Tesis Doctoral
Estudios embriológicos sobre algunas gramíneas nativas útiles (Poaceae) presentes en la Depresión del Salado, provincia de Buenos Aires, Argentina
Lovisolo, Marcelo R. 2011
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
Estudios embriológicos sobre algunas gramíneas nativas útiles (Poaceae) presentes en la depresión del salado, Provincia de Buenos Aires, Argentina
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el Área CIENCIAS BIOLÓGICAS
Marcelo R. Lovisolo
Directora: Beatriz G. Galati Directora Asistente: Zulma E. Rúgolo de Agrasar Consejera de Estudios: Patricia Hoc
Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Buenos Aires, Junio de 2011
1 ESTUDIOS EMBRIOLÓGICOS SOBRE ALGUNAS GRAMÍNEAS NATIVAS
ÚTILES (POACEAE) PRESENTES EN LA DEPRESIÓN DEL SALADO,
PROVINCIA DE BUENOS AIRES, ARGENTINA.
Resumen: El objetivo general de este trabajo fue estudiar el desarrollo del grano de polen, del megagametófito, el endosperma y el embrión, como así también la anatomía de las estructuras esporofíticas relacionadas con estos procesos, en diez taxones de Poaceae, correspondientes a las tres subfamilias (Pooideae, Chloridoideae y Panicoideae) más ricamente representadas en la región de la depresión del Salado, Provincia de Buenos Aires. Los objetivos particulares fueron: ‹ Describir la Microsporogénesis y la Microgametogénesis. ‹ Realizar el estudio ontogenético ultraestructural de los cuerpos de Ubisch con el fin de aportar datos que ayuden a dilucidar su posible función y participación en la formación de la pared del grano de polen. ‹ Describir la Megasporogénesis y Megagametogénesis. ‹ Realizar el estudio ultraestructural del saco embrionario pre- y post-fertilización, a fin de aportar datos sobre el rol que cumplen las antípodas. ‹ Describir la Endospermogénesis, la Embriogénesis, el desarrollo total de los tegumentos seminales y las capas del pericarpio del fruto. ‹ Realizar el estudio anatómico del óvulo y del microsporangio. ‹ Relacionar las características embriológicas particulares de los taxones con las subfamilias a las cuales pertenecen.
Todas las especies estudiadas, a excepción de Paspalidium geminatum, presentan un desarrollo normal del grano de polen, el cual se libera en estadio tricelular. La ontogenia del megagametófito corresponde al tipo Polygonum, con antípodas haustoriales bien desarrolladas y en número variable de acuerdo a las especies. En Paspalidium geminatum se observó la formación de varios gametófitos femeninos en distintos estadios de desarrollo en un mismo óvulo. En Stenotaphrum secundatum y Melica brasiliana son pocos los óvulos que forman megagametófitos viables, y una gran cantidad de óvulos abortivos fue observada. Por lo tanto, estas tres especies podrían tener una tendencia a un desarrollo de tipo apomíctico. El presente trabajo constituye un aporte original debido a que nada se conocía previamente sobre la embriología de estas especies nativas de Argentina. También representa una contribución a favor del desarrollo socio-económico del país, pues aporta información sobre la reproducción de algunas gramíneas útiles, nativas de una zona relevante desde el punto de vista de la producción agropecuaria en la Provincia de Buenos Aires. Dichos datos podrán ser de aplicación para proyectos donde genetistas y otros investigadores se dediquen al mejoramiento de pastizales. Palabras claves: Poaceae, embriología, microsporogénesis, microgametogénesis, orbículas, polen, megasporogénesis, megagametogénesis, endospermogénesis, embrión, fruto.
2 EMBRYOLOGICAL STUDIES OF SOME USEFUL NATIVE GRASSES
(POACEAE) PRESENT AT THE SALADO RIVER DEPRESSION, PROVINCE OF
BUENOS AIRES, ARGENTINA.
Abstract: The general goal of this work was to study the development of the pollen grain, the megagametophyte, the endosperm and the embryo as well as the anatomy of the sporophytic structures involved in these processes in ten taxa of the three subfamilies of Poaceae (Pooideae, Chloridoideae and Panicoideae) most richly represented in the region of the depression of the Salado river, Province of Buenos Aires. The particular objectives were to: ‹ Describe both Microsporogénesis and Microgametogenesis. ‹ Fulfil the anatomical study of the ovule as of the microsporangium. ‹ Study the ultra-structural ontogeny of the Ubisch bodies in order to contribute data that would help to dilucidate their feasible function and participation in the development of the pollen grain wall. ‹ Describe both Megasporogenesis and Megagametogenesis. ‹ Carry out the ultra-structural study of the embryo-sac right before and after fertilization with the purpose of contributing to the general knowledge of the performance played by the antipodal cells. ‹ Describe the Endospermogenesis, Embryogenesis as well as the whole development of the seminal teguments and layers of the fruit pericarp. ‹ Relate embryological characteristics of the taxa with the subfamilies to which they belong to.
All the species studied, except Paspalidium geminatum, show a normal development of the pollen grain, which is released in a tri-cellular-stage. The ontogeny of the megagametophyte is of the Polygonum type, with well-developed haustorial antipodal cells and in changeable number according to the species. In Paspalidium geminatum the formation of several female gametophytes in different stages of development within a same ovule were observed. Otherwise, in Stenotaphrum secundatum and Melica brasiliana only a few ovules give rise to viable megagametophytes but instead a great amount of abortive ovules was noted. Therefore, these three species could tend towards an apomictic type of development. The present work constitutes an original contribution since nothing was previously known about the embryology of these native species from Argentina. Moreover, it represents a contribution to the social and economic development of the country due to the information given on the reproduction of some useful grasses, natural from an outstanding region in terms of the farming (and stockbreeding) production of the Province of Buenos Aires. Such data could be used by geneticists and other investigators conducting grass breeding projects. Keywords: Poaceae, embryology, microsporogenesis, microgametogenesis, orbicules, pollen, megasporogenesis, megagametogenesis, genesis of the endosperm, embryo, fruit.
3 AGRADECIMIENTOS
a mi directora de tesis, la Dra. Beatriz G. Galati, que aparte de ser una gran persona, es y será mi gran maestra sobre la embriología vegetal. Agradezco todo su apoyo durante estos años y especialmente a su dedicación, consejos, enseñanzas y sobretodo paciencia;
a mi directora asistente, la Prof. Zulma E. Rúgolo de Agrasar, quien me guió en la determinación, clasificación y herborización de los materiales; correcciones y aportes relevantes sobre la familia Poáceae, quien considero que es una de las referentes mas importante del país especialista en Poaceae y única y mejor discípula de una grande que fue la Lic. Elisa G. Nicora;
a mi consejera de estudios, la Dra. Patricia Hoc, por todo el apoyo que me brindó y especialmente quiero destacar que permitió que realizara en su laboratorio los preparados para microscopía óptica y todas las fotografías que tiene este trabajo;
a la Dra. Elena Ancibor, mi gran maestra en Anatomía Vegetal y referente científico con principios, valores y enseñanzas inolvidables, por compartir esos té de las cinco y charlas que no tenían desperdicio alguno;
al Dr. Ángel Chiesa, profesor titular de la cátedra de Botánica Morfológica, a quien considero parte de mi familia, después de haber compartido 25 años de docencia en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Lomas de Zamora. También le agradezco haberme apoyado todos estos años en la realización de este trabajo;
al Dr. Alberto De Magistris, compañero de cátedra y amigo, que compartimos cursos y viajes de subte y tren tediosos pero anecdóticos, mientras cursábamos la carrera de doctorado;
al Ing. Agr. Amado Bozzo, por sus enseñanzas y anécdotas que compartimos durante los viajes de recolección en la zona de la Depresión del Salado, quien me acompañó siempre voluntariamente. Gran especialista en suelos y con basta experiencia práctica sobre el tema, que desgraciadamente este año ya no está entre nosotros, pero creo que está en el corazón de todos los que lo conocimos;
a la Téc. Isabel Farías, Téc. Gabriela Zarlavsky, Téc. Dante Giménez, Dr. Arquímides Bolondi, Lic. Fabián Tricarico y Dr. Pablo Picca, por el apoyo técnico en la realización de preparados y observación de materiales en microscopía electrónica;
a la Sra. Erica Werner y Sr. Horacio Illarraga, personal de la biblioteca del Instituto Darwinion, que siempre tuvieron una amable atención y predisposición durante mis búsquedas bibliográficas;
a la Dra. Mónica B. Barrios, mi amiga y hermana, por tantos años de aguante y apoyo desde que estudiamos la carrera de grado hasta ahora en nuestros postgrados;
a la Ing. Agr. Silvina Debelis, compañera y amiga, por los viajes compartidos de recolección y asesoramiento sobre la descripción de los suelos de la zona estudiada;
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al Sr. Pablo Thime por su asesoramiento informático y por haberme acompañado en los años que fui Secretario de Investigación y Postgrado de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Lomas de Zamora;
al Ing. Agr. Victor Corcuera, compañero y amigo, y a la Dra. Marina Gotelli que revisaron el inglés del resumen en este trabajo;
a mis compañeras y amigas, Dra. Ana Costas e Ing. Agr. Ana Broccoli.
a mis compañeros, Ing. Agr. Fabiana Rodríguez, Ing. Agr. Miguel Della Villa, Ing. Forest. Silvia Masoni, Ing. Edgardo Mónaco, Ing. Agr. Victor Milicias, Ing. Agr. Federico Aguirre, Ing. Agr. Cristian López, Ing. Agr. Mónica Astiz Gassó y Sr. Andrés Molla Kralj;
a mis compañeras embriólogas y anatomistas Dra. Sonia Rosenfeld, Dra. Lara Strittmatter, Dra. María Teresa Amela García y Dra. Sandra Alicioni;
a quien me apoyó en todo momento, Lic. Marcelo Della Mora.
y finalmente a las instituciones que hicieron posible el desarrollo de este trabajo: Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Facultad de Agronomía de la Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Lomas de Zamora e Instituto Darwinion (CONICET).
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aaa la memoria de mis Padres
6 ÍNDICE
1. Introducción general---9-59 1.1. Posición sistemática de las especies en estudio---22-32 1.1.2. Taxonomía---22-23 1.1.3. Descripción botánica---23-32 1.2. Caracterización y descripción de la zona estudiada---33-41 1.3. Bibliografía---42-59
2. Materiales y Métodos---60-65 2.1. Materiales---60-61 2.2. Métodos---61-64 2.3. Bibliografía---65
3. Desarrollo del grano de polen 3.1. Introducción---66-67 3.2. Observaciones---67 3.2.1. Microsporangio---68-71 3.2.2. Microsporogénesis---71-72 3.2.3. Microgametogénesis---72-73 3.3. Discusión---73-77 3.4. Bibliografía---78-83 Figuras---84-106
4. Ontogenia del grano de polen y las orbículas en Eleusine tristachya 4.1. Introducción---107-108 4.2. Resultados 4.2.1. Estadio I: Célula madre de los micrósporos (CMm)---108-109 4.2.2. Estadio II: Tétrade de micrósporos---109 4.2.3. Estadio III: Micrósporos recién liberados---109-110 4.2.4. Estadio IV: Micrósporo maduro---110 4.2.5. Estadio V: Grano de polen bicelular---111 4.2.6. Estadio VI: Grano de polen tricelular---111-112 4.3. Discusión---112-115 4.4. Bibliografia---116-121 Figuras---122-124
5. Diversidad de orbículas 5.1. Introducción---125-126 5.2. Resultados 5.2.1. Morfologia general de las orbículas---126-128 5.3. Discusión---129-131 5.4. Bibliografía---132-135 Cuadro 1---136 Figuras---137-139
6. Desarrollo del megagametófito
7 6.1. Introducción---140-141 6.2. Resultados 6.2.1. Óvulo y megasporogénesis---141-142 6.2.2. Megagametogénesis---143-144 6.3. Discusión---145-149 6.4. Bibliografía---149-156 Cuadro 1---157 Figuras---158-180
7. Ultraestructura y desarrollo del megagametófito en Eleusine tristachya 7.1. Introducción---181 7.2. Resultados---181-184 7.3. Discusión---184-187 7.4. Bibliografía---187-190 Figuras---191-193
8. Fertilización, endospermogénesis y embriogénesis 8.1. Introducción---194-195 8.2. Resultados---195-197 8.3. Discusión---198-199 8.4. Bibliografía---199-201 Figuras---202-204
9. Embrión y fruto 9.1. Introducción---205-206 9.2. Resultados---207-211 9.3. Discusión---211-215 9.4. Bibliografía---215-220 Figuras---221-225 Cuadro 1---226
10. Conclusiones generales---227-232
8 1- INTRODUCCIÓN GENERAL
La familia Poaceae (Gramineae) es una de las más importantes del Reino Vegetal por el gran número de especies que la componen y es, taxonómica y ecológicamente, uno de los grupos más importantes en el mundo (Clayton & Renvoize 1986; Grass Phylogeny
Working Group, GPWG 2001). Reconocida como un “grupo natural” desde fines del siglo
XX, esta familia incluye aproximadamente alrededor de 10.000 especies distribuidas en unos 700 géneros, cubriendo más de 1/5 de la superficie de la tierra (Tzvelev 1989;
Renvoize & Clayton 1992; Watson & Dallwitz 1992; Jacobs et al. 1999; Grass Phylogeny
Working Group, GPWG 2001). Las gramíneas han suscitado el interés del hombre desde tiempos antiguos, principalmente porque entre sus especies se hallan plantas alimenticias, forrajeras, de uso o aplicación industrial, ornamental y aún medicinal (Nicora & Rúgolo de
Agrasar 1987). Es importante mencionar también que muchas de las especies de la familia
Poaceae son el componente principal de los pastizales naturales que existen en el mundo
(Jacobs et al. 1999). Los pastizales naturales cubren una gran superficie de la Tierra y en muchos casos estos sistemas son utilizados por el hombre como áreas de pastoreo, de inmenso valor para la ganadería local por la producción de forraje la mayor parte del año, o de producción agrícola (Burkart 1969, Sala & Paruelo 1997). De hecho, numerosas especies de gramíneas han sido domesticadas y están siendo cultivadas ampliamente en todo el mundo. Entre ellas, se pueden citar las especies que constituyen el componente principal de la dieta de la humanidad, como por ejemplo la caña de azúcar y numerosos cereales (maíz, arroz, avena, trigo, cebada y centeno, entre otros). Las gramíneas se distinguen del resto de las Angiospermas por características del fruto, embrión, polen y estructura de sus flores e inflorescencias (Grass Phylogeny Working Group, GPWG 2001).
La Argentina cuenta con 187 géneros y alrededor de 1150 especies entre nativas, 9 naturalizadas y cultivadas. Viven desde el nivel del mar hasta en las altas montañas, en regiones frías o tropicales e intermedias, así como en suelos inundados o secos hasta desérticos. Las variadas regiones en que habitan explican la versatilidad morfológica que presentan, adaptándose a los diferentes medios en que viven. Prácticamente no existe una región fitogeográfica que carezca de gramíneas (Cabrera 1970, Parodi 1971, Nicora 1978,
Deregibus & Kropft 1983, Nicora & Rúgolo de Agrasar 1987, Rúgolo de Agrasar &
Nicora 1988, Zuloaga et al 1994, Rúgolo de Agrasar et al. 2008). En el cono sur
(Argentina, sur de Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay) se registran 203 géneros y 1528 especies nativas e introducidas (Zuloaga et al., 2008).
Con referencia a la flora agrostológica de Sudamérica no existen muchas contribuciones referidas a estudios embriológicos para la familia Poaceae. Los estudios embriológicos para especies propias de la Argentina y áreas limítrofes podemos decir que son relativamente escasos. Anton (1982) y Astegiano (1989) realizaron un trabajo minucioso sobre la biología reproductiva y embriología completa de Axonopus fissifolius y
Sporobolus indicus respectivamente. Luego de una recopilación de trabajos relacionados con el desarrollo del óvulo y del megagametófito, Anton de Triquell (1986) demostró ontogenéticamente que el óvulo tipo para la familia es hemicampilótropo. Anton y Cocucci
(1984) describieron dos tipos de megagametófitos femeninos maduros para Poaceae: el tipo
Polygonum, con su variante Poaceae y el tipo Drusa. Izaguirre de Artucio y Ziliani (1979) resumieron en un cuadro los diferentes tipos de megagametófitos encontrados y sus modos de origen en Paspalum dilatatum. En una revisión sistemática de las especies americanas del género Bothriochloa, Vega (2000) describió la embriología de Bothriochloa laguroides y B. alta.
10 Con respecto al fruto maduro de gramíneas nativas de Argentina, existen trabajos donde se lo define y se interpretan las partes que componen al embrión (Cocucci &
Astegiano 1978, Filgueiras 1986, Izaguirre & Laguardia 1987). En cuanto a la anatomía, se han hecho estudios en: Paspalum dilatatum (Izaguirre-Artucio & Ziliani 1975, 1988), Stipa brachychaeta (Medán & De Eilberg 1978, 1979), Briza maxima (Rost et al. 1990), Stipa spp. (Izaguirre 1992), Arrhenatherum elatius, Festuca arundinacea y Phalaris aquatica
(Lovisolo 1997).
En cuanto a la reproducción asexual de las Poaceae se ha trabajado bastante en citoembriología y apomixis del género Paspalum. (Quarín & Caponio 1995, Espinoza &
Quarín 1997, Martínez & Quarín 1999 y Quarín 1999).
De acuerdo a lo expuesto se desprende que los estudios embriológicos sobre especies de Poaceae deben incrementarse. La riqueza agrostológica propia de la Argentina, integrada por numerosas especies nativas, muchas de ellas endémicas, merece ser tomada en consideración para ser estudiada desde varios puntos de vista, entre ellos el embriológico.
Para la realización de las investigaciones se ha seleccionado el área geográfica que corresponde a la Depresión del Salado. La cuenca del Río Salado está ubicada en la
Provincia de Buenos Aires, donde ocupa un área aproximada de 58.000 km2 (Ver 1.2).
Esta región ha sido estudiada desde el punto de vista edafológico, florístico y fitosociológico, por cuanto existe suficiente información básica al respecto (Vervoorst
1967, Cabrera 1970, Tricart 1973, Deregibus & Cauhépé 1983, Burkart et al. 1990, Soriano et al. 1992 y León & Burkart 1998). Por otra parte, constituye una de las regiones del país de importancia en relación a la producción agropecuaria. Se destacan la cría de vacunos y en particular la producción láctea, sobre la base de la utilización de praderas naturales
11 integradas principalmente por gramíneas, cuyo potencial y eficiencia son evaluados constantemente en relación con los sistemas de producción intensivos.
Existen vastas zonas productivas basadas en el manejo de los pastizales naturales.
En ese ecosistema conviven gramíneas nativas valoradas por sus características forrajeras y especies que sin serlo, posibilitan la regeneración del suelo para la implantación de otras especies más valiosas. Por otra parte algunas especies nativas son utilizadas con fines ornamentales (Rúgolo de Agrasar & Puglia 2003, Rúgolo de Agrasar & Puglia 2004, Puglia
& Rúgolo de Agrasar 2008).
El conocimiento sobre la biología reproductiva de especies forrajeras potenciales, aportará información a estudios experimentales dirigidos al mejoramiento de las mismas para la intensificación de su uso. Para ello, la producción de semillas es una de las características fundamentales a ser tomada en consideración.
Los estudios embriológicos propuestos tienen por finalidad aportar información al conocimiento de la biología reproductiva de diez taxones correspondientes a las tres subfamilias mas ricamente representadas en la región: Pooideae, Chloridoideae y
Panicoideae. La selección de las especies se basó en los siguientes aspectos:
• Importancia y valor forrajero.
• Uso con fines ornamentales y en la formación de césped-
• Especies pioneras en suelos alcalino-salinos.
• Taxones correspondientes a Tribus poco exploradas embriológicamente.
• Taxones no estudiados desde el punto de vista embriológico.
Se fundamenta la elección de las tres subfamilias anteriormente mencionadas por las siguientes razones: la subfamilia Bambusoideae no tiene representantes nativos en la región seleccionada y la subfamilia Arundinoideae, si bien se encuentra representada en la zona,
12 ha sido estudiada desde el punto de vista embriológico (Stover 1937; Connor 1974;
Philipson 1977, 1978a; Philipson & Connor 1984; Bhanwra 1988; Jane 1992; Jane &
Chiang 1996 y Jane 1997). Con referencia a las Arundinoideae existen datos previos sobre diferentes géneros que la componen y es una subfamilia problemática que se tiene que reevaluar y muy probablemente colocar varios taxa en otras subfamilias (Clarke & Sánchez
1999).
El presente trabajo constituye un aporte original debido a que nada se conocía previamente sobre la embriología de estas especies nativas propuestas para este estudio.
También representa una contribución en pro del desarrollo socio-económico del país, pues aporta información sobre la reproducción de algunas gramíneas útiles, nativas de una zona relevante desde el punto de vista de la producción agropecuaria en la Provincia de Buenos
Aires. Dichos datos serán de aplicación para proyectos donde genetistas y otros investigadores se dediquen al mejoramiento de pastizales. Al mismo tiempo se propone en este trabajo esclarecer aspectos relacionados con la mayor o menor producción de semillas y señalar especies dignas de ser conservadas en vinculación con el mejoramiento de los suelos.
HIPÓTESIS:
‹ Existen diferencias embriológicas entre los géneros de las distintas Subfamilias que apoyan la actual clasificación taxonómica.
‹ Existen características embriológicas relacionadas con la forma y el hábito de crecimiento de los taxa seleccionados.
OBJETIVOS:
∑ Generales
13 ‹ Incrementar el conocimiento sobre la embriología de la familia Gramineae (Poaceae).
‹ Sentar las bases sobre el conocimiento reproductivo para un posterior estudio genético y de mejoramiento de los pastizales naturales del país. ∑ Particulares
‹ Describir la Microsporogénesis y la Microgametogénesis.
‹ Realizar el estudio anatómico del óvulo y del microsporangio.
‹ Realizar el estudio ontogenético ultraestructural de los cuerpos de Ubisch con el fin de aportar datos que ayuden a dilucidar su posible función y participación en la formación de la pared del grano de polen.
‹ Describir la Megasporogénesis y Megagametogénesis.
‹ Realizar el estudio ultraestructural del saco embrionario pre- y post- fertilización, a fin de aportar datos sobre el rol que cumplen las antípodas.
‹ Describir la Endospermogénesis, Embriogénesis, desarrollo total de los tegumentos seminales y capas del pericarpio del fruto.
‹ Relacionar las características embriológicas particulares de los taxones con las subfamilias a las cuales pertenecen.
ANTECEDENTES
De acuerdo a la revisión bibliográfica, podemos decir que los estudios embriológicos realizados hasta el momento a nivel mundial, tomando en cuenta el número de especies que conforman la familia, son relativamente escasos y que el porcentaje aproximado de especies estudiadas bajo este aspecto no superaría un 4 %.
Con respecto a la bibliografía general, donde se recopilan los caracteres embriológicos conocidos hasta el momento y sus posibles implicancias filogenéticas y sistemáticas, podemos citar la siguiente: Mehlenbacher (1970), Bhatnagar & Chandra 1975,
14 Connor (1981), Anton & Cocucci (1984), Anton de Triquell (1986), Bhanwra (1988),
Bhanwra et al. (1991) y Johri et al. (1992).
Microsporangio y desarrollo del grano de polen
Estudios realizados sobre la pared del microsporangio revelan que en la mayoría de las especies la misma está compuesta por una epidermis, 1 ó 2 capas medias efímeras y un tapete de tipo secretor con células binucleadas (Chandra 1963a, Untawale et al. 1969,
Bhanwra & Choda 1986, Bhanwra 1988, Bhanwra et al. 1991, Febulaus & Pullaiah 1991 y
Johri et al. 1992). Sólo en Eleusine compresa y Penisetum typhoideum el tapete es uninucleado (Mahalingappa 1977, Narayanaswami 1952).
En el tejido esporógeno del microsporangio se diferencian las células madres de los micrósporos que sufren citocinesis sucesivas durante la división meiótica. Como resultado de esta división se forman en la mayoría de las especies estudiadas tétrades de tipo isobilateral, pero también se han encontrado en menor proporción de tipo tetraédricas, decusadas, lineales y en forma de T. (Chandra 1963a, Untawale et al. 1969, Bhanwra &
Choda 1986, Bhanwra 1988, Bhanwra et al. 1991, Febulaus & Pullaiah 1991 y Johri et al.
1992). Hasta el momento sólo se ha descripto citocinesis simultánea en Spinifex littoreus dando como resultado tétrades de tipo isobilateral, lineal, tetraédrica y decusada
(Lakshmann & Jayalakshmi 1980).
Estudios sobre el desarrollo del gametófito masculino revelan que los granos de polen son siempre uniporados, a veces operculados y se liberan en estadio tricelular (Cass
& Karas 1975, Anton, 1982; El-Gazaly & Jensen 1986; Cass & Fabri 1988; Astegiano,
1989; Bhanwra et al., 1991; Febulaus & Pullaiah, 1991, 1996; Johri et al. 1992 y Pacini et
15 al., 1992). En Eleusine crocana (Narayanaswami 1952) se han encontrado gametas diploides debido a la endoduplicación. Estudios sobre la exina del grano de polen y su origen fueron realizados en varias especies de la familia mediante la técnica de imagen
óptica confocal (Helsop-Harrison 1962 y Salih et al. 1997).
Se ha confirmado la presencia de cuerpos de Ubisch en 15 especies de gramíneas
(Anton 1982, Astegiano 1989 y Huysmans et al. 1998). Su función y su posible participación en la formación de la pared del grano de polen no fueron aún dilucidadas. Se cree que estas estructuras podrían ser importantes desde el punto de vista taxonómico
(Kosmath 1927; Ubisch 1927; Carniel 1967; Rowley 1962, 1963; Heslop-Harrison
1968a,b; Bhandari & Kishori 1971; Christensen et al. 1972; Bhandari 1984; Eric & Lux
1985; Hess 1985, 1986; El-Ghazaly & Jensen 1987; Raj & El-Ghazaly 1987; El-Ghazaly
1989; Huysman et al. 1997; Vinckier et al. 2000; Schols et al. 2001; Vinckier & Smets
2002 a, b, c, 2003; Galati 2003; Rosenfeldt & Galati 2007).
Óvulo y desarrollo del megagametófito
En cuanto al óvulo, las descripciones muestran gran variabilidad con respecto a su clasificación; éste puede ser anátropo, hemianátropo o campilótropo; bitegumentado, tenuinucelado, crasinucelado o pseudocrasinucelado (Chandra 1963a, Davis 1966,
Untawale et al. 1969, Aulbach-Smith & Herr 1984, Xi & DeMason 1984, Bhanwra 1988,
Bhanwra et al. 1991, Febulaus & Pullaiah 1991, Johri et al. 1992 y Bhanwra et al. 2001).
Anton de Triquell (1986) tomó en cuenta las diferentes interpretaciones del megasporangio para la familia y, de acuerdo a estudios ontogenéticos del óvulo, lo clasifica como hemicampilótropo a la madurez. En las Pooideae el tegumento externo cubre todo el óvulo
16 excepto en la región micropilar, mientras que en Panicoideae detiene su desarrollo en una etapa temprana de la ontogenia (Chandra 1963a, Choda et al. 1982).
El tejido nucelar está bien desarrollado en Panicoideae (Chandra 1963a). Las células de la epidermis nucelar son conspicuas y se convierten en multinucleadas en Penisetum ramosum (Narayan 1962). Se ha encontrado como carácter no frecuente para esta familia la presencia de una epístasis en Themeda australis (Woodland 1964).
Morfología y ultraestructura del gametófito femenino
A nivel ultraestructural se han estudiado sacos embrionarios en especies de importancia económica como Arundo formosana, Coix lacryma-jobi, Hordeum vulgare,
Oriza sativa y Zea mays (Diboll & Larson 1966, Cass 1973, Jane 1992; Engell 1994; Dong et al. 1995; Jane & Chiang 1996; Maeda & Miyake 1996, 1997; Jane 1997 y Liu et al.
