UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO

REVISÃO DO GÊNERO BLUMENAVIA MÖLLER (): INTEGRAÇÃO DE DADOS MORFOLÓGICOS E MOLECULARES

GISLAINE CRISTINA DE SOUZA MELANDA ______Dissertação de Mestrado Natal/RN, fevereiro de 2018 GISLAINE CRISTINA DE SOUZA MELANDA

REVISÃO DO GÊNERO BLUMENAVIA MÖLLER (PHALLALES): INTEGRAÇÃO DE DADOS MORFOLÓGICOS E MOLECULARES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução.

Orientador: Profº. Dr. Iuri Goulart Baseia Coorientadora: Dra. María P. Martín

Natal/RN 2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - •Centro de Biociências - CB

Melanda, Gislaine Cristina de Souza. Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares / Gislaine Cristina de Souza Melanda. - Natal, 2018. 155 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução. Orientador: Prof. Dr. Iuri Goulart Baseia. Coorientadora: Profa. Dra. María P. Martín.

1. Clathraceae - Dissertação. 2. Gasteromycetes - Dissertação. 3. Sistemática - Dissertação. 4. Taxonomia - Dissertação. 5. Espécies novas - Dissertação. 6. Análise multigênica - Dissertação. I. Baseia, Iuri Goulart. II. Martín, María P. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 57.06

Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351

GISLAINE CRISTINA DE SOUZA MELANDA

REVISÃO DO GÊNERO BLUMENAVIA MÖLLER (PHALLALES): INTEGRAÇÃO DE DADOS MORFOLÓGICOS E MOLECULARES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução.

Área de concentração: Sistemática e Evolução

Aprovada em 15/02/2018

BANCA EXAMINADORA:

______Dr. Iuri Goulart Baseia Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Orientador)

______Dra. Bianca Denise Barbosa da Silva Universidade Federal da Bahia

______Dra. Tiara Sousa Cabral Universidade Federal do Rio Grande do Norte

DEDICATÓRIA

Dedico ao meus pais, Almerinda e Luiz, e ao meu esposo Alexandre, por sempre me apoiarem, incentivarem e acreditarem em mim, e ao Profº Drº Iuri por me dar um voto de confiança.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por me iluminar e me fortificar a cada dia, por me arientar e me dar sempre alegria e coragem. Ao meu orientador Dr. Iuri Goulart Baseia por me aceitar orientar mesmo não me conhecendo ainda, por acreditar no meu trabalho e me dar um voto de confiança. Por todo incentivo que me deu ao longo destes dois anos e por sempre se preocupar pela boa realização do trabalho, disponibilando sempre os recursos materiais necessários. Agradeço também por sempre estar preocupado com minha vida pessoal, estando disposto a ajudar em qualquer necessidade. À minha coorientadora Dr. Maria Paz Martín Esteban, do Real Jardín Botánico de Madrid, mesmo em outro país sempre se fez presente, disposta a ensinar e tirar dúvidas com muita excelência, o que foi indispensável para um bom desenvolvimento da minha dissertação. Ao Dr. Paulo Marinho, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pelo espaço cedido e pelo ótimo suporte nas análises moleculares. Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução, Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela oportunidade. E à secretária do Programa, Gisele S. M. de Melo, que sempre esteve disposta a esclarecer minhas dúvidas e resolver o necessário para um bom andamento do curso. Aos professores que ministraram as aulas durante estes anos, foram inspirações para mim, muito importantes para minha formação acadêmica. À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução, Dr. Bruno Tomio Goto e Dr. Bruno Cavalcante Bellini. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de doutorado, imprescindível para minha permanência em Natal e para a realização desta pesquisa. Ao projeto Pesquisador Visitante Especial do Programa Ciência sem Fronteiras – ESTUDOS TAXONOMICOS E FILOGENETICOS DE FUNGOS GASTEROIDES COM ENFASE EM LYCOPERDACEAE – no qual fui beneficiada com recursos para as análises moleculares e por ter proporcionado a vinda da Dr. Maria Paz Martín o que me proporcionou ensinamentos valiosos. Aos professores Dr. Bruno Tomio Goto, Dr. Fulvio Aurelio de Morais Freire e Dr. Bruno Cavalcante Bellini pela revisão e avaliação do meu projeto incial, o que foi muito

importante para o inicio das minhas atividades. Novamente ao Dr. Bruno Cavalcante Bellini e à Dra. Raquel Cordeiro Theodoro por terem aceitado participar da minha qualificação e me daram contribuições valiosas para a minha dissertação final. Aos curadores de Herbário que responderam as solicitações, enviando materiais quando disponíveis, o que foi fundamental para o desenvolvimento da dissertação. Aos meus pais, Almerinda Sordi Souza e Luiz Geraldo de Souza, pelo apoio durante toda minha formação, eles nunca me impuseram nenhum curso ou área, mas sempre me apoiaram e acreditaram no meu sonho. Ao meu pai e à Silvanete Macedo pela companhia durante as coletas, sem o suporte e apoio deles não seria possível. Aproveito para agradecer meus outros companheiros de coleta Felipe, Alexandro e Ana Clarissa. Ao meu esposo, Alexandre, que deixou tudo em Londrina para me acompanhar, por acreditar no meu sonho e vontade de fazer este mestrado, por acreditar mais em mim que eu mesmo, por me apoiar e animar em todos os momentos, por me conhecer tão bem e não deixar de me incentivar. Aos meus demais familiares que ficaram em Londrina, de longe sempre mandando energias positivas e sempre rezando por minha vida aqui, aos meus sobrinhos, Emanuel, Maria Votória, Ian, Beatriz e Nicolas, que alegram minha vida e me enchem de orgulho. Às minhas amigas de infância, Daiane, Mayara, Rafaela, Magnane, Taiane, Jéssica, Karlla, que acompanharam as minhas escolhas e sempre me apoiaram. Aos meus amigos de faculdade, Aline, Bianca, Jheimison, Jéssica Vidal, Amanda, Hanny, Gabriela que mesmo cada um tomando um caminho sempre torceram por mim e me ajudaram quando precisei. À Vanessa que me deu suporte no meu estágio durante a graduação e até hoje sempre esteve disposta a mostrar as consequências dos caminhos que eu poderia tomar nesta vida acadêmica. À Dra. Anabela Marisa Azul que durante a minha graduação saduiche me apresentou seus estudos e me fez ficar encantada pelos cogumelos. Aos meus amigos do BCC (Brasileiros Católicos em Coimbra), Rodrigo, Marcílio, Mariana, Jonata, Laís, Fernanda, Nicole, Thaís, que me apoiaram durante minha estadia em Portugal, na graduação, e continuaram sendo uma família para mim. Sem esquecer é claro da Cíntia, que tornou minhas vindas a Natal muito mais simples e acolhedoras. À Jaydeth, amiga que me acompanhou desde Portugal. Também às minhas amigas de fé Lucimara, Irmã Ideralda e Rafaela que não me deixaram desamaparadas pelo amor de Deus que me mostram sempre. Aos que conheci durante minha estadia em Natal, Kássia que me ajudou muito nas minhas vindas para realizar a seleção, jamais esquecerei seu gesto. À Verena e Edna, vizinhas que se tornaram família. Aos que compartilharam comigo a vida de mestranda, entrando na

mesma selação e passando pelas mesmas dificuldades, Ana Carolina, Alexandro, Brayan e Nielson. Aos doutorandos que compartilharam suas experiências durante as aulas, Flávia, Yasmin, Ricardo, Rudy, João Paulo, em especial à Mariana que além de dividir suas experiências foi uma amiga que me ouviu muito, me entendeu e me ajudou nesta etapa me preparando para o futuro. Agradeço imensamente a todos do Laboratório de Biologia de Fungos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, por me acolherem tão bem e me ensinarem tanto. Ao Marcelo por me incentivar quando estive pela primeira vez em Natal. Ao Donis e Pâmela por me acolherem em sua casa nos primeiros dias quando cheguei em Natal e por continuarem sendo muito prestativos. À Renato, Ana Clarissa, Nathalia e Alexandro que além de me ajudarem na pesquisa se tornaram meus amigos, os quais eu pude compartilhar minhas fraquezas e alegrias. Ana Clarissa agradeço mais uma vez por me ensinar praticamente todo o funcionamento do laboratório e por ter me ensinado a coletar, jamais esquecerei. Ao Rhudson, Thiago, Julieth, Renan e Alexandre (conterrâneo) por sempre estarem dispostos a me ajudar. À Rafaela e Gleyce, companheiras de publicação, torço de mais por vocês e acredito que irão muito longe. À Cinthia, Ana Paula, Freitas, Miguel, Jefferson, Brenda e Layla, por toda ajuda e companheirismo, admiro a disposição de vocês e também torço pelo sucesso e realização de cada um. À Tiara e Bianca, por aceitarem participarem da minha banca final e por compartilharem comigo a vasta experiência que possuem e sempre estiveram dispostas a me ajudar, ensinar, enviar trabalhos, agradeço por tudo mesmo. Também agradeço à Fátima que proporcionou um bom ambiente de trabalho. Meus sinceros agradecimentos a todos que direta ou indiretamente foram importantes para mim durante estes anos.

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.

Madre Teresa de Calcutá

RESUMO

Os fungos da ordem Phallales utilizam odores atrativos e uma adesiva para propagar seus esporos através de agentes dispersores, principalmente artrópodes, sendo chamados de stinkhorns (chifres fedorentos). O gênero Blumenavia Möller é um representante desta ordem e pertence à família Clathareae, atualmente, com base em dados morfológicos, apenas duas espécies são consideradas: Blumenavia rhacodes Möller e B. angolensis (Welw. & Curr.) Dring, cujas localidades tipo são Brasil e África, respectivamente. Outras duas espécies descritas foram consideradas sinônimos por alguns autores, Blumenavia toribiotalpaensis Vargas-Rodr. sinonimizada com B. rhacodes, e B. usambarensis Henn. sinonimizada com B. angolensis. Foi constatada a inconsistência dos caracteres morfológicos utilizados para a delimitação das espécies do gênero e a escassez de dados moleculares, em especial da região ITS. Este trabalho objetivou revisar e identificar os caracteres informativos e melhor delimitar as espécies de Blumenavia. Foram analisadas 32 exsicatas provenientes de herbários nacionais e internacionais indexados, além de uma basidioma coletado no estado do Ceará, por meio de um estudo comparativo morfológico e molecular, usando sequências ITS, LSU, ATP6, RPB2 e TEF1α. Para descrição morfológica destes espécimes foram analisados macro e microestruturas (rizomorfa, volva, braços, glebíferos e esporos) em KOH 5%, Reagente de Melzer, Vermelho Congo 1% e Azul de Algodão. Os resultados concatenados (morfológicos e moleculares, com 42 novas sequências geradas) permitiram delimitar sete espécies para o gênero, Blumenavia rhacodes e B. angolensis se mantiveram, B. usambarensis e B. toribiotalpaensis foram reconsideradas e foram propostas três espécies novas para o gênero. Os caracteres: cor, espessura (da base ao ápice) e sulco na face exterior e interior dos braços, bem como a disposição e formas dos glebíferos, tamanho e forma dos esporos, hifas do exoperídio apical (filamentosa e/ou globosas), presença de cristais nas camadas do perídio foram delimitados como pertinentes para a segregação e delimitação das espécies dentro do gênero.

Palavras-chave: Clathraceae; gasteromycetes; sistemática; taxonomia; espécies novas; análise multigênica.

ABSTRACT

Phallales is the order represented by fungi called stinkhorns that use attractive odors and an adhesive gleba to propagate its through dispersing agents, mainly arthropods. The genus Blumenavia is a gasteroid fungi. This genus is included in the family Clathraceae. Currently, based on only in morphological data, two species are considered for the genus: Blumenavia rhacodes and B. angolensis, whose type localities are Brazil and , respectively. Two other species, described previously, were considered synonymous by some authors: Blumenavia toribiotalpaensis originally described for Mexico and synonimized with B. rhacodes and B. usambarensis synonimized with B. angolensis. It was verified the inconsistency of the morphological characters used for the delimitation of the species and the scarcity of molecular data, especially of the ITS region. With the objective of reviewing and identify informative characters of the genus and the best species delimitation, the present work was conducted by comparative morphological and molecular studies using ITS, LSU, ATP6, RPB2 and TEF1α sequences from 32 collections from several herbaria, as well a specimen collected from the state of Ceará-BR. For the morphological description of these specimens were analyzed macro and microstructures (rhizomorph, volva, columns, glebiferous and spores) in 5% KOH, Melzer Reagent, 1% Congo Red and Cotton Blue. Seven species for this genus was delimited based on the concatenated results (morphological and molecular, with 42 new sequences generated). Blumenavia rhacodes and B. angolensis manteined, B. usambarensis and B. toribiotalpaensis were reconsidered here, and three new species are proposed for the genus. The characters: arms color and thickness, as well as the presence of grooves on their faces; shape and arrangement of glebifers; size and shape of basidiospores; hyphae of apical exoperium and criytals in peridium layers were defined as relevant for segregation and delimitation of species within the genus.

Key words: Clathraceae; Gasteromycetes; Systematic; ; New species; Multigenic analysis.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Filogenia e classificação de e outros ...... 19 Figura 2 – Relação filogenética entre os representantes da ordem Phallales ...... 21 Figura 3 – Tipos de desenvolvimento em Phallales ...... 24 Figura 4 – Esboço esquemático da provável filogenia dos gêneros da ordem Phallales proposta por Cunningham (1944) ...... 23 Figura 5 – Possível evolução das séries da família Clathraceae segundo Pegler e Gomez (1994) ...... 25 Figura 6 – Imagens dos protólogos das espécies de Blumenavia ...... 29 Figura 7 – Imagens de espécimes de Blumenavia rhacodes em publicações ...... 35 Figura 8 – Imagens de espécimes de Blumenavia angolensis em publicações ...... 36 Figura 9 – Área de Proteção Ambiental do Maciço de Baturité, Guaramiranga – CE ...... 39 Figura 10 – Áreas de coleta em Blumenau – SC ...... 41 Figura 11 – Unidade de Conservação Ambiental do Desterro (UCAD), Florianópolis – SC .. 42 Figura 12 – Áreas de coleta em Joinville – SC e em Londrina – PR ...... 43 Figura 13 – Ovo e camadas do perídio de Blumenavia ...... 46 Figura 14 – Equipamentos utilizados para realização das análises morfológicas ...... 48 Figura 15 – Representação de um basidioma expandido de Blumenavia...... 48 Figura 16 – Tipos de cristais observados em Blumenavia ...... 51 Figura 17 – Materiais e equipamentos utilizados na análise molecular ...... 53 Figura 18 – Imagem digital do basidioma de rhacodes (SI 218229) ...... 57 Figura 19 – Ovos e basidioma expandido de Blumenavia coletados em Guaramiranga – CE. 72 Figura 20 – Topologia da árvore filogenética da matriz concatenada obtida por análise Bayasiana ...... 79 Figura 21 – Espécimes de Blumenavia angolensis de São Tomé e Príncipe ...... 83 Figura 22 – Espécimes de Blumenavia rhacodes ...... 87 Figura 23 – Microscopia de Blumenavia rhacodes ...... 88 Figura 24 – Espécimes de Blumenavia toribiotalpaensis ...... 91 Figura 25 – Espécime de Blumenavia usambarensis ...... 94 Figura 26 – Espécimes de Blumenavia sp. nov.1 com glebífero PTQ ...... 98 Figura 27 – Espécimes de Blumenavia sp. nov.1 com glebífero PCI ...... 99 Figura 28 – Espécimes de Blumenavia sp. nov.2 ...... 103 Figura 29 – Espécimes de Blumenavia sp. nov.3 ...... 107 Figura 30 – Basidiósporos de Blumenavia ...... 108 Figura 31 – Hifas do exoperídio apical das espécies de Blumenavia ...... 109

Figura 32 – Hifas da rizomorfa das espécies de Blumenavia, em Vermelho Congo 1% ...... 110 Figura 33 – Registros duvidosos ...... 116 Figura 34 – Distribuição mundial do gênero Blumenavia ...... 119

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Resumo das classificações da família Clathraceae ...... 26 Tabela 2: Ordem cronológica das classificações do gênero Blumenavia e sinônimos ...... 28 Tabela 3: Sequências dos primers utilizados ...... 54 Tabela 4: Programas de amplificação para cada região ...... 54 Tabela 5: Total de herbários consultados que responderam ou não à solicitação de disponibilidade de exsicatas de Blumenavia, com o total de herbários que emprestaram ou os materiais solicitados ...... 65 Tabela 6: Herbários que fizeram o empréstimo de exsicatas ...... 66 Tabela 7: Total de exsicatas de Blumenavia e sinônimos em herbários, a nível mundial ...... 67 Tabela 8: Exsicatas de Blumenavia emprestadas ...... 69 Tabela 9: Quantidade do produto da extração de DNA de espécimes de Blumenavia sp., e os primers utilizados para cada marcador no PCR (PCR Beads)...... 74 Tabela 10: Espécimes sequenciados e retirados do GenBank com os respectivos locais de coleta, herbários depositados, números de tombamento e números de acesso do GenBank para cada marcador, quando houver ...... 75 Tabela 11: Comparação dos caracteres diagnósticos do gênero Blumenavia, antes e depois da revisão proposta neste trabalho...... 81 Tabela 12: Principais caracteres morfológicos macroscópicos das espécies de Blumenavia. 111 Tabela 13: Principais caracteres morfológicos microscópicos das espécies de Blumenavia . 113 Tabela 14: Distribuição das espécies do gênero Blumenavia ...... 117

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 15 2 REVISÃO DE LITERATURA ...... 18

2.1 POSIÇÃO TAXONÔMICA DO GÊNERO BLUMENAVIA ...... 18 2.1.1 A ordem Phallales ...... 20 2.1.2 A família Clathraceae ...... 22 2.1.3 O gênero Blumenavia: histórico bibliográfico das tipificações e sinonimizações das espécies do gênero ...... 26 2.1.3.1 Blumenavia rhacodes Möller e sinônimos ...... 26 2.1.3.2 Blumenavia angolensis (Welw. & Curr.) Dring e sinônimos ...... 27 2.2 REGISTROS DE ESPÉCIMES DE BLUMENAVIA ANALISADAS EM PUBLICAÇÕES POR ORDEM CRONOLÓGICA ...... 30 2.3 CONCEITO DE ESPÉCIE UTILIZADO ...... 36 3 METODOLOGIA ...... 37

3.1 OBTENÇÃO DE MATERIAL PARA ANÁLISE ...... 37 3.1.1 Busca por exsicatas de Blumenavia e sinônimos em herbários ...... 37 3.1.2 Coletas ...... 38 3.1.2.1 Áreas de coleta...... 38 3.1.2.2 Metodologia de coleta ...... 44 3.1.2.3 Processamento e herborização dos espécimes ...... 45 3.2 ANÁLISES MORFOLÓGICAS DE ESPÉCIMES HERBORIZADOS ...... 46 3.2.1 Caracteres macroscópicos ...... 47 3.2.2 Caracteres microscópicos ...... 49 3.3 ANÁLISES MOLECULARES ...... 52 3.3.1 Extração e amplificação de DNA ...... 52 3.3.2 Sequenciamento e análises das sequências ...... 54 4 RESULTADOS ...... 56

4.1 RESULTADO DA OBTENÇÃO DE MATERIAIS PARA ANÁLISE ...... 56 4.1.2 Disponibilidade de empréstimo de exsicatas de Blumenavia e sinônimos ...... 56 4.1.2.1 Busca de herbários de forma direta com base em publicações...... 56 4.1.2.2 Species Link ...... 57 4.1.2.3 Mycoportal ...... 58 4.1.2.4 's Virtual Herbarium ...... 59 4.1.2.5 Plataforma EA ...... 59 4.1.2.6 Plataforma Herbário K...... 59 4.1.2.7 Plataforma Index Herbariorum ...... 59 4.1.3 Exsicatas solicitadas e emprestadas...... 63 4.1.4 Espécimes coletados ...... 71 4.1.5 Materiais analisados ...... 71 4.2 ANÁLISES MOLECULARES ...... 73 4.2.1 Extrações e amplificações ...... 73 4.2.2 Análises filogenéticas ...... 75 4.3 ANÁLISES MORFOLÓGICAS ...... 80

4.3.1 Reavaliação dos critérios utilizados para descrição das espécies de Blumenavia 80 4.3.2 Descrições das espécies ...... 82 1- Blumenavia angolensis (Welw. & Curr.) Dring, Kew Bull. 35(1): 53 (1980) [MB#113149] ...... 82 2- Blumenavia rhacodes Möller, Bot. Mitt. Trop.: 57 (1895) [MB#241046] ...... 83 3- Blumenavia toribiotalpaensis Vargas-Rodriguez, Mycotaxon 94: 8 (2005) [MB#356388] ...... 89 4- Blumenavia usambarensis Henn., Botanische Jahrbücher für Systematik Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie 33: 37 (1902) [MB#241148] ...... 92 5- Blumenavia sp. nov. 1 ...... 94 6- Blumenavia sp. nov. 2 ...... 100 7- Blumenavia sp. nov. 3 ...... 104 4.3.3 Chave de identificação para o gênero Blumenavia ...... 116 4.4 DISTRIBUIÇÃO MUNDIAL DO GÊNERO BLUMENAVIA ...... 116 5 DISCUSSÃO ...... 120 6 CONCLUSÃO ...... 122 REFERÊNCIAS ...... 123 APÊNDICES ...... 128

15 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

1 INTRODUÇÃO

Os fungos gasteroides historicamente são agrupados na tradicional classe Gasteromycetes Fr.. A palavra “gasteromycetes” deriva da palavra grega gaster, que significa estômago, e mycetes, fungos, estes atualmente representam um agrupamento polifilético de várias linhagens evolutivamente distintas de representantes da classe Agaricomycetes Doweld, pertencente ao reino Fungi, subreino Dikaria e filo Basidiomycota R.T. Moore (MILLER; MILLER, 1988; HIBBETT et al.,1997). Os basidiomas constituem os corpos de frutificação dos representantes do filo Basidiomycota, cuja função principal é a produção e dispersão de esporos de origem sexuada, chamados basidiósporos. Uma das características que os fungos gasteroides compartilham é a natureza angiocárpica dos basidiomas e a liberação dos esporos por estatismosporia, de forma passiva (MILLER; MILLER, 1988). Angiocárpica é o nome dado à maturação dos basidióporos no interior do corpo de frutificação, protegidos pelo perídio (parede externa que recobre o basidioma). Os basidiósporos maturam em um tecido pegajoso, carnoso ou gelatinoso, chamado gleba, composto por esporos (alguns contendo também hifas estéreis) que é revestido pelo himênio. O himênio é a camada de tecido do corpo de frutificação onde as células se desenvolvem em basídios produtores de esporos (ELLIS; ELLIS,1990). Devido a incapacidade da liberação ativa dos esporos, os fungos gasteroides desenvolveram uma série de mecanismos dispersivos facilitando a sua propagação. Em relação aos mecanismos dispersivos, os fungos da ordem Phallales apresentam um tipo de dispersão muito peculiar, denominado de mecanismo adesivo. Este mecanismo consiste na liberação de odores atrativos aos agentes dispersores (maioria composta por insetos). Ao se alimentar da gleba mucilaginosa o inseto fica com esporos aderidos ao corpo, e promovem a dispersão ao se locomoverem para outro local, ou podem também eliminar os esporos inteiros e viáveis nos seus excrementos (PEGLER; LÆSSØE; SPOONER, 1995; WEBSTER; WEBER, 2007; BASEIA et al., 2014). Dentro da ordem Phallales E. Fisch. está o gênero Blumenavia Möller, proposto pelo naturalista alemão Friedrich Alfred Gustav Jobst Möller em 1895, cuja espécie tipo é Blumenaia rhacodes Möller. As relações entre as espécies do gênero Blumenavia não estão totalmente esclarecidas. Na chave de identificação para o gênero Blumenavia, Dring (1980) utiliza a cor do receptáculo, quantidade de braços e números de tubos. Para Trierveiler-Pereira, Alves, Silveira (2014) é importante a altura, espessura e cor dos braços. A cor da volva e distribuição da gleba 16 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. são variáveis e não devem ser levados em consideração na descrição das diferentes espécies, segundo estes autores. Alguns autores fazem, porém, a distinção das espécies também em relação à disposição da gleba. Em B. rhacodes ela está disposta ao longo de toda a parte interior do braço (DRING, 1980; LÓPEZ; GARCÍA, 2001,2012, VARGAS-RODRÍGUEZ; VÁZQUEZ-GARCÍA, 2005), em B. angolensis, B. usambarensis e B. toribiotalpaensis em um quarto ou um terço da parte superior, ou somente restrita à parte superior (DRING; RAYNER, 1967; DRING, 1980; VARGAS-RODRÍGUEZ; VÁZQUEZ-GARCÍA, 2005; DEGREEF et al., 2013; RODRIGUES; BASEIA, 2013). Alguns espécimens de B. rhacodes foram descritos com receptáculo laranja claro à amarelo e seção tranversal do braço triangular e trapezoidal (DRING, 1980; VARGAS- RODRÍGUEZ; VÁZQUEZ-GARCÍA, 2005; LÓPEZ; GARCÍA, 2012), mas para alguns autores este gênero não possui a cor laranja (TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014). Blumenavia angolensis foi descrita com receptáculo puramente branco e seção tranversal subtriangular ou quadrangular (DRING 1980; VARGAS-RODRÍGUEZ & VÁZQUEZ-GARCÍA 2005; DEGREEF et al., 2013; TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014). Um espécime de B. angolensis coletado no Ceará possuía receptáculo amarelo claro à laranja e seção dos braços semicirculares (Rodrigues & Baseia 2013). A seção dos braços de B. toribotalpaensis é também semicircular. Dring (1980) relatou diferenças no tamanho dos basidiósporos de alguns espécimes de B. angolensis da África com os da América, porém tal autor não pode afirmar tal fato por não ter analisado materiais da África, somente os da América. A utilização da morfologia para identificação das espécies não tem sido completamente eficaz. Tal fato é evidenciado pelos posicionamentos contrários entre diversos autores em relação a definição de caracteres informativos para a segregação e identificação das espécies. A escassez de caracteres morfológicos que diferenciam as espécies e a efemeridade dos corpos de frutificação, leva a limitação dos estudos sobre esse gênero. Ainda assim, a padronização da identificação morfológica para o gênero pode ser empregada se os caracteres se mostrarem informativos para a separação dos clados terminais, e se for estabelecido uma relação destes com os dados filogenéticos obtidos através das análises moleculares (sequências de DNA). No entanto, existem atualmente somente duas sequências de DNA de espécies do gênero disponíveis nos bancos de dados (Genbank). 17 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Faz-se necessário a obtenção de sequências de DNA do maior número de espécies possíveis dentro do gênero e de diversas regiões gênicas, bem como a obtenção de descrições morfológicas detalhadas destes espécimes. Com isso será possível realizar uma revisão do gênero através da integração dos dados de relações filogenéticas e determinação de caracteres morfológicos diagnósticos de cada espécie. Diante destes fatos o objetivo do presente estudo é revisar as coleções do gênero Blumenavia por meio de análises morfológicas e moleculares, sendo possível assim reavaliar os critérios utilizados para segregação das espécies do gênero avaliando quais caracteres morfológicos são informativos, através da comparação com as árvores filogenéticas baseadas nas sequências moleculares obtidas.

18 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 POSIÇÃO TAXONÔMICA DO GÊNERO Blumenavia

O gênero Blumenavia faz parte do subreino Dikaria, filo Basidiomycota, subfilo Agaricomycotina Doweld, classe Agaricomycetes, subclasse Phallomycetidae K. Hosaka, Castellano & Spatafora, ordem Phallales, família Clathraceae Chevall. emend. Baseia. A classe Agaricomycetes contém 21 mil espécies descritas, o que representa 1/5 de todo reino Fungi (KIRK et al., 2008). Todas espécies possuem corpo de frutificação na fase reprodutiva. Segundo estudos recentes baseados em dados moleculares de diversas linhagens evolutivas, os fungos gasteroides estão distribuídos em duas subclasses de Agaricomycetes: Agaricomycetidae e Phallomycetidae (HOSAKA et al., 2006). A Figura 1 mostra a árvore filogenética dos grupos de Agaricomycetes e outros Basidiomycota, destacando-se os clados de Agaricomycetidae e Phallomycetidae, apresentada por Hibbet et al. (2014). A subclasse Phallomycetidae, informalmente chamada de clado gomphoid-phalloid por Hibbett e Thorn (2001), foi proposta por Hosaka et al. (2006), e abriga quatro ordens: Geastrales K. Hosaka & Castellano, Hysterangiales K. Hosaka & Castellano, Gomphales Jülich e Phallales. A ordem Gomphales é a única que engloba tanto formas gasteroides como formas não gasteroides, as demais ordens da subclasse Phallomycetidae são compostas inteiramente por representantes com formas gasteroides. A proposta de Hosaka et al. (2006) foi adotada como um novo consenso na classificação dos fungos proposta no Projeto Assembling the Fungal Tree of Life (AFTOL) (HIBBETT et al., 2007), bem como na última edição do Dictionary of the Fungi (KIRK et al., 2008).

19 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 1 – Filogenia e classificação de Agaricomycetes e outros Basidiomycota

Fonte: Retirado de Hibbett et al. (2014).

20 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

2.1.1 A ordem Phallales

Phallales é conhecida pelos representantes “chifres fedorentos”, stinkhorns, () (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996) e pelos “chifres fedorentos em forma de rede”, lattice stinkhorns (MILLER; MILLER, 1988), mas estudos moleculares indicam que representantes sequestrados também estão inseridos nessa ordem (HOSAKA et al., 2006; HIBBETT et al., 2014). A maior parte possui corpo de frutificação gelatinoso/esponjoso, muitas vezes colorido e podendo ser composto por múltiplos braços de hifas pseudoparênquimatosas (HIBBETT et al., 2014). O receptáculo é a porção do basidioma que suporta a gleba, em alguns falóides como Clathrus P. Micheli este compreende toda a extensão da rede (ou braços) que se estendeu da volva, já em outros, como Phallus Junius ex L., o receptáculo é suportado pelo pseudoestipe, ficando a cima deste (LLOYD, 1909). A gleba é mucilaginosa e geralmente fétida, por isso o nome “chifre fedorento”, pelo odor ocorre a atração de insetos e dispersão dos esporos (HIBBETT et al., 1997). Os corpos de frutificação da ordem Phallales indicam possuir uma forma ancestral semelhante às falsas-trufas. Apesar da maturação dos basidiósporos ocorrer dentro dos corpos de frutificação fechados, o receptáculo é responsável pela exposição do esporo maduro e representa um tecido independente da origem do estipe entre os Basidiomycota (HOSAKA et al., 2006). A ordem Phallales foi descrita por Fischer (1900) com duas famílias Clathraceae e Phallaceae, com corpo de frutificação ramificado em braços e não ramificado, respectivamente. Cunningham (1931) fez uma emenda na ordem ao propor uma terceira família, Claustulaceae, este conceito foi aceito e empregado por um longo tempo: Bottomley (1948); Zeller (1949); Dring (1973); Jülich (1981); Hawksworth et al. (1995); Mills et al. (1997); Kirk et al. (2001); May et al. (2003); Kirk et al. (2008). Atualmente, a ordem Phallales contém sete famílias, sendo elas, Clathraceae, Claustulaceae G. Cunn, Gastrosporiaceae Pilát, Lysuraceae Corda, Phallaceae, Protophallaceae Zeller e Trappeaceae P.M. Kirk (TRIERVEILER-PEREIRA; SILVEIRA; HOSAKA, 2014). O monofiletismo de cada família é fortemente apoiado por análises filogenéticas multigênicas feitas por Trierveiler-Pereira, Silveira, Hosaka (2014), conforme observado na Figura 2. As famílias mais basais da ordem Phallales são: Claustulaceae, Gastrosporiaceae, Protophallaceae e Trappeaceae, todos os representantes exibem um hábito exclusivamente sequestrado. Já os corpos de frutificação tipo stinkhorn são morfologias derivadas em Phallales 21 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

(HOSAKA et al., 2006; HIBBETT et al., 2014). Desde o último balanço de Kirk et al. (2008) foram registrados 29 gêneros e 100 espécies para a ordem. Dentro de Agaricomycetes, a ordem Phallales representa o único exemplo de uma transição de formas sequestradas para formas não sequestradas. Figura 2 – Relação filogenética entre os representantes da ordem Phallales

Legenda: A: árvore consenso obtida por análise de Parcimônia. B: Árvore consenso obtida por Bayesiana. Cl = Clathraceae; Ly = Lysuraceae; Ga = Gastrosporiaceae; Ph = Phallaceae; Pr = Protophallaceae; Ct = Claustulaceae; og = outgroups. Fonte: Retirado de Trierveiler-Pereira, Silveira, Hosaka (2014). 22 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

2.1.2 A família Clathraceae

A família Clathraceae foi proposta por Chevallier em 1826 e abriga os fungos gaiola, do inglês cage fungi (PEGLER; GOMEZ, 1994), também denominados chifres fedorentos em forma de rede, “lattice stinkhorns” (MILLER; MILLER, 1988). Possuem corpo de frutificação esponjoso, tubular com braços ocos, interconectados em forma de rede, entrelaçados, erguidos e soltos ou unidos na ponta (MILLER; MILLER, 1988). Uma emenda na família foi feita por Cabral et al. (2012) ao incluir o gênero Abrachium Baseia & T.S. Cabral que não apresenta braços, estes são colapsados em forma de flor. Kirk et al. (2001) incorporaram os representantes de Clathraceae dentro de Phallaceae. No estudo molecular de Hosaka et al. (2006), sobre a classificação de Phallomycetidae, Clathraceae é reconhecida como uma família monofilética, representada por um grande clado independente de Phallaceae (Figura 2). Cabral et al. (2012) também corroboraram para tal conclusão quando propuseram o gênero Abrachium em Clathraceae. Apesar deste forte indício, Kirk et al. (2008) na mais recente edição do Dictionary of the Fungi, não reconheceram Clathraceae, incorporando os gêneros da família em Phallaceae. Kirk et al. (2008) também não consideraram Lysuraceae como uma família segregada de Clathraceae sensu Dring (1980). Pode-se citar como grupo irmão de Clathraceae a família Phallaceae, mas o período da origem e evolução dos clados ainda é incerta. A família Clathraceae, está intimamente relacionada com Phallaceae morfologicamente, mas difere na complexidade e variabilidade do receptáculo. Nos fungos clatróides, da família Clathraceae, a gleba é suportada diretamente no interior ou na lateral do receptáculo, que pode ser séssil ou com estipe curto, e consiste de uma rede globosa, com vários braços unidos na porção superior ou livres no ápice, como mencionado anteriormente. Observa-se um contraste com Phallaceae, onde a gleba é apoiada externamente na parte superior do receptáculo único (DRING; RAYNER, 1967; DRING, 1980). O ovo também apresenta uma característica distintiva entre as famílias. Em Clatharaceae não é uma camada contínua, como Phallaceae, mas dividida em segmentos por suturas do perídio, cada sutura peridial corresponde a um braço do receptáculo. As linhas de fusão entre a sutura peridial e o perídio podem ser vistas como ligeiras dobras rodando sobre a superfície exterior do ovo fechado (DRING; RAYNER, 1967). Em corte transversal esse ovo caracteriza o desenvolvimento multipileado encontrado em Clathraceae, já em Phallaceae o desenvolvimento é pileado, estes cortes podem ser observados na Figura 3 (MILLER; MILLER, 1988).

