MASARYKOVA UNIVERZITA

LEKÁRSKA FAKULTA

KATEDRA LABORATÓRNYCH METÓD

HMYZ – MOŽNÝ ZDROJ ČI VEKTOR PATOGÉNOV V NEMOCNIČNOM PROSTREDÍ

Bakalárska práca

v obore zdravotný laborant

Vedúci bakalárskej práce: Autor: doc. MUDr. Filip Růţička, Ph.D. Nikoleta PAVLOVIČOVÁ

Brno, apríl 2015 Meno a priezvisko autora: Nikoleta Pavlovičová

Názov bakalárskej práce: Hmyz – moţný zdroj či vektor patogénov v nemocničnom prostredí

Pracovisko: Mikrobiologický ústav LF MU a FN u svätej Anny v Brne

Vedúci bakalárskej práce: doc. MUDr. Filip Růţička, Ph.D.

Rok obhajoby bakalárskej práce: 2015

Súhrn:

Táto práca sa zaoberá invazívnym druhom koutule Clogmia albipunctata a moţnosťou prenosu infekcie na pacienta. V prvej časti teórie je popísaná Clogmia a jej moţnosti prenosu nozokomiálnych infekcií a potom jej eliminácia. Druhá časť teórie je zameraná na sledované nozokomiálne patogény a choroby, ktoré spôsobujú. Ďalšou stručne spracovanou témou je antibiotická rezistencia vznikajúca v nemocniciach. Praktická časť obsahuje postup odchytu a spracovania jedincov, následne identifikácia druhov a zhodnotenie potencionálneho rizika. Celkovo bolo identifikovaných 50 rodov mikróbov. Najväčšie zastúpenie mal Acinetobacter sp.

Kľúčové slová: Clogmia albipunctata, patogény, infekcia, nemocnica

Summary:

This work deals with the invasive species of the sandfly Clogmia albipunctata and the possibilty of the transmission of infection to pacients. The first part of the theory describes the possibility of a transmission of the nosoclomial infections by Clogmia and its elimination. The second part of the theory focuses on the observed nosoclomial pathogenes and the ilnesses they cause. The next topic briefly deals with the antibiotic resistance developing in the hospitals. The practical part describes the process of capturing and processing the specimens, the subsequent identification of species and evaluates the potential risks. In total we identified 50 genera of microorganisms, majority of them being the Acinetobacter spp

.

Keywords: Clogmia albipunctata, pathogens, infection, hospital

Prehlásenie:

Prehlasujem, ţe som bakalársku prácu vypracovala samostatne pod vedením doc. MUDr. Filip Růţička, Ph.D. a uviedla v zozname literatúry všetky pouţité literárne a odborné zdroje.

V Brne dňa: ......

Poďakovanie:

Rada by som poďakovala vedúcemu mojej bakalárskej práce doc. Filipovi Růţičkovi za vedenie, pomoc, cenné rady a dohľad pri písaní teoretickej aj praktickej časti mojej práce, ďalej Mikrobiologickému ústavu LF MU a FN u svätej Anny v Brne za moţnosť uskutočnenia praktickej časti práce a tieţ centru Laboratórnej medicíny BioVendor, Brno- Řečkovice za moţnosť vyuţitia ich laboratória. OBSAH

1. Úvod ...... 8

1 Clogmia albipunctata ...... 9

1.1 Taxonomické zaradenie ...... 9

1.2 Popis ...... 9

1.2.1 Dospelý jedinec ...... 9 1.2.2 Larválne štádium ...... 10 1.3 Výskyt ...... 11

1.4 Ţivotný cyklus ...... 13

1.5 Eliminácia C. albipunctata ...... 14

1.6 C. albipunctata ako zdroj nozokomiálnych infekcií ...... 14

1.6.1 Nozokomiálne infekcie ...... 15 1.6.2 Zdroj patogénov ...... 15 1.6.3 Kolonizácia C. albipunctata ...... 15 1.6.4 Prenos infekčných agens kontaktom ...... 16 1.6.5 Miáza ...... 17 2 Sledované nozokomiálne patogény ...... 18

2.1 Charakteristika nozokomiálnych patogénov ...... 18

2.2 Antibiotická rezistencia ...... 18

2.3 Rod Staphylococcus ...... 19

2.3.1 Stafylokokus aureus ...... 19 2.3.1.1 MRSA ...... 20

2.3.2 Koaguláza negatívne stafylokoky ...... 20 2.4 Rod Streptococcus ...... 21

2.5 Čeľaď Enterobacteriaceae ...... 21

2.5.1 Rod Escherichia ...... 22 2.5.2 Rod. Salmonella ...... 22 2.5.3 Rod Klebsiela, Yersinia, Serratia, Proteus ...... 23 2.5.4 Ďalšie enterobaktérie ...... 24 2.6 Gramnegatívne nefermentujúce baktérie ...... 24

2.6.1 Rod Pseudomonas ...... 24 2.6.1.1 Pseudomonas aeruginosa ...... 25

2.6.1.2 Ostatné pseudomonády ...... 25

2.6.2 Rod Acinetobacter, Stenotrophomonas, Delftia, Comamonas ...... 25 2.7 Rod Aeromonas ...... 26

2.8 Preţívanie patogénov na povrchoch ...... 26

3 Ciele práce ...... 27

4 Praktická časť...... 28

4.1 Kultivačné médiá ...... 28

4.2 Chemikálie ...... 28

4.3 Roztoky ...... 29

4.4 Diagnostické súpravy ...... 29

4.5 Prístroje ...... 29

4.6 Software ...... 30

4.7 Materiál ...... 30

4.8 Metodika spracovania C. albipunctata ...... 31

4.8.1 Odchyt ...... 31 4.8.2 Odber povrch kolonizujúcich mikróbov ...... 32 4.8.3 Odber mikróbov kolonizujúcich aj vnútorné prostredie ...... 32 4.8.4 Izolácia mikroorganizmov ...... 33 4.8.5 Identifikácia izolátov ...... 33 4.8.5.1 Identifikácia izolátov pomocou MALDI-TOF analýzy ...... 34

4.8.5.1.1 Príprava vzoriek na identifikáciu pomocou MALDI-TOF analýzy ... 34

4.8.5.1.2 Analýza vzoriek pomocou MALDI-TOF analýzy ...... 34

4.8.5.1.3 Verifikácia výsledkov MALDI-TOF analýzy ...... 35

4.8.5.2 Biochemická identifikácia izolátov ...... 35 4.8.5.2.1 Podrobná identifikácia grampozitívnych a katalázapozitívnych kokov 37

4.8.5.2.2 Podrobná identifikácia gramnegatívnych tyčiniek fermentujúcich glukózu 38

5 Výsledky ...... 40

6 Diskusia a záver ...... 50

7 Pouţité symboly a skratky ...... 53

8 Bibliografia ...... 54

9 Zoznamy ...... 57

9.1 Zoznam pouţitých obrázkov ...... 57

9.2 Zoznam pouţitých tabuliek ...... 57

9.3 Zoznam pouţitých grafov ...... 57

9.4 Prílohy ...... 58

Príloha 1 ...... 59

1. Úvod

Nozokomiálne patogény sú obávané zdroje infekcií vo všetkých nemocniciach, nielen z pohľadu doktora, ale aj z pohľadu pacienta. Kaţdá nemocnica sa snaţí zabrániť šíreniu infekcií a má vypracované postupy dezinfekcie materiálov, prístrojov a povrchov. Zdroj infekcie ale môţe mať rôzny pôvod a významným vektorom môţe byť tieţ hmyz, vrátane Clogmia albipunctata.

Jedná sa o invazívny druh koutule, ktorá sa pomerne výrazne rozširuje aj do nášho klimatického pásma a je zaznamenaný aj početný výskyt v Brne (Šuláková et al. 2014) a bol zistení výskyt aj v areáli FN u Sv. Anny vo veľkom mnoţstve. Keďţe nie je prirodzeným druhom v našich podmienkach, nie je známe, aké mikroorganizmy môţe prenášať v našom prostredí. Problémom môţe byť hlavne výskyt tohto vektora v nemocničnom prostredí, kde sa vo zvýšenom mnoţstve vyskytujú rezistentné aţ multirezistentné ľudské patogény, ktorých prenos C. albipunctata uľahčí.

C. albipunctata nemusí prenášať len obligátne patogény V nemocnici je veľké mnoţstvo pacientov s oslabenou obranyschopnosťou, ktorí sú náchylní na infekcie aj oportúnnymi alebo podmienenými patogénmi, ktoré tieţ môţe C. albipunctata prenášať.

Antibiotická rezistencia aţ multirezistencia začína byť veľkým problémom v terapií závaţných infekcií. V nemocničnom prostredí tak môţe C. albipunctata uľahčiť prenos a šírenie aj rezistentných kmeňov.

1 Clogmia albipunctata

Clogmia albipunctata alebo tieţ Telmatoscopus albipunctatus patrí do čeľade koutulovitých, ide o ne-hryziacu koutuľu (Jeţek et al. 2012).

1.1 Taxonomické zaradenie

Po prvý krát bola C. albipunctata popísaná v roku 1893 pánom Willistonom pod menom Psychoda albipunctata. Odvtedy získala viacero synoným ako Telmatoscopus albipunctatus (Jeţek et al. 2012) citoval (Vaillant 1971a, 1971b). V roku 1937 pánom Enderleinom bola zaradená do rodu Clogmia. Podľa Fauna Europaea (Beuk a Pape 2013) je správny názov Clogmia albipunctatus, ktorého koncovka ale nekorešponduje s gramatiku pohlavia, preto budem aj naďalej pouţívať gramaticky správny názov Clogmia albipunctata (Boumans et al. 2009).

Celkové zaradenie: doména Eukaryota, ríša Animalia, podríša Eumetazoa, kmeň Arthropoda, podkmeň Hexapoda, trieda Insecta, rad Diptera, podrad Nematocera, infrarad Psychodomorpha, nadčeľaď Psychodoidae, čelaď Psychodidae, podčeľaď Psychodinae, kmeň Telmatoscopini, rod Clogmia, druh albipunctata (Beuk a Pape 2013). Pre bliţšie informácie o taxonomickom zaradení a stavbe (Ibanez-Bernal 2008).

1.2 Popis

Počas svojho vývinu C. albipunctata prekonáva rôzne významné štádiá s rozdielnym vzhľadom. Najvýznamnejšie pre účel mojej práce sú dve štádia: dospelý jedinec a larva. Obe môţu byť zdrojom patogénov pre človeka. (Faulde a Spiesberger 2013)

1.2.1 Dospelý jedinec

Celé telo sa skladá z 3 častí. Z hlavy, na ktorej sa nachádza jeden pár antén, tela, na ktorom sú 3 páry nôh a 2 páry krídiel a bruška, ktoré obsahuje väčšinu orgánov (Verheggen et al. 2008). C. albipunctata spolu so všetkými jedincami z čeľade Psychodidae majú dlhé chĺpky na ţilách krídiel a po celom tele. C. albipunctata je ale jedna z najväčších koutulí (3-4mm), väčšinou šedej alebo tmavo hnedej farby, teda tieţ jedna z najtmavších (Boumans et al. 2009).

Krídla majú nápadné biele fľaky na koncoch rovnobeţných ciev končiacich aţ na okraji krídla. Asi v polovici dĺţky krídla je druhá rada bielych fľakov uloţených do tvaru písmena V, ktoré hrotom smeruje distálne. Pribliţne v jednej tretine krídiel sa nachádzajú dva zväzky trichii (typ štetinových výbeţkov), ktoré vyzerajú ako čierno-biele fľaky. Trichie nachádzajúce sa na začiatku ciev sú červenkasto hnedej farby. Uhol apexu krídla je širší ako 90°, čo napomáha k odlíšeniu od T. alternata alebo P. cinerea, ktoré majú uhol asi 70° (Boumans et al. 2009).

V mikroskope môţeme pozorovať anténu (tykadlo), ktorá sa skladá z flagellomerov (článkov) uzlovitého tvaru. Na kaţdom flagellomere sa nachádza pár ascoidov (chĺpkových čidiel) v tvare písmena V. Dĺţka antény je 0,66-krát dĺţka krídel. Hmatadlo je dlhé 0,5-krát dĺţky antény (Boumans et al. 2009; Ibanez-Bernal 2008). (Obrázok 1 Clogmia albipunctata (Bradford 2010))

1 mm

Obrázok 1 Clogmia albipunctata (Bradford 2010)

1.2.2 Larválne štádium

Dĺţka larvy je obvykle okolo 9-11mm ţltkasto hnedej farby. Na chrbtovej strane obvykle hnedá a na brušnej strane ţltkastá alebo slonovinová. Hlava, predné a bočné strany chrbtových plátov sú oveľa tmavšie. Jedna alebo dve posledné chrbtové pláty a 4 análne môţu byť aţ úplne čierne (El-Badry et al. 2014).

Celé telo pozostáva z 11 segmentov a hlavy. Chrbtová strana je pokrytá 26 plátmi. Hlava je strednej veľkosti v tvare trojuholníka. Ústna časť sa nachádza na prednej strane v trojuholníkovom priestore. Kaţdý segment je rozdelený do 3 prstencov s výnimkou prvého brušného, ktorý má len 2. Predné prieduchy sú v strede predhrudného segmentu. Okraje prvých piatich brušných segmentov obsahujú predné chĺpky a po stranách zadnej časti

segmentu 2 alebo 3 zadné chĺpky. Kaudálne zakončenie má kuţeľovitý tvar 3-4 krát dlhší ako široký. Dva zadné análne výbeţky sú dlhšie ako predné, kaţdý má dlhé chĺpky, ktoré sú na predných trošku dlhšie ako na zadných výbeţkoch (El-Badry et al. 2014). (Obrázok 2 Dospelá larva (4 štádium) C. albipunctata: (a) zadný pohľad na celú larvu; (b) predný pohľad na análnu oblasť(El-Badry et al. 2014)) (Obrázok 3 Larva C. albipunctata (Bradford 2010))

Obrázok 2 Dospelá larva (4 štádium) C. albipunctata: (a) zadný pohľad na celú larvu; (b) predný pohľad na análnu oblasť(El-Badry et al. 2014)

Obrázok 3 Larva C. albipunctata (Bradford 2010)

1.3 Výskyt

C. albipunctata je veľmi rozšírený druh, ktorý sa nachádzal hlavne v tropickom prostredí po celom svete. Najstarší záznam o výskyte v Európe je z Barcelony a Španielska v roku 1920. Neskôr (Oboňa a Jeţek 2012) citoval (Vaillant 1971b, 1971a) popísal, ţe druh sa nachádza hlavne medzi 40°S a 42°N. Napriek tomu sa teraz tento druh vyskytuje v Belgicku, Francúzsku, Nemecku, Grécku, Taliansku, Slovinsku aj Španielsku (Oboňa a Jeţek 2012).

V prirodzených tropických a miernych oblastiach sa druh vyskytuje v prírodných biotopoch ako napríklad hnilobné diery v stromoch (Jenkins, 1946).

Všetky predchádzajúce krajiny v centrálnej Európe, vrátane Českej a Slovenskej republiky, zaznamenali výskyt hlavne v zastavaných priestoroch. Súčasný nález na Slovensku potvrdzuje, ţe C. albipunctata sa mnoţí aj vo vodou naplnených dutinách stromov. Ale podľa pozorovania v prírodnom ekosystéme mierneho pásma nedokázala preţiť zimu 2011/2012 (Jeţek et al. 2012).

Celkovo bola C. albipunctata zaznamenaná v Brne na 9 lokalitách (Obrázok 4 Lokality výskytu C. albipunctata (Šuláková et al. 2014)), z toho jedno miesto bolo osídlené masívne. To naznačuje, ţe sa tu vyskytuje uţ dlhšie a doteraz nebola zaznamenaná. (Šuláková et al. 2014) Podľa pozorovania ale v prírodnom ekosystéme mierneho pásma nedokázala preţiť zimu 2011/2012. Predpokladá sa, ţe na jar bol kmeň stromu znovu kolonizovaný jedincami z mestskej aglomerácie, ktorí preţili vďaka vykurovaniu a to na miestach ako kuchyne, kúpeľne, kanalizácie, či opustené budovy. Ide teda o pomerne veľmi invazívny druh, ktorý môţe narušiť prirodzenú biodiverzitu (Oboňa a Jeţek 2012).

