Doctorat National N°De Thèse 05/19 CSVS

Université Mohammed V Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat

Centre d’Etudes Doctorales des Sciences de la Vie et de la Santé Filière de biologie médicale, pathologie humaine et expérimentale et environnement

THESE En vue de l’obtention du

Doctorat National N°de thèse 05/19 CSVS

Présentée et soutenue publiquement le : 03/10/2019

Par

Fatima YOUSSOUFI

Titre

LES FACTEURS GénétiqueS de la variabilité interindividuelle de la réponse à l’inFeCtion par le vih-1 :

rôle des gènes du système HLA

JURY Pr M. ADNAOUI, Professeur de Médecine interne Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V- Rabat Président de jury

Pr S. MRANI, Professeur de Virologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V– Rabat Directeur de thèse

Pr Y. SEKHSOKH, Professeur de Microbiologie Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université

Mohammed V- Rabat Rapporteur

Pr J. ELBAKKOURI, Professeur d’Immunologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Hassan II- Casablanca Rapporteur

Pr A. BELMEKKI, Professeur d’Hématologie Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V- Rabat Rapporteur

Université Mohammed V Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat

Centre d’Etudes Doctorales des Sciences de la Vie et de la Santé Filière de biologie médicale, pathologie humaine et expérimentale et environnement

THESE En vue de l’obtention du

Doctorat National N°de thèse 05/19 CSVS

Présentée et soutenue publiquement le : 03/10/2019

Par

Fatima YOUSSOUFI

Titre

LES FACTEURS GénétiqueS de la variabilité interindividuelle de la réponse à l’inFeCtion par le vih-1 :

rôle des gènes du système HLA

JURY Pr M. ADNAOUI, Professeur de Médecine interne Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V- Rabat Président de jury

Pr S. MRANI, Professeur de Virologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V– Rabat Directeur de thèse

Pr Y. SEKHSOKH, Professeur de Microbiologie Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université

Mohammed V- Rabat Rapporteur

Pr J. ELBAKKOURI, Professeur d’Immunologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Hassan II- Casablanca Rapporteur

Pr A. BELMEKKI, Professeur d’Hématologie Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V- Rabat Rapporteur

Remerciements

Je tiens à exprimer tout d’abord mes remerciements aux membres du jury, Monsieur le Professeur M. ADNAOUI

Merci infiniment d’avoir accepté de présider ce jury malgré votre agenda chargé. Votre énorme apport dans la prise en charge de personnes vivantes avec le VIH au Maroc est inestimable. C’est un honneur pour moi d’avoir dans ce jury un grand acteur national et international de la lutte contre le VIH/SIDA. Soyez assuré de ma gratitude.

. Monsieur le Professeur S.MRANI Je vous remercier pour tout le soutien que vous m’avez apporté au cours de ce travail. Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance de m’avoir accepté sans réserve, de diriger cette thèse malgré les prérogatives qui vos tiennes et de m’avoir accueillie au sein de votre équipe, pour la confiance et la liberté que vous m’avez accordées.

Monsieur le Professeur Y. SAKHSOUKH Merci Professeur pour m’avoir accueilli au sein du laboratoire LRB P3.Merci pour l’intérêt que vous avez porté à ce travail. Un grand merci d’avoir accepté de faire partie de ce jury. Je suis très honoré. Veuillez accepter mes sincères remerciements

Madame le Professeur J. ELBAKKOURI Je vous remercie infiniment d’avoir accepté d’être rapporteur de cette thèse. Je suis très honoré que vous ayez bien voulu apporter à ce travail votre expertise. Merci de prendre le temps de venir à Rabat pour particper à mon jury. Je tiens à vous exprimer toute ma reconnaissance.

Monsieur le Professeur A. BELMEKKI Merci pour l’intérêt que vous avez porté à ce travail. Merci d’avoir accepté de faire partie de ce jury. Je suis très honoré. Veuillez accepter mes sincères remerciements.

Je remercie le directeur du Centre d’Etudes Doctorales des sciences de la vie et de la santé, Monsieur le Professeur JAMAL TOUFIK Merci de m’avoir accueilli au sein de votre école doctorale et de m’avoir permis d’effectuer cette thèse dans de bonnes conditions. Je serais toujours admirative de votre rigueur scientifique, de votre créativité, de votre efficacité et de votre amour pour cette école.

A Mon Directeur de Thèse Monsieur le Professeur S.MRANI Directeur du Centre de Recherche de Génomique des Pathologies Humaines (GENOPATH) Je vous remercie de m'avoir accueilli au sein de vote équipe de Recherche en Virologie Moléculaire et Oncobiologie du centre GENOPATH et de m'avoir accordé la confiance et la liberté de travailler et d'évoluer. Vous m’avez apporté un grand soutien au cours de ces années passées. Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance d'avoir accepté sans réserve, de diriger cette thèse malgré toutes vos occupations et vos responsabilités.

Un grand merci à Monsieur le Professeur H.EL ANNAZ Ce travail ne serait pas aussi riche et n’aurait pas pu voir le jour sans votre aide et votre encadrement, je vous remercie infiniment pour la qualité de votre encadrement exceptionnel, votre patience, votre rigueur et votre disponibilité durant ma préparation de cette thèse, vous avez toujours été là pour répondre à mes questions techniques ou scientifiques. Merci pour votre humanité et votre gentillesse en n’oubliant jamais vos petits mots d’encouragement.

Je remerci Monsieur le Professeur A. LARAQUI C’est avec un grand honneur et un grand plaisir que je vous remercie. Merci infiniment pour votre encadrement, votre esprit scientifique, votre humanité et votre gentillesse. Merci de m’avoir transmis votre rigueur et votre disponibilité, mais aussi de m’avoir appris à être critique, à exploiter une manip jusqu’au bout pour en tirer le maximum d’informations. Merci de m’avoir transmis une partie de vos connaissances et votre savoir-faire.

Monsieur le Professeur T. TAHAR Un grand merci pour votre gentillesse et humanité, pour vos précieux conseils et vos encouragements, merci pour vos judicieuses orientations.

A mes collègues de CEDOC SVS de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat

Je tiens à remercier l’ensemble des personnes qui ont collaboré de près ou de loin à ce travail.

Toutes les lettres ne sauraient trouver les mots qu'il faut...? Tous les mots ne sauraient exprimer la gratitude, l'amour, respect, la reconnaissance...? Aussi, c'est tout simplement que...?

Je dédie cette thèse ...

A MA TRÈS CHÈRE MÈRE

Autant de phrases aussi expressives soient-elles ne sauraient montrer le degré d’amour et d’affection que j’éprouve pour toi.

A la plus douce et la plus merveilleuse de toutes les mamans. Tu représentes pour moi le symbole de la bonté par excellence. A une personne qui m’a tout donné sans compter. Aucun hommage ne saurait transmettre à sa juste valeur ; l’amour, le dévouement et le respect que je porte pour toi. Sans toi, je ne suis rien, mais grâce à toi j’obtiens mon doctorat national. J’implore Dieu qu’il te procure santé et qu’il m’aide à te compenser tous les malheurs passés. Pour que plus jamais le chagrin ne pénètre ton cœur, car j’aurais encore besoin de ton amour. Je te dédie ce travail qui grâce à toi a pu voir le jour. Je te dédie à mon tour cette thèse qui concrétise ton rêve le plus cher et qui n’est que le fruit de tes conseils et de tes encouragements. Tu n’as pas cessé de me soutenir et de m’encourager, ton amour, ta générosité exemplaire et ta présence constante ont fait de moi ce que je suis aujourd’hui. Tes prières ont été pour moi un grand soutien tout au long de mes études. J’espère que tu trouveras dans ce modeste travail un témoignage de ma gratitude, ma profonde affection et mon profond respect. Puisse Dieu tout puissant te protéger du mal, te procurer longue vie, santé et bonheur afin que je puisse te rendre un minimum de ce que je te dois.

Je t’aime maman.

A MON TRÈS CHER PÈRE

Autant de phrases et d’expressions aussi éloquentes soit-elles ne sauraient exprimer ma gratitude et ma reconnaissance.

De tous les pères, tu as été le meilleur, tu as su m’entourer d’attention, m’inculquer les valeurs nobles de la vie, m’apprendre le sens du travail, de l’honnêteté et de la responsabilité.

Tes conseils ont toujours guidé mes pas vers la réussite. Ta patience sans fin, ta compréhension et ton encouragement sont pour moi le soutien indispensable que tu as toujours su m’apporter.

Je te dois ce que je suis aujourd’hui et ce que je serai demain et je ferai toujours de mon mieux pour rester ta fierté et ne jamais te décevoir. Rien au monde ne vaut les efforts fournis jour et nuit pour mon éducation et mon bien être. Ce travail est le fruit des sacrifices que vous avez consentis pour mon éducation et ma formation.

Que Dieu le tout puissant te préserve, t’accorde santé, bonheur, quiétude de l’esprit et te protège de tout mal.

A MES CHERS ET ADORABLE FRERES ET SŒUR

Abdelaziz, mon deuxième père, Najia la prunelle de mes yeux, Abdelhak, Le doux, au cœur généreux et Simohammed. Vous avez été à mes côtés pendant toutes les étapes de mes études, je vous en suis très reconnaissante. L’encouragement, les conseils et les soutiens que vous m’avez apporté étaient et reste la bouffée d’oxygène qui me ressourçait dans les moments pénibles Quoique je puisse dire et écrire, Aucune dédicace ne peut exprimer la profondeur des sentiments fraternels et d’amour, d’attachement que j’éprouve à votre égard. Je vous dédie ce travail en témoignage de ma profonde affection en souvenirs de notre indéfectible union qui s’est tissée au fil des jours. J'espère ne jamais vous décevoir, ni trahir votre confiance et vos sacrifices. Je vous souhaite une vie pleine de bonheur et de succès. Puisse dieu vous protéger, garder et renforcer notre fraternité.

A MA TRES CHERE ET ADORABLE BELLE SŒUR ET BEAU FRERE

Quoique je dise, je ne saurais exprimer l’amour et la tendresse que j’ai pour vous. Je vous remercie, pour votre support et vos encouragements, et je vous dédie ce travail, pour tous les moments de joie et de taquinerie qu’on a pu partager ensemble.Puisse DIEU, le tout puissant, vous préserver du mal, vous combler de santé et de bonheur.

À MES CHERS PETITS NEVEUX ET A MES PETITE PERLES NIECES

Aucune dédicace ne saurait exprimer tout l’amour que j’ai pour vous, Votre joie et votre gaieté me comblent de bonheur. Puisse Dieu vous garder, éclairer votre route et vous aider à réaliser à votre tour vos vœux les plus chers.

Table des matières

Introduction

Table des matières

Remerciements ...... 3 Table des matières ...... 12 Résumé ...... 18 Abstract ...... 19 20 ...... ملخص Production scientifique liée à la thèse ...... 21 Liste des tableaux ...... 22 Liste des figures ...... 23 Liste des abréviations ...... 25 Première partie : synthèse bibliographique ...... 29 Chapitre I : Généralités sur le virus de l’immunodéficience humaine ...... 30 1. Historique ...... 31 2. Taxonomie et Classification du VIH ...... 33 3.1. Structure du virus ...... 34 3.2.1. Les gènes majeurs du VIH-1 ...... 36 .3.2.2 Les gènes supplémentaires du VIH ...... 38 4. Variabilité génétique du VIH ...... 39 4.1. Le VIH-1 ...... 40 4.2. Le VIH-2 ...... 42 4.3. Formes recombinantes circulantes (CRF) ...... 43 5. Origine du VIH ...... 44 5.1. Passage du VIH du singe à l’Homme...... 45 6. Epidémiologie ...... 47 6.1. L’épidémiologie dans le monde ...... 47 6.2. L’épidémiologie au Maroc ...... 50 7. Modalités de transmission ...... 50 7.1. Transmission par voie sexuelle ...... 51 7.2. Transmission par voie sanguine...... 51 7.2.1. Usagers de Drogues par Injection (UDI)...... 52 7.2.2. Transfusion de sang ou de dérivés du sang ...... 52 7.2.3. Accidents d'exposition au sang (AES) ...... 52 8. Cellules cibles, cycle de réplication et tropismes...... 52 8.1. Cellules cibles du VIH ...... 52 8.2. Cycle de la réplication ...... 54 9. Evolution clinique et biologique de l’infection à VIH ...... 57

9.1. Classification biologique de l’infection par VIH ...... 57 9.1.1. La primo-infection (phase séroconversion) ...... 57 9.1.2. La phase asymptomatique (ou phase de latence clinique -7 à 10 ans) ...... 58 9.1.3. Le stade SIDA (phase symptomatique) ...... 58 9.2. Classification clinique ...... 60 10. Le diagnostic biologique de l’infection par le VIH ...... 62 10.1. Tests de dépistage sérologique ...... 63 10.1.1. Les tests ELISA ...... 63 10.1.2. Les tests rapides d’orientation diagnostique (TROD ou TDR) ...... 64 10.1.3. Le test de confirmation sérologique : western-blot ou immuno-blot ...... 65 10.2. Diagnostic direct de l’infection par le VIH-1 ...... 67 10.2.1. Détection de l’antigène viral p24 ...... 67 10.2.2. Détection des acides nucléiques viraux ...... 67 10.2.3. Isolement du VIH en culture ...... 67 10.3. Le suivi des patients infectés par les virus VIH ...... 68 11. Les Antirétroviraux...... 69 11.1. Objectifs généraux du traitement antirétroviral...... 69 11.2. Classes d’antirétroviraux ...... 70 11.2.1. Inhibiteurs de l’entrée ...... 71 11.2.2. Inhibiteurs de la transcriptase inverse ...... 71 11.2.3. Inhibiteurs de l’intégrase ...... 72 11.2.4. Inhibiteurs de protéase ...... 73 12. La réponse immunitaire contre le VIH ...... 73 12.1. La réponse innée ...... 73 12.2. La réponse adaptative ...... 74 13. Cas particulier de patients exposés non infectés et LTNP ...... 76 13.1. Présentation des patients exposés non infectés ...... 76 13.2. Présentation des patients « long term non progressors (LTNP) » ...... 76 Chapitre II : Généralités sur le système des antigènes des leucocytes humains ...... 80 1. Historique ...... 82 2. Gènes et molécules du HLA ...... 82 3. Caractéristique du système HLA ...... 83 3.1. Le polymorphisme ...... 83 3.2. La transmission en haplotype ...... 86 3.3. La codominance ...... 86 4. Génes de HLA classe I...... 86

4.1. Structure des molécules de classe I ...... 86 4.2. Distribution tissulaire des molécules HLA I ...... 87 4.3. Nature de peptide présenté par HLA I ...... 88 4.4. Présentation de peptides antigéniques par le CMH-I ...... 88 5. Gènes de HLA classe II ...... 90 5.1. Structure des molécules de classe II ...... 90 5.2. Distribution tissulaire des molécules HLA II...... 91 5.3. Nature de peptide présenté par HLA II ...... 92 5.4. Présentation de peptides antigéniques par le HLA II...... 92 6. Nomenclature...... 93 7. Méthodes utilisées pour la réalisationd’un typage HLA...... 95 Chapitre III: HLA et maladie infectieuse VIH ...... 98 1. Introduction ...... 99 2. L'influence du système HLA sur laprogression de l'infection par le VIH-1 ...... 100 2.1. Les allèles HLA-A Protecteurs...... 101 2.2. Les allèles HLA-B protecteurs ...... 102 2.3. Allèles HLA associés à la susceptibilité au VIH ...... 104 3. HLA et hypersensibilité médicamenteuse ...... 106 3.1. Hypérsensibilité ...... 106 3.2. Hypersensibilité médicamenteuse ...... 107 3.3. Phénomène de sensibilisation ...... 107 3.3.1. Le concept d’haptène ...... 108 3.3.2. Le concept p-i ...... 108 4. HLA et hypersensibilités médicamenteuses ...... 109 4.1. Propriétés pharmacologiques de l’abacavir ...... 109 4.2. Mécanisme de l’hypersensibilité à l’abacavir ...... 111 5. Manifestations de la réaction d’hypersensibilité à l’abacavir ...... 115 5.1. Association entre l’hypersensibilité à l’abacavir et HLA-B*5701 ...... 117 Deuxième partie : Travaux de thèse ...... 122 Context général ...... 123 Chapitre I : L’allèle HLA-B*57 :01 et l’hypérsensibilité à l’abacavir ...... 126 1. Lieu d’étude ...... 127 2. Patients ...... 127 2.1. Présentation des patients ...... 127 2.2. Considerations Ethiques ...... 127 2.3. Prélèvement sanguin ...... 127

3. Méthodes ...... 128 3.1. Paramètres cliniques du VIH ...... 128 3.2. Extraction de l’ADN des échantillons...... 128 3.3. Vérification de la qualité d’ADN par Electrophorese ...... 130 3.4. Quantification de l’ADN par spectrophotométrie ...... 130 3.4.1. Principes de la détermination spectrophotométrique de l’ADN...... 130 3.5. Génotypage de HLA-B57*01 ...... 131 3.5.1. Préparation des solutions d'amorces ...... 133 3.5.2. Composition du mélange réactionnel dans les microtubes ...... 134 3.5.3. Amplification de HLA-B*57:01 ...... 134 3.5.4. Programmes PCR ...... 134 3.5.5. Révélation des produits d’amplification...... 135 3.5.6. Interprétation des résultats ...... 137 3.6. Analyses statistiques ...... 138 4. Principaux résultats ...... 138 4.1. Caractéristiques des patients ...... 138 4.2. Génotypage de l’allèle HLA-B*57 :01 ...... 139 5. Discussion ...... 140 6. Conclusion ...... 144 7. Publication ...... 144 Chapitre II : La prévalence et l’effet de l’allèle HLA-B*44 chez les patients infectés par le VIH ...... 148 1. Présentation des patients ...... 149 2. Methodes ...... 149 2.1. Paramètres cliniques du VIH ...... 149 2.2. Extraction de l’ADN des échantillons...... 149 2.3. Génotypage de l’allèle HLA-B*44...... 149 2.3.1. Préparation des solutions d'amorces ...... 150 2.3.2. Composition du mélange réactionnel dans les microtubes ...... 150 2.3.3. Programmes PCR ...... 150 2.3.4. Révélation des produits d’amplification...... 151 2.4. Analyses statistiques ...... 151 3. Principaux résultats ...... 152 3.1. Caractéristiques de la cohorte ...... 152 3.2. Distribution de l'allèle HLA-B * 44 ...... 153

3.3. Association entre l'allèle HLA-B*44 et les caractéristiques cliniques et démographiques...... 155 4. Discussion ...... 156 5. Conclusion ...... 160 6. Publication ...... 160 Bibliographie ...... 167

Résumé

Les facteurs génétiques de la variabilité interindividuelle de la réponse à l’infection par le VIH-1

Auteur : Fatima YOSSOUFI

Mots clés : HIV, HLA-B*57 :01, Abacavir, HLA-B*44, Morocco

Le système HLA est un facteur génétique important qui a une influence sur la progression vers le SIDA. Certains allèles HLA-B ont un effet protecteur contre la progression vers le Sida comme HLA-B*57 :01 et HLA-B*44. Malgré l’effet protecteur de HLA-B*57:01 contre l’infection, il est associé à un risque significativement majoré de la réaction d’hypersensibilité à l’abacavir.

L’objectif de ce travail est d’étudier la prévalence de l’allèle HLA-B*57 :01, déterminer la prévalence de HLA-B*44 et son association à la progression de l’infection chez des patients infectés par le VIH.

L’étude a été réalisée chez 167 patients infectés par le VIH-1, les allèles HLA-B*57 :01 et HLA-B*44 ont été génotypés par sequence specific primer PCR (SSP PCR).

La première étude de ce travail a été consacrée à l’étude de la prévalence de l’allèle HLA- B*57 :01. Les résultats ont montré que la fréquence de cet allèle était plus faible chez les patients marocains (0%). Nous pourrions conclure que l’allèle HLA-B*57 :01 n'est pas un allèle commun chez les marocains, donc la prescription de l’abacavir n’aura pas un effet néfaste pour les patients infectés par le VIH et le dépistage de l’allèle HLA-B*57 :01 ne serait pas une stratégie rentable et efficace au Maroc.

Le deuxième travail a porté sur l’étude de l’allèle HLA-B*44. Les résultats ont montré que 16% des patients exprimant l’allèle HLA-B*44. D’après les résultats obtenus, on a constaté que le stade clinique au moment du diagnostic, la médiane de la charge virale plasmatique et le nombre de T CD4 avant le traitement diffèrent de manière significative (p = 0,0001, p = 0,001 et p = 0,0001 respectivement) entre les patients exprimant l'allèle HLA-B*44 et ceux qui ne l’expriment pas. On peut constater que pourrait être classé parmi les allèles protecteurs contre la progression vers le SIDA.

Abstract

Genetic factors of interindividual variability in the response to HIV-1 infection

Author : Fatima YOSSOUFI

Keywords: HIV, HLA-B*57:01, Abacavir, HLA-B*44, Morocco

The HLA system is an important genetic factor that influences the kinetics of progression to the AIDS stage. Certain alleles of the HLA-B have a protective effect against progression to AIDS: HLA –B*57: 01and HLA-B*44. Despite the protective effect of the HLA-B*57: 01 against HIV, it is associated with a significantly increased risk of the hypersensitivity reaction to abacavir.

The objective of this work is to investigate the prevalence of the HLA-B*57: 01 and to determine the prevalence of HLA-B*44 and its association with progression of infection in HIV-infected patients.

The study was conducted in 167 HIV-infected patients, the HLA-B*44 and HLA-B*57:01 alleles were genotyped by sequence specific primer PCR (SSP PCR).

The first practical part of this work was devoted to the study of the prevalence of the HLA-B*57: 01. The results obtained showed that the genetic frequency of this allele was lower in our cohort (0%). From the results obtained, we could conclude that the HLA-B*57: 01 is not a common allele in Moroccans, so the prescription of abacavir will not have a detrimental effect on HIV-infected patients and the HLA-B*57:01 screening would not be a cost-effective and effective strategy in Morocco.

The second practical part of this work focused on the study of the HLA-B*44 allele. The results obtained showed that 16% of the patients included in the study expressing the HLA-B *44 allele. Based on the results obtained in our study, it was found that the clinical stage at the time of diagnosis, the median plasma viral load before treatment and the number of CD4 T cells differed significantly (p = 0.0001, p = 0.001 and p = 0.0001 respectively) between patients expressing the HLA-B*44 and those who do not express it. The HLA-B*44 allele could be classified as a protective allele against progression to the AIDS stage.

ملخص العوامل الوراثية للتغيرات بين األفراد في االستجابة لعدوى فيروس نقص المناعة المكتسبة

المولف: فاطمة يوسفي

كلمات المفتاح: فيروس نقص المناعة، المغرب، HLA-B*57 :01،HLA-B*44 ،ABACAVIR

فيروس نقص المناعة البشرية )السيدا( هو وباء عالمي. تطور هذا المرض يختلف من فرد ألخر. يصاب بعض المرضى بالمرض بسرعة، بينما يظل اخرون بدون اعراض لعدة سنوات. نظام HLA هو عامل وراثي يلعب دورا مهما على سرعة تقدم االصابة الى مرحلة السيدا. هناك حليالت لها تأثير وقائي ضد المرض : HLA-B*57 :01 HLA-B*44، على الرغم من التأثير الوقائي ل HLA-B*57 :01 ، ضد فيروس نقص المناعة المكتسبة اال انه يرتبط بزيادة خطر الحساسية المفرطة اتجاه دواء ABACAVIR.

الهدف من هذا العمل هو تحديد مدى انتشار الحليلينHLA-B*44 ، HLA-B*57 :01 وارتباطهما بتطور مرض فيروس نقص المناعة المكتسبة.

اجريت الدراسة على 167 مريض مصاب بفيروس نقص المناعة، تم تصنيف الحليلين بواسطة تقنية SSP PCR. كرس الجزء العملي االول من هذا العمل لدراسة مدى انتشار الحليل HLA-B*57 :01، أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها على ان التردد الوراثي لهذا الحليل نادر عند المرضى المغاربة، حيث انه وال مريض كان حامال لهذا الحليل)٪0( هذه النسبة تضل ضعيفة مقارنة مع النسب المحصل عليها في الدول األوروبية واألمريكية. من النتائج المحصل عليها يمكننا ان نستنتج ان الحليل HLA-B*57 :01 ليس بحليل مشترك في المغرب. لذا فان وصفة ABACAVIR يحتمل بان ال يكون لها اي تأثير سلبي على المرضى المغاربة المصابين بمرض نقصان المناعة المكتسبة.ولهذا فان االختبار او الفحصHLA-B*57 :01 يمكن ان ال يكون استراتيجية فعالة في المغرب.

ركز الجزء الثاني من هذا العمل على دراسة الحليل HLA-B*44، حيث أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها على ان 26 من بين 167 )16٪( مريض يعبرون عن الحليل .HLA-B*44 وبناءا على النتائج تبين على ان المرحلة السريرية في وقت التشخيص، و متوسط عدد الفيروسات في البالزما و عدد الخاليا قبل العالج يختلف بين المرضى الذين يعبرون عن الحليل واولك الذين ال يعبرون عنه )p=0.001، p=0.0001،p=0.0001(. يمكن تصنيف الحليل HLA-B*44 كحليل واقي ضد المرض نظرا لتأثيره على انخفاض عدد الفيروسات وحفاظه على خاليا المناعة.

كلمات المفتاح: فيروس نقص المناعة، المغرب، HLA-B*57 :01،HLA-B*44 ،ABACAVIR

PRODUCTION SCIENTIFIQUE LIEE A LA THESE

 Articles originaux publiés

 Fatima Youssoufi, Hicham El Annaz, Abdelilah Laraqui, Tahar Bajjou, Naoufal Hjira, Ouafa Atouf, Yassine Sekhsokh, Malika Esskalli, Saad Mrani.The prevalence of human leukocyte antigen-B*57:01 allele in HIV-1-infected Moroccan subjects. Gene Reports 9 (2017) 108–110.  Fatima Youssoufi, Hicham El Annaz, Abdelilah Laraqui, Reda Tagajdid, Rachid Abi, Safae Elkochri, Rachid Frikh, Tahar Bajjou, Naoufal Hjira, Yassine Sekhsokh, Saad Mrani. HLA-B*44 allele associated with clinical parameters in HIV-1 infected Moroccan cohort. Int J Res Med Sci. 2019 Apr; 7(4):1354-1359.  Communications orales

 Fatima Youssoufi, Hicham El Annaz, Abdelilah Laraqui, Tahar Bajjou, Naoufal Hjira, Ouafa Atouf, Yassine Sekhsokh, Malika Esskalli, Saad Mrani. The prevalence of human leukocyte antigen-B*57:01 allele in HIV-1-infected Moroccan subjects. 8èmes Journées Scientifiques du CEDoc-SVS et aux 5ème Journées Scientifiques d’AMADOC SVS, Faculté de médecine et de pharmacie de Rabat, 31 mars 2018  Communications affichées

 Fatima Youssoufi, Hicham El Annaz, Abdelilah Laraqui, Tahar Bajjou, Naoufal Hjira, Ouafa Atouf, Yassine Sekhsokh, Malika Esskalli, Saad Mrani.The prevalence of human leukocyte antigen-B*57:01 allele in HIV-1-infected Moroccan subjects. 1ère édition des Rencontres Médicales et Scientifiques. Univérsité Internationale des Science de la Santé de Rabat, 11 Mai 2018.  Fatima Youssoufi, Hicham El Annaz, Abdelilah Laraqui, Tahar Bajjou, Naoufal Hjira, Ouafa Atouf, Yassine Sekhsokh, Malika Esskalli, Saad Mrani. La prévalence de l’allèle HLA-B*57 :01 chez une cohort des patients marocains inféctés par Le VIH-1. 8èmes Journées Scientifiques du CEDoc-SVS et aux 5ème Journées Scientifiques d’AMADOC SVS, Faculté de médecine et de pharmacie de Rabat, 31 mars 2018

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Manifestation cliniques selon la classification de CDC

Tableau II : Définition des catégories cliniques

Tableau III : Caractéristiques et évolution des tests ELISA pour le diagnostic du VIH

Tableau IV : Nombre des allèles de HLA

Tableau V : Allèles et protéines HLA

Tableau VI : Nomenclature HLA en sérologie : les antigènes HLA

Tableau VII : présente certains allèles de HLA-B associés à la protection contre le VIH.

Tableau VIII : certains allèles HLA connus pour être associés à la susceptibilité à l'infection par le VIH

Tableau IX : Résumé des études pharmacogénétiques et de leurs principaux résultats concernant HLA- B*57 : 01 HSR à l’abacavir

Tableau X : Amorces spécifiques utilisé pour le génotypage de HLA-B*57 :1 et la séquence de HGH

Tableau XI : Caractéristiques d’amorces

Tableau XII : Programmation de la PCR pour l’amplification de l’allèle HLA-B*57 :01

Tableau XIII : Caractéristiques démographiques et cliniques des patients

Tableau XIV : Fréquence allélique de HLA-B * 57: 01 dans divers groupes de population

Tableau XV : Caractéristiques d’amorces spécifique de l’allèle HLA-B*44 :

Tableau XVI : Programmation de la PCR pour l’amplification de l’allèle HLA-B*44

Tableau XVII : Caractéristiques démographiques et cliniques des patients

Tableau XVIII : Distribution de l'allèle HLA-B * 44 et comparaison statistique entre les deux groupes

Tableau XIX : Analyses bivariées et multivariées des facteurs associés aux stades avancés de l'infection par le VIH

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Arbre phylogénétique des rétrovirus basé sur l’alignement des séquences de la RT et de l’IN Figure 2 : Représentation de la structure VIH Figure 3 : Représentation schématique de la TI du VIH-1 Figure 4 : Organisation génomique du VIH-1 et représentation des précurseurs protéiques et des protéines issues de leur maturation Figure 5 : Diversité génétique du VIH. Figure 6 : Arbre phylogénique illustrant l’origine simienne du VIH-1 Figure 7 : Estimation du nombre de personnes vivant avec le VIH dans le monde en 2017 Figure 8 : Adultes et enfants nouvellement infectés par le VIH entre 1990 et 2017 Figure 9 : Décès liés au SIDA dans le monde entre 1990 et 2017 Figure 10 : Changements de conformation au cours de l’entrée du VIH dans la cellule cible Schéma du mécanisme d’adressage de l’ADN viral aux régions activement transcrites du génome Figure 11 : Cycle de réplication du VIH Figure 12 : Phases de l’évolution de l’infection à VIH, en l’absence de traitement. Figure 13 : Survenue des infections opportunistes en fonction du nombre de lymphocytes T CD4 Figure 14 : Algorithme pour les tests de dépistage rapide du VIH (TDR) Figure 15 : Algorithme de dépistage du VIH Figure 16 : Cibles moléculaires des traitements antirétroviraux Figure 17 : Activation de T CD8+ après la reconnaissance d’un peptide du VIH par CMHI

Figure 18 : Réponse lymphocytaire contre le VIH.

