Instituto Nacional De Pesquisas Da Amazônia – Inpa

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

DIVISÃO DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA - DIGEN

Estudos citogenéticos evolutivos em roedores da família Echimyidae (Mammalia:Rodentia), com ênfase no gênero Proechimys

EDUARDO SCHMIDT ELER

Manaus/2017

EDUARDO SCHMIDT ELER

Estudos citogenéticos evolutivos em roedores da família Echimyidae (Mammalia:Rodentia), com ênfase no gênero Proechimys

Orientadora: ELIANA FELDBERG, Dra.

Co-Orientadora: MARIA NAZARETH FERREIRA DA SILVA, Dra.

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Manaus/2017

ii EDUARDO SCHMIDT ELER

Estudos citogenéticos evolutivos em roedores da família Echimyidae (Mammalia:Rodentia), com ênfase no gênero Proechimys

Tese apresentada Programa de Pós- Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

APROVADA EM: 26 / 05 / 2017

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Izeni Pires Farias - UFAM

Profa. Dra Gislene Almeida de Carvalho Zilse – INPA

Profa. Dra. Daniele Aparecida Matoso - UFAM

Prof. Dr. Vanderly Pedro Tadei - INPA

Profa. Dra. Natália Dayane Moura Carvalho - UFAM

iii FICHA CATALOGRÁFICA

E37 Eler, Eduardo Schmidt Estudos citogenéticos evolutivos em roedores da família Echimyidae (Mammalia:Rodentia), com ênfase no gênero Proechimys /Eduardo Schmidt Eler . --- Manaus: [s.n.], 2017. 69 f.: il.

Tese (Doutorado) --- INPA, Manaus, 2017. Orientador: Eliana Feldberg Coorientador:Maria Nazareth Ferreira da Silva Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Roedores . 2.Citogenética de mamíferos . 3. Citotaxonomia . I. Título. CDD 599.35

Sinopse: Realizamos um estudo cariotípico (clássico e molecular) comparativo em setes gêneros (Proechimys, Makalata, Trinomys, Thrichomys, Dactylomys, Mesomys e Isothrix) da família Echimyidae, com maior volume de dados para Proechimys, o mais especioso e diverso (em termos cromossômicos). Novas formas cariotípicas foram descritas para P. cuvieri, P. echinothrix, Isothrix pagurus, Dactylomys dactylinus, Makalata didelphoides, Trinomys paratus e Thrichomys apereoides. Considerações a respeito da evolução cromossômica da família foram feitas.

Palavras-Chave: Bandeamento cromossômico, FISH, roedores equimídeos, evolução cariotípica, citotaxonomia

Dedico este trabalho ao meu pequeno Otto, que adora “trabalhar com célula de rato”! Seu entusiasmo e fantasia com o mundo do laboratório me encantam.

“A vida é uma peça de teatro que não permite ensaios. Por isso, cante, chore, dance, ria e viva intensamente, antes que a cortina se feche e a peça termine sem aplausos”

Charles Chaplin

vi A realização deste projeto foi possível devido:

À Divisão de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, do INPA. Ao laboratório de Genética Animal do INPA, Coordenação de Pesquisas em Biodiversidade, onde a maior parte deste trabalho foi desenvolvida, com financiamento proporcionado pelos Projetos de Pesquisas Institucionais (PPIs). À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo e pelo financiamento da pesquisa por meio dos Projetos: Sisbiota - Rede BIOPHAM (MCTI/MEC/CAPES/FNDCT n◦ 47/2010); AUXPE – Pró Amazônia, CAPES 3297/2013/Processo nº 23038.009446/2013- 09. Estudos citogenéticos e citogenômicos da biodiversidade da Amazônia, com implementação de avanços técnicos. Ao CNPq: Edital Universal 14/2013: Mapeamento físico-cromossômico do DNA repetitivo e seu papel na organização genômica e evolução cariotípica na família Echimyidae.

vii AGRADECIMENTOS

Agradeço, sobretudo, a Deus, que me concedeu a vida e dela tem cuidado, enchendo-a de graça e misericórdia.

À minha orientadora, Dra. Eliana Feldberg, por abrir as portas do LGA, por tantos anos de amizade e de trabalho. Por garantir todas as condições para realização do meu projeto, por permitir minhas convicções e escolhas participarem das decisões. Aqui registro minha sincera gratidão e reconhecimento ao papel fundamental que minha orientadora desempenhou em minha formação acadêmica nos últimos 11 anos, que foi muito além de aprovar financiamento para nossos projetos. Obrigado pelo exemplo de compromisso e responsabilidade na formação de pessoas.

À minha co-orientadora, Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva, por me ajudar a caminhar neste mundo dos roedores, por viabilizar a realização de tantas coletas, que além de fornecerem material de estudo, me permitiram conhecer um pouco a Amazônia e o povo ribeirinho. Agradeço pelas contribuições sempre muito pertinentes ao meu trabalho.

Aos colegas do Laboratório de Genética Animal do INPA (LGA), de hoje (Ramon Favarato, Milena Ferreira, Lucas Barros, Leandro Marajó, Patrik Viana, Alber Campos, José Souza, Simone Soares e Arlindo Batista) e de ontem (Maria Claudia Gross, Carlos Schneider, Maria Leandra Terencio, Leila Ribeiro) pela sadia convivência diária, pelas muitas contribuições e discussões, e pela ajuda tanto no campo como na bancada, sempre muito importantes.

Ao colega Carlos Eduardo Faresin e Silva, pela inestimável contribuição na bancada, nas discussões de trabalhos, e em tantas coletas e consultorias. Ao colega Patrik Viana, pelo auxílio com a montagem de cariótipos quando o prazo era curto.

Aos professores Dr. Yuri Leite e Dra. Valéria Fagundes, pelo apoio para realização da coleta em Guarapari/ES. Agradeço à Dra. Valéria pelas contribuições já no final da tese.

Ao professor Dr. Leonardo Lessa, pelo apoio para realização da coleta no Parque Nacional Sempre Vivas, Diamantina/MG.

Aos colegas do Laboratório de Mastozoologia e Biogeografia da UFES, pela parceria nos trabalhos de campo em Guarapari. Ao Marco Aurélio Pacheco e Verônica Senna, pela parceria nos trabalhos de campo em Diamantina.

viii Ao Dr. Breno Schumaher, pelo apoio constante dispensado ao meu doutoramento, especialmente nas concessões de afastamento para realização do trabalho de campo.

À minha esposa Tahisa Kuck, e meus queridos filhos Isabelle, Otto e Lia, por tantas alegrias que me proporcionam, por suportarem minha jornada tripla (e consequente ausência em casa) durante o período de doutorado. Vocês são o meu porto-seguro. Agradeço em especial à Tahisa, que se tornou mãe e pai nestes últimos cinco meses, a partir da chegada da nossa pequena Lia, se dedicando com amor e praticamente sozinha ao cuidado de nossa filha, para que eu concluísse a tese. Com vocês, meus queridos, estão os meus melhores sentimentos, minha admiração e minha gratidão.

Aos meus pais, Sérgio e Cidnéa, por semearem em mim a convicção de que a educação é o mais promissor caminho a ser seguido, e por garantirem, enquanto necessário, as condições para que eu me dedicasse integralmente a ela. Aos meus irmãos, Luiz e Lilian, por vibrarem com todas as minhas alegrias, pelas palavras de incentivo!

Aos meus sogros Luzinete e Jaime, por auxiliarem tantas vezes no cuidado com as crianças, sempre com muito carinho, quando a rotina foi extensa, e também nos meus períodos de viagens.

Ao professor Dr. Jorge Dergam, meu primeiro orientador, pelo pontapé inicial em minha jornada científica. Sua forma entusiasmada e responsável de me apresentar a ciência e a citogenética me inspira até hoje.

À sociedade brasileira, que com seus tributos financiou minha formação na graduação, mestrado e doutorado.

Aos membros da banca examinadora, por aceitarem o convite para compô-la e pelas considerações feitas a este trabalho.

Obrigado a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho e para e minha formação.

ix RESUMO

Equimídeos apresentam grande diversidade cariotípica, com o número diploide variando de 14-16 em Proechimys sp. até 118 em Dactylomys boliviensis, e em alguns casos o número diploide parece ser um caráter diagnóstico para o nível específico. Dados de bandeamentos cromossômicos, quando disponíveis, também têm fornecido subsídio para diferenciação de espécies ou populações. Com objetivo de compreender melhor a organização genômica e os padrões evolutivos cromossômicos de Echimyidae, realizamos um estudo cariotípico clássico e molecular, comparativo em setes gêneros (Proechimys, Makalata, Trinomys, Thrichomys, Dactylomys, Mesomys e Isothrix) da família, com maior volume de dados para Proechimys, o mais especioso e diverso (em termos cromossômicos). Novas formas cariotípicas foram descritas para P. cuvieri, P. echinothrix, Isothrix pagurus, Dactylomys dactylinus, Makalata didelphoides, Trinomys paratus e Thrichomys apereoides. Também ampliamos a distribuição geográfica de citótipos já conhecidos para Mesomys hispidus, Proechimys gardneri, P. guyannensis e P. goeldii. A distribuição da heterocromatina foi em blocos pequenos, preferencialmente na região pericentromérica da maioria dos cromossomos. Apresentamos a distribuição da sequência de DNAr 18S, que na maioria das vezes esteve presente em apenas um par de cromossomos, intersticial no braço longo, mas em diferentes posições no cariótipo das espécies. Sequência telomérica esteve presente apenas nas regiões terminais dos cromossomos em todas as espécies analisadas, exceto Isothrix pagurus, que apresentou ITS em 3 pares cromossômicos. A família Echimyidae é um grupo extremamente diverso do ponto de vista da macroestrutura do cariótipo (números diploide e fundamental) e, apesar de não observarmos uma tendência de evolução cromossômica para a família, quando consideramos os agrupamentos mais internos das filogenias propostas, podemos inferir sobre padrões evolutivos cromossômicos, como observado nos gêneros Isothrix, Mesomys, Dactylomys e Makalatata. Toda diversidade cromossômica encontrada em Echimyidae se deve a rearranjos Robertsonianos e/ou não Robertsonianos, entretanto marcações teloméricas intersticiais (ITS), que pudessem comprovar alguns deles, não foram observadas. Assim, eventos ecomorfológicos e biogeográficos, seguidos de alterações moleculares, seriam

x os principais fatores responsáveis pela diversificação em equimídeos, passando os rearranjos cromossômicos a figurarem como consequência desse processo. Por outro lado, os estudos cromossômicos continuam desempenhando importante papel no estudo da biodiversidade da família, revelando marcadores populacionais e específicos, auxiliando na diferenciação de cariomorfos e frequentemente atuando como gatilho para estudos sistemáticos mais aprofundados.

xi ABSTRACT

Echimyids are characterized by high levels of karyotypic diversity, with the diploid number ranging from 14-16 in Proechimys sp. up to 118 in Dactylomys boliviensis, and in some cases the diploid number seems to be a diagnostic character for the specific level. Chromosome banding data, when available, have also provided subsidies for characterizing different species or populations. In order to better understand the genomic organization and evolutionary chromosomal patterns of Echimyidae, we performed a classical and molecular karyotypic study comparing seven genera (Proechimys, Makalata, Trinomys, Thrichomys, Dactylomys, Mesomys and Isothrix) of the family, with the highest volume of data for Proechimys, the most specious and chromosomally diverse taxon. New karyotypic forms have been described for P. cuvieri, P. echinothrix, Isothrix pagurus, Dactylomys dactylinus, Makalata didelphoides, Trinomys paratus, and Thrichomys apereoides. We have also extended the geographic distribution of known cytotypes of Mesomys hispidus, Proechimys gardneri, P. guyannensis and P. goeldii. Heterochromatin was always distributed in small blocks, occurring usually in the pericentromeric region of most chromosomes. We present the distribution of the 18S rDNA sequence, which was most often interstitial, occurred on the long chromosome arm and was restricted to one chromosome pair, but in different positions of the karyotype of each species. The telomeric sequence was present only in the terminal regions of the chromosomes in all species analyzed except Isothrix pagurus, which presented interstitial telomeric markings (ITS) in three chromosome pairs. The Echimyidae family is an extremely diverse group from the karyotype macrostructure (diploid and fundamental numbers) point of view, and although chromosome evolution trend is not observed in this Family, some chromosomal evolutionary inference can be made in more internal groupings of the phylogenies proposed (as observed in the genera Isothrix, Mesomys, Dactylomys and Makalatata). Although The family Echimyidae has an extremely diverse karyotypical macrostructure (diploid and fundamental numbers), we do not observe a clear chromosomal evolutionary trendendency, although some chromosomal evolutionary inference can be made in more internal groupings of the phylogenies proposed, in relation to the diploid number, as observed in the

xii genera Isothrix, Mesomys, Dactylomys and Makalatata. Although chromosome diversity in Echimyidae is due to Robertsonian and / or non Robertsonian rearrangements, we did not observe ITS associated to those evolutionary mechanisms. Thus, ecomorphological and biogeographic events or processes, and their consequent molecular signatures, would be the main factors responsible for the diversification in echimyids, and chromosomal rearrangements would represent a by-product of these process. On the other hand, chromosome studies continue to play an important role in the study of family biodiversity, revealing specific population markers, aiding in the differentiation of caryomorphs and often acting as a trigger for deeper systematic studies.

xiii SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 1 1.1. A família Echimyidae ...... 1 1.2. Citogenética de equimídeos ...... 5 1.3 Citogenética molecular e sequências repetitivas de DNA ...... 8 2. OBJETIVOS ...... 10 2.1. Objetivo geral ...... 10 2.2 Objetivos específicos ...... 10 3. MATERIAL E MÉTODOS ...... 11 3.1 Coleta dos Indivíduos ...... 13 3.2 Métodos Citogenéticos Clássicos ...... 13 3.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos e coloração convencional ...... 13 3.2.2 Bandeamento C ...... 14 3.2.3 Detecção da Região Organizadora de Nucléolo (Ag-RON) ...... 15 3.2.4. Análise cariotípica ...... 15 3.3. Métodos Citogenéticos Moleculares ...... 16 3.3.1. Extração de DNA ...... 16 3.3.2. Amplificação de sequências repetitivas ...... 16 3.3.3. Hibridização in situ fluorescente (FISH) ...... 17 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 19 Capítulo 1 Eler, E.S.; Silva, C.E.F.; da Silva, M.N.F.; Feldberg. E. 2017. Análise citogenética comparativa de espécies de Proechimys (Rodentia: Echimyidae) com novos registros cariotípicos para o gênero, na Amazônia brasileira...... 20 Resumo ...... 21 Introdução ...... 22 Material e Métodos ...... 24 Resultados ...... 26 Discussão ...... 32 Capítulo 2 Eler, E.S.; Silva, C.E.F.; da Silva, M.N.F.; Feldberg. E. 2017. Diversidade citogenética e mapeamento físico-cromossômico de sequências repetitivas de DNA em seis espécies de roedores da família Echimyidae (Mammalia : Rodentia)...... 37 Resumo ...... 38 Introdução ...... 39 Material e Métodos ...... 41 Resultados ...... 43 Discussão ...... 50 5. CONCLUSÕES ...... 58 6 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 59

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Filogramas inferidos para a família Echimyidae, a partir da análise de máxima verossimilhança, utilizando sequências mitocondriais e nucleares, por Galewski et al. 2005 (A) e Fabre et al. 2012 (B).

Figura 2: Mapa do Brasil (e parte da América do Sul), indicando as regiões de coleta de roedores equimídeos: 1- baixo rio Japurá (1.84341666667°S, 69.0264722222°W); 2- Santa Isabel do Rio Negro, rio Negro (0.57725000000°S, 64.8976944444°W); 3- Região do baixo rio Purus (6.5784111000°S, 64.5723388900°W); 4- margem esquerda do médio rio Madeira (5.24610277778°S, -60.7140500000°W); 5- região do baixo rio Aripuanã (6.00000000000° S, 60.1666666667°W); 6- Parque Estadual do rio Negro Setor Sul, rio Cuieiras (2.70708611111°S, 60.3738388889°W); 7- região do rio Jatapú (2.0179400000° S, 58.2032280000° W); 8- Flona Saracá-Taquera e Rebio Trombetas, rio Trombetas (1.48163888889°S, 56.4573333333°W); 9- Parque Nacional da Amazônia e Flona do Tapajós, rio Tapajós (4.53486111111°S, 56.6031666667°W); 10- Vale do rio Jari (0.7000000000°S, 52.6666666667°W); 11- Parque Nacional Sempre Vivas, Diamantina, Minas Gerais (17.9172656000°S, 43.7867219000°W); 12- Município de Guarapari, Espírito Santo (20.5308333333°S, 40.5988888889°W).

Capítulo 1

Figura 1: Mapa da bacia amazônica brasileira, indicando os locais de coleta dos indivíduos de Proechimys: 1- baixo rio Japurá (1.84341666667°S, - 69.0264722222°W); 2- Santa Isabel do Rio Negro, rio Negro (0.57725000000°S, 64.8976944444°W); 3- Reserva extrativista de Canutama, rio Purus (6.5784111000°S, 64.5723388900°W); 4- baixo rio Jacinto, margem direita do rio Purus (6.8300640000°S; 64.2819020000°W); 5- Rebio Abufari, margem esquerda do rio Purus (4.97616666667ºS, 62.9774722222ºW ); 6– margem esquerda do rio Madeira (5.24610277778°S, -60.7140500000°W); 7- baixo rio Aripuanã (6.00000000000° S, 60.1666666667°W); 8- rio Jatapú (2.0179400000° S, 58.2032280000° W); 9- Flona Saracá-Taquera e Rebio Trombetas, rio Trombetas (1.48163888889° S, 56.4573333333° W); 10- Vale do rio Jari (0.7000000000° S, 52.6666666667° W

Figura 2: Cariótipos de Proechimys goeldii (2n=16): coloração convencional (a), Banda-C (b), Ag-RON (c); Proechimys echinothrix (2n=32): coloração convencional (d), Banda-C (e), Ag-RON (f); Proechimys cuvieri (2n=28): coloração convencional (g), Banda-C (h), Ag-RON (i). Barra=10μm.

xv Figura 3: Marcações teloméricas em Proechimys cuvieri das localidades 7, 8 e 9 (a); P. cuvieri da localidade 1 (b); P. gardneri das localidades 5 e 6 (c); P. goeldii da localidade 4 (d); P. guyannensis da localidade 2 e 10 (e); P. guyannensis da localidade 9 (f); P. echinothrix das localidades 3 e 4 (g); P. longicaudatus da localidade 6 (h). Barra=10μm.