Obrázok 4 Lokality výskytu C. albipunctata (Šuláková et al. 2014)

Okrem toho bol tieţ tento druh často pozorovaný v čistiarňach odpadových vôd, zle čistených sprchách, toaletách, športových centrách. To môţe byť problémom v budovách napríklad v nemocniciach (Verheggen et al. 2008).

1.4 Životný cyklus

Celý ţivotný cyklus C. albipunctata trvá v priemere 27±5 dní pri 25°C a 75 % vlhkosti pri striedaní dňa a noci v pomere 16/8 hodín. Embryogenéza trvá pribliţne 3 dni, larválne štádium v priemere 4,5 dňa. Štádium kukly asi 5 dní a dospelí jedinci preţívajú v priemere 12 dní. Dospelí jedinci sú schopní párenia krátko po vyliahnutí z kukly. Vajíčka sú po oplodnení pripravené na kladenie po 3 dňoch (Jimenez-Guri et al. 2014). (Obrázok 5 Ţivotný cyklus C. albipunctata(Jimenez-Guri et al. 2014))

Larválne štádium sa vyvíja v plytkých znečistených vodných nádobách alebo v iných vlhkých organických materiáloch, ako napríklad sliz. V nich pouţívajú svoje hryzadlá na rozmelnenie organického materiálu a získavajú tak potravu. Oplodnená samička je schopná naklásť 200-300 vajec, ktoré sa v priebehu niekoľkých dní vyliahnu. Jeden pár môţe naklásť vajcia aj viac krát (Sehgal et al. 1977). To znamená, ţe môţe vyprodukovať tisíce potomkov počas niekoľkých mesiacov (Boumans et al. 2009). Kombináciou relatívne krátkeho ţivotného cyklu, vysokej fertility a hojnosti vhodných miest pre vývoj lariev vyplýva, ţe sa C. albipunctata bude aj naďalej rýchlo šíriť (Oboňa a Jeţek 2012).

Obrázok 5 Ţivotný cyklus C. albipunctata(Jimenez-Guri et al. 2014)

1.5 Eliminácia C. albipunctata

Boj proti C. albipunctata je potreba zamerať proti všetkým vývojovým štádiám. Na dospelých jedincov dobre účinkujú insekticídy na báze pyretrinov alebo pyretroidov, ktoré fungujú ako neurotoxíny a sú povaţované za najbezpečnejšiu triedu insekticídov (Dorman a Beasley 1991).

Problém ale nastáva s larválnym štádiom, na ktorý insekticídy nezaberajú, keďţe sa vyvíja v menej prístupných vlhkých oblastiach, ktoré sú bohaté na organickú hmotu. Kľúčom k úspechu teda je nájsť všetky miesta kde C. albipunctata kladie vajíčka a odstrániť ich. Preto odstránenie C. albipunctata z oblasti vyţaduje dlhodobé pozorovanie, vytrvalosť a aj predstavivosť , kde tieto jedince môţu sídliť. Jedným z moţností ako potvrdiť, ţe dané miesto slúţi na vývin larválneho štádia, je pomocou silnej lepiacej pásky. Tá sa nalepí na pozorované miesto tak, aby lepiaca časť smerovala nahor. Po jednej noci sa páska skontroluje na prítomnosť uviaznutých okrídlených jedincov, ktorí potvrdzujú tento predpoklad. Dôleţité je dbať a na detailné miesta kde by mohli prebývať. Napríklad povolené tesnenie u odpadového potrubia, cez ktoré dokáţe dospelý jedinec vletieť dnu a naklásť vajcia a nový jedinci zas vyletieť von. Dobrým miestom pre kladenie vajec sú taktieţ kvetináče, keďţe sú udrţované primerane vlhké (Verheggen et al. 2008).

Existujú niektoré špecifické produkty, ktoré sú zamerané na boj proti larvám a vajíčkam. Ich účinnosť však môţe byť porovnateľná s koncentrovaným roztokom hydroxidu sodného, ktorý má ale podstatne niţšiu cenu. Stále však treba nájsť všetky miesta slúţiace na reprodukciu. Základom je udrţiavať hygienicky čisté prostredie, ktoré by zabránilo prítomnosti vhodných vlhkých plôch, aby nedošlo k opätovnému osídleniu. Jedná sa tieţ o popolnice, umývadlá sprchy, mokré mopy a utierky. Ak dospelí jedinci nezmiznú behom týţdňa po odstránení takýchto miest je vysoko pravdepodobné, ţe to neboli miesta jediné (Verheggen et al. 2008).

1.6 C. albipunctata ako zdroj nozokomiálnych infekcií

C. albipunctata, tak isto ako kaţdý iný väčší organizmus, môţe prenášať na svojom povrchu alebo vo vnútornom prostredí, patogény. V nemocničnom prostredí však kolonizujú C. albipunctata nemocničné patogény, ktoré majú často získanú antibiotickú rezistenciu. Medzi základné moţné spôsoby prenosu nákazy na pacienta patrí prenos priamym kontaktom a v prípade C. albipunctata aj miáza (Faulde a Spiesberger 2013), (El-Badry et al. 2014).

Mikrobiálne osídlenie jedincov spolu s ich správaním, napríklad aj defekáciou, či sekréciou, a ich spôsobom rozmnoţovania môţe spôsobiť kontamináciu nemocničných povrchov kontaktom, ale tieţ môţe infikovať zdroj vody, kuchynské prostredie, sprchy a toalety, tieţ spôsobiť kontamináciu jedla. (Faulde a Spiesberger 2013)

1.6.1 Nozokomiálne infekcie

Jedná sa o infekciu exogénneho alebo endogénneho pôvodu, ktorá vznikla v nemocničnom prostredí v súvislosti s liečbou. Dôleţité je miesto nákazy, takţe aj infekcie, ktoré sa prejavia aţ po opustení zdravotníckeho zariadenia, ale k ich nákaze došlo počas pobytu, sú tieţ nozokomiálne nákazy. Naopak infekcie ktoré sa prejavia do 48 hodín od prijatia do liečenia za nozokomiálne infekcie nepovaţujeme, keďţe prijímaný pacient uţ bol v inkubačnej dobe, ide teda o komunitnú infekciu prinesenú do nemocnice (Šrámová a kol 2013) str.12-13.

1.6.2 Zdroj patogénov

V nemocničnom prostredí sa nachádza väčšia koncentrácia patogénov ako v beţnej komunite. Nemocnice, samozrejme, majú zvýšené hygienické štandardy, takţe sa plochy častejšie umývajú a dezinfikujú (Šrámová a kol 2013) str. 116-125. Pouţitá voda sa vylieva do odpadu, kde môţe vznikať väčšia koncentrácia rezistentných kmeňov (Šrámová a kol 2013) str. 125-144. Keďţe sa C. albipunctata často mnoţí v odpadových vodách alebo iných znečistených vodných plochách, pouţitých mopoch, môţu získavať jedince väčšie mnoţstvo patogénov, ako len beţným dotykom s povrchom. (Faulde a Spiesberger 2013)

1.6.3 Kolonizácia C. albipunctata

V nemeckých nemocniciach bolo izolovaných 45 bakteriálnych druhov kolonizujúcich C. albipunctata. V rôznom stupni kolonizovali C. albipunctata baktérie ako napríklad Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophila, Alcaligenes faecalis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomoas aeruginosa a Pseudomonas fluorescens ďalej napríklad Stenotrophomonas maltophili a Comamonas testosteroni. Ďalej po jednom kmeni boli tieţ izolované Yersinia frederiksenii a Nocardia sp. (Faulde a Spiesberger 2013)

Testované boli 4 nemocnice a podľa spektier izolovaných baktérií bolo zjavné, ţe kolonizácia C. albipunctata výrazne závisí aj na lokálnom bakteriálnom spektre. Napríklad Acinetobacter baumannii sa vyskytoval v závislosti na nemocnici na mnoţstve jedincov od 0 % po 17,5 %. Pseudomonas aeruginosa od 0 % po 12,5 % a Stenotrophomonas maltophilia od 0 % po 10 %. (Faulde a Spiesberger 2013)

Po testovaní antibiotickej rezistencie sa našlo 11 kmeňov Stenotrophomonas maltophilia multirezistentných na antibiotiká. Z čeľade Enterobacteriaceae multirezistentný kmeň nebol izolovaný ţiadny. Autori Faulde a Spiesberger, (2013) ale vyjadrili obavu, ţe C. albipunctata môţe zohrať významnú roľu aj v prenose multirezistentných kmeňov čeľade Enterobacteriaceae. (Faulde a Spiesberger 2013)

1.6.4 Prenos infekčných agens kontaktom

Vzhľadom na fakt, ţe C. albipunctata je lietajúci hmyz, môţe byť zdrojom ako priamych, tak aj nepriamych nozokomiálnych infekcií. C. albipunctata má na svojom povrchu veľké mnoţstvo chĺpkov, to výrazne zvyšuje povrch a zväčšuje moţnosť prenosu patogénov. (Faulde a Spiesberger 2013)

Priame infekcie

Zdrojom priamych infekcií môţe byť v prípade, ţe infikovaný jedinec priamo sadne na pacienta. Môţe tak prenášať nákazy pooperačných rán, močového traktu, respiračného traktu a aj krvného riečiska. Viac rizikoví sú pacienti, udrţiavaní v umelom spánku alebo v kóme. Riziko infekcie sa tieţ zvyšuje v noci, kedy pacient prípadnú nakazenú koutuľu nemá moţnosť odohnať. Dôleţité je teda zvýšiť starostlivosť nemocničného personálu a zamedziť prístupu hmyzu do miestnosti napríklad pouţitím sieťok na oknách (Šrámová a kol 2013). 146-149.

K priamej infekcií môţe tieţ dôjsť larvami C. albipunctata. A to jedlom alebo znečistenou vodou v sprche, či umývadle. Je teda dôleţité dbať na zvýšenú pozornosť personálu aj v kuchyni a sociálnych zariadeniach (Šrámová a kol 2013) str. 146-149.

Nepriame infekcie

K nepriamym infekciám môţe dôjsť, ak pacient príde do kontaktu s predtým infikovaným materiálom. Môţe ísť o posteľnú bielizeň, nástroje či obväzy, ale aj jedlo. Inou moţnosťou je, ak príde pacient do kontaktu s chĺpkami uvoľnenými z C. albipunctata. Tie môţu spôsobovať alergie alebo infekcie respiračného traktu. V neposlednej rade môţe ísť tieţ o infikovanú vodu, v ktorej sa vyvíjali larvy C. albipunctata alebo prišli do kontaktu s dospelým jedincom a to tieţ vo zvlhčovačoch vzduchu, inhalátoroch, liekopisnej vode, ale aj pitnej vode a prístrojoch s riadenou ventiláciou. C. albipunctata tieţ môţe sprostredkovať prenos z infikovaného pacienta na pacienta iného (Šrámová a kol 2013) str. 80.

1.6.5 Miáza

Ide o ochorenie vyvolané larvami múch, ktoré sa vyvinuli z vajíčok nakladených na koţi alebo do rán a ţivia sa ľudskými tkanivami. Môţu prenikať aj do dutín (Votava, a kol 2010) str. 445.

Je samozrejmé, ţe pri kladení vajíčok sa mnoţstvo baktérií prenáša z dospelého jedinca na povrch vajíčka, vznikajú tak vehikulá, v ktorých môţe dôjsť k pomnoţeniu patogénov. Môţe tak dôjsť nielen k miáze, ale aj k nemocničným infekciám (Šrámová a kol 2013) str. 146.

Taktieţ ako pri priamych infekciách, sa pravdepodobnosť zvyšuje, ak ide o pacienta nemohúceho alebo v noci. Rovnako aj v kúpeľni, kde je väčšie mnoţstvo lariev, ktoré sa môţu preniesť na pacienta (Šrámová a kol 2013) str. 148.

U C. albipunctata boli zdokumentované rôzne typy miáz:

Gastrointestinálna miáza u 21 ročného muţa na Taiwane. Po podaní antiparazitálnej liečby sa vo výkaloch objavilo 5 ţivých lariev, ktoré boli identifikované ako C. albipunctata. K infekcií pravdepodobne došlo poţitím skorého štádia lariev alebo vajíčok (Tu et al. 2007).

Urogenitálna miáza bola prvý krát zdokumentovaná u pacienta v Egypte. Prítomnosť lariev C. albipunctata v dvoch rôznych čerstvých vzorkách moču potvrdila diagnózu urinálnej miázy (El-Badry et al. 2014). Môţe týmto spôsobom dôjsť aj k vzniku urogenitálnej infekcie (Šrámová a kol 2013) str. 146.

Nasopharyngeálna miáza sa preukázala u 32-ročnej ţeny pracujúcej ako archeológička v Pompejach. Ţena udávala upchatie nosa hlavne pravej nozdry a príznaky zápalového procesu. Počas vyplachovania sa z nozdry vylúčil malý hmyz identifikovaný ako C. albipunctata. Teplota, kašeľ a upchatie nosa sa úplne vytratili behom pár dní (Gelardi et al. 2009).

2 Sledované nozokomiálne patogény

Pôvodcom nozokomiálnych nákaz môţe byť akýkoľvek mikroorganizmus, baktéria, ricketsia, chlamýdia, vírus, prvok a kvasinka. Môţe ísť o vyslovene patogénne agens alebo podmienene patogénny mikroorganizmus, ktorý v komunite nespôsobuje infekcie. U oslabených jedincov, ktorých je v nemocnici zvýšené mnoţstvo môţu tieto mikroorganizmy ale infekcie spôsobovať (Šrámová a kol 2013) str. 28. Ja sa zameriam hlavne na baktérie, ktorých prítomnosť sa na C. albipunctata predpokladá.

2.1 Charakteristika nozokomiálnych patogénov

V priebehu 1.-4. dňa hospitalizácie pacienta vyvolávajú nozokomiálne infekcie hlavne kmene, ktoré pochádzajú z komunity. Sú dobre citlivé na antibiotiká a chemoterapeutika, kolonizáciou a šírením v nemocnici sa však flóra pacienta stáva nemocničnou flórou a získava jej vlastnosti. V prípade nadmerného uţívania antibiotík dochádza u tejto flóry k vzniku rezistencie (Šrámová a kol 2013) str. 28.

Pri hospitalizácií dlhšej ako 5 dní, dochádza k nakazeniu pacienta exogénnymi multirezistentnými kmeňmi. Medzi ne patria hlavne stafylokoky ako Staphylococcus aureus, v poslednej dobe MRSA a tieţ koaguláza-negatívne stafylokoky. Ďalej sú významné enterokoky, pneumokoky, streptokoky. Z gramnegatívnych tyčiniek sú významní členovia čeľade Enterobacteriaceae a tieţ rod Pseudomonas a Acinetobacter (Šrámová a kol 2013) str. 28 a 43.

2.2 Antibiotická rezistencia

Antibiotická rezistencia je vlastnosť baktérií preţívať v prítomnosti určitého antibiotika. Primárnu rezistenciu majú mnohé baktérie, ide hlavne o rezistenciu na antibiotiká, ktoré pre ne nie sú určené (antibiotiká napadajúce bunkovú stenu na baktérie bez bunkovej steny). V posledných rokoch ale vzniká získaná rezistencia. Baktéria tak napríklad pomocou plazmidu alebo mutácie génu získa vlastnosť, proteín alebo membránový prenášač, pomocou ktorého dokáţe odolávať antimikrobiálnej látke, na ktorú bola predtým citlivá. U pacienta potom selekčným tlakom dôjde k zníţeniu mnoţstva nerezistentnej flóry a rezistentná baktéria sa tak môţe premnoţiť a rozširovať (Votava, 2005) str. 240-241.

Tento proces je najvýznamnejší v nemocničnom prostredí, kde dochádza k veľkému uţívaniu rôznych antibiotík na rôzne druhy baktérií. Dochádza tak k vzniku polyrezistentných

kmeňov, ktorých infekcie sa ťaţko liečia. Vznikajúce nozokomiálne infekcie tak majú ťaţší priebeh, keďţe ich terapia je menej alebo úplne neúčinná (Votava, 2005) str. 240-241.