Figure 19 : cartographie des gènes HLA sur le chromosome 6 humain Figure 20 : Transmission parentale des haplotypes HLA Figure 21 : Représentation schématique des gènes de classe I du CMH Figure 22 : Présentation de la formation puis de la présentation aux lymphocytes T du complexe binaire Pcmh Figure 23 : Formation du complexe PLC puis du complexe pCMH dans le réticulum endoplasmique Figure 24 : Représentation schématique des gènes de classe II du CMH Figure 25 : Dégradation et transport de l'antigène qui fixe les molécules de classe II Figure 26 : Nomenclature des allèles HLA Figure 27 : Principe de la technique PCR SSP

Figure 28 : Représentations plane de l'abacavir Figure 29 : Métabolisme et activation de l'abacavir Figure 30 : Mécanisme de l’hypersensibilité à ABC Figure 31 : Liaison de l’abacavir à HLA-B * 57: 01 Figure 32 : p-i HLA : la modification des molécules HLA-B*57 :01 par l'abacavir se fait par les voies extracellulaires et intracellulaires Figure 33 : Hypersensibilité à l’abacavir, patients avec une éruption maculo-papuleuse Figure 34 : Symptômes d’hypersensibilité rapportés avec une fréquence  10 % Figure 35 : Les principales étapes d’extraction d’ADN. Figure 36 : Les étapes de la préparation du gel d’électrphorèse Figure 37 : Électrophorèse sur gel d'agarose illustrant des produits de PCR pour le HLA-B* 5701. Figure 38 : Électrophorèse sur gel d'agarose illustrant les produits de PCR pour l'allèle HLA-B*44

LISTE DES ABREVIATIONS

ABC : Abacavir ADN : Acide désoxyribonucléique ARN : acide ribonucléique ARV : antirétroviraux AZT : azidothymidine CCR5 : C-C chemokine receptor type 5 CD : Cellule dendritique CD4: Cluster of differentiation 4 CD8: Cluster of differentiation 8 CDC : Centers for disease control CMH : complexe majeur d'histocompatibilité CPA : cellule présentatrice d’antigènes cpx: complex cpz: chimpanzé CRF : Formes recombinantes circulantes CRF: recombinant circulating form CTL: cytotoxic T lymphocytes CV : Charge Virale CXCR4 : Chemokine (X-C motif) Receptor 4 DC-SIGN: Dendritic Cell-specific ICAM3-Grabbing Non-integrin EDTA : Éthylènediaminetétraacétique ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay Env. : Enveloppe Gp : glycoprotéine HAART : Highly Active Antiretroviral Therapy HAS : Haute Autorité de Santé HLA: human leukocyte antigen HSR: hypersensitivity reaction HTLV: Human T-Lymphotropic Virus ICTV: International Comittee on Taxonomy of Viruses

IF : inhibiteurs de fusion INI : inhibiteurs d’intégrase INNTI : inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse INTI : inhibiteurs nucléosidiques /nucléotidiques de la transcriptase inverse IP : Les inhibiteurs de protéase LAV : Lymphadenopathy Associated Virus LNTP: long-term non-progressor LTR: Long Terminal Repeat MA: matrice NASBA: nucleic acid sequence based amplification) NC: Nucléocapside Nef: negative factor OMS : Organisation mondiale de la santé ONUSIDA : Programme commun des Nations Unies sur le VIH/sida PCR : polymerase chain reaction PCR-SSP : polymerase chain reaction-Sequence Specific Primers SIDA : syndrome d'immunodéficience acquise TDR : tests rapides de détection TI : Transcriptase inverse TNF: Tumor Necrosis Factor TROD: Test Rapide d’Orientation Diagnostic VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine VIS : virus de l’immunodéficience simienne

Introduction

Si le syndrome du sida est bien présent, la lutte contre ce fléau est toujours continue. Le Maroc parmi les pays du nord d’Afrique qui a réalisé des avancées remarquables en matière de lutte contre le sida, grâce aux efforts déployés par le Ministère de la Santé, à l’engagement des pouvoirs publics, ainsi qu’au dynamisme de la société civile. Le Programme commun des Nations Unies sur le VIH/sida (ONUSIDA) a cité le Maroc dans son rapport de 2017 comme une particularité et déclaré auteur de la meilleure pratique au niveau de la région du Moyen-Orient et de l'Afrique du Nord. Malgré la diminution des chiffres, le VIH cause des décès dans nos contrées.

La réponse de l’infection par ce virus ce diffère d’un patient à un autre. Plusieurs facteurs (liés au virus et/ ou de l’hôte) sont mis en évidence pour expliquer la variabilité interindividuelle de la réponse à l’infection par le VIH. Le facteur génétique de l’hôte reste un facteur primordial, qui joue un rôle important. Les gènes du système HLA est l’un des facteurs génétiques, qui ont d’une part, un effet sur le taux de la progression de la maladie vers stade SIDA, d’autre part la présence de certains HLA peut provoquer une allergie ou hypersensibilité vis-à-vis à certains médicaments antirétroviraux (ARV). Les antirétroviraux sont des substances qui ont été élaborés pour bloquer différentes étapes de la multiplication du VIH ou pour réduire sa capacité à infecter de nouveaux lymphocytes CD4.

Dans ce contexte que nous avons mené, cette thèse comporte deux parties, une première partie a été consacrée à une synthèse bibliographique sur les aspects du VIH/SIDA, ainsi que le système HLA, alors que dans la deuxième partie, nous avons présenté les deux travaux de cette thèse, avec les différents résultats obtenus. L’objectif général était d’étudier l’effet de certains allèles de HLA-B, notamment HLA-B*57 :01 et HLA-B*44 sur le taux de la progression de la maladie et la prévalence de l’allèle HLA- B*57 :01 et son association à l’hypersensibilité à l’abacavir.

PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

CHAPITRE I : GENERALITES SUR LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE

Rôle des gènes du HLA dans la variabilité interindividuelle de la réponse à l’infection par VIH-1

1. Historique Le VIH est un virus nommé Virus de l’Immunodéficience Humaine, responsable du Syndrome de l’Immunodéficience Acquise, que tout le monde connait sous le nom de SIDA. L’agence gouvernementale américaine de santé publique « Center for Disease Control and Prevention », consacre un article en 3 juin 1981 de son « Morbidity and Mortality Weekly Report » à l’apparition de pneumopathies à Pneumocystis Jirovecii, chez de jeunes homosexuels de Los Angeles (1). Apèrs quelques semaines, un nouvel article décrit la recrudescence associée ; toujours chez des jeunes homosexuels, de sarcomes de Kaposi (2). L’émergence de ce que l’on appelle alors « gay syndrome », « peste gay » ou « gay cancer » inexpliquée, devient rapidement une évidence. Les observations montrent, néanmoins, que ce syndrome ne touche pas que les homosexuels mais il s’agit également chez les Haïtiens, les hémophiles, les héroïnomanes… indépendamment de leur pratique sexuelles, même chez les usagers de drogues par voie intraveineuse et les nouveaux nés issus des mamans infectées. La transmission de ce que l’on nommera dorénavant syndrome de l’immunodéficience acquise, se fait dans la plus grande majorité des cas par voie sanguine, sexuelle et materno- fœtale. Ces modes de transmission laissant penser, par ailleurs, à une cause infectieuse dont l’agent responsable est un virus, qui reste encore à déterminer (3). Deux équipes de chercheurs l’une à l’Institut Pasteur à Paris et l’autre au National Cancer Institut aux États- Unis, travaillent sur l’identification de l’agent pathogène. A la fin de 1982, Willy Rozenbaum, médecin infectiologue français, se constitue à l’Institut Pasteur, un groupe de travail composé, entre autres, de Luc Montagnier, Jean Claude Chermann et Françoise Barré Sinoussi, dont les recherches, au sein de l’unité d’oncologie virale, concernent les relations rétrovirus et cancers. A partir d’une biopsie ganglionnaire de patients atteints de « lymphadénopathie généralisée », les chercheurs mettent en culture des cellules ganglionnaires dont des lymphocytes T CD4+, cibles apparentes du virus. Ils ne tardent pas à mettre en évidence une activité transcriptase inverse, caractéristique des rétrovirus, conjointement à la mort cellulaire des lymphocytes T CD4+ présents. Le virus est observé pour la première fois, quelques jours plus tard, au microscope électronique.

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En mai 1983, la publication de ces résultats dans la revue Science, par l’équipe de l’Institut Pasteur, marque, a posteriori, l’identification du virus responsable du SIDA, qu’ils baptiseront bientôt « Lymphadenopathy Associated Virus », soit LAV (4). Cette découverte de ce virus, représentant un grand pas en avant dans l’état des connaissances scientifiques, leur a valu l’obtention du prix Nobel de médecine en 2008. Le travail effectué par cette équipe de recherche française, marque un jalon très important dans la recherche scientifique relative au Sida. Parallèlement, dans le National Cancer Institute, les chercheurs américains, Robert Gallo et son équipe, avaient également entrepris de découvrir l'étiologie du SIDA. Le professeur Gallo avait discerné, tout d'abord, le premier rétrovirus humain connu à l'époque, le HTLV I, qu'il avait lui-même décrit quelques années auparavant, avant d'annoncer en 1984 l'isolement d'un nouveau virus, responsable du SIDA, le HTLV III (5). En 1985, le séquençage des génomes du HTLV III et du LAV, démontrera cependant qu'il s'agit d'un seul et même virus. L'isolement du virus ouvre la voie au diagnostic sérologique. Les premiers tests de dépistage de ce qui deviendra le LAV-1, ainsi apparaissent en 1985, alors que l’Institut Pasteur a réussi d’isoler un second virus, le LAV-2. Un test de dépistage spécifique au LAV-2 sera mis au point quelques années plus tard. Grâce aux travaux effectués aussi bien en France qu’aux Etat Unies, la connaissance autour de ce virus est devenue importante. Justifiant ainsi la préconisation en 1986 par le comité international de nomenclature de la désignation de nouveaux agents infectieux, ainsi que la dénomination officielle, qui est restée jusqu’à aujourd’hui « Virus de l’Immunodéficience Humaine », soit VIH-1 et VIH-2 (6). A la fin de l’année 1986, plus de 30.000 cas de SIDA, répartis dans le monde entier, ont été déclarés à l’organisation mondiale de la santé (OMS) ; ce qui amènera les autorités sanitaires à travers le monde de qualifier ce virus de pandémie et non pas d’épidémie. Les avancées en terme de thérapeutiques antirétrovirales, furent considérables ces dernières années offrant ainsi la possibilité aux personnes séropositives de bénéficier d’une espérance de vie ramenée à celle de la population non infectée avec une qualité de vie satisfaisante.

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2. Taxonomie et Classification du VIH D’après l’International Comittee on Taxonomy of Viruses (ICTV), sept genres de rétrovirus (Figure 1) sont classés selon plusieurs critères tels que la pathogénicité, la structure du génome, la morphologie, les propriétés antigéniques parmi lesquelles :

- les Alpharétrovirus (ALV : Avian Leukosis Virus) - les Betarétrovirus (MMTV: Mouse Mammary Tumor Virus) - les Gammarétrovirus (MLV : Murine Leukemia Virus) Des autres rétrovirus complexes codants en plus des protéines Gag, Pol, Env portant dans leur génome des séquences codantes pour des protéines régulatrices : - les Deltarétrovirus (HLTV : Human T-Lymphotropic Virus) - les Epsilonrétrovirus (WDSV : Walleye Dermal Sarcoma Virus) - les Spumavirus (HFV : Human Foamy Virus) - les Lentivirus (HIV : Human Immunodeficiency Virus) sont des virus responsables d’infections virales à développement lent. Les premiers travaux de recherche ont permis de conclure que le VIH appartient à la famille des Retroviridae, caractérisée essentiellement par son mode de réplication, qui dépend d'une enzyme particulière : la transcriptase inverse, capable de transcrire, à partir d'un ARN (acide ribonucléique) simple brin du virus, un ADN bicaténaire (acide désoxyribonucléique). Le VIH appartient à la sous-famille des Orthoretrovirinae et au genre des Lentivirus (Figure 1). Ces virus sont à l'origine de maladies opportunistes, dont l'évolution est spécifiquement longue et au cours desquelles la réplication virale est constante. Ils sont également qualifiés de cytopathogènes puisqu'ils induisent généralement la mort des cellules qu'ils infectent (7–9).

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Figure 1 : Arbre phylogénétique des rétrovirus basé sur l’alignement des séquences de la RT et de l’IN (10).

3. Structure et organisation génomique du VIH

3.1. Structure du virus S’agissant de la structure du virus, nombreux sont les chercheurs qui ont démontré que le VIH est une particule sphérique, qui mesure entre 90 et 120 nanomètre de diamètre. Il est composé de plusieurs structures : l’enveloppe, la matrice et la nucléocapside.  L’enveloppe Elle est formée d’une bicouche phospholipidique provient de la membrane cytoplasmique de la cellule infectée. La bicouche lipidique jonchée de spicules formés des glycoprotéines (gp) de surface gp 120 et transmembranaire gp 41. La gp41 traverse la bicouche lipidique et permet l’ancrage du virus à la cellule cible et la gp 120 permet la fixation de celui-ci sur les récepteurs des cellules cibles. Ces glycoprotéines sont spécifiques et différentes de chaque type de virus (les glycoprotéines d’enveloppe du VIH- 2 étant la gp105 et la gp36) (Figure 2).

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 La matrice Juste sous l’enveloppe du virus VIH, se trouve la matrice qui est composée de la protéine p17 et plus en profondeur, la protéine p6 (Figure 2). La protéase, enzyme viral qui participe à la maturation des virions, est située entre cette matrice et la nucléocapside.  La nucléocapside La capside virale en forme de cône tronqué constituée de la protéine p24. A l’intérieur se trouve le génome viral (deux molécules d’ARN) et des enzymes qui sont : l’intégrase (p32), la protéase (p10) et la rétrotranscriptase (p66 et p61). La figure ci-dessous visualise la structure du VIH.

Figure 2 : Représentation de la structure VIH (11).

3.2. Organisation génétique du VIH

Le génome rétroviral est constitué de deux copies d’ARN simple brin de polarité positive de 10 kilobases (9200 nucléotides) (12), L’ARN viral est encadré de séquences répétées « R », de la région U5 en 5’ et U3 en 3’ qui sera convertie en ADN, lors de la transcription inverse, permettant la création de séquences répétées non codantes aux extrémités appelées LTR (Long Terminal Repeat) composé des régions U3, R et U5 jouant un rôle crucial dans la réplication virale. Le VIH-1 comporte plusieurs gènes communs à

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l’ensemble des rétrovirus codants pour les protéines de structure et les enzymes de réplication ainsi que les gènes accessoires (Figure 4) (12,13). La région codante du gène du VIH-1 contient principalement trois gènes rétroviraux classiques et six gènes viraux supplémentaires. Ces gènes supplémentaires sont, impliqués dans des phénomènes de régulation de l’expression des protéines virales et par la même, de la multiplication du virus (Figure 4) (12-15).

3.2.1. Les gènes majeurs du VIH-1 S’aggisant en ce qui concerne de la typologie du VIH, Plusieurs auteurs distinguent trois gènes principaux : 1) Le gène gag est le précurseur des protéines structurales internes de tous les rétrovirus. Il code pour une polyprotéine, qui sera découpée en protéines comme de la capside, de nucléocapside et de matrice. Le gène gag peut être considéré comme l'élément majeur dans le processus d'assemblage des virions (Figure 4) ; 2) Le gène pol pour « polymérase », code pour les trois principales protéines enzymatiques telles que, la transcriptase inverse (TI), l’intégrase p34 et la protéase p10. Ces protéines sont nécessaires au cours des différentes étapes du cycle viral (Figure 4) ;  La transcriptase inverse : ou « reverse transcriptase » est un hétérodimère p51/66. Elle convertit un ARN viral simple brin en ADN double brin complémentaire (ADNc) (ADN polymérase ADN-ARN dépendante et RNase H), qui s’intègrera ensuite facilement à l’ADN de la cellule hôte sous forme d’ADN proviral. Une particularité de la transcriptase inverse est de ne pas être fidèle dans sa transcription et de souvent faire des erreurs, 1 mutation par 300 000 paires de base (16) C'est la raison pour laquelle le VIH a une haute diversité génétique observée entre les différentes souches du VIH-1. Les premières études cristallographiques de l’enzyme ont décrit une structure en 4 domaines schématisant une main : doigts, paume, pouce et connexion (Figure 3) (16,17).

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Figure 3 : Représentation schématique de la TI du VIH-1(18).

 L’intégrase : ou p32 (IN), c’est une protéine de 288 acides aminés (32kD) (19). Elle permet l’intégration du génome viral, constitué désormais par de l’ADN double brin linéaire (l’ADNc) dans l’ADN chromosomique de la cellule hôte. Elle possède trois domaines : un domaine central relativement résistant aux protéases responsable de l’activité catalytique, un domaine N-terminal (20-23) qui est nécessaire à l’oligomérisation de l’intégrase, enfin un domaine C-terminal (24-26) qui comporte par lui-même une activité de fixation à l’ADN de caractère non spécifique.  La protéase : Elle intervient au cours de la dernière étape de la réplication virale en jouant un rôle primordial dans la maturation du virus. Cette enzyme est impliquée dans le clivage protéolytique des précurseurs polyprotéiques exprimés des gènes gag et pol du VIH. Cette action permet la production à la fois de protéines structurelles et fonctionnelles, nécessaires et indispensables à la formation de nouveaux virus. 3) Le gène env : code pour la gp 160 qui est le précurseur de deux protéines différentes : la protéine de surface (gp 120) et la protéine transmembranaire (gp41). Ces protéines, présentes à la surface de la membrane des virions, sont les premiers déterminants du type de cellules pouvant être infectées puisqu’elles reconnaissent des récepteurs cellulaires.

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3.2.2. Les gènes supplémentaires du VIH Des nombreux travaux de recherche ont permis de conclure à l’existence de pouvoirs d’activations, dont peuvent être dotés des gènes. En effet, il existe 6 types :  Le gène tat : code la protéine Tat (p14) qui régule la transcription du promoteur viral. En se fixant sur l’ARN TAR (Transactivation Responsive element) du 5’LTR induit le recrutement d’un complexe enzymatique, dont les acétyles transférases conduisant à la modification de la chromatine au niveau du site d’intégration du provirus, le rendant ainsi accessible à la transcription.  Le gène rev : code la protéine Rev (Regulation of expression of viral proteins), qui régule la transition entre les phases précoces et tardives de l’expression des gènes viraux en permettant l’export nucléaire des ARN longs vers le cytoplasme après interaction avec la séquence d’ARN RRE (Rev Responsive Element) située dans le gène env.  Le gène nef (negative regulatory factor ou facteur de régulation négative) a un rôle de régulation négative. La protéine nef se trouve non pas dans le noyau mais dans le cytoplasme. Il code la protéinée Nef (Negative factor, p27), intervient dans la propagation du virus et l’évolution de l’infection VIH vers le stade SIDA. Pour ce faire, Nef module la transduction des messages cellulaires activant la présentation des récepteurs CD4+, les molécules de CMH I et II, les récepteurs des chimiokines. De plus, la protéine Nef induit des modifications lipidiques de la membrane des virions et les microdomaines de la cellule hôte à l’origine d’une augmentation éventuelle de l’infectivité des virions ;  Le gène vif (virion infectivity factor ou facteur déterminant le pouvoir infectant du virus) intervient dans la réplication virale, la protéine vif produit le facteur d’infectivité virale. Les virus sans gène vif sont perturbés au niveau des dernières étapes de l’infection et infectent moins les cellules ;  Le gène vpr (viral protein r) code pour une protéine incorporée dans le virion. Cette protéine agit avec la protéine p6 du gag, elle est localisée au niveau du noyau. Les fonctions de la protéine vpr consistent à orienter les complexes de pré-activation de certains gènes cellulaires. Son action se traduit par une accélération du taux de réplication ;  Le gène vpu (viral protein unique) retrouvé uniquement chez les VIH-1 et certains SIV. La protéine vpu est une protéine de membrane à deux fonctions : dégradation des CD4 dans le réticulum endoplasmique et augmentation du nombre de virions libérés des cellules infectées (réplication, assemblage, maturation des virions) (27).

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La figure suivante permet de montrer l’organisation génique du virus VIH-1.

Figure 4 : Organisation génomique du VIH-1 et représentation des précurseurs protéiques et des protéines issues de leur maturation (28). gag code pour un précurseur pr55gag clivé par la protéase virale en 4 protéines : MAp17, CAp24, NCp7 et le peptide C-terminal P6 ainsi que deux spacers : le peptide p2 et le peptide p1. Le précurseur pr160gag-pol est clivé par la protéase virale en trois enzymes : la protéase PRp10, l’intégrase INp32 et la transcriptase inverse RTp66/p51. Le gène env code pour le précurseur gp160, qui est clivé par une protéase cellulaire en deux protéines, la glycoprotéine de surface (SU) gp120 et la glycoprotéine transmembranaire (TM) gp41. En plus des protéines Gag, Pol et Env, le génome du VIH-1 code pour des protéines régulatrices Tat et Rev, mais aussi des protéines accessoires Vpu, Vpr, Vif et Nef.

4. Variabilité génétique du VIH La transcriptase inverse n’est pas comme certaines ADN polymérases, qui disposent aussi d'une activité exonucléase 3’ → 5’, et qui ont la capacité de corriger les erreurs d'incorporation dans le brin néoformé. La diversité génétique remarquable chez le VIH, est liée aux nombreuses erreurs d’incorporation de nucléotides de la transcriptase inverse, d'autant plus accentuées que la dynamique de réplication virale est intense (1 à 10 milliards de virus par jour). La technique la plus utilisée pour étudier la variabilité

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génétique du VIH, est l'analyse de séquences nucléotidiques (fragments comprenant la région hypervariable V3 du gène env et souvent une portion du gène gag). Chez un même individu infecté, on met en évidence une population virale évoluant de façon dynamique tout au long de l’infection, témoignant de la variabilité très importante du VIH. Les nouveaux variants générés, appelés quasi-espèces, sont sélectionnés en fonction de leur adaptation à l’environnement cellulaire, à la pression de sélection exercée par le système immunitaire, et éventuellement à celle des traitements antirétroviraux. Les pressions de sélection pouvant différer d’un compartiment à l’autre de l’organisme, l’évolution des populations virales chez un même patient peut se faire de façon indépendante entre deux compartiments (29). Deux types de virus sont responsables de l’infection à VIH/sida : le VIH-1 qui est répandu dans le monde entier et le VIH-2 qui est essentiellement localisé en Afrique.

4.1. Le VIH-1 Le VIH de type 1 (VIH-1) fut mis en évidence pour la première fois chez un patient homosexuel avec lymphadénopathies multiples. Le VIH-1 se caractérise par sa très grande variabilité génétique ayant conduit à une classification en quatre groupes : M, N, O, et P (Figure 5) (30, 31).  Le groupe M (« Major ») ; en 1983, c’est le premier virus de l’immunodéficience humaine isolé, c’est le groupe le plus répondu dans le monde. L’Afrique centrale est l’épicentre de l’infection à VIH-1 du groupe M (30). Il comporte actuellement 9 sous-types désignés par des lettres (A, B, C, D, F, G, H, J et K) (32), et des sous-sous- types désignés par des chiffres (A1 à A4, F1 et F2). L’analyse de génomes entiers a permis de mettre en évidence des virus recombinant provenant de sous-types différents qui sont nommés circulating recombinant form (CRF).Le sous-type C est majoritaire dans le monde avec 50% de cas à lui seul.  Le groupe O (Outlier), découvert chez un couple camerounaise vivant en Belgique et présentant des lymphadénopathies généralisées en 1990, le virus a été isolé à l’institut de médecine tropicale d’Anvers, Ce virus présentait des caractéristiques génétiques très particulières, mais il était plus proche du VIH-1 que du VIH-2. Des études sérologiques allaient attester de l’existence de ce virus atypique au Cameroun et au Gabon(33). Une nouvelle souche MVP5180 identifiée en Allemagne par Gürtler et al, qui est quasiment identique à la souche ANT70 et isolée chez un patient camerounais au stade

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sida(34). En 1994, un nouveau variant nommé VAU était isolé chez une patiente française atteinte du sida, dont la séquence du gène env s’avérait proche de celles des virus MVP5180 et ANT70 (35). Néanomoins, les analyses phylogénétiques montraient que ces trois virus étaient différents les uns des autres que les sous-types du VIH-M entre eux (35). Le séquençage des virus ANT70 et MVP5180 montrait une similarité de 73 % dans le gène pol avec les VIH-1 d’origine européenne ou africaine (36). La différence d’ensemble entre les génomes étant inférieure à 50 %, il ne pouvait cependant s’agir des représentants d’un VIH-3. Une nouvelle nomenclature fut alors proposée, avec une classification du VIH-1 en deux groupes : le groupe Major (M) et le groupe Outlier (O). Le groupe (O) est plus rare et principalement isolé chez des patients vivant en Afrique centrale (Cameroun, Gabon et Guinée équatoriale). Au sein de ce groupe, il existe une forte variabilité génétique. Les 3 sous-types définis (O:A, O:B, O:C) regroupent de nombreux virus variables entre eux (37).  Le groupe N (Non M Non O), décrit en 1998 et identifié au Cameroun chez une patiente camerounaise décédée du sida en 1995 (38). Le sérum de la patiente présentait la particularité de réagir avec un antigène de l’enveloppe d’un virus de l’immunodéficience simienne isolé d’un chimpanzé (VIScpz) plutôt qu’avec les antigènes représentatifs des groupes M et O. Le Le séquençage du génome complet de cette souche divergente par une équipe franco-camerounaise montrait une position phylogénétique différente selon les gènes considérés, au sein des VIScpz pour env et entre les VIScpz et les VIH-M pour gag et pol. Une autre étude séro-épidémiologique éffectué au Cameroun sur 700 sérums VIH positifs mettait en évidence trois échantillons réactifs sur l’antigène de la souche YBF30 (38). La caractérisation moléculaire de l’un d’entre eux montrait une parenté phylogénétique avec YBF30, cette étude a confirmé ainsi la circulation de ces variants au Cameroun et permettant de définir, selon la nomenclature, un nouveau groupe de VIH-1 : le groupe N (VIH-N), pour « non-M, non-O» (38).  Le groupe P (Putative) : Ce nouveau variant atypique (RBF168) a été isolé en 2009 chez une patiente camerounaise de 62 ans. Une infection par un VIH-O fut d’abord suspectée du fait : de la négativité de certains tests de charge virale spécifiques du VIH-M ; de l’origine de la patiente et ; des résultats du sérotypage (39). Une réplication virale importante, détectable à la fois par une technique spécifique du VIH-O et par une technique non spécifique de groupe, semblait conforter ce diagnostic. Mais paradoxalement, la négativité de PCR spécifiques du groupe O laissait suspecter une

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infection par une souche divergente. L’analyse génétique a finalement montré que ce virus était clairement distinct génétiquement des VIH M, N et O, mais très proche d’un VIS récemment identifié au Cameroun chez des gorilles (VISgor) (40). Cette souche constitue ainsi le premier représentant d’une nouvelle lignée de VIH-1 dénommée groupe P. L’identification d’un deuxième cas par une équipe américaine, chez un patient camerounais de 56 ans prélevé en 2006, corrobore la présence de ce variant au Cameroun (41).

4.2. Le VIH-2 Le VIH de type 2 (VIH-2), suspecté initialement à partir de la réactivité sérologique particulière d’échantillons issus de travailleuses du sexe sénégalaises (42), fut isolé des prélèvements de deux patients en stade SIDA, mais n’ayant pas présenté de réactivité sérologique sur les tests commerciaux de l’époque. Le VIH-2 présente un potentiel évolutif plus lent que le VIH-1 (43). Ce virus diffère par son génome et ses caractéristiques phylogéniques. Il est génétiquement très proche du virus de l’immunodéficience simienne (Figure 5). Il est moins répandu que le VIH-1 et se localise surtout en Afrique de l’Ouest. Il est classé en 8 groupes (A à H) et seuls les groupes A et B sont épidémiques. La variabilité génétique des VIH est un des nombreux obstacles auxquels les scientifiques sont confrontés. Ses conséquences sur les tests de diagnostic, les traitements antirétroviraux, la transmissibilité, la pathogenèse et la vaccination sont les plus mentionnés dans les travaux.

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Figure 5 : Diversité génétique du VIH.Sont représentésles 4 groupes du VIH-1 (M, N, O et P), les 9 sous types du groupe majeur M (A, B, C, D, F, G, H, J et K), les relations phylogénétiques avec le SIV de différents singes ainsi que celles avec le VIH-2 et deux de ses 8 sous types majoritaires (39).

4.3. Formes recombinantes circulantes (CRF) La synthèse de l’ADN proviral se produit à partir des 2 molécules d’ARN génomique empaquetées dans la même capside, l’une et l’autre pouvant servir alternativement de brin matrice lors de la transcription inverse par l’effet de sauts de matrice. Trois modèles, non exclusifs mutuellement, ont été proposés pour illustrer et expliquer l’effet du saut de matrice sur la recombinaison rétrovirale :  Le « modèle du choix de la copie forcé » repose sur l’hypothèse que les ARN génomiques sont fréquemment fragmentés. Ainsi le saut de la TI est imposé du fait de coupures naturelles sur la matrice (44) ;  Le « modèle du choix de la copie» se produit en l’absence de brèche sur les molécules d’ARN (45) ;  Le « modèle du choix de la copie dynamique» détermine le niveau de recombinaison en fonction de l’état d’équilibre entre deux activités de la TI : le taux de polymérisation de l’ADN et le niveau de l’activité RNAse H (46). La recombinaison peut avoir lieu chez l’hôte entre des virus identiques, relativement proches, voire divergents. L’impact de la recombinaison sur le potentiel évolutif viral est donc lié au degré de divergence entre les souches parentales, mais surtout à l’avantage sélectif procuré par la

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souche recombinante par rapport à son environnement (47). En somme, ces mécanismes moléculaires ont un impact à la fois sur la production de quasi-espèces virales, générant une diversité génétique à l’échelle individuelle du patient, mais aussi et plus largement, à l’échelle de la population infectée en générant des variants (sous-types, CRF), dont l’introduction dans un environnement propice à leur adaptation, facilite leur émergence et leur évolution. Le séquençage des génomes de VIH a joué un rôle important dans l’indentification de recombinants inter-sous-types. Ils résultent de recombinaison entre sous-types chez un individu ayant été infecté par plusieurs sous-types du VIH-1. Pour proposer nouvelle forme recombinante (CRF), la nomenclature impose l’identification de trois virus séquencés sur la totalité de leur génome présentent les mêmes points de recombinaison et sont isolés chez au moins trois patients sans lien épidémiologique entre eux (48). URF (unique recombinant forms) sont des formes recombinantes ne correspondant pas à ces critères de classification. Les CRF sont nommées avec un numéro séquentiel dans l’ordre dans lequel ils ont été rapportés dans la littérature suivi par les lettres des sous-types impliqués, la première étant la CRF01_AE. Si plus de deux sous-types sont impliqués, ils sont donc remplacés par la désignation ¨cpx¨, par exemple, CRF06_cpx(A,G,J,K,). En avril 2019, 98 CRFs du VIH-1 (de CRF01_AE à CRF98_06B) et 1 CRF du VIH-2 (HIV-2 CRF01_AB) qui ont été découvertes et décrites dans la littérature(49).

5. Origine du VIH Deux types de VIH (VIH-1 et VIH-2) infectent l’espèce humaine. L’origine de ces virus comme dérivants des virus de l’immunodéficience simienne (SIV), contrepartie simienne des VIH, ne fait aucun doute (Figure 6) (50). Il y a une transmission inter-espèce du singe à l'Homme. Hahn et al, ont montré que quelques souches du VIH-2 sont presque identiques à celles des SIV retrouvées dans la population des petits singes de l’Afrique de l’Ouest, nommés mangabeys (50). La coexistence d’épidémies chez l’Homme et chez le singe mangabey, a également été notée, dans certaines régions en Afrique de l’Ouest. La propagation du virus dans ces régions, a été expliquée par le phénomène de capture des singes qui ont été considérés comme animaux de compagnie. Les auteurs ont émis, en 1990, l’hypothèse de l’origine simienne du VIH-1 (51). Selon eux, le VIH-1 proviendrait de certaines populations de chimpanzés. Cette possibilité était

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consolidée par l’organisation similaire des génomes des deux virus, le VIH-1 chez l’homme et le SIV chez les chimpanzés. L’origine simienne du VIH- a été suggéré par une autre étude, qui a mis en évidence chez des sujets camerounais des souches très proches du SIV présentes chez des chimpanzés vivant dans la même région qu’eux (50). L’analyse phylogénétique ainsi que le séquençage des lentivirus ont permis de prouver l’existence d’une corrélation entre le SIV et le VIH. Toutefois, il existe une différence entre le VIH-1 et VIH-2 (Figure 6). Le VIH-1 est, réelement, proche du SIV pz, qui infecte une sous-espèce de chimpanzés dits Pan troglodytes troglodytes (52), alors que le VIH-2 est plus proche des SIVsmm, qui sont responsables de l’infection des mangabeys couronnés et des SIVmac, qui sont à leur tour à l’origine de l’infection chez les macaques (Figure 6). Certains chercheurs ont pensés, que d’abord le VIH-1, puis le VIH-2 seraient issus de la mutation des SIV, une fois passés du singe à l’homme (53).

