UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca
Marina Escoque Lodovicho
Ribeirão Preto 2015 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Toxicologia para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Toxicologia
Versão corrigida da Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Toxicologia no dia 06/11/2015. A versão original encontra-se disponível na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP.
Orientada: Marina Escoque Lodovicho Orientadora: Profa. Dra. Suely Vilela
Ribeirão Preto 2015 FICHA CATALOGRÁFICA
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Lodovicho, Marina Escoque
Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca. Ribeirão Preto, 2015.
103p. : il. ; 30 cm
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP - Área de concentração: Toxicologia.
Orientadora: Vilela, Suely
1. Bothrops jararaca, 2. BJ-CRP, 3. CRISP, 4.Caracterização bioquímica,
5. Potencial inflamatório, 6. Sistema complemento
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome do aluno: Marina Escoque Lodovicho
Título do trabalho: Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Toxicologia para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Toxicologia
Orientadora: Profa. Dra. Suely Vilela
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. ______
Instituição:______Assinatura: ______
Prof. Dr. ______
Instituição:______Assinatura: ______
Prof. Dr. ______
Instituição:______Assinatura: ______
RESUMO
LODOVICHO, M. E. Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca. 2015. 103f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
Envenenamentos por serpentes do gênero Bothrops provocam reações sistêmicas e locais como coagulopatias, hemorragias, reação inflamatória, dor e mionecrose. Proteínas secretadas ricas em cisteínas (CRISPs) estão presentes nas peçonhas de serpentes e estão amplamente distribuídas entre mamíferos, répteis e anfíbios. Estão envolvidas em algumas reações biológicas, porém muitas funções ainda são desconhecidas. O presente trabalho objetivou o isolamento, a caracterização bioquímica/estrutural, enzimática e funcional, a avaliação do potencial inflamatório e avaliação da atividade sobre o sistema complemento de uma CRISP isolada da peçonha de Bothrops jararaca. A CRISP denominada BJ-CRP, foi isolada da peçonha de Bothrops jararaca através da combinação de três etapas cromatográficas: exclusão molecular em Sephacryl S-200, cromatografia de troca aniônica em coluna Source 15Q e cromatografia de fase reversa em coluna C18. O grau de homogeneidade foi determinado e confirmado por eletroforese SDS-PAGE, que mostrou uma banda única de 25,19 kDa, e por MALDI-TOF/TOF que apresentou a massa molecular de 24,6 kDa. A sequência N-terminal e a análise dos peptídeos trípticos por MALDI TOF/TOF demonstrou a presença de 100 resíduos de aminoácidos, os quais apresentaram até 96% de similaridade com sequências de outras CRISPs já descritas, porém de outros gêneros e espécies de serpentes, pois ainda não há CRISPs isoladas do gênero Bothrops. A BJ-CRP não possui atividade proteolítica sobre a azocaseína, o fibrinogênio e a fibrina. Também não apresentou atividade coagulante e hemorrágica, e não demonstrou atividade quando testada na concentração de 1µM em 13 diferentes canais para potássio dependentes de voltagem. Por outro lado, esta toxina foi capaz de induzir um processo inflamatório agudo (tempos de 1 e 4 horas), observado pelo recrutamento de neutrófilos e aumento da citocina pró-inflamatória IL-6 na cavidade peritoneal de camundongos. Ensaios realizados com a BJ-CRP e a peçonha de Bothrops jararaca mostraram modulação na atividade hemolítica promovida pela via clássica do sistema complemento. A BJ-CRP também promoveu ação direta sobre alguns componentes isolados do sistema complemento, como C3 e C4, conforme avaliado por SDS-PAGE e Western blot. O presente trabalho descreve a purificação da BJ-CRP, a primeira CRISP isolada da peçonha da serpente do gênero Bothrops. Os resultados obtidos são promissores e abrem perspectivas para o melhor entendimento desta classe de proteínas, e para a compreensão do mecanismo de ação desta classe de toxinas na resposta inflamatória induzida pelo envenenamento botrópico.
Palavras Chave: CRISP, BJ-CRP, Bothrops jararaca, caracterização bioquímica, potencial inflamatório, sistema complemento.
ABSTRACT
Lodovicho, M. E. Isolation, biochemical characterization and evaluation of the inflammatory potential of acysteine rich secretory protein (CRISP) from Bothrops jararaca. 2015. 103f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
Envenomation by snakes from Bothrops genus is characterized by systemic and local effects such as coagulopathies, bleeding disorders, inflammation, pain and myonecrosis.The cysteine rich secretory proteins (CRISPs) are present in snake venoms and are widely distributed mammals, reptiles and amphibians. They are involved in certain biological activities, however many of their functions are still unknown. The aim of the present study was to isolate a CRISP from Bothrops jararaca and to biochemically/functionally characterize it by evaluating its involvement on inflammatory responses and on the complement system. The CRISP named BJ-CRP was isolated from Bothrops jararaca crude venom through the combination of three chromatographic steps: molecular exclusion on Sephacryl S-200 column, anion exchange chromatography on Source 15Q and reverse phase chromatography using C18 column. A high purity degree was obtained as confirmed by SDS- PAGE, showing a single band of 25.19 kDa, and by MALDI-TOF/MS showing a molecular mass of 24.6 kDa. The N-terminal sequence and analysis of tryptic peptides by MALDI TOF/ MS resulted in the determination of 100 amino acid residues, which had up to 96% similarity to sequences from other snake venom CRISPs that were previously described, but from other genus and snake species. The BJ-CRP did not have proteolytic activity on azocasein, fibrinogen or fibrin. It did not show coagulant or hemorrhagic activity, and also did not show activity on 13 different voltage dependent potassium channels when tested at a concentration of 1µM. Moreover, this toxin was able to induce an acute inflammatory response (1 and 4 hours after injection), observed by the recruitment of neutrophils and increase of interleukin-6 into the peritoneal cavity of mice. BJ-CRP and B. jararaca crude venom were capable of modulating the hemolytic activity promoted by the classical pathway of the complement system, and BJ-CRP also showed direct action on some complement system components, such as C3 and C4 as evaluated by SDS-PAGE and Western blot. The present work describes the purification of BJ-CRP, the first CRISP isolated from a Bothrops snake venom. The results obtained showed to be promising and open up prospects in order to better understand the involvement of this class of toxins in the inflammatory response induced by Bothrops envenomation.
