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[Tapez Le Titre Du Document] REPUPLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE ABOU BEKR BELKAID TLEMCEN FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE, [Tapez DESle SCIENCES titre DE LA duTERRE ETdocument] DE L’UNIVERS DEPARTEMENT DE BIOLOGIE [Tapez le sous-titre du document] Laboratoire de microbiologie appliquée à l’agroalimentaire, au biomédical et à l’environnement « LAMAABE » THÈSE Présentée En vue de l’obtention du diplôme de Doctorat en Biologie Option : Microbiologie Par Lotfi GHELLAI Étude de l’effet de trois huiles essentielles sur la formation de biofilm à Staphylococcus aureus responsable d’infections nosocomiales au C.H.U de Tlemcen Soutenue le 26/10/2016 devant le jury composé de : Présidente Boucherit-Otmani Zahia Professeur, Université Tlemcen Directrice de thèse Hassaine Hafida Professeur, Université Tlemcen Codirecteur de thèse Zingg Walter Professeur, Université Genève Examinateur Abdelouahid Djamel E Professeur, Université Tlemcen Examinateur Kahloula Khaled Maître de Conférences Université Saïda Année universitaire : 2016-2017 En tout premier lieu A mes chers parents pour leur amour…et leur soutien précieux pendant ces longues années de thèse. A mon épouse ZK pour sa patience et son amour. A mes frères et sœurs. A ma belle famille. A mes Amis frères, en particulier Abdelatif Bouabdelah, Ali Benachou, Ayoub Ougrine et Mohammed Bedi. A tous les membres du laboratoire LAMAABE. A tous mes collègues de l’Université. A tous ceux-ci qu’ils trouvent le témoignage de ma courtoise reconnaissance ‘Dans la vie il n’y a pas une possibilité pour rendre le possible impossible ! Mais il est possible que l’impossible d’aujourd’hui soit le possible de demain!’ Remerciements Je remercie Monsieur le Professeur Boumediène MOUSSA-BOUDJEMAA directeur du laboratoire LAMAABE de m’avoir permis de réaliser ce travail au sein du laboratoire. Mes remerciements s’adressent tout particulièrement à ma directrice de thèse, Madame le Professeur Hafida HASSAINE, de l’Université de Tlemcen, pour son encadrement constant et consciencieux, son engagement et son soutien, ses conseils précieux, dans un domaine aussi passionnant que porteur d’espoir ainsi que pour la pertinence de ses remarques. Je remercie sincèrement mon Codirecteur de thèse, Monsieur le Docteur Walter ZINGG, Service de Prévention et contrôle de l’Infection, Hôpitaux Universitaires de Genève (HUG), pour son soutien moral, son enthousiasme, sa gentillesse, ses conseils avisés et ses encouragements de tous les instants ainsi que pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et offert l’opportunité de progresser dans mes recherches. Je tiens à exprimer ma sincère gratitude à : Madame le Professeur Zahia BOUCHERIT OTMANI, de nous avoir honoré par sa présence en acceptant de présider le jury de cette thèse. Monsieur le Professeur Djamel ABDELWAHID d’avoir accepté, avec toute modestie, d’examiner mon travail de thèse. Monsieur le Docteur Khaled KAHLOULA d’avoir cordialement accepté d’être l’un des examinateurs de cette thèse. Je remercie également : Monsieur le Professeur William KELLEY, Directeur du laboratoire de Microbiologie et Médecine Moléculaire au Centre Médical Universitaire de Genève, de m’avoir accueilli dans son laboratoire. Madame le Docteur Adriana RENZONI pour son aide précieuse, pour sa sympathie exemplaire, son dévouement et son hospitalité. Mes sincères remerciements vont également à Messieurs les Professeurs : Stephan HARBARTH, Didier PITTET et Stéphane EMONET, à Monsieur le Docteur Abdessalam CHERKAOUI et à Monsieur l’Ingénieur Yves MARTIN. Finalement, Je remercie chaleureusement le personnel du CHU de Tlemcen, les membres du laboratoire LAMAABE, les membres du laboratoire de Microbiologie et médecine moléculaire du CMU Genève et toute l’équipe du service de prévention et contrôle de l’infection du HUG, Genève. Table des matières Introduction……………………………………………………………………………… 1 Partie I. Synthèse bibliographique……………………...…………………………........ 3 Chapitre I : Infections associées aux soins et S. aureus……………………………….….. 3 1. Infections associées aux soins………………………………………………………….. 3 1.1. Fréquence des infections associées aux soins………………………………………. 3 1.2. Gravité des infections associées aux soins………………………………………..... 4 1.3. Germes impliqués ………………………………………………………………….. 4 2. Staphylococcus aureus…………..……………….………………………….………… 4 2.1. Description……………………..…….…………………………………………...... 4 2.2. Taxinomie…………………...…..…..…………………………………...…….….... 5 2.3. Caractères physiologiques et culturaux……..…………...……………….……….... 6 2.4. Pouvoir pathogène de S. aureus…………………………...…….….……................ 7 2.5. S. aureus associé aux biofilms……………………………….…………………...… 9 2.6. Résistance de S. aureus associé au biofilm ……………………………...............