UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIES Mention CHIMIE

Mémoire d’étude pour l’obtention du

DIPLOME DE MASTER II EN CHIMIE

Parcours : CHIMIE BIOLOGIE

ETUDE CHIMIQUE et ACTIVITES ANTIBACTERIENNES DE Dupuya madagascariensis ssp tamarindoïde ()

Présenté le 09 Novembre 2018 par : Manjato Reibe RAKOTONANDRASANA

Président du Jury : Madame Bakolinirina ANDRIAMIHAJA Professeur Titulaire Rapporteurs : Monsieur Andrianambinina A. RAZAKARIVONY Maître de Conférences Madame Vanihalahaja Eliane RAZAFINTSALAMA Maitre de recherche HDR Examinateurs : Monsieur Rivoarison RANDRIANASOLO Maitre de conférences HDR Madame Angela Irène RATSIMBA Docteur

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé suivant la collaboration du Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN) et le Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques (CNARP).

Tout d’abord, nous souhaitons adresser nos plus vifs remerciements pour les membres du Jury :

− Madame Bakolinirina ANDRIAMIHAJA Professeur Titulaire à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, rattachée au Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN) Vous nous faites honneur d’avoir accepté de présider ce jury malgré vos multiples occupations. Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’enseignement et la formation que vous nous avez dispensés, pour l’accueil chaleureux, pour la confiance et le soutien que vous nous avez accordés dans votre laboratoire, pour les conseils, les remarques constructives, les encouragements et la bienveillance dont vous nous avez accompagnés tout au long de ce travail.

− Monsieur Andrianambinina A. RAZAKARIVONY Maître de Conférences à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo Directeur du Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN) Vous avez accepté d’être le Rapporteur de ce mémoire. Nous avons eu le privilège de travailler parmi votre équipe. Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’accueil chaleureux dans votre laboratoire, pour les savoir-faire et expériences que vous nous avez partagés, pour votre exigence qui a grandement stimulé nos réflexions, pour vos encouragements et pour votre bienveillance qui nous a permis de travailler dans les meilleures conditions ainsi qu’à votre grande disponibilité malgré vos multiples occupations.

− Madame Vanihalahaja E. RAZAFINTSALAMA Maître de Recherches-HDR Chef du Département Pharmacodynamie au Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques

Vous avez accepté d’être le Rapporteur de ce mémoire. Vous nous avez réservé un accueil meilleur malgré vos obligations professionnelles et guidé à chaque étape des études biologiques. Votre participation à l’élaboration de ce mémoire nous a été essentielle. Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour nous avoir initiés aux tests biologiques, pour les compétences et conseils vivement qualitatifs que vous nous avez partagés et pour votre bienveillance qui nous a permis d’arriver au terme de ce travail.

− Monsieur Rivoarison RANDRIANASOLO Professeur à l’Université d’Antananarivo, Domaine Sciences et Technologies, Enseignant Chercheur dans la Mention Chimie, Membre du Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et de Chimie Organique Biologique (LCSN-COB), Responsable du parcours « Chimie Biologie »

Vous avez accepté d’être l’Examinateur de ce mémoire. Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’enseignement et la formation en Chimie que vous nous avez donnés, pour le temps que vous avez consacré sur ce travail pour le rendre meilleur, vos remarques et vos conseils nous ont été précieux.

− Madame Angela Irène RATSIMBA

Enseignant dans la Mention Chimie

Vous avez accepté avec bienveillance d’être l’Examinateur de ce mémoire. Votre participation à ce travail nous a été précieuse. Veuillez accepter nos profondes gratitudes et reconnaissances.

− Docteur Michel RATSIMBASON Directeur du Centre National d’Application des Recherches Pharmaceutiques (CNARP). Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’aimable accueil et la collaboration dont vous nous avez accordés. Ce qui nous a permis de réaliser les tests biologiques au Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques et d’arriver au terme de ce mémoire. Nous adressons notre sincère et respectueuse reconnaissance

− A Monsieur le Doyen de la Faculté des Sciences qui nous a permis de soutenir le présent mémoire. − A Monsieur Dimby RALAMBOMANANA, Maître de Conférences, Responsable de la Mention Chimie et Directeur du Laboratoire de Chimie

Organique « Produits Naturels » et Biotechnologie (LPNB), pour sa collaboration qui nous a permis d’arriver en ce jour. − A tous les professeurs qui ont participé à nos enseignements et formations durant ces années d’étude universitaire. − Au Comité de lecture pour l’intérêt porté et le temps consacré sur ce travail. Nos sincères remerciements vont aussi :

− A Monsieur Ralinandrianina RANDRIAMIARAMISAINA, Enseignant-chercheur et membre de l’équipe LaCASN (Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles) pour ses aides pratiques en laboratoire. − A Monsieur Maonja F. RAKOTONDRAMANGA, Maître de Conférences, pour le moteur de recherche qu’il nous a partagé. − A Monsieur Hariliva RAMIARISON, Enseignant-chercheur et membre de l’équipe LaCASN pour les moteurs de recherches. − A Madame N. J. Patricia RAMANANTSOA, membre de l’équipe LaCASN pour ses aides dans la réalisation du livre − A tous les membres de l’équipe du Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN) pour leurs interventions afin de rendre ce travail meilleur, pour l’ambiance et la convivialité. − A tous les membres du Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques pour l’aimable accueil, l’ambiance et la convivialité. − A mes collègues de promotion pour leur aide. Je souhaite remercier mes parents pour la confiance qu’ils m’ont accordée et le soutien qu’ils m’ont donné tout au long de mes études. A ma famille, mes amis et tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail, merci.

LISTE DES ILLUSTRATIONS

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde ...... 3

Figure 2 : Distribution de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde ...... 5

Figure 3: Montage soxhlet...... 11

Figure 4: Évaporateur rotatif HEIDOLPH Laborota 4010-digital ...... 11

Figure 5: Représentation de CCM ...... 13

Figure 6: Colonne chromatographique ...... 14

Figure 7: Microplaque à 96 puits ...... 19

Figure 8: Chromatogramme de l’extrait SE2 ...... 22

Figure 9: Chromatogramme de l’extrait F5 ...... 23

Figure 10: Chromatogramme du produit P5 ...... 25

Figure 11 : spectre de masse SM-ESI en mode positif...... 26

Figure 12 : spectre de masse SM-ESI en mode négatif ...... 27

1 Figure 13 : spectre de RMN H-1D du composé P5 ...... 28

La figure 14 représente le spectre RMN 13C « Broadband decoupling » et DEPT 135 du compose P5. Figure 14 : DEPT 135(en haut) et spectre RMN 13C « Broadband decoupling » (en bas) du composé P5 ...... 29

Figure 15 : spectre RMN-2D HMQC du composé P5 ...... 31

Figure 16 : spectre RMN-2D HMBC ...... 33

Figure 17 : spectre RMN-2D COSY ...... 35

Figure 18: Résultats bioautographie des extraits bruts et les 5 fractions (F1-F5) de Dupuya madagascariensis ssp. tamarindoïde ...... g

Figure 19: Résultats CMI par la méthode de microdulition ...... g

Figure 20: Résultats CMB des extraits et fractions testés ...... h

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LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Molécules isolées dans le Cordyla madagascariensis R.Vig subsp madagascariensis ...... 6

Tableau 2: Quelques exemples d’antibiotiques et leurs cibles ...... 7

Tableau 3: Exemples des bactéries résistantes aux antibiotiques...... 8

Tableau 4: Récapitulatif du criblage phytochimique...... 10

Tableau 5: Liste des souches testées ...... 17

Tableau 6: Résultats du criblage phytochimique ...... 20

Tableau 7: Masses et caractéristiques des trois extraits bruts ...... 21

Tableau 8: Paramètre CCM de l'extrait SE2 ...... 22

Tableau 9: Interprétation du chromatogramme de SE2 ...... 22

Tableau 10: Masses et caractéristiques des fractions ...... 23

Tableau 11: Paramètre CCM de l'extrait F5...... 24

Tableau 12: Interprétation du chromatogramme de F5 ...... 24

Tableau 13: Paramètre CCM du produit P5 ...... 25

Tableau 14: Interprétation et comportement chromatographique de P 5 ...... 26

Tableau 15 : type de carbone selon les valeurs de δ (RMN 13C)...... 30

Tableau 16 : Corrélations observées dans le spectre HMQC ...... 32

Tableau 17 : attribution des protons aux carbones porteurs ...... 32

Tableau 18 : corrélations observées dans le COSY ...... 36

Tableau 19 : Comparaison des valeurs de déplacements chimiques de P5 avec ceux de la littérature ...... 38

Tableau 20: Résultats des tests antibactériens des extraits bruts...... 40

Tableau 21: Résultats du test antibactérien des fractions et le produit isolé de SE2 ...... 41

Tableau 22: Résumé des résultats des déterminations CMI et CMB ...... 42

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LISTE DES SCHÉMAS

Schéma 1: Diagramme d’extraction ...... 12

Schéma 2: Diagramme de fractionnement du SE2 ...... 14

Schéma 3: Diagramme d’isolement du P5 ...... 25

Schéma 4: attribution des protons aromatiques aux carbones porteurs...... 33

Schéma 5: corrélation 1H-13C en HMBC dans le noyau A...... 34

Schéma 6 : corrélation 1H-13C en HMBC dans le noyau B ...... 34

Schéma 7 : corrélation 1H-13C en HMBC du sucre ...... 35

Schéma 8 : corrélation 1H-1H en COSY ...... 36

Schéma 9 : Structure finale du composé P5 ...... 37

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LISTES DES ABRÉVIATIONS ET SIGLES

AcOEt : Acétate d’éthyle

ADN : Acide Désoxyribo-Nucléique

APCI : Atmospheric Pressure Chimical Ionization

APG : Angiosperm Phylogeny Group

API : Appareils et Procédés d’Identification

CCM : Chromatograhie sur Couche Mince cm : Centimètre

CMB : Concentration Minimale Bactéricide

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

CNARP : Centre National d’Application des Recherches Pharmaceutiques

COSY : COrrelation SectroscopY

DCM : Dichlorométhane dd : doublé de doublé

DMSO : Diméthylsulfoxyde

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

ESI : Electrospray Ionization

EtOH : Ethanol

FAB : Fast Atom Bombardment

FeCl3 : Chlorure ferrique h : heure

Hz : Hertz

HCl : Acide chlorhydrique

HMBC : Heteronuclear Multile Bond Correlation

HSQC : Heteronulear Single Quantum Correlation

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H2SO4 : Acide sulfurique

IE : Ionisation Electronique

J : Constante de couplage

LaCASN : Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles m : mètre

MeOD : Méthanol deutéré

MeOH : Méthanol

Mg : Magnésium

MHz : Mégahertz mL : millilitre mm : millimètre mn : minute nm : nanomètre ppm : Partie par million ssp : sous espèce