Figure 6 : Arbre phylogénique illustrant l’origine simienne du VIH-1 (54)

5.1. Passage du VIH du singe à l’Homme

La contamination par le VIH est considérée comme une zoonose (50). Du moment qu’environ 18 espèces de singes contaminés ont été recensées, le réservoir du SIV est donc considérable. Ces singes étaient infectés par des virus, ayant des critères antigéniques et génomiques très différentes. Cela laisse croire à l’existence suggère l’existence de nouvelles souches de virus susceptibles d’engendrer une infection chez l’Homme (50). La

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question qui se pose ici, c’est : comment, expliquer la transmition du SIV du singe à l’espèce humaine ? Lors du dépeçage du singe, il existe un risque d’exposition au sang contaminé. Le passage du virus SIV à l’Homme se ferait soit en cas d’une blessure de l’Homme survenant lors de dépeçage du gibier ou au cours de morsure par un singe. La communauté scientifique a ainsi conservé cette théorie, dite « théorie du chasseur de viande de brousse », dans le but d’expliquer la transmission du SIV du singe à l’Homme. La barrière des espèces joue un rôle important dans la protéction, le franchissement de la barrière est habituellement létal pour les virus. Mais, une fois que le SIV réussit à pénétrer chez l’Homme, il va s’intégrer dans son génome, muter, se transformer en VIH et ainsi s’adapter à son nouvel hôte. La période du passage du SIV à l’Homme n’est pas clairement précisée, mais selon de nombreuses études, les chercheurs ont éstimé que le VIH serait apparu chez l’espèce humaine entre 1884 et 1924 (55,56). Des auteurs ont proposé d’autres théories différentes, un peu plus discutées, afin d’expliquer le passage du SIV du singe à l’Homme. Entre autres, celle du vaccin polio oral qui a été écartée rapidement par absence d’arguments scientifiques. Finalement, en 2000, une étude publiée, dans le prestigieux journal « Nature », s’est appuyée sur la distance génétique entre le virus du Sida du singe (SIVcpz) et le virus du Sida humain (VIH-1). D’autres études ont pu confirmer l’existance du VIH-1 dans la région de Kisangani au Congo Belge, plus de 30 ans avant la production du vaccin polio oral. Une analyse des échantillons des vaccins polio oral va affirmer l’absence absolue d’ADN du VIH humain et du SIV dans ceux-ci (55). Grâce au séquençage génétique comparatif, S. Plotkin a réussi à justifier que le SIVcpz est à l’origine du VIH-1, alors que le SIV de mangabey, lui, est à la genèse du VIH-2 (57). Selon S. Plotkin, il a été montré aussi, que le début de la propagation du Sida chez l’espèce humaine se situerait entre 1920 et 1940, mais à cause des différences génétiques entre le SIVcpz et le VIH-1, l’on pourrait situer le passage du virus simien à l’Homme bien avant cette date. Une autre étude (58), montre que le SIVcpz est à l’origine d’une recombinaison entre deux virus de l’immunodéficience simienne (SIV), qui contamine respectivement le singe hocheur et le cercocèbe à collier blanc. Cette découverte a été une contribution importante pour la compréhension de l’origine et de l’épidémiologie du VIH.

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En 2011, Jacques Pépin dans son livre, The Origins of AIDS (59), reprenant la théorie du chasseur de viande de brousse, montrera comment le VIH, apparu 90 ans plus tôt en Afrique, s’est propagé diffusé en Occident, puis après dans le monde entier. Tout aurait commencé débuté au début des années dans les années 1920. Au départ, une contamination infection par le virus a probablement peut etre eu lieu par quelques chasseurs de viande de brousse. Mais, le moment exact du passage du virus du singe à l’homme n’est pas encore déterminé défini. Finalement, il est clairement admis accepté que l’origine du VIH-1 est le chimpanzé d’Afrique centrale, dont l’habitat est le le Gabon sud du Cameroun, le Congo-Brazzaville, le sud du Cameroun, la République centrafricaine, la Guinée équatoriale, et la République démocratique du Congo et de l’enclave du Cabinda (60,61).

6. Epidémiologie

6.1. L’épidémiologie dans le monde Selon les dernières données du Programme commun des Nations Unies sur le VIH/sida (ONUSIDA) extraites de la fiche d’information en date de juillet 2018 (62), le nombre de personnes vivant avec le VIH continue d’augmenter de 34 millions à la fin de l’année 2011 à 36,9 millions [31,1 millions – 43,9 millions] personnes vivant avec le VIH en 2017 (Figure 7), y compris 35,1 millions [29,6 millions-41,7 millions] d’adultes, 1,8 million [1,3million -2,4 millions] d'enfants (< 15 ans).

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Figure 7 : Estimation du nombre de personnes vivant avec le VIH dans le monde en

2017(63). L’Afrique de l'Est et du Sud sont les pays où l’on dénombre le plus de séropositifs 19,6 millions [17,5millions-22,0millions], dont les femmes et les filles représentent plus de la moitié [59%] du nombre total de personnes vivant avec le VIH en Afrique orientale et australe. Parmi les 36,9 millions de personnes séropositives au VIH dans le monde, 21,7 millions bénéficient d’un traitement antirétroviral, selon la fiche d’information de juillet 2018, contre 17,1 millions en 2010. En 2017, la part des individus ayant accès à un traitement antirétroviral s’élève à 75%, dont : - 59% des adultes de plus de 5 ans - 2% des enfants de moins de 15 ans - 80% des femmes enceintes vivant avec le VIH, de manière à prévenir la transmission du virus à leurs bébés. 1,8 millions de personnes ont été infectées par le VIH dans le monde en 2017 mais le nombre de nouvelles infections annuelles chez les adultes a diminué de 16% depuis 2010 où il était de 1,9 millions (Figure 8). Chez les enfants de moins de 15 ans, ce nombre de nouvelles infections a également diminué puisque 180 000 nouvelles infections ont été enregistrées en 2017 contre environ 300 000 en 2010.

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Enfin, les décès liés au SIDA ont été réduits de moitié depuis le niveau le plus élevé, 1,9 millions enregistrés en 2005. En effet, seuls 940 000 morts ont été recensés en 2007 (Figure 9).

Figure 8 : Adultes et enfants nouvellement infectés par le VIH entre 1990 et 2017

Figure 9 : Décès liés au SIDA dans le monde entre 1990 et 2017

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6.2. L’épidémiologie au Maroc Au Maroc, le premier cas de VIH a été notifié en 1986 et depuis, le nombre de cas est en nette progression. Les chiffres du ministère marocain de la santé, montre que le nombre de personnes vivant avec le VIH (PVVIH) est estimé à 22 000 (16 000 - 28 000) en fin 2016, avec 1 000 nouvelles infections et 700 décès par année (64). La prévalence du VIH reste faible dans la population générale (0,1 %). Elle est cependant beaucoup plus élevée chez les populations clés plus exposées aux risques d’infection à VIH telles que les professionnelles du sexe féminin (PSF) (1,3 %), les hommes ayant des relations Sexuelles avec les hommes (4,3 %) et les personnes qui s’injectent les drogues (8 %). Cette prévalence est plus élevée dans certaines villes (5,7 % à Marrakech parmi les HSH, 13,2 % à Nador et 7,1 % à Tétouan parmi les PID). Trois Régions concentrent plus de 50 % des cas (Souss Massa, Marrakech-Safi et Casablanca Settat) (64).

Le rapport de l'organisation d’ONUSIDA, basé sur les chiffres du ministère marocain de la Santé, a montré, que le nombre estimé de nouvelles infections VIH a diminué de 37% entre 2011 et 2016. La proportion de personnes vivant avec le VIH, qui connaissent leur statut sérologique, a augmenté de 37% (en 2011) à 63% (en fin 2016), dépassant la proportion de 53% observée dans la région du Moyen-Orient et de l’Afrique du Nord (Mena) (62). Le rapport révèle aussi que près de 150.000 femmes enceintes ont été diagnostiquées positives pour le VIH en 2016 contre 43.000 en 2012. Le nombre de femmes enceintes séropositives suivies dans les centres de prise en charge au cours de l’année 2016 était de 215 avec une augmentation du taux de couverture passant de 33% en 2011 à 62% en 2016. Un taux dépassant le pourcentage observé dans la région Mena qui est de moins de 20% (62).

7. Modalités de transmission Le VIH est isolé principalement dans le sang, le sperme et les sécrétions vaginales des personnes infectées, ainsi que dans le lait et les liquides pleural, amniotique, broncho alvéolaire ou céphalorachidien. Il a aussi été retrouvé dans d’autres liquides biologiques que sont la salive, les larmes et les urines, mais en faible concentration et avec la présence de composants qui tendent à inactiver le virus. C’est pourquoi, les trois principaux modes de transmission du VIH sont les rapports sexuels, la transmission par le sang et la transmission de la mère à l’enfant (pendant la grossesse, au cours de l’accouchement ou

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lors de l’allaitement). On rappellera que ces hypothèses ont été formulées et en très grande partie validées dès le tout-début de l’épidémie (1981-1983) par les premières études épidémiologiques.

7.1. Transmission par voie sexuelle C’est le mode de transmission de l’infection par le VIH le plus répandu dans le monde : 85 à 90% des infections par le VIH ont été acquises à l’occasion de rapports sexuels non protégés. La totalité des études publiées s’accordent sur le fait que les rapports anogénitaux représentent un risque majeur de contamination. Le risque pour un rapport anal réceptif (pénétration par un partenaire séropositif) est compris entre 0,65 % et 1,43 %, selon qu’il y ait ou non éjaculation. Lors d’un rapport anal insertif, l’estimation du risque est comprise entre 0,11 % (0,02-0,24) chez les hommes circoncis et 0,62 % (0,07-,68) chez les autres. Le risque lors d’un rapport vaginal est plus faible de l’ordre de 0,1 % avec, selon le sexe du partenaire séropositif, un risque de 0,15 % par acte dans le sens homme - femme et de 0,09 % dans le sens femme- homme. Ces estimations reposent sur des études, maintenant anciennes, réalisées chez des couples séro-différents. Elles n’ont néanmoins jamais été remises en cause, mais ont été affinées notamment en fonction du stade de l’infection VIH et de la charge virale du partenaire. Le risque est particulièrement élevé lors de la phase de primo-infection, jusqu’à 12 fois plus dans les semaines ou mois qui suivent la contamination par rapport à la phase chronique de l’infection. La présence de sang durant les rapports sexuels, en raison des règles de la femme constitue aussi un facteur augmentant le risque de contamination. Les infections ou lésions génitales augmentent le risque de transmission sexuelle d’un facteur de 03 à 13 selon les études en accroissant l’infectiosité du partenaire séropositif (augmentation de la charge virale dans les sécrétions génitales) et la susceptibilité de la personne exposée (du fait de la présence d’ulcères génitaux, de l’inflammation locale et de l’augmentation du pH des sécrétions vaginales).

7.2. Transmission par voie sanguine. Ce mode de transmission inclut le sang (sang total) et l'ensemble de ses dérivés (concentrés globulaires, plaquettaires, leucocytaires, plasma frais congelé, facteurs de coagulation).Trois types de transmission sanguine ont été décrits :

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7.2.1. Usagers de Drogues par Injection (UDI). La transmission se fait par l'usage et l'échange de seringues non stérilisées. Néanmoins avec la mise en vente libre en pharmacie dès 1987 de seringues stériles puis la vente en 1995 de trousses de matériel d'injection stérile, le risque de contamination chez les UDI a fortement diminué.

7.2.2. Transfusion de sang ou de dérivés du sang Ce mode de transmission a provoqué l'infection de nombreux patients transfusés avant 1985, en particulier hémophiles et a donné lieu à l'affaire du « sang contaminé ».

7.2.3. Accidents d'exposition au sang (AES) Il est défini comme tout contact percutané (piqûre, coupure...) ou muqueux (œil, bouche...) ou sur peau lésée (eczéma, plaie...) avec du sang ou un produit biologique contenant du sang. Il est dû dans près de la moitié des cas au non-respect des précautions standard en hygiène. Le risque de contamination après exposition au sang d'une personne infectée ne recevant pas de traitement antirétroviral est de 0,3%. Il nécessite une déclaration obligatoire et peut justifier un Traitement Post Exposition. 7.3. Transmission materno-fœtale Elle combine un risque de transmission par le sang et par le lait maternel. Le risque est majeur en période périnatale : au cours du 3ème trimestre par passage transplacentaire, lors de l'accouchement par exposition au sang et aux secrétions vaginales et durant l'allaitement. Il est, en l'absence de mesures préventives, estimé entre 15 à 20%. Le risque de transmission materno-fœtale, également nommée transmission verticale, peut être prévenu par l’instauration d’un traitement antirétroviral chez la mère. La prévention est d’autant plus efficace que le traitement est débuté précocement et que la charge virale est devenue indétectable bien avant l’accouchement. Le risque résiduel est alors inférieur à 1%.

8. Cellules cibles, cycle de réplication et tropismes.

8.1. Cellules cibles du VIH Les cibles du VIH sont les cellules exprimant spécifiquement à leur surface le récepteur CD4. Ce récepteur CD4 présente en effet, une forte affinité pour la gp120. Ainsi, les

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principales cibles du virus sont les LT CD4+, les cellules dendritiques, les monocytes, les macrophages et les cellules de la microglie cérébrale.  Les lymphocytes T CD4+ La grande majorité de la réplication virale a lieu dans les LT CD4+, qui se localisent dans les organes lymphoïdes. L’infection d’un LT CD4+ par le VIH a plusieurs conséquences : une diminution de ses capacités fonctionnelles, une activation de processus internes entrainant son apoptose et une activation du système immunitaire qui, ne reconnaissant plus cette cellule, la détruit. C’est cette destruction des LT CD4+ qui conduit progressivement à l’immunodépression de l’hôte.  Les cellules dendritiques Elles sont présentes dans la peau (cellules de Langerhans), le thymus et dans tous les organes lymphoïdes secondaires. Elles jouent un rôle essentiel lors de la reconnaissance d’un antigène au cours d’une réponse immune primaire en le présentant aux lymphocytes T naïfs. La cellule dendritique (CD) est capable de lier le VIH, grâce à sa molécule DC-SIGN (Dendritic Cell-specific ICAM3-Grabbing Non-integrin) ou CD209, de la transporter des muqueuses aux ganglions lymphatiques et de le transférer aux lymphocytes T (65), jouant un rôle important d’amplification et de diffusion, notamment au moment de la primo- infection.  Les cellules de la ligné monocytaire On les retrouve dans le sang sous forme de monocytes et dans les tissus sous forme de macrophages. Les monocytes sont des cellules mobiles, capables de se différencier en phagocytes : macrophage, microgliocytes et ostéoclastes. Ils possèdent des récepteurs spécifiques aux immunoglobulines et au complément. Ces cellules sont également capables de présenter l’antigène aux lymphocytes T. Les macrophages infectés par le virus développent un dysfonctionnement de la phagocytose. Dès la primo-infection, le VIH entre dans le système nerveux central où son principal réservoir cellulaire est constitué de monocytes, de macrophage et de cellules de la microglie.

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8.2. Cycle de la réplication La réplication du VIH se fait dans les cellules de nombreux tissus et liquides biologiques de l’organisme. 8 étapes clés constituent le cycle de réplication du VIH (Figure 11) : reconnaissance et fixation du virus, fusion, décapsidation et transcription inverse, transport et intégration, transcription et traduction, assemblage, bourgeonnement et, pour finir, libération et maturation du nouveau virus.  La fixation et l’ancrage des virus sur les récepteurs cellulaires Cette étape repose sur la reconnaissance par la gp120, ancrée dans l’enveloppe virale, d’un récepteur sur la cellule cible : le récepteur CD4 (une grande affinité du domaine V1 de ce récepteur pour la partie C-terminale de la gp120 a été montrée) (66). Dans un second temps, un changement conformationnel de la gp120 permet la reconnaissance d’autres molécules de surface cellulaire : les corécepteurs (Figure 10). Il en existe deux sortes : - Le CXCR4, exprimé par de nombreuses cellules, en particulier les lymphocytes T. Il est reconnu uniquement par les VIH-1 qui se répliquent dans les lignées lymphocytaires T. - Le CCR5, exprimé surtout par les macrophages et les lymphocytes T mémoires. Il est reconnu par les VIH-1 qui se répliquent dans les lignées lymphocytaires et monocytaires (monocytes et macrophages). Une nomenclature est ainsi définie selon le tropisme des VIH pour leurs cellules cibles : - Virus X4 : utilisation du CXCR4 : virus lymphocytotrope - Virus R5 : utilisation du CCR5 : virus monocytotrope - Virus R5X4 : utilisation du CCR5 et/ou du CXCR4 : virus à double tropisme La connaissance de ce tropisme est importante pour la mise en route de certaines thérapeutiques antirétrovirales.

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Figure 10 : Changements de conformation des récepteurs du VIH au cours de l’entrée dans la cellule cible (66). A) La liaison entre gp120 et le récepteur CD4 induit des changements de conformation dans la gp 120 découvrant les sites d’interaction aux corécepteurs. B) Liaison de la gp120 aux corécepteurs (CCR5 ou CXCR4) et exposition du peptide de fusion de la gp41. C) Changement de conformation des régions HR1 et HR2 de gp41 dirigeant à la formation du faisceau à 6 hélices permettant la fusion complète des membranes virales et cellulaires.

 Fusion Un arrimage de la glycoprotéine gp41 de l’enveloppe virale à la membrane cellulaire hôte et une modification de sa structure suite à l’interaction avec le corécepteur permet la fusion membrane virale - membrane cellulaire, la création d’un pore dans la membrane de la cellule cible puis la libération de la capside virale dans le cytoplasme de cette dernière.  Décapsidation et transcription inverse La décapsidation libère le contenu génomique du virus dans le cytoplasme cellulaire. Le brin d’ARN est copié en ADN intermédiaire simple brin grâce à la TI. On obtient un hybride ARN – ADN. Une ribonucléase intervient, alors pour détruire l’ARN d’origine et la polymérase produit alors un second brin d’ADN en utilisant le premier comme matrice (67). La transcriptase inverse est une enzyme peu fidèle conduisant à des erreurs de copie et ainsi au phénomène de variabilité génétique du VIH. ● L’intégration Cet ADN proviral double brin nouvellement formé est ensuite transporté jusqu’au noyau de la cellule hôte (Figure 11) grâce à son association à des protéines telles que la protéine de la matrice qui possède un signal de localisation nucléaire et une deuxième enzyme, l’intégrase ou l’endonucléase, intervient. Elle permet l’intégration de la copie

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d’ADN du génome viral dans le génome cellulaire sous forme de provirus, l’intégration du génome VIH se faisait de manière assez aléatoire, mais préférentiellement dans des sites activement transcrits du génome hôte, c’est-à-dire dans l’euchromatine. Le facteur permettant de diriger l’intégration vers un site adéquat n’est pas d’origine virale mais cellulaire, il s’agit de la protéine LEDGF/p75 (68).  La transcription du provirus La phase de transcription répond à deux nécessités, la première étant la synthèse d’ARN génomique qui sera associé aux protéines gag et incorporé dans les particules virales et la seconde étant la synthèse d’ARN messagers spécifiques de chaque grand groupe de protéines virales. L’expression de l’ARN viral est régulée par des facteurs viraux (facteurs de transcription) et cellulaires (directement liés au fonctionnement normal de la machinerie cellulaire de la cellule infectée). L'ARN génomique issu des gènes gag et pol est traduit au niveau des ribosomes pour produire le précurseur protéique gag et pol ainsi que les génomes de nouveaux virus. La synthèse des protéines virales dépend d’ARN messagers spécifiques codant pour des précurseurs spécifiques qui donneront, après maturation, des protéines spécifiques (protéines de la matrice, de la capside, de la nucléocapside et à activité enzymatique telles que la transcriptase inverse, l’intégrase et la protéase). La protéine env est clivée en gp120 et gp41 par une protéase cellulaire. Ces glycoprotéines vont ensuite aller s’implanter dans la membrane de la cellule hôte.  L’assemblage, encapsidation et morphogénèse Le polypeptide gag-pol se lie à l’ARN viral et initie l’assemblage de la protéine gag dans une nucléocapside qui bourgeonne à partir de la membrane plasmique. Il y a formation de la nucléocapside hélicoïdale qui protège le nucléoïde, lui-même constitué des 2 molécules d'ARN simple brin et des protéines de structure internes  Bourgeonnement, Libération et maturation L'interaction entre cette structure nouvellement formée et la membrane plasmique de la cellule infectée (où sont insérées les glycoprotéines virales) induit la formation du bourgeon viral. La lyse cellulaire provoque la libération des nouveaux virions. Les protéines virales sont initialement produites sous forme de précurseurs : elles ne sont pas fonctionnelles mais ont la capacité de s’assembler à la surface de la cellule infectée, ce qui donne lieu au bourgeonnement et à la production de particules virales immatures. La protéase effectue un découpage des différentes protéines à partir de sites bien précis, les

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sites de clivage. Il s’ensuit un réassemblage de la particule virale, spontanément par l’intermédiaire de domaines d’interaction spécifique portés par les protéines structurales. Le virus devient infectieux.

Figure 11 : Cycle de réplication du VIH (69)

9. Evolution clinique et biologique de l’infection à VIH

9.1. Classification biologique de l’infection par VIH Dans l’histoire naturelle de l’infection par le VIH, l’évolution de la maladie en l’absence de traitement peut se décomposer en trois phases : la contamination suivie de la primo-infection, la phase asymptomatique et le stade SIDA (Figure 12).

9.1.1. La primo-infection (phase séroconversion) Cette première phase va durer de 3 à 8 semaines en fonction des individus. La charge virale augmente rapidement au cours des premières semaines suivant la contagion (Figure 12). Cette phase se caractérise par l’apparition fréquente de symptômes similaires à ceux

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d’un refroidissement ou d’une grippe légère : fièvre, éruptions cutanées, fatigue, maux de tête, etc. Souvent, les personnes touchées ou même les médecins ne remarquent pas ces symptômes ou ne font pas le lien avec une possible infection par le VIH. Les premiers signes de la maladie disparaissent spontanément après quelques semaines, à l’augmentation du nombre de lymphocytes T CD8+ et d’anticorps anti-VIH dans le sang. L’apparition de ces anticorps anti-VIH environ 3 semaines après la contamination permet le dépistage de l’infection (séroconversion). Actuellement, d’autres méthodes plus fines permettent un diagnostic plus précoce, comme le dosage de l’antigène p24 produit par le virus.

9.1.2. La phase asymptomatique (ou phase de latence clinique -7 à 10 ans) Correspond à la mise en place d’un équilibre entre les défenses immunitaires de l’hôte et la réplication du virus. Cela conduit à une réduction de la charge virale dans le sang et peut permettre un contrôle apparent du VIH jusqu’à plusieurs années suivant l’infection (Figure 12). Le renouvellement rapide de nouvelles particules de VIH circulantes résulte de la réplication constante du virus in vivo dans les tissus lymphoïdes. Cela a pour conséquence l’augmentation régulière de la charge virale observée au cours de l’évolution de l’infection (70), et donc la mort progressive des lymphocytes T CD4+ se régénérant jusqu’à épuisement du thymus (71). La charge étant telle, un état cellulaire d’activation généralisée à l’origine des dysfonctions cellulaire et de la mort par apoptose des cellules est observé chez les individus infectés (72). Dès lors, l’organisme entre dans la phase d’immunodéficience appelée SIDA.

9.1.3. Le stade SIDA (phase symptomatique) Dans les 10 ans qui suivent l’infection par le VIH, environ 50% des sujets développe un SIDA déclaré, environ 40% sont atteints d’affection souvent associées au SIDA et 5 à 10% demeurent asymptomatiques. A cette phase tardive de l’infection, on observe une augmentation de la charge virale suivie par la chute du nombre de lymphocytes CD4+ (< 200/mm3). Elle se définit par une lymphopénie généralisée et persistante accompagnée de manifestation symptomatiques (diarrhée chronique, amaigrissement, fièvre….). Apparaissent alors des infections multiples dites opportunistes, des cancers et des encéphalites (Figure 13). La progression de l’infection à VIH est plus rapide chez certains individus infectés. La vitesse de l’évolution dépend des caractéristiques du virus et de

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l’hôte. En ce qui concerne le virus, il s’agit du sérotype et de la souche. Pour l’hôte, les facteurs d’une évolution plus rapide seraient (73) l’âge (moins de 5 ans ou plus de 40 ans) ; les infections concomitantes comme herpès, tuberculose, le facteure du groupe tissulaire HLA et le polymorphisme génétique des co-récepteurs viraux.

Figure 12 : Phases de l’évolution de l’infection à VIH, en l’absence de traitement.

Figure 13 : Survenue des infections opportunistes en fonction du nombre de lymphocytes T CD4 (74).

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9.2. Classification clinique En l’absence de traitement antirétroviral, la quasi-totalité des patients infectés par le VIH évolue vers le SIDA et le décès. Ce syndrome regroupe l’ensemble des manifestations opportunistes infectieuses ou tumorales, liées à l’immunodépression cellulaire. Le niveau d’immunodépression conditionne le risque de survenue et le type de manifestations opportunistes. Les « Center for Disease and Control Prevention »(CDC) ont proposé en 1993 une classification révisée de l'infection par le VIH pour les adultes et les adolescents (Tableau I). Cette classification est basée sur des critères cliniques et sur une donnée biologique : le nombre de lymphocytes T CD4+/μL, elle est devenue la classification internationale de référence. Précisons que la progression à travers les stades de cette classification est irréversible, et que le stade « SIDA » est différemment défini en France et aux Etats-Unis.

Tableau I : Manifestation cliniques selon la classification de CDC (75)

Classification de l’infection VIH en tenant compte du nombre de LT cd4+

>500/mm3 200-499/ mm3 <200/ mm3

A : asymptomatique primo-inection A1 A2 A3

B : symptomatique, sans critères A ou C B3 B2 B3

C : SIDA C1 C2 C3

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Tableau II : Définition des catégories cliniques(75)

Catégorie A Un ou plusieurs des critères listés ci-dessous chez un adulte ou un adolescent infecté par le VIH, en l’absence de critère B ou C.  Infection VIH asymptomatique  Lymphadénopathies généralisées persistantes  Primo-infection symptomatique

Catégorie B

Manifestations cliniques chez un adulte ou un adolescent infecté par le VIH, ne faisait pas partie de la catégorie C et qui répondent ou moins à l’une des conditions suivantes : a) Elles sont liées au VIH ou indicatives d’un déficit immunitaire. b) Elles ont une évolution clinique ou une prise en charge thérapeutique compliquée par infection VIH. Les pathologies suivantes font partie de la catégorie B, la liste n’est pas limitative :  Angiomatose bacillaire  Candidose oropharyngée  Candidose oropharyngée  Candidose vaginale, persistante, fréquente ou qui répond mal au traitement  Dysplasie du col (modérée ou grave), carcinome in situ  Syndrome constitutionnel : fièvre (38°5 C) ou diarrhée supérieure à 1 mois  Leucoplasie chevelue de la langue  Zona récurrent ou envahisant plus d’un dermatome  Pupura thrombocytopénique idiopathique  Neuropathie périphérique

Catégorie C

Cette catégorie correspond à la définition du SIDA chez l’adulte. Lorsqu’un sujet a présenté une des pathologies de cette liste, il est classé définitivement dans la catégorie C. Les pathologies suivantes font partie de la catégorie C :  Candidose bronchique, trachéale ou extra pulmonaire  Candidose oesophagienne

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 Cancer invasif du col  Coccidioidomycose  Cryptococcose extra pulmonaire  Cryptosporidiose intestinale > 1 mois  Infection à CMV (autre que foie, rate, ganglions)  Rétinite à CMV, Encéphalopathie due au VIH  Infection herpétique, ulcères chroniques > 1 mois ou bronchique, pulmonaire ou œsophagienne  Histoplasmose disséminée ou extra pulmonaire  Isosporidiose intestinale chronique (>1 mois)  Sarcome de kaposi  Lymphome cérébral primaire  Infection à Mycobacterium tuberculosis, quelle que soit la localisation (pulmonaire ou extra pulmonaire)  Infection à Mycobactérie identifiée ou non, disséminée ou extra pulmonaire  Pneumopathie bactérienne récurrente  Leuco-encéphalite multifocale progressive  Septicémie cachectique dûe au VIH  Toxoplasmose cérébrale  Septicémie à salmonella non typhique recurrente  Syndrome cachectique dû au VIH  Pneumonie à pneumocystose carinii

10. Le diagnostic biologique de l’infection par le VIH Le diagnostic initial de l’infection par les VIH-1 et VIH-2 repose sur une méthode sérologique fondée sur la détection des anticorps dirigés contre les antigènes viraux grâce à un test ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) qui reste la méthode la plus pertinente et la plus répandue. La détection de la présence virale par une méthode directe, c’est-à-dire la mise en évidence du virus ou de ces composants, peut se faire soit par mise en évidence des antigènes viraux, par la détection du génome viral ou encore par multiplication virale en culture cellulaire (76). La quantification de la charge virale et la caractérisation virale sont utilisées dans le suivi des patients infectés. Le diagnostic direct est indiqué dans le cas d’un échec du diagnostic indirect en particulier pendant la fenêtre sérologique de la primo-infection(76).

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Tout diagnostic d’infection à VIH confirmé doit s’accompagner de la déclaration obligatoire anonymisée, à la Direction départementale des affaires sanitaires et sociales (77). Suivant les recommandations de la Haute Autorité de Santé (HAS), le schéma d’un dépistage biologique du VIH se déroule en trois étapes (Figure 15) : - un test de dépistage ELISA combiné - si positif : un test de confirmation VIH-1 et VIH-2 (western-blot ou immuno-blot) - si positif : un test de dépistage sur un second prélèvement (une deuxième prise de sang) pour éviter les erreurs d’identification de la personne.

10.1. Tests de dépistage sérologique

10.1.1. Les tests ELISA En 1971, Engvall et Perlmann ont développé une technique permettant des dosages immunoenzymatiques (ELISA). ELISA est l'acronyme d'un examen de laboratoire appelé en anglais enzyme-linked immunosorbent assay, littéralement «dosage d'immuno- adsorption par enzyme liée », c'est-à dire dosage immuno-enzymatique sur support solide. Ce test entre dans le cadre plus général des EIA (enzyme immunoassays), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par spectrophotométrie. La détection des anticorps dirigés contre des antigènes du VIH-1 est réalisée à l’aide d’une technique de type ELISA. Ces tests donnent des résultats spécifiques et reproductibles. Ils mettent en jeu une réaction entre les anticorps du sérum d’un sujet infecté et des antigènes viraux déposés dans des puits d’une microplaque ELISA. Cette réaction permet la capture et la révélation des anticorps spécifique du VIH-1. L’utilisation de sérum reste la méthode de référence, malgré l’apparition de tests de dépistage rapides du VIH-1, utilisant la salive comme liquide biologique.

Une autre téchnique électro-chimiluminescence « ECLIA », fait appel à la méthode « sandwich » a une sensibilité équivalente de ELISA permet aussi la détection des anticorps dirigés contre des antigènes du VIH-1.

Selon les antigènes viraux utilisés et l’isotype de l’anticorps détecté, on distingue des tests ELISA de première, deuxième, troisième et quatrième génération. Les tests ELISA de 1ère génération utilisaient des lysats viraux, ces tests ne sont plus utilisés en diagnostic. Les tests de 2ème génération utilisent des antigènes viraux recombinants ou des peptides. Les

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tests de 3èmegénération sont des tests d’immunocapture reconnaissant des anticorps IgG et IgM dirigés contre le VIH-1. Enfin, les tests de 4ème génération utilisés actuellement, sont des tests mixtes (détectent des anticorps anti- VIH-1 et VIH-2) et combinés (détection des anticorps dirigés contre le VIH-1, le VIH-2 et l’antigène p24 à un seuil de détection entre 30 et 50 pg/ml). L’utilisation de protéines virales recombinantes et des peptides de synthèse a augmenté la spécificité des tests mais peut, dans certains cas, ne pas détecter certains variants (78,79). Ces tests permettent une réduction de plusieurs jours de la fenêtre sérologique au cours de la primo-infection.

Tableau III : Caractéristiques et évolution des tests ELISA pour le diagnostic du VIH

1ère génération 2ème génération 3ème génération 4ème génération Protèines Protèines et Protèines et Antigène utilisé Lysat viral et peptides peptides peptides recombinants recombinants recombinants Elisa Indirect Indirect Sandwich Indirect Anticorps Détection IgG IgG IgG et IgM Ag P24 Semaines estimées ~6 ~4-6 ~3-4 ~2 Sensibilité + ++ +++ ++++

Spécificité + +++ +++ +++

Année 1985 1987 1989 1997

10.1.2. Les tests rapides d’orientation diagnostique (TROD ou TDR) Les TROD sont des tests immuno-chromatographiques basés sur la chromatographie d’un sérum, plasma ou salive sur une membrane préalablement sensibilisée avec des antigènes recombinants des VIH-1 et VIH-2. Ces tests sont rapides car ils sont réalisables en moins de 30 minutes et ne nécessitent aucun équipement spécifique, ce qui leur assure une large diffusion dans les pays en voie de développement. Actuellement il y a des TDR conbinés qui permettent la détection à la fois les anticorps et des antigènes. Trois critères déterminants ont été retenus pour définir un test rapide : obtention d’un résultat dans un délai de quelques minutes ; possibilité d’être réalisé auprès du patient ; possibilité d’utilisation en test unitaire et ceci en l’absence d’automatisation et détection des anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2. Les tests rapides peuvent être réalisés sur le plasma, le sérum, le sang total.

