Pharmacological Investigations on Muscarinic and P2 Receptor Subtypes
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Pharmacological Investigations on Muscarinic and P2 Receptor Subtypes Pharmacological Characterisation of the Stereoisomers of Glycopyrronium Bromide and their Tertiary Analogues and Evaluation of the Isolated Guinea-pig and Rat Ileal Longitudinal Smooth Muscle as Novel P2 Receptor Subtype Models Dissertation for the Achievement of the Doctor’s Degree of Natural Sciences Submitted to the Faculty of Chemical and Pharmaceutical Sciences of the Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt am Main by SITTAH CZECHE from Gotha Frankfurt/Main 2001 (DF 1) This work has been carried out from December 1994 until April 1999 at the Department of Pharmacology (Faculty of Chemical and Pharmaceutical Sciences) of the Johann Wolfgang Goethe-University, Frankfurt am Main, Germany. Accepted as dissertation by the Faculty of Chemistry and Pharmaceutical Sciences of the Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt/Main Dean: Prof. Dr. W. Müller 1st Referee: Prof. Dr. G. Lambrecht 2nd Referee: Prof. Dr. H. Stark Date of disputation: 31.10.2001 Meiner Familie True science teaches above all to doubt and to be aware of one’s ignorance. Miguel de Unamuno Danksagung Herrn Prof. Dr. Günter Lambrecht, meinem Doktorvater, danke ich für die Überlassung des Themas und seine fortwährende wissenschaftliche Unterstützung sowie Diskussionsbereitschaft bei der Anfertigung dieser Arbeit. Ferner danke ich Herrn Prof. Dr. Dr. Ernst Mutschler Dank für die freundliche Integration in seinen Arbeitskreis, sein Interesse am Fortgang meiner Dissertation und die großzügige finanzielle Unterstützung. Mein besonderer Dank gilt Herrn Michael Elgert (!) aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. C. Noe, Institut für Pharmazeutische Chemie der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main, für die Bereitstellung der Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids. Herrn Dr. Ulrich Moser möchte Dank sagen für seine Hilfestellung bei wissenschaftlichen und organisatorischen Fragestellungen. Irene Bischoff und Ulrike Hermanni danke ich für die stete Hilfestellung und besonders für die vergnüglichen Aktivitäten außerhalb des Institutes. Caren Hildebrandt danke ich insbesondere für die Tipps im Umgang mit ‘Figure P’ und die Besorgung der Literatur aus den verschiedensten Bibliotheken. Nicht zuletzt danke ich Frau Beate Niebel für die erfolgreiche Zusammenarbeit bei der Charakterisierung der Rezeptoren im Meerschweinchenileum und die netten Einladungen. Bei Frau Elke Förster, Frau Daniela Konca-Mucha und Frau Karin Merbitz- Zahradnik bedanke ich mich für die freundliche Atmosphäre im Sekretariat, die immerwährende Hilfsbereitschaft bei organisatorischen Problemen und ihre persönliche Anteilnahme am Auf und Ab während der Dissertation. Besonders bedanken möchte ich mich auch bei Frau Irma Bozyk für ihren unermüdlichen Einsatz bei der Versorgung der Labortiere. Frau Dr. Magali Waelbroeck (Freie Universität Brüssel, Belgien) danke ich für die Bereitstellung der Bindungsdaten. Ganz herzlich danke ich Susanne Damer. Ich denke gern an unsere gemeinsame Doktorandenzeit zurück, in der wir gemeinsam etliche Höhen und Tiefen, neben den wissenschaftlichen auch die in der Schweiz und in Frankreich, zu