23 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 3 – Tipos de desenvolvimento em Phallales

Legenda: a: Pileado. b: Multipileado. h = Himênio. Setas indicam direção de crescimento do tecido primordial da gleba. Fonte: Adaptado de Miller e Miller (1988).

Cunningham (1944) dividiu a família Clathraceae em três tribos de acordo com a forma do receptáculo e disposição da gleba, inferindo a possível evolução do grupo (Figura 4): - Columnateӕ: gêneros Blumenavia, Laternea Turpin e Linderiella G. Cunn., estes possuem receptáculo composto por braços e gleba aderida ao arco superior do receptáculo ou dispostas ao longo dos braços; - Clathrateӕ: gêneros Clathrus P. Micheli ex L., Colus Cavalier & Séchier, Kalchbrennera Berk. e Simblum Klotzsch ex Hook. que apresentam receptáculo séssil ou fusionado abaixo por um pseudoestipe, gleba distribuída na parte interna da superfície do receptáculo; - Stellateӕ: gêneros Anthurus Kalchbr. & MacOwan, Aseroë Labill. e Lysurus Fr. com receptáculo tipo pseudoestipe, gleba restrita à parte superior do receptáculo. Posteriormente, em uma tentativa de sistematizar Clathraceae e utilizando uma combinação de caracteres morfológicos, Dring (1980) divide a família em seis séries: - Anthuroide: Clathrus crispatus Thwaites ex E. Fisch. C. kusanoi (Kobayasi) Dring, C. mauritianus (Lloyd) Dring, C. archeri (Berk.) Dring; - Blumenavioide: Blumenavia, Clathrus sp. nov.1; - Clathrelloide: Clathrus crispus Turpin, C. cameroensis P. Henn., C. baumii P. Henn., C. preussii (P. Henn.) P. Henn. ex Sacc., C. chrysomycelinus Möller, C. oahuensis Dring, C. delicatus Berk. & Broome, Ileodictyon Tul. & C. Tul.; 24 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

- Laternoide: Micheli ex Persoon; C. columnatus Bosc; C. bicolumnatus (Lloyd) Sacc. & Trotter; Laternea; - Lysuroide: Aseröe, Colus, Lysurus, Pseudocolus Lloyd; - Treubii: Clathrus treubii (Bernard) Lloyd. Dring (1980) considerou como pertencente à família os gêneros Ileodictyon e Pseudocolus, não presentes na classificação de Cunningham (1944), além de distribuir espécies de Clathrus em diferentes séries. O autor também incluiu Anthurus em Clathrus, e Kalchbrennera e Simblum em Lysurus aceitando, portanto, oito gêneros para a família.

Figura 4 – Esboço esquemático da provável filogenia dos gêneros da ordem Phallales proposta por Cunningham (1944)

Fonte: Adaptação de Cunningham (1944).

Outra forma de classificação foi sugerida por Pegler e Gomez (1994) dividindo a família em quatorze gêneros, distribuídas em três séries, utilizando como principal caractere a disposição da gleba no receptáculo (Figura 6): - Série Clathroide: Anthurus, Blumenavia, Clathrus, Ileodictyon; - Série Lysuroide: Aseroë, Colus, Lysurus, Kalchbrennera, Neolysurus O.K. Mill., Ovrebo & Burk, Pseudocolus, Simblum; - Série Laternoide: Laternea, Linderiella, Ligiella J.A. Sáenz.

25 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 5 – Possível evolução das séries da família Clathraceae segundo Pegler e Gomez (1994)

Fonte: Adaptação de Pegler e Gomez (1994).

26 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Um resumo com os gêneros de cada divisão proposta por Cunningham (1944), Dring (1980) e Pegler e Gomez (1994) pode ser observado na Tabela 1. O que diferencia os gêneros na família é, portanto, a forma do corpo de frutificação e a disposição da gleba. Dring (1980) e Pegler e Gomez (1994) afirmam que há uma tendência para a diversificação de formas mais simples sem braços (taxa basais) para aquelas em forma de rede (taxa derivados), promovendo uma maior área de exposição da gleba. Segundo Dring (1980), as formas dos corpos de frutificação desta família representam uma adaptação óbvia para a dispersão de esporos por insetos. Em relação aos taxons basais, para Möller (1895) é do gênero Clathrus, formado por uma rede oca, que derivam as outras formas.

Tabela 1: Resumo das classificações da família Clathraceae Autores Classificação TRIBOS Columnateӕ Clathrateӕ Stellateӕ Clathrus , Blumenavia , Anthurus, Cunningham(1944) Gêneros Colus, Laternea, Aseroë, correspondentes Kalchbrennera, Linderiella Lysurus Simblum SÉRIES Anthuroide Blumenavioid Clathrelloide Laternoide Lysuroide Aseröe , Dring (1980) Gêneros Blumenavia , Clathrus, Clathrus, Colus , Clathrus correspondentes Clathrus Ileodictyon Laternea Lysurus , Pseudocolus SÉRIES Clathroide Lysuroide Laternoide Aseroë, Colus, Anthurus, Lysurus, Laternea, Pegler e Gomez (1994) Gêneros Blumenavia, Kalchbrennera, Linderiella, correspondentes Clathrus, Neolysurus, Ligiella Ileodictyon Pseudocolus, Simblum Fonte: Autoria da prória autora com os dados retirados de Cunningham (1944); Dring (1980); Pegler e Gomez (1994).

2.1.3 O gênero Blumenavia: histórico bibliográfico das tipificações e sinonimizações das espécies do gênero

2.1.3.1 Blumenavia rhacodes Möller e sinônimos

O gênero Blumenavia é procedente de Blumenau (SC-BR) e a etimologia do gênero faz referência à esta localidade. 27 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Lloyd (1909) sinonimizou Blumenavia rhacodes com Laternea rhacodes (Möller) Lloyd, uma vez que para ele o caráter que distingue a primeira, células internas dos braços rasgadas e laceradas, não seria um carácter suficiente para separar em outro gênero. Entretanto, esta sinomização não foi aceita por autores posteriores (DRING, 1980; LÓPEZ; GARCÍA, 2001, 2012; RODRIGUES; BASEIA, 2013; TRIERVEILER-PEREIRA, 2014; TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014), bem como na plataforma Species Fungorum (http://www.speciesfungorum.org), nesta última a espécie Laternea rhacodes se mostra como sinônimo de Blumenavia rhacodes, sendo a última o nome vigente. Blumenavia toribiotalpaensis Vargas-Rodr. é a mais recente espécie descrita para o gênero (VARGAS-RODRIGUEZ; VÁZQUEZ-GARCÍA, 2005) até este trabalho. Os caracteres apresentados no protólogo que a separa das outras espécies do gênero são: cor, tamanho dos basidiósporos, disposição da gleba nos braços do receptáculo e seção transversal do braço. Calonge et al. (2007) reduziram Blumenavia toribiotalpaensis como sinônimo de B. rhacodes, por meio de comparação morfológica. Esta sinonimização foi adotada por demais autores (LÓPEZ, GARCÍA, 2012; TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014).

2.1.3.2 Blumenavia angolensis (Welw. & Curr.) Dring e sinônimos

Welwitsch e Currey (1870) descreveram a espécie Laternea angolensis Welw. & Curr. de uma coleta próximo à Catete em Angola, Punto Andongo-África em 10 de dezembro de 1856. Fischer (1886) altera o gênero da espécie para Clathrus, permanecendo o mesmo epíteto: Clathrus angolensis (Welw. & Curr.) Fischer. O mesmo autor em 1933, muda novamente o gênero da espécie, passando a ser considerada como Collonaria angolensis (Welw. & Curr.) E. Fisch.. O tipo de Blumenavia usambarensis Henn. foi coletado em 19 de janeiro de 1900 em Usambara: Derema, Tanzânia- África. As quatro espécies citadas anteriormentes foram utilizadas por Dring (1980) para propor a combinação nova: Blumenavia angolensis (Welw. & Curr.) Dring. O basiônimo é Laternea angolensis, com as sinônímias homotípicas: Clathrus angolensis, Colonnaria angolensis, e com a sinonímia heterotípica: Blumenavia usambarensis. Esta classificação foi adotada por autores subsequentes (DEGREEF et al., 2013; RODRIGUES; BASEIA, 2013; TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014, DESJARDIN, PERRY, 2015). 28 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Um resumo da ordem cronológica das obras que classificaram espécies do gênero é apresentado na Tabela 2. As figuras das espécies de Blumenavia presente nos protólogos estão agrupadas na Figura 6.

Tabela 2: Ordem cronológica das classificações do gênero Blumenavia e sinônimos Autor, data Acontecimento Welwitsch e Frederich Currey, 1868 Descrição da espécie nova Laternea angolensis Ed. Fischer, 1886 Laterna angolensis como sinônimo de Clathrus angolensis Möller, 1895 Descrição do gênero novo Blumenavia , tipo Blumenavia rhacodes P. Hennings, 1902 Descrição da espécie nova Blumenavia usambarensis Lloyd, 1909 Blumenavia rhacodes como sinônimo de Laterna rhacodes Ed. Fischer, 1933 Clathrus angolensis como sinônimo de Collonaria angolensis Descrição da combinação nova Blumenavia angolensis, com os Dring, 1980 sinônimos Laternea angolensis , Clathrus angolensis , Colonnaria angolensis e Blumenavia usambarensis Yalma L. Vargas-Rodriguez e J. Antonio Vázquez-García, 2005 Descrição da espécie nova Blumenavia toribiotalpaensis Fonte: Autoria prória com os dados retirados de Welwitsh e Currey (1944), Fisher (1886, 1933); Möller (1895); Hennings (1902); Lloyd (1909); Dring (1980); Vargas-Rodriguez e Vázquez-García (2005).

29 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 6 – Imagens dos protólogos das espécies de Blumenavia

Legenda: a: Basidiomas de Blumenavia rhacodes de Blumenau – SC (tipo). b: Ilustração de Laternea angolensis. c: Ilustação de Blumenavia angolensis. d: Basidiomas e vista superior de B. toribiotalpaensis. Seta indica que a figura é a representação da parte superior do receptáculo ao lado. Barras: a-d = 1 cm. Fonte: Imagens retiradas de: a: Möller (1895). b: Welwitsch e Currey (1868). c: Dring (1980). d: Vargas-Rodriguez e Vázquez-García (2005). 30 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

2.2 REGISTROS DE ESPÉCIMES DE Blumenavia ANALISADAS EM PUBLICAÇÕES POR

ORDEM CRONOLÓGICA

Os protólogos de Laternea angolensis, Blumenavia usambarensis e o de B. rhacodes não especificam onde os tipos foram depositados. Fisher (1900) faz a descrição do gênero Blumenavia considerando apenas B. rhacodes como pertencente a ele. É exibida uma ilustração para tal espécie evidenciando os glebíferos tipo asas ao longo de todos braços (Figura 7 a). Este autor não cita materiais adicionais analisados, além da publicação de Möller (1895). Em 1905, Lloyd analisou um exemplar de Blumenavia rhacodes coletado no Rio grande do Sul pelo Padre Rick (sem data) (Figura 7 b), o autor evidencia que tal exemplar possuía os braços mais delgados que o exemplar descrito por Möller (1895). Para a sinonimização do gênero Blumenavia com Laternea Lloyd (1909) comparou o mesmo material analisado em 1905 com o tipo descrito por Möller Dennis (1953) analisou um exemplar de Blumenavia rhacodes de Trinidad, coletado em trilha de floresta tropical, 1800 m, em Naranja, Cordilheira Norte, de 2 de outubro de 1949, coletor R. W. G. Dennis s.n.. Para tais autores este material se tratava de Blumenavia rhacodes porém possuía a cor branca. Pela cor branca Dring e Rayner (1967) mencionam o mesmo material como sendo um exemplar de Blumenavia usambarensis (Figura 7 c) e Dring (1980) como B. angolensis. Este material encontra-se depositado no Herbarium Royal Botanic Gardens, Kew (K) com o número 153781, na Inglaterra, como Blumenavia angolensis. Dring (1980) analisou espécimes de B. rhacodes do Rio Grande do Sul depositadas no Herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICN), coletados em Viamão em 5 de julho de 1970 por F. R. Schoenwald (ICN 6131), e em Santa Cruz do Sul, Trombudo, em 7 de setembro de 1975 por J. L. Waechter (ICN 6534), ambas estão armazenadas em álcool. Dring (1980) também analisa o material coletado por J. Rick (SI 21829) em 1932, depositado no herbário Instituto de Botánica Darwinion (SI) da Argentina, segundo a publicação ele foi coletado em Santa Catarina, São Leopolda, mas ao consultar a imagem digital do material, cedida pelo herbário, a localização correta é a cidade de São Leopoldo no estado do Rio Grande do Sul. Tal autor apresentou uma ilustração da espécie (Figura 7 d). Para propor a combinação nova Blumenavia angolensis, Dring (1980) analisou exemplares da África e América do Sul. África: Pungo Andongo, próximo de Catete, 10 de dezembro de 1856, Welwitsch 120, ilustração, holótipo (somente existe o registro da imagem 31 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. deste material), depositado no Herbarium K (Figura 6 b). América do Sul: Brasil, São Paulo, Instituto de Botânica, Parque, 14 de outubro de 1966 (coletado por B. Stkvortzov e determinada por Dring como Blumenavia usambarensis – SP 97633); Trinidad, Naranja, Norte ao lado da Trilha Tucuche, 600 m, 2 de outubro de 1949, R. W. G. Dennis. Este último exemplar foi citado como B. rhacodes por Dennis (1953) e Blumenavia usambarensis por Dring e Rayner (1967), como mencionado anteriormente (Figura 7 c), que pela cor branca fez se agrupar à combinação nova proposta por Dring (1980). Na discussão da combinação nova sugere que o registro de Montagne (1850, 1854) para o Chile como Laternea triscapa Turpin se trata, pela figura, de B. angolensis. Domínguez de Toledo (1995) analisou as exsicatas de Blumenavia rhacodes depositidas no Herbario IMBIV-Museo Botánico (CORD) da Província de Córbada na Argentina: Departamento Capital - Villa Warcale, Country Club Colegio de Escribanos em 13 de abril de 1991, Domínguez & Daniele 1056; Departamento Colón: Ascochinga, 16 de abril de 1989, L. Domínguez 520; Departamento Punilla, El Diquecito em 20 de janeiro de 1979, L. Domínguez 787; Departamento Totoral, Villa de Totoral em abril de 1986, L. Domínguez 769. Na Província de Santa Fé: Departamento Capital, Cidade de Santa Fé em março de 1986, L. Domínguez 767 (Figura 7 e). Vargas-Rodriguez e Vázquez-García (2005) publicaram a espécie Blumenavia toribiotalpaensis analisando um total de 12 exemplares. O holótipo foi depositado no U.S. National Collections (BPI) coletado no México, Talpa de Allende, em floresta de transição, “Ojo de Agua del Cuervo”, Oeste ao Cumbre de los Arrastrados (20º 11” N; 105º 16” W), 1800 m alt., em tronco caído e detritos de Pinus sp., em 10 de setembro de 2002, Yalma L. Vargas-Rodriguez 24. O isótipo Yalma L. Yalma L. Vargas-Rodriguez 240a está depositado no Herbario do Instituto de Botánica, Universidad de Guadalajara (IBUG). Os parátipos coletados em 14 de setembro de 2003, em tronco caído e detritos de Pinus sp. nov.e Carpinus caroliniana, Yalma L. Vargas-Rodriguez 422b, 423a, 423b e J. Antonio Vázquez-García, estão preservadas em Formalin - Acetic Acid - Alcohol (FAA) no Bernard Lowy Mycological Herbarium - Louisiana State University (LSUM) e a coleta do mesmo dia de Yalma L. Vargas- Rodriguez 422a e J. Antonio Vázquez-García está em FAA no IBUG; os coletados em 13 de setembro de 2005, Yalma L. Vargas-Rodriguez 454, 456, 462 e J. Antonio Vázquez-García) estão desidratadas no IBUG, e coleta do mesmo dia Yalma L. Vargas-Rodriguez 459, 463 e J. Antonio Vázquez-García estão desidratadas no LSUM. Calonge et al. (2007) e López e García (2001, 2012) analisaram materiais coletados no México. Calonge et al. (2007) analisou espécies do Herbario do Instituto de Ecología, A.C. 32 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

(XAL) e do IBUG. Do IBUG foi analisado o material de Jalisco, Talpa de Allende, Oeste de la Cumbre de los Arrastrados, junto al Ojo de agua del Cuervo, 1800 m, 10 de novembro de 2002, Y.L. Vargas e al., 240a. Material analisado para propor a espécie nova Blumenavia. toribiotalpaensis, por Vargas-Rodriguez e Vázquez-García (2005). Do XAL foram analisados materiais de Michoacán, Cañada de Cointzio, 8 de outubro de 1994, X. Madrigal 4535, . De Veracruz: Xalapa, Jardin Botánico F.J. Clavijero, bosque mesófilo, km 2,4 carretera Xalapa- Coatepec, 19 de agosto de 2005, E. Gándara 1455; Ibidem, 24 de julho de 1998, R. Mede1 654; Ibidem, 13 de junho de 1986, Jc. Anel 410. Colonia Cerro Colorado, 5 de julho de 1991, F Tapia 712. Jardin Botánico F.J. Clavijero, 30 de setembro de 19n, S. Chacón 5107. Ibidem, 27 de setembro de 1998, R. Madel 672. Ibidem, 9 de junho de 2000, S. Chacón 5257-A. Ibidem, 9 de novembro de 1999, D. Jarvio 370. Ibidem, 21 de novembro de 2000, D. Jarvio 778. Ibiem, 17 de agosto de 1998, R. Medel 662. Amantlán, perto da lixeira: 9 de julho de 1986, R. Farias. Em jardim privado: 14 de janeiro de 1991, S. Chacón 4475. López e García (2001) analisaram uma exsicata do Caminho à Teocelo, López 1325. A mesma foi analisada no trabalho dos mesmos autores de 2012, com adição de mais oito materiais: 1 km há Oeste de Alborada, Emiliano Zapata, García 747 e 764; Cerro La Martinica, Banderilla, de 23 de julho de 1983, A. Aguirre; Parque Ecológico El Haya, Xalapa, 5 de setembro de 2005 e 29 de março de 2010, López e García; Prados da Facultade de Biologia, Zona Universitaria, Xalapa, 21, 22 e 25 de junho de 2012, López y García. Todos estes materiais estão depositados no Herbário da Universidad Veracruzana (XALU) (Figura 7 f). Degreef et al. (2013) analisaram um material da África, São Tomé, Parque Nacional do Obô, trilha do Jardim Botânico do Bom Sucesso até Lagoa Amelia, N 0˚17'315 E 6˚36'745, aprox. 1200 m alt., sobre folhagem, em árvore Ficus sp., de 12 de abril de 2011, Degreef 772. O material está depositado no Herbarium Botanic Garden Meise (BR) (Figura 8 a). Rodrigues e Baseia (2013) analisaram um material do estado do Ceará no Brasil, cidade de Guaramiranga, Trilha dos Veadeiros, 04º15’18.8” S, 38º55’52.3” W, 865 m, de 07 de julho de 2012, A.C.M. Rodrigues e T.L.D. Silva, depositada no UFRN-Fungos com o número de tombamento 1943 (Figura 8 c). Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014) analisaram espécimes de Blumenavia rhacodes do Brasil, estado do Rio Grando do Sul (RS) depositadas no ICN: coletas de Trierveiler-Pereira no Morro Santana, Porto Alegre em maio de 2011: dia 17, Trierveiler- Pereira 230 (ICN176968) e dia 31, L. Trierveiler-Pereira 247 (ICN176969); coletas de EP. Fazolino no Campus da Universidade Federal do Rio Grande (UFRS), também em Porto Alegre em abril de 2014: dia 1º, E.P. Fazolino 164 (ICN177266) e dia 02, E.P. Fazolino 165 33 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

(ICN177267) (Figura 7 g). Estes autores também analisaram o material depositado no Herbário do Instituto Anchietano de Pesquisas/UNISINOS-RS (PACA-Fungi), coletado por J. Rick também no RS, na cidade de São Leopoldo: de 1906 (PACA-Fungi 12550) e 1907 (PACA- Fungi 12552). Assim como uma exsicata do mesmo coletor para o Brasil (sem especificar a localidade nem a data de coleta na exsicata) depositada no BPI (BPI 703249). As exsicatas de Blumenavia angolensis analisadas por Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014) foram todas coletas do Brasil: Estado do Paraná, Antonina, Reserva Natural do Rio Cachoeira, em 17 de agosto de 2005, A.A.R. de Meijer 4339 (MBM); Santa Catarina, Florianópolis, Unidade de Conservação Desterro, 9 de novembro de 2013, A.C. Magnago 816 (FLOR 51619) (Figura 8 d); Rio Grande do Sul, São Francisco de Paula, FLONA de São Francisco de Paula, 8 de feveiro de 2014, C.R. Alves 143 (ICN 177268) (Figura 8 e); Ibidem, 13 de abril de 2014, A.C. Magnago 1049 (ICN 177269), estes autores fornecem também uma ilustração da espécie (Figura 8 f). Desjardin e Perry (2015) registraram um espécime de Blumenavia angolensis para África, São Tomé, ao longo da rodovia entre São Luis e Chimico, em camada de bambu, 0˚18'23.6"N, 6˚36'24.5"E, em 8 de maio de 2013, Miko Nadel, porém o exemplar não foi retido. Os demais registros da publicação foram depositados no H.D. Thiers Herbarium, Dept. of Biology, San Francisco State University (SFSU) (Figura 8 b). Alguns registros foram encontrados através do site Mushroom Observer (http://mushroomobserver.org/observer/observation_search?pattern=Blumenavia). Neste site pessoas registradas colocam fotos de registros de materiais, estes são identificados pelo próprio observador ou por outros integrantes registrados do site, através da fotografia depositada.. Esses não são dados publicados, portanto não foram usados como fonte de dados, somente serão listados, como forma de expor possíveis locais para coletas. No site se encontra: - Do observador Hans W. Dahners (Atlides) um registro de Blumenavia rhacodes de Cali, Valle del Cauca, Colombia, coletado em 23/04/2017. Este mesmo coletor fez mais 14 registros em 2016, da mesma espécie e para o mesmo local, para novembro nos dias 21 e 15, o último dia com 3 registros, em outubro dias 04 e 16, em abril no dia 05 e em março dia 25. Em 2015 foram feitos registros nos dias 16,13 e 09 de novembro e 16 de abril. Em 2014 dias 06 de dezembro, bem como em 26 e 18 de março. O mesmo coletor, para o mesmo local, fez um registro reconhecido como B. angolensis em 26/03/2014. - De Wasil Kha um registro de B. angolensis para Jasper Co., Carolina do Sul, EUA, em 10/01/2016. 34 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

- De Alonso Cortés-Pérez o registro de dois basidiomas inteiros de B. rhacodes em 30/08/2012 e de um ovo (cortado longitudinalmente) em 11/09/2015, ambos registrados para Coyopolan, Veracruz, Mexico. - De Christian Schwarz um espécime de B. rhacodes para Eco-Posada Tisey, Reserva Natural Cerro Tisey Estanzuela, Esteli, Nicaragua, em 17/07/2010. - De Camila Seibt em 14/08/2015 registro de B. angolensis para Gaspar, Santa Catarina, Brazil, (próximo à Blumenau, e no mesmo dia do mês que foi coletado o tipo do gênero, B. rhacodes). - De Liz Popich em 17/09/2014 para Sudwala Caves, Mpumalanga, África do Sul, B. angolensis. - De Miko Nadel em São Luis, São Tomé, São Tomé e Príncipe, em 08/05/2013 (espécime da publicação de Desjardin e Perry, 2015). - De Alan Rockefeller um registro com fotos da exsicata e dos esporos de IBUG 454 (parátipo de B. toribiotalpaensis), coletado em 13/09/2005 em Valle del Maple, Talpa de Allende, Jalisco, México. Este observador fez o registro mais recente do site em 06/09/2017, de exemplares maduros e imaturos, com alguns começando a se expandir, de B. toribiotalpaensis, também para Valle del Maple.

35 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 7 – Imagens de espécimes de Blumenavia rhacodes em publicações

Legenda: a: Ilustração de basidioma do Brasil, por Fischer. b: Basidioma fresco e desidratado do Rio Grande do Sul-Brasil. c: Ilustração de basidioma de Trinidad, por Dennis. d: Ilustração de basidioma do Brasil, por Dring. e: Ilustração de basidioma da Argentina, pr Domínguez de Toledo. f: Basidioma do México. g: Ilustração de basidioma do Brasil, retirada de Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014). Barras: c-f = 1cm; g = 2cm. Fonte: Imagens retiradas de: a: Fischer (1900, 1933). b: Lloyd (1905) e em Lloyd (1909) como Laternea rhacodes. c: Dennis (1953) como Blumenavia rhacodes, em Dring e Rayner (1967) como B. usambarensis e em Dring (1980) como B. angolensis. d: Dring (1980). e: Domínguez de Toledo (1995). f: López e García (2012). g: Trierveiler- Pereira, Alves e Silveira (2014). 36 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 8 – Imagens de espécimes de Blumenavia angolensis em publicações

Legenda: a: Basidioma in situ em São Tomé e Príncipe-África. b: Ovo e basidioma in situ em São Tomé e Príncipe. c: Ovo e basidioma in situ em Ceará-Brasil. d: Basidioma in situ em Santa Catarina-Brasil. e: Basidioma in situ em Rio Grande do Sul-Brasil. f: Ilustração retirada de Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014). Barras a-e = 1 cm; f = 2 cm. Fonte: a: Fotografia de Jérôme Degreef, imagem retirada de Degreef et al. (2013). b: Fotografia de Miko Nadel, imagem retirada de Desjardin e Perry (2015). Fotografia de Ana Clarissa Moura Rodrigues, imagem retirada de Rodrigues e Baseia (2013). d-e: Fotografia de A. C. Magnago, imagens retiradas de Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014). f: Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014).

2.3 CONCEITO DE ESPÉCIE UTILIZADO

Neste trabalho foi utilizado o conceito da taxonomia integrativa (TAN et al., 2010), reunindo a base de dados morfológica, oriunda da literatura e da análise comparativa de diversas coleções científicas, e a base de dados molecular, proveniente dos espécimes analisados morfologicamente e disponíveis no GenBank. A base molecular, quando integrada como os dados morfológicos, possibilita uma melhor interpretação dos caracteres morfológicos informativos, possibilitando detectar espécies polimórficas, semi-crípticas ou crípticas.

37 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

3 METODOLOGIA

3.1 OBTENÇÃO DE MATERIAL PARA ANÁLISE

3.1.1 Busca por exsicatas de Blumenavia e sinônimos em herbários

A busca por espécimes de Blumenavia preservados em herbário se deu primeiramente através da verificação dos artigos que faziam referência a coletas deste gênero ou de seus sinônimos. Após verificar quais foram as exsicatas analisadas, os herbários que estavam depositadas foram contactados para verificar a disponibilidade de empréstimo. Foram pesquisadas as espécies: Blumenavia rhacodes, seu sinônimo: Laternea rhacodes, também Blumenavia toribiotalpaensis; Blumenavia angolensis e seus sinônimos: Laternea angolensis, Clathrus angolensis, Colonnaria angolensis, Blumenavia usambarensis. Foi utilizado também como medida de busca o Herbário Virtual da Flora e dos Fungos (INCT - http://inct.florabrasil.net/sobre-o-inct-hvff/), que conta com as informações dos acervos dos herbários do Brasil e das coletas realizadas no Brasil depositadas no exterior. O INCT é vinculado à rede SpeciesLink (http://www.splink.org.br/) para realizar a busca. Após verificar os espécimes e seus respectivos herbários de depósito a plataforma Index Herbariorum – IH (http://sweetgum.nybg.org/science/ih/) foi consultada para localizar o contato e endereço dos herbários. O MycoPortal foi utilizado para consultar as coleções dos herbários dos Estados Unidos e o Australia's Virtual Herbarium (AVH - http://avh.chah.org.au/) para consultar as coleções dos herbários da Austrália. O East African Herbarium (EA - http://herbaria.plants.ox.ac.uk/bol/eavhea) foi usado para consultar os herbários do Leste Africano, o contato dos herbários para verificar as coleções deste último foi obtido através do IH. A base de dados micológica do Herbarium K (K - http://apps.kew.org/herbtrack/search?_ga=1.259772554.103123427.1481578588) foi consultada diretamente para verificar as exsicatas deste herbário. Por meio do IH também foi possível fazer a busca direta de herbários por localidade de interesse. Foram buscados outros herbários das localidades próximas dos registros de coletas, e possíveis herbários que poderiam ter recebido exsicatas: América: Argentina, Brasil (Blumenau e Joinville), Colombia, Nicaragua e Venezuela; Europa: Alemanha, Espanha, Portugal, Reino Unido; e África: África do Sul, Angola, Botswana, Quênia, São Tomé e 38 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Príncipe, Tanzânia. Quando possuía o endereço de e-mail do herbário, foi realizado o contato diretamente com os curadores dos herbários para verificar a disponibilidade de empréstimo de exsicatas de Blumenavia e/ou seus sinônimos. A partir da disponibilidade afirmada pelo curador solicitado foi realizado o pedido formal de empréstimo por meio de uma guia confeccionada e assinada pelo curador do Herbário de Fungos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN-Fungos), Dr. Iuri Goulart Baseia. Após o recebimento das exsicatas a guia de recebimento foi assinada pelo curador, Dr. Iuri G. Baseia, e enviada ao herbário remetente, para comprovar o recebimento. Os prazos dos empréstimos foram respeitados, solicitando a renovação quando necessário. Os acrônimos dos herbários utilizados durante todo o texto seguem a Plataforma IH.

3.1.2 Coletas

3.1.2.1 Áreas de coleta

As áreas de coleta abrangeram os Estados do Ceará (Guaramiranga), Santa Catarina (Blumenau, Florianópolis, Gaspar e Joinville) e Paraná (Londrina). Rodrigues e Baseia (2013) analisaram um material coletado em Guaramiranga, no Ceará, por esse motivo tal local foi visitado para recoletar espécimes do gênero. O estado de Santa Catarina foi explorado porque o tipo do gênero estudado foi descrito para ele. O Paraná foi escolhido como local de coleta pelo registro de Blumenavia angolensis para Reserva do Rio Cachoeira na cidade de Antonina por De Meijer em 17 de agosto de 2005 (MBM 4339).

