Approches moléculaires de la diversité microbienne de deux environnements extrêmes : les sources hydrothermales profondes et les réservoirs pétroliers Erwan Corre

To cite this version:

Erwan Corre. Approches moléculaires de la diversité microbienne de deux environnements extrêmes : les sources hydrothermales profondes et les réservoirs pétroliers. Biologie moléculaire. Université de Bretagne Occidentale, 2000. Français. ￿tel-01115381￿

HAL Id: tel-01115381 https://hal.sorbonne-universite.fr/tel-01115381 Submitted on 12 Feb 2015

HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. Avertissement

Au vu de la législation sur les droits d'auteur, ce travail de thèse demeure la propriété de son auteur, et toute reproduction de cette oeuvre doit faire l'objet d'une autorisation de l'auteur. (cf Loi n°92-597; 1/07/1992. Journal Officiel, 2/07/1992) THESE

présentée pour l'obtention du grade de Docteur de l'Université de Bretagne Occidentale

(Mention Microbiologie)

Erwan CORRE

Approches moléculaires de la diversité microbienne de deux environnements extrêmes : les sources hydrothermales profondes et les réservoirs pétroliers

Soutenue le Mercredi 2 Février 2000 devant le jury composé de :

MM. P. CAUMETTE, Professeur, Université de Pau Examinateur M. MAGOT, Responsable de Laboratoire, Sanofi, Labège Rapporteur P. NORMAND, Directeur de Recherche CNRS, Université Lyon I Rapporteur B. PICARD, Professeur, Université de Bretagne Occidentale Président D. PRIEUR, Professeur, Université de Bretagne Occidentale Examinateur A.L. REYSENBACH, Professeur, Université de Portland, USA Examinatrice Remerciements

Le travail présenté dans ce mémoire a été réalisé avec le soutien financier de la Communauté Urbaine de Brest

Je remercie tout d'abord Daniel Prieur pour m'avoir accueilli dans son équipe de recherche, d'abords en DEA puis en thèse et de m'avoir fait confiance tout au long de ces années.

Mes remerciements s'adressent tout particulièrement à Christian Jeanthon pour son soutien, sa patience et sa disponibilité. Je tiens à lui exprimer ici ma reconnaissance pour toutes les discussions enrichissantes, les conseils avisés et les directives salutaires qu'il a su m'indiquer tout au long de ce travail. Merci profondément pour le temps consacré à la correction des articles.

Je remercie également Anna-Louise Reysenbach pour m'avoir accueilli dans son laboratoire à Rutgers et de m'avoir permis de travailler sur les échantillons de Vent Cap. Son expérience en biologie moléculaire, ses conseils en phylogénie m'ont été grandement utiles. Je la remercie également de m'avoir fait partager durant mon séjour à Rutgers sa passion pour les chevaux et pour le trafic de fromages et de vins français.

Je remercie également les membres du jury : Pierre Caumette, Philippe Normand, Michel Magot et Bertrand Picard d'avoir accepté de juger mon travail de thèse.

Je tiens à adresser mes plus profonds remerciements à l'ensemble des étudiants avec qui j'ai eu la joie de travailler : Cédric Hobel (qui a essuyé les plâtres), la brillante Anne Postec, l'inénarrable mais néanmoins charmante Catherine Charpentier et enfin le précieux Laurent Toffin avec qui j'ai passé une année de travail formidable. Une grande partie des résultats présentés dans ce manuscrit sont le fruit de leur acharnement et de leur persévérance.

J'adresse un remerciement tout particulier à Tristan Barbeyron pour m'avoir formé aux techniques moléculaires, pour sa disponibilité et son savoir intemporel sur tout ce qui à trait la biologie moléculaire, la microbiologie, la radioactivité, Serge Lama et les 24 heures du Mans. Merci également à Hermie Harmsen pour ses conseils avisés à la paillasse comme à l'e-mail.

Je remercie tout particulièrement Olivier Collin, Stéphan Jouannic et Jean Ranc pour les heures qu'ils ont accepté de passer à lire et corriger ce manuscrit. Spéciale dédicace à Stéphane et Olivier pour leur travail de pionniers dans la jungle des fautes d'orthographes et les marais fangeux des accords mal à propos.

Je remercie également tous les membres du laboratoire. En particulier Stéphane et Edmond pour leur amitié, les foulées et la sueur que nous avons partagé (enfin surtout eux) sur de nombreux kilomètres. Jenny pour m'avoir supporté et pour nous être épaulé mutuellement dans la dernière (longue, très longue) ligne droite. Marc, Patrick, Olivier, Jean-Louis, Laurent, Viggo, Soizick et Valérie pour avoir survécu dans les bureaux que nous avons partagés. Enfin je remercie les membres de la Station Biologique de Roscoff pour leur accueil, leurs compétences et la formidable ambiance qu'ils savent entretenir dans leur laboratoire et dans les couloirs de la station.

Merci à Odile, Claire, Catherine's, Jeff's, Didier, Vincent et Lolo, à la famille Collin à 2 jambes ou 4 pattes pour leur soutient moral et véliplanchesque ainsi que pour leur accueil tout au long de mon travail.

Merci à l'ensemble de ma famille, à Juliette de m'avoir aiguillé vers la Station Biologique, à mes parents, "beaux"-parents et grands-parents de leur soutien.

Merci enfin à Anne d'avoir su supporter au quotidien mes sautes d'humeurs, mes absences et d'avoir finalement, plus qu'aucune autre personne, contribué à ce que je mène à bien ce travail. Introduction générale

La microbiologie de l'environnement est une discipline jeune, qui a pour vocation d'étudier les relations qu'entretiennent les micro-organismes avec leur biotope. Si l'adage populaire n'accorde que peu d'influence à ce qui est invisible à l'oeil et si la présence de micro-organismes est souvent associée à une nuisance plutôt qu'à un bienfait, le rôle des micro-organismes est pourtant prépondérant dans le fonctionnement de nombreux écosystèmes naturels et anthropiques. L'étude des micro-organismes a longtemps été liée à la capacité des microbiologistes à recréer in vitro des conditions favorables à la croissance des communautés microbiennes. Or, des écosystèmes complexes, soumis à des contraintes physico-chimiques extrêmes telles que, de fortes températures, de fortes pressions ou l'absence d'oxygène, ou à des fluctuations de sources de nutriments ou d'énergie, sont particulièrement difficiles à simuler au laboratoire. Aussi, dans ces écosystèmes ,comme dans d'autres étudiés déjà depuis fort longtemps tels que le sol où l'eau de mer, un grand nombre de micro-organismes ont échappé à toute méthode de culture. Le développement des techniques de biologie moléculaire et l'utilisation de la molécule d'ARN ribosomique comme marqueur évolutif a permis de s'affranchir des étapes de culture et a permis d'asseoir sur des bases phylogénétiques les relations taxinomiques s'établissant entre les différents organismes vivants. Le travail présenté dans ce mémoire a pour objet l'étude de la diversité microbienne de deux écosystèmes considérés comme extrêmes : les sources hydrothermales profondes et les réservoirs pétroliers. Les techniques mises en oeuvre sont fondées soit sur l'analyse des ARN ribosomiques (ARNr) sans étape préalable de culture, par séquençage ou hybridation in situ, soit sur le positionnement phylogénétique de souches isolées de ces environnements.

Avant de présenter les résultats de ce travail sous la forme d'articles en préparation, soumis ou publiés, je me propose :

- de présenter une revue des techniques d'écologie microbienne classiques et moléculaires couramment utilisées pour accéder à la diversité des écosystèmes microbiens, de présenter des moyens d'accéder à la diversité fonctionnelle de ces écosystèmes et d'insister sur les biais inhérents à chacune de ces techniques, - d'effectuer un tour d'horizon des différents habitats microbiens qui ont été étudiés ces dernières années et de présenter pour chacun de ces habitats les apports des techniques moléculaires dans la description de la diversité et la découverte de nouveaux groupes phylogénétiques, et enfin - de présenter et de discuter les différentes techniques que nous avons mises en oeuvre pour étudier la diversité microbienne d'un écosystème pétrolier continental et d'un site hydrothermal profond.

ii Abréviations IPTG : isopropylthio-ß-D-galactoside ISRT : In Situ Reverse Transcription A : Adénosine Knuc : distance phylogénétique ADN: Acide désoxyribonucléique Kpb : Kilo paires de bases ADNc : ADN cloné LB (milieu liquide ou gélose) : Luria-Bertani ADNr 16S : ADN codant pour la sous unité 16S de l'ARN ribosomal LFRFA : Low Frequency Restriction Fragment Analysis

ADNr : ADN codant pout l'ARN ribosomal LMW RNA: ARN de faible poids moléculaire

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism LPS : Lipopolysaccharides

APS : Ammonium Persulfate LUCA : Last Unversal Common Ancestor

ARDRA : Amplified rDNA Restriction Analysis. MAR : Middle Atlantic Ride

ARN : Acide ribonucléique MPN : Most probable number

ARNm : ARN messagé NPP : Nombre le plus probable

ARNr 16S : sous unité 16S de l'ARN ribosomal OTU : Operational Taxonomic Unit

ARNr : ARN ribosomale p/v : (masse à volume)

ATP : Adénosine tri-phosphate pb : paire de base

BrdU : bromodéoxyuridine. PCB : PolyChlorinated Biphenyl

BSA : Bovine Serum Albumin PCR : Polymerase Chain Reaction

BSR: Bactéries sulfato-réductrices PFLA : analyse des profils lipidiques

C : Cytosine PGFE : Pulsed-Field Gel Electrophoresis

C.F.B. : Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA

CDGE : Constant Denaturant Gel electrophoresis RDP : Ribosomal Database Project

CMF : Cytométrie en flux RFLP : Restriction Length Fragment Polymorphism comm. pers. : communication personelle RPM : Rotation par minute

CTAB : Hexadecyltrimethyl ammonium bromide RT-PCR : Reverse Transcriptase-PCR

CTC : 5-cyano-2,3-dotolyl tetrazolium chloride S : Svedberg

Da : Dalton SDS : Sodium dodecyl sulfate

DAPI: Acide diamino-pimélique SET (tampon) : Sucrose/EDTA/Tris

DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ssADN : ADN simple brin (single strand)

DH : Deshydrogénases T : Thymine

DMSO : Di methyl sulfoxyde T-RFLP : Terminal Restriction Length Fragment Polymorphism dNTP : deoxynucléotide triphosphate TAE (tampon) : Tris/Amonium/EDTA dsADN : ADN double brin (double strand) TBE (tampon) : Tris/Borate/EDTA EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid Td : Température de dissociation EPR : East Pacific Ride TE (tampon) : Tris/EDTA FAME : Fatty acid Methyl Ester TEMED : N,N,N',N' Tétraméthyléthylènediamine FISH : Fluorescent In Situ Hybridization TGGE : Temperature Gradient Gel Electrophoresis G : Guanidine Tm : Température de fusion GES (tampon) : GIT/EDTA/SDS TNE (tampon) : Tris/NaCl/EDTA GIT : Guanosine isothiocyanate UFC : Unité formant colonie GNS : Bactéries vertes non sulfureuses v/v : volume à volume HPLC : High Presure Liquid Chromatography X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3 indolyl-ß-D-galactopyranoside INT : 2 (p-iodo-pheny)-3-(p-nitropheny)-5-phenyl tetrazolium chloride iii Sommaire Remerciements i Introduction générale ii Abréviations iii Sommaire iv Partie 1 : Les techniques d'écologie microbienne I Notions d'écologie microbienne 1 II Les méthodes classiques d'écologie microbienne 3 2.1 Les cultures d'enrichissement et l'isolement 3

2.1.1 L'enrichissement 3

2.1.2 L'isolement et la taxinomie 4 2.2 Quantification et mesure d'activité microbienne 7

2.2.1 Quantification 7

2.2.2 Mesure d'activité microbienne 12 2.3 Une vue restreinte de la diversité 14 III Les acides nucléiques en écologie microbienne 15 3.1 Le développement des techniques moléculaires 15

3.1.1 La phylogénie moléculaire 16

3.1.2 L'ARN ribosomique 16

3.1.3 Le choix de l'ARN 16S 17 3.2 L'analyse phylogénétique 18

3.2.1 Les méthodes de phylogénie 18

3.2.2 L'informatique au service de la phylogénie 23 3.3 Les méthodes moléculaires 27

3.3.1 Le clonage et le séquençage des ARNr 27

3.3.2 Les sondes nucléiques 32

3.3.3 La DGGE 34

3.3.4 Les autres techniques 36 3.4 De la diversité phylogénétique à la diversité physiologique 37 3.5 Les biais des techniques moléculaires 39

3.5.1 Echantillonnage et conservation des échantillons 40

3.5.2 Les techniques de PCR 40

3.5.3 Les techniques d'hybridation 42

3.5.4 Les techniques de DGGE 43

3.5.5 Une solution : l'approche pluridisciplinaire 43 Partie 2 : Les habitats microbiens I Les origines de la vie 45 1.1 Les premières traces de vie 45

iv 1.2 Une origine de la vie controversée 46 II. L'atmosphère 49 III. Les habitats terrestres 49 3.1 Les couches superficielles de la lithosphère 49

3.1.1 Description de l'habitat 49

3.1.2 La rhizosphère 50

3.1.3 L'apport des techniques moléculaires 50 3.2 La biosphère souterraine 52

3.2.1 Description de l'habitat 52

3.2.2 Le concept de biosphère souterraine 53

3.2.3 La communauté microbienne souterraine 54

3.2.4 Des profondeurs aux astres 55 3.3 Les réservoirs pétroliers 56

3.3.1. Formation et production du pétrole 56

3.3.2. Composition physico-chimique du biotope 57

3.3.3. La diversité microbienne des puits de pétrole 58 3.3.4 Activité microbienne liée aux hydrocarbures 62 IV. Habitats aquatiques 63 4.1 L'habitat d'eau douce 64 4.2 L'habitat maritime 65

4.2.1 Les micro-organismes marins isolés 65

4.2.2 L'utilisation des techniques moléculaires 65

4.2.3 Les Fosses océaniques 69 4.3 Les zones sédimentaires marines et lacustres 69

4.3.1 Description du biotope 69

4.3.2 Les techniques moléculaires 70 4.4 Les sources hydrothermales océaniques profondes 72

4.4.1 Nature et structure des émissions hydrothermales profondes 73

4.4.2 Faune associée à l'écosystème hydrothermal 76

4.4.3 Les micro-organismes des sources hydrothermales 78 4.5 Les sites hydrothermaux continentaux et côtiers 89

4.5.1 Description des biotopes 89

4.5.2 Les micro-organismes des sites côtiers et continentaux 91 V La flore microbienne liée à l'Homme, aux animaux et à l'activité humaine 97 5.1 L'Homme comme écosystème microbien 97

5.1.1. La flore de la cavité buccale 97

5.1.2. Les micro-organismes du tractus digestif 98

5.1.3 L'apport des techniques moléculaires en microbiologie humaine 99 5.2 La flore microbienne associée aux autres animaux 100

v 5.3 Les micro-organismes associés aux activités humaines 103

5.3.1 L'extraction de minerai 103

5.3.2. Les boues de stations d'épuration 104

5.3.3 Les autres milieux 105 VI Conclusion et présentation du projet d'étude 106 Partie 3 : Matériels et méthodes I Echantillonnage et conservation de l'échantillon 109 1.1 Echantillonnage des puits de pétrole 109 1.2 Echantillonnage des sources hydrothermales profondes 109

1.2.1 Echantillons de cheminée 110

1.2.2 Echantillons de fluides 111 1.3 Echantillonnage des sources chaudes terrestres 111 II Analyse de l'ADNr 16S 111

2.1 Extraction d'ADN 111

2.1.1 Extraction de l'ADN sur filtre ou sur culot de centrifugation 112

2.1.2 Extraction de l'ADN chromosomique par la méthode de Sambrook et al. (1989) 112

2.1.3 Méthode d'extraction au micro-ondes 113

2.1.4 Extraction de l'ADN chromosomique par la méthode de Pitcher et al. (1989) 113

2.1.5 Extraction de l'ADN au "Bead-Beater" 113 2.2 Amplification de l'ADNr 16S 114

2.2.1 Réactions d'amplification classiques 114

2.2.2 Techniques d'optimisation de la réaction 114

2.2.3 Choix des amorces d'amplification 115 2.3 Clonage des produits de PCR 116

2.3.1 Utilisation du kit TOPO TA Cloning 116

2.3.2 Transformation des cellules par électroporation 117 2.4 Analyse des clones par RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism 117 2.5 Séquençage 118

2.5.1 Réactions de séquence 118

2.5.2 Amorces de séquençage 118

2.5.3 Migration des réactions de séquences 119 2.6 Analyse des séquences 120 III Hybridation in situ 120 3.1 Construction des sondes 120 3.2 Mise au point des sondes - Test de spécificité 121

3.2.1 Hybridation sur membrane 121

3.2.2 Hybridation sur culture pure 123 3.3 Hybridation in situ 123

3.3.1 L'enrobage des lames d'observation 123

vi 3.3.2 Fixation des cellules 123

3.3.3 Extraction des cellules de l'échantillon 124

3.3.4 Hybridation in situ 124 IV Observation et quantification des cellules 125 Partie 4 : Articles Article 1 129 Article 2 154 Article 3 174 Article 4 193 Article 5 202 Article 6 206 Conclusion générale 209 Réferences bibliographiques 214 Annexes Structure secodaire de l'ADNr 16S de E. coli Arbre phylogénétique des Bacteria et des Archaea

vii Les techniques d'écologie microbienne Les techniques d'écologie microbienne

La microbiologie est fondée depuis le 19ème siècle sur l'observation et la culture des micro- organismes. Or on s'est rendu compte que les techniques de mise en culture donnent une image faussée, puisque obligatoirement sélective, du rôle et de l'importance des micro-organismes dans la nature. Aussi, aux techniques classiques de microbiologie (techniques de culture, de comptage, microscopie électronique, utilisation de marqueurs radioactifs) se sont ajoutées des techniques de biologie moléculaire (analyses du génome, sondes nucléiques, séquençage) qui permettent dorénavant d'obtenir une image plus précise des relations des micro-organismes avec leur environnement. Dans ce chapitre je me propose, après un bref rappel de notions d'écologie microbienne, de présenter les techniques classiquement utilisées en écologie puis, plus spécifiquement, les techniques fondées sur l'utilisation des acides nucléiques. Une attention particulière sera portée aux biais inhérents à ces technologies.

I Notions d'écologie microbienne

Définitions

Un écosystème est un ensemble dynamique au sein duquel interagissent à divers degrés des facteurs biotiques (individu, population, communauté) et abiotiques (facteurs physico-chimiques) (cf. figure 1.1) (Begon et al., 1996).

Complexité de l'interaction croissante

Guilde Individu Population Communauté Ecosystème Individu PopulationPopulation CommunautéCommunauté IndividuIndividuIndividu PopulationPopulation IndividuIndividu

Effet des facteurs abiotiques (environnement)

pH, T°, 02, NaCl, Lumière, H20, Nutriments

Figure1.1. Représentation schématique des relations au sein d'un écosystème Individu : Unité distincte qui évolue séparément des autres, qui se reproduit dans un groupe et a un rôle (une niche) défini. Population : Groupe d'individus qui vivent sur une zone définie. Guilde : Plusieurs populations distinctes réalisant des tâches similaires ou exploitant les mêmes ressources environnementales dans un but similaire. Communauté : Assemblage de populations dans un même espace et sur une même période de temps. Environnement : Se réfère à tout ce qui entoure un organisme vivant. Correspond aussi bien à des facteurs physiques, chimiques ou biologiques qu'aux forces qui agissent sur l'organisme.

1 Les techniques d'écologie microbienne

Les interactions entre les composants de l'écosystème

La structure d'une communauté microbienne va donc être soumise à des fluctuations temporelles et spatiales qui vont correspondre à des phases de colonisation de nouveaux milieux ou de remplacement d'une communauté par une autre plus adaptée (comme c'est le cas dans le tractus digestif au cours de la croissance d'un individu). Nous savons qu'un grand nombre de facteurs peuvent modifier la composition de la communauté microbienne : la disponibilité en sources de carbone, d'énergie et en accepteurs d'électrons, la température, le pH, l'O2, la teneur en eau ou encore la lumière. Aussi pour survivre et se développer les micro-organismes ont développé des adaptations structurales et nutritionnelles qui correspondent à différentes stratégies en fonction des conditions physico-chimiques auxquelles ils sont exposés (par exemple stratégies r et K, cf. tableau 1.1). Tableau 1.1. Comparaison des stratégies r et K d'après Mac Arthur (1962) stratégies r stratégies K Ø Taux de reproduction élevé Ø Taux de reproduction faible Ø La forte teneur en nutriments permet une croissance importante au Ø La faible teneur en nutriments limite la croissance de tous détriment de cellules moins bien adaptées les organismes. Ø Très forte population microbienne Ø Population plus réduite Ø Grosses variations de population lorsque la teneur en nutriments Ø Communauté pérenne et stable varie Ø Ex: "Blooms" cyanobactériens dus à un apport de phosphates, ou Ø Ex: Spirillum et Vibrio dans l'eau de mer, bactéries dans les "blooms"" de Pseudomonas dus a un apport de sources carbonées lac oligotrophiques

D'autres part, aux facteurs extérieurs s'ajoutent de fortes interactions qui peuvent se produire au sein d'une population (coopération ou compétition) ou entre populations (synergie, symbiose et antagonisme).

L'habitat naturel

L'étendue de l'habitat microbien est à mettre en rapport avec la taille du micro-organisme1. Même si les cellules seules n'existent pas ou très peu dans la nature (on parle plutôt de micro-colonies) des micro-environnements de l'ordre du millimètre peuvent être le siège de très fortes variations physico- chimiques (c'est le cas notamment dans les particules de sol). De plus les cellules colonisent souvent les surfaces sous la forme d'un biofilm. Cette structure complexe permet aux micro-organismes d'accéder plus facilement aux nutriments nécessaires à leur croissance et de les stocker.

L'étude des populations microbiennes dans leur environnement devra donc répondre aux questions de la composition, de la structure et de la fonction de cette population. Pour répondre à ces questions les premiers microbiologistes disposaient de méthodes fondées sur leur capacité à recréer le plus fidèlement possible les conditions de croissance in situ. Par la suite, le développement des techniques moléculaires a permis de s'affranchir partiellement des étapes de mise en culture.

1 Pour une cellule de 3µm une distance de 3 mm correspond à l'équivalent d'une distance de 2 km pour l'homme.

2 Les techniques d'écologie microbienne

II Les méthodes classiques d'écologie microbienne

2.1 Les cultures d'enrichissement et l'isolement

2.1.1 L'enrichissement

La plupart de nos connaissances sur les micro-organismes proviennent d'études réalisées sur des cultures pures isolées de l'environnement. Cet isolement est précédé par une phase d'enrichissement qui va favoriser la croissance d'un type donné de micro-organisme, sélectionné en fonction des conditions physiques et nutritionnelles du milieu.

On distingue deux grands types de milieux, les milieux électifs où les souches les plus adaptées aux conditions de culture vont se développer et les milieux sélectifs où on intervient physiquement ou chimiquement pour favoriser la croissance d'un type donné de micro-organismes2. On favorise dans tous les cas les micro-organismes ayant les vitesses de croissance des plus élevées dans des conditions données. Il existe plusieurs moyens classiques de modifier la sélectivité d'un milieu : Ø Ajouter un composé utilisé par un organisme comme source nutritive. Ø Supprimer un composé utilisé uniquement par les organismes que l'on ne souhaite pas isoler

(supprimer toutes les sources d'azote autres que l'azote gazeux (N2) pour isoler les bactéries fixatrices d'azote). Ø Ajouter des antibiotiques (pénicilline pour inhiber les bactéries Gram + et certaines bactéries Gram -, néomycine et streptomycine pour inhiber les bactéries en général, actidone et nystatine pour inhiber les champignons). Ø Modifier les propriétés physico-chimiques du milieu (pH, potentiel redox, etc.). Ø Modifier les conditions d'incubation (température, teneur en eau, pression osmotique, lumière, etc.). Un panel de milieux d'enrichissement, présentant l'ensemble des conditions physico-chimiques rencontrées dans le biotope d'étude, devra être choisi pour permettre la croissance du plus grand nombre possible de types métaboliques. Compte tenu de la complexité de certains écosystèmes, il est parfois nécessaire de mettre en oeuvre des systèmes élaborés de culture afin de pouvoir assurer le développement de certains organismes. C'est le cas notamment des milieux à fort gradient (physico-chimiques, nutritionnels, etc.) pour lesquels les systèmes suivants ont été mis au point : Ø La colonne de Winogradsky (cf. figure 1.2). Ø la chambre de culture en flux continu de Huber et al. (1998b) pour isoler Thermocrinis ruber, une bactérie hyperthermophile pléomorphe formant, une fois fixée, de longs filaments roses dans les

2 Les milieux électifs sont en fait des milieux peu sélectifs.

3 Les techniques d'écologie microbienne sources chaudes d'Octopus Spring à Yellowstone (USA). Les systèmes de culture en continu permettent de sélectionner des micro-organismes ayant de fortes affinités avec des substrats en faibles concentrations. Les micro-organismes n'ayant pas d'affinité suffisante sont lessivés du milieu. Ø La "Benthic Gradient Chamber" mise au point pour reproduire les gradients sédimentaires et étudier les phénomènes de compétitions entre bactéries pourpres et vertes (Caumette et al., 1998). Ø Les chémostats pour maintenir en culture les bactéries formant des enchevêtrements ("mats") filamenteux de soufre (Taylor et al., 1999). Ø Les co-cultures pour la croissance de bactéries syntrophes : Syntrophomonas avec des bactéries sulfato-réductrices (BSR) (Harmsen et al., 1993) ou de Proteobacteria epsilon soufre oxydantes avec des BSR (Thiovulum sp. pour Wirsen et Jannasch, 1978 ou Arcobacter sp. pour Teske et al., 1996b). Dans ce cas le développement du micro-organisme est conditionné par la consommation d'un des produits de son métabolisme par un second micro-organisme.

Couvercle

Algues et cyanobactéries Eau de lac ou de Figure 1.2. Principe de fonctionnement d'une colonne de marais Bactéries soufrées Winogradsky. La phase supérieure reproduit les pourpres conditions retrouvées dans le milieu liquide (luminosité, Bactéries soufrées aération) alors que la phase inférieure reproduit les vertes Boues conditions des premiers centimètres de sédiments enrichies en (obscurité, augmentation du potentiel réducteur). Au cours matières Décomposition du temps, l'établissement de la flore microbienne organiques et anaérobie et sulfato-

en CaSO4 réduction s'effectue en fonction de leur préférendum au sein des gradients (d'après Madigan, 1996).

2.1.2 L'isolement et la taxinomie

A partir de l'enrichissement il est possible d'isoler des espèces pures. Pour ce faire on dispose de trois grands types de techniques : l'isolement sur boite, la dilution successive en milieu liquide ou dans l'agar. Pour chacune des méthodes plusieurs repiquages successifs des souches isolées seront nécessaires pour s'assurer de la pureté de l'isolat.

Une fois la souche isolée il convient de la caractériser, c'est à dire de définir les caractères phénotypiques et génotypiques qui permettront de la comparer avec d'autres micro-organismes préalablement isolés. On réalise alors une taxinomie. Une partie de ces caractères est regroupée dans le tableau 1.2. La taxinomie microbienne a longtemps été considérée comme une discipline ingrate. A l'instar de la taxinomie des organismes supérieurs elle était essentiellement fondée sur l'utilisation de clés dichotomiques successives. Or ces clés n'étaient pas d'un emploi simple et étaient de plus sources

4 Les techniques d'écologie microbienne d'erreurs. Le développement de la taxinomie numérique3 et des approches polyphasiques dans les années 70 (Colwell, 1970; Sneath et Sokal, 1973; Vandamme et al., 1996) mais surtout l'apparition de la taxinomie moléculaire (en particulier l'analyse de l'ARN ribosomique ou des gènes codant pour l'ARNr (ADNr)) ont permis de redonner un véritable élan à cette discipline.

Tableau 1.2. Liste non -exhaustive des caractères phénotypiques et génotypiques déterminés pour une souche isolée. Morphologie : Physiologie : Forme de la cellule Milieu de culture Taille de la cellule (diamètre, longueur) Optimum et gamme de température Mobilité Optimum et gamme de pH Flagelle Croissance phototrophique ou lithotrophique Type de division cellulaire Besoins en vitamines Différenciation cellulaire Sources de carbone nécessaire à la croissance Structures internes et externes (endospores, vésicules Sources d’azote nécessaire à la croissance gazeuses, etc.). Relation vis à vis de l’oxygène Coloration de Gram Modes de production d’énergie : Ultrastructure - donneurs d’électrons : organiques ou inorganiques

Composition chimique et analyse molécul aire : - accepteurs d’électrons : oxygène, nitrate, sulfate, CO2, Couleur des suspensions de cellules oxydes de fer, etc. Pigments Enzymes extracellulaires : Composition en base de l’ADN - amylases, lipases, gélatinases, cellulases, xylanases Séquence de l’ARNr 16S Autres enzymes : Réassociation ADN/ADN entre espèces proches - oxydase, catalase Acides gras totaux. Fermentation du glucose Dénitrification

La notion d'espèce est le concept clé et l'unité de base de la taxinomie. Elle résulte des premiers travaux de hiérarchisation du monde vivant au 18ème siècle par le naturaliste suédois Carl Von Linné. Selon la définition devenue classique proposée par Ernst Mayr (1982), une espèce est un ensemble d'individus féconds entre eux et seulement entre eux, donc isolés des autres groupes d'êtres vivants. Or le concept de sexualité chez les procaryotes est très différent de celui des eucaryotes puisque la reproduction est végétative et asexuée. De plus on sait que des phénomènes de parasexualité existent chez les procaryotes (conjugaison, transformation et transduction) et que ceux-ci passent la barrière des espèces (cf. revue de Taddei et al., 1996). A la différence des eucaryotes, les caractères morphologiques des procaryotes considérés seuls n'ont toujours qu'une faible signification dans la classification des bactéries car la grande majorité des micro-organismes ont des formes trop simples pour que l'on puisse les utiliser pour la taxinomie. Le développement des techniques moléculaires a permis de donner une définition très rigoureuse de l'espèce. Cette définition est fondée sur les propriétés de dénaturation et de renaturation du double brin de l'ADN génomique bactérien en fonction de la température. Elle permet de définir une espèce

3 Des caractères phénotypiques (tels que ceux présentés dans le tableau 1.2) peuvent servir de base à la comparaison de plusieurs souches. Il faut s'assurer que les caractères comparés sont informatifs et notamment qu'ils ne correspondent pas à un caractère dérivé. Il convient dans un premier temps de discrétiser ces caractères (sous forme de 0 et de 1) puis de les présenter sous la forme d'une matrice. Les similitudes entre organismes vont être exprimées sous forme de dendrogrammes. Des valeurs d'hybridations ADN-ADN ou ARN-ADN pourront être aussi utilisées comme caractères dans une taxinomie. Toutefois les hybridations ADN-ADN ne vont être informatives que dans le cas d'espèces proches et ne pourront être utilisées entre des espèces éloignées.

5 Les techniques d'écologie microbienne procaryotique comme constituée de souches qui présentent des valeurs d'hybridation ADN-ADN

4 supérieures ou égales à 70% et une valeur DTm inférieure ou égale à 5°C (Wayne et al., 1987). Par la suite la généralisation de l'analyse de l'ADNr a incité les auteurs à corréler les pourcentages d'identité entre ARNr 16S et les pourcentages de réassociation ADN/ADN (Stackebrandt et Göebel, 1994). Ainsi les séquences d'ADNr ayant des identités inférieures à 97% correspondent généralement à des espèces différentes. Amann et al. (1995) abaissent par précaution cette limite à 95%. Selon certains auteurs les critères d'hybridation ADN-ADN et de similarité d'ADNr 16S ne suffisent pas pour distinguer des populations écologiquement distinctes. Il faut leur associer des mesures de similarité de gènes codants pour des protéines du métabolisme (plus impliquées dans les mécanismes écologiques) (Palys et al., 1997). Le positionnement taxonomique d'une souche ne saurait toutefois se faire uniquement sur des critères génétiques et l'utilisation de l'ensemble des caractères phénétiques et génétiques permettent d'ancrer plus solidement l'organisme au sein d'une famille, d'un genre ou d'une espèce définie (cf. tableau 1.3).

Tableau 1.3. Résolution taxonomique des techniques d'analyse (d'après Vandamme et al., 1996) Techniques Niveau résolutif Famille Genre Espèce Souche RFLP PGFE, LFRFA Ribotypage Amplifications d'ADN (RAPD, AFLP, ARDRA) Typage de phages et de bactériocines Techniques sérologiques (monoclonales, polyclonales) Zymogrammes Analyse des profils protéiques Hybridations ADN-ADN G+C % Marqueurs chemotaxiques (quinones, polyamines) FAME Constituants des parois Phénotype (classique, API, Biolog, ...) Séquençage ARNr Sondes nucléiques Séquençage du génome Abréviations : RFLP : Restriction Length Fragment Polymorphism; PGFE : Pulsed-Field Gel Electrophoresis; LFRFA : Low Frequency Restriction Fragment Analysis; RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA; AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism; ARDRA : Amplified rDNA Restriction Analysis.

2.2 Quantification et mesure d'activité microbienne

L'isolement des souches permet de définir le type métabolique des micro-organismes mais il peut être intéressant : Ø de suivre l'évolution du micro-organisme dans le temps au sein de son environnement,

4 Tm , Temperature melting, est la valeur médiane du profil thermique de dénaturation d'un duplex ADN/ADN ou ADN/ARNr, le DTm

étant la différence de Tm entre l'hybride homologue et hétérologue.

6 Les techniques d'écologie microbienne

Ø de définir sur quelle distance s'étend sa niche écologique et sa zone de densité optimum, Ø de connaître la vitesse à laquelle il dégrade les nutriments qu'il utilise, Ø de comprendre comment les éléments qu'il métabolise s'insèrent dans les grands cycles géochimiques et comment ils sont éventuellement incorporés dans le métabolisme d'autres populations de micro-organismes.

2.2.1 Quantification

Les méthodes pour quantifier les micro-organismes présents dans un échantillon naturel dérivent de celles utilisées pour quantifier les micro-organismes en culture pure. On distingue trois grand types de méthodes : les techniques de mise en culture, les techniques de comptage direct et les techniques d'analyse chimique de composants cellulaires.

2.2.1.1 Les techniques culturales

A l'aide de dilutions successives sur milieu liquide ou solide on détermine la dilution maximale à laquelle il est possible d'obtenir une croissance de micro-organismes (technique du NPP: Nombre le Plus Probable sur milieu liquide et de UFC : Unité Formant Colonie sur milieu solide). Ces techniques sont grandement dépendantes du milieu et des conditions de culture utilisés. Elles ne permettent d'accéder qu'à un nombre restreint de micro-organismes présents dans l'échantillon (cf. §. 2.3) Ces techniques peuvent toutefois être utilisées conjointement avec d'autres méthodes pour détecter des populations au type métabolique défini (par exemple les BSR, les méthanogènes, les autotrophes soufre réducteur).

2.2.1.2 Les techniques de comptage direct

Cellules de com ptage

L'échantillon sous une forme liquide est disposé dans des cellules de comptage (cellules de Mallassez et de Petroff-Hausser). Les cellules sont comptées sous le microscope dans un volume bien déterminé. Cette technique n'est malheureusement applicable que dans des échantillons où les cellules sont individualisées. Or dans la nature les cellules sont très fréquemment associées de manière très cohésive ou associées à des surfaces. Pour simplifier le comptage et pour ne compter que des cellules viables il est parfois possible de faire croître les cellules dans un milieu contenant un inhibiteur de la synthèse d'ADN comme l'acide nalidixique et de l'extrait de levure avant de les dénombrer (Kogura et Simidu, 1979). Les cellules viables vont alors former des cellules géantes (la croissance de paroi n'étant pas stoppée). Toutefois la limite de détection de cette technique est de l'ordre de 5.106 à 10 7 cellules par ml, et cette valeur est bien supérieure à la teneur en micro- organismes que l'on peut retrouver dans l'eau de mer de surface (5.105 cellules/ml) ou de profondeur (5.104 cellules/ml) par exemple.

7 Les techniques d'écologie microbienne

Comptage par épifluorescence

Pour ce type de comptage on utilise la propriété qu'ont certains chromophores lorsqu'ils sont excités à une longueur d'onde (l 1), de réémettre l'énergie fournie sous forme lumineuse à une longueur d'onde supérieure (l 2) (Zimmermann et Meyer-Reil, 1974). La fluorescence réémise a une durée de vie plus ou moins longue (fading). Selon les colorations c'est le chromophore qui va se fixer directement sur la cible (DAPI, SYBR Green) alors que dans d'autres cas il sera relié à une molécule non fluorescente qui jouera le rôle d'agent de spécificité (anticorps, sondes nucléiques). La coloration va être réalisée directement sur les cellules. Pour des environnements pauvres en micro-organismes il est souvent nécessaire de concentrer les échantillons par filtration. On utilise couramment un filtre noirci (Hobbie et al., 1977) sur lequel il est possible de colorer les cellules avec des marqueurs fluorescents tels que : Ø le DAPI (diaminodino-phenylindole) colorant l'ADN, Ø l'acridine orange qui colore l'ADN et l'ARN, Ø la fluorescéine isothiocianate (FITC fluorescence verte) et la rhodamine (fluorescence rouge) qui colorent les protéines en réagissant avec les groupes sulfydryles, Ø le SYPRO qui colore les protéines et qui a été utilisé récemment pour quantifier la biomasse planctonique (Zubkov et al., 1999), Ø le Calcofluor qui réagit avec la cellulose, la chitine et les polysaccharides similaires, Ø le DANSYL chloride et le "8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid salts" (Mg-ANS et Na- ANS) qui réagissent (fluorescent) en entrant en contact avec les lipides microbiens. Les deux premiers colorants ont une forte propension à se fixer sur des particules non biologiques et sont souvent inutilisables dans des échantillons naturels. Il est donc nécessaire de prévoir une extraction spécifique des cellules avant leur coloration. Il est aussi possible d'utiliser des colorants beaucoup plus spécifiques des acides nucléiques tels que le SYBR Green I et II, le YOYO-1, le POPO-1 ou le YO-PRO-1 (cf. tableau 1.4) (Noble et Fuhrman, 1998; Weinbauer et al., 1998; Marie et al., 1999).

Certains colorants vont permettre de distinguer les cellules mortes des cellules vivantes soit en ne pénétrant que dans les cellules vivantes (on parle de colorants métaboliques), soit en ne pénétrant que dans les cellules mortes. De plus les colorants métaboliques permettent de détecter le niveau d'activité des cellules (par exemple mesure du potentiel d'oxydo-réduction, Rodriguez et al., 1992). Enfin il est aussi possible d'utiliser des anticorps fluorescents à la spécificité plus ou moins large pour compter certaines populations de micro-organismes (en particulier dans le domaine médical et dans l'alimentaire pour la détection et le comptage de certains sérotypes de souches pathogènes).

8 Les techniques d'écologie microbienne

Tableau 1.4. Liste non-exhaustive des fluorochromes spécifiques des acides nucléiques et utilisables pour le comptage cellulaire (d'après le site MolecularProbes http://www.molecularprobes.com). Colorants des acides nucléiques Ex/Em£ Propriétés et usages 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 358/461 Semi-perméable Sélectif des bases AT Etude du cycle cellulaire, détection des mycoplasmes Colorant cellulaire et chromosomique 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 546/647 Peu permanent Sélectif des bases GC CMF (cytométrie en flux) Acridine orange 500/526 (ADN) Perméable 460/650 (ARN) Mesures du taux ADN/ARN Marquage des lysozomes, CMF Bromure d'éthidium 518/605 Imperméable Intercalant du dsADN (double brin) Coloration des cellules mortes Colorant chromosomique Electrophorèses, CMF Excitable par un laser Argon Hoechst 33342 350/461 Perméable Sélectif des bases AT Coloration des cellules vivantes Etude du cycle cellulaire Colorant cellulaire et chromosomique POPO-1 434/456 Imperméable Forte affinité avec l'ADN Coloration des cellules mortes Colorant cellulaire et chromosomique Pré-colorant d'électrophorèse SYBR Green I 494/521 Forte sensibilité à l'ADN et aux oligonucléotides Colorant post électrophorèse Colorant cellulaire SYBR Green II 492/513 Forte sensibilité à l'ARN et aux ssADN (simple brin) Colorant post électrophorèse Colorant cellulaire YO-PRO-1 491/509 Imperméable Coloration des cellules mortes Electrophorèses Excitable par un laser Argon YOYO-1 491/509 Imperméable Forte sensibilité à l'ADN Coloration des cellules mortes Coloration chromosomique Pré-colorant d'électrophorèse £Longueur d'onde d'excitation et d'émission (nm/nm)

Des tentatives d'automatisation des comptages ont été entreprises pour faciliter certaines études comparatives. L'analyse d'image assistée par ordinateur permet de reconnaître différents paramètres morphométriques (longueur, largeur, surface, périmètre), de quantifier les cellules et de déterminer le volume cellulaire (Van Wambeke, 1995). Mise au point sur des cultures pures, cette technologie n'est encore pas applicable pour le comptage d'échantillons environnementaux; en effet la diversité des morphotypes, la taille des cellules (moins importante que pour les cultures pures), le bruit de fond important lié aux particules (sédiments, sol, matière organique) rendent l'analyse très fastidieuse et très aléatoire. L'amélioration des technologies d'acquisition d'image (microscopie

9 Les techniques d'écologie microbienne confocale, caméra CCD), l'accélération de l'acquisition et du traitement des données (cartes d'acquisition et microprocesseur) devraient permettre dans les années à venir de généraliser l'analyse d'image associée à l'épifluorescence. Récemment Blackburn et al., (1998) proposaient d'utiliser des algorithmes de calcul fondés sur les réseaux neuronaux pour faciliter la quantification et l'analyse de l'activité bactérienne d'échantillons de bactérioplancton prélevés en mer Baltique.

La cytométrie en flux (CMF)

Cette technique apparue dans les années 1980 pour détecter des anomalies dans les cellules animales et analyser le cycle cellulaire est dorénavant couramment utilisée pour quantifier les micro- organismes en particulier dans les environnements liquides comme l'eau de mer (Joux et Lebaron, 1995; Monfort et al., 1995). Différents signaux optiques permettent de mesurer différents paramètres cellulaires (cf. tableau 1.5) :

Tableau 1.5. Paramètres mesurés en CMF en fonction des signaux optiques analysés Signaux optiques Paramètre mesuré Diffusion à petit angle Taille cellulaire Diffusion à grand angle Réfringence cellulaire Fluorescence Contenu en ADN, flux ioniques, potentiel transmembranaire

La taille des cellules, le contenu en ADN, l'emploi de colorants particuliers ou plus récemment l'utilisation de sondes nucléaires ou d'anticorps spécifiques permettent de distinguer et de séparer les différentes populations contenues dans l'échantillon. Utilisée pour le comptage direct des cellules, cette technique très puissante et très rapide (une fois mise au point) est applicable pour suivre le métabolisme cellulaire (potentiel membranaire, activité respiratoire, activité enzymatique par exemple) et effectuer un tri cellulaire (et donc un isolement puisque la technique n'est pas destructive). La CMF atteint toutefois ses limites pour des échantillons où la répartition des cellules n'est pas homogène, où on retrouve des morphotypes non réguliers tels que des filaments ou des structures en chaînettes, où de nombreuses particules (que l'on peut confondre avec des cellules) sont présentes et où les cellules sont associées fortement aux particules (particules de sols ou de cheminée).

2.2.1.3 Les mesures de constituants cellulaires

Ces techniques ont pour objectif la quantification d'un constituant cellulaire et permettent d'extrapoler la biomasse microbienne en fonction de la biomasse de ce constituant (Servais, 1995). Si certaines de ces techniques sont très précises en terme de mesure (par exemple mesure de l'ATP), elles sont par contre extrêmement dépendantes de la qualité de l'extrapolation.

La mesure de l'ATP

L'adénosine-triphosphate peut être utilisée comme marqueur de biomasse active en écologie microbienne et peut être détectée avec une très forte sensibilité à l'aide de techniques enzymatiques

10 Les techniques d'écologie microbienne de bioluminescence (Holm-Hansen et Booth, 1966; Hodson et al., 1976). Cette technique est toutefois sujette à des sources d'erreur liées : au stress de la cellule lors du prélèvement et du traitement de l'échantillon, à la méthode d'extraction (rendement plus ou moins grand selon les solvants utilisés), à la destruction de l'ATP lors de l'extraction, à l'inactivation des réactifs de dosages par l'échantillon (notamment dans le cas des sédiments) ou à la présence d'ATP sous une forme libre dans l'échantillon (par exemple liée aux argiles). De plus le taux d'ATP n'est pas directement corrélé aux cellules vivantes et l'extrapolation "biomasse d'ATP à biomasse cellulaire" est très dépendante de l'état physiologique des cellules (Poulicek et Danckers, 1995).

Mesure de l'Azote et du Carbone cellulaires

Par spectrométrie de masse il est possible de définir la quantité de N et C présents dans l'échantillon et d'extrapoler cette quantité à celle contenue dans les cellules. Cette technique est très approximative et nécessite de travailler sur des échantillons très propres.

Mesure des constituants de la paroi microbienne

Les acides muramiques contenus dans la paroi bactérienne peuvent être extraits d'échantillons environnementaux et analysés par HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) (Moriarty, 1977). La quantité d'acide muramique dans la cellule est fonction du type de paroi (Gram négative ou Gram positive : 12 µg.mg -1 en moyenne chez les Gram- et 44 µg.mg-1 chez les Gram+). Cette technique n'est pas applicable si on ne connaît pas la proportion de Gram- et de Gram+ dans l'échantillon. Il faut de plus tenir compte du fait que les spores contiennent 4 fois plus d'acide muramique que les cellules végétatives.

Lipopolysaccharides (LPS)

Les LPS protéobactériens agissant comme endotoxines peuvent être détectés à de très faibles doses (10-20 pg/mL) en analysant leur effet sur les amaebocytes de Limule (Limulus polyphemus) (Watson et al., 1977). Ce test est utilisé en pharmacologie ou en microbiologie clinique pour détecter les micro-organismes présents dans les fluides cérébro-spinaux, le sérum ou l'eau potable. Toutefois la sensibilité de la méthode la rend très dépendante des contaminants et sa spécificité la limite aux milieux colonisés par des entérobactéries.

2.2.1.4 L'analyse lipidique et les autres marqueurs moléculaires

La technique FAME (Fatty Acid Methyl Ester) est fondée sur l'analyse des profils d'acides gras obtenus par chromatographie en phase gazeuse. Chaque profil est spécifique d'une souche et peut- être comparé avec d'autres profils contenus dans une banque de données (Drucker et Owen, 1971; Moss et al., 1974; Guezennec, 1995; Böttiger, 1996). En plus de l'établissement de profils lipidiques, il est possible de rechercher un ou des lipides marqueurs spécifiques dont la présence sera caractéristique d'un groupe de micro-organismes (par exemple étude des micro-organismes colonisant

11 Les techniques d'écologie microbienne différents coupons en milieu hydrothermal, Guezennec et al., 1998). Les rapports entre certains marqueurs spécifiques pourront donner une indication sur l'état physiologique de la communauté. Cette technique peut donc être utilisée sur des souches isolées ou sur des environnements peu diversifiés afin de suivre l'évolution d'une souche particulière. Par exemple la recherche des Nocardia dans les boues actives (Cha et al., 1999) ou l'étude de souches isolées d'environnements naturels (des sols (Ka et al., 1994) ou des sédiments pollués (Wagner-Döbler et al., 1998)). L’analyse des profils lipidiques est toutefois limitée par un manque de banques de données uniformisées, par un nombre relativement faible de micro-organismes type étudiés et par l’influence de l’état physiologique cellulaire sur les profils observables. En dehors des lipides, d'autres marqueurs moléculaires peuvent être utilisés pour accéder à la diversité microbienne d'un échantillon (cf. tableau 1.6).

Tableau 1.6. Principaux marqueurs bactériens (d'après Guezennec, 1995) Biomarqueurs Micro-organismes Remarques ou Exemples de molécules Phospholipides (Acides Gras) Toutes cellules Mesure de la biomasse viable Acides ß Hydroxylés (LPS) Bactéries Gram - ß OH C14:0 Acides Gras Toutes cellules C16:1w7, C16:0 Sulfato-réductrices iC17: 1w7c, 10MEC16:0 Thio-oxydantes OH monoinsaturés, 10-11MeOC18:0 Plasmalogènes Bactéries anaérobies essentiellement Quinones Bactéries aérobies Ubiquinones Bactéries anaérobies Ménaquinones Anaérobies facultatives Ubiquinones et Ménaquinones Ethers de Glycérol Archaea Acide Muramique Bacteria Acide diaminopimélique Bactéries Gram - et quelques Gram + Acides aminés (D) Bacteria D-alanine, D-glutamine Hopanes Quelques Bacteria Phytopigments Phototrophes

2.2.2 Mesure d'activité microbienne

2.2.2.1 Incorporation des radio-isotopes

Ils permettent de suivre la dégradation, la production ou la transformation d'un composé, d'en estimer la vitesse ou la localisation. Pour ce faire on va suivre l'incorporation d'isotopes radioactifs 14C,

3 35 14 H, S. L'incorporation du CO2 permettra de suivre les mécanismes de photosynthèse, ou la 14 production de CH4 permettra de suivre les mécanismes de méthanogenèse. La sulfato-réduction 35 2- 35 pourra être suivie par mesure de la conversion de SO4 en H2 S, alors que la méthylotrophie ou la méthanogenèse acétoclastique pourra être suivie en mesurant la conversion du méthanol ou de

14 14 l'acétate marqué au C en CH4 (Zehnder et al., 1979). Les mécanismes de chimioorganotrophie pourront être suivis par mesure de l'incorporation de sucres et d'acides aminés marqués au 14C. La synthèse de l'ARN ou de l'ADN peut être suivie par mesure de l'incorporation de la 3H-adénine (Karl, 1979, 1981). L'activité des cellules bactériennes peut être suivie en mesurant l'incorporation de la 3H-

12 Les techniques d'écologie microbienne thymidine dans l'ADN chez la majeure partie des hétérotrophes (Fuhrman et Azam, 1980, 1982;

35 2- 3 Pollard, 1998), du SO4 (Monheimer, 1972) ou de la H-leucine (Kirchman et al., 1985) dans les protéines pour l'ensemble du monde bactérien. Enfin les bactéries nitrifiantes ou dénitrifiantes sont analysées par mesure de l'isotope 15N (Goering et Dungale, 1966). Ces mesures peuvent être effectuées dans la nature ou sur cultures isolées. On parle alors de microautoradiographie.

2.2.2.2 Mesure des ratios isotopiques

Dans la nature chaque élément chimique existe sous la forme de plusieurs isotopes de stabilité variable. Les ratios entre ces isotopes sont fixes (par exemple le ratio 12C/13C=19/1), or les mécanismes de transformation cellulaire vont favoriser l'incorporation d'un isotope (en général le plus léger) et les composants synthétisés vont donc avoir un ratio isotopique différent du ratio naturel. De plus les mécanismes métaboliques vont incorporer différemment chaque isotope et pour une molécule donnée un ratio isotopique pourra être attribué à chaque métabolisme.

2.2.2.3 Mesures d'activités spécifiques

L'emploi d'analogues structuraux fluorescents permet de détecter des activités enzymatiques extra-cellulaires spécifiques comme celles des lipases, des phosphatases, des aminopeptidases. L'incorporation de bromodéoxyuridine (BrdU), un analogue de la thymine chez les bactéries actives (synthétisant de l'ADN) peut être suivie par méthode immunochimique. L'ADN ainsi marqué peut être extrait et étudié (Urbach et al., 1999) L'emploi du CTC (5-cyano-2,3-dotolyl tetrazolium chloride) ou de l'INT (2 (p-iodo-phenyl)-3-(p- nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride) permet de suivre l'activité respiratoire par l'apparition (CTCàCTC-formazan) ou la disparition (INT à INT-formazan) d'un cristal fluorescent. L'emploi du système Biolog directement à partir d'échantillon environnemental a été proposé par Garland (1997) puis par Smalla et al. (1998) en conjonction avec une étude en TGGE. Le métabolisme du carbone dans l'échantillon peut être ainsi appréhendé mais sans identifier les micro- organismes qui en sont responsables.

2.2.2.4 Les microélectrodes

Si l'utilisation des microélectrodes était une chose commune en neurophysiologie et en biologie animale, ce n'est que très récemment (ces 15 dernières années) que sous l'impulsion de Jørgensen et de Revsbech elles ont été utilisées en écologie microbienne (de Wit , 1995; Amann et Kuhl, 1998;

2- Cooper, 1999). On dispose actuellement de microélectrodes qui permettent de mesurer O2, pH, S , - + NO2, CO2, NO3 , NH 4 et potentiels redox. D'un diamètre de 2 à 100 µm, voire 2 à 3 µm pour les

électrodes à O2, elles ont une très forte résolution spatiale qui permet de suivre des microvariations dans des environnements où de nombreuses populations microbiennes se succèdent comme par exemple: les sédiments ou les biofilms (Santegoeds et al., 1998 a, b; Okabe et al., 1999).

13 Les techniques d'écologie microbienne

2.3 Une vue restreinte de la diversité

L'ensemble des techniques préalablement décrites pour analyser la diversité microbiologique d'un échantillon présente l'inconvénient de ne donner qu'une vue restreinte ou une approximation grossière de la diversité naturelle. Les techniques qui permettent d'accéder individuellement à chaque organisme sont notamment entachées d'erreurs inhérentes aux méthodes culturales. Celles ci sont connues depuis fort longtemps et ont été décrites sous le terme de "la grande anomalie du comptage sur boite" (Staley et Konopka, 1985). Selon les auteurs entre 0,001% et 15% des bactéries présentes dans un échantillon sont cultivables à l'aide des techniques classiques (cf. tableau 1.7)

Tableau 1.7. Cultivabilité déterminée comme le pourcentage des bactéries cultivables par rapport aux cellules totales déterminées par comptage direct. (D'après Amann et al., 1995)

Habitat Cultivabilité (%)a Eau de mer 0,001-0,1 Eau douce 0,25 Lac mésotrophique 0,1-1 Eaux d'estuaires non polluées 0,1-3 Boues actives 1-15 Sédiments 0,25 Sol 0,3 a Bactéries cultivables mesurées en tant qu'unités formant des colonies (UFC)

Ce décalage est à attribuer à différentes causes (Amann et al., 1995; Joux et Lebaron, 1995; Ward et al., 1997): Ø Le milieu de culture choisi ne peut être universel et l'ensemble des conditions de l'environnement ne peuvent être reproduites sur un seul et même milieu de culture en particulier pour les environnements à forts gradients physico-chimiques. Ø Certaines cellules hors de leur environnement peuvent entrer dans un état viable mais non- cultivable (cf. tableau 1.8 pour des études réalisées sur le milieu aquatique). Cet état cellulaire correspond à une adaptation aux conditions de stress, notamment nutritionnel. Il s'accompagne de modifications physiologiques et structurales dont le rétablissement n'est pas simplement possible sur milieu synthétique. Cet état peut être maintenu de plusieurs jours à plusieurs années. Ø Des populations inférieures numériquement peuvent supplanter des populations majoritaires moins adaptées au milieu de culture. Ø Des populations enrichies en liquide peuvent ne pas se développer sur milieu solide. Ø La quantité d'inoculum choisie pour l'enrichissement influence le type de cellules enrichies. Ø Des micro-organismes différents ayant des conditions de croissance similaires seront difficilement distinguables.

14 Les techniques d'écologie microbienne

Ø Certaines cellules sont impossibles à obtenir en culture pure comme c'est le cas des micro- organismes symbiotes et syntrophes.

Tableau 1.8. Pourcentages de bactéries actives par rapport au nombre total de bactéries (comptées en épifluorescence), cité dans Servais (1995) Méthodes Environnements Pourcentages Autoradiographies 3H acides aminés Marin (Kiel Bay) 41% Marin (Chesapeake Bay) 45 à 76 %; 17 à 82 % 3H glucose Marin (Kiel Bay) 2,3 à 56,2 % 3H acétate Marin (Chesapeake Bay) 49 à 59 %; 6 à 51 % 3H thymidine Marin (Chesapeake Bay) 15 à 94 % Marin (S. California Bight) 28 à 50 % Marin (Côte du Danemark) 20 à 80 %

Réduction d'INT Marin (mer Baltique) 8 à 97% Marin (Chesapeake Bay) 61 %; 25 à 94 % Eau potable (France) 10 à 20 % Lac Léman 0,6 à 26 %

Acide nalidixique Marin (Chesapeake Bay) 7 à 15 % Marin (Porto Rico) 0,5 à 6 %

Des techniques permettant d'accéder individuellement aux micro-organismes présents dans un échantillon en s'affranchissant des techniques culturales ont été proposées à la fin des années 1980. Ces techniques sont fondées essentiellement sur l'analyse, non plus de la cellule, mais des acides nucléiques qu'elle contient sous la forme d'ADN génomique ou d'ARN ribosomaux. Dans le chapitre suivant je me propose de décrire ces techniques après avoir présenté les molécules analysées (les ARN ribosomaux) et les principes de phylogénie. Les apports des techniques moléculaires dans l'analyse de différents habitats microbiens seront abordés dans la seconde partie de mon introduction.

III Les acides nucléiques en écologie microbienne

3.1 Le développement des techniques moléculaires

L'émergence des technologies moléculaires en écologie microbienne est liée au développement de la phylogénie moléculaire à la fin des années soixante (Zuckerland et Pauling, 1965) ainsi qu'au choix de l'ARN ribosomique comme marqueur évolutif à la fin des années soixante- dix (Woese et Fox, 1977). Les premiers travaux d'écologie microbienne moléculaire provinrent de l'équipe de Pace qui utilisa les résultats de Woese pour accéder à la diversité d'échantillons environnementaux (Olsen et al., 1986; Pace et al., 1986a et b). Un grand nombre de publications se sont proposées de décrire sous forme de revue les techniques moléculaires employées en écologie microbienne. Parmi les plus anciennes on peut citer, en plus des deux publications précédentes : Turner et al., 1989; Olson, 1991; Pickup, 1991; Atlas et

15 Les techniques d'écologie microbienne al., 1992; Liesack et Stackebrandt, 1992; Olson et Tsai, 1992; Ward et al., 1992. Si nombre de ces revues décrivent avec enthousiasme les apports de ces techniques certains auteurs s'interrogent déjà sur les nouvelles limitations qu'elles impliquent.

3.1.1 La phylogénie moléculaire

Le concept de phylogénie moléculaire est né des travaux de Zuckerland et Pauling (1965) qui les premiers considérèrent les molécules comme des marqueurs de l'histoire évolutive et développèrent le concept d'horloge moléculaire. Cette notion est liée à la théorie neutraliste de l'évolution (Kimura, 1968). Les mutations s'accumulent au cours du temps dans le génome et chez des organismes différents. Le taux d'accumulation est dicté par l'intensité de la pression de sélection et il est du même ordre de grandeur dans des domaines homologues du génome (région soumise à la même pression de sélection). Ainsi les gènes à mutations rapides vont pouvoir refléter des événements évolutifs récents alors que les gènes très conservés seront les témoins d'un passé très éloigné. Sans pour autant remettre en cause la validité de la phylogénie moléculaire, la théorie neutraliste de l'évolution est fortement contestée (Goodman, 1981) voire niée (Li, 1993). La différence de taux d'évolution est alors attribuée soit aux différences de temps de génération soit aux différences d'activité du métabolisme (Li, 1993). Près de dix ans après les travaux de Zuckerland et Pauling, Woese et ses collaborateurs (Fox et al., 1977; Woese et Fox, 1977) appliquent cette théorie à l'étude de la phylogénie bactérienne en utilisant l'ARN ribosomique comme marqueur de l'évolution. Les premières études portent sur l'analyse de fragments de séquences et définissent des signatures spécifiques qui scindent le monde du vivant en trois grands domaines. La dichotomie du monde vivant en terme de Procaryote et Eucaryote était abandonnée au profit d'une division tripartite constituée d'Eucarya, de Bacteria et d'Archaea. Les études menées par la suite sur des séquences entières confirmèrent ces résultats (Woese, 1987; Woese et al., 1990).

3.1.2 L'ARN ribosomique

Les ARN ribosomiques (ARNr) sont formés de sous unités pouvant se grouper en polysomes. Ces éléments sont caractérisés par leur constante de sédimentation exprimée en Svedberg (S). Chez les organismes procaryotes, il existe des ribosomes 70S (de poids moléculaire 2,5.106 Da (1 Dalton= 1 g/mol)) formés de 2 sous-unités. La petite unité 30S de poids moléculaire 0,93.106 Da est composée de 21 protéines et d'ARNr 16S (1541 nucléotides chez E. coli; 0,56.106 Da) (Moore, 1998). Lorsque des régions sur sa séquence sont complémentaires (appariement AU et GC), le brin d'ARN se replie sur lui même pour former une structure en "épingle à cheveux". Dans le ribosome les molécules d'ARNr, repliées en une structure secondaire, peuvent être représentées à partir d'études comparatives des séquences primaires (Gutell et al., 1994; Noller, 1984; Noller et Woese, 1981; Woese et al., 1975). Une modification de la séquence primaire de l'ARNr va influencer directement sa

16 Les techniques d'écologie microbienne structure secondaire. Pour maintenir la fonctionnalité de la molécule, la structure secondaire de l'ARNr doit être conservée dans l'ensemble du monde vivant par le biais de mutations compensatoires (Hancock et al., 1988; Wheeler et Honeycutt, 1988; Otsuka et al., 1999).

3.1.3 Le choix de l'ARN 16S

Le choix de Woese et de ses collaborateurs s'est porté sur la petite sous-unité de l'ARNr (16S chez les Procaryotes et 18S chez les Eucaryotes) pour plusieurs raisons (Pace et al., 1985; Ludwig et Schleifer, 1994; Ludwig et al., 1998) : Ø Sa présence est universelle et il y accomplit le même rôle chez tous les organismes. Ø Sa séquence est une alternance de domaines dont les vitesses d'évolution varient, permettant de comparer des espèces très proches sur des domaines hypervariables et des espèces très éloignées sur des domaines très conservés. Ø Il a évolué lentement. Ø Il n'est pas le résultat de transferts latéraux5. Ø Il est relativement facile à isoler en raison de son abondance dans les cellules Ø Sa séquence est facilement obtenue par des méthodes standard d'extraction et de séquençage. Les techniques d'extraction (Dorsch et Stackebrandt, 1992) et de séquençage ont été simplifiées et optimisées au fil des ans par l'introduction du séquençage des ADNr (Böttger, 1989) plutôt que des ARNr (Lane et al., 1985c), et l'utilisation du "cycle-sequencing" à l'aide d'amorces fluorescentes (Hiraishi, 1992; Ruano et al., 1993) Ø Il est préféré au 5S et au 23S en raison de sa taille moyenne et de sa structure secondaire moins marquée. Sa séquence est suffisamment longue pour réaliser des comparaisons statistiquement cohérentes (cf. § 3.2.2.2 calcul de la déviation standard). L'ADN codant pour l'ARNr (ADNr) est organisé en opéron. Au sein d'une souche, cet opéron peut être en copies multiples (de 1 à 14 selon les souches) et ces copies sont généralement identiques ou très proches en raison des fortes pressions évolutives gouvernant le maintien de la structure secondaire de l'ARNr (Hillis et al., 1991). Il a toutefois été observé au sein d'un même organisme d'importantes variations entre les différentes copies de l'ADNr 16S (Clayton et al., 1995). D'autre part des séquences d'ADNr 16S correspondant à des souches phénotypiquement très distinctes pouvaient s'avérer quasiment identiques (Fox et al., 1992). Récemment Ueda et al. (1999) attribuent ces différences entre copies d'un même opéron à deux mécanismes : d'une part une mauvaise incorporation durant la réplication de l'ADN et d'autre part des transferts horizontaux. Le choix de l'ARNr 16S est parfois contesté (cf. Partie 2 §1.2), il serait donc préférable d'établir les phylogénies sur plusieurs gènes afin de ne conserver que l'arbre consensus à toutes ces phylogénies. Des tentatives ont été entreprises (Gupta, 1998a; Huang, 1996). Mais le travail est actuellement très laborieux. Gageons que les améliorations des techniques de séquençage :

5 Une étude récente de complémentation de E. coli (dont l'ensemble des opérons rrn (7) avaient été inactivés) par des ARNr d'une autre espèce semble indiquer que la possibilité de transferts horizontaux de l'ARNr n'est pas à exclure (Asai et al., 1999a et b).

17 Les techniques d'écologie microbienne augmentation du nombre d'échantillons traités simultanément, accélération des migrations dans des microcapillaires, utilisation de puces de séquençage ou de séquençage par spectrométrie de masse, permettront d'ici quelques années d'accéder à l'ensemble du génome des micro-organismes comme nous accédons actuellement à l'ARNr 16S.

3.2 L'analyse phylogénétique

Une étude de diversité microbienne est fondée sur l'identification des micro-organismes présents dans un échantillon et donc sur la comparaison de ces micro-organismes avec d'autres préalablement isolés. Selon que l'on dispose uniquement de séquences (ADNr ou gènes du métabolismes clonés) ou de souches isolées, les comparaisons porteront uniquement sur ces séquences ou sur l'ensemble de l'ADN génomique et sur des caractères phénotypiques. Dans tous les cas il convient de définir des homologies entre les organismes à comparer puis de réaliser une phylogénie à partir des caractères homologues. On définit par homologues des caractères dérivant d'un même caractère ancestral. Ces caractères sont orthologues s'ils ont conservé la même fonction et paralogues si la fonction est différente. Les caractères analysés lors d'une phylogénie moléculaire sont des séquences d'acides aminés ou des séquences d'acides nucléiques. Ce sont des caractères discontinus qui peuvent donc être étudiés comme des caractères discrets (absence ou présence). L'extrémité des branches d'arbres phylogénétiques correspond aux taxons. Ces taxons constitueront des OTU (Unité Taxinomique Opérationnelle) sur la base de caractères phénétiques (Sokal et Sneath, 1963). C'est cette unité que choisit Moyer et al. (1994) pour définir la structure et la diversité de la communauté d'un tapis microbien hydrothermal sur un site du Pacifique. D'autres auteurs leur préfèrent la définition de phylotype (ou type phylogénétique) qui s'applique plus à une analyse fondée sur des caractères moléculaire (Haddad et al., 1994; Poltz and Cavanaugh, 1995).

3.2.1 Les méthodes de phylogénie

Il n'existe pas de techniques qui permettent de réaliser l'arbre phylogénétique vrai. On ne dispose que de moyens statistiques pour construire l'arbre "le moins faux possible". Trois méthodes permettent de construire les arbres : l'analyse des distances (Fitch et Margoliash, 1967), l'analyse de la parcimonie (Fitch, 1971), l'analyse du maximum de vraisemblance (Felsenstein, 1981). La première est une méthode phénétique c'est à dire fondée non pas sur un critère généalogique mais sur un critère de similarité : on utilise alors des distances et il n'y a pas de tentative pour établir des relations d'ancestralité entre des séquences différentes. Les deux autres méthodes sont des méthodes cladistiques reposant sur des caractères discrets; on cherche par ces méthodes à établir des relations généalogiques entre les individus étudiés. On détermine alors le nucléotide le plus probable pour une position donnée sur la séquence ancestrale. La méthode de parcimonie est

18 Les techniques d'écologie microbienne fondée sur un nombre minimal de mutations pour établir les relations entre les espèces et la méthode du maximum de vraisemblance est une méthode statistique. On considère qu'une phylogénie est solide lorsque les arbres obtenus par les trois méthodes sont concordants. Toutefois différentes sources d'erreurs doivent être prises en compte : Ø Dans les zones hypervariables, l'alignement de certains nucléotides est hasardeux car la présence d'une même base sur deux séquences différentes n'est pas liée obligatoirement à une homologie mais à une homoplasie (cf. définition §3.2.1.1). Ø Les différences entre deux séquences sont censées représenter un événement dans une lignée, or un même site peut avoir changé plusieurs fois dans une lignée ou avoir changé une fois dans deux lignées différentes. Ø Des "gaps" doivent parfois être introduits dans des séquences qui correspondent soit à des insertions soit à des délétions. Ces modifications peuvent correspondre à un ou plusieurs événements.

3.2.1.1 L'alignement

L'alignement est l'étape cruciale de l'analyse phylogénétique. Il consiste à mettre en regard des nucléotides à des positions homologues. Au sein de zones très conservées, les zones homologues sont facilement détectables mais lorsque des événements d'insertion et de délétion (fréquents dans l'ARNr 16S) surviennent, il convient de les répercuter sur les alignements. Au sein de zones hypervariables, des nucléotides peuvent s'avérer identiques alors que ceux-ci ne sont pas homologues6 mais ont subi des phénomènes de réversion, de parallélisme ou de convergence. Il convient alors, si ces séquences sont impliquées dans une structure secondaire, de vérifier la présence de mutation compensatoire assurant le maintien de cette structure. Des banques de structures secondaires d'ARNr ainsi que des logiciels de détermination de structures secondaires d'ARN sont disponibles à cet effet sur le Web (Neefs et al., 1993; Van de Peer et al., 1997, 1999). Une fois l'alignement obtenu il faut choisir quelles positions sur la séquence seront informatives pour l'étude. Ce choix va être dicté par la proximité des séquences prises en compte durant l'étude. Il n'est par exemple pas informatif de choisir des portions de séquences hypervariables sur un ensemble de souches correspondant à plusieurs genres voire plusieurs familles. Toutefois ces zones hypervariables pourront n'être que faiblement variables voire partiellement conservées si l'étude est restreinte aux individus d'un même genre (les zones deviennent homologues). Il va donc falloir créer des masques qui spécifieront pour les programmes de phylogénie les zones à analyser.

6 Homoplasie : similarité qui ne dérive pas d'un caractère ancestral. Il existe trois sortes de phénomènes qui conduisent à une homoplasie: réversion : changement dans une séquence annulé par un second changement (A ® C ® A), parallélisme : changements parallèles dans deux séquences. convergence : des bases différentes dans deux séquences ancestrales peuvent être semblables dans des séquences contemporaines.

19 Les techniques d'écologie microbienne

3.2.1.2 L'analyse des distances

Ce sont des méthodes rapides fondées sur le nombre de nucléotides différents entre deux séquences. Les méthodes différeront en fonction de la façon dont les nucléotides seront pondérés, dont les changements de bases (transition, transversion)7 seront traités, et des algorithmes utilisés pour construire les arbres. Ê Le nombre de différences observées entre deux séquences est toujours inférieur au véritable nombre de différences en raison de phénomènes de mutation réverses et de mutations multiples. Cette différence véritable ou distance évolutive peut être estimée par une loi de Poisson. Si P est la proportion calculée de nucléotides différents entre deux séquences, alors le taux de substitution selon Jukes et Cantor (1969) : 3 æ 4 Knuc = - Ln 1 - Pö 4 è 3 ø Cette méthode sous-entend que toutes les positions sur une molécule changent à la même vitesse, que les transitions et les transversions7 ont la même probabilité et que chaque site évolue de manière indépendante. Ce qui n'est pas nécessairement le cas. Ë Selon Kimura (1980) le poids des transversions7 (proportion Q) est double par rapport à celui des transitions (proportion P). Alors le taux de substitution 1 é 1 ù Knuc = - Ln (1 - 2P - Q)(1- 2Q) 2 2 ë û Ì Van de Peer et al. (1994) proposent quant à eux de tenir compte des "gaps" qui peuvent être introduits au cours de l'alignement. Pour P : proportion calculée de nucléotides différents entre deux séquences, G : nombre de "gaps" dans une séquence par rapport à une autre, T : nombre total de nucléotides pris en compte dans l'analyse. Une série de "gaps" adjacents, quel que soit le nombre de "gap", est traitée comme un "gap". Alors 3 æ 4 æ G G Knuc = - Ln 1- Pö 1 - ö + 4 è 3 øè T ø T

Les valeurs Knuc sont alors soumises à des algorithmes produisant des arbres dont la longueur des branches est minimisée en fonction de la proximité des séquences. Les méthodes principalement utilisées sont celles : Ø de UPGMA. Méthode agglomérative rapide mais peu précise. On groupe les deux espèces les plus proches puis on construit une nouvelle matrice avec ce doublet, etc. (Sneath et Sokal, 1973). Développée à l'origine pour réaliser de la taxinomie numérique, cette méthode a tendance à raccourcir les branches des arbres lorsque l'on réalise une phylogénie (distances égales des branches de chaque cotés du noeud). Ø de Fitch et Margoliash (1967) fondée sur le principe d'additivité (la distance entre deux taxons est égale à la somme des longueurs de branche les reliant). C'est une méthode précise mais

7 Transition : passage d'une purine à une purine (A « G) ou d'une pyrimidine à une pyrimidine (T « C) Transversion : passage d'une purine à une pyrimidine et inversement.

20 Les techniques d'écologie microbienne qui nécessite un temps de calcul élevé. Elle permet de corriger l'effet "d'écrasement" obtenu par la méthode UPGMA en acceptant des longueurs de branches inégales de chaque coté d'un noeud. Ø de Neighbor-joining (Saitou et Nei, 1987) la plus couramment utilisée car elle permet d'atténuer la méthode d'additivité en tenant compte des phénomènes d'homoplasie. Cette méthode est rapide et précise. Dans une analyse de séquence il faut aussi tenir compte du nombre de nucléotides analysés. Plus celui ci sera important plus l'erreur ou la déviation standard sera faible. Cette déviation standard dépend du nombre de résidus (N), de la proportion de nucléotides différents (P), de la proportion de nucléotides semblables (Q=1-P). P.Q Alors 3 L . D = . 1 4 Q - 4 Par exemple pour 50% de différence sur 1000 nucléotides D=0,05 soit ±10% et pour 100 nuc. D=0,15 soit ± 30%. On considère que les méthodes de distance sont faciles et rapides à réaliser. Elles conviennent à une comparaison de séquences proches, ayant un haut score de similarité. Toutefois ces méthodes perdent de l'information (les séquences sont réduites à des distances) et ne conviennent pas à la comparaison de séquences éloignées.

3.2.1.3 Le maximum de parcimonie

Cette méthode est fondée sur le principe de l'économie : l'arbre le plus parcimonieux sera celui présentant le moins de mutations pour passer d'une séquence à une autre. Le noeud qui relie deux séquences est une séquence commune ou ancestrale (Fitch, 1971). A partir de l'alignement total, un nombre réduit de sites informatifs est utilisé pour construire des arbres. On élimine les sites qui ne varient pas (et parfois les sites qui diffèrent par transition dans le cas d'une parcimonie de transversion). En effet on ne considère comme informatifs que les sites qui favorisent une topologie d'arbre parmi toutes celles possibles. Les différentes topologies d'arbres sont testées et l'arbre le plus parcimonieux est conservé. Pour des comparaisons s'appliquant à plus de 8 séquences les techniques de choix d'arbres par des recherches exhaustives peuvent être difficiles et très longues, aussi on utilise une technique dite heuristique (plus rapide mais moins précise, par exemple le "branch swaping") afin de définir l'arbre le plus parcimonieux. Cette méthode suppose que l'horloge évolutive est constante or ce n'est pas toujours le cas et les résultats obtenus peuvent parfois être erronés. De plus il est fréquent de générer des arbres aussi parcimonieux les uns que les autres et le choix de l'arbre consensus est alors difficile.

3.2.1.4 Le maximum de vraisemblance

C'est une méthode statistique où les changements évolutifs dans la séquence nucléique suivent des modèles probabilistes. On recherche l'arbre possédant la plus forte probabilité pour qu'un

21 Les techniques d'écologie microbienne ensemble de données soit le résultat de l'évolution décrite par cet arbre. Les éventualités de mutations sont calculées pour chaque site en suivant le modèle de Kimura dans le programme DNAML développé par Felsenstein (1973, 1981). D'une manière similaire à la parcimonie la vraisemblance assigne une séquence ancestrale à chaque noeud, mais elle ne suppose pas que l'évolution ait été parcimonieuse. Pour chaque site et à chaque noeud tous les nucléotides possibles sont testés en calculant dans tous les cas la probabilité pour que la séquence observée soit produite avec une longueur de branche donnée. La première version du programme DNAML ne permettait pas de traiter beaucoup de séquences à la fois, aussi Olsen a amélioré la technique en rendant possible le traitement de plusieurs séquences (FastDNAML) (Olsen et al., 1994a).

Pour mémoire on peut citer une quatrième méthode de phylogénie qui tient compte de taux d'évolution variables au sein des différentes branches d'un arbre. Il s'agit de la méthode des invariants développée par Lake (1987).

3.2.1.5 Estimation de la robustesse des arbres

Ø Des méthodes différentes de phylogénie peuvent donner des arbres de topologies différentes, aussi ne sont conservés, pour la construction de l'arbre final, que les branchements retrouvés dans chacune des trois méthodes (Huelsenbeck et Hillis, 1993; Kim, 1993). Ø Mais il existe aussi des méthodes statistiques qui permettent de vérifier la stabilité (robustesse) des arbres : le "jackknife" et le "bootstrap". Cette dernière méthode est la plus couramment utilisée. Elle consiste en la construction d'une nouvelle matrice de même taille que la matrice initiale en réalisant des tirages avec remise des différentes colonnes de la première matrice (Felsenstein, 1985). Aussi certaines colonnes de l'alignement pourront être utilisées plusieurs fois alors que d'autres ne seront pas du tout utilisées pour construire la nouvelle matrice. Un arbre phylogénétique est construit et cette opération est reproduite 50, 100 ou 1000 fois. Un arbre consensus est calculé, portant sur chaque noeud de branches le pourcentage d'arbres où ce noeud est retrouvé. Plus le pourcentage est élevé plus le noeud est considéré comme robuste. Dans la pratique un noeud est considéré comme robuste lorsque le pourcentage est supérieur ou égal à 90%. Les noeuds ayant un pourcentage inférieur à 50% ne sont pas pris en considération. Ø Les séquences incluses dans une analyse peuvent influer sur la topologie d'un arbre. On valide donc une topologie en incluant de nouvelles séquences et en supprimant d'anciennes. Ø Enfin il est possible de vérifier la topologie en comparant les associations entre les séquences sur la base de signatures spécifiques comme des nucléotides spécifiques à une position donnée ou la présence (ou l'absence) de structures secondaires (par exemple des boucles, la longueur de structure en épingle) à une position donnée. Il reste toutefois difficile de définir "à coup sûr" si l'on est parvenu à réaliser une bonne phylogénie et il est souvent nécessaire de vérifier la congruence de la phylogénie obtenue avec des phylogénies obtenues au cours d'autres études ou à l'aide d'autres caractères.

