adhesion to biomaterials: review. European cells and Materials. 4 : 39 - 60. Hassaine H (2008). Ecologie bactérienne et lutte contre l’infection hospitalière. Thèse de doctorat : Université A.B.Belkaid Tlemcen. 159p. Hassan A, Usman J, Kaleem F, Omair M, Khalid A, Iqbal M (2011). Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Braz J Infect Dis. 15(4):305-11. Heilmann C, Schweitzer O, Gerke C, Vanittanakom N, Mack D, Götz F (1996). Molecular basis of intercellular adhesion in the biofilm-forming Staphylococcus epidermidis. Mol. Microbiol. 20:1083–1091. Heilmann C, Hussain M, Peters G, Gotz F (1997). Evidence for autolysin-mediated primary attachment of Staphylococcus epidermidis to a polystyrene surface. Mol Microbiol. 24: 1013-1024. Heilmann C and Götz F (2010). Cell-cell communication and biofilm formation in Gram positive bacteria. Bacteria signaling. Ed. par Krämmer, R. et K. Jung. Chap.1: 7-22. Heilmann C, Thumm G, Chhatwal GS, Hartleib J, Uekotter A, Peters G (2003). Identification and characterization of a novel autolysin (Aae) with adhesive properties from Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 149 : 2769-2778. Heinrichs JH, Bayer MG, Cheung AL (1996). Characterization of the sar locus and its interaction with agr in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 178: 418–423. Hell W, Meyer HG, Gatermann SG (1998). Cloning of aas, a gene encoding a Staphylococcus saprophyticus surface protein with adhesive and autolytic properties. Mol Microbiol. 29 : 871-881. Hendry ER, Worthington T, Conway BR, Lambert PA (2009). Antimicrobial efficacy of eucalyptus oil and 1,8-cineole alone and in combination with chlorhexidine digluconate against microorganisms grown in planktonic and biofilm cultures. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64: 1219–1225. Hill KD and Johnson LAS (1995). Systematic studies in the eucalypts. A revision of the bloodwoods, genus Corymbia (Myrtaceae). Telopea. 6: 185-504.

Références

Higashi JM and Sullam PM (2006). Staphylococcus aureus biofilms. In Biofilms, Infection, and Antimicrobial Therapy, pp. 81–108. Edited by J. L. Pace, M. E. Rupp & R. G. Finch. Boca Raton, FL: Taylor & Francis. Hisata K, Kuwahara-Arai K, Yamanoto M, Ito T, Nakatomi Y, Cui L, Baba T, Terasawa M, Sotozono C, Kinoshita S, Yamashiro Y, Hiramatsu K (2005). Dissemination of methicillin-resistant staphylococci among healthy Japanese children. J Clin Microbiol. 43:3364-3372. Hmamouchi B, Chakkouri K, Nejmi SE et al (2005). Epidémiologie de l’infection nosocomiale en réanimation pédiatrique. AnnFr Anesth Reanim. 24:699–700. Hoffman LR, D’Argenio DA, MacCoss MJ, Zhang Z, Jones RA, Miller SI (2005). Aminoglycoside antibiotics induce bacterial biofilm formation. Nature. 436: 1171–1175. Howard BJ and Kloos WE (1987). Staphylococci. In: Howard BJ, Klass J II, Rubin SJ, Weissfeld AS, Tilton RC, eds. Clinical and Pathogenic Microbiology. Mosby, Washington D.C. pp 231-244. Hussain AI, Anwar F, Chatha SAS, Jabbar A, Mahboob S, Nigam PS (2010). Rosmarinus officinalis essential oil: Antiproliferative, antioxidant and antibacterial activities. Brazilian Journal of Microbiology. 41: 1070-1078. Hussain M, Becker K, von Eiff C, Schrenzel J, Peters G, Herrmann M (2001). Identification and characterization of a novel 38.5-kilodalton cell surface protein of Staphylococcus aureus with extended-spectrum binding activity for extracellular matrix and plasma proteins. J Bacteriol. 183: 6778-6786.

Izano EA, Amarante MA, Kher WB, Kaplan JB (2008). Differential roles of poly- Nacetylglucosamine surface polysaccharide and extracellular DNA in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74: 470–476.

Jarrar N, Abu-Hijleh A, Adwan K (2010). Antibacterial activity of Rosmarinus officinalis L. alone and in combination with cefuroxime against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine.121-123. Jass J, Surman S and Walker JT (2003). Microbial Biofilms in Medicine. In: Medical Biofilms: Detection, Prevention and Control.England : John Wiley & Sons Ltd, p 1-23. Jayasena DD and Jo C (2013). Essential oils as potential antimicrobial agents in meat and meat products: A review. Trends in Food Science & Technology. 34 : 96-108. Jefferson KK, Cramton SE, Gotz F, Pier GB (2003). Identification of a 5-nucleotide sequence that controls expression of the ica locus in Staphylococcus aureus and characterization of the DNA-binding properties of IcaR. Mol Microbiol. 48: 889-899. Jeljaszewicz J, Switalskil M, Adlam C (1983). Staphylocoagulase and clumping factor. In «Staphylococci and Staphylococcal infections», CSF Easmon and C.Adlam (ed). Vol.2, Academic Press, London. 525-557. Johansen C, Falholt P, Gram L (1997). Enzymatic removal and disinfection of bacterial biofilms. Appl Environ Microbiol. 63: 3724–8. Johnson LAS (1976). Problems of species and genera in Eucalyptus (Myrtaceae). Plant Systematics and Evolution. 125: 155-167.

Kalemba D and Kunicka A (2003). Antibacterial and antifungal properties of essential oils. Curr. Med. Chem. 10: 813-829. Kandil O, Radwan NM, Hassan AB, Amer AM, el-Banna HA, Amer WM (1994). Extracts and fractions of Thymus Capitatitus exhibit antimicrobial activities. J Ethnopharmacol. 44(1): 19-24.

Références

Kaplan JB et al. (2004). Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms. J. Bacteriol. 186: 8213-8220. Karakawa WW and Vann WF (1982). Capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. Semin Infect Dis. 4: 285-293. Kara Terki I, Hassaine H, Oufrid S, Bellifa S, Mhamedi I, Lachachi M, Timinouni M (2013). Detection of icaA and icaD genes and biofilmformation in Staphylococcus spp. isolated from urinary catheters at the University Hospital of Tlemcen (Algeria). African Journal of Microbiology. 7(47): 5350-5357. Karpanen TJ, Worthington T, Hendry ER, Conway BR, Lambert PA (2008). Antimicrobial efficacy of chlorhexidine digluconate alone and in combination with eucalyptus oil, tea tree oil and thymol against planktonic and biofilm cultures of Staphylococcus epidermidis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 62 : 1031–1036. Keren I, Kaldalu N, Spoering A, Wang Y, Lewis K (2004). Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiol Lett. 230: 13-18. Khadir AM (2013). Effet inhibiteur de certains extraits de plantes aromatiques sur des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline SARM isolées du CHU de Tlemcen. Thèse de doctorat: Université A.B.Belkaid Tlemcen.123P. Khouchoua M (2013). Enquête de prévalence des infections associées aux soins au centre hospitalier régional Mohamed V Meknès, Avril 2013. Mémoire de fin d’études : épidémiologie de santé publique, École Nationale de Santé Publique ; Maroc. Klevens RM, Tokars JI, Andrus M (2005). Electronic reporting of infections associated with hemodialysis.Nephrol News Issues. 19:37–38. Kloos WE and Shleifer KH (1975). «Simplified scheme for routine identification of human Staphylococcus species». Journal of clinical Microbiology. 1: 82-88. Kloos WE and Lambe DW JR (1991). Staphylococcus. In: Barlows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. ASM, Washington, D.C. pp 222-237. Kloos WE and Lambe JR DW (1981). Staphylococcus In manual of clinical microbiology, 4th ed Am. Soc. For Microbiology. 222-235 Kloos WE and Bannerman TL (1999). Staphylococcus and Micrococcus, p. 264–282. In P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C Kloos WE and Schleifer KH (1986). Genus IV. Staphylococcus. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Eds P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe, and J. G. Holt, Williams & Wilkins. pp.1013-1035. Kloos WE and Smith PB (1980). Staphylococci, p. 83-87. In Lennette EH, Balows A, Hausler WJ, Jr., and J. P. Truant (ed.), Manual of clinical microbiology, 3rd ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. Kluytmans J, van Belkum A, Verbrugh H (1997). Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clin Microbiol Rev. 10: 505-520. Knobloch JK, Bartscht K, Sabottke A, Rohde H, Feucht HH, Mack D (2001).Biofilm formation by Staphylococcus epidermidis depends on functional RsbU, anactivator of the sigB operon: differential activation mechanisms due to ethanoland salt stress. J. Bacteriol. 183: 2624–2633. Knox KW and Wicken AJ (1973). Immunological properties of teichoic acids. Bacteriol Rev. 37: 215-257.

Références

Kogan G, Sadovskaya I, Chaignon P, Chokr A, Jabbouri S (2006). Biofilms of clinical strains of Staphylococcus that do not contain polysaccharide intercellular adhesin. FEMS Microbiol Lett. 255 : 11-16. Kropec A, Maira-Litram T, Jefferson KK, Grout M, Cramton SE, Gotz F, Goldmann DA, Pier GB (2005). Poly N-acetylglucosamine production in Staphylococcus aureus is essential for virulence in murine models of systemic infection. Infect. Immun. 73:6868–6876. Kullik I, Giachino P, Fuchs T (1998). Deletion of the alternative sigma factor sigmaB in Staphylococcus aureus reveals its function as a global regulator of virulence genes. J. Bacteriol. 180 : 4814–4820.