Figura 4: Marcações de DNAr 18S (indicadas por flechas) em Proechimys cuvieri das localidades 7, 8 e 9 (a); P. cuvieri da localidade 1 (b); P. gardneri da localidade 5 e 6 (c); P. goeldii da localidade 4 (d); P. guyannensis das localidades 2 e 10 (e); P. guyannensis da localidade 9 (f); P. echinothrix das localidades 3 e 4 (g); P. longicaudatus da localidade 6 (h). Barra=10μm

Capítulo 2

Figura 1: Mapa do Brasil (e parte da América do Sul), indicando as regiões de coleta de roedores equimídeos: 1- baixo rio Japurá (1.84341666667°S, 69.0264722222°W); 2- Santa Isabel do Rio Negro, rio Negro (0.57725000000°S, 64.8976944444°W); 3- Região do baixo rio Purus (6.5784111000°S, 64.5723388900°W); 4- Parque Estadual do rio Negro Setor Sul, rio Cuieiras (2.70708611111°S, 60.3738388889°W); 5- região do rio Jatapú (2.0179400000° S, 58.2032280000° W); 6- Flona Saracá-Taquera e Rebio Trombetas, rio Trombetas (1.48163888889°S, 56.4573333333°W); 7- Parque Nacional da Amazônia e Flona do Tapajós, rio Tapajós (4.53486111111°S, 56.6031666667°W); 8- Vale do rio Jari (0.7000000000°S, 52.6666666667°W); 9- Parque Nacional Sempre Vivas, Diamantina, Minas Gerais (17.9172656000°S, 43.7867219000°W); 10- Povoados de Rio da Prata e Buenos Aires, Município de Guarapari, Espírito Santo (20.5308333333°S, 40.5988888889°W).

Figura 2: Cariótipos de Mesomys hispidus: coloração convencional (a), Banda- C (b), DNAr 18S (c); Makalata didelphoides: coloração convencional (d), Banda-C (e), DNAr18S (f); Trinomys paratus: coloração convencional (g), Banda-C (h), DNAr18S (i); Thrichomys apereoides: coloração convencional (j), Banda-C (k), DNAr 18S (l); Dactylomys dactylius: coloração convencional (m), Banda-C (n), DNAr 18S (o); Isothrix pagurus: coloração convencional (p), Banda-C (q), DNAr 18S (r). Nos cariótipos em coloração convencional e Banda C, os cromossomos sexuais do sexo oposto estão destacados em caixas. Barra=10μm.

Figura 3: Marcações teloméricas em Mesomys hispidus (a); Makalata didelphoides (b); Trinomys paratus (c); Thrichomys apereoides (d); Dactylomys dactylinus (e); Isothrix pagurus (f). Barra=10μm.

xvi

LISTA DE TABELAS

Capítulo 1

Tabela 1: Espécies coletadas, número de indivíduos, sexo, número diploide e fundamental, procedência e registro de identificação.

Capítulo 2

Tabela 2: Espécies, número de indivíduos analisados por sexo, procedência e número de registro. 2n=número diploide, NF=número fundamental.

xvii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES

2n – Número diploide

ES – Espírito Santo

FISH – Fluorescent in situ hybridization

FLONA – Floresta Nacional

IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis

INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

ITS – Intersticial Telomeric Sequence

MG – Minas Gerais

MMA – Ministério do Meio Ambiente

NF – Número Fundamental / número de braços cromossômicos

PCR – Polimerase Chain Reaction

RB – Razão de braços cromossômicos

REBIO – Reserva Biológica

RON – Região Organizadora de Nucléolo

SISBIO - Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade

xviii 1. INTRODUÇÃO

1.1. A família Echimyidae Roedores neotropicais da família Echimyidae são considerados os mais diversos entre os Hystricognati, tanto em termos taxonômicos, como também ecológicos, morfológicos e adaptativos. Atualmente, abrangem 19 gêneros viventes e mais de 90 espécies descritas. Além dos gêneros viventes, Echimyidae também inclui quatro gêneros extintos (Woods 1993; Lara et al. 1996; McKenna e Bell 1997; Eisenberg e Redford, 1999; Leite e Patton 2002; Bonvicino et al. 2002; Emmons 2005; Galewski et al. 2005; Iack-Ximenes et al. 2005, Woods e Kilpatrick 2005; Fabre et al. 2012). Os equimídeos estão distribuídos ao longo de toda a região Neotropical, desde a América do Norte até a Argentina (Leite e Patton 2002). Boa parte dos equimídeos habitam a região amazônica, desde regiões mais baixas até florestas de montanha, onde estão representados pelos gêneros Dactylomys, Echimys, Isothrix, Lonchothrix, Makalata, Mesomys, Proechimys e Toromys. Outros biomas também são habitados pelos equimídeos, como Cerrado e Caatinga, com ocorrência de Carterodon, Clyomys e Thrichomys; Mata Atlântica, com ocorrência de Callistomys, Euryzygomatomys, Kannabateomys, Phyllomys e Trinomys. Myocastor ocorre na Argentina, e outros três gêneros, Olallamys, Diplomys, Hoplomys, bem como algumas espécies do gênero Proechimys, estão restritas à região compreendida entre o oeste dos Andes e América Central (Galewski et al. 2005). Dois gêneros descritos mais recentemente, Santamartomys e Pattonomys, são encontrados na região montanhosa do norte da Colômbia (Sierra Nevada de Santa Marta) e região costeira do norte da Venezuela, respectivamente (Emmons 2005). Apesar da grande diversidade de equimídeos, vários gêneros dessa família, especialmente os arbóreos, são pobremente representados em coleções zoológicas, devido à amostragem inadequada do dossel como também a possível raridade desses indivíduos (Patton et al. 2000). Esses fatores certamente contribuem para a instabilidade taxonômica em Echimyidae, que ainda apresenta rearranjos a nível do gênero e revalidação de espécies. Recentemente, por exemplo, Emmons (2005) sugeriu dois novos gêneros para Echimyidae, Pattonomys e Santamartamys, associados até então a Nelomys

1 semivillosus e Isothrix rufodorsalis, respectivamente. Iack-Ximenes et al. (2005) descreveram o gênero Toromys para alocar Loncheres grandis, anteriormente alocado em Echimys. Também permanecem indefinições sobre as relações filogenéticas na família, com classificações ainda conflitantes (Woods 1993; Lara et al. 1996; Vié et al. 1996; McKenna e Bell 1997; Leite e Patton 2002; Galewski et al. 2005). Woods (1993) agrupou os equimídeos em cinco subfamílias: Dactylomyinae, que abrange três gêneros dos ratos de bambu; Echimyinae, com quatro gêneros que vivem predominantemente no dossel; Eumysopinae, com oito gêneros terrestres; Chaetomyinae, que inclui somente o gênero Chaetomys; Heteropsomyinae, já extinta, inclui ratos endêmicos de ilhas do Caribe. McKenna e Bell (1997) agruparam os equimídeos extintos do Caribe juntamente com os sul-americanos na subfamília Heteropsomyinae, assumindo Eumysopinae como sinonímia. Os autores também excluíram o gênero Chaetomys da família Echimyidae, sendo ele alocado posteriormente na família Erethizontidae, baseado em características da dentição (Martin 1994; Carvalho 2000). Os autores ainda reclassificaram a família Myocastoridae (Woods 1993) como subfamília de Echimyidae (Myocastorinae, composta pelo gênero Myocastor). Woods e Kilpatrick (2005) realizaram a mais recente classificação taxonômica de Echimyidae. Esta é similar à apresentada por Woods (1993) porém, inclui os gêneros Trynomys na subfamília Eumysopyinae, Phyllomys e Callistomys em Echimyinae, além de considerar Chaetomys não pertencente à essa família. Para esses autores, Myocastor e Capromys pertencem às famílias Myocastoryidae e Capromyidae, respectivamente. Dado suas diferenças em caracteres cranianos, Emmons e Vucetich (1998) alocaram o rato-do-cacau em um novo gênero de Echimyidae, Callistomys. Decorrente de extenso trabalho de campo em áreas amazônicas até então pouco amostradas, da Silva (1995; 1998) descreveu quatro novas espécies no gênero Proechimys e outros estudos moleculares em colaboração com J.L. Patton evidenciaram alta diversidade genética em vários gêneros da família, como Dactylomys, Isothrix, Makalata e Mesomys (da Silva e Patton 1993; Patton et al. 2000). Leite (2001) separou os equimídeos arbóreos

2 amazônicos dos da Mata Atlântica, e estes constituíram um novo gênero, Phyllomys, que assim como Echimys, também pertence à subfamília Echimyinae. Em termos moleculares, Lara et al. (1996), utilizando a sequência completa do citocromo b mitocondrial, estudaram 12 gêneros da família Echimyidae e encontraram alto suporte para a maioria dos gêneros analisados e confirmaram a monofilia do grupo, embora a relação filogenética entre táxons supra específicos tenha permanecido incerta. Os autores concluíram que os grupos poderiam ter tido uma divergência simultânea e propuseram a hipótese filogenética de politomia (star-phylogeny). Naquele estudo, dado o suporte e alto nível de divergência observado para o subgênero Trinomys, anteriormente parte do gênero Proechimys, foi proposta a elevação de Trinomys ao nível genérico. Leite e Patton (2002) tomaram por base o conjunto de dados utilizados no trabalho de Lara et al. (1996) e incluíram mais três espécies de equimídeos (Kannabateomys amblyonyx, Clyomys laticeps e Myocastor coypus). Além do citocromo b, os autores utilizaram os genes mitocondriais 12S e 16S RNAr como marcadores. Esses autores obtiveram resultados similares ao trabalho de Lara e colaboradores, corroborando a hipótese de rápida diversificação e de politomia na família Echimyidae. No entanto, a monofilia da família não foi mantida, quando se incluiu o gênero Myocastor e se excluiu Capromys, conforme McKenna e Bell 1997. Os autores verificaram que a relação desses dois gêneros como grupo-irmão da família Echimyidae é bem suportada, tanto no método de parcimônia como na máximaverossimilhança, e sugeriram que ambos gêneros fossem incluídos em Echimyidae. Leite e Patton (2002) sugeriram ainda, que grande parte da cladogenesis que levou à formação dos diversos gêneros de equimídeos atuais ocorreu no Mioceno Superior, cerca de oito milhões de anos atrás. Ampliando a base de dados utilizada nos estudos de Lara et al. (1996) e Leite e Patton (2002) tanto em termos da representação taxonômica quanto de marcadores genéticos, Galewski et al. (2005) estudaram a filogenia da família Echimyidae (Figura 1). Esses autores utilizaram como marcadores os genes mitocondriais 12S, 16S, citocromo b, e o éxon 28 do gene nuclear vWF (von Willebrand factor). Este último gene nuclear tem sido utilizado para estudos

3 filogenéticos em outros grupos de mamíferos (Porter et al. 1996; Springer et al. 1997; Huchon et al. 1999; 2000; Huchon e Douzery 2001) e sua inclusão no estudo de Galewski e colaboradores propiciou maior resolução da politomia observada anteriormente na família Echimyidae, além de esclarecer sobre a posição filogenética do gênero Myocastor. Os autores sugeriram que, a partir da análise integrada de diferentes marcadores, Myocastor não deve formar uma sub-família de Echimyidae (refutando a hipótese de Leite e Patton 2002), mas sim compor a sub-família Heteropsomyinae, estando filogeneticamente próximo aos gêneros Proechimys e Hoplomys. O gênero Capromys, por sua vez, parece ser um grupo externo aos equimídeos porém, sua posição filogenética ainda é incerta. Ainda segundo Galewski et al. (2005), eventos de vicariância explicam a diversificação dos gêneros Dactylomys e Kannabateomys (Dactylomyinae) e de Echimys e Phillomys (Echimyinae), os quais seriam, respectivamente, gêneros ecologicamente equivalentes em biomas distintos. No estudo de Galewski e colaboradores foi identificado um clado com alto suporte que inclui todos os gêneros arbóreos de Echimyidae, e um grupo formado por Myocastor, Thrichomys e Proechimys+Hoplomys. Com suporte mais baixo, a associação de Trinomys com Clyomys+Euryzygomatomys também foi sugerida (Figura 1). A politomia da subfamília Heteropsomyinae também foi confirmada. Galewski e colaboradores também demonstraram que duas subfamílias atualmente reconhecidas, Heteropsomyinae e Echmyinae, não parecem ser monofiléticas. Finalmente, esse estudo corrobora a separação filogenética de Trinomys e Proechimys e os autores concluem que, a grande similaridade ecológica e morfológica entre estes dois gêneros é resultado de convergência evolutiva devido a pressão de seleção equivalente. Fabre et al. (2012) também estudaram as relações filogenéticas de 16 gêneros de Echimyidae (incluindo Myocastor e Capromys), com base em três novos genes nucleares sequenciados (APOB, GHR e RBP3) e os cinco marcadores previamente utilizados por Galewski et al. (2005). Para estes autores, a família é organizada em três grupos monofiléticos, coincidentes com os dados ecomorfológicos da família, e a radiação na família parece ter começado com divergência de habitat, seguida por divergência morfológica e, finalmente, a linhagem arbórea sofreu uma explosão de especialidade.

Figura 1: Filogenias propostas para a família Echimyidae por Galewski et al. 2005 (A) e Fabre et al. 2012 (B).

1.2. Citogenética de equimídeos A utilização das técnicas citogenéticas tem contribuído de modo significativo para elucidar problemas taxonômicos e delinear relações filogenéticas entre grupos. O estudo do cariótipo permite enfocar problemas relativos à determinação cromossômica do sexo, mecanismos de origem dos rearranjos cromossômicos, papel da heterocromatina constitutiva na evolução, significado adaptativo dos polimorfismos cromossômicos, diferenças citotaxonômicas entre raças ou espécies relacionadas, papel da variabilidade cromossômica na especiação e, até mesmo, à estrutura e dinâmica das populações com variabilidade cromossômica (Yonenaga 1977; Reig 1984). Os estudos cariotípicos em equimídeos foram iniciados na metade da década de 1970 (Patton e Gardner 1972; Yonenaga 1975; Reig e Useche 1976) e até hoje, o volume de dados cromossômicos para esta família é

5 incipiente e insuficiente para o entendimento dos padrões de evolução cromossômica e isso se torna mais evidente, quando tratamos dos táxons amazônicos. Os dados disponíveis praticamente se limitam a número diploide (2n) e número de braços cromossômicos (NF), sendo que os maiores valores de ambos são encontrados nas espécies arborícolas e os menores são encontrados nas espécies terrestres (Weksler et al. 2001; Eler et al., 2012). Uma característica cariotípica compartilhada entre todos os equimídeos é a presença de uma constrição secundária em um par cromossômico, coincidente com a RON (Yonenaga-Yassuda et al. 1985), indicando a homeologia do par nucleolar nesta família. Entretanto, a posição deste par, no cariótipo, varia entre espécies, e isto se deve a rearranjos robertsonianos e não-robertsonianos que ocorreram no processo evolutivo desta família, alterando a fórmula cariotípica das espécies (Eler et al. 2012; Silva et al. 2012). Para a subfamília Echimyinae foram estudadas cariotipicamente aproximadamente 15 espécies, nos gêneros Isothrix, Makalata, Callistomys, Pattonommys e especialmente Phyllomys, que apresenta o maior número de táxons cariotipados (Yonenaga 1975; Souza 1981; Patton e Emmons 1985; Leal-Mesquita 1991; Vié et al. 1996; Aguilera et al. 1998; Lima et al. 1998; Patton et al. 2000; Bonvicino et al. 2003; Leite 2003; Emmons 2005; Ventura et al. 2008). Nesta subfamília é observada grande variação do número diploide entre os diferentes gêneros, desde 2n=22 em Isothrix pagurus até 2n=96 em Phyllomys medius. O número diploide também varia consideravelmente entre espécies de um mesmo gênero, como é o caso das espécies do gênero Phyllomys, que apresentam número diploide variando de 50 a 96 (Patton e Emmons 1985; Leite 2003). No caso desse gênero, o número diploide parece ser um caráter diagnóstico para o nível específico. Ainda na subfamília Echimyinae, o gênero Isothrix, apesar de pouco representado em coleções zoológicas, possui dados cromossômicos descritos, e também apresenta grande variação no número diploide, com 2n=22 em Isothrix pagurus (Pattons e Emmons, 1985), 2n=28 em Isothrix sinnamariensis (Vié et al. 1996), 2n=60 em Isothrix negrensis (Bonvicino et al. 2003) e Isothrix bistriata (Leal-Mesquita 1991; Patton et al. 2000), sem homogeneidade entre os cariótipos e com a ocorrência de vários rearranjos para explicar a origem destes (Bonvicino et al. 2003). As diferenças cariotípicas entre I. negrensis e I.

6 bistriata podem ser explicadas por inversões pericêntricas em dois pares autossomais. Apesar das similaridades cariotípicas entre estas duas espécies, estimativas da distância genética entre elas mostram valor similar à distância entre I. negrensis e I. pagurus, as quais diferem drasticamente no número diploide (Bonvicino et al. 2003). Para a subfamília Heteropsomyinae os dados cromossômicos são mais abundantes, certamente devido ao significativo volume de dados disponíveis para o gênero Proechimys, o roedor neotropical com o maior número de espécies estudadas cariotipicamente (Eler et al. 2012, Silva et al. 2012). O gênero Thrichomys, com distribuição ao longo da Mata Atlântica brasileira, apresenta 2n=26 em T. inermis (Leal-Mesquita 1991; Bonvicino et al. 2002), 2n=30 em Thrichomys sp. (Lima 2000; Bonvicino et al. 2002) e 2n=34 em T. pachyurus (Bonvicino et al. 2002). Já T. apereoides apresentou quatro diferentes complementos cromossômicos: 2n=28, NF=50 (Bonvicino et al. 2002); 2n=28, NF=52 (Bonvicino et al. 2002); 2n=30, FN=54 (Souza e Yonenaga-Yassuda 1982; Leal-Mesquita 1991); 2n=30, FN=56 (Svartman 1989), sugerindo tratar-se de um complexo de espécies. Neste caso, o número diploide e número de braços são excelentes caracteres para distinção de espécies e subespécies. Lima (2000) atribuiu as diferenças encontradas em Thrichomys principalmente à ocorrência de reordenamentos complexos do tipo fusão/fissão cêntricas e inversão pericêntrica. O gênero Mesomys também apresenta variação cariotípica entre espécies, com 2n=42 em M. occultus e 2n=60 em M. hispidus (Patton et al. 2000) e M. stimulax (Emmons, dados não publicados). Por outro lado, o gênero Trinomys apresenta o mesmo número diploide (2n=60) em T. albispinus e T. iheringi (Yonenaga-Yassuda et al. 1985; Leal-Mesquita et al. 1992; Fagundes et al. 2004), porém com a presença de microcromossomos, que variam em número entre as duas espécies. Fagundes et al. (2004) concluíram que os microcromossomos de T. iheringi são provavelmente cromossomos B e sugerem, ainda, um estudo da composição genômica destes microcromossomos, por meio do isolamento de possíveis sequências repetitivas a partir do DNA centromérico. Para o gênero Proechimys, estudos citogenéticos revelaram que a maioria das espécies possui cariótipos distinguíveis, e numa compilação destes

7 feita por Eler et al. (2012) foram verificadas 61 formas cariotípicas para o gênero, embora correspondendo a um número menor de espécies [25, de acordo com Wilson e Reeder (2005)]. Por outro lado, técnicas de bandeamento cromossômico começaram a ser empregadas no final da década de 1970 (Barros 1978), porém ainda hoje os trabalhos que envolvem tais técnicas são escassos. Para a subfamília Dactylomyinae, são conhecidos os cariótipos de apenas três espécies, e são estas que apresentam os maiores números diploides dentre os equimídeos: 2n=98 em Kannabateomys amblyonyx (Paresche et al. 2004), 2n=94 em Dactyolomys dactylinus (Aniskin 1993) e 2n=118 em Dactylomys boliviensis (Dunnum et al. 2001). No caso desta última espécie, aparentemente restrita ao território boliviano, este é o maior número diploide conhecido dentre todos os mamíferos.

