ΠΡΩΤΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΤΗΣ ΦΥΛΟΓΕΩΓΡΑΦΙΑΣ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ CYRTOCARENUM CUNICULARIUM (Olivier, 1811) (Ctenizidae, Aranae) ΣΤΗΝ ΚΡΗΤΗ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΤΗΣ ΕΛΛΑΔΑΣ

Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης ή ή ί  ή

 

ΚΑΛΑΪ ΤΣΙΔΗΣ ΒΛΑΔΙΜΗΡΟΣ

έ: . ί ί - ά Επίκουρος Καθηγήτρια

ύ 2015

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Οι αράχνες του γένους Cyrtocarenum (Ausserer, 1871) περιλαμβάνουν δύο είδη, το Cyrtocarenum cunicularium (Olivier, 1811) και το Cyrtocarenum grajum (C. L. Koch, 1836). Και τα δύο είδη εμφανίζονται στη Ελλάδα, άλλοτε συντοπικά και άλλοτε, κυρίως, ακολουθώντας ξεχωριστή κατανομή, όπως για παράδειγμα στην Κρήτη όπου εκδηλώνεται μόνο η παρουσία του C. cunicularium που αποτελεί και το αντικείμενο της παρούσας μελέτης. Ελάχιστες ταξινομικές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί με σκοπό την διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των ειδών C. cunicularium με πρώτη περιγραφή της κατανομής τους στον ελλαδικό χώρο από τον A. E. Decae το 1996 βάσει μορφολογικών χαρακτηριστικών. Στην παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε φυλογεωγραφική προσέγγιση του είδους C. cunicularium με χρήση μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) που παρουσιάζει πλειάδα πλεονεκτημάτων ως μοριακός δείκτης σε φυλογενετικές μελέτες. Για τον σκοπό αυτό, αφού πραγματοποιήθηκε εξαγωγή ολικού DNA από δείγματα που προήλθαν κυρίως από περιοχές της Κρήτης, στη συνέχεια πολλαπλασιάστηκε, με τη μέθοδο της PCR, ο μιτοχονδριακός γενετικός τόπος COI που κωδικοποιεί για την υπομονάδα 1 κυτοχρωμικής οξειδάσης C και ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει της φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των δειγμάτων. Από τα αποτελέσματα της φυλογένεσης προκύπτει πως η κατανομή της εξάπλωσης των πληθυσμών C. cunicularium ακολουθεί κάποιο γεωγραφικό πρότυπο που διαφοροποιείται μεταξύ Δυτικής και Ανατολικής Κρήτης (συμπεριλαμβανομένης της Νάξου να εμφανίζεται συγγενική με την Δυτική Κρήτη), καθώς επίσης, και μεταξύ των νησιών του Ιονίου, της ηπειρωτικής Ελλάδας και Ανατολικών νησιών του Αιγαίου. Η εξάπλωση αυτή συνδέεται άμεσα με την παλαιογεωγραφία του ελλαδικού χώρου και καθορίστηκε από βικαριανιστικά γεγονότα που συνέβησαν, πιθανότατα, κατά το μέσο Μειόκαινο (12 Mya).

Λέξεις κλειδιά: αράχνες, Cyryocarenum cunicularium, φυλογεωγραφία, φυλογένεση, παλαιογεωγραφία, βικαριανισμός, mtDNA.

ABSTRACT

Spiders of genus Cyrtocarenum (Ausserer, 1871) consist of 2 species, Cyrtocarenum cunicularium (Olivier, 1811) & Cyrtocarenum grajum (C.L. Koch, 1836). Both species exist in Greece, either at the same location or with distinct distribution patterns, as is the case of Crete where only C. cunicularium is located. In the past, few taxonomy studies have been conducted aiming to elucidate the phylogenetic relationship between the species of C. cunicularium; the 1st record of their distribution in Greece was carried out by A.E. Decae in 1996 based on their morphological features. In this diploma thesis, phylogeographical study of the genus C. cunicularium was carried out using mitochondrial DNA (mtDNA), which offers many advantages when used as a molecular marker in phylogenetic studies.. To this end, total DNA was extracted from samples obtained manely from the area of Crete. Thereafter, the mitochondrial genetic locus COI, which encodes for cytochrome C oxidase subunit I, was used to determine the phylogenetic relationships between the various samples, via PCR amplification. The results of the phylogenetic analysis suggest that the distribution of populations of C. cunicularium is characterized by a geographic pattern that differs between Western and Eastern Crete (including Naxos), as well as between Ionian islands, continental Greece and eastern islands from Aegean. This distribution is likely related with the paleogeography of the Greek area which was defined by vicarianistic events that took place, most likely, during Miocene (12 Mya).

Keywords: spiders, Cyryocarenum cunicularium, phylogeography, phylogeny, paleogeography, vicarianism, mtDNA.

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ…………………………………………………………………………………………….6-4 1.1. Βιογεωγραφία………………………………………………………………….6-7 1.2. Φυλογεωγραφία………………………………………………………………8-11 1.3. Πληθυσμιακή Γενετική…………………………………………………….11-21 1.3.1. Γενετική Ποικιλομορφία………………………………………..11-17 1.3.1.1. Φυσική Επιλογή………………………………………..12-15 1.3.1.2. Γονιδιακή Ροή…………………………………………..15-16 1.3.1.3. Γενετική Παρέκκλιση………………………………..16-17 1.3.2. Ειδογένεση…………………………………………………………….17-21 1.4. Μοριακή Φυλογένεση και Εξέλιξη…………………………………21-27 1.4.1. Μοριακό Ρολόι………………………………………………………25 1.4.2. Μιτοχονδριακό DNA……………………………………………..25-27 1.5. Παλαιογεωγραφία του Ελλαδικού Χώρου………………………28-32 1.6. Οργανισμός της Φυλογενετικής Μελέτης……………………..33-41 1.6.1. Παλαιότερη Συστηματική Προσέγγιση του ΓένουςCyrtocarenum………………………………………………33-35 1.6.2. Αράχνες της Οικογένειας Ctenizidae………………………35-37 1.6.3. Κατανομή Cyrtocarenum στον Ελλαδικό Χώρο……….38-39 1.6.4. Χαρακτηριστικά της αράχνης C. cunicularium…………39-41 1.7. Σκοπός της Διπλωματικής Εργασίας………………………………42 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ…………………………………………………………………43-69

2.1. Συλλογή Δειγμάτων………………………………………………………..43 2.2. Εργαστηριακές Τεχνικές…………………………………………………44-54 2.2.1. Εξαγωγή Ολικού DNA……………………………………………..44-46 2.2.2. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)……………46-52 2.2.2.1. Τα Συστατικά της PCR………………………………..47-49 2.2.2.2. Τα Στάδια της PCR……………………………………..49-51 2.2.2.3. Γενετικός Τόπος COI…………………………………..51-52 2.2.3. Ηλεκτροφόρηση σε Πήκτωμα Αγαρόζης………………….53-54 2.3. Φυλογενετικές Αναλύσεις………………………………………………54-69 2.3.1. Έλεγχος και Επεξεργασία Αλληλουχιών………………….58-59 2.3.2. Στοίχιση των Αλληλουχιών……………………………………..59-60 2.3.3. Έλεγχος για Ομοπλασία και Κορεσμό……………………..61 2.3.4. Επιλογή Μοντέλου Εξέλιξης……………………………………61-63 2.3.5. Μέθοδοι Φυλογενετικής Ανάλυσης……………………….63-68 2.3.5.1. Neighbor Joining (NJ)...... 65-66

2.3.5.2. Maximum Parsimony (MP)……………………….66 2.3.5.3. Bayesian Inference (BI)……………………………..67-68 2.3.6. Έλεγχος των Αποτελεσμάτων………………………………..68-69

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ……………………………………………………………….69-74 3.1. Φυλογενετικά Δέντρα……………………………………………………70-74

4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ – ΣΥΖΗΤΗΣΗ…………………………………………..74-77

5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ…………………………………………………………………..78-86

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.1. Βιογεωγραφία

Η βιογεωγραφία είναι η επιστήμη που επιχειρεί να τεκμηριώσει και να κατανοήσει τα χωρικά πρότυπα της βιοποικιλότητας. Είναι η μελέτη της κατανομής των οργανισμών, στο παρελθόν και στο παρόν, και των σχετικών προτύπων διαφοροποίησης στη Γη που αφορούν στον αριθμό και τα είδη των ζωντανών οργανισμών. Μερικά βασικά ενδεικτικά ερωτήματα των βιογεωγράφων είναι τα εξής: 1. Γιατί ένα είδος ή ανώτερη ταξινομική ομάδα (γένος, οικογένεια, ομοταξία, κ.ο.κ), περιορίζεται στην παρούσα του εξάπλωση; 2. Τι επιτρέπει σε ένα είδος να ζει εκεί που βρίσκεται, και τι το εμποδίζει να εποικίσει άλλες περιοχές; 3. Ποιος είναι ο ρόλος του κλίματος, της τοπογραφίας, και των αλληλεπιδράσεων με άλλους οργανισμούς, στον περιορισμό της κατανομής ενός είδους; 4. Πώς τα διαφορετικά είδη των οργανισμών αντικαθιστούν το ένα το άλλο καθώς ανεβαίνουμε σε ένα βουνό, ή μετακινούμαστε από μία βραχώδη ακτή σε μία κοντινή αμμώδη παραλία; 5. Πώς καταλήγει ένα είδος να περιορίζεται στη σημερινή του εξάπλωση; 6. Ποιοι είναι οι κοντινότεροι "συγγενείς" ενός είδους, και πού βρίσκονται; Πού ζούσαν οι πρόγονοί του; 7. Πώς ιστορικά γεγονότα, όπως η μετακίνηση των ηπείρων, οι παγετώνες του Πλειστοκαίνου, και οι πρόσφατες κλιματικές αλλαγές, έχουν διαμορφώσει την κατανομή των ειδών; 8. Γιατί τα ζώα και τα φυτά μεγάλων, απομονωμένων περιοχών, όπως η Αυστραλία, η Νέα Καληδονία και η Μαδαγασκάρη, είναι τόσο διακριτά; 9. Γιατί κάποιες ομάδες στενά συνδεδεμένων ειδών περιορίζονται στην ίδια περιοχή, ενώ άλλες βρίσκονται σε αντίθετα τμήματα της Γης;

10. Γιατί υπάρχουν πολύ περισσότερα είδη στις τροπικές ζώνες, παρά στην εύκρατη ζώνη και τους πόλους; Πώς εποικίζονται τα απομονωμένα ωκεάνια νησιά, και γιατί υπάρχουν, σχεδόν πάντα, λιγότερα είδη στα νησιά παρά στα ίδια είδη ενδιαιτημάτων στις ηπειρωτικές περιοχές; Τελικά όμως το θεμελιώδες ερώτημα στη βιογεωγραφία είναι: Πώς οι οργανισμοί κατανέμονται στην επιφάνεια και την ιστορία της Γης; Η βιογεωγραφία βασίζεται σημαντικά στη θεωρία και τα δεδομένα που προέρχονται από διάφορα επιστημονικά πεδία: Οικολογία, Πληθυσμιακή βιολογία, Συστηματική, Εξελικτική βιολογία, Επιστήμες της Γης (γεωγραφία, γεωλογία, κλιματολογία) και προσπαθεί, όπως και οι άλλες φυσικές επιστήμες, να προσδιορίσει πρότυπα (μη τυχαίες, επαναλαμβανόμενες συγκροτήσεις) και να ανακαλύψει διεργασίες (τους αιτιακούς μηχανισμούς παραγωγής των προτύπων). Δηλαδή, αναζητεί πρότυπα, σχηματίζει θεωρίες και κατόπιν ελέγχει υποθέσεις και προβλέψεις τόσο ανεξάρτητα όσο και σε συνδυασμό με τις νέες παρατηρήσεις. H βασική παραδοχή που κάνουν οι βιογεωγράφοι (και η οποία δεν μπορεί να ελεγχθεί) είναι ότι οι βασικές φυσικές και βιολογικές διεργασίες που δρουν σήμερα στη Γη έχουν παραμείνει ίδιες στο χρόνο καθώς είναι εκδηλώσεις παγκοσμίων επιστημονικών νόμων. Διαφέρει από τις περισσότερες βιολογικές αρχές, και από τις άλλες επιστήμες, καθώς είναι: περισσότερο επιστήμη σύγκρισης και παρατήρησης παρά πειραματική επιστήμη, καθώς ασχολείται με κλίμακες χώρου και χρόνου στις οποίες ο πειραματικός χειρισμός είναι αδύνατος ή δύσκολος Η σύγχρονη βιογεωγραφία βασίζεται στη μελέτη και ανάλυση: (1) των προτύπων που προκύπτουν από: (α) συγκρίσεις των γεωγραφικών εξαπλώσεων, της γενετικής, και άλλων χαρακτηριστικών διαφορετικών τύπων οργανισμών, ή των ίδιων τύπων οργανισμών που ζουν σε διαφορετικές περιοχές, (β) παρατηρήσεις των διαφορών που αφορούν στην ποικιλότητα των ειδών και τη σύνθεση των βιοκοινοτήτων, (2) των διαταραχών που προκαλούνται φυσικά ή από τον άνθρωπο, (3) των δεδομένων που έχουν συλλεχθεί από πολλούς επιστήμονες και έχουν εργαστεί σε μεγάλες περιοχές για μακρύ χρονικό διάστημα, (4) των δεδομένων που προέρχονται από διαφορετικά επιστημονικά πεδία.

1.2. Φυλογεωγραφία

Η φυλογεωγραφία είναι η επιστήμη που ασχολείται με τις αρχές και τις διαδικασίες που καθορίζουν τα γεωγραφικά πρότυπα των γενεαλογικών γραμμών, ειδικά εκείνων εντός του είδους, αλλά ακόμα και μεταξύ στενά συγγενικών εξελικτικά ειδών (Avise 2000). Θέτει υπό την εποπτεία της διάφορα εναλλακτικά σενάρια για την ερμηνεία των χωρικών διευθετήσεων των οργανισμών και των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους. Η διασπόρα και ο βικαριανισμός είναι δύο συχνά ανταγωνιστικοί παράγοντες που καθορίζουν, ο καθένας με το δικό του τρόπο την προέλευση του χωρικού διαχωρισμού των ταξινομικών μονάδων. Η πρώτη περίπτωση εξηγεί πώς μια ταξινομική μονάδα αποκτά τη σημερινή της κατανομή μέσω ενεργητικής ή παθητικής διασποράς από ένα ή περισσότερα προγονικά κέντρα προέλευσης, ενώ η δεύτερη αφορά στον κατακερματισμό από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως φαινόμενα ορογένεσης, σπασίματα ηπειρωτικών μαζών, ευστατικά φαινόμενα κ.α.

Οι φυλογεωγράφοι προσπαθούν να ερμηνεύσουν τον τρόπο και το βαθμό στον οποίο οι διάφορες ιστορικές διαδικασίες που σχετίζονται με τη δημογραφία των πληθυσμών, έχουν αφήσει τα εξελικτικά τους αποτυπώματα στη σύγχρονη γεωγραφική κατανομή των γονιδιακών γραμμών των οργανισμών. Στη πιο απλή της μορφή, η φυλογεωγραφία ασχολείται με τη χωρική κατανομή των απλοτύπων, των οποίων οι φυλογενετικές σχέσεις είναι γνωστές ή μπορούν να εκτιμηθούν. Ως

κλάδος της βιογεωγραφίας προσπαθεί να τοποθετήσει σε ευρύτερο χρονικό πλαίσιο τις παραδοσιακές οικογεωγραφικές απόψεις και αντιλήψεις, οι οποίες έδιναν έμφαση στο ρόλο των σύγχρονων οικολογικών πιέσεων στο σχηματισμό των χωρικών κατανομών των οργανισμών ( Avise 2000 ). Τα είδη αποτελούνται από γεωγραφικά δομημένους πλυθησμούς, μερικοί από τους οποίους μπορεί να έχουν μικρή ή καθόλου γενετική επαφή για μεγάλο χρονικό διάστημα. Άλλα είδη πάλι χαρακτιρίζονται από σχετικά πρόσφατη επέκταση της κατανομής τους, με αποτέλεσμα οι πλυθησμοί τους να συνδέονται πολύ στενά μεταξύ τους. Οι κατηγορίες των φυλογενετικών σχέσεων που παρατηρούνται σε ζευγάρια αδελφών, όταν εξετάζονται σε διαφορετικές χρονικές στιγμές από την στιγμή που διαχωρίστηκαν από τον αρχικό πλυθησμό είναι τρείς. (Εικόνα 1-1) (Avise et al.,1983):

1. Αμοιβαία μονοφυλετικότητα που όλοι οι απλότυποι μέσα σε κάθε θυγατρικό πληθυσμό είναι πιο συγγενικοί μεταξύ τους παρά με τους απλότυπους του συγκρινόμενου πληθυσμού. 2. Παραφυλετικότητα, όταν ενώ όλοι οι απλότυποι του ενός πληθυσμού είναι πιο συγγενικοί μεταξύ τους, ορισμένοι απλότυποι του δεύτερου πληθυσμού είναι συγγενικότεροι με κάποιους απλότυπους του πρώτου πληθυσμού, παρά με τους υπόλοιπους απλότυπους του δεύτερου πληθυσμού και 3. Πολυφυλετικότητα όταν οι απλότυποι ενός πληθυσμού είναι πιο συγγενικοί από κάποιος άλλους πληθυσμούς παρά μεταξύ τους.

κγψξψξξξξξηηξηηηηηηηηηηηηηηηηηηηξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξ ξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξ ξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξ ξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξξ ξξξξξξξξξξξξξξξ

ό 1-1: ί ώ έ: (a) µό, (b) ό  (c) ό. Το ιδεατό σε όλες τις φυλογεωγραφικές και φυλογενετικές μελέτες είναι οι γενεαλογικές γραμμές των πληθυσμών και των ειδών να ακολουθούν τον κανόνα

της μονοφυλετικότητας. Το πρόβλημα είναι η σύνδεση των ειδών σε μονοφυλετικές ομάδες χωρίς παραπλάνηση από τις ομοπλασίες και τους διαφορετικούς εξελικτικούς ρυθμούς. Σύμφωνα με τον Henning, το κλειδί για να αναγνωριστεί μια μονοφυλετική ομάδα είναι η παρουσία σε όλα τα μέλη της, μοναδικών παραγώγων, καταστάσεων, χαρακτήρων, δηλαδή συναπομορφιών, που έχουν σχηματιστεί μια και μόνο φορά (Futuyma,1991). Μέχρι σχετικά πρόσφατα, η αναπαράσταση των φυλογενετικών σχέσεων των οργανισμών προσεγγίζονταν αποκλειστικά με βάση τις μορφολογικές τους ομοιότητες και την βοήθεια του αρχείου των απολιθωμάτων. Τα δεδομένα αυτά δεν ήταν πάντοτε επαρκή ώστε να προσδιοριστούν με ακρίβεια οι φυλογενετικές σχέσεις των οργανισμών, αφού οι μορφολογικοί χαρακτήρες δεν αντικατοπτρίζουν πάντοτε πιστά την φυλογενετική συγγένεια, καθώς επηρεάζονται σε μεγάλο βαθμό από τις περιβαλλοντικές παραμέτρους. Ο Avise (1989) πρότεινε ως εργαλείο για την διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων που διέπουν τα τάξα, τη δημιουργία δέντρων γονιδίων, δηλαδή τυφλογένεση ενός συγκεκριμένου (μιτοχονδριακού ή πυρινικού) γονιδίου ή μιας μηκωδικής περιοχής. Σήμερα η χρήση των μοριακών δεδομένων στη φυλογένεση έχει γίνει ευρέως αποδεκτή, ενώ έχει καταφέρει να δώσει λύσεις για την εξελικτική ιστορία των μελετούμενων σε περιπτώσεις που οι μορφολογικοί χαρακτήρες αποτυγχάνουν (Michel-Salzat και Bouchon,2000). Η χρήση DNA στη φυλογένεση, αποκάλυψε μια ποικιλότητα που δεν ήταν ανιχνεύσιμη μέχρι πρότινος. Με την αύξηση των μοριακών δεδομένων αποδείχτηκε η ύπαρξη κρυπτικών ειδών, δηλαδή ειδών που ενώ ικανοποιούν το βιολογικό ορισμό του είδους, δεν διαχωρίζονται μορφολογικά και μπορεί ακόμα και να συναντώνται συμπάτρια. Η διαφορετική ιστορία τους όμως αντανακλάται στο γονιδίωμα τους και ενδεχομένως σε διαφορετικές προτιμήσεις θώκου (Hebertetal, 2004). Αξίζει όμως να σημειωθεί ότι υπάρχουν και περιπτώσεις ερευνών (Arnoldetal, 2007) που αποδεικνύουν ότι η χρήση του DNA για την εξερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων δεν αποτελούν πανάκεια, καθώς αποτυγχάνει εκεί που οι μορφολογικοί χαρακτήρες μπορούν να δώσουν λύση. Βλέποντας το από διαφορετική οπτική γωνία τα φυλογενετικά συμπεράσματα που επάγονται από ποικιλότητα σε αλληλουχίες DNA μπορεί να είναι λανθασμένα ακόμα και αν το δέντρο γονιδίων έχει επιλυθεί σωστά (Moore, 1995).

Για την αποφυγή όσο το δυνατόν περισσότερο, τέτοιων καταστάσεων, είναι απαραίτητη η καλή γνώση των ιδιοτήτων των μοριακών δεικτών για να χρησιμοποιούνται ορθά και να απαντούν στα κατάλληλα ερωτήματα.

1.3. Πληθυσμιακή Γενετική

Η πληθυσμιακή γενετική είναι ο κλάδος ο οποίος μελετά τη γενετική ποικιλομορφία που παρατηρείται τόσο στα άτομα ενός πληθυσμού όσο και μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών, δηλαδή την ποικιλότητα αλληλομόρφων και γενοτύπων και τις αντίστοιχες συχνότητές τους καθώς και τα αίτια-μηχανισμούς οι οποίοι μεταβάλλουν τη γενετική δομή των πληθυσμών. Η πληθυσμιακή γενετική είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την εξέλιξη και αποτελεί τη βάση για τη γενετική βελτίωση των ζωικών οργανισμών, τη διατήρηση των ειδών και της βιοποικιλότητας (Russell, 2009). Εφαρμόζοντας τις αρχές της κλασσικής γενετικής σε μεγάλες ομάδες ατόμων, η πληθυσμιακή γενετική μελετάει τα πρότυπα της γενετικής ποικιλομορφίας που εντοπίζονται μέσα σε κάθε ομάδα, δηλαδή τη γενετική δομή των πληθυσμών, τη γεωγραφική τους διαφοροποίηση και τη μεταβολή τους στο χρόνο.

1.3.1. Γενετική Ποικιλομορφία

Από τη στιγμή της σύλληψης της ιδέας της εξέλιξης, η μελέτη της έχει συνδεθεί στενά με τη μελέτη της κληρονομικότητας. Από τις σημαντικότερες αρχές της κληρονομικότητας είναι η αρχή της μονόδρομης ροής πληροφοριών από το γενότυπο στο φαινότυπο και η αρχή της διατήρησης της ταυτότητας των μονάδων της κληρονομικότητας από γενιά σε γενιά. Η κληρονομικότητα είναι μια συντηρητική δύναμη που παρέχει σταθερότητα στα βιολογικά συστήματα (Dobzhansky 1970). Οι μοριακοί μηχανισμοί, όμως, που υπόκεινται στην επίδραση του περιβάλλοντος δεν μπορούν να είναι τέλειοι. Λάθη που συμβαίνουν στη διαδικασία της αντιγραφής παράγουν τροποποιημένες αλληλουχίες DNA (μεταλλάξεις) οι οποίες είναι δυνατόν να μεταβιβαστούν στις επόμενες γενιές. Η πληθυσμιακή γενετική ποικιλομορφία έχει τη βάση της στη

διαφοροποίηση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Προϋπόθεση για την ύπαρξη γενετικής ποικιλομορφίας είναι οι νουκλεοτιδικές αλλαγές-μεταλλάξεις. Αυτές οι αλλαγές μπορούν να προκύψουν κατά τη διαδικασία της αντιγραφής του DNA και αν συμβούν στα κύτταρα της γαμετικής σειράς είναι δυνατόν να μεταβιβαστούν στις επόμενες γενιές. Τις τελευταίες δεκαετίες, η εξέλιξη των μοριακών τεχνικών και των μεθόδων αλληλούχησης συνετέλεσε στη ραγδαία αύξηση των δεδομένων της πληθυσμιακής ποικιλομορφίας στο επίπεδο της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Γενετική ποικιλότητα μπορεί επίσης να προκύψει και από το γενετικό ανασυνδυασμό. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς υπάρχουν δύο διεργασίες ανασυνδυασμού: Α) Ο διαχρωμοσωματικός ανασυνδυασμός, που γίνεται με βάση τον ελεύθερο συνδυασμό των χρωμοσωμάτων, κατά τον οποίο τα μειωτικά προϊόντα αντιστοιχούν στο 50% του συνόλου των απογόνων και Β) Ο ενδοχρωμοσωματικός ανασυνδυασμός (διασκελισμός), που συμβαίνει κατά τη μείωση ανάμεσα σε μη αδελφές χρωματίδες και οδηγεί σε διαφορετικό συνδυασμό αλληλομόρφων. Τα παραγόμενα μειωτικά προϊόντα αυτού του τύπου ανασυνδυασμού αντιστοιχούν σε ποσοστό μικρότερο από το 50% του συνόλου των απογόνων (Τριανταφυλλίδης, 2001). Η γενετική ποικιλομορφία, που παράγεται μέσα σε έναν πληθυσμό από τις μεταλλάξεις και τον ανασυνδυασμό, τροποποιείται (αυξομειώνεται, καθιερώνεται ή απαλείφεται) μέσα από εξωτερικούς μηχανισμούς διεργασιών όπως η φυσική επιλογή, η γονιδιακή ροή και η γενετική παρέκκλιση που περιγράφονται παρακάτω.