Langer S, Sedigh M, Salakdeh O (2004). The impact of topical antiseptics on skin microcirculation. Eur J Med Res. 9:449-54. Lardry JM and Haberkorn V (2007). L’aromathérapie et les huiles essentielles. Kinesither Rev. 61:14-7. Lardry JM and Haberkorn V (2003). Les formes galéniques destinées à l’usage externe. Kinésithérapie, Les Annales, n° 16, avril 2003, 21-5. Lasa I and Penadés JR (2006). Bap: a family of surface proteins involved in biofilm formation. Res. Microbiol. 157: 99–107. Lauderdale KJ, Malone CL, Boles BR, Morcuende J, Horswill AR (2010). Biofilm dispersal of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus on orthopedic implant material. J. Orthop. Res. 28:55–61. Leclercq R (2002). Résistance des Staphylocoques aux antibiotiques. Ann Fr Anesth Réanim. 21: 375-383. Lee SF, Li YH, Bowden GH (1996). Detachment of Streptococcus mutans biofilm cells by an endogenous enzymatic activity. Infect Immun. 64: 1035-1038. Lee JH, Kim YG, Ryu SY, Cho MH, Lee J (2014). Ginkgolic acids and Ginkgo biloba extract inhibit Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus biofilm formation. International Journal of Food Microbiology. 174 : 47–55. Le Minor L and Veron M (1990). Bactériologie Médicale «Staphylococcus et Micrococcus» J.Fleurette 2ème édition. Flammarion Médecine-Sciences, Paris. 773-794. Lewis K and Ausubel FM (2006). Prospects for plant derived antibacterials. Nat. Biotechnol. 24:1504-1507. Li D, Renzoni A, Estoppey T, Bisognano C, Francois P, Kelley WL, Lew DP, Schrenzel J, Vaudaux P (2005). Induction of Fibronectin Adhesins in Quinolone-Resistant Staphylococcus aureus by Subinhibitory Levels of Ciprofloxacin or by Sigma B Transcription Factor Activity Is Mediated by Two Separate Pathways. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49(3):916–924. Liang X, Zheng L, Landwehr C, Lunsford D, Holmes D, Ji Y (2005). Global regulation of gene expression by arlrs, a two-component signal transduction regulatory system of Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 187: 5486-5492. Liberto MC, Matera G, Quirino A, Lamberti AG, Capicotto R, Puccio R, Barreca GS, Focà E, Cascio A, Foca F (2009). Phenotypic and genotypic evaluation of slime production by conventional and molecular microbiological techniques. MicrobiologicalResearch. 164 : 522-528. Lim Y, Jana M, Luong TT, Lee CY (2004). Control of glucose- and nacl-induced biofilm formation by rbf in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 186: 722-729. Lima CO, Barreto HM, Lima EO, Leite de Souza E, JúniorJPS (2013). Antimicrobial effect of the essential oil from Rosmarinus officinalis L. against Staphylococcus pseudintermedius isolated from dogs. R. bras. Bioci. 11 (3): 280-283.

Références

Lina G, Jarraud S, Ji G, Greenland T, Pedraza A, Etienne J, Novick RP, Vandenesch F (1998). Transmembrane topology and histidine protein kinase activity of AgrC, the agr signal receptor in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol. 28: 655-662. Lindqvist R (2006). Estimation of Staphylococcus aureus Growth Parameters from Turbidity Data: Characterization of Strain Variation and Comparison of Methods. Applied and environmental Microbiology. 4862–4870. Luzar MA, Coles GA, Faller B, Slingeneyer and al. (1990). Staphylococcus aureus nasal carriage and infection in patients on continuous ambulatory peritoneal dialysis. N Engl J Med. 322:505–509.

Mack D, Siemssen N, Laufs R (1992). Parallel induction by glucose of adher-ence and a polysaccharide antigen specific for plastic-adherent Staphylococcus epidermidis: evidence for functional relation to intercellular adhesion. Infect.Immun. 60: 2048–2057. Mack D, Nedelmann M, Krokotsch A, Schwarzkopf A, Heesemann J, Laufs R (1994). Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intercellular adhesin. Infect Immun. 62: 3244-3253. Mack D, Fischer W, Krokotsch A, Leopold K, Hartmann R, Egge H, Laufs R (1996). The intercellular adhesin involved in biofilm accumulation of Staphylococcus epidermidis is a linear beta-1,6-linked glucosaminoglycan: purification and structural analysis. J Bacteriol. 178: 175-183. Mackenzie I (1988). Preoperative skin preparation and surgical outcome. J Hosp Infect. 11:27-32. Mannion PT, Thom BT, Reynolds CS (1989). The acquisition of antibiotic resistant coagulase-negative staphylococci by aortic graft recipients. J Hosp Infect. 14:313-23. Markum E and Baillie J (2012). Combination of essential oil of Melaleuca alternifolia and iodine in the treatment of Molluscum Contagiosum in children. Journal of Drugs In Dermato. 11 (3): 349-353. Mathur T, Singhal S, Khan S, Upadhyay DJ, Fatma T, Rattan A (2006). Detection Of Biofilm Formation Among The Clinical Isolates Of Staphylococci: An Evaluation Of Three Different Screening Methods. Indian J. Med. Microbiol. 24(1):25-29. McDougald D, Rice SA, Barraud N, Steinberg PD, Kjelleberg S (2012). Should we stay or should we go: mechanisms and ecological consequences for biofilm dispersal. Nature Rev. Microbiol. 10: 39-50. McKenney D, Pouliot KL, Wang Y, Murthy V, Ulrich M, Döring G, Lee JC, Goldmann DA, Pier GB (1999). Broadly protective vaccine for Staphylococcus aureus based on an in vivo-expressed antigen. Science. 284: 1523–1527. McLure AR and Gordon J (1992). In-vitro evaluation of povidone-iodine and chlorhexidine against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Hosp Infect. 21:291-9. Mebarki N (2010). Extraction de l'huile essentielle de Thymus fontanesii et application à la formulation d'une forme médicamenteuse – antimicrobienne. Thèse de magistère. de chimie, Université –M’Hamed Bougara-Boumerdes. Mendes S (2005). Etude des variants métaboliques dans le genre Staphylococcies caractérisation in vitro et étude prospective in vivo. Thèse doc. Univ. Nantes, France. Menzies RE (1977). Comparison of coagulase, deoxyribonuclease (DNase), and heat-stable nuclease tests for identification of Staphylococcus aureus. J. Clin. Path. 30: 606-608. Messager S, Goddard PA, Dettmar PW, Maillard JY (2001). Determination of the antibacterial efficacy of several antiseptics tested on skin by an ex vivo test. J Med Microbiol. 50:284-92.

Références

Messaili B (1995). Systématique Spermaphytes, Botanique. O. P. U. Alger, pp :63-65. M’hamedi I, Hassaine H, Bellifa S, Lachachi M, Kara Terki I, Djeribi R (2014). Biofilm formation by Acinetobacter baumannii isolated from medical devices at the intensive care unit of the University Hospital of Tlemcen (Algeria). African Journal of Microbiology Research. 8(3) :270-276. Miguel MG, Falcato–Simões M, Figueiredo AC, Barroso JMG, Pedro LG, Carvalho LM (2005). "Evaluation of the antioxidant activity of Thymbra capitata, Thymus mastichina and Thymus camphoratus essential oils. Journal. Food Lipids. 12(3): 181-197. Ministère de la santé, de la jeunesse et des sports. Comité technique des infections nosocomiales des infections liées aux soins (CTINILS). Définition des infections associées aux soins, 2007, DGS/DHOS, CTINILS. 11 pages. Morales R (1997). Synopsis of the genus Thymus L. in the Mediterranean area. Logascalia. 19: 249-262. Moretro T, Hermansen L, Holck AL, Sidhu MS, Rudi K, Langsrud S (2003). Biofilm Formation and the Presence of the Intercellular Adhesion Locus ica among Staphylococci from Food and Food Processing Environments. Applied and Envronmental Microbiology. 69(9): 5648–5655. Murphy TM et al. 2000. Therapeutic efficacy of GAR- 936, a novel glycylcycline, in a rat model of experimental endocarditis. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 3022–3027. Myrick BA and Ellner PD (1982). Evaluation of the Latex Slide Agglutination Test for Identification of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. p. 275-277.

