Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Agrarias

Escuela de Agronomía

Efecto nematicida sobre Meloidogyne hapla Chitwood 1949, del tejido foliar de especies arbóreas.

Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al título de Ingeniero Agrónomo

Macarena Paz Subercaseaux Iglesias

Valdivia – Chile

2011

PROFESOR PATROCINANTE:

______

Laura Böhm S.

Ing. Agr.

Instituto de Producción y Sanidad Vegetal

PROFESORES INFORMANTES:

______

Maritza Reyes C.

Ing. Agr. M Sc. Dr. Cs. Ag.

Instituto de Producción y Sanidad Vegetal

______

Miguel Neira C.

Ing. Agr.

Instituto de Producción y Sanidad Vegetal i

INDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN 1

SUMMARY 2

1 INTRODUCCIÓN 3

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5

2.1 Características generales de los nemátodos 5

2.1.1 Distribución del Phylum Nematoda 6

2.1.2 Clasificación 6

2.1.3 Nemátodo del nudo de la raíz Meloidogyne hapla Chitwood, 1949 7

2.1.4 Clasificación taxonómica de M. hapla 8

2.1.5 Biología y ciclo de vida de M. hapla 8

2.2. Relación patógeno hospedero 9

2.3 Efectos y daños de M. hapla en plantas 10

2.4 Control de nemátodos 11

2.4.1 Control biológico 12

2.4.1.1 Uso de plantas antagonistas 13

2.5 Propiedades y características de las especies vegetales en estudio 15 ii

2.5.1 Arrayán (Luma apiculata) 15

2.5.2 Avellano (Gevuina avellana) 16

2.5.3 Matico (Buddleja globosa) 16

2.5.4 Eucalipto (Eucalyptus globulus) 16

2.5. Maitén (Maytenus boaria) 16

2.5.6 Murta o murtilla (Ugni molinae) 17

3 MATERIAL Y MÉTODO 18

3.1 Materiales 18

3.1.1 Material vegetal 18

3.1.2 Material de laboratorio 18

3.1.3 Equipamiento 18

3.1.4 Reactivos 18

3.1.5 Sustrato 18

3.1.6 Inóculo de M. hapla 19

3.2 Método 19

3.2.1 Especies vegetales a evaluar 19

3.2.2 Preparación del tejido foliar 19

3.2.3 Incorporación del tejido foliar de cada especie vegetal al sustrato 19

3.2.4 Obtención de juveniles de M. hapla 20

3.2.5 Transplante e inoculación de plantas de lechuga con propágulos de 20 iii

M. hapla

3.3 Evaluaciones 21

3.3.1 Estimación del efecto de los tratamientos en la capacidad infestiva 21 de M. hapla

3.3.2 Efecto de los tratamientos en el desarrollo de las plantas 22

3.3.3 Diseño Experimental y análisis estadístico 22

4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS 24

4.1 Efecto de la incorporación de tejido foliar al sustrato en la 24 capacidad de infestación de M. hapla

4.1.1 Número y porcentaje de agallas desarrolladas por planta 24

4.1.2 Propágulos formados en masas de huevos adheridas a raíces 27

4.2 Efecto de los tratamientos en parámetros de desarrollo en plantas 31 de lechuga

4.2.1 Desarrollo aéreo de plantas de lechuga 32

4.2.1.1 Efecto de la especie vegetal incorporada al sustrato en el 32 desarrollo aéreo de plantas de lechuga

4.2.1.2 Efecto de la concentración de tejido foliar deshidratado aplicadas al 35 sustrato, en parámetros de desarrollo del sector aéreo de plantas de lechuga

4.2.2 Desarrollo radicular de plantas de lechuga 38

4.2.2.1 Efecto de la incorporación del tejido foliar deshidratado de distintas 38 especies sobre el desarrollo del sector radicular de plantas de lechuga iv

4.2.2.2 Diferencias de las concentraciones de tejido foliar deshidratado 40 aplicadas al sustrato, en parámetros de desarrollo del sector radicular de plantas de lechuga

5 CONCLUSIONES 43

6 BIBLIOGRAFÍA 44

v

INDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1 Distribución de tratamientos del ensayo 20

2 Índices de agallamiento de raíces 22

3 Efecto del tiempo de interacción del tejido vegetal con el sustrato 24 en los índices de agallamiento por Meloidogyne en plantas de lechuga

4 Efecto del tiempo de interacción del tejido vegetal con el sustrato 28 en la formación de propágulos de Meloidogyne en plantas de lechuga

5 Efecto del tiempo de interacción del tejido foliar de especies 32 vegetales con el sustrato, en los parámetros de desarrollo de plantas de lechuga

6 Efecto de las diferentes especies incorporadas al sustrato, para 10 33 días de interacción tejido-sustrato en parámetros de desarrollo del sector aéreo de plantas de lechuga

7 Efecto de la especie incorporada al sustrato, para 20 días de 34 interacción, en parámetros de desarrollo aéreo de plantas de lechuga

8 Efecto de la especie vegetal, para 10 días de interacción tejido- 39 sustrato en parámetros de desarrollo del sector radicular de plantas de lechuga

9 Efecto de la especie vegetal, para 20 días de interacción tejido- 40 vi sustrato en parámetros de desarrollo del sector radicular de plantas de lechuga

vii

INDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Efecto de la especie vegetal incorporada al sustrato en el Índice de 25 agallamiento A (número de agallas) en plantas de lechuga

2 Efecto de la concentración de tejido de especies arbóreas 26 incorporadas al sustrato en el Índice de agallamiento A (número de agallas) en plantas de lechuga

3 Efecto de especies arbóreas incorporadas al sustrato en el Índice de 27 agallamiento B (porcentaje de agallas) en plantas de lechuga

4 Número total de propágulos de M. hapla recuperados desde raíces 29 de lechuga, para 10 días de interacción del tejido foliar deshidratado con el sustrato

5 Propágulos de M. hapla en raíces de plantas de lechuga evaluadas, 30 para 20 días de interacción del tejido foliar deshidratado con el sustrato

6 Efecto de la concentración del tejido vegetal incorporado al sustrato 36 en la materia seca (g), de plantas de lechuga

7 Efecto de la concentración en el número de hojas por planta en 37 lechuga, para ambos tiempos de interacción tejido-sustrato

8 Efecto de la concentración en la altura de plantas de lechuga, para 38 ambos tiempos de interacción tejido-sustrato

9 Efecto de la concentración de tejido incorporado al sustrato en el 41 peso fresco de raíces de lechuga, para ambos tiempos de viii

interacción

10 Efecto de la concentración de tejido incorporado al sustrato en la 42 longitud de raíces de lechuga, para ambos tiempos de interacción 1

RESUMEN

Con el propósito de encontrar alternativas medioambientalmente sustentables para el control de infestaciones de Meloidogyne hapla Chitwood en cultivos, esta investigación planteó como objetivo general, determinar si la incorporación de tejido foliar de Luma apiculata Burret (arrayán), Gevuina avellana Mol (avellano), Eucalyptus globulus Labill (eucalipto), Maytenus boaria Mol. (maitén), Buddleja globosa Hoppe (matico), y Ugni mollinae Turcz (murta), influyen en la infestación del nemátodo. El ensayo se efectuó en macetas conteniendo como sustrato tierra vegetal mezclada con dos concentraciones (1 y 5 % v/v) de tejido foliar seco y triturado de las especies en estudio, dejando interactuar por 10 y 20 días. Posteriormente, se trasplantaron plantas de lechuga (Lactuca sativa L. cv. Reina de mayo) las cuales se inocularon con 2000 huevos y juveniles II de M. hapla. Además, se establecieron macetas inoculadas con el nemátodo, pero sin tejido foliar incorporado a su sustrato (testigo inoculado) y el control absoluto (macetas sin inoculo ni tejido foliar incorporado). Una vez inoculadas, las plantas se mantuvieron en invernadero frío por 60 días. El efecto sobre M. hapla se evaluó determinando el índice de agallamiento en raíces en base a dos escalas, una porcentual y otra numérica, además del número de huevos y juveniles II (propágulos) obtenidos por planta. Los resultados indican que la especie más efectiva en el control del nemátodo fue avellano, mostrando una disminución significativa en el agallamiento radical y en el número de propágulos.

Para determinar el posible efecto de las especies y sus diferentes concentraciones en las plantas, se midieron los parámetros de desarrollo materia seca, número de hojas, altura de la planta, peso fresco de raíces y longitud de raíces, presentándose los mejores resultados a los 10 días de interacción tejido-sustrato.

2

SUMMARY

In order to find environmentally sustainable alternatives to control infestations of Meloidogyne hapla Chitwood in cultures, the general objective of this investigation was to determine whether the leaf tissue of Luma apiculata Burret (myrtle), Gevuina avellana Mol (hazel), Eucalyptus globulus Labill (eucalyptus), Maytenus boaria Mol. (Maitén), Buddleja globosa Hoppe (shades) and Ugni mollinae Turcz (Murtilla) in two concentrations and two periods of tissue-substrate interaction, influence nematode infestation. The trial was conducted in pots containing topsoil as a substrate mixed with two concentrations (1 and 5% v / v) of dry, crushed leaf tissue of the species under study, leaving interact for 10 to 20 days. Subsequently, lettuce (Lactuca sativa L. cv. Reina de Mayo) plants were transplanted and they were inoculated with 2000 eggs and juveniles II of M. hapla. Inoculated pots were also established with the nematode, but not leaf tissue incorporated into the substrate (inoculated control) and the absolute control (uninoculated pots or embedded leaf tissue). Once inoculated, plants were kept in a cold greenhouse for 60 days. The effect on M. hapla was evaluated by determining the root gall index based on two scales, one numeric and other are percentage, plus the number of eggs and juveniles II (propagules) obtained per plant. The results indicate that the species most effective in controlling nematode was chilean hazel, showing a significant decrease in root galls and the number of propagules.

To determine the possible effect of different species and their concentrations in plants development parameters as dry matter, leaf number, plant height, fresh weight of roots and root length, whit the best results at 10 days of tissue-substrate interaction. 3

1 INTRODUCCION

Los nemátodos de las agallas radiculares, como se conoce a las especies del género Meloidogyne, son fitoparásitos que constituyen un problema permanente en la mayoría de las plantas cultivadas, estimándose que su infestación causa aproximadamente un 5 % de pérdidas en la producción de cultivos a nivel mundial.