1.3.1.1. Φυσική Επιλογή

Η διαδικασία την οποία ο Κάρολος Δαρβίνος αποκάλεσε φυσική επιλογή αποτέλεσε επανάσταση στην ανθρώπινη σκέψη. Σύμφωνα με το Δαρβίνο, η εξέλιξη προχωρά κατά κύριο λόγο βάσει της δράσης της φυσικής επιλογής. Στην απλούστερή της μορφή, δηλώνει το γεγονός ότι αναπαραγόμενες μονάδες (αλληλόμορφα, γενότυποι, πληθυσμοί ή και είδη) που εμφανίζουν γενετικές διαφορές έχουν διαφορετικές πιθανότητες αντιπροσώπευσής τους στις επόμενες γενιές. Αν κάποια από τα χαρακτηριστικά τους έχουν μεγαλύτερη καταλληλότητα ως προς το περιβάλλον, βοηθούν δηλαδή την επιβίωση και την αναπαραγωγή, τότε τα χαρακτηριστικά αυτά θα έχουν αυξημένη αντιπροσώπευση στην επόμενη γενιά. Αν, μάλιστα, η συγκεκριμένη φυσική επιλογή συνεχιστεί για πολλές γενιές,

τα χαρακτηριστικά αυτά θα αποτελέσουν ιδιαίτερο γνώρισμα του είδους. Η δράση της φυσικής επιλογής υπολογίζεται με βάση την αρμοστικότητα (fitness). Σύμφωνα με μια προσέγγιση, γίνεται αντιληπτή ως σχετική αρμοστικότητα και εκφράζει το ρυθμό με τον οποίο ένας γενότυπος αυξάνει την παρουσία του στον πληθυσμό, σε σχέση με το ρυθμό των άλλων γενοτύπων, ενώ δεν έχει να κάνει με τις φυσικές ή άλλες ιδιότητες του γενοτύπου (όπως μορφολογία, φυσιολογία). Ευκαιρίες για δράση της φυσικής επιλογής υπάρχουν όπου υπάρχουν φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ ατόμων, οι οποίες μεταφράζονται σε διαφορές βιωσιμότητας και γονιμότητας. Για να δράσει όμως η επιλογή, οι φαινοτυπικές αυτές διαφορές πρέπει να έχουν γενετική βάση (Εικόνα 1-2).

Εικόνα 1-2: Σχηματική απόδοση της δράσης της φυσικής επιλογής σε έναν πληθυσμό, όπου τα άτομα που φέρουν το σκούρο χρώμα ευνοούνται. Ι) Μέσω μετάλλαξης δημιουργούνται νέα αλληλόμορφα. ΙΙ) Τα άτομα που φέρουν τις δυσμενείς μεταλλάξεις απομακρύνονται από τον πληθυσμό. ΙΙΙ) Ακολουθεί αναπαραγωγή των ατόμων, ενώ ταυτόχρονα έχουμε και νέες μεταλλάξεις. IV) Τα άτομα που φέρουν τις ευνοϊκές μεταλλάξεις έχουν μεγαλύτερες πιθανότητες να επιβιώσουν. V) Τα άτομα που επιβιώνουν συνεχίζουν να αναπαράγονται.

Διαφορές οι οποίες οφείλονται αποκλειστικά σε περιβαλλοντικές συνθήκες επίσης υπόκεινται στη φυσική επιλογή, αλλά η επιλογή αυτή δεν έχει αποτέλεσμα, αφού δεν αλλάζει την κατανομή των φαινοτύπων της επόμενης γενιάς. Η φυσική επιλογή μπορεί να έχει διάφορες μορφές, οι οποίες εξαρτώνται από τις περιβαλλοντικές πιέσεις και τις επιδράσεις τους στις γονιδιακές συχνότητες των πληθυσμών. Αναλυτικότερα, έχουμε τις ακόλουθες μορφές επιλογής:

 Σταθεροποιούσα επιλογή (balancing selection). Οι μέσοι φαινότυποι έχουν μεγαλύτερη αρμοστικότητα, ενώ μειώνεται η συχνότητα των ακραίων φαινοτύπων.  Κατευθύνουσα επιλογή (directional selection). Ένας εκ των ακραίων φαινοτύπων εμφανίζει μεγαλύτερη αρμοστικότητα.  Διασπαστική επιλογή (disruptive selection). Οι ακραίοι φαινότυποι ευνοούνται εις βάρος των μεσαίων φαινοτύπων, οπότε αυξάνεται η διασπορά των γενοτύπων του πληθυσμού.

Εκτός από τις τρεις παραπάνω μορφές επιλογής, υπάρχει μια ακόμη εξίσου σημαντική μορφή, η συχνοεξαρτώμενη επιλογή (frequency dependent selection). Η αρμοστικότητα ενός φαινοτύπου εξαρτάται από τη σχετική συχνότητά του μέσα στον πληθυσμό. Πιο συγκεκριμένα, στη θετική συχνοεξαρτώμενη επιλογή, η αρμοστικότητα ενός φαινοτύπου αυξάνει καθώς αυξάνει η συχνότητά του. Αυτό σημαίνει ότι τα νέα αλληλόμορφα δύσκολα μπορούν να εισβάλουν σε έναν πληθυσμό, γιατί για να ευδοκιμήσουν πρέπει να αυξήσουν τη συχνότητά τους. Στην αρνητική συχνοεξαρτώμενη επιλογή, η αρμοστικότητα ενός φαινοτύπου αυξάνει όσο αυτός εμφανίζεται σπανιότερα. Ένα παράδειγμα αποτελεί η αλληλεπίδραση με τον ανθρώπινο οργανισμό πολλών παθογόνων, όπως ο ιός της γρίπης. Εφόσον ένα συγκεκριμένο στέλεχος του ιού είναι συχνό σε έναν ανθρώπινο πληθυσμό, η πλειονότητα των ατόμων θα έχει αναπτύξει ανοσολογική απόκριση γι’ αυτό. Ένα σπάνιο, όμως, στέλεχος του ιού μπορεί να εξαπλωθεί γρήγορα σε όλα σχεδόν τα άτομα. Η ύπαρξη συνεπώς, της γενετικής ποικιλότητας είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη δράση της φυσικής επιλογής, της διεργασίας που «προσαρμόζει» τον πληθυσμό στο διαρκώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον του. Γι’ αυτό είναι σημαντικό να γνωρίζει κανείς εάν οι γενετικές διαφορές που χαρακτηρίζουν τα άτομα, τους πληθυσμούς και τα είδη, αντανακλούν το

αποτέλεσμα της δράσης της επιλογής στο παρελθόν και εξακολουθούν ακόμη και τώρα να υπόκεινται στην επιλογή, ή εάν αποτελούν το προϊόν της αέναης διαδικασίας της μετάλλαξης και απώλειας της ποικιλότητας, λόγω του πεπερασμένου μεγέθους των φυσικών πληθυσμών.

1.3.1.2. Γονιδιακή Ροή

Η γονιδιακή ροή περιγράφει την είσοδο στη γενετική δεξαμενή ενός πληθυσμού, γονιδίων από έναν ή περισσότερους άλλους πληθυσμούς. Συνήθως οι πληθυσμοί αυτοί ανήκουν στο ίδιο είδος, σε μερικές περιπτώσεις, όμως, γίνεται υβριδισμός ανάμεσα σε διαφορετικά είδη, τα οποία δεν είναι πλήρως αναπαραγωγικά απομονωμένα. Η ποικιλότητα που προέρχεται από υβριδισμό συχνά υπερβαίνει την εσωτερική ποικιλότητα καθενός από τα γονικά είδη. Κάποιες φορές ο υβριδισμός είναι δυνατόν να δώσει γενετική ποικιλότητα επαρκή για προσαρμογή σε περιβάλλοντα που φυσιολογικά θα ήταν απρόσιτα για ένα είδος. Η γονιδιακή ροή λαμβάνει χώρα είτε με μετακίνηση ατόμων μεταξύ δύο πληθυσμών, όπως μέσω της μετανάστευσης, είτε με μεταφορά γαμετών. Αποτελεί συντηρητικό παράγοντα που αποτρέπει την απόκλιση μερικώς απομονωμένων πληθυσμών και συμβάλλει σημαντικά στη σταθερότητα των διαδεδομένων ειδών και τη στάση των πολυπληθών ειδών. Διαφέρει ανάλογα με τον πληθυσμό και το είδος και μειώνει τις διαφορές των γενετικών δεξαμενών. Ανάλογα, λοιπόν, με τη δομή των πληθυσμών στους οποίους αναφερόμαστε, διακρίνονται διάφορα μοντέλα γονιδιακής ροής (Εικόνα 1-3), όπως τα εξής:

 Μοντέλο «ήπειρος – νησί», στο οποίο το ενδιαφέρον έγκειται στη ροή από ένα μεγάλο πληθυσμό (ήπειρο) σε έναν άλλο πολύ μικρότερο (νησί).  Μοντέλο «νησιών», στο οποίο η ροή γίνεται μεταξύ μικρών πληθυσμών κατά τυχαίο τρόπο.  Μοντέλο «βηματισμού», στο οποίο οι πληθυσμοί είναι πολυάριθμοι, η γονιδιακή ροή όμως γίνεται μόνο μεταξύ γειτονικών πληθυσμών, μέσα στο χρονικό διάστημα μιας γενιάς.  Μοντέλο «απομόνωσης λόγω απόστασης», στο οποίο η γονιδιακή ροή

είναι συνάρτηση της απόστασης μεταξύ τοπικών πληθυσμών που συναποτελούν μια συνέχεια.

Εικόνα 1-3: Σχηματική απόδοση μοντέλων γονιδιακής ροής. 1) Μοντέλο «ήπειρος – νησί», 2) Μοντέλο των «νησιών», 3) Μοντέλο του «βηματισμού» (α-μονοδιάστατο, β-δισδιάστατο), 4) Μοντέλο της «απομόνωσης λόγω απόστασης».

1.3.1.3. Γενετική Παρέκκλιση

Με τον όρο γενετική παρέκκλιση αναφερόμαστε στις τυχαίες αλλαγές στις συχνότητες των αλληλομόρφων, συνήθως λόγω της τυχαίας δειγματοληψίας από τη γενετική δεξαμενή κάποιου πληθυσμού κατά τη μεταβίβαση από τη μια γενιά στην άλλη (Εικόνα 1-4). Πρόκειται για πολύ σημαντική εξελικτική διεργασία, η οποία οδηγεί σε αλλαγές των αλληλικών συχνοτήτων με το πέρασμα του χρόνου. Μπορεί να συμβάλει στην πλήρη εξάλειψη κάποιων αλληλομόρφων, με συνέπεια την ελάττωση της γενετικής ποικιλότητας. Σε αντίθεση με τη φυσική επιλογή, όπου η συχνότητα εμφάνισης των αλληλομόρφων εξαρτάται από την αναπαραγωγική τους επιτυχία, οι αλλαγές

δεν καθοδηγούνται από την περιβαλλοντική ή την προσαρμοστική πίεση και μπορεί να αποδειχθούν ευεργετικές, ουδέτερες, ή καταστρεπτικές για την αναπαραγωγική επιτυχία.

Εικόνα 1-4: Σχηματική απεικόνιση της τυχαίας δειγματοληψίας και της γενετικής παρέκκλισης.

Ο αντίκτυπος της γενετικής παρέκκλισης είναι μεγαλύτερος στους μικρούς πληθυσμούς και μικρότερος στους μεγάλους πληθυσμούς. Παλαιότερα πίστευαν πως ο ρόλος της γενετικής παρέκκλισης ήταν ασήμαντος για την εξέλιξη, μέχρι την έκδοση του συγγράμματος «Ουδέτερη θεωρία της μοριακής εξέλιξης» του Motoo Kimura, ο οποίος πίστευε πως οι περισσότερες αλλαγές που σταθεροποιούνται στο γενετικό υλικό οφείλονται στη γενετική παρέκκλιση (Kimura 1985).

1.3.2. Ειδογένεση

Στη διαδικασία προσαρμογής των πληθυσμών στις μεταβολές του περιβάλλοντος, μπορεί να υπάρξουν αλλαγές στη γενετική τους δομή, με αποτέλεσμα οι πληθυσμοί να εκδηλώνουν διαφορές στη μορφολογία και τη φυσιολογία τους. Όταν οι αλλαγές αυτές φτάσουν σε σημείο που δεν είναι δυνατή η γέννηση βιώσιμων και γόνιμων απογόνων (αναπαραγωγική απομόνωση), τότε μιλάμε για τη δημιουργία νέου είδους. Προϋπόθεση για την αλλαγή της γενετικής δομής των πληθυσμών είναι η

απομόνωσή τους, η οποία μπορεί να είναι είτε γεωγραφική, είτε αναπαραγωγική. Φυσικές δομές, όπως βουνά, φαράγγια κ.ά., είναι πιθανό να λειτουργήσουν ως γεωγραφικά εμπόδια, τα οποία παρεμποδίζουν την ανταλλαγή γονιδίων ανάμεσα σε δύο πληθυσμούς. Έτσι, πληθυσμοί που ζουν χωριστά για μεγάλο χρονικό διάστημα μπορούν να αναπτύξουν, λόγω της προσαρμογής τους σε διαφορετικά περιβάλλοντα, αναπαραγωγική απομόνωση. Η αναπαραγωγική απομόνωση μπορεί να οφείλεται αφενός σε μηχανισμούς που δεν επιτρέπουν τη συνεύρεση δύο πληθυσμών, όπως για παράδειγμα η διαφορετική ανατομία των γεννητικών οργάνων τους, η διαφορετική αναπαραγωγική εποχή, ο διαφορετικός χώρος κατοικίας ή η διαφορετική προτίμηση για σύζευξη (προσυζευκτικοί), και αφετέρου σε μηχανισμούς που δεν επιτρέπουν τη βιωσιμότητα ή τη γονιμότητα των απογόνων (μετασυζευκτικοί). Σε μια απλή περίπτωση ειδογένεσης, η σειρά των γεγονότων που λαμβάνουν χώρα μπορεί να έχει ως εξής:

 Δύο πληθυσμοί ενός είδους απομονώνονται, ώστε η αναπαραγωγή μεταξύ τους να είναι αδύνατη. Συνήθως η απομόνωση οφείλεται σε κάποιο γεωγραφικό εμπόδιο ή σε μεγάλες αποστάσεις. Η αναπαραγωγική απομόνωση μπορεί να προκύψει όμως και από άλλες αιτίες, όπως εποχικές, λειτουργικές ή συμπεριφοράς.  Οι γονιδιακές δεξαμενές των δύο πληθυσμών δεν επικοινωνούν. Με το πέρασμα του χρόνου, οι μεταλλάξεις και η επιλογή κάνουν τους δύο πληθυσμούς γενετικά διαφορετικούς, ώστε να μην μπορούν πλέον να αποκτήσουν βιώσιμους και γόνιμους απογόνους.  Στο σημείο αυτό η διαδικασία της ειδογένεσης έχει ολοκληρωθεί. Συνεπώς εκεί που υπήρχε ένα είδος, τώρα υπάρχουν δύο.

Οι γενετικοί φραγμοί ή οι αναπαραγωγικοί μηχανισμοί μπορεί να προκύψουν με διάφορους τρόπους και, αντίστοιχα, η ειδογένεση να ταξινομηθεί σε διάφορες κατηγορίες (Εικόνα 1-5):

Εικόνα 1-5: Σχηματική απόδοση των κατηγοριών της ειδογένεσης.

 Παραπάτρια ειδογένεση. Είναι ένας τύπος απόκλισης που δεν απαιτεί την

πλήρη απομόνωση των πληθυσμών. Αν η επιλογή ευνοεί διαφορετικά αλληλόμορφα σε δύο παρακείμενους (ή όπως ονομάζονται παραπάτριους) πληθυσμούς, δημιουργείται μια διαβάθμιση στη συχνότητα των γονιδίων. Οι πληθυσμοί μπορούν να διαφοροποιηθούν σε αναπαραγωγικά απομονωμένα είδη, αν υπάρχει ισχυρή επιλογή για ένα ή περισσότερα γονίδια που ελέγχουν κάποια μορφή αναπαραγωγικής απομόνωσης.  Αλλοπάτρια ειδογένεση. Προτάθηκε από τον Mayr έπειτα από μελέτες της γεωγραφικής ποικιλομορφίας που εμφάνιζαν διάφοροι πληθυσμοί. Είναι γνωστή και ως γεωγραφική ειδογένεση, και πρόκειται για το φαινόμενο κατά το οποίο οι βιολογικοί πληθυσμοί απομονώνονται φυσικά από έναν εξωτερικό φραγμό και αναπτύσσουν γενετική αναπαραγωγική απομόνωση. Καθ’ αυτό τον τρόπο ακόμα και αν ο φυσικός αυτός φραγμός κάποτε πάψει να υφίσταται, τα άτομα των πληθυσμών δεν μπορούν πλέον να διασταυρωθούν μεταξύ τους. Για τους εξελικτικούς βιολόγους η αλλοπάτρια ειδογένεση είναι ένας συνήθης τρόπος για τη δημιουργία νέων ειδών.  Συμπάτρια ειδογένεση. Εάν δημιουργηθεί ένας βιολογικός μηχανισμός αναπαραγωγικής απομόνωσης μέσα σε ένα παμμικτικό πληθυσμό, χωρίς τοπικό διαχωρισμό των «εν τη γενέσει» ειδών, τότε μιλάμε για συμπάτρια ειδογένεση. Διακρίνεται σε στιγμιαία και προοδευτική. Στους πολυκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, δεν είναι τόσο συνηθισμένη, αλλά μέσω αυτής, η γενετική απόκλιση (διαμέσου της αναπαραγωγικής απομόνωσης) διαφόρων πληθυσμών που προέρχονται από ένα γονικό είδος και κατοικούν στην ίδια γεωγραφική περιοχή, οδηγεί στη δημιουργία νέων ειδών. Πρόσφατο παράδειγμα αποτελεί η παρουσία νέων ειδών σαλαμάνδρας των σπηλαίων στην περιοχή του Tennessee (Niemiller et al. 2008). Στα βακτήρια, αντιθέτως, η ανάλογη διαδικασία είναι πιο συνηθισμένη και πραγματοποιείται μέσω οριζόντιας μεταβίβασης γονιδίων.  Περιπάτρια ειδογένεση. Είναι μια κατηγορία ειδογένεσης κατά την οποία νέα είδη δημιουργούνται σε απομονωμένους περιφερειακούς πληθυσμούς. Μοιάζει με την παραπάτρια ειδογένεση στο γεγονός ότι οι πληθυσμοί δεν είναι πλήρως απομονωμένοι, όμως αντίθετα με την αλλοπάτρια, στην περιπάτρια ειδογένεση, ένας εκ των πληθυσμών είναι

πολύ μικρότερος από τον άλλο.  Αρχή του ιδρυτή. Στην πληθυσμιακή γενετική, η αρχή του ιδρυτή αφορά την απώλεια της γενετικής ποικιλότητας, η οποία λαμβάνει χώρα όταν ένας νέος πληθυσμός ιδρύεται από έναν πολύ μικρό αριθμό ατόμων ενός μεγαλύτερου πληθυσμού (Provine 2004). Πρόκειται, δηλαδή, για ιδιαίτερη περίπτωση γενετικής παρέκκλισης. Ως αποτέλεσμα της απώλειας της γενετικής ποικιλότητας, ο νέος πληθυσμός μπορεί να είναι ευδιάκριτα διαφορετικός, τόσο γενετικά όσο και φαινοτυπικά, από τον πληθυσμό από τον οποίο προέρχεται. Σε ακραίες περιπτώσεις, πολλαπλές επαναλήψεις ιδρυτικών φαινομένων μπορούν να οδηγήσουν σε ειδογένεση και ακολούθως στην εξέλιξη νέων ειδών. Τέλος, το φαινόμενο του ιδρυτή μπορεί να παρατηρηθεί και έπειτα από περιόδους πληθυσμιακήςστενωπού, παρόλο που δεν πρόκειται ακριβώς για νέο πληθυσμό.

1.4. Μοριακή Φυλογένεση και Εξέλιξη

Η φυλογένεση αναφέρεται στη μελέτη των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ οργανισμών, πληθυσμών και ειδών όπως αυτές διαμορφώνονται με το πέρασμα του χρόνου. Με άλλα λόγια, ασχολείται με την ανοικοδόμηση της εξελικτικής ιστορίας των οργανισμών, αποτελεί βασικό στόχο της συστηματικής και είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με τη φυλογεωγραφιά. Η εξελικτική διαδικασία είναι δυνατόν να δημιουργήσει διακλαδώσεις, καθώς οι πληθυσμοί μεταβάλλονται στο χρόνο, διαχωρίζονται σε ξεχωριστούς κλάδους (ειδογένεση), διασταυρώνονται ή εξαφανίζονται. Ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων είναι συνδεδεμένος με την ταξινόμηση των οργανισμών, καθώς, από την εποχή του Δαρβίνου ακόμη, στόχος των ειδικών ήταν η ταξινόμηση να αντανακλά όσο πιο πιστά γίνεται τις φυλογενετικές σχέσεις των οργανισμών. Ένα φυλογενετικό δέντρο που αποτελεί τη δεντροειδή αναπαράσταση της φυλογένεσης βοηθάει στη συσχετισμένη ανάλυση των γεωγραφικών και γενετικών αποστάσεων μεταξύ των πληθυσμών.