3.1.2.1.1 Ceará

No Ceará foram realizadas coletas na cidade de Guaramiranga: município serrano, situado à 120 km de Fortaleza, está localizada à 865 m de altitude, e inserida totalmente na Área de Proteção Ambiental do Maciço de Baturité (APA), conhecida também como Serra de Guaramiranga (Figura 9). A temperatura varia entre 15 e 25ºC, possui clima úmido. Com uma vegetação diversificada variando desde a caatinga arbustiva densa, floresta subcaducifólia tropical, floresta úmida semiperenofólia, floresta úmida semicaducifólia, floresta caducifólia à mata ciliar. 39 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Foram realizadas duas expedições uma de 09/06/2016 à 11/06/2016 e outra de 27/06/2016 à 01/07/2016. Nestes mesmos meses, em 2013 foram coletados dois exemplares de Blumenavia angolensis por Rodrigues, ACM, na Trilha dos Veadeiros (UFRN 1943), analisado em Rodrigues e Baseia (2013). Nas excursões foram percorridas as trilhas listadas abaixo. - Trilha dos Veadeiros, em propriedade particular (04º 15’ 13.4” S, 38º 55’ 47.5” W, altitude de 874 m) - Mata em frente aos chalés e Trilha Poço das Veadas do Complexo Turístico Alto da Serra (04º 15’ 22.2”S, 38º 55’ 48.3”W, altitude de 875 m e 04º 15’ 29.4”S, 38º 55’ 39.9”W, altitude de 903 m, respectivamente) - Trilha do Pau d’Arco e Trilha do Cipó no Parque das Trilhas (04º 16’ 04.7”S, 38º 55’ 55”W, altitude de 850m).

Figura 9 – Área de Proteção Ambiental do Maciço de Baturité, Guaramiranga – CE

Legenda: a: Vista da Serra de Guaramiranga. b: Trilha dos Veadeiros. c: Acesso à Trilha dos Veadeiros (fotos da autora). 40 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

3.1.2.1.2 Santa Catarina

No estado de Santa Catarina foram visitadas quatro cidades: Blumenau, Gaspar, Florianópolis e Joinville. A cidade de Blumenau é a localidade típica do gênero, coletado por Möller em 1891 e 1893 (MÖLLER, 1895). Nesta cidade foram explorados entre os dias 26/09/2016 e 31/09/2016 os locais: - Parque Natural Municipal São Francisco de Assis: ao todo o parque possui 23 ha de Floresta Ombrófila Densa. O trajeto feito percorreu a Trilha do Caminho das Águas, Trilha da Cutia e Trilha do Tucano. Este local foi explorado durante dois dias (26º 55’ 17.34”S, 49º 4’ 40.05”W, altitude de 75m). - RPPN Bugerkopf: conserva um total de 82,70 ha de Mata Atlântica. Por meio da autorização com o proprietário foi possível fazer um dia de visitação pelas trilhas, acompanhado por ele (27º 0’ 18.02” S, 49º 4’ 22.27” W, altitude de 311m). - Parque das Nascentes (Figura 10 a): situado a 23 km ao sul de Blumenau, com uma área total de 5.300 ha. A trilha percorrida foi a Trilha da Chuva, uma área com remanescentes de canela preta e seis travessias do Rio Garcia Pequeno (27º 3” 35.17” S, 49º 4’ 55.93” W, altitude de 304m) (Figura 10 b). Neste local está a sede do Instituto Parque das Nascentes. - Parque Ecológico Spitzkopf: com uma área total de 500 ha, possui 936 metros de altitude no ponto mais alto. Foi percorrida a Trilha do Ribeirão Caeté e a Trilha da Represa (27° 0' 21.06" S, 49° 6' 39.67" W). O Parque das Nascentes, o Parque Ecológico Spitzkopf e boa parte da RPPN Bugerkopf fazem parte do Parque Nacional da Serra do Itajaí (criado pelo Governo Federal, segundo o Decreto s/n°, publicado no DOU em 04 de junho de 2004). Possui ao todo uma área de 57.374 ha de Mata Atlântica. No município de Gaspar, localizado a 17,3 km de Blumenau, foi feito um registro fotográfico no site Mushroom Observer (http://mushroomobserver.org/254492?q=70bP) de Blumenavia angolensis. Por esse motivo o local foi visitado, no dia 31/09/2016, juntamente com a pessoa que realizou o registro fotográfico, Camila Seibt (Figura 10 c, d).

41 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 10 – Áreas de coleta em Blumenau – SC

Legenda: a-b: Instituto Parque das Nascentes, Blumenau: a: Caminho para a Trilha da Chuva; b: Rio Garcia Pequeno ao centro da Trilha da Chuva. c-d: Gaspar: c: Área do registro do basidioma de Blumenavia angolensis (fotos da autora). d: Basidioma de Blumenavia angolensis registrado por Camila Seibt em Gaspar (fotografia de Camila Seibt, imagem retirada do site Mushroom Observer (http://mushroomobserver.org/254492?q=70bP).

Em Florianópolis foram realizadas visitas a dois locais distintos, nos dias 07/10/2016 e 10/10/2016, são eles, respectivamente: - Parque Ecológico do Córrego Grande (PECG): integralmente em área urbana, com uma área de 21,3 ha. Foram percorridas as trilhas Palmiteiro, Pau-Jacaré e Garapuvu e a pista de caminha de 1km. - Unidade de Conservação Ambiental do Desterro (UCAD): com 491,53 ha ocupa 1,1% da Ilha de Santa Catarina e está localizada na parte insular central do município de Florianópolis. Possui relevo de baixadas e morros, vegetação típica de floresta ombrófila densa submontana em regeneração. Neste local foi coletado um exemplar de Blumenavia angolensis 42 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. por Magnago, AC em 10/06/2013 (FLOR 51619), analisado em Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014). Neste local foi percorrida a Trilha do Jacatirão (Figura 11).

Figura 11 – Unidade de Conservação Ambiental do Desterro (UCAD), Florianópolis – SC

Legenda: a: Trilha do Jacatirão (foto da autora). b: Basidioma de Blumenavia angolensis coletado por Magnago, AC na UCAD (fotografia de A. C. Magnago, imagem retirada de Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira, 2014). Barra: b = 1 cm.

Em Joinville foram realizadas visitas nos dias 12/10/2016 e 13/10/2016 nos locais: - Parque Morro do Finder (Figura 12 a): unidade de conservação da natureza de proteção integral, criado por meio do Decreto Municipal nº 7.056/1993. Com uma área de aproximadamente 50 ha, abrange importante remanescente de Mata Atlântica inserida na paisagem urbana de Joinville. Foram percorridas três trilhas: Trilha do Palmiteiro, Trilha da Gruta e Trilha do Bananal (26º 15’ 51.41” S, 48º 50’ 7.93” W, altitude de 122 m). - Parque Zoobotânico (Fugura 12 b): possui 1,7 ha de Mata Atlântica foi construído para atender a uma reivindicação dos habitantes da cidade, com o objetivo de valorizar o restante de Mata Atlântica que ainda existe na região e propiciar uma área de lazer aos visitantes. Está inserido totalmente em área urbana. Neste Parque foi realizada a Trilha Rústica (26º 17’ 37.37” S, 48º 50’ 5.10” W, 48 m de altitude).

3.1.2.1.3 Paraná

Foram realizadas trilhas no Parque Estadual Mata do Godoy no dia 28/10/2016 (Figura 12 c, d). Não havia registro de estudos com fungos gasteroides para o parque até o momento. O Parque é uma Unidade de Conservação classificada na categoria de manejo de Proteção Integral, segundo o Sistema Nacional de Unidades de Conservação (SNUC). Localizado no 43 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. município de Londrina e foi criado oficialmente pelo Decreto nº 5.150 de 05 de junho de 1989, com uma área de 675,70 ha. Em 30 de dezembro de 1997 teve sua área ampliada em 14,4756 ha pelo Decreto n° 3.917, totalizando 690,1756 ha. O local foi visitado no dia 28/10/2016 percorrendo três trilhas abertas à visitação – Trilha do Projeto Madeira, Trilha Interpretativa (ou das Perobas e Figueiras), e a Trilha Álvaro Godoy, ou dos Catetos (23º 26’ 38.63” S, 51º 14’ 48.84” W, altitude de 641 m).

Figura 12 – Áreas de coleta em Joinville – SC e em Londrina – PR

Legenda: a-b: Joinville: a: Parque Morro do Finder; b: Parque Zoobotânico. c-d: Londrina, Mata dos Godoy: c: caminho até o início das trilhas; d: Trilha Álvaro Gogoy, mostrando tronco em decomposição. Fonte: Melanda, G.C.S.

44 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

3.1.2.2 Metodologia de coleta

As coletas foram realizadas em trilhas pré-existentes, a busca por espécimes do gênero Blumenavia foi de forma livre e mata adentro quando foi possível. A metodologia seguiu Fidalgo e Bononi (1984), Lodge et al. (2004), Baseia et. al (2014) e Trierveiler-Pereira (2014), com modificações. Para cada material coletado foi designado um número de coletor com as iniciais do nome do coletor, estes dados foram anotados em caderno de coletor no momento da coleta (GCSM + nº). Adicionalmente foram registradas as informações do local de coleta, data, coordenadas geográficas, altitude, o nome dos demais coletores presentes e nome da espécie coletada (para incerteza foi adicionado cf. – entre o epíteto e o gênero, para ser confirmada posteriormente, ou só foi adicionado o gênero). Ao serem observados, os espécimes encontrados foram fotografados, com e sem escala (régua outro material mensurável ao lado), e coletados manualmente ou com auxílio de um canivete. A rizomorfa enterrada, juntamente com o substrato aderido a ela também foram coletados. Pelo basidioma expandido (receptáculo e volva) ser muito frágil e a volva ser gelatinosa, foi preciso muito cuidado ao manusear e acondicionar, para manter ao máximo o formato natural. Por este motivo foram feitas adaptações ao modo de coleta. As alterações foram o armazenamento dos materiais frescos sobre papel cartão, ou papel alumínio e acondicionados em caixas plásticas individualizadas, e não em caixas de coleta com vários compartimentos, sem papel embaixo, como se faz para a maioria dos grupos de macrofungos. No campo (ou logo após chegar da coleta) características macroscópicas do basidioma expandido e do ovo foram analisadas e anotadas na ficha de caracteres, seguindo a metodologia de preenchimento da ficha (Apêndice C). A preparação da ficha, construída especificamente para o gênero Blumenavia, teve o objetivo de analisar o máximo de caracteres para avaliar quais seriam informativos para o gênero. Na ficha de caracteres há espaço para adicionar informações do local de coleta, dos coletores, se o material foi analisado fresco ou desidratado (os caracteres podem ser alterados após a desidratação), data da análise, informações macroscópicas, e no verso os caracteres microscópicos. No Apêndice C após a ficha de caracteres estão listados os caracteres observados e como foi realizado o preenchimento da ficha. As medidas foram obtidas com um paquímetro de precisão e as cores foram determinadas seguindo o guia de cores de Küppers (2002). 45 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Na coleta alguns ovos foram deixados em temperatura ambiente por quatro dias, para tentar observar a expansão do basidioma. Outros foram coletados e já cortados, transversalmente, com a parte da rizomorfa para baixo, para fazer o registro fotográfico e identificar a qual família pertencia, pelo modo de desenvolvimento (Clathraceae: multipileado, Phallaceae: pileado), ver Figura 3 e melhor detalhamento dos cortes na Figura 13. Um dos cortes é o longitudinal (Figura 13 c), foi mostrado apenas uma das partes, pois a outra era semelhante. O outro corte é o transversal (Figura 13 b), esse corte mostra quantos braços o basidioma expandido terá, bem como as porções de gleba em desenvolvimento e a camada de glebífero que ocupará os ângulos antero-laterais de cada braço após a expansão (G - esta camada de glebífero ao se expandir se rasga, por isso os glebíferos membranosos em Blumenavia mostram-se separados ao longo do basidioma). É possível observar também as suturas peridiais (Spr) que ligam o perídio exterior com o receptáculo. Na Figura 13 d pode-se observar as camadas do perídio no ovo fresco, imagem obtida por microscópio estereoscópico, aumento de 3 x, mostrando o endoperídio gelatinoso (E), mesoperídio esponjoso (M) e exoperídio (Ex).

3.1.2.3 Processamento e herborização dos espécimes

Após a coleta foram retiradas partes do basidioma fresco, preferencialmente do braço ou glebífero, e separados em tubos de centrífuga de 1,5 mL e estocados em sílica gel para extração de DNA. A secagem do material, tanto do basidioma expandido, como do ovo, se deu em desidratador elétrico de alimentos da marca FunKitchen, a temperatura aproximada de 40 ºC, durante 24-48 horas, dependendo das dimensões do material. Posteriormente foram acondicionados em saco Ziplock juntamente com um papel com as informações contidas no caderno de coletor para aquele espécime. Toda a coleção teve seus dados transferidos para um banco de dados (BRAHMS - Botanical Research and Herbarium Management System), juntamente com fotos e ilustrações que ficaram disponíveis online pelo Herbário UFRN – Fungos (Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Departamento de Botânica e Zoologia).

46 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 13 – Ovo e camadas do perídio de Blumenavia

Legenda: a: Ovo de Blumenavia sobre tronco em decomposição, no campo, traços e setas amarelas representam a direção dos cortes. b: Corte transversal do ovo fresco, mostrando desenvolvimento multipileado; na parte do ovo da esquerda: setas pretas representam as suturas peridiais; Bn = braço número n; Gn = gleba e tecidos de glebíferos imaturos que ficarão aderido ao braço n após a expansão; na parte da direita: quadrado amarelo representa a parte do ovo de b que está ampliada em d. c: Corte longitudinal do ovo; B = Braço; G = gleba e tecido de glebífero imaturos; R = rizomorfa. Em b e c: linhas amarelas delimitam a camada do perídio (P). d: Camadas do perídio no ovo (aumento de 3x); E = endoperídio, Ex = exoperídio, M = mesoperídio (fotos da autora). Barras a-c = 1 cm, d = 0,5 mm.

3.2 ANÁLISES MORFOLÓGICAS DE ESPÉCIMES HERBORIZADOS

As análises morfológicas foram realizadas no Laboratório de Biologia de Fungos, Departamento de Botânica e Zoologia - Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (DBZ-UFRN), seguindo metodologia descrita abaixo.

47 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

3.2.1 Caracteres macroscópicos

Os caracteres macroscópicos foram analisados a olho nu e com auxílio do microscópio estereoscópico Leica EZ4 e para capturar imagens com o microscópio estereoscópico Nikon SMZ15000 com câmera Nikon DS-Ri1 acoplada (Figura 14 a-d). Por meio deste último foi possível realizar fotos das camadas da volva, dos glebíferos, da rizomorfa e da textura dos braços, bem como fazer medições da rizomorfa. Como mencionado na metodologia de coleta as medidas aqui também foram obtidas com um paquímetro de precisão e as cores foram determinadas seguindo o guia de cores de Küppers (2002). Trabalhos anteriores que analisaram materiais do gênero foram estudados e agrupados para a análise detalhada dos basidiomas (MÖLLER, 1895; FISHER, 1886, 1900; HENNINGS, 1902; LLOYD, 1905, 1909; DENNIS, 1953; DRING; RAYNER, 1967; DRING, 1980; DOMÍNGUEZ DE TOLEDO, 1995; LÓPEZ; GARCÍA, 2001, 2012; VARGAS- RODRIGUEZ; VÁZQUEZ-GARCÍA, 2005; CALONGE, 2007, DEGREEF et al., 2013; RODRIGUES; BASEIA, 2013; TRIERVEILER-PEREIRA, 2014; TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014; DESJARDIN; PERRY, 2015). A Figura 15 mostra uma ilustração do basidioma expandido de Blumenavia com a indicação das estruturas que foram examinadas, tais estruturas foram analisadas quanto ao tamanho, cor e textura. Tais caracteres estão melhor detalhados na ficha de caracteres (APÊNDICE C). Para determinar a forma de estruturas globosas (como formato do ovo, volva e também estruturas microscópicas como pseudoparênquima e esporos) se utilizou o valor de Q, onde Q é determinado pela divisão do valor da altura pela largura, e Qm é a média dos valores de Q de uma determinada estrutura. Segundo Bas (1969) os valores representam: Q=1,00–1,05 formato globoso; Q= 1,05–1,15 subgloboso; Q=1,15–1,30 levemente elipsoide; Q=1,30–1,60 elipsoide; Q=1,60–2,00 alongado; Q=2,00–3,00 cilíndrico e Q > 3,00 baciliforme.

48 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 14 – Equipamentos utilizados para realização das análises morfológicas

Legenda: a-b: Vista frontal e lateral do microscópio estereoscópico Nikon SMZ15000 com câmera Nikon DS-Ri1 acoplada. c-d: Vista frontal e lateral do microscópio estereoscópico Leica EZ4. e: Microscópio óptico Nikon Eclipse Ni, com câmera Nikon DS-Ri1 acoplada, ligado a computador (fotos da autora).

Figura 15 – Representação de um basidioma expandido de Blumenavia

Legenda: larg. = largura do braço. Fonte: Adaptado de Baseia et al. (2014). 49 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

3.2.2 Caracteres microscópicos

Para realizar fotografias e mensuração dos caracteres microscópicos foi utilizado o Microscópio óptico Nikon Eclipse Ni, com câmera Nikon DS-Ri1 acoplada (Figura 14 e). Foram montadas lâminas de todas partes dos basidiomas, para identificar as hifas que as compõem. As partes são: basidiósporos, braços parte basal, braços parte apical (partes dos braços conforme Dominguéz de Toledo, 1995), glebífero, hifas do endoperídio, hifas do mesoperídio, hifas apicais e basais do exoperídio. Quando a volva possui parte craquelada e parte basal mais clara, para montar a lâmina com as hifas apicais do exoperídio retira-se da parte corada (craquelada superior) e as basais da parte clara inferior (tomando cuidado para não confundir com o mesoperídio que está logo abaixo). Hifas das camadas do endo-, e mesoperídio e das diferentes partes do exoperídio ainda não tinham sido feitas por nenhum trabalho com o gênero Blumenavia. As lâminas dos esporos foram montadas em KOH 5% (hidróxido de potássio), reagente de Melzer, Azul de Algodão e Vermelho Congo 1%. As demais estruturas foram montadas em KOH 5% e Vermelho Congo 1%. Estes corantes podem fornecer informações importantes através de reações químicas características de determinados táxons (MILLER; MILLER, 1988). Na confecção das lâminas, para observação das microestruturas do basidioma, foram feitos pequenos cortes na parte a ser estudada com o auxílio de um bisturi com lâmina de corte nº 11. No caso dos braços e glebífero uma alternativa foi adicionar uma pequena gota de KOH 5% sobre a parte a ser cortada e a retirar do basidioma com o auxílio de pinça de ponta fina nº 10. A parte a ser analisada foi depositada sobre uma lâmina com o reagente adequado, e com a ajuda de pinça de ponta fina e agulha esta foi separada em pequenos pedaços para expor as hifas separadamente, sendo possível visualizar e medir. Após a montagem da lâmina de cada parte a visualização em microscópio proporcionou registrar (anotadas na ficha de caracteres-APÊNDICE C) e depois agrupadas para a descrição das espécies: - Tipo de hifa: se globosa ou filamentosa. - Formato dos esporos e das hifas globosas (de acordo com o valor do Qm). - Para os basidiósporos se possuem uma gútula em cada extremidade do comprimento. - Tipos de reações e cor dependendo do reagente empregado – KOH 5%, A.A: Azul de Algodão, RMe: reagente de Melzer, V.C: Vermelho Congo. 50 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

- Formato da parede das hifas: reta (r) ou sinuosa (s), e se regulares (re) ou irregulares (ir) em relação à espessura, se mantém espessura na mesma hifa é considerada regular, se há diferença é irregular. Não foram medidas as paredes dos basidiósporos por serem muito finas, difíceis de ver no microscópio óptico com a técnica empregada. - Para as hifas filamentosas também foram observadas a presença e frequência dos septos – res: regularmente septado (septos frequentes), irs: irregularmente septado (septos pouco frequentes). - Foram observadas a presença de Ci: células infladas, Gc: grampo de conexão, cmfr: cristais marrons fusiformes dispostos em raio, cmag: cristais marrons assimétricos (de formas irregulares) agrupados em formas globosas, ccis: cristais cianos de formas irregulares separados uns dos outros (não agrupados) (Figura 16). - Valores utilizados para as estruturas – para as hifas filamentosas: diâmetro e parede (µm), para hifas pseudoparênquimatosas ou globosas: comprimento × largura e parede (µm), para os esporos: comprimento × largura (µm). - Medições: para cada basidioma analisado foram feitas 30 medidas de cada microestrutura, os valores foram anotados e posteriormente calculado o máximo, mínimo, média e desvio-padrão (sd), bem como o valor de Qm (média dos valores de Q) para aqueles que possuíram essa informação. Os valores finais da descrição da espécie se deram pelos valores extremos (máximo e mínimo), comparando todas as exsicatas da espécie. Os valores de média e desvio-padrão foram calculados pelo valor da média dos resultados das médias e dos desvios-padrão de cada exsicata analisada. Todas as siglas descritas anteriormente foram elaboradas para este trabalho, como forma de categorizar os caracteres, estas não foram utilizadas em trabalhos anteriores.

51 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 16 – Tipos de cristais observados em Blumenavia

Legenda: a-b: Cristais marrons de formas irregulares agrupados em formas globosas. a: em KOH 5%. b: em Vermelho Congo 1% (V.C). c-d: Cristais marrons afilados dispostos em raio. c: em KOH. d: em V.C. e-f: Cristais cianos de formas irregulares separados uns dos outros. e: em KOH 5%. f: em V.C (em hifa de rizomorfa). Em c: ccis: cristais cianos de formas irregulares separados uns dos outros; setas pretas indicando alguns ccsi (fotos da autora). Barras: a-c, e, f = 5 µm, d = 20 µm. 52 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

3.3 ANÁLISES MOLECULARES

3.3.1 Extração e amplificação de DNA

As extrações e amplificações de DNA foram realizadas no Laboratório de Biologia Celular e Genética de Plantas no Departamento de Biologia Celular e Genética-UFRN. Para os espécimes de herbário que estavam muito danificados (com contaminação ou muito quebrados), não foi feita a análise molecular. Para a extração de DNA utilizou-se o FTA® cards e Qiagen DNeasy® Plant Mini Kit, Germantown, MD, USA, com algumas modificações no protocolo no último. As modificações são: 1 - em adição ao primeiro passo do protocolo do fabricante as amostras foram maceradas com pistilo de polipropileno cônico cor azul (80 mm comp. x 5 mm diam.) e incubadas em banho-maria à 65 ºC toda a noite; 2 - entre os passos 9 e 10 foi adicionado um procedimento de centrifugação dos tubos vazios com a coluna branca, também vazia, por 2 min. à 14000 rpm. Após a extração os produtos foram armazenados à -20 ºC até a amplificação. As amplificações por PCR (Polymerase Chain Reaction - Reação em Cadeia da Polimerase) foram realizadas utilizando o PuReTaq Ready-To-Go™ PCR Beads (GE Healthcare) em termociclador Techne TC-512 (Figuras 17 a-c). Cada reação possuía um volume final de 25 µl, contendo 1µl de cada primer (direto e reverso) na concentração de 10 µmol, 10 ou 23 µl do produto da extração, completando o volume final com de Água MilliQ® autoclavada. Foram amplificadas as regiões: ITS - espaçador interno transcrito do RNA ribossomal; LSU - DNA ribossômico (28S); ATP6 - região do DNA mitocondrial que codifica a subunidade 6 da ATPase; RPB2 - sequência que codifica a segunda subunidade maior da RNA polimerase II - e TEF1α - fator de alongamento 1 alfa da tradução. Os primers utilizados para cada região foram, respectivamente: ITS5/ITS4 (WHITE et al., 1990) e ITS1-F/ITS4-B (GARDES; BRUNS, 1993), LR0R/LR5 (VILGALYS; HESTER, 1990), ATP6-3/ATP6-4 (KRETZER; BRUNS, 1999), bRPB2-6F/bRPB2-7.1R (LIU et al., 1999), EF1-1018F/EF1-1620 (STIELOW et al., 2015). As sequências de cada primer estão na Tabela 3, e os programas de amplificação na Tabela 4. Para verificar o resultado das amplificações após os produtos de PCR saírem do termociclador foi preparado gel de agarose a 1% e adicionado em cada poço as amostras contendo: 3 µl de cada produto da amplificação, 1 µl de Tampão de corrida (de sacarose e azul de bromofenol) e 2 µl de GelRed™ - Biotium (corante fluorescente de ácidos nucleicos), no 53 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. primeiro poço ao invés da amostra estava o marcador de 100 pares de bases (Figura 17 d). A corrida do gel se deu em cuba de eletroforese com TBE 0,5%, 100 Volts, 300 mA por 30-40 min (Figura 17 e). Após a corrida os géis foram visualizados no Hoefer® Macro-Vue Uv 20 Transilluminator e fotografados no Cleaver View® UV Transiluminator com câmera Canon acoplada (Figura 17 f). As amostras com banda única foram purificadas para enviar para sequenciamento. Os produtos de PCR foram purificados com o ExoSAP-IT™ PCR Product Cleanup Reagent, seguindo as instruções do fabricante. As amostras foram inseridas no termociclador no programa com desnaturação inicial por 30 min a 37 ºC e um ciclo de 15 min a 80 ºC, sem extensão final, e mantido a 4 ºC. Após a purificação as amostras foram preparadas para serem enviadas para sequenciamento em até no máximo dois dias.

Figura 17 – Materiais e equipamentos utilizados na análise molecular

Legenda: a: Tubos de PCR do PuReTaq Ready-To-Go™ PCR Beads, imagem ampliada. b-c: Vista lateral e frontal com a tampa aberta do Termociclador Techne TC-512. d: Gel de agarose com amostras amplificadas de ITS fotografado em raio UV. e: Cuba de eletroforese. f: A esquerda Cleaver View® UV Transiluminator com câmera Canon acoplada, a direita Hoefer® Macro-Vue Uv 20 Transilluminator (fotos da autora). 54 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Tabela 3: Sequências dos primers utilizados

Região Primer Sequência 5’-3’ ITS ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G ITS4 TCC TTC CGC TTA TTG ATA TGC ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG LSU LR0R ACC CGC TGA ACT TAA GC LR5 TCC TGA GGG AAA CTT CG ATP-6 ATP6-3 TCT CCT TTA GAA CAA TTT GA ATP6-4 AAG TAC GAA WAC WTG WGM TTG RPB2 bRBP2-6F TGG GGK WTG GTY TGY CCT GC bRPB2-7.1R CCC ATR GCY TGY TTM CCC ATD GC TEF1α EF1-1018F GAYTTCATCAAGAACATGAT EF1-1620 GACGTTGAADCCRACRTTGTC

Tabela 4: Programas de amplificação para cada região Região Desnaturação Ciclagem Extensão inicial final ITS 95°C, 5’ 5x [30’’, 94°C; 30’’, 58°C; 1’, 72°C] 10’, 72°C 33x [30’’, 94°C; 30’’, 48°C; 1’,72°C] LSU 94°C, 5’ 5x [30’’, 94°C; 30’’, 54°C; 1’, 72°C] 10’, 72°C 33 x [30’’, 94°C; 30’’, 48°C; 1’30’’,72°C] ATP6 95ºC, 2’ 5x [35’’, 94°C; 55’’, 37°C; 1’, 72°C] 5’, 72°C 36x [35’’, 94°C; 55’’, 55°C; 1’,72°C]

RPB2 95°C, 4’ 39x [1’, 94°C; 1’, 55°C; 1’, 72°C] 10’, 72°C TEF1α - 95°C, 5’ 40 x [1’, 95°C; 1’, 49°C; 2’, 72°C] 10’, 72°C

3.3.2 Sequenciamento e análises das sequências

O sequenciamento dos produtos da PCR foi realizado na empresa Macrogen, na Coréia do Sul. As sequências consenso foram obtidas por meio do Sequencher 4.1.4 ou no programa Geneious R9 (KEARSE et al., 2012) e submetidas à busca por similaridade na base de dados Nucleotide BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool - 55 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Nesta base de dados foi verificado se a sequência correspondia à região esperada, pela similaridade com outras sequências. Também foi possível observar se a região sequenciada não se tratava de contaminação. Para realizar as análises filogenéticas foram escolhidas no GenBank® algumas sequências proximamente relacionadas (filogeneticamente) ao gênero Blumenavia, com base em trabalhos anteriores (HUMPERT et al., 2001; HIBBETT; BINDER, 2002; LANGER, 2002; HOSAKA et al., 2006; CABRAL et al., 2012; DEGREEF et al., 2013; TRIERVEILER- PEREIRA; SILVEIRA; HOSAKA, 2014; PIETRAS et al., 2016) para compor o integrar o grupo interno (ingroup) e outras mais afastadas filogeneticamente para o grupo externo (outgroup) (ver em resultados: Tabela 11). As sequências geradas e as retiradas do GenBank foram alinhadas por meio do Seaview (GOUY et al., 2010). Análises de Máxima Parcimônia (MP) e Bayesiana foram realizadas com as matrizes de alinhamento para cada marcador (ITS, LSU, ATP6, RPB2, TEF1α) em separado e, posteriormente, com uma única matriz concatenada. A ausência de uma sequência para determinado marcador foi substituída por uma sequência de ‘N’ (CORNISH-BOWDEN, 1985). Para as análises de Máxima Parcimônia foi utilizado o PAUP 4.0a156 versão teste (SWOFFORD, 2002), pela opção de busca heurística com tree bisection-reconnection (TBR) e MULTrees, 1000 réplicas de bootstrap e 10 réplicas de adição randômica. Os modelos de substituição para os métodos de reconstrução foram escolhidos por meio do MrModelTest 2.3 (NYLANDER, 2004). As análises de Bayesiana foram conduzidas no MrBayes ver. 3.2.6 x 86 (HUELSENBECK; RONQUIST, 2001), com o respectivo modelo de substituição para cada alinhamento. Este modelo também se aplica para análise concatenada, onde cada partição representando um gene recebe o seu modelo específico. Foram realizadas duas corridas com quatro cadeias cada (MCMC), por 10 milhões de gerações. As árvores foram amostradas a cada 1000 ciclos, produzindo 10 mil árvores por corrida. Os valores de suporte foram testados pelas probabilidades posteriores obtidas pelo consenso das regras da maioria após a deleção das árvores durante o burn-in, que foi determinado em cada análise. Este valor de descarte foi obtido pela observação de quando os valores de ASDSF (average standard deviation of split frequencies) atingiam o estado estacionário (abaixo de 0,01). Para visualização e edição dos dendogramas foram utilizados os programas FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) e Inkskape (https://inkscape.org/pt-br/). Todas as sequências obtidas no presente estudo foram depositadas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 56 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

4 RESULTADOS

4.1 RESULTADO DA OBTENÇÃO DE MATERIAIS PARA ANÁLISE

4.1.2 Disponibilidade de empréstimo de exsicatas de Blumenavia e sinônimos

4.1.2.1 Busca de herbários de forma direta com base em publicações

Os Herbários BPI, CORD, IBUG, ICN, LSUM, FLOR, MBM, PACA-Fungi, XAL, XALU, SI, UFRN-Fungos foram buscados diretamente no IH por haver citações de registros em artigos (DRING, 1980; DOMÍNGUEZ DE TOLEDO, 1995; LÓPEZ; GARCÍA, 2001, 2012; VARGAS-RODRIGUEZ; VÁZQUEZ-GARCÍA, 2005; CALONGE, 2007; RODRIGUES; BASEIA, 2013; TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014). Os herbários responderam e emprestaram as exsicatas, com exceção do CORD, LSUM, XALU e SI. Dring (1980) cita na descrição de Blumenavia rhacodes o herbário da Argentina: SI, este possui um exemplar de Clathrus rhacodes (SI 21829) coletado por J. Rick em 1932 em São Leopoldo RS-BR. Uma foto digital do material foi enviada pela curadora Norma Deginani não sendo possível o envio da exsicata devido à má condição da mesma, esta estava muito deteriorada (Figura 18). Dominguéz de Todelo (1995) estudou materiais depositados no CORD, também da Argentina, este possui cinco exscicatas de Blumenavia rhacodes coletadas na Argentina. Não foi possível emprestar porque a curadora estava ausente do herbário temporariamente, e não foi possível despachar esses materiais.

57 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 18 – Imagem digital do basidioma de Clathrus rhacodes (SI 218229)

Fonte: Fotografia enviada por e-mail para Melanda, G.C.S pela curadora do Herbário SI, Norma Deginani.

López e García (2001, 2012) analisaram matereias do XALU, mas não foi possível o empréstimo pela falta de recursos. Vargas-Rodriguez e Vázquez-García (2005) citaram materiais do LSUM, mas não se obteve resposta. A busca direta também se deu em contato com o Herbário da Bélgica BR (DEGREEF et al., 2013) e com o SFSU (DESJARDIN; PERRY, 2015). O registro de Blumenavia angolensis do artigo de Degreef et al. (2013) não foi localizado no herbário pelo curador. O SFSU foi consultado já que o autor do artigo, que possuía um registro B. angolensis para São Tomé e Príncipe, Dennis Desjardin, é curador do herbário, mesmo que na publicação há registro que o material não foi retido. Portanto, não houve resposta.