1998). Raramente la oosfera desarrolla un haustorio en la región micropilar en especies apomícticas como Cortaderia jubata (Philipson 1978a). Las sinérgidas presentan habitualmente ganchos. En el género Cortaderia (Connor 1974, Philipson 1977) y en especies de la tribu Danthoneae (Philipson & Connor 1984) éstas células muestran un masivo desarrollo haustorial, su extremo superior se elonga y sale de la micrópila ubicándose entre el óvulo y la pared del ovario. En C. selloana (Philipson 1977) las dos sinérgidas son haustoriales, mientras que en especies apomícticas como C. jubata
(Philipson 1978a) el saco embrionario nucelar contiene una simple sinérgida, la cual se convierte en haustorial. Estudios ultraestructurales revelan que la pared externa de las células del haustorio presenta repliegues y su citoplasma contiene gran cantidad de retículo endoplásmico, por lo que actúan como células transfer. Esto indica que están altamente
17 adaptadas para la absorción y la transferencia de nutrientes al saco embrionario (Philipson
1977).
La ubicación de las antípodas en el saco embrionario es variable dentro de la familia
Poacae. En Panicoideas las antípodas se ubican en la región calazal, mientras que en
Pooideas están en posición lateral (Chandra 1963a, Anton de Triquell 1986). El alargamiento, la persistencia y la multiplicación secundaria de las antípodas parece ser un patrón común para la familia Poaceae (Johri & Ambegaokar 1975). En Sasa paniculata su número supera a 300 (Davis 1966). En Phleum boemeri el número de antípodas en un saco embrionario varía considerablemente, así como su nivel de ploidía. El 38 % de los sacos embrionarios maduros de esta especie poseen tres antípodas cada uno, pero el número se incrementa a 10 en el estadio celular del endosperma. Antípodas haustoriales son reportadas en Agostis vulgaris, Alopecurus pratensis, Festuca pratensis y Holcus lanatus
(Terzijski & Kuristov 1973). En Eleusine (Narayanaswami 1955c, Mahalingappa 1977), las antípodas son grandes y ricas en citoplasma. El rol nutricional de las antípodas es evidente en Oryza y Triticale debido a que cuando degeneran precozmente producen semillas vanas
(Maeda & Miyake 1996, 1997).
Polinización y Fertilización
Se considera que generalmente la polinización en las Poaceae es anemófila. Sin embargo, Pant et al. (1982a, b) observaron que en las espiguillas de Dichanthium annulatum la polinización es entomófila, producida por una especie de abeja de reducido peso corporal, Apis indica. Tambén Bogdan (1962) estudió numerosos géneros de gramíneas que eran polinizados por Apis melifera. Por otra parte, algunos géneros de bambusoideas herbáceas son polinizadas por insectos (Soderstrom & Calderón 1971).
18 Con respecto a la fertilización en cebada y en trigo, se encontró que el estigma es totalmente receptivo y los granos de polen germinan en el momento de la polinización
(Cass & Jensen 1970 y Chandra & Bhatnagar 1974). El tubo polínico penetra en el saco embrionario y descarga las dos gametas masculinas, el núcleo vegetativo y abundante almidón en una de las sinérgidas que luego degenera (Cass & Jensen 1970 y Chao 1971).
Endospermogénesis
Pocos son los trabajos sobre el desarrollo del endosperma. En éstos se ha determinado que el mismo es de tipo nuclear. La formación de la pared se inicia en el extremo micropilar y continúa hacia el calazal en el estadio de proembrión globular. La capa periférica del endosperma celular se transforma en una capa de naturaleza proteica llamada aleurona. Generalmente la aleurona está compuesta de un solo estrato pero en
Eleusine puede haber dos (Mahalingappa 1977). El endosperma maduro se vuelve coriáceo y almacena abundante almidón. Endosperma líquido se ha encontrado en Limnodea arkansana (Brown 1955), Helicotrichon hookeri, Koeleria cristata, Sphenopholis filiformis y Trisetum bifidum (Dore 1956) y en 61 géneros más (Rosengurtt et al. 1971, 1972 y
Torrell 1971).
Embriogénesis y embrión maduro
Con respecto a los trabajos realizados sobre la embriogénesis de esta familia podemos decir que el desarrollo del embrión corresponde al tipo Asteráceo (Ambegaokar &
Johori 1977, Bhanwra 1988, Bhanwra et al. 1991 y Johri et al. 1992). Reeder (1957) investigó cerca de 300 especies de 150 géneros de gramíneas y clasificó los embriones maduros en seis categorías basándose en la vascularización, presencia o ausencia de
19 epiblasto, desarrollo de la parte basal del escutelo y morfo-anatomía de las hojas embrionales. Son muchos los autores que dedican capítulos de libros y trabajos de investigación a la clasificación y orígenes de las partes del embrión y fruto maduro de las gramíneas (Bennett 1944: Brown 1959, 1960, 1965; Norstog 1969; Guignard & Mestre
1970; Swift & O'Brien 1970; Guignard 1974; Roth 1977; Cocucci & Astegiano 1978 y
Kosina 1996).
Fruto
Numerosos trabajos se han hecho sobre la anatomía y morfología del fruto de las gramíneas en especies como Arrhenatherum elatius, Briza maxima, Eleusine indica,
Festuca arundinacea, Nasella brachychaeta (sub. Stipa brachychaeta), Panicum miliare,
Panicum miliaceum, Pappophorum subbsulbosum, Paspalum dilatatum, Paspalum sccrobiculatum, Phalaris aquatica, Setaria lutescens, Stipa sp. y Triticum aestivum
(Cummins 1929; Avery 1930; Narayanaswami 1954, 1955 a y b, 1961; Rost 1970; Rost
1973; Izaguirre-Artucio & Ziliani 1975, 1988; Laguardia 1975; Bhatnagar & Chandra
1976; Medan & Elberg 1978/79; Bourdu 1983; Rost et al 1984: Rost et al 1990; Filgueiras
1986, Izaguirre & Laguardia 1987 y Lovisolo 1997).
Se considera que el fruto de las gramíneas es típicamente una cariopsis, fruto seco indehiscente, uniseminado con el pericarpo soldado a los tegumentos de la semilla (Roth
1977, Esau 1978, Filgueiras 1986, Izaguirre & Laguardia 1987 y Nicora & Rúgolo de
Agrasar 1987). No obstante existen taxones con fruto seco dehiscente como el utrículo o aquenio, caracterizado por la separación del pericarpo membranáceo, de los tegumentos de la semilla (Guérin 1898, Nicora & Rúgolo de Agrasar 1987, Astegiano 1989). Pericarpo delicuescente caracteriza al género Sporobolus (Nicora & Rúgolo de Agrasar 1987).
20
Apomixis
Una de las características interesantes de algunas especies, es que se reproducen en forma asexual por el fenómeno apomíctico (Emery 1957; Emery & Brown 1958; Reddy
1977; Muniyamma 1978; Quarin & Caponio 1995; Leblanc et al. 1995a, b; Espinoza &
Quarín 1997; Martínez & Quarín 1999; Pessino et al. 1999; Quarín 1999; Alves et al. 2001;
Guohua et al. 2009 y Felismino et al. 2010). Brown y Emery (1957, 1958) han estudiado el comportamiento apomíctico de dos especies de la tribu Andropogoneae: Themeda triandra y Bothriochloa ischaemum y de algunos representantes de la tribu Panicoideae. Estos autores realizan un cuadro comparativo donde detallan número de óvulos examinados y tipos de sacos embrionarios normales y apomícticos. Yu et al. (2000) comparan la biología reproductiva en especies de reproducción sexual y apomíctica en los géneros Bothriochloa y Dichantium. Czapik (2000) realiza un trabajo sobre apomixis en Monocotiledóneas donde hace mención a 62 géneros que presentan este tipo de reproducción. Leblanc et al. (1995) estudian la megasporogénesis y la megagametogénesis en 12 especies apomícticas del género Tripsacum. Soreng (2000a) hace un estudio exhaustivo sobre el comportamiento apomíctico de 15 especies del género Poa y 6 sub-especies. Otros autores hacen un estudio reproductivo en especies como Cortaderia jubata, Dichanthium annulatum, Dichanthium aristatum, Eragrostis curvula, Eremopogon foveolatus, Paspalum commersonii, Paspalum dilatatum, Paspalum longifolium, Paspalum notatum, Paspalum secans y Themeda australis, demostrando el comportamiento apomíctico de las mismas (Bennett 1944, Snyder
1957, Bashaw & Holt 1958, Knox & Helsop-Harrison 1963, Evans & Knox 1969, Reddy &
D’Cruz 1969, Brix 1974, Chao 1974, Philipson 1978, Izaguirre de Artucio & Ziliani 1979,
Bhanwra & Choda 1981, Rabau et al. 1986, Soreng 2000a y Martínez 2001).
21 1.1- POSICIÓN SISTEMÁTICA DE LAS ESPECIES EN ESTUDIO.
1.1.2- TAXONOMÍA:
|Estudios recientes sobre la familia han tomado en consideración caracteres morfológicos y moleculares que permitieron proponer nuevas clasificaciones que se encuentran en elaboración (Soreng 2000b, 2001, 2003; Soreng & Pennington 2003).
Para la ubicación sistemática de los géneros aquí considerados se han consultado clasificaciones recientes (Grass Phylogeny Working Group, GPWG 2001; Sánchez-Ken &
Clark 2007). No obstante, en relación con el número de géneros tratados y en pro de una mejor comprensión de la posición de los mismos, se ha adoptado en parte lo propuesto por
Nicora & Rúgolo de Agrasar (1987). De esta manera no se han considerado aquí supertribus y subtribus.
Familia: POACEAE
Subfamilia: POOIDEAE
Tribu: POEAE
• Briza subaristata Lam.
Tribu: MELICEAE
• Glyceria multiflora Steud.
• Melica brasiliana Ard.
Tribu: AGROSTIDEAE
• Chaetotropis imberbis (Phil.) Björkman. var. imberbis.
• Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees)
Cabrera & Rúgolo.
Subfamilia: CHLORIDOIDEAE
22 Tribu: AELUROPODEAE
• Distichlis laxiflora Hack.
• Distichlis spicata (L.) Greene.
Tribu: ERAGROSTIDEAE
• Eleusine tristachya (Lam.) Lam.
Subfamilia: PANICOIDEAE
Tribu: PANICEAE
• Paspalidium geminatum (Forssk.) Stapf. (ex Paspalidium paludivagum
(Hitchc. et Chase) Parodi.).
• Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze.
1.1.3- DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
Briza subaristata Lam. Nombre vulgar: “Lágrimas”. Especie nativa, perenne, cespitosa, de
10-80 cm de altura, hojas lineales largas, algo ásperas, lígula membranosa, partida, glabra, de 2 mm; panoja contraída, erecta pero a la madurez algo mutante, ramas laterales breves, espiguillas medianas, multifloras, de 4,5-8 mm de longitud, subgloboso-tetrágonas, pálidas o rojizas, no comprimidas, de antecios imbricados glumas obtusas, cóncavas, de 2mm de longitud, a veces hendidas en el ápice; lemmas casi planas, de 2,5-4 mm, ápice agudo hasta subaristulado, giba pequeña, márgenes dilatados en dos puntas laterales, haciendo que la lemma supere 3 veces en ancho a la pálea y dando aspecto trílobo al órgano, pálea oval, plana, de 1,2-1,5 mm de longitud, cariopse dorsiventralmente comprimido, redondeado, de
1,2 mm de diámetro. Es común en Uruguay y Argentina oriental. Buena forrajera de campos altos, en flor desde fines de julio hasta marzo (Burkart 1969). (Fig. 1A).
23 Glyceria multiflora Steud. Especie nativa, acuática, glabra, perenne, cespitosa ascendente, cañas largas, de 3-5 mm de diámetro, vainas de 8-18 cm de longitud, nudos comprimidos en seco, oscurecidos, lígula ancha, de 5-10 mm de longitud, lámina de 8-20 cm de longitud y 4-9 mm de latitud; panoja laxa angosta, de 20-60 cm de longitud, con los ejes secundarios adosados al raquis principal; espiguillas de 13-21 mm de longitud, 8-14 floras, glumas de
2-4 mm de longitud; lemma 7-nervada, escabrosa, de 3,5-4,5 mm de longitud, nervios rectos, que no llegan al ápice membranoso, obtuso, levemente 3-dentado; pálea plana, bicarenada, de 3-5 mm de longitud; cariopse elíptico-alargado, rojizo-oscuro, glabro, de 2 mm de longitud, con apendículo radicular en el extremo basal y otro estilar bífido en el
ápice; escudete circular, hilo linear, largo. (Burkart 1969). Especie sudamericana, común en sur de Entre Ríos, Argentina y Chile. Vegeta en invierno y florece en primavera. Habita lugares anegadizos en invierno, bordes de lagunas, zanjas, etc. valiosa forrajera, muy común en la provincia de Buenos Aires, donde es muy buscada por el ganado (Vidal &
Piergentili 1973). Se recomienda su propagación en lagunas. (Fig. 1B).
Melica brasiliana Ard. Especie perenne, con rizomas horizontales breves, matas flojas,
ásperas, de 15-80 cm de altura, hojas angostas, subglabras, estriadas en seco, un poco escabrosas y a menudo con el borde ciliado; lígula membranosa, glabra, de aprox. 2-6 mm de long., hendida o dilacerada, lámina de 6-15 cm long. x 4-9 mm de lat.; panoja angosta, de 5-25 cm long., al madurar un poco abierta, pedicelos pubescentes, gráciles, dilatados en el ápice; espiguillas con 2 flores fértiles y 2-3 antecios reducidos, en posición horizontal o mutantes, de 8-18 mm long., cuando jóvenes obcónico-cilindroides, maduras con gluma inferior extendida, subplana, un poco dorsalmente comprimidas; gluma I oblanceolada, subaguda u obtusa, 7-9 nervada, su mitad superior y márgenes hialinos, superando los
24 antecios; gluma II angosta y más breve, 5-nervada; lemma inferior de 7 mm long., ciliada y multinervada, escabrosa, lemma inferior del 2° antecio igual pero sin cilias; cariopse de
2,5-3 mm. Habita en el sur de Brasil, Uruguay y Buenos Aires (Burkart 1969). Es de escaso valor forrajero pero ha sido mencionada como una interesante gramínea de valor ornamental. (Fig. 1C).
Chaetotropis imberbis (Phil.) Björkman. var. imberbis. Especie sudamericana, perenne, cespitosa, erecta; panoja angosta, interrumpida, subnutante, de 10-25 cm de longitud y 1-3 cm de diámetro, glumas lanceoladas-subuladas involutas, de 2-3 mm de longitud, sin contar las aristas apicales de 0,5-4 mm, pedicelo caedizo aproximadamente tan largo como la espiguilla, dorso de las glumas redondeado, pubescente y un poco pestañoso; lemma oval, glabra, tenue, 5-nervada, de 1,5-1,6 mm de longitud, truncado-denticulada, con arístula subapical recta, caediza, de 1,3-2,3 mm de longitud; pálea oval, membranosa, de 0,6 mm, anteras de 0,5-0,6 mm, cariopse oval, castaño de 1-1,2 mm de longitud. Se distribuye desde
Estados Unidos a Argentina. Común en campos húmedos, cercano a los arroyos (Burkart
1969). De valor forrajero, habita en terrenos con subsuelos muy arcillosos y alcalinos
(Vidal & Piergentili 1973), se la encuentra alrededor de las comunidades puras de Distichlis spp. propia de terrenos bajos con alto contenido de sodio (Lovisolo, observ. pers.) (Fig.
1D).
Observación: La posición sistemática del género Chaetotropis es aún incierta dado que ha sido incluido en el género Polypogon (Soreng et al., 2003) o bien considerado como género independiente fundamentado en Nicora & Rúgolo de Agrasar (1987).
25 Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees) Cabrera & Rúgolo.
Especie nativa, perenne, erecta, de 60 cm a 1,30 m de altura, macollos escasos y rizomas horizontales muy breves, yemas de renuevo extravaginales, cañas apretadas, poco apartadas, cubiertas de largas vainas foliares abajo más o menos rojizo-violáceas, glabra o pubescentes; lígula breve, membranácea, dentada, lámina plana, larga, de 4-6 mm de latitud; cañas 2-3 nodes, panoja oblonga de 15-30 cm de longitud, más o menos unilaterales y de ápice inclinado, suave, plateado-rosado-hialina al florecer, pálido pajiza a la madurez, espiguillas pequeñas y numerosas, apretadas; glumas lineales, hialinas 1-nervadas de 5-6,5 mm de longitud, persistentes y en parte caducas, lemma 5-nervada de 3-4,5 mm de longitud, subaguda, tenue, arístula en su tercio apical, breve, de 1-3 mm, a menudo retorcida, pálea poco menor que la lemma, mútica, membranácea, con sus nervios muy aproximados, medianos; anteras 3, de 0,3-0,8 mm de longitud; prolongación estéril de raquilla de 0,2-2 mm, a veces subnula; pelos sedosos de callo y raquilla abundantes, casi tan largos como las glumas, envolviendo el antecio maduro y haciéndolo volar; cariopse oblongo, glabro, envuelto por, pero no adherido a los glumelas, de 2-3 mm de longitud.
Común en las Regiones del Plata (Burkart 1969). Se ha comprobado que se trata de una especie de reproducción sexual (Lovisolo & Galati 1999), hasta el momento la única especie estudiada desde el punto de vista embriológico para el género. Estudios más profundos sobre este género contribuirán a establecer relaciones con Calamagrostis Adans., algunas de cuyas especies estudiadas hasta el presente han demostrado ser apomícticas
(Greene 1984). (Fig. 2 A).
26 Distichlis laxiflora Hack. Especie dioica, perenne, rizomatosa, común en suelos salino- alcalinos. Es de escaso valor forrajero y habita en el centro del país hasta la provincia de
Buenos Aires. (Burkart 1969, Nicora & Rúgolo de Agrasar 1987). (Figs. 2 B, C).
Distichlis spicata (L.) Greene. Especie dioica, perenne subglabra, gregaria; con rizomas definidos y viajeros, escamosos, duros, de 2-7 mm de diámetro, pajizo, lustroso, catáfilas agudas, estriadas, caducas; entrenudos de 1,5 mm a 2,5 cm de longitud, a veces uno largo y
3 breves alternándose, nudos marcados por anillos; vástagos foliados erectos, de 10-30 cm de altura; hojas dísticas semiduras, vaina pajiza, glabra, de 1-3,5 cm de longitud, lígula brevísima, membranosa y denticulada, bordes con largos pelitos en mechón, lámina erguida, de 2,5-14 cm de longitud, multiestriada, convoluta, abajo subplana, hacia el ápice setácea, escabrosa, epifilo larga y realmente sedoso-piloso, glabrescente, dorso (hipofilo) glabro; panojas breves y densas, de 2,5 cm de longitud x 0,6-1,5 cm de latitud, las femeninas menores que las hojas, las masculinas superándolas (a veces no) por alargamiento del pedúnculo, pedicelos y raquis abreviados; espiguilla pajiza 3-11- (-14) flora, de 7-12 (-15) mm de longitud, comprimida, mútica, pajiza, glumas de 2-3 mm de longitud, glumelas oval-lanceoladas anchas, 7-11 nervadas, las femeninas y masculinas indistinguibles sin observar las flores, pálea ancha 2-carenada poco menor que la lemma; cariopse glabro, oval, picudo y 2-dentado, de 2,5-3 mm de longitud, libre, comprimido, escudete de 1 mm de longitud. Presenta notable variabilidad morfológica, comprende numerosas variedades; se extiende desde América del Norte a América del Sur y Australia.
Es de escaso valor forrajero y habita en cuencas salino-alcalinas (Burkart 1969, Nicora &
Rúgolo de Agrasar 1987). (Figs. 2 D, E).
27 Estas especies de Distichlis dominan en los bajos alcalinos de la cuenca del Salado, son especialmente valiosas durante los meses de enero y febrero, donde se concentra su mayor producción. Dado que son especies pioneras en suelos salitrosos, favorecen la deposición de materia orgánica donde posteriormente prosperan otras forrajeras de mejor calidad
(Com. Pers. Ing. E. Jacobo).
Eleusine tristachya (Lam.) Lam. Especie bienal o perenne, cespitosa glabra, de 10-45 cm de altura, cañas delgadas, tenaces, comprimidas, hojas lineales, plegadas, lámina de 6-25 cm de longitud, zona ligular pálida, a veces con mechón de pelitos sedosos, lígula muy brevemente membranosa y pestañosa. Espigas 1-3, cortas y gruesas, digitadas en la extremidad, a veces 1 más baja, con mechón de pelos sedosos en su inserción, rectas o un poco incursadas, con el raquis arriba cóncavo, de 1-4 cm de longitud, rara vez más largas, de 1-1,6 cm de latitud; espiguillas 6-13-floras, de 5-9 mm de longitud x 4-6 mm de latitud; gluma I de 1,5-2 mm, gluma II de 3-4mm, lemma 4-5 mm de longitud; utrículo de 2 mm de longitud, grueso, ovoide, pericarpo tenue, pilósulo, semilla oscura, anguloso-globosa, de tegumento duro, alveolado, hilo circular. Especie frecuente en praderas y de valor forrajero, originalmente descripta para el Uruguay, introducida en Estados Unidos y Europa, es muy común en la Argentina cálida y templada. Se encuentra tanto en campos naturales, como en los rastrojos, orillas de caminos, etc. Sus pequeñas y medianas matas empiezan a macollar a mediados de la primavera, produciendo pasto de buena calidad, pero de escaso rendimiento
(Burkart 1969, Vidal & Piergentili 1970). (Fig. 3 A).
Paspalidium geminatum (Forssk.) Stapf ex Paspalidium paludivagum (Hitchc. et Chase)
Parodi. Especie perenne, rizomatosa, nativa de América, distribuida desde el sudeste de
28 EE.UU. hasta Uruguay y nordeste de Argentina. Se encuentra a orillas de ríos, arroyos, esteros, bañados y lagunas. Constituye un forraje natural de importancia. Es común observarla como maleza en los arrozales (Vidal & Piergentili 1970). (Fig. 3, B).
Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze. Especie perenne, rastrera, glabra, nativa de
América cálida, distribuida desde el sudeste de EE. UU., Antillas, Brasil, Uruguay hasta las costas de Buenos Aires. Buena forrajera estival para pastoreo y muy estimada para formar céspedes de adorno en jardines y paseos. Como produce poca semilla y ésta es de difícil cosecha, se planta por división de matas o trasladando panes de césped (Burkart 1969).
(Fig. 3 C).
29
Fig. 1 - A. Briza subaristata Lamarck.; B. Glyceria multiflora Steudel.; C. Melica brasiliana P. Arduinus.; D. Chaetotropis imberbis (Kunth) Björkman. var. imberbis.
30
Fig. 2 - A. Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees) Cabrera y Rúgolo.; B - C. Distichlis laxiflora Hackel. B. Planta pistilada. C. Planta estaminada. D – E. Distichlis spicata (L.) Greene. D. Planta pistilada, E. Planta estaminada.
31
Fig. 3 - A. Eleusine tristachya (Lam.) Lam.; B. Paspalidium geminatum (Forssk.) Stapf (ex Paspalidium paludivagum (Hitchc. et Chase) Parodi.); C. Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze.
32 1.2- CARACTERIZACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE LA ZONA ESTUDIADA
La Pampa Deprimida es una región muy particular debido, principalmente, a la ausencia de diferenciación de su relieve, el cual es, al mismo tiempo, causa y efecto de la morfogénesis (Tricart, 1973).
La Depresión del Salado, nombre que también recibe esta amplia región baja e inundable de la Prov. de Buenos Aires, ocupa un área de 58.000 km2 aproximadamente.
(Fig. 4)
La extensión es variable según diversas opiniones, pero la que consideran Tricart
(1973) y Vervoorst (1967) es prácticamente coincidente, y comprende los partidos de
Magadalena, Chascomús, General Paz, Monte, Roque Perez, Saladillo, General Alvear,
Tapalque, parte de Azul, Las Flores, Rauch, General Belgrano, Pila, Castelli, Dolores,
General Conesa, General Lavalle, Genereal Guido, Maipú, Ayacucho, General Madariaga, y Mar Chiquita. (Fig. 5)
Es de forma triangular con la base sobre la costa atlántica, limitada al norte por la
Pampa Ondulada y al Sur por las Sierras Peripampeanas, drenada por el Río Salado que ocupa la parte mas honda de la Depresión y se extiende desde 35º 30' lat. S hasta 37º 40' lat.
N, y en longitud desde 56º 50' hasta 60º 30', long. O. (Fig. 4)
Esta zona posee escasísimos ríos por lo que prácticamente carece de desagüe. Las altitudes bajas oscilan entre 10-15 m en los alrededores de Chascomús, con valores mayores al pie de las Sierras de Tandilia (100 a 170 m) y se combinan con declives muy poco marcados. Por lo general las inclinaciones alcanzan 0.5 a 0.25 % en la zona de piedemonte serrano, 0.12 % en la zona intermedia cercana a Rauch y Tapalque, y apenas
0.025 % cerca del eje de drenaje del Río Salado. Inclinaciones del terreno tan bajas
33 perjudican el escurrimiento, se producen extensas lagunas de agua estancada, muchas de ellas sin salida, donde el agua se acumula durante las lluvias y allí permanece evaporándose durante la sequía. Estas lagunas constituyen elementos de drenaje endorreico. En otros casos, no se produce ninguna red hidrográfica, ni siquiera en forma de lagunas, asignando así aspectos de drenaje arreico, sin ningún escurrimiento organizado.
La mayor parte de los arroyos recorren una distancia y luego se secan. Otros llegan a las lagunas que se inundan durante las crecidas, pero también después se secan. Durante períodos normales, la mayoría no logran unirse con el Río Salado, corren sobre la superficie general sin encajonarse, pero con lluvias excepcionales originan amplios planos de inundación.
El clima es templado, con una escasa amplitud diaria y anual de temperatura como consecuencia del efecto atenuador que ejerce el océano. En general, la diferencia térmica entre el mes más cálido y el más frío es de 14 °C. En enero el valor medio es de 23,3 °C, y en julio 8,9 °C. La temperatura media anual es de 15,9 °C. En cuanto a los valores extremos el máximo absoluto es 38,8 °C y el mínimo absoluto -3,9 °C.
La estación con mayores precipitaciones es, en términos generales, la primavera, registrándose el máximo de lluvias en el mes de noviembre (134 mm). Los menores valores se registran en invierno, particularmente en junio (42 mm). Según Burgos y Vidal (1951), la aplicación del método de Thornthwaite permitió elaborar mapas del país con líneas del exceso y de la deficiencia de agua, estableciendo para la Pampa Deprimida un exceso de
150 mm. El mayor volumen de agua almacenada en el suelo se produce durante el invierno, registrándose deficiencias en el verano, ya que a pesar de una mayor pluviosidad hay también una mayor demanda por evapotranspiración. Estos mismos autores (1951) señalan que la región hídrica a la que pertenece esta zona es subhúmeda a húmeda.
34 Las unidades cartográficas dominantes están representadas por complejos donde, en las áreas de encharcamiento, predominan los Natracualfes típicos; en bordes de lagunas y cubetas Argialboles típicos y en las posiciones intermedias Argiudoles ácuicos. En lomas destacadas ubicadas en el margen de lagunas, atribuidas a los procesos eólicos anteriormente mencionados, predominan los Hapludoles tapto-árgicos.
Fig. 4. Depresión del Salado. Fig. 5. Partidos que abarcan la Depresión del Salado.
Caracterización de los suelos
El estudio de los suelos presentes se realizó a través del análisis de la cartografía a nivel de semidetalle (Inta, 1989) y de la revisión de trabajos de detalle, anteriormente efectuados en el establecimiento.
El lugar de estudio está situado en el Pdo. de Chascomús (Pcia. de Bs. As.).
Geomorfológicamente coincide con el sector definido por Tricart (1973) como superficie de abrasión marina del mar querandinense. El paisaje se caracteriza por presentar superficies tendidas dominantes, interrumpidas por depresiones de variada extensión acompañadas de zonas de acumulación situadas periféricamente.
35 Caracterización de los suelos de la topo-secuencia loma baja a plano encharcable.
La ubicación de los suelos en las distintas posiciones del paisaje es la característica diferencial más importante, ya que determina su comportamiento en condiciones de exceso de agua o anegamiento. A través del estudio cartográfico se han separado unidades cartográficas correspondientes a las siguientes geoformas: loma, bajo encharcable alcalino- hidromórfico y bajo anegable.
En la loma (Fig. 6, A-B) el perfil típico es Argiudol ácuico, con un solum de más de un metro de profundidad y moderadamente bien drenado.
En el pie de loma (Fig. 6, E) es factible encontrar perfiles semejantes aunque de menor desarrollo y con rasgos hidromórficos más acentuados.