Παλαιότερα, η περιγραφή των σχέσεων μεταξύ των οργανισμών βασιζόταν κυρίως σε φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, στη συγκριτική μορφολογία, στη φυσιολογία κ.λπ. Οι μέθοδοι ανάλυσης των γνωρισμάτων (που ονομάστηκαν κλαδιστικές μέθοδοι) βασίζονται εν γένει στις αρχές που περιγράφηκαν από το Γερμανό εντομολόγο Willi Hennig στο βιβλίο του Phylogenetic Systematics (1966). Εφόσον ήταν γνωστό ότι ο γενότυπος ενός ατόμου αντικατοπτρίζεται στο φαινότυπό του, τα μορφολογικά γνωρίσματα ήταν αυτά που χρησιμοποιήθηκαν κατά κύριο λόγο στις κλαδιστικές μελέτες. Επιπροσθέτως, ο φαινότυπος είναι εκείνος που υφίσταται τις πιέσεις της φυσικής επιλογής και εξελίσσεται ορατά. Ένα ακόμη πλεονέκτημα της χρήσης των μορφολογικών γνωρισμάτων, είναι η δυνατότητα χρήσης μεγάλου δείγματος ατόμων στις αναλύσεις, μειώνοντας με τον τρόπο αυτόν την πιθανότητα στατιστικού σφάλματος, καθώς και η δυνατότητα επανάληψης των αναλύσεων με τη χρήση των ίδιων ατόμων, εφόσον είναι δυνατή η διατήρησή τους. Για τους παραπάνω λόγους, η χρήση της μορφολογίας βρισκόταν σε άνθιση μέχρι τη δεκαετία του ’80. Ωστόσο, οι αναλύσεις που στηρίζονται στη μορφολογία των ατόμων έχουν και μειονεκτήματα, όπως για παράδειγμα το γεγονός ότι τα διαφορετικά γνωρίσματα είναι, ορισμένες φορές, δύσκολο να διακριθούν, συνεπώς πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η υποκειμενικότητα του ερευνητή. Επίσης, είναι δυνατό τα μορφολογικά χαρακτηριστικά να συγκλίνουν ή να εξελίσσονται παράλληλα, γεγονός που δυσχεραίνει τον εντοπισμό ομοπλασιών (Moore & Willmer 1997, Conway 2003). Επιπλέον, τα πρότυπα της κληρονομικότητας των μορφολογικών γνωρισμάτων δεν είναι πάντα σαφή. Τέλος, υπάρχουν περιπτώσεις κατά τις οποίες το πλήθος των δεδομένων (διαθέσιμων γνωρισμάτων) δεν επαρκεί για την αξιόπιστη στήριξη των φυλογενετικών υποθέσεων. Μια λύση στα προβλήματα αυτά έδωσε η ανάπτυξη των μοριακών μεθόδων, οι οποίες βρίσκουν εφαρμογή σε όλους τους οργανισμούς και σε κάθε μόριο το οποίο φέρει πληροφορία για τον οργανισμό. Με την ανάπτυξη μοριακών τεχνικών, όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), δόθηκε στους ερευνητές η δυνατότητα προσδιορισμού αλληλουχιών DNA σε μεγάλη κλίμακα. Έτσι, η μοριακή ανάλυση εντάχθηκε ως απαραίτητο εργαλείο στις φυλογενετικές μελέτες καθώς θεωρήθηκε ότι τα μοριακά δεδομένα, και κυρίως οι αλληλουχίες του DNA παρέχουν αποδείξεις οι οποίες επιτρέπουν τον προσδιορισμό της φυλογένεσης όλωντων μορφών ζωής. Επιπλέον, θεωρήθηκε ότι τα μοριακά δεδομένα ήταν ανώτερα από τα

μορφολογικά, καθώς αναφέρονται στο επίπεδο του DNA και των γονιδίων, τα οποία παρέχουν τις απαραίτητες αποδείξεις για τις σχέσεις μεταξύ των ατόμων. Ωστόσο, από την αρχή σχεδόν της χρήσης των μοριακών δεδομένων, ήταν γνωστό ότι οι μέθοδοι αυτές, όπως και οι μέθοδοι που χρησιμοποιούσαν μορφολογικά δεδομένα, είχαν τόσο πλεονεκτήματα όσο και μειονεκτήματα.. Η μελέτη του DNA επιτρέπει την άμεση ανάλυση του γενετικού υλικού, το οποίο έχει κληρονομηθεί από τους προγόνους και συνεπώς αντανακλά τη γενεαλογία και είναι αξιόπιστο για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων. Αντιθέτως, μια συγκεκριμένη δομή σε έναν οργανισμό, δεν παρέχει πληροφορίες για τον τρόπο με τον οποίο έχει προκύψει, δηλαδή εάν οφείλεται σε άμεσες περιβαλλοντικές επιρροές ή στην κληρονομικότητα. Εφόσον, λοιπόν, για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων είναι απαραίτητη η μελέτη των κληρονομούμενων χαρακτηριστικών, η μορφολογία καθίσταται λιγότερο αξιόπιστη για τις φυλογενετικές μελέτες. Ένα από τα προβλήματα των μορφολογικών μελετών είναι το γεγονός ότι οι υπό μελέτη οργανισμοί μπορεί να μοιάζουν εξαιρετικά μεταξύ τους στη μορφολογία, με συνέπεια οι ομοιότητες αυτές να καθιστούν δυσκολότερη την εύρεση ενός αριθμού χαρακτήρων, ικανού για αξιόπιστη και συστηματική ανάλυση. Αντιθέτως, οι αλληλουχίες DNA είναι ευμετάβλητες ανάμεσα στα είδη και κατά συνέπεια, είναι δυνατόν να βρεθεί μεγάλος αριθμός χαρακτήρων (θέσεις ζευγών βάσεων) οι οποίοι φέρουν φυλογενετικά πληροφοριακή μεταβλητότητα. Το κόστος είναι ένας σημαντικός παράγοντας σε κάθε μελέτη. Η μελέτη της μορφολογίας είναι πολύ πιο οικονομική από τη μελέτη των αλληλουχιών του DNA. Αυτό σημαίνει ότι με το ίδιο κόστος είναι δυνατόν να μελετηθούν περισσότερες δομές ενός οργανισμού, απ’ ότι γονίδια. Στην περίπτωση αυτή η μορφολογία υπερτερεί του DNA. Ωστόσο, η τεχνολογία του DNA γίνεται όλο και πιο οικονομική και γρήγορη, οπότε το συγκεκριμένο πλεονέκτημα της μορφολογίας συνεχώς φθίνει. Ένα συγκεκριμένο μορφολογικό χαρακτηριστικό είναι δυνατόν να καθορίζεταιαπό περισσότερα του ενός γονίδια, με αποτέλεσμα η μελέτη του να αντλεί πληροφορίες για πολλαπλά τμήματα του γενετικού υλικού. Αντιθέτως, συνήθως λόγω οικονομικών περιορισμών, η μοριακή ανάλυση περιορίζεται σε ένα ή σε μικρό αριθμό γονιδίων. Έτσι, δεν λαμβάνεται υπ’ όψιν η πιθανή αλληλεπίδρασή του με άλλα άγνωστα γονίδια, με συνέπεια να υπάρχει πιθανότητα χαρακτήρες οι οποίοι αναφέρονται ως ξεχωριστοί, να εξελίσσονται

κατά συσχετιζόμενο τρόπο, γεγονός που καθιστά τη φυλογένεση λιγότερο αξιόπιστη. Αντίθετα, εάν η μελέτη αφορά χαρακτηριστικά που κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια, είναι λιγότερο πιθανό η εξέλιξή τους να συσχετίζεται. Στην περίπτωση αυτή, οι μορφολογικές μελέτες υπερτερούν. Ωστόσο, αυτή η διαφορά με τις μοριακές μελέτες μειώνεται όσο μεγαλώνει ο αριθμός των υπό μελέτη γονιδίων. Συμπερασματικά, οι πλέον αξιόπιστες φυλογενετικές μελέτες βασίζονται σε συνδυασμό διαφορετικών ειδών δεδομένων. Αυτή η προσέγγιση τις καθιστά πιο ολοκληρωμένες και μειώνει την πιθανότητα να περιέχουν σφάλματα όσον αφορά τα συμπεράσματα που εξάγονται, ιδιαίτερα δε εάν αυτά συμφωνούν ανάμεσα σε διαφορετικά είδη αναλύσεων (Bininda-Emonds, 2000). Παρ’ όλα αυτά, η συμβολή της μοριακής ανάλυσης στη φυλογένεση και ο σημαντικός της ρόλος στη διαλεύκανση των φυλογενετικών σχέσεων ακόμα και μεταξύ ανώτερων ταξινομικών βαθμίδων δεν είναι δυνατόν να αμφισβητηθεί. Πλέον η χρήση των μοριακών δεικτών είναι ευρέως διαδεδομένη μεταξύ των εξελικτικών βιολόγων και οι μέθοδοι ανάλυσης των γενετικών δεδομένων βελτιώνονται ταχύτατα, ωστόσο υπάρχει έλλειψη ενός οργανωμένου πλαισίου εργασίας με το οποίο να μπορούν να δουλέψουν οι επιστήμονες. Στοιχεία της μοριακής εξέλιξης συνοψίζονται για να εξηγήσουν την προέλευση της μεταβλητότητας στο επίπεδο του DNA, τα όριά της, καθώς και τις σχέσεις που συνδέουν τη γενετική διαφοροποίηση με τις βιολογικές παραμέτρους των υπό μελέτη οργανισμών (Chenuil 2006).

Οι μοριακοί δείκτες καθορίζονται από δύο συνιστώσες:  Την περιοχή του DNA που πρόκειται να «καλύψουν».  Την τεχνική που χρησιμοποιείται για την εύρεση της διαφοροποίησης.

Τα κριτήρια για την επιλογή του κατάλληλου μοριακού δείκτη χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες:  Το επίπεδο της διαφοροποίησης.  Τη φύση της πληροφορίας, η οποία πρέπει να προσδιορίζεται σύμφωνα με το επιστημονικό ερώτημα.  Κάποια πρακτικά κριτήρια, τα οποία έχουν να κάνουν κυρίως με τον εξοπλισμό του εκάστοτε εργαστηρίου και την εμπειρία του ερευνητή.

1.4.1. Μοριακό Ρολόι

Η ιδέα της υπόθεσης για το μοριακό ρολόι ξεκίνησε στη δεκαετία του 60’ με τους Zuckerkandl & Pauling με δύο σημαντικές μελέτες σχετικά με τον εξελικτικό ρυθμό των πρωτεϊνών, σημειώνοντας ότι η γενετική απόσταση δύο αλληλουχιών διαφορετικών ειδών που κωδικοποιούν την ίδια πρωτεΐνη αυξάνει γραμμικά με το χρόνο απόκλισης των δύο ειδών. To μοριακό ρολόι αποτελεί την συσχέτιση της απόσχισης δύο ειδών και του αριθμού των διαφορών που παρατηρούνται μεταξύ νουκλεοτιδικών ή πρωτεϊνικών μορίων των ειδών αυτών. Επιτρέπει την πιθανή χρονολόγηση άγνωστων χρονικά αποσχίσεων δύο γενεαλογικών γραμμών μέσω σύγκρισης των πρωτεϊνικών τους ή των νουκλεοτιδικών τους αλληλουχιών.

1.4.2. Μιτοχονδριακό DNA

Από τους μοριακούς δείκτες που χρησιμοποιούνται ευρέως στις φυλογενετικές μελέτες είναι το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) (Εικόνα 1-6), καθώς η ευκολία στον πολλαπλασιασμό, οι σχετικά γρήγοροι εξελικτικοί ρυθμοί, καθώς και η απουσία γενετικού ανασυνδυασμού, έκαναν το mtDNA αναπόσπαστο κομμάτι της συστηματικής και της γενετικής πληθυσμών (Avise, 1986, Awadalla et al., 1999, Simon et al., 2006). Πρόκειται για ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο μεγέθους ~16kb (στους περισσότερους πολυκύτταρους οργανισμούς), ενώ μπορεί να φτάσει και τις 80kb στους ζυμομύκητες και να ξεπεράσει τις 100kb στα φυτά. Στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα περιλαμβάνονται 37, συνήθως, γονίδια, από τα οποία 13 κωδικοποιούν πρωτεΐνες, 22 κωδικοποιούν tRNAs και 2 κωδικοποιούν rRNAs. Επειδή όλο το μιτοχονδριακό DNA κληρονομείται ως μία μονάδα, ή απλότυπος, η σύγκριση του μιτοχονδριακού DNA από διαφορετικά άτομα μπορεί να παρουσιαστεί με τη μορφή φυλογενετικού δένδρου. Παρ’ όλα αυτά, το μιτοχονδριακό DNA αντανακλά μόνο την ιστορία των θηλυκών ατόμων του πληθυσμού και έτσι μπορεί να μην αντιπροσωπεύει την εξελικτική ιστορία όλου του πληθυσμού. Για αυτό το λόγο χρησιμοποιούνται συνήθως συμπληρωματικά και μελέτες του πυρηνικού DNA ή περιοχή του χρωμοσώματος Υ, το οποίο διακρίνεται από πατρική κληρονόμηση (Garrigan & Hammer, 2006).

Εικόνα 1-6: Η δομή του μιτοχονδριακού DNA, όπου φαίνονται αναλυτικά η διάταξη των γονιδίων, καθώς και τα μόρια που κωδικοποιούν. Η σειρά με την οποία εμφανίζονται τα γονίδια στο mtDNA συνήθως είναι συγκεκριμένη. Υπάρχουν όμως και περιπτώσεις όπου η διάταξη αυτή φαίνεται να αλλάζει (Chen & Zhao 2009).

Το mtDNA εμφανίζεται σε μεγάλο αριθμό αντιγράφων στα κύτταρα, είναι πλήρως χαρακτηρισμένο, ενώ ο μητρικός, κυρίως, τρόπος κληρονομικότητας (Zhao et al. 2004) δεν αφήνει περιθώρια για ανασυνδυασμό, με ελάχιστες εξαιρέσεις (Rokas et al. 2003). Συνεπώς θεωρείται μια απλοειδής γενετική μονάδα. Επιπλέον, το ζωικό μιτοχονδριακό DNA εμφανίζει γρήγορο εξελικτικό ρυθμό. Εξελίσσεται έως και 10 φορές πιο γρήγορα από το μη επαναλαμβανόμενο πυρηνικό DNA, ενώ ο εξελικτικός ρυθμός είναι διαφορετικός ακόμα και ανάμεσα σε διαφορετικά τμήματα του mtDNA. Ο γρήγορος εξελικτικός ρυθμός αποδίδεται σε μεταλλάξεις, οι οποίες συσσωρεύονται λόγω αδυναμίας επιδιόρθωσης των λαθών κατά την αντιγραφή (η γ-πολυμεράση δεν έχει την ικανότητα

επιδιόρθωσης). Το ζωικό μιτοχονδριακό DNA δεν διαθέτει εσώνια, ενώ η απουσία ιστονών φαίνεται να το καθιστά ευάλωτο σε δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) και άλλους επιβλαβείς παράγοντες. Ωστόσο υπάρχουν έρευνες που υποδεικνύουν ότι ο σχηματισμός συμπλόκων του mtDNA με κάποιες πρωτεΐνες, μπορεί να το προστατεύσει, για παράδειγμα, από τις ακτίνες Χ ή το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Gouliaeva et al. 2006). Υπάρχουν όμως και πρακτικά πλεονεκτήματα, όπως για παράδειγμα το γεγονός ότι δείγματα mtDNA μπορούν να ληφθούν εύκολα, ενώ δεν είναι απαραίτητη μεγάλη ποσότητα ιστού. Τέλος, μπορεί εύκολα να μελετηθεί και να πολλαπλασιαστεί, καθώς έχουν σχεδιαστεί παγκόσμιοι εκκινητές για RCR. Το μικρό λοιπόν δραστικό μέγεθος του mtDNA σε σχέση με τα πυρηνικά γονίδια και ο υψηλός ρυθμός νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, καθιστούν το mtDNA πολύτιμο εργαλείο στη μελέτη φυλογενετικών σχέσεων σε διάφορα ταξινομικά επίπεδα, ανάλογα πάντα με το υπό μελέτη γονίδιο, ή συνδυασμό γονιδίων. Για παράδειγμα, τα δύο γονίδια που κωδικοποιούν για τα rRNAs (12S και 16S) είναι πιο συντηρημένα, οπότε μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό των φυλογενετικών σχέσεων σε υψηλά (φύλο, υποφύλο) και μεσαία (οικογένεια, γένος) ταξινομικά επίπεδα (Weisburg et al. 1991, Ballard et al. 1992). Εκτός όμως, από τις πληροφορίες που μπορεί να δώσει η αλληλούχιση των γονιδίων του μιτοχονδριακού DNA, η διάταξη των μιτοχονδριακών γονιδίων είναι δυνατό να παρέχει πληροφορίες για τη «βαθιά» φυλογένεση (Boore et al. 1995). Αν εξαιρέσει κανείς την εκτεταμένη γονιδιακή μετατόπιση σε ορισμένα τάξα (Machida et al. 2002), η ταυτοποίηση συγκεκριμένης γονιδιακής διάταξης του μιτοχονδριακού γονιδιώματος οδήγησε στην ισχυρή στήριξη των μέχρι τώρα αβέβαιων ομαδοποιήσεων και την εύρεση νέων φυλογενετικών σχέσεων ανάμεσα σε διαφορετικά φύλα (Podsiadlowski et al. 2008). Τέλος, για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων σε κατώτερα ταξινομικά επίπεδα, έχουν χρησιμοποιηθεί γονίδια όπως αυτά που κωδικοποιούν το κυτόχρωμα b, την υπομονάδα Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης, την περιοχή του βρόχου εκτόπισης και την υπομονάδα Ι της NADH αφυδρογονάσης.

1.5. Παλαιογεωγραφία του Ελλαδικού Χώρου

Η ιστορία του ελλαδικού χώρου ξεκινά κατά το Ολιγόκαινο (30 Mya). Την περίοδο αυτή το Αιγαίο αποτελούσε ενιαία ηπειρωτική περιοχή, γνωστή ως Αιγαιίδα, η oποία καταλάμβανε τη Μικρά Ασία, τη σημερινή ηπειρωτική Ελλάδα, τα νησιά του Αιγαίου και του Ιονίου, και εκτεινόταν νότια περιλαμβάνοντας και την Κρήτη. Στο βορρά ο ελλαδικός χώρος χωριζόταν από την κεντρική Ευρώπη με τη θάλασσα της Παρατηθύος. Κατά το Βουρδιγάλιο (17 Mya), η επικοινωνία της Μεσογείου με τον Ινδικό ωκεανό διακόπηκε με αποτέλεσμα το κλίμα να γίνει υγρό και ξηρό. Στη συνέχεια, στο Σερραβάλιο (14,5-12 Mya), ο ενιαίος όγκος ξηράς στην περιοχή του Αιγαίου άρχισε να κατακερματίζεται. Ακολούθησε ο σχηματισμός λιμνών με γλυκά και υφάλμυρα νερά, και στο βορρά συνδέθηκε η ηπειρωτική Ελλάδα με την κεντρική Ευρώπη. Στο Τορτόνιο (10,5-7,5 Mya), η λεκάνη του Κρητικού Πελάγους καθιζάνει με αποτέλεσμα την εισροή θαλάσσιων υδάτων και την απαρχή της δημιουργίας του Αιγαίου Πελάγους. Παρατηρείται βάθυνση του Κρητικού Πελάγους αλλά και ανύψωση ορεινών όγκων (Ίδη). Η εισροή των γλυφών ή/και θαλάσσιων νερών οδηγεί στον κατακερματισμό της Κρήτης και την αποκοπή της από την ενιαία μάζα ξηράς. Εν συνεχεία, βορειότερα, η θάλασσα που διεισδύει χωρίζει τις Κυκλάδες από τα νησιά του Αν. Αιγαίου και την Πελοπόννησο. Ωστόσο οι σύνδεση των Κυκλάδων διατηρείται τόσο με την Αττική όσο και με τη νότιο Εύβοια. Κατά το Μεσσήνιο (6,5-5,5 Mya), λόγω σύγκρουσης της βορειοδυτικής Αφρικής με την Ιβηρική χερσόνησο, τα στενά του Γιβραλτάρ έκλεισαν με αποτέλεσμα η επικοινωνία της Μεσογείου με τον Ατλαντικό να ωκεανό να διακοπεί. Το γεγονός αυτό οδήγησε στη αποστράγγιση της περιοχής και στη γνωστή «κρίση αλατότητας». Χαρακτηριστικά της κρίσης ήταν η ανύψωση πολλών περιοχών και οι εκτεταμένες γέφυρες ξηράς που αποτέλεσαν διαδρόμους επικοινωνίας και μετακίνησης πολλών πανιδικών και χλωριδικών στοιχείων, καθώς και η δημιουργία μεγάλων και αλμυρών λιμνών και κλειστών θαλασσών στην περιοχή του Αιγαίου, οι οποίες όμως θα πρέπει να ήταν «νεκρές» εξαιτίας της υψηλής αλατότητας (Dermitzakis 1990). Κατά το Μεσσήνιο το κλίμα δεν άλλαξε σημαντικά, όμως η κρίση αλατότητας οδήγησε σε πιο άνυδρο κλίμα. Η Πικερμική πανίδα που

βρέθηκε στις περιοχές της Σάμου, της Κω, της Εύβοιας και της Αττικής, αποτελεί απόδειξη της μετακίνησης ζώων της Αφρικής προς τον ελλαδικό χώρο. Η κρίση αλατότητας έλαβε τέλος κατά το κατώτερο Πλειόκαινο και συγκεκριμένα στο Ζάγκλιο (5,5-4,5 Mya), μετά την αποκατάσταση της επικοινωνίας της Μεσογείου με τον Ατλαντικό (στενά Γιβραλτάρ) και την άνοδο της στάθμης της θάλασσας. Σε αυτήν την περίοδο το Αιγαίο πέλαγος αρχίζει να μορφοποιείται. Η Κρήτη αποχωρίζεται από την ηπειρωτική Ελλλάδα (Poulakakis & Sfenthourakis 2008, Dermitzaks & Papanikoloaou 1981). Η ανατολική Κρήτη ενώνεται με τη δυτική και παρατηρείται ο σχηματισμός των κόλπων Ηρακλείου και Μεσσαράς, οι νότιες και κεντρικές Κυκλάδες «απομονώνονται» αποτελώντας ενιαία ξηρά, και οι βόρειες Κυκλάδες ενώνονται μέσω της Εύβοιας με την ηπειρωτική Ελλάδα. Ακολουθεί αύξηση του ρυθμού ανύψωσης των τεκτονικών πλακών κατά το Πλακέντιο (ανώτερο Πλειόκαινο 4,5-3,5 Mya) που οδηγεί σε αλλαγές κυρίως στο σχήμα των νησιών και των ηπειρωτικών περιοχών. Για παράδειγμα, στην Κρήτη σημειώνεται ανύψωση ορεινών όγκων άνω των 2000m με ταυτόχρονη υποχώρηση του θαλάσσιου βυθού. Οι νότιες περιοχές της Κρήτης καταβυθίζονται (καταβύθιση Γαύδου, Παξιμαδιών που οδηγεί σε σημαντική μείωση του μεγέθους τους). Κατά αυτή την περίοδο δημιουργείται ο νότιος Ευβοϊκός, ο οποίος χωρίζει τη νότιο Εύβοια από την Αττική. Με την έναρξη του Πλειστοκαίνου (2 Mya) ξεκινούν οι παγετώδεις και οι μεσοπαγετώδεις περίοδοι που χαρακτηρίζονται από έντονο ευστατισμό αλλά και από ισοστατικές κινήσεις. Οι παγετώνες κατά το Πλειστόκαινο προκάλεσαν μείωση της στάθμης της θάλασσας από 100 έως 180 μέτρα σε σχέση με σήμερα. Οι μεταβολές της θαλάσσιας στάθμης καθ’ όλη τη διάρκεια της περιόδου αυτής οδήγησαν άλλες φορές σε συνένωση περιοχών και άλλες φορές σε αποχωρισμό τους. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την δημιουργία διόδων, για τη μετακίνηση και διακίνηση των πληθυσμών και τη μετέπειτα καταστροφή τους. Κατά το μέσο Πλειστόκαινο οι Κυκλάδες αποχωρίζονται από την Εύβοια και κατακερματίζονται. Τα νησιά του Αν. Αιγαίου παραμένουν ενωμένα με τη Μικρά Ασία (με εξαίρεση τη Νίσυρο) μέχρι και το Ολόκαινο (Σφενδουράκης 1994, Welter-Schultes 2000, Poulakakis et al. 2005a, Parmakelis et al. 2006) ενώ τα Κύθηρα είναι ακόμα συνδεδεμένα με την νότια Πελοπόννησο (Poulakakis & Sfenthourakis 2008). Την ίδια περίοδο σχηματίστηκε και ο βόρειος Ευβοϊκός κόλπος, διαχωρίζοντας έτσι την Εύβοια από τη Στερεά Ελλάδα. Σημαντικό στοιχείο για τη μετακίνηση των ειδών αποτελεί η κατά

περιόδους ανάδυση νησιών ως αποτέλεσμα της πτώσης της στάθμης της θάλασσας και της αποκάλυψης υποθαλάσσιων ορέων. Τα νησιά αυτά λειτουργούσαν ως ενδιάμεσοι σταθμοί. Το Αιγαίο πέλαγος χαρακτηρίζεται από έντονες ορογενετικές κινήσεις και ως εκ τούτου είναι ελάχιστες οι περιπτώσεις που υπήρξαν νησιά πλήρως απομονωμένα. Η πλειονότητα των νησιών είχαν ενωθεί μεταξύ τους ή/και με κάποια ηπειρωτική περιοχή. Οι μεταβολές αυτές του Αιγαίου κατά το Πλειστόκαινο, συμπληρώνονται και περιπλέκονται από τις πολύ μεγάλες σε αριθμό και ένταση τεκτονικές κινήσεις. Οι τεκτονικές διεργασίες, παρά το ότι ήταν περιορισμένες σε γεωγραφική έκταση, έδρασαν καθοριστικά στην παλαιογεωγραφική εξέλιξη πολλών νησιών και δορυφορικών νησίδων (Van Andel & Shakleton 1982). Οι μελέτες αναφορικά με τις ανακατατάξεις στεριάς και θάλασσας στη διάρκεια του ανώτερου Τεταρτογενούς (ανώτερο Πλειστόκαινο – Ολόκαινο) καταδεικνύουν πως περί τα 18.000 ya η βόρεια Ελλάδα και η βόρεια Αδριατική σχημάτιζαν μεγάλες παραθαλάσσιες πεδιάδες που τις διέσχιζαν πολλά ποτάμια. Ευρείες πεδιάδες υπήρχαν στον Κορινθιακό Κόλπο. Πολλά νησιά, όπως η Εύβοια, η Κέρκυρα και οι Β. Σποράδες, συνδέονταν με την ηπειρωτική Ελλάδα, και τα περισσότερα νησιά των Κυκλάδων ήταν ενωμένα σχηματίζοντας την λεγόμενη «Κυκλαδική ημι-χερσόνησο» (Van Andel & Shakleton 1982). Τα πλέον εντυπωσιακά γεωλογικά γεγονότα της Παλαιολιθικής και Μεσολιθικής περιόδου ήταν αυτά της ένωσης της Πελοποννήσου και της Εύβοιας με την υπόλοιπη ηπειρωτική Ελλάδα, η κυκλαδική ημι-χερσόνησος και η ύπαρξη αρκετών μεγάλων λιμνών. Περί τα 18.000 ya μια ευμεγέθης ενιαία πεδιάδα, στη θέση της σημερινής Αδριατικής, συνέδεε την Ιταλία με την πρώην Γιουγκοσλαβία. Η πεδιάδα αυτή συνέχιζε από τα δυτικά παράλια της Αλβανίας και έφτανε μέχρι τα νοτιοδυτικά παράλια της Πελοποννήσου και τον Κορινθιακό Κόλπο, διακοπτόμενη μόνο από μια ορεινή ζώνη βόρεια της Κέρκυρας. Η Κεφαλονιά και η Ζάκυνθος ήταν ενωμένες σχηματίζοντας ένα ενιαίο νησί που απείχε μόλις 10-15 km από την ηπειρωτική Ελλάδα. Στη διάρκεια της τελευταίας παγετώδους περιόδου η Πελοπόννησος ήταν ενωμένη με την κεντρική Ελλάδα τόσο στα βορειοδυτικά της όσο και στα βορειοανατολικά μέσω του Ισθμού της Κορίνθου ενώ ο Κορινθιακός Κόλπος σχημάτιζε λίμνη. Μεταξύ της Αργολίδας και της Αττικής εκτεινόταν μια πεδιάδα στην οποία τα σημερινά νησιά πρόβαλαν ως απομονωμένοι λόφοι. Τα στενά μεταξύ Εύβοιας και ηπειρωτικής περιοχής ήταν ξηρά.