2.3 Rod Staphylococcus

Stafylokoky sú povaţované za najčastejšieho pôvodcu nozokomiálnych infekcií. Podľa produkcie plasmakoagulázy ich rozdeľujeme na tie, ktoré koagulujú ľudskú plazmu (tvoriace koagulázu, Staphylococcus aureus) a koagulázu netvoriace (koaguláza negatívne) (Šrámová a kol 2013) str. 33.

Keďţe sú stafylokoky rezistentné k vyschnutiu a k vysokej koncentrácií soli, preţívajú na koţi ľudí aj zvierat (Greenwood et al. 1999) str. 181. Majú tak dobrý predpoklad aj na rozšírenie prostredníctvom C. albipunctata.

2.3.1 Stafylokokus aureus

Staphylococcus aureus sa vyskytuje v nose a na koţi určitého počtu zdravých osôb, je teda podmieneným patogénom. Najčastejšie infikuje poškodenú koţu, sliznicu alebo hematóm v mäkkých tkanivách. Často tieţ dochádza k vzniku stafylokokovej pneumónie ako napríklad komplikácia chrípky (Greenwood et al. 1999) str. 182. U oslabených jedincov vyvoláva hnisavé ochorenia koţe, abscesy, ale aj ochorenia podkoţia, kostí a ţliaz. Spôsobuje aj rôzne zápaly stredoušnej dutiny, sinusov, empyémy a meningitídy. Keďţe je k stafylokokom vnímavejšie poškodené tkanivo, tak často infikuje popáleniny, dekubity, vredy predkolenia, ale aj cudzie telesá, ako endoprotézy, kardiostimulátor, kanyly a katétre (Šrámová a kol 2013) str. 33-34.

Veľmi nebezpečná je tieţ akútna stafylokoková endokarditída. Stafylokoky obklopené medzibunkovou hmotou vytvárajú takzvanú vegetáciu na srdcových chlopniach. Z tejto zvláštnej formy biofilmu sa uvoľňujú stafylokokové septické kúsky, ktoré spôsobujú metastázovanie abscesov do koţe, pľúc, mozgu aj ľadvín (Votava, a kol 2003) str. 103.

Veľké mnoţstvo stafylokokov produkuje rôzne toxíny. Od enterotoxínov, ktoré po poţití v potrave vyvolávajú nauzeu, zvracanie a hnačku, cez epidermolytické toxíny, ktoré vyvolávajú vznik pľuzgierov. Najčastejšie sú postihnuté deti a vzniká zčervenalá, zlupujúca sa pokoţka, ktorá následne vyzerá ako po oparení alebo popálení. Posledným príkladom tvorby toxínu je toxín syndrómu toxického šoku, ktorý často končí systémovou toxickou infekciou zakončenou smrťou (Greenwood et al. 1999) str. 182-183.

2.3.1.1 MRSA

Methicilín rezistentný S. aureus (MRSA) je kmeň, ktorý má mutáciu jednej z esenciálnych bielkovín viaţúcich penicilín na jeho bakteriálnej stene. To vyvoláva rezistenciu k methicilínu, oxacilínu a ostatným β-laktamom. Kmene tieţ môţu byť rezistentné aj na iné protistafylokokové antibiotiká. Príkladom môţe byť gentamicín, erytromycín alebo tetracyklín. Vznikajú tak multirezistentné kmene MRSA (Greenwood et al. 1999) str. 185. Vyplýva z toho, ţe jedna mutácia spôsobí rezistenciu na väčšie mnoţstvo antibiotík.

Kmene MRSA sú v súčasnosti izolované zo všetkých krajín sveta. V USA uţ podiel stúpol na 63 % v roku 2004. V Európe sú hodnoty rôzne, Portugalsko udáva viac ako 50 %, stredná Európa, kam patrí aj Česká republika, hlási asi 10-15 %, severské štáty menej ako 1 %. V Českej republike výskyt stúpa z necelých 4 % v roku 2000, na 14,2 %. Tieţ počet nemocníc s výskytom stúpol na 83 v roku 2006 (EARSS Management Team 2007) str. 49-53.

Infekcie spôsobené MRSA sú povaţované za váţny medicínsky problém. Ohrozujú totiţ pacienta vzniknutou sepsou, infekciou chirurgických rán, či pneumóniou. Najčastejším zdrojom infekcie sú infikovaní pacienti s príznakmi, ale aj bez klinických príznakov. Prenos z nich môţe byť priamy aj nepriamy (Šrámová a kol 2013) str. 34-36. To, ţe infekcia rezistentným kmeňom je významným faktorom úmrtnosti dokazuje aj fakt, ţe v prípade MRSA kmeňu bola úmrtnosť 3-krát väčšia, ako v prípade kmeňu citlivého (Bastug et al. 2012).

2.3.2 Koaguláza negatívne stafylokoky

Patria medzi podmienene patogénne organizmy. Na vznik ochorenia teda veľmi vplývajú aj iné ochorenia pacienta. Napríklad imunitné defekty alebo nepriaznivý stav, ako napríklad liečba imunosupresívami, cytotoxickými látkami, operácie alebo transplantácie a taktieţ psychický stav. Preto sú veľmi dobrými nozokomiálnymi patogénmi pre dlhodobo hospitalizovaných pacientov (Šrámová a kol 2013) str. 36-38. Koaguláza negatívne stafylokoky často infikujú aj rizikových novorodencov, ktorým spôsobujú ţivot ohrozujúce infekcie (Baumgart, 1983).

Vďaka glykokalixu tvoria biofilm a tieţ majú schopnosť adherovať na syntetických materiáloch, napríklad na implantátoch, katétroch alebo iných cudzích telesách v tele pacienta (kĺbne náhrady, chlopne, centrálny ţilný katéter, kardiostimulátor). Keďţe ich pouţívanie v posledných rokoch výrazne zvýšilo intenzitu, zvyšuje sa aj incidencia nozokomiálnych infekcií koaguláza negatívnymi stafylokokmi (Šrámová a kol 2013) str. 36-38. Medzi príklady

patrí napríklad Staphylococcus epidermidis, z klinického materiálu izolovaný v pribliţne 34,5 %, Staphylococcus haemolyticus 22,8 % a Staphylococcus hominis 12,2 % z celkového mnoţstva koaguláza negatívnych stafylokokov (Votava, a kol 2003) str. 107. V prípade bakterémií vo Švajčiarsku bola prítomnosť koaguláza negatívnych stafylokokov preukázaná v prípade v 411 prípadoch zo 1108 nozokomiálnych bakterémií, 234 z nich niesli známky sepsy a boli označené za relevantné a analyzované. Hrubá úmrtnosť sa vyšplhala na 24,4 % a pridruţená na 12,8 % (Favre et al. 2005).

V nemocnici sa často stretávame aj s rezistentnými kogauláza negatívnymi stafylokokmi, napríklad k methicilínu a rýchlo tieţ stúpa aj rezistencia k iným, napríklad k chinolonom Beţná je rezistencia k penicilínu, gentamicínu, erytromycínu, voleným liekom je tak vankomycin alebo teikoplanin, ku ktorému však tieţ uţ vzniká rezistencia (Greenwood et al. 1999) str. 187. Schopnosť tvoriť biofilm a sliz, ich tieţ chráni pred pôsobením antibiotík a dochádza k perzistencií infekcie. Kvôli tomu je často najlepším riešením odstránenie infikovaného telesa. V prípade neúspešnej antibiotickej liečby, je to jediné riešenie (Šrámová a kol 2013) str. 37.

2.4 Rod Streptococcus

Druhou významnou skupinou nozokomiálnych patogénov sú streptokoky. Vyskytujú sa rovnako ako stafylokoky v beţnej bakteriálnej flóre človeka. Najčastejšie osídľujú respiračný systém a obvykle sú neškodné. Niektoré druhy ale môţu spôsobovať rozsiahle spektrum ochorení s rôznym priebehom. Príkladom ochorení sú napríklad hnisavé infekcie, angíny, tonzilitídy ale aj meningitídy a sepsa. Významnou komplikáciou streptokokových infekcií sú neskoré následky. Môţu spôsobovať reumatickú horúčku, prejavujúcu sa ako horúčkovitý nehnisavý zápal srdca a kĺbov a akútnu glomerulonefritídu (Votava, a kol 2003) str. 111-127. Klasifikujeme ich podľa hemolýzy na krvnom agare. Pozorujeme tak β-hemolytické, α-hemolytické a non-hemolytické (Greenwood et al. 1999) str. 189. Keďţe α-hemolýza sa nemusí vţdy prejaviť, rozdeľujeme streptokoky na β-hemolytické a non-β-hemolytické (Votava, a kol 2003).

2.5 Čeľaď Enterobacteriaceae

Enterobaktérie sú pomerne pestro členená čeľaď a obsahuje mnoţstvo rozdielnych druhov. V klinickej praxi sa však jedná o jednu z najvýznamnejších skupín baktérií. Jej prirodzeným prostredím je črevo. V tráviacom systéme môţe byť len ako komenzálová alebo saprofytická

kolonizácia. Problém nastáva ak spôsobuje chorobné príznaky, tie môţe vyvolať dismikrobia, zmena pomeru prirodzenej mikroflóry alebo nahradenie niektorej zloţky novým patogénnym druhom, k čomu v nemocniciach dochádza. Keďţe sa anus nachádza v blízkosti urogenitálneho systému, často Enterobacteriaceae môţu spôsobovať urogenitálne infekcie. U hospitalizovaných pacientov sa nález enterobaktérií vo výtere z krku povaţuje za významnejší ako u pacientov zdravých. V oboch prípadoch však môţe ísť len o kontamináciu potravou. Potrebné je tieţ diferencovať mnoţstvo izolovaných kolónií zo vzorku. Šírenie infekcií prebieha väčšinou fekálne-orálnou cestou. Serracie ale napríklad môţu preţívať aj vo vonkajšom prostredí a byť tak zdrojom nozokomiálnych patogénov (Votava, a kol 2003) str.53-56.

2.5.1 Rod Escherichia

Z rodu Escherichia je ľudským patogénom hlavne Escherichia coli, ostatné len výnimočne. Je najznámejšou baktériou a často sa vyuţíva ako modelový organizmus alebo ako prostriedok na tvorbu rekombinantných vakcín. Prirodzene sa vyskytuje v črevnej mikroflóre zdravých ľudí. Napomáha tvorbe vitamínu K a tieţ pôsobí symbioticky, lebo tvorí látky, ktoré zabraňujú prieniku niektorých patogénov. Ako aj iné, je však podmieneným patogénom. Ak sa nachádza mimo čreva, tak je skoro vţdy patogénna. E. coli môţeme rozdeliť na niekoľko kmeňov podľa patogenity, tvorby toxínov. Rozoznávame napríklad EPEC (entoropatogénna, dispeptická E.coli), ETEC (enterotoxická E.coli), EIEC (enteroinvazivna E.coli), STEC (shiga-like toxigénna E.coli), EaggEC (enteroagregatívna E.coli), DAEC (difúzne adherentná E.coli) a často sa uvádzajú aj ďalšie. E.coli najčastejšie spôsobuje hnačkové ochorenia, ktoré môţu byť s prímesou krvi. Mimo črevo môţeme hovoriť o uropatogénnych E.coli, spôsobujú močové infekcie. Prirodzene je rezistentná k ampicilínu, ale stúpa aj počet inak rezistentných kmeňov. Účinkujú ale cefalosporiny, chránený penicilín fluorované chinolony a ko-trimoxazol (Votava, a kol 2003) str. 64-66.

2.5.2 Rod. Salmonella

Baktérie rodu Salmonella môţeme rozlíšiť do pár druhov, príkladom je Salmonella enterica a tie sa ďalej delia na rôzne sérotvary. Salmonella Typhi alebo Paratyphi patria medzi závaţné patogény, spôsobujú brušný týfus respektíve paratýfus. Ten sa prejavuje aţ po asi desať aţ štrnásťdňovej inkubačnej dobe. Prvými príznakmi je teplota a bolesť hlavy. V tom čase sa uţ pôvodca nachádza v krvnom riečisku a spôsobuje bakterémiu. Týfusová salmonela sa môţe usídliť v ţlčových cestách alebo ţlčníku a vzniká tak celoţivotné nosičstvo, ktorého liečba je ťaţká aţ nemoţná. Kaţdou porciou ţlče sa dostáva dávka baktérií opäť do čreva, kde môţe spôsobovať hemorrhagiu alebo perforáciu čreva. V prípade týfu, ktorý sa nelieči, môţe mortalita dosiahnuť aţ 20%. Liečba prebieha napríklad fluoroginolonmi, kotrimoxazolom alebo ampicilínom, v prípade komplikovaných situácií sa tieţ pouţíva chloramfenikol (Votava, a kol 2003) str. 60-61.

Druhou skupinou salmonel sú zoopatogénne druhy, ktoré sú najbeţnejším pôvodcom črevných nákaz. Spôsobujú hnačky bez prítomnosti krvi. U detí alebo starších pacientov môţe dôjsť k salmonelovej sepse, ktorá môţe končiť aj smrťou. K infekcií je však nutná pomerne vysoká infekčná dávka. Antibiotická terapia sa neodporúča (Votava, a kol 2003) str. 61-62.

2.5.3 Rod Klebsiela, Yersinia, Serratia, Proteus

Klebsiela je adaptovaná aj na ţivot mimo čreva a tak sa z vonkajšieho prostredia môţe dostať do iných telových dutín. Stávasa tak závaţným nozokomiálnym patogénom. Ide o druhý najčastejší pôvod uroinfekcie. Tieţ v porovnaní s enterobaktériami pomerne často spôsobujú nozokomiálne sepsy alebo infekcie dýchacích ciest. Nozokomiálne kmene produkujú širokospektré beta-laktamázy a tak sú citlivé len ku karbapenom a cefalosporínom 4. generácie. Môţu sa niekedy pouţiť aj aminoglykosidy, nitrofurantoín a kolistín. Liečba je však komplikovaná (Votava, a kol 2003) str. 67-68.

Z rodu Yersinia sú najvýznamnejšie Yersinia enterocolitica a Yersinia pseudotuberculosis. Spôsobujú črevné infekcie a tieţ často imitujú apendicitídu. Hnačka nemusí byť vţdy prítomná, často sa však vyskytuje bolesť brucha alebo horúčka. Šíri sa fekálne-orálnou cestou. Na infekcie sa môţu uplatňovať fluorochinolony, cefalosporíny tretej generácie a tetracyklíny (Votava, a kol 2003) str. 59.

Serratia sa nachádza viacej vo vonkajšom prostredí, k jej významnej úlohe nozokomiálneho patogénu napomáha jej odolnosť voči dezinfekcií. Infekcie, ktoré spôsobuje sú napríklad pneumónie, ale aj ranné infekcie vznikajúce v nemocničnom prostredí. Pouţitie antibiotík v liečbe je problémové, serracie bývajú polyrezistentné a tieţ majú značné mnoţstvo primárnej rezistencie (Votava, a kol 2003) str.68.

Proteus spolu s providenciami a morganellami patria do taxonomickej jednotky tribus Proteae. U niektorých ľudí sa vyskytujú v beţnej flóre. Mimo čreva sú výrazne patogénnejšie. Napríklad v močových cestách alebo ranách a dekubitoch. U matkou nakazeného novorodenca dokonca bola popísaná aj sepsa. Infekciou sú však ohrození aj iní oslabení jedinci. Rezistencia je druhovo rôzna (Votava, a kol 2003) str. 69.

2.5.4 Ďalšie enterobaktérie

Enterobaktérie rodu Shigella sú z enterobaktérií najchúlostivejšie na ţivotné podmienky. Spôsobujú úplavicu, intenzívne vodnaté hnačkové ochorenie, ktoré môţe byť sprevádzane aj krvou v inak hlienovitej a hnisavej stolici. V dnešnej dobe sa uţ úplavica vyskytuje málo, keďţe k prenosu dochádza hlavne neumytými rukami. V minulosti boli tieţ časté prípady kontaminovanej vody (Votava, a kol 2003) str. 63.