Naghibi F, Mosaddegh M, Motamed SM, Ghorbani A (2005). Labiatae Family in folk Medicine in Iran: from Ethnobotany to Pharmacology. Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 4(2): 63-79. Nair SP, Bischoff M, Senn MM & Berger-Bächi B (2003).The sigma B regulon influences internalization of Staphylococcus aureus by osteoblasts. Infect Immun. 71: 4167–4170. Namvar AE, Asghari B, Ezzatifar F, Azizi G, Lari AR (2013). Detection of the intercellular adhesion gene cluster (ica) in clinical Staphylococcus aureus isolates. GMS Hygiene and Infection Control. 8(1) :1-4. Nauciel C (2005). ABREGES connaissances et pratique « Bactériologie médicale ». 2ème édition. MASSON, Paris. 83-85. Navarre WW and Schneewind O (1999). Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol Mol Biol Rev. 63: 174-229. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (1993). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically—Third Edition: Approved Standard M7-A3. NCCLS, Villanova, PA, USA. Nicholas RO, Li T, McDevitt D, Marra A, Sucoloski S, Demarsh PL, Gentry DR (1999). Isolation and characterization of a sigB deletion mutant of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 67: 3667–3669. Niel-Weise BS, Stijnen T, van den Broek PJ (2007). Anti-infective-treated central venous catheters: A systematic review of randomized controlled trials. Intensive Care Med.33: 2058– 2068. Ninin E, Caroff N, Espaze E, Maraillac J, Lepelletier D, Milpied N, Richet H (2006). Assessment of ica operon carriage and biofilm production in Staphylococcus epidermidis isolates causing bacteraemia in bone marrow transplant recipients. Clin Microbiol Infect. 12(5):446-52.

Références

Nostro A, Roccaro AS, Bisignano G, Marino A, Cannatelli MA, Pizzimenti FC, et al. (2007). Effects of oregano, carvacrol and thymol on Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms. Journal of Medical Microbiology. 56(4), 519e523. Novick RP, Ross HF, Projan SJ, Kornblum J, Kreiswirth B, and Moghazeh S (1993). Synthesis of staphylococcal virulence factors is controlled by a regulatory RNA molecule. EMBO. J. 12: 3967–3975. Novick RP (2003). Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Molecular microbiology. 48: 1429-1449. Novick RP and Muir TW (1999). Virulence gene regulation by peptides in staphylococci and other Gram-positive bacteria. Curr Opin Microbiol. 2: 40-45.

Okusa-Ndjolo P (2012). Etude phytochimique et activité antimicrobienne directe et indirecte de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae). Th. Doct. Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques. Bruxelles. Oliveira DR (1992). Physico-chemical aspects of adhesion. Dans Biofilms- Science and technology. Melo L.F., Bott T.R., Fletcher M., Capdeville B. Ed., NATO ASI Series, Serie E: applied sciences, Vol 223, ISBN: 0-7923-2022-0, p. 45-58. Olson ME, Ceri H, Morck DW et al (2002). Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can J Vet Res. 66: 86–92. O'Shaughnessy M, O'Malley VP, Corbett G (1991). Optimum duration of surgical scrub- time. Br J Surg. 78:685-6. Oshida T, Sugai M, Komatsuzawa H, Hong YM, Suginaka H, Tomasz A (1995). A Staphylococcus aureus autolysin that has an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase domain and an endo-beta-N-acetylglucosaminidase domain: cloning, sequence analysis, and characterization. Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 285-289. Otto M (2008). Staphylococcal biofilms. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322: 207–228. Otto M (2009). Staphylococcus epidermidis — the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7 : 555-567. Otto M (2012). Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinant of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64: 1-14.

Park CE, De Melo Serrano A, Landgraf M, Huang JC, Stankiewicz Z, Rayman MK (1980). A survey of Microorganisms for thermonuclease production. Can. J. Microbiol. 26: 532-535. Tu Quoc PH, Genevaux P, Pajunen M, Savilahti H, Georgopoulos C, Schrenzel J, Kelley WL (2007). Isolation and Characterization of Biofilm Formation-Defective Mutants of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 75(3) :1079–1088. Pedersen JA (2000). Distribution and taxonomic implication of some phenolics in the family Lamiaceae determined by ESR spectroscopy. Biochem. Syst. Ecol. 28: 229-253. Pellerin JL, Gautier M, Le Loir Y(2010). Identification de l’espèce au sein du genre. Monographies de Microbiologie. In Larpent JP, le Loir Y, Gautier M. Staphylococcus aureus. Editions Tec & Doc. Paris : Lavoisier, p. 1-20. Pénoël D (1991) . Médecine aromatique, médecine planétaire. Vers la fin d’une survie artificielle. Éditions Roger Jollois. Peschel A, Otto M, Jack RW, Kalbacher H, Jung G, Gotz F (1999). Inactivation of the dlt operon in Staphylococcus aureus confers sensitivity to defensins, protegrins, and other antimicrobial peptides. J Biol Chem. 274: 8405-8410.

Références

Pittet D, Allegranzi B, Storr J, Donaldson L (2006). The Global Patient Safety Challenge 2005-2006 “Clean Care is Safer Care”. Geneva. International Journal of Infectious Diseases. 10: 419-424. Planchon S (2006).Aptitude de Staphylococcus carnosus et Staphylococcus xylosus à former des biofilms. Etude d’une souche “biofilm-positif” par une approche protéomique. Thèse doc. Ecole doctorale des sciences de la vie et de la santé. Univ. Blaise Pascal, France. Poitras E, Houde A (2002). La PCR en temps réel: principes et applications. Reviews in Biology and Biotechnology. 2(2) :2-11. Prescott L, Harley J, Klein D (2003). Microbiologie. De Boeck Université. 2ème édition, P 527. Pratten J, Foster SJ, Chan PF, Wilson M, Nair SP (2001). Staphylococcus aureus accessory regulators: expression within biofilms and effect on adhesion. Microbes Infect. 3: 633-637. Pryor LD and Johnson LAS (1971). A classification of the Eucalypts, Australian National University, Canberra, Australia, p. Public Health England (PHE) (2014). UK Standards for Microbiology Investigations : Identification of Staphylococcus species, Micrococcus species and Rothia species. P 1-32.

Ouattara B, Simard RE, Holley RA, Piette GJP and Begin A (1997). Antibacterial activity of selected fatty acids and essential oils against six meat spoilage organisms. Inter. J. of Food Microbiology. 37: 155-162. Quezel P and Santa S (1963). Nouvelle flore de l’Algérie et des régions désertiques méridoniales, Tome II, Ed. CNRS, Paris.

Raad I et al. (2007). Comparative activities of daptomycin, linezolid, and tigecycline against catheter-related methicillin-resistant Staphylococcus bacteremic isolates embedded in biofilm. Antimicrob. Agents Chemother. 51:1656–1660. Rachid S, Ohlsen K, Wallner U, Hacker J, Hecker M, Ziebuhr W (2000a). Alternative transcription factor sigma(B) is involved in regulation of biofilm expression in a Staphylococcus aureus mucosal isolate. J Bacteriol. 182, 6824-6826. Rachid S, Ohlsen K, Witte W, Hacker J, Ziebuhr W (2000b). Effect of subinhibitory antibiotic concentrations on polysaccharide intercellular adhesion expression in biofilm- forming Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother. 44 (12):3357–63. Ramasubbu N et al. (2005). Structural analysis of dispersin B, a biofilm-releasing glycoside hydrolase from the periodontopathogen Actinobacillus actinomycetemcomitans. J.Mol. Biol. 349: 475–486. Rebiahi, SA, Abdelouahid DE, Rahmoun M, Abdelali S, Azzaoui H (2011). Emergence of vancomycin-resistant Staphylococcus aureus identified in the Tlemcen university hospital (North-West Algeria). Medecine et maladies infectieuses. 41 : 646-651. Reimer K, Wichelhaus TA, Schäfer V, Rudolph P, Kramer A, Wutzler P, Ganzer D, Fleischer W (2002). Antimicrobial effectiveness of povidone–iodine and consequences for new application areas. Dermatology. 204:114–20. Renzoni A, Francois P, Li D, Kelley WL, Lew DP, Vaudaux P, Schrenzel J (2004). Modulation of Fibronectin Adhesins and Other Virulence Factors in a Teicoplanin-Resistant Derivative of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48(8):2958–2965. Renzoni A, Barras C, Franc P¸ Charbonnier Y, Huggler E, Garzoni C, Kelley WL, Majcherczyk P, Schrenzel J, Lew DP, Vaudaux P (2006). Transcriptomic and Functional