Rf : Rapport frontal

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire

UV : Ultraviolet

13C : Carbone 13

1H : Proton

1D : A une dimension

2D : A deux dimensions

µM : Micromolaire

 : Déplacement chimique

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TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ...... 1 PREMIÈRE PARTIE : GÉNÉRALITÉS ...... 3

CHAPITRE I : LA PLANTE : DUPUYA MADAGASCARIENSIS R.VIG SSP. TAMARINDOÏDE (FABACEAE)...... 3 I.1 Position systématique de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde (FABACEAE) ...... 3 I.2 Famille de FABACEAE...... 3 I.3 Genre Dupuya ...... 4 I.4 Espèce : Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde ...... 4 a. Description botanique ...... 4 b. Distribution ...... 4 c. Utilisation traditionnelle : ...... 5 I.5 TRAVAUX ANTERIEURS ...... 5

CHAPITRE II : ACTIVITES ANTIBACTÉRIENNES ET RÉSISTANCES BACTÉRIENNES ...... 7 II.1 Antibactériennes ou antibiotiques...... 7 II.2 Résistance bactériennes ...... 8 DEUXIÈME PARTIE : MATÉRIELS ET MÉTHODES ...... 9

CHAPITRE I : ETUDE CHIMIQUE ...... 9 I.1 Matériel végétal...... 9 I.2 Criblage phytochimique ...... 9 I.3 Méthodes d’extraction...... 11 a. Soxhlet ...... 11 b. Rendement d’extraction ...... 13 I.4 Fractionnement et isolement ...... 13 a. Chromatographie sur couche mince : CCM ...... 13 b. Chromatographie sur colonne ouverte ...... 14

I.5 Isolement du produit P5 ...... 15 I.6 Méthodes d’identification ...... 15 a. Spectroscopie Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ...... 15 a.1 Spectres monodimensionnels (1D)...... 15 a.2 RMN bidimensionnelles (RMN – 2D) ...... 16 b. Spectrométrie de masse ...... 16 CHAPITRE II : ETUDE BIOLOGIQUE ...... 17 I.1 Tests biologiques...... 17 a. Méthode bioautographie ...... 17 b. Méthode de microdilution ...... 18 TROISIÈME PARTIE : RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ...... 20

CHAPITRE I: ETUDE CHIMIQUE ...... 20

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I.1 Criblage phytochimique : ...... 20 I.2 Extraction ...... 21

I.3 Analyse préliminaire de l’extrait SE2...... 21 I.4 Fractionnement...... 23 I.5 Isolement ...... 24

I.6 Identification de P5 ...... 25

I.7 Analyse spectrale de P5 ...... 26 I.7.1 Spectroscopie de masse ...... 26 I.7.2 Spectres RMN ...... 27 I.7.2.1 Interprétation des spectres ...... 27 o Spectre RMN 1H ...... 27 o Spectre RMN 13C « Broadband decoupling » et DEPT 135...... 29 o Spectre HMQC ...... 31 o Spectre HMBC ...... 33 o Spectre COSY...... 35 CHAPITRE II : ÉTUDE BIOLOGIQUE ...... 40 III.1 Test bioautographie ...... 40 III.2 Détermination de la CMI et de la CMB ...... 41 CONCLUSION ...... 20

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE ET WEBOGRAPHIQUE ...... 45 BIBLIOGRAPHIE ...... 45 WEBOGRAPHIE : ...... 49

ANNEXES ...... A ANNEXE I : CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE ...... A

ANNEXE II : PREPARATION DES REACTIFS ...... E ANNEXE III : TEST ANTIBACTERIEN ...... G

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INTRODUCTION INTRODUCTION

Historiquement, les maladies infectieuses sont l’une des plus importantes causes de mortalité. Vers la fin du vingtième siècle, la médecine a été révolutionnée par la découverte d’Alexander Flemming du premier antibiotique : la pénicilline, efficace dans le traitement des infections bactériennes (Ligon et al., 2004). Après, de nombreux antibiotiques synthétiques ou hémi-synthétiques, ont également été découverts, entre autres, la viridicatumtoxine B (Nicolaou K. et al., 2015), l’oxytetracycline, la minocycline (Yala D. et al., 2001). Mais le problème se pose sur la résistance des différentes bactéries à ces antibiotiques.

Actuellement, la découverte de beaucoup d’antibiotiques est rendue possible grâce à l’utilisation des différentes sources de matières premières comme les champignons, les plantes et les bactéries (François S. et al., 2013). A titre d’illustration, pour ceux qui sont d’origines végétales, parmi les 400 espèces de plantes médicinales en Afrique, presque 90% sont utilisées en médecine traditionnelle pour traiter les maladies infectieuses, selon l’OMS en 2005 (Diallo A., 2005).

A Madagascar, la diversité de son climat et de son relief a favorisé le développement d’une flore unique au monde. Par ses 5% de la flore de la planète soit environ 13000 espèces dont 80% endémiques (Rasoanaivo P., 1996), plusieurs plantes sont utilisées par la population malagasy en médecine traditionnelle et font l’objet d’étude au laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN) et au Centre National d’Application des recherches Pharmaceutique (CNARP). Quelques exemples sont cités ci-dessous :

− Mussaenda erectiloba Wernham de la famille de Rubiacées est utilisée contre le paludisme (Felanarisoa S., 2018) − Distephanus trinervis est connue contre le paludisme et la fièvre (Ramanantsoa N.J.P. et al., 2016)

Pour notre part, nous avons proposé l’étude phytochimique et la recherche de l’activité antibactérienne de Dupuya madagascariensis subsp tamarindoïde (Fabaceae), une plante endémique à Madagascar, localisée au Village de Français (Tendrombohitr’i Tsingy) utilisée en menuiserie et comme poison de pêche (Joseph H. K. Jr., 2005).

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Dans le cadre de l’initiation à la recherche, l’isolement, l’identification structurale du produit isolé de la plante ainsi que la détermination du pouvoir antibactérien des extraits, des fractions et du produit isolé feront l’objet de notre travail.

Trois parties composeront notre manuscrit :

- Après l’introduction générale, la première partie sera focalisée sur les généralités de Dupuya madagascariensi subsp tamarindoïde (Fabaceae). - La deuxième partie sera consacrée aux matériels et méthodes utilisés pour les études chimique et biologique de la plante - Avant la conclusion générale et les perspectives, la troisième partie fournira les résultats obtenus et les discussions.

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PREMIÈRE PARTIE : GÉNÉRALITÉS PREMIÈRE PARTIE : GÉNÉRALITÉS

CHAPITRE I : LA PLANTE : Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde (FABACEAE)

I.1 Position systématique de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde (FABACEAE) [w1]. Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde est endémique à Madagascar.

La position systématique de la plante indique les affiliations suivantes :

 Règne : Végétal  Classe : Equisetopsida C. Agardh  Sous-classe : Magnoliidae Novak ex Takht  Division : Rosanae Takht.  Ordre : Bromhead  Famille: Fabaceae Lindl.  Sous-famille : Papilionaceae (Nigel C. V. et al., 2008)  Genre : Dupuya Figure 1 : Dupuya madagascariensis R.Vig  Espèce : madagascariensis ssp. tamarindoïde  Sous-espèce : tamarindoïde Source : Fidy RATOVOSON/ Tropicos  Nom vernaculaire : Hazomena, Anakaraka, Kataka , Madiroala  Synonyme : Cordyla madagascariensis R. Vig

I.2 Famille de FABACEAE

La famille des fabacées est une grande famille appartenant à la classe des Dicotylédones (deux cotylédons sur l'embryon, deux feuilles constitutives de la graine) [w2]. Le nom de la famille est adopté en classification phylogénétique APG II (2003). Elle comprend environ 730 genres et 19400 espèces réparties dans six (6) sous-familles selon LPWG (2017) (Nasim A. et al., 2017) :

 Duparquetioideae (LPWG, stat. nov.) : 1 genre, 1 espèce  Cercidoideae (LPWG, stat. nov.) : 12 genres, 335 espèces  Detarioideae Burmeist. : 84 genres, 760 espèces  Dialioideae (LPWG, stat. nov.) : 17 genres, 85 espèces  Caesalpinioideae DC: 148 genres, 4400 espèces  Papilionoideae DC: 765 genres, 19,581 espèces

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I.3 Genre Dupuya

Le genre Dupuya est un genre récent. Dans les anciennes études, ce genre est placé dans le genre Cordyla mais, vu la présence de staminodes1 et de différentes morphologies des graines, deux espèces ont été séparées du genre Cordyla et placées dans le nouveau genre Dupuya. Dupuya madagascariensis et Dupuya haraka qui sont endémiques de Madagascar (Joseph H. K. Jr., 2005).

I.4 Espèce : Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde

a. Description botanique

C’est un arbre de taille moyenne, atteignant 20 à 25 m de haut, caducifoliés. Il fût généralement droit et cylindrique, de 0,60 à 0,90 m de diamètre. Son écorce est fissurée et écailleuse avec des écailles allongées, brun-grisâtre à gris foncé. La cime est arrondie, de grande taille et dense. Les feuilles sont disposées en spirales, composées imparipennées de 15 à 43 folioles avec stipules arquées, de 4 mm de long, caduques. Les pétioles et les rachis mesurent ensemble 18,5 cm de long, avec côtes étroites ; pétiolules jusqu’à 1 mm de long. Les folioles sont normalement alternées, étroitement obovales à étroitement elliptiques ou oblongues. L’inflorescence est en grappe terminale environ 18 cm de long, à pubescence clairsemée, bractées de petite taille. Les fleurs sont bisexuées, régulières ; pédicelle d’environ 0,5 cm de long ; hypanthium en coupe, d’environ 2 mm de long de couleur verdâtre. Le calice est initialement entier, mais se fendant en 2-4 lobes. Les pétales sont absents. Les étamines sont nombreuses, insérées au bord de l’hypanthium, de 1 à 1,5 cl de long, blancs, avec une rangée intérieure d’étamines rudimentaires atteignant 2,5 mm de long. L’ovaire est supère, ellipsoïde, 1-loculaire, sur un stipe long avec un style court. Les fruits sont des gousses en forme de baie, ellipsoïdes à cylindrique, indéhiscente, de 3,5 - 6,5(-10) cm fois 2-3,5 cm. Ils sont de couleur brun rougeâtre à brun foncé, à stipe atteignant 3,5 cm de long. Il contient 1 à 3 graines enveloppées dans une pulpe blanchâtre. Les graines sont oblongues-ellipsoïdes, de 1,5 à 2 cm de long, à tégument brun rougeâtre et à albumen épais [w2].

b. Distribution

Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde est endémique de Madagascar où il est répandu dans les sols sableux, sableux-limoneux ou calcaires bien drainés et dans la forêt sèche d’altitude 600 m.

