EESTI MAAÜLIKOOL Metsandus- ja maaehitusinstituut

Kati Küngas

VALITUD ENDOFÜÜTSETE SEENTE JA ARMILLARIA spp. ANTAGONISM IN VITRO

Bakalaureusetöö loodusvarade kasutamise ja kaitse erialal

Juhendaja dotsent Bellis Kullman

Tartu 2014

Lõputöö koostasin iseseisvalt. Kõigile töös kasutatud teiste autorite töödele ja andme- allikatele on viidatud. Kinnitan, et annan oma intellektuaalomandi varalised õigused lõputöö suhtes üle Eesti Maaülikoolile.

...... kuupäev/ nimi/ allkiri/

Tunnistan lõputöö kaitsevalmiks.

Juhendaja: …………………………………………...... kuupäev/ nimi/ allkiri

Eesti Maaülikool Bakalaureusetöö lühikokkuvõte Kreutzwaldi 1, Tartu 51014 Autor:Kati Küngas Õppekava:Loodusvarade kasutamine ja kaitse Pealkiri: Valitud endofüütsete seente ja Armillaria spp. antagonism in vitro Lehekülgi: 89 Jooniseid: 9 Tabeleid: 6 Lisasid: 14 Osakond: PKI mükoloogia Uurimisvaldkond: mükoloogia Juhendaja: dotsent Bellis Kullman Kaitsmiskoht ja aasta: Tartu, 2014 Külmaseene ( Armillaria) liigid on levinud üle kogu maailma, nakatades erinevaid peremeestaimi ja põhjustades metsades suurt majanduslikku kahju. Endofüütsed seened elavad peremeestaime sees kahjustusi põhjustamata. Mitmed uurimused on näidanud, et endofüüdid on peremeestaimele kasulikud stimuleerides kasvu ning kaitstes haiguste eest (Gao et al . 2010). Töö eesmärgiks oli külmaseente ja endofüütide vaheliste kaksikkultuurtestide (dual culture tests ) abil uurida endofüütide antagonismi külmaseente suhtes. Töös kasutati 9 erinevat endofüütset seent: Annulohypoxylon multiforme, Aureobasidium pullulans, Epicoccum nigrum, Hypoxylon howeanum, Phoma multirostrata, Phoma var . verbascicola, Fusarium culmorum, Lewia infectoria, Cladosporium tenuissimum ja kolm külmaseene liiki: põhja- külmaseen ( Armillaria borealis), tutt-külmaseen (Armillaria cepistipes), tõmmu külmaseen (Armillaria ostoyae). Uurimuses antakse ülevaade antud katses kasutatavatest endofüütidest biotõrjes ja külmaseentest kui patogeenidest. Töös arvutatakse antagonismiprotsendid iga patogeeni suhtes. Katse läbiviimisel kasutatakse Kusari et al. (2013) metoodikat. Töö tulemusena antakse ülevaade mõnede endofüütide kasutatavusest külmaseente biotõrjes. Kõik valitud endofüütsed seened pärssisid külmaseente kasvu in vitro 2% MEA söötmel. Kõige rohkem pärssis tutt-külmaseene kasvu F. culmorum , tõmmu külmaseene kasvu A. multiforme ja põhja-külmaseene kasvu P. poolensis var . verbascicola (antagonismiprotsent vastavalt 67 ±6,8, 77 ±1,5 ja 79 ±4,2). A. multiforme pärssis nii põhja- külmaseene kui ka tõmmu külmaseene kasvu kõikides katses üle 70%. Antud töös parimateks külmaseente tõrjujateks olid A. multiforme , P. poolensis var . verbascicola ja E. nigrum. Endofüütset seent A. multiforme võib soovitada ka teiste külmaseente liikide, näiteks A. mellea vastu , kes põhjustab üle maailma majanduslikku kahju nii põllumajanduses kui ka metsanduses. Tuvastamaks parimaid endofüütseid seenetüvesid külmaseente biotõrjeks, tuleks edaspidises töös katsetada puude nakatamist endofüütidega looduses ja kasutada spetsiifilisi bioloogiliselt aktiivseid ühendeid, mida endofüüdid oma elutegevuse käigus toodavad. Märksõnad: endofüüdid, Armillaria spp., antagonism, kaksikkultuurtest, biotõrje

Estonian University of Life Sciences Abstract of Bachelor’s Thesis Kreutzwaldi 1, Tartu 51014 Author: Kati Küngas Specialty: Managment of natural resources Title: Antagonistic effect of selected endophytic fungi against Armillaria spp. in vitro Pages: 89 Figures: 9 Tables: 6 Appendixes: 14 Department: PKI mycology Field of research: mycology Supervisors: assistant professor Bellis Kullman Place and date: Tartu, 2014 Armillaria spp. is widespread around the world. The host range of Armillaria spp. is wide, it can infect many host species and causes serious economic loss to forests. Endophytic fungi are microbes that live in the healthy tissue of the host plant causing no damage. There are many studies showing that endophytes are beneficial to their hosts stimulating growth and providing protection from diseases (Gao et al .2011). The aim of this study was to perform dual culture tests between Armillaria spp. and endophytic fungi to evaluate the antagonistic effect between these species. Nine different endophytic fungi were used in this study: Annulohypoxylon multiforme, Aureobasidium pullulans, Epicoccum nigrum, Hypoxylon howeanum, Phoma multirostrata, Phoma var. verbascicola, Fusarium culmorum, Lewia infectoria, Cladosporium tenuissimum and three Armillaria spp. species: A. borealis, A. cepistipes, A. ostoyae. This study gives an overview of endophytes currently used as biocontrol agents in the world and of Armillaria spp. as pathogens. Percentages of antagonism against each pathogen were calculated in the assay. The methodology of Kusari et al. (2013) was used in the dual culture tests. The results of this study give an overview of the potential of some endophytic fungi as a source of biocontrol agents against Armillaria spp. All selected endophytic fungi inhibited the growth of Armillaria spp. in vitro using MEA 2% media. F. culmorum inhibited the growth of A. cepistipes the most (percentage of antagonism 67 ±6.8). A. multiforme inhibited the growth of A. ostoyae the most (percentage of antagonism 77 ±1.5). P. poolensis var. verbascicola inhibited the growth of A. borealis the most (percentage of antagonism 79 ±4.2). In each test A. multiforme inhibited the growth of A. ostoyae and A. borealis over 70%. A. multiforme, P. poolensis var . verbascicola and E. nigrum are considered, in this study, the best biocontrol agents against Armillaria spp. Endophytic fungus A. multiforme should also be tested against other Armillaria species such as A. mellea that causes economic loss to forests and the agricultural sector on a global scale. In the future, further studies should be conducted with endophyte infected trees and also into disease control by specific biologically active compounds produced by endophytes in order to select the most fitting species for biological control against Armillaria spp. Keywords: Endophytes, Armillaria spp., antagonism, dual culture tests, biocontrol

SISUKORD

Sissejuhatus ...... 7 1. Kirjanduse ülevaade ...... 9 1.1. Endofüütsete seente kasutatavus biotõrjes ...... 9 1.2. Valitud endofüütsed seened ...... 10 1.2.1. Annulohypoxylon multiforme ja Hypoxylon howeanum ...... 10 1.2.2. Fusarium culmorum ...... 11 1.2.3. Aureobasidium pullulans ...... 12 1.2.4. Caldosporium tenuissimum ...... 12 1.2.5. Phoma multirosrtata ja Phoma poolensis. var . verbascicola ...... 13 1.2.6. Epicoccum nigrum ...... 14 1.2.7. Lewia infectoria ...... 15 1.3. Perekond külmaseen ( Armillaria ) ...... 16 1.3.1. Külmaseene keemiline ja bioloogiline tõrje ...... 19 1.3.2. Valitud külmaseene liigid ...... 20 1.3.2.1. Põhja- külmaseen ( Armillaria borealis ) ja tutt-külmaseen ( Armillaria cepistipes ) ...... 20 1.3.2.2. Tõmmu külmaseen ( Armillaria ostoyae ) ...... 20 2. Materjal ...... 22 3. Metoodika ...... 24 4. Tulemused ...... 27 4.1. Endofüütide antagonistlik toime põhja-külmaseenele ( Armillaria borealis ) ...... 28 4.1.1. Liigi Hypoxylon howeanum toime ...... 30 4.1.2. Liigi Fusarium culmorum toime ...... 30 4.1.3. Liigi Aureubasidium pullulans toime ...... 30 4.1.4. Liigi Cladosporium tenuisimmum toime ...... 31 4.1.5. Liigi Phoma poolensis var. verbascicola toime...... 31

4.1.6. Liigi Phoma multirostrata toime ...... 31 4.1.7.Liigi Epicoccum nigrum toime ...... 32 4.1.8. Liigi Annulohypoxylon multiforme toime ...... 32 4.1.9. Liigi Lewia infectoria toime ...... 33 4.2. Endofüütide antagonistlik toime tutt-külmaseenele ( Armillaria cepistipes ) ...... 33 4.2.1.Liigi Hypoxylon howeanum mõju ...... 35 4.2.2. Liigi Fusarium culmorum toime ...... 35 4.2.3. Liigi Aureobasidium pullulans toime ...... 35 4.2.4. Liigi Cladosporium tenuissimum toime ...... 36 4.2.5. Phoma poolensis var. verbascicola toime ...... 36 4.2.6. Liigi Phoma multirostrata toime ...... 37 4.2.7. Liigi Epicoccum nigrum toime ...... 37 4.2.8. Liigi Annulohypoxylon multiforme toime ...... 37 4.2.9. Liigi Lewia infectoria toime ...... 38 4.3. Endofüütide antagonistlik toime tõmmu külmaseenele ( Armillaria ostoyae ) ...... 38 4.3.1. Liigi Hypoxylon howeanum toime ...... 40 4.3.2. Liigi Fusarium culmorum mõju ...... 40 4.3.3. Liigi Aureobasidium pullulans toime ...... 40 4.3.4. Liigi Cladosporium tenuissimum toime ...... 41 4.3.5. Liigi Phoma poolensis var . verbascicola toime...... 41 4.3.6. Liigi Phoma multirostrata toime ...... 41 4.3.7. Liigi Epicoccum nigrum toime ...... 42 4.3.8. Liigi Annulohypoxylon multiforme toime ...... 42 4.3.9. Liigi Lewia infectoria toime ...... 43 5. Arutelu ...... 44 Kokkuvõte ...... 48 Viidatud allikate loetelu ...... 50 LISAD ...... 61 Lisa 1. Lühendid ...... 61 Lisa 2. Külmaseente kontrollkatse kasv 33 päeva jooksul ...... 62 Lisa 3. Põhja-külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 1) ...... 63 Lisa 4. Põhja- külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 2) ...... 65 Lisa 5. Põhja külmaseene kasv 33 päeva jooksul (Katse 3) ...... 67

Lisa 6. Tutt-külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 1) ...... 69 Lisa 7. Tutt-külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 2) ...... 71 Lisa 8. Tutt-külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 3) ...... 73 Lisa 9. Tõmmu külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse1) ...... 75 Lisa 10. Tõmmu külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 2) ...... 77 Lisa 11. Tõmmu külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 3) ...... 79 Lisa 12. Põhja-külmaseene ( Armillaria borealis ) katsed ...... 81 Lisa 13. Tutt-külmaseene ( Armillaria cepistipes ) katsed ...... 84 Lisa 14. Tõmmu külmaseene ( Armillaria ostoyae ) katsed ...... 87

Sissejuhatus

Metsa on inimesed tähtsaks pidanud läbi ajaloo ja tänapäevalgi on puit majanduses väga tähtsal kohal. Mets katab Eestist 50,6% ehk 2,3 miljonit hektarit (Keskkonnaamet). Seega on oluline roll ka puudega seonduvatel haigustel ning nende ennetamisel ja vähendamisel. Eestis on põhiliseks metsa kahjustajateks patogeensed seened, mis moodustavad 2/3 kogukahjustustest (Eesti Keskkonnanäitajad 2012). Külmaseen tekitab erinevatel taimedel juuremädanikke. Liigi biotõrjeks on katsetatud perekond Trichoderma liike (Tarus et al . 2003). Taimede juuremädanike biotõrjet on uuritud juba 1920ndatel, aga tänapäevani pole häid näiteid nende kasutamisest praktikas (Campell 1989).

Endofüütseid seened elavad taimekudedes kahjustusi tekitamata. Arvatavasti leidub neid kõigis taimedes (Arnold et al . 2000). Teadaolevalt toodavad endofüüdid kasulikke aineid, mis kaitsevad taime herbivooride ja parasiitide eest, tõstavad taime põuakindlust ning aitavad peremehel paremini taluda toitainete puudust ja stressi (Cheplick ja Clay 1988, Lewis 2004, Ren et al. 2007, Vega et al. 2008).

Bakalaureuse töö eesmärgiks on määrata patogeensete külmaseente ja valitud endofüütsete seente antagonismi. Termini antagonismi all mõistetakse organismide olelussuhet, milles üks liik kannatab teise elutegevuse läbi (ökoloogialeksikon 1992 sub. antagonism). Töös uurititakse kolme külmaseene: tutt-külmaseene ( Armillaria cepistipes ), tõmmu külmaseene (Armillaria ostoyae ) ja põhja-külmaseene ( Armillaria borealis ) ning üheksa endofüütse seene:Annulohypoxylon multiforme, Aureobasidium pullulans, Epicoccum nigrum, Phoma multirostrata, Lewia infectoria, Phoma poolensis var . verbascicola, Fusarium culmorum, Cladosporium tenuissimum, Hypoxylon howeanum vastastikust mõju. Uuringus kasutatakse Kusari et al . poolt kirjeldatud metoodikat (2013).

7

Töö teema valimisel lähtuti autori huvist antud valdkonnas ning töö vajalikkusest kahjuri tõrjumisel. Haigustekitajate tõrjumiseks kasutatakse maailmas palju kemikaale, aga keskkonnasõbralikum oleks kasutada looduslikke vahendeid. Tulevikus tahetakse katses antagonismi ilmingutega endofüütseid seeni täpsemalt uurida ja rakendada viimaseid külmaseene biotõrjes.

Töö on jagatud viieks osaks. Esimeses osas antakse katses kasutatud liikide ülevaade kirjanduse põhjal. Teises osas tuuakse välja töös kasutatavate liikide andmed. Kolmandas osas kirjeldatakse töös kasutatavat metoodikat. Neljanadas osas esitatakse katses saadavad tulemused. Viiendas osas käsitletakse endofüütsete seente kasutatavusest külmaseene tõrjes.

Avaldan tänu dotsent Bellis Kullmanile juhendamise ja nõu eest lõputöö tegemisel. Tänan kõiki põllumajandus- ja keskkonnainstituudi mükoloogia osakonna töötajaid, eriti Triin Varvast ja Anu Kollomit, labori ja vahendite kasutamise võimaluse ja kogemuste ning õpetussõnade eest. Tänuavaldused Eesti Maaülikooli metsapatoloogia osakonnale külmaseente puhaskultuuride ja Eesti Maaülikooli põllumajandus- ja keskkonnainstituudi mükoloogia osakonnale seente eluskultuuride kollektsiooni (TFC) endofüütsete seente eest.

8

1. Kirjanduse ülevaade

1.1. Endofüütsete seente kasutatavus biotõrjes

Endofüütseteid seeni on uuritud nendest loodetava kasu saamise eesmärgil. Endofüütsed seened elavad taimede rakkudes või rakkude vahelises alas ning paljud neist stimuleerivad peremeest tootma aineid, mis kaitsevad neid kahjurite ja põua eest (Gao et al . 2010). Arvatakse, et endofüütseid seeni võib Maal elada 1,3 miljonit (Dreyfuss ja Chapela 1994, viidatud Kumar et al . 2013 kaudu; Fávaro et al. 2012). Endofüütseid seeni leidub kõige rohkem troopika taimedes. Paljud puudes elavad endofüütsed seened on leitud ka teistest substraatidest (Pirttilä et al. 2011). See näitab, et endofüütsed seened asustavad mitmeid keskkondi ning vaid vähesed on peremehespetsiifilised.

Väga mitmed teadlased on vastandanud endofüütseid seeni ja patogeene in vitro Petri tassis (Gao et al. 2010, Campell 1989). Kasutades kahjurite tõrjuks nende endi looduslikke vaenlasi, hoiame keskkonda ning samuti võib see majanduslikult kasulik olla. Kindlasti on veel väga mitmed looduslikud ained avastamata, mida toodavad seened konkurentsis teiste liikidega. Tüved, mida on kasutatud biotõrjes, toodavad polüpeptiide, aromaatseid ühendeid, alkaloide ja terpenoide, mis on patogeensetele seentele ebasobivad (Ibid). Endofüütsed seened võivad viimati nimetatud ainete tõttu olla antagonistideks patogeensetele külmaseente liikidele perekonnast Armillaria (Fox 2000: 114).

Bioloogilise kontrolli käigus võivad antagonistid käituda väga erinevalt. Biotõrjes kasutatavad liigid võivad piirata patogeeni levikut ja pärssida nende kasvu ( Ibid ).

9

Üheks võimaluseks on kasutada konkurentsi ehk jätta kahjur ilma toitainetest (Campell 1989: 114). Antud katsesse valiti kiirekasvulised endofüütsed seeneliigid, kes oleksid võimelised konkureerima aeglasemalt kasvavate külmaseentega substraadi pärast. Endofüütsed seened võivad toota antibiootikume või muid toksilisi aineid, mis mõjutavad patogeeni elu. Samuti võivad nad ergutada peremehe kaitsesüsteemi ( Ibid ). Endofüütsete seente sekundaarsed metaboliidid võivad kaitsta permeestaime nakatumast kahjuriga. Katsesse valiti endofüütsed seened, kellel oli teada mitmeid erinevaid bioloogilise tõrje omadusi ning oletatavasti on paljud neist ka peremeestaimedele kasulikud.

1.2. Valitud endofüütsed seened

1.2.1. Annulohypoxylon multiforme ja Hypoxylon howeanum

Annulohypoxylon multiforme kuulub kottseente (Ascomycota) hõimkonda, süsikulaadsete (Xylariales) seltsi ja sugukonda süsikulised (Xylariceae) ning liigi sünonüüm on Hypoxylon multiforme (Elurikkuse andmebaas). Hypoxylon howeanum kuulub kottseente (Ascomycota) hõimkonda, süsikulaadsete (Xylariales) seltsi ja sugukonda süsikulised (Xylariaceae) (Index Fungorum).

Sugukond Xylariaceae toodab mitmeid seentevastaseid aineid nagu tsütohalasiin ja mellein (Whalley ja Edwards 1995, viidatud Bailey 2006 kaudu). Samuti toodavad sugukond Xylariaceae liigid ainet sordarin, mis pärsib seentel proteiinide tootmist (Vicente et al . 2009). Võib järeldada, et sugukonna esindajad võivad pärssida mitmete seente kasvu ja seetõttu kasutatakse liike ka antud katses. A. multiforme toodab antimikroobseid aineid (Quang et al . 2005).

Perekonna esindajad on levinud väga mitmetes taimedes endofüüdina. Perekonna esindajaid on leitud parasvöötme puudelt endofüüdina (Pirttilä et al . 2011). Hypoxylon sp.

10

on leitud hariliku männi ( Pinus sylvestris ) okastest endofüütse seenena (Terhonen et al. 2011). Perekond Hypoxylon võib olla sobiv, kelle aineid kasutada patogeenide biotõrjes.