Rod Hafnia je pomerne beţný, avšak často zamieňaný napríklad za E. coli alebo Enterobacter sp. Ako mnoţstvo iných, ide tieţ o oportúnneho patogéna. Je menej patogénny ako enterobaktery, ale asi rovnako ako serracie. V prípade mimo črevnej infekcie bola popísaná infekcia oka. Na antibiotiká sú hafnie pomerne rezistentné (Votava, a kol 2003) str. 66.

Z rodu Citrobacter sa najčastejšie vyskytujú Citrobacter freundii a Citrobacter koseri. Ide o podmienené patogény v črevách a tieţ môţe infikovať močové cesty alebo spôsobovať endokarditídy, meningitídy a bakterémie. U detí sa vyskytli aj osteomyelitídy. U citrobakterov tieţ stúpa mnoţstvo rezistentných kmeňov produkujúcich širokospektrálne beta-laktamázy. V liečbe sa uplatňujú chinolony alebo ko-trimoxazol (Votava, a kol 2003) str. 70-71.

Baktérie rodu Enterobacter a Pantoea sú druhou najbeţnejšou súčasťou črevnej flóry človeka, stále sa ale môţe prejaviť ako podmienený patogén. Môţu spôsobovať infekcie mimo čreva kde najčastejšie infikujú pohybový aparát (Votava, a kol 2003) str. 66-67.

2.6 Gramnegatívne nefermentujúce baktérie

2.6.1 Rod Pseudomonas

Rod Pseudomonas je veľmi obsiahly. V minulosti obsahoval mnoţstvo skupín, ktoré boli na základe DNA/RNA preradené do novo vytvorených vlastných rodov (Votava, a kol 2003) str. 34. Zväčša sa vyskytujú v pôde, vode alebo vlhkom prostredí (Greenwood et al. 1999) str. 297. C. albipunctata je teda ideálnym prenášačom pseudomonád, keďţe sa sama liahne z vlhkého prostredia. V okolitom prostredí môţe prísť do kontaktu s pseudomonádami a počas kladenia vajec do vody miesto mnoţenia infikovať. Všetci novo vyliahnutí jedinci tak budú prenášačmi. (Faulde a Spiesberger 2013)

2.6.1.1 Pseudomonas aeruginosa

Aţ 10 % nozokomiálnych infekcií je spôsobených práve týmto druhom. U imunodeficientných pacientov, pacientov s popáleninami, či inak oslabených jedincov spôsobuje katétrové infekcie, infikuje popáleniny alebo preleţaniny. Obávanou komplikáciou u oslabených jedincov je generalizácia infekcie. Sepsa alebo nekrotizujúca pneumónia majú okolo 60 % mortalitu. Pri cystickej fibróze u detí sú pľúca veľmi náchylné na bezpríznakovú kolonizáciu a neskôr aj vznik mukóznej varianty. V prípade exacerbáce má vysokú morbiditu a mortalitu. K úspešnosti jeho šírenia napomáha aj fakt, ţe preţívajú ajvo vlhkom prostredí, ale aj v antiseptickom roztoku alebo sa dokáţu šíriť vzduchoma prachom. Prenos infekcie môţe nastať aj rukami personálu alebo kontaminovaným materiálom či nástrojom (Greenwood et al. 1999) str. 297-300; Votava, a kol 2003) str. 34-35. Terapia je problémová. P. aeruginosa má schopnosť prijímať gény kódujúce rezistenciu a predávať ich ďalším kmeňom. Spôsobujú tak v nemocniciach významné rozširovanie rezistencie. Pouţívame protipseudomonádové penicilíny, cefalosporiny tretej a štvrtej generácie. Volíme aj karbapenemy a protipseudomonádové aminoglykosidy (Votava, a kol 2003) str. 35-36.

2.6.1.2 Ostatné pseudomonády

Pseudomonas fluorescens sa môţe stať nozokomiálnym patogénom. Zdrojom môţe byť infúzny roztok alebo voda. Izolovaný býva pomerne často. Zriedkavé infekcie sú však s ťaţkým priebehom. Veľmi podobným patogénom je P. putida, ktorý ale nedokáţe rásť pri 4°C (Votava, a kol 2003) str.36.

Pseudomonas stutzeri je pomerne častý v prírodnom vlhkom prostredí. Dokáţe vyvolávať hnisavé zápaly spojiviek, kĺbov alebo stredného ucha. Medzi závaţné infekcie patrí aj sepsa (Votava, a kol 2003) str.36.

Burkholderia (Pseudomonas) cepacia spôsobuje rôzne infekcie aj sepse. Medzi najčastejšie infikovaných pacientov patria pacienti trpiaci cystickou fibrózou alebo pacienti s náhradou srdečnej chlopne, či iným cievnym implantátom. Šírenie podporuje aj rezistencia voči dezinfekčným prostriedkom ako je Ajatin alebo Septonex (Votava, a kol 2003) str. 33.

2.6.2 Rod Acinetobacter, Stenotrophomonas, Delftia, Comamonas

Acinetobaktery sa medzi sebou pomerne zle rozlišujú a aj ich klasifikácia sa stále mení. Najčastejšie je izolovaný z klinického materiálu Acinetobacter baumannii a to z popálenín alebo u imunitne oslabených jedincov (Votava, a kol 2003) str. 37. Acinetobacter sp je rozšírený v pôde aj vo vode a je odolný k vyschnutiu a dezinfekcií. Spôsobuje hlavne

pneumónie, meningitídy a endokarditídy a tieţ infikuje popáleniny (Šrámová a kol 2013) str. 44. Problém týchto infekcií je ich polyrezistencia k antibiotikám. Volíme tak karbapenemy, aminoglykosidy tretej generácie alebo fluorované chinolony (Votava, a kol 2003) str.37.

Baktérie rodu Stenotrophomonas sa vyskytujú u oslabených jedincov ako nozokomiálna infekcia. Ich mortalita je pomerne vysoká, aţ 43 %, spôsobuje to rezistencia S. maltophilia k protipseudomonádovým antibiotikám. Našťastie je väčšina kmeňov citlivá ku karbapenemom, fluorochinolonom a kotrimoxazolu (Votava, a kol 2003) str. 37.

Z rodov Delphia a Comamonas sa najviac vyskytujú Delphia acidovorans a Comamonas testosteroni. Prvý druh môţe u oslabených jedincov spôsobovať sepsy alebo hnisavé infekcie a druhý býva izolovaný z brušnej dutiny pri dialýze.

2.7 Rod Aeromonas

Baktérie z tohto rodu sú pomerne často izolované z potravín a vôd. V nemocniciach sú často nakazené vodovodné kohútiky. Iba pomerne úzke mnoţstvo z nich je patogénnych. Rozdeľujeme ich do skupín označených názvom druhu. Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae a Aeromonas sobria. Spôsobujú hnačky, ktoré môţu mať nekomplikovaný priebeh, napríklad u A. caviae. Aţ po priebeh podobný bacilárnej dyzentérií alebo cholere, pri druhoch A. hydrophila a A. veronii. V prípade kontaktu infikovanej vody s poranenou pokoţkou môţe dôjsť k infekcií, tá môţe skončiť aţ ako myonekróza. Veľké mnoţstvo je rezistentné k ampicilínu, niektoré druhy tieţ k cefalosporinom. V liečbe extraintestinálnej infekcie volíme aminoglykosidy a chinolonomy (Votava, a kol 2003) str. 75-76.

2.8 Prežívanie patogénov na povrchoch

Základným predpokladom infekcie je prenos patogénu. V prípade nepriameho prenosu, je dôleţitý typ mikróba. Rôzne rody preţívajú na povrchoch rôznu dobu. Väčšina grampozitívnych baktérií ako S. aureus, alebo S. pyogenes preţívajú na suchom povrchu aj mesiac. Iné, gramnegatívne, ako Acinetobacter spp. E. coli, P. aeruginosa alebo Serratia marcescens, tieţ dokáţu preţiť aj mesiac. Menej vydrţí napríklad Proetus vulgaris, len pár dní (Kramer et al. 2006). Nozokomiálne patogény majú teda pomerne významnú schopnosť preţívať na povrchu a dôjsť do kontaktu s vnímavým jedincom. C. albipunctata, ktorý môţe infikovať aj pôvodne čisté prostredie, ako posteľnú bielizeň alebo spotrebný materiál, napríklad obväzy. Môţe sa tak stať významným prvkom v prenosu nepriamych infekcií pomocou vehikul (Šrámová a kol 2013) str. 146.

3 Ciele práce

Cieľom tejto práce je spracovať informácie o C. albipunctata ako moţnom zdroji ľudských ochorení, či uţ miáz alebo rôznych infekčných ochorení. Tieţ v krátkosti spracováva postupy pri jej eliminácií.

Výskum je zameraný na zber jedincov z okolia a interiéru Mikrobiologického ústavu u Sv. Anny v Brne. Izoláciu baktérií kolonizujúcich povrch a vnútorné prostredie. Ďalej ich identifikáciu pomocou MALDI-TOF a biochemických testov. Cieľom je sledovanie kolonizácie tohto hmyzu významnými nozokomiálnymi patogénmi, hlavne stafylokokmi a enterobaktériami. Následne sa práca snaţí zhodnotiť mieru rizika pre pacientov z hľadiska prenosu nozokomiálnych infekcií prostredníctvom tejto cesty.

4 Praktická časť

4.1 Kultivačné médiá

Krvný agar (KA) - pripravený z 7 % baranej krvi a základu pre Columbia blood agar - Oxoid, (Veľká Británia) v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne Endova pôda (ENDO) - Oxoid, (Veľká Británia), podľa návodu pripravená v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne Krvný agar s amikacinom (antibiotikum) (AMI) o koncentrácií 0,036 gramov na 1 liter agaru - pripravený v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne Krvný agar s 10 % prímesou chloridu sodného (NACL) - pripravený v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne Saburaudova pôda šikmo naliata v skúmavke (SABA) - Merck, Nemecko, pripravená podľa návodu v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne Ţivný bujón - HIMEDIA Laboratories Pvt. Ltd, (India), pripravený podľa návodu v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne Glycerol-sérový bujón (GSB) - 40 ml konského séra (ZOO servis, Dvůr Králové, Česká republika) 50 ml mozgovo-srdcovej infúzie (Oxoid, Veľká Británia), 10 ml glycerolu (Kulich s.r.o., Česká republika), pripravený v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne Muler-Hintonov agar (MH) - Oxoid, (Veľká Británia), podľa návodu pripravený v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne Hajn pôda (HAJN) - Imuna Pharm, (Slovenská republika), podľa návodu pripravená v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne

4.2 Chemikálie

Sol. Gram-Nowy - pripravila lekáreň FN u Sv. Anny v Brne Sol. Lugol diluta - pripravila lekáreň FN u Sv. Anny v Brne Ethanolum benz. denat. - pripravila lekáreň FN u Sv. Anny v Brne Sol. Safranini - pripravila lekáreň FN u Sv. Anny v Brne Imerzný olej - Delta Optical (Poľsko) Kyselina α-kyano-4-hydroxyškoricová (HCCA) - (Bruker Daltonik, Nemecko) Kyselina mravčia - 98+ % Fischer Sientific (Česká republika)

Triflóroctová kyselina - 99 % (Sigma-Aldrich (USA)) Etanol 96 % - PENTA s.r.o. (Česká republika) Acetonitril 100 % - Sigma-Aldrich (USA) Ultra čistá voda - Sigma-Aldrich (USA)

3 % peroxid vodíka (H2O2) - FAGRON (Česká republika) OXIstrip - TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. (Česká republika) Sterilný fyziologický roztok - pripravený v technickom úseku Klinickej mikrobiológie FN u Sv. Anny v Brne Sterilný parafínový olej - Erba Lachema (Česká Republika) Činidlá IND, PHE, VPT I, VPT II - Erba Lachema (Česká republika) Diagnostický kmeň Streptococcus equi - kmeň českej kolekcie mikrooganizmov CCM 7316

4.3 Roztoky

Zásobný roztok pre matricu HCCA - obsahujúci 50 % acetonitrilu (Sigma-Aldrich (USA)), 47,5 % ultra čistej vody (Sigma-Aldrich (USA)) a 2,5 % triflóroctovej kyseliny (Sigma-Aldrich (USA)) Matrica HCCA - nasýtený roztok kyseliny α-kyano-4-hydroxyškoricovej (Bruker Daltonik) a zásobného roztoku pre matricu HCCA Semiextrakčný roztok - Kyselina mravčia 70 % - obsahujúca 70 % kyseliny mravčej Fischer Sientific (Česká Republika) a 30 % ultra čistej vody Sigma-Aldrich (USA) Čistiaci roztok 1 - Etanol 70 % - obsahujúca 70 % etanolu PENTA s.r.o. (Česká republika) a 30 % ultra čistej vody (Sigma-Aldrich (USA)) Čistiaci roztok 2 - Triflóroctová kyselina 80 % - obsahujúca 80 % triflóroctovej kyseliny (Sigma-Aldrich (USA)) a 20 % ultra čistej vody (Sigma-Aldrich (USA))

4.4 Diagnostické súpravy

STAPHYtest 24 - Erba Lachema (Česká republika) ENTEROtest 24 - Erba Lachema (Česká republika)

4.5 Prístroje

VX-200 Lab Vortexer Vortex Mixer - Labnet (USA) Chladnička - Zanussi (Taliansko)

Komorový termostat Mraznička -80°C - ESCO Lexikon ULT Freezer (Nemecko) Automatické pipety - Biohit (USA) objem: 10-100 µl, 100-1000 µl Automatická pipeta - Pippet4u (Nemecko) objem: 0,5-10 µl, plynový kahan DensiLAmeter typ II - Erba Lachema (Česká republika) Mikroskop Typ LP 1213 - Arsenal (Ukrajina) MALDI-TOF microflexTM LT/SH mass spectrometer - Bruker Daltonics (Nemecko) Biohazard box - MERCI s.r.o. (Slovenská republika)

4.6 Software

MALDI Biotyper Realtime Classification Version 3.1 - Bruker Daltonic (Nemecko) FlexControl microflex Version 3.1 - Bruker Daltonic (Nemecko) Bruker taxonomy Version 3.3.1 - Bruker Daltonic (Nemecko) Identifikačný program TNW ProAuto 7.0 - Erba Lachema (Česká republika)

4.7 Materiál

Sterilné špičky 100 µl, 1000 µl - Top-Line Tips (Nemecko) Sterilné špičky 20 µl – Eppendorf (Nemecko) Stojan na skúmavky Sklenená skúmavka (hliníkový vrchnák a guľaté dno, dĺţka 18 cm, priemer 1,6 cm) Sklenená skúmavka (guľaté dno, dĺţka 10cm, priemer 1 cm) Sklenená skúmavka (guľaté dno, dĺţka 3,5 cm, priemer 1,6 cm) Sklenená skúmavka (guľaté dno, dĺţka 10 cm, priemer 1,6 cm) 2ml sterilné kryo skúmavky - SARSTEDT (Nemecko) Mikrobiologické kľučky Pinzeta Sterilný morský piesok (prečistený) Mikroskopické sklíčka Doštička na MS MALDI-TOF - (Bruker, Nemecko) MALDI aplikátor kolónií - BioVendor (Česká republika) Kimtech utierky - Kimberly-Clark Professional (USA)

4.8 Metodika spracovania C. albipunctata

Celkový proces spracovania C. albipunctata pozostáva z odchytu, odobratia povrchových baktérií, semikvantitatívne zistenie colony foming units. Homogenizovanie jedinca a izolácia baktérií aj z vnútorného prostredia. Následne zistenie semikvantitatívneho mnoţstva jednotiek schopných vytvoriť kolóniu, colony forming units (CFU). Následná identifikácia izolátov.

4.8.1 Odchyt

Dospelí jedinci C. albipunctata boli odchytení na stenách, pri teplovzdušnom potrubí, pri kanáli a v interiéri Mikrobiologického ústavy FN u sväté Anny. Odchyt prebiehal od 2.10.2014 do 19.11.2014. Celkovo bolo odchytených 57 jedincov. Odchytení boli do sterilných sklenených skúmaviek, s dĺţkou 18 cm a priemerom 1,6 cm, s hliníkovým vrchnákom bez kontaktu s ich neprirodzeným prostredím. Následne boli urýchlene ţiví transportovaní do laboratória pri izbovej teplote pre ďalšie spracovanie. Kaţdý jedinec bol identifikovaný podľa článku New Records and Descriptions of Mexican Moth Flies (Diptera: Psychodidae, Psychodinae) (Ibanez-Bernal 2008).