1 Staminode : un staminode est une étamine stérile ou avortée, souvent rudimentaire Page | 4

: Présence de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde Figure 2 : Distribution de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde Source : [w3] c. Utilisation traditionnelle :

Les populations sakalava utilisent cette espèce dans la construction des cases traditionnelles et dans la menuiserie. Elles emploient aussi ce bois surtout pour la confection des bordés 2et du vaigrage3.

Ces bois sont utilisés pour la confection de solives4, de poteaux, d’huisseries et de madriers dans la construction d’habitations. Ils sont aussi utilisés en menuiserie, pour la construction navale 5et les bardeaux. Ils servent également comme poison de pêche (Joseph H. K. Jr., 2005).

I.5 Travaux antérieurs De nombreux travaux chimiques ont été effectués sur le genre Cordyla :

2 Bordé : ensemble des bordages. Un bordage c’est l’ensemble de planches épaisses ou de tôles recouvrant la membrure d'un navire. 3 Vaigrage : Ensemble des vaigres ; côté intérieur des membrures. Une vaigre c’est une planche qui revêt le côté intérieur des membrures d'un navire 4 Solive : 5 Navale : ce qui concerne les navires, la navigation

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D’après les travaux de Yanpeng H. et al., 2008 et Yanpeng H., 2009, trois molécules antiprofilerante ont été isolés dans les fruits de Cordyla madagascariensis R.Vig ssp. madagascariensis. Une espèce endémique de Madagascar qui est récoltée à Antsiranana dans la proximité de la commune de Mahavanoma (12°23'10"S 49°20'19"E)

Tableau 1: Molécules isolées dans le Cordyla madagascariensis R.Vig subsp madagascariensis Partie Structure des molécules Nom systématique Activité utilisée isolées

Acide cassa-12,14(17),15- Fruits Antiproliferative trien-19α-hydroxyl-18β-oïque

6β-

Fruits acetoxy-cassa-19α-acetoxy- Antiproliferative 12,15-dien-18β-ol

Acide cassa-12,15-dien-19α- Fruits Antiproliferative hydroxyl-18β-oïque

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CHAPITRE II : ACTIVITES ANTIBACTÉRIENNES ET RÉSISTANCES BACTÉRIENNES

II.1 . Antibactériennes ou antibiotiques

Généralement, il y a deux classes d’antibiotiques : les bactéricides et les bactériostatiques. Quand une substance donnée inhibe seulement la croissance des bactéries, celle-ci a un effet bactériostatique, mais lorsque qu’elle provoque la mort des bactéries on parle d’un effet bactéricide (Hammer K.A et al., 1999).

II.1.1 Effet bactériostatique :

C’est une manifestation au cours de laquelle aucune destruction bactérienne n’est observée. On remarque une inhibition de la croissance bactérienne vis à vis d’une substance à effet bactériostatique. Cette croissance reprend dès que la substance disparaît (Muanda FN et al., 2010). L’effet bactériostatique d’une molécule est évalué par la concentration minimale inhibitrice (CMI) II.1.2 Effet bactéricide :

C’est un effet qui se manifeste par une accélération de la mort des bactéries aux concentrations d’antibiotiques utilisées in vivo ou in vitro (Muanda FN et al., 2010).

Le tableau 2 représente quelques exemples d’antibiotiques et leurs cibles (Mainardi J.L., 2015) :

Tableau 2: Quelques exemples d’antibiotiques et leurs cibles

Antibiotiques à activité principalement Antibiotiques à activité principalement bactéricide Bactériostatique Cible bactérienne Cible bactérienne Classe Classe d’action d’action Béta lactamines Phénicols Ribosome (Mainardi J.L. Paroi (peptidoglycane6) Ex. : pénicillines Ex. :chloramphénicol 2015) Aminosides Nitroimidazolés Ribosome Acides nucléiques Ex. : streptomycine Ex. métronidazole Quinolones Cyclines Ribosome (Mainardi J.L. Ex. : Acide ADN gyrase Ex. : tétracycline 2015) nalidixique

6 Peptidoglycane : est un composant de la paroi bactérienne maintenant la forme des cellules et assurant une protection mécanique contre la pression osmotique Page | 7

II.2 . Résistance bactériennes

Récemment, de nombreux déterminants de résistance ont été décrits avec l’émergence de bactéries de plus en plus résistantes (Alekshun MN et al., 2007)

Une bactérie est dite résistante, si elle peut se développer, même en présence des antibiotiques à des concentrations élevées. Ces résistances sont des phénomènes naturels qui résultent d’une évolution par sélection naturelle ou acquise. En général, plusieurs facteurs peuvent être les causes des résistances aux antibiotiques. Citons entre autres (Sanath K. et al., 2013) :

. La structure bactérienne ciblée par l’antibiotique est modifiée dans le cas d’une mutation, favorisant une méconnaissance de l’antibiotique de son cible; . La bactérie produit de nouvelles enzymes qui détruisent l’antibiotique d’où inactivation de celui-ci ; . L’antibiotique est pompé à l’extérieur de la bactérie par des molécules spécialisées, entrainant son élimination. À titre d’exemple, le tableau 3 présente quelques exemples de bactéries résistantes avec quelques antibiotiques (Michael R. et al., 2009).

Tableau 3: Exemples des bactéries résistantes aux antibiotiques

Nom de bactéries résistantes Antibiotiques

Staphylococus aureus Méthicilline

Enterococcus Vancomycine

Pseudomonas aeruginosa Quinolones et carbapénèmes

Salmonella pneumoniae Penicilline et ciprofloxacine

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DEUXIÈME PARTIE : MATÉRIELS ET MÉTHODES

CHAPITRE I : ETUDE CHIMIQUE

I.1 Matériel végétal

L’espèce sélectionnée (Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde) a été collectée dans son habitat naturel. La récolte a été effectuée à la montagne des Français ou Tendrombohitr’Antsingy (12°22'20"S 49°21'59"E).

Les tiges de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp tamarindoïde ont été séchées à l’abri de la lumière du soleil et broyées à l’aide d’un broyeur électrique. Ensuite la poudre de la plante obtenue a été utilisée comme matériel végétal.

I.2 Criblage phytochimique

Le criblage phytochimique est un test rapide, simple et reproductible. Il permet de détecter les principales familles de substances naturelles présentes dans un matériel végétal de façon qualitative. Il permet aussi d’informer la nature des principes actifs ou la nature des produits isolés dans la plante. La méthode utilisée est celle de FONG et ses collaborateurs (Fong H.H.J. et al., 1977).

Les tests de criblage phytochimiques sont détaillés dans l’annexe I et les préparations des réactifs sont présentées dans l’annexe II.

La récapitulation des différents tests de criblage phytochimique est consignée dans le tableau 4.

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Tableau 4: Récapitulatif du criblage phytochimique

Classes de Observations Tests et réactifs Signification produits naturels attendues Réactif de Mayer Alcaloïdes Réactif de Wagner Précipité Présence d’alcaloïdes Réactif de Dragendorff Présence de flavones Test de Wilstater Rouge

HCl conc + tournures de Présences de flavonols Mg Rouge pourpre

Coloration Présence de flavanones Rouge violacée et flavanols

Présence de flavones Test de Wilstater Rouge modifié Flavonoïdes et HCl conc + tournures de leucoanthocyanes Présence de flavonols Mg + eau + alcool Rouge pourpre isoamylique Coloration Test de BatsMith Coloration rouge Présence de violacé leucoanthocyanes  HCl conc à chaud Coloration rouge Présence des  HCl conc à froid anthocyanes

Gélatine 1% Précipité Présence de polyphénols

Gélatine salée Précipité Présence de tanins Tanins et

polyphénols Bleu vert Présence de tanins condensés FeCl3 dans MeOH Noir-bleuâtre Présence de tanins

Coloration hydrolysables Coloration rouge Présence de quinones Quinones NH4OH violacé

Présence de Test de Liebermann Pourpre triterpénoïdes Burchard Anhydride acétique + Violet ou bleu Présence de stéroïdes

H2SO4 conc Coloration vert Test de Salkowski Anneau de séparation Présence de stérols Stéroïdes et H2SO4 en rouge insaturés terpénoïdes Test de Badjet Kedde Présence de stéroïdes Coloration rouge Acide picrique lactoniques Test de Keller-Killiani Anneau de séparation Présence de desoxy-2- FeCl3 10 % + acide en rouge pourpre sucre acétique glacial HCl concentré à chaud Coloration bleue Présence d’iridoïdes Eau + agitation pendant Mousses persistantes Saponines Présence de saponines 30 s après 30 mn Présence de Polysaccharides Eau/ Ethanol Précipité polysaccharides

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I.3 Méthodes d’extraction

a. Soxhlet

C’est une méthode classique pour l’extraction solide-liquide. La matière végétale entre en contact avec une portion de solvant pur. L’avantage de cette méthode est la rapidité de l’extraction.

Figure 3: Montage soxhlet

Source : auteur La figure 3 présente un extracteur Soxhlet de 250 ml adapté à un ballon de 1000 ml contenant 600 ml de solvant, utilisé pour extraire 195 g de poudre de tiges de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde avec une série des 3 solvants de polarité croissante. La poudre des tiges de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde a été d’abord extraite avec le dichlorométhane jusqu'à épuisement, de l’acétate d’éthyle puis de méthanol.

L’extrait au dichlorométhane, l’extrait à l’Acétate d’éthyle et l’extrait méthanolique ont été respectivement obtenus après un passage sur l’évaporateur rotatif HEIDOLPH Laborota 4010-digitale à 39°C.

Figure 4: Évaporateur rotatif HEIDOLPH Laborota 4010-digital

Source : auteur

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Le protocole d’extraction est représenté sur Schéma 1:

Poudre de tige de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde 195,0 ± 0,1g

Soxhlet avec DCM

Évaporation

SE1 Marc 1 16,0 ± 0,1g

Sohxlet avec AcOEt

Evaporation

SE2 Marc 2 15,0 ± 0,1g

Sohxlet avec Evaporation MeOH

SE3 Marc 3 12,0 ± 0,1g

Schéma 1: Diagramme d’extraction

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b. Rendement d’extraction

Le rendement d’une extraction est donné par :

Masse d′extrait obtenu Rendement (%) = × 100 Masse de matériel végétal utilisé

I.4 Fractionnement et isolement

a. Chromatographie sur couche mince : CCM

La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique analytique rapide, simple, utilisée au cours de la séparation et de l’identification des différents métabolites. Elle repose principalement sur le phénomène d’adsorption, avec comme phase stationnaire une couche d’absorbant (gel de silice ou autre) étalé uniformément sur un support en aluminium ou en verre de dimensions variables et une phase mobile comme éluant. Cette dernière est composée d’un solvant unique ou d’un mélange de solvants qui migrent lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l’échantillon déposé (Mahuzier G. et al., 1990).