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La sensibilité et spécificité des TDR sont comparables à ceux des tests ELISA détectant les anticorps anti-VIH mais ils sont moins sensibles que les ELISA combinés en particulier pour l’analyse de prélèvements effectués durant la phase de séroconversion. Ils sont donc à proscrire dans les cas de prise de risque d’expostion au virus datant de moins de 3 mois (80). La HAS considère les TDR comme « un outil complémentaire intéressant au modèle de dépistage classique » et a émis des recommandations quant à leur utilisation structurée dans certaines situations d’urgence et des orientations quant à leur utilisation pour faciliter le dépistage du VIH de certaines populations comme les migrants, les populations fuyant les institutions, les personnes marginalisées hors du système de santé, les personnes sans droit ouvert à la sécurité sociale. Il s’agit de situations d’urgences nécessitant de mettre en place rapidement une prise en charge adaptée : - accident professionnel d’exposition au sang : TDR pour le patient source ; - accident d’exposition sexuelle : TDR pour les deux partenaires ; - accouchement chez les femmes enceintes dont le statut n’est pas connu ; - urgence diagnostique devant la survenue d’une pathologie évocatrice du stade sida. Toute les autorités sanitaire et scientifique sont une unanimes pour considérer que tout résultat positif du TDR devra faire l’objet d’une sérologie ELISA puis une confirmation par un western-blot ou un immuno-blot (Figure 14).

Figure 14 : Algorithme pour les tests de dépistage rapide du VIH (TDR) (76)

10.1.3. Le test de confirmation sérologique : western-blot ou immuno-blot Un test de dépistage positif doit toujours être complété par un test de confirmation de référence dont le but est de confirmer ou d’infirmer la séropositivité vis-à-vis du VIH d’un

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échantillon positif ou douteux en ELISA. La séropositivité n’est établie que lorsque le résultat de l’analyse de confirmation est positif. Cette analyse permet de préciser la spécificité des anticorps anti-VIH-1 ou des anti-VIH-2 présents dans le sérum étudié. La technique utilisée est soit un western-blot, soit un immuno-blot. Dans la technique du western-blot, les protéines virales sont séparées par électrophorèse avant d’être transférées sur membrane. La présence d’anticorps spécifiques du VIH-1 est mise en évidence grâce à une réaction enzymatique qui se matérialise par une bande colorée au niveau de la protéine virale reconnue. Un résultat est négatif lorsqu’aucune bande ne correspond à une protéine virale. Le contrôle positif fait apparaître un ensemble de bandes correspondant aux glycoprotéines d’enveloppe (gp160, gp120, gp41), aux protéines codées par le gène gag (p55, p24, p17) et aux enzymes codées par le gène pol (p66, p51, p31) (76). Pour affirmer qu’un test est positif, il faut obligatoirement avoir détecté dans le sang du patient au moins 2 réactivités vis-à-vis d’au moins deux glycoprotéines d’enveloppe virale (gp120 et gp160) et un anticorps dirigé contre une des protéines codées par les gènes gag ou pol. Les tests d’immuno-blot agréés comme réactifs de confirmation sont comparables aux western-blots à la différence que les protéines recombinantes et les peptides de synthèses sont déposés en bandes séparées sur des membranes ou supports (76). L’interprétation des résultats du western-blot peut être délicate. Un western-blot négatif associé à des résultats positifs par les techniques sérologiques de dépistage fait envisager un début de « séroconversion », ce qui signifie que les anticorps commencent tout juste à apparaître dans le sang. Un nouveau prélèvement de sang périphérique s’impose alors, une à deux semaines plus tard pour répéter l’analyse. D’autres situations peuvent être rencontrées, par exemple la présence d’un seul anticorps dirigé contre une protéine d’enveloppe du virus, et sont à interpréter au cas par cas en fonction du contexte clinique et des autres résultats biologiques. Il faut affirmer au patient qu’une infection due au VIH nécessite impérativement de disposer des résultats de deux prélèvements distincts. Si l’analyse de dépistage est positive, il est recommandé que l’analyse de confirmation soit réalisée sur le même prélèvement, afin que le médecin puisse être orienté plus rapidement sur l’existence réelle de l’infection. Cependant, en cas de positivité de l’analyse de confirmation, un second prélèvement doit être impérativement effectué et une analyse de dépistage est à nouveau réalisée pour éliminer une erreur éventuelle. Seul un résultat positif sur le second prélèvement permet d’affirmer définitivement l’infection par le VIH.

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10.2. Diagnostic direct de l’infection par le VIH-1 C’est la mise en évidence de la présence virale par le dosage d’une protéine virale, en détectant l’ARN ou l’ADN viral ou encore par culture virale.

10.2.1. Détection de l’antigène viral p24 Les antigènes viraux dans le sang de patients infectés correspondent aux particules virales et aux protéines virales. La détection d’antigène p24 dans le sérum, plasma ou LCR peut se réaliser grâce à des tests faciles standardisés. Les tests de dépistage ELISA combiné permettent la détection à la fois des anticorps dirigés contre le VIH et de la protéine p24 virale. Des tests permettant uniquement le dosage de la p24 du VIH-1 sont aussi disponibles. Des techniques de dissociations des complexes anticorps-antigène p24 sont utilisées pour augmenter la sensibilité des tests (76).

10.2.2. Détection des acides nucléiques viraux L’amplification génique de type PCR ou l’amplification de type isotherme NASBA (nucleic acid sequence based amplification) permettent de détecter l’ADN proviral (intégré dans le génome cellulaire) et après une étape de rétrotranscription de l’ARN génomique viral. La commercialisation de plusieurs trousses agréées et qui font appel soit à la technologie d’amplification par PCR (Abbott Molecular Diagnostic et Roche Diagnostics) soit à la technologie NASBA (bioMérieux) a permis leur utilisation pour le suivi des patients infectés. Une technique de biologie moléculaire dite de l’ADN branché (bDNA) peut aussi être utilisée pour déterminer la charge virale. Cette technique, qui n’implique pas une amplification génique, est basée sur l’utilisation de sondes ramifiées. Elle repose sur un branchement successif de sondes, ce qui multiplie les signaux émis et facilite la détection d’une séquence cible. Le signal émis est directement proportionnel à la quantité de la cible génique (76). La sensibilité de cette technique est proche de celle d’amplification génique avec l’avantage d’être plus reproductible et moins sensible aux problèmes de variabilité génétique des virus L’amplification génique et l’hybridation amplifiée permettent la détection de l’ARN viral plasmatique ou de l’ADN proviral cellulaire (76).

10.2.3. Isolement du VIH en culture L’isolement du virus à partir du sang est une approche longue, coûteuse et nécessitante un laboratoire de confinement de haute sécurité L3. L’isolement est réalisé directement à

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partir de cellules mononucléaires du sang périphérique ou du plasma par mise en culture des échantillons en présence de cellules mononucléées du sang d’un donneur sain, qui servent de support pour la multiplication virale. La multiplication virale est mise en évidence par dosage dans le milieu de culture de l’antigène p24 (76). Actuellement, cette approche peut être intéressante dans le cas de variants ou de recombinants non reconnus par les techniques de biologie moléculaire visant à détecter l’ARN viral ou l’ADN proviral (76).

Figure 15 : Algorithme de dépistage du VIH (adulte et enfants de moins de 18 ans).

10.3. Le suivi des patients infectés par les virus VIH Le suivi biologique joue un rôle essentiel dans la prise en charge de l’infection VIH. Chez le patient traité, il permet de vérifier l’efficacité du traitement grâce à la mesure de la charge virale VIH et du nombre de lymphocytes CD4. Chez le patient non traité, il permet de déterminer le moment adéquat pour initier un traitement antirétroviral ou la prévention de certaines infections opportunistes. La détermination du sous-type viral et la recherche

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de résistance sont recommandées dans le bilan biologique dès le diagnostic de l’infection, afin d’adapter au mieux le traitement antirétroviral (77).

11. Les Antirétroviraux Depuis la découverte en 1985 de l’azidothymidine (AZT), suivie de la prescription de trithérapies en 1996, le traitement anti rétroviral (ARV) n’a pas cessé d’évoluer, avec la commercialisation régulière de nouveaux médicaments y compris dans des classes thérapeutiques nouvelles. Les progrès réalisés ont permis d’améliorer les conditions de prise en charge des patients porteurs du VIH et ainsi d’améliorer leur qualité et leur espérance de vie.

11.1. Objectifs généraux du traitement antirétroviral. Bien que l’éradication du VIH ne soit pas possible, l’association optimisée de ces différents médicaments permet dans la grande majorité des cas d’atteindre les objectifs viro-immunologiques. L’objectif principal du traitement antirétroviral est d’empêcher la progression vers le Sida en restaurant un nombre de lymphocytes CD4 supérieurs à 500/mm3. Pour atteindre cet objectif, le traitement antirétroviral doit rendre la charge virale plasmatique indétectable (< 50 copies/ml), ce qui permet la meilleure restauration immunitaire et limite au maximum le risque de sélection de virus résistants. Si l’efficacité immunovirologique du traitement antirétroviral est essentielle, d’autres objectifs doivent être recherchés simultanément : - la meilleure tolérance possible, à court, moyen et long terme ; - l’amélioration ou la préservation de la qualité de vie ; - la réduction de la transmission mère-enfant du VIH. De plus, la réduction du risque de transmission du VIH par un traitement antirétroviral efficace pourrait constituer, en elle-même, une justification supplémentaire en faveur de l’introduction du traitement antirétroviral (81). Les facteurs prédictifs d’une réponse virologique durable, après l’instauration d’un premier traitement antirétroviral, sont le niveau de charge virale et de lymphocytes CD4 à l’initiation du traitement, l’observance du traitement et la vitesse de réduction de la charge virale après l’instauration du traitement (82).

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11.2. Classes d’antirétroviraux Il existe actuellement six classes de médicaments antivirus de l’immunodéficience humaine (VIH), avec des mécanismes d’action différents (Figure 16).  Les inhibiteurs de fusion (IF)  les antagonistes du récepteur CCR5 (anti-CCR5).  Les inhibiteurs nucléosidiques (INsTI)/nucléotidiques de la transcriptase inverse (INtTI)  Les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI)  Les inhibiteurs d’intégrase (INI).  Les inhibiteurs de protéase (IP)

Figure 16 : Cibles moléculaires des traitements antirétroviraux (83).

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11.2.1. Inhibiteurs de l’entrée  Inhibiteurs de fusion Molécule : Enfuvirtide (T20 ou ENF) FUZEON® Le seul représentant de la classe des IF est l’Enfuvirtide (T-20). Il s’agit d’un peptide de synthèse comportant 36 acides aminés qui, du fait de son homologie de séquence avec une région (HR2) de la gp41, se fixe dans le milieu extracellulaire à la gp41 du VIH-1. Cette fixation entraîne l’inhibition du réarrangement structural en épingle à cheveu, bloquant ainsi l’entrée du VIH dans les cellules T4, on parle donc de non infection.  Inhibiteurs du récepteur CCR5 Molécule : Maraviroc (MVC) CELSENTRI® Le Maraviroc est le seul représentant de la classe des anti-CCR5. Il s’agit d’un inhibiteur d’entrée du virus dans les cellules de l’hôte. Cette molécule empêche le VIH de pénétrer dans les cellules, en se fixant de façon sélective au récepteur CCR5 aux chimiokines, empêchant ainsi sa liaison entre le récepteur CD4 et la gp120 virale des virus à tropisme CCR5. Le CCR5 est l’un des deux corécepteurs du VIH, le second étant le CXCR4.

11.2.2. Inhibiteurs de la transcriptase inverse  Inhibiteurs nucléosiques de la transcriptase inverse Molécules : - Emtricitabine (FTC) EMTRIVA® ou générique - Lamivudine (3TC) EPIVIR® ou générique - Zidovudine (ZDV) RETROVIR® ou générique - Ténofovir disoproxil (TDF) VIREAD® ou générique - Abacavir (ABC) ZIAGEN® ou générique - Ténofovir alafénamide (TAF) : disponible seulement en association Les inhibiteurs de la transcriptase inverse (INTI) s’incorporent dans la chaîne d’ADN proviral du VIH et empêchent son élongation. Ils se comportent comme de faux analogues, entraînant une interruption du cycle de réplication virale et inhibant donc sa multiplication dans les cellules infectées (84). Les INTI n’ont pas d’action sur le virus intégré, mais agissent à la fois sur le VIH-1 et le VIH-2. Ces molécules agissent après phosphorylation intracellulaire des nucléosides donnant des nucléotides. Ceux-ci entrent en compétition avec les nucléotides naturels au niveau de

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la transcriptase inverse, s’incorporent dans la chaîne d’ADN proviral en formation et entraînent : - Un arrêt de la synthèse d’ADN proviral - La formation d’un ADN incomplet incapable de s’intégrer à l’ADN humain de la cellule hôte. Chaque molécule cible spécifiquement une base qu’elle soit purique ou pyrimidique : - Adénine ciblée par : Ténofovir disoproxil, Ténofovir alafénamide - Guanine ciblée par : Abacavir - Cytosine ciblée par : Emtricitabine, Lamivudine - Thymidine ciblée par : Zidovudine  Inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse Molécules : - Rilpivirine (RPV) EDURANT®, - Etravirine (ETV) INTELENCE®, - Efavirenz (EFV) SUSTIVA® ou générique - Névirapine (NVP) VIRAMUNE® ou générique Les INNTI sont également des inhibiteurs de la transcriptase inverse du VIH mais, contrairement aux INTI, ils agissent directement, sans être phosphorylés, ce qui leur permet de rester actifs sur des souches de VIH multirésistantes aux INTI ou aux antiprotéases. Ces agents n’agissent que sur le VIH-1. Chimiquement très différents des INTI, les inhibiteurs non nucléosidiques ne s’incorporent pas dans la chaîne d’ADN proviral en formation, mais inhibent directement la transcriptase inverse en s’y liant de manière non compétitive, sur un site de liaison spécifique.

11.2.3. Inhibiteurs de l’intégrase Molécules : - Raltégravir (RAL) ISENTRESS®, - Dolutégravir (DTG) TIVICAY®, - Elvitégravir (EVG) disponible en association à doses fixes et boosté par du cobicistat. Ces molécules agissent en bloquant l’intégrase virale du VIH-1 et du VIH-2 par fixation directe sur l’enzyme entraînant ainsi un arrêt de l’intégration de l’ADN proviral dans l’ADN de la cellule hôte.

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11.2.4. Inhibiteurs de protéase Molécules : - (DRV) PREZISTA®, - Atazanavir (ATV) REYATAZ®, - Fosamprénavir (FPV) TELZIR®, - Tipranavir (TPV) APTIVUS®, - Ritonavir (RTV) NORVIR® non utilisé comme IP mais comme inhibiteur enzymatique à faible dose. - Lopinavir (LPV) disponible en association à doses fixes seulement dans la spécialité KALETRA® La protéase du VIH est une enzyme virale. Elle possède un rôle central dans le cycle de réplication du virus en réalisant le clivage protéolytique de différents précurseurs peptidiques (84). Cette action permet la production à la fois de protéines structurelles et fonctionnelles, nécessaires et indispensables à la formation de nouveaux virus. Les IP se fixent sur le site actif de la protéase virale, l’empêchant de catalyser le clivage des polypeptides Gag et Pol du virus. La maturation protéique étant altérée, les virions formés sont inactifs et non infectieux. Ces agents sont actifs sur le VIH-1 et le VIH-2.

12. La réponse immunitaire contre le VIH Comme tous les autres agents pathogènes, l’organisme déclenche une réponse immunitaire contre le VIH pour tenter de l’éliminer. Les deux types de la réponse immunitaire sont, la réponse innée (ou naturelle) qui est immédiate avec les cellules dendritiques et cellules naturelles tueuses (NK), et la réponse adaptative (ou aquise) qui est tardiveet qui s’effectue avec les lymphocytes T CD8+ conjointement avec les LT CD4+ et la réponse humorale

12.1. La réponse innée La réponse immunitaire innée est une réponse non spécifique, qui se met en place rapidement (quelques minutes à quelques heures suivant la pénétration du pathogène dans l’organisme), il se fait par l’activation des macrophages, les cellules dendritiques et les cellules tueuses naturelles (NK). Son rôle est de fournir une réponse rapide face aux agents pathogènes afin de donner le temps nécessaire au système immunitaire adaptatif de

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développer une réponse spécifique. La réponse innée ne possède pas de mémoire immunitaire

Lors de l’infection aigüe par le VIH, les macrophages et les cellules dendritiques vont être les premiers à reconnaitre le VIH. Ils le font par des motifs moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) grâce à leurs TOLL like receptors(TLR) (85). Les cellules dendritique détectent le virus et sont les premières à libérer des cytokines pro- inflammatoires antivirales telles que interféron-γ (IFN-γ) et le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) (86). De plus, elle augmente l’expression de CCR7 pour diriger les cellules vers les ganglions lymphatiques. Néanmoins cela a aussi comme conséquence d’accroitre le niveau d’activation du système immunitaire augmentant ainsi le nombre de LT CD4+ susceptibles d’être infectés.

Les cellules NK font partie de la première ligne de défense contre les agents pathogènes NK interagissent avec le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH-1) exprimé sur les cellules infectées, et sécrètent des cytokines immunorégulantes tel que IFN-γ, le facteur de nécrose tumorale β (TNF-β), le facteur de croissance hématopoïétique (GM-CSF) et les interleukines (IL)-10 et IL-13, des chimiokines ainsi que d’autres molécules antivirales, telle que les granzymes (87). Ce mécanisme induit la destruction des cellules infectées et permet de restreindre la réplication virale (87).

12.2. La réponse adaptative Pendant que le système immunitaire inné travaille, le système immunitaire adaptatif bâtit sa réponse (elle se met en place au bout de 4 jours environ). La première réponse du système immunitaire adaptatif provient des cellules T CD8+. Les LT CD8+ apparaissent très tôt dans l’infection et sont à l’origine du déclin du pic viral pendant la phase aigüe de l’infection. Les lymphocytes T CD8+ sont activés par la reconnaissance d’un peptide du VIH présenté par le CMH de classe I, situé sur les cellules infectées, ainsi que par les cytokines (IFN-γ et IL-2) produites par les cellules T CD4+ (88). Lorsque les cellules T CD8+ sont activées, elles sécrètent aussi des chimiokine (RANTES, MIP-1α et MIP-1β) et des α -défensines qui empechent l’entrée du virus dans de nouvelle cellules (89), les protéines perforine et granzyme A et B afin de lyser les cellules infectées et induire leur apoptose (90). L’immunité humorale passera par l’activation de lymphocytes B sécréteurs

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d’anticorps, elle est dirigée essentiellement contre Env, seule proteine viral exprimée à la surface des cellules infectés et des virion.

Figure 17 : Activation de T CD8+ après la reconnaissance d’un peptide du VIH par CMH I.

Figure 18. Réponse lymphocytaire contre le VIH.

Lors de la phase aigüe, ces cellules contrôlent l’infection, mais deviennent inefficaces lors de l’apparition de virus mutants émergeants (91). Les cellules spécifiques au VIH perdent beaucoup de leur efficacité, parce ce qu’elles ne sont plus aptes de

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reconnaître leur épitope. Le corps doit donc générer de nouvelles cellules T CD8+ (92).Cependant, avec la baisse du nombre de cellules T CD4+, le processus n’est pas aussi facile. Malgré tout, ce sont ces réponses qui vont permettre de contrôler la réplication du VIH et de retarder la progression de la maladie (93). La réponse à l’infection par le VIH et la progression à la maladie a une cinétique différente entre les patients.

13. Cas particulier de patients exposés non infectés et LTNP La majorité des patients infectés par le VIH va progresser dans la maladie et atteindre le stade SIDA (apparition des maladies opportunistes). Néanomoins, des chercheurs ont démontré une exception ; un petit nombre de patients qui pararaître, protégés soit de l’infection malgré une forte exposition au VIH soit en contrôlant l’infection. On peut ainsi définir deux groupes de patients : (1) les patients exposés non infectés et (2) les « long term non progressors » 13.1. Présentation des patients exposés non infectés

Des études à Nairobi au Kenya de 1981 à 1985, sur une cohorte de travailleurs du sexe, ont permis de déterminer un groupe de personnes qui n’a jamais été infecté par le VIH malgré des années d’exposition (94) et ces personnes ont été appelées des individus fortement exposés mais non infectés par le VIH (HESN, HIV Exposed but Seronegative) (95). Plusieurs hypothèses ont été mises pour expliquer cette différence de susceptibilité à l’infection par le VIH parmi lesquelles on retrouve des facteurs viraux, génétiques, immunologiques mais également des facteurs sociologiques (96). Cependant, le mécanisme de protection de ces individus n’a pas encore été élucidé dû à la fois à une définition imprécise des personnes résistantes à l’infection par le VIH mais également au faible nombre de patients dans les études (97, 98).

13.2. Présentation des patients « long term non progressors (LTNP) » L’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est un processus dynamique, dont la susciptibilité à l’infection est variable chez les personnes infectées. Malgré les taux de progression variables de la maladie, la plupart des personnes infectées par le VIH finissent par évoluer vers le sida (99). Selon le taux de progression, l’infection à VIH peut être divisée en trois types principaux :

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- Une progression rapide, où le SIDA se développe dans les trois ans suivant l’infection ; - Une progression intermédiaire, où le SIDA se développe lentement entre 3 et 10 ans après la séroconversion ; - La non progression à long terme (LTNP) où les personnes infectées par le VIH ne développent pas de symptômes pendant plus de 10 ans d’infection. Le groupe des non-progresseurs à long terme séropositifs représente moins de 5% de la population totale séropositive (99). Différentes études ont utilisé différentes durées pour définir le non-progrès à long terme, ce qui rend la comparaison difficile. Certaines études ont utilisé une durée > 8 ans pour définir le non-progrès alors que d'autres ont utilisé > 10 ans (100, 101). Ces patients ont été identifiés avant la création des tests permettant de quantifier la charge virale plasmatique et la virémie ne faisait donc pas partie des premiers critères de définition de cette population (102, 103). En 1995, l’apparition des techniques de mesure de la charge virale VIH dans le sang périphérique (ADN branché et PCR en temps réel), ont permis d’accéder à un indicateur précis de la réplication virale. De nouvelles études ont ensuite prouvée que la mesure de la charge virale et des LTCD4 à des stades précoces de la maladie varient très fortement d’un patient à l’autre (104). Avec l’introduction des premiers tests et un suivi plus long de ces patients, les non progresseurs à long terme ont été divisés en deux groupes : l'un présentant une virémie plasmatique détectable faible (<5 000 copies d'ARN du VIH / ml), appelés les suppresseurs virémiques, deuxième groupe qui parvient à maintenir une charge virale très basse (<50 copies d’ARN viral/ml de plasma) en absence de traitement antiviral et pendant une très longue période et appelées «élite» ou « Elites Controllers » (99). De nombreuses recherches se sont focalisées sur l’étude de ces patients et sur la compréhension des mécanismes mis en jeu expliquant leur capacité à inhiber la réplication virale. La découverte des mécanismes précis mis en jeu pourraient donner des informations importantes dans le but de développer des thérapies à la fois préventives et curatives contre le VIH. De nombreuses études ont analysé les facteurs génétiques de l’hôte qui permettent d’expliquer le statut de LNTR. L’année 1996 marque un tournant dans la compréhension de la physiopathologie de la maladie VIH. Plusieurs groupes démontrent simultanément que l’entrée du VIH dans les LTCD4 nécessite, en plus de la glycoprotéine CD4, un ou deux co-récepteurs. Ces derniers

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appartiennent à la famille des récepteurs de chimiokines et sont CCR5 et/ou CXCR4 (105). De nombreuses équipes recherchent alors une variation génétique commune pour chacun de ces récepteurs. Ils observent que CCR5 est hautement polymorphe chez les caucasiens ainsi que chez les asiatiques. Par ailleurs, la majorité des variants de couverts sont non synonymes et indiquent que le répertoire allélique de la molécule CCR5 est façonné par pression de sélection (105-107). Parmi les allèles du gène CCR5, l’allèle CCR delta 32 est porteur d’une délétion de 32 paires de bases qui aboutit à l’apparition d’un codon stop prématuré (106,107). Cette mutation induit la synthèse d’une protéine non fonctionnelle qui ne peut servir ni de récepteur aux chimiokines ni de co-récepteur au VIH (107). Plusieurs études réalisées sur des cohortes des patients infectés par le VIH ont montré que les individus homozygotes pour la mutation CCR5 delta 32 ayant une résistance forte à l’infection par le VIH-1 (108, 109). Cependant, Les hétérozygotes peuvent en revanche s’infecter par le virus mais présentent une charge virale moindre lors de la primo infection et progressent plus lentement vers le stade Sida (110). La fréquence allélique de CCR5 delta 32 est d’environ 0,1 % dans les populations du Nord de l’Europe dont approximativement 1 % sont homozygotes. Mais l’allèle est très rare ou absent dans les populations africaines, asiatiques de l’est et les indiens d’Amérique (111). Autres études en France et aux Etats-Unis ont montré que les LT CD4+ sont moins susceptibles à l’infection par le VIH (112,113). Deux études contradictoires ont analysé l’implication de la protéine p21 sur l’inhibition de la réplication virale vue son activité inhibitrice de kinase dépendante de cycline (112,113). L’une montre que l’élongation transcriptionnelle du VIH nécessite l’activité des kinases donc l’inhibition de la réplication virale est associée à une uprégulation de la protéine p21 et l’autre a montré que cette protéine n’est pas la cause de cette inhibition et que d’autres facteurs de restriction doivent être impliqués comme APOBEC (Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide-like). Parmi les facteurs génétiques impliqués dans le contrôle de l’infection, le rôle des molécules du système des antigènes des leucocytes humains (HLA) a été étudié. Des études ont montré que l'hétérozygotie au niveau des locus HLA de classe I (HLA-A, HLA- b et HLA-C) est fortement associée à la résistance à la progression vers le SIDA notamment, la présence des allèles HLA-B57 et B27, ainsi que l’absence de B35, est

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associée au phénotype de contrôleurs du VIH (114). En 2012 il a été montré que les allèles HLA-B*81: 01 et B*39: 10 sont aussi associés au contrôle de la virémie dans le cadre de l’infection par le VIH-1 de sous-type C (115). Le rôle de ces molécules pourrait être en lien avec l’activation de cellules de l’immunité innée, telles les cellules NK, conduisant à la destruction de la cellule infectée (116).

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CHAPITRE II : GENERALITES SUR LE SYSTEME DES ANTIGENES DES LEUCOCYTES HUMAINS

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1. Historique En 1936, Peter Görer, a été évoquée l’existence du CMH chez la souris. Des réactions d’agglutinations d’érythrocytes de souris par des sérums de lapin préalablement immunisés par des érythrocytes murins ont permis de suggérer l’existence d’allo-antigènes en surface cellulaire. Par la suite Snell observa que le rejet du greffon chez la souris était associé à une incompatibilité au niveau des allo- antigènes précédemment définis par Görer. C’est ainsi qu’il décrit pour la première fois le Complexe Majeur d’Histocompatibilité murin, nommé «H2» en l'honneur de l'antigène II découvert par Görer (117). Le rôle majeur du CMH dans la réponse immunitaire et dans l’éducation des lymphocytes T par la présentation des antigènes, n’a été découvert que 30 ans après. Jean Dausset en 1952, fut découvert le Complexe Majeur d’Histocompatibilité de l'Homme, et récompensé du prix Nobel de médecine en 1980. Son nom de système HLA (Human Leukocyte Antigen) symbolise le groupe sanguin leucocytaire mis en évidence par l’agglutination de leucocytes par des sérums de sujets immunisés à l’occasion de transfusions sanguines. En effet, après ses études de médecine à Paris, Jean Dausset porta un grand intérêt aux patients polytransfusés et leucopéniques, chez qu’il découvrit l’existence d’anticorps anti- leucocytes, d’abord soupçonnés d’auto anticorps. Il démontra qu’il s’agissait en fait d’une allo-immunisation générée par les nombreuses transfusions. Ce n’est pourtant que six ans plus tard, en 1958, que le premier antigène du CMH humain MAC (HLA-A2) est décrit. A cette époque, des expériences ont été réalisées à partir du sérum d’un patient qui avait reçu des transfusions d’un unique donneur. Elles permirent de constater que les anticorps développés par ce patient réagissaient avec les leucocytes de la moitié d’une population de donneurs volontaires. Les noms des trois premiers donneurs avec qui le sérum n’a montré aucune réaction sont à l’origine de l’acronyme MAC (118). Ensuite, la technique sérologique de lymphocytotoxicité complément-dépendante va être développée et permettra la découverte de nouveaux antigènes qui montrent alors progressivement le grand polymorphisme du système HLA. La classe II du système HLA fut caractérisée plus tardivement, par des réactions lymphocytaires mixtes. La possibilité d’une relation étroite entre les groupages HLA et la susceptibilité génétique à développer certaines maladies, est évoqué par Jean Dausset en 1968. Le concept de médecine prédictive entraîne alors la nécessité d’établir la carte génétique, en

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particulier du système HLA, localisé quelques années plus tôt sur le bras court du chromosome 6. Des centaines de laboratoires dans le monde entier sont enthousiasmés par ce projet ce qui permit des progrès rapides en biologie moléculaire et une description de plus en plus précise du CMH, au niveau génétique(118).  Définitions En 1999, une collaboration entre quatre principales équipes (Cancer Research Center, University of Washington, Japanese Science and Technology Corporation, The Sanger Centre), a publié la première séquence complète de HLA. Le système HLA, représente un segment génomique situé sur le bras court du chromosome 6, occupant environ quatre mégabases. La carte génétique fut établie à partir des séquences de différents haplotypes, 224 gènes dévoilés et seulement 60% d’entre eux seraient exprimés (119). Le HLA est caractérisé par une élevée densité génique, avec en moyenne 35 gènes par mégabase. Il est connu comme la région la plus polymorphe du génome humain (119).

2. Gènes et molécules du HLA Il existe trois grande classes des gènes du système HLA et qui sont divisées selon leurs caractéristiques structurelles et fonctionnelles (Figure 19) :  Les gènes de classe I, occupent la région télomérique du CMH sur environ deux mégabases (2Mb). Les principaux gènes de classe I comprennent les locus dits « classiques » HLA-A, - B, -C, et « non-classiques » HLA-E, -F et -G, dont chacun code seulement pour la chaîne lourde (chaîne α) des deux chaînes d’un « isoforme » de molécule correspondante de classe I. Quelques pseudogènes HLA-H, -J, -K et -L se trouvent aussi dans la région, sans qu’aucune protéine soit exprimée (119).  Les gènes de classe II, se retrouvent dans la région centromérique du HLA, ils occupent 900 kilobases. Les gènes de classe II codent chacun pour les deux chaînes (chaînes α et β, de taille similaire) d’un isoforme de molécule correspondante de classe II : les gènes « classiques » HLA-DP, -DQ, et -DR, et les gènes « non-classiques » HLA-DM et –DO (119).  Les gènes de classe III, situés entre les deux classes précédentes, s’étendent sur une zone très dense de plus d’une mégabase (1.1 Mb). Il y a 39 gènes qui codent principalement pour des molécules ayant un rôle dans les réactions immunitaires, comme le Tumor Necrosis Factor (TNFαβ), et le les protéines intervenant dans la voie d’activation

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du complément (C2, C4, Bf). Toutefois, de nombreux gènes n’ayant pas de fonction dans le système immunitaire se trouveraient également dans cette région, comme par exemple la 21-hydroxylase ou encore les protéines du choc thermique (HSP) (120). En comparaison avec gènes de classe I et II, la polymorphisme des gènes HLAIII est très limité voire inexistant.

Figure 19 : cartographie des gènes HLA sur le chromosome 6 humain, d’après (121)

3. Caractéristique du système HLA Il y en a trois : le polymorphisme, la transmission en haplotypes et la codominance.

3.1. Le polymorphisme Le système HLA, est un système très polymorphe : tous les loci ont un très grand nombre d’allèles. L'allèle est le support du polymorphisme mais ne le définit pas complètement dans la mesure où, lorsqu'on découvre un variant, il faut qu'il soit présent à une fréquence suffisante dans la population pour être qualifié de polymorphisme. La variabilité se différencie donc du polymorphisme par sa définition au niveau de la population. Ainsi, le polymorphisme pour le système HLA se définit comme l’existence d’un grand nombre de gènes pour lesquels on retrouve de nombreux allèles, largement présents dans la population (>1%).