Meloidogyne daña las raíces de las plantas produciendo agallas y reduciendo su capacidad de absorción de agua y nutrientes del suelo. Además, las heridas provocadas en los tejidos radicales durante el proceso infestivo se convierten en una vía de ingreso para otros organismos patógenos comunes del suelo, como hongos y bacterias que exacerban el daño.

Al tratarse de organismos que parasitan internamente los tejidos, además de ser translúcidos y de pequeño tamaño, pasan normalmente desapercibidos, hasta que las plantas manifiestan el daño en la parte aérea con pérdida de vigor, reducción del tamaño de hojas y brotes, clorosis, marchitamiento en horas de mayor calor, entre otros.

El objetivo de realizar control de nemátodos fitoparásitos es disminuir la densidad de la población existente, de manera que no provoque daño económico importante. La forma tradicional de enfocar este problema en cultivos ha sido por medio de productos químico sintéticos, los cuales son de alto costo, tóxicos y persistentes, además contaminan el agua y el suelo; ello representa un riesgo potencial para los organismos benéficos y al medio ambiente, desequilibrando el ecosistema, ocasionando cambios en la flora y fauna, generando resistencia. Lo anterior, y la mayor exigencia de las regulaciones ambientales para la aplicación de pesticidas químicos, han acentuado la tendencia a buscar y emplear alternativas más sustentables y menos dañinas para el manejo de las plagas, con lo que el control biológico de nemátodos fitoparásitos en Chile ha adquirido importancia.

A nivel mundial se han realizado numerosos estudios tendientes a buscar alternativas de control para nemátodos fitoparásitos, entre ellos el uso de plantas con efecto 4

antagonista, de las cuales algunas presentan altas concentraciones ya sea de aceites aromáticos, como también taninos y fenoles en sus tejidos, los cuales tienen propiedades nematicidas y causan reducciones en las poblaciones de nemátodos.

La abundancia, cercanía y variedad de especies arbustivas nativas y naturalizadas de la zona sur utilizadas en la medicina popular por sus propiedades antiparasitarias las hacen interesantes de evaluar para el control de nemátodos fitoparásitos, lo que lleva a postular como hipótesis para esta investigación que el follaje de especies arbóreas como Luma apiculata Burret (arrayán), Gevuina avellana Mol (avellano), Eucalyptus globulus Labill (eucalipto), Maytenus boaria Mol. (maitén), Buddleja globosa Hoppe (matico), y Ugni mollinae Turcz (murta), presentan actividad nematicida sobre M. hapla.

La presente investigación tuvo como objetivo general:

Evaluar el efecto nematicida del follaje de seis especies arbustivas y arbóreas de la zona sur de Chile.

Los objetivos específicos son:

- Establecer el efecto nematicida del tejido foliar de: Luma apiculata Burret (arrayán), Gevuina avellana Mol (avellano), Eucalyptus globulus Labill (eucalipto), Maytenus boaria Mol. (maitén), Buddleja globosa Hoppe (matico), y Ugni mollinae Turcz (murta), sobre M. hapla.

- Contrastar el efecto de dos tiempos de interacción del tejido foliar deshidratado de las especies en estudio incorporadas al sustrato.

- Evaluar el efecto de la incorporación al sustrato de dos concentraciones de tejido foliar deshidratado de las especies en estudio sobre la infestación de M. hapla en plantas de lechuga.

- Determinar el efecto de los tratamientos en el desarrollo de plantas de lechuga.

5

2 REVISION BIBLIOGRAFICA

2.1 Características generales de los nemátodos

Los nemátodos pertenecen al reino animal, son organismos pluricelulares y a pesar de tener un aspecto vermiforme, taxonómicamente son distintos de los verdaderos gusanos. Presentan tamaño muy variable, dependiendo de su hábitat, siendo las formas marinas, terrestre y fitoparásitas por lo general pequeñas, fluctuando entre unas pocas micras a varios milímetros. Las especies de mayor tamaño se encuentran en los parásitos de animales superiores (AGRIOS, 1996; MAGUNACELAYA y DAGNINO, 1999).

Según DROPKIN (1980), los nemátodos fitoparásitos son organismos tubulares alargados, que se mueven en superficies húmedas y se alimentan de células vivas, usualmente tienen entre 1-2 mm de largo y con algunas excepciones no son visibles a simple vista.

La estructura básica del cuerpo consiste en una pared corporal flexible y en su interior un tubo digestivo compuesto de un esófago y el intestino; las gónadas son tubulares, las que usualmente se ubican en forma paralela al intestino (Hooper y Siddiqi, 1978 citado por BARRIA, 1997).

Los nemátodos fitoparásitos se caracterizan por poseer un estilete protráctil que se ubica en la cavidad bucal. En la sección anterior del cuerpo, formando parte del aparato digestivo se encuentra el esófago, el cual conecta al intestino. Todas las formas adultas presentan un aparato reproductor bien desarrollado (CASTAÑO y DEL RIO, 1997).

De acuerdo a GOVERSE et al. (2000) los nemátodos son parásitos biotrópicos que pueden inducir la rediferenciación de células diferenciadas o no diferenciadas de las plantas en células especializadas para alimentación. Esta rediferenciación incluye la reactivación del ciclo de la célula en células específicas de la planta resultando en células de alimentación que funcionan como sitio de alimentación. 6

GUERENA (2006), señala que al alimentarse, los nemátodos fitoparásitos crean heridas en los tejidos vegetales las cuales facilitan el ingreso de hongos y bacterias patógenas a plantas. Estas infecciones microbianas son a menudo más perjudiciales económicamente, que los efectos directos de la alimentación de nemátodos.

Los nemátodos tienen un mayor impacto en la productividad de los cultivos cuando atacan las raíces de las plantas inmediatamente después de la germinación de la semilla (PLOEG, 2001).

2.1.1 Distribución del Phylum Nematoda. Gracias a su gran adaptabilidad, se pueden encontrar nemátodos en una diversidad de hábitat, siendo la condición más importante para mantener su actividad, el contar con agua en el medio ambiente. Por lo tanto, pueden habitar el suelo, el agua de mar o dulce, sobre y dentro de vegetales y animales, incluso el hombre. Es prácticamente imposible encontrar un suelo, cultivado o no, en que no se encuentren nemátodos (MAGUNACELAYA y DAGNINO, 1999).

Aun cuando estos organismos se encuentran en todas las regiones productoras del mundo, son más agresivos y causan mayores daños en regiones cálidas y templadas y en suelos ligeros o arenosos (AVILA et al., 2008)

Según CHAVES (2002), se establecen en forma pasiva, a través de semillas infectadas, restos vegetales, agua, viento y suelo adherido a las maquinarias y otros implementos agrícolas y, sobre todo, de plantas infestadas.

2.1.2 Clasificación. Todos los nemátodos fitoparásitos pertenecen al Phylum Nematoda. En términos de hábitat, los nemátodos patógenos pueden ser ectoparásitos o endoparásitos. Los ectoparásitos, normalmente no penetran en los tejidos sino que se alimentan únicamente de las células que se localizan cerca de la superficie de la raíz u otros órganos subterráneos; por su parte los endoparásitos penetran los tejidos del hospedante para alimentarse y desarrollar su ciclo biológico (AGRIOS, 1996).

OTT (2003), señala que los nemátodos formadores de agallas, es decir especies del género Meloidogyne, son parásitos obligados y constituyen el principal grupo de nemátodos fitoparásitos de importancia agronómica. Sus más de 50 especies conocidas están ampliamente distribuidas y atacan a casi todas las plantas cultivadas, 7

como algodón, papa, tomate, soja, caña de azúcar, café, entre otras, causando pérdidas considerables en las producciones y afectando la calidad de los productos.

Hussey (1989), citado por BARRIA (1997) indica que los endoparásitos sedentarios, están altamente especializados en su relación de alimentación con el hospedero. Estos nemátodos entran en las raíces como juveniles vermiformes y luego al comenzar a alimentarse, sus cuerpos comienzan a engrosar y van quedando inmóviles dentro de ellas.

Según AGRIOS (1996), los nemátodos del nudo de la raíz, dañan a las plantas al debilitar las puntas de las raíz y al inhibir su desarrollo o estimular una formación radical excesiva, pero principalmente al inducir la formación de hinchamientos en las raíces, las cuales no sólo privan a las plantas de sus nutrientes sino también deforman y disminuyen el valor de muchas raíces de los cultivos.

2.1.3 Nemátodo del nudo de la raíz Meloidogyne hapla Chitwood, 1949. Los nemátodos del género Meloidogyne son endoparásitos sedentarios, causan agallas visibles en las raíces y disminución del desarrollo, sus plantas hospederas, incluyen en su mayoría hortalizas, cereales y algunos árboles. Las agallas inducidas por Meloidogyne son extremadamente variables en su tamaño, lo cual dependerá de la relación hospedero-parásito. Ya que, las agallas se pueden ver sin necesidad de un microscopio, son la enfermedad más ampliamente conocida en la planta (DROPKIN, 1980).

M. hapla posee un amplio rango de hospederos que alcanza más de 500 diversas especies. Recientemente se han hecho estudios que han documentado el incremento de las apariciones y daños de este nemátodo en cultivos de vegetales establecidos en suelos orgánicos (WIDMER y ABAWI, 2000)

Los sistemas radicales de lechugas en suelos de New York (USA), se vieron afectados severamente por la infestación de este nemátodo, al incapacitarlas de proveer con suficiente agua y nutrientes a la planta para su normal desarrollo, como resultado, al momento de la cosecha, las lechugas tuvieron un tamaño pequeño que imposibilitó su comercio (VIAENE Y ABAWI, 1998). 8

Los nemátodos formadores de agallas como M. hapla, lesionan los tejidos de las plantas. Las agallas bloquean el paso del agua y nutrientes, reduciendo el crecimiento y dañando la producción de fruta, causando amarillamiento y moteado de las hojas, deformando las raíces y granos, haciéndolos susceptibles a agrietarse (YEPSEN, 1984).

2.1.4 Clasificación taxonómica de M. hapla. SOUTHEY (1978), señala que todos los nemátodos fitoparásitos pertenecen al Phylum Nematoda y que la mayoría de los géneros parásitos importantes pertenecen al orden Tylenchida.