4.1.2.2 Species Link

Outra maneira de localizar herbários foi por meio das plataformas disponíveis. No Species Link foram localizadas treze exsicatas de Blumenavia rhacodes, quatro de B. angolensis e uma de B. usambarensis, dentre os sinônimos foi encontrado um exemplar de Clathrus angolensis. As exsicatas de B. rhacodes estão distribuídas nos herbários: 58 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

- Herbário Anchieta do Instituto Anchietano de Pesquisas/UNISINOS (PACA-Fungi) com seis exemplares, todos do estado Rio Grande do Sul, Brasil (RS-BR); - ICN com quatro exemplares também do RS, BPI com um exemplar do Brasil; - Herbário do Instituto de Botânica (SP-Fungi) com um exemplar de São Paulo-BR; - Herbário de Fungos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN-Fungi) com um exemplar também de SP-BR. Blumenavia angolensis possui: dois registros para o ICN, do RS-BR, um para o UFRN-Fungi do Ceará-BR e um para o Herbário da Universidade Federal de Santa Catarina (FLOR). Blumenavia usambarensis possui apenas um registro no SP-Fungi, de SP-BR. Clathrus angolensis foi registrado para o Farlow Reference Library and Herbarium of Cryptogamic Botany (FH) do RS-BR. As exsicatas coletadas no Brasil do ICN, BPI, FLOR e duas do PACA-Fungi foram citadas em Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014). Em contato direto com o curador do herbário FH foi observado que além dos registros anteriormente citados, tal herbário conta com mais cinco exemplares de Blumenavia rhacodes e um de Collonaria sp., este último foi solicitado para verificar se poderia se tratar de Collonaria angolensis, mas os materiais não chegaram.

4.1.2.3 Mycoportal

O Mycoportal foi consultado pelo registro de exsicatas nos herbários dos Estados Unidos, BPI e LSUM e por um registro deste local no Mushroom Observer. Os resultados mostraram duas exsicatas de B. rhacodes e quatro de B. toribiotalpaensis. Blumenavia rhacodes possui um registro para o BPI, o mesmo mostrado pelo Species Link do Brasil, e um da Venezuela depositado no New York Botanical Garden (NY). As exsicatas de Blumenavia toribiotalpaensis são procedentes de Jalisco, México, uma delas é o holótipo depositado no herbário BPI e três depositadas no LSUM, sendo duas preservadas em FAA. Todas as exsicatas de B. toribiotalpaensis são citadas por Vargas- Rodrigues e Vázquez-García (2005) e o holótipo é também citado por Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014). Dentre os sinônimos foram encontrados um exemplar de Clathrus angolensis (o mesmo registro do Species Link para o RS-BR) e um de Laternea angolensis para Réduit, Moka, Maurícia, ambas depositadas no BPI. 59 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

4.1.2.4 Australia's Virtual Herbarium

O AVH não obteve resultados de espécimes de Blumenavia na Austrália. Visto isso, foi pesquisado através da plataforma IH os herbários para Austrália e entrado em contato com dois deles: State Herbarium of South Australia (AD) e Herbarium Icelandic Institute of Natural History (AMNH). Ambos não possuíam exsicatas de Blumenavia. O curador do herbário AMNH informou que não há registros de Blumenavia para a Austrália.

4.1.2.5 Plataforma EA

Por meio da Plataforma EA foi possível identificar quatro herbários do Leste Africano, três deles foram contactados por meio do contato do IH, e não se obteve resposta., são eles: The National Herbarium (ETH) da Etiópia, National Herbarium of Tanzania (NHT), encontrado também diretamente através do IH, e Herbarium Botany Department - University of Dar es Salaam (DSM), os dois últimos da Tânzania. O Makerere University Herbarium (MAK), não foi encontrado no IH, então através do site (http://cns.mak.ac.ug/makerere-university- herbarium) foi possível localizar o contato, este também não apresentou resposta.

4.1.2.6 Plataforma Herbário K

Por meio da plataforma do Herbário K (http://apps.kew.org/herbtrack/search) foi encontrado um registro em solução spirit (álcool desnaturado) de Bluenavia usambarensis de São Paulo, e um de B. angolensis de Trinidad, desidratada, determinado por Dring (1980). Este último material foi identificado por Dring e Rayner (1967) como Blumenavia rhacodes e por Dennis (1953) como B. usambarensis, como menscionado anteriormente. Ao contactar o herbário K foi constatado que além das duas exsicatas, o mesmo possui a ilustração de 1856 (Welwitsch 120) de Laternea angolensis, basiônimo de Blumenavia angolensis, da publicação original de Welwitsch e Currey (1870, Dring (1980) afirma que este é o holótipo de B. angolensis.

4.1.2.7 Plataforma Index Herbariorum

De acordo com a Plataforma IH existem aproximadamente três mil herbários no mundo, com aproximadamente doze mil curadores e 350 milhões de exemplares, que 60 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. documentam a diversidade de fungos e plantas dos últimos 400 anos. Através da busca por localidade de interesse por meio desta plataforma foi possível verificar o endereço e contato de: - 44 herbários da América: Argentina (1), Brasil (2), Colombia (34), Nicaragua (4) e Venezuela (3); - 11 da Europa: Alemanha (6), Espanha (1), Portugal (1), Bélgica (1), Reino Unido (2); - 73 da África: África do Sul (55), Angola (4), Botswana (5), Quênia (2), São Tomé e Príncipe (1), Tanzânia (6).

América Pelo registro de Dominguéz de Toledo (1995), ao analisar materiais da Argentina, outro herbário deste país foi consultado, o Herbario del Departamento de Ciencias Biológicas Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires (BAFC), porém não houve resposta. Os herbários do Brasil foram escolhidos por serem do estado de Santa Catarina, localidade tipo do gênero. A cidade do tipo, Blumenau, possui o Herbário Dr. Roberto Miguel Klein (FURB). Outro herbário consultado foi de uma cidade onde foi realizada coleta, Joinville, Herbário Joinvillea (JOI). Nenhum dos dois herbários possui exscicatas de Blumenavia. Pelos registros no Mushroom Observer havia exemplares na Colombia, Venezuela e Nicaragua e os herbários desses locais foram consultados no IH. Na Colômbia trinta e quatro herbários estão registrados no IH. Em doze deles não foi possível obter contato, cinco destes por não possuírem correio eletrônico, e em sete o e-mail não foi encontrado no servidor. Um destes que não possuía correio eletrônico, o Herbario do Jardín Botánico de Cartagena “Guillermo Piñeres” (JBGP), foi possível localizar o e-mail do curador por meio de uma publicação realizada pelo mesmo. No retorno do e-mail este informou não possuir exsicatas de fungos na coleção. Outros doze herbários também afirmaram não possuírem exsicatas de fungos, são eles: PSO, UTMC, COAH, DUGANG, LLANOS, CAUP, FMB, UDBC, HUA, HG, UNO, JBB. O herbário COL (Herbario Nacional Colombiano) afirmou possuir 1 exsicata de Blumenavia rhacodes, mas não foi possível fazer o envio porque o herbário estava com problemas para receber a permissão de exportação do Ministério do Meio Ambiente. Outros 9 herbários não responderam. Devido o registro no NY e no Mushroom Observer de exemplares de Blumenavia na Venezuela, três herbários foram consultados, Herbario Micológico Albert S. Muller (VIA), Herbario de la Universidad Pedagógica Libertador, Núcleo Maracay (IPMY) não 61 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. responderam. O Herbario Victor Manuel Badillo (MY) não possui exsicatas de Blumenavia ou sinônimos. Da Nicaragua dois herbários não possuíam contato eletrônico (Herbario do Instituto Pedagógico de Varones – MGA, Herbario Nacional de Nicaragua – HNMN). O Herbario de la Universidad Nacional Agraría (ENAG) não conta com coleção de fungos. O Herbario Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua (HULE) não respondeu.

Europa Os Herbários da Espanha, Portugal, Bélgica, Reino Unido (Escócia e Inglaterra) foram consultados por poderem possuir exscicatas de coletas brasileiras enviadas por pesquisadores. O Herbário do Museu Nacional de História Natural e da Ciências (LISU) de Portugal e o Herbario da Universidad de Alcalá (AH) da Espanha, reponderam que não possuem exsicatas do gênero nem de sinônimos. O herbário da Escócia consultado, Royal Botanic Garden Edinburgh (E), da Bélgica, Herbarium Ghent University (GENT), bem como o Herbarium CABI Bioscience UK Centre (IMI) da Inglaterra não responderam. Herbários da Alemanha foram consultados para verificar onde o pesquisador alemão que descreveu o gênero, Möller, depositou seu material, uma vez que essa informação não está disponível na publicação de 1895. Foram consultados seis herbários, dentre eles dois responderam que não possuíam as exsicatas procuradas, em dois o e-mail enviado não foi encontrado no servidor e dois responderam que contavam com exsicatas coletadas por Möller no Brasil. Estes últimos são o Herbarium Hamburgense - Biozentrum Klein-Flottbek (HBG) e o Botanischer Garten und Botanisches Museum Berlin (B). HBG possui em álcool um espécime coletado por Möller no Brasil, o curador Mathias Schultz, por meio de contato por e-mail, informou que seria provável que este material fosse o tipo, mas não havia nenhuma indicação escrita deste fato. O mesmo aconteceu com o herbário B, que possuía um espécime preservado em álcool coletado por Möller, mas sem especificar que seria o tipo. Também estão depositadas duas imagens originais de Blumenavia rhacodes de Möller, uma delas está na publicação original da descrição da espécie. Este herbário possui também o tipo de Blumenavia usambarensis que tinha parte preservada em álcool, e parte desidratada. Os materiais de Blumenavia do herbário B foram enviados como empréstimo pelo curador Robert Lüking: parte desidratada de Blumenavia usambarensis; amostra inicialmente em álcool de B. rhacodes, enviada porque estava seca pela evaporação do álcool quando foi encontrada na coleção pelo curador; e as duas imagens. 62 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Dos quatro herbários da Angola que constam no IH, três deles: Herbarium Museu do Dundo (DIA), Herbarium Instituto Superior de Ciencias da Educação (LUBA) e Herbarium Instituto de Investigação Agronómica (LUA) não possuíam correio eletrônico para contato. O quarto Luanda Herbarium (LUAI) estava com o e-mail errado.

África Dos 58 herbários da África do Sul contactados 20 responderam que não possuem exsicatas de Blumenavia ou sinônimos, a maioria deles não possui coleção de fungos. Oito não responderam, 13 não possuía o contato no IH e 16 deles o e-mail estava errado, porque retornou como não encontrado. Dos cinco herbários de Botswana o National Museum, Monuments, and Art Gallery (GAB) não possuía correio eletrônico para contato, o e-mail para o Herbarium Department of Agricultural Research (MAH) retornou como não encontrado; o Herbarium Department of Biological Sciences (UCBG) e o Herbarium Botswana College of Agriculture (BACH) responderam que não possuíam exsicatas do fungo procurado. Peter Smith Herbarium (PSUB) não respondeu ao e-mail enviado. O registro de dois herbários do Quênia foi encontrado, são eles o East African Herbarium - National Museums of Kenya I (EA) e o Herbarium Botany Department - University of Nairobi (NAI). O EA não possui exsicatas de Phallales em sua coleção e o NAI não respondeu. Há somente um registro de Blumenavia para São Tomé e Príncipe, por esse motivo o herbário dessa localidade foi consultado -Herbário Nacional of São Tomé e Príncipe (STPH)-, mas não respondeu. Na Tanzânia o Grumeti Fund Field Herbarium (GFT) não possuía exsicatas de Blumenavia. O Herbarium Forest Biology Department - Sokoine University of Agriculture (SUA) não possui endereço eletrônico, o National Herbarium of Tanzania (NHT), Herbarium Silviculture Research Centre (TFD), Herbarium Institute of Traditional Medicine (ITMH) e Forestry Training Herbarium (FTOH) não responderam. Foram consultados diretamente alguns pesquisadores da África para verificar se saberiam de alguma coleção de Blumenavia coletadas na África, porém nenhum teve resposta afirmativa. São eles: Francisco Maiato, Gideon Smith, Jolanda Roux, Cathy Sharp, e Pedro Crows. O último pesquisador recomendou o Herbário de Pretória, África do Sul - National Collection of Fungi, Biosystematics Division, Unit (PREM), após consulta com a curadora se constatou que não há coleções de Blumenavia neste herbário. 63 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

4.1.3 Exsicatas solicitadas e emprestadas

A Tabela 5 mostra o total de herbários consultados e o resultado da busca por exsicatas. Foram consultados 151 herbários, dentre aqueles que se obteve resposta, 48 não possuíam espécimes de Blumenavia ou sinônimos (APÊNDICE A) e 20 posuíam. Dos 20 herbários que possuíam exsicatas,10 realizaram o empréstimo (Tabela 6) e 11 herbários não puderam realizar (APÊNDICE B). O valor não corresponde à 20 porque o herbáro BPI está duplicado, emprestou algumas, mas não todas exsicatas. Infelizmente em um dos herbários que emprestou, FLOR, o material foi extraviado pelos Correrios no envio. O herbário LSUM dos EUA não respondeu à solicitação, portanto não realizou o empréstimo, mas sabe-se que possui exsicatas de Blumenavia toribiotalpaensis (ele corresponde ao único valor da coluna “Não respondeu, possui exsicata”, na Tabela 5). Houve mais 32 herbários que não responderam o contato, além destes não foi possível o contato com 26 herbários pela falta de correio eletrônico na plataforma consultada e com 25 pelo retorno do e-mail. Na Tabela 7 está a relação da quantidade de exsicatas do gênero Blumenavia e sinônimos (destas é descriminada a quantidade das que estão desidratadas, em solução e ilustrações) por espécie e herbário, a nível mundial, e a especificação das que foram emprestadas. Foram recebidas 40 exsicatas de 9 herbários, num total de 80 em 20 herbários. Dentre as recebidas está duas imagens. Na Tabela 8 está a relação das exscicatas emprestadas por herbário com os respectivos números de tombamento, anos e locais das coletas, e as especificações dos tipos quando houver. Blumenavia angolensis possuía o registro em seis herbários totalizando sete exsicatas, todas desidratadas. Há também dois registros do basiônimo Laternea angolensis, sendo um deles a ilustração do protólogo (holótipo). Também um registro de Clathrus angolensis. Foi realizado o empréstimo de quatro exsicatas desidratadas de B. angolensis num total de três herbários. Blumenavia rhacodes possuía o registro em quatorze herbários totalizando duas ilustrações e 52 exsicatas, dentre estas três estavam preservadas em solução de álcool, 48 desidratadas, sendo uma destas últimas inicialmente preservada em álcool e posteriormente desidratada. Foi realizado o empréstimo de 27 exsicatas desidratadas e duas ilustrações, num total de sete herbários. Blumenavia toribiotalpaensis possuía o registro em três herbários totalizando doze exsicatas, dentre estas cinco estavam preservadas em solução de álcool e sete desidratadas. Foi 64 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. realizado o empréstimo de cinco exsicatas desidratadas num total de dois herbários, incluindo o holótipo, isótipo e parátipos. Blumenavia usambarensis possuia o registro em três herbários totalizando três exsicatas, duas desidratadas, com uma delas com parte preservada em álcool, e uma totalmente em solução spirit. Foi realizado o empréstimo de duas exsicatas desidratadas num total de dois herbários, incluindo o holótipo.

65 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Tabela 5: Total de herbários consultados que responderam ou não à solicitação de disponibilidade de exsicatas de Blumenavia, com o total de herbários que emprestaram ou os materiais solicitados

Respondeu e possui exsicata de Blumenavia Não Respondeu, respondeu, Não tem Continente ou Quantidade Não não possui Não possui contato E-mail Subcontinente País de herbários Emprestou emprestou exsicata respondeu exsicata eletrônico errado

África 76 África do Sul 58 0 0 21 8 0 13 16 4 0 0 0 0 0 3 1 Angola 5 0 0 2 1 0 1 1 Botswana

Quênia 2 0 0 1 1 0 0 0 São Tomé e Príncipe 1 0 0 0 1 0 0 0 Tânzania 6 0 0 1 4 0 1 0 América 4 Central Nicarágua 4 0 0 1 1 0 2 0 América do 48 Sul Argentina 3 0 2 0 1 0 0 0 Brasil 8 6¹ 0 2 0 0 0 0 Colômbia 34 0 1 13 9 0 4 7 3 0 0 1 2 0 0 0 Venezuela

América do Norte 8 Estados Unidos 5² 1 3 0 1 1 0 0 México 3 2 1 0 0 0 0 0 Europa 13

Inglaterra 2 0 1 0 1 0 0 0 Escócia 1 0 0 0 1 0 0 0 Portugal 1 0 0 1 0 0 0 0 Espanha 1 0 0 1 0 0 0 0 Alemanha 6 1 1³ 2 0 0 2 0 Bélgica 2 0 1 0 1 0 0 0 2

Austrália 2 0 0 2 0 0 0 0 TOTAL 21 países 1512 10 10 48 32 1 26 25 ¹ O Herbário FLOR enviou o empréstimo, mas a exsicata foi perdida no translado. ² Valor não corresponde à soma dos herbários discriminados na correspondente linha da tabela, pois um deles está duplicado. O herbário BPI fez o empréstimo de algumas exsicatas, mas não de todas. ³ Enviou parte de material para extração de DNA. 66 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Tabela 6: Herbários que fizeram o empréstimo de exsicatas

Localidade Acrôni- Continente ou Data de (cidade, estado, Herbário mo do Contato Subcontinente recebimento país) herbário América do Norte Zapopan, Jalisco Instituto de Botánica IBUG Laura Guzmán Dávalos 22/06/2016 México Universidad de Guadalajara Xalapa, Instituto de Ecología, XAL Florencia Ramírez Guillén 11/07/2016 Veracruz, A.C México Beltsville, U.S. National Fungus BPI Shannon Dominick 11/07/2016 Maryland, E.U.A Collections, USDA- ARS

América do Sul Natal, RN, Brasil Herbário de Fungos UFRN Iuri Goulart Baseia 15/03/2016 da Universidade Federal do Rio Grande do Norte Florianópolis, Herbário FLOR Maria Alice Neves NÃO SC, Brasil Departamento de RECEBIDA Botânica Universidade Federal de Santa Catarina Porto Alegre, Herbário ICN ICN Mara Rejane Ritter 08/04/2016 RS, Brasil Departamento de Botânica Universidade Federal do Rio Grande do Sul São Leopoldo, Herbário Anchieta- PACA-F Maria Salete Marchioretto 11/07/2016 RS, Brasil PACA < [email protected]> Instituto Anchietano de Pesquisas/UNISINOS Curitiba, PR, Museu Botânico MBM José Tadeu Motta 28/07/2016 Brasil Municipal

São Paulo, SP, Herbário do Instituto SP Adriana de Mello 17/02/2017 Brasil de Botânica Gugliotta Europa Berlim, Botanischer Garten B Robert Lücking 16/03/2017 Alemanha und Botanisches Museum Berlin

67 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Tabela 7: Total de exsicatas de Blumenavia e sinônimos em herbários, a nível mundial

Espécie Quantidade Total de Quantidade Total de Total de Herbário preservada exsicatas desidratada ilustrações recebidas¹ em álcool B. angolensis BR 1 0 1 0 0 FLOR 1 0 1 0 0 ICN 2 0 2 0 2 K 1 0 1 0 0 MBM 1 0 1 0 1 UFRN- Fungos 1 0 1 0 1 TOTAL 6 7 0 7 0 4 B. rhacodes B 3 0 1² (tipo) 2 3 BPI 1 0 1 0 1 CORD 5 0 5 0 0 FH 5 0 5 0 0 HBG 1 (tipo) 1 0 0 0 ICN 6 2 4 0 4 NY 1 0 1 0 0 PACA 6 0 6 0 6 SI 1 0 1 0 0 SP 1 0 1 0 1 UFRN- Fungos 1 0 1 0 1 XAL 13 0 13 0 13 XALU 9 0 9 0 0 COL 1 0 1 0 0 TOTAL 14 54 3 49 2 29 B. toribiotalpaensis IBUG 5 1 4 (1 isótipo, 0 4 3 parátipos) BPI 1 0 1 (tipo) 0 1 LSUM 6 4 2 0 0 TOTAL 3 12 5 7 0 5 B. usambarensis B 1 (holótipo) ½ ½ 0 ½ K 1 1 0 0 0 SP 1 0 1 0 1 TOTAL 3 3 1 e ½³ 1 e ½³ 0 1 e ½³ Clathrus angolensis FH 1 0 1 0 0 TOTAL 1 1 0 1 0 0 Continua

68 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Conclusão Espécie Quantidade Total de Quantidade Total de Total de Herbário preservada exsicatas desidratada ilustrações recebidas¹ em álcool Colonnaria sp. FH 1 0 1 0 0 TOTAL 1 1 0 1 0 0 Laternea angolensis BPI 1 0 1 0 0 K 1 0 0 1 (tipo) 0 TOTAL 2 2 0 1 1 0 TOTAL GERAL 20 80 9 68 3 40 ¹ As exsicatas recebidas estavam desidratadas ² Inicialmente preservada em álcool ³ ½ foram consideradas como exsicatas inteiras para soma do total geral

69 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Tabela 8: Exsicatas de Blumenavia emprestadas

Data da Seq. Herbário Espécime Nº de tombamento Local de coleta Obs. coleta 1 B B. usambarensis B700016468 19/01/1900 TAN-Usambara Tipo 2 B. rhacodes¹ B700016478 sem data BR-SC-Blumenau Tipo?² 3 B. rhacodes³ B700016470 sem data BR-SC-Blumenau Imagem 4 B. rhacodes³ B700016469 sem data BR-SC-Blumenau Imagem 5 BPI B. rhacodes BPI 703249 sem data BR 6 B. toribiotalpaensis BPI 870955 10/09/2002 MX-JA, Talpa de Tipo Allende 7 IBUG B. toribiotalpaensis 13/09/2005 MX-JA, Talpa de Parátipo IBUG 454 Allende 8 B. toribiotalpaensis 13/09/2005 MX-JA, Talpa de Parátipo IBUG 456 Allende 9 B. toribiotalpaensis 13/09/2005 MX-JA, Talpa de Parátipo IBUG 462 Allende 10 B. toribiotalpaensis 10/09/2002 MX-JA, Talpa de Isótipo IBUG 240a Allende

11 ICN B. rhacodes ICN 177266 1.iv.2014 BR-RS, Porto Alegre, Campus Vale UFRGS

12 B. rhacodes ICN 177267 2.iv.2014 BR-RS, Porto Alegre, Campus Vale UFRGS

13 B. rhacodes ICN 176968 17/05/2011 BR-RS, Porto Alegre, Morro Santana

14 B. rhacodes ICN 176969 31/05/2011 BR-RS, Porto Alegre, Morro Santana

15 B. angolensis ICN 177268 08/02/2014 BR-RS, São Francisco de Paula, Floresta Nacional de São Francisco de Paula (FLONA) 16 B. angolensis ICN 177269 13/04/2014 BR-RS, São Francisco de Paula, Floresta Nacional de São Francisco de Paula (FLONA) 17 MBM B. angolensis Meijer 4339 17/08/2005 BR-PR Antonina, Reserva Natural do Rio Cachoeira 18 PACA-F B. rhacodes PACA-FUNGI 12549 sem data BR-RS, São Leopoldo

19 B. rhacodes PACA-FUNGI 12550 1906 BR-RS, São Leopoldo

20 B. rhacodes PACA-FUNGI 12551 1932 BR-RS, São Leopoldo

21 B. rhacodes PACA-FUNGI 12552 1907 BR-RS, São Leopoldo

22 B. rhacodes PACA-FUNGI 12553 sem data BR-RS, São Leopoldo

23 B. rhacodes PACA-FUNGI 14978 1930 BR-RS, São Leopoldo 24 SP-F B. usambarensis SP-FUNGI 97633 14/10/1966 BR-SP, Instituto de Botânica 25 B. rhacodes SP-FUNGI 22620 1907 sem local definido 26 UFRN B. rhacodes UFRN-Fungos 176 26/07/1998 BR-SP, Instituto de Botânica 27 B. angolensis UFRN-Fungos 1943 07/07/2012 BR-CE, Guaramiranga Continua

70 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Conclusão Data da Seq. Herbário Espécime Nº de tombamento Local de coleta Obs. coleta 28 XAL B. rhacodes J.C.Anel 410 13/06/1986 MX-VE, Parque Ecológico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 rua antiga em Coatepec,Xalapa 29 B. rhacodes R. Farias 09/07/1986 MX-VE, 1Km ao S da Fac de Biologia pelo caminho Penuela

30 B. rhacodes F. Tapia 712 05/07/1991 MX-MC, Cañada de Cointzio, Mpio.Morelia

31 B. rhacodes S. Chacón 4475 14/01/1991 MX-VE, jardim de uma casa ao Norte da cidade de Xalapa

32 B. rhacodes X. Madrigal 4535 08/10/1994 MX-MC, Cañada de Cointzio, Mpio.Morelia

33 B. rhacodes S. Chacón 5107 30/09/1997 MX-VE, Jardim Botânico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec,Xalapa 34 B. rhacodes R. Medel 654 24/07/1998 MX-VE, Caminho em frente ao Jardim Botânico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec,Xalapa 35 B. rhacodes R. Medel 662 17/08/1998 MX-VE, Caminho em frente ao Jardim Botânico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec,Xalapa 36 B. rhacodes R. Medel 672 27/09/1998 MX-VE, Jardim Botânico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec,Xalapa 37 B. rhacodes D. Jarvio 370 09/11/1999 MX-VE, Jardim Botânico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec,Xalapa 38 B. rhacodes S. Chacón 5257-A 09/06/2000 MX-VE, Jardim Botânico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec,Xalapa 39 B. rhacodes D. Jarvio 778 21/11/2000 MX-VE, Jardim Botânico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec,Xalapa 40 B. rhacodes E. Gándara 1455 19/08/2005 MX-VE, Jardim Botânico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec,Xalapa ¹ Inicialmente preservada em álcool. ² Não está especificado na exsicata que é o tipo, informação do curador. ³ Ilustrações. 71 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

4.1.4 Espécimes coletados

Apesar dos esforços de coleta somente um basidioma expandido de Blumenavia foi coletado em 30/06/2016 na Trilha dos Veadeiros, APA do Maciço de Baturité, na Serra de Guaramianga-CE, com o número de coletor GCSM 15. Localidade: 09º 15’ 13.4” S, 38º 55’ 47,5” W. Foram necessárias duas excursões para o local, uma vez que, na primeira visita foram encontrados somente dois ovos de Phallales. Ao coletar e cortar um dos ovos o mesmo apresentou o desenvolvimento multipileado indicando ser da Família Clathraceae (Figura 3 b e 13 b). Na segunda excursão no mesmo local foi encontrado mais 7 ovos de Phallales, e um basidioma expandido em outro ponto da trilha. Os ovos estavam sobre e próximo a um tronco de árvore caído à 856 m de altitude, mesmo os que estavam próximos ao desenterrar foi verificado que a rizomorfa estava aderida ao tronco (Figura 19 a-d). Com o corte de alguns ovos foi possível identificar o tipo de desenvolvimento, multipileado e as camadas do perídio. O basidioma expandido estava em um ponto mais próximo ao início da Trilha dos Veadeiros, em serapilheira com a rizomorfa aderida a um pequeno tronco em decomposição. 844 m de altitude, 4º 15’ 15,12” S, 38º 55’ 49,28” W (Figura 19 e-f). O material coletado foi tombado no Herbário de Fungos da UFRN com o número UFRN-Fungos 2868, a descrição e identificação do material será observada posteriormente.

4.1.5 Materiais analisados

Dentre as 38 exsicatas emprestadas foram descartadas da análise: PACA-F 12553, por estar muito deteriorada (contaminada com outros fungos), UFRN-Fungos 176, SP-F 22620, SP- F 97633 e ICN176969, pelos materiais estarem muito quebrados e/ou faltando pedaços. O material X. Madrigal 4535 do herbário XAL foi determinado como Clathrus columnatus pela ausência de glebíferos. Este último também foi retirado das descrições finais realizadas somente para o gênero Blumenavia. Ao total foram analisadas macro e microscopicamente 32 exsicatas emprestadas e 1 basidioma expandido coletado (analisado macroscopicamente quando fresco e desidratado). Destre estes, 27 foram separados para a molecular. O critério de escolha foi optar por um representante de cada localidade, ou por semelhanças morfológicas. O Apêndice D mostra o resultado das extrações e amplificações para cada amostra testada.

72 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 19 – Ovos e basidioma expandido de Blumenavia coletados em Guaramiranga – CE

Legenda: a: Tronco caído onde estavam os ovos. b: Faces laterais do ovo coletado. c: Ovo sobre serapilheira. d: Local de coleta do basidioma de Blumenavia. e: Basidioma em campo. f: Basidioma coletado, com os detalhes do glebífero e do braço esponjoso (fotos da autora). Barras: b, c, e, f = 1cm.

73 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

4.2 ANÁLISES MOLECULARES

4.2.1 Extrações e amplificações

A extração de DNA teve um sucesso de 21,15%, no total foram 42 sequências boas, sendo destas 10 de ITS, 8 de LSU, 6 de ATP6, 9 de RPB2 e 9 de TEF1α. A quantidade de produto de extração no tubo de PCR Beads variou para algumas amplificações, as quantidades são: 1µl de cada primer (direto e reverso) na concentração de 10 µmol, 10µl do produto da extração e 13µl de Água MilliQ® autoclavada; ou 1µl de cada primer (direto e reverso) na concentração de 10 µmol e 23µl do produto da extração. A Tabela 9 mostra a quantidade de DNA utilizada para o PCR de cada amostra, bem como os primers utilizados para cada marcador. Ao todo 11 espécimes foram sequenciados nos diferentes marcadores. Resultando um total de dez sequências de ITS, oito de LSU, seis de ATP6, nove de RPB2 e nove de TEF1 α.

74 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Tabela 9: Quantidade do produto da extração de DNA de espécimes de Blumenavia sp., e os primers utilizados para cada marcador no PCR (PCR Beads) ITS LSU ATP6 RPB2 TEF1 α Quant. Quant. Quant. Quant. Quant. Espécie Herbário Nº tombamento Primer para produto Primer produto Primer para produto Primer para produto Primer para produto ITS extração para LSU extração ATP6 extração RPB2 extração TEF1 α extração (µl) (µl) (µl) (µl) (µl) B. angolensis UFRN 1943 ITS5/ ITS4 23 LR0R/LR5 * ATP6-3/ 23 bRPB2-6F/ 23 EF1-1018/ 23 ATP6-4 bRPB2-7R EF1-1620R B. angolensis ICN 177268 - - LR0R/LR5 10 ATP6-3/ 10 bRPB2-6F/ 23 EF1-1018/ 23 ATP6-4 bRPB2-7R EF1-1620R B. angolensis ICN 177269 ITS5/ ITS4 10 LR0R/LR5 10 ATP6-3/ 23 bRPB2-6F/ 10 - - ATP6-4 bRPB2-7R B. rhacodes ICN 176968 ITS5/ ITS4 10 LR0R/LR5 10 ATP6-3/ 10 - - EF1-1018/ 10 ATP6-4 EF1-1620R B. rhacodes ICN 177266 ITS5/ ITS4 10 LR0R/LR5 10 ATP6-3/ 10 bRPB2-6F/ 10 EF1-1018/ 10 ATP6-4 bRPB2-7R EF1-1620R B. rhacodes XAL S.Chacón 5257-A ITS5/ ITS4 10 LR0R/LR5 10 - - bRPB2-6F/ 10 EF1-1018/ 10 bRPB2-7R EF1-1620R

B. rhacodes XAL E. Gandará 1455 ITS5/ ITS4 10 - - - - bRPB2-6F/ 23 EF1-1018/ 23 bRPB2-7R EF1-1620R B. rhacodes XAL D. Jarvio 778 ITS5/ ITS4 10 ------

B. toribiotalpaensis IBUG 456 ITS5/ ITS4 10 - - - - bRPB2-6F/ 10 EF1-1018/ 10 (PARATIPO) bRPB2-7R EF1-1620R B. toribiotalpaensis BPI 870955 ITS5/ ITS4 10 LR0R/LR5 10 - - bRPB2-6F/ 10 EF1-1018/ 10 (TIPO) bRPB2-7R EF1-1620R Blumenavia sp. UFRN 2868 ITS5/ ITS4 10 LR0R/LR5 10 ATP6-3/ 10 bRPB2-6F/ 10 EF1-1018/ 10 ATP6-4 bRPB2-7R EF1-1620R * Sequencia fornecida pela Dra. Tiara Cabral. - Não amplificada.

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4.2.2 Análises filogenéticas

Para as análises filogenéticas foram utilizadas 42 novas sequências geradas de 11 espécimes de Blumenavia. Adicionalmente foram retiradas sequências de 24 espécimes do GenBank, sendo 19 para compor o ingroup e 5 para o outgroup. No ingroup uma corresponde a Blumenavia, e as demais a outros membros da família Clathraceae, Protubera canescensis G.W. Beaton & Malajczuk (MEL 210535), foi considerada dentro do ingroup por se tratar da forma imatura de Ileodyction Tul. & C. Tul. conforme afirmou Cabral (2011), e se confirmou no presente trabalho. Para o outgroup foram escolhidos 4 espécimes da família Protophallaceae e 1 de Lysuraceae (no GenBank está Aseroe arachnoidea, mas atualmente é Lysurus arachnoideus). A Tabela 10 mostra os espécimes sequenciados e os espécimes retirados do GenBank, para cada marcador.