22 Packages généraux Construction, dessin, manipulation Calcul des distances Arbre consensus et comparaison d'arbres d'arbres - PHYLIP - PHYLIP - PAUP* - COMPONENT - PAUP* - PHYLIP - RAPDistance - MULTICOMP - TREEMAP - MEGA - PAUP* - MARKOV - RSVP - NTSYSpc - VOSTORG - TreeTool - Microsat - DIPLOMO - PHYLIP - Fitch programs - TreeView - OSA - DISPAN - PAUP* - Phylo_win - Fitch programs - RESTSITE - NTSYSpc - REDCON - Zharkikh Unix programs - NJplot - PUZZLE - Hadtree, Prepare and - TAXEQ2 - ARB - DendroMaker Trees - TreeCons - DAMBE - Tree Draw Deck - Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG) - Phylodendron - AMP - DISTREE Manipulation et soumission des séquences - ARB - GCUA - DERANGE2 - unrooted - calcdist - POPGENE - PARBOOT - DAMBE - TFPGA - REAP - Random Cladistics - MacClade - MVSP - SOTA - Tree Gardener - ClaDOS - RSTCALC - Genetix - GDE - PDAP - BIOSYS-2 - RAPD-PCR package - MUST - TreeTool - DISTANCE - Darwin - DNA Stacks - sendbs - K2WuLi - SeqPup - GeneStrut - Arlequin - Tonex - DAMBE - DnaSP - ARB - PAML - puzzleboot - MATRIX Maximum de vraisemblance et Maximum de Parcimonie Méthodes des matrices de distance Bootstrap et autres tests de validation méthodes associées - PAUP* - PHYLIP - PAUP* - PHYLIP - PHYLIP - Hennig86 - MEGA - MacT - PAUP* - PAUP* - MEGA - ODEN - Fitch programs - Zharkikh bootstrapping programs - fastDNAml - Tree Gardener - SINCAIDEN - ABLE - PARBOOT - MOLPHY - RA - TREECON - DISPAN - ABLE - PAML - Pee-Wee and Noname - RESTSITE - Random Cladistics - Spectrum - PHYLIP - NTSYSpc - AutoDecay - SplitsTree - PHYSYS - METREE - TreeRot - PLATO - TurboTree - TreePack - RASA - SPOT - Freqpars - TreeTree - DNA Stacks - PUZZLE - Fitch programs - GDA - OSA - Hadtree, Prepare and Trees - CAFCA - Hadtree, Prepare and Trees - DISPAN - SeqPup - Phylo_win - Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG) - TreeTree - Phylo_win - sog - SeqPup - PHYLTEST - PASSML - gmaes - PHYLTEST - Lintre - ARB - LVB - Lintre - sog - Darwin - GeneTree - WET - njbafd - BAMBE - TAAR - Phylo_win - PICA95 - DAMBE - ARB - njbafd - TAXEQ2 - Modeltest - DAMBE - gmaes - BIOSYS-2 - TreeCons - GTREE, ADDTREE, and EXTREE - RAPD-PCR package - VeryfastDNAml - DENDRON - TreeCons - Molecular Analyst Fingerprinting - BAMBE - DAMBE - puzzleboot Tableau 1.9. Logiciels dédiés aux différentes méthodes de phylogénie Les techniques d'écologie microbienne

L'essor de l'écologie moléculaire bactérienne est indubitablement associé à l'essor des outils d'analyse phylogénétique et des banques de données. La généralisation de l'outil informatique dans les laboratoires a permis de démocratiser l'emploi de programmes de phylogénie longtemps confinés dans des équipes disposant de centres de calculs surpuissants. Je me propose dans le chapitre suivant de présenter différents logiciels et sites internet dédiés aux analyses de diversité.

3.2.2 L'informatique au service de la phylogénie

Les ordinateurs le plus souvent utilisés pour réaliser des calculs de phylogénie sont des stations de travail fonctionnant sous environnement UNIX. En complément à ces machines il est désormais possible à tout utilisateur disposant d'un ordinateur personnel de type PC ou Macintosh de faire fonctionner sous le système d’exploitation Linux8 (http://www.linux.org) des logiciels réservés jusqu'alors à une station de travail UNIX. D'autre part un grand nombre de programmes de phylogénie ont été développés pour fonctionner sur Macintosh ou sur PC sous les environnements Mac Os, DOS ou Windows.

3.2.2.1 Les programmes de phylogénie

Un grand nombre de logiciels sont disponibles pour réaliser des phylogénies à partir d'alignements d'acides nucléiques ou d'acides aminés (cf. tableau 1.9). Je m'appliquerai ici à réaliser une liste non exhaustive des logiciels disponibles sur Macintosh et sur Station SUN. Une liste plus complète est disponible sur le site de l'institut Pasteur (http://www.pasteur.fr/outils.html).

Les logiciels d'alignements

La première étape d'une étude phylogénétique est celle de l'alignement. Ce travail peut être effectué "à la main" ou à l'aide d'algorithmes regroupés dans des programmes [Clustal V ou clustal W (GDE), Fast align sequence, aligner v1.0 ou v2.0 (ARB), pileup (GCG)]. Les résultats obtenus par ces algorithmes ne sont malheureusement pas suffisamment fiables. Ils nécessitent toujours une vérification de la part de l'utilisateur notamment dans le cas de l'ADNr afin de tenir compte des structures secondaires de la molécule.

Sous environnement de type UNIX l'un des logiciels les plus ergonomiques est GDE (Genetic Data Environment par Steven Smith). Il nécessite cependant une mémoire vive et vidéo importante pour être utilisé sans trop de désagréments. Ce logiciel peut être utilisé seul ou dans le package ARB (voir plus loin).

8 LINUX est un environnement gratuit de type UNIX qui a été développé à l'origine par Linus Torvalds puis qui a été amélioré par des programmeurs du monde entier. C'est un environnement ouvert dont les sources sont disponibles gratuitement dans le cadre du projet GNU General Public License (http://www.linux.org/info/gnu.html).

23 Les techniques d'écologie microbienne

Seaview développé par Manolo Gouy (Galtier et al., 1996) est un logiciel d'alignement multiple très convivial. Il traite aussi bien les séquences d'acides nucléiques que les séquences d'acides aminés (http://pbil.univ-lyon1.fr/software/seaview.html). Développé récemment, il intègre les principales formes d'acquisitions de fichiers et un alignement manuel ou automatique sur la base des algorithmes Clustal et de Dot Plot. Ce programme est destiné à fonctionner en aval du logiciel d'analyse de séquences Phylo_Win (Galtier et al., 1996). Le package ARB (voir plus loin) propose à lui seul 4 logiciels d'alignement : GDE2.2., ALE, ARB4 et ABRNT. Certains de ces logiciels (ARB4 et ABRNT) permettent de réaliser l’alignement en tenant compte de la structure secondaire propre à l’ADNr 16S. Pour finir sur UNIX, TkDCSE est la version pour X-Window de DCSE (Dedicated Comparative sequence editor)(http://indigo2.uia.ac.be/~peter/dcse). Sur Macintosh il est aussi possible de réaliser des alignements de séquences grâce au logiciel Seqpup. Il n'existe pas de mise à jour récente du logiciel.

Les Packages

PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.57c est historiquement l'un des premiers ensembles de logiciels développés pour l'analyse phylogénétique des séquences. Mis au point en 1986 par Joseph Felsenstein et ses collaborateurs de l'université de Washington, ce package a évolué avec la mise au point de nouvelles techniques de phylogénie (Felsenstein, 1989). Toutefois son interface uniquement en mode texte n'est pas conviviale et on lui préférera des programmes comme ARB (voir plus loin) ayant intégré l'ensemble des méthodes de calcul de Phylip au sein d'une interface beaucoup plus ergonomique. GCG (Genetic Computer Group) (http://www.gcg.com) est un ensemble de logiciels très complet mais aussi très coûteux. L'ensemble des programmes peut tourner en mode texte, mais il est aussi possible de les faire fonctionner sous une interface graphique (SeqLab) à partir d'un Terminal X, d'une station de travail ou à partir de n'importe quel ordinateur grâce à une "interface www" nommée SeqWeb. L'intérêt de ce package réside dans la mise à jour régulière des logiciels et des banques de données fournies avec ce programme. Toutefois cette dernière possibilité a été rendue caduque par la disponibilité des banques sur le réseau. Phylo_Win est un logiciel d'analyse phylogénétique de séquences (http://pbil.univ- lyon1.fr/software/phylowin.html) (Galtier et al., 1996). Il accepte des alignements au format MASE produits par Seaview. Il permet de réaliser des analyses par les méthodes du "Neighbor-joining", du maximum de parcimonie et du maximum de vraisemblance en permettant de réaliser des réechantillonages sur chacune de ces méthodes. Un grand nombre de facteurs de distance sont disponibles (Jukes et Cantor, Kimura, Tajima et Nei, HKY, Galtier et Gouy (Galtier et Gouy, 1995), LogDet pour les séquences nucléiques, la correction de Poisson pour les séquences protéiques). La gestion des masques est très facilement effectuée à la souris et les arbres construits sont aisément exploitables par d'autres logiciels.

24 Les techniques d'écologie microbienne

ARB est un package développé par Olivier Strunk et Wolfgang Ludwig au sein de l'université technique de Munich (TUM) et qui est avant tout destiné à l’analyse de l’ARN ribosomique 16S. Il fonctionne sous environnement UNIX mais une version a été récemment développée pour LINUX. Il intègre un grand nombre de programmes déjà existants tant en alignement (GDE) qu’en phylogénie (Phylip). ARB possède sa propre base de données de séquences. Il s'agit d’ADNr 16S préalablement alignés par les membres de la TUM. Cette base de données contient de plus toutes les informations disponibles sous le format GenBank (dépositaire de la séquence, publication de référence, groupe phylogénétique de la séquence, etc.). Elle n’est malheureusement pas mise à jour suffisamment régulièrement (dernière mise à jour en mars 1997). Il est donc préalablement nécessaire lors de la construction d’arbres de vérifier le dépôt de nouvelles séquences au près du RDP ou auprès de GenBank. Il est possible grâce à ce logiciel de réaliser des arbres à l’aide des trois méthodes phénétique et cladistiques. L’arbre consensus peut être par la suite édité à l’aide du logiciel Xfig fourni avec le package puis importé sur Macintosh ou PC sous un format poscript (type PS ou EPS). Mais l’un des atouts majeurs de ce logiciel est le programme très ergonomique de construction de sondes nucléiques. En choisissant dans la banque de données d’ARB les séquences cibles, il est possible de construire puis de vérifier la validité des sondes. L’orientation "procaryotes-ADNr 16S" fait d'ARB un outil idéal pour les microbiologistes.

3.2.2.3 Les outils d’analyse en ligne et les bases de données

Les outils d'analyse en ligne et les banques de données se sont considérablement développés ces 5 dernières années avec la généralisation de l'accès à Internet9 au sein des laboratoires. Dans un premier temps cantonnées à un échange de données uniquement en mode texte via le courrier électronique (e-mail) ou ftp (file transfer protocol), les analyses sont désormais possibles via des sites http (hypertext transfert protocol) avec une interface beaucoup plus ergonomique basée sur le html (hypertext markup language). L'information étant disponible à tous il devient alors possible de centraliser la source d'information, de mettre à jour plus facilement les banques, de stocker les données sur une seule machine (The Integration of Microbial Databases (site web), 1995; Burks, 1999; FitzGerald et Blacke, 1998; Nierlich, 1996). En France le site de l'institut Pasteur (http://www.pasteur.fr) fournit une liste des logiciels disponibles pour la comparaison et l'alignement de séquences, les analyses phylogénétiques, la recherche de gènes et de régions codantes, la recherche et l'extraction de motifs, les HMM (Hidden Markov Model), les analyses de structures secondaires et tertiaires des acides nucléiques et des acides aminés (par exemple pour l'ARNr la Mfold home page (Zuker et Jacobson, 1998)). Le

9 Internet est né il y a un peu plus de 20 ans de la volonté du département de la défense américaine de mettre en réseau l'ensemble de ses services de recherche militaire afin de répondre le plus rapidement possible à d'éventuelles attaques nucléaires, ce premier réseau s'appelait ARPAnet. Un protocole de communication est alors développé afin de permettre la communication entre les ordinateurs (quelle que soit leur marque) : le protocole IP (Internet Protocol). Dix ans plus tard le développement des réseaux internes (Ethernet local area network, ou LAN) et la pression du marché (de la part des université américaines notamment) permettent l'accès de n'importe quel utilisateur équipé d'un ordinateur et d'un modem à ce réseau devenu un réseau de réseaux ou World Wide Web.

25 Les techniques d'écologie microbienne

BioCatalog de l'EBI (European Bioinformatics Institute) référence quant à lui la plus grande partie des logiciels pour la biologie (UNIX, Macintosh, PC) (http://www.ebi.ac.uk/biocat).

Dans le cadre d'une analyse de séquence d'ARN ribosomique deux sites sont indiqués : Ø Le site du NCBI (National Center for Biotechnology Information) va permettre d'accéder à l'ensemble des séquences publiques déposées dans GenBank (Benson et al., 1999) et dans l'EMBL (Stoesser et al., 1999). En décembre 1999 plus de 4,9.106 séquences et 3,8.109 bases étaient disponibles dans cette banque de données (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Il est possible via ce site de récupérer des séquences (Entrez), de soumettre de nouvelles séquences (BankIt et Seqin) ou de comparer des séquences avec celles présentes dans GenBank (BLAST Basic Local Alignment Search Tool, Altshul et al., 1997; Tatusova et Madden, 1999). Ce site permet de plus d'avoir accès au projet PubMed gérant la banque de données développée par la NLM (National Library of Medecine) regroupant les 9.106 références bibiographiques MEDLINE et PreMEDLINE. Ø Le site du RDP ou Ribosomal Database Project (http://www.cme.msu.edu/RDP/html/ index.html) (Maidak et al., 1999) est une base de données et un ensemble de logiciels d'analyse en ligne essentiellement destinés à l'analyse de l'ADNr 16 et 18S. Cette banque, gérée par le CME (Center for Microbial Ecology) est régulièrement mise à jour à partir des séquences soumises à GenBank mais aussi par des séquences (très souvent des clones environnementaux) soumises directement par les utilisateurs. En plus de la banque de séquences d'ARNr, le RDP met à la disposition des scientifiques un ensemble de programmes permettant : Ø de comparer une ou plusieurs séquences avec celles de la banque de données, Ø de réaliser un premier alignement sommaire, Ø de placer des séquences dans un arbre phylogénétique rudimentaire, Ø de vérifier la nature chimérique des séquences analysées, Ø de vérifier la validité d'une sonde Ø d'accéder aux banques de données de séquences d'ADNr 16S et 23S10.

Il existe aussi des banques de données concernant les micro-organismes cultivés. Ces banques sont disponibles sur le site de l'ATCC (http://www.atcc.org) et de DSMZ (http://www.dsmz.de/). Le site du Bergey's Manual Trust (http://www.cme.msu.edu/bergeys) donne aussi accès à la liste des souches disponibles, aux espèces, genres, familles reconnus ou incertains, ainsi qu'à un arbre phylogénétique type regroupant les souches isolées et les séquences provenant d'ARNr clonés à partir d'échantillons environnementaux. Un projet de normalisation de cette liste sous la forme d'une base de données plus aboutie est en cours sous le nom du PDP Phenotypic Database Project.

10 En complément du site du RDP deux banques inventorient les structures secondaires des petites sous-unités de l'ARNr (Van de Peer et al., 1999) et des grandes sous-unités de l'ARNr (de Rijk et al., 1999)

26 Figure 1.3. Utilisation des techniques moléculaires d’analyse de l’ADNr 16S pour l’étude de la diversité microbienne.

Dessin d’après Amann et al., 1995

Environnement

Hybridation in-situ Echantillon

Enrichissement Hybridation sur cellule totale cellulaire

Acides nucléiques extraits Dot Blot quantitatifs ADN ARNr ADN

ADNr c ADNr Southern amplifiés PCR

Sondes nucléiques Dot Blot Clones contenant ADNr /colonies Séquençage

Séquences d’ADNr

+ + Analyse comparative

Banques de données

HYBRIDATION SEQUENCAGE Les techniques d'écologie microbienne

Après m'être intéressé au choix des acides nucléiques comme marqueurs de la diversité microbienne et à l'analyse des séquences d'acides nucléiques, je me propose de décrire les différentes méthodes moléculaires couramment utilisées en écologie microbienne.

3.3 Les méthodes moléculaires

Les techniques moléculaires peuvent en principe s'appliquer à tous les gènes pour peu que ceux-ci répondent aux principes d'universalité et d'évolution que nous avons évoqués précédemment. Toutefois nous nous attacherons dans cette partie à décrire les principales techniques mettant en jeu l'ARNr 16S. Les hybridations ADN/ADN et la mesure du G+C% d'un ADN génomique sont elles aussi des méthodes moléculaires, mais elles s'appliqueront plus à la caractérisation d'une souche isolée qu'à l'étude directe d'un environnement (à l'exception de l'approche présentée dans le §3.3.4.1).

3.3.1 Le clonage et le séquençage des ARNr

Cette technique est l'une des premières à avoir été employée pour s'affranchir de toute étape de culture. Les différentes étapes de cette technique sont regroupées dans la partie droite de la figure 1.3. Elles consistent : à extraire l'ADN ou l'ARN total de l'échantillon environnemental, à amplifier spécifiquement les gènes codant pour l'ARN ribosomique, puis à cloner le produit d'amplification et enfin, à séquencer et à analyser les clones de la banque.

3.3.1.1 Historique de la méthodologie

Le résultat des premières études portant sur l'analyse de l'ARN ribosomique est reporté dans la seconde partie de ce manuscrit. Ces études consistaient à analyser la communauté microbienne d'échantillons naturels par séquençage des ARNr 5S directement extraits de l'échantillon. Elle portaient sur l'analyse : de la communauté symbiotique de vers hydrothermaux considérés comme chémo-autotrophiques (Stahl et al., 1984), de bactéries colonisant une source chaude terrestre (Stahl et al., 1985) et des micro-organismes colonisant les bassins de biolixiviation du cuivre (Lane et al., 1985b). Le manque de pouvoir résolutif de l'ARNr 5S (seulement 120 pb) incita les chercheurs à analyser les ARNr 16S. La première stratégie a été d'extraire l'ADN génomique total et de le cloner dans une banque phagique. Les phages contenant des fragments d'ARNr ont été par la suite criblés à l'aide d'une sonde spécifique et les clones ont été séquencés. Il a été possible à l'aide de cette technique d'analyser une communauté picoplanctonique marine (Schmidt et al., 1991). Cette technique a été reprise par Stein et al. (1996) pour accéder à des gènes du métabolisme à partir du même type de banque phagique. Afin de réduire l'étape de criblage Giovannoni et al. (1990b), proposèrent à l'aide d'amorces spécifiques d'amplifier les gènes codant pour l'ARNr 16S (ADNr 16S) puis de cloner le produit d'amplification. Afin d'accéder à la population réellement active de l'échantillon Weller et Ward (1989)

27 Les techniques d'écologie microbienne proposèrent de travailler sur les ADNc transcrits à l'aide d'une réverse transcriptase à partir du pool d'ARNr 16S. Amann et al. (1992a) modifièrent cette technique en ajoutant une étape de PCR après l'utilisation de la reverse transcriptase afin de travailler directement sur des ADNr (cf. figure 1.3). L'approche proposée par Giovannoni et al. (1990b) est actuellement la plus utilisée. Les modifications qui y ont été apportées s'attachent à réduire les biais inhérents à cette méthodologie en optimisant les techniques d'extraction d'ADN, d'amplification (jeu d'amorces, cycle, etc..) et d'analyse de la banque (RFLP, séquençage total). Nous reviendrons en détail dans la troisième partie de ce manuscrit sur les différentes étapes de cette méthode et le chapitre 3.4 s'attachera à décrire les biais qui peuvent entacher une étude de diversité.

3.3.1.2 L'échantillonnage et l'extraction d'ADN

Il faut considérer que l'étude reflétera la diversité de l'échantillon avant de refléter, par extrapolation, celle de l'environnement tout entier. Aussi l'échantillon devra représenter le plus fidèlement possible l'environnement étudié. Un grand nombre de dispositifs d'échantillonnage sont disponibles selon que l'on travaille sur des échantillons solides ou liquides, profonds ou de surface. L'accessibilité du site d'échantillonnage est la première donnée du problème. Les sources hydrothermales profondes ne sont par exemple accessibles qu'à un nombre réduit de submersibles scientifiques. Pour les échantillons des sols, il est possible d'effectuer des prélèvements par carottage à partir de la surface ou d'utiliser des puits pour accéder à des échantillons profonds (Pedersen, 1996). Pour des échantillons liquides il est possible de réaliser des prélèvements ponctuels (seringue titane, bouteille NIO, bouteille Niskin) ou de travailler sur de grands volumes pour accéder à une diversité plus importante, notamment aux souches rares. Il est alors nécessaire de concentrer par filtration les échantillons (Bej et al., 1991; Giovannoni et al., 1990a; Sommerville et al., 1989). Le mode de conservation de l'échantillon pourra lui aussi influer sur la diversité observée. Il faudra conserver les cellules intactes, c'est à dire les fixer si on souhaite réaliser des hybridations in situ ou les maintenir dans des conditions proches de celles où elles se développent (pH, potentiel redox). Afin de limiter la dégradation des acides nucléiques durant le stockage, il faudra limiter l'action des DNAses ou des RNAses qui sont libérées dans le milieu dès que les cellules sont altérées. Pour ce faire il faudra conserver les cellules au froid, dans l'éthanol ou dans des tampons bloquant les DNAses et les RNAses (comme le Guanidide Iso Thiocyanate). La solution idéale reste de pouvoir extraire l'ADN des échantillons dès que ceux ci sont collectés afin de réduire au minimum le temps de stockage de l'échantillon. La méthode d'extraction des acides nucléiques devra lyser de manière efficace l'ensemble des parois microbiennes, sachant que la paroi des Gram + est plus résistante que celle des Gram- et que les Archaea ne possèdent pas de peptidoglycane et sont donc insensibles à l'action du lysozyme. De plus, des composants présents dans l'échantillon peuvent réduire l'efficacité de l'extraction (matière organique, métaux, etc.) en se fixant sur l'ADN libéré des cellules. Il est souvent nécessaire de

28 Les techniques d'écologie microbienne combiner des méthodes de lyse physique (pilon et mortier, cycles de congélation-décongélation, etc.), de lyse chimique (détergents, phénol, etc.) et de lyse enzymatique (lysozyme, protéinase K, etc.) afin d'extraire le plus efficacement possible l'ADN contenu dans l'échantillon. Une technique particulière de purification des ADN bactériens a été proposée par Neimark et al. (1998) dans le cadre de l'étude de l'agent (non cultivable) du poumon gris (GLA: Grey Lung Agent). Après extraction des ADN, ceux-ci sont séparés par électrophorèse en champ pulsé. Il est ainsi possible de travailler sur des chromosomes entiers. Deux autres techniques ont été proposées dans le cas d'études de milieux peu complexes pour isoler spécifiquement les micro-organismes sans utiliser de méthodes culturales. Ces techniques reposent sur la micromanipulation des micro-organismes ou sur leur extraction du milieu d'étude. Dans le cadre de l'étude des bactéries symbiotes du poisson chirurgien (famille des Acanthuridae), Angert et al. (1993) ont isolé le symbiote par micromanipulation. La taille de la bactérie (80 x 600 nm) a permis d'utiliser cette technique habituellement appliquée aux Eucarya. Hubert et al. (1995) ont utilisé quant à eux les pinces optiques pour isoler une Archaea hyperthermophile préalablement détectée par extraction et séquençage des ADNr 16S à partir d'échantillons de la source chaude d'Obsidian Pool (Barns et al., 1994). Le micro-organisme était minoritaire dans les cultures d'enrichissement et échappait à toutes les tentatives d'isolement (Hubert et al., 1995). La technique d'isolement utilisée est fondée sur la détection du morphotype à l'aide de sondes nucléotidiques spécifiques, puis sur la recherche du morphotype dans des cultures d'enrichissement. Les cellules sont alors prélevées dans le milieux à l'aide d'un LASER (Ashkin et Dziedzic, 1987)11. La seconde méthode, employée pour étudier les symbiotes des vers hydrothermaux, consistait à isoler les cellules bactériennes des cellules hôtes sur un gradient de Ficoll après centrifugation (Lane et al., 1985a).

3.3.1.3 L'amplification et le clonage

Chaque étape de la PCR devra être prise en compte afin d'optimiser les conditions d'amplification (voir pour revue Arnheim et Erlich, 1992; Steffan et Atlas, 1991). L'utilisation de l'ADNr 16S permet de concevoir des amorces de PCR aux extrémités 5' et 3' de la molécule avec des spécificités plus ou moins importantes (Brunk et al., 1996; Marchesi et al., 1998). On utilise généralement plusieurs jeux d'amorces universelles afin de réaliser des banques de séquences de Bacteria, d'Archaea et parfois d'Eucarya (Hugenholtz et al., 1998a par exemple). Dans certaines études il a été possible d'amplifier spécifiquement des séquences d'ADNr 16S correspondant à un type métabolique défini (les BSR, Devereux et Mundfrom, 1994; Devereux et al., 1996). En jouant sur les conditions de PCR (enzyme, nombre de cycles, température, etc.) il est possible par la suite de modifier la spécificité de la réaction et de diminuer les risques de création de

11 L'utilisation des pinces optiques touche de nombreux domaines de la biologie. Ces pinces sont utilisées pour travailler notamment sur les chromosomes (séparation des chromosomes lors de la division cellulaire), les mitochondries ou les microfilaments. Il est également possible d'utiliser le LASER à la fois comme pince (maintien de la cellule) et comme ciseaux (découpage précis de la cellule) (Berns, 1998). Récemment Arai et al. (1999) sont parvenus à l'aide de pinces optiques à faire des noeuds dans des filaments d'actine et d'ADN et ont prouvé que l'ADN était plus solide que l'actine.

29 Les techniques d'écologie microbienne chimères (voir §3.4.2.2). Les biais inhérents à la PCR rendent difficile une approche quantitative même si de nombreuses techniques ont été proposées (Ferré et al., 1994 pour revue; Lee et al., 1996; Poltz et Cavanaugh, 1997). Le développement des techniques de PCR quantitative en temps réel permet désormais de suivre l'évolution des produits d'amplification à l'aide d'amorces marquées12 (Patel et al., 1998; Pahl et al., 1999).

Le clonage des produits de PCR est l'étape préalable au tri. Dans la mesure où les fragments amplifiés sont de petite taille (1,5 Kpb pour l'ADNr 16S) il est possible de les cloner dans des vecteurs plasmidiques (généralement dérivés du plasmide pBluescript). Il est par contre nécessaire de réaliser des banques phagiques lorsque l'on souhaite cloner l'ensemble de l'ADN génomique d'un échantillon pour accéder à des gènes du métabolisme. Le clonage peut être réalisé directement sur produits de PCR en utilisant le principe du TA- cloning (Mead et al., 1991) ou après digestion du produit de PCR et d'un vecteur afin de réaliser des clonages en bouts francs et ou en bouts cohésifs. L'avantage de la dernière méthode est de connaître l'orientation du fragment inséré, mais le traitement du produit de PCR par des enzymes peut entraîner une digestion partielle de ce dernier. Il n'est alors pas possible d'accéder à la séquence du gène dans son intégrité.

3.3.1.5 Le criblage et le séquençage

Une fois les fragments clonés il est nécessaire de vérifier la nature de l'insert et sa taille. Il est alors possible d'hybrider directement les colonies à l'aide de sondes spécifiques des ARN ribosomiques ou plus simplement extraire le plasmide ou de réamplifier directement sur colonies l'insert à l'aide d'amorces spécifiques du plasmide flanquant le site de clonage (T3, T7, M13, reverse, universelle par exemple). Afin de réduire le coût de séquençage de l'étude il peut être intéressant de réaliser un premier tri parmi les clones de la banque. Des classes, ou OTU (Moyer et al., 1994), ou phylotypes (Ward et al., 1998) peuvent être définis par comparaison des profils de restriction des inserts coupés à l'aide d'enzymes tétramériques (RFLP, AFLP, ARDRA). Le choix des enzymes de restriction va conditionner la qualité du tri (Moyer et al., 1996). Il est possible de coupler la RFLP à un marquage fluorescent. On observe la migration des fragments de restriction marqués sur un gel de séquençage: T-RFLP (Liu et al., 1997; Pukall et al., 1998; Chin et al., 1999; Marsh, 1999). On peut aussi analyser les profils obtenus après séquençage des différents clones sur une seule base (Ward et al., 1990b). Suzuki et al. (1998) analysent quant à eux le polymorphisme de taille de fragments d'ADNr 16S amplifiés. Récemment la diminution des coûts ainsi que la simplification des techniques de séquençage a permis de généraliser l'analyse de la totalité de la banque par séquençage. On séquence alors les

12 Les entreprises BioRad et Perkin Elmer proposent par exemple des systèmes de PCR quantitative clé en main (iCyclerÔ et Gene AmpÒ, TaqManÒ respectivement).

30 Les techniques d'écologie microbienne clones à l'aide d'une seule amorce dans un sens (par exemple l'amorce 515F (nos études) ou l'amorce 533F (Hugenholtz et al., 1998a). L'utilisation de séquenceurs automatiques ou le recours à des entreprises réalisant le séquençage "à façon" a permis de grandement faciliter l'étape de séquençage dans une analyse de diversité. L'utilisation de jeu d'amorces marquées réparties sur l'ensemble de l'ADNr 16S tous les 200 à 400 pb (cf. figure 1.4) permet de couvrir l'ensemble de la molécule en lecture double ou triple (Edwards et al., 1989).

Figure 1.4. Exemple de jeu d'amorces permettant de couvrir l'ensemble du gène de l'ADNr 16S

L'analyse de la séquence est réalisée à l'aide des techniques de phylogénie classique (méthodes de distance, de maximum de vraisemblance et de maximum de parcimonie) en comparant la séquence du clone avec les séquences des micro-organismes déposées dans les banques de données (Maidak et al., 1999).

3.3.2 Les sondes nucléiques

A la différence des techniques d'analyse par extraction et séquençage de l'ADNr 16S, l'utilisation des sondes nucléiques permet d'accéder individuellement à chaque cellule. Cette technique implique la formation d'un duplex entre une sonde nucléique et un ARNr cible. Comme l'indique la figure 1.3, les sondes peuvent être utilisées aussi bien sur de l'ADN fixé sur membrane (Dot ou Slot Blot après Southern), directement sur les colonies de clones (Grunstein et Hogness, 1975), sur des cultures d'enrichissement ou sur souche pure (Whole-cell hybridation) ou sur des échantillons naturels (hybridation in situ). Pour marquer la sonde on utilise soit des radioéléments (ATP-35S ou ATP- 32P) (Giovannoni et al., 1988) soit des enzymes (Amann et al., 1992b) soit des marqueurs fluorescents (fluorescéine, rhodamine, CY3, etc.); on parle alors de FISH (Fluorescent In-Situ Hybridization) (Delong et al., 1989; Amann et al., 1990 a et b; Stahl et Amann, 1991). On retiendra deux publications décrivant en détail les principes et les procédures d'hybridation sur membranes et cellules (Stahl et Amann, 1991; Johansson, 1996).

3.3.2.1 La construction des sondes nucléiques

La succession de domaines, de conservés à très variables, sur la molécule d'ADNr 16S permet de disposer de sondes au spectre plus ou moins large (de l'espèce au domaine cf. tableau 1.10). La spécificité de la sonde s'accroît à mesure qu'elle s'hybride dans un domaine de plus en plus variable.

31 Les techniques d'écologie microbienne

Tableau 1.10. Exemple de différentes sondes ayant des niveaux de spécificité différents.

Nom de la sonde Spécificité Référence S-*-Univ-1390-a-A-18 universelle Zheng et al., 1996 S-D-Bact-0338-a-A-18 domaine : Bacteria Amann et al., 1990a S-D-Arch-0915-a-A-20 domaine : Archaea Amann et al., 1990b S-K-Cren-0499-a-A-18 royaume : Crenarchaeota Burgraff et al., 1994 S-Sc-aProt-0019-a-A-17 sous classe : Proteobacteria a Manz et al., 1992. S-G-Dsbb-0660-a-A-20 genre : Desulfobulbus Deveureux et al., 1992 S-S-Thip-0829-a-A-21 espèces : Thioplaca araucae, T. chileae Teske et al., 1995

Une grande partie des sondes ont été dessinées pour être spécifiques de l'ARNr 16S et un grand nombre de publications décrivent la construction de ces sondes13, par exemple : sondes générales (Amann et al., 1990b), sondes pour méthanogènes (Raskin et al., 1994a), sondes pour les différentes sous-classes des Proteobacteria (Manz et al., 1992) ou pour les Proteobacteria d sulfato- réductrices (Devereux et al., 1992). Des auteurs ont ciblé d'une manière similaire l'ARNr 23S (Ludwig et al., 1994; Trebesius et al., 1994) ou les gènes codant pour des activités métaboliques spécifiques (Ogram et Sayler, 1988). Une technique alternative de construction de sondes a été proposée par Fani et al. (1993). Ces derniers ont utilisé comme sondes des fragments spécifiques produits par RAPD. Ces fragments pouvaient alors cibler l'ensemble du génome. Une technique de construction de sondes par hybridation soustractive a été proposée par Mau et Timmis (1998) pour obtenir des sondes très spécifiques (d'un clone par exemple) en limitant ainsi le nombre de séquences identiques à analyser. L'accessibilité de la sonde à l'ARN est le second facteur qui va influer sur la qualité de la sonde. La forte structure secondaire de la molécule d'ARNr (Gutell et al., 1994) impose des contraintes structurales d'hybridation qui peuvent réduire considérablement l'intensité du signal (Fuchs et al., 1998).

L'un des paramètres importants de l'hybridation est la température de fusion (Tm). Cette dernière définit pour un oligonucléotide la température d'équilibre à laquelle la moitié du duplex sonde-cible est dissociée. La Tm est dépendante de la concentration en oligonucléotides mais est indépendante du temps (situation d'équilibre). La Td ou température de dissociation est la température pour laquelle 50% du duplex reste intact pour une durée de lavage définie dans des conditions de non-équilibre

(donc Td peut être différent de Tm). La Td est la variable expérimentale de référence, elle définit la température de lavage de posthybridation pour laquelle 100% des hybridations non spécifiques sont dissociées (cf. tableau 1.11).

Une fois la sonde construite il est nécessaire de la valider en vérifiant sa spécificité dans un premier temps sur Dot blot contre des ARN ou des ADN de souches s'hybridant ou non avec la sonde

13 Une banque de séquence de sondes (OPD: Oligonucleotide Probe Database) a été créée et est disponible sur le réseau (http://www.cme.msu.edu/opd/). Elle n'a malheureusement pas été remise à jour récemment (Alm et al., 1996).

32 Les techniques d'écologie microbienne puis en testant la sonde sur culture pure ou mélange de culture pure (voir par exemple Harmsen et al., 1997b).

Tableau 1.11. Caractéristiques de la température de dissociation (Td)

La Td est déterminée par : La Td est dépendante de : Ø le nombre de liaisons hydrogène entre bases Ø la structure du duplex, complémentaires, Ø la séquence de la chaîne, Ø le degré de "stacking" (échange d'électrons) des Ø la longueur de la chaîne, bases adjacentes sur une même chaîne, Ø le nombre, le type et la position des mésappariements, les interactions entre les phosphates (chargés Ø Ø la présence de bases désappariées en fin de chaîne, négativement) les cations en solution. Ø des conditions de lavage et d'hybridation.

3.3.2.2 L'utilisation des sondes en dot blot

Les sondes marquées peuvent être utilisées en dot blot pour qualifier voire quantifier un type de micro-organismes (s'hybridant avec la sonde) par rapport à une population totale dont l'ADN serait fixé sur membrane. La présence ou l'absence du micro-organisme sera liée à l'hybridation ou non de la sonde. L'intensité de l'hybridation par rapport à une sonde plus générale (par exemple une sonde universelle ou domaine spécifique) pourra refléter la quantité de micro-organismes présents dans l'échantillon. Cette intensité est toutefois fortement liée au nombre de ribosomes dans la cellule (variant de 103 à 105 selon les organismes et l'état cellulaire) et à la qualité d'extraction d'ADN.

3.3.2.3 Les sondes en hybridation in situ

A la différence des hybridations sur colonies ou sur membrane, les hybridations sur cellules entières permettent d'accéder directement à l'ARNr sans endommager la structure pariétale de la cellule et donc d'accéder en plus du caractère phylogénétique ou métabolique lié à la sonde à un caractère morphologique. Olsen et al., (1986) proposent les premiers d'utiliser les sondes marquées pour identifier et compter les cellules dans des échantillons environnementaux. Le premier essai est réalisé à l'aide de sondes radioactives (Giovannoni et al., 1988). L'hybridation consiste en une première phase de perméabilisation de la cellule et de fixation des acides nucléiques à l'aide de paraformaldehyde le plus souvent. Puis les cellules sont fixées sur une lame enduite de gélatine. Elles sont incubées sur lame en présence de la sonde marquée dans des conditions de stringence qui sont définies par la température d'hybridation ou la quantité de formamide présente dans le tampon. Après lavage, les cellules peuvent être observées sous microscope à épifluorescence. Il est possible de combiner l'hybridation de plusieurs sondes (ayant des spécificités différentes) au sein d'un même échantillon par l'utilisation de différents fluorochromes (Amann et Kuhl, 1998). Il est aussi possible d'utiliser plusieurs sondes ayant la même spécificité mais des sites d'hybridation différents afin de détecter des micro-organismes en très faible quantité (Lee et Kemp, 1994). Des comparaisons des différentes méthodes de quantification des cellules ont été entreprises par Karner et Furhman (1997). Les techniques les mieux corrélées sont les sondes nucléiques et les

33 Les techniques d'écologie microbienne techniques d'autoradiographie. Ces deux techniques détectent toutefois moins de cellules que le comptage par DAPI. Une technique de transcription reverse in situ (ISRT) a été développée afin de pouvoir détecter plus facilement les bactéries actives d'un échantillon (Chen et al., 1997). Les hybridations, sur des ADNc, à l'aide de sondes spécifiques des ARNr ou de certains ARNm, permettent d'obtenir des signaux plus puissants (sur les bactéries actives) que par simple FISH.

3.3.3 La DGGE

3.3.3.1 Principe

Le principe de la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) est fondé sur la séparation d'un double brin d'ADN sous l'action de la chaleur ou d'un dénaturant (Fischer et Lerman, 1979). La température à laquelle le duplex est détruit est conditionnée par deux facteurs : Ø Le nombre de liaisons hydrogène entre les bases complémentaires. Ainsi une liaison GC (3 liaisons hydrogène) est détruite à une température plus élevée qu'une liaison AT (2 liaisons hydrogène) Ø L'attraction entre des bases voisines sur un même brin ou "stacking".

La molécule d'ADN aura donc une Tm (ou température de fusion) qui variera selon les domaines et qui sera fonction de sa séquence nucléique. Deux molécules d'ADN proches, différant d'un seul nucléotide dans une zone à faible température de fusion, auront deux températures de fusion différentes. Lors d'une migration électrophorétique dans un gradient croissant de dénaturant (habituellement formamide ou urée), la mobilité de la molécule d'ADN décroît alors que les zones à faible température de fusion se dissocient. La structure de l'ADN, alors en simple brin, stoppe la migration de la molécule. Pour éviter la dénaturation totale du double brin, une structure à très haute température en fusion (très riche en GC) est associée lors de l'amplification. Une PCR est alors réalisée à l'aide d'une amorce portant en 5' une succession de 40 GC : le GC clamp. La mise au point de la technique réside essentiellement (Michaelides et al., 1995; Cotton, 1997) : Ø dans le choix des amorces. Elles permettent d'amplifier de 100 à 400 pb dans une zone à faible point de fusion. Le "GC clamp" doit être proche de l'extrémité amplifiée ayant le plus fort point de fusion. Il est donc nécessaire de connaître avant l'amplification les zones qui auront une température de fusion plus ou moins élevée. Dans le cas de l'ADNr 16S ces zones peuvent être connues en raison de la forte stabilité de la structure secondaire de la molécule. Ø dans la préparation du gel (nature et établissement du gradient, tension et durée d'électrophorèse). Dans les deux cas des outils informatiques permettent d'assister le scientifique pour déterminer le type de gradient à réaliser dans le gel et la durée de migration estimée de l'échantillon.

En résumé les avantages et les désavantages de la méthode peuvent être présentés dans le tableau 1.12.

34 Les techniques d'écologie microbienne

Tableau 1.12. Avantages et désavantages de la technique de DGGE

AVANTAGES DESAVANTAGES 1. Méthode très sensible 1. La phase de mise au point peut être longue 2. En routine, la mise en oeuvre est simple et ne requiert 2. Il est préférable d'acheter un appareillage spécifique pas l'emploi de radio éléments. 3. Le séquençage des fragments est limité à 400 pb. 3. Les fragments de PCR après migration peuvent être Problématique pour réaliser des phylogénies par la suite récupérés et séquencés. 4. Les gènes ou régions très riches en GC sont difficilement analysables par DGGE.14

3.3.3.2 La DGGE en écologie microbienne

Initialement développée dans le domaine médical pour détecter des mutations impliquées dans des maladies génétiques, cette technique a été utilisée pour distinguer les différentes populations de micro-organismes dans des échantillons naturels après amplification de leur ADNr 16S (Muyzer et al., 1993; Muyzer, 1999). Cette technique permet : Ø la comparaison d'échantillons différents : évolution d'une communauté dans le temps (Santegoeds et al., 1998b), action de différents nutriments et de l'inoculum dans des cultures en "batch" (Jackson et al., 1998a) ou action des facteurs environnementaux dans un milieu défini (Santegoeds et al., 1996; Ward et al. 1997), Ø une identification des souches présentes dans un échantillon par comparaison du profil de migration avec des profils obtenus sur des cultures pures, par séquençage des bandes après excision (Ferris et al., 1996a) ou par hybridation sur le gel d'électrophorèse à l'aide de sondes spécifiques (Muyzer et al., 1995).

3.3.3.3 Les variantes de la DGGE

Il existe différentes variantes de la DGGE selon le type de gradient utilisé (TGGE ou CDGE). D'autres techniques (SSCP, HMA) sont elles aussi fondées sur les migrations de structures secondaires d'ADNr différents. Ø TGGE : Temperature Gradient Gel Electrophoresis. Le gradient dénaturant chimique est remplacé par un gradient de température qui augmente au cours de la migration. (Zoetendal et al., 1998; Eichner et al., 1999) Ø CDGE : Constant Denaturant Gel Electrophoresis. La concentration d'agent dénaturant est constante dans le gel et équivalente à la température de la plus base zone de fusion. Cette technique utilisée lorsque l'on ne connaît pas la localisation des zones de mutations requiert l'utilisation de plusieurs gels reproduisant chacun différentes conditions de dénaturation. Ø La technique de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) est fondée sur la différence de structure secondaire et donc de migration au sein d'un gel non dénaturant entre deux fragments

14 Wu et al. (1999) ont proposé une méthode combinant la CDGE et la DGGE pour l'analyse des régions très riche en GC.

35 Les techniques d'écologie microbienne d'ADN simples brins ayant des séquences différentes (Lee et al., 1996; Schwieger et Tebbe, 1998). Plus facile à mettre en oeuvre que la DGGE, la SSCP nécessite l'utilisation d'ADN témoin pour identifier les micro-organismes auxquels correspondent les bandes (Widjojoatmodjo et al., 1994). Elle peut aussi être utilisée pour distinguer des espèces entre elles (Borin et al., 1997). Ø La technique HMA (Heteroduplex Mobility Assay) consiste elle aussi à faire migrer des fragments d'ADNr 16S dénaturés puis renaturés de différentes espèces. Au cours de la renaturation des hétéroduplex se forment dont la mobilité est fonction des structures secondaires recréées dans les régions non-appariées. La migration a lieu sur gel de polyacrylamide mais elle permet surtout de distinguer des populations peu complexes (Espejo et al., 1998) 15.

3.3.4 Les autres techniques

3.3.4.1 Les renaturations d'ADN totaux

La technique proposée par Torsvik et al. (1990a) repose sur la mesure de la vitesse de renaturation d'un mélange d'ADN préalablement dénaturé. Plus l'échantillon est constitué d'une population complexe plus il mettra de temps à se renaturer. Il ne s'agit pas d'une identification des micro-organismes impliqués dans la diversité de la population mais de la mesure d'un indice de diversité.

3.3.4.2 L'analyse des fragments de restriction.

Des endonucléases de restriction sont utilisées pour générer des fragments de différentes tailles sur de l'ADN génomique ou sur de l'ADNr 16S amplifié. La comparaison des profils de restriction sur gel de polyacrylamide permet d'accéder simplement et d'une manière peu onéreuse à la diversité de l'échantillon (Moyer et al., 1994; Martinez-Murcia et al., 1995). Moyer et al. (1996), sur la base d'une simulation réalisée à l'aide de différentes enzymes tétramériques et des séquences disponibles sur le RDP, a proposé une liste d'enzymes particulièrement résolutives pour des RFLP sur ADNr 16S. S'il est possible de comparer les communautés entre elles par cette technique, il n'est pas possible d'identifier les éléments de ces communautés. Une étape de séquençage est alors indispensable.

3.4 De la diversité phylogénétique à la diversité physiologique

Si les techniques d'écologie microbienne moléculaire fondées sur l'étude de l'ADNr 16S permettent d'accéder et de quantifier la diversité phylogénétique associée à un milieu, ces techniques ne permettent malheureusement pas d'accéder à la diversité métabolique. En effet à l'exception de quelques grands groupes phylogénétiques correspondant à une type métabolique donné, tels que les Archaea méthanogènes ou les cyanobactéries, le rôle fonctionnel d'un micro-organisme détecté

15 Les mêmes auteurs proposent de corréler les profils de migration aux pourcentages de similitudes sur l'ADNr 16S entre souches.

36 Les techniques d'écologie microbienne

"moléculairement" reste dans bien des cas non défini. De plus l'isolement et la caractérisation des micro-organismes ne nous informent que sur leur capacité métabolique dans des conditions définies. Aussi pour accéder aux diverses contributions métaboliques au sein de l'environnement différentes approches ont été proposées, elles consistent soit à étudier les gènes du métabolisme, soit à étudier les ARNm. Comme nous l'évoquerons dans la partie suivante (les habitats microbiens), à l'instar des études réalisées sur les gènes codants pour l'ARNr 16S, des stratégies fondées sur l'emploi de sondes nucléiques et sur l'amplification des gènes du métabolisme à l'aide d'amorces spécifiques ont déjà été employées. Bien que le degré de conservation des gènes codants pour des fonctions métaboliques soit moins important que celui des gènes d'ARNr, un certains nombre de gènes sont suffisamment conservés pour pouvoir déterminer des sondes ou des amorces spécifiques. Ainsi il est possible d'amplifier la bisulfite réductase, l'APS réductase ou l'hydrogénase impliquées dans des mécanismes de sulfato-réduction, la méthane monooxygénase soluble (sMMO) ou particulaire (pMMO ou pmoA) impliquées dans les phénomènes de méthanotrophie, l'ammoniaque monooxygénase (amoA) impliquée dans la nitrification, les gènes de fixation de l'azote atmosphérique (opéron nif), la sous- unité alpha de la méthyle coenzyme-M réductase (mer) impliquée dans la méthanogénèse ainsi que des gènes impliqués dans des résistances aux métaux (cf. chapitre 2 §3.1.3 et §5.3.2). L'utilisation de sondes pour des hybridations in situ est rendue aléatoire par le fait qu'à la différence des ARNr, les gènes codant pour des fonctions métaboliques sont présents en bien moins grande quantité. Pour circonvenir cette limitation une technique d'amplification in situ a été mise au point (Hodson et al., 1995). Cette technique permettrait d'amplifier des gènes, des ARNm et des ARNr, mais elle n'a jusqu'à présent été utilisée que pour étudier des cellules isolées ou des communautés peu complexes (Tolker-Nielsen et al., 1997; Holmstrøm et al., 1999; Tani et al., 1998). L'approche la plus utilisée consiste à amplifier directement les gènes à partir d'un pool d'ADN génomique directement extrait de l'échantillon, puis d'une manière analogue à l'ADNr 16S, à réaliser des phylogénies en comparant les séquences des gènes clonés avec celles de micro-organismes isolés. Les biais inhérents aux techniques d'extraction de l'ADN, d'amplification et d'analyse phylogénétique (cf. §3.5) peuvent malgré tout entacher cette analyse. De plus l'amplification d'un gène n'implique pas obligatoirement que celui-ci soit transcrit. Il est donc préférable d'utiliser des techniques de PCR compétitive pour quantifier la présence du gène dans une population (Lee et al., 1996b; Kowalchuk et al., 1999). L'une des solutions les plus élégantes consiste donc à analyser les ARNm dont la présence dans le cytoplasme procaryotique est directement corrélée à l'expression du gène par le micro-organisme. Cette technique fondée sur l'extraction des ARNm suivie d'une RT-PCR à permis d'étudier l'expression des gènes de résistance au mercure dans des échantillons d'eau (Nazaret et al., 1994), les gènes de la manganèse péroxydase dans le sol (Bogan et al., 1996), de la naphtalène dioxygénase dans des eaux souterraines (Wilson et al., 1999), de la fixation de l'azote chez la communauté symbiotique du termite Neotermes kokunensis (Noda et al., 1999). La quantification de l'expression des ARNm peut être effectuée par PCR compétitive (Tsai et Wiltbank, 1996). La technique de "Differential Display" employée couramment dans l'étude des ARNm d'Eucarya est aussi

37 Les techniques d'écologie microbienne applicable à partir d'ARNm procaryotique (Fleming et al., 1998), il n'est alors pas nécessaire de connaître la séquence des ARNm dont on souhaite suivre l'induction. Une dernière technique consiste à rechercher une fonction métabolique dans un environnement par clonage d'une banque d'ADN génomique dans Esherichia coli, puis par criblage de la banque en suivant l'expression des gènes clonés. Il a été possible à l'aide cette technique, à partir de différents échantillons de sol, de détecter la présence de gènes codants pour l'utilisation du 4-hydroxybutyrate (Henne et al., 1999). Cette technique est toutefois très laborieuse puisqu'il a fallu cribler 930000 souches d'E. coli pour détecter 36 clones positifs dont seuls 5 possédaient un plasmide recombinant. Une étude similaire, passant toutefois par une étape préalable clonage dans une banque de phage, a été entreprise pour rechercher des chitinases à partir d'échantillons d'eau de mer (Cottrell et al., 1999) L'analyse d'un gène codant pour une fonction du métabolisme ne nous renseigne pas sur la position phylogénétique du micro-organisme qui exprime ce gène. Seules les études de communautés très simples telles que les associations symbiotiques n'impliquant généralement qu'un hôte et un symbiote permettent d'attribuer à un micro-organisme défini, à la fois une position phylogénétique et une fonction métabolique. Ainsi, il a été possible d'attribuer les gènes d'une nouvelle famille de bisulfite réductase dissimilatoire aux épibiotes de l'annélide polychète Alvinella pompejana (Cottrell et Cary, 1999) et les gènes codants pour une flagelline au symbiote de Riftia pachyptila (Millikan et al., 1999). Une autre méthode consiste à cloner des grands fragments d'ADN génomique à partir d'une extraction directe d'ADN et à rechercher dans les banques des fragments portant les gènes codant pour l'ADNr 16S (Stein et al., 1996). Il est alors possible d'étudier les gènes adjacents disposés sur le même "contig". Comme dans le cas précédent il n'est pas garanti que les gènes détectés soient exprimés, de plus l'effort d'échantillonnage à fournir pour détecter les gènes d'ADNr 16S peut parfois être démesuré. Cette technique employée dans l'étude d'une communauté simple à permis de caractériser l'ADNr 16S et les gènes de l'ADN polymérase de l'Archaea Crenarchaeum symbiosum associée à l'éponge Axinella mexicana (Preston et al., 1996; Schleper et al., 1997b). Les imposants projets de séquençage génomique humain et procaryotique ont favorisé le développement des nanotechnologies. Nombre de ces développements ne sont encore qu'à l'état de pré-projet mais la demande en systèmes d'analyse rapides et bon marché de la part des industriels les imposeront probablement très rapidement au sein des laboratoires. L'effort de recherche semble s'être porté sur différentes technologies de puces à ADN fondées sur la détection du signal par fluorescence (Marschall et Hodgson, 1998; Schena et al., 1998; Gerhold et al., 1999) ou par spectrométrie de masse (Tang et al., 1999) ainsi que sur la miniaturisation des dispositifs de migration d'ADN utilisant des systèmes électrophorètiques en microcapillaires de silicone (Chou et al., 1999) ou des "crochets" animés de mouvements browniens (Bader et al., 1999). L'écologie microbienne n'a pour l'instant que très peu bénéficié du développement de ces techniques, seule une étude décrit la mise au point (Guschin et al., 1997b) puis l'emploi (Guschin et al., 1997a) de puces à ADN pour détecter différentes communautés de bactéries nitrifiantes. Les programmes de séquençage génomique ont quant à eux fourni de nombreuses informations sur l'organisation génomique, sur la

38 Les techniques d'écologie microbienne fonctionnalité génétique et sur les mécanismes évolutifs impliqués dans les micro-organismes séquencés (Olsen et Woese, 1996; Karp et al., 1998, 1999; Ge et Taylor, 1999). Ils permettent désormais de comparer les micro-organismes non sur la base de caractères phénotypiques ou phylogénétiques mais sur l'ensemble des informations contenues dans leur génome (Koonin et Galperin, 1997; Rastan et Beeley, 1997).

3.5 Les biais des techniques moléculaires

A l'instar des techniques culturales, les techniques moléculaires sont elles aussi soumises à de nombreux biais qui peuvent lourdement entacher l'analyse de la diversité microbienne d'un échantillon. Ces biais peuvent intervenir à différents stades de l'analyse : lors de l'échantillonnage, de la conservation de l'échantillon, de la lyse cellulaire, de l'amplification de l'ADNr 16S, de l'analyse des séquences. Dans le cadre des études par hybridation in situ la construction et la spécificité de la sonde, l'état cellulaire et la perméabilité des membranes ainsi que la sensibilité des méthodes d'analyse peuvent influencer les résultats de l'analyse. Trois publications récentes font le point sur les principaux bais de ces techniques. La première (Amann et al., 1995) s'attache plus particulièrement à décrire les biais des techniques d'hybridation in situ et propose des techniques pour améliorer la sensibilité de la méthode. La seconde (Wintzingerode et al., 1997) fait un inventaire très complet des biais majeurs rencontrés dans les études par amplification et séquençage. La troisième (Head et al., 1998) fait le point sur dix années d'études moléculaires ainsi que sur les biais de l'ensemble de ces techniques.

3.5.1 Echantillonnage et conservation des échantillons

En dehors de très rares milieux où la diversité microbienne est très restreinte (par exemple symbiose réduite à un micro-organisme) l'échantillon prélevé dans le milieu devra rendre compte le plus fidèlement possible de l'ensemble des espèces présentes dans l'environnement. Il est donc nécessaire de connaître les conditions physico-chimiques de chaque échantillon. Dans la mesure où il n'est pas possible de traiter (lyse, extraction) l'échantillon dès son prélèvement, il est nécessaire de le conserver dans les conditions qui permettront de conserver l'intégrité des acides nucléiques. Une étude a comparé les effets de différentes techniques de conservation sur la composition de banques de clones d'ADNr 16S (Rochelle et al., 1994). Il a été observé que les échantillons congelés rapidement et maintenus sous atmosphère anaérobie (non- oxydante) présentent une diversité bien plus importante que les échantillons conservés en aérobiose ou congelés plus tardivement. La congélation tardive des échantillons est source selon les auteurs d'enrichissement de certains phylotypes.

39 Les techniques d'écologie microbienne

3.5.2 Les techniques de PCR

3.5.2.1 La lyse cellulaire et l'extraction des acides nucléiques

La lyse cellulaire est une étape cruciale de l'analyse de la diversité. Elle devra détruire les parois et membranes des micro-organismes en endommageant le moins possible les acides nucléiques. L'efficacité de la technique de lyse cellulaire sur un échantillon environnemental est d'autant plus difficile à déterminer que l'on ne connaît pas le type et la quantité de cellules à lyser. On sait toutefois que les techniques de lyse bactérienne doivent être modifiées pour lyser des Archaea, que les bactéries Gram + sont plus difficiles à lyser que les Gram -, que les spores et les petites cellules résistent mieux à la lyse. Tableau 1.13. Les techniques de lyse cellulaire Techniques physiques Techniques chimiques congélation- décongélation solvants Azote liquide détergents (SDS) pilon et mortier enzymes bead beating lysozyme Presse de French protéinase K sonication - micro-onde N-acetylmuramidase chauffage à 100°C Lysostaphin Résine d'échange d'ions (Chelex) Achromopeptidase

Les techniques de lyse les plus efficaces sont celles qui combinent à la fois les traitements physiques et chimiques (cf. tableau 1.13). Toutefois elles peuvent conduire à une forte fragmentation de l'ADN et favoriser la production d'amplifiats chimériques. Aussi est-il parfois nécessaire de simplifier la technique d'extraction afin d'avoir un ADN de meilleure qualité. On est alors confronté à la présence de contaminants tels que les acides humiques (pour des échantillons de sols) ou les métaux lourds qui peuvent inhiber l'action de certaines ADNpolymérases.

La solution idéale consisterait à utiliser plusieurs techniques de lyse et à rassembler le résultat des différentes extractions pour réaliser l'amplification.

3.5.2.2 L'amplification par PCR

L'amplification est l'une des sources majeures de biais dans l'étude de la diversité. Ces biais sont introduits pour différentes raisons : Ø inhibition de la PCR en raison de la présence de contaminants chimiques ou organiques (Wilson, 1997) Ø l'état physiologique de la cellule va influer sur la qualité de l'amplification : les ADN des cellules à l'état quiescent ou létal vont être plus difficilement amplifiables (Silva et Batt, 1995)

40 Les techniques d'écologie microbienne

Ø amplification préférentielle de certaines molécules : celle-ci est liée au nombre de copies de l'opéron rrn16 (de 1 à 14) (Farrelly et al., 1995), au choix des amorces (Reysenbach et al., 1992; Brunk et Eis, 1998), à l'échantillon (Suzuki et Giovannoni, 1996), à la composition en GC de la séquence (Dutton et al., 1993), aux proportions initiales de séquences dans l'échantillon (Suzuki et Giovannoni, 1996), aux séquences adjacentes de la zone à amplifier (Hansen et al., 1998) Ø formation de molécules chimériques : lors de l'appariement les simples brins d'ADN vont s'associer entre eux plutôt qu'avec les amorces, en particulier lorsque l'ADN a été fragmenté (Pääbo et al., 1990; Liesack et al., 1991; Kopczynski et al., 1994; Wang et Wang, 1996) Ø formation de mutant de délétion : la structure secondaire de l'ADNr 16S va persister lors de la dénaturation et la polymérase va "sauter" certaines structures résistantes Ø mauvaise incorporation de la polymérase : selon les enzymes utilisées et les conditions d'amplification le taux d'erreur variera d'une toutes les 300 bases à une toutes les 5000 bases. Ø variation des séquences des différentes copies dans l'opéron rrn au sein d'une même souche (voir § 3.1.3 et Ninet et al., 1996; Reischl et al., 1998). Ø présence de séquences de contaminants de la réaction : les tampons de réaction, l'eau ou les tubes peuvent être source de contaminants qui passent alors pour faire partie de la population indigène de l'échantillon (Tanner et al., 1998). L'une des solutions est d'exposer le mélange d'amplification aux U.V. (Goldenberger et Altwegg, 1995)

3.5.2.3 Le clonage et l'analyse des séquences

Il semblerait que la technique de clonage influence la composition de la banque de clones. En particulier pour les clonages en bouts cohésifs où il est nécessaire d'utiliser des enzymes de restriction qui peuvent couper le fragment d'ADNr 16S (Rainey et al., 1994b). L'orientation du fragment cloné peut elle aussi générer des différences de profils lors de l'analyse par RFLP de la banque en cas de clonage par TA-cloning. Pitule et Pace (1999) ont proposé un vecteur spécialement construit pour le clonage de l'ADNr 16S dans une orientation donnée. Le criblage de la banque doit être effectué en tenant compte des espèces minoritaires. Ainsi, dans un échantillon contenant 108 cellules.g-1 et une population présente à 102 ou 104 individus.g-1, il sera nécessaire de cribler 104 à 106 clones pour statistiquement détecter cette population17. La détection des chimères est une étape essentielle lors de l'analyse des séquences. Si différents auteurs ont proposé des techniques pour réduire le nombre de chimères lors de l'étape de PCR (voir § 3.4.2.2 et Wintzingerode et al., 1997), les outils pour détecter ces séquences sont assez réduits. Il s'agira d'utiliser le programme CHIMERA sur le site du RDP (Robinson-Cox et al., 1995) ou de comparer la topologie d'arbres phylogénétiques en n'utilisant que certaines parties de l'alignement (par exemple de la partie 5' à la base 500, de 500 à 1000 et de 1000 à la partie 3'). Ces séquences

16 Ce nombre de copies peut être variable au sein d'une même espèce. Prüß et al. (1999) détectent des séquences signatures spécifiques d'une part de souches psychrotolérantes et d'autre part de souches mésophiles sur différentes copies de l'ADNr 16S de Bacillus cereus dont le nombre varie de 6 à 10 selon les souches. 17 Lors de l'amplification, les ratios cellulaires ne sont pas maintenus, ce nombre de clones à analyser est donc théorique.

41 Les techniques d'écologie microbienne seront d'autant plus difficiles à détecter qu'elles sont formées entre espèces proches ou entre copies d'un même opéron (Wang et Wang, 1997).

3.5.3 Les techniques d'hybridation

Les principaux biais des techniques d'hybridation sont liés d'une part à la perméation des cellules, et d'autre part à l'état cellulaire et à la construction des sondes. Ø Pour la fixation des cellules et leur perméation l'utilisation d'aldéhyde comme le paraformaldéhyde (agent de pontage) va être plus efficace sur les bactéries Gram - alors qu'un dénaturant comme l'éthanol fixera mieux les Gram +. Pour les Gram + il est parfois nécessaire d'utiliser du lysozyme pour faciliter la pénétration de la sonde. Ø Des cellules actives dans l'échantillon, donc riches en ribosomes, seront plus facilement détectées que des cellules en dormance. En effet le taux de croissance est corrélé dans la plupart des cas avec le nombre de ribosomes par cellule. Le nombre de ribosomes n'est toutefois pas un facteur limitant de la croissance et de la synthèse protéique chez les bactéries oligotrophes à la différence des hétérotrophes (Fegatella et al., 1998). Ø La construction de la sonde devra tenir compte de la spécificité de la séquence. Ainsi pour un nucléotide de 18 bases, il y a 0,25-18 chance pour détecter une séquence non recherchée. Mais dans la pratique des hybridations non spécifiques peuvent se produire avec quelques mésappariements dans la sonde. Il est donc nécessaire de vérifier la validité de la sonde en la confrontant avec les banques de séquences et par hybridation sur membrane ou sur culture pure.

Ø En jouant sur les conditions d'hybridation, Td ou pourcentage de formamide on modifie la spécificité de la sonde. Zheng et al. (1996) ont quantifié avec plus de précision des organismes des trois domaines (Eucarya, Bacteria et Archaea) en diminuant la Td pour différentes sondes universelles. Ø Le type de marquage de la sonde influera sur la qualité de détection, aussi des nouveaux marqueurs et des nouvelles techniques de détection ont été développés (Glöckner et al., 1996; Schönhuber et al., 1997, 1999) Ø La sonde devra "accéder" à son site d'hybridation sur la molécule d'ARNr 16S. La forte structure secondaire de l'ARNr ainsi que les interactions avec des protéines peuvent rendre certains sites inaccessibles. L'utilisation de formamide permet alors de réduire les liaisons hydrogène et d'accroître l'accessibilité du site. Et en utilisant une sonde dans les régions déjà connues pour donner des hybridations efficaces il est possible de limiter ce biais (Frischer et al., 1996). Récemment l'équipe de Amann a établi sur la base de l'ARNr 16S d'E. coli une carte d'accessibilité de la molécule en comparant par cytométrie en flux l'hybridation de l'ensemble des sondes couvrant les 1500 nucléotides de la séquence avec la valeur de la sonde EUB 338 donnée pour 100% d'hybridation (Fuchs et al., 1998).

42 Les techniques d'écologie microbienne

3.5.4 Les techniques de DGGE

Les biais de la technique DGGE sont semblables à ceux rencontrés dans les techniques d'amplification et de séquençage. Dans la mesure où il est nécessaire d'effectuer une amplification de fragments d'ADNr 16S, l'ensemble des biais d'échantillonnage, d'extraction et d'amplification sont présents. Seules les bandes de fortes intensités, correspondant aux populations majoritaires ou majoritairement amplifiées pourront être détectées.

3.5.5 Une solution : l'approche pluridisciplinaire

L'engouement "excessif" du début des années 1990 vis à vis des techniques moléculaires (Olsen et Woese, 1993; Olsen et al., 1994b; Woese, 1994 a et b) a désormais fait place à une vision plus pondérée des différentes méthodologies d'étude de la diversité microbienne (Palleroni, 1997; Amann et Kühl, 1998; Head et al., 1998). Si les biais des techniques culturales sont depuis longtemps pris en compte, les résultats obtenus par des techniques d'analyse des ARNr peuvent parfois être surprenants. D'une part : Ø La grande majorité des séquences obtenues ne sont pas similaires à celles de souches cultivées. Ø Un grand nombre de séquences bactériennes et archaéennes correspondent à de nouveaux phylums. Ø Les séquences de souches isolées de sites d'où provient une collection de clones d'ADNr 16S sont rarement identiques à celles des clones. Ø Des séquences de clones obtenus de sites très éloignés peuvent être très similaires. Ø Des organismes très peu ou pas cultivés peuvent présenter une très grande variabilité phylogénétique et être ubiquitairement présents dans la nature.

D'autre part : Ø Les données "de base" d'écologie ne peuvent être obtenues par ces techniques; notamment en raison des problèmes méthodologiques il est difficile de quantifier les taxons présents dans le milieu. Ø La qualité des amplifications est dépendante de conditions physiologiques et génomiques cellulaires que l'on ne peut prévoir. Ø Il est difficile de définir les propriétés physiologiques, métaboliques et le rôle écologique des organismes détectés à partir de leur position phylogénétique d'autant plus si ceux-ci forment de nouveaux phylums. Ø Les amorces dites "universelles" n'ont été construites qu'en utilisant une très faible fraction des organismes connus. Ø La présence d'un grand nombre de séquences similaires est difficile à interpréter : s'agit-il de microhétérogénéités au sein de l'opéron rrn ou de souches très proches? Ø La détection et la quantification des cellules par hybridation in situ est actuellement soumise à de nombreux biais notamment lors de la détection du signal et de la perméation cellulaire.

43 Les techniques d'écologie microbienne

Ø Par amplification (séquençage et DGGE) ou par hybridation il est encore très difficile de détecter les espèces minoritaires. Ø Le traitement des banques de clones devrait être soumis à plus de rigueur statistique. Ø Le pouvoir résolutif de l'ADNr 16S au niveau de l'espèce (qui est l'unité de base en écologie) est limité. Des valeurs de 95% d'identité peuvent distinguer des espèces différentes, contre 70% de similitude en hybridation ADN/ADN.

Si les techniques moléculaires ont permis de considérablement accroître le champ des connaissances en écologie microbienne (cf. partie suivante), il est désormais indéniable que seul l'emploi combiné de techniques culturales et non-culturales permettra de lier les informations concernant la diversité et la fonction des communautés microbiennes dans leur environnement. Au même titre que la taxinomie bactérienne a su intégrer aux techniques classiques d'identification et de taxinomie numérique les techniques moléculaires et la phylogénie moléculaire, l'écologie microbienne devra elle aussi intégrer l'ensemble des techniques mises à sa disposition. Cette approche polyphasique peut s'envisager par l'utilisation conjointe des sondes moléculaires et des microélectrodes (Schramm et al., 1996), des sondes moléculaires et des mesures d'incorporation spécifiques (Lee et al., 1999; Ouverney et Fuhrman, 1999), le clonage de grands fragments d'ADN génomique (Stein et al., 1996), l'utilisation des microscopes confocaux (Manz et al., 1995, 1999; Harmsen et al., 1996b; Rocheleau et al., 1999) et des pinces optiques (Huber et al., 1995). La biomasse procaryotique, cette "majorité invisible" telle que la décrivent Whitman et al. (1998), ne devrait nous être accessible qu'au terme de ces efforts.

44 Les habitats microbiens Les habitats microbiens

La Terre est un écosystème extraordinairement complexe où l'on peut distinguer trois habitats majeurs : l'atmosphère, le sol et l'eau. Aux habitats naturels se sont adjoints de nouvelles niches écologiques liées à la présence et aux activités humaines. L'étude de tous ces habitats a longtemps été limitée aux grandes formes de vie et nombre de textes d'écologie articulaient leur réflexion uniquement autour de ce qui était visible à l'œil nu. L'utilisation de techniques culturales en microbiologie, relayé ces dernières années par l'emploi de techniques moléculaires, nous a permis d'observer à quel point la diversité et le rôle des procaryotes pouvait être prépondérant dans l'équilibre de la biosphère. Je me propose dans cette seconde partie introductive, après une description sommaire des différents écosystèmes et des micro-organismes qui y ont été isolés, de présenter une revue des apports des techniques moléculaires dans l'étude de la diversité de ces milieux. Les écosystèmes pétroliers et hydrothermaux seront plus particulièrement approfondis. Un arbre phylogénétique présenté en annexe permettra au lecteur de repérer les différents groupes phylogénétiques cités dans cette seconde partie.

I Les origines de la vie

1.1 Les premières traces de vie

Aller à la recherche des premières formes de vie sur terre c'est tenter de répondre à ces trois questions : qu'est ce que la vie? Quand cela a-t-il commencé? Et à quoi ressemblait la Terre à cette époque? La première question peut revêtir des aspects tant métaphysiques que physiologiques. Norman Pace (Pace, 1991; et site web de l'équipe de Norman Pace http://pacelab.berkeley.edu) répond qu'une forme est considérée comme vivante lorsqu'elle est autoréplicative et réalise une chimie organique sous une forme libre. Pour répondre à la seconde et à la troisième question nous disposons d'enregistrements astronomiques (formation des systèmes solaires et des planètes), d'enregistrements géologiques (fossiles, mesure d'isotopes, étude des roches, etc.) et d'enregistrements biologiques (la phylogénie moléculaire).

On considère que la Terre est apparue il y a 4,6 milliards d'années, mais il faut attendre encore 800 millions d'années avant que l'eau liquide apparaisse sur la terre créant ainsi des conditions compatibles avec la vie telle que nous l'imaginons. Les premières traces fossiles de micro-organismes datent de 3,6 milliards d'années1. Ce sont des tapis microbiens fossilisés connus sous le nom de stromatolites. On en retrouve encore en activité en Australie en Amérique et en Afrique dans des lagunes côtières où dans des sources chaudes. A la différence des stromatolites actuels colonisés par des cyanobactéries (aérobies) les premiers stromatolites devaient être constitués de phototrophes

1 Il existerait une trace plus ancienne de vie dans des roches prélevées au Groenland. Prélevées dans des sédiments vieux de 3,8 à 3,9 milliards d'années, des roches Isua présentent des rapport isotopiques 13C/12C laissant supposer une origine biologique.

45 Les habitats microbiens anaérobies, l'oxygène sous une forme libre étant apparu il y a 2 à 2,5 milliards d'années. Cette période correspond à une augmentation de la diversité morphologique des fossiles microbiens laissant supposer un accroissement de la diversité phylogénétique. Lorsque la vie est apparue, la Terre présentait des conditions qui nous sembleraient particulièrement inhospitalières. C'était un environnement très réducteur où les gaz principaux étaient le méthane, le dioxyde de carbone et l'azote. On retrouvait des traces de sulfures sous la forme H 2S et FeS. Lors du premier milliard d'années la température était alors très élevée (supérieure à 100°C). Ce n'est que lorsque la Terre a commencé à se refroidir (4 milliards d'années) que la vie a pu se développer (cf. figure 2.1).

°C 400 “océan magmatique”

300 Condensation de l’eau

Synthèses abiotiques 200

Synthèses biotiques 100

4,5 4 3,5 Temps en milliards d’années

Figure 2.1. Représentation schématique de l'évolution de la température à la surface de la Terre depuis sa formation.

On considère que les premières synthèses de macromolécules comme les acides nucléiques et les protéines se sont déroulées de manière abiotique sur des surfaces de roches ayant le rôle de catalyseur. La pyrite (FeS2) a probablement joué un rôle majeur dans ces synthèses où le rayonnement U.V. était la source principale d'énergie (très importante à l'époque du fait de la quasi absence d'atmosphère) (Wächtershäuser, 1988).

1.2 Une origine de la vie controversée

L'ensemble de la communauté scientifique semble s'accorder sur le type métabolique des premiers organismes vivant sur Terre. Il s'agirait d'organismes anaérobies chimiolithotrophes tirant leur énergie de la réduction du soufre (Pace, 1991; Stetter et al., 1996) ou plus probablement du fer (FeS ou FeCO3) (Slobodkin and Wiegel, 1997, Vargas et al., 1998), la source de carbone provenant de 2 molécules organiques abiotiques ou du CO2 atmosphérique. La température à laquelle la vie est apparue est quant à elle sujette à discussion. Les similitudes observées entre les sources hydrothermales et les conditions retrouvées sur Terre il y a 4 milliards d'années : milieu très réducteur et anoxique, forte teneur en soufre, en méthane et métaux lourds, températures élevées, ont conduit les scientifiques, au début des années 70, à

2 La voie d'assimilation du carbone par autotrophie étant un mécanisme complexe il est peu probable qu'il ait précédé l'hétérotrophie.

46 Les habitats microbiens considérer ces écosystèmes comme des lieux possibles d'émergence de la vie sur Terre (Corliss et al., 1981; Baross et Hoffman, 1985)

A la même époque Woese propose une division tripartite du monde vivant en créant le domaine des Archaebactéries (Woese, 1987) (devenant par la suite Archaea, Woese et al., 1990) qui ne regroupait alors que des micro-organismes aux préférendums vitaux extrêmes (très forte température, très forte salinité, production de méthane, réduction du soufre). Les branches basses de l'arbre du vivant étaient courtes (donc ayant peu évolué) et essentiellement occupées par des micro- organismes thermophiles (Bacteria: Aquificales, Thermotogales; Archaea: Crenarchaeota soufre- dépendantes, Thermococcales et méthanogènes thermophiles) (Stetter et al., 1996). L'émergence d'un concept de biosphère microbienne souterraine thermophile quelques années plus tard (Gold, 1992) abonda dans le sens d'une origine de la vie thermophile. Or cette proposition va à l'encontre de la théorie d'un monde à ARN. On considère que l'apparition de l'ARN a précédé celle de l'ADN (les ribonucléides avant les desoxyribonucléides). L'ARN jouait un rôle de stockage d'information et un rôle enzymatique. Il possède encore des capacités catalytiques qui lui permettent d'associer les acides aminés pour former les protéines (ribosyme). De plus s'il a été prouvé que l'ADN (pour peu qu'il soit super-enroulé) pouvait résister à de très fortes températures (Forterre, 1996; Forterre et al., 1996), l'ARN quant à lui, est très rapidement dénaturé à mesure que la température augmente. Il est donc peu probable que les premiers organismes (à ARN) aient pu supporter les très fortes températures que supportent les hyperthermophiles actuels3. De plus les phylogénies réalisées sur les ARNr ont été récemment remises en cause4. Ø La généralisation des séquençages génomiques permet d'accéder à de nombreuses séquences protéiques pouvant, au même titre que l'ARNr, servir de base à des phylogénies. Or si la majeure partie des arbres obtenus sont en accord avec une division tripartite du monde vivant (33 protéines sur 40), la monophylie de ces domaines est mise en cause dans 17 phylogénies sur 40 (Williams et Embley, 1996). Ce résultat soulève le problème de la représentation d'un arbre universel reflétant soit la majorité des arbres obtenus à partir de toutes les molécules, soit le résultat d'une phylogénie sur un ou plusieurs gènes clés (Doolittle, 1996; Doolittle et al., 1996). Ø Des phylogénies récentes placent Aquifex (la bactérie branchant le plus profondément sur l'arbre à ARNr) non plus à la base des Bacteria mais à proximité de Bacillus ou au sein des Archaea (Klenk, 1998; Pennisi, 1998).

3 L'instabilité de l'ARN est en partie liée à la présence de cytidine , qui représente le moins stable des 3 acides nucléiques. Il a donc été proposé que cet acide aminé pouvait être absent des premiers matériaux génétique (Levy et Miller, 1998), des liaisons A:U, G:U pouvant être suffisamment fortes pour maintenir la structure secondaire de la molécule. Il a de plus été démontré que l'activité d'un ribozyme était accrue lorsque celui ci était dépourvu de cytidine (Rogers et Joyce, 1999). Cet ARN primaire, stabilisé, dépourvu de cytidine pourrait être alors en accord avec une origine de la vie dans des conditions thermophiles. 4 La division du monde vivant en trois domaines telle que l'avait proposé Woese, a même été remise en cause récemment par Ernst Mayr (1998). Cet article a conduit à un échange très vif entre les deux protagonistes par journal interposé (Woese, 1998b). Pour sa part Gupta (1998 a, b et c) s'interroge sur les similitudes entre les Archaea et les Firmicutes et propose une nouvelle classification du monde vivant.

