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Aus dem Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

SIND IMIDAZOLINREZEPTOREN AN DER BLUTDRUCKSENKUNG DURCH CLONIDIN-ARTIGE ANTIHYPERTENSIVA BETEILIGT ?

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

vorgelegt von Christina Bock-Ketterer geboren in Freiburg i. Br.

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Dekan: Professor Dr. rer. nat. M. Schumacher 1. Gutachter: Professor Dr. med. B. Szabo 2. Gutachter: Professor Dr. med. H. Neumann Jahr der Promotion: 2003

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Herrn Professor Dr. Bela Szabo danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, die Geduld, hervorragende Betreuung und stetige Hilfestellung bei der Durchführung der Arbeit.

Frau Dr. Nathalie Niederhoffer danke ich für die Zusammenarbeit und Unterstützung während der Arbeit im Labor.

Frau Claudia Schurr danke ich für die zuverlässige Aufbereitung der Blutproben.

Professor Dr. Klaus Starke und allen Angehörigen des Pharma- kologischen Instituts danke ich für die Hilfsbereitschaft und die freundliche kollegiale Zusammenarbeit.

Meiner Familie danke ich für die Unterstützung auf dem Weg durchs Studium und meinem Mann für die Geduld und Hilfe bei der Fertigstellung dieser Arbeit.

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Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:

Bock C, Niederhoffer N, Szabo B (1999) Analysis of the receptor involved in the central hypotensive effect of rilmenidine and moxonidine. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmakol 359(4):262-71

Szabo B, Bock C, Nordheim U, Niederhoffer N (1999) Mechanism of the sympathoinhibition produced by the clonidine-like drugs rilmenidine and moxonidine. A N Y Acad Sci 881: 253-64

Die Ergebnisse wurden auch auf einem Kongress präsentiert und in Abstraktform veröffentlich:

Bock C, Niederhoffer N, Szabo B (1998) Comparison of Rilmenidine and Moxonidine with α-methyldopa: are different receptors involved in the sympathoinhibition? Deutsche Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie 17.-19. März 1998 in Mainz (Poster)

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INHALTSVERZEICHNIS

1. Einleitung 6 2. Methode 19 2.1. Einleitung 19 2.2. Katheterherstellung 19 2.3. Operation 19 2.4. Experimente 21 2.5. Versuchsprotokoll 23 2.5.1. Versuchsprotokoll für Experimente mit α-Methyldopa 23 2.5.2. Versuchsprotokoll für Experimente mit Rilmenidin, Moxonidin oder Kochsalzlösung 24 2.6. Datenregistrierung 26 2.7. Plasmakatecholaminmessung 26 2.7.1. Katecholaminextraktion aus dem Plasma 27 2.7.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 27 2.8. Statistik 28 2.9. Substanzen 29 3. Ergebnisse 30 3.1. Ausgangswerte 30 3.2. Wirkung der Agonisten 30 3.3. Wirkung von Kochsalzlösung nach Applikation der Agonisten 33 3.4. Wirkung der Antagonisten nach Applikation der Agonisten 36 3.4.1. Wirkung der Antagonisten nach Applikation von α-Methyldopa 36 3.4.2. Wirkung der Antagonisten nach Applikation von Moxonidin 36 3.4.3. Wirkung der Antagonisten nach Applikation von Rilmenidin 38 3.5. Wirkung der Antagonisten nach Applikation von Kochsalzlösung 39 4. Diskussion 40 5. Zusammenfassung 49 6. Literaturverzeichnis 50

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1. EINLEITUNG

Bluthochdruck ist in unserer heutigen Gesellschaft eine sehr häufige Erkrankung, die das Gesundheitswesen beträchtlich belastet. Man geht in großen nordamerikanischen Studien von einer Prävalenz von 24% in der Population der über Achtzehnjährigen aus, mit zunehmender Prävalenz im Alter (Burt et al. 1995). Bluthochdruck ist die häufigste Ursache für einen Arztbesuch in den USA (Schappert & Nelson 1999). Als Risikofaktor für Gefäßkrankheiten wie koronare Herzkrankheit, Schlaganfall, terminale Niereninsuffizienz und periphere Gefäßkrankheit (Fiebach et al. 1989; MacMahon et al. 1990; Whelton et al. 1992; Stamler et al. 1993; Whelton 1994) sind der Bluthochdruck und seine Therapie eine große Herausforderung für viele Bereiche der Medizin. Pharmakotherapie und nicht pharmakologische Therapieansätze führen zu einer Senkung des Blutdruckes (Working Group on Primary Prevention of Hypertension 1993) und damit auch zu einer Senkung des Risikos, einen Herzinfarkt, Schlaganfall oder eine terminale Niereninsuffizienz zu erleiden (Shulman et al. 1989; Collins et al. 1990). β-Adrenozeptor-Antagonisten, Ca++-Kanalblocker, Diuretika, ACE- Hemmer und Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten sind Medikamente der ersten Wahl in der heutigen Therapie des arteriellen Hypertonus. Die in dieser Arbeit untersuchten Substanzen aus der Gruppe der Clonidin-ähnliche Antihypertensiva und α-Methyldopa (siehe Abbildung 1) sind als Medikamente der zweiten Wahl in der Therapie des arteriellen Hypertonus etabliert, wobei α-Methyldopa heute besonders in der Schwangerschaft Verwendung findet. Diese Substanzen wirken als Antisympathotonika. Sie senken zentral den Sympathikustonus und steigern den Vagustonus. Dies führt über Senkung des peripheren Gefäßwiderstandes und der Herzfrequenz - und damit des Herz-

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Cl N NH Clonidin NH Cl

N NH Rilmenidin O

OCH3 N H3C NH Moxonidin NH OCH3

Cl NH

CH NNHCNH2 Guanabenz

Cl

CH3

HO CH2 CNH2 COOH α-Methyldopa

HO

OH CH3 HO CH α-Methylnoradrenalin NH2 HO

ABBILDUNG 1: Strukturformeln von Clonidin und der verwendeten Agonisten zeitvolumens - zur Senkung des Blutdruckes (Kobinger 1978; Kobinger & Pichler 1990). α-Methyldopa ist die älteste zentralwirkende blutdrucksenkende Substanz (Oates et al. 1960). Dabei ist α-Methyldopa selbst nur eine Vorstufe der eigentlich wirksamen Substanz. α-Methyldopa wird in zwei

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Schritten über α-Methyldopamin zu α-Methylnoradrenalin decarboxyliert (Abbildung 1). α-Methylnoradrenalin aktiviert als falscher Neurotrans- mitter mit hoher Affinität α2-Adrenozeptoren und wird wie Noradrenalin selbst gespeichert, freigesetzt und wieder aufgenommen (Carlsson & Lindquist 1962; Day & Rand 1964). Clonidin, ein Imidazolinderivat, wurde 1962 von dem Chemiker H. Stähle auf der Suche nach neuen abschwellenden Nasentropfen bei Boehringer Ingelheim entwickelt. Überraschender Weise kam es bei der Anwendung der neuen Substanz zu einer ausgeprägten Sedierung, was zu weiteren Untersuchungen führte, bei denen zusätzlich eine Senkung von Blutdruck, Herzfrequenz und Speichelproduktion gefunden wurde. Damit wurde Clonidin zum Prototyp eines zentral wirkenden Antihypertensivums (Hoefke & Kobinger 1966; Klingspohr 1983). In den nächsten Jahren wurden noch andere zentral wirkende Antihypertensiva entwickelt (siehe Abbildung 1), unter anderem auch die in dieser Studie verwendeten Substanzen Rilmenidin (Laubie et al. 1985) und Moxonidin (Armah 1987; Armah et al. 1988). Die Wirkungsweise von Clonidin und seiner Abkömmlinge wurde in den Jahren nach 1962 erforscht. Man fand heraus, dass das lipophile Clonidin rasch die Bluthirnschranke überwindet und über zentrale Senkung des Sympathikustonus und zentral vermittelte Bradykardie den

Blutdruck senkt. Als verantwortliche Rezeptoren vermutete man α2- Adrenozeptoren in der Medulla oblongata. Bei rascher intravenöser Applikation kam es zu einem kurzen Anstieg des Blutdruckes, bevor es zur erwünschten blutdrucksenkenden Wirkung kam. Dies ist auf die

Aktivierung peripherer α2-Adrenozeptoren der glatten Gefäßmuskulatur zurückzuführen, die zu einer initialen Zunahme des Gefäßwiederstandes führt (Schmitt 1977; Van Zwieten et al. 1984; Kobinger & Pichler 1990).

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Für die zentrale Wirkungsweise spricht die Tatsache, dass man für dieselbe hypotensive Wirkung bei zentraler Applikation deutlich geringere Dosen von Clonidin benötigt als bei systemischer Applikation (Kobinger 1967; Sattler & Van Zwieten 1967). Der wahrscheinliche zentrale Wirkort für Clonidin-ähnliche Substanzen ist die rostrale ventrolaterale Medulla oblongata (RVLM) (Dampney 1994; Guyenet et al. 1995; Guyenet 1997; Eglen et al. 1998). In der RVLM liegen die Zellkörper der sogenannten präsympathischen Neurone. Diese Schrittmacherneurone innervieren exzitatorisch die präganglionären Neurone in der intermediolateralen Säule des Rückenmarkes und stellen durch ihre Schrittmachertätigkeit den Sympathikustonus her. Die Wirkung auf den Blutdruck und die Herzfrequenz wird von dort über die sympathischen Ganglien an die Blutgefäße und ans Herz weitergegeben (Abbildung 4). Durch Hemmung der Neurone in der RVLM kommt es so also zur Blutdrucksenkung und Bradykardie. Für die typischen Nebenwirkungen Sedierung und Mundtrockenheit sind vermutlich α2-Adrenozeptoren in anderen Zentren des Gehirns verantwortlich. So geht man davon aus, dass die Sedierung durch eine Senkung der Frequenz von Neuronen im Locus coeruleus verursacht wird (De Sarro et al. 1987; Correa-Sales et al. 1992; Scheinin & Schwinn 1992). Wie es zur verminderten Speichelsekretion kommt, konnte bisher nicht sicher beantwortet werden. Es kommen drei verschiedene Angriffspunkte in Frage: erstens zentral im Hirnstamm (Green et al. 1979; Warren et al. 1991), zweitens durch Hemmung von postganglionären cholinergen Neuronen in den Speicheldrüsen (Montastruc et al. 1989; Izumi et al. 1995) oder drittens direkt an den Drüsenzellen in den Speicheldrüsen (Kaniucki et al. 1984; Lung 1994, 1998).