Phylum: Nematoda

Clase: Secernentea

Orden: Tylenchida

Suborden: Tylenchina

Superfamilia: Heteroderoidea

Familia: Meloidogynidae

Subfamilia: Meloidogyninae

Género: Meloidogyne

Especie: Meloidogyne hapla

2.1.5 Biología y ciclo de vida de M. hapla. El ciclo de vida se inicia con los huevos, que son depositados por la hembra en una matriz gelatinosa, la que es secretada por seis glándulas ubicadas alrededor del poro anal. En esta masa gelatinosa una hembra puede llegar a depositar más de 500 huevos, pudiendo alcanzar un tamaño superior al cuerpo de la hembra (ORION et al., 1994).

Los huevos son depositados en forma indiferenciada y de su desarrollo embrionario, que puede durar entre 8-20 días dependiendo de la temperatura, resulta la formación de una larva o juvenil de primer estado (INSERRA et al., 1983).

La primera muda ocurre en el interior del huevo formándose el juvenil II el cual eclosa y se mueve en la solución del suelo en busca de una raíz para alimentarse, guiado por 9

los exudados de las plantas. Este juvenil II, que corresponde al único estado infectivo, penetra normalmente en el sector apical de las raíces migrando intercelularmente a través del tejido cortical, hacia la región de la diferenciación celular, para finalmente establecerse con su cabeza insertada en la periferia de los tejidos vasculares, mientras que su cuerpo queda en la región cortical paralelo al eje de la raíz. Las primeras punciones del estilete son acompañadas por secreciones de las glándulas esofágicas que causan una alteración en el desarrollo de las células afectadas, las cuales incrementan en tamaño, llevando a la formación de las “células gigantes” o nutridoras de sincitio, las que además de dividirse en forma acelerada no forman paredes celulares, aumentan su núcleo y sufren cambios protoplasmáticos. Al mismo tiempo una intensa multiplicación celular (hiperplasia), causa el aumento de las raíces formando las agallas (HUSSEY y JANSSEN, 2002; CAILLAUD et al., 2008).

La duración del ciclo es muy variable para cada especie de Meloidogyne, dependiendo principalmente de la temperatura (generalmente 25 días a 27ºC), también la susceptibilidad de la planta hospedera a las condiciones químicas y físicas del suelo (OTT, 2003).

El macho es un endoparásito sedentario solamente durante su desarrollo larvario, porque una vez alcanzado el juvenil IV abandonan la cutícula larvaria y la raíz en forma de verme delgado, siendo sus hábitos de aquí en adelante desconocidos. Por su parte, las hembras son sedentarias toda su vida, continuando con su desarrollo en el interior de las raíces adoptando una forma cada vez más globosa y depositando huevos en una masa gelatinosa que los mantiene reunidos (RODRIGUEZ et al., 1997).

2.2 Relación patógeno hospedero

Según MAGUNACELAYA y DAGNINO (1999), el primer carácter que destaca de Meloidogyne, es el amplio espectro de hospederos que puede parasitar, de los cuales pocos han sido investigados. A veces algunos exudados radiculares estimulan el desarrollo de los huevos de Meloidogyne. Se diseminan en forma pasiva, a través de restos vegetales, agua, viento, suelo adherido a las maquinarias y otros implementos agrícolas y, sobre todo, de plántulas infestadas (CHAVES, 2002).

HOFMAN y GRUNDLER (2007), señalan que algunos reguladores del crecimiento de las plantas están implicados en el desarrollo de las células gigantes cuya función es 10

servir de fuente alimenticia al nemátodo y en la formación de agallas. Las auxinas promueven el crecimiento celular y las citoquininas promueven la división celular, aumentando en tamaño y sufriendo sucesivas divisiones sin alcanzar a formar paredes celulares.

Según FERRIS et al. (1982), el número de juveniles que logra establecer un sitio de alimentación en la raíz se relaciona directamente con la susceptibilidad del hospedero y la competencia intraespecífica que ocurre en el momento.

2.3 Efectos y daños de M. hapla en plantas

Los efectos de la infección de Meloidogyne spp. sobre el desarrollo de las plantas son bien conocidos. Por una parte se produce una deformación y reducción radicular. Las raíces de las plantas atacadas presentan agallas típicas, están poco o nada ramificadas y carentes de pelos radiculares. Por otra parte, decrece notablemente la eficiencia en la normal translocación de agua y nutrientes por obstaculización mecánica y como consecuencia ocurren marchiteces frecuentes en épocas de mayor temperatura, aún sin falta de agua en el suelo (RODRIGUEZ et al., 1997).

El daño causado por estos organismos puede ser directo e indirecto; el primero se origina por ruptura de las células de la planta con el estilete del nemátodo, por la disolución de las paredes o por la inducción de cambios fisiológicos en las células como resultado de la inyección de sustancias por el nemátodo a través del estilete. El segundo tipo de daño, el indirecto, surge como consecuencia del daño directo, el cual causa una predisposición de la planta al ataque de otros microorganismos patogénicos como son hongos, bacterias y virus. Estos daños dan origen a la manifestación de síntomas que no son característicos, pero sí indicativos a nivel de campo (SUAREZ y ROSALES, 2008).

MAGUNACELAYA y DAGNINO (1999), señalan que también existe relación entre el número de individuos, la tasa de reproducción y el crecimiento de la planta hospedera, aunque es una situación ecológica compleja.

De acuerdo a TAYLOR y SASSER (1983) y HUSSEY y JANSSEN (2002), los efectos de la infección causada por las especies de Meloidogyne en el crecimiento de las plantas, pueden clasificarse en efectos físicos, como el acortamiento y deformación de 11

las raíces y la disminución de la eficiencia radicular; por otro lado, esta infección trae consigo efectos fisiológicos en la planta como la pérdida de eficiencia radicular o la reducción en crecimiento y rendimiento. Un tercer efecto sería la predisposición a otras enfermedades, debido a que las especies de Meloidogyne hacen más susceptible a las plantas para la infección provocada por hongos y bacterias.

Los efectos de los nemátodos parásitos de plantas sobre los cultivos se subestiman frecuentemente, debido a los síntomas inespecíficos que producen, que suelen confundirse con desordenes nutricionales, estrés hídrico, problemas de fertilidad del suelo, así como con otras infecciones secundarias causadas por hongos y bacterias. No obstante, estimaciones de diversas fuentes sugieren que los nemátodos fitoparásitos reducen la producción agrícola mundial en un 11% aproximadamente (ANDRÉS, 2003; AGRIOS, 1996). Los nemátodos son especialmente problemáticos en condiciones marginales de suelo o irrigación, es decir en suelos muy arenosos o demasiado arcillosos, en perfiles poco profundos, cuando el agua es un factor limitante y cuando las prácticas agrícolas no son las adecuadas (marcos de plantación demasiado altos, monocultivos y rotaciones con varios cultivos susceptibles al mismo nemátodo) (MONTEALEGRE, 2005).

2.4 Control de nemátodos

La mejor estrategia de control de estos organismos es la prevención, ya que una vez que la planta es parasitada, es muy difícil contrarrestar sus daños, principalmente si se hablan de nemátodos endoparásitos, o sea, que penetran a los tejidos (AVILA et al., 2008)

SANCHEZ (2006), menciona que el objetivo de realizar un control de nemátodos fitoparásitos, es disminuir la densidad de población de la plaga existente reduciendo los daños que provocan, de manera que no provoque un perjuicio económico importante.

Según CHITWOOD (2002), los nemátodos fitoparásitos son una de las plagas más difíciles de controlar. Históricamente, el daño que producen en los cultivos ha sido manejado con la utilización de variedades resistentes, rotación de cultivos y otras prácticas culturales, o nematicidas químicos dentro de estos últimos, dos grupos predominan en el suelo: los fumigantes de bajo peso molecular y carbamatos de contacto u organofosfatados. 12

Los nematicidas químicos han jugado un papel importante en tratar de disminuir el impacto de la plaga, no obstante lo cual, se prevee que en un futuro cercano muchos de ellos podrían no estar disponibles, debido a las cada vez más importantes restricciones que existen para su utilización por la alta toxicidad que presentan, lo cual implica un riesgo importante en su aplicación, problemas de residuos y otros aspectos de contaminación del suelo y aguas subterráneas (ABALLAY, 2005).

Cualquier método de control que se utilice, debe apuntar lo más específicamente posible a los nemátodos fitoparásitos, ya que estos se alimentan de los nutrientes de las plantas, reduciendo su productividad y su vigor en general. Mientras que los productos químicos con efecto nematicida afectan a todos los nemátodos, incluyendo loa no fitoparásitos o nemátodos de vida libre, que son parte del ecosistema del suelo y contribuyen con los ciclos del nitrógeno y el fósforo, por ende a su fertilidad. De esta manera no se produzcan cambios drásticos en el ecosistema del suelo (SATOSHI et al., 2008)

2.4.1 Control biológico. El uso de métodos alternativos a la utilización de materiales químicos en el control de nemátodos fitoparásitos ha ido en aumento, ya sea por el elevado costo económico de éstos o por su toxicidad y consecuencias medioambientales de su utilización (OKA et al., 2000).

Métodos de control, como la solarización del suelo, desinfección del material vegetal y tratamientos con inyección de agua caliente, han sido usados en reemplazo de la fumigación con químicos, pero las condiciones climáticas, el tipo de suelos y el contenido de agua del suelo, pueden afectar estos métodos físicos haciéndolos fracasar (NISHI et al., 2000; NICO et al., 2003).

Existe una extensa variedad de organismos en el suelo que son conocidos como depredadores o parásitos de nemátodos fitoparásitos; algunos de estos antagonistas resultan ser efectivos supresores de las poblaciones de nemátodos. Muchos invertebrados del suelo tienen potencial en el control biológico de nemátodos fitoparásitos alimentándose de ellos (MCSORLEY et al., 2008)

De acuerdo a MCSORLEY et al. (2006) y MEYER y ROBERTS (2002), probablemente existe potencial de control biológico en la mayor parte de los suelos, porque en éstos existe una comunidad compleja de organismos que pueden alimentarse o parasitar a 13

nemátodos fitoparásitos; ello hace muy probable que la supresión sea resultado del impacto combinado de múltiples antagonistas. Los autores antes señalados, indican que al combinar varios agentes de control biológico, éstos aumentan su potencial para controlar nemátodos fitoparásitos, puesto que al poseer una mayor colonización de la rizósfera, tendrán una expresión más constante de rasgos benéficos como antagonistas a un número más grande de nemátodos fitoparásitos que el que tendría un solo agente de control biológico.