1.2.2. Fusarium culmorum

Fusarium culmorum kuulub kottseente (Ascomycota) hõimkonda, seltsi helekottseenelaadsed (hypocreales) ja sugukonda komuseenelised (Nectriacea). F. culmorum on maailmas levinud dominantse kõrreliste ja ravimtaimede endofüüdina, aga samuti on perekonna esindajad taimedel haigustekitajad (Rodriguez et al . 2009). Antud katses on kasutatud F. culmorum endofüütset mittepatogeenset tüve. Sonaimuthu et al . (2010) järgi avastati ravimtaimest Tinospora cordifolia endofüütne F. culmorum tüvi, mis toodab taksooli, mida üldjuhul saadakse jugapuu ( Taxus ) perekonna koorest (Your Dictionary 2014 sub . taxol). Perekonna Fusarium liigid toodavad antibiootikume ja samuti on perekond Fusarium esindajad seenevastaste ja bioaktiivsete ühendite tootjad (Moore 1998, Kumar et al . 2013).

Taimed nakatuvad haigustesse stressi ning halvenenud keskkonna tõttu, aga osad endofüütsed seened suudavad aidata taimedel nendega toime tulla. F. culmorum suudab aidata taluda taimel järske temperatuurimuutusi ning soolast keskkonda (Rodriguez et al. 2009). Perekonna Fusarium liike on leitud endofüüdina metsikutel taimedel, põllukultuuridelt ja puudelt (Kuldau ja Yale 2000). See näitab, et endofüütse liigi peremeestaimedeks võivad olla väga paljud taime liigid. Samas mitmed Fusarium sp. on ka arvestatavad patogeenid ja seetõttu tuleb pidada oluliseks ka seda, et mõni endofüütne seen on võimeline ise muutuma patogeenseks (ibid ). Liigiga oleks vaja pärast in vitro katseid teha veel uurimusi, kuidas viimast biotõrjes kasutada. Edaspidi oleks vaja eraldada aineid, mida F. culmorum toodab olles koos patogeeniga.

11

1.2.3. Aureobasidium pullulans

Aureobasidium pullulans kuulub kottseente hõimkonda (Ascomycota), seltsi Dothideales ning sugukonda Dothioracea (Elurikkuse andmebaas). A. pullulans on pärmilaadne seen, mida leidub väga erinevates materjalides ja organismides ning samuti saab A. pullulans hakkama väga ekstreemsetes oludes nagu soolastes vetes (Zalar et al. 2008 ). A. pullulans elab endofüüdina paljudel põllukultuurides, aga ka puudes. Liiki A. pullulans on endofüüdina leitud hobukastanil (Aesculus hippocastanum ), pärnadel ( Tilia spp.) ning mägivahtral (Acer pseudoplatanus ) (Pugh ja Buckley 1971). Samuti leidub A. pullulans viinapuul ja on antagonist paljude patogeenide suhtes. Põhiline viis teiste liikide tõrjumiseks on konkurents ja toksiliste ainete tootmine nagu pektolüütilised ensüümid ja sekundaarsed metaboliidid ning kõrgmolekulaarsed polüsahhariidid (Martini et al . 2009). Liik on levinud üle maailma ning tema vastupidavusest järeldub, et A. pullulans võib olla ka tugev antagonist teistele seentele. Viimast kasutatakse biotõrjena viljade peal leiduvate patogeenide hävitamiseks ( Ibid ).

A. pullulans esineb hariliku männi (Pinus sylvestris ) okastes endofüüdina (Terhonen et al. 2011). Liiki on leitud mitmetelt parasvöötme metsades esinevatelt puudelt. (Pirttilä et al. 2011). Eeldatavasti on võimalik liiki A. pullulans kasutada peremeestaime kaitseks patogeenide eest.

1.2.4. Caldosporium tenuissimum

Cladosporium tenuissimum kuulub kottseente (Ascomycota) hõimkonda, seltsi Capnodiales ja sugukonda Cladosporiaceae. Liigi C. tenuissimum anamorf on Davidiella (Index Fungorum). Perekond Cladosporium on levinud peaaegu igal pool maismaal ning väga erinevates keskkondades. Perekonda kuulub umbes 770 liiki ja neid leitakse järjest enam juurde (Braun ja Schubert 2007, Paul ja Hun Yu 2008).

12

C. tenuissimum toodab sekundaarseid metaboliite, mis pärsivad patogeensete seente kasvu (Nasini et al . 2004). C. tenuissimum on agressiivne seente parasiit ja toodab seente vastaseid metaboliite, mis näitab, et liik võib olla kasutatav biotõrjes mitmete liikide puhul. Nasini et al. järgi eraldati 2004. aastal liigist uued ühendid (cladosporols), mida kasutati patogeenide kasvu pärssimiseks. Arvestades, et liik on seente parasiit võib C. tenuissimum osutuda efektiivseks mitmete patogeenide puhul. Viimane pärssis märgatavalt Cronatium flaccidum ja Peridermium pini , kasvu nii in vitro kui ka in vivo, mis annab lootust seda liiki kasutada ka biotõrjena mändidel (Moricca et al . 2001).

C. tenuissimum on dominantne endofüüt riisil ja maisil ning samuti on perekonna Cladosporium esindajaid leitud männipuude okastest Koreas (Mueller et al. 2004, Paul ja Hun Yu 2008). Liik esineb väga erinevatel peremeestaimedel ning seega võib olla sobiv biotõrjeks. Liigi Cladosporium perekonnaesindajaid on leitud paljudest parasvöötme metsadest endofüüdina (Pirttilä et al. 2011). Olenevalt tingimustest võib C. tenuissimum olla kasutatav patogeeni nakatamisel, et viimane häviks.

1.2.5. Phoma multirosrtata ja Phoma poolensis. var . verbascicola

Phoma multirostrata ja Phoma poolensis var . verbascicola kuuluvad kottseente (Ascomycota) hõimkonda ja seltsi Paleosporales ning Index Fungorumi järgi ei ole sugukond kindel. P. multirostrata anamorf on Didymella (Index Fungorum). Perekond Phoma liigid toodavad mikroobide vastaseid aineid ning tõenäoliselt omavad suurt potentsiaali biotõrjes nii taimede- kui ka inimeste haigustele. Endofüütidena esinevad Phoma sp mitmetel ravimtaimedel ja samuti ka palmil ( Trachycarpus fortunei ), mida kasvatakse Eestis aedades (Taylor et al. 1999, Krishnamurthy et al . 2008). Mitmed katsed viitavad Phoma sp. kasutamist biokontrolli agendina, aga taimepatogeenide vastast toimet on vähe uuritud.

Phoma perekonna esindajaid on leitud endofüüdina jugapuudelt perekond ( Taxus ) Himaalajas (Yang et al .1994). Liike on leitud ka mitmetelt parasvöötme puudelt (Pirttilä et

13

al. 2011). Nagu paljud teised endofüütsed seened on Phoma spp. substraat väga mitmekesine.

1.2.6. Epicoccum nigrum

Epicoccum nigrum kuulub kottseente hõimkonda (Ascomycota), seltsi Paleosporales ning sugukonda Paleosporaceae (Index Fungorum). Seda liiki on mitmed teadlased uurinud eesmärgiga kasutada teda bioloogilises tõrjes (Zhou et al . 1996, Fávaro et al. 2012). Võib oletada, et erinevatest substraatidest isoleeritud sama liiki seened võivad käituda erinevalt. Seetõttu võib katsete käigus saada mitmeid tulemusi ning iga liiki on vaja eraldi testida konkreetse kahjuri vastu.

E. nigrum toodab antibiootikume, mis võivad vähendada bakterite ja seente kasvu. Toodetavate antibiootikumide hulka kuuluvad Epicorazine A ja Epicorazine B . (Deffieux 1978a, Deffieux 1978b). Samuti toodab E. nigrum antibiootikumi flavipin , mis on seentevastase toimega (Bamford et al . 1961, Mellea et al. 1991). Antagonistlikes suhtes on tihti olulised ained, mida liik toodab, et saavutada eelis konkurendi ees. Enamasti konkureerivad liigid toitainete ja eluruumi pärast.

E. nigrum on väga paljude erinevate patogeenide kasvu pärssinud ning seega loodeti selle liigiga saada tulemusi ka antud katses. E. nigrum on andnud tulemusi pärssides õunapuudel haigust põhjustava Phytoplasma mali elutegevust (Musetti et al. 2011, Fávora et al. 2012 ). Samuti on E. nigrum antagonist virsikutel pruunmädanikku põhjustavale patogeenile Monilinia laxa (Mari et al . 2007). E. nigrum toodab antibiootikumi epicoccnone , mis aitab tõrjuda Monilinia laxa (Martini et al. 2009). Mitmed uuringud on näidanud liigi E. nigrum tõhusust antagonistina patogeenide vastu.

E. nigrum võib olla endofüüt väga mitmetes taimedes, mis ei ole omavahel taksonoomiliselt seotud (Fàvaro et al . 2012). Viimane on üks sagedaseim endofüüt hariliku männi (Pinus sylvestris ) okastes ja samuti õunapuudel (Terhonen et al. 2011, Musetti et al.

14

2011). Samuti on ilmnenud, et suhkruroost eraldatud endofüüt E. nigrum tõstab juurte biomassi ja pärsib ka peremestaime patogeenide kasvu (Fávaro et al . 2012). Edaspidi oleks vaja teostada uuringuid, et selgitada, kas ka teistel peremeestaimedel takistab E. nigrum patogeenide levimist.

1.2.7. Lewia infectoria

Lewia infectoria kuulub kottseente (Ascomycota) hõimkonda, seltsi pelospoorilaadsed (Pleosporales) ning sugukonda Pleosporaecea (Elurikkuse andmebaas). L. infectoria anamorf on Alternaria infectoria (Index Fungorum).

Perekonna Alternaria liigid on levinud nii patogeenide kui ka endofüütidena. Perekond Alternaria liike leidub endofüüdina viinapuudel ja samuti parasvöötme metsas puudel (Pirttilä et al. 2011, Polizzotto et al . 2012). Perekond Alternaria liigid toodavad mitmeid mükotoksiine, bioaktiivseid ühendeid ja samuti alkaloide (Lou et al. 2013). Aineid, mida need seened toodavad, on palju ja mitmed neist on veel määramata. Kindlasti ei ole katsetatud kõikide nende omadusi erinevates tingimustes patogeenide suhtes. Arvestades anamorfi laia kasutatavust, võib oletada, et L. infectoria toodab ühendeid, mida saaks kasutada biotõrjes. Oluline on jälgida, et tegu on ka taimedel haigusi tekitava liigiga, kuigi antud juhul on kasutatav kultuur eraldatud taimest endofüüdina. Liigiga L. infectoria on vaja tulevikus veel katseid teha ning loodetavasti saab liigist eraldada aineid, mis mõjuvad patogeenidele pärssivalt.

L. infectoria on leitud dominantse endofüüdina kõrreliselt Dactylis glomerata (Márquez 2007). Troopiliste taimede lehtedest eraldatud endofüütne L. infectoria tüvi toodab antibakteriaalset ainet Pyrrocidine C ning samuti toodab liik teisi mürgiseid aineid, mis võivad osutuda ka seente kasvu pärssivateks (Casella et al . 2013). Paljude taimede endofüüdid on uurimata, kuid nende metaboliidid võivad kasutust leida tulevikus põllumajanduses, biotehnoloogias ja meditsiinis (Strobel ja Daisy 2003). L. infectoria kohta on tehtud vähe uuringuid ning ravimtaimedest pärit kultuuride metaboliitide kohta andmed

15

puuduvad. Oletatavasti toodab L. infectoria sõltuvalt peremehest erinevaid aineid, mida saab kasutada biotõrjes.

1.3. Perekond külmaseen ( Armillaria )

Perekond külmaseen ( Armillaria ) kuulub hõimkonda kandseened (Basidiomycota) klassi Agaricomycetes, seltsi lehikseened (Agaricales) ning sugukonda Physalacriaceae. Eestis on Elurikkuse andmebaasi järgi leitud järgmisi liike: põhja-külmaseen ( A. borealis ), tutt- külmaseen ( A. cepistipes ), mugul-külmaseen ( A. gallica ), A. lutea , A. matsutake , harilik külmaseen ( A. mellea ), tõmmu külmaseen ( A. ostoyea ) ja tamme-külmaseen ( A. tabescens ) (Elurikkuse andmebaas). Eestis on nendest ohtlik kiire levikuga parasiit tõmmu külmaseen. Põhja- ja tutt-külmaseent loetakse nõrgemateks patogeenideks (Hanso, M ja Hanso, S 1999).

Külmaseene perekond on levinud üle maailma hõlmates boreaalseid, parasvöötme ning isegi troopilisi metsi, põhjustades majanduslikku kahju (Forest Service British Columbia, Prospero 2003). Liike on perekonnas üle 40 ja õige määramine on keerukas (Pérez-Sierra et al. 2000, Baumgartner et al. 2010, Klopfenstein et al. 2012). Teatavasti on juuremädanikud ühed kahjutoovamad haigustekitajad, kellest Eestis loetakse tähtsamateks juurepessu (Heterobasidum spp.) ja teisel kohal on külmaseened (Hanso, M ja Hanso, S 1999). Kahjustatud puistuid võeti metsaaladel 2011. aasta jooksul arvele 12 969,3 ha, millest juuremädanike kahjustused moodustasid 1820,2 ha (Asi ja Õunap 2013: 101).

Külmaseen võib nakatada väga laias ulatuses puittaimi ja elada edasi surnud substraadil (Termorshuizen 2000: 45). Üldjuhul on perekonna Armillaria liigid puittaimede patogeenid, siis leitud on ka nakatunud pehmet kortslehte ( Alchemilla mollis ) (Fox 2000: 113) . Seda liiki looduslikult Eestis ei esine, aga viimast kasvatatakse aedades (Juhani Puukool, Elurikkuse andmebaas). Külmaseene liigid on poolparasiidid ning tekitavad puudel juure- ja südamemädanikku (Prospero 2003). Külmaseened on valgemädaniku

16

tekitajad, mis lagundavad tselluloosi, hemitselluloosi ning ligniin lagundatakse üldjuhul viimasena (Fox 2000: 113). Külmaseene mütseel eraldab koore ja puidu ning seega hävitab toimiva floeemi ja ksüleemi (ibid). Seetõttu ei suuda juured puid tormide ajal mullas kinni hoida.

Erinevad külmaseene liigid on parasiitluse poolest oluliselt teistsuguse iseloomuga, seetõttu on tähtis teada, millise liigiga on tegemist. Perekonna taksonoomia on problemaatiline, sest liigid on välimuselt sarnased ning raskesti eristatavad. Varem käsitleti külmaseent ühe liigina Armillaria mellea , millest nüüdseks on eraldatud mitu erinevat liiki (Hanso, M ja Hanso, S; Pegler 2000).

Külmaseene perekond moodustab pseudosklerootsiume puutudes kokku teiste seentega või kahjustatud peremeestaime osadega moodustades tumedaid tsoone (Fox 2000: 15). Teistel seentel on raske konkurentsis külmaseene vastu võidelda arvestades liigi keerukat bioloogiat. Külmaseened toodavad mitmeid antibiootikume ning sekundaarseid metaboliite seente ja teiste bakterite vastu ( Ibid ). Biotõrjes on seda väga oluline teada, sest tegemist on suhteliselt tugeva ja resistentse liigiga. Osad külmaseene liigid suudavad isegi lagundada teiste seente toodetud toksiine, olles seega konkurentsis edukad. Külmaseene antagoniste leidub perekonnas Trichoderma (Tarus et al. 2003).

Mõned uuringud on näidanud, et külmaseen kasvab kõige paremini happelistel aladel, pH 3-4 (Termorshuizen 2000). Väheste uuringute tõttu ei saa seda täiesti õigeks pidada. Inglismaal tehtud katses selgus, et aluselise mullaga aladel tõmmu külmaseenmände ei nakatanud ning Ameerikas on täheldatud Armillaria nakkust rohkem madala pH-ga aladel (Ibid). Seega tuleks happelistel aladel külmaseene liikide jälgimise ja ennetava tegevusega rohkem tegeleda. Külmaseene eripäraks on vegetatiivsetest hüüfidest moodustunud tugevnenud risomorfid, mis transpordivad vett, toitaineid ja hapnikku (Fox 2000: 5).

Külmaseen võib levida õhu kaudu basidiospooridega, aga samas nendega ei suuda patogeen oletatavalt nakatada elus taimi, seega võib pidada põhiliseks levimisviisiks vegetatiivset levikut peremeestaime juurtega ja risomorfidega mullas (Fox 2000: 121). Vanad kännud on nakkusallikateks noortele puudele ning majandatavates metsades oleks need mõttekas

17

eemaldada. Külmaseen nakatab noori puid juba 3-aastaselt, aga suurimad kahjustused tekivad tihti 10 kuni 30 aastastel puudel (Ma ńka 2007). Haigusilminguteta puu võib juba nakatunud olla, seega on haigete puude leidmine keeruline.

Perekonna Armillaria liigid võivad elavatel puudel põhjustada kasvu pidurdumist üle 58% (Cruickshank 2011 viidatud Klopfenstein et al. 2012 kaudu). Samas musta kuuse ( Picea mariana ) metsades Kanadas ei täheldatud väga suurt kasvu erinevust haigetel ja tervetel puudel (Westwood 2011). Briti Kolumbia majandatud metsades on puidu kadu Armillaria liikide tõttu aastas 2-3 miljonit m³ (Morrison ja Mallet 1996). Perekonna Armillaria liigid põhjustavad kasvu vähenemist, võrastiku hõrenemist, lehtede kolletumist, kloroosi. Haiguse edasi arenemisel tekivad koore alla lehvikukujulised mütseelid ning risomorfid (Klopfenstein et al. 2012, Rosso ja Hansen 1998). Kuigi mõnel juhul võib liigi määramine olla keerukas, siis igal juhul on see oluline majandatavates metsades otsustamaks tõrje kasuks või mitte. Metsanduses on kriitilise tähtsusega teada, kas tegu on väga agressiivse liigiga või pigem saprotroofsusele kalduva liigiga (Lamour ja Jeger 2000: 75).

Külmaseen võib mütseeli ja risomorfide abil nakatada tervete puude juuri, kui need satuvad kontakti haigetega (Fox 2000: 3). On täheldatud, et perekonna Armillaria liigid võivad suures ulatuses nakatada taime istandusi, kus on kasutatud herbitsiide (Termorshuizen 2000: 49). Arvestades külmaseene liikide tugevat elujõulisust ning pikka eluiga, siis alad, mis on nakatunud külmaseenega ei ole enam üldjuhul sobilikud taimekasvatuseks. Külmaseenega nakatunud puudel on suurem risk saada ka muid kahjustusi. Näiteks soodustab külmaseen kuuskede nakatumist vähki, mida põhjustab Nectria cucurbitula (Ma ńka 2007). Külmaseene nakkuse leviku piiramiseks tuleks istutamisel eelistada resistentsemaid liike. Nendeks on mõned rohttaimed ning Ilex ja Taxus perekonnad (Fox 2000: 157).

