2. Vakcíny a Vakcinace

MASARYKOVA UNIVERZITA

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

ÚSTAV BIOCHEMIE

Bakalářská práce

Brno 2015 Karolína Snížková

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE

MOŽNOSTI VAKCINACE

V BOJI PROTI PARAZITÁRNÍM

ONEMOCNĚNÍM Bakalářská práce Karolína Snížková

Vedoucí práce: RNDr. Martin Kašný, Ph.D. Brno 2015

Bibliografický záznam

Autor: Karolína Snížková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie

Název práce: Možnosti vakcinace v boji proti parazitárním onemocněním

Studijní program: Biochemie

Studijní obor: Biochemie

Vedoucí práce: RNDr. Martin Kašný, Ph.D.

Akademický rok: 2014/2015

Počet stran: 56

Klíčová slova: vakcíny, imunologie, helminti, peptidová (epitopová) vakcína, coupling peptidů na nosič, ELISA, imunoblot

Bibliographic Entry

Author: Karolína Snížková Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry

Title of Thesis: The possibilities of vaccination against the infections caused by parasites

Degree Programme: Biochemistry

Field of Study: Biochemistry

Supervisor: RNDr. Martin Kašný, Ph.D.

Academic Year: 2014/2015

Number of Pages: 56

Keywords: vaccines, immunology, helminths, peptide (epitope) vaccine, coupling peptides to carrier, ELISA, immunoblot

Abstrakt

Tato bakalářská práce pojednává o charakterizaci a průběhu vývoje vakcinačních látek až po současné výzkumy týkajících se především syntetických vakcín. Tyto vakcíny by představovaly vhodné prostředky pro kontrolu infekcí způsobených helminty (helmintózy). Jedná se o mnohobuněčné parazity cizopasící v obratlovcích, kteří tak mají negativní dopad pro člověka z hlediska medicíny i produkčních ztrát v hospodářství. Předmětem experimentální části je syntéza multi-epitopové molekuly, která by mohla fungovat jako imunizační agens. Jako experimentální organismy posloužila hlístice Trichinella spiralis a motolice Trichobilharzia szidati. Peptidy pocházející z vybraných exkrečně-sekrečních produktů sloužily jako antigenní epitopy, které byly navázány na poly-L-lysinové jádro. Výsledný produkt byl na závěr testován pomocí imunologických metod ELISA a imunoblot.

Abstract

This bachelor thesis discusses the characterization and process of development of vaccines to the current researches related mainly to synthetic vaccines. These vaccines would present a suitable remedy to control infections caused by helminths (helminthoses). These are multi-celled parasites of vertebrates, which have a negative impact on human in meaning of medicine and economical production looses. The subject of the experimental part is the synthesis of a multi-epitope molecule, which could act as an immunizing agent. As experimental organisms were used nematode Trichinella spiralis and fluke Trichobilharzia szidati. Peptides from selected excretory-secretory products were used as antigenic epitopes that were coupled to poly-L-lysine core. Resulting product was finally tested using immunological methods ELISA and immunoblot.

Poděkování

Na tomto místě bych ráda poděkovala zejména vedoucímu mé bakalářské práce RNDr. Martinu Kašnému, Ph.D. za vedení, cenné rady, trpělivost a veškerý čas, který mi věnoval při odborných konzultacích a vypracovávání této práce. Dále děkuji Bc. Michaele Chmelíkové za ochotu a seznámení s prací v laboratoři.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci na téma „Možnosti vakcinace v boji proti parazitárním onemocněním“ vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 12. května 2015 …………………………………… Karolína Snížková__ -__

Obsah

1. Úvod ...... 9

2. Vakcíny a vakcinace ...... 10

2.1. Co je to vakcína? ...... 10 2.2. Význam vakcinace ...... 10 2.3. Historie ...... 11 2.4. Současnost ...... 14 2.5. Imunologie ...... 15 2.5.1. Mechanismy imunitního systému ...... 15 2.5.2. Složky imunitního systému ...... 16 2.5.3. Základní průběh imunitní reakce ...... 19

2.6. Role očkovacích látek v imunizaci ...... 20 2.7. Rozdělení vakcín dle typu antigenu ...... 22 2.8. Rozdělení vakcín dle počtu druhů antigenů ...... 24

3. Helminti ...... 25

3.1. Taxonomické zařazení a význam ...... 25 3.2. Interakce parazit-hostitel z pohledu imunologie ...... 25 3.2.1. Antigeny helmintů ...... 26 3.2.2. Imunomodulační schopnosti helmintů ...... 27

3.3. Komerčně dostupné vakcíny proti helmintům ...... 29

4. Syntéza vakcíny proti helmintům ...... 31

4.1. Peptidová (epitopová) vakcína ...... 31 4.2. Vývoj peptidové vakcíny ...... 32 4.2.1. Identifikace a výběr antigenních determinant ...... 32 4.2.2. Chemická syntéza antigenů a konjugace na nosič ...... 34

4.3. Testování vakcíny ...... 36

5. Experimentální část...... 37

5.1. Materiály a metodika ...... 37 5.1.1. Coupling peptidů na poly-L-lysin...... 38 5.1.2. 1-D elektroforéza ...... 39 7

5.1.3. ELISA ...... 40 5.1.4. Imunoblot ...... 42

5.2. Výsledky a diskuze ...... 43 5.2.1. Hydropathicity plot ...... 43 5.2.2. 1-D elektroforéza a hmotnostní spektrometrie ...... 47 5.2.3. ELISA ...... 48 5.2.4. Imunoblot ...... 49

6. Závěr ...... 51

7. Použitá literatura...... 52

8. Internetové zdroje ...... 56

1. Úvod

Infekce helminty (helmintózy) stále spadají mezi celosvětově rozšířená a běžná onemocnění. Je odhadováno, že je infikována přibližně jedna třetina celkové světové populace, přičemž nejčastější a nejzávažnější případy jsou pozorovány v chudých rozvojových oblastech, jako je subsaharská Afrika nebo jižní Asie. Význam pro člověka mají helmintózy také v souvislosti s hospodářstvím, protože infikovaná zvířata představují mnohdy vysoké produkční ztráty. Možnosti kontroly infekcí způsobených helminty jsou však stále nedostatečné. Běžně jsou využívány především antihelminitika jako například albendazol, oxamniquine, praziquantel nebo ivermektin (Hotez a kol., 2008). Avšak léčba chemoterapií má často omezenou účinnost, a po nějaké době po léčbě může dojít k reinfekci. Další pozorovanou hrozbou je vznik tolerance parazitů na tato léčiva – rezistence, jejichž účinek se tímto výrazně snižuje. Vhodné řešení těchto komplikací v terapii by mohla představovat vakcinace.

Hlavní cíl práce: V navržené práci by měly být utříděny dosavadní poznatky související s vývojem vakcín proti parazitárním onemocněním.

Dílčí cíle této práce jsou: 1. Zpracovat dostupnou literaturu zaměřenou na vývoj a testování různých vakcinačních látek využitelných v boji s parazitárními organismy se zaměřením na helminty.

2. Na základě literárních údajů se pokusit definovat potenciál jednotlivých vakcín, zejména syntetických a způsoby jejich přípravy.

3. Pokusit se připravit syntetickou multi-antigenní molekulu na základě znalostí sekvencí dominantních antigenů vybraného druhu parazita.

2. Vakcíny a vakcinace

2.1. Co je to vakcína?

Vakcína neboli očkovací látka je přípravek, jehož cílem je zvýšení odolnosti organismu proti konkrétnímu onemocnění aktivací účinné protektivní imunity, kterou je možné zajistit např. inokulací oslabené nebo usmrcené, a tedy nepatogenní, ale stále imunogenní složky patogenu. Tímto se v organizmu stimuluje imunitní odpověď, kdy je patogen rozpoznán a následně eliminován. V rámci imunitního systému poté zůstávají zachovány vytvořené protilátky a speciální buňky imunitního systému pro případ opětovného setkání s patogenem. Očkovací látka může být použita k prevenci klinických příznaků daného onemocnění u konkrétního jedince nebo jejím prostřednictvím lze dosáhnout kontroly či eliminace onemocnění na úrovni populace.

2.2. Význam vakcinace

Jelikož v minulosti vakcinace stála za záchranou mnoha životů, dal by se objev očkovacích látek považovat za jeden z nevýznamnějších úspěchů v historii medicíny. Avšak v současnosti se stále častěji objevuje otázka, zda očkovat či neočkovat (Friedman, 2014). V souvislosti s touto otázkou je nutné zmínit pojem tzv. kolektivní imunita, kdy se při proočkování dostatečně vysokého procenta populace (při plné protektivní účinnosti vakcíny), sníží procento přenosu infekce i na neočkované jedince (Vavrečka, 2013). Příkladem vlivu očkování na kolektivní imunitu může být v současnosti pozorovaný nárůst onemocnění spalničkami v USA. V roce 1993 zde byla zahájena třetí a již úspěšná kampaň eliminace spalniček, díky níž byla tato vysoce nakažlivá nemoc od roku 2000 považována za eradikovanou (Orenstein a kol., 2004; Friedman, 2014). Avšak v posledních letech, zejména v roce 2014, byl zaznamenán velký nárůst nakažených (viz graf 1.). Tento fakt je odůvodňován cirkulací viru spalniček v jiných zemích a dále právě negativním přístupem veřejnosti k očkování proti spalničkám, což vede právě k poklesu kolektivní imunity (Orenstein a kol., 2014).

Graf 1. Počet nakažených spalničkami ve Spojených Státech v letech 1994-2014 (Orenstein a kol., 2014; upraveno)

2.3. Historie

Pokusy bránit lidskou populaci před infekčními onemocněními pomocí vakcinace mají kořeny pravděpodobně již ve starověké Číně. V tehdejší době za četnou úmrtností stála epidemie černých neboli pravých neštovic. Čínští léčitelé si všimli, že ti, kteří infekci prodělali, jí již podruhé nepodlehli, byli vůči ní imunní. Na základě tohoto poznatku začali provádět primitivní očkování (dnes nazývané variolizace) tak, že do nosu nebo otevřené rány sypali sušený hnis z puchýřů způsobených neštovicemi (Beran a kol., 2005). Jednalo se o riskantní očkování, jelikož živý a plně virulentní vir neštovic mohl zapříčinit infekčnost pacienta a tedy snadné šíření nemoci a následně i smrt (Plotkin, 2005; Fenner, 1988). První patřičně dokumentovanou vakcinaci prováděla anglická spisovatelka Mary Wortley Montagu (Beran a kol., 2005). Své poznatky o očkování z cest začala uplatňovat v roce 1721. Již zmíněnou metodu záměrného nakažení nechala aplikovat na své dceři, která se tak stala první úspěšně naočkovanou osobou v Anglii. Veřejnost její metody nejprve odmítala, ale s vypuknutím epidemie postupně získaly postupy Mary Montagu plnou podporu. Ačkoliv si samotné očkování díky své riskantnosti vyžádalo několik obětí, oproti obětem epidemie byly počty takových úmrtí minimální a metoda byla dále využívána téměř do konce 18. století (Grundy, 2000).

S bezpečnou alternativou očkování proti černým neštovicím přišel britský lékař Edward Jenner, který je dnes považován za objevitele očkování (Beran a Havlík, 2008). V druhé polovině 18. století si všiml, že lidé, kteří pracují s dobytkem a kteří prodělali kravské neštovice, jsou povětšinou imunní vůči pravým neštovicím. Místo prášku ze strupů pravých neštovic tedy použil prášek z kravských neštovic. V květnu 1796 byl takto naočkován první pacient osmiletý chlapec James Phipps. Úspěch potvrdila chlapcova odolnost vůči pravým neštovicím při jeho vystavení této nemoci již po několika týdnech. Studii související s tímto Jenner publikoval roku 1798. V této průlomové práci také poprvé použil latinský termín „vacca“ (kráva) ze kterého pochází název vakcína (Baxby, 1999; Beran a kol., 2005). Rozvoj dalších imunizačních metod musel počkat na vývoj vhodných laboratorních technik. O další významný pokrok ve vakcinaci se zasloužil až na konci 19. století francouzský vědec Louis Pasteur. Jedním z Pasteurových okruhů vědeckého zájmu byla drůbež napadená cholerou. Náhodou si všiml, že kultury drůbeží cholery po nějakém čase stání ztrácejí schopnost způsobovat nemoc a zkusil těmito kulturami infikovat kuřata. Při opětovné infikaci plně virulentním kmenem cholery zjistil, že kuřata jsou vůči této nemoci imunní (Ullmann, 2007; Plotkin, 2005). Na základě tohoto poznatku vyvinul metodu kultivace, kdy nechával mikroby vystavené atmosférickému kyslíku po dobu 2-3 měsíců, čímž se snížila jejich virulence (Plotkin, 2014). Pasteur tedy dokázal uměle připravit oslabené formy původce nemoci. Následně se Pasteur zaměřil na očkování proti anthraxu. V roce 1877 použil stejnou metodu vytvoření oslabené vakcíny jako u cholery, čímž dokázal, že tato metoda lze aplikovat i na další infekční původce (Smith, 2012). Vrcholem jeho studia v odvětví imunologie byla příprava vakcíny proti vzteklině v roce 1881. Pasteur tímto virem záměrně infikoval králíky a jejich zasaženou nervovou tkáň následně vysušil, čímž získal oslabený kmen připravený k očkování lidí. V roce 1885 již byl postexpozičně naočkován první pacient (Beran a Havlík, 2008).