Tabuľka 1 Zoznam jedincov C. albipunctata

Číslo Dátum odchytu Miesto odchytu Číslo Dátum odchytu Miesto odchytu 1 2.10.2014 2 poschodie 31 30.10.2014 kanál 2 6.10.2014 4 poschodie 32 30.10.2014 kanál 3 6.10.2014 vchod 33 30.10.2014 kanál 4 6.10.2014 vonkajšia stena 34 30.10.2014 hlina 5 6.10.2014 Laboratórium STD 35 30.10.2014 hlina 6 9.10.2014 schody 3/4 poschodie 36 30.10.2014 hlina 7 9.10.2014 2 poschodie 37 30.10.2014 kanál 8 9.10.2014 dvere márnice 38 11.11.2014 1. poschodie 9 16.10.2014 schody 3/4 poschodie 39 11.11.2014 vonkajšia stena 10 16.10.2014 schody 1/2 poschodie 40 11.11.2014 vonkajšia stena 11 16.10.2014 1 poschodie 41 11.11.2014 vonkajšia stena 12 16.10.2014 vchod 42 11.11.2014 vonkajšia stena 13 16.10.2014 vonkajšia stena 43 12.11.2014 vonkajšia stena 14 16.10.2014 vonkajšia stena 44 12.11.2014 vonkajšia stena 15 16.10.2014 vonkajšia stena 45 12.11.2014 dvere márnice 16 16.10.2014 vonkajšia stena 46 12.11.2014 kanál 17 16.10.2014 kanál 47 12.11.2014 kanál 18 16.10.2014 Teplovzdušné potrubie 48 13.11.2014 vchod 19 27.10.2014 schody 1/2 poschodie 49 13.11.2014 schody 2/3 poschodie 20 27.10.2017 schody 1/2 poschodie 50 13.11.2014 vonkajšia stena 21 27.10.2014 schody 1/2 poschodie 51 13.11.2014 vonkajšia stena 22 27.10.2014 schody 1/2 poschodie 52 13.11.2014 vonkajšia stena Pokračovanie na ďalšej strane.

Číslo Dátum odchytu Miesto odchytu Číslo Dátum odchytu Miesto odchytu 23 27.10.2014 vonkajšia stena 53 19.11.2014 schody 1/2 poschodie 24 27.10.2014 schody 2/3 poschodie 54 19.11.2014 schody 1/2 poschodie 25 27.10.2014 kanál 55 19.11.2014 schody 1/2 poschodie 26 27.10.2014 1 poschodie 56 19.11.2014 schody 1/2 poschodie 27 27.10.2014 kanál 57 19.11.2014 schody 1/2 poschodie 28 30.10.2014 vonkajšia stena 29 30.10.2014 kanál 30 30.10.2014 kanál

4.8.2 Odber povrch kolonizujúcich mikróbov

Pred odberom boli jedinci imobilizovaní pomocou chladu umiestnením na 5 minút do chladničky s teplotou 4 °C (Zanussi). Následne k nim bol pridaný 1 ml ţivného bujónu. Pre dobré uvoľnenie baktérií z povrchu tela, bola skúmavka vortexovaná po dobu 40 sekúnd (Labnet). Následne bolo 100 µl bujónu semikvantitatívne naočkovaných pomocou pipety a sterilnej mikrobiologickej kličky na KA (pre neselektívne pomnoţenie baktérií), na ENDO (pre záchyt gramnegatívnych baktérií), na NACL (pre selektívne odlíšenie stafylokokov), AMI (pre odlíšenie streptokokov) a na pôdu SABA šikmo naliatu v skúmavke (pre odlíšenie kvasiniek). Všetky pôdy boli inkubované 72 hodín pri 37 °C v komorovom termostate. SABA pôda bola inkubovaná 14 dní.

4.8.3 Odber mikróbov kolonizujúcich aj vnútorné prostredie

Po rozočkovaní povrchových baktérií bol jedinec pomocou sterilnej pinzety prenesený do skúmavky s dĺţkou 3,5 cm a priemerom 1,6 cm a pomocou sterilného morského piesku a vonkajšieho konca skúmavky s dĺţkou 10 cm a priemerom 1cm, čo najlepšie homogenizovaný. (Obrázok 6 Pomôcky na homogenizovanie) K homogenizátu bol následne pridaný 1 ml sterilného ţivného bujónu a dôkladne premiešaný s homogenizátom. Homogenizát bol semikvantitatívne naočkovaný v mnoţstve 100µl na KA, na ENDO a na NACL. Všetky pôdy boli inkubované 72 hodín pri teplote 37 °C v komorovom termostate.

Obrázok 6 Pomôcky na homogenizovanie

4.8.4 Izolácia mikroorganizmov

Po 72 hodinách od inkubácie bola na všetkých pôdach hodnotená prítomnosť kolónií. Na pôde SABA bola prítomnosť kolónií hodnotená po 14 dňoch inkubácie. Bolo zistené ich mnoţstvo na kaţdej pôde. Jednotlivé druhy kolónií boli izolované samostatne na príslušnú pôdu na ktorej narástli a čistota bola skontrolovaná kríţovým rozterom. Po 24 hodinách inkubácie v komorovom termostate pri 37°C bola popísaná veľkosť, tvar, profil, okraje, povrch, transparencia, farba, okolie a konzistencia kolónií. Kaţdý kmeň bol následne zamrazený v 0,7 ml GSB pri -80 °C (ESCO Lexikon ULT Freezer).

4.8.5 Identifikácia izolátov

Mikroskopia

Identifikácia druhov sa začala globálnym pripravením mikroskopických preparátov z kaţdého izolátu. Všetky mikroskopické preparáty boli zafixované v plameni a ofarbené podľa Grama. S postupom Sol. Gram – Nowy 20 sekúnd, oplach vodou, Sol. Lugol diluta 20

sekúnd, oplach vodou, Ethanolum benz. denat. 30 sekúnd oplach vodou a Sol. Safranini 60 sekúnd s následným oplachom vodou.

Mikroskopické preparáty boli vyhodnotené na mikroskope typu LP 1213 (Arsenal) s imerzným olejom (Delta optical) a imerzným objektívom so zväčšením 100-krát a okulárom so zväčšním 10-krát. Celkové zväčšenie tak bolo 1000-krát. Bola popísaná grampozitivita, gramnegativita, tvar a usporiadanie mikróbov.

4.8.5.1 Identifikácia izolátov pomocou MALDI-TOF analýzy

4.8.5.1.1 Príprava vzoriek na identifikáciu pomocou MALDI-TOF analýzy

Izoláty boli spracované pomocou metódy priameho prenosu mikroorganizmov (Bruker Daltonik GmbH 2014) a pomocou predĺţeného priameho prenosu mikroorganizmov (Bruker Daltonik GmbH 2014).

Metóda priameho prenosu mikroorganizmov:

K analýze všetkých izolátov bola najskôr pouţitá metóda priameho prenosu mikroorganizmov, tieţ nazývaná klasická metóda (Bruker Daltonik GmbH 2014). Jednotlivé izoláty boli kríţovo vyočkované na krvný agar pre overenie čistoty kmeňa. Po 24 hodinách pri 37 °C v komorovom termostate boli jednotlivé čisté kolónie kaţdého izolátu pomocou MALDI aplikátora kolónií (BioVendor) v tenkej vrstve nanesené na MALDI doštičku (Obrázok 7 MALDI doštička). Následne boli zakvapnuté 1 µl matrice HCCA. Po príprave boli vzorky ihneď analyzované.

Metóda predĺženého priameho prenosu mikroorganizmov:

Kmene, ktoré sa metódou priameho prenosu mikroorganizmov (Bruker Daltonik GmbH 2014) nepodarilo spoľahlivo identifikovať, boli pripravené metódou predĺţeného priameho prenosu mikroorganizmov, tieţ nazývanou semiextrakcia (Bruker Daltonik GmbH 2014). Ide o kmene so skóre menším ako 1,7. Pomocou MALDI aplikátora kolónií (BioVendor) boli znovu jednotlivé čerstvé kolónie, nedostatočne identifikovaných izolátov, nanesené v tenkej vrstve na terčík MALDI doštičky. Následne zakvapnuté 1 µl 70 % kyseliny mravčej a po zaschnutí opäť zakvapnuté 1 µl matricou HCCA a ihneď analyzované.

4.8.5.1.2 Analýza vzoriek pomocou MALDI-TOF analýzy

Všetky vzorky nanesené na MALDI doštičku boli analyzované pomocou Matrix assisted laser desorption and ionization - time of flight (MALDI-TOF) detekciou analýzy na prístroji MALDI-TOF microflexTM LT/SH (Bruker Daltonik). Desorpcia a ionizácia prebiehala

pomocou laseru s vlnovou dĺţkou zdroja 240 nm, počtom pulzov v jednom bode 40 a s frekvenciou 60 Hz. Intenzita iónového zdroja bola 20 kV. Na všetky vzorky bol pouţitý automatický zber dát, kedy bol laser zameriavaný podľa dopredu definovaného rastru.

Získané spektrá boli spracované programom flexControl microfles Version 3.1 (Bruker Daltonik). Identifikácia prebehla pomocou programu MALDI Biotyper Realtime Classification Version 3.1 (Bruker Daltonik), ktorý porovnal získané spektrá s komerčnou databázou Bruker taxonomy Version3.3.1 (Bruker Daltonik). Skóre nad 2,0 znamená spoľahlivé určenie rodu a druhu vzorky. Skóre nad 1,7 do 1,999 znamená spoľahlivé určenie rodu a pravdepodobné určenie druhu vzorky. Skóre pod 1,7 znamená nespoľahlivé určenie vzorku. (Schulthess et al. 2014)

Obrázok 7 MALDI doštička

4.8.5.1.3 Verifikácia výsledkov MALDI-TOF analýzy

Identifikované izoláty, čiţe vzorky so skóre viac ako 1,7, boli porovnané s výsledkami mikroskopie a jednoduchými biochemickými testami (4.8.5.2 Biochemická identifikácia izolátov, niţšie).

4.8.5.2 Biochemická identifikácia izolátov

Kaţdý izolát bol otestovaný katalázovým testom, vybrané oxidázovým, hyaluronidázovým, testom fermentácie glukózy a test rastu na pôde NACL

Katalázový test:

Kaţdému izolátu bol prevedený katalázový test pomocou 3 % H2O2. Malé mnoţstvo bakteriálnej kultúry bolo zmiešané s 3 % H2O2 a bol sledovaný vznik bublín kyslíku, ktorý indikoval prítomnosť enzýmu peroxidázy.

Oxidázový test:

Všetkým gramnegatívnym tyčinkám bol prevedený oxidázový test pomocou OXIstrip (TestLine Clinical Diagnostics s.r.o). Testovaný prúţok bol priloţený ku kolónií testovaného izolátu a po 60 sekundách bola odčítaná zmena farby prúţku na fialovú.

Kultivácia na KA s 10 % NaCl

Všetky grampozitívne a katalázapozitívne koky boli kultivované na krvnom agare s prímesou 10 % NaCl.

Hyaluronidáza:

Všetkým grampozitívnym, katalázapozitívnym kokom, ktoré rástli aj na krvnom agare s prímesou 10 % NaCl bol prevedený test na produkciu hyaluronidázy. Streptococcus equi CCM 7316 bol v hrubej čiare naočkovaný na krvný agar a k nemu v pravom uhle testovaný izolát. Po inkubácií 24 hodín pri 37 °C bola sledovaná eventuálna prítomnosť lýzy púzdier S. equi hyaluronidázou produkovanou S. aureus. (Obrázok 8 Test hyaluronidázy)

b

a

Obrázok 8 Test hyaluronidázy a) negatívny výsledok, b) pozitívny výsledok

Test fermentácie glukózy:

Gramnegatívne tyčinkovité izoláty nedostatočne identifikované pomocou analýzy MALDI- TOF, čiţe vzorky so skóre menej ako 1,7, a pozitívne na tvorbu oxidázy, boli naočkované na pôdu HAJN a po 24 hodinách pri 37 °C bola na základe zmeny farby z ruţovej na ţlté vyhodnotená fermentácia glukózy (Obrázok 9 Pôda HAJN).

Obrázok 9 Pôda HAJN

4.8.5.2.1 Podrobná identifikácia grampozitívnych a katalázapozitívnych kokov

Na grampozitívnych a katalázapozitívnych kokoch, rastúcich na krvnom agare s 10 % prímesou NaCl, ktoré sa nepodarilo identifikovať pomocou MALDI-TOF analýzy bol prevedený STAPHYtest 24 (ErbaLachema) podľa výrobcom uvedeného postupu.

STAPHYtest 24:

Z čerstvej kultúry bol pripravený zákal 2. stupňa McFarlandovej stupnice za pomoci DensiLAmetru (Česká Republika). Potom po 100 µl suspenzie inokulovaný do konkrétnych testovacích jamiek a podľa návodu určené jamky zakvapnuté sterilným parafínovým olejom (Erba Lachema). Čistota suspenzie bola overená kríţovým rozterom na krvnom agare. Po 24

hodinách bola podľa výrobcom priloţenej farebnej škály vyhodnotená pozitivita alebo negativita jednotlivých biochemických testov. Výsledok bol vyhodnotený pomocou počítačového programu Identifikačný program TNW ProAuto 7.0 (Erba Lachema).

4.8.5.2.2 Podrobná identifikácia gramnegatívnych tyčiniek fermentujúcich glukózu

Izoláty, ktoré boli oxidáza negatívne, fermentovali glukózu a nepodarilo sa ich spoľahlivo identifikovať pomocou MALDI-TOF analýzy, čiţe vzorky so skóre menej ako 1,7, boli kríţovo vyočkované na pôdu MH a bol im prevedený ENTEROtest 24 (ErbaLachema).

ENTEROtest 24:

Bol pripravený zákal 1 McFarlandovej stupnice. Následne bolo po 100 µl suspenzie inokulovaných do mikrotitračných jamiek a podľa návodu potrebné jamky zakvapnuté sterilným parafínovým olejom (Erba Lachema). Čistota suspenzie bola overená kríţovým rozterom na krvnom agare. Po 24 hodinách boli pridané ďalšie určené chemikálie, IND, PHE, VPT I, VPT II (Erba Lachema), podľa postupu výrobcu a po 30 minútach bola pomocou výrobcom priloţenej farebnej škály vyhodnotená pozitivita alebo negativita jednotlivých biochemických testov (Obrázok 10 ENTEROtest). Pomocou počítačového programu Identifikačný program TNW ProAuto 7.0 bol určený konkrétny kmeň.

Obrázok 10 ENTEROtest 24

5 Výsledky

Z pozorovania výskytu pri odchyte sa jedinci Clogmia albipunctata vyskytovali v najväčších mnoţstvách pri kanáli, v ktorom pravdepodobne dochádzalo k ich mnoţeniu. Veľké mnoţstvo sa nachádzalo aj na okolitých stenách, ale len do pomerne nízkej výšky. V pribliţne výške 2. poschodia sa jedinci C. albipunctata vyskytovali naozaj ojedinele v porovnaní s poschodím prvým, kde bol výskyt hojný. Pri kontakte s narušiteľom reagovali aţ v jeho tesnej blízkosti, čo veľmi zjednodušovalo ich chytanie do skúmaviek. Keď po vyrušení odlietali, nikdy neodleteli veľmi ďaleko. V niekoľkých prípadoch si dokonca sadli na skúmavku. Dá sa z toho usudzovať, ţe ako vektor prenosu infekcie môţu pôsobiť veľmi významne, keďţe ich odplašenie je mnohonásobne ťaţšie ako odplašenie obyčajnej muchy a majú tendenciu zotrvať na mieste a sadajú si na všetky povrchy.

Celkovo bolo odchytených 57 jedincov a boli izolované mikroorganizmy z ich povrchu aj z ich vnútorného prostredia.

Na povrchu jedincov C. albipunctata sa nachádzalo rôzne mnoţstvo colony forming units (CFU)). Semikvantitatívne moţno povedať, ţe povrch C. albipunctata bol u 13 jedincov kolonizovaný menej ako 100 CFU. Rozsah počtu CFU bol u 32 jedincov 100-1000. Celkovo 12 jedincov malo na svojom povrchu viac ako 1000 CFU.