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Les gènes codant pour les molécules HLA de classe I et II sont les plus polymorphes du génome humain, avec plus de 17000 allèles décrits en 2017 (Tableau IV et V) (122). Ce polymorphisme suggère que HLA a été soumis à une pression évolutive intense et un taux de mutation supérieur à n’importe quelle autre région du génome (123, 124). Il est le résultat de mutations ponctuelles, mais également de conversions géniques et de recombinaisons homologues ayant eu lieu au moment de la méiose. C’est pour cela que les différents allèles HLA sont très proches entre eux au sein d’un même locus, mais également entre plusieurs loci de la même classe, et que l’on dit que les molécules HLA sont des mosaïques de déterminants antigéniques. Les gènes codant pour la chaîne lourde des molécules HLA de classe I classiques sont toutes très polymorphes. Les gènes codant pour les chaînes β des molécules HLA-DR, -DQ et -DP sont beaucoup plus polymorphes que ceux codant pour les chaînes α, la chaîne α du DR étant notamment presque monomorphe.

Tableau IV: Nombre des allèles de HLA (122)

Nombre des allèles de HLA

Alleles de HLA 17.331

Alleles de HLA Classe I 12.631

Alleles de HLA Classe II 4700

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Tableau V : Allèles et protéines HLA (122).

Géne Nombre

Allèles Protéines Allèles nuls

HLA I

HLA-A 3.997 2.792 186

HLA-B 4.859 3.518 147

Classiques HLA-C 3.605 2.497 8

HLA-E 26 8 1

HLA-F 26 5 0

HLA-G 56 18 2

Non classiques HLA II

HLA-DRA 7 2 0

HLA-DRB 2.395 1751 66

HLA-DQA1 92 35 3

HLA-DQB1 1.152 779 31

HLA-DPA1 56 26 0

Classiques HLA-DPA2 5 2 0

HLA-DPB1 942 655 22

HLA-DPB2 6 3 0

HLA-DMA 7 4 0

HLA-DMB 13 7 0

HLA-DOA 12 3 1

Non classiques HLA-DOB 13 5 0

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3.2. La transmission en haplotype Sur le chromosome 6, les gènes du système HLA sont étroitement liés et il y a assez peu de recombinaison méiotique à leur niveau. L'ensemble des allèles du père et de la mère sont ainsi transmis le plus souvent en bloc à la descendance. Cette particularité du système HLA permet par ailleurs d'effectuer des contrôles des typages parents-enfants (Figure 20).

Figure 20 : Transmission parentale des haplotypes HLA (125)

3.3. La codominance Les deux allèles parentaux de chaque gène du HLA sont exprimés. Cela permet d'augmenter le nombre de molécules différentes du HLA présentées à la surface des cellules ; ainsi, plus on est polymorphe pour les gènes HLA, plus on a de chances de bien présenter au moins un peptide infectieux et d'être capable de s'en défendre.

4. Génes de HLA classe I.

4.1. Structure des molécules de classe I Les molécules de classe I sont des glycoprotéines hétérodimériques exprimées à la surface des cellules nucléées. Elles sont formées de l’association non covalente d’une chaîne lourde α, transmembranaire et d’une chaîne légère β2 microglobuline. Seule la chaîne lourde α, d’environ 45 kilodaltons (45kDa) (126), est codée par des gènes du HLA et présente un grand polymorphisme. A l’inverse, la chaîne légère de β2-microglobuline est

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une chaine invariante de douze kilodaltons (12 kDa) codée par un gène situé sur le chromosome 15 (126). La chaîne lourde α compte une partie intracytoplasmique, une partie transmembranaire et une partie extracellulaire composée de trois domaines α1, α2, et α3. Les deux premiers constituent la zone la plus polymorphe de la molécule (Figure 21). Leur structure tridimensionnelle, avec deux hélices α encadrant un plancher de feuillets β, permet de former un sillon destiné à l’accueil des peptides à présenter. On parle aussi de gouttière à peptide ou «peptide binding groove». Le peptide présenté, composé de 8 à 10 acides aminés, sera lié par seulement deux résidus à la molécule de classe I

Figure 21 : Représentation schématique des gènes de classe I du HLA, des ARNm transcrits et des protéines obtenues (127). a) Représentation schématique d’une molécule d’ADN correspondant à un gène HLA-A (A noter que le gène HLA-B et les gènes de la classe I ne comportent que 7 exons), de son transcrit et de la molécule obtenue. b) Structure tridimensionnelle de la molécule HLA de classe I, et interaction avec le récepteur (T cell Receptor, TCR) d’un lymphocyte T CD8.

4.2. Distribution tissulaire des molécules HLA I Les molécules de classe I classiques sont retrouvées à la surface de toutes les cellules nucléées, cependant leur niveau d’expression est variable. Les lymphocytes (B plus que T) et les cellules dendritiques sont les cellules qui expriment le plus de molécules de classe I classiques. Inversement, les cellules musculaires squelettiques et cardiaques, et les cellules endocrines de certains organes (thyroïde, pancréas, muqueuse gastrique par exemple) expriment très faiblement les molécules de classe I classiques (128). Néanmoins quelques

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cellules nucléées en semblent exemptes comme par exemple les cellules germinales, l’endothélium cornéen et certaines cellules du système nerveux central (120).

4.3. Nature de peptide présenté par HLA I La détection des protéines par les lymphocytes T ne peut avoir lieu qu’après leur transformation en peptide, formant un complexe ternaire avec la molécule HLA et le récepteur du lymphocyte T (TCR, T cell receptor). La cavité formée par les domaines α1 et α2, permet de loger un peptide de 8 à 10 acides aminés issu de la dégradation intracytoplasmique de protéines endogènes. En l’absence d’infection par un pathogène, les sillons des molécules de classe I de la cellule sont occupés par des peptides dérivés de protéines du soi (self). En revanche, lorsque la cellule héberge un pathogène, les peptides présentés en surface dérivent de l’agent infectieux (protéines du non soi), c’est ce qui va permettre de déclencher une réponse du système immunitaire entraînant ainsi l’élimination des cellules infectées.

4.4. Présentation de peptides antigéniques par le CMH-I La formation du complexe binaire peptide/CMH-I (pCMH) peut être divisée en trois phases à savoir la génération des peptides antigéniques, la formation d’un complexe stable précurseur du CMH-I et l’association de ces deux entités pour former le complexe pCMH (Figure 22).

Figure 22. Présentation de la formation puis de la présentation aux lymphocytes T du complexe binaire Pcmh (129).

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D’une part, les peptides antigéniques liant les CMH-I sont issus de protéines endogènes, virales ou mutées, qui sont principalement dégradées par le protéasome 26S. Cet immuno-protéasome clive les protéines en peptides allant de trois à trente acides aminés (Figure 22), avec un taux maximum de peptides composés de 8 à 11 résidus, longueur optimale pour se lier au CMH-I(130,131). De plus, il génère préférentiellement des peptides possédant des résidus hydrophobes ou basiques en position C-terminale, plus favorables pour les interactions aux CMH-I. Enfin, afin d’optimiser les interactions pCMH, différents acteurs dans le cytosol ou au sein du réticulum endoplasmique, interviennent dans la modification de l’extrémité N-terminale du peptide (132-135). D’autre part, le bon repliement du CMH-I et sa complexation avec le peptide antigénique ont lieu au sein du réticulum endoplasmique et nécessitent la formation d’un complexe de macromolécules nommé PLC pour « Peptide Loading Complex » (Figure 22). Ce complexe a pour rôle de maintenir la conformation globale du CMH-I et d’amener le peptide antigénique jusqu’à lui. Il est composé de la chaîne lourde α du CMH-I, de la β2- microglobuline, d’une glycoprotéine transmembranaire nommée tapasin, de la thiooxireductase ERp57 et de deux protéines TAP 1 et 2 pour « Transporter Associated with Antigen Processing » (Figure 23).

Figure 23. Formation du complexe PLC puis du complexe pCMH dans le réticulum endoplasmique (136).

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La formation de ce complexe met en jeu d’autres protéines qui jouent le rôle de chaperon. Ainsi, la chaîne lourde α du CMH-I fraichement synthétisée et non-repliée s’associe à la calnexine (protéine chaperonne) qui initie son repliement et à la protéine ERp57 qui le facilite en participant à la formation de ponts disulfures intramoléculaires (étape 1 dans figure 23) (137,138). La β2-microglobuline se complexe alors pour former le CMH-I ; puis la calnexine s’échange rapidement avec la calréticuline qui stabilise le complexe et la protéine ERp57 se détache également du complexe (2 dans figure 23). En parallèle, la glycoprotéine transmembranaire tapasin juste synthétisée s’associe rapidement aux transporteurs de peptide antigénique TAP 1 et TAP 2 puis à la protéine ERp57 (3 dans figure 23). Pour finir, les deux sous-complexes chaîne α/β2-microglobuline/calréticuline et tapasin/TAP1/TAP2/ERp57 s’associent pour donner le PLC (4 dans figure 23). Le complexe transmembranaire TAP, composé des protéines TAP1 et 2, permet alors le transfert du peptide antigénique du cytosol dans le réticulum endoplasmique(139). Les peptides générés se complexent rapidement au complexe TAP afin qu’ils ne soient pas dégradés par les peptidases cytolytiques. Ensuite, le mécanisme de transfert du peptide antigénique dans le lumen du réticulum endoplasmique au travers du complexe TAP s’accompagne d’une réaction d’hydrolyse d’ATP (pour adénosine triphosphate) en ADP (pour acide adénosine diphosphorique) (140). Ce transfert est favorisé par la présence de la tapasin qui, d’une part, stabilise le complexe TAP et relie ce complexe au complexe chaîne α/β2- microglobuline/calréticuline afin de rapprocher le donneur et l’accepteur de peptide antigénique et optimise la liaison du peptide au complexe chaîne α/β2-microglobuline (141). La complexation du peptide au complexe chaîne α/β2-microglobuline/calréticuline permet de stabiliser le complexe CMH-I qui va alors se libérer de la calréticuline et du complexe ATP/tapasin/ERp57 (5 dans figure 23). Finalement, le complexe pCMH, naturellement formé, est transporté à travers l’appareil de Golgi jusqu’à la surface de la cellule pour être présenté aux récepteurs des lymphocytes T « circulants ».

5. Gènes de HLA classe II

5.1. Structure des molécules de classe II Les molécules de classe II sont des glycoprotéines transmembranaires constituées d’une chaîne α et d’une chaîne β s’associant de façon non covalente. Chacune des chaînes est ancrée à la membrane cellulaire et possède une partie extracellulaire faite de deux

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domaines α1 et α2 pour la chaîne α et β1 et β2 pour la chaîne β suivis des parties transmembranaire et intracytoplasmique très courtes. Les domaines les plus externes sont les plus polymorphes. Ils s’associent très étroitement pour former une cavité qui reste ouverte aux deux extrémités appelée sillon où pourra donc se loger un peptide de longueur plus variable que pour les molécules de classe I. La partie externe du domaine β2 porte un site d’interaction avec la molécule CD4 (Figure 24).

Figure 24 : Représentation schématique des gènes de classe II du CMH, de l’ARNm transcrit et des protéines obtenues (127). a) Représentation de deux molécules d’ADN correspondant à des gènes HLA de classe II (codant pour les chaînes α et β), de leurs transcrits et de la molécule obtenue. b) Structure tridimensionnelle de la molécule HLA de classe II, et interaction avec le TCR d’un lymphocyte T CD4.

5.2. Distribution tissulaire des molécules HLA II. L’expression constitutive tissulaire des molécules de classe II est beaucoup plus restreinte que celle de classe I. Dans le sang, seules les cellules dendritiques, les lymphocytes B et les monocytes en possèdent en surface. Dans les tissus, outre les macrophages et les cellules dendritiques, les molécules de classe II existent sur les endothéliums capillaires et certaines cellules de l’épithélium de l’intestin grêle. Néanmoins, sous l’effet de cytokines comme l’interféron δ ou le TNF (Tumor Necrosis Factor), de nombreuses cellules parenchymateuses et les lymphocytes T peuvent synthétiser et exprimer des molécules HLA de classe II.

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5.3. Nature de peptide présenté par HLA II La source des peptides présentés par les molécules de classe II provient de protéines dites exogènes, qui pénètrent dans la cellule après phagocytose par les cellules présentatrices d’antigènes(CPA), pour subir ensuite une dégradation lysosomale. Il s’agit donc de protéines qui ne sont pas synthétisées dans la cellule. Les peptides logés dans la niche des molécules de classe II peuvent être plus grands que ceux de la classe I, allant de 10 à 24 résidus d’acides aminés, les extrémités de la gouttière étant ouvertes.

5.4. Présentation de peptides antigéniques par le HLA II. Comme mentionné au-dessus, les peptides présentés par les molécules du CMH-II sont généralement des protéines exogènes endocytées par la cellule puis dégradées par protéolyse acide dans des compartiments successifs (Figure 25). Lorsque la molécule du CMH-II est synthétisée au niveau du RE, elle s’associe à une autre protéine, la chaîne invariante (Li) (142,143). Cette dernière entre en interaction avec la cavité de liaison au peptide, empêchant tous les peptides dérivés des protéines endogènes de se lier à la cavité tant que la molécule du CMH-II est dans le RE. Elle semble également être impliquée dans le repliement des chaînes α et β de classe II, dans leur sortie du RE et dans l’acheminement ultérieur des molécules de CMH-II vers la voie d’apprêtement endocytaire à partir de l’appareil de Golgi. Les chaînes α et β sont glycosylées dans l’appareil de Golgi, puis transportées dans les endosomes ou les lysosomes. Dans ces compartiments, la chaîne invariante est progressivement dégradée (l’activité protéolytique augmente dans chaque compartiment successif). Cependant un court fragment de la chaîne invariante, appelé CLIP (Class II-associated Invariant chain Peptide), continue de bloquer la cavité de liaison au peptide, empêchant toute liaison prématurée avec un autre peptide (142,143). La molécule HLA-DM ou son homologue murin H2-M permettent ensuite l’échange entre le peptide CLIP et le peptide issu de la dégradation des protéines exogènes.

Les complexes CMH-II/peptide qui en résultent sont adressés vers la membrane plasmique (Figure 25).

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Figure 25 : Dégradation et transport de l'antigène qui fixe les molécules de classe II (144)

6. Nomenclature. La nomenclature HLA doit respecter des critères précis qui permettent son homogénéité entre les résultats au niveau international. Elle est tenue à jour par le comité international « WHO nomenclature committee » (122). La nomenclature est adaptée à la technique utilisée pour réaliser le typage :  En sérologie, on définit des spécificités. Une spécificité regroupe plusieurs allèles, qui possèdent le même profil de réactivité sérologique. Il est courant d’utiliser le terme « broad » pour définir une spécificité large que l’on peut subdiviser en « split ». Ces derniers ont été découverts dans un second temps avec la mise en évidence d’anticorps anti-HLA plus spécifiques. Pour les allèles HLA-C définis en sérologie, la lettre w (pour workshop) a été ajoutée afin d’éviter les confusions avec les facteurs du complément. Ex : HLA-Cw1.

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Tableau VI : Nomenclature HLA en sérologie : les antigènes HLA (145). Séries de classe I Séries de classe I A B Cw DR DQ DP

A1 B5 B49(21) Cw1 DR1 DQ1 DPw1 A2 B7 B50(21) Cw2 DR103 DQ2 DPw2 A203 B703 B51(5) Cw3 DR2 DQ3 DPw3 A210 B8 B5102 Cw4 DR3 DQ4 DPw4 A3 B12 B5103 Cw5 DR4 DQ5(1) DPw5 A9 B13 B52(5) Cw6 DR5 DQ6(1) DPw6 A10 B14 B53 Cw7 DR6 DQ7(3) A11 B15 B54(22) Cw8 DR7 DQ8(3) A19 B16 B55(22) Cw9(w3) DR8 DQ9(3) A23(9) B17 B56(22) Cw10(w3) DR9 A24(9) B18 B57(17) DR10 A2403 B21 B58(17) DR11(5) A25(10) B22 B59 DR12(5) A26(10) B27 B60(40) DR13(6) A28 B2708 B61(40) DR14(6) A29(19) B35 B62(15) DR15(2) A30(19) B37 B63(15) DR16(2) A31(19) B38(16) B64(14) DR17(3) A32(19) B39(16) B65(14) DR18(3) A33(19) B3901 B67 DR51 A34(10) B3902 B70 DR52 A36 B40 B71(70) DR53 A43 B4005 B72(70) A66(10) B41 B73 A68(28) B42 B75(15) A69(28) B44(12) B76(15) A74(19) B45(12) B77(15) A80 B46 B78 B47 B81 B48 Bw4 Bw6

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 Pour les allèles définis par biologie moléculaire, une étoile suit systématiquement l’identification du locus. On distingue trois types de résolution de typage: - Le typage générique, dit de «basse résolution», on parle aussi de résolution 2 digits: - Le typage allélique, dit de « haute résolution », on parle de résolution 4 digits. Avec certaines techniques de biologie moléculaire, on peut obtenir une haute résolution de 6 digits, voire même 8 digits (146). La Figure 26 apporte des précisions sur ces derniers digits.

Figure 26 : Nomenclature des allèles HLA (122).

Le suffixe « N » désigne un allèle nul, c'est-à-dire codant pour une protéine qui n’est pas exprimée à la surface cellulaire. « L » désigne un allèle codant pour une protéine dont l’expression à la surface cellulaire est significativement réduite. « S » correspond aux protéines sécrétées sous forme soluble et enfin « Q » signifie que l’expression demeure indéterminée. 7. Méthodes utilisées pour la réalisationd’un typage HLA La technique de référence pour les typages HLA est la technique sérologique de microlymphocytotoxicité complément dépendante (LCT). Les lymphocytes des patients ayant en surface des antigènes HLA sont déposés dans les puits d’une plaque, pour laquelle chaque puits contient des anticorps monoclonaux ayant une spécificité HLA déterminée. Si l’anticorps monoclonal a reconnu l’antigène lui correspondant à la surface d’un lymphocyte donné, l’immun complexe ainsi formé active le complément de lapin rajouté dans le puits (147). Il s’ensuit une lyse de la cellule, qui permet à un colorant fluorogénique ajouté par la suite, de pénétrer dans la cellule. La lecture de la plaque au

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microscope permet de détecter les puits dans lesquels a eu lieu la lyse. La technique de LCT permet d’effectuer des typages HLA-A, HLA-B, HLA-DR et HLA-DQ ; cependant, cette technique est la technique de typage historique, rapide et la moins coûteuse. En revanche, la LCT nécessite au départ une bonne viabilité cellulaire. De plus, l’interprétation est parfois difficile, car il existe de nombreuses réactions croisées et les plaques de typage ne montrent pas toujours une bonne discrimination pour la détection des antigènes de classe II (147). Un typage HLA peut également être réalisé en faisant appel aux différentes techniques de biologie moléculaire, basées sur la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), qui permet la synthèse d’un brin d’ADN complémentaire à partir d’un brin unique qui sert de matrice. La biologie moléculaire a permis de mettre au point plusieurs techniques de typage HLA :  PCR-SSO (Sequence Specifique Oligonucleotides) Cette technique repose sur l’amplification d’une région contenant les polymorphismes que l’on souhaite étudier. Les amorces sont situées dans des séquences consensus encadrant la région à étudier. Les produits d’amplification sont transférés sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon. Une hybridation par oligo-sonde marquée spécifique de l’allèle recherché est réalisée. La révélation se fait actuellement par méthode immunoenzymatique ; les nucléotides sont biotinylés et lient un conjugué à base de streptavidine marquée par une enzyme. La révélation est obtenue par addition d’un substrat chromogène hydrolysé par l’enzyme. Cette technique est adaptée aux grandes séries (147)..  PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Cette technique fait intervenir des enzymes de restriction qui coupent les produits de PCR. L’ADN est coupé en un point précis selon une séquence de base spécifique de chaque enzyme. Les différents fragments obtenus sont séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide puis sont transférés sur une membrane de nitrocellulose. L’étape finale est une hybridation avec des sondes d’ADN complémentaire de la région étudiée. La révélation se fait généralement par autoradiographie. Cette technique possède de nombreux inconvénients et manque de performance (147).  PCR-SSP (Sequence Specific Primers) PCR-Sequence Specific Primers (SSP) a été développée en 1992 et utilise une ou deux amorces judicieusement choisies pour n’être capables de s’hybrider qu’avec une séquence

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déterminée spécifique d’un allèle ou d’un groupe d’allèle (148). L’amplification ne sera vraiment effective que si la séquence de l’amorce est complémentaire de la séquence présente dans l’ADN génomique. Un gel d’électrophorèse en agarose à 2 % après coloration de l’ADN au bromure d’éthidium (agent s’intercalant dans l’ADN), visualisé sous UV permet de voir les fragments amplifiés. Il s’agit d’une technique rapide, plutôt réservé aux typages ponctuels comme la demande de typage HLA pour les dons d’organes. Elle génère très peu d’ambiguïtés de typages (c’est-à-dire que plusieurs possibilités de typage existent pour le même individu), mais elle ne détecte pas les nouveaux allèles (121).

Figure 27 : principe de la technique PCR SSP (149)

Des techniques plus récentes ont été développées. La technologie Luminex™ est fondée sur le principe de la cytométrie en flux, utilisant des billes fluorescentes. Ces billes peuvent être couplées à leur surface avec des sondes oligonucléotidiques, permettant ainsi la détection d’allèles spécifiques (147). Un laser rouge excite les fluorochromes incorporés aux billes de polystyrène et permet l’identification précise de chacune. Un laser vert excite le fluorochrome qui est couplé à une molécule reporté (147). Cette molécule reporter (produit d’amplification) permet de détecter l’interaction sonde/amplicon se produisant à la surface de la bille, Après addition d’un conjugué marqué avec un fluorochrome émettant dans le vert (phycoérythrine). La fluorescence émise témoigne alors de la réaction en surface. Une autre nouvelle technique prometteuse correspond à la méthode de séquençage direct, utilisée pour définir de nouveaux allèles, ou pour lever les ambiguïtés de typages non résolues par les autres techniques.

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CHAPITRE III : HLA ET MALADIE INFECTIEUSE VIH

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1. Introduction Un grand nombre de maladies fréquentes résulte de l’interaction complexe entre des facteurs environnementaux et des gènes de susceptibilité. Parmi ces maladies multifactorielles, plus de 200 sont associées au composant HLA (150). Citons, en particulier, les maladies auto-immunes et les maladies infectieuses (hépatite C, paludisme, sida, tuberculose). À l’heure actuelle, les gènes de susceptibilité ou de résistance aux maladies fortement associées au composant HLA sont connus avec précision grâce, en particulier, aux méthodes de typage par biologie moléculaire et aux résultats obtenus lors des 11e et 12e Workshops HLA (150). Cependant, la plupart des allèles de susceptibilité ne sont ni nécessaires ni suffisants au développement de ces maladies, mais confèrent seulement un risque plus ou moins élevé. Il ne s’agit que de gènes de prédisposition. On appelle prédisposition génétique, l'existence d'association entre la présence chez un individu de certains allèles HLA et la susceptibilité d’être atteint par certaines pathologies. Le système HLA a un intérêt comme marqueur de susceptibilité ou la résistance à une maladie donnée dans une population donnée. Si un antigène HLA se retrouve avec une fréquence accrue chez les malades, une association entre cet antigène et la maladie existe. La force de cette association est estimée par le « Risque Relatif, (RR) qui permet d’exprimer combien de fois le risque de développer une maladie donnée est augmenté chez les sujets possédant l’allèle à risque par rapport à ceux qui ne l’ont pas. Les associations de HLA avec les maladies infectieuses ont été difficiles à identifier, peut-être parce qu'un ensemble plus complexe d'épitopes antigéniques est impliqué dans la pathogenèse des maladies infectieuses (151). Les études d'association concluantes concernant l'influence des HLA sur les maladies infectieuses nécessitent des échantillons volumineux, une stratification appropriée du contexte ethnique, des informations cliniques précises et l'utilisation de modèles prenant en compte d'autres effets génétiques connus sur la maladie. De remplir complètement ces critères est souvent difficile (151) ; de nombreuses associations alléliques avec l'infection et l'issue de la maladie doivent encore être confirmées. Néanmoins, un certain nombre d'associations convaincantes de HLA de classe I et de classe II avec des maladies infectieuses ont été identifiées. L'effet protecteur de HLA-B*53 contre le paludisme grave en Afrique de l'Ouest est particulièrement notable et pourrait expliquer la fréquence élevée de B*53 dans cette région (152). Parmi les autres

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associations HLA cohérentes avec les maladies infectieuses, on peut citer la sensibilité conférée par les antigènes HLA-DR2 aux maladies mycobactériennes (153, 154), la clairance immunologique du virus de l'hépatite C conférée par DQB1-0301 (155-157) et la clairance du virus de l'hépatite B chez les individus DRB1 ∗ 1302 (158, 159). Le VIH / SIDA a fait l’objet d’une analyse approfondie des effets conférés par HLA.

2. L'influence du système HLA sur laprogression de l'infection par le VIH-1 Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sont capables de reconnaître des cellules cibles infectées par le VIH parce que les cellules infectées présentent à leur surface des fragments de protéines du VIH dans le sillon de liaison peptidique des molécules HLA de classe I. La reconnaissance du complexe peptide / HLA sur la cellule cible, par le récepteur des cellules T (TCR) des CTL, conduit à la libération de cytokines, de chimiokines et des molécules, telles que la perforine et les granzymes, qui affectent la lyse rapide et l'apoptose de la cellule cible infectée (160). Le rôle de HLA dans le contrôle de la réplication du VIH a été largement rapporté. Dès 1996, Kaslow et ses collègues ont signalé l'influence de différents allèles HLA sur l'infection par le VIH et le taux de progression vers le sida (161). Suite à cela, plusieurs études dans le monde ont observé le rôle des allèles HLA dans la résistance ou la susceptibilité à l'infection par le VIH. Des études d'association à l'échelle du génome ont également confirmé le rôle des allèles HLA dans la détermination de l'issue de la maladie (162-166). En 2003, le Pr Carrington a montré que les personnes homozygotes pour un des loci du HLA de classe I ont le risque de progresser plus rapidement vers le stade SIDA (151). Ceci a permis de mettre en évidence l’importance de la diversité de la réponse T CD8+ dans la lutte contre le VIH. Cependant, dans certaines situations, une réponse restreinte sur une séquence du VIH peut être associée à un contrôle efficace sur une longue période de temps. Le degré de polymorphisme extraordinaire des allèles HLA garanti une présentation d’un large éventail de peptides dérivés du VIH qui conduit à une défense relativement large et forte contre l'infection par le VIH. La progression de l’infection du VIH, dépend donc des fragments peptidiques particuliers présentés par les molécules HLA de classe I. Chacun possédant son propre

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HLA, les personnes pourvues d'un HLA mieux adapté ont donc plus de chances de résister au virus. Dans le contexte du VIH, la raison pour laquelle différentes molécules HLA peuvent être associées à la variabilité interindividuelle à l’infection, peut être due à des différences dans le sillon de liaison aux peptides des molécules HLA et donc aux différents fragments de peptides VIH présentés aux CTL. Les allèles associés à une diminution du risque d'infection, une virémie plus faible et à une progression lente vers la maladie, sont classés comme allèles HLA protecteurs, comme HLA-B*27, HLA-B*57, HLA-B*25 (167-174). De même, les allèles qui présentent une virémie élevée, un contrôle défavorable des maladies et un développement rapide des conditions définissant le SIDA, sont classés comme allèles HLA associés sensibles, B*3501 (175).

2.1. Les allèles HLA-A Protecteurs. Certain allèle HLA classe 1 du type HLA-A sont associés à la diminution de la progression rapide vers stade Sida. Le supertype HLA-A2 est bien connu pour son association avec la protection contre l'infection par le VIH (168, 176,177). Plusieurs sous- types de HLA-A2, à savoir, HLA-A / 02: 01, A / 02: 02, A / 02/05, A / 02/14 / A / 68/01 et A*68 : 02 (176, 177) ont été associés à la protection contre le VIH / SIDA. En 2014, Gartland et al ont montré que l'efficacité du vaccin Rv144 s'est révélée plus importante chez les participants ayant exprimé HLA A02 (178). Bien que l'efficacité du vaccin ne puisse pas être uniquement attribuée à la présence de HLA A*02, Gartland et ses collègues ont émis l'hypothèse que les lymphocytes T CD8 + restreints à HLA-A02 pourraient jouer un rôle direct dans l'efficacité vaccinale (178). HLA-A11, en particulier HLA-A11 : 01, est également indiqué comme protecteur contre l'infection par le VIH dans une population indienne (179, 180). Koehler et ses collègues (2010) ont montré dans une cohorte de la communauté à Mbeya, en Tanzanie, que l’allèle HLA-A*74 :01 est associé à une diminution du risque d'infection par le VIH. Cette découverte a été confirmée dans une autre étude qui a rapporté que HLA-A*74: 01 était associée à un contrôle virémique favorable dans une cohorte sud-africaine de plus de 2100 sujets infectés par le VIH-1 type C (181).

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2.2. Les allèles HLA-B protecteurs L'association entre le contrôle immunitaire du VIH et l'expression de certaines molécules HLA de classe I est la plus frappante pour les allèles situés dans le locus HLA- B. Le locus HLA-B est le plus polymorphique des trois principaux locus HLA de classe I, avec 4859 allèles décrits par rapport à 3997 allèles HLA-A et 3605 allèles HLA-C (182). En effet, le locus HLA-B est la région la plus polymorphique du génome humain entier, reflétant le fait qu'il s'agit d'un site de sélection équilibrante exceptionnellement forte (183,184) Les allèles HLA-B seraient plus protecteurs contre VIH-1 que les allèles HLA-A (185); l'explication mécanistique est que les domaines cytoplasmiques des molécules HLA-B sont plus résistants à la régulation négative médiée par Nef que les domaines cytoplasmiques HLA-A, et ces différences affectent probablement la reconnaissance par les CTL des cellules infectées par le virus in vitro (186). Parmi les nombreux allèles HLA-B connus pour être associés à la protection contre le VIH, HLA-B*57 est le plus largement rapporté. Plusieurs études ont rapporté que les individus avec HLA-B*57:01 et HLA-B*57:03 sont largement protégés contre le VIH (164, 171, 187). Le rôle protecteur de HLA-B*57:01 a également été démontré dans une cohorte multinationale (188). La suppression virale chez les suppresseurs d'élite HLA-B*57+ infectés par le VIH-1 a été démontrée, malgré l'acquisition de mutations d'échappement de CTL par le virus dans les épitopes Gag (189). Toutes ces données suggèrent que HLA-B*57 agit comme un agent génétique protecteur contre l'infection par le VIH. Récemment, Moroni et ses collègues 2014 ont décrit en 2014 une femme VIH-1 +, qui a spontanément contrôlé sa virémie pendant 14 de ses 20 années d'infection par le VIH (190); le patient n'a pas exprimé CCR5-D 32 mais possédait les molécules HLA-B*14:02 et B*57:08; C*06 et C*08:02. Les chercheurs ont expliqué, que la co-expression des allèles protecteurs HLA-B et HLA-C avec les SNP HLA-C et les réponses immunitaires associées aux lymphocytes T assuraient un contrôle fort et durable de la réplication du VIH-1 et de la progression de la maladie chez cet individu. En plus de l’allèle HLA-B*57, HLA-B*27, en particulier HLA-B*27:05, est un autre allèle couramment rapporté qui protège de l'infection par le VIH (165,173,177). Peu d'autres allèles HLA-B, à savoir, HLA-B*51 (161,191), et son allèle haute résolution HLA-B*51:01 et B*13:02 ont également été signalés à être associé au contrôle du VIH (172,192).

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En outre, Le HLA-B*44 est un allèle qui fait partie des antigènes de classe I les plus fréquents dans de nombreuses populations étudiées jusqu'à présent. HLA-B*44 a été rapporté d’avoir des résultats prometteurs dans le contrôle de la virémie au cours de deux phases distinctes de l'infection primaire par le VIH-1 chez les individus en Afrique subsaharienne et chez les individus vivant à long terme avec l’infection par VIH-1 aux États-Unis (193,194). Voir Le tableau VII qui montre quelques allèles HLA-B qui ont un effet protecteur contre l’infection du VIH.

Tableau VII : présente certains allèles de HLA-B associés à la protection contre le VIH .