47 Les habitats microbiens

Ø Il semblerait que la position d'un micro-organisme sur un arbre soit très fortement liée à la vitesse à laquelle la molécule ayant servi à construire l'arbre a évolué. Cette fréquence mutationnelle varie au sein de la molécule et entre les organismes induisant des phénomènes d'attraction des branches longues5. Ces phénomènes perturbent particulièrement les analyses d'organismes "branchant profondément" sur les arbres phylogénétiques et qui sont sensés être les plus proches de l'état ancestral (Philippe et Laurent, 1998). Ø On a observé que les ARNr d'hyperthermophiles étaient riches en bases G et C. Or ces dernières forment des structures stables qui pourraient ralentir les mutations, raccourcir les branches et donc rapprocher les branches courtes (Galtier et Gouy, 1998; Galtier et al., 1999). Ø Enfin la détection de séquences de Crenarchaeota et d'Euryarchaeota (très probablement non thermophiles) au sein de nombreux environnements (sols, sédiments, eaux douce et eau de mer, symbiose avec des animaux, voir Olsen, 1994; Schleper, 1999) vient faire vaciller le dogme d'Archaea exclusivement cantonnées dans des environnements extrêmes. L'ensemble de ces informations présente la thermophilie comme un caractère dérivé, une adaptation à de nouvelles niches écologiques et remet en cause une origine thermophile de la vie sur terre. La nature de la première forme de vie sur terre est elle aussi discutée. Les phylogénies réalisées sur les ARNr ont permis de présenter un arbre de la vie non raciné, mais des études ont été entreprises afin d'enraciner cet arbre, à partir de travaux effectués sur les protéines codant pour les facteurs d'élongation, les ATPases et les ADN et ARN polymérases. Ces travaux présentent la racine de l'arbre entre la branche des Bacteria et celle des Eucarya-Archaea. Différents noms ont été proposés pour nommer l'organisme qui serait à la base de l'arbre : progénote, cenancestor, LUCA (Last Universal Common Ancestor). Les deux premiers termes ont le désavantage de donner une idée primitive de la biologie de cette entité6. Or il est tout à fait probable que cet organisme ait eu un métabolisme assez complexe, qui ait évolué en se simplifiant au cours des générations et de la conquête de nouveaux milieux. De plus, raisonner en terme de dernier organisme commun ne doit pas faire oublier qu'à l'origine les échanges génétiques et les fréquences de mutations devaient être très élevés, favorisant l'apparition de gènes paralogues et xénologues (Woese, 1998a). Le séquençage du génome de nombreux micro-organismes devrait fournir de nouveaux matériaux pour établir des relations phylogénétiques plus solides et avancer de nouvelles hypothèses sur la nature des premiers organismes ayant colonisé le globe.

Des trois compartiments de la biosphère, l'atmosphère constitue l'environnement le moins propice au développement d'une vie endémique. Il semble toutefois que les micro-organismes soient parvenus à coloniser ce milieu.

5 Les positions sur deux séquences ayant des fréquences de mutation très élevées peuvent s'avérer similaires par convergence sans que cette similitude reflète un caractère d'ancestralité (Felsentein, 1978). 6 Les termes employés pour la dénomination des domaines peuvent conduire à de faux raisonnements. Ainsi les Archaea ne sont pas essentiellement confinés dans des environnements extrêmes (proches des conditions ancestrales) et les "pro"caryotes possèdent des mécanismes aussi évolués que ceux des eucaryotes.

48 Les habitats microbiens

II. L'atmosphère

La présence de micro-organismes dans l'air a été mise en évidence par les expériences de Pasteur en 1864, mettant ainsi fin au concept de génération spontanée. Au sein de cet habitat inhospitalier les micro-organismes ne sont qu'en transit. En haute altitude, l'absence de nutriments, d'eau et les fortes irradiations (rayonnements U.V.) ne permettent pas le développement des micro- organismes7. Les organismes sont donc sous la forme de spores. Au fur et à mesure que l'on s'élève dans l'atmosphère la concentration en micro-organismes diminue. A l'échelle humaine les micro-organismes présents dans l'air ambiant, sous forme d'aérosols, sont responsables d'un grand nombre d'infections humaines, en particulier dans des environnements anthropiques clos, chauffés et humides comme ceux des hôpitaux. Ces infections peuvent aussi toucher d'autres organismes supérieurs tels que les plantes et les animaux domestiques. La teneur de l'air en micro-organismes, qu'ils soient sous une forme viable, viable mais non cultivable ou mort, est fonction de facteurs climatologiques (humidité, pluie, température) comme de facteurs liés à l'ensoleillement (saison, cycle nycthéméral) (Lighthart, 1997). Les techniques de culture classiques (Heidelberg et al., 1997; Shaffer et Lighthart, 1997; Reponen et al., 1998), comme les techniques de biologie moléculaire (Alvarez et al., 1995; Palmer et al., 1995; Pillai et al., 1996; Bartlett et al., 1997; Stärk et al., 1998) ont été mises à profit à de nombreuses reprises pour détecter les micro-organismes en suspension dans l'air. Il n'a s'agit toutefois que de détecter des micro-organismes généralement impliqués dans des infections humaines, et aucune étude ne s'est encore intéressée à la diversité totale des micro-organismes "aériens". Ce type d'étude est beaucoup plus commun au sein des habitats terrestres.

III. Les habitats terrestres

On distingue trois compartiments majeurs parmi les habitats terrestres : la couche superficielle du sol qui s'étend de la surface à quelques mètres de profondeur, la biosphère souterraine qui s'étend sur toute la lithosphère, et le cas particulier des réservoirs pétroliers. Chacune de ces niches abrite une communauté particulière de micro-organismes.

3.1 Les couches superficielles de la lithosphère

3.1.1 Description de l'habitat

Le sol abrite de fortes quantités de micro-organismes qui interviennent activement dans différents cycles géochimiques (C, N, S et métaux). La diversité microbienne y est fonction du type de sols étudiés (par exemple : elle est plus abondante dans la rhizosphère que dans des sols nus) mais

7 Certains chercheurs auraient proposé l'hypothèse que des micro-organismes pourraient se développer dans les nuages, là où la teneur en eau est plus élevée. Source : site du Microbe Zoo, Digital Learning Center for Microbial Ecology (http://commtechlab.msu.edu/sites/dlc-me). De plus des bactéries actives ont été détectées dans des gouttes d'eau de nuage à 3000 m d'altitude (Psenner et Sattler, 1998).

49 Les habitats microbiens elle s'étend dans toutes les niches où la vie est thermodynamiquement possible. La proportion de micro-organismes s’accroît à mesure que l'on s'éloigne de la surface du sol. A 10 cm de profondeur on estime retrouver 75 à 95% de la population totale microbienne du sol. Les micro-organismes procaryotes y côtoient des Eucarya. Par gramme de sol on retrouve 10 7 à 10 8 procaryotes, 10 5 champignons, 5.104 algues et 3.104 protozoaires (Madigan, 1996; Withman et al., 1998).

3.1.2 La rhizosphère

Au sein de la rhizosphère la diversité et la richesse microbienne sont très importantes. Les populations peuvent atteindre jusqu'à 109 individus par gramme de sol. Cette richesse est à attribuer aux relations qui s'établissent entre les plantes et les micro-organismes (Bally et al., 1999). Ø La plante excrète des sucres, des acides aminés et des vitamines qui permettent la croissance des micro-organismes alors que ces derniers produisent des hormones favorisant la croissance de la plante (auxine, indole, acide acétique ou des molécules "gibbereline-like"). Ø Certains micro-organismes de la rhizosphère permettent de lutter contre les pathogènes (bactéries et champignons) de la plante. Ø Les polysaccharides bactériens favorisent quant à eux l'agrégation du sol autour des racines (Amellal et al., 1998). Ø Enfin d'importants phénomènes symbiotiques sont observables, notamment chez les légumineuses où, au sein de bactériocystes, des Rhizobium permettent la fixation de l'azote atmosphérique par le végétal (Ferrera-Cerrato, 1980).

Les méthodes de culture classiques ont permis d'isoler essentiellement des micro-organismes associés aux genres Bacillus, Arthrobacter et Actinomycetes. Or les milieux de culture utilisés ne peuvent que difficilement recréer l'ensemble des interactions que les micro-organismes entretiennent avec le sol et les plantes. De plus les micro-organismes retrouvés en culture diffèrent de ceux observés in situ. Ces derniers semblent avoir une paroi plus complexe et une taille plus petite (ce qui les protégerait contre les contraintes hydriques et alimentaires).

3.1.3 L'apport des techniques moléculaires

Compte tenu de l'importance des micro-organismes tant au niveau des cycles géochimiques que de l'augmentation des rendements de cultures, de la production d'antibiotiques, et des mécanismes d'infection (par exemple Clostridium tetani ou Bacillus anthrax), de nombreuses études utilisant les techniques moléculaires ont été entreprises (Liesack et al., 1997; van Elsas et al., 1998; O'Donnel et Görres, 1999). Ces dernières ont révélé une diversité microbienne bien plus abondante que celle obtenue par les méthodes de cultures classiques et dont les représentants se répartissent dans toutes les branches (mésophiles) de l'arbre des bactéries (Torsvik et al., 1990a; Borneman et al., 1996).

50 Les habitats microbiens

La première étape à franchir dans le cadre de telles études, est l'extraction d'ADN à partir d'échantillons riches en matière humique et en substances susceptibles de fixer l'ADN telles que les argiles (Vettori et al., 1996). Un grand nombre d'articles décrivent et comparent l'efficacité de différentes méthodes d'extraction à partir de tels échantillons (Holben et al., 1988; Steffan et al., 1988; Pillai et al., 1991; Tsai et Olson, 1992 a et b; Moran et al., 1993; Ogram et al., 1995; Felske et al., 1996; Zhou et al., 1996; Jackson et al., 1997; Porteous et al., 1997; Abu Al-Soud et Rådström, 1998; Kuske et al., 1998). Les plus efficaces de ces techniques sont décrites dans la troisième partie de ce manuscrit. Une fois résolus les problèmes liés à l'extraction de l'ADN, la communauté microbienne au sein de différents types de sols a été analysée soit par séquençage direct des ADNr 16S, soit par hybridation à l'aide d'amorce domaine-spécifique. Le tableau 2.1 présente une liste non-exhaustive des différentes études réalisées sur les sols; chacune de ces études à contribué à la découverte de nouvelles séquences de micro-organismes proches de micro-organismes déjà isolés mais le plus souvent correspondant à de nouveaux phylums. Tableau 2.1. Etudes de la diversité microbienne des sols par des approches moléculaires Sols cultivés Autres types de sols Ø mise en évidence d'une nouvelle lignée de Crenarchaeota (Bintrin et al., Ø communautés rhizobiales (Khbaya et al., 1998; 1997; Buckley et al., 1998), Lafay et Burdon, 1998), Ø recherche des bactéries actives dans le sol (Christensen et al., 1999), Ø sols traités par des herbicides (elFantroussi et al., Ø étude sur des sols isolés de l’archipel Hawaiien (Nüsslein et Tiedje, 1999), 1998), Ø sols pollués par des hydrocarbures par la Ø approche de la diversité bactérienne très complète (séquençage, méthode d'hybridation génomique reverse (Shen et hybridation, DGGE) et quantification des espèces actives par RT-PCR al., 1998), (Felske et al., 1998a; Felske and. Akkermans, 1998a), Ø sols forestiers (Borneman et Triplett, 1997; Ø communauté des Archaea (Großkopf et al., 1998a et b) et des bactéries Jurgens et al., 1997; Widmer et al., 1999), oxydant le méthane (Henckel et al., 1999) se développant sur les racines Ø tourbières (Hales et al., 1996; Lloyd et al., 1998), de riz, Ø sols gelés, permafrosts (Shi et al. 1997), ou sols Ø une des premières études mettant en évidence la présence de de toundra (Zhou et al., 1997), nouvelles lignées de Planctomycetales (Liesack et Stackebrandt, 1992) Ø sols arides (Kuske et al., 1997; Dunbar et al., suivit des travaux de Stackebrandt et al. (1993), 1999), Ø communauté bactérienne des pâtures (Borneman et al., 1996; Lloyd- Ø sols hypersalés : Mer Morte (Arahal et al., 1996), Jones et Lau, 1998; McCaig et al., 1999) marais salants et marécages (Martínez-Murcia et Ø étude des méthanotrophes et des méthylotrophes dans des sols al., 1995; Nübel et al., 1999) anoxiques ou "fluchés" en CH4 (Øvreås et al., 1998), après culture Ø fumier et compost (Blanc et al., 1997; Kowalchuk d'enrichissement (Jensen et al., 1998), et al., 1999). Ø approche générale (Picard et al., 1992; Ueda et al., 1995; Lee et al., Ø sols pollués par le plomb et bactéries résistantes 1996b), associées (Konopka et Zakharova, 1999; Konopka et Ø approche de la diversité par analyse du G+C% et la réassociation de al., 1999) l'ADN génomique et par les méthodes de cultures classiques (Torsvik et al., 1990 a et b). D'autre part des recherches de plasmides susceptibles, par transfert horizontal, d'être vecteurs de résistance aux antibiotiques ont été réalisées en utilisant des techniques d'extraction directes sur différents échantillons de sols (Götz et al., 1996). Des techniques similaires ont été utilisées pour détecter des entérovirus dans des sols amendés par des boues actives (Straub et al., 1995). D'autres techniques s'attachent à amplifier ou hybrider spécifiquement certains types de micro- organismes à l'aide d'amorces et de sondes espèces- ou sous espèces- spécifiques, ou à rechercher des métabolismes ou des gènes impliqués dans des mécanismes de résistance (cf. tableau 2.2).

51 Les habitats microbiens

Tableau 2.2. Etudes de micro-organismes ou de métabolismes spécifiques Recherche d'une espèce spécifique Recherche d'un métabolisme ou d'une résistance Ø une espèce de Mycobacterium (Briglia et al., 1996), Ø la méthane monooxygénase (gènes mmo) et la méthanol Ø un Bacillus incultivable (Felske et al., 1998b; Felske, 1999) et deshydrogénase (gènes mxaF) des micro-organismes une souche associée aux Verucomicrobiales (Felske et méthanotrophes (McDonald et al., 1995; Henckel et al., 1999), Akkermans, 1998b) détectés en grande quantité par une étude de Ø le gène mcr des méthanogènes dans des échantillons de diversité générale, tourbières (Nercessian et al, 1999), Ø des Acidobacterium (Barns et al., 1999), Ø la nitrogénase réductase (gène nifH) (Widmer et al., 1999), Ø des Pseudomonas par une approche traditionnelle de culture et Ø sous unité a du gène codant pour la coenzyme M réductase d'amplification (Johnsen et al., 1999), (Hales et al., 1996), Ø des Leptothrix et des Sphaerotilus impliqués dans les processus Ø l'ammoniaque monooxygénase (gène amoA) (Rotthauwe et al., d'oxydation du fer et du manganèse (Siering et Ghiorse, 1997), 1997), Ø des Sphingomonas hybridés à l'aide d'une sonde spécifique et Ø la résistance au mercure (gène mer) (Bruce et al., 1992), quantifiés par cytométrie en flux (Thomas et al., 1997)., Ø la résistance au cadmium au cobalt et au zinc (Diels et Ø des Proteobacteria b oxydant l'ammoniaque genres Mergeay, 1990), Nitrosomonas et Nitrospira dans des sols cultivés (Stephen et Ø dégradation des PCB (polychlorinated biphenyl) (Walia et al., al., 1996, 1998) ou par DGGE dans des sables dunaires 1990). (Kowalchuk et al., 1997) ou dans des sols cultivés (Bruns et al., 1999), Ø des bactéries sulfato-réductrices dans le sol (Telang et al., 1994; Devereux et al., 1996) ou au niveau de la rhizosphère d'une plante colonisant les marais salants (Hines et al., 1999). On notera en particulier les études réalisées pour étudier les bactéries magnétotactiques dont la présence dans les sédiments fossiles est le témoin des variations du champ électromagnétique terrestre (Spring et al., 1992, 1998; Thornhill et al., 1995).

Si les micro-organismes colonisant les couches superficielles du sol ont fait l'objet de nombreuses études et ont même conduit à la création d'une discipline à part entière (la microbiologie des sols), les couches stratigraphiques plus profondes sont moins bien connues et les micro- organismes qui s'y développent ne sont étudiés que depuis récemment.

3.2 La biosphère souterraine

3.2.1 Description de l'habitat

L'habitat souterrain est défini comme celui compris au dessous de 8 mètres pour les habitats terrestres et en dessous de 10 cm pour les sédiments marins. En terme de volume c'est le plus gros habitat colonisable sur le globe. Il est constitué de roches magmatiques (basaltes, granites) et de roches sédimentaires (les argiles par exemple). La température et la pression y croissent à mesure que la profondeur augmente. On considère que la limite inférieure de colonisation de la lithosphère ne s'étend pas en dessous de 4 km où la température atteint 125°C et avoisine la température limite de la vie procaryotique (Whitman et al., 1998).

52 Les habitats microbiens

3.2.2 Le concept de biosphère souterraine

La notion de biosphère souterraine est née au début des années 90, en particulier grâce aux réflexions d'un astronome, Thomas Gold, qui le premier supposa qu'il pouvait exister dans la croûte terrestre (ou dans l'équivalent extra-terrestre) des conditions physico-chimiques pouvant permettre la vie de micro-organismes tout à fait indépendamment de la surface (Gold, 1992). On considérait jusqu'alors que les micro-organismes souterrains étaient essentiellement des chimioorganotrophes se développant très lentement en métabolisant les restes de matière organique qui s'infiltraient dans les couches stratigraphiques profondes (Arrage et al., 1993; Paul et al., 1995). Les études réalisées par la suite par des microbiologistes dans les environnements tels que les sources hydrothermales (Deming et Baross, 1993), les sédiments profonds (Parkes et al., 1994; Wellsbury et al., 1997) ou les puits de pétrole (Bernard et al., 1992, L'Haridon et al., 1995), ainsi que les travaux de Yayanos et al. (1981; Yayanos, 1995) sur les souches barophiles des fosses océaniques, permirent de confirmer en partie les hypothèses de Gold. D'une part les souches thermophiles isolées en profondeur avaient une pression optimale de croissance supérieure à la pression à laquelle elles avaient été récoltées (ce qui laissait supposer une origine plus profonde), d'autre part on retrouvait dans des environnements très éloignés géographiquement, mais tous proches de la lithosphère (réservoirs pétroliers et sources hydrothermales), les mêmes espèces de procaryotes, enfin les prélèvements effectués dans des sédiments marins profonds indiquaient la présence de micro-organismes jusqu'à 750 mètres de profondeur à des teneurs encore élevées (1,8.106 bactéries/g). Par ailleurs l'étude d'aquifères basaltiques profonds par des méthodes moléculaires et des méthodes de cultures classiques a indiqué la présence de micro-organismes chimiolithotrophes anaérobies (BSR, méthanogènes, homoacétogènes) (Kotelnikova et Pedersen, 1997; Kotelnikova et al., 1998, Motamedi et Pedersen, 1998) ou thermophiles (Szewzyk et al., 1994; Boone et al., 1995) dont le métabolisme (source de carbone et d'énergie) pourrait entièrement dériver de composés libérés par la lithosphère (Stevens et

McKinley, 1995). Ainsi H2 ne dériverait pas de la décomposition anoxique de la matière organique mais de la réaction de l'eau sur les basaltes et pourrait ainsi servir de donneur d'électrons dans des réactions

2- où interviendraient en tant qu'accepteurs le CO2 ou le SO4 présents sous une forme inorganique dans les couches profondes (cf. réactions ci dessous).

Production de H2 inorganique : 2FeO (basaltes) + H2O Õ H2 + Fe2O3

Méthanogenèse : 4H2 + CO2 Õ CH4 + 2H2O - + - Acétogenèse : 4H2 + 2HCO3 + H Õ CH3COO + 4H2O 2- + - Réduction des sulfates : 4H2 + SO4 + H Õ HS + 4H2O

Cette hypothèse a été réfutée récemment par Anderson et al. (1998) car selon eux la production de H2 au pH in situ (pH»8) ne peut être suffisante pour pouvoir soutenir la croissance chimiolithotrophique de toute la biomasse souterraine. Ils attribuent la croissance des micro- organismes à la matière organique emprisonnée dans les sédiments, ou apportée par l'eau des aquifères. Ils n'excluent toutefois pas la possibilité que cette croissance soit liée aux gaz réduits

53 Les habitats microbiens provenant de couches stratigraphiques inférieures et percolant au travers de la lithosphère, comme l'avait proposé Thomas Gold.

3.2.3 La communauté microbienne souterraine

Les micro-organismes se développant dans cette biosphère ne sont étudiés que depuis une quinzaine d'années. L'intérêt pour l'étude de la biosphère souterraine s'est accru dès lors que l'homme a dû trouver de nouveaux espaces pour enterrer des déchets. Il s'agissait particulièrement de se défaire des déchets ultimes radioactifs des centrales nucléaires. Cet enfouissement était réalisé dans des zones granitiques ou argileuses où les déchets pouvaient entrer en contact avec de l'eau d'aquifère. Ces eaux chargées en micro-organismes pouvaient accélérer la corrosion des contenants à déchets et favoriser la dispersion des radionucléides (Pedersen, 1996a; Santo Domingo et al., 1998a; White et al., 1998). D'autre part l'étude de la flore souterraine permettait de suivre la dégradation de polluants tels que les hydrocarbures ou les solvants chlorés (Dojka et al., 1998; Klier et al. 1999). De plus, on suppose que les micro-organismes interagissent avec les roches dans des processus de formation de minéraux (formation de silicates, de carbonates ou initiation de sites de nucléation des minéraux) comme dans des processus de dégradation (lixiviation) (Torsvik, 1997; Douglas et Beveridge, 1998; Fisk et al, 1998). L'intérêt pour ces micro-organismes s'est traduit par la mise en place de sections spécialisées dans l'étude de micro-organismes au sein des programmes de forages océaniques (Ocean Drilling P roject) et par la constitution (par le Departement of E nergy des Etats- Unis) d'une collection de souches isolées spécifiquement d'environnements souterrains (Stim, 1994; Reeves et al., 1996; Balkwill et al., 1997). Cette collection ayant été réalisée à partir de techniques de cultures traditionnelles, mettant en jeu des milieux de culture classiques pour hétérotrophes aérobies, les souches isolées ne pouvaient que partiellement rendre compte de l'entière diversité du milieu. Les études réalisées notamment par Pedersen sur des forages d'aquifères profonds ont quant à elles mis en évidence des séquences très diverses pouvant correspondre aussi bien à des souches aérobies qu'anaérobies. Elles se répartissent dans 11 branches du domaine bactérien et 5 nouvelles branches (Ekendahl et Pedersen., 1994; Pedersen et al., 1996 a, b, 1997). D'autre part, des représentants des Proteobacteria a , b, g, d et e, des Firmicutes à haut et bas G+C%, des Cytophagales (ex-C.F.B) ont été retrouvés à de nombreuses reprises dans différents gisements (Boivin-Jahns et al., 1996; Barns et Nierzwicki-Bauer, 1997; Chandler et al. 1997, 1998; Fry et al., 1997; Stroes-Gascoyne et al., 1997). Récemment Crozier et al. (1999) ont étudié les indices de biodiversité à partir des différentes séquences collectées sur le site Oklo par l'équipe de Pedersen. 5 sites ont été comparés et les résultats semblent indiquer que, dans aucune des études, l'ensemble de la population n'a pu être détecté (par clonage et séquençage). Les similitudes de population entre sites de prélèvement sont discutées en fonction de leur caractéristiques physiques.

54 Les habitats microbiens

Une étude a permis de comparer l'effet d'une pollution par des carburants sur la flore microbienne dans un aquifère à l'aide de sondes spécifiques (domaine, classe, phylum, etc.) et de réitérer cette expérience au laboratoire en fermenteur alimenté en nitrates (Shi et al., 1999) 8. La majeure partie des études réalisées dans de tels environnements a porté sur l'analyse de la diversité à l'aide du gène de l'ADNr 16S, mais quelques études ont porté sur l'analyse de la naphtalène dioxygénase (gène nahAc) (Herrick et al., 1993; Wilson et al., 1999). L'utilisation des techniques moléculaires a permis d'accroître considérablement nos connaissances sur la flore souterraine mais, comme dans tous les milieux où ces techniques ont été utilisées, un gros effort reste à réaliser pour améliorer les techniques d'échantillonnage (asepsie, pression), en particulier pour les sites profonds, ainsi que les techniques de culture (prise en compte des gaz disponibles sur le lieu d'échantillonnage, techniques d'enrichissement in situ).

3.2.4 Des profondeurs aux astres

Le concept de biosphère souterraine intéresse particulièrement les exobiologistes. Les

3+ observations de chimie microbienne à base de H2S, CO2, Fe (Vargas et al., 1998), de minéraux réducteurs, et en quasi absence d'eau liquide, permettent d'extrapoler cette chimie prébiotique à d'autres planètes du système solaire (ou à leurs satellites) où ces composés sont présents en grande quantité (Brack, 1999; Brack et Raulin, 1999). Il y a 20 ans alors que les premières sources hydrothermales étaient découvertes, la sonde Voyager mettait en évidence une activité volcanique sur deux satellites de Jupiter, Io et Gaymède. A la surface d'Europe (un autre satellite de Jupiter) il a été observé des plaques (de nature inconnue) qui se déplaceraient sur un fluide (liquide ou gazeux). Il y a de fortes présomptions pour que ces plaques soient des glaces d'eau qui se déplacent sur un océan d'eau liquide. Les mouvements des plaques sont à attribuer à des phénomènes de courants liés à une marée due à la force gravitationnelle de Jupiter ou à la présence d'un noyau chaud au centre du satellite. Si ce noyau existe il est probable que des phénomènes d'hydrothermalisme soient observables sur Europe. Aujourd'hui un programme spatial a été initié afin de prélever des échantillons sur ce satellite et rechercher des traces de vie à proximité de sites hydrothermaux (Delaney, 1998). La découverte (McKay et al., 1996) (contestée par Mc Coy, 1997) de formes associées à des micro-organismes dans la météorite martienne ALH84001, (bien que ces formes n'atteignent que 380 nm de long !?) a permis de relancer, en plus de nouveaux crédits pour la NASA, le concept d'une vie extraterrestre martienne (Carr, 1996; Farmer, 1996; McKay, 1997). Cette découverte ravive de plus l'idée qu'un fort bombardement météorique aurait pu initier la chimie prébiotique terrestre, c'est le concept de panspermie (Brack et Pillinger, 1998) ou au contraire supprimer toute forme de vie et induire la division tripartite du monde vivant (Gogarten-Boekels et al., 1995).

8 Une étude sur un environnement similaire a été réalisée par Bekins et al. (1999) en utilisant une approche culturale : NPP (MPN) et enrichissement de métabolismes spécifiques (méthanogènes, flore aérobie, flore fermentative, etc.). Rooney-Varga et al. (1999) ont analysé par amplification et séquençage la flore anaérobie associée à la dégradation des benzènes dans un aquifère contaminé.

55 1 2 3

1-Sédimentation de la matière organique 2-Recouvrement de la matière 3-Phénomènes géologiques de organique par des couches sableuses mouvements du terrain (tectonique) (jaune) et imperméables (vert)

4 5 6

4-Phénomènes géologiques de 5 et 6 Migration de l’huile (vert clair) du gaz (rouge) et de l’eau (bleu cyan) dans la transformation de la matière organique roche réservoir (jaune) jusqu’à atteindre la roche couverture (vert) sous l’effet de la pression et de la température (métamorphisme)

Figure 2.2. Mécanismes de formation du pétrole

images d’après le site Total (http://www.total.com) Les habitats microbiens

3.3 Les réservoirs pétroliers

3.3.1. Formation et production du pétrole

3.3.1.1 La formation du pétrole Le pétrole résulte de la transformation de la matière organique en hydrocarbures. Les débris végétaux ou animaux sont théoriquement dégradés par les micro-organismes, mais certains échappent à cette dégradation. Ils se déposent au fond des mers fermées, des lagunes, des lacs, des deltas ou d'autres milieux aquatiques pauvres en oxygène. Protégés de l'action des bactéries, les matières organiques se mélangent à des sédiments (sable, argile, sel...) et s'accumulent au fond des océans où ils sont recouverts par la suite d'autres sédiments plus jeunes. Par leur propre masse, ces couches sédimentaires s'enfoncent naturellement. Les mouvements tectoniques qui agitent la lithosphère les cassent, et les entraînent plus profondément dans l'écorce terrestre. Lors de cet enfouissement, pression et température s'accroissent jusqu'au point où ces débris se transforment en hydrocarbures et sont expulsés de leur matrice originelle. L'azote et l'oxygène sont éliminés pour ne laisser que des molécules formées de carbone et d'hydrogène qui constituent les hydrocarbures liquides et gazeux qui se retrouvent au sein d'une roche, appelée roche mère. Moins denses que l'eau, les hydrocarbures vont migrer vers la surface profitant de microcavités et de fissures du sol. Si rien ne les arrête, ils s'échappent et suintent à la surface ou bien se solidifient en bitume en perdant leurs constituants volatils. Mais si au cours de leur migration, les hydrocarbures rencontrent une couche imperméable qu'on nomme la couverture, ils seront bloqués par cette barrière rocheuse étanche. Piégés dans les interstices microscopiques et les fissures d'une roche dite roche réservoir, ils vont constituer le réservoir de pétrole (cf. figure 2.2).

3.3.1.2 L'exploitation et la production du pétrole Les premières traces d'utilisation du pétrole par d'homme datent de la haute antiquité, en Mésopotamie. Ramassé en surface, le pétrole servait alors dans des préparations médicinales, comme combustible d'éclairage ou pour étancher les bateaux (calfatage). Il faut attendre 1859 pour qu'en Pennsylvanie le "colonel" Drake initie les premiers forages pétroliers qui étaient alors de quelques mètres de profondeur (cf. figures 2.3 et 2.4).

Figure 2.3. Premier puits commercial Figure 2.4. Deux ans d'Edwin Drake, plus tard exploitation à Titusville, Run Creeks, Pennsylvanie, 1859 Pennsylvanie Images site du D.O.E. agence "fossile energy" : http://www.fe.doe.gov/ Actuellement les forages peuvent atteindre des profondeurs de plusieurs milliers de mètres. La première phase d'une exploitation passe par l'exploration du site. A l'aide de techniques sismiques, gravimétriques ou magnétométriques, des géologues et des géophysiciens définissent les propriétés

56 Les habitats microbiens physiques du sous sol et confirment la présence d'hydrocarbures. La mise en évidence directe s'opère par forage. La production consistera à récupérer les hydrocarbures. Ils remontent à la surface sous l'effet naturel de la pression dans le gisement. Cinq à 20% du pétrole est ainsi extrait. Afin d'accroître le taux de production des gisements, des techniques de récupération secondaire sont mises en place. L'une d'entre elle consiste à injecter de l'eau ou du gaz au fond des puits afin d'y exercer une pression. La récupération peut alors atteindre 35%. Pour récupérer le maximum des 65% restants, des techniques d'extraction tertiaires ont été mises au point. Elles consistent en des procédés complexes qui améliorent le drainage du pétrole : injection de vapeur, injection d'eau additionnée de produits chimiques, injection de gaz miscible, combustion in situ. (Sources : TOTAL http://www.total.com et ELF http://www.elf.fr). Lorsque l'extraction du pétrole devient moins rentable, les grosses sociétés pétrolières (ELF, TOTAL, EXXON) cèdent leur place à de petites sociétés qui se chargent de tarir la nappe en injectant plus d'eau lors de l'extraction.

3.3.2. Composition physico-chimique du biotope

Les micro-organismes que l'on peut s'attendre à trouver dans la nappe de pétrole se trouvent en réalité dans la phase aqueuse piégée avec l'huile et les gaz sous la roche couverture. Dans cette eau, appelée de production, les conditions physico-chimiques sont variables selon les puits analysés, mais elles sont généralement anoxiques et légèrement acides du fait de la dissolution du CO2 ou de l'H2S (pH entre 3 et 7). La température du puits est fonction de sa profondeur : à raison d'une augmentation de la température de 3°C tous les 100 m, la température de certains puits peut atteindre 130 à 150°C (généralement de 60 à 130°C, Beeder et al., 1994). Selon la profondeur du puits la pression au sein de la nappe va varier entre 150 et 400 bars. En outre la salinité des puits peut être très élevée. Celle-ci dépend de la salinité de la roche mère au sein de laquelle la nappe va

-1 être emprisonnée et peut varier entre 0 et 300 g.l de sels totaux (NaCl, MgCl2, KCl essentiellement) (pour revue Magot et al., 1999; Ravot, 1996). L'analyse des accepteurs et donneurs d'électrons potentiels dans la nappe de pétrole souffre d'un cruel manque de données. En effet les industriels ne collectent pas de façon routinière les données concernant par exemple le phosphore ou les nitrates. On estime toutefois que le potentiel redox des eaux de production est relativement bas et que des accepteurs comme l'oxygène, les nitrates et le fer ferrique sont généralement absents. Par contre la présence de sulfates et de carbonates laisse supposer que les métabolismes que l'on peut espérer rencontrer sont la sulfato- réduction, la méthanogenèse, l'acétogenèse et les fermentations. Les donneurs d'électrons sont quant à eux l'H2 d'origine biotique et abiotique ainsi que des molécules organiques. Les acides organiques comme l'acétate, le formate, le propionate et le butyrate sont souvent détectés dans les puits de pétrole, mais on détecte aussi des acides plus complexes. Si la dégradation aérobie de nombreuses molécules organiques présentes dans le pétrole a souvent été démontrée (n-alcanes et

57 Les habitats microbiens alkylbenzènes), ce n'est que très récemment que des preuves d'une potentielle dégradation anaérobie de ces composés ont été apportées (Ruetter et al., 1994; Connan et al., 1996; Heider et al., 1999; Zengler et al., 1999). De plus des composés comme les résines et les asphaltènes, structures riches en soufre, azote et oxygène, présentes en grandes quantités dans les huiles, pourraient servir de sources de carbone et d'énergie à des micro-organismes anaérobies (Magot, communication personnelle). Enfin la production anaérobie de l'hydrogène lors de la réaction de l'eau avec du basalte pourrait servir de donneur à des hydrogénotrophes tels que les micro-organismes méthanogènes, les sulfatoréducteurs et homoacétogènes (Stevens et McKinley, 1995) (voir §3.2.2).

3.3.3. La diversité microbienne des puits de pétrole

Même si la présence des micro-organismes dans les puits de pétrole a été établie depuis longtemps, c'est seulement depuis une dizaine d'années que les industries pétrolières ont pris en compte le rôle de ces micro-organismes dans la formation des huiles et les problèmes liés à la dégradation des systèmes d'extraction. La première étude de la flore microbienne associée aux puits de pétrole a mis en évidence des bactéries sulfato-réductrices (Bastin, 1926), et dès cette époque l'auteur s'est interrogé sur la nature endémique des souches étudiées. La microflore des gisements pétroliers est relativement peu diversifiée (Ravot, 1996). On retrouve principalement des micro- organismes anaérobies qui appartiennent aux deux règnes des Procaryotes : Archaea et Bacteria. On a cependant mis en évidence la présence d’organismes aérobies dont l'origine semble être exogène.

3.3.3.1 La colonisation exogène des gisements de pétrole L'étude de la flore des nappes de pétrole pose le délicat problème de l'origine des micro- organismes présents dans l'échantillon étudié. En effet, le mécanisme d'extraction du pétrole, notamment les techniques d'extraction secondaires et tertiaires, sont des sources non négligeables de contamination de la nappe de pétrole. ¬ L'eau injectée dans la nappe peut avoir diverses origines : Ø eau d'un réseau interne à l'entreprise de forage : injectée, récupérée, traitée et réinjectée, Ø eau de rivière ou de mer dans le cas d'exploitation "offshore", Ø eau de nappe phréatique adjacente à la nappe de pétrole, Ø eau de consommation courante lorsque qu'aucune nappe souterraine n'est proche du puits ou lorsque ce puits est trop éloigné du site de production pour être alimenté par un réseau d'eau interne. • La contamination peut aussi provenir du matériel utilisé. Les têtes de forage et les canalisations peuvent perturber la composition initiale de la nappe. La nature de ces dernières favorise particulièrement le développement de bactéries sulfato-réductrices (BSR) qui en se multipliant en biofilm autour des canalisations provoquent une dégradation accélérée des installations connue sous le terme de "pitting".

58 Les habitats microbiens

® Enfin, les micro-organismes présents dans les différentes couches stratigraphiques qui surmontent la nappe peuvent eux aussi contaminer l'eau de production. Dans les couches superficielles on retrouve des micro-organismes chimio-organotrophes se développant sur la matière organique présente en grande quantité dans le sol. Il s'agit de souches aérobies ou anaérobies qui interviennent dans les cycle de l'azote, du soufre et des métaux. Dans les couches plus profondes on retrouve une flore plus spécifique (voir § 3.2.).

Des études menées sur différents gisements ont indiqué que certains puits de pétrole étaient stériles. Ces gisements pouvaient être classés en trois catégories différentes : Ø Les puits dont la température dépassait 82°C, ce qui semble correspondre à la température pour laquelle aucune biodégradation des huiles n'a été observée (Philipi, 1977). Il faut toutefois noter qu'il a été possible d'isoler des micro-organismes thermophiles et hyperthermophiles ayant des optima de croissance supérieurs à 85°C dans les puits de pétrole terrestres et marins (Stetter et al., 1993; Jeanthon et al., 1995; L'Haridon et al., 1995; Ravot et al., 1995b). La température élevée des puits n'est donc pas un critère d'absence de micro-organismes. On estime toutefois que les gisements dont la température dépasse les 130 à 150°C (température fréquemment observée dans des puits profonds) sont stériles. Les processus indispensables à la "machinerie cellulaire" ne peuvent se dérouler convenablement à de telles températures. Ø Les puits dont la température est supérieure à 50°C mais dont la salinité était supérieure à celle de l'eau de mer (Bernard et al., 1992). Cette dernière donnée corrobore l'incapacité actuelle des microbiologistes à isoler des souches à la fois halophiles et thermophiles. Ø Enfin des gisements dont les caractéristiques physico-chimiques les rendraient favorables au développement de micro-organismes, mais dont le parcours géologique a porté ces gisements à des températures plus élevées que la température actuelle ce qui a eu pour effet de "stériliser" la nappe de pétrole (Bernard et al., 1992).

3.3.3.2 Les micro-organismes des gisements pétroliers Les techniques moléculaires n'ont été que très peu utilisées dans les réservoirs pétroliers comparativement à d'autres environnements. La majeure partie des études a été initiée par Gerrit Voordouw. Elles consistent en une étude par hybridation génomique inverse sur des cultures d'enrichissement et par séquençage des ADNr 16S (Voordouw et al., 1991, 1992, 1996; Leu et al., 1998). Les travaux de Voordouw et de Leu ont permis de détecter, en plus des BSR, la présence de micro-organismes aérobies ou anaérobies facultatifs semblables à ceux trouvés dans les eaux de surface (genres Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas). Mais il a été également possible de détecter (amplification de l'ADNr 16S) des micro-organismes associés aux genres microaérophiles : Oceanospirillum, Thiomicrospira et Campylobacter. Une souche nommée CVO associée aux Campylobacter a d'ailleurs été isolée par Voordouw et al. (1996) à partir de cultures d'enrichissement sur milieu pour Thiomicrospira denitrificans. Les Campylobacter et les Thiomicrospira pourraient trouver une niche de développement au sein de la nappe de pétrole dans des cavités micro-aérées de la

59 Les habitats microbiens roche mère et pourraient intervenir dans la réoxydation des sulfures (après réduction des sulfates par les BSR) en utilisant les nitrates ou les nitrites comme accepteurs d'électrons (Voordouw et al., 1996). Si ces micro-organismes peuvent être anaérobies facultatifs, leur caractère indigène peut être contestable : aussi considère-t-on plus sûrement comme indigènes des micro-organismes anaérobies. Parmi ceux-ci les micro-organismes sulfato-réducteurs, fermentaires ou homoacétogènes sont les plus fréquemment retrouvés dans les études de diversité par une approche classique de culture.

Les micro-organismes sulfato-réducteurs

Les micro-organismes sulfato-réducteurs représentent la grande majorité des micro- organismes endogènes aux gisements de pétrole. Ces organismes anaérobies stricts (du domaine

2- des Bacteria comme des Archaea) ont la particularité d'utiliser les ions sulfate SO4 comme accepteurs 2- d'électrons dans des oxydations génératrices d'ATP. Les ions SO4 sont réduits en plusieurs étapes métaboliques en soufre élémentaire (ions sulfure S2- en général) qui, lorsqu'il est libéré réagit avec les molécules d'H2O pour donner du sulfure d'hydrogène H2S en conditions acides, d'où la présence de ce gaz en très grandes quantités dans les réservoirs. Il a été prouvé également que ces bactéries ont la propriété de réguler leur environnement, c'est-à-dire le biofilm, par une diminution ou une augmentation de la consommation d'ions H+. On distingue parmi ces micro-organismes les mésophiles, impliqués dans la précipitation de sulfures de fer ou pitting (fer provenant des systèmes d'extraction) et les thermophiles impliqués dans les phénomènes d'acidification du réservoir. Le tableau 2.3 énumère les souches et genres sulfato-réducteurs couramment isolés dans les gisements pétroliers (d'après Magot et al. 1999).

Tableau 2.3. Micro-organismes sulfato-réducteurs isolés de réservoirs pétroliers.

Bacteria Archaea Sulfato réducteur mésophile Sulfato réducteur thermophile Sulfato réducteur hyperthermophile Genre Desulfovibrio Genre Desulfotomaculum Genre Archaeoglobus Desulfotomaculum halophilum Desulfacinum infernum Desulfomicrobium aspheronum Thermodesulforabdus novegicus Genre Desulfobacter Thermodesulfobacterium mobile

Les méthanogènes

Ces micro-organismes appartiennent exclusivement au domaine des Archaea. Ce sont des anaérobies stricts qui tirent leur énergie de la réduction du CO2 en oxydant H2 tout en produisant du méthane (CH4). La méthanogenèse n'a été que récemment décrite au sein des gisements pétroliers. Elle est souvent associée à des puits riches en sels. Jusqu'à présent seules des souches mésophiles ou thermophiles modérées ont été isolées de gisements pétroliers; aucune souche hyperthermophile n'a pu être isolée de gisements en raison de la teneur en sel trop élevée de ces derniers. Certaines souches méthanogènes sont capables de se développer sur d'autres composés en C1 plus réduits que le CO2, ce sont des méthanogènes méthyloclastiques. Elles se développent sur méthylamine

(CH3NH2), méthanol (CH3OH), diméthyl sulfures ((CH3)2S) (Madigan, 1996; Thauer, 1998). L'acétate

60 Les habitats microbiens

- (CH3COO ) présent à de très fortes concentrations dans certains puits pourrait lui aussi servir de substrat à certaines méthanogènes acétoclastiques soit directement, soit en syntrophie avec d'autres organismes acétoclastiques ou acétogènes. Parmi les souches méthanogènes isolées d'environnements pétroliers on retrouve des micro- organismes appartenant à l'ordre des Methanobacteriales, des Methanoccoccales, des Methanomicrobiales, des Methanosarcinales.

Les micro-organismes fermentaires

Les micro-organismes fermentaires sont des Archaea ou des Bacteria mésophiles, thermophiles ou hyperthermophiles hétérotrophes, c'est-à-dire qu'ils utilisent de la matière organique, comme les sucres ou les peptides, en tant que substrat énergétique en l'absence d'accepteur d'électron externe. Les bactéries mésophiles sont le plus souvent des halophiles modérées anaérobies et appartiennent au genre Haloanaerobium. Certaines de ces souches présentent un intérêt pour les industriels car en produisant des acides, des solvants et des gaz à partir des sucres elles pourraient participer à une augmentation du rendement d'extraction du pétrole (MEOR : microbial enhancement oil recovery). Magot et al. (1999) rapportent l'isolement de deux bactéries halophiles modérées appartenant aux genres Spirochaeta et Dethiosulfovibrio. Les techniques fondées sur l'étude des ADNr 16S par amplification sur des enrichissements ont quant à elles permis de détecter la présence de micro-organismes potentiellement anaérobies stricts ou facultatifs associés aux genres Clostridium, Eubacterium et Synergistes (Voordouw et al., 1996). Les bactéries thermophiles appartiennent généralement à l'ordre des Thermotogales pour lequel on retrouve dans les gisements, les genres Thermotoga, Geotoga et Petrotoga. Au sein de cet ordre le genre Thermotoga regroupe les seuls micro-organismes du domaine des Bacteria considérés comme hyperthermophiles. Il constitue une des branches phylogénétiques les plus ancestrales de ce domaine. Thermotoga, isolée et identifiée dans les gisements pétroliers, pourrait jouer un rôle dans les phénomènes de corrosion, en réduisant le thiosulfate en sulfures (Jeanthon et al., 1995; Ravot et al., 1995a). En effet la réduction du soufre interviendrait en tant que mécanisme de détoxication en oxydant H2 produit lors de la fermentation. D'autres familles ont également été identifiées dans des puits pétroliers comme les Thermoanaerobiaceae capables de réduire le thiosulfate en soufre (Thermoanaerobacterium) ou en sulfures (Thermoanaerobacter) (Grassia et al., 1996) et la souche Anaerobaculum thermoterrenum (Rees et al. 1997) capable de réduire le soufre et le thiosulfate. Des Archaea fermentaires ont, elles aussi, été identifiées au sein des gisements de pétrole (Stetter et al., 1993; L'Haridon et al., 1995). Elle appartiennent au genre Thermococcus et Pyrococcus. Leur caractère endémique a été discuté par Stetter (1993) mais leur capacité à réduire le soufre et le fer à température élevée en fait des candidats potentiels pour des phénomènes de biocorrosion (Magot et al. 1994; Grassia et al. 1996; Magot, 1996).

61 Les habitats microbiens

Les bactérie s homoacétogènes et les bactéries réductrices des métaux

Les bactéries homoacétogènes se caractérisent par une production exclusive d'acétate à partir de CO2 et de H2. En dehors des composés gazeux habituels H2 et CO2, elles peuvent réduire le CO2 à partir d'autres composés en C1 ou de sucres. A ce jour, peu de bactéries homoacétogènes ont été mises en évidence en milieu pétrolier (Acetobacterium romashkowii par Davydova-Charakhch'yan et al., 1992). Magot et al. (1999) rapportent dans leur revue l'isolement au sein de gisements pétroliers de micro-organismes bactériens capables de réduire le fer (Shewanella putrefaciens) ou le fer et le manganèse (Deferribacter thermophilus, Green et al., 1997). Le manque de données concernant le cycle de ces composés au sein du gisement ne nous permet pas de déterminer le rôle de ces micro- organismes au sein de la nappe. Il semble toutefois que les processus de réduction du Fe (III) soient très largement répartis dans le monde procaryotique en particulier au sein des genres thermophiles. Aussi de nombreux genres initialement décrits comme fermentatifs pourraient sous certaines conditions respirer en anaérobiose le fer ferrique (Slobodkin et Wiegel, 1997; Vargas et al., 1998; Slobodkin et al., 1999).

3.3.4 Activité microbienne liée aux hydrocarbures

Les techniques d'exploration et de production d'hydrocarbures bénéficient de nouvelles informations fournies par les études microbiologiques : les propriétés physiologiques des bactéries identifiées pourraient renseigner sur la température du milieu. Ces études peuvent aussi être un indice pour montrer la correspondance entre deux gisements, apparemment distincts, si la flore microbienne est similaire dans les deux puits. Un suivi régulier de la flore peut permettre de s'assurer de l'effet de certains biocides que les producteurs injectent dans les puits lors de l'extraction des huiles pour se défaire des BSR, ou dans les tanks pour limiter le développement des souches oxydant les hydrocarbures en présence d'O2. La détection de certaines bactéries peut également annoncer un risque majeur pendant la phase de production : la biocorrosion. Les BSR constituent le groupe majeur impliqué dans ce phénomène. La corrosion provoque des dégâts considérables sur le matériel, en particulier sur les pipelines. Mais la dégradation des hydrocarbures par des micro-organismes peut être aussi mise à profit dans le cas de catastrophes écologiques majeures telles que l'échouage de pétrolier ou la rupture de canalisations (Button et al., 1992). La décomposition des hydrocarbures est alors assurée par des bactéries aérobies, des algues ou des champignons (Swanell et al., 1996). Les hydrocarbures aliphatiques n'étant pas fermentables, leur dégradation se produit en présence d'O2 sous l'action de bactéries telles que des Pseudomonas, des Corynebacterium ou des Mycobactéries. Pour accélérer le développement de ces micro-organismes il est parfois nécessaire d'apporter des nutriments (azote et phosphore) sous forme de "spray" en surface de la zone à nettoyer. Les micro-organismes peuvent aussi produire des surfactants qui peuvent accélérer la dispersion des hydrocarbures dans le cas de

62 Les habitats microbiens pollution par des nappes de pétrole (Desai et Banat, 1997). Il est possible de suivre le développement et la présence de ces souches en amplifiant ou en hybridant spécifiquement les gènes impliqués dans le métabolisme de dégradation des hydrocarbures (Guo et al., 1997): xylE : cathécol 2,3-dioxygénase, tod : toluène dioxgénase, alkB : alcane hydroxylase, tmo : toluène monooxygénase, nahAcd : composant de la naphtalène dioxygénase. McNaughton et al. (1999) ont suivi, par mesure des profils lipidiques (PFLA) et DGGE (sur ADNr 16S), l'évolution des populations eucaryotiques et procaryotiques lors d'une pollution simulée aux hydrocarbures en eau de mer. Les deux techniques permettent de suivre la disparition des eucaryotes au profit de bactéries Gram - (Proteobacteria a et Cytophagales).

Il est à noter que certains micro-organismes eucaryotes produisent des hydrocarbures en C30 jusqu'à

C36. Cette "production microbienne" de pétrole est réalisée par l'algue verte Botryococcus braunii (Dennis et Kolattukudy, 1991; Madigan, 1996).

Si les premières études moléculaires des communautés microbiennes des sols s'attachaient surtout à décrire la formidable diversité procaryotique qui s'y développe, l'effort s'est désormais porté sur l'analyse de l'activité et la taille des différentes populations. L'ensemble de ces informations devrait permettre de mieux définir l'action de l'Homme dans cet environnement et notamment d'améliorer les pratiques agriculturales et les processus de dégradation des déchets.

IV. Habitats aquatiques

Au même titre que les habitats terrestres, on distingue trois habitats aquatiques physiquement et chimiquement différents : l'eau douce (rivière, lac), l'eau de mer et les estuaires qui constituent la frontière physique entre l'eau douce et l'eau de mer. Au sein de chaque habitat, de fortes variations physiques et chimiques vont avoir lieu entre la surface de l'eau, la colonne d'eau et le fond. Ces variations vont influer fortement sur la disponibilité en nutriments et donc sur la composition de la communauté microbienne. D'autre part l'analyse de cette communauté est confrontée au délicat problème de la nature endémique des souches isolées ou détectées. Au même titre que les études réalisées dans des environnements terrestres, les premières analyses effectuées sur des échantillons d'eau douce et d'eau de mer ont essentiellement permis d'isoler la flore aérobie, hétérotrophe, correspondant majoritairement à des bactéries Gram - (Bertrand et Larsen, 1988). Ces bactéries étaient en tout point semblables à celles obtenues à partir d'environnements terrestres et cette diversité apparemment limitée comparativement à la multitude de formes observées en comptage direct laissait présager d'un biais énorme dans les méthodes d'échantillonnage et de culture employées. L'utilisation des méthodes moléculaires ainsi que l'introduction de techniques plus fines d'observation (microscopie, cytométrie en flux) ont permis de révéler à quel point les milieux aquatiques pouvaient être plus riches et diversifiés que ce que les premières études culturales pouvaient laisser présager.

63 Les habitats microbiens

4.1 L'habitat d'eau douce

Au même titre que l'eau de mer, la composition microbiologique de l'eau douce des lacs et des rivières sera fonction de la disponibilité du milieu en oxygène et en matière organique. Dans les rivières et dans les lacs en hiver où on peut observer de très forts courants de fond, toute la masse d'eau va être brassée, oxygénée et alimentée en matière organique. Par contre au cours de l'été les couches d'eau superficielles chauffées par le soleil et donc moins denses vont se disposer au dessus des eaux plus froides et plus denses créant ainsi une stratification au sein de laquelle les micro-organismes aérobies vont coloniser préférentiellement les couches supérieures en consommant activement la matière organique. Les couches inférieures appauvries en oxygène vont être colonisées par les micro- organismes micro-aérophiles ou anaérobies. Au sein des rivières (même avec un fort courant) un apport massif de matière organique (rejet d'industrie, boues d'épuration) peut entraîner des conditions ponctuelles d'anaérobiose qui peuvent alors profondément perturber la composition de la communauté microbienne indigène. Différentes méthodologies moléculaires ont été mises à profit afin d'étudier la population totale microbienne : Øpar extraction des ARN à bas poids moléculaire (LMW RNA), électrophorèse et séquençage des bandes majoritaires à partir d'échantillons d'eau d'un lac eutrophe (Höfle et al., 1999). La comparaison des profils LMW RNA permet de suivre l'évolution des populations au cours de l'année. Ø Par amplification et séquençage de l'ADNr 16S d'échantillons d'eau d'un lac de montagne (Hiorns et al., 1997), Ø par amplification et DGGE sur des échantillons de différentes profondeurs d'un lac méromictique (Øvreås et al., 1997) et d'un fjord (Teske et al., 1996a), Ø par utilisation de sondes domaines- et phylum- spécifiques sur des échantillons de lac de montagne (Alfreider et al., 1996; Pernthaler et al, 1998; Tonolla et al., 1998), d'eau de Fjord (Ramsing et al., 1996), d'eau de rivière (Kenzaka et al., 1998), Il a été aussi possible de détecter des micro-organismes spécifiques tels que des bactéries sulfureuses pourpres associées aux Chromatiaceae dans la chémocline d'un lac suisse (Tonolla et al., 1999), et des bactéries ammonium oxydantes (Proteobacteria b) participant activement au cycle de l'azote dans les sédiments lacustres ou dans les eaux de surface. La présence de ces Proteobacteria était connue depuis longtemps mais elles étaient difficilement détectables par les techniques de culture classiques (Voytek et Ward, 1995; Hastings et al., 1998; Speksnijder et al., 1998). Une étude très complète a été réalisée par Priscu et al. (1998) afin d'analyser la diversité biologique au sein de lacs gelés en Antarctique. Au sein de cet environnement la température ne dépasse pas 0°C en été. Il est toutefois possible d'y observer une activité microbienne. Durant l'été, des poches d'eau liquide se créent à l'intérieur de la glace et des sédiments parviennent à atteindre ces poches d'eau. Ces "oasis" permettent alors la croissance de bactéries photoautotrophes (cyanobactéries) et hétérotrophes ainsi que de certaines algues (Priscu et al., 1998; Psenner et Sattler, 1999).

64 Les habitats microbiens

4.2 L'habitat maritime

4.2.1 Les micro-organismes marins isolés

Les écosystèmes marins peuvent être considérés comme des environnements stressants en raison de la salinité (3,5% soit 0,6M NaCl), de la pression (1 atm tous les 10 mètres; on considère que 90% des océans correspondent à des profondeurs supérieures à 1000 mètres), de la température (90% des océans sont à une température inférieure à 5°C). On distingue communément dans cet habitat deux zones principales : les océans et le littoral. Les océans sont pauvres en matière organique (oligotrophe) et étaient donc considérés jusqu'il y a peu comme pauvres en producteurs primaires, sauf lorsque certains courants permettent à des nutriments de profondeur de passer en surface comme au large du Pérou et de la Californie. Les côtes océaniques quant à elles sont des régions riches en matières organiques (eutrophe), donc riches en producteurs primaires et riches en poissons et en coquillages. Les premières études réalisées à l'aide de techniques de culture classiques confirmèrent ces hypothèses. Les bactéries isolées en haute mer (Oceanospirillum, Vibrio, Photobacterium et Alteromonas) correspondaient à des micro-organismes hétérotrophes présents en très faibles quantités (102 à 10 5 organismes/l). L'amélioration des techniques de microscopie a permis au début des années 80 de mettre en évidence au milieu des océans une diversité microbienne jusque là insoupçonnée. Dans un premier temps des équipes américaines ont mis en évidence une abondante colonisation des eaux de haute mer par des Cyanobactéries associées au genre Synechococcus. Par la suite les techniques de cytométrie en flux permirent d'isoler le plus petit et le plus abondant des micro-organismes photosynthétiques connus : Prochlorococcus. Ces deux micro-organismes cohabitent dans les océans en colonisant des zones concomitantes. Alors que les Synechococcus colonisent les eaux de surface bien éclairées et sont présents dans tous les océans aussi bien oligotrophes qu'eutrophes, les Prochlorococcus colonisent des zones plus oligotrophes et sont retrouvés à des profondeurs plus importantes (pour revue Madigan, 1996; Blanchot et al., 1998; Partensky et al, 1999).

4.2.2 L'utilisation des techniques moléculaires

4.2.2.1 Le bactérioplancton océanique et côtier Les techniques moléculaires basées sur l'identification directe des gènes codants pour l'ARNr 16S furent appliquées très rapidement aux échantillons d'eau de haute mer. L'une des premières études a consisté à comparer plusieurs échantillons d'eau de mer par hybridation de l'ADN génomique total extrait (Lee et Fuhrrman, 1990). Chaque échantillon servait successivement de sonde et de cible. Il était alors possible de déterminer des similitudes entre les échantillons mais la diversité de ces derniers était encore inaccessible. Après la mise au point d'une technique d'échantillonnage permettant de filtrer de très grandes quantités d'eau de mer (Giovanonni et al., 1990a), les travaux de l'équipe de Giovanonni et de DeLong (Giovanonni et al., 1990b; Britschgi et Giovannini, 1991; Schmidt et al., 1991) permirent de confirmer la présence d'une part (pour la moitié de la banque) de

65 Les habitats microbiens séquences associées aux Cyanobactéries (Synechococcus et Prochlorococcus, ces derniers n'étaient alors pas décrits) et d'autre part de séquences associées aux Proteobacteria communément isolées (Alteromonas, Vibrio, Pseudomonas pour les Proteobacteria g et Caulobacter pour les Proteobacteria a ), ou ne correspondant à aucun genre connu (clade SAR11). Par la suite des travaux réalisés sur de nouveaux sites permirent de confirmer l'ubiquité des séquences précédemment décrites comme le clade SAR11 mais aussi la présence de séquences associées aux Firmicutes à haut G+C%, aux Flavobactéries (Fuhrman et al., 1993), aux bactéries vertes non-sulfureuses (Giovannoni et al., 1996). Récemment une étude plus approfondie des séquences proches des Actinobacteria a confirmé l'existence d'un clade de séquences marines provenant d'échantillons côtiers et hauturiers sur les océans Pacifique et Atlantique (Rappé et al., 1999). Des études similaires ont été réalisées à partir des séquences proches des Proteobacteria a associées au clade SAR11 (Fields et al., 1997), de la sous-classe 3 des Proteobacteria a 9 (Gonzalez et Moran, 1997) et des bactéries sulfureuses vertes associées au clade SAR 406 (Gordon et Giovannoni, 1996). Des études menées par une équipe espagnole en Méditerranée permirent dans un premier temps de suivre les variations de la diversité microbienne de différents échantillons (formes libres et attachées, variations de profondeur, variations temporales) ceci par une étude uniquement fondée sur l'analyse des profils RFLP (Acinas et al, 1997) puis par séquençage des profils majeurs associés aux formes libres et attachées (Acinas et al, 1999). L'approche suivie par Giuliano et al. (1999) sur des échantillons de surface et profonds de Méditerranée consiste en une première étape d'isolement par dilutions successives suivie d'une analyse des séquences d'ARNr 16S présentes dans la dernière dilution. Cette technique conduit à l'identification de séquences proches des Proteobacteria g et a et des Cytophagales mais elle ne permet l'analyse que des micro-organismes majoritaires de l'échantillon. Des études similaires ont été réalisées sur les micro-organismes associés aux neiges marines révélant là encore une grande diversité de séquences se répartissant au sein de nombreux groupes bactériens mais apparemment différents de ceux trouvés sous une forme libre dans la colonne d'eau environnante (DeLong et al., 1993). On a retrouvé des séquences associées aux Proteobacteria (a , g, d, e), aux Cytophagales, aux Planctomycetales, aux Verucomicrobiales (DeLong et al., 1993; Rath et al., 1998). Une comparaison de la diversité bactérienne existant sous une forme libre ou sous une forme associée avec des particules a été réalisée par extraction de l'ADN et séquençage de l'ARNr 16S le long de la rivière Columbia (Crump et al., 1999). Les auteurs ont comparé des prélèvements dans la rivière, dans l'estuaire et sur la côte et ont observé une plus grande diversité phylogénétique au niveau de l'estuaire. Une des premières études réalisées sur des sites côtiers a été effectuée dans deux lagunes françaises en baie d'Arcachon et dans une zone saumâtre près de Palavas (Benlloch et al., 1995). Cette étude complète (comptage, mesure du métabolisme et séquençage) mettait en évidence une diversité bactérienne plus importante dans l'échantillon eutrophe (Méditerranée) et une grande diversité de micro-organismes majoritairement associés aux Cytophagales et aux Proteobacteria a . Les

9 Il a été possible d'isoler des représentants de ce clade préalablement détectés par séquençage.

66 Les habitats microbiens analyses phylogéniques de cette étude souffrent toutefois de la faible longueur d'ADNr 16S séquencé (210 pb). L'étude effectuée sur des échantillons provenant de la côte Est des Etats-Unis révèle encore une fois la prédominance des séquences associées aux Proteobacteria a et g (75% de la banque bactérienne de séquences) (Rappé et al., 1997). Par contre les eaux côtières se distinguent des eaux du large par la présence de séquences associées aux Proteobacteria b (notamment associées au méthylotrophes), l'absence de cyanobactéries et l'abondance de séquences plastidiales (expliquée par l'absence de filtration de l'échantillon et l'abondante biomasse d'eucaryotes dans les environnements côtiers). On note aussi la présence de Cytophagales, d'Actinobacteria et de Planctomyces comme dans les études précédentes. L'emploi de la DGGE a permis de comparer la composition du bactérioplancton sur deux estuaires de la côte Californienne (Murray et al., 1996). Il a été ainsi possible de relier la variation de types métaboliques détectés par des techniques classiques d'incorporation de radioisotopes à des variations de phylotypes. L'étude réalisée par Suzuki et al. (1997) est particulièrement intéressante car elle compare les résultats d'une analyse directe des gènes codants pour l'ARNr 16S par séquençage et RFLP à ceux obtenus après culture d'enrichissement sur milieu solide pour hétérotrophes marins. Si les Proteobacteria a et g sont bien les phylums les plus représentés dans les deux banques de séquences, seules 4 séquences d'isolats (sur 127) sont retrouvées dans la banque environnementale. De plus la diversité des séquences est plus grande dans la banque de clones environnementaux que dans la banque d'isolats. Cette étude nous permet d'observer à la fois le biais engendré par les techniques de culture classiques (la plupart des micro-organismes ne sont pas présents sous une forme cultivable) comme celui engendré par les techniques d'amplification (l'ensemble des micro-organismes présents dans l'échantillon n'a pas été détecté, soit il n'a pas été amplifié, soit l'effort d'échantillonnage était trop important pour le détecter). Enfin on peut citer l'étude réalisée sur un mésocosme constitué d'eau de mer méditerranéenne rendue eutrophe par addition d'azote et de phosphore (Pukall et al., 1999). Les auteurs comparent les résultats obtenus par extraction directe de l'ADN et séquençage des ADNr 16S à ceux obtenus par isolement après dilutions successives. Parmi les 739 clones analysés (96 clones séquencés - le reste est discriminé par dot-blot) et les 128 souches isolées, les séquences associées à Alteromonas macleodii prédominent largement dans les deux banques. Les auteurs s'interrogent alors sur la très forte micro-variabilité de séquence qu'ils n'attribuent pas uniquement à un grand nombre d'opérons rrn dans cette souche mais à un possible mécanisme adaptatif.

Les études moléculaires des communautés bactériennes de l'eau mer ont confirmé que les techniques culturales n'avaient permis d'accéder qu'à une très faible part de la diversité. Si on retrouve toujours les même grands groupes bactériens (Proteobacteria a et g, Cytophagales) de nouveaux phyllums sont apparus à proximité ou au sein de ces groupes. On peut considérer toutefois que l'un des apports majeurs de l'approche moléculaire dans l'étude des communautés microbiennes marines a été la découverte, en grande quantité et de manière ubiquitaire, de deux grands groupes d'Archaea

67 Les habitats microbiens rattachés aux Euryarchaeota et aux Crenarchaeota visiblement non associées à des conditions physico-chimiques extrêmes.

4.2.2.1 L'archaeoplancton océanique et côtier En 1992, à quelques mois d'intervalle, Fuhrman et al. (1992) et DeLong (1992) détectent dans des eaux prélevées à 100 et 500 m de profondeur dans l'océan Pacifique (Fuhrman) et dans les eaux côtières d'Amérique du Nord (DeLong) des séquences de micro-organismes branchant profondément à la base des Crenarchaeota (Marine Group I - DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1992; Fuhrman et al., 1993) et des séquences associées aux Euryarchaeota mais formant là encore un clade bien distinct (Marine Group II - DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1993). Leur abondance semble indiquer qu'elles interviennent activement dans les cycles chimiques océaniques et ne correspondraient donc pas à des micro-organismes au métabolisme thermophile ou halophile comme le sont leur plus proches "voisins" isolés. De plus le G+C% de leur ADNr (I : 0,51, II : 0,55-0,57) est inférieur à celui observé pour des souches thermophiles (entre 0,60 et 0,69). DeLong propose alors que ces Archaea pourraient correspondre soit à des méthanogènes soit à des Archaea mésophiles, aérobies10. Par la suite l'analyse d'échantillons provenant d'eau de surface de l'Antarctique (DeLong et al., 1994) a confirmé l'abondance des Archaea dans le picoplancton marin (jusque 34% de la biomasse procaryotique). Ensuite des séquences associées au groupe I furent détectées dans l'estomac d'une Holoturie (Mc Inerney et al., 1995), parmi les symbiotes d'une éponge (Preston et al., 1996) et parmi d'autres échantillons de bactérioplancton (Stein et al., 1996; McInerney, 1997). Des séquences associées au groupe II ont été détectées dans l'estomac de poissons (van der Maarel et al., 1998). L'approche utilisée par Stein est particulièrement séduisante quoique fastidieuse. Elle consiste à cloner non pas un produit d'amplification mais des fragments génomiques extraits de l'environnement. On dispose donc à la fois de l'information phylogénétique en recherchant dans la banque de fosmides les gènes codants pour l'ARNr 16S11 et d'informations sur le métabolisme en analysant les autres gènes contenus dans la banque. Il faut toutefois garder à l'esprit que les gènes clonés ne sont pas forcément exprimés. Enfin l'étude réalisée par l'équipe de DeLong à l'aide de sondes nucléiques spécifiques des groupes I et II semble indiquer une zonation dans la colonisation de la colonne d'eau. Le groupe I serait dominant en profondeur alors que le groupe II proliférerait en surface (Massana et al., 1997). La détection de nouvelles Crenarchaeota dans des échantillons de sol (Bintrim et al., 1997), d'un champ de soja (Ueda et al., 1995), de sources chaudes terrestres (Barns et al., 1994) et marines (Takai et Sako, 1999) et de sédiments lacustres (MacGregor et al., 1997), ainsi que les séquences d'Archaea associées au groupe II détectées avec d'autres Euryarchaeota (proches des

10 Une étude réalisée sur les éthers lipidiques présents dans la colonne d'eau associe ces derniers à des Archaea mais leur nature les distingue clairement des méthanogènes (Hoefs et al., 1997 dans Vetriani et al, 1998). Les Crenarchaeota non thermophiles restent la source principale de tétraéthers lipidiques dans les échantillons de plancton marin (DeLong et al., 1998). Des Archaea méthanogènes ont toutefois été détectées dans des échantillons d'eau de mer, associées à des particules ou dans l'estomac de poissons (van der Maarel et al., 1999) 11 Un "screening" plus complet de banque fosmidique a permis par la suite de détecter des séquences de clones associées aux Panctonomycetales (Vergin et al., 1998).

68 Les habitats microbiens

Methanosarcinales et des Halophiles) dans des sédiments de marais salants (Munson et al., 1997) et sur des racines de riz (Großkopf et al., 1998b) nous amène à considérer ces "nouveaux" micro- organismes comme les Archaea les plus représentées à la surface du globe (Olsen, 1994; Schleper, 1999)12.

4.2.3 Les fosses océaniques

Les fosses océaniques constituent des environnements particulièrement atypiques. En plus de supporter des températures basses (2°C) les micro-organismes (bien souvent psychrophiles) se développant dans de tels environnements (jusqu'à 10000 mètres de profondeur) doivent supporter de très fortes pressions. On retrouve donc jusqu'à 4000 mètres de profondeur des micro-organismes barotolérants, entre 5000 et 6000 mètres de profondeur des micro-organismes barophiles et des barophiles stricts à des profondeurs avoisinants les 10000 mètres, nécessitant pour certains 700 bars de pression minimale pour se développer (Yayanos et al., 1981; Nogi et Kato, 1999). Très peu d'études à ce jour ont mis à profit les méthodes moléculaires pour analyser les échantillons provenant de fosses océaniques. Seuls les travaux de Kato et al. (1997) et de Yanagibayashi et al. (1999) associant les extractions directes et les techniques de culture en pression et sans pression suivies d'extraction font référence. Récemment Li et al. (1999) ont comparé après extraction de l'ADN total et séquençage la composition de sédiments abyssaux prélevés à différentes profondeurs (entre 1159 m et 6482 m de profondeur). Ils n'ont pas observé de différences majeures entre les échantillons dominés, pour la plupart, par des séquences proches de Pseudomonas, du symbiote de Solemya velum ou des Proteobacteria e.

4.3 Les zones sédimentaires marines et lacustres

4.3.1 Description du biotope

Interfaces entre le milieux terrestre et le milieu aquatique, entre des zones aérobies et anaérobies, les sédiments sont le siège d'importants processus biogéochimiques impliquant les principaux cycles de matière (N, C, S, O). La disponibilité de ces différents constituants dans la couche de sédiments ainsi que les échanges de matières réalisés avec l'eau vont entraîner une forte zonation des micro-organismes présents dans les sédiments en fonction de leur type métabolique et de leur préférendum (cf. figure 2.5).

12 Des études similaires à celles effectuées sur les Procaryotes ont été entreprises sur les picoeucaryotes océaniques. En effet la taille de ces organismes ainsi que la difficulté à les obtenir en culture ou à maintenir les cultures pures ont favorisé l'emploi de méthodologies moléculaires pour accéder à la diversité eucaryotique de certains échantillons (Lim, 1996; Guillou, 1999). L'une des techniques consiste à analyser les ADNr 16S plastidiaux contenus dans les banques de séquences (Rappé et al., 1998). Les ADNr plastidiaux constituent dans cette étude près de 47% de la banque bactérienne.

69 Les habitats microbiens

En dehors des sédiments abyssaux qui sont aérés sur plusieurs mètres, les sédiments présentent une couche oxygénée très fine et donc une succession de types respiratoires microbiens très rapide. On a donc affaire à des micro-organismes réalisant des respirations aérobies sur les toutes premières couches de sédiments puis plus profondément des bactéries fermentaires ou des bactéries réalisant des respirations anaérobies en utilisant les nitrates (bactéries dénitrifiantes), les sulfates (bactéries sulfato-réductrices) ou les carbonates (bactéries méthanogènes). De la même façon un gradient s'établit entre les bactéries aérobies, anaérobies facultatives, microaérophiles et anaérobies strictes. La disponibilité de la matière organique va conditionner quant à elle la présence de micro- organismes hétérotrophes et chimio-autotrophes alors que le rayonnement lumineux à la surface du sédiment va favoriser la présence de photoautotrophes.

Les techniques de culture classiques

AIR ont conduit à l'isolement de nombreux genres

Accepteurs terminaux d’électrons bactériens associés aux différents types métaboliques décrits précédemment. Parmi EAU O2

Respiration aérobie Bactéries aérobies les plus spectaculaires on peut citer ZONE AEROBIE O2 H2O S Bactéries Bactéries Fermentation fermentatives + sulfo-oxydantes Thiomargarita namibiensis, une bactérie sulfo- H2S

NO 3- NO3- Respiration nitrate Bactéries dénitrifiantes oxydante accumulant les nitrates dans une N2

SO42- grande vésicule qui permet à cet organisme 2- Respiration sulfate Bactéries SO4 sulfato-réductrices H2S d'atteindre 750 µm de diamètre (Schlulz et al.,

HCO3-

SEDIMENT HCO3- Methanogénèse Bactéries méthanogènes 1999). C'est à ce jour le plus gros Procaryote CH4 ZONE ANOXiQUE connu. Dans ces zones où l'oxygène et l'H2S coexistent sous forme de gradient (stables ou Figure 2.5. Représentation schématique des populations bactériennes dans les couches de sédiments (d'après Marty et al., versatiles en raison des courants, de la marée, 1988). des pluies qui remettent les sédiments en suspension) on peut observer des micro-organismes accumulant le soufre sous forme de granules internes Thioplaca ou Beggiatoa (Jørgensen et Gallardo, 1999; Teske et al., 1999) ou sous forme de très longs filaments externes créant de véritables réseaux "mycéliens" dans les gradients d'O2 et d'H2S (Taylor et Wirsen, 1997; Taylor et al., 1999).

4.3.2 Les techniques moléculaires

L'application des techniques moléculaires a contribué à accroître le nombre d'espèces détectées dans cet environnement. Comme pour les études de sols, le problème principal a été l'extraction d'ADN des échantillons de sédiments. Dès 1992 Rochelle et al. proposent des techniques d'extraction couplées à des amplifications à partir d'échantillons de différentes profondeurs. Par la suite, les travaux d'extraction d'ADN à partir d'échantillons de sols (cités § 3.1.3) servirent de référence.

70 Les habitats microbiens

Compte tenu du rôle des bactéries sulfato-réductrices dans les mécanismes de production d'H2S dans les sédiments, ces dernières ont été couramment étudiées: soit après extraction de l'ADN total de l'échantillon et amplification à l'aide d'amorce spécifique des BSR affiliées aux Proteobacteria d (Devereux et Mundfrom, 1994), soit après extraction et détection à l'aide de sondes spécifiques de ces mêmes BSR (Trimmer et al., 1997). Une étude récente réalisée sur des échantillons de sédiments lacustres côtiers et profonds s'est attachée à étudier les BSR après isolement, séquençage de l'ADNr 16S et empreinte génomique ("genomic fingerprints") (Sass et al., 1998). Les auteurs ont ainsi observé que même si leur souches correspondaient majoritairement (70%) au même genre (Desulfovibrio) et présentaient de très fortes similarités d'ADNr 16S, leur contenu génomique, et donc leur capacité physiologique, étaient très variables. Ce résultat permettrait d'attribuer l'hypervariabilité de séquences de phénotypes proches à des souches ayant des rôles métaboliques distincts. Des études s'intéressant à la diversité globale de l'échantillon ont été aussi réalisées : Ø sur des échantillons de sédiments côtiers près de Seattle (Etats-Unis) où malgré le peu de clones analysés (22 essentiellement bactériens) les auteurs observent une grande diversité phylogénétique dans leur échantillon (Gray et Herwig, 1996). L'étude réalisée par Wise et al. (1997) sur des échantillons prélevés dans une baie en Caroline (Etats-Unis) avec peu de clones (35 clones bactériens) démontre encore cette très grande diversité. Ø sur des échantillons marins provenant de sédiments sableux et boueux (Mer de Wadden en Allemagne) hybridés à l'aide d'un grand nombre de sondes sur différentes profondeurs (Llobet- Brossa et al., 1998)13. Un des points marquants de cette étude est la détection de séquences associées aux Proteobacteria e proches du genre Arcobacter. Ø sur des sédiments coquilliers continentaux où Vetriani et al. (1998) détectent pour la première fois dans ce biotope des séquences associées aux Archaea pélagiques proches du groupe I et d'autres proches du groupe II. Puis sur des sédiments profonds où ces séquences sont de nouveau détectées (Vetriani et al., 1999) Ø des séquences similaires sont détectées (Crenarchaeota groupe II et méthanogènes) dans des sédiments d'un lac du Michigan (Etats-Unis) (MacGregor et al., 1997; Schleper et al., 1997a). Les séquences crearchaéennes semblent être plus abondantes dans la zone oxique du sédiment où elles n'interviennent toutefois que pour 10% de l'ensemble des ARN archaéens. Ø sur des sédiments lacustres d'origine postglaciaire sur lesquels une étude complète a été entreprise (comptage total, comptage de bactéries viables, culture, extraction et séquençage) (Miskin et al., 1998). Les 14 clones bactériens se répartissent parmi les Firmicutes à haut et bas G+C% et parmi les Proteobacteria b et d, et 9 clones archaéens sont quant à eux associés aux méthanogènes. Ø enfin sur des sédiments lacustres datés de plus de 9000 ans où des séquences associées aux bactéries pourpres sulfureuses sont détectées (à l'aide d'amorces genre-spécifique : Chromatium) et analysées par DGGE et séquençage (Coolen et Overmann, 1998).

13 Cette étude a été suivie d'une analyse plus poussée concernant les Proteobacteria g soufre oxydantes du genre Thiomicrospira, par comptage, culture, amplification et DGGE (Brinkhoff et al., 1998).

71 Les habitats microbiens

D'une manière similaire aux études menées à partir d'échantillons de sols, la diversité microbienne associée au sédiments marins ou lacustres s'avère être très importante. La part que prennent chacun des groupes phylogénétiques détectés dans les processus géochimiques reste malgré tout encore à définir. Si extraordinaire que semble être la découverte de nouveaux phylums archaéens ou bactériens, il ne semble pas que ceux-ci interviennent de manière prépondérante dans les communautés. Les études sont donc à poursuivre en s'attachant a définir les rôles que chaque micro-organisme détecté peut tenir dans le biotope étudié.

4.4 Les sources hydrothermales océaniques profondes

Les mouvements de la croûte terrestre (ou tectonique des plaques) ont généré à la surface du globe des zones d'anfractuosités où de l'eau (de mer ou douce) entre parfois en contact avec le magma profond (cf. figure 2.6).

Figure 2.6. Représentation des zones d'accrétion et de subduction. De droite à gauche : création de la lithosphère au niveau de la dorsale médio océanique. La surface du bassin océanique s'accroît alors que sur la gauche la plaque plus ancienne glisse sous une marge passive continentale. Cette subduction est accompagnée de la création d'une faille profonde et l'accroissement de température sur cette zone de friction crée un arc volcanique (par exemple les îles japonaises) et une nouvelle zone d'accrétion dans le bassin arrière arc (d'après Press, F. et Siever, R. (1978) Earth (second edition). W.H. Freeman, San Francisco). Ces zones sont le siège de phénomènes hydrothermaux. Chargée en métaux, l'eau émerge soit au niveau de sites océaniques profonds, de sites marins côtiers ou de sites terrestres. Ces deux derniers sont connus depuis fort longtemps car ils sont le siège de phénomènes spectaculaires comme les geysers (Parc de Yellowstone (USA), site de Geysir (Islande) pour les plus connus mais aussi Russie, Nouvelle Zélande, Japon, Chili et Açores), les solfatares (Solfatara (Italie), Açores) ou les émergences côtières (Vulcano (Italie), Ile de Santorin (Grèce), Iles Kouriles (Russie), Afrique). Si la présence des sites hydrothermaux profonds était connue (ou supposée) déjà depuis plusieurs

72 Les habitats microbiens années, il faut attendre la fin des années 70 pour que les premières plongées profondes mettent à jour la formidable vie associée à ces sites.