En el Bajo encharcable (Fig. 6, C-D) los suelos se entremezclan conformando una unidad cartográfica del tipo complejo constituido por suelos alcalinos que ocupan un 65 % de la superficie de la unidad y el resto por suelos hidromórficos no alcalinos. Los suelos en general presentan un solum corto, con horizontes B2t fuertemente expresados, ya que el porcentaje de arcilla es próximo al 50%. El epipedón es predominantemente mólico con un espesor cercano a los 20 cm junto a otros perfiles del complejo que aparecen con epipedón
ócrico. La presencia de la napa es constante a lo largo de casi todo el año en los períodos húmedos, encontrándose a los 0,65 m de altura. El intenso hidromorfismo se manifiesta desde superficie a través de moteados y concreciones ferromanganésicas abundantes y precisas, la coloración gley se presenta en los B2. Hay en el complejo un alto porcentaje de suelos alcalinos, algunos desde superficie y otros con elevado contenido de PSI (Porcentaje de sodio de intercambio) en los horizontes subsuperficiales (Natracuol típico y Natracualf típico). Hay pedones levemente salinos. En años secos la napa desciende fuera del solum.
36 En el Bajo inundable (Fig. 6, C-D) con agua en superficie por períodos prolongados encontramos perfiles con un A2 muy lixiviado (Albacualf vértico), que en las estaciones de otoño e invierno posee una napa colgada. Fuertes coloraciones gley y abundantes concreciones ferromanganésicas de 0,5 cm de diámetro demuestran la intensidad del proceso redox.
Caracterización de la vegetación
La loma presenta una vegetación conformada por un numeroso grupo de gramíneas de valor forrajero y de ciclo primavera-verano-otoño (P.V.O.) en su mayoría. La especie gramínea dominante por excelencia es Lolium multiflorum, anual y de ciclo otoño-invierno- primavera (O.I.P.), junto con Stenotaphrum secundatum, Bromus mollis, Botriochloa laguroides y Paspalum dilatatum. Como acompañantes de la misma familia se encuentran:
Deyeuxia viridi-flavescens, Eleusine tristachya, Stipa papposa, Stipa neesiana, S. hialina,
Cynodon dactylon, Chaetotropis imberbis, Melica brasiliana, Piptochaetium bicolor, P. montevidense, Vulpia dertonensis y Briza subaristata. También se determinó la presencia de Setaria geniculata, Polypogon monspeliensis, Sporobolus indicus; leguminosas como
Trifolium repens, Medicago lupulina y Adesmia incana; y graminoides y hierbas tales como Juncus imbricatus, Carex sororia, Hipochoeris radicata, Dichondra repens,
Pamphalea bupleurifolia, Ambrosia tenuifolia, Plantago major, Apium leptophillum, Aster squamatus.
En el pie de loma se encuentra prácticamente el mismo grupo de especies que en la loma, pero allí donde los procesos hidromórficos se intensifican es manifiesto el aumento de Stenotaphrum secundatum y Cynodon dactylon, así como también la disminución de
37 Lolium multiflorum. Se presentan en esta posición especies tales como Centaureum pulchellum, Juncus imbricatus y Heleocharis viridans.
Paspalum dilatatum es una especie de alta plasticidad, pero es mayor su presencia en la loma y media loma, aunque es muy influida por el pastoreo debido a su alta palatabilidad.
La heterogeneidad edáfica se manifiesta a través de la vegetación. Ésta presenta una gran diversidad, donde se repiten y entremezclan las diferentes especies. Así se han diferenciado los siguientes grupos:
1. En el bajo encharcable, donde los suelos resultan predominantemente alcalinos,
dominan Distichlis spicata y D. laxiflora (Fig. 6, C-D). Estas especies alternan con
superficies considerables de suelo desnudo, acompañadas por Juncus imbricatus,
Chaetotropis imberbis, Paspalum vaginatum, Hordeum stenostachys y Sporobolus
indicus en menor proporción. Entre las dicotiledóneas presentes, se destacan hierbas
como Sida leprosa, Lepidium parodii, Plantago sp., y Sisyrinchium platense.
2. En igual posición topográfica, pero en suelos cuya alcalinidad se manifiesta solo en
profundidad, se presenta una cobertura graminosa de bajo porte (35-40 cm)
predominantemente representada por Cynodon dactylon, Stenotaphrum secundatum,
Panicum milioides, Paspalidium geminatum (ex P. paludivagum), Lolium
multiflorum, Paspalum vaginatum, P. dilatatum, Leersia hexandra, Sporobolus
indicus, Chaetotropis imberbis. Junto a estas especies encontramos graminoides y
hierbas tales como Heleocharis viridans, Jussiaea repens, Hidrocotile bonariensis,
Juncus imbricatus, J. microcephalus, Polygonum aviculare, Carex sororia, C.
38 Bonariensis, Mentha pulegium, Eryngium echinatum, Pamphalea bupleurifolia,
Phyla canescens, Nothoscordum bonariense, Centaureum pulchellum, Cyperus
reflexus, C. Laetus y C. corymbosus. Entre las leguminosas se destacan Lotus
tennuis y Melilotus indicus (Fig. 6, E).
3. En los suelos correspondientes al bajo inundable se presenta como especie
dominante Juncus imbricatus, que tiene una altura promedio de 50 cm y que
comparte el estrato inferior con Cynodon dactylon principalmente, Distichlis
spicata, D. laxiflora, Chaetotropis imberbis, Paspalum vaginatum, Hordeum
stenostachys, y las siguientes hierbas Heleocharis viridans, Jussiaea repens y
Myriophyllum brasiliensi.
4. En los sectores ubicados en posición topográfica más baja (cubetas) y sin
alcalinidad sódica se encuentra la comunidad descripta por Vervoorst (1967) como
Duraznillar. Presenta franjas concéntricas desde el borde al centro de la depresión.
En la franja más externa dominan especies como Azolla filiculoides, Marsilea
concinna y Lemna sp., hacia el centro continúa Alternanthera philoxeroides,
Glyceria multiflora, Jussiaea repens y Scirpis americanus, el sector siguiente
representa al duraznillar propiamente dicho con Solanum malacoxylon y
Heleocharis macrostachys, y hacia el centro de la laguna domina Alternanthera
philoxeroidea (Fig. 6, F).
Según Vervoorst (op. cit.), en la Depresión del Salado y fuera del área de estudio, coexisten otras comunidades propias de depresiones y bajos anegables, como el Hunquillar
39 (Juncus acutus var. leopoldii), Espartillar (Spartina sp.), Juncal (Scirpus californicus),
Totoral (Typha latifolia), Espadañal (Zizaniopsis bonariensis), Talar (Celtis spinosa) y vegetación de los médanos.
40
Fig. 6. A–F. Diferentes paisajes de la Zona. A-B. Loma. C-D. Bajo encharcable con suelos alcalinos, con comunidades puras de Distichlis o zonas de pelochanchal. E. Pie de loma. F. Bajo inundable con Cubetas.
41 1.3- BIBLIOGRAFÍA
En este trabajo se tomó como referencia para las abreviaturas de las revistas y libros de la bibliografía el sistema BPH, basado en: Lawrence G H M, A F G Buchheim, G S
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59 2- MATERIALES Y MÉTODOS
2.1- MATERIALES
Los materiales fueron recolectados en el área de estudio y todos los especímenes fueron herborizados, identificados, y depositados en el Herbario del Instituto de Botánica
Darwinion (SI). Para las abreviaturas de las siglas de los autores se ha seguido a Brummitt
& Powell (1992).
Briza subaristata Lam. ARGENTINA. Prov. Buenos Aires: Pdo. Chascomús, Ruta 58,
Camino a Comandante Giribone, 14-XI-2001, Lovisolo, M. 2. (SI).
Glyceria multiflora Steud.. ARGENTINA. Prov. Buenos Aires. Pdo. de Coronel Brandsen.
Ruta 29, 40 km antes de llegar a Ranchos. 14-XI-2001. Lovisolo, M. 3. (SI).
Melica brasiliana P. Arduinus. ARGENTINA. Prov. Buenos Aires. Pdo. de Chascomús.
Ruta 58, Camino a Comandante Giribone. 14-XI-2001. Lovisolo, M. 5. (SI).
Chaetotropis imberbis (Kunth) Björkman. var. imberbis. ARGENTINA. Prov. Buenos
Aires. Pdo. de Chascomús. Ruta 29, Camino Brandsen - Chascomús. 14-XI-2001. Lovisolo,
M. 4. (SI).
Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees) Cabrera y Rúgolo.
ARGENTINA. Prov. Buenos Aires. Pdo. de Coronel Brandsen. Ruta 29, 30 km antes de llegara Ranchos. 14-XI-2001. Lovisolo, M. 1. (SI).
60
Distichlis laxiflora Hack. ARGENTINA. Prov. Buenos Aires. Pdo. de Coronel Brandsen.
Ruta 29, 10 km antes de llegar a Coronel Brandsen. 19-XII-2001. Lovisolo, M. 12. (SI);
ARGENTINA. Prov. Buenos Aires. Pdo. de Gral. Paz.
Ranchos. Ruta 29, 5 km antes de llegar a Villanueva. 16-I-2002. Lovisolo, M. 18. (SI).
Distichlis spicata (L.) Greene. ARGENTINA. Prov. Buenos Aires. Pdo. de Coronel
Brandsen. Ruta 29, 20 km antes de llegar a Ranchos. 16-I-2002. Lovisolo, M. 17. (SI).
Eleusine tristachya (Lam.) Lam. ARGENTINA. Prov. Buenos Aires. Pdo. de Coronel
Brandsen. Ruta 29, 30 km antes de llegar a Ranchos. 14-XI-2001. Lovisolo, M. 8. (SI).
Paspalidium geminatum (Forssk.) Stapf, [Paspalidium paludivagum (Hitchc. et Chase)
Parodi]. ARGENTINA. Prov. Buenos Aires. Pdo. de Coronel Brandsen. Ruta 29, 40 km antes de llegar a Ranchos. 19-XII-2001. Lovisolo, M. 13. (SI).
Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze. ARGENTINA. Prov. Buenos Aires. Pdo.
Chascomús. Ruta 58, Camino a Comandante Giribone. 14-XI-2001. Lovisolo, M. 16. (SI).
2.2- MÉTODOS
Las especies estudiadas han sido coleccionadas y acondicionadas para material de referencia (Herbario). Las identificaciones han sido verificadas sobre la base de la bibliografía correspondiente y comparadas con materiales de herbario conservados (SI). Al mismo tiempo se realizaron observaciones a campo sobre el hábitat de los taxones.
61 Diferentes metodologías fueron desarrolladas para realizar las observaciones con el
Microscopio Óptico (MO), el Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) y el Microscopio
Electrónico de Transmisión (MET).
A- Microscopio óptico.
Inflorescencias en diferentes estadios de desarrollo fueron coleccionadas y fijadas en FAA
(Formol-ácido acético-alcohol):
1- Inflorescencias totalmente incluidas dentro de la hoja bandera (antes de la antesis de las espiguillas).
2- Inflorescencias con la base incluida dentro de la hoja bandera y el ápice en estado de antesis (polen maduro).
3- Inflorescencias totalmente fuera de la hoja bandera, con anteras maduras y dehiscentes (post-antesis).
4- Inflorescencias totalmente fuera de la hoja bandera, con anteras caídas y estigmas marchitos.
5- Inflorescencias con cariopsis de tamaño definitivo pero inmaduros (pre- maduración).
1 2 4 5 3
62
Previa selección de las espiguillas, las mismas fueron tratadas con ácido fluorhídrico al
20% durante 24-48 horas para disolver los cuerpos silíceos presentes en la epidermis de glumas y glumelas, que dificultan la obtención de los cortes. Las cariopsis pre-maduras y maduras se separaron de las glumelas y fueron sometidas a un tratamiento de ácido clorhídrico al 50% durante 48 horas para hidrolizar el almidón presente en el endosperma.
Todos los materiales fueron incluidos en parafina por el método tradicional de D’Ambrogio
(1986). Los cortes se realizaron con Micrótomo rotativo tipo Minot a 7-9 µm de espesor. Se obtuvieron cortes longitudinales y transversales seriados de espiguillas completas y de frutos. La coloración básica utilizada fue safranina-fast-green (D’Ambrogio 1986) y el montaje se realizó en forma definitiva utilizando un medio sintético (PMy R), propio de preparados permanentes.
Sobre material conservado, se realizaron los siguientes tests histoquímicos en frutos
(inmaduros y maduros) y en anteras (maduras e inmaduras), para detectar distintos compuestos citoplasmáticos y de paredes celulares:
* Reactivo de lugol: para reconocimiento y clasificación de almidón (Tateoka
1954, 1955, 1962).
* Solución diluida de azul de algodón (0,1%) y observación con microscopio de
fluorescencia: para reconocimiento de calosa (D’Ambrogio 1986, Rost 1992).
* Sudán IV para identificación de lípidos (D’Ambrogio 1986).
*Solución de cloruro férrico al 10% y carbonato de sodio al 2% para la detección
de taninos.
63 Se realizaron además observaciones con microscopio de luz polarizada (Wild M20) para el reconocimiento de almidón.
B- Microscopio electrónico de barrido (MEB).
Espiguillas conservadas en FAA se observaron con microscopio estereoscópico
Wild M5 con el fin de seleccionar páleas, lemmas, anteras maduras y frutos. Luego se deshidrataron en una serie ascendente de acetonas y se secaron al aire, se montaron en platinas metálicas y se metalizaron con oro-paladio. Para observar granos de polen y óvulos turgentes se aplicó la técnica de punto crítico (O’Brien & Mc. Cully 1981). Las observaciones se realizaron con un microscopio electrónico de barrido Philips XL 30
(Museo Argentino de Ciencias Naturales Bernardino Rivadavia).
C- Microscopio electrónico de transmisión (MET).
El material vivo (anteras y ovarios) fue fijado en glutaraldehído al 3%, en buffer fosfato durante 4-24 horas y post-fijado en tetróxido de osmio al 1,5% en igual buffer durante 4 horas. Se incluyó en resina epoxy y se obtuvieron cortes ultrafinos de 750-900 nm de espesor con un ultramicrótomo Sorvall. Para la observación de la ultraestructura de los sacos embrionarios se realizaron grillas con cortes seriados. Todos los cortes se colorearon con acetato de uranilo y citrato de plomo (solución de Reynolds) (O’Brien &
Mc. Cully 1981). Las observaciones se realizaron con un microscopio electrónico de transmisión Jeol-Jem 1200 EXII a 85 kV (INTA, Castelar) y un Philips EM 301 a 60 kV
(F.C.E. y N. UBA).
64
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65 3- DESARROLLO DEL GRANO DE POLEN
3.1- INTRODUCCIÓN
Los estudios realizados hasta el momento sobre el desarrollo del polen y la morfología del microsporangio en la familia Poaceae muestran las siguientes características generales: citocinesis sucesivas en las células madres del polen, granos de polen uniporados y operculados, granos de polen liberados en estadio 3-celular, con gran cantidad de almidón en su citoplasma y tapete de tipo secretor con células binucleadas (Chandra 1963a,
Woodland 1964, Untawale et al. 1969, Bhanwra & Choda 1986, Bhanwra 1988, Bhanwra et al. 1991, Johri et al. 1992, Kirpes et al. 1996, Clement & Pacini 2001, Dane & Meric
2005 y Montiel & Sánchez 2006). Sólo en Eleusine compresa, Eleusine coracana y
Penisetum typhoideum las células del tapete se han descripto como uninucleadas
(Mahalingappa 1977, Narayanaswami 1952).
Dentro de la familia Poaceae, numerosas especies relevantes tanto económica como ecológicamente, exhiben una baja producción de semillas. Diversos trabajos sobre el desarrollo y viabilidad del polen se han encarado en algunas especies con el objetivo de aportar datos que ayuden a dilucidar el problema en la reproducción sexual de las mismas
(De Vries & Ie 1970, Warmke & Overman 1972, Muniyamm 1978, Ping et al. 2000, Huang et al. 2004 y Nianjun et al. 2005).
Entre los pocos estudios existentes referidos a la muerte celular programada durante el proceso de microsporogénesis, encontramos un estudio destacado en Poaceae, específicamente en el género Brachiaria (Fuzinatto et al. 2007), el cual está directamente relacionado con la esterilidad masculina.
66 Es sabido que la calosa juega un rol muy importante en la producción de granos de polen funcionales. La dinámica en la deposición de esta sustancia ha llamado la atención en algunas Poaceae, por lo que se han realizado estudios detallados de este proceso (Nianjun et al. 2004, Li et al. 2001).
En la mayoría de las especies de gramíneas estudiadas hasta el presente, la citocinesis es sucesiva y las tétrades son de tipo isobilateral, pero también se han encontrado en menor proporción tétrades tetraédricas, decusadas, lineales y en forma de T.
(Chandra 1963a, Untawale et al. 1969, Bhanwra & Choda 1986, Bhanwra 1988, Bhanwra et al. 1991 y Johri et al. 1992). Hasta el momento sólo se ha descripto citocinesis simultánea en Spinifex littoreus (Burm. f.) Merr. dando como resultado tétrades de tipo isobilateral, lineal, tetraédrica y decusada (Lakshmann & Jayalakshmi 1980).
Teniendo en cuenta el elevado número de especies que presenta la familia Poaceae,
los trabajos sobre el desarrollo del polen realizados hasta el momento son muy escasos. El
objetivo de este capítulo fue realizar el estudio de la microsporogénesis, la
microgametogénesis y la ontogenia del microsporangio en las 10 especies seleccionadas,
con el objetivo de incrementar el conocimiento embriológico básico para la familia y
aportar datos de valor taxonómico, además de contribuir a dilucidar los problemas de
reproducción sexual que presenta la especie Stenotaphrum secundatum.
3.2- OBSERVACIONES
Los siguientes resultados se refieren a todas las especies tomadas en consideración, aportándose generalidades, diferencias y relaciones entre los taxones. Cada entidad ha sido ilustrada, con el fin de complementar los caracteres descriptos.
67 3.2.1 - MICROSPORANGIO
La pared de la antera joven está compuesta de afuera hacia adentro por: una epidermis, el endotecio, una capa media y un tapete de tipo secretor (Figs. 1, A; 2, A; 3, A;
5, A; 7, A; 8, A, B; 10, A;11, A; 13, A; 14, A; 15, A; 16, A, B; 17, A; 18, A; 19, A; 20, A;
21, A, B; 22, A).
El desarrollo de la pared corresponde al tipo Monocotiledóneo (Davis, 1966), es decir que la capa media y el tapete tienen un origen común. En un estado muy joven de desarrollo, la pared presenta tres capas iniciales: la futura epidermis y 2 estratos parietales secundarios. El primer estrato parietal secundario origina al endotecio y el segundo estrato parietal secundario por divisiones periclinales origina la capa media y el tapete (Fig. 17, A flecha).
La epidermis es la capa que permanece intacta en todos los estadios del desarrollo
(Figs. 1, A-F; 3, A-D; 4, D; 5, A-D; 7, A-F; 10, A, D, E; 13, A-E; 15, A-E; 17, A-F; 19, A-
I; 20, A-D; 22, A-D). A medida que la pared va madurando, las células de este estrato aumentan considerablemente de volumen (Figs. 1, E, F; 3, C, D; 4, D; 5, C, D; 7, D, E, F;
10, D, E; 13, D, E; 15, D, E; 17, F; 20, C, D; 22, C, D). Deyeuxia viridiflavescens presenta en el estadio de antera madura la cutícula epidérmica lisa, a diferencia del resto de las especies en donde la misma es estriada (Figs. 10, E; 11, H flecha). Este carácter se observa más marcado en Distichlis laxiflora (Fig. 13 C, D, E). A su vez, en Paspalidium geminatum el citoplasma de las células epidérmicas contiene abundante cantidad de sustancias tánicas
(Fig. 20 B, C, D).
Las células del tapete son las que experimentan mayores modificaciones, en este sentido siguen las células del endotecio. Ellas sufren un aumento de volumen a medida que va madurando la pared de la antera, hasta que en el estadio de micrósporos libres,
68 comienzan a formarse engrosamientos fibrilares lignificados en forma de bandas continuas, que recorren tanto las paredes tangenciales como las radiales, completando su desarrollo en el estadio de grano de polen maduro (Figs. 1, E, F; 3, C, D; 4,D; 5, C, D; 6, D; 7, E, F; 9, A,
C, D; 10, E; 11 H; 20, C, D; 22, C, D). Solamente Distichlis laxiflora, D. spicata y Eleusine tristachya desarrollan estos engrosamientos muy tempranamente, esto es, cuando los micrósporos están siendo liberados de sus tétrades (Figs. 13, C, D, E; 14, I; 15, C, D, E; 17,
C, D, E, F; 18, C, E, F). La disposición, el número y las interconexiones de estas bandas en las distintas caras de estas células, es lo que le confiere a este estrato la capacidad de actuar mecánicamente en el proceso de apertura de la antera. En la pared tangencial externa, las bandas que se depositan son pocas y delgadas, y corren en forma aproximadamente paralela en el sentido del eje longitudinal de la antera. Estas mismas bandas, en las paredes radiales se ramifican y en la tangencial interna se anastomosan. De este modo, esta última cara es la más rígida, ya que es la que posee mayor cantidad de espesamientos. Debido a que la pared tangencial externa tiene entre las bandas lignificadas una alta proporción de pared primaria delgada, es capaz de plegarse al producirse la deshidratación en el momento de la dehiscencia de la antera. Por efecto de esta acción, la pared de la antera se curvará hacia fuera produciendo la apertura de la misma.
Paralelamente a la especialización de las células del endotecio, se diferencia la zona de dehiscencia. Esta zona está formada por un grupo o hilera de células pequeñas de aspecto parenquimático, vacuolizadas y de paredes delgadas, que se desintegran por ruptura de paredes conjuntamente con algunas células del septo, cuando los granos de polen están maduros, permitiendo así la apertura de la antera (Fig. 19 F, H, flechas).
El tapete es de tipo secretor. En el estadio de células madres de los micrósporos, sus células son uninucleadas y con un citoplasma muy denso, poco vacuolizado (Figs. 1, A; 2,
69 A, B; 3, A; 5, A; 7, A; 8, A, B; 10, A; 13, A; 14, A, B; 15, A; 16, A, B; 17, A; 18, A; 19, A,
B, C; 20, A; 21, A, B; 22, A, B). Cuando las tétrades ya se han formado, estas células se observan binucleadas debido a la división mitótica de sus núcleos (Figs. 1, C, D; 5,C; 7, C,
D, E; 8, A, B; 13, B, C, D; 15, B, C, D; 16, A, B; 17, D, E; 18, A; 20, B, C; 22, C). Sólo en
Briza subaristata, Chaetotropis imberbis y Eleusine tristachya se observa el tapete binucleado en un estadio más temprano del desarrollo, esto es, previo a la división meiótica de la célula madre de los micrósporos. (Figs. 1, B; 7, B; 10, A; 17, B; 19, D flecha, E). En
Distichlis spicata se destaca una gran vacuolización de las células tapetales en el momento de formación de las tétrades, lo que genera una polarización de los núcleos hacia la capa media (Fig. 15, B).
En el estadio de micrósporos libres, las células tapetales muestran signos de degradación, mientras que sobre la cara tangencial interna se observa una membrana tapetal con cuerpos de Ubisch u orbículas (Figs. 1, D, E; 3, C; 5, C; 7, E; 8, I; 10, D; 13, D; 15, D;
17, D, E; 19, G, H, I; 20, C; 22, C).
Cuando los granos de polen están totalmente maduros ya no se visualizan restos de las células tapetales y la membrana tapetal se encuentra en íntimo contacto con el endotecio en la mayoría de las especies estudiadas (Figs. 1, F; 2, D; 3, D; 4, C, D; 10, E; 11, H; 13, E;
14, I; 15, E; 16, F; 17, F; 18, F; 19, H, I; 22, D; 23, E). En Melica brasiliana y Chaetotropis imberbis la degradación del tapete es más lenta, y en estos últimos estadios todavía se observan algunos restos celulares (Figs. 5, D; 7, F; 9, C). En Paspalidium geminatum las células tapetales se encuentran presentes en el estadio de antera totalmente madura y presentan sólo signos de degradación menor (Fig. 20, D).
La capa media es un estrato muy efímero, ya que comienza su degradación luego de formadas las tétrades, y se encuentra ausente en el estadio de micrósporos libres (Figs. 3, B,
70 C; 5, B, C; 10, D; 13, B, C, D; 15, B, C, D; 20, B, C). En Briza subaristata, Chaetotropis imberbis, Eleusine tristachya y Stenotaphrum secundatum la desaparición de este estrato es aún más temprana, dado que en el estadio de tétrades sólo se observan restos de sus células (Figs. 1, C; 7, C; 17, C; 19, C; 22, B).
3.2.2- MICROSPOROGÉNESIS
Las células del arquesporio forman una o dos hileras por lóculo, su citoplasma es muy denso, poseen paredes delgadas y carecen de espacios intercelulares (Figs. 2, A; 7, A;
8, A, B; 14, A; 15, A; 17, A, B; 18, A; 19, A). El proceso de maduración que consiste en la preparación para la meiosis y la diferenciación en células madres de los micrósporos, está acompañado de cambios citológicos y morfológicos muy evidentes. En primer lugar se produce la formación de una pared especial de calosa, la cual es particularmente conspicua en la zona de contacto entre las dos hileras de células del arquesporio. La laminilla media y las paredes primarias de las células del tejido arquespórico se degradan (Figs. 1, A; 3, A; 5,
A; 11, A; 12, A; 13, A; 14, B; 16, A, B; 19, B; 20, A; 21, A, B; 22, A). Este proceso va acompañado de un cambio de forma, ya que las células se vuelven esféricas y aparecen espacios intercelulares entre ellas. Las ahora células madres de los micrósporos se observan rodeadas por la pared especial de calosa y parcialmente unidas entre sí por prolongaciones de dicha pared (Figs. 1, B; 10, A)
Las divisiones de las células madres de los micrósporos son de tipo sucesivo, es decir que tanto la meiosis I como la meiosis II están acompañadas por la formación de pared de calosa (Figs. 6, A; 7 B; 8, C; 10, B; 11, B; 12, B; 15, B; 16, C; 20, B; 22, B).
Todas las especies presentan tétrades isobilaterales (Figs. 1, C; 3, B; 5, B; 6, B; 7, C; 8, E,
71 F; 10, C; 11, C; 12, C; 13, B; 14, C; 15, B; 17, C; 18, B; 20, B; 21, C; 23, A, B). Sin embargo, Briza subaristata, Melica brasiliana, Chaetotropis imberbis, Deyeuxia viridiflavescens, Eleusine tristachya y Paspalidium geminatum desarrollan esporádicamente algunas tétrades decusadas (Figs. 1, C; 2, B; 3, B; 5, B; 7, C; 8, D; 10, C;
11, D; 17, C; 20, B; 21, C, 23, B). Generalmente estos dos tipos de tétrades están bien definidos, pero se observaron también algunas tétrades intermedias en cuanto a la disposición de sus micrósporos (Fig. 1, C).
3.2.3- MICROGAMETOGÉNESIS
La pared de calosa que rodea a las células madres, y que se conserva en el estadio de tétrades, se disuelve y se produce la liberación dentro del lóculo de los micrósporos, sobre los cuales comienza a depositarse la esporopolenina, formando las esculturaciones de la ectexina (Figs. 7, D; 8, G; 11, E; 13, C; 15, C; 17, D; 18, C).
Una vez liberados los micrósporos, incorporan una importante cantidad de agua desarrollando una gran vacuola, lo que genera un notable aumento de volumen de los mismos (Figs. 1, D, E; 2, C; 3, C; 4, A, B; 5, C; 6, C; 7, E; 8, H, I; 10, D; 11, F; 13, D; 14,
D; 15, D; 16, D, E; 17, E; 18, C, D; 19, G; 20, C; 22, C; 23, C, D).
La división mitótica del micrósporo origina una célula generativa pequeña, que ocupa una posición parietal, y una vegetativa de mayor tamaño, la cual hereda la gran vacuola del micrósporo (Figs. 1 D-E; 3, C; 7, E; 9, A-B; 10, E; 11, G; 14, E-F; 15, D; 18, E;
20, D; 21, D). Posteriormente, el citoplasma de esta última engloba a la primera, la cual se observa entonces en una posición central (Figs. 7, F; 17, F; 20, D; 21, E).