Po homogenizovaní sa vo vnútornom prostredí C. albipunctata semikvantitatívne nachádzalo menej ako 100 CFU u 26 odchytených jedincov, 100-1000 CFU bolo zaznamenaných u 19 jedincov. Viac ako 1000 CFU sa nachádzalo u 12 jedincov.

Tabuľka 2 Mnoţstvo jedincov s rôznym rozsahom CFU

Počet jedincov CFU Z povrchu Z vnútra

<100 13 17

100-1000 32 18

>1000 12 12

Pri porovnaní je zrejmé, ţe kolonizácia C. albipunctata na povrchu a vo vnútri je porovnateľná.

Celkovo bolo získaných 712 izolátov. 476 z povrchu a 236 po homogenizácií.

Pomocou MALDI-TOF analýzy metódou priameho prenosu mikroorganizmu sa podarilo identifikovať, čiţe na vzorkách so skóre viac ako 1,7, 472 izolátov. Metódou predĺţeného priameho prenosu mikroorganizmov sa pomocou MALDI-TOF analýzy podarilo identifikovať, čiţe na vzorkách so skóre viac ako 1,7, 16 izolátov. Nespoľahlivo identifikovaných, čiţe vzoriek so skóre menej ako 1,7, bolo 240 izolátov.

Identifikácia MALDI bola okrem farbenia podľa Grama overená aj jednoduchými biochemickými testami ako kataláza, oxidáza, rast na krvnom agare s prímesou 10 % NaCl, hyaluronidáza, fermentácia glukózy.

Práca bola zameraná na sledovanie výskytu stafylokokov kolonizujúcich C. albipunctata. Preto všetky grampozitívne a katalázapozitívne koky, ktoré sa nepodarilo spoľahlivo identifikovať pomocou MALDI-TOF analýzy a rástli na krvnom agare s 10 % prímesou NaCl, boli otestované pomocou biochemickej súpravy STAPHYtest 24 (n = 6). Tieto kmene boli identifikované ako S. gallinarum (n = 1) a Micrococcus sp (n = 5).

Ďalej bola pozornosť venovaná enterobaktériám, preto u všetkých gramnegatívnych tyčiniek, ktoré neboli spoľahlivo identifikované pomocou MALDI-TOF a fermentovali glukózu bol prevedený ENTEROtest (n = 8). Tieto kmene boli identifikované ako Serratia plymuthica (n = 5) a Pantoea agglomerans (n = 3).

Izoláty rovnakého druhy, ktoré boli opakovane izolované z jednej C. albipunctata, z dôvodu vyočkovávania na viacero pôd boli počítané len jedenkrát. Po uvedenej úprave dosiahol počet izolovaných kmeňov hodnoty 572, z toho dobre identifikovaných bolo 346 a 226 izolátov sa pouţitými metódami nepodarilo spoľahlivo identifikovať.

Z povrchu bolo izolovaných celkom 81 druhov zaradených do 50 rodov. Po homogenizácií bolo izolovaných 57 druhov zaradených do 32 rodov.

Tabuľka so všetkými izolovanými kmeňmi na konkrétnych jedincoch sa nachádza v prílohách (Príloha č. 1).

Tabuľka 3 Počty izolátov u jednotlivých druhov mikróbov.

Počet pozitívnych vzorkov. C. albipunctata Druh Celkom (%) Z povrchu Z vnútra Acinetobacter sp. 21 (37 %) 19 (28 %) 12 (21 %) Stenotrophomonas maltophilia 19 (28 %) 14 (25 %) 10 (18 %) Acinetobacter junii 16 (28 %) 11 (20 %) 10 (18 %) Micrococcus luteus 15 (26 %) 13 (23 %) 5 (9 %) Brevibacterium sp. 12 (21 %) 12 (21 %) 2 (4 % ) Comamonas testosteroni 11 (20 %) 7 (12 %) 7 (12 %) Achromobacter xylosoxidans 9 (16 %) 9 (16 %) 0 (0 %) Brevibacterium casei 9 (16 %) 9 (16 %) 2 (4 % ) Staphylococcus warneri 9 (16 %) 5 (9 %) 6 (11 %) Acinetobacter johnsonii 8 (14 %) 5 (9 %) 4 (7 %) Arthrobacter polychromogenes 7 (12 %) 5 (9 %) 2 (4 % ) Ochrobactrum sp. 6 (11 %) 4 (7 %) 2 (4 % ) Aeromonas hydrophila 5 (9 %) 2 (4 % ) 5 (9 %) Amycolatopsis lurida 5 (9 %) 5 (9 %) 1 (2 %) Pseudochrobactrum asaccharolyticum 5 (9 %) 4 (7 %) 1 (2 %) Staphylococcus epidermidis 5 (9 %) 3 (5 %) 3 (5 %) Staphylococcus capitis 5 (9 %) 5 (9 %) 0 (0 %) Acinetobacter lwoffii 4 (7 %) 2 (4 % ) 2 (4 % ) Burkholderia anthina 4 (7 %) 3 (5 %) 1 (2 %) Pandoraea norimbergensis 4 (7 %) 4 (7 %) 0 (0 %) Raoultella ornithinolytica 4 (7 %) 0 (0 %) 4 (7 %) Serratia plymuthica 4 (7 %) 1 (2 %) 3 (5 %) Terrimonas ferruginea 4 (7 %) 4 (7 %) 0 (0 %) Acinetobacter guillouiae 3 (5 %) 1 (2 %) 3 (5 %) Achromobacter spanius 3 (5 %) 3 (5 %) 0 (0 %) Bacillus cereus 3 (5 %) 2 (4 % ) 1 (2 %) Elizabethkingia miricola 3 (5 %) 3 (5 %) 0 (0 %) Gordonia australis 3 (5 %) 1 (2 %) 3 (5 %) Lysinibacillus sphaericus 3 (5 %) 2 (4 % ) 1 (2 %) Microbacterium liquefaciens 3 (5 %) 2 (4 % ) 1 (2 %) Ochrobactrum tritici 3 (5 %) 2 (4 % ) 1 (2 %) Sphingobacterium mizutaii 3 (5 %) 3 (5 %) 0 (0 %) Staphylococcus hominis 3 (5 %) 2 (4 %) 1 (2 %) Tsukamurella paurometabola 3 (5 %) 1 (2 %) 3 (5 %) Acinetobacter haemolyticus 2 (4 % ) 1 (2 %) 1 (2 %) Acinetobacter parvus 2 (4 % ) 0 (0 %) 2 (4 %) Bacillus simplex 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Bacillus thuringiensis 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Candida palmioleophila 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Citrobacter freundii 2 (4 % ) 1 (2 %) 1 (2 %) Delfia acidovorans 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Pokračovanie na ďalšej strane

Počet pozitívnych vzorkov. C. albipunctata Druh Celkom (%) Z povrchu Z vnútra Dietzia maris 2 (4 % ) 1 (2 %) 1 (2 %) Enterococcus casseliflavus 2 (4 % ) 0 (0 %) 2 (4 % ) Latobacillus paracasei 2 (4 % ) 2 (4 % ) 1 (2 %) Leclercia adecarboxylata 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Lysinibacillus fusiformis 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Micrococcus sp. 2 (4 % ) 1 (2 %) 1 (2 %) Miroides odoratimimus 2 (4 % ) 2 (4 % ) 1 (2 %) Nocardia asteroides 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Pantoea agglomerans 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Pseudomonas stutzeri 2 (4 % ) 2 (4 % ) 1 (2 %) Rhodococcus fascians 2 (4 % ) 1 (2 %) 1 (2 %) Serratia fonticola 2 (4 % ) 1 (2 %) 2 (4 % ) Shewanella putrefaciens 2 (4 % ) 1 (2 %) 1 (2 %) Stenotrophomonas acidaminiphila 2 (4 % ) 1 (2 %) 1 (2 %) Stenotrophomonas rhizophila 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Wautersiella falsenii 2 (4 % ) 2 (4 % ) 0 (0 %) Acidovorax temperans 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Acinetobacter tjernbergiae 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Aerococcus viridans 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Aeromonas bestiarum 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Aeromonas eucrenophyla 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Alcaligenes faecalis 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Amycolatopsis keratiniphila 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Bacillus licheniformis 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Bacillus marisflavi 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Bacillus megaterium 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Bacillus mycoides 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Brachybacterium faecium 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Brevibacterium celere 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Brevundimonas diminuta 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Burkholderia cepacia 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Corynebacterium aurimucosum 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Dietzia natronolimnaea 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Empedobacter brevis 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Enterobacter amnigenus 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Enterococcus durans 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Escherichia coli 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Exiguobacterium sp 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Chryseobacterium sp. 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Microbacterium oxidans 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Micrococcus terreus 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Miroides odoratus 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Neisseria flavescens 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Neisseria mucosa 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Pokračovanie na ďalšej strane

Počet pozitívnych vzorkov. C. albipunctata Druh Celkom (%) Z povrchu Z vnútra Pseudomonas putida 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Pseudomonas rhodesiae 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Pseudomonas viridiflava 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Rheinheimera soli 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Rhodococcus erythropolis 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Serratia marcescens 1 (2 %) 1 (2 %) 1 (2 %) Sphingobacterium multivorum 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Sphingobacterium spiritivorum 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Staphylococcus equorum 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Staphylococcus gallinarum 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Staphylococcus xylosus 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Vagococcus fluvialis 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Yersinia enterocolitica 1 (2 %) 1 (2 %) 1 (2 %)

Zastúpenie výskytu jednotlivých bakteriálnych rodov kolonizujúcich C. albipunctata Acinetobacter sp. Stenotrophomonas sp. 7 6 6 7 37 Micrococcus sp. 7 Staphylococcus sp. 10 Brevibacterium sp. 11 21 Comamonas testosteroni Achromobacter sp. 12 19 18 Ochrobactrum sp. Arthrobacter polychromogenes Aeromonas sp. Bacillus sp. Amycolatopsis sp.

Graf 1 Zastúpenie výskytu jednotlivých bakteriálnych rodov kolonizujúcich C. albipunctata Poznámka: Počet kolonizovaných jedincov C. albipunctata (n = )

Zastúpenie výskytu jednotlivých bakteriálnych rodov kolonizujúcich C. albipunctata na povrchu Acinetobacter sp. 2 4 Stenotrophomonas sp. 5 5 6 Micrococcus sp. 34 Staphylococcus sp. 10 Brevibacterium sp. 7 Comamonas testosteroni 17 12 Achromobacter sp. 13 14 Ochrobactrum sp. Arthrobacter polychromogenes Aeromonas sp. Bacillus sp. Amycolatopsis sp.

Graf 2 Zastúpenie výskytu jednotlivých bakteriálnych rodov kolonizujúcich C. albipunctata na povrchu

Poznámka: Počet kolonizovaných jedincov C. albipunctata (n = )

Zastúpenie výskytu jednotlivých bakteriálnych rodov kolonizujúcich C. albipunctata vo vnútri Acinetobacter sp. 1 Stenotrophomonas sp. 2 3 3 6 Micrococcus sp. 0 Staphylococcus sp. 7 37 Brevibacterium sp. 2 Comamonas testosteroni 10 Achromobacter sp. 5 10 Ochrobactrum sp. Arthrobacter polychromogenes Aeromonas sp. Bacillus sp. Amycolatopsis sp.

Graf 3 Zastúpenie výskytu jednotlivých bakteriálnych rodov kolonizujúcich C. albipunctata vo vnútri

Poznámka: Počet kolonizovaných jedincov C. albipunctata (n = )

Pri porovnaní grafov je patrné rozdielne zastúpenie druhov na povrchu jedinca a v jeho vnútornom prostredí.

Z rodu Staphylococcus izolovaných celkom 28 jedincov náleţiacich do 7 druhov. Najväčšie zastúpenie má S. warneri (n = 9). Druhé najväčšie zastúpenie mali druhy S. epidermidis a S. capitis (n = 5). Ţiadny z izolátov nebol identifikovaný ako S. aureus, najvýznamnejší patogén tohto rodu.

Tabuľka 4 Stafylokoky izolované z C. albipunctata

Počet pozitívnych jedincov C. albipunctata Druh Celkom (%) z povrchu z vnptra Staphylococcus warneri 9 (16 %) 5 (9 %) 6 (11 %) Staphylococcus epidermidis 5 (9 %) 3 (5 %) 3 (5 %) Staphylococcus capitis 5 (9 %) 5 (9 %) 0 (0 %) Staphylococcus hominis 3 (5 %) 2 (4 %) 1 (2 %) Staphylococcus equorum 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Staphylococcus gallinarum 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Staphylococcus xylosus 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %)

Zastúpenie rodu Staphylococcus 10 9 Celkom 8 Z povrchu 7 Z vnútra 6 5 4 3 2 1 0 S. warneri S. capitis S. epidermidis S. hominis S. equorum S. gallinarum S. xylosus

Graf 4 Zastúpenie jednotlivých druhov rodu Staphylococus izolovaných z povrchu a po homogenizácií

Poznámka: Počet kolonizovaných jedincov C. albipunctata (n = )

Zastúpenie príslušníkov čeľade Enterobacteriaceae, teda enterobaktérií bolo niţšie (n = 20). Celkom bolo izolovaných 10 druhov. Najväčší počet izolátov náleţal do druhu Raoultella

ornithinolytica a Serratia plymuthica (n = 4). Druhé najčastejšie zastúpenie mali druhy Citrobacter freundii, Lectercia adecarboxylata, Pantoea agglomerans a S. fonticola (n = 2).

Tabuľka 5 Počet izolovaných enterobaktérií z C. albipunctata

Počet pozitívnych jedincov C. albipunctata Druh Celkom (%) z povrchu z vnútra Raoultella ornithinolytica 4 (7 %) 0 (0 %) 4 (7 %) Serratia plymuthica 4 (7 %) 1 (2 %) 3 (5 %) Citrobacter freundii 2 (4 %) 1 (2 %) 1 (2 %) Lectercia adecarboxylata 2 (4 %) 2 (4 %) 0 (0 %) Pantoea agglomerans 2 (4 %) 2 (4 %) 0 (0 %) Serratia fonticola 2 (4 %) 1 (2 %) 2 (4 %) Enterobacter amnigenus 1 (2 %) 1 (2 %) 0 (0 %) Escherichia coli 1 (2 %) 0 (0 %) 1 (2 %) Serratia marcescens 1 (2 %) 1 (2 %) 1 (2 %) Yersinia enterocolitica 1 (2 %) 1 (2 %) 1 (2 %)

Zastúpenie čeľade Enterobacteriaceae

4.5 4 Celkom 3.5 Z povrchu 3 Z vnútra 2.5 2 1.5 1 0.5 0

Graf 5 Zastúpenie jednotlivých druhov čeľade Enterobacteriaceae

Poznámka: Počet kolonizovaných jedincov C. albipunctata (n = )

Pri porovnaní kolonizácie odchytených C. albipunctata vonku a vnútri budovy Mikrobiologického ústavu u Sv. Anny je patrné väčšie mnoţstvo Acinetobacter sp. Aeromonas sp. Bacillus sp. Comamonas testosteroni, Stenotrophomonas maltophilia u jedincov z vonkajšieho prostredia.

U jedincov z vnútorného prostredia Mikrobiologického ústavu u Sv. Anny sa nachádzalo väčšie mnoţstvo Brevibacterium casei a Staphylococcus sp.

Zastúpenie druhov z vonkajšieho prostredia mikrobiologického ústavu.

0 Acinetobacter sp. 7 Aeromonas sp. 26 13 Bacillus sp. Comamonas testosteroni 9 5 6 Stenotrophomonas maltophilia Brevibacterium casei Staphylococcus sp.

Graf 6 Zastúpenie druhov z vonkajšieho prostredia mikrobiologického ústavu

Poznámka: Počet kolonizovaných jedincov C. albipunctata (n = )

Zastúpenie druhov z vnútorného prostredia mikrobiologického ústavu

11 11 Acinetobacter sp. Aeromonas sp. Bacillus sp. Comamonas testosteroni 2 1 9 Stenotrophomonas maltophilia 5 1 Brevibacterium casei Staphylococcus sp.