18

1.3.1. Külmaseene keemiline ja bioloogiline tõrje

Külmaseenele ei ole praegu tõhusat tõrjet. Külmaseeni on proovitud hävitada erinevate kemikaalidega, aga katsetes on selgunud, et tegemist ei ole efektiivse lahendusega. Paljud kemikaalid ei suuda jõuda külmaseene mütseelini ja kaugele ulatuvate risomorfideni. Külmaseene tõrjumisel on katseid tehtud Derosal’i, Fundazol’i ja paljude muude fungitsiididega (West 2000). Viimased avaldasid külmaseenele lühiajalist mõju pärssides kasvu, aga külmaseene risomorfid säilitasid eluvõime ning kemikaalide lahustumisel jätkasid kasvu (West 2000: 175). Järeldub, et keemiline tõrje ei ole selle perekonna puhul tõhus. Bioloogiline tõrje on tihti pikaajalisem ega avalda nii suurt kahjulikku mõju ümbritsevale keskkonnale.

Fungitsiidid on mullas lisaks tõrjutavale toksilised ka teistele organismidele ning tapavad tihti looduslikke antagoniste (Campell 1989: 70-75). Hästi korraldatud tõrjeprogramm võib sisaldada nii keemilist kui ka bioloogilist tõrjet. Külmaseent on proovitud nõrgestada gaasilisel kujul pestitsiidi metüülbromiidiga ning seejärel lisada bioloogilisi antagoniste nagu Trichoderma spp. (West 2000). Peab arvestama, et fumigeerimine on äärmiselt ohtlik keskkonnale ning avatud keskkonnas keeruline ning seega ei ole ka perekonna Trichoderma liigid sellisel viisil kasutatavad antagonistidena külmaseente vastu.

Bioloogiline tõrje võib olla erinevalt keemilisest tõrjest edukas pikaajaliselt, aga samas on tähtis teada, et külmaseene risomorfide ja mütseeli võrgustik võib olla mullas väga laiaulatuslik ning elada kaitstult surnud puudes kümneid aastaid (Fox 2000: 121). Enne külmaseene liigi tõrjumist tuleks eelnevalt kindlaks teha liik, sest nõrga patogeensusega liike ei ole suurtel aladel majanduslikult tasuv tõrjuda. Külmaseen võib moodustada puidu sees pseudosklerootsiume ja sklerootsiume, mille tõttu elab ta ka väga ebasobivad keskkonnatingimused üle (West 2000: 174). Võimaluse korral oleksid sobilikud ennetavad meetodid ja taimede tugevdamine. Antud uurimuses leitud kasulike endofüütide lisamine võib muuta taime haiguskindlamaks ning seega ka vigastuste korral vähem vastuvõtlikuks külmaseene põhjustatud haigusele.

19

1.3.2. Valitud külmaseene liigid

1.3.2.1. Põhja- külmaseen ( Armillaria borealis ) ja tutt-külmaseen ( Armillaria cepistipes )

Põhja-külmaseen on pigem saprotroofse eluviisiga. Põhja-külmaseen levib harilikul kuusel (Picea abies ) rohkem Põhja-Euroopas ja vähem keskosas (Ma ńka 2007). Ta põhjustab harva südamemädanikku okaspuudel ning harva on see liik puu surma põhjuseks. Antud töös kasutatud põhja-külmaseene liik on pärit elusalt puult (vt tabel 2.2). Põhja-külmaseen ja tõmmu külmaseen on geneetiliselt väga lähedased (Wahlström et al. 1991).

Tutt-külmaseen on loetud nõrgaks patogeeniks leht- ja okaspuudel ning on Euroopas üks tavalisemaid perekonna esindajaid põhjustades okaspuudel südamemädanikku (Prospero 2003). Tutt-külmaseen kahjustab taimi kui viimased on stressis või kahjustatud teiste liikide poolt (Termorshuizen 2000: 46). See liik võib siiski levida ka kahjustatud pinnale mullaga ning seeläbi nakatada puid (Ibid). Liik moodustab tugevaid risomorfe ning elab kauem kui harilik külmaseen ( Armillaria mellea) (Fox 2000: 123). Tutt-külmaseen ja tõmmu külmaseen kasvad tihti koos ning on samal ajal ka ökoloogiliselt väga sarnased koloniseerides värskelt lõigatud kände (Prospero 2003).

1.3.2.2. Tõmmu külmaseen ( Armillaria ostoyae )

Tõmmu külmaseen on teadaolevalt üks tugevaima patogeensusega külmaseeni. Tõmmu külmaseen võib hõlmata väga laia ala. Geneetiliselt üks ja sama isend kasvas 965 hektaril ning tema vanuseks hinnati 1900-8650 aastat (Ferguson et al. 2003). Suurbritannias on liik tähtis juurekahjustuste tekitaja noortes okasmetsades levides nii looduslikes metsades kui ka inimese poolt rajatud noorendikes. Peremeestaimedena võivad esineda veel põõsad ja mõned rohttaimed (Forest Service British Columbia).

20

Tõmmu külmaseen põhjustab südamemädanikku ja on ka saprotroof (Marek 1999). Tõmmu külmaseen vähendab puidu kvaliteeti ning kasvu. Patogeen on võimeline isegi noore puu surmama või nõrgestab seda ja seeläbi levivad teised kahjurid (Forest Service British Columbia). Tõmmu külmaseen võib tekitada mädanikku või tappa puu ning sellega toob kaasa suure majandusliku kahju okasmetsades. Mädanik muudab puu tuuleheite altiks (Fox 2000: 140). Uuringu järgi kahjustas tõmmu külmaseen noori männiistandusi Poolas Zielonkas isegi rohkem, kui Heterobasidium annosum (Szewczyk 2005).

Tõmmu külmaseen nakatab ja tapab nii kiirekasvulisi ja jõulisi kui ka nõrgestatud ebatsuugasid (Rosso ja Hansen 1998). Peab arvestama, et liigi olemasolu korral vanades puudes nende asemele uusi istutada ei saa, sest tõmmu külmaseen võib ka neid nakatada. Prognoositav kliima soojenemine võib luua soodasid tingimusi külmaseene liikide leviala laienemiseks (Klopfenstein et al. 2009). Seega võib tulla suurem vajadus külmaseeni piirata kasutades tõrjevahendeid.

Kõik külmaseene liigid on teadaolevalt erinevate metaboliitide ja antibiootikumide tootjad. Teiste seentega koos kasvades toodavad paljud liigid konkurentsi tõttu veel mitmeid aineid. Katses toodab tõmmu külmaseen koos teise seenega kasvades 100 korda rohkem mürgiseid metaboliite, kui looduses üksi kasvades (Fox 2000: 19). Seega võib ta osutuda tugevaks vastaseks mitmetele biotõrjes kasutatavatele liikidele.

21

2. Materjal

Töös kasutati üheksat endofüütset seeneliiki, mille andmed on toodud all olevas tabelis (vt Tabel 2.1). Endofüütsed seened pärinevad Eesti Maaülikooli põllumajandus- ja keskkonnainstituudi seente eluskultuuride kogust (TFC). Liikide Hypoxylon howeanum, Annulohypoxylon multiforme, Phoma poolensis var. verbascicola ja Cladosporium tenuissimum puhaskultuurid eraldati Kertu Kaisi bakalaureusetöös (2013). Liigid Phoma multirostrata, Fusarium culmorum ja Lewia infectoria puhaskultuurid eraldati Tiina Poolaku bakalaureusetöös (2013). Eeltoodud liigid on eraldatud raivtaimedest. Teised töös kasutatud liigid Aureobasidium pullulans ja Epicoccum nigrum on eraldatud põldtimutist.

Tabel 2.1. Töös kasutatud endofüütide liigid, koos kasvusubstraadiga ning nende puhaskultuuri numbrid.

Seente eluskultuuride Endofüütne seen Endofüüdi substraat kollektsiooni (TFC) nr Harilik jõhvikas 2013-22 Hypoxylon howeanum (Oxycoccus palustris ) Harilik kortsleht 2013-54 Fusarium culmorum (Alchemilla vulgaris ) Aureobasidium pullulans Põldtimut ( Phleum pratense ) C1-7 Harilik leesikas 2013-29 Cladosporium tenuissimum (Arctostaphylos uva-ursi ) Leesikas 2013-18 Phoma poolensis var . verbascicola (Arctostaphylos uva-ursi ) Suur teeleht 2013-44 Phoma multirotsata (Plantago major ) Epicoccum nigrum Põldtimut ( Phleum pratense ) H4-2-3 Annulohypoxylon multiforme Sookail ( Ledum palustre ) - Suur teeleht 2013-46 Lewia infectoria (Plantago major )

22

Tabel 2.2. Töös kasutatud külmaseente liigid, koos kasvusubstraadiga ning nende puhaskultuuri numbrid. Külmaseene Kultuuri number Külmaseen substraat registris Põhja- külmaseen Kask [145551] (Armillaria borealis ) (Betula spp.) EPS 1330 Tutt-külmaseen [145838] (Armillaria cepistipes ) Tundmatu känd EPS 1328 Tõmmu külmaseen Kuivanud kask [145517] (Armillaria ostoyae ) (Betula spp.) EPS 1203

Töös kasutatavad külmaseened on saadud Eesti Maaülikooli metsandus- ja maaehitusinstituudi metsapatoloogia labori registrist. Andmed töös kasutatavate külmaseente kohta on esitatud eelnevas tabelis 2.2.

23

3. Metoodika

Katse läbiviimise eelduseks oli kultuuride ettekasvatamine, mida tehti 5,5 cm steriilsetes Petri tassides. Eelnevalt ettekasvatatud kultuuridest eraldati kuni 0,9 sentimeetri suurused tükid koos söötmega ning teostati vastandamise katse.

Vastastikkuse mõju määramiseks viidi läbi kaksikkultuurtest ( dual culture test ), mida on tehtud väga paljude teadlase poolt erinevate liikidega (Highley et al . 1997, Combes et al. 2012, Fávaro et al . 2012, Kusari et al. 2013). Kultuurid vastandati 9 cm steriilsetes Petri tassides. Vastandamisel jäi kahe kultuuri vahele kuni 3-4 cm. Kontrollkatses kasvatati iga kultuuri eraldi. Külvid teostati võrdluse tagamiseks samal kuupäeval.

Katses kasutati 2% MEA (Malt extract agar) söödet, mille tootjad on vastavalt Merck KgaA ja Liofilchem Bacteriology Products. Katsesse valiti MEA sööde, sest külmaseene liigid on aeglasekasvulised ja selle söötmega on saadud parimad kasvukiirused (Fox 2000: 17). Ühe liitri kohta kasutati 20 grammi malti ja 15 grammi agarit. Lahjendamiseks kasutati destilleeritud vett. Sööde valmistati ja seejärel steriliseeriti Systec 3850 ELV autoklaavis. Steriliseeriti 121 °C juures 15 minutit. Pärast steriliseerimist jahutati sööde 50-60 °C ning valati laminaari all Petri tassidesse. Seejärel lasti söötmel tahkuda ja oodati ööpäev ning veenduti söötme puhtuses. Kultuurid külvati laminaari all, et vältida mikroobide levikut ning külvamiseks kasutati piirituses ja leegis steriliseeritud külvinõelaga.

Kultuure kasvatati steriilsetes tingimustes temperatuuril 22–23 °C. Kultuuride kasvu jälgiti 33 päeva vältel. Mõõdeti mütseeli kasvu ning jälgiti muutusi mütseelide lähenemisel. Kasvu mõõdeti üle päeva (vt lisad 2-11), mis fikseeriti kasutades MS Exceli programmi ning selle põhjal arvutati valemitega (3.1 ja 3.2) radiaalne kasv. Koostati graafikud, mis

24

illustreerivad kasvumuutusi (vt pt 4.). Vastandatud kultuure ja kontrollkatsed mõõdeti 16 korral.

Mõõtmistel saadud andmete põhjal arvutati patogeeni radiaalne kasv endofüütse seene juuresolekul kasutades valemit (3.1). Samuti mõõdeti patogeeni kasvu kiirust eraldi kontrollkatses ning arvutati radiaalne kasv kasutades valemit (3.2). Antagonismi määramiseks kasutati arvutuste käigus saadud tulemusi ning arvutati valemi (3.3) alusel antagonismiprotsent.

Patogeeni radiaalse kasvu arvutamiseks kasutati valemit (Kusari et al. 2013) Kogukasv − inokulum RK = , (3.1) 2 kus RK – patogeeni radiaalne kasv endofüütse seene juuresolekul Kogukasv – patogeeni diameeter Inokulum – külvatud tüki suurus

Patogeeni radiaalne kasvu arvutamiseks kasutati valemit kontrollkatses (Kusari et al. 2013) Kogukasv − inokulum Kontroll = , (3.2) 2 kus Kontroll – patogeeni radiaalne kasv eraldi Kogukasv – patogeeni diameeter Inokulum – külvatud tüki suurus

Antagonismi määramiseks kasutati valemit (Kusari et al . 2013)  RK  %Antagonism = 1−  ×100 , (3.3)  Kontroll  kus RK – patogeeni radiaalne kasv endofüütse seene juuresolekul Kontroll – patogeeni radiaalne kasv eraldi

Mütseelide lähenemise käigus toimuvaid muutusi määrati visuaalselt jälgides mütseelis ja söötmes toimuvaid värvimuutusi. Samuti vaadeldi patogeeni ja endofüütse seene kasvusuunda. Visuaalsel hinnangul lähtuti (Kusari et al . 2013) hinnangutest (vt tabel 3.1), mida modifitseeriti vastavalt katsele.

25

Tabel 3.1 Endofüütide antagonistliku mõju kirjeldus Erinevad tüübid Vastastikumõju kirjeldus 1 Endofüüt ja patogeen kasvavad üksteise suunas, aga kasv peatub , kui mütseelid satuvad füüsilisse kontakti; ei ole ülekasvu ning pärssimistsoon ja värvi muutus puudub. 2 Endofüüt ja patogeen kasvavad üksteise suunas ja järgneb endofüüdi vähene ülekasv, aga puudub pärssimise tsoon ja värvi vaheldumine mütseelis. 3 End ofüüt ja patogeen kasvavad üksteise suunas, aga kasv peatub enne mütseelide kontakti. Pärssimistsoon ja värvimuutus puuduvad. 4 Endofüüt ja patogeen kasvavad üksteise suunas, aga kasv pe atub enne mütseelide kontakti: endofüüdi/patogeeni ümber selge pärssimistsoon. Värvimuutused mütseelis puuduvad. 5 Endofüüt ja patogeen kasvavad üksteise suunas, aga kasv peatub enne mütseelide kontakti. Selge pärssimistsoon nii patogeeni kui endofüüdi ümber. Värvimuutuseid ei täheldata. 6 Endofüüt ja patogeen kasvavad ük steise suunas ning endofüüt kasvab patogeenist täielikult üle. Värvimuutused olemas/puuduvad. 7 Endofüüt ja patogeen kasvavad üksteise suunas, aga kasv peatub enne , kui mütseelid satuvad füüsilisse kontakti ja söötmes/mütseelis on värvimuutused. 8 Endofüüt ja patogeen kasvavad üksteise suunas, aga kasv peatub mütseelide kontaktil, aga värvimuutused puuduvad. 9 Endo füüt ja patogeen kasvavad üksteise suunas, aga kasv peat ub mütseelide kontaktil. Värvimuutused mütseelis endofüüdil/patogeenil või mõlemal. Allikas: Kusari et al. 2013

Vaatluse käigus saadud tulemused ning kirjeldused on toodud tulemuste osas (vt pt 4).

26

4. Tulemused

Alljärgnevalt esitatakse andmed endofüütsete seente toimest uuritud kolme külmaseene suhtes. Iga külmaseene liigi kohta moodustati koondtabelid, kus on toodud külmaseenete ja endofüütsete seente tsoonide vahelised laiused, ülekasvu olemasolu või selle puudumine ning antagonismiprotsendid arvutatuna kolme kaksikkultuurtesti ( dual culture tests ) korduskatse kohta (vt tabelid 4.1.; 4.2. ja 4.3). Nimetatud tabelites on endofüütide nimetused toodud lühenditega, mille vasted on esitatud lisas 1.

Tabel 4.1. Endofüütide keskmine antagonismi%, tsooni laius ja ülekasv A. borealis suhtes. Keskmine antagonismi % Keskmine tsooni laius (cm) Külmaseen Endofüüt ± standardhälve ± standardhälve Ülekasv Armillaria PV 79 ±4.2 0.5 ±0.1 - borealis AM 76 ±3.1 0.3 ±0.1 + CT 71 ±25.1 - - FC 70 ±0.6 - + EN 63 ±7.8 0.8 ±0.3 - HH 63 ±31.6 1 - PM 56 0.5 ±0.1 - LI 54 ±4.7 0.2 ±0.1 - AP 50 ±6.7 - -

Tabel 4.2. Endofüütide keskmine antagonismi%, tsooni laius ja ülekasv A. cepisties suhtes Keskmine antagonismi% Keskmine tsooni laius (cm) Külmaseen Endofüüt ± standardhälve ± standardhälve Ülekasv Armillaria FC 67 ±6.8 - + cepistipes PV 62 ±7.5 0.4 ±0.2 - AM 60 ±6.0 - + EN 58 ±6.1 0.3 ±0.2 - HH 44 ±3.8 1.6 ±0.2 - CT 38 ±5.8 - - PM 35 ±5.9 - - AP 33 ±3.0 0.3 - LI 27 ±1.5 0.4 ±0.1 -

27

Tabel 4.3 . Endofüütide keskmine antagonismi%, tsooni laius ja ülekasv A. ostoyae suhtes.

Keskmine antagonismi% Keskmine tsooni laius (cm) Külmaseen Endofüüt ± standardhälve ± standardhälve Ülekasv Armillaria ostoyae AM 77 ±1.5 - + PV 75 ±2.6 - - EN 70 ±8.7 0.7 ±0.2 - FC 61 ±5.1 - + PM 60 ±2.5 - - CT 57 ±17.2 - - LI 52 ±4.0 0.3 ±0.2 - HH 45 ±5.5 1 - AP 39 ±5.7 - -

Järgnevalt kirjeldatakse iga endofüütse seene mõju kolmele külmaseene liigile eraldi lähtudes tabelis 3.1 toodud vastastikmõju tüüpidest, et anda lisaks protsentarvutustele visuaalne hinnang liikide vahelisele suhtele. Samuti tuuakse välja radiaalse kasvu graafikud, mis ilmestavad endofüütsete seene antagonismi külmaseente suhtes. Joonistele 4.1.1; 4.1.2; 4.1.3 on kantud vastavalt kolme külmaseente kasv kaksikultuurtestides koos üheksa endofüütsete seentega. Viimaste nimetused on joonistel antud lühenditega, mille vasted on toodud lisas 1. Igas katseseerias on võrdluseks külmaseen, kes kasvab ilma teda pärssiva endofüüdita.

4.1. Endofüütide antagonistlik toime põhja-külmaseenele (Armillaria borealis )

Endofüütsete seente antagonismi põhja-külmaseenele uuriti kolmes korduskatses (vt joonised: 4.1.1; 4.1.2; 4.1.3). Joonistel on näha, kuidas endofüütne seen aeglustas patogeeni kasvu ja samuti, mis päeval võrreldes kontrolliga patogeeni kasv peatus. Endofüütsete seente toimet põhja-külmaseenele illustreerivad katsest tehtud fotod (vt lisa 12).