Alleles HLA-B protecteur References Cohorts

B*13:02 Honeyborne et al (192) ; C clade South Africa; Pereyra et al., 2010 (165) Multinational consortium B*14/14:02 Pereyra et al., 2010 (165); Multinational consortium Lazaryan et al., 2011(195) African American B*27 (161,172) USA, UK B*27:05 (162,163) Multinational consortia B*42:01 Carlson et al., 2012 (196) C clade South Africa/ Botswana/Zimbabwe B*44:03 Leslie et al., 2010 (197); C clade, South Africa; Carlson et al., 2012(196) South Africa/Botswana/ Zimbabwe B*51 (161) USA B*52:01 (165) Multinational consortium B*57/B*57:01 (161) USA B*57:02 Leslie et al., 2010 (197) C clade South Africa B*57:03 Costello et al., 1999 (198); A clade Rwanda; Leslie et al., 2010 (197) C clade South Africa Tang et al., 2010 (199) C clade Zambia; Carlson et al., 2012 (196) South Africa/Botswana/Zimbabwe B*57:03 Pereyra et al., 2010 (165); Multinational consortium Lazaryan et al., 2011 (195) AfricanAmerican B*58:01 Kiepiela et al., 2004 (185); C clade South Africa; Carlson et al., 2012 (196) C clade South Africa/ Botswana/Zimbabwe B*81:01 Kiepiela et al., 2004 (185); C clade, South Africa; Tang et al., 2010 (199) Zambia; Carlson et al., 2012 (196); South Africa/ Botswana/Zimbabwe

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2.3. Allèles HLA associés à la susceptibilité au VIH De même, certains allèles HLA sont connus pour être associés à la susceptibilité à l'infection par le VIH ou à la progression rapide vers le SIDA. Plusieurs allèles HLA de classe I, à savoir, HLA-A*23: 01 (200), HLA-A*24 (177), HLA-B*7 (177,196), HLA- B*07: 02 (200,201), HLA-B*35 (202-204), HLA-B35Px, (200), HLA-B*35: 03 (165), HLA-B*40 (179), et B*40:06 (180), HLA-B*53 (177,203) et HLA-B*53: 01 (177) ont été associés à la susceptibilité au VIH. HLA-B*35, qui est presque toujours trouvé en association haplotypique avec Cw 04, est l'allotype le plus systématiquement impliqué dans la susceptibilité à la progression du SIDA (149, 205-207). Il aide le virus à échapper à la défense immunitaire en réduisant l'activité des cellules NK contre le VIH-1. HLA-B*35 est divisés en deux groupes en fonction de la spécificité de liaison au peptide : le groupe HLA-B*35-PY qui lie les épitopes avec la proline en position 2 et la tyrosine en position 9, et HLA- B*35-Px, plus largement réactif, qui lie également les épitopes avec la proline en position 2 mais accepte plusieurs acides aminés autres que la tyrosine en position 9 (208,209). Les études ont montré que en comparaison avec HLA-B*35-PY, HLA-B * 35Px a été associé à une progression accélérée du sida chez les personnes infectées par le VIH-1(210). Une liste des allèles HLA signalés comme étant associés à la susceptibilité à l'infection par le VIH est fournie dans le tableau VIII.

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Tableau VIII: Certains allèles HLA connus pour être associés à la susceptibilité à l'infection par le VIH

HLA-B accelérante la progression vers SIDA Auteurs Cohorts

B*07:02 Pereyra et al., 2010 (165) Multinational consortium

B*08/08:01 Pereyra et al., 2010 (165); Multinational consortium;

Carlson et al., 2012 (196) C clade South Africa/ Botswana/Zimbabwe B*18/18:01 Leslie et al. 2010 (197) ; C clade, South Africa;

Carlson et al., 2012 (196) Botswana/Zimbabwe B*35 Carrington et al.,1999 (175); B clade Caucasian

B*35:01 Pereyra et al., 2010 (165) B clade North American European B*35:02/35:03 Gao et al., 2001(210); B clade Caucasian

B*45/45:01 Tang et al., 2010 (199); C clade Zambia;

Carlson et al., 2012 (187) South Africa/Botswana/ Zimbabwe B*51:01 Carlson et al., 2012 (196) C clade South Africa/ Botswana/Zimbabwe B*53:01 Gao et al., 2001 (210); B clade Caucasian;

Pereyra et al., 2010 (165) African American B*58:02 Kiepiela et al., 2004 (185); C clade South Africa; Tang et al., 2010 (199) Zambia

Carlson et al., 2012 (196) South Africa/Botswana/ Zimbabwe A*36:01 Tang et al., 2010 (199); C clade Zambia;

Carlson et al., 2012 (196) South Africa/Botswana/ Zimbabwe B*07:02 Pereyra et al., 2010 (165) B clade Caucasian

B*08/08:01 Pereyra et al., 2010 (165) B clade Caucasian

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3. HLA et hypersensibilité médicamenteuse

3.1. Hypérsensibilité L’hypersensibilité est un terme utilisé pour décrire des signes ou symptômes reproductibles dans le temps, apparaissant après l’exposition à un stimulus donné à une dose habituellement tolérée par des individus sains (211, 212). Ces manifestations peuvent être allergiques ou non. Lorsqu’elles sont allergiques (secondaires à un mécanisme immunologique), elles peuvent être IgE dépendantes ou non (211). Les phénomènes d’hypersensibilité sont habituellement décrits selon la classification de Gell et Coombs en 2009 (213). Le type I correspond à des réactions médiées par les immunoglobulines E (IgE). Après un premier contact antigénique induisant la production d’IgE spécifiques dirigées contre l’antigène, l’antigène soluble est reconnue à l’occasion d’un second contact par les IgE spécifiques qui vont se lier à leur récepteur de haute affinité placé à la surface des mastocytes. Cette liaison va provoquer l’activation et la dégranulation des mastocytes. Celle ci libère différents médiateurs tels que l’histamine et provoque l’apparition de symptômes tels qu’une rhinite allergique, un asthme, une urticaire ou un choc anaphylactique (213). Le type II est un mécanisme cytotoxique, médié par les IgG. Cette réaction cytotoxique va être dirigée contre la membrane des globules rouges, des globules blancs ou des plaquettes. Elle pourrait également se diriger contre les précurseurs des cellules hématopoiétiques de la moëlle osseuse, induisant une anémie hémolytique, une leucopénie ou une thrombopénie. Il peut également s’agir d’anticorps dirigés contre d’autres récepteurs cellulaires tels que les récepteurs de la thyroïde (anticorps anti-thyroglobuline) qui seront alors responsables d’une thyroïdite auto-immune (213). Le type III est lié à la présence de complexes immuns circulants. Ces complexes immuns pourraient se lier à la cellule endothéliale et provoquer l’activation du complément. Les symptômes classiquement associés à ces phénomènes sont les vascularites immunoallergiques (213). Enfin le type IV est lié à des phénomènes d’immunité cellulaire. Il existe différents mécanismes faisant intervenir les lymphocytes T CD4 avec une réponse Th1 ou Th2, ou les lymphocytes T CD8. Les manifestations cliniques sont extrêmement variables : psoriasis, dermatite atopique, pelade ou vitiligo mais aussi diabète, asthme allergique

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chronique, par exemple (213). Pichler a détaillé le type IV en 4 sous-catégories afin de tenir compte des mécanismes cellulaires sous-jacents. Le type IVa est lié à une réponse immunitaire Th1, impliquant majoritairement l’IFNγ. Le type IVb est associé à une réponse Th2 impliquant l’IL4 et 5. Le type IVc est associé à une réponse lymphocytaire T cytotoxique, impliquant la perforine et le granzyme B. Enfin, le type IVd est associé aux cellules T et tout particulièrement à l’IL8 (214).

3.2. Hypersensibilité médicamenteuse L’hypersensibilité aux médicaments est une réponse immune inappropriée, consécutive à l’administration d’une molécule thérapeutique, provoquant des lésions tissulaires. À priori imprévisible, elle affecte une minorité de patients. On classe les hypersensibilités médicamenteuses en fonction du délai de réaction par rapport à la prise médicamenteuse : allergie immédiate, survenant dans un délai inférieur à quelques heures après la prise médicamenteuse et l’allergie retardée, survenant plus tardivement (215). Classiquement, les réactions immédiates correspondent cliniquement à une urticaire ou un angioedème voire un choc anaphylactique. Elles sont majoritairement IgE médiées. Les réactions retardées quant à elles peuvent se présenter, cliniquement, sous une multitude de formes : exanthème maculo-papuleux (EMP), érythème polymorphe, syndrome de Stevens Johnson (SSJ), syndrome de Lyell ou nécrolyse épidermique toxique (NET), pustulose exanthématique aigüe généralisée, érythème pigmenté fixe ou drug reaction with eosinophiliaand systemic symptoms (DRESS). Les mécanismes immunologiques sous tendant ces réactions retardées semblent multiples et hétérogènes. Ils sont décrits comme « non-IgE médiés ».

3.3. Phénomène de sensibilisation La sensibilisation médicamenteuse implique la stimulation et l’expansion de lymphocytes T spécifiques du médicament. Cette réaction peut impliquer soit les lymphocytes T uniquement soit les cellules T et les cellules B avec formation consécutive d’anticorps spécifiques (majoritairement IgE) (213). Cette stimulation du système immunitaire repose principalement sur 2 concepts : le concept d’haptène et le concept « p- i» pour pharmacologic interaction with immune receptor (216,217).

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3.3.1. Le concept d’haptène L’haptène est une molécule de petit poids moléculaire chimiquement active capable de former une liaison covalente avec des protéines endogènes pour devenir immunogènes. Il y a alors formation d’une protéine du soi altérée, qui sera dégradée en peptides de huit à dix acides aminés. Les haptènes liés ou non à un peptide sont alors apprêtés par les cellules présentatrices d’antigènes. Ils sont alors liés aux molécules du HLA et transportés dans les organes lymphoïdes pour être présentés aux cellules T. Leur reconnaissance induit dès lors une prolifération et une expansion cellulaire T avec différenciation en lymphocytes T effecteurs et en lymphocytes T mémoires. Le complexe protéique comportant l’haptène peut également être immunogène pour les cellules B : en présence de lymphocytes T auxilliaires spécifiques (Th2) producteurs d’interleukines (IL) 4, 5 et 10, les lymphocytes B peuvent proliférer, se différencier et produire des IgE. En présence de lymphocytes Th1, une production IgG et IgM prédomine (213). Certains médicaments existent initialement sous la forme de pro-haptène qui est une molécule inactive nécessitant d’être métabolisée pour devenir active et réactive. Une fois métabolisé, le composé réactif se comporte comme un haptène.

3.3.2. Le concept p-i Il a été démontré que certains médicaments ne passent pas par la voie des haptènes pour stimuler les cellules T. Certains médicaments pourraient ainsi se lier avec des molécules du HLA de façon non covalente et être présentés directement aux lymphocytes T par les cellules présentatrices d’antigènes. Trois conditions semblent requises pour passer par cette voie : - les lymphocytes T doivent exprimer un récepteur T capable de se lier au médicament et d’induire une réponse immunitaire, - le seuil d’activation de ces lymphocytes doit être faible (ceci implique que les lymphocytes T stimulés par cette voie soient des lymphocytes T mémoire issus d’une réponse antigénique préalable), - une interaction entre la molécule du HLA à la surface de la cellule présentatrice d’antigène et le récepteur T doit permettre d’intensifier la réponse immunitaire. Au total cela implique donc un réseau immunitaire dense. Ces conditions semblent tout particulièrement réunies au niveau de la peau (213).

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4. HLA et hypersensibilités médicamenteuses L’hypothèse d’un terrain génétique prédisposant à la survenue d’une réaction d’hypersensibilité médicamenteuse a été évoquée du fait du caractère imprévisible de ces évènements et de la sévérité variable d’un patient à l’autre. En effet, à l’occasion d’un traitement strictement identique avec une molécule administrée, à la même posologie et pour une même durée d’exposition, les tableaux cliniques observés pourront varier de la toxidermie peu sévère à la toxidermie sévère avec atteinte systémique et pronostic vital engagé. Les études publiées à ce jour se sont beaucoup intéressées au typage HLA, étant donné le rôle central des molécules du HLA dans le déclenchement de la réponse immunitaire. Plusieurs associations entre une hypersensibilité à un médicament et un phénotype HLA ont été décrites, comme la carbamazépine et le gène HLA DR3, l’hydralazine et le gène HLA DR4, et l’abacavir avec l’allèle HLA-B*57:01.

4.1. Propriétés pharmacologiques de l’abacavir L’abacavir, inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse. On retrouve cette molécule dans trois types de préparations : seule comme dans Ziagen® :300 mg : comprimés pelliculés ; Ziagen20 mg/mlsolution buvable ou combinée avec d’autres antirétroviraux, comme dans Kivexa® : comprimés pelliculés (combiné avec la lamivudine) ou Trizivir® : comprimés pelliculés (combine avec la lamivudine et la zidovudine).

Figure 28 : Représentations plane de l'abacavir

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Comme de nombreux autres INTI, l'abacavir est un précurseur médicamenteux qui nécessite la phosphorylation intracellulaire pour produire son métabolite actif, le carbovir triphosphate (CBV-TP; Figure 29) (218). Cette biotransformation se produit via des étapes d’anabolisme, impliquant des enzymes qui ne sont pas impliquées dans le métabolisme des autres INTI. (218). ABC est initialement phosphorylé en abacavir 5’-monophosphate (ABC-MP) par l'adénosine phosphotransférase, puis par désamination par des enzymes cytosoliques pour former du carbovir 5’-monophosphate (CBV-MP). Les phosphorylations suivantes ont pour origine de formation de carbovir diphosphate (CBV-DP) et triphosphate (CBV-TP), par les activités guanylate kinase et nucléoside diphosphate kinase, respectivement. Le carbovir triphosphate est capable d'inhiber la transcriptase inverse virale en entrant en compétition avec le désoxyguanosine triphosphate endogène au site actif. Lors de l’incorporation dans l’ADN viral nouvellement synthétisé, le carbovir triphosphate est capable d’induire une terminaison de chaîne en raison de l’absence du groupe hydroxyle 3’ nécessaire pour former les liaisons phosphodiester critiques dans l’épine dorsale de l’ADN, interrompant ainsi le processus de transcription inverse (Figure 29).

Figure 29 : Métabolisme et activation de l'abacavir. Conversion du promédicament abacavir en son métabolite pharmacologiquement actif, le carbovir triphosphate (CBV-TP), qui est responsable de l'inhibition de la réplication virale. ABC-MP, abacavir monophosphate; CBV-MP, carbovir monophosphate; CBV-DP, carbovir diphosphate (219).

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L’efficacité virologique de l’abacavir fait de cet inhibiteur nucléosidique une option de premier choix pour les combinaisons de trithérapie habituellement recommandées chez les patients naïfs. De même, son profil de sécurité au long cours est relativement favorable : il occasionne moins de toxicités mitochondriales, notamment toxicités hépatiques ou métaboliques (220). Si la tolérance de l’abacavir est globalement acceptable, son implication dans le risque cardiovasculaire reste un élément d’interrogation soulevé récemment. La principale limitation de la prescription d’abacavir est une réaction fréquente, précoce d’hypersensibilité qui oblige au retrait du traitement.

4.2. Mécanisme de l’hypersensibilité à l’abacavir Bien que le mécanisme physiopathologique de l’hypersensibilité à l’abacavir ne soit pas précisément connu, une origine immunologique, impliquant la présentation du médicament ou de ses métabolites par les molécules du HLA aux lymphocytes T CD8+ est fortement suspectée. Pour rappel (chapitre II pag 62-63), les peptides présentés par les molécules HLA de classe I sont à l’origine de la dégradation de protéines endogènes, synthétisées par la cellule présentatrice d’antigènes (CPA). Ces protéines sont dégradées dans le protéasome cytosolique en fragments peptidiques. La translocation des fragments peptidiques de leur site de production (cytosol) vers le site d’assemblage avec les molécules HLA de classe I (réticulum endoplasmique) nécessite l’intervention du transporteur (transporter associated with antigen processing) (TAP), ainsi que celle de protéines chaperonnes dont la tapasine. Après la liaison d’un peptide de bonne affinité, les molécules de classe I chargées en peptides sont libérées vers la surface de la CPA en passant par le réseau transgolgien. L’ensemble peptide-molécule HLA est reconnu par le TCR des lymphocytes T CD8+ et engendre ainsi une réponse immune cytotoxique. L’abacavir ou son métabolite en se liant à une plus grosse molécule se comporterait comme un haptène, qui serait ensuite chargé dans le sillon de présentation peptidique de la molécule HLA-B*57:01. En 2008, Chessman et al. ont rapporté que le mécanisme est TAP-et tapasine-dépendant (221). D’autres études ont émis des hypothèses pour expliquer la restriction abacavir- HLA B*57:01. Les molécules HLA de classe I ont une structure telle qu’elles présentent un site de fixation peptidique constitué des deux domaines alpha 1 et alpha 2 de la chaîne lourde alpha. Le présentoir peptidique ainsi formé a la forme d’un sillon, ouvert aux deux extrémités et permettant le chargement de peptides d’environ neuf

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acides aminés. Les acides aminés ainsi engagés présentent, par leur taille et leur charge, une spécificité de liaison peptidique et une spécificité de reconnaissance par les TCR des lymphocytes T CD8+. Le sillon peptidique est découpé en six poches (A à F). Ces poches constituent des points d’ancrage pour le peptide (222). En 2004, à son tour Martin et al. (223) ont émis l’hypothèse que les métabolites de l’abacavir se lient par une liaison covalente à une protéine endogène et engendrent la présentation d’une molécule du soi altérée aux lymphocytes T cytotoxiques, à l’origine de la réponse immune observée lors de la réaction d’hypersensibilité. Cette présentation de peptides du soi altérés nécessiterait une coopération entre la molécule codée par l’allèle HLA-B*5701 et la protéine de choc thermique Hsp70-Hom (Figure 30).

Figure 30 : Mécanisme de l’hypersensibilité à ABC(223). Les métabolites de l’ABC se lient à une protéine endogène pour former une protéine du soi altérée. Celleci est dégradée en peptides de huit à dix acides aminés qui sont ensuite transloqués dans le réticulum endoplasmique où ils se lient à la molécule HLA-B*5701. Cette présentation nécessiterait la coopération de la protéine de choc thermique Hsp 70. La molécule HLA est ensuite transportée à la membrane cellulaire où elle présente le peptide aux lymphocytes TCD8+

La liaison non covalente de l’abacavir à la molécule HL-A-B*57:01 altère le répertoire peptidique présenté par la molécule HLA-B*57:01. Deux équipes ont réalisé des études cristallographiques du complexe HLA-abacavir-peptide, soit par l’intermédiaire

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d’un peptide endogène (224), soit par l’intermédiaire d’un peptide synthétique (225). La structure cristallographique de la molécule HLA-B*57:01 lié avec l'abacavir (224, 226) constitue une percée dans la compréhension du lien entre l'association de l’hypersensibilité au traitement et HLA. Les peptides qui se lient aux molécules HLA-B*57:01 sont des peptides de neuf acides aminés, avec en position C-terminale un tryptophane ou une phénylalanine se liant dans la poche F (Figure 31).

Figure 31 : Liaison de l’abacavir à HLA-B * 57: 01 (227). L'abacavir (indiqué en rouge) se lie dans la poche F de HLA-B* 57: 01 où les résidus C-terminaux de peptides liés se lieraient normalement, modifiant ainsi son répertoire de liaison. La présentation de peptides alternatifs (en bleu) au système immunitaire est supposée déclencher la HSR d'abacavir.

En présence d’abacavir les données suggèrent que lorsque l'abacavir est incubé avec une cellule présentatrice d’antigène, il est absorbé, pénètre dans le réticulum endoplasmique et se lie dans la poche F encore vide de HLA-B*57:01 via des liaisons non covalentes (Figure 32). Cela modifie la capacité de laison de HLA-B * 57:01 au peptide (221,225, 226). Au lieu que la molécule HLA-B*57:01 se lie aux peptides normaux ancrés avec le tryptophane au niveau du résidu d'ancrage, elle se lie aux peptides possédant des acides aminés plus petits aliphatique en position 9 (valine, isoleucine et leucine). «Un changement massif des peptides du soi présentés à la surface cellulaire. En position P9 en contact avec la poche F, il y a plus de leucine, d’isoleucine et moins de tryptophane. C’est un shift majeur, avec20 à 25 % du pool total de peptides renouvelé » (228).

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Figure 32 : p-i HLA: la modification des molécules HLA-B * 57: 01 par l'abacavir se fait par les voies extracellulaires et intracellulaires (229). Via la voie extracellulaire (à droite), les molécules d’abacavir peuvent se lier directement à la poche F9 des complexes peptHLA-B * 57: 01 présentés à la surface des cellules.2) Par la voie intracellulaire (à gauche), les molécules d’abacavir sont transportées dans les cellules et pénètrent dans le réticulum endoplasmique, où se produit le chargement du peptide sur les molécules HLA de classe I disponible.

En 2011, une étude par Adam et al. a montré que la fixation entre la molécule HLA B*57:01 et l’abacavir permet de stabiliser les molécules HLA à la surface cellulaire et que en présence du médicament, 40 % des clones T activés spécifiquement par l’abacavir réagissent très rapidement (2 à 5 min). Cette réactivité est rapide, suggérant que les clones T reconnaissent l’abacavir lui-même et non pas un peptide altéré (230). En 2012 Adam et al. Ont montré que la réactivité des clones T vis-à-vis de l’abacavir est hétérogène proportionnelle à la densité antigénique des molécules HLA-B*57:01 à la surface des CPA, et semble fonction de l’avidité des TCR pour le médicament, de la concentration du médicament dans le milieu réactionnel (231). D’après les données, qui ont été établies pour connaitre et expliquer le mécanisme d’action d’hypersensibilité à l’abacavir, on peut conclure que : l’hypersensibilité à l’abacavir est fortement associée à la molécule HLA-B*57:01 ; - le mécanisme du chargement d’abacavir au sein de HLAB*57:01 est

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TAP/Tapasine-dépendant ; - la réaction d’hypersensibilité à l’abacavir est médiée par une réponse T CD8+ spécifique ; - la poche F de la molécule HLA-B*57:01 joue un rôle crucial dans la fixation du peptide, surtout le résidu d’ancrage en position 116 ; - la fixation de l’abacavir sur HLA-B*57:01 provoque un changement des peptides chargés, créant des peptides altérés, qui présentent des acides aminés plus petits en position 9 C-terminale (232).

5. Manifestations de la réaction d’hypersensibilité à l’abacavir Il s’agit d’une réaction allergique retardée due aux lymphocytes T (réaction allergique de type IV, hypersensibilité retardée - HSR). La réaction d’hypersensibilité à l’abacavir est un effet indésirable fréquent chez 5 à 8% des patients recevant cette thérapeutique anti- VIH, survenant le plus souvent dans la phase initiale du traitement (6 premières semaines) (233). Les symptômes sont les suivants : rashs cutanés, fièvre, léthargie, nausées, vomissements, diarrhées, dyspnée, troubles ostéo musculaires, céphalées, paresthésies, œdèmes, défaillance hépatique ou rénale (234) (Figure 33, 34). Ces troubles disparaissent dans les 72 heures après l’arrêt du traitement. Un arrêt trop tardif du médicament ou sa réintroduction peuvent menacer des collapsus, engageant le pronostic vital dans 0,03% des cas (235). Donc la réintroduction de celui-ci est strictement contrindiquée après la survenue d’une HSR du fait du risque élevé de récidive grave. Les symptômes engendrés manquent cependant de spécificité et il n’est pas évident de faire la différence avec une infection concomitante, une réaction inflammatoire ou une réactivité vis-à-vis d’autres molécules médicamenteuses. Donc la vigilance du clinicien, ainsi que l’information du patient, sont donc déterminantes, le patient devant être informé des risques de survenue d’une HSR, de ses symptômes, ainsi que du risque de retraitement après avoir développé une HSR. Il est recommandé de réaliser un suivi étroit pendant les 2 mois suivant l’introduction de l’abacavir (1 consultation tous les 15 jours) (203).

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Figure 33 : Hypersensibilité à l’abacavir, patients avec une éruption maculo-papuleuse .

Figure 34 : Symptômes d’hypersensibilité rapportés avec une fréquence  10 %

Le test épicutané (patch test) a été parfois utilisé pour confirmer une réaction d’hypersensibilité à l’abacavir (204). L’utilisation de ce test en pratique courante ne revêt pas d’intérêt car il nécessite par définition une exposition antérieure à l’abacavir et les patients sont des patients naïfs pour ce traitement (205).

D’une façon générale, le diagnostic d’hypersensibilité à l’abacavir est essentiellement clinique.

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5.1. Association entre l’hypersensibilité à l’abacavir et HLA-B*5701 La première étude rétrospective liant HLA-B*57:01 au risque de RHS d'abacavir a été publiée au début de 2002, portait sur les 200 premiers patients de l’Australie occidentale exposés à l’abacavir (TableauIX) (236). Les patients, principalement des hommes Blancs, étaient typés sur plusieurs gènes HLA, notamment HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR et HLADQ. Un clinicien, qui ignorait le génotype HLA de chacun de ces patients, a examiné leurs dossiers médicaux pour rechercher des signes d'hypersensibilité selon les critères de diagnostic établis. Celles-ci comprenaient au moins deux symptômes de la HSR au cours des six premières semaines d'exposition à l'abacavir. Dans la cohorte, 18 cas «définis» HSR à l’abacavir ont été identifiés, tous de race blanche. De plus, 167 personnes tolérantes à l'abacavir (témoins) et 15 personnes supplémentaires présentant des symptômes non spécifiques ont été identifiées, mais ne répondaient pas aux critères établis pour le diagnostic de la HSR. HLA-B*57: 01 était présent dans 14 (78%) des cas de HSR à l'abacavir, contre seulement 4 (2,4%) chez les témoins tolérants à l'abacavir (odds ratio [OR] 117; intervalle de confiance à 95% [CI ]: 29–481; p <0,0001). De plus, les allèles HLA-DR7 et HLA-DQ3 étaient présents dans les cas de HSR à un niveau significativement supérieur à celui des témoins. Sur l'ensemble de la cohorte, ils ont constaté que l'haplotype HLA-B*57:01, HLA-DR7 et HLA-DQ3 avait une valeur prédictive positive (VPP) de 100% et une valeur prédictive négative (VPN) de 97%. Ces chercheurs ont ensuite commencé à effectuer un dépistage génétique chez tous les patients éligibles à l'abacavir, ils n'ont pas prescrit d'abacavir aux individus porteurs de l'haplotype HLA-B*57:01, HLA-DR7, HLADQ3. Cependant, comme leur cohorte était principalement composée d'hommes Blancs, ces résultats ont nécessité une réplication chez les femmes et d'autres groupes ethniques. Quelques semaines après la publication de ces résultats, GlaxoSmithKline a publié sa propre étude cas-témoins rétrospective (237), qui reproduit la valeur prédictive de HLA- B*57:01, mais a de nouveau souligné la nécessité de reproduire ces résultats chez les femmes et d'autres groupes ethniques. Dans une étude de suivi rétrospective publiée en 2004 (238), les chercheurs de GlaxoSmithKline ont répliqué leurs découvertes originales chez des hommes blancs et ont étendu la valeur prédictive de HLA-B*57:01 chez des femmes blanches et des Hispaniques. L'étude GlaxoSmithKline n'a montré aucune association entre HLA B*57:01

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et HSR chez les patients noirs, dont la majorité étaient afro-américains (238). Parmi les cas étudiés, il y avait moins de porteurs noirs de l’allèle HLA-B*57:01 que de blancs ou hispaniques, ce qui peut simplement être dû au fait que HLA-B*57:01 est moins répandu chez les Noirs par rapport aux autres groupes ethniques. Dans l’étude rétrospective réalisée par Saag et al. (239), la présence de cet allèle est retrouvée chez tous les patients ayant une hypersensibilité immunologiquement confirmée par des tests épicutanés, quelle que soit l’origine ethnique du patient. Ainsi, bien que la fréquence de l’hypersensibilité à l’abacavir soit significativement plus faible chez les sujets africains, l’association avec l’allèle HLA- B*57:01 semble pouvoir être généralisée à tous les groupes ethniques, contrairement à ce qu’avaient conclu les premières études réalisées (240). Les résultats de PREDICT-1, le premier essai randomisé, à double aveugle, portant sur l'évaluation d'un test pharmacogénétique destiné à réduire les effets indésirables da l’abacavir, ont été publiés dans le « New England Journal of Medicine » au début de 2008 (233). L'étude a recruté dans 19 pays, 1956 personnes naïves à l'abacavir et séropositives, principalement blanches (84%) et masculines (72%). Les participants étaient divisés en deux groupes: le groupe témoin, qui n’avait reçu aucun test HLA-B*57:01, et le groupe de dépistage prospectif, où tous les individus étaient soumis à un test génétique et où seuls les individus HLA-B*57:01-négatifs pouvaient se prescrire de l'abacavir. Tous les patients présentant une HSR cliniquement diagnostiquée avaient également subi un test de patch cutané (TPC) à l'abacavir dans les 6 à 10 semaines suivant la réaction initiale. La présence de HLA-B*57:01 avait une sensibilité de 100% pour la prédiction de la HSR confirmée immunologiquement. Malgré la force de ces résultats, leur applicabilité à l'ensemble de la population de patients était limitée car la cohorte PREDICT-1 était à prédominance blanche et masculine. Peu de temps après la publication de PREDICT-1, les résultats de l'étude rétrospective SHAPE ont été publiés (239). Le but de cette étude était d'évaluer la sensibilité et la spécificité de HLA-B*57:01 en tant que marqueur de la HSR de l'abacavir confirmée par le TPC. De plus, en raison du manque de données sur la capacité prédictive de HLA-B*57:01 chez les individus noirs, l'étude SHAPE a été spécifiquement conçue pour valider le dépistage HLA B*57:01 dans les cohortes noires et blanches qui seraient évaluées séparément. Au total, 130 patients blancs et 69 patients noirs identifiés par un diagnostic clinique antérieur de HSR ont subi un test de patch cutané. Parmi les deux groupes, 32,3%

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des patients blancs et 7,2% des patients noirs avaient une HSR positif à l’abacavir et tous étaient positifs pour HLA-B*57:01. Chez les patients blancs et noirs, la présence de HLA-B*57:01 avait une sensibilité de 100% pour la prédiction de la HSR confirmée immunologiquement. La spécificité était également très élevée dans les deux populations , 96% chez les patients blancs et 99% chez les patients noirs. Cet essai clinique a validé l'utilisation des tests HLA-B*57:01 chez les Noirs, bien que immunologiquement la HSR confirmée est rare dans cette population de patient.

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Tableau IX : Résumé des études pharmacogénétiques et de leurs principaux résultats concernant HLA-B * 57: 01 HSR à l'abacavir...

Année de publication Auteurs Type d'étude Principales conclusions 1. HLA-B*57:01 est un facteur prédictif significatif de la HSR à ABC, présent dans 78% des cas de HSR, contre seulement 2,4% chez les témoins tolérants à ABC dans une population composée principalement d'hommes de race blanche. 2002 Mallal et al (227) Rétrospective 2. Un haplotype de HLA-B*57:01, HLA-DR7 et HLA-DQ3 a un VPP de 100% et une VAN de 97% pour la HSR. 3. Le porteur de l'haplotype devrait réduire l'incidence de la HSR de 9% à 2,5% Hetherington et al ● 2002 Rétrospective HLA-B*57:01 est présent dans 44% des cas de HSR. (228) ● HLA * 57: 01 est un facteur prédictif significatif de la HSR chez les hommes et les femmes de race blanche. 2004 Hughes et al (238) Rétrospective ● Pour la première fois, il a été montré que HLA-B*57:01est un facteur de prédiction significatif de la HSR chez les Hispaniques ● Des critères de diagnostic mis à jour, y compris les résultats du SPT, ont été utilisés pour reclasser les cas de HSR précédemment diagnostiqués dans une cohorte essentiellement 2004 Martin et al (223) Rétrospective caucasienne. ● HLA-B*57:01 était présent dans 94,4% des cas de THV, contre seulement 1,7% des témoins. ● HLA-B*57:01 a une VPP de 78,9% et une VPN de 99,4% ● À la suite du dépistage prospectif de la présence de HLA-B*57:01, aucun des sujets négatifs pour HLA-B*57:01 ayant reçu de l'abacavir n'a développé de HSR. 2006 Rauch et al (241) Rétrospective ● Le dépistage a réduit de manière significative l’incidence de la HSR, comparativement aux taux précédents de HSR avant la mise en œuvre du dépistage. ● Dans un essai portant sur une cohorte de 1 956 personnes, la HSR cliniquement diagnostiquée était significativement réduite dans le groupe de dépistage prospectif par rapport au groupe 2008 Mallal et al (233) Rétrospective contrôle (3,4% contre 7,8%). ● Le test HLA-B*57:01 a un VPP de 47,9% et un VPN de 100% ● 32,3% des patients blancs atteints d'une HSR cliniquement diagnostiquée avaient une HSR confirmée immunologiquement, contre seulement 7,2% des cas de HSR diagnostiqués cliniquement chez les Noirs 2008 Saag et al (239) Rétrospective ● Parmi les patients blancs et noirs, tous les individus avec la HSR confirmée immunologiquement était positive pour HLA-B*57:01 ● Bien que la HSR confirmée immunologiquement soit rare chez les individus noir, HLA- B*57:01 a une sensibilité de 100% à ABC

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Bien que les résultats de PREDICT-1 et du SHAPE aient été officiellement publiés au début de 2008, les résultats en avaient déjà été présentés à l'été 2007 lors de la conférence de la Société internationale de lutte contre le sida. LabCorp, un laboratoire de référence national basé aux États-Unis, propose le test HLA-B*57:01 depuis le début de 2005, en réponse aux études cliniques initiales et aux demandes des médecins. Le volume de test était faible, provenait d’un petit nombre de médecins et le restait pendant plusieurs années. Cependant, une fois que les résultats de PREDICT-1 et de SHAPE ont été présentés, le volume du test a été multiplié par 5 sur une période de 6 mois. À la fin de 2007, la recommandation concernant le dépistage HLA-B*57:01 a été ajoutée au Department Health and Human Services HIV Guidelines et l'utilisation des tests a continué d'augmenter. En juillet 2008, Food and Drug Administration (FDA, « Agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux ») a publié un avis aux cliniciens et mis à jour les notices pour tous les produits contenant de l'abacavir, avertissant du risque de HSR chez les personnes atteintes de HLA-B*57:01-positives. Elle a recommandé le dépistage de HLA- B*57:01 chez tous les patients avant d’instaurer un traitement par abacavir, quelle que soit leur origine ethnique. L’origine ethnique des patients VIH+ semble importante, une relation hypersensibilité abacavir/HLA-B*57:01 ayant été trouvée dans les populations blanche et hispanique, mais pas dans la population noire (238), ni dans les populations taiwanaise (242) ou coréenne(243). Donc la description de la prévalence de ce biomarqueure (HLA-B*57:01) dans une population est la première étape qui peut évaluer la faisabilité et l'utilité des tests pharmacogénétiques pour cette drogue.