Graf 7 Zastúpenie druhov z vnútorného prostredia mikrobiologického ústavu

Poznámka: Počet kolonizovaných jedincov C. albipunctata (n = )

Celkovo sa nepodarilo identifikovať 226 izolátov. Zastúpenie jednotlivých skupín mikroorganizmov je uvedené v tabuľke č. Tabuľka 6 Zastúpenie neidentifikovaných izolátov. Tieto izoláty budú identifikované v rámci ďalšej práce. Tieţ bude z izolovaných významných nozokomiálnych patogénov sledovaná rezistencia k antibiotikám. Podobne budú v ďalšej práci identifikované vláknité mikromycéty, ktoré boli izolované z 27 jedincov.

Tabuľka 6 Zastúpenie neidentifikovaných izolátov (* izoláty nerastúce v prítomnosti 10% NaCl, ** nefermentujúce glukózu)

Počet izolátov z povrchu Počet izolátov po homogenizácií

Kataláza Kataláza Kataláza Kataláza

pozitívne negatívne pozitívne negatívne

G + kok 5* 1 3* 0

G + tyč 50 25 16 10

G - kok 4 0 3 3

G – tyč** 44 27 26 9

6 Diskusia a záver

Clogmia albipunctata je invazívny druh koutule, ktorá sa do nášho prostredia mohla dostať vplyvom globálneho otepľovania. Bola zaznamenaná na 9 miestach v Brne (Šuláková et al. 2014). Fakultná nemocnica u Sv. Anny je ďalšou brnenskou lokalitou kde bol výskyt C. albipunctata preukázaný.

Podľa pozorovania správania môţe C. albipunctata dochádzať do väčšieho kontaktu s pacientom, ako iný druh hmyzu, takţe môţe byť významnejším vektorom prenosu. Vzhľadom k biológií tohto druhu môţe v nemocnici ľahko prichádzať ku styku C. albipunctata s nozokomiálnymi patogénmi, najčastejšie v odpadoch a tento vektor sa tak stáva potenciálnou hrozbou pre pacientov.

V porovnaní s rovnakým výskumom v Nemecku autormi Faulde a Spiesberger (2013) je spektrum izolovaných mikroorganizmov veľmi podobné. Rozdielne je však hlavne mnoţstvo kolonizovaných jedincov jednotlivými kmeňmi. Zatiaľ čo jednotlivých nemocniciach v Nemecku prevládal Bacillus sp. (32-62,1 %) u Sv. Anny boli najčastejšie izolované baktérie rodu Acinetobacter sp. (65 %). (Faulde a Spiesberger 2013)

Autormi Faulde a Spiesberger (2013) bol v jednotlivých nemocniciach v Nemecku u jedincov C. albipunctata najčastejšie izolovaný rod Bacillus sp. (0-62,1 %), u Sv. Anny bol tento rod izolovaný u 11 % jedincov. Druhým najčastejším druhom v jednotlivých nemeckých nemocniciach je Staphylococcus sp. (4-25 %), zatiaľ čo u Sv. Anny bol izolovaný u 32 % jedincov C. albipunctata. Stenotrophomonas maltophilia sa autorom Faulde a Spiesberger podarilo identifikovať u 0-10 % jedincov v závislosti na nemocnici, zatiaľ čo u Sv. Anny 33 % jedincov. Posledným vybraným zástupcom je Comamonas testosteroni z jednotlivých nemeckých nemocníc izolovaný u 0-8 % testovaných jedincov C. albipunctata a u Sv. Anny u 20 % odchytených jedincov. (Faulde a Spiesberger 2013)

V Nemecku však odchytené jedince prenášali i ďalšie významné patogény ako Klebsiela pneumoniae a Pseudomonas aeruginosa, ktoré sa u C. albipunctata odchytených v nemocnici Sv Anny nepodarilo preukázať. V predloţenej práci sa ani autorom Faulde a Spiesberger (2013) z Nemecka nepodarilo preukázať prítomnosť takého významného patogéna, ako je Staphylococcus aureus alebo beta-hemolytické streptokoky. (Faulde a Spiesberger 2013).

Zaujímavý bol nález kmeňa Yersinia enterocolitica. Identifikácia tohto kmeňa bola verifikovaná aj pomocou ENTEROtestu napriek skóre nad 1,7 pri testovaní pomocou MALDI-TOF analýzy. Autormi Faulde a Spiesberger nebola Y. enterocolitica zaznamenaná,

avšak zachytili Y. frederiksenii (Faulde a Spiesberger 2013). Y. enterocolitica je povaţovaná za významného patogéna gastrointestinálneho traktu, ktorý zpôsobuje črevné infekcie, bolesť brucha a horúčky. Šírenie fekálne-orálnou cestou je pravdepodobnou príčinou kolonizácie C. albipunctata, keďţe dochádza v kanáloch ku kontaktu s odpadom a fekáliami (Votava, a kol 2003) str. 59. Rizikom je skutočnosť, ţe C. albipunctata by ľahko mohla infikovať jedlo.

Veľké zastúpenie mali ale aj významné nozokomiálne patogény ako rody Acinetobacter sp. 65 %, Stenotrophomonas maltophilia 32 %, Comamonas testosteroni 20 %. Ich rizikovosť spočíva hlavne vo vysokej rezistencií týchto mikróbov k antibiotikám (Šrámová a kol 2013) str. 46-49.

Napriek tomu, ţe neboli izolované ţiadne nozokomiálne patogény zo skupiny Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa a zástupcovia rodu Streptococcus a Klebsiela, je dôvodná obava, ţe v budúcnosti sa tieto kmene budú môcť šíriť aj prostredníctvom C. albipunctata. Zatiaľ je nízke percento výskytu nozokomiálnych patogénov z čeľadi Enterobacteriae ako Raoultella ornithinolytica a Serratia plymuthica, kaţdá izolovaná u 7 % testovaných jedicov alebo Citrobacter freundii, Lectercia adecarboxylata, Pantoea agglomerans, Serratia fonticola, všetky nachádzajúce sa u 4 % jedincov C. albipunctata. Najmenšie zastúpenie mali kmene Yersinia enterocolitica, Enterobacter amnigenus, Serratia marcescens, a Escherichia coli, kaţdá osídľujúca 2 % odchytených jedincov. Kolonizácia C. albipunctata týmito patogénmi ale môţe vzrastať a môţe sa tak C. albipunctata stať nebezpečná pre pacientov. Nízke zastúpenie týchto druhov ukazuje na nízku fekálnu kontamináciu v mieste mnoţenia C. albipunctata. Nejde totiţ o kanalizáciu splaškovú, ale o krytý bývalý mlynský náhon odvádzajúci vodu z rieky Svratky a iné povrchové vody.

C. albipunctata je v nemocničnom prostredí veľkým rizikom aj z dôvodu moţného prenosu nozokomiálnych kmeňov, keďţe k jej pomnoţeniu dochádza v odpadných vodách a kanáloch, kde sa v odpade z nemocničného prostredia môţe nachádzať zvýšené mnoţstvo polyrezistentných kmeňov aj samotných antibiotík. Sanitácia takýchto odpadov je prakticky nemoţná. Je teda predpoklad väčšej miery kolonizácie C. albipunctata týmito rezistentnými kmeňmi, čo je potreba sledovať (Faulde a Spiesberger 2013).

Rizikové u C. albipunctata je aj to, ţe sa jej larvy vyvíjajú priamo v prostredí kanálu a sú schopné odpadnými trubkami a cez sifóny prechádzať priamo do interiéru budov. Tu sa potom môţe ľahko kontaminovať čisté nemocničné prostredie, stravovacie zariadenia, zdravotnícky materiál a aj priamo pacient (Faulde a Spiesberger 2013).

Zatiaľ bola C. albipunctata vo FN u Sv Anny zaznamenaná len v okolí kanálu, kde našla vhodné prostredie na pomnoţenie. Pod ulicou sa nachádza zastrešený náhon rieky Svratka, ktorý poskytuje vlhkosť a pri ňom prechádza potrubie s horúcou parou, ktorá poskytuje teplo.

Jedinci C. albipunctata sa dostávajú tieţ do interiéru Mikrobiologického ústavu jednak z vonkajšieho prostredia a jednak bol zaznamenaný prienik priamo cez odpadovú kanalizáciu po prekonaní sifónu. To by mohlo vysvetliť rozdielne osídlenie jedincov z vonkajšieho prostredia a z interiéru Mikrobiologického ústavu, kde sú jedinci C. albipunctata viac exponovaní baktériám, ktoré sú ovplyvnené dezinfekčnými prostriedkami.

To, ţe nedošlo ku kolonizácií C. albipunctata inými významnými patogénmi naznačuje, ţe sa jedinci C. albipunctata nedostávajú do kontaktu s odpadovou vodou a infikovaným odpadom z klinických oddelení, kde môţeme očakávať väčšie mnoţstvo významných nozokomiálnych patogénov, obvykle spojených s vyššou mierou rezistencie k antibiotikám. Je tu však hrozba, ţe sa C. albipunctata dostane aj na miesta s vyššou koncentráciou rizikových patogénov, kde sa potom ľahko kolonizuje a stane sa vektorom týchto patogénov.

Preto je treba zabezpečiť nebezpečný odpad a kontrolovať miesta moţného výskytu C. albipunctata, prípadne ich sanitovať.

7 Použité symboly a skratky

AMI Ţivný agar s amikacinom (antibiotikum)

CCM Česká zbierka mikroorganizmov

CFU Colony foming units

ENDO Endova pôda

FN Fakultná nemocnica

GSB Glycerol-sérový-bujón

HCCA Kyselina α-kyano-4-hydroxyškoricová

IND Činidlo pre test na indol

KA Krvný agar

KNS Koaguláza negatívne stafylokoky

LF Lekárska fakulta

MALDI-TOF Matrix assisted laser desorption and ionization – time of flight detection

MH Muller – Hinton agar

MRSA Methicilín rezistentný Stapfylococus aureus

MU Masarykova univerzita

NACL Krvný agar s 10 % NaCl

PHE Činidlo deamincie fenylalanínu

SABA Sabouraudov agar

VPT Činidlo pre Voges-Proskauerov test

8 Bibliografia

BASTUG, Aliye, Gul Ruhsar YILMAZ, Bircan KAYAASLAN, Esragul AKINCI a Hurrem BODUR, 2012. Risk factors for mortality in patients with nosocomial Staphylococcus aureus bacteremia. Turk. J. Med. Sci. [online]. 2012, roč. 42, s. 1222–1229. ISSN 1300-0144. Dostupné na: doi:10.3906/sag-1201-24

BEUK, Paul a Thomas PAPE, 2013. Fauna Europaea : Taxon Details [online] [cit. 13. apríl 2015]. Dostupné na: http://www.faunaeur.org/full_results.php?id=141827

BOUMANS, Louis, Jean-yves ZIMMER a François VERHEGGEN, 2009. First records of the ’ bathroom mothmidge ’ Clogmia albipunctata , a conspicuous element of the Belgian fauna that went unnoticed (Diptera : Psychodidae). Phegea [online]. 2009, roč. 37, č. November 2006, s. 153–160. ISSN 07715277. Dostupné na: http://dare.uva.nl/document/2/71517

BRADFORD, Ashley, 2010. Moth Fly #2 - Clogmia albipunctata - BugGuide.Net [online] [cit. 13. apríl 2015]. Dostupné na: http://bugguide.net/node/view/369056

BRUKER DALTONIK GMBH, 2014. Instructions for Use Bruker Matrix HCCA, portioned [online]. [cit. 22. apríl 2015]. Dostupné na: https://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8- PDF-Docs/Separations_MassSpectrometry/CertificatesOfAnalysis/8255344- IFU_255344_Bruker_HCCA_port_en_Rev2.pdf-B_P002051948_.PDF

DORMAN, Dc a Vr BEASLEY, 1991. Neurotoxicology of Pyrethrin and the Pyrethroid Insecticides. Vet. Human Toxicol. [online]. 1991, roč. 33, č. 3, s. 238–243. ISSN 0145-6296. Dostupné na: http://www-ncbi-nlm-nih- gov.ezproxy.muni.cz/pubmed/1713367?report=abstract

EARSS MANAGEMENT TEAM, 2007. EARSS Annual Report 2007 [online] [cit. 14. apríl 2015]. Dostupné na: http://ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS- Net/Documents/2007_EARSS_Annual_Report.pdf

EL-BADRY, Ayman A, Hosni Khairy SALEM a Yusuf Abd EL-AZIZ EDMARDASH, 2014. Human urinary myiasis due to larvae of Clogmia (Telmatoscopus) albipunctata Williston (Diptera: Psychodidae) first report in Egypt. J Vector Borne Dis [online]. 2014, roč. 51, č. 3, s. 247–249. ISSN 0972-9062. Dostupné na: http://www.researchgate.net/profile/Yusuf_Edmardash/publication/265964799_Human_urina ry_myiasis_due_to_larvae_of_Clogmia_(Telmatoscopus)_albipunctata_Williston_(Diptera_P sychodidae)_first_report_in_Egypt/links/5421cce40cf238c6ea678008.pdf

FAULDE, M a M SPIESBERGER, 2013. Role of the moth fly Clogmia albipunctata (Diptera: Psychodinae) as a mechanical vector of bacterial pathogens in German hospitals. The Journal of hospital infection [online]. 2013, roč. 83, č. 1, s. 51–60 [cit. 14. apríl 2015]. ISSN 1532- 2939. Dostupné na: doi:10.1016/j.jhin.2012.09.019

FAVRE, B, S HUGONNET, L CORREA, H SAX, P ROHNER a D PITTET, 2005. Nosocomial bacteremia: Clinical significance of a single blood culture positive for coagulase- negative staphylococci. Infect. Control Hosp. Epidemiol. [online]. 2005, roč. 26, č. 8, s. 697– 702. ISSN 0899-823X. Dostupné na: doi:10.1086/502605

GELARDI, Matteo, Maria Luisa FIORELLA, Eustachio TARASCO, Giovanni PASSALACQUA a Francesco PORCELLI, 2009. Blowing a nose black and blue. Lancet [online]. 2009, roč. 373, č. 9665, s. 780. ISSN 0140-6736. Dostupné na: http://www-ncbi- nlm-nih-gov.ezproxy.muni.cz/pubmed/1713367?report=abstract

GREENWOOD, David, Richard C. B. SLACK, John F. PEUTHERER a A KOL, 1999. Lékařská mikrobiologie. B.m.: Grada Publishing. ISBN 80-7169-365-0.

IBANEZ-BERNAL, Sergio, 2008. New records and descriptions of Mexican moth flies (Diptera : Psychodidae, Psychodinae). Trans. Am. Entomol. Soc. [online]. 2008, roč. 134, č. 1- 2, s. 87–131. ISSN 0002-8320. Dostupné na: doi:10.3157/0002- 8320(2008)134[87:NRADOM]2.0.CO;2

JEŢEK, Jan, Jozef LUKÁŠ, Gunnar Mikalsen KVIFTE a Jozef OBOŇA, 2012. New faunistic records of non-biting moth flies (Diptera: Psychodidae) from the Czech Republic and Slovakia Nové faunistické nálezy koutulí (Diptera:Psychodidae) z České republiky a Slovenska. Klapalekiana [online]. 2012, roč. 48, s. 121–126. Dostupné na: http://www.researchgate.net/profile/Jozef_Obona/publication/261637133_New_faunistic_rec ords_of_non- biting_moth_flies_(Diptera_Psychodidae)_from_the_Czech_Republic_and_Slovakia/links/0f 317534e404459f1e000000.pdf

JIMENEZ-GURI, Eva, Karl R WOTTON, Brenda GAVILAN a Johannes JAEGER, 2014. A Staging Scheme for the Development of the Moth Midge Clogmia albipunctata. PLoS One [online]. 2014, roč. 9, č. 1, s. e84422. ISSN 1932-6203. Dostupné na: doi:10.1371/journal.pone.0084422

KRAMER, Axel, Ingeborg SCHWEBKE a Günter KAMPF, 2006. How long do nosocomial pathogens persist on inanimate surfaces? A systematic review. BMC Infectious Diseases [online]. 2006, roč. 6, č. 1, s. 130 [cit. 12. apríl 2015]. ISSN 1471-2334. Dostupné na: doi:10.1186/1471-2334-6-130

OBOŇA, Jozef a Jan JEŢEK, 2012. RANGE EXPANSION OF THE INVASIVE MOTH MIDGE CLOGMIA ALBIPUNCTATA ( WILLISTON , 1893 ) IN SLOVAKIA ( DIPTERA : PSYCHODIDAE ). Folia faunistica Slovaca [online]. 2012, roč. 17, č. November, s. 387–391. Dostupné na: http://www.biopond.sk/publikacie/ObonaEtJezek2012.pdf

SEHGAL, S S, L C G SIMÖES a A JURAND, 1977. EFFECTS OF CAFFEINE ON GROWTH AND METAMORPHOSIS OF MOTH FLY TELMATOSCOPUS ALBIPUNCTATUS (DIPTERA, PSYCHODIDAE). Entomologia Experimentalis et Applicata [online]. 1977, roč. 21, č. 2, s. 174–181 [cit. 12. apríl 2015]. ISSN 00138703. Dostupné na: doi:10.1111/j.1570-7458.1977.tb02670.x

SCHULTHESS, Bettina, Guido V BLOEMBERG, Reinhard ZBINDEN, Erik C BÖTTGER a Michael HOMBACH, 2014. Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory. Journal of clinical microbiology [online]. 2014, roč. 52, č. 4, s. 1089–97 [cit. 27. apríl 2015]. ISSN 1098-660X. Dostupné na: doi:10.1128/JCM.02399-13

ŠRÁMOVÁ, Helena a KOL, 2013. Nozokomiální nákazy. 3rd vyd. Praha: Maxdorf. ISBN 978-80-7345-286-5.