bewältigen hatten. Mein besonderer Dank gilt weiterhin: aus der “Rezeptorgruppe” Kirsten Braun, Dr. Edwin Bungardt (für die Animation zum Tauchen), Matthias Ganso (für die Verstärkung der Ossiquote), Dr. Jan Gross (für die Einarbeitung ins Muskarinrezeptorgebiet und die ersten Skistunden), Dr. Christine Keim (für gemeinsame Labor-, Appartement- und Fitnessclubgemeinschaft), Kai Kreutzmann (u. a. für sein Interesse an Formeln und deren räumlicher Ausrichtung), Dr. Otmar Pfaff, Dr. Lisa Vockert (für die Überlassung der Wohnung), Dr. Jahn Wehrle (für seinen Zweckoptimismus), Dr. Martin Weiser und Dr. Ragip Ziyal; aus der “Kinetikgruppe” Dr. Monika Dahms, Dr. Bettina Fuchs (für die zahlreichen gemeinsamen Erlebnisse von A wie Aussuchen eines Fitnessclubs bis Z wie zusammen Liften), Dr. Andreas Hermening, Dr. Antje Howitz, Dr. Susan Kober (sowie S. D. und B. F. für anregende Ernährungstipps innerhalb der ‘Gourmet-’ bzw. ‘Diätgruppe’) und Dr. Andrea Soldner; aus dem ZL Dr. Eberhard Strack (für seinen kulturellen Enthusiasmus) und Dr. Alexander Staab; aus der “Schmalzing-Gruppe” Dr. Eberhard Biemer, Dr. Bernd Knau, Dr. Annette Nicke und Dr. Jürgen Rettinger; aus der “Müller-Gruppe” Andrea Kastl, Dr. Silke Leutner, und Steffen Leutz sowie Dr. Marlene Geider, Dr. Kerstin Gräfe und Barbara Siebert (für ihren unermüdlichen organisatorischen Einsatz in allen Lebenslagen). Ferner möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Pharmakologischen Institutes für die hilfsbereite und freundschaftliche Zusammenarbeit bedanken. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft und der Hermann Willkomm-Stiftung danke ich für die finanzielle Unterstützung. TABLE OF CONTENTS TABLE OF CONTENTS Page 1. INTRODUCTION 1 1.1. Muscarinic receptors 1 1.1.1. Historical background 1 1.1.2. Subclassification and nomenclature 1 1.1.3. Cloning studies and structure 6 1.1.4. Signal transduction pathways 8 1.1.5. Localisation and biological function 9 1.1.6. Therapeutic potential of selective muscarinic agonists and antagonists 12 1.2. P2 receptors 17 1.2.1. Historical background 17 1.2.2. Subclassification and nomenclature 17 1.2.3. Cloning studies and structure 19 1.2.3.1. Structural features of P2X receptors 19 1.2.3.2. Cloned P2X receptors 21 1.2.3.3. Co-assembly of distinct P2X receptor subunits 24 1.2.3.4. Properties of P2Y receptors 25 1.2.3.5. Further P2Y receptors 28 1.2.4. Agonists 29 1.2.5. Antagonists 30 1.2.6. Agonist breakdown 35 1.2.7. Signal transduction mechanisms 38 1.2.8. Localisation and physiological roles 40 1.2.9. Therapeutic targets 42 2. AIM OF THE THESIS 45 2.1. Investigations of the isomers of glycopyrronium bromide and their tertiary analogues at muscarinic receptors 45 2.2. Evaluation of the guinea-pig ileal longitudinal smooth muscle with respect to the distribution of P2 receptors 48 2.3. Characterisation of functional P2 receptor subtypes mediating contraction in the rat ileal longitudinal smooth muscle 50 I TABLE OF CONTENTS 3. MATERIALS AND METHODS 51 3.1. Drugs 51 3.1.1. Commercially available drugs 51 3.1.2. Gifts 52 3.1.3. Syntheses 52 3.2. Preparation of buffer and stock solutions 52 3.3. Animals 53 3.4. Methods 54 3.4.1. Rabbit vas deferens (RVD) 54 3.4.2. Guinea-pig atria (GPA) 55 3.4.3. Guinea-pig ileum (GPI) 55 3.4.3.1. Preparation for experiments with exogenously applied muscarinic