4.4.1 Nature et structure des émissions hydrothermales profondes

4.4.1.1 Localisation des sources La carte (figure 2.7) présente une liste non exhaustive des sites hydrothermaux étudiés jusqu'à présent, où une faune associée a été observée (d'après Chevaldonné, 1996). On retrouve des sites hydrothermaux profonds dans des zones à forte activité tectonique : - Soit à proximité des zones d'accrétion, le long des dorsales médio-océaniques.

(Middle Atlantic Ride (MAR), East Pacific Ride (EPR), légende ____). - Soit à proximité de zones de subduction, au niveau des bassins arrière arc (Bassin

de Lau, Bassin Nord Fidjien, légende tt).

Figure 2.7. Emplacements des sites hydrothermaux marins sur le globe

4.4.1.2 Composition du fluide hydrothermal Les sources étudiées jusqu'à présent sont situées entre 700 et 4000 mètres de profondeur. Dans ces zones où la croûte océanique a été fragilisée, l'eau de mer froide et dense s'infiltre. Elle est alors portée à très haute température, très forte pression et peut atteindre le stade de fluide supercritique. Sous cet état sa fluidité augmente ainsi que son pouvoir solvant. Elle remonte donc en surface, et en percolant dans la lithosphère des échanges chimiques importants sont réalisés avec la roche crustale. Les sulfates réagissent avec le fer contenu dans la roche pour produire du sulfure d'hydrogène (H2S) ou des oxydes de fer, le magnésium réagit avec les hydroxydes et la silice. Le fluide hydrothermal se charge en gaz dissous (H2S, CH4, CO, CO2, H2) et en métaux (Si, Mn, Fe, Zn). Ce fluide est anoxique, acide, de salinité variable et ne contient pas de magnésium, de sulfates, de nitrates et de phosphates. Sa composition contraste donc très fortement avec celle de l'eau de mer.

73 Les habitats microbiens

La température, le débit et la composition du fluide hydrothermal sont variables selon le site étudié et même selon les points d'émission sur un même site. Ces données vont conditionner la forme sous laquelle le fluide va être émis et les types de faunes associées.

4.4.1.3 Edification des cheminées hydrothermales (d'après Erauso, 1994; Chevaldonné, 1996)

Les fumeurs noirs

Si le fluide en remontant dans la lithosphère ne subit pas de dilution avec l'eau de mer, il est émis en surface à de très fortes températures (jusqu'à 400°C) et à un débit important (0,7-2,4 m.s-1) (Converse et al. 1984). Il entre alors en contact avec l'eau de mer et forme une matrice poreuse de sulfates (barytine ou anhydrite). La paroi de l'édifice croît alors verticalement et des grains de sulfure de cuivre, de zinc et de fer se déposent sur la croûte externe (cf. figure 2.8). Par la suite, la forte température du fluide induit le dépôt d'une couche interne de sulfures de cuivre et de fer en formant un conduit. La perméabilité de l'édifice diminue alors que de nouveaux sulfures se déposent à la place de l'anhydrite. Les minéraux s'arrangent de manière concentrique, stabilisant la structure de la cheminée et créant un gradient de température horizontal dans l'édifice. La communauté microbienne associée à ce type de cheminée est essentiellement de type thermophile ou hyperthermophile. On observe très peu d'Eucarya à proximité de la zone d'émission de ces cheminées. La colonisation par des Figure 2.8. Fumeur noir sur le site du Bassin Nord Fidjien bivalves ou des gastéropodes et les vers est plus éloignée de la cheminée.

Les fumeurs blancs ou diffuseurs

Lorsque le fluide sort à des températures moins élevées (<280°C), des cheminées riches en zinc peuvent alors se former. Elles sont qualifiées de diffuseur car le conduit central de la cheminée est absent ou très étroit et le fluide diffuse à très faible vitesse (0,5 m.s-1) au travers d'un réseau de petits canaux dans la cheminée. La cheminée va alors croître dans toutes les directions car les dépôts de minéraux vont se Figure 2.9. Diffuseur sur le site du Snake Pit (MAR) faire très lentement (cf. figure 2.9) Ces diffuseurs peuvent être surmontés d'une structure en nid d'abeille au sein de laquelle des échanges importants entre l'eau de mer et le fluide ont lieu. Ces structures très poreuses sont idéales pour étudier les zonations de peuplement qui s'établissent en fonction des gradients de nutriments et

74 Les habitats microbiens de température. On y retrouve aussi bien des micro-organismes mésophiles que thermophiles. Ces structures sont toutefois très difficiles à échantillonner car elles sont très fragiles.

Les autres structures

En fonction de la composition du fluide et de sa célérité, d'autres types d'édifices vont être rencontrés. Certaines cheminées sont dépourvues de sulfures et sont essentiellement constituées d'anhydrite ("La Dame Blanche" dans le bassin nord Fidjien). Pour d'autres, le fluide a traversé une couche de sédiments au cours de sa remontée. Le conduit de la cheminée est alors constitué de dépôts argileux. Enfin des structures horizontales sont parfois observées. Elles se constituent progressivement lorsque le fluide émis le long d'une surface verticale rencontre un obstacle qui initie le dépôt des minéraux. Le fluide retenu sous ces constructions s'en échappe par les bords ou en percolant au travers de la structure. Il se crée alors un gradient de température dans l'épaisseur de la structure qui favorise la colonisation par une grande diversité de micro-organismes (Delaney , 1998).

4.4.1.4 Autres types d'émission L'émission des fluides hydrothermaux peut ne pas conduire à la formation d'édifices, c'est le cas par exemple dans le bassin de Guaymas ou au fond du lac Tanganyika. En plus des structures classiques en cheminée, le fluide percole au travers de sédiments d'origine planctonique très riches en matière organique et en sulfates. Ses sédiments sont le siège d'une forte activité sulfato-réductrice se produisant à différentes profondeurs (donc à différentes températures) dans les sédiments ( pour revue Elsgaard, 1995). Ces biotopes abritent une communauté bactérienne très riche qui se nourrit de la matière organique présente en grandes quantités dans ces bassins. Des suintements froids, ou à faible température, observés à proximité des marges passives (Golfe de Californie, Golfe du Mexique), sont colonisés par une faune similaire à celle des sites hydrothermaux profonds. La communauté microbienne est quant à elle essentiellement mésophile. Récemment Hinrichs et al. (1999) ont analysé, par amplification et séquençage de l'ADNr 16S, la communauté microbienne se développant dans les sédiments à proximité des suintements de méthane émanant des réserves de méthane solidifié ("methane hydrates"). En plus de la flore anaérobie de sulfato-réducteurs et de Gram +, les auteurs détectent des séquences associées aux méthanogènes mésophiles (Methanomicrobiales et Methanosarcinales). L'analyse du contenu lipidique de leur échantillon et le suivi du 13C leur permet de supposer que parmi les séquences proches des méthanogènes certaines souches utiliseraient le méthane solidifié comme source de carbone. La présence dans ces échantillons de sulfato-réducteurs laisserait supposer que ces nouvelles souches réaliseraient une oxydation anaérobie du méthane en utilisant les sulfates comme accepteurs d'électrons (Hinrichs et al., 1999; Summons, 1999).

75 Les habitats microbiens

4.4.2 Faune associée à l'écosystème hydrothermal

L'une des caractéristiques les plus remarquables des sources hydrothermales est la faune que l'on peut y observer. Jusqu'en février 1977 (date des premières plongées réalisées par John Corliss et John Edmond) les fonds sous-marins étaient considérés comme des espaces désertiques. Ces oasis de vie que représentent ces nouveaux biotopes ont alors considérablement bouleversé la biologie, remettant en question le dogme d'une vie impossible sans lumière (Corliss et Ballard, 1977; Corliss et al., 1979). Les premiers prélèvements réalisés sur des sites hydrothermaux entre les Iles Galápagos et l'Equateur permirent de collecter les premiers spécimens de Calyptogena magnifica et de Bathymodiolus thermophilus, deux mollusques se développant à proximité des fumeurs noirs. Par la suite, de nombreux autres organismes ont été isolés de cet écosystème. Parmi ceux-ci les vestimentifères : Riftia pachyptila et Tevnia jerichonana, les polychètes appartenant aux genres Alvinella (pompejana et caudata) et Paralvinella. Les crevettes Rimicaris exoculata sont quant à elles uniquement présentes sur les sites de la dorsale médio-Atlantique. Cette faune est caractérisée par (d'après Laubier 1989; Tunnicliffe, 1991, 1992 cités dans Cornec, 1995): ¬ Une dépendance vis à vis du système hydrothermal. • Une biomasse très importante répartie sur des surfaces limitées de l'ordre de 10 kg.m-2 (contre quelques grammes par m2 dans les zones intra-plaques). ® Un fort taux d'endémisme : 97% de la faune observée sur ces sites est taxonomiquement distincte de celle observée à des profondeurs équivalentes. ¯ Un nombre important d'espèces nouvelles de grande taille appartenant à des taxons nouveaux (du genre jusqu'à l'embranchement).

Mais l'une des caractéristiques les plus importantes de cette faune est son développement inféodé aux symbiotes dont elle tire son énergie (voir plus loin) (Wirsen et al. 1993) Les Riftia, les Alvinella et les Rimicaris sont probablement les organismes les plus surprenants de ce biotope. Les premiers (cf. figure 2.10) sont de long vers pouvant atteindre 2 mètres de long pour 4-5 cm de diamètre. Ils se développent en véritables buissons pouvant atteindre une densité de 100 à 200 individus au m2. Ces vers

Figure 2.10. Colonie de Riftia pachyptila (photo site University of dépourvus de système digestif tirent leur Washington) énergie des producteurs primaires qu'ils abritent dans leur trophosome, des

76 Les habitats microbiens

bactéries sulfo-oxydantes endosymbiotiques. Ces bactéries sont alimentées en H2S par l'hémoglobine des Riftia qui possède la capacité de fixer aussi bien l'O2, le CO2 que l'H2S. Une fois l'échange réalisé au niveau du trophosome l'hémoglobine transporte l'H+ à l'extérieur du ver.

L'hémoglobine de Riftia assure l'alimentation des symbiotes et la protection du vers vis à vis de l'H2S hautement toxique en le transportant sous une forme stable (pour revue récente voir Zal, 1999).

Les seconds (cf. figure 2.11) sont des Alvinellidés vivant dans des tubes construits en surface des cheminées, mais ils peuvent aussi se déplacer librement sur le site hydrothermal pour se nourrir de bactéries. L'une des caractéristiques majeures de ces vers est la présence d'une importante communauté épibiotique de bactéries filamenteuses (voir plus loin) (pour revue Desbruyères et al., 1998; et pour analyse moléculaire Haddad et al., 1995; Cary et al. 1997). Si la majeure partie de la faune se développant dans les sites hydrothermaux Figure 2.11. A. pompejana. Photo C. Cary. Taille 6 cm. se trouve dans des zones "froides" (20-30°C), les On observe à la surface du vers les filaments bactériens Alvinellidés sont quant à eux fréquemment rencontrés à qui dominent la communauté épibiotique. proximité d'émissions à très haute température. A de nombreuses reprises il a été observé des vers traversant le panache de fluide à la sortie d'un fumeur où la température dépassait les 100°C (Chevaldonné et al., 1992). La température à l'intérieur des tubes dans lesquels ces vers se réfugient correspond à un très fort gradient thermique de 60°C (entre 22°C à la sortie du tube et 81°C au fond du tube) (Cary et al., 1998).

La troisième communauté (cf. figure 2.12) très fréquemment rencontrée sur les sites hydrothermaux de la MAR est constituée par les crevettes du genre Rimicaris. Rimicaris exoculata constitue une biomasse très importante sur ces sites de 25 à 50000 individus.m -2 (Segonzac et al., 1993; Van Dover, 1994). Elles ingèrent des petites particules de soufre recouvertes de bactéries et sont elles-mêmes recouvertes de bactéries filamenteuses sur leur carapace Figure 2.12. Des essaims de Rimicaris exoculata broutant à la surface et autour de leur orifice buccal (Polz et d'une cheminée. On observe la tache blanche à la surface de la crevette Cavanaugh, 1995). correspondant à l'oeil. Photo E. Gaten. Ces crevettes considérées auparavant

77 Les habitats microbiens comme aveugles possèdent à la surface de leur céphalo-thorax un oeil fonctionnel dont le caractère ancestral a été discuté (Gaten, 1998; Gaten et al. 1998a et b; Hering et al., 1999).

4.4.3 Les micro-organismes des sources hydrothermales

La découverte des sources hydrothermales, où la vie en l'absence de lumière s'était développée, a incité de nombreux scientifiques à rechercher l'activité microbienne source de la production primaire chimiolithotrophique. C'est en 1979 que Jannasch et Wirsen (entre autres) ont mis en évidence cette présence pour la première fois en indiquant le rôle prépondérant dans cet écosystème des bactéries sulfo-oxydantes sous une forme libre, associées symbiotiquement à la macrofaune ou dans des consortiums microbiens (Jannasch et Wirsen, 1979). Par la suite, de nombreuses études (comptages, techniques de culture, mesure de l'activité du métabolisme) ont permis de mettre à jour une flore microbienne aux métabolismes et aux préférendums très diversifiés. Si ces dernières années l'accent a été mis préférentiellement sur l'étude des micro-organismes thermophiles, peu de choses sont en fait connues des micro-organismes mésophiles (Baross et Deming, 1995). L'emploi récent des techniques moléculaires devrait nous permettre d'appréhender l'écosystème hydrothermal dans sa globalité.

4.4.3.1 Habitats et types métaboliques microbiens On considère actuellement que les communautés microbiennes s'établissent au sein des écosystèmes hydrothermaux océaniques dans les habitats suivants (Karl, 1995) (cf. figure 2.13) : ¬ Les micro-organismes vivant sous une forme libre dans le fluide hydrothermal. Ces micro- organismes se développeraient dans une biosphère souterraine sous-jacente aux cheminées et seraient transportés par le fluide. Ce concept de biosphère souterraine (cf. § 3.2.2) expliquerait l'ubiquité de certains micro-organismes dans des zones où la croûte terrestre profonde entrerait en contact avec des milieux plus superficiels. C'est le cas par exemple des Thermoccoccales, des Méthanogènes des Archaeoglobales retrouvées sur la quasi totalité des sites hydrothermaux profonds et côtiers et au sein des réservoirs pétroliers (Prieur et al., 1995). • Les micro-organismes se développant à la surface des cheminées ou des roches proches des émissions et qui seraient alimentés en nutriments par le fluide. On distingue les micro-organismes se développant dans les cheminées (essentiellement thermophiles) des micro-organismes se développant sous forme de tapis à proximité des cheminées (essentiellement mésophiles). La présence de tapis bactériens très abondants est l'une des caractéristiques majeures de certains sites hydrothermaux (Jannasch et Wirsen, 1981; Prieur, 1992). Ces enchevêtrements constituent des zones frontières à la fois en contact avec des zones aérobies (l'eau de mer) et anaérobies (le fluide). Le type de cheminée, sa porosité principalement, va influer sur la profondeur de colonisation des micro-organismes. Afin d'étudier la communauté capable de se développer à la surface des cheminées, différentes expériences ont été menées. Elles consistaient soit à prélever directement le tapis microbien afin de réaliser des cultures d'enrichissement et des isolements, soit

78 Les habitats microbiens

à mettre à proximité du fluide des coupons de différentes matières (Téflon, acier, porcelaine, métaux, plastiques) durant des durées d'expositions variables (Prieur et Ferra, résultats non publiés dans Prieur, 1992; Guezennec et al., 1998) ® Les micro-organismes se développant en ecto- ou endo-symbiose avec les macro-organismes colonisant les cheminées : vers polychètes, vestimentifères, mollusques. L'étude des symbiotes associés aux mollusques des sources hydrothermales constitue la plus ancienne référence à l'utilisation des techniques moléculaires pour accéder à la diversité microbienne d'un échantillon (Stahl et al., 1984). ¯ Les micro-organismes retrouvés dans les panaches ("plume") de fluides hydrothermaux. Ces derniers correspondent à de l'eau de mer enrichie par les minéraux communément retrouvés dans le fluide. Ces panaches peuvent atteindre des tailles considérables (700m d'épaisseur pour 20 km de diamètre) (Winn et al., 1995). ° Enfin les micro-organismes se développant dans les sédiments où le fluide peut percoler comme c'est le cas dans le bassin de Guaymas.

Communauté bactérienne Oxydation/précipitation par dans les panaches mélange avec l'eau de mer froide environnante

FeS + O2 Fe(O)OH

Mn + O2 MnO2 350°C

350°C Communauté Thermophiles/Mésophiles

350°C Sous forme libre

50 à 100°C 20 à 40°C Macr aune Communauté Mésophiles Communauté bactérienne Sous forme libre/ mésophile symbionte Sous forme de mats

Percolation de l'eau de mer froide 100°C Fort débit Température élevée 200°C 1-3 km Zone de mélange des eaux Eau de mer chauffée Température moyenne 300°C enrichie en minéraux

400°C 2- 2- Lessivage de Ca2+, Mn2+, Mg2+,Fe2+ et Cu2+ SO réduit en S 4

BASALTE

Figure 2.13. Schéma de fonctionnement d'une source hydrothermale océanique (d'après Jannasch et Mottl, 1985). Si les bactéries sulfo-oxydantes et méthanotrophes semblent constituer le premier maillon de la chaîne alimentaire de l'écosystème hydrothermal, la chimiolithoautotrophie ne constitue pas le seul type métabolique et énergétique rencontré au sein des sources hydrothermales. De nombreux auteurs ont proposé une liste des métabolismes bactériens observés ou potentiellement observables à proximité des émissions de fluide (cf. tableau 2.4 d'après Prieur et al., 1987; Jannasch, 1995; Karl, 1995).

79 Les habitats microbiens

Tableau 2.4. Métabolismes microbiens observés d'isolats de sources hydrothermales profondes Donneur Accepteur Source Température Type Processus d'électron d'électron de carbone de réaction respiratoire métabolique

2- S O2 CO2 méso, hyper Aérobie Oxydation de sulfures

S° O2 CO2 méso, hyper Aérobie Oxydation du soufre 2- S2O3 O2 CO2 méso, hyper Aérobie Oxydation du thiosulfate 2+ Fe O2 CO2 méso Aérobie Oxydation du fer 2+ Mn O2 [CH2O] méso Aérobie Oxydation du manganèse + 2- NH4 , NO O2 CO2 méso Aérobie Nitrification

CH4, CO O2 CH4, CO2, CO méso Aérobie Oxydation du méthane

et des composés en C1

[CH2O] O2 [CH2O] méso, hyper Aérobie Hétérotrophie aérobie

H2 O2 CO2 méso, hyper Aérobie Oxydation de l'hydrogène - H2 NO3 CO2 méso, hyper Anaérobie Dénitrification

H2 S° CO2 hyper Anaérobie Sulfo-réduction 2- H2 SO4 CO2 méso, hyper Anaérobie Sulfato-réduction

H2 CO2 CO2 méso, hyper Anaérobie Méthanogénèse 2- 2- - S , S°, S2O3 NO3 CO2 méso Anaérobie Dénitrification, Sulfo-oxydation

[CH2O] S° [CH2O] hyper Anaérobie Hétérotrophie soufre réducteur 2- [CH2O] SO4 [CH2O] méso, hyper Anaérobie Hétérotrophie sulfatoréductrice - [CH2O] NO3 [CH2O] méso Anaérobie Dénitrification

[CH2O] [CH2O] [CH2O] méso, hyper Anaérobie Fermentation méso : mésophile; hyper : hyperthermophile

4.4.3.2 Abondance des micro-organismes Les comptages réalisés sur des échantillons provenant de différents sites donnent des résultats très variables en fonction de la technique de comptage utilisée et du type d'échantillon analysé (cf. tableau 2.5).

Tableau 2.5. Densité microbienne sur les sites hydrothermaux Echantillon Température Densité Références (°C) $ (Cellules.ml-1); £ (Cellules.g-1); & (Cellules.cm-2) Fluide à basse température <50 5-10 106 $ Jannasch et Wirsen, 1979 <50 <2 106 $ Karl, 1987; Straube et al., 1990 <50 108-109 $ Corliss et al., 1979 Fluide à haute température 304 5 105 $ Baross et al., 1984 174-357 <3 105 $ Straube et al., 1990 Cheminée 65-80 2 105-5 107 £ Harmsen et al., 1997a 104-1010 £ Chevaldonné et Godfroy, 1997 Flange 20-100 et+ 106->108 Baross et Deming, 1995 Colonisation sur coupon 2 104-5 105 & (3 jours) Prieur et Ferra (com. perso.) 3 105-5 107 & (10 jours) " " Colonisation sur Vent Cap 20 -80 4 108-2 109 $ (2-5 jours) Ce manuscrit (Article 3) Sédiments 80-104 2 107-2 108 £ Hoaki et al., 1995 Tubes A. pompejana face externe 2-3 106 & Chevaldonné, 1989 Tubes A. pompejana face interne 0,4-2 106 & " " Endobiote (R. pachyptila) 3 109 £ trophosome (humide)14 Cavanaugh et al., 1981 Ectobiote (R. exoculata) 8,5 106 (cellules/individu) Poltz et Cavanaugh, 1995

14 Le trophosome correspond à 40-60% du poids total du ver, ce qui fait des vers des animaux chimioautotrophes (Felbeck et Childress, 1988)

80 Les habitats microbiens

Les trois méthodes principales de numération sont les comptages sur boites, la méthode par dilution (NPP) et la microscopie. Les résultats obtenus par les deux premières méthodes sont entachés des erreurs inhérentes à toute technique culturale. Les méthodes microscopiques sont quant à elles entachées de l'erreur "humaine". Il est en effet difficile de distinguer au microscope certaines cellules des granules de soufre qui présentent parfois une très forte autofluorescence. Je reviendrai dans la troisième partie sur les techniques mises au point pour limiter les erreurs de comptage en microscopie.

4.4.3.3 Les micro-organismes isolés de tapis microbiens et d'échantillons d'eau de mer

Les micro-organismes mésophiles

Les premières observations réalisées sur les tapis microbiens du bassin de Guaymas ont indiqué la présence de bactéries soufre-oxydantes se présentant sous la forme de longs filaments et associées aux genres Beggiatoa et Thiothrix (Jannasch et Wirsen, 1981; Jannasch et al., 1989). Ces micro-organismes autotrophes oxydent l'H2S en utilisant les nitrates accumulés dans une large vacuole. Ces enchevêtrements peuvent atteindre des épaisseurs de 10 ou 20 cm et sont aussi observables à proximité des suintements froids (Ahmad et al., 1999; Nealson, 1999). Une souche sulfo-oxydante, autotrophe associée au genre Arcobacter a été retrouvée dans les sédiments chauds du bassin de Guaymas. Cette souche préalablement observée dans des sédiments côtiers produit d'importants filaments de soufre (de 0,5 à 5 µm de diamètre pour 20 à 500 µm de long) qui pourraient servir de facteur d'initiation pour la colonisation des Alvinella (Taylor et Wirsen, 1997; Taylor et al., 1999). La plupart des isolats obtenus à partir d'échantillons de fluides ou de surfaces exposées aux fluides correspondent à des bactéries soufre-oxydantes autotrophes ou mixotrophes associées aux genres Thiomicrospira, Thiobacillus (Durand et al., 1993; Jannasch et al., 1985; Ruby et al., 1981). Des études récentes effectuées sur un isolat de Thiomicrospira prélevé sur la dorsale médio-Atlantique, indiquent que ce dernier correspondrait à une Thiomicrospira crunogena préalablement isolée dans le Pacifique (Wirsen et al., 1998). Cette espèce semble donc présenter une répartition ubiquitaire. Mais un grand nombre d'autres bactéries soufre-oxydantes hétérotrophes ou mixotrophes ont été isolées de milieux hydrothermaux. Elles sont associées aux genres Pseudomonas, Acinetobacter et Vibrio (Durand et al., 1994). Des bactéries sulfato-réductrices associées au genre Desulfovibrio ont été isolées à partir d'échantillons provenant de la Ride Est-Pacifique (Elsgaard et al., 1991). Jannasch dans sa revue (1995) rapporte l'isolement de bactéries oxydant le méthane du genre Methylococus et de bactéries oxydant l'hydrogène du type des Hydrogenomonas. Des bactéries mangano-oxydantes et des bactéries résistantes à de fortes concentrations en métaux lourds ont été isolées de coupons colonisés et d'échantillons de moules et d'Alvinellidés (Ehrlich et al., 1983; Durand et al., 1990; Jeanthon et Prieur, 1990). Elles sont associées aux genres Pseudomonas, Aeromonas et Vibrio. La recherche de bactéries productrices d'exopolysaccharides à partir de divers échantillons

81 Les habitats microbiens hydrothermaux a conduit à l'isolement de souches apparentées aux Vibrio et aux Alteromonas (Vincent, 1993; Raguenes et al., 1997 a et b). Enfin des bactéries nitrifiantes, hétérotrophes, aérobies ont été isolées à partir d'échantillons de cheminées actives sur le site 13°N, EPR et dans le bassin de Guaymas (Mevel et al., 1996). Ces bactéries correspondent majoritairement à des Pseudomonas et des Alcaligenes. Récemment une souche aérobie anoxygénique photosynthétique a été isolée à 2000m de profondeur dans un panache hydrothermal (Yurkov et Beatty, 1998). Cette présence atypique (à de telles profondeurs) mais significative (près de 10% des enrichissements) n'est pas expliquée par les auteurs.

Les micro-organismes mésophiles associés à la macrofaune

La majeure partie de la faune observée au niveau des sites hydrothermaux présente de fortes associations avec des micro-organismes sulfo-oxydants15. Ces symbioses correspondent à des associations hôtes-bactéries très spécifiques qui ont été étudiées dans le cas des vestimentifères Riftia pachyptila, des mollusques bivalves Bathymodiolus thermophilus et Calyptogena magnifica, des gastéropodes Alviniconcha hessleri et Neomphalus fretterae, des polychètes annélidés Alvinella pompejana et A. caudata, des crustacés Rimicaris exoculata et R. chacei (Prieur, 1992; Nealson et Fisher, 1995). L'ensemble de ces études souffre de l'impossibilité d'isoler les symbiotes de leur hôte. Seules des techniques de mesure d'incorporation d'isotopes stables de carbone et d'azote, des recherches d'enzymes impliquées dans le cycle de Calvin et des observations des tissus par microscopie électronique à balayage et à transmission avaient permis, avant l'emploi des techniques de séquençage et de marquage moléculaire, d'établir les relations trophiques s'établissant entre l'hôte et les bactéries (Prieur, 1992). Si les relations nutritionnelles entre les ectobiotes d'A. pompejana et de R. exoculata ne sont pas encore complètement établies16 (Poltz et Cavanaugh, 1995; Cary et al., 1997; Desbruyères et al., 1998), celles entre les endobiotes et les mollusques ou les vestimentifères des sources hydrothermales ont été plus étudiées et l'emploi des techniques moléculaires a permis d'accroître considérablement le champ des connaissances sur les mécanismes relationnels hôtes- symbiotes (Nealson, 1999; cf. § 4.4.3.4).

Les micro-organisme s thermophiles

Définition de la thermophilie

La température est l'un des facteurs qui conditionnent la vie sur terre17. On peut alors diviser le monde vivant en trois groupes principaux, en fonction des températures optimales de croissance : les psychrophiles se développant à de faibles températures, les mésophiles se développant à des températures moyennes et les thermophiles se développant à des températures élevées.

15 Il a été aussi observé des symbioses avec des micro-organismes méthanotrophes chez Bathymodiolus (Cavanaugh et al., 1992; Distel et al., 1995; Nealson et Fisher, 1995). 16 Une étude a été menée par Poltz et al. (1998) afin d'établir (par assimilation de carbone marqué, techniques moléculaires de marquage, etc.) les relations que R. exoculata entretenait avec ses ectobiotes. 17 La température influe sur la structure des molécules (notamment des protéines et de l'ADN) et sur la disponibilité de l'eau par exemple.

82 Les habitats microbiens

Les Archaea et les Bacteria thermophiles peuvent être divisées en trois sous-groupes (cf. figure 2.14):

Frontière de la Ø les thermophiles modérés, dont thermophilie (50 à 60°C) la température maximale de croissance Thermophiles Thermophiles Hyperthermophiles modéres extrêmes (Tmax) ne dépasse pas 70°C, Ø les thermophiles extrêmes, capables de se développer au delà de 85°C, Ø les hyperthermophiles, dont la Vitesse de croissance température optimale de croissance Température (°C) (Topt) est supérieure à 90°C. Figure 2.14. Répartition des micro-organismes thermophiles (d'après Brock, 1986)

La notion de frontière de thermophilie, d'organismes mésophiles et thermophiles modérés ne fait pas l'unanimité. On peut toutefois définir pour chaque organisme trois points cardinaux : la température minimale, T min, à partir de laquelle la croissance est possible; le taux de croissance augmente ensuite presque linéairement jusqu'à la T opt, puis généralement chute brutalement dans les 18 5 à 10°C qui suivent jusqu'à T max .

Isolement des micro-organismes thermophiles

Les fortes températures relevées au sein des sites hydrothermaux profonds ont conduit à rechercher des micro-organismes thermophiles et hyperthermophiles. Le tableau 2.6 présente les principaux genres thermophiles isolés au sein des sources hydrothermales profondes. Tableau 2.6. Micro-organismes thermophiles isolés de sources hydrothermales profondes (d'après la revue de Stetter, 1996). Domaine Genres Optimum Métabolisme Références (°C) énergétique BACTERIA Thermus 60-70 Hétérotrophe, aérobie Marteinsson et al., 1995 Bacillus 60-80 Hétérotrophe, aérobie Marteinsson et al., 1996 Thermotoga 80 Fermentaire, anaérobie Marteinsson et al., 1997 Thermosipho 70 Fermentaire, anaérobie Antoine et al., 1997 Desulfurobacterium 70 Autotrophe, anaérobie L'Haridon et al., 1998a et b ARCHAEA Euryarchaeota Thermococcus 80-90 Fermentaire, anaérobie Kobayashi et al., 1994 Pyrococcus 95-100 Fermentaire, anaérobie Erauso et al., 1993 "Palaeococcus" Fermentaire, anaérobie Takai et al., 1998 (resul. non pub.) Archeaoglobus 83 Mixotrophe, anaérobie Burggraf et al., 1990 Methanococcus 85 Methanogène, anaérobie Jones et al., 1983;* Methanopyrus 98 Methanogène, anaérobie Kurr et al., 1991 Crenarchaeota Staphylothermus 92 Hétérotrophe, anaérobie Fiala et al., 1986 Pyrodictium 97 Hétérotrophe, anaérobie Pley et al., 1991 Pyrolobus Autotrophe, aérobie Blöchl et al., 1997 Desulfurococcus 85-90 Fermentaire, anaérobie Jannasch et al., 1988 * Jeanthon et al., 1998, 1999 a et b

18 D'une manière analogue aux courbes d'efficacité enzymatique, les courbes de croissance des micro-organismes en fonction de la température sont les résultantes de la combinaison de la loi d'Arrhenius jusqu'à la Topt et de la dénaturation du micro-organisme jusqu'à la Tmax.

83 Les habitats microbiens

La plupart de ces micro-organismes sont des anaérobies stricts (hétérotrophes fermentaires, méthanogènes ou sulfato-réducteurs) appartenant au domaine des Archaea. Mais il a été possible d'isoler certaines Bacteria thermophiles (§ tableau 2.6). Il s'agit généralement de souches appartenant à des genres déjà décrits au niveau des sources côtières ou terrestres. Ce phénomène pourrait être expliqué soit par l'ubiquité de ces souches au sein des différents points chauds du globe, soit par un biais lié aux techniques de cultures toutes issues d'études des environnements côtiers et ne tenant pas compte de l'un des principaux paramètres: la pression (Prieur, 1997).

Les applications industrielles des souches thermophiles

Ces dix dernières années les études portant sur les Archaea et les Bacteria ont amené les chercheurs à s'intéresser aux propriétés de ces micro-organismes pouvant se développer dans des conditions extrêmes de pH, de température et de salinité. Leur capacité à produire des enzymes très stables a très rapidement été étudiée par les industriels. Toutefois si certains de ces organismes étaient déjà employés depuis longtemps (Archaea méthanogènes) d'autres, bien qu'offrant des perspectives fort intéressantes, entraient en concurrence avec des bactéries déjà sur le marché et beaucoup plus simples à produire en grande quantité. D'autre part les conditions optimales de croissance (température, pression, anaérobiose) rendent complexe la mise en culture de telles souches(Cowan, 1992). Les Archaea thermophiles ont surtout été pressenties par les industriels pour les caractéristiques de leurs enzymes. Les avantages apportés par l'utilisation d'enzymes thermophiles et thermostables par rapport aux enzymes classiques sont : Ø un gain de temps (pas de refroidissement) Ø une diminution des coûts de refroidissement Ø l'amélioration de la stérilité Ø la possibilité d'extraction de composés volatils Ø la réduction de la viscosité

La thermostabilité d'une protéine implique le plus souvent une meilleure résistance aux agents dénaturants et à la protéolyse. Il faut garder à l'esprit que des enzymes thermostables ne réagiront pas plus rapidement que des enzymes classiques. La vitesse de réaction d'une enzyme ayant son optimum de température à 90°C ne sera pas 32 fois supérieure à celle de l'enzyme ayant une Topt de 37°C (la loi d'Arrhenius prévoit en effet un doublement de la vitesse de réaction pour une augmentation de 10°C). Ceci est dû à des relations structure-fonction qui accroissent certes la stabilité mais réduisent la flexibilité de l'enzyme aux faibles températures (Cowan, 1992). On peut augmenter la vitesse d'une réaction en utilisant une enzyme thermostable, lorsqu'à des températures élevées le substrat est plus susceptible d'être catalysé. C'est le cas des mécanismes de dégradation des polymères protéiques et glucidiques. Le tableau 2.7 donne un aperçu des applications actuelles des enzymes extraites des micro- organismes extrêmophiles.

84 Les habitats microbiens

Tableau 2.7. Applications biotechnologiques des extrêmophiles Organismes extrêmophiles Enzymes / Composé organique Applications Produits Thermophiles 50 - 110°C Amylases Glucose,Fructose , Edulcorants Xylanases Blanchiment du papier Protéases Acides aminés produits de la kératine, détergents, agro-alimentaire : cuisson, brasserie. ADN-polymérases, Intéines Biologie moléculaire Psychrophiles 0 - 20°C Protéases neutres Production laitière et fromagère Protéases, Amylases, Lipases Additifs de dégradation dans les détergents Acides gras polyinsaturés Industrie pharmaceutique Déshydrogénases Biocapteurs Acidophiles pH < 2 Oxydation des sulfures Désulfuration des minerais et du charbon Alcaliphiles pH > 9 Cellulases, Protéases Additifs de dégradation dans les détergents Amylases, Lipases Cyclodextrines Stabilisation de substances volatiles Antibiotiques Industrie pharmaceutique Halophiles 3 - 20% sel Carotène Colorants alimentaires Glycérol et additifs solubles Industrie pharmaceutique Membranes Surfactants pour l'industrie pharmaceutique Barophiles Amylase, Protéases Agro-alimentaire, Industrie pétrolière (d'après Querellou et al., 1999; site programme européen (voir note bas de page n°19))

L'un des domaines d'application courant de telles enzymes est celui de la biologie moléculaire. La PCR a ouvert le champ à l'utilisation de nombreuses enzymes thermostables. Dans un premier temps la Taq polymérase extraite de la Bacteria Thermus aquaticus a remplacé le fragment de Klenow qui exigeait des manipulations longues et était thermosensible, puis de nouvelles polymérases plus fidèles ont été extraites d'organismes hyperthermophiles (voir pour revue récente Quérellou, 1999).

D'autres domaines d'applications de la biologie moléculaire peuvent être envisagés: Applications ind ustrielles (König, 1989; Cowan, 1992; Querellou et al., 1999) : 75% des enzymes utilisées dans le monde le sont dans les industries des détergents, de l'amidon et du lait. Si des enzymes thermostables pouvaient logiquement intervenir dans de telles industries, il faudrait toutefois que cette substitution aux enzymes classiques soit commercialement intéressante. Il faut rappeler notamment que : Ê Certains procédés industriels ne sont pas compatibles avec des températures élevées (ex : industrie fromagère). Ë Certains procédés fonctionnent de préférence à faible température (ex : détergents). Ì Des enzymes suffisamment thermostables sont déjà utilisées (ex : saccharification de l'amidon). Í Parfois il n'y a pas d'intérêt à augmenter la température de réaction (ex : certaines réactions de chimie fine sur les acides aminés ou les pénicillines). Î L'augmentation de productivité à haute température peut ne pas couvrir l'augmentation des coûts de chauffage.

Par conséquent l'utilisation d'une enzyme thermostable doit être dictée par les règles suivantes : À L'enzyme doit être disponible dans des quantités équivalentes à une enzyme classique.

85 Les habitats microbiens

Á Son prix par unité d'activité doit être plus faible. Â Ses performances doivent être significativement supérieures à l'enzyme classique. Ã Son utilisation ne doit pas entraîner de modifications majeures de l'équipement existant.

Il s'avère donc difficile de remplacer par des enzymes extraites d'Archaea thermophiles les enzymes déjà présentes sur le marché. L'emploi d'enzymes thermostables devra donc plutôt s'orienter vers de nouvelles niches d'utilisation (cf. tableau 2.8). Tableau 2.8. Domaines d'applications des enzymes issues de micro-organismes thermophiles Enzymes Applications A.D.N. ligases recherche d'enzymes plus thermostables, plus processives et plus fidèles que la Taq polymérase classique. Alcool-déshydrogénases des alcools secondaires DH thermostables pourraient avoir de nombreuses applications en chimie pour la production de molécules chirales. Leur résistance aux produits de réaction (alcool, aldéhydes et cétones) rendent les DH de Sulfolobus solfataricus et de Hyperthermus butylicus intéressantes. Estérases permettant des réactions en milieu non liquide. Enzymologie en phase gazeuse à l'aide de l'alcool DH de S. Solfataricus. Cette technique permettrait de minimiser l'emploi de solvant. Biolixiviation jusqu'à présent des Bacteria mésophiles étaient utilisées à très grande échelle (500 tonnes par an) pour le traitement du minerai d'uranium. L'emploi d'Archaea sulfo- et métalo-oxydantes thermophiles se limitait à la récupération de métaux précieux. Les Archaea acidophiles Sulfolobus, Acidianus et Metallosphaera pourraient être d'un usage intéressant dans le cas de bio- lixiviation thermodépendante. Le problème réside dans la sensibilité parfois trop forte aux métaux de ces bactéries dans les réacteurs.

Actuellement le marché des enzymes et des autres composés issus de micro-organismes extrêmophiles correspondrait à 17 milliards de dollars. Les programmes européens du type "Extrêmophiles, usines cellulaires"19 ainsi que le séquençage de génomes totaux de micro- organismes hyperthermophiles20 témoignent de l'intérêt grandissant des industriels pour ces souches. Toutefois une exploitation à grande échelle de ces enzymes tarde encore à venir.

4.4.3.4 L'apport des techniques moléculaires Les environnements hydrothermaux ont constitué l'un des premiers champs d'essai des techniques moléculaires pour accéder à la diversité microbienne en s'affranchissant de toute étape de culture (Stahl et al., 1984; Lane et al., 1985a). Les premiers échantillons analysés provenaient des symbiotes de R. pachyptila, de C. magnifica et de Soleyama velum. Ces études confirment par analyse des ARNr 5S l'affiliation de ces symbiotes avec les bactéries soufre-oxydantes correspondant aux Proteobacteria g (appelées alors bactéries pourpres). L'engouement suscité par l'emploi de telles méthodes a conduit à l'analyse d'échantillons (coupons colonisés) provenant de sites hydrothermaux terrestres (Octopus Spring dans le Parc de Yellowstone, Stahl et al., 1985) et à la publication de nombreuses revues dans les années qui ont suivi (Pace et al., 1985, 1986 a et b; Olsen et al., 1986; Turner et al., 1989). Par la suite les limites de détermination des souches liées à la petite taille du 5S

19 Extremophiles as cell factories http://www.tu-harburg.de/tv/ecf/ecf0_1.htm. 20 Sur 17 génomes microbiens séquencés , 5 correspondent à des micro-organismes hyperthermophiles.

86 Les habitats microbiens entraînèrent les scientifiques vers l'analyse des gènes codants pour l'ARNr 16S (1500 nucléotides contre 120 pour le 5S). Après la mise au point d'une technique rapide et efficace de séquençage (Lane et al., 1985b), les premières études de diversité microbienne fondées sur l'analyse des gènes codants pour l'ARNr 16S ne sont appliquées qu'en 1990 en milieu hydrothermal continental (Ward et al., 1990 a et b) et en 1994 et 1995 par Moyer et al. en milieu profond. Jeanthon (1999) propose une revue très complète sur l'emploi des techniques moléculaires en milieu hydrothermal profond. Ces dernières ont permis d'étudier à la fois les bactéries associées à la macro-faune comme celles présentes sous une forme libre; ce sont : Ê les travaux de Poltz et Cavanaugh sur les ectobiotes de R. exoculata (Poltz et Cavanaugh, 1995), Ë les travaux de l'équipe de Cary sur les symbiotes d'A. pompejana (Haddad et al., 1995; Cary et al., 1997), Ì les travaux de Distel sur les symbiotes de Riftia par étude du gène de l'ADNr 16S (Distel et al., 1988, 1994), Í les travaux de l'équipe de Vrijenhoek sur la co-évolution des symbiotes et de leur hôte chez Calyptogena (Peek et al., 1998)et chez Riftia (Feldman et al., 1997), Î les travaux de Moyer sur des tapis microbiens d'un site hydrothermal du Pacifique (Moyer et al., 1994, 1995, 1998) Ï les travaux de Harmsen sur la quantification à l'aide de sondes nucléiques des micro-organismes de cheminées hydrothermales d'un site Atlantique (Harmsen et al., 1997 a et b) Ð les travaux de Riley sur les communautés méthanogènes des cheminées (Riley, 1997, 1999) Ñ les travaux de Takai sur des sources côtières et profondes au large du Japon (Takai et Horikoshi, 1999; Takai et Sako, 1999),

Des travaux Ê et Ë on retiendra la prédominance dans les banques d'ADNr 16S de phylotypes bactériens associés aux Proteobacteria e parmi les épibiotes de R. exoculata et A. pompejana. Ces épibiotes correspondent dans les deux cas à de longs filaments situés sur l'épiderme dorsal des annélides et sur des excroissances buccales des crustacés. Cette prédominance a été confirmée par des expériences d'hybridation in situ ou de Dot-blot sur des échantillons d'animaux21. De plus il semblerait que l'association bactérie-hôte ne soit pas exclusive. En effet il a été détecté dans l'environnement proche des animaux (tubes externes des annélides, surfaces des roches) des phylotypes similaires à ceux observés à la surface des animaux (jusque 60% des bactéries détectées à la surfaces des roches dans le cas du symbiote de R. exoculata). Les épibiotes de R. exoculata pourraient de plus correspondre à des bactéries pléomorphes comme l'indiquent les expériences d'hybridation menées sur 3 morphotypes différents à l'aide d'une sonde spécifique du symbiote. Les travaux Ì et Í confirmèrent les premières études portant sur l'ADNr 5S, sur le positionnement phylogénétique des symbiotes de Riftia. Par contre il a été possible de définir deux

21 La présence de séquences associées à d'autres Proteobacteria e a été aussi détectée dans le trophosome de vestimentifères proches de suintements froids (Naganuma et al., 1997)

87 Les habitats microbiens modes d'acquisition probables du symbiote pour les mollusques et les vestimentifères. Alors que les symbiotes de Riftia n'ont jamais été détectés dans les oeufs ou les tissus juvéniles des vers et que le même symbiote est retrouvé sur des individus d'origines géographiques distinctes ou des individus de genre proche (Ridgea piscesae) (laissant supposer un mode d'acquisition horizontal du symbiote), les symbiotes thioautotrophes de Calyptogena étaient quant à eux retrouvés dans les oocytes du mollusque (mode d'acquisition vertical). La forme libre du symbiote de Riftia n'a jamais été détectée dans l'environnement proche des vers, mais le gène codant pour une flagelline a été détecté dans l'endosymbiote (Millikan et al., 1999). La forme libre du symbiote pourrait donc être mobile. Les travaux Î effectués sur des échantillons de tapis microbien confirment eux aussi la prédominance dans les banques d'ADNr 16S de phylotypes bactériens associés aux Proteobacteria e (différents des précédents). Ces phylotypes ne correspondent à aucun micro-organisme isolé de source hydrothermale. La séquence bactérienne la plus proche est celle de Thiomicrospira denitrificans22 une bactérie sulfo-oxydante chimiolithoautotrophe pouvant dénitrifier et isolée de sédiments marins côtiers. Ces micro-organismes pourraient revêtir un rôle dans le cycle du soufre au sein des écosystèmes hydrothermaux. Le second phylotype le plus abondant correspond à une Proteobacteria g proche de Xanthomonas sp. récemment isolée d'eau douce, oxydant l'ion Fe2+ (Emmerson et Moyer, 1997). En ce qui concerne les séquences archaéennes, Moyer (1998) détecte 2 groupes principaux de séquences répartis parmi les Archaea marines du groupe I (Crenarchaeota) et les Archaea marines du groupe II (Euryarchaeota). Ces dernières ont été aussi détectées dans les échantillons provenant de la dorsale médio-Atlantique (Reysenbach et al., 1999, résultats non publiés). Sur des échantillons de cheminée provenant du même site, Harmsen (Ï) détecte une forte proportion (40%) de bactéries hybridant à la fois avec la sonde bactérienne et avec la sonde ciblant les Aquificales. Ces micro-organismes s'avéreront correspondre aux Desulfobacteriaceae isolées des mêmes échantillons (L'Haridon et al., 1998). Malgré l'isolement de Thermus, de Bacillus et de Thermotoga de ces échantillons, seul ce dernier genre a pu être détecté par hybridation in situ. Ces études confirment de plus que la colonisation microbienne est plus abondante à l'extérieur qu'à l'intérieur des cheminées (avec de plus en plus de Bacteria par rapport aux Archaea à mesure que l'on se rapproche du centre de la cheminée). L'un des problèmes majeurs lors des études moléculaires d'échantillons hydrothermaux est rencontré durant l'extraction d'ADN 23. Riley (Ð) a probablement solutionné ce problème en extrayant directement l'ADN à bord du bateau à l'aide d'un Ribolyser (Hybaid). Il lui a ainsi été possible d'obtenir de l'ADN génomique amplifiable à l'aide d'amorces ribosomales. Il n'a toutefois pas pu détecter de méthanogènes comme il l'aurait désiré.

22 Le genre Thiomicrospira est mal attribué car il ne s'agit pas ici d'une Proteobacteria g comme les autres Thiomicrospira isolées d'environnements hydrothermaux (Muyzer et al., 1995) 23 Ce problème a été reporté d'ailleurs sur des échantillons hydrothermaux par Reysenbach et al., 1998.

88 Les habitats microbiens

Takai (Ñ) est quant à lui parvenu à extraire de l'ADN procaryotique d'échantillons de fumeurs profonds. Une exploitation rapide des échantillons ainsi qu'une technique efficace de broyage et de filtration des échantillons lui a permis de disposer de suffisamment d'ADN pour réaliser des amplifications et des clonages. Il a observé une très forte diversité de séquences archaéennes se répartissant parmi des phylums déjà détectés dans les sources profondes (Archaeoglobales, Methanoccoccales) mais aussi parmi de nombreux nouveaux phylums dont certains sont associés aux Euryarchaeota, aux Crenarchaeota et aux Korarchaeota. De manière très surprenante aucune Thermoccoccales n'a été détectée durant ces études.

Les conditions extrêmes de température, de pression ainsi que les forts gradients physico- chimiques observés dans des écosystèmes hydrothermaux profonds font de ces sites des candidats idéaux pour les études moléculaires de la diversité. Jusqu'à présent les résultats obtenus laissent augurer une diversité très abondante qui ne dément pas le qualificatif "d'oasis" qui avait été attribué aux sources il y a 20 ans.

4.5 Les sites hydrothermaux continentaux et côtiers

4.5.1 Description des biotopes

4.5.1.1 Les sites terrestres D'une manière analogue aux systèmes profonds, les systèmes continentaux et côtiers sont liés à la rencontre d'eau d'infiltration avec le magma profond. Le parcours de cette eau dans la croûte terrestre va conditionner sa composition chimique et sa forme d'émergence (fumerolles, geysers, mares de boues acides ou basiques). S'il s'infiltre une faible quantité d'eau, celle ci va s'échapper sous la forme de fumerolles comme c'est le cas à Pozzuoli en Italie. Mais souvent ces émissions sont associées à une activité hydrothermale plus diversifiée. Ainsi, aux fumerolles placées en haut des collines sont souvent associés des geysers et des sources chaudes situées quant à elles dans la partie basse du bassin. Les fumerolles et les geysers (cf. figure 2.15) correspondent à l'émission d'un fluide très minéralisé qui a traversé profondément la croûte terrestre et qui ressort violemment à 100°C dans le cas des geysers ou qui recircule sur de longues distances dans la lithosphère pour ressortir sous Photos ParkVision. Figure 2.15. Old Faithfull Geyser (à droite) et formes de vapeurs (fumerolles). fumerolles (en haut) au parc de Yellowstone (USA).

Il existe deux formes de sources chaudes , en fonction du type de

89 Les habitats microbiens minéraux dont se sera chargé le fluide en traversant la lithosphère. S'il est chargé en acide sulfurique le pH sera de 1 à 2,5. S'il est par contre chargé en carbonate ou en bicarbonate il sera de l'ordre de 6,3 à 10,2. Dans les sources acides (cf. figure 2.16), on relève une forte concentration en soufre et en fer mais une très faible minéralisation (l'eau n'a pas pénétré profondément dans le sol). Les gaz volcaniques qui s'échappent de la

source sont chargés en H2, CO2, H2, H2S, CO et NH3. En arrivant au contact de l'air les sulfures sont oxydés en S°. Cette oxydation est poursuivie par les bactéries soufre- oxydantes qui produisent alors de l'acide sulfurique Figure 2.16. Bassin de boues acides dans le Upper Geyser Bassin. Photos ParkVision. Yellowstone (USA) H2SO4. Il peut se former de manière concomitante des mares de boues acides. Elles seront très acides en surface (pH 0,5 à 4) et anoxiques et plus basiques en profondeur. Elles ne constituent pas par contre un biotope stable car les eaux de pluie modifient très régulièrement leur pH. Les sources alcalines correspondent à des eaux ayant circulé en profondeur dans la croûte terrestre (cf. figure 2.17). Très chargées en minéraux qui vont se solidifier au contact de l'air, elles constituent un biotope très stable car les eaux de profondeur les alimentent régulièrement et tamponnent les effets liés aux eaux de pluie. Ces écosystèmes sont caractérisés par la présence d'amas bactériens très stratifiés. Les sources du parc de Yellowstone ont fait l'objet d'études très Figure 2.17. Fountain Paint Pot Photo Park Vision. poussées et de suivis réguliers dont des synthèses ont Yellowstone (USA) été proposées récemment par D. Ward et al. (1998) et par Reysenbach (en préparation).

4.5.1.2 Les sites côtiers On observe des sites hydrothermaux à faible profondeur sur les côtes de l'île Vulcano en Italie et à proximité des côtes Islandaises (cf. figure 2.18). Comme dans les sites profonds on peut

retrouver des petites cheminées émettant un fluide chargé en H2S mais on peut aussi observer le fluide qui percole parmi les sédiments ou le sable. Les températures sont alors proches de 100°C mais ne peuvent atteindre de très fortes valeurs du fait de la faible pression hydrostatique. Figure 2.18. Emissions côtières sur le site de Vulcano. Source site web de la municipalité de Vulcano. Il existe aussi un hydrothermalisme lacustre. Certains lacs situés sur les failles actives sont le

90 Les habitats microbiens siège de phénomènes d'hydrothermalisme. Le fluide hydrothermal peut percoler aux travers de sédiments à faible température ou sortir à des températures plus élevées en édifiant de petites cheminées.

4.5.2 Les micro-organismes des sites côtiers et continentaux

Les sites hydrothermaux côtiers et terrestres ont fait l'objet de nombreuses études. En effet leur facilité d'accès (par rapport aux sites océaniques profonds)24 permet de réaliser des suivis et des collectes d'échantillons d'une manière beaucoup plus simple donc beaucoup plus fréquente. Ceci explique en partie la grande diversité de souches isolées aussi bien de milieux marins que terrestres. De plus les isolements réalisés en surface ou proches de la surface permettent d'accéder à une communauté aérobie ou micro-aérophile sûrement moins abondante dans les gisements profonds. Il ne semble pas qu'il y ait des genres particulièrement inféodés aux milieux terrestres et d'autres aux milieux marins. En effet, de nombreuses souches ont été retrouvées de manière ubiquitaire dans des sources côtières après avoir été décrites dans des sources continentales. Seules certaines sulfothermophiles acidophiles n'ont pu être isolées de milieu marin.

4.5.2.1 Les souches mésophiles marines et continentales Les souches mésophiles observées dans les écosystèmes marins côtiers sont les mêmes que celles observées en milieux profonds. On retrouve notamment des bactéries sulfo-oxydantes associées aux genres Beggiatoa et Thioplaca (Hoaki et al., 1994, 1995) et de nombreuses hétérotrophes (Gugliandolo et Maugeri, 1998). Dans certains sédiments on retrouve la communauté microbienne associée aux sédiments froids (BSR, méthanogènes, dénitrifiantes, voir § 4.3.1).

En milieu terrestre le facteur de dilution observé en milieu marin n'a pas cours. Les écosystèmes sont beaucoup plus stables et sont aussi beaucoup moins étendus. Les écosystèmes terrestres chauds ne vont donc être colonisés que par de pures thermophiles (modérées à hyperthermophiles).

4.5.2.2 Les souches thermophiles marines et continentales. Les écosystèmes terrestres tels que ceux observés au Parc de Yellowstone aux USA constituent les premiers milieux d'étude des micro-organismes thermophiles. En 1964 Thomas Brock se rend pour la première fois au Parc de Yellowstone afin d'isoler des représentants du genre Thiotrix. Les relevés de température qu'il réalise l'incitent à rechercher des micro-organismes capables de se développer aux températures observées in situ. En 1965 il observe et tente de cultiver de longs filaments roses, particulièrement abondants à la sortie du fluide et dans un bassin qui deviendra par la suite un bassin de référence pour les études microbiologiques : l'Octopus Spring25 (Brock, 1995). Si la

24 Les sites côtiers ne nécessitent pas de submersibles et sont souvent accessibles par de simples plongeurs. 25 Cette source fait la couverture de la 8éme édition de "Biology of Microorganisms" de T. Brock.

91 Les habitats microbiens position phylogénétique de ces filaments a été définie en 1994 (Reysenbach et al., 1994) ces derniers vont rester incultivables jusqu'aux travaux de l'équipe de Stetter (Huber et al., 1998b) qui va mettre au point une chambre de culture recréant les conditions de croissance in situ, notamment en recréant les surfaces permettant la fixation des filaments exposés à un flux chaud de nutriments, et va utiliser des pinces optiques pour isoler spécifiquement les micro-organismes qui seront remis en culture par la suite. Mais l'une des découvertes majeures réalisée à Yellowstone est l'isolement en 1966 de Thermus aquaticus qui deviendra en 1980 la source de l'enzyme clé de la biologie moléculaire la Taq polymérase (Brock et Freeze, 1969 puis Saiki et al., 1985, 1989).

Le tableau 2.9 présente l'ensemble des bactéries thermophiles isolées de sites terrestres et côtiers.

Tableau 2.9. Bacteria isolées de sites hydrothermaux terrestres et côtiers Domaine Genres Optimum Origine Type Références BACTERIA (°C) Respiratoire Acidothermus sp. 55 t aérobie Mohagheghi et al., 1986 Aquifex sp. 85 m microaérobie Huber et al., 1992 Alicyclobacillus (=Bacillus) 60-80 t/m aérobie (Darland et Brock 1971) Wisotzkey et al., 1992. Calderobacterium 75 t aérobie Kryukov et al., 1983 Chloroflexus 50 t aérobie Pierson et Castenholz,1974 Fervidobacterium 70 t anaérobie Patel et al., 1985 Hydrogenobacter 70-75 t aérobie Kawasumi et al., 1984 Miothermus 60-70 t aérobie Chung et al., 1997 Moorella 60 t ananérobie Slobodkin et al., 1997a Rhodothermus 65 m aérobie Alfredsson et al., 1988 Synechococcus 65 t aérobie Thermoanaerobacter ium 60 t anaérobie Schink et Zeikus, 1983 Thermoanaerobacter 65 t anaérobie Zeikus et al., 1979 Thermobrachium 55 t anaérobie Engle et al., 1996 Thermocrinis 80 t aérobie Huber et al., 1998b Thermodesulfobacterium 70 t anaérobie Zeikus et al., 1983 Thermodesulfovibrio 60 t anaérobie Henry et al., 1994 Thermoleophilum 60 t aérobie Zarilla et Perry, 1986 Thermomicrobium 73 t aérobie Jackson et al., 1973 Thermonema 60 t aérobie Hudson et al., 1989 Thermosipho 75 m anaérobie Huber et al., 1989b Thermosyntropha 60 t anaérobie Svetlitshnyi et al., 1996 Thermoterrabacterium 65 t anaérobie Slobodkin et al., 1997b Thermothrix 72 t anaérobie Caldwell et al., 1976 Thermotoga 80 m anaérobie Huber et al., 1986 Thermus 60-70 t aérobie Brock et Freeze, 1969 t: terrestre; m: marine cotière, Acido: acidophile

D'une manière analogue le tableau 2.10 présente l'ensemble des souches d'Archaea thermophiles isolées d'environnements hydrothermaux terrestres et côtiers.

92 Les habitats microbiens

Tableau 2.10. Archaea isolées de sites hydrothermaux terrestres et côtiers. Domaine Genres Optimum Origine Type Références ARCHAEA (°C) Respiratoire Euryarchaeota Thermococcales Thermococcus 80-90 t,m anaérobie Zillig et al., 1983b Pyrococcus 95-100 m anaérobie Fiala et Stetter , 1986. "Aphrodite" m anaérobie Arab,1999 (result. non pub.) Archaeoglobales Archeaoglobus 83 t,m anaérobie Stetter, 1988 Ferroglobus 85 m anaérobie Hafenbradl et al., 1996 Méthanococcales Methanococcus 65 m anaérobie Huber et al., 1982 Méthanobactériales Methanobacterium 55-65 t anaérobie Winter et al., 1984 Methanothermus 83-88 t anaérobie Stetter et al., 1981 Thermoplasmales Thermoplasma 59 t,m Acido, aérobie Darland et al., 1970 Picrophilus 60 t Acido, aérobie Scleper et al., 1995 Crenarchaeota Thermoprotéales Thermoproteus 88-90 t anaérobie Zillig et al., 1981 Thermofilum 80-88 t anaérobie Zillig et al., 1983a. Pyrobaculum 100 t, m anaérobie Huber et al., 1987 Thermocladium 75 t anaérobie Itoh et al., 1998 Désulfurococcales Desulfurococcus 85-90 t anaérobie Zillig et al., 1982 Staphylothermus 92 m anaérobie Fiala et al., 1986 Stetteria 93 m anaérobie Jochimsen et al., 1998 Sulfolobales Sulfolobus 65-87 t Acido, aérobie Zillig et al., 1980 Sulfurisphaera 85 t Acido, aérobie Kurosawa et al., 1998 Stygiolobus 80 t Acido, aérobie Segerer et al., 1991 Mettalosphaera 75 t Acido, aérobie Huber et al., 1989a Sulfurococcus 70-75 t Acido, aérobie Karavaiko et al., 1994 Desulfurolobus 81 t Acido, aérobie = Acidianus sp. Acidianus 70-90 t, m Acido, aérobie Segerer et al., 1985 Pyrodictiales Pyrodictium 80 m anaérobie Stetter et al., 1983 Hyperthermus 95-106 m anaérobie Zillig et al., 1990 non-classés Aeropyrum 90-95 m aérobie Sako et al., 1996 Caldococcus t Aoshima et al., 1996 Igneococcus t Burggraf et al., 1997 Sulfophobococcus 90 t anaérobie Hensel et al., 1997 Thermodiscus 93 m Burggraf et al., 1997 Thermosphaera 85 t anaérobie Huber et al., 1998a t: terrestre; m: marine côtière, Acido: acidophile

Au sein de nombreux écosystèmes terrestres, notamment les sources chaudes à pH neutre, on retrouve comme producteurs primaires des thermophiles modérés bactériens réalisant la photosynthèse. Ces bactéries appartiennent aux cyanobactéries du genre Synechococcus ou Mastigocladus et des bactéries vertes non sulfureuses (GNS) du genre Chloroflexus.

4.5.2.3 L'apport des techniques moléculaires

Sur les sites hy drothermaux côtiers

D'une manière analogue aux sites profonds, très peu d'études ont été réalisées afin de déterminer la diversité microbienne des sites côtiers par des méthodes moléculaires. Les sources étudiées jusqu'à présent sont des sources situées à proximité des côtes japonaises ou près des îles grecques. Yamamoto et al. (1998) ont étudié la diversité microbienne d'enchevrêtrements bactériens soufrés par séquençage de l'ADNr 16S cloné et par hybridation in situ. Ils observent :

93 Les habitats microbiens

- qu'il n'est pas possible d'amplifier de l'ADN archaéen, - que les banques de 16S diffèrent selon qu'elles sont construites à partir du lysat brut ou de l'ADN purifié du lysat (diversité plus abondante dans le dernier cas), - que ces séquences bactériennes sont majoritairement (40 à 68 %) associées aux Aquificales. Les autres séquences correspondent à des Firmicutes et à des Proteobacteria (a , b et g). Cette étude a été complétée récemment par une analyse des profils quinoliques indiquant que lorsque la température du tapis bactérien augmente sa diversité décroît (Hiraishi et al., 1999).

Les travaux de Takai et Sako (1999) ont porté sur des sources terrestres et côtières en réalisant des banques de séquences archaéennes et universelles. Dans le cas des sources marines (fluide chaud : 128°C), l'ensemble des séquences isolées des banques universelles correspond à des Bacteria se répartissant parmi des Pseudomonas, des bactéries fixatrices d'azote (Bartonella, Rhizobium, Agrobacterium)26 et des hyperthermophiles (Aquifex). Les séquences archaéennes se répartissent parmi les Euryarchaeota hyperthermophiles (Thermococcales) et les Crenarchaeota proches de représentants isolés (Pyrolobus, Pyrodictium, Stetteria) ou proches du groupe I de Crenarchaeota marines. Mais l'un des plus intéressants résultats est la détection en milieu marin de séquences associées aux Korarchaeota détectées jusqu'à présent uniquement dans des sources terrestres (voir plus loin). Les séquences provenant d'échantillons de sédiments hydrothermaux sont réparties essentiellement autour des Archaea marines du groupe I, de Proteobacteria et des Firmicutes à bas G+C%.

Enfin Dando et al. (1998) décrivent la composition microbienne de sédiments chauds sur le site de la baie de Palaeochori sur l'arc volcanique grec. Ils ont réalisé des enrichissements d'hyperthermophiles coccoïdes anaérobies correspondant à de nouveaux genres : Stetteria (Jochimsen et al., 1997) et "Aphrodite" (Arab, 1999 result. non pub.) et de bactéries aérobies proches des genres Bacillus, Achromatium et Thioplaca. Des amplifications ont été réalisées à l'aide d'amorces spécifiques des Archaea et des Crenarchaeota conduisant à l'identification de séquences associées aux genres Staphylothermus, Desulfurococcus, Thermodiscus, Thermosphaera, Stetteria et Sulfofobococcus ainsi qu'à des séquences correspondant à de nouvelles lignées archaéennes.

Sur les sites continentaux

Une abondante littérature décrit l'utilisation des techniques moléculaires afin d'identifier la flore microbienne associée aux sources hydrothermales et notamment aux sources du parc de Yellowstone. Ces techniques ont permis non seulement d'étudier la composition de la communauté microbienne mais de suivre l'évolution de cette communauté dans le temps et dans l'espace. Ward et al. (1992, 1997, 1998) ont proposé un historique des travaux réalisés dans leur laboratoire, qui ont

26 Il attribue ces deux premiers types de micro-organismes à des contaminants non représentatifs de la communauté hydrothermale comme l'avait suggéré Tanner et al. (1998).

94 Les habitats microbiens porté essentiellement sur l'étude des tapis bactériens. Ces travaux ont été complétés par ceux de l'équipe de Pace qui a travaillé sur des échantillons de sédiments prélevés dans un autre bassin.

Figure 2.19. Octopus Spring Figure 2.20. Obsidian Pool Photos : N. Pace http://crab2.berkeley.edu/~pacelab/

La première étude a porté sur l'analyse de l'ARNr 5S (Stahl et al., 1985) sur le bassin d'Octopus Spring (cf. figure 2.19). Les auteurs décrivent alors 3 phylotypes dominants : un premier associé aux Crenarchaeota soufre-dépendantes et deux autres associés aux Bacteria proches du genre Thermus. Cette étude a été suivie dans le laboratoire de Ward d'une analyse des ADNr 16S d'un tapis cyanobactérien (Ward et al., 1990 a et b; Weller et al., 1992) en utilisant différentes techniques de clonage moléculaire. Ces travaux ont conduit à la description de nouvelles séquences associées aux cyanobactéries et aux GNS. Conjointement aux travaux de séquençage, des essais d'isolement furent entrepris afin d'identifier les bactéries associées aux séquences de clones (Nold et al., 1996) ainsi que

14 des essais d'incorporation de CO2 pour étudier les mécanismes photosynthétiques en fonction du cycle nycthéméral (Nold et Ward, 1996). La mise au point de sondes spécifiques des cyanobactéries et des GNS cultivées et non cultivées (Ruff-Roberts et al., 1994) permet de mettre en évidence les biais liés aux méthodes culturales (l'espèce cultivée n'est pas l'espèce la plus abondante dans le milieu et elle est sélectionnée dans différents échantillons). Puis, par des techniques de dilutions successives de l'inoculum avant l'enrichissement, il a été possible d'isoler pour la première fois un micro-organisme correspondant à une séquence d'ADNr 16S préalablement clonée (Ferris et al., 1996b). La technique de DGGE a été utilisée afin d'identifier la communauté microbienne colonisant différents gradients de température au sein du tapis microbien (Ferris et al., 1996a). Il a ainsi été possible d'observer une grande diversité de séquences toutes associées au cyanobactéries ou aux GNS. Cette diversité pourrait correspondre à une adaptation de l'espèce en fonction des températures du biotope. La DGGE a par ailleurs été utilisée afin de détecter les modifications dans la communauté microbienne : (I) lors d'un enrichissement (Santegoeds et al., 199627; Ward et al., 199728), (II) lors des changements de saisons29 (Ferris et Ward, 1997), (III) lors d'une modification du milieu30 (Ferris et al., 1997).

27 Il est par ailleurs observé que de nouvelles séquences sont détectées après enrichissement alors que celles-ci n'avaient pas été détectées ni par isolement ni par clonage direct. 28 L'accent est mis cette fois ci sur le choix de la température d'isolement. A forte température, des souches de Thermus sont préférentiellement isolées alors qu'elles ne représentent qu'une très faible proportion de la communauté microbienne présente dans l'échantillon dans cette gamme de température. 29 Il n'y a pas à proprement parler de succession de populations mais une adaptation des souches à différentes gammes de températures. Certains phylotypes semblent accroître puis restreindre, au cours de l'année, leur gamme de température.

95 Les habitats microbiens

L'ensemble des résultats obtenus sur le site d'Octopus Spring a été synthétisé récemment permettant aux auteurs d'apporter un regard critique sur leur approche polyphasique de la diversité (Ward et al., 1998). Au sein de l'équipe de Pace, Reysenbach et al. (1994) s'attachent à une description phylogénétique de la communauté bactérienne associée aux filaments roses du bassin d'Octopus Spring. Ils observent 3 phylotypes majeurs se répartissant au sein des Thermotogales (1) et au sein des Aquificales (2). Barns et al. (1994) vont travailler sur la source Jim's Black Pool (appelée maintenant Obsidian Pool, cf. figure 2.20). Après amplification des ADNr 16S archaéens ils observent une grande diversité de séquences associées à la fois à des Crenarchaeota soufre-dépendantes et à des Euryarchaeota. Un nouveau groupe de séquences enraciné très profondément à la base de l'arbre archaéen est aussi détecté (Barns et al., 1996a). Il sera décrit plus tard comme un nouveau domaine : les Korarchaeota (Barns et al., 1996b). Il n'a pas été possible jusqu'à présent d'isoler des représentants de ce domaine. Brunk et Eis (1998) sont toutefois parvenus à maintenir un enrichissement en activité dans un chemostat et à étudier les mécanismes d'amplification spécifique des séquences d'ADNr 16S korarchaéennes en fonction du type d'amorces utilisées. Les travaux de Barns ne portant que sur des amplification archaéennes, Hugenholtz et al. (1998a) présentent par la suite les amplifications réalisées à l'aide d'amorces bactériennes et universelles. D'une manière surprenante les banques universelles ne contiennent pas de séquences archaéennes (alors que Barns en avait détecté précédemment) mais elles contiennent par contre une grande diversité de séquences bactériennes. Ces dernières se répartissent, pour 70% d'entre elles, dans 14 des 24 divisions bactériennes couramment reconnues : parmi celles ci on retrouve des groupes thermophiles dont la présence s'explique dans un tel environnement (Aquificales, Thermotogales, Thermus) mais aussi des séquences correspondant à des divisions plus mésophiles (Proteobacteria, Firmicutes haut G+C%, Cytophagales, etc.). Les 30% de séquences bactériennes restantes forment 12 nouvelles divisons dans l'arbre bactérien au sein desquelles aucun représentant n'a été jusqu'à présent isolé. Hugenholtz et al. (1998b) proposent donc une nouvelle version de l'arbre bactérien se répartissant en 36 divisions dont seulement 23 présentent des représentants isolés. A la lumière de l'ensemble des résultats obtenus sur les sites hydrothermaux terrestres de Yellowstone, il est évident que les études menées par des techniques culturales et non-culturales ont considérablement accru nos connaissances de cet écosystème. Il est, dans bien des cas, possible de répondre aux questions de la composition, de la structure, et de la fonction des différentes populations de micro-organismes se développant dans cet environnement simple et stable. Si de nombreuses questions restent encore en suspens concernant le type métabolique de certaines séquences uniquement détectées par clonage et les relations que l'on peut établir entre les distances phylogénétiques et les distances géographiques, Ward et al., (1998) nous démontrent la puissance de l'approche polyphasique et pluridisciplinaire en écologie microbienne.

30 Cette approche a consisté à retirer les premiers centimètres de cellules à la surface d'un mat. Cette étude est complémentée par 14 l'utilisation de microélectrodes à O2 et par des mesures d'assimilation du CO2. Il est alors possible de suivre les successions de populations lors de la colonisation du mat ainsi que leur métabolisme.

96 Les habitats microbiens

V La flore microbienne liée à l'Homme, aux animaux et à l'activité humaine

5.1 L'Homme comme écosystème microbien

L'homme constitue un environnement favorable à la croissance microbienne31. C'est un "milieu" constant physiquement (pH, température, pression osmotique) et riche en nutriments (matière organique, facteurs de croissance). Les micro-organismes colonisent donc de nombreux compartiments (la peau, les cavités buccale et vaginale, le tractus digestif, les voies respiratoires) à l'exception du sang, des organes et des voies urinaires32. Mais c'est aussi un "milieu" hétérogène où des compartiments de composition chimique particulière ont sélectionné certains organismes ayant développé des mécanismes de résistance aux systèmes de défense de leur hôte (les lactopéroxydases et les lysozymes de la salive, l'acide lactique des sécrétions cutanées, la bile et l'acidité du tractus digestif). L'étude de la flore microbienne est importante car on peut ainsi détecter des modifications lors d'infections, en déduire la source de contamination et mieux saisir (voir induire) les mécanismes immunitaires de défense.

5.1.1. La flore de la cavité buccale

(d'après Marsh et Bradshaw, 1995; Madigan, 1996) C'est un environnement complexe et hétérogène, il est constitué de surfaces lisses et crevassées baignées dans la salive (qui contient des nutriments mais aussi des anti-bactériens). Les dents sont constituées de structures minérales comme l'émail (cristaux de phosphate de calcium formant une matrice enrichie en fluor qui limite les processus de dégradation) et de structures "vivantes" comme la dentine et la pulpe. Certains micro-organismes forment des plaques qui se développent comme des films à la surface de la dent. Cette colonisation correspond à une succession de populations de micro- organismes. Dans un premier temps les glycoprotéines de la salive créent un film fin de matière organique à la surface des dents sur lequel des Streptoccocus (S. sanguii, S. sorbinus et S. miltis) forment des microcolonies. Par la suite des bactéries filamenteuses (Fusobacterium et Spirochètes) contribuent à l'épaississement de la plaque. Si aucun brossage n'intervient, des germes anaérobies peuvent s'installer, principalement des Actinomycètes. Si la plaque dentaire n'est pas détruite régulièrement, l'acide lactique produit par les bactéries conduit généralement à la formation de caries par décalcification de l'émail. Deux micro-organismes sont impliqués dans la formation des caries. S. mutans produit à partir des sucres contenus dans

31 Chez l'homme ont dénombre 1014 cellules bactériennes pour 1013 cellules purement humaines. 10% du poids de l'homme serait d'origine bactérienne et 1/3 des fèces sont constituées de bactéries. 32 Ceux-ci ne sont colonisés qu'en cas d'infection.

97 Les habitats microbiens l'alimentation d'importants réseaux de polysaccharides (dextran) qui favorisent la fixation de S. sorbinus qui lui utilise les sucres pour produire de l'acide lactique. Enfin certains micro-organismes (Bacteroides gingivalis) peuvent former une plaque à la base de la dent. Ils produisent une protéase qui peut conduire à une inflammation, puis une nécrose des tissus de la gencive et à un déchaussement des dents.

5.1.2. Les micro-organismes du tractus digestif

Le tractus digestif est constitué de trois parties principales : l'estomac, le petit intestin (duodénum, jéjunum, iléon) et le gros intestin (ou colon) (cf. figure 2.21).

Pricipales bactéries Organe détectées Oesophage

Lactobacilles Estomac

Duodénum Enterococcus Lactobacilles Jéjunum

Enterobactéries Petit intestin Bacteroides Iléon Enterococcus faecalis Bifidobacterium Eubacterium Peptonococcus Colon Ruminococcus Peptonostreptococcus

Clostrium Gos intestin Lactobacilles Anus

Figure 2.21. Micro-organismes du tractus digestif (d'après Madigan, 1996)

L'estomac est un milieu particulièrement agressif. Les sucs gastriques à un pH proche de 2 sont constitués d'HCl et de nombreuses enzymes digestives qui constituent une barrière efficace contre les germes pathogènes (l'estomac est lui même protégé des sucs par une épaisse couche de mucus). L'estomac est toutefois colonisé par de nombreux micro-organismes Gram + tels que des Lactobacillus et des Streptococcus. Cette colonisation fluctue avec l'âge, l'alimentation et l'état de santé de l'individu. L'un des germes pathogènes le plus fréquemment étudié est Helicobacter pylori. Cette Proteobacteria e micro-aérophile utilise l'urée contenue dans la salive et les sucs gastriques, la convertit en ammoniaque et carbonate33 (base fortes) et contrecarre les effets de l'acidité stomacale. H. pylori pénètre alors dans le mucus et produit des cytotoxines qui détruisent les cellules mucosales. Sans mucus l'acidité naturelle de l'estomac et les pepsines contribuent à la formation des ulcères.

33 + - CO(NH2)2 + H +2H2O --uréase--> HCO3 + 2(NH4)

98 Les habitats microbiens

Dans le petit intestin le pH et la densité microbienne vont s'accroître au fur et à mesure que l'on s'éloigne de l'estomac. On peut atteindre des densités de 105-107 bactéries.g-1. Dans le gros intestin la colonisation microbienne est très importante. Elle atteint 107 cellules.g-1 pour les micro-organismes aérobies jusqu'à 10 10-1011 cellules.g-1 pour les anaérobies. Le tractus digestif d'un nouveau né est stérile. Par la suite des micro-organismes pionniers colonisent cet environnement, le modifient et permettent la mise en place d'une seconde flore qui prend la place des pionniers.34 A la naissance cette flore est essentiellement constituée de Bifidobacterium puis la modification du régime alimentaire entraîne l'apparition d'une nouvelle flore intestinale incluant un grand nombre de genres fermentatifs comme Clostridium, Bacteroides, Enteroccocus et les coliformes mais aussi des Archaea méthanogènes, des bactéries sulfato-réductrices et acétogènes (Pochart et al., 1992; Bernalier et al., 1996; Morvan et al., 1996)

5.1.3 L'apport des techniques moléculaires en microbiologie humaine

La flore microbienne associée à l'homme a été intensivement étudiée par des techniques de culture et jusqu'à présent très peu de travaux ont abordé l'étude de la diversité par une approche moléculaire. On estime toutefois que pour cet environnement entre 20 et 40% des micro-organismes ont échappé aux méthodes culturales (Suau et al., 1999). Les techniques moléculaires ont par contre été mises à profit pour détecter spécifiquement certains germes commensaux ou le plus souvent pathogènes. En microbiologie clinique la recherche de germe spécifiques prime souvent sur l'écologie et de nombreuses techniques de détection par PCR à l'aide d'amorces spécifiques du genre, de l'espèce, de la sous-espèce ou d'un biovariant ont été décrites pour étudier la flore pathogène comme la flore indigène (Schmidt et Relman, 1994; Dzik, 1995; Whelen et Persing, 1996). Certaines techniques ont toutefois été développées afin d'extraire l'ADN procaryotique de tissus particuliers comme la plaque dentaire (Parrish et Greenberg, 1995) ou les gencives (Smith et al., 1989 a et b).

Sur la flore de la cavité buccale, jusqu'à présent, une seule étude a été réalisée pour étudier la diversité microbienne d'un abcès dentaire par amplification de l'ADNr 16S bactérien et séquençage (Dymock et al., 1996). Ce travail a été approfondi par une étude plus précise de trois phylotypes (préalablement détectés) dans des tissus de patients sains et malades par amplification à l'aide d'amorces de PCR spécifiques (Harper-Owen et al., 1999). Au sein du même laboratoire une étude similaire a porté sur l'amplification spécifique d'ADNr 16S codant pour le genre Eubacterium suivi d'un séquençage (Spratt et al., 1999). Une tentative de quantification bactérienne par PCR compétitive de la flore buccale a récemment été entreprise (Rupf et al., 1999). Mais la majeure partie des études entreprises sur la flore buccale consiste à détecter par PCR des germes connus à l'aide d'amorces

34 Chez la souris Flavobacterium, Lactobacillus et entérococci sont les micro-organismes pionniers. Flavobacterium disparaît au bout de 8 jours et Lactobacillus au bout de 18; Bacteroides (anaérobies stricts) apparaît par la suite et domine la communauté.