28

2,5 HH FC 2 AP

1,5 CT

1 PV

kasv kasv cm PM 0,5 EN

0 AM Põhja-külmaseene radiaalne 0 5 10 15 20 25 30 35 LI Päev Kontroll Joonis 4.1.1. Katse 1. Põhja-külmaseene radiaalne kasv enofüütsete seente juuresolekul

2,5 HH

2 FC AP 1,5 CT 1 PV

kasv kasv cm PM 0,5 EN 0 AM Põhja-külmaseene radiaalne 0 5 10 15 20 25 30 35 LI Päev Kontroll

Joonis 4.1.2. Katse 2. Põhja-külmaseene radiaalne kasv endofüütse seene juuresolekul

2,5 HH FC 2 AP

1,5 CT

1 PV

kasv kasv cm PM 0,5 EN 0 AM Põhja-külmaseeneradiaalne 0 5 10 15 20 25 30 35 LI

Päev Kontroll

Joonis 4.1.3 Katse 3. Põhja-Külmaseene radiaalne kasv endofüütse seene juuresolekul

29

4.1.1. Liigi Hypoxylon howeanum toime

Üheski katsekorduses ei täheldatud söötmes värvimuutusi. Põhja-külmaseen ja Hypoxylon howeanum kasvasid üksteise suunas ning mütseelid saavutasid kontakti kõigis kolmes katses. Kahes esimeses katses on moodustunud kontaktialal selgelt nähtavad lainjad jooned (vt lisa 12, foto 12.4). Kolmandas katses hakkas põhja-külmaseen kasvama, aga kasv peatus 7. päeval ning radiaalne kasv jäi alla 0,5 cm. Mõõtmistulemuste järgi arvutatud keskmine antagonismiprotsent saadi 63.

4.1.2. Liigi Fusarium culmorum toime

Söötme värimuutusi ei esinenud mitte üheski katses. Endofüütne seen on värvunud tumepunaseks. Endofüüt F. culmorum ja põhja-külmaseen kasvasid üksteise suunas ning endofüüt kasvas kõigis kolmes katses õhumütseeliga üle. Söötme sees mütseelid kokku ei kasvanud ning nende vahele tekkis selge piir (vt lisa 12). Endofüütne seen on kasvanud patogeeni ümbruses Petri tassi täielikult täis. Patogeeni ümber on kollakas halo. Kolmandas katses on endofüüdil väga tugev õhumütseel, välimuselt meenutab valkjat vatti. Arvutatud keskmine antagonismiprotsent saadi 70.

4.1.3. Liigi Aureubasidium pullulans toime

Söötmes värvimuutusi ei esinenud. Endofüüt A. pullulans ja põhja-külmaseen kasvasid üksteise suunas ning mütseelid saavutasid kontakti. Endofüütse seene mütseeli serv on kokkupuute kohalt kahes esimeses katses värvunud tumeroheliseks (vt lisa 12, foto 12.8). Ülekasv puudub. Endofüütne seen kasvas patogeeni ümber edasi. Keskmine A. pullulans põhjustatud antagonismiprotsent põhja-külmaseene suhtes saadi 50.

30

4.1.4. Liigi Cladosporium tenuisimmum toime

Söötmes värvimuutusi ei esinenud. Endofüütne seen C. tenuissimum ja põhja-külmaseen kasvasid üksteise suunas. Külmaseene kasv aeglustus ning peatus mütseelide kontaktil. Endofüütne seen on moodustanud nähtava tumenenud hüüfidega serva ümber patogeeni (vt lisa 12, foto 12.10). Kolmandas katses põhja-külmaseene kasv jäi väheseks. Keskmine radiaalne kasv jäi alla 0,5 cm ning kasv peatus üheksandal mõõtmispäeval. Keskmine antagonismiprotsent põhja-külmaseene suhtes saadi 71.

4.1.5. Liigi Phoma poolensis var. verbascicola toime

Sööde on värvus katse käigus pruunikaks. Endofüüt P. poolensis var. verbascicola ja põhja- külmaseen kasvasid üksteise suunas. Mütseelide lähenemise käigus saavutati kontakt ning selles piirkonnas kasv peatus mõlemal liigil, aga endofüüt kasvas patogeeni kõrvalt edasi. Kõigis kolmes katse kordustes on endofüütne seen moodustanud patogeeni ümber tumeda mütseeli osa, mis on nähtav roheka alana. Endofüütse seene mütseel on muidu patogeeni ümbruses heledam, kui teistes piirkondades (vt lisa 12, fotod: 12.11; 12.12). Heledama ala läbimõõdu keskmine saadi 0,5 cm. Mõõtmistulemuste järgi arvutati keskmine antagonismiprotsent 79.

4.1.6. Liigi Phoma multirostrata toime

Phoma multirostrata ja põhja-külmaseene antagonismikatses söötmes värvimuutusi ei esinenud. Endofüütne seen P. multirostrata ja põhja-külmaseen kasvavad üksteise suunas, aga mõlema kasv on erinevates suunades märgatavalt suurem. Mütseelide lähenemise käigus kontakti ei saavutatud. Mütseelide vahelise ala keskmine laius saadi 0,5 cm. Endofüütse seene ümber on nähtav hele ring, mis on moodustunud õhukesest mütseelist (vt lisa 12, foto 12.14). Kolmandas katses on endofüütne seen on moodustanud hüüfidest

31

tumedama ala patogeeni poolses servas, mis on nähtav peenikese joonena. Külmaseene ümber on samuti moodustunud söötme sisse hele ring. Mõõtmistulemuste järgi arvutati antagonismiprotsent, mis saadi kõigis kolmes katses 56.

4.1.7.Liigi Epicoccum nigrum toime

Sööde on värvunud kõigis katse kordustes kollakaspruuniks. Mõlemad kasvasid üksteise suunas ja patogeeni kasv peatus mütseelide lähenemise käigus ning kontakti ei saavutatud. Patogeen on märgatavalt kasvanud vastupidises suunas endofüüdile kõigis kolmes katse korduses (vt lisa 12, foto 12.16). Mütseelide vahelise väikseima ala keskmine on 0,8 cm. Keskmine liigi E. nigrum põhjustatud antagonismiprotsent saadi 63.

4.1.8. Liigi Annulohypoxylon multiforme toime

Endofüüdi tõttu värvus sööde mütseeli ulatuses värvunud tumeroheliseks kõigis kolmes katses (vt lisa 12, fotod: 12.17 ja 12.18). Endofüütne seen Annulohypoxylon multiforme ja põhja-külmaseen kasvasid üksteise suunas ning mütseelid saavutasid kontakti. Söötme sees on endofüüdi mütseel heledam patogeeni ümbruses. Patogeeni ja endofüüdi mütseelide kontaktil on kõigis kolmes katses söötmes märgata tumenenud piirjoont, aga õhumütseeliga kasvas endofüüt patogeenist umbes poole mütseeli ulatuses üle. Endofüütne seen on moodustanud kõikides katse kordustes õhumütseeliga ümber patogeeni kollakas-valge joone läbimõõduga 0,3 cm. Mõõtmistulemuste järgi arvutatud keskmine antagonismi- protsent saadi 76.

32

4.1.9. Liigi Lewia infectoria toime

Üheski katses söötme värvimuutusi ei täheldatud. Endofüütne seen Lewia infectoria ja põhja-külmaseen kasvavasid üksteise suunas, aga patogeeni kasv peatus enne mütseelide kontakti saavutamist. Patogeeni kasv peatus, aga endofüütne seen kasvas ümber patogeeni Petri tassi täis. Endofüütse seene mütseel on kõigis katse kordustes patogeeni poolses servas tumedam ning ümber patogeeni on endofüüt moodustanud heleda joone (vt lisa 12, foto 12.20). Vahetsooni keskmine, kus mütseelid kokku ei kasva, saadi 0,2 cm. Endofüütsel seenel toimub sporulatsioon kogu mütseeli ulatuses. Keskmine L. infectoria antagonism põhja-külmaseene suhtes saadi 54%.

4.2. Endofüütide antagonistlik toime tutt-külmaseenele ( Armillaria cepistipes )

Endofüütsete seente mõju tutt-külmaseenele iseloomustavad radiaalse kasvu graafikud, mis on toodud kolme korduskatse kohta (vt joonised: 4.2.1; 4.2.2 ja 4.2.3). Graafikutel on näha tutt-külmaseene kasv 9 erineva endofüütse seene juuresolekul. Võrdluse tagamiseks on graafikule kantud tutt-külmaseene kontrollkatse, mis näitab viimase kasvu endofüüdi mõjuta. Visuaalse hinnanguna saadud kirjeldused on iga katse kohta eraldi välja toodud graafikute all. Graafikute tegemisel on kasutatud valemeid (3.1; 3.2 vt pt 3) ja algallikana tutt-külmaseene mõõdetud diameetreid (vt lisa 6-8). Pildid katsetest tutt-külmaseenega on toodud lisas 13.

33

2,5 HH FC 2 AP 1,5 CT 1 PV

kasv kasv cm PM 0,5 EN 0 AM Tutt-külmaseeneradiaalne 0 5 10 15 20 25 30 35 LI Päev Kontroll

Joonis 4.2.1. Katse 1. Tutt-külmaseene radiaalne kasv endofüütsete seente juuresolekul

2,5 HH FC 2 AP

1,5 CT 1 PV kasv kasv cm PM 0,5 EN

Tutt-külmaseeneradiaalne 0 AM 0 5 10 15 20 25 30 35 LI Päev Kontroll

Joonis 4.2.2. Katse 2. Tutt-külmaseene radiaalne kasv endofüütsete seente juuresolekul

2,5 HH 2 FC AP 1,5 CT 1 PV cm PM 0,5 EN 0 AM 0 5 10 15 20 25 30 35 LI Tutt-külmaseene radiaalne kasv Päev Kontroll

Joonis 4.2.3. Katse 3. Tutt-külmaseene radiaalne kasv endofüütsete seente juuresolekul

34

4.2.1.Liigi Hypoxylon howeanum mõju

Endofüütne seen on värvunud roosakasvalgeks. Tutt-külmaseen ja Hypoxylon howeanum kasvasid üksteise suunas ning saavutati mütseelide vaheline kontakt. Kontaktiala läbimõõdu keskmine kolme katse kohta saadi 1,6 cm (vt lisa 13, foto 13.4). Selles alas on kokku saanud mõlema liigi mütseelid ning toimunud on värvimuutused. Mütseelide kokkupuuteala on kõigis kolmes katses lainjalt triibuline. Keskmine liigi H. Howeanum põhjustatud antagonism tutt-külmaseene suhtes saadi 44 %.

4.2.2. Liigi Fusarium culmorum toime

Sööde on endofüütse seene Fusarium culmorum pigmendi tõttu värvunud punakasroosaks. Endofüütne seen F. culmorum ja tutt-külmaseen kasvasid üksteise suunas ning mütseelide kontakti saavutamisel patogeeni kasv aeglustus ning peatus kõigis kolmes katses. Endofüütne seen kasvas kõigis kolmes katses patogeenist õhumütseeliga üle, aga söötme sees on moodustunud märgatav joon kahe liigi mütseelide vahele. Tutt-külmaseen on tekitanud endofüütse seene suunas tumeda moodustise ja ümber patogeeni on kollakas halo (vt lisa 13). Liigi F. culmorum põhjustatud keskmine antagonism tutt-külmaseene suhtes saadi 67%.

4.2.3. Liigi Aureobasidium pullulans toime

Tutt-külmaseene poolne sööde on värvunud tumepruuniks ning endofüütse seene mütseeli serv on värvunud rohekaspruuniks (vt lisa 13, fotod: 13.7;13.8). Endofüüt Aureobasidium pullulans ja tutt-külmaseen kasvasid üksteise suunas ning mõlema kasv peatus mütseelide kontaktil kahes esimeses katses. Kolmandas katses liigid omavahel kontakti ei saavutanud

35

ning väikseim ala, mis jäi kahe mütseeli vahele oli 0,3 cm. Endofüütne seen on kasvanud patogeeni ümber. Mõõtmistulemuste järgi arvutati antagonismiprotsent, mis saadi 33.

4.2.4. Liigi Cladosporium tenuissimum toime

Tutt-külmaseene poolne sööde on värvunud punakaks kõigis katse kordustes. Endofüütne seen Cladosporium tenuissimum ja patogeen tutt-külmaseen kasvasid üksteise suunas. Endofüütne seen hõlmas katse lõpuks suurema ala Petri tassist. Mütseelide kontaktil on endofüütne seen moodustanud märgatava tumenenud joone tutt-külmaseene suunas, kus mõlema liigi kasv peatub. Ülekasv puudub ning tutt-külmaseene kasv peatus mütseelide kontaktil, aga endofüüt kasvas ümber patogeeni edasi. Patogeen on moodustanud tumeda tugevnenud ala, et elus püsida (vt lisa 13, foto 13.10). Keskmine antagonism tutt- külmaseene suhtes saadi 38%.

4.2.5. Phoma poolensis var. verbascicola toime

Kõigis kolmes katsekorduses on sööde värvunud pruunikaks. Endofüütne seen P. poolensis var. verbascicola ja tutt-külmaseen kasvasid üksteise suunas ning saavutati mütseelide vaheline kontakt. Ülekasv puudub, aga endofüütne seen on kasvatanud heleda mütseeliringi ümber patogeeni kõigis katse kordustes. Mütseelide kokkupuutetsooni keskmine läbimõõt saadi 0,4 cm. Endofüütne seen kasvas ümber patogeeni edasi ning endofüütse seene õhumütseel on patogeeni suunas selgelt tumedam igas katses. Keskmine antagonismiprotsent tutt-külmseene suhtes saadi 62.

36

4.2.6. Liigi Phoma multirostrata toime

Tutt-külmaseene ümbruses on kasvades koos endofüütse seenega Phoma multirostrata sööde värvunud punakaspruuniks. Endofüütne seen P. multirostrata ja patogeen kasvasid algselt suuremas osas üksteisest vastassuunas. Mütseelide lähenemise käigus saavutati kontakt, aga ülekasv puudub. Endofüütne seen on kasvanud Petri tassi suuremas ulatuses kui külmaseened. Endofüütse seene mütseelis ei täheldatud värvimuutusi mitte üheski katse korduses. Keskmine P. multirostata põhjustatud antagonism tutt-külmaseene suhtes saadi 35%.

4.2.7. Liigi Epicoccum nigrum toime

Sööde on värvunud punakaspruuniks. Endofüütne seen E. nigrum ja tutt-külmaseen kasvasid üksteise suunas ja kasv peatus ning mütseelide vahel kontakt puudub (vt lisa 13, fotod: 13.15; 13.16). Mõlemad liigid kasvasid pigem üksteisest erinevas suunas. Endofüütse seene mütseel on patogeeni poolses servas tumenenud. Mütseelide vahele jäänud kõige väiksem alade keskmine on 0,3 cm. Keskmine antagonismiprotsent tutt- külmaseene suhtes saadi 58.

4.2.8. Liigi Annulohypoxylon multiforme toime

Annulohypoxylon multiforme ja tutt-külmaseene koos kasvamisel ei täheldatud söötmes värvimuutusi. Endofüütne seen A. multiforme ja tutt-külmaseen kasvasid üksteise suunas. Mütseelide lähenemise käigus saavutati kontakt ning patogeeni kasv aeglustus. Endofüütse seene mütseel värvus patogeeni vastassuunas tumedamaks ning lõpuks üleni tumeroheliseks (vt lisa 13, fotod: 13.17; 13.18). Endofüütne seen kasvas patogeenist üle poole mütseeli ulatuses, aga patogeen jätkas kahel päeval veel aeglast kasvu, kuni peatus. Endofüütse seene õhumütseel on patogeeni ümber moodustanud valge ringi. Endofüüt

37

kasvas igas katses patogeeni ümbert Petri tassi täis. Keskmine antagonismiprotsent patogeeni suhtes saadi 60.

4.2.9. Liigi Lewia infectoria toime

Külmaseene poolne sööde on igas katses värvunud pruunikaspunaseks. Endofüütne seen Lewia infectoria ja tutt-külmaseen kasvasid üksteise suunas ning mütseelide lähenemise käigus saavutati kontakt, kus patogeeni kasv peatus. Ülekasv puudub, aga endofüütse seene hüüfid on värvunud tumedaks ning moodustavad selgelt nähtava piirjoone kõigis kolmes katses. Mõõdetud vahetsoonide keskmine on 0,4 cm. Algselt oli endofüütse seene sporulatsioon vähene patogeeni poolses servas, aga hiljem toimus sporulatsioon kogu endofüütse seene mütseeli ulatuses (vt lisa 13, fotod: 13.19; 13.20). Keskmine L. infectoria poolt põhjustatud antagonismiprotsent tutt-külmaseene suhtes saadi 27.

4.3. Endofüütide antagonistlik toime tõmmu külmaseenele (Armillaria ostoyae )

Endofüütsete seente antagonismi tõmmu külmaseene suhtes iseloomustavad kolme korduskatse tulemused (vt joonised: 4.3.1; 4.3.2; 4.3.3), kus on näha tõmmu külmaseene kasv 9 erineva endofüütse seene juuresolekul. Võrdluse tagamiseks on graafikule kantud tõmmu külmaseene kontrollkatse, mis näitab viimase kasvu endofüüdi mõjuta. Visuaalse hinnanguna saadud kirjeldused iga katse kohta eraldi on välja toodud graafikute all, mida illustreeriad fotod (vt lisa 14).

38

2,5 HH 2 FC AP 1,5 CT 1 PV

kasv kasv cm PM 0,5 EN 0 AM

Tõmmukülmaseene radiaalne 0 5 10 15 20 25 30 35 LI Päev Kontroll

Joonis 4.3.1. Katse 1. Tõmmu külmaseene radiaalne kasv endofüütse seene juuresolekul

2,5 HH

2 FC AP 1,5 CT 1 PV

kasv kasv cm PM 0,5 EN 0 AM

Tõmmukülmaseene radiaalne 0 5 10 15 20 25 30 35 LI Päev kontroll Joonis 4.3.2. Katse 2. Tõmmu külmaseene radiaalne kasv endofüütse seene juuresolekul

2,5 HH

2 FC AP 1,5 CT 1 PV

kasv kasv cm PM 0,5 EN 0 AM

Tõmmukülmaseene radiaalne 0 5 10 15 20 25 30 35 LI Päev Kontroll

Joonis 4.3.3 . Katse 3. Tõmmu külmaseene radiaalne kasv endofüütse seene juuresolekul

39

4.3.1. Liigi Hypoxylon howeanum toime

Endofüütne seen on värvunud roosakasvalgeks ning sööde on muutunud pruunikaks. Tõmmu külmaseen ja Hypoxylon howeanum kasvasid üksteise suunas ning mütseelid saavutavad kontakti. Kontaktialal on moodustunud triibuline ala, mis näitab liikide vahelist toimet (vt lisa 14, fotod: 14.3; 14.4). Kõigis kolmes katses oli kontaktiala läbimõõt 1 cm. Keskmine liigi H. howeanum põhjustatud antagonism tõmmu külmaseene suhtes saadi 45%.