Tabulka 1. Přehled vybraných Pasteurových prací (Smith, 2012) „Sur les maladies virulentes, et en particulier sur la maladie appelee vulgairement cholera des poules“ O zhoubném onemocnění, zejména o onemocnění zvaném cholera drůbeže (publikováno 1880)

„Compte rendu sommaire des experiences faites a Pouilly-Le-Fort, pres de Melun, sur la vaccination charbonneuse“ Záznamy o experimentech očkování proti anthraxu (publikováno 1881)

„De l’attenuation des virus et de leur retour a la virulence“ Zeslabení virulence viru a opětovný návrat k virulenci (publikováno 1881)

„Methode pour prevenir la rage apres morsure“ Metoda postexpozičního zabránění vzteklině (publikováno 1885)

Pasteurovy průlomové postupy při přípravách vakcín přinesly v následujících letech mnoho dalších vakcín. Historický přehled vývoje některých vakcín od konce 19. století uvádí tabulka 2.

Tabulka 2. Přehled historie vývoje vybraných vakcín (Parthasarathy, 2006; upraveno) Onemocnění Rok Objevitel cholera 1892 Waldemar Haffkine tyfus 1896 Almroth E. Wright TBC 1921 Albert Calmette, Camille Guérin černý kašel 1923 Thorvald Madsen tetanus 1927 Gaston Ramon, Christian Zoller žlutá zimnice 1932 Andrew Sellard, Jean Laigret dětská obrna 1957 Albert Sabin spalničky 1960 Anton Schwarz zarděnky 1962 Thomas H. Weller, F. A. Neva, Paul D. Parkman příušnice 1966 Robert Weibel, Eugene Buynach, Maurice Hilleman meningitida C 1968 Emil C. Gotschlich meningitida A 1971 Emil C. Gotschlich

2.4. Současnost

7. dubna 1948 byla založena Světová zdravotnická organizace WHO (World Health Organization), jejíž snahy směřují ke zvýšení zdravotního standardu celosvětové populace. Jedním z poslání této organizace je i nástin strategických cílů souvisejících s eradikací různých onemocnění. Ve vakcinologii to jsou například především urychlené zavádění očkovacích látek do praxe a garance bezpečnosti imunizace. Aby komerční vakcíny splňovaly náročné podmínky bezpečnosti a účinnosti, jsou většinou nezbytné dlouholeté studie v rámci, jak veterinární, tak i humánní medicíny. Především u humánních vakcín je nutné splnit stále přísnější kritéria, a proto se v posledních letech zvyšují náklady na jejich vývoj a výrobu. Tento fakt má za následek vysokou cenu jedné dávky vakcíny a tedy často i její nedostupnost, zejména v rozvojových zemích. Všeobecnou dostupnost vakcinačních látek se snaží řešit aliance, která roku 2000 vznikla právě pod záštitou WHO pod zkratkou GAVI (Global Alliance on Vaccines and Immunisation) (Beran a kol., 2005).

Co se týče současného výzkumu očkovacích látek, jsou díky nedávnému rozvoji genového inženýrství, genomiky a proteomiky zkoumány stovky potenciálních vakcín. Stále totiž existuje mnoho onemocnění, kterým se nedokážeme bránit. Mezi nejaktuálnější zkoumané vakcíny patří například ty proti AIDS nebo malárii.

2.5. Imunologie

Pro pochopení funkce očkovacích látek je třeba přiblížit, jak funguje imunitní systém. Ten můžeme definovat jako souhrn buněk, tkání a molekul, které zprostředkovávají odolnost proti infekčním nemocím a koordinované reakce těchto buněk a molekul na patogeny zprostředkovávají imunitní odpověď (Abbas a kol, 2012). Imunitní systém tedy stojí za obranyschopností organismu. Umožňuje rozpoznávat jak antigeny z okolního prostředí organismu, tak i antigeny vznikající uvnitř něj (například mutací buněk nebo metabolizací různých látek). Složky imunitního systému jsou také schopné tyto antigeny eliminovat. Důležitá je i autotolerance imunitního systému, díky níž imunitní systém rozpoznává vlastní tkáně a udržuje vůči nim toleranci (Hořejší a Bartůňková, 2005).

2.5.1. Mechanismy imunitního systému

Imunitního systém lze podle mechanismů rozčlenit na dvě základní kategorie, které na sebe navazují a kooperují spolu.

2.5.1.1. Nespecifická imunita

Nespecifická imunita se nazývá také přirozená imunita, což odkazuje na skutečnost, že tento typ obrany organismus vlastní již od počátku svého života. Nespecifická imunita je evolučně starší než specifická imunita, působí rychle (v řádech minut) a je první obrannou linií při setkání organismu s patogenem. Již povrch těla a povrchy sliznic fungují jako bariéra a brání vstupu patogenu do organismu, například díky pohybu řasinek na sliznicích, kyselému pH kůže nebo přirozené mikroflóře ve střevě. Pokud se patogenu do organismu podaří vniknout, nastoupí na řadu nespecifické buněčné systémy, jimiž jsou fagocytující buňky a NK buňky (natural killer) a humorální nespecifické systémy tvořené komplementem a sérovými proteiny (Hořejší a Bartůňková, 2005; Beran a kol., 2005; Abbas a kol, 2012).

2.5.1.2. Specifická imunita

Na rozdíl od nespecifické imunity, je stimulována až po setkání s patogenem, takže se tento typ obrany získává a formuje až v průběhu života. Je evolučně mladší a působí pomaleji v řádech hodin až dnů. Důležitými vlastnostmi této imunity jsou specifita a imunologická paměť v podobě mnoha individuálních paměťových buněk s receptory specifickými pro různé antigeny. Imunologická paměť organismu usnadňuje obranu proti patogenům, se kterými se již v minulosti setkal a je tedy připraven v případě opětovného setkání s patogenem pohotově zahájit imunitní reakci, která je rychlejší a efektivnější (Hořejší a Bartůňková, 2005; Abbas a kol, 2012).

2.5.2. Složky imunitního systému

2.5.2.1. Buněčná složka

Největší procento buněk imunitního systému je zastoupeno leukocyty (bílými krvinkami). Ty jsou dle funkce a vzhledu členěny na několik typů, avšak všechny se tvoří ze stejných pluripotentních kmenových buněk. V organizmu lze nalézt granulocytární neutrofily, eosinofily a bazofily a agranulocytární monocyty a lymfocyty. Hlavní funkcí neutrofilů je fagocytóza malých cizorodých částic a buněk, účinné jsou především po opsonizaci1 patogenu (Zabriskie, 2009). Eosinofily se také podílejí na fagocytóze a jsou aktivní při zánětu. Tkáňovou formou bazofilů jsou mastocyty (žírné buňky). Granulocyty (především eosinofily a bazofily) se aktivně podílejí při napadení organismu parazitem (Issouf a kol., 2014). Monocyty se diferencují buď v makrofágy, nebo v dendritické buňky. Makrofágy dokáží fagocytovat větší částice nebo buňky a dendritické buňky představují významné antigen prezentující buňky (APC). Snad nejdůležitější buňky imunitního systému jsou lymfocyty. Jsou to jediné buňky, které mají specifické receptory pro antigeny a jsou tedy mediátory specifické imunity. Podle místa tvorby rozlišujeme B-lymfocyty, které se tvoří v kostní dřeni a T-lymfocyty, tvořící se v brzlíku. Buněčná imunita je zprostředkovávána hlavně T-lymfocyty. Ty mají na svém povrchu antigenně specifické receptory CD8, které vážou MHC glykoproteiny I. třídy nebo receptory CD4, které vážou MHC glykoproteiny II. třídy (MHC gp jsou u lidí označovány jako HLA). Dle receptoru rozlišujeme dále pomocné T-lymfocyty TH (afinita k MHC II) a cytotoxické T- lymfocyty TC (afinita k MHC I). Pomocné TH buňky produkcí cytokinů směřují imunitní odpověď dvěma směry. TH1-lymfocyty bojují proti intracelulárním antigenům, mobilizují makrofágy a zajišťují eliminaci původců těchto antigenů. TH2-lymfocyty směřují imunitní reakci

1 Zvýšení účinnosti fagocytózy. 16 proti extracelulárním antigenům (většina antigenů) a aktivují protilátkovou odpověď tím, že napomáhají stimulaci B-lymfocytů. Úkolem TC-lymfocytů je likvidace buněk a z části těchto lymfocytů se později stanou paměťové buňky. Existují i lymfocyty, které likvidují vlastní poškozené buňky (například napadené virem), nazýváme je přirození zabíječi (natural killer, NK buňky). Z pluripotentních kmenových buněk vznikají také erytrocyty (červené krvinky) a trombocyty (krevní destičky), které se též účastní některých mechanismů imunitního systému, avšak jejich primární funkce je jiná (Hořejší a Bartůňková, 2005; Beran a kol., 2005; Abbas a kol, 2012).

Obrázek 1. Diferenciace leukocytů (Zabriskie, 2009; upraveno)

2.5.2.2. Humorální složka

Kromě imunitních buněk se do imunitní reakce zapojují i humorální látky. Důležité humorální látky imunitního systému jsou především imunoglobuliny (protilátky). Jediné buňky, které jsou schopné protilátky produkovat, jsou B-lymfocyty. Ty musí být nejprve stimulovány k namnožení a diferenciaci v efektory zvané plazmatické buňky a ty až produkují příslušné protilátky. Později se z nich stávají paměťové buňky. Na rozdíl od T-lymfocytů, které rozpoznávají jen proteinové antigeny, jsou protilátky B-lymfocytů schopny rozpoznat mnoho typů molekul, včetně proteinů, sacharidů a lipidů. 17

Protilátky jsou bílkoviny s různou antigenní specifitou a jejich funkce je především deaktivace a eliminace extracelulárních mikrobů a jejich toxinů (Abbas a kol, 2012). Rozlišujeme 5 tříd imunoglobulinů: IgM, IgD, IgG, IgA a IgE.

Tabulka 3. Třídy imunoglobulinů a jejich vlastnosti (Zabriskie, 2009; Beran a kol., 2005)  Při imunitní reakci se tvoří jako první IgM  Intravaskulární neutralizace mikroorganismů  Poměrně velká molekula

 V séru se vyskytuje v malém množství IgD  Slabá protilátková aktivita

 Nejhojnější protilátka, hlavně při sekundární odpovědi  Existují podtřídy IgG1-IgG4 IgG  Menší molekula, snadno projde do tkání  Jediná protilátka imunizující plod skrz placentu

 Vyskytuje se v slizniční a sérové formě IgA  Existují podtřídy IgA1 a IgA2

 V séru se vyskytuje v malém množství IgE  Obrana proti mnohobuněčným parazitům  Příčina alergických reakcí

Při rozeznání patogenu v organismu se aktivuje také komplementový systém. Komplement je systém asi 30-ti plazmatických proteinových prekurzorů, které mezi sebou vzájemně reagují. Jejich hlavním úkolem je opsonizace patogenu, lýze patogenu a chemotaktická indukce zánětlivé reakce. Imunitní reakce je regulována tkáňovými hormony cytokiny (např. interleukiny, chemokiny). Jsou produkovány buňkami imunitního systému a mohou stimulovat nebo inhibovat imunitní reakce. Tvoří tak komplexní regulační systém nazývaný cytokinová síť (Hořejší a Bartůňková, 2005; Zabriskie, 2009).

Obrázek 2. Schéma zobrazující humorální a buněčnou složku imunitního systému (Abbas a kol, 2012; upraveno)

2.5.3. Základní průběh imunitní reakce

Při setkání organismu s antigenem se tedy nejprve uplatňují mechanismy nespecifické imunitní odpovědi. Poté, co antigen překoná základní bariéry a dostane se do organismu, je rozpoznán fagocytujícími buňkami, které se snaží antigen pohltit a zlikvidovat. Dále je iniciována zánětlivá reakce, kdy dochází ke změnám v krevním a lymfatickém oběhu, aktivaci komplementového systému, mobilizaci fagocytů, zvýšené teplotě a podobně. Přirozená imunita někdy může účinně bojovat proti infekcím, avšak mnoho patogenních mikroorganismů dokáže těmto nespecifickým mechanismům odolávat. Jejich likvidace je tedy na mechanismech specifické imunity. Antigeny jsou vychytávány antigen prezentujícími buňkami, které jsou v organismu strategicky rozmístěny tak, aby na antigen narazily, navázaly ho a následně se přemístili do sekundárních lymfatických orgánů, aby patogen prezentovaly buňkám specifické imunity T-lymfocytům a B-lymfocytům, které následně plní své funkce k likvidaci patogenu. Poté některé stimulované lymfocyty umírají (apoptóza) a některé se mění v paměťové buňky. 19

Doba trvání imunitní reakce se může lišit v závislosti na druhu patogenu. Obrázek 3. zobrazuje průběh specifické imunitní reakce, kde osa x zobrazuje orientační dobu trvání této imunitní reakce v řádech hodin až dnů (Abbas a kol, 2012).