ŠULÁKOVÁ, Hana, František GREGOR, Jan JEŢEK a Michal TKOČ, 2014. Nová invaze do našich obcí a měst: koutule Clogmia albipunctata a problematika myiáz. Živa [online]. 2014, roč. 1, s. 29–32 [cit. 22. apríl 2015]. Dostupné na: http://ziva.avcr.cz/files/ziva/pdf/nova- invaze-do-nasich-obci-a-mest-koutule-clogmia.pdf

TU, Wu-Chun, Hsin-Cheng CHEN, Ke-Min CHEN, Li-Cheng TANG a Shih-Chan LAI, 2007. Intestinal myiasis caused by larvae of Telmatoscopus albipunctatus in a Taiwanese man. J. Clin. Gastroenterol. [online]. 2007, roč. 41, č. 4, s. 400–402. ISSN 0192-0790. Dostupné na: doi:10.1097/01.mcg.0000212615.66713.ba

VAILLANT, F, 1971a. Psychodidae- Psychodinae. Die Fliegen der Palaearktischen Region. 1971, roč. 49-79, s. 186–194.

VAILLANT, F, 1971b. Psychodidae-Psychodinae. Die Fliegen der Palaearktischen Region. 1971, roč. 1-48, s. 1–186.

VERHEGGEN, F, J MIGNON, J LOUIS, E HAUBRUGE a J VANDERPAS, 2008. Mothflies (Diptera : Psychodidae) in hospitals: A guide to their identification and methods for their control. Acta Clin. Belg. [online]. 2008, roč. 63, č. 4, s. 251–255. ISSN 0001-5512. Dostupné na: http://orbi.ulg.ac.be/bitstream/2268/20819/1/Verheggenetal2008.pdf

VOTAVA, Miroslav, 2005. Lékařská mikrobiologie obecná. 2nd vyd. Brno: Neptun. ISBN 80-86850-00-5.

VOTAVA, Miroslav a KOL, 2003. Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun. ISBN 80-902896-6-5.

VOTAVA, Miroslav a KOL, 2010. Lékařská mikrobiologie vyšetřovací metody. Brno: Neptun. ISBN 978-80-86850-04-8.

9 Zoznamy

9.1 Zoznam použitých obrázkov

Obrázok 1 Clogmia albipunctata (Bradford 2010) ...... 10

Obrázok 2 Dospelá larva (4 štádium) C. albipunctata: (a) zadný pohľad na celú larvu; (b) predný pohľad na análnu oblasť(El-Badry et al. 2014) ...... 11

Obrázok 3 Larva C. albipunctata (Bradford 2010) ...... 11

Obrázok 4 Lokality výskytu C. albipunctata (Šuláková et al. 2014) ...... 12

Obrázok 5 Ţivotný cyklus C. albipunctata(Jimenez-Guri et al. 2014) ...... 13

Obrázok 6 Pomôcky na homogenizovanie ...... 33

Obrázok 7 MALDI doštička ...... 35

Obrázok 8 Test hyaluronidázy a) negatívny výsledok, b) pozitívny výsledok ...... 36

Obrázok 9 Pôda HAJN ...... 37

Obrázok 10 ENTEROtest 24 ...... 39

9.2 Zoznam použitých tabuliek

Tabuľka 1 Zoznam jedincov C. albipunctata ...... 31

Tabuľka 2 Mnoţstvo jedincov s rôznym rozsahom CFU ...... 40

Tabuľka 3 Počty izolátov u jednotlivých druhov mikróbov...... 42

Tabuľka 4 Stafylokoky izolované z C. albipunctata ...... 46

Tabuľka 5 Počet izolovaných enterobaktérií z C. albipunctata ...... 47

Tabuľka 6 Zastúpenie neidentifikovaných izolátov (* izoláty nerastúce v prítomnosti 10% NaCl, ** nefermentujúce glukózu) ...... 49

9.3 Zoznam použitých grafov

Graf 1 Zastúpenie výskytu jednotlivých bakteriálnych rodov kolonizujúcich C. albipunctata ...... 44

Graf 2 Zastúpenie výskytu jednotlivých bakteriálnych rodov kolonizujúcich C. albipunctata na povrchu ...... 45

Graf 3 Zastúpenie výskytu jednotlivých bakteriálnych rodov kolonizujúcich C. albipunctata vo vnútri ...... 45

Graf 4 Zastúpenie jednotlivých druhov rodu Staphylococus izolovaných z povrchu a po homogenizácií ...... 46

Graf 5 Zastúpenie jednotlivých druhov čeľade Enterobacteriaceae ...... 47

Graf 6 Zastúpenie druhov z vonkajšieho prostredia mikrobiologického ústavu...... 48

Graf 7 Zastúpenie druhov z vnútorného prostredia mikrobiologického ústavu ...... 48

9.4 Prílohy

Príloha 1 ...... 59

Príloha 1

Povrchové kmene Vnútorné kmene Číslo Clogmie Izolovaný mikroorganizmus Izolovaný mikroorganizmus 1 Acinetobacter johnsonii Acinetobacter junii Acinetobacter sp Acinetobacter guillouiae Stenotrophomonas maltophilia Serratia plymuthica 2 Brevibacterium casei Brachybacterium faecium 5 Acinetobacter junii Acinetobacter haemolyticus Comamonas testosteroni 6 Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila Lysinibacillus fusiformis Staphylococcus warneri 7 Staphylococcus capitis Microbacterium oxydans Acinetobacter junii 8 Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter sp Microbacterium liquefaciens Comamonas testosteroni Rheinheimera soli Acinetobacter junii Acinetobacter sp Escherichia coli Ochrobactrum sp Raoultella ornithinolytica Acinetobacter guillouiae Citrobacter freundii 9 Staphylococcus warneri Staphylococcus warneri Amycolatopsis lurida Micrococcus luteus Micrococcus luteus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus capitis 10 Nocardia asteroides Staphylococcus warneri Staphylococcus epidermidis 11 Staphylococcus warneri Staphylococcus warneri Staphylococcus epidermidis Micrococcus luteus Amycolatopsis keratiniphila Micrococcus luteus 12 Acinetobacter lwoffii Staphylococcus warneri Pseudomonas putida 13 Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter junii Staphylococcus epidermidis Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter junii Micrococcus luteus Micrococcus luteus Staphylococcus warneri Pandoraea norimbergensis Staphylococcus epidermidis 14 Stenotrophomonas maltophilia Micrococcus luteus Acinetobacter sp Microbacterium liquefaciens Ochrobactrum sp Achromobacter xylosoxidans Pokračovanie na ďalšej strane.

Povrchové kmene Vnútorné kmene Číslo Clogmie Izolovaný mikroorganizmus Izolovaný mikroorganizmus 15 Pandoraea norimbergensis Micrococcus luteus Ochrobactrum tritici Achromobacter xylosoxidans Staphylococcus warneri Ochrobactrum sp 17 Terrimonas ferruginea Stenotrophomonas maltophilia Achromobacter xylosoxidans Staphylococcus warneri Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter junii Staphylococcus hominis 18 Achromobacter spanius Serratia plymuthica Terrimonas ferruginea Raoultella ornithinolytica Stenotrophomonas maltophilia Comamonas testosteroni Comamonas testosteroni 19 Sphingobacterium spiritivorum Stenotrophomonas maltophilia Brevibacterium casei Brevibacterium casei Leclercia adecarboxylata Brevibacterium casei Sphingobacterium mizutaii 20 Amycolatopsis lurida Amycolatopsis lurida Dietzia maris Micrococcus luteus Stenotrophomonas maltophilia 21 Acinetobacter lwoffii Brevibacterium casei Amycolatopsis lurida Micrococcus luteus Brevibacterium casei Staphylococcus capitis 22 Arthrobacter polychromogenes Gordonia australis Brevibacterium casei Staphylococcus capitis Lactobacillus paracasei 23 Acinetobacter sp Arthrobacter polychromogenes Achromobacter xylosoxidans Acinetobacter sp 24 Sphingobacterium mizutaii Lactobacillus paracasei Micrococcus luteus Acinetobacter sp Lactobacillus paracasei Arthrobacter polychromogenes Brevibacterium casei Stenotrophomonas maltophilia 25 Elizabethkingia miricola Acinetobacter lwoffii Alcaligenes faecalis Aeromonas bestiarum Sphingobacterium mizutaii Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter sp Gordonia australis Stenotrophomonas maltophilia Aeromonas eucrenophila Burkholderia anthina Pokračovanie na ďalšej strane.

Povrchové kmene Vnútorné kmene Číslo Clogmie Izolovaný mikroorganizmus Izolovaný mikroorganizmus 26 Gordonia australis Gordonia australis Brevibacterium casei Enterococcus casseliflavus 27 Acinetobacter sp Ochrobactrum sp Aeromonas hydrophila Staphylococcus epidermidis 28 Micrococcus luteus Lysinibacillus sphaericus Pseudomonas stutzeri Comamonas testosteroni Pantoea agglomerans 29 Exiguobacterium sp Pantoea agglomerans Rhodococcus fascians Acinetobacter sp Candida palmioleuphila 30 Elizabethkingia miricola Brevundimonas diminuta Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter sp Acinetobacter sp Ochrobactrum tritici Micrococcus luteus Delftia acidovorans 31 Terrimonas ferruginea Acinetobacter lwoffii Burkholderia anthina Acinetobacter sp 32 Bacillus licheniformis Bacillus simplex Achromobacter xylosoxidans Acinetobacter junii Bacillus cereus Achromobacter spanius Acinetobacter junii 33 Micrococcus terreus Acinetobacter johnsonii Bacillus simplex Acinetobacter guillouiae Arthrobacter polychromogenes Acinetobacter guillouiae Staphylococcus hominis Achromobacter spanius Achromobacter xylosoxidans 34 Bacillus marisflavi Acinetobacter johnsonii Bacillus megaterium Stenotrophomonas maltophilia Micrococcus luteus Aeromonas hydrophila Bacillus thuringiensis Bacillus cereus 35 Micrococcus luteus Acinetobacter parvus Acinetobacter johnsonii Acinetobacter junii Acinetobacter junii Dietzia maris Aeromonas hydrophila Pokračovanie na ďalšej strane.

Povrchové kmene Vnútorné kmene Číslo Clogmie Izolovaný mikroorganizmus Izolovaný mikroorganizmus 36 Acinetobacter junii Rhodococcus fasciens Terrimonas ferruginea Burkholderia anthina Arthrobacter polychromogenes Staphylococcus equorum Aerococcus viridans 37 Acinetobacter tjernbergiae Candida palmioleophila 38 Tsukamurella paurometabola Acinetobacter johnsonii Acinetobacter junii Tsukamurella paurometabola Acinetobacter johnsonii Acinetobacter junii Brevibacterium casei Brevibacterium casei Chryseobacterium sp Pseudomonas stutzeri 39 Acinetobacter sp Acinetobacter sp Comamonas testosteroni Shewanella putrefaciens Staphylococcus gallinarum Acinetobacter johnsonii 40 Shewanella putrefaciens Myroides odoratus Pseudochrobactrum asaccharolyticumYersinia enterocolitica Aeromonas hydrophila Acinetobacter sp Yersinia enterocolitica Aeromonas hydrophila Wautersiella falsenii Raoultella ornithinolytica Acinetobacter sp Comamonas testosteroni 41 Corynebacterium aurimucosum Ochrobactrum sp Stenotrophomonas acidaminiphila Stenotrophomonas maltophilia Stenotrophomonas maltophilia Comamonas testosteroni Acinetobacter sp Acinetobacter sp Citrobacter freundii Acinetobacter haemolyticus 42 Wautersiella falsenii Microbacterium liquefaciens Rhodococcus erythropolis Acinetobacter sp Acinetobacter sp Enterococcus casseliflavus Acinetobacter junii 43 Micrococcus luteus Serratia marcescens Acinetobacter sp Pseudomonas viridiflava Serratia marcescens Acinetobacter sp Comamonas testosteroni Acinetobacter junii Serratia marcescens 44 Acinetobacter johnsonii Staphylococcus hominis Acinetobacter sp Pseudomonas rhodesiae Pandoraea norimbergensis Pokračovanie na ďalšej strane.

Povrchové kmene Vnútorné kmene Číslo Clogmie Izolovaný mikroorganizmus Izolovaný mikroorganizmus 45 Achromobacter xylosoxidans Stenotrophomonas maltophilia Pandoraea norimbergensis Empedobacter brevis Micrococcus luteus acinetobacter sp Arthrobacter polychromogenes Stenotrophomonas maltophilia 46 Enterobacter amnigenus Stenotrophomonas rhizophila 47 Delftia acidovorans Ochrobactrum tritici Stenotrophomonas maltophilia Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia anthina acinetobacter parvus Sphingobacterium multivorum Stenotrophomonas acidaminiphila Elizabethkingia miricola Neisseria mucosa

48 Acinetobacter sp Comamonas testosteroni Vagococcus fluvialis Acinetobacter sp Pseudochrobactrum asaccharolyticumStenotrophomonas maltophilia Comamonas testosteroni Acidovorax temperans Achromobacter xylosoxidans Pseudochrobactrum asaccharolyticum 49 Acinetobacter junii Acinetobacter junii Stenotrophomonas rhizophila Acinetobacter johnsonii 50 Comamonas testosteroni Comamonas testosteroni Ochrobactrum sp Myroides odoratimimus Myroides odoratimimus Acinetobacter sp Lysinibacillus sphaericus Pseudochrobactrum asaccharolyticum Acinetobacter sp Raoultella ornithinolytica Stenotrophomonas maltophilia Achromobacter xylosoxidans Burkolderia cepacia 51 Myroides odoratimimus Micrococcus luteus Comamonas testosteroni Serratia fonticola Bacillus thuringiensis Pseudochrobactrum asaccharolyticum 52 Acinetobacter sp Serratia plymuthica Serratia fonticola Bacillus mycoides Acinetobacter junii Serratia fonticola 53 Serratia plymuthica Enterococcus durans Staphylococcus warneri Pokračuje na ďalšej strane.

Povrchové kmene Vnútorné kmene Číslo Clogmie Izolovaný mikroorganizmus Izolovaný mikroorganizmus 54 Brevibacterium casei Tsukamurella paurometabola Acinetobacter junii Acinetobacter sp 55 Lysinibacillus fusiformis Tsukamurella paurometabola Lysinibacillus sphaericus Neisseria flavescens Amycolatopsis lurida Staphylococcus capitis Dietzia natronolimnaea 56 Brevibacterium casei Staphylococcus xylosus Bacillus cereus 57 Amycolatopsis lurida Acinetobacter junii Arthrobacter polychromogenes Brevibacterium celere