Tabela 10: Espécimes sequenciados e retirados do GenBank com os respectivos locais de coleta, herbários depositados, números de tombamento e números de acesso do GenBank para cada marcador, quando houver

Nº Número de acesso do GenBank Espécie Origem Herbário tombamento ITS 28S ATP6 RPB2 TEF1α Ingroup Blumenavia angolensis1 BR-CE, UFRN 1943 MG817726 MG817734 MH0619245 MH061934 MH061943 Guaramiranga Blumenavia angolensis1 BR-RS, São ICN 177268 - MG817727 MH061920 MH061926 MH061935 Francisco de Paula, Floresta Nacional de São Francisco de Paula (FLONA) Blumenavia angolensis1 BR-RS, São ICN 177269 MG817717 MG817728 MH061921 MH061927 - Francisco de Paula, Floresta Nacional de São Francisco de Paula (FLONA) Blumenavia rhacodes1 BR-RS, Porto ICN 176968 MG817718 MG817729 MH061922 - MH061936 Alegre, Morro Santana Blumenavia rhacodes1 BR-RS, Porto ICN 177266 MG817719 MG817730 MH061923 MH061928 MH061937 Alegre, Campus Vale UFRGS

Blumenavia rhacodes1 MX-VE, Jardim XAL S.Chacón MG817720 MG817731 - MH061929 MH061938 Botânico 5257-a "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec, Xalapa

Blumenavia rhacodes1 MX-VE, Jardim XAL E. Gandará MG817721 - - MH061930 MH061939 Botânico 1455 "Francisco Javier Clavijero", km. Continua 2.5 antiga rua em Coatepec, Xalapa 76 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Continuação

Nº Número de acesso do GenBank Espécie Origem Herbário tombamento ITS 28S ATP6 RPB2 TEF1α Ingroup Blumenavia rhacodes1 MX-VE, Jardim XAL D. Jarvio 778 MG817722 - - - - Botânico "Francisco Javier Clavijero", km. 2.5 antiga rua em Coatepec, Xalapa

Blumenavia MX-JA, Talpa de IBUG 456 MG817723 - - MH061931 MH061940 toribiotalpaensis1 Allende (PARÁTIPO)

Blumenavia MX-JA, Talpa de BPI 870955 MG817724 MG817732 - MH061932 MH061941 toribiotalpaensis1 Allende (HOLOTIPO)

Blumenavia sp.1 BR-CE, UFRN 2868 MG817725 MG817733 MH061924 MH061933 MH061942 Guaramiranga Blumenavia angolensis África- SãoTomé BR JD772 - KC128653 - - -

Abrachium floriforme BR-RN, Natal- UFRN 1851 *** JF968440 JF968438 JF968442 - Parque das Dunas

Anthurus archeri Nova Zelândia, PDD REB-2182 - DQ218624 DQ218913 DQ219081 DQ219260 Auckand City, (PDD100630) Meadowbank School Anthurus archeri - - GEL5392 - AJ406479 - - -

Aseroë rubra Austrália OSC 122632 - DQ218625 DQ218914 DQ219082 DQ219261

Clathrus archeri Polônia, Marwice Institute of C_A005 KP688380 KP688386 - - - Dendrology PAS Kórnik Clathrus archeri Polônia, Siedlec Institute of C_A007 KP688381 KP688388 - - - Dendrology PAS Kórnik Clathrus Austrália PDD 75096 - DQ218626 DQ218915 DQ219083 DQ219262 chrysomycelinus Clathrus delicatus Tailândia KH TH09-091 - KF783240 KF783256 KF783220 -

Clathrus ruber EUA-São OSC 79910 - - DQ218916 DQ219084 - Francisco, Califórnia

Clathrus ruber - KM 143411 GQ981501 - - - - Clathrus ruber - KM 28443 GQ981500 - - - -

Clathrus columnatus BR-RS, Viamão ICN 176972 - KF783239 KF783255 KF783219 - P.E. Itapoã (LTP257)

Ileodictyon gracile Austrália MEL 2024221 - DQ218634 DQ218923 DQ219094 DQ219271

Ileodictyon gracile Austrália MEL 2037639 - DQ218635 DQ218924 DQ219095 DQ219272

Ileodictyon gracile Austrália MEL 2054561 - DQ218636 DQ218925 DQ219096 DQ219273

Pseudocolus fusiformis USA DSH 96-033 - AF518641 - - - Continua

77 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Conclusão

Nº Número de acesso do GenBank Espécie Origem Herbário tombamento ITS 28S ATP6 RPB2 TEF1α Ingroup - ASM 4705 - AF213128 - - -

Protubera canescensis Austrália-Victória, MEL 210535 - DQ218645 DQ218932 DQ219108 DQ219284 (Ileodyction imaturo) EastGippsland

Outgroup - Aseroë arachnoidea Japão SK 69 (TNS) - KF783236 - KF783216 (atualmente Lysurus) -

Protubera canescensis - KM 153882 GQ981520 - - - -

Protubera canescensis - KM 158324 GQ981521 - - - -

Protubera maracuja BR-RS, Porto ICN 168980 - KC808513 KC808515 KF783231 - Alegre (LTP220) Protubera maracuja BR-PR, ICN 176967 - KC808514 KC808516 KF783232 - Guaraqueçaba, (LTP284) RPPN Salto Morato 1 Novas sequências geradas. - Sem informação ou sem sequência disponível. ** Sequências depositadas no GenBank, esperando números. *** Sequência cedida pessoalmente pela Dra. Tiara Cabra.

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A matriz concatenada gerada com 35 sequências (30 ingroup e 5 outgroup) possui 3874 pb, sendo estas 662 pb de ITS, 944 pb de LSU, 698 pb de ATP6, 791 pb de RPB2 e 779 pb de TEF1α, respectivamente. O modelo de substituição foi empregado para cada partição, que representa cada marcador, são eles: SYM+G para ITS, GTR+I+G para LSU e ATP6, GTR+G para RPB2 e HKY+I para TEF1α. As matrizes de cada gene seguem o mesmo tamanho e modelo de substituição descritos na matriz concatenada, para cada respectivo gene. Ao observar o resultado das análises de cada gene (árvores de Máxima Parcimônia e de Bayesiana – APÊNDICES E a N) constatou-se que os resultados não são incompatíveis. Visto isso se optou pelos dados para definir as espécies com base na matriz concatenada A análise de Máxima Parcimônia da matriz concatenada resultou nos índices: árvore= 1; tamanho=1207; Índice de consistência (CI) = 0,710853; Índice de retenção (RI) = 0.795906; Índice de consistência reescalonado (RC) = 0.565773; Índice de homoplasia (HI) = 0.289147; Goloboff-fits (G-fit) = -469.807143. Para a análise Bayesiana com a matriz concatenada foi necessário a adição de mais 10 milhões de gerações, somente com 10 milhões, como descrito na metodologia, o valor de ASDSF não tinha atingido o estado estacionário (estava acima de 0,01). O burn-in foi de 15,75 %, das 20 mil árvores geradas foram sumarizadas 16.850. A topologia da árvore consenso computada após o burn-in é mostrada na Figura 20, os valores de Propabilidade Posterior e bootstrap (da análise de MP) estão descritos em cada ramo na árvore.

79 Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 20 – Topologia da árvore filogenética da matriz concatenada obtida por análise Bayasiana

Legenda: Os valores decimais, antes da barra, representam os valores de probabilidade posterior, e os inteiros, depois da barra, de bootstrap da Máxima Parcimônia. Os clados das espécies de Blumenavia estão destacados em cores diferentes: roxo Blumenavia sp nov. 3; verde claro B. rhacodes; verde escuro Blumenavia sp. nov. 1; amarelo Blumenavia sp. nov. 2, amarelo escuro B. toribiotalpaensis, vermelho B. angolensis. A escala representa substituições por sítio. Fonte: Melanda, G. C. S. 80

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4.3 ANÁLISES MORFOLÓGICAS

4.3.1 Reavaliação dos critérios utilizados para descrição das espécies de Blumenavia

Ao descrever o gênero Blumenavia, e o seu tipo Blumenavia rhacodes Möller diferenciou dos gêneros próximos pela cor dos braços (amarelo pálido), forma dos glebíferos (lacerados ao longo de todo receptáculo) e sulco na face externa dos braços. Segundo o mesmo autor Laternea, o gênero mais próximo, também composto por braços, se diferenciava pela cor alaranjada a avermelhada e glebíferos somente no ápice. A segunda espécie descrita para o gênero, Blumenavia usambarensis, se diferenciou de Blumenavia rhacodes por ser de cor branca (HENNINGS, 1902). Utilizando Blumenavia usambarensis, Laternea angolensis, Clathrus angolensis e Colonnaria angolensis para propor a combinação nova, Blumenavia angolensis, Dring (1980) diferenciou de B. rhacodes pela cor do basidioma (branco), disposição da gleba em glebíferos (somente na metade superior dos braços e não ao longo de todos eles), e a forma e quantidade dos tubos em corte transversal dos braços, onde B. rhacodes apresentava pequeno número de tubos triangulares, e B. angolensis por volta de 6 tubos subtriangulares a quadrangulares e as braços afilando-se no ápice. Vargas-Rodrigues e Vazquez-García (2005) propuseram a espécie nova Blumenavia toribiotalpaensis pela cor do basidioma, amarelado-esbranquiçado à bege, por possuir glebíferos somente na metade superior dos braços, os tubos são diferentes das outras duas espécies por serem semicirculares por volta de 9 tubos, os esporos de maiores dimensões e possuírem sulco na face externa dos braços, assim como B. rhacodes. Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014) avaliando as espécies do gênero consideraram o tamanho e cor do basidioma como caracteres diagnósticos, já a disposição da gleba e cor da volva como caracteres não informativos. Neste trabalho se afirma que a cor e tamanho do basidioma são informativos, mas também a disposição e forma dos glebíferos, já a cor da volva não, mas sim as formas das hifas do exoperídio, e se as camadas do perídio possuem cristais na microscopia. A comparação entre os caracteres dito anteriormente como diagnósticos e quais realmente o são, segundo este trabalho, poderão ser visualizados na Tabela 11.

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Tabela 11: Comparação dos caracteres diagnósticos do gênero Blumenavia, antes e depois da revisão proposta neste trabalho

Caracteres já utilizados para descrição Caracteres considerados como das espécies diagnósticos para descrição das espécies Tamanho do basidioma Tamanho do basidioma Cor dos braços Cor dos braços Sulco na face exterior dos braços Sulco na face exterior dos braços - Sulco na face interior dos braços Espessura dos braços (da base ao ápice) Espessura dos braços (da base ao ápice) Disposição e forma dos glebíferos Disposição e novas formas dos glebíferos Tamanho e forma dos esporos Tamanho e forma dos esporos - Hifas do exoperídio apical (filamentosa e/ou globosas) - Presença de cristais nas camadas do perídio - Espessura da parede das hifas da rizomorfa

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4.3.2 Descrições das espécies

Após revisão é proposta a seguir uma emendação para o gênero Blumenavia:

O gênero Blumenavia é caracterizado por possuir ovo globoso à subgloboso, de cor branca, marrom-clara, preta a acinzentada, possuindo a cor uniforme ou escurecendo até o ápice, o exoperídio pode se craquelar exibindo o mesoperídio de cor branca, endoperídio gelatinoso amarelado, na base do ovo se estende a rizomorfa única de cor branca a amarelada que se ramifica após alguns milímetros de comprimento. Basidioma expandido medindo 40– 155 mm comp. × 13–55 mm larg. quando fresco, possuindo de 3 a 5 braços unidos no ápice e livres na base, com a mesma largura no comprimento inteiro de cada braço ou afilando-se a partir do meio, braços brancos ou amarelo-esbranquiçados a bege-claro, com glebíferos mais concentrados na parte superior dos braços ou se estendendo igualmente por todo receptáculo. Basidiósporos lisos cilíndrigos a alongados, podendo apresentar hifas filamentosas e/ou globosas no exoperídio apical.

Neste trabalho consideramos sete espécies para o gênero Blumenavia. Segue as descrições morfológicas de cada uma delas, ao final das descrições há o resumo dos caracteres analisados (Tabelas 12 e 13).

1- Blumenavia angolensis (Welw. & Curr.) Dring, Kew Bull. 35(1): 53 (1980) [MB#113149] Basiônimo ≡ Laternea angolensis Welwitsch & Currey, Trans. Linn. Soc. London 26(1): 286 (1870) Sinônimos ≡ Clathrus angolensis (Welw. & Curr.) Fischer, Jahrb. Bot. Gart. Mus. Berlin 4: 70 (1886) ≡ Colonnaria angolensis (Welw. & Curr.) Fischer in Engler & Prantl, Nat. Pflanzenfam., 2 Aufl. 7a: 85 (1933) Figura 21

Basidioma imaturo esbranquiçado à marrom-acinzentado (N60Y00M00 até N90Y00M00) ou totalmente cinza-escuro (N70C00Y20), com 25–30 mm diam., globoso, porção basal anexado a uma rizomorfa única que se ramifica posteriormente, 1,5 mm diam. Basidioma expandido 80–85 mm comp. × 35–40 mm larg. quando fresco, obovoide. Volva 30 mm diam. quando fresca. Endo-, mesoperídio não observados. Exoperídio branco (N00Y00M00) na base, craquelado de marrom-acinzentado (N60Y00M00 até N90Y00M00) até o ápice ou lisa totalmente cinza-escuro (N70C00Y20). Receptáculo consiste em 4 braços triangulares unidos no ápice e livres na base, esponjoso, branco, 10 mm diâmetro na base de cada braço estreitando levemente no ápice (BAA), sem sulco longitudinal na face exterior e 83

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. interior de cada braço. Glebíferos membranosos aderidos aos ângulos ântero-laterais dos braços, formados por projeções triangulares, quadrangulares ou irregulares, espaçados regularmente ao longo de todo receptáculo (PTQ - tr), de tamanho uniforme. Gleba, disposta em glebíferos, verde-acinzentada quando fresca. Basidiósporos alongados a cilíndricos, (3,2–)3,3–3,6–4(–4) × (1,3–)1,4–1,6–1,8(–1,9) μm, Q = (1,88)1,89–2,25–2,61(–2,68) [N = 75].

A descrição da espécie segue Degreef et al. (2013) e Desjardin e Perry (2015).

Hábito, habitat e substrato: Epígeo, solitário em floresta secundária.

Distribuição: África: Angola, São Tomé.

Comentários: A espécie se assemelha à Blumenavia usambarensis e Blumenavia sp. nov.2 pela cor do basidioma, mas se assemelha à B. rhacodes na forma e disposição dos glebíferos (PTQ – tr) de tamanho uniforme. Não possui sulco nas faces dos braços assim como Blumenavia usambarensis e Blumenavia sp. nov.3. Se diferencia de Blumenavia sp. nov.2 pela forma dos esporos, ausência de sulco nas faces dos braços e forma dos glebíferos. Se diferencia de Blumenavia toribiotalpaensis pelo tamanho e cor do receptáculo e pelo formato dos glebíferos.

Figura 21 – Espécimes de Blumenavia angolensis de São Tomé

Legenda: a: Coleta em 12 abril de 2011. b: Registro em 08 de maio de 2013, basidioma imaturo a esquerda e basidioma expandido a direita. Barras a, b = 1 cm. Fonte: a: Fotografia de Jérôme Degreef, imagem retirada de Degreef et al. (2013); b: Fotografia de Miko Nadel, imagem retirada de Desjardin e Perry (2015).

2- Blumenavia rhacodes Möller, Bot. Mitt. Trop.: 57 (1895) [MB#241046] Figuras 22; 23; 30d; 31c,f,g; 32d Sinônimo ≡ Laternea rhacodes (Möller) Lloyd, Synopsis of the known phalloids (7): 50 (1909) Basidioma imaturo não observado. Basidioma expandido 85–130 mm comp. quando fresco, 35–87 mm comp. × 16–52 mm larg. desidratado, oval a obovoide. Volva 15–35 mm comp. × 25–35 mm larg. quando fresca, 17–28 mm comp. × 14–26 mm larg. desidratada, 84

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. globosa a subglobosa, perídio composto por três camadas. Endoperídio formado por uma camada gelatinosa amarelada (N00Y40M00) quando fresco, coriácea amarelo-escura (Y80M30C10) quando seco, composto por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente sepatadas, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 1,55–5,73 [x= 3,39 ± 0,86] µm diam., paredes retas a levemente sinuosas, regulares 0,20–0,81 [x= 0,41 ± 0,09] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, com a presença de cristais marrons em KOH 5% e corados de vermelho em Vermelho Congo, assimétricos agrupados em formas globosas (cmag), e alguns fusiformes agrupados em raio (cmfr), as formas globosas dos agrupamentos medem 13,80–49,39 × 12,95–47,78 [n= 40, x= 30,98 ± 9,54 × 27,39 ± 9,37, Qm = 1,13] µm. Mesoperídio branco (N00M00C00) lanoso a esponjoso, fresco e desidratado, composto por hifas filamentosas, irregularmente sepatadas, sem células infladas e grampo de conexão, 2,06–9,09 [x= 4,80 ± 1,21] µm diam., paredes retas a levemente sinuosas, regulares 0,22–1,07 [x= 0,45 ± 0,13] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, com a presença de cristais marrons em KOH 5% e corados de vermelho em Vermelho Congo, assimétricos agrupados em formas globosas (cmag), e alguns fusiformes agrupados em raio (cmfr), as formas globosas dos agrupamentos medem 11,42–38,33 × 10,97–32,67 [n= 23, x= 23,50 ± 7,24 × 20,37 ± 5,68, Qm = 1,21] µm. Exoperídio branco (N00Y00M00) a marrom-claro (N40Y70M30) na base, craquelado de cinza (N70Y00M00) ou marrom-escuro (N90Y80M40) até o ápice, sem alteração da cor após desidratação. Exoperídio basal composto por hifas filamentosas, ramificadas, regulamente septada, sem células infladas e grampo de conexão, 2,06–8,89 [n=30, x= 5,10 ± 1,13] µm diam., paredes retas e regulares 0,21–0,86 [x= 0,51 ± 0,12] µm de espessura, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Exoperídio apical composto por hifas filamentosas e/ou hifas subglobosas, levemente elipsoides, elipsoides, alongadas, cilíndricas (o basidioma pode apresentar as duas formas ou somente uma delas). Hifas filamentosas, regularmente septadas, sem células infladas e grampo de conexão, 2,54–9,23 [n=30, x= 5,13 ± 1,16] µm diam., paredes retas e regulares 0,23–1,01 [x= 0,55 ± 0,13] µm de espessura, hifas hialinas com o lúmen de algumas marrons em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Hifas subglobosas a cilíndricas, 6,53–23,96 × 4,03–12,22 [n=30, x= 11,66 ± 3,21 × 6,74 ± 1,64, Qm = 1,80] µm, paredes retas e regulares 0,30–1,30 [x= 0,97 ± 0,25] µm de espessura, hifas com lúmen marrom em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Exoperídio apical com cristais cianos em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular (ccis), com menos de 5 µm e cristais marrons em KOH 5%, corados de vermelho em Vermelho Congo, assimétricos agrupados em formas globosas (cmag), as formas globosas dos agrupamentos medem 10,97–45,48 × 10,68–45,60 [n= 85

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

3, x= 30,98 ± 12,28 × 28,27 ± 11,56, Qm = 1,05] µm. Porção basal da volva anexada a uma rizomorfa única, que se ramifica posteriormente, com uma camada branca (N00M00C00) por cima e cor amarelada (N00Y60M40) por baixo, radiciforme, dividida em duas metades, com mais de 30 mm de comp., 0,51–1,52 mm diam. próximo à volva e 0,27–0,83 mm diam. na extremidade, composta por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente septadas, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 1,45–7,52 [x= 3,56 ± 1,05] µm diam., paredes retas e regulares, 0,27–0,98[x= 0,59± 0,21] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, com cristais de forma irregular (ccsi), com menos de 5 µm de comprimento, azulados em KOH e Vermelho Congo, pode apresentar cristais acinzentados em KOH 5% e Vermelho Congo, pentagonais, agrupados tipo pétalas de uma flor, os agrupamentos medem 20,24–84,76 × 15,68–77,54 [n= 10, x= 44,88 ± 21,21 × 41,37 ± 20,59, Qm = 1,12] µm. Receptáculo consiste em 3, 4 ou 5 braços triangulares unidos no ápice e livres na base, esponjoso, amarelo esbranquiçado a levemente alaranjado, fresco, amarelo-claro (Y70M10C00) a amarelo-escuro (Y90M20C10) quando seco, cada braço possui diâmetro aproximado da base ao ápice de cada braço (BMD), 3–10 mm diam., face exterior de cada braço com um sulco longitudinal (FES). Braço porção basal composto por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides, elipsoides a alongadas, 10,12–40,12 × 9,53– 33,03 [n=30, x= 24,14 ± 6,54 × 19,45 ± 5,47, Qm = 1,28] µm, paredes retas e regulares 0,25– 1,43 [x= 0,68 ± 0,20] µm de espessura, porção apical com hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 9,98–34,23 × 7,26–28,57 [n=30, x= 19,85 ± 3,94 × 16,50 ± 3,27, Qm = 1,21] µm, paredes retas e regulares 0,29–1,43 [x= 0,68 ± 0,20] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Glebíferos membranosos aderidos aos ângulos ântero-laterais dos braços, formados por projeções triangulares, quadrangulares ou irregulares, espaçadas regularmente ao longo de todo receptáculo (PTQ - tr), de tamanho uniforme, ou podendo diminuir de tamanho na metade inferior até a base (em - ptq). Glebíferos compostos por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides, elipsoides a alongadas, 8,76–38,17 × 7,84–32,02 [n=30, x= 19,39 ± 4,66 × 17,91 ± 4,11, Qm = 1,24] µm, paredes retas e regulares 0,33–1,65 [x= 0,75 ± 0,19] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Gleba, disposta sobre os glebíferos, verde-oliva quando fresca, marrom-escuro (N90Y70M60) a preta (N99Y30M00), com alguns pontos avermelhados (N90Y80M99) quando seca. Basidiósporos alongados a cilíndricos, 2,97–4,66 × 1,11–2,29 [x= 3,72 ± 0,23 × 1,69 ± 0,17, Qm = 2,22] µm, lisos, com duas gútulas internas, uma em cada extremidade do comprimento, hialinos em KOH 5% e Vermelho Congo, inamiloides, cianofílicos. 86

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Hábito, hábitat e substrato: Epígeo, solitário, lignícola, em mata de floresta estacional semidecidual, sobre tronco em decomposição e sobre serrapilheira. Distribuição: Neotrótipos: Sul do Brasil (MÖLLER, 1895; RICK, 1929; TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014). Espécimes examinados: Brasil, Santa Catarina, Blumenau, sem data, Möller (B700016478, tipo – sem especificar na exsicata que é o tipo); Brasil, RS, Porto Alegre, Morro Santana, 30º 01' 59''S 51º 13' 48'’W, 17/05/2011, L. Trierveiler-Pereira 230 (ICN 176968); Brasil, RS, Porto Alegre, Campus Vale UFRGS, 30º01'59'' S 51º13'48'’ W, 3 m, 1/04/2014, E. Fazolino, 164 (ICN 177266); ibid., 02/04/2014, E. Fazolino, 165 (ICN 177267); Brasil, RS, São Leopoldo, sem data, Rick (PACA 12549); ibid., 1906, Rick (PACA 12550), ibid., 1907, Rick (PACA 12552); ibid., 1930, Rick (PACA 14978); ibid., 1932, Rick (PACA 12551). Duas fotografias em preto e branco: Nr12. (B700016469) e Nr. 10 (B700016470, presente no protólogo da espécie). Comentários: A espécie tipo do gênero contém características únicas como a disposição formados por projeções triangulares, quadrangulares ou irregulares, espaçadas regularmente ao longo de todo receptáculo, cristais na rizomorfa, e hifas do exoperídio apical podendo ser filamentosa e globosa, no mesmo espécime. Os braços possuem mesmo diâmetro da base ao ápice, assim como em Blumenavia sp. nov.1, Blumenavia sp. nov.2, e B. usambarensis. Apresentam cristais agrupados em formas globosas no endoperídio assim como em Blumenavia sp. nov.1.

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Figura 22 – Espécimes de Blumenavia rhacodes

Legenda: a-d: ICN 177266. a: Basidioma fresco. b: Glebífero fresco. c: Glebífero desidratado. d: Basidioma desidratado. e-g: B700016478 (TIPO). f: Aproximação do ápice. g: Aproximação da base, mostrando sulco longitudinal na face exterior dos braços. h: Camadas do perídio da volva desidratada de ICN 177267; E = endoperídio, M = mesoperídio, Ex = exoperídio. Barras: a, d, e = 10 mm; c, f, g = 1mm; h = 0,2 mm Fonte: a-b: Fotografia de Eduardo P. Fazolino. (nº de coletor: 164), imagens cedida pelo fotógrafo. c-h: Melanda, G. C. S.

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Figura 23 – Microscopia de Blumenavia rhacodes

Legenda: a: Receptáculo basal. b: Receptáculo apical. c: Glebífero. d: Endoperídio; setas indicando algumas células infladas. e: Mesoperídio. f: Exoperídio basal. g-h: Hifas da rizomorfa com cristais agrupados tipo flor (PACA 12551). Barras a-f, h = 5 µm; g = 20 µm. Fonte: Melanda, G. C. S.

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3- Blumenavia toribiotalpaensis Vargas-Rodriguez, Mycotaxon 94: 8 (2005) [MB#356388] Figuras 24; 30e; 31j,k; 32e Basidioma imaturo não observado. Basidioma expandido 121–153 mm comp. × 38– 56 mm larg. quando fresco, 54–88 mm comp. × 24–55 mm larg. desidratado, oval a obovoide. Volva 21–39 mm comp. × 22–38 mm larg, fresca, 11–28 mm comp. × 16–33 mm larg. quando desidratada, globosa a subglobosa, perídio composto por três camadas. Endoperídio formado por uma camada gelatinosa amarelada (N00Y40M00) quando fresco, coriácea amarelo-escura (Y80M30C10) quando seco, composto por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente sepatadas, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 2,32–5,57 [x= 3,71 ± 0,59] µm diam., paredes retas a levemente sinuosas, regulares 0,23–0,86 [x= 0,46 ± 0,10] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Mesoperídio branco (N00M00C00) lanoso a esponjoso, fresco e desidratado, composto por hifas filamentosas retas, ramificadas, irregularmente sepatadas, com células infladas nas extremidades de algumas hifas, sem grampo de conexão, (2,28–)3,08–7,41 (–9,75) [x= 4,74 ± 0,91] µm diam., paredes retas e regulares 0,28–0,89 [x= 0,50 ± 0,10] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, com a presença de cristais marrons em KOH 5% e corados de vermelho em Vermelho Congo, assimétricos agrupados em formas globosas (cmag), as formas globosas dos agrupamentos medem 18,81– 51,33 × 16,73–39,81 [n= 20, x= 30,94 ± 6,67 × 33,60 ± 6,25, Qm = 1,16] µm. Exoperídio amarelo claro na base (N10C00Y30-Y60), craquelado de cinza (N70C00Y20) a partir da parte media até ficar cinza-escuro na parte apical (N90C00Y10), sem alteração da cor após desidratação. Exoperídio basal composto por hifas filamentosas, irregularmente septadas, com a presença de células infladas nas extremidades de algumas hifas, sem grampo de conexão, 2,27–8,61 [x= 4,53 ± 1,10] µm diam., paredes retas e regulares 0,23–0,88 [x= 0,44 ± 0,11] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, com cristais cianos em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular (ccis), com menos de 5 µm de comprimento. Exoperídio apical composto por hifas filamentosas, irregularmente septadas, com a presença de células infladas nas extremidades de algumas hifas, sem grampo de conexão, 2,09–7,06 [x= 4,35 ± 0,91] µm diam., paredes retas e regulares 0,21–0,75(–1,08) [x= 0,43 ± 0,11] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, com a presença de cristais cianos em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular (ccis), com menos de 5 µm de comprimento e cristais marrons em KOH 5%, corados de vermelho em Vermelho Congo, assimétricos agrupados em uma formas globosas (cmag) e alguns fusiformes agrupados em raio (cmfr), as formas globosas dos agrupamentos medem 13,79–48,57 × 13,33– 90

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

48,78 [n= 20, x= 31,60 ± 6,67 × 33,60 ± 6,25, Qm = 1,16] µm. Porção basal da volva anexada a uma rizomorfa única, que se ramifica posteriormente, com uma camada branca (N00M00C00) por cima e cor amarelada (N00Y60M40) a avermelhada (Y99M99C60) por baixo, radiciforme, dividida em duas metades, com mais de 80 mm de comp., 0,74–1,19 mm diam. próximo à volva e 0,42–0,95 mm diam. na extremidade, composta por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente septadas, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 1,22–6,10 (–8,00) [x= 3,39 ± 0,93] µm diam., paredes retas e regulares com algumas levementente sinuosas, 0,14–0,90 [x= 0,44± 0,11] µm de espessura, hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Receptáculo consiste em 3, 4 ou 5 braços triangulares unidos no ápice e livres na base, esponjoso, esbranquiçado a bege pálido fresco, amarelo-claro (Y80M20C10) a amarelo mais escuro (Y90M20C10) quando seco, os braços afilam-se a partir do meio (BAM), 5–10 mm de diam. na porção basal, 3–7 mm na porção mediana, 2–4 mm na porção apical, face exterior de cada braço com um sulco longitudinal (FES). Receptáculo porção basal composto por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 21,16–61,63 × 16,34–50,87 [x= 37,88 ± 8,63 × 31,60 ± 6,77, Qm = 1,23] µm, paredes regulares e retas 0,53–1,57 [x= 0,85 ± 0,24] µm de espessura, porção apical com hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 14,61–39,61 × 11,51–36,27 [x= 26,68 ± 7,34 × 22,16 ± 7,06, Qm = 1,23] µm, paredes retas e regulares 0,37–1,27(–1,71) [x= 0,76 ± 0,21] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Glebíferos membranosos aderidos aos ângulos ântero-laterais dos braços, formados por grandes projeções laceradas (LG), pouco espaçadas umas das outras no ápice até a metade superior (ms), com pequenos pontos retorcidos (pr), mais espaçados entre si, até a base do receptáculo. Glebíferos compostos por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, (8,89–)11,02–40,94(–48,02) × (8,71–) 9,14–35,12(–38,83) [x= 23,96 ± 6,08 × 19,54 ± 5,27, Qm = 1,24] µm, paredes retas e regulares 0,27–1,71 [x= 0,71 ± 0,14] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Gleba, disposta em glebíferos, verde-oliva-amaronzada-escura quando fresca, cinza esverdeada (N60Y30M00) quando seca. Basidiósporos alongados a cilíndricos, 3,28–4,85 × 1,40–2,25 [n=30, x= 4,05 ± 0,23 × 1,78 ± 0,15, Qm = 2,29] µm, lisos, com duas gútulas internas, uma em cada extremidade do comprimento, hialinos em KOH 5% e Vermelho Congo, inamiloides, cianofílicos.

Hábito, hábitat e substrato: Epígeo, solitário, lignícola, bosque mesófilo de montanha (Acer, Abres, Podocarpus), sobre tronco de Pinus. 91

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Distribuição: México: Jalisco (VARGAS-RODRIGUEZ; VÁZQUEZ-GARCÍA, 2005). Espécimes examinados: México, Jalisco, Talpa de Allende, "Ojo de Agua del Cuervo" oeste ao “cumbre de los Arrastrados”, 20º 11" N, 105º 16" W, 1800 m, 10/09/2002, Yalma L. Vargas-Rodríguez 240, Javier Currel, António Vázquez, Toribio Quintero (BPI 870955, holótipo); ibid., 10/09/2002, Y. L. Vargas-Rodríguez 240a, J. Currel, A. Vázquez- García, T. Quintero (IBUG 240a, isótipo); ibid., 13/09/2005, Y. L. Vargas-Rodríguez 454, J. A. Vázquez-García (IBUG 454, parátipo); ibid., 13/09/2005, Y. L. Vargas-Rodríguez 456, J. A. Vázquez-García (IBUG 456, parátipo); ibid., 13/09/2005, Y. L. Vargas-Rodríguez 462, J. A. Vázquez-García (IBUG 462, parátipo). Comentários: Espécie sinonimizada por Calonge et al. (2007) com Blumenavia rhacodes devido a distribuição do glebífero por todo receptáculo, fato comprovado com as análises morfológicas do presente trabalho, mas estes glebíferos não se mantêm constantes, no ápice são formados por grandes projeções laceradas agrupadas, e ficam com pequenos pontos retorcidos até a base do receptáculo. O basidioma desta espécie é maior em tamanho em relação às demais espécies do gênero, os esporos possuem tamanho maior em relação à todas outras espécies do gênero e forma alongada à cilíndrica, assim como B. rhacodes, Blumenavia sp. nov.1, Blumenavia sp. nov.3 As hifas do exoperídio basal somente são constituídas por hifas filamentosas assim como Blumenavia sp. nov.3 e B. usambarensis.

Figura 24 – Espécimes de Blumenavia toribiotalpaensis

Legenda: a: Exsicatas do holótipo BPI 870955. b-c: Glebífero apical LG. d: Receptáculo basal mostando glebíferos pr. e:Ápice mostrando sulco na face exterior do braço. f-g: Glebíferos pr. h: Parte da volva e rizomorfa. i: Detalhes do perídio; E = endoperídio, M = mesoperídio, Ex = exoperídio. Barras: a = 10 mm; b, c, f = 1 mm; d, e, h = 2 mm; g= 0,1 mm; i = 0,5 mm Fonte: Melanda, G. C. S.