4.3.2. Liigi Fusarium culmorum mõju

Endofüütne seen Fusarium culmorum on värvunud kollakat ja punakat tooni, seega on toimunud mütseelis võrreldes kontrolliga värvimuutused. Endofüütne seen F. culmorum ja tõmmu külmaseen kasvasid üksteise suunas. Kõigis kolmes katses saavutasid mütseelid kontakti ning endofüüt kasvas õhumütseeliga patogeenist üle. Endofüütne seen on patogeeni poolses servas heledam, kui teises servas. Teises ja kolmandas katses on söötme sisse moodustunud selge piir kahe liigi vahele ning tõmmu külmaseene ümber on kollakas halo (vt lisa 14, fotod: 14.5; 14.6). Esimeses katses liikide vahel nähtav piirjoon puudub. Endofüütne seen pärssis patogeeni kasvu kesmiselt 61%.

4.3.3. Liigi Aureobasidium pullulans toime

Söötmes värvimuutusi ei täheldatud. Endofüüt Aureobasidium pullulans ja patogeen tõmmu külmaseem kasvasid üksteise suunas ning mütseelid saavutasid kontakti, kuid ülekasv puudub. Kõigis kolmes katses moodustus mütseelide kokkupuutealal nähtav joon (vt lisa

40

14, foto 14.8). Keskmine liigi A. pullulans antagonism tõmmu külmaseene suhtes saadi 39%.

4.3.4. Liigi Cladosporium tenuissimum toime

Söötmes värvimuutusi ei täheldatud. Endofüütne seen Cladosporium tenuissimum ja patogeen tõmmu külmaseen kasvasid üksteise vastassunas. Endofüütne seen hõlmas suurema ala Petri tassist. Mütseelide kontaktil on endofüütne seen moodustanud kõigis kolmes katses märgatava tumenenud joone patogeeni suunas, kus mõlema liigi kasv peatub (vt lisa 14, fotod: 14.9; 14.10). Ülekasv puudub ning patogeeni kasv peatus mütseelide kontaktil, aga endofüüt kasvas ümber patogeeni edasi. Keskmine antagonismiprotsent tõmmu külmaseene suhtes saadi 57.

4.3.5. Liigi Phoma poolensis var . verbascicola toime

Sööde on värvunud pruunikaks kõigis katse kordustes. Endofüütne seen P. poolensis var . verbascicola ja patogeen tõmmu külmaseen kasvasid üksteise suunas ning mütseelide kontakti saavutamisel patogeeni kasv peatus, aga endofüüt kasvas edasi. Ülekasvu ei toimunud, kuid endofüüt moodustas patogeeni suunas hüüfidest tumenenud ala, mis on nähtav tumeda joonena ümber patogeeni (vt lisa 14, fotod: 14.11; 14.12). Keskmine antagonismiprotsent saadi 75.

4.3.6. Liigi Phoma multirostrata toime

Phoma multirostrata ja tõmmu külmaseene kooskasvul ei olnud söötmes märgata suuri värvierinevusi. Endofüütne seen P. multirostrata ja tõmmu külmaseen kasvasid üksteise

41

suunas ning saavutati mütseelide kontakti, kus mõlema kasv peatus (vt lisa 14, fotod: 14.13; 14.14). Mütseelide vahel on tekkinud vähenähtav joon, kus hüüfid edasi ei kasva. Kolmandas katses kasvas endofüütne seen ümber patogeeni edasi. Endofüütse seene mütseelis ei täheldatud värvimuutuseid, aga endofüüt hõlmas suurema ala Petri tassist. Keskmine antagonismiprotsent tõmmu külmaseene suhtes saadi 60.

4.3.7. Liigi Epicoccum nigrum toime

Sööde on värvunud kõigis kolmes katse korduses kollakaspruuniks. E. nigrum ja tõmmu külmaseen kasvasid üksteise suunas ja patogeeni kasv peatus mütseelide lähenemise käigus ning kontakti ei saavutatud. Mõlemad liigid kasvasid suuremas ulatuses üksteisest erinevas suunas (vt lisa 14, fotod: 14.15; 14.16). Endofüütse seene mütseeli serv on igas katses patogeeni läheduses värvunud tumedamaks. Mütseelide vahelise ala läbimõõt oli 0,7 cm. Keskmine antagonismiprotsent tõmmu külmaseene suhtes saadi 70.

4.3.8. Liigi Annulohypoxylon multiforme toime

Söötmes värvimuutuseid ei esinenud. Endofüütne seen Annulohypoxylon multiforme ja patogeen tõmmu külmaseen kasvasid üksteise suunas ning mütseelide lähenemise käigus saavutati kontakt ja patogeeni kasv aeglustus. Endofüütse seene söötmesisene mütseel jäi patogeeni vastassuunas tumedamaks ning lõpuks värvus üleni tumeroheliseks (vt lisa 14, fotod: 14.7; 14.8). Endofüütne seen kasvas patogeenist üle poole mütseeli ulatuses. Endofüütse seene õhumütseel on patogeeni ümber moodustanud valge ringi. Endofüütne seen kasvas igas katses patogeeni ümbert Petri tassi täis. Keskmine antagonismiprotsent patogeeni suhtes saadi 77.

42

4.3.9. Liigi Lewia infectoria toime

Endofüütne seen Lewia infectoria ja patogeen tõmmu külmaseen kasvasid üksteise suunas ning saavutati mütseelide vaheline kontakt. Söötmes värvimuutuseid ei esinenud. Patogeense seene kasv peatus mütseelide kontaktil kõigis katse kordustes. Ülekasvu ei ole täheldatud patogeense ega endofüütse seene poolt. Kahe liigi vahele jäi tsoon, kus hüüfid on mõlemal heledad ning endofüütsel seenel ei toimunud seal sporulatsiooni (vt lisa 14, fotod: 14.19; 14.20). Keskmine vahetsooni laius saadi 0,3 cm. Teises katses selgus, et endofüüt kasvab ümber patogeense seene edasi pärast mütseelide kontakti ning ümber patogeeni toimus märgatavalt suurem sporulatsioon. Mõõtmistulemuste järgi arvutatud kesmine L. infectoria antagonism tõmmu külmaseene suhtes saadi 52%.

43

5. Arutelu

Endofüütseid seeni on kasutatud mitmete patogeenide biotõrjes (Campell 1989, Gao et al 2010). Antud katse tulemused kinnitasid, et valitud endofüütsed seened on külmaseentele antagonistid. Erinevate liikide puhul saadi ka erinevad antagonismiprotsendid, mis näitab kui oluline on külmaseene liikide eristamine.

Kõige kõrgemat antagonismi näitas tõmmu külmaseene suhtes A. multiforme ning samuti näitas see liik suhteliselt kõrget antagonismi teiste külmaseente suhtes (vt tabelid: 4.1; 4.2; 4.3). A. multiforme kuulub Xylariaceae sugukonda, mis on kirjanduse põhjal antimikroobsete ainete tootja (Quang et al . 2005, Vicente et al . 2009). Liigiga A. multiforme tuleks läbi viia edasiseid katseid kasutamaks teda biotõrjes Armillaria spp. vastu.

Põhja-külmaseene vastu näitas kõrgeimat antagonismi Phoma poolensis var. verbascicola. Antagonism põhja-külmaseene suhtes saadi 79%. Viimane näitas kõrget antagonismiprotsenti ka tõmmu külmaseene ja tutt-külmaseene suhtes vastavalt 75 ja 62. Seetõttu tuleks liiki edaspidi uurida ka võimaliku antagonistina teiste külmaseente vastu, mis tekitavad majanduslikku kahju.

Tutt-külmaseene suhtes näitas kõrgeimat antagonismi Fusarium culmorum, mis saadi 67%. Liik kasvas tutt-külmaseenest õhumütseeliga üle, aga söötme sisse jäi nähtav piirjoon. Külmaseene kasv peatus, aga ei ole teada, kas jäi ta endofüüdi mütseeli all ellu. Visuaalsel hinnangul moodustusid liigi H. howeanum ja tutt-külmaseene mütseelide kontaktalal lainjad jooned (vt lisa 13, foto 13.1). Ilmselt tuleks edaspidi teha uuringuid, et kasutada liiki H. howeanum tutt-külmaseene tõrjeks, kuigi liigi antagonism tutt-külmaseene suhtes saadi

44

44%. Liigi kasutamisel metsanduses tuleb arvestada, et töös kasutati endofüüdi H. howeanum mittepatogeenset tüve, aga see liik on võimeline tekitama puudel ka haigust. Seega tuleks uurida, mis aineid tootis H. howeanum tutt-külmaseene vastu, et kasutada viimaseid biotõrjes.

Kõige väiksemat antagonismi näitas tõmmu külmaseene ja põhja-külmaseene suhtes A. pullulans, kuigi kirjanduse andmetel on A. pullulans mitmete liikide suhtes olnud tugev antagonist ning viimast on kasutatud mitmetes uuringutes (Martini et al . 2009). Käesolevas katses moodustus tõmmu külmaseen selle liigi mütseeliga kokkupuutel tumenenud ala, mis viitab sellele, et need liigid üksteisega koos siiski antagonistlike ilminguteta ei kasva, kuigi põhja-külmaseene ja liigi A. pullulans mütseelide kontaktil tekkis tumeroheline ala ainult ühes katses. Sama endofüüdiga saadi ka tutt-külmaseene suhtes vähene antagonism, seega selle liigi edasine kasutamine külmaseene biotõrjes pole põhjendatud.

Tutt-külmaseene suhtes näitas kõige väiksemat antagonismi L. infectoria. Keskmiseks antagonismiprotsendiks saadi 27. Kirjanduse põhjal on liik näidanud antagonismi mitmete patogeenide suhtes ning toodab aineid, mis mõjuvad seente kasvule pärssivalt (Casella et al .2013, Lou et al. 2013). L. infectoria näitas tõmmu külmaseene ja põhja-külmaseene suhtes kõrgemat antagonismi kui tutt-külmaseene suhtes, mis viitab endofüütse ja parasiitse seene omavahelistele selektiivsetele suhetele (vt tabelid: 4.1.1; 4.2.1).

Kuigi liigi E. nigrum põhjustatud antagonismiprotsent külmaseente suhtes ei olnud kõige kõrgem (vt pt 4), siis kasutades Kusari et al . (2013) poolt välja töötaud meetodit (vt pt 3), võiks lugeda seda liiki potentsiaalselt tugevaks antagonistiks. Mitte ühegi külmaseenega ei tekkinud liigil E. nigrum mütseelide vahelist kontakti, mis näitab liigi tugevat vastasmõju võrreldes teiste liikidega, kus mütseelide vahel kontakt saavutati (vt lisad 12-13). Kirjanduse andmetel on E. nigrum mitmete patogeenide kasvu pärssinud ning toodab antibiootikume (Bamford et al. 1961, Mellea et al . 1991, Fávora et al. 2012).

C. tenuissimum on seente parasiit (Nasini et al . 2004). Käesoleva töö ühes katses kasvas põhja-külmaseen selle liigi kõrval vähe. Keskmine radiaalne kasv jäi alla 0,2 cm ning kasv peatus üheksandal päeval (vt lisa 3). Arvestades, et see juhtus ühel korral kolmest sama

45

külmaseene liigi puhul ning teiste külmaseene liikide puhul sellist tulemust ei täheldatud, ei pruukinud C. tenuissimum olla siiski põhjuseks, miks külmaseen edasi ei kasvanud. Ilmselt oli külmaseene mütseel mingil põhjusel nõrgenenud. Sellest järeldati, et nõrgestatud külmaseent võib liik tõrjuda. Edasised katsed oleks selle liigiga kindlasti vajalikud.

A. multiforme . näitas kõigi külmaseene liikide suhtes kõrget antagonismiprotsenti. Põhja- külmaseene ja tõmmu külmaseene suhtes saadi katsetes antagonism vastavalt 76% ja 77% ning tutt-külmaseene suhtes saadi 60% (vt pt 4). Mõju võib seletada liikide omapäraga, aga on teada, et tutt-külmaseen on nõrgem patogeen kui tõmmu külmaseen. Tõenäoliselt on in vitro kasvades tutt-külmaseen parema kasvuga, kui põhja-külmaseen ja tõmmu külmaseen. See näitab, et looduses võivad liigid käituda teistmoodi, kui kunstlikes tingimustes kasvades. Endofüütide mõju põhja-külmaseene ja tõmmu külmaseene vastu võib pidada usaldusväärseks, sest viimased on geneetiliselt väga lähedased liigid (Wahlström et al. 1991).

Ükski katse ei andnud kinnitust sellele, et mõni endofüütidest oleks külmaseene surmanud. Kahel korral täheldati, et põhja-külmaseene maksimaalne mõõdetud diameeter oli alla 0,5 cm, mis tähendab, et liigi kasv peatus võrreldes kontrolliga mitu päeva varem (vt lisa 5). Katse alguses, kahel päeval oli märgata, et külmaseen hakkab kasvama, aga kasv peatus. Niisugust tulemust täheldati ainult põhja-külmaseene kolmandas katse korduses liikidega C. tenuissimum ja H. howeanum .

Mõnel juhul kasvas külmaseen võrreldes kontrolliga alguses endofüütse seene juuresolekul kiiremini, aga hiljem aeglustus (vt lisad 12-14). Oletatavasti kasvas külmaseen suure konkurentsi tõttu kiiremini. Mõnel juhul kasv peatus mitmeks päevaks ja seejärel hakkas uuesti kasvama (vt lisad 3-11). Seda võib seletada kahe liigi konkurentsiga. Arvatavasti püüdis külmaseen veel võidelda endofüütse seene vastu, et säilitada endale sobilikumad tingimused. Endofüütne seen saavutas sellegipoolest igas katses ülekaalu.

Väikseimat antagonismi näitasid kõik endofüütsed seened tutt-külmaseene suhtes, mis on in vitro kasvades ilmselt põhja-külmaseenest ja tõmmu külmaseenest tugevam. Käesolevas

46

töös uuritud liikide vastastikune käitumine looduses vajab veel uurimist. Põhja- ja tutt- külmaseenele leiti in vitro tulemustele tuginedes tugevaid antagoniste (vt tabelid: 4.1; 4.3).

Selgus, et iga konkreetse külmaseene liigi jaoks leidub erinev kõige tõhusam pärssiv endofüütne seen ja seega on väga oluline külmaseene liikide täpne eristamine, et valida õige liik biotõrjeks. Tõmmu külmaseene ja põhja-külmaseene biotõrjes võiksid kasutust leida A. multiforme ja P. poolensis var. verbascicola . Eeldusel, et on vajadus tutt- külmaseenele biotõrjet teha, võiks sobivaks osutuda F. culmorum või viimase toodetud ühendid. Arvestades tõmmu külmaseene põhjustatud majanduslikke kahjusid, võiks enim tähelepanu pöörata selle liigi biotõrjele.

47

Kokkuvõte

Uurimuse eesmärgiks oli leida tutt-külmaseenele ( Armillaria cepistipes ), tõmmu külmaseenele (Armillaria ostoyae ) ja põhja-külmaseenele (Armillaria borealis ) antagonistlike endofüütseid seeni, millel oleks perspektiivi biotõrjes. Kõik töös kasutatud endofüütsed seened Annulohypoxylon multiforme, Aureobasidium pullulans, Epicoccum nigrum, Phoma multirostrata, Lewia infectoria, Phoma poolensis var. verbascicola, Fusarium culmorum, Cladosporium tenuissimum ja Hypoxylon howeanum osutusid külmaseentele antagonistlikeks, kuid olid seda erineval määral.

Kirjanduse ülevaates käsitleti endofüütsete seente kasutamisest biotõrjes. Iga katsesse valitud endofüütse liigi kohta anti lühikirjeldus. Varem on kasutatud patogeenide tõrjumises kõige rohkem liike E. nigrum ja A. pullulans . Kirjanduse põhjal leiti, et antud töös kasutatavatest külmaseene liikidest on kõige kõrgema patogeensusega tõmmu külmaseen, aga kõik kolm liiki võimelised erilise konkurentsita koos elama. Külmaseeni on püütud tõrjuda seeneperekonna Trichoderma liikidega. Kemikaalide kasutamine ei ole andnud külmaseene tõrjes efektiivseid tulemusi.

Materjali osas on välja toodud kasutatavate liikide andmed koos päritolu, peremeestaime ja kultuuri numbriga. Metoodika osas kirjeldati katsekäiku, kultuuride külvi, vastandatud liikide kasvutingimusi. Esitati valemid, mille järgi arvutati seente radiaalne kasv ja antagonismiprotsent ning tabel, millest lähtuti tulemuste visuaalsel hinnangul.

Tulemuste osas iseloomustati uuritud üheksa endofüütse seene mõju kolmele külmaseene liigile ja samuti esitati iga katse kohta radiaalse kasvu graafikud, mis iseloomustasid kui palju endofüütsed seened pärssisid patogeense külmaseene kasvu võrreldes kontrolliga. F.

48

culmorum pärssis kõige rohkem tutt-külmaseene kasvu, keskmine antagonismiprotsent saadi 67. Tõmmu külmaseene kasvu pärssis kõige rohkem A. multiforme, keskmine antagonismiprotsent saadi 77. Põhja-külmaseene kasvu pärssis kõige rohkem Phoma poolensis var . verbascicola , keskmine antagonismiprotsent saadi 79. Seega selgus, et iga konkreetse külmaseene liigi jaoks leidub erinev kõige tõhusam pärssiv endofüütne seen.

Arutluses selgus, et kõrge antagonismiprotsendiga kõigi uuritud külmaseente liikide suhtes oli A. multiforme ja P. poolensis var . verbascicola . Tutt-külmaseene suhtes saadi kõrgeim antagonismiprotsent liigiga F. culmorum. Edukaks võib lugeda ka kõiki kolme katset liigiga E. nigrum , sest üheski katses ei saavutanud mütseelid füüsilist kontakti ning patogeenide kasvu pärsiti. Edaspidiseid uuringuid külmaseente biotõrjeks tuleb teha endofüütidega, mis näitasid kõige kõrgemat antagonismi konkreetse külmaseene suhtes. A. multiforme, P. poolensis var. verbascicola , F. culmorum ja E. nigrum kui potentsiaalsed biotõrje liigid, vajaksid edaspidiseid katseid, et rakendada tulemusi praktikas.

49

Viidatud allikate loetelu

Arnold, A.E., Maynard, Z., Gilbert, G.S., Coley, P.D., Kusar, T.A. 2000. Are tropical fungal endophytes hyperdiverse? – Ecology Letters, 3(4), 267-274. [http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1461-0248.2000.00159.x/abstract] (12.05.2014)

Asi, E., Õunap, H., 2013. Metsade tervislik seisund. – Rmt: Pullarits, E., Pere, J., Valgepea, M. Aastaraamat mets 2011. Keskkonnateabe Keskus. Tartu: OÜ PAAR. 97-108.

Bamford, P.C., Norris, G.L.F., Ward, G. 1961. Flavipin production by Epicoccum spp. – Transactions of the British Mycological Society, 44(3), 354-356. [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0007153661800284] (10.05.2014)

Baumgartner, K., Coetzee, A.P.M., Hoffmeister, D. 2010. Secrets of the subterranean pathosystem of Armillaria. – Molecular Plant Pathology, 12(6), 515-534.

Braun, U., Schubert, K. 2007. Taxonomic revision of the genus Cladosporium s . lat 7. Description of new species, a new combination and further new data. – Schlechtendalia, 16, 61-76.

Campell, R. 1989. Biological control of microbial plant pathogens. New York: Cambridge University Press. 218 pp.