Obrázek 3. Průběh specifické imunitní reakce (Abbas a kol, 2012; upraveno)

2.6. Role očkovacích látek v imunizaci

Imunizace je členěna na pasivní a aktivní. Pasivní imunizace je důsledkem převedení již vytvořených protilátek na neimunizovaného jedince. Typickým příkladem je převod protilátek matky na dítě prostřednictvím placenty nebo mateřského mléka (Abbas a kol, 2012). Aktivní imunizace nastane, když je neimunizovaný jedinec vystaven přímo patogenu a protilátky poté vytvoří jeho imunitní systém. Na rozdíl od pasivní imunizace vyvolává aktivní imunizace dlouhodobou imunitu (Clem, 2011). Jak pasivní, tak i aktivní imunizace může být způsobena přirozenou nebo umělou cestou. Nejčastějším případem umělé aktivní imunizace je právě očkování. Aby byla v organismu pomocí očkování navozena imunizace, musí být nejprve rozpoznány antigeny obsažené v očkovací látce. Před tím než antigen prezentující buňky aktivují klonální expanzi lymfocytů a následné vytvoření efektorových a paměťových buněk, musejí být 20 antigeny antigen prezentujícími buňkami zachyceny. Pro zlepšení nejen zachytávání antigenů, ale i celkové imunitní odpovědi se v očkovacích látkách používají tzv. adjuvancia. Přesný mechanismus účinku většiny těchto látek však není doposud plně poznán. Jedním z předpokládaných mechanismů je udržování antigenů v blízkosti vpichu vakcíny, aby je snadno nalezly buňky imunitního systému (NCIRS, 2013). Příkladem používaných adjuvancií je Freundovo adjuvans, což je emulze minerálních olejů, která pravděpodobně napomáhá právě pohlcování antigenů dendritickými buňkami. V humánních vakcínách se nejčastěji jako adjuvans používají hlinité soli, konkrétně hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a síran draselno-hlinitý (kamenec) (Offit a Jew, 2003; Hořejší a Bartůňková, 2005). Nedávná studie ukázala, že funkce vakcíny velmi závisí také právě na zvoleném adjuvantním prostředku. V souvislosti s helminty byly v práci Piedrafita a kol. (2013) porovnávány tři adjuvans, fosforečnan hlinitý, DEAE-dextran a Quil A, kdy byla u druhého prokázána nejvyšší účinnost vakcíny proti Haemonchus contortus.

Tabulka 4. Příklady adjuvantních prostředků v humánní medicíně (Rappuoli a kol., 2011) Název (rok Třída Složky udělení licence) Alum (1924) minerální sůl fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý MF59 (1997) emulze oleje ve vodě skvalen, polysorbát 80, sorbitan-trioleát AS03 (2009) emulze oleje ve vodě skvalen, α-tokoferol, Tween 80 Virosomes (2000) liposom lipidy, hemaglutininy AS04 (2005) minerální sůl hydroxid hlinitý, MPL (monofosforyl lipid A)

Kromě antigenů a adjuvancií často očkovací látky obsahují i složky, které se na vytvoření protektivní imunity podílí jen nepřímo. Těmito látkami jsou stabilizátory a konzervační prostředky. Jelikož použití závisí na typu vakcíny, způsobu jejího podání a mnoha dalších parametrech, existuje obrovská škála všech těchto látek. Stabilizátory by měly zajišťovat stálost vakcíny od její výroby až po aplikaci pacientovi. Příkladem stabilizátorů jsou laktóza a sacharóza, glycin a glutamát sodný a lidský nebo hovězí sérový albumin (NCIRS, 2013). Aby se zabránilo jakékoliv kontaminaci vakcíny i po otevření původního obalu, přidávají se do některých vakcín konzervační látky. Často používanou konzervační látkou je thiomersal, což je organická sloučenina obsahující rtuť. Dále vakcíny mohou obsahovat stopová množství antibiotik, jako například neomycin nebo streptomycin (Offit a Jew, 2003). Například chřipkové 21 vakcíny obsahují vaječné bílkoviny, jako pozůstatek po kultivaci. Stopově se mohou objevit také inaktivační látky jako například formaldehyd (Eldred a kol., 2006). Některé látky obsažené ve vakcínách jsou důvodem obav veřejnosti z vakcín. Bylo zjištěno, že u dětí dochází k nízké kumulaci rtuti při podání vakcín s thiomersalem a ačkoliv dosud nebylo dokázáno, že hladina rtuti ve vakcínách je škodlivá, byl thiomersal v rámci zachování důvěry ve většinu dětských vakcín odstraněn. Často diskutované jsou také hlinité soli, výjimečně totiž mohou v místě vpichu vznikat lokální zarudnutí a podkožní granulomy. Přestože někteří pacienti mohou být na některé složky alergičtí, nebylo doposud dokázáno, že jsou takové očkovací látky nebezpečné (Offit a Jew, 2003).

2.7. Rozdělení vakcín dle typu antigenu

Imunologické dělení vakcín podle typu antigenu v závislosti na jeho původu a zpracování, shrnuje tabulka 5.

Tabulka 5. Dělení vakcín dle typu antigenu (Beran a kol., 2005; upraveno) Vakcína Příklady infekcí živá oslabená (atenuovaná) příušnice, spalničky, tuberkulóza, dětská obrna inaktivovaná cholera, vzteklina, virová hepatitida A toxoid záškrt, tetanus subjednotková chřipka syntetická virová hepatitida B

Živé oslabené (atenuované) vakcíny vznikají oslabením virulence přirozených původců onemocnění. Vytvořit takovou vakcínu z bakteriální kultury je složitější než z kultur virů, protože mají více genů a je složitější je kontrolovat. Atenuované vakcíny vyvolávají silnou imunitní odpověď a dlouhodobou imunologickou paměť bez klinických příznaků a zpravidla tedy stačí jedna nebo dvě dávky. Nevýhodou je však to, že se někdy mohou nepatogenní organismy obsažené ve vakcíně změnit zpět v patogenní a vyvolat tak onemocnění. Další nevýhodou je nutnost skladování v chladu a při krátkodobém porušení chladového řetězce může vakcína ztratit antigenní charakter. Příkladem dnes užívaných živých oslabených vakcín je vakcína proti tuberkulóze nazývaná BCG (bacille Calmette–Guérin), připravená oslabením bakterie Mycobacterium bovis, která je původcem tuberkulózy skotu, a navozuje u člověka

22 imunitu proti tuberkulóze způsobovanou bakterií Mycobacterium tuberculosis (Venkataswamy a kol., 2012). Inaktivované vakcíny obsahují celé viry nebo bakterie, které byly usmrceny, aby nebyly schopné rozmnožování a vyvolávání infekce. Aby byly schopné stále stimulovat tvorbu protilátek, musí mít zachovány své antigenní determinanty. Oproti atenuovaným vakcínám jsou ty inaktivované považovány za bezpečnější a lépe se skladují. Vyvolávají ale slabší imunitní reakci a je tedy třeba více dávek. Jelikož obsahují i antigeny nepotřebné k navození ochrany, mohou vyvolávat nechtěné vedlejší účinky, jako je zarudnutí nebo horečka. Jednou ze současně používaných inaktivovaných celobuněčných vakcín je vakcína proti černému kašli. Ta obsahuje suspenzi bakterií Bordetella pertussis, které byly inaktivovány formaldehydem (WHO, 2005). Toxoidy jsou toxiny vyprodukované bakteriemi, které byly fyzikálně nebo chemicky zbaveny své toxicity. Musí však být zachována jejich imunogenicita. Ke zvýšení účinku se často používají hlinité soli jako nosič a adjuvans. Vakcína na bázi toxoidů je například vakcína proti tetanu TT (tetanus toxoid). Její produkce spočívá v kultivaci bakterie Clostridium tetani v kapalném médiu a následné inaktivaci vyprodukovaného toxinu formaldehydem (WHO, 2006). Subjednotkové vakcíny na rozdíl od celobuněčných vakcín obsahují jen část daného mikroorganismu obsahující důležité epitopy. Díky tomu, že se při přípravě vakcíny eliminují přebytečné a nepotřebné části patogenu, sníží se také šance vzniku vedlejších účinků. Pro zlepšení účinku často obsahují též adjuvantní prostředek v podobě minerálního nebo bílkovinného nosiče. Skupiny subjednotkových a syntetických vakcín se často prolínají, jelikož v obou případech antigeny představují část mikroorganismu. Příkladem subjednotkové vakcíny může být vakcína proti chřipce. Chřipkové viry patří do čeledi Orthomyxoviridae. V závislosti na kombinaci antigenních povrchových glykoproteinů existuje mnoho podtypů tohoto viru. Je proto třeba sledovat antigenní změny viru chřipky a vyvíjet vakcíny. Rekombinantní subjednotkové vakcíny v tomto případě představují efektivní strategii. V současnosti je klinicky testováno mnoho vakcín proti chřipce. Například vakcína HAC1 s rekombinačními proteiny HA chřipkového viru A subtypu H1N1 prokázaly imunogenicitu a bezpečnost ve fázi I (první testování na lidech) u zdravých dospělých lidí (Zhang a kol., 2015). Syntetické vakcíny obsahují antigeny, které jsou připraveny uměle pomocí genového inženýrství a počítačové techniky (Domorázková, 1997). Do této kategorie spadá několik dalších typů vakcín. Například rekombinantní vakcíny, které vznikají vložením genu kódujícího potřebný antigen daného patogenního organismu do genetické informace nepatogenního organismu, který posléze daný antigen vyprodukuje. Slibné jsou také DNA vakcíny, což jsou

23 geneticky modifikované DNA plazmidy, které jsou při inokulaci transfekovány2 do hostitelských buněk a ty pak produkují příslušné antigeny (Flingai a kol., 2013). Pro tuto bakalářskou práci jsou důležité peptidové neboli epitopové vakcíny. Antigeny, které taková vakcína obsahuje, představují syntetizované peptidové epitopy navázané na nosiči, kterým je často adjuvantní prostředek (Beran a kol., 2005; Clem, 2011).

2.8. Rozdělení vakcín dle počtu druhů antigenů

Účinnost vakcíny nemusí být směřována jen proti jednomu onemocnění, ale může obsahovat více rozdílných antigenů a být tak účinná proti více infekcím, čímž se zjednoduší očkovací kalendář.

Tabulka 6. Dělení vakcín dle počtu druhů antigenů (Beran a kol., 2005; upraveno) Vakcína Příklad infekce Počet antigenů monovalentní Meningitida typu C 1 polyvalentní bivalentní Meningitida typu A + C 2 trivalentní Dětská obrna sérotypu 1, 2, 3 3 … kombinovaná Spalničky, příušnice, zarděnky 3

Monovalentní vakcíny jsou takové vakcíny, které obsahují jen jeden druh antigenů a jsou tedy namířeny jen proti jedinému infekčnímu onemocnění. Polyvalentní vakcíny obsahují dva nebo více druhů antigenů. Tyto antigeny však nepocházejí od odlišných původců, ale jen od rozdílných subtypů infekčního onemocnění stejného druhu. Kombinované vakcíny je třeba od polyvalentních striktně rozlišovat. Na rozdíl od nich již obsahují dva nebo více druhů antigenů odlišných infekčních původců, čímž zajišťují ochranu proti několika onemocněním zároveň. U kombinovaných vakcín může docházet k tomu, že jedna ze složek amplifikuje účinnost druhé a kombinovaná vakcína může být účinnější než monovalentní. Avšak může dojít i k opačnému účinku, a proto efekt kombinované vakcíny nesmí být nižší než efekt monovalentní vakcíny (Beran a kol., 2005).