WIDMER y ABAWI (2000), relacionan la aplicación de abono verde al suelo, como una manera de aumentar la actividad microbiológica creando de esta manera una competencia contra los organismos patógenos.

2.4.1.1 Uso de plantas antagonistas. El concepto de alelopatía es clave para el entendimiento de por qué algunas plantas logran modificar o reducir las poblaciones de nemátodos fitoparásitos. Para HALBRENDT (1996), este concepto creado en 1937, se define como: “el efecto dañino de una planta o microorganismo sobre otro al liberar productos (metabolitos secundarios) al medioambiente”.

SANO (2005), define las plantas antagonistas de nemátodos, como aquellas que producen substancias que inhiben el crecimiento o son letales para los nemátodos fitoparásitos que atacan tejidos de plantas y el suelo y reducen las densidades de poblaciones de nemátodos.

Recientemente el uso de plantas antagónicas ó alelopáticas a los nemátodos se ha vuelto una práctica usual. Estas plantas producen sustancias como politienilos, glucosinolatos, glicósidos, alcaloides, lípidos, terpenoides, esteroides, fenoles, triterpenoides, los cuales tienen propiedades nematicidas y causan reducciones en las poblaciones de nemátodos (AVILA et al., 2008).

A juicio de CIUDAD (2000), los metabolitos secundarios, fenólicos, terpénicos y nitrogenados no proteicos (alcaloides), constituyen la parte esencial de los mecanismos de defensa y subsistencia de las plantas. Algunos de ellos pueden utilizarse en agricultura para mejorar la resistencia al ataque de plagas en la elaboración de plaguicidas. 14

CHITWOOD, (2002) indica que se han reportado numerosas especies de plantas, representando varias familias botánicas, que producen compuestos nematicidas, y que en la literatura se las denomina como plantas nematicidas o como plantas antagónicas a los nemátodos. En agricultura es factible usar algunas de estas plantas antagónicas en el manejo de nemátodos, tanto en rotaciones, como en cultivos en cobertera, en entre hileras, enmiendas o abono verde en suelos cultivables (HALBRENDT, 1996; ABALLAY e INSUNZA, 2002).

TSAY et al. (2004), determinaron que algunas plantas pueden ser hospederas a una especie de nemátodo fitoparásito, pero a la vez presentar efecto antagonista hacia la misma u otra especie, cuando se incorporan sus extractos o tejidos al sustrato; el mismo autor ejemplifica lo anterior, para Calendula officinalis que resultó altamente susceptible a Meloidogyne incognita, sin embargo al aplicar tejido de caléndula como enmienda al suelo se redujo la incidencia de este nemátodo. El autor antes señalado, cita a Prakash y Rao (1997), quienes reportaron que Helianthus annus y Xanthium strumarium mostraron el mismo efecto también en el caso de M. incognita.

De acuerdo a BIRCH et al. (1993) y CHITWOOD (2002), las propiedades nematicidas en determinadas especies y variedades se explican por la presencia de compuestos fitoquímicos en sus tejidos y extractos o la formación de éstos como producto de su degradación. CHITWOOD (2002), señala como ejemplos la presencia de algunos politienilos en raíces de Tagetes patula y Tagetes erecta y otras Asteraceas, los que causan un efecto supresivo a la infestación y desarrollo de Pratylenchus penetrans, M. incognita y Meloidogyne javanica; estos autores explican que, sin embargo, la incorporación de tejido foliar de estas especies al sustrato no reduce la infestación de los mismos nemátodos en plantas de tomate, indicando que los compuestos del tipo politienilos en Tagetes muestran un efecto nematicida solamente en sus raíces.

Otros compuestos nematicidas ampliamente conocidos son isotiocianatos y glucosinolatos presentes en especies de los géneros Brassica y Sinapsis (STIRLING y STIRLING, 2003). CHITWOOD (2002), señala que todas las Brasicas contienen glucosinolatos los cuales son hidrolizados en el suelo formando isotiocianatos que reaccionan con el grupo sulfhídrico de las proteínas. Las propiedades nematicidas y fungicidas de los isotiocianatos son reconocidas (BROWN y MORRA, 1997) ya que 15

estos compuestos son formados también por la degradación de fumigantes químicos como el metam sodio (STIRLING y STIRLING, 2003).

La incorporación de raps (Brassica napus) como abono verde ha mostrado un efecto antagónico hacia Tylenchulus semipenetrans, Pratylenchus neglectus, Xiphinema americanum, Heterodera schachtii y Globodera rostochiensis y algunas especies de Meloidogyne, entre otros nemátodos (BROWN y MORA, 1997; ABALLAY e INSUNZA, 2002; STIRLING y STIRLING, 2003).

Los compuestos liberados por estas plantas tienen un efecto directo sobre los nemátodos fitoparásitos al modificar su comportamiento en relación con la planta hospedera, así como tendrían un efecto indirecto consistente en estimular el crecimiento de la planta, aumentar la tolerancia al ataque, mejorar las reacciones de defensa del vegetal y en algunos casos aumentar el rendimiento en más de 30% (ALLAM et al., 1990; BIRCH et al., 1993).

2.5 Propiedades y características de las especies vegetales en estudio

Una especie vegetal puede contener uno o varios principios activos como, por ejemplo, alcaloides y glucósidos; pero, además, puede contener una diversidad de cada tipo, lo cual hace que cada planta posea muchas propiedades no necesariamente relacionadas entre sí (HOFFMAN et al., 2003).

Según CAMPOS (1998), la conciencia de que los elementos naturales podrían tener ventajas con respecto a elementos sintetizados artificialmente, y la constatación de que muchas plantas usadas en medicina popular tienen principios activos de comprobado efecto, ha volcado a un creciente número de personas a interesarse en esta área.

Las especies evaluadas en el ensayo corresponden a: arrayán, maitén, avellano, matico, eucalipto y murta. Existen pocos antecedentes en la literatura que indiquen claramente la composición química del follaje de éstas, destacando los trabajos de diversos autores que describen algunas de las características, utilización y propiedades químicas que poseen.

2.5.1 Arrayán (Luma apiculata). Familia Myrtaceae. Generalmente se presenta como arbusto, sin embargo, puede llegar a crecer como un árbol. Sus hojas son muy aromáticas debido a la producción de aceites esenciales provenientes de glándulas 16

lisígenas, aceites que al volatilizarse producen aromas agradables. Originaria de Chile, presente también en Argentina, se puede encontrar desde la V hasta la XI Región (MONTENEGRO, 2002). La especie ha sido utilizada desde tiempos remotos por sus propiedades estimulantes. Sus principios activos más importantes son taninos, resinas y aceite esencial (su esencia se compone de a-b apineno, cineol y mirtol. También se reporta la presencia de flavonoides, quercitina, camferol, mirecitina (MONTES y WILKOMIRSKY, 1985).

2.5.2 Avellano (Gevuina avellana). Familia Proteaceae. Es un árbol que llega a alcanzar los 20 metros de altura, crece desde la VI hasta la X Región, especialmente en los faldas de ambas cordilleras. Se han descrito usos para combatir diarreas, leucorreas y metrorragias (MONTENEGRO, 2002). También es ampliamente conocido por sus frutos de los cuales se extrae un aceite con propiedades regenerativas de tejidos (TACON, 2002); de sus hojas destaca el uso ornamental.

2.5.3 Matico (Buddleja globosa). Familia Buddlejaceae. Es un arbusto nativo de Chile, crece desde la IV hasta la X Región y puede alcanzar los cuatro metros de altura. A sus hojas se le han atribuido propiedades principalmente como cicatrizante de heridas y úlceras digestivas (RAZMILIC et al., 2004; MONTENEGRO, 2002). Entre los compuestos activos se informa la presencia de flavonoides con actividad diurética, cicatrizante y antiinflamatoria (MUÑOZ et al., 2001).

MENSAH et al. (2001), le atribuyeron efecto antioxidante al extracto de saponinas, flavonoides y otros fenoles presentes en matico.

2.5.4 Eucalipto (Eucalyptus globulus). Familia Myrtaceae. Originario de Australia, corresponde a una especie introducida en Chile central, ampliamente distribuida en la actualidad. A sus hojas se le atribuyen propiedades balsámicas y antisépticas, la infusión de estas es utilizada para fumigar y en la fabricación de cigarrillos. El aceite esencial que se extrae de sus hojas contiene más de 70 % de eucaliptol, además de taninos, resinas, terpenos y alcoholes. La esencia sirve de excipiente a otros medicamentos y además va incorporada en insecticidas (TACON, 2002; MONTENEGRO, 2002).

2.5.5 Maitén (Maytenus boaria). Familia Celastracea. Originario de Chile, presenta amplia distribución entre la IV hasta X Región. El maitén ha sido bastante estudiado 17

desde el punto de vista fitoquímico y farmacológico, de las hojas y tallos se han extraído principios activos tales como daucosterina, lupenona, beta amyrina, ácido oleanoico, dulcitol, beta sitosterol (estos dos serían en parte responsables de actividad biológica antitumoral) y alfa espinasterol, también se han aislados varios terpenos, flavonoides, esteroides y azúcares (HOFFMANN et al., 2003; TACON, 2002).

2.5.6 Murta o murtilla (Ugni molinae). Familia Myrtaceae. NIEMEYER y TEILLIER (2007), indican que es una especie de la ecorregión del bosque templado lluvioso, crece entre la Región del Maule y la Región de Aysén, tanto en en la costa como en el interior, es una especie abundante. Según TACON (2002), las hojas de murta poseen gran cantidad de compuestos polifenólicos, a las cuales se atribuyen propiedades antiinflamatorias y cicatrizantes, por lo cual están siendo utilizados en la industria cosmética.

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3 MATERIAL Y METODO

3.1 Materiales

A continuación se describe el material utilizado en la investigación y posteriormente se presenta la metodología aplicada.

3.1.1 Material vegetal. En el ensayo se utilizó tejido foliar de Luma apiculata (arrayán), Gevuina avellana (avellano), Eucalyptus globulus (eucalipto), Maytenus boaria (maitén), Buddleja globosa (matico) y Ugni mollinae Moll (murta), además de semillas de lechuga cv. Reina de Mayo.