… 9 Chapitre II : Organisation du biofilm chez S. aureus…………..…………………………. 11 1. Composants du biofilm à S. aureus…………………………………………………...... 11 1.1. Microorganisme…………..……………………………………………………….... 11 1.2. Matrice……………………………………………………………………………… 11 1.3. Surface……………………………………………………………………………… 12 2. Bases moléculaires de la formation du biofilm chez S. aureus sur implants médicaux.. 12 2.1. Adhésion aux surfaces abiotiques…………………………………………………... 14 2.1.1. Protéines de surface (Adhésines)……………………………………………… 14 2.1.1.1. MSCRAMM……………………………………………………………… 14 2.1.1.2. Autolysines……………………………………………………………….. 15 2.1.2. Acides teichoïques…………………………………………………………….. 15 2.2. Agrégation intercellulaire…………………………………………………………... 16 2.2.1. Adhésine Intercellulaire Polysaccharidique (PIA)…………………………….. 16 2.2.2. Protéine associée au biofilm (BAP)………………………………………….... 18 2.2.3. Protéines SasG et Pls…………………………………………………………... 18 2.3. Maturation et dispersion……………………………………………………………. 18 3. Communication intercellulaire au sein du biofilm……………………………………... 19 4. Régulation génétique du biofilm chez S. aureus…………………………………………..... 20 5. Lutte contre les biofilms à S. aureus associés aux dispositifs médicaux………………. 22 5.1. Modification de la surface des implants…………………………………………..... 22 5.2. Inhibition ou perturbation de la formation de biofilm……………………………… 23 5.2.1. Substances anti-biofilm………………………………………………………... 23 5.2.2. Quorum sensing……………………………………………………………….. 23 5.2.3. Traitement des biofilms préformés…………………………………………..... 23 Chapitre III : Huiles essentielles et biofilm à S. aureus………….……………………..… 25 1. Généralités sur les huiles essentielles………………………………………………..… 25 2. Composition chimique des huiles essentielles………………………………………..... 26 3. Mode d’action des huiles essentielles………………………………………………...... 28 Partie II. Matériel et Méthodes………………………………....................................... 30 1. Lieu d’étude………………………………..................................................................... 30 2. Prélèvements……………………………………………................................................ 30 3. Ensemencement et isolement………………………………........................................... 30 4. Identification des souches………………………………................................................ 30 4.1. Production de catalase …………………................................................................. 31 4.2. Oxydase………………………………....………………………………................ 31 4.3. Test de Coagulase………………………………....………………………………. 31 4.4. Galerie API 20 STAPH………………………………....………………………… 31 5. Conservation des souches………………………………....…………………………… 31 6. Détection de la production de biofilm chez les souches isolées……………………….. 32 6.1. Méthode de microplaque 96 puits……………………………….......................... 32 6.1.1. Classification des souches selon leur pouvoir adhérent……………………. 33 6.2. Détection de la production de slime sur milieu rouge Congo……………………. 33 6.3. Identification moléculaire des souches hautement adhérentes …………………… 34 6.3.1. Test d’agglutination au latex Pastorex Staph-Plus…………………………. 34 6.3.2. MALDI-TOF MS………………………………....………………………... 35 6.3.3. Recherche du gène femA………………………………................................ 36 7. Etude de l’Antibiorésistance chez les souches de S. aureus…………………………… 36 7.1. Antibiogramme………………………………....………………………………..... 36 7.2. Recherche du gène mecA ………………………………......................................... 37 8. Etude de l’expression de l’opéron ica (intercellular adhesion locus) chez les souches hautement adhérentes………………………………....………………………………....... 38 8.1. Etablissement des courbes de croissance………………………………................. 38 8.2. Procédure d’extraction de l’ARN total ………………………………................... 38 8.2.1. kit RNeasy Plus Mini………………………………..................................... 39 8.2.2. Préparation des suspensions bactériennes………………………………...... 39 8.2.3. Extraction d’ARN……………………………….......................................... 40 8.2.4. Mesure de la quantité d’ARN extraite………………………………............ 40 8.3. PCR en temps réel (méthode TaqMan)……………………………….................... 41 8.3.1. Kit Eurogentec RT-QP2X-03………………………………......................... 42 8.3.2. Procédure de la PCR en temps réel………………………………................ 44 8.4. PCR inverse en temps réel………………………………....……………………… 44 8.4.1. kit Invitrogen Cat no. 11731-023………………………………................... 44 8.4.2. Procédure de la QRT-PCR en temps réel………………………………....... 47 9. Detection du PIA par Dot Blotting ……………………………….................................. 47 10. Etude de l’effet des huiles essentielles et de la povidone iodée vis-à-vis de S. aureus 49 10.1. Matériel végétal………………………………....……………………………….. 49 10.1.1. Eucalyptus globulus………………………………....……………………. 49 10.1.2. Rosmarinus officinalis………………………………....………………….. 50 10.1.3. Thymus capitatus………………………………....……………………….
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