Une fois l’élution terminée, la plaque est séchée à température ambiante, puis examinée sous l’UV (longueurs d’onde λ = 254 nm et 365 nm).

Si nécessaire, les tâches du chromatogramme sont révélées par pulvérisation de vanille sulfurique. On détermine alors, pour chaque constituant, le Rapport frontal (Rf).

푑푖푠푡푎푛푐푒 푝푎푟푐표푢푟푢푒 푝푎푟 푙푒 푐표푚푝표푠é 푅 = 푓 푑푖푠푡푎푛푐푒 푝푎푟푐표푢푟푢푒 푝푎푟 푙푒 푠표푙푣푎푛푡

Figure 5: Représentation de CCM

Source : auteur

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b. Chromatographie sur colonne ouverte

Elle est basée sur l’utilisation d’une phase stationnaire comme le gel de silice et une phase mobile constituée par divers systèmes de solvants comme éluant. Elle est la plus utilisée pour la séparation des quantités importantes de mélanges complexes. En principe, la phase mobile est composée des mêmes solvants que ceux utilisés pour la CCM analytique (Portret B., 2007).

Figure 6: Colonne chromatographique Source : auteur

L’extrait SE2 a été choisi pour le fractionnement après avoir su qu’elle a des propriétés antibactériennes très fortes et après avoir observé le nombre des tâches du CCM. L’extrait SE2 a été monté sur la colonne de silice par voie humide, la masse de silice utilisée est de 40 fois de celui de SE2 (15×40g). L’échantillon a été déposé sous forme solide. L’élution a été effectuée avec des systèmes de solvants de polarités croissantes (DCM/MeOH 100/0 à 0/100). Le volume utilisé pour chaque éluant est le double du volume mort (2 × 500ml). Les fractions obtenues ont été évaporées sous vide avec l’évaporateur rotatif HEIDOLPH Laborota 4010-digital. Le schéma 2 ci-après présente le diagramme du fractionnement :

SE2 4500±0,01mg

Colonne de silice Système d’éluant : DCM/ MeOH (100/0 – 0/100)-(V/V)

F1 F2 F3 F4 F5

110± 0,01mg 250± 0,01mg 290± 0,01mg 260± 0,01mg 347± 0,01mg

Schéma 2: Diagramme de fractionnement du SE2

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I.5 Isolement du produit P5

Au sujet de l’isolement, 347 mg de fraction F5 ont été chromatographiés sur la colonne de silice. Le montage a été fait par voie humide et la masse de silice utilisée a été de 40 fois de celui de l’extrait (347 × 40 mg). L’échantillon a été déposé sous forme solide. L’élution a été effectuée par un système de solvants DCM/MeOH de polarité croissante (100/0 à 0/100)-(V/V).

I.6 Méthodes d’identification

a. Spectroscopie Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

La structure de molécule isolée a été déterminée principalement par la spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN).

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est une technique assez récente au regard des spectroscopies classiques. Elle constitue actuellement la technique la plus puissante et la plus générale d’analyse structurale des composés organiques.

Le principe est que l’on applique à la molécule, une fréquence électromagnétique donnée, spécifique à un noyau (H, C, N, P…), correspondant à sa fréquence d’excitation. Et cette fréquence électromagnétique va entrainer un changement énergétique des noyaux de même nature présents dans la molécule. Lors de leur retour à l’état d’équilibre, ces noyaux vont émettre une onde électromagnétique (ou fréquence de résonance) qui sera détectée par un capteur. Cette fréquence de résonance sera différente selon l’environnement chimique du noyau étudié (Hamon M. et al., 1990).

Parmi les différents types de RMN, seuls les spectres utilisés sont pris en considération.

a.1 Spectres monodimensionnels (1D)

. Spectre RMN 1H

Le spectre RMN du proton est une méthode puissante utilisée dans la détermination structurale des composés organiques inconnus. Il fournit de nombreuses informations telles que, les différents types d’hydrogènes présents dans la molécule analysée, les différents types d’hydrogènes présents dans l'environnement électronique, le nombre d'hydrogènes "voisins" d’un hydrogène donné et le déplacement chimique caractéristique de chaque proton.

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. RMN carbone (13C) et DEPT 135°

Généralement, cette technique permet de mettre en évidence tous les carbones de la molécule.

En plus, elle permet la mise en évidence des carbones primaires (CH3), secondaires

(CH2) et tertiaires (CH). Elle permet aussi d’identifier les carbones quaternaires qui sont invisibles dans le spectre DEPT 135°.

a.2 RMN bidimensionnelles (RMN – 2D)

. Corrélations homonucléaires :

 COSY (1H – 1H): cette technique fournit des informations sur les couplages

homonucléaires 2JH-H et 3JH-H (protons séparés par deux ou trois liaisons) entre les protons voisins et ceux qui sont adjacents (Timite G., 2012).

. Corrélations hétéronucléaires :

 HSQC (1JH-C) : cette technique permet d'observer les couplages chimiques entre les carbones et les protons directement liés entre eux. En conséquence, elle ne permet pas d'observer les déplacements chimiques des atomes de carbones quaternaires.

 HMBC (2JH-C, 3JH-C) : cette technique permet d'observer les couplages chimiques entre les carbones et les protons distance de deux ou trois liaisons et permet de déduire les carbones quaternaires couplés aux protons.

b. Spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse est une technique de détection extrêmement sensible qui permet de déterminer le poids moléculaire d’un produit pur.

Le principe de la spectrométrie de masse est basé sur l’ionisation des molécules introduite dans l’appareillage. L’ion ainsi obtenu, appelé ion moléculaire, permet de déterminer la masse molaire du composé. Il existe plusieurs types spectrométrie de masse :

− L’électrospray ou l'ionisation par électronébulisation (ESI) ; − L’ionisation par impact électronique (IE) ; − L’ionisation chimique à pression athmosphérique (ICPA) ; − Le Fast Atom Bombardment (FAB).

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CHAPITRE II : ETUDE BIOLOGIQUE

I.1 Tests biologiques

La méthode de bioautographie et la méthode de microdilution en milieu liquide ont été utilisées pour les tests antibactériens des extraits et des fractions de Dupuya madagascariens R.Vig ssp. tamarindoïde. Pour le test, 03 souches de bactéries Gram + et 02 souches de bactéries Gram - ont été utilisées. Les souches testées appartiennent au CNARP. Elles sont présentées dans le tableau 5 ci-après :

Tableau 5: Liste des souches testées

QUELQUES SOUCHES REFERENCES TYPES FORMES POUVOIRS PATHOGENES

infections nosocomiales, Staphylococcus aureus ATCC11632 Gram positif Cocci intoxication alimentaires

Septicémie, infections Listeria monocytogenes ATCC19114 Gram positif Bacille sporadiques

Diarrhée mixtes (invasives + Yersinia enterocolitica ATCC23715 Gram négatif Bacille toxiniques), douleurs abdominales

Salmonella enterica ATCC13076 Gram négatif Bacille Fièvre typhoïde

Dysenterie Shigella flexneri ATCC12022 Gram négatif Bacille bactérienne, diarrhée a. Méthode bioautographie

. Principe Le test consiste à chercher l’activité antibactérienne des extraits déposés sur des plaques CCM. Les extraits diffusent en créant une zone circulaire sous un milieu gélosé préalablement ensemencé avec une suspension de bactéries. Dans cette zone, les concentrations d’antibiotique

Page | 17 diminuent du centre vers la périphérie. Le diamètre de la zone d’inhibition varie en fonction du degré de sensibilité de la bactérie à l’extrait.

. Mode opératoire : Les plaques CCM de dimension 3 cm x 5 cm ont été stérilisées à l’alcool 90° pendant

10 minutes sous la hotte à flux laminaire. Des échantillons d’extrait SE1, SE2 et SE3 ont été déposés sur les plaques. Celles-ci ont ensuite été séchées et étalées dans des boites de Pétri. Elles ont ensuite été étalées dans des boites de Pétri. Pendant cette période, les milieux de cultures préalablement inoculés ont été maintenus à 45 °C. Le mélange a été agité afin de mieux éparpiller les bactéries et a ensuite été coulé dans les boîtes de Pétri contenant les plaques CCM. Une fois les cultures consolidées après un séchage de 20 minutes sous la hotte, les boîtes de Pétri ont été incubées à 37 °C dans une atmosphère humide durant 24 heures.

Après cette période d’incubation, les boites de Pétri ont été pulvérisées avec de l’INT (Iodonitrotetrazolium), un réactif qui colore les cellules vivantes en grenat. La présence d’activité antibactérienne se traduit par l’existence d’une zone d’inhibition au dépôt ou sur les tâches qui ont migré sur les plaques. La zone en question n’est pas colorée en grenat du fait qu’elle ne comporte pas de cellules vivantes. b. Méthode de microdilution

 Détermination de la CMI

 Principe

Cette méthode consiste à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes d'extrait. L'inoculum bactérien est distribué dans une série de microcupules d’une plaque de microtitration contenant l'extrait. Après incubation, la CMI est indiquée par le puits qui contient la plus faible concentration d'extrait où aucune croissance n'est visible (Kil et al., 2009).

 Mode opératoire La méthode utilisée est celle décrite par (Fawole et al., 2009) et (Kuete et al., 2009), les tests sont effectués de la manière suivante :

Préparation de l’inoculum et de l’extrait de plante

La poudre de chaque extrait à tester est dissoute dans du DMSO 6% pour avoir une concentration égale à 1mg/ml, puis stérilisée par filtration Millipore (diamètre des pores : 0,22μm).

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Remplissage des puits

Figure 7: Microplaque à 96 puits

90μl de chaque extrait à tester ont été distribués dans la colonne 1 de A à F. Ensuite, 90μl de MHB ont été répartis dans toutes les colonnes 2 à 12 de la microplaque à 96 puits et 100μl d’extrait à tester ont été partagés dans la colonne 2 de A à F. Puis, une dilution en cascade de l’extrait a été effectuée, en prenant 100μl, de façon à avoir une concentration finale comprise entre 0,48μg/ml et 1mg/ml. En autre, 90 μl de MHB ont été répartis dans toutes les colonnes 1 à 12 de G qui est noté comme témoin négatif et 90 μl de MHB additionnés de 10 μl d’inoculum sont partagés dans toutes les colonnes 1 à 12 de H qui est noté comme témoin positif. Et enfin, 10 μl d’inoculum à 1,5.10⁷ bactéries /ml sont ajoutés dans chaque puits. Les plaques sont ensuite incubées dans une atmosphère humide à 37°C pendant 24h. Lecture des résultats Après 24h d’incubation à 37°C, la lecture des résultats se fait par l’ajout de 20μl de solution de INT à 10% dans chaque puits. La CMI est indiquée par la cupule qui contient la plus faible concentration d’extrait où aucun changement de coloration n’est observé c'est-à-dire là où il n’y a pas eu de croissance bactérienne (Kuete et al., 2008).  Détermination de la CMB  Principe La recherche de la CMB consiste à repiquer sur milieu solide le contenu de tous les puits qui ne présentaient pas de trouble visible à l’œil nu lors de la détermination de la CMI.  Mode opératoire 5μl du contenu de chaque puits utilisé pour la détermination de la CMI qui ne présente pas de croissance visible sont repiqués en stries sur le milieu Mueller Hinton puis le tout est incubé à 37°C pendant une nuit. La CMB correspond à la plus faible concentration de l’extrait où aucune colonie bactérienne ne pousse après incubation (Bassole et al., 2001).