Βουρδιγάλιο Σερραβάλιο Τορτάνιο (17 Mya) (12 Mya) (8 Mya)

Μεσσήνιο Πλακέντιο Μέσο (5,5 Mya) (3,5 Mya) Πλειστόκαινο (0,8 Mya)

Εικόνα 1-7: Η κατανομή ξηράς-θάλασσας στον ελλαδικό χώρο στις περιόδους του Τριτογενούς και του Τεταρτογενούς (τροποποιημένο από Dermitzakis & Papanikolaou 1981 και Parmakelis et al. 2005).

Πολλά από τα νησιά του Αιγαίου ήταν ενωμένα μεταξύ τους. Οι Σποράδες, με εξαίρεση τη Σκύρο, σχημάτιζαν μια μεγάλη χερσόνησο, η οποία ενδεχομένως διακοπτόταν με δύο πολύ ρηχά στενά που απείχαν μόλις μερικά χιλιόμετρα. Πολλά από τα κυκλαδίτικα νησιά είχαν και αυτά ενωθεί σχηματίζοντας ενιαία περιοχή, η οποία σύμφωνα με τις περισσότερες απόψεις χωριζόταν από την ηπειρωτική Ελλάδα με μια ρηχή «τάφρο» πλάτους 10 km αλλά ενδέχεται να ήταν και ενωμένη με αυτή. Οι θαλάσσιες περιοχές μεταξύ Μικράς Ασίας και Ελλάδας,

αλλά και μεταξύ της Κρήτης και της ευρωπαϊκής και ασιατικής ενδοχώρας, είχαν κατά πολύ μειωθεί σε εύρος. Συνολικά, θα μπορούσε να θεωρηθεί πως η γεωγραφία στα τέλη της Παλαιολιθικής περιόδου χαρακτηρίζεται από εκτεταμένες παραλιακές πεδιάδες ιδιαίτερα στα βορειοδυτικά και βορειοανατολικά της χώρας, μια μεγάλη κυκλαδική χερσόνησο και μια συνολική μεγέθυνση της ελλαδικής ηπειρωτικής περιοχής με ταυτόχρονη μείωση του πλάτους του Αιγαίου. Θα μπορούσαμε να πούμε πως η ελληνική χερσόνησος είχε πολύ πιο «λεία» ακτογραμμή από τη σημερινή και πως το μέγεθός της ήταν αρκετά μεγαλύτερο. Η ανύψωση της στάθμης της θάλασσας που ξεκίνησε περί τα 15.000 ya, με την έναρξη της μεταπαγετώδους περιόδου, αποκατέστησε γύρω στα 9.000 ya την ακτογραμμή του ελλαδικού χώρου περίπου όπως είναι διαμορφωμένη και σήμερα. Μετά τα 9.000 ya, η στάθμη της θάλασσας ανέβηκε κατά ακόμα 30m και η εναπόθεση υλικών και ιζημάτων σχημάτισε τα δέλτα ποταμών και παραλιακές πεδιάδες. Σε γενικές γραμμές, τα όρια των ακτών μεταβλήθηκαν πολύ λίγο (Van Andel & Shakleton 1982, Shakleton et al. 1984, Demitzakis 1990, Westaway 1996).

Εικόνα 1-8: Παλαιογεωγραφικός χάρτης του ελλαδικού χώρου 18.000 ya. Απεικονίζονται τα όρια της ηπειρωτικής περιοχής και των νήσων κατά τη διάρκεια της χαμηλότερης στάθμης της θάλασσας στο τέλος της τελευταίας παγετώδους περιόδου.

1.6. Οργανισμός της Φυλογενετικής Μελέτης

Το γένος Cyrtocarenum Ausserer 1871 περιλαμβάνει δύο είδη: Cyrtocarenum cunicularium (Olivier 1811) και Cyrtocarenum grajum (CL Koch 1836). Και τα δύο αυτά είδη εμφανίζονται στην Ελλάδα. Η εξάπλωσή τους έξω από την Ελλάδα είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Τέσσερα είδη που έχουν αποδοθεί στο γένος --C. hellenum Doleschall (Ausserer 1871), C. ionicum (Saunders 1842), C. Lapidarium (Lucas 1853) και C. werneri Kulczynski 1903— τίθενται, συμφωνα με (Decae 1996), συνώνυμα με το C. cunicularium. Επίσης επιβεβαιώνεται η συνωνυμία του C. tigrinum (L. Koch 1867) και Cteniza orientalis (Ausserer1871) με το C. cunicularium.

Βασίλειο (Kingdom) Animalia Φύλο (Phylum) Arthropoda Υποφύλο (Subphylum) Chelicerata Οµοταξία (Class) Arachnida Υφοµοταξία (Subclass) Micrura Τάξη (Order) Araneae Υπόταξη (Suborder) Orthognatha - Mygalomorphae Υπεροικογένεια (Superfamily) Ctenizoidea Οικογένεια (Family) Ctenizidae Υποοικογένεια (Subfamily) Ctenizinae Γένος (Genus) Cyrtocarenum Είδος (Species) cunicularium

Πινακας 1-1: Συστηματική κατάταξη της αράχνης Cyrtocarenum cunicularium

1.6.1. Παλαιότερη Συστηματική Προσέγγιση του Γένους Cyrtocarenum

Μεταξύ 1811 και 1903, οκτώ είδη τοποθετήθηκαν στο γένος Cyrtocarenum Ausserer 1871. Από τότε δεν έχουν αποδοθεί νέα είδη στο γένος αυτό. Επτά είδη έχουν αναφερθεί από την βόρειο-ανατολική Μεσόγειο, και ένα είδος, το C.

33 rufidens Ausserer 1871, από τη Νότια Αφρική. Σύμφωνα με Simon 1903, το γένος Stasimopus εμπεριέχει το αφρικανικό είδος, έτσι περιορίζεται το εύρος των Cyrtocarenum στην Ελλάδα και τη δυτική Ανατολία. Η πρωτότυπη περιγραφη των επτά μεσογειακών ειδών Cyrtocarenum είναι γενικά σύντομη, βασισμένη σε ένα ή λίγα, μερικές φορές ανώριμα, δείγματα και πάντα περιορίζεται σε ένα μόνο φύλο (Decae !996). Οι Ausserer 1871 και Simon 1884 παρουσίασαν περιγραφές για τα έξι είδη Cyrtocarenum που αναγνωρίστηκαν στην εποχή τους. Και οι δύο συγγραφείς είχαν αναπόφευκτα να βασίσουν το έργο τους στο σχετικά περιορισμένο υλικό και στην αραιή πληροφορία που διέθεταν τότε. Μεταξύ του 1979 και του 1994 έχουν συλλεγεί εκτενώς δείγματα Cyrtocarenum στην Ελλάδα. Σύγκριση αυτού του νέου υλικού με τύπους και άλλα δείγματα παρόντα σε μεγάλες ευρωπαϊκές μουσειακές συλλογές δείχνει ότι το C. hellenum Doleschall (Ausserer 1871), C. ionicum (Saunders 1842), C. Lapidarium (Lucas 1853), C. tigrinum (L. Koch 1867), C. werneri (Kulczynski 1903) και Cteniza orientalis (Ausserer 1871) είναι όλα συνώνυμα του C. cunicularium (Olivier 1811) και ότι το C. grajum (CL Koch 1836) είναι ένα ξεχωριστό είδος(Decae !996). Το Cytrocarenum περιγράφηκε από τον Ausserer (1871) να συνδέεται στενά αλλά να είναι διακριτό από τα γένη Cteniza Latreille (1829) και Aepycephalus Ausserer (1871). Σε μια συμπληρωματική σημείωση ο Ausserer (1871 :152) έδωσε έμφαση στην στενή σχέση μεταξύ Cteniza, Aepycephalus και Cytrocarenum. Το γενικό σχήμα της περιοχής της κεφαλής, η διαμόρφωση των ματιών και τα σχετικά μεγέθη των ματιών είχαν παρουσιαστεί σαν χαρακτηριστικά για να διακρίνουν τα τρία γένη, χωρίς ποσοτικοποίηση όμως, που θα μπορούσε να κάνει την επαλήθευση δυνατή. Επιπλέον, υπήρχαν σοβαροί λόγοι για να αμφισβητηθεί η ξεχωριστή κατάσταση των τριών γενών στην εργασία του Ausserer, ιδιαίτερα από την εμφανή προσωπική του σύγχυση, στο θέμα αυτό, όταν αυτός χαρακτήρισε το Cteniza Orientalis Ausserer 1871 και αναγνωρίστηκε μετέπειτα και από άλλους μελετητές (Roewer, 1942- Bonnet, 1956) σαν συνώνυμο με το C. Lapidarium (τώρα C. cunicularium). Η συνωνυμία αυτή επιβεβαιώνεται από τοn Decae εξετάζοντας τον τύπο του Ausserer C. orientalis var. mannii. Ο Simon το 1892 αναγνώρισε επίσης το Cteniza, το Aepycephalus και το Cyrtocarenum ως τρία διακριτά γένη, χρησιμοποιώντας διαφορές στην γενική διαμόρφωση των ματιών ως χαρακτήρες-κλειδιά (όχι τα σχετικά μεγέθη των ματιών όπως έκανε ο Ausserer). Επιπλέον ο Simon χρησιμοποίησε την μορφολογία της γνάθου για να διακρίνει το Cyrtocarenum τόσο από το Cteniza

οσο κι από το Aepycephalus. Tα χαρακτηριστικά που χρησιμοποίησε ο Simon είναι εξαιρετικά σταθερά εντός των ειδών του Cyrtocarenum και ως εκ τούτου είναι δυνητικά καλοί διαγνωστικοί χαρακτήρες. Η μορφολογία της γνάθου σε Cyrtocarenum ωστόσο, είναι σχεδόν πανομοιότυπη με αυτήν σε Cteniza και επομένως δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διακρίνει τα τρία γένη. Από την άλλη, οι διαφορές στο σχήμα των ματιών μεταξύ των τριών γενών φαίνεται να διακρίνονται. Κατά πόσο αυτές οι διαφορές πρέπει να θεωρηθούν ως οριστικές στα διαγνωστικά χαρακτηριστικά σε επίπεδο γένους μένει να διερευνηθεί (Decae et al 1982). H χωριστή ταυτότητα των τριών γενών αμφισβητήθηκε από τον Raven (1985: 142) ο οποίος δήλωνε ότι μόνο η περιορισμένη διαθεσιμότητα των δειγμάτων τον αποτρέπει από το να ισχυριστεί την συνωνυμία των Cteniza, Aepycephalus και Cyrtocarenum. Με βάση νέα δεδομένα Decae (2010) επιβεβαιώνεται η ξεχωριστή γενική κατάσταση των Cteniza και Cyrtocarenum λόγω απουσίας δομών σε πόδια αρσενικών Cteniza που εντοπίζονται στα Cyrtocarenum.

1.6.2. Αράχνες της Οικογένειας Ctenizidae

Οι αράχνες της οικογένειας Ctenizidae (Thorelli, 1887) (Εικόνα 1-9) ονομάζονται και αράχνες καταπακτών (trapdoor spiders), είναι μεσαίου μεγέθους και ανήκουν στα μυγαλόμορφα όπως και οι ταραντούλες με τις οποίες μοιράζονται αρκετά κοινά χαρακτηριστικά όπως είναι οι δάγκανες. Ο τρόπος πρόσληψης θηράματος και δημιουργίας κατοικίας τους είναι μοναδικός και δεν συναντάται σε κανένα άλλο αραχνοειδές. Πολλά είδη αραχνοειδών σκάβουν λαγούμια επενδύοντας τα με μετάξι, αλλά κανένα δεν χρησιμοποιεί τον εκπληκτικό μηχανισμό που χρησιμοποιούν οι αράχνες καταπακτών . Στο λαγούμι (Εικόνα 1-10) που σκάβουν χτίζουν μια καταπακτή στην είσοδο της φωλιάς με ιστό, χώμα και πολλές φορές αλλά υλικά (κλαράκια, πέτρες, βρύα) η οποία κλείνει όταν η αράχνη βρίσκεται μέσα με αποτέλεσμα να είναι αδύνατο να εντοπιστεί από θηρευτές και θηράματα. Οι αράχνες που είναι συνήθως νυκτόβια ζώα αναμένουν το θήραμά τους (έντομα, άλλα αρθρόποδα ή μικρά σπονδυλωτά) στο κλειστό και καλά καμουφλαρισμένο λαγούμι τους κι όταν το αντιλαμβάνονται από τις

δονήσεις του εδάφους, μετρώντας αν το μέγεθος του ζώου που περνάει ανυποψίαστο έξω από την φωλιά είναι κατάλληλο για γεύμα, πηδάνε από το λαγούμι και το αρπάζουν με τις δαγκάνες τους. Ένας από τους μεγαλύτερους εχθρούς της αράχνης καταπακτής είναι η σφήκα της οικογένειας Pompilidae, η οποία αφού εισέλθει στο λαγούμι εναποθέτει τα αυγά της, με τσίμπιμα, στο σώμα της αράχνης από το οποίο τρέφονται έπειτα οι προνύμφες.

Εικόνα 1-9: Αράχνη καταπακτής του γένους Cyrtocarenum.

Εικόνα 1-10: Φωλιές από αράχνες Ctenizidae.

Οι αράχνες καταπακτής χρησιμοποιούν την ιδιά φωλιά που χτίζουν από μικρές μέχρι το τέλος της ζωής τους. Οι θηλυκές δεν φεύγουν ποτέ μακριά από τη φωλιά τους, ειδικά όταν έχουν αυγά. Διαφέρουν από άλλες αράχνες της κατηγορίας μυγαλόμορφα καθώς φέρουν μία σειρά από σκληρές ακάνθους (rastellum) που τις βοηθάνε στο σκάψιμο και την κατασκευή των φωλιών. Οι Ctenizidae ταξινομούνται σε 9 γένη (Πίνακας 1-2) που περιλαμβάνουν 120 είδη και συναντώνται σε ζεστά μέρη ανά την υφήλιο (Εικόνα 1-11) καθώς και σε σε μεγάλο αριθμό σε όλη την Ελλάδα, όπου υπάρχει χώμα (ακόμα και στον κήπο), αλλά η εύρεση τους είναι αρκετά δύσκολη λόγω του καμουφλάζ της φωλιάς τους. Ο ευκολότερος τρόπος να εντοπιστούν είναι όταν έχει βρέξει ή όταν το χώμα είναι ποτισμένο, διότι το έδαφος γίνεται μαλακό και γίνονται πιο ευδιάκριτα τα καπάκια από τις φωλιές τους.

Εικόνα 1-11: Περιοχές (με πράσινο) εξάπλωσης των αραχνών Ctenizidae

Bothriocyrtum Simon, 1891 USA, Mexico, Taiwan Cteniza Latreille, 1829 Europe, Central Asia Cyclocosmia Ausserer, 1871 USA to Guatemala, Thailand, China Cyrtocarenum Ausserer, 1871 Greece, Turkey Latouchia Pocock, 1901 Asia Stasimopus Simon, 1892 South Africa Conothele Thorell, 1878* Australian region Hebestatis Simon, 1903* Costa Rica, USA Ummidia Thorell, 1875* America, Mediterranean, Japan, Taiwan Πίνακας 1-2: Ταξινόμηση των αραχνών Ctenizidae και οι περιοχές εμφάνισής τους σύμφωνα με Raven (1985) *Τα γένη ανήκουν στην υποοικογένεια Pachylomerinae (Simon, 1889).

1.6.3. Κατανομή Cyrtocarenum στον Ελλαδικό Χώρο

Το γένος Cyrtocarenum (Ausserer, 1871) περιλαμβάνει δύο είδη: το

Cyrtocarenum cunicularium (Olivier, 1811) και το Cyrtocarenum grajum (C. L. Koch, 1836) που εμφανίζονται στην Ελλάδα και την Τουρκία (Εικόνα 1-12). Σύμφωνα με Decae (1996), παρατηρείται πολυμορφία στην ταξινόμηση και βιογεωγραφία του γένους στον ελλαδικό χώρο. Και τα δύο είδη εμφανίζονται συντοπικά στα Ιόνια νησιά, στα Κύθηρα και ίσως σε κάποιες ηπειρωτικές περιοχές (π.χ. Αττική). Αντίθετα, η εξάπλωσή τους στην Πελοπόννησο είναι εντελώς διαφορετική για τις περισσότερες περιοχές. Παρά την μικρή παρουσία του C. cunicularium στο Γύθειο, η περιοχή αυτή, όπως και όλη σχεδόν η Πελοπόννησος αποτελούν τόπο κατοικίας για το C. grajum. Εξαίρεση αποτελούν η βόρειο-ανατολική επαρχία της Αργολίδας και το Ναύπλιο όπου το C. cunicularium έχει αντικαταστήσει την παρουσία του C. grajum, καθώς επίσης και οι πλαγιές των βουνών του Πάρνωνα 23 χιλιόμετρα δυτικά του Ναυπλίου όπου συνυπάρχουν τα δύο είδη. Όσον αφορά την περιοχή της Κρήτης, τις Κυκλάδες και την Ρόδο, παρατηρείται αποκλειστική παρουσία του C. cunicularium. Πιθανή παρουσία του C. grajum αναφέρεται στη Σκόπελο των Σποράδων. Εικόνα 1-12: Περιοχές εμφάνισης C. cunicularium και C. grajum (Decae, 1996).

Corfu Skopelos

Athens Tinos Sakyntho s Nauplion

Syros Sifnos Paros

Milos Gythion Rhodos Kythir a

= C. cuniculariu m Crete = C. grajum

Από την παρούσα εξάπλωση των δύο ειδών προκύπτει ότι η κατανομή του γένους Cyrtocarenum δεν επηρεάζεται από τον διαειδικό ανταγωνισμό λόγω στενής συμβίωσης των ειδών στα Ιόνια νησιά και στα Κύθηρα και δύσκολα μπορεί να κατανοηθεί η εξάρτησή της από γεωγραφικές ή κλιματολογικές παραμέτρους. Ωστόσο, επειδή οι αράχνες καταπακτής σε γενικές γραμμές είναι μία εξελικτικά συντηρητική ομάδα, που συνδυάζουν πολύ κακή ικανότητα διασποράς με μεγάλη ικανότητα επιβίωσης, πιθανότατα η παρούσα κατανομή τους στον ελλαδικό χώρο να σχετίζεται με την παλαιογεωγραφική ανάπτυξη της τεκτονικά ταραχώδους περιοχής της Μεσογείου.

1.6.4. Χαρακτηριστικά της αράχνης C. cunicularium

Οι θηλυκές αράχνες C. cunicularium είναι χαμηλές με κοντά πόδια και ανάλογα της γεωγραφικής προέλευσης το χρώμα του κεφαλοθώρακά τους κυμαίνεται από καστανέρυθρο εώς ανοιχτό κιτρινωπό καφέ, ενώ της κοιλιάς από μωβ εώς γκρι. Ο κεφαλοθώρακάς τους έχει μήκος 6 – 11,7 mm. Οι αρσενικές είναι μικρότερες με μήκος κεφαλοθώρακα 5,8 – 8 mm, ωστόσο είναι ισχυρές αράχνες με μακριά πόδια. Το ταρσικό τμήμα των ποδοπροσακτρίδων τους παρουσιάζει μία διεύρυνση από την οποία προεξέχει το σύστημα σύζευξης. Έχουν γκριζωπή κοιλιά και από σκούρο εώς ανοιχτό καφέ κεφαλοθώρακα. Στην εικόνα 1-13 φαίνονται τα βασικά ανατομικά τμήματα αραχνών της οικογένειας Ctenizidae. Σύμφωνα με Decae (1996), τα χαρακτηριστικά των C. cunicularium που τις ξεχωρίζουν από τις υπόλοιπες Ctenizidae είναι τα εξης:  Αναλογία πλάτος/ύψος στην διαμόρφωση της περιοχής των ματιών (Εικόνα 1-14α). Ο λόγος αυτός στις C. cunicularium είναι μεγαλύτερος του 2,5.  Παρουσία μονής σειράς ακάνθων στην κνήμη των ποδοπροσακτρίδων (Εικόνα 1-14β).  Οι πόροι στις μεσαίες αράχνιες θηλές συγκεντρώνονται σε διακριτές ομάδες σχήματος V στα ενδιάμεσα και τερματικά τμήματα (Εικόνα 1-14γ).  Η σπερματοθήκη στις θηλυκές αράχνες έχει σχήμα μανιταριού και φέρει παχύ δακτυλοειδές τοίχωμα από αδενικό ιστό (Εικόνα 1-14δ).  Παρουσία περιοχής στην κνήμη II κοντά στο μεταταρσίο με πολύ κοντά

αγκάθια (τα αντίστοιχα στο C. grajum είναι μεγαλύτερα) (Εικόνα 1-14ε).  Στα θηλυκά άτομα η περιοχή της κνήμης IV κοντά στην επιγονατίδα δεν φέρει αγκάθια, ενώ το μεταταρσίο IV κοντά στην κνήμη φέρει ένα αγκάθι.  Στα αρσενικά άτομα μεταξύ μεταταρσίου I και κνήμης I σχηματίζεται χαρακτηριστικό άγκιστρο (Εικόνα 1-14στ) (στο C. grajum σχηματίζονται τρία τέτοια άγκιστρα).  Οι ποδοπροσακτρίδες στις αρσενικές C. cunuicularium είναι φανερά επιμηκυσμένες σε σχέση με άλλες Ctenizidae (π.χ. C. grajum).

Εικόνα 1-13: Εξωτερική μορφολογία (κοιλιακή όψη) από θηλυκή αράχνη

α β γ

δ ε στ

Εικόνα 1-14(α-στ): Χαρακτηριστικές ανατομικές δομές C. cunicularium.

1.7. Σκοπός της Διπλωματικής Εργασίας

Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε πληθυσμιακή ανάλυση ενός μεγάλου αριθμού δειγμάτων της αράχνης C. cunicularium, καλύπτοντας ένα εκτεταμένο δίκτυο δειγματοληψίας, κυρίως από περιοχές της Κρήτης, καθώς και διάφορες περιοχές από την υπόλοιπη Ελλάδα. Η μελέτη στηρίχθηκε στην ανάλυση μοριακών δεικτών του μιτοχονδριακού DNA. Βασικός σκοπός της μελέτης είναι ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων και έλεγχος γονιδιακής ροής, μεταξύ των περιοχών δειγματοληψίας C. cunicularium. Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης, επιχειρήθηκε η εκτίμηση του βαθμού απομόνωσης και του παράγοντα επιρροής της κατανομής των πληθυσμών της αράχνης, ο έλεγχος της πιθανότητας να υπάρχει γεωγραφική δομή στο πρότυπο της εξάπλωσής τους, καθώς επίσης και τυχόν προσδιορισμός κρυπτικών ειδών εντός των πληθυσμών.