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O N Idazoxan O NH

CH2CH3 O N Efaroxan NH

Yohimbin N NH H3C H

H OH3C C O OH

Cl

N CH3 SK&F86466

ABBILDUNG 2: Strukturformeln der verwendeten Antagonisten

Eine neuere Hypothese vermutet, dass nicht α2-Adrenozeptoren sondern I1-Rezeptoren in der RVLM für die antisympathotone Wirkung von Clonidin und besonders seinen Abkömmlingen wie Moxonidin und Rilmenidin verantwortlich sind. Direkt in den der RVLM entsprechenden Nucleus reticularis von Katzen injizierte Imidazolinabkömmlinge verursachten eine Blutdrucksenkung. α2-Adrenozeptor-Agonisten ver- ursachten hingegen keine Blutdrucksenkung (Bousquet et al. 1984). In Radioligand-Bindungsstudien zeigte sich, dass Clonidin und seine chemischen Abkömmlinge in der Medulla oblongata auch an - im

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weiteren als Imidazolinbindungsstellen bezeichneten - „Nicht-α2-Adreno- zeptoren-Bindungsstellen“ binden (Ernsberger et al 1987, 1990). Sie wurden Imidazolinbindungsstellen genannt, weil Substanzen mit Imidazolinstruktur höhere Affinität zu diesen Bindungsstellen besitzen als die Katecholamine Noradrenalin und Adrenalin. Injizierte man diese Substanzen in die RVLM von Ratten, korrelierte die hypotensive Wirkung eher mit der Affinität zu den Imidazolinbindungsstellen als mit der Affinität zu den α2-Adrenozeptoren (Ernsberger et al. 1990). Durch weitere Untersuchungen fand man drei verschiedene

Imidazolinbindungsstellen: I1-, I2- und I3-Rezeptoren.

I1-Rezeptoren sind besonders Clonidin empfindlich, man findet sie vor allem in der Medulla oblongata und sie sollen für die kardiovaskulären Effekte verantwortlich sein.

I2-Rezeptoren sind Idazoxan und weniger Clonidin empfindlich und im Zentralnervensystem und in vielen Geweben der Peripherie zu finden, wo sie die Enzymaktivität der Monoaminoxidase A und B in der äußeren Membran von Mitochondrien verändern (Eglen et al. 1998).

I3-Rezeptoren wurden der in β-Zellen des Pankreas gefunden und erhöhen dort die Insulinausschüttung (Morgan et al. 1999).

Für die Untersuchungen in unserer Studie sind die I1-Rezeptoren in der RVLM relevant, die für die Blutdrucksenkung verantwortlich sein sollen. Da Rilmenidin und Moxonidin eine hohe Affinität und mäßige Selektivität für diese neuen Rezeptoren zeigten, wurde postuliert, dass auch ihre antisympathotone Wirkung über diese Imidazolinrezeptoren vermittelt wird. Diese so genannte Imidazolinhypothese geht davon aus, dass Clonidin-ähnliche Substanzen wie Rilmenidin und Moxonidin durch ihre hohe Affinität zu I1-Rezeptoren an den I1-Rezeptoren in der RVLM

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ihre hypotensive Wirkung entfalten. Weil ihre Affinität zu α2-Adreno- zeptoren geringer ist, sollen α2-Adrenozeptor-vermittelten Neben- wirkungen wie Sedierung und Mundtrockenheit geringer ausgeprägt sein (Ernsberger et al. 1995; Ernsberger & Haxhiu 1997; Bousquet & Feldman 1999; Head & Burke 2000). Die Imidazolinhypothese wurde durch drei Beobachtungen unterstützt. Die erste Beobachtung war, dass in einigen Studien direkt in die

RVLM injizierte α2-Adrenozeptor-Agonisten keine oder eine deutlich geringere Blutdrucksenkung als Imidazolinderivate verursachten (Ernsberger et al. 1990; Buccafusco et al. 1995). Die blutdrucksenkende

Wirkung der Imidazoline korrelierte dabei mit ihrer I1-Rezeptor-Affinität.

Die zweite Beobachtung war, dass I1-Rezeptor-Antagonisten die blutdrucksenkende Wirkung von I1-Rezeptor-Agonisten effektiver als α2- Adrenozeptor-Antagonisten blockierten (Ernsberger et al. 1990; Feldmann et al. 1990; Gomez et al. 1991; Tibiriça et al. 1991; Majorov et al. 1993; Haxhiu et al. 1994; Mao & Abdel-Rahman 1996; Tolentino-Silva et al. 2000). Die Interaktion von Antagonisten und Agonisten auf den Blutdruck bei intracisternaler Applikation, wie in der vorliegenden Arbeit, wurde von drei Arbeitsgruppen untersucht (Sannajust & Head 1994; Chan et al. 1996; Szabo & Urban 1997). Das Resümee dieser letzteren Arbeiten war, dass die Clonidin-ähnlichen Substanzen über Aktivierung von I1-Rezeptoren den Sympathikustonus senken. Die dritte Beobachtung war, dass die Imidazolinagonisten Rilmenidin und Moxonidin den Blutdruck senken ohne - oder mit einem deutlich geringeren - Einfluss auf α2-Adrenozeptor-vermittelte Neben- wirkungen. Untersuchungen beim Menschen zeigten, dass bei gleicher hypotensiver Wirkung Rilmenidin geringere Sedierung und Tabelle 1

Affinitäten der Agonisten für α2-Adrenozeptoren und I1-Rezeptoren in Radioligand-Bindungsstudien

Clonidin Rilmenidin Moxonidin Guanabenz α-Methylnoradrenalin

α2 I1 α2 I1 α2 I1 α2 I1 α2 I1 Spezies Quelle - 13

5 1 11 > 106 360 89000 Rind Ernsberger et al. 1990

4 1 180 6 75 2 7 >10000 2 2500 Rind Ernsberger et al. 1993 - 13

15 Rind Molderings et al. 1993 - 13

220 590 5000 240 Rind Czerwiec et al. 1996 412 593 >20000 Mensch Bricca et al. 1994 55 Mensch Piletz & Sletten 1993

9 (α2A) 55 36 59 13 4 2 35 Mensch Piletz et al. 1996

31 (α2B) 43 10 3

9 (α2C) 13 16 1 371 15 2371 11 1065 1,3 Kaninchen Hamilton et al. 1991 34 81 >20000 49 >20000 Kaninchen Bricca et al. 1993 8 Ratte Separovic et al. 1996

Alle Angaben sind als Ki oder IC50 Werte in nM angegeben, wobei die IC50 Werte auf Grund der Tatsache,.daß sie in Konzentrationen nahe der Dissoziationskonstanten verwendet wurden mit den Ki Werten vergleichbar sind. Tabelle 2

Affinitäten der Antagonisten für α2-Adrenozeptoren und I1-Rezeptoren in Radioligand-Bindungsstudien

Idazoxan Efaroxan Yohimbin SK&F86466

α2 I1 α2 I1 α2 I1 α2 I1 Spezies Quelle

179 3200 Rind Ernsberger et al. 1987 61 186 84 93000 Rind Ernsberger et al. 1990

19 0,11 Rind Haxhiu et al. 1994 - 14

1020 52 441000 239 Mensch Piletz & Sletten 1993

12 (α2A) 1255 10 52 441000 Mensch Piletz et al. 1996

20(α2B) 10

235(α2C) 178 33 11500 Mensch Bricca et al. 1989a 152 Mensch Bricca et al. 1994 120 1,5 22 21810 Kaninchen Hamilton et al. 1991 20 1216 568 >20000 6 Kaninchen Bricca et al. 1993 2 2570 Ratte Separovic et al. 1996

Alle Angaben sind als Ki oder IC50 Werte in nM angegeben, wobei die IC50 Werte auf Grund der Tatsache,.daß sie in Konzentrationen nahe der Dissoziationskonstanten verwendet wurden mit den Ki Werten vergleichbar sind.

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Mundtrockenheit verursachte als Clonidin (Weerasuriya et al. 1984; Fillastre et al. 1988). Moxonidin zeigte ein ähnliches Wirkungsmuster (Plänitz 1984; Plänitz 1987), wobei sich in einer der beiden Studien die sedierende Wirkung von Moxonidin und Clonidin nicht deutlich unterschied (Plänitz 1987). In den Abbildungen 1 und 2 sind die wichtigsten Substanzen, die in kardiovaskulären Experimenten zur Klärung der Rolle der beteiligten Rezeptoren Verwendung finden, aufgeführt. In Tabelle 1 und 2 sieht man ihr Verhalten in Radioligand-Bindungsstudien mit den Affinitäten zu α2- und I1-Bindungsstellen in verschiedenen Geweben. Die Imidazolin- Forschung wird durch die Tatsache, dass keine der verwendeten Substanzen eine richtige Selektivität für einen der beiden Rezeptoren aufweist, erschwert. Die in kardiovaskulären Experimenten als Imidazolinagonisten hauptsächlich verwendeten Substanzen – Clonidin,

Rilmenidin und Moxonidin - sind gleichzeitig auch α2-Adrenozeptor-

Agonisten. Auch die I1-Rezeptor-Antagonisten Efaroxan und Idazoxan sind zusätzlich sehr potente α2-Adrenozeptor-Antagonisten. Die Tabellen zeigen noch ein zweites Problem: die Affinitäten für I1-Bindungsstellen der wichtigen Substanzen Moxonidin, Guanabenz und Efaroxan variieren erheblich in den Untersuchungen der verschiedenen Arbeitsgruppen. Experimente, die die Interaktion von Antagonisten mit Agonisten untersuchen, sind wichtig für die Entscheidung zwischen der

Imidazolinhypothese und der α2-Adrenozeptorhypothese. Die Ergebnisse der Studien zu diesem Thema sind nicht eindeutig:

Auf der einen Seite gibt es einige Arbeiten, in denen selektive α2- Adrenozeptor-Antagonisten die Wirkung von Clonidin, Rilmenidin und Moxonidin vollständig aufheben; dementsprechend wurde auf eine

Beteiligung von α2-Adrenozeptoren geschlossen (Timmermanns et al.