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TROISIÈME PARTIE : TROISIÈME PARTIE : RÉSULTATS ET DISCUSSIONS RÉSULTATS ET DISCUSSIONS

CHAPITRE I: ETUDE CHIMIQUE

I.1 Criblage phytochimique :

Les résultats du criblage phytochimique sont présentés dans le tableau 6 :

Tableau 6: Résultats du criblage phytochimique

Familles chimiques Résultats

-

Alcaloïdes -

-

Flavonoïdes +++

Leucoanthocyanes -

+

Tanins et polyphénols +

+

Quinone -

Stéroïdes ++

Triterpénoïdes ++

Stérols insaturés -

Stéroïdes lactoniques -

Désoxy-2-sucre ++

Iridoïdes ++

Saponines -

Polyssacharides ++

D’après ce résultat qualitatif, nous avons noté la forte présence de flavonoïdes, des traces de tanins et de polyphénols dans D. madagascariensis. La tige renferme aussi de stéroïdes, de tritérpénoïdes, de désoxy-2-sucre, de iridoïdes et de polyssacharides. Ces

Page | 20 différentes classes de composes sont également observées dans les autres espèces (Yanpeng H. et al., 2008 et Yanpeng H., 2009)

I.2 Extraction

L’extraction au soxhlet de 195g de poudre de tige Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde avec les solvants de polarité croissante a permis d’obtenir trois extraits bruts. La masse de ces trois extraits bruts et leurs caractéristiques ainsi que leurs rendements sont donnés dans le tableau 7.

Tableau 7: Masses et caractéristiques des trois extraits bruts

Extraits Aspect Couleur Masse(en g) Rendement(%)

SE1 Pâteux Noir verdâtre 14 7,17

SE2 Huileux Noir verdâtre 15 7,69

SE3 Huileux Marron foncé 12 6,15

Partant de 195g de matériel végétal, des extraits codés respectivement SE1, SE2 et SE3 ont été obtenus avec des rendements respectifs de 7,17%, 7,69% et de 6,15% par soxhlet en utilisant du solvant de polarité croissante. L’extrait acétate d’éthyle (SE2) présente le meilleur rendement. Nous avons orienté notre étude sur cet extrait. Notre choix a été appuyé par les résultats des tests biologiques effectués sur chaque extrait (Voir résultats de tests biologiques)

I.3 Analyse préliminaire de l’extrait SE2

Le test bioguidé des extraits a montré que l’extrait SE2 contenait les produits actifs antibactériens. Nous l’avons retenu pour la suite de notre travail. Le chromatogramme sur couche mince de cet extrait et leur interprétation sont donnés sur la figure 8 et le tableau 9 respectivement.

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Cercle en bleu : observation sous lumière UV à 254nm

Cercle en noir : observation sous lumière UV à 365nm

P : après révélation

Figure 8: Chromatogramme de l’extrait SE2

Source : auteur

Tableau 8: Paramètre CCM de l'extrait SE2 Adsorbant Éluant Observation Révélation

gel de silice 60F 254 AcOEt/MeOH UV 254 nm et sur support vanilline sulfurique (9,5/0,5 V/V) 365nm aluminium

Tableau 9: Interprétation du chromatogramme de SE2

N◦ tache 1 2 3 4 5 6

Observation à l’œil nu - - Jaune - - Vert

Observation à 254 nm Noir - Noir - - -

Observation à 365 nm Bleu Bleu Noir Rose Rose Rose

Observation après Jaune - Jaune - - - révélation

Rf 0 0,42 0,66 0,76 0,88 0,96

(-) tache non observée

Six taches ont été observées sur le chromatogramme de SE2. Toutes ces taches absorbent la lumière UV a une longueur d’onde 365 nm.

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I.4 Fractionnement

Dans le cadre du fractionnement, l’extrait SE2 a été choisi dont 5g ont été élués sur colonne chromatographique ouverte. Cinq fractions ont été obtenues en se référant à ses profils CCM. Leurs caractéristiques, leur masse et leur rendement sont résumés dans le tableau 10

Tableau 10: Masses et caractéristiques des fractions

Fractions Aspect Couleur Masse(en mg) Rendement(en %)

F1 Huileux Verte 110 2,2

F2 Huileux Marron 250 5

F3 Huileux Jaune 290 5,8

F4 Poudre Marron 260 5,3

F5 Poudre Grise 347 6,9

La fraction F5 a été retenue, car elle est moins complexe et contenait un produit majoritaire. Le chromatogramme sur une couche mince de cette fraction et son interprétation sont donnés respectivement sur la figure 9 et dans le tableau 12 :

Cercle bleu : observation sous lumière UV à 254nm

Cercle noire : observation sous lumière UV à 365nm P : après révélation

Figure 9: Chromatogramme de l’extrait F5 Source : auteur

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Tableau 11: Paramètre CCM de l'extrait F5 Adsorbant Éluant Observation Révélation

gel de silice 60F 254 AcOEt/MeOH UV 254 nm et sur support vanilline sulfurique (9,5/0,5 V/V) 365nm aluminium

Tableau 12: Interprétation du chromatogramme de F5

N◦ tache 1 2 3 4 5 6

Observation à l’œil nu - Jaune - - - -

Observation à 254 nm Noir Noir - Noir -

Observation à 365 nm Bleue Noir Rose Bleue Rose Rose

Observation après - Jaune - - - - révélation

Rf 0,34 0,66 0,70 0,80 0,88 0,96

(-) tache non observée

I.5 Isolement

P5 a été isolé à partir de fraction F5. Le diagramme d’isolement du produit P5 est présenté dans le schéma 3.

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F5

347±0,01mg

Colonne de gel de silice

Système : AcOEt/MeOH de polarité croissante

Après lavage au DCM

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 4 ±0,01mg 3±0,01mg 3±0,01mg 2±0,01mg 7±0,01mg 3±0,01mg 8±0,01mg 4±0,01mg 2±0,01mg

Schéma 3: Diagramme d’isolement du P5

I.6 Identification de P5

Le produit P5 se présente comme une monotache sur la CCM. Le chromatogramme et les caractéristiques de ce produit sont présentés respectivement sur la figure 10 et le tableau 14.

Après révélation

Figure 10: Chromatogramme du produit P 5 Source : auteur

Tableau 13: Paramètre CCM du produit P5 Adsorbant Éluant Observation Révélation

gel de silice 60F 254 AcOEt/MeOH UV 254 nm et sur support vanilline sulfurique (9,5/0,5 V/V) 365nm aluminium

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Tableau 14: Interprétation et comportement chromatographique de P5

Chromatographie sur couche mince

Observation Observation Observation Aspect Couleur Révélation Rf à l’œil nu à 254 nm à 365 nm

Poudre Jaune Jaune Noir Noir Jaune 0,66

L’élucidation structurale du composé P5 a été faite en deux étapes : l’analyse des spectres SM de type ESI en mode négatif et positif et l’analyse des spectres RMN où 6 types de spectres ont été utilisés : le spectre RMN 1H-1D, le spectre RMN 13C « Broadband decoupling », le spectre DEPT, le spectre HSQC, le spectre HMBC et le spectre COSY.

I.7 Analyse spectrale de P5

I.7.1 Spectroscopie de masse La figure 11 et figure 12 montrent le spectre de masse SM-ESI en mode positif et négatif respectivement

Figure 11 : spectre de masse SM-ESI en mode positif

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Figure 12 : spectre de masse SM-ESI en mode négatif

Le spectre de masse SM-ESI en mode positif indique un ion moléculaire à m/z =487,1 [M+Na] (figure 11) d’une part et le spectre de masse SM-ESI montre en mode négatif un ion pseudo-moléculaire à m/z =462,9 [M-H] (figure 12) d`autre part, on peut en déduire que la masse moléculaire du produit P5 est égale m/z= 464.

On suppose que le produit P5 a une formule brute C21H20O12 et le nombre d’insaturations et/ou cycle est égal à 12

I.7.2 Spectres RMN Le MeOD est utilisé pour solubiliser le produit. Le signal de MeOD apparaisse à = 3,34 ppm dans le spectre RMN 1H. Le MeOD sort à = 48,0 ppm dans le spectre RMN 13C.

I.7.2.1 Interprétation des spectres o Spectre RMN 1H

1 La figure 13 ci-après représente le spectre RMN H du P5

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1 Figure 13 : spectre de RMN H-1D du composé P5

Il subdivise en 3 zones différentes. La première zone correspond aux protons aromatiques, la deuxième correspond aux protons osidiques et la troisième correspond aux protons méthyléniques.

 Zone des protons aromatiques : 3 pics (ppm, ppm et ppp) sont observés dans cette zone. Ils sont probablement des pics des protons aromatiques.

Selon les informations tirées à partir de la courbe d’intégration de ces signaux, nous pouvons en déduire que les 3 pics correspondent à 4 protons.

La courbe d’intégration du pic à 6,96 ppm présente 2 protons. Ce signal est un singulet, cela signifie que ces deux protons se trouvent dans un site isolé.

Les deux autres pics respectivement à δ = 6,38ppm (d, J = 2.05Hz, 1H) et à δ = 6,22 ppm (d, J=2.05Hz, 1H), quant à eux, se présentent sous forme de doublets. Leurs constantes de couplage nous indiquent que ces deux protons sont méta couplé (1˂ Jméta ˂ 3Hz). Par rapport à l’intégration des signaux, chaque pic compte pour un proton (CH).

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 Zone des protons osidiques : 6 pics sont observés sur cette zone dont l’un à = 3,34 ppm est un pic du solvant MeOD et les 5 autres sont des pics des protons osidiques dont le pic à δ= 5,33 ppm (d, J= 1,35Hz, 1H) correspond à celui d’un proton anomérique. Selon Samy M. N. et al. 2014, si la constante de couplage d’un proton anomérique est inférieur à 5Hz, le sucre forme une liaison osidique de configuration alpha. Alors nous pouvons dire que notre sucre a une configuration alpha. Et d’après son allure, il présente un seul proton est un CH.