3.1.2 Material de laboratorio. Durante la investigación se utilizaron: bandejas, fuentes y jarros plásticos de distinto tamaño, cubreobjetos, frascos de vidrio, macetas de plumavit de 200 mL de volumen, pala manual, pipetas, placas Petri, portaobjetos, probetas, reglas, rejillas porta tubos, tamices de bronce de diferente graduación, tijeras, tubos de ensayo, vasos de precipitado, También material fungible como: bolsas de papel, etiquetas, cinta de papel engomada, lápices marcadores, toalla Nova MR.

3.1.3 Equipamiento. Durante el ensayo fueron utilizados horno, juguera, lupa estereoscópica, micropipetas, microscopio, molinillo eléctrico y refrigerador.

3.1.4 Reactivos. El único producto químico utilizado fue hipoclorito de sodio (Clorox MR 5,0 %).

3.1.5 Sustrato. Se utilizó como sustrato una mezcla de suelo orgánico y arena de río, en proporción volumétrica de 2:1; el suelo orgánico se obtuvo una pila de compostaje ubicada en la Estación Experimental Santa Rosa. En este sustrato se realizaron los almácigos y luego anterior al establecimiento de los tratamientos se le incorporó el tejido foliar de cada especie vegetal en estudio (punto 3.1.1).

La tierra vegetal fue analizada previa a su utilización para descartar la presencia de nemátodos fitoparásitos en ésta. 19

3.1.6 Inóculo de M. hapla. Se utilizó como inóculo huevos y juveniles II de Meloidogyne hapla, extraídos de tubérculos de papa infestados, el que fue identificado a través de cortes perineales de hembras grávidas extraídas de los tubérculos.

3.2 Método

A continuación se describe el procedimiento llevado a cabo al realizar este ensayo.

3.2.1 Especies vegetales a evaluar. El tejido foliar de las especies evaluadas (punto 3.1.1) se colectó durante el mes de septiembre, desde árboles establecidos en el Arboretum de la Universidad Austral de Chile, ubicado en el sector norte de la Isla Teja en Valdivia. De cada especie se cortaron brotes del sector medio de las plantas, tomando solamente aquellos que presentaban hojas completamente expandidas.

3.2.2 Preparación del tejido foliar. Las hojas de cada especie se dejaron secar sobre bandejas a temperatura ambiente por varias semanas; posteriormente fueron molidas (partículas de menos de 2 mm) y almacenadas e identificadas en frascos de vidrio, en oscuridad, hasta su utilización.

3.2.3 Incorporación del tejido foliar de cada especie vegetal al sustrato. El sustrato se distribuyó en macetas de 200 mL de capacidad, a las cuales se incorporó, de acuerdo a cada tratamiento, el tejido foliar seco previamente molido de las especies en estudio, es decir 1 y 5 %. La mezcla de sustrato más tejido foliar se homogenizó usando una fuente plástica antes de llenar las macetas. Una vez llenas éstas se dejaron reposar, para interactuar durante dos tiempos 10 y 20 días. Transcurrido cada período de interacción en cada maceta se transplantó una planta de lechuga las que se inocularon con huevos y juveniles del nemátodo (punto 3.2.5)

Los tratamientos evaluados fueron 42: dos concentraciones de tejido foliar seco de seis especies vegetales (1% y 5%), dos tiempos de interacción entre el tejido foliar y el sustrato (10 y 20 días), más un testigo inoculado (inoculado, pero 0% de tejido foliar) y un control absoluto (sin inoculo ni tejido foliar).

Los tratamientos de tiempo (10 y 20 días) se hicieron en paralelo haciendo coincidir las fechas de tal forma que uno partió 10 días antes.

Cada tratamiento contempló cinco repeticiones, correspondiendo cada una de ellas a una maceta (Cuadro 1). 20

CUADRO 1 Distribución de tratamientos del ensayo.

Especies 10 días 20 días Control Repeticiones

0% 1% 5% 0% 1% 5% Absoluto

Avellano + + + + + + - 5

Arrayán + + + + + + - 5

Eucalipto + + + + + + - 5

Maitén + + + + + + - 5

Matico + + + + + + - 5

Murta + + + + + + - 5

* símbolo + incluye inoculación con Meloidogyne hapla. * símbolo – excluye inoculación e incorporación de tejido foliar. 3.2.4 Obtención de juveniles de M. hapla. La obtención del inóculo se realizó a través del método de HUSSEY y BARKER (1973). Para ello, a los tubérculos de papa se les realizó pequeños cortes superficiales, en los lugares en donde habían protuberancias (agallas, producto de la infestación de M. hapla), los que se dispusieron en una juguera agregando suficiente solución de hipoclorito de sodio al 1% hasta cubrir; esto se procesó a velocidad media durante tres minutos. Luego, el contenido del vaso se vertió sobre un set de tamices 150, 53 y 25 µ de abertura de poros, dispuestos uno sobre el otro desde el más abierto arriba al más cerrado abajo, lavando con agua corriente a presión y recuperando con una pisceta el residuo del tamiz más fino en un vaso de precipitado. La suspensión obtenida en este último contenedor se aforó a un volumen conocido de agua y de esta suspensión previamente homogenizada, se tomó una alícuota de 0,5 mL, la que se depositó en un portaobjeto para realizar el recuento de huevos y juveniles al microscopio (dos a tres veces).

3.2.5 Transplante e inoculación de plantas de lechuga con propágulos de M. hapla. Transcurridos los 10 y 20 días, a cada tratamiento y repetición se trasplantó enlas macetas de 200 mL de capacidad, una planta de lechuga por maceta. A esta se le incorporó con micropipeta el inóculo de M. hapla (10 huevos y juveniles II / mL sustrato). 21

Las macetas fueron llevadas a invernadero durante 60 días, de tal forma de asegurar el cumplimiento de a lo menos un ciclo de vida del nemátodo.

3.3 Evaluaciones

Transcurridos 60 días desde el transplante e inoculación se levantó el ensayo, evaluando parámetros de desarrollo de las plantas y el nivel de infestación de M. hapla

3.3.1 Estimación del efecto de los tratamientos en la capacidad infestiva de M. hapla. Esto se evaluó en el sistema radical de las plantas de lechuga, registrando el Índice de agallamiento y el número de propágulos (huevos y juveniles) formados en las masas de huevo adheridas a las raíces.

En primer lugar se separaron cuidadosamente las plantas y especialmente las raíces del suelo; estas últimas se lavaron, moviéndolas suavemente dentro de un frasco de plástico para extraer la tierra adherida, luego se absorbió el exceso de agua con un papel absorvente para así revisarlas directamente bajo lupa, estimando el número de agallas desarrolladas, tomando como referencia los índices de agallamiento adaptados de TAYLOR y SASSER (1978) y de HUSSEY y JANSSEN (2002), descritos en el Cuadro 2.

Para estimar el número de huevos y juveniles formados, las raíces de cada repetición y tratamiento se procesaron por separado siguiendo el método de HUSSEY y BARKER (1973), mencionado en el punto 3.2.4. Para ello, el sistema radical de cada planta se cortó en trozos de aproximadamente 1 - 2 cm, depositándolos en un frasco de vidrio al que se incorporó una solución de hipoclorito de sodio al 1% y, una vez tapado, se agitó vigorosamente por alrededor de tres minuto. El contenido del frasco se lavó profusamente sobre tamices (siguiendo la metodología expuesta en el punto 3.2.4 de obtención de inóculo). La suspensión obtenida se recuperó en un tubo de ensayo de 200 mL el cual se llevó a refrigeración por 24 horas para permitir la decantación de los propágulos presentes. Posteriormente a través de sifonación se eliminó el agua contenida sobre los 10 mL de base de cada tubo y de este remanente se tomó una alícuota de 0,5 mL la que, depositada sobre un portaobjetos, se revisó directamente bajo microscopio contabilizando los huevos y juveniles. El recuento de 0,5 mL se multiplicó por 20 para así tener la estimación del número total de propágulos por sistema radical. 22

CUADRO 2 Índices de agallamiento de raíces.

Nivel A* (número) B (porcentaje)

0 Sin agallas sin agallas

1 1-2 agallas 0-25% de las raíces agalladas

2 3-10 agallas ≤ 25% de las raíces agalladas

3 11-30 agallas 25-50% de las raíces agalladas

4 31-100 agallas 51-75% de las raíces agalladas

5 más de 100 agallas > 75% de las raíces con agallas

FUENTE: * adaptado de (A) TAYLOR y SASSER (1978) escala numérica y (B) HUSSEY y JANSSEN (2002) escala porcentual. 3.3.2 Efecto de los tratamientos en el desarrollo de las plantas. Inmediatamente levantado el ensayo se registraron parámetros de desarrollo de las plantas, como altura, número de hojas, materia seca del tejido aéreo. En el caso de raíces se evaluó el peso fresco (éstas fueron utilizadas para la extracción de propágulos por lo cual no fue posible evaluar peso seco) y longitud de raíces.

3.3.3 Diseño experimental y análisis estadístico. El diseño experimental que se utilizó para este ensayo fue completamente al azar, con tratamientos en arreglo factorial 6x2x2+2, con cinco repeticiones (Cuadro 1).

Una vez obtenidos los datos se procedió a comprobar si estos cumplían con los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas, que exige este tipo de análisis. En el caso de los datos que no poseían una distribución normal, los análisis aplicados correspondieron a estadística no paramétrica y se usó el test de Kruskal Wallis en los índices de agallamiento y propágulos. En el caso de la comprobación de diferencias entre tiempos, se utilizó el test de Mann Whitney y luego para los factores especies y concentraciones se usó el test Varianzas ANOVA de Una Vía. El test de comparación de medias usado fue Tukey HSD.

Todos los análisis y test mencionados anteriormente, fueron realizados mediante el programa computacional Statistica 7.0. 23

En el análisis estadístico de los índices (número y porcentaje de agallas), no se tomaron en cuenta los resultados del control absoluto (planta sin inóculo y sin tejido foliar), porque al no haber sido inoculados, no presentaron agallas (índice 0).

24

4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1 Efecto de la incorporación de tejido foliar al sustrato en la capacidad de infestación de M. hapla. Ésta se evaluó por medio de dos índices de agallamiento radical, denominados para efectos de este ensayo, como índices “A” y “B” y posteriormente al número de propágulos formados en raíces.