Casella, M.T., Epavier, V., Mandavid, H., Bendelac, A., Odonne, G., Daryan, L., Duplais, C., Esmindola, S.L., Stien, D. 2013. Antimicrobal and cytotoxic secondary metabolites

50

from tropical leaf endophytes: Isolation of antibacterial agent pyrrocidine C from Lewia infectoria SNB-GTC2402. – Phytochemistry, 96, 370-377.

Cheplick, G.P., Clay, K. 1988. Acquired chemicaal defences in grasses: the role of fungal endophytes.[http://www.jstor.org/discover/10.2307/3565204?uid=3737920&uid=2&uid=4 &sid=21103747489721] (12.05.2014)

Combes, A., Ndoye, I., Bance, C., Bruzaud, J., Djediat, C., Dupont, J., Nay, B.,Prado, S. Chemical Communication between the Endophytic Fungus Paraconiothyrium Variable and the Phytopathogen Fusarium oxyporum .– PLOS ONE, 7(10), 1-11.

Cruickshank, M.G. 2011.Yield reduction in spruce infected with Armillaria solidipes in the southern interior of British Columbia. – Forest Pathology,41,425-428.Viidatud Klopfenstein, B.N., Kim, M-S., Hannah, W.J., Ross-Davis, L.A., Ashiglar, M.S., McDonald, I.G.2012 Armillaria species: Primary drivers of forest ecosystem processes and potential impacts of climate change. kaudu. [http://www.fs.fed.us/rm/pubs_other/rmrs_2012_klopfenstein_n001.pdf] (17.05.2014)

Deffieux, G., Filleau, M.J., Baute, R. 1978a. New antibiotics from the fungus Epicoccum nigrum . II. Epicorazine A: structure elucidatio and absolute configuration. – The Journal of Antibiotics, 31(11), 1102-1105. [https://www.jstage.jst.go.jp/article/antibiotics1968/31/11/31_11_1102/_pdf] (14.05.2014)

Deffieux, G., Filleau, M.J., Baute, R. 1978b. New antibiotics from the fungus Epicoccum nigrum . III. Epicorazine B: structure elucidatio and absolute configuration. – The Journal of Antibiotics, 31(11), 1106-1109. [https://www.jstage.jst.go.jp/article/antibiotics1968/31/11/31_11_1106/_pdf] (14.05.2014)

Dreyfuss, M., Chapela, I.1994. Potential of fungi in Discovery of, low molecular weight Pharmaceutical. – The Discovery of Natural products with Therapeutic Potential, 26, 49-80. Viidatud Kumar, S., Aharwal, R.P., Shukla, H., Rajak, R.C., Sandhu S.S. Endophytic fungi: As a source of antimicrobals bioactive compounds – World Journal of Pharmacy and

51

Pharmaceutial Sciences, 3(2), 1179-1197 kaudu. [http://www.wjpps.com/admin/assets/article_issue/1391264820.pdf] (14.05.2014)

Eesti Keskkonnanäitajad 2012. Keskkonnateabekeskus Tallinn: Vaba Maa. 75lk.

Elurikkuse andmendaas 2014 [http://elurikkus.ut.ee/] (25.05.2014)

Fávaro, C.L., Sebastianes, L.F., Arújo, L.W. 2012 . Epicoccum nigrum P16, a Sugarcane Endophyte, Produces Antifungal Compounds and Induces Root Growth. PLOS ONE. [http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0036826#pone. 0036826-Musetti1] (12.05.2014)

Ferguson, B.A., Dreisebach, A.T., Parks, G.C., Fillip, M.G., Schmitt, C.L. 2003. Coarse- scale population structure of pathogenic Armillaria species in a mixed-conifer forest in the Blue Mountains of northeast Oregon. – Canadin Journal of Forest Research, 33(4), 612- 623. [http://www.fs.fed.us/pnw/pubs/journals/pnw_2003_ferguson001.pdf] (10.05.2014)

Forest Service. British Columbia. Nelson Forest Region. [http://www.for.gov.bc.ca/hfd/pubs/RSI/FSP/Nelson/RSN015/RSN015.htm] (15.05.2014)

Fox, V.T.R. 2000. Cultural Methods to Manage Armillaria . – In . Armillaria root rot Biology and Control of Honey Fungus. /Fox, V.T.R. (ed.). Gosport: Ashford Colour Press Limited, 151-17.

Fox, V.T.R. 2000. Pathogenicity. – In . Armillaria root rot Biology and Control of Honey Fungus. /Fox, V.T.R. (ed.). Gosport: Ashford Colour Press Limited, 113-136.

Fox, V.T.R. Biology and Life cycle. – In . Armillaria root rot Biology and Control of Honey Fungus. /Fox, V.T.R. (ed.). Gosport: Ashford Colour Press Limited, 3-44.

Fox, V.T.R.2000. The Extent of Losses and Aims for Managing Armillaria . – In. Armillaria root rot Biology and Control of Honey Fungus. /Fox, V.T.R. (ed.). Gosport: Ashford Colour Press Limited, 139-171.

52

Fu-Kang Gao, Chun-Chao Dai, Xiao-zhen Liu. 2010. Mechanisms of fungal endophytes in plant protection against pathogens. – African Journal of Micorobiology Research, 4(13), 1346-1351. [http://www.academicjournals.org/article/article1380280021_Gao%20et%20al.pdf] (14.05.2014)

Hanso, M., Hanso, S. 1999. Andmeid juuremädanike tekitajate kohta Eesti metsades.- Rmt:Tamm, Ü., Kurm, M. (koos.) Metsanduslikud uurimused XXXI. Tartu: Eesti loodusfoto. 141-163.

Highley, T.L., Padmanabha, H.S.A., Howell, C.R. 1997. Control of food decay by Trichoderma (Gliocladium) virens. II. Antibiosis. Material und organismen. [http://www.fpl.fs.fed.us/documnts/pdf1997/highl97c.pdf] (04.05.2014)

Index Fungorum 2014 [http://www.indexfungorum.org/Names/NamesRecord.asp?RecordID=226758] (14.05.2014)

Juhani Puukool 2014. [http://juhanipuukool.ee/?et/istikute_nimekiri/p%C3%BCsikud/alchemilla_mollis_thriller_ pehme_kortsleht_thriller.html] (25.05.2014)

Kais, K. 2013. Harilikus jõhvikas, leesikas ja sookailus esinevate endofüütsete seente kooslused. Bakalaureusetöö. Eesti Maaülikool, metsandus- ja maaehitusinstituut, Tartu. 56 lk.

Keskkonnaamet [http://www.envir.ee/375987] (22.04.2014)

Klopfenstein, B.N., Kim, M-S., Hanna, W.J., Richardson, A.B., Lundquist, J. 2009. Approaches to Predicting Potential Impacts of Climate Change on Forest Disease:An Example With Armillaria Root Disease. United States Department of Agriculture. Forest Service. Rocky Mountain Research Station. Fort Colorado: Research Paper. 10 pp. [http://www.fs.fed.us/rm/pubs/rmrs_rp076.pdf] (15.03.2014)

53

Krishnamurthy, L.Y., Naik, B.S., Jayarm, S. 2008. Fungal communities in Herbaceous Medicinal Plants from the Malnad Region, Southern India. – Microbes and Environments, 23(1), 24-28.

Kuldau, A.G., Yates, E. 2000. Evidence for Fusarium Endophytes in Cultivated and Wild Plant. – In : Microbal Endphytes. 1th ed./ Bacon, W. C., White, J.(ed). New York: CCR Press. 85-109

Kusari, P., Kusari, S., Spiteller, M., Kayser, O. 2013. Endophytic fungi harbored in Cannabis sativa L: diversity and potential as biocontrol agents against host plant- specific phytopathogens. – Fungal Diversity, 60, 137-151.

Lamour, A., Jeger, J.M. Quantitative aspects of the epidemology of Armillaria in the field. – In. Armillaria root rot Biology and Control of Honey Fungus. /Fox, V.T.R. (ed.). Gosport: Ashford Colour Press Limited, 65-77.

Lewis, G.C. 2004. Effects of biotic and abiotic stress on the growth of three genotypes of Lolium perenne with and without infection by the fungal endophyte Neotyphodium lolii . – Annals of Applied Biology, 144 (1), 53-63. [http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1744-7348.2004.tb00316.x/abstract] (12.05.2014)

Lou, J., Fu, L., Peng, Y., Zhou, L. 2013. Metabolites from Alternaria Fungi and Their Bioactivities. – Molecules, 18, 5891-5935.

Ma ńka, M. 2007. Tree Health. – In : Biology and Ecology of Norway Spruce. /Tjoelker, M.G., Boraty ński, A., Bugała (ed.). Dordrect: Springer, 275- 293.

Marek, J., Lepšová, A. 1999. Armillaria populations and pathology at different forest sites of South Bohemia. [http://www.npsumava.cz/gallery/8/2455-sg3_mareklepsova.pdf] (19.05.2014)

54

Mari, M., Torres, M., Casalini, L., Lamarca, N., Mandarin, F.J., Lichou, J., Larena, I., A De Cal, M., Melgarejo, P., Usall, J. 2007. Control of post-harvest brown rot on nectarine by Epicoccum nigrum and physico-chemical treatments. – Journal of the Science of Food and Agriculture, 87, 1271-1277. [http://www.monilinia.org/documents/info/13.JCFA%202007%2087%201271-1277.pdf] (14.05.2014)

Márquez, S.S., Bills, F.G., Zabalgogeazcoa, I. 2007. The endophytic mycobiota of the grass Dactylis glomerata. – Fungal Diversity, 27, 171-195. [http://digital.csic.es/bitstream/10261/17021/1/27_11.pdf] (16.05.2014)

Martini, M., Musetti, R., Grisan, S., Polizzotto, R., Borselli, S., Pavan, F., Osler, R. 2009. DNA – Dependent Detection of the Grapevine Fungal Endophytes Aureobasidium pullulans and Epicoccum nigrum , 93(10), 993-998. [http://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-93-10-0993] (14.05.2014)

Masing, Viktor (koost.). 1992. Ökoloogialeksikon. Loodusteaduslik oskusõnastik. Tallinn: Eesti Entsüklopeediakirjastus. 319 lk.

Mellea, M., Pesando, D., Bernhard, P., Khoulalene, B. 1991. Comparison between antifungal and antibacterial activities of several strains of Epicoccum purpurascens from the Mediterranean area. – Mycopathologia, 115(2), 83-88. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1784310] (14.05.2014)

Moore, D. 1998. Fungal Morphogenesis. Developmental and Cell Biology Series. UK: Cambridge University Press. 488 pp.

Moricca, S., Ragazzi, A., Mitchelson, K, R,.Assante, G. 2001. Antagonism of the Two– needle Pine Stem Rust Fungi Cronartium flaccidum and Peridermium pini by Cladosporium tenuissimum In Vitro and In Planta. – Phytopathology, 91(5), 457-468.

Morrison, D.J., Mallet, K.I. 1996. Silvicultural management of armillaria root rot disease in western Canadion Forests. – Canadian Journal of Plant Pathology, 18, 194-199.

55

Mueller, G.M., Bills, G.F., Foster, M.S. 2004. Biodiversity of Fungi: Inventory and Monitoring Methods. San Diego CA: Elsevier Academic Press Publications, 263 pp.

Musetti, R., Grisan, S., Polizzotto, R., Martini, M., Paduano, C., Osler, R. 2011. Interactions between ‘Candiatus Phytoplasma mali ’ and the apple endophyte Epicoccum nigrum in Catharanthus roseus plants. – Journal of Applied Microbiology, 110(3), 746-756. [http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2672.2011.04937.x/abstract] (15.05.2014)

Nasini, G., Arnone, A., Assante, G., Bava, A., Moricca, S., Ragazzy, A. 2004. Secondary mould metabolites of Cladosporium tenuissimum , a hyperparasite of rust fungi. – Phytochemistry, 65 (14), 2107-2111. [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942204001141] (13.05.2014)

Paul, N.C., Yu Hun, Seung. 2008.Two Species of Endophytic Cladosporium in Pine Trees in Korea. – Mycobiology, 36(4), 211-216.

Pegler, N.D. Taxonomy, Nomenclature and Description of Armillaria . – In . Armillaria root rot Biology and Control of Honey Fungus. /Fox, V.T.R. (ed.). Gosport: Ashford Colour Press Limited, 81-93.

Pérez-Sierra, A., Whitehead, D., Whitehead, M. 2000. Molecular methods used for the detection and identification of Armillaria. – In: Armillaria root rot: Biology and Control of Honey Fungus. /Fox, V.T.R. (ed.). Gosport: Ashford Colour Press Limited, 95-110 pp.

Pirttilä, A. M., Frank, A. C., 2011. Endophytes of Forest trees. Biology and Applications. – Forestry Sciences Vol 80. New York: Springer. 319 pp.

Polizzotto, R., Andersen, B., Martini, M., Grisan, S., Assante, G., Musetti, R. 2012. A polyphasic approach for the characterization of endophytic Alternaria strains isolated from grapevines. – Journal of Microbiological Methods, 88, 167-171. [http://air.unimi.it/bitstream/2434/164987/2/Alternaria%20on%20Plasmopara%20in%20pr ess_MIMET-D-11-00665R1.pdf] (07.05.214)

56

Poolak, T. 2013. Nõgesest, kortslehest ja teelehest eraldatud endofüütsed seened. Bakalaureusetöö. Eesti Maaülikool, metsandus– ja maaehitusinstituut, Tartu. 62 lk.

Prospero, S. 2003. Ecology of Armillaria cepistipes : population structure, niches, pathogenicity and interactions with Armillaria ostoyae. Thesis. Swiss Federal Institute of Technology Zurich. [http://e-collection.library.ethz.ch/eserv/eth:26608/eth-26608-02.pdf] (19.05.2014)

Pugh, F.J.G., Buckley, G.N. 1971. Aureobasidium pullulans : An endophyte in sycamore and other trees. – Transactions of the Britisch Mycological Society, 57(2), 227-231. [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0007153671800049] (14.05.2014)

Quang, N.D., Hashimoto, T., Stadler, M., Radulovi ć, N., Asakawa, Y. 2005. Antimicrobal azaphilones from the fungus Hypoxylon multiforme . – Planta Medica, 12, 1058-1062. [http://www.researchgate.net/publication/7449187_Antimicrobial_azaphilones_from_the_f ungus_Hypoxylon_multiforme] (27.04.204)

Ren, A.Z., Gao,Y.B., Zhou, F. 2007. Response of Neotyphodium lolii -infected perennial ryegrass to phosphorus deficiency. – Plant Soil Environ, 53(3), 113–119. [http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/00060.pdf] (12.05.2014)

Rodriguez, J.R., White, F.J., Arnold, E.A., Redman, S.R. 2009. Fungal endophytes: diversity and functional roles. – New Phytologist, 182(2), 314-330. [http://ag.arizona.edu/mycoherb/arnoldlab/Rodriguez.pdf] (14.04.2014)

Rosso, P., Hansen, E.,1998. Tree vigour and the suscepilty of Douglas fir to Armillaria root disease.[http://andrewsforest.oregonstate.edu/pubs/pdf/pub2566.pdf] (15.05.2014)

Sonaimuthu, V., Krishnamoorthy, S., Johnpaul, M.2010. Taxol producing endophytic fungus Fusarium culmorum SVJM072 from medicinal plant of Tinospora cordifolia – a first report. – Journal of Biotechnology, 1(150), 425. [http://www.researchgate.net/publication/241082625_Taxol_producing_endophytic_fungus

57

_Fusarium_culmorum_SVJM072_from_medicinal_plant_of_Tinospora_cordifolia_- _a_first_report] (14.05.2014)

Szewczyk, W. 2005. Monitoring Armillaria root rot in young (up to 20 yrs) scots pine plantations in Zielonka forest District.[http://www.forestry.actapol.net/pub/7_2_2005.pdf] (12.05.2014)

Strobel, G., Daisy, B. 2003. Bioprospecting for Microbal Endophytes and Their Natural Products. – Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(4), 491-502. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC309047/] (16.05.2014)

Zalar, P.,Gostin čar, C., de Hoog, S.G., Urši č, V., Sudhadham, M., Gunde-Cimerman, N. 2008. Redefinition of Aureobasidium pullulans and its varieties. – Studies in Mycology, 61, 21-38. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2610310/] (14.05.2014)

Zhou, T., Reedleder, R.D., Sparace, A.S. 1996. Influence of nutrients on growrh of Epicoccum nigrum . – Canadian Journal of Microbiology, 42(7), 647-654. [http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/m96-089#.U3MpGFV_uFi] (14.05.2014).

Tarus, P. K., Lang’at-Thoruwa, C.C., Wanyonyi, A.W., Chhabra, S. C. 2003. Bioactive metbolites from Trichoderma harzianum and Trichoderma longibrachiatum . Chemical Sociaiety of Ethiopia. [http://www.ajol.info/index.php/bcse/article/view/61675] (02.05.2914)

Taylor, J. E., Hyde, D. K., Jones, E. B. G.1999. Endophytic fungi associated with the temperate palm, Trachycarpus fortunei , within and outside its natural geographic range – New Phytologist, 142(2), 335-346. [http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1469- 8137.1999.00391.x/pdf] (14.05.2014)

Terhonen, E., Marco, T., Sun, H., Jalkanen, R., Kasnanen, R., Vuorinen, M., Asiegbu, F. 2011. The Effect of Latitude, Season and Needle-age on the Mycota of Scots Pine ( Pinus sylvestris ) in Finland. – Silva Fennica, 45(3), 301-317.

58

Termorshuizen, J.A. 2000. Ecology and epidemology of Armillaria. – In. Armillaria root rot: Biology and Control of Honey Fungus. /Fox, V.T.R. (ed). Gosport: Ashford Colour Press Limited, 45-63.

Vega, E.F., Posdada, F., Aime, M.C., Pava-Ripoll, M., Infante, F., Rehner, S. A. 2008. Entomopathogenic fungal endophytes. –Biological Control, 46, 72-78. [http://digitalcommons.unl.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1390&context=usdaarsfacpub] (12.05.2014)

Vicente, F., Basilio, A., Platas, G., Collado, J., Bills, F.G., Gonzáles Del Val, A., Martín, J., Tromo, R.J., Harris, H.G., Zink, L.D., Justice, M., Kahn, N.J., Peláez, F. 2009. Distribution of the antifungal agents sordarins across filamentous fungi. – Mycological Research, 113(6- 7), 754-770. [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0953756209000537] (14.05.2014)

Wahlström, K., Karlsson, Jan-Olof., Holdenrieder, O., Stenlid, J. 1991. Pectinolytic activity and isozymes in European Armillaria species. – Canadian Journal of Botany, 69(12). 2732- 2739.

West, S.J. Chemical Control of Armillaria . – In. Armillaria root rot Biology and Control of Honey Fungus. /Fox, V.T.R. (ed.). Gosport: Ashford Colour Press Limited, 173-182.

Westwood, R.A., Conciatori, F., Tardif, C.J., Knowles, K. 2011. Effects of Armillaria root disease on the growth of Picea mariana trees in the boreal plains of central Canada. [http://e-bangla.blogspot.com/2011/12/effects-of-armillaria-root-disease-on.html] (15.05.2014)

Whalley, A.J.S., Edwards, R.L. 1995. Secondary metabolites and systematic arrangement within the Xylariaceae. – Canadian Jpurnal of Botany,73, 802-810.Viidatud Bailey, M. J., Lilley. A.K., Timms-Wilson, T. M., Spencer-Phillips, P.T.N. 2006. Microbal Ecology of Aerial Plant Surfaces kaudu. UK: CABI Publishing. 368 pp.