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DEUXIEME Partie : Travaux de thèse

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CONTEXT GENERAL

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En raison de ces caractéristiques génétiques, l’exploration du système HLA revêt un intérêt capital dans de nombreux domaines dont la médecine (appariement donneur–receveur, aide au diagnostic et à la prédiction de certaines maladies infectieuses HIV, auto-immunes, allergiques ou cancers).

Les études menées sur le système HLA au Maghreb (Afrique du Nord) présentent un grand intérêt d'un point de vue génétique car les populations maghrébines sont caractérisées par un haut degré de mélange.

Le Maroc est un pays maghrébin, situé au nord-ouest de l’Afrique (latitude 34◦2 N, longitude 6◦51 O), bordé par l’océan Atlantique à l’ouest, la mer Méditerranée au nord et le Sahara au sud. De plus, elle est caractérisée par une importante diversité culturelle avec deux groupes ethniques principaux parlant des langues différentes, l'arabe et le berbère, ajoutant ainsi une autre source possible de variation génétique. Les populations berbères autochtones apparues en Afrique du Nord pendant le Néolithique ont été mélangées à un nombre considérable de populations à travers les siècles : phéniciens, romains, vandales, arabes, immigrés andalous (musulmans et juifs), populations d'Afrique sub-saharienne, esclaves noirs du Soudan, et des Européens (Français, Espagnols, Italiens et Portugais). Toutes ces populations ont probablement contribué à la diversité génétique de la population actuelle.

Au Maroc, de nombreuses études ont été réalisées sur HLA. Une étude a été faite sur le polymorphisme de HLA dans la population saine marocaine, alors que d’autres ont déterminé la prévalence de HLA et son association avec des maladies comme Pemphigus, polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, spondylarthrite ainsi que l’association de HLA avec le diabète.

Cependant, Il n’existe aucune étude évaluant la prévalence de HLA notamment HLA- B*57 :01 et HLA-B*44 parmi les patients infectés par le VIH.

Aujourd’hui, le Maroc semble avoir abordé tous les aspects essentiels d’une riposte globale à l’infection à VIH. Toutefois, beaucoup reste encore à faire, le nombre de nouvelles infections est toujours en augmentation. Le nombre estimé de personnes vivantes, au Maroc, avec le VIH en fin de 2016 est de 22.000, un nombre important, qui ne doit pas être négligé. Le taux d’accès au traitement contre le VIH a été multiplié par 3 en passant de 16% en 2010 à 48% en 2016.

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Comme vu précédemment, il y a une association entre HLA et VIH. Donc Cela montre l'importance d'étudier la relation entre l'HLA sur la progression de l'infection par le VIH-1 d'une part et son association sur l’hypersensibilité à l’abacavir, un traitement anti VIH d’une autre part.

Dans ce contexte, notre travail est une étude transversale à visée descriptive qui se fixe deux objectifs :

 Dans le premier travail de cette thèse, nous nous sommes intéressés à déterminer la prévalence de l’allèle HLA-B*57 :01 et évaluer son association avec l’hypersensibilité à l’abacavir chez une population de patients infectés par le VIH-1 au Maroc.  Dans le deuxième travail, nous avons aussi déterminé la prévalence de l’allèle HLA- B*44 et étudier son effet sur le taux de la progression de la maladie suite à l’infection chez les patients infectés par le VIH-1.

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CHAPITRE I : L’ALLELE HLA-B*57 :01 & HYPERSENSIBILITE A L’ABACAVIR

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1. Lieu d’étude L’étude a été effectuée au Centre de Virologie, des maladies infectieuses et tropicales, Hôpital Militaire d'Instruction Mohammed V, Rabat, qui vient de conforter le réseau international de surveillance des pathologies émergentes et ré-émergentes. Le suivi de l’étude s’est déroulé au Laboratoire de Recherche et de Biosécurité P3, Hôpital Militaire d'Instruction Mohammed V, Rabat.

2. Patients Cette section présente le groupe de patients étudiés et les techniques utilisées dans la réalisation de ce projet de thèse.

2.1. Présentation des patients La collecte des échantillons de cette étude est effectuée du décembre 2014 au juin 2016 au Centre de Virologie, des maladies infectieuses et tropicales à l’Hôpital Militaire d'Instruction Mohammed V. Le nombre a atteint 166 patients HIV1 positif. Des variables indépendantes du temps comme le sexe, le mode de transmission et d’autres dépendantes du temps comme l’âge, les CD4, la charge virale plasmatique, les traitements et les évènements cliniques sont employés s’ils sont disponibles. Après avoir expliqué le but de l'étude aux patients ils ont été convaincus d'y participer.

2.2. Considerations Ethiques L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de rabat Mohamed V, pour la recherche biomédicale de Rabat, enregistré au Bureau de la protection de la recherche humaine du Département américain de la santé et des services humains sous le numéro IORG0006594. Les sujets d’étude étaient des adultes (âgés de plus de 18 ans) inclus après leur consentement libre et éclairé par écrit avant le don de l'échantillon de sang. Pour préserver leur anonymat, un numéro sous forme de code leur a été donné.

2.3. Prélèvement sanguin Pour l’échantillonnage, le sang total (6 ml) a été prélevé au département de dermatologie dans deux tubes contenant de l’EDTA. Le centre de Virologie, des maladies infectieuses et tropicales accueille les échantillons pour faire le diagnostic ou le suivi des patients infectés par le VIH. Les tubes ont été conservés à - 20 °C jusqu’au jour de l'extraction de l'ADN.

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3. Méthodes

3.1. Paramètres cliniques du VIH La charge virale plasmatique (CVp) du VIH a été déterminée par polymerase chain reaction (PCR) en temps réel automatisée utilisant le système Cobas Ampliprep / Cobas TaqMan (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne) avec une limite de détection de 20 copies d'ARN du VIH / ml. Les numérations de cellules CD45 +, CD3 +, CD4 + et CD8 + ont été obtenues par cytométrie en flux en utilisant le cytomètre en flux Navios (Beckman Coulter).

3.2. Extraction de l’ADN des échantillons. L'ADN total a été extrait et purifié à partir d'échantillons de sang total, en utilisant un kit commercial d’extraction d’ADN génomique Purelink genomic DNA Kit (Invitrogen, Life technology, USA). Selon les instructions du fabricant. En bref, des aliquotes de 200 ul pour chaque échantillon de sang total ont été utilisées et l'ADN total a été élue dans 100 ul de tampon d'élution  Procédure d’extraction Avant de commencer l’extraction d’ADN de nos échantillons il faut s’assurer qu'il n'y a pas de précipité visible dans Pure Link Buffer Digestion ®Genomic ou PureLink® génomique Lysis/Binding Buffer. S’il y en a, on réchauffe les tampons à 37 ° C pendant 3-5 minutes et bien mélanger pour dissoudre le précipité avant l’utilisation.  En premier temps configurer l’incubateur à 55 ° C.  Dans un micro tube stérile, ajouter 200 µl échantillon de sang.  Ajouter 20 µl Proteinase K à l'échantillon.  Ajouter 20µl RNase à l'échantillon, bien mélanger en bref agitation par vortex, et incuber à température ambiante pendant 2 minutes.  Ajouter 200 µl PureLink®Genomic Lysis/Binding Buffer et bien mélanger par vortex pour obtenir une solution homogène.  Incuber à 55 °C pendant 10 minutes pour favoriser la digestion des protéines.  Ajouter 200 µl d'éthanol à 96-100% du lysat. Bien mélanger par vortex pendant 5 secondes, pour donner une solution homogène.  Retirer une colonne dans la collecte des tubes de l'emballage.  Ajouter le lysat (640 µl) préparée avec PureLinkGenomic Lysis/Binding Buffer et de l'éthanol à la colonne PureLink®Spin.

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 Centrifuger la colonne à 10.000xg pendant 1 minute à température ambiante.  Jeter le tube de collecte et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur  Ajouter 500µl de Wash Buffer 1, préparé avec de l'éthanol à la colonne.  Centrifuger la colonne à la température ambiante à 10.000 xg pendant 1 minute.  Jeter le tube de collecte et placer la colonne de centrifugation dans un tube de collecte de PureLink® propre fourni avec le kit.  Ajouter 500µl Wash Buffer 2 préparé avec de l'éthanol à la colonne.  Centrifuger la colonne à la vitesse maximale pendant 3 minutes à température ambiante.  Jeter le tube collecteur et placer la colonne de centrifugation dans un tube de micro centrifugation de 1,5ml stérile  Ajouter 100µl de ®Genomic Elution Buffer Pure Link à la colonne.  Incuber à température ambiante pendant 1 minute. Centrifuger la colonne à la vitesse maximale pendant 1 minute à température ambiante. (Le tube contient de l'ADN génomique purifié).  Le tube contient de l'ADN purifié. Retirer et jeter la colonne. Pour éviter la congélation et la décongélation répétée de l'ADN, stocker l'ADN purifié à 4°C pour une utilisation immédiate ou aliquote de l'ADN et de conserver à -20°C pour le stockage à long terme. La procédure de purification de l'ADN génomique à l'aide des mini kits d'ADN génomique PureLink® est illustrée dans la figure ci-dessous.

Figure 35 : Les principales étapes d’extraction d’ADN.

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3.3. Vérification de la qualité d’ADN par Electrophorese

 Procédure  Préparer un gel d’agarose à 2% (1g d’agarose dans 50 ml de TBE à 0.5x)  Sur un papier para film déposer 2µl de loading Dye et melanger de solution d’ADN.  Deposer les ADN dans les différents puits du gel placé dans la cuve pour électrophorèse contenant du tampon TBE 0.5x.  Electrophorèse du gel 40 min à 100 volts  Retirer le gel et procéder à la prise de photos du gel sous UV.

3.4. Quantification de l’ADN par spectrophotométrie L’ADN, l’ARN, les oligonucléotides et même les mononucléotides peuvent être mesurés directement dans des solutions aqueuses sous forme diluée ou non diluée en mesurant l’absorption A (également définie comme état la densité optique, DO) en lumière ultraviolette (mais aussi dans le spectre visible). Si l’échantillon est pur (autrement dit, s’il ne contient pas de quantité significative de contaminants tels que des protéines, du phénol ou de l’agarose), la mesure spectrophotométrique de la quantité de rayons ultraviolets absorbés par les bases est une opération facile et précise. Les spectres d’absorption des acides nucléiques présentent une bande d’absorption maximale autour de 260 nm. La concentration d’acides nucléiques est généralement déterminée par une mesure effectuée à 260 nm contre un échantillon appelé « blanc ». L’interférence par des contaminants se reconnaît par calcul d’un « ratio ». Les protéines absorbant à 280 nm, le ratio A260/A280 est utilisé pour estimer la pureté de l’acide nucléique. L’ADN pur devrait avoir un ratio d’environ 1,8, tandis que l’ARN pur devrait avoir une valeur d’environ 2,0.

3.4.1. Principes de la détermination spectrophotométrique de l’ADN. Un spectrophotomètre utilise la transmission de la lumière à travers une solution pour déterminer la concentration d’un soluté à l’intérieur de la solution. L’appareil fonctionne suivant un principe simple dans lequel de la lumière d’une longueur d’onde connue traverse un échantillon et où la quantité d’énergie lumineuse transmise est mesurée à l’aide d’une cellule photoélectrique placée de l’autre côté de l’échantillon. Dans cette étude on a utilisé le spectrophotomètre Jenway serie 67.

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 Procedure Afin de calibrer le spectrophotomètre, il est essentiel de :  Sélectionner la longueur de chemin optique de la cuve 260nm.  Choisir le bon facteur (faire une sélection dsADN),  Mesurer une solution vierge (référence) constituée d’eau, A260= 0).  Mesurer un échantillon inconnu. En fonction de la capacité de la cuvette utilisée, des quantités spécifiques de solution d’ADN sont utilisées afin d’évaluer la concentration (on a fait une dilution d’ADN de 1/50. Après étalonnage du spectrophotomètre et de la solution d’acide nucléique à ajouter, la cuvette est bouchonnée, la solution est mélangée et l’absorbance est mesurée. Afin de réduire les erreurs de pipetage, la mesure devrait être répétée deux fois au minimum. La concentration [C] d’un acide nucléique spécifique présent dans une solution se calcule à l’aide des équations suivantes : Par exemple Si A260= 0.04 Dilution= 1/50 donc facteur de dilution est 50 A 260=1, alors 50ug/ul d’ADN Donc si A260=0.04 quelle est la concentration d’ADN ? Concentration [ADN]= A260 x 50 x facteur de dilution Concentration [ADN]= 0.04 x 50 x 50 Concentration [ADN]= 100ug/ul.

3.5. Génotypage de HLA-B57*01 Le typage HLA-B*57 :01 a été effectué par PCR-SSP (Sequence-Specific Primers). PCR-SSP permet l'amplification de l'ADN double brin même lorsque l'information de séquence est disponible à une extrémité seulement. Cette méthode, permet l'amplification de gènes pour lesquels seule une information de séquence partielle est disponible, et permet la marche unidirectionnelle du génome depuis des régions inconnues du chromosome. PCR-SSP devrait être utile pour l'analyse des jonctions intron-exon dans l'ADN génomique eucaryote. Elle est basée sur l’utilisation d’amorces spécifiques d’un allèle (sequence specific primers) ou d’un groupe d’allèles en fonction du degré de résolution de l’amorce. Dans ce cas l’amplification par PCR ne se fait que sur l’allèle ou groupe d’allèle recherché. Il suffira donc simplement de déterminer si l’amplification s’est réalisée ou non. Cette technique présente l’avantage d’être rapide et de permettre la détection allélique directe (HLA B*57:01).

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Un test SSP multiplexe a été développé pour la détection, et la discrimination de HLA- B*57:01. L’exon 3 du gène HLA-B*57:01 a été amplifié en utilisant les amorces d’oligonucleotides décrits par Martin et al. (244) (. L’amorce sens de HLA-B * 57 :01 1F, et trois amorces anti-sens HLA-B*57 :01 :2R ,3R et 4R (voir tableau X). Les amorces spécifiques HLA-B*57 :01 1F, 2R et 3R permettent d’amplifier un fragment de 94 -paires de bases (pb) d’une région de l’exon 3. Cependant la paire d'amorces spécifiques du groupe HLA-B57 1F et 4R permet d’amplifier une région de 175 pb de tous les sous-types HLA-B57, de HLA-B * 5701 à HLA-B * 5709 à l'exclusion des allèles B*57 :05 et –B*57 :06. Toutes ces amorces sont de types séquences spécifiques (SSP), elles sont capables de détecter les versions alléliques des différents gènes codants. Un deuxième couple d'amorces désignées à l'amplification d'une région du gène HGH (amorce sens HGH-I et l’amorce HGH-II anti-sens) (voir tableau X), gène monomorphe codant l'hormone de croissance chez l'homme, a été utilisé comme contrôle de qualité (contrôle interne) pour les différentes étapes d'extension d'ADN pour vérifier l'efficacité de la réaction d'amplification témoignant le succès de la réaction PCR (renseigner sur la présence ou l'absence d'inhibiteurs de l'amplification). Ces deux amorces permettent d’amplifier un fragment de 439-pb à l'intérieur de HGH. Les amorces qu’on a utilisées dans cette étude étaient synthétisées par Eurogentec, Belgique. Tableau X : Amorces spécifiques utilisé pour le génotypage de HLA-B*57 :1 et la séquence de HGH

Amorces Sequences

HLA-B*5701 allele

1F 5-GTCTCACATCATCCAGGT-3

2R 5-ATCCTTGCCGTCGTAGGCGG-3

3R 5-ATCCTTGCCGTCGTAGGCAG-3

4R 5-CGCCTCCCACTTGCGCTGGG-3

Housekeeping HGH

HGH-I 5-CAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3

HGH-II 5-ATCCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3

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Tableau XI : Caractéristiques d’amorces N° de lot amorces MW g/mol Qty Tm Base N° 5130.4 306 µg 1F 52 °C 17 6073471 g/mol =59.7nmol 6125.0 365 µg 2R 66 °C 20 6073472 g/mol =59.5nmol 6109.0 325 µg 3R 64 °C 20 6073473 g/mol =53.2noml 1000793721 6045.9 365 µg 4R 70 °C 20 6073474 g/mol =60.4nmol HGH-I 7472.9 355 µg 54.2 °C 6073475 (5F) g/mol =47.5nmol HGH-II 315 µg 8511.6g/mol 53.4 °C 1208518 6R =37nmol

3.5.1. Préparation des solutions d'amorces Dans la préparation du stock il faut éviter la contamination en travaillant sous la hote avec des réactifs de qualité PCR (d’eau stérile DNase-free).  Les amorces sont reçues dans un état lyophilisé. Commencer par créer une solution stocke à 100 µM pour chaque amorce. Pour déterminer la quantité de H2O à ajouter à l'amorce lyophilisée, il suffit de multiplier le nombre de nmol d'amorce dans le tube par 10 et ce sera la quantité de H2O à ajouter pour faire un stock d'amorces à 100 uM. 100 µM = X nmol amorce lyophilisé + (X × 10 µl eau stérile DNase-free). Exemple: pour l’amorce 1F 100µM = 59.7nmol + 59µl eau stérile DNase-free  Laisser reposer le stock pendant 2 minutes à température ambiante.  Faire une dilution de 1/5 pour tout les amorces pour avoir une solution à 20 µM;  Prélever 20 µl à partir de la solution stock à100 µM et y ajouter 80 µl d'eau ultrapure.

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3.5.2. Composition du mélange réactionnel dans les microtubes La PCR-SSP conventionnelle du HLA B*57 :01 a été réalisée dans un volume final de 25 µl. Le mélange s'effectué toujours sur la glace et les différents élèments qui le compose sont placés dans l'ordre suivant dans les microtubes : 7.7 µl d’eau stérile DNase-free, 3µl du tampon 10X, 3µl de MgCl2,2µl dNTP, 0.3ul de chaque amorce de HLA-B*5701 et HGH (1F, 2R,3R et 4R ,5F et 6R)(20 pmoles ), 0.5µl Taq DNA polymérase 1U(Biosystems) et enfin 2 µl d’ADN à amplifié. Le tout est mélangé doucement pour ne pas altérer l'enzyme de la Taq DNA polymérase. NB: on réalise toujours un témoin positif qui permettra de valider la bonne conservation des réactifs, de l'enzyme responsable de la polymération et des performances du thermocycleur, le témoin positif pour HLA-B*57 est obtenu chez le centre Hospitalier Ibn Sina, service de transfusion sanguine et d’hémovigilance, hôpital des Enfants de Rabat, CHU Ibn Sina Rabat. Un témoin interne présent dans le milieu réactionnel renseignera sur la présence ou l'absence d'inhibiteurs de l'amplification.

3.5.3. Amplification de HLA-B*57:01 Comme nous avons mentionné avant, on a adopté la technique PCR-SSP : c'est la technique la plus utilisée pour l'étude du polymorphisme allélique des gènes. Elle a l'avantage d'être une méthode en une seule étape où la spécificité de primer simplifie la détection du produit amplifié. C'est une technique simple, rapide et précise.

3.5.4. Programmes PCR Chaque série d'amplification comporte différentes étapes selon un programme bien déterminé. Tous les éléments nécessaires à la réaction sont regroupés dans un tube PCR qui sera soumis aux différentes températures correspondant à chaque étape. Ces cycles de température sont réalisés automatiquement dans un thérmocycleur. Dans cette étude la PCR a été réalisée dans un thermocycleur US iCycler® from BioRad (Hercules, Californie, USA), en utilisant un cycle initial de dénaturation à 95˚C pendant 1 min; quatre cycles à 96˚C pendant 25s, 70˚C pendant 45s et 72˚C pour 45s; suivi de 24 cycles à 96˚C pendant 25 s, 65˚C for 50 s, puis 72˚C pendant 45 s, suivi de 8 cycles 96˚C pendant 25s, 55˚C pour 60 s, et 72˚C pendant 90 s ( Tableau XII).

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Photo : Thermocycleur iCycler BioRad (PCR conventionnel)

Tableau XII: Programmation de la PCR pour l’amplification de l’allèle HLA-B*57 :01

Etape Temperature Temps Cycle 96 2 1 cycle Dénaturation Initiale 96 25s Dénaturation 4 cycles

70 45s Hybridation 72 45 Extension 96 25s 24 cycles Dénaturation 65 50s Hybridation 72 54 Extension 96 25s 8 cycles Dénaturation 55 1 min Hybridation 72 1.20 min Extension 4 Stokage

3.5.5. Révélation des produits d’amplification Le 25 µl des produits de PCR ont été séparés sur un gel d’agarose à 2% dans un tampon TBE0.5 X (Tris–Borate–EDTA), après coloration avec 0,1 ug / ml de bromure d'éthidium (BEt produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléiques faisant apparaitre à

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la molécule d'ADN une fluorescence rosâtre sous illumination par des UV) pour visualiser l’ADN par un transilluminator à ultraviolets (Figure 40). Le gel a été photographié et analysé pour l’expression du HLA B*57/01. Un marqueur de taille 100-bp a été utilisé pour comparer les tailles des produits de PCR.

 Procédure de la préparation du gel d’électrophorèse.

Figure 36: Les étapes de la préparation du gel d’électrphorèse

 Mélanger la poudre d’agarose 1g avec 50 ml du tampon TBE à 0.5X (gel d’agarose à 2% ) dans une fiole de 250 ml.  Dissoudre la poudre d’agarose en faisant bouillir la solution. Chauffer la solution dans le micro ondes à haute température pendant 1 minute. Retirer soigneusement la fiole du micro-ondes et melanger la solution en faisant tournoyer la fiole. Continuer à chauffer la solution jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissolue (la solution doit être claire, comme de l’eau).  Laisser refroidir l’agarose jusqu’à 60°C en tournoyant délicatement la fiole afin de permettre une dissipation régulière de la chaleur.  Pendant que l’agarose refroidit, placer le gabarit (peigne) dans cuve pour créer des puits.  Verser la solution d’agarose refroidie dans le support de coulage (cuve) sans faire de bulles d’air dans le support de gel préparé. Le gel devrait se solidifier au bout d’une vingtaine de minutes. Le gel se raffermira et deviendra moins transparent en se solidifiant.

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 Enlever le peigne. En enlevant le peigne, prendre soin d’éviter d’endommager les puits.  Placer le gel (le support) dans la cassette d’électrophorèse. Couvrir le gel avec le tampon d’électrophorèse 0.5X. Le gel doit être submergé dans son intégrité  Sur un papier parafilm déposer 2ul de loading Dye (Bleu de Bromothymol) et mélanger avec 8ul de solution d’ADN d’échantillons aussi l’ADN de contrôle positif.  Déposer l’ADN dans les différents puits du gel le premier puits contenant le marqueur de taille de 100 pb le deuxième contenant le contrôle positif et dans les autres puits on dépose l’ADN des échantillons.  Brancher les prises à la source de courant et réaliser électrophorèse du gel 40 min à 100 volts.  Retirer le gel et procéder à la prise de photos du gel sous UV (le gel est placé sur un transilluminateur UV) et photographié afin d’interpréter les résultats.

Photo : transilluminateur UV BIORAD

3.5.6. Interprétation des résultats Sur la photographie les produits apparaissaient sous forme de bandes. Les bandes spécifiques sont exprimées en nombre de paires de bases en référence au marqueur utilisé pour l’électrophorèse. L'interprétation des résultats était basée sur la présence ou l'absence d'un fragment d'ADN amplifié spécifique, le produit de 193 bp a été détecté dans les échantillons portant HLA-B *57 et le produit de 112 bp a été amplifié dans un HLA-B*57:01- échantillon positif.

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3.6. Analyses statistiques Des statistiques descriptives ont été réalisées pour détailler les caractéristiques démographiques et cliniques des patients. Les variables quantitatives ont été décrites en utilisant les moyennes et les écarts-types (SD) dans les cas où la distribution était normale. La médiane a été utilisée pour les variables dont la distribution n’est pas normale. Les fréquences alléliques ont été estimées par comptage génotypique direct et exprimées en pourcentage. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel SPSS 13.

4. Principaux résultats

4.1. Caractéristiques des patients Nous avons obtenu pour cette partie, 166 patients séropositifs VIH1. Le tableau XIII montre les caractéristiques démographiques et cliniques des patients y compris l’âge, le sexe, le risque de transmission, la charge virale et le nombre des cellules TCD4.

Tableau XIII : Caractéristiques démographiques et cliniques des patients

Variables Nombre Fréquence

Age, median (SD) 43 (±10)

Sex Homme 118/166 71.1%

femme 48/166 28. 9 Groupe de risque de transmission

Heterosexuel 129/166 77.7%

Inconnu 37/166 22.3% Charge virale plasmatique 389,000 [4000; 500,000] (copies/ml), Médiane Nombre de cellules CD4 (cellules 420 [272; 580] / ml), médiane

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Au moment de l'inscription la moyenne d’âge des patients était de 43 ans (± 10), la majorité des patients infectés par le VIH dans cette étude sont les hommes avec un nombre de 118 (71,1%). Nos résultats suggèrent que le groupe du risque de transmission hétérosexuelle est la voie prédominante de l'infection par le VIH chez les patients marocains (77,7%). Le nombre de cellules TCD4 était de 420 cellules / mm3 avec une médiane de [272; 580] , alors que la charge virale plasmatique était de 389 000 copies d'ARN du VIH / ml.

4.2. Génotypage de l’allèle HLA-B*57 :01 Le statut HLA-B*57 :01 a été déterminé chez 166 sujets ayant fourni un consentement éclairé à la participation à l'étude. Après la migration électrophorétique des produits de la PCR, la révélation sous UV et la photographie nous donnent le profil des résultats de dépistage de l’allèle HLA-B*57 :01 des patients (Figure 37)

Figure 37: Électrophorèse sur gel d'agarose illustrant des produits de PCR pour le HLA-B * 5701.

Légende : - Au niveau des puits N° 1 à gauche (M) : marqueur de poids moléculaire de 100 pb - Au niveau des puits N°2 CP (Contrôle positif) : Il y a deux produits formés, le premier entre 100 et 200 paires de base (pb); ce qui correspond à la taille du fragment attendu (193 pb), et le deuxième entre 400 et 500pb ce qui correspond à la taille du fragment du contrôle interne HGH 439pb. Tous les échantillons qui n’ont pas donné des résultats similaires n’étaient donc pas positifs et les patients correspondants ont été considérés non porteurs d’allèle HLA- B*57 :01 (échantillons 3 jusqu’à 10).

Par la technique de SSP PCR, dans les échantillons d’étude, aucun patient n’a été porteur de l’allèle HLA-B*57 :01. La prévalence de l’allèle HLA-B*57 :01 au Maroc est trop faible jusqu’à nulle. Un régime contenant de l'abacavir a été administré à 166 patients. Tous les

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patient ont reçu de l'abacavir sans le test de dépistage HLA B * 57 :01 et aucune réaction d’hypersensibilité à l’abacavir a été déclarée.

5. Discussion L’infection par le VIH-1 est l’un des plus grands problèmes de santé publique au monde. Cependant, l'utilisation d'un traitement antirétroviral hautement actif (HAART) a diminué la morbidité et la mortalité associée à l'infection par le VIH.1 Le traitement HAART comprend généralement un schéma associant des inhibiteurs nucléosidiques et non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI). L’abacavir, inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse prescrit chez les patients infectés par le VIH-1, il est utilisé soit seul ou combinée avec d’autres antirétroviraux, cet inhibiteur nucléosidique est recommandé comme un traitement du premier choix grâce à son efficacité virologique et de son profil de sécurité au long cours. La principale limitation d’abacavir est des réactions d’hypersensibilité potentiellement fatales chez 4 à 8 % des patients (235,245). Ces réactions se caractérisent par une réaction systémique idiosyncrasique comprenant fièvre, éruption cutanée, fatigue et symptômes gastro-intestinaux et respiratoires. Ces symptômes disparaissent généralement après l'arrêt du médicament, la réintroduction de l’abacavir est strictement contrindiquée après la survenue d’une HSR car il peut entraîner une réaction potentiellement mortelle. Plusieurs marqueurs génétiques apparaissent associés au développement de réactions d’hypersensibilité. Par sa fréquence apparemment plus élevée ainsi que par son association suffisamment forte, HLA B*57 :01 semble être le plus pertinent de ces marqueurs en pratique clinique. Prospective Randomized Evaluation of DNA screening In a Clinical Trial 1 (PREDICT-1) (233), l’étude de l'hypersensibilité à l'abacavir et l’évaluation pharmacogénétique ont montré que l’expression de l'allèle HLA-B*57 :01 est fortement associée à un risque significativement majoré de réaction d'hypersensibilité à l'abacavir. L'association entre HLA-B*57 :01 et ABC-HSR a fait l'objet de nombreuses études épidémiologiques et montrant que l’allèle HLA-B*57 :01 est strictement associé à un risque majoré de réaction d'hypersensibilité retardée (HSR) à l'abacavir. Deux études retrospectives, publiées par deux équipes indépendantes, une d’Australie par Mallal en 2002 (236), 359 et l'autre des Etats Unis par Hetherington en 2002 (237), ont montré que la présence de l'allèle HLA-B*5701 est le facteur de risque prédominant de l’HSR à l’abacavir. Les australiens ont

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confirmé cette découverte par une étude prospective sur 260 patients infectés par le VIH-1 qui n’ont jamais été exposés à l’abacavir auparavant. Tous ont été testés pour la présence de l’HLA-B*57 :01 et les patients porteurs de l’allèle (7.7%) ne recevaient pas d’abacavir. Ainsi, la fréquence d’HSR a été réduite de 8% avant le dépistage à 2% et le nombre de traitements interrompus de 16.5% avant à 6% après le dépistage. Dans cette études tous les patients inclus sont traités par abacavir avant le dépistage de l’allèle HLA-B*57 :01, aucun n’a déclaré la présence d’une hypersensibilité après l’utilisation du ce traitement. Ce qui confirme la relation étroite entre la présence de l’allèle HLA- B*57:01 et la réaction d’hypersensibilité à l’abacavir. En 2015, les résultats d’une étude meta-analytique sur 10 articles inclus parmi 1026 (246), ont montré une forte association entre HLA-B * 57 :01 et ABC. Le OR était de 1 056,2 (IC à 95% = 345,0 - 3 233,3). Les OR parmi les ethnies (Blanc, noir et asiatique) étaient légèrement différents. L'intérêt du dépistage génétique a été démontré définitivement par PREDICT-1, une étude internationale double aveugle, incluant 1956 patients infectés par le VIH-1 de 19 pays. En 2008, la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a recommandé un test de dépistage HLA-B * 57 :01 avant de commencer l'abacavir pour tous les patients quel que soit leur origine ethnique. Suite à la recommandation de dépistage de l’allèle HLA-B*57 :01, plusieurs pays ont commencé d’étudier la prévalence de ce dernier et démontrer la fiabilité du test avant la prescription de l’abacavir. De nombreuses techniques ont été utilisées pour détecter la présence de l’allèle HLA-B* 57:01. Ces méthodes impliquent à la fois des méthodes sérologiques comme la cytométrie en flux et moléculaires comme le séquençage et la PCR. La cytométrie en flux (CMF) est une technique qui se fait sur le sang total frais prélevé sur héparine, citrate ou EDTA. Elle permet la détection de HLA-B57 en utilisant l’anticorps monoclonal HLA-B-17. HLA-B17 est une spécificité sérologiquement définie qui est divisée en deux : HLA-B57 et HLA-B58 donc la CMF n’est pas spécifique que pour HLA- B*57 :01, la sensibilité élevée du test de CMF (aucun faux négatif) rend cette méthode préférée pour le dépistage initial de HLA-B*57 :01. Cependant, la spécificité relativement faible (faux positif) de la cytométrie en flux par rapport aux tests génétiques, le rend inadapté en tant qu'outil autonome.