Keywords: CRISP, BJ-CRP, Bothrops jararaca, inflammatory potential, complement system.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Ofidismo Acidentes ofídicos afetam milhões de pessoas anualmente, sendo que no Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde, no período de 2000 a 2013 foram notificados 360.506 acidentes e 1.487 óbitos. A maior incidência de casos concentra-se nas regiões Norte e Sudeste ultrapassando o número de 90.000 casos, porém o maior número de óbitos está registrado nas regiões Norte e Nordeste, ficando em torno de 500 óbitos no período mencionado (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Esse contraste pode ocorrer devido às diferenças de acesso ao tratamento em cada localidade, pois encontramos os mesmos gêneros distribuídos em todo o território nacional e, sendo o gênero o meio pelo qual se baseia o tratamento. Em 2009 a Organização Mundial de Saúde (OMS) acrescentou o envenenamento por serpentes à lista de doenças tropicais negligenciadas, pois assim como a malária, a tuberculose, a dengue e algumas doenças parasitárias, o risco de um acidente com serpentes está sempre presente, sendo que a mortalidade associada a acidentes peçonhentos é muito maior quando comparada a outras doenças tropicais negligenciadas (WILLIAMS et al., 2010). Em uma análise de âmbito mundial, sabe-se que o maior número de acidentes por serpentes encontra-se no Sul e no Sudeste da Ásia e na África subsaariana (CHIPPAUX, 1998; KASTURIRATNE et al., 2008). O DALYs (Disability Adjusted Life Years) é um indicador conhecido mundialmente que avalia a carga de uma doença. Na avaliação do envenenamento por serpentes, constatou-se um impacto elevado, pois a maioria dos acometidos são crianças ou jovens trabalhadores agrícolas que devido ao envenenamento evoluem com sequelas permanentes, sejam elas físicas e/ou psicológicas (HARRISON et al., 2009). Estimativas sobre a incidência, a morbidade e a mortalidade por acidentes ofídicos são baseadas muitas vezes em dados hospitalares que não retratam o verdadeiro impacto deste agravo, pois muitas pessoas acometidas não procuram atendimento adequado e utilizam-se de tratamentos tradicionais (WHO, 2010). O animal causador do acidente sempre deve ser identificado, pois ajudará no reconhecimento de espécies de importância médica em nível regional, auxiliando na indicação mais precisa do antiveneno a ser administrado. O tratamento para acidentes ofídicos consiste na infusão endovenosa de soro específico que depende do gênero da serpente, e quando há falta de soros específicos, o tratamento pode ser realizado por meio das associações de outros soros, porém este pode não ser capaz de neutralizar de maneira eficiente a ação da peçonha (BRASIL, 1998). A terapia com antiveneno baseia-se na neutralização das ações tóxicas dos diversos componentes da peçonha, reduzindo os efeitos sistêmicos causados pelo envenenamento (CARDOSO et al., 1993; JORGE; RIBEIRO, 1997). As toxinas presentes nas peçonhas de serpentes podem induzir uma série de efeitos fisiológicos no indivíduo acometido, como distúrbios neurotóxicos, cardiotóxicos, miotóxicos hemorrágicos, hemostáticos, coagulantes, ações nefrotóxicas e hepatotóxicas, que combinados podem levar a digestão/morte da presa ou vítima (CHIPPAUX; WILLIAMS, 1991; CALKOSINSKI et al., 2010). Os efeitos clínicos observados no envenenamento humano causado por peçonha de serpentes podem ser agrupados em categorias de acordo com a sua significância clínica: (1) paralisia flácida; (2) miólise sistêmica; (3) coagulopatia e hemorragia; (4) falhas e danos renais; (5) cardiotoxicidade e, (6) danos teciduais no local da picada (WHITE, 2004). Cada um desses efeitos pode causar diversos efeitos secundários, contribuindo potencialmente para danos locais do envenenamento e mortalidade (WHITE, 2005).
1.2. Serpentes As serpentes constituem um grupo de répteis que apresentam um longo corpo flexível, cabeça recoberta de escamas ou placas; olhos redondos, com pupila vertical ou circular; uma narina de cada lado da cabeça; boca com grande extensibilidade e fosseta loreal, um orgão termorreceptor posicionado entre os olhos e a narina (FRANCO, 2003). Serpentes peçonhentas apresentam pupilas em fenda; presas anteriores com orifício central ou sulco; fosseta loreal, sendo a cabeça destacada do corpo. A maioria possuem hábitos noturnos e são vagarosas (PINHO; PERREIRA, 2001). O Brasil apresenta uma fauna rica em serpentes, as quais estão atualmente divididas em 10 famílias: Anomalepididae (6 espécies), Leptotyphlopidae (14), Typhlopidae (6), Aniliidae (1), Tropidophiidae (1), Boidae (12), Colubridae (34), Dipsadidae (237), Elapidae (27) e Viperidae (28) (BERNARDE, 2011), contudo apenas as famílias Viperidae e Elapidae são consideradas peçonhentas, sendo os gêneros Bothrops, Crotalus e Lachesis pertencentes à família Viperidae e o gênero Micrurus pertencente à família Elapidae (MELGAREJO, 2003). Costa e Bérnils (2012) discutiram alguns argumentos contrários à nomenclatura de gêneros e famílias sumarizada por Bernarde (2011). Dos argumentos utilizados contra a nomenclatura, estão o fato da futura necessidade da republicação de materiais educativos e banco de dados, uma possível confusão de assimilação dessas alterações pelos profissionais não familiarizados com a taxonomia e os erros já existentes quanto ao uso de nomes populares para as serpentes brasileiras. A classificação das serpentes sofreu modificações nos últimos anos, devido à descoberta de novas espécies e novas informações taxonômicas (WHO, 2010; CARRASCO et al., 2012). Fernwick e colaboradores (2009) propuseram uma nova classificação para as serpentes do gênero Bothrops da família Viperidae. Esta foi dividida em cinco gêneros: Bothriopsis, Bothrocophias, Bothropoiodes, Bothrops e Rhinocerophis baseada em informações taxonômicas, dados moleculares e morfológicos, porém esta nova classificação ainda não está bem aceita na comunidade científica. A árvore filogenética de Fernwick e colaboradores (2009) é semelhante à de outros autores, como Parkinson e colaboradores (2002) e Wüster e colaboradores (2005), os quais concordam que Bothrocophias é um gênero válido, entretanto os autores também possuem opiniões divergentes. Parkinson e colaboradores (2009) preferem não realizar mudanças que afetem a nomenclatura e argumentam que são necessários maiores estudos. Já Wüster e colaboradores (2005) optaram por invalidar o gênero Bothriopsis. Serpentes da família Viperidae apresentam um complexo sistema de produção e estocagem da peçonha devido ao maior grau de especialização no aparelho venenífero (PINHO; PERREIRA, 2001). Nos acidentes ofídicos, a peçonha é injetada na vítima via seus dentes afiados e causa danos de forma grave. As serpentes usam a peçonha para imobilizar e matar suas presas, sendo o mecanismo de defesa de menor importância quando consideramos a composição do veneno (KARLSSON, 1979). As peçonhas de serpentes são constituídas por uma mistura de componentes biológicos que compreendem enzimas hidrolíticas, proteínas não enzimáticas, moléculas orgânicas e inorgânicas (AIRD, 2002). As toxinas presentes na peçonha de serpentes são resultados da duplicação de genes de proteínas ou peptídeos tipicamente usados em outras regiões do corpo e que são expressos na glândula de veneno (FRY, 2005). Os componentes da peçonha variam de acordo com a localização geográfica da serpente, as estações do ano, também em relação a espécie e a idade da serpente (CHIPPAUX; WILLIAMS, 1991; SHASHIDHARAMURTHY et al., 2002).