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4- Blumenavia usambarensis Henn., Botanische Jahrbücher für Systematik Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie 33: 37 (1902) [MB#241148] Figuras 25; 30f; 31l; 32f Basidioma imaturo não observado. Basidioma expandido 80 mm comp. × 25–30 mm larg. fresco, 46 mm comp. × 22 mm larg. desidratado, obovoide. Volva 35–40 mm larg. fresca, 23 mm comp. × 13 mm larg, desidratada, globosa a subglobosa, perídio composto por três camadas. Endoperídio formado por uma camada gelatinosa amarelada (N00Y40M00) quando fresco, coriácea amarelo-escura (Y80M30C10) quando seco, composto por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente sepatadas, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 2,12–3,81 [x= 2,92 ± 0,47] µm diam., paredes retas a levemente sinuosas, regulares 0,20–0,49 [x= 0,35 ± 0,08] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Mesoperídio branco (N00M00C00) lanoso a esponjoso, fresco e desidratado, composto por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente septadas, sem células infladas e grampo de conexão, 6,70–11,20 [x= 8,83 ± 2,26] µm diam., paredes retas e regulares 0,80–1,20 [x= 1,03 ± 0,21] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, com a presença de cristais cianos em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular, com menos de 5 µm de comprimento. Exoperídio com cor uniforme esbranquiçado (N00Y30M00) a marrom-claro (N30Y60M30), composto por hifas filamentosas, irregularmente septadas, sem células infladas e grampo de conexão, 2,14–7,82 [x= 4,35 ± 1,17] µm diam., paredes retas e regulares 0,30–0,54 [x= 0,41 ± 0,07] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Porção basal da volva anexada a uma rizomorfa única, que se ramifica posteriormente, com uma camada branca (N00M00C00) por cima e cor amarelada (N00Y60M40) por baixo, radiciforme, dividida em duas metades, com mais de 19 mm de comp., 1,54 mm diam. próximo à volva e 1,39 mm diam. na extremidade, composta por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente sepatada, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 5,75– 16,16 [x= 8,18 ± 2,26] µm diam., paredes retas a sinuosas e levemente irregulares em diâmetro com, 1,01–4,67 [x= 2,26± 0,72] µm de espessura, hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Receptáculo consiste em 3–5 braços triangulares unidos no ápice e livres na base, esponjoso, branco fresco, amarelo-claro (Y70M10C00) a amarelo-escuro (Y90M20C10) quando seco, cada braço possui diâmetro similar da base ao ápice (BMD) com 2–3 mm de diam., face exterior de cada braço sem sulco longitudinal. Receptáculo porção basal composto por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 12,16–52,49 × 11,24–41,61 [x= 32,03 ± 9,15 × 26,54 ± 7,33, Qm = 1,22] µm, paredes regulares e retas 0,48– 93

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

1,43 [x= 0,84 ± 0,21] µm de espessura, porção apical com hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides, elipsoides a alongadas, 9,99–20,78 × 8,90–19,81 [x= 16,27 ± 3,10 × 14,33 ± 2,79, Qm = 1,14] µm, paredes retas e regulares 0,33–0,73 [x= 0,55 ± 0,12] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Glebíferos membranosos aderidos aos ângulos ântero-laterais dos braços, formados por projeções triangulares ou quadrangulares na metade superior dos braços (PTQ – ms). Glebíferos compostos por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 9,03–18,30 × 6,54–18,03 [x= 13,73 ± 2,60 × 11,54 ± 2,22, Qm = 1,22] µm, paredes retas e regulares 0,31– 0,78 [x= 0,50 ± 0,12] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Gleba, disposta em glebíferos, verde-oliva-escura quando fresca, preta (N99Y30M00) quando seca. Basidiósporos cilíndricos, 2,62–3,31 × 1,13–1,48 [x= 3,08 ± 0,18 × 1,29 ± 0,09, Qm = 2,41] µm, lisos, com duas gútulas internas, uma em cada extremidade do comprimento, hialinos em KOH 5% e Vermelho Congo, inamiloides, cianofílicos.

Hábito, hábitat e substrato: Epígeo, solitário, saprófito, vegetação de montanha. Distribuição: África: Usambara (HENNINGS, 1902). Espécimes examinados: África, Tanzania, Usambara, Kummer 60, 19/01/1900 (B 700016468, holótipo). Comentários: Esta espécie é a única que apresenta esporos cilíndricos, somente, com possuem comprimento e largura menores (2,62–3,31 × 1,13–1,48 µm) em relação às demais espécies do gênero (2,90–4,85 × 1,10–2,29 µm). Esta espécie também se caracteriza por apresentar as hifas da rizomorfa com paredes espessas (1,01–4,67 µm) em relação às demais espécies do gênero (0,14–1,12 µm). Possuem braços com o mesmo diâmetro da base ao ápice, assim como Blumenavia sp.1, Blumenavia sp.2 e B. rhacodes. Volva com cor uniforme esbranquiçada a marrom-claro, mais claras que os espécimes de Blumenavia sp.1 com volva de cor uniforme, e diferente de Blumenavia sp.2, Blumenavia sp.3, B. angolensis, B. rhacodes e B. toribiotalpaensis com a volva clara na base escurecendo da metade para o ápice. Possuem cristais cianos no mesoperídio assim como Blumenavia sp.1.

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Figura 25 – Espécime de Blumenavia usambarensis

Legenda: a: Exsicatas do tipo B700016468. b: Glebífero PTQ. c: Volva com parte da rizomorfa. d: Rizomorfa radiciforme dividida ao meio. Barras: a = 10 mm; b, d = 0,5 mm; c = 1 mm Fonte: Melanda, G. C. S.

5- Blumenavia sp. nov. 1 Figuras 26; 27; 30a; 31a, d; 32a Diagnose: Basidioma expandido 70–105 mm comp. quando fresco, obovoide, receptáculo esponjoso, amarelo esbranquiçado, 3 a 5 braços triangulares unidos no ápice e livres na base. Glebíferos membranosos aderidos aos ângulos ântero-laterais dos braços, formados por projeções triangulares, quadrangulares ou irregulares, espaçadas regularmente e de tamanho uniforme em todos braços, ou podem ser também projeções formadas por linhas paralelas que se curvam para o interior ao longo da metade superior do receptáculo com pontos triangulares a quadrangulares até a base. Basidiósporos alongados a cilíndricos aproximado Qm = 2,35. A espécie apresenta cristais marrons agrupados em formas globosas no endo- meso- e exoperídio basal, e cristais cianos em todas as camadas do perídio.

Holótipo: México, Veracruz, Xalapa, Parque Ecológico “Francisco Javier Clavijero”, 13/06/1986 D. Jarvio 778 (XAL, como Collonaria); parátipos: ibid., 09/06/2000, S. Chacón 5257-A (XAL, como Colonnaria); ibid., 19/08/2005 E. Gándara 1455 (XAL, como Collonaria).

Descrição: Basidioma imaturo não observado. Basidioma expandido 70–105 mm comp. × 13–45 mm larg. quando fresco, 44–87 mm comp. × 10–37 mm larg. desidratado, obovoide. Volva, sem informações de tamanho quando fresca, 20–37 mm comp. × 9–39 mm larg. desidratada, globosa a subglobosa, perídio composto por três camadas. Endoperídio formado por uma camada gelatinosa amarelada (N00Y40M00) quando fresco, coriácea amarelo-escura (Y80M30C10) quando seco, composto por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente sepatadas, células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de 95

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. conexão, 1,06–5,97 [x= 2,98 ± 0,68] µm diam., paredes retas a levemente sinuosas, regulares 0,17–0,86 [x= 0,37 ± 0,10] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, com a presença de cristais cianos (ccis) em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular, com menos de 5 µm de comprimento e cristais marrons em KOH 5% e corados de vermelho em Vermelho Congo, assimétricos agrupados em formas globosas (cmag), e alguns fusiformes agrupados em raio (cmfr), as formas globosas dos agrupamentos medem 7,35–76,41 × 5,76–68,25 [n= 57, x= 31,90 ± 9,61 × 28,26 ± 8,92, Qm = 1,17] µm. Mesoperídio branco (N00M00C00) lanoso a esponjoso, fresco e desidratado, composto por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente sepatadas, sem células infladas e grampo de conexão, 1,21–9,74 [x= 4,64 ± 1,39] µm diam., paredes retas a levemente sinuosas, regulares 0,14–1,14 [x= 0,47 ± 0,14] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, com a presença de cristais cianos (ccis) em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular, com menos de 5 µm de comprimento e cristais marrom-escuros em KOH 5% e em Vermelho Congo, assimétricos agrupados em formas globosa (cmag) e alguns fusiformes agrupados em raio (cmfr), 10,35–50,47 × 8,98–35,68 [n= 21, x= 23,58 ± 17,81 × 11,73 ± 6,89, Qm = 1,15] µm. Exoperídio totalmente amarelo-claro (N00Y60M10) ou cinza-escuro, quase preto (N99Y10M00), com superfícia lisa, podendo apresentar cor diferenciada da base e do ápice, branco (N00Y00M00) a marrom-claro (N40Y70M30) na base, craquelado de cinza mais claro (N80Y30M10) a cinza-escuro (N99Y00M10), marrom-claro (N30Y60M30) ou marrom-escuro (N90Y80M40) da metade para o ápice, sem alteração da cor após desidratação. Exoperídio basal composto por hifas filamentosas retas, irregularmente sepatadas, sem célula inflada e grampo de conexão, 1,97–9,42 [x= 4,59 ± 1,24] µm diam., paredes retas e regulares 0,11–1,02 [x= 0,42 ± 0,11] µm de espessura, avermelhadas em Vermelho Congo, com a presença de cristais cianos em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular (ccsi), com menos de 5 µm de comprimento e cristais marrom-escuros em KOH 5% e em Vermelho Congo, assimétricos agrupados em formas globosa (cmag) e alguns fusiformes agrupados em raio (cmfr), as formas globosas dos agrupamentos medem 9,38–38,69 × 5,43–29,63 [n= 14, x= 21,53 ± 9,73 × 16,99 ± 7,24, Qm = 1,51] µm. Exoperídio apical composto por hifas filamentosas ou hifas subglobosas, levemente elipsoides, elipsoides, alongadas, cilíndricas e formas irregulares. Hifas filamentosas retas, regularmente septadas, sem células infladas e grampo de conexão, 3,04– 9,97 [x= 5,49 ± 1,36] µm diam., paredes retas e regulares 0,27–0,97 [x= 0,52 ± 0,13] µm de espessura, hifas hialinas com o lúmen de algumas marrons em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Hifas subglobosas a cilíndricas, 5,63–30,64 × 3,75–21,46 [x= 14,97 ± 4,27 × 9,02 ± 2,60, Qm = 1,81] µm, paredes retas e regulares 0,25–1,24 [x= 0,52 ± 0,12] µm de 96

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. espessura, hifas com lúmen marrom em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Exoperídio apical com cristais cianos em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular (ccis), com menos de 5 µm de comprimento. Porção basal da volva anexada a uma rizomorfa única, que se ramifica posteriormente, com uma camada branca (N00M00C00) por cima e cor amarelada (N00Y60M40) por baixo, radiciforme, dividida em duas metades, com mais de 135 mm de comp., 1,10–1,50 mm diam. próximo à volva e 0,80–1,40 mm diam. na extremidade, composta por hifas filamentosas, ramificadas, septação irregular, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 1,41–7,96 [x= 4,06 ± 1,07] µm diam., paredes retas e regulares, 0,16–1,12[x= 0,52± 0,16] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Receptáculo consiste em 3, 4 ou 5 braços triangulares unidos no ápice e livres na base, esponjoso, amarelo-esbranquiçado fresco, amarelo-claro (Y70M10C00) a amarelo-escuro (Y90M20C10) quando seco, cada braço possui diâmetro aproximado da base ao ápice (BMD), 3–4 mm de diam., também afilando-se a partir do meio (BAM), 5–6 mm de diam. na porção basal, 3–4 mm na porção mediana, 2–3 mm na porção apical ou somente afilando-se no ápice (BAA), 5–7 mm de diam. na porção basal, 5–7 mm na porção mediana, 2–4 mm na porção apical, face exterior de cada braço com um sulco longitudinal (FES). Receptáculo porção basal composto por hifas globosas, subglobosas a levemente elipsoides, 14,04–57,24 × 10,31–51,78 [x= 30,59 ± 6,80 × 24,16 ± 5,91, Qm = 1,24] µm, paredes retas e regulares 0,41–1,77 [x= 0,80 ± 0,18] µm de espessura, porção apical com hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 9,47–49,13 × 8,86–41,18 [x= 22,87 ± 4,87 × 18,99 ± 4,33, Qm = 1,22] µm, paredes retas e regulares 0,32–1,19 [x= 0,70 ± 0,15] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Glebíferos membranosos aderidos aos ângulos ântero-laterais dos braços, formados por projeções triangulares, quadrangulares ou irregulares, espaçadas regularmente e de tamanho uniforme em todos braços (PTQ - tr) ou podem ser também projeções formadas por linhas paralelas que se curvam para o interior (PCI) pouco espaçadas ao longo da metade superior do receptáculo (PCI – ms), ou PCI regularmente espaçadas ao longo da metade superior (PCI - em), ambas com pontos triangulares a quadrangulares até a base (ptq). Glebíferos compostos por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides, elipsoides a alongadas, 8,52–45,44 × 6,43–27,05 [x= 22,35 ± 4,75 × 17,68 ± 3,93, Qm = 1,30] µm, paredes retas e regulares 0,27– 1,32 [x= 0,68 ± 0,15] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Gleba, disposta em glebíferos, cinza-esverdeada a café-escuro quando fresca, marrom- escuro (N90Y70M60) a preta (N99Y30M00) quando fresca. Basidiósporos alongados a cilíndricos, 2,80–4,42 × 1,10–2,08 [x= 3,65 ± 0,24 × 1,57 ± 0,14, Qm = 2,35] µm, lisos, com 97

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. duas gútulas internas, uma em cada extremidade do comprimento, hialinos em KOH 5% e Vermelho Congo, inamiloides, cianofílicos. Hábito, hábitat e substrato: Epígeo, solitário, saprófito, em Bosque mesófilo de montanha. Distribuição: México: Veracruz (CALONGE, 2007). Espécimes adicionais examinados: México, Veracruz, Xalapa, Parque Ecológico “Francisco Javier Clavijero”, 13/06/1986, J. C. Anell 410 (XAL); ibid., 27/09/1998, R. Medel 672 (XAL, como Collonaria collumnata); ibid., 09/11/1999, D. Jarvio 370 (XAL, como Collonaria). México, Veracruz, Xalapa, jardim de uma casa ao norte da cidade, 1200 m, 14/01/1991, S. Chacón 4475 (XAL, como Blumenavia angolensis); México, Veracruz, Xalapa, Cerro Colorado, 1400 m, 05/07/1991, F. Tapia 712 (XAL). Comentários: Basidioma com tamanho variado desde pequenos, 44 mm quando seca, até maiores com 87 mm, mostrando uma plasticidade no tamanho, os glebíferos também possuem formas distintas, somente esta espécie possui duas formas distintas de glebíferos em basidiomas diferentes, as demais possuem apenas uma forma. A cor da volva também varia estre os espécimes, apresentando cor uniforme (amarelo-claro a preto) ou mais de uma cor como em Blumenvaria angolensis, Blumenavia sp.2, Blumenavia sp.3, B. rhacodes e B. toribiotalpaensis. Esta espécie compartilha com Blumenavia rhacodes, B. toribiotalpaensis e Blumenavia sp.2 a presença de um sulco longitudinal na face exterior de cada braço. As hifas do exoperídio apical podem ser filamentosas ou globosas, assim como Blumenavia sp.2 e B. rhacodes. Esta espécie é a única que apresenta cristais marrons agrupados em formas globosas no endo-, meso- e exoperídio basal, e cristais cianos em todas as camadas do perídio.

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Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 26 – Espécimes de Blumenavia sp. nov.1 com glebífero PTQ

Legenda: a-b: Tapia 712. c-e: Anel 410. c: Basidioma. d: Glebífero. e: Sulco na face exterior dos braços. f-h: E. Gandará 1455. f: Basidioma. g: Ápice. h: Glebífero ao longo do braço. Barras: a, c, f = 10 mm; b, d, e, g, h = 1 mm Fonte: Melanda, G. C. S.

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Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Figura 27 – Espécimes de Blumenavia sp. nov.1 com glebífero PCI

Legenda: a: S. Chacón 4475. b: S. Chacón 5257-A. c: D. Jarvio 778. d: Glebífero de S. Chacón 5257-A. e: Glebífero de S. Chacón 4475. f-h: Medel 672. f: Basidioma. g: Glebífero PCI ápice. h: Glebífero ptq ao longo do braço. i-k: D. Jarvio 370. i: Basidioma. j: Sulco longitudinal na face exterior do braço. k: Glebífero ptq ao longo do braço Barras: a-c, f, i = 10 mm; d, e, g, h, j, k = 1 mm Fonte: Melanda, G. C. S.

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Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

6- Blumenavia sp. nov. 2 Figuras 28; 30b; 31b, e; 32b Diagnose: Receptáculo de até 60 mm de comprimento, com braços de cor branca e diâmetro aproximado da base ao ápice, possui um sulco longitudinal na face exterior e um na face interior de cada braço. Glebífero apical proeminente e glebíferos denteados ao longo do receptáculo até a base. Basidiosporos oblongos (alongados) com aproximado Qm = 1,93 µm.

Holótipo: Brasil, RS, São Francisco de Paula, Floresta Nacional de São Francisco de Paula (FLONA), 29º 26’ 53’’ S 5º 35’ 01’’ W, 907 m, 08/02/2014, C.R. Alves 143 (ICN 177268, como B. angolensis). Parátipo: ibid, 13/04/2014, A.C. Magnano 1049 (ICN 177269, como B. angolensis).

Basidioma imaturo não observado. Basidioma expandido 40–60 mm comp. × 27–40 mm larg. quando fresco, 45–54 mm comp. × 12–18 mm larg. desidratado, obovoide. Volva 8– 10 mm comp. × 10–15 mm larg. quando fresca, 9–20 mm comp. × 10–25 mm larg. desidratada, globosa a subglobosa, perídio composto por três camadas. Endoperídio formado por uma camada gelatinosa amarelada (N00Y40M00) quando fresco, coriácea amarelo-escura (Y80M30C10) quando seco, composto por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente sepatadas, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 2,02–6,02 [x= 3,10 ± 0,77] µm diam., paredes retas a levemente sinuosas, regulares 0,23–0,73 [x= 0,44 ± 0,09] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Mesoperídio branco (N00M00C00) lanoso a esponjoso, fresco e desidratado, composto por hifas filamentosas retas e regulares a levemente sinuosas, ramificadas, irregularmente septadas, com células infladas nas extremidades de algumas hifas, sem grampo de conexão, 2,72–8,31 [x= 4,44 ± 1,30] µm diam., paredes retas e regulares 0,27– 0,84 [x= 0,48 ± 0,11] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Exoperídio branco (N00Y00M00) a amarelo-escuro (N10C00Y70) na base, craquelado de marrom-claro (N30Y60M30) a marrom-escuro (N90Y80M40) da metade para o ápice, sem alteração da cor após desidratação. Exoperídio basal composto por hifas filamentosas retas, regularmente septadas, sem células infladas e grampo de conexão, 2,62– 9,85 [x= 4,67 ± 1,78] µm diam., paredes retas e regulares 0,27–0,71 [x= 0,46 ± 0,09] µm de espessura, avermelhadas em Vermelho Congo, com a presença de cristais cianos em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular (ccis), com menos de 5 µm de comprimento. Exoperídio apical composto por hifas filamentosas ou hifas subglobosas, levemente elipsoides, elipsoides, alongadas, cilíndricas e formas irregulares. Hifas filamentosas, regularmente septadas, sem 101

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. células infladas e grampo de conexão, 2,67–7,70 [x= 4,46 ± 1,08] µm diam., paredes retas e regulares 0,21–0,78 [x= 0,48 ± 0,12] µm de espessura, hifas hialinas com o lúmen de algumas marrons em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Hifas subglobosas a cilíndricas, 13,12–35,06 × 11,08–30,88 [x= 26,40 ± 5,15 × 19,79 ± 4,06, Qm = 1,36] µm, paredes retas e regulares 0,43–1,01 [x= 0,64 ± 0,15] µm de espessura, hifas com lúmen marrom em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Exoperídio apical com a presença de cristais cianos em KOH 5% e Vermelho Congo, de forma irregular (ccis), com menos de 5 µm de comprimento. Porção basal da volva anexada a uma rizomorfa única, que se ramifica posteriormente, com uma camada branca (N00M00C00) por cima e cor amarelada (N00Y60M40) por baixo, radiciforme, dividida em duas metades, com mais de 30 mm de comp., 0,53–0,54 mm diam. próximo à volva e 0,24–0,50 mm diam. na extremidade, composta por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente septadas, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 1,86–7,11 [x= 3,59 ± 0,85] µm diam., paredes retas e regulares, 0,23– 0,99[x= 0,52± 0,16] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Receptáculo consiste em 3 ou 4 braços triangulares unidos no ápice e livres na base, esponjoso, branco fresco, amarelo-claro (Y70M10C00) a amarelo-escuro (Y90M20C10) quando seco , cada braço possui diâmetro aproximado da base ao ápice (CMD), 1–3 mm de diam., face exterior e interior de cada braço com um sulco longitudinal (FES, FIS). Receptáculo porção basal composto por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 15,13–53,76 × 10,84–53,38 [x= 29,73 ± 6,57 × 24,75 ± 5,78, Qm = 1,22] µm, paredes retas e regulares 0,39–1,64 [x= 0,86 ± 0,21] µm de espessura, porção apical com hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 11,16–52,82 × 9,37–43,06 [x= 28,44 ± 6,43 × 23,21 ± 5,34, Qm = 1,24] µm, paredes retas e regulares 0,24–1,96 [x= 0,88 ± 0,36] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Glebíferos membranosos aderidos aos ângulos ântero-laterais dos braços, formados por projeções denteadas, pontiagulas, uniformes em tamanho e forma, espaçados regularmente ao longo de todo receptáculo (pd), há também, quando seco, uma extensa projeção enrugada na parte superior (PPP), em alguns basidiomas há por uma projeção semicircular no ápice (PCA - ap). Glebíferos compostos por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides, elipsoides a alongadas, 10,81–40,41 × 8,12–35,53 [x= 23,80 ± 5,04 × 19,69 ± 4,62, Qm = 1,23] µm, paredes retas e regulares 0,41–1,50 [x= 0,81 ± 0,21] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Gleba, disposta em glebíferos, marrom-aliva quando fresca, preta (N99Y30M00), quando seca. Basidiósporos alongados (oblongos), 3,19–4,10 × 1,48–2,20 [x= 3,65 ± 0,20 × 1,89 ± 0,14, Qm = 1,93] µm, lisos, com duas gútulas internas, uma 102

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. em cada extremidade do comprimento, hialinos em KOH 5% e Vermelho Congo, inamiloides, cianofílicos

Hábito, hábitat e substrato: Epígeo, solitário, saprófito, em mata de Araucária, sobre serrapilheira. Distribuição: Neotrótipos: Sul do Brasil (TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014). Espécimes adicionais examinados: Brasil, Paraná, Antonina, Reserva Natural do Rio Cachoeira, 17/08/2005, A.A.R. de Meijer 4339 (MBM, como Blumenavia sp.). Comentários: Esta espécie é a única que apresenta um sulco na face interior de cada braço, e a formação de glebífero apical proeminente com glebíferos denteados ao longo do receptáculo até a base, pelos esporos oblongos (alongados), com largura proporcionalmente maior que o comprimento, apresentando um Qm de 1,93, ao contrário dos esporos cilíndrico (Qm 2,22-2,41) das demais espécies. Se observa um menor tamanho do receptáculo em relação à Blumenavia rhacodes, Blumenavia sp.3 e B. toribiotalpaensis. Apresenta somente cristais cianos no exoperídio, não apresentando cristais em formas globosas como em Blumenavia sp.1, B. rhacodes e B. toribiotalpaensis. As hifas do exoperídio apical podem ser filamentosas ou globosas, assim como Blumenavia sp.1 e B. rhacodes. A espécie Blumenavia sp.2 se diferencia de B. angolensis pela consistência dos braços, que são de menor espessura, e a presença de um sulco fortemente marcado na face exterior e interior.

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Figura 28 – Espécimes de Blumenavia sp. nov.2

Legenda: a-d: ICN 177268. a: Basidioma fresco. b: Basidioma desidratado. c: Glebífero PPP no ápice. d: Glebíferos pd ao longo dos braços. f-h: Meijer 4339. g: Glebífero PCA. h: Glebífero pd. Barras: a-b, f = 10 mm; c-e = 1mm; g = 0,5 mm; h = 0,1 mm Fonte: a: Fotografia de A. C. Magnago, imagem adaptada de Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira (2014). b-g: Melanda, G. C. S.

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7- Blumenavia sp. nov. 3 Figuras 29; 30c; 31h, i; 32c Diagnose: Receptáculo até 119 mm comp. quando fresco, esponjoso, oval a obovoide, próximo à volva é branco, mais amarelado da metade superior para o ápice, expandido em 4 ou 5 braços triangulares unidos no ápice e livres na base, estes afilam-se a partir do meio. Glebíferos membranosos aderidos aos ângulos antero-laterias dos braços, formados por projeções tentaculares (linhas digitadas, tipo dedos) enrugadas, agrupadas paralelamente e espaçadas regularmente na metade superior. Em pontos próximos ao ápice essas projeções saindo de cada lado do braço se unem pelo lado interno dos braços e formam uma projeção maior deixando um espaço fusiforme entre elas, possui projeções dilaceradas e retorcidas do meio para a base do receptáculo. Volva branca na base podendo ser cinza ou preta da metade para o ápice, não apresenta cristais em nenhuma das camadas do perídio.

Holótipo: Brasil, Ceará, Guaramiranga, APA do Maciço de Baturité, Trilha dos Veadeiros, 04º 15’18.8’’ S 38º 55’ 52.3’’ W, 865 m, 07/07/2012, A.C.M. Rodrigues, T.L.D. Silva (UFRN-Fungos 1943); parátipo: ibid. 04º 15’ 15.2’’S 38º 55’ 49.28’’ W, 844 m, 30/06/2016, G.C.S. Melanda 15, A. A., Lima (UFRN-Fungos 2868).

Basidioma imaturo branco na base, cinza (N60Y00M00 até N90Y00M00) até o ápice ou totalmente preto, com suturas peridiais representando os braços do receptáculo, com 27–40 mm diam., globoso, porção basal anexado a uma rizomorfa única que se ramifica posteriormente, 2 mm diam. próximo ao ovo, 1 mm nas extremidades. Basidioma expandido 91-119 mm comp. × 35-55 mm larg. quando fresco, 90-115 mm comp. × 34-40 mm larg. desidratado, oval a obovoide. Volva 28–37 mm comp. × 27–35 mm larg, fresca, 32–38 mm comp. × 25–26 mm larg. quando desidratada, globosa a subglobosa, perídio composto por três camadas. Endoperídio formado por uma camada gelatinosa amarelada (N00Y40M00) quando fresco, coriácea amarelo-escura (Y80M30C10) quando seco, composto por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente septada, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 1,79–3,78 [x= 2,59 ± 0,42] µm diam., paredes retas e regulares 0,17–0,58 [x= 0,43 ± 0,08] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Mesoperídio branco (N00M00C00) lanoso a esponjoso, fresco e desidratado, composto por hifas filamentosas retas, ramificadas, irregularmente septadas, com células infladas nas extremidades de algumas hifas, sem grampo de conexão, 3,31–9,62 [x= 5,89 ± 1,78] µm diam., paredes retas e regulares 0,30–1,03 [x= 0,59 ± 0,14] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Exoperídio 105

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. amarelo-claro (N10C00Y30-Y60) a amarelo-escuro (N10C00Y30-Y60) na base, craquelado de cinza (N60Y00M00 - N90Y00M00), marrom-escuro (N90Y80M40) ou preto (N99Y30M00) a partir da parte media até a parte apical (N90C00Y10). Exoperídio basal composto por hifas filamentosas retas, regularmente septadas, sem células infladas e grampo de conexão, 2,87– 11,12 [x= 4,68 ± 1,65] µm diam., paredes retas e regulares 0,30–0,80 [x= 0,60 ± 0,11] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Exoperídio apical composto por hifas filamentosas retas, regularmente septadas, sem células infladas e grampo de conexão, 2,79–8,65 [x= 5,58 ± 1,19] µm diam., paredes retas e regulares 0,30–0,82 [x= 0,58 ± 0,13] µm de espessura, hifas hialinas xom lúmen marrom escuro em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Porção basal da volva anexada a uma rizomorfa única, que se ramifica posteriormente, com uma camada branca (N00M00C00) por cima e cor amarelada (N00Y60M40) por baixo, radiciforme, dividida em duas metades, com mais de 27 mm de comp., 1,37–1,38 mm diam. próximo à volva e 1,1–1,2 mm diam. na extremidade, composta por hifas filamentosas, ramificadas, irregularmente septada, com células infladas nas extremidades de várias hifas, sem grampo de conexão, 1,42–5,35 [x= 2,55 ± 0,62] µm diam., paredes retas e regulares com algumas levementente sinuosas, 0,26–0,89 [x= 0,52± 0,12] µm de espessura, hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo, sem cristais. Receptáculo consiste em 4 ou 5 braços triangulares unidas no ápice e livres na base, esponjosos, branco (N00Y00C00) próximo à volva, mais amarelado da metade superior para o ápice (N00Y50M00) ou todo amarelo-esbranquiçado fresco, amarelo-claro (Y70M210C00) quando seco, cada braço afila-se a partir do meio (BAM), 5–7 mm de diam. na porção basal, 2–5 mm na porção mediana, 2–4 mm na porção apical, face exterior de cada braço sem sulco longitudinal. Receptáculo porção basal composto por hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 10,25–39,51 × 8,89–30,19 [x= 24,44 ± 5,55 × 19,61 ± 4,88, Qm = 1,26] µm, paredes regulares e retas 0,36–1,04 [x= 0,73 ± 0,15] µm de espessura, porção apical com hifas globosas, subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 13,61–44,41 × 11,09–43,68 [x= 26,50 ± 5,58 × 10,19 ± 5,25, Qm = 1,19] µm, paredes retas e regulares 0,48–1,68 [x= 0,92 ± 0,25] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Glebíferos membranosos aderidos aos ângulos antero-laterias dos braços, formados por projeções tentaculares (linhas digitadas, tipo dedos) enrugadas, agrupadas paralelamente e espaçadas regularmente na metade superior (PTE - em), em pontos próximos ao ápice essas projeções saindo de cada lado da braço se unem pelo lado interno dos braços e formam uma projeção maior deixando um espaço fusiforme entre elas, possui projeções dilaceradas e retorcidas do meio para a base do receptáculo (pr). Glebíferos compostos por hifas globosas, 106

Melanda, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. subglobosas, levemente elipsoides a elipsoides, 9,96–23,10 × 8,15–19,05 [x= 16,19 ± 2,69 × 13,95 ± 2,18, Qm = 1,16] µm, paredes retas e regulares 0,20–0,94 [x= 0,57 ± 0,12] µm de espessura, hifas hialinas em KOH 5%, avermelhadas em Vermelho Congo. Basidiósporos alongados a cilíndricos, 2,90–4,16 × 1,11–1,98 [x= 3,54 ± 0,23 × 1,48 ± 0,12, Qm = 2,42] µm, lisos, com duas gútulas internas, uma em cada extremidade do comprimento, hialinos em KOH 5% e Vermelho Congo, inamiloides, cianofílicos. Hábito, hábitat e substrato: Epígeo, solitário, lignícola, em floresta de Brejo de altitude, sobre tronco em decomposição e sobre serrapilheira. Distribuição: Neotrópicos: Nordeste do Brasil (RODRIGUES; BASEIA, 2013). Comentários: Os braços do receptáculo afilando-se a partir do meio são um diferencial em relação à Blumenavia sp. nov. 2, B. angolensis, e B. usambarensis. O basidioma da espécie só é menor em relação ao comprimento de B. toribiotalpaensis. A volva branca na base pode ser cinza ou preta da metade para o ápice, o que não se encontra nas demais espécies, que são geralmente cinza a marrom, ou pode possuir a cor uniformemente preta como em Blumenavia sp. nov.1. Blumenavia sp. nov. 3 é a única espécie que apresenta os glebíferos que se projetam e se unem no interior do receptáculo. A espécie não apresenta cristais em nenhuma das camadas do perídio ao contrário de Blumenavia sp.1, Blumenavia sp.2, B. toribiotalpaensis e B. usambarensis, e as hifas do exoperídio basal somente são constituídas por hifas filamentosas assim como B. toribiotalpaensis e B. usambarensis.

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Figura 29 – Espécimes de Blumenavia sp. nov.3

Legenda: a-d: UFRN 1943. a: Basidioma em campo. b-c: Glebíferos PTE. d-e: Glebíferos pr. Barras: a = 10 mm; b, c = 1mm; d, e = 0,5 mm Fonte: a: Fotografia de Rodrigues, A. C. M, imagem cedida pela fotógrafa. b-e : Melanda, G. C. S.