99 Les habitats microbiens spécifiques définies sur l'ADNr 16S. Pour exemple : Helicobacter pylori (Nguyen et al., 1993; Wahlfors et al., 1995), Treponena sp. (Willis et al., 1999), Spirochètes incultivables (Choi et al., 1994), Eikenella corrodens et Actinobacillus actinomycetemcomitans (Furcht et al., 1996). Des sondes oligonucléotidiques ont été utilisées pour détecter des Bacteroides forsythus sur des extraits d'ADN buccaux (Moncla et al., 1991). La diversité de la flore intestinale a été étudiée par culture et extraction de l'ADN total suivi de l'amplification et du séquençage des gènes d'ADNr 16S bactériens par Wilson et Blitchington (1996). Cette étude révèle à la fois la différence obtenue entre les deux méthodes (certaines séquences sont abondantes dans la banque d'ADNr 16S mais sont absentes dans les cultures et inversement) et le biais produit par la PCR (la diversité phylogénétique est bien plus importante après 9 cycles de PCR qu'après 35 cycles). La majorité des séquences détectées sont associées à des genres ou des espèces communément enrichies dans la flore intestinale (Bacteroides, Clostridium). Une étude plus récente menée par Suau et al. (1999) obtient des résultats similaires. Quatre-vingt quinze pour cent de la banque de clone sont associés à trois groupes phylogéniques (Bacteroides, Clostridium coccoides, C. leptum), mais seuls 24% de la banque sont clairement associés à des espèces isolées. Wang et al. (1996) quantifient quant à eux les principaux germes anaérobies retrouvés dans les flores intestinales animales par des techniques de dilutions successives suivies de PCR à l'aide d'amorces spécifiques de certaines espèces. Des approches fondées sur l'emploi d'un grand nombre de sondes nucléotidiques (domaine spécifique et orientées vers la flore anaérobie) (Franks et al., 1998) et sur l'emploi de la TGGE (Zoetendal et al., 1998) ont aussi été utilisées. Enfin d'une manière similaire à la flore buccale, beaucoup de publications décrivent la détection par PCR d'espèces ou de genres spécifiques à l'aide d'amorces ou de sondes dessinées sur l'ADNr 16S (cf. revue de Whelen et Persing, 1996). Des articles récents ont mis à profit la puissance de la détection PCR pour analyser des septicémies anciennes dans des tissus conservés dans le formol : Ø infection de 1979, individus susceptibles d'avoir été infectés par des "armes biologiques" (Bacillus anthracis; Jackson et al., 1998b), Ø infection de 1997, dans des tissus d'animaux ayant été tués par le charbon (Patra et al., 1998), Ø infection datant des 16 eme et 18 eme siècles, dans des restes de pulpe dentaire sur des squelettes d'individus probablement morts de la peste (Yersinia pestis; Drancourt et al., 1998), Ø infection datant de 1918, dans des tissus de foie d'individus ayant été tués lors de l'épidémie de grippe espagnole (Reid et al, 1918). Des études similaires à celles réalisées sur la flore buccale et intestinale ont été effectuées sur la flore pathogène pouvant infecter le liquide cérébro-spinal (Greisen et al., 1994) et sur les micro- organismes impliqués dans les infections chroniques de la prostate (Tanner et al., 1999).

5.2 La flore microbienne associée aux autres animaux

Les micro-organismes entretiennent des relations avec un grand nombre d'Eucarya : protozoaires, animaux comme végétaux. La microbiologie classique a permis de résoudre nombre des

100 Les habitats microbiens relations qui peuvent être de nature commensale, mutualiste ou parasitaire. Mais certaines relations mettent en jeu des mécanismes de symbiose très stricts que des techniques d'étude uniquement culturales ne peuvent résoudre. Les techniques moléculaires ont donc permis d'accéder à la diversité des micro-organismes impliqués dans ces relations, je me propose dans ce chapitre d'en décrire certaines. Mollusques, Eponges et Holoturies : Les travaux sur la communauté symbiotique des mollusques hydrothermaux ont été décrits précédemment (cf. § 4.4.3). On peut toutefois citer des travaux similaires effectués sur des mollusques prélevés dans des environnements tropicaux côtiers (Distel et al., 1991; Durand et al., 1996; Gros et al., 1996; Krueger et Cavanaugh, 1997). Les travaux de Preston et al. (1996) sur les Eponges et ceux de Mc Innerney et al. (1995) sur les Holoturies ont été décrits plus haut (cf. § 4.2.2.1). Les travaux de Preston ont été poursuivis par la construction d'une banque fosmidique d'ADN génomique permettant d'accéder à des gènes fonctionnels comme le gène de l'ADN polymérase (Schleper et al., 1997b) mais aussi aux micro- hétérogénéités au sein de l'opéron ADNr (Schleper et al., 1998). Insectes : De nombreux insectes présentent de fortes relations symbiotiques avec les micro-organismes. Ces derniers sont très souvent retrouvés dans le tractus digestif de ces animaux (Cazemier et al., 1997). Les micro-organismes contenus dans l'estomac des termites ont été très étudiés. En effet cette communauté conditionne chez cet Arthropode la digestion des composés à base de cellulose et, à une échelle réduite, peut être comparée au fonctionnement du rumen chez un grand nombre de ruminants. Jusqu'à présent très peu d'isolats ont pu être obtenus; les informations dont on dispose proviennent d'études réalisées à l'aide de microélectrodes (Brune, 1998) ou d'amplifications des gènes d'ADNr 16S à partir d'extrait d'estomac : Ø du termite Reticulitermes speratus par analyse de l'ADNr 16S (Ohkuma et Kudo, 1996); de l'ADNr 16S, du gène mcr et du gène NifH (Kudo et al., 1998), Ø du termite Cryptotermes domesticus (Ohkuma et Kudo, 1998), Ø du termite Reticulitermes speratus par T-RFLP (Liu et al., 1997) Ø du termite Reticulitermes speratus par analyse de l'ADNr 16S et hybridation in situ de la communauté archaéenne (Shinzato et al., 1999), Ø des symbioses entre les méthanogènes et R. speratus (Ohkuma et al., 1995) et chez d'autres termites (Ohkuma et al., 1999), Ø des termites Nasutitermes lujae (spirochètes incultivables, Paster et al., 1996), et de Mastodermes darwiniensis (spirochètes incultivables, Brechtold et König, 1996), (flore totale par hybridation in situ, Bertchold et al., 1999) Ø et des protozoaires de l'estomac de R. speratus par analyse de l'ADNr 18S (Ohkuma et al., 1998) et des facteurs d'élongation (Moriya et al., 1998). Des études similaires ont été réalisées sur les micro-organismes intestinaux de Criquets (Santo Domingo et al., 1998b). Il a même été possible d'étudier les bactéries associées à des insectes

101 Les habitats microbiens emprisonnés dans l'ambre depuis 25 à 40 millions d'années. Après la mise au point d'une technique efficace d'extraction d'ADN à partir d'échantillons anciens (Cano et Poinard, 1993), il a été possible de détecter par amplification et séquençage des Bacillus dans des échantillons d'insectes (Proplebeia dominicana) (Cano et al., 1994) puis de remettre en culture des spores de Bacillus provenant des mêmes échantillons (Cano et Borucki, 1995)35 ainsi que des Staphylococcus (Lambert et al., 1998). Récemment des isolements caractérisés par séquençage et FAME suivis d'une analyse moléculaire de la communauté totale d'échantillons d'ambre par T-RFLP a été entreprise (Greenblatt et al., 1999). Les résultats obtenus par ces deux méthodes sont cohérents mais il apparaît que les méthodes moléculaires peuvent être biaisées en raison de la forte dégradation des ADN dans de très vieux échantillons et par la présence d'inhibiteurs de la PCR. Chordés: Les micro-organismes du rumen ont été aussi intensivement étudiés que ceux des intestins humains, dans un premier temps par des techniques culturales puis par l'emploi de sondes nucléiques (Krause et Rusell, 1996a; Stahl et al., 1988). Dans un environnement stabilisé on peut observer des micro-organismes dégradant la cellulose (Bacteroides, Ruminococcus), les protéines (Veillonella), l'amidon (Selenomonas), et des producteurs de méthane (Methanobacterium). L'utilisation de sondes plus spécifiques a permis de suivre l'évolution de certaines espèces en fonction du régime alimentaire (Forster et al., 1996; Krause et Rusell, 1996b; Schofield et al., 1997). Récemment Tajima et al. (1999) ont étudié le rumen de vaches en amplifiant spécifiquement l'ADNr 16S bactérien à partir d'échantillons liquides et solides. Ils n'observent pas de différences avec les résultats obtenus par les méthodes de mise en culture : les Firmicutes à haut G+C% et les Cytophagales dominent dans les banques. Des techniques fondées sur l'analyse du G+C% de l'ADN total extrait de tractus digestifs de poulets a permis de suivre l'évolution de la flore intestinale entre le petit intestin et le cæcum (Apajalahti et al., 1998). Il n'est toutefois pas possible dans cette étude de définir précisément les genres des bactéries présentes dans l'échantillon. Angert et al. (1993) ont isolé par micromanipulation et séquençage le symbiote incultivable du poisson chirurgien. Epulopiscium fishelsoni était alors la plus grande bactérie connue (80 x 600 nm). Enfin la communauté intestinale du poisson (Platichthys flesus) a été étudiée après amplification et séquençage. Il a été possible d'y détecter des séquences associées aux Archaea marines du groupe II (van der Maarel et al., 1998), et des séquences associées aux methanogènes (van der Maarel et al., 1999). Autres: Les symbiotes d'Acanthamoeba spp. ont été étudiés aussi par amplification de l'ADNr 16S et séquençage (Fritshe et al., 1999). Ces organismes retrouvés de manière ubiquitaire dans le sol et l'eau se nourrissent de micro-organismes et sont des facteurs de dissémination de germes pathogènes notamment en milieu hospitalier.

35 Des études sur la flore intestinale de Mammouth ont été aussi réalisées mais elles consistaient uniquement en une mise en culture des souches retrouvées dans des restes d'intestins (vieux de 12000 ans) suivi d'un séquençage des isolats (Rhodes et al., 1998). On ne peut dans ce cas exclure la possibilité de contaminants.

102 Les habitats microbiens

Les micro-organismes associés aux algues ont été étudiés également par des techniques semblables chez Halophila stipulacea (Weidner et al., 1996) et chez des algues vertes de la classe des Charophyceae (Fisher et al., 1998).

Aux écosystèmes animaux, marins et terrestres naturellement colonisés par les micro- organismes, les activités humaines ont contribué à adjoindre de nouveaux biotopes dérivant de processus industriels de productions alimentaires ou chimiques (fermentation, bioconversion), de transformation des déchets (traitements biologique) ou d'extraction des minerais (biolixiviation). L'essor des biotechnologies, intégrant celui de la microbiologie industrielle, a contribué à faire prendre pleinement conscience du rôle des micro-organismes dans notre économie. L'étude de ces écosystèmes devait dépasser alors l'aspect purement écologique pour permettre de contrôler, c'est à dire de prévoir et de modifier le comportement des différentes populations microbiennes au sein d'un environnement confiné. L'emploi de méthodes moléculaires à grandement facilité cette tâche.

5.3 Les micro-organismes associés aux activités humaines

Deux biotopes liés à des activités anthropomorphiques ont été particulièrement étudiés à l'aide des techniques moléculaires : les boues de station d'épuration et les bassins de biolixiviation. Le fonctionnement de ces deux biotopes est intimement lié à la présence de micro-organismes qui dans un cas (boues actives) vont accélérer la dégradation de la matière organique et les processus de floculation et dans l'autre cas, faciliter la solubilisation des métaux précieux (lixiviation).

5.3.1 L'extraction de minerai

L'extraction des minerais comme le Cuivre ou l'Uranium est réalisée à grande échelle par des procédés de solubilisation des minerais (soufrés généralement) par des solutions acides. Cette solubilisation réalisée à l'air libre permet la colonisation des réservoirs par une communauté bactérienne très abondante constituée essentiellement de micro-organismes soufre-oxydants, autotrophes ou hétérotrophes. Les techniques moléculaires ont été mises à profit pour suivre les successions de populations au sein de ces réservoirs soit par amplification et séquençage des ADNr 16S (Goebel et Stackebrandt, 1994), soit par amplification et séquençage de l'espace inter-génique 16-23S sur l'ADNr (Pizarro et al., 1996; Espejo et Romero, 1997; Vàsquez et Espejo, 1997), soit par DGGE (Fournier et al., 1998). Une étude récente a permis de détecter, dans des extraits de biolixiviation de cuivre des séquences archaéennes correspondant aux Thermoplasmales (la souche a été cultivée mais n'a pas pu être obtenue en culture pure) (Vàsquez et al., 1999).

103 Les habitats microbiens

5.3.2. Les boues de stations d'épuration

Les stations d'épuration constituent un système complexe où se mêlent à la fois des techniques physiques (filtration, sédimentation, chloration, cf. figure 2.22) et des techniques biologiques mettant en jeu une importante communauté microbienne . La connaissance de la structure de la communauté microbienne des boues actives (traitement aérobie de la phase soluble) et des fermenteurs (traitement anaérobie de la phase insoluble) est un axe de recherche majeur. En effet la connaissance de cette structure permet d'influer sur sa dynamique (en jouant sur les nutriments ou sur l'ensemencement par une flore définie) et donc sur l'efficacité du traitement des eaux usées (cf. figure 2.22). Compte tenu de la diversité des nutriments disponibles dans les boues, la diversité métabolique et phylogénétique est aussi très importante. Aussi les techniques de culture, d'analyse par immunofluorescence, comme les profils quinoliques et polyaminiques ne rendent qu'une image très restreinte de cette diversité (Snaidr et al., 1997). Les techniques moléculaires ont donc été utilisées abondamment pour rendre compte de la diversité aussi fidèlement que possible.

Eaux Filtration usées Sédimentation

Boues solides Effluant liquide fraction insoluble fraction soluble

Traitement anaérobie: Traitement aérobie: digestion oxydation

Boues actives Egouttage Traitement microbiologique

Séchage Désinfection: Incinération - chloration Effluant traité rejetté dans les rivières

Figure 2.22. Représentation schématique du fonctionnement d'une station d'épuration (d'après Madigan, 1996)

Les tableaux 2.11 et 2.12 se proposent d'énumérer une partie des analyses réalisées à l'aide de techniques moléculaires sur différents échantillons de boues actives ou d'eau usées de stations d'épuration. Tableau 2.11. Analyse de la diversité microbienne totale Références Techniques Commentaires Bond et al., 1995 Amplif. 16S / Séqu. Comparaison de la population microbienne de 2 fermenteurs dont l'un élimine les phosphates. Bradford et al., 1996 Micromanipulation / Isolat Etude des bactéries filamenteuses. Isolement par micromanipulation, Amplif. 16S / Séqu. séquençage et localisation à l'aide de sondes spécifiques. Sondes 16S Eichner et al., 1999 TGGE 16S Effet de l'addition d'un micro-organisme pouvant dégrader les phénols sur une population microbienne lors d'un choc phénolique. Harmsen et al., 1996b Sondes 16S Analyse des gradients de population dans des granules des boues actives. Analyse des successions syntrophe/méthanogènes. Kämpfer et al., 1996 Isolats 70% des souches isolées (Proteobacteria b) ne correspondent qu'à 5% des Sondes 16S et 23S bactéries détectées par hybridation in situ.

104 Les habitats microbiens

Tableau 2.11. (suite) Références Techniques Commentaires Liu et al., 1997 T-RFLP Quantification de flore microbienne de boues actives et de fermenteurs. Nielsen et al., 1999 DGGE 16S Analyse de la flore de boue d'un fermenteur pour l'élimination du phosphore. Sondes 16S Détection d'un nouveau groupe de Proteobacteria g. Pillai et al., 1996 Ribotypage sur l'espace Détection de Clostridium dans l'atmosphère à proximité des tanks d'épuration. intergénique 16-23S Sekiguchi et al., 1998 Amplif. 16S / Séqu. Analyse des gradients de population dans des granules des boues actives Sekiguchi et al., 1999 Sondes spécifiques prélevées à 35 et 65°C. Relation entre les Syntrophobacter et les méthanogènes. Microscopie confocale Snaidr et al., 1997 Amplif. 16S / Séqu. Concordance des proportions entre les hybridations réalisées sur la banque et Sondes 16S celles réalisées in situ. Vainio et al., 1997 Isolats Communauté microbienne cultivable et non cultivable. Aucun clone ne Amplif 16S/Séqu correspond aux isolats. Wagner et al., 1993 Isolats / sondes 16S Effet de la charge en matière organique sur la population microbienne. Wagner et al., 1994 Proportion d'Acinetobacter dans les tanks éliminant les phosphates. Wallner et al., 1995 Sondes 16S Analyse et sélection de la population microbienne des boues. Wallner et al., 1997 Cytométrie en flux

Tableau 2.12. Analyse de genres ou d'espèces particuliers Références Techniques Commentaires Harmsen et al., 1996a Sondes 16S Analyse des bactéries oxydant le propionate et des syntrophes associés. Neef et al., 1998. Sondes 16S Recherche et quantification de Planctomycetales. Ces souches peuvent correspondre jusqu'à 5% de la population totale mais ne sont pas détectées par les sondes bactériennes (EUB 338). Juretschko et al., 1998 Isolats Analyse des bactéries oxydant l'ammoniac et les nitrites. Rotthauwe et al., 1997 Sondes 16S Mobarry et al., 1996 Amplif. amoA et 16S Holben et al., 1998 Séqu. Hallin et Lindgren, 1999 Raskin et al., 1994b sondes spécifiques 16S Analyse de la flore anaérobie des boues : étude des méthanogènes. Miguez et al., 1999 Amplif. mmoX Schuppler et al., 1995 Amplif. 16S / Séqu. Recherche des Actinomycetes nocardioformes agents pathogènes responsables Schuppler et al., 1998 Sondes sur clones de la prise en masse et de la mousse dans les tanks. de los Reyes et al., 1997 Microscopie confocale de los Reyes et al., 1998 Straub et al., 1994 PCR Détection d'entérovirus dans les boues. Rocheleau et al., 1999 Sondes 16S Etude de Methanosaeta concilii et Methanosarcina barkeri Microscopie confocale Tsai et al., 1993 Amplif. de 16S et de uidA Détection spécifique de E.coli Sondes 16S Lee et al., 1999 Microscopie confocale Watanabe et al., 1998a TGGE 16S et LmPH Analyse de l'effet du phénol sur la population microbienne. Isolement d'une Isolats souches spécifique de la dégradation de ce composé. Watanabe et al., 1998b Amplif. gyrB Quantification des bactéries dégradant le phénol dans un fermenteur par quantification des produits de PCR Selvaratnam et al., 1995 RT-PCR tfdB et dmpN Mise au point de la technique puis suivi de l'expression des gènes métabolisant les phénols par mesure des ARN messagers. Amplif. : amplification par PCR Séqu : Séquençage

5.3.3 Les autres milieux

La gestion de déchets produits par les activités humaines est une préoccupation économique et écologique majeure. En effet il ne s'agit pas simplement de se défaire de grandes quantités de produits finaux des métabolismes humains ou animaux (matière organique, fèces), mais aussi de détruire des composés uniquement produits par synthèse chimique : les xénobiotiques (pesticides, herbicides, plastiques). Ces produits n'entrent pas naturellement dans les grands cycles de

105 Les habitats microbiens dégradation des composés naturels, mais des micro-organismes peuvent avoir un rôle prépondérant dans leur dégradation. Les études moléculaires ont été mises à profit pour étudier ces micro- organismes, notamment pour suivre les dynamiques de dégradation. Le tableau 2.13 présente une liste non-exhausive d'études réalisées sur des fermenteurs industriels ou sur des reproductions à l'échelle du laboratoire de milieux naturels contaminés par des polluants d'origine anthropique. Ces travaux sont très souvent associés à des méthodes culturales. Il est effet indispensable de disposer du ou des micro-organismes impliqués dans les processus de dégradation afin d'envisager une mise à l'échelle industrielle du processus.

Tableau 2.13. Etude d'autres processus de dégradation Milieux Techniques d'étude Références

Effluent de papeterie culture Gonzàlez et al., 1996 (riche en lignine) amplification de l'ADNr 16S séquençage quantification sur ADN total Filtre biologique amplification de l'ADNr 16S Sakano et Kerkhof, 1998 pour contaminants aérosols amplification du gène amoA séquençage Biofilm bactérien dans les sondes nucléiques 16S Kalmbach et al., 1997 canalisations d'eau potable sondes nucléiques 16S et 23S Manz et al., 1993 Culture d'enrichissement amplification de l'ADNr 16S Pulliam Holoman et al., 1998 sur milieux riches en PCB séquençage de sédiments côtiers Culture en flux continus de sondes nucléiques 16S Bruns et Berthe-Corti, 1998 sédiments côtiers pour suivre la dégradation des hydrocarbures Flore thermophile impliquée dans amplification de l'ADNr 16S Inagaki et al., 1997 les dépôts siliceux dans une usine séquençage géothermale Processus de dégradation amplification de l'ADNr 16S Britschgi et Fallon, 1994 des cyanures séquençage Fermenteur anaérobie amplification de l'ADNr 16S Godon et al., 1997 sur vinasses et mélasses séquençage Processus de dégradation amplification de l'ADNr 16S von Wintzingerode et al., 1999 du trichlorobenzène séquençage Reproduction d'un aquifère pollué par culture-isolement Hess et al., 1997 des carburants à l'échelle du laboratoire sondes nucléiques 16S espèce-spécifiques Fermenteur alimenté en eau usées culture-isolement Stoffels et al., 1998 de peinture de carrosserie sondes nucléiques 16S

VI Conclusion et présentation du projet d'étude

Les formidables avancées dans le domaine des biotechnologies sont certes à attribuer aux efforts réalisés par les microbiologistes pour cerner le fonctionnement des micro-organismes, mais aussi à la manne financière de l'industrie pharmaceutique destinée au développement de nouvelles molécules à forte valeur ajoutée. Comprendre le fonctionnement des populations microbiennes au sein des écosystèmes naturels est certes une tâche laborieuse et coûteuse mais qui requiert avant tout une approche holistique. Aux compétences du microbiologiste doivent s'ajouter celles de l'écologiste, du biologiste moléculaire, du chimiste et du physicien afin d'appréhender

106 Les habitats microbiens l'environnement dans sa totalité. Un inventaire complet de la diversité microbienne terrestre n'est certes pas envisageable mais, comme cela a été proposé par Pace (1997), il est possible de définir sur le globe une centaine de sites (biotopes aux conditions physico-chimiques différentes) pour lesquels une étude intensive de la diversité tant procaryotique qu'eucaryotique serait entreprise. Certains sites naturels, comme les sources chaudes du parc de Yellowstone (Etats-Unis), font déjà l'objet de suivis réguliers depuis de nombreuses années. D'autres sites, comme les sources hydrothermales profondes et les réservoirs pétroliers, pourraient être des candidats potentiels à cette entreprise d'inventaire. Jusqu'à présent les informations concernant l'écologie de ces milieux ont été principalement obtenues par des travaux fondés sur des techniques de cultures traditionnelles, peu d'études moléculaires y ont été entreprises.

Le but de mon travail de thèse aura été d'utiliser des technologies moléculaires fondées sur l'analyse des ARNr 16S (séquençage - hybridation in situ) au profit de l'étude de la diversité et de la taxonomie microbienne, en association avec deux environnements extrêmes (un réservoir pétrolier et des sources hydrothermales océaniques). Après un exposé des méthodes générales utilisées, les résultats sont présentés sous forme d'articles, soumis ou à soumettre.

Le premier article (Article 1) présenté dans ce manuscrit décrit l'analyse de la diversité microbienne associée à un réservoir pétrolier situé dans le bassin Parisien. Si quelques travaux décrivent l'isolement et la caractérisation de micro-organismes, mésophiles ou thermophiles, impliqués dans des mécanismes de fermentation, de méthanogenèse ou d'acétogenèse, la majeure partie des études réalisées sur les puits de pétrole se sont intéressées aux micro-organismes impliqués dans les phénomènes de sulfato-réduction. L'originalité de cette étude était d'accéder à la diversité microbienne totale d'un réservoir en s'affranchissant de toute étape de mise en culture. L'analyse a porté sur des échantillons d'eaux de production prélevés en tête de puits et dans des collecteurs. On observe que les communautés microbiennes s'organisent différemment selon les échantillons. Dans certains puits, les BSR thermophiles ou mésophiles dominent les banques de clones, alors qu'elles sont absentes d'autres échantillons provenant du même réservoir. En revanche on retrouve dans ces échantillons des séquences associées à des souches micro-aérophiles pouvant être impliquées dans le cycle du soufre. En introduction de cet article je présenterai une étude réalisée sur un échantillon d'eau chaude prélevée sur un site hydrothermal terrestre en Roumanie. Les résultats obtenus sur cet échantillon d'eau géothermale éclairent ceux qui sont présentés pour certains échantillons d'eau de production.

Le second et le troisième articles décrivent l'utilisation conjointe de techniques culturales (enrichissements) et moléculaires (séquençage et hybridation in situ) pour étudier la diversité microbienne associée à des fluides hydrothermaux prélevés sur le site du "Snake Pit" sur la

107 Les habitats microbiens dorsale médio-Atlantique durant la campagne "Microsmoke" (1995). Les fluides ont été collectés à l'aide d'un échantillonneur original, le "Vent Cap", qui est déployé durant plusieurs jours sur le site d'émission du fluide. Deux sites ont été échantillonnés au cours de déploiements de 2 et 5 jours. L'article 2 décrit, par une approche d'extraction d'ADN total et séquençage des ADNr 16S, la diversité bactérienne associée à un déploiement de 5 jours sur le "Chi". On observe que la banque de clones est dominée par une grande diversité de micro-organismes associés ou proches des Proteobacteria epsilon. Deux nouveaux phylums associés à la classe des Proteobacteria, mais distincts des sous-classes décrites jusqu'à présent, sont aussi observés dans cet échantillon. Deux sondes nucléiques spécifiques sont construites afin d'identifier les micro-organismes détectés par séquençage. L'article 3 (Manuscrit en préparation) présente une synthèse des résultats obtenus à partir de l'ensemble des déploiements du "Vent Cap" lors de la campagne "Microsmoke". Il reprend les résultats décrits dans l'article 2 sur le site "Chi" et ceux décrits par Reysenbach et al. (1999) sur le site "Les Ruches". Il présente, de plus, des résultats originaux d'enrichissement de micro-organismes thermophiles, de comptage de cellules totales, d'analyse par séquençage du déploiement de 2 jours sur le site "Les Ruches" et de quantification de micro-organismes par hybridation in situ à l'aide de sondes nucléiques spécifiques. La confrontation des résultats obtenus par ces différentes analyses avec ceux obtenus lors de l'étude de cheminées hydrothermales nous permet de mieux cerner la distribution des micro-organismes au sein des sources hydrothermales profondes.

Comme nous l'avons vu dans les deux premières parties de ce manuscrit, l'utilisation de techniques moléculaires et l'emploi de méthodes culturales classiques ne sauraient s'exclure dans l'étude de la diversité d'un écosystème. Dans le cadre de la caractérisation d'une nouvelle souche, l'analyse phylogénétique de l'ADNr peut permettre d'asseoir une taxonomie sur une base cladistique. Le travail que j'ai effectué pour les articles suivants constitue une contribution à la caractérisation de souches isolées d'environnements hydrothermaux (articles 4, 5 et 6). L'article 4 (article publié) présente la caractérisation d'une nouvelle espèce de Methanococcales, Methanococcus vulcanius et l'identification d'une Methanococcales déjà isolée, M. fervens. L'article 5 (manuscrit en préparation) présente la caractérisation phylogénétique de 5 Thermococcales radiorésistantes isolées sur des sites hydrothermaux des dorsales médio-Atlantique et est-Pacifique. L'article 6 (manuscrit en préparation) présente la caractérisation phylogénétique d'une souche de Bacillus thermophile isolée sur le site hydrothermal du bassin de Lau au sud-est des îles Fidji.

108 Matériel et Méthodes 1 2

Ardennes

Val-d'Oise Marne Yvelines Paris Seine- MONTMIRAIL et-Marne

Essonne Aube Haute- Marne

3 4

5

Légendes: 1: Situation géographique de Montmirail. 2: Puit de Pétrole (LMN). 3: Décanteur (B01C). 4: Echantillonnage en tête de puits (I50). 5: Procédé de filtration de l’eau de production.

Figure 3.1. Echantillonnage des puits de pétrole. Site de Montmirail

Planche 1 Matériel et Méthodes

I Echantillonnage et conservation de l'échantillon

Durant ce travail de thèse, trois types de sites ont été échantillonnés : Ø des puits de pétrole en région parisienne (échantillons d'eau de production), Ø des sources hydrothermales profondes sur la dorsale médio Atlantique (échantillons de fluides et de cheminées), Ø des sources chaudes terrestres Roumaines (échantillon d'eaux).

1.1 Echantillonnage des puits de pétrole

Les échantillons proviennent des puits de pétrole du site de Montmirail, dans le Bassin Parisien (cf. planche photos figure 3.1). La société COPAREX, spécialisée dans l'exploitation des puits en fin de production, en assure la gestion. Les techniques d'extraction utilisées nécessitent l'envoi d'eau pressurisée dans le réservoir afin de faire remonter l'huile. Une fois en surface, le mélange eau/huile est envoyé par des pipelines vers des bassins de décantation, puis vers des bassins de collecte. Les échantillons étudiés sont des mélanges eau/huile prélevés en tête de puits ou dans un décanteur. Après décantation des échantillons, la partie aqueuse a été conservée. Afin de récupérer un grand nombre de micro-organismes, les échantillons ont été filtrés ou centrifugés. Les extractions d'ADN sont donc réalisées à partir d'un filtre ou d'un culot de centrifugation.

La technique de filtration est dérivée de la technique décrite par Sommerville et al., 1989. Cette technique peut s'appliquer à de nombreux échantillons liquides. Elle permet de concentrer les échantillons et d'effectuer directement la lyse cellulaire sur filtre. Réalisée initialement sur des filtres Millipore Sterivex GT (2 mL), elle peut être extrapolée à des filtres de plus grande taille afin de pouvoir filtrer de plus gros volumes d'échantillons. Il convient de filtrer l’échantillon à l'aide d'une pompe péristaltique. Le filtre utilisé est un filtre GT (Millipore) de 0,2 µm en polycarbonate. En fin de filtration le filtre est lavé avec 10 mL de tampon SET stérile (S ucrose E DTA Tris, voir composition § 2.1.1) puis stocké à -20°C.

1.2 Echantillonnage des sources hydrothermales profondes

Les échantillons ont été prélevés à 3500m de profondeur durant la campagne "Microsmoke" en 1995 (chef de mission Daniel Prieur). Cette campagne a été effectuée sur le site du Snake Pit (23°22'118N, 44°56'984W) sur la dorsale médio Atlantique (cf. planche cartes figure 3.2). Le site du "Snake Pit" a été retenu car il était profond (donc susceptible d'être colonisé par des micro-organismes barophiles), la faune associée était relativement simple (essentiellement des crevettes) et les cheminées présentaient des structures minéralogiques permettant un bon échantillonnage. Plusieurs types de cheminées sont observables sur ce site. Les cheminées dénommées "Chi" et "les Ruches" ont retenu notre attention.

109 Planche 2

Localisation des sites d'échantillonnage sur le Snake Pit. Vignette: localisation du site Snake Pit sur la dorsale Médio-Atlantique. (d'après Y. Fouquet)

Chi Les Ruches

Localisation des cheminées sur le site du SnakePit . Section

Figure 3.2. Localisation : Campagne MICROSMOKE, Oct-Nov 95 Matériel et Méthodes

Deux types d'échantillons ont été prélevés durant cette campagne : des échantillons de cheminée (solides) et des échantillons de fluides collectés à l'aide d'un incubateur in situ, le Vent Cap. La troisième planche de photos représente les différents échantillonneurs utilisés durant la campagne.

1.2.1 Echantillons de cheminée Afin d'étudier la répartition des micro-organismes le long de la cheminée par des méthodes culturales et moléculaires, les cheminées ont été sous-échantillonnées en suivant un axe longitudinal et radial (cf. figure 3.3).

B PARTIE Top

Section BB’ Section AA’

B’ PARTIE B

A

1 1 2 2 3

PARTIE A

A’

Figure 3.3. Echantillonnage des cheminées prélevées sur le site du Snake-Pit.

Les échantillons ont été prélevés par grattage des cheminées à bord du bateau (Le Nadir) après collecte de la cheminée à l'aide du sous marin (Le Nautile). Ils ont été conservés à -20 ou -80°C jusqu'à extraction de l'ADN. Les échantillons conservés pour l'hybridation in situ ont été fixés par la méthode décrite § 3.3.3. La technique de conservation des échantillons pour l'extraction d'ADN n'a pas été optimale et a sûrement contribué à une forte dégradation des échantillons. S'il n'est pas possible de réaliser l'extraction d'ADN dès la remontée de la cheminée, il est préférable de conserver les échantillons dans l'éthanol ou dans un milieu réducteur bloquant l'activité des DNAses afin d'éviter la dénaturation des cellules et la dégradation de l'ADN. Par exemple il est possible de conserver les cellules dans un tampon GIT (Guanidine isothiocyanate) 5 M, à raison de 1 volume de solution de GIT pour 1 volume d'échantillon puis on stocke à 4°C. solution de GIT 5M : Dissoudre 60 g de GIT dans 5 mL 1 M Tris buffer pH 7,4, 5 mL 0,5 M EDTA (le GIT représente la majeure partie des 98,2 mL : dissoudre le GIT dans le Tris l'EDTA et très peu d'eau en chauffant la solution au micro-ondes). Ajouter de l'eau MilliQ pour un volume final de 98,2 mL. Ajouter 800 µl b-mercaptoethanol et 1 mL d’une solution de Sarkosyl stérile 10 % (p/v) (sodium N-lauroyl- sarcosinate). Conserver la solution à température ambiante.

1.2.2 Echantillons de fluides Le fluide a été collecté à l'aide d'un échantillonneur, le Vent Cap, qui permet, à la différence des bouteilles Niskin ou des seringues de titane, de collecter du fluide sur plusieurs jours. Ce dispositif a été mis au point par l'équipe de Norman Pace (Karl et al., 1988) (cf. planche photos figure 3.4).

110 Planche 3

4

1 5

Sonde de température

Chambre 2 d’incubation

Jupe de collecte 6

Légendes: 3 1 Submersible ”Le Nautile” 2 Seringues de prélévement en titane Crédits photos: 3 Bouteille NIO 4 Vent Cap sur site (2 jupes) 1 IFREMER 5 Vent Cap sur site (1 jupe) 2,3 Laboratoire de microbiologie Roscoff 4, 5, 6 A.L. Reysenbach 6 Vent Cap schéma descriptif

Figure 3.4. Echantillonnage des sites hydrothermaux profonds Matériel et Méthodes

Disposé sur le lieu d'émission du fluide (petite cheminée ou fissure), le fluide est dirigé vers une chambre d'incubation par une jupe en Téflon. Cette chambre est ouverte et fermée par une trappe manoeuvrable par le submersible. A l'intérieur de la chambre on peut disposer des surfaces de différents matériaux (Téflon, acier, porcelaine, etc.) qui serviront de support au développement des micro-organismes. Le fluide ressort de la chambre à l'extérieur de la jupe lorsque la trappe est ouverte. Les échantillons de fluide contenus dans le Vent Cap ainsi que les coupons sont conservés dans l'éthanol à - 20°C ou fixés pour des hybridations in situ.

1.3 Echantillonnage des sources chaudes terrestres

Un échantillon provenant d'une source chaude Roumaine a été analysé. Il provient du site de Caciulata (Roumanie du sud) et a été prélevé (par D. Prieur et I. Gomoiu) à la sortie du puits 1003 ayant 3000 m de profondeur. La température de l'eau était de 89,6°C et le pH de 6,8-6,9. Cette eau très riche en sel est utilisée dans un système de chauffage.

II Analyse de l'ADNr 16S

L'analyse de la diversité microbienne de nos échantillons s'est déroulée selon le schéma suivant 1. Extraction de l'ADN. 2. Amplification spécifique du gène codant pour l'ARNr 16S par PCR. 3. Clonage des fragments d'ADNr 16S dans un plasmide. 4. Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction des clones (RFLP), afin de déterminer des classes de clones (O.T.U. ou phylotype). 5. Séquençage des différents clones. 6. Analyse des séquences à l'aide d'outils informatiques et construction d'arbres phylogénétiques.

2.1 Extraction d'ADN

Plusieurs protocoles d'extraction d'ADN ont été utilisés et testés notamment pour extraire l'ADN des cheminées hydrothermales (cf. figure 3.5A). Différents essais ont été entrepris pour tester l'efficacité des méthodes d'extraction. Des cellules de E. coli on été ajoutées à un échantillon de cheminée et l'échantillon a été soumis à différents protocoles d'extraction. Les quantités d'ADN extrait ont été comparées par Spot -test (cf. figure 3.5B). Les codes utilisés dans cette figure correspondent à ceux utilisés dans la figure 3.5. Les méthodes qui semblent être les plus efficaces pour les cheminées hydrothermales sont : la technique du CTAB (2), la technique du micro-ondes (5) et la technique de Tiedje (6). Pour les échantillons de fluide d'hydrothermaux et d'eaux de production les protocoles les plus efficaces ont été ceux décrits ci dessous.

111 A

Méthode du PVPP Méthode de Delong 8 PVPP Tampon sucrose 4 4-aminosalicylate 1min à 100°C B

Méthode deTiedje Méthode du 100 75 50 25 10 (ng d’ADN) Micro-onde 5 6 pilon-mortier SDS 65¡C et M.O. congél°-décongél° agitation 1 2 3 4 Méthode du Chelex Echantillon Chelex/100¡C / 3 de PCR directe cheminée 5 6 7 8 Méthode par sonication 1 Sonication/GIT SDS Méthode du GIT 7 GIT/ Bead Beating Méthode du Chelex/ PEG 9 Méthode du CTAB 2 Bead Beating/Chelex PEG

Références:

1 Pierre Chevaldonné,1995 personal communication. 5 C. Bollet, M.J. Gevaudant, X. de Lamballerie, C. Zandotti and P. de 2 Currents protocols in Molecular Biology 2.4.1. Micco, A simple method for the isolation of chromosomal DNA from Gram positive od acid-fast bacteria, Nucl.Acids Res., 1991,19, 1955. 3 M.A. Voytek and B.B. Ward, Detection of ammonium-oxidizing bacteria of Figure 3.5. Techniques d’extraction d’ADN beta-subclass of the class Proteobacteria in aquatic samples with the PCR, 6 J. Zhou, M.A. Burns and J.M. Tiedje, DNA recovery from soils of A.E.M., 1995, 61, 4, p 1444-1450. diverse composition, A.E.M., 1996, 62, 2, p 316-322. 4 D.L. Distel, E.F. Delong and J.B. Waterbury, Phylogenetic 7 Jeff Stein, personal communication. characterization and in situ localization of the bacterial symbiont of 8 Sue Barns, personal communication. shipworms (teredinidae: bilvalva) by using 16S rRNA sequence analysis and 9 P.R. Herron, Phage ecology and genetic exchange in soil, Molecular oligodeoxynucleotide probe hybridization, A.E.M. 1991, 57, 8, p 2376-2382. Microbial Ecology Manual,1995, 5.3.2., p 1-12, Elsevier. Matériel et Méthodes

2.1.1 Extraction de l'ADN sur filtre ou sur culot de centrifugation (d'après Sommerville et al., 1989) Ajouter sur le filtre ou sur le culot de centrifugation : 1,8 mL de tampon SET (voir composition plus bas) + 20 mL de lysosyme à 20 mg/mL (fragilisation de la paroi cellulaire). Placer le mélange 15 min sur la glace. Ajouter 20 mL de SDS à 10% et 20 mL de N-lauryl-sarcosyl à 10% (p/v) (dénaturant des protéines et des polysaccharides). Laisser 1 heure en agitation à température ambiante. Ajouter 50 µL de protéinase K à 20 mg/mL. Laisser 2 heures à 50°C (digestion des protéines). La solution est récupérée dans le filtre. Ajouter : 0,5 volume d'acétate d'ammonium 7.5 M à pH 8 (précipitation des protéines et des polysaccharides). Il est possible à ce niveau de réaliser une extraction au phénol chloroforme (extraction des protéines), mais il est aussi possible de passer directement à l'étape suivante. Laisser 10 min à température ambiante. Centrifuger à 12000 g à 20°C durant 10 min. Eliminer le culot et ajouter 2 volumes d'éthanol 100% au surnageant. Laisser 20 min à -20°C (précipitation de l’ADN). Centrifuger à 10000 g à température ambiante durant 20 min. Eliminer le surnageant. Resuspendre le culot avec 1 mL d'éthanol à 70% (v/v) (lavage de l’ADN et élimination des sels). Centrifuger à 13000 RPM à 4°C durant 30 min. Jeter le surnageant et sécher le culot au SpeedVac. Dissoudre le culot dans 30 mL d'eau milliQ ou du TE (voir composition ci-dessous).

Composition des tampons SET : 20% saccharose (p/v) TE : 10 mM Tris 50 mM EDTA 1 mM EDTA 50 mM Tris pH=7,6 pH=7,6

2.1.2 Extraction de l'ADN chromosomique par la méthode de Sambrook et al. (1989) Chaque milieu est centrifugé et les culots contenant les bactéries sont récupérés. Ces culots sont resuspendus dans 400 µL de tampon TNE (Tris Cl /NaCl /EDTA). On ajoute 15 µL de lysozyme (5 mg/mL) et 10 µL de la protéinase K à 20 mg/mL. Ce mélange est incubé durant 1 heure à 50°C. Il est alors possible de rajouter 0,1 volume de SDS à 10% (p/v) et 0,1 volume de L-Lauryl-Sarcosyl à 10% (p/v) et d'incuber de nouveau pendant 2 heures à 50°C. Afin d'extraire les protéines, 1 volume de phénol équilibré dans du Tris est ajouté. La phase aqueuse est récupérée après centrifugation de 5 à 10 min à 10000 g. Ajouter 1 volume d’un mélange contenant du phénol saturé TRIS, du chloroforme et de l’alcool isoamylique (24:24:1) avant de centrifuger durant 10 min à 6000 g. La phase aqueuse contenant l’ADN est récupérée et traitée au chloroforme et à l’alcool isoamylique (24:1), et centrifugée à nouveau. L’ADN est précipité avec 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M et 2 volumes d'éthanol 100% durant 1 heure à -20°C avant une dernière centrifugation. Le culot contenant l’ADN précipité est séché puis repris dans de l'eau MilliQ ou dans du TE.

112 Matériel et Méthodes

2.1.3 Méthode d'extraction au micro-ondes (d'après Bollet et al., 1991) Laver les cellules ou l'échantillon dans du TE ou du TNE. Ajouter du SDS à une concentration finale de 5% (p/v). Mettre 30 min à 65°C. Centrifuger et supprimer le surnageant. Mettre le culot au micro-ondes 2 fois 1 min à 900 W (ou 3 x 1 min à 750 W). Resuspendre le culot dans du TNE et effectuer une extraction au phénol-chloroforme suivie d'une précipitation de l'ADN à l'éthanol.

2.1.4 Extraction de l'ADN chromosomique par la méthode de Pitcher et al. (1989) Cette méthode peut être utilisée à la place de la méthode traditionnelle décrite par Sambrook et al., (1989) pour extraire l'ADN à partir de cultures pures. Il conviendra de rajouter du L-Lauryl-Sarcosyl pour lyser plus efficacement les Archaea. 1,5 mL de culture en phase exponentielle (ou d'échantillon) sont centrifugés durant 5 min à 5000 g. Les cellules sont resuspendues dans 100 µL de tampon TE et lysées avec 0,5 mL de tampon GES (5 M guanidium thiocyanate, 100 mM EDTA, 0,5% v/v SDS, pH 8). Les cellules en suspension sont agitées brièvement et laissées à température ambiante durant 10 min. Le lysat est refroidi sur glace et on ajoute 0,25 mL d'acétate d'ammonium 7,5 M froid. Les échantillons sont maintenus sur glace pendant 10 min et occasionnellement agités. On ajoute 0,5 mL de chloroforme/2-pentanol (24:1). Après agitation les phases sont séparées par 2 min de centrifugation à 2000 g. La phase aqueuse est transférée dans un nouveau tube et 0,54 volume d'isopropanol froid est ajouté. On agite les tubes par inversion pendant 10 min et l'ADN précipité est recueilli par centrifugation durant 1 min à 7000 g. Les culots d'ADN sont lavés à l'éthanol 70% (v/v) et séchés (Speed Vac ou air ambiant). L'ADN est resuspendu durant une nuit dans 100 µL de tampon TE stérile (pH 8).

2.1.5 Extraction de l'ADN au "Bead-Beater" Cette technique a été utilisée avec succès par la société Diversa et par Paul Riley (1997) pour extraire l'ADN de sédiments ou de cheminée. Utiliser 10 à 20 grammes de cheminée ou de sédiments. Ajouter un volume de billes pour "bead- beating". Puis ajouter un volume (billes + échantillons) de solution de 5M GIT contenant 0.1% (p/v) de SDS. Agiter vigoureusement (Bead-beater ou Ribolyser) durant 30 min à 1 h. Centrifuger à faible vitesse pour éliminer les débris cellulaires et extraire l'ADN de la solution de GIT. Le culot est resuspendu dans un tampon de lyse (TE/SDS 10% (p/v) par exemple) et traité par la protéinase K et subit ensuite une extraction phénol/chloroforme.

2.2 Amplification de l'ADNr 16S

Afin d'amplifier l'ADNr 16S de nos échantillons nous avons utilisé une technique d'amplification classique. Il a toutefois été nécessaire d'introduire des modifications dans la technique lorsque l'ADN extrait était en trop faible quantité ou lorsque des contaminants (hydrocarbures, métaux) inhibaient la réaction.

113 Matériel et Méthodes

2.2.1 Réactions d'amplification classiques Deux types d’enzymes ont été utilisées. La Taq polymérase commercialisée par Promega et l'ampliTaq Gold (Perkin Elmer). L'avantage de cette dernière est de n'être activée qu'après un passage à 95°C. Ceci revient à réaliser une PCR Hot Start (moins d’hybridations aspécifiques lors de la montée en température du mélange d'amplification). A chaque cycle de dénaturation un nouveau pool enzymatique est libéré (il y a moins de risque d'erreur), il est donc possible de faire plus de cycles (cf. tableau 3.1). Tableau 3.1. Protocole d'utilisation de la Taq polymérase et de l'AmpliTaq Gold AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) Taq polymérase (Promega) Milieux d'amplification : Milieux d'am plification: Tampon 10X 1X Tampon 10X 1X MgCl2 25 mM 2,5 mM MgCl2 25 mM 1,5 mM dNTP 100 mM 200 µM de chaque dNTP 100 mM 200 µM de chaque Amorce Foward 0,2 µM Amorce Foward 0,2 µM Amorce Reverse 0,2 µM Amorce Reverse 0,2 µM AmpliTaq Gold 5U.µl-1 2,5 U/100 µL Taq polymérase 5U.µl-1 2,5 U/100 µL Matrice d'ADN < 1 µg/tube Matrice d'ADN < 1 µg/tube Eau MilliQ qsp Eau MilliQ qsp

Cycles employés : Cycles employés : 1 cycle : 12 min à 96°C (activation de l'enzyme), 1 min 15 à 50°C, 1 cycle : 5 min à 96°C puis 1 min 15 à 50°C, 2 min 15 à 72°C. 2 min 15 à 72°C. 29 cycles : 1 min 15 à 95°C, 1 min 15 à 50°C, 2 min 15 à 72°C. 34 cycles : 1 min 15 à 95°C, 1 min 15 à 50°C, 2 min 15 à 72°C. 1 cycle : 7 min à 72°C. 1 cycle : 7 min à 72°C.

Afin d'amplifier un fragment cloné (voir technique de clonage) nous avons directement réalisé les réactions de PCR sur cellules entières. Les cellules sont prélevées sur boites à l'aide d'un cure- dent ou d'un cône de pipette et sont resuspendues dans un mélange d'amplification sans enzyme. Après un premier cycle de 10 min à 95°C, on ajoute l'enzyme et on effectue une PCR classique.

2.2.2 Techniques d'optimisation de la réaction Différents paramètres peuvent être modifiés afin d'optimiser la réaction d'amplification : La concentration de l'échantillon : une simple dilution du produit d'extraction contenant l'ADN suffit parfois à faciliter l'amplification. En effet, les inhibiteurs de la PCR sont alors également dilués. On peut effectuer des gammes de dilutions du 1/10e au 1/100e par exemple. Le milieu réactionnel : il est possible d'ajouter de l'acétamide et de la BSA (Bovin Serum Albumin) ou de la BSA seule. L'acétamide rend théoriquement l'amplification plus spécifique. La BSA, quant à elle, tend à stabiliser la Taq polymérase en fixant les inhibiteurs possibles de la réaction. L'enzyme : on peut utiliser de la Taq classique ou de l'AmpliTaq Gold (voir plus haut). Les amorces : à partir d'un premier produit d'amplification, on effectue une nouvelle réaction mais en utilisant des amorces différentes. Ces secondes amorces sont choisies de façon à permettre l'amplification d'une portion de la séquence déjà amplifiée par fixation "à l'intérieur" de celle-ci. On parle

114 Matériel et Méthodes de "PCR nichée". Par exemple, si le premier couple d'amorces utilisé est 8F-1525R, le second peut être 50F-1492R. La séquence alors amplifiée sera légèrement plus courte mais le rendement de la "PCR interne" est parfois meilleur car les amorces peuvent s'hybrider sur plus de matrice. Le nombre de cycles effectués : sur des produits ayant subi une première réaction, il est possible de rajouter de l'enzyme (1 ou 1,5 U) et de relancer un nouveau cycle de PCR. La première amplification est parfois insuffisante pour permettre de visualiser une bande lors de la vérification sur gel. Réparation préalable du matériel génétique : lors d'un cycle particulier (1 fois : 5 min à 95°C puis 10 fois : 30 sec à 95°C, 30 sec à 54°C et 45 sec à 72°C) on met l'ADN extrait en présence d'un milieu réactionnel classique de PCR mais sans amorce. Il se produit alors une réparation de l'ADN; c'est-à-dire que la polymérase ajoute des dNTP aux endroits dégradés. Les petits fragments d'ADN servent en quelque sorte d'amorces à l'enzyme. Cette technique est susceptible d'augmenter la quantité de chimères.

2.2.3 Choix des amorces d'amplification Les amorces suivantes (cf. tableau 3.2) sont utilisées pour les différentes réactions d'amplification. Tableau 3.2. Spécificité et description des amorces d'amplification Amorces Localisation Séquence Spécificité E. coli Archaea Bacteria Eukarya Orientation “Forward” 4F (3-20) 5'- TCCGGTTGATCCTGCCRG -3' + 21F (2-21) 5'-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3' + 333F (333-348) 5'- TCCAGGCCCTACGGG -3' + 8F (8-27) 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' + 50F (50-68) 5'- AACACATGCAAGTCGAACG -3' + 515F (515-533) 5'-GTGCCAGC(AC)GCCGCGGTA-3' + + + Orientation “Reverse” 1492R (1510-1492) 5'- CGGTTACCTTGTTACGACTT -3' + + + 1525R (1541-1525) 5'- AAGGAGGTGATCCAGCC -3' + + +

Universal MCS 5'- GGAAACAGCTATGACCAT -3' hybridation avec Reverse MCS 5'- GTAAAACGACGGCCAGTG -3' le plasmide MCS: site multiple de clonage localisé sur le plasmide de chaque coté de l'insert.

2.3 Clonage des produits de PCR

Deux techniques de clonage ont été utilisées durant ces études. La plus fréquemment utilisée est la technique du “TA cloning". Il a été aussi possible de transformer les cellules en utilisant un électroporateur.

2.3.1 Utilisation du kit TOPO TA Cloning (Invitrogen ) Le protocole de clonage repose sur une erreur de la Taq polymérase qui ajoute systématiquement un dNTP de type adénine (A) aux extrémités 3' du brin néosynthétisé. Le vecteur utilisé possède, quant à lui, une thymine (T) au niveau du site d'insertion, à ses extrémités 3'. Une

115 Matériel et Méthodes liaison entre ses deux bouts cohésifs est donc possible. Elle est facilitée par l'action d'une topoisomérase qui va liguer les deux fragments d'ADN à température ambiante.

Clonage dans le plasmide pCR Ò 2.1 et transformation: Le protocole de clonage et de transformation est celui décrit par le fabriquant.

Analyse des clones positifs : Couler en boîte de Pétri un milieu LB additionné de 0.1 g/L d'ampicilline et de 0.3 mL/L de tétracycline à 50µg/mL. Appliquer sur le milieu une solution contenant 40µL de X-Gal 5% dans du DMSO (p/v) et 40µL d'IPTG 100 mM. Etaler 80 µl de la solution de transformation. Incuber au minimum 18 heures à 37°C. Puis placer les boîtes environ 2 heures à 4°C pour faire apparaître la coloration bleue. On repique les colonies blanches sur des boîtes de Pétri contenant du milieu LB additionné d'ampicilline et de tétracycline (même milieu que précédemment), ceci afin de les conserver. On réalise également une PCR suivie d'une électrophorèse sur gel d'agarose 0.8% (p/v) pour vérifier la taille de l'insert. La PCR est effectuée directement sur les souches contenues dans le milieu de réaction à l'aide des amorces “universal et reverse“ s'hybridant sur le plasmide.

Conservation des clones : Il est possible de conserver les clones obtenus en les cultivant sur microplaques dans du milieu LB liquide. On ajoute par la suite 5% (final) de glycérol à la culture. La microplaque protégée (film plastique ou couvercle) peut être conservée à - 20°C (pendant une nuit) puis - 80°C (pendant plusieurs mois).

Composition des milieux utilisés : Milieu LB (Luria-Bertani) : 1.0% Tryptone, 0.5% d'extrait de levure (Yeast Extract), 1.0% NaCl, pH 7.0 Gélose LB : milieu LB + 15 g/L d'agar avant d'autoclaver IPTG = isopropylthio-ß-D-galactoside X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3 indolyl-ß-D-galactopyranoside

2.3.2 Transformation des cellules par électroporation Une autre technique de transformation des cellules a été utilisée. Moins rapide que la technique du choc thermique, la technique d'électroporation est toutefois très efficace.

1- Dessaler les produits de ligation. S'il y a trop de sel dans les échantillons ou si la cuvette est trop vieille, celle-ci peut exploser durant l'électroporation. Utiliser 2 µL de produit de ligation. Les déposer sur un filtre 0,022 µm flottant dans une boite de Pétri remplie d'eau désionisée. Effectuer la dialyse durant 45 min à 1 heure. 2- Décongeler les cellules compétentes (sur la glace) en évitant les chocs thermiques. Mettre la cuvette d'électroporation dans la glace. Aliquoter dans des tubes de 5 mL, 50µL de cellules compétentes. Conserver ces tubes au froid. Ajouter les 2 µL de produit de ligation dialysé aux cellules compétentes. Laisser 1 min sur glace.

116 Matériel et Méthodes

3- Mettre les cellules dans la cuvette à la fin de la minute et procéder à l'électroporation. 4- Puis rapidement : Récupérer la cuvette et y ajouter directement 1 mL de milieu SOC puis retransférer le tout dans un tube. Mettre les tubes à 37°C durant 45 min avec agitation. 5- Déposer entre 100 et 800 µL de la culture sur boite de Pétri en fonction de l'efficacité de la transformation. Mettre les boites à 37°C durant la nuit.

2.4 Analyse des clones par RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

Afin de réaliser un premier tri parmi les clones à séquencer, nous avons analysé ces derniers par RFLP. A chaque profil de restriction correspondait une classe, ou phylotype ou OTU. A chaque classe correspondait des séquences différentes mais au sein d'une même classe on pouvait retrouver des séquences différentes. Le choix des enzymes a été dicté par les résultats obtenus par Moyer et al. (1996). MspI et HinP1I (ou HhaI son isoschyzomère) sont parmi les enzymes les plus discriminantes sur l'ADNr 16S.

Site de coupure des enzymes de restriction :

MspI ® 5’ C*CGG 3’ HinP1I ® 5’ G*CGC 3’ HhaI ® 5’ GCC*C 3’ 3’ GGC*C 5’ 3’ CGC*G 5’ 3’ C*GCG 5’

Coupure : Sur une microplaque, on met en présence l'ADN, le tampon et l' (les) enzyme(s) dans les proportions suivantes (pour un puits) : 9 mL d’ADN, 1,2 mL de tampon, 0,6 mL HinP1I ou HhaI, 0,3 ml MspI. La microplaque est placée au bain-marie à 37°C durant au moins deux heures. L'ADN matrice est le produit de PCR ayant permis de vérifier l'efficacité du clonage.

Electrophorèse des produits de restriction: L'électrophorèse est réalisée dans des gels résolutifs pour des fragments de (100 à 1500 pb). Idéalement elle sera effectuée dans un gel d'agarose "NU Sieve" à 4% (p/v) dans un tampon TAE. On pourra aussi pour des raisons d'économie faire la migration dans du gel "Sea Kem LE" à 2% (p/v) avec un tampon TAE. Les échantillons sont chargés avec un tampon de charge contenant de l'Orange G afin de détecter la sortie des bandes à faible poids moléculaire. Le marqueur couramment utilisé est le "100 bp DNA ladder" (5mL par puits soit 5 U) . Ce marqueur comporte 11 fragments d’ADN double-brin de 100 à 1500 paires de bases .

Composition des produits d'électrophorèse Tampon TAE : 0.04 M Tris-acétate Loading Buffer : 0.25% Orange G (p/v) 0.001 M EDTA 40% saccharose dans du TE (p/v).

117 Matériel et Méthodes

2.5 Séquençage

Si une des séquences a été réalisée manuellement (souche de Bacillus SG9) la majeure partie des séquences réalisées durant cette thèse (clones et autres souches) l'ont été à l'aide d'un séquenceur automatique. Nous ne décrirons donc que cette méthode de séquençage.

2.5.1 Réactions de séquence Le principe de séquençage utilisé est celui développé par Sanger : l'incorporation de didésoxynucléotides. A ce principe de séquençage a été couplée une réaction de PCR afin d'amplifier le signal de séquençage. Il s'agit donc de séquençage cyclique ou "cycle sequencing". L’amorce est marquée au moyen d'un fluorochrome (Texas Red) fixé aux extrémités 3' du simple brin et l'enzyme Thermo Séquénase, analogue de la Taq polymérase, est thermostable et très processive. Les conditions de séquençage sont celles décrites par le fabriquant du kit de Séquençage (Amersham). Seul le cycle de PCR est modifié et l'ADN matrice utilisé est le produit de PCR obtenu après amplification des clones à l'aide des amorces "universal et reverse". Cycle : 97°C - 5 min (1 cycle); 95°C - 1 min, 54°C - 1 min, 61°C - 1 min (24 fois).

2.5.2 Amorces de séquençage Les amorces utilisées pour le séquençage (cf. tableau 3.3) sont semblables à celles utilisées pour l'amplification de l'ADNr 16S. Il est nécessaire d'utiliser des amorces internes à l'ADNr 16S afin de couvrir la totalité de la séquence de la molécule.

Tableau 3.3. Spécificité et description des amorces de séquençage. Amorces Localisation Séquence Spécificité E. coli Archaea Bacteria Eukarya Forward 4F (3-20) 5'- TCCGGTTGATCCTGCCRG -3'TRed + 8F (8-27) 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'TRed + 515F (515-533) 5'- GTGCCAGCMGCCGCGGTAA -3'TRed +/- + + 906F (906-922) 5'- GAAACTTAAAKGAATTG -3'TRed + + Reverse 515R (533-515) 5'- TTACCGCGGCKGCTGGCAC -3'TRed +/- + + 906R (922-906) 5'- CAATTCMTTTAAGTTTC -3'TRed + + 1492R (1510-1492) 5'- CGGTTACCTTGTTACGACTT -3'TRed + + +

Universal MCS 5'- GGAAACAGCTATGACCAT -3'TRed hybridation avec Reverse MCS 5'- GTAAAACGACGGCCAGTG -3'TRed le plasmide MCS: site multiple de clonage localisé sur le plasmide de chaque coté de l'insert. IUB nomenclature: M=A ou C, K=G ou T.

118 Matériel et Méthodes

2.5.3 Migration des réactions de séquences L'obtention d'une séquence nécessite donc quatre dépôts (1 par base). Le gel utilisé a un fort pouvoir résolutif. C'est un gel dénaturant à 7% d'acrylamide-bisacrylamide. Le caractère dénaturant est dû à la présence d'urée (6M)1. Pour 30 mL de gel à 7% de polyacrylamide : 4,2 mL de Long Ranger 50% (mélange Acrylamide- Bisacrylamide) TEBU-FMC Bio Products, 11g d'urée, qsp 27 mL d'eau MilliQ. Le mélange est désionisé (aide d'une résine échangeuse d'ions) et 3 mL de TBE X10 filtrés sont ajoutés. Avant de couler le gel on ajoute les agents polymérisants : 150mL de TEMED et 15mL d'APS 10% (p/v)2. Le gel est coulé entre deux plaques de verre borosilicaté et polymérisé durant 45 min à 1 heure. Le gel est placé verticalement dans le séquenceur. Un peigne à dents de requin permet de former les puits. Les échantillons peuvent ensuite être chargés.

Principe du séquenceur La migration de 10 réactions de séquences (40 puits) s'effectue verticalement (cf. figure 3.6). Les brins les plus courts migrent plus rapidement; ils vont donc se retrouver les premiers en bas du gel. 512 photodiodes sont situées en ligne au bas du gel. Un faisceau laser de longueur d'onde 594 nm traverse le gel dans sa largeur et excite les fluorochromes qu'il rencontre. Les photodiodes enregistrent l'intensité lumineuse émise à 612 nm par les fluorochromes excités. Le signal est numérisé et transmis à l'ordinateur qui enregistre et analyse les données.

Figure 3.6. Représentation schématique du fonctionnement d'un séquenceur automatique.

1 La teneur en urée du gel peut varier de 4 à 7 M. 2 APS = Ammonium Persulfate, Long Ranger = Acrylamide et N,N'-méthylenebisacrylamide 50%, TEMED = N,N,N',N' Tétraméthyléthylènediamine

119 Matériel et Méthodes

2.6 Analyse des séquences

Les principes d'analyse des séquences ont été rappelés dans la première partie de ce manuscrit. Après migration les séquences sont vérifiées afin d'éliminer d'éventuelles erreurs de lecture (logiciel du séquenceur Vistra V 2.0). Puis elles sont comparées aux banques de données (RDP et GenBank), alignées contre les séquences les plus proches et assemblées (logiciel ARB). L'analyse phylogénétique est réalisée par la suite en comparant les résultats obtenus par les techniques d'analyse des distances, de maximum de parcimonie et de maximum de vraisemblance (logiciel ARB).

III Hybridation in situ

La technique d'hybridation in-situ peut elle aussi se diviser en plusieurs étapes : la construction des sondes, la mise au point des sondes et l'hybridation in situ.

3.1 Construction des sondes

La construction des sondes est réalisée sur ordinateur. A partir d'un choix de séquences le logiciel ARB permet de construire des sondes spécifiques des séquences à cibler. Les paramètres à considérer sont le nombre de mésappariements, la longueur de la sonde, le Tm relatif de la sonde, le G+C% de la sonde (plus il est important plus le signal d'hybridation sera fort). A partir de la liste de sondes fournie par le logiciel il convient de déterminer la plus efficace , c'est à dire: Ø la sonde qui ciblera le plus grand nombre d'organismes que l'on souhaite marquer. Ø la sonde qui aura un nombre de mésappariements suffisant avec les micro-organismes que l'on souhaite exclure; l'idéal est 3 mésappariements répartis sur toute la longueur de la sonde (notamment au centre de la sonde). Ø la sonde qui s'hybridera sur une région de l'ADNr 16S où la structure secondaire de la molécule n'empêchera pas sa fixation (cf. la structure secondaire analysée par Fusch et al., 1999 et voir exemple de structure secondaire en annexe).

3.2 Mise au point des sondes - Test de spécificité

Avant de réaliser les hybridations in situ il convient de tester la spécificité de la sonde sur membrane (pour vérifier la fixation de la sonde sur l'ADN) et sur culture pure (afin de vérifier la pénétration de la sonde dans la cellule et son hybridation sur la structure secondaire de l'ARN).

3.2.1 Hybridation sur membrane On va déposer sur membrane l'ADN génomique, l'ARNr ou l'ADNr de souches dont on souhaite vérifier l'hybridation avec la sonde. Il convient de choisir à la fois: Ø des espèces qui sont spécifiquement ciblées par la sonde,

120 Matériel et Méthodes

Ø des espèces de groupes phylogénétiques proches et éloignés ne s'hybridant pas avec la sonde, Ø des espèces non recherchées mais pour lesquelles la sonde présente peu de mésappariements. Il est possible de fixer sur la membrane des ARNr ou de l'ADNr 16S. Les ARN sont extraits à l'aide des techniques classiques d'extraction (cf. Harmsen et al., 1997a). Les ADNr 16S déposés sur la membrane peuvent être le produit d'amplification de l'ADNr 16S de souches pures ou d'ADNr 16S clonés.

Dépôt sur membrane : On dépose sur la membrane (par puits) soit 30 ng d'ARNr soit 100 ng d'ADNr. Avant dépôt, l'appareil est nettoyé à l'eau MilliQ et séché à l'éthanol absolu. La membrane (Zeta Probe, GT-BioRad ou Hybond N+-Amersham) est humidifiée par flottaison dans de l'eau MilliQ stérile puis séchée sur papier Whatman. Les ADN ou les ARN sont dénaturés durant ce temps dans 1 volume de 0,4N NaOH, 4 mM EDTA 10 min à 100°C. On ajoute 0,1 volume de solution stop (2M d'acétate d'ammonium + Bleu). Les échantillons sont conservés sur glace avant leur dépôt. Le volume total est de 50µL/dépôt. On dépose les matrices dénaturées sur la membrane à l'aide d'un appareil à Dot-Blot ou à Slot-Blot. Après séchage sommaire (sur papier Whatman) et emballage dans du film alimentaire, les matrices sont fixées sur la membrane à l'aide d'un Cross linker (2 cycles de 30 mJoules). Les membranes sont conservées à - 20°C.

Marquage de la sonde : La sonde est commandée non marquée. Pour les tests de spécificité la sonde est marquée à l'[g-32P]ATP à l'aide de la T4 polynucléotide kinase. 100ng (dans 1µL) de sonde sont marqués à chaque réaction. On ajoute 2µL de tampon, 16µL d'eau MilliQ stérile, 1 µL de sonde et 0,5 à 1 µL de T4-Kinase et pour finir 1 µL de [g-32P]ATP. Hybridation sur membrane : Les membranes sont préhybridées dans un volume minimal de tampon d'hybridation (10 à 20 mL) préchauffé durant 15 min à 45°C. Après marquage, la sonde (20µL) est introduite dans le tube et l'hybridation se déroule durant la nuit à 45°C. Le lendemain, le mélange d'hybridation est éliminé et la membrane est lavée 2 ou 3 fois avec du tampon 5X SSC. 20 mL de tampon de lavage préchauffé (45°C) sont ajoutés et la membrane est incubée 20 min à 45°C. Le tampon est renouvelé et la membrane est incubée à Td (voir plus bas) durant 1 heure au moins. Les membranes sont emballées (humides) dans du film alimentaire et déposées contre un écran photo-stimulable. Les écrans sont lus après 15 min à 1 heure d'exposition sur un Fluorimager (Storm, Molecular Dynamics). Les membranes sont stockées à -20°C jusqu'à leur lavage.

Tampon d'hybridation Tampon SSCx20 Tampon de lavage 0,5M tampon phosphate 0,15 M NaCl 1X SCC 7% SDS (p/v) 0,015M Citrate de sodium 1% SDS (p/v) 1% BSA (p/v) 1 mM EDTA pH7,2

121 Matériel et Méthodes

Mesure de la T d :

La technique de mesure de la Td est celle mise au point par Raskin et al. (1994a). Elle consiste a effectuer des lavages successifs à des températures de lavage croissantes (avec un pas de 3 °C par lavage par exemple).

CPM

6000 CPM max

4000 CPM 50%

2000 Td 40 50 60 70 80 °C Température de lavage

Figure 3.7. Mesure de la température de dissociation (Td) Dans un premier temps, la sonde est hybridée avec sa cible en duplicat ou en triplicat puis est lavée comme précédemment 2 à 3 fois par 5X SSC. Après ce premier lavage, chaque "dot" est découpé et déposé dans des tubes à scintillation contenant 2,5 mL de tampon de lavage préchauffé. Le premier lavage est effectué à 38°C durant 20 min (pour supprimer l'excès de sonde). Puis un deuxième lavage est effectué à 38°C durant 45 min à 1 heure. Après chaque lavage le "dot" est transféré dans un nouveau tube à scintillation contenant du tampon de lavage. L'ancien tube est rempli de 2,5 mL de liquide à scintillation et est conservé jusqu'au comptage. On procède alors à un nouveau lavage à 41°C durant 45 min à 1 heure (puis à 44, 47, 50, etc., jusqu'à 71 ou 74°C). Lorsque tous les lavages sont effectués, les tubes sont comptés et la courbe de valeur cumulées de

CPM=f(température de lavage) est construite. La Td est la température pour laquelle 50% de la radioactivité aura été libérée (cf. figure 3.7).

Lavage des membranes pour réhybridation : Les membranes peuvent être réhybridées plusieurs fois pour peu qu'elles aient été lavées. Pour ce faire les membranes froides (-20°C) sont plongées dans une solution chaude (85°C) de 0,5% SDS (p/v) dans de l'eau MilliQ. Elles y sont laissées durant 30 min au minimum. Puis les membranes sont lavées avec du tampon de lavage froid, emballées dans du film alimentaire et stockées à -20°C.

3.2.2 Hybridation sur culture pure Pour les hybridations sur culture pure, on choisit généralement deux souches. Chacune d'entre elles s'hybride avec la sonde générale (EUB 338 par exemple pour la sonde bactérienne) et une seule des souches s'hybride avec la sonde à analyser. Les hybridations sur souche pure permettent d'optimiser la stringence du tampon d'hybridation en utilisant différentes concentrations de formamide. Pour les conditions d'hybridation voir (§ 3.3).

122 Matériel et Méthodes

3.3 Hybridation in situ

3.3.1 L'enrobage des lames d'observation Avant le dépôt des cellules, les lames sont traitées. Laver les lames dans du KOH-éthanol (10% KOH : 10 mL 5M KOH+ 40 mL éthanol). Rincer abondamment avec de l'eau MilliQ (2X). Plonger dans une solution chaude (70°C) de gélatine 0,1% (p/v) et CrKSO4 0,01% (p/v). Sécher à l'air et conserver à l'abri de l'humidité.

3.3.2 Fixation des cellules Cette technique s'applique aux cellules obtenues par culture pure ou aux échantillons. Préparation de la solution de fixation: Chauffer 20 mL d'eau MilliQ dans un tube de 50 mL à 60°C (micro-onde). Ajouter 2 g de paraformaldéhyde. Ajouter 100 ml de NaOH 5N et agiter. La poudre doit se dissoudre rapidement. Ajouter 100 ml HCl 5N. Ajouter 15 mL PBS 10x et 10 mL d'eau. Refroidir la solution à température ambiante. Equilibrer le pH à 7,2 et ajuster à 50 mL. Stériliser par filtration à 0,2 mm. Fixation des cellules Centrifuger 1 mL de culture en fin de phase logarithmique dans un microtube à 4000 g durant 5 min. Supprimer le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS 3x et centrifuger à 4000 g durant 5 min. Resuspendre le culot dans 1 mL de solution de fixation (paraformaldéhyde 4% (p/v) dans du PBS 3x). Fixer les cellules durant 3 heures à 4°C (au minimum) ou 1,5 heure à température ambiante. Centrifuger 5 min à 3000 g (attention les cellules sont fragiles). Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS 3x et centrifuger 3000 g (optionnel). Resuspendre le culot dans 100 mL de PBS 1x /0,1% IGEPAL (p/v) et ajouter 100 µL d'éthanol. Stocker à -20°C.

3.3.3 Extraction des cellules de l'échantillon Afin de limiter le bruit de fond lié à des hybridations non spécifiques des sondes sur des morceaux de cheminée, il a été nécessaire d'extraire les cellules de l'échantillon avant de réaliser les hybridations. Les cellules sont extraites après agitation avec un agent chélateur (le Chelex) et migration sur un gradient de sucrose. Déposer l'échantillon fixé dans un tube de 25 mL. Ajouter 5 mL de PBS 1x/2% PEG8000 (p/v) et 1 g Chelex-100. Agiter vigoureusement. Puis agiter durant 1 heure à 4°C à l'aide d'un agitateur horizontal. Centrifuger à 700 g pendant 1 min et récupérer le surnageant. Effectuer deux nouvelles extractions sur le culot en ne rajoutant que 3 mL de PBS 1x/2% PEG8000 (p/v). Après centrifugation, rassembler les surnageants et les centrifuger 5 min à 700 g. Le surnageant est finalement centrifugé 10 min à 4000g. Le culot (contenant les cellules) est resuspendu dans 1 mL de PBS 1x/0,1% IGEPAL (p/v) (Sigma) et est déposé à la surface de 2 mL d'une solution de PBS 1x/0,1% IGEPAL (p/v)/ 50% Ficoll (p/v) (Sigma). Après 1 min de centrifugation à 4000 g les cellules sont récupérées à la surface du gradient de Ficoll et sont lavées dans du PBS 1x/0,1% IGEPAL (p/v). Elle sont resuspendues dans 60 µL de PBS 1x/ 0,1% IGEPAL (p/v) et 60µL d'éthanol 100%.

123 Matériel et Méthodes

3.3.4 Hybridation in situ Il faut dans un premier temps fixer les cellules sur la lame puis réaliser l'hybridation. Les lames sont ensuite lavées et conservées jusqu'à leur observation. Fixation des cellules sur la lame :

Essuyer les côtés de la lame avec du papier Whatman. Ajouter 1 à 5 mL de la solution de cellules fixées (1µL pour les cultures pures). Laisser sécher à l'air en agitant avec un cône de pipette. Sécher 10 min à 46°C. Pour les bactéries Gram + ajouter 10 µL de lysozyme à 2 mg/mL (5 min à température ambiante). Laver à l'eau MilliQ et sécher à l'air. Sécher les cellules en transférant les lames dans des tubes de 50 mL contenant : 50% (v/v) d'éthanol dans l'eau MilliQ (5 min), 70% (v/v) d'éthanol dans l'eau MilliQ (5 min), 96% (v/v) ou éthanol pur (5 min). Sécher les lames à l'air comprimé. Chambre humide : Utiliser un petit récipient avec un couvercle. Mettre des serviettes en papier au fond et les humidifier avec une solution de la même force ionique que le tampon d'hybridation. On peut utiliser du tampon d'hybridation ou une vieille solution de lavage. Préchauffer la chambre à 48°C. Hybridation : 0,5 µL de sonde (50 ng pour chacune des deux sondes) sont mélangés à 9 µL de tampon d'hybridation (Les solution filles de sondes sont préparées à 100 ng/µL; la solution stock est généralement à 1µg/µl). Déposer les 10 µl dans les puits de la lame. Transférer rapidement dans la chambre humide pour éviter l'évaporation. Incuber 3h à la température d'hybridation (généralement à 46°C).

Stringence des tampon d'hybridation (% de formamide) Pour Eub/Arch : 20% (optimum) 40% (maximum). Pour Cren/Eury : 0%. Pour Thermus : 60%. Pour Thermus/Eub: 60%. Pour Bacillus : 40%. Pour Bacillus/Eub: 40%. Pour Hydrogeno : 60%. Pour Hydr/Eub: 60%. Pour Toga : 20 à 40%. Pour Toga/Eub: 20 to 40%. Pour Epsi : 40%. Pour Epsi/Eub: 40%. Pour GroupC : 40%. Pour GroupC/Eub: 40%. Pour Cren/Arch : 30% Pour Arch : pas plus de 40%

Tampon d'hybridation Tampon de lavage 0,9M NaCl 180mM NaCl 20mM Tris pH 7,5 20mM Tris pH 7,5 0,1% SDS (p/v) % de formamide désiré (voir articles 2 et 3 pour la description des sondes)

Lavage des cellules : Préchauffer 50 mL de solution de lavage dans un tube de 50 mL à la température d'hybridation plus 2°C (soit 48°C). Prévoir deux lames par tube au maximum. Rincer les lames avec de la solution de lavage et les mettre dos à dos dans les tubes de 50 mL. Incuber de 15 minutes à 1 heure. Rincer les lames sur les deux faces avec précaution à l'eau MilliQ pour supprimer le tampon de lavage. Sécher

124 Matériel et Méthodes rapidement à l'air comprimé (pour éviter l'élution de la sonde par l'eau MilliQ). Conserver à 4°C ou observer directement. Epifluorescence : Ajouter environ 20 µL de Citifluor (dans du PBS-glycérol) à la surface de la lame (pas directement dans les puits) et mettre une lamelle. Laisser 15 à 30 min à température ambiante. Le Citifluor (pH 9) équilibre le pH des cellules et limite les phénomènes de fading (affaiblissement). Visualiser les cellules sous un microscope à épifluorescence à l'aide de filtres appropriés : Fluorescéine : excitation à 490 nm, émission à 520 nm. Rhodamine : excitation à 550 nm, émission à 580 nm.

IV Observation et quantification des cellules

Les échantillons fixés sont colorés au SYBR-Green I ou II pour réaliser des comptages de cellules totales. A la différence du DAPI, le SYBR Green se fixe spécifiquement sur les acides nucléiques. Il y a très peu de bruit de fond avec cette coloration, même sur des échantillons dans lesquels les cellules n'ont pas été extraites. 1 à 5 µL d'échantillon ou de cellules extraites sont resuspendus dans 4,5 mL de TE stérile. Le mélange est agité et filtré sur Anodisc 25 à 0,2 µm (Whatman). Afin d'assurer une filtration régulière un second filtre de 0,65 µm (Millipore) est placé sous le filtre de 0,2 µm. Le filtre 0,2 µm est récupéré puis est déposé sur une goutte (100 µL environ) de solution diluée de SYBR Green I ou II (dilution au 1/1000e de la solution mère). La coloration s'effectue par diffusion durant 15 min (au moins) à l'obscurité. Le filtre est monté sur lame, recouvert d'un mélange d'anti-fading (100 à 150 µL) puis d'une lamelle.