1.3. O gênero Bothrops O gênero Bothrops compreende diversas espécies, como: Bothrops jararaca (jararaca), Bothrops jararacussu (jararacussu), Bothrops alternatus (urutu-cruzeiro), Bothrops neuwiedi (jararaca-pintada), e Bothrops moojeni (caiçara) (MELGAREJO, 2003), e estão amplamente distribuídas por todo o território nacional (BRASIL, 2001). Peçonhas de serpentes do gênero Bothrops possuem ação proteolítica, coagulante e hemorrágica. A atividade proteolítica é derivada de frações heterogêneas da peçonha, como proteases, hialuronidases e fosfolipases, que atuam promovendo alterações no local da picada e proximidades, caracterizando uma atividade inflamatória aguda com a presença de edema, bolhas e necrose. A ação coagulante é caracterizada por distúrbios na coagulação através da ativação de fatores como protrombina e Fator X. O consumo de fatores de coagulação e a geração de produtos de degradação de fibrinogênio e fibrina podem ocasionar a incoagulabilidade sanguínea. Na peçonha de filhotes, a atividade coagulante é predominante, assim, manifestações locais podem não existir ou serem discretas. A atividade hemorrágica ocorre devido às hemorraginas presentes na peçonha que provocam lesões na membrana basal dos capilares (FRANÇA; MÁLAQUE, 2003; FUNASA, 2001). O envenenamento botrópico causa inflamação, equimose, bolhas e necrose na região da picada. Sistemicamente ocorrem alterações na coagulação sanguínea e sangramento (RIBEIRO; JORGE,1997). Além do quadro clínico citado, podem ocorrer complicações locais, como necrose do local afetado e formação de abscesso; complicações sistêmicas, como choque e insuficiência renal aguda (IRA) (BRASIL, 2001). Os acidentes botrópicos são clinicamente classificados como leve, moderado ou severo, de acordo com as manifestações clínicas apresentadas. A classificação baseia-se no tamanho do edema local, no tempo de coagulação que se apresenta normal ou alterado, e na presença/ausência e grau de hemorragia apresentada (CARDOSO et al., 2009). O gênero Bothrops é responsável pela maioria dos acidentes ofídicos por serpentes peçonhentas no país. Apesar do gênero Crotalus apresentar maior porcentagem de letalidade, a maior porcentagem de morbidade fica atribuída ao gênero Bothrops (PINHO; PERREIRA, 2001; BERNARDE, 2011). A detecção sistêmica do envenenamento por Bothrops pode ser feita pelo ensaio imunoenzimático ELISA (THEAKSTONet al., 1992), e também pelos testes de tempo de coagulação sanguínea (TC), tempo de protrombina (TP), tempo de protrombina parcial ativada (TPPA), tempo de coagulação ativado (TCA) e aumento dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina (PDF) devido aos distúrbios relacionados com os fatores de coagulação ocasionados por esses acidentes (TAKAHIRA, 1999). O hemograma completo do paciente pode ajudar a detectar variações provenientes do envenenamento e avaliar a eficácia do tratamento. A dose de antiveneno administrada é baseada de acordo com a severidade dos sinais e sintomas apresentados pelo paciente (FRANÇA; MÁLAQUE, 2003), no entanto, o tratamento não é 100% eficaz no controle das manifestações locais, mas se mostra eficaz no controle de sintomas sistêmicos (GONÇALVES; MARIANO, 2000). Em casos de hemorragias locais ou sistêmicas a administração do antiveneno estabelece os níveis normais de plaquetas (SANTORO et al., 2008). O soro utilizado no tratamento botrópico é constituído pela mistura da peçonha de 5 espécies do gênero Bothrops: B. jararaca (50%), B. alternatus (12,5%), B. moojeni (12,5%), B. neuwiedi (12,5%) e B. jararacussu (12,5%), produzido a partir da imunização em cavalos (CARDOSO; YAMAGUCHI; SILVA, 2003).
1.4. Bothrops jararaca A serpente Bothrops jararaca é popularmente conhecida como jararaca e pertence à família Viperidae. Possui coloração variada, desde tons castanhos claros a preto, com manchas em forma de “v” invertido ao longo do corpo. Possuem tamanho médio de aproximadamente 1 metro. São vivíperas, alimentam-se de pequenos roedores e possuem hábitos noturnos. É característica das regiões sul e sudeste do Brasil, sendo responsável pela maioria dos casos de acidentes ofídicos (FRANÇA, MÁLAQUE, 2009) (Fig.1A). É encontrada em algumas localidades das regiões Nordeste, Sudeste e Sul do Brasil (Fig.1B). Apresentam dentição do tipo solenóglifo, como qualquer serpente da família Viperidae, sendo capazes de injetar a peçonha armazenada em duas glândulas localizadas na parte posterior da mandíbula (JACKSON, 2007; VONK et al., 2008).
Figura 1. Foto da espécie Bothrops jararaca e distribuição da espécie Bothrops jararaca no Brasil. (A) Bothrops jararaca. Fonte: http://www.cobrasbrasileiras.com.br/viperidae.html; (B) Distribuição da espécie Bothrops jararca no Brasil. Fonte: BRASIL, 2001.
A peçonha de Bothrops jararaca é constituída por diversos componentes, sendo que mais de 80% do peso seco é constituído pela fração proteica (ESCALANTE et al., 2003). A fração não proteica é representada por carboidratos, lipídeos, metais, aminas biogênicas, nucleotídeos e aminoácidos livres (FRANÇA; MÁLAQUE, 2009). A peçonha da serpente de B. jararaca pode provocar lesões no local da picada, tais como sangramento local, dor, aparecimento de bolhas e edema. Complicações também podem ocorrer levando a necrose do local. Os sinais sistêmicos incluem sangramentos, incoagulabilidade sanguínea e plaquetopenia (SANTORO et al., 2008). O indivíduo acometido também pode apresentar quadros de vômitos, sudorese, hipotensão arterial, insuficiência renal e choque (SANTORO et al., 2008; FRANÇA, MÁLAQUE, 2003; CARDOSO et al., 1993). Os primeiros estudos sobre a composição da peçonha de B. jararaca datam de 1949, quando pesquisadores observaram que ao incubar o plasma com a peçonha de B. jararaca, ocorria a geração de um fator hipotensor e espasmogênico para a musculatura lisa, o qual foi denominado bradicinina (ROCHA e SILVA; BERLADO; ANDRADE, 1949). A partir disso, várias toxinas foram identificadas na peçonha de B. jararaca e divididas em diferentes classes. Na tabela 1 podemos destacar algumas toxinas de diferentes classes presente na peçonha de B. jararaca.
Tabela 1. Diferentes classes de toxinas encontradas na peçonha de Bothrops jararaca.
Classes Classificação Proteína Referência
BJ-PLA2 Serrano et al.,1999, 1 Fosfolipase A2 BJ-PLA2-I Araújo, 2014 KN-BJ1 e KN-BJ2 Serrano et al.,1998
2 Serinoprotease Bothrombina Nishida et al., 1994 TL-BJ Serrano et al., 2000
3 Lectina like Bothrojaracina cadeia A Zingali et al.,1993
4 Lectina do tipo C Proteína de ligação ao fator IX/X Mizuno et al.,1997
5 Lectina α-GPIb-BP Fujimura et al.,1995 Jararagina Maruyama et al., 1992a
6 Metaloprotease Bothrojaractivase Berger et al., 2008 Jararafibrase I Maruyama et al., 1992a
7 Nucleotidase NPP-BJ Santoro et al., 2009
Cada uma das famílias de proteínas presentes nas peçonhas do gênero Bothrops possuem características específicas. As metaloproteases, por exemplo, possuem participação nas atividades hemorrágica, fibrinogenolítica e colagenolítica (MARUYAMA et al., 1992b). As serinoproteases são capazes de agir na agregação plaquetária, coagulação sanguínea e na fibrinólise (SANO-MARTINS, SANTORO, 2003). O grupo das fosfolipases A2 presentes no gênero Bothrops desencadeiam uma reação inflamatória intensa com liberação de mediadores inflamatórios (OLIVEIRA, 2009) e também possuem atividade miotóxica (TEIXEIRA et al., 2003). Lectinas tipo-C estão relacionadas às atividades pró-coagulante e anticoagulante, também podem ser agonistas e antagonistas da ativação plaquetária (MORITA, 2004). Embora a peçonha de Bothrops jararaca seja alvo de vários estudos, a composição da peçonha ainda é pouco estudada. Estudos mostraram que o veneno de filhotes apresenta uma atividade coagulante sobre o plasma 12 vezes maior do que a observada em serpentes adultas dessa espécie (FURTADO et al., 1991). Menezes e colaboradores (2006) avaliaram de forma individual o proteoma da peçonha de 18 espécimes de Bothrops jararaca, de uma única ninhada, utilizando técnicas de eletroforese e avaliação da atividade proteolítica, demonstrando assim que a peçonha de fêmeas possui um perfil eletroforético mais homogêneo e uma maior atividade proteolítica sobre a caseína, quando comparada com a peçonha dos machos. Zelanis (2011) em uma análise proteômica demonstrou que a porcentagem de toxinas na peçonha de Bothrops jararaca possui variações dependentes do sexo e da idade das serpentes. Metaloproteases por exemplo, estão presentes na porcentagem de 53,2% nos filhotes, 29,9% nas serpentes adultas, 25,4% em adultos machos e 33,1% em fêmeas adultas; já as serinoproteases estão presentes na porcentagem de 3,3% nos filhotes, 8,1% nos adultos, sendo 8,6% nos adultos machos e 7,7% em fêmeas adultas. Em relação às CRISPs que serão abordadas posteriormente, foi demonstrado que as maiores porcentagens são encontradas nos filhotes (2,7%) e nas fêmeas adultas (1,5%) (ZELANIS, 2011). Uma análise transcriptômica da glândula da serpente Bothrops jararaca demonstrou 1,6% de CRISPs; 53,1% de metaloproteases; 28,5% de serinoproteases; 0,5% de LAAOs;
8,3% de lectina tipo-C; 0,7% de PLA2; 0,9% de inibidor de PLA2;6,2% de precursor de peptídeo potenciador de bradicinina (PPB) e 0,2% de svVEGF (fator de crescimento vascular endotelial de peçonha de serpentes) do total de transcritos (CIDADE et al., 2006). Toxinas presentes em peçonhas de serpentes já foram descritas como agentes terapêuticos. No caso da serpente Bothrops jararaca, um peptídeo potenciador de bradicinina foi descoberto através do estudo do envenenamento desta serpente, dando origem ao fármaco captopril utilizado para tratar a hipertensão (CUSHMAN, ONDETTI, 1991). Porém devido a escassez da peçonha e suas variações de composição, a alternativa foi sintetizar uma substância com a mesma fórmula da toxina para a produção do medicamento em massa. Peçonhas de serpentes são ricas em compostos bioativos, os quais podem ser estudados e posteriormente contribuírem para o desenvolvimento de novos fármacos, entretanto a ação conjunta das toxinas que compõem a peçonha de animais pode exercer intoxicação e afetar o sistema fisiológico de um indivíduo, não sendo adequada para o uso terapêutico (KOH; ARMUGAN; JEYASEELAN, 2006). A maioria das toxinas já descritas, isoladas da peçonha de Bothrops jararaca pertencem às classes das fosfolipases, metaloproteases e serinoproteases, sendo que até o presente momento não há dados na literatura referentes ao isolamento de uma CRISP da peçonha de Bothrops jararaca.