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1981; Tibiriça et al. 1988; Hieble and Kolpak 1993; Szabo et al. 1993; Sannajust & Head 1994; Urban et al. 1994, 1995a; Chan et al. 1996). Einige Autoren erklären diese Wirkung als funktionellen Antagonismus.

Die α2-Adrenozeptor-Antagonisten reagieren nicht direkt mit I1- Rezeptoren, sondern sie interferieren mit der Kette von Ereignissen, an deren Ende die Senkung des Sympathikustonus steht (Sannajust & Head 1994; Chan et al. 1996). Auf der anderen Seite gibt es Arbeiten, in denen die hypotensive

Wirkung von Clonidin, Rilmenidin und Moxonidin effektiver durch die I1-

Rezeptor-Antagonisten Efaroxan und Idazoxan als durch die α2- Adrenozeptor-Antagonisten Yohimbin, Methoxyidazoxan und SK&F86466 aufgehoben wird (Ernsberger et al. 1990; Feldman et al. 1990; Gomez et al. 1991; Tibiriça et al. 1991; Mayorov et al. 1993; Haxhiu et al. 1994; Sannajust & Head 1994; Chan et al. 1996; Szabo & Urban 1997). In diesen Untersuchungen wurde allerdings zum Teil nicht diskutiert, dass die schwächere Wirkung der α2-Adrenozeptor-Antagonisten auf eine zu niedrige Dosis zurückzuführen sein könnte. Auch die Möglichkeit, dass

Efaroxan und Idazoxan über α2-Adrenozeptoren wirken könnten, wurde experimentell nicht ausgeschlossen (Ernsberger et al. 1990; Feldman et al. 1990; Gomez et al. 1991; Tibiriça et al. 1991; Mayorov et al. 1993; Haxhiu et al. 1994). In der vorangehenden Arbeit aus unserer

Arbeitsgruppe (Szabo & Urban 1997) wurden die I1-Rezeptor-Agonisten

Moxonidin und Rilmenidin mit Guanabenz als α2-Adrenozeptor-selektiven Agonisten verglichen. Bei gleicher antagonistischer Wirkung von Efaroxan und Yohimbin gegen Guanabenz war Efaroxan effektiver gegen Rilmenidin und Moxonidin als Yohimbin. Dies wurde als Unterstützung für die Imidazolinhypothese gewertet. Guanabenz weist aber in einigen

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Untersuchungen auch eine hohe Affinität zu I1-Rezeptoren auf, ist also nicht α2-Adrenozeptor-selektiv (siehe Tabelle 1). Ziel der vorliegenden Arbeit war es eine Antwort auf die Frage zu finden, welcher Rezeptor für die zentrale blutdrucksenkende Wirkung der Clonidinderivate Rilmenidin und Moxonidin verantwortlich ist. In dieser Studie haben wir mit einem ähnlichen Protokoll wie in der vorherigen Studie (Szabo & Urban 1997) gearbeitet, es wurde aber α-Methyldopa an

Stelle von Guanabenz als selektiver α2-Adrenozeptor-Agonist verwendet. Der aktive Metabolit α-Methylnoradrenalin besitzt praktisch keine Affinität zu I1-Rezeptoren (siehe Tabelle 1). α-Methyldopa, Rilmenidin und Moxonidin wurden in Dosen verwendet, die eine gleiche Blutdrucksenkung verursachten. Diese Dosierung entsprach jeweils einer gerade submaximalen Dosierung auf der Dosis-Wirkungs-Kurve der Substanzen. Gegen diese Agonisten wurden drei Antagonisten eingesetzt. Yohimbin und SK&F86466 als selektive α2-Adrenozeptor-

Antagonisten und Efaroxan, die einzige Substanz, der eine I1-Rezeptor- Selektivität zugesprochen wird. Alle Substanzen wurden wachen Kaninchen direkt in die Cisterna cerebellomedullaris injiziert, also in die Nähe der kardiovaskulären Zentren des Hirnstamms. Tabelle 2 kann man entnehmen, dass Efaroxan einen Ki-Wert von 0,11 nM an I1-Rezeptoren und von 19 nM an α2-Adrenozeptoren hat (Haxhiu et al. 1994). Bei der

Studie sind wir von diesen Ki-Werten ausgegangen, auf die davon abweichenden Daten von Piletz et al. wird in der Diskussion eingegangen. Die Ki-Werte von Yohimbin werden mit >3200 nM an I1-

Rezeptoren und um 180 nM an α2-Adrenozeptoren angegeben.

SK&F86466 hat Ki-Werte an α2-Adrenozeptoren von 93000 nM und 84 nM an I1-Rezeptoren.

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Auf Grund dieser Daten und der Annahme, dass Rilmenidin und

Moxonidin ihre hypotensive Wirkung an I1-Rezeptoren in der RVLM entfalten und α2-Adrenozeptor-Antagonisten über einen funktionellen Antagonismus wirken, können zwei Vorhersagen getroffen werden.

Erstens sollte Efaroxan auf Grund seiner hohen I1-Rezeptor- Affinität sehr viel stärker die antisympathotone Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin antagonisieren als Yohimbin und SK&F86466, mit ihrer relativ niedrigen α2-Adrenozeptor-Affinität.

Zweitens sollte Efaroxan auf Grund seiner hohen I1-Rezeptor-

Selektivität (K1 an α2/ Ki an I1=190) sehr viel stärker die Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin aufheben als die von α-Methyldopa.

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2. METHODE

2.1. Einleitung

Die Experimente wurden an wachen Kaninchen beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht von 1,9 - 3,3 kg vorgenommen. In einer Voroperation wurde den Kaninchen ein Katheter in die Cisterna cerebellomedularis implantiert.

2.2. Katheterherstellung

Ein flexibler Polyethylenschlauch (ID: 0,28 mm; AD: 0,61 mm; Portex, Hythe, England) wurde mit Hilfe eines Heißluftföns im 90° Winkel umgebogen (siehe Abbildung 3). Das eine Ende wurde auf 8 mm gekürzt, das andere auf 250 mm. An das längere Ende wurden zwei 3 mm lange Schlauchstücke (ID: 0,75 mm; AD: 1,22 mm) in einem Abstand von 1 mm mit einem Cyanoacrylatkleber (Loctite 414; Loctite, Dublin, Irland) angebracht.

8 mm

7 mm

250 mm

ABBILDUNG 3: schematische Darstellung des intracisternalen Katheters

2.3. Operation

Zunächst wurde eine Ohrvene kanüliert (Abbocath® 26G; Abbott, Chicago, Illinois, USA). Über diesen Katheter erhielt das Kaninchen das

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Protuberantia occipitalis

Katheter

Cerebellum Cisterna cerebellomedullaris

Atlas

Columna inter- Ventriculus quartus mediolateralis Nucleus tractus solitarii Medulla oblongata

CVLM Sympathisches Ganglion

Herz und Blutgefäße

ABBILDUNG 4: Medianer Sagittalschnitt durch das Gehirn des Kaninchens. Eingezeichnet sind die Lage des Katheters in der Cisterna cerebellomedullaris die an der zentralen Blutdruckregulation beteiligten Neurone. (RVLM = rostrale ventrolaterale Medulla oblongata, CVLM = caudale ventrolaterale Medulla oblongata) intravenöse Steroidnarkotikum Saffan® (0,5 ml kg-1; enthält Alfadolon+Alfaxalon im Verhältnis 3:1). Anschließend wurden die Kaninchen mit einem Babytrachealtubus (AD: 3-4 mm; Portex, Hythe, England) intubiert. Die Narkose wurde dann bei Spontanatmung mit Halothan (1,5-4,0 % in Sauerstoff) in einem halboffenen System fortgeführt. Jetzt wurde der Kopf des Tieres in eine stereotaktische Halterung (Narishige, Tokio, Japan) eingespannt und der Nacken rasiert. Nach steriler Abdeckung und Hautdesinfektion wurde ein ca. 4 cm langer,

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medianer Schnitt von der Protuberantia occipitalis nach unten geführt, die Muskulatur darunter stumpf getrennt und die atlanto-occipitale Membran freipräpariert. Im rostralen Anteil der Membran wurde eine Tabaksbeutelnaht (DR-9-Faden, 0,5 metric, Serag-Wiessner, Naila) angelegt und in der Mitte derselben mit einer Injektionsnadel (AD: 0,55 mm) ein Loch gesetzt. Der Katheter wurde durch die Öffnung in die Cisterna cerebellomedullaris eingeführt und mit der Tabaksbeutelnaht, zwei Muskelannähten und zusätzlich mit Cyanoacrylatkleber (Loctite 416; Loctite, Dublin, Irland) fixiert (siehe Abbildung 4). Nach schichtweiser Naht der Muskelschichten wurde der Katheter subkutan bis zu einem zweiten Hautschnitt in Höhe der Schulterblätter und von dort nach außen geführt. Die Hautschnitte wurden verschlossen und die Narkose ausgeschaltet. Nach dem Erwachen wurde den Kaninchen 100000 I.E. Penicillin G i.v. verabreicht. Den Tieren wurde eine mindestens 14-tägige Erholungsphase vor dem ersten Experiment zugestanden. In dieser Zeit nahmen sie alle an Gewicht zu.