72 En el último estadio, la célula generativa se divide mitóticamente originando las dos gametas masculinas de forma lenticular. El núcleo vegetativo se observa muy lobulado y en
íntimo contacto con ambas gametas. Asimismo, el citoplasma vegetativo presenta gran cantidad de granos de almidón. Los granos de polen se observan dispuestos en la periferia del lóculo de la antera, con el poro generalmente orientado hacia la pared de la misma y son liberados en estadio tricelular en todas las especies estudiadas (Figs. 1, F; 2, D; 3, D; 4, C,
D; 5, D; 6, D; 7, F; 9, C, D; 11, I; 13, E; 14, G-H; 15, E; 16, F; 18, F; 19, H, I; 20, D; 21, F;
22, D; 23, E, F).
En Paspalidium geminatum se observa en la antera madura gran proporción de granos de polen bicelulares que no han alcanzado su maduración total al estadio tricelular, cuya célula vegetativa permanece muy vacuolada y no acumula sustancias de reserva (Fig.
21, D).
Los granos de polen son monoporados o monotremos (Figs. 10 E; 13, E; 15, D, E;
17, F; 20, D). Distichlis laxiflora, Distichlis spicata, Eleusine tristachya, Paspalidium geminatum y Stenotaphrum secundatum poseen un opérculo bien desarrollado, a diferencia de las restantes especies en donde el mismo está ausente (Figs. 13, E; 15, D, E; 17, F; 19 G, flecha; 20, D; 22, C). La exina presenta tectum, columelas y capa basal. Espículas supratectales se encuentran en todas las especies.
3.3- DISCUSIÓN
El desarrollo de la pared de la antera es del tipo Monocotiledóneo para todas las especies estudiadas y corresponde al descripto para la familia (Johri et al. 1992 y Furness &
Rudall 2001). Todas las especies presentan una única capa media que posee origen común
73 con el tapete. Esto es coincidente con las observaciones realizadas previamente para
Eleusine compressa (Mahalingappa,1977), Triticale CV TRI -1 ( Bhandari &
Koshla,1982), en siete especies de Poaceae (Bhanwra,1988) y en especies de
Bambusoideae, Panicoideae y Chloridoideae (Nakamura et al.,2010.).
Todas las especies estudiadas, excepto Deyeuxia viridiflavescens, poseen la cutícula estriada. Este último carácter fue descripto detalladamente para Zea mays por Cheng et al.
(1986), quienes estudiaron la ultraestructura de la membrana cuticular.
El tapete es de tipo secretor, el cual representa una característica general para la familia Poaceae, ya que no se han observado excepciones hasta el momento (Johri et al.
1992). Las células de este tejido se vuelven binucleadas a partir del estadio de tétrades en las especies estudiadas. Este carácter es variable dentro la familia, ya que las mismas permanecen uninucleadas en algunas especies pertenecientes a las tribus Bambuseae,
Eragrosteae, Cynodonteae (ex –Chlorideae), Paniceae y Aveneae (Anton 1982, Bhanwra
1988, Bhanwra et al. 1991 y Nakamura et al 2010). También en Sporobolus indicus (Tribu:
Sporoboleae) se encontró este mismo carácter descripto por Astegiano (1989).
Las células tapetales aparecen totalmente degradadas en el estadio de grano de polen maduro, a excepción de Paspalidium geminatum, donde éstas permanecen con un alto grado de integridad en este último estadio del desarrollo. Durante la gametogénesis masculina ocurre uno de los mejores ejemplos conocidos de muerte celular programada en plantas, donde luego de producidas las tétrades de micrósporos las células tapetales comienzan a degenerar produciendo nutrientes para el desarrollo de los futuros granos de polen (Wu & Cheung 2000 y Fuzinatto et al. 2007). Por lo tanto, cualquier alteración de esta programación podría traer como consecuencia la esterilidad del polen. Varios tipos de anormalidades en las células tapetales se han documentado en relación al aborto del polen
74 (Raghavan 1997). En el primer tipo, la desintegración del tapete comienza tempranamente junto con la desorganización de las células esporógenas. En el segundo tipo, el tapete forma un periplasmodio que engloba a los microsporocitos y los destruye previamente a la meiosis. En el tercero, la degeneración tapetal va precedida por una elongación tangencial de sus células y un decrecimiento en el tamaño de los núcleos (Chauhan & Singh, 1966).
En un último tipo, el tapete persiste hasta que los granos de polen han madurado, mientras que dicho tejido desaparece en las anteras fértiles (Joppa et al. 1966). Este último caso es el que se observa en Paspalidium geminatum, donde el tapete se desarrolla más notablemente y persiste en el estadio de polen maduro, a diferencia de las otras especies estudiadas. Es precisamente en P. geminatum donde se observa en la antera madura gran proporción de granos de polen bicelulares que no llegan a alcanzar su maduración total al estadio tricelular, y cuya célula vegetativa permanece muy vacuolada y no acumula sustancias de reserva. Por lo tanto, la persistencia de las células tapetales podría ser una de las causas que impide la maduración completa de muchos de los granos de polen.
Un posible nexo entre la función tapetal y la esterilidad masculina fue detectado en una línea androestéril de cebada, en la cual se detectó una sobreproducción de esporopolenina, identificada como glóbulos dentro del lóculo (Ahokas 1978). P. geminatum forma orbículas más tempranamente que el resto de las especies estudiadas, además de presentar en la antera madura una mayor concentración de las mismas, las cuales a su vez aparecen conectadas entre sí (ver Capítulo: Diversidad de Orbículas). Esta producción prematura y mayor de orbículas podría estar en relación con una sobreproducción de esporopolenina que afectaría la formación de granos de polen viables.
La microsporogénesis es de tipo sucesivo y las tétrades formadas son isobilaterales a decusadas en todas las especies estudiadas. La mayoría de las especies de Poaceae
75 estudiadas hasta el momento presentan tétrades isobilaterales (Chandra 1963a; Untawale et al. 1969; Mahalingappa 1977; Xi & DeManson 1984; Bhanwra 1988; Bhanwra et al. 1991,
Febulaus & Pullaiah 1990, 1991, 1994, 1996; Teng et al. 2005 y Nakamura et al. 2010). Sin embargo, Bhanwra (1988) reporta que en algunas especies de la familia se han encontrado tétrades de tipo tetraédricas y lineales. Las numerosas observaciones realizadas en este trabajo permiten confirmar la ausencia de este tipo de tétrades en las especies aquí estudiadas.
El grano de polen se libera en estadio tricelular, con las dos gametas masculinas formadas. (Chandra 1963a; Untawale et al. 1969; Cass 1973; Cass & Karas 1975;
Mahalingappa 1977; Anton 1982; Bhandari & Khosla 1982; Xi & DeManson 1984;
Bhanwra 1988; Cass & Fabi 1988; Astegiano 1989; Bhanwra et al. 1991, Febulaus &
Pullaiah 1990, 1991, 1994, 1996; Pacini et al. 1992 y Nakamura et al. 2010). Esto es característico de la familia (Johri et al. 1992), y típico de aquellas especies cuyo gametófito masculino tiene una vida corta. En todas las especies estudiadas en este trabajo se observó que ambas gametas se encuentran muy próximas entre sí y asociadas a su vez con el núcleo vegetativo, el cual se presenta con un aspecto muy lobulado. Toda esta estructura hace recordar a la unidad germinal masculina tal cual fuera descripta por Yu et al. (1989) y Hu
(1990). Reconstrucciones asistidas por computadora de la unidad germinal masculina fueron realizadas en varias especies (Brassica, Plumbago, Zea mays, Hordeum sp.), las cuales permitieron comprobar de manera fehaciente su estructura y funcionamiento
(Russell & Cass 1981, Russell 1984, McConchie et al. 1985, Mogensen & Wagner 1987 y
Mogensen et al. 1989). La íntima interconexión entre las gametas y el núcleo vegetativo facilitaría el desplazamiento de las primeras a través del tubo polínico.
76 Todas las especies estudiadas desarrollan una membrana tapetal con orbículas o cuerpos de Ubisch. Ésta aparece formada en el estadio de micrósporos libres y permanece cuando la antera está madura y el tapete ya se ha degradado. Esta característica fue observada previamente para otras especies de Poaceae (Rowley 1963; Banerjee 1967;
Christensen et al. 1972; Rowley & Skvarla 1974; Mahalingappa 1977; El-Ghazaly &
Jensen 1986, 1987 y Ogorodnikova 1986).
El grano de polen es uniporado en todas las especies estudiadas en este trabajo, carácter que coincide con lo descripto en general para la familia Poaceae (Johri et al. 1992).
Sin embargo, Guohua et al. (2009) encontraron granos de polen multiporados en 14 especies apomícticas.
Los granos de polen de todas las especies estudiadas presentan una disposición especial dentro del lóculo de la antera, éstos se encuentran dispuestos en la periferia del lóculo, en íntimo contacto con el tapete primero y con la pared de la antera o más específicamente con la membrana tapetal, en el estadio maduro. Generalmente el único poro que presenta el gametófito masculino maduro se encuentra orientado hacia dicha membrana. Esto es característico de Poaceae y Cyperaceae (Kirpes et al. 1996), las cuales se diferencian claramente del resto de la mayoría de las Angiospermas, que presentan una disposición central del polen en el lóculo de la antera. Este tipo de disposición del polen dentro del lóculo de la antera en Poaceae y Cyperaceae se cree que podría estar relacionado con la anemofilia presente en estas dos familias.
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83
Fig. 1. A–F - Briza subaristata Lamarck. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Pared del microsporangio joven con células madres de los micrósporos rodeadas de calosa. B. Células madres de los micrósporos con las paredes disueltas previas a la primera división meiótica y con pared de calosa con prolongaciones. C. Tétrades isobilaterales y decusadas. Pared con restos de estratos parietales. D-E. Estadio de micrósporo libre y polen bicelular con la pared en diferentes estados de maduración (doble flecha), D más joven, E, más madura. F. Grano de polen maduro tricelular y detalle de la pared de la antera madura. Reglilla = 25 µm
84
Fig. 2. A-D- Briza subaristata Lamarck. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Microsporangio joven. Células madres de los micrósporos (CMm). B. Tétrades decusadas. C. Micrósporos libres. D. Grano de polen maduro tricelular. Reglillas = A, 7 µm; B-D, 8 µm; C, 9 µm.
85
Fig. 3. A–D- Glyceria multiflora Steudel. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Pared del microsporangio joven con células madres de los Micrósporos rodeadas de calosa. B. Tétrades isobilaterales y decusadas. Pared con los estratos parietales en proceso de degradación. C. Estadio de micrósporo libre y polen bicelular con el tapete secretor casi consumido y membrana tapetal con cuerpos de Ubisch. F. Grano de polen maduro tricelular. Detalle de la pared de la antera madura con engrosamientos fibrilares en el endotecio. Reglilla = 50 µm.
86
Fig. 4. A–D- Glyceria multiflora Steudel. A – B. Microsporangio (CT) – Micrósporos libres. C –D. Microgametogénesis. C. Antera madura con granos de polen maduros (CL). D. Pared de la antera madura y grano de polen maduro tricelular. Reglillas = A, 6 µm; B, 12 µm, C, 9 µm; D, 14 µm.
87
Fig. 5. A–D- Melica brasiliana P. Arduinus. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Pared del microsporangio joven con células madres de los Micrósporos rodeadas de calosa. B. Tétrades isobilaterales y decusadas con restos de calosa con prolongaciones. Pared con los estratos parietales en proceso de degradación. C. Estadio de micrósporo libre. Pared de la antera con el tapete secretor binucleado degradándose y membrana tapetal con cuerpos de Ubisch. D. Grano de polen maduro tricelular. Detalle de la pared de la antera madura con engrosamientos en el endotecio y escasos restos del tapete secretor. Reglillas = a: 25 µm (B-C-D); b: 50 µm (A).
88
Fig. 6. A–D- Melica brasiliana P. Arduinus. A – C – Microsporogénesis. A. Primera división meiotica de los Micrósporos. B. Tétrades de Micrósporos isobilaterales. C. Micrósporo liberado. D. Grano de Polen maduro con el poro hacia la pared del microsporangio. Detalle del endotecio. Reglillas = A-B, 3 µm; C-D, 3,5 µm.
89 Fig. 7. A–F- Chaetotropis imberbis (Kunth) Björkman var. imberbis. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Pared del microsporangio joven con células madres de los Micrósporos rodeadas de calosa. B. Células Madres de los micrósporos con las paredes disueltas, en primera división meiótica y con prolongaciones de callosa. C. Tétrades isobilaterales y decusadas. Pared con los estratos parietales totalmente consumidos. D. Estadio de micrósporo recién liberado. Pared de la antera con tapete secretor binucleado. E. Estadio de micrósporo libre y polen bicelular con el tapete secretor casi consumido y membrana tapetal con cuerpos de Ubisch. F. Grano de polen maduro tricelular. Detalle de la pared de la antera madura con engrosamientos fibrilares en el endotecio. Reglillas = 25 µm. 90
Fig. 8. A–I- Chaetotropis imberbis (Kunth) Björkman var. imberbis. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A - B. Microsporangio joven (CT). Células Madres de los Micrósporos (CMm). C. Células madres de los micrósporos en primera división Meiotica. D – E. Tétrades de micrósporos. D. Tipo decusada. E. Tipo isobilateral. F - I. Micrósporo. F- G Micrósporos recién liberandose. H - I. Micrósporo libre (CT y CL respectivamente). Reglillas = A, 25 µm; B, 24 µm; C, 6 µm; D, 5,5 µm; E, 7 µm; F, 6,5 µm; G, 19 µm; 80 µm; I, 11 µm.
91
Fig. 9. A–D- Chaetotropis imberbis (Kunth) Björkman var. imberbis. Microgametogénesis. A-B. Grano de Polen Bicelular. C-D. Grano de polen maduro. C. Corte Longitudinal de la antera. D. Corte transversal con detalle de la pared madura y membrana tapetal con cuerpos de Ubisch. Reglillas = A, 14 µm; B, 5,5 µm; C, 16 µm; D, 13 µm.
92
Fig. 10. A–E- Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth var. Montevidensis (Nees). Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Detalle de la pared del microsporangio joven con tapete secretor binucleado y células madres de los Micrósporos. B. Célula madre de los micrósporos en primera y segunda división meiótica. C. Tétradas de micrósporos isobilaterales y decusadas. D. Estadio de micrósporo libre con cuerpos de Ubisch en el tapete secretor. E. Pared de la antera madura con grano de polen bicelular. Reglilla = 25 µm.
93
Fig. 11. A–I- Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth var. montevidensis (Nees). Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Microsporangio joven con Células Madres de los Micrósporos (CMm). B. Células madres de los micrósporos en primera división Meiotica (Díades). C-D. Tétrades de micrósporos. C. Tipo isobilateral. D. Tipo decusada. E. Micrósporos recién liberados. F. Micrósporo libre. G. Grano de polen bicelular. H-I. Polen Maduro. H. Detalle de la pared de la antera madura. Cutícula lisa (flecha). I. Detalle del grano de polen maduro observado con microscopio electrónico de transmisión. g1-g2. gametas. nv. Núcleo vegetativo. Reglillas = A, 7 µm; B, 9 µm; C, D, E, H, 6 µm; F, G, 8 µm; I, 2 µm.
94
Fig. 12. A–C- Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. Presencia de calosa por el método de Fluorescencia. A. En CMm. B. En CMm después de la primera división meiotica. C. En tétrades de micrósporos isobilaterales. Reglillas = A, 14 µm; B, 10 µm; C, 7 µm.
95
Fig. 13. A–E- Distichlis laxiflora Hackel. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Detalle de la pared del microsporangio joven con células madres de los Micrósporos rodeadas de calosa. B. Detalle de la pared con los estratos parietales degenerando y el tapete secretor binucleado. Tétrades de micrósporos de tipo isobilateral. C. Estadio de micrósporo recién liberado. D. Estadio de micrósporo libre y polen bicelular. Tapete binucleado degenerando con cuerpos de Ubisch sobre la membrana tapetal. E. Grano de polen maduro tricelular con poro operculado y detalle de la pared de la antera madura. Reglilla = 25 µm.
96
Fig. 14. A–I- Distichlis laxiflora Hackel. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A – B. Microsporangio joven. A. Células madres de los Micrósporos (CMm) y detalle de la pared de la antera joven. B. CMm con calosa central. C. Tétrades isobilaterales. D. Micrósporo libre uniporado. E - F. Grano de polen bicelular. E. Detalle de la pared de la antera. F. Detalle de células generativa y vegetativa. G – H. Grano de polen maduro tricelular. I – Detalle de la pared de la antera madura. Reglillas = A, 13 µm; B, E, 14 µm; C, 4 µm; D, 7 µm; F, 5 µm; G, H, I, 6 µm.
97
Fig. 15. A–E- Distichlis spicata (L.) Greene. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Detalle de la pared del microsporangio joven con células madres de los Micrósporos rodeadas de calosa. B. Detalle de la pared con los estratos parietales degenerando y el tapete secretor binucleado. Tétrade de micrósporos de tipo isobilateral. C. Estadio de micrósporo recién liberado. D. Estadio de micrósporo libre. Tapete binucleado degenerando con cuerpos de Ubisch sobre la membrana tapetal. E. Grano de polen maduro tricelular con poro operculado y detalle de la pared de la antera madura. Reglilla = 25 µm.
98
Fig. 16. A–F- Distichlis spicata (L.) Greene. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A – B. Microsporangio joven. A. CMm con calosa central. B. Detalle de las células madres de los micrósporos (CMm) y de la pared de la antera joven. C. Primera división meiotica en las CMm. D. Antera en CL con los micrósporos libres dispuestos alrededor del lóculo. E. Micrósporo libre y detalle del poro con opérculo. F. Antera en CL con granos de polen maduros. Reglillas = A, 16 µm; B, 9 µm; C, E, 6 µm; D, 61 µm; 54 µm.
99
Fig. 17. A–F- Eleusine tristachya (Lam.) Lam. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Pared del microsporangio muy joven aún formándose (flecha), con células madres de los micrósporos rodeadas de calosa. B. Pared de la antera joven con células madres de los micrósporos con los estratos parietales en proceso de degradación y el tapete binucleado. C. Tétrades isobilaterales y decusadas. Pared de la antera con los estratos parietales casi consumidos. D. Estadio de micrósporo recién liberado. Tapete secretor binucleado con cuerpos de Ubisch formados. E. Estadio de micrósporo libre con el tapete secretor casi consumido y membrana tapetal con cuerpos de Ubisch. F. Grano de polen en estado bicelular. Detalle de la pared de la antera madura con engrosamientos fibrilares en el endotecio. Reglilla = 25 µm. 100
Fig. 18. A–D- Eleusine tristachya (Lam.) Lam. Microsporogénesis y Microgametogénesis. A – B. Microsporangio joven. A. Células madres de los Micrósporos (CMm) y detalle de la pared joven. B. Tétrades isobilaterales. C. Micrósporos recién liberados. D. Micrósporos libres dispuestos alrededor de la pared de la antera. E. Grano de polen bicelular. F. Grano de polen maduro tricelular. Reglillas = A, 20 µm; B, 18 µm; C, 16 µm; D, F, 14 µm; E, 15 µm.
101
Fig. 19. A–I- Eleusine tristachya (Lam.) Lam. Microsporogénesis y Microgametogénesis en cortes semifinos, inclusión en resina epoxy. A - C. Corte transversal de la antera en estadio de células madres de los micrósporos. A. Detalle de la pared de la antera joven y células arquespóricas. B – C. Células madres de los micrósporos con calosa. C. Detalle de la pared de la antera con el tapete secretor uninucleado. D. Detalle de la pared de la antera en estadio de tétrade de micrósporos, con el tapete secretor binucleado (flecha). E. Vista del tapete binucleado en un corte tangencial. F – G. Estadio de micrósporo libre. F. Corte transversal de la antera y zona de dehiscencia, estomio (flecha). G. Detalle de la pared de la antera y micrósporos libres con poro y opérculo (flecha). H – I. Estadio de polen maduro. H. Corte transversal de la antera madura y zona de dehiscencia (flecha). I. Detalle de la pared de la antera madura con el tapete totalmente consumido y membrana tapetal con cuerpos de Ubisch. Reglillas = A, 6 µm; B, F, H, 14 µm; C, D, E, G, 5 µm; I, 13 µm.
102
Fig. 20. A–D- Paspalidium geminatum (Forssk.) Stapf (ex P. paludivagum). Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Detalle de la pared del microsporangio joven con células madres de los micrósporos rodeadas de calosa. B. Detalle de la pared de la antera con estratos parietales degenerando y tapete secretor binucleado. Células madres de los micrósporos en primera división meiotica. Díades en el comienzo de la segunda división meiotica. Tétrades de micrósporos de tipo isobilateral y decusadas. C. Estadio de micrósporo libre. Tapete binucleado degenerando con cuerpos de Ubisch sobre la membrana tapetal. D. Grano de polen bicelular y tricelular en el mismo lóculo, con poro operculado y detalle de la pared de la antera madura con tapete secretor parcialmente degradado. Reglilla = 25 µm. 103
Fig. 21. A–E– Paspalidium geminatum (Forssk.) Stapf (ex P. paludivagum). Microsporogénesis y Microgametogénesis. A. Microsporangio joven con células madres de los micrósporos (CMm) con calosa central. B. Detalle de la pared de la antera joven. C. Tétrades isobilaterales y decusadas. D. Grano de polen bicelular y maduro en la misma antera. E. Grano de polen bicelular en un corte semifino, inclusión en resina epoxy. F. Grano de polen maduro tricelular. Reglillas = A, 8 µm; B, C, E, 4 µm; D, F, 3 µm. 104
Fig. 22. A–D- Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze. A. Detalle de la pared del microsporangio joven con células madres de los micrósporos rodeadas de calosa. B. Detalle de la pared con los estratos parietales degenerando. Díades en el comienzo de la segunda división meiotica rodeadas con pared delgada de calosa. C. Estadio de micrósporo libre con el tapete binucleado muy bien conservado con desarrollo de cuerpos de Ubisch sobre la membrana tapetal. Pared del futuro grano de polen porado y operculado. D. Grano de polen maduro tricelular y detalle de la pared madura. Reglilla = 25 µm. 105
Fig. 23. A–F- Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze. A – B. Microsporogénesis. A. Tétrades isobilaterales casi en estadio de micrósporos recién liberados. B. Tétrade de micrósporo isobilateral y decusada C – F. Microgametogénesis. C. Micrósporos libres dispuestos alrededor de la pared en un CT de antera. D. Detalle de un Micrósporo libre. E. Granos de polen maduros en un corte longitudinal de antera. F. Detalle de grano de polen maduro tricelular. Reglillas = A, 15 µm; B, 16 µm; C, 51 µm; D, F, 4 µm; E, 45 µm. 106 4 - ONTOGENIA DEL GRANO DE POLEN Y LAS ORBÍCULAS EN ELEUSINE TRISTACHYA.
4.1- INTRODUCCIÓN
El desarrollo del polen a nivel de microscopía electrónica de transmisión fue analizado
hasta el momento en tan sólo unas pocas especies de la familia Poaceae (Poa annua, Zea
mays, Triticum aestivum, Lolium perenne, Saccharum spontaneum, Oryza sativa) (Rowley
et al. 1959; Rowley 1962; Skvarla & Larson 1966; El-Ghazaly & Jensen 1986a, b, 1987;
Pacini et al. 1992; Roques & Feldmann 1996 y Mamun et al. 2005a, b, 2006). Con
referencia al tapete también es escasa la información (Steer 1977; Pacini 1990; Nishiyama
1970a, b, c, 1976a, b; Young et al. 1979 y Mamun et al. 2005a, b). Estos estudios revelaron
la presencia en dichos taxa, de una membrana tapetal con orbículas.
La morfología de las orbículas fue estudiada con Microscopio Electrónico de Barrido en las
siguientes entidades: Dactylis glomerata L., Phleum pratense L., Spartina patens Muhl. y
Zea mays L. (Banerjee 1967).Su desarrollo ontogenético ha sido analizado con Microscopio
Electrónico de Transmisión en Phleum pratense L., Poa annua L., Secale cereale L.,
Sorghum bicolor Moench y Triticum aestivum L. (Rowley & Skvarla 1974; Rowley 1963;
Ogorodnikova 1986; Christensen et al. 1972 y El-Ghazaly & Jensen 1986a).
De acuerdo a la revisión bibliográfica, en la actualidad se sabe que más de 300 especies
pertenecientes aproximadamente a 80 familias de Angiospermas presentan estos cuerpos
denominados orbículas (Huysmans et al. 1998; Galati 2003). A pesar de que ha transcurrido
casi un siglo desde su descubrimiento, la función de estas estructuras todavía permanece
oscura. Muchas hipótesis se han planteado hasta el momento, pero ninguna de ellas ha
podido ser comprobada todavía (Huysmans et al. 1998). Algunos autores relacionan a las
orbículas con el mecanismo de transporte de la esporopolenina desde el tapete hacia los 107 granos de polen en formación. Otros las asocian con la liberación del polen, dado que en el momento de la apertura de la antera las orbículas podrían estar formando una capa continua seca que facilitaría la dispersión del mismo (Huysmans et al. 1998). Rowley & Erdtman
(1967) y posteriormente Herich & Lux (1985) consideraron que las orbículas podrían estar participando en la lisis y degradación de las células tapetales. Por otra parte, El-Ghazaly &
Jensen (1986a) y El-Ghazaly & Nilsson (1991) pensaron en la posibilidad de que estos cuerpos actuaran como un depósito para el exceso de precursores de esporopolenina sintetizados por el tapete, dado que una alta concentración de los mismos podría significar un riesgo para el normal desarrollo de los micrósporos. Recientemente, Galati et al. (2010) han relacionado la morfología de las orbículas con el modo de polinización, lo cual parece orientar de manera más fehaciente la posible función que estarían cumpliendo estos corpúsculos.
Todas las especies estudiadas en este trabajo de tesis presentan orbículas, por lo que se decidió elegir como representativa a una de ellas, Eleusine tristachya, para describir la ultraestructura y desarrollo de los granos de polen y de las orbículas, con el objetivo de aportar datos que ayuden a comprender mejor la forma y función de estas últimas.
4.2- RESULTADOS
4.2.1- ESTADIO I: CÉLULA MADRE DE LOS MICRÓSPOROS (CMm)
En Eleusine tristachya las CMm se observan muy poco vacuolizadas, presentan un citoplasma denso y un núcleo conspicuo. Poseen gran cantidad de mitocondrias, escaso retículo endoplásmico rugoso, abundantes proplástidos y ribosomas sueltos (Fig. 1).
108 En este estadio, las células tapetales también se observan con un citoplasma denso que posee abundante cantidad de mitocondrias, retículo endoplásmico rugoso y plástidos
(Fig. 1).
4.2.2- ESTADIO II: TÉTRADE DE MICRÓSPOROS.
Luego de la meiosis, los micrósporos de las tétrades formadas conservan las características ultraestructurales de las CMm. Estos poseen un citoplasma poco vacuolizado con abundante cantidad de mitocondrias y ribosomas libres, escaso retículo endoplásmico rugoso y algunos plástidos. Entre la pared de calosa y la membrana plasmática se observa el comienzo de la formación de la pared de primexina (Fig. 2 A-C).
Las células tapetales presentan núcleos conspicuos, citoplasma denso, abundante cantidad de mitocondrias y retículo endoplásmico rugoso (Fig. 1; 2 A-D). Se destaca en ellas el elevado número de dictiosomas, observándose liberación de vesículas como así también las invaginaciones de la membrana plasmática, que soportan glóbulos lipídicos, dispuestos entre ella y la pared celular (Fig. 2 C-D). Sobre la pared primaria de las células tapetales en contacto con el lóculo de la antera, se observa una sustancia granular a fibrilar, de elevada electrodensidad. A su vez, esta pared se manifiesta con un aspecto fibrilar laxo
(Fig. 2 C-D).
4.2.3- ESTADIO III: MICRÓSPORO RECIÉN LIBERADO.
Luego de la disolución de la calosa que mantenía unida a la tétrade, los micrósporos liberados adquieren una forma completamente esférica (Fig. 2 E). Poseen un citoplasma con gran cantidad de mitocondrias, plástidos, glóbulos lipídicos y retículo endoplásmico rugoso muy abundante, con cisternas dispuestas de manera paralela (Fig. 2 E).
109 Una sustancia electrodensa se observa en forma de glóbulos disponiéndose sobre la primexina (Fig. 2 E-F).
La ultraestructura del citoplasma de las células tapetales es coincidente con el estadio anterior, con la diferencia que la pared celular se ha degradado totalmente, la membrana plasmática aparece sin las invaginaciones y los glóbulos lipídicos se observan directamente dispuestos sobre ella. Sobre éstos glóbulos lipídicos se observan depósitos de elevada electrodensidad, presuntos precursores de esporopolenina, dado que presentan el mismo aspecto que en la pared del grano de polen en formación (Fig. 2 F).