Les comptages sont effectués au grossissement X 1000. Un filtre est compté lorsque le nombre de bactéries dans le champ est compris entre 30 et 200. On compte 20 champs par filtre et 2 filtres par échantillon. L’oculaire de comptage permet le dénombrement soit sur toute la surface de l’oculaire soit sur la surface quadrillée. Le filtre optique du SYBR Green est le même que celui utilisé pour l'observation des cellules marquées à la fluorescéine. Les comptages de cellules marquées par des sondes nucléiques sont effectués sur le même nombre de filtres et de champs.

Solution d'anti-fading Solution Fille de SYBR Green 50% 1x PBS (v/v) dilution au 1/1000ede la solution mère dans du TE 50% Glycérol (v/v) le SYBR Green est instable dans l'eau MilliQ. 0,1% p-phénylènediamine (p/v)

125 Articles Article 1

- Analyse moléculaire de la diversité phylogénétique de réservoirs pétroliers continentaux et d'une source chaude terrestre. - Article soumis à Applied and Environmental Microbiology (Janvier 2000). Corre Erwan, Laurent Toffin,and Christian Jeanthon. Molecular Phylogenetic Analysis of the Microbial Diversity of Continental Oil reservoirs.

Article 2

- Etude de la diversité phylogénétique bactérienne associée à un échantilloneur déployé sur un site hydrothermal de la dorsale médio-Atlantique. - Article à soumettre Applied and Environmental Microbiology (Janvier 2000) Corre Erwan, Daniel Prieur and Anna Louise Reysenbach. Molecular Phylogenetic Bacterial Diversity Associated with In Situ Growth Chambers deployed on a Vent Site on the Mid Atlantic Ridge.

Article 3

- Article en préparation : Corre Erwan, Laurent Toffin, Julie Kirshtein, Anna-Louise Reysenbach, Daniel Prieur et Christian Jeanthon. Analyse de la diversité procaryotique associée à des fluides hydrothermaux profonds par séquençage des ADNr 16S, hybridation in situ et enrichissement.

Article 4

-Caractérisation d'une Archaea hyperthermophile méthanogène provenant d'un site hydrothermal profond. - Article publié dans International Journal of Systematic Bacteriology (1999).

Jeanthon C., S. L'Haridon, A.L. Reysenbach, E. Corre, M. Vernet, P. Messner, U.W. Sleytr and D. Prieur. 1999. Methanococcus vulcanius sp. nov., a novel hyperthermophilic methanogen isolated from East Pacific Rise and identification of Methanococcus spp. DSM 4213 as Methanococcus fervens sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:583-589.

Article 5

- Article en préparation : Caractérisation phylogénétique d'Archaea hyperthermophiles radiorésistantes isolées d'un site hydrothermal profond. Edmond JOLIVET, Stéphane L'HARIDON, Erwan CORRE, Patrick FORTERRE and Daniel PRIEUR

Article 6

- Article en préparation : Caractérisation phylogénétique d’une Bacteria thermophile isolée sur le site du Bassin de Lau.

127 Bibliographie : Les références bibliographiques non citées dans les articles sont présentées dans la partie références du manuscrit.

128 Conclusion générale Conclusion générale

Le but de ce travail de thèse était d'étudier, à l'aide de techniques de phylogénie moléculaire, la diversité microbienne inféodée aux réservoirs pétroliers et aux sources hydrothermales profondes. A la lumière des résultats présentés dans ce manuscrit, une représentation schématique des relations s'établissant entre les différents groupes bactériens et archaéens des écosystèmes pétroliers (cf. figure 11.1) et hydrothermaux (cf. figure 11.2) peut être proposée.

Les processus de production primaire autotrophes au sein du réservoir pétrolier sont encore méconnus. Il est donc probable que les micro-organismes se développant dans les réservoirs utilisent, en absence d'oxygène, les hydrocarbures et leurs dérivés comme sources de carbone et comme donneurs d'électrons. Les hydrocarbures peuvent soit subir une dégradation abiotique liée aux fortes pressions, aux fortes températures et à des réactions physico-chimiques avec la roche mère, soit subir une dégradation biotique liée aux micro-organismes présents dans l'eau de production ou dans la roche réservoir. Il a en effet été démontré que les alcanes et un grand nombre d'alkyles benzènes pouvaient être dégradés en anaérobiose par des micro-organismes (Heider et al., 1999 pour revue; Zengler et al., 1999). Il s'agit de bactéries réduisant le sulfate et fer ferrique, ainsi que de bactéries dénitrifiantes. Certains consortiums de bactéries syntrophes et méthanogènes peuvent dégrader les hydrocarbures si l'hydrogène et l'acétate sont consommés activement par méthanogenèse acétoclastique et hydrogénoclastique. Enfin, certaines fermentations peuvent être impliquées dans la dégradation des hydrocarbures (Heider et al., 1999). Les composés simplifiés (chaînes d'alcanes réduites, composés cycliques "ouverts") vont être disponibles pour des micro-organismes pratiquant la respiration anaérobie ou la fermentation. Le méthane et le CO2 peuvent être présentés comme les produits terminaux de cette dégradation anaérobie des hydrocarbures. Or le méthane pourrait être à son tour consommé par d'autres micro-organismes. Il y a peu, seuls les mécanismes d'oxydation aérobie du méthane étaient connus, mais la détection récente de micro-organismes assimilant en anaérobiose le méthane au sein de sédiments marins (Hinrichs et al., 1999) rend cette réaction également envisageable au sein d'un réservoir pétrolier. Les études réalisées par des techniques moléculaires (article 1) et culturales (L'Haridon et al., 1995; Jeanthon et al., 1995) dans le réservoir de Montmirail, nous ont permis de détecter ou de cultiver des micro-organismes fermentaires, sulfato- ou thiosulfato-réducteurs, des bactéries syntrophiques et des méthanogènes. Ces populations pourraient dégrader à forte température et en absence d'oxygène les hydrocarbures et constitueraient la communauté indigène. Cette communauté a pu être "enrichie" par des micro-organismes injectés dans le réservoir lors des processus de récupération secondaire. Présents dans l'eau potable, l'eau de nappe phréatique ou dans les eaux de production retraitées, ces micro-organismes, exogènes et généralement aérobies, sont par la suite retrouvés dans les échantillons prélevés en tête de puits. Les conditions physico- chimiques régnant au sein du réservoir ne permettent probablement pas à ces micro-organismes de participer très activement à la dégradation des hydrocarbures. Toutefois il est probable que certaines micro-niches, à proximité de la zone d'injection d'eau ou dans le puits, rendent cette dégradation possible dans des conditions d'aérobiose ou de micro-aérophilie. Les canalisations des puits

209 Injection d’eau

de nappe CO2 de production potable phréatique

- 3+ Matière organique NO3 Fe Micro-organismes Bactéries sulfato- Mn4+ SO 2- hétérotrophes ou 4 réductrices mésophiles fermentaires Proteobacteria delta (Desulfovibrionaceae) Proteobacteria alpha CO2 2+ Peptococaccaceae Proteobacteria beta N2 Fe Proteobacteria epsilon (Desulfotomaculum) - (Campylobacteriaceae) Proteobacteria gamma NO3 Mn2+ S2- Firmicutes à haut G+C% N2

Mn4+ MnO2(S) Processus de sulfato-réduction et Gaz fermentaires mésophiles Mn2+ induisant le “Pitting”

Fe3+ FeXOXOHX(S) Propionibacteriaceae Thermococcales 2+ Fe Thermotogales Thermoanaerobacter 2- SO4 Thermodesulfobacterium

Bactéries syntrophiques S2- Firmicutes Proteobacteria Composés en C1 CO 2 Fermentations Alcools n-Alcanes CH4 Apport de micro- Acides gras à organismes aérobies Composés Acétogenese courte chaine CO2 contaminants Bactéries du sol et souterraines cycliques Acétate acétoclastique Respirations Méthanogenèse CH4 H2 CO2 Acides gras à CH4 anaérobies hydrogénoclastique longue chaine CO2 Micro-organismes hétérotrophes ou fermentaires

Bactéries sulfato- Methanosarcinales Proteobacteria alpha réductrices thermophiles Proteobacteria beta Proteobacteria delta (Desulfobulbaceae, Proteobacteria gamma Desulfovibrionaceae) Firmicutes à haut 2- Gaz d’origine géologique Fe3+ SO42- S2O3 Peptococaccaceae G+C% (Desulfotomaculum) NO3- Mn4+ - HCO3 Archaeoglobales Dégradation aérobie Fig. 11.1. Ecologie microbienne des sous forme soluble Zone mésophile d’aérobiose réservoirs pétroliers Processus indigènes thermophiles et mésophiles partielle Conclusion générale constituent par ailleurs des biotopes favorables au développement de micro-organismes sulfato- réducteurs mésophiles intervenant activement dans les phénomènes de biocorrosion. La présence de cette communauté mésophile est corrélée à un faible débit d'extraction. Plus la longueur de canalisation est importante, plus le débit est réduit et plus il est possible aux micro-organismes de se développer au sein des installations. Tout autour du réservoir, les communautés de micro-organismes souterrains peuvent elles aussi interagir avec celles présentes dans le réservoir. Il a été proposé (Voordouw et al., 1996) que des micro-organismes sulfo-oxydants (pouvant correspondre dans notre cas à des Proteobacteria epsilon) interviendraient dans la réoxydation des composés soufrés réduits produits par les bactéries sulfato-, thiosulfato- et soufre-réductrices du réservoir. Mais d'autres interactions entre ces deux communautés sont envisageables notamment via les processus de respiration anaérobie. Les mécanismes biotiques et abiotiques se déroulant au sein des réservoirs pétroliers sont encore mal connus en raison, notamment, des difficultés d'échantillonnage et de notre incapacité à prévenir les contaminations par les micro-organismes des sols ou injectés dans la nappe. Aussi considère-t-on comme endémiques des micro-organismes dont les conditions de croissance sont compatibles avec les conditions physico-chimiques des puits. Il est toutefois difficile de connaître l'ensemble des conditions physico-chimiques inhérentes à un réservoir s'étendant sur une surface de plusieurs kilomètres carrés, sur plusieurs dizaines de mètres de profondeur et au travers de différentes roches. Aussi, il est probable que des conditions de température modérée et/ou d'aérobiose partielle puissent exister au sein du réservoir en particulier lorsque la nappe est en contact avec la roche couverture. Il ne nous aura pas été possible au cours de cette étude d'estimer la représentativité des séquences détectées au sein du réservoir. Si les séquences correspondant aux micro-organismes sulfato-réducteurs semblent dominer certaines des banques obtenues, seules des expériences d'hybridation in situ nous permettraient de préciser la contribution de ces micro-organismes dans cet environnement. Par ailleurs ce type d'étude n'a jamais été réalisé à partir d'échantillon de réservoirs pétroliers.

Au sein des écosystèmes hydrothermaux profonds on distingue les micro-organismes se développant dans la "zone chaude" à proximité des fumeurs, dans le fluide ou les parois des cheminées (partie gauche de la figure 11.2), de ceux se développant dans la zone froide ou à température modérée, dans l'eau de mer, sous forme libre ou en association symbiotique avec la macro-faune des sources hydrothermales (partie droite de la figure 11.2). Dans la zone froide, la production primaire est assurée par des bactéries chimiosynthétiques autotrophes sulfo-oxydantes sous une forme libre ou associées à la macrofaune. Les Proteobacteria epsilon que nous avons détectées dans les échantillons de "Vent Cap" pourraient intervenir dans ces processus puisqu'elles semblent être associées à certaines espèces d'Annélides (Haddad et al., 1994) et de Crustacés (Poltz et Cavanaugh, 1995) mais qu'elles sont aussi présentes sous une forme libre dans des tapis bactériens ou sur des édifices minéraux (Moyer et al., 1995; Poltz et Cavanaugh,

210 Micro-organismes Micro-organismes autotrophes 2- hétérotrophes S2O3 Communauté microbienne Communauté microbienne marine (CH2O)n S2- 2- Sulfato-, thiosulfato- Sulfato-réducteurs SO4 réducteurs thermophile sous une forme libre Archaeoglogus CO2 SO42- Archaeoglogus Micro-organismes S2- Thermotoga dans les panaches ou dans les parois Micro-organismes hétérotrophes photosynthétiques Production primaire Soufre-réducteurs S2- S° Soufre-réducteurs Desulfurobacteriales Thermococcales des cheminées Cytophagales Cyanobactéries 2- Pyrodictium S° 60 à 100°C S Staphylothermus Planctonomycetales (CH2O)n H2O O2 Aérobies Verucomicrobiales Archaea Groupes I et II Hydrogène-oxydants Thermus sp. H Proteobacteria Firmicutes Aquificales 2 H2O Bacillus sp. (CH2O)n Méthanogènes CH4 Fermentaires hydrogénoclastiques Thermococcales (CH2O)n CO2 CO2 CO2 Methanococcales CO2 Thermosipho sp. Methanopyrus Desulfurococcus sp. Staphylothermus Production primaire Pyrodictium Consommateurs 350°C

350°C ? ? Consommateurs Archaea non cultivées H O CO 2 350°C ? Proteobacteria inconnues 2 Micro-organismes O2 aérobies 350°C SO42- ? Micro-organismes CO2 sulfo-oxydants Micro-organismes (CH2O)n fermentaires Proteobacteria S2- Oxydation/précipitation par N 2+ 2+ Thiomicrospira sp. 2 Fe Mn Micro-organismes à mélange avec l'eau de mer froide Thiobacillus sp. - respiration anaérobie Beggiatoa sp. Mn4+ NO3 Fe3+ Mn4+ 3+ S2- Micro-organismes Fe (dont micro-organismes CO2 (CH2O)n SO42- sulfato réducteurs) FeS + O2 Fe(O)OH Fe-, Mn- oxydants SO 2- Mn2+ 4 Thiobacillus sp. CH4 2+ Micro-organismes Mn + O MnO Fe 2 2 (CH2O)n méthanogènes CH4 CH4 CO2 S2- CO2 Micro-organismes Micro-organismes methylo, sulfo-oxydants Communauté microbienne methanotrophes mésophile sous forme libre ou Proteobacteria Proteobacteria 100°C Proteobacteria Proteobacteria Percolation de l'eau de Fort débit sous forme de tapis mer froide Température élevée Macro-faune et communauté Eau de mer chauffée microbienne mésophile symbiotique Communauté microbienne enrichie en minéraux Zone de mélange des eaux soutérraine Température moyenne (voir Fig. 11.1)

1000°C Lessivage de Ca2+, Mn2+, Fe2+ et Cu2+

Fig. 11.2. Ecologie microbienne des BASALTE sources hydrothermales profondes Conclusion générale

1995; Cary et al., 1997) ou dans le fluide (articles 2 et 3). Jusqu'à présent aucun micro-organisme méthanotrophe autotrophe n'a été détecté sous une forme libre mais ceux-ci interviennent activement en tant que producteurs primaires sous une forme symbiotique associée à des Mythilidés (Nealson et Fischer, 1995). D'autre part, des activités in situ correspondant à une oxydation du méthane par des formes libres ont déjà été enregistrées à proximité des sources hydrothermales profondes (De Angelis et al., 1991). Des micro-organismes n'oxydant strictement que les métaux, tels que le Fe(II) et le Mn(II), n'ont pas été isolés. Si certains Thiobacillus peuvent se développer en autotrophie en oxydant les métaux, le fer ferreux n'est quant à lui stable que dans des conditions acidophiles qui ne sont rencontrées dans les sources hydrothermales que dans le fluide chaud. Les consommateurs du pôle froid sont soit les macro-organismes associés aux bactéries symbiotiques, soit d'autres micro- organismes sous une forme libre se développant en hétérotrophie en conditions d'anaérobiose (fermentations, respirations anaérobies) ou d'aérobiose complète ou partielle (respiration aérobie, micro-aérophilie). On connaît peu de chose sur ces micro-organismes mésophiles en grande partie parce que les études microbiologiques se sont très vite focalisées sur les micro-organismes thermophiles. Il est toutefois probable qu'on puisse retrouver dans cette communauté des micro- organismes issus des communautés microbiennes marines et souterraines. Ces micro-organismes transportés par les courants, déposés avec les sédiments ou charriés par des émissions de fluide hydrothermal à base température, profiteraient d'un apport abondant en matière organique pour se développer activement et contribuer aux différents cycles géochimiques (C, N, S, métaux) au sein de l'écosystème hydrothermal. Dans la zone chaude, c'est à dire dans le panache du fluide hydrothermal, à proximité et dans les parois des cheminées, la production primaire pourrait être assurée par des micro-organismes chimiolithoautotrophes thermophiles. Il est aussi possible que la matière organique produite dans les zones froides se retrouve dans les zones chaudes ou que des processus géochimiques de profondeur puissent être générateurs de matière organique. Les Methanococcales réalisant une méthanogenèse hydrogénoclastique (article 4), les Archaeoglobales sulfato-réductrices et les Desulfurobacteriales soufre-réductrices détectées dans nos échantillons pourraient contribuer activement à la production primaire biotique du pôle chaud (Harmsen et al., 1997b; article 3). Les micro-organismes associés aux Aquificales détectés dans l'échantillon VC 2.1 pourraient quant à eux intervenir dans la production primaire en oxydant l'hydrogène (article 3; Reysenbach et al., 1999). Les micro-organismes thermophiles hétérotrophes se développant dans le pôle chaud sont mieux connus que leurs analogues du pôle froid. Les enrichissements d'hétérotrophes thermophiles en présence de soufre sont généralement dominés par les Thermococcales, micro-organismes fermentaires réduisant le soufre (articles 3 et 5). Il nous a été possible, par ailleurs, de détecter des Thermotogales et des Thermus dans de faibles proportions, pouvant eux aussi se développer, respectivement en anaérobiose et aérobiose, au niveau du pôle chaud (article 3). Bien qu'ils n'aient pas été détectés dans nos échantillons, des Bacillus ont déjà été isolés sur le site du Snake Pit (cf. tableau 6.1; Marteinson et al., 1996). Ces micro-organismes sont présents de manière ubiquiste dans de nombreux environnements terrestres ou marins, en raison notamment de leur capacité à sporuler. Ils

211 Conclusion générale dominent généralement les enrichissements aérobies à haute température. Ces micro-organismes peuvent prendre part activement à la consommation de la matière organique au niveau du pôle chaud des sources hydrothermales (article 6). Les variations de disponibilité des nutriments, liées aux caractère abrupt des gradients physico-chimiques à la sortie des sources hydrothermales, mais aussi aux forts courants de fond, favorisent très probablement le développement des micro-organismes mixotrophes. Mais les techniques d'isolement généralement utilisées ne favorisent pas la détection de ce type métabolique (Karl, 1995). La forte variabilité de séquences d'ADNr 16S observée pour de nombreux groupes phylogénétiques (notamment pour les Proteobacteria epsilon) dans chacun de nos échantillons (articles 2 et 3, Reysenbach et al., 1999) pourrait correspondre à une réponse adaptative corrélée aux variabilités des conditions environnementales.

Les écosystèmes pétroliers et hydrothermaux profonds présentent de fortes similitudes tant au niveau de leur localisation (environnements souterrains ou profonds), de leurs conditions physico- chimiques (forte température, forte pression, anoxie) que des communautés microbiennes qu'ils hébergent (micro-organismes thermophiles, fermentatifs, sulfato-réducteurs, soufre-oxydants). Le soufre et les composés soufrés y sont considérés comme des éléments-clés des processus métaboliques indigènes. Comme les micro-organismes décrits les plus intimement associés au dernier ancêtre commun sont des hyperthermophiles anaérobies réduisant le soufre, il a été suggéré que la réduction du soufre pourrait être l'une des premières formes de respiration microbienne (Madigan et al., 1996). Il a cependant été récemment démontré qu'un grand nombre de micro-organismes thermophiles isolés d'écosystèmes chauds (par exemple des méthanogènes, des fermentatifs ou des sulfato-réducteurs) étaient également capables de réduire le fer ferrique en présence d'H2 comme seule source d'électrons (Vargas et al., 1998; Slododkin et al., 1999). Compte tenu de l'abondance de ce métal dans l'ensemble de la biosphère terrestre, la réduction du fer aurait pu constituer un processus majeur sur la Terre primitive et serait encore actuellement prépondérante dans les biosphères souterraines (Liu et al.,1997b; Lovley, 1997).

Un grand nombre de séquences, en particulier celles affiliées à des groupes phylogénétiques où aucun isolat n'est disponible (Crenarchaeota et Euryarchaeota non cultivées, Bacteria "branchant" profondément, nouvelles Proteobacteria) ne peuvent clairement être associées à un biotope ou à un processus métabolique. L'utilisation de nouvelles techniques d'isolement (comme par exemple les pinces optiques) combinée à celle de sondes moléculaires, l'analyse phylogénétique et la quantification de gènes impliqués dans des fonctions métabolique (via le séquençage, les puces à ADN et l'analyse des ARNm) ainsi que la généralisation des études génomiques pourraient permettre d'attribuer une fonction et une place dans l'écosystème à ces micro-organismes.

L'origine endémique ou cosmopolite des communautés de micro-organismes thermophiles et mésophiles des écosystèmes hydrothermaux et pétroliers reste encore indéterminée. Si certains

212 Conclusion générale genres, à l'instar de Thermococcus, de Bacillus, de Thermotoga, de Thermosipho ou de Methanococcus, ont été détectés de manière ubiquiste en milieu hydrothermal côtier et profond, et en milieu pétrolier marin et continental, d'autres semblent strictement associés à un environnement donné, comme les Petrotoga et les Geotoga dans les réservoirs pétroliers ou les Pyrolobus et Desulfurobacterium dans les écosystèmes hydrothermaux profonds. En poursuivant l'analyse de ces écosystèmes, en entreprenant par exemple des études de génétique des populations, sur la base des espaces intergéniques ou des gènes codants pour des protéines, de différencier les populations écologiquement distinctes et d'établir leur origine biogéographique.

L'analyse de la diversité des communautés microbiennes d'environnements extrêmes peut présenter un intérêt économique autant que fondamental. Hunter-Cevera s'interrogeait récemment sur la valeur que pouvait présenter cette diversité (Hunter-Cevera, 1998). On peut y voir une valeur pécuniaire au travers des processus métaboliques que l'on peut détecter, cloner et exprimer à une échelle industrielle (Garrity et Hunter-Cevera, 1999). Mais elle présente avant tout une valeur fondamentale. De telles études contribuent d'une part à un inventaire des espèces vivantes tel que cela a été proposé par Pace (1997), et d'autre part à mieux définir quelles pourraient être les frontières géographiques et physico-chimiques du vivant et la nature des premières formes de vie terrestres.

213 Références biobliographiques Références bibliographiques

Angert E.R., K.D. Clements and N.R. Pace. 1993. The A largest bacterium. Nature 362:239-241. Antoine E., V. Cilia., J.R. Meunier, J. Guezennec, F. Abu Al-Soud W. and P. Rådström. 1998. Capacity of nine Lesongeur and G. Barbier. 1997. Thermosipho thermostable DNA polymerases to mediate DNA melanesiensis sp. nov., a new thermophilic anaerobic amplification in the presence of PCR-inhibiting samples. Appl. bacterium belonging to the order Thermotogales, isolated from Environ. Microbiol. 64:3748-3753. deep-sea hydrothermal vents in the Southwestern Pacific Acinas S.G., F. Rodriguez-Valera and C. Pedros-Alio. ocean. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:1118-1123. 1997. Spatial and temporal variation in marine Aoshima M., Y. Nishibe, M. Hasegawa, A. Yamagishi and bacterioplankton diversity as shown by RFLP fingerprinting of T. Oshima. 1996. Cloning and sequencing of a gene encoding PCR amplified 16 S rDNA. FEMS Microbiol. Ecol. 24:27-40. 16S ribosomal RNA from a novel hyperthermophilic Acinas S.G., J. Anton and F. Rodriguez-Valera. 1999. archaebacterium NC12. Gene 180:183-187. Diversity of free-living and attached bacteria in offshore Apajalahti J.H., L.K. Sarkilahti, B.R. Maki, J.P. Heikkinen, Western Mediterranean waters as depicted by analysis of P.H. Nurminen and W.E. Holben. 1998. Effective recovery genes encoding 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 65:514- of bacterial DNA and percent-guanine-plus-cytosine-based 522. analysis of community structure in the gastrointestinal tract of Ahmad A., J.P. Barry and D.C. Nelson. 1999. Phylogenetic broiler chickens. Appl. Environ. Microbiol. 64:4084-8408. affinity of a wide, vacuolate, nitrate-accumulating Beggiatoa Arahal D.R., F.E. Dewhirst, B.J. Paster, B.E. Volcani and sp. from Monterey Canyon, California, with Thioploca spp. A. Ventosa. 1996. Phylogenetic analyses of some extremly Appl. Environ. Microbiol. 65:270-277. halophilic archaea isolated from Dead Sea water, determined Alfredsson G. A., J.K. Kristjansson, S. Hjorleifsdottir and on the basis of their 16S rRNA sequences. Appl. Environ. K.O. Stetter. 1988. Rhodothermus marinus, gen. nov., a Microbiol. 62:3779-3786. thermophilic, halophilic bacterium from submarine hot springs Arai Y., R. Yasuda, K.I. Akashi, Y. Harada, H. Miyata, K. in Iceland. J. Gen. Microbiol. 134:299-306. Kinosita Jr. and H. Itoh. 1999. Tying a molecular knot with Alfreider A., J. Pernthaler, R. Amann, B. Sattler, F.O. optical tweezers. Nature 399: 446-448. Glöckner, A. Wille and R. Pessner. 1996. Community Arnheim N. and H. Erlich. 1992. Polymerase chain reaction analysis of the bacterial assemblags in the winter cover and strategy. Annu. Rev. Biochem. 61:131-156. pelagic layers of a high mountain lake by in situ hybridization. Appl. Envir. Microbiol. 62:2138-2144. Arrage A.A., T.J. Phelps, R.E. Benoit and D.C. White. 1993. Survival of subsurface microorganisms exposed to UV Alm E.W., D.B. Oerther, N. Larsen, D.A. Stahl and L. radiation and hydrogen peroxide. Appl. Envir. Microbiol. 59: Raskin. 1996. The oligonucleotide probe database. Appl. 3545-3550. Environ. Microbiol. 62:3557-3559. Asai T., C Condon, J. Voulgaris, D. Zaporojets, B. Shen, Altschul S.F., T.L. Madden, A.A. Schaffer, J. Zhang, Z. M. Al-Omar, C. Squires and C.L. Squires. 1999a. Zhang, W. Miller and D.J. Lipman. 1997. Gapped BLAST Construction and initial characterization of Escherichia coli and PSI-BLAST: a new generation of protein database search strains with few or no intact chromosomal rRNA operons. J. programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Bacteriol. 181:3803-3809. Alvarez A.J., M.P. Buttner and L.D. Stetzenbach. 1995. Asai T., D. Zaporojets, C. Squires and C.L. Squires. PCR for bioaerosol monitoring: sensitivity and environmental 1999b. An Escherichia coli strain with all chromosomal rRNA interference. Appl. Envir. Microbiol. 61:3639-3644. operons inactivated: complete exchange of rRNA genes Amann R. and M. Kuhl. 1998. In-situ methods for between bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1971-1976. assessment of microorganisms and their activities. Curr. Askin A. and J.M. Dziedzic. 1987. Optical trapping and Opin. Microbiol. 1:352-358. manipulation of virus and bacteria. Science 235:1517-1520. Amann R.I., B. Binder, R.I. Olson, S.W. Chisholm, R. Atlas R.M., G. Sayler, R.S. Burlage and A.K. Bej. 1992. Devereux and D.A. Stahl. 1990a. Combination of 16S rRNA- Molecular approaches for environmental monitoring of targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for microorganisms. BioTechniques 12:706-717. analyzing mixed microbial populations. Appl. Environ. Microbiol. 56:1919-1925. Amann R.I., B. Zarda, D.A. Stahl and K.H. Schleifer. 1992b. Identification of individual prokaryotic cells by using B enzymes-labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes. Appl. Envir. Microbiol. 58:3007-3011. Bader J.S., R.W. Hammond, S.A. Henck, M.W. Deem, Amann R.I., J. Stromley, R. Deveureux, R. Key and D.A. G.A. McDermott, J.M. Bustillo, J.W. Simpson, G.T. Stahl. 1992a. Molecular and microscopic identification of Mulhern and J.M. Rothberg. 1999. DNA transport by a sulfate reducing bacteria in multispecies biofilm. Appl. Envir. micromachined brownian ratchet device. Proc. Natl. Acad. Microbiol. 58:614-623. Sci. USA 96:13165-13169. Amann R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990b. Balkwill D.L., R.H. Reeves, G.R. Drake, J.Y. Reeves, F.H. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for Crocker, M.B. King and D.R. Boone. 1997. Phylogenetic determinative, phylogenetic, and environmental studies in characterization of bacteria in the subsurface microbial culture microbiology. J. Bacteriol. 172:762-770. collection. FEMS Microbiol. Rev. 20:201-216. Amann R.I., W. Ludwig and K.H. Schleifer. 1995. Bally R., T. Heulin and P. Lemanceau. 1999. Les microbes phylogenetic identification and in situ detection of individual et le cultivateur. Biofutur 185:17-19. microbial cells without cultivation. Microbiological Reviews. Barns S. and S.A. Nierzwicki-Bauer. 1997. Microbial 59:143-169. diversity in ocean, surface and subsurface environments. from Amellal N, G. Burtin, F. Bartoli and T. Heulin. 1998. Geomicrobiology: Interaction between microbes and minerals. Colonization of wheat roots by an exopolysaccharide- J.F. Banfield and K.H. Nealson, eds. J. Revs. in Mineralogy producing pantoea agglomerans strain and its effect on 35:35-79. rhizosphere soil aggregation. Appl. Environ. Microbiol. Barns S.M., C.F. Delwiche, J.D. Palmer and N.R. Pace. 64:3740-3747. 1996a. Perspectives on archaeal diversity, thermophily and Anderson A.W., N.R.F. Cain, G. Parrish and D. Duggan. monophyly from environmental rRNA sequences. Proc. Natl. 1956. Studies on a radio-resistant Micrococcus. I. Isolation, Acad. Sci. USA 93:9188-9193. morphology, cultural characteristics and resistance to gamma Barns S.M., C.F. Delwiche, J.D. Palmer, S.C. Dawson, K.L. radiation. Food technology 10:575-578. Hershberger and N.R. Pace. 1996b. Phylogenetic Anderson R.T., F.H. Chapelle and D.R. Lovley. 1998. perspective on microbial life in hydrothermal ecosystems, Evidence against hydrogen-based microbial ecosystems in past and present. Ciba Found Symp. discussion 32-9 202:24- basalt aquifers. Science 281:976-977. 32.

214 Références bibliographiques

Barns S.M., R.E. Fundyga, M.W. Jeffries and N.R. Pace. bacteria isolated from hot composts. Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. Remarkable archaeal diversity detected in a 47:1246-1248. Yellowstone National Park hot spring environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1609-1613. Blanchot J., L. Guillou, F. Partensky, N. Simon and D. Vaulot. 1998. Le petit peuple du grand large. Biofutur 179:22- Barns S.M., S.L. Takala and C.R. Kuske. 1999. Wide 24. distribution and diversity of members of the bacterial kingdom Acidobacterium in the environment. Appl. Environ. Microbiol. Blöchl E., R. Rachel, S. Burggraf, D. Hafenbradl, H.W. 65:1731-1737. Jannasch and K.O. Stetter. 1997. Pyrolobus fumarii, gen. and sp. nov., represents a novel group of archaea, extending Baross J.A. and Deming J.W. 1995. Growth at high the upper temperature limit for life to 113¡C. Extremophiles temperatures: isolation and taxonomy, physiology, ecology. In: 1:14-21. Karl DM (Ed) The Microbiology of Deep-sea Hydrothermal Vents (pp 169-217). CRC Press Inc, Boca Raton. Bogan B.W., B. Schoenike, R.T. Lamar and D. Cullen. 1996. Manganese peroxidase mRNA and enzyme activity Baross J.A. and S.E. Hoffman. 1985. Submarine levels during bioremediation of polycyclic aromatic hydrothermal vent and associated gradients environments as hydrocarbon-contaminated soil with Phanerochaete sites for the origin and evolution of life. Origins of life 15:327- chrysosporium. Appl. Envir. Microbiol. 62:2381-2386. 345. Boivin-Jahns V, R Ruimy, A Bianchi, S Daumas and R Baross J.A., J.W. Deming and R.R. Becker. 1984. Evidence Christen.1996. Bacterial diversity in a deep-subsurface clay for microbial growth in high-temperature high-pressure environment. Appl. Environ. Microbiol. 62:3405-3412. environments. In: Current Perspectives in Microbial ecology (M.J. Klug and C.A. Reddy eds.), p 186-195. A.S.M.: Bollet C., M.J. Gevaudant, X. de Lamballerie, C. Zandotti Washington D.C. and P. de Micco. 1991. A simple method for the isolation of chromosomal DNA from Gram positive od acid-fast bacteria, Bartlett M.S., S.H. Vermund, R. Jacobs, P.J. Durant, M.M. Nucl.Acids Res.19:1955. Shaw, J.W. Smith, X. Tang, J.J. Lu, B. Li, S. Jin and C.H. Lee. 1997. Detection of Pneumocystis carinii DNA in air Bond P.L., P. Hugenholtz, J. Keller and L.L. Blackall. samples: likely environmental risk to susceptible persons. J. 1995. Bacterial community structures of phosphate-removing Clin. Microbiol. 35:2511-2513. and non-phosphate-removing activated sludges from sequencing batch reactors. Appl. Envir. Microbiol. 61:1910- Bastin E.S. 1926. The problem of natural reduction of sulfates. 1916. Bull. Am. Associat. Petrol. Geologists 10:1270-1299. Boone D.R., Y. Liu, Z.J. Zhao, D.L. Balkwill, G.R. Drake, Beeder J., R.K. Nilsen, J.T. Rosnes, T. Torsvik and T. T.O. Stevens and H.C. Aldrich. 1995. Bacillus infernus sp. Lien. 1994. Achaeoglobus fulgidus isolated from hot north sea nov., an Fe(III)- and Mn(IV)-reducing anaerobe from the deep oil field waters. Appl. Environ. Microbiol. 60:1227-1231. terrestrial subsurface. Int. J. Syst. Bacteriol. 45:441-448. Begon M., Harper J.L. and C.R. Townsend. 1996. Ecology: Borin S., D. Daffonchio and C. Sorlini. 1997. Single strand individuals, populations and communities. 3rd Edition. conformation polymorphism analysis of PCR-tDNA Blackwell Science Eds. Oxford. fingerprinting to address the identification of Bacillus species. FEMS Microbiol. Lett. 157:87-93. Bej A.K., M.H. Mahbubani, J.L. Dicesare, and R. Atlas. 1991. Polymerase chain reaction-gene probe detection of Borneman J. and E.W. Triplett. 1997. Molecular microbial microorganisms by using filter-concentrated samples. Appl. diversity in soils from eastern Amazonia: evidence for unusual Envir. Microbiol. 57:3529-3534. microorganisms and microbial population shifts associated with deforestation. Appl. Envir. Microbiol. 63: 2647-2653. Bekins BA, E.M. Godsy and E. Warren. 1999. Distribution of microbial physiologic types in an aquifer contaminated by Borneman J., P.W. Skroch, K.M. O'Sullivan, J.A. Palus, crude oil. Microb. Ecol. 37:263-275. N.G. Rumjanek, J.L. Jansen, J. Nienhuis and E.W. Triplett. 1996. Molecular microbial diversity of an agricultural Benloch S., F. Rodriguez-Valera and A.J. Martinez- soil in Wisconsin. Appl. Envir. Microbiol. 62: 1935-1943. Murcia. 1995. Bacterial diversity in two coastal lagoons deduced from 16S rDNA PCR amplification and partial Böttger E.C. 1989. Rapid determination of bacterial sequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 18:267-280. ribosomal RNA sequences by direct sequencing of enzymatically amplified DNA. FEMS Microbiol. Lett. 65:171- Benson D.A., M.S. Boguski, D.J. Lipman, J. Ostell, B.F. 176. Ouellette, B.A. Rapp and D.L. Wheeler. 1999. GenBank. Nucleic Acids Res. 27:12-17. Böttiger E.C. 1996. Approaches for identification of microorganisms. ASM News 62:247-250. Bernalier A., V. Rochet, M. Leclerc, J. Dore and P. Pochart. 1996. Diversity of H2/CO2-utilizing acetogenic Brack A. 1999. Vie extraterrestre : les charmes de bacteria from feces of non-methane-producing humans. Curr. l'improbable. La Recherche 317:50-52. Microbiol. 33:94-99. Brack A. and C.T. Pillinger. 1998. Life on Mars: chemical Bernard F.P., J. Connan and M. Magot. 1992. Indigenous arguments and clues from martian meteorites. Extremophiles microorganisms in connate water of many oil fields: a new 2:313-319. tool in exploration and production techniques, SPE 24811. Annual technical conference and exhibition of the Society of Brack A. and F. Raulin. 1999. La vie dans le système Petroleum Engineers, Washington, D.C., October, 4-7. solaire. Pour la Science H.S. Les terres celestes:40-42. Berns M. 1998. Pinces et ciseaux optiques. Pour la Science Bradford D., P. Hugenholtz, E.M. Seviour, M.A. 248 (Edition internet). Cunningham, H. Stratton, R.J. Seviour and L.L. Blackhall. 1996. 16S rRNA analysis of isolates obtained from Bertrand C. and H. Larsen. 1988. La “bactérie marine” : gram-negative filamentous bacteria micromanipulated from mythe ou réalité, pp.3-25. In: Micro-organismes dans les actived sludge. System. Appl. Microbiol. 19:334-343. écosystèmes océaniques, M. Bianchi, D. Marty, J.C. Bertrand, P. Caumette, M. Gauthier et coll. (Eds), Masson, Brechtold M. and H. König. 1996. Phylogenetic analysis Paris. and in situ identification of uncultivated Spirochete from the hindgut of the termite Mastotermes darwiniensis. System. Bintrin S.B., T.J. Donohue, J. Handelsman, G.P. Roberts Appl. Microbiol. 19:66-73. and R.M. Goodman. 1997. Molecular phylogeny of archaea from soil. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:227-282. Brechtold M., A. Chatzinotas, W. Schönhuber, A. Brune, R. Amann, D. Hahn and H. König. 1999. Differential Blackburn N., Å. Hagström, J. Wikner, R. Cuadros- enumeration and in situ localization of microorganisms in the Hansson and P.K. Bj¿rnsen. 1998. Rapid determination of hingut of the lower termite Mastodermes darwiniensis by bacterial abundance, biovolume, morphology, and growth by hybridization with rRNA-targeted probes. Arch. Microbiol. neural network-based image analysis. Appl. Envir. Microbiol. 172:407-416. 64:3246-3255. Briglia M., R.I.L. Eggen, W.M. de Vos, and J.D. van Elsas. Blanc M., L. Marilley, T. Beffa and M. Aragno. 1997. Rapid 1996. Rapid and sensitive method for the detection of identification of heterotrophic, thermophilic, spore-forming Mycobacterium chlorophenolicum PCP-1 in soil based on 16S

215 Références bibliographiques rRNA gene-targeted PCR. Appl. Envir. Microbiol. 62: 1478- Canganella F., W.J. Jones, A. Gambacorta and G. 1480. Antranikian. 1998. Thermococcus guaymasensis sp. nov. and Thermococcus aggregans sp. nov., two novel Brinkhoff T., C.M. Santegoeds, K. Sahm, J. Kuever and thermophilic archaea isolated from the Guaymas Basin G. Muyzer. 1998. A polyphasic approach to study the diversity hydrothermal vent site. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:1181-1185. and vertical distribution of sulfur-oxidizing Thiomicrospira species in coastal sediments of the german wadden Sea. Appl. Cano R.J. and H.N. Poinar. 1993. Rapid isolation of DNA Environ. Microbiol. 64:4650-4657. from fossil and museum specimens suitable for PCR. Biotechniques 15:432-436. Britschgi T.B. and R.D. Fallon. 1994. PCR-amplification of mixed 16S rRNA genes from anaerobic, cyanide-degrading Cano R.J. and M.K. Borucki. 1995. Revival and consortium. FEMS Microbiol. Ecol. 13:225-232. identification of bacterial spores in 25- to 40-million-year-old Dominican amber. Science 268:1060-1064. Britschgi T.B. and S.J. Giovannoni. 1991. Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by Cano R.J., M.K. Borucki, M. Higby-Schweitzer, H.N. rRNA gene cloning and sequencing. Appl. Environ. Microbiol. Poinar, G.O. Poinar Jr and K.J. Pollard. 1994. Bacillus DNA 57:1707-1713. in fossil bees: an ancient symbiosis? Appl. Environ. Microbiol. 60:2164-2167. Brock T.D. 1986. Introduction: an overview of the thermophiles. In: Brock, T.D. (ed) Thermopiles: general, Carr M.H. 1996. Water on early mars. Evolution of molecular, and applied microbiology. Wiley, New-York, p 1- hydrothermal ecosystems on Earth (and Mars?). Wiley, 16. Chichester (ciba Foundation symposium 202) 249-267. Brock T.D. 1995. The road to Yellowstone and beyond. Annu. Cary C., T. Shank and J. Stein. 1998. Worms bask in Rev. Microbiol. 49:1-28. extreme temperature. Nature 391:545-546. Brock T.D. and H. Freeze. 1969. Thermus aquaticus gen. Cary S.C., M.T. Cottrel, J.L. Stein, F. Camacho and D. nov., a nonsporulating extreme thermophile. J. Bacteriol. Desbruyères. 1997. Molecular indentification and localization 98:289-297. of filamentous symbiotic bacteria associated with the hydrothermal vent annelid, Alvinella pompejana. Appl. Bruce K.D., W.D. Hiorns, J.L. Hobman, A.M. Osborn, P. Environ. Microbiol. 63:1124-1130. Strike and D.A. Ritchie. 1992. Amplification of DNA from native populations of soil bacteria by using the polymerase Caumette P., M. Kühl, O. Pringault and R. De Witt. 1998. chain reaction. Appl. Envir. Microbiol. 58:3413-3416. Etude expérimentale de la compétition entre bactéries pourpres et bactéries vertes anoxygéniques en milieu Brune A. 1998. Termite guts: the world's smallest benthique. 5ème congrès de la Société Française de bioreactors. Trends Biotech. 16:16-21. Microbiologie. 27, 28, 29 avril 1998 Lille, France. Brunk C.F. and N. Eis. 1998. Quantitative measure of small- Cavanaugh C.M., C.O. Wirsen and H.W. Jannasch. 1992. subunit rrna gene sequences of the kingdom Korarchaeota. Evidence for methylotrophic symbionts in a hydrothermal vent Appl. Envir. Microbiol. 64:5064-5066. mussel (Bivalvia: Mytilidae) from the Mid-Atlantic Ridge. Brunk C.F., E. Avaniss-Aghajani and C.A. Brunk. 1996. A Appl. Environ. Microbiol. 58:3799-3803. computer analysis of primer and probe hybridization potential Cavanaugh C.M., S.L. Gardiner, M.L. Jones, H.W. with bacterial small-subunit rRNA sequences. Appl. Envir. Jannasch and J.B. Waterbury. 1981. Prokaryotic cells in the Microbiol. 62:872-879. hydrothermal vent tube worm, Riftia pachyptila: possible Bruns A. and L. Berhe-Corti. 1998. In-situ detection of chemoautotrophic symbionts. Science 213:340-342. bacteria in continuous-flow cultures of seawater sediments Cazemier A.E., J.H.P. Hackstein, H.J.M. Op den Camp, J. suspensions with fluorescently labelled rRNA-directed Rosenberg and C. van der Drift. 1997. Bacteria in the oligonucleotide probes. Microbiology 144:2783-2790. intestinal tract of different species of Arthropods. Microb Ecol Bruns M.A., J.R. Stephen, G.A. Kowalchuk, J.I. Prosser 33:189-197. and E.A. Paul. 1999. Comparative diversity of ammonia Cha D.K., J.J. Fuhrmann, D.W. Kim and C. M. Golt. 1999. oxidizer 16S rRNA gene sequences in native, tilled, and "Fatty acid methyl ester (FAME) analysis for monitoring successional soils. Appl. Environ. Microbiol. 65:2994-3000. Nocardia levels in activated sludge." Water Research, Buckley D.H., J.R. Graber and T.M. Schmidt. 1998. 33:1964. Phylogenetic analysis of nonthermophilic members of the Chandler D.P., F.J. Brockman, T.J. Bailey and J.K. kingdom Crenarchaeota and their diversity and abundance in Fredrickson. 1998. Phylogenetic diversity of Archaea and soils. Appl. Envir. Microbiol. 64:4333-4339. Bacteria in a deep subsurface paleosol. Microb. Ecol. 36:37- Burggraf S., H. Huber and K.O. Stetter. 1997. 50. Reclassification of the crenarchaeal orders and families in Chandler D.P., S.M. Li, C.M. Spadoni, G.R. Drake, D.L. accordance with 16S rRNA sequence data. Int. J. Syst. Balkwill, J.K. Fredrickson and F.J. Brockman. 1997. A Bacteriol. 47:657-660. molecular comparaison of culturable aerobic heterotrophic Burggraf S., H.W. Jannasch, B. Nicolaus and K.O. bacteria and 16S rDNA clones derived from a deep Stetter. 1990. Archaeoglobus profundus sp. nov., represents a subsurface sediment. FEMS Microbiol. Ecol. 23:131-144. new species within the sulfate-reducing archaeobacteria. Charbonnier F., P. Forterre, G. Erauso and D. Prieur. System. Appl. Microbiol. 13:24-28. 1995. Purification of plasmids from thermophilic and Burggraf S., T. Mayer, R. Amann, S. Schadhauser, C.R. hyperthermophilic Archaea, in Thermophiles, Archaea a Woese and K.O. Stetter. 1994. Identifying members of the laboratory manual, edited by F.T. Robb and A.R. Place, Cold domain Archaea with rrna-targeted oligonucleotide probes. Spring Harbor Laboratory Press. Appl. Environ. Microbiol. 60:3112-3119. Chen F., J.M. González, W.A. Dustman, M.A. Moran and Burks C. 1999. Molecular biology database list. Nucleic Acids R.E. Hodson. 1997. In situ reverse transcription, an approach Res. 27:1-9. to characterize genetic diversity and activities of prokaryotes. Appl. Envir. Microbiol. 63:4907-4913. Button D.K., B.R. Robertson, D. McIntosh and F. Jüttner. 1992. Interactions between marine bacteria and Cherry R., D. Desbruyères, M. Heyraud and C. Nolan. dissolved-phase beached hydrocarbons after the Exxon 1992. High levels natural radioactivity in hydrothermal vent Valdez oil spill. Appl. Environ. Microbiol. 58:243-251. polychetes. C. R. Acad. Sci. Paris III:21-26. Chevaldonné P. 1989. Ecologie des Alvinellidae (annélides polychètes des souces hydrothermales profondes) : comportement, biomasse, environnement thermique et C microflore du tube. D.E.A d'Océanologie de l'Université d'Aix- Marseille II, 30p. Caldwell D.E., S.J. Caldwell and J.P. Laycock. 1976. Thermothrix thioparus gen. et sp. nov. a facultatively Chevaldonné P. 1996. Ecologie des cheminées anaerobic facultative chemolithotroph living at neutral pH and hydrothermales actives. Thèse de doctorat de l'Université de high temperature. Can. J. Microbiol. 22:1509-1517. la méditérannée (Aix-Marseille II), 257p.

216 Références bibliographiques

Chevaldonné P. and A. Godfroy. 1997. Enumeration of Crozier R.H., P.M. Agapow and K. Pedersen. 1999. microorganisms from deep-sea hydrothermal vent chimneys. Towards complete biodiversity assesment: an evaluation of FEMS Microbiol. Lett. 146:211-216. the subterranean bacterial communities in the Oklo region of the sole surviving natural nuclear reactor. FEMS Microbiol. Chevaldonné P., D. Desbruyère and J.J. Childress. 1992. Ecol. 28:325-334. And some even hotter. Nature 359:593. Crump B.C., E.V. Armbrust and J.A. Baross. 1999. Chin K.J., T. Lukow and R. Conrad. 1999. Effect of Phylogenetic analysis of particle-attached and free-living temperature on structure and function of the methanogenic bacterial communities in the columbia river, its estuary, and archaeal community in an anoxic rice field soil. Appl. Environ. the adjacent coastal ocean. Appl. Environ. Microbiol. 65:3192- Microbiol. 65:2341-2349. 3204. Choi B.K., B.J. Paster, F.E. Dewhirst and U.B. Gobel. 1994. Diversity of cultivable and uncultivable oral Spirochetes from a patient with severe destructive periodontitis. Infect. Immun. 62:1889-1895. D

Chou H.P., C. Spence, A. Scherer and S. Quake. 1999. A Dando P.R., M. Thomm, H. Arab, M. Brehmer, L.E. microfabricated device for sizing and sorting DNA molecules. Hooper, B. Jochimsen, H. Schlesner, R. Stöhr, J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11-13. Miquel and S.W. Fowler. 1998. Microbiology of shallow Christensen H., M. Hansen and J. S¿rensen. 1999. hydrothermal sites of Palaeochori Bay, Milos (Hellenic Counting and size classification of active soil bacteria by Volcanic Arc). Cah. Biol. Mar. 39:369-372. fluorescence in situ hybridization with an rRNA Darland G. and T.D. Brock. 1971. Bacillus acidocaldarius oligonucleotide probe. Appl. Envir. Microbiol. 65:1753-1761. sp. nov., an acidophilic thermophilic spore-forming bacterium. Chung A.P., F. Rainey, M.F. Nobre, J. Burghardt and J. Gen. Microbiol. 67:9-15. M.S. da Costa. 1997. Meiothermus cerbereus sp. nov., a new Darland G., T.D. Brock, W. Samsonoff and S.F. Conti. slightly thermophilic species with high levels of 3-hydroxy 1970. A thermophilic, acidophilic mycoplasma isolated from a fatty acids. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:1225-1230. coal refuse pile. Science 170:1416-1418. Clayton R.A., G. Sutton, P.S. Hinkle Jr., C. Bult and C. Fields. 1995. Intraspecific variation in small-subunit rRNA Davydova-Charakhch'yan I.A., A.N. Mileeva, L.L. sequences in GenBank: why single sequences may not Mityushima and S.S. Belyaev. 1992. Acetogenic bacteria adequately represent procaryotic taxa. Int. J. Syst. Bacteriol. from oil fields of tataria and west siberia. Microbiology (Engl. 45:595-599. Tr.) 61:306-315. Colwell R.R. 1970. Polyphasic taxonomy of the genus vibrio: De Angelis M.A., J.A. Baross and M.D. Liley. 1991. numerical taxonomy of Vibrio cholerae, Vibrio Enhenced microbial methane oxidation in water from a deep parahaemolyticus, and related Vibrio species. J. sea hydrothermal vent field at simulated in situ hydrostatic Bacteriol.104:410-433. pressures. Limmol. Oceanogr. 36:565-570. Connan J., G. Lacrampe-Coulome and M. Magot. 1996. De Bartolomeo A., F. Trotta, F. La Rosa, G. Origin of gases in reservoirs. In : Dolenc A (Ed.) Proceedings Saltalamacchia and V. Mastrandrea. 1991. Numerical of the 1995 International Gas Research Conference. analysis and DNA base compositions of some thermophilic Government Institutes Inc., Rocokville, Md. Bacillus species. Int. J. Syst. Bacteriol. 41:502-509. Converse D.R., H.D. Holland and J.M. Edmond. 1984. de los Reyes F.L., W. Ritter and L Raskin. 1997. Group- Flow rate in the axial sprimgs of the East Pacific Rise (21¡N): specific small-subunit rRNA hybridization probes to implications for the heat budget and the formation of massive characterize filamentous foaming in activated sludge systems. sulfide deposits. Earth Planet. Sci. Lett. 69:159-175. Appl. Envir. Microbiol. 63:1107-1117. de los Reyes M.F., F.L. de los Reyes, M. Hernandez and L Coolen M.J. and J. Overmann.1998. Analysis of subfossil Raskin. 1998. Quantification of Gordona amarae strains in molecular remains of purple sulfur bacteria in a lake foaming activated sludge and anaerobic digester systems with sediment. Appl. Environ. Microbiol. 64:4513-4521. oligonucleotide hybridization probes. Appl. Envir. Microbiol. Cooper J.M. 1999. Towards electronic Petri dishes and 64:2503-2512. picolitre-scale single-cell technologies. Trends Biotechnol. De Rijk P., E. Robbrecht, S. de Hoog, A. Caers, Y. Van de 17:226-230. Peer and R. De Wachter. 1999. Database on the structure of Corliss J.B. and R.D. Ballard. 1977. Oases of life in the cold large subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 27:174-178. abyss. Natl. Geogr. 152:440-453. Delaney J.R. 1998. Volcanic ecology- A planetary Corliss J.B., J. Dymond, L.I. Gordon, J.M. Edmond, R.P. perspective. Thermophiles'98, International Conference, 6-11 Von Herzen, R.D. Ballard, K. Green, D. Willianms, A. septembre, Brest France. Bainbridge, K. Crane and T.H. van Andel. 1979. Submarine thermal springs on the galapagos Rift. Sciences DeLong E.F. 1992. Archaea in coastal marine environments. 203:1073-1083. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5685-5689. Corliss J.B., J.A. Baross and S.E. Hoffman. 1981. A DeLong E.F., D.G. Franks and A.L. Alldredge. 1993. hypothesis concerning the relationship between submarine hot Phylogenetic diversity of aggregate-attached vs. free-living springs and the orign of life on earth. Oceanol. Acta, Special marine bacterial assemblages. Limnol. Oceanogr. 38:924- issue 59-69. 934. Cornec L. 1995. Mise en évidence et étude de deux enzymes DeLong E.F., G.S. Wickham and N.R. Pace. 1989. thermostables : lipase et estérase, de micro-organismes Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the thermophiles isolés d'écosystèmes hydrothermaux sous- identification of single cells. Science 243:1360-1363. marins. Thèse de doctorat de l'Université de Technologie de DeLong E.F., K.Y. Wu, B.B. Prezelin and R.V. Jovine. Compiègne, 205p. 1994. High abundance of Archaea in Antarctic marine Cotton R.G.H. 1997. Mutation Detection. Oxford: Oxford picoplankton. Nature 371:695-697. University Press. DeLong E.F., L.L. King, R. Massana, H. Cittone, A. Cottrell M.T. and S.C. Cary. 1999. Diversity of disimilatory Murray, C. Schleper and S.G. Wakeham.1998. Dibiphytanyl bisulfite reductase genes of Bacteria associated with the deep- ether lipids in nonthermophilic Crenarchaeotes. Appl. Environ. sea hydrothermal vent polychaete annelid Alvinella Microbiol. 64:1133-1138. pompejana. Appl. Envir. Microbiol. 65:1127-1132. Deming J.W. and J.A. Baross. 1993. Deep-sea smokers: Cottrell M.T., J.A. Moore and D. Kirchman. 1999. windows to a subsurface biosphere. Geochim. et Cosmo- Chitinases from uncultured marine microorganisms. Appl. chim. Acta 57:3219-3230. Environ. Microbiol. 65:2553-2557. Dennis M.W. and P.E. Kolattukud. 1991. Alkane biosynthesis by decarbonylation of aldehyde catalyzed by a Cowan D.A. 1992. Biotechnology of the Archaea. Trends microsomal preparation from Botryococcus braunii. Arch. Biotechnol. 10:315-323. Biochem. Biophys. 287:268-275

217 Références bibliographiques

Desai J.D. and I.M. Banat. 1997. Microbial production of diagnosis of ancient septicemia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. surfactants and their commercial potential. Microbiol. Mol. 95:12637-12640. Biol. Rev. 61: 47-64. Drucker D.B. and I. Owen. 1971. Bacterial identification by Desbruyères D., P. Chevaldonné, A.-M. Alayse, D. gas-liquid chromatography. J. Gen. Microbiol.69:ix-x. Jollivet, F.H. Lallier, C. Jouin-Toulmond, F. Zal, P.M. Sarradin, R. Cosson, J.C. Caprais, C. Arndt, J. O'Brien, J. Duffaud G.D., O.B. d'Hennezel, A.S. Peek, A.L. Guezennec, S. Hourdez, R. Riso, F. Gaill, L. Laubier and Reysenbach and R.M. Kelly. 1998. Isolation and A. Toulmond. 1998. Biology and ecology of the "Pompeii characterization of Thermococcus barossii, sp. nov., a worm" (Alvinella pompejana Desbruyères and Laubier), a hyperthermophilic archaeon isolated from a hydrothermal vent normal dweller of an extreme deep-sea environment: a flange formation. Syst. Appl. Microbiol. 21:40-49. synthesis of current knowledge and recent developments. Dunbar J., S. Takala, S.M. Barns, J.A. Davis and C.R. Deep-Sea Res. II 45:383-422. Kuske. 1999. Levels of bacterial community diversity in four Devereux R. and G.W. Mundfrom. 1994. A phylogenetic arid soils compared by cultivation and 16S rRNA gene tree of 16S rRNA sequences from sulfate-reducing bacteria in cloning. Appl. Environ. Microbiol. 65:1662-1669. a sandy marine sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60:3437- Durand P., A.L. Reysenbach, D. Prieur and N.R. Pace. 3439. 1993. Isolation and characterization of Thiobacillus Devereux R., M.D. Kane, J. Winfrey and D.A. Stahl. 1992. hydrothermalis sp. nov. a mesophilic obligately Genus- and group- specific hybridization probes for chemolithotrophic bacterium isolated from a deep-sea determinative and environmental studies of sulfate-reducing hydrothermal vent in Fiji Bassin. Arch. Microbiol. 159:39-44. Bacteria. System. Appl. Microbiol. 15:601-609. Durand P., D. Prieur, C. Jeanthon and E. Jacq. 1990. Devereux R., M.E. Hines and D.A. Stahl. 1996. S Cycling: Présence et activité de bactéries hétérotrophes mangano- characterization of natural communities of sulfates-reducing oxydantes associées aux Alvinellidés (Annélides polychètes) bacteria by 16S rRNA sequence comparaisons. Microb. Ecol. dans un site d'hydrothermalismes profond de la dorsale du 32:283-292. Pacifique oriental. C. R. Acad. Sci. Paris 310(III):273-278. deWit R. 1995. Measurements of sedimentary gradients of Durand P., E. Benyagoub and D. Prieur. 1994. Numerical pore water species, by use of microelectrodes. Calculations of taxonomy of heterotrophic sulfur-oxidizing bacteria isolated microbial metabolic processes in the sediments. Océanis from southwestern Pacific hydrothermal vents. Can. J. 287-297. Microbiol. 40:690-697. Diels L. and M. Mergeay. 1990. DNA probe-mediated Durand P., O. Gros, L. Frenkiel and D. Prieur. 1996. detection of resistant bacteria from soils highly polluted by Phylogenetic characterization of sulfur-oxidizing bacterial heavy metals. Appl. Envir. Microbiol. 56: 1485-1491. endosymbionts in three tropical Lucinidae by 16S rDNA sequence analysis. Mol. Mar. Biol. Biotech. 5:37-42. Dirmeier R., M. Keller, D. Hafenbradl, F.J. Braun, R. Rachel, S. Burggraf and K.O. Stetter. 1998. Thermococcus Dutton C.M., C. Paynton and S. Sommer. 1993. General acidaminovorans sp. nov., a new hyperthermophilic method for amplifying regions of very high G + C content. alkalophilic archaeon growing on amino acids. Extremophiles Nucleic Acids Res. 21:2953-2954. 2:109-114. Dymock D., A.J. Weightman, C. Scully and W.G. Wade. DiRuggiero J., N. Santangelo, Z. Nackerdien, J. Ravel and 1996. Molecular analysis of microflora associated with F.T. Robb. 1997. Repair of extensive ionizing-radiation DNA dentoalveolar abscesses. J. Clin. Microbiol. 34:537-542. damage at 95 degrees C in the hyperthermophilic archaeon Dzik W.H. 1995. Molecular diagnostics in transfusion Pyrococcus furiosus. J. Bacteriol. 179:4643-4645. medecine : the best is yet to come. Transfusion 35:183-185. Distel D.L., D.J. Lane, G.J. Olsen, S.J. Giovannoni, B. Pace, N.R. Pace, D.A. Stahl and H. Felbeck. 1988. Sulfur- oxidizing bacterial endosymbionts: analysis of phylogeny and specificity by 16S rRNA sequences. J. Bacteriol. 170:2506- E 2510. Edwards U., T. Rogall, H. Blöcker, M. Emde and E.C. Distel D.L., E.F. DeLong and J.B. Waterbury. 1991. Böttger. 1989. Isolation and direct complete nucleotide Phylogenetic characterization and in situ localization of the determination of entire genes. Characterization of a gene bacterial symbiont of shipworms (Teredinidae: Bivalvia) by coding for 16S ribosomal RNA. Nucl. Acids Res. 17:7843- using 16S rRNA sequence analysis and oligodeoxynucleotide 7853. probe hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 57:2376-2382. Eichner C.A., W.E. Rainer, K.N. Timmis and I. Wagner- Distel D.L., H. Felbeck and C.M. Cavanaugh. 1994. Döbler. 1999 Thermal gradient gel electrophoresis analysis of Evidence for phylogenetic congruence among sulfur-oxidizing bioprotection from pollutant shocks in the activated sludge chemoautotrophic bacterial endosymbionts and their bivalve microbial community. Appl. Envir. Microbiol. 65:102-109. hosts. J. Mol. Evol. 38:533-542. Ekendahl S. and K. Pedersen. 1994. Carbon transformations Distel D.L., H.K.W. Lee and C.M Cavanaugh. 1995. by attached bacterial populations in granitic groundwater from Intracellular coexistence of methano- and thioautotrophic deep crystalline bed-rock of the Stripa research mine. bacteria in a hydrothermal vent mussel. Proc. Natl. Acad. Sci. Microbiology 140:1565-73. USA 92:9598-9602. el Fantroussi S., L. Verschuere, W. Verstraete and E.M. Dojka M.A., P. Hugenholtz, S.K. Haack and N.R. Pace. Top. 1999. Effect of phenylurea herbicides on soil microbial 1998. Microbial diversity in a hydrocarbon- and chlorinated- communities estimated by analysis of 16S rRNA gene solvent-contaminated aquifer undergoing intrinsic fingerprints and community-level physiological profiles. Appl. bioremediation. Appl. Envir. Microbiol. 64:3869-3877. Environ. Microbiol. 65: 982-988. Doolittle R.F., D.F. Feng, S. Tsang, G. Cho and E. Little. Elsgaard L. 1995. Le cycle du soufre et bactéries sulfato 1996. Determining divergence times of the major kingdoms of réductrices dans les sédiments hydrotheramux, marins et living organisms with a protein clock. Science 271:470-477. lacustres. Thèse de l'Université Paris 6. 195p. Doolittle W.F. 1996. At the core of the Archaea. Proc. Natl. Elsgaard L., J. Guezennec, N. Benbouzid-Rollet and D. Acad. Sci. USA 93:8797-8799. Prieur. 1991. Fatty acid composition of sulfate-reducing Dorsch M. and E. Stackebrandt. 1992. Some modification in bacteria isolated from deep-sea hydrothermal vent (13¡N, east the procedure of direct sequencing of PCR amplified 16S Pacific Rise). Kieler Meeresforsch. 8:182-187. rDNA. J. Microbiol. Methods 16:271-279. Emmerson D. and C. Moyer. 1997. Isolation and Douglas S. and T.J. Beveridge. 1998. Mineral formation by characterization of novel iron-oxidizing bacteria that grow at bacteria in natural microbial communities. FEMS Microbiol. circumneutral pH. Appl. Env. Microbiol. 63:4784-4792. Ecol. 26:79-88. Engle M., Y. Li, F. Rainey, S. DeBlois, V. Mai, A. Reichert, Drancourt M., G. Aboudharam, M. Signoli, O. Dutour F. Mayer, P. Messner and J. Wiegel. 1996.Thermobrachium and D. Raoult. 1998. Detection of 400-year-old Yersinia celere gen. nov., sp. nov., a rapidly growing thermophilic, pestis DNA in human dental pulp: An approach to the

218 Références bibliographiques alkalitolerant, and proteolytic obligate anaerobe. Int. J. Syst. rRNA sequences in Drentse A grassland soils (The Bacteriol. 46:1025-1033. Netherlands). Appl. Envir. Microbiol. 64: 871-879. Erauso G. 1994. Les Thermococcales du Bassin Nord- Felske A., A.D.L. Akkermans and W.M. De Vos. 1998b. In Fidjien, description d'une nouvelle espèce Pyrococcus abyssi situ detection of an uncultured predominant Bacillus in Dutch et caractérisation de son plasmide. Thèse de doctorat de grassland soils. Appl. Envir. Microbiol. 64: 4588-4590. l'Université de Bretagne Occidentale. 461 p Felske A., B. Engelen, U. Nubel and H. Backhaus. 1996. Erauso G., A.L. Reysenbach, A. Godfroy, J-R. Meunier, Direct ribosome isolation from soil to extract bacterial rRNA B. Crump, F. Partensky, J.A. Baross, V. Marteinsson, G. for community analysis. Appl. Envir. Microbiol. 62:4162-4167. Barbier, N.R. Pace and D. Prieur. 1993. Pyrococcus abyssi sp. nov., a new hyperthermophilic archaeon isolated from a Ferber D.M., P.J. Haney, H. Berk, D. Lynn and J. Konisky. deep-sea hydrothermal vent. Arch. Microbiol., 160:338-349. 1997. The adenylate kinase genes of M. voltae, M. thermolithotrophicus, M. jannaschii, and M. igneus define a Erhlich H.L. 1983. Magnanese-oxidizing bacteria from new family of adenylate kinases. Gene 185:239-244. hydrothermally active area on the Galapagos Rift. Environ. Biogeochem. Ecol. Bull. 35:357-366. Ferré F., A. Marchese, P. Pezzoli, S. Griffin, E. Buxton and V. Boyer. 1994. Quantitative PCR: an overview.In : The Espejo R.T. and J. Romero. 1997. Bacterial community in Polymerase Chain Reaction. K.B. Mullis, F. Ferre, R.A. copper sulfide ores inoculated and leached with solution from Gibbs, Eds. Birkhauser, Boston. a commercial-scale copper leaching plant. Appl. Envir. Microbiol. 63:1344-1348. Ferreira A.C., M.F. Nobre, F.A. Rainey, M.T. Silva, R. Wait, J. Burghardt, A.P. Chung and M.S. da Costa. 1997. Espejo R.T., G.G. Feijóo, J. Romero and M. Vásquez. Deinococcus geothermalis sp. nov. and Deinococcus murrayi 1998. PAGE analysis of the heteroduplexes formed between sp. nov., two extremely radiation-resistant and slightly PCR-amplified 16S rRNA genes: estimation of sequence thermophilic species from hot springs. Int. J. Syst. Bacteriol. similarity and rDNA complexity. Microbiology 144:1611-1617. 47:939-947. Ferrera-Cerrato R. 1980. [Inoculation of Rhizobium phaseoli onto different species of the genus Phaseolus originating in F Mexico]. Rev. Latinoam. Microbiol. 22:175-180. Ferris M.J. and D.M. Ward. 1997. Seasonal distributions of Fani R., G. Damiani, C. Di Serio, E. Galllori, A. Grofoni dominant 16S rRNA-defined populations in a hot spring and M. Bazzicapulo. 1993. Use of random amplified microbial mat examined by denaturing gradient gel polymorphic DNA (RAPD) for generating specific DNA electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 63:1375-1381. probes for microorganisms. Mol. Ecol. 2:243-250. Ferris M.J., A.L. Ruff-Roberts, E.D. Kopczynski, M.M. Farmer J.D. 1996. Hydrothermal systems on mars: an Bateson and D.M. Ward. 1996b. Enrichment culture and assesment of present evidence. Evolution of hydrothermal microscopy conceal diverse thermophilic Synechococcus ecosystems on Earth (and Mars?). Wiley, Chichester (ciba populations in a single hot spring microbial mat habitat. Appl. Foundation symposium 202) 273-299. Environ. Microbiol. 62:1045-1050. Farrelly V., F.A. Rainey and E. Stackebrandt. 1995. Effect of Ferris M.J., G. Muyzer and D.M. Ward. 1996a. Denaturing genome size and rrn gene copy number on PCR amplification gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl. populations inhabiting a hot spring microbial community. Appl. Envir. Microbiol. 61:2798-2801. Environ. Microbiol. 62:340-346 Fegatella F., J. Lim, S. Kjelleberg and R. Cavicchioli. 1998. Ferris M.J., S.C. Nold, N.P. Revsbech and D.M. Ward. Implications of rRNA operon copy number and ribosome 1997. Population structure and physiological changes within a content in the marine oligotrophic ultramicrobacterium hot spring microbial mat community following disturbance. Sphingomonas sp. strain RB2256. Appl. Envir. Microbiol. Appl. Envir. Microbiol. 63:1367-1374. 64:4433-4438. Fiala G. and K.O. Stetter. 1986. Pyrococcus furiosus sp. nov. Felbeck H. and J.J. Childress. 1988. Riftia pachyptila: a represents a novel genus of marine heterotrophic highly integrated symbiosis. Oceanol. Acta 8:131-138. archaebacteria growing optimally at 100¡C. Arch. Microbiol. 145:56-61. Feldman R.A., M.B. Black, C.S. Cary, R.A. Lutz and R.C. Vrijenhoek. 1997. Molecular phylogenetics of bacterial Fiala G., K.O. Stetter, H.W. Jannasch, T.A. Langworthy endosymbionts and their vestimentiferan hosts. Mol. Mar. and J. Madon. 1986. Staphylothermus marinus sp. nov. Biol. Biotechnol. 6:268-277. represent a novel genus of marine heterotrophic archaebacteria growing optimally at 100¡C. Arch. Microbiol. Felsenstein J. 1973. Maximum-likelihood estimation of 145:56-61. evolutionary trees from continuous characters. Am. J. Hum. Genet. 25:471-492. Field K.G., D. Gordon, T. Wright, M. Rappe, E. Urback, K. Vergin and S.J. Giovannoni. 1997. Diversity and depth- Felsenstein J. 1978. Cases in wich parsimony or specific distribution of SAR11 cluster rRNA genes from compatibility methods will be positively misleading. syst. marine planktonic bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 63:63- Zool. 27:401-410. 70. Felsenstein J. 1981. Evolutionary trees from DNA Fischer, S.G. and L.S. Lerman. 1979. Length-independent sequences: a maximum likelihood approach. J. Mol. Evol. separation of DNA restriction fragments in two-dimensional 17:368-376. gel electrophoresis. Cell 16:191-200. Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an Fisher M.M., L.W. Wilcox and L.E. Graham. 1998. approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791. Molecular characterization of epiphytic bacterial communities Felsenstein J. 1989. PHYLIP -- Phylogeny Inference Package on charophycean green algae. Appl. Environ. Microbiol. (Version 3.2).Cladistics 5:164-166. 64:4384-4389. Felske A. 1999. Reviewing the DA001-files: a 16S rRNA Fisk M.R., S.J. Giovannoni and I.H. Thorseth. 1998. chase on suspect #X99967, a Bacillus and Dutch underground Alteration of oceanic volcanic glass: textural evidence of activist. J. Microbiol. Methods 36:77-93. microbial activity. Science 281:978-980. Felske A. and A.D.L. Akkermans. 1998a. Spatial Fitch W.M. 1971. Toward defining the course of evolution: homogeneity of abundant bacterial 16S rRNA molecules in minimum change for a specific tree topology. Syst. Zool. Grassland soils. Micro. Ecol. 36:31-36. 20:406-416. Felske A. and A.D.L. Akkermans. 1998b. Prominent Fitch W.M. and E. Margoliash. 1967. Construction of occurrence of ribosomes from an uncultured bacterium of the phylogenetic trees. Science 155:279-284 . Verrucomicrobiales-cluster in grassland soils. Lett. Appl. FitzGerald L.M. and J.A. Blake. 1998. Databases for use in Microbiol. 26:219-223. molecular biology: cocepts in their design, access and use. Felske A., A. Wolterink, R. Van Lis and A.D.L. Molecular Approaches to the Study of the Ocean. K.E. Akkermans. 1998a. Phylogeny of the main bacterial 16S Cooksey Eds. Chapman & Hall, London pp 515-527.

219 Références bibliographiques

Fleming J.T., W.H. Yao and G.S. Sayler. 1998. Optimization of differential display of prokaryotic mRNA: application to pure culture and soil microcosms. Appl. Envir. Microbiol. 64:3698- 3706. G Forster R.J., J. Gong and R.M. Teather. 1997. Group- Galtier N. and M. Gouy. 1995. Inferring phylogenies from specific 16S rRNA hybridization probes for determinative and DNA sequences of unequal base compositions. Proc. Natl. community structure studies of Butyrivibrio fibrisolvens in the Acad. Sci. U S A 92:11317-11321. rumen. Appl. Environ. Microbiol. 63:1256-1260. Galtier N. and M. Gouy. 1998. Inferring pattern and process: Forterre P. 1996. A hot topic: the origin of hyperthermophiles. maximum-likelihood implementation of a nonhomogeneous Cell. 85:789-792. model of DNA sequence evolution for phylogenetic analysis. Forterre P., A. Bergerat and P. Lopez-Garcia. 1996. The Mol. Biol. Evol. 15:871-879. unique DNA topology and DNA topoisomerases of Galtier N., M. Gouy and C. Gautier. 1996. SeaView and hyperthermophilic Archaea. FEMS Microbiol Rev 18:237-248. Phylo_win, two graphic tools for sequence alignment and Fouquet Y., U. Von Stackelberg, J.L. Charlou, J.P. molecular phylogeny. Comput. Applic. Biosci. 12:543-548. Donval, J. Erzinger, J.P. Foucher, P. Herzig, R. Mühe, S. Galtier N., N. Tourasse and M. Gouy. 1999. A Sokai, M. Wiedicke and H. Whitechurch. 1991. nonhyperthermophilic common ancestor to extant life forms. Hydrothermal activity and metallogenesis in the Lau back-arc Science 283:220-221. basin. Nature 349:778-781. Garland J.L. 1997. Analysis and interpretation of community- Fournier D., R. Lemieux and D. Couillard. 1998. Genetic level physiological profiles in microbial ecology. FEMS evidence for highly diversified bacterial poulations in Microbiol. Ecol. 24:289-300. wastewater sludge during biological leaching of metals. Biotech. Lett. 20:27-31. Garrity G. and J. Hunter-Cevera. 1999. Bioprospecting in the developing world. Curr. Opin. Microbiol. 2:236-240. Fox G.E., J.D. Wisotzkey and P. Jurtshuk Jr. 1992. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be Gaten E. 1998. Eye structure and phylogeny: is there an sufficient to guarantee species identity. Int. J. Syst. Bacteriol. insight? The evolution of superposition eyes in the Decapoda 42:166-170. (Crustacea). Contributions to Zoology 67:223-235. Fox G.E., K.J. Pechman and C.R. Woese. 1977. Gaten E., P.J. Herring, P.M.J. Shelton and M.L. Johnson. Comparative cataloging of 16S ribosomal ribonucleic acid: 1998a. Comparative morphology of the eyes of post-larval molecular approach to prokaryotic systematics. Int. J. Syst. bresiliid shrimps obtained from the region of hydrothermal Bacteriol. 27:44-57. vents. Biological Bulletin. 194:267-280. Franks A.H., H.J. Harmsen, G.C. Raangs, G.J. Jansen, F. Gaten E., P.J. Herring, P.M.J. Shelton and M.L. Johnson. Schut and G.W. Welling. 1998. Variations of bacterial 1998b. The development and evolution of the eyes of vent populations in human feces measured by fluorescent in situ shrimps (Decapoda: Bresiliidae). Cahiers de Biologie Marine, hybridization with group-specific 16S rRNA-targeted 39:287-290. oligonucleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 64:3336- Ge Z. and D.E. Taylor. 1999. Contributions of genome 3345. sequencing to understanding the biology of Helicobacter pylori. Frischer M.E., P.J. Floriani and S.A. Nierzwicki-Bauer. Annu. Rev. Microbiol. 53:353-387. 1996. Differential sensitivity of 16S rRNA targeted Gerhold D., T. Rushmore and C.T. Caskey. 1999. DNA oligonucleotide probes used for fluorescence in situ chips: promising toys have become powerful tools. Trends hybridization is a result of ribosomal higher order structure. BioSci. 24:168-173. Can. J. Microbiol. 42:1061-1071. Giovannoni S.J., E.F. DeLong, G.J. Olsen and N.R. Pace. Fritsche T.R., M. Horn, S. Seyedirashti, R.K. Gautom, 1988. Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide K.H. Schleifer and A. Wagner. 1999. In situ detection of probes for identification of single microbial cells. J. Bacteriol. novel bacterial endosymbionts of Acanthamoeba spp. 170:720-726. phylogenetically related to members of the order Rickettsiales. Appl. Environ. Microbiol. 65:206-212. Giovannoni S.J., E.F. DeLong, T.M. Schmidt and N.R. Pace. 1990a. Tangential flow filtration and preliminary Fry N.K., J.K. Fredrickson, S. Fishbain, M. Wagner and phylogenetic analysis of marine picoplankton. Appl. Environ. D.A. Stahl. 1997. Population structure of microbial Microbiol. 56:2572-2575. communities associated with two deep, anaerobic, alkaline aquifers. Appl. Environ. Microbiol. 63:1498-1504. Giovannoni S.J., M.S. Rappe, K.L. Vergin and N.L. Adair. 1996. 16S rRNA genes reveal stratified open ocean Fuchs B.M., Wallner G., W. Beisker, I. Schwippl, W. bacterioplankton populations related to the Green Non-Sulfur Ludwig and R. Amann. 1998. Flow cytometric analysis of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7979-7984. the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Appl. Environ. Giovannoni S.J., T.B. Britschgi, C.L. Moyer and K.G. Microbiol. 64:4973-4982. Field. 1990b. Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton. Nature 345:60-63. Fuhrman J.A. and F. Azam. 1980. Bacterioplankton secondary production estimates for coastal waters of Britsh Giuliano L., M. De Domenico, E. De Domenico, M.G. Columbia, Antarctica, and California. Appl. Environ. Microbiol. Hofle and M.M. Yakimov. 1999. Identification of culturable 39:1085-1095. oligotrophic bacteria within naturally occurring bacterioplankton communities of the Ligurian Sea by 16S Fuhrman J.A. and F. Azam. 1982. Thymidine incorporation rRNA sequencing and probing. Microb. Ecol. 37:77-85. as a mesure of heterotrophic bacterioplankton production in marine surface waters: evaluation and field results. Mar. Biol. Glöckner F.O., R. Amann, A. Alfreider, J. Pernhaler, R. 66:109-120. Psenner, K. Trebesius and K.H. Schleifer. 1996. An in situ hybridization protocol for detection and indentification of Fuhrman J.A., K. McCallum and A.A. Davis. 1992. Novel planktonic bacteria. System. Appl. Microbiol. 19:403-406. major archaebacterial group from marine plankton. Nature 356:148-149. Godfroy A., F. Lesongeur, G. Raguenes, J. Querellou, E. Antoine, J.R. Meunier, J. Guezennec and G. Barbier. Fuhrman J.A., K. McCallum and A.A. Davis. 1993. 1997. Thermococcus hydrothermalis sp. nov., a new Phylogenetic diversity of subsurface marine microbial hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea communities from the Atlantic and Pacific Oceans. Appl. hydrothermal vent. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:622-666. Environ. Microbiol. 59:1294-1302. Godfroy A., J.R. Meunier, J. Guezennec, F. Lesongeur, G. Furcht C., K. Eschrich and K. Merte. 1996. Detection of Raguenes, A. Rimbault and G Barbier. 1996. Eikenella corrodens and Actinobacillus Thermococcus fumicolans sp. nov., a new hyperthermophilic actinomycetemcomitans by use of the polymerase chain archaeon isolated froma deep-sea hydrothermal vent in the reaction (PCR) in vitro and in subgingival plaque. J. Clin. north Fiji Basin. Int. J. Syst. Bacteriol. 46:1113-1119. Periodontol. 23:891-897.