4.1.1 Número y porcentaje de agallas desarrolladas por planta. Al no presentarse diferencias estadísticas entre los tiempos de interacción del tejido vegetal con el sustrato para ninguno de los dos índices (Índice A; Z = 1,434; p =0,1515 / Índice B; Z=- 0,104; p=0,9171) (CUADRO 3) se tomaron los 10 días de interacción para la demostración de los resultados

CUADRO 3 Efecto del tiempo de interacción del tejido vegetal con el sustrato en los índices de agallamiento por Meloidogyne en plantas de lechuga.

Variable 10 Días 20 Días

promedio DS promedio DS

Índice A (nº agallas) 2,34 ± 0,86 a 2,17 ± 0,85 a

Índice B (% agallas) 1,78 ± 0,79 a 1,78 ± 0,71 a

* Letras distintas en la misma fila para cada índice, indican diferencias entre los tiempos de interacción entre el tejido foliar deshidratado y el sustrato, según Mann Whitney (p< 0.05). En relación al índice A, que mide el número de agallas desarrolladas por planta, el factor especie fue relevante (H (6,90)=16,49; p=0,0113), tal como se ve en la Figura 1, destacando avellano como la más eficiente con respecto al testigo, pero sin diferencias significativas respecto a las demás especies.

25

FIGURA 1 Efecto de la especie vegetal incorporada al sustrato en el Índice de agallamiento A (número de agallas) en plantas de lechuga. Letras distintas sobre las columnas indican diferencias entre las especies según Kruskal Wallis (p< 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. De acuerdo a SEPÚLVEDA (2003), cuando interesa evaluar el efecto nematicida de la incorporación de especies vegetales, el número de agallas formadas en plantas es un mejor indicador que el peso total de plantas; el mismo autor indica que el recuento de agallas radicales presenta cierta dificultad, pues miden aproximadamente 1-2 mm y a veces se sobreponen, tendiendo además a concentrarse en las raíces tiernas próximas a la zona del cuello.

El factor concentración de tejido foliar deshidratado de especies incorporado al sustrato, tuvo efecto (H(2,90)=7,34; p=0,026), tal como se aprecia en la Figura 2, donde el 5% de concentración, presentó mejor acción depresora del agallamiento radicular, en relación al testigo. 26

FIGURA 2 Efecto de la concentración de tejido de especies arbóreas incorporadas al sustrato en el Índice de agallamiento A (número de agallas) en plantas de lechuga. Letras distintas sobre las columnas indican diferencias entre las concentraciones según Kruskal Wallis (p< 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. En una ensayo similar BÖHM et al. (2009), sostienen que el tejido foliar de avellano incorporado al sustrato reduce el número y porcentaje de agallas. Este mismo ensayo muestra que en la mayoría de las especies evaluadas la concentración de 5% obtuvo el mejor efecto en los índices, tal como se ve en este ensayo.

PANDEY (2000), usando otras enmiendas supone que el grado de disminución en la densidad de la población de M. incognita puede ser atribuible a un efecto tóxico de los materiales orgánicos utilizados o a una interferencia química de éstos afectando la susceptibilidad de la planta hacia el nemátodo. Se ha encontrado que los compuestos volátiles presentes en algunas plantas, especialmente sus aceites esenciales, poseen actividad antimicrobial e insecticida, sin embargo, sólo algunos aceites esenciales y sus compuestos han sido evaluados por sus propiedades nematicidas (OKA et al., 2001; IBRAHIM et al., 2006).

Para el índice B, que estima el porcentaje de agallas desarrolladas en la planta (a diferencia del índice A que mide número de agallas por planta) tampoco hubo diferencias en el tiempo de interacción (Cuadro 3), pero sí en el factor especie (Figura 3), donde nuevamente destaca avellano, la cual mostró diferencias con respecto a 27

eucalipto, matico y el testigo, pero no con las restantes especies (H(6,90)=23,19; p=0,0007).

En este caso el factor concentración no fue relevante (H(2,90)=1,06; p= 0,6), puesto que no presentó diferencias.

FIGURA 3 Efecto de especies arbóreas incorporadas al sustrato en el Índice de agallamiento B (porcentaje de agallas) en plantas de lechuga. Letras distintas sobre las columnas indican diferencias entre las especies según Kruskal Wallis (p< 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. 4.1.2 Propágulos formados en masas de huevos adheridas a raíces. En el análisis de los propágulos (huevos + juveniles II) extraídos desde las masas de huevos desarrollados en raíces, el factor tiempo de interacción del tejido foliar deshidratado con el sustrato presentó diferencias significativas (Z=5,052; p=0,0000), como se aprecia en el Cuadro 4. En este caso los 20 días de interacción tejido-sustrato, inhibió en mayor proporción la formación de propágulos, por lo cual los resultados se presentarán por separado.

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Cuadro 4 Efecto del tiempo de interacción del tejido vegetal con el sustrato en la formación de propágulos de Meloidogyne en plantas de lechuga.

Variable 10 Días 20 Días

Número de propágulos formados en raíces promedio DS promedio DS

(huevos + juveniles II) 758,44 ±1548,07 a 117,33 ±130,83 b

Letras distintas indican diferencias entre tiempos de interacción tejido – sustrato según Mann Whitney (p < 0.05). Según STARR et al. (1996), la cuantificación de propágulos del nemátodo presente en las raíces es fundamental para estimar el nivel de infestación de Meloidogyne en un cultivo. En el caso de Meloidogyne los propágulos corresponden a huevos y juveniles II los cuales pueden ser utilizados para estimar el nivel reproductivo que logra el nemátodo en las raíces. Las larvas infestivas eclosionan de los huevos formados por una hembra, que los deposita en una matriz gelatinosa adherida a la parte posterior de su cuerpo asomando de las agallas formadas en las raíces (SIDDIQUI, 2003).

El procesamiento de raíces con hipoclorito de sodio, como se realizó en este ensayo, solamente permite estimar el número de propágulos formados, ya que como muestran MORTIZ et al. (2008), ya a los 6 y 8 días post inoculación los juveniles II, penetran las raíces, en su caso soya, destacando además que un gran número de hembras comenzó a aparecer entre los 22 y 32 días después de la inoculación.

CHARCHAR et al. (2006), efectuaron un ensayo en el que a través de un solo método de extracción de nemátodos, pudieron identificar individuos de todos los estadios de vida de especies de Meloidogyne, lo cual es muy importante desde el punto de vista evaluativo del factor de reproducción de los nemátodos, puesto que al cuantificar sólo huevos y juveniles II, como se hizo en este ensayo, sólo se hace una estimación parcial de la infestación ya que no se consideran los otros estados.

Para los 10 días de interacción tejido-sustrato, la especie evaluada presentó diferencias (H (6,90)=26,56; p=0,0002), mientras que para la concentración esta no existió (H (2,90)=3,3; p=0,19). Avellano destacó con la menor cantidad de propágulo, presentando contraste con respecto a eucalipto y el testigo (Figura 4). 29

FIGURA 4 Número total de propágulos de M. hapla recuperados desde raíces de lechuga, para 10 días de interacción del tejido foliar deshidratado con el sustrato. Letras distintas sobre las columnas indican diferencias entre especies según Kruskal Wallis (p < 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. ADEGBITE (2011), utilizando los extractos de 13 especies vegetales, para el control de M. incognita, encontró que todas ellas, indígenas del suroeste de Nigeria, mostraron una inhibición sobre los propágulos de nemátodos, aun cuando no se refiere a los ingredientes activos involucrados, pero indica que algunas de ellas presentan compuestos polifenólicos tóxicos, alcaloides y saponinas. Algunos tejidos de plantas se han reportado como nematicidas, por sus propiedades nemostáticas, y su incorporación al suelo ha mostrado un decrecimiento en las poblaciones de nemátodos (KHAN, 1990; PANDEY, 1997 y 1990; SASANELLI y ADDABBO, 1993; WALIA Y GUPTA, 1995).

En los resultados de BÖHM et al. (2009), se observa que la incorporación de tejido foliar seco, independiente de la especie, afectó negativamente la reproducción de M. hapla en lechuga, reduciendo en forma significativa (p < 0.05) el número de huevos y la formación de juveniles II.

A los 20 días de interacción del tejido foliar deshidratado de las especies con el sustrato, éstas presentaron diferencias significativas tal como se observa en la Figura 5. En este caso la presencia de matico en el sustrato pareciera haber favorecido el 30

desarrollo de huevos y juveniles del nemátodo (H(6,90)=20,13; p=0,0026). Sin embargo, no se nota un efecto depresor importante con respecto al testigo por parte de ninguna especie.

El análisis para evaluar el efecto de las dos concentraciones empleadas en el ensayo, mostró que éstas se comportaban igual no existiendo por lo tanto diferencias entre ellas (H (2,90)=4,527; p=0,104).

FIGURA 5 Propágulos de M. hapla en raíces de plantas de lechuga evaluadas, para 20 días de interacción del tejido foliar deshidratado con el sustrato. Letras distintas sobre las columnas indican diferencias entre especies según Kruskal Wallis (p< 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. Cabe destacar que en los 20 días de interacción tejido-sustrato, los valores numéricos del eje “y” en la Figura 5 son mucho menores a los valores expresados en la Figura 4 y ésta diferencia con los 10 de días interacción tejido-sustrato se hizo visible en el Cuadro 4.

A pesar de que no se encontró información sobre la identificación de los compuestos activos presentes en las hojas de avellano, la presencia de fenoles y taninos pueden tener un efecto directo sobre M. hapla (CHACÓN y ARMESTO, 2006). En un ensayo llevado a cabo en Chile, Valle de Casablanca, (RIVERA y ABALLAY, 2008) observaron 31

que enmiendas orgánicas ricas en polifenoles como orujo de uva y residuos de té disminuyeron los índices reproductivos de Meloidogyne ethiopica en plantas de vides, variedad Chardonnay.

Aun cuando en este en ensayo no existió una diferencia estadística en las concentraciones que se utilizaron, al momento de contabilizar el propágulo formado en las masas de huevos adheridas a las raíces MAGUNACELAYA et al. (2004), realzan que la importancia de la acción nematicida de los productos que se aplicarán, depende de la concentración y del tiempo de exposición de éstos. Asimismo dicen que los nemátodos deben ser controlados en ciertos volúmenes de suelo, ya que pretender el control distribuyendo el producto en todo el suelo significaría usar mucha agua como vehículo y llegar a concentraciones tan bajas que no existiría acción nematicida.