1.3 Citogenética molecular e sequências repetitivas de DNA Durante várias décadas, análises citogenéticas foram realizadas por métodos clássicos de estudo do cariótipo, o que permitiu uma descrição macroscópica da estrutura e organização cromossômica, como o número e morfologia dos cromossomos e sistemas de cromossomos sexuais. Um avanço importante na citogenética veio nas duas últimas décadas com a detecção in situ de sequências de DNA nos cromossomos por meio da utilização de segmentos específicos de DNA como sondas (técnica de FISH) (Guerra 2004). Isto permitiu estudos mais detalhados no campo da citogenética e a integração da informação molecular da sequência do DNA com sua localização física ao longo dos cromossomos e genomas (Schwarzacher 2003; Jiang e Gill 2006). A citogenética molecular pode ser aplicada na detecção de sequências únicas ou repetitivas, regiões específicas de cromossomos, cromossomos ou genomas inteiros. Tal abordagem permite a integração de mapas citogenéticos aos mapas de ligação, auxiliando na compreensão da estrutura do cromossomo e organização genômica (Martins et al. 2010). Além disso, sequências de DNA repetitivo podem ser bons marcadores cromossômicos para serem utilizados em estudos evolutivos, identificação de rearranjos cromossômicos e identificação de cromossomos sexuais e supranumerários

8 (Teixeira et al. 2009). Ainda, permite a identificação de polimorfismos e/ou variabilidade não detectados por ferramentas da citogenética clássica (Yonenaga-Yassuda 2004). Yonenaga-Yassuda (op. cit.) afirma que, pelo menos uma ou algumas espécies de quase todas as ordens de mamíferos placentários já foram estudadas por meio da citogenética molecular. A autora ressalta, que esta ferramenta pode revelar muitos rearranjos cromossômicos, que levaram à reorganização nos genomas de diferentes espécies de mamíferos e outros vertebrados. No caso dos roedores, e especialmente dos equimídeos, poucos estudos foram realizados, utilizando a citogenética molecular, e os que existem, em geral, enfocam sítios teloméricos e ribossomais. Genes de cópia única ou de poucas cópias correspondem a uma pequena parte do genoma dos vertebrados (2-10%), quando comparado às regiões repetitivas (Horvath et al. 2001). Eucariotos têm dois tipos de DNA altamente repetitivos: sequências dispersas, como os elementos transponíveis e repetidas em tandem, como DNA satélite e ribossomal (Phillips e Reed 1996; Martins 2007). DNAs satélites podem variar de 1.000 a 100.000 cópias por genoma, comumente com repetições entre 100 a 300 pares de bases. Estas sequências são organizadas em grandes grupos, principalmente na região telomérica e centromérica dos cromossomos e são os principais componentes das heterocromatinas (Martins 2007). Esta classe de DNA repetitivo é utilizada para o mapeamento físico do genoma, contribuindo para o desenvolvimento de marcadores genéticos de fundamental importância para o conhecimento da estrutura cromossômica e da evolução em muitas espécies (Azevedo et al. 2005). Um exemplo clássico da aplicabilidade da metodologia FISH em roedores é o caso da espécie Akodon cursor, que apresenta diferentes morfotipos, ou seja, 2n=14, com um grande par metacêntrico; 2n=15 com um par metacêntrico e dois submetacêntricos de tamanhos diferentes; e 2n=16 com dois pares submetacêntricos. Pelo menos 28 formas cariotípicas diferentes são conhecidas para a espécie devido a rearranjos deste par grande (par 1), inversões, trissomia e aneuploidia. A aplicação da FISH com sonda telomérica revelou marcações terminais e intersticiais, que associadas ao padrão de

9 banda G, revelou os mecanismos de rearranjos cromossômicos entre as diferentes formas desta espécie e permitiu concluir que o cariótipo com 2n=16 é o provável ancestral e a forma 2n=14, a mais derivada para a espécie (Fagundes et al. 1998). Considerando a grande diversidade observada na família Echimyidae, as incertezas nas relações entre as espécies e o potencial da citogenética na caracterização da biodiversidade e seu processo evolutivo, realizamos um estudo cariotípico em táxons representantes desta diversidade, a fim de mapear os rearranjos cromossômicos que participaram neste processo e compreender os fatores que levaram à diversificação na família.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral Este trabalho teve como principal objetivo comparar os padrões cariotípicos, clássico e de sequências de DNA repetitivo, em espécies de Echimyidae, buscando padrões evolutivos cromossômicos.

2.2 Objetivos específicos  Descrever a macroestrutura cariotípica de espécies representantes da família Echimyidae.  Mapear a localização da heterocromatina constitutiva e de sequências repetitivas de DNAr 18S e teloméricas nestes representantes.  Identificar rearranjos cromossômicos envolvidos no processo de evolução cariotípica na família.  Detectar marcadores citotaxonômicos que auxiliem da diferenciação dos táxons.

10 3. MATERIAL E MÉTODOS Neste trabalho, utilizamos a classificação taxonômica de Woods e Kilpatrick (2005) e os agrupamentos filogenéticos propostos por Galewski et al. (2005) e Fabre et al. (2012) para analisar, citogeneticamente, representantes das diferentes subfamílias viventes de Echimyidae, a saber: Dactylomys dactylinus, Isothrix paguros, Makalata didelphoides, Proechimys spp., Mesomys hispidus, Thrichomys apereoides e Trynomys paratus. Além de representarem as três subfamílias de Echymyidae, tais táxons também representam diferentes subclados (linhagens) nos filogramas propostos (Figura 1), permitindo-nos dessa forma uma abordagem evolutiva. A maior parte do material analisado foi proveniente das coletas realizadas no âmbito do projeto “Rede de Pesquisa para ampliação do conhecimento sobre a biodiversidade de vertebrados da Amazônia brasileira (SISBIOTA BRASIL)” e de outras duas coletas: uma na Mata Atlântica, município de Guarapari, ES, visando amostras de Trynomys paratus e outra no Parque Nacional Sempre Vivas, município de Diamantina, MG, visando a obtenção de amostras de Thrichomys apereoides (Figura 2). Também foram utilizadas algumas amostras do banco do Laboratório de Genética Animal do INPA (cujas localidades de coleta também estão representadas no mapa) (Figura 2). Os animais coletados foram mantidos vivos até a chegada à base de apoio (laboratório) em campo, onde foram eutanasiados, feito a biometria e amostras de tecidos foram retiradas para as análises. As coletas dos espécimes e obtenção das amostras foram autorizadas pelas licenças 02005.000642/03-11 (IBAMA/MMA), 02000.002336/2003-93 (IBAMA/MMA), 02005.002672/04 (IBAMA/MMA), 37585-5 (SISBIO/MMA), 37592-4 (SISBIO/MMA), 10985 (SISBIO/MMA). As atividades de experimentação com animais foram autorizadas pelo parecer 002/2013 da Comissão de Ética em Pesquisa no Uso de Animais do INPA.

Figura 2: Mapa do Brasil (e parte da América do Sul), indicando as regiões de coleta de roedores equimídeos: 1- alto rio Japurá (1.84341666667°S, 69.0264722222°W); 2- Santa Isabel do Rio Negro, rio Negro (0.57725000000°S, 64.8976944444°W); 3- Região do baixo rio Purus (6.5784111000°S, 64.5723388900°W); 4- margem esquerda do médio rio Madeira (5.24610277778°S, 60.7140500000°W); 5- região do baixo rio Aripuanã (6.00000000000° S, 60.1666666667°W); 6- Parque Estadual do rio Negro Setor Sul, rio Cuieiras (2.70708611111°S, 60.3738388889°W); 7- região do rio Jatapú (2.0179400000°S, 58.2032280000°W); 8- Flona Saracá- Taquera e Rebio Trombetas, rio Trombetas (1.48163888889°S, 56.4573333333°W); 9- Parque Nacional da Amazônia e Flona do Tapajós, rio Tapajós (4.53486111111°S, 56.6031666667°W); 10- Vale do rio Jari (0.7000000000°S, 52.6666666667°W); 11- Parque Nacional Sempre Vivas, Diamantina, Minas Gerais (17.9172656000°S, 43.7867219000°W); 12- Município de Guarapari, Espírito Santo (20.5308333333°S, 40.5988888889°W).

12 3.1. Coleta dos indivíduos Para a coleta dos espécimes foram utilizadas armadilhas “live-traps” do tipo tomahawk (14x14x40cm) e sherman (8x8x23cm). Estas foram distribuídas em transectos lineares, dispostas aos pares (uma tomahawk e uma sherman), em 50 estações de coleta espaçadas 25 metros entre si. Nas estações ímpares, a armadilha do tipo Sherman foi disposta no sub-bosque e a do tipo Tomahawk no chão. Nas estações pares, a armadilha do tipo Sherman foi disposta no chão e a do tipo Tomahawk no sub-bosque. As armadilhas foram iscadas com pedaços de banana e pasta de amendoim torrado moído, permaneceram ativadas por um período mínimo de 10 noites consecutivas e vistoriadas diariamente no período matutino (e re-iscadas conforme a necessidade). Os espécimes de hábito arborícola foram coletados por meio de tiro, utilizando espingarda calibre 22 e munição escumilho. Os indivíduos coletados foram preparados segundo procedimentos utilizados na Coleção de Mamíferos do INPA. Cada espécime teve informações de idade, sexo, estágio reprodutivo, peso, medidas, localidade, ambiente e condições climáticas anotadas em caderno de campo padronizado pela curadoria da Coleção. Em seguida o indivíduo foi sacrificado por meio de deslocamento cervical ou injeção de anestésico (Ketamina, a 300mg/Kg IP). Uma incisão de aproximadamente 4cm foi feita na região ventral do animal para a retirada do fêmur (para obtenção de células medulares) e tecido muscular (para extração de DNA). Em seguida o animal foi preparado em via úmida tendo todo o corpo fixado em formol 10% e preservado em álcool 70%. Todos os espécimes foram depositados na Coleção de Mamíferos do INPA.

3.2 Métodos Citogenéticos Clássicos 3.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos e coloração convencional Os cromossomos foram obtidos de espécimes de ambos os sexos, pelo método in vitro, com modificações e adaptado para mamíferos a partir dos trabalhos de Ford e Harmerton (1956). Após a retirada do fêmur dos indivíduos, a medula foi retirada da cavidade óssea por meio de injeção vigorosa de solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075M na diáfise do osso, com uma seringa de 5mL. A medula foi divulcionada em uma Placa de Petri com 10mL

13 da solução hipotônica, e acrescidas 10 gotas de solução de colchicina 0,0125% para interrupção da divisão celular e hipotonização. Esta suspensão permaneceu em estufa a 37 ºC por 30 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi transferido para um tubo Falcon de 15mL e oito a 10 gotas de fixador Carnoy (metanol-ácido acético: 3:1) foram adicionadas e novamente homogeneizado. Essa solução foi centrifugada a 900rpm, por 10 minutos, o sobrenadante desprezado e o pellet ressuspendido em 10mL de fixador. Esse passo foi repetido duas vezes. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi descartado e adicionou-se fixador na proporção de 2:1, em relação à quantidade de sedimento, e homogeneizado. Esta suspensão foi transferida para um tubo tipo Eppendorf devidamente identificado com o número do espécime e guardado em freezer (-10 °C) até a preparação das lâminas. No laboratório, a suspensão celular foi gotejada sobre uma lâmina de vidro limpa (2 a 3 gotas em lâmina aquecida em água destilada a 50 °C), a uma altura de 30-40cm e seca à temperatura ambiente. As lâminas foram coradas com solução de Giemsa, diluída a 5% em tampão fosfato pH 6,8, por 10 minutos. Posteriormente foram lavadas e secas novamente ao ar.

3.2.2 Bandeamento C Para o estudo da distribuição da heterocromatina constitutiva, foi utilizado o Bandeamento C, seguindo o protocolo de Sumner (1972). As lâminas foram envelhecidas por 7 dias, em estufa a 37ºC. Após esse período, foram tratadas com HCl 0,2N em temperatura ambiente por 30 minutos, lavadas com água destilada e deixadas secar ao ar. Logo em seguida, as mesmas foram incubadas em solução de hidróxido de bário octahidratado

(Ba(OH)2.8H2O) a 5%, recém preparada e filtrada, por um período de cinco segundos a um minuto em uma temperatura de 41 ºC. O tempo de tratamento com hidróxido de bário foi determinado para cada espécie. Após isso, as lâminas foram lavadas rapidamente em solução de HCl 0,2 N e posteriormente em água destilada e novamente deixadas secar ao ar. Em seguida as lâminas foram incubadas em solução salina 2XSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trissódico 0,06M em pH 6,8) a 60 ºC, por 15 minutos. Novamente as lâminas foram lavadas em água destilada, secas ao ar e coradas em Giemsa diluído a

14 2% em tampão fosfato pH 6,8, por 20-30 minutos ou com Giemsa 5% por 5 a 10 minutos e novamente, lavadas em água destilada e secas ao ar.

3.2.3 Detecção da Região Organizadora de Nucléolo (Ag-RON) A Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs) foi feita segundo o protocolo descrito por Howell e Black (1980), por meio da técnica de precipitação de cristais de prata (Ag-RON), com pequenas modificações. Sobre a lâmina com cromossomos mitóticos foi colocada, uma gota de solução aquosa de gelatina a 2% acrescida de ácido fórmico na proporção de 1mL/100mL de solução. Adicionou-se sobre a gota de gelatina duas gotas de solução aquosa de nitrato de prata (AgNO3) a 50%, agitando levemente a lâmina e cobrindo com lamínula. Esse material foi levado à câmara úmida, em banho-maria à 60 ºC, por um período de dois a quatro minutos, ou até a lâmina apresentar uma coloração marrom-dourada. Em seguida as lâminas foram lavadas em água destilada, permitindo que a lamínula e o excesso de soluções fossem removidos, e novamente secas ao ar.

3.2.4. Análise cariotípica As preparações cromossômicas foram examinadas em microscópio óptico comum com objetiva de imersão. Foram contadas pelo menos 30 metáfases de cada indivíduo, com o intuito de estabelecer o valor modal (2n) e o número fundamental (número de braços) de cada espécime. As melhores metáfases foram editadas no programa Adobe Photoshop CS4. A média do comprimento total dos cromossomos e da razão entre os braços cromossômicos (q/p) foram calculadas, com auxílio do programa livre Image J. O cariótipo foi montado emparelhando os cromossomos com base na razão entre os braços cromossômicos e na posição do centrômero, segundo Levan et al. (1964). Os cromossomos mitóticos foram classificados em metacêntricos (RB=1,0-1,69), submetacêntricos (RB=1,7-2,99), subtelocêntricos (RB=3,00-7,0) e acrocêntricos (RB>7,00). Na determinação do número de braços (Número Fundamental) foram considerados os autossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois braços e os acrocêntricos como tendo apenas um braço. Os cromossomos sexuais não foram considerados.

15 3.3. Métodos Citogenéticos Moleculares 3.3.1. Extração de DNA A extração do DNA foi feita a partir de tecido muscular, seguindo o protocolo de Sambrook e Russell (2001), com modificações. O tampão de lise (Tris-HCl pH 8,0 em 10 mM, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, Ureia 4 M, SDS 1%) foi utilizado. Posteriormente acrescentou-se 15 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 6 μL de RNAse (10 mg/mL) e as amostras foram incubadas para a digestão do tecido. O material foi lavado sucessivamente com 500μl de fenol, 500μl de fenol clorofórmio, 500μl de álcool isoamílico e 500μl de clorofórmio hidratado. Em seguida o DNA foi desproteinado por precipitação salina e centrifugação a 14000 rpm. O sobrenadante foi então precipitado com 600 μL de isopropanol 100%, também com o auxílio de centrifugação. Em seguida o DNA foi hidratado com aproximadamente 100 μL de água milli-Q, dependendo do tamanho do pellet (DNA precipitado) formado. Para possibilitar a análise da quantidade e integridade do material, o DNA extraído foi quantificado por comparação com marcador de concentração conhecida, em eletroforese padrão (com tampão Tris-Borato- EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 0,8% e corado com corante GelRed 10.000X em água). A visualização e análise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency).

3.3.2. Amplificação de sequências repetitivas Regiões repetitivas de DNA 18S e teloméricas foram estudadas utilizando-se primers já testados em mamíferos: 18S (F 5’-CCG CTT TGG TGA CTC TTG AT-3’; R 5’CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA-3’) (Gross et al. 2010) e região telomérica (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al. 1991). A amplificação enzimática destas regiões dos indivíduos amostrados foi realizada a partir do DNA celular total previamente isolado, sendo a amplificação realizada através da técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction – Saiki et al. 1988). Os produtos de PCR fita dupla foram obtidos em um volume total de 25 μL (~100 ng de DNA genômico; Tampão 1X; 0,5 unidades de Taq DNA Polimerase; 0,2 mM de cada dNTP – dATP, dCTP, dTTP, dGTP; 0,2 μM de cada oligonucleotídeo iniciador (primer); 2,0 mM de cloreto de

16 magnésio e água mili-Q para completar o volume). As reações foram processadas em termociclador (Ependorff - Mastercycler Gradient). Depois de amplificados, os produtos de PCR foram verificados e quantificados por comparação com o marcador Low Mass DNA Ladder (Invitrogen) em eletroforese em gel de agarose 1,0% corado com corante GelRed 10.000X em água. As visualizações e documentações dos géis de agarose foram realizadas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency).