2.4. Experimente

Vor jedem Experiment wurde den Kaninchen an einem Ohr eine Lokalanästhesie mit 0,1 - 0,2 ml Xylocain 2% rechts und links der Arteria auricularis caudalis Ohres gesetzt. Anschließend wurde die Arterie mit einem Verweilkatheter (Abbocath® 20G; Abbott, Chicago, Il., USA) kanüliert. Über diesen Katheter wurde kontinuierlich der Blutdruck gemessen und aus diesem Signal die Herzfrequenz und der mittlere arterielle Druck berechnet. Zusätzlich wurde der Katheter zur Entnahme der Blutproben, die zur Katecholaminbestimmung benötigt wurden, verwendet. Zur Rückgabe des Blutes nach Zentrifugation wurde eine Ohrvene (Vena auricularis rostralis) kanüliert (Abbocath® 26G; Abbott,

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Plasmanoradrenalin Plasmanoradrenalin Blutdruck Blutdruck und und Herzfrequenz Herzfrequenz

Blutrückgabe

Medikamentenapplikation

ABBILDUNG 5: Versuchsaufbau während des Experimentes

Chicago, Il., USA). Nach Lokalanästhesie der Nahtstelle im Bereich des Schulterblattes mit 1-2 ml Xylocain 2%, wurde das Katheterende freigelegt. Nach diesen Vorbereitungen wurden die Kaninchen in eine sichtgeschützte Box (35 x 15 x 15 cm) gesetzt, in der sie für den Rest des Experimentes blieben (siehe Abbildung 5). Anschließend wurde ihnen eine 45-minütige Erholungsphase gewährt. Außerdem wurde darauf geachtet, möglichst wenig Störungen durch Lärm zu verursachen. An einem Tier wurden maximal neun Experimente durchgeführt. Zwischen den Experimenten wurde jeweils eine Wartezeit von mindestens sieben Tagen eingehalten. Bei α-Methyldopa sogar eine Wartezeit von mindestens zehn Tagen. Die Experimente erfolgten in einer randomisierten Reihenfolge und jedes Tier erhielt jedes Protokoll nur einmal.

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2.5. Versuchsprotokoll

Zunächst wurden die Ausgangswerte bestimmt: in 15-minütigem Abstand wurden Blutdruck und Herzfrequenz bestimmt und Blut zur Katecholaminmessung entnommen. Diese beiden Werte wurde jeweils gemittelt und ergaben den Ausgangswert (PRE). Anschließend wurde zunächst einer der Agonisten α-Methyldopa, Rilmenidin und Moxonidin oder Kochsalzlösung intracisternal appliziert. Nach Eintritt der maximalen Wirkung wurden in 15-minütigem Abstand drei bis fünf ansteigende Dosen eines der Antagonisten Efaroxan, Yohimbin und SK&F86466 oder Kochsalzlösung intracisternal appliziert. Der Effekt der Agonisten wurde als Differenz zu PRE angegeben. Die Effekte der Antagonisten wurden jeweils 15 Minuten nach Applikation gemessen und als Differenz zu t = 0 min, also zum maximalen Effekt der Agonisten, angegeben. Auf Grund der unterschiedlichen Dauer des Wirkeintrittes der Agonisten wurden zwei unterschiedliche Protokolle benutzt.

2.5.1. Versuchsprotokoll für Experimente mit α-Methyldopa

Bei diesem Protokoll (siehe Abbildung 6) wurde nach Bestimmung der Ausgangswerte α-Methyldopa mit einer Dosierung von 0,4 oder 1,2 mg kg-1 in einem Volumen von 50 µl kg-1 appliziert. Nach 90 Minuten erfolgte eine Blutentnahme. Bis zum Eintritt des maximalen sympatho- inhibitorischen Effekts von α-Methyldopa musste 180 Minuten gewartet werden und dieser Zeitpunkt wird im folgenden als t = 0 min definiert. Es erfolgte erneut eine Blutentnahme und anschließend wurde die erste von maximal fünf Dosen Efaroxan (0,1; 0,3; 1; 3 und 10 µg kg-1), Yohimbin (0,4; 1; 3 und 10 µg kg-1) oder SK&F86466 (0,4; 1; 3; 10 und 30 µg kg-1) oder von Kochsalzlösung mit einem Volumen von 25 µl kg-1 zu den

- 24 -

ABBILDUNG 6: Wirkung von α-Methyldopa, Kochsalz, Efaroxan, Yohimbin und SK&F86466 auf den mittleren arteriellen Druck (MAD). In allen vier Experimenten wurde zunächst α-Methyldopa (AMD; 0,4 mg kg-1) intracisternal appliziert. Erst nach 180 Minuten wurde die maximale blutdrucksenkende Wirkung erreicht. Dieser Zeitpunkt wurde als t=0 min definiert. Anschließend wurde Kochsalzlösung (SAL; 25 µl kg-1), Efaroxan (EFA; 0,1; 0,3; 1; 3; und 10 µg kg-1), Yohimbin (YOH; 0,4; 1; 3 und 10 µg kg-1) oder SK&F86466 (SKF; 0,4; 1; 3; 10 und 30 µg kg-1) verabreicht (siehe Pfeile).

Zeitpunkten t = 0, 15, 30, 45, 60 min verabreicht. Der Effekt wurde jeweils nach 15 Minuten gemessen.

2.5.2. Versuchsprotokoll für Experimente mit Rilmenidin, Moxonidin oder Kochsalzlösung

Bei diesem Protokoll wurde Rilmenidin mit einer Dosierung von 10 µg kg-1 oder Moxonidin mit einer Dosierung von 0,3 mg kg-1 mit einem Volumen von 25 µl kg-1 appliziert (siehe Abbildung 7). Hier war ein Intervall von 30 Minuten bis zum Erreichen des maximalen blutdrucksenkenden Effekts

- 25 -

ABBILDUNG 7: Wirkung von Moxonidin, Kochsalz, Efaroxan, Yohimbin und SK&F86466 auf den mittleren arteriellen Druck (MAD). In allen vier Experimenten wurde zunächst Moxonidin (MOX; 0,3 µg kg-1) intracisternal appliziert. Nach 30 Minuten wurde die maximale blutdrucksenkende Wirkung erreicht. Dieser Zeitpunkt wurde als t=0 min definiert. Anschließend wurde Kochsalzlösung (SAL; 25 µl kg-1), Efaroxan (EFA; 0,3; 1; und 3 µg kg-1), Yohimbin (YOH; 1,3; 3 und 10 µg kg-1) oder SK&F86466 (SKF; 4,3; 10 und 30 µg kg-1) verabreicht (siehe Pfeile). notwendig, weshalb dieser Zeitpunkt wieder als t = 0 min definiert wird. Nun folgte nach erneuter Blutentnahme die Applikation von drei ansteigenden Dosen Efaroxan (0,3; 1; und 3 µg kg-1), Yohimbin (1,3; 3 und 10 µg kg-1) oder SK&F86466 (4,3; 10 und 30 µg kg-1) oder von Kochsalzlösung wieder mit einem Volumen von 25 µl kg-1 bei t = 0, 15 und 30 min und Blutentnahmen jeweils 15 Minuten nach Gabe der Substanzen. Als Kontrollgruppe wurden Experimente mit Applikation von 25 µl kg-1 Kochsalzlösung nach PRE durchgeführt. Anschließend wurden vier

- 26 -

bis fünf Dosen von Kochsalzlösung oder Antagonist in ansteigender Dosierung in 15-minütigem Abstand nach t = 0 min appliziert.

2.6. Datenregistrierung

Der Blutdruck wurde über eine Arterie mittels eines Statham P 23 Db- Druckumwandlers (Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten) gemessen, der an ein HSE Elektromanometer (Typ 302, Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten) angeschlossen war. Die Herzfrequenz wurde aus diesem Signal mit einem EKA-Pulsintegrator (Typ 400, Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten) errechnet. Die Datenregistrierung erfolgte über einen Mehrkanallinearschreiber (WR3310 Linearcorder Mark VII, Graphtec Corporation, Yokohama, Japan). Zusätzlich konnte die Messung an einem digitalen Speicheroszilloskop (Gould, Seligenstadt) verfolgt werden.

2.7. Plasmakatecholaminmessung

Bei jeder Blutentnahme wurde den Tieren zunächst 1,1 ml Totraumvolumen und dann 2,2 ml Blut aus der Ohrarterie entnommen. Das Blut wurde sofort 2 Minuten bei 0 °C und mit 12000 U min-1 zentrifugiert. Danach wurden 1,1 ml Plasma abpipettiert. Das Plasma wurde mit 50 µl Na2SO3 (12,5%) und 50 µl Na2EDTA (10%) gemischt, in Eppendorfröhrchen gefüllt und bis zur Weiterverarbeitung bei –70 °C gelagert. Das Zentrifugat wurde mit 1 ml Heparin-Natrium-Lösung (100000 U Heparin-Natrium auf 1 l physiologische Kochsalzlösung) resuspendiert und bei der nächsten Blutentnahme mit dem Totraumvolumen über die Vene zurückgegeben.

- 27 -

2.7.1. Katecholaminextraktion aus dem Plasma

Zur weiteren Verarbeitung wurden die Proben aufgetaut und erneut 15 Minuten bei 4 °C und 5200 U min-1 zentrifugiert. Ein ml wurde in ein spezielles Mischgefäß (Greiner, Nürtingen) überführt. Es wurden 50 µl Dihydroxybenzylamin (100 ng ml-1) als interner Standard und 250 µl -1 Na2EDTA (1%), 250 µl Na2SO3 (1,25%), 300 µl TRIS HCl (2 mol l , pH

8,7) und 20 mg Al2O3 (Recipe, München) zugegeben. Danach wurde alles fünf bis zehn Minuten mittels eines Überkopfschüttlers gemischt. Nach Ersetzen des unteren Verschlusses durch einen Filtereinsatz, wurde der Überstand zweimal mit 1 ml destilliertem Wasser gewaschen und durch erneute Zentrifugation 2 Minuten bei 2 °C mit 2600 U min-1 abfiltriert. Die auf dem Filter an das Aluminiumoxid gebundenen Katechole wurden jetzt zweimal mit je 100 µl Perchlorsäure (0,1 mol l-1) eluiert. Nach jedem dieser Schritte wurde erneut 2 Minuten bei 2 °C mit 2600 U min-1 zentrifugiert.