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Figura 30 – Basidiósporos de Blumenavia

Legenda: a-d: Em Reagente de Melzer. e: Em KOH 5%. e: Em Vermelho Congo 1%. a-e: Setas indicando gútulas nas extremidades dos esporos. a: Blumenavia sp.1. b: Blumenavia sp.2. c: Blumenavia sp.3. d: B. rhacodes. e: B. toribiotalpaensis. f: B. usambarensis Barras a-f = 5 µm. Fonte: Melanda, G. C. S.

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Figura 31 – Hifas do exoperídio apical das espécies de Blumenavia

Legenda: a-c: De espécime com hifas filamentosas. d-f: De espécime com hifas globosas. g: De espécime com hifas filamentosas e globosas. h-l: Espécimes que possuem apenas hifas filamentosas. a, d: Blumenavia sp.1. b, e: Blumenavia sp.2. c, f, g: B. rhacodes. h-i: Blumenavia sp.3. j-k: B. toribiotalpaensis. k1, k2: Cristais globosos. l: B. usambarensis. f 1, i, k1, k2: Em KOH 5%; as demais foram coradas em Vermelho Congo 1% Barras a-l = 5 µm. Fonte: Melanda, G. C. S.

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Figura 32 – Hifas da rizomorfa das espécies de Blumenavia, em Vermelho Congo 1%

Legenda:a: Blumenavia sp.1. b: Blumenavia sp.2. c: Blumenavia sp.3. d: B. rhacodes. e: B. toribiotalpaensis. f: B. usambarensis; linhas mostram as paredes das hifas. Em a-e: Setas indicando algumas células infladas. Barras a-f = 5 µm. Fonte: Melanda, G. C. S.

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MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. Tabela 12: Principais caracteres morfológicos macroscópicos das espécies de Blumenavia BASIDIOMA RECEP- EXPANDIDO TÁCULO BRAÇOS GLEBÍFERO GLEBA VOLVA LG/ Largu Volva Vd PCA/ Distribui- ra; ap/ pd/ cor da Comp. × larg. BBA / PCI/ Vd Volva Vu Volva Comp. × larg. Espécies ção Cor Qua BAA/ em/ pr/ Cor cr / metade para (com volva) BLB / FES FIS PPP/ /V cor Vd cor mm desidratado (fresco) nt. BAE/ ms/ ptq (fresco) li o ápice mm BUB / PPR/ u (toda) da base (ds), fresco (fr) BAM/ tr NA (parte PTE/ BMD craquelada) PTQ B. angolensis África: fr: 80-85 × 35- Branco BLB 4 Não Não BAA PTQ tr NA Cinza- Vd cr Cinza- Branca Marrom fr: 30-30 (DEGREEF et Angola, S. 40 esverde- ou escura acinzentado al., 2013) Tomé ada Vu

B. rhacodes Brasil: SC, fr: 85-130; Esbranqui- BLB 3;4 Sim Não BMD PTQ tr/ Verde- Vd cr NA Branca a Cinza ou fr: 15-35 × 25-35; RS. ds: 35-87 × 16- çado a em ptq oliva marrom- marrom- ds: 17-28 × 14-26 52 levemente claro escuro amarelado B. México: fr:121-153 × Esbranqui- BLB 3;4;5 Sim Não BAM LG ms pr Verde- Vd cr NA Amarelo Cinza fr: 21-39 × 22-38; toribiotalpaensis Jalisco 38-56; çado a bege oliva- -claro tornando-se ds: 11-28 × 16-33 ds: 54-88 × 24- pálido amaron- cinza-escuro 55 zada- escura

B. usambarensis África: fr: 80 × 25-30; Branco BLB 3;5 Não Não BMD PTQ ms NA Verde- Vu li Esbran- NA NA fr: 35-40; Usambara ds: 46 × 22 oliva- quiçada a ds: 23 × 13 escura marrom claro Blumenavia sp.1 México: fr: 70-105 × Esbranqui- BLB 3;4;5 Sim Não BAA/ PTQ/ tr / Cinza- Vd cr Amarelo- Branca a Marrom- ds: 20-37 × 9-39 Veracruz 13-45; çado com BAM/ PCI ms/ ptq esverde- ou ou claro; marrom- claro, ds: 44-87 × 10- tons BMD em ado a Vu li cinza- claro marrom- 37 amarelados café- escuro escuro ou escuro quase cinza-escuro preto

Blumenavia sp.2 Brasil: PR, fr: 40-60 × 27– Branco BLB 3;4 Sim Sim BMD PCA/ pd Marrom- Vd cr NA Branca a Marrom- fr: 8-10 × 10-15; SC, RS 40; PPP ap olivaceo amarelo- claro a ds: 9-20 × 10-25 ds: 45-54 ×12- escuro marrom- 18 escuro

Continua

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Conclusão BASIDIOMA RECEP- EXPANDIDO TÁCULO BRAÇOS GLEBÍFERO GLEBA VOLVA LG/ Largu Volva Vd PCA/ Distribui- ra; ap/ pd/ cor da Espécies Comp. × larg. BBA / PCI/ Vd Volva Vu Volva Comp. × larg. ção Cor Qua BAA/ em/ pr/ Cor cr / metade para (com volva) BLB / FES FIS PPP/ /V cor Vd cor mm desidratado (fresco) nt. BAE/ ms/ ptq (fresco) li o ápice mm BUB / PPR/ u (toda) da base (ds), fresco (fr) BAM/ tr NA (parte PTE/ BMD craquelada) PTQ Blumenavia sp.3 Brasil: CE fr: 91-119 × Branco BLB 4;5 Não Não BAM PTE em pr Verde- Vd cr NA Branca Cinza ou fr: 28-37 × 27-35; 35-55; próximo a oliva marrom- ds: 32-38 × 25-26 ds: 90-115 × volva, escuro a 34-40 amarelado- preto esbranqui- çado na metade superior para o ápice

Legenda: ds: basidioma desidratado; fr: brasidioma fresco; NA: não se aplica; NO: não observado. Braços: CBA: lives na base e no ápice; BLB: livres na base unidos no ápice; CUB: unidos na base e no ápice. – Faces: FES: face exterior com um sulco longitudinal; FIS: face interior com um sulco longitudinal. – Diâmetro: BAA: afilados no ápice; BAE: afilados nas extremidades; BAM: afilados a partir do meio; BMD: mesmo diâmetro no comprimento inteiro. Glebíferos – Inserção no braço: AL: inseridos em cada braço nos dois ângulos antero-laterais (entre as faces interior e exterior do braço); ID: glebíferos irregularmente dispostos. – Forma: LG: lacerado grande; PCA: projeção semicircular no ápice; PCI: projeções formadas por linhas paralelas que se curvam para o interior; PPP: pequenas projeções formadas por linhas onduladas paralelas que se estendem por alguns mm do comprimento do receptaculo; PPR: projeções formadas por pontos em roseta; PTE: projeções tentaculares (linhas digitadas, tipo dedos) enrugada paralelas que se unem no interior; PTQ: projeções formadas por pontos triangulares ou quadrangulares. –Localização: ap: ápice; em: espaçados regularmente na metade superior; ms: pouco espaçados ao longo da metade superior; tr: espaçados regularmente por todo receptáculo. – Podem possuir também pontos de glebífero espaçados até a base de forma: pd: denteada; pr: retorcida; ptq: triangular a quadranguar. Volva – Cor: Vu: volva de cor uniforme; Vd: volva com mais de uma cor. – Superfície: cr: craquelada; li: lisa. Fonte: da autora.

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MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

Tabela 13: Principais caracteres morfológicos microscópicos das espécies de Blumenavia

ESPOROS PERÍDIO CRISTAIS PERÍDIO RIZOMORFA Globosos, marrom claro ou Irregulares, cianos escuro Espécies Qm. Compr. × Hifas do exoperídio apical Formato Diam. (µm) larg. (µm) (quant. de exsicatas) E M Ex. b. Ex. a. E M Ex. b. Ex. a. (µm) mín Esp. nov.parede Presença e máx (µm) mín e máx de cristais B. angolensis Alongado a 3,20–4,00 × (DEGREEF et al., 2,26 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA cilíndrico 1,30–1,90 2013) Alongado a 2,97–4,66 × Filamentosas (6) ou globosas B. rhacodes 2,22 Sim Sim Não Sim Não Não Não Sim 1,45-7,52 0,27-0,98 Sim cilíndrico 1,11–2,29 (2); filamentosas e globosas (1) Alongado a 3,28–4,85 × B. toribiotalpaensis 2,29 Filamentosas (5) Não Sim Não Sim Não Não Sim Sim 1,22-6,10 0,14-0,90 Não cilíndrico 1,40–2,25 2,62–3,31 × B. usambarensis Cilíndrico 2,41 Filamentosas (1) Não Não Não Não Não Sim Não Não 5,75-16,16 1,01-4,67 Não 1,13–1,48 Alongado a 2,80–4,42 × Blumenavia sp.1 2,35 Filamentosas (3) ou globosas (5) Sim Sim Sim Não Sim Sim Sim Sim 1,41-7,96 0,16-1,12 Não cilíndrico 1,10–2,08 Blumenavia sp. 3,19–4,10 × Alongado 1,93 Filamentosas (2) ou globosas (1) Não Não Não Não Não Não Sim Sim 1,86-7,11 0,23-0,99 Não nov.2 1,48–2,20 Alongado a 2,90–4,16 × Blumenavia sp.3 2,42 Filamentosas (2) Não Não Não Não Não Não Não Não 1,42-5,35 0,26-0,89 Não cilíndrico 1,11–1,98 Legenda: E: endoperídio; Esp: espessura; Ex. a: exoperídio apical; Ex.b: exoperídio basal; M: mesoperídio; NA: Não analisado.

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Registros duvidosos: O exemplar R. Medel 654 é o único exemplar com braços unidos no ápice e na base, formato do basidioma ovalado com 140 mm comp. × 73 mm larg., R. Farias possui braços unidos no ápice e livres na base, 150 mm comp. × 33 mm larg.. Ambos foram coletados no mesmo local e mesmo ano– em frente ao Jardín Botânico Francisco Javier Clavijero, Xalapa - Coateped, Veracruz- MX em 1998, R. Medel 654 em 24 de julho e R. Farias 17 de agosto. Se assemelham pela cor tanto do basidioma (amarelo esbranquiçado, como cor da volva marrom claro, e também pelo tamanho, forma (roseta com tamanho aproximado um do outro) e disposição dos glebíferos (espaçamento regular ao longo de todo receptáculo), com a diferença de R. Medel 654 ser unido na base. Por esta diferença R. Medel 654 foi considerado um registro duvidoso e R. Rarias também por se assemelharem em outros pontos (Figura 35 a- b). S. Chacón 5107 e R. Medel 662 possuem basidioma amarelo claro, ambos estão com todos braços separados da volva, não sendo possível determinar a forma original, e foram considerados duvidosos por que possuem o meio dos braços mais largos que as extremidades. Além do herbário XAL, uma exsicata do BPI: 703249, identificada como Blumenavia rhacodes, possui os braços unidos pela gleba, sendo difícil a visualização dos glebíferos e análise do material (Figura 33 c-d). A exsicata PACA 14978 foi coleta como Pseudoculus rugulosus, por Rick no Brasil- RS em 1930, atualmente determinado como Blumenavia rhacodes, os braços parecem ser livres no ápice, não se tratando se Blumenavia (Figura 33 e-f).

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Figura 33 – Registros duvidosos

Legenda: a: Basidioma desidratado de R. Medel 654, a esquerda basidioma expandido, a direita superior glebífero, a direita inferior visão dos braços unidos na base. b: Basidioma desidratado de R. Farias. c: A esquerda basidioma desidratado de S. Chacón 5107, a direita superior glebífero de S. Chacón 5107, a direita inferior glebífero do ápice de um braço de R. Medel 662. d: Basidioma desidratado de R. Medel 662. e:A esquerda braços de BPI 703249, a direita volva. f: Basidioma desidratado de PACA 14978. Barras: a (esquerda e direita inferior), b, c (esquerda), d-f = 10 mm. a (direita superior), c (direita superior e inferior) = 1mm. Fonte: Melanda, G. C. S. 116

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4.3.3 Chave de identificação para o gênero Blumenavia

1. Braços brancos ...... 2 1’. Braços amarelo-esbranquiçados a bege-claro ...... 3

2. Esporos alongados a cilíndricos medindo 2,9–4, µ alt. × 1,3–2,5 µ larg...... 4 2’. Esporos cilíndricos medindo 2,62–3,31 µm alt. × 1,13–1,48 µm larg...... Blumenavia usambarensis

3. Glebíferos de diferentes dimensões no mesmo basidioma ...... 5 3’. Glebíferos de igual dimensão no mesmo basidioma ...... Blumenavia rhacodes

4. Presença de sulco nas faces externa e interna dos braços...... Blumenavia sp. nov.2 4’. Ausência de sulco nas faces externa e interna dos braços...... Blumenavia angolensis

5. Ausência de cristais nas camadas do perídio, com esporos medindo 2,90–4,16 µm alt. × 1,11–1,98 µm larg...... Blumenavia sp. nov.3 5’. Presença de cristais em pelo menos uma das camadas do perídio, com esporos medindo 2,80–4,85 µm alt. × 1,10–2,25 µm larg ...... 6

6. Basidioma expandido com 70–105 mm de comprimento ...... Blumenavia sp. nov. 1 6’. Basidioma expandido com 121–153 mm de comprimento ..... Blumenavia toribiotalpaensis

4.4 DISTRIBUIÇÃO MUNDIAL DO GÊNERO BLUMENAVIA

Com base nas publicações e contato com os herbários foi possível delimitar a distribuição mundial do gênero Blumenavia (Figura 34). A Tabela 14 mostra quais registros foram utilizados na montagem dos mapas, separados por localidade, e a citação da bibliografia. Os espécimes analisados para confecção do mapa estão descritos na tabela com a classificação revisada. Os exemplares não analisados não estão nas descrições das espécies pela incerteza da identificação.

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Tabela 14: Distribuição das espécies do gênero Blumenavia

Espécies País Estado Cidade Localidade Latitude Longitude Analisado Bibliografia1 Blumenavia angolensis São Tomé e x São Tomé x 0.281845 6.595011 Não Degreef et al. (2013); Desjardin e Perry (Welw. & Curr.) Dring Príncipe (2015) Blumenavia angolensis Angola Malanje Punto Andongo x -9.6540607 15.5933027 Não Welwichtie e Currey (1870) como (Welw. & Curr.) Dring Laternea angolensis

Blumenavia angolensis Maurícia Moka Reduit x -20.231766 57.492320 Não Deposito no herbário BPI (Welw. & Curr.) Dring Blumenavia angolensis Trinidade e Trinidade Naranja x 10.730989 -61.398189 Não Dennis (1953) como B. rhacodes; (Welw. & Curr.) Dring Tobago Dring e Rayner (1967) como B. usambarensis; Dring (1980) como B. angolensis Blumenavia sp. nov. 2 Brasil Santa Catarina Florianópolis Unidade de Conservação -27.531102 -48.512500 Não Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira Desterro (2014) como B. angolensis

Blumenavia sp. nov. 2 Brasil Rio Grande do São Francisco de Floresta Nacional de São -29.434788 -50.390747 Sim Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira Sul Paula Francisco de Paula (2014) como B. angolensis (FLONA) Blumenavia sp. nov. 2 Brasil Paraná Antonina Reserva Natural do Rio -25.344472 -48.669694 Sim Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira Cachoeira (2014) como B. angolensis

Blumenavia sp. nov. 1 México Veracruz Xalapa Jardim Botánico Francisco 19.513818 -96.942375 Sim Calonge et al. (2007) Javier Clavijero Blumenavia sp. nov. 3 Brasil Ceará Guaramiranga APA Serra de Baturité -4.254416 -38.930410 Sim Rodrigues e Baseia (2013) Trilha dos Veadeiros Blumenavia rhacodes Brasil Santa Catarina Blumenau x -26.922219 -49.071842 Sim Möller (1895) Möller

Blumenavia rhacodes Brasil Rio Grande do Porto Alegre Morro Santana -30.058329 -51.135130 Sim Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira Möller Sul (2014) como B. angolensis Blumenavia rhacodes Brasil Rio Grande do Porto Alegre Campus Vale UFRGS -30.076109 -51.124693 Sim Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira Möller Sul (2014) como B. angolensis

Blumenavia rhacodes Brasil Rio Grande do São Leopoldo -29.737783 -51.176080 Sim Trierveiler-Pereira, Alves e Silveira Möller Sul (2014) Continua 118

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Conclusão

Espécies País Estado Cidade Localidade Latitude Longitude Analisado Bibliografia Blumenavia rhacodes Venezuela Aragua x Parque Nacional Henry 10.370266 -67.642468 Não Depósito no herbário NY Möller Pittier, Estación Biológica Rancho Grande Blumenavia rhacodes Colômbia x x x 3.257831 -73.974890 Não Depósito no herbário COL Möller Blumenavia rhacodes Argentina Província de Córdoba Villa Warcalde -31.3167 -64.3278 Não Dominguéz de Todelo (1995) Möller Córdoba

Blumenavia rhacodes Argentina Província de Santa Fé x -31.635371 -60.719993 Não Dominguéz de Todelo (1995). Möller Santa Fé

Blumenavia México Jalisco Talpa de "Ojo de Agua del Cuervo" 20.194472 -105.269694 Sim Vargas-Rodrigues e Vázquez-García toribiotalpaensis Vargas- Allende oeste ao “cumbre de los (2005) Rodr. 2005 Arrastrados”

Blumenavia Tanzânia x Mgwashi Montanhas Usambara -4.753093 38.500582 Sim Hennings (1902); Dring (1980) como usambarensis Henn. B. angolensis 1902

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Figura 34 – Distribuição mundial do gênero Blumenavia

Mapa da autora. 120

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5 DISCUSSÃO

O gênero Blumenavia apresentava quatro espécies, a saber: B. rhacodes, B. usambarensis, B. angolensis, B. toribiotalpaensis. Segundo alguns autores (CALONGE et al., 2007; TRIERVEILER-PEREIRA et al., 2014) apenas duas espécies poderiam ser consideradas, já que B. usambarensis está como sinônimo de B. angolensis e B. toribiotalpaensis como sinônimo de B. rhacodes. Com os dados obtidos no presente trabalho, tem-se suporte morfológico e molecular para redefinir o status atual das espécies existentes, além de ter subsídios para propor novas espécies para o gênero. Antes deste estudo, as sequencias moleculares de Blumenavia disponíveis eram apenas duas: B. angolensis 28S de São Tomé-África (DEGREEF et al., 2013) e B. rhacodes ATP6 do Rio Grande do Sul (TRIERVEILER-PEREIRA; SILVEIRA; HOSAKA, 2014). Neste trabalho foram geradas 42 sequencias de 11 coleções. Apesar de obter a coleção tipo do gênero Blumenavia (B. rhacodes, coleta de Möller depositada no herbário B da Alemanha), e parte de uma coleção depositada em álcool também coletada por Möller, no herbário HBG, da Alemanha, não foi possível obter DNA dos espécimes, possivelmente em consequência da conservação do material em álcool por mais de 100 anos. As análises moleculares das coleções de Blumenavia rhacodes procedentes da região sul do Brasil, localidade tipo, e as coleções oriundas do Nordeste, mais precisamente do estado do Ceará (UFRN-Fungos1943, como B. angolensis e a coleta UFRN-Fungos 2868) resultaram na segregação em dois clados terminais e, mesmo com o valor de suporte não sendo superior à 95, foram consideradas aqui como espécies distintas devido ao suporte dado pelas características morfológicas que as separam. A espécie procedente do Ceará, Blumenavia sp. nov.3, está sendo proposta aqui como nova com base nos seguintes caracteres morfológicos: maiores dimensões do basidioma, braços afilados no ápice em relação à base, não possuírem sulco londigitudinal na face exterior dos braços, forma dos glebíferos que se projetam de ambos os lados dos braços e se unem na parte interna do receptáculo e formam uma projeção maior deixando um espaço fusiforme entre elas (Figura 29c). Coleções de Blumenavia rhacodes provenientes de Veracruz, México foram estudadas e demonstraram grande variação em sua morfologia. Uma delas foi identificada como Clathrus columnatus devido a gleba não estar disposta em glebíferos. Dentre as demais coleções, dois grupos de morfotipos foram utilizados para a análise molecular, que não representam a total

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MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. diversidade de morfotipos, apesar do grande esforço (APÊNDICE D) para incluir mais exemplares nesta análise. Os resultados obtidos corroboram para o estabelecimento de uma espécie nova para o México, Blumenavia sp. nov.1. As demais coleções que não se encaixam nessa morfologia foram relatadas em registros duvidosos nos resultados deste trabalho. Ainda há a necessidade de mais esforço nos estudos moleculares no intuito de conseguir abranger a maior parte de morfologias deste grupo e esclarecer quantas e quais espécies podem ser consideradas. Ainda para o México, agora em Jalisco, a espécie Blumenavia toribiotalpaensis apresentou alto suporte (1 de probabilidade posterior e 97% de bootstrap) para ser considerada molecularmente distinta de B. rhacodes. Morfologicamente observou-se distinção no tamanho dos seus esporos e na forma dos glebíferos. Sendo assim, os resultados obtidos neste estudo se contrapõem com os resultados de outros autores que utilizaram apenas morfologia (CALONGE et al., 2007) e sinonimizaram as duas espécies. Após analises de morfologia comparativa, chega-se à conclusão de que a espécie procedente da África, Usamba, denominada Blumenavia usambarensis, distingue-se das demais espécies do gênero por alguns caracteres morfológicos que estão sendo considerados aqui como informativos: esporos cilíndricos com comprimento e largura menores que B. rhacodes, B. toribiotalpaensis, Blumenavia sp. nov.1, Blumenavia sp. nov.3, forma diferente dos esporos de Blumenavia sp. nov.2, que são oblongos (alongados). e hifas filamentosas da rizomorfa com paredes mais espessas em relação as hifas das outras espécies. Infortunadamente, mesmo após diversas tentativas, não foi possível obter DNA da amostra de B. usambarensis analisada (APÊNDICE D). A única sequência de Blumenavia angolensis de São Tomé e Príncipe no GenBank (apenas LSU) e a perda do material no herbário de origem tornou-nos impossibilitados de analisar e comparar tal material com os descritos como B. angolensis para o Brasil. As análises moleculares demostraram que a coleção procedente da África se segrega das coleções de B. angolensis provenientes do sul do Brasil. Morfologicamente, alguns, caracteres dos exemplares do sul do país como forma dos glebíferos (grande projeção no ápice e denteados até a base), braços com mesmo diâmetro da base ao ápice com sulco nas faces interna e externa, bem como basidiósporos oblongos, fez-nos considerar estas espécies como distintas, com suporte para considerarmos uma nova espécie, denominada Blumenavia sp.2. Estas coleções do Sul do Brasil foram inicialmente identificadas como B. angolensis utilizando apenas dados morfológicos (TRIERVEILER-PEREIRA; ALVES; SILVEIRA, 2014).

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MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. 6 CONCLUSÃO

Diante destes resultados e discussões se observa que o trabalho gerou significativo incremento para a taxonomia do gênero Blumenavia. De duas espécies consideradas até este trabalho, com duas sequências existentes no GanBank (ATP6 e LSU), o número aumentou para sete espécies, sendo cinco com suporte molecular, além da adição de 42 sequências, de cinco marcadores (ITS, LSU, ATP6, RPB2 e TEF1α). Com estas análises novos questionamentos surgiram como a posição dos espécimes com morfotipos distintos do México. Faz-se necessário o contínuo estudo com estes grupos por meio da taxonomia integrativa para elucidar tais questões.

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MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares. REFERÊNCIAS

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MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares.

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MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares - APÊNDICES

APÊNDICE A – Herbários consultados que não possuíam exsicatas de Blumenavia

Acrôni- Continente ou Data da Localidade Herbário mo do Contato Subcontinente resposta herbário

África ÁFRICA DO SUL- Eastern Cape The Curator Schonland Herbarium, Albany GRA Tony Dold [email protected] 16/03/2017 Province. Grahamstown Museum http://www.ru.ac.za/schonlandherbarium/

ÁFRICA DO SUL-Northern Province, Larry Leach Herbarium, University of Limpopo UNIN Bronwyn Egan [email protected] 30/03/2017 Pietersburg

ÁFRICA DO SUL- Gauteng Province, H. G. W. J. Schweickerdt Herbarium, Botany PRU Abraham Van Wyk [email protected] 15/03/2017 Pretoria Department University of Pretoria http://www.up.ac.za/academic/botany/index.html

ÁFRICA DO SUL- Northern Cape South African National Parks KSAN Hugo Bezuidenhout [email protected] 27/03/2017 Province, Kimberley

ÁFRICA DO SUL- KwaZulu-Natal, Hugh Nicholson and Tony Abbott Herbarium PCE Graham Grieve [email protected] 28/03/2017 Port Edward ÁFRICA DO SUL- Gauteng Province PREM Adriaana Jacobs-Venter [email protected] 05/05/2016 National Collection of Fungi

ÁFRICA DO SUL- KwaZulu-Natal South African National Biodiversity Institute NH Yashica Singh [email protected] 27/03/2017 Province, Durban

ÁFRICA DO SUL- Free State Province, Herbarium Department of Plant Sciences, BLFU Lize Joubert [email protected] 27/03/2017 Bloemfontein University of the Free State

ÁFRICA DO SUL- KwaZulu-Natal Herbarium School of Life Sciences, University NU Benny Bytebier [email protected] 25/03/2017 Province, Pietermaritzburg of KwaZulu-Natal, Pietermaritzburg campus http://herbaria.plants.ox.ac.uk/bol/nu

ÁFRICA DO SUL- Gauteng Province, Charles E. Moss Herbarium, University of the J Kevin Balkwill; Renee Reddy [email protected]; 04/04/2017 Johannesburg Witwatersrand [email protected] Continua

129

MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares - APÊNDICES Continuação Acrôni- Continente ou Contato Data da Localidade Herbário mo do Subcontinente resposta herbário África ÁFRICA DO SUL- Eastern Cape Herbarium Botany Department, Walter Sisulu KEI Kathleen Immelman [email protected] 27/03/2017 Province, Umtata University

ÁFRICA DO SUL- Western Cape Compton Herbarium, South African National NBG Christopher Cupido [email protected] 24/03/2017 Province, Cape Town Biodiversity Institute http://www.sanbi.org

ÁFRICA DO SUL- Western Cape Bolus Herbarium, HW Pearson Bldg. University BOL Terry Trinder-Smith [email protected] 04/04/2017 Province, Cape Town of Cape Town http://www.uct.ac.za/depts/bolus/

ÁFRICA DO SUL- Gauteng Province, University of Johannesburg JRAU Annah Moteetee [email protected] 29/03/2017 Johannesburg

ÁFRICA DO SUL- Middelburg EC Grootfontein Agricultural Development Institute GADI Loraine Van den Berg [email protected] 27/03/2017

ÁFRICA DO SUL- North-West A. P. Goossens Herbarium, North-West PUC Stefan Siebert [email protected] 27/03/2017 Province University

ÁFRICA DO SUL- Western Cape Hermanus Botanical Society HER Lee Burman [email protected] 26/03/2017 Province, Hermanus

ÁFRICA DO SUL - Western Cape Southern Cape Herbarium SCHG Priscilla Burgoyne [email protected] 27/03/2017 Province, George

ÁFRICA DO SUL- Gauteng Province, South African National Biodiversity Institute PRE Erich van Wyk [email protected] 27/03/2017 Pretoria (SANBI)

ÁFRICA DO SUL- Mpumalanga Buffelskloof Herbarium, Buffelskloof Nature BNRH John Burrows [email protected] 26/03/2017 Province, Lydenburg Reserve

ÁFRICA DO SUL- Mpumalanga, Whyte Thorne Botanic Garden HSMC Douglas McMurtry [email protected] 02/04/2017 Nelspruit Continua

130

MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares - APÊNDICES Continuação

Acrôni- Continente ou Contato Data da Localidade Herbário mo do Subcontinente resposta herbário África ÁFRICA-Gaborone, Botswana Herbarium Botswana College of Agriculture BACH Albertinah Matsika [email protected] 07/03/2017

ÁFRICA-Gaborone, Botswana Herbarium Department of Biological Sciences UCBG Mbaki Muzila [email protected] 13/03/2017 University of Botswana

ÁFRICA, Quênia East African Herbarium - National Museums of EA Itambo Malombe; Paul Kirika; [email protected]; 20/01/2017 Kenya Joyce Jefwa [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected] TANZÂNIA - Serengeti District, Grumeti Fund Field Herbarium GFT Peter Goodman [email protected] 12/03/2017 Mugumu América do Sul BRASIL-SC,Blumenau Herbário Dr. Roberto Miguel Klein FURB André de Gasper [email protected] 04/04/2016

BRASIL-SC, Joinville Herbário Joinvillea JOI Karin Esemann-Quadros [email protected] 26/08/2016

COLÔMBIA-Nariño,Pasto Herbario Facultad de Ciencias Agrícolas, PSO Marta Gonzalez Insuasty, [email protected] 03/03/2017 Universidad de Nariño

COLÔMBIA-Maglalena,Santa Maria Herbário Universidad del Magdalena UTMC Eduino Carbonó [email protected] 02/03/2017

COLÔMBIA-D.F. Bogotá Herbario Amazónico Colombiano COAH Dairon Cárdenas López [email protected] 01/03/2017 http://www.sinchi.org.co/herbariov/

COLÔMBIA-Barranquilla. Herbário "Armando Dugand Gnecco" DUGAND Hermes Cuadros [email protected] 01/03/2017

COLÔMBIA-Villavicencio Herbarium Universidad de los Llanos LLANOS Luz Stella Suarez Suarez [email protected] 01/03/2017

COLÔMBIA-Cauca, Poyopayán Herbario Museo de Historia Natural CAUP Bernardo Ramírez [email protected] 02/03/2017

COLÔMBIA- San Agustín, Villa de Herbarium Federico Medem Bogotá FMB Claudia Medina [email protected] 01/03/2017 Leyva, D.C.

Continua

131

MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares - APÊNDICES Continuação Acrôni- Continente ou Contato Data da Localidade Herbário mo do Subcontinente resposta herbário América do Sul COLÔMBIA-D.C. Herbario Forestal UDBC Jorge Eduardo Sastoque [email protected] 02/03/2017 Bogotá. http://herbario.udistrital.edu.co/herbario/

COLÔMBIA- Herbario Centro de Investigaciones Facultad de HUA Felipe Alfonso Cardona [email protected] 22/03/2017 Antioquia,Medellín Ciencias Exactas y Naturales (CIEN) Naranjo; Aída Vasco

COLÔMBIA-Guajira, Herbario de La Guajira Wunü´Ülia HG Sandra Obando [email protected]; 01/03/2017 Riohacha. http://www.uniguajira.edu.co/ [email protected]

COLÔMBIA- Herbario Universidad del Norte UNO María Cristina Martínez-Habibe [email protected] 01/03/2017 Atlántico COLÔMBIA- Bogotá. Jardín Botánico José Celestino Mutis JBB Jenny Carolina Sarmiento [email protected] 01/03/2017 Espitia

COLÔMBIA- Bolívar, Jardín Botánico de Cartagena “Guillermo JBGP Fabio Ávila [email protected] 01/03/2017 Turbaco. Piñeres” http://www.jbgp.org.co/en/

VENEZUELA-Aragua Herbario Micológico Albert S. Muller VIA Milagros Araujo [email protected] 29/03/2017

América Central NICARÁGUA, Herbario Departamento de Ciencias Básicas ENAG Rosa Perez [email protected] 10/03/2017 Managua Universidad Nacional Agraría

Europa ALEMANHA, Berlin Herbarium BSB Wolfgang Frey [email protected] 14/01/2017 Institut für Biologie - Systematische Botanik und Pflanzengeographie http://www.biologie.fu- berlin.de/sysbot/ Continua

132

MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares - APÊNDICES

Conclusão

Acrôni- Data da Continente ou Contato Localidade Herbário mo do resposta Subcontinente herbário Europa ALEMANHA, Berlin Herbarium Institut für Biologie, Technische BTU Dietrich Müller-Doblies [email protected] 17/01/2017 Universität Berlin

ESPANHA, Madrid Herbario Departamento de Ciencias de la Vida AH F. Rejos [email protected] 20/02/2017 Facultad de Biología, Química y Ciencias Ambientales Universidad de Alcalá

PORTUGAL, Lisboa Jardim Botânico Museu Nacional de História LISU Ireneia Melo [email protected] 16/12/2016 Natural e da Ciência

Oceania AUSTRÁLIA, Adelaide State Herbarium of South Australia AD Helen Vonow [email protected] 31/01/2017

AUSTRÁLIA, Akureyri Herbarium Icelandic Institute of Natural History AMNH Starri Heiðmarsson [email protected] 16/01/2017

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MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares - APÊNDICES

APÊNDICE B – Herbários consultados que possuíam exsicatas de Blumenavia ou sinônimos, mas não realizaram o empréstimo

Localidade Acrôni- Continente ou Herbário Quantidade, espécie, local de coleta Subcontinente (cidade, estado, mo do Contato da exsicata Motivo de não emprestar país) herbário América do Norte Veracruz, México Universidad XALU Armando López ? Blumenavia rhacodes, México Falta de recurso para o envio Veracruzana

Louisiana, E.U.A Bernard Lowy LSUM Jennifer S Kluse 6 Blumenavia toribiotalapaensis, Sem resposta do curador Mycological Jalisco, México sendo 4 preservadas em Herbarium álcool e duas desidratadas

Cambridge, Farlow Reference FH Donald Pfister 5 Blumenavia rhacodes, ? Solicitação enviada, mas material não foi Massachusetts, Library and 1 Clathrus angolensis, RS-Brasil remetido E.U.A Herbarium of 1 Colonnaria, ? Cryptogamic Botany Beltsville, U.S. National BPI Shannon Dominick 1 Laternea angolensis, Reduit, Ilhas Solicitação enviada, mas material não foi Maryland, E.U.A Fungus USDA-ARS Bronx, New York, New York NY Matthew Pace 1 B. rhacodes, Venezuela Solicitação enviada, mas material não foi E.U.A Botanical Garden remetido

América do Sul Córdoba, IMBIV-Museo CORD Alejandro Bringas 5 Blumenavia rhacodes, Argentina Curadora em viagem, não foi possível Argentina Botánico Buenos Aires, Instituto de SI Norma Deginani 1 Clathrus rhacodes, RS-Brasil Material muito deteriorado. Argentina Botánica Darwinion

Bogotá, Colombia Herbario Nacional COL Carlos Parra-O. 1 Blumenavia rhacodes, ? Herbário estava com problemas para Colombiano receber a permissão de exportação do Ministério do Meio Ambiente

Meise, Bélgica Botanic Garden BR Ann Bogaerts 1 Blumenavia angolensis, São Tomé e Exsicata não encontrada no herbário pela Meise < curator@botanicgardenmei Príncipe, África curadora se.be> Continua

134

MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares - APÊNDICES

Conclusão

Localidade Acrôni- Continente ou (cidade, estado, Herbário mo do Quantidade, espécie, local de coleta Subcontinente país) herbário Contato da exsicata Motivo de não emprestar Europa

Inglaterra, Reino Royal Botanic K Angela Bond 1 Blumenavia usambarensis (SP- Material em solução spirit não é possível Unido Gardens Brasil)- em solução spirit emprestar e a outra exsicata não era 1 B. angolensis (Trinidad) permitido a extração de DNA 1 ilustração de Laternea angolensis,(Angola, África)- holótipo (Welwitsch 120)

Hamburgo, Herbarium HBG Matthias 1 Blumenavia rhacodes, provavelmente Material em álcool, não é possível Alemanha Hamburgense - Schultz enviado para a Espanha para a Dra. Maria Flottbek Paz Martín, coorientadora, fazer extração de DNA.