1.5. Proteína secretada rica em cisteína (CRISP) de peçonha de serpentes As CRISPs são proteínas amplamente distribuídas entre mamíferos, répteis e anfíbios. Apresentam massa molecular entre 20 e 30 kDa e uma sequência homóloga de aminoácidos contendo 16 resíduos de cisteína conservados que formam 8 pontes dissulfeto, sendo que dez desses resíduos de cisteína estão localizados na sua porção C-terminal (YAMAZAKI, MORITA, 2004; GUO et al., 2005). O nome CRISP é devido ao conjunto de resíduos de cisteína que residem na sua porção C-terminal, formando um domínio compacto (EBERSPAECHER et al., 1995). Com base em algumas estruturas tridimensionais já estudadas, as CRISPs apresentam dois domínios: o domínio N-terminal e o domínio C-terminal rico em cisteína (CRD) (GIBBS, O‟ BRYAN, 2007). O domínio N-terminal faz parte da superfamília de proteínas CAP (CRISPs, Antigen 5, Pathogenesis Related (PR-1) Proteins) e está envolvido na formação de uma estrutura em forma de fenda formando um sítio ativo que contém três pontes dissulfeto intramoleculares (HENRIKSEN et al, 2001; SHIKAMOTO et al., 2005), no entanto a função deste domínio ainda não está bem definida. Sabe-se que algumas CAPs estão relacionadas com agentes antifúngicos em plantas (NIDERMAN et al., 1995) e significantes alergenos em humanos (KING et al., 1978; LU et al., 1993). Já o domínio CRD contém duas sub-regiões, uma região dobrável composta por duas pontes dissulfeto cruzadas que formam um elo com o domínio CAP, e a região reguladora de canais iônicos (ICR) (GUO et al.,2005; SHIKAMOTO et al., 2005; GIBBS et al., 2006), a qual parece ser essencial para a atividade de bloqueio de canais dessas proteínas (WANG et al., 2005, 2006; ZHOU et al., 2008; SHIKAMOTO et al., 2005; GUO et al., 2005; GIBBS et al., 2006). A região N-terminal é mais conservada quando comparada com outras regiões da CRISP (OSIPOV et al., 2005). São proteínas de natureza básica, com exceção de uma CRISP (CRVP-25h-A) isolada da peçonha de Naja haje (OSIPOVet al., 2005), a qual apresenta caráter ácido. As CRISPs encontradas nos mamíferos estão distribuídas em 4 classes baseando-se na similaridade da sequência dos aminoácidos (CRISP 1; CRISP 2; CRISP 3 e CRISP 4 (KRATZSCHMAR et al., 1996; JALKANEM et al., 2005), porém autores como Sunagar e colaboradores (2014) descreveram somente três tipos, pelo fato da CRISP 4 ter sido descrita somente em ratos. A CRISP foi identificada pela primeira vez em epidídimo de mamíferos e recebeu o nome de glicoproteína epididimal ácida (AEG), também conhecida como CRISP 1 (KIERSZENBAUM et al., 1981), podendo ser encontrada também nos testículos, sendo sua função sugerida como maturação do esperma (KASAHARA et al., 1989) e inibição da fusão dos gametas (ELLERMAN et al., 2002). Estudos demonstraram que a CRISP 1 quando incubada com gametas de camundongos, ratos e humanos, seja ela nativa ou recombinante, é capaz de se ligar na superfície do ovo impedindo a fusão dos gametas (COHEN et al., 2000b, 2001; ELLERMAN et al., 2002), porém a CRISP 1 não afeta a ligação dos gametas, sugere-se que ela possui ação em eventos subsequentes que levam à fusão (COHEN, ELLERMAN, CUASNICU, 2000a, COHEN et al., 2001). Em experimentos com a epididymal sperm protein DE isolada por Cameo e Blaquier (1976) semelhante às outras CRISPs 1, foi demonstrado que as pontes dissulfeto são necessárias para a atividade biológica da proteína, pois quando a proteína foi reduzida e alquilada para evitar a restauração das pontes dissulfeto, observou-se a diminuição da capacidade da proteína de inibir a fusão dos gametas (ELLERMAN et al., 2002). Estudos mais recentes também demonstraram que a CRISP 1 de humanos pode ser futuramente considerada um método imunocontraceptivo, pois a imunização com a proteína em primatas produziu um elevado título de anticorpos, os quais demonstraram capacidade de entrar no trato reprodutivo masculino e também de se ligar às células in vivo, podendo assim interferir no processo de fertilização (ELLERMAN et al., 2010). A CRISP 2, também conhecida como TPX-1 e testis-specific protein 1 (KASAHARA et al., 1989) é expressada somente nos testículos, produzida e secretada a partir de células espermatogências nos vários estágios de diferenciação, a qual pode estar envolvida com a interação entre células espermatogênicas e células de Sertoli, pois observou-se uma redução de 50% na interação dessas células na presença de um anticorpo anti- TPX-1 (MAEDA, 1998), sendo esta interação necessária para que as células espermatogências se diferenciem, uma vez que as células de Sertoli proporcionam todas as condições necessárias para que ocorra a diferenciação de células durante a espermatogênese (FRANÇA, RUSSELL, 1998). Em uma análise de estrutura-função foi observado que resíduos de aminoácido da porção N- terminal dessa proteína eram suficientes para a atividade de adesão celular, enquanto a região rica em resíduos de cisteína da porção C-terminal eram dispensáveis (MAEDA, NISHIDA, NAKANISHI, 1991). A CRISP 3 (specific granule protein of 28 kDa; SGP 28) (KJELDSEN et al., 1996) indica uma possível relação com a defesa inata do hospedeiro, pois sua distribuição inclui: glândulas salivares (HAENDLER et al., 1993), grânulos de neutrófilos humanos (KJELDSEN et al., 1996), epidídimo, ovário, timo e cólon (KRATZSCHMAR et al., 1996), também pelo fato de sua expressão estar aumentada no câncer de próstata (KOSARI et al., 2002) e na pancreatite crônica (LIAO et al., 2003), no entanto seu papel na fisiopatologia dessas doenças ainda não foi confirmado. Recentemente, a CRISP 3 foi descrita por apresentar uma possível relação com o vírus da hepatite C (VHC), onde constataram que esta proteína inibe a fase inicial da infecção, ou seja, a entrada do vírus na célula hospedeira. Porém o mecanismo pelo qual ocorre essa inibição ainda não foi definido. Acredita-se que ela pode se ligar ao envelope do vírus impedindo assim sua fixação à receptores da célula hospedeira, ou pode se ligar a superfície da célula hospedeira interferindo com o processo de endocitose do vírus (LEE et al., 2014). A CRISP 4 isolada de ratos é expressada exclusivamente no epitélio do epidídimo de uma forma andrógeno dependente que começa na puberdade juntamente com a maturação do esperma. Possui alta similaridade com a CRISP-1 de humanos, podendo estar envolvida nos mesmos processos, porém a comparação dos padrões de expressão das CRISPs entre ratos e humanos torna-se complicado, uma vez que a estrutura dos epidídimos de cada um são diferentes (JALKANEN et al., 2005). A primeira CRISP identificada em répteis foi a Helothermine (HLX), isolada da saliva do lagarto mexicano Heloderma horridum horridum (MOCHCA-MORALES, MARTIN, POSSANI, 1990) responsável por modular canais iônicos, como canais de cálcio e potássio dependentes de voltagem, e receptores rianodina (MORRISSETTE et al., 1995; NOBILE et al., 1994 e 1996). Em relação às serpentes, Yamazaki e colaboradores (2003), isolaram CRISPs de diferentes espécies de serpentes, demonstrando assim que esta proteína possui grande distribuição entre as serpentes das famílias Viperidae e Elapidae de diferentes continentes. Na tabela 2 estão representadas algumas CRISPs isoladas de peçonha de serpentes.