4.2.4- ESTADIO IV: MICRÓSPORO MADURO.
La ultraestructura del citoplasma del micrósporo es similar a la del estadio anterior, pero con mayor cantidad de ribosomas libres. Se observa ya formada la capa basal, las columelas y el tectum que conforman la ectexina (Fig. 3 A). Tanto el tectum como la capa basal presentan microcanales. Se observan además espículas supratectales. En algunas zonas se puede ver la separación de la plasmalema de la pared como un inicio de la formación de la intina (Fig. 3 A).
Las células tapetales mantienen la misma estructura que en el estadio anterior (Fig.
3 B). Sobre la superficie de los glóbulos lipídicos se observa al comienzo de la formación de la pared de la orbícula, la cual presenta microcanales y espículas. Sin embargo, en la zona de contacto entre el glóbulo lipídico y la plasmalema de la célula tapetal no se observa formación de pared orbicular (Fig. 3 B).
110 4.2.5- ESTADIO V: GRANO DE POLEN BICELULAR.
El micrósporo ya se dividió mitóticamente y la célula generativa fue englobada por la vegetativa. El citoplasma de ésta última se observa con abundante cantidad de amiloplastos y retículo endoplasmático rugoso, el cual conserva en algunas zonas la disposición paralela de sus cisternas. También presenta mitocondrias, dictiosomas, glóbulos lipídicos y ribosomas libres. Vesículas con un contenido fibrilar de mediana electrodensidad se observan dispersas por todo el citoplasma (Fig. 3 C).
La célula generativa posee una delgada pared de moderada electrodensidad. El núcleo ocupa la mayor parte de su volumen y su citoplasma posee mitocondrias, algo de retículo endoplasmático rugoso y ribosomas libres (Fig. 3 C).
La pared del grano de polen se encuentra totalmente formada y las columelas aparecen más espaciadas que en el estadio anterior. La esporopolenina se observa un poco más compactada y la intina está un poco más desarrollada (Fig. 3 D).
El citoplasma de la célula tapetal se encuentra muy degradado, y solo se pueden observar restos de algunas organelas y membranas (Fig. 3 D).
El glóbulo lipídico que formaba el corazón de las orbículas se ha degradado totalmente y el volumen que ocupaba se redujo. La pared de la orbícula está totalmente desarrollada. Se observan claramente los microcanales y las espículas superficiales (Fig. 3
D). Todas las orbículas se encuentran dispuestas sobre una membrana tapetal.
4.2.6- ESTADIO VI: GRANO DE POLEN TRICELULAR.
La célula generativa se dividió mitóticamente dando origen a las dos gametas masculinas. Las mismas presentan un citoplasma muy reducido con pocas organelas. El
111 citoplasma de la célula vegetativa conserva gran cantidad de amiloplastos y vesículas con contenido fibrilar de mediana electrodensidad.
La pared del grano de polen se encuentra totalmente formada. Las espículas supratectales se encuentran bien definidas con sus ápices agudos y la electrodensidad de la exina ha disminuido. La intina se observa muy gruesa y presenta un aspecto fibrilar con zonas de diferente contraste electrónico (Fig. 3 E).
Las células tapetales ya se han degradado totalmente. Las orbículas se observan dispuestas sobre los restos celulares de las mismas, presentan un corazón totalmente transparente a los electrones y una pared de esporopolenina incompleta en la zona de contacto con la pared del microsporangio. Se observa en la pared de la orbícula gran cantidad de microcanales y espículas superficiales de extremos redondeados (Fig. 3 F).
4.3- DISCUSIÓN
Eleusine tristachya presenta un desarrollo del grano de polen normal, similar a lo descripto para otras especies de la familia Poaceae (Johri et al. 1992), el cual ya había sido observado previamente con microscopía óptica, razón por la que fue elegida como especie representativa para este estudio. Los cambios ultraestructurales observados en los distintos estadios del desarrollo en las células tapetales están directamente relacionados con la formación de las orbículas y la producción de esporopolenina (Christensen et al. 1972; El-Ghazaly & Jensen 1986a).
El tapete de tipo secretor es una característica general de la familia Poaceae. Sin embargo, el notable desarrollo del retículo endoplásmico rugoso concomitante con el comienzo de la formación de las orbículas, sugiere la posible intervención de esta organela en la síntesis de las mismas. Un origen similar fue reportado en Oxalis articulata
(Rosenfeldt & Galati 2008), Passiflora spp. (Amela García et. al. 2002), Jacaranda
112 mimosifolia (Galati & Strittmatter 1999), Ceiba insignis (Galati & Rosenfeldt 1998),
Prosopis julifora (Vijayaraghavan & Chaudhry, 1993), Catharanthus roseus (EL-Ghazaly
& Nilsson 1991), Anemarrhena asphodeloides (Chen et al. 1988), Lilium henryi (Herich &
Lux 1985), Lavandula dentata (Suarez-Cervera & Seoane-Camba 1986) y Allium cepa
(Risueño et al. 1969).
En el estadio de tétrades, numerosos glóbulos aparecen entre la plasmalema y la pared tangencial interna de las células tapetales. De acuerdo a la electro-densidad que presentan, estos glóbulos serían lipídicos y podrían se considerados como “pro- orbículas”.
Similares observaciones e interpretaciones fueron realizadas por Clement & Audran (1993 a, b) y Heslop- Harrison & Dickinson (1969) en Lilium sp.; Christensen et al. (1972) en
Sorgum bicolor y Steer (1977) en Avena sp.
Las pro-orbículas son observadas en depresiones o criptas de la plasmalema de las células tapetales. Rowley y Walles (1987) y Steer (1977) encontraron criptas similares para otras especies de Angiospermas y suponen que son el lugar en donde se depositan los lípidos para la formación de las pro-orbículas.
Una sustancia fibrilar con la misma electrodensidad que la esporopolenina se acumula sobre los glóbulos una vez degradada la pared de las células tapetales. Por esta razón, la polimerización de los precursores de esporopolenina parece ocurrir extracelularmente. Esta observación concuerda con las de Amela García et al. (2002), Galati & Strittmatter (1999),
Galati & Rosenfeldt (1998), Clement & Audran (1993 a, b), Christensen et al. (1972) y
Echlin (1971).
Los glóbulos lipídicos o pro-orbículas desaparecen en los cuerpos de Ubisch maduros, y el lugar que éstos ocupaban se observa transparente a los electrones.
113 Observaciones similares fueron reportadas previamente para Oxalis pubescens (Carniel
1967) y Oxalis articulata Savigny (Rosenfeldt & Galati 2005).
En los granos de polen jóvenes de Eleusine tristachya, la célula vegetativa atraviesa un período de crecimiento caracterizado por la síntesis de nuevo citoplasma y el aumento de las organelas. Estos hechos fueron descriptos en la mayoría de los estudios ultraestructurales realizados hasta el momento en diversas especies de Angiospermas
(Raghavan 1997).
Numerosas vesículas con un contenido de moderada electrodensidad están dispersas en el citoplasma de la célula vegetativa de Eleusine tristachya. De acuerdo con Fisher et al.
(1968) estas vesículas derivan de los dictiosomas y según Noguchi (1990) vesículas de este tipo podrían fusionarse para formar vacuolas durante el inicio del crecimiento del tubo polínico. Amela García et al. (2002) suponen que estas vesículas serían un reservorio de membrana que podría ser utilizado en el crecimiento inicial del tubo polínico a fin de asegurar su rápido anclaje sobre el estigma. Las vesículas observadas en Eleusine tristachya recuerdan a las p-partículas descriptas ya para otras especies de Poaceae; estas partículas son cuerpos que poseen precursores polisacarídicos de la pared celular derivados de la actividad dictiosómica (Heslop-Harrison & Heslop-Harrison 1992, 1993, 1997 y
Heslop-Harison et al., 1997).
La morfología del polen coincide con las descripciones generales para la familia
Poaceae (Erdtman 1952). Los mismos son monoporados, y poseen una exina con capa basal, columelas y tectum con espículas supratectales. El tectum y la capa basal presentan microcanales. Los estudios realizados en Zea mays por Skvarla & Larson (1966) y en
Sorghum bicolor por Christensen et al. (1972) revelaron que en estas dos especies dichos canales se encuentran presentes también en el tectum y la capa basal. Sin embargo, canales
114 dentro de las columelas de la pared del grano de polen de sorgo, fueron descriptos previamente por Rowley et al. (1959).
Las orbículas de Eleusine tristachya se encuentran a la madurez dispuestas sobre una membrana tapetal. Este es un carácter común para todas las Poaceas estudiadas hasta el momento. Banerjee (1967) realizó un estudio detallado sobre la ultraestructura de estas membranas tapetales en gramíneas.
La morfología general de las orbículas de Eleusine tristachya concuerda con la descripta para Zea mays (Skvarla & Larson 1966), Sorghum bicolor (Christensen et al.
1972), Triticum (DeVreis & Ie 1970) y Poa (Rowley 1962, 1963 y 1964). Las mismas presentan una pared con espículas y canales que la atraviesan. Las espículas son similares a las presentes en la exina de los granos de polen de dichas especies. Sin embargo, en
Eleusine tristachya las espículas de las orbículas presentan extremos redondeados mientras que las del polen los poseen agudos. Skvarla & Larson (1966) destacaron para Zea también la similitud entre los canales presentes en la exina del grano de polen y la pared de las orbículas, hecho que se confirma en la especie estudiada en este trabajo.
Según Galati et al. (2010), la pared orbicular espiculada sería característica de las orbículas de especies anemófilas y/o ambófilas. Esto hace pensar en la posibilidad de que las orbículas faciliten la dispersión del polen en estas especies. Por otra parte, la alta similitud morfológica entre la pared de las orbículas y la pared del grano de polen en
Poaceae, debido a la presencia no sólo de espículas sino también de microcanales en ambas, podría ser un carácter que refuerce aún más esta función.
115 4.4- BIBLIOGRAFÍA
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121
Fig. 1. Estadio de célula madre de los micrósporos (CMm). CMm con abundantes proplástidos (p). Células tapetales (T) con mitocondrias, retículo endoplásmico rugoso (RER) y plástidos (p). Escala: 1,2 µm.
122
Fig. 2. A-F. Eleusine tristachya. A-D. Estadio de tétrade. A-B. Micrósporos (m) de la tétrade rodeados de calosa (c) y células tapetales (ct). Escalas: 1 µm. C-D. Detalle de células tapetales con pro-orbículas (po) y citoplasma con abundantes mitocondrias (m) y RER. Escalas: 0,2 µm. E. Micrósporo recién liberado con citoplasma con mitocondrias (m), glóbulos lipídicos (gl) y RER. Escala: 1 µm. F. Detalle de micrósporos con glóbulos lipídicos e inicio de formación de pared de esporopolenina y célula tapetal con abundante RER, mitocondrias (m) y pro-orbículas. Escala: 0,5 µm.
123
Fig. 3. A-F. Eleusine tristachya. A-B. Estadio de micrósporos libres. A. Detalle de micrósporos con pared de exina formada y célula tapetal con orbículas jóvenes (o). Escala: 0.2 µm. B. Detalle de célula tapetal con mitocondrias (m), dictiosomas (d) y orbículas jóvenes (o). Escala: 0.2 µm. C-D. Estadio de grano de polen bicelular. C. Detalle de célula generativa con citoplasma reducido con mitocondrias (m) y citoplasma de célula vegetativa con amiloplastos (a), RER y vesículas con contenido fibrilar. Escala: 1 µm. D. Detalle de pared de grano de polen joven y orbículas (o). Escala: 0.5 µm. E-F. Estadio de grano de polen maduro. E. Detalle de pared de grano de polen, con intina (i) formada. Escala: 0.2 µm. F. Detalle de orbículas. Escala: 0.2 µm.
124 5- DIVERSIDAD DE ORBÍCULAS
5.1- INTRODUCCIÓN
Las orbículas o cuerpos de Ubisch pueden ser definidos como corpúsculos de tamaño variable (0,14um - 20um) que muestran la misma respuesta a las coloraciones, electrodensidad, autofluorescencia y resistencia a la acetólisis que la exina del grano de polen (Ubisch, 1927; Galati, 2003).
Heslop-Harrison (1968a, b) fue el primero en nombrar a estos cuerpos como orbículas, pero Bhandari (1984) prefirió seguir denominándolos cuerpos de Ubisch debido al prolongado uso de este término en la bibliografía ya existente. A partir de ese momento, los autores usan ambos nombres de manera indistinta.
El paralelismo entre la exina del grano de polen y las paredes de las orbículas fue explicado por Hess (1985, 1986) basándose en la homología o parentesco entre el tapete y el tejido esporógeno. Este autor considera que las células tapetales podrían potencialmente formar su propia pared de esporopolenina.
Teniendo en cuenta las consideraciones de Hess (1985, 1986), podríamos pensar que si la ornamentación de la pared del grano de polen es utilizada como una característica de valor sistemático, las orbículas también podrían ser consideradas de ese modo. Según
Rowley (1963), la forma y el origen de las orbículas son diferentes en las distintas especies de plantas. Heslop-Harrison (1962) da evidencias de la existencia de diferencias entre las orbículas a nivel genérico. Banerjee (1967) considera que las diferencias encontradas entre las distintas especies de Poaceas estudiadas pueden ser usadas taxonómicamente. Así, el
125 tamaño y la forma de las orbículas, como también su distribución sobre la membrana tapetal es diferente para las distintas especies.
El valor taxonómico de las características de las orbículas sólo fue tratado en algunos pocos taxa de angiospermas: la familia Chloranthaceae, ahora incluida en Lamiaceae (Raj and El-Ghazaly, 1987); el género Euphorbia L. (El-Ghazaly, 1989; El-Ghazaly and
Chaudhary, 1993); la sub-familia Cinchonoideae de Rubiaceae (Huysman et al., 1997), el orden Gentianales (Vinckier et al., 2000; Vinckier and Smets, 2002 a, b, c, 2003.) y en los géneros Dioscorea L., Lilium y Oxalis spp. (Clement & Audran 1993a, b, c; Schols et al.
2001 y Rosenfeldt & Galati 2007).
Este capítulo está referido al estudio de la morfología y ultraestructura de las orbículas en las 10 especies tomadas en consideración en este trabajo, utilizando MEB. El objetivo tuvo por finalidad aportar datos de importancia taxonómica para la familia
Poaceae.
5.2- RESULTADOS
5.2.1- Morfología general de las orbículas
Las orbículas son esféricas a subesféricas o tipo placa. Poseen un corazón central transparente a los electrones a la madurez, y una pared de esporopolenina con microcanales que la atraviesan y espículas superficiales. La distribución sobre la membrana tapetal es variable.
126 Las orbículas pueden presentar conexiones o puentes de unión de esporopolenina entre ellas. Ocasionalmente forman pequeños agregados de 2 o 3 orbículas por fusión de sus paredes.
De acuerdo a las diferencias encontradas en las distintas especies estudiadas, se pudieron establecer cuatro tipos de orbículas , dos de ellos con dos subtipos cada uno.
TIPO A:
Orbículas esféricas, de 1µm. Espículas cortas y de extremos sub-agudos. La distribución sobre la membrana tapetal es uniforme.
Taxa incluidos: Glyceria multiflora y Melica brasiliana. (Fig. 2 A, B, C, D).
TIPO B:
Orbículas esféricas, de 0,6 a 0,9 µm. Espículas largas y de extremos agudos.
Subtipo B1
Distribución sobre la membrana tapetal uniforme. Taxa incluidos:
Chaetotropis inberbis y Deyeuxia viridiflavescens. (Fig. 2 E, F, G, H).
Subtipo B2
Distribución sobre la membrana tapetal en grupos aislados. Taxón
incluido: Briza subaristata. (Fig. 3 I, J).
TIPO C:
127 Orbículas tipo placa, de 0,8 a 1µm. Espículas largas y de extremos romos.
Distribución sobre la membrana tapetal densa y uniforme.
Subtipo C1
Orbículas plano-convexas, con la cara convexa orientada hacia el interior del lóculo.
Taxa incluidos: Distichlis spicata y D. laxiflora. (Fig. 3 K, L, M, N).
Subtipo C2
Orbículas con ambas caras planas. Taxón incluido: Eleusine tristachya. (Fig. 4 O,
P).
TIPO D:
Orbículas esféricas a sub-esféricas, de 0,9 a 1µm. Espículas cortas y de extremos romos. Distribución sobre la membrana tapetal densa y uniforme, y recubiertas por una sustancia tipo polenkit. Taxa incluidos: Paspalidium geminatum y Stenotaphrum secundatum. (Fig. 4 Q, R, S, T).
Los resultados y los taxa se resumen en el cuadro 1.
128 5.3- DISCUSIÓN
La morfología general de las orbículas de las especies analizadas en este trabajo concuerda en líneas generales con la de otras especies de la misma familia estudiadas previamente (Banerjee, 1967; Christensen et al., 1972; El-Ghazaly & Jensen, 1987; Steer,
1977). Por lo tanto, de acuerdo a los estudios realizados hasta el momento podemos definir a las orbículas de Poaceae como corpúsculos de forma variable, con un corazón central transparente a los electrones y una pared de esporopolenina con microcanales que la atraviesan y espículas superficiales. Este tipo de orbículas concuerda con el Tipo A3 de la clasificación de Galati (2003).
Las 10 especies estudiadas presentan sus orbículas dispuestas sobre una membrana tapetal. Esto concuerda con lo descripto hasta el momento para otros representantes de la familia Poaceae (Bhandari & Khosla, 1982; Bhandari & Kishori, 1971; Banerjee, 1967).
Todos los individuos investigados de una misma especie presentaron el mismo tipo de orbículas, por lo que la variación morfológica intraespecífica puede ser descartada.
Las orbículas de las especies estudiadas en este trabajo presentan diferencias en la forma y en el tamaño promedio. Variación en el tamaño dentro de una misma especie se encontró en alguno de los especímenes analizados. La variación de tamaño fue previamente observada en numerosas especies del género Euphorbia (El-Ghazaly, 1989; El-Ghazaly &
Chaudhary, 1993) y de la tribu Cinchonoideae (Rubiaceae) (Huysmans et al., 1997). De acuerdo con Rowley & Walles (1985, 1987) y El-Ghazaly & Nilsson (1991), la variación intraespecífica en el tamaño puede ser atribuida al cambio del ciclo hiperactivo de las células tapetales durante su desarrollo. De acuerdo a las observaciones realizadas con MEB,
Deyeuxia viridiflavescens es la especie que presenta las orbículas mas pequeñas y las de
129 mayor tamaño son las de Glyceria multiflora, Melica brasiliana, Eleusine tristachya y
Stenotaphrum secundatum (ver cuadro 1).
Ocasionalmente, las orbículas pueden fusionarse y formar pequeños agregados. Este es un hecho que ha sido comúnmente observado en otras especies de Angiospermas (Galati
& Strittmatter, 1999).
Paspalidium geminatum y Stenotaphrum secundatum se distinguen porque sus orbículas presentan una cubierta que hace recordar al polen-kit presente en muchas
Angiospermas polinizadas por insectos. De acuerdo a Vinckier & Smets (2001), las orbículas, y entre ellas las de Poaceae, pueden cumplir un rol como posibles vectores de alérgenos junto con el polen. La presencia de sustancias del tipo polen-kilt podría estar contribuyendo a que estos corpúsculos actúen en este sentido. Otros estudios realizados en granos de polen y orbículas a nivel ultraestructural reafirman estos procesos alergénicos en diferentes familias como: Asphodelaceae, Avicenniaceae, Betulaceae, Chenopodiaceae,
Euphorbiaceae, Fagaceae, Melanthiaceae, Liliaceae, Poaceae, Polygonaceae, Tofieldiaceae,
Verbenaceae y Urticaceae; y en géneros como Avicennia, Betula, Ephedra, Euphorbia,
Lolium, Triticum, entre otros. (Pacini et al. 1992 y El-Ghazaly 1999).
Se considera que generalmente la polinización en las Poaceae es anemófila. Sin embargo, Pant et al. (1982a, b) observaron que en las espiguillas de Dichanthium annulatum la polinización es entomófila, producida por una especie de abeja de reducido peso corporal, Apis indica. La presencia de polen-kit en Paspalidium geminatum y
Stenotaphrum secundatum nos hace pensar en la posibilidad de que estas dos especies presenten un modo de polinización ambófilo, con la participación ocasional de algún polinizador. Observaciones hechas a campo permitieron detectar la presencia relativamente
130 frecuente de insectos en las espiguillas de estas especies, lo cual amerita la realización de estudios posteriores sobre biología floral en ambas.
Las monocotiledóneas se encuentran dentro del grupo de plantas más evolucionadas, sin embargo las orbículas en la familia Poaceae tienen características poco evolutivas debido a su semejanza con las observadas en algunas Gimospermas (Hesse 1984, Rowley
& Walles 1987, Chen 1988, Doores et al., 2007) y en algunas dicotiledóneas como
Fagaceae y Chenopodiaceae (Vinckier & Smets 2001).
Las orbículas de las especies de Poaceae estudiadas en este trabajo, de acuerdo a su morfología externa e interna, fueron agrupadas en 4 tipos distintos, dos de ellos con dos subtipos cada uno. Estos tipos se corresponden con las subfamilias y tribus a las que pertenecen dichas especies (ver Cuadro 1). De esta manera, podemos definir a las orbículas de la Subfamilia Pooideae como corpúsculos esféricos de superficie espiculada. En la
Subfamilia Chloridoideae las orbículas se presentan como corpúsculos tipo placa con espículas en una de sus caras y en la Subfamilia Panicoideae como corpúsculos subesféricos y espiculados.
Sin duda, la afinidad taxonómica entre las especies se ve también reflejada en la semejanza de sus orbículas. Por esta razón, de acuerdo a lo investigado hasta el momento, se puede concluir que en la familia Poaceae, la morfología de las orbículas podría ser utilizada con fines taxonómicos.
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135 Cuadro 1
TAMA ULTRAESTRU MORFOLOGÍA DE LA ORBICULA ÑO CTURA
SU TAXA TRIBU SUB-FAMILIA TIP B- SUPERFIC DISTRIBU CORAZÓN FORMA ESPÍCULAS µm O TIP IE CIÓN CENTRAL O Glyceria Cortas y de + ó - Transparente a multiflora A * Esférica Espiculada extremos 1 µm MELICEAE uniforme los electrones Melica semiagudo brasiliana Chaetotropis Largas y de + ó - 0,6–0,8 Transparente a inberbis AGROSTIDE POOIDEAE B1 Esférica Espiculada extremos uniforme µm los electrones Deyeuxia AE agudos B viridiflavescens Largas y de grupos Transparente a los Briza B2 Esférica Espiculada extremos 0,9 µm POEAE aislados electrones subaristata agudos Distichlis Placa, Largas y de Densa y 0,8-0,9 Transparente a los spicata ALUROPODE C1 plano- Espiculada extremos uniforme µm electrones Distichlis AE convexa romos CHLORIDOID C laxiflora EAE Placa, Largas y de Densa y Transparente a los Eleusine ERAGROSTI C2 ambas caras Espiculada extremos 1 µm uniforme electrones tristachya DEAE planas romos Paspalidium Cortas y de Esférica a Densa y 0,9-1 Transparente a los geminatum D * Espiculada extremos PANICEAE PANICOIDEAE sub-esférica uniforme µm electrones Stenotaphrum romos secundatum
136
Fig. 1 - A–H - Orbículas con Microscopio electrónico de barrido. A–B - Glyceria multiflora. C–D - Melica brasiliana. E-F – Chaetotropis imberbis var. imberbis. G–H – Deyeuxia viridiflavescens var. montevidensis. A, C, E, G = 5 µm; B, D, F, H = 2 µm.
137
Fig. 2 - I–N - Orbículas con Microscopio electrónico de barrido. I–J – Briza subaristata. K–L – Distichlis spicata. M-N – Distichlis laxiflora. I, K, M = 5 µm; J, L, N = 2 µm.
138
Fig. 3 - O–T - Orbículas con Microscopio electrónico de barrido. O–P – Eleusine tristachya. Q–R – Paspalidium geminatum. S-T – Stenotaphrum secundatum. O, Q, S = 5 µm; P = 2 µm; R, T = 1 µm.
139 6- DESARROLLO DEL MEGAGAMETÓFITO
6.1- INTRODUCCIÓN
Los estudios sobre megasporogénesis y megagametogénesis realizados en
Poáceas son relativamente escasos, si se tiene en cuenta el número elevado de especies que componen a esta familia (Johri et al. 1992).
De acuerdo a los trabajos efectuados hasta el momento, la morfología del óvulo es muy variada, pudiendo ser anátropo, hemianátropo o campilótropo. De acuerdo al desarrollo de la nucela, se han descripto óvulos tenuinucelados, crasinucelados o pseudo-crasinucelados. Por otra parte, el desarrollo del tegumento externo es variable en las especies de las distintas subfamilias estudiadas (Narayanaswami 1955, Chandra
1963, Woodland 1964, Untawale et al. 1969, Maze et al. 1970, Mehlenbacher Jr. 1970,
Yakovlev 1970, Bhatnagar & Chandra 1975, Bhatnagar & Chandra 1976, Maze &
Bohm 1977, Ambegaokar & Johri 1977, Mahalingappa 1977, Choda et al. 1982,
Aulbach-Smith & Herr Jr. 1984, Hari Gopal & Ram 1981, Antón 1982, Bhanwra 1988,
Astegiano 1989, Bhanwra et al. 1991, Febulaus & Pullaiah 1991, Johri et al. 1992,
Linder & Rudall 1993, Febulaus & Pullaiah 199 y Bhanwra et al. 2001)
El desarrollo del saco embrionario se ha descripto como perteneciente al tipo
Polygonum (Anton & Cocucci 1984, Johri et al 1992). Numerosas variantes en cuanto a la morfología de la oosfera y las sinérgidas se han observado (Philipson 1978a, Connor
1974, Philipson 1977). Sin embargo, lo que más ha llamado la atención de los investigadores, y sigue siendo un tema de estudio permanente, es el desarrollo apomíctico que presentan muchas de las especies de esta familia (Synder 1957; Bashaw
& Holt 1958; Brown & Emery 1958; Reddy & D’Cruz 1969; Brix 1974; Chao 1974;
Philipson 1977; Reddy 1977; Philipson 1978; Izaguirre de Artucio & Ziliam 1979;
140 Rabau et al. 1986; Leblanc et al. 1995; Espinoza & Quarín 1997; Raghavan 1997;
Martínez & Quarín 1999; Pessino et al. 1999; Soreng 2000; Martínez 2001; Yu et al.
2000, 2003; Yao et al. 2004, Bhat et al. 2005 y Quero Carrillo et al. 2010).
No existen antecedentes previos sobre el tipo de formación que presenta el megagametofito en las especies tratadas en este trabajo. Tampoco se indagó si alguna de ellas presenta desarrollo apomíctico. Por estas razones se decidió encarar el estudio ontogenético del óvulo y del saco embrionario, a fin de aportar datos que ayuden al conocimiento sobre el tipo de reproducción que presentan estas especies, para un posterior estudio de mejoramiento genético y selección de las mismas.
6.2- RESULTADOS
6.2.1- Óvulo y Megasporogénesis
El primordio del óvulo es bizonado y se inicia a partir de divisiones periclinales en la segunda capa de células de la placenta. La capa externa se divide principalmente de modo anticlinal y una de las células sub-dermales se convierte en la célula arquespórica (Figs. 2, A; 10, A). La iniciación del tegumento toma lugar en un estadio muy temprano, y luego de su aparición, el óvulo continúa curvándose hasta los 90°. El
óvulo maduro es hemítropo y bitégmico (Figs. 2, E; 4, A; 8, E; 10, E; 11, B; 12, A; 14,
D; 16, C; 21, D y 23, D). Los tegumentos son de origen dérmico y de un espesor de dos capas de células. El tegumento externo es ligeramente más corto que el interno y la micrópila está formada por este último (Figs. 1, A; 2, A-B; 4, A-B; 5, A; 6, A; 7, A, 8,
A, E; 10, A-B, E; 11, A; 12, A; 14, A; 16, A, C; 17, A; 20, A y 22, A). El óvulo es tenuinucelado en la mayoría de las especies (FIgs. 1, A; 2, A-B; 5, A; 7, A; 8, A;10, B;
141 11, A; 14, A; 16, A; 17, A y 18, A) a excepción de Stenotaphrum secundatum y
Paspalidium geminatum donde las células de la epidermis nucelar se dividen periclinalmente dando lugar a una caliptra nucelar y por lo tanto a un óvulo de tipo pseudocrasinucelado (Figs. 20, A; 21, A y 22, A). En esta última especie, algunas células de la epidermis nucelar se agrandan notablemente, su citoplasma se vuelve muy denso y sus núcleos aumentan de volumen (Figs. 20, C-D y 21, C-D).