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1. Συλλογή Δειγμάτων

Το μεγαλύτερο ποσοστό των δειγμάτων που μελετήθηκαν στην παρούσα διπλωματική εργασία προέρχονται από συλλογή της Δρ. Μαρίας Αλεξίου-Χατζάκη και καλύπτουν μεγάλο εύρος περιοχών της Κρήτης. Δείγματα που καλύπτουν υπόλοιπες περιοχές της Ελλάδας προέρχονται από συλλογή του Arthur E. Decae και διατηρούνταν για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα σε διάλυμα 80% κατ’ όγκο αιθανόλης, πράγμα που ίσως επέφερε, σε συνδυασμό με λάθος πειραματικούς χειρισμούς του πρωτοκόλλου, τα αναμενόμενα αρνητικά αποτελέσματα στο στάδιο εξαγωγής του ολικού DNA. Αξίζει να σημειωθεί πως, στην περίπτωση των αρθροπόδων γενικά, όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό αλκοόλης στο διάλυμα όπου διατηρούνται τα δείγματα τόσο καλύτερη είναι η ποιότητα του DNA που λαμβάνεται. Για την συλλογή τέτοιου είδους δειγμάτων χρησιμοποιούνται, συνήθως, παγίδες παρεµβολής (pitfall traps) (Duelli et al, 1999), οι οποίες έχουν μεγάλη επιτυχία, γενικά, σε δειγµατοληψίες εδαφόβιων αρθροπόδων (Κολλάρος et al, 2001). Η εγκυρότητα των αποτελεσµάτων εξαρτάται από τη σταθερότητα του αριθµού των παγίδων, της συντηρητικής ουσίας που περιέχουν, της µέσης απόστασης µεταξύ τους και του τρόπου που εφαρµόζουν στο έδαφος (Τριχάς, 1996). Οι παγίδες παρεμβολής είναι μια ημιποσοτική μέθοδος που στηρίζεται στη δραστηριότητα - αφθονία των οργανισμών καθώς αυτά κινούνται μέσα στο ενδιαίτημά τους. Η αποτελεσµατικότητα των παγίδων παρεµβολής επηρεάζεται από το µέγεθος του πληθυσµού, αλλά γενικότερα, ο αριθµός των ατόµων που παγιδεύονται εξαρτάται από (Κολλάρος et al., 2001):  την πυκνότητα του πληθυσμού,  την κινητικότητα των οργανισµών,  το σχήµα και το µέγεθος του χείλους της παγίδας και  το υλικό από το οποίο είναι κατασκευασµένα τα δοχεία.

2.2. Εργαστηριακές Τεχνικές

Οι εργαστηριακές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο Οικολογίας και Διατήρησης της Βιοποικιλότητας στο τμήμα Μοριακης Βιολογίας και Γενετικής του Δημοκριτείου Πανεπιστημίου Θράκης υπό την επίβλεψη της Δρ. Μαρίας Αλεξίου – Χατζάκη. Κατά την διάρκεια των πειραμάτων ελήφθησαν όλες οι απαραίτητες προφυλάξεις, τόσο για την ασφάλεια του ερευνητή και του εξοπλισµού που χρησιµοποιήθηκε, όσο και για την αποφυγή µολύνσεων των δειγµάτων που θα οδηγούσαν σε λανθασµένα αποτελέσµατα (γάντια, αποστείρωση των υλικών, καθαρισµός του πάγκου εργασίας µετά το πέρας των εργασιών κ.α.).

2.2.1. Εξαγωγή Ολικού DNA

Οι μέθοδοι απομόνωσης του DNA στηρίζονται στην εκπληκτική σταθερότητά του σε επίδραση χημικών. Η χημική αδράνεια του DNA εξηγείται από τη δομή του. Οι δραστικές χημικές ομάδες των οργανικών βάσεων βρίσκονται στο εσωτερικό της διπλής έλικας και η όλη δομή προφυλάσσεται από τις φωσφορικές ομάδες και τα σάκχαρα στο εξωτερικό. Έτσι, είναι δυνατό να απομονωθεί επιτυχώς DNA από ευκαρυωτικά κύτταρα αρχαίων ευρημάτων και από κατεστραμμένα δείγματα εγκληματολογίας. Παρόλα αυτά, υπάρχουν και προβλήματα όσον αφορά την απομόνωση, τα οποία σχετίζονται, για παράδειγμα, με τη δράση ενδογενών νουκλεασών, οι οποίες όμως εύκολα μπορούν να απενεργοποιηθούν, καθώς και με την ευαισθησία που παρουσιάζει στις υδροδυναμικές δυνάμεις διάτμησης που εμφανίζονται λόγω της αδράνειας του μορίου, ακόμα και στην πιο ήπια ανάδευση. Υπάρχουν διάφορα πρωτόκολλα απομόνωσης DNA, ωστόσο οι πιο σημαντικές παράμετροι που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη σε κάθε περίπτωση, κατά την απομόνωση είναι οι εξής:  Το είδος των κυττάρων από τα οποία θα γίνει η απομόνωση.  Ο χρόνος αποθήκευσης.  Η χρήση του DNA μετά την απομόνωσή του.

Στην παρούσα μελέτη για την απομόνωση του DNA από τα δείγματα C. cunicularium χρησιμοποιήθηκε το παρακάτω πρωτόκολλο που βασίζεται στο διάλυμα εξαγωγής CTAB:  Ομογενοποίηση του ιστού με λειοτριβή στα πόδια ή τομές στο κεφαλοθώρακα κι έπειτα πλήρες στέγνωμα.  Προσθήκη 500 μl διαλύματος εξαγωγής CTAB το οποίο περιέχει:  2% CTAB (hexadecyl trimethyl-ammonium bromide)  100 mM TrisHCl [pH=8] (ethylenediaminetetra acetic acid di- sodium salt)  20 mM EDTA  1.4 M NaCl  Επώαση για 10 λεπτά σε υδατόλουτρο στους 60 βαθμούς κελσίου.  Προσθήκη 10 μg πρωτεϊνάσης Κ η οποία διασπά τις πρωτεΐνες.  Επώαση στους 60 βαθμούς κελσίου για 3-4 ώρες ή όλη νύχτα (έπειτα από το στάδιο αυτό τα δείγματα μπορούν να φυλαχθούν στους -20 βαθμούς κελσίου).  Προσθήκη 500μl χλωροφορμίου (CHCl3) και φυγοκέντριση για 15 λεπτά στις 13000 στροφές/λεπτό.  Τοποθέτηση υπερκειμένου σε νέα eppendorfs.  Προσθήκη 500μl χλωροφορμίου ή φαινόλης και φυγοκέντριση για 8 λεπτά στις 13000 στροφές/λεπτό.  Τοποθέτηση υπερκειμένου σε νέα eppendorfs.  Προσθήκη 500μl χλωροφορμίου και φυγοκέντριση για 8 λεπτά στις 13000 στροφές/λεπτό.  Τοποθέτηση υπερκειμένου σε νέα eppendorfs.  Προσθήκη 1000μl ισοπροπανόλης (παγωμένης) και ανάδευση σε μηχάνημα Vortex (στην φάση αυτή μέσα στο eppendorf παρατηρείται DNA σε μορφή ‘’κλωστής’’).  Διατήρηση δειγμάτων για τουλάχιστον μισή ώρα στους -20 βαθμούς κελσίου.  Φυγοκέντριση για 20 λεπτά στις 13000 στροφές/λεπτό.  Προσεκτική αποβολή του υπερκειμένου (διατήρηση του καθισμένου DNA στον πάτο του Eppendorf).  Προσθήκη 1000μl παγωμένης αιθανόλης σε συγκέντρωση 70% κατ’ όγκο και φυγοκέντριση για 15 λεπτά στις 13000 στροφές/λεπτό.  Προσεκτική αποβολή του υπερκειμένου (αιθανόλης) και διατήρηση των ιζιματοποιημένων δειγμάτων (με ανοιχτά τα καπάκια των eppendorfs) για τουλάχιστον 12 ώρες στους 37 βαθμούς κελσίου.

 Τέλος, διάλυση του DNA με προσθήκη 50μl dH2O (σε θερμοκρασία δωματίου για 3-4 ώρες ή στον κλίβανο για 2-3 ώρες) και διατήρηση των δειγμάτων στην κατάψυξη.

Το ολικό DNA, που έχει εξαχθεί μετά την επιτυχημένη ολοκλήρωση των σταδίων που περιγράφονται παραπάνω, είναι έτοιμο για χρήση σε οποιαδήποτε ενζυματική αντίδραση όπως είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Για τον έλεγχο της ποσότητας και ποιότητας των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εργαστηριακές τεχνικές:  Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Συνήθως παρασκευάζονταν πήκτωμα με 70 ml TBE και προσθήκη 0,7gr αγαρόζης και 4μl βρωμιούχο αιθίδιο.  Μέτρηση της συγκέντρωσης DNA με το φασματοφωτόμετρο Nanodrop που χρειάζεται μόλις 1μl διαλύματος DNA και το κατάλληλο λογισμικό στον υπολογιστή για να απεικονίσει την φασματοφωτομετρική καμπύλη.

2.2.2. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction – PCR) (Mullis et al. 1986, Mullis & Faloona 1987). Πρόκειται για μια τεχνική η οποία επιτρέπει την παραγωγή μεγάλου αριθμού αντιγράφων μιας συγκεκριμένης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο μια πιο σύνθετη αλληλουχία DNA, και όλα αυτά σε μια ενζυμική αντίδραση. Είναι, δηλαδή, μια μέθοδος η οποία χρησιμεύει στον in vitro πολλαπλασιασμό του DNA. Εξαιτίας της απλότητάς της, η PCR είναι μια δημοφιλής τεχνική, με μεγάλο εύρος εφαρμογών, οι οποίες περιλαμβάνουν την άμεση αλληλούχιση, την κλωνοποίηση γονιδίων, καθώς και την ανάλυση αλληλουχιών αλληλομόρφων (Erlich et al. 1991, Strachan & Read 1999). Όλες αυτές οι εφαρμογές στηρίζονται ουσιαστικά σε τρία μεγάλα πλεονεκτήματα που εμφανίζει η μέθοδος, τα οποία έχουν ως εξής:  Ταχύτητα και ευκολία στη χρήση. Η κλωνοποίηση του DNA μέσω της PCR μπορεί να πραγματοποιηθεί σε σχετικά μικρό χρονικό διάστημα ορισμένων ωρών. Πρόκειται, σαφώς, για διαδικασία πιο γρήγορη από την κλωνοποίηση με πλασμίδια, για παράδειγμα, η οποία μπορεί να διαρκέσει ακόμη και βδομάδες. Επιπροσθέτως, τα υλικά που χρησιμοποιούνται είναι ασφαλή (χωρίς ραδιενεργά

ισότοπα) και ο εξοπλισμός σχετικά απλός. Εμπόδια μπορεί να παρουσιάσουν οι απαιτούμενες αποστειρωμένες συνθήκες, η σχεδίαση και σύνθεση των κατάλληλων εκκινητών, καθώς και η δημιουργία του κατάλληλου προγράμματος για την εκάστοτε αντίδραση. Όλα αυτά όμως μπορούν να αντιμετωπιστούν σχετικά εύκολα πλέον.  Ευαισθησία. Με την PCR μπορεί κανείς να πολλαπλασιάσει αλληλουχίες από τμήματα DNA τα οποία έχουν υποστεί εκτεταμένη αποικοδόμηση, ακόμα και από ιστούς οι οποίοι διατηρούνται σε παραφίνη ή φορμαλδεΰδη. Επίσης, δίνεται η δυνατότητα πολλαπλασιασμού αλληλουχιών έχοντας ως βάση πολύ μικρές ποσότητες DNA στόχου, ακόμα και DNA προερχόμενο από ένα κύτταρο. Η εξαιρετική αυτή ευαισθησία έχει ανοίξει το δρόμο σε νέες μεθόδους μοριακής παθογένεσης και έχει βρει πολυάριθμες εφαρμογές, από τις παλαιοντολογικές μελέτες, έως τις εγκληματολογικές έρευνες. Εντούτοις, η ευαισθησία της μεθόδου απαιτεί μεγάλη προσοχή για την αποφυγή μολύνσεων από εξωγενές γενετικό υλικό.

2.2.2.1. Τα Συστατικά της PCR

Το χημικό «περιβάλλον» μιας αντίδρασης PCR είναι πολύ σημαντικό για την ειδικότητα και την αποτελεσματικότητα του πολλαπλασιασμού. Ένα καλό σημείο εκκίνησης για τα συστατικά που πρέπει να χρησιμοποιηθούν προτείνεται από τον προμηθευτή του ενζύμου, ώστε οι συνθήκες να είναι όσο το δυνατό κατάλληλες για τη δράση του. Σε γενικές γραμμές, σε ένα τυπικό διάλυμα PCR είναι απαραίτητα τα εξής:  Αλληλουχία μήτρα (template DNA). Πρόκειται για μια μικρή αρχική ποσότητα DNA η οποία περιλαμβάνει την αλληλουχία που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε.  DNA πολυμεράση (Taq). Η Taq πολυμεράση είναι μια θερμοσταθερή DNA πολυμεράση, η οποία πήρε το όνομά της από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus, από το οποίο και απομονώθηκε πρώτη φορά από τους Chien et al. (1976). Θεωρείται πως είναι ένα ένζυμο ικανό να αντέχει τις υψηλές θερμοκρασίες που αναπτύσσονται σε μια αντίδραση PCR, οι οποίες μπορούν να αποδιατάξουν μια πρωτεΐνη. Έτσι αντικατέστησε την πολυμεράση του E.coli που χρησιμοποιούνταν αρχικά στην PCR (Saiki et al. 1985). Η βέλτιστη θερμοκρασία για τη δράση του ενζύμου είναι μεταξύ

72˚C και 75˚C. Ο χρόνος ημιζωής είναι τα 9 λεπτά στους 97,5˚C και μπορεί να αντιγράψει έναν κλώνο 1000 βάσεων σε λιγότερο από 10 δευτερόλεπτα στους 72˚C, ενώ η συχνότητα λαθών είναι 1/9000 νουκλεοτίδια. Έτσι, η Taq προστίθεται μια φορά στην αρχή της αντίδρασης και παραμένει ενεργή καθ’ όλη τη διάρκειά της.  Εκκινητές (primers). Πρόκειται για συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, τα οποία ονομάζονται εκκινητές, επειδή χρησιμοποιούνται στην αντίδραση για να καθορίσουν το σημείο έναρξης της σύνθεσης του DNA σε συγκεκριμένα σημεία πάνω στην αρχική αλληλουχία. Χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικοί εκκινητές (ζεύγος εκκινητών), οι οποίοι σχεδιάζονται με τέτοιο τρόπο ώστε να προσδένονται σε διαφορετικές αλυσίδες, και η κατεύθυνσή τους είναι τέτοια που να επιτρέπει την αντιγραφή του τμήματος που βρίσκεται ανάμεσά τους. Το μήκος τους κυμαίνεται από 18 έως 30 ζεύγη βάσεων, ενώ όσο μεγαλύτερο είναι το μήκος τόσο αυξάνεται και η ειδικότητα πρόσδεσης. Η περιεκτικότητα σε G-C πρέπει να κυμαίνεται από 40- 60%, καθώς εκκινητές πλούσιοι σε G-C είναι πιο ανθεκτικοί σε υψηλές θερμοκρασίες υβριδισμού, ωστόσο είναι πιο επιρρεπείς σε αυτο-υβριδισμό. Επιπλέον, είναι σημαντικό τα σημεία τήξης των δύο εκκινητών να έχουν παρόμοιες τιμές (συνήθως μεταξύ 45˚C και 60˚C), ώστε να μπορεί να υπολογιστεί μια μέση τιμή θερμοκρασίας υβριδισμού. Τέλος, οι εκκινητές πρέπει να σχεδιάζονται έτσι ώστε να αποφεύγεται ο σχηματισμός τόσο ομοδιμερών όσο και ετεροδιμερών μεταξύ τους, καθώς και ο σχηματισμός δευτεροταγούς δομής (π.χ. βρόγχοι).  dNTPs. Πρόκειται για ένα διάλυμα ελεύθερων 5’ τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων, το οποίο περιλαμβάνει ίση συγκέντρωση καθενός εκ των dATP, dTTP, dCTP και dGTP, τα οποία αποτελούν τους δομικούς λίθους των νεοσυντιθέμενων DNA κλώνων.  MgCl2. Πρόκειται για διάλυμα MgCl2 το οποίο παρέχει στην αντίδραση τα ιόντα Mg2+ που δρουν ως προσθετική ομάδα και είναι απαραίτητα για τη δράση του ενζύμου. Τα ιόντα Mg2+ προωθούν τις DNA/DNA αλληλεπιδράσεις και σχηματίζουν σύμπλοκα με τα dNTPs που είναι το υπόστρωμα για την πολυμεράση. Η απόδοση της αντίδρασης εξαρτάται άμεσα από τη συγκέντρωση των ιόντων, εφόσον όταν αυτή είναι πολύ μικρή, οι εκκινητές δεν προσδένονται στο DNA στόχο, ενώ όταν είναι πολύ μεγάλη, το ζευγάρωμα των βάσεων γίνεται τόσο ισχυρό που τα νέα

δίκλωνα τμήματα δεν μπορούν να αποδιαταχθούν πλήρως ακόμα και στους 94˚C (Williams 1989).

 Ρυθμιστικό διάλυμα (reaction buffer). Πρόκειται για ένα διάλυμα το οποίο παρέχει τις κατάλληλες συνθήκες για τη δράση του ενζύμου και αυτό λόγω των συστατικών του. Το περιεχόμενο του ρυθμιστικού διαλύματος μπορεί να ποικίλλει, ανάλογα με την παρασκευάστρια εταιρία, σε γενικές γραμμές όμως περιλαμβάνει Tris-HCl, το οποίο βοηθά στη ρύθμιση του pH, KCl (άλας) το οποίο διευκολύνει τον υβριδισμό των εκκινητών και επιταχύνει τη σύνθεση του συμπληρωματικού κλώνου, καθώς και κάποιο απορρυπαντικό (μη ιονικό), όπως το Triton X-100, το Tween 20 ή το NP-40, που σταθεροποιεί την πολυμεράση (εξουδετερώνοντας την όποια ποσότητα SDS έχει παραμείνει από την απομόνωση του DNA) και αποτρέπει τη δημιουργία δευτεροταγών δομών. Τέλος, το ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να περιλαμβάνει ιόντα Mg2+, οπότε στην περίπτωση αυτήδεν είναι απαραίτητη η προσθήκη MgCl2.  ddH2o. Πρόκειται για διπλά αποστειρωμένο νερό, το οποίο προστίθεται στο μείγμα, ύστερα από τον υπολογισμό του όγκου των παραπάνω διαλυμάτων, για να συμπληρώσει τον τελικό όγκο της αντίδρασης, ο οποίος φτάνει τα 50μl.  Άλλα συστατικά. Σε ορισμένες περιπτώσεις είναι δυνατή η προσθήκη και άλλων συστατικών, όπως είναι για παράδειγμα το BSA (αλβουμίνη ορού βοός), το οποίο σταθεροποιεί την πολυμεράση, το DMSO, το φορμαμίδιο και η γλυκερόλη (μη τοξική), που αυξάνει την εξειδίκευση της αντίδρασης μειώνοντας το δραστικό Tm των εκκινητών. Το DMSO επίσης αποτρέπει το σχηματισμό δευτεροταγών δομών του μηχανισμού στόχου.

Η αντίδραση πραγματοποιείται με τη βοήθεια ενός προγραμματιζόμενου θερμικού κυκλοποιητή (PCR thermal cycler).

2.2.2.2. Τα Στάδια της PCR

Μια αντίδραση PCR περιλαμβάνει τρία διακριτά στάδια (Εικόνα 2-1), τα οποία έχουν ως εξής:  1ο στάδιο: Αποδιάταξη (Denaturation). Στο στάδιο αυτό, η αυξημένη θερμοκρασία χρησιμοποιείται για την αποδιάταξη των δίκλωνων τμημάτων DNA σε μονόκλωνα όπου θα υβριδιστούν οι

εκκινητές, καθώς και για την παύση όλων των ενζυμικών αντιδράσεων (όπως η σύνθεση των νέων κλώνων που λαμβάνει χώρα στο στάδιο της επιμήκυνσης, εφόσον τα 3 στάδια επαναλαμβάνονται). Συνήθως, η θερμοκρασία που χρησιμοποιείται είναι οι 94˚C, ωστόσο σε ορισμένα πρωτόκολλα προτείνονται οι 92˚C. Εάν η θερμοκρασία είναι χαμηλή, ή εάν η χρονική διάρκεια του σταδίου αυτού είναι μικρή, είναι δυνατό να αποτύχει η πλήρης αποδιάταξη γενωμικού DNA μεγάλου μοριακού βάρους. Έτσι προτείνεται το στάδιο της αποδιάταξης στην αρχή της αντίδρασης να είναι μεγαλύτερης διάρκειας, γιατί σε αυτό το σημείο είναι απαραίτητο να γίνει πλήρης αποδιάταξη.  2ο στάδιο: Υβριδισμός (Annealing). Στο στάδιο αυτό η θερμοκρασία μειώνεται ώστε να πραγματοποιηθεί ο υβριδισμός των εκκινητών με τις μονόκλωνες πλέον αλυσίδες DNA. Η κατάλληλη θερμοκρασία υπολογίζεται με βάση το σημείο τήξης των εκκινητών και κυμαίνεται μεταξύ 40˚C και 60˚C, καθώς και από το κατά πόσο οι εκκινητές είναι ειδικοί για την αλληλουχία που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε. Συνήθως, όσο πιο μεγάλη η εξειδίκευση τόσο περισσότερο μπορεί να αυξηθεί η θερμοκρασία υβριδισμού (μέσα στα επιτρεπτά πάντα όρια). Τόσο λοιπόν η θερμοκρασία όσο και η χρονική διάρκεια του σταδίου, προσδιορίζονται με δοκιμές, ώστε να βρεθεί ο κατάλληλος συνδυασμός ανάλογα με την αλληλουχία στόχο.  3ο στάδιο: Επιμήκυνση (Extension). Στο στάδιο η θερμοκρασία ανεβαίνει στους 72˚C, που είναι και η βέλτιστη θερμοκρασία για τη δράση της Taq, η οποία καθοδηγεί την επιμήκυνση των εκκινητών, με την προσθήκη των κατάλληλων dNTPs, βάσει της αλληλουχίας που χρησιμοποιείται ως μήτρα, συνθέτοντας έτσι τους νέους κλώνους. Η χρονική διάρκεια του σταδίου αυτού εξαρτάται από τη δράση του ενζύμου.

Μετά το τέλος και του 3ου σταδίου, έχει πλέον ολοκληρωθεί ο πρώτος κύκλος της αντίδρασης, οπότε και έχουμε δύο θυγατρικές δίκλωνες αλυσίδες DNA. Η εναλλαγή των σταδίων συνεχίζεται για περισσότερους κύκλους (συνήθως 30-35), ενώ τα μόρια-στόχοι παράγονται από τον 3ο κύκλο και μετά. Στο τέλος n κύκλων η αντίδραση θα δώσει θεωρητικά 2n δίκλωνα μόρια DNA, αντίγραφα της αρχικής αλληλουχίας που βρίσκεται μεταξύ των σημείων υβριδισμού των εκκινητών. Πιο συγκεκριμένα ο αριθμός των τελικών δίκλωνων μορίων αντιστοιχεί σε (2n – 2n)x, όπου n= ο αριθμός των κύκλων, 2n= τα δίκλωνα μόρια με ακαθόριστο μήκος και

50 x= ο αριθμός των αντιγράφων της αρχικής αλληλουχίας. Στο τέλος κάθε αντίδρασης, για να ολοκληρωθεί η επιμήκυνση σε όλες τις μονόκλωνες περιοχές, πραγματοποιείται ένα τελικό βήμα επιμήκυνσης στους 72˚C, συνήθως για 5-10 λεπτά.

Εικόνα 2-1: Σχηματική απεικόνιση μιας αντίδρασης PCR. Στην εικόνα παρουσιάζονται οι τρεις πρώτοι κύκλοι και τα νέα δίκλωνα μόρια που παράγονται. (Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings).