Les 4 pics d’allure multiplets correspondent probablement aux autres protons du sucre et leurs courbes d’intégrations correspondent à un CH.

 Zone des protons méthyléniques : un doublet à δ = 0,98 ppm (d, J =6,20 Hz) est observé sur cette zone. Il possède alors un proton voisin. L’intégration de signaux nous a indiqué que

ce site porte 3 protons d’où c’est un CH3. Selon, Luis L. et al., 2013, la constante de couplage de ce protons caractérise le méthyle en position 6 du sucre L-rhamnose.

Le spectre protons nous indique que notre molécule contient deux noyaux aromatiques et un hétéroside o Spectre RMN 13C « Broadband decoupling » et DEPT 135 La figure 14 représente le spectre RMN 13C « Broadband decoupling » et DEPT 135 du compose P5.

Figure 14 : DEPT 135(en haut) et spectre RMN 13C « Broadband decoupling » (en bas) du composé P5

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13 Le spectre de RMN C du composé P5 présente dix-neuf pics dont treize correspondent aux signaux des noyaux aromatiques, un méthyle et cinq signaux appartiennent au sucre. Il manque deux signaux de deux carbones car selon le spectre de masse, notre compose contient 21 carbones. Cela confirme qu’il y a chevauchements des signaux à 108.14 ppm et 145.45ppm respectivement.

Le pic qui sort à 178,26 ppm, le plus deblindé, révèle la présence d’un groupement carbonyle C=O. les pics qui sortent a 164,48 et 161,81 ppm, correspondent à un C-O et ces valeurs confirment la présence d’un noyau aromatique méta substitue. Par ailleurs, vue l’intensité du pic à 145,45 ppm, on peut en déduire qu’il présente deux carbones appartenant au même environnement chimique et ce sont deux carbones quaternaire (C-O) en position méta l’un de l’autre. En outre, le spectre RMN 13C révèle aussi la présence de quatre signaux de carbone C-H aromatique suggérant ainsi la présence de deux noyaux aromatique dans la structure de P5. Le carbone à δ = 102,22 ppm indique la présence d’un carbone anomérique d’un sucre qui est justifié par la présence des signaux des carbones C-H respectivement à 71,94 ;

70,71 ; 70,63 et 70,47 ppm. Le signal à 16,26 ppm représente un CH3 lie à un carbone saturé d’un sucre. Les signaux qui sortent respectivement entre 18.4 ppm et 72.8 ppm sont caractéristique d’un sucre ayant une forme pyranoside (Mulinacci N. et al., 1995).

Les analyses concomitantes des spectres RMN 1H, 13C et DEPT 135 nous ont permis alors de dire que le compose P5 est constitué de deux noyaux aromatiques séparer par un carbonyle d’une part et d’un sucre probablement un rhamnose d’autre part

La distribution des déplacements chimiques selon le type de carbone est consignée dans le tableau 15 ci-dessous.

Tableau 15 : type de carbone selon les valeurs de δ (RMN 13C)

Type du Valeurs des déplacements chimiques (ppm) carbone

CIV 178,26 164,48 161,81 158,03 157,10 145,45 136,40 134,98 120,50 104,46

CH 108,14 102,22 98,38 93,26 71,94 70,71 70,63 70,47

CH3 16,26

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o Spectre HMQC

La figure 15 représente le spectre HMQC du composé P5

Figure 15 : spectre RMN-2D HMQC du composé P5

L’analyse des corrélations dans le spectre HMQC nous a permis de montrer la présence de carbone protonés dans notre compose P5. En effet, quatre protons 6.97 ppm (intégré pour deux protons), 6.38 ppm, 6.22 ppm sont liée directement a des carbones éthyléniques (-CH=C ) respectivement à 108,15 ppm (deux carbones ayant le même environnement chimique), 98,36 ppm, 93,25 ppm. Le proton qui sort à 5,33 ppm corrèle avec un carbone (C-H) à

102,22ppm. Le doublet à 0.98 ppm est attribué à un méthyle CH3 à 16,28 ppm.

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Le tableau 16 montre les corrélations observées en HMQC. Tableau 16 : Corrélations observées dans le spectre HMQC 1H 6,96 6,38 6,22 5,33 4,24 3,80 3,54 3,36 0,98 13C

108,15

102,22

98,36

93,25

71,93

70,71

70,63

70,47

16,28

L’attribution des protons aux carbones porteurs correspondants est représentée dans le tableau 17 Tableau 17 : attribution des protons aux carbones porteurs

CH CH3

δ (ppm) 13C δ (ppm) 1H δ (ppm) 13C δ (ppm) 1H

108,15 6,96 16,28 0,98

102,22 5,33

98,36 6,22

93,25 6,38

71,94 3,36

70,71 3,80

70,63 3,54

70,47 4,24

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Schéma 4: attribution des protons aromatiques aux carbones porteurs

Le squelette de base du compose P5 semble être celui d’un flavonoïde

o Spectre HMBC

La figure 16 présente le spectre HMBC de P5

Figure 16 : spectre RMN-2D HMBC

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L’interprétation du spectre HMBC nous permet d’obtenir des informations sur les enchaînements dans la molécule.

Dans le noyau A : Le proton à δ= 6,38 ppm corrèle avec le carbone à δ= 98,38 ppm et 164,48 ppm et le proton à δ= 6,22 ppm corrèle avec le carbone à δ= 93,26 ppm et 161,81 ppm.

Schéma 5: corrélation 1H-13C en HMBC dans le noyau A

Dans le noyau B :

Le proton à δ= 6,96 ppm corrèle avec les carbones aux δ= 158,03 ppm ; δ= 145,45 ppm ; δ= 136,48 ppm ; δ= 120,50 ppm et à δ= 108,14 ppm

Schéma 6 : corrélation 1H-13C en HMBC dans le noyau B

Sucre : Les corrélations proton-carbone observées dans le spectre HMBC (Figure 16) confirment l’hypothèse de structure. En effet, une corrélation à longue distance a été observée entre le

Page | 34 proton anomérique H-1’’ du sucre (δ 5.33 ppm) et le carbone C-3 (δ 134.90 ppm) de l’aglycone, ceci confirme la position du sucre en C-3.

Le proton à δ= 0, 98 ppm corrèle avec le carbone à δ= 70,71 ppm dont le tache de corrélation est forte, donc ils sont proche distant de 2 liaisons. Cela indique que le méthyle est lié avec le sucre en position 5’’. Le proton à δ= 0,98 ppm présente aussi de corrélation symétrique par rapport à la verticale avec le carbone à δ= 16,26 ppm qui est son carbone porteur.

Le schéma 7 présente les corrélations dans le sucre

Schéma 7 : corrélation 1H-13C en HMBC du sucre

o Spectre COSY La figure 17 représente le spectre COSY

Figure 17 : spectre RMN-2D COSY

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Le spectre COSY montre la corrélation homonuclaire entre 1H - 1H. Les corrélations observées sont résumées dans le tableau 18

Tableau 18 : corrélations observées dans le COSY

1H 6,96 6,38 6,22 5,33 4,24 3,80 3,54 3,36 0,98 1H

6,96

6,38

6,22

5,33 m

4,24 m F

3,80 F F

3,54 F

3,36 F

0,98 F

F : corrélation forte

m : corrélation moyenne

Le schéma 8 représente les corrélations obtenues dans le spectre COSY

Schéma 8 : corrélation 1H-1H en COSY

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Les corrélations obtenues dans le spectre COSY permettent de confirmer l’enchaînement protonique et compléter les informations tirées dans le spectre HMBC.

La structure finale du composé P5 peut être celle représentée dans le schéma 9

Schéma 9 : Structure finale du composé P5

P5 correspond donc à la structure de myricetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside. La comparaison avec les données de la littérature corrobore cette hypothèse

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Tableau 19 : Comparaison des valeurs de déplacements chimiques de P5 avec ceux de la littérature Littérature 1 (Chinedu Littérature 2 (Torgils F. et Position P J. O. et al., 2016) al., 1999) 5 δ – 1H δ – 1H δ– 1H δ – 13C δ – 13C δ – 13C (Allure, J(Hz)) (Allure, J(Hz)) (Allure, J(Hz)) 2 159,0 - 158,51 - 158,0 - 3 136,5 - 136,34 - 134,9 - 4 179,8 - 179,72 - 178,3 - 5 163,0 - 163,21 - 161,8 - 6 99,9 6,20 99,84 6,33(d, 1.9) 98,4 6,22(d, 2.0) 7 166,0 - 165,88 - 164,5 - 8 94,8 6,36 94,74 6,49(d, 1.9) 93,3 6,38(d, 2.0) 4a 106,0 - 105,92 - 104,5 - 8a 158,7 - 159,51 - 157,1 - 1’ 122,1 - 121,99 - 120,5 - 2’ 109,7 6,95 109,64 7,07(s) 108,1 6,97(s) 3’ 147,0 - 146,86 - 145,4 - 4’ 138,0 - 137,90 - 136,5 - 5’ 147,0 - 146,86 - 145,4 - 6’ 109,7 6,95 109,64 7,07(s) 108,1 6,97(s) 1’’ 103,8 5,32 103,64 5,44(d, 1.5) 102,2 5,33(d, 1.3) 4,35(dd, 1.5, 4,24(dd, 1.5, 2’’ 72,2 4,22 71,90 70,6 3.3) 3.2) 3’’ 72,3 3,79 72,15 3,9(dd, 3.3, 9.5) 70,7 3,80(d, 3.3) 4’’ 73,5 3,44 73,37 3,47(t, 9.5) 71,9 3,36(t, 13.5) 3,64(dd, 9.5, 3,55(dd, 6.2, 5’’ 72,0 3,51 72,07 70,5 6.2) 9.5) 6’’ 17,8 0,96 17,67 1,08(d, 6.2) 16,3 0,98(d, 6.2)

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L’étude chimique de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde contribue aux investigations phytochimiques et pharmacologiques sur les espèces appartenant à l’ancien genre Cordyla. Elle offre aussi des informations sur le nouveau genre Dupuya car le Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde a été appelé aussi Cordyla madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde.

Le criblage phytochimique d’extrait brut a révélé la présence de flavonoïde, tanins et polyphénols, stéroïdes, triterpénoïdes, désoxy-2-sucre, iridoïdes et polyssacharides.

Des tests biologiques, notamment des tests sur l’étude d’activité antibactériens ont été réalisés avec ces extraits et dont nous verrons les résultats dans le chapitre suivant.