La célula arquespórica funciona directamente como célula madre de las megásporas (Figs. 1, A; 2, A-B; 5, A; 7, A, 8, A, B; 10, A-B, E; 11, A; 14, A; 16, A; 17,
A; 18, A, B; 20, A y 22, A). Esta célula forma tempranamente una conspicua pared de calosa en el extremo micropilar, la cual se adelgaza notablemente hacia el polo chalazal, donde se encuentra totalmente ausente (Figs. 2, B; 18, A-D y 22, A). Su citoplasma se observa con microscopía electrónica de transmisión muy homogéneo, con gran cantidad de ribosomas libres. Contiene escasas mitocondrias, plástidos y glóbulos lipídicos. En el polo calazal de la célula madre se visualizan conexiones citoplasmáticas con las células nucelares adyacentes (Fig. 18 D, flecha).
La célula madre se agranda y sufre división meiótica resultando una tétrade de megásporas con disposición en T en todas las especies estudiadas (Figs. 1,B; 3, A; 5, B;
8, B; 7, B; 9, A; 10, C; 13, A; 15, A; 17, A y 22, B;), a excepción de Paspalidum geminatum donde la tétrade es lineal (Fig, 20, B). Las tres megásporas micropilares degeneran, y la chalazal se desarrolla en el megagametófito (Figs. 2, C; 8, C; 9, B-C;
16, B; 17, C; 20, C y 21, A).
142 6.2.2- Megagametogénesis
La megáspora chalazal funcional se agranda rápidamente y por tres sucesivas cariocinesis mitóticas se originan sacos embrionarios 2-nucleados, 4-nucleados y 8- nucleados respectivamente (Figs. 1, C-D, 2, D; 3, B-C; 5, C; 7, C-E; 8, D; 9, D-F; 10,
D; 13, B-C; 14, B-C; 15, B-C; 17, D-E; 20, D; 21, B y 22, C;). Luego de este estadio, el megagametófito cenocítico se hace parcialmente celular. Este proceso es simultáneo en la micrópila y la chalaza.
El gametófito femenino joven consiste de siete células: la oosfera, dos sinérgidas, la célula central binucleada y tres células antipodales (Figs. 1, E; 3, D; 4, B;
13, D-E; 15, D y 17, F). Las sinérgidas presentan sus núcleos polarizados hacia el extremo micropilar y las vacuolas hacia el calazal (Figs. 1, E-F; 2, G; 3, E-G; 4, C; 5, D;
7, F-G; 8, F; 9, G-I; 10, E; 13, D-F; 15, D-E; 17, F-G; 19, A; 20, D-E y 22, D-E). Todas las especies poseen un aparato filar bien desarrollado (Figs. 1, F; 2, G; 3, E-G; 4, C; 5,
D; 6, B; 7, F-G; 8, F; 9, I; 10, E; 13, F; 14, E; 15, E; 16, D; 17, G; 19, A-B; 20, D-E; 22,
E y 23, C). La oosfera es escasamente vacuolada y sus núcleos usualmente ocupan una posición chalazal (Fig. 1, F; 3, E-G; 5, D; 6, B; 7, F-G; 13, D-F; 15, D-E; 17, F-G; 20, E y 22, E). La célula central es muy vacuolada y contiene dos núcleos polares que a la madurez se acercan al aparato oosférico, y se fusionan conjuntamente con el núcleo de la gameta masculina en el momento de la fertilización (Figs. 1, E-F; 2, F-G; 3, E-G; 4,
B, D; 5, D; 7, F-G; 8, F; 9, G-I; 10, E; 13, D-F; 14, F; 15, D-E; 16, D; 17, F-G; 19, A;
20, D-E, 21, D; 22, D-E y 23 A, C).
Las células antipodales son las que poseen el citoplasma más denso y núcleos conspicuos. En Chaetotropis imberbis y Eleusine tristachya no se ha observado proliferación de las mismas por división posterior (Figs. 7, F-G; 8, F; 17, F-G y 19, C),
143 mientras que en las restantes especies.hay proliferación. El número de antípodas en el gametófito maduro es variable: Briza subaristata, Melica brasiliana y Deyeuxia viridiflavesces presentan entre 3 y 5 (Figs. 1, E-F; 2, F, H; 5, D; 6, C; 9, G-I y 10, E),
Distichlis laxiflora y D. spicata hasta 6 (Figs. 13, D-F; 14, E; 15, D-E y 16, D),
Glyceria multiflora entre 7 y 9 (Figs. 3, E-G; y 4, B, E). Paspalidium geminatum y
Stenotaphrum secundatum desarrollan un tejido antipodal de más de 12 células (Figs.
20, D-E; 21, E; 22, E y 23 B). La posición de las antípodas en el megagametófito varía en las distintas especies. Estas células se ubican en el polo chalazal del megagametófito en Briza subaristata, Deyeuxia viridiflavescens, Paspalidium paludivagum y
Stenotaphrum secundatum (Figs. 1, E; 2, F, H; 9, G-H; 20, D-E; 21, D-E; 22, D-E y 23,
A-B), mientras que en el resto de las especies se desplazan a una posición lateral previo a la fecundación (Figs. 3, E-G; 5, D; 6, C; 7, F-G; 8, F; 13, F; 14, E; 15, E; 16, D y 17,
F-G). Estas células son persistentes y en las dos primeras especies, que se ubican chalazalmente, cambian de posición durante el desarrollo temprano de la semilla (Figs.
1, F; 9, I y 10, E). Esto es el resultado de un crecimiento desigual del óvulo luego de la fecundación, lo que hace que las antípodas queden dispuestas finalmente también en una posición lateral.
En Paspalidium geminatum se observó la formación de varios sacos embrionarios en distintos estadios de desarrollo en un mismo óvulo (Fig. 20, D).
La especie Stenotaphrum secundatum presenta una alta proporción de óvulos con características abortivas (Fig. 23, D). También este último carácter fue observado en Melica brasiliana, pero siempre con un solo megagametófito por óvulo en ambas especies.
Las características de la megasporogénesis y la megagametogénesis de las 10 especies estudiadas se resumen en el Cuadro 1.
144 6.3- DISCUSIÓN
El óvulo de Poaceae muestra gran variabilidad con respecto a su clasificación; ya que ha sido descripto como anátropo, hemianátropo o campilótropo; bitegumentado, tenuinucelado, crasinucelado o pseudocrasinucelado (Chandra 1963, Davis 1966,
Untawale et al. 1969, Aulbach-Smith & Herr 1984, Xi & DeMason 1984, Bhanwra
1988, Bhanwra et al. 1991, Johri et al. 1992 y Bhanwra et al. 2001). De acuerdo a una recopilación de trabajos relacionados con el desarrollo del óvulo y del megagametófito,
Anton de Triquell (1986) concluye que el óvulo tipo para la familia es en realidad hemicampilótropo. Sin embargo, el óvulo de todas las especies aquí estudiadas ha sido descripto como hemítropo, dado que sufre una curvatura de 90º y contrariamente a lo que considera Anton de Triquel (1986), la nucela no presenta curvatura alguna a la madurez, y el megagametófito permanece recto. Es probable que la posición lateral de las antípodas en muchas especies haya generado confusión en la interpretación del tipo de óvulo de Poaceae.
B. subaristata, G. multiflora, M. brasiliana, Ch. imberbis, D. viridiflavescens, D. laxiflora, D. spicata y E. tristachya tienen un óvulo bitégmico y tenuinucleado, en concordancia con E. indica y E. crocana (Chandra 1963; Narayanaswami 1955),
Triticum (Bhatnagar & Chandra 1975, 1976), Festuca microstachys (Maze & Bohm
1977), Sporobolus indicus (Astegiano 1989), Chloris roxburghiana (Febulaus &
Pullaiah 1991), Eustachys petraea y E. glauca (Aulbach-Smith & Herr, Jr. 1984) y
Arundo formosana (Jane & Tsai Chiang 1996). De acuerdo a Mahalingappa (1977) el
óvulo de Eleusine compressa es campilótropo, bitégmico y pseudocrasinucelado, lo cual no concuerda con lo observado para Eleusine tristachya en el presente trabajo.
145 Stenotaphrum secundatum y Paspalidium geminatum presentan un óvulo bitégmico, pero pseudocrasinucelado, dado que la epidermis nucelar se divide periclinalmente y forma una caliptra nucelar. Este último carácter fue observado en algunas otros géneros de Poaceae, tales como Panicum, Setaria, Echinochloa,
Paspalum, Sorghum, Pennisetum (Narayanaswami, 1953; 1955), Themeda (Woodland,
1964), Oryzopsis miliacea y Stipa tortilis (Maze et al. 1970), Stipa elmeri (Maze &
Bohm 1973), Apluda aristata, Ischaemum rugosum, Panicum repens (Seshavatharam &
Satyamurthi 1976), Echinochloa colonum y E. crugalli ( Bhanwra & Choda 1986),
Digitaria bicornis y D. ciliaris (Febulaus & Pullaiah 1996) y Bambusa tulda y
Thyrsostachys siamensis (Bhanwra et al. 2001).
En general, el tejido nucelar está bien desarrollado en Panicoideae (Chandra
1963). El mayor desarrollo de algunas células de la epidermis nucelar fue observado en
Paspalidium geminatum. De acuerdo a las características citoplasmáticas que presentan y al notable desarrollo de sus núcleos, estas células poseen aspecto de células secretoras.
Este carácter fue observado en algunos representantes de la sufamilia Arundinoideae
(Verboom et al. 1994) y en Themeda australis (Woodland, 1964). En Pennisetum ramosum (Narayan 1962), las células de la epidermis nucelar son conspicuas y se convierten en multinucleadas. En cuanto a la función que cumplen, nada se ha dicho hasta el momento. En general se han observado en especies que desarrollan numerosos sacos embrionarios por óvulo, con diversas anormalidades, por lo que es probable que algunas de estas células tengan la capacidad de desarrollarse como sacos embrionarios no reducidos. De lo contrario, podrían interpretarse como células secretoras que participan en la atracción y guía del tubo polínico.
Todas las especies presentan una sola célula arquespórica que luego se transforma en la célula madre de las megásporas (Johri et al. 1992). En Eleusine
146 compressa, Mahalingappa (1977) describe la presencia de varias células arquespóricas, si bien sus ilustraciones no lo muestran claramente.
De acuerdo a las características observadas en el género Diarrhena (Schwab,
1971), la célula madre de las megásporas comienza a depositar una conspicua pared de calosa en su extremo micropilar al momento de iniciarse la megasporogénesis. Según
Rodkiewicz (1970), la calosa comienza a depositarse en el extremo calazal de la célula madre en aquellas especies en las que la megáspora funcional se ubica en ese polo. Sin embargo, en las especies estudiadas en este trabajo pudo observarse lo contrario. En E. tristachya se comprobó ultraestructuralmente que la pared de calosa está ausente en el polo calazal de la célula madre de las megásporas, coincidentemente con lo observado con microscopio óptico en las demás especies aquí estudiadas. Por otra parte, se observaron en dicha zona conexiones citoplasmáticas con las células nucelares adyacentes, las cuales podrían servir para el pasaje de nutrientes en el momento de la división meiótica durante el proceso de megasporogénesis. Esto podría estar relacionado con la determinación de la megáspora funcional, la cual ocupa siempre la posición calazal. La ausencia de pared de calosa en el polo calazal de la célula madre de las megásporas y la presencia de conexiones citoplasmáticas fue observada también en
Arundo formosana por Jane & Tsai Chang (1996).
El desarrollo del megagametófito en todas las especies estudiadas es del tipo
Polygonum, como en la mayoría de las Poaceae (Narayanaswami 1955, Chandra 1963,
Woodland 1964, Untawale et al. 1969, Maze et al. 1970, Mehlenbacher Jr. 1970,
Yakovlev 1970, Bhatnagar & Chandra 1975, Bhatnagar & Chandra 1976, Maze &
Bohm 1976, Ambegaokar & Johri 1977, Mahalingappa 1977, Hari Gopal & Ram 1981,
Antón 1982, Choda et al. 1982, Aulbach-Smith & Herr Jr. 1984, Bhanwra and Choda
1986, Bhanwra 1988, Astegiano 1989, Bhanwra et al. 1991, Febulaus & Pullaiah 1991,
147 Jane 1992, Johri et al. 1992, Linder & Rudall 1993, Febulaus & Pullaiah 1996, Jane &
Tasi Chiang 1996, Bhanwra et al. 2001, Caponio & Pensiero 2002 y Nakamura et al.
2009). Las megásporas están dispuestas en una tétrade en forma de T, en donde la chalazal es la funcional. Sólo en Paspalidium geminatum se observaron tétrades lineales de megásporas. Si bien en la mayoría de las especies de Poaceae estudiadas hasta el momento se han observado tétrades en T (Seshavatharam & Satyamurthi 1976), han sido citadas también tétrades lineales para algunos representantes de la familia (Stover,
1937).
La ubicación de las antípodas en el megagametófito es variable dentro de la familia Poacae. En Panicoideas las antípodas se ubican en la región calazal mientras que en Pooideas están en posición lateral (Chandra 1963, Anton de Triquell 1986). Esto es coincidente con las observaciones realizadas en este trabajo. Los dos representantes de la subfamilia Panicoideae, Paspalidium geminatum y Stenotaphrum secundatum, poseen las antípodas en posición calazal y las mismas perduran en dicha ubicación luego de la fecundación. Las restantes especies, todas pertenecientes a las subfamilias
Pooideae y Chloridoideae, presentan las antípodas en posición lateral. Si bien Briza subaristata y Deyeuxia viridiflavescens mantienen las antípodas en posición calazal aún en megagametófitos maduros, luego de la fecundación rápidamente se ubican lateralmente.
El alargamiento, la persistencia y la multiplicación secundaria de las antípodas parece ser un patrón común para la familia Poaceae (Johri & Ambegaokar 1975). En
Sasa paniculata su número supera a 300 (Davis 1966). En Phleum boemeri el número de antípodas en un saco embrionario varía considerablemente así como su nivel de ploidía. El 38 % de los sacos embrionarios maduros de esta especie poseen tres antípodas cada uno, pero el número se incrementa a 10 en el estadio celular del
148 endosperma. De las especies aquí estudiadas, solamente en Eleusine tristachya
(Chloridoideae) y Chaetotropis imberbis (Pooideae) no se ha observado proliferación de antípodas. Las restantes especies pertenecientes a estas dos subfamilias presentan una proliferación leve de estas células (5-9). Solamente los representantes de Panicoideae,
Paspalidium geminatum y Stenotaphrum secundatum desarrollan un tejido antipodal de más de 12 células.
En todas las especies estudiadas en este trabajo, las antípodas son grandes y ricas en citoplasma. Su persistencia luego de la fecundación y durante el desarrollo de la semilla nos permite adjudicarles funciones haustoriales. Antípodas haustoriales fueron reportadas para Agostis vulgaris, Alopecurus pratensis, Festuca pratensis y Holcus lanatus (Terzijski & Kuristov 1973). El rol nutricional de las antípodas es evidente en
Oryza y Triticale debido a que cuando degeneran precozmente producen semillas vanas
(Maeda & Miyake 1996, 1997).
En Stenotaphrum secundatum y Melica brasiliana son pocos los óvulos que desarrollan megagametófitos viables, y una gran cantidad de óvulos abortivos fueron observados. Por lo tanto, estas dos especies podrían tener una tendencia a un desarrollo de tipo apomíctico.
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156 TIPO DE LONGITUD DEL ANTÍPODAS FAMILIA SUB-FAMILIA TRIBU ESPECIE TÉTRADES MEGAGAMETÓFITO POSICIÓN NÚMERO POEAE Briza subaristata en T 97 calazal - lateral 3 a 5 Glyceria multiflora en T 307 lateral 7 a 9 MELICEAE POOIDEAE Melica brasiliana en T 242 lateral 3 a 5 Chaetotropis imberbis var. imberbis en T 83 lateral 3 AGROSTIDEAE Deyeuxia viridiflavescens var. POIDEAE montevidensis en T 132 calazal - lateral 3 a 5 Distichlis laxiflora en T 300 lateral 3 a 6 ALUROPODEAE CHLORIDOIDEAE Distichlis spicata en T 220 lateral 3 a 6 ERAGROSTOEDEAE Eleusine tristachya en T 116 lateral 3 Paspalidium geminatum lineal 158 calazal mas de 12 PANICOIDEAE PANICEAE Stenotaphurm secundatum en T 175 calazal mas de 12
Cuadro 1: Resumen de las características de la megasporogénesis y la megagametogénesis.
157
Fig. 1 - Briza subaristata Lamarck. A. Óvulo tenuinucelado con célula madre de las Megásporas (CMM). B. Tétrade de megásporas en T. C. Gametófito femenino binucleado. D. Gametófito femenino tetranucleado. E. Megagametófito joven. F. Megagametófito maduro con proliferación de antípodas en posición lateral. Reglilla = 25 µm.
158
Fig. 2 - Briza subaristata Lamarck. A. Primordio de óvulo con CMM. B. Óvulo joven con CMM. Comienzo de la formación de calosa en el polo micropilar. C. Megáspora funcional en posición calazal con las tres megásporas micropilares degenerando. D. Gametófito femenino tetranucleado. E. Aspecto general del óvulo maduro con el gametófito femenino. F. Detalle del gametófito femenino. G. Detalle de las sinérgicas con ganchos y célula media con los dos núcleos polares. H. Detalle de las antípodas proliferadas y núcleos poliploides. Reglillas: A-D = 45 µm; E = 65 µm; F = 12 µm; G-H = 6 µm.
159 Fig. 3 - Glyceria multiflora Steudel. A. Tétrade de megásporas en T. B. Gametófito femenino tetranucleado. C. Gametófito femenino octonucleado. D. Megagametófito joven. E. Megagametófito inmaduro con las antípodas insinuando una posición lateral. F – G. Megagametófitos maduros con las antípodas en posición lateral y proliferadas. Reglillas: a = 25µ (A-D); b = 50µ (G); c = 50µ (E, F).
160
Fig. 4 - Glyceria multiflora Steudel. A. Aspecto general del óvulo maduro con un megagametófito joven. B. Detalle del megagametófito joven, sinérgidas, célula media con núcleos polares y antípodas. C – E. Detalle del megagametófito maduro. C. Sinérgida con gancho conspicuo. D. Célula media y núcleos polares. E. Antípodas con citoplasma muy denso y núcleos conspicuos. Reglillas: A = 74 µm; B = 19 µm; C-E = 22 µm.
161
Fig. 5 - Melica brasiliana P. Arduinus. A. Óvulo joven con díada de megásporas en segunda división meiótica. B. Tétrade de megásporas en T. C. Gametófito femenino binucleado. D. Megagametófito maduro a punto de ser fertilizado. Aparato oosférico, célula media con núcleos polares. Antípodas en posición lateral. Tubo polínico descargando la gameta masculina (flecha). Reglilla: 50 µm.
162
Fig. 6 - Melica brasiliana P. Arduinus. A. Óvulo joven con díade de megásporas en segunda división meiótica. B. Detalle del aparato oosférico de un megagametófito maduro a punto de ser fertilizado. Tubo polínico descargando la gameta masculina (flecha). C. Antípodas en posición lateral. Reglillas: A-B = 10 µm.
163
Fig. 7 - Chaetotropis imberbis (Kunth) Björkman. var. imberbis. A. Óvulo jóven tenuinucelado con CMM. B. Tétrade de megásporas en T. C. Gametófito femenino binucleado. D. Gametófito femenino tetranucleado. E. Gametófito femenino octonucleado. F. Megagametófito maduro. Detalle del aparato oosférico y el aparato filar muy marcado. Célula media con los núcleos polares. Detalle de las tres antípodas claviformes con sus núcleos poliploides y en posición lateral. G. Megagametófito maduro en el momento de la fecundación. Detalle de la oosfera con la aproximación de núcleo de la primera gameta masculina (flecha). Núcleos polares con el núcleo de la segunda gameta masculina a punto de fusionarse (flecha). Antípodas en posición lateral no proliferadas. Reglilla 25 µm.
164
Fig. 8 - Chaetotropis imberbis (Kunth) Björkman. var. imberbis. A. Óvulo joven con CMM. B. Tétrade de megásporas en T en vista lateral. C. Megáspora funcional en posición calazal y las tres micropilares degenerando. D. Gametófito femenino tetranucleado. E. Aspecto general de un óvulo maduro con el megagametófito. F. Detalle del megagametófito maduro en el momento de la fecundación. Reglillas: A-D, F = 13 µm; E = 55 µm.
165
Fig. 9 - Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees) Cabrera y Rúgolo. A. Tétrade de megásporas en T. B. Tétrade de megásporas con degradación parcial de las megásporas micropilares. C. Megáspora calazal funcional y las tres micropilares degeneradas. D. Gametófito femenino binucleado. E. Gametófito femenino tetranucleado. F. Gametófito femenino octonucleado. G-H. Megagametófitos con diferente estado de maduración y variación en el número de antípodas. I. Detalle del aparato oosférico. Celula media con el núcleo endospermogenético ya formado. Antípodas con núcleos poliploides y en posición lateral. Reglilla = 50 µm. 166
Fig. 10 - Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees) Cabrera y Rúgolo. A. Primordio de óvulo. B. Óvulo joven tenuinucelado con CMM. C. Tétrade de megásporas en T. D. Gametófito femenino binucleado. E. Detalle del megagametófito maduro. Aparato oosférico. Célula media con los núcleos polares. Tres antípodas claviformes con núcleos poliploides, en posición lateral. Reglillas: A = 65 µm, B = 65 µm, C = 48 µm, D = 32 µm, E = 23 µm.
167
Fig. 11 - Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees) Cabrera y Rúgolo. A. Óvulo joven tenuinucelado con CMM. B. Óvulo maduro hemítropo con el gametófito femenino joven. ot: tegumento externo, it: tegumento interno.
168
Fig. 12 - Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees) Cabrera y Rúgolo. A. Óvulo maduro con saco embrionario maduro luego de la fecundación con restos de antípodas en posición bien lateral. B. Semilla = Óvulo fecundado en MEB. C. Óvulo fecundado, micrópilo (flecha). D. Detalle del micrópilo (flecha). Reglillas: A = 25 µm, B-C = 50 µm, D = 5 µm.
169
Fig. 13 - Distichlis laxiflora Hackel. A. Tétrade de megásporas en T. B. Gametófito femenino binucleado. C. Gametófito femenino tetranucleado. D – E. Megagametófitos jóvenes con tres antípodas en posición calazal. F. Megagametófito maduro. Detalle del aparato oosférico, célula media con sus núcleos polares y proliferación de antípodas en posición lateral. Reglillas: a = 50 µm (F); b = 25 µm (A-E). 170
Fig. 14 - Distichlis laxiflora Hackel. A. Óvulo joven tenuinucelado con CMM. B. Gametófito femenino binucleado. C. Gametófito femenino tetranucleado. D. Aspecto general del óvulo hemítropo maduro con el gametofito femenino maduro. E. Detalle del gametófito femenino maduro. Aparato oosférico, célula media y antípodas múltiples en posición lateral. Reglillas: A, C = 11 µm; B = 6,5 µm; D = 136 µm; E 14 µm.
171
Fig. 15 - Distichlis spicata (L.) Greene. A. Tétrade de megásporas en T. B. Gametófito femenino binucleado. C. Gametófito femenino tetranucleado. D. Megagametófito joven con tres antípodas en posición calazal. E. Megagametófito maduro. Detalle del aparato oosférico, célula media con sus núcleos polares y proliferación de antípodas en posición lateral. Reglillas: a = 50 µm (E); b = 25 µm (A-D).
172
Fig. 16 - Distichlis spicata (L.) Greene. A. Óvulo joven tenuinucelado con CMM. B. Megáspora calazal funcional y las tres micropilares degenerando. C. Aspecto general de óvulo hemítropo con el gametófito femenino maduro. D. Detalle del gametófito femenino maduro con aparato oosférico, célula media y antípodas múltiples en posición lateral. Reglillas: A = 18 µm; B-D = 35 µm; C = 83 µm.
173
Figura 17 - Eleusine tristachya (Lam.) Lam. A. Óvulo joven con CMM. B. Tétrade de megásporas con disposición en T. C. Megáspora chalazal funcional con las tres megásporas micropilares degeneradas. D. Gametófito femenino binucleado. E. Gametófito femenino tetranucleado. F. Megagametófito joven. G. Megagametófito maduro. Reglilla: 25 µm.
174
Figura 18 - Eleusine tristachya (Lam.) Lam. A-D. Fotomicrografías electrónicas de transmisión de la CMM. A. Polo micropilar con calosa (c). B. Polo calazal sin pared de calosa. C-D. Detalle del citoplasma de la CMM. C. Detalle del polo micropilar con contenidos citoplasmáticos y calosa (c). D. Detalle del polo calazal con contenidos y conexiones citoplasmáticas entre la CMM y las células nucelares (flecha). c: calosa, p: plástidos; m: mitocondria; lg: glóbulos lipídicos. Reglillas: A-B: 2,5 µm; C-D: 1,2 µm.
175
Figura 19 - Eleusine tristachya (Lam.) Lam. A – C. Cortes semifinos de un megagametófito maduro, inclusión en resina epoxy. A. Detalle del aparato oosférico y célula media con un núcleo polar. B. Detalle de una sinérgida con el aparato filar conspicuo. C. Detalle de las antípodas. Reglillas: A, C = 14 µm; B = 11 µm.
176
E
F
Fig. 20 - Paspalidium geminatum (Forssk.) Stapf, ex Paspalidium paludivagum (Hitchc. et Chase) Parodi. A. Óvulo pseudocrasinucelado con CMM. B. Tétrade de megásporas lineal. C. Megáspora funcional en posición calazal y las tres micropilares degenerando. Detalle de células activas de la epidermis nucelar. D. Gametófito femenino octonucleado. E. Formación de varios megagametófitos anormales y detalle de las células activas de la epidermis nucelar. F. Megagametófito maduro normal con tejido antipodal en posición calazal. Reglilla: 25 µm.
177
Fig. 21 - Paspalidium geminatum (Forssk.) Stapf, ex Paspalidium paludivagum (Hitchc. et Chase) Parodi. A. Óvulo pseudocrasinucelado con megáspora funcional en posición calazal y las tres megásporas micropilares degenerando. B. Gametófito femenino octonucleado. C. Detalle de las células activas de la epidermis nucelar. D. Aspecto general del óvulo hemítropo maduro con el megagametófito. E Detalle de las antípodas múltiples con el citoplasma denso. Reglillas: A = 2 µm; B = 8 µm; C = 12 µm; D = 31 µm; E = 9 µm.
178
Fig. 22 - Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze. A. Óvulo joven pseudocrasinucelado con CMM. B. Tétrade de megásporas en T. C. Gametófito femenino tetranucleado. D. Megagametófito con aparato oosférico, célula media con núcleos polares y antípodas claviformes en posición calazal. E. Megagametófito maduro con tejido antipodal en posición calazal. Reglillas: a = 25 µm (A); b = 50 µm (D); c = 25 µm. (B, C,E) .
179 .
Fig. 23 - Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze. A. Megagametófito maduro. Detalle del aparato oosférico, célula media y antípodas piriformes. B. Detalle de las células antipodales. C. Detalle del aparato oosférico, célula media con el núcleo polar secundario y el segundo núcleo de la gameta masculina aproximándose. D. Aspecto general de un óvulo abortado. Reglillas: A = 28 µm; B-C = 9 µm; D = 40 µm.
180 7- ULTRAESTRUCTURA Y DESARROLLO DEL MEGAGAMETÓFITO EN
ELEUSINE TRISTACHYA
7.1- INTRODUCCIÓN
Trabajos previos sobre la ultraestructura del gametófito femenino maduro en algunas
especies de Poáceas (Diboll & Larson 1966; Diboll 1968; Maze & Lin 1975; Russell 1979;
You & Jensen 1985; Jane 1992, 1997; Jane & Tsai Chiang 1996) han demostrado que la
oosfera y la célula central son similares en estructura, mientras que las sinérgidas y las
antípodas presentan algunas variaciones. Sin embargo, los cambios ocurridos en el
megagametófito maduro luego de la polinización no son claros.