59

Yang, X., Strobel, G., Stierle, A., Hess, W.M., Lee, J., Clardy, J. 1994. A fungal endophyte-tree relationship: Phoma sp. in Taxus wallachiana . – Plant Science, 102(1), 1-9. [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0168945294900175] (14.05.2014)

Your Dictionary. 2014. [http://www.yourdictionary.com/taxol] (13.05.2014)

60

LISAD

Lisa 1. Lühendid

HH – Hypoxylon howeanum

FC – Fusarium culmorum

AP – Aureobasidium pullulans

CT – Cladosporium tenuissimum

PV – Phoma poolensis var . verbascicola

PM – Phoma multirostrata

EN – Epicoccum nigrum

AM – Annulohypoxylon multiforme

LI – Lewia infectoria

61

Lisa 2. Külmaseente kontrollkatse kasv 33 päeva jooksul

Külmaseen Inokulum (cm) Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 Keskmine Armillaria 0.9 0.75 0.95 0.8 1.1 0.9 borealis 0.6 0.65 0.7 Armillaria 0.6 0.65 0.65 0.775 1.6 1.4 cepistipes 0.7 0.9 1.2 Armillaria 0.6 0.55 0.7 0.65 1.2 1.2 ostoyae 0.5 0.6 1.2 Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine 1.3 1.2 1.6 1.45 1.9 1.85 1.1 1.3 1.8 2 1.9 2.1 2.05 2.4 2.35 1.8 2 2.3 1.5 1.5 2 1.95 2.7 2.65 1.5 1.9 2.6 Päev 17 Keskmine Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine 2.4 2.3 2.7 2.6 3.1 3 2.2 2.5 2.9 2.6 2.6 2.6 2.75 2.9 3.05 2.6 2.9 3.2 2.9 2.75 3 2.85 3.2 3.05 2.6 2.7 2.9 Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine Päev 27 Keskmine 3.5 3.45 4 3.85 4.4 4.3 3.4 3.7 4.2 2.9 3.05 3 3.3 4 4 3.2 3.6 4 3.7 3.4 4 3.65 4.2 3.85 3.1 3.3 3.5 Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine 4.7 4.55 4.9 4.8 5 4.95 4.4 4.7 4.9 4.3 4.25 4.7 4.6 4.9 4.8 4.2 4.5 4.7 4.8 4.35 4.9 4.45 5.1 4.65 3.9 4 4.2

62

Lisa 3. Põhja-külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 1)

Endofüüt Inokulum (cm) Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 Keskmine HH 1 0.85 1.1 0.95 1.6 1.3 0.7 0.8 1 FC 0.8 0.75 0.9 0.9 1.2 1.3 0.7 0.9 1.4 AP 0.6 0.55 0.8 0.75 1.2 1.3 0.5 0.7 1.4 CT 0.4 0.45 0.7 0.65 1.1 1.05 0.5 0.6 1 PV 0.8 0.7 1 0.85 1.2 1.1 0.6 0.7 1 PM 0.9 0.75 1.1 0.95 1.6 1.55 0.6 0.8 1.5 EN 0.9 0.75 1 0.95 1.4 1.45 0.6 0.9 1.5 AM 0.7 0.75 0.9 1 1.3 1.35 0.8 1.1 1.4 LI 0.5 0.75 0.6 0.85 1.2 1.25 1 1.1 1.3

Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine Päev 17 Keskmine 1.9 1.7 2 1.8 2.2 1.95 2.2 2.1 1.5 1.6 1.7 2 1.6 1.65 1.8 1.8 1.9 1.95 1.9 1.95 1.7 1.8 2 2 1.7 1.65 1.9 1.85 2 2.05 2.2 2.3 1.6 1.8 2.1 2.4 1.3 1.2 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.1 1.4 1.4 1.4 1.3 1.2 1.5 1.4 1.5 1.45 1.5 1.45 1.1 1.3 1.4 1.4 1.8 1.7 2 1.85 2.3 2.15 2.5 2.35 1.6 1.7 2 2.2 1.6 1.65 1.8 1.85 2 1.95 2.2 2.1 1.7 1.9 1.9 2 1.5 1.5 1.6 1.6 1.7 1.7 1.7 1.7 1.5 1.6 1.7 1.7 1.6 1.65 1.7 1.85 1.7 1.95 2.1 2.3 1.7 2 2.2 2.5

63

Lisa 3. järg

Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine 2.4 2.2 2.4 2.2 2.5 2.35 2.8 2.5 2 2 2.2 2.2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2.6 2.6 2.7 2.7 2.7 2.7 2.7 2.7 2.6 2.7 2.7 2.7 1.6 1.5 1.6 1.55 1.6 1.55 1.6 1.55 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.45 1.5 1.45 1.5 1.45 1.5 1.45 1.4 1.4 1.4 1.4 2.5 2.35 2.6 2.4 2.8 2.6 2.8 2.6 2.2 2.2 2.4 2.4 2.2 2.1 2.4 2.25 2.6 2.55 2.8 2.65 2 2.1 2.5 2.5 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 2.1 2.3 2.2 2.4 2.4 2.55 2.4 2.55 2.5 2.6 2.7 2.7

Päev 27 Keskmine Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine 2.8 2.5 2.9 2.6 2.9 2.6 2.9 2.6 2.2 2.3 2.3 2.3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2.8 2.85 2.9 2.95 2.9 2.95 2.9 2.95 2.9 3 3 3 1.6 1.55 1.6 1.55 1.6 1.55 1.6 1.55 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.45 1.5 1.45 1.5 1.45 1.5 1.45 1.4 1.4 1.4 1.4 2.8 2.6 2.8 2.6 2.8 2.6 2.8 2.6 2.4 2.4 2.4 2.4 2.8 2.7 2.8 2.7 2.8 2.7 2.8 2.7 2.6 2.6 2.6 2.6 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 2.5 2.6 2.5 2.6 2.5 2.6 2.5 2.6 2.7 2.7 2.7 2.7

64

Lisa 4. Põhja- külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 2)

Endofüüt Inokulum (cm) Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 Keskmine HH 0.6 0.55 0.7 0.65 1.1 1.15 0.5 0.6 1.2 FC 0.7 0.65 0.8 0.8 1 1.05 0.6 0.8 1.1 AP 0.8 0.75 1 0.95 1.1 1.15 0.7 0.9 1.2 CT 0.7 0.6 0.8 0.7 1.1 1.35 0.5 0.6 1.6 PV 0.5 0.65 0.8 0.9 1 1.15 0.8 1 1.3 PM 0.8 0.75 0.9 0.85 1.1 1.15 0.7 0.8 1.2 EN 0.6 0.65 0.7 0.75 1 1.2 0.7 0.8 1.4 AM 0.7 0.8 0.9 1.05 1.3 1.45 0.9 1.2 1.6 LI 0.6 0.8 0.7 0.9 1.2 1.2 1 1.1 1.2

Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine Päev 17 Keskmine 1.3 1.3 1.7 1.85 2.1 2.15 2.3 2.35 1.3 2 2.2 2.4 1.4 1.45 1.4 1.45 1.5 1.55 1.5 1.55 1.5 1.5 1.6 1.6 1.4 1.65 1.8 1.95 1.8 2.1 2.1 2.3 1.9 2.1 2.4 2.5 1.4 1.6 1.8 1.95 1.8 2.1 2 2.25 1.8 2.1 2.4 2.5 1.3 1.35 1.4 1.45 1.4 1.45 1.5 1.5 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.4 1.6 1.55 1.8 1.75 2 2 1.3 1.5 1.7 2 1.4 1.35 1.5 1.5 1.6 1.65 1.8 1.85 1.3 1.5 1.7 1.9 1.4 1.6 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 1.8 2 2 2 1.3 1.45 1.5 1.7 1.7 1.9 2 2.2 1.6 1.9 2.1 2.4

65

Lisa 4. järg

Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine 2.4 2.45 2.6 2.6 2.8 2.95 2.9 3 2.5 2.6 3.1 3.1 1.5 1.65 1.5 1.65 1.8 1.9 1.8 1.9 1.8 1.8 2 2 2.3 2.5 2.5 2.7 2.5 2.7 2.5 2.7 2.7 2.9 2.9 2.9 2 2.3 2.3 2.45 2.5 2.7 2.8 2.9 2.6 2.6 2.9 3 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 2.2 2.2 2.4 2.35 2.5 2.5 2.5 2.5 2.2 2.3 2.5 2.5 1.8 1.85 1.9 1.9 1.9 1.9 2 2 1.9 1.9 1.9 2 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 2 2 2 2 2 2.2 2.2 2.35 2.2 2.4 2.2 2.4 2.4 2.5 2.6 2.6

Päev 27 Keskmine Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine 3 3.1 3.2 3.2 3.4 3.4 3.4 3.4 3.2 3.2 3.4 3.4 1.8 1.9 1.8 1.9 1.8 1.9 1.8 1.9 2 2 2 2 2.5 2.75 2.5 2.75 2.5 2.75 2.5 2.75 3 3 3 3 2.8 2.9 2.8 2.9 2.8 2.9 2.8 2.9 3 3 3 3 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 2.5 2.55 2.5 2.55 2.5 2.55 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2 2 2 2.1 2 2.1 2 2.1 2 2.2 2.2 2.2 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 2 2 2 2 2.3 2.45 2.3 2.45 2.5 2.55 2.5 2.55 2.6 2.6 2.6 2.6

66

Lisa 5. Põhja külmaseene kasv 33 päeva jooksul (Katse 3)

Endofüüt Inokulum (cm) Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 HH 0.6 0.6 0.7 0.6 0.7 FC 0.4 0.55 0.5 0.65 1.2 0.7 0.8 1 AP 0.7 0.7 0.8 0.8 1 0.7 0.8 1.1 CT 0.5 0.6 0.6 0.7 0.7 0.7 0.8 0.9 PV 0.6 0.75 0.7 0.9 1.4 0.9 1.1 1.1 PM 0.8 0.75 1 0.95 1.3 0.7 0.9 1.2 EN 1 0.95 1.2 1.15 1.5 0.9 1.1 1.5 AM 0.8 0.85 1.1 1.15 1.6 0.9 1.2 1.4 LI 0.7 0.55 1 0.8 1.2 0.4 0.6 0.9

Keskmine Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine Päev 17 Keskmine 0.7

1.1 1.4 1.45 1.6 1.7 1.7 1.8 1.7 1.8 1.5 1.8 1.9 1.9 1.05 1.4 1.5 1.5 1.6 1.7 1.85 1.9 2.2 1.6 1.7 2 2.5 0.8

1.25 1.5 1.45 1.7 1.6 1.7 1.8 1.7 1.85 1.4 1.5 1.9 2 1.25 1.6 1.6 1.7 1.7 1.8 1.9 2 2.05 1.6 1.7 2 2.1 1.5 1.6 1.55 1.6 1.7 1.7 1.75 1.8 1.85 1.5 1.8 1.8 1.9 1.5 1.5 1.7 1.5 1.7 1.6 1.75 1.6 1.75 1.9 1.9 1.9 1.9 1.05 1.4 1.35 1.5 1.5 1.8 1.75 2 1.9

1.3 1.5 1.7 1.8

67

Lisa 5. järg

Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine

1.8 1.85 1.8 1.85 1.8 1.85 1.8 1.85 1.9 1.9 1.9 1.9 2 2.2 2.2 2.45 2.2 2.45 2.3 2.55 2.4 2.7 2.7 2.8

1.7 1.85 1.7 1.85 1.7 1.85 1.7 1.85 2 2 2 2 2.2 2.15 2.4 2.25 2.5 2.45 2.5 2.45 2.1 2.1 2.4 2.4 1.9 1.9 2 2 2.4 2.25 2.4 2.25 1.9 2 2.1 2.1 1.6 1.75 1.6 1.75 1.6 1.75 1.6 1.75 1.9 1.9 1.9 1.9 2.3 2.1 2.3 2.1 2.5 2.35 2.5 2.5 1.9 1.9 2.2 2.5

Päev 27 Keskmine Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine

1.8 1.85 1.8 1.85 1.8 1.85 1.8 1.85 1.9 1.9 1.9 1.9 2.3 2.55 2.3 2.55 2.3 2.55 2.3 2.55 2.8 2.8 2.8 2.8

1.7 1.85 1.7 1.85 1.7 1.85 1.7 1.85 2 2 2 2 2.5 2.5 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.5 2.6 2.6 2.6 2.4 2.25 2.4 2.25 2.4 2.25 2.4 2.25 2.1 2.1 2.1 2.1 1.6 1.75 1.6 1.75 1.6 1.75 1.6 1.75 1.9 1.9 1.9 1.9 2.7 2.6 2.7 2.6 2.8 2.7 2.8 2.7 2.5 2.5 2.6 2.6

68

Lisa 6. Tutt-külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 1)

Endofüüt Inokulum (cm) Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 Keskmine HH 0.7 0.6 0.9 0.85 1.2 1.25 0.5 0.8 1.3 FC 0.8 0.7 1.2 1.15 1.7 1.65 0.6 1.1 1.6 AP 0.8 0.75 1.1 1.05 1.6 1.65 0.7 1 1.7 CT 0.8 0.75 1.3 1.35 1.3 1.45 0.7 1.4 1.6 PV 0.7 0.65 1.2 1.1 1.8 1.75 0.6 1 1.7 PM 0.7 0.6 1 0.95 1.4 1.45 0.5 0.9 1.5 EN 0.7 0.85 1.3 1.25 1.7 1.7 1 1.2 1.7 AM 0.6 0.55 1.1 1 1.6 1.6 0.5 0.9 1.6 LI 0.8 0.75 1.2 1.15 1.6 1.55 0.7 1.1 1.5

Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine Päev 17 Keskmine 1.5 1.6 1.6 1.8 1.7 1.85 1.7 1.85 1.7 2 2 2 1.5 1.55 2.2 2.15 2.2 2.15 2.3 2.25 1.6 2.1 2.1 2.2 2 1.95 2.3 2.3 2.8 2.65 2.9 2.75 1.9 2.3 2.5 2.6 1.7 1.75 2.4 2.25 2.4 2.35 2.5 2.45 1.8 2.1 2.3 2.4 2.1 2.2 2.2 2.3 2.3 2.35 2.3 2.35 2.3 2.4 2.4 2.4 1.9 1.85 2 2 2.2 2.25 2.4 2.5 1.8 2 2.3 2.6 2.2 2.15 2.3 2.3 2.4 2.4 2.5 2.5 2.1 2.3 2.4 2.5 2.1 2.15 2.2 2.25 2.2 2.25 2.2 2.25 2.2 2.3 2.3 2.3 2.1 2.05 2.5 2.45 2.6 2.65 2.7 2.8 2 2.4 2.7 2.9

69

Lisa 6. järg

Keskmine Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine 1.85 2.1 2.25 2.4 2.45 2.4 2.45 2.6 2.7 2.4 2.5 2.5 2.8 2.25 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.75 3 3.05 3 3.2 3.3 3.35 3.5 3.5 3.1 3.4 3.4 3.5 2.45 2.6 2.75 2.9 2.95 2.9 3.05 2.9 3.2 2.9 3 3.2 3.5 2.35 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.5 2.5 2.65 2.6 2.7 2.8 2.9 3 3.1 2.8 2.8 3 3.2 2.5 2.5 2.55 2.9 2.75 2.9 2.75 2.9 2.75 2.6 2.6 2.6 2.6 2.25 2.2 2.25 2.2 2.25 2.6 2.45 2.6 2.45 2.3 2.3 2.3 2.3 2.8 2.9 3.2 3 3.45 3.2 3.6 3.5 3.85 3.5 3.9 4 4.2

Päev 27 Keskmine Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 2.9 3.2 2.9 3.2 3 3.3 3 3.3 3.5 3.5 3.6 3.6 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 3 3.1 3 3.1 3 3.1 3 3.1 3.2 3.2 3.2 3.2 2.9 2.75 2.9 2.75 2.9 2.75 2.9 2.75 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.45 2.6 2.45 2.6 2.45 2.6 2.45 2.3 2.3 2.3 2.3 3.5 3.85 3.5 3.85 3.5 3.85 3.5 3.85 4.2 4.2 4.2 4.2

70

Lisa 7. Tutt-külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 2)

Endofüüt Inokulum (cm) Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 Keskmine HH 0.8 0.7 1.3 1.15 1.6 1.55 0.6 1 1.5 FC 0.9 0.85 1.5 1.35 1.8 1.7 0.8 1.2 1.6 AP 0.6 0.55 0.9 0.9 1.5 1.6 0.5 0.9 1.7 CT 0.7 0.7 1.2 1.2 1.6 1.65 0.7 1.2 1.7 PV 0.7 0.75 1.2 1.15 1.8 1.75 0.8 1.1 1.7 PM 0.8 0.65 1.2 1.15 1.6 1.55 0.5 1.1 1.5 EN 0.6 0.65 1.2 1.1 1.6 1.55 0.7 1 1.5 AM 0.5 0.6 1 1.2 1.6 1.65 0.7 1.4 1.7 LI 0.6 0.65 1 1.15 1.5 1.6 0.7 1.3 1.7

Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine Päev 17 Keskmine 2 1.95 2.3 2.15 2.3 2.15 2.4 2.25 1.9 2 2 2.1 2 2 2.2 2.1 2.2 2.1 2.4 2.3 2 2 2 2.2 2 2.05 2.2 2.25 2.6 2.75 2.7 3 2.1 2.3 2.9 3.3 1.9 1.95 2 2.15 2.4 2.5 2.9 2.95 2 2.3 2.6 3 2.2 2.2 2.4 2.35 2.5 2.5 2.5 2.5 2.2 2.3 2.5 2.5 2.1 2.05 2.3 2.2 2.6 2.6 2.7 2.75 2 2.1 2.6 2.8 1.9 1.9 1.9 1.95 2 2.05 2 2.05 1.9 2 2.1 2.1 1.9 2.1 2 2.2 2 2.2 2 2.2 2.3 2.4 2.4 2.4 2.1 2.15 2.3 2.4 2.4 2.65 2.6 2.95 2.2 2.5 2.9 3.3

71

Lisa 7. järg

Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine 2.4 2.25 2.5 2.45 2.5 2.45 2.6 2.6 2.1 2.4 2.4 2.6 2.4 2.3 2.4 2.3 2.4 2.3 2.4 2.3 2.2 2.2 2.2 2.2 2.9 3.15 2.9 3.15 2.9 3.15 2.9 3.2 3.4 3.4 3.4 3.5 3 3 3.4 3.3 3.5 3.35 3.5 3.35 3 3.2 3.2 3.2 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.8 2.9 2.8 2.9 2.9 2.95 2.9 3.1 3 3 3 3.3 2 2.1 2 2.1 2 2.1 2 2.1 2.2 2.2 2.2 2.2 2.1 2.25 2.1 2.25 2.1 2.25 2.1 2.25 2.4 2.4 2.4 2.4 2.9 3.15 3 3.3 3.3 3.5 3.3 3.6 3.4 3.6 3.7 3.9