2.2.2.3. Γενετικός Τόπος COI Για την διεκπεραίωση της παρούσας εργασίας προγματοποιήθηκε, με την μέθοδο της PCR, ο πολλαπλασιασμός του μιτοχονδριακού γονιδίου της κυτοχρωμικής οξειδάσης 1 (COI), χρησιμοποιώντας ως ανοδικό (upstream) εκκινητή τον LCO1490 (Folmer et al, 1994) και καθοδικό (downstream) τον C1-N-2191 (nancy) (Simon et al, 1994). Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' και 5'- CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3' αντίστοιχα. Το γονίδιο CO1 είναι

παρόν σε εκατοντάδες αντίγραφα ανά κύτταρο, δεν εμπεριέχει ενθέσεις ή ελλείμματα και όπως κάθε γονίδιο που κωδικοποιεί για πρωτεΐνες, η τρίτη θέση των κωδικονίων παρουσιάζει μεγάλο ρυθμό νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων. Αλλαγές στην αμινοξική του αλληλουχία εμφανίζονται πιο αργά από κάθε άλλο μιτοχονδριακό γονίδιο, βοηθώντας στη διερεύνηση μεγαλύτερων ταξινομικών λεπτομερειών και στον ευκολότερο σχεδιασμό εκκινητών. Τα συστατικά και τα στάδια της PCR περιγράφονται στους πίνακες 2-1 και 2-2 αντίστοιχα:

Πίνακας 2-1: Αντιδραστήρια και Συνθήκες PCR για συνολικό όγκο μείγματος 25 μl. Αντιδραστήριο Stock Τελική Χρησιμοποιήθηκε Συγκέντρωση (μl) Ρυθμιστικό 10X 1X 2,5 διάλυμα MgCl2 50 μM 5 μΜ 2,5 dNTPs 10 μΜ 0,2 μΜ 0,5 LCO1490 10 μΜ 0,4 μΜ 1 Nancy 10 μΜ 0,4 μΜ 1 Taq 5 u/μl 0,02 μΜ 0,2 πολυμεράση DNA 2 ddH2O 17,3

Πίνακας 2-2: Συνήθης κατανομή κύκλων PCR. Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος Προεπώαση 94 °C 5’ Αποδιάταξη 94 °C 30’’ Υβριδισμός 38 °C 40’’ Επιμήκυνση 72 °C 45’’ Αριθμός κύκλων 10 Αποδιάταξη 94 °C 30’’ Υβριδισμός 40 °C 40’’ Επιμήκυνση 72 °C 45’’ Αριθμός κύκλων 30 Τελική επιμήκυνση 72 °C 5’ Αναμονή 4 °C -

2.2.3. Ηλεκτροφόρηση σε Πήκτωμα Αγαρόζης

Πολλά βιολογικά µόρια, όπως είναι το DNA, φέρουν ιοντιζόµενες ομάδες και έτσι μπορεί να υπάρξουν σε διάλυμα υπό τη μορφή ηλεκτρικά φορτισμένων µορίων, είτε ως κατιόντα (+) είτε ως ανιόντα (-). Επιπλέον µόρια µε παρόμοιο φορτίο θα έχουν διαφορετικά µοριακά βάρη. Σε συνδυασμό, οι δυο αυτές διαφορές συνιστούν επαρκή βάση για τη διαφοροποιημένη μετανάστευση όταν τα ιόντα που βρίσκονται εντός διαλύματος εκτίθενται σε ηλεκτρικό πεδίο. Η ηλεκτροφόρηση ορίζεται ως η μετακίνηση µορίων υπό την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου. Η βασικότερη μέθοδος ανάλυσης και διαχωρισμού των μορίων DNA σε ηλεκτρικό πεδίο, ανάλογα με το μοριακό βάρος τους, είναι η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης (agarose gel electrophoresis). Η αγαρόζη έχει εξαιρετική ικανότητα να σχηματίζει πηκτώματα, τα οποία εμφανίζουν πολύ καλές διαχωριστικές ικανότητες. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ταχύτητα των μορίων DNA είναι διάφοροι. Ο πιο σημαντικός είναι το μήκος του DNA, εφόσον όσο πιο μικρό είναι το μόριο τόσο γρηγορότερα γίνεται η μεταφορά κατά μήκος του πηκτώματος. Σημαντική όμως, είναι και η τρισδιάστατη διαμόρφωση του DNA, η συγκέντρωση και ο τύπος της αγαρόζης, η τάση του ηλεκτρικού πεδίου και άλλα. Υπάρχουν δηλαδή διάφορες παράμετροι οι οποίες πρέπει να ληφθούν υπόψη για το σωστό διαχωρισμό του DNA σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. Στην παρούσα εργασία, η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε σε δύο φάσεις (Εικόνα 2-2) και σε συγκέντρωση αγαρόζης 1% βάρος κατ’όγκο. Αρχικά μετά την απομόνωση του ολικού DNA, για να βεβαιωθεί ότι υπάρχει DNA σε ικανοποιητική συγκέντρωση, χωρίς προσμίξεις, με την παρουσία μιας ευκρινούς ζώνης. Έπειτα, μετά την ολοκλήρωση της PCR, η ύπαρξη μιας ευκρινούς ζώνης στο πήκτωμα δηλώνει την απουσία παραπροϊόντων, ενώ το μέγεθος των προϊόντων, καθώς και η ποιότητά τους, υπολογίζεται με τη βοήθεια ενός μάρτυρα, όπως ο GelPilot της Qiagen και ο DNA Ladder της GenScript. Οι μάρτυρες αυτοί δίνουν τη δυνατότητα προσδιορισμού τόσο της σχετικής συγκέντρωσης όσο και του μοριακού βάρους του DNA.

Εικόνα 2-2: Αριστερά φαίνεται το πρότυπο που προκύπτει από την απομόνωση ολικού DNA. Παρατηρείται μια φωτεινή ζώνη η οποία αντιστοιχεί στο ολικό DNA. Δεξιά φαίνεται το πρότυπο ζωνών των προϊόντων μιας αντίδρασης PCR. Στην τελευταία θέση του πηκτώματος διακρίνεται ο μάρτυρας.

2.3. Φυλογενετικές Αναλύσεις

Έπειτα από το στάδιο της PCR τα δείγματα απεστάλησαν για αλληλούχιση στη μονάδα Αλληλούχισης του τμήματος Ανοσολογίας ‐ Ιστοσυμβατότητας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας με επιβλέποντα τον Δρ. Βάιο Καρανίκα. Συνολικά, 81 δείγματα έδωσαν ικανοποιητικές αλληλουχίες για περαιτέρω φυλογενετικές αναλύσεις. Τα δείγματα αυτά καθώς και οι περιοχές προέλευσής αναφέρονται στον Πίνακα 2-3 και Εικόνα 2-3.

seqCode region DNA code 1 Cc_NX1 AIGAIO Naxos, Moutsouna MX290 2 C_C_Fa1 CHANIA Falassarna MX296 3 C_L_Pam1 LASITHI Pacheia Ammos MX324 4 C_C_Plo1 CHANIA Plokamiana to Stomio MX340 5 C_R_Geo1 RETHYMNO Georioupoli MX341 6 Cg_C_Sfa1 CHANIA Sfakia, 200m from junction rd to MX345 Frangocastello 7 C_C_Sfa2 CHANIA Sfakia, 200m from junction rd to MX346 Frangocastello 8 C_L_Br22 LASITHI Bramiana lake MX348 9 C_L_Pin1 LASITHI Pinakiano MX349 10 C_L_Gor1 LASITHI Gorgolaini MX350 11 C_R_Pre1 RETHYMNO Moni Kato Preveli MX351 12 C_I_Ast1 IRAKLEIO Tops of Asterusia dir. Lendas MX352 13 C_C_To1 CHANIA Topolia MX355 14 C_C_Fou1 CHANIA Fournes Meskla MX356 15 C_R_Kas1 RETHYMNO Kastelo MX357 16 C_C_LK2 CHANIA Limni Kourna MX364 17 C_I_Ast2 IRAKLEIO Tops of Asterusia dir. Lendas MX366 18 C_C_Kou3 CHANIA Koustomatados MX367 19 C_R_Kas2 RETHYMNO Kastelo MX368 20 C_C_LK3 CHANIA Limni Kourna MX369 21 C-C_Om2 CHANIA Omalos MX370 22 C_L_Gor2 LASITHI Gorgolaini MX371 23 C_C_Fou2 CHANIA Fournes Meskla MX373 24 C_L_Gor3 LASITHI Gorgolaini MX374 25 C_L_Gor5 LASITHI Gorgolaini MX376 26 C_C_To2 CHANIA Topolia MX377 27 C_C_Fou4 CHANIA Fournes Meskla MX380 28 C_C_To3 CHANIA Topolia MX382 29 C_I_Ape2 IRAKLEIO Apesokari heading to asteroisia MX383 30 C_I_Ast4 IRAKLEIO Tops of Asterusia dir. Lendas MX384 31 C_L_Gor6 LASITHI Gorgolaini MX385 32 C_I_Ape3 IRAKLEIO Apesokari heading to asteroisia MX386 33 C_C_Kar2 CHANIA between Kares and Gori MX387 34 C_I_Fo1 IRAKLEIO Fodele, 2km near Irakleio MX388 35 C_I_Fo2 IRAKLEIO Fodele, 2km near Irakleio MX389 36 C_C_Msk2 CHANIA Meskla MX390 37 C-C_Om3 CHANIA Omalos MX391 38 C_I_Fo3 IRAKLEIO Fodele, 2km near Irakleio MX392 39 C_I_Fo4 IRAKLEIO Fodele, 2km near Irakleio MX393 40 C_C_Sfa3 CHANIA Sfakia, 200m from junction rd to MX396 Frangocastello 41 C_C_To4 CHANIA Topolia MX397

42 C_I_Fo5 IRAKLEIO Fodele, 2km near Irakleio MX399 43 C_C_Msk5 CHANIA Meskla MX400 44 C_C_Fou5 CHANIA Fournes Meskla MX403 45 C_C_Kou5 CHANIA Koustomatados MX406 46 C_C_Sfa4 CHANIA Sfakia, 200m from junction rd to MX407 Frangocastello 47 C_C_Msk9 CHANIA Meskla MX408 48 C_L_Zir1 LASITHI Ziros MX412 49 C_L_2Lmn1 LASITHI 4,5km to Limnakaro MX413 50 C_L_Zir2 LASITHI Ziros MX414 51 C_I_Ape5 IRAKLEIO Apesokari heading to asteroisia MX416 52 C_L_AgS5 LASITHI Agioi Saranta MX419 53 C_L_Vai1 LASITHI Vai MX420 54 C_L_Sxi1 LASITHI Sxinokapsala, rd to Ag. Fotia MX421 55 C_L_2Lmn2 LASITHI 4,5km to Limnakaro MX422 56 C_L_2Lmn3 LASITHI 4,5km to Limnakaro MX423 57 C_L_Pin2 LASITHI Pinakiano MX424 58 C_L_Zir3 LASITHI Ziros MX425 59 C_L_2Lmn4 LASITHI 4,5km to Limnakaro MX427 60 C_L_Zir4 LASITHI Ziros MX428 61 C_L_2Lmn5 LASITHI 4,5km to Limnakaro MX429 62 C_L_Br3 LASITHI Bramiana lake MX430 63 C_L_Pin3 LASITHI Pinakiano MX431 64 C_L_Gouv LASITHI towards Lasithi plateau, to Moni MX432 Gouverniotissa 65 C_L_DikA LASITHI Dikteon Andron MX437 66 C_ATT_Pa1 ATTIKI Parnitha Mt MX442 67 C_ATT_Pa2 ATTIKI Parnitha Mt MX443 68 C_NX2 AIGAIO Naxos, Moutsouna MX446 69 C_NX3 AIGAIO Naxos, Moutsouna MX447 70 C_NX4 AIGAIO Naxos, Moutsouna MX448 71 C_NX5 AIGAIO Naxos, Moutsouna MX449 72 C_RD_Pr AIGAIO Rhodos, Prasonisi MX450 73 C_SA_PsA3 AIGAIO Samos, Psili Ammos MX453 74 C_CH_Ma AIGAIO Chios, near to Maradovouno MX454 75 C_ATT_AgM2 ATTIKI Agia Marina MX456 76 Cc_CH_Ga AIGAIO Chios, Ag. Gala MX471 77 C_PH_Mh1 VOLOS Pilio, Milies MX478 78 C_PH_Mh2 VOLOS Pilio, Milies MX479 79 C_PH_Mh3 VOLOS Pilio, Milies MX480 80 C_ZKT3 ZAKYNTHOS Volimes MX481 81 C_ZKT5 ZAKYNTHOS Volimes MX483 Πίνακας 2-3: Δείγματα C. cunicularium που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα φυλογενετική μελέτη. Αναφέρονται: η κωδική ονομασία κατά την αλληλούχιση (seqCode), η περιοχή προέλευσης (region) και η κωδική ονομασία που χρησιμοποιήθηκε κατά εξαγωγή DNA (DNA code).

Εικόνα 2-3: Χάρτης περιοχών προέλευσης των δειγμάτων. Πάνω φαίνονται επτά περιοχές από την Ελλάδα (εκτός Κρήτης) και κάτω αναφέρονται περιοχές της Κρήτης από της οποίες προήλθαν τα δείγματα.

2.3.1. Έλεγχος και Επεξεργασία Αλληλουχιών

Μετά την παραλαβή των χρωματογραφημάτων από την αλληλούχιση, το πρώτο βήμα είναι ο έλεγχος της ποιότητάς της. Ο αρχικός έλεγχος γίνεται από τον ερευνητή και είναι καθαρά εμπειρικός. Τα χρωματογραφήματα που θα χρησιμοποιηθούν για της φυλογενετικές αναλύσεις πρέπει να έχουν τον ίδιο αριθμό βάσεων, ο οποίος θα πρέπει να είναι αρκετά μεγάλος ώστε να δώσει πληροφορίες, ενώ οι κορυφές για κάθε σημείο της αλληλουχίας πρέπει να είναι ευδιάκριτες και μοναδικές. Συνεπώς, εάν κάποιο χρωματογράφημα δεν συγκεντρώνει όλα αυτά τα χαρακτηριστικά, η αντίστοιχη αλληλουχία δεν μπορεί να περιληφθεί της περαιτέρω αναλύσεις. Ο δεύτερος έλεγχος αφορά τη σύγκριση της καθεμίας αλληλουχίας με της κατατεθειμένες αλληλουχίες στη διαδικτυακή βάση δεδομένων Genbank (Benson et al. 2007) του NCBI, για εύρεση ομολογίας με της οργανισμούς. Η σύγκριση γίνεται με το διαδικτυακό πρόγραμμα BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. 1990), το οποίο χρησιμοποιεί έναν γενικό αλγόριθμο για ταίριασμα προτύπων (pattern matching). Πραγματοποιεί μια απλή μετρική σύγκριση, η οποία αναζητά την ακριβή στοίχιση τριών μονάδων (βάσεων) στην υπό εξέταση αλληλουχία με της αλληλουχίες στη βάση δεδομένων. Όταν γίνει η κατάλληλη στοίχιση, μέσα σε προκαθορισμένα όρια πιστότητας, τότε η στοίχιση ελέγχεται και της της δύο κατευθύνσεις για τον εντοπισμό του μεγαλύτερου ταιριαστού τμήματος (matching string). Το ταίριασμα που υπερβαίνει τα όρια πιστότητας καταλήγει σε μια τοπικά ευνοϊκή στοίχιση χωρίς κενά, που με βάση το BLAST θεωρείται ως έγκυρο αποτέλεσμα. Βάσει των αποτελεσμάτων μπορεί να δει κανείς εάν η αλληλουχία που μελετά, προέρχεται από το ίδιο είδος, ή από κάποιο συγγενικό, ώστε να απορριφθεί η πιθανότητα χρήσης λανθασμένων αλληλουχιών κατά την ανάλυση, ή μόλυνσης των δειγμάτων με ξένο γενετικό υλικό. Μετά τον επιτυχή δεύτερο έλεγχο, ακολουθεί η διόρθωση των αλληλουχιών, η οποία πραγματοποιείται από τον ερευνητή και πρέπει να γίνεται πολύ προσεκτικά. Τα σημεία που διορθώνονται συνήθως εντοπίζονται στην αρχή της κάθε αλληλουχίας όπου το χρωματογράφημα δεν είναι καλό (οι κορυφές δεν είναι σαφείς) και στο τέλος όπου οι κορυφές φθίνουν απότομα. Αυτό μπορεί να οφείλεται είτε σε εσφαλμένη υβριδοποίηση κατά τη διάρκεια της PCR, είτε σε λάθος της πολυμεράσης. Τα τμήματα αυτά, διαγράφονται από την αλληλουχία. Διορθώσεις είναι πιθανό να χρειάζονται και σε ορισμένα σημεία κατά μήκος της αλληλουχίας, όπου παρατηρούνται λάθη της η αντιστοίχιση του

χαρακτήρα Ν (άγνωστη βάση) σε ευδιάκριτες κορυφές και η αντιστοίχιση κάποιας βάσης σε μη διακριτή κορυφή. Τα λάθη αυτά, εάν δε διορθωθούν, μπορούν να μειώσουν την ακρίβεια του συνολικού φυλογενετικού σήματος των αλληλουχιών. Για τον αρχικό έλεγχο των χρωματογραφημάτων, καθώς και για τη διόρθωση των αλληλουχιών, χρησιμοποιήθηκαν τα εξής προγράμματα:  FinchTV v1.4.0 (Geospiza, Inc.). Με το πρόγραμμα αυτό δίνεται η δυνατότητα άμεσης επέμβασης στην αλληλουχία που αντιστοιχεί στο κάθε χρωματογράφημα, οπότε μπορούν να γίνουν οι κατάλληλες διορθώσεις και να αποθηκευτεί το νέο αρχείο.  Sequencher v4.8 Demo (Gene Codes Co.). Με το πρόγραμμα αυτό γίνεται μια πρόχειρη στοίχιση των αλληλουχιών για τον εντοπισμό πιθανών πολυμορφισμών, ενώ η ταυτόχρονη αντιπαράθεση των χρωματογραφημάτων δίνει τη δυνατότητα σύγκρισης των αλληλουχιών βάση της βάση.  CodonCode Aligner v.2.0.6. (CodonCode Corp., Dedham, MA, USA). Το πρόγραμμα αυτό χρησιμοποιήθηκε για την συναρμολόγηση (assembling) των δύο χρωματογραφημάτων για κάθε δείγμα που προήλθαν από την αλληλούχιση με χρήση του καθενός εκ των δύο εκκινητών αντίστοιχα, με αποτέλεσμα να προκύψει μια αλληλουχία αντιπαράθεσης (contiguous) που φέρει την κοινή ακολουθία και ανταποκρίνεται όσο το δυνατόν βέλτιστα της αρχικές αλληλουχίες. Έπειτα, με τη βοήθεια του προγράμματος αυτού έγινε εξαγωγή όλων των contig αλληλουχιών σε ένα κοινό αρχείο fasta που χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω αναλύσεις.

2.3.2. Στοίχιση των Αλληλουχιών

Η πολλαπλή στοίχιση των αλληλουχιών αποτελεί το πρώτο και πολύ σημαντικό βήμα για την κατασκευή της φυλογενετικού δέντρου. Η στοίχιση αποσκοπεί στον προσδιορισμό των ομόλογων θέσεων μεταξύ των αλληλουχιών, ενώ αποκαλύπτει της πολυμορφισμούς, οι οποίοι αποτελούν τη βάση για τον υπολογισμό των εξελικτικών σχέσεων των υπό μελέτη ατόμων. Η στοίχιση πρέπει να γίνεται με μεγάλη προσοχή και να ελέγχεται, γιατί αν είναι λανθασμένη μπορεί να οδηγήσει σε λάθη στο τελικό φυλογενετικό δέντρο, δηλαδή στην εξαγωγή λανθασμένων φυλογενετικών συμπερασμάτων. Συνεπώς η ακρίβεια της στοίχισης των

αλληλουχιών είναι πολύ σημαντική (Ogden & Rosenberg 2006). Υπάρχουν βέβαια περιπτώσεις όπου της φυλογενετικές αναλύσεις δεν περιλαμβάνεται η στοίχιση των αλληλουχιών, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι η μέθοδος αυτή είναι αξιόπιστη (Hao & Qi 2004). Οι αμφισβητούμενες ή οι κακώς στοιχισμένες αλληλουχίες είναι σημαντικό να αφαιρούνται πριν από της περαιτέρω αναλύσεις, γιατί μπορεί να δημιουργήσουν προβλήματα. Της, ορισμένες φορές από της στοιχισμένες αλληλουχίες απομακρύνονται τμήματα που αντιστοιχούν σε ενθέσεις ή ελλείμματα, ώστε να χρησιμοποιηθούν θέσεις που είναι κοινές για της της αλληλουχίες, ρισκάροντας έτσι να χαθούν πολύτιμα ίσως φυλογενετικά σήματα. Το ποια τμήματα θα αφαιρεθούν επαφίεται στην κρίση του ερευνητή. Για να γίνει η στοίχιση, είναι απαραίτητο να υπάρχει ένα αρχείο το οποίο θα περιλαμβάνει της της αλληλουχίες σε μορφή fasta. Το αρχείο αυτό, της αναφέρεται παραπάνω δημιουργήθηκε με τη βοήθεια του προγράμματος CodonCode Aligner v.2.0.6 Για την πολλαπλή στοίχιση των αλληλουχιών, στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε, χωρίς αλλαγή των παραμέτρων, το πρόγραμμα ClustalW (Thompson et al. 1994) που περιέχεται στο πρόγραμμα Mega v6.0 (Tamura et al. 2013). Πρόκειται για το πιο διαδεδομένο μέλος της οικογένειας μεθόδων ευρετικής πολλαπλής στοίχισης Clustal. Ο βασικός αλγόριθμος για την πολλαπλή στοίχιση περιλαμβάνει τρία στάδια:  Όλοι οι συνδυασμοί των αλληλουχιών στοιχίζονται χωριστά με στόχο τον υπολογισμό μιας μήτρας αποστάσεων που θα φανερώσει τη διαφοροποίηση καθενός ζεύγους αλληλουχιών.  Ένα δέντρο οδηγός κατασκευάζεται βάσει της παραπάνω μήτρας αποστάσεων.  Οι αλληλουχίες στοιχίζονται σταδιακά, σύμφωνα με τη διάταξη των κλάδων του δέντρου οδηγού. Το πρόγραμμα αυτό αποτελεί κατάλληλο εργαλείο για διάφορους τύπους αλληλουχιών, ενώ εάν η στοίχιση βασιστεί στην ύπαρξη αλληλουχιών με μεγάλη ποσοστό ομοιότητας τότε είναι σχεδόν ιδανική. Τα αρχεία με της στοιχισμένες αλληλουχίες που προέκυψαν από το ClustalW, δέχθηκαν επεξεργασία στη συνέχεια με το πρόγραμμα Mega v6.0 (Tamura et al. 2013), για την εκτίμηση των συνολικών νουκλεοτιδικών αποκλίσεων μεταξύ των ατόμων και για την εξαγωγή της αρχείου τύπου Nexus, το οποίο είναι απαραίτητο για της περαιτέρω αναλύσεις.

2.3.3. Έλεγχος για Ομοπλασία και Κορεσμό

Οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ δύο νουκλεοτιδικών αλληλουχιών προκύπτουν από τη μέτρηση του συνόλου των διαφορετικών νουκλεοτιδίων. Ωστόσο, ο αριθμός που προκύπτει δεν αντικατοπτρίζει της πραγματικές εξελικτικές αλλαγές και αυτό γιατί όσο μεγαλύτερη είναι η γενετική απόσταση, τόσο αυξάνεται η πιθανότητα να συμβεί μια αλλαγή σε μια θέση, στην οποία είχε ήδη προηγηθεί μια άλλη αλλαγή. Καθεμία από της πολλαπλές υποκαταστάσεις που μπορεί να συμβεί στο ίδιο νουκλεοτίδιο αποτελεί, στο πλαίσιο της Κλαδιστικής, ξεχωριστό ομοπλαστικό γεγονός. Εάν παρατηρηθεί κάτι τέτοιο, τότε υπάρχει κορεσμός των νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων (substitution saturation), οπότε σταματά να ισχύει η γραμμική σχέση του χρόνου και της απόκλισης δύο αλληλουχιών, συνεπώς αλλοιώνεται ποιοτικά η φυλογενετική πληροφορία που θα έδιναν οι αλληλουχίες (Page & Holmes 1998). Της από της τρόπους με της οποίους μπορεί να ελεγχθεί η ομοπλασία των δεδομένων, είναι η κατασκευή της διαγράμματος διασποράς, στο οποίο απεικονίζεται η σχέση του αριθμού μεταπτώσεων και μεταστροφών σε σχέση με τη γενετική απόσταση των αλληλουχιών. Ένδειξη για την ομοπλασία των δεδομένων λοιπόν, αποτελεί η παρέκκλιση από τη γραμμική σχέση των μεταπτώσεων και μεταστροφών με τη γενετική απόσταση (Nei & Kumar 2000). Πριν προχωρήσουν περαιτέρω οι αναλύσεις στην παρούσα μελέτη, κατασκευάστηκαν τα γραφήματα κορεσμού (saturation plots) με τη βοήθεια του προγράμματος DAMBE (Xia & Xie 2001). Πρόκειται για διαγράμματα του συνόλου των μεταπτώσεων και των μεταστροφών συναρτήσει της γενετικής απόστασης p, όπου όσο πιο κορεσμένες είναι οι αλληλουχίες, τόσο μεγαλύτερη θα είναι η απόκλιση του διαγράμματος από την ευθεία γραμμική μορφή.