agonist 55 3.4.3.2. Preparation for experiments with endogenous acetylcholine as agonist 56 3.4.3.3. Preparation for experiments with exogenously applied P2 agonists 56 3.4.4. Rat ileum (RI) 57 3.5. Evaluation of data 57 3.6. Statistics 58 4. RESULTS 59 4.1. Functional in vitro experiments with the isomers of glycopyrronium bromide and its corresponding tertiary analogues at muscarinic receptors 59 4.1.1. General considerations 59 4.1.2. Affinity profile of the parent compound glycopyrronium bromide 59 4.1.3. Affinity profile of the quaternary stereoisomers of glycopyrronium bromide 62 4.1.4. Affinity profile of the tertiary stereoisomeric analogues of glycopyrronium bromide 68 4.2. P2 receptor heterogeneity in the guinea-pig ileal longitudinal smooth muscle preparation 71 II TABLE OF CONTENTS 4.2.1. Experiments at neuronal P2 receptors 71 4.2.1.1. Preliminary experiments with ,-meATP 71 4.2.1.2. Antagonism by suramin, PPADS and NF023 74 4.2.1.3. Antagonism by NF279 78 4.2.1.4. Investigations on the postjunctional muscarinic receptor subtype responsible for contraction of GPI 79 4.2.2. Experiments at postjunctionally localised P2 receptors 82 4.2.2.1. Potency profile of P2 agonists 82 4.2.2.2. Effects of atropine, TTX and CCPA 84 G 4.2.2.3. Effects of N -nitro-L-arginine and hexa- methonium on contractions elicited by ADPS 85 4.2.2.4. Antagonism by suramin, PPADS and NF023 85 4.2.2.5. Antagonism by NF279 88 4.2.2.6. Antagonism by A3P5P and MRS2179 89 4.3. Experiments with the longitudinal smooth muscle of the rat ileum 92 4.3.1. Experiments with P2 agonists 92 4.3.2. Effects of TTX and atropine on responses to ,-meATP 93 4.3.3. Effects of TTX and atropine on responses to ADPßS 94 4.3.4. Effects of NF023, suramin and PPADS on responses to ADPßS 94 4.3.5. Effects of NF279 and A3P5P on responses to ADPßS 96 5. DISCUSSION 98 5.1. Functional in vitro experiments with glycopyrronium bromide, its four stereoisomers and their corresponding tertiary analogues at muscarinic receptors 98 5.1.1. Affinity profile of glycopyrronium bromide 98 5.1.2. Affinity profile of the four stereoisomers of glycopyrronium bromide 99 5.1.3. Affinity profile of the tertiary stereoisomeric analogues of glycopyrronium bromide 101 5.2. Stereoselectivity and eudismic analysis of the isomers of glycopyrronium bromide 104 III TABLE OF CONTENTS 5.3. Therapeutical implications of the isomers of glycopyrronium bromide 110 5.4. P2 receptor heterogeneity in the guinea-pig ileal longitudinal smooth muscle preparation 112 5.4.1. Experiments at neuronal P2 receptors 112 . 5.4.1.1. Preliminary experiments with ,-meATP 112 5.4.1.2. Effects of TTX and atropine 113 5.4.1.3. Antagonism by P2 antagonists 114 5.4.1.4. Concluding remarks 120 5.4.1.5. Investigations on the muscarinic receptor subtype responsible for contraction of GPI 120 5.4.2. Experiments at postjunctionally localised P2 receptors 124 5.4.2.1. Potency profile of P2 agonists 124 5.4.2.2. Effects of atropine, TTX and CCPA 124 5.4.2.3. Antagonism by P2 antagonists 125 5.4.2.4. Antagonism by A3P5P and MRS2179 126 5.4.3. Conclusion 128 5.5. Experiments at the longitudinal smooth muscle of rat ileum 129 5.5.1. Experiments with P2 agonists 129 5.5.2. Effects of P2 antagonists on responses to ADPS 130 5.5.3. Conclusion 130 6. SUMMARY 131 7. ZUSAMMENFASSUNG 135 8. GLOSSARY OF ABBREVATIONS 140 9.