2 Vpravení nukleové kyseliny do hostitelské buňky. 24

3. Helminti

3.1. Taxonomické zařazení a význam

Pojem helminti označuje taxonomickou skupinu velmi různorodých a fylogeneticky nepříbuzných mnohobuněčných organismů. Jedná se o relativně velké bilaterálně souměrné protostomní živočichy, kteří v určité fázi svého životního cyklu parazitují v obratlovcích. Podle stavby jejich těla a lokalizace v hostiteli jsou helminti členěni do několika skupin: neodermátní platyhelminti (Trematoda, Cestoda, Monogenea), hlístice (Nematoda) a vrtějši (Acanthocephala). Někdy jsou přiřazovány i parazitické ploštěnky (Turbellaria), vířníci (Rotifera), strunovci (Nematomorpha), pásnice (Nemertea) a pijavky (Hirudinea). Životní cyklus helmintů bývá složitý. Během ontogenetického vývoje projdou poměrně velkým počtem morfologicky odlišných vývojových fází, od vajíčka, přes až několik larválních stádií, po dospělce. Helminti mohou během ontogeneze vystřídat i několik mezihostitelů a pohlavní dospívání a reprodukci prodělávají až v definitivním hostiteli. Můžeme se setkat s přímým cyklem, kdy helmint cizopasí jen na jediném hostiteli, nebo s cyklem dvouhostitelským, tříhostitelským a výjimečně čtyřhostitelským se třemi mezihostiteli (Volf a Horák, 2007). Mnozí zástupci helmintů jsou závažnými patogeny pro člověka i pro zvířata, přičemž nejzávažnější infekce jsou dokumentovány v rozvojových oblastech, kde distribuce parazitů závisí především na hygienických podmínkách. I přesto, že nákazy helminty probíhají často asymptomaticky, mohou mít pro hostitele fatální následky. Z obecného pohledu helminti ovládli množství regulačních a únikových strategií, kterými dokáží ovlivňovat a modulovat děje v těle hostitele a lépe tak čelit jeho obranným mechanismům (Wakelin, 1996).

3.2. Interakce parazit-hostitel z pohledu imunologie

Z pohledu hostitele představuje helmint v těle hostitele „cizorodý prvek“, nejen ve smyslu invazivním, ale i v imunologickém. Hostitel se parazitům brání prostřednictvím nespecifických i specifických imunitních mechanismů, kterým však helminti díky mnoha adaptacím dokáží unikat (Wakelin, 1996).

3.2.1. Antigeny helmintů

Podle schopnosti hostitele rozpoznávat antigeny parazita rozlišujeme antigeny skryté a přirozené. Skryté antigeny obvykle nejsou imunitnímu systému hostitele vystavovány a běžně tedy imunitní odpověď nevyvolávají. Naproti tomu přirozené antigeny jsou hostiteli rozpoznávány při přirozené imunitní reakci (Hewitson a Maizels, 2014). Jelikož povaha požadované imunitní odpovědi závisí pouze na typu antigenu, na použitém adjuvantním prostředku a na způsobu aplikace vakcíny, není žádný rozdíl mezi imunitní odpovědí indukovanou přirozenými antigeny a skrytými antigeny (Munn, 1996). Obrázek 4. zobrazuje obecné typy antigenů modelového dospělce helminta parazitujícího v gastrointestinálním traktu hostitele. Červeně jsou označeny přirozené antigeny (1, 2, 3, 4) a modře skryté antigeny (5, 6, 7). Antigeny znázorněné pod číslem 7 mohou být přístupné protilátkám, ale protože nejsou vystavovány lymfocytům, hostitel si proti nim žádné protilátky nevytváří (Munn, 1996). Je však třeba vzít v úvahu, že helminti vykazují rozmanitou antigenicitu a v závislosti na životní fázi nebo druhu helminta se může skutečnost od schématu lišit.

Obrázek 4. Schéma typů antigenů helmintů (Munn, 1996; upraveno)

3.2.1.1. Skryté antigeny

Skryté antigeny jsou exprimovány výlučně ve střevě krevsajících červů. Všechny střevní proteiny jsou považovány za skryté antigeny, ale ne všechny indukují protektivní imunitní odpověď. Vzhledem k tomu, že přirozeně se imunitní systém se skrytými antigeny nesetká, očekává se, že helmint nemá žádné únikové mechanismy proti hostitelem vytvořeným protilátkám (Munn, 1996). Vakcíny se skrytými antigeny jsou tedy vysoce účinné proti krevsajícím helmintům, protože vytvořené protilátky červ přijímá v potravě, takže v krvi. Předpokládá se, že tyto protilátky neutralizují základní parazitické enzymy, především proteázy (Hewitson a Maizels, 2014). Z toho vyplývá, že vakcíny s těmito antigeny nemají žádný efekt na helminty, kteří se krví hostitele neživí. Dobře charakterizovaný skrytý antigen je například 110 kDa střevní membránový glykoprotein zvaný H11 produkovaný hlísticí H. contortus, který při testování indukovat až 90% protektivní imunitu. Jedná se o mikrosomální aminopeptidázu, proti níž hostitelem vytvořené protilátky znemožňují helmintu štěpit bílkoviny, a ten pak není schopen přijímat potravu. Vakcína s antigeny H11 ale nikdy nebyla uvedena na trh, kvůli problémům s rekombinantními formami těchto antigenů (Munn, 1996; Hewitson a Maizels, 2014, Newton a Meeusen, 2003).

3.2.1.2. Přirozené antigeny

Jedná se především o exkrečně-sekreční (ES) produkty helmintů a jejich povrchové antigeny. Na rozdíl od skrytých antigenů přirozené antigeny by měly vyvolávat stejné imunitní reakce proti krevsajícím helmintům i těm, kteří se krví neživí (Newton a Meeusen, 2003). ES produkty jsou látky vylučované a sekretované z těla parazita. Jedná se o biologicky aktivní látky většinou bílkovinné povahy s různými funkcemi, jako je například podpora trávení nebo imunomodulace (viz dále). Povrchové antigeny nejsou v těle hostitele distribuovány podobně jako ES produkty, ale bývají podobně imunogenní. Příkladem takového antigenu je glykoprotein na povrchu dospělců hlístice Brugia malayi Bm-GPX-1, který parazita nejspíš chrání před volnými kyslíkovými radikály (Maizels a kol., 2001).

3.2.2. Imunomodulační schopnosti helmintů

V hostitelském organismu jsou v průběhu parazitace iniciovány četné imunitní reakce. Přestože mezi helminty figurují vzájemně nepříbuzné organismy, často jsou jimi vyvolané imunitní reakce velmi podobné, vedené většinou TH2 směrem (Maizels a kol., 2004). Helmintózy

27 jsou tedy obvykle charakterizovány zvýšením hladin cytokinů (především interleukin IL-4), TH2 buněk s CD4 receptorem, plazmatických buněk sekretujících hlavně imunoglobulin IgE, žírných buněk, eosinofilů a bazofilů (Anthony a kol., 2007). Obrázek 5. shrnuje obranné mechanismy imunitního systému hostitele a mechanismy helminta, kterými se imunitnímu systému hostitele brání.

Obrázek 5. Schéma interakce helmintů s hostiteli (Wakelin, 1996; upraveno)

Ve zkratce se po průniku do těla hostitele parazit setká s mnoha nepřátelskými buňkami, z nichž jsou nejaktivnější fagocytující makrofágy. Vedle toho je aktivován komplementový systém a iniciován zánět, jako reakce na podráždění nebo poškození tkáně. Poté, co antigen prezentující buňky prezentují zachycené antigeny T- a B-lymfocytům, produkují pomocné T- lymfocyty cytokiny a napomáhají stimulaci B-lymfocytů, které tvoří protilátky (Jíra, 1998). Ty se specificky váží na antigenní epitopy a tím značí cíle pro komplement a buněčné efektory (Wakelin, 1996). Helminti se dokáží několika způsoby vyhýbat rozpoznání imunitním systémem hostitele. Někteří umí zamaskovat svůj povrch tak, že do svých povrchových struktur začlení molekuly hostitele. Například Schistosoma mansoni má receptory pro hostitelské molekuly, které tak na sebe váže a hostitel poté parazita toleruje a nepovažuje ho za cizí. Dalším způsobem maskování je fúze a inkorporace hostitelských buněčných membrán do povrchu helminta. Podobným obranným mechanismem jsou mimikry. V tomto případě má helmint ve svém genomu informaci pro vytváření podobných nebo totožných hostitelských molekul. Helminti mohou své povrchové antigeny také obměňovat, čímž zpomalují vývoj imunitní reakce. Jedná se o velmi rychlý proces, kdy se helmint adaptuje na imunní prostředí v hostiteli.

Využívají různých enzymů k odstranění některých antigenů ze svého povrchu včetně těch s již navázanými protilátkami. K tomu slouží například parazitární fosfolipázy nebo peptidázy (Volf a Horák, 2007; Jíra, 1998). Mnoho ES produktů uvolňovaných do těla hostitele má mimo jiné imunomodulační účinky. Tyto látky často bývají homology cytokinů hostitele. Těmi si imunitní systém hostitele reguluje imunitní odpověď a pro parazita tak cytokiny představují vhodný nástroj k imunomodulaci. Například hlístice B. malayi vytváří homology savčího cytokinu TGF-β (tranforming growth factor β) regulující T-lymfocyty a homology cytokinu MIF (macrophage migration inhibitory factor), který inhibuje migraci makrofágů. Další vhodné cíle helmintů jsou inhibitory proteáz. Příkladem je produkce proteinu CPI (cysteine protease inhibitor), který je homologem cystatinu podílejícím se na prezentaci antigenů (Maizels a kol., 2004). Jiné ES produkty jsou parazitům vlastní a nemají v těle hostitele obdobu. Protože zánětlivá reakce může vést k oslabení parazita nebo výjimečně i k jeho smrti, někteří helminti dokáží produkovat protizánětlivé faktory. Bylo prokázáno, že přítomnost hlístice Trichuris suis dokonce napomáhá tlumit projevy Crohnovy choroby (chronický zánět trávicího traktu) (Summers a kol., 2005). Mnozí helminti dovedou produkovat látky, které blokují komplementové kaskády. Například hlístice B. malayi a T. spiralis vylučují enzymy, které inhibují sérový protein C5a (chemoatraktant neutrofilů), který je součástí komplementu (Rees- Roberts a kol., 2010). Helminti vylučují poměrně velké množství antigenních látek a u mnohých z nich stále není známá jejich funkce. Předpokládá se však, že některé mají jen funkci irelevantních antigenů, pomocí kterých od sebe helmint odvádí pozornost imunitního systému hostitele (Wakelin, 1996).

3.3. Komerčně dostupné vakcíny proti helmintům

Vzhledem k antigenní rozmanitosti a regulačním schopnostem helmintů, je vývoj vakcíny proti mnoha závažným patogenům komplikovaný. I přes mnohaleté snahy četných vědeckých týmů zatím neexistuje žádná vakcína proti helmintóze, kterou by bylo možné aplikovat u člověka. Vakcinace zvířat proti helmintům je v tomto směru rozpracována lépe. V minulosti se objevilo několik takovýchto vakcín, které však byly založeny jen na živých oslabených parazitech (Meeusen a kol., 2007). I přes fakt, že tyto vakcíny vyvolávaly relativně vysokou ochranu, existovaly v minulosti jen tři komerčně dostupné vakcíny.

První a jedinou dnes používanou vakcínou proti helmintům je veterinární vakcína proti hlístici parazitující v plicích krav Dictyocaulus viviparus. Její prodej byl zahájen před více než padesáti lety roku 1959 pod názvem „Dictol“. Ke stimulaci imunitní reakce byly použity larvy L3 oslabené gama-zářením a již po čtyřech týdnech poskytovala vysokou ochranu proti infekci. V té době za velkými produkčními ztrátami stála infekce způsobená právě D. viviparus a obchodní úspěch vakcíny byl tedy zaručen. V následujících letech však vakcínu nahradila antihelminitika a její prodej tak poklesl. I přesto se vakcína proti D. vivparus téměř beze změny dochovala dodnes a pod názvem „Huskvac“ se stále řadí mezi nejúspěšnější a nejvýdělečnější produkty ve veterinární medicíně (Bain, 1999; Hewitson a Maizels, 2014; Meeusen a kol., 2007). Po vzoru vakcíny proti D. viviparus byla připravena vakcína proti plicní hlístici Dictyocaulus filaria, která byla na trh uvedena roku 1965. Také vakcíně proti hlístici Ancylostoma caninum napadající tenké střevo psů, byla roku 1973 udělena licence. Dnes však ani jedna vakcína není dostupná. I přes to, že byla vakcína proti A. caninum relativně úspěšná, byla její výroba kvůli nízkým tržbám roku 1975 zrušena. Pravděpodobným důvodem náhlého přerušení prodeje byl nízký odbyt vakcíny způsobený neochotou veterinářů vakcínu začlenit do běžných očkovacích programů (Loukas a kol., 2006). Jiný zdroj uvádí, že důvodem byly vedlejší účinky v podobě respiračních potíží a krátká životnost vakcíny (Vercruysse a kol.; 2004). Stejnou metodu se vědci pokoušeli uplatnit na vývoj vakcín i proti jiným helmintům. Úspěšná se zdála být například i vakcína proti H. contortus, která naočkovaným ovcím navozovala relativně vysokou ochranu. Avšak později se ukázalo, že vysoké úrovně ochrany u zvířat lze dosáhnout jen do sedmi měsíců věku a jen v případě, že do té doby zvířata nebyla infikována (Bain, 1999).