Le profil chromatographie de l’extrait SE2 a permis de poursuivre la démarche de l’étude chimique par le fractionnement de cet extrait. Le fractionnement de l’extrait SE2 nous a permis d’obtenir 5 fractions. On a choisi la fraction F5 pour la suite de notre étude et pour isoler des produits par chromatographie sur colonne. Un produit pur codé P5 a été isolé de cette fraction et sa structure a été élucidée par des comparaisons avec des données de littérature concernant les flavonoïdes. Le résultat obtenu est en accord avec le criblage phytochimique où nous avons pu mettre en évidence la présence de flavonoïde dans le matériel végétal utilisé au cours de cette étude.

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CHAPITRE II : ÉTUDE BIOLOGIQUE

III.1 Test bioautographie :

Les tests antibactériens des extraits bruts (SE1, SE2, SE3), des fractions F1, F2, F3 et F4 et le produit P5 de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp. tamarindoïde ont été effectués suivant la méthode décrite au paragraphe II.1. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau ci- après.

Tableau 20: Résultats des tests antibactériens des extraits bruts

Extraits testés Souches testées Images SE1 SE2 SE3

Listeria monocytogenes + ++ + Annexe III

Staphylococus aureus + ++ - Annexe III

Shigella flexneri - ++ - Annexe III

Y. enterocolitica + ++ - Annexe III

Salmonella enterica Subsp + + - Annexe III

 - : Inactif  + : Faiblement actif  ++ : Moyennement actif

Ce tableau montre que, SE1 est faiblement actif sur 04 bactéries parmi les 05 souches

testées. SE2 est moyennement actif sur les 02 bactéries Gram positif et les 02 bactéries Gram

négatif. Il est faiblement actif vis à vis de la souche Salmonella enterica Subsp. SE3 n’est actif que sur Listeria monocytogenes.

Du point de vue profil chromatographique, l’extrait SE2 présente une séparation nette. Sa masse et ses résultats biologiques constituent les facteurs décisifs lors de l’orientation de la suite des travaux. Ce qui nous amène à choisir l’extrait SE2 pour la suite de cette étude.

Après fractionnement et purification de l’extrait SE2, l’évaluation de l’activité antibactérienne des fractions et le produit isolé est montré dans le tableau 21 ci-après :

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Tableau 21: Résultats du test antibactérien des fractions et le produit isolé de SE2

Fractions et produit testés Souches testées Images F1 F2 F3 F4 P5

Listeria monocytogenes ++ ++ + - - Annexe III

Staphylococus aureus ++ ++ + + - Annexe III

Shigella flexneri ++ ++ - + - Annexe III

Y. enterocolitica ++ ++ + + - Annexe III

Salmonella enterica Subsp ++ ++ + - - Annexe III

N B :

 - : Inactif  + : Faiblement actif  ++ : Moyennement actif  +++ : Très actif

D’après ce tableau, l’activité antibactérienne que possède l’extrait SE2 est plutôt

localisée dans les fractions F1 et F2. F3 est faiblement actif sur 4 des souches testées et F4 sur seulement 3 germes. Le produit isolé est inactif.

III.2 Détermination de la CMI et de la CMB

La détermination de la CMI et de la CMB a été effectuée sur l’extrait et les fractions qui ont présenté une activité antibactérienne intéressante et une quantité largement suffisante pour le test. Les souches sensibles (Listeria monocytogenes, Staphylococus aureus, Shigella flexneri, Y. enterocolitica et Salmonella enterica Subsp) ont été choisies. La manipulation a été faite suivant la méthode qui a été décrite au paragraphe matériels et méthodes chapitre II, les résultats sont consignés dans le tableau 22 ci-après :

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Tableau 22: Résumé des résultats des déterminations CMI et CMB

CMI CMB Extraits Souches testées 퐂퐌퐁⁄ Activité (μg/mL) (μg/mL) 퐂퐌퐈

Listeria 125 125 1 Bactéricide monocytogène

F2 Shigella flexneri 125 1000 8 Bactériostatique

Yersinia 125 1000 8 Bactériostatique enterocolitica

Listeria 125 1000 8 Bactériostatique monocytogène

F3 Shigella flexneri 62,5 >1000 >16 ND

Salmonella 62,5 >1000 >16 ND enterica subsp

Staphylococcus 1000 1000 1 Bactéricide aureus

Yersinia F4 1000 1000 1 Bactéricide enterocolitica

Salmonella 1000 1000 1 Bactéricide enterica subsp

Staphylococcus 1000 >1000 >1 ND aureus

SE2 Shigella flexneri 1000 >1000 >1 ND

Salmonella 1000 >1000 >1 ND enterica subsp

ND : Non Déterminé

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

CMB : Concentration Minimale Bactéricide

Ce tableau montre que, les valeurs de CMI varient de 62,5 à 1000 μg/mL. Shigella flexneri et Salmonella enterica subsp étant les souches les plus sensibles vis à vis de F3.

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D’après les travaux de Carbomelle et al., 1987, les substances antimicrobiennes sont considérées comme des agents bactéricides lorsque le rapport CMB/CMI est inférieur ou égal à 4. Celles-ci sont des bactériostatiques quand le rapport CMB/CMI est supérieur à 4. D’après cette référence, la nature de l’activité antibactérienne des 03 fractions a été connue. Celle de

SE2 sur les trois souches et de F3 sur les 2 souches testées a été non déterminée.

Les résultats obtenus ont indiqué l'existence de composés antimicrobiens dans les fractions et l’extrait testés.

D’après les travaux de Holetz FB et al., 2002, les extraits ayant une CMI inférieure à 100 μg/ml sont fortement actifs et entre 100 et 500 μg/mL sont moyennement actifs. Ils ont une activité antibactérienne faible si leur CMI est compris entre 500 et 1000 μg/ml. Si la CMI est supérieure à 1000μg/ml, les extraits sont inactifs. En considérant cette référence, la fraction F3 a une bonne activité sur les souches Shigella flexneri et Salmonella enterica subsp. F2 et F4 ont une activité modérée contre Listeria monocytogène. L’activité de F2 est également modérée sur

Shigella flexneri et Yersinia enterocolitica. La fraction F4 et l’extrait SE2 sont faiblement actif vis- à-vis des souches testées.

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CONCLUSION

CONCLUSION

L’analyse phytochimique de la plante en commençant par l’extraction nous a permis d’obtenir 03 extraits (SE1, SE2 et SE3). Le fractionnement de l’extrait SE2 a donné 05 fractions

(F1-F5). La purification de la fraction F5 a fourni le produit P5. L’analyse structurale du produit

P5 par spectrométrie de masse, par Résonance Magnétique Nucléaire et par comparaison avec les données de la littérature a permis d’identifier P5 comme étant le myricetin-3-O-α-L- rhamnopyranoside.

L’étude des activités antibactériennes a révélé une sensibilité de la majeure partie des germes (bactéries Gram + et Gram -) vis à vis des extraits et des fractions des tiges de Dupuya madagascariensis ssp. tamarindoïde (Fabaceae). La méthode bioautographie a montré que l’extrait SE2 possède la meilleure activité antibactérienne. L’activité antibactérienne que possède l’extrait SE2 est plutôt localisée dans les fractions F1 et F2. Le produit isolé P5 est inactif. La quantification du pouvoir antibactérien par la méthode de microdilution montre que les valeurs de CMI varient de 62,5 à 1000 μg/mL. Les 03 fractions sont connues comme un agent bactéricide et/ou bactériostique et celle de SE2 sur les trois souches et de F3 sur les 2 souches testées a été non déterminée.

Pour conclure, la tige de Dupuya madagascariensis ssp. tamarindoïde a une capacité antibactérienne et cette activité est localisée dans l’extrait SE2

Les études sur Dupuya madagascariensis ssp. tamarindoïdes constituent une première investigation chimique et biologique de cette sous-espèce. Les résultats nous ont pu fournir des informations sur ses constituants chimiques et des informations sur les propriétés antibactériennes de ses extraits et fractions.

La suite des travaux de recherches sur Dupuya madagascariensis ssp. tamarindoïdes sera basée sur la purification des autres produits de fractions F5, l’isolement et l’identification des produits de l’extrait SE3 ainsi que les études des activités antibactériennes et antioxydants de ces produits isolés.

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBOGRAPHIQUE

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[w3] https://www.tropicos.org/MapsGoogle.aspx?mapid=16835624 octobre 2018

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ANNEXES

Annexe I : Criblage phytochimique

− Criblage des alcaloïdes

Une masse de 5g de poudre sèche est macérée dans 20 ml de HCl 12% pendant 15 min. Le mélange est filtré sur coton. Le filtrat obtenu est divisé dans 4 tubes à essais pour faire les tests.

Tube n°1 : sert de témoin

Tube n°2 : + 5 gouttes de Réactif de Wagner

Tube n°3 : + 5 gouttes de Réactif de Mayer

Tube n°4 : + 5 gouttes de Réactif de Dragendorff

L’apparition de précipité indique un test positif.

− Criblage des flavonoïdes et des leucoanthocyanes

Un volume de 10ml de solution hydroalcoolique sont évaporé dans un cristallisoir au bain-marie. Après refroidissement, les pigments sont éliminés par épuisement avec l’hexane. Le résidu est dissous dans l’éthanol. La solution obtenue est filtrée sur coton. Le filtrat est réparti dans 5 tubes à essais :

Tube n°1 : témoin

 Test de Wilstater

Tube n°2 : + 0,5 ml de HCl concentré et quelques tournures de Mg

Après 10 min, si la coloration est :

 Rouge  présence de flavone  Rouge pourpre  présence de flavonols  Rouge violacée  présence de flavanones et flavanols

 Test de Wilstater modifié Tube n°3 : + 0,5ml de HCl concentré et quelques tournures de Mg

Et après dissolution de Mg, additionner 1 ml d’eau et 1 ml d’alcool isoamylique.

Après 10 min, si la coloration de la phase supérieure est

 Rouge  présence de flavone  Pourpre  présence de flavonols

Page | a

 Test de Bate-Smith Tube n°4 : + 0,5 ml de HCl concentré

La solution est chauffée pendant 30 min au bain-marie.

On la laisse se refroidir.

Si la coloration est rouge violacée  présence de leucoanthocyanes

Tube n°5 : + 0,5 ml de HCl concentré à froid

Si la coloration est rouge  présence d’anthocyanes

− Criblage des tanins et polyphénols Un volume de 10 ml de solution hydroalcoolique est évaporé dans un cristallisoir au bain-marie. On y verse ensuite 15 ml d’eau distillée. Le mélange est chauffé et agité. 4 gouttes de solution de NaCl 10 % y sont ajoutées. Après filtration, le filtrat est réparti en 4 tubes à essais :

Tube n°1 : témoin

Tube n°2 : + 4 gouttes de gélatine à 1%

Si on observe un précipité  présence de polyphénols

Tube n°3 : + 4 gouttes de gélatine salée

Si on observe un précipité  présence de tanins

Tube n°4 : + 4 gouttes de FeCl3 10 % dans MeOH

Si la coloration est

 Bleu vert  présence de tanins condensés (catéchiques ou flavan-3-ols condensés et leucoanthocyanes ou flavan-3,4-diols)  Noir bleuâtre  présence de tanins hydrolysables (galliques ou ellagiques)  Incolore  absence de tanins − Criblage des quinones Un volume de 10 ml de solution hydroalcoolique est évaporé dans un cristallisoir au bain-marie. Le résidu est dissout dans 15 ml d’eau distillée puis le mélange est filtré sur coton. Le filtrat est extrait avec un mélange hexane/dichlorométhane 3/1 (V/V) dans une ampoule à décanter. La phase supérieure est recueillie dans un tube à essais puis 5 ml de NH4OH y sont versés. Le mélange est ensuite agité.