Tabela 2. CRISPs isoladas de peçonhas de serpentes.
Proteína isolada Espécie Referência Ophanin Ophiophagus hannah Yamazaki et al., 2003 catrin-1/ catrin-2 Crotalus atrox Yamazaki et al., 2003 Triflin Trimeresurus flavoviridis Yamazaki et al., 2002b Piscivorin Agkistrodon p. piscivorus Yamazaki et al., 2003 NA-CRVP1/NA-CRVP2 Naja atra Jin et al., 2003 Tigrin Rhabdophis t. tigrinus Yamazaki et al., 2002b Ablomin Agkistrodon blomhoffi Yamazaki et al., 2002b Latisemin Laticauda semifasciata Yamazaki et al., 2002b pseudechetoxin (PsTx) Pseudechis australis Brown et al., 1999 pseudecin (Pdc) Pseudechis porphyriacus Yamazaki et al., 2002a Stecrisp Trimeresurus stejnegeri Tu et al., 2004 TJ-CRVP Trimeresurus jerdonii Jin et al., 2003 CRVP-25h-A Naja haje Osipov et al., 2005 CRVP-23K Naja kaouthia Osipov et al., 2005 CRVP-24K Naja kaouthia Osipov at el., 2005 Inflamin Aipysurus eydouxii Barnwal e Kini, 2013 Natrin Naja atra Wang et al., 2010
Peçonhas de serpentes já demonstraram um potencial como novos agentes para o combate de doenças negligenciadas. Podemos citar a peçonha da serpente Bothrops moojeni, que demonstrou ser capaz de matar as promastigotas, mas não as amastigotas da leishmaniose in vitro devido a ação do peróxido de hidrogênio da L-aminoácido oxidase (LAAO) (TEMPONE et al., 2001) e a peçonha de Bothrops jararaca que demonstrou potencial para inibição do crescimento dos parasitas de Trypanosoma cruzi e de Leishmania major possivelmente relacionado com o comprometimento mitocondrial (GONÇALVES et al., 2002). Adade e colaboradores (2014) testaram a CRISP crovirin isolada da peçonha da serpente Crotalus viridis viridis quanto a sua atividade nos parasitas de Leishmania amazonensis, Trypanosoma cruzie Trypanosoma brucei rhodesiense, e constataram a atividade leishmanicida e tripanomicida principalmente contra as formas intracelulares, podendo então futuramente ser usada para o tratamento da Leishmaniose e da doença de Chagas, uma vez que ela também apresenta baixa toxicidade para as células hospedeiras. Lecht e colaboradores (2015) demonstraram que a CRISP denominada ES-CRISP, isolada da peçonha de Echis carinatus sochureki é capaz de inibir a angiogênese por meio da interação direta com células endoteliais, inibindo alguns fatores reguladores deste processo, podendo contribuir para a compreensão de mecanismos envolvidos na progressão da angiogênese. Em relação a outras possíveis atividades biológicas das CRISPs de serpentes, podemos citar a CRISP patagonin isolada da peçonha de Philodryas patagonienses, a qual demonstrou atividade miotóxica, pois quando injetada em ratos via intramuscular causou danos ao músculo gastrocnêmio, uma atividade ainda não descrita para as CRISPs. Quando administrada uma dose mais elevada, observaram fibras musculares necrosadas com desorganização do material miofibrilar juntamente com edema e uma reação inflamatória, devido à presença de um infiltrado polimorfonuclear, porém não foi observado hemorragia. A injeção de patagonin também não causou danos nos tecidos do cérebro, cerebelo, coração, fígado, baço e pulmão (PEICHOTO et al., 2009). Estudos sugerem que a maioria das CRISPs com funções já descritas estão envolvidas com o bloqueio de canais iônicos. Por exemplo, a helothermine (HLX) de Heloderma horridum horridum bloqueia canais para cálcio (NOBILE et al., 1996) e potássio dependentes de voltagem (NOBILE et al., 1994) e, receptores rianodina (MORRISSETTE et al., 1995). As CRISPs ablomim (Agkistrodon blomhoffi), latisemin (Laticauda semifasciata) e triflin (Trimeresurus flavoviridis) estão relacionadas ao bloqueio de canais para cálcio tipo-L, já tigrin (Rhabdophis t. Tigrinus) não demonstrou essa atividade. Opanin (Ophiophagus hannah), catrin-2 (Crotalus atrox) e piscivorin (Agkistrodon p. piscivorus) possuem uma baixa, mas significante inibição da contração das células do músculo liso devido às altas concentrações de potássio (YAMAZAKI et al., 2002b, 2003). Em relação aos canais CNG (canais dependente de nucleotídeos cíclicos), as CRISPs PsTx (Pseudechetoxin) de Pseudechis australise e Pseudecin (Pdc) de Pseudechis porphyriacus podem atuar como bloqueadoras, enquanto triflin (Trimeresurus flavoviridis), latisemin (Laticauda semifasciata), piscivorin (Agkistrodon piscivorus piscivorus) e tigrin (Rhabdophis t. tigrinus) não bloqueiam esse canal (BROWN et al., 1999; YAMAZAKI et al., 2002a; YAMAZAKI et al., 2003; ZAGOTTA, SIEGELBAUM, 1996). A comparação entre PsTx e Pdc demonstrou que elas se diferem em apenas sete resíduos de aminoácidos e bloqueiam o canal CNG com afinidades diferentes (YAMAZAKI et al., 2002a), o que sugere a existência de uma região específica nessas proteínas que pode ser crítica para a inibição do canal. Estudos demonstraram que algumas toxinas que inibem canais apresentam o resíduo Glu 186. Quando essas toxinas apresentam o resíduo Phe 189 além do Glu 186 elas são consideradas fortes bloqueadoras, porém outros estudos ainda são necessários para confirmar tal suspeita (YAMAZAKI et al., 2003). Estudos com a toxina PsTx demonstraram que ela inibe o fluxo de corrente através dos canais CNG, funcionando como um bloqueador de alta afinidade pelo poro do canal (BROWN et al. (1999); (2003). Yamazaki e colaboradores (2002b) demonstraram que a CRISP ablomin é capaz de bloquear canais para potássio devido à inibição do potencial elétrico, bem como a contração, promovida pela interação de proteínas com receptores. O presente trabalho traz contribuições para o conhecimento mais aprofundado dessa família de proteínas amplamente distribuída, mas pouco caracterizada, e ainda destacar funções como indução do processo inflamatório e modulação do sistema complemento.