4.2 Efecto de los tratamientos en parámetros de desarrollo en plantas de lechuga

La medición de los parámetros de desarrollo de las plantas es un indicador de los posibles efectos que pueden producirse por las especies vegetales incorporadas al sustrato como consecuencia de su desarrollo sobre suelo infestado.

En el Cuadro 5 se observa que los tiempos de interacción del tejido foliar de las especies en estudio con el sustrato, presentaron diferencias para todos los parámetros, por lo que, los análisis posteriores de los factores especies y concentraciones se llevaron a cabo de manera independiente.

En el mismo Cuadro 5, se aprecia que el tiempo de 10 días de interacción tejido – sustrato, afectó en menor proporción el desarrollo de las plantas.

32

CUADRO 5 Efecto del tiempo de interacción del tejido foliar de especies vegetales con el sustrato, en los parámetros de desarrollo de plantas de lechuga.

Variable 10 Días 20 Días

promedio DS promedio DS

Materia seca (g) 3,1 ± 0,9 a 1,0 ± 0,5 b

Altura (cm) 7,3 ± 1,0 a 5,7 ± 0,7 b

Nº hojas 34,0 ±5,5 a 20,0 ± 3,2 b

Peso fresco raíces (g) 15,3 ± 5,6 a 4,7 ± 1,8 b

Longitud raíces (cm) 10,5 ± 4,7 a 10,2 ± 0,8 b

* Letras distintas en la misma fila indican diferencias entre los tiempos de interacción entre el tejido foliar y el sustrato, según Mann Whitney (p< 0.05).

4.2.1 Desarrollo aéreo de plantas de lechuga. Como se mencionó anteriormente, dado que los tiempos de interacción tejido – sustrato presentaron diferencias, éstos, al igual que los análisis de los factores de especies y concentraciones, se evaluaron por separado.

4.2.1.1 Efecto de la especie vegetal incorporada al sustrato en el desarrollo aéreo de plantas de lechuga. En el Cuadro 6 se observan los resultados para los 10 días de interacción tejido-sustrato. En éste se aprecia que la materia seca (MS) presentó diferencias (F=3,492; p=0,0020), sin embargo, ésta se ve reflejada sólo entre murta y el tratamiento control absoluto que no presentaba inóculo del nemátodo y tampoco incorporación de tejido al sustrato. Entre especies no hubo disimilitudes, ni tampoco por parte de éstas hacia el testigo inoculado (maceta con inóculo, pero sin especie incorporada al sustrato).

En cuanto al número de hojas formadas por planta, se observaron diferencias (F= 5,462; p=0,0000), destacando nuevamente el tratamiento control absoluto (sin nemátodo ni tejido foliar) por sobre arrayán, avellano, matico y murta. Cabe resaltar que no hubo diferencias entre especies, ni de estas hacia el testigo inoculado. 33

Por otra parte, también a los 10 días de interacción tejido sustrato, la altura de las plantas evaluadas, presentó diferencias (F=6,098; p=0,0000), destacando nuevamente el mejor desarrollo del control absoluto con respecto a arrayán, maitén, matico y murta, no existiendo diferencias entre especies. En este caso sólo murta se diferenció también del testigo inoculado.

Cuadro 6 Efecto de las diferentes especies incorporadas al sustrato, para 10 días de interacción tejido-sustrato en parámetros de desarrollo del sector aéreo de plantas de lechuga.

Materia seca (g) Nº hojas Altura (cm) Especie prome prome prome dio DS dio DS dio DS

Arrayán 2,73 ±0,86 A B 32 ±2,95 B 6,81 ±0,89 B C

Avellano 2,79 ±1,15 A B 32 ±4,69 B 7,13 ±1,15 AB C

Eucalipto 2,97 ±0,83 A B 34 ±6,04 A B 7,07 ±0,77 AB C

Maitén 2,91 ±0,74 A B 34 ±5,44 A B 6,73 ±0,67 B C

Matico 2,61 ±0,71 A B 31 ±3,57 B 6,94 ±0,54 B C

Murta 2,43 ±1,29 B 31 ±7,49 B 6,39 ±1,03 C

Testigo c/inoc 3,39 ±1,05 A B 35 ±4,74 A B 7,45 ±1,08 A B

Control absoluto 3,56 ±0,57 A 39 ±4,61 A 8,05 ±0,67 A

* Letras distintas en la misma columna para cada parámetro indican diferencias entre especies, para el tiempo 10 días de interacción tejido-sustrato, según la prueba de Tukey (p< 0.05). Los resultados obtenidos indican que la presencia del nemátodo en el sustrato no afectó el desarrollo de las plantas, ya que no se observaron diferencias entre el testigo con inóculo y el control sin inocular. Por otra parte también demuestran que la incorporación de tejido foliar, seco y triturado de algunas de las especies en el sustrato afecta el desarrollo de las plantas (Cuadro 6).

ARISMENDI y BÖHM (2011), sugieren que algunas de las especies evaluadas en su ensayo, que coinciden con las acá presentadas, tienen en común compuestos activos con actividad fitotóxica hacia plantas de lechuga, sin embargo, no se sabe a cabalidad 34

qué concentraciones, interacciones o síntesis de derivados se producen durante los procesos de degradación de estos tejidos.

En cuanto a los resultados obtenidos a los 20 días de interacción tejido-sustrato, se observó un efecto de los tejidos vegetales en la materia seca aérea de lechuga, puesto que el tratamiento el control absoluto obtuvo valores más altos que avellano, maitén y murta (F=7,555; p=0,0000), sin embargo, nuevamente no hubo diferencias entre especies (Cuadro 7)

En relación al número de hojas por planta en este mismo periodo de interacción tejido- sustrato, el testigo inoculado se diferencia de maitén y murta con un mayor número de hojas en su promedio. Entre especies nuevamente no hay diferencias entre si (F=4,547; p=0,0002).

Cuadro 7 Efecto de la especie incorporada al sustrato, para 20 días de interacción, en parámetros de desarrollo aéreo de plantas de lechuga.

Materia seca (g) Nº hojas Altura (cm) Especie prome prome prome dio DS dio DS dio DS

Arrayán 0,9 ±0,53 b c 18 ±3,24 a b 5,04 ±0,84 c

Avellano 0,68 ±0,29 c 19 ±2,88 a b 5,33 ±0,65 b c

Eucalipto 1,11 ±0,3 a b c 21 ±3,41 a b 5,70 ±0,31 a b c

Maitén 0,77 ±0,29 c 18 ±2,5 b 5,65 ±0,46 a b c

Matico 0,86 ±0,34 b c 19 ±2,58 a b 5,70 ±0,68 a b c

Murta 0,67 ±0,43 c 18 ±4,14 b 5,18 ±0,83 c

Testigo c/inoc 1,39 ±0,56 a 22 ±3,06 a 6,27 ±0,62 a

Control absoluto 1,31 ±0,33 a b 20 ±2,43 a b 6,0 ±0,45 a b

* Letras distintas en la misma columna para cada parámetro indican diferencias entre especies, para el tiempo 20 días de interacción tejido-sustrato, según la prueba de Tukey (p< 0.05). En el parámetro de altura, a los 20 días de interacción tejido-sustrato, destacaron las diferencias del control absoluto, sobre arrayán y murta (F=7,983; p=0,0000), además 35

se puede observar que el testigo inoculado se diferencia de arrayán, avellano y murta, superándolos en sus medias. Cabe destacar que nuevamente no hay diferencias entre especies, por lo tanto no existe un control de éstas (Cuadro 7).

En este ensayo, en general no se presentaron grandes diferencias para los parámetros de desarrollo de la planta entre el testigo inoculado y el resto de tratamientos. Esto puede deberse a que como destaca CROZZOLI (2002), los síntomas que causan nemátodos no son tan evidentes, sin embargo, merman paulatinamente el rendimiento sin llegar normalmente a matar a sus hospederos, pasando incluso desapercibidos.

4.2.1.2 Efecto de la concentración de tejido foliar deshidratado aplicadas al sustrato, en parámetros de desarrollo del sector aéreo de plantas de lechuga. Como se mencionó anteriormente y se aprecia en el Cuadro 5, se presentaron diferencias entre los tiempos de interacción tejido-sustrato en todos los parámetros de desarrollo de las plantas de lechuga, lo que conllevó a su evaluación por separado.

Para el parámetro de materia seca (MS), se observó un efecto de las concentraciones (F=14,353; p=0,0000), donde a los 10 días de interacción tejido-sustrato, el 5% de concentración registró valores significativamente menores con respecto al 1%, al testigo inoculado y al control absoluto. A los 20 días de interacción tejido-sustrato el 1% de concentración se diferenció del testigo inoculado y del 5% de concentración (F=23,231; p=0,0000), siendo también la concentración 5% la que presentó menores valores y diferencias con respecto al resto de los tratamientos (Figura 6). 36

4,5 a 4,0 a a 3,5 (g)

3,0 b Seca 2,5 2,0 A B AB 10 días

Materia 1,5 1,0 C 20 días 0,5 0,0 15TestigoControl inoculado Absoluto Concentraciones (%)

Figura 6 Efecto de la concentración del tejido vegetal incorporado al sustrato en la materia seca (g), de plantas de lechuga. Letras minúsculas y mayúsculas distintas sobre las columnas, indican diferencias entre las concentraciones para 10 y 20 días de interacción tejido-sustrato, respectivamente, de acuerdo a la prueba de Tukey (p< 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. En tratamientos con sustrato conteniendo 5% de tejido foliar de canelo, avellano, murta, laurel y eucalipto, ARISMENDI y BÖHM (2011), observaron un efecto alelopático en las plantas de lechuga, donde las especies vegetales redujeron significativamente la productividad de este parámetro. Los autores señalados indican que independientemente de la infestación del nemátodo en las plantas, la incorporación de concentraciones mayores a un 5% de tejido foliar seco de estas mismas especies al sustrato explicarían el 60% de reducción de la materia seca.

En la Figura 7, se aprecian los resultados de las diferencias entre concentraciones en cuanto al número de hojas.

Los tratamientos que tuvieron 10 días de interacción tejido-sustrato, el control absoluto presenta diferencias (F=18,423; p=0,0000) con un mayor número de hojas por planta de lechuga. En este mismo período de tiempo, el 5% de concentración nuevamente presentó los valores más bajos, diferenciándose del 1 % de concentración y de ambos testigos. También en los tratamientos de 20 días de interacción tejido-sustrato, el 5% 37

de concentración presenta diferencias con respecto al 1% de concentración y a ambos testigos (F=15,062; p=0,0000), los cuales entre ellos no presentaron diferencias.