3.3.3. Hibridização in situ fluorescente (FISH) A técnica de hidridização in situ por fluorescência (FISH) foi a descrita por Pinkel et al. (1986) com algumas modificações. Foram utilizadas lâminas obtidas conforme descrito no tópico 3.2.1. Tratamento das lâminas: Tratar cada lâmina com 100µl de RNase 40 µg/mL (0,4 µL de RNase 10 mg/mL e 99,6 µL de 2XSSC) por 1 hora e 30 minutos em câmara úmida a 37 ºC. Lavar as lâminas duas vezes em 2xSSC durante 10 minutos cada. Desidratá-las em série alcoólica 70%, 85% e 100% (etanol mantido no freezer) durante 10 minutos cada. Mergulhar as lâminas em formamida 70% em 2xSSC por 5 minutos a 70 ºC. Desidratar o material em etanol 70%, 85% e 100% a -20 °C por 5 minutos cada. Deixar secar ao ar. Solução de hibridização: No tubo Eppendorf com a sonda adicionar: 40 µL de formamida, 16 µL de sulfato de dextrano 50% e 8 µL de 20xSSC. Aquecer a 95 ºC por 10 minutos e passar imediatamente ao gelo. Hibridização: Colocar 80 µL da solução de hibridização sobre a lamínula e inverter a lâmina sobre a lamínula. Manter as lâminas com o material voltado para baixo em câmara úmida (2xSSC) a 37 ºC durante uma noite (aproximadamente 16 horas). Lavagens: Lavar em 2xSSC em temperatura ambiente apenas para tirar a lamínula e escorrer bem a lâmina sem deixar secar. Lavar em formamida 50% por 15 minutos a 37 ºC. Lavar em 2xSSC por 15 minutos a 37 ºC. Lavar em 2xSSC

17 por 15 minutos à temperatura ambiente. Lavar todas as lâminas em 4xSSC à temperatura ambiente. Detecção: Colocar sobre cada lâmina 70 µL de avidina-FITC 0,07% em tampão C (0,1 M de bicarbonato de sódio, pH 8,5 e 0,15 M de NaCl). Cobrir com lamínula e deixar por 40 minutos em câmara úmida com 2xSSC. Lavar em tampão de bloqueio (NaHCO3 1,26%; citrato de sódio 0,018%; Triton 0,0386%; leite em pó desnatado 1%; diluido em água destilada ajustando para pH 8,0) recém preparado a 42 ºC por 5 minutos por 3 vezes. Após a lavagem, colocar sobre cada lâmina 80 µL de anti-avidina biotina-conjugada 2,5% (2 µL de anti-avidina estoque em 78 µL de tampão de bloqueio), cobrir com lamínula, deixar em câmara úmida com 2xSSC a 37 ºC por 30 minutos. Lavar em tampão de bloqueio por 3x (5 minutos cada) com agitação. Lavar em 4xSSC/Triton 2% por duas vezes (3 minutos cada com agitação) e mais duas vezes em 4xSSC/Triton 0,2%. Secar as lâminas em temperatura ambiente. Montagem das lâminas e análise: A cada lâmina adicionou-se solução de DAPI diluída em antifadeing VectaShield na proporção de 20 µL de antifading para µL de DAPI. Os cromossomos metafásicos foram analisados e fotografados em um microscópio de fluorescência Olympus BX51. As imagens foram capturadas através do software Image-PRO MC 6.0 e as melhores metáfases tiveram seus cromossomos emparelhados.

18 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos com a análise cromossômica comparativa de equimídeos e a discussão desses dados são apresentados na forma de dois capítulos, conforme mencionados a seguir:

Capítulo 1 – Análise citogenética comparativa de espécies de Proechimys (Rodentia: Echimyidae) com novos registros cariotípicos para o gênero, na Amazônia brasileira.

Capítulo 2 – Diversidade citogenética e mapeamento físico-cromossômico de sequências repetitivas de DNA em seis espécies de roedores da família Echimyidae (Mammalia : Rodentia).

Capítulo 1

Eler, E.S.; Silva, C.E.F.; da Silva, M.N.F.; Feldberg. E. 2017. Análise citogenética comparativa de espécies de Proechimys (Rodentia: Echimyidae) com novos registros cariotípicos para o gênero, na Amazônia brasileira

20 Análise citogenética comparativa de espécies de Proechimys (Rodentia: Echimyidae) com novos registros cariotípicos para o gênero, na Amazônia brasileira

Eler, E.S.1; Silva, C.E.F.1; da Silva, M.N.F.2; Feldberg. E.1

1 – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Genética Animal / Coordenação em Biodiversidade. Av. André Araújo, 2936, Petrópolis, Manaus, Amazonas, Brazil. CEP: 69067-375.

2 – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coleção de Mamíferos / Coordenação em Biodiversidade. Av. André Araújo, 2936, Petrópolis, Manaus, Amazonas, Brazil. CEP: 69067-375

Palavras-chave: ratos espinhosos, FISH, bandeamento cromossômico, floresta tropical

Resumo Roedores do gênero Proechimys são os representantes mais diversos da família Echimyidae, inclusive em termos cromossômicos. Neste trabalho apresentamos novos registros cariotípicos para seis espécies deste gênero, coletadas em diferentes localidades da Amazônia brasileira, incluindo a macroestrututra cariotípica, o padrão de localização da RON, da heterocromatina constitutiva e de sequências de DNA repetitivo (ribosomal 18S e telomérico). Ainda, novos citótipos são descritos para P. echinothrix (2n=32, NF=58) da região do rio Purus e para P. cuvieri (2n=28, NF=46) da região do rio Japurá. Todos os indivíduos apresentaram hibridização da sonda de DNAr 18S em um par cromossômico, com exceção de P. cuvieri da região do rio Japurá, que apresentou uma terceira marcação em um dos homólogos do par 1. Dadas as variações cariotípicas verificadas, não descartamos a possibilidade das populações estudadas de P. cuvieri da região do rio Japurá e P. echinothrix da região do baixo rio Purus tratarem-se de novas espécies para o gênero. Verificamos que a distribuição geográfica dos citótipos descritos para P. gardneri (2n=40, NF=54) foi ampliada da região do rio Madeira até a margem esquerda do rio Purus, do citótipo descrito para P. guyannensis (2n=46, NF=50) da região do rio Uatumã até a margem esquerda do rio Trombetas, e

21 do citótipo recém descrito para P. goeldii (2n=16, NF=14) para região norte do Mato Grosso até o baixo rio Purus.

Introdução Roedores neotropicais da família Echimyidae são considerados os mais diversos entre os Hystricognathi, tanto em termos taxonômicos, como ecológicos, morfológicos e adaptativos (Araújo et al. 2014). Esta família, que compreende cerca de 90 espécies descritas em 19 gêneros (Woods e Kilpatrick 2005), constitui um exemplo de uma grande radiação evolutiva dentro destes roedores (Fabre et al. 2012). Sua distribuição ocorre por toda a região Neotropical, desde a América do Norte até a Argentina (Leite e Patton 2002), sendo que a região amazônica abriga grande parte de suas espécies (da Silva et al. 2001; Iack-Ximenes et al. 2005).

Nesta família, Proechimys é o gênero que abriga o maior número de espécies (25 espécies, segundo Wilson e Reeder 2005) e é o táxon que mais tem sido estudado em termos da genética molecular e citogenética (Patton et al. 2000; Weksler et al. 2001; Bonvicino et al. 2005; Machado et al. 2005; Silva et al. 2012; Eler et al. 2012, Fabre et al. 2012; Amaral et al. 2013). Do ponto de vista citogenético, este gênero tem mostrado uma grande variação cromossômica, com 2n variando desde 14 até 62 cromossomos. Ainda, pelo menos 62 formas cariotípicas são conhecidas, oriundas não só dos diferentes números diploides, mas também da morfologia dos cromossomos e do padrão de distribuição de outros marcadores citogenéticos (Eler et al. 2012; Amaral et al. 2013). Entretanto, mesmo com diversos cariótipos já registrados, nenhuma hipótese para a evolução cromossômica pôde ser elaborada para este grupo. Isto se deve, em grande parte, à carência de informações citogenéticas para a grande maioria das espécies de Proechimys, e também pela inexistência de uma filogenia robusta, que estabeleça as relações interespecíficas neste gênero (Eler et al. 2012). Diversos trabalhos têm demonstrado que sequências de DNA repetitivo não codificantes do DNA desenvolve um papel fundamental na manutenção celular e estão envolvidos em mecanismos de regulação, determinantes na expressão gênica, podendo resultar em mudanças fenotípicas, além de estarem envolvidos em processos de especiação

22 (Kazazian 2004; Martins 2007; Vitte et al. 2014; Zeigler 2014). Assim, o mapeamento físico-cromossômico dessas sequências repetitivas pode proporcionar um melhor panorama do genoma, além de gerar marcadores cromossômicos úteis em estudos de evolução, na identificação de cromossomos específicos, rearranjos cromossômicos e identificação de cromossomos sexuais (Martins 2007). Em Akodon cursor, por exemplo, a análise de sequências repetititvas teloméricas revelou marcações terminais e intersticiais que, associada ao padrão de banda G, mostrou mecanismos de rearranjos cromossômicos entre as diferentes formas cariotípicas desta espécie. Ainda, permitiu concluir que o cariótipo com 2n=16 é o provável ancestral e a forma 2n=14, a mais derivada para a espé cie (Fagundes et al. 1998). Ventura et al. (2006) associaram o padrão de localização das sequências teloméricas de DNA com o padrão de bandeamento C e G em quatro espécies de Akodon e concluiram que a presença de sequências teloméricas intersticiais (ITS) pode estar relacionada: 1) com eventos de rearranjos cromossômicos (fusão e fissão), que moldaram o cariótipo; 2) com a presença de sequências de DNA repetitivo na heterocromatina constitutiva e; 3) também com a amplificação dessas sequências na eucromatina ao longo dos braços cromossômicos. Até o momento, o mapeamento de sequências repetitivas de DNA em Proechimys se limita às espécies P. guyannensis, P. cuvieri (Silva et al. 2012) e P. longicaudatus (Amaral et al. 2013), com a descrição da localização do DNAr 18S e sequências teloméricas. Dada a grande instabilidade taxonômica verificada no gênero Proechimys, a ocorrência de diferentes fórmulas cariotípicas para uma mesma espécie, ser um grupo de diversificação recente, tornam este gênero um bom modelo para estudo evolutivo em equimídeos. Assim, o objetivo deste trabalho foi ampliar os estudos neste gênero tanto em número de espécies como em sua distribuição na Amazônia, incluindo a descrição do padrão de localização das sequências de DNA ribosomal 18S e DNA telomérico, na tentativa de compreender os mecanismos cromossômicos envolvidos em sua evolução, bem como na família Echimyidae.

23 Material e Métodos No presente trabalho, analisamos citogeneticamente 56 indivíduos do gênero Proechimys, distribuídos em seis espécies (Tabela 1), coletados em 10 localidades da Amazônia brasileira (Figura 1), e depositados na Coleção de Mamíferos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Brasil. As coletas dos espécimes e obtenção das amostras foram autorizadas pelas licenças 02005.000642/03-11 (IBAMA/MMA), 02000.002336/2003-93 (IBAMA/MMA), 02005.002672/04 (IBAMA/MMA), 37585-5 (SISBIO/MMA), 37592-4 (SISBIO/MMA), 10985 (SISBIO/MMA). As atividades de experimentação com animais foram autorizadas pelo parecer 002/2013 da Comissão de Ética em Pesquisa no Uso de Animais do INPA.

Tabela 1: Espécies coletadas, número de indivíduos, sexo, número diploide e fundamental, procedência e registro de identificação.

Figura 1. Mapa da bacia amazônica brasileira, indicando os locais de coleta dos indivíduos de Proechimys: 1- alto rio Japurá (1.84341666667°S, 69.0264722222°W); 2- Santa Isabel do Rio Negro, rio Negro (0.57725000000°S, 64.8976944444°W); 3- Reserva extrativista de Canutama, rio Purus (6.5784111000°S, 64.5723388900°W); 4- baixo rio Jacinto, margem direita do rio Purus (6.8300640000°S; 64.2819020000°W); 5- Rebio Abufari, margem esquerda do rio Purus (4.97616666667ºS, 62.9774722222ºW ); 6– margem esquerda do rio Madeira (5.24610277778°S, 60.7140500000°W); 7- baixo rio Aripuanã (6.00000000000°S, 60.1666666667°W); 8- rio Jatapú (2.0179400000°S, 58.2032280000°W); 9- Flona Saracá-Taquera e Rebio Trombetas, rio Trombetas (1.48163888889°S, 56.4573333333°W); 10- Vale do rio Jari (0.7000000000°S, 52.6666666667°W.

As suspensões celulares foram obtidas a partir de células da medula óssea usando o método “air-drying” de Ford e Harmerton (1956). A heterocromatina constitutiva foi evidenciada segundo protocolo de Banda C de Sumner (1972). A região organizadora do nucléolo (RON) foi localizada usando o método descrito por Howell e Black (1980). Regiões repetitivas de DNA 18S e teloméricas foram mapeadas pela FISH (in situ fluorecence hybridizationi) (Pinkel et al. 1986), com condição de estringência de 77%, utilizando sondas obtidas com primers já testados em mamíferos: 18S (F 5’-CCG CTT TGG TGA

25 CTC TTG AT-3’; R 5’CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA-3’) (Gross et al. 2010); região telomérica (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al. 1991). Os produtos da PCR do gene DNAr 18S e da sequência telomérica foram marcados por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick Translation mix; Roche), seguindo as instruções do fabricante. A detecção dos sinais de hibridização foi realizada com anti digoxigenina-rodamina (Roche Applied Science). Em seguida os cromossomos foram contracorados com DAPI e analisados em microscópio de epifluorescência Olympus BX51. Para montagem dos cariótipos os cromossomos foram organizados em ordem decrescente de tamanho, e separados em grupos por tipo morfológico, determinado pela posição do centrômero [metacêntrico (m), submetacêntrico (sm), subtelocêntrico (st) e acrocêntrico (a)]. Para determinação do número de braços cromossômicos (NF) apenas os cromossomos autossomos foram considerados.

Resultados

Citogenética clássica

Neste trabalho foi ampliada geograficamente a distribuição de dados já conhecidos para P. gardneri e P. guyannensis, uma vez que amostragens foram feitas em regiões anteriormente não coletadas. Também registramos novas informações cromossômicas para P. cuvieri, P. goeldii e P. echinothrix.

As informações da macroestrutura cariotípica (2n, NF, RON, Banda C e G) de P. gardneri da região do médio rio Madeira (localidade 6, Fig. 1), P. longicaudatus (2n=28, NF=46) da região do rio Aripuanã (localidade 7, Fig.1) e de P. guyannensis (2n=38, NF=52) da região de Santa Izabel do rio Negro e Vale do Jari (localidades 2 e 10 da Fig.1, respectivamente) estão descritas no trabalho de Eler et al. (2012). No presente trabalho adicionamos informações de citogenética molecular para os indivíduos estudados por Eler et al. (2012) e para outras populações.

P. gardneri, REBIO Abufari (localidade 5, Fig. 1), apresenta 2n=40 (12m+4sm+22a+XX/XY) e NF=54. Cromossomos X e Y acrocêntricos de

26 tamanho médio e pequeno, respectivamente. RON simples, localizada intersticialmente no braço longo do segundo par submetacêntrico (par 8). Blocos heterocromáticos em quatro pares metacêntricos (pares 3 a 6), em todos os pares acrocêntricos e no cromossomo X (dados similares à Fig.5 de Eler et al. 2012, para indivíduos do Médio rio Madeira).

P. guyannensis da FLONA Saracá-Taquera e REBIO Trombetas, margens direita e esquerda do rio Trombetas, respectivamente (localidade 9, Fig.1) apresenta 2n=46 (4m+2sm+38a+XX/XY) e NF=50, com os pares acrocêntricos 4, 5 e 6 significativamente maiores que os demais do complemento. Os cromossomos X e Y são acrocêntricos, tendo o Y cerca de metade do tamanho do X. RON simples, localizada intersticialmente no braço longo do par 3 (sm). Blocos de heterocromatina observados na região centromérica de 10 pares autossômicos e no X, enquanto o Y é totalmente heterocromático (dados similares à Fig.2 de Silva et al. 2012, para indivíduos da região do rio Uatumã).

P. goeldii, baixo Igarapé Jacinto (margem direita do rio Purus) (localidade 4, Fig. 1), apresenta 2n=16 (14a+XX/XY) e NF=14. O cromossomo X é o maior submetacêntrico (Fig. 2a). Como nossa única amostra é de um indivíduo fêmea, não temos dados do cromossomo Y. Os blocos de heterocromatina constitutiva estão localizados na região centromérica de todos os autossomos e o cromossomo X apresenta, além da região centromérica, os braços curtos totalmente heterocromáticos (Fig. 2b). A RON é simples e está localizada, intersticialmente, nos braços longos do par 6 (Fig. 2c).

P. echinothrix, da Resex Canutama (margem esquerda do rio Purus) e do baixo Igarapé Jacinto (margem direita do rio Purus) (localidades 3 e 4 respectivamente, Fig.1) apresenta 2n=32 cromossomos (16m+8sm+4st+2a +XX/XY) e com NF=58 Os cromossomos sexuais são do tipo metacêntrico, tendo o X praticamente o dobro do tamanho do Y (Fig.2d). Os pares 9 e 10 (sm) e par 13(st) são significativamente maiores que os demais do complemento. Os blocos de heterocromatina constitutiva estão localizados na região centromérica de todos os autossomos e do cromossomo X, o par 12 apresenta o braço curto totalmente heterocromático e o Y é um cromossomo

27 totalmente heterocromático (Fig.2e). A RON é simples e localiza-se, intersticialmente, nos braços longos do par 11 (sm), coincidente com a constrição secundária observada (Fig. 2f).

P. cuvieri, Comunidade Taboca, rio Japurá (localidade 1, Fig.1), apresenta 2n=28 (18m+2st+6a+XX/XY) e NF=46. Os cromossomos X e Y são do tipo acrocêntrico, sendo o X significativamente maior que o cromossomo Y (Fig. 2g). A heterocromatina constitutiva está localizada em blocos pericentroméricos nos pares cromossômicos 1, 2, 4, 6, 7 (m), 10 (st), 12 (a) e também no centrômero do cromossomo X. O cromossomo Y apresenta-se totalmente heterocromático (Fig. 2h). A RON é simples e está localizada na região intersticial do par 7 (Fig. 2i). Já, P. cuvieri, rio Jatapú (localidade 8 da Fig.1, em simpatria com P. guyannesis), bem como da FLONA Saracá-Taquera e REBIO Trombetas (localidade 9, Fig.1) apresenta 2n=28 (14m+4sm+2st+6a+XX/XY) e NF=46. Os cromossomos X e Y são acrocêntricos, sendo X maior que Y. A RON é simples e está localizada na região intersticial dos braços longos do par 9. A heterocromatina constitutiva está localizada em blocos pericentroméricos 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13 e no X (dados similares à Fig.2 de Silva et al. 2012, para indivíduos das regiões de Manaus e rio Cuieiras).

Citogenética Molecular

Todos os indivíduos aqui estudados (Tabela 1) apresentaram marcações teloméricas nas regiões terminais de todos os cromossomos, sem qualquer evidência de ITS (Fig. 3). De igual forma, todos os indivíduos estudados apresentaram hibridização da sonda de DNAr 18S em um par cromossômico (Fig. 4), coincidente com a Ag-RON, com exceção de 5 indivíduos de P. cuvieri, coletados na Comunidade Taboca (rio Japurá), que apresentaram uma terceira marcação na região pericentromérica e heterocromática de um dos homólogos do par 1, em todas as células (Fig. 4b).

Figura 3: Marcações teloméricas em Proechimys cuvieri das localidades 7, 8 e 9 (a); P. cuvieri da localidade 1 (b); P. gardneri das localidades 5 e 6 (c); P. goeldii da localidade 4 (d); P. guyannensis da localidade 2 e 10 (e); P. guyannensis da localidade 9 (f); P. echinothrix das localidades 3 e 4 (g); P. longicaudatus da localidade 6 (h). Barra=10μm.