1.6. O processo inflamatório e peçonhas de serpentes A inflamação constitui um processo homeostático desencadeado pelo organismo com o objetivo de reduzir a lesão, isolar ou destruir o agente agressor após uma lesão tecidual ou infecção local (LEVY, 1996). Desencadeado o processo inflamatório, ocorre a ativação de mecanismos de reparo necessários para garantir o restabelecimento das funções normais do organismo (ROCHA e SILVA, 1978). A resposta inflamatória aguda pode ser dividida em imunidade inata, não imunológica, englobando os eventos que ocorrem localmente no interior dos tecidos, como os eventos vasculares e celulares; e a imunidade adquirida que contribui com a defesa do organismo por meio da produção de anticorpos, células T auxiliares e linfócitos T citotóxicos (TLASKALOVA-HOGENOVA et al., 2005). A imunidade inata é a primeira linha de defesa do organismo contra agentes infecciosos e suas principais células efetoras são os macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, células NK (natural killers), proteínas do sistema complemento e citocinas (CRUVINEL et al., 2010). Macrófagos e neutrófilos possuem receptores responsáveis pelo reconhecimento de moléculas como lipopolissacarídeos, resíduos de manose e ácidos teicóicos, conhecidos como PAMPS (Padrões Moleculares Associados a Patógenos) que estão presentes na superfície dos microorganismos, ativando assim a resposta imune inata e conduzindo a fagocitose dos microorganismos (CRUVINEL et al., 2010; MEDZHITOV, JANEWAY, 1997). Esses receptores também podem ser encontrados nas células dendríticas, as quais são responsáveis pela captura e apresentação de antígenos para os linfócitos, já as células NK reconhecem e lisam células infectadas e também são responsáveis pelo recrutamento de macrófagos e neutrófilos (CRUVINEL et al., 2010). As alterações decorrentes do processo inflamatório são reguladas pela liberação imediata e sequencial de mediadores inflamatórios, os quais são produzidos principalmente por células inflamatórias (SHARMA, BUCHANAN, 1994). Os mediadores são responsáveis por promoverem os sinais característicos da resposta inflamatória: dor, calor, rubor e tumor, que podem vir acompanhados ou não de perda de função do tecido ou órgão afetado (ROCHA e SILVA, 1978). Os mediadores inflamatórios são classificados em: aminas vasoativas (histamina e serotonina), neuropeptídeos, mediadores derivados de lipídios (eicosanoides, leucotrienos e prostaglandinas), óxido nítrico, citocinas e quimiocinas, cascata de proteínas plasmáticas (fatores do complemento) e fator de ativação plaquetária (PAF) (KING, 2007). Em relação à sua liberação, são classificados como intermediários e finais. Mediadores intermediários são liberados no ínicio e durante o processo inflamatório, incluem as citocinas TNF-α e IL-1, a quimiocina IL-8 (CUNHA et al., 2008), fatores do complemento C3a e C5a (JANG et al., 2010), e bradicinina (FERREIRA et al., 1965; TONUSSI, FERREIRA, 1997), sendo responsáveis pela liberação de outros mediadores, sejam eles intermediários e/ou finais. Os mediadores finais são representados pelas prostaglandinas e eicosanoides, responsáveis pela dor (FERREIRA, 1973), tais como: histamina, serotonina, fator de agregação plaquetária (CEVIKBAS, STEINHOFF, IKOMA, 2010) e leucotrienos (CUNHA et al., 2003). As citocinas constituem um grupo de proteínas solúveis de curta atividade, são glicoproteínas e peptídeos produzidos por várias células imunes e células vasculares, que através de uma baixa concentração são capazes de ativar receptores específicos e modular as funções de células e tecidos. Diferentes tipos de células podem secretar algumas citocinas, e uma citocina específica também pode agir em vários tipos de células e desencadear várias atividades biológicas dependendo do tipo de célula, tempo e contexto (HIRANO, 1999). As citocinas podem ser divididas em pró inflamatórias, como é o caso da IL-6, IL-1 e TNF- α, as quais se caracterizam como uma potente defesa contra patógenos exógenos; e as citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10 que são importantes para a regulação do processo inflamatório e manutenção da homeostasia do organismo (HOWARD et al., 1993). Concomitantemente com os eventos celulares, ocorrem os eventos vasculares que compreendem a vasodilatação e o aumento da permeabilidade da vênula com consequente exsudação plasmática, promovendo um aumento local da concentração de mediadores de origem plasmática (ROCHA e SILVA, 1978). Inicialmente ocorre uma vasoconstrição, seguida de uma vasodilatação favorecendo o aumento do fluxo sanguíneo no local e promovendo sinais como calor e vermelhidão local. Mudanças estruturais na parede do vaso levam ao aumento da permeabilidade vascular e ao extravasamento de proteínas, evento pelo qual forma o edema (KOWAL-VERN et al., 1997; RANKIN, 2004; ROITT, BROSTOFF, MALE, 1999). Ocorre o aumento da viscosidade do sangue e a redução do fluxo sanguíneo, fazendo com que os leucócitos circulantes no interior do vaso migrem para a periferia, dando início ao processo de migração leucocitária (CONTRAN, KUMAR, COLLINS, 1999). Como dito anteriormente, a vasodilatação decorrente da inflamação faz com que o fluxo sanguíneo diminua, assim as células circulantes colidem mais frequentemente com as células endoteliais ativadas que expressam moléculas de superfície capazes de se ligarem aos leucócitos. Estes são então atraídos para a periferia do vaso e entram em contato com o endotélio (CRUVINEL et al., 2010) e, posteriormente participam da fagocitose e destruição de agentes patogênicos, levando à resolução do processo inflamatório (BROCHE, TELLADO, 2001). A migração dos leucócitos circulantes para o local da inflamação é dependente de moléculas endoteliais e mediadores quimiotáticos (SPRINGER, 1994; WEBER, 2003). Por outro lado, a resposta imune adquirida é estimulada pela exposição a certos agentes, aumentando a capacidade de defesa após cada exposição sucessiva e sempre “lembrando” do agente que o organismo entrou em contato (LAROSA, ORANGE, 2008). A imunidade adaptativa se divide em humoral, na qual anticorpos são secretados pelos linfócitos B, reconhecendo antígenos e os neutralizando, impedindo que infectem outras células, porém este tipo de imunidade atua somente contra patógenos extracelulares e toxinas, e a imunidade adquirida, a qual é mediada por linfócitos T que atuam contra patógenos intracelulares, osquais sobrevivem e se proliferam dentro dos fagócitos, não podendo, portanto, serem alcançados por anticorpos (MESQUITA et al., 2010). Peçonhas de algumas serpentes estão relacionadas com o processo inflamatório. As serpentes do gênero Bothrops apresentam diversos componentes na sua peçonha, que contribuem para os efeitos hemorrágicos e coagulantes (NEIVA et al., 2009; DE
ALVARENGA et al., 2011). As fosfolipases A2 (PLA2) presentes na peçonha são capazes de desencadear alguns efeitos inflamatórios como: aumento da permeabilidade microvascular, recrutamento de leucócitos nos tecidos, nocicepção e liberação de mediadores inflamatórios (TEIXEIRA et al., 2003). As metaloproteases são responsáveis pelos efeitos de origem inflamatória, mediada por metabólitos do ácido araquidônico (prostaglandinas e leucotrienos) no edema induzido pelo envenenamento (TEIXEIRA et al., 2005). Zychar e colaboradores (2010) demonstraram que metaloproteases, fosfolipases e serinoproteases presentes na peçonha de serpentes possuem participação na resposta inflamatória, sendo que a maior ação se deve às metaloproteases, que contribuem para os efeitos inflamatórios locais e nociceptivos. As fosfolipases A2 apresentaram um efeito menor, limitado a nocicepção, já as serinoproteases não contribuíram significativamente para a resposta inflamatória, mas seu papel não deve ser descartado. Em relação às CRISPs, Barnwal e Kini (2013) identificaram a CRISP inflamin a partir da biblioteca de cDNA da glândula da serpente Aipysurus eydouxii. Inflamin foi injetada na cavidade peritoneal de camundongos e demonstrou a ativação de cPLA2 (fosfolipase A2 dependente de cálcio) conduzindo a biossíntese de prostanóides e a indução de edema quando injetada na pata de camundongos. Wang e colaboradores (2010) isolaram a CRISP natrin da peçonha da serpente Naja atra, a qual demonstou atuação na regulação da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais, participando assim do processo inflamatório. Contudo, ainda pouco se sabe sobre a participação das CRISPs no processo inflamatório causado pelo envenenamento por serpentes. Como há outros componentes na peçonha que também participam deste processo, suas funções precisam ser estudadas isoladamente.