4. Syntéza vakcíny proti helmintům

4.1. Peptidová (epitopová) vakcína

Příprava „tradičních“ vakcín je spojována s několika problémy. Kultivace patogenů, jejich purifikace a detoxikace je poměrně nákladná, genetická variabilita mnohých virů komplikuje detekci imunogenních složek a v neposlední řadě i možný výskyt vedlejších účinků, zahrnujících reaktogenitu3, která je pozorována i v případě subjednotkových vakcín. Řešení těchto problémů vyžaduje znalosti antigenních struktur patogenů a mechanismů jimi vyvolané imunitní odpovědi. Na základě těchto znalostí jsou vyvíjeny vakcíny „nové generace“ (Moisa a Kolesanova, 2012; Ben-Yedidia a Arnon, 1997). Kvůli široké škále antigenů helmintů není příprava vakcíny proti nim snadná, avšak nezdá se být nemožná. Bylo prokázáno, že imunitní reakce jsou často namířené proti více proteinům z daného patogenu a proti více epitopům v rámci jednoho proteinu (Sette a Fikes, 2003). Velký potenciál ve vakcinaci proti helmintům mají syntetické peptidové neboli epitopové vakcíny. Jedná se o syntetizované antigenní epitopy konjugované s nosičem, se kterým tak tvoří jednu molekulu. Na nosič je možné navázat více odlišných peptidů z různých antigenů, a proto jsou tyto vakcíny atraktivní právě v řešení problémů vakcinace proti helmitům, kdy je možné pokrýt co nejvíce antigenních kombinací. Další výhodou je poměrně levná a bezpečná výroba a možnost vystavení jen těch antigenů, které nejsou reaktogenní a nemají ani jiné vedlejší účinky. U antigenů, které při přirozeném vystavení organismu nejsou příliš imunogenní, může být jejich imunogenicita zvýšena (Moisa a Kolesanova, 2012, Li a kol., 2014). V současnosti je vyvíjeno mnoho peptidových vakcín. Například vakcína proti viru HIV, virové hepatitidě C, malárii, slintavce a kulhavce, chřipce nebo terapeutické vakcíny proti rakovině. Průběžně aktualizované informace o právě probíhajících klinických studiích vakcín poskytuje databáze veřejně dostupná na webové stránce ClinicalTrials.gov. Databáze nyní uvádí více než 500 registrovaných studií peptidových vakcín v různých fázích klinických testů (Li a kol., 2014). V současné době prozatím žádné klinické testy vakcín proti helmintům neprobíhají, výzkumu těchto vakcín se však věnuje mnoho vědeckých týmů. Takové studie jsou často soustředěny na trávicí enzymy parazitů živících se krví. Podle této myšlenky by taková vakcína měla indukovat tvorbu protilátek neutralizujících aktivitu enzymů a zabránit tak proteolýze hemoglobinu ve střevě parazita. Příkladem je vakcína proti lidskému měchovci Necator

3 Očekávané vedlejší účinky, zahrnující například nadměrné imunologické reakce nebo bolest v místě vpichu. 31 americanus, která by nahradila používané antihelminitkum benzimidazol. Jako antigenní determinanta je zde použita asparagová proteáza katepsin D (Na-APR-1) na lipidovém jádře (Skwarczynski a kol., 2012). Na stejném principu byla syntetizována vakcína proti S. mansoni, která obsahovala konjugát hlavního trávicího enzymu katepsinu D (Sm-CatD), pomocného T- epitopu P25 a lipidového jádra (Ahmad Fuaad a kol., 2015; Dougall a kol., 2014). Jiná studie testovala 6 peptidů obsažených v glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáze produkované též S. mansoni, v různých kombinacích na větveném nosiči. Právě schistosomózy patří mezi nejčastější onemocnění helmintózou, a proto jsou častým předmětem výzkumu peptidových vakcín, které by nahradily antihelminitikum praziquantel (El Ridi a kol., 2004). Vilar a kol. (2003) se dokonce pokoušeli o bivalentní peptidovou vakcínu, která obsahovala rekombinantní protein Sm14 (produkovaný S. mansoni), který obsahuje totožné antigenní determinanty jako Fh15 (Fasciola hepatica).

4.2. Vývoj peptidové vakcíny

K syntéze antigenů a tvorby syntetické peptidové vakcíny jsou třeba následující kroky: 1. Identifikace a výběr imunoaktivních peptidových fragmentů z antigenních proteinů jako infekční činidlo a navržení jejich konstrukce. 2. Chemická syntéza peptidových antigenů a jejich konjugace na nosič. 3. Testování imunogenicity výsledných konstruktů na laboratorních zvířatech, stanovení protilátek a jejich ochranných vlastností. 4. Preklinické a klinické testy vzorků vakcíny (Moisa a Kolesanova, 2012).

4.2.1. Identifikace a výběr antigenních determinant

Identifikace epitopů je jistě klíčovým krokem v přípravě peptidové vakcíny. Nejprve je třeba antigeny získat. V případě helmintů skryté antigeny získáme jejich mechanickým narušením, centrifugací a následným zpracováním supernatantu. ES produkty se získávají in vitro kultivací parazita v kultivačním médiu s antibiotiky poté, co byli promyti ve fyziologickém roztoku. Médium s vyprodukovanými ES produkty je následně dál zpracováváno. K ověření přítomnosti antigenních proteinů a k analýze imunodominantních antigenů se využívají interakce předpokládaných antigenů s protilátkami získaných ze zvířat či pacientů s prokázanými odpovídajícími infekcemi (Uray a Hudecz, 2014; Moisa a Kolesanova, 2012; Virginio a kol. 2012). Nejběžnější diagnostické metody jsou ELISA a imunoblot.

4.2.1.1. ELISA

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) je rychlá metoda detekce a kvantitativní analýzy antigenů nebo protilátek. Principem testu je použití detekce enzymu navázaného na imunokomplexech antigenu s primární a sekundární protilátkou. Využívá se tedy protilátková specifita k cílovému proteinu. V prvním kroku je třeba na dno mikrotitrační destičky navázat antigen. Po zablokování nespecifických vazeb se do jamky nanese primární protilátka, která s proteinem vytvoří komplex antigen-protilátka. Po promytí přebytku primární protilátky se do jamky přidá sekundární protilátka, na kterou je kovalentně navázán enzym. Nakonec je třeba reakci vizualizovat přidáním bezbarvého substrátu, který s enzymem vytvoří barevný produkt. Ten značí přítomnost cílového proteinu. Nakonec jsou měřeny absorbance při určité vlnové délce (Berg a kol., 2002; Yang a Ma, 2009).

Obrázek 6. Schematické znázornění metody ELISA (Berg a kol., 2002; upraveno)

4.2.1.2. Imunoblot

Imunoblot (Western blot) je specifičtější metoda detekce a charakterizace proteinů v daném vzorku. Je velmi citlivá, může být detekováno již 1 ng antigenu, ale je nákladnější a časově náročnější a než metoda ELISA. V této metodě jsou proteiny nejprve separovány pomocí gelové elektroforézy na polyakrylamidovém gelu v závislosti na jejich molekulové hmotnosti. Separované proteiny jsou následně pomocí elektrického proudu procházejícím sestaveným „sandvichem“ přeneseny z gelu na membránu (nitrocelulózová nebo z PVDF – polyvinilidenfluoridu). Aby se zabránilo tvorbě nespecifických vazeb membrány a protilátky, je membrána dále blokována (často BSA nebo odtučněným sušeným mlékem) a poté je inkubována s primárními protilátkami. Po 24 hodinách se promytím odstraní nenavázané primární protilátky a nanesou se značené (často enzymem, např. křenovou peroxidázou) sekundární protilátky. Po dalším promytí následuje detekce 33 navázaných značených sekundárních protilátek pomocí chromogenních nebo chemiluminiscenčních činidel. Tím dojde ke vzniku reakcí, které odpovídají cílovým antigenním proteinům (Gallagher a Chakavarti, 2008; Yang a Mahmood, 2012; Yang a Ma, 2009).

Obrázek 7. Schematické znázornění metody imuoblot (Leinco Technologies, Inc.; upraveno)

Poté je třeba tyto antigeny identifikovat. To lze provést například pomocí elektroforetické separace proteinů přítomných v ES produktech, následnou hmotnostní spektrometrií a vyhodnocením získaných spekter. Získáme tak primární strukturu antigenních proteinů, tedy jejich aminokyselinovou sekvenci. Za předpokladu, že nejantigennější epitopy jsou na povrchu terciární struktury bílkoviny (jsou hydrofilní) a naopak hydrofobní epitopy jsou skryté uvnitř terciární struktury, byly vyvinuty internetové programy (Hydropathicity plot) umožňující predikci hydrofóbnosti a hydrofility proteinů (Uray a Hudecz, 2014). Při známé aminokyselinové sekvenci proteinu je tedy možné vyhledat antigeny teoreticky nejvhodnější pro syntézu vakcín.

4.2.2. Chemická syntéza antigenů a konjugace na nosič

Peptidy do syntetických vakcín jsou získávány syntézou v roztoku nebo syntézou na pevné fázi. Díky automatizaci je dnes využívána hlavně syntéza na pevné fázi. Někdy je také využívána kombinace syntézy na pevné fázi se syntézou v roztoku. Hlavní výhodou této kombinace je, že není třeba purifikace výsledného produktu. Ten zůstává kovalentně vázán na polymerní nosič po celou dobu procesu a nezreagované komponenty, aktivátory a vedlejší produkty jsou vyplaveny rozpouštědlem. To syntézu na pevné fázi výrazně urychluje.

Na tvorbě silné a dlouhodobé specifické imunitní odpovědi na antigeny mají značný podíl také adjuvantní prostředky. Často jsou peptidy samy o sobě slabě imunogenní a snadno podléhají proteolýze. Proto je výběr nosné adjuvantní molekuly též velmi významný (Li a kol., 2014). Často používaný hydroxid hlinitý a hlinité soli v případě peptidových vakcín použít nelze, protože špatně adsorbují peptidy. Za vhodné adjuvantní nosiče do peptidových vakcín jsou považovány polymerní molekuly. Takové adjuvans podporují vychytávání peptidových antigenů antigen prezentujícími buňkami a podporují buněčnou i humorální imunitu. K tvorbě nosičů mohou být použity jak přírodní polymery (např. chitosan), tak i syntetické (např. poly-L-lysin, poly-L-arginin) (Moisa a Kolesanova, 2012).

4.2.2.1. Poly-L-lysin

Komplex nosiče v podobě rozvětveného dendrimeru (větvená polymerní struktura vznikající pravidelným spojováním jednoho monomeru; obrázek 8.) s navázanými peptidy je obecně označován jako MAP (multiple antigen peptide). Jako jádro dendrimeru je použit nejčastěji lysin. Takové jádro je asymetrické. Jeho dlouhé rameno obsahuje ε-aminoskupinu a krátké rameno tvoří α-aminoskupina a obě jsou vhodné k větvení. Výhodou takovýchto MAP konstrukcí je, že dendrimer s relativně malou molekulovou hmotností nese velký počet peptidových antigenů a neobsahuje tak zbytečné komponenty, které by mohly ve výsledné vakcíně způsobovat vedlejší účinky (Tam, 1988; Tam a Spetzler, 1997).

Obrázek 8. Schematické znázornění (A) L-lysinu a (B) dendrimeru tvořeného poly-L- lysinem (Okuda a kol, 2003; upraveno)

Aby bylo možné peptid na nosič navázat, je třeba na jeho N‘- nebo C‘-konec přisyntetizovat cystein. Díky síťovacímu činidlu obsahující maleinimidovou skupinu (např. SMCC) se poté peptid může kovalentně navázat přes thiolovou skupinu cysteinu na nosič (Gegg a Etzler, 1993).

4.3. Testování vakcíny

Na výsledných konstruktech se nakonec provádí testování antigenních vlastností zahrnující farmakologický screening a následující preklinické a klinické testy. Testování zejména humánních potenciálních vakcín je podrobné a přísné a je obvykle udáváno sanitárními předpisy a metodickými pokyny schválenými příslušnými vládními kontrolními úřady (Moisa a Kolesanova, 2012). Farmakologický screening spočívá v in vitro testování na molekulární a buněčné úrovni a testování na tkáňové úrovni in vivo na laboratorních zvířatech. Dalším stupněm jsou preklinické testy. Jedná se o nákladné několikaleté testování vakcíny na různých modelech zdravých i infikovaných laboratorních zvířat v různých modelových situacích. Jejich účelem je určit míru rizika po podání vakcíny, jako například údaje o toxicitě, karcinogenitě a mutagenitě. Tyto údaje však nemusejí být aplikovatelné ze zvířat na člověka, proto jsou nutné i následující klinické testy. Závěrečné klinické testování probíhá na lidech, kteří byli dobře informováni a písemně s testy souhlasili. Klinické testy zahrnují tři odlišné fáze. Fáze I probíhá na malé skupině zdravých dobrovolníků a sleduje se účinek v závislosti na velikosti dávky. Ve fázi II je testován účinek na několika desítkách osob s cílovým onemocněním, a jejichž vlastnosti (rasa, pohlaví, věk, výskyt dalších chorob) jsou co nejpodobnější. Fáze III bývá nejdelší a nejnáročnější. Vakcína je testována na větším množství osob (řádově tisíce), jejichž vlastnosti jsou již co nejrozmanitější. Poté je testovaná látka povolena k prodeji a probíhá fáze IV klinického testování. V této fázi je účinek sledován v klinické praxi po dobu minimálně 5 let od registrace (Starobová a kol., 2006; Hampl a kol., 2007).