Références

Analysis of an Autolysis-Deficient, Teicoplanin-Resistant Derivative of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50(9): 3048-3061. Resch A, Rosenstein R, Nerz C, Götz F (2005). Differential Gene Expression Profiling of Staphylococcus aureus Cultivated under Biofilm and Planktonic Conditions. Applied and Environmental Microbiology. 71(5) :2663–2676. Robins K, Wilson R, Watkins EJ (2005). Chlorhexidine spray versus single use sachets for skin preparation before regional nerve blockade for elective caesarean section: an effectiveness, time and cost study. Int J Obstet Anesth. 14:189-92. Roche FM, Meehan M, Foster TJ (2003). The Staphylococcus aureus surface protein SasG and its homologues promote bacterial adherence to human desquamated nasal epithelial cells. Microbiology. 149: 2759-2767. Rohde H, Burdelski C, Bartscht K, Hussain M, Buck F, Horstkotte MA, Knobloch JK, Heilmann C, Herrmann M, Mack D (2005). Induction of Staphylococcus epidermidis biofilm formation via proteolytic processing of the accumulationassociated protein by staphylococcal and host proteases. Mol Microbiol. 55: 1883-1895. Roulier G (1990). Les huiles essentielles pour votre santé : traité pratique d’aromathérapie. Propriétés et indications thérapeutiques des essences de plantes. Éditions Dangles. Roux A and Ghigo JM (2006). Les biofilms bactériens. Bull. Acad. Vét. France. 159(3):261- 268. Rutala WA (1996). APIC guideline for selection and use of disinfectants. 1994, 1995, and 1996 APIC Guidelines Committee. Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology, Inc. Am J Infect Control. 24:313-42. Sabat A, Krzyszton-Russian J, Strzalka W, Filipek R, Kosowska K, Hryniewicz W, Travis J, Potempa J (2003). New method for typing Staphylococcus aureus strains: multiple-locus variable-number tandem repeat analysis of polymorphism and genetic relationships of clinical isolates. J.Clin.Microbiol. 41:1801-1804. Saginur R, StDenis M, Ferris W et al (2006). Multiple combination bactericidal testing of staphylococcal biofilms from implant-associated infections. Antimicrob Agents Chemother. 50: 55–61. Salgueiro LR, Vila R, Tomi F, Figueiredo AC, Barroso JG, Canigueral S, Casanova J, Proenca A, Adzet T (1997). Variability of essential oils of Thymus caespititus from Portugal. J. of Phytochemistry. 45: 307-311. Salzer UJ (1977). The analysis of essential oils and extracts (oleoresins) from seasonings. a critical review. C.R.C Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 9: 345-373. Sangwan NS, Farooqi AHA, Shabih F, Sangwan RS (2001). Regulation of essential oil production in plants. Plant Growth Regulation. 34 : 3–21. Sarlangue J, Hubert P, Dageville C, et al (1998). Infections nosocomiales en pédiatrie. Données épidémiologiques, intérêt des réseaux. Arch Pediatr. 5(2):191–4. Sattar SA, Springthorpe S, Mani S, Gallant M, Nair RC, Scott E, Kain J (2001). Transfer of bacteria from fabrics to hands and other fabrics: development and application of a quantitative method using Staphylococcus aureus as a model. Journal of Applied Microbiology. 90: 962-970. Savey A. Infections nosocomiales : définitions. In : Maîtrise des infections nosocomiales de A à Z. 2004 ; Editions HEALTH&CO. Scheuerman TR, Camper AK, Hamilton MA (1998). Effects of substratum topography on bacterial adhesion. J Col Interf Sci. 208: 23-33. Schleifer KH, Kilpper-Balz R, Fischer U, Faller A, AND Endl J (1982). Identification of “Micrococcus candidus” ATCC 14852 as a Strain of Staphylococcus epidermidis and of

Références

“Micrococcus caseolyticus” ATCC 13548 and Micrococcus varians ATCC 29750 as Members of a New Species, Staphylococcus caseolyticus. Int J Syst Bacteriol. 32:269. Schmidt KA., Manna AC, Gill S, Cheung AL, SarT (2001). a repressor of alpha-hemolysin in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 69: 4749–4758. Sebben JE (1983). Surgical antiseptics. J Am Acad Dermatol. 9:759-69. Shanks RM, Sargent JL, Martinez RM, Graber ML, O'Toole GA (2006). Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21: 2247-2255. Sikkema J, de Bont JAM, Poolman B (1994). Interactions of cyclic hydrocarbons with biological membranes. J. Biol. Chem. 269: 8022-8028 Shirtliff ME, Mader JT, Camper AK (2002). Molecular interactions in biofilms. Chem Biol. 9: 859-871. Singh R, Ray P, Das A, Sharma M (2009). Role of persisters and small-colony variants in antibiotic resistance of planktonic and biofilm-associated Staphylococcus aureus: an in vitro study. Journal of medical microbiology. 58: 1067-1073. Singh R, Ray P, Das A, Sharma M (2010). Penetration of antibiotics through Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 65: 1955-1958. Sjoquist J, Movitz J, Johansson IB, Hjelm H (1972). Localization of protein A in the bacteria. Eur J Biochem. 30:190–4. Skandamis P, Koutsoumanis K, Fasseas K, Nychas GJE (2001). Inhibition of oregano essential oil and EDTA on Escherichia coli O157:H7. Italian Journal of Food Science. 13 (1): 65–75. Smith JL, Buchanan RL, Palumbo SA (1983). Effect of food environment on staphylococcal enterotoxin synthesis: A review. J. Food Protect. 46:545–555. Smith K et al. (2009). Comparison of biofilm-associated cell survival following in vitro exposure of meticillinresistant Staphylococcus aureus biofilms to the antibioticsclindamycin, daptomycin, linezolid, tigecycline and vancomycin. Int. J. Antimicrob. Agents. 33: 374–378. Sperber WH and Tatini SR (1975). Interpretation of the tube coagulase test for the identification of Staphylococcus aureus. Appl. Microbiol. 29:502-505. Stephan J, Pantucek R, Doskar J (2004). Molecular diagnostics of clinically important staphylococci.Folia Microbio. 49 (4) 353-386. Stepanovic S, Vukovic D, Dakic I, Savic B, Svabic-Vlahovic M (2000). A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods.40:175-179. Stoodley P, Debeer D, Llewandowski Z (1994). Liquid Flow in Biofilm Systems. Appl. Environ. Microbiol. 60: 2711-2716. Suh M, Limbach P (2004). Investigation of methods suitable for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of proteins from ribonucleoprotein complexes. Eur J Mass Spectrom. 10(1):89-99. Sutherland IW (2001). The biofilm matrix--an immobilized but dynamic microbial environment. Trends Microbiol. 9: 222-227.

Tang H, Cao T, Liang X, Wang A, Salley SO et al. (2009). Influence of silicone surface roughness and hydrophobicity on adhesion and colonization of Staphylococcus epidermidis. J. Biomed. Mater. Res., Part A. 88: 454–463 Tegmark K, Karlsson A, Arvidson S (2000). Identification and characterization of SarH1, a new global regulator of virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 37: 398–409

Références

Tegos G, Stermitz FR, Lomovskaya O, Lewis K (2002). Multidrug Pump Inhibitors Uncover Remarkable Activity of Plant Antimicrobials Antimicrob. Agents Chemother. 46: 3133-3141. Thakker M, Park JS, Lee JC (1998). Staphylococcus aureus serotype 5 capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacterial virulence in a murine bacteraemia model. Infect Immun. 66: 5183-5189. Thallinger B, Argirova M, Lesseva M, Ludwig R, Sygmund C, Schlick A, Nyanhongo GM, Guebitz GM (2014). Preventing microbial colonisation of catheters: Antimicrobial andantibiofilm activities of cellobiose dehydrogenase. International Journal of Antimicrobial Agents. 44:402–408. Thormar H. (2011). Lipids and Essential Oils as Antimicrobial Agents. New Delhi: India, John Wiley & Sons, Ltd. Tian F, Li B, Ji B, Yang J, Zhang G, Chen Y, Luo Y (2008). Antioxidant and antimicrobial activities of consecutive extracts from Galla chinensis: the polarity affects the bioactivities. Food Chem. 113: 173–179 Toledo-Arana A, Merino N, Vergara-Irigaray M, Debarbouille M, Penades JR, Lasa I (2005). Staphylococcus aureus Develops an Alternative, ica-Independent Biofilm in the Absence of the arlRS Two-Component System. J Bacteriol. 187: 5318-5329. Tomi F, Bradesi P, Bighelli A, Casanova J (1995). Computer-aided identification of individual components of essential oils using Carbon-13 NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. Anal. 1: 25-34. Tonolla M, Benagli C, Rossi V, Fragoso C, Petrini O (2010). MALDI-TOF MS: a new laboratory option for the diagnosis of clinical infections. Pipette Swiss Laboratory Medicine. 3: 6-10. Touati A, Achour W, Abbassi MS, Ben Hassen A (2007). Detection of ica genes and slime production in a collection of Staphylococcus epidermidis strains from catheter-related infections in neutropenic patients. Pathologie Biologie. 55: 277–282. Tran PL, Lowry N, Campbell T, Reid TW, Webster DR, Tobin E, Aslani A, Mosley T, Dertien J, Colmer-Hamood JA et al. (2012). An organoselenium compound inhibits Staphylococcus aureus biofilms on hemodialysis catheters in vivo. Antimicrob. Agents Chemother. 56: 972–978. Tristan A, Ying L, Bes M, Etienne J, Vandenesch F, Lina G (2003). Use of multiplex PCR to identify Staphylococcus aureus adhesion involved in human hematogenous infections. J.Clin.Microbiol. 41:4465-4467. Trotot-Voilliot C (2012). Aspect clinique des infections cutanées à Staphylococcus aureus secréteurs de leucocidine de Panton Valentine à propos de 15 cas, Th. doct., Faculté de Médecine de Nancy, France. Truong VK, Lapovok R, Estrin YS, Rundell S, Wang JY, Fluke CJ, Crawford RJ, Ivanova EP (2010). The influence of nano-scale surface roughness on bacterial adhesion to ultrafine-grained titanium. Biomaterials. 31: 3674–3683. Tyagi AK and Malik A (2011). Antimicrobial potential and chemical composition of Eucalyptus globulus oil in liquid and vapour phase against food spoilage microorganisms. Food Chemistry. 126 : 228–235.

Ultee A, Bennik MH, Moezelaar R (2002). The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1561-1568. Ultee A, Kets EP, Smid EJ (1999). Mechanisms of action of carvacrol on the food-borne pathogen Bacillus cereus. Applied and Environmental Microbiology. 65: 4606–4610.

Références

Unal S, Hoskins J, Flokowitsch JE, Wu CYE, Preston DA, Skatrud PL (1992). Detection of methicillin-resistant staphylococci by using polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 30:1685–1691. Utili R, Durante-Mangoni E, Tripodi MF (2007). Infection of intravascular prostheses: how to treat other than surgery. Int. J. Antimicrob. Agents. 30 S: S42- S50.