Debido a que los trabajos sobre la ultraestructura del gametófito femenino en la subfamilia Chloridoidea son escasos, se propuso incrementar el conocimiento mediante el estudio detallado a nivel de microscopía electrónica de transmisión del megagametófito joven y maduro de la especie Eleusine tristachya Lam.
7.2- RESULTADOS
Ultraestructura del megagametófito
Oosfera
El núcleo de la oosfera está situado hacia el polo chalazal y ocupa gran parte del
volumen celular. El citoplasma tiene algunas vacuolas en el extremo micropilar y muestra
abundantes mitocondrias y ribosomas libres (Fig.1, E-F). El retículo endoplásmico rugoso
181 (RER) y algunos plástidos que contienen almidón, se distribuyen en todo el citoplasma de esta célula (Fig. 1, G).
La oosfera está rodeada por una pared celular que tiene baja densidad electrónica.
Esta pared se adelgaza en algunas zonas del extremo chalazal hasta desaparecer totalmente, quedando la plasmalema de esta célula en contacto directo con la de las células sinérgidas y la de la célula media (Fig. 3, C).
Sinérgidas
El extremo micropilar de cada sinérgida está ocupado por su núcleo mientras que la vacuola se ubica hacia el polo chalazal (Fig. 1, B). El núcleo tiene forma elipsoidal (Fig. 1,
B). El citoplasma es muy denso porque tiene un rico complemento de organelas. El RER es abundante y sus cisternas tienen un contenido de alta densidad electrónica (Fig.1, C). Las mitocondrias son numerosas y poseen crestas bien desarrolladas (Fig. 1, C-D). Algunas de ellas se encuentran en aparente división. Se observa además gran cantidad dictiosomas y glóbulos lipídicos (Fig. 1, C-D).
La pared de las sinérgidas está fuertemente engrosada en el polo micropilar y forma el aparato filar. Éste presenta proyecciones tubulares laberínticas hacia el citoplasma, con baja densidad electrónica (Fig. 1, A, F). Porciones de citoplasma se observan incluidas entre dichas proyecciones. La pared de las sinérgidas se adelgaza ligeramente hacia la región calazal, y en algunos puntos se angosta considerablemente o desaparece, quedando las membranas plasmáticas de las sinérgidas y la célula central en contacto directo (Fig. 1, C).
182 Célula media o central
La célula media es la más grande del saco embrionario. Contiene una gran vacuola central, por lo que el citoplasma se restringe a la periferia de la célula (Fig. 2, A, B). Los dos núcleos polares son grandes y aproximadamente del mismo tamaño.
El citoplasma de esta célula contiene abundantes organelas. Numerosas mitocondrias con una matriz clara así como RER se distribuyen uniformemente en el mismo (Fig. 2, B-D,
G). Se observan además dictiosomas rodeados por vesículas y numerosos cuerpos lipídicos y plástidos con gránulos de almidón (Fig. 2, C-D).
La pared de la célula media presenta algunas proyecciones o crecimientos internos en las zonas adyacentes a las células nucelares (Fig. 2, A-B). En el área de contacto con las células sinérgidas (extremo micropilar) la pared está ausente o es muy delgada y se observan además algunas conexiones citoplasmáticas (Fig. 2, E-F).
Antípodas
La ultraestructura de las antípodas varía de acuerdo al grado de maduración que presenta el megagametófito.
En el gametófito femenino joven, las antípodas muestran un citoplasma denso con numerosas organelas (Fig. 3, A-B). El RER es muy abundante y posee cisternas muy dilatadas e irregulares. Debido a este carácter, numerosas porciones del citoplasma con organelas se observan aisladas y delimitadas por las cisternas. Las mitocondrias son abundantes y también se pueden ver algunos glóbulos lipídicos aislados (Fig. 3, A-B).
183 Numerosos glóbulos osmiofílicos se observan entre la plasmalema y la pared celular (Fig. 3,
A). La pared celular de las antípodas es delgada en este estadio.
Cuando el saco embrionario está maduro, el RER aparece mas desarrollado y sus cisternas se organizan en una configuración paralela (Fig. 3, C-F). Los dictiosomas son muy abundantes y también se observan muchas vesículas cercanas (Fig. 3, E). La pared celular de las antípodas tiene una densidad electrónica moderada. Dicha pared forma proyecciones muy desarrolladas y ramificadas hacia el citoplasma, principalmente en la cara de las antípodas adyacente a la chalaza del óvulo. Estas proyecciones internas son más conspicuas y están más desarrolladas que en la célula central (Fig. 3, C-E).
7.3- DISCUSIÓN
Este trabajo constituye el primer aporte sobre el conocimiento de la ultraestructura del megagametófito en la subfamilia Chloridoidea.
La ultraestructura del citoplasma de la oosfera es altamente variable en las angiospermas estudiadas hasta la fecha (Willemse & Van Went 1984). En Eleusine tristachya, la alta concentración de mitocondrias en su citoplasma es la característica mas destacable. La desaparición parcial o total de la pared celular de la oosfera en la zona calazal, descripta en este trabajo para Eleusine tristachya, es un hecho común observado en otras especies de distintas familias de Angiospermas estudiadas previamente (Willemse &
Van Went 1984, Yan & Yang 1991, Jane 1992, Wang & Wang 1992, Pandey 1997, Liu et al. 1998).
El citoplasma más denso de las sinérgidas, comparado con el de la oosfera, así como las cisternas del RER con un contenido electrodenso, mitocondrias con crestas bien
184 desarrolladas y numerosos dictiosomas, ponen en evidencia que se trata de células metabólicamente muy activas. Estas observaciones concuerdan con aquellas realizadas en otras especies de Angiospermas (Maheshwari 1950, Folsom & Peterson 1984, Johri et al.
1992, Murgia et al. 1993, Raghavan 1997, Coimbra & Salema 1999).
El aparato filar de Eleusine tristachya está muy bien desarrollado. Este aparato es característico de las sinérgidas y tiene una morfología variable en diferentes especies de
Angiospermas (Jane 1997). La morfología del aparato filar recuerda a las invaginaciones que presentan las paredes de las células de transferencia - “transfer cells” - (Pate & Gunning
1972), las cuales tienen como función facilitar la absorción y el transporte de metabolitos.
Por otra parte, el adelgazamiento de la pared celular de las sinérgidas hacia el extremo chalazal es un hecho común en las Angiospermas (Jensen 1965, Mogensen 1978,
Vijayaraghavan & Bhat 1983, Willemse & Went 1984, Wang & Wang 1991, Jane 1992, Sun
1992, Liu et al. 1998), el cual se explica como una adaptación que facilitaría el pasaje de las gametas masculinas hacia la oosfera y la célula media.
Se han observado plasmodesmos entre las sinérgidas y la célula central al igual que en Passiflora caerulea (Amela García et al. 2003), Agave (Tilton & Mogensen 1979, citado en Pandey 1997), Proboscidea louisianica (Mogensen 1978) y Vicia faba (Wang & Wang,
1992).
La presencia de numerosas mitocondrias, RER y dictiosomas activos en la célula media indicaría una alta actividad metabólica. De acuerdo a You & Jensen (1985), estas características ultraestructurales podrían ser interpretadas para explicar que en las Poaceae se produce una más rápida concreción de la fusión entre los núcleos polares y la gameta masculina.
185 En Arundo formosana (Jane 1992) y Triticum aestivum (You & Jensen 1985) se observaron plástidos con gránulos de almidón y glóbulos lipídicos en la célula media de la misma manera que en E. tristachya. Una característica importante de la célula central en la especie estudiada es la presencia de crecimientos internos de la pared adyacente a la nucela.
Debido a esta característica, esta célula puede ser considerada como una célula “transfer”
(Pate & Gunning 1972), por lo que actuaría facilitando el transporte de nutrientes desde los tegumentos y el tejido nucelar hacia el megagametófito. Estas observaciones concuerdan con las realizadas en otras Poaceae estudiadas previamente (Jane 1992, Diboll & Larson 1966).
Las antípodas constituyen uno de los aspectos más destacados del saco embrionario de las Poaceae. En E. tristachya, tres células antipodales normales fueron observadas al igual que en E. indica (Cummins 1929, Chandra 1963). Por el contrario, en E. compressa
(Mahalingappa 1977), E. africana (Chikkannaiah & Manhalingappa 1976) y E. coracana
(Khosla 1946) se ha comprobado una variación en su número (de 3 a 16) así como en su condición nuclear (bi y trinucleadas).
El gran número de ribosomas, RER y dictiosomas con vesículas asociadas indican un alto grado de actividad metabólica de las antípodas. De hecho, de acuerdo a las observaciones ultraestructurales realizadas, estas células tienen el citoplasma aparentemente mas activo de todo el megagametófito. Resultados similares fueron reportados por Diboll
(1968) para Zea mays.
Las antípodas de E. tristachya muestran diferencias ultraestructurales de acuerdo al grado de madurez del megagametófito. El RER de las antípodas del saco embrionario joven presenta cisternas con dilataciones irregulares y conspicuas, mientras que en el saco embrionario maduro, estas cisternas se reorganizan en una configuración paralela. Estas observaciones coinciden con los resultados reportados para Zea sp. por Doboll (1968), pero
186 son opuestas a aquellas encontradas por Maeda & Miyake (1997) en Oryza sativa, donde las cisternas están organizadas en configuración paralela en los megagametófitos jóvenes, a la inversa de lo descripto para la especie aquí estudiada.
Una característica especial de las células antipodales jóvenes de E. tristachya es que algunas inclusiones osmiofilicas están presentes entre la membrana plasmática y la pared celular. Estas inclusiones fueron observadas también en las células antipodales de Oryza sativa (Maeda & Miyake 1996), pero en sacos embrionarios post-antesis.
Las antípodas de E. tristachya podrían ser consideradas como células de transferencia, debido a que sus paredes celulares, adyacentes a la chalaza del óvulo, se invaginan considerablemente y su citoplasma contiene un extensivo sistema de RER (Pate &
Gunning 1972). La misma condición se describió para Zea sp. (Diboll & Larson 1966) y
Stipa sp. (Mase & Lin 1975). La función de las células antipodales está todavía en discusión.
Sin embargo, la mayoría de los investigadores cree que cumplen un rol importante en la nutrición del saco embrionario, especialmente en forrajeras (Diboll & Larson 1966, You &
Jensen 1985). El RER organizado en una configuración paralela y los crecimientos internos de la pared sugieren que las antípodas podrían estar involucradas en el transporte de metabolitos desde la nucela y tegumentos hacia el megagametófito.
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190
Figura 1: Eleusine tristachya. Fotomicrografías electrónicas de transmisión del megagametófito maduro. A, Célula sinérgida mostrando el aparato filiforme (fa). Escala: 2 µm. B, Citoplasma y núcleo de la célula sinérgida (Sy). Citoplasma de la célula central (Cc). Escala: 2 µm. C, Detalle del adelgazamiento de la pared celular (flecha) entre una sinérgida y la célula central. Citoplasma de la sinérgida con mitocondrias (m), dictiosomas (d), glóbulos lipídicos (lg) y retículo endoplásmico rugoso (err). Escala: 500nm. D, Detalle del citoplasma de la sinérgida con dictiosomas (d) y mitocondrias (m). Escala: 100nm. E, Detalle de citoplasma de sinérgida (Sy) y oosfera (Ec) con mitocondrias (m) y retículo endosplasmático rugoso (err). Escala: 200nm. F, Porción de una célula sinérgida, mostrando el aparato filar (fa) con las proyecciones tubulares laberínticas y citoplasma de la oosfera con mitocondrias (m). Escala: 200nm. G, Detalle del citoplasma de la oosfera con plástidos (p), mitocondrias (m) y retículo endoplásmico rugoso (err). Escala: 200nm.
191
Figura 2: Eleusine tristachya. Fotomicrografías electrónicas de transmisión del megagametófito maduro. A, Área de contacto de la célula central (Cc) con las células nucelares (Nu). Crecimientos internos de la pared en la célula central (flecha). Escala: 500 nm. B, Detalle de los crecimientos internos de la pared (flecha) y el citoplasma con dictiosomas (d) y mitocondrias (m) de la célula central (Cc). Escala: 1 µm. Figs. C-D, Detalle del citoplasma de la célula central con mitocondrias (m), dictiosomas (d), gránulos de almidón (st), retículo endoplásmico rugoso (err) y glóbulos lipídicos (lg). Escala: 500 nm. Fig. E, Detalle de la conexión entre la célula sinérgida y la célula central (flecha). Citoplasma de la sinérgida (Sy) con glóbulos lipídicos (lg). Citoplasma de la célula central (Cc) con dictiosomas (d). Escala: 200 nm. Fig. F, Área de contacto entre la sinérgida (Sy) y la célula central (Cc). Mitocondria (m), retículo endoplásmico rugoso (err). Escala: 500 nm. Fig. G, Detalle del citoplasma de la célula huevo (Ec) en contacto con el citoplasma de la célula central (Cc), dictiosoma (d), retículo endoplásmico rugoso (err), mitocondria (m) y glóbulos lipídicos (lg). Escala: 500nm.
192
Figura 3: Eleusine tristachya. Fotomicrografías electrónicas de transmisión de células antipodales jóvenes y maduras. A-B, Detalle del citoplasma de antípodas jóvenes. Mitocondrias (m) y dilataciones irregulares de las cisternas del retículo endoplásmico rugoso (err). Escala: 500 nm. Figs. C-F, Detalle del citoplasma de antípodas maduras. Figs. C-E, Detalle del crecimiento interno de la pared celular (flechas) y retículo endoplásmico rugoso (err) concéntrico en el citoplasma. Escalas: 1 µm-500 nm. F, Contacto de las tres antípodas con el retículo endoplásmico rugoso concéntrico en el citoplasma. Escala: 500nm.
193 8- FERTILIZACIÓN, ENDOSPERMOGÉNESIS Y EMBRIOGÉNESIS
8-1. Introducción
La polinización en las Poaceae se considera que es fundamentalmente anemófila. Sin embargo, Pant et al. (1982) observaron en las espiguillas de Dichanthium annulatum que la polinización es entomófila, producida por una especie de abeja de reducido peso corporal,
Apis indica. Por otra parte, algunos géneros de bambusoideas herbáceas son polinizadas por insectos (Soderstrom & Calderón 1971).
Cass y Jensen (1970) observaron en Hordeum vulgare que el estigma es totalmente receptivo y que los granos de polen germinan en el momento de la polinización. El tubo polínico penetra en el saco embrionario y descarga las dos gametas masculinas, el núcleo vegetativo y abundante almidón en una de las sinérgidas que luego degenera.
Pocos son los trabajos sobre el desarrollo del endosperma. En todas las especies estudiadas hasta el momento se ha determinado que el mismo es de tipo nuclear (Jorhi et al.
1992) y la formación de las paredes se inicia en el extremo micropilar en el estadio de proembrión globular. El estrato periférico del endosperma maduro se transforma en una capa de naturaleza proteica llamada aleurona. Generalmente la aleurona está compuesta de un solo estrato, pero en el género Eleusine se han descripto dos (Mahalingappa 1977). El endosperma maduro se vuelve coriáceo y almacena abundante almidón en la mayoría de las especies (Jorhi et al. 1992). Sin embargo, endosperma líquido se ha encontrado en Limnodea arkansana (Brown 1955); Helicotrichon hookeri, Koeleria cristata, Sphenopholis filiformis y Trisetum bifidum (Dore 1956); Calamagrostis montevidensis, Polypogon chilensis y
Gaudinia fragilis (Laguardia 1975) y en 30 géneros mas (Torrell 1971). Rosengurtt et al.
194 (1971, 1972), estudiaron numerosas especies con endosperma central de carácter lipídico.
Probablemente este endosperma es coloidal en forma natural e incluye gránulos de almidón y gotas de aceite.
Con respecto a los trabajos realizados sobre la embriogénesis en representantes de esta familia podemos decir que el desarrollo general del embrión responde al tipo Asteráceo
(Johansen 1950, Bhanwra 1988, Bhanwra et al. 1991 y Johri et al. 1992).
En este capítulo se encaró el estudio de la fertilización, endospermogénesis y embriogénesis de las diez especies seleccionadas en este trabajo, dado que nada se conocía sobre estos aspectos para dichos taxa.
8-2. Resultados
En el momento de la antesis de las espiguillas, cuando los estigmas emergen por sobre las glumelas, se observan en contacto con los pelos estigmáticos numerosos granos de polen en diferentes estadios de germinación, lo cual indica que la polinización ya se ha producido.
En los diferentes estadios de germinación de los granos de polen se pueden observar casos donde el opérculo del grano está recién comenzando a abrirse, gametófitos iniciando el proceso de germinación y otros donde el tubo polínico se ha desarrollado conside- rablemente.
Los tubos polínicos crecen a lo largo de las dos ramas estigmáticas y los pequeños estilos de manera endotrófica, para poder llegar hasta el micrópilo del óvulo y continuar su crecimiento por el tegumento externo. Las células de éste se desorganizan por completo y especialmente en la zona de contacto del tegumento externo con la pared ovárica, justo en el
195 punto donde nacen los estilos. Asimismo esto sucede también en la zona micropilar, lo cual parecería indicar que el tegumento externo funciona como obturador.
El tubo polínico penetra por el micrópilo y después de atravesar la nucela alcanza el megagametófito, donde realiza la descarga en una de las células sinérgidas (Fig. 1 C). Los gametos masculinos tienen aspecto fusiforme y poseen un núcleo pequeño. La sinérgida que recibió la descarga presenta el citoplasma y el núcleo muy desorganizados. En contraposición, la otra sinérgida conserva tanto el citoplasma como el núcleo sin mayores cambios. La oosfera, que se sitúa al lado de las células sinérgidas, se observa esférica a piriforme y a la altura de la región micropilar del saco presenta un ancho pie (Fig. 1 A, B,
C). Esta célula posee un gran núcleo en posición calazal y un citoplasma con numerosas vacuolas pequeñas en posición micropilar. Los 2 grandes núcleos polares de la célula media se disponen próximos a la oosfera y las células antipodales se observan vitales, con sus citoplasmas muy densos y sus núcleos conspicuos que evidencian alta actividad metabólica
(Fig. 1 A, C).
Posteriormente, uno de los gametos masculinos se fusiona con la oosfera y el otro con la célula media (Fig. 1 A, C). El núcleo del gameto masculino que se ha incorporado al citoplasma de la célula media aumenta considerablemente de volumen debido a la incorporación de cariolinfa que dispersa su material cromático, alcanzando dimensiones similares a la de los núcleos polares (Fig 1 A). Estos 3 núcleos, que se hallan en contacto, se fusionan de manera simultánea para formar el núcleo endospermogenético (Fig. 1 B). En dicho núcleo pueden observarse a veces 3 nucléolos como entidades separadas, 2 procedentes de los núcleos polares y uno del gameto masculino. Las antípodas son persistentes (Fig. 2 A, B), y en aquellas especies como Briza subaristata, Deyeuxia viridiflavescens, Paspalidium geminatum y Stenotaphrum secundatum, en las que ocupaban
196 una posición calazal, se desplazan lateralmente quedando en este momento en la misma posición en todas las especies estudiadas. La cigota experimenta un período de reposo antes de comenzar a dividirse. En este momento, el gametófito femenino aumenta considerablemente de tamaño y el núcleo endospermogenético comienza a sufrir divisiones mitóticas libres. Cuando el endosperma posee 16 núcleos o más, ubicados todos periféricamente debido a la presencia de una gran vacuola central, la cigota (Fig. 3 A) se divide transversalmente originando una célula basal (cb) muy vacuolada y una apical con citoplasma denso (ca) (Fig. 2 C; Fig. 3 B). La segunda división en la célula basal es también transversal (cb1 y cb2), mientras que en la apical la misma es longitudinal o vertical
(ca1 y ca2) (Fig. 3 C). Es precisamente en este estadio cuando se desencadena la celularización o formación de las paredes del endosperma.
Lugo que la célula apical se divide longitudinalmente, la célula cb2 experimenta otra división transversal, originando en consecuencia 2 células (cb2a y cb2b) (Fig. 3 D).
Posteriormente la célula cb2b se divide transversalmente dando lugar a cb2b1 y cb2b2 (Fig. 3
E). Una nueva división longitudinal se produce en la célula apical, formando de esta manera un cuadrante (4ca) (Fig. 3 F). La célula cb1, inmediata al cuadrante originado por a, también se divide longitudinalmente formando cb1a y cb1b (Fig. 3 F). Por sucesivas divisiones, en el estadio de pro-embrión 8-celular (8ca), se origina un cuerpo más o menos globular o claviforme, donde se observa el suspensor lineal que se origina a partir de la célula cb2 o inicial del suspensor, compuesto por 3 ó 4 células (cb2a, cb2b1 y cb2b2)(Fig. 2 D, E, F; Fig. 3
G).
En estadios más avanzados del desarrollo del pro-embrión se puede distinguir en uno de los costados y hacia su ápice terminal, una pequeña muesca o escotadura que evidencia la zona donde se diferenciará el futuro ápice caulinar.
197 8-3. Discusión
En todas las especies estudiadas en este trabajo, los granos de polen germinan en el momento de la polinización, de la misma manera que lo observado previamente por Cass &
Jensen (1970) para Hordeum vulgare. También se pudo observar que en el momento de la fertilización, el tubo polínico penetra a través del aparato filar y realiza la descarga dentro de una de las sinérgidas, en coincidencia con lo descripto para otras Poaceae por Chandra
(1963), Chao (1971), Chandra & Bhatnagar (1974), Anton (1982), Bhanwra (1988),
Astegiano (1989), Bhanwra et al. (1991), Febulaus & Pullaiah (1991, 1996) y Bhanwra et al. (2001). Sin embargo, Cho (1956) en Oryza sativa y Bhatnagar & Chandra (1975) en
Triticum aestivum, observaron que el tubo polínico penetra entre la sinérgida y la oosfera, sin realizar la descarga dentro de la primera.
En cuanto a la endospermogénesis, todas las especies aquí observadas presentan un endosperma de tipo nuclear como se lo describe en numerosos trabajos realizados para la familia Poaceae (Chandra 1963, Chao 1971, Anton 1982, Bhanwra 1988, Astegiano 1989,
Bhanwra et al. 1991, Febulaus & Pullaiah 1991, Jorhi et al. 1992, Brown et al. 1996,
Febulaus & Pullaiah 1996, Bhanwra et al. 2001, etc).
En coincidencia con los estudios efectuados en otras especies por Chandra (1963),
Anton (1982), Bhanwra (1988), Bhanwra et al. (1991), Febulaus & Pullaiah (1991, 1996) y
Bhanwra et al. (2001), las 10 especies estudiadas en este trabajo forman el núcleo endospermogenético a partir de la fusión simultanea de los dos núcleos polares y el gameto masculino, sin la previa formación de un núcleo polar secundario. Solamente en Sporobolus indicus (Astegiano 1989) y Eleusine compressa (Mahalingappa 1977) se describió la formación de un núcleo polar secundario.
198 El desarrollo del embrión de las especies estudiadas en este trabajo coincide con el de otras especies de la familia descriptas previamente, Cenchrus setigerus, Chloris roxburghiana, Digitaria abludens, Digitatia bicornis, Digitatia ciliaris, Eragrostis cilianensis, Lolium multiflorum, Rostraria cristata, Sporobolus indicus, etc. (Bhanwra
1988; Astegiano 1989, Bhanwra et al. 1991; Febulaus & Pullaiah 1991, 1996 y Johri et al.
1992), y corresponde al tipo Asteráceo (Johansen 1950). Bhatnagar & Chandra (1975) estudiaron el desarrollo embrionario de Triticum aestivum y lo definieron como tipo
Gramíneo debido a la morfología que presenta el embrión maduro. Para unificar los diferentes criterios, podemos decir que la embriogénesis es de tipo Asteraceo de acuerdo a las primeras divisiones que se producen, pero con una variante Poaceae debido a las características tan particulares que presenta el embrión maduro en esta familia.
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201
10 µm
50 µm
Fig. 1 - A. Chaetotropis imberbis. Megagametófito maduro en el momento de la fecundación. Detalle de la oosfera con la aproximación de núcleo de la primera gameta masculina (flecha). Núcleos polares con el núcleo de la segunda gameta masculina a punto de fusionarse (flecha). B. Deyeuxia viridiflavescens var. montevidensis. Detalle del del aparato oosférico. Celula media con el núcleo endospermogenético luego de la fusión de los núcleos polares. C. Melica brasiliana. Megagametófito maduro a punto de ser fertilizado. Tubo polínico descargando la gameta masculina en una de las sinérgicas (flecha).
202
Fig. 2 - A-F. Endospermogénesis y Embriogénesis. A-C. Distichlis spicata. A. Endosperma nuclear y restos de antípodas múltiples. B. Detalle. C. Primera división del cigoto y endosperma nuclear con gran vacula central. D-E. Glyceria multiflora. D. Embrión globular y endosperma celular. E. Detalle. F. Detalle del embrión globular con el suspensor y detalle del endosperma celular en Distichlis spicata. Reglillas: A = 302 µm; B = 78 µm; C =108 µm; D = 156 µm; E = 104 µm; F = 102 µm.
203 cb2b cb cb2
cb2a
cb1 cb1
ca b ca1 ca1 ca2 ca A BCD 2
cb2b2 cb2b2 cb2b2
cb2b1 cb2b1 cb2b1
cb2a cb2a cb2a
cb1 cb1b cb1b cb1a cb1a
ca 4ca 8ca 1 ca E 2 F
G
Fig. 3Fig. A-G. Esquema de la Embriogénesis. A. Cigota. B. Primera división de la cigota. C. Embrión 4- celular. D-E. Estadios intermedios del desarrollo del embrión. F. Estadio de cuadrante. G. Embrión globular con el suspensor formado por las células cb2a, cb2b1 y cb2b2. 204 9- EMBRIÓN Y FRUTO
9-1. Introducción
El embrión de las Poaceae ocupa una posición basal y lateral en el fruto. Su morfología ha sido estudiada y discutida por diferentes autores en cuanto a la interpretación de sus partes. Brown (1960) resume los conceptos expuestos por ellos en una tabla comparativa.
Son muchos los autores que dedican capítulos de libros y trabajos de investigación a la clasificación y orígenes de las partes del embrión y fruto maduro de las gramíneas
(Bennett 1944, Brown 1960, Brown 1965, Norstog 1969, Guignard & Mestre 1970, Swift &
O'Brien 1970, Guignard 1974, Roth 1977, Cocucci & Astegiano 1978 y Kosina 1996).
Reeder (1957) investigó cerca de 300 especies de 150 géneros de gramíneas y clasificó los embriones maduros en seis categorías basándose en la vascularización, presencia o ausencia de epiblasto, desarrollo de la parte basal del escutelo y morfo-anatomía de las hojas embrionales.
El fruto típico de las Poaceae es la cariopsis y se lo define como un fruto seco, monotalámico, derivado de gineceo súpero bicarpelar, indehiscente, uniseminado y cuyo pericarpo está soldado a los tegumentos de la semilla (Font Quer 1953).
También existen otros tipos de frutos en esta familia que son menos frecuentes, como el aquenio, cuyo pericarpo no está soldado a la semilla y es más o menos engrosado y resistente, como en los géneros Merostachys y Zizaniopsis; y el utrículo, con un pericarpo membranáceo que se desprende fácilmente como en los géneros Eleusine y Dactyloctenium
(Nicora & Rúgolo de Agrasar 1987). También este último tipo de fruto se encontró en
Sporobolus indicus, cuyo pericarpio mucilaginoso, al estar en contacto con el agua, deja salir
205 con facilidad a la semilla (Astegiano 1989). Por otra parte, según Soderstom (1981), en algunos géneros de Bambusoideae, como Olmeca, los frutos son carnosos bacciformes.