5. Experimentální část

Předmětem experimentu byl coupling peptidových antigenů helmintů na poly-L-lysinové nosiče a vytvoření tak molekuly, která by byla schopná vyvolat protektivitu vůči infekcím způsobeným těmito parazity. Byly tak vytvořeny dvě potencionální vakcíny, kdy každá obsahovala peptidy jednoho ze dvou experimentálních modelových organismů. Za experimentální organismy byly zvoleny hlístice Trichinella spiralis a motolice Trichobilharzia szidati, respektive peptidy, které jsou součástí aminokyselinových sekvencí některých proteinů obsažených v jejich exkrečně-sekrečních produktech. Úspěšnost experimentu byla poté ověřována jednodimenzionální gelovou elektroforézou (1-DE) a následným provedením hmotnostní spektroskopie (MS) pro zjištění, zda se ve vzorcích výchozí peptidy opravdu nacházejí. Antigenní vlastnosti byly na závěr testovány pomocí imunologických metod ELISA a imunoblot.

5.1. Materiály a metodika

K dispozici bylo 6 peptidů odpovídajících známým antigenním proteinům produkovaných T. spiralis, z nichž dva peptidy pocházely ze 43 kDa glykoproteinu, dva z inhibičního „multi cystatin-like domain“ proteinu a dva z 53 kDa exkrečně-sekrečního proteinu. Dále byl k dispozici peptid produkovaný T. szidati, jež je součástí enzymu trióza fosfát izomeráza. U všech peptidů byla známa jejich aminokyselinová sekvence a na jejich N‘- nebo C‘-konci byl přisyntetizován cystein za účelem kovalentního navázání peptidů na poly-L-lysin.

Tabulka 7. Dostupné peptidy a jejich aminokyselinové sekvence

Organismus Naše označení peptidu Aminokyselinová sekvence Ts43a VSSEKATEFADLTSLC Ts43b NDRSKDKSQWAVIDDKPVC TsCYSa CNPSKATVSKCFEEVE Trichinella spiralis TsCYSb ECDIKEKAFNSYEC Ts53a CQNERQFDENKLKKL Ts53b CSDKEDKLQKLY Trichobilharzia szidati TPI CTLSEREANKTEEV

Na základě znalostí sekvencí aminokyselin výše zmíněných exkrečně-sekrečních proteinů byly pomocí internetového programu Hydropathicity plot (http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/hydropathy/) nalezeny aminokyselinové sekvence našich peptidů a zkontrolováno, zda jsou aminokyseliny hydrofobní a tedy i antigenní.

5.1.1. Coupling peptidů na poly-L-lysin

5.1.1.1. Přístroje

 Třepačky – GyroTwister™ 3-D Laboratory Shaker (Labnet Internacional, Inc.) – Bio RS-24, Mini-rotator (bioSan)  Centrifuga – Microcentrifuge 5415R (eppendorf)

5.1.1.2. Chemikálie a spotřební materiál

 Peptidy (viz tabulka 7.)  Fosfátový pufr – 0,1M, pH7  SMCC (SIGMA-ALDRICH) – 100x koncentrovaný  TCEP (SIGMA-ALDRICH)  Dialyzační kolonky – Spectra/Por® CE DispoDialyzer – „cut off“ 3,5 kDa, objem 2 ml

5.1.1.3. Pracovní postup

Nejprve bylo třeba poly-L-lysinový nosič aktivovat přidáním SMCC (4-(N- Maleimimidomethyl)cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester). Množství poly- L-lysinu bylo přepočítáno na 150 μl SMCC, kterého mělo být dle protokolu 10x více:

→ 2,287 · 10 = 22,87

m (SMCC) = 0,036 mg (poly-L-lysin) · 22,87 = 0,82332 mg

V (SMCC) μ

V (poly-L-lysin) = 3,6 μl

Bylo tedy smícháno 3,6 μl poly-L-lysinu se 150 μl SMCC a následně bylo přidáno 0,9 ml fosfátového pufru. Tato směs byla inkubována 1 hodinu při pokojové teplotě.

Poté byla směs přenesena do dialyzační kolonky, aby se odstranily nezasíťované molekuly. Dialýza probíhala přes noc při 4°C ve fosfátovém pufru a poté ještě 1 hodinu při pokojové teplotě, zatímco byla míchána. Cysteiny mají tendenci oxidovat a vytvářet tak disulfidové vazby. Aby bylo možné peptidy na polypeptidový nosič navázat, bylo nutné cysteiny zredukovat přidáním TCEP (tris(2- carboxyethyl)phosphine), imobilizovaným v agarózovém gelu, kterého je třeba v poměru nejméně 1:1 vůči množství peptidů:

Vzorek A: 21,7 μl Ts43a + 27,6 μl Ts43b + 21,6 μl TsCYSa + 16,3 μl TsCYSb + 22,1 μl Ts53a + 11,6 μl Ts53b = 120,9 μl peptidu → 120,9 μl TCEP Vzorek B: 39,7 μl peptidu → 39,7 μl TCEP

Bylo tedy odebráno 120,9 μl a 39,7 μl TCEP, přebytečný roztok byl po centrifugaci (1 min, 1000 x g) odstraněn. Stejným způsobem byly agarózové kuličky promyty fosfátovým pufrem. Následně byly přidány peptidy (vzorek A: 120,9 μl, vzorek B: 39,7 μl) a za stálého míchání byly směsi 1 hodinu inkubovány při pokojové teplotě. Mikrozkumavky byly opět centrifugovány (1 min, 1000 x g) a získaný supernatant obsahoval potřebné zredukované proteiny. Na závěr byl komplex poly-L-lysinu a SMCC smíchán s redukovanými peptidy. Směs byla inkubována přes noc při 4 °C.

5.1.2. 1-D elektroforéza

5.1.2.1. Přístroje

 Aparatura na elektroforézu – Mini-PROTEAN Tetra Cell (BIO RAD)  Třepačka – Orbital Shaker PSU-10i (Grant-bio)  Skener – GS-900™ Calibrated Densitometer (BIO RAD)

5.1.2.2. Chemikálie a spotřební materiál

 Amicon® Ultra 0.5mL Centrifugal Filters (Merck Millipore)  TGS pufr – obsahuje redukční činidlo SDS  Redukující vzorkovací pufr  Gradientový gel (4-15%) – Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Precast Gel  Marker – BenchMark™ Pre-stained Protein Ladder (Life technologies)

 Barvivo - Coomassie Brilliant Blue G-250  Odbarvovací roztok

5.1.2.3. Pracovní postup

Z každé „vakcíny“ bylo odebráno 0,5 ml a tyto vzorky byly centrifugací zkoncentrovány na objem 100 μl (10 min, 14 000 x g). Získali jsme tak zkoncentrované vzorky a jejich filtráty, které by neměly obsahovat žádné proteiny. 25 μl každého testovaného vzorku bylo smícháno s 6,25 μl vzorkovacího pufru (poměr 4:1) a následně naneseny do jamek gelu. Markeru bylo použito 10 μl. Elektroforéza probíhala při 150 V. Jako kontrola posloužil poly-L-lysin a čistý peptid TPI.

Tabulka 8. Schéma zaplnění jamek gelu vzorky

Jamka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

lysin

Filtrát Filtrát

Marker Marker -

Vzorek

oly

Zkoncentrovaný Zkoncentrovaný

ČistýTPI peptid

Nezkoncentrovaný Nezkoncentrovaný

Organismus T. spiralis T. szidati

Po skončení elektroforézy byl gel 1,5 hodiny za stálého míchání barven a následovalo odbarvování gelu. Na závěr byl gel vyfocen.

5.1.3. ELISA

5.1.3.1. Přístroje

 ELISA reader – SpectraMax i3 (Molecular Devices)

5.1.3.2. Chemikálie a spotřební materiál

 Uhličitanový pufr (0,159 g Na2CO3 + 0,293 g NaHCO3 + 100 ml ddH2O)  Antigeny – peptidy Ts navázané na poly-L-lysinovém nosiči – homogenát Trichinella pseudospiralis

 Primární protilátky – Tp sérum – negativní sérum Porsing neg  Sekundární protilátka – Anti pig  PBS-T (PBS + 0,05 % Tween-20)  Hovězí sérový albumin BSA

5.1.3.3. Pracovní postup Na dno jamek mikrotitrační destičky byly navázány antigeny – vzorek syntetizované molekuly peptidů Ts konjugovaných s poly-L-lysinovým nosičem a jako kontrola sloužil homogenát T. pseudospiralis, který vykazuje zkřížené reakce s T. spiralis. Vzorky byly ředěny v uhličitanovém pufru (1:100) a byly pipetovány vždy duplicitně (viz tabulka 9.). Celá mikrotitrační destička byla inkubována přes noc při 4 °C. Po inkubaci byla mikrotitrační destička 3x propláchnuta PBS-T (vždy po jedné minutě) a případný vznik nespecifických vazeb byl blokován nanesením 1 % BSA v PBS-T a inkubací 1 hodinu při pokojové teplotě. Následně byly naneseny primární protilátky ředěné 1:100 v PBS-T – Tp sérum a negativní sérum sloužící jako kontrola (viz tabulka 9.). Inkubace probíhala 2 hodiny při pokojové teplotě. Jamky byly opět 3x propláchnuty roztokem PBS-T a následně byla do jamek nanesena sekundární protilátka ředěná 1:1000 v PBS-T. Po 1 hodině inkubace při pokojové teplotě byly jamky znovu 3x propláchnuty roztokem PBS-T. Reakce byla na závěr vizualizovaná nanesením TMB substrátu temperovaným na pokojovou teplotu. Po vyvinutí barvy byla reakce ukončena přidáním 1M HCl a byla změřena absorbance při 450 nm na ELISA readeru.

Tabulka 9. Schéma nanesení antigenů a primárních protilátek na mikrotitrační destičku

1 2 3 4 Homogenát + Tp Homogenát + Tp A Ts + Tp sérum Ts + Tp sérum sérum sérum Homogenát + Homogenát + Ts + negativní Ts + negativní B negativní sérum negativní sérum sérum sérum Homogenát bez Homogenát bez Ts bez primární Ts bez primární C primární protilátky primární protilátky protilátky protilátky

D Bez Ag Bez Ag Bez Ag Bez Ag

5.1.4. Imunoblot

5.1.4.1. Přístroje

 Aparatura na elektroforézu – Mini-PROTEAN Tetra Cell (BIO RAD)  Blotovací přístroj - Trans-Blot® Turbo™ Transfer Systém (BIO RAD)  Třepačka – Orbital Shaker PSU-10i (Grant-bio)

5.1.4.2. Chemikálie a spotřební materiál

 Antigeny – peptidy Ts navázané na poly-L-lysinovém nosiči – homogenát Trichinella pseudospiralis  Primární protilátky – Tp sérum – negativní sérum Porsing neg  Sekundární protilátka – Anti pig  Gradientový gel (4-15%) – Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Precast Gel  TGS pufr – obsahuje redukční činidlo SDS  Redukující vzorkovací pufr  Marker – BenchMark™ Pre-stained Protein Ladder (Life technologies)  Blotovací pufr  PBS-T (PBS + 0,05 % Tween-20)  Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad)

5.1.4.3. Pracovní postup

Na začátku byla provedena elektroforéza stejně jako v kapitole 5.1.2. Jamky 2, 3 a jamky 4, 5 byly však spojeny a zaplněny zkoumanými vzorky se vzorkovacím pufrem (viz tabulka 10.). 1D-elektrolýza probíhala za napětí 165 V.