Vandenbergh MF and Verbrugh HA (1999). Carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology and clinical relevance. J Lab Clin Med. 133: 525-534. Van Loosdrecht MC, Norde W, Zehnder AJB (1990). Physical chemical description of bacterial adhesion. J Biomaterials Appl. 5: 91-106. Vannuffel P, Gigi J, Ezzedine H, Vandercam B, Delmée M, Wauters G, Gala JL (1995). Specific detection of methicillin-resistant staphylococci species by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 33 : 2864–2867. Van Vuuren S and Viljoen A (2007). Antimicrobial activity of limonene enantiomers and 1,8-cineole alone and in combination. Flavour Fragr. J. 22 : 540–544. Vaudaux P, Francois P, Bisognano C, Kelley WL, Lew DP, Schrenzel J, Proctor RA, McNamara PJ, Peters G, Von Eiff C (2002).Increased Expression of Clumping Factor and Fibronectin-BindingProteins by hemB Mutants of Staphylococcus aureus Expressing Small Colony Variant Phenotypes. Infection and Immunity. 70(10) : 5428–5437. Vincent A and laprugne-Garcia E (2008). Infections associées aux soins définition, fréquence et facteurs de risque, Fiches conseils pour la prévention du risque infectieux. CCLIN Sud-Est. , P.5. Vincent-Boulétreau A (2004). Infections nosocomiales : épidémiologie. In – Maîtrise des infections nosocomiales de A à Z ; Editions HEALTH&CO. Vincent JL (2003). Nosocomial infections in adult intensive-care units. Lancet. 361: 2068- 2077. Virginie L (2008). Influence du cuire sur les biomasses microbiennes dans les canalisations d’eau. Th. doct., Faculté de de pharmacie de Chatenay Malabry. Paris, France. Von Eiff C (2008). Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. International Journal of Antimicrobial Agents. 31: 507–510. Von Eiff C, Heilmann C, Peters G (1999). New aspects in the molecular basis of polymer- associated infections due to staphylococci. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 18:843–846 Vuong C, Saenz HL, Götz F, Otto M (2000). Impact of the agr quorum-sensing system on adherence to polystyrene in Staphylococcus aureus. J Infect Dis. 182: 1688–1693.

Waldvogel FA (1990). Staphylococcus aureus (including toxic shock syndrome), In: Mandell GL, Douglas RG, Bennett JE (eds.). Principles and Practice of Infectious Disease, 3rded. Churchill Livingston, London. pp 1489-1510. Waters EM, McCarthy H, Hogan S, Zapotoczna M, O'Neill E, O'Gara JP (2014). Rapid quantitative and qualitative analysis of biofilm production by Staphylococcus epidermidis under static growth conditions. Methods Mol. Biol. 1106:157-66. Weems JJ Jr (2001). The many faces of Staphylococcus aureus infection. Recognizing and managing its life-threatening manifestations. Postgrad Med. 110 (4): 24-6, 29-31, 35-6. Werner M (2002). Les huiles essentielles : réveil du corps et de l’esprit. Éditions Vigot, collection Santé Bien-être, 95 pages. Wertheim HF, Vos MC, Ott A, van Belkum A, Voss A, Kluytmans JA, van Keulen PH, Vandenbroucke-Grauls CM, Meester MH, Verbrugh HA. (2004). Risk and outcome of nosocomial Staphylococcus aureus bacteraemia in nasal carriers versus noncarriers. Lancet. 364: 703–05.

Références

White RL, Burgess DS, Manduru M, Bosso JA (1996). Comparison of three different in vitro methods of detecting synergy: time kill, checkerboard, and E test. Antimicrob Agents Chemother. 40: 1914-8. Wilkinson BJ (1997) Biology. In: Crossley KB, Archer GL, eds. The Staphylococci in Human Diseases. Churchill Livingston, London. pp 1-38 Wrangstadh M, Conway PL, Kjelleberg S (1986). The production and release of an extracellular polysaccharide during starvation of a marine Pseudomonas sp. and the effect thereof on adhesion. Arch Microbiol. 145: 220-227. Wu JA et al. (2003). Lysostaphin disrupts Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms on artificial surfaces. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 3407–3414.

Xu LC and Siedlecki CA (2012). Submicron-textured biomaterial surface reduces staphylococcal bacterial adhesion and biofilm formation. Acta Biomater. 8: 72–81.

Yamashita K and Kagawa S (1992). Detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by non-radioactive probes. J Clin Exp Med. 162: 535-9. You Y, Xue T, Cao L, Zhao L, Sun H, Sun B (2014). Staphylococcus aureus glucose- induced biofilm accessory proteins, GbaAB, influence biofilm formation in a PIA-dependent manner. Int J Med Microbiol. 304:603-12. Yu D, Zhao L, Xue T, Sun B (2012). Staphylococcus aureus autoinducer-2 quo-rum sensing decreases biofilm formation in an icaR-dependent manner. BMC Microbiol. 12 : 288.

Zhang B, Halouska S, Schiaffo CE, Sadykov MR, Somerville GA, Powers R (2011). NMR analysis of a stress response metabolic signaling network. J. Proteome Res.10:3743– 3754. Ziebuhr W, Heilmann C, Götz F, Meyer P, Wilms K, Straube E, Hacker J (1997). Detection of the intercellular adhesion gene cluster (ica) and phase variation in Staphylococcus epidermidis blood culture strains and mucosal isolates. Infect Immun. 65: 890–896. Ziebuhr W, Krimmer V, Rachid S, Lössner I, Götz F & Hacker J (1999). A novel mechanism of phase variation of virulence in Staphylococcus epidermidis: evidence for control of the polysaccharide intercellular adhesin synthesis by alternating insertion and excision of the insertion sequence element IS256. Mol Microbiol. 32: 345–356. Ziebuhr W, Lössner I, Rachid S, Dietrich K, Götz F, Hacker J (2000). Modulation of the polysaccharide intercellular adhesion (PIA) expression in biofilm forming Staphylococcus epidermidis. Analysis of genetic mechanisms. Adv Exp Med Biol. 485: 151–157.

ANNEXES

Annexes .

Annexe 1. Source et profil numérique des souches de Staphylococcus obtenues par l’identification biochimique (API 20 STAPH)

Souche Code Service Profil numérique S. aureus LMB20318 Néonatologie 6726151 LMB20320 Néonatologie 6726153 LMB20325 Neurologie 6736253 LMB20326 Neurologie 6737353 LMB20371 Néonatologie 6336051 LMB20346 Néonatologie 6376111 LMB20310 Neurologie 6337053 LMB20311 Pneumologie LMB20338 Néonatologie 6376153 LMB20351 Néonatologie

LMB20306 Néonatologie 6736053 LMB20340 Néonatologie LMB20301 Néonatologie LMB20390 Néonatologie LMB20388 Néonatologie LMB20322 Pédiatrie 6736113 LMB20345 Pneumologie LMB20332 Dermatologie 6336151 LMB20336 Pédiatrie LMB20307 Néonatologie 6335053 LMB20323 Med. interne LMB20330 Pneumologie LMB20372 Néonatologie 6736152 LMB20362 Néonatologie LMB20365 Néonatologie LMB20308 Pédiatrie 6736153 LMB20321 Néonatologie LMB20324 Med. interne LMB20328 Med. interne LMB20331 Med. interne LMB20333 Néonatologie LMB20334 Néonatologie LMB20342 Néonatologie LMB20343 Néonatologie LMB20344 Néonatologie LMB20348 Néonatologie LMB20350 Pneumologie LMB20353 Néonatologie LMB20368 Pneumologie LMB20354 Néonatologie LMB20373 Néonatologie LMB20376 Pneumologie LMB20379 Med. Interne LMB20381 Med. Interne LMB20386 Pédiatrie LMB20305 Pneumologie LMB20316 Néonatologie LMB20341 Pneumologie LMB20339 Pédiatrie

Annexes .

LMB20317 Med. interne 6336153 LMB20327 Pédiatrie LMB20337 Med. interne LMB20352 Pédiatrie LMB20355 Néonatologie LMB20356 Pneumologie LMB20357 Néonatologie LMB20347 Néonatologie LMB20359 Néonatologie LMB20314 Pédiatrie LMB20361 Néonatologie LMB20363 Neurologie LMB20364 Néonatologie LMB20349 Néonatologie LMB20370 Néonatologie LMB20367 Néonatologie LMB20374 Néonatologie LMB20302 Pneumologie LMB20303 Pneumologie LMB20304 Pneumologie LMB20319 Pneumologie LMB20335 Néonatologie S. lentus LMB20315 Néonatologie 6677773 S. hyicus LMB20369 Néonatologie 6557153 S. haemolyticus LMB20358 Med. interne 6236111 S. xylosus LMB20360 Med. Interne 6777753 LMB20366 Néonatologie 6677753

Annexes .