Numerosos trabajos se han hecho sobre la anatomía y morfología del fruto cariopsis, en especies como Arrhenatherum elatius, Briza maxima, Festuca arundinacea, Nasella brachychaeta (sub. Stipa brachychaeta), Panicum miliare, Panicum miliaceum,
Pappophorum subbsulbosum, Paspalum dilatatum, Paspalum sccrobiculatum, Pennisetum typhoideum, Phalaris aquatica, Setaria italica, Setaria lutescens, Stipa sp., Triticum aestivum y Triticale (Avery 1930; Narayanaswami 1953, 1954, 1955a y b, 1956, 1961; Rost
1973; Izaguirre-Artucio & Ziliani 1975, 1988; Laguardia 1975; Bhatnagar & Chandra 1975,
1976; Ambegaokar & Johri 1977; Medan & Elberg 1978/79; Bourdu 1983; Rost et al 1990;
Filgueiras 1986, Izaguirre & Laguardia 1987 y Lovisolo 1997). Algunos autores, además de describir las cubiertas seminales, pusieron especial interés en el estudio de las células de transferencia a nivel de la zona placentaria del fruto (Rost & Lersten 1970; Zee & O´Brien
1970, 1971; Izaguirre-Artucio & Ziliani 1975 y Rost et al. 1984).
Hasta el momento se hicieron diversos estudios que refieren al tipo de consistencia que tiene el endosperma que se encuentra dentro del grano de Poaceae, y se clasificó a este tejido de acuerdo a si es duro o coriáceo o si es blando o líquido o si es de origen lipídico
(Brown 1955; Dore 1956; Rosengurtt et al. 1971, 1972 y Torrell 1971). A un nivel más detallado, referido a los contenidos celulares de este tejido, se clasificaron los tipos de granos de almidón que presentan a nivel de la Familia (Tateoka 1962) y de acuerdo a las distintas familias de las plantas vasculares (Czaja 1978).
206 9-2. Resultados
Embrión:
Todas las especies estudiadas en este trabajo presentan un embrión típico compuesto por un escutelo, más o menos peltado, que corresponde al único cotiledón presente en las angiospermas monocotiledóneas (Figs. 1 A-D; 2 A-D; 3 B, D, F). Se encontraron diferencias a nivel de la base del escutelo respecto de las especies observadas. Las especies de la subfamilia Pooideae, Briza subaristata, Glyceria multiflora, Melica brasiliana, Chaetotropis imberbis var. imberbis y Deyeuxia viridiflavescens var. montevidensis tienen la base del escutelo soldada a la coleorriza. Este carácter coincide con el tipo Festucoide (F) de Reeder
(1957) (Figs. 1 A-D, 3 B). Las especies de las subfamilias Chloridoideae: Distichlis laxiflora, Distichlis spicata, Eleusine tristachya y Panicoideae, ; Paspalidium geminatum y
Stenotaphrum secundatum presentan la base del escutelo bien desarrollada o separada de la coleorriza. Esta característica corresponde al tipo Panicoide (P) de Reeder (op. cit.) (Figs. 2
A-D; 3 D, F).
Se encontraron dos tipos de sistemas de vascularización en el embrión: uno en donde las trazas que inervan el escutelo y la hoja embrionaria divergen aproximadamente en el mismo punto, que corresponde al tipo Festucoide (F) y fue observado en las especies de la subfamilia Pooideae: Briza subaristata, Glyceria multiflora, Melica brasiliana, Chaetotropis imberbis var. imberbis y Deyeuxia viridiflavescens var. montevidensis (Fig. 3 A, B). En el otro sistema ambas trazas, del escutelo y de la hoja embrionaria, están separadas por un entrenudo mas o menos alargado, por lo que divergen a distintas alturas, corresponde al tipo
Panicoide (P) de Reeder (1957) y fue observado en las especies de las subfamilias
207 Chloridoideae: Distichlis laxiflora, Distichlis spicata, Eleusine tristachya y Panicoideae:
Paspalidium geminatum y Stenotaphrum secundatum (Fig. 3 C-F).
El coleóptilo tiene aspecto de cartucho y cubre protegiendo a la plúmula o ápice caulinar con algunos primordios foliares diferenciados (Fig 3 B, D, F). Hacia la base del embrión se visualiza la coleorriza, que tiene una forma más o menos cónica y está opuesta al coleóptilo. Ésta protege a la futura radícula que se esboza en su interior y se ve claramente dentro de la escotadura formada por la misma (Fig. 3 B, D, F). Entre el coleóptilo y la coleorriza se ubica el nudo cotiledonar o mesocótilo que los conecta directamente con el escutelo (Fig. 3 B, D, F).
En el mesocótilo, opuesto al escutelo, se observó en Briza subaristata, Glyceria multiflora, Melica brasiliana, Chaetotropis imberbis var. imberbis, Deyeuxia viridiflavescens var. montevidensis. Distichlis laxiflora, Distichlis spicata y Eleusine tristachya, la presencia de un apéndice más o menos desarrollado, que corresponde al epiblasto (Figs. 1 A-D; 2 A, B; 3 A, B, C, D). En Paspalidium geminatum y Stenotaphrum secundatum el mismo se encuentra ausente (Figs. 2 C, D; 3 E, F).
La proporción endosperma/embrión es variable en las distintas especies estudiadas.
En la subfamilia Pooideae dicha proporción es alta (5:1), y corresponde al tipo Festucoide
(F) (Fig. 3 A); en la subfamilia Panicoideae es intermedia (2:1) y responde al Tipo
Panicoide (P) (Fig. 3 E); mientras que, una proporción aproximadamente de 1:1 fue observada en las especies de la subfamilia Chloridoideae, Tipo Ch (Reeder, 1957) (Fig. 3 C)
- (ver cuadro1).
De acuerdo a todas las características descriptas anteriormente, los embriones de las diferentes especies estudiadas se agruparon en tres tipos: Tipo A, Tipo B y Tipo C, los cuales se resumen en el cuadro1.
208 Pericarpo maduro del fruto:
Briza subaristata posee un pericarpo de espesor reducido donde se distinguen algunas células transversales bastante espaciadas entre sí. Hacia adentro se observan dos capas del tegumento interno limitadas por cutículas refringentes a la luz, y la más interna de ellas presenta algunas células de coloración rojiza. Más internamente, se observa una sola capa de células espaciadas, muy despigmentadas, que corresponden al resto del tejido nucelar. Finalmente se encuentra la capa de aleurona y luego el tejido endospermático con gran cantidad de amiloplastos compuestos (Fig. 4 A).
Glyceria multiflora tiene un pericarpo delgado, dónde solo se ve claramente en la capa más interna un estrato de células transversales. Luego se observan los restos del tegumento interno de coloración rojiza, con dos capas de células, en dónde la más interna está más desarrollada. Son células isodiamétricas y con las paredes más o menos engrosadas.
Le sigue una capa que corresponde a los restos del tejido nucelar y finalmente se observa una capa de aleurona y luego el endosperma con amiloplastos compuestos (Fig. 4
B).
Melica brasiliana posee un pericarpo de espesor reducido donde se observan células transversales muy desarrolladas y por debajo algunas células tubulares espaciadas entre sí.
Luego se ven, entre cutículas, los restos del tegumento interno constituido por dos capas de coloración rojiza, la más interna con células rectangulares mas desarrolladas. Finalmente se encuentra la capa de aleurona y luego el tejido endospermático con gran cantidad de amiloplastos compuestos (Fig. 4 C).
Chaetotropis imberbis var. imberbis tiene el pericarpo muy comprimido, en donde solo se observan restos de las cutículas las cuales se tiñen intensamente. Luego se ven los restos del tegumento interno que está también muy reducido, y que se colorea más
209 débilmente. Le sigue una capa de aleurona bien desarrollada y luego el endosperma con amiloplastos compuestos (Fig. 4 D).
Deyeuxia viridiflavescens var. montevidensis posee un pericarpo muy comprimido, en donde solo se observan claramente restos de las cutículas refringentes que formaban parte de las capas de este estrato. Luego se ven los restos del tegumento interno que está también muy reducido. Finalmente se observa la capa de aleurona bien desarrollada y luego el endosperma con amiloplastos compuestos (Fig. 4 E).
Eleusine tristachya posee un pericarpo separado de los restos del tegumento interno, con dos a tres capas de células muy homogéneas. El tegumento está formado por dos estratos celulares, en dónde el más interno está compuesto por células isodiamétricas y de coloración rojiza. Mas internamente se ve una aleurona bien desarrollada y luego el endosperma con amiloplastos de tipo compuesto. La separación entre el pericarpo y los tegumentos indica que el fruto de esta especie es un utrículo (Fig. 4 F).
Distichlis laxiflora y Distichlis spicata poseen un desarrollo semejante de la pared madura del fruto. El pericarpo está compuesto por alrededor de 11 a 12 capas de células esclerosadas. Luego se observa un estrato que toma una coloración azul intenso con el colorante Fast green, y que corresponde a los restos del tegumento interno. Finalmente se observa la capa de aleurona, con células alargadas y de tamaño muy inferior al que presentan el resto de las células del endosperma propiamente dicho. Este último está compuesto por células grandes que contienen gran densidad de amiloplastos compuestos
(Fig. 5 A, B).
Paspalidium geminatum tiene un pericarpo formado por una epidermis con cutícula engrosada, muy ondulada y conspicua. Por debajo se observan células transversales con paredes muy engrosadas y más internamente una capa de células tubulares. Le siguen los
210 restos del tegumento interno y luego la capa de aleurona con el endosperma amiláceo (Fig. 5
C).
Stenotaphrum secundatum posee un pericarpo con dos capas de células pigmentadas de coloración ocre. Luego se observan los restos del tegumento interno y hacia el interior se puede diferenciar la capa de aleurona y el endosperma amiláceo (Fig. 5 D, E).
9-3. Discusión
La definición dada para el fruto de la familia Poaceae por varios autores (Guerin
1898, Font Quer 1953, Usher 1966, Gould 1968, Rizzini & Rizzini 1981, Campbell 1985,
Rost 1977, Izaguirre & Laguardia 1987, Esau 1987, etc) corresponde a una Cariopsis. De acuerdo a las observaciones realizadas en este trabajo, este tipo de fruto es el que presenta la mayoría de las especies aquí estudiadas, tales como Briza subaristata, Glyceria multiflora,
Melica brasiliana, Chaetotropis imberbis var. imberbes, Deyeuxia viridiflavescens var. montevidensis, Distichlis laxiflora y Distichlis spicata, ya que poseen el pericarpio soldado al tegumento seminal. Por el contrario, en Eleusine tristachya se observó que los tegumentos seminales no están soldados al pericarpo, lo que indica que el fruto corresponde a un
Utrículo. Esta característica concuerda con lo observado previamente por Guerin (1898) y
Chandra (1963) para Eleusine indica y E. coracana.
Roth (1977) describe la estructura del pericarpo maduro del fruto de Poaceae como relativamente uniforme, con sólo pequeñas variaciones en los diferentes géneros. En las distintas especies estudiadas en este trabajo se observaron cambios estructurales y en el número final de capas celulares que componen el pericarpio del fruto y de los tegumentos seminales. En general, las partes fundamentales que lo componen son la epidermis externa
211 cubierta por una cutícula; una o más capas de tejido parenquimatoso parcialmente comprimido, una capa de células alargadas transversalmente al eje mayor del fruto y con gruesas paredes lignificadas y restos de una epidermis interna transformada en células tubulares, con paredes lignificadas, alargadas paralelamente al eje mayor del grano (Esau
1987).
Narayanaswami (1953, 1954, 1955 a y b, 1956) estudió la estructura de la pared del ovario y del pericarpio en algunos pastos o mijos hindúes en donde el número de capas de la pared y los cambios estructurales durante el desarrollo de la cariopsis muestran variaciones en las diferentes especies. Este autor observó que en Pennisetum typhoideum todas las capas de células de los tegumentos y pared del ovario se mantienen a la madurez y en el pericarpio maduro se diferencian fibras y esclereidas. Este carácter coincide con lo observado en
Distichlis laxiflora y Distichlis spicata que poseen un pericarpio compuesto por alrededor de
11 a 12 capas de células esclerosadas, que en el fruto inmaduro corresponderían al mesocarpo parenquimatoso.
En todas las especies los tegumentos del óvulo, tanto el externo como el interno, están compuestos por dos capas de células, pero el externo usualmente se reabsorbe durante la maduración de la semilla en la mayoría de las especies. Así es que sólo quedan restos del tegumento interno a la madurez, en donde sus células aumentan considerablemente de tamaño y generalmente presentan diferencias en su coloración, como lo observado previamente por Cummins (1929) y Chandra (1963) para Eleusine indica y Dactyloctenium aegyticum.
En coincidencia con lo conocido para la mayoría de los representantes de la familia, las especies estudiadas en este trabajo poseen la capa más periférica del endosperma celular transformada en una sola capa de naturaleza proteica llamada aleurona, que contiene granos
212 formados por una proteína amorfa y cristaloides. Contrariamente a lo observado, en Eleusine compressa se describieron dos capas bien desarrolladas de aleurona (Mahalingappa 1977).
En Briza subaristata, Glyceria multiflora, Melica brasiliana, Distichis laxiflora, D. spicata, Eleusine tristachya, Paspalidium geminatum y Stenotaphrum secundatum el tejido del endosperma maduro se vuelve coriáceo o seco y almacena abundante cantidad de almidón, haciendo a los granos harinosos y blanquecinos, pulverulentos al cortarlos. Esto concuerda con la mayoría de las especies estudiadas para la familia Poáceas. Sin embargo, las especies aquí estudiadas pertenecientes a la tribu Agrostideae, Chaetotropis imberbis var. imberbis y Deyeuxia viridiflavescens var. montevidensis, presentan endosperma blando ó líquido, en concordancia con las observaciones realizadas previamente por Rosengurtt et al.
(1972). También se ha encontrado este tipo de endosperma en Limnodea arkansana (Brown
1955), Helicotrichon hookeri, Koeleria cristata, Sphenopholis filiformis y Trisetum bifidum
(Dore 1956) y en 61 géneros mas (Rosengurtt et al. 1971, 1972 y Torrell 1971). La histología de este tipo de endosperma ha sido estudiada en cariopsis premaduros y maduros, observándose en ellos un proceso de lisis de las paredes celulares (Laguardia 1975).
Probablemente este endosperma es coloidal en forma natural e incluye gránulos de almidón y gotas de aceite o lípidos.
Tateoka (1962) clasificó a los granos de almidón contenidos en el endosperma de las cariopsis en cuatro tipos: Tipo 1 y Tipo 2, amiloplastos simples que varían entre ellos por sus diferentes formas; Tipo 3, combinación de amiloplastos simples y compuestos y Tipo 4, solamente amiloplatos compuestos. De acuerdo a esta clasificación todas las especies aquí estudiadas corresponden al Tipo 4 descripto por este autor.
El embrión de las Poáceas se encuentra en posición lateral, pero a diferencia del resto de los embriones de las Monocotiledóneas, está altamente especializado dado que los
213 meristemas del tallo y de la raíz, las hojas y el sistema vascular están claramente diferenciados en esta etapa del desarrollo (Cocucci & Astegiano 1978).
El tipo de vascularización descripta para el embrión de las especies estudiadas en este trabajo concuerda con los tipos Festucoidea (F) y Panicoidea (P) de Reeder (1957).
Todas las especies estudiadas pertenecientes a la subfamilia Chloridoideae fueron ubicadas también dentro del tipo (P) de acuerdo a su anatomía vascular (ver cuadro 1 y Fig. 3).
Son muchas las interpretaciones controvertidas que se han hecho sobre las partes que componen al embrión maduro de las Poáceas y no es el propósito de este trabajo discutir las distintas teorías sobre el origen de cada una de ellas. De acuerdo a las observaciones realizadas en este estudio, podemos decir que el escutelo corresponde al único cotiledón que tienen las Monocotiledóneas, teoría que coincide con la mayoría de los autores que se dedicaron a su interpretación (Arber 1934; Reeder 1953; Brown 1956, 1960; Norstog 1969;
Gignard & Mestre 1970; Guignard 1974; Cocucci & Astegiano 1978; Bourdu 1983).
Además el escutelo se encuentra muy vascularizado y la zona de contacto del mismo con el endosperma presenta un epitelio secretor que tiene función haustorial durante la germinación. De acuerdo con Briggs (1972) y Stoddart (1973), durante este proceso, este
órgano es la fuente del complemento inicial de las enzimas hidrolíticas que causan la degradación del endosperma y la probable fuente de estímulo inicial de las giberelinas.
El epiblasto, a nuestro juicio, es una protuberancia o extensión de la coleorriza debido a que ambos forman una sola estructura, aseverando las interpretaciones de Avery
(1930), Nicora (1947) Brown (1959) y Gignard & Mestre 1970, contrariamente a lo interpretado por otros autores que lo relacionan con la vaina del cotiledón (Negry & Keller
1962, Cocucci & Astegiano 1978).
214 De acuerdo con Guignard & Mestre (1970) el coleóptilo es la vaina o primera hoja modificada que protege a la plúmula o gémula, donde se ubica el meristema apical junto con los primordios foliares, en contraposición a las teorías que dicen que dicha estructura corresponde a la lígula del cotiledón. (Cocucci &Astegiano 1978)
El mesocótilo es el nudo cotiledonar entre el escutelo y el coleóptilo (Guignard &
Mestre 1970).
De acuerdo con Guignard (1962) y Cocucci & Astegiano (1978), consideramos que la coleorriza es la raíz embrional abortiva, equivalente a la radícula del embrión. Al desaparecer esta raíz es reemplazada por raíces adventicias que surgen del nudo cotiledonar o mesocótilo.
En este trabajo se definieron tres tipos de embriones distintos, A, B y C, de acuerdo a las características de la vascularización, la presencia o no de epiblasto, el tipo de escutelo, la relación endosperma/embrión y la posición del embrión en el grano. Estos tipos coinciden con las tres subfamilias estudiadas y fueron resumidos en el cuadro 1.
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220
Fig. 1 – A-D. Embriones maduros. A. Briza subaristata Lamarck.; B. Glyceria multiflora Steudel.; C. Chaetotropis imberbis (Kunth) Björkman. var. imberbis. D. Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees) Cabrera. cl: coleóptilo, cr: coleorriza, em: embrión, en: endosperma, es: escutelo, ms: mesocótilo, p: pericarpo, sv: sistema vascular. Reglillas: A, 55 µm; B, C, D, 50 µm.
221
Fig. 2 – A-D. Embriones maduros. A. Distichlis spicata (L.) Greene. B. Eleusine tristachya (Lam.) Lam.; C. Paspalidium geminatum (Forssk.) Staff.; D. Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze. cl: coleóptilo, cr: coleorriza, em: embrión, en: endosperma, es: escutelo, ms: mesocótilo, p: pericarpo, sv: sistema vascular. Reglillas: A, C, 112 µm; B, 43 µm ; D, 63 µm.
222 p
p e
cl
ep en ms en sv cr
em
em e
e
m cl cl en
ep
m sv c sv m em
p c
Fig. 3 – A- F. Fruto y Embrión. A-B. Glyceria multiflora Steudel. A. Cariopsis. B. Detalle embrión. C-D. Distichlis spicata (L.) Greene. C. Cariopsis. D. Detalle embrión. E-F. Paspalidium geminatum (Forssk.) Staff. E. Cariopsis. F. Detalle embrión. cl: coleóptilo, cr: coleorriza, em: embrión, en: endosperma, es: escutelo, ms: mesocótilo, p: pericarpo, sv: sistema vascular. Escala: a=25 µm, B, D, F ; b=500 µm, A, C, E. Reglillas: a, 250 µm; b, 200 µm.
223
ti p
en en ti p
ti
en ti p en p
p en p en ti ti
Fig. 4 – A-F. Pericarpio maduro. A. Briza subaristata Lamarck.; B. Glyceria multiflora Steudel.; C. Melica brasiliana P. Arduinus; D. Chaetotropis imberbis (Kunth) Björkman; E. Deyeuxia viridiflavescens (Poir.) Kunth. var. montevidensis (Nees) Cabrera ; F. Eleusine tristachya (Lam.) Lam. en: endosperma, p: pericarpo, ti: tegumento interno. Reglillas: A, D, E, 54 µm; B, C, F, 50 µm.
224 en ti p en
ti
P
P en ti
en p ti
P ti
Fig. 5 – A-E. A. Distichlis laxiflora Hackel. B. Distichlis spicata (L.) Greene.; C. Paspalidium geminatum (Forssk.) Stapf.; D-E. Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze. en: endosperma, p: pericarpo, ti: tegumento interno. Reglillas: A, B, 112 µm; C, 50 µm; D, E, 54 µm.
225 SUBFAMILIA TRIBU ESPECIE Tipo de embrión Vascularización Epiblasto Tipo de escutelo endosperma/embrión Posición Poeae Briza subaristata A F (+) F F BL Glyceria multiflora A F (+) F F BL Meliceae Melica brasiliana A F (+) F F BL Chaetotropis imberbis var. imberbis A F (+) F F BL Pooideae Agrostideae Deyeuxia viridiflavescens var. montevidensis A F (+) F F BL Distichlis laxiflora B P (+) P Ch B Aluropodeae Distichlis spicata B P (+) P Ch B
Chloridoideae Eragrostoideae Eleusine tristachya B P (+) P Ch B Paspalidium geminatum C P (-) P P B Panicoideae Paniceae Stenotaphurm secundatum C P (-) P P B
F = Tipo Pooideae Ch = Tipo Chloridoideae P = Tipo Panicoideae (+) = Presencia de epiblasto (-) = Ausencia de epiblasto BL = Posición basal- lateral B = Posición basal
Cuadro 1: Tipos de Embriones
226 10. CONCLUSIONES GENERALES
Para la realización de este estudio se han tomado en consideración 10 taxones de Poaceae, correspondientes a tres subfamilias: Chloridoideae, Panicoideae y Pooideae.
Se describen las características del desarrollo del grano de polen, microsporangio,
óvulo, megagametófito, endospermogénesis, embriogénesis, morfología del embrión y anatomía del fruto, que representan un aporte original al conocimiento embriológico y estructural de la familia. Las mismas se resumen de manera comparativa en el cuadro de caracteres embriológicos de Poaceae (Tabla 1 en CD anexo en contratapa), que comprende tanto las especies estudiadas en este trabajo como aquellas descriptas previamente por otros autores. Este cuadro constituye una recopilación minuciosa de todo lo conocido hasta el momento sobre las Poaceae, con referencia a los caracteres embriológicos en un sentido amplio. El mismo se complementa con otra síntesis que detalla los aspectos embriológicos estudiados previamente para cada una de las especies con la consiguiente referencia bibliográfica (Tabla 2 en CD anexo en contratapa). En ambos cuadros se ha tratado de ubicar a las entidades en una clasificación que permita ser comparativa con lo propuesto para las especies estudiadas (Nicora & Rúgolo de
Agrasar 1987).
Del análisis de estos cuadros se deduce que si bien existen diferencias a nivel embriológico tanto entre las especies estudiadas en este trabajo como en aquellas descriptas por otros autores, las mismas no son suficientes como para diferenciar y delimitar las tribus o subfamilias sobre la base de estos caracteres. Entre los aspectos más relevantes que podemos destacar como caracteres que puedan ser utilizados para diferenciar algunas de las subfamilias se señalan:
227 ‹ Morfología del megagametófito maduro sobre la base del número o
proliferación de antípodas y posición que estas ocupan en el mismo. Esta
característica permitió diferenciar las especies de la subfamilia Panicoideae de
las restantes pertenecientes a las Chloridoideae y Pooideae.
‹ Morfología del embrión maduro. Pudo confirmarse un tipo característico para
cada una de las tres subfamilias estudiadas.
‹ Relación endosperma/embrión. Tres relaciones distintas, basadas en la
proporción que ocupan cada uno de ellos en el fruto fueron halladas, las cuales
se correspondieron con cada una de las subfamilias analizadas.
‹ Ultraestructura de las orbículas. El estudio a nivel de microscopía electrónica
de barrido de la morfología de las orbículas, permitió diferenciar las especies de
las tres subfamilias. Dentro de Pooideae se observaron dos subtipos, uno de ellos
característico de la tribu Meliceae y el otro correspondiente a las otras dos tribus,
Poeae y Agrostideae.
Todas las especies estudiadas presentaron en general un desarrollo de los gametófitos femenino y masculino normal. Se observó y analizó el proceso de fertilización con la consiguiente formación de un embrión de origen sexual.
Paspalidium geminatum es la única especie cuya antera madura presenta gran proporción de granos de polen bicelulares que no llegan a alcanzar su maduración total al estadio tricelular. Además, la célula vegetativa permanece muy vacuolada y no acumula sustancias de reserva. Por otra parte, se observó la formación de varios sacos embrionarios en distintos estadios de desarrollo en un mismo óvulo.
Stenotaphrum secundatum presenta una alta proporción de óvulos con características abortivas. Este último carácter también fue observado en Melica
228 brasiliana, pero siempre con un solo megagametófito por óvulo en ambas especies.
Las citadas tres especies: Paspalidium geminatum, Stenotaphrum secundatum y
Melica brasiliana, si bien forman semillas de origen sexual, son producidas en baja proporción. Debido a las características aberrantes observadas en el desarrollo de los gametófitos de las mismas, y teniendo en cuenta la alta proporción de especies apomícticas que presenta la familia Poaceae (Guohua et al. 2009), podemos pensar que podrían tener una tendencia a un desarrollo de este tipo.
Paspalidium geminatum crece en suelos inundados y tiene características de buena calidad forrajera (Burkart 1969, Vidal & Piergentili 1970, Deregibus &
Kropfl 1983). Si bien produce baja proporción de semillas como consecuencia de las anormalidades embriológicas observadas, es una especie rizomatosa, por lo que se reproduce asexualmente de manera exitosa. Ésta podría ser una de las causas que esté llevando a la pérdida de reproducción sexual por parte de la misma
Stenotaphrum secundatum se destaca por su valor como forrajera y su utilización para césped en distintos tipos de parquización (Burkart 1969, Rúgolo de
Agrasar & Puglia 2004). Esta especie es estolonífera, por lo que está adaptada también a una eficiente reproducción asexual. La tendencia a una baja producción de semillas fértiles no tendría incidencia en su aplicación paisajística y en el uso comercial de la misma, pero es indudable que de lograrse una selección con buena producción de frutos viables podría ser más exitosa desde ese punto de vista.
Melica brasiliana se caracteriza por ser un forraje poco productivo
(Rosengurtt et al. 1970), pero las características de sus vistosas inflorescencias permiten proponerla como una interesante especie con valor ornamental. La baja producción de frutos constituiría un aspecto negativo para tales fines, pero al
229 mismo tiempo la determina como no invasora, carácter muy favorable para su aplicación.
Briza subaristata es una especie valiosa como forrajera nativa en la región pampeana (Burkart 1969, Deregibus & Kropfl 1983) y un elemento apreciado desde el punto de vista ornamental (Rúgolo de Agrasar & Puglia 2004). Eleusine tristachya de valor forrajero (Burkart 1969, Vidal & Piergentili 1970), al igual que
B. subaristata presentan reproducción sexual normal, con buena producción de frutos. Este carácter favorece su dispersión ya que no desarrollan rizomas ni estolones y no se reproducen fácilmente de manera asexual. La alta producción de semillas facilita la formación de nuevos individuos, lo que aumenta la densidad poblacional.
Glyceria multiflora es una muy buena especie forrajera de suelos inundados
(Burkart 1969, Vidal & Piergentili 1973). Si bien se reproduce exitosamente de manera sexual, también lo hace asexualmente por el gran desarrollo de rizomas. La condición de suelo inundado es fundamental para el desarrollo de esta especie.
Cuando el suelo se seca por períodos prolongados los rizomas mueren, pero la semilla puede germinar cuando las condiciones vuelven a ser favorables permitiendo la supervivencia de la especie.
Chaetotropis imbervis y Deyeuxia viridiflavescens son especies aplicadas con fines ornamentales (Rúgolo de Agrasar & Puglia 2004) y consideradas como forrajeras naturales de relativo valor (Vidal & Piergentili 1973, Deregibus & Kropfl
1983). Ambas presentan un desarrollo embriológico normal con buena producción de semillas. Los rizomas que presentan son definidos, por lo que no poseen una exitosa reproducción asexual.
230 Distichlis spicata y Distichlis laxiflora son especies pioneras en suelos salinos (Lovisolo) y se encuentran en manchones o comunidades puras (Deregibus
& Kropfl 1983). Son forrajeras no apetecidas por el ganado, aunque consumidas y de rendimiento escaso (Deregibus & Kropfl 1983). Presentan rizomas indefinidos muy engrosados que permiten la aireación del suelo y a su vez aportan materia orgánica al mismo mejorando sus condiciones. La doble posibilidad de reproducción tanto sexual como asexual en estas especies, las convierte en exitosas y esto representa un carácter favorable para actuar como especies mejoradoras de suelos salinos permitiendo el desarrollo posterior de otras especies colonizadoras. A pesar de ser especies agresivas, no son invasoras debido a que sólo crecen en condiciones de salinidad del suelo.
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