220 Références bibliographiques

Godon J.J., E. Zumstein, P. Dabert, F. Habouzit and R. anoxic rice paddy soil microcosms as examined by cultivation Moletta. 1997. Molecular microbial diversity of an anaerobic and direct 16S rRNA gene sequence retrieval. Appl. Envir. digestor as determined by small-subunit rDNA sequence Microbiol. 64:960-969. analysis. Appl. Envir. Microbiol. 63:2802-2813. Gro§kopf R., S. Stubner and W. Liesack. 1998b. Novel Goebel B.M. and E. Stackebrandt. 1994. Cultural and Euryarchaeotal lineages detected on rice roots and in the phylogenetic analysis of mixed microbial populations found in anoxic bulk soil of flooded rice microcosms. Appl. Envir. natural and commercial bioleaching environments. Appl. Microbiol. 64:4983-4989. Envir. Microbiol. 60:1614-1621. Grote R., L. Li, J. Tamaoka, C. Kato, K. Horikoshi and G. Goering J.J. and V.A. Dungale. 1966. Estimates of the rates Antranikian. 1999. Thermococcus siculi sp. nov., a novel of denitrification in a subartic lake. Limnol. Oceanogr. 11:113- hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea 116. hydrothermal vent at the Mid-Okinawa Trough. Extremophiles 3:55-62 Gogarten-Boekels M., E. Hilario and J.P. Gogarten. 1995. The effects of heavy meteorite bombardement on the early Grunstein M. and D. Hogness. 1975. Colony hybridization: evolution - the emergence of the three domains of life. Origins a method for the isolation of cloned DNAs that contain a of life and evolution of the biosphere 25:251-264. specific gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72:3961-3965. Gold T. 1992. The deep, hot biosphere. Proc. Natl. Acad. Sci. Guezennec J. 1995. Approche des écosystèmes bactériens USA 89:6045-6049. par les lipides: force et faiblesse des marqueurs bactériens. Océanis 21:75-93. Goldenberger D. and M. Altwegg. 1995. Eubacterial PCR: contaminating DNA in primer preparations and its elimination Guezennec J., O. Ortega-Morales, G. Raguenes and G. by UV light. J. Microbiol. Meth. 21:27-32. Geesey. 1998. Bacterial colonization of artificial substrate in the vicinity of deep-sea hydrothermal vents. FEMS Microbiol. Gonzàlez J.M. and M.A. Moran. 1997. Numerical Ecol. 26:89-99. dominance of a group of marine bacteria in the alpha-subclass of the class Proteobacteria in coastal seawater. Appl. Environ. Gugliandolo C. and T.L. Maugeri. 1998. Temporal Microbiol. 63:4237-4242. variations in heterotrophic mesophilic bacteria from a marine shallow hydrothermal vent off the island of Vulcano. Microb. González J.M., D. Sheckells, M. Viebahn, D. Krupatkina, Ecol. 36:13-22. K.M. Borges and F.T. Robb. 1999. Thermococcus waiotapuensis sp. nov., an extremely thermophilic archaeon Guillou L. 1999. Diversité des picoeucaryotes océaniques: isolated from a freshwater hot spring. Arch. Microbiol. 172:95- description, phylogénie et écologie de nouvelles espèces. 101. Thèse de doctorat de l'université de Paris VI. 172p. Gonzàlez J.M., W.B. Withman, R.E. Hodson and M.A. Guo C., W. Sun, J.B. Harsh and A. Ogram. 1997. Moran. 1996. Identifying numerically abundant culturable Hybridization analysis of microbial DNA from fuel oil- bacteria from complex communities: an example from a lignin contaminated and noncontaminated soil. Microb. Ecol. 34:178- enrichment culture. Appl. Envir. Microbiol. 62:4433-4440. 187. Good I.J. 1953. The population frequencies od species and the Gupta R.S. 1998a. Protein phylogenies and signature estimation of population parameters. Biometrika 40:237-264. sequences: A reappraisal of evolutionary relationships among archaebacteria, eubacteria, and eukaryotes. Microbiol. Mol. Goodman M. 1981. Globin evolution was apparently very Biol. Rev. 62:1435-1491. rapid in early vertebrates: a reasonable case against the rate constancy hypothesis. J. Mol. Evol. 17:114-120. Gupta R.S. 1998b. Life's third domain (Archaea): an established fact or an endangered paradigm? Theor. Popul. Gordon D.A. and S.J. Giovannoni. 1996. Detection of Biol. 54:91-104. stratified microbial populations related to Chlorobium and Fibrobacter species in the Atlantic and Pacific oceans. Appl. Gupta R.S. 1998c. What are archaebacteria: life's third Environ. Microbiol. 62:1171-1177. domain or monoderm prokaryotes related to gram-positive bacteria? A new proposal for the classification of prokaryotic Gotz A., R. Pukall, E. Smit, E. Tietze, R. Prager, H. organisms. Mol. Microbiol. 29:695-707. Tschape, J.D. van Elsas and K. Smalla. 1996. Detection and characterization of broad-host-range plasmids in Guschin D., B.K. Mobarry, D. Proudnikov, D.A. Stahl, environmental bacteria by PCR. Appl. Envir. Microbiol. 62: B.E. Rittmann and A.D. Mirzabekov. 1997a. 2621-2628. Oligonucleotide microchips as genosensors for determinative and environmental studies in microbiology. Appl. Envir. Grassia G.S., K.M. McLean, P. Glénat, J. Bauld and A. J. Microbiol. 63:2397-2402. Sheehy. 1996. A systematic survey for thermophilic fermentative bacteria and archaea in high temperature Guschin D., G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell, V. petroleum reservoirs. FEMS Microbiol. Ecol. 21:47-58. Shick, D. Proudnikov, P. Arenkov and A. Mirzabekov. 1997b. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA, and Graves D.J. 1999. Powerful tools for genetic analysis come of protein microchips. Anal. Biochem. 250:203-211. age. Trends Biotech. 17:127-134. Gutell R.R., N. Larsen and C.R. Woese. 1994. Lessons Gray J.P. and R.P. Herwig. 1996. Phylogenetic analysis of from an evolving rRNA: 16S and 23S rRNA structures from a the bacterial communities in marine sediments. Appl. Environ. comparative perspective. Microbiol. Rev. 58:10-26. Microbiol. 62:4049-4059. Guyard S. 1994. Etude de la resistance aux métaux lourds Greenblatt C.L., A. Davis, B.G. Clement, C.L. Kitts, T. chez les Eubactéries et des archaebactéries thermophiles. Cox and C.J. Cano. 1999. Diversity of microorganisms D.E.A., UBO. 34p. isolated from amber. Micro. Ecol. 38:58-68. Greene A.C., B.K.C. Patel and A.J. Sheehy. 1997. Deferribacter thermophilus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic manganese- and iron-reducing bacterium H isolated from a petroleum reservoir. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:505-509. Haddad A.F., P. Camacho, P. Durand and S.C. Cary. 1995. Greisen K., M. Loeffelholz, A. Purohit and D. Leong. Phylogenic characterization of the epibiotic bacteria 1994. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of associated with the hydrothermal vent polychaete Alvinella most species of pathogenic bacteria, including bacteria found pompejana. Appl. Environ. Microbiol. 61:1679-1687. in cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol. 32:335-351. Hafenbradl D., M. Keller, R. Dirmeier, R. Rachel, P. Rossnagel, S. Burggraf, H. Huber and K.O. Stetter. 1996. Gros O., A. Darrasse, P. Durand, L. Frenkiel and M. Ferroglobus placidus gen. nov., sp. nov., A novel Moueza. 1996. Environmental transmission of a sulfur- 2+ oxidizing bacterial gill endosymbiont in the tropical lucinid hyperthermophilic archaeum that oxidizes Fe at neutral pH bivalve Codakia orbicularis. Appl. Envir. Microbiol. 62:2324- under anoxic conditions. Arch. Microbiol. 166:308-314. 2330. Hales B.A., C. Edwards, D.A. Ritchie, G. Hall, R.W. Gro§kopf R., P.H. Janssen and W. Liesack. 1998a. Pickupand and J.R. Saunders. 1996. Isolation and Diversity and structure of the methanogenic community in identification of methanogen-specific DNA from blanket bog

221 Références bibliographiques peat by PCR amplification and sequence analysis. Appl. Envir. Hensel R., K. Matussek, K. Michalke, L. Tacke, B.J. Microbiol. 62:668-675. Tindasll, M. Kohlhoff, B. Siebers and J. Dielenschneider. 1997. Sulfophobococcus zilligii gen. nov., sp. nov., a novel Hallin S. and P.E. Lindgren. 1999. PCR detection of genes hyperthermophilic archaeum isolated from hot alkaline encoding nitrite reductase in denitrifying bacteria. Appl. Envir. springs of Iceland. Syst. Appl.Microbiol. 20:102-110. Microbiol. 65:1652-1657. Herrick J.B., E.L. Madsen, C.A. Batt and W.C. Ghiorse. Hancock J.M., D. Tautz and G.A. Dover. 1988. Evolution of 1993. Polymerase chain reaction amplification of naphthalene- the secondary structures and compensatory mutations of the catabolic and 16S rRNA gene sequences from indigenous ribosomal RNAs of Drosophila melanogaster. Mol. Biol. Evol. sediment bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 59:687-694. 5:393-414. Herring P.J., E. Gaten and P.M.J. Shelton. 1999. Are vent Hansen M.C., T. Tolker-Nielsen, M. Givskov and S. Molin. shrimps blinded by science? Nature 398:116. 1998. Biased 16S rDNA PCR amplification caused by inference from DNA flaking the template region. FEMS Hess A., B. Zarda, D. Hahn, A. Haner, D. Stax, P. Hohener Microbiol. Ecol. 26:141-149. and J. Zeyer. 1997. In situ analysis of denitrifying toluene- and m-xylene-degrading bacteria in a diesel fuel-contaminated Harmsen H.J., A.D. Akkermans, A.J. Stams and W.M. de laboratory aquifer column. Appl. Envir. Microbiol. 63:2136- Vos. 1996b. Population dynamics of propionate-oxidizing 2141. bacteria under methanogenic and sulfidogenic conditions in anaerobic granular sludge. Appl. Envir. Microbiol. 62:2163- Hillis D.M., C. Moritz, C.A. Porter and R.J. Baker. 1991. 2168. Evidence for biased gene conversion in concerted evolution of ribosomal DNA. Science 251:308-310. Harmsen H.J., B. Wullings, A.D. Akkermans, W. Ludwig and A.J. Stams. 1993. Phylogenetic analysis of Hines M.E., R.S. Evans, B.R. Sharak Genthner, S.G. Willis, Syntrophobacter wolinii reveals a relationship with sulfate- S. Friedman, J.N. Rooney-Varga and R. Devereux. 1999. reducing bacteria. Arch. Microbiol. 160:238-240. Molecular phylogenetic and biogeochemical studies of sulfate- reducing bacteria in the rhizosphere of Spartina alterniflora. Harmsen H.J., D. Prieur and C. Jeanthon. 1997a. Appl. Environ. Microbiol. 65:2209-2216. Distribution of microorganisms in deep-sea hydrothermal vent chimneys investigated by whole-cell hybridization and Hinrichs K.U., J.M. Hayes, S.P. Sylva, P.G. Brewer and enrichments of thermophilic subpopulations. Appl. Environ. E.F. DeLong. 1999. Methane-consuming archaebacteria in Microbiol. 63:2876-2883. marine sediments. Nature 398:802-805. Harmsen H.J., D. Prieur and C. Jeanthon. 1997b. Group- Hiorns W.D., B.A. Methé, S.A. Nierzwicki-Bauer and J.P. specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes to identify Zehr. 1997. Bacterial diversity in Adirondack mountain lakes thermophilic bacteria in marine hydrothermal vents. Appl. as revealed by 16S rRNA gene sequences. Appl. Environ. Environ. Microbiol. 63: 4061-4068. Microbiol. 63:2957-2960. Harmsen H.J., H.M. Kengen, A.D. Akkermans, A.J. Stams Hiraishi A. 1992. Direct automated sequencing of 16S rDNA and W.M. de Vos. 1996a. Detection and localization of amplified by polymerase chain reaction from bacterial syntrophic propionate-oxidizing bacteria in granular sludge by cultures without DNA purification. Lett. Appl. Microbiol. in situ hybridization using 16S rRNA-based oligonucleotide 15:210-213. probes. Appl. Envir. Microbiol. 62:1656-1663. Hiraishi A., T. Umezawa, H. Yamamoto, K. Kato and Y. Harper-Owen R., D. Dymock, V. Booth, A.J. Weightman Maki. 1999. Changes in quinone profiles of hot spring and W.G. Wade. 1999. Detection of unculturable bacteria in microbial mats with a thermal gradient. Appl. Environ. periodontal health and disease by PCR. J. Clin. Microbiol. Microbiol. 65:198-205. 37:1469-1473. Hoaki T., M. Nishijima, H. Miyashita and T. Maruyama. Hastings R.C., J.R. Saunders, G.H. Hall, R.W. Pickup and 1995. Dense community of hyperthermophilic sulfur- A.J. McCarthy. 1998. Application of molecular biological dependent heterotrophs in a geotherlly heated shallow techniques to a seasonal study of ammonia oxidation in a submarine biotope near Kodakara-Jima island, Kagoshima, eutrophic freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 64:3674- Japan. Appl. Environ. Microbiol. 61:1931-1937. 3682. Hoaki T., M. Nishijima, M. Kato, K. Adachi, S. Mizobuchi, Head I.M., J.R.Saunders and R.W. Pickup. 1998. Microbial N. Hanzawa and T. Maruyama. 1994. Growth requirements evolution, diversity and ecology: a decade of ribosomal RNA of hyperthermophilic sulfur-dependent heterotrophic archaea analysis of uncultivated microorganisms. Micro. Ecol. 35:1- isolated from a shallow submarine geothermal system with 21. reference to their essential amino acids. Appl. Envir. Microbiol. 60:2898-2904. Heidelberg J.F., M. Shahamat, M. Levin, I. Rahman, G. Stelma, C. Grim and R.R. Colwell. 1997. Effect of Hobbie J.E., R.J. Dailey and S. Jasper. 1977. Use of aerosolization on culturability and viability of Gram- negative Nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence bacteria. Appl. Envir. Microbiol. 63:3585-3588. microscopy. Appl. Envir. Microbiol. 37:805-812. Heider J., A.M. Spormann, H.R. Beller and F. Widdel. Hodson R.E. O. Holm-Hannsen and F. Azam. 1976. 1999. Anaerobic bacterial metabolism of hydrocarbons. FEMS Improved methodology for ATP determination in marine Microbiol. Rev. 22:459-473. environments. Mar. Biol. 34:143-149. Heinen U.J. and W. Heinen. 1972. Characteristics and Hodson R.E., W.A. Dustman, R.P. Garg and M.A. Moran. properties of a caldo-active bacterium producing extracellular 1995. In situ PCR for visualization of microscale distribution of enzymes and two related strains. Arch. Mikrobiol. 82:1-23. specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Envir. Microbiol. 61:4074-4082. Henckel T., M. Friedrich and R. Conrad. 1999. Molecular analyses of the methane-oxidizing microbial community in Hoefs M.J.L., S. Schouten, J.W. De Leeuw, L.L. King, rice field soil by targeting the genes of the 16S rRNA, S.G. Wakeham and J.S. Sinninghe Damsté. 1997. Ether particulate methane monooxygenase, and methanol lipids of planktonic Archaea in marine water column. Appl. dehydrogenase. Appl. Environ. Microbiol. 65:1980-1990. Environ. Microbiol. 63:3090-3095. Henne A., R. Daniel, R.A. Schmitz and G. Gottschalk. Höfle M.G., H. Haas and K. Dominik. 1999. Seasonal 1999. Construction of environmental DNA libraries in dynamics of bacterioplankton community structure in a Escherichia coli and screening for the presence of genes eutrophic lake as determined by 5S rRNA analysis. Appl conferring utilization of 4-hydroxybutyrate. Appl. Envir. Environ. Microbiol. 65:3164-3174. Microbiol. 65:3901-3907. Holben W.E., J.K. Jansson, B.K. Chelm and J.M. Tiedje. Henry E.A., R. Devereux, J.S. Maki, C.C. Gilmour, C.R. 1988. DNA probe method for the detection of specific Woese, L. Mandelco, R. Schauder, C.C. Remsen and R. mircroorganisms in the soil bacteria community. Appl. Envir. Mitchell. 1994. Thermodesulfovibrio yellowstonii, gen. nov. Microbiol. 54:703-711. and sp. nov.: its phylogenetic relationship to Thermodesulfobacterium commune and their origins deep Holben W.E., K. Noto, T. Sumino and Y. Suwa. 1998. within the bacterial domain. Arch. Microbiol. 161:62-69. Molecular analysis of bacterial communities in a three- compartment granular activated sludge system indicates

222 Références bibliographiques community-level control by incompatible nitrification Bacillus stearothermophilus and Bacillus subtilis. J. Bacteriol. processes. Appl. Envir. Microbiol. 64:2528-2532. 149:824-30 Holm-Hannsen O. and C.R. Booth. 1966. The Inagaki F., S. Hayashi, K. Doi, Y. Motomura E. Izawa and measurement of adenosine triphosphate in the ocean and its S. Ogata. 1997. Microbial participation in the formation of ecological significance. Limnol. Oceanogr. 11:510-519. siliceous deposits from geothermal water and analysis of the extremly thermophilic bacterial community. FEMS Microbiol. Holmstr¿m K., T. Tolker-Nielsen and S. Molin. 1999. Ecol. 24:41-48. Physiological states of individual Salmonella typhimurium cells monitored by in situ reverse transcription-PCR. J. Itoh T., K. Suzuki and T. Nakase. 1998. Thermocladium Bacteriol. 181:1733-1738. modestius gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped, extremely thermophilic crenarchaeote. Int. J. Syst. Bacteriol. Huang W.M. 1996. Bacterial diversity based on type II DNA 48:879-887. topoisomerase genes. Annu. Rev. Genet. 30:79-107. Huber G., C. Spinnler, A. Gambacorta and K.O. Stetter. 1989a. Metallosphaera sedula gen. and sp. nov. represents a new genus of aerobic, metal-mobilizing, thermoacetophilic J archaebacteria. System. Appl. Microbiol. 12:38-47. Jackson C.R., E.E. Roden and P.F. Churchill. 1998a. Huber H., M. Thomm, H. König, G. Thies and K.O. Changes in bacterial species composition in enrichment Stetter. 1982. Methanococcus thermolithotrophicus, a novel cultures with various dilutions of inoculum as monitored by thermophilic lithotrophic methanogen. Arch. Microbiol. denaturing gradient gel electrophoresis. Appl. Environ. 132:47-50. Microbiol. 64:5046-5048. Huber R., C.R. Woese, T.A. Langworthy, H. Fricke and Jackson C.R., J.P. Harper, D. Willoughby, E.E. Roden K.O. Stetter. 1989b Thermosipho africanus gen. nov., and P.F. Churchill. 1997. A simple, efficient method for the represents a new genus of thermophilic eubacteria within the separation of humic substances and DNA from environmental "Thermotogales". System. Appl. Microbiol. 12:32-37. samples. Appl. Envir. Microbiol. 63: 4993-4995. Huber R., D. Dyba, H. Huber, S. Burggraf and R. Rachel. Jackson P.J., M.E. Hugh-Jones, D.M. Adair, G. Green, 1998a. Sulfur-inhibited Thermosphaera aggregans sp. nov., a K.K. Hill, C.R. Kuske, L.M. Grinberg, F.A. Abramova and new genus of hyperthermophilic archaea isolated after its P. Keim. 1998b. PCR analysis of tissue samples from the prediction from environmentally derived 16S rRNA 1979 Sverdlovsk anthrax victims: The presence of multiple sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:31-38. Bacillus anthracis strains in different victims. Proc. Natl. Huber R., J.K. Kristjansson and K.O. Stetter. 1987. Acad. Sci. USA 95:1224-1229. Pyrobaculum gen. nov., a new genus of neutrophilic, rod- shaped archaebacteria from continental solfataras growing Jackson T.J., R.F. Ramaley and W.G. Meinschein. 1973. optimally at 100 ¡C. Arch. Microbiol. 149:95-101 Int. J. Syst. Bacteriol. 23:28-36. Jannasch H.W. 1995. Microbial interactions with Huber R., S. Burggraf, T. Mayer, S.M. Barns, P. hydrothermal fluids. In: Humphris SE, Zierenberg RA, Rossnagel and K.O. Stetter. 1995. Isolation of a Mullineaux LS & Thomson RE (Eds) Seafloor Hydrothermal hyperthermophilic archaeum predicted by in situ RNA Systems: Physical, Chemical, Biological, and Geological analysis. Nature 376:57-58 Interactions, p 273-296. Geophysical monograph 91, American Huber R., T. Wilharm, D. Huber, A. Trincone, S. Geophysical Union, Washington DC. Burggraf, H. König, R. Rachel, I. Rockinger, H. Fricke, K.O. Stetter. 1992. Aquifex pyrophilus gen. nov. sp. nov., Jannasch H.W. and M.J. Mottl. 1985. Geomicrobiology of represents a novel group of marine hyperthermophilic deep-sea hydrothermal vents. Science 229:717-725. hydrogen-oxidizing bacterium. System. Appl. Microbiol. Jannasch H.W. and C.O. Wirsen. 1979. Chemosynthetic 15:340-351. primary production at East Pacific sea-floor spreading Huber R., T.A. Langworthy, H. Köning, M. Thomm, C.R. centers. Bioscience 29:592-598. Woese, U.B. Sleytr and K.O. Stetter. 1986. Thermotoga Jannasch H.W. and C.O. Wirsen. 1981. Morphological maritima sp. nov. represents a new genus of unique extremely survey of microbial mats near deep sea thermal vents. Appl. thermophilic eubacteria growing up to 90¡C. Arch. Microbiol. Environ. Microbiol. 41:528-538. 144:324-333. Jannasch H.W., C.O. Wirsen ,S.J. Molyneaux and T.A. Huber R., W. Eder, S. Heldwein, G. Wanner, H. Huber, R. Langworthy. 1988. Extremely thermophilic fermentative Rachel and K.O. Stetter. 1998b. Thermocrinis ruber gen. archaebacteria of the genus Desulfuroccocus from deep-sea nov., sp. nov., a pink-filament-forming hyperthermophilic hydrothermal vents. Appl. Environ. Microbiol. 41:528-538. bacterium isolated from Yellowstone national park. Appl. Envir. Microbiol. 64:3576-3583. Jannasch H.W., C.O. Wirsen, D.C. Nelson and L.A. Robertson. 1985. Thiomicrospira cruogena sp. nov., a Hudson J.A., K.M. Schofield, H.W. Morgan and R.M. colorless sulfur-oxidizing bacterium from deep-sea Daniel. 1989. Thermonema lapsum gen. nov., sp. nov., a hydrothermal vent. Int. J. Microbiol. 35:422-424. thermophilic gliding bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 39:485- 487. Jannasch H.W., D.C. Nelson and C.O. Wirsen. 1989. Massive natural occurrence of unusually large bacteria Huelsenbeck J.J. and D.M. Hillis. 1993. Success of (Beggiatoa sp.) at a hydrothermal vent site. Nature 342:834- phylogenetic methods in four taxon cases. Syst. Biol. 42:247- 836. 264. Jeanthon C. 1999. Molecular ecology of hydrothermal vent Hugenholtz P., B.M. Goebel and N.R. Pace. 1998b. Impact microbial communities. Antonie van Leeuwenhoek (soumis). of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity. J. Bacteriol. 180:4765-4774. Jeanthon C. and D. Prieur. 1990. Suceptibility to heavy metals and characterization of heterotrophic bacteria isolated Hugenholtz P., C. Pitulle, K.L. Hershberger and N.R. from two hydrothermal vent polychete annelids, Alvinella Pace. 1998a. Novel division level bacterial diversity in a pompejana and Alvinella caudata. Appl. Environ. Microbiol. Yellowstone hot spring. J. Bacteriol. 180:366-376. 56:3308-3314. Hunter-Cevera J.C. 1998. The value of microbiel diversity. Jeanthon C., A-L Reysenbach, S. L'Haridon, A. Curr. Opin. Microbiol. 1:278-285. Gambacorta, N. Pace, P. Glénat and D.Prieur. 1995. Thermotoga subterranea sp. nov., a new thermophilic bacterium isolated from a continental oil reservoir. Arch. Microbiol. 164:91-97. I Jeanthon C., S. L'Haridon, A.L. Reysenbach, E. Corre, M. Vernet, P. Messner, U.W. Sleytr and D. Prieur. 1999a. Imanaka T., M. Fujii, I. Aramori and S. Aiba. 1982. Methanococcus vulcanius sp. nov., a novel hyperthermophilic Transformation of Bacillus stearothermophilus with plasmid methanogen isolated from East Pacific Rise and identification DNA and characterization of shuttle vector plasmids between of Methanococcus spp. DSM 4213 as Methanococcus fervens sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:583-589.

223 Références bibliographiques

Jeanthon C., S. L'Haridon, A.L. Reysenbach, M. Vernet, Karl D.M. 1981. Simultaneous rates of ribonucleic acid and P. Messner, U.W. Sleytr and D. Prieur. 1998. deoxyribonucleic acid syntheses for estimating growth and Methanococcus infernus sp. nov., a novel hyperthermophilic cell division of aquatic microbial communities. Appl. Envir. lithotrophic methanogen isolated from a deep-sea Microbiol. 42:802-810. hydrothermal vent. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:913-919. Karl D.M. 1987. Bacterial production at deep-sea Jeanthon C., S. L'Haridon, N. Pradel and D. Prieur. 1999b. hydrothermal vent and cold seeps: evidence for Rapid identification of hyperthermophilic methanococci chemosynthetic primary production. In: Ecology of Microbial isolated from deep-sea hydrothermal vents. Int. J. Syst. Communities, Forty First Symposium of the Society for Bacteriol. 49:591-594. General Microbiology (M. Fletcher, T.R. Gary and J.G. Jones eds.), p 319-359. Cambridge Universtity Press: Cambridge. Jensen S., L. Øvreås, F.L. Daae and V. Torsvik. 1998. Diversity in methane enrichments from agricultural soil Karl D.M. 1995. Ecology of free-hydrothermal vent microbial revealed by DGGE separation of PCR amplified 16S rDNA communities. In: Karl DM (Ed) The Microbiology of Deep-sea fragments. FEMS Microbiol. Ecol. 26:17-26. Hydrothermal Vents (p 35-124). CRC Press Inc, Boca Raton. Jochimsen B., S. Peinemann-Simon, H. Völker, D. Karl D.M., G.T. Taylor, J.A. Novitsky, H.W. Jannasch, C.O. Stüben, R. Botz, P. Stoffers, P.R. Dando and M. Thomm. Wirsen, N.R. Pace, D.J. Lane, G.J. Olsen, and S.J. 1997. Stetteria hydrogenophila, gen. nov. and sp. nov., a novel Giovannoni. 1988. A microbiological study of Guaymas basin mixotrophic sulfur-dependent crenarchaeote isolated from high temperature hydrothermal vents. Deep-Sea Res. 35:777. Milos, Greece. Extremophiles 1:67-73. Karner M. and J.A. Fuhrman. 1997. Determination of active Johansson K.E. 1996. Oligonucleotide probes marine bacterioplankton: a comparaison of universal 16S complementary to 16S rRNA. Molecular and diagnostic rRNA probes, autoradiography and nucleoid staining. Appl. Procedures in Mycoplasmology, Vol II p 29-46. Envir. Microbiol. 63:1208-1213. Johnsen K., ¯. Enger, C.S. Jacobsen, L. Thirup and V. Karp P.D., M. Riley, S.M. Paley, A. Pellegrini-Toole and M. Torsvik. 1999. Quantitative selective PCR of 16S ribosomal Krummenacker. 1999. Eco Cyc: encyclopedia of Escherichia DNA correlates well with selective agar plating in describing coli genes and metabolism. Nucleic Acids Res. 27:55-58. population dynamics of indigenous Pseudomonas spp. in soil hot spots. Appl. Envir. Microbiol. 65:1786-1788. Karp P.D., M. Riley, S.M. Paley, A. Pellegrini-Toole and M. Krummenacker. 1998. Eco Cyc: encyclopedia of Escherichia Jones W.J., J.A. Leigh, F. Mayer, C.R. Woese and R.S. coli genes and metabolism. Nucleic Acids Res. 26:50-53. Wolfe. 1983. Methanococcus jannaschii sp. nov., an extremely thermophilic methanogen from a submarine Kato C., L. Li, J. Tamaoka and K. Horikoshi. 1997. hydrothermal vent. Arch. Microbiol. 136:254-261. Molecular analyses of the sediment of the 11,000-m deep Mariana Trench. Extremophiles 1:117-123. Jorgensen B.B. and V.A. Gallardo. 1999. Thioplaca spp.: filamentous sulfur bacteria with nitrate vacuoles. FEMS Kawasumi T., Y. Igarashi, T. Kodama and Y. Minoda. Microbiol. Ecol. 28:301-313. 1984. Hydrogenobacter thermophilus gen. nov. sp. nov., an extremely thermophilic, aerobic, hydrogen-oxidizing Joux F. and P. Lebaron. 1995. Applications en écologie bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 34:5-10. bactérienne des sondes oligonucléotidiques fluorescentes par les techniques d'hybridation et de cytométrie. Océanis 21:125- Keller M., F.J. Braun, R. Dirmeier, D. Hafenbradl, S. 138. Burggraf, R. Rachel and K.O. Stetter. 1995. Thermococcus alcaliphilus sp. nov., a new hyperthermophilic archaeum Jukes T. H. and C.R. Cantor. 1969. Evolution of protein growing on polysulfide at alkaline pH. Arch. Microbiol. molecules, p.21-32. In H. N. Munro (ed.), Mammalian protein 164:390-395. metabolism. Academic Pres, New York, N.Y. Kenzaka T., N. Yamaguchi, K. Tani and M. Nasu. 1998. Juretschko S., G. Timmermann, M. Schmid, K.H. rRNA-targeted fluorescent in situ hybridization analysis of Schleifer, A. Pommerening-Röser, H.P. Koops and M. bacterial community structure in river water. Microbiology Wagner. 1998. Combined molecular and conventional 144:2085-2093. analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge: Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as Keswani J., S. Orkand, U. Premachandran, L. Mandelco, dominant populations. Appl. Envir. Microbiol. 64:3042-3051. M.J. Franklin and W.B. Whitman. 1996. Phylogeny and taxonomy of mesophilic Methanococcus spp. and comparison Jurgens G., K. Lindstrom and A. Saano. 1997. Novel group of rRNA, DNA hybridization, and phenotypic methods. Int. J. within the kingdom Crenarchaeota from boreal forest soil. Syst. Bacteriol. 46:727-735. Appl. Envir. Microbiol. 63: 803-805. Khbaya B., M. Neyra, P. Normand, K. Zerhari and A. Filali-Maltouf. 1998. Genetic diversity and phylogeny of rhizobia that nodulate Acacia spp. in Morocco assessed by analysis of rRNA genes. Appl. Envir. Microbiol. 64: 4912- K 4917. Ka J.O., W.E. Holben and J.M. Tiedje. 1994. Genetic and Kim J. 1993. Improving the accuracy of phylogenetic phenotypic diversity of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4- estimation by combining different methods. Syst. Biol. 42:331- D)-degrading bacteria isolated from 2,4-D-treated field soils. 340. Appl. Envir. Microbiol. 60:1106-1115. Kimura M. 1968. Evolutionary rate at the molecular level. Kalmbach S., W. Manz and U. Szewzyk. 1997. Isolation of Nature. 217:624-626. new bacterial species from drinking water biofilms and proof Kimura M. 1980. A simple method for estimating evolutionary of their in situ dominance with highly specific 16S rRNA rates of base substitutions through comparative studies of probes. Appl. Envir. Microbiol. 63: 4164-4170. nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16:111-120. Kämpfer P., R. Erhart, C. Beimfohr, J. Böhringer, M. Wagner and R. Amann. 1996. Characterization of bacterial Kirchman D., F. K'Ness and R. Hodson. 1985. Leucine communities from activated sludge: culture-dependent incorporation and its potential as a measure of protein numerical identification versus in situ identification using synthesis by bacteria in natural aquatic systems. Appl. Envir. group- and genus-specific rRNA-targeted oligonucleotide Microbiol. 49:599-607. probes. Microbial Ecology 32:101-121. Klenk H.P. 1998. On the phylogenetic position of Aquifex Karavaiko G.I., O.V. Golyshina, A.V. Troitskii, K.M. pyrophilus in protein based phylogenies. Thermophiles'98, Val'ekho-Roman, R.S. Golovacheva and T.A. Pivovarova. International Conference, 6-11 septembre, Brest France. 1994. Sulfurococcus yellowstonii sp. nov/ a new species of Klier N.J., R.J. West and P.A. Donberg. 1999. Aerobic iron- and sulfur-oxidizing thermoacidophilic biodegradation of dichloroethylenes in surface and subsurface Archaeobacterium. Mikrobiologiia 63:668-682. soils. Chemosphere 38:1175-1188. Karl D.M. 1979. Measurement of microbial activity and Kobayashi T., Y.S. Kwak, T. Akiba, T. Kudo and K. growth in the ocean by rates of stable ribonucleic acid Horikoshi. 1994. Thermococccus profundus sp. nov., a new synthesis. Appl. Envir. Microbiol.38:850-860. hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent. System. Appl. Microbiol. 17:232-236.

224 Références bibliographiques

Kogura K. and U. Simidu. 1979. A tentative direct Kuske C.R., S.M. Barns and J.D. Busch. 1997. Diverse microscopic method for countingliving marine bacteria. Can. uncultivated bacterial groups from soils of the arid J. Microbiol. 25:415-420. southwestern United States that are present in many geographic regions Appl. Envir. Microbiol. 63: 3614-3621. König H. 1989. Archaebacteria. Biotechnology, Vol 6b, Special Microbial Processes, V.C.H. editors, 6b, p 697-728. Konopka A. and T. Zakharova. 1999. Quantification of bacterial lead resistance via activity assays. J. Microbiol. L Methods 37:17-22. Konopka A., T. Zakharova, M. Bischoff, L. Oliver, C. L'Haridon S., A.-L. Reysenbach, P. Glénat, D. Prieur and Nakatsu and R.F. Turco. 1999. Microbial biomass and C. Jeanthon. 1995. Hot subterranean biosphere in a activity in lead-contaminated soil. Appl. Environ. Microbiol. continental oil reservoir. Nature 377:223-224. 65:2256-2259. L’Haridon S., M. Speck, C. Vetriani, A.L. Reysenbach, D. Prieur and C. Jeanthon. 1998b. The Desulfurobacteriaceae, Koonin E. and M.Y. Galperin. 1997. Prokaryotic genomes: a new family of thermophilic bacteria from deep-sea the emerging paradigm of genome-based microbiology. Curr. hydrothermal vents. Thermophiles 98’ International Opin. Genet. Dev. 7:757-763. Conference BP 28. Kopczynski E.D., M.M. Bateson and D.M. Ward. 1994. L'Haridon S., V. Cilia, P. Messner, G. Raguénès, A. Recognition of chimeric small-subunit ribosomal DNAs Gambacorta, U.W. Sleytr, D. Prieur and C. Jeanthon. composed of genes from uncultivated microorganisms. Appl. 1998a. Desulfurobacterium thermolithotrophum gen. nov., sp. Environ. Microbiol. 60:746-748. nov., a novel autotrophic, sulfur-reducing bacterium isolated Kopylov V.M., E.A. Bonch-Osmolovskaya, V.A. from a deep-sea hydrothermal vent. Int. J. Syst. Bacteriol. Svetlichnyi, M.L. Miroshnicheko and V.S. Skobkin. 1993. 48:701-711. Gamma-irradiation and UV-sensitivity of extremly Lafay B. and J.J. Burdon. 1998. Molecular diversity of thermophilic archaebacteria and eubacteria. Microbiologiya. rhizobia occurring on native shrubby legumes in southeastern 62:90-95. Australia. Appl. Envir. Microbiol. 64: 3989-3997. Kotelnikova S. and K. Petersen. 1997. Evidence for Lake J.A. 1987. A rate-independent technique for analysis of methanogenic Archaeae and homoacetogenic Bacteria in deep nucleic acid sequences: evolutionary parsimony. Mol. Biol. granitic rock aquifers. FEMS Microbiol. Rev. 20:339-349. Evol. 4:167-191. Kotelnikova S., A.J. Macario and K. Pedersen. 1998. Lambert L.H., T. Cox, K. Mitchell, R. Rossello-Mora, C. Methanobacterium subterraneum sp. nov., a new alkaliphilic, Del Cueto, D.E.Dodge, P. Orkand and R.J. Cano. 1998. eurythermic and halotolerant methanogen isolated from deep Staphylococcus succinus, sp. nov., Isolated from Dominican granitic groundwater. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:357-367. ambert. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:511-518. Kowalchuk G.A., J.R. Stephen, W. De Boer, J.I. Prosser, T.M. Embley and J.W. Woldendorp. 1997. Analysis of Lane D.J., B. Pace, G.J. Olsen, D.A. Stahl, M.L. Sogin and ammonia-oxidizing bacteria of the beta subdivision of the N.R. Pace. 1985c. Rapid determination of 16S ribosomal RNA class Proteobacteria in coastal sand dunes by denaturing sequences for phylogenetic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. gradient gel electrophoresis and sequencing of PCR-amplified USA 82:6955-6959. 16S ribosomal DNA fragments. Appl. Envir. Microbiol. Lane D.J., D.A. Stahl, G.J. Olsen and N.R. Pace. 1985a. 63:1489-1497. Analysis of hydrothermal vent-associated symbionts by Kowalchuk G.A., Z.S. Naoumenko, P.J. Derikx, A. Felske, ribosomal RNA sequences. Proc. Biol. Soc. Wash. 6:389-400. J.R. Stephen and I.A. Arkhipchenko. 1999. Molecular Lane D.J., D.A. Stahl, G.J. Olsen, D.J. Heller and N.R. analysis of ammonia-oxidizing bacteria of the beta subdivision Pace. 1985b. Phylogenetic analysis of the genera Thiobacillus of the class Proteobacteria in compost and composted and Thiomicrospira by 5S rRNA sequences. J. Bacteriol. materials. Appl. Environ. Microbiol. 65:396-403. 163:75-81. Krause D.O. and J.B. Russell. 1996a. How many ruminal Lee D.H., Y.G. Zo and S.J. Kim. 1996a. Nonradioactive bacteria are there? Dairy Sci. 79:1467-1475. method to study genetic profiles of natural bacterial Krause D.O. and J.B. Russell. 1996b. An rRNA approach for communities by PCR-single-strand-conformation assessing the role of obligate amino acid-fermenting bacteria polymorphism. Appl. Envir. Microbiol. 62:3112-3120. in ruminal amino acid deamination. Appl. Environ. Microbiol. Lee N., P.H. Nielsen, K.H. Andreasen, S. Juretschko, J.L. 62:815-821. Nielsen, K.H. Schleifer and M. Wagner. 1999. Combination Krueger D.M. and C.M. Cavanaugh. 1997. Phylogenetic of fluorescent in situ hybridization and microautoradiography a diversity of bacterial symbionts of Solemya host based on new tool for structure-function analyses in microbial ecology. comparative sequence analysis of 16S rRNA genes. Appl. Appl. Envir. Microbiol. 65:1289-1297. Environ. Microbiol. 63:91-98. Lee S. and J.A. Fuhrman. 1990. DNA hybridization to Kryukov V.R., N.D. Savelyeva and M.A. Pusheva. 1983. compare species compositions of natural bacterioplankton Calderobacterium hydrogenophilum nov. gen., nov. sp., an assemblages. Appl. Environ. Microbiol. 56:739-746. extreme thermophilic bacterium and its hydrogenase activity. Lee S.H. and P.F. Kemp. 1994. Single-cell RNA content of Mikrobiologiya 52:781-788. natural marine planktonic bacteria mesured by hybridization Kudo T., M. Ohkuma, S. Moriya, S. Noda and K. Ohtoko. with multiple 16S-rRNA targeted fluorescent probes. Limnol. 1998. Molecular phylogenetic identification of the intestinal Oceannogr. 39:869-879. anaerobic microbial community in the hindgut of the termite, Lee S.Y., J. Bollinger, D. Bezdicek and A. Ogram. 1996b. Reticulitermes speratus, without cultivation. Extremophiles Estimation of the abundance of an uncultured soil bacterial 2:155-161. strain by a competitive quantitative PCR method. Appl. Envir. Kurosawa N., Y.H. Itoh, T. Iwai, A. Sugai, I. Uda, N. Microbiol. 62: 3787-3793. Kimura, T. Horiuchi and T. Itoh. 1998. Sulfurisphaera Leu J.Y., C.P. McGovern-Traa, A.J.R. Porter, W.J. Harris ohwakuensis gen. nov., sp. nov., a novel extremely and W.A. Hamilton. 1998. Identification and phylogenetic thermophilic acidophile of the order Sulfolobales. Int. J. Syst. analysis of thermophilic sulfate-reducing bacteria in oil field Bacteriol. 48:451-456. samples by 16S rDNA gene cloning and sequencing. Kurr M., R. Huber, H. König, H.W. Jannasch, H. Fricke, A. Anaerobe 4:165-174. Trincone, J.K. Kristjansson and K.O. Stetter. 1991. Levy M. and S.L. Miller. 1998. The stability of RNAbases: Methanopyrus kandleri, gen. and sp. nov. represents a novel implications for the origin of life. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. group of hyperthermophilic methanogens, growing at 110¡C. 95:7933-7938. Arch. Microbiol. 156:239-247. Li L. C. Kato and K. Horikoshi. 1999. Bacterial diversity in Kuske C.R., K.L. Banton, D.L. Adorada, P.C. Stark, K.K. deep-sea sediments from different depths. Biodiversity and Hill and P.J. Jackson. 1998. Small-scale DNA sample Conservation. 8:659-677. preparation method for field PCR detection of microbial cells and spores in soil. Appl. Envir. Microbiol. 64: 2463-2472.

225 Références bibliographiques

Li W. 1993. So, what about the molecular clock hypothesis? Maidak B.L., J.R. Cole, C.T. Parker Jr, G.M. Garrity, N. Curr. Opin. Gen. Dev. 3:896-901. Larsen, B. Li, T.G. Lilburn, M.J. McCaughey, G.J. Olsen, R. Overbeek, S. Pramanik, T.M. Schmidt, J.M. Tiedje and Liesack W. and E. Stackebrandt. 1992. Occurrence of novel CR Woese.1999. A new version of the RDP (Ribosomal groups of the domain Bacteria as revealed by analysis of Database Project). Nucleic Acids Res. 27:171-173. genetic material isolated from an Australian terrestrial environment. J. Bacteriol. 174: 5072-5078. Manz W., K. Wendt-Potthoff, T.R. Neu, U. Szewzyk and J.R. Lawrence. 1999. Phylogenetic composition, spatial Liesack W., H. Weyland and E. Stackebrandt. 1991. structure, and dynamics of lotic bacterial biofilms investigated Potential risk of gene amplification by PCR as determined by by fluorescent in situ hybridization and confocal laser scanning 16S rDNA analysis of a mixed-culture of strict barophilic microscopy. Microb. Ecol. 37:225-237. bacteria. Microb. Ecol. 21:191-198. Manz W., R. Amann, R. Szewzyk, U. Szewzyk, T.A. Liesack W., P.H. Janssen, F.A. Rainey, N.L. Ward-Rainey Stenstrom, P. Hutzler and K.H. Schleifer. 1995. In situ and E. Stackebrandt. 1997. Microbial diversity in soil: the identification of Legionellaceae using 16S rRNA-targeted need for a combined approach using molecular and cultivation oligonucleotide probes and confocal laser scanning techniques. In Modern Soil Microbiology, J.D. VanElsas, J.T. microscopy. Microbiology 141:29-39. Trevors, E.M.H. Wellington Eds. Marcel Decker, New York. p 375-439. Manz W., R. Amann, W. Ludwig, M. Wagner and K.-H. Schleifer. 1992. Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for Lighthart B. 1997. The ecology of bacteria in the alfresco the major subclasses of Proteobacteria: problems and atmosphere. FEMS Microbiol. Ecol. 23:263-274. solutions. Syst. Appl. Microbiol.15:593-600. Lim E.L. 1996. Molecular identification of nanoplanktonic Manz W., U. Szewzyk, P. Ericsson, R. Amann, K.H. protists based on small subunit ribosomal RNA gene Schleifer and T.A. Stenstrom. 1993. In situ identification of sequences for ecological studies. J. Eukaryot. Microbiol. bacteria in drinking water and adjoining biofilms by 43:101-106. hybridization with 16S and 23S rRNA-directed fluorescent Liu W.T., T.L. Marsh, H. Cheng and L.J. Forney. 1997. oligonucleotide probes. Appl. Envir. Microbiol. 59:2293-2298. Characterization of microbial diversity by determining Marchesi J.R., T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. terminal restriction fragment length polymorphisms of genes Fry, S.J. Hiom and W.G. Wade. 1998. Design and evaluation encoding 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 63:4516-4522. of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes Liu S. V.,J. Zhou, C. Zhang, D.R. Cool, M. Gajdarziska- coding for bacterial 16S rRNA. Appl. Envir. Microbiol. 64:795- Josifovska and T.J. Phelps. 1997b. Thermophilic Fe(III)- 799. reducing bacteria from deep subsurface: the evolutionary Marie D., C.P.D. Brussaard, R. Thyrhaug, G. Bratbak and implication. Science 277:1106-1109. D. Vaulot. 1999. Enumeration of marine virus in culture and Llobet-Brossa E., R. Rossello-Mora and R. Amann. 1998. natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. Microbial community composition of Wadden sea sediments 65:45-52. as revealed by fluorescence in situ hybridization. Appl. Marsh P.D. and D.J. Bradshaw. 1995. Dental plaque as a Environ. Microbiol. 64:2691-2696. biofilm. J. Ind. Microbiol. 15:169-175. Lloyd D., K.L. Thomas, A. Hayes, B. Hill, B.A. Hales, C. Marsh T.L. 1999. Terminal restriction fragment length Edwards, J.R. Saunders, D.A. Ritchie and M. Upton. polymorphism (T-RFLP): an emerging method for 1998. Micro-ecology of peat: minimally invasive analysis characterizing diversity among homologous populations of using confocal laser scanning microscopy, membrane inlet amplification products. Curr. Opin. Microbiol. 2:323-327. mass spectrometry and PCR amplification of methanogen- specific gene sequences. FEMS Microbiol. Ecol. 25:179-188. Marshall A. and J. Hodgson. 1998. DNA chips: an array of possibilities. Nature Biotech. 16:27-31. Lloyd-Jones G. and P.C.K. Lau. 1998. A molecular view of microbial diversity in a dynamic landfill in Québec. FEMS Marteinsson V.T., J.-L. Birrien and D. Prieur. 1997. In situ Microbiol. Letters 162:219-226. enrichment and isolation of thermophilic microorganisms from deep-sea hydrothermal environments. Can. J. Microbiol. Lovley D.R. 1997. Microbial Fe(III) reduction in subsurface 43:694-697. environments, Fems Microbiol. Rev.3-4:305-313 Marteinsson V.T., J.-L. Birrien, C. Jeanthon and D. Ludwig W. and KH Schleifer. 1994. Bacterial phylogeny Prieur. 1996. Numerical taxonomic study of thermophilic based on 16S and 23S rRNA sequence analysis. FEMS Bacillus isolated from three geographically separated deep- Microbiol. Rev. 15:155-173. sea hydrothermal vents. FEMS Microbiol. Ecol. 21:255-266. Ludwig W., O. Strunk, S. Klugbauer, N. Klugbauer, M. Marteinsson V.T., J.-L. Birrien, J.K. Kristjansson and D. Weizenegger, J. Neumaier, M. Bachleitner and K.H. Prieur. 1995. First isolation of thermophilic aerobic non- Schleifer. 1998. Bacterial phylogeny based on comparative sporulating heterotrophic bacteria from deep-sea sequence analysis. Electrophoresis 19:554-568. hydrothermal vents. FEMS Microbiol. Ecol. 18:163-174. Ludwig W., S. Dorn, N. Springer, G. Kirchhof and K.H. Marteinsson V.T., J.L. Birrien, A.L. Reysenbach, M. Schleifer. 1994. PCR-based preparation of 23S rRNA- Vernet, D. Marie, A. Gambacorta, P. Messner, U.B. Sleytr targeted group-specific polynucleotide probes. Appl. Envir. and D. Prieur. 1999. Thermococcus barophilus sp. nov., a Microbiol. 60:3234-3244. new barophilic and hyperthermophilic archaeon isolated under high hydrostatic pressure from a deep-sea hydrothermal vent. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:351-359. M Martínez-Murcia A.J., S.G. Acinas and F. Rodriguez- Valera. 1995. Evaluation of prokaryotic diversity by restrictase MacArthur R.H. 1962. Some generalized theorems of natural digestion of 16S rDNA directly amplified from hypersaline selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 48:1893-1897. environments. FEMS Microbiol. Ecol. 17:247-256. MacGregor B.J., D.P. Moser, E.W. Alm, K.H. Nealson and Marty D., J.C. Bertrand and P. Caumette. 1988. Les D.A. Stahl. 1997. Crenarchaeota in Lake Michigan sediment. métabolismes bactériens dans les systèmes sédimentaires Appl. Environ. Microbiol. 63:1178-1181. marins, pp.:101-151. In: Micro-organismes dans les écosystèmes océaniques, M. Bianchi, D. Marty, J.C. Madigan M.T. 1996. Brock biology of microorganisms/ Bertrand, P. Caumette, M. Gauthier et coll. (Ed), Masson, Michael T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker 8th ed. Paris. Magot M. 1996. Similar bacteria in remote oil fields. Nature. Massana R., A.E. Murray, C.M. Preston and E.F. DeLong. 379:681. 1997. Vertical distribution and phylogenetic characterization of marine planktonic Archaea in the Santa Barbara Channel. Magot M., J. Connan and J.L. Crolet. 1994. Les bactéries Appl. Environ. Microbiol. 63:50-56. des gisements pétroliers. La recherche. 25:936-937. Mau M. and K.N. Timmis. 1998. Use of subtractive Magot M., Ollivier B. and B.K.C. Patel. 1999. Microbiology hybridization to design habitat-based oligonucleotide probes of petroleum reservoirs. Antonie van Leeuwenhoek (soumis).

226 Références bibliographiques for investigation of natural bacterial communities. Appl. detection of Bacteroides forsythus in plaque samples. J. Clin. Environ. Microbiol. 64:185-191. Microbiol. 29:2158-2162. Mayr E. 1982. Biology is not postage stamp collecting. Monfort P., M.H. Ratinaud, P.Got and B. Baleux. 1995. Science. 216:718-720. Apports de la cytométrie en flux et en image en écologie bactérienne des milieux aquatiques. Océanis 21:97-111. Mayr E. 1998. Two empires or three? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:9720-9723. Monheiner R.H. 1972. Heterotrophy by plankton in three lakes of different productivity. Nature 236:463-464. McCaig A.E., L.A. Glover and J.I. Prosser. 1999. Molecular analysis of bacterial community structure and diversity in Moore P.B. 1998. The three-dimensional structure of the unimproved and improved upland grass pastures. Appl. Envir. ribosome and its components. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Microbiol. 65:1721-1730. Struct. 27:35-58. McCoy T.J. 1997. A lively debate. Nature 386:557-558. Moran M.A., V.L. Torsvik, T. Torsvik and R.E. Hodson. 1993. Direct extraction and purification of rRNA for ecological McDonald I.R., E.M. Kenna and J.C. Murrell. 1995. studies. Appl. Envir. Microbiol. 59:915-918. Detection of methanotrophic Bacteria in environmental samples with the PCR. Appl. Envir. Microbiol. 61: 116-121. Moriarty D. 1977. Improved method using muramic acid to estimate biomass of bacteria in sediments. Oecologia 26:317- McInerney J.O., M. Mullarhey, M.E. Wernecke and R. 323. Powell. 1997. Phylogenetic analysis of group I marine archaeal rRNA sequences emphasizes the hidden diversity Moriya S., M. Ohkuma and T. Kudo. 1998. Phylogenetic within the primary group Archaea. Proc. R. Soc. Lond. B position of symbiotic protist Dinenympha [correction of 264:1663-1669. Dinemympha] exilis in the hindgut of the termite Reticulitermes speratus inferred from the protein phylogeny of McInerney J.O., M. Wilkinson, J.W. Patching, T.M. elongation factor 1 alpha. Gene 210:221-227. Embley and R. Powell. 1995. Recovery and phylogenetic analysis of novel archaeal rRNA sequences from a deep-sea Morvan B., F. Bonnemoy, G. Fonty and P. Gouet. 1996. deposit feeder. Appl. Environ. Microbiol. 61:1646-1648. Quantitative determination of H2-utilizing acetogenic and sulfate-reducing bacteria and methanogenic archaea from McKay C.P. 1997. The search for life on Mars. Origins of life digestive tract of different mammals. Curr. Microbiol. 32:129- and evolution of the biosphere 27:263-289. 133. McKay D.S., E.K. Gibson Jr., K.L. Thomas-Keprta, H. Vali, Moss C.W., M.A. Lambert and W.H. Merwin. 1974. C.S. Romanek, S.J. Clemett, X.D.F. Chillier, C.R. Comparison of rapid methods for analysis of bacterial fatty Maechling and R.N. Zare. 1996. Search for past life on mars: acids. Appl. Microbiol. 28:80-55. possible relic biogenic activity in martian meteorite ALH84001. Science 273:924-930. Motamedi M. and K. Pedersen. 1998. Desulfovibrio aespoeensis sp. nov., a mesophilic sulfate-reducing bacterium McNaughton S.J., J.R. Stephen, A.D. Venosa, G.A. Davis, from deep groundwater at Aspo hard rock laboratory, Sweden. Y.J. Chang and D.C. White. 1999. Microbial population Int. J. Syst. Bacteriol. 48:311-315. changes during bioremediation of an experimental oil spill. Appl. Envir. Microbiol. 65:3566-3574. Moyer C.L., F.C. Dobbs and D.M. Karl. 1994. Estimation of diversity and community structure through restriction Mead D.A., N.K. Pey, C. Herrnstadt, R.A. Marcil and L.M. fragment length polymorphism distribution analysis of Smith. 1991. A universal method for the direct cloning of PCR bacterial 16S rRNA genes from a microbial mat at an active, amplified nucleic acid. Bio/Technology 9:657-663. hydrothermal vent system, Loihi Seamount, Hawaii. Appl. Mevel G., C. Fady and D. Prieur. 1996. Distribution, activity, Environ. Microbiol. 60:871-879. and diversity of heterotrophic nitrifiers originating from Est Moyer C.L., F.C. Dobbs and D.M. Karl. 1995. Phylogenetic Pacific deep-sea hydrothermal vents. Can. J. Microbiol. diversity of the bacterial community from a microbial mat at 42:162-171. an active, hydrothermal vent system, Loihi Seamount, Hawaii. Michaelides K., R. Schwaab, M.R.A. Ialloz, W. Schmidt Appl. Environ. Microbiol. 61:1555-1562. and E.G.D. Tuddenham. 1995. Mutational analysis: new Moyer C.L., J.M. Tiedje, F.C. Dobbs and D.M. Karl. 1996. mutations. In: McPherson MJ, Hames BD, Taylor, GR, A computer-simulated restriction fragment length editors. PCR 2 A practical approach. Oxford: IRL Press at polymorphism analysis of bacterial small-subunit rRNA Oxford University Press. p. 255-287. genes : efficacy of selected tetrameric restriction enzymes for Miguez C.B., C.F. Shen, D. Bourque, S.R. Guiot and D. studies of microbial diversity in nature. Appl. Environ. Groleau. 1999. Monitoring methanotrophic bacteria in hybrid Microbiol. 62:2501-2507. anaerobic-aerobic reactors with PCR and a catabolic gene Moyer C.L., J.M. Tiedje, F.C. Dobbs and D.M. Karl. 1998. probe. Appl. Envir. Microbiol. 65:381-388. Diversity of deep-sea hydrothermal vent Archaea from Loihi Millikan D.S., H. Felbeck and J.L. Stein. 1999. Identification Seamount, Hawaii. Deep-Sea Res II 45:303-317. and characterization of a flagellin gene from the endosymbiont Mullins T.D., T.B. Britschgi, R.L. Krest and S.L. of the hydrothermal vent tubeworm Riftia pachyptila. Appl. Giovannonni. 1995. Genetic comparaisons reveal the same Environ. Microbiol. 65:3129-3133. unknown bacterial lineages in Atlantic and Pacific Miroshnichenko M.L., G.M. Gongadze, F.A. Rainey, A.S. bacterioplankton communities. Limnol. Oceanogr. 40:148-158. Kostyukova, A.M. Lysenko, N.A. Chernyh and E.A. Munson M.A., D.B. Nedwell and T.M. Embley. 1997. Bonch-Osmolovskaya. 1998. Thermococcus gorgonarius Phylogenetic diversity of Archaea in sediment samples from a sp. nov. and Thermococcus pacificus sp. nov.: heterotrophic coastal salt marsh. Appl. Environ. Microbiol. 63:4729-4733 extremely thermophilic archaea from New Zealand submarine hot vents. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:23-29. Murray A.E., J.T. Hollibaugh and C. Orrego. 1996. Phylogenetic compositions of bacterioplankton from two Miskin I., G. Rhodes, K. Lawlor, J.R. Saunders and R.W. California estuaries compared by denaturing gradient gel Pickup. 1998. Bacteria in post-glacial freshwater sediments. electrophoresis of 16S rDNA fragments. Appl. Envir. Microbiology 144:2427-2439. Microbiol. 62:2676-2680. Mobarry B.K., M. Wagner, V. Urbain, B.E. Rittmann and Muyzer G. 1999. DGGE/TGGE a method for identifying genes D.A. Stahl. 1996. Phylogenetic probes for analyzing from natural ecosystems. Curr. Opin. Microbiol. 2:317-322. abundance and spatial organization of nitrifying bacteria. Appl. Envir. Microbiol. 62:2156-2162. Muyzer G., A. Teske, C.O. Wirsen and H.W. Jannasch. 1995. Phylogenetic relationships of Thiomicrospira species Mohagheghi A., K. Grohmann, M. Himmel, L. Leighton and their indentification in deep-sea hydrothermal vent and D.M. Updegraff. 1986. Isolation and characterization of samples by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S Acidothermus cellulyticus gen. nov., sp. nov., a new genus rRNA fragments. Arch. Microbiol. 164:165-172. ofthermophilic, acidophilic, cellulolytic bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 36:435-443. Muyzer G., E.C. de Waal, A.G. Uitterrlinden. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel Moncla B.J., S.T. Motley, P. Braham, L. Ewing, T.H. electrophoresis analysis of polymerase chain reaction- Adams and N.M. Vermeulen. 1991. Use of synthetic oligonucleotide DNA probes for identification and direct

227 Références bibliographiques amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Nübel U., F. Garcia-Pichel, M. Kühl and G. Muyzer. 1999. Microbiol. 59:695-700. Quantifying microbial diversity: morphotypes, 16S rRNA genes, and carotenoids of oxygenic phototrophs in microbial mats. Appl. Envir. Microbiol. 65:422-430. Nüsslein K. and J.M. Tiedje. 1998. Characterization of the N dominant and rare members of a young Hawaiian soil bacterial community with small-subunit ribosomal DNA Naganuma T., C. Kato, H. Hirayama, N. Moriyama, J. amplified from DNA fractionated on the basis of its guanine Hashimoto and K. Horikoshi. 1997. Intracellular ocurrence and cytosine composition. Appl. Envir. Microbiol. 64:1283- of ε-proteobacterial 16S rRNA sequences in the 1289. Vestimentiferan Trophosome. J. Oceano. 53:193-197. Nazaret S., W.H. Jeffrey, E. Saouter, R. Von Haven and T. Barkay. 1994. merA gene expression in aquatic environments measured by mRNA production and Hg(II) volatilization. Appl. O Envir. Microbiol. 60: 4059-4065. O'Donnell A.G. and H.E. Görres. 1999. 16S rDNA methods Nealson D.C. 1999. Recent progress in the microbiology of in soil microbiology. Curr. Op. in Biotec. 10:225-2229. deep-sea hydrothermal vent and seeps. Cah. Biol. Mar. 39:373-378. Ogram A., W. Sun, F.J. Brockman and J.K. Fredrickson. 1995. Isolation and characterization of RNA from low-biomass Nealson D.C. and C.R. Fisher. 1995. Chemoautrophic and deep-subsurface sediments. Appl. Envir. Microbiol. 61:763- methanotrophic endosymbiotic bacteria at deep-sea vents and 768. seeps. In: Karl DM (Ed) The Microbiology of Deep-sea Hydrothermal Vents (pp 125-167). CRC Press Inc, Boca Ogram A.V. and G.S. Sayler. 1988. The use of gene probes in Raton. the rapid analysis of natural microbial communities. J. Ind. Microbiol. 3:281-292. Neef A., R. Amann, H. schlesner and K.H. Schleifer. 1998. Monitoring a widespread bacterial group: in situ detection of Ohkuma M. and T. Kudo. 1996. Phylogenetic diversity of the planctomycetes with 16S rRNA-targeted probes. Microbiology intestinal bacterial community in the termite Reticulitermes 144:3257-3266. speratus. Appl. Environ. Microbiol. 62:461-468. Neefs J.M., Y. Van de Peer, P. De Rijk, S. Chapelle and R. Ohkuma M. and T. Kudo. 1998. Phylogenetic analysis of the De Wachter. 1993. Compilation of small ribosomal subunit symbiotic intestinal microflora of the termite Cryptotermes RNA structures. Nucleic Acids Res. 21:3025-3049. domesticus. FEMS Microbiol. Lett. 164:389-395. Neimark H., D. Mitchelmore and R.H. Leach. 1998. An Ohkuma M., K. Ohtoko, C. Grunau, S. Moriya and T. approach to characterizing uncultivated prokaryotes: the Grey Kudo. 1998. Phylogenetic identification of the symbiotic Lung agent and proposal of a Candidatus taxon for the hypermastigote Trichonympha agilis in the hindgut of the organism, 'Candidatus Mycoplasma ravipulmonis'. Int. J. termite Reticulitermes speratus based on small-subunit rRNA Syst. Bacteriol. 48:389-394. sequence. J. Eukaryot. Microbiol. 45:439-444. Nercessian D., M. Upton, D. Lloyd and C. Edwards. 1999. Ohkuma M., S. Noda and T. Kudo. 1999. Phylogenetic Phylogenetic analysis of peat bog methanogen populations. relationships of symbiotic methanogens in diverse termites. FEMS Microbiol. Lett. 173:425-429. FEMS Microbiol. Lett. 171:147-153. Nguyen A.M., L. Engstrand, R.M. Genta, D.Y. Graham Ohkuma M., S. Noda, K. Horikoshi and T. Kudo. 1995. and F.A. el-Zaatari. 1993. Detection of Helicobacter pylori in Phylogeny of symbiotic methanogens in the gut of the termite dental plaque by reverse transcription-polymerase chain Reticulitermes speratus. FEMS Microbiol. Lett. 134:45-50. reaction. J. Clin. Microbiol. 31:783-787. Okabe S., H. Satoh and Y. Watanabe. 1999. In situ analysis Nielsen A.T., W.T. Liu, C. Filipe, L. Grady Jr, S. Molin and of nitrifying biofilms as determined by in situ hybridization and D.A. Stahl. 1999. Identification of a novel group of bacteria in the use of microelectrodes. Appl. Environ. Microbiol.65:3182- sludge from a deteriorated biological phosphorus removal 3191. reactor. Appl. Environ. Microbiol. 65:1251-1258. Olsen G.J. 1994. Archaea, archaea, everywhere. Nature Nierlich D.P. 1996. Futur directions for biomolecular 371:657-658. databases. ASM News 62:251-254. Olsen G.J. and C. Woese. 1996. Lessons from an Archaeal Ninet B., M. Monod, S. Emle, J. Pawlowski, C. Metral, P. genome: what are we learning from Methanococcus Rohner, R. Auckenthaler and B. Hirschel. 1996. Two jannaschii? Trends Genet. 12:377-379. different 16S rRNA genes in a mycobacterial strain. J. Clin. Microbiol. 34:2531-2536. Olsen G.J. and C.R. Woese. 1993. Ribosomal RNA: a key to phylogeny. FASEB J. 7:113-123. Noble R.T. and J. A. Fuhrman. 1998. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and Olsen G.J., C.R. Woese and R. Overbeek. 1994b. The winds bacteria. Aquat. Microb. Ecol. 14:113-118. of (evolutionary) change: breathing new life into microbiology. J. Bacteriol. 176:1-6. Noda S., M. Ohkuma, R. Usami, K. Horikoshi and T. Kudo. 1999. Culture-independent characterization of a gene Olsen G.J., D.J. Lane, S.J. Giovannoni, D.A. Stahl and responsible for nitrogen fixation in the symbiotic microbial N.R. Pace. 1986. Microbial ecology and evolution: a ribosomal community in the gut of the termite Neotermes koshunensis. RNA approach. Ann. Rev. Microbiol. 40:337-365. Appl. Environ. Microbiol. 65: 4935-4942. Olsen G.J., H. Matsuda, R. Hagstrom and R. Overbeek. Nogi Y and C Kato. 1999. Taxonomic studies of extremely 1994a. fastDNAmL: a tool for construction of phylogenetic barophilic bacteria isolated from the Mariana Trench and trees of DNA sequences using maximum likelihood. Comput. description of Moritella yayanosii sp. nov., a new barophilic Appl. Biosci. 10:41-48. bacterial isolate. Extremophiles 3:71-77. Olson B.H. 1991. Tracking and using genes in the Nold S.C. and D.M. Ward. 1996. Photosynthate partitioning environment. Environ. Sci. Technol. 25:604-611. and fermentation in hot spring microbial mat communities. Olson B.H. and Y.L.Tsai. 1992. Molecular approaches to Appl. Environ. Microbiol. 62:4598-4607. environmental management. Environmental. Microbiology, Nold S.C., E.D. Kopczynski and D.M. Ward. 1996. Wiley-Liss, Inc., p 239-263. Cultivation of aerobic chemoorganotrophic proteobacteria and Otsuka J., G. Terai and T. Kakano. 1999. Phylogeny of Gram-positive bacteria from a hot spring microbial mat. Appl. organisms investigated by base-pair changes in the stem Environ. Microbiol. 62:3917-3921. regions of small and large ribosomal subunit RNAs. J. Mol. Noller H.F. 1984. Structure of ribosomal RNA. Annu. Rev. Evol. 48:218-235. Biochem. 53:119-162. Ouverney C.C. and J.A. Fuhrman. 1999. Combined Noller H.F.and C.R. Woese. 1981. Secondary structure of microautoradiography-16S rRNA probe technique for 16S ribosomal RNA. Science. 212:403-411. determination of radioisotope uptake by specific microbial cell types in situ. Appl. Envir. Microbiol. 65:1746-1752.