2.3.4. Επιλογή Μοντέλου Εξέλιξης

Οι περισσότερες φυλογενετικές μέθοδοι βασίζονται σε μοντέλα ή εξαρτώνται από τα μοντέλα Markov, τα οποία έχουν σχεδιαστεί για την εκτίμηση των εξελικτικών ρυθμών μεταξύ των αλληλουχιών. Όταν επιλεγούν τα μοντέλα αυτά για την ανάλυση των αλληλουχιών, θεωρείται ότι πρόκειται για αυστηρές προσεγγίσεις των εξελικτικών διεργασιών που εμπεριέχονται στα δεδομένα. Η επιλογή λοιπόν, του σωστού μοντέλου αποτελεί κρίσιμο σημείο για της μεθόδους φυλογένεσης, αφού η

απόδοσή της εξαρτάται από τον τρόπο με τον οποίο θα συνδυαστούν τα δεδομένα, βάσει του προτεινόμενου μοντέλου (Huelsenbeck & Crandall 1997). Μια πληθώρα μεθόδων έχει αναπτυχθεί για την εκτίμηση της ικανότητας των μοντέλων Markov και ορισμένες από αυτές της μεθόδους χρησιμοποιούνται ευρέως για την επιλογή του κατάλληλου μοντέλου (Jermiin et al. 2008). Μέχρι σήμερα έχουν προταθεί διάφορα μοντέλα εξέλιξης, τα οποία διαφέρουν στον αριθμό των παραμέτρων (1-60) που χρησιμοποιούν για να εξηγήσουν της εξελικτικές αλλαγές. Τα περισσότερα μοντέλα εμφανίζουν κοινές παραδοχές, της ότι της οι νουκλεοτιδικές θέσεις αλλάζουν ανεξάρτητα η μια από την άλλη, ότι ο ρυθμός υποκατάστασης είναι σταθερός μέσα στο χρόνο και σε της της γενεαλογικές γραμμές, η συχνότητα των νουκλεοτιδίων είναι σε ισορροπία και τέλος, ο ρυθμός υποκατάστασης σε μια νουκλεοτιδική θέση είναι ο της για της της νουκλεοτιδικές θέσεις και δεν αλλάζει με το χρόνο (Page & Holmes 1998). Παρακάτω, της, φαίνεται ότι αυτές οι παραδοχές της περισσότερες περιπτώσεις δεν ανταποκρίνονται στην πραγματικότητα. Υπάρχουν, λοιπόν, τρεις τύποι παραμέτρων οι οποίοι είναι κοινοί σε όλα τα μοντέλα, και είναι οι ακόλουθοι:  Οι συχνότητες των βάσεων (base frequencies). Πρόκειται για την εκτίμηση της συχνότητας των τεσσάρων βάσεων κατά μέσο όρο, στο σύνολο των νουκλεοτιδικών θέσεων των αλληλουχιών. Γενικά θεωρείται πως η συχνότητα των βάσεων είναι ίση, της αυτό δεν ισχύει σε της περιπτώσεις, όπου οι υποκαταστάσεις των βάσεων τροποποιούν της συχνότητες αυτές.  Οι ρυθμοί υποκαταστάσεων (substitution rates). Πρόκειται για της ρυθμούς με της οποίους γίνονται οι υποκαταστάσεις των βάσεων. Αναφέρονται σε όλα τα μοντέλα, της διαφέρουν αρκετά. Σε κάποια μοντέλα οι ρυθμοί είναι κοινοί για της της στοιχισμένες θέσεις, ενώ σε άλλα οι ρυθμοί μεταπτώσεων και μεταστροφών διαφέρουν.  Ο ρυθμός ετερογένειας μεταξύ θέσεων των αλληλουχιών. Η προσέγγιση του ρυθμού ετερογένειας πραγματοποιείται κυρίως μέσω της γ-κατανομής. Ο Yang το 1996 απέδειξε πως, γενικά, αν θεωρηθεί ότι η διασπορά στην ετερογένεια του ρυθμού υποκατάστασης ακολουθεί τη γ-κατανομή αντί της κανονικής, τότε οι φυλογενετικές σχέσεις μπορούν να ανασυσταθούν ορθότερα με τη βοήθεια των υπολογιστικών μεθόδων. Έτσι, σε όλα τα μοντέλα μπορεί να προστεθεί και μια τιμή για τη σχηματική παράμετρο ‘α’ (shape parameter alpha), που καθορίζει τη μορφή της γ-κατανομής,

ενώ είναι δυνατό να προστεθεί και μια τιμή που θα προσδιορίζει το ποσοστό των αμετάβλητων θέσεων (proportion of invariable sites).

Το μοντέλο που θα χρησιμοποιηθεί λοιπόν, πρέπει να περιλαμβάνει τουλάχιστον της τρεις παραμέτρους που προαναφέρθηκαν. Αναφορικά, κάποια από τα πλέον χρησιμοποιούμενα μοντέλα είναι τα εξής:  JC69 (Jukes & Cantor 1969)  K80 (Kimura 1980)  F81 (Felsenstein 1981)  HKY85 (Hasegawa et al. 1985)  T92 (Tamura 1992)  TN93 (Tamura & Nei 1993) και  GTR: Generalised time-reversible (Tavaré 1986). Μέχρι τώρα έχουν προταθεί κάποιοι στατιστικοί έλεγχοι για την επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου, με το AIC (Akaike Information Criterion, Akaike 1974) να θεωρείται γενικά πιο αξιόπιστο (Burnham & Anderson 2002). Αυτό συμβαίνει γιατί υπολογίζει την πιθανότητα των προτεινόμενων μοντέλων, επιβάλλοντας αρνητική βαθμολόγηση βασισμένη στον αριθμό των παραμέτρων που χρησιμοποιήθηκαν από τα ίδια τα μοντέλα (Bos & Posada 2004). Στην παρούσα μελέτη, η επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου έγινε βάσει των αποτελεσμάτων του AIC, με χρήση των προγραμμάτων PAUP* v4.0 beta10 (Swofford 2003) και Modeltest (Posada & Crandall 1998).

2.3.5. Μέθοδοι Φυλογενετικής Ανάλυσης

Οι μέθοδοι φυλογενετικής ανάλυσης είναι εκείνες που χρησιμοποιούνται για την εξαγωγή συμπερασμάτων όσον αφορά της φυλογενετικές σχέσεις των υπό μελέτη οργανισμών. Οι μέθοδοι αυτές πρέπει να πληρούν ορισμένες προϋποθέσεις. Αυτές, συνοπτικά, περιλαμβάνουν:  Τη συνέπεια (consistency). Πρόκειται για την τάση που εμφανίζει η μέθοδος να συγκλίνει της τη σωστή απάντηση όσο αυξάνει το μέγεθος του δείγματος. Στη φυλογένεση αφορά τη σύγκλιση στο σωστό δέντρο με την προσθήκη περισσότερων χαρακτήρων στη στοίχιση.  Την αποδοτικότητα (efficiency). Πρόκειται για την ικανότητα της μεθόδου να ανακτά τη σωστή απάντηση με περιορισμένο αριθμό

δεδομένων. Εάν το μέγεθος του δείγματος διατηρείται σταθερό, η αποδοτικότερη εκτίμηση θα έχει μικρότερη διακύμανση.  Την ισχύ (power). Πρόκειται για συνώνυμο της αποδοτικότητας, ή αφορά την πιθανότητα απόρριψης μιας υπόθεσης όταν αυτή είναι λανθασμένη.  Την έλλειψη μεροληψίας (lack of bias). Πρόκειται για την τάση της μεθόδου να παράγει, με περιορισμένο αριθμό δεδομένων, αποτελέσματα τα οποία ποικίλλουν και διανέμονται τυχαία γύρω από τη σωστή απάντηση.  Την ανοχή (tolerance). Πρόκειται για την ικανότητα της μεθόδου να ανακτά τη σωστή απάντηση κάτω από συνθήκες που δε συνάδουν με της εκ των προτέρων υποθέσεις.  Την ικανότητα πληροφόρησης (informativeness). Πρόκειται για την ικανότητα της μεθόδου να περιγράφει λεπτομερώς τα κριτήρια. Για τη φυλογένεση, τα κριτήρια αυτά περιλαμβάνουν την τοπολογία του δέντρου, το μήκος των κλάδων και τα κριτήρια αξιοπιστίας. Η μέθοδος που θα επιλεγεί για την κατασκευή των φυλογενετικών δέντρων πρέπει να πληροί όσο το δυνατό περισσότερες από της παραπάνω προϋποθέσεις. Οι φυλογενετικές μέθοδοι χωρίζονται σε δύο κατηγορίες βάσει του χειρισμού των δεδομένων και της προσέγγισης που ακολουθούν για την κατασκευή του πιο σωστού φυλογενετικού δέντρου:  Της μεθόδους ομαδοποίησης, της οποίες αρχικά εξάγονται πίνακες γενετικών αποστάσεων μεταξύ των αλληλουχιών και μετά, με βάση έναν αλγόριθμο, γίνεται η κατασκευή του φυλογενετικού δέντρου με τη χρήση των στοιχείων του πίνακα. Παραδείγματα αποτελούν οι μέθοδοι Neighbor Joining (NJ) και UPGMA, οι οποίες είναι αρκετά εύχρηστες τεχνικά, δεν απαιτούν μεγάλο υπολογιστικό χρόνο, της δε θεωρούνται πολύ αξιόπιστες, καθώς θεωρείται ότι χάνεται μεγάλο ποσό εξελικτικής πληροφορίας κατά τον υπολογισμό των γενετικών αποστάσεων (Page & Holmes 1998).  Της μεθόδους διερεύνησης δέντρων, όπου κάθε θέση της στοιχισμένες αλληλουχίες αντιμετωπίζεται ως διακριτός φυλογενετικός χαρακτήρας. Στην αρχή της μεθόδου ορίζεται ένα κριτήριο βελτιστοποίησης, δηλαδή μια τιμή η οποία καθορίζει το πόσο καλά ταιριάζει το δέντρο με τα δεδομένα. Έτσι αναζητούνται ανάμεσα σε όλα τα πιθανά δέντρα, εκείνα με τη μέγιστη τιμή του κριτηρίου βελτιστοποίησης. Τέτοιες μέθοδοι είναι η Μέγιστη Φειδωλότητα (Maximum Parsimony), η Μέγιστη Πιθανοφάνεια

(Maximum Likelihood) και η Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία (Bayesian Ιnference). Στην παρούσα μελέτη, από της παραπάνω μεθόδους χρησιμοποιήθηκαν τρεις και είναι η NJ, η Μέγιστη Φειδωλότητα και η Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία. Παρακάτω ανλύεται η κάθε μέθοδος χωριστά.

2.3.5.1. Neighbor Joining (NJ)

Η μέθοδος σύνδεσης γειτόνων (Neighbor Joining, Saitou & Nei 1987) αποτελεί μια από της δημοφιλέστερες μεθόδους κατασκευής φυλογενετικών δέντρων. Ανήκει της μεθόδους ομαδοποίησης αλλά δεν απαιτεί της οι γενεαλογίες να αποκλίνουν ισόποσα. Η μέθοδος αυτή είναι κατάλληλη για δεδομένα που περιλαμβάνουν γενεαλογίες με μεγάλο εύρος εξελικτικών ρυθμών. Μπορεί της να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με μεθόδους που επιτρέπουν την αντιστάθμιση των υποκαταστάσεων που βρίσκονται σε υπέρθεση (εκείνων δηλαδή που εντοπίζονται σε θέσεις πολλαπλών υποκαταστάσεων). Η NJ ακολουθεί της κόμβους σε ένα δέντρο παρά τα τάξα ή της ομάδες των τάξων καθαυτές. Τα δεδομένα περιλαμβάνονται σε έναν πίνακα αποστάσεων και το αρχικό δέντρο έχει αστεροειδές σχήμα. Τότε κατασκευάζεται της τροποποιημένος πίνακας αποστάσεων, στον οποίο ο διαχωρισμός κάθε ζεύγους κόμβων προσαρμόζεται βάσει των μέσων αποκλίσεων όλων των άλλων κόμβων. Το δέντρο κατασκευάζεται με την ένωση των κόμβων με τη μικρότερη απόσταση σε αυτόν τον τροποποιημένο πίνακα. Όταν δύο κόμβοι ενώνονται, ο κοινός της προγονικός κόμβος προστίθεται στο δέντρο και οι τελικοί κόμβοι με της αντίστοιχους κλάδους απομακρύνονται από το δέντρο. Αυτή η διαδικασία «κλαδέματος» μετατρέπει τον προγονικό κόμβο που μόλις προστέθηκε, σε τελικό κόμβο σε ένα δέντρο μειωμένου μεγέθους. Σε κάθε στάδιο δύο τελικοί κόμβοι αντικαθίστανται από έναν νέο. Η διαδικασία ολοκληρώνεται όταν απομένουν δύο κόμβοι, οι οποίοι διαχωρίζονται από έναν κλάδο. Η μέθοδος Neighbor Joining είναι γρήγορη, οπότε είναι χρήσιμη όταν ο όγκος των δεδομένων είναι μεγάλος, επιτρέπει τη χρήση γενεαλογιών με μεγάλες διαφορές στο μήκος των κλάδων, καθώς και τη διόρθωση πολλαπλών υποκαταστάσεων. Παρόλα αυτά, κατά την κατασκευή του δέντρου χάνονται πολύτιμες πληροφορίες, δίνει μόνο ένα δέντρο και

εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το μοντέλο που επιλέγεται για τη μετατροπή των καταστάσεων των χαρακτήρων σε γενετικές αποστάσεις. Στην παρούσα μελέτη η κατασκευή του δέντρου με τη μέθοδο Neighbor Joining πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του προγράμματος Mega v6.0 (Tamura et al. 2013) και το μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε ήταν του Tamura-Nei με ενσωμάτωση της παραμέτρου G.

2.3.5.2. Maximum Parsimony (MP)

Η μέθοδος της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony) βασίζεται στην παραδοχή ότι το πιθανότερο δέντρο είναι εκείνο που απαιτεί το μικρότερο αριθμό αλλαγών για την ερμηνεία των δεδομένων. Η βασική αρχή της μεθόδου είναι ότι η παρουσία ενός κοινού χαρακτηριστικού μεταξύ δύο κλάδων οφείλεται στην κληρονόμησή του από τον κοινό τους πρόγονο. Οποιαδήποτε ασυμφωνία με την παραδοχή αυτή ερμηνεύεται ως ομοπλασία. Η μέθοδος είναι μη παραμετρική και στηρίζεται σε έναν αλγόριθμο, ο οποίος χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του ελάχιστου αριθμού βημάτων που απαιτείται σε κάθε δεδομένο δέντρο ώστε αυτό να συμφωνεί με τα δεδομένα. Ο αριθμός αυτός αντιστοιχεί στο μήκος του δέντρου και εκείνο ή εκείνα τα δέντρα με το μικρότερο μήκος είναι τα πιο φειδωλά. Η μέθοδος είναι σχετικά εύκολη στην κατανόησή της και απαιτεί λίγες αρχικές υποθέσεις για την εξέλιξη των αλληλουχιών. Όπως, όμως, και η προηγούμενη μέθοδος, έτσι και εδώ υπάρχουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Η μέθοδος αυτή βασίζεται σε κοινούς χαρακτήρες μεταξύ των κλάδων, συνεπώς πρόκειται για μια κλαδιστική παρά φαινετική μέθοδο. Επίσης, δεν μειώνει το μέγεθος της πληροφορίας, κάνει μια αποτίμηση διαφόρων δέντρων, ενώ γίνεται μια προσπάθεια εξαγωγής πληροφοριών για τις προγονικές αλληλουχίες. Από την άλλη, είναι πιο αργή σε σύγκριση με τις μεθόδους αποστάσεων, δεν χρησιμοποιεί όλα τα σημεία των αλληλουχιών ως πληροφοριακά, δεν διορθώνει τις πολλαπλές υποκαταστάσεις και τέλος, δεν δίνει πληροφορίες για το μήκος των κλάδων. Στην παρούσα μελέτη η κατασκευή του δέντρου με τη μέθοδο της μέγιστης φειδωλότητας πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του προγράμματος Mega v6.0 (Tamura et al. 2013).

2.3.5.3. Bayesian Inference (BI)

Πρόκειται για μια σχετικά πρόσφατη φυλογενετική μέθοδο (Huelsenbeck et al. 2001), με βάση την οποία προϋποθέτουμε ένα μοντέλο εξέλιξης και αναζητούμε τα καλύτερα δέντρα, τα οποία συμφωνούν τόσο με το μοντέλο όσο και με τα δεδομένα. Η Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία περιλαμβάνει τη συλλογή αποδείξεων, οι οποίες είναι είτε σύμφωνες είτε ασύμφωνες με μια δεδομένη υπόθεση. Καθώς συγκεντρώνονται οι αποδείξεις, ο βαθμός κατά τον οποίο πιστεύουμε στην αρχική υπόθεση αλλάζει. Με αρκετές αποδείξεις θα πρέπει είτε να μειωθεί αρκετά είτε να αυξηθεί. Έτσι, οι συνήγοροι της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας υποστηρίζουν ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το διαχωρισμό συγκρουόμενων υποθέσεων (υποθέσεις με ισχυρή στήριξη πρέπει να θεωρούνται σωστές και εκείνες με πολύ μικρή στήριξη πρέπει να απορρίπτονται). Ωστόσο, υπάρχουν και εκείνοι που υποστηρίζουν ότι η μέθοδος μπορεί να είναι «προκατειλημμένη» εξαιτίας των αρχικών παραδοχών που έχει κανείς πριν από τη συλλογή των αποδείξεων. Η μέθοδος χρησιμοποιεί μια σημαντική αρχή, η οποία ονομάζεται εκ των υστέρων πιθανότητα (posterior probability) και στηρίζεται στο θεώρημα του Bayes, σύμφωνα με το οποίο:

όπου H είναι η υπόθεση, P(H) η πιθανότητα η υπόθεση να είναι σωστή πριν από τη συλλογή αποδείξεων (prior probability), P(E/H) η πιθανοφάνεια των δεδομένων, P(E) η οριακή πιθανότητα των αποδείξεων και P(H/E) η εκ των υστέρων πιθανότητα της αρχικής υπόθεσης υπό το πρίσμα των παρατηρηθέντων δεδομένων. Το θεώρημα δεν αποτελεί μαθηματική πράξη αλλά μάλλον επανασταθμισμένη πιθανότητα, η οποία προκύπτει λαμβάνοντας υπόψη τα δεδομένα. Η Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία χρησιμοποιεί τη μέθοδο MCMC (Markov Chain Monte Carlo), η οποία μπορεί να θεωρηθεί ως μια ομάδα ανεξάρτητων αναζητήσεων που περιστασιακά ανταλλάσσουν πληροφορίες. Αυτή η μέθοδος επιτρέπει στην αναζήτηση να διασχίσει μια κοιλάδα, χωρίς να παγιδευτεί σε ένα μη βέλτιστο λόφο. Το τελικό

αποτέλεσμα είναι μια ομάδα δέντρων η οποία έχει αξιολογηθεί επανειλημμένα και συγκροτεί την κορυφή του λόφου. Η μέθοδος αυτή δεν απαιτεί πρόσθετο στατιστικό έλεγχο για τη στήριξη των κλάδων (π.χ. bootstrap), εφόσον οι επανασταθμισμένες πιθανότητες των κλάδων στο δέντρο αποτελούν ταυτόχρονα και το μέτρο της στατιστικής τους αξιοπιστίας. Στη μελέτη αυτή οι αναλύσεις Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας πραγματοποιήθηκαν με τη βοήθεια του προγράμματος MrBayes v3.1.2 (Huelsenbeck & Ronquist 2001).

2.3.6. Έλεγχος των Αποτελεσμάτων

Τα δέντρα που μπορεί να προκύψουν από την ανάλυση των δεδομένων με κάποια από τις μεθόδους που αναφέρθηκαν μπορεί να είναι λανθασμένα, εξαιτίας της ομοπλασίας των δεδομένων για παράδειγμα. Ένας τρόπος για να αποφευχθεί η εξαγωγή εσφαλμένων συμπερασμάτων είναι η χρήση μεγάλου αριθμού δεδομένων που θα εγγυηθούν το σωστό αποτέλεσμα των μεθόδων που χρησιμοποιούνται. Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι εκτίμησης της αξιοπιστίας των δέντρων που προκύπτουν από τις φυλογενετικές αναλύσεις και είναι η μέθοδος Bootstrap και η μέθοδος Jackknife. Και οι δύο χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της ποικιλότητας που σχετίζεται με κάποια στατιστική παράμετρο, για την οποία η δειγματοληπτική κατανομή είναι άγνωστη ή δύσκολο να βρεθεί. Στη μελέτη αυτή ο στατιστικός έλεγχος των αποτελεσμάτων, όπου ήταν απαραίτητος (π.χ. NJ, μέγιστη φειδωλότητα), έγινε με τη μέθοδο Bootstrap (Efron 1981) και με χρήση του προγράμματος Mega v6.0. Πρόκειται μια δειγματοληπτική μέθοδο η οποία πραγματοποιεί ψευδο- επαναλήψεις των δεδομένων. Η δειγματοληψία της αρχικής αλληλουχίας γίνεται με αντικατάσταση ορισμένων από τα αρχικά δεδομένα, δηλαδή κάποια θέση (η οποία είναι τυχαία) μπορεί να τοποθετηθεί πάνω από μία φορά στην ψευδο-στοίχιση, ή ακόμη και να μην εμφανιστεί καθόλου. Σε κάθε νέα δειγματοληψία η στατιστική παράμετρος του ενδιαφέροντός μας υπολογίζεται εκ νέου. Συνήθως πραγματοποιούνται 100 έως 1000 bootstrap επαναλήψεις και στο τέλος προκύπτει ένα δέντρο στο οποίο, για κάθε κλάδο, φαίνεται υπό μορφή ποσοστού, δηλαδή πόσες φορές εμφανίστηκε ο κλάδος στις bootstrap επαναλήψεις. Το όριο αποδοχής δεν είναι σταθερό και εξαρτάται από τη σημασία του συγκεκριμένου κλάδου, ωστόσο προτιμούμε οι τιμές να είναι υψηλές. Τέλος, χρησιμοποιείται και μια. ή περισσότερες, ταξινομικές μονάδες,

οι οποίες χρησιμεύουν για να δοθεί προσανατολισμός (πολικότητα) στο δέντρο, δηλαδή, για να εντοπισθεί η ρίζα του. Η εξωομάδα (outgroup), λοιπόν, χρησιμοποιείται σε όλες σχεδόν τις φυλογενετικές αναλύσεις. Η εξωομάδα πρέπει να είναι συγγενική με τα εξεταζόμενα τάξα αλλά να μην ανήκει στην ενδοομάδα. Μετά την επιλογή της κατάλληλης εξωομάδας, τη φυλογενετική ανάλυση των δεδομένων και τον έλεγχο της αξιοπιστίας των αποτελεσμάτων, καταλήγουμε σε έναν αριθμό φυλογενετικών δένδρων που μπορεί να είναι από 1 έως πάρα πολλά. Όταν η ανάλυση δώσει περισσότερα από 1 ισοπίθανα δένδρα, προχωράμε σε υπολογισμό ενός συναινετικού δένδρου, το οποίο συμπυκνώνει την κοινή πληροφορία από τα πολλά ισοπίθανα δένδρα. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι εκτίμησης συναινετικών δένδρων, με πιο συνηθισμένη εκείνη που χρησιμοποιεί τον κανόνα της «πλειονότητας άνω του 50%». Δηλαδή, απεικονίζονται στο συναινετικό δένδρο οι κλάδοι που εμφανίζονται σε περισσότερα από τα μισά ισοπίθανα δένδρα. Οι τιμές κάθε κλάδου (ποσοστό των δένδρων στα οποία εμφανίζεται) δίνονται, συνήθως, σε κάθε κόμβο. Εννοείται, ότι η αξιοπιστία κάθε κλάδου είναι άμεσα συνδεδεμένη με το ποσοστό των ισοπίθανων δένδρων στα οποία εμφανίζεται.

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Για τις φυλογενετικές αναλύσεις βάσει του γενετικού τόπου COI, από το σύνολο των δειγμάτων που στάλθηκαν για αλληλούχιση και εφόσον ταυτοποιήθηκαν με τη βοήθεια του BLAST ότι ανήκουν στα υπό μελέτη είδη, χρησιμοποιήθηκαν 81 αλληλουχίες από άτομα του είδους C. cunicularium, που προέρχονται κατά βάσει από περιοχές της Κρήτης, και 1 αλληλουχία από αράχνη του γένους Nemesia ως εξωομάδα. Στο σύνολο, λοιπόν, των 82 αλληλουχιών, μετά την πολλαπλή στοίχιση (731 βάσεις ανά αλληλουχία), με τη βοήθεια του προγράμματος MEGA 6 υπολόγίστηκαν οι συχνότητες των βάσεων ως εξής: A=13,64%, T=46,41%, C=15,48% και G=24,46%.

Για λόγους ευκολίας, αφού ορίστηκαν 12 ομάδες βάσει ευρύτερης γεωγραφικής προέλευσης των 82 ατόμων, μέσω του MEGA 6 υπολογίστηκαν οι διαπληθυσμιακές νουκλεοτιδικές αποκλίσεις (Between Group Mean Distance) με βάσει το μοντέλο Tamura-Nei οι οποίες παρατίθενται στον πίνακα 3-1.

Nem. ZKT NX ATT PH L I CH RD C R

Nemesia ZKT 0,320 NX 0,332 0,206 ATT 0,299 0,154 0,138 PH 0,374 0,173 0,158 0,093 L 0,316 0,168 0,110 0,121 0,132 I 0,329 0,172 0,096 0,130 0,132 0,066 CH 0,360 0,146 0,118 0,106 0,138 0,093 0,101 RD 0,369 0,141 0,130 0,120 0,152 0,105 0,111 0,023 SA 0,308 0,143 0,123 0,104 0,150 0,114 0,120 0,085 0,089 C 0,343 0,166 0,128 0,085 0,115 0,117 0,108 0,106 0,111 0,109 R 0,327 0,165 0,119 0,092 0,119 0,117 0,113 0,110 0,115 0,091 0,056

Πίνακας 3-1: Οι ομάδες αντιστοιχούν στις περιοχές ως εξής: ZKT=Ζάκυνθος, ΝΧ=Νάξος, ΑΤΤ=Αττικκή, ΡΗ=Πήλιο, L=Λασίθι, Ι=Ηράκλειο, CH=Χίος, RD=Ρόδος, SA=Σάμος, C=Χανιά και R=Ρέθυμνο.

