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Bitis Arietans Venom Gland Cdna Library: a Putative Intermediate in the Evolution of the Long-Chain Disintegrin Bitistatin……………………………………..……47

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Bitis Arietans Venom Gland Cdna Library: a Putative Intermediate in the Evolution of the Long-Chain Disintegrin Bitistatin……………………………………..……47 VENÓMICA. MECANISMOS MOLECULARES Y EVOLUTIVOS DE LA DIVERSIFICACIÓN ESTRUCTURAL DE LA FAMILIA DE LAS DISINTEGRINAS TESIS DOCTORAL DE PAULA JUÁREZ GÓMEZ DIRIGIDA POR EL DR. JUAN JOSÉ CALVETE Y LA DRA. LIBIA SANZ D. Juan José Calvete Chornet, Doctor en Biología y Profesor de Investigación en el Instituto de Biomedicina de Valencia, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y Dª Libia Sanz Sanz, Doctora en Química CERTIFICAN: Que Paula Juárez Gómez, licenciada en Biología por la Universitat de València, ha realizado bajo su dirección el trabajo de Tesis Doctoral que lleva por titulo “Venómica. Mecanismos moleculares y Evolutivos de la diversificación estructural de la familia de las disintegrinas”. En Valencia, a 9 de enero de 2007 Dr. Juan José Calvete Chornet Dra. Libia Sanz Sanz Dpto. de Proteómica Estructural Dpto. de Proteómica Estructural Instituto de Biomedicina de Valencia Instituto de Biomedicina de Valencia A mi familia y amig@s AGRADECIMIENTOS/ ACKNOWLEDGEMENTS Parece que ha llegado el momento de dar gracias a toda la gente que ha hecho posible que esta Tesis haya salido adelante… empezaré por mi familia, sin ellos no estaría aquí delante de todos defendiendo mi trabajo. He tenido en casa el mejor ejemplo de tenacidad, espíritu de superación e ilusión, valores muy importantes a la hora de trabajar en un laboratorio. Siempre me he sentido respaldada en mis decisiones y me han animado cuando han venido “vacas flacas”, incluso cuando no entendían el porqué de mis quejas!. Mis padres han sido, y serán, un pilar en mi vida que junto a mi hermano Alex, tías, tío, primos y abuelas forman mi hogar. Me siento muy orgullosa y afortunada de la familia que tengo. Aquí aprovecho para dar las gracias especialmente a mi iaia Alejandra. Ella es mi ejemplo de bondad y coraje. Te echo de menos. Espero llegar a alcanzar lo que ella deseaba para mí. Os quiero. Si ahora tuviera que nombrar a todas las personas que han estado implicadas en esta andadura no acabaría nunca pero empezare por Manolo Portolés e Inma Azorín del Centro de Investigación de La Fe que fueron mi primer contacto con la poyata y me dieron el empujón que necesitaba para tomar la decisión crucial, pero muy acertada, de dar el salto al CSIC. Cuando doy las GRACIAS al IBV lo hago en mayúsculas porque tanto a nivel científico como personal este centro está por encima de la media, mejor dicho, se sale!. Gracias a las chicas de administración, las de la limpieza (Luisa y Susi que siempre me suben la moral!), Amparo, Paco, Nacho, Manolo, los de seguridad (que sería de mi sin Yolinda!), al Sr. Cubells y sus eventos y a nuestra Sra. Gerente. En cuanto al personal científico… que puedo decir! A lo largo de estos años creo que he usado algo de alguno de los 11 laboratorios del centro y a todos os doy las gracias por vuestra ayuda. En especial quiero agradecer al lab de la Dra. Casado por las PCRs, cuantificaciones, enzimas y consejos y al del Dr. Sanz por el electroporador y placas de última hora. A nivel personal quiero dar las gracias a Juanjo y Libia, no sólo por los conocimientos científicos que he aprendido de ellos sino por introducirme el gusanillo de querer saber más y más. Me han tratado casi como una hija (ja, ja), incluso ha habido épocas que los he visto más que a mis verdaderos padres!. Si todo mi trabajo ha salido adelante a sido gracias también a Alicia. Ella ha sido mi confidente y mis manos en el labo cuando he estado fuera. Celso empezó este camino conmigo, hemos compartido risas y gruñidos. Vas a ser un Gran Jefe!. Miguel llegó justo a tiempo para equilibrar la guerra de sexos en el labo, aunque luego se ha decantado hacia los XY por la vuelta de Pepe y el último en llegar, Pedro, que estoy segura que va a disfrutar/aprender mucho. Toda la gente que ha pasado por mi labo ha dejado un poquito de ellos mismos en esta Tesis y a todos vosotros os doy las gracias. Sabía que llegado el momento de daros las gracias a vosotros mis compañeros, y sin embargo amigos, me quedaría sin palabras. Son tantas emociones compartidas: alegría, tristeza, frustración, optimismo… Laia, nunca olvidaré las carreras por la 5ª Av., el margarita en el Village y las confesiones por el messenger. Santi, gracias por escucharme, pero también por aguantar mis silencios. Cintia, por mucho que te empeñes no me engañas, eres todo ternura y ahora te ha llegado el momento de demostrarlo!!. Hemos compartido muchas risas y alguna que otra lagrimita y aunque me ponga sentimental sabéis de sobra que os quiero y que siempre me tendréis para lo que queráis. Gracias a Sandra y Pili por hacerme participe de vuestra faceta de mamás, a Amalia (recuerda lo mucho que vales!), a Belén (viva Robbie!), mis chic@s del 3º que valen su peso en oro, en especial MC-Ada-Leda-Leo-Jose LL.-Fer-Jose G.