135 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE C – Ficha de caracteres morfológicos para espécimes de Blumenavia

Local de coleta: Data: Espécie:

Altitude: Coordenadas: Vegetação:

Coletor: Nº de coletor: Código Herbário:

Substrato: Nº corpos de frutificação (maduros/imaturos)

Obs::

MATERIAL O fresco O desidratado DATA ANÁLISE:

O cr: craquelado - local: O Base O Meio O Ápice / O li: liso Tamanho: alt x larg mm Q:

Cor O uniforme O diferentes cores Formato: O globoso O subgloboso O amplamente elipsoide OVO / VOLVA Cor: O elipsoide O alongado O cilíndrico O baciliforme

Corte transversal do ovo: O multipileado O unipileado

ENDOPERÍDIO O gelatinoso O outro: Cor: Espessura: MESOPERÍDIO O esponjoso O outro: Cor: Espessura: Cor: Com incrustação:

RIZOMORFA Comprimento: mm O única ao sair da volva O ramificada ao sair da volva Largura (perto da volva): mm Largura extremidade(a mm da volva): Ramificação: O presente O ausente Ramificações a partir de: mm mm Cor: Forma dos braços: O braços O braços com rede no ápice RECEPTÁCU- Braços: BBA: livres na base e no ápice BLB: livres na base e unidos no ápice LO O O O BUB: unidos na base e no ápice O outro: Forma: O globoso O subgloboso O amplamente elipsoide O elipsoide O alongado O cilíndrico Tamanho total (com volva): comp. x larg. mm O baciliforme O ovoide O obovoide O piriforme O obopiriforme O outro: Textura dos braços: Com poros na superfície: Se possuir poros, estes são oclusos internamente: O esponjosa O externa O sim O outra: O interna O não

Número de braços: Faces de cada braço com sulco longitudinal na face: O exterior O interior O em nenhuma

Comprimento e largura de cada braço: 4. Compr. mm Larg. basal . mm / Larg. meio . mm / 1. Compr. mm Larg. basal . mm / Larg. meio . mm / Larg. ápice mm Larg. ápice mm 5. Compr. mm Larg. basal . mm / Larg. meio . mm / 2. Compr. mm Larg. basal . mm / Larg. meio . mm / Larg. ápice mm Larg. ápice mm 6. Compr. mm Larg. basal . mm / Larg. meio . mm / 3. Compr. mm Larg. basal . mm / Larg. meio . mm / Larg. ápice mm Larg. ápice mm MÉDIA: Compr. mm Larg. basal . mm / Larg. meio . mm / Larg. ápice mm O BAA O BAE O BAM O BMD Forma geral dos braços (corte transversal): O trapezoidal O triangular O quadrangular O outra Nº de tubos (base/parte média/ápice):

Seção transversal do braço: O multilobular O unilobular Tubos intercomunicados: O sim O não Forma dos tubos base/parte média/ápice (irregular; trapezoidal; quadrangular; circular; triangular; subtriangular; outra):

Inserido em cada braço: Forma: O LG O PCA O PCI Localização: O ap O em O ms O tr GLEBÍFERO O AL: ângulos antero-laretais (em 2 fileiras longitudinais) O PPP O PPR O PTE O PTQ Glebíferos até a base: O pd O pr O ptq O ID: irregularmente dispostos Cor: Odor: Localização: O gl: glebíferos O ds: disperso GLEBA O outro

Material confecionado por Melanda, G.C.S. Legenda: vide explicação a baixo. Referência da carta de cores utilizada: 136 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES BASIDIÓSPOROS RECEP. BASAL RECEP. APICAL GLEBÍFERO ENDOPERÍDIO MESOPERÍDIO EXO. BASAL EXO. APICAL HIFA RIZOMORFA Forma: O pseudoparânquima O pseudoparânquima O pseudoparânquima O pseudoparânquima O pseudoparânquima O globosa O globosa O globosa O filamentosa O filamentosa O filamentosa O filamentosa O filamentosa O filamentosa O filamentosa O filamentosa O com uma gútula Se pseudop. forma: Se pseudop. forma: Se pseudop. forma: Se pseudop. forma: Se pseudop. forma: Se pseudop. forma: Se pseudop. forma: de cada lado KOH: KOH: KOH: KOH: KOH: KOH: KOH: KOH: KOH: A.A.: A.A.: A.A.: A.A.: A.A.: A.A.: A.A.: A.A.: A.A.: RMe: RMe: RMe: RMe: RMe: RMe: RMe: RMe: RMe: V.C: V.C: V.C: V.C: V.C: V.C: V.C: V.C: V.C: Obs: Parede: Or Os/Ore Oir Parede: Or Os/Ore Oir Parede: Or Os/Ore Oir Parede: Or Os/Ore Oir Parede: Or Os/Ore Oir Parede: Or Os/Ore Oir Parede: Or Os/Ore Oir Parede: Or Os/Ore Oir Septo: Ores Oirs Septo: Ores Oirs Septo: Ores Oirs Septo: Ores Oirs Septo: Ores Oirs Septo: Ores Oirs Septo: Ores Oirs Septo: Ores Oirs Possui: O Ci O Gc Possui: O Ci O Gc Possui: O Ci O Gc Possui: O Ci O Gc Possui: O Ci O Gc Possui: O Ci O Gc Possui: O Ci O Gc Possui: O Ci O Gc O cmar Ocmig Occis O cmar Ocmig Occis O cmar Ocmig Occis O cmar Ocmig Occis O cmar Ocmig Occis O cmar Ocmig Occis O cmar Ocmig Occis O cmar Ocmig Occis O______O______O______O______O______O______O______O______ODiâm / parede (µm) ODiâm / parede (µm) ODiâm / parede (µm) ODiâm / parede (µm) ODiâm / parede (µm) ODiâm / parede (µm) ODiâm / parede (µm) ODiâm / parede (µm) Comp x larg (µm) OComp×larg/par(µm). OComp×larg/par(µm). OComp×larg/par(µm). OComp×larg/par(µm). OComp×larg/par(µm). OComp×larg/par(µm). OComp×larg/par(µm). OComp×larg/par(µm). 1 x 1 x / 1 x / 1 x / 1 x / 1 x / 1 x / 1 x / 1 x / 2 x 2 x / 2 x / 2 x / 2 x / 2 x / 2 x / 2 x / 2 x / 3 x 3 x / 3 x / 3 x / 3 x / 3 x / 3 x / 3 x / 3 x / 4 x 4 x / 4 x / 4 x / 4 x / 4 x / 4 x / 4 x / 4 x / 5 x 5 x / 5 x / 5 x / 5 x / 5 x / 5 x / 5 x / 5 x / 6 x 6 x / 6 x / 6 x / 6 x / 6 x / 6 x / 6 x / 6 x / 7 x 7 x / 7 x / 7 x / 7 x / 7 x / 7 x / 7 x / 7 x / 8 x 8 x / 8 x / 8 x / 8 x / 8 x / 8 x / 8 x / 8 x / 9 x 9 x / 9 x / 9 x / 9 x / 9 x / 9 x / 9 x / 9 x / 10 x 10 x / 10 x / 10 x / 10 x / 10 x / 10 x / 10 x / 10 x / 11 x 11 x / 11 x / 11 x / 11 x / 11 x / 11 x / 11 x / 11 x / 12 x 12 x / 12 x / 12 x / 12 x / 12 x / 12 x / 12 x / 12 x / 13 x 13 x / 13 x / 13 x / 13 x / 13 x / 13 x / 13 x / 13 x / 14 x 14 x / 14 x / 14 x / 14 x / 14 x / 14 x / 14 x / 14 x / 15 x 15 x / 15 x / 15 x / 15 x / 15 x / 15 x / 15 x / 15 x / 16 x 16 x / 16 x / 16 x / 16 x / 16 x / 16 x / 16 x / 16 x / 17 x 17 x / 17 x / 17 x / 17 x / 17 x / 17 x / 17 x / 17 x / 18 x 18 x / 18 x / 18 x / 18 x / 18 x / 18 x / 18 x / 18 x / 19 x 19 x / 19 x / 19 x / 19 x / 19 x / 19 x / 19 x / 19 x / 20 x 20 x / 20 x / 20 x / 20 x / 20 x / 20 x / 20 x / 20 x / 21 x 21 x / 21 x / 21 x / 21 x / 21 x / 21 x / 21 x / 21 x / 22 x 22 x / 22 x / 22 x / 22 x / 22 x / 22 x / 22 x / 22 x / 23 x 23 x / 23 x / 23 x / 23 x / 23 x / 23 x / 23 x / 23 x / 24 x 24 x / 24 x / 24 x / 24 x / 24 x / 24 x / 24 x / 24 x / 25 x 25 x / 25 x / 25 x / 25 x / 25 x / 25 x / 25 x / 25 x / 26 x 26 x / 26 x / 26 x / 26 x / 26 x / 26 x / 26 x / 26 x / 27 x 27 x / 27 x / 27 x / 27 x / 27 x / 27 x / 27 x / 27 x / 28 x 28 x / 28 x / 28 x / 28 x / 28 x / 28 x / 28 x / 28 x / 29 x 29 x / 29 x / 29 x / 29 x / 29 x / 29 x / 29 x / 29 x / 30 x 30 x / 30 x / 30 x / 30 x / 30 x / 30 x / 30 x / 30 x / Máx: Máx: Máx: Máx: Máx: Máx: Máx: Máx: Máx: Mín: Mín: Mín: Mín: Mín: Mín: Mín: Mín: Mín: Méd.(sd): Méd.(sd): Méd.(sd): Méd.(sd): Méd.(sd): Méd.(sd): Méd.(sd): Méd.(sd): Méd.(sd): Qm: Qm: Qm: Qm: Qm: Qm: Qm: Qm: Qm: Material confecionado por Melanda, G.C.S. Legenda: Formato da parede das hifas: reta (r) ou sinuosa (s), e se regulares (re) ou irregulares (ir) em relação à espessura. Frequência dos septos: septos frequentes (fr), não frequentes (nfr), espaçados regularmente (e), (n): não espaçados regularmente. Presença de: células infladas (Ci), grampo de conexão (Gc), cristais marrons afilados dispostos em raio (cmar), cristais marrons de formas irregulares agrupados em formas globosas (cmig), cristais cianos de formas irregulares separados uns dos outros (não agrupados) (ccis). 137 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES Metodologia de preenchimento da ficha: Já que o ovo (que mostra o exoperídio do basidioma não expandido) e a volva (perídio que fica na base após os braços se expandirem) com a rizomorfa aderida à parte basal, possuem os mesmos caracteres, estes não foram dividos na ficha de caracteres. Se forem coletados ovos utilizar a ficha somente para preencher os campos da descrição do ovo, rizomorfa, endo e mesoperídio. Já no caso de coletar basidioma expandido (receptáculo e volva) preencher esses campos com os dados da volva e da rizomorfa aderida a ela. Os caracteres do ovo ou volva são: - Craquelado ou liso: representa a cor do exoperídio, se se mostra composto por pedaços corados espaçados (craquelado) ou se a cor é uniforme sem serem sepadas (liso). Se for craquelado indicar o local em que é observado essa forma, base, meio ou ápice da volva ou ovo. - Cor: uniforme – se possuem somente uma cor na volva ou ovo todo, ou diferentes cores – anotar se possuem mais de uma cor (por exemplo base mais clara ficando mais escuro ao ápice). - Cor: informar as cores segundo o guia de cores a ser utilizado, se for de cores diferentes detalhar as cores da base, do meio e do ápice. - Tamanho: altura e largura (a posição vertical é relacionada à rizomorfa, sendo que esta deve estar na parte basal); valor de Q (divisão do valor da altura pela largura). - Corte transversal do ovo: o corte deve ser feito com a rizomorfa voltada para baixo (Figura 8 a-b), este corte determina se o ovo pertence a família Clathraceae (multipileado) ou Phallaceae (pileado ou unipileado). Endoperídio: - Se é gelatinoso ou outra forma. - Cor: de acordo com o guia de cores. - Espessura: medir na volva ou no ovo cortado transversalmente. Mesoperídio: - Se é esponjoso ou outra forma. - Cor: de acordo com o guia de cores. - Espessura: medir na volva ou no ovo cortado transversalmente. Os caracteres da rizomorfa são: - Cor: anotar a cor que possui - Com incrustações: se possuir incrustações informar de que tipo são, exemplo areia.

138 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES - Comprimento: medir o máximo que for possível acompanhar com os olhos, anotar antes do valor o símbolo + se verificar que a rizomorfa ainda se ramifica mais do que foi possível medir. - Largura: deve ser anotado o valor da largura próximo à volva e da extremidade. Na lacuna - Largura da extremidade (a ____ mm da volva) - anotar a medida do comprimento da rizomora até chegar o ponto considerado a extremidade. Os caracteres do receptáculo são: - Cor: anotas a cor dos braços, anotar se possuem cores diferentes ao longo do comprimento ou se possuem cor uniforme. - Forma dos braços: anotar se o basidioma é composto por braços, ou se possuem rede no ápice. - Braços: se for composto por braços informar se são livres na base e no ápice (BBA), se são livres na base e unidos no ápice (BLB), ou se são unidas na base e no ápice (BUB), caso apresentem uma forma diferente de união dos braços informar em ‘outro’ qual seria. - Tamanho (com volva): medir a altura e largura do basidioma, a altura é medida desde a base da volva até o ápice dos braços, e a largura representa a largura extrema, medindo as delimitações dos braços. - Forma: determinada pelo valor de Q, onde: Q=1,00–1,05 formato globoso; Q= 1,05–1,15 subgloboso; Q=1,15–1,30 levemente elipsoide; Q=1,30–1,60 elipsoide; Q=1,60–2,00 alongado; Q=2,00–3,00 cilíndrico e Q > 3,00 baciliforme. Aém destas formas também são utilizadas como opções formas representadas por Kirk et al. (2008) em Dictyonary of the Fungi 10ed., são elas: ovoide, obovoide, obpiriforme, piriforme (Figura abaixo).

139 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES Formas adicionais de basidiomas

Fonte: Adaptado de Kirk et al. (2008).

- Textura dos braços: se o basidioma possui textura esponjosa ou outra que deve ser escrita em frente a opção ‘outra’. - Com poros na superfície externa e/ou na superfície interna, se for de textura esponjosa este se caracteriza por conter poros, observar se são nas duas faces do braço. - Se possuir poros: estes são internamente oclusos ou não. - Número de braços: informar quantos braços compõem o receptáculo. - Face de cada braço com sulco longitudinal: se está presente na face exterior e/ou interior, ou em nenhuma das duas. - Comprimento e largura de cada braço: fazer medida da largura de cada braço em três partes, basal, média e apical e ao final completar com a média dessas dimensões. Essas informações são importantes para determinar posteriormente se os braços são: afilados no ápice (BAA), afilados nas extremidades (BAE), afilados a partir do meio (BAM), mesmo diâmetro no comprimento inteiro (BMD). - Forma geral dos braços: ao fazer um corte transversal dos braços observar o formato da delimitação externa, se é trapezoidal, triangular, quadrangular ou outra. - Seção transversal dos braços: observar se é composta por múltiplos (multilobular) tubos ou por um único tubo (unilobular). - Tubos intercomunicados: se possuem comuniação entre os tubos. - Número de tubos: quantidade de tubos na parte basal, média e apical dos braços.

140 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES - Forma dos tubos: observar as formas dos tubos nas três partes e descrever se é irregular; trapezoidal; quadrangular; circular; triangular; subtriangular ou outra. Caracteres dos glebíferos: - Inseridos em cada braço: nos dois ângulos antero-laterais (entre as faces interior e exterior do braço - AL) ou se são irregularmente dispostos (ID). - Forma: escolher se o glebífero possui a forma: lacerada grande (LG), projeção semicircular no ápice (PCA), projeções formadas por linhas paralelas que se curvam para o interior (PCI), pequenas projeções formadas por linhas onduladas paralelas que se estendem por alguns milímetros do comprimento do receptáculo (PPP), projeções formadas por pontos em roseta (PPR), projeções tentaculares (linhas digitadas, tipo dedos) enrugada paralelas que se unem no interior (PTE), projeções formadas por pontos triangulares ou quadrangulares (PTQ). - Localização: se os glebíferos mencionados anteriormente estão dispostas no ápice dos braços (ap), espaçados regularmente na metade superior (em), pouco espaçados ao longo da metade superior (ms - que significa que são próximos uns dos outros) ou espaçados regularmente por todo receptáculo (tr). - Algumas espécies além de possuir uma das formas anteriores também podem possuir pontos de glebífero espaçados até a base de forma denteada (pd), retorcida (pr) ou triangular a quadrangular (ptq). Caracteres da gleba: - Cor: de acordo com o guia de cores. - Odor: tentar anotar qual o odor perebido pelos coletores. - Localização: anotar se estão sobre os glebíferos (gl), dispersas pelo receptáculo (ds), ou especificar outro lugar. Ao final anotar qual o guia de cores utilizado e observações adicionais que não são contempladas pela ficha.

141 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE D – Resultado das extrações e amplificações dos espécimes de Blumenavia

Espécime Nº de Código da Código da Primers utilizados Resultado da Resultado do tombamento extração¹ amplificação¹ na amplificação amplificação sequenciamento

B. usambarensis B700016468 E17/08-3 A17/15-3 ITS5/4 2 -

E17/08-3 A17/19-1N ITS5/4 3 6

E17/10-1* A17/19-5 ITS5/4 2 -

E17/10-1* A17/19-3D ITS1F/4B 2 -

E17/10-1* A17/19-3N ITS5/4 3 6 E17/08-3 A17/20-5 LROR/LR5 2 - B. rhacodes B700016478 E17/08-4 A17/15-4 ITS5/4 2 -

E17/08-4 A17/19-2D ITS1F/4B 2 -

E17/08-4 A17/19-2N ITS5/4 3 6

E17/08-4 A17/19-2F ITS5/2 3 6

E17/08-4 A17/19.2G ITS3/4 3 6

E17/10-2* A17/19-4 ITS5/4 2 - E17/08-4 A17/20-6 LROR/LR5 2 - B. toribiotalpaensis BPI 870955 E16/14-7 A16/36-5 ITS5/4 2 -

E16/14-7 A16/37-9.2 ITS5/4 3 5

E16/14-7 A16/51-1 ITS5/4 3 4

E16/14-7 A16/68-9 EF1-1018/EF1-1620R 3 4

E16/14-7 A16/69-9 bRPB2 -6F/7.1R 3 4

E16/14-7 A17/20-1 LROR/LR5 3 4 E16/14-7 A17/21-1 ATP6-3/4 2 - B. toribiotalpaensis IBUG456 E16/9-1 A16/48-1 ITS5/4 3 4

E16/9-1 A16/68-8 EF1-1018/EF1-1620R 3 4

E16/9-1 A16/69-8 bRPB2 -6F/7.1R 3 4

E16/9-1 A17/21-2 ATP6-3/4 2 - B. rhacodes ICN 177266 E16/7-14 A16/14-10 ITS5/4 2 -

E16/8-15 A16/16-15 ITS5/4 2 -

E16/8-15 A16/21-2 ITS5/4 2 -

E16/8-15 A16/28.2 ITS5/4 3 4

E16/8-15 A16/34-3 ATP6-3/4 3 5

E16/8-15 A16/49.3 ATP6-3/4 3 4

E16/8-15 A16/40-3 LROR/LR5 3 5

E16/8-15 A16/50.2 LROR/LR5 3 4

E16/8-15 A16/68.5 EF1-1018/EF1-1620R 3 4 E16/8-15 A16/69.5 bRPB2 -6F/7.1R 3 4 B. rhacodes ICN 176968 E16/7-13 A16/14-9 ITS5/4 2 -

E16/8-13 A16/16-13 ITS5/4 2 -

E16/8-13 A16/18-1 ITS5/4 3 5

E16/8-13 A16/41-1 ITS5/4 3 5

E16/8-13 A16/51-2 ITS5/4 3 4 E16/8-13 A16/34-2 ATP6-3/4 3 5

Continua

142 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES Continuação Espécime Nº de Código da Código da Primers utilizados na Resultado Resultado do tombamento extração¹ amplificação¹ amplificação da sequenciamento amplificação E16/8-13 A16/49-2 ATP6-3/4 3 4

E16/8-13 A16/40-2 LROR/LR5 3 5

E16/8-13 A16/50-1 LROR/LR5 3 4 E16/8-13 A16/68-4 EF1-1018/EF1-1620R 3 4 B. angolensis ICN 177268 E16/7-15 A16/14-11 ITS5/4 2 -

E16/8-17 A16/16-17 ITS5/4 2 -

E16/8-17 A16/21-4 ITS5/4 3 5

E16/8-17 A16/41-2 ITS5/4 3 5

E16/8-17 A16/70-16 ITS5/4 3 6

E16/8-17 A16/40-4 LROR/LR5 3 5

E16/8-17 A16/50-3 LROR/LR5 3 4

E16/8-17 A16/34-4.3 ATP6-3/4 3 4

E16/8-17 A16/68-2.1 EF1-1018/EF1-1620R 3 4 E16/8-17 A16/69-2.1 bRPB2 -6F/7.1R 3 4 B. angolensis ICN 177269 E16/7-16 A16/14-12 ITS5/4 2 -

E16/8-18 A16/16-18 ITS5/4 2 -

E16/8-18 A16/21-5 ITS5/4 3 4

E16/8-18 A16/40-5 LROR/LR5 3 5

E16/8-18 A16/50-4 LROR/LR5 3 4

E16/8-18 A16/34-5 ATP6-3/4 3 4

E16/8-18 A16/68-3 EF1-1018/EF1-1620R 3 4 E16/8-18 A16/69-3 bRPB2 -6F/7.1R 3 4 B. angolensis Meijer 4339 E16/16-3 A16/42-3 ITS5/4 3 6

E16/18-5 A16/51-7 ITS5/4 3 6 E16/29-10 A16/70-14 ITS5/4 3 6 B. rhacodes PACA- E16/29-4 A17/02-4 ITS5/4 3 6 FUNGI 12549 B. rhacodes PACA- E16/14-2 A16/37-5.2 ITS5/4 3 5 FUNGI 12550 E16/14-2 A16/51-3 ITS5/4 3 6

E16/29-1 A16/70-5 ITS5/4 2 -

E16/29-1 A16/71-1 ITS5/4 2 - E16/29-1 A17/02-1 ITS5/4 3 6 B. rhacodes PACA- E16/14-3 A17/37-6 ITS5/4 2 - FUNGI 12551 E16/29-2 A16/71-2 ITS1F/4B 3 5 B. rhacodes PACA- E16/29-3 A17/70-7 ITS5/4 2 - FUNGI 12552 E16/29-3 A17/71-3 ITS5/4 2 -

E16/29-3 A17/02-3 ITS5/4 (nested) 2 - E17/03-1 A17/04-2 ITS1F/4B 2 - Continua

143 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES

Continuação

Espécime Nº de Código da Código da Primers utilizados na Resultado Resultado do tombamento extração¹ amplificação¹ amplificação da sequenciamento amplificação B. rhacodes PACA- E16/14-5 A16/37-7 ITS5/4 2 - FUNGI 14978 E16/29-4 A17/70-7 ITS5/4 2 -

E16/29-4 A17/71-4 ITS5/4 2 - E16/29-4 A17/02-4 ITS5/4 (nested) 2 - B. angolensis UFRN- E16/5-6 A16/9-6 TS5/4 2 - Fungos 1943 E16/5-6 A16/21-1 ITS5/4 3 4

E16/5-6 A16/40-1 LROR/LR5 3 -

E16/5-6 A16/34-1 ATP6-3/4 3 5

E16/5-6 A16/49-1.1 ATP6-3/4 3 4

E16/5-6 A16/68-1 EF1-1018/EF1-1620R 3 4

E16/5-6 A16/69-1 bRPB2 -6F/7.1R 3 4 Blumenavia sp UFRN- E16/9-4 A16/48-2 ITS5/4 3 4 Fungos 2868 (GCSM15) E16/9-4 A17/20.2 LROR/LR5 3 4

E16/9-4 A16/49.4 ATP6-3/4 3 4

E16/9-4 A16/68.10 EF1-1018/EF1-1620R 3 4 E16/9-4 A16/69.10 bRPB2 -6F/7.1R 3 4 B. rhacodes J.C.Anel 410 E16/12-2 A16/35-3 ITS5/4 2 -

E16/12-2 A16/37-3 ITS5/4 2 -

E16/17-1 A16/46-1 ITS5/4 3 6

E16/18-4 A16/51-8 ITS5/4 3 6

E16/29-6 A16/70-10 ITS5/4 2 -

E16/29-6 A16/71-6 ITS5/4 2 -

E16/29-6 A17/02-6 ITS5/4(nested) 3 6 B. rhacodes R. Farias E16/12-3 A16/43-3 ITS5/4 2 -

E16/29-7 A16/70-11 ITS5/4 2 -

E16/29-7 A16/71-7 ITS5/4 2 -

E16/29-7 A17/02-7 ITS5/4(nested) 2 - E17/03-3 A17/04-4 ITS1F/4B 2 - B. rhacodes F. Tapia 712 E16/12-4 A16/37-4 ITS5/4 2 -

E16/12-4 A16/41-4 ITS5/4 2 -

E16/17-2 A16/46-2 ITS5/4 3 6

E16/18-5 A16/51-9 ITS5/4 3 6

E16/29-8 A16/70-12 ITS5/4 2 -

E16/29-8 A16/71-8 ITS5/4 2 -

E16/29-8 A17/02-8 ITS5/4(nested) 2 - E17/03-3 A17/04-1 ITS1F-4B 2 - Continua

144 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES Conclusão Espécime Nº de Código da Código da Primers utilizados na Resultado Resultado do tombamento extração¹ amplificação¹ amplificação da sequenciamento amplificação B. rhacodes S. Chacón E16/12-1 A16/35-3 ITS5/4 2 - 5107 E16/12-1 A16/36-1 ITS5/4 2 -

E16/12-1 A16/37-8.2 ITS5/4 2 -

E16/29-5 A16/70-9 ITS5/4 2 -

E16/29-5 A16/71-5 ITS5/4 2 -

E16/29-5 A17/02-5 ITS5/4 (nested) 2 - E17/03-2 A17/04-3 ITS1F/4B 2 - B. rhacodes R. Medel E16/12-7 A16/37-1 ITS5/4 2 -

654 E16/12-7 A16/41-3 ITS5/4 2 -

E16/17-3 A16/46.3 ITS5/4 3 6

E16/29-9 A17/02-9 ITS5/4(nested) 2 - E17/03-5 A17/04-5.2 ITS5/4 3 5 B. rhacodes R. Medel E16/13-1 A17/37-2 ITS5/4 2 -

662 E16/13-1 A16/70-1 ITS5/4 3 5 B. rhacodes R. Medel E16/13-2 A16/70-2 ITS5/4 3 6 672 B. rhacodes D. Jarvio E16/13-3 A16/70-3 ITS5/4 3 6 370 B. rhacodes S. Chacón E16/13-4 A16/36-2 ITS5/4 2 - 5257-A E16/13-4 A16/48-3 ITS5/4 3 4

E16/13-4 A17/20-3 LROR/LR5 3 4

E16/13-4 A16/68-6 EF1-1018/EF1-1620R 3 4 E16/13-4 A16/69-6 bRPB2 -6F/7.1R 3 4 B. rhacodes D. Jarvio E16/13-5 A16/36-3 ITS5/4 2 - 778 E16/13-5 A16/70-4 ITS5/4 3 4

B. rhacodes E. Gándara E16/13-6 A16/35-5 ITS5/4 2 -

1455 E16/13-6 A16/48-4 ITS5/4 3 4

E16/13-6 A17/20-4 LROR/LR5 2 -

E16/13-6 A16/68-7.1 EF1-1018/EF1-1620R 3 4 E16/13-6 A16/69-7.1 bRPB2 -6F/7.1R 3 4 * Extração realizada em FTA® Cards, as não sinalizadas foram pelo Kit Qiagen DNeasy®. - Não enviado para sequenciamento 1 Os códigos de extração e amplificação seguem contole interno do Laboratório de Biologia de Fungos da UFRN, cada código diferente representa uma extração ou amplificação realizada. Em negrito os que resultaram em boas sequências. 2 Não resultou em banda no gel de eletroforese 3 Resultou em banda no gel de eletroforese, foi purificado e enviado para sequenciamento 4 O sequenciamento resultou em uma boa sequência 5 O sequenciamento resultou em um eletroferograma com picos baixos ou muito sobrepostos 6 O sequenciamento resultou em um eletroferograma com sequência de contaminação (por exemplo: Aspergillus sp.)

145 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES

APÊNDICE E – Árvore filogenética do gene ITS obtida pela análise de Máxima Parcimônia. Os números nos ramos indicam valores de bootstrap. Os índices de parcimônia estão listados à direita. A escala representa as mudanças ocorridas (quantidade de passos).

146 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES

APÊNDICE F – Árvore consenso computada após burn-in de 17% na análise Bayesiana do gene ITS. Os números nos ramos indicam valores de probabilidade posterior. A escala representa substituições por sítio.

147 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE G – Árvore filogenética do gene LSU obtida pela análise de Máxima Parcimônia. Os números nos ramos indicam valores de bootstrap. Os índices de parcimônia estão listados à direita. A escala representa as mudanças ocorridas (quantidade de passos).

148 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE H – Árvore consenso computada após burn-in de 9% na análise Bayesiana do gene LSU. Os números nos ramos indicam valores de probabilidade posterior. A escala representa substituições por sítio.

149 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE I – Árvore filogenética do gene ATP6 obtida pela análise de Máxima Parcimônia. Os números nos ramos indicam valores de bootstrap. Os índices de parcimônia estão listados à direita. A escala representa as mudanças ocorridas (quantidade de passos).

150 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE J – Árvore consenso computada após burn-in de 8,1% na análise Bayesiana do gene ATP6. Os números nos ramos indicam valores de probabilidade posterior. A escala representa substituições por sítio.

151 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE K – Árvore filogenética do gene RPB2 obtida pela análise de Máxima Parcimônia. Os números nos ramos indicam valores de bootstrap. Os índices de parcimônia estão listados à direita. A escala representa as mudanças ocorridas (quantidade de passos).

152 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE L – Árvore consenso computada após burn-in de 6,3% na análise Bayesiana do gene RPB2. Os números nos ramos indicam valores de probabilidade posterior. A escala representa substituições por sítio.

153 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE M – Árvore filogenética do gene TEF1α obtida pela análise de Máxima Parcimônia. Os números nos ramos indicam valores de bootstrap. Os índices de parcimônia estão listados à direita. A escala representa as mudanças ocorridas (quantidade de passos).

154 MELANDA, G. C. S – Revisão do gênero Blumenavia Möller (Phallales): integração de dados morfológicos e moleculares- APÊNDICES APÊNDICE N – Árvore consenso computada após burn-in de 5,8% na análise Bayesiana do gene TEF1α. Os números nos ramos indicam valores de probabilidade posterior. A escala representa substituições por sítio.