31 Discussão Segundo Patton et al. (2000), o fato de ainda não termos uma filogenia para o gênero Proechimys torna difícil entender as relações entre suas espécies. Estudos citogenéticos vem oferecendo marcadores úteis para o entendimento da evolução deste gênero, pois embora muitas vezes os números diploides sejam os mesmos, diferenças na morfologia dos cromossomos são refletidas no número fundamental (NF) e, consequentemente na posição dos demais marcadores, por exemplo a posição da região organizadora do nucléolo (RON) no cariótipo. Ainda, diferenças citotaxonômicas entre espécies têm sido detectadas nos cromossomos sexuais, e isto se deve a rearranjos, como inversões, translocações e adição/deleção de heterocromatina. Entretanto, existem fatores limitantes para o real conhecimento do gênero, como a sua taxonomia ainda não totalmente resolvida e a presença de espécies crípticas. Ainda, os dados citogenéticos, em sua maioria, restringirem–se apenas aos números diploide e fundamental (Nagamachi et al. 2015).

Com a ampliação da região de coleta na Amazônia, observamos que cariótipos se repetem, o que nos permite sugerir a ampliação da área de distribuição de algumas espécies. Por exemplo, P. gardneri, coletada na REBIO Abufari, tem o cariótipo idêntico ao já descrito para espécimes coletados na margem esquerda do rio Madeira (Eler et al. 2012), inclusive em relação à posição da RON e distribuição da heterocromatina. Com isso, assumimos que a distribuição deste citótipo se estende desde a margem esquerda do rio Madeira até a margem esquerda do rio Purus e, possivelmente, até o rio Juruá, acompanhando a distribuição geográfica sugerida por da Silva (1998) para esta espécie. O mesmo pode ser dito para P. guyannensis com 2n=46, onde o cariótipo observado nos indivíduos provenientes da FLONA Saracá-Taquera e REBIO Trombetas é igual ao encontrado para P. guyannensis das ilhas da Usina Hidrelétrica de Balbina, rio Uatumã (Silva et al. 2012). Deste modo, este citótipo tem sua distribuição ampliada em cerca de 330Km para leste, em relação ao registro anterior e se estende até ambas as margens do rio Trombetas.

32 O grupo guyannensis (sensu Patton 1987) parece tratar-se de um complexo de espécies, pois sete citótipos foram descritos, com 2n variando em 30, 38, 40 e 46 cromossomos e diferentes fórmulas cariotípicas (Machado et al. 2005; Eler et al. 2012; Silva et al. 2012). Indivíduos com 2n=46 estão distribuídos na região central da Amazônia brasileira, a qual está flanqueada a leste (Vale do Jari) e a oeste (alto rio Negro) por indivíduos com 2n=38. Nos extremos nordeste (Cayene, Guyana Francesa) e noroeste (Loreto, Peru) por indivíduos com 2n=40. Assim, o que se verifica é que a taxonomia deste grupo (sensu Patton 1987), bem como do gênero Proechimys como um todo, ainda não estão resolvidas.

Em relação à P. cuvieri, o cariótipo observado para indivíduos da região do rio Japurá difere dos demais registrados para a espécie. Nos três cariótipos conhecidos (2n=28 e NF=46, 48 e 50) existem três pares cromossômicos significativamente maiores que os demais do complemento e pelo menos um par submetacêntrico (Maia e Langguth 1993; Patton et al. 2000; Eler et al. 2012; Silva et al. 2012). Nos indivíduos do rio Japurá, aqui analisados (2n=28, NF=46), observamos apenas dois pares de cromossomos grandes (pares 1 e 10), a inexistência de cromossomos submetacêntricos e maior quantidade de acrocêntricos, em relação aos cariótipos já descritos. Em relação à distribuição da heterocromatina, nossos dados são similares aos observados nos indivíduos da região do rio Uatumã, com marcações sempre na região centromérica da maioria dos pares cromossômicos (incluindo o cromossomo X) e Y totalmente heterocromático. Entretanto, a posição da RON no complemento variou em função dos rearranjos que alteraram a morfologia cromossômica, consequentemente alterando a posição do par que apresenta esta marcação. Com esta nova descrição cariotípica fica evidente que rearranjos cromossômicos do tipo inversão pericêntrica têm ocorrido nesta espécie, uma vez que a morfologia dos cromossomos tem sofrido alteração, porém conservando o seu número diploide. Assim, sugerimos que, provavelmente, trata-se de uma nova espécie para o gênero. Já, P. cuvieri da região do rio Jatapú é similar aos dados já registrados para esta espécie nas regiões da Usina Hidrelétrica de Balbina/rio Uatumã (Maia e Langutth 1993), Manaus e região do rio Cuieiras (Silva et al. 2012), região do rio Jaú (Patton et

33 al. 2000) e Vale do Jari (neste último caso com uma pequena diferença na morfologia dos cromossomos sexuais) (Eler et al. 2012). Até o momento, a distribuição geográfica deste citótipo está ao norte do eixo Solimões- Amazonas, se estendendo do Parque Nacional do Jaú até praticamente a foz do rio Amazonas (Vale do Jari). Interessante notar que esta espécie ocorre apenas na planície amazônica, uma vez que na região do Escudo das Guianas ela é substituída por P. guyannensis.

Para P. echinothrix da RESEX Canutama e baixo Igarapé Jacinto encontramos um cariótipo que difere em vários aspectos do cariótipo conhecido anteriormente para esta espécie (NF=60, fórmula cariotípica 20m-sm+10st, X e Y pequenos acrocêntricos) (da Silva 1998). Este novo citótipo de P. echinothrix, aqui descrito, difere especialmente na morfologia dos cromossomos sexuais, na presença de um par de acrocêntricos de tamanho médio e na redução da quantidade de pares subtelocêntricos (de 5 para 2 pares) (Fig. 2d). Além disso, um importante marcador cromossômico para este citótipo é a presença de braços curtos totalmente heterocromáticos nos autossomos do par 12 (Fig. 2e), característica registrada pela primeira vez no gênero Proechimys.

Considerando a manutenção do número diploide em P. echinothrix, mas com variação do NF (mesmo considerando alguma divergência na classificação da morfologia cromossômica), fica evidente que eventos de inversão pericêntrica moldaram estes cariótipos. Interessante notar que a distribuição geográfica proposta para esta espécie (da Silva 1998) restringia sua ocorrência à margem esquerda do rio Juruá e a leste do alto rio Urucu. Nossos dados ampliam esta distribuição até a região do rio Purus, em ambas as margens. Ainda que inversões cromossômicas não impliquem necessariamente em isolamento reprodutivo (devido ao ajustamento sináptico durante a meiose), o acúmulo destes rearranjos, associados a rearranjos envolvendo os cromossomos sexuais e distância geográfica da população aqui estudada, em relação aos dados anteriores, podemos sugerir que os indivíduos de P. echinothrix da região do rio Purus estejam num processo de especiação. Porém, não podemos descartar a possibilidade de estarmos tratando de uma nova espécie.

34 Já em relação os dados obtidos para P. goeldi, ao compararmos com a literatura, verificamos que Amaral et al. (2013) descreveram um cariótipo idêntico, tanto no número diploide como na fórmula cariotípica, para espécimes provenientes da região sul da Amazônia (estado do Mato Grosso), os quais foram classificados como P. cf. longicaudatus. Tal cariótipo é bastante diferente dos dados conhecidos até então para o gênero, com baixo número diploide e diferenças significativas no tamanho e morfologia dos cromossomos (inclusive sexuais) e também no padrão de bandeamento. Encontramos este mesmo citótipo em um espécime fêmea, da região do baixo rio Purus. Certamente trata-se da mesma espécie estudada por Amaral et al. (2013). Entretanto, dados moleculares preliminares associam nosso espécime do rio Purus a P. goeldii (da Silva, comunicação pessoal). Assim, a distribuição deste citótipo (2n=16, NF=14) é ampliada até a margem esquerda do baixo rio Purus, cerca de 1400Km noroeste em relação à amostra de Amaral et al. (2013).

Com relação às sequências repetitivas de DNA em Proechimys, embora a presença de muitos rearranjos seja indiscutível , sequências teloméricas foram encontradas apenas nas porções terminais de todos os cromossomos em todas as espécies, ou seja, sequências teloméricas intersticiais (ITS) ou sinais centroméricos não foram encontrados, nem mesmo na literatura, todavia, dada a sua imensa plasticidade cariotípica, com ampla variação do número diploide e fórmulas cromossômicas, nos parece razoável acreditar que: 1) sequências teloméricas intersticiais podem estar presentes nas espécies de Proechimys e não serem detectadas pela FISH, por apresentarem poucas unidades de repetições ou pela pouca sensibilidade da técnica (Ruiz-Herrera et al. 2008) e; 2) sequências teloméricas intersticiais podem ter sofrido erosão ou terem sido substituídas por sequências heterocromáticas ou de DNA satélite após rearranjos, uma vez que geram um sitio frágil no cromossomo, sendo portanto eliminadas como estratégia para evitar quebras.

Já, a presença de apenas um par cromossômico marcado com a sonda de DNAr 18S, em todas as espécies de Proechimys estudadas, confirma a presença de um único par nucleolar ativo nestas espécies, evidenciado também pela prata. Este par cromossômico é considerado homeólogo não só entre as espécies de Proechimys, mas para a família como um todo

35 (Yonenaga-Yassuda et al. 1985; Eler et al. 2012). Por se tratar de uma sequência com relevante papel transcricional, mesmo havendo rearranjos estruturais ao longo do complemento autossômico nas espécies de Proechimys (inclusive envolvendo o próprio par da RON, como é caso de P. goeldii, aqui estudada), a RON é sempre preservada, garantindo sua funcionalidade no genoma. Por outro lado, a terceira marcação de DNAr 18S, pericentromérica (Fig. 4b) e coincidente com uma região de heterocromatina em P. cuvieri, da região do rio Jatapu, não esteve ativa, o que sugere tratar-se de um fragmento da sequência ribossomal que pode ter sido carreado durante rearranjos ou mobilizado a partir de outra região do genoma, por algum elemento transponível.

A presença de marcações adicionais de DNAr 18S, ainda que incomum para vários grupos de vertebrados, está relacionada também ao processo natural de origem e desaparecimento de sequências repetitivas no genoma (Rooney e Ward 2005). Cazaux et al. (2011) estudaram a variação de marcações de DNAr 18S em 19 espécies de Mus e verificaram a associação dessas sequências com regiões centroméricas, sugerindo ser regiões de hotspot para quebras cromossômicas. Entretanto, os autores afirmam que embora esta associação tenha sido positiva, ainda é insuficiente para explicar a plasticidade cariotípica existente em Mus. Os autores acreditam que esta plasticidade está mais fortemente determinada por outros fatores, como a modificação epigenética do DNA. Aqui apresentamos o primeiro registro de marcação múltipla de DNAr 18S em Proechimys e sem associação com a plasticidade cariotípica, observada neste grupo. Contudo, ainda que seja uma região inativa transcricionalmente (não evidenciada pela Ag-RON) e não associada a evento de quebra cromossômica, pode ser utilizada como um marcador citológico populacional de P. cuvieri da região do rio Japurá.

Assim, embora estudos cromossômicos neste gênero venham fornecendo ferramentas (marcadores) taxonômicas, ainda não é possível observar padrões bem definidos de evolução cromossômica em Proechimys, e nem direcionar abordagens para o entendimento da sistemática do grupo. Entretanto, o estudo dos cromossomos tem contribuído para desvendar ainda mais a diversidade existente neste gênero.

Capítulo 2

Eler, E.S.; Silva, C.E.F.; da Silva, M.N.F.; Feldberg. E. 2017. Diversidade citogenética e mapeamento físico-cromossômico de sequências repetitivas de DNA em seis espécies de roedores da família Echimyidae (Mammalia: Rodentia).

37 Diversidade citogenética e mapeamento físico-cromossômico de sequências repetitivas de DNA em sete espécies de roedores da família Echimyidae (Mammalia:Rodentia).

Eler, E.S.1; Silva, C.E.F.1; da Silva, M.N.F.2; Feldberg. E.1 1 – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Genética Animal / CBio. Av. André Araújo, 2936, Petrópolis, Manaus, Amazonas, Brazil. CEP: 69067-375. 2 – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coleção de Mamíferos / CBio. Av. André Araújo, 2936, Petrópolis, Manaus, Amazonas, Brazil. CEP: 69067-375 Palavras-chave: equimídeos, evolução cromossômica, citogenética molecular, diversidade cariotípica

Resumo Echimyidae é um grupo de roedores amplamente distribuído na região Neotropical, mas com sérias indefinições sobre suas relações filogenéticas e com propostas de classificação muitas vezes conflitantes. Apresentam grande variação cariotípica, especialmente em relação ao número diploide e fundamental. Em alguns casos o número diploide parece ser um caráter diagnóstico para o nível específico. Também há registros de espécies congêneres apresentarem o mesmo número diploide, mas variando a fórmula cariotípica ou uma mesma espécie apresentar diferentes números diploides e/ou fórmulas cariotípicas. Com objetivo de compreender melhor a organização genômica e os padrões evolutivos cromossômicos de Echimyidae, realizamos um estudo cariotípico clássico e molecular, comparativo em setes gêneros (Proechimys, Makalata, Trinomys, Thrichomys, Dactylomys, Mesomys e Isothrix) da família, coletados em diferentes localidades da Amazônia e região sudeste brasileiras. Novas formas cariotípicas foram descritas para Isothrix pagurus, Dactylomys dactylinus, Makalata didelphoides, Trinomys paratus e Thrichomys apereoides. Apresentamos a distribuição da sequência de DNAr 18S nestas espécies, que na maioria das vezes esteve presente em apenas um par de cromossomos, intersticial no braço longo, mas em diferentes posições no cariótipo das espécies. Sequências teloméricas estiveram presentes nas regiões terminais dos cromossomos em todas as espécies analisadas, exceto Isothrix pagurus, que

38 apresentou ITS em 3 pares cromossômicos. Comparando os dados cromossômicos com as informações filogenéticas da família, concluímos que eventos ecomorfológicos e biogeográficos, seguidos de alterações moleculares, seriam os principais fatores responsáveis pela diversificação em equimídeos, passando os rearranjos cromossômicos figurarem num segundo momento desse processo.

Introdução

Echimyidae é um grupo de roedores amplamente distribuído na região Neotropical, mas com sérias indefinições sobre suas relações filogenéticas e com propostas de classificação muitas vezes conflitantes (Woods, 1993; Lara et al. 1996; Vié et al. 1996; McKenna e Bell, 1997; Leite e Patton, 2002; Galewski et al. 2005; Fabre et al., 2012). Woods e Kilpatrick (2005) realizaram a mais recente classificação taxonômica de Echimyidae, sendo similar à apresentada por Woods (1993), com três subfamílias: Eumysopinae, Echimyinae e Dactylomyinae. Galewski et al. (2005) propuseram uma filogenia para a família, utilizando os genes mitocondriais 12S, 16S, citocromo b e o éxon 28 do gene nuclear vWF (von Willebrand factor), e conseguiram uma maior resolução da politomia observada anteriormente para Echimyidae. Para Fabre et al. (2012), com base em três novos genes nucleares (APOB, GHR e RBP3), além dos cinco marcadores previamente utilizados por Galewski et al. (2005), sugeriram que a família está organizada em três grupos monofiléticos, coincidentes com dados ecomorfológicos, e que sua radiação parece ter começado com divergência de habitat, seguida por divergência morfológica e, finalmente, a linhagem arbórea teria sofrido uma explosão de especialidade. Quanto ao estudo cromossômico em equimídeos, até hoje o volume de dados é incipiente e insuficiente para o entendimento dos padrões de evolução cromossômica, e isso se torna mais evidente quando tratamos dos táxons amazônicos (Eler et al. 2012). Os dados disponíveis praticamente se limitam a número diploide (2n) e número de braços cromossômicos (NF), sendo

39 que os maiores valores de ambos são encontrados nas espécies arborícolas e os menores são encontrados nas espécies terrestres (Lima et al. 1998). Equimídeos apresentam grande variação cariotípica, com o número diploide variando de 14-16 em Proechimys sp. (Barros 1978) até 118 em Dactylomys boliviensis (Dunnum et al. 2001). Em alguns casos o número diploide parece ser um caráter diagnóstico para o nível específico, como é o caso das espécies de Phyllomys, que apresentam os números diploides: 50, 52, 72, 80, 90, 92 e 96 (Patton e Emmons 1985; Leite 2003). Também há registros de espécies congêneres apresentarem o mesmo número diploide, mas variando a fórmula cariotípica ou uma mesma espécie apresentar diferentes números diploides e/ou fórmulas cariotípicas, como observado em Proechimys spp. (Eler et al. 2012) e em Thrichomys apereoides (Bonvicino et al. 2002), respectivamente. Neste caso, o número diploide e número de braços são excelentes caracteres para distinção de espécies e subespécies. Dados de bandeamentos cromossômicos, quando disponíveis, também têm fornecido subsídio para diferenciação de espécies ou populações, como observado em espécies do gênero Proechimys a partir do estudo da distribuição da heterocromatina constitutiva (Eler et al. 2012). Por outro lado, do ponto de vista da Citogenética molecular, especialmente em equimídeos, poucos estudos foram realizados (Silva et al., 2012; Amaral et al., 2013; Araújo et al. 2014; Rabelo, 2015). Estudos dessa natureza permitem a realização do mapeamento físico- cromossômico, auxiliando a compreensão da estrutura do cromossomo e organização genômica, detectando marcadores cromossômicos, que podem ser utilizados em estudos evolutivos, identificação de rearranjos cromossômicos, identificação de cromossomos sexuais e supranumerários (Azevedo et al. 2005, Teixeira et al. 2009, Martins et al. 2010). Assim, o objetivo deste trabalho foi um estudo cariotípico clássico e molecular, comparativo entre espécies representantes de diferentes gêneros e subfamílias de Echimyidae, objetivando maior compreensão da organização genômica e o entendimento dos padrões evolutivos cromossômicos.

40 Material e Métodos Neste estudo, analisamos 52 indivíduos, distribuídos em sete gêneros, representantes das três subfamílias de equimídeos viventes, coletados ao longo da região Amazônica e também nos biomas Mata Atlântica (Guarapari, Espírito Santo) e região de transição entre Mata Atlântica e Cerrado (Diamantina, Minas Gerais), conforme Tabela 1 e Figura 1.

As coletas e obtenção das amostras foram autorizadas pelas licenças 02005.000642/03-11 (IBAMA/MMA), 02000.002336/2003-93 (IBAMA/MMA), 02005.002672/04 (IBAMA/MMA), 37585-5 (SISBIO/MMA), 37592-4 (SISBIO/MMA), 10985 (SISBIO/MMA), e os animais foram depositados na Coleção de Mamíferos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Brasil. As atividades de experimentação com animais foram autorizadas pelo parecer 002/2013 da Comissão de Ética em Pesquisa no Uso de Animais do INPA.