Tabulka 10. Schéma zaplnění jamek gelu

Jamka 1 2 3 4 5 Peptidy Tp navázané na poly- Vzorek Marker Homogenát T. pseudospiralis L-lysinovém nosiči

Po elektroforéze byl gel vyjmut a vložen na 5 minut do blotovacího pufru. Následoval elektrotransfer na PVDF membránu. Gel byl přiložen na PVDF membránu aktivovanou methanolem a poté byl gel i membrána vloženy mezi dva filtrační papíry nasáté blotovacím pufrem. Tento komplex byl vložen do blotovacího přístroje, kdy procházející proud přenesl separované proteiny z gelu na membránu. Z membrány byl odříznut marker a její zbytek byl rozřezán na 6 stejně širokých svislých pásů tak, aby každému vzorku náležely právě 3 pásy. Tyto pásy byly vloženy do inkubační vaničky a byly blokovány roztokem tvořeným 5 % odtučněného mléka, 2,5 % BSA a 0,05 % Tween-20. Inkubací přes noc při 4 °C se zabránilo tvorbě nespecifických vazeb. Po odstraněné blokovacího roztoku byly přidány primární protilátky ředěné 1:100 v PBS- T s 2,5 % BSA (viz tabulka 11.) a inkubace probíhala 1,5 hodiny.

Tabulka 11. Schéma nanesení primárních protilátek

Peptidy Tp navázané na poly-L- Antigen Homogenát T. pseudospiralis lysinovém nosiči Jamka 1 2 3 4 5 6 Bez Bez Primární Negativní Negativní Tp sérum primární Tp sérum primární protilátka sérum sérum protilátky protilátky

Následně byly membrány 3x po 5 minutách promyty PBS-T a byla nanesena sekundární protilátka ředěná 1:1000 v PBS-T. Inkubace probíhala 1 hodinu. Nakonec byly membrány znovu stejným způsobem promyty (3 x 5 minut v PBS-T) a reakce byla vizualizovaná přidáním substrátu (kit Opti-4CN Substrate Kit).

5.2. Výsledky a diskuze

5.2.1. Hydropathicity plot

V následující tabulce jsou zobrazeny aminokyselinové sekvence proteinů. Tyto sekvence byly vloženy do programu Hydropathicity plot a v těchto sekvencích i grafech jsou vyznačeny použité peptidy. Hydropathicity plot dle Hopp-Woods algoritmu zobrazuje všechny hydrofilní části proteinu nad nulou vyznačené na ose y a naopak všechny hydrofobní části pod ní. Osa x udává 43 pořadí aminokyselin. V grafech se všechny peptidy vyskytují právě nad nulou, tedy lze předpokládat, že jsou vybrané peptidy imunogenní a mohou být použity jako antigenní determinanty v peptidových vakcínách.

Tabulka 12. Aminokyselinové sekvence proteinů s vyznačenými peptidy a hydropathicity plot

43 kDa secreted glycoprotein (Trichinella spiralis)

MRIYIFLSAFWVILHNCLQIHAANCTCRTATDDTEWFLLFKPVGLLKAKIISPANAGWAN DGANMNTDSGHALVQTLAEWMGPILDDMTALGYSNTPPKSTITSQTTSSKGILMFGNET TDGFWLLHTFERAFPNSVAWSWPSKFTSEGHMALCLSISEDNVPLIVPALQYQEVVIYFG QVSSEKATEFADLTSLIDGSLPTITPPLWNQQTITTLNSALSTVVYSKTSSSRLEMYGSFL AKVMVVNMRIWAVTDNTLQTTCGGKIGFVKVVKSPVTIDGTQNDRSKDKSQWAVIDD KPVFCFTTNGYSTKQRTVAGSATCITQQVVSNLFATSAANFIPCPY

Multi cystatin-like domain protein precursor (Trichinella spiralis)

MSFMHCIFVVLFFAVGEAQILGETTHYGRNDPVMLRNAHEALFSSDLKQESGVFHKLLE LEESSTMGILTTMKVVMQDTDCPVSFALLSYYDVLVNCQGEGRRKHCTMEYTHRNPSK ATVSKCFEEVEEPLIIPQRVKMIGGRAVYIDSNADVEEQMQMLGETTHYGRNDPVMLPK AREALFSSDSKEQSGVLHKLVELEESSTMGILTTMKVVIQDTECRVSSAYSSYYDVLHY CHGKGPRKHCTLEYRHRTPSTATVSECFEEVEEPLIVPQRVQRVNGRTIYLDSSDDVEEQ VVSQRSQMLGGTTKYTDSNVHIKEEVKQAIFESDKKKSSGTYLLLDKIVEGFNMGISSRF QVLVKETECDIKEKAFNSYEDVYKNCSGSGDSKVCSVEYKYFDPTKSTVEC

53 kDa excretory-secretory antigen (Trichinella spiralis)

MFSITLNLFIIAFVNFQLCTCSTDNENVAMKEMTFSVPISVLQNERQFDENKLKKLLKPL GKLYKTPSDKGIPISRTEATLSVEKMMVELNRLIQKEYSFLYKQYQKLKTVQQAEKCDD TTNVYTVTLQNTDCESKPIIEGSPATNCSDVENKHPLSCSILSKVASAEEKIIGAYCSVHL EESFPKKKSICKLSRYPGEEKFKTFVPEDVSSWFHDAIVYVPTGNRPQSNSKHSNNYRGR QGIAGLGMLPHLGAVQMNVVTIFRKNGKTTEVLSLINANDSIEIPKVFVTNPIQKPFGDEI DRILRKAFDTMELSNSDKEDKLQKLYNATISTKVKHRATPYDTDDAYVITEVAGVFDEN KEHIGSIDKFPSDGNLQIGWKEADKSALRLKRFAKPPKGFFQHVFSELQLLF

Triose Phosphate Isomerase (Trichobilharzia szidati)

MPESRKFFVGGNWKMNGSLSDNDKLIQILSEAQFGENIEVLVAPPSIYLREVRARLKKNI HVAAQNCYKLPKGAFTGEISPAMIKDVGCEWVILGHSERRNIFGEPDELIAEKVQHAIAE GLSVIACIGETLSEREANKTEEVCVRQLKAIANKIKSADEWQRIVVAYEPVWAIGTGKV ATPTQAQEVHNFLRKWLKSNAPAGVDEKLRIIYGGSVTAANCKELAQQPDVDGFLVGG ASLKPEFIDICKAR

5.2.2. 1-D elektroforéza a hmotnostní spektrometrie

Na obrázku 9. je fotografie gelu z 1-D elektroforézy. U „vakcíny“ proti T. spiralis i proti T. szidati byla potvrzena přítomnost proteinů. Nejvíce se ho nacházelo ve zkoncentrovaných vzorcích, méně v nezkoncentrovaných. Ve vzorcích obsahujících filtráty se protein objevit neměl, což se potvrdilo. Ve vzorku s poly-L-lysinem se správně žádný protein neobjevil, protože takový nosič obsahuje dle informací výrobce průměrně 4 – 16 lysinových jednotek a největší molekula by tedy měla cca 2 kDa, tedy méně než je nejnižší hodnota v markeru (146,19 · 16 = 2339,04 Da). Tmavý oblak peptidu TPI je způsoben příliš vysokou koncentrací peptidu.

Vyznačené oblasti gelu ze zkoncentrovaného vzorku obsahujícího peptidy T. spiralis a dva proteiny ze zkoncentrovaného vzorku s peptidem T. szidati byly vyříznuty a dále identifikovány hmotnostní spektrometrií (výsledky hmotnostní spektroskopie budou pravděpodobně až součástí obhajoby bakalářské práce).

Obrázek 9. Fotografie gelu z 1-D elektroforézy

5.2.3. ELISA

Byla testována reakce syntetizovaného vzorku šesti peptidů T. spiralis navázaných na poly-L-lysinovém nosiči s pozitivním sérem získaným po infekci T. pseudospiralis, které vykazuje zkřížené reakce. Jako kontrola sloužil homogenát T. pseudospiralis.

Tabulka 13. Výsledné naměřené absorbance při 450 nm

1 2 3 4

A 0,079 0,091 0,068 0,067 B 0,477 0,478 0,422 0,318 C 0,092 0,072 0,144 0,069 D 0,12 0,063 0,063 0,058

Graf 2. Srovnání reakcí testovaného vzorku a homogenátu s různými primárními protilátkami

0,6

] 0,5

nm [

0,4

0,3

0,2

0,1 Absorbance při 450nm 450nm při Absorbance

0 Tp sérum Negativní sérum Bez primární Bez antigenu protilátky Primární protilátka

Homogenát T. pseudospiralis Proteiny Ts navázené na poly-L-lysinovém nosiči

Negativní kontroly představovaly reakce s negativním sérem, test bez primární protilátky a test bez antigenu. U testů bez primární protilátky a bez antigenu vyšly nízké absorbance, jak bylo očekáváno. U reakce s negativním sérem byly předpokládány též nízké, avšak byly naměřeny nejvyšší absorbance. Test ELISA tedy mohl detekovat neočekávané nespecifické reakce s negativním sérem. Naopak při reakci s Tp sérem měly testované antigeny reagovat nejvíce a měly tak být naměřené absorbance nejvyšší, tento předpoklad ale nebyl potvrzen. Nelze vyloučit možnost neúmyslné záměny Tp séra a negativního séra, ale opakovaný test, který by chybu vyloučil, nebyl kvůli časovým důvodům proveden.

5.2.4. Imunoblot

Touto imunologickou metodou byly testovány antigenní vlastnosti stejného vzorku jako v metodě ELISA a byly použity i totožné kontroly. Byla očekávána reakce testovaného vzorku a homogenátu s Tp sérem, avšak žádné reakce s využitím této metody detekovány nebyly. Žádné reakce nebyly prokázány ani v případě membrán s negativním sérem a bez primární protilátky, čímž byl potvrzen předpoklad. Opakování testu pro vyloučení jakýchkoliv chyb, nebylo provedeno. 49

Obrázek 10. Fotografie výsledků metody imunoblot

6. Závěr

Předložená bakalářská práce shrnuje informace o vakcínách a jejich vývoji a ubírá se směrem zaměřeným na infekce způsobované parazitickými helminty. Právě helmintózy představují pro lidstvo poměrně velký problém. I přesto, že existují antihelminitika, kterými je možné částečně tyto infekce kontrolovat, vývoj vakcíny proti helmintům by představoval velký pokrok v humánní i veterinární medicíně. Vakcinologie si do budoucna klade hned několik cílů, mezi které patří právě nahrazení současných léků a očkovacích látek takovými, které by měly vyšší účinnost a bezpečnost a nižší náklady a zároveň si musí ponechat některé důležité vlastnosti jako je například dlouhodobá účinnost a snadná imunizace. Dalším neméně důležitým cílem je hledání nových vakcín proti již existujícím problematickým infekcím, ale i těm, které se mohou v budoucnu objevit. Experimentální část pojednává o přípravě peptidové vakcíny založené na představě navázat dostatečně antigenní epitopy některých exkrečně-sekrečních produktů helmintů na nosič a připravit tak molekulu, která by vyvolávala uspokojivou protektivitu a zároveň nevyvolávala vedlejší reakce běžně způsobované zbytečnými komponentami vakcín. I přes to, že se v experimentální části této bakalářské práce nepodařilo dokázat imunogenní vlastnosti syntetizované molekuly, není představa peptidových vakcín proti helmintům nereálná. Naopak mnoho vědeckých týmů se jejich výzkumem zabývá a se stále zlepšujícími se technickými i jinými možnostmi je jen otázkou času, než takovou vakcínu získáme.

7. Použitá literatura

Abbas A. K, Hlichtman A., Polla S. (2012): Basic immunology: functions and disorders of the immune systém, Vyd. 5., 320 s., ISBN 14-557-0707-4.

Ahmad Fuaad A. A., Roubille R., Pearson M. S., Pickering D. A., Loukas A. C., Skwarczynski M., Toth I. (2015): The use of a conformational cathepsin D-derived epitope for vaccine development against Schistosoma mansoni. Bioorganic, 23 (6), 1307-1312, DOI: 10.1016/j.bmc.2015.01.033. Anthony R. M., Rutitzky L. I., Urban J.F., Stadecker M. J., Gause W. C. (2007): Protective immune mechanisms in helminth infection. Nature Reviews Immunology, 7 (12), 975-987, DOI: 10.1128/9781555816872.ch28. Bain R. K. (1999): Irradiated vaccines for helminth control in livestock. International Journal for Parasitology, 29 (1), 185-191, DOI: 10.1016/b978-0-7506-9265-6.50011-7.

Baxby D. (1999): Edward Jenner's Inquiry; a bicentenary analysis. Vaccine, 17 (4), 301-307, DOI: 10.1016/s0264-410x(98)00207-2.

Ben-Yedidia T., Arnon R. (1997): Design of peptide and polypeptide vaccines. Current Opinion in Biotechnology, 8 (4), 442-448. Beran J., Havlík J. (2008): Lexikon očkování. Praha. ISBN 978-807-3451-646.

Beran J., Havlík J., Vonka V. (2005): Očkování: minulost, přítomnost, budoucnost. Vyd. 1. Praha: Galén, 348 s. ISBN 80-726-2361-3.