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Si la coloration de la phase alcaline (phase inférieure) est rouge violacée  présence de quinones.

− Criblage des stéroïdes et terpénoïdes Un volume de 10 ml de solution hydroalcoolique est évaporé dans un cristallisoir au bain-marie. Après refroidissement, le résidu est dépigmenté par ajout répétitif de 5 ml hexane. 10 ml de dichlorométhane sont ajoutés. Après une agitation de 5 min, le mélange est décanté puis séchés avec Na2SO4 anhydre. Le mélange est ensuite filtré et le filtrat est réparti dans 5 tubes à essais :

Tube n°1 : témoin

 Test de Liebermann Burchard Tube n°2 : + 4 gouttes d’anhydride acétique

+ 4 gouttes de H2SO4 concentré

Si la coloration est

 Pourpre  présence de triterpénoïdes  Violet ou bleu vert  présence de stéroïdes  Test de Salkowski

Tube n°3 : + 1 ml de H2SO4 concentré

Si l’anneau de séparation est rouge  présence de stérols insaturés

 Test de Badjet Kedde Tube n°4 : + quelques grains d’acide picrique

Si la coloration est rouge  présence de stéroïdes lactoniques

 Test de Keller-Killiani

Tube n°5 : + quelques gouttes de FeCl3 10 %

+ quelques gouttes d’acide acétique glacial

Le tube est incliné de 45°.

Si l’anneau de séparation est rouge pourpre  présence de désoxy-2-sucre

− Criblage des iridoïdes Un millilitre de HCl concentré est ajouté à 1ml d’extrait aqueux. L’apparition d’une coloration bleue après 30 min d’ébullition montre la présence d’irridoïdes.

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− Criblage des saponines 1 g de poudre est mis dans un tube à essais avec 10 ml d’eau distillée. Après agitation vigoureuse pendant 30 sec, le tube est placé verticalement pendant 30 min.

Si la hauteur de la mousse est supérieure ou égale à 3 cm  présence de saponines

− Criblage des polyssacharides Une masse de 5g de poudre est utilisée pour préparer un décocté. Après filtration, 3 volumes d’alcool sont ajoutés au filtrat.

Si on observe un précipité  présence de polyssacharides

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Annexe II : Préparation des réactifs

− Réactif de Dragendorff Solution A : 1,7 g de sous-nitrate de bismuth et 20 g d’acide tartrique sont dissoutes dans 30 ml d’eau.

Solution B : 16 g d’iodure de potassium sont dissoutes dans 40 ml d’eau.

Au moment de l’emploi, 2,5 ml de A et 2,5 ml de B sont mélangés. 10 g d’acide tartrique préalablement dissous dans 50 ml d’eau distillée sont versés dans le mélange.

− Réactif de Wagner On mélange 2 g d’iodure de potassium et 1,27 g d’iode dans un erlenmeyer de 250 ml et on ajoute 100 ml d’eau distillée. On agite le mélange jusqu’à dissolution complète du soluté.

− Réactif de Meyer Une masse de 1,35 g de chlorure mercurique (II) est dissoute dans 94 ml d’eau. On y ajoute 5 g d’iodure de potassium pour dissoudre complètement le soluté. Le volume total de l’eau est ensuite ramené à 100 ml d’eau.

− Gélatine On met en suspension 1 g de gélatine dans 100 ml d’eau.

Chlorure de sodium 10 %

10 g de chlorure de sodium sont dissoutes dans 100 ml d’eau.

− Gélatine salée On mélange un volume de gélatine à un volume égal de la solution de chlorure de sodium à 10 %.

− Réactif de Kedde 2 g d’acide 3,5-dinitrobenzoïque sont dissoutes dans 100 ml de méthanol.

5,6 g de potasse sont dissoutes dans 100 ml.

Au moment de l’emploi, on mélange à un volume égal la solution d’acide et de potasse.

− Réactif de Keller-Killiani 10 g de chlorure ferrique sont dissoutes dans 100 ml d’eau. On moment de l’emploi, on mélange 0,3 ml de la solution précédente de chlorure ferrique dans 50 ml d’acide acétique glacial. On prélève 3 ml du mélange pour le test de Keller-Killiani.

Chlorure ferrique à 10 % dans le méthanol

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On dissout 1 g de chlorure ferrique dans 10 ml de méthanol en agitant et en chauffant au bain-marie jusqu’à dissolution complète.

− Vanilline sulfurique Solution A : 3 ml d’acide sulfurique concentré et 50 ml d’éthanol sont mélangés.

Solution B : 3 g de vanilline sont dissoutes dans 50 ml d’éthanol.

Au moment de l’emploi, on mélange à un volume égal les solutions A et B.

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Annexe III : Test antibactérien

L.monocytogènes S. aureus S. flexneri

Zone d’inhibition

S.enterica Y.enterocolitica

 Figure 18: Résultats bioautographie des extraits bruts et les 5 fractions (F1-F5) de Dupuya madagascariensis ssp.

tamarindoïde  Résultats CMI par méthode de microdulition en milieu liquide des extraits et des

fractions

F2(CMI) F3(CMI)

F4(CMI) SE2(CMI) Figure 19: Résultats CMI par la méthode de microdulition Légendes

 Zone violette : croissance bactérienne  Zone claire : inhibition de croissance

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 Résultats CMB des extraits et fractions testés

Colonies bactériennes

Figure 20: Résultats CMB des extraits et fractions testés Absence colonies bactérienne

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Auteur Manjato Reibe RAKOTONANDRASANA E-mail [email protected] Téléphone 0345049400 Titre Etude chimique, activité antibactérienne de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp tamarindoïde(Fabaceae) Nombre de page : 49 Nombre de figures : 20 Nombre d’annexes : 3 Nombre de tableaux : 22 Nombre de schémas : 9 Résumé Dupuya madagascariensis R.Vig ssp tamarindoïde (Fabaceae) est une plante médicinale, connue sous les noms vernaculaires Anakara, Hazomena, Madiroala. Elle est endémique de Madagascar. Traditionnellement, la plante est utilisée pour sa dureté en menuiserie et aussi utilisée comme poison de pêche. Les objectifs de travaux sont d’isoler les principes actifs contenus dans les tiges de la plante et d’évaluer leur activité antibactérienne. Les tiges de Dupuya madagascariensis R.Vig ssp tamarindoïde ont été récoltées au village de Français. Elles ont été séchées à l’abri de la lumière puis broyées. L’extraction au soxhlet de la poudre des tiges par des solvants à polarité croissante nous a permis d’obtenir 3 extraits. Le fractionnement de l’extrait acétate d’éthyle par la chromatographie sur colonne avec le système de solvant (DCM/MeOH - 100/0 au 0/100 - V/V) a donné 05 fractions. La purification de la fraction F5 par la chromatographie sur colonne a permis d’isoler 09 produits notés P1 à P9. Les analyses par spectrométrie de masse, par spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire mono et bidimensionnelle et les comparaisons avec les données de la littérature nous ont permis d’identifier P5 comme étant le myrcetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside.

L’évaluation de l’activité antibactérienne des extraits bruts, des 4 fractions (F1-F4) et le produit isolé par les méthodes biaoutographie et microdilution a montré l’importante activité de SE2 sur Listeria monocytogenes, Staphylococus aureus, Shigella flexneri, Yersinia enterocolitica et Salmonella enterica Subsp. Cette activité a été localisée dans les fractions F1 et F2. F3 et F4 présentent respectivement une faiblement active sur les 4 souches testées et sur 3 germes seulement. Le produit isolé P5 est inactif. La quantification du pouvoir antibactérien a montré des valeurs de CMI variant de 62,5 à 1000 μg/mL. Les 03 fractions (F2, F3 et F4) ont été connues comme un agent bactéricide et/ou bactériostique. Mots-clés : Dupuya madagascariensis R.Vig ssp tamarindoïde, plante médicinale, endémique, activité antibactérienne, myrcetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside, RMN, Spectrométrie de masse Title: Chemical study, antibacterien activities of Dupuya madagascariensis R.Vig ssp tamarindoïdes (Fabaceae) Summary

Dupuya madagascariensis R.Vig ssp tamarindoïde (Fabaceae) is a medicinal plant, known as vernacular names: Anakara, Hazomena, Madiroala. It is an endemic plant of Madagascar. Traditionally, the plant is used for its hardness in joinery and also used like poison of fishing. Our objectives are to isolate the active compounds from the stems of the plant and to evaluate their antibacterial activity. The stems of Dupuya madagascariensis R.Vig ssp tamarindoïde were collected at the village de Français. Dried and powdered stems of D. madagscariensis were extracted by Soxhlet within an increasing polarity solvent led us to have 3 extracts. Fractionation of the ethyl acetate extract by means of column chromatography with the gradient solvent system (DCM/MeOH - 100/0 to the 0/100 - V/V) gave us 5 fractions. The purification of fraction F5 by the column chromatography gives us nine products noted P1 to P9 according to the TLC profiles. The analyses by means of mass spectrometry, Nuclear Resonance Magnetic (NMR) mono and two-dimensional and the comparisons with the data of the literature let us to identify P5 as being the myrcetin-3- O-α-L- rhamnopyranoside.

The antibacterial evaluation of the rough extracts, the 4 fractions (F1 - F4) and the isolated product by the biaoutography and microdilution methods showed a significant activity of SE2 against Listeria monocytogenes, Staphylococus aureus, Shigella flexneri, Yersinia enterocolitica and Salmonella enterica Subsp. This activity was localized in the fractions F1 and F2. F3 is slightly active against the 4 bacteria and F4 is active against 3 bacteria. The isolated product P5 is inactive. The quantification of the capacity antibacterial showed values of CMI variable from 62,5 to 1000μg/mL. The 03 fractions (F2, F3 and F4) were known like a bactericidal and/or bacteriostic agent. Key words: Dupuya madagascariensis R.Vig ssp tamarindoïde, plant medicinal endemic, antibacterial activity, myrcetin-3- O-α-L- rhamnopyranoside, NMR, mass Spectrometry