Tabela 1: Espécies, número de indivíduos analisados por sexo, procedência e número de registro. 2n=número diploide, NF=número fundamental

* espécimes com iniciais “INPA” já foram tombados. Os demais estão em processo de tombamento.

Figura 1. Mapa do Brasil (e parte da América do Sul), indicando as regiões de coleta de roedores equimídeos: 1- alto rio Japurá (1.84341666667°S, 69.0264722222°W); 2- Santa Isabel do Rio Negro, rio Negro (0.57725000000°S, 64.8976944444°W); 3- Região do baixo rio Purus (6.5784111000°S, 64.5723388900°W); 4- Parque Estadual do rio Negro Setor Sul, rio Cuieiras (2.70708611111°S, 60.3738388889°W); 5- região do rio Jatapú (2.0179400000° S, 58.2032280000° W); 6- Flona Saracá-Taquera e Rebio Trombetas, rio Trombetas (1.48163888889°S, 56.4573333333°W); 7- Parque Nacional da Amazônia e Flona do Tapajós, rio Tapajós (4.53486111111°S, 56.6031666667°W); 8- Vale do rio Jari (0.7000000000°S, 52.6666666667°W); 9- Parque Nacional Sempre Vivas, Diamantina, Minas Gerais (17.9172656000°S, 43.7867219000°W); 10- Povoados de Rio da Prata e Buenos Aires, Município de Guarapari, Espírito Santo (20.5308333333°S, 40.5988888889°W).

As suspensões celulares foram obtidas a partir de células da medula óssea segundo Ford e Harmerton (1956). A heterocromatina constitutiva foi evidenciada segundo protocolo de Banda C de Sumner (1972), a partir de lâminas envelhecidas sete dias em estufa a 37 °C. Regiões repetitivas de DNA 18S e teloméricas foram mapeadas pela FISH (in situ fluorecence hybridizationi) (Pinkel et al. 1986), com condição de estringência de 77%, utilizando sondas obtidas com primers já testados em mamíferos: 18S (F 5’- CCG CTT TGG TGA CTC TTG AT-3’; R 5’CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA-

3’) (Gross et al. 2010); região telomérica (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al. 1991). Os produtos da PCR do gene DNAr 18S e da sequência telomérica

42 foram marcados por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick Translation mix; Roche), seguindo as instruções do fabricante. O tempo utilizado para hibridização da sonda foi de dois dias. A detecção dos sinais de hibridização foi realizada com anti digoxigenina-rodamina (Roche Applied Science). Em seguida os cromossomos foram contracorados com DAPI e analisados em microscópio de epifluorescência Olympus BX51. Para montagem dos cariótipos os cromossomos foram organizados em ordem decrescente de tamanho, e separados em grupos por tipo morfológico, determinado pela posição do centrômero [metacêntrico (m), submetacêntrico (sm), subtelocêntrico (st) e acrocêntrico (a)] (Levan et al. 1964). Para determinação do número de braços cromossômicos (NF) apenas os cromossomos autossomos foram considerados.

Resultados

Mesomys hispidus

Todos os indivíduos apresentaram 2n=60 cromossomos (44m+14sm+XX/XY) e NF=116 (Fig. 2a). O cromossomo X é um submetacêntrico de tamanho médio e o Y um pequeno cromossomo de dois braços, de morfologia duvidosa entre submetacêntrico e subtelocêntrico. Blocos de heterocromatina estão localizados na região pericentromérica de todos os pares cromossômicos, inclusive dos sexuais (Fig. 2b). O gene de DNA ribossomal 18S está localizado intersticialmente no braço longo do par 28 (submetacêntrico), numa região de constrição secundária (nem sempre visível), indicando a RON simples. Uma duplicação em um dos homólogos do par nucleolar foi evidenciada (Fig. 2c). Sequências teloméricas de DNA estão localizadas nas regiões terminais de todos os cromossomos, sendo que alguns cromossomos apresentaram marcações maiores (Fig. 3a).

Makalata didelphoides

Todos indivíduos apresentaram 2n=72 cromossomos (48m+12sm+2st+8a+XX/XY) e NF=132 (Fig. 2d). O cromossomo X é um

43 grande submetacêntrico, o maior cromossomo do cariótipo, e o cromossomo Y um pequeno acrocêntrico. O bandeamento C revelou um padrão mais tênue de marcações pericentroméricas em 11 pares metacêntricos (7, 8, 11, 13, 14, 16, 18, 20, 21, 22 e 23), em todos os pares submetacêntricos e em todos os pares acrocêntricos. O cromossomo Y apresenta-se totalmente heterocromático, e não foi detectada região heterocromática no cromossomo X (Fig. 2e). Os genes de DNA ribossomal 18S estão localizados intersticialmente no braço longo do segundo par submetacêntrico (26), indicando RON simples. Também foi detectada duplicação da RON em um dos homólogos deste par (Fig. 2f). Sequências teloméricas de DNA estão localizadas nas regiões terminais de todos os cromossomos (Fig. 3b).

Trinomys paratus

Todos indivíduos apresentaram 2n=58 cromossomos (38m+10sm+8st+XX/XY) e NF=112. Os cromossomos do par 1 (m) e par 25 (st) são significativamente maiores que os demais do complemento (Fig. 2g). O cromossomo X é submetacêntrico, e o Y um pequeno cromossomo de dois braços, provavelmente metacêntrico. Blocos heterocromáticos pericentroméricos são observados em todos os pares autossômicos, com exceção do par 1. O cromossomo X apresenta um bloco distal no braço longo e um bloco na região terminal do braço curto e o Y é totalmente heterocromático (Fig. 2h). Os genes de DNA ribossomal 18S estão localizados intersticialmente no braço longo do segundo par submetacêntrico (21) (Fig. 2i), numa região de constrição secundária (Fig. 2g), indicando RON simples. Sequências teloméricas de DNA estão localizadas nas regiões terminais de todos os cromossomos (Fig. 3c).

Thrichomys apereoides

Todos indivíduos apresentaram 2n=28 cromossomos (20m+4sm+2a+XX/XY) e NF=50 (Fig. 2j). O cromossomo X é um acrocêntrico de tamanho médio, e o cromossomo Y um pequeno acrocêntrico. O par 13, acrocêntrico representa o maior par do complemento, seguido do par 1, metacêntrico. O par 1 possui uma região de constrição secundária intersticial no braço longo. Blocos heterocromáticos pericentroméricos foram observados

44 nos pares metacêntricos 2, 3, 4, 5, 8 e 9 e nos dois pares submetacêntricos (11 e 12). O cromossomo X, além da marcação pericentromérica, apresentou uma banda heterocromática intersticial no braço longo, enquanto o cromossomo Y foi totalmente heterocromático (Fig. 2k). Os genes de DNA ribossomal 18S estão localizados intersticialmente no braço longo do par 1, coincidente com a constrição secundária, indicando RON simples (Fig. 2l). Sequências teloméricas de DNA estão localizadas nas regiões terminais de todos os cromossomos (Fig. 3d).

Dactylomys dactylinus

Todos indivíduos apresentaram 2n=94 cromossomos (24m+18sm+50a+XX/XY) e NF=134 (Fig. 2m). O cromossomo X é um grande submetacêntrico, o maior cromossomo do cariótipo, e o cromossomo Y um pequeno acrocêntrico. Blocos heterocromáticos pericentroméricos foram observados em todos os pares cromossômicos, incluindo os sexuais, e o cromossomo Y apresentou-se totalmente heterocromático (Fig. 2n). Os genes de DNA ribossomal 18S estão localizados intersticialmente no braço longo de um dos maiores pare submetacêntricos (par 13 ou 14), indicando RON simples (Fig. 2o). Sequências teloméricas de DNA estão localizadas nas regiões terminais de todos os cromossomos e, adicionalmente, seis cromossomos de dois braços apresentaram intenso acúmulo de marcações teloméricas na região centromérica (ITS) (Fig. 3e). Devido ao reduzido tamanho dos autossomos e a resolução da morfologia cromossômica, não foi possível determinar a numeração dos pares com acúmulo de marcações teloméricas.

Isothrix pagurus

Todos indivíduos apresentaram 2n=22 cromossomos (12m+6sm+2a+XX/XY) e NF=38. O cromossomo X é um subtelocêntrico de tamanho médio e o cromossomo Y um pequeno acrocêntrico. Os cromossomos do par 1 são significativamente maiores que os demais do complemento e apresentam uma constrição secundária proximal no braço curto (Fig. 2p). A heterocromatina constitutiva esteve presente na região centromérica do par 2; região terminal do braço curto dos pares 3 e 7; regiões terminais e centromérica do par 5; regiões terminais dos pares 6, 8, 9 e 10. Os pares 8 e

45 10 apresentam ainda blocos heterocromáticos ao longo de quase toda a extensão do braço longo, o cromossomo X apresenta a região centromérica e todo o braço curto heterocromático e o cromossomo Y é totalmente heterocromático (Fig. 2q). Os genes de DNA ribossomal 18S estão localizados proximal no braço curto do par 1, coincidente com a constrição secundária, caracterizando RON simples. A RON apresenta-se duplicada em um dos homólogos (Fig. 2r). Sequências teloméricas de DNA estão localizadas nas regiões terminais de todos os cromossomos. Adicionalmente, sequências teloméricas intersticiais (ITS) foram vista nos pares : 1, na região proximal do braço curto, 2 no braço curto e o 7, na região proximal do braço longo (Fig. 3f).

Os dados da espécie P. cuvieri já foram previamente apresentados no capítulo 1 desta tese e foram utilizados nas análises e discussão do presente capítulo.

Figura 2 continua na próxima página

Figura 2: Cariótipos de Mesomys hispidus: coloração convencional (a), Banda-C (b), DNAr 18S (c); Makalata didelphoides: coloração convencional (d), Banda-C (e), DNAr18S (f); Trinomys paratus: coloração convencional (g), Banda-C (h), DNAr18S (i); Thrichomys apereoides: coloração convencional (j), Banda-C (k), DNAr 18S (l); Dactylomys dactylius: coloração convencional (m), Banda-C (n), DNAr 18S (o); Isothrix pagurus: coloração convencional (p), Banda-C (q), DNAr 18S (r). Nos cariótipos em coloração convencional e Banda C, os cromossomos sexuais do sexo oposto estão destacados em caixas. Barra=10μm.

Figura 3: Marcações teloméricas em Mesomys hispidus (a); Makalata didelphoides (b); Trinomys paratus (c); Thrichomys apereoides (d); Dactylomys dactylinus (e); Isothrix pagurus (f). Barra=10μm.

49 Discussão Segundo o filograma de Galewski et al. (2005), a partir da análise de máxima verossimilhança dos marcadores vWF, citocromo b, genes ribossomais 12S e 16S, em 19 espécies (13 gêneros) de equimídeos, cinco clados são bem definidos. Isso nos levou a pensar que um estudo sobre a evolução cromossômica em táxons representando estes clados mostrasse uma tendência evolutiva. Entretanto, os eventos cromossômicos determinantes para a diversificação cariotípica em equimídeos ainda não estão totalmente elucidados. Associado a isto, incertezas sobre a taxonomia dificultam a compreensão de padrões ou tendências de evolução cariotípica na família (Woods 1993; Lara et al. 1996; Vié et al. 1996; McKenna e Bell 1997; Leite e Patton 2002; Galewski et al. 2005). Com relações filogenéticas mais robustas, propostas para os equimídeos por Galewski et al. (2005) e Fabre et al. (2012), combinando informações de genes mitocondriais e nucleares, passou a ser possível associar os dados cromossômicos disponíveis com a história evolutiva da família, na busca por tendências evolutivas cromossômicas, mas isso só tem permitido algumas conclusões evolutivas em agrupamentos menores (mais internos), como é caso do clado formado por Mesomys+Lonchothrix+Isothrix, bem como do agrupamento formado por Kannabateomys+Dactylomys.

Para Mesomys hispidus (2n=60), tanto os dados coletados no presente trabalho como aqueles citados na literatura não evidenciaram nenhuma diferença entre as populações estudadas, nem mesmo no padrão de banda C, localização do gene ribossomal 18S (par 28), que corresponde à região organizadora de nucléolo, e mapeamento das sequências telomérica. Desta forma, ainda que a espécie esteja distribuída por toda a região amazônica, desde o Peru até o Vale do Jari (Pará, Brasil) (Leal-Mesquita 1991; Aniskin 1993; Patton et al 2000), e ainda apresente variação tanto em caracteres morfológicos como moleculares entre populações, revelando inclusive linhagens distintas (Patton et al 2000; Orlando et al. 2003), essa grande conservação cariotípica observada revela que rearranjos cromossômicos não tem participado do processo de diferenciação neste grupo.

50 Já, em relação à Isothrix pagurus (2n=22), cariótipo já descrito por Patton e Emmons (1985) para um indivíduo coletado a 80Km ao norte de Manaus, encontramos para os indivíduos da região do rio Cuieiras e rio Jatapú, regiões que margeiam o local de coleta de Patton e Emmons (1985), um padrão diferente de banda C, tendo em vista que estes autores descrevem blocos heterocromáticos pericentroméricos em 4 cromossomos e marcações teloméricas em 8 cromossomos, além do braço curto do cromossomo X e o cromossomo Y serem heterocromáticos. Ainda, há diferença na classificação do cromossomo X, já que no indivíduo estudado por Patton e Emmons (1985) o X é submetacêntrico, e em nossas amostras ele é claramente subtelocêntrico. É provável que o citótipo descrito por Patton e Emmons (1985) seja o mesmo estudado por nós, com diferenças no padrão de bandeamento que poderiam ser explicadas pela menor qualidade das preparações cromossômicas e, especialmente, por se tratar de apenas um indivíduo analisado. Ainda, este padrão de banda C observado em I. pagurus é distinto daquele comumente observado em roedores equimídeos, com várias marcações teloméricas e braços totalmente heterocromáticos.

Quatro espécies são reconhecidas para o gênero Isothrix (Wilson e Reeder 2005; Mendes-Oliveira 2015): I. bistriata, com 2n=60 e FN=116-118 (Leal-Mesquita 1991; Patton et al. 2000); I. negrensis, com 2n=60 e NF=112; I. pagurus, com 2n=22 e NF=38 (Patton e Emmons 1985; presente trabalho); e I. sinnamariensis, sem dados cariotípicos descritos. Nos agrupamentos filogenéticos, propostos por Galewski et al. (2005) e Fabre et al. (2012), verificamos que Isothrix está filogeneticamente relacionado com outros táxons (Mesomys e Lonchothrix) com número diploide superior. Desta forma, acreditamos que I. pagurus é uma condição derivada de um ancestral com maior número diploide (provavelmente 2n=60 cromossomos, o qual foi mantido em Mesomys hispidus e Isothrix bistriata), tendo seu cariótipo originado a partir de fusões cromossômicas. Fato que pode ser considerado, uma vez que marcações teloméricas intersticiais (ITS) foram observadas em três pares cromossômicos. Ainda, heterocromatina em braços inteiros e em regiões terminais de alguns pares cromossômicos, que também evidencia possíveis

51 eventos de fusão cromossômica e cariótipo ainda em processo de estabilização (Sumner 2003).

Com relação ao agrupamento Kannabateomys (2n=98) + Dactylomys [2n=114 e NF=144 (Aniskin 1993); 2n=118 e NF=168 (Dunnum et al. 2001)], suas espécies são pobremente estudadas do ponto de vista citogenético. Mas, em ambos os gêneros, observa-se números diploides altos. Nosso trabalho apresenta o primeiro registro cariotípico para Dactylomys dactylinus (2n=94 e NF=134) da Amazônia Brasileira (Fig. 1), sendo ainda inédito para a espécie. Os indivíduos por nós estudados possuem cinco pares acrocêntricos a mais do que D. dactylinus proveniente de Loreto, Peru (Aniskin 1993).

Como estas são as espécies com maior número diploide na família Echimydae e, considerando as relações filogenéticas propostas por Galewski et al. (2005) e Fabre et al. (2012), que propõem Dactylomys como grupo irmão de Kannabateomys (2n=98) (Paresque et al. 2004; Rabelo 2013), e este subclado como grupo irmão daquele formado por Makalata (2n=66, 70 e 72) (Leal- Mesquita 1991; Lima et al. 1998; Silva et al. 2013; Nagamachi et al. 2015; presente trabalho) + Echimys (sem dados cariotípicos descritos) + Phyllomys (2n=50, 72, 76, 80, 90 e 92) (Machado 2010), sugerimos que o cariótipo de D. boliviensis (2n=118) foi originado por eventos de fissão cromossômica a partir de um ancestral com menor número diploide e, a partir dele teria surgido o cariótipo de D. dactylinus por fusão cromossômica. Considerando que este é o primeiro registro cariotípico para D. dactylinus da Amazônia brasileira e a imensa distância geográfica entre a região dos rios Tapajós e Trombetas (nossos registros) e Loreto (Peru) (Aniskin 1993), acreditamos que outras formas cariotípicas existam para esta espécie na Amazônia, e novos estudos devem contemplar este tipo de abordagem, auxiliando na delimitação da diversidade cariotípica existente no grupo.

Um aspecto interessante encontrado em D. dactylinus foi a presença de grandes blocos de sequências teloméricas, possivelmente tratando de mega- telômeros (Ingles e Deakin 2016), na região pericentromérica de três pares cromossômicos, o que pode ser a confirmação de fusões, seguida de duplicação. Este é o primeiro registro deste tipo de marcação em roedor

52 equimídeo porém, já foi observado em alguns grupos de mamíferos, como morcegos, cetáceos, primatas e marsupiais, e mesmo em outros grupos de vertebrados, como aves, répteis, e peixes (Ingles e Deakin 2016).

Em algumas espécies existe forte relação dos mega-telômeros com DNA ribossômico, enquanto em outras eles estão associados a microcromossomos e cromossomos sexuais e, neste último caso, costuma coincidir com grandes blocos heterocromáticos (Carvalho et al. 2000; Nanda et al. 2002; Bulazel et al. 2006; Delany et al. 2007; Srikulnath et al. 2009; 2011; 2013; Ocalewics 2013; McPherson et al. 2014; Pokorná et al. 2014; Matsubara et al. 2015). Esta é uma característica que não costuma ser fortemente conservada, não sendo observada sua manutenção em espécies relacionadas (Ingles e Deakin 2016). Assim, enquanto o significado fisiológico e adaptativo de mega-telômeros ainda precisa ser elucidado, esta característica, em indivíduos de D. dactylinus das regiões dos rios Tapajós e Trombetas, pode ser considerada um marcador populacional.