45 a 40 b b 35 c 30 (nº)

A A 25 A 20 B Hojas 15 10 días 10 20 días 5 0 15TestigoControl inoculado Absoluto Concentraciones (%)

Figura 7 Efecto de la concentración en el número de hojas por planta en lechuga, para ambos tiempos de interacción tejido-sustrato. Letras minúsculas y mayúsculas distintas sobre las columnas, indican diferencias entre las concentraciones para 10 y 20 días de interacción tejido-sustrato, respectivamente, de acuerdo a la prueba de Tukey (p< 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. En la Figura 8 se aprecia que existió diferencias entre concentraciones para el parámetro altura de plantas, sobresaliendo, a los 10 días de interacción tejido-sustrato, control absoluto con respecto a el resto de tratamientos, sin embargo, no existieron diferencias entre el 1% y el 5% de concentración (F=15,367; p=0,0000). Por otra parte, en los 20 días de interacción tejido-sustrato cabe destacar el 1% de concentración, que se diferencia del testigo inoculado y del 5% de concentración (F=23,52; p=0,0000), sobresaliendo este ultimo, obteniendo nuevamente el valor más bajo.

38

9,0 b a 8,0 bc c 7,0 A B AB 6,0 C (cm) 5,0 4,0 Altura 3,0 10 días 2,0 20 días 1,0 0,0 15TestigoControl inoculado Absoluto Concentraciones (%)

Figura 8 Efecto de la concentración en la altura de plantas de lechuga, para ambos tiempos de interacción tejido-sustrato. Letras minúsculas y mayúsculas distintas sobre las columnas, indican diferencias entre las concentraciones para 10 y 20 días de interacción tejido-sustrato, respectivamente, de acuerdo a la prueba de Tukey (p< 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. De acuerdo a KERRY (2000), la sintomatología aérea causada por especies de Meloidogyne es variable dependiendo del hospedante, pero generalmente se aprecia como marchitez, enanismo y clorosis, por lo que los rendimientos disminuyen su desarrollo, ya sea altura o número de hojas por planta, mientras que la presencia de agallas en las raíces, es el síntoma principal, causado por el sobrecrecimiento del tejido alrededor del nemátodo.

4.2.2 Desarrollo radicular de plantas de lechuga. Dado que los tiempos de interacción tejido – sustrato presentaron diferencias, éstos, al igual que los análisis de los factores de especies y concentraciones, se evaluaron por separado.

4.2.2.1 Efecto de la incorporación del tejido foliar deshidratado de distintas especies sobre el desarrollo del sector radicular de plantas de lechuga. En relación al peso fresco de raíces, el control absoluto presenta los valores más altos, diferenciándose de avellano, matico y del testigo inoculado (F=4,49; p=0,0002), sin 39

embargo, no existieron diferencias entre especies (Cuadro 8). También en longitud de raíces, y como era de esperarse, los valores más altos se presentaron en el control absoluto, destacándose por sobre eucalipto, maitén, matico y el testigo inoculado (F=6,61; p=0,0000). A su vez, arrayán presentó diferencias con respecto a maitén y matico, diferenciándose además del testigo inoculado.

Cuadro 8 Efecto de la especie vegetal, para 10 días de interacción tejido- sustrato en parámetros de desarrollo del sector radicular de plantas de lechuga.

Peso fresco (g) Longitud (cm) Especie promedio DS promedio DS.

Arrayán 18,8 ±3,03 A B 11,27 ±0,99 A B

Avellano 11,79 ±5,74 B 10,43 ±1,04 A B C

Eucalipto 14,34 ±3,52 A B 10,09 ±0,62 B C

Maitén 14,19 ±6,60 A B 9,71 ±0,90 C

Matico 12,47 ±3,41 B 9,78 ±0,71 C

Murta 13,46 ±4,00 A B 10,96 ±0,71 A B C

Testigo inoculado 13,9 ±5,31 B 10,12 ±0,93 C

Control absoluto 18,97 ±6,06 A 11,32 ±1,26 A * Letras distintas en la misma columna para cada parámetro indican diferencias entre especies, para el tiempo 10 días de interacción tejido-sustrato, según la prueba de Tukey (p< 0.05). En el Cuadro 9 se observa que para los 20 días de interacción tejido-sustrato, el peso fresco de raíces presentó diferencias (F=3,609; p=0,0015), destacando eucalipto sobre matico, murta y el control absoluto. En la longitud de raíces, las diferencias se presentan entre arrayán y el testigo inoculado, sin existir contrastes entre especies (F=2,27; p=0,0337).

40

Cuadro 9 Efecto de la especie vegetal, para 20 días de interacción tejido- sustrato en parámetros de desarrollo del sector radicular de plantas de lechuga.

Peso fresco (g) Longitud (cm) Especie promedio DS promedio DS

Arrayán 5,28 ±2,9 a b 10,82 ±0,71 a

Avellano 4,51 ±1,36 a b 10,73 ±0,73 a b

Eucalipto 6,75 ±0,94 a 10,55 ±1,17 a b

Maitén 4,37 ±1,34 a b 10,26 ±0,94 a b

Matico 4,03 ±1,37 b 10,22 ±0,96 a b

Murta 3,2 ±2,25 b 10,22 ±0,74 a b

Testigo inoculado 4,97 ±2,07 a b 9,89 ±0,69 b

Control absoluto 4,48 ±1,17 b 10,13 ±0,8 a b * Letras distintas en la misma columna para cada parámetro indican diferencias entre especies, para el tiempo 20 días de interacción tejido-sustrato, según la prueba de Tukey (p< 0.05). 4.2.2.2 Diferencias de las concentraciones de tejido foliar deshidratado aplicadas al sustrato, en parámetros de desarrollo del sector radicular de plantas de lechuga. Ya que, los tiempos de interacción tejido-sustrato presentaron diferencias (Cuadro 5), éstos se evaluaron en forma separada. La Figura 9 muestra que a los 10 días de interacción tejido-sustrato, el parámetro peso fresco de raíces presentó diferencias (F=7,179; p=0,0002), sobresaliendo el control absoluto por sobre el testigo inoculado y las concentraciones 1% y 5%, que a su vez no se contrastaron entre si. En este mismo parámetro, a los 20 días de interacción tejido- sustrato, las diferencias se presentaron entre el 1% y el 5%, siendo más eficiente el 1%, ya que obtuvo los valores más altos, pero no existió un control por parte del 1% de concentración con respecto al testigo inoculado. 41

25 a (g) 20 b b b raíces 15 fresco

10 A B AB AB 10 días Peso 5 20 días 0 15TestigoControl inoculado Absoluto Concentraciones (%)

Figura 9 Efecto de la concentración de tejido incorporado al sustrato en el peso fresco de raíces de lechuga, para ambos tiempos de interacción. Letras minúsculas y mayúsculas distintas sobre las columnas, indican diferencias entre las concentraciones para 10 y 20 días de interacción tejido-sustrato, respectivamente, de acuerdo a la prueba de Tukey (p< 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. A los 10 días de interacción tejido-sustrato, tal como observa en la Figura 10, el parámetro longitud de raíces, sólo presenta diferencias con respecto del control absoluto hacia ambas concentraciones y al testigo inoculado (F=7,49; p=0,0001), pero no hay un control por parte de las concentraciones hacia el testigo inoculado y tampoco se observa disimilitud entre 1% y 5%. Para los 20 días de interacción tejido sustrato, se presentaron diferencias (F=3,48; p=0,0183) entre el 5% de concentración sobre el testigo inoculado, pero nuevamente ésta no difirió del 1% de concentración y tampoco del control absoluto. 42

14,0 a 12,0 b AB b A

(cm) b AB

B 10,0 raíces 8,0 de 6,0 10 días 4,0

Longitud 20 días 2,0 0,0 15TestigoControl inoculado Absoluto Concentraciones (%)

Figura 10 Efecto de la concentración de tejido incorporado al sustrato en la longitud de raíces de lechuga, para ambos tiempos de interacción. Letras minúsculas y mayúsculas distintas sobre las columnas, indican diferencias entre las concentraciones para 10 y 20 días de interacción tejido- sustrato, respectivamente, de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0.05). Barras verticales sobre las columnas indican DS. Similar efecto observó FIERRO (2009), obteniendo un menor peso total (aéreo y radicular) y una menor elongación radicular en sus plantas de lechuga evaluadas expuestas a extractos de menta, con respecto al testigo, atribuyendo ésto a que probablemente las condiciones restrictivas de cultivo, en macetas de tamaño pequeño y al tiempo de cultivo, produjeron un efecto adverso en el desarrollo total de la planta.

Según PLOWRIGHT et al. (2002), las altas densidades de nemátodos en raíces, causan una disminución del peso de raíces, sector aéreo e incluso semillas de muchas especies vegetales. En este ensayo esto se detectó sólo en algunos casos, registrándose una disminución de dichos parámetros de desarrollo en las plantas, lo cual pudo deberse entre otras razones a un bajo tiempo de interacción entre los nemátodos y las plantas y por otra parte a que las condiciones bajo las que se desarrolló el ensayo: temperatura, riego frecuente y uso de un sustrato adecuado, fueron capaces de disminuir el posible efecto de los nemátodos sobre ellas.

43

5 CONCLUSIONES

 Con excepción de avellano, el tejido foliar seco y triturado de las diferentes especies arbóreas incorporadas al sustrato, no mostraron efecto nematicida hacia M. hapla. Avellano destacó en casi todas las evaluaciones presentando los valores más bajos en los índices de agallamiento y propágulos encontrados en raíces de lechuga.

 En los propágulos de M. hapla, existieron diferencias en los períodos evaluados, destacando los 20 días de interacción tejido-sustrato, siendo éste el más efectivo. En los parámetros de desarrollo de plantas de lechuga, sobresalió el tiempo de 10 días de interacción tejido-sustrato.

 Sólo se observó efecto de las concentraciones en el índice de agallamiento número de agallas.

 En los parámetros de desarrollo, las diferencias se observaron hacia el control absoluto, sin presentarse un control real con respecto al testigo inoculado o destacando una concentración sobre la otra.

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