Annexe 2. Collection des 50 Souches de S. aureus en rapport avec le sexe et l’âge des patients, et la durée du cathéter. (-) pas de données disponibles)

N° Code Sexe Age Durée cathéter Service patient patient 1 LMB20318 Garçons - ≥14jrs Néonatologie 2 LMB20320 Garçons 24jrs 7jrs Néonatologie 3 LMB20371 Garçons - 10jrs Néonatologie 4 LMB20346 Garçons 24jrs ≥14jrs Néonatologie 5 LMB20338 Garçons - 7jrs Néonatologie 6 LMB20306 Fille 24jrs - Néonatologie 7 LMB20340 Garçons 16jrs 7jrs Néonatologie 8 LMB20307 Fille - 10jrs Néonatologie 9 LMB20372 Fille Prématuré - Néonatologie 10 LMB20362 Fille 20jrs - Néonatologie 11 LMB20365 Fille 20jrs - Néonatologie 12 LMB20321 Fille Prématuré - Néonatologie 13 LMB20333 Garçons Prématuré - Néonatologie 14 LMB20334 Fille 28jrs 7jrs Néonatologie 15 LMB20342 Garçons 17jrs 8jrs Néonatologie 16 LMB20343 Fille - 10jrs Néonatologie 17 LMB20344 Garçons 20jrs - Néonatologie 18 LMB20348 Fille - ≥14jrs Néonatologie 19 LMB20353 Fille Prématuré - Néonatologie 20 LMB20354 Garçons - - Néonatologie 21 LMB20355 Garçons 19jrs - Néonatologie 22 LMB20357 Garçons - - Néonatologie 23 LMB20347 Fille - 7jrs Néonatologie 24 LMB20359 Garçons 15jrs ≥14jrs Néonatologie 25 LMB20361 Fille 14jrs - Néonatologie 26 LMB20364 Garçons 26jrs - Néonatologie 27 LMB20349 Fille - - Néonatologie 28 LMB20370 Fille 21jrs 8jrs Néonatologie 29 LMB20322 Fille - ≥14jrs Pédiatrie 30 LMB20336 Fille 12ans - Pédiatrie 31 LMB20327 Garçons 6ans 8jrs Pédiatrie 32 LMB20352 Fille 10ans 7jrs Pédiatrie 33 LMB20314 Garçons - ≥14jrs Pédiatrie 34 LMB20308 Garçons 3ans - Pédiatrie 35 LMB20323 Femme 50ans ≥14jrs Med. interne 36 LMB20324 Femme - ≥14jrs Med. interne 37 LMB20328 Femme 45ans ≥14jrs Med. interne 38 LMB20331 Homme 70ans ≥14jrs Med. interne 39 LMB20317 Homme 55ans 10jrs Med. interne 40 LMB20337 Femme - - Med. interne 41 LMB20345 Homme 39ans ≥14jrs Pneumologie 42 LMB20330 Homme 27ans 7jrs Pneumologie 43 LMB20350 Homme - - Pneumologie 44 LMB20368 Homme - 7jrs Pneumologie 45 LMB20356 Homme - ≥14jrs Pneumologie 46 LMB20325 Homme 49ans ≥14jrs Neurologie 47 LMB20326 Homme 28ans - Neurologie 48 LMB20310 Femme 32ans - Neurologie 49 LMB20363 Homme 66ans 7jrs Neurologie 50 LMB20332 Homme - - Dermatologie

Annexes .

Annexe 3. Valeurs de Densité optique (DO) des biofilm à S. aureus, mesurées par un lecteur de microplaques (model El×800) à 630nm par la méthode de microplaque 96 puits

S LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB Test contrôle 20306 20365 20326 20327 20328 20334 20331 20332 20333 20368 20336 DO

1 0,40 0,48 0,93 1,12 0,39 1,11 0,21 0,56 0,10 0,65 0,08 0,07 2 0,13 0,28 0,84 2,76 0,59 0,51 0,03 0,35 0,20 0,34 0,14 0,06 3 0,23 0,47 0,64 1,42 0,45 0,86 0,06 0,44 0,12 0,41 0,17 0,19 4 0,24 0,43 0,40 1,45 0,47 0,86 0,30 0,45 0,07 0,47 0,03 0,02 5 0,16 0,42 0,52 0,90 0,36 0,58 0,14 0,48 0,12 0,25 0,04 0,16 6 0,18 0,38 0,61 1,05 0,47 0,72 0,11 0,49 0,19 0,33 0,12 0,01 7 0,23 0,31 0,66 0,59 0,55 1,10 0,02 0,33 0,07 0,32 0,05 0,27 8 0,08 0,28 0,54 2,74 0,29 1,14 0,21 0,29 0,05 0,29 0,07 0,06 M 0,20 0,38 0,64 0,50 0,44 0,86 0,13 0,42 0,11 0,38 0,08 0,10

S LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB Test contrôle 20350 20352 20353 20354 20355 20356 20357 20359 20364 20362 20363 DO

1 0,62 0,24 0,22 0,91 0,45 0,13 0,32 2,67 0,46 0,28 0,20 0,23 2 0,45 0,30 0,04 0,21 0,39 0,05 0,14 1,73 0,80 0,44 0,11 0,10 3 0,46 0,24 0,13 0,15 0,30 0,17 0,21 1,79 0,85 0,38 0,24 0,05 4 0,49 0,06 0,11 0,16 0,26 0,06 0,48 1,62 0,59 0,43 0,28 0,14 5 0,48 0,25 0,16 0,30 0,48 0,09 0,59 1,71 0,61 0,79 0,56 0,18 6 0,48 0,22 0,39 0,41 0,44 0,01 0,45 2,07 0,52 0,22 0,38 0,13 7 0,42 0,35 0,37 0,57 0,52 0,08 0,27 2,05 0,73 0,36 0,37 0,05 8 0,53 0,17 0,24 0,48 0,46 0,14 0,31 2,08 0,47 0,22 0,00 0,20 M 0,49 0,22 0,20 0,39 0,41 0,09 0,34 1,96 0,62 0,39 0,26 0,13 S LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB Test contrôle 20324 20307 20371 20310 20370 20317 20318 20320 20321 20322 20323 DO

1 0,33 0,18 0,55 0,81 0,19 0,15 0,25 0,36 0,11 0,02 0,00 0,03 2 0,47 1,13 0,83 0,38 0,27 0,07 0,01 0,57 0,20 0,21 0,00 0,03 3 0,22 0,31 0,46 0,24 0,07 0,08 0,11 0,12 0,04 0,38 0,10 0,05 4 0,25 2,73 0,89 0,66 0,29 0,20 0,62 0,50 0,13 0,05 0,04 0,04 5 0,07 0,16 0,27 0,38 0,17 0,29 0,03 0,64 0,13 2,03 2,31 0,02 6 0,03 0,47 0,49 0,27 0,06 0,00 0,07 0,26 0,11 0,56 0,45 0,02 7 0,01 0,19 0,36 0,09 1,92 0,34 0,05 0,02 0,05 0,02 0,08 0,09 8 0,19 0,44 0,39 0,28 0,01 0,10 0,05 0,10 0,06 0,00 0,10 0,07 M 0,19 0,70 0,53 0,38 0,37 0,15 0,14 0,32 0,10 0,40 0,38 0,04 S LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB LMB Test contrôle 20337 20338 20340 20342 20343 20344 20345 20346 20347 20348 20349 DO

1 0,12 0,99 0,70 0,47 0,28 0,46 0,29 0,24 0,00 0,20 0,19 0,03 2 0,54 1,25 0,58 0,39 0,09 0,27 0,29 1,44 0,33 0,39 0,39 0,02 3 0,22 1,40 0,69 0,44 0,16 0,25 0,37 0,25 0,50 0,36 0,26 0,13 4 0,49 1,70 0,68 0,26 0,05 0,22 0,37 0,25 0,29 0,48 0,37 0,06 5 0,36 1,49 0,57 0,41 0,17 0,46 0,43 0,48 0,20 0,28 0,18 0,06 6 0,19 1,59 0,48 0,52 0,05 0,23 0,55 0,61 0,35 0,26 0,29 0,00 7 0,31 1,86 0,58 0,45 0,10 0,32 0,72 0,49 0,40 0,45 0,22 0,14 8 0,37 1,84 0,44 0,44 0,08 0,19 0,37 0,54 0,30 0,49 0,03 0,17 M 0,32 1,51 0,59 0,42 0,12 0,30 0,42 0,53 0,29 0,36 0,24 0,07 S LMB20 LMB2 LMB2 LMB2 LMB2 LMB2 Test contrôle 308 0314 0325 0330 0361 0372 DO

Annexes .

1 0,32 0,20 0,90 1,65 0,31 0,13 0,03 2 0,45 0,10 0,85 1,73 0,15 1,15 0,04 3 0,22 0,11 0,65 1,79 0,20 0,34 0,02 4 0,25 0,07 0,30 1,60 0,46 2,13 0,05 5 0,06 0,13 0,51 1,61 0,69 0,13 0,06 6 0,04 0,18 0,60 1,07 0,44 0,37 0,00 7 0,03 0,06 0,61 2,25 0,26 0,49 0,06 8 0,01 0,05 0,56 1,04 0,32 0,45 0,09 M 0,17 0,11 0,62 1,59 0,35 0,64 0,04 M : moyenne, S : souche

Annexes .