Em relação à Makalata, a revisão sistemática mais recente de Miranda (2015) reconhece 14 espécies para o gênero, separadas em dois clados (um com animais da porção ocidental da Amazônia e outro da porção oriental até o nordeste brasileiro). Este autor observou uma alternância entre os números diploides 2n=70 e 2n=72 (e NF variando de 120 a 132) entre os diferentes subclados, sendo que os animais com 2n=66 cromossomos formam um subclado mais derivado. No presente trabalho, o cariótipo observado em Makalata didelphoides (2n=72), da região do rio Tapajós, é inédito para a espécie, uma vez que difere na fórmula cariotípica e número fundamental dos indivíduos estudados anteriormente, coletados no Amapá (Silva et al. 2013; Nagamachi et al. 2015;) e na região de Barcelos (Amazonas) (Menezes et al. 2003), que apresentam 2n=72 e NF=128. Porém, tanto para as amostras estudadas do Amapá como de Barcelos, os dados não foram publicados, não permitindo a comparação dos cariótipos. Também são registrados 2n=66 (NF=106) e 2n=70 (NF=120) para indivíduos da região da Usina hidrelétrica de Balbina (rio Uatumã, Amazonas) e da Usina Hidrelétrica de Samuel (rio Jamari, Rondônia), respectivamente (Leal-Mesquita 1991; Lima et al. 1998). Estes dois trabalhos também descrevem a presença de heterocromatina constitutiva na

53 região pericentromérica da maioria dos pares cromossômicos (e no caso dos animais do estado de Rondônia ainda há duas marcações intersticiais em um par), porém, o cariótipo por nós descrito apresenta maior quantidade de pares cromossômicos (13) sem marcações heterocromáticas. Já, em relação a dados cromossômicos moleculares, o presente trabalho apresenta pela primeira vez a localização dos genes de DNAr 18S e de sequências telomérica.

Nossa hipótese, a partir da análise dos dados cromossômicos disponíveis para este grupo, é que apesar dos dados moleculares separarem as espécies de Makalata em dois grupos e várias linhagens evolutivas (Miranda 2015), os dados cromossômicos não evidenciam linhagens citogenéticas bem definidas, sendo os cariótipos aparentemente instáveis, moldados tanto por eventos robertsonianos como por inversões pericêntricas e/ou translocações. A ausência de marcações teloméricas intersticiais e a presença de blocos heterocromáticos pericentroméricos, por nós observadas, não descarta a ocorrência de fusões cromossômicas, uma vez que regiões de sequências teloméricas intersticiais podem ser eliminadas e/ou heterocromatinizadas como estratégia para evitar pontos de quebra cromossômica, dando certa estabilidade ao cariótipo. Por outro lado, 2n=66 cromossomos, provavelmente, é uma característica homoplásica para este gênero e não há uma tendência evolutiva cromossômica clara para Makalata.

O cariótipo de Trinomys paratus foi recentemente descrito por Lazar et al. (2017), a partir de indivíduos coletados também no município de Guarapari (Espírito Santo), porém, com alguma divergência em relação aos dados que apresentamos no presente trabalho, uma vez que estes autores descrevem heterocromatina em 48 autossomos e nos cromossomos sexuais, enquanto nós observamos blocos heterocromáticos em todos os pares, exceto no par 1.

No gênero Trinomys o número diploide varia entre 54, 56, 58 e 60 cromossomos e o NF varia entre 104 e 116 (Yonenaga-Yassuda et al. 1985; Zanchin 1988; Paresque et al. 2004; Pessôa et al. 2005; Souza et al. 2006; Lazar et al. 2017). Trinomys iheringi teve dados de bandeamento cromossômico, que se mostraram semelhantes aos que encontramos para T. paratus, com blocos de heterocromatina pericentromérico em todos os

54 cromossomos, um par com constrição secundária coincidente com a localização da marcação de DNA 18S e sequências de DNA telomérico presentes na região terminal de todos os braços cromossômicos (Fagundes et al. 2004), mostrando a conservação destas características cromossômicas no gênero.

No agrupamento filogenético proposto por Galewski et al. (2005) estão contempladas sete espécies de Trinomys e a filogenia proposta por Lazar et al. (2012) mostra relações muito semelhante entre as espécies. Assim, a partir da combinação dos dados filogenéticos com os dados cromossômicos disponíveis, nossa hipótese é que Trinomys derivou de um ancestral com 2n=60 cromossomos, com este número diploide mantido em T. albispinus e no subclado composto por T. dimidiatus e T. iheringi (Lazar et al. 2017), e reduzido nos demais grupos (2n=54, 56 e 58) a partir de fusão cromossômica, envolvendo de 1 a 3 pares cromossômicos.

No caso de Thrichomys apereoides, pelo menos sete formas cariotípicas são registradas, com o número diploide variando entre 2n= 26, 28, 30 e 34, NF variando entre 48, 50, 54 e 64, com diferenças registradas na morfologia e tamanho dos cromossomos sexuais, na posição da RON e no padrão de banda C (Souza e Yonenaga-Yassuda 1982; Leal-Mesquita et al. 1993; Bonvicino et al. 2002; Pessoa et al. 2003; Nascimento et al. 2013; presente estudo). O cariótipo de Thrichomys apereoides aqui descrito é inédito para a espécie. T. apereoides da região de Lagoa Santa, por exemplo, apresentou o mesmo cariótipo (número diploide, fundamental e RON) (Pessoa et al. 2003) dos indivíduos por nós analisados, porém, variou no padrão de Banda C, tendo em vista que indivíduos de Lagoa Santa apresentam apenas dois pares autossomais (par 1 e 9) sem marcações heterocromáticas, enquanto os animais por nós estudados apresentam cinco pares (pares 1, 6, 7, 10 e 13) sem marcações.

Bonvicino et al. (2002) sugeriram que rearranjos cromossômicos desempenharam um importante papel na diversificação deste gênero, embora a direção da evolução cromossômica ainda não possa ser confirmada. Estes autores ainda sugerem que 2n=34 seria ancestral dos demais, ocorrendo uma

55 redução do número diploide de oeste (Pantanal) para leste (Minas Gerais, até Pernambuco) do Brasil. Se observarmos a filogenia proposta por Nascimento et al. (2013) para o gênero, esta hipótese é descartada, uma vez que T. inermis (2n=26) é considerado ancestral e os táxons mais derivados apresentam números diploides mais altos, porém, sem um padrão evolutivo bem definido.

T. apereoides, sozinha, apresenta populações com todos os números diploides conhecidos para o gênero, o que reforça a ideia de se tratar de um complexo de espécies. Neste cenário, é fundamental ampliar os estudos neste táxon, mas de forma integrativa, com bandeamentos e mapeamento físico- cromossômico, e com uma filogenia mais robusta para o grupo.

O gênero Proechimys, mais detalhadamente estudado no primeiro capítulo desta tese, é extremamente diverso do ponto de vista do cariótipo, com espécies distintas apresentando padrões citogenéticos semelhantes (tanto no número diploide, número de braços cromossômicos, padrão de bandeamentos e localização de sequências repetitivas de DNA), como também populações de uma mesma espécie apresentando variação nos dados cromossômicos (Weksler et al. 2001; Machado et al. 2005; Silva et al. 2012; Eler et al. 2012; Eler et al. em preparação). O estudo cariotípico, desenvolvido neste gênero, mostrou a mesma condição observada para toda a família: a falta de um padrão evolutivo cromossômico. Quando comparamos os dados cromossômicos gerados no presente trabalho para as espécies Proechimys cuvieri, Trinomys paratus, Thrichromys apereoides, Mesomys hispidus, Isothrix pagurus, Dactylomys dactylinus e Makalata didelphoides, à luz das filogenias propostas por Galewski et al. (2005) e Fabre et al. (2012), verificamos que os números diploide e fundamental são diversos (tanto inter como intraespecificamente), confirmando a proposição de fissões e fusões cromossômicas como os rearranjos mais significativos na diversificação cariotípica da família, seguido de inversões pericêntricas e/ou translocações (Leal-Mesquita 1991; Lima et al. 1998; Weksler et al. 2001; Bonvicino et al. 2002; Machado 2010; Dunnum 2011; Eler et al. 2012; Lazar et al. 2012). A distribuição da heterocromatina constitutiva, parece ser conservada na família, mas variações intraespecíficas são encontradas. Sua variação foi mais evidente em relação às espécies arborícolas. Por outro lado, as

56 sequências de DNAr 18S e teloméricas são muito conservadas na família, sendo que o par nucleolar, embora sua posição no cariótipo é variável, sua homeologia entre as espécies fica muito evidente. A grande diversidade cromossômica observada em equimídeos, associada à falta de padrões de evolução cromossômica e eventos recentes de diversificação, justificam este dinamismo cromossômico, o que nos leva a caracterizar esta família de roedores como um grupo em plena atividade de especiação, com cariótipos ainda em processo de estabilização.

Bonvichino et al. (2002) propõem que as semelhanças ecológicas e morfológicas, entre os citótipos de Thrichomys, indicam que rearranjos cariotípicos (e consequente especiação) não estão necessariamente correlacionados com a evolução adaptativa e, que a seleção morfológica e ecológica pode operar após a fixação dos rearranjos cromossômicos. Provavelmente, esta seja uma regra que pode ser aplicada à família Echimyidae como um todo, na qual eventos de rearranjos cromossômicos não são os principais fatores de sua diversificação específica.

Assim, eventos ecomorfológicos e biogeográficos, seguidos de alterações moleculares, seriam os principais fatores responsáveis pela diversificação em equimídeos [conforme sugerido pelos agrupamentos propostos por Galewski et al. (2005) e Fabre et al. (2012)], passando os rearranjos cromossômicos a figurarem num segundo momento desse processo. Por outro lado, os estudos cromossômicos continuam desempenhando importante papel no estudo da biodiversidade da família, revelando marcadores populacionais e específicos, auxiliando na diferenciação de cariomorfos e frequentemente atuando como gatilho para estudos sistemáticos mais aprofundados.

57 5. CONCLUSÕES

A família Echimyidae é um grupo extremamente diverso do ponto de vista da macroestrutura do cariótipo (números diploide e fundamental), porém sem uma tendência evolutiva cromossômica definida. Entretanto, inferências evolutivas cromossômicas podem ser feitas em agrupamentos mais internos, em relação ao número diploide, como observado nos gêneros Isothrix, Mesomys, Dactylomys e Makalata. Novas formas cariotípicas ainda devem ser descritas para a família, a medida que novas regiões forem amostradas, especialmente para espécies do gênero Proechimys, com variações tanto na macroestrutura cariotípica como nos padrões de bandeamentos. Os limites de distribuição das espécies e citótipos de Proechimys também não estão bem estabelecidos. Toda diversidade cromossômica encontrada em Echimyidae se deve a rearranjos Robertsonianos e/ou não Robertsonianos, entretanto marcações teloméricas intersticiais (ITS), que pudessem comprovar alguns deles não foram observadas. Por outro lado, a variabilidade da posição do par nucleolar no cariótipo e a duplicação em um dos seus homólogos, evidencia a presença deles. Os maiores números diploides são observados em espécies arborícolas, confirmando a hipótese já proposta anteriormente.

O padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva geralmente está restrito às regiões pericentroméricas de todos ou da maioria dos cromossomos na família, mostrando conservação deste caráter.

As sequências de DNA telomérico, em geral, estão localizadas nas regiões terminais de todos os cromossomos na família, com exceção de Isothrix paguros e Dactylomys dactylinus.

Caracteres cromossômicos, ainda que úteis do ponto de vista citotaxonômico na família Echimyidae, parecem ser características homoplásicas em muitos casos, o que justifica a não observação de linhagens cromossômicas bem definidas. Portanto, as mudanças cromossômicas observadas não são o principal fator de diversificação na família.

58 6 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aguilera, M.; Sangines, N.; Perez-Zapata, A. 1998. Echimys semiviIlosus, a rodent species with a very high chromosomal number. Caryologia, 51(3-4): 181-87. Amaral, P.J.S.; Nagamachi, C.Y.; Noronha, R.C.R.; Costa, M.J.; Pereira, A.L.; Rossi, R.V.; Mendes-Oliveira, A.C.; Pieczarka, J.C. 2013. Proechimys (Rodentia, Echimyidae): characterization and taxonomic considerations of a form with a very low diploid number and a multiple sex chromosome system. BMC Genetics (Online) 14: 1-7. Aniskin, V.M. 1993. Three new karyotypes of prickly chinchillas of the family Echimyidae (Rodentia). Genetika, 29(3): 1500-1507. Araújo, N.P.; Loss, A.C.; Cordeiro-Junior, D.A.; da Silva, K.R; Leite, Y.L.; Svartman, M. (2014) New karyotypes of Atlantic tree rats, genus Phyllomys (Rodentia: Echimyidae). Genome 57:1–8 Azevedo, M.F.C.; Oliveira, C.; Martins, C.; Wasko, A.P.; Foresti, F. 2005. Isolation and characterization of a satellite DNA family in Achirus lineatus (Teleostei: Pleuronectiformes: Achiridae). Genetica, 125: 205–210. Barros, R.M.S. 1978. Variabilidade cromossômica em Proechimys e Oryzomys (Rodentia) da Amazônia. Dissertação de mestrado. Instituto de Biociências, USP, São Paulo. 184pp. Bonvicino, C.R.; Otazú, I.B.; D´Ándrea, P.S. 2002. Karyological evidence for the diversification of the genus Thrichomys (Rodentia,Echimyidae). Cytogenetics and Cell Genetics, 97: 200-204. Bonvicino, C.R.; Menezes, A.R.E.A.N.; Oliveira, J.A. 2003. Molecular and karyologic variation in the genus Isothrix (Rodentia, Echimyidae). Hereditas, 139: 206–211. Bonvicino, C.R.; Otazú, I.B.; Vilela, J.F. 2005. Karyologic and molecular analysis of Proechimys Allen, 1899 (Rodentia, Echimyidae) from the Amazonian region. Arq. Mus. Nac. RJ, 63:191-200. Bulazel, K;, Metcalfe, C.; Ferreri, G.C.; Yu, J.; Eldridge, M.D.B.; O’Neil, R.J. 2006. Cytogenetic and molecular evaluation of centromere-associated DNA

59 sequences from a marsupial (Macropodidae:Macropus rufogriseus) X chromosome. Genetics, 172: 1129-1137. Carvalho, G.A.S. 2000. Substitution of the deciduous premolar in Chaetomys subspinosus (Olfers, 1818) (Hystricognathi, Rodentia) and its taxonomic implications. Zeitschrift fur Saugetierkunde, 65: 187–190. Carvalho, B.A.; Mattevi, M. 2000. (T2AG3)n telomeric sequence hybridization suggestive of centric fusion in karyotype marsupials evolution. Genetica, 108: 205–210. Cazaux, B.; Catalan, J.; Veyrunes, F.; Douzery, E.J.P.; Britton-Davidian, J. 2011. Are ribosomal DNA clusters rearrangement hotspots? A case study in the genus Mus (Rodentia, Muridae). BMC Evol Biol 11:124–137. doi: 10.1186/1471-2148-11-124 da Silva, M.N.F. 1995. Systematics and phylogeography of Amazonian spiny rats of the genus Proechimys (Rodentia: Echimyidae). Tese de doutorado. University of California, Berkeley. 206 pp. da Silva, M.N.F. 1998. Four new species of spiny rats of the genus Proechimys (Rodentia: Echimyidae) from the Western Amazon of Brasil. Proceedings of the Biological Society of Washington, 111(2): 436-471. da Silva, M.N.F.; Patton, J.L. 1993. Amazonian Phylogeography: mtDNA sequence variation in arboreal echimyid rodents (Caviomorpha). Molecular Phylogenetics and Evolution, 2(3): 243-255. Delany, ME.; Gessro, T.M.; Rodrigue, K.L.; Daniels, L.M. 2007. Chromosomal mapping of chicken mega-telomere arrays to GGA9, 16, 28 and W using a cytogenomic approach. Cytogenet Genome Res, 117: 54-63. Dunnum, J.L.; Salazar-Bravo, J.; Yates, T.L. 2001. The Bolivian Bamboo Rat, Dactylomys boliviensis (Rodentia: Echimyidae), a new record for chromosome number in a mammal. Zeitschrift fur Saugetierkunde, 66(2): 121-126. Eisenberg, J.F.; Redford, K.H. 1999. Mammals of the Neotropics. The Central Neotropics. V.3: Ecuador, Peru, Bolivia, Brazil. University of Chicago Press, Chicago. 609p. Eler, E.S.; Silva, C.E.F.; da Silva, M.N.F.; Feldberg, E. 2012. Comparative cytogenetics of spiny rats of the genus Proechimys (Rodentia, Echimyidae) from the Amazon region. Genetics and Molecular Research, 11: 830-846.

60 Emmons, L.H. 2005. A revision of the genera of arboreal Echimyidae (Rodentia, Echimyidae, Echimyinae), with description of two new genera. Zoology, 133: 247-310. Emmons, L.H.; Vucetich, M.G. 1998. The identity of Winge’s Lasiuromys villosus and the description of a new genus of Echimyid rodent (Rodentia: Echimyidae). American Museum Novitates, 3223: 1–12. Fabre, PH; Galewski, T; Tilak, MK; Douzery, EJP. 2012. Diversification of South American spiny rats (Echimyidae): a multigene phylogenetic approach. Zoological Scripta, 42: 117-134. Fagundes, V.; Christoff, A.V.; Yonenaga-Yassuda, Y. 1998. Extraordinary chromosomal polymorphism with 28 different karyotypes in the neotropical species Akodon cursor (Muridae, Sigmodontinae), one of the smallest diploid number in rodents (2n=16, 15 and 14). Hereditas, 129: 263-274. Fagundes, V.; Camacho, J.P.; Yonenaga-Yassuda, Y. 2004. Are the dot-like chromosomes in Trinomys iheringi (Rodentia, Echimyidae) B chromosomes? Cytogenetic and Genome Research, 106(1): 159-164. Ford, C.; Hamerton, J. 1956. A colchicine, hypothonic citrate, squash sequence for mammalian chromosomes. Stain Technology, 31: 247-251. Galewski, T.; MauVrey, J.F.; Leite, Y.L.R.; Patton, J.L.; Douzery, E.J.P. 2005. Ecomorphological diversification among South American spiny rats (Rodentia; Echimyidae): a phylogenetic and chronological approach. Molecular Phylogenetics and Evolution, 34: 601–615. Gross, M.C.; Schneider, C.H.; Valente, G.T.; Porto, J.I.R.; Martins, C.; Feldberg, E. 2010. Comparative cytogenetic analysis of the genus Symphysodon (Discus Fishes, Cichlidae): chromosomal characteristics of retrotransposons and minor ribosomal DNA. Cytogenetics and Genome Research, 127: 43-53. Guerra, M. 2004. Hibridização in situ: Princípios básicos. In: Guerra, M. (Ed) FISH: Conceitos e Aplicações na Citogenética. Editora da Sociedade Brasileira de Genética, Ribeirão Preto, 184p. Horvath, J.E.; Bailey, J.A.; Locke, D.P.; Eichler, E.E. 2001. Lessons from the human genome: transitions between euchromatin and heterochromatin. Human Molecular Genetics, 10: 2215-2223.