3.1. Φυλογενετικά Δέντρα

Για την πραγματοποίηση των αναλύσεων, υπολογίστηκε με το πρόγραμμα Modeltest το καταλληλότερο μοντέλο εξέλιξης, το οποίο είναι το HKY (Hasegawa-Kishino-Yano) με ενσωμάτωση των παραμέτρων I και G (HKY+I+G με -lnL = 5743,7627 ). Παρατηρήθηκε ποσοστό αμετάβλητων θέσεων I = 0,5065, σχήμα παραμέτρου γ-κατανομής με G = 0,5694,

αριθμό παραμέτρων που λήφθησαν υπόψην Κ = 6 και ρυθμό μεταπτώσεων μεταστροφών ti/tv ratio = 4.1283. Το φυλογενετικό δέντρο με τη μέθοδο της Σύνδεσης Γειτόνων (NJ) (Εικόνα 3-1) κατασκευάστηκε με το πρόγραμμα Mega 6 χρησιμοποιώντας το μοντέλο Tamura-Nei με ενσωμάτωση της παραμέτρου G (TN93+G), το οποίο προέκυψε ως καταλληλότερο στην δοκιμασία του λόγου των πιθανοφανειών (Likelihood Ratio Test) καθώς έφερε τη μικρότερη τιμή BIC (Bayesian Information Criterion). Για τον έλεγχο της στατιστικής στήριξης των κλάδων πραγματοποιήθηκαν 1000 bootstrap επαναλήψεις και στο δέντρο σημειώνονται εκείνες που υπερβαίνουν το 50%. Στην Εικόνα 3-2 παρατίθεται το δέντρο που προέκυψε από την ανάλυση με τη μέθοδο της Μέγιστης Φειδωλότητας (MP). Πιο συγκεκριμένα, με τη χρήση του προγράμματος MEGA 6 πραγματοποιήθηκε μια σταθμισμένη ανάλυση, χρησιμοποιώντας την ευρετική μέθοδο αναζήτησης του πιο φειδωλού δέντρου. Τα κενά που προέκυψαν μετά τη στοίχιση αντιμετωπίστηκαν ως απόντες χαρακτήρες. Έγιναν 1000 bootstrap επαναλήψεις για να ελεγχθεί η στατιστική στήριξη των κλάδων, ωστόσο στο δέντρο παρουσιάζονται μόνο οι τιμές που ήταν μεγαλύτερες από 50%. Στην Εικόνα 3-3 παρατίθεται το δέντρο που προέκυψε από την ανάλυση της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (BI) με τη βοήθεια του προγράμματος MrBayes v3.1.2 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). Το εξελικτικό μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε, όπως αυτό προέκυψε από το πρόγραμμα Modeltest, ήταν το HKY με ενσωμάτωση των παραμέτρων I και G. Ο συνολικός αριθμός γενεών ήταν 1.000.000, τα δέντρα σώζονταν ανά 100 γενεές, από τα οποία τελικά απορρίφθηκε το αρχικό 25%.

Εικόνα 3-1: Δέντρο NJ. Οι αριθμοί στους κλάδους αντιστοιχούν στις τιμές bootstrap (1000 επαναλήψεις) που υπερβαίνουν το 50%.

Εικόνα 3-2: Συναινετικό κλαδόγραμμα Μέγιστης Φειδωλότητας (MP) βάσει ευρετικής αναζήτησης και 1000 bootstrap επαναλήψεις.

Εικόνα 3-3: 50% πλειοψηφικής αποδοχής όπως προκύπτει από την μπεϊεσιανή συμπερασματολογία (BI).

4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ – ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Από τα αποτελέσματα της παρούσας διπλωματικής εργασίας προκύπτει πως οι πληθυσμοί C. Cunicularium στον ελλαδικό χώρο παρουσιάζουν μια σχετικά πολύπλοκη κατανομή που διακρίνεται μεταξύ των διάφορων περιοχών. Η διάκριση αυτή παρουσιάζεται στην Εικόνα 4-1 που αποτελεί φυλογενετικό δέντρο Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας. Στο δέντρο παρατηρούνται δύο κύριες γενεαλογίες (ΚΛΑΔΟΣ Α και ΚΛΑΔΟΣ Β1-3) με τη μία να περιλαμβάνει περιοχές μόνο της Ανατολικής Κρήτης (Ηράκλειο και Λασίθι) και την άλλη να τοποθετείται στις περιοχές της Δυτικής Κρήτης (Χανιά και Ρέθυμνο), καθώς επίσης και στις υπόλοιπες περιοχές δειγματολειψίας από την Ελλάδα. Ως εκ τούτου, πιθανότατα, ακολουθήθηκαν δύο διαφορετικά εξελικτικά δρόμενα όσον αφορά το είδος C. cunicularium. Συμπερασματικά, για τους πληθυσμούς της Ανατολικής Κρήτης (ΚΛΑΔΟΣ Α), παρατηρείται εξελικτική διαφοροποίση με βάση το γεωγραφικό πρότυπο Βοράς-Νότος, καθώς δύο κύριοι υποκλάδοι τοποθετούνται στις περιοχές Φόδελε (κοντά στο βόρειο Ηράκλειο) και Απεσωκάρι (νότιο Ηράκλειο). Ενδιαφέρον παρουσιάζει η διαφοροποίηση των πληθυσμών της Νάξου (ΚΛΑΔΟΣ Β1) από εκείνα των υπόλοιπων νησιών του Αιγαίου καθιστώντας τα πιο συγγενικά με τους πληθυσμούς της Δυτικής Κρήτης οι οποίοι παρατηρούνται ως μια αρκετά κλειστή ομάδα. Τέλος, στον ΚΛΑΔΟ Β3 διακρίνεται η κσεχωριστή γενεαλογία των ειδών του Ιονίου (Ζάκυνθος) από εκείνα της ηπειρωτικής Ελλάδας (Αττική, Πήλιο) και του Ανατολικού Αιγαίου (Ρόδος, Σάμος, Χίος) που φαίνεται να προέρχοντα από κοινό πρόγονο.

Εικόνα 4-1: Δέντρο Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας βάσει του μοντέλου εξέλιξης HKY+I+G. Διακρίνονται 4 χαρακτηριστικοί κλάδοι που ανταποκρίνονται στις εξής περιοχές: ΚΛΑΔΟΣ Α = Ανατολική Κρήτη (Ηράκλειο, Λασίθι), ΚΛΑΔΟΣ Β1 = Νάξος, ΚΛΑΔΟΣ Β2 = Δυτική Κρήτη (Χανιά, Ρέθυμνο), ΚΛΑΔΟΣ Β3 = Ζάκυνθος, Σάμος, Ρόδος, Χίος, Αττική, Πήλιο, (Νάξος?).

Επειδή οι αράχνες καταπακτής σε γενικές γραμμές είναι μία εξελικτικά συντηρητική ομάδα, που συνδυάζουν πολύ κακή ικανότητα διασποράς με μεγάλη ικανότητα επιβίωσης, πιθανότατα η παρούσα κατανομή τους στον ελλαδικό χώρο να σχετίζεται με την παλαιογεωγραφική ανάπτυξη της τεκτονικά ταραχώδους περιοχής της Μεσογείου. Ο σχηματισμός της μέσοαιγαικού τάφρου MAT (mid-Aegean trench) κατά το Μέσο Μειόκαινο (12 Mya), αποτελεί πολύ ισχυρό βικαριανιστικό παράγοντα για τις εξελικτικές σχέσεις των ειδών (Poulakakis et al. 2003) δημιουργώντας ένα αδιαπέραστο φράγμα μεταξύ δυτικών και ανατολικών περιοχών. Έτσι, πιθανότατα, να συντέλεσε σε σημαντικό βαθμό στο πρότυπο εξάπλωσης των C. cunicularium στην ευρύτερη περιοχή.

5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

 Akaike H. (1974). A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control 19(6): 716–723.  Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. (1990). BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.  Ausserer, A. (1871). Beitrage zur Kenntnis der Arachniden Familie der Territelariae Thorell (Mygalidae). Verh. zool.-bot. Ges. Wien 21: 177- 224.  Ausserer, A. (1875). Zweiter Beitrage zur Kenntnis der Arachniden Familie der Territelariae Thorell (Mygalidae). Verh. zool.-bot. Ges. Wien 25: 125-206.  Avise J.C. (1986). Mitochondrial-DNA and the evolutionary genetics of higher animals. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 312: 325–342.  Avise J.C. (2000). Phylogeography: The History and Formation of Species. Harvard University Press, Cambridge, Massachusetts.  Avise J.C., Arnold J., Ball R.M., Bermingham E., Lamb T., Neigel J.E., Reeb C.A., Saunders N.C. (1987). Intraspecific phylogeography: The Mitochondrial DNA Bridge Between Population Genetics and Systematics. Ann. Rev. Ecol. Syst., 18, 489-522.  Avise J.C., Shapira J.F., Daniel S.W., Aquadro, C.F., Lansman R.A. (1983). Mitochondrial DNA differentiation during the speciation process in Peromyscus. Mol. Biol & Evol., 1, 38-56.  Avise, J.C. (1998). The history and purview of phylogeography: a personal reflection. Molecular Ecology 7, 371-379.  Avise, J.C. (2000). Phylogeography: The History and Formation of Species. Harvard University Press, Cambridge, MA.  Avise, J.C., Nelson, W.S., Sibley, C.G. (1994). DNA-Sequence Support for a Close Phylogenetic Relationship between Some Storks and New- World Vultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 5173-5177.  Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. (2007). GenBank. Nucleic Acids Res. 35: D21-25.

 Bickford D., Lohman D.J., Sodhi N.S., Ng P.K., Meier R., Winker K., Ingram K.K., Das I. (2006). Cryptic species as a window on diversity and conservation. TRENDS in Ecology and Evolution 22(3): 148-155.  Bininda-Emonds O.R.P. (2000). Factors influencing phylogenetic inference: a case study using the mammalian carnivores. Molecular Phylogenetics and Evolution 16(1): 113-126.  Blair J.E., Hedges S.B. (2005). Molecular phylogeny and divergence times of deuterostome animals. Mol Biol Evol. 22(11): 2275-84.  Bohonak A.J. (1999). Dispersal, gene flow and population structure. Q. Rev. Biol. 74: 21–45.  Bonnet, P. (1956). Bibliographia Araneorum 2(2): 919-1926. Toulouse.  Boore J.L., Collins T.M., Stanton D., Daehler L.L., Brown W.M. (1995). Deducing the pattern of arthropod phylogeny from mitochondrial DNA rearrangements. Nature 376:163–165.  Bos D.H., Posada D. (2004). Using models of nucleotide evolution to build phylogenetic trees. Dev. Comp. Immunol. 29: 211-227.  Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. (1980). Construction of a genetic linkage map using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331.  Bourlat S.J., Nielsen C., Economou A.D., Telford M.J. (2008). Testing the new animal phylogeny: a phylum level molecular analysis of the animal kingdom. Mol Phylogenet Evol. 49(1): 23-31.  Brusca R., Wilson G. (1991). A phylogenetic analysis of the Isopoda with some classificatory recommendations. Memoirs of the Queensland Museum 31: 143-204.  Buburuzan L., Gorgan L.D., Băra I.I. (2007). Types of DNA used in speciation and phylogeny studies. Analele Ştiinţifice ale Universităţii, Alexandru Ioan Cuza”, Secţiunea Genetică şi Biologie Moleculară, TOM VIII.  Burnham K.P., Anderson D.R. (2002). Model Selection and Multimodel Inference: A Practical-Theoretic Approach. 2nd ed. Springer-Verlag  Burns K.J. (1997). Molecular systematics of tanagers (Thraupinae): evolution and biogeography of a diverse radiation of neotropical birds. Mol. Phylogenet. Evol. 8: 334–348.

 Chatzimanolis S, Trichas A., Giokas S., Mylonas M., (2003). Phylogenetic analysis and biogeography of Aegean taxa of the genus Dendarus (Coleoptera: Tenebrionidae). Insect Systematics and Evolution 34 (3) : 295-312.  Chen N., Zhao S. (2009). New progress in snake mitochondrial gene rearrangement. Mitochondrial DNA 20(4): 69-71.  Chenuil A. (2006). Choosing the right molecular genetic markers for studying biodiversity: from molecular evolution to practical aspects. Genetica 127: 101-120.  Chien A., Edgar D.B., Trela J.M. (1976). Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J. Bact. 174: 1550–1557.  Decae, A. E. (1983) (unpubl.). A preljmjnary revjsjon of the mygalomorph spjder genus Cyrtocarenum Ausserer, 1871 (Araneae, Ctenjzjdae). Doctoraal scriptie, Rijksuniversiteit Groningen.  Decae, A. E. (1986). Cyrtocarenum Ausserer, 1871, a living fossil? In W. G. Eberhard, Y. D. Lubin & B. C. Robinson (eds.), Proceedjngs of the njnth jnternatjonal congress of arachnology, Panama, 1983: 39- 44. Smithsonian Inst. Press, Washington.  DECAE, A. E. (1993). Taxonomy and distribution of the genus Cyrtocarenum Ausserer, 1871 in Greece (Araneae, Mygalomorphae).. Bjologia gallo-hellen. 20(1): 75-82.  Decae, A. E., 1996. Systematics of the trapdoor spider genus Cyrtocarenum Ausserer, 1871 (Araneae, Ctenizidae). Bull. Br. arachnol. Soc. (1996) 10 (5), 161-170.  Decae, A. E., Caranhac, G. & Thomas, G. (1982). The supposedly unique case of Cyrtocarenum cunjcularjum (Olivier, 1811) (Araneae, Ctenizidae). Bull. Br. arachnol. Soc. 5(9): 410-419.  Dennis C., Gallagher R. (2004). DNA Το παρόν και το μέλλον. Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης.  Dermitzakis D.M. (1990). Paleogeography, geodynamic processes and event stratigraphy during the Late Cenozoic of the Aegean area. Accademia Nazionale de. Lincei 85: 263–288.  Dermitzakis D.M., Papanikolaou D.J. (1981). Paleogeography and geodynamics of the Aegean region during the Neogene. Annales Geologiques de Pays Hellenique 30: 245–289.

 Dermitzakis, D. M., (1990). Paleogeography, Geodynamic Processes and event Stratigraphy during the Late Cenozoic of the Aegean area. International Symposium on: Biogeographical Aspects of Insularity, Roma 1987, Accademia Nazionale de Lincei, 85, 263–288.  Dobzhansky Th. (1970). Genetics of the evolutionary process. Columbia University Press, New York.  Efron B. (1981). Censored data and the bootstrap. J. Amer. Statist. Assoc. 76: 312-319.  Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. (1991). Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction. Science 252(5013): 1643-1651.  Excoffier L., Smouse P.E., Quattro J.M. (1992). Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131(2): 479-491.  Felsenstein J. (1981). Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. Journal of Molecular Evolution 17: 368–376.  FinchTV 1.4.0 (Geospiza, Inc.; Seattle, WA, USA; http://www.geospiza.com)  Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R. (1994). DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 294-299.  Freeman S., Herron J.C. (2007). Evolutionary analysis, fourth edition. Pearson International Edition.  Futuyma D.J. (1995). Εξελικτική Βιολογία. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης.  Gibbs R.A. (1990). DNA Amplification by the Polymerase Chain Reaction. Analytical Chemistry 62: 1202-1214.  Gibson G., Dworkin I. (2004). Uncovering cryptic genetic variation. Nature Reviews Genetics 5(9): 681—690.  Groves, R. H. & Di Castri, F. (Eds.) (1991). Biogeography of Mediterranean Invasions. Cambridge University Press, Cambridge.  Grundt H.H., Kjølner S., Borgen L., Rieseberg L.H., Brochmann C. (2006). High biological species diversity in the arctic flora. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 972–975.

 Hasegaw M., Kishino H., Yano T. (1985). Dating of human-ape splitting by a molecular clock of mitochondrial DNA. Journal of Molecular Evolution 22: 160–174.  Hennig W. (1966). Phylogenetic systematics. University of Illinois Press, Urbana.  Hillis D.M., Wiens J.J. (2000). Molecular versus morphological systematics: Conflicts, artifacts, and misconceptions. In Wiens, JJ (ed.). Phylogenetic analysis of morphological data. Smithsonian Institution Press, Washington, D.C., pp. 1–19.  Huelsenbeck J.P., Ronquist F. (2001). MRBAYES: Bayesian inference of phylogeny. Bioinformatics 17:754-755.  Huelsenbeck J.P., Ronquist F., Nielse, R., Bollback J.P. (2001). Bayesian Inference of Phylogeny and Its Impact on Evolutionary Biology. Science 294: 2310-2314.  Huelsenbeck P., Crandall K.A. (1997). Phylogeny estimation and hypothesis testing using maximum likelihood. Annu. Rev. Ecol. Syst. 28: 437–466.  Jermiin L.S., Jayaswal V., Ababneh F., Robinson J. (2008). Phylogenetic Model Evaluation. Bioinformatics 452: 16.  Kasapidis P., Magoulas A., Mylonas M., Zouros E. (2005). The phylogeography of the gecko Cyrtopodion kotschyi (Reptilia: Gekkonidae) in the Aegean archipelago. Molecular Phylogenetics and Evolution 35: 612–623.  Kassapidis, P. (2001). A study of the phylogeography of Mediodactylus kotschyi (Sauria: Gekkonidae) in the Aegean Archipelago and adjacent regions. PhD thesis, University of Crete, Irakleion, Crete (In Greek).  Kayiampaki, A. (2003). Phytogeographical study of the South Aegean Island Arc. MSc thesis, University of Crete, Irakleion, Crete (In Greek).  Kelly D.W., Muirhead J.R., Heath D.D., Macisaac H.J. (2006). Contrasting patterns in genetic diversity following multiple invasions of fresh and brackish waters. Mol Ecol. 15(12): 3641-3653.  Kimura M. (1980). A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16: 111–120.  Kimura M. (1985). The neutral theory of molecular evolution. New Scientist 41-46.

 Koch, C. L. (1836). Dje Arachnjden 3: 1-120. Niimberg.  Lefébure T., Douady C.J., Gouy M., Trontelj P., Briolay J., Gibert J. (2006). Phylogeography of a subterranean amphipod reveals cryptic diversity and dynamic evolution in extreme environments. Mol. Ecol. 15: 1797–1806.  Maxam A.M., Gilbert W. (1977). A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74(2): 560–564.  Meulenkamp J.E. (1985). Aspects of the Late Cenozoic evolution of the Aegean region. In: Stanley D.J., Wezel F.C. (eds), Geological evolution of the Mediterranean basin. Springer, New York, pp. 307– 321.  Meulenkamp, J. E., (1985). Aspects of the Late Cenozoic Evolution of the Aegean Region. In: Geological evolution of the Mediterranean Basin (eds. Stanley D. J. and Wezel F. C.), pp. 307-321. Springer, New York.  Moore J., Willmer P. (1997). Convergent evolution in invertebrates. Biol. Rev. 72: 1–60.  Mullis K.B., Faloona F.A. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155: 335-350.  Mullis K.B., Faloona F.A., Scharf S., Saiki R.K., Horn G., Erlich H.A., (1986). Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology.  Nei M., Kumar S. (2000). Molecular evolution and phylogenetics. Oxford, New York: Oxford University Press Inc.  Niemiller M.L., Fitzpatrick B.M., Miller B.T. (2008). Recent divergence with gene flow in Tennessee cave salamanders (Plethodontidae: Gyrinophilus) inferred from gene genealogies. Molecular Ecology 17 (9): 2258–2275.  Ogden T.H., Rosenberg M.S. (2006). Multiple sequence alignment accuracy and phylogenetic inference. Syst Biol. 2: 314-328.  Olivier, G. A. (1811). Mygale, Oxyope. Encycl. méth., Hist. nat., Ins. Parjs 8: 83-86.  Page R.D.M., Holmes E.C. (1998). Molecular evolution. A phylogenetic approach. Blackwell Science Ltd.

 Palumbi S.R. (1996). The polymerase chain reaction. In: Hillis D.M., Moritz C., Mable B.K.(eds), Molecular Systematics. Sunderland, MA: Sinauer Associates, pp. 205–247.  Parmakelis A., Klossa-Kilia Ε., Kilias G., Triantis K.A., Sfenthourakis S. (2008). Increased molecular divergence of two endemic Trachelipus (Isopoda, Oniscidea) species from Greece reveals patterns not congruent with current taxonomy. Biological Journal of the Linnean Society 95: 361–370.  Pfenninger M., Schwenk K. (2007). Cryptic animal species are homogeneously distributed among taxa and biogeographical regions. BMC Evolutionary Biology 7: 121.  Posada D., Crandall K.A. (1998). Modeltest: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics 14 (9): 817-818.  Poulakakis N., Lymberakis P., Antoniou A., Chalkia D., Zouros E., Mylonas M., Valakos E. (2003). Molecular phylogeny and biogeography of the wall-lizard Podarcis erhardii (Squamata: Lacertidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 28: 38–46.  Poulakakis N., Lymberakis P., Valakos E., Zouros E., Mylonas M. (2005). Phylogenetic relationships and biogeography of Podarcis species from the Balkan Peninsula, by bayesian and maximum likelihood analyses of mitochondrial DNA sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution 37: 845–857.  Poulakakis N., Sfenthourakis S. (2008). Molecular phylogeny and phylogeography of the Greek populations of the genus Orthometopon (Isopoda, Oniscidea) based on mitochondrial DNA sequences. Zoological Journal of the Linnean Society 152: 707–715.  Poulakakis, N., Lymberakis, P., Antoniou, A.-B., Chalkia, D., Zouros, E., Mylonas, M. & Valakos, E. (2003). Molecular phylogeny and biogeography of the wall-lizard Podarcis erhardii (Squamata: Lacertidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 28 : 38–46.  Provine W.B. (2004). Ernst Mayr: Genetics and speciation. Genetics 167(3): 1041-1046.  Raven, R. I. (1985). The Spider infraorder Mygalomorphae (Araneae): Cladistics and systematics. Bull. Am. Mus. nat. Bist. 182: 1-180.  Rokas A., Ladoukakis E., Zouros E. (2003). Animal mitochondrial DNA recombination revisited. TRENDS in Ecology and Evolution 18(8) 411- 417.

 Rozas J., Sánchez-DelBarrio J. C., Messeguer X., Rozas R. (2003). DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics 19: 2496-2497.  Saez A.G., Lozano E. (2005). Body doubles. Nature 433: 111.  Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis or diagnosis of sickle cell anemia. Science 230(4732): 1350–1354.  Saitou N., Nei M. (1987). The Neighbor-Joining method - a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.  Sequencher 4.8 version (Gene Codes Corporation, Inc., Ann Arbor, MI, USA)  Sfenthourakis S., Giokas S. (1998). A biogeographic analysis of Greek Oniscidean endemism. Israel Journal of Zoology 44(3-4): 273-282.  Sfenthourakis S., Legakis A. (2001). Hotspots of endemic terrestrial invertebrates in southern Greece. Biodiversity and Conservation 10: 1387– 1417.  Simon C., Buckley T.R., Frati F., Stewart J.B., Beckenbach A.T. (2006). Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 37: 545–579.  Simon C., Frati F., Beckenbach A., Crespi B., Liu H., Flook P. (1994). Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Ann. Ent. Soc. Amer. 87: 671-701.  Simon, E. (1903). Histoire naturelle des Araignées 2(4): 669-1080. Paris.  Steininger F.F., Rögl F. (1984). Paleogeography and palinspastic reconstruction of the Neogene of the Mediterranean and Paratethys. In: Dixon J.E., Robertson A.H.F. (eds), The Geological Evolution of the Eastern Mediterranean. Blackwell Scientific Publications, pp. 659– 668.  Swofford D.L. (2003). PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and Other Methods). ver 4.0beta10. computer program. Sinauer Associates, Sunderland, MA.

 Tamura K. (1992). Estimation of the number of nucleotide substitutions when there are strong transition-transversion and G+C content biases. Molecular Biology and Evolution 9: 678–687.  Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599.  Tamura K., Nei M. (1993). Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution 10: 512–526.  Tavare S. (1986). Some probabilistic and statistical problems in the analysis of DNA sequences. In: R.M. Miura, Editor, DNA sequence analysis, American Mathematical Society, Providence, pp. 57–86.  Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22(22): 4673-4680.  Thorell, T. (1870). On European spiders. Nova Acta R. S~c. Scient. upsal. (3)7: 109-242.  Tριανταφυλλίδης Κ. (2001). Κλασική και Μοριακή Γενετική. Εκδοτικός Οίκος Αδελφών Κυριακίδη α.ε.  Williams J.F. (1989). Optimization strategies for the polymerase chain reaction. Biotechniques 7: 762–769.