Annexe 4. Détection de la production de biofilm chez S. aureus par deux méthodes: microplaque 96 puits et rouge Congo agar. Souches Méthode de microplaque Méthode rouge Congo agar LMB20306 - - LMB20307 + + LMB20308 - - LMB20310 + - LMB20314 - - LMB20317 - - LMB20318 - - LMB20320 + - LMB20321 - - LMB20322 + - LMB20323 + - LMB20324 - - LMB20325 + - LMB20326 + + LMB20327 + + LMB20328 + + LMB20330 + + LMB20331 - - LMB20332 + - LMB20333 - - LMB20334 + + LMB20336 - - LMB20337 + - LMB20338 + + LMB20340 + - LMB20342 + + LMB20343 - - LMB20344 + - LMB20345 + - LMB20346 + - LMB20347 + - LMB20348 + - LMB20349 - - LMB20350 + - LMB20352 - - LMB20353 - - LMB20354 + - LMB20355 + - LMB20356 - - LMB20357 + - LMB20359 + + LMB20361 + - LMB20362 + - LMB20363 - - LMB20364 + + LMB20365 + - LMB20368 + - LMB20370 + - LMB20371 + - LMB20372 + - (+) : présence de slime, (-) : absence de slime

Annexes .

Annexe 5. Fiche récapitulative d’identification par MALDI-TOF des souches LMB20327, LMB20330, LMB20338 et LMB203594

Annexes .

Annexe 6. Fiche d’identification par MALDI-TOF de l’échantillon témoin (Analyte 1)

Annexes .

Annexe 7. Fiche d’identification par MALDI-TOF de la souche LMB20327 (Analyte 2)

Annexes .

Annexe 8. Fiche d’identification par MALDI-TOF de la souche LMB20338 (Analyte 3)

Annexes .

Annexe 9. Fiche d’identification par MALDI-TOF de la souche LMB20359 (Analyte 4)

Annexes .

Annexe 10. Fiche d’identification par MALDI-TOF de la souche LMB20330 (Analyte 5)

Annexe 11. Spectre d’identification MALDI-TOF obtenu pour la souche LMB20327

Annexes

Annexe 12. Spectre d’identification MALDI-TOF obtenu pour la souche LMB20330

Annexes

Annexe 13. Spectre d’identification MALDI-TOF obtenu pour la souche LMB20338

Annexes

Annexe 14. Spectre d’identification MALDI-TOF obtenu pour la souche LMB20359

Annexes

Annexe 15. Valeurs critiques des diamètres des zones d’inhibition pour S. aureus [(CLSI, 2008) ; (CASFM, 2010)]

Antibiotique Charge du S I R disque Pénicilline (P) 10 UI ≥ 29 - ≤28 Oxacilline (OX) 5 µg ≥20 - <20 Imipéneme (IMP) 10 µg ≥16 14-15 ≤13 Ofloxacine (OFX) 5 µg ≥18 15-17 ≤14 Gentamicine (CN) 10 µg ≥15 13-14 ≤12 Amikacine (AK) 30 µg ≥17 15-16 ≤14 Erythromycine (E) 15 µg ≥23 14-22 ≤13 Vancomycine (VA) 30 µg ≥15 - - Acide fusidique (FA) 10 µg ≥22 15-21 ≤15 Tétracycline (TE) 30 µg ≥19 15-18 ≤15 Fosfomycine (FF) 50 µg ≥14 - ≤14 Chloramphénicol (C) 30 µg ≥18 13-17 ≤12

Annexe 16. Résultats de l’antibiogramme des quatre souches de S. aureus fortement productrices de biofilm

LMB20327 LMB20330 LMB20338 LMB20359

E AK

IMP

OFX

Annexes P

Arrêt net de croissance avec grosses colonies Résistance hétérogène

Annexes .

Annexe 17. Composition du milieu Letheen 1% (w/v) d’agar

Digestion enzymatique de tissus animaux………………………………... 10g

Extrait de boeuf……………………………………………………………... 5g

NaCl…………………………………………………………………………. 5g

Lécithine…………………………………………………………………….. 0,7g

Tween 80……………………………………………………………………. 5mL

Agar………………………………………………………………………….. 10g

Eau distillée………………………………………………………………….. 1L pH final : 7.0 ± 0.2 à 25°C

Annexes .

Annexe 18. CMIs et CMBs des HEs et de la PVI contre la forme planctonique des souches de S. aureus. HE : Huile essentielle, PVI : Povidone iodée, HEE : HE d’E. globulus, HER : HE de R. officinalis, HET: HE de T. capitatus.

Souches sous forme Agent antibactérien CMI (g/L) CMB (g/L) planctonique LMB20306 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.25 0.5 HET 0.5 1 LMB20307 PVI 8.19 8.19 HEE 0.25 1 HER 0.5 2 HET 0.5 1 LMB20308 PVI 8.19 8.19 HEE 0.25 4 HER 0.5 4 HET 0.5 2 LMB20310 PVI 4.09 8.19 HEE 0.25 0.5 HER 0.5 1 HET 0.5 2 LMB20314 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.5 1 HET 0.25 2 LMB20317 PVI 8.19 8.19 HEE 0.25 0.5 HER 0.5 1 HET 0.5 1 LMB20318 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 1 HER 0.25 2 HET 0.5 4 LMB20320 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 05 HER 0.5 0.5 HET 0.5 1 LMB20321 PVI 8.19 8.19 HEE 0.25 1 HER 0.25 1 HET 0.5 1 LMB20322 PVI 8.19 8.19 HEE 0.06 0.5 HER 0.25 1 HET 0.12 05 LMB20323 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 1 HER 0.25 0.5 HET 0.5 2 LMB20324 PVI 4.09 8.19 HEE 0.06 1 HER 0.25 1 HET 0.5 1 LMB20325 PVI 2.04 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.12 1 HET 2

Annexes .

0.5 LMB20326 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 1 HER 0.25 2 HET 0.5 4 LMB20327 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 0.25 HER 0.12 0.5 HET 0.25 1 LMB20328 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 0.25 HER 0.25 0.5 HET 0.5 1 LMB20330 PVI 2.04 8.19 HEE 0.12 1 HER 0.25 1 HET 0.5 2 LMB20331 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.25 1 HET 0.5 2 LMB20332 PVI 2.04 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.12 1 HET 0.5 0.5 LMB20333 PVI 4.09 8.19 HEE 0.5 0.5 HER 0.5 1 HET 0.5 1 LMB20334 PVI 2.04 8.19 HEE 1 2 HER 1 4 HET 0.5 0.5 LMB20336 PVI 4.09 8.19 HEE 0.5 1 HER 0.12 1 HET 0.5 2 LMB20337 PVI 4.09 4.09 HEE 0.5 1 HER 0.5 2 HET 0.5 0.5 LMB20338 PVI 4.09 8.19 HEE 0.5 1 HER 0.12 05 HET 0.5 1 LMB20340 PVI 4.09 8.19 HEE 0.5 0.5 HER 0.5 1 HET 0.25 1 LMB20342 PVI 8.19 8.19 HEE 0.5 2 HER 1 2 HET 0.5 1 LMB20343 PVI 8.19 8.19 HEE 0.5 0.5 HER 0.12 1 HET 0.5 1 LMB20344 PVI 8.19 8.19 HEE 0.5

Annexes .

HER 0.12 1 HET 0.25 2 0.25 LMB20345 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 1 HER 0.5 2 HET 0.25 0.5 LMB20346 PVI 4.09 8.19 HEE 0.5 1 HER 0.5 2 HET 0.25 1 LMB20347 PVI 4.09 8.19 HEE 0.5 1 HER 0.5 0.5 HET 0.5 1 LMB20348 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.25 0.5 HET 0.5 2 LMB20349 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.12 1 HET 0.25 1 LMB20350 PVI 4.09 8.19 HEE 0.25 1 HER 0.5 2 HET 0.25 1 LMB20352 PVI 8.19 8.19 HEE 0.06 0.5 HER 0.25 0.5 HET 0.25 1 LMB20353 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 0.25 HER 0.5 1 HET 0.25 0.5 LMB20354 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.25 1 HET 0.5 0.5 LMB20355 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.25 0.5 HET 0.5 1 LMB20356 PVI 8.19 8.19 HEE 0.5 2 HER 0.12 1 HET 0.5 2 LMB20357 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.25 0.5 HET 0.25 1 LMB20359 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.25 1 HET 0.5 1 LMB20361 PVI 4.09 8.19 HEE 0.25 1 HER 0.5 1 HET 1

Annexes .

0.5 LMB20362 PVI 2.04 8.19 HEE 0.25 0.5 HER 0.5 1 HET 0.5 1 LMB20363 PVI 2.04 8.19 HEE 0.12 1 HER 0.12 2 HET 0.25 2 LMB20364 PVI 8.19 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.5 1 HET 0.5 1 LMB20365 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.5 1 HET 0.5 1 LMB20368 PVI 4.09 8.19 HEE 0.12 0.5 HER 0.5 0.5 HET 0.5 1 LMB20370 PVI 2.04 8.19 HEE 0.12 1 HER 0.5 1 HET 0.25 0.5 LMB20371 PVI 2.04 8.19 HEE 0.25 2 HER 0.5 1 HET 0.5 1 LMB20372 PVI 4.09 8.19 HEE 0.25 0.5 HER 1 1 HET 0.5 2 S. aureus PVI 2.04 8.19 ATCC25923 HEE 0.5 1 HER 0.5 2 HET 0.5 1 SARM PVI 2.04 8.19 ATCC 43300 HEE 0.5 2 HER 2 2 HET 1 1 SARM PVI 2.04 8.19 ATCC 33591 HEE 1 1 HER 0.5 1 HET 0.5 1

Annexe 19. Récapitulatif sur les caractéristiques phénotypiques et génotypiques des quatre souches de S. aureus hautement adhérentes

Biotype (galerie API 20STAPH)

d’identificationScore (MALDI

gène

Phénotype (antibiogramme)