61 Howell, W.M.; Black, D.A. 1980. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36: 1014-1015. Huchon, D.; Catzeflis, F.M.; Douzery, E.J.P. 1999. Molecular evolution of the nuclear von Willebrand Factor gene in mammals and the phylogeny of rodents. Molecular Biology and Evolution, 16: 577–589. Huchon, D.; Catzeflis, F.M.; Douzery, E.J.P. 2000. Variance of molecular dating, evolution of rodents, and the phylogenetic affinities between Ctenodactylidae and Hystricognathi. Proceedings of the Royal Society, 267: 393–402. Huchon, D.; Douzery, E.J.P. 2001. From the Old World to the New World: a molecular chronicle of the phylogeny and biogeography of hystricognath rodents. Molecular Phylogenetics and Evolution, 20: 238–251. Iack-Ximenes, G.E.; Vivo, M. de; Percequillo, A.R. 2005. A new genus for Loncheres grandis Wagner, 1845, with taxonomic comments on other arboreal echimyids (Rodentia, Echimyidae). Arquivos do Museu Nacional do Rio de Janeiro, 63(1): 89-112. Ijdo, J.W.; Wells, R.A.; Baldini, A.; Reeders, S.T. 1991. Improved telomere detection using a telomere repeat probe (TTAGGG)n generated by PCR. Nucleic Acids Research, 19: 4780. Ingles, E.D.; Deakin, J.E. 2016. Telomeres, species differences, and unusual telomeres in vertebrates: presenting challenges and opportunities to understanding telomere dynamics. AIMS Genetics, 3(1): 1-24. Jiang, J.; Gill, B.S. 2006. Current status and the future of fluorescence in situ hybridization (FISH) in plant genome research. Genome, 49: 1057-1068. Kazazian, H.H.J. 2004. Mobile elements: drivers of genome evolution. Science 303: 1626-1632. Lara, M.C.; Patton, J.P.; da Silva, M.N.F. 1996. The simultaneous diversification of South American echimyid rodents (Hystricognathi) based on complete cytochrome b sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, 5: 403- 413. Lazar, A.; Nacif, C.; Weksler, M.; Bonvicino, C. 2017. The karyotype of Trinomys paratus (Rodentia:Echimyidae) with comments about its phylogenetic relationship . Mammalia, published on line.

62 Leal-Mesquita, E.R.R.B.P. 1991. Estudos citogenéticos em dez espécies de roedores brasileiros da família Echimyidae. Dissertação de mestrado. Instituto de Biociências, USP. São Paulo. 167pp. Leal-Mesquita, E.R.R.B.P; Yonenaga-Yassuda, Y.; Chu, T.H.; Chu, P.L.B. 1992. Chromosomal characterization and comparative cytogenetic analysis of two species of Proechimys (Echimyidae, Rodentia) from Caatinga domain of the State of Bahia, Brazil. Caryologia, 45: 197-212. Leal-Mesquita, E.R.R.B.P.; Fagundes, V.; Yonenaga-Yassuda, Y.; Rocha, P.L.B. 1993. Comparative cytogenetic studies of two karyomorphs of Thrichomys apereoides (Rodentia:Echimyidae). Genet. Mol. Biol., 16: 639- 651. Leite, Y.L.R. 2001. Systematics of the Atlantic tree rats, genus Phyllomys (Rodentia, Echimyidae), and the evolution of Echimyid rodents in South America. Tese de Doutorado, University of California, Berkeley. 118p. Leite, Y.L.R., 2003. The evolution and systematics of Atlantic tree rats, genus Phyllomys (Rodentia, Echimyidae), with description of two new species. University of California Publications in Zoology, 132: 1–118. Leite, Y.L.R., Patton, J.L. 2002. Evolution of South American spiny rats (Rodentia, Echimyidae): the star-phylogeny hypothesis revisited. Molecular Phylogenetics and Evolution, 25: 455–464. Levan, A.; Fredga, K.; Sandberg, A.A. 1964. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas, 52: 201-220. Lima, J.F.S. 2000. Diversidade cariológica de roedores de pequeno porte do estado do Tocantins, Brasil. Tese de Doutorado. Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 194p. Lima, J.F.S.; Langguth, A.; Sousa, L.C. 1998. The karyotype of Makalata didelphoides (Rodentia, Echimyidae). Zeitschrift fur Saugetierkunde, 63: 315- 318. Machado, M.X. 2010. Diversidade citogenética e citotaxonomia de Phyllomys (Rodentia, Echimyidae). Dissertação de mestrado. Departamento de Ciências Biológicas, UFES. Vitória, 36p. Machado, T.; Silva M.J.J.; Leal-Mesquita, E.R.; Carmignotto, A.P.; Yonenaga- Yassuda, Y. 2005. Nine karyomorphs for spiny rats of the genus Proechimys

63 (Echimyidae, Rodentia) from North and Central Brazil. Genet. Mol. Biol. 28: 682-692 Maia, V.; Langguth, A. 1993. Constitutive heterochromatin polymorphism and NORs in Proechimys cuvieri Petter, 1978 (Rodentia, Echimyidae). Braz. J. Genet. 16:145-154 Martin, T. 1994. African origin of caviomorph rodents is indicated by incisor enamel microstructure. Paleobiology, 20: 5–13. Martins, C. 2007. Chromosomes and repetitive DNAs: a contribution to the knowledge of fish genome. In Pisano, E.; Ozouf-Costaz, C.; Foresti, F.; Kapoor, B.G. (Eds). Fish Cytogenetics. Science Publisher, Inc., Enfield, New Hampshire, USA. p. 421-453. Martins, C.; Cabral-de-Mello, D.C.; Valente, G.T.; Mazzuchelli, J.; Oliveira, S.G. 2010. Cytogenetic mapping and its contribution to the knowledge of animal genomes. In: Urbano, K.V. (Ed). Advances in Genetics Research, Vol. 4. Nova Science Publisher, Hauppauge, NY, USA. Pp. 1-82. Matsubara, K.; Uno, Y.; Srikulnath, K.; Matsuda, Y.; Miller, E.; Olsson, M. 2015. No Interstitial Telomeres on Autosomes but Remarkable Amplification of Telomeric Repeats on the W Sex Chromosome in the Sand Lizard (Lacerta agilis). J Hered, 106: 753-757. McKenna, M.C.; Bell, S.K. 1997. Classification of Mammals above the Species Level. Columbia University Press, New York. 631pp. McPhearson, M.C.; Robinson, C.M.; Gehlen, L.P.; Dealny, M.E. 2014. Comparative cytogenomics of poultry: mapping of single gene and repeat loci in the Japanese quail (Coturnix japonica). Chromosome Research, 22 (1):1– 83. Miranda, C.L. 2015. Sistemática e biogeografia dos ratos-de-esppinho do gênero Makalata Husson, 1978 (Rodentia:Echimyidae). Tese de doutorado. Universidade Federal do Pará, Belém, 223p. Nagamachi, C.Y.; Feldberg, E.; Pieczarka, J.C.; Pereira, A.L.; Faresin, C.; Rosa, C.C.; Souza, E.; Pinto, J.A.; Costa, M.J.R.; Malcher, S.M.; Paixão, V.S.; Silva, W.O. 2015. Citognética de pequenos mamíferos não-voadores da Amazônia Brasileira. In: MendesOliveira, A.C.; Miranda C.L. eds. Pequenos Mamíferos não-voadores da Amazônia Brasileira. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de Mastozoologia. Série Livros 2, 275- 307.

64 Nanda, I.; Schrama, D.; Feichtinger, W.; Haaf, T.; Schartl, M.; Schmid, M. 2002. Distribution of telomeric (TTAGGG)n sequences in avian chromosomes. Chromosoma, 111(4): 215-227. Nasciento, F.F.; Lazar, A.; Menezes, A.R.A.N.; Durans, A.M.; Moreira, J.C.; Salazar-Bravo, J.; Dandrea, P.S.; Bonvicino, C.R. 2013. The role of historical barriers in the diversification processes in open vegetation formations during the Miocene/Pliocene using an ancient rodent lineage as a model. Plos One, 8, p. e61924. Ocalewicz, K. 2013. Telomeres in fishes. Cytogenet Genome Res, 141: 114- 125. Paresque, R.; Souza, W.P.; Mendes, S.L.; Fagundes, V. 2004. Composição cariotípica da fauna de roedores e marsupiais de duas localidades de Mata Atlântica no Espírito Santo, Brasil. Boletim do Museu de Biologia Mello Leitão, Santa Teresa, ES, 17(1): 5-34. Patton, J.L. 1987. The Species Groups of Spiny Rats, Genus Proechimys (Rodentia, Echimyidae). In: Patterson, B.D.; Timm, R.M. (eds) Studies in Neotropical mammalogy - Essay in Honor of Philip Hershkovitz. Field Museum of Natural History, Chicago, pp. 305-345. Patton, J.L.; Gardner, A.L. 1972. Notes on the systematics of Proechimys (Rodentia: Echimyidae), with emphasis on Peruvian forms. Occasional Papers of the Museum of Zoology, 44: 1-30. Patton, J.L.; Emmons, L.H. 1985. A review of genus Isothrix (Rodentia, Echimyidae). American Museum Novitates, 2817: 1-14. Patton, J.L.; da Silva, M.N.F.; Malcolm, J.R. 2000. Mammals of the rio Juruá and the evolutionary and ecological diversification of Amazonia. Bulletin of the American Museum of Natural History, 244: 1-306. Pessôa, L.M.; Corrêa, M.M.O; Oliveira, J.A.; Lopes, M.O.G. 2003. Karyological and morphometric variation in the genus Thrichomys (Rodentia: Echimyidae). Zeitschrift fur Saugetierkunde, 69(4):258-269. Pessôa, L.M., Corrêa, M.M.O.; Bittencourt, E.; Reis, S.F. 2005. Chromosomal characterization of taxa of the genus Trinomys Thomas, 1921, in states of Rio de Janeiro and São Paulo (Roden- tia: Echimyidae). Arq. Mus. Nac. 63: 161–68.

65 Phillips, R.B.; Reed, K.M. 1996. Application of fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques to fish genetics: a review. Aquaculture, 140: 197-216. Pinkel, D.; Straume, T.; Gray, J.W. 1986. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the Natural Academy of Science, 83: 2934-2938. Pokorná, M.J.; Rovatsos, M.; Kratochvíl, L. 2014. Sex chromosomes and karyotype of the (nearly) mythical creature, the gila monster, Heloderma suspectum (Squamata: Helodermatidae). Plos One, 9: 7. Porter, A.P.; Goodman, M.; Stanhope, M.J. 1996. Evidence on mammalian phylogeny from sequences of exon 28 of the von Willebrand Factor gene. Molecular Phylogenetics and Evolution, 5: 89–101. Rabelo, P.H.F. 2015. Análise citogenética de Thrichomys apereoides (Lund, 1839) e Kannabateomys amblyonyx (Wagner, 1845) (Rodentia, Echimyidae) provenientes do Estado de Minas Gerais, Brasil. Dissertação de mestrado. Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 49pp. Reig, O.A. 1984. Significado de los metodos citogeneticos para la distincion y la interpretacion de las especies, con especial referencia a los mamíferos. Revista do Museu Argentino de Ciências Naturales Bernardino Rivadavia, 13(3): 19-44 Reig, O.A.; Useche, M. 1976. Diversidad cariotípica y sistemática en poblaciones venezolanas de Proechimys (Rodentia, Echimyidae), con datos adicionales sobre poblaciones de Perú y Colombia. Acta Científica Venezolana, 27: 132-140. Rooney, A.P.; Ward, T.J. 2005. Evolution of a large ribosomal RNA multigene family in filamentous fungi: birth and death of a concerted evolution paradigm. Proc Natl Acad Sci, 102:5084–5089. Ruiz-Herrera, A.; Nergadze, S.G.; Santagostino, M.; Giulotto, E. 2008. Telomeric repeats far from the ends: mechanisms of origin and role in evolution. Cytogenet Genome Res 122:219–228. Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; Scharf, S.J.; Higuchi, R.; Horn, G.T.; Mullis, K.B.; Erlich, H.A. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239: 487-491. Sambrook, J.; Russell, D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Vol. I. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. NY. 2344pp.

66 Schwarzacher, T. 2003. DNA, chromosomes, and in situ hybridization. Genome, 46: 953-962. Silva, C.E.F.; Eler, E.S.; da Silva, M.N.F.; Feldberg, E. 2012. Karyological analysis of Proechimys cuvieri and Proechimys guyannensis (Rodentia, Echimyidae) from central Amazon. Genetics and Molecular Biology, 35: 88- 94. Silva, C.R.; Martins, A.C.M.; Castro, I.J.; Bernard, E.; Cardoso, E.M.; Lima, D.S.; Gregorin, R.; Rossi, R.V.; Percequillo, A.R.; Castro, K. C. 2013. Mammals of Amapá State, Eastern Brazilian Amazonia: a revised taxonomic list with comments on species distributions. Mammalia 2013; 77(4): 409–424 Souza, M.J. 1981. Caracterização cromossômica em oito espécies de roedores brasileiros das famílias Cricetidae e Echimyidae. Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo, São Paulo. 198pp. Souza, M.J.; Yonenaga-Yassuda, Y. 1982. Chromosomal variability of sex chromosomes and NORs in Trichomys apereoides (Rodentia, Echimyidae). Cytogenetics and Cell Genetics, 33: 197-203. Souza, A.L.G., Corrêa, M.M.O.; Pessôa, L.M. 2006. Morphomet- ric discrimination between Trinomys albispinus (Is. Geof- froy, 1838) and Trinomys minor (Reis & Pessôa, 1995) from Chapada Diamantina, Bahia, Brazil, and the karyotype of Trinomys albispinus (Rodentia, Echimyidae). Arq. Mus. Nac., 64: 325–332. Springer, M.S.; Burk, A.; Kavanagh, J.R.; Waddell, V.G.; Stanhope, M.J. 1997. The inter photoreceptor retinoid binding protein gene in therian mammals: implications for higher level relationships and evidence for loss of function in the marsupial mole. Proceedings National Academy of Science Usa, 94: 13754–13759. Srikulnath, K.; Matsubara, K.; Uno, Y.; Thongpan, A.; Suputtitada, S.; Apisitwanich, S.; Matsuda, Y.; Nishida, C. 2009. Karyological Characterization of the Butterfly Lizard (Leiolepis reevesii rubritaeniata, Agamidae, Squamata) by Molecular Cytogenetic Approach. Cytogenet Genome Res, 125: 213–223. Srikulnath, K.; Uno, Y.; Matsubara, K.; Thongpan, A.; Suputtitada, S.; Apisitwanich, S.; Nishida, C.; Matsuda, Y. 2011. Chromosomal localization of the 18S-28S and 5S rRNA genes and (TTAGGG)n sequences of butterfly

67 lizards (Leiolepis belliana belliana and Leiolepis boehmei, Agamidae, Squamata). Genet Mol Biol, 34: 582-586. Srikulnath, K.; Uno, Y.; Nishida, C.; Matsuda, Y. 2013. Karyotype evolution in monitor lizards: cross-species chromosome mapping of cDNA reveals highly conserved synteny and gene order in the Toxicofera clade. Chromosome Res, 21:805–819. Sumner, A.T. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research, 75: 304-306. Sumner, A.T. 2003. Chromosomes Organization and Function. Blackwell Science Ltd, Oxford, UK. 287p.

Svartman, M. 1989. Levantamento cariotípico de roedores do Distrito Federal. Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo, São Paulo. 160pp. Teixeira, W.G.; Ferreira, I.A.; Cabral-de-Mello, D.C.; Mazzuchelli, J.; Valente, G.T.; Pinhal, D.; Poletto, A.B.; Venere, P.C.; Martins, C. 2009. Organization of repeated DNA elements in the genome of the Cichlid fish Cichla kelberi and its contributions to the knowledge of fish genomes. Cytogenetic and Genome Research, 125: 224-234. Upham, N.S; Patterson, B.D. 2012. Diversification and biogeography of the Neotropical caviomorph lineage Octodontoidea (Rodentia: Hystricognathi). Molecular Phylogenetics and Evolution, 63: 417–429. Ventura, K.; Silva, M.J.J.; Fagundes, V.; Christoff, U.A.; Yonenaga-Yassuda, Y. 2006. Non-telomeric sites as evidence of chromosomal rearrangement and repetitive (TTAGGG)n arrays in heterochromatic and achromatic regions in four species of Akodon (Rodentia, Muridae). Cytogenetic and Genome Research, 115: 169–175. Ventura, K.; Iack-Ximenes, G.E.; Pardini, R.; Sousa, M.A.N.; Yonenaga- Yassuda, Y.; Silva, M.J.J. 2008. Karyotypic analyses and morphological comments on the endemic and endangered Brazilian painted tree rat Callistomys pictus (Rodentia, Echimyidae). Genetics and Molecular Biology, 31(3): 697-703. Vié, J.C.; Volobouev, V.; Patton, J.L.; Granjon, L. 1996. A new species of Isothrix (Rodentia: Echimyidae) from French Guiana. Mammalia, 60: 393– 406.

68 Vitte, C.; Fustier, M.A.; Alix, K.; Tenaillon, M.I. 2014. The bright side of transposons in crop evolution. Brief Funct Genomics, 13(4):276-295. Weksler, M.; Bonvicino, C.R.; Otazu, I.B.; Júnior, J.S.S. 2001. Status of Proechimys roberti and P. oris (Rodentia: Echimyidae) from Eastern Amazonia and Central Brasil. J Mammal, 82:109-122. Wilson, D.E.; Reeder, D.M. 2005. Mammal species of the world: a taxonomic and geographic reference. Smithsonian Institute Press. Washington. 1206pp. Woods, C.A. 1993. Suborder Hystricognathi. In: Wilson, D.E., Reeder, D.M. (Eds.), Mammals Species of the World, a Taxonomic and Geographic Reference. Smithsonian Institution Press, Washington, pp. 771–806. Woods, C.A.; Kilpatrick, C.W. 2005. Infraorder Hystricognathi. In: Wilson, D.E., Reeder, D.M. (Eds.) Mammals Species of the World, a Taxonomic and Geographic Reference. 3ª Edição. John Hopkins University Press, Baltimore MD, pp.1538-1600. Yonenaga, Y. 1975. Karyotypes and chromosome polymorphism in Brazilian rodents. Caryologia, 28: 269-286. Yonenaga, Y. 1977. Perspectivas em citogenética de mamíferos brasileiros. Revista Brasileira de Pesquisa Médica e Biológica, 10(6): 431-433. Yonenaga-Yassuda, Y. 2004. Contribuição da FISH à citogenética de mamíferos e répteis. In: Guerra, M. FISH - Conceitos e aplicações na citogenética. Sociedade Brasileira de Genética, Ribeirão Preto, Brasil. pp. 89-114. Yonenaga-Yassuda, Y.; Souza, M.J.; Kasahara, S.; L’Abbate, M.; Chu, H.T. 1985. Supernumerary system in Proechimys iheringi iheringi (Rodentia, Echimydae) from the state of São Paulo, Brazil. Caryologia, 38: 179-194. Zanchin, N.I. 1988. Estudos cromossômicos em orizominos e equimídeos da Mata Atlântica. Dissertação de mestrado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil. 160p. Zeigler, D. 2014. Transposable elements, viruses, and genomes. In: Zeigler, D. (Ed) Evolution: Components and Mechanisms, v.1. Academic Press, pp.55- 60.