228 Références bibliographiques

Øvreås L., L. Forney, F.L. Daae and V. Torsvik. 1997. and the subsurface aquifer in Key Largo, Florida. Appl. Envir. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Microbiol. 61: 2235-2241. Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for Pedersen K. 1996. Investigations of subterranean bacteria in 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 63:3367-3373. deep crystalline bedrock and their importance for the disposal of nuclear waste. Can. J. Microbiol. 42:382-391. Øvreås L., S. Jensen, F. L. Daae and V. Torsvik. 1998. Microbial community changes in a perturbed agricultural soil Pedersen K., J. Arlinger, L. Hallbeck and C. Pettersson. investigated by molecular and physiological approaches. Appl. 1996a. Diversity and distribution of subterranean bacteria in Envir. Microbiol. 64:2739-2742. groundwater at Oklo in Gabon, Africa, as determined by 16S rRNA gene sequencing. Mol. Ecol. 3:427-436. Pedersen K., J. Arlinger, S. Ekendahl and L. Hallbeck. 1996b. 16S rRNA gene diversity of attached and unattached P bacteria in boreholes along the acces tunnel to the Äspö hard rock laboratory, Sweden. FEMS Microbiol. Ecol. 19:249-262. Pääbo S., D.M. Irwin and A.C. Wilson. 1990. DNA damage Pedersen K.,L. Hallbeck, J. Arlinger, A.-C. Erlandson and promotes jumping between template during enzymatic N.Jahromi. 1997. Investigation of the potential for micobial amplification. J. Biol. Chem. 265:4718-4721. contamination of deep granitic aquifers during drilling using Pace N.R. 1991. Origin of life-facing up to the physical setting. 16S rRNA gene sequencing and culturing methods. J. Cell 65:531-533. Microbiol. Meth. 30:179-192. Pace N.R. 1997. A molecular view of microbial diversity and Peek A.S., R.A. Feldman, R.A. Lutz and R.C. Vrijenhoek. the biosphere. Science 276:734-740. 1998. Cospeciation of chemoautotrophic bacteria and deep sea clams. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9962-9966. Pace N.R., D.A. Stahl, D.J. Lane and G.J. Olsen. 1985. The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA Pennisi E. 1998. Genome data shake tree of life. Science sequences. Am. Soc. Microbiol. News 51:4-12. 280:672-674. Pace N.R., D.A. Stahl, D.J. Lane and G.J. Olsen. 1986a. Pernthaler J., F.O. Glockner, S. Unterholzner, A. The analysis of natural microbial populations by ribosomal Alfreider, R. Psenner and R. Amann. 1998. Seasonal RNA sequences. Adv. Microbial Ecol. 9:1-55. community and population dynamics of pelagic bacteria and archaea in a high mountain lake. Appl. Environ. Microbiol. Pace N.R., D.J. Lane, G.J. Olsen and D.A. Stahl. 1986b. 64:4299-4306. Phylogenetic analysis of organisms and populations using ribosomal RNA sequences. Proc. Fourth Internatl. Symp. on Philippe H. and J. Laurent. 1998. How good are deep Microbial Ecology, pp. 117-122. phylogenetic trees? Curr. Opin. Genet. Dev. 8:616-623. Pahl A., U. Kühlbrandt, K. Brune, M. Röllinghoff and A. Philippi G.T. 1977. On the depth, time, and mecanism of Gessner. 1999. Quantitative Detection of Borrelia burgdorferi origin of the heavy to medium gravity naphtenic crude oil. by Real-Time PCR. J. Clin. Microbiol. 37:1958-1963. Geochim. Cosmochim. Acta 41:33-52. Palleroni N.J. 1997. Procaryotic diversity and the importance Picard C., C. Ponsonnet, E. Paget, X. Nesme and P. of culturing. Antonie van Leeuwenhoeck 72:3-19. Simonet. 1992. Detection and enumeration of bacteria in soil by direct DNA extraction and polymerase chain reaction. Appl. Palmer C.J., G.F. Bonilla, B. Roll, C. Paszko-Kolva, L.R. Envir. Microbiol. 58: 2717-2722. Sangermano and R.S. Fujioka. 1995. Detection of Legionella species in reclaimed water and air with the EnviroAmp Pickup R.W. 1991. Development of molecular methods for Legionella PCR kit and direct fluorescent antibody staining. the detection of specific bacteria in the environment. J. Gen. Appl. Envir. Microbiol. 61: 407-412. Microbiol. 137:1009-1019. Palys T., L.K. Nakamura and F.M. Cohan. 1997. Discovery Pierson B.K. and R.W. Castenholz. 1974. A phototrophic and classification of ecological diversity in the bacterial world: gliding filamentous bacterium of hot springs, Chloroflexus the role of DNA sequence data. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:1145- aurantiacus, gen. and sp. nov. Arch. Mikrobiol. 100:5-24. 1156. Pillai S.D., K.L. Josephson, R.L. Bailey. C.P. Gerba and Parkes R.J., B.A. Cragg, S.J. Bala, J.M. Getiff, K. I.L. Pepper. 1991. Rapid method for processing soil samples Goodman, P.A. Rochelle, J.C. Fry, A.J. Weightman and for polymerase reaction amplification of specific gene S.M. Harvey. 1994. Deep bacterial biosphere in pacific ocean sequences. Appl. Envir. Microbiol. 57: 2283-2286. sediments. Nature 371:410-413. Pillai S.D., K.W. Widmer, S.E. Dowd and S.C. Ricke. 1996. Parrish K.D. and E.P. Greenberg. 1995. A rapid method for Occurrence of airborne bacteria and pathogen indicators extraction and purification of DNA from dental plaque. Appl. during land application of sewage sludge. Appl. Envir. Envir. Microbiol. 61:4120-4123. Microbiol. 62:296-299. Partensky F., W.R. Hess and D. Vaulot. 1999. Pitcher D.G., N.A. Saunders and R.J. Owen. 1989. Rapid Prochlorococcus, a marine photosynthetic prokaryote of global extraction of bacterial genomic DNA with guanidium significance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63:106-127. thiocyanate. Lett.Appl.Micro. 8:151-156 Paster B.J., F.E. Dewhirst, S.M. Cooke, V. Fussing, L.K. Pitulle C. and N.R. Pace. 1999. T-cloning vector for plasmid- Poulsen and J.A. Breznak. 1996. Phylogeny of not-yet- based 16S rDNA analysis. Biotechniques 26:222-224. cultured Spirochetes from termite guts. Appl. Environ. Pizarro J., E. Jedlicki, O. Orellana, J. Romero and R.T. Microbiol. 62:347-352. Espejo. 1996. Bacterial populations in samples of bioleached Patel B.K.C., H.W., Morgan and R.M. Daniel. 1985. copper ore as revealed by analysis of DNA obtained before Fervidobacterium nodosum gen. nov. and spec. nov., a new and after cultivation. Appl. Envir. Microbiol. 62:1323-1328. chemoorganotrophic, caldoactive, anaerobic bacterium. Arch. Pley U., J. Schipka, A. Gambacorta, H.W. Jannasch, H. Microbiol. 141:63-69. Fricke, R. Rachel and K.O. Stetter. 1991. Pyrodictium Patel B.K.C., M. Spanevello and B. Olivier. 1998. Microbial abyssi sp. nov., represents a novel heterotrophic marine diversity of the thermal waters emmited from the deep archaeal hyperthermophile growing at 110¡C. System. Appl. subterrestrial aquifer, The Great Artesian Bassin of Australia. Microbiol. 14:245-253. Thermophiles'98, International Conference, 6-11 septembre, Pochart P., J. Dore, F. Lemann, I. Goderel and J.C. Brest France. Rambaud. 1992. Interrelations between populations of Patra G., J. Vaissaire, M. Weber-Levy, C. Le Doujet and M. methanogenic archaea and sulfate-reducing bacteria in the Mock. 1998. Molecular characterization of Bacillus strains human colon. FEMS Microbiol. Lett. 77:225-228. involved in outbreaks of Anthrax in France in 1997. J. Clin. Pollard P.C. 1998. Estimating the growth rate of a bacterial Microbiol. 36:3412-3414. species in a complex mixture by hybridization of genomic Paul J.H., J.B. Rose, S. Jiang, C. Kellogg and E.A. Shinn. DNA. Microb. Ecol. 36:111-120. 1995. Occurrence of fecal indicator bacteria in surface waters

229 Références bibliographiques

Poltz M.F. and C.M. Cavanaugh. 1995. Dominance of one Guezennec. 1997a. Alteromonas infernus sp. nov., a new bacterial phylotype at a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent polysaccharide-producing bacterium isolated from a deep-sea site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7232-7236. hydrothermal vent. J. Appl. Microbiol. 82:422-430. Poltz M.F. and C.M. Cavanaugh. 1997. A simple method for Raguenes G.H., R. Christen, J. Guezennec, P. Pignet and quantification of uncultured microorganisms in the G. Barbier. 1997b. Vibrio diabolicus sp. nov., a new environment based on in vitro transcription of 16S rRNA. Appl. polysaccharide-secreting organism isolated from a deep-sea Envir. Microbiol. 63:1028-1033. hydrothermal vent polychaete annelid, Alvinella pompejana. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:989-995. Polz M.F., J.J. Robinson, C.M. Cavanaugh and C.L. Van Dover. 1998. Trophic ecology of massive shrimp Rainey F.A., D. Fritze and E. Stackebrandt. 1994a. The aggregations at a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent site. phylogenetic diversity of thermophilic members of the genus Limnol. Oceanogr. 43:1631-1638. Bacillus as revealed by 16S rDNA analysis. FEMS Microbiol. Lett. 115:205-211. Porteous L.A., R.J. Seidler and L.S. Watrud. 1997. An improved method for purifying DNA from soil for polymerase Rainey F.A., N. Ward, L.I. Sly and E. Stackebrandt. 1994b. chain reaction amplification and molecular ecology Dependence on the taxon composition of clone libraries for applications. Mol. Ecol. 6:787-791. PCR amplified, naturally occuring 16S rDNA, on the primer pair and the cloning system used. Experientia 50:796-797. Poulicek M. and V. Danckers. 1995. L'ATP et la charge énergétique adénylique (ECA) en écologie microbienne des Ramsing N.B., H. Fossing, T.G. Ferdelman, F. Andersen milieux aquatiques. Océanis 21:191-223. and B. Thamdrup. 1996. Distribution of bacterial populations in a stratified fjord (Mariager Fjord, Denmark) quantified by in Preston C.M., K.Y. Wu, T.F. Molinski and E.F. DeLong. situ hybridization and related to chemical gradients in the 1996. A psychrophilic crenarchaeon inhabits a marine sponge: water column. Appl. Environ. Microbiol. 62:1391-1404. Crenarchaeum symbiosum gen. nov., sp. nov. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6241-6246. Rappé M.S. P.F. Kemp and S.J. Giovannoni. 1997. Phylogenetic diversity of marine coastal picoplankton 16S Prieur D. 1992. Physiology and biotechnological potential of rRNA genes cloned from the continental shelf off Cape deep-sea bacteria, in: Molecular biology and Biotechnology of Hatteras, North Carolina. 1997. Limnol. Oceanogr. 42:811- extremophiles. R.A. Herbert and R.J. Sharp, Eds. Blackie, 826. Glasgow & London. p 163-197. Rappé M.S., D.A. Gordon, K.L. Vergin and S.J. Prieur D. 1997. Deep-sea hydrothermal vents. TIBTech. Giovannoni. 1999. Phylogeny of Actinobacteria small subunit 15:242-244. (SSU) rRNA gene clones recovered from marine Prieur D., C. Jeanthon and E. Jacq. 1987. Les bacterioplankton. System. Appl. Microbiol. 22:106-112. communautés bactériennes des sources hydrothermales Rappé M.S., M.T. Suzuki, K.L. Vergin and S.J. profondes du Pacifique Oriental. Vie Milieu 28:419-424. Giovannoni. 1998. Phylogenetic diversity of ultraplankton Prieur D., C. Jeanthon and G. Erauso. 1995. plastid small-subunit rRNA genes recovered in environmental Hyperthermophilic life at deep-sea hydrothermal vents. nucleic acid samples from the Pacific and Atlantic coasts of Planet. Space Sci. 43:115-122. the United States. Appl. Environ. Microbiol. 64:294-303. Priscu J.C., C.H. Fritsen, E.E. Adams, S.J. Giovannoni, Raskin L., J.M. Stromley, B.E. Rittmann and D.A. Stahl. H.W. Paerl, C.P. McKay, P.T. Doran, D.A. Gordon, B.D. 1994a. Group-specific 16S rRNA hybridization probes to Lanoil and J.L. Pinckney. 1998. Perennial Antarctic lake ice: describe natural communities of methanogens. Appl. Envir. an oasis for life in a polar desert. Science 280:2095-2098. Microbiol. 60:1232-1240. Prüß B.M., K.P. Francis, F. von Stetten and S. Scherer. Raskin L., L.K. Poulsen, D.R. Noguera, B.E. Rittmann 1999. Correlation of 16S ribosomal DNA signature sequences and D.A. Stahl. 1994b. Quantification of methanogenic groups with temperature-dependent growth rates of mesophilic and in anaerobic biological reactors by oligonucleotide probe psychrotolerant strains of the Bacillus cereus group. J. hybridization. Appl. Envir. Microbiol. 60:1241-1248. Bacteriol. 181:2624-2630. Rastan S. and L.J. Beeley. 1997. Functional genomics: going Psenner R. and B. Sattler. 1998. Life at the freezing point. forwards from the database. Curr. Opin. Genet. Dev. 7:777- Science 280:2073-2074. 783. Pukall R., E. Brambilla and E. Stackebrandt. 1998. Rath J., K.Y. Wu, G.J. Herndl and E.F. DeLong. 1998. High Automated fragment lenght analysis of fluorescently-labeled phylogenetic diversity in a marine-snow-associated bacterial 16S rDNA after digestion with 4-base cutting restriction assemblage. Aquat. Microb. Ecol. 14:261-269. enzymes. J. Microbiol. Methods 32:55-63. Ravot G. 1996. Nouvelles approches microbiologiques de la thiosulfato-reduction en milieu pétrolier. Thèse de doctorat de Pukall R., O. Päuker, D. Buntelfu§, G. Ulrichs, P. Lebaron, eme L. Bernard, T. Guindulain, J. Vives-Rego, E. 3 cycle Université Aix - Marseille I : 6-17. Stackebrandt. 1999. High sequence versity of Alteromonas Ravot G., B. Ollivier, M. Magot, B.K.C. Patel, J.L. Crolet, macleodii-related cloned and cellular 16S rDNAs from M.L. Fardeau and J.L. Garcia. 1995a. Thiosulfate reduction, Mediterranean seawater mesocosm experiment. FEMS an important physiological feature shared by members of Microbiol. Ecol. 28:335-344. order Thermotogales. Appl. Envir. Microbiol. 61:2053-2055. Pulliam Holoman T.R., M.A. Elberson, L.A. Cutter, H.D. Ravot G., M. Magot, M.L. Fardeau, B.K.C. Patel, G. May and K.R. Sowers. 1998. Characterization of a defined Prensier, A. Egan, J.L. Garcia and B. Ollivier. 1995b. 2,3,5,6-tetrachlorobiphenyl-ortho-dechlorinating microbial Thermotoga elfii sp. nov., a novel thermophilic bacterium from community by comparative sequence analysis of genes an african oil-producing well. Int. J. Syst. Bacteriol. 45:308- coding for 16s rRNA. Appl. Envir. Microbiol. 64:3359-3367. 314. Rees G.N., B.K. Patel, G.S. Grassia and A.J. Sheehy. 1997. Anaerobaculum thermoterrenum gen. nov., sp. nov., a novel, Q thermophilic bacterium which ferments citrate. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:150-154. Quérellou J. 1999. La biologie moléculaire colonisée par une Reeves R.H., J.Y. Reeves and D.L. Balkwill. 1996. enzyme. La Recherche 317:34-35. Strategies for phylogenetic characterization of subsurface Quérellou J., Y. Guéguen, G. Barbier and J. Dietrich. 1999. bacteria. J. Microbiol. Methods 21:235-251. Des enzymes pour l'industrie. La Recherche 371:87-88. Reid A.H., T.G. Fanning, J.V. Hultin and J.K. Taubenberger. 1999. Origin and evolution of the 1918 "Spanish" influenza virus hemagglutinin gene. Proc. Natl. R Acad. Sci. USA 96:1651-1656. Reischl U., K. Feldmann, L. Naumann, B. J. M. Gaugler, Raguenes G.H., A. Peres, R. Ruimy, P. Pignet, R. B. Ninet, B. Hirschel and S. Emler. 1998. 16S rRNA Christen, M. Loaec, H. Rougeaux, G. Barbier and J.G. sequence diversity in Mycobacterium celatum strains caused

230 Références bibliographiques by presence of two different copies of 16S rRNA gene. J. Clin. ammonia-oxidizing populations. Appl. Envir. Microbiol. 63: Microbiol. 36:1761-1764. 4704-4712. Reponen T.A., S.V. Gazenko, S.A. Grinshpun, K. Willeke Ruano G., M.E. Lewis and R.E. Kouri. 1993. Cycled primer and E.C. Cole. 1998. Characteristics of airborne extension: a method for DNA amplification and labelling from Actinomycete spores. Appl. Envir. Microbiol. 64:3807-3812. templates of unknown sequence. Annal. Biochem. 212:1-6. Reysenbach A.L., G.S. Wickham and N.R. Pace. 1994. Ruby E.G., C.O. Wirsen and H.W. Jannasch. 1981. Phylogenetic analysis of the hyperthermophilic pink filament Chemolithotrophic sulfur-oxidizing bacteria from the community in Octopus Spring, Yellowstone National Park. Galapagos Rift hydrothermal vents. Appl. Environ. Microbiol. Appl. Environ. Microbiol. 60:2113-2119. 42:317-324. Reysenbach A.L., J.D. Kirshtein, D. Lane, K. Longnecker Rueter P., R. Rabus, H. Wilkes, F. Aeckersberg, F.A. and N.R. Pace. 1999. Microbial diversity associated with in Rainey, H.W. Jannasch and F. Widdel. 1994. Anaerobic situ growth chambers deployed on a deep sea hydrothermal oxidation of hydrocarbons in crude oil by new types of vent. (en préparation). sulphate-reducing bacteria. Nature 372:455-458. Reysenbach A.L., L.J. Giver, G.S. Wickham and N.R. Ruff-Roberts A.L., J.G. Kuenen and D.M. Ward. 1994. Pace. 1992. Differential amplification of rRNA genes by Distribution of cultivated and uncultivated cyanobacteria and polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58:3417- Chloroflexus-like bacteria in hot spring microbial mats. Appl. 3418. Environ. Microbiol.60:697-704. Reysenbach A.L., N.G. Holm, K. Hershberger, D. Prieur Rupf S., K. Merte and K. Eschrich. 1999. Quantification of and C. Jeanthon. 1998. In search of a subsurface biosphere bacteria in oral samples by competitive polymerase chain at a slow-spreading ridge. In: Herzig PM, Humphris SE, reaction. J. Dent. Res. 78:850-856. Miller DJ & Zierenberg RA (Eds) Proc ODP Sci Results Vol 158 (pp 355-360), College Station, TX. Rhodes A.N., J.W. Urbance, H. Youga, H. Corlew- Newman, C.A. Reddy, M.J. Klug, J.M. Tiedje and D.C. S Fisher. 1998. Identification of bacterial isolates obtained from intestinal contents associated with 12,000-year-old mastodon Saiki R.K., D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. remains. Appl. Envir. Microbiol. 64:651-658. Higuchi, G.T. Horn, K.B. Mullis and H.A. Erlich. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a Riley P. 1999. Detection of methanogen communities. Report. thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491. Amores: Azores Mid-Oceanic Ridge Ecosystem Studies. Final Detailed scientific report. Theme N¡3 (1/2) Saiki R.K., S. Scharf, F. Faloona, K.B. Mullis, G.T. Horn, H.A. Erlich and N. Arnheim. 1985. Enzymatic amplification Riley P.W. 1997. The development of an alternative to 16S of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for rDNA, the mcrA gene, as a phylogenetic tool in the description diagnostic of sickle cell anemia. Science 230:1350-1354. of methanogen communities in the marine environment. First International Symposium on Deep-sea Hydrothermal Vent Saitou N. and M. Nei. 1987. The neighbor-joining method: a Biology. p. 109. new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4:406-425. Risatti J.B., W.C. Capman and D.A. Stahl. 1994. Community structure of a microbial mat: the phylogenetic Sakano Y. and L. Kerkhof. 1998. Assessment of changes in dimension. Proc. Natl. Acad .Sci. USA 91:10173-10177. microbial community structure during operation of an ammonia biofilter with molecular tools. Appl. Envir. Microbiol. Robison-Cox J.F., M.M. Bateson and D.M. Ward. 1995. 64:4877-4882. Evaluation of nearest-neighbor methods for detection of chimeric small-subunit rRNA sequences. Appl. Environ. Sako Y., N. Nomura, A. Uchida, Y. Ishida, H. Morii, Y. Microbiol. 61:1240-1245. Koga, T. Hoaki and T. Maruyama. 1996. Aeropyrum pernix gen. nov., sp. nov., a novel aerobic hyperthermophilic Rocheleau S., C.W. Greer, J.R. Lawrence, C. Cantin, L. archaeon growing at temperatures up to 100 degrees C. Int. J. Laramee and S.R. Guiot. 1999. Differentiation of Syst. Bacteriol. 46:1070-1077. Methanosaeta concilii and Methanosarcina barkeri in anaerobic mesophilic granular sludge by fluorescent in situ Sambrook J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular hybridization and confocal scanning laser microscopy. Appl. clonning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Environ. Microbiol. 65:2222-2229. Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Rochelle P.A., B.A. Cragg, J.C. Fry, R. J. Parkes and A.J. San Martin R., D. Bushell, D.J. Leak and B.S. Hartley. Weightman. 1994. Effect of sample handling on estimation of 1992. Development of a synthetic medium for continuous bacterial diversity in marine sediments by 16S rRNA gene anaerobic growth and ethanol production with a lactate sequence analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 15:215-226. dehydrogenase mutant of Bacillus stearothermophilus. J. Gen. Microbiol.138:987-996. Rochelle P.A., J.C. Fry, R.J. Parkes and A.J. Weightman. 1992. DNA extraction for 16S rRNA gene analysis to Santegoeds C.M., A. Schramm and D. de Beer. 1998a. determine genetic diversity in deep sediment communities. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients FEMS Microbiol. Lett. 179:59-65. and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation 9:159-167. Rodriguez G.G., D. Phipps, K. Ishiguro and H.F. Ridgway. 1992. Use of a fluorescent redox probe for direct Santegoeds C.M., S.C. Nold and D.M. Ward. 1996. visualization of actively respiring bacteria. Appl. Envir. Denaturing gradient gel electrophoresis used to monitor the Microbiol. 58:1801-1808. enrichment culture of aerobic chemoorganotrophic bacteria from a hot spring cyanobacterial mat. Appl. Environ. Rogers J. and G.F. Joyce. 1999. A ribozyme that lacks Microbiol. 62:3922-3928. cytidine. Nature. 408:323-325. Santegoeds C.M., T.G. Ferdelman, G. Muyzer and D. de Ronimus R.S., A. Reysenbach, D.R. Musgrave and H.W. Beer. 1998b. Structural and functional dynamics of sulfate- Morgan. 1997. The phylogenetic position of the reducing populations in bacterial biofilms. Appl. Environ. Thermococcus isolate AN1 based on 16S rRNA gene Microbiol. 64:3731-3739. sequence analysis: a proposal that AN1 represents a new species, Thermococcus zilligii sp. nov. Arch. Microbiol. Santo Domingo J.W., C.J. Berry, M. Summer and C.B. 168:245-248. Fliermans. 1998a. Microbiology of spent nuclear fuel storage bassins. Curr. Microbiol. 37:387-394. Rooney-Varga J.N., R.T. Anderson, J.L. Fraga, D. Ringelberg and D.R. Lovley. 1999. Microbial communities Santo Domingo J.W., M.G. Kaufman, M.J. Klug and J.M. associated with anaerobic benzene degradation in a Tiedje. 1998b. Characterization of the Cricket hindgut petroleum-contaminated aquifer. Appl. Environ. Microbiol. microbiota with fluorescently labeled rRNA-targeted 65:3056-3063. oligonucleotide probes. Appl. Envir. Microbiol. 64:752-755. Rotthauwe J.H., K.P. Witzel and W. Liesack. 1997. The Sass H., E. Wieringa, H. Cypionka, H.D. Babenzien and J. ammonia monooxygenase structural gene amoA as a Overmann. 1998. High genetic and physiological diversity of functional marker: molecular fine-scale analysis of natural

231 Références bibliographiques sulfate-reducing bacteria isolated from an oligotrophic lake Segonzac M., M. de SaintLaurent and B. Casanova. 1993. sediment. Arch. Microbiol. 170:243-251. L'énigme du comportement trophique des crevettes Alvinocarididae des sites hydrothermaux de la dorsale medio- Schink B. and J.G. Zeikus. 1983. Clostridium atlantique. Cah. Biol. Mar. 34:535-571. thermosulfurogenes sp. nov., a new thermophile that produces elemental sulfur from thiosulfate. J. Gen. Microbiol. 129:1149- Sekiguchi Y., Y. Kamagata, K. Syutsubo, A. Ohashi, H. 1158 . Harada and K. Nakamura. 1998. Phylogenetic diversity of mesophilic and thermophilic granular sludges determined by Schleper C. 1999. Les archaebactéries sont parmi nous. La 16S rRNA gene analysis. Microbiology 144:2655-2665. Recherche 317:30-33. Sekiguchi Y., Y. Kamagata, K. Nakamura, A. Ohashi and Schleper C., E.F. DeLong, C.M. Preston, R.A. Feldman, H. Harada. 1999. Fluorescence in situ hybridization using 16S K.Y. Wu and R.V. Swanson. 1998. Genomic analysis rRNA-targeted oligonucleotides reveals localization of reveals chromosomal variation in natural populations of the methanogens and selected uncultured bacteria in mesophilic uncultured psychrophilic archaeon Cenarchaeum symbiosum. and thermophilic sludge granules. Appl. Envir. Microbiol. J. Bacteriol. 180:5003-5009. 65:1280-1288. Schleper C., G. Puehler, I. Holz, A. Gambacorta, D. Selvaratnam S., B.A. Schoedel, B.L. McFarland and C.F. Janekovic, U. Santarius, H.P. Klenk and W. Zillig. 1995. Kulpa. 1995. Application of reverse transcriptase PCR for Picrophilus gen. nov., fam. nov.: a novel aerobic, monitoring expression of the catabolic dmpN gene in a phenol- heterotrophic, thermoacidophilic genus and family comprising degrading sequencing batch reactor. Appl. Envir. Microbiol. archaea capable of growth around pH 0. J.Bacteriol. 177:7050- 61:3981-3985. 7059. Servais P. 1995. Estimation de la biomasse et de l'activité des Schleper C., R.V. Swanson, E.J. Mathur and E.F. DeLong. bactéries en milieux aquatique. Océanis 21:141-160. 1997b. Characterization of a DNA polymerase from the uncultivated psychrophilic archaeon Cenarchaeum Shaffer B.T. and B. Lighthart. 1997. Survey of culturable symbiosum. J. Bacteriol. 179:7803-7811. airborne bacteria at four diverse locations in oregon: urban, rural, forest and coastal. Microb. Ecol. 34:167-177. Schleper C., W. Holben and H.P. Klenk. 1997a. Recovery of crenarchaeotal ribosomal DNA sequences from Sharp R.J., K.J. Bown and A. Atkinson. 1980. Phenotypic freshwater-lake sediments. Appl. Envir. Microbiol. 63:321- and genotypic characterization of some thermophilic species 323. of Bacillus. J. Gen. Microbiol. 117:201-210. Schmidt T.M. and D.A. Relman. 1994. Phylogenetic Sharp R.J., P.W. Riley and D. White. 1992. Heterotrophic identification of uncultured pathogens using ribosomal RNA thermophilic Bacilli. In: Thermophilic Bacteria (Kritjansson sequences. Methods Enzymol. 235:205-222. J.K. Ed.) p 19-50. CRC Press, Boca Raton. Fl. Schmidt T.M., E.F. DeLong and N.R. Pace. 1991 Analysis Shen Y., L.G. Stehmeier and G. Voordouw. 1998. of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene Identification of hydrocarbon-degrading bacteria in soil by cloning and sequencing. J. Bacteriol. 173:4371-4378. reverse sample genome probing. Appl. Envir. Microbiol. 64:637-645. Schofield P., A.N. Pell and D.O. Krause. 1997. Molecular beacons: trial of a fluorescence-based solution hybridization Shena M., R.A. Heller, T.P. Theriault, K. Konrad, E. technique for ecological studies with ruminal bacteria. Appl. Lachenmeier and R.W. Davis. 1998. Microarrays: Environ. Microbiol. 63:1143-1147. biotechnology's discovery platform for functional genomics. Trends Biotech. 16:301-306. Schönhuber W., B. Fuchs, S. Juretschko and R. Amann. 1997. Improved sensitivity of whole-cell hybridization by the Shi T., R.H. Reeves, D.A. Gilichinsky and E.I. Friedmann. combination of horseradish peroxidase-labeled 1997. Characterization of viable bacteria from Siberian oligonucleotides and tyramide signal amplification. Appl. permafrost by 16S rDNA sequencing. Microb. Ecol. 33:169- Envir. Microbiol. 63:3268-3273. 179. Schönhuber W., B. Zarda, S. Eix, R. Rippka, M. Herdman, Shi Y., M.D. Zwolinski, M.E. Schreiber, J.M. Bahr, G.W. W. Ludwig and R. Amann. 1999. In situ identification of Sewell and W.J. Hickey. 1999. Molecular Analysis of cyanobacteria with horseradish peroxidase-labeled, rRNA- microbial community structures in pristine and contaminated targeted oligonucleotide probes. Appl. Envir. Microbiol. 65: aquifers: field and laboratory microcosm experiments. Appl. 1259-1267. Envir. Microbiol. 65:2143-2150. Schramm A., L.H. Larsen, N.P. Revsbech, N.B. Ramsing, Shinzato N., T. Matsumoto, I. Yamaoka, T. Oshima and A. R. Amann and K.H. Schleifer. 1996. Structure and function Yamagishi. 1999. Phylogenetic diversity of symbiotic of a nitrifying biofilm as determined by in situ hybridization and methanogens living in the hindgut of the lower termite the use of microelectrodes. Appl. Environ. Microbiol. 62:4641- Reticulitermes speratus analyzed by PCR and in situ 4647. hybridization. Appl. Envir. Microbiol. 65:837-840. Schulz H.N., T. Brinkhoff, T.G. Ferdelman, M. Hernandez Siering P.L. and W.C. Ghiorse. 1997. Development and Marine, A. Teske and B.B. Jorgensen. 1999. Dense application of 16S rRNA-targeted probes for detection of iron- populations of a giant sulfur bacterium in Namibian shelf and manganese-oxidizing sheathed bacteria in environmental sediments. Science 284:493-495. samples. Appl. Envir. Microbiol. 63: 644-651. Schuppler M., F. Mertens, G. Schon and U.B. Gobel. Silva M.C. and C.A. Batt. 1995. Effect of cellular physiology 1995. Molecular characterization of nocardioform on PCR amplification efficiency. Mol. Ecol. 4:11-16. actinomycetes in activated sludge by 16S rRNA analysis. Microbiology 141:513-521. Slobodkin A., A.L. Reysenbach, F. Mayer and J. Wiegel. 1997a. Isolation and characterization of the homoacetogenic Schuppler M., M. Wagner, G. Schon and U.B. Gobel. thermophilic bacterium Moorella glycerini sp. nov. Int. J. Syst. 1998. In situ identification of nocardioform actinomycetes in Bacteriol. 47:969-974. activated sludge using fluorescent rRNA-targeted oligonucleotide probes. Microbiology 144:249-259. Slobodkin A., A.L. Reysenbach, N. Strutz, M. Dreier and J. Wiegel. 1997b. Thermoterrabacterium ferrireducens gen. Schwieger F. and C.C. Tebbe. 1998. A new approach to nov., sp. nov., a thermophilic anaerobic dissimilatory Fe(III)- utilize PCR-single-strand-conformation polymorphism for reducing bacterium from a continental hot spring. Int. J. Syst. 16S rRNA gene-based microbial community analysis. Appl. Bacteriol. 47:541-547. Envir. Microbiol. 64:4870-4876. Slobodkin A., C. Jeanthon, S. L'Haridon, T. Nazina, M. Segerer A., K.O. Stetter and F. Klink. 1985. Two contrary Miroshnichenko and E. Bonch Osmolovskaya. 1999. modes of lithotrophy in the same archaebacterium. Nature Dissimilatory reduction of Fe(III) by thermophilic bacteria and 313:787-789. archaea in deep subsurface petroleum reservoirs of Western Siberia. Curr. Microbiol.. 39:99-102 Segerer A.H., A. Trincone, M. Gahrtz and K.O. Stetter. 1991. Stygiolobus azoricus gen. nov., sp. nov. represents a Slobodkin A.I. and J. Wiegel. 1997. Fe(III) as an electron novel genus of anaerobic, extremely thermoacidophilic acceptor for H2 oxidation in thermophilic anaerobic archaebacteria of the order Sulfolobales. Int. J. Syst. Bacteriol. enrichment cultures from geothermal areas. Extremophiles 41:495-501. 1:106-109.

232 Références bibliographiques

Smalla K., U. Wachtendorf, H. Heuer, W.T. Liu and L Steffan R.J., J. Goks¿yr, A.K. Bej and R.M. Atlas. 1988. Forney. 1998 Analysis of BIOLOG GN substrate utilization Recovery DNA from soils and sediments. Appl. Envir. patterns by microbial communities. Appl. Envir. Microbiol. Microbiol. 54: 2908-2915. 64:1220-1225. Stein J.L., T.L. Marsh, K.Y. Wu, H. Shizuya and E.F. Smith G.L., C. Sansone and S.S. Socransky. 1989a. DeLong. 1996. Characterization of uncultivated prokaryotes: Comparison of two methods for the small-scale extraction of isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment DNA from subgingival microorganisms. Oral Microbiol. from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178:591-599. Immunol. 4:135-140. Stephen J.R., A.E. McCaig, Z. Smith, J.I. Prosser and T.M. Smith G.L., S.S. Socransky and C.M. Smith. 1989b. Rapid Embley. 1996. Molecular diversity of soil and marine 16S method for the purification of DNA from subgingival rRNA gene sequences related to beta-subgroup ammonia- microorganisms. Oral Microbiol. Immunol. 4:47-51. oxidizing bacteria. Appl. Envir. Microbiol. 62:4147-4154. Snaidr J., R. Amann, I. Huber, W. Ludwig and K.H. Stephen J.R., G.A. Kowalchuk, M.A.V. Bruns, A.E. Schleifer. 1997. Phylogenetic analysis and in situ identification McCaig, C.J. Phillips, T.M. Embley and J.I. Prosser. 1998. of bacteria in activated sludge. Appl. Envir. Microbiol. Analysis of beta-subgroup proteobacterial ammonia oxidizer 63:2884-2896. populations in soil by denaturing gradient gel electrophoresis analysis and hierarchical phylogenetic probing. Appl. Envir. Sneath P.H. and R.R. Sokal. 1973. Numerical taxonomy. Microbiol. 64:2958-2965. San Francisco: W.H. Freeman and Co. Stetter K.O. 1988. Archaeoglobus fulgidus gen. nov., sp. nov.: Sokal R.R. and P.H. Sneath. 1963. Principles of numerical a new taxon of extremely thermophilic archaebacteria. taxonomy. Freeman, San Francisco. System. Appl. Microbiol. 10:172-173. Somerville C.C., I.T. Knight, W.L. Straube and R.R. Stetter K.O. 1996. Hyperthermophilic procaryotes. FEMS Colwell. 1989. Simple, rapid method for direct isolation of Microbiol. Rev. 18:149-158. nucleic acids from aquatic environments. Appl. Envir. Microbiol. 55:548-554. Stetter K.O., H. König and E. Stackebrandt. 1983. Pyrodictium, a new genus of submarine disc-shaped sulfur Speksnijder A.G., G.A. Kowalchuk, K. Roest H.J. reducing archaebacteria growing optimally at 105¡C. System. Laanbroek. 1998. Recovery of a Nitrosomonas-like 16S Appl. Microbiol. 4:535-551. rDNA sequence group from freshwater habitats. Syst. Appl. Microbiol. 21:321-330. Stetter K.O., M. Thomm, J. Winter, G. Wildgruber, H. Huber, W. Zillig, D. Janecovic, H. König and P. Palm. Spratt D.A., A.J. Weightman and W.G. Wade. 1999. 1981. Methanothermus fervidus, sp. nov., a novel extremely Diversity of oral asaccharolytic Eubacterium species in thermophilic methanogen isolated from an Islandic hot spring. periodontitis--identification of novel phylotypes representing Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. C 2:166-178. uncultivated taxa. Oral Microbiol. Immunol. 14:56-59. Stetter K.O., R. Huber, E. Blöchl, M. Kurr, R.D. Eden, M. Spring S., R. Amann, W. Ludwig, K.H. Schleifer and N. Fielder, H. Cash and L. Vance. 1993. Hyperthermophilic Petersen. 1992. Phylogenetic diversity and identification of archaea are thriving in deep North Sea and Alaskan Oil nonculturable magnetotactic bacteria. System. Appl. reservoirs. Nature 365:743-745. Microbiol. 15:116-122. Stevens T.O. and J.P. McKinley. 1995. Lithotrophic Spring S., U. Lins, R. Amann, K.H. Schleifer, L.C. microbial ecosystems in deep basalts aquifiers. Science Ferreira, D.M. Esquivel and M. Farina. 1998. Phylogenetic 270:450-454. affiliation and ultrastructure of uncultured magnetic bacteria with unusually large magnetosomes. Arch. Microbiol. Stim K.P. 1994. A phylogenetic analysis of micro-organisms 169:136-147. isolated from subsurface environments. Mol. Ecol. 3:1-10. Stackebrandt E. and B.M. Goebel. 1994. Taxonomic note: a Stoesser G., M.A. Tuli, R. Lopez and P. Sterk. 1999. The place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence EMBL Nucleotide Sequence Database. Nucleic Acids Res. analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. 27:18-24. Syst. Bacteriol. 44:846-849. Stoffels M., R. Amann, W. Ludwig, D. Hekmat and K.H. Stackebrandt E., W. Liesack and B.M. Goebel. 1993. Schleifer. 1998. Bacterial community dynamics during start- Bacterial diversity in a soil sample from a subtropical up of a trickle-bed bioreactor degrading aromatic compounds. Australian environment as determined by 16S rDNA analysis. Appl. Environ. Microbiol. 64:930-939. FASEB. J. 7:232-236. Straub T.M., I.L. Pepper and C.P. Gerba. 1995. Comparison Stahl D.A. and R. Amman. 1991. Development and of PCR and cell culture for detection of enteroviruses in application of nucleic acid probes, p. 205-248. In E. sludge-amended field soils and determination of their Stackebrandt and E. Goodfellow (ed.), Nucleic acid techniques transport. Appl. Envir. Microbiol. 61:2066-2068. in bacterial systematics, John Wiley and Sons, Chichester, England. Straub T.M., I.L. Pepper, M. Abbaszadegan and C.P. Gerba. 1994 A method to detect enteroviruses in sewage Stahl D.A., B. Flesher, H.R. Mansfield and L. sludge-amended soil using the PCR. Appl. Envir. Microbiol. Montgomery. 1988. Use of phylogenetically based 60:1014-1017. hybridization probes for studies of ruminal microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol. 54:1079-1084. Straube W.L., J.W. Deming, C.C. Somerville, R.R. Colwell and J.A. Baross. 1990. Particulate DNA in smoker fluids: Stahl D.A., D.J. Lane, G.J. Olsen and N.R. Pace. 1984. evidence for existence of microbial populations in hot Analysis of hydrothermal vent-associated symbionts by hydrothermal systems. Appl. Environ. Microbiol. 56:1440- ribosomal RNA sequences. Science 224:409-411. 1447. Stahl D.A., D.J. Lane, G.J. Olsen and N.R. Pace. 1985. Stroes-Gascoyne S., K. Pedersen, S.A. Haveman, K. Characterization of a Yellowstone hot spring microbial Dekeyser, J. Arlinger, S. Daumas, S. Ekendahl, L. community by 5S ribosomal RNA sequences. Appl. Environ. Hallbeck, C.J. Hamon, N. Jahromi and T.L. Delaney. 1997. Microbiol. 49:1379-1384. Occurrence and identification of microorganisms in compacted clay-based buffer material designed for use in a Staley J.T. and A. Konopka. 1985. Measurement of in situ nuclear fuel waste disposal vault. Can. J. Microbiol. 43:1133- activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and 1146. terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39:321-346. Studholme D.J., R.A. Jackson and D.J. Leak. 1999. Stärk K.D.C., J. Nicolet and J. Frey. 1998. Detection of Phylogenetic analysis of transformable strains of thermophilic Mycoplasma hyopneumoniae by air sampling with a nested Bacillus species. FEMS Microbiol. Lett. 172:85-90. PCR assay. Appl. Envir. Microbiol. 64:543-548. Suau A., R. Bonnet, M. Sutren, J.J. Godon, G.R. Gibson, Steffan R.J. and R.M. Atlas. 1991. Polymerase chain M.D. Collins and J. Doré. 1999. Direct analysis of genes reaction: applications in environmental microbiology. Annu. encoding 16s rRNA from complex communities reveals many Rev. Microbiol. 45:137-161. novel molecular species within the human gut. Appl. Envir. Microbiol. 65: 4799-4807.

233 Références bibliographiques

Summit M. and J.A. Baross. 1999. Thermophilic Telang A.J., G. Voordouw, S. Ebert, N. Sifeldeen, J.M. subseafloor microorganisms from 1996 North Gorda Ridge Foght, P.M. Fedorak and D.W. Westlake. 1994. eruption. Deep-Sea Res. II 45:2751-2766. Characterization of the diversity of sulfate-reducing bacteria in soil and mining waste water environments by nucleic acid Summons R. 1999. Molecular probing of deep secrets. hybridization techniques. Can. J. Microbiol. 40:955-964. Nature. 398:752-753. Teske A., C. Wawer, G. Muyzer and N.B. Ramsing. 1996a. Suzuki M., M.S. Rappe and S.J. Giovannoni. 1998. Kinetic Distribution of sulfate-reducing bacteria in a stratified fjord bias in estimates of coastal picoplankton community structure (Mariager Fjord, Denmark) as evaluated by most-probable- obtained by measurements of small-subunit rRNA gene PCR number counts and denaturing gradient gel electrophoresis of amplicon length heterogeneity. Appl. Environ. Microbiol. PCR-amplified ribosomal DNA fragments. Appl. Envir. 64:4522-4529. Microbiol. 62:1405-1415. Suzuki M.T. and S.J. Giovannoni. 1996. Bias caused by Teske A., M.L. Sogin, L.P. Nielsen and H.W. Jannasch. template annealing in the amplification of mixtures of 16S 1999. Phylogenetic relationships of a large marine Beggiatoa. rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62:625-630. Syst. Appl. Microbiol. 22:39-44. Suzuki M.T., M.S. Rappe, Z.W. Haimberger, H. Winfield, Teske A., N.B. Ramsing, J. Kuver and H. Fossing. 1995. N. Adair, J. Strobel and S.J. Giovannoni. 1997. Bacterial Phylogeny of Thioploca and related filamentous sulfide- diversity among small-subunit rRNA gene clones and cellular oxidizing bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 18:517-526. isolates from the same seawater sample. Appl. Environ. Microbiol. 63:983-989. Teske A., P. Sigalevich, Y. Cohen and G. Muyzer. 1996b. Molecular identification of bacteria from a coculture by Svetlitshnyi V., F. Rainey and J. Wiegel. 1996. denaturing gradient gel electrophoresis of 16S ribosomal DNA Thermosyntropha lipolytica gen. nov., sp. nov., a lipolytic, fragments as a tool for isolation in pure cultures. Appl. Envir. anaerobic, alkalitolerant, thermophilic bacterium utilizing Microbiol. 62:4210-4215. short- and long-chain fatty acids in syntrophic coculture with a methanogenic archaeum. Int. J. Syst. Bacteriol. 46:1131-1137. Thauer R.K. 1998. Biochemistry of methanogenesis : a tribute to Marjory Stephenson. Microbiology 144:2377-2406. Swannell R.P., K. Lee and M. McDonagh. 1996. Field evaluations of marine oil spill bioremediation. Microbiol. Rev. The Integration of Microbial Databases Report of a 60: 342-365. Workshop held at Michigan State University, August 11-12, 1995, Organized by the Center for Microbial Ecology, Szewzyk U., R. Szewzyk and T.A. Stenström. 1994. http://www.cme.msu.edu/index.html/PUBLICATIONS/IMD_W Thermophilic, anaerobic bacteria isolated from deep boirehole ORKSHOP/TofC.html. in granite in Sweden. Proc. Natl. Acd. Sci. USA 91:1810-1813. Thomas J.C., M. Desrosiers, Y. St Pierre, P. Lirette, J.G. Bisaillon, R. Beaudet and R. Villemur. 1997. Quantitative flow cytometric detection of specific microorganisms in soils T samples using rRNA targeted fluorescent probes and ethidium bromide. Cytometry 27:224-232. Tachibana Y., A. Kuramura, N. Shirasaka, Y. Suzuki, T. Thornhill R.H., J.G. Burgess and T. Matsunaga. 1995. Yamamoto, S. Fujiwara, M. Takagi and T. Imanaka. 1999. PCR for direct detection of indigenous uncultured magnetic Purification and characterization of an extremely thermostable cocci in sediment and phylogenetic analysis of amplified 16S cyclomaltodextrin glucanotransferase from a newly isolated ribosomal DNA. Appl. Envir. Microbiol. 61: 495-500. hyperthermophilic archaeon, a Thermococcus sp. Appl. Environ. Microbiol. 65:1991-1997. Tolker-Nielsen T., K. Holmstr¿m and S. Molin. 1997. Visualization of specific gene expression in individual Taddei F., I. Matic and M. Radman. 1996. Du nouveau sur Salmonella typhimurium cells by in situ PCR. Appl. Envir. l'origine des espèces. La recherche. 291:52-59. Microbiol. 63:4196-4203. Tajima K., R.I. Aminov, T. Nagamine, K. Ogata, M. Toniuc M., F. Popea and I. Gomoiu. 1998. Studies on the Nakamura, H. Matsui and Y. Benno. 1999. Rumen bacterial Bacteria from thermal habitats in Romania. Thermophiles'98 diversity as determined by sequence analysis of 16S rDNA International conference, 6-11 September, Brest, FRANCE. libraries. FEMS Microbiol. Ecol. 29:159-169. Tonolla M., A. Demarta, D. Hahn and R. Peduzzi. 1998. Takai K. and K. Horikosi. 1999. Genetic diversity of archaea Microscopic and molecular in situ characterization of bacterial in deep-sea hydrothermal vent environments. Genetics. populations in the meromictic lake Cadagno pp. 31-44. In: 152:1285-1297. Lake Cadagno: a meromictic Alpine lake, Peduzzi, R., R. Takai K. and Y. Sako. 1999. A molecular view of archaeal Bachofen,and M. Tonolla (Eds), Documenta Ist. ital. Idrobiol. diversity in marine and terrestrial hot water environments 63. FEMS Microbiol. Ecol. 28:177-188. Tonolla M., A. Demarta, R. Peduzzi and D. Hahn. 1999. In Tang K., D.J. Fu, D. Julien. A. Braun, C.R. Cantor and H. situ analysis of phototrophic sulfur bacteria in the chemocline Köster. 1999. Chip-based genotyping by mass spectrometry. of meromictic lake cadagno. Appl. Environ. Microbiol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:10016-10020. 65:1325-1330. Tani K., K. Kurokawa and Nasu M. 1998. Development of a Torsvik T. 1997. Bacteria/rock interaction in exploring the direct in situ PCR method for detection of specific bacteria in deep sub-seafloor biosphere Workshop. Bristol 2-4 July 1997. natural environments. Appl. Envir. Microbiol. 64:1536-1540. Torsvik V., F.L. Daae, R.A. Sandaa and L. Øvreås. 1998. Tanner M., B.M. Goebel, M.A. Dojka and N.R. Pace. 1998. Novel techniques for analysing microbial diversity in natural Specific ribosomal sequences from diverse environmental and perturbed environments. J. Biotech. 64:53-62. settings correlate with experimental contaminants. Appl. Torsvik V., J. Goks¿yr and F.L. Daae. 1990a. High Diversity Environ. Microbiol. 64:3110-3113. in DNA of Soil Bacteria. Appl. Envir. Microbiol. 56:782-787. Tanner M., D. Shoskes, A. Shahed and N.R. Pace. 1999. Torsvik V., K. Salte, R. S¿rheim and J. Goks¿yr. 1990b. Prevalence of corynebacterial 16S rRNA sequences in Comparison of phenotypic diversity and DNA heterogeneity in patients with bacterial and "nonbacterial" prostatitis. J. Clin. a population of soil bacteria. Appl. Envir. Microbiol. 56:776- Microbiol. 37:1863-1870. 781. Tatusova T.A. and T.L. Madden. 1999. BLAST 2 Trebesius K., R. Amann, W. Ludwig, K. Mühlegger and Sequences, a new tool for comparing protein and nucleotide K.H. Schleifer. 1994. Identification of whole fixed bacterial sequences. FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250. cells with nonradioactive 23S rRNA-targeted polynucleotide Taylor C.D. and C.O. Wirsen. 1997. Microbiology and ecolgy probes. Appl. Envir. Microbiol. 60:3228-3235. of filamentous sulfur formation. Science 277:1483-1485. Trimmer M., K.J. Purdy and D.B. Nedwell. 1997. Process Taylor C.D., C.O. Wirsen and F. Gaill. 1999. Rapid measurement and phylogenetic analysis of the sulfate microbial production of filamentous sulfur mats at reducing bacteria communities of two contrasting benthic sites hydrothermal vents. Appl. Environ. Microbiol. 65:2253-2255. in the upper estuary of the Great Ouse, Norfolk, UK. FEMS Microbiol. Ecol. 24:333-342.

234 Références bibliographiques

Tsai S.J. and M.C. Wiltbank. 1996. Quantification of mRNA Vargas M., K. Kashefi, E.L. Bunt-Harris and D.R. Lovley. using competitive RT-PCR with standard curve methodology. 1998. Microbiological evidence for Fe(III) reduction on early BioTechniques. 21:862-866. earth. Nature 395:65-67. Tsai Y.L. and B.H. Olson. 1992a. Detection of low numbers Vàsquez M. and R.T. Espejo. 1997. Chemolithotrophic of bacterial cells in soils and sediments by polymerase chain bacteria in copper ores leached at high sulfuric acid reaction. Appl. Envir. Microbiol. 58:754-757. concentration. Appl. Envir. Microbiol. 63:332-334. Tsai Y.L. and B.H. Olson. 1992b. Rapid method for Vàsquez M., E.R.B. Moore and R.T. Espejo. 1999. separation of bacterial DNA from humic substances in Detection by polymerase chain reaction-amplification and sediments for polymerase chain reaction. Appl. Envir. sequencing of an archaeon in a commercial-scale copper Microbiol. 58:2292-2295. bioleaching plant. FEMS Microbiol. Lett. 173:183-187. Tsai Y.L., C.J. Palmer and L.R. Sangermano. 1993. Vergin K.L., E. Urbach, J.L. Stein, E.F. DeLong, B.D. Detection of Escherichia coli in sewage and sludge by Lanoil and S.J. Giovannoni. 1998. Screening of a fosmid polymerase chain reaction. Appl. Envir. Microbiol. 59:353- library of marine environmental genomic DNA fragments 357. reveals four clones related to members of the order Planctomycetales. Appl. Environ. Microbiol. 64:3075-3078. Turner S., E.F. DeLong, S.J. Giovannoni, G.J. Olsen and N.R. Pace. 1989. Phylogenetic analysis of microorganisms Vetriani C., A.L. Reysenbach and J. Dore. 1998. Recovery and natural populations using ribosomal RNA sequences. In, and phylogenetic analysis of archaeal rRNA sequences from "Microbial Mats: Ecological Physiology of Benthic Microbial continental shelf sediments. FEMS Microbiol. Lett. 161:83-88. Communities," Y. Cohen and E. Rosenberg (eds.). Am. Soc. Vetriani C., H.W. Jannasch, B.J. MacGregor, D.A. Stahl Microbiol. pp. 390-401. and A.L. Reysenbach. 1999. Population structure and phylogenetic characterization of marine benthic Archaea in deep-sea sediments. Appl. Env. Microbiol. 65:4375-4384. U Vettori C., D. Paffetti, G. Pietramellara, G. Stotzky and E. Gallori. 1996. Amplification of bacterial DNA bound on clay Ueda K., T. Seki, T. Kudo, T. Yoshida and M. Kataoka. minerals by the random amplified polymorphic DNA (RAPD) 1999. Two distinct mechanisms cause heterogeneity of 16S technique. FEMS Microbiol. Ecol. 20:251-260. rRNA. J. Bacteriol. 181:78-82. Vieille C., D.S. Burdette and J.G. Zeikus. 1996. Ueda T., Y. Suga and T. Matsuguchi. 1995. Molecular Thermozymes. Biotechnol. Annu. Rev. 2:1-83. phylogenetic analysis of a soil microbial community in a Vincent P. 1993. Etude d'eubactéries productrices soybean field. Eur. J. Soil Sc. 46:415-421. d'exopolysaccharides, originaires d'un site hydrothermal Urbach E., K.L. Vergin and S.J. Giovannoni. 1999. profond (13¡N). Thèse de doctorat de l'Université de Bretagne Immunochemical detection and isolation of DNA from Occidentale, 368p. metabolically active Bacteria. Appl. Envir. Microbiol. 65:1207- von Wintzingerode F., B. Selent, W. Hegemann and U.B. 1213. Göbel. 1999. Phylogenetic analysis of an anaerobic, trichlorobenzene-transforming microbial consortium. Appl. Envir. Microbiol. 65:283-286. V Voordouw G., J.K. Voordouw, R.R. Karkhoff-Schweizer, P.M. Fedorak and D.W.S. Weslake. 1991. Reverse sample Vainio E.J., A. Moilanen, T.T. Koivula, D.H. Bamford and genome probing, a new technique for identification of bacteria J. Hantula. 1997. Comparison of partial 16S rRNA gene in environmental samples by DNA hydridization, and its sequences obtained from activated sludge bacteria. Appl. application to the identification of sulfate-reducing bacteria in Microbiol. Biotech. 48:73-79. oil field samples. Appl. Environ. Microbiol. 57:3070-3078. Van de Peer Y., E. Robbrecht, S. de Hoog, A. Caers, P. De Voordouw G., J.K. Voordouw, T.R. Jack, J. Foght, P.M. Rijk and R. De Wachter. 1999. Database on the structure of Fedorak and D.W.S. Weslake. 1992. Identification of distinct small subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 27:179- communities of sulfate-reducing bacteria in oil fields by 183. reverse sample genome probing. Appl. Environ. Microbiol. 58:3542-3552. Van de Peer Y., J. Jansen, P. de Rijk and R. de Wachter. 1997. Database on the structure of small ribosomal subunit Voordouw G., S.M. Armstrong, M.F. Reimer, B. Fouts, RNA. Nucleic Acids Res. 25:111-116. A.J. Telang, Y. Shen and D. Gevertz. 1996. Characterization of 16S rRNA genes from oil field microbial communities Van de Peer Y., J.M. Neefs, P. deRijk, P de Vos and R. de indicates the presence of a variety of sulfate-reducing, Wachter. 1994. About the order of divergence of the major fermentative, and sulfide-oxidizing bacteria. Appl. Envir. bacterial taxa during evolution. System. Appol. Microbiol. Microbiol. 62:1623-1629. 17:32-38. Voytek M.A. and B.B. Ward. 1995. Detection of ammonium- Van der Maarel M.J., R.R. Artz, R. Haanstra and L.J. oxidizing bacteria of the beta-subclass of the class Forney. 1998. Association of marine archaea with the Proteobacteria in aquatic samples with the PCR. Appl. digestive tracts of two marine fish species. Appl. Environ. Environ. Microbiol. 61:1444-1450. Microbiol. 64:2894-2898. Van der Maarel M.J.E.C., W. Sprenger, R. Haanstra and L.J. Forney. 1999. Detection of methanogenic archaea in seawater particles and the digestive tract of a marine fish W species. FEMS Microbiol. Lett. 173:189-194. Wächtershäuser. 1988. Pyrite formation, the first energy Van Dover C.L. 1994. in Hydrothermal Vents and Processes, source for life: a hypothesis. System. Appl. Microbiol. 10:207- Special Publication 87, eds. Parson L.M., Walker, C.L. and 210. Dixon D.R. (Geol. Soc., London), 257-294. Wagner M., R. Amann, H. Lemmer and K.H. Schleifer. Van Elsas J.D., G.F. Duarte, A.S. Rosado and K. Smalla. 1993. Probing activated sludge with oligonucleotides specific 1998. Microbiological and molecular biological methods for for Proteobacteria: inadequacy of culture-dependent methods monitoring microbial inoculants and their effects in soil for describing microbial community structure. Appl. Envir. environment. J. Microbiol. Methods 32:133-154. Microbiol. 59:1520-1525. Vandamme P., B. Pot, M. Gillis, P. DeVos, K. Kersters and Wagner M., R. Erhart, W. Manz, R. Amann, H. Lemmer, J. Swings. 1996. Polyphasic Taxonomy, a consensus D. Wedi and K.H. Schleifer. 1994. Development of an rRNA- approach to bacterial systematics. Appl. Environ. Microbiol. targeted oligonucleotide probe specific for the genus 60:407-438. Acinetobacter and its application for in situ monitoring in VanWambeke F. 1995. Numération et taille des bactéries activated sludge. Appl. Envir. Microbiol. 60:792-800. planctoniques au moyen de l'analyse d'image couplée à Wagner-Döbler I., A. Bennasar, M. Vancanneyt, C. l'épifluorescence. Océanis 21:113-124. Strömpl, I. Brümmer, C. Eichner, I. Grammel and E.R.B.

235 Références bibliographiques

Moore. 1998. Microcosm enrichment of biphenyl-degrading Weller R. and D.M. Ward. 1989. Selective recovery of 16S microbial communities from soils and sediments. Appl. Envir. RNA sequences from natural microbial communities in the Microbiol. 64:3014-3022. form of cDNA. Appl. Envir. Microbiol. 55:1818-1822. Wahlfors J., J.H. Meurman, J. Toskala, A. Korhonen, P. Weller R., M.M. Bateson, B.K. Heimbuch, E.D. Alakuijala, E. Janatuinen, U.M. Karkkkainen, P. Nuutinen Kopczynski and D.M. Ward. 1992. Uncultivated and J. Janne. 1995. Development of a rapid PCR method for cyanobacteria, Chloroflexus-like inhabitants, and spirochete- identification of Helicobacter pylori in dental plaque and gastric like inhabitants of a hot spring microbial mat. Appl. Environ. biopsy specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 14:780- Microbiol. 58:3964-3969. 786. Wellsbury P., K. Goodman, T. Barth, B.A. Cragg, S.P. Walia S., A. Khan and N. Rosenthal. 1990. Construction Barnes and R.J. Parkes. 1997. Deep marine biosphere and application of DNA probes for detection of polychlorinated fuelled by increasing organic matter availability during burial biphenyl-degrading genotytpes in toxic organic-contaminated and heating. Nature 388:573-576. soil environments. Appl. Envir. Microbiol. 56:254-259. Wheeler W.C. and R.L. Honeycutt. 1988. Paired sequence Wallner G., B. Fuchs, S. Spring, W. Beisker and R. difference in ribosomal RNAs: evolutionary and phylogenetic Amann. 1997. Flow sorting of microorganisms for molecular implications. Mol. Biol. Evol. 5:90-96. analysis. Appl. Envir. Microbiol. 63:4223-4231. Whelen A.C. and D.H. Persing. 1996. The role of nucleic Wallner G., R. Erhart and R. Amann. 1995. Flow cytometric acid amplification and detection in the clinical microbiology analysis of activated sludge with rRNA-targeted probes. Appl. laboratory. Annu. Rev. Microbiol. 50:349-373. Envir. Microbiol. 61:1859-1866. White D., R.J. Sharp and F.G. Priest.1993. A polyphasic Wang G.C. and Y. Wang. 1996. The frequency of chimeric taxonomic study of thermophilic Bacilli from a wide molecules as a consequence of PCR co-amplification of 16S geographical area. Antonie Van Leeuwenhoek 64:357-86 rRNA genes from different bacterial species. Microbiology 142:1107-1114. White D.C., T.J. Phelps and T.C. Onstott. 1998. What's up down there? Curr. Opin. Microbiol. 1:286-290. Wang G.C.Y. and Y. Wang. 1997. Frequency of formation of chimeric molecules as a cosequence of PCR coamplification Whitman W.B., D.C. Coleman and W.J. Wiebe. 1998. of 16S rRNA genes from mixed bacterial genomes. Appl. Prokaryotes: the unseen majority. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Environ. Microbiol. 63:4645-4650. 95:6578-6583. Wang R.F., W.W. Cao and C.E. Cerniglia. 1996. PCR Widjojoatmodjo M.N., A.C. Fluit and J. Verhoef. 1995. detection and quantitation of predominant anaerobic bacteria in Molecular identification of bacteria by fluorescence-based human and animal fecal samples. Appl. Environ. Microbiol. PCR-single- strand conformation polymorphism analysis of 62:1242-1247. the 16S rRNA gene. J. Clin. Microbiol. 33:2601-2606. Ward D.M., C.M. Santegoeds, S.C. Nold, N.B. Ramsing, Widmer F., B.T. Shaffer, L.A. Porteous and R.J. Seidler. M.J. Ferris and M.M. Bateson. 1997. Biodiversity within hot 1999. Analysis of nifH gene pool complexity in soil and litter at spring microbial mat communities: molecular monitoring of a Douglas Fir forest site in the Oregon cascade mountain enrichment cultures. Antonie von Leeuwenhoek 71:143-150. range. Appl. Envir. Microbiol. 65:374-380. Ward D.M., M.J. Ferris, S.C. Nold and M.M. Bateson. Williams D.M. and T.M. Embley. 1996. Microbial diversity: 1998. A natural view of microbial biodiversity within hot spring domains and kingdoms. Annu. Rev. Syst. 27:569-595. cyanobacterial mat communities. Microbiol. Mol. Biol. Rev. Willis S.G., K.S. Smith, V.L. Dunn, L.A. Gapter, K.H. 62:1353-1370. Riviere and G.R. Riviere. 1999. Identification of seven Ward D.M., M.M. Bateson, R. Weller and A.L. Ruff- Treponema species in health- and disease-associated dental Roberts. 1992. Ribosomal RNA analysis of microorganisms plaque by nested PCR. J. Clin. Microbiol. 37:867-869. as they occur in nature. Adv. Microb. Ecol. 12:219-286. Wilson I.G. 1997. Inhibition and facilitation of nucleic acid Ward D.M., R. Weller and M. Bateson. 1990a. 16S rRNA amplification. Appl. Environ. Microbiol. 63:3741-3751. sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a Wilson K.H. and R.B. Blitchington. 1996. Human colonic natural community. Nature 345:63-65. biota studied by ribosomal DNA sequence analysis. Appl. Ward D.M., R. Weller and M. Bateson. 1990b. 16S rRNA Environ. Microbiol. 62:2273-2278. sequences reveal uncultured inhabitants of a well-studied Wilson MS., C. Bakermans and E.L. Madsen. 1999. In situ, thermal community. FEMS Microbiol. Rev. 6:105-115. real-time catabolic gene expression: extraction and Watanabe K., M. Teramoto, H. Futamata and S. characterization of naphthalene dioxygenase mRNA Harayama. 1998a. Molecular detection, isolation, and transcripts from groundwater. Appl. Envir. Microbiol. 65:80- physiological characterization of functionally dominant phenol- 87. degrading bacteria in activated sludge. Appl. Envir. Microbiol. Winn C.D., J.P. Cowen and D.M. Karl. 1995. Microbes in 64:4396-4402. deep-sea hydrothermal plumes. In: Karl DM (Ed) The Watanabe K., S. Yamamoto, S. Hino and S. Harayama. Microbiology of Deep-sea Hydrothermal Vents (pp 255-273). 1998b. Population dynamics of phenol-degrading bacteria in CRC Press Inc, Boca Raton. activated sludge determined by gyrB-targeted quantitative Winter J., C. Lerp, H.P. Zabel, F.X. Wildenauer, H. König PCR. Appl. Envir. Microbiol. 64:1203-1209. and F. Schindler. 1984. Methanobacterium wolfei, sp. nov., a Watson S.W., T.J. Novitsky, H.L. Quinby and F.W. Valois. new tungsten-requiring, thermophilic, autotrophic methanogen. 1977. Determination of bacterial number and biomass in the System. Appl. Microbiol. 5:457-466. marine environment. Appl. Envir. Microbiol. 33:940-946. Wintzingerode F.V., U.B. Gobel and E. Stackebrandt. Wayne L.L., D.J. Brenner, R.R. Colwell, P.A.D. Grimont, 1997. Determination of microbial diversity in environmental O. Kandler, K.I. Krichevsky, L.H. Moore, W.E.C. Moore, samples: pitfalls of PCR-based rRNA analysis. FEMS R.G.E. Muray, E. Stackebrandt, M.P. Starr and H.G. Microbiol. Rev. 21:213-229. Trüper. 1987. Report of the Ad Hoc committee on Wirsen C.O., H.W. Jannasch and S.J. Molyneaux. 1993. reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int. J. Chemosynthetic microbial activity at Mid-Atlantic Ridge Syst. Bacteriol. 37:463-464. hydrothermal vent site. J. Geophys. Res. 98:9693-9703. Weidner S., W. Arnold and A. Puhler. 1996. Diversity of Wirsen C.O., T. Brinkhoff, J. Kuever, G. Muyzer, S. uncultured microorganisms associated with the seagrass Molyneaux and H.W. Jannasch. 1998. Comparison of a new Halophila stipulacea estimated by restriction fragment length Thiomicrospira strain from the mid-atlantic ridge with known polymorphism analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes. hydrothermal vent isolates. Appl. Environ. Microbiol. 64:4057- Appl. Environ. Microbiol. 62:766-771. 4059. Weinbauer M.G., C. Beckmann and M.G. Höfle. 1998. Wirsen C.O. and H.W. Jannash. 1978. Physiological and Utility of green fluorescent nucleic acid dyes and aluminum morphological observation on Thiovulum sp. J. Bacteriol. oxide membrane filters for rapid epifluorescence enumeration 136:765-774. of soil and sediment Bacteria. Appl. Envir. Microbiol. 64:5000- 5003.

236 Références bibliographiques

Wise M.G., J.V. McArthur and L.J. Shimkets. 1997. Zeikus J.G., P.W. Hegge and M.A. Anderson. 1979. Bacterial diversity of a Carolina bay as determined by 16S Thermoanaerobium brockii gen. nov., sp. nov., a new rRNA gene analysis: confirmation of novel taxa. Appl. Environ. chemoorganothrophic caldoactive anaerobic bacterium. Arch. Microbiol. 63:1505-1514. Microbiol. 122:41-48. Wisotzkey J.D., P.Jr. Jurtshuk, G.E. Fox, G. Deinhard and Zengler,K., H.H. Richnow, R. Rossello-Mora, W. K. Poralla. 1992. Comparative sequences analyses on the Michaelis and F. Widdel. 1999. Methane formation from 16S rRNA (rDNA) of Bacillus acidocaldarius, Bacillus long-chain alkanes by anaerobic microorganismes. Nature acidoterrestris, and Bacillus cycloheptanicus and proposal for 401:266-269. creation of a new genus, Alicyclobacillus gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 42:263-269. Zheng D., E.W. Alm, D.A. Stahl and L. Raskin. 1996. Characterization of universal small-subunit rRNA Woese C.R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. hybridization probes for quantitative molecular microbial 51:221-271. ecology studies. Appl. Envir. Microbiol. 62:4504-4513. Woese C.R. 1994a. There must be a prokaryote somewhere: Zhou J., M.A. Bruns and J.M. Tiedje. 1996. DNA recovery microbiology's search for itself. Microbiol. Rev. 58:1-9 from soils of diverse composition Appl. Envir. Microbiol. 62:316-322. Woese C.R. 1994b. Microbiology in transition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:1601-1603. Zhou J., M.E. Davey, J.B. Figueras, E. Rivkina, D. Gilichinsky and J.M. Tiedje. 1997. Phylogenetic diversity of a Woese C.R. 1998a. The universal ancestor. Proc. Natl. Acad. bacterial community determined from Siberian tundra soil Sci. USA 95:6854-6859. DNA. Microbiology 143:3913-3919. Woese C.R. 1998b. Default taxonomy: Ernst Mayr's view of Zillig W., A. Gierl, G. Schreiber, S. Wunderl, D. Janekovic, the microbial world. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11043- K.O. Stetter and H.P. Klenk. 1983a. The archaebacterium 11046. Thermophilum pendens represents a novel genus of the Woese C.R. and G. Fox. 1977. Phylogenetic structure of the thermophilic, anaerobic sulfur respiring Thermoproteales. prokaryotic domain: The primary kingdoms. Proc. Natl. Acad System. Appl. Microbiol. 4:79-87. Sci. USA 74:5088-5090. Zillig W., I. Holz, D. Janekovic, H.P. Klenk, E. Imsel, J. Woese C.R., G.E. Fox, L. Zablen, T. Uchida, L. Bonen, K. Trent, S. Wunderl, V.H. Forjaz, R. Coutinho and T. Pechman, B.J. Lewis and D. Stahl. 1975. Conservation of Ferreira. 1990. Hyperthermus butylicus, a hyperthermophilic primary structure in 16S ribosomal RNA. Nature 254:83-86. sulfur-reducing archaebacterium that ferments peptides. J. Bacteriol. 172:3959-3965. Woese C.R., O. Kandler and M.L. Wheelis. 1990. Towards a natural system of organisms : proposal for the domains Zillig W., I. Holz, D. Janekovic, W. Schäfer and W.D. Archae, Bacteria, Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Reiter. 1983b The archaebacterium Thermococcus celer 87:4576-4579. represents a novel genus within the thermophilic branch of the archaebacteria. System. Appl. Microbiol. 4:88-94. Wu Y., R.P. Stulp, P. Elfferich, J. Osinga, C.H. Buys and R.M. Hofstra. 1999. Improved mutation detection in GC-rich Zillig W., K.O. Stetter, D. Prangishvilli, W. Schäfer, S. DNA fragments by combined DGGE and CDGE. Nucleic Wunderl, D. Janekovic, I. Holz and P.Palm. 1982. Acids Res. 27:e9. Desulfurococcaceae, the second family of the extremely thermophilic, anaerobic, sulfur-respiring Thermoproteales. Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. C 3:304-317. Zillig W., K.O. Stetter, W. Schäfer, D. Janekovic, S. Y Wunderl, J. Holz and P. Palm. 1981. Thermoproteales: a novel type of extremely thermoacidophilic anaerobic Yamamoto H., A. Hiraishi, K. Kato, H.X. Chiura, Y. Maki archaebacteria isolated from Icelandic solfataras. Zbl. Bakt. and A. Shimizu. 1998. Phylogenetic evidence for the Hyg., I. Abt. Orig. C 2:205-227. existence of novel thermophilic bacteria in hot spring sulfur- turf microbial mats in Japan. Appl. Envir. Microbiol. 64:1680- Zillig W., K.O., Stetter, S. Wunderl, W. Schulz, H. Priess 1687. and J. Scholz. 1980. The Sulfolobus-"Caldariella" group: taxonomy on the basis of the structure of DNA-dependent Yanagibayashi M., Y. Nogi, L. Li and C. Kato. 1999. RNA polymerases. Arch. Microbiol. 125:259-269. Changes in the microbial community in Japan Trench sediment from a depth of 6292 m during cultivation without Zimmermann R. and L.A. Meyer-Reil. 1974. A new method decompression. FEMS Microbiol. Lett. 170:271-279. for fluorescent staining of bacterial population on membrane filters. Kiel. Meeresforsh. 30:24-27. Yayanos A.A. 1995. Microbiology to 10,500 meters in the deep sea. Annu. Rev. Microbiol. 49:777-805. Zoetendal E.G., A.D. Akkermans and W.M. de Vos. 1998 Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S Yayanos A.A., A.S. Dietz and R. Van Boxtel. 1981. rRNA from human fecal samples reveals stable and host- Obligately barophilic bacterium from the Mariana trench. specific communities of active bacteria. Appl. Environ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5212-5215. Microbiol. 64:3854-3859. Yurkov V. and J.T. Beatty. 1998. Isolation of aerobic Zubkov M.V., B.M. Fuchs, H. Eilers, P.H. Burkill and R. anoxygenic photosynthetic bacteria from black smoker plume Amann. 1999. Determination of total protein content of waters of the Juan de Fuca ridge in the Pacific Ocean. Appl. bacterial cells by SYPRO staining and flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 64:337-341. Environ. Microbiol. 65:3251-3257. Zuckerland E. and L. Pauling. 1965. Evolutionary divergence and convergence in proteins, In Evolving Genes and Proteins, V. Bryson and H.J. Vogel (éd), academic Press, Z New York, pp 97-166. Zal F. 1999. "Riftia pachyptila" le vers géant des abysses. La Zuker M. and A.B. Jacobson. 1998. Using reliability Recherche 317:90-95. information to annotate RNA secondary structures. RNA 4:669-679. Zarilla K.A. and J.J. Perry. 1986. Thermoleophilum album, gen. nov. and sp. nov., a bacterium obligate for thermophily and n-alkane substrates. Arch. Microbiol. 137:286-290 . Zehnder A.J.B., B. Huser and T.D. Brock. 1979. Measuring radioactive methane with liquid scintillation counter. Appl. Envir. Microbiol. 37:897-899. Zeikus J.G., M.A. Dawson, T.E. Thompson, K. Ingvorsen and E.C. Hatchikian. 1983. Microbial ecology of volcanic sulfidogenesis: isolation and characterization of Thermodesulfotobacterium commune gen. nov. and spec. nov. J. Gen. Microbiol. 129:1159-1169.

237 Annexes G A U A G A G U700 C G G C G A U U A G G U A G A G U G C A U U A A 680 C G G C G U U 1100 U A G C U G G CA A A G 720 G CC C A A U G G C A A C G G A G 1120 G A C U U G C A U A G G C C C C U G G U U C U A U C C U U U A G U G U G G U G U G C C U G C A A U A G G G G U C G G C G C C G U C G G A G G A A A C G C G A U 1180 G A A G G C G A A 1080 U A A U C G C C G G C A G G C A C G G C G U C G A U 1140 G C 740 U U G G A G U G C 1160 G G C A A G C G G 1060 U A G A A G A A U A U U C G U G G C A G U C U 660 C G U G C 1200 A G A A C U C U A A A U A G C A U C G G C U G A U C U A A U 800 C G C C G U A G C 780 A A C G G A U A G 1020 G A U G G G U G U A C G 640 U C A A G A A U G A A C U A G G U G A C 1040 U C A A C G C A A G A G C G G C A C C U G G G U G C A U C U G A U U G C C G G U A A C U U U U G G U A 620 C G G G C G A A G G C G C G U G U A G A C U G A U U G U U U G C C G C CA G A U U C G G G C C C A G U C C A U C A A 760 U A 1000 C U A 600 G G G C U A A A 840 C U U A C C G A C G C G G C U A G C C CC G C UU A A G G G G A A CA U G U G C 1260 580 C G A GU G 980 G C G U C G C C A U UG U U A G C G C G A G G C C U AC G 1220 A A C U A G G G A C G A C G 820 C A C G A C A G G U A G A G G C G A A G U G C G C A C A U G A C U U C A A G G U C C AA U U A C G U 860 G A A A C G G C G C U G A A G C G C U U A C 480 U C A G U A A U U G C A G A U A C G880 U A A C A U U 520 A G C U G G 960 G C C C U G UG U U C C A G C A A A G A A C A G G U G C C U C G U U A U G A UC A U A G U G G C A A 460 UG C C U G C A U G C G A G A C A G U A C 1280 G G C G 560 U A C G G G A G U G G A U C G A U C G U C G U G C C C G 1240 G C A U A C U A A A C G C G G G C AU 540 A C U C A U U A U U A G C A G G G A 900 A U A C A A C A G A C U C G A A A A G G G G G C G A G U G C A C G 940 U 1300 G G G C G A 920 G A CG G A A U U C U G G A A A A G C A U C G AC G U A G U A A A U U G A C G G G C UA 1340 U A U U G C U UA A G G C G G G C C C G C A C A A G C G G A440A U A C G U C U C 20 U C G C C G G U U 500 G A U G G U A C A CA G A U U C C G G G C A G U C G G G C G C G U C C G G U A U G400 U G C U C U A G U C A U U G A 420 A G C G G U U A U G A A G C C A U A A U A U G U C 1380 A G U A G 1310 C G 40 G U C C C G A C C 1330 G A G A A A G U G C A A G C C U G U G C A G C U A A GG U U G A G G C 1400 C G C C 1370 G A U C C G G G U A C G U C A G AC U A C G C U A A C C G U A A U U C A 1360 380 A A G C G C G A U G U C G A U C A A C A G G G C U G A U A A 1320 360 G U C 60 A A A C A G U U 1 A A C C G A A G U C G A G G C A C G U A AC A U C G C G A G G 70 A 1500 C G G G C G A A G U A G C U A A C C U 80 U G C A G U A A 340 A C A G G A A G A C G C G C C G U C C A G A G U G A G A G G U C U U U C U U C U A G U A A C C G U A G G G G C A G G U C A G G G U G A A 1420 1480 A G U 320 A C U A G U U G G C G U C C A 300 G A C G G C G U A A 100 1520 A G G A C C A G C C G G G U A G U G U G U U A G U C G G A G C G G U A G U C U G A G A G G C U G C U U G U A C C 280 C A C G C G A A U C U G U 120 C A G240 U G A U U A G A A U A U C G U A C C U G C G C G A U A A U 1540 G G A C G C C A G C U A U C G U A U U A C G A CC A G G A A U A G A G U C G U A 1440 G C U U G C U G C G U A U G G G G G C 1460 G A C C G G C C G A A U 260 G U U G C G A U G U A A A 220 A U 140 C G C G C G G C G A U G G C C U C U U G G G G A UA A G 160 U C C G G G C U A C U G A C A U U C C G G G G A G AG C C A U A G A U G G C A A G A A C 200 A U U A A C C G C A 180 A U G C A G A C Structure secondaire de l’ARN r 16S d’E. coli. Methanospirillum hungatei str. JF1 (DSM 864)

Methanosarcina barkeri str. 227 (DSM 1538)

Haloferax volcanii str. DS-2 (ATCC 29605)

Thermoplasma acidophilum str. 122-1B2

Santa Barbara Channel bacterioplankton DNA clone SBAR16 Archaeoglobus fulgidus str. VC-16 (DSM 4304)

Methanothermus fervidus

Methanobacterium formicicum (DSM 1312)

Thermococcus celer str. VU 13 (DSM 2476)

Methanococcus vannielii str. EY33

Methanococcus jannaschii str. JAL-1 (DSM 2661)

Methanopyrus kandleri str. av19 (DSM 6324)

Mud Volcano area of Yellowstone NP ("Black Pool") hot spring DNA clone pJP27 Korarchaeota

Santa Barbara Channel bacterioplankton DNA clone SBAR12 Mud Volcano area of Yellowstone NP ("Black Pool") hot spring DNA clone pJP89 Thermofilum pendens str. Hvv3 (DSM 2475) Sulfolobus acidocaldarius str. 98-3 (ATCC 33909)

Thermoproteus tenax Aquificales Aquifex pyrophilus str. Kol5a

Fervidobacterium islandicum str. H-21 (DSM 5733) Thermotogales Thermotoga maritima str. MSB8 (DSM 3109)

Chloroflexus aurantiacus str. J-10-fl

Thermomicrobium roseum (ATCC 27502)

Meiothermus ruber str. Loginova 21 (ATCC 35948) Deinococcus - Thermus Group Deinococcus radiodurans (ATCC 35073) Acholeplasma laidlawii str. JA1

Clostridium ramosum str. 113-I (ATCC 25582)

Mycoplasma capricolum (ATCC 27343)

Streptococcus thermophilus (ATCC 19258)

Enterococcus faecalis

Lactobacillus casei subsp. casei (NCDO 161)

Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii str. Calvert (NCIMB 8130)

Listeria monocytogenes Bacillus cereus (IAM 12605) Bacillus stearothermophilus (NCDO 1768)

Bacillus subtilis str. 168

Eubacterium barkeri (NCIMB 10623)

Heliobacterium chlorum (ATCC 35205)

Clostridium quercicolum (ATCC 25974) Clostridium leptum (ATCC 29065)

Clostridium pasteurianum (ATCC 6013)

Clostridium butyricum str. E.VI.3.6.1 (NCIMB 8082)

Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum (ATCC 25586) Fusobacteria

Streptomyces ambofaciens

Corynebacterium xerosis (ATCC 373)

Bifidobacterium bifidum (DSM 20456) Arthrobacter globiformis (DSM 20124) Spirillum volutans (ATCC 19554)

Rubrivivax gelatinosus str. ATH 2.2.1 (ATCC 11169)

Rhodocyclus purpureus str. 6770 (DSM 168)

Neisseria gonorrhoeae str. B 5025 (NCTC 8375)

Stenotrophomonas maltophilia (NCIMB 9203)

Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa (NCPPB 965) Chromatium vinosum (ATCC 17899)

Ectothiorhodospira halochloris str. A (ATCC 35916)

Rhodospirillum rubrum str. ATH 1.1.1; S.1 (ATCC 11170)

Azospirillum brasilense str. Sp 7 (DSM 1690) {1461 bp}

Rickettsia prowazekii str. Breinl (ATCC VR-142)

Sphingomonas capsulata (JCM 7508)

Rhizobium leguminosarum (IAM 12609)

Rhodomicrobium vannielii str. EY33 (ATCC 51194)

Bradyrhizobium japonicum (LMG 6138) Myxococcus xanthus str. DK1622 Desulfobacter postgatei str. 2 ac 9 (DSM 2034)

Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774)

Bdellovibrio stolpii str. UKi2 (ICPB 3291)

Campylobacter jejuni subsp. jejuni str. TGH 9011 (ATCC 43431) Campylobacter jejuni subsp. jejuni str. TGH 9011 (ATCC 43431)

Helicobacter pylori (RPH 13487)

Wolinella succinogenes str. 602W (FDC) (ATCC 29543)

Treponema pallidum str. Nichols

Spirochaeta stenostrepta str. Z1 (ATCC 25083) Borrelia burgdorferi str. B 31 (ATCC 35210) Spirochaeta halophila str. RS1 (ATCC 29478)

Serpulina hyodysenteriae str. B204 (ATCC 31212)

Leptonema illini str. 3055

Leptospira interrogans str. Kennewicki, serovar pomona

Acidobacterium capsulatum str. 161 Fibrobacter Fibrobacter succinogenes str. S85 (ATCC 19169) group

Zea mays (maize) -- chloroplast Chloroplastes Olisthodiscus luteus (stramenopile) -- chloroplast

Synechococcus sp. (PCC 6301) Nostoc muscorum (PCC 7120) Gloeobacter violaceus (PCC 7421) Mount Coot-tha region (Brisbane, Australia) 5-10cm depth soil DNA clone MC 18 Planctomycetes- Chlamydia psittaci str. 6 BC (ATCC VR-125) Verrucomicrobia- Chlamydia group Pirellula staleyi (ATCC 27377)

Chlorobium limicola str. 8327 GS

Thermonema lapsum (ATCC 43532)

Flexibacter litoralis str. Lewin SIO-4 (ATCC 23117)

Cytophaga hutchinsonii str. D465 (P.H.A. Sneath) (ATCC 33406)

Cytophaga diffluens str. Lewin LIM-1 (ATCC 23140) Saprospira grandis (ATCC 23119) Flexibacter canadensis (ATCC 29591) 0,5 Cytophaga lytica str. LIM-21 (ATCC 23178) Empedobacter brevis (ATCC 14234)

Bacteroides fragilis (ATCC 25285) Prevotella ruminicola subsp. ruminicola (ATCC 19189) RESUME L'étude des communautés de micro-organismes des sources hydrothermales profondes et des réservoirs pétroliers a longtemps été limitée par l'utilisation exclusive de méthodes culturales ne permettant d'accéder qu'à une part restreinte de la diversité microbienne. Afin de dépasser cette restriction, nous avons utilisé les approches culturales en combinaison avec des approches moléculaires pour étudier les communautés microbiennes de deux réservoirs pétroliers du bassin parisien et des fluides hydrothermaux profonds collectés sur la dorsale médio- Atlantique. Ces approches ont consisté d'une part en une analyse phylogénétique des gènes codant pour l'ARNr 16S par amplification et hybridation in situ en s'affranchissant de toute étape de culture, d'autre part dans l'enrichissement de diférents types métaboliques à haute température, et enfin dans le positionnement phylogénétique de souches isolées d'environnements hydrothermaux. L'étude réalisée à partir d'échantillons d'eau de production de deux réservoirs pétroliers a conduit à la description de séquences d'Archaea méthanogènes, halophiles ou hyperthermophiles affiliées aux Methanosarcinales ou aux Thermococcales. Pour deux échantillons, les séquences de Bacteria étaient associées à des Thermotogales, des Proteobacteria delta et des Firmicutes à bas G+C% généralement impliqués dans des processus thermophiles et mésophiles de sulfato- ou thiosulfato-réduction. Des séquences associées au genre Arcobacter pouvant intervenir dans le cycle des composés soufrés au sein du réservoir ont été détectées dans un troisième échantillon. Enfin un dernier échantillon au sein duquel les séquences associées au genre Herbaspirillum, provenant probablement d'une contamination liée aux processus d'extraction secondaires des hydrocarbures, étaient dominantes. Des fluides hydrothermaux ont été échantillonnés à l'aide d'un collecteur original, le "Vent Cap". Des enrichissements de différents types métaboliques (soufre-réducteurs autotrophes et hétérotrophes, sulfato- et thiosulfato-réducteurs, et méthanogènes) à 65 et 80¡C ont été positifs dans la majorité de nos échantillons. L'amplification et le séquençage des ADNr 16S bactériens et archaéens a conduit à la détection d'une grande diversité de séquences. Les Proteobacteria epsilon dominent généralement les banques de séquences bactériennes et sont détectées avec les Desulfurobacteriales en forte proportion par hybridation in situ. Des séquences d'Archaea communément isolées en milieu hydrothermal profond, telles que les Thermococcales, les Methanococcales et les Archaeoglobales ont également été détectées. L'utilisation combinée de différentes méthodes moléculaires et de méthodes culturales nous a permis de dépasser les limitations inhérentes à chacune de ces méthodes et de proposer une image des relations s'établissant entre les différentes communautés de micro-organismes présents dans ces deux environnements.

ABSTRACT Studies of the microbial communities from deep sea hydrothermal vents and oil reservoir have been for a long time exclusively limited to the use of cultural techniques which described only a restricted part of the diversity. To circumvent this limitation we used cultural techniques in conjunction with molecular methods to investigate microbial communities of continental oil reservoirs in the East Paris Basin and of hydrothermal fluids collected on the Mid Atlantic Ridge. Our approach combined total 16S rDNA sequencing and in situ hybridization without any cultural step, enrichments of differents metabolic types at high temperature and phylogenic characterisation of strains isolated from hydrothermal environment. The study of oil reservoirs water production lead to the description of archaeal sequences affiliated with the methanogenic, halophilic or hyperthermophilic, Methanosarcinales and Thermococcales orders. Bacterial sequences are mostly affiliated, in two of our samples, to thermophilic or mesophilic sulfate- or thiosulfate-reducing bacteria belonging to the Thermotogales and δ-Proteobacteria phylum and to the Low G+C Gram-positive bacteria. Sequences affiliated to the genus Arcobacter, probably involved in the sulphur cycle inside/or in the vicinity of the oil reservoir, were also detected in another sample. Finally a last sample was dominated by sequences related to the aerobic genus Herbaspirillum, that may come from contaminations occuring during the secondary oil recovery process. Deep hydrothermal fluids were sampled by a special collector, the Vent Cap. Enrichments of heterotrophic and autotrophic sulphur-reducers, sulphate and thiosulfate reducers and methanogenes at 65 and 80¡C were positive in most of our samples. Archaeal and bacterial 16S rDNA analyses revealed a wide sequences diversity. ε-Proteobacteria dominated the bacterial clones libraries and have been detected in high proportions by in situ hibridization with Desulfurobacteriales. Archaeal sequences associated to genera commonly isolated in the deep hydrothermal environment, as Thermococcales, Methanococcales and Archaeoglobales were also detected. Combined use of molecular and cultural methods allows us to overcome the limitations inherent to each techniques and yield to the description of the relations between the different microbial communities in their environments.