1.7. O sistema complemento e peçonhas de serpentes O sistema complemento (SC) consiste em um conjunto de mais de 30 proteínas que interagem com outras moléculas do sistema imune de uma maneira altamente regulada para gerar componentes ativos com funções de promover a inflamação e destruir microorganismos invasores (WAGNER; FRANK, 2010; WALPORT, 2001). Suas proteínas são sintetizadas principalmente nos hepatócitos e nos monócitos (BURGER, 1988; COLE, COLTEN, 1988), já proteínas reguladoras ligadas à membrana são sintetizadas nas células que são expressas (CAMPBELL, 1988). A ativação do SC leva à formação de produtos de clivagem, como as anafilatoxinas C3a e C5a, que são importantes na iniciação da resposta inflamatória contra microorganismos invasores e na quimiotaxia dos leucócitos (HAAS, STRIJP, 2007). Além das anafilatoxinas, a ativação do sistema complemento também leva à formação do MAC (membrane attack complex), através da ligação de C5b a C6 e posteriormente a ligação com as últimas proteínas do SC (SIM, 1992). A ativação do sistema complemento pode ocorrer por três vias distintas dependendo do estímulo, são elas: via clássica (VC), via alternativa (VA) e via das lectinas (VL) (WAGNER; FRANK, 2010) (Fig. 2). Na via clássica (VC) um antígeno e um anticorpo específico (IgM ou IgG) se interagem formando um imunocomplexo que é reconhecido pelo componente C1. A ativação da via das lectinas (VL) ocorre pela ligação de uma lectina tipo-C ligante de manose (MBL, mannose-binding lectin) a glicoproteínas ou polissacarídeos encontrados na superfície de microorganismos. A ligação de MBL a serinoproteases circulantes associadas (MASP) forma um complexo que leva à clivagem dos componentes C4 e C2, resultando na geração de uma C3 convertase similar à da VC. A via alternativa (VA) é iniciada por hidrólise espontânea do componente circulante C3, independente do reconhecimento de patógenos por anticorpos. A ligação de proteínas específicas da VA levam a ativação de C3 que irá interagir com polissacarídeos e proteínas de superfície de células alteradas ou microorganismos para gerar o MAC (WAGNER; FRANK, 2010). As três vias tornam-se iguais e segue-se uma via comum quando o complexo C3 convertase é formado. Assim, ocorre a clivagem de mais moléculas de C3 e a formação do complexo C5 convertase que é capaz de clivar moléculas de C5 dando origem aos fragmentos C5a e C5b. Enquanto o fragmento C5a é uma importante anafilatoxina, o C5b se liga às últimas proteínas do SC (C6, C7, C8 e C9), resultando na formação do complexo de ataque à membrana (MAC) (ABBAS, LICHTMAN, PILLAI, 2011). As proteínas C6, C7, C8 e C9 não possuem atividade enzimática, apenas fazem parte da estrutura de formação do MAC, que se deposita na superfície das células, onde forma poros permitindo a livre passagem de água e íons, resultando no aumento do volume osmótico e a consequentemente ruptura das células (CARROLL; SIM, 2011). O sistema complemento é caracterizado como uma cascata enzimática capaz de gerar complexos que estão envolvidos com a anafilaxia, quimiotaxia, opsonização, remoção de imunocomplexos e a modulação da resposta imune (WALPORT, 2001). É fundamental que haja uma regulação precisa desse sistema a fim de evitar o consumo exagerado de proteínas do complemento e a ocorrência de danos às células hospedeiras, portanto paralelo à ativação do SC ocorre também o processo de regulação. A regulação pode ocorrer por meio de fatores plasmáticos, como o fator C4b Binding Protein (C4BP) que atua na via clássica e na via das lectinas; o Fator H (FH) que atua na via alternativa, os quais impedem a continuidade das três vias, pois aceleram o decaimento das C3 convertases e atuam como co-fatores do Fator I (FI) na clivagem dos fragmentos C3b e C4b (BLOM et al., 2002; MORGAN, HARRIS, 1999; RODRÍGUEZ DE CÓRDOBA et al., 2004), e também por meio de reguladores presentes na membrana das células, como o complement receptor 1 (CR1), o membrane co-factor protein (MCP), que atuam como co- fatores do Fator 1 na clivagem dos fragmentos C3b e C4b; o decay accelerating factor (DAF), responsável pelo decaimento de C3 e C5 convertase e a protectina (CD59) que inibe a incorporação do C9 ao complexo que posteriormente formaria o MAC (KIM; SONG, 2006).
Figura 2. Vias de ativação do sistema complemento (WAGNER; FRANK, 2010).
Alguns compostos das peçonhas de animais são capazes de modular o sistema complemento, seja pela clivagem direta de um componente específico ou pela formação de complexos capazes de ativar a cascata do complemento (DIAS DA SILVA et al., 1995), porém essa atividade ainda é pouco estudada. A literatura nos mostra alguns exemplos de toxinas ou peçonhas que possuem atividades sobre o sistema complemento. A serinoprotease flavoxobin, isolada da peçonha da serpente Trimeresurus flavoviridis demonstrou ser capaz de ativar o sistema complemento, atráves da clivagem da molécula de C3 em dois fragmentos (YAMAMOTO et al., 2002). A glicoproteína oxiagin da peçonha de Naja oxiana demonstrou através de ensaios, que inibe a lise de eritrócitos e a formação da C3 convertase, pois impede a interação de C2 com C4b (SHOIBONOV et al., 2005). Já a peçonha de Crotalus atrox demonstrou ser capaz de gerar anafilatoxinas C3a a partir do componente C3 e C5a a partir dos componentes C5 (MAN, MINTA, 1977). Pidde-Queiroz e colaboradores (2013) demonstraram que a metaloprotease P-I de Bothrops pirajai ativa preferencialmente a via clássica do sistema complemento pela clivagem direta dos componentes C3, C4 e C5, gerando fragmentos biologicamente ativos. Na literatura não encontramos estudos de CRISPs relacionadas com o sistema complemento, sendo assim é de grande importância o seu isolamento e a caracterização funcional, bem como os estudos sobre o processo inflamatório e sobre a modulação do sistema complemento.