2.7.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Das auf diese Weise konzentrierte und gereinigte Noradrenalin und Adrenalin wurde in den Perchlorsäureeluaten mit einem Waters Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (Waters, Eschborn) getrennt und quantitativ bestimmt. Die Anlage bestand aus einer Pumpe (Waters 510), einer automatischen Probeninjektionseinheit (Waters 712) einem elektrochemischen Detektor (Waters 460), einem Fraktions- kollektor (Retreiver IV, ISCO, Lincoln, Nebraska, USA) und einem Steuerungscomputer mit Maxima 820 Software (Waters, Eschborn), der die erhaltenen Chromatogramme automatisch speicherte. Die stationäre Phase bestand aus einer 5 µm Hypersil ODS Säule (125 x 4,6 mm, Bischoff, Leonberg) und wurde mit Hilfe eines

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Durchlaufkühlers konstant bei +22 °C gehalten. Die mobile Phase bestand aus 30 mM Zitronensäure, 15 mM Na2HPO4, 2 mM Na2EDTA und 1,7 mM Oktansulfat gelöst in einem Gemisch von destilliertem Wasser und Methanol im Verhältnis 90:10. Die Flussrate betrug 1 ml min-1 Nach Einspritzen von 100 µl des Perchlorsäureeluates wurden die Katecholamine Noradrenalin und Adrenalin getrennt und am elektrochemischen Detektor bei einer Spannung von 0,6 V zum Chinon oxidiert. Der bei der Oxidation entstehende Strom ist der Menge des oxidierten Katecholamins proportional. Das System wurde mit 150 µl Standard von Noradrenalin und Adrenalin mit einer Konzentration von 1 pg µl-1 und 10 pg µl-1 geeicht. Ausgewertet wurde der jeweilige Peak. Durch Zugabe einer definierten Menge von Katecholamin ( 5 ng ml-1) zu einer der Proben ließ sich die Ausbeute der Proben nach Aufarbeitung berechnen.

2.8. Statistik

Alle Werte sind als arithmetische Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwertes der Summe der Experimente angegeben. Zwischen den Ausgangswerten (PRE) und zwischen den einzelnen Punkten der Gruppen wurden die Unterschiede mit dem nicht parametrischen zweiseitigen Wilcoxon signed rank Test (SPSS for Windows, Version 8.0.0) durchgeführt. Wenn mehrfache Vergleiche durchgeführt wurden, wurde die Bonferroni-Korrektur angewendet. Das Signifikanzniveau wurde immer mit P < 0,05 angegeben, auch wenn es bei P < 0,01 oder P < 0.001 lag.

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2.9. SUBSTANZEN

Efaroxan-Hydrochlorid RBI, Köln

Halothan ICI, Plankstadt

Heparin-Natrium, 100000 U l-1, Grad II, Schweinemukosa Sigma, München

Moxonidin Beiersdorf-Lilly, Hamburg

Penicillin G Grünenthal, Stolberg

Rilmenidin-Dihydrogenphosphat Servier, Courbevoie, Frankreich

Saffan® Schweizerisches Seruminstitut, (Alfaxolon und Alfadolon-Acetat) Bern, Schweiz

SK&F86466 (6-Chloro-2,3,4,5-Tetrahydro-3-Methyl- SmithKline Beecham, King of 1H-3-Benzazepin-Hydrochlorid) Prussia, PA, USA

Xylocain 2%® (Lidocain-Hydrochlorid) Astra, Wedel

Yohimbin-Hydrochlorid Carl Roth, Karlsruhe

α-Methyldopa Sigma, Deisenhofen

Alle Substanzen wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, die Dosen beziehen sich auf die Salze.

- 30 -

3. ERGEBNISSE

3.1. Ausgangswerte

Fünfundvierzig Minuten nach Kanülierung einer Ohrarterie und Freilegung des Endes des intracisternalen Katheters unter der Haut wurden, noch vor Substanzgabe, die Ausgangswerte von Blutdruck, Herzfrequenz und Plasmakatecholaminen bestimmt. Der mittlere Blutdruck (n=143) betrug 76 ± 1 mmHg, die Herzfrequenz 217 ± 3 min-1 und die Plasmanoradre- nalinkonzentration 187 ± 8 pg ml-1. Damit lagen die Werte in einem ähnlichen Bereich wie bei vorherigen Versuchsreihen (Szabo et al. 1995; Urban et al. 1995a). Die Plasmaadrenalinkonzentration lag häufig unter der Nachweis- grenze, so dass eine statistische Auswertung nicht möglich war. Das zeigt aber auch, dass die Tiere insgesamt ruhig waren. Alle Substanzen wurden intracisternal appliziert.

3.2. Wirkung der Agonisten

Nach Bestimmung der Ausgangswerte wurden Kochsalzlösung, α- Methyldopa 0,4 und 1,2 mg kg-1, Moxonidin 0,3 µg kg-1 oder Rilmenidin 10 µg kg-1 injiziert. Die Injektion von Kochsalzlösung löste keine Wirkung auf Blut- druck, Herzfrequenz und Plasmanoradrenalinkonzentration aus (siehe Abbildung 8). Nach Injektion von α-Methyldopa sank der Blutdruck langsam (siehe Originalregistrat in Abbildung 6). Die maximale Blutdrucksenkung wurde nach 180 Minuten erreicht. In Abbildung 8 sind Werte gezeigt, die 180 min nach der Substanzapplikation bestimmt wurden. α-Methyldopa

- 31 - SAL 0,4 AMD 1,2 AMD RIL MOX

0

(mmHg) -10 + + + + mittlerer arterieller Druck ∆ -20

0 ) -1 (min -25 Herzfrequenz ∆

-50

0 ) -1 -50 + (pg ml + -100 +

Plasmanoradrenalin + ∆ -150

ABBILDUNG 8: Wirkung von den Agonisten und Kochsalzlösung auf den mittleren arteriellen Druck, die Herzfrequenz und die Plasmanoradrenalin- konzentration. α-Methyldopa (AMD) 0,4 mg kg-1 (n=41) und 1,2 mg kg-1 (n=8), Rilmenidin (RIL, n=34) 10 µg kg-1, Moxonidin (MOX, n=32) 0,3 µg kg-1 und Kochsalzlösung (SAL, n=18) 25 µl kg-1. Signifikante Veränderungen gegen PRE sind mit einem Stern gekennzeichnet (P<0.05).

0,4 und 1,2 mg kg-1 senkten den Blutdruck identisch (Abbildung 8 oben). Die Herzfrequenz wurde durch α-Methyldopa nicht verändert (Abbildung 8 Mitte). Die beiden Dosen senkten die Plasmanoradrenalinkonzentration ähnlich (Abbildung 8 unten).

- 32 -

Moxonidin (0,3 µg kg-1) senkte ebenfalls den Blutdruck. Bei dieser Substanz fand die Blutdrucksenkung schneller statt: bereits innerhalb von 30 Minuten wurde die maximale Wirkung erreicht (siehe Originalregistrat in Abbildung 7). Abbildung 8 zeigt die statistische Analyse der Moxonidinwirkungen 30 Minuten nach Substanzapplikation. Neben dem Blutdruck (Abbildung 8 oben) senkte Moxonidin die Plasmanoradrenalin- konzentration (Abbildung 8 unten). Auch Moxonidin veränderte die Herz- frequenz nicht (Abbildung 8 Mitte). Rilmenidin (10 µg kg-1) wirkte ähnlich wie Moxonidin: innerhalb von 30 Minuten wurde die maximale Wirkung erreicht (nicht gezeigt). Auch hier sanken Blutdruck (Abbildung 8 oben) und Plasmanoradrenalin- konzentration (Abbildung 8 unten), nicht aber die Herzfrequenz (Ab- bildung 8 Mitte). α-Methyldopa 0,4 und 1,2 mg kg-1, Moxonidin 0,3 µg kg-1 und Rilmenidin 10 µg kg-1 hatten also identische Wirkungen auf die gemessenen Parameter. Bei den weiteren Interaktionsexperimenten wurde die kleinere α-Methyldopa-Dosis (0,4 mg kg-1) verwendet. Es ist hier zu bemerken, dass diese Dosen von α-Methyldopa, Moxonidin und Rilmenidin submaximalen oder „gerade maximalen“ (α-Methyldopa) Dosen auf der Dosis-Wirkungs-Kurve der Substanzen entsprechen (Badoer et al. 1983; Szabo und Urban 1997). Da die Agonisten keine signifikante Wirkung auf die Herzfrequenz hatten, wurde die Herzfrequenz während des weiteren Verlaufs der Experimente nicht ausgewertet. Die fehlende Wirkung intracisternal applizierter Imidazoline auf die Herzfrequenz wurde schon bei früheren Experimenten beobachtet (Chan et al. 1996; Szabo und Urban 1997).

- 33 -

20 AMD 0,4 SAL SAL SAL SAL SAL

10

0 (mmHg)

-10 AMD+SAL mittlerer arterieller Druck ∆ -20

100

50

0 ) -1 -50 (pg ml -100 Plasmanoradrenalin

∆ -150 PRE -200 -180 0 1530456075min

ABBILDUNG 9: Wirkung von α-Methyldopa und Kochsalzlösung auf den mittleren arteriellen Druck und die Plasmanoradrenalinkonzentration. Nach Bestimmung der Ausgangswerte (PRE) wurde α-Methyldopa (AMD; 0,4 mg kg-1) intracisternal appliziert. Nach 180 Minuten trat die maximale Wirkung ein. Anschließend wurde zu den Zeitpunkten t = 0, 15, 30, 45 und 60 min Kochsalzlösung (SAL; 25 µl kg-1) intracisternal injiziert (n=8). Aufgeführt sind die Mittelwerte ± Standardfehler der Differenz zwischen PRE und den Messungen zu den Zeitpunkten t = 15, 30, 45, 60 und 75 min. Injektion von Kochsalzlösung löste keine signifikante Wirkung (P<0,05) aus.

3.3. Wirkung von Kochsalzlösung nach Applikation der Agonisten

Nach Erreichen der maximalen Blutdrucksenkung durch die Agonisten wurde in einem Teil der Experimente Kochsalzlösung mehrfach im Abstand von 15 Minuten injiziert. In keiner der Gruppen fand eine signifikante Änderung der Werte statt (siehe Abbildungen 6 und 7 für

- 34 -

SAL / RIL / 20 MOX SAL SAL SAL

10

SAL+SAL 0

(mmHg) RIL+SAL

-10 MOX+SAL mittlerer arteriellerDruck ∆ -20

100

50

0 ) -1 -50

(pg ml -100 Plasmanoradrenalin

∆ -150 PRE -200 -30-150 153045min

ABBILDUNG 10: Wirkung von Moxonidin, Rilmenidin und Kochsalzlösung auf den mittleren arteriellen Druck und die Plasmanoradrenalinkonzentration. Nach Bestimmung der Ausgangswerte (PRE) wurde Moxonidin (MOX; 0,3 µg kg-1; n=8) oder Rilmenidin (RIL; 10 µg kg-1; n=8) intracisternal appliziert. Nach 30 Minuten trat die maximale Wirkung ein. Anschließend wurde zu den Zeitpunkten t = 0, 15 und 30 min Kochsalzlösung (SAL; 25 µl kg-1) intracisternal injiziert. Eine Kontrollgruppe erhielt Kochsalzlösung nach PRE und zu den Zeitpunkten t = 0, 15 und 30 min (n=7). Aufgeführt sind die Mittelwerte ± Standardfehler der Differenz zwischen PRE und den Messungen zu den Zeitpunkten t = 15, 30, 45, 60 und 75 min. Injektion von Kochsalzlösung löste keine signifikante Wirkung (P<0,05) aus.