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Plusieurs études ont été faites en 2013 et 2015 sur la comparaison entre les différents techniques du typage de HLA-B*57 :01 (247-249). Les résultats ont montré que malgré la rapidité, la sensibilité et le coût faible de CMF, elle demeure une technique limitée car elle est moins spécifique, permet la détection du groupe d’allèles HLA B57. Il peut constituer la première étape de typage allélique ; Si aucun allèle de ce type n'est retrouvé dans le sang prélevé, alors la recherche peut s'arrêter là : ce résultat signifie en effet que le patient n'est pas porteur de l'allèle HLA-B*57 :01, Si l'ADN analysé révèle la présence d'allèles de type HLA- B*57, alors il faut passer à la seconde étape : la recherche du HLA-B*57 :01, qui se révèle beaucoup plus coûteuse. Une étude Turquie sur 109 échantillons du plasma a été faite pour comparer entre la PCR SSP et PCR en temps réel dans la détection de l’allèle HLA-B*57 :01 (250). Cette étude a montré que la PCR en temps réel présentait une sensibilité de 33% et une spécificité de 94% pour l'allèle HLA-B*57:01. La valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN) étaient respectivement de 14% et 98%. Par conséquent, les résultats positifs de la PCR en temps réel doivent être confirmés par la technique SSP. Donc la PCR SSP reste une technique spécifique et sensible pour l’allèle HLA-B*57:01. Vue les inconvénients de CMF, on a choisi la technique de la biologie moléculaire de PCR SSP, développé par Mallal. Ce protocole facilite le typage rapide de l’allèle HLA- B*57:01. Le test SSP est une méthode rapide et cohérente de distinction entre HLA B * 57: 01 et les allèles HLA-B * 57: 02 et HLA-B * 57: 03 les plus courants. D’après le génotypage de l’allèle HLA-B*57 :01 chez patients VIH-1 positifs concernés par notre étude, nous n’avons trouvé aucun porteur d’allèle HLA-B*57:01 (0%). La prévalence de cet allèle trouvée dans cette étude est inférieure à celle décrite précédemment en 2015 chez 647 patients marocains sains avec une prévalence de 2,1% (251). Nos résultats sont cohérents avec les études asiatiques comme le Japon (252), la Coré (243), la chine(253) et le Taiwan (242). En Corée et au Japon, aucun des 534 et 371 patients infectés par le VIH respectivement n’ont exprimés HLA-B*57:01 (243,252). En outre Chez 320 patients taiwanais infectés par le VIH, un seul patient (0,3%) a exprimé HLAB * 57: 01 (242). En 2015, les résultats obtenus chez 3000 patients chinois infectés, ont montré que 25 patients ont exprimé l’allèle HLA-B*57 :01 avec une prévalence de 0,86% (253).Cependant, les résultats obtenus restent plus faibles que la prévalence obtenue chez la population européenne. L'estimation globale de la prévalence de HLA-B * 57 :01 en Europe était de 4,98%, avec des estimations spécifiques par pays allant de 1,53 à 7,75%. La prévalence HLA-B*57:01 était la

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plus élevée dans la population blanche (6,49%) et le plus bas parmi la population noire (0,39%) (254).

Tableau XIV : Fréquence allélique de HLA-B * 57: 01 dans divers groupes de population

Pays Nombre total de Positifs HLA- Prévalence patients B*57 :01 Portugal (255) 573 35 6.1% Espagne (254) 1189 71 5.67% France (254) 2345 125 5.25% UK (254) 1494 56 3.75% sud de l'alberta 489 18 3.7% (256) Argentine (257) 1646 81 4.9% Chilie (258) 300 11 3.7%

La fréquence génétique de HLA-B*57 :01 était plus faible chez les patients marocains (0% porteurs d’allèle HLA-B*57 :01) que chez les autres populations caucasiennes, ce qui pourrait expliquer la faible incidence de l’hypersensibilité à l’abacavir dans la présente étude. Vue les résultats ci-dessus, nous pourrions conclure que HLA-B*57:01 n'est pas un allèle commun chez les marocains, donc l'hypersensibilité à l'abacavir semble être rare chez cette population et l’'utilisation des tests pour le dépistage de HLA-B*57:01 ne serait pas une stratégie rentable et spécifique pour réduire le risque associé à l’hypersensibilité à ABC au Maroc. L'observation clinique pourrait remplacer le test de dépistage HLA-B*57 :01, en particulier dans un environnement où les ressource de soins de santé sont limité. Dans ce cas, le patch cutané pourrait être utilisé pour confirmer rétrospectivement l’hypersensibilité à l’abacavir chez des patients suspectés ou cliniquement suspects d’hypersensibilité à l’abacavir. Des tests cutanés (TPC) à l'abacavir ont été effectués dans le cadre de nombreuses études afin de confirmer le diagnostic clinique de la HSR. La méthode de test est essentiellement la même que celle d'un test cutané standard pour les allergènes. La solution d'abacavir, généralement comprise entre 1% et 10% dans une base de pétrolatum, est appliquée sur un timbre placé sur la peau du patient, généralement sur le dos. Entre 24 et 48

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heures, les résultats du test sont ensuite «lus» en recherchant une réponse immunitaire sur les sites d’exposition à l’abacavir, notamment rougeur, induration, démangeaisons et cloques. L'étude PREDICT-1 a utilisé les résultats du TPC d'abacavir pour confirmer la HSR. Bien que PREDICT-1 et d’autres études aient mis en évidence une corrélation exceptionnelle entre les résultats positifs du TPC et la présence de HLA-B*57: 01, on ne sait pas vraiment quel est le taux de faux négatifs pour ce test. En outre, une erreur du clinicien lors de l'application du test ou d'autres facteurs liés au patient, tels que des maladies ou des médicaments associés, peuvent contribuer à des résultats faux négatifs. Étant donné que la reprise du traitement d’abacavir est contre-indiquée chez les personnes chez lesquelles une HSR est suspectée cliniquement, il est peu probable que la précision de ce test ne soit jamais complètement déterminée. En tant que tel, le TPC fait partie du cadre de recherche, mais son utilisation en pratique clinique n'est pas recommandée pour confirmer l'hypersensibilité. Malgré la faible spécificité des TPC à l’abacavir, il peut constituer un outil utile de diagnostic de HSR surtout chez la population où la prévalence de l’allèle HLA-B*57 :01 est trop faible comme le cas dans cette étude. Et bien sur la vigilance du clinicien, ainsi que l’information du patient, sont donc déterminantes, le patient devant être informé des risques de survenue d’une HSR, de ses symptômes, ainsi que du risque de retraitement après avoir développé une HSR.

6. Conclusion L’absence de la réaction d’hypersensibilité à l’abacavir chez les patients inclus dans cette étude peut être expliqué par le statut négatif de l’allèle HLA-B*57 :01. D’après les résultats obtenus on peut conclure qu’il y a une relation étroite entre la HSR à l’abacavir et l’allèle HLA-B*57 :01.Vu la prévalence nulle des porteurs de cet allèle dans cette étude, la prescription de l’abacavir aux patients marocains infectés par le VIH n’aura pas des effets indésirables et toxiques. En outre le dépistage du HLA-B*57 :01 ne pourra pas être une stratégie rentable pour réduire le risque associé à l'hypersensibilité ABC au Maroc.

7. Publication Ce travail a fait l’objet d’une publication dans la revue Gene Reports Fatima Youssoufi, Hicham El Annaz, Abdelilah Laraqui, Tahar Bajjou, Naoufal Hjira, Ouafa Atouf, Yassine Sekhsokh, Malika Esskalli, Saad Mrani.The prevalence of human leukocyte antigen-B*57:01 allele in HIV-1-infected Moroccan subjects. Gene Reports 9 (2017) 108–110

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CHAPITRE II : LA PREVALENCE &

L’EFFET DE L’ALLELE HLA-B*44

CHEZ LES PATIENTS

INFECTES PAR LE VIH

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1. Présentation des patients Cent soixante-sept sujets (n’ont pas encore utilisé le traitement) du service des maladies infectieuses de l'hôpital militaire Mohammed V de Rabat, infectés par le VIH-1, ont été recrutés par échantillonnage de proximité entre décembre 2014 et juin 2016. Des échantillons de sang total ont été prélevés et cryoconservées jusqu'à l'extraction de l'ADN.

2. Methodes

2.1. Paramètres cliniques du VIH La charge virale plasmatique (CVp) du VIH a été déterminée par polymerase chain reaction (PCR) en temps réel automatisée utilisant le système Cobas Ampliprep / Cobas TaqMan (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne) avec une limite de détection de 20 copies d'ARN du VIH / ml. Les numérations de cellules CD45 +, CD3 +, CD4 + et CD8 + ont été obtenues par cytométrie en flux en utilisant le cytomètre en flux Navios (Beckman Coulter).

2.2. Extraction de l’ADN des échantillons. L'ADN total a été extrait et purifié à partir d'échantillons de sang total, en utilisant un kit commercial d’extraction d’ADN génomique Purelink genomic DNA Kit (Invitrogen, Life technology, USA). Selon les instructions du fabricant. En bref, des aliquotes de 200 ul pour chaque échantillon de sang total ont été utilisées et l'ADN total a été élue dans 100 ul de tampon d'élution. (Voir la page 102-103) Après l’extraction d’ADN on a vérifié de la qualité d’ADN par électrophorèse. L’ADN a été quantifié par spectrophotométrie Jenway serie 67 (Voir page 104).

2.3. Génotypage de l’allèle HLA-B*44 Une partie de l'exon 3 de l'allèle HLA-B*44 a été amplifiée à partir de l'ADN génomique avec les oligonucléotides BX3S1 amorce sens (5’-GGGTCCAGGG TCTCACATCA-3’) et BX3R1 anti sens (5’-CCAGGTATCTGCGGAGCG-3’) (259), synthétisées par Eurogentec, Belgique.

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Tableau XV: Caractéristiques d’amorces spécifique de l’allèle HLA-B*44 MW N° de lot amorces Qty Tm Base N° g/mol 6118 356 µg BX3S1 64.0 °C 20 607377 g/mol =58.3nmol 1000793721 6125.0 336 µg 2R 60 °C 18 6073478 g/mol =60.6nmol

2.3.1. Préparation des solutions d'amorces Ces amorces sont aussi reçues dans un état lyophilisé, donc on Commence par créer une solution stock de 100 µM puis diluez-le à 1/5 pour obtenir un stock de travail de 20µM) (Voir procédure au-dessus, préparation des solutions d’amorces de HLA-B*57 :01 page 107).

2.3.2. Composition du mélange réactionnel dans les microtubes La PCR du HLA B*44 a été réalisée dans un volume final de 25 µl. Le mélange s'effectue toujours sur la glace, les différents élèments qui le composent, sont placés dans l'ordre suivant dans les microtubes : 12 µl d’eau stérile DNase-free, 3µl du tampon 10X contenant MgCl2 (ABI buffer),2.5 µl dNTP, 0.5ul de chaque amorce pour le génotypage de HLA-B*44 et 0.6 µl de chaque amorce sens et d’anti sens du contrôle interne HGH (20 pmoles ), 0.3µl Taq DNA polymérase 1U et enfin 5 µl d’ADN à amplifié. Le tout est mélangé doucement pour ne pas altérer l'enzyme de la Taq DNA polymérase. NB: on réalise toujours un témoin positif qui permettra de valider la bonne conservation des réactifs, de l'enzyme responsable de la polymération et des performances du thermocycleur, le témoin positive pour HLA-B*44 est obtenu chez le centre Hospitalier Ibn Sina , service de transfusion sanguine et d’hémovigilance, hôpital des Enfants de Rabat, CHU Ibn Sina Rabat, un témoin interne présent dans le milieu réactionnel renseignera sur la présence ou l'absence d'inhibiteurs de l'amplification.

2.3.3. Programmes PCR La PCR a été réalisée dans un thermocycleur US iCycler® from BioRad (Hercules, Californie, USA), en utilisant un cycle initial de dénaturation à 95˚C pendant 1 min ; dix cycles à 94˚C pendant 30s, 65˚C pendant 30 s et 72˚C pour 1 min; suivi de 25 cycles à 94˚C pendant 30 s, 60˚C for 30 s, puis 72˚C (259) pendant 1 min (voir tableau XVI).

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Tableau XVI: Programmation de la PCR pour l’amplification de l’allèle HLA- B*44

Etape Temperature Temps Cycle

1 cycle Dénaturation Initiale 96 1

Dénaturation 94 30s

65 30s Hybridation 10 cycles Extension 72 1 min

Dénaturation 94 30s 25 cycles Hybridation 60 30s

Extension 72 1 min

2.3.4. Révélation des produits d’amplification Les produits de PCR ont été séparés sur un gel d’agarose à 2% dans un tampon TBE 0.5 X (Tris–Borate–EDTA), après coloration avec 0,1 ug / ml de bromure d'éthidium pour visualiser l’ADN par un transilluminateur à ultraviolets. Le gel a été photographié et analysé pour l’expression du HLA B*44. Un marqueur de taille 100-bp a été utilisé pour comparer les tailles des produits de PCR. L'interprétation des résultats était basée sur la présence ou l'absence d'un fragment de 254 bp d'ADN amplifié spécifique.

2.4. Analyses statistiques Des statistiques descriptives ont été obtenues pour détailler les caractéristiques démographiques et cliniques des patients. Les variables quantitatives ont été décrites en utilisant les moyennes et les écarts types (SD) dans les cas où la distribution était normale. La médiane a été utilisée pour les variables dont la distribution n’est pas normale. Les fréquences alléliques ont été estimées par numération génotypique directe et exprimées en pourcentage. Les comparaisons statistiques ont été effectuées à l'aide des tests de Chi2 pour les variables nominales. Les variables continues ont été analysées à l'aide du test t pour les distributions normalement distribuées, tandis que les tests U-Mann Whitney et ANOVA ont été utilisés pour les statistiques non paramétriques. Des analyses bivariées et multivariées ont également

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été effectuées à l'aide de modèles de régression logistique pour estimer les facteurs associés aux stades avancés de l'infection par le VIH. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel SPSS version 13.0. Toutes les valeurs de P étaient bilatérales et étaient considérées comme significatives à <0,05.

3. Principaux résultats

3.1. Caractéristiques de la cohorte Les caractéristiques cliniques et démographiques des 167 patients infectés par le VIH-1 inclus dans cette étude (tableau XVII) sont compatibles avec le diagnostic fréquent du VIH chez les hétérosexuels. L'étude incluait des patients avec une moyenne de 43 ans (SD ± 11), la majorité étant des hommes (70,7%). Le diagnostic d'infection par le VIH aux stades avancés (stade B et C) était dans 52,7% des cas. La médiane de la charge viral plasmatique était de 5,14 [4,42-5,77] Log copies d'ARN de VIH / ml de plasma, alors que la médiane du nombre de CD4 (avant le début du traitement antirétroviral) était de 300 [160-473] cellules / mm3.

Tableau XVII : Caractéristiques démographiques et cliniques des patients

Characteristiques Valeur N= 167 ( 100%) Age, moyen (SD) 43 (±11)

sexe

Homme 118 (70.7)

Femme 49 (29.3)

Catégorie d'exposition

Hétérosexuel 147 (88)

autre 20 (12)

Catégorie clinique (CDC)

A 79 (47,3)

B 49 (29,4)

C 39 (23,3)

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Charge Viral Plasmatique (Log 5,14 [4,42-5,77] copies/ml) Median [interquartile range]

<3 7 (4,3)

3-5 73 (43,7)

>5 87 (52)

Nombre de cellule CD4 (cellules/µl) 300 [160-473]

Median [interquartile range]

<200 50 (30)

200-350 46 (27,5)

350-500 34 (20,4)

>500 37 (22,1)

3.2. Distribution de l'allèle HLA-B * 44 Parmi les 167 individus génotypés, 26 (16%) exprimaient l'allèle HLA-B * 44. Comme le montre la figure 38, l'amplification de HGH s'est produite dans tous les échantillons avec des bandes de 439 pb et le produit de 254 pb a été détecté dans les échantillons portant l'allèle HLA-B * 44.

Figure 38 : Électrophorèse sur gel d'agarose illustrant les produits de PCR pour l'allèle HLA- B * 44.

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Légende :

- Au niveau des puits N° 1 à gauche (M) : marqueur de poids moléculaire de 100 pb. - Au niveau des puits N°2 CP (Contrôle positif) : Il y a deux produit formés, le premier entre 200 et 300 paires de base (pb) ; ce qui correspond à la taille du fragment attendu (254 pb) de l’allèle HLA-B*44, le deuxième entre 400 et 500pb ce qui correspond à la taille du fragment du contrôle interne HGH (439pb). Les échantillons qui ont donné des résultats similaires ont été déclarés porteurs de l’allèle HLA-B*44 (échantillons S4 ,S5,S6, S7) , alors que les échantillons qui n’ont pas donné des résultats similaires n’étaient donc pas positifs et les patients correspondants ont été considérés non porteurs d’allèle HLA-B*44 (échantillons S1,S2,S3).

Au moment du diagnostic, les catégories cliniques : la médiane de la CVp et du nombre des cellules CD4 diffère significativement (p = 0,0001, p = 0,001 et p = 0,0001 respectivement) entre les patients exprimant l'allèle HLA-B * 44 et les patients n'exprimant pas cet allèle (Tableau XVIII). L'âge, le sexe et la catégorie d'exposition ne différaient pas significativement entre les deux groupes.

Tableau XVIII : Distribution de l'allèle HLA-B * 44 et comparaison statistique entre les deux groupes. Characteristiques HLA-B*44 allele Valeur p Presence d’allele Absence d’allele N = 26 (16 %) N = 141 ( 84 %) Age, moyenne (SD) 40 (±12) 44 (±11) 0,81 Sexe 0,059 Homme 14 (53,8) 104 (73,8) Femme 12 (46,2) 37 (26,2) Catégorie d'exposition 0,74 Heterosexual 24 (92,3) 123 (87,2) Other 2 (7,7) 18 (12,8) Catégorie Clinique (CDC) 0,0001 A 22 (84,6) 57 (40,1) B 2 (7,7) 47 (33,6) C 2 (7,7) 37 (26,3)

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Charge Viral Plasmatique(Log 4,93[4,39-5,67] 5,42[4,78-5,94] 0,001 copies/ml) Median [interquartile range] <3 0 (0) 7 (5) 3-5 19 (73) 54 (38,3) >5 7 (27) 80 (56,7) Nombre de cellule CD4 495 [367-600] 269 [141-408] 0,0001 (cellules/µl) Median [interquartile range] <200 4 (15,4) 46 (32,6) 200-350 2 (7,7) 44 (31,2) 350-500 7 (26,9) 27 (19,1) >500 13 (50) 24 (17,1)

3.3. Association entre l'allèle HLA-B*44 et les caractéristiques cliniques et démographiques. Selon la différence significative entre les patients exprimant l'allèle HLA-B*44 et les patients qui ne l’exprimaient pas, nous avons exploré les associations d'allèle HLA-B*44 avec les paramètres du VIH-1. Le test de Chi2 a montré que la présence de l'allèle HLA-B*44 était significativement associée au nombre de la CVp et les cellules T CD4 (p = 0,0001 et p = 0,0001). Nous avons également évalué les facteurs associés aux stades avancés (stade B et C) de l'infection par le VIH-1. L'analyse bivariée a montré que l'expression de l'allèle HLA-B*44 était fortement associée aux stades avancés de l'infection par le VIH-1 (ratio odd (OR) 0,12 (intervalle de confiance à 95% (IC) 0,04-0,37), p = 0,0001). Dans le modèle multivarié, seul le sexe, une pVL moyenne à faible et une numération des cellules T CD4 inférieure étaient associés aux stades avancés de l'infection par le VIH (tableau XIX).

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Rôle des gènes du HLA dans la variabilité interindividuelle de la réponse à l’infection par VIH-1

Tableau XIX : Analyses bivariées et multivariées des facteurs associés aux stades avancés de l'infection par le VIH

Analyse bivariée analyse Multivariée OR IC 95% Valeur OR IC 95% Valeur P P Sexe Homme 2,59 1,28 - 5,22 0,008 4,20 1,58 -11,13 0,004 Femme 1 - - - - - Catégorie d'exposition Heterosexual 0,59 0,19 - 1,86 0,37 - - - Other 1 - - - - - Charge viral plasma < 3 0,22 0,03 - 1,32 0,100 0,42 0,05 - 3,07 0,39 3-5 0,24 0,12 - 0,48 0,0001 0,24 0,09 - 0,59 0,002 > 5 1 - - - - - Nombre de TCD4 < 200 28,31 8,61 - 93,02 0,0001 20,0 5,32 - 75,21 0,0001 200-350 10,35 3,50 - 30,62 0,0001 8,71 2,45 - 30,86 0,001 350-500 1,97 0,61 - 6,38 0,254 1,11 0,29 - 4,17 0,87 > 500 1 - - - - - HLA-B*44 allele Presence of allele 0,12 0,04 - 0,37 0,0001 3,85 0,96 - 15,45 0,056 Absence of allele 1 - - - - -

4. Discussion Le virus de l’immunodéficience humaine, l’agent responsable du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), détourne essentiellement le système immunitaire du corps en infectant et en tuant les lymphocytes T CD 4 (lymphocytes T auxiliaires). Avec le

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temps, le système immunitaire de l’organisme est compromis, ce qui entraîne l’installation des infections opportunistes.

Le VIH / sida est une pandémie mondiale avec environ 36,9 millions de personnes infectées à la fin de 2017 et environ 940 000 de morts à cause de complications liées au VIH. Au cours de la même période, environ 1,8 millions de personnes ont été infectées par le virus. Au Maroc, le nombre estimé de personnes vivant avec le VIH / sida était de 22.000 en 2016, dans la même année, 1.000 nouvelles infections par VIH-1 et 700 décès liés au sida.

Le taux de progression du SIDA est de trois principaux types ;  La progression lente (slow progression (SP)), où le SIDA se développe lentement entre 3 et 10 ans après la séroconversion;  Une non-progression à long terme (long-term non progression) (LTNP), lorsque la charge virale est indétectable (20 copies / mL) depuis plus de 10 ans et que les individus ne sont pas affectés;  Une progression rapide (PR), où le SIDA se développe entre 2 et 3 ans après l’infection (260). Pourquoi certains séropositifs développent-ils la maladie rapidement, alors que d'autres restent en bonne santé pendant des années, quand d'autres encore ne déclarent même jamais le Sida ? Afin de comprendre quelle est la particularité de ces personnes, et à terme tenter de transposer leur capacité dans un médicament ou un vaccin, des chercheurs américains (Massachusetts General Hospital, Massachusetts Institute of Technology, Harvard University) ont lancé en 2006 une étude intitulée International HIV controllers study ( 165). Presque 1.000 contrôleurs du VIH ont pris part à cette étude. Leurs génomes ont été comparés à ceux de 2.600 personnes infectées par le VIH chez qui le virus parvient à se multiplier normalement. Les équipes de recherche américaines impliquées dans le projet ont passé l'ADN des patients au crible, à la recherche de variations nucléotidiques dans la séquence (SNP) qui pourraient être liées au contrôle de l'infection. D'après la publication dans la revue Science, plus de 300 sites ont pu être identifiés, tous situés sur le chromosome 6, au niveau des gènes codant pour les protéines HLA. Les allèles HLA sont parmi les facteurs génétiques impliqués dans le ralentissement ou l’accelération de la progression de la maladie chez un patient (261). Les fréquences alléliques HLA, qui diffèrent d'une population ethnique à l'autre, peuvent avoir des effets spécifiques sur la progression de la maladie. Des études ont montré que les individus exprimant des allèles

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HLA tels que HLA-B*57,HLA-B*27 et HLA-B*44 ont progressé lentement vers le SIDA, tandis que ceux exprimant des allèles HLA tels que HLA-B*35 ont rapidement progressé vers le SIDA. A notre connaissance, cette étude représente la première analyse de l’association entre les allèles HLA et la progression de la maladie VIH chez la population marocaine. Le but de cette étude est de déterminer la fréquence de l’allèle HLA-B*44 en identifiant son association avec la progression de la maladie du VIH-1. Peu d'études ont été investiguées sur l’études de l'allèle HLA-B*44 chez des patients infectés par le VIH-1, car avant il n'a pas été définitivement associé à la virologie, à l'immunologie ou aux résultats cliniques. D’après le genotypage de l’allèle HLA-B*44, Les résultats obtenus ont montré que 16% des patients inclus dans cette étude exprimant l’allèle HLA-B*44, en comparaison avec les résultats de la première étude (HLA*B57 :01 positif (0%)) cette fréquence (16%) montre que HLA-B * 44 est un allèle commun chez la population marocaines. La prévalence de cet allèle est élevée par rapport aux autres populations, en 2011 Tang et al. a montré que chez la population subsahariens, dans 134 séroconverses, seuls 12 sujets (8,4%) ont exprimé HLA-B*44 (262). En outre, en 2013, Zhang et al. ont montré que 13 (10,3%) patients exprimaient l'allèle HLA-B*44 chez 126 patients chinois atteints d'une infection par le VIH (263). Cependant, la fréquence de cet allèle était similaire chez les sujets sains de la région méditéranienne. Au Maroc (251), en Espagne (264), en France chez les immigrants français du nord-africains (265) et en Tunisie (266), la fréquence des allèles chez les personnes en bonne santé était respectivement de 12,4%, 15,4%, 16,2% et 11,79%. D’après ces résultats ça montre que l’allèle HLA-B*44 a une prévalence non négligeable dans certains pays, donc on peut le considérer un allèle commun dans les populations. Les paramètres cliniques (catégorie clinique, numération des cellules pVL et CD4) diffèrent significativement (p = 0,0001, p = 0,001 et p = 0,0001 respectivement) entre les patients exprimant l'allèle HLA-B*44 et les patients n'exprimant pas cet allèle. En outre, la présence de l'allèle HLA-B*44 était significativement associée au nombre moyenne à faible de CVp et au nombre inférieur de lymphocytes T CD4 (p = 0,0001 et p = 0,0001 respectivement). Il faut tout d’abord noter que le VIH-1 échappe au système immunitaire en induisant une diminution d’expression des HLA de classe I à travers la protéine Nef. A cause des différences de séquences dans le domaine cytoplasmique, les HLA-A et –B sont plus affectés par Nef que les HLA-C et E (267). Néanmoins, une étude a montré que le domaine

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cytoplasmique du HLA-B est plus résistant à la régulation médiée par Nef comparé au HLA- A. Ces différences de régulation ont un effet sur la reconnaissance des cellules infectées par les LT CD8+in vitro. Rajapaksa et al. Emettent l’hypothèse que la relative résistance de régulation du HLA-B comparé au HLA-A contribue au meilleur contrôle du VIH par les réponses des LT CD8+ restreintes par le HLA-B (268) et permettrait d’expliquer la forte corrélation de certains HLA-B avec un meilleur pronostic. Une étude thaïlandaise a montré que dans l’analyse de la relation entre les sérotypes HLA de classe I et la réponse des LT CD8+ cytotoxiques (CTL), seul HLA-B*44 était associé de manière significative à la lyse spécifique du VIH-1 induite par le vaccin (OR 7.6, 95% IC: 2,71 à 22,22, P <0,001)(269). Dans un rapport ultérieur, il a été établi que l’allèle B*44 était associé à la résistance au VIH (270). Dans la présente étude, les paramètres cliniques (catégorie clinique, numération des cellules pVL et CD4) diffèrent significativement (p = 0,0001, p = 0,001 et p = 0,0001 respectivement) entre les patients exprimant l'allèle HLA-B*44 et les patients n'exprimant pas cet allèle. En outre, la présence de l'allèle HLA-B*44 était significativement associée au nombre inférieur de CVp et au nombre faible de lymphocytes T CD4 (p = 0,0001 et p = 0,0001 respectivement). A propos de la charge virale plasmatique, nos résultats sont cohérents avec les résultats obtenus en Afrique subsaharienne à partir de 134 VIH-1 (262) et avec les résultats chinois de 126 patients infectés par le VIH-1(263). Tang et al ont montré que chez les Africains sub-sahariens, l'allèle HLA-B * 44 était associé à une CVp plus faible (P = 0,026) et à des numérations de CD4 plus élevées (P = 0,022). L’étude de Tang a révélé une association significative entre l’allèle HLA-B*44 et le contrôle de la virémie VIH-1 à la fois pendant la phase aiguë et la phase chronique précoce de l'infection (262). Aussi, Zhang et al. ont rapporté que les patients exprimant l'allèle HLA-B*44 présentaient des charges virales de consigne significativement plus faibles que ceux qui n'exprimaient pas l'allèle B*44 (263). Une autre étude par Scorza et al a montré que HLA-B*44 est un facteur de résistance possibles au développement du SIDA (270) A l’aide d’une analyse bivariée, une association significative entre l'allèle HLA-B*44 et les stades avancés de l'infection par le VIH (OR 0,12 (IC à 95% 0,04-0,37) p = 0,0001) a été observée, mais aucune association directe a été observée entre la présence de cet allèle et les stades cliniques de l'infection par le VIH en analyse multivariée.

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Comme les allèles HLA-B*57 et HLA-B*27, l’allèle HLA-B*44 pourrait être considéré comme un bons marqueur de pronostic. L'induction de l’association entre HLA-B*44 et la progression négative de VIH peut être importante pour stratégies de vaccination.

5. Conclusion Cette étude renforce l’importance des allèles HLA-B dans la détermination des résultats de l’infection par le VIH. Nous avons décrit pour la première fois au Maroc l'association de l'allèle HLA-B*44 avec les paramètres cliniques de l'infection par le VIH, il a une influence sur la diminution de la charge virale plasmatique. Ces résultats élargissent nos connaissances sur la distribution et l'effet de cet allèle dans la population marocaine, où des études supplémentaires et de grande envergure dans le contexte de l'infection par le VIH sont encore nécessaires.

6. Publication Ce travail a fait l’objet d’une publication dans la revue International Journal of Research in Medical Sciences. Fatima Youssoufi, Hicham El Annaz, Abdelilah Laraqui, Reda Tagajdid, Rachid Abi, Safae Elkochri, Rachid Frikh, Tahar Bajjou, Naoufal Hjira, Yassine Sekhsokh, Saad Mrani. HLA-B*44 allele associated with clinical parameters in HIV-1 infected Moroccan cohort. Int J Res Med Sci. 2019 Apr;7(4):1354-1359.

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Résumé

Les facteurs génétiques de la variabilité interindividuelle de la réponse à l’infection par le VIH-1

Auteur : Fatima YOSSOUFI

Mots clés : HIV, HLA-B*57 :01, Abacavir, HLA-B*44, Morocco

L’étude a été réalisée chez 167 patients infectés par le VIH-1, les allèles HLA-B*57 :01 et HLA-B*44 ont été génotypés par sequence specific primer PCR (SSP PCR).

La première étude de ce travail a été consacrée à l’étude de la prévalence de l’allèle HLA-B*57 :01. Les résultats ont montré que la fréquence de cet allèle était plus faible chez les patients marocains (0%). Nous pourrions conclure que l’allèle HLA-B*57 :01 n'est pas un allèle commun chez les marocains, donc la prescription de l’abacavir n’aura pas un effet néfaste pour les patients infectés par le VIH et le dépistage de l’allèle HLA- B*57 :01 ne serait pas une stratégie rentable et efficace au Maroc.

Abstract Genetic factors of interindividual variability in the response to HIV-1 infection

Author: Fatima YOSSOUFI

Keywords: HIV, HLA-B*57:01, Abacavir, HLA-B*44, Morocco

The objective of this work is to investigate the prevalence of the HLA-B*57: 01 and to determine the prevalence of HLA-B*44 and its association with progression of infection in HIV-infected patients.

The study was conducted in 167 HIV-infected patients, the HLA-B*44 and HLA-B*57:01 alleles were genotyped by sequence specific primer PCR (SSP PCR).

Equipe de Recherche en Virologie moléculaire et Onco-Biologie (ERVMOB) Centre de Génomique des Pathologies Humaines (GENOPATH)