1.8. Canais iônicos e toxinas animais Os canais iônicos são formados por glicoproteínas de membrana que permitem a passagem seletiva de íons através de um poro. Esses canais respondem a estímulos elétricos, químicos, mecânicos, alterações da concentração de ligantes (neurotransmissores, peptídeos e hormônios) e mudanças de voltagem (HILLE, 1992). Canais iônicos sensíveis à voltagem são responsáveis pela geração e propagação de sinais elétricos em neurônios e outras células excitáveis; mudam sua conformação (abertos, fechados ou inativos) em função do potencial de membrana. Assim, ocorre a despolarização ou repolarização da membrana devido à passagem de correntes iônicas para dentro ou para fora das células (CATTERALL, 1984). Os canais para cálcio (Ca+) dependentes de voltagem estão presentes no sistema nervoso, endócrino e cardiovascular. Atuam regulando processos intracelulares, como: neurotransmissão e expressão gênica, liberação de hormônios e contração da musculatura cardíaca por meio do influxo do íon cálcio em resposta a despolarização da membrana (McDONOUGH, 2007). São canais formados por uma subunidade α1 tetramérica, responsável pela formação do poro do canal e por várias subunidades reguladoras que são responsáveis pelas propriedades eletrofisiológicas e cinéticas do canal (BELEBONI et al., 2004, ESCOUBAS, DIOCHOT, CORZO, 2000). Os canais para sódio (Na+) dependentes de voltagem são responsáveis pela geração e propagação do potencial de ação. São encontrados na maioria das células excitáveis (BELEBONI et al., 2004). São constituídos por proteínas transmembrana compostas de uma subunidade α e pelo menos 3 subunidades β. A subunidade α é o local onde existem sítios receptores para os agentes farmacológicos que agem nesse tipo de canal. As subunidades β são responsáveis pela dependência de voltagem e pela cinética de abertura do canal (CESTÈLE, CATTERALL, 2000). Os canais para potássio (K+) são proteínas que permitem o movimento de íons K+ através da membrana plasmática (JAN, JAN, 1992). Quatro tipos distintos de canais de K+ são identificados no músculo liso arterial, entre eles: canais para potássio sensíveis ao cálcio
(Kca), canais para potássio dependentes de voltagem (Kv), canais de potássio de retificação interna (Kir) e os canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP). Canais para potássio dependentes de voltagem (Kv) são importantes em alguns processos fisiológicos, como: ativação de linfócitos, liberação de neurotransmissores e excitabilidade celular (GUTMAN et al., 2005), são capazes de regular o potencial de membrana do músculo liso em resposta à estímulos despolarizantes, promovendo a repolarização do potencial de ação nas células excitáveis (NELSON, QUAYLE, 1995). Os canais para potássio são formados por mais de 40 tipos diferentes de canais, e classificados de acordo com sua homologia na sequência de aminoácidos em pelo menos 12 subfamílias (Kv1-Kv12) (GUTMAN et al., 2005). A subfamília Kv1 (Shaker) e seus subtipos (Kv1.1-Kv1.8) são os mais estudados, e encontrados no cérebro, coração, rim, pâncreas, pulmão, sistema nervoso periférico, retina, linfócitos, osteoclastos e células hematopoiéticas. A subfamília Shaw (Kv3.1-Kv3.4) pode ser encontrada principlamente no cérebro e interage com toxinas de anêmonas do mar. A subfamília Kv7 (Kv7.1-Kv7.5) é encontrada no coração, músculo esquelético e sistema nervoso central. Já a subfamília hERG (Eag) (Kv10, Kv11, Kv12) é pouco estudada, e encontrada principlamente no sistema nervoso central (MOUHAT et al., 2008). As toxinas animais possuem alta especificidade por certos subtipos de canais iônicos ou receptores de membrana. Como existem poucas drogas com ação específica sobre canais iônicos, esse mecanismo de ação das toxinas animais serve como ferramenta para elucidar o papel fisiológico ou patologias relacionadas aos canais iônicos e receptores de membrana (HARVEY et al., 1998). Existem dois mecanismos nos quais as toxinas animais atuam nos canais iônicos dependentes de voltagem. A toxina pode se ligar em alguma região do canal provocando mudanças conformacionais que alteram a abertura, fechamento e inativação do canal (WANG, STRICHARTZ, 1983), ou a toxina pode se ligar na porção extracelular do canal, causando obstrução do poro condutor e impedindo o fluxo de íons (GARCIA et al., 1991). A peçonha de aranhas do gênero Lasiodora já foi descrita com ações farmacológicas, como o bloqueio do canal para cálcio (Ca2+) do tipo-L e alteração da cinética e voltagem de canais para sódio (Na+) (KUSHMERICK et al., 2001). Alguns exemplos de toxinas de aranhas ativas em canais para sódio (Na+), são as μ-agatoxinas (μ-Aga I a μ-Aga VI), isoladas da peçonha da espécie Agelenopsis aperta (SKINNER et al., 1989). A toxina Argiotoxina 636 (Argiope sp.), que é capaz de inibir canais para potássio dependentes de ligantes e dependentes de voltagem (LEE, JOHN, WEISS, 1999). E a toxina denominada stromatoxina (ScTx1) isolada da peçonha da aranha caranguejeira africana Stromatopelma calceata (ESCOUBAS et al., 2002), que é um potente inibidor de canais para potássio dos subtipos Kv4.2 e Kv2.2. Toxinas presentes na peçonha do escorpião Tityus serrulatus também já foram descritas pela capacidade de atuar em canais para potássio (K+), como: Ts6, Ts7, Ts8, Ts9 e Ts15 (COLOGNA et al., 2001, MARCUSSI et al., 2011). As toxinas IpTxA e IpTxi (Pandinus imperator) isoladas por Valdivia e Possani (1998), e a toxina maurocalcina (Mca) do escorpião Maurus palmatus, isolada por Fajloun e colaboradores (2000) são exemplos de toxinas específicas para canais de cálcio (Ca+), elas ativam o receptor de rianodina (Ryr), um canal de liberação de cálcio intracelular. As toxinas escorpiônicas que atuam em canais para sódio (Na+) são divididas em dois grupos de acordo com seus efeitos farmacológicos, as toxinas α que agem diminuindo ou bloqueando o mecanismo de inativação desses canais, e as toxinas β que afetam a ativação do canal (JOVER, COURAUD, ROCHAT, 1980; COURAUD et al., 1982; CATTERALL , 1986). Em relação às serpentes, a toxina crotamina isolada da peçonha da serpente Crotalus durissus terrificus, demonstrou atividade sobre canais de sódio (Na+) dependentes de voltagem (CHEYMOL, 1978a, 1978b; CHANG, TSENG, 1978). Ainda na peçonha de Crotalus durissus terrificus, a toxina isolada crotoxina demonstrou ser capaz de modular a corrente em canais de cálcio do tipo-L (ZHANG et al., 2010). Em relação às CRISPs, a toxina Natrin purificada da peçonha de Naja atra é conhecida por bloquear canais para potássio do subtipo Kv1.3 (WANG et al., 2006) e também canais para potássio ativados por cálcio (BKCa) (WANG et al., 2005). Yamazaki e colaboradores (2003) testaram a atividade de algumas CRISPs (ophanin, piscivorin, catrin-1 e catrin-2) sobre a contração da artéria caudal de ratos, e observaram que as CRISPs ophanin, piscivorin e catrin-2 demonstraram uma inibição dos canais para potássio em diferentes graus.
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