Originalregistrate und Abbildungen 9 und 10 für die statistische Analyse). Das heißt, dass die Blutdrucksenkung und die Senkung der Plasmanor- adrenalinkonzentration durch α-Methyldopa, Rilmenidin und Moxonidin während der Experimente konstant blieb.

- 35 -

30

20

AMD + EFA * * AMD + YOH

(mmHg) * 10 * AMD + SKF * * * *

mittlerer arterieller Druck arterieller mittlerer *

∆ * 0 * 110 30 * RIL + YOH RIL + EFA * 20 RIL + SKF * * * (mmHg) 10 * mittlerer arterieller Druck ∆ 0 110

30

MOX + YOH

20 * MOX + EFA *

(mmHg) * * 10 * MOX + SKF * mittlerer Druck arterieller ∆ 0 110

-1 Antagonistendosis (µg kg )

ABBILDUNG 11: Interaktion der Antagonisten mit den Agonisten und deren Wirkung auf den mittleren arteriellen Druck. Zunächst wurde α-Methyldopa (AMD; 0,4 mg kg-1; oberes Feld), Rilmenidin (RIL; 10 µg kg-1; mittleres Feld) oder Moxonidin (MOX; 0,3 µg kg-1; unteres Feld) intracisternal appliziert. Nach Erreichen der maximalen Wirkung wurden mehrere Dosen der Antagonisten Efaroxan (EFA), Yohimbin (YOH) oder SK&F86466 (SKF) in 15-minütigen Abständen intracisternal verabreicht – hier in kumulativen Dosen gezeigt. Nicht gezeigt ist die niedrigste Dosis Efaroxan in der α-Methyldopa-Gruppe (0,1 µg kg-1). Aufgeführt sind die Mittelwerte ± Standardfehler der Differenz zwischen der Wirkung der Antagonisten und der maximalen Wirkung der Agonisten zum Zeitpunkt t = 0 min (n=8-13). Signifikante Veränderungen gegen t = 0 min sind mit einem Stern gekennzeichnet (P<0,05)

- 36 -

3.4. Wirkung der Antagonisten nach Applikation der Agonisten

Nach Erreichen der maximalen Blutdrucksenkung durch die Agonisten wurden Antagonisten in steigenden Dosen im Abstand von 15 Minuten injiziert. Generell erhöhten die Antagonisten den Blutdruck und die Plasmanoradrenalinkonzentration in diesen Experimenten.

3.4.1. Wirkung der Antagonisten nach Applikation von α-Methyldopa

Nach Applikation ansteigender Dosen von Efaroxan, Yohimbin und SK&F86466 stieg der mittlere arterielle Druck dosisabhängig an (siehe Abbildung 6 für Originalregistrate und Abbildung 11 oben für die statistische Analyse). Efaroxan war der potenteste Antagonist mit einer etwa zehnfach stärkeren Potenz als Yohimbin und SK&F86466. Der maximale Effekt von Efaroxan war auch höher als der Effekt der anderen Antagonisten. Die Tiere reagierten auf höhere Dosen von Yohimbin und SK&F86466 mit starker Erregung, so dass keine höheren Dosen verwendet werden konnten. Die Wirkung der Antagonisten auf die Plasmanoradrenalin- konzentration war weniger eindeutig als die Wirkung auf den Blutdruck. Die Antagonisten scheinen aber die Plasmanoradrenalinkonzentration erhöht zu haben (obwohl die Wirkungen nicht signifikant waren) (Abbildung 12 oben). Wie bei dem Blutdruck war auch hier Efaroxan am potentesten.

3.4.2. Wirkung der Antagonisten nach Applikation von Moxonidin

Nach Applikation ansteigender Dosen von Efaroxan, Yohimbin und SK&F86466 stieg der mittlere arterielle Druck dosisabhängig an (siehe Abbildung 7 für Originalregistrate und Abbildung 11 unten für die

- 37 -

200

150 AMD + SKF )

-1 100

MOX + YOH(8) AMD + YOH

(pg ml 50 AMD + EFA Plasmanoradrenalin

∆ 0 RIL + YOH(8)

-50 110

200

150 * RIL + YOH RIL + EFA(8)

) RIL + EFA RIL + SKF

-1 100 MOX + EFA(8)

AMD + EFA(11)*

(pg ml 50 *

Plasmanoradrenalin SAL + EFA(6)

∆ 0

-50 110

200 * * 150 MOX + EFA MOX + SKF )

-1 100 MOX + YOH

(pg ml 50 Plasmanoradrenalin

∆ 0

-50 110

-1 Antagonistendosis (µg kg )

ABBILDUNG 12: Interaktion der Antagonisten mit den Agonisten und deren Wirkung auf die Plasmanoradrenalinkonzentration. Zunächst wurde α-Methyldopa (AMD; 0,4 mg kg-1; oberes Feld), Rilmenidin (RIL; 10 µg kg-1; mittleres Feld) oder Moxonidin (MOX; 0,3 µg kg-1; unteres Feld) intracisternal appliziert. Nach Erreichen der maximalen Wirkung wurden mehrere Dosen der Antagonisten Efaroxan (EFA), Yohimbin (YOH) oder SK&F86466 (SKF) in 15-minütigen Abständen intracisternal verabreicht – hier in kumulativen Dosen gezeigt. Nicht gezeigt ist die niedrigste Dosis Efaroxan in der α-Methyldopa-Gruppe (0,1 µg kg-1). Aufgeführt sind die Mittelwerte ± Standardfehler der Differenz zwischen der Wirkung der Antagonisten und der maximalen Wirkung der Agonisten zum Zeitpunkt t = 0 min (n=8-13). Signifikante Veränderungen gegen t = 0 min sind mit einem Stern gekennzeichnet (P<0,05)

- 38 -

statistische Analyse). Efaroxan war wieder der potenteste Antagonist mit einer etwa zehnfach stärkeren Potenz als Yohimbin und SK&F86466. Die höchsten Dosen steigerten den mittleren arteriellen Druck über den Ausgangswert hinaus (siehe Abbildung 7). Der Effekt der Antagonisten überstieg also die blutdrucksenkende Wirkung von Moxonidin (vergleiche Abbildungen 10 oben und 11 unten). Die Plasmanoradrenalinkonzentration wurde ebenfalls dosis- abhängig durch die Antagonisten gesteigert (siehe Abbildung 12 unten). Wieder war Efaroxan der stärkste Antagonist und der Anstieg aller Antagonisten ging über den Ausgangswert hinaus (vergleiche Abbildungen 10 unten und 12 unten).

3.4.3. Wirkung der Antagonisten nach Applikation von Rilmenidin

Nach Applikation ansteigender Dosen von Efaroxan, Yohimbin und SK&F86466 stieg der mittlere arterielle Druck auch nach Rilmenidin dosisabhängig an (siehe Abbildung 11 Mitte). Efaroxan war auch hier der potenteste Antagonist mit einer etwa zehnfach stärkeren Potenz als Yohimbin und SK&F86466. Die maximale Wirkung der Antagonisten ging ebenfalls über die Ausgangswerte hinaus (vergleiche Abbildungen 10 oben und 11 Mitte).

Die Plasmanoradrenalinkonzentration wurde ebenfalls dosisabhängig durch die Antagonisten gesteigert (siehe Abbildung 12 Mitte). Efaroxan war der stärkste Antagonist und der Anstieg der Plasmanoradrenalin- konzentration durch die Antagonisten ging über den Ausgangswert hinaus (vergleiche Abbildungen 10 unten und 12 Mitte).

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15 30 45 60 75 min 30

20

SAL-EFA 10 SAL-YOH SAL-SKF (mmHg) SAL-SAL 0 mittlerer arterieller Druck ∆ -10

110 Antagonistendosis (µg kg-1)

ABBILDUNG 13: Interaktion von Kochsalzlösung mit den Antagonisten auf den mittleren arteriellen Druck. Nach Bestimmung der Ausgangswerte (PRE) wurde Kochsalzlösung (SAL; 25 µl kg-1) intracisternal appliziert. Nach einer Wartezeit von 30 Minuten wurde zu den Zeitpunkten t = 0, 15, 30, 45 und 60 min Efaroxan (EFA), Yohimbin (YOH), SK&F86466 (SKF) in kumulativen Dosen oder Kochsalzlösung (SAL; 25 µl kg-1) intracisternal injiziert (n=4-7). Eine Kontrollgruppe erhielt Kochsalzlösung nach PRE und zu den Zeitpunkten t = 0, 15 und 30 min (n=7). Aufgeführt sind die Mittelwerte ± Standardfehler der Differenz zwischen PRE und den Messungen zu den Zeitpunkten t = 15, 30, 45, 60 und 75 min. Injektion der Antagonisten oder von Kochsalzlösung löste keine signifikante Wirkung (P<0,05) aus.

3.5. Wirkung der Antagonisten nach Applikation von Kochsalzlösung

Einige Tiere erhielten nach Bestimmung der Ausgangswerte anstelle des Agonisten Kochsalzlösung nach dem Protokoll der Moxonidin- und Rilmenidin-Experimente (siehe Abbildung 10). Danach wurden ansteigende Dosen von Efaroxan, SK&F86466 oder Kochsalzlösung injiziert. Weder Kochsalzlösung noch die Antagonisten veränderten den Blutdruck dieser Tiere (Abbildung 13). Abbildung 13 enthält zusätzlich die Ergebnisse der Applikation von Yohimbin nach Kochsalzlösung (nicht veröffentlichte Daten von Urban und Szabo). Yohimbin hat ebenfalls keine Wirkung bei Kochsalz-vorbehandelten Tieren.