-Mariano, vuestras sonrisas y algún que otro piropo me han animado más de un día gris. Gracias Marta por los achuchones y por tener tu puerta siempre abierta para mí. A los que ya no están por aquí: Mª Paz, Rafa y Kiko (espero que cumplas y cuando seas jefe me guardes un hueco en tu lab! Gracias por intentar comprenderme, tarea ardua y complicada!!). Fuera de estas cuatro paredes esta mi “otro mundo”. Mis amigos han sido mi válvula de escape a tanta ciencia, aunque mis BioCompis no han tenido escapatoria y en algún momento he tenido que tirar de su ayuda para mis experimentos. Gracias Txa, Silvi-David, Dani, Vicente- Sandra, Gsus-Alba, Pepe y Mer. ¡Menos mal que nos quedaban 4 días en el convento! Ja, ja. Gracias Juanma-Marisol, Ana, Luisito, Paula y Moni. Las que a la fuerza han acabado entendiendo que es eso del veneno de las serpientes han sido mis amigas Belén, Sara, Ampa, Amparo, Bárbara, Ilona (quina paciència mare!), Carmen, Irene, Lorelai, Luisa y Sara. Elisabet y Eva, habéis sido mi mejor apoyo y compañía en Liverpool’06. A toda la gente que he tenido la suerte de conocer en mis estancias (Philly’03 y Liverpool). Ellos hicieron de vivir en el extranjero una aventura personal además de profesional. Todos ellos han tenido que aguantar mis “rollos” más de una vez, así que ahora es el momento de decir GRACIAS de todo corazón. Of course I would like to thank people from Venom Unit in The School of Tropical Medicine in Liverpool. Thanks Rob and Dave for giving me the chance to work in your lab and introducing me to the exciting world of Snake Venoms! I have enjoyed every minute I’ve spent with you. Even after our first meal together you wanted me in your lab! Thanks Si for all your brilliant knowledge about molecular biology and bioinformatics, without your help I couldn’t have done it. I can’t miss Jen, Gav, Daz, Paul, Helen and Fran, all of them were very helpful and cheered me up when things weren’t going well. I can say very proudly that more than colleagues I’ve got good friends over there. Mary and Amanda’s smiles have been a good reason to return to the Pool. I’d like to extend my gratitude to Kelly, Clare, AGRADECIMIENTOS/ ACKNOWLEDGEMENTS Gian, Claudia, Dee, Lee, Isabella, people from Dr. Bates’ lab, especially Davina, the porters and all the DTMH’06 gang. To all of you, many many thanks! ¡GRACIAS A TOD@S! Paula Índice Página 1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………............3 1.1. Las serpientes……………………………………………………………………………………………5 1.2. Composición del veneno………………………………………………………………..............9 1.3. Proteínas del veneno de serpientes de la familia Viperidae………….10 1.4. La familia de las disintegrinas………………………………………………………..…..18 2. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………..……..27 2. MATERIALES Y MÉTODOS. RESULTADOS……………………….……………....31 2.1. ARTÍCULO 1 Snake venomics: characterization of protein families in Sistrurus barbouri venom by cysteine mapping, N-terminal sequencing and tandem mass spectrometry analysis…………………………………………………………………………………………..33 2.2. ARTÍCULO 2 Molecular cloning of disintegrin-like transcript BA-A5 from a Bitis arietans venom gland cDNA library: a putative intermediate in the evolution of the long-chain disintegrin Bitistatin……………………………………..……47 2.3. ARTÍCULO 3 Molecular cloning of Echis ocellatus disintegrins reveals non-venom- secreted proteins and a pathway for the evolution of Ocellatusin……………59 3.4. ARTÍCULO 4 Loss of introns along the evolutionary diversification pathway of snake venom disintegrins evidenced by sequence analysis of genomic DNA from Macrovipera lebetina transmediterranea and Echis ocellatus...........73 1 Índice 3. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………………..…..87 4.1. Venómica: caracterización proteómica de venenos de serpientes……...92 4.2. Transcriptómica: caracterización de cDNAs de disintegrinas………….100 4.2.1. Bitis arietans: BA-5A, un intermediario PIII-PII 4.2.2. Echis ocellatus 4.2.2.1. Disintegrinas diméricas 4.2.2.2. Dos precursores de la disintegrina corta ocellatusin 4.3. Genómica: estructura de los genes de disintegrinas diméricas y cortas…………………………………………………………………………………………………………………… 107 4. ANEXOS……………………………………………………………………………………………………….111 4.1. TRABAJO 1 Snake venom disintegrins: evolution of structure and function……………….113 4.2. TRABAJO 2 cDNA cloning and functional expression of Jerdostatin, a novel RTS- disintegrin from Trimeresurus jerdonii and a specific antagonist of the α1β1 integrin…………………………………………………………………………………………………….…..127 5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………..…..139 6. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………….143 2 Introducción 1. INTRODUCCIÓN 3 Introducción 4 Introducción 1.1 LAS SERPIENTES La inmensa mayoría de las cerca de 3000 especies de serpientes actuales no son venenosas, y -como se discutirá más adelante- los varios cientos de especies de ofidios potencialmente peligrosos para el hombre albergan en sus glándulas del veneno un arsenal químico, cuya composición y acción biológica han sido refinadas a lo largo de millones de años de evolución y que representa tanto un arma mortífera para la presa como una farmacopea natural cuyo enorme potencial biotecnológico y clínico está siendo activamente explorado en laboratorios de todo el orbe (Menez 2002; Menez et al.
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