Slime (méthode Rouge Congo

Code (Origine) de souchela

Gène Gène

Présence et expréssion du

Gène Gène

Polysaccharide PIA (Dot

microplaque 96 puits)

Biofilm (méthode de

ica

femA

mecA (QRT PCR en temps

TOF MS)

blotting)

réel) réel)

Agar)

(PCR en temps

réel)

(PCR en temps

LMB20327 (service de pédiatrie) 6336153 (++) (+) P (R), E(R) , TE(I) 2,386 (+++) (+) (+)* (-) (+)

LMB20330 (service de pneumologie) 6335053 (++) (+) P (R), E(R) 2,359 (+++) (+) (+)* (-) (+)

LMB20338 (service de néonatologie) 6376153 (++) (+) S 2,390 (+++) (+) (+)* (-) (+)

LMB20359 (service de néonatologie) 6336153 (++) (+) S 2,353 (+++) (+) (+)* (-) (+)

(+++) : forte probabilité d’identification à l’espèce P : pénicilline S : aucune résistance vis-à-vis des antibiotiques (++) : fortement adhérente E : érythromycine testés (+) : présence TE : tétracycline (-) : absence (R) : résistante (I)

* : expression positive : intermédiaire Annexes

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Strain Code Strains Biotype Source/Unit LMB20330 S.aureus 6335053 Pneumology service LMB20338 S.aureus 6376153 Neonatology service LMB20359 S.aureus 6336153 Neonatology service LMB20327 S.aureus 6336153 Pediatric service

العنوان دراسة مفعول ثالثة زيوت طيارة ضد البيوفيلم لدى الكرويات العنقودية المسؤولة عن األمراض المكتسبة في المستشفيات بالمستشفى الجامعي لوالية . تلمسان ملخص إذا كانت تعتبر كممرض رئيسي لإلنسان،ذلك النها مسؤولة عن 1 إلى 5% من األمراض المكتسبة في المجتمع و بنسبة 30% من األمراض المكتسبة في المستشفيات. هذه الكرويات العنقودية )huccua lyhpatSururrua( لها القدرة على تشكيل طبقات تعرف باسم 'moufoSb' فوق األسطح الحيوية و غير الحيوية. في فترة دراسة مدتها 30 شهر،تم نزع 360 قسطر من المرضى المسعفين بالمستشفى الجامعي لوالية تلمسان. تم عزل 71 ساللة huccua .l من بين ap. 240 lyhpatSururrua. هذه السالالت تتوزع بشكل تنازلي على المصالح اآلتية: م. حديثي الوالدة 37 )52.11%(، م. أمراض الرئة 13 )18.30%(، م. الطب الداخلي و م. طب األطفال 8 )11.26%(، م. طب األعصاب 4 )5.63%( و م. طب الجلد 1 )1.40%(. الكشف عن البيوفيلم تحقق على 50 ساللة huccua .l .حسب طريقة 'puoya q6borcupSh9uc' 34 )68%( ساللة قادرة على صنع البيوفيلم من بينها 20 )40%(، 10 )20%(، 4 )8%(، تعتبر بالترتيب ضعيفة ، متوسطة و قوية من حيث إنتاج البيوفيلم. بينما حسب طريقة 'hghc uggu cuugc ' ماعدا 10 )20%( من ال ّسالالت قادرة على إفراز ال'lSobc'. األربع سالالت القوية من حيث إنتاج البيوفيلم تم تمييزها ظاهريا و جينيا. هذه السالالت المعرفة بتقنية IFLAM-Fl SM تمتلك جينة fcbL وال تحتوي على جينة bcrL. جينة orh توجد عند األربع سالالت بنسبة إفراز جد معتبرة في فترة النمو األسي مقارنة بفترة النمو الثابت. هذه السالالت تحتوي أيضا على متعدد السكريات 'AIL'. تبين أن الزيوت الطيارة ل'gMA : FI 1-0.06( 'gSumuSua .g( هي األكثر فعالية ضد الجراثيم المدروسة بعدها تأتي rhpoyhyua. )gMA : FI 2-0.12( ثم gMA : FI 1-0.12( ufforoghSoa.o(. التّركيزات الدّنيا الموقفة إلنتاج البيوفيلم )FCI a( بال ّنسبة لل ّزيوت الطيارة المدروسة كانت كاألتي: ufforoghSoa.o' gMA 2-0.25 ،g'. gSumuSua' gMA 1-0.25' و rhpoyhyua. ' gMA 2-0.5'. أثبتت الدّراسة أ ّن ال ّزيوت الطيارة ممزوجة مع المط ّهر'oudic cpueodug' لها مفعول أفضل.

Titre : Etude de l’effet de trois huiles essentielles sur la formation de biofilm à Staphylococcus aureus responsable d’infections nosocomiales au C.H.U de Tlemcen

Résumé S’il est considéré comme pathogène majeur de l’homme, c’est par ce qu’il est impliqué dans 1 à 5% des infections communautaires et jusqu’à 30% des infections nosocomiales. Staphylococcus aureus ayant la capacité de former des biofilms sur des surfaces biotiques et abiotiques, est considérablement étudié de nos jours. Pendant une période d’étude de 30 mois, 362 cathéters prélevés sur des patients hospitalisés au CHU de Tlemcen ont été analysés. 71 souches de S. aureus ont été identifiées sur un nombre total de 240 Staphylococcus sp. Ces souches se répartissaient, par ordre décroissant, sur les services suivants : néonatologie 37 (52,11%), pneumologie 13 (18,30%), médecine interne et pédiatrie 8 (11,26%), Neurologie 4 (5,63%) et dermatologie 1 (1,40%). La détection du biofilm a été réalisée seulement sur 50 souches de S. aureus. Selon la méthode de microplaque 96 puits, 34 (68%) souches étaient biofilm positif dont 20 (40%), 10 (20%) et 4(8%) étaient faiblement adhérentes, modérément et fortement adhérentes, respectivement. Cependant, seulement 10 (20%) souches étaient susceptibles de produire le slime par la technique du rouge Congo agar (RCA). Les 4 souches fortement adhérentes ont été phénotypiquement et génotypiquement caractérisées. Ces souches, identifiées avec un bon score (> 2.300) par la technique MALDI-TOF MS et possédant le gène femA ont été dépourvues du gène mecA. Le gène ica était présent chez les 4 souches avec un taux d’expression plus haut pendant la phase de croissance exponentielle que pendant la phase stationnaire. Ainsi, l’adhésine intercellulaire polysaccharidique (PIA) était mis en évidence chez les 4 souches testées. Une meilleure activité antibactérienne a été attribuée à l’huile essentielle d’E. globulus (CMI : 0,06 à 1 g/L) suivie par T. capitatus (CMI : 0,12 à 2 g/L) puis R. officinalis (CMI : 0,12 à 1 g/L) contre la croissance planctonique des souches de S. aureus. Les concentrations minimales inhibitrices du biofilm (CMIBs) étaient de 0,25 à 1 g/L pour l’HE d’E. globulus, 0,25 à 2 g/L pour l’HE de R. officinalis et 0,5 à 2 g/L pour l’HE de T. capitatus contre la forme sessile de S. aureus. Un effet synergique a été constaté pour les trois HEs testées en combinaison avec la povidone iodée sur le biofilm de S. aureus avec des index de FIC < 0,5.

Title: Study of effect of three essential oils against formation of biofilm of Staphylococcus aureus responsible for nosocomial infections in the university hospital of Tlemcen. Summary If it is considered as a major pathogen of human, this is because it is involved in 1-5% of community infections and up to 30% of nosocomial infections. Staphylococcus aureus having the ability to form biofilms on biotic and abiotic surfaces is widely studied to date. During a 30-month study period, 362 catheters collected from hospitalized patients in University Hospital of Tlemcen were analyzed. 71 strains of S. aureus were identified out of a total of 240 Staphylococcus sp. These strains were distributed in descending order, in the following services: neonatology 37 (52,11%), Pneumology 13 (18,30%), internal medicine and pediatrics 8 (11,26%), Neurology 4 (5,63%) and dermatology 1 (1,40%). The detection of biofilm was made only on 50 strains of S. aureus. According to the method of 96-well microplate, 34 (68%) strains were biofilm positive which 20 (40%), 10 (20%) and 4 (8%) were weakly adherent, moderately and strongly adherent, respectively. However, only 10 (20%) strains were able to produce the slime by red Congo agar technique (RCA). the four strongly adherent strains were phenotypically and genotypically characterized. These strains identified with a good score (> 2,300) by MALDI-TOF MS and possessing the femA gene were lacking of the mecA gene. The ica gene was present in the four strains with more important expression levels during the exponential growth phase than it was during stationary phase. Thus, the polysaccharide intercellular adhesin (PIA) was detected in the 4 strains tested. The best antibacterial activity was attributed to the essential oil (EO) of E. globulus (MIC 0.06 to 1 g/L) followed by T. capitatus (MIC 0,12 to 2 g/L) and R. officinalis (MIC 0,12 to 1 g/L) against planktonic growth of S. aureus strains. The minimal biofilm inhibitory

concentrations (MBICs) were 0,25 to 1 g/L for EO of E. globulus, 0,25 to 2 g/L for EO of R. officinalis and 0,5 to 2 g/L for EO of T. capitatus against the sessile form of S. aureus. A synergistic effect was observed for the three EOs tested in combination with povidone iodine on the biofilm of S. aureus with FIC index values <0,5.