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4. DISKUSSION

Teile der Ergebnisse dieser Studie stimmen mit allgemein akzeptierten Erkenntnissen über die Wirkungsweise zentral wirkender Antihyper- tensiva überein. So war zu erwarten ,dass α-Methyldopa, Rilmenidin und Moxonidin intracisternal appliziert den mittleren arteriellen Druck senken würden. Diese Wirkung wird wahrscheinlich über eine Sympathikus- hemmung vermittelt, was an der Senkung der Plasmanoradrenalin- konzentration zu erkennen ist. Alle drei Antagonisten, Efaroxan, Yohimbin und SK&F86466, heben die Wirkung von α-Methyldopa komplett auf. Die Daten erlauben keine exakte Berechnung, aber Efaroxan war etwa zehnfach potenter als

Yohimbin und SK&F86466. Diese Beobachtung passt etwa zu den α2- Adrenozeptor-Bindungsdaten aus Tabelle 2 und zu der Tatsache, dass α-

Methylnoradrenalin, der aktive Metabolit von α-Methyldopa, ein α2- Adrenozeptor-Agonist ist. Die antisympathotone und hypotensive Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin wird ebenfalls durch Efaroxan, Yohimbin und SK&F86466 aufgehoben. Wieder ist Efaroxan der potenteste Antagonist, aber nicht in der durch die Bindungsstudien aus Tabelle 2 zu erwartenden deutlich stärkeren Weise. Es stellt sich also die Frage, ob Rilmenidin und Moxonidin, wie α-

Methylnoradrenalin, über α2-Adrenozeptoren wirken. Dementsprechend würden alle Antagonisten direkt die primären Effekt-auslösenden α2- Adrenozeptoren blockieren. Die alternative Möglichkeit ist, dass

Rilmenidin und Moxonidin primär über I1-Rezeptoren wirken. Efaroxan würde in diesem Fall die Wirkungen durch direkte Interaktion mit dem I1- Rezeptor aufheben. Yohimbin und SK&F86466 würden die Wirkungen

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von Rilmenidin und Moxonidin durch Blockade von α2-Adrenozeptoren aufheben, die in der Ereigniskette beteiligt sind, an deren Ende die Senkung des Sympathikustonus steht (funktioneller Antagonismus). Beide in der Einleitung aufgestellten Vorhersagen auf Grund der Imidazolinhypothese und der Rezeptoraffinitäten von Efaroxan, Yohimbin und SK&F86466 konnten nicht bestätigt werden.

Wenn Rilmenidin und Moxonidin über I1-Rezeptoren wirken würden, sollte Efaroxan, auf Grund seiner hohen I1-Affinität (Ki = 0,1nM), deutlich potenter die hypotone Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin aufheben als Yohimbin und SK&F86466 mit ihren vergleichsweise schwächeren α2-Affinitäten (Ki für Yohimbin circa 180 nM und für SK&F86466 84 nM). Efaroxan war aber nur etwa zwei- bis zehnfach potenter gegen Rilmenidin und Moxonidin als Yohimbin und SK&F86466 und nicht wie erwartet 1800- oder 840-fach stärker. Die zwei- bis zehnfach stärkere Wirkung könnte man eventuell darauf zurückführen, dass die Affinität von Efaroxan zu α2-Adrenozeptoren höher ist als die α2- Affinität von Yohimbin und SK&F86466. Dies wird auch durch die Beobachtung unterstützt, dass Efaroxan die antisympathotone Wirkung von α-Methyldopa zwei- bis zehnfach stärker als Yohimbin und SK&F86466 aufhebt. Deshalb ist es sehr wahrscheinlich, dass Efaroxan die Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin genauso wie Yohimbin und

SK&F86466 über eine antagonistische Wirkung an einem α2-

Adrenozeptor aufhebt und nicht über einen I1-Rezeptor.

Wenn Rilmenidin und Moxonidin über I1-Rezeptoren wirken würden, sollte Efaroxan auf Grund seiner hohen I1-Selektivität (Ki zu α2 /

Ki zu I1 = 190) deutlich stärker die Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin antagonisieren, als die Wirkung von α-Methyldopa. Efaroxan antago- nisierte die Wirkung von α-Methyldopa, Rilmenidin und Moxonidin aber

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mit identischen Dosen (0,4 – 4,4 µg kg-1). Vermutlich also auch über denselben Rezeptor, nämlich den α2-Adrenozeptor. Auch so gesehen gibt es keinen Hinweis auf eine Wirkung über den I1-Rezeptor. Nachdem also beide Vorhersagen auf Grund der Imidazolin- hypothese nicht belegt werden konnten, kann davon ausgegangen werden, das im Kaninchen ein α2-Adrenozeptor und kein I1-Rezeptor für die antisympathotone und somit blutdrucksenkende Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin verantwortlich ist. Zwei vorhergehende Studien an Kaninchen mit ähnlichem Protokoll wie in unserer Studie kamen zu dem Schluss, dass Imidazolinrezeptoren für die zentrale blutdrucksenkende Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin verantwortlich sind (Chan et al. 1996; Szabo & Urban 1997). Eine Erklärung für die unterschiedlichen Ergebnisse in der vorangegangenen Studie aus dieser Arbeitsgruppe könnte die

Verwendung von Guanabenz als selektiver α2-Adrenozeptor-Agonist sein (Szabo & Urban 1997). Eine Erklärung für die unterschiedlichen Ergebnisse von Chan et al. (1996) gibt es nicht , außer der Tatsache, dass bei Chan et al. (1996) Methoxyidazoxan als selektiver α2-Adreno- zeptor-Antagonist und in dieser Studie Yohimbin und SK&F86466 als α2- Adrenozeptor-Antagonisten verwendet wurden. Yohimbin und

SK&F86466 besitzen praktisch keine Affinität zu I1-Rezeptoren, wohingegen Methoxyidazoxan eine Affinität zu I1-Rezeptoren besitzt (Ernsberger et al. 1997).

Die Theorie, dass Imidazoline primär den I1-Rezeptor in der RVLM aktivieren, dann aber - im weiteren Verlauf der Kette von Ereignissen an deren Ende die Senkung des Sympathikustonus steht - α2-Adreno- zeptoren an der letztendlichen Blutdrucksenkung mitbeteiligt sind wurde von Head aufgestellt (Sannajust & Head 1994; Chan et al. 1996; Head et

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al. 1998; Head & Burke 2000). α2-Adrenozeptor-Antagonisten würden also - im Sinne eines funktionellen Antagonismus - die hypotensive

Wirkung von Imidazolinen am I1-Rezeptor in der RVLM durch Blockade von α2-Adrenozeptoren senken. Diese Theorie stellt die Aussagekraft aller Experimente in Frage, die α2-Adrenozeptor-Antagonisten verwenden um zwischen α2-Adrenozeptoren und I1-Rezeptoren zu unterscheiden. Diese Theorie von Head wurde bisher nicht experimentell bewiesen.

Eine Voraussetzung dieser Studie war die hohe I1-Rezeptor- Affinität von Efaroxan, die von Haxhiu et al. (1994) gefunden wurde.

Während der Durchführung dieser Arbeit wurden viel niedrigere I1-

Rezeptor-Affinitäten von Piletz et al. (1996) mit Ki = 52 nM und Separovic et al. (1996) mit Ki = 2 nM veröffentlicht. Falls diese Zahlen stimmen sollten, haben sowohl unsere Vorhersagen, als auch deren Wiederlegung durch die Experimente mit Efaroxan keinen Bestand. Genauso verlieren aber auch alle anderen Experimente mit Efaroxan als selektivem I1-

Rezeptor-Antagonisten, die die I1-Rezeptor-vermittelte Wirkung von Imidazolinen unterstützen (Haxhiu et al. 1994; Sannajust & Head 1994; Chan et al. 1996; Szabo & Urban 1997; Tolentino-Silva et al. 2000), ihre Aussagekraft. Falls diese niedrigen Affinitäten also zuträfen, würde das bedeuten, dass zum momentanen Zeitpunkt kein selektiver I1-Rezeptor- Antagonist zur Verfügung steht und somit das entscheidende Instrument zur Überprüfung der Imidazolinhypothese fehlt. Studien, die einen anderen Ansatz als den hier vorliegenden verfolgen, stellen die I1-Rezeptor-vermittelte Wirkung von Imidazolin- derivaten zum Teil ebenfalls in Frage.

In einigen Versuchen wurden Mäuse mit genetisch veränderten α2-

Adrenozeptoren verwendet. Entweder war die Bindung des α2A/D- Adrenozeptors an spezielle K+-Kanäle unterbrochen (sogenannte D79N-

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Mäuse; MacMillan et al. 1996; Zhu et al. 1999; Tolentino-Silva et al. 2000) oder es handelte sich um α2A/D-Adrenozeptor Knock-out Mäuse (Altman et al. 1999).

Injizierte man Dexmedetomidin, ein Imidazolinderivat mit hoher α2- Adrenozeptor-Affinität, in die Arteria carotis, so hatte es weder bei D79N-

Mäusen (MacMillan et al. 1996) noch bei α2A/D-Adrenozeptor Knock-out- Mäusen (Altman et al. 1999) eine blutdrucksenkende Wirkung. Auch intravenös appliziertes Clonidin, Rilmenidin und Moxonidin in D79N- Mäusen hatte keinen hypotensiven Effekt (Zhu et al. 1999). Diese

Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit eines intakten α2-Adrenozeptors für die symphatikolytische Wirkung, helfen aber nicht bei der Beantwortung der Frage, ob α2-Adrenozeptoren oder I1-Rezeptoren für die Wirkung der Imidazolinderivate wie Rilmenidin oder Moxonidin verantwortlich sind. Im Gegensatz dazu zeigte eine Arbeit, bei der Moxonidin direkt in die RVLM von narkotisierten D79N-Mäusen injiziert wurde, eine blutdrucksenkende Wirkung (Tolentino-Silva et al. 2000). Die Autoren führten diesen Befund auf eine Beteiligung von I1-Rezeptoren zurück. Es gibt keine Erklärung für die entgegengesetzten Ergebnisse von Zhu et al. und Tolentino-Silva et al.. Die Experimente an genetisch veränderten Tieren helfen also auch nicht bei der endgültigen Beantwortung der Frage, welcher Rezeptor für die zentrale blutdruck- senkende Wirkung der Imidazolinderivate verantwortlich ist. In einer anderen Studie wird die neue Substanz 2-endo-amino-3- exo-isopropyl-bicyclo[2.2.1]heptane (AGN192403) untersucht, die eine hohe Affinität zu I1-Bindungsstellen, aber praktisch keine Affinität zu α2- Adrenozeptoren aufweist. Allein gegeben hatte die Substanz keine blutdrucksenkende Wirkung. Sie interferierte auch nicht mit der Wirkung von Clonidin. Die Autoren schließen aus diesen Beobachtungen, dass I1-