Berg J. M., Tymoczko J. L., Stryer L. (2002): Biochemistry, Vyd. 5., New York: W.H. Freeman, ISBN 07-167-3051-0. Clem A. S. (2011): Fundamentals of vaccine immunology. Journal of Global Infectious Diseases. 3 (1), 73-78, DOI: 10.4103/0974-777X.77299.

Domorázková E. (1997): Očkování v praxi praktického lékaře. Vyd. 1., Praha: Grada, 105 s. ISBN 80-716-9481-9.

Dougall A. M., Skwarczynski M., Khoshnejad M., Chandrudu S., Daly N. L., Toth I., Loukas A. (2014): Lipid core peptide targeting the cathepsin D hemoglobinase of Schistosoma mansoni as a component of a schistosomiasis vaccine. Human Vaccines, 10 (2), 399-409, DOI: 10.4161/hv.27057. El Ridi R., Montash M., Tallima H. (2004): Immunogenicity and Vaccine Potential of Dipeptidic Multiple Antigen Peptides from Schistosoma mansoni Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase. Scandinavian Journal of Immunology, 60 (4), 392-402, DOI: 10.1111/j.0300-9475.2004.01497.x. Eldred B. E., Dean A. J., McGuire T. M., Nash A. L. (2006): Vaccine components and constituents: responding to consumer concerns. The medical journal of Australia, 184 (4), 170-175. 52

Fenner F. (1988): Smallpox and its eradication. Geneva: World Health Organization, 246-252, ISBN 9241561106.

Flingai S., Czerwonko M., Goodman J., Kudchodkar S. B., Muthumani K., Weiner D. B. (2013): Synthetic DNA Vaccines: Improved Vaccine Potency by Electroporation and Co- Delivered Genetic Adjuvants, Frontiers in Immunology, 4, DOI: 10.3389/fimmu.2013.00354.

Gallagher S., Chakavarti D. (2008): Immunoblot Analysis. Journal of Visualized Experiments, 16, DOI: 10.3791/759. Gegg C.V., Etzler M. E. (1993): Directional Coupling of Synthetic Peptides to Poly-L-Lysine and Applications to the ELISA. Analytical Biochemistry, 210 (2), 309-312, DOI: 10.1007/978-94-010-9595-2_96. Grundy I. (2000): Montagu’s variolation. Endeavour. 2000, 24 (1), 4-7, DOI: 10.1016/s0160- 9327(99)01244-2.

Hampl F., Rádl S., Paleček J. (2007): Farmakochemie, Vyd. 2., Praha: VŠCHT, 450 s., ISBN 978-80-7080-639-5. Hewitson J. P., Maizels R. M. (2014): Vaccination against helminth parasite infections, Expert Review of Vaccines, 13 (4), 473-487, DOI: 10.1586/14760584.2014.893195.

Hořejší V., Bartůňková J. (2005): Základy imunologie. Vyd. 3., Praha: Triton, 2005, 279 s. ISBN 80-725-4686-4.

Hotez P. J., Brindley P. J., Bethony J. M., King C. H., Pearce E. J., Jacobson J. (2008): Helminth infections: the great neglected tropical diseases. Journal of Clinical Investigation, 118 (4), 1311-1321, DOI: 10.1172/JCI34261.

Issouf M., Guégnard F., Koch Ch., Le Vern Y., Blanchard-Letort A., Che H., Beech R. N., Kerboeuf D., Neveu C., Aroian R. V. (2014): Haemonchus contortus P-Glycoproteins Interact with Host Eosinophil Granules: A Novel Insight into the Role of ABC Transporters in Host-Parasite Interaction. PLoS ONE., 9 (2), DOI: 10.1371/journal.pone.0087802.

Jíra J. (1998): Lékařská helmintologie: helmintoparazitární nemoci. Vyd. 1., Praha: Galén, 495 s., ISBN 80-858-2482-5. Li W., Joshi M. D., Singhania S., Ramsey K. H., Murthy A. K. (2014): Peptide Vaccine: Progress and Challenges. Vaccines, 2 (3), 515-536, DOI: 10.3390/vaccines2030515. Loukas A., Bethony J., Brooker S., Hotez P. (2006): Hookworm vaccines: past, present, and future. The Lancet Infectious Diseases, 6 (11), 733-741, DOI: 10.1016/S1473- 3099(06)70630-2.

Maizels R. M., Balic A., Gomez-Escobar N., Nair M., Taylor M. D., Allen J. E. (2004): Helminth parasites - masters of regulation. Immunological Reviews, 201 (1), 89-116, DOI: 10.1111/j.0105-2896.2004.00191.x.

Maizels R. M., Gomez-Escobar N., Gregory W. F., Murray J., Zang X. (2001): Immune evasion genes from filarial nematodes. International Journal for Parasitology, 31 (9), 889-898, DOI: 10.1007/978-4-431-55381-6_11.

Meeusen E. N. T., Walker J., Peters A., Pastoret P.-P., Jungersen G. (2007): Current Status of Veterinary Vaccines. Clinical Microbiology Reviews, 20 (3), DOI: 10.1128/CMR.00005- 07.

Moisa A. A., Kolesanova E. F. (2012): Synthetic Peptide Vaccines, Insight and Control of Infectious Disease in Global Scenario, Dr. Roy Priti (Ed.), ISBN: 978-953-51-0319-6. Munn E. A. (1996): Rational design of nematode vaccines: Hidden antigens. International Journal for Parasitology, 27 (4), 359-366, DOI: 10.1016/s0020-7519(97)00003-9.

Newton S. E., Meeusen E. N. T. (2003): Progress and new technologies for developing vaccines against gastrointestinal nematode parasites of sheep. Parasite Immunology, 25 (5), 283- 296, DOI: 10.1002/9783527652969.ch24.

Offit P. A.,Jew R. K. (2003): Addressing Parents’ Concerns: Do Vaccines Contain Harmful Preservatives, Adjuvants, Additives, or Residuals?, Pediatrics, 112 (6).

Okuda T., Kidoaki S., Ohsaki M., Koyama Y., Yoshikawa K., Niidome T., Aoyagi H. (2003): Time-dependent complex formation of dendritic poly(L-lysine) with plasmid DNA and correlation with in vitro transfection efficiencies. Org. Biomol. Chem, 1 (8), 1270-1273, DOI: 10.1039/b212086k. Orenstein W., Seib K. (2014): Mounting a Good Offense against Measles. New England Journal of Medicine, 371 (18), 1661-1663. DOI: 10.1056/NEJMp1408696.

Orenstein, W. A., Papania M. J., Wharton M. E. (2004): Measles Elimination in the United States. The Journal of Infectious Diseases, 189, S1-S3. DOI: 10.1086/377693.

Parthasarathy (2006): IAP textbook of pediatrics, Vyd. 3., Jaypee Brothers Medical Publishers, ISBN 81-806-1495-6.

Piedrafita D., Preston S., Kemp J., Veer M., Sherrard J., Kraska T., Eelhay M., Meeusen E. (2013): The Effect of Different Adjuvants on Immune Parameters and Protection following Vaccination of Sheep with a Larval-Specific Antigen of the Gastrointestinal Nematode, Haemonchus contortus, PLoS ONE, 8 (10), DOI: 10.1371/journal.pone.0078357.

Plotkin S. (2014): History of vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111 (34), 12283-12287, DOI: 10.1073/pnas.1400472111.

Plotkin S. A. (2005): Vaccines: past, present and future. Nature Medicine, 10, S5-S11, DOI: 10.1038/nm1209.

Rappuoli R., Mandl Ch. W., Black S., De Gregorio E., (2011): Vaccines for the twenty-first century society. Nature Reviews Immunology, DOI: 10.1038/nri3085.

Rees-Roberts D., Mullen L. M., Gounaris K., Selkirk M. E. (2010): Inactivation of the complement anaphylatoxin C5a by secreted products of parasitic nematodes. International Journal for Parasitology, 40 (5), 527-532, DOI: 10.1016/j.ijpara.2009.10.006. Sette A., Fikes J. (2003): Epitope-based vaccines: an update on epitope identification, vaccine design and delivery. Current Opinion in Immunology, 15 (4), 461-470, DOI: 10.1016/S0952-7915(03)00083-9 Skwarczynski M., Dougall A. M., Khoshnejad M., Chandrudu S., M. S. Pearson M. S., Loukas A., Toth I., Diemert D. J. (2012): Peptide-Based Subunit Vaccine against Hookworm Infection. PLoS ONE, 7 (10), DOI: 10.1371/journal.pone.0046870. Smith K. A. (2012): Louis Pasteur, the Father of Immunology? Frontiers in Immunology, 3, 1- 10, DOI: 10.3389/fimmu.2012.00068.

Starobová O., Landa L., Nováková J., Šulcová A. (2006): Výzkum nových léčiv od zrodu k registraci. Multimediální podpora výuky klinických a zdravotnických oborů: portál Lékařské fakulty Masarykovy univerzity. Summers R. W., Elliot D. E., Urban J. F., Thompson R., Weinstock J. V. (2005): Trichuris suis therapy in Crohn's disease. Gut, 54 (1), )87-90, DOI: 10.1136/gut.2004.041749. Tam J. P. (1988): Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system. Proceedings of the National Academy of Sciences, 85 (15), 5409-5413, DOI: 10.1007/0-306-46859-x_52. Tam J. P., Spetzler J. C. (1997): Multiple antigen peptide system. Methods in enzymology. 289, 612-637, DOI: 10.1016/S0076-6879(97)89067-2. Ullmann A. (2007): Pasteur–Koch: Distinctive Ways of Thinking about Infectious Diseases. Microbe, 2 (8), 383-387.

Uray K., Hudecz F. (2014): Peptide epitopes: identification and structural modifications of synthetic antigens. Amino Acids, Peptides and Proteins, 39, 68-113, DOI: 10.1039/978-1- 84973-996-2-00068. Venkataswamy M. M., Goldberg M. F., Baena A., Chan J., Jacobs W. R., Porcelli S. A. (2012): In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine, 30 (6), 1038-1049, DOI: 10.1016/j.vaccine.2011.12.044.

Vercruysse J., Knox D. P., Schetters T. P. M., Willadsen P. (2004): Veterinary parasitic vaccines: pitfalls and future directions. Trends in Parasitology, 20 (10), 488-492, DOI: 10.1016/j.pt.2004.07.009.

Vilar M. M., Barrientos F., Almeida M., Thaumaturgo N., Simpson A., Garratt R., Tendler M. (2003): An experimental bivalent peptide vaccine against schistosomiasis and fascioliasis. Vaccine, 22 (1), 137-144, DOI: 10.1016/S0264-410X(03)00300-1.

Virginio V. G., Monteiro K. M., Drumond F., Carvalho M. O., Vargas D. M., Zaha A. (2012): Excretory/secretory products from in vitro-cultured Echinococcus granulosus protoscoleces. Molecular and Biochemical Parasitology, 183 (1), DOI: 10.1016/j.molbiopara.2012.01.001. Volf P., Horák P. (2007): Paraziti a jejich biologie. Vyd. 1. Praha: Triton, 318 s. ISBN 978-807- 3870-089.

Wakelin D. (1996): Helminths: Pathogenesis and Defenses. V: Baron S., editor. Medical Microbiology, Vyd. 4, Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; Kapitola 87

WHO (World Health Organization) (2005): Pertussis valine: WHO position paper, Weekly Epidemiological Record Geneva, 80(4), 29-40.

WHO (World Health Organization) (2006): Tetanus vaccine: WHO position paper, Weekly Epidemiological Record Geneva, 81(20), 197–208.

Yang P.-Ch., Mahmood T. (2012): Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences, 4 (9), 428-434, DOI: 10.4103/1947-2714.100998. Yang Y., Ma H. (2009): Western Blotting and ELISA Techniques. Researcher, 2, 67-86. Zabriskie J. B. (2009): Essential clinical immunology: functions and disorders of the immune system. Vyd. 4., Cambridge: Cambridge University Press, 320 s., ISBN 978-051-1465-291.

Zhang N., Zheng B., Lu L., Zhou Y., Jiang S., Du L. (2015): Advancements in the development of subunit influenza vaccines. Microbes and Infection, 17 (2), 123-134, DOI: 10.1016/j.micinf.2014.12.006.

8. Internetové zdroje

Friedman L. (2014): A Disease We Thought Was History Is Making An Alarming Comeback. Dostupné z: http://www.businessinsider.com/measles-outbreak-in-us-at-20-year-high- 2014-11

Leinco Technologies, Inc., Dostupné z: http://www.leinco.com/general_wb NCIRS (National Centre for Immunisation Research and Surveillance of Vaccine Preventable Diseases) (2013): Vaccine components fact sheet, Dostupné z: http://www.ncirs.edu.au/immunisation/fact-sheets/vaccine-components-fact-sheet.pdf

Vavrečka J. (2013): Kauza očkování: Je kolektivní imunita pouze kolektivní iluze? Dostupné z: http://www.vitalia.cz/clanky/18-kauza-ockovani-kolektivni-imunita/