Päev 27 Keskmine Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine 2.9 2.85 2.9 2.85 2.9 2.85 2.9 2.85 2.8 2.8 2.8 2.8 2.4 2.3 2.4 2.3 2.4 2.3 2.4 2.3 2.2 2.2 2.2 2.2 2.9 3.2 2.9 3.2 2.9 3.2 2.9 3.3 3.5 3.5 3.5 3.7 3.6 3.55 3.6 3.55 3.6 3.55 3.6 3.55 3.5 3.5 3.5 3.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3 3.2 3 3.2 3 3.2 3 3.2 3.4 3.4 3.4 3.4 2 2.1 2 2.1 2 2.1 2 2.1 2.2 2.2 2.2 2.2 2.1 2.25 2.1 2.25 2.1 2.25 2.1 2.25 2.4 2.4 2.4 2.4 3.4 3.7 3.4 3.7 3.4 3.7 3.4 3.7 4 4 4 4

72

Lisa 8. Tutt-külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 3)

Endofüüt Inokulum (cm) Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 Keskmine HH 0.8 0.8 1 1.05 1.6 1.55 0.8 1.1 1.5 FC 0.6 0.7 0.8 0.95 1.2 1.45 0.8 1.1 1.7 AP 0.9 0.75 1.3 1.2 1.6 1.75 0.6 1.1 1.9 CT 0.7 0.65 0.9 0.95 1.5 1.45 0.6 1 1.4 PV 0.7 0.75 0.9 1 1.4 1.45 0.8 1.1 1.5 PM 1.1 0.85 1.3 1.05 1.9 1.65 0.6 0.8 1.4 EN 0.7 0.8 1.2 1.3 2.1 1.95 0.9 1.4 1.8 AM 0.7 0.65 1 0.95 1.4 1.4 0.6 0.9 1.4 LI 0.5 0.6 0.8 0.95 1.3 1.4 0.7 1.1 1.5

Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine Päev 17 Keskmine 1.9 1.9 2.1 2.05 2.4 2.4 2.7 2.6 1.9 2 2.4 2.5 1.3 1.5 1.5 1.7 1.6 1.75 1.6 1.75 1.7 1.9 1.9 1.9 2 2.1 2.2 2.4 2.4 2.6 2.6 2.85 2.2 2.6 2.8 3.1 1.7 1.7 2 1.95 2.3 2.25 2.4 2.45 1.7 1.9 2.2 2.5 1.7 1.8 1.8 1.9 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 2 2 2 2.3 2.4 2.6 2.8 2.8 3 3 3.2 2.5 3 3.2 3.4 2.4 2.3 2.4 2.5 2.4 2.55 2.5 2.6 2.2 2.6 2.7 2.7 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 2 2 2 2 2.1 2.15 2.4 2.5 2.8 3.1 2.9 3.15 2.2 2.6 3.4 3.4

73

Lisa 8. järg

Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine 2.9 2.75 3 2.9 3.2 3 3.4 3.2 2.6 2.8 2.8 3 1.6 1.75 1.6 1.75 1.6 1.75 1.6 1.75 1.9 1.9 1.9 1.9 2.9 3.1 3.2 3.55 3.2 3.6 3.3 3.65 3.3 3.9 4 4 2.5 2.6 2.8 2.9 2.9 2.95 3 3.1 2.7 3 3 3.2 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 2 2 2 2 3.2 3.35 3.3 3.45 3.4 3.65 3.5 3.7 3.5 3.6 3.9 3.9 2.6 2.65 2.6 2.65 2.6 2.65 2.6 2.65 2.7 2.7 2.7 2.7 1.9 1.95 1.9 1.95 2.1 2.05 2.1 2.05 2 2 2 2 2.9 3.45 3 3.5 3 3.6 3 3.6 4 4 4.2 4.2

Päev 27 Keskmine Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine 3.4 3.25 3.4 3.25 3.4 3.25 3.4 3.25 3.1 3.1 3.1 3.1 1.6 1.75 1.6 1.75 1.6 1.75 1.6 1.75 1.9 1.9 1.9 1.9 3.3 3.65 3.3 3.65 3.3 3.65 3.3 3.65 4 4 4 4 3 3.1 3 3.1 3 3.1 3 3.1 3.2 3.2 3.2 3.2 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 1.9 1.95 2 2 2 2 3.5 3.75 3.6 3.85 3.6 3.85 3.6 3.85 4 4.1 4.1 4.1 2.6 2.65 2.6 2.65 2.6 2.65 2.6 2.65 2.7 2.7 2.7 2.7 2.1 2.05 2.1 2.05 2.1 2.05 2.1 2.05 2 2 2 2 3 3.6 3 3.6 3 3.6 3 3.6 4.2 4.2 4.2 4.2

74

Lisa 9. Tõmmu külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse1)

Endofüüt Inokulum (cm) Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 Keskmine HH 0.7 0.6 0.8 0.75 1.2 1.1 0.5 0.7 1 FC 0.7 0.7 0.7 0.8 1.4 1.35 0.7 0.9 1.3 AP 0.5 0.55 0.6 0.6 1 0.9 0.6 0.6 0.8 CT 0.5 0.55 0.6 0.65 1.1 1.25 0.6 0.7 1.4 PV 0.7 0.6 1.2 0.95 0.5 0.7 PM 0.6 0.55 0.9 0.7 1.2 1.15 0.5 0.5 1.1 EN 0.5 0.55 0.6 0.65 1 1.05 0.6 0.7 1.1 AM 0.6 0.5 0.9 0.7 1.6 1.35 0.4 0.5 1.1 LI 0.5 0.55 0.6 0.65 1 1.05 0.6 0.7 1.1

Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine Päev 17 Keskmine 1.6 1.45 2 1.8 2.1 2 2.5 2.25 1.3 1.6 1.9 2 1.5 1.65 1.7 1.9 1.8 2 1.9 2.1 1.8 2.1 2.2 2.3 1.1 1.05 1.6 1.55 1.8 1.75 2.2 2.15 1 1.5 1.7 2.1 1.7 1.6 1.9 1.75 1.9 1.75 2.1 2.05 1.5 1.6 1.6 2 1.2 1.2 1.4 1.35 1.4 1.4 1.7 1.6 1.2 1.3 1.4 1.5 1.5 1.4 1.7 1.55 1.7 1.55 1.9 1.9 1.3 1.4 1.4 1.9 1.2 1.2 1.3 1.35 1.4 1.4 1.5 1.55 1.2 1.4 1.4 1.6 1.6 1.4 1.6 1.4 1.6 1.45 1.6 1.45 1.2 1.2 1.3 1.3 1.2 1.25 1.5 1.6 1.8 1.8 2.1 2.25 1.3 1.7 1.8 2.4

75

Lisa 9. järg

Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine 2.7 2.45 2.8 2.6 2.8 2.65 2.8 2.65 2.2 2.4 2.5 2.5 2 2.25 2 2.25 2 2.25 2 2.25 2.5 2.5 2.5 2.5 2.4 2.45 2.5 2.55 2.6 2.7 2.8 2.8 2.5 2.6 2.8 2.8 2.5 2.3 2.6 2.5 2.6 2.5 2.6 2.55 2.1 2.4 2.4 2.5 1.7 1.6 1.7 1.6 1.7 1.6 1.7 1.6 1.5 1.5 1.5 1.5 2 1.95 2 1.95 2.2 2.1 2.2 2.1 1.9 1.9 2 2 1.5 1.55 1.5 1.55 1.5 1.55 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.4 1.4 1.4 1.4 2.3 2.4 2.5 2.6 2.5 2.6 2.5 2.7 2.5 2.7 2.7 2.9

Päev 27 Keskmine Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine 2.8 2.65 2.8 2.65 2.8 2.65 2.8 2.65 2.5 2.5 2.5 2.5 2 2.25 2 2.25 2 2.25 2 2.25 2.5 2.5 2.5 2.5 3 2.95 3 2.95 3 2.95 3 2.95 2.9 2.9 2.9 2.9 2.6 2.55 2.6 2.55 2.6 2.55 2.6 2.6 2.5 2.5 2.5 2.6 1.7 1.6 1.7 1.6 1.7 1.6 1.7 1.6 1.5 1.5 1.5 1.5 2.2 2.1 2.2 2.1 2.2 2.1 2.2 2.1 2 2 2 2 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.4 1.4 1.4 1.4 2.8 2.9 2.8 2.9 2.8 2.9 2.8 2.9 3 3 3 3

76

Lisa 10. Tõmmu külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 2)

Endofüüt Inokulum Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 Keskmine HH 0.6 0.75 0.7 0.9 1.2 1.3 0.9 1.1 1.4 FC 0.6 0.55 0.6 0.7 1.2 1.3 0.5 0.8 1.4 AP 0.6 0.65 1.2 1.25 0.7 1.3 CT 0.9 0.75 1.1 0.95 1.4 1.25 0.6 0.8 1.1 PV 0.4 0.45 0.5 0.55 0.9 0.95 0.5 0.6 1 PM 0.7 0.8 0.7 0.85 1 1.15 0.9 1 1.3 EN 0.8 0.7 0.8 0.75 1.1 1.2 0.6 0.7 1.3 AM 0.4 0.6 0.6 0.75 0.8 1 0.8 0.9 1.2 LI 0.5 0.55 0.8 0.75 1.1 1.1 0.6 0.7 1.1

Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine Päev 17 Keskmine 1.5 1.6 1.7 1.9 2.2 2.35 2.2 2.4 1.7 2.1 2.5 2.6 1.6 1.6 1.8 1.85 1.9 2 2.1 2.15 1.6 1.9 2.1 2.2 1.4 1.55 1.8 2 2.1 2.25 2.6 2.7 1.7 2.2 2.4 2.8 1.5 1.45 1.5 1.45 1.6 1.55 1.8 1.65 1.4 1.4 1.5 1.5 1.1 1.25 1.2 1.35 1.4 1.55 1.4 1.55 1.4 1.5 1.7 1.7 1.2 1.3 1.5 1.55 1.6 1.75 1.7 1.85 1.4 1.6 1.9 2 1.3 1.4 1.3 1.5 1.6 1.75 1.9 2 1.5 1.7 1.9 2.1 1.1 1.2 1.2 1.3 1.4 1.45 1.4 1.45 1.3 1.4 1.5 1.5 1.5 1.45 1.8 1.8 2 1.95 2.1 2.05 1.4 1.8 1.9 2

77

Lisa 10. järg

Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine 2.6 2.75 2.9 2.95 3 3 3.2 3.2 2.9 3 3 3.2 2.2 2.25 2.4 2.35 2.4 2.35 2.4 2.4 2.3 2.3 2.3 2.4 2.7 2.85 2.8 3 3 3.25 3 3.25 3 3.2 3.5 3.5 1.8 1.7 1.8 1.7 1.8 1.7 1.8 1.7 1.6 1.6 1.6 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.7 1.7 1.7 1.7 1.7 1.9 1.9 2.15 1.9 2.25 2 2.3 2.1 2.4 2.6 2.6 2 2.1 2.1 2.25 2.1 2.25 2.1 2.25 2.2 2.4 2.4 2.4 1.4 1.45 1.4 1.45 1.4 1.45 1.4 1.45 1.5 1.5 1.5 1.5 2.2 2.15 2.4 2.35 2.4 2.35 2.5 2.45 2.1 2.3 2.3 2.4

Päev 27 Keskmine Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 3 3.25 3.1 3.4 3.1 3.4 3.1 3.4 3.5 3.7 3.7 3.7 1.8 1.7 1.8 1.7 1.8 1.7 1.8 1.7 1.6 1.6 1.6 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.5 1.6 1.7 1.7 1.7 1.7 2.1 2.4 2.2 2.45 2.2 2.45 2.2 2.45 2.7 2.7 2.7 2.7 2.3 2.35 2.3 2.35 2.3 2.35 2.3 2.35 2.4 2.4 2.4 2.4 1.4 1.45 1.4 1.45 1.4 1.45 1.4 1.45 1.5 1.5 1.5 1.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

78

Lisa 11. Tõmmu külmaseene kasv 33 päeva jooksul (katse 3)

Endofüüt Inokulum (cm) Keskmine Päev 3 Päev 5 Päev 7 Keskmine Päev 9 Keskmine HH 0.6 0.7 0.7 0.9 1 1.3 0.8 1.1 1.6 FC 0.7 0.75 0.8 0.9 1.5 1.4 0.8 1 1.3 AP 0.7 0.65 1.1 0.95 1.2 1.1 0.6 0.8 1 CT 0.7 0.65 0.8 0.8 1 1.1 0.6 0.8 1.2 PV 0.6 0.5 0.8 0.65 1.2 1.1 0.4 0.5 1 PM 0.5 0.4 0.8 0.7 0.9 0.95 0.3 0.6 1 EN 0.5 0.55 0.6 0.65 0.9 0.95 0.6 0.7 1 AM 0.7 0.65 0.8 0.7 1 0.9 0.6 0.6 0.8 LI 0.6 0.7 0.7 0.85 1.3 1.35 0.8 1 1.4

Päev 11 Keskmine Päev 13 Keskmine Päev 15 Keskmine Päev 17 1.4 1.6 1.6 1.8 2 2.05 2.2 1.8 2 2.1 2.6 1.6 1.75 1.7 1.85 1.9 2 2.1 1.9 2 2.1 2.3 1.6 1.45 1.6 1.7 2 1.95 2.3 1.3 1.8 1.9 2.1 1.4 1.55 1.5 1.7 2 2 2 1.7 1.9 2 2 1.2 1.1 1.3 1.25 1.5 1.4 1.6 1 1.2 1.3 1.3 1.6 1.35 1.8 1.6 1.9 1.7 2 1.1 1.4 1.5 1.8 1.1 1.15 1.2 1.3 1.2 1.35 1.2 1.2 1.4 1.5 1.5 1.3 1.25 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.2 1.6 1.6 1.6 1.6 1.65 1.7 1.7 2 2.1 2.3 1.7 1.7 2.2 2.4

79

Lisa 11. järg

Keskmine Päev 19 Keskmine Päev 21 Keskmine Päev 23 Keskmine Päev 25 Keskmine 2.4 2.2 2.45 2.4 2.7 2.4 2.7 2.9 2.95 2.7 3 3 3 2.2 2.1 2.2 2.1 2.2 2.1 2.2 2.1 2.2 2.3 2.3 2.3 2.3 2.2 2.5 2.45 2.6 2.55 2.6 2.55 2.6 2.55 2.4 2.5 2.5 2.5 2 2.5 2.3 2.5 2.4 2.5 2.5 2.9 2.85 2.1 2.3 2.5 2.8 1.45 1.6 1.45 1.6 1.45 1.6 1.45 1.6 1.45 1.3 1.3 1.3 1.3 1.9 2.2 2 2.2 2.1 2.2 2.1 2.2 2.1 1.8 2 2 2 1.35 1.2 1.35 1.4 1.45 1.4 1.45 1.4 1.45 1.5 1.5 1.5 1.5 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 2.35 2.3 2.4 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Päev 27 Keskmine Päev 29 Keskmine Päev 31 Keskmine Päev 33 Keskmine 3 3.1 3.3 3.25 3.3 3.25 3.3 3.25 3.2 3.2 3.2 3.2 2.1 2.2 2.1 2.2 2.1 2.2 2.1 2.2 2.3 2.3 2.3 2.3 3 2.95 3 2.95 3 2.95 3 2.95 2.9 2.9 2.9 2.9 2.9 2.85 2.9 2.9 2.9 2.9 2.9 2.9 2.8 2.9 2.9 2.9 1.6 1.45 1.6 1.45 1.6 1.45 1.6 1.45 1.3 1.3 1.3 1.3 2.3 2.15 2.3 2.15 2.3 2.15 2.3 2.15 2 2 2 2 1.5 1.55 1.5 1.55 1.5 1.55 1.5 1.55 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

80

Lisa 12. Põhja-külmaseene (Armillaria borealis ) katsed

81

Lisa 12. järg

82

Lisa 12. järg

Esimeses piltide reas on põhja-külmaseene kontrollkatse erinevatel päevadel (päev 13; päev 33). Järgnevad kaksikkultuurtestid (dual culture tests ).

12.1; 12.2 Põhja-külmaseene kontrollkatsed

12.3; 12.4 Vasakul: Hypoxylon howeanum ; paremal: põhja-külmaseen

12.5; 12.6 Vasakul: Fusarium culmorum ; paremal: põhja-külmaseen

12.7; 12.8 Vasakul: Aureobasidium pullulans ; paremal: põhja-külmaseen

12.9; 12.10 Vasakul: Cladosporium tenuissimum ; paremal: põhja-külmaseen

12.11; 12.12 Vasakul: Phoma poolensis var. verbascicola ; paremal: põhja-külmaseen

12.13; 12.14 Vasakul: Phoma multirostrata ; paremal: põhja-külmaseen

12.15; 12.16 Vasakul: Epicoccum nigrum ; paremal: põhja-külmaseen

12.17; 12.18 Vasakul Annulohypoxylon multiforme ; paremal põhja-külmaseen

12.19; 12.20 Vasakul Lewia infectoria ; paremal põhja-külmaseen

83

Lisa 13. Tutt-külmaseene (Armillaria cepistipes ) katsed

84

Lisa 13. järg

85

Lisa 13. järg

Esimeses piltide reas on tutt-külmaseene kontrollkatse erinevatel päevadel (päev 13; päev 33). Järgnevad kaksikkultuurtestid (dual culture tests ).

13.1; 13.2 Tutt-külmaseene kontrollkatsed

13.3; 13.4 Vasakul: Hypoxylon howeanum ; paremal: tutt-külmaseen

13.5; 13.6 Vasakul: Fusarium culmorum ; paremal: tutt-külmaseen

13.7; 13.8 Vasakul: Aureobasidium pullulans ; paremal: tutt-külmaseen

13.9; 13.10 Vasakul: Cladosporium tenuissimum ; paremal: tutt-külmaseen

13.11; 13.12 Vasakul: Phoma poolensis var . verbascicola ; paremal: tutt-külmaseen

13.13; 13.14 Vasakul: Phoma multirostrata ; paremal tutt-külmaseen

13.15; 13.16 Vasakul: Epicoccum nigrum ; paremal tutt-külmaseen

13.17; 13.18 Vasakul Annulohypoxylon multiforme ; paremal tutt-külmaseen

13.19; 13.20 Vasakul Lewia infectoria ; paremal tutt-külmaseen

86

Lisa 14. Tõmmu külmaseene (Armillaria ostoyae ) katsed

87

Lisa 14. järg

88

Lisa 14. järg

Esimeses piltide reas on tõmmu külmaseene kontrollkatse erinevatel päevadel (päev 13; päev 33). Järgnevad kaksikkultuurtestid (dual culture tests ).

14.1; 14.2 Tõmmu külmaseene kontrollkatsed

14.3; 14.4 Vasakul: Hypoxylon howeanum ; paremal:

13.5; 13.6 Vasakul: Fusarium culmorum ; paremal: tõmmu külmaseen

14.7; 14.8 Vasakul: Aureobasidium pullulans ; paremal: tõmmu külmaseen

14.9; 14.10 Vasakul: Cladosporium tenuissimum ; paremal: tõmmu külmaseen

14.11; 14.12 Vasakul: Phoma poolensis var . verbascicola ; paremal: tõmmu külmaseen

14.13; 14.14 Vasakul: Phoma multirostrata ; paremal: tõmmu külmaseen

14.15; 14.16 Vasakul: Epicoccum nigrum ; paremal: tõmmu külmaseen

14.17; 14.18 Vasakul Annulohypoxylon multiforme ; paremal tõmmu külmaseen

14.19; 14.20 Vasakul Lewia infectoria ; paremal tõmmu külmaseen

89