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Bindungsstellen „keine funktionellen Rezeptoren sind, sondern nur eine funktionslose Bindungsstelle“ (Munk et al. 1996). Nach Gabe der Antagonisten in den Experimenten mit Rilmenidin und Moxonidin, stieg der Blutdruck und die Plasmanoradrenalin- konzentration bei den Kaninchen über den Ausgangswert hinaus. Diese Beobachtung könnte eventuell auf ein akutes Entzugsphänomen hinweisen. Solch ein akutes, durch Antagonisten ausgelöstes Entzugs- phänomen wurde bereits 75 min nach Gabe von Clonidin und Morphin durch eine gesteigerte Aktivität von Locus coeruleus-Neuronen nachgewiesen (Duggan et al. 1994; Hall et al. 1996). Bei Clonidin ist ein solches Rebound-Phänomen, mit überschießenden Blutdruckwerten nach plötzlichem Absetzen der Therapie, bekannt (Kobinger & Pichler 1990). Für Rilmenidin und Moxonidin wurde bisher kein solches Phänomen beobachtet (Plänitz 1984; Laurent & Safar 1992). Bei den Experimenten mit α-Methyldopa war die Dosis-Wirkungs- Kurve der Antagonisten relativ flach im Vergleich zu denen von Rilmenidin und Moxonidin. Auch eine Steigerung des Blutdrucks und der Plasmanoradrenalinkonzentration über den Ausgangswert hinaus, wurde in dieser Gruppe nicht beobachtet. Der Grund für diesen Unterschied zwischen α-Methyldopa und Rilmenidin und Moxonidin ist nicht bekannt. Eventuell ist es auf den indirekten Wirkmechanismus von α-Methyldopa über α-Methylnoradrenalin zurückzuführen. Die niedrige Ausgangssympathikusaktivität der ruhig im Käfig sitzenden Kaninchen, mit einer Ausgangskonzentration des Plasma- noradrenalins von 187 pg ml-1, kann als Nachteil bei der Auswertung der Senkung des Sympathikustonus gesehen werden, da dadurch auch das Ausmaß der maximalen Effekte relativ klein war.

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In vielen kardiovaskulären Studien wurden narkotisierte Tiere verwendet. Bei diesen Tieren ist auf Grund der Narkose die Sympathikus- aktivität sehr hoch. Auch durch die unmittelbar zuvor durchgeführten chirurgischen Eingriffe und den damit verbundenen Schmerzreizen steigt die Sympathikusaktivität. In Folge dessen ist auch die Wirkung der Clonidin-ähnlichen Substanzen auf die Sympathikusaktivität und damit die Blutdrucksenkung stärker ausgeprägt als in unserer Versuchsreihe (Sannajust et al. 1992). Eine starke Blutdrucksenkung kann auch bei spontan hypertensiven Ratten beobachtet werden. Allerdings wurde von Befürwortern der Imidazolinhypothese beobachtet, dass die blutdruck- senkende Wirkung von Clonidin in spontan hypertensiven Ratten keiner typischen Imidazolinwirkung entspricht und somit spontan hypertensive Ratten für Experimente mit Imidazolinen nicht geeignet sind (Tibiriça et al. 1988,1992). Positiv ausgedrückt hilft unsere Versuchsreihe bei der Beantwortung der Frage, ob bei normalen wachen Kaninchen - und vielleicht auch beim Menschen - eine Aktivierung des zentralen Imidazolinrezeptors eine Senkung der Sympathikusaktivität und des Blutdruckes bewirkt oder nicht. Rilmenidin und Moxonidin sind bewährte Antihypertensiva beim Menschen. Ein Ausgangspunkt der Imidazolinhypothese war die

Beobachtung, dass die auf eine zentrale Aktivierung von α2-Adreno- zeptoren zurückzuführende, durch Clonidin und anderen α2-Adreno- zeptor-Agonisten ausgelösten Nebenwirkungen, wie Sedierung und Mundtrockenheit unter Therapie mit Moxonidin schwächer ausgeprägt waren (Dollery et al. 1976; Davies et al. 1977). Direkt nach Behandlungsbeginn und nach zweiwöchiger Therapie wurde bei

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Moxonidin und Rilmenidin im Vergleich zu Clonidin seltener oder weniger ausgeprägt von Sedierung und Mundtrockenheit berichtet (Moxonidin: Plänitz 1984 und 1987; MacPhee et al. 1992; Rilmenidin: Weeasuriya et al. 1984, Fillastre et al. 1988). Dieses vorteilhafte Wirkungs- Nebenwirkungs-Profil von Imidazolinen wurde mit der selektiven

Aktivierung von sympathikolytischen I1-Rezeptoren in den kardio- vaskulären Zentren im Hirnstammbereich erklärt. Die Ergebnisse unserer Studie ergeben keinen Hinweis auf eine Imidazolinrezeptor-vermittelte Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin. Deshalb müssen andere Erklärungsmodelle für das vorteilhafte Wirkungs-Nebenwirkungs-Profil von Rilmenidin und Moxonidin gesucht werden. Es ist möglich, dass periphere Effekte wie die Blockade von α1- Adrenozeptoren der glatten Gefäßmuskulatur (Cario-Toumaniantz et al.

1998) oder die Aktivierung von inhibitorischen präsynaptischen α2- Adrenozeptoren auf Axonendigungen postganglionär sympathischer Neurone (Urban et al. 1995b) zu der blutdrucksenkenden Wirkung der Imidazoline beitragen. Dazu passen Daten, nach denen Rilmenidin und Moxonidin vermutlich schlechter die Blut-Hirnschranke passieren als Clonidin, was auch zu einer Senkung der Rate zentraler Nebenwirkungen führen würde. Dabei wurden die Wirkungen von Clonidin, Rilmenidin und Moxonidin auf die Feuerfrequenz von Locus coeruleus-Neuronen bei zentraler und peripherer Applikation verglichen (Aktivierung von α2- Adrenozeptoren senkt die Frequenz der Locus coeruleus-Neurone). Bei peripherer Applikation senkte Rilmenidin die Feuerfrequenz weniger potent als Clonidin. Bei direkter iontophoretischer Applikation in den Locus coeruleus war dagegen Rilmenidin potenter als Clonidin (Dresse & Moreau 1986). Moxonidin senkte bei intravenöser Applikation den Blutdruck weniger potent als Clonidin; bei intracisternaler Applikation war

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das Potenzverhältnis umgekehrt (Armah 1987). Zusammengefasst könnte dies bedeuten, dass bei Moxonidin und Rilmenidin die niedrigere Rate zentraler Nebenwirkungen bei identischer blutdrucksenkender Wirkung durch das Zusammenspiel peripherer und zentraler Wirkungen bedingt ist, wobei die niedrigere Konzentration im Zentralnervensystem eine entscheidende Rolle bei dem besseren Wirkungs-Nebenwirkungs- Profil spielt.

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5. ZUSAMMENFASSUNG

Ziel dieser Arbeit war zu klären, welcher Rezeptor für die zentrale blutdrucksenkende Wirkung der Clonidin-artigen Antihypertensiva

Rilmenidin und Moxonidin verantwortlich ist: der α2-Adrenozeptor oder der I1- Imidazolinrezeptor. Unter Narkose wurde ein Katheter in die Cisterna cerebello- medullaris von Kaninchen implantiert. Die Experimente fanden später an wachen Tieren statt. Alle Substanzen wurden über den intracistrenalen Katheter in die Nähe von Kreislaufregulationszentren in der Medulla oblongata injiziert. Rilmenidin und Moxonidin senkten den Blutdruck und die Plasma- noradrenalinkonzentration. Zum Vergleich wurde der indirekt wirkende selektive α2-Adrenozeptor-Agonist α-Methyldopa appliziert: er löste

ähnliche Wirkungen aus wie Rilmenidin und Moxonidin. Die reinen α2- Adrenozeptor-Antagonisten Yohimbin und SK&F86466 hoben die Wirkungen aller drei Agonisten vollständig auf. Zum Vergleich wurde der

Antagonist Efaroxan appliziert: er besitzt hohe Affinität zu I1-

Imidazolinrezeptoren und eine geringere Affinität zu α2-Adrenozeptoren. Efaroxan hob ebenfalls die Wirkung aller drei Agonisten auf. Es ist wichtig, dass die Potenz von Efaroxan gegen Rilmenidin und Moxonidin nicht höher war als gegen α-Methyldopa. Auf Grund dieser Ergebnisse meinen wir, dass bei der zentralen Senkung des Sympathikustonus und somit des Blutdruckes durch alle drei Agonisten derselbe Rezeptor beteiligt ist, der α2-Adrenozeptor. Auf eine Beteiligung des I1-Imidazolinrezeptors bei der zentralen Wirkung von Rilmenidin und Moxonidin gab es in unseren Experimenten keinen Hinweis.

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6. LITERATURVERZEICHNIS

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LEBENSLAUF

Name: Christina Julia Maria Bock-Ketterer geb. am: 24.06.74 in Freiburg

Familienstand: verheiratet

Schulischer Werdegang:

1980-84 Besuch der Emil-Gött-Grundschule in Freiburg

1984-93 Besuch des Droste-Hülshoff-Gymnasiums in Freiburg

5/93 Abitur mit den Leistungsfächern Mathematik und Physik

Beruflicher Werdegang:

1993-2000 Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg

8/95 Physikum

1995-98 Famulaturen in den Fächern Unfallchirurgie, ambulante Chirurgie, Gynäkologie und Augenheilkunde

8/96 1. Staatsexamen

8/96-6/97 Experimenteller Teil der Doktorarbeit am Institut für Pharmakologie und Toxikologie in Freiburg

3/99 2. Staatsexamen

4/99-3/00 Praktisches Jahr am Universitätsklinikum Freiburg mit Wahlfach Gynäkologie

5/00 3. Staatsexamen

10/00-3/02 AIP an der Universitätsfrauenklinik in Freiburg seit 5/02 Assistenzärztin an der Universitätsfrauenklinik in Freiburg