Étude De L'activité De L'extrait Moha-04 Sur La

FACULTÉ DES SCIENCES DOMAINE DES SCIENCES ET TECHNOLOGIES MENTION PHYSIOLOGIE ANIMALE, PHARMACOLOGIE, COSMÉTOLOGIE

Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie

LPGPC

MÉMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLÔME DE MASTER OPTION PHARMACOLOGIE

ÉTUDE DE L’ACTIVITÉ DE L’EXTRAIT MOHA-04 SUR LA DIARRHÉE CHEZ LE COCHON D’INDE

Présenté par AYADE Mohamed Houmadi le 18 Août 2017 Devant le JURY composé de :

Président : M. RANDIMBIVOLOLONA Fanantenanirainy Pr Titulaire Rapporteur : Mme RANDRIANAVONY Patricia Pr Examinateur : M. RAFATRO Herintsoa Pr Titulaire Nom : AYADE

Prénoms : Mohamed Houmadi

Adresse : lot III K 3 A Ankaditoho

E-mail : [email protected]

Téléphone : 032 62 755 60

ÉTUDE DE L’ACTIVITÉ DE L’EXTRAIT MOHA-04 SUR LA DIARRHÉE CHEZ LE COCHON D’INDE

Promotion : 2016-2017

Rapporteur : Professeur RANDRIANAVONY Patricia

Laboratoire : Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de

Cosmétologie.

B.P : 8357

E-mail : [email protected]

Faculté des Sciences

Université d’Antananarivo

REMERCIEMENTS

Au terme de la réalisation de ce mémoire, je tiens à exprimer ma profonde gratitude :

 A Monsieur le Professeur Titulaire RANDIMBIVOLOLONA Fanantenanirainy. Permettez-nous de vous remercier cher maître de la confiance que vous avez faite en nous acceptant à vos côtés. C’est un honneur pour nous d’être cité parmi vos élèves. Veuillez accepter le témoignage de notre sincère et profonde gratitude.

 A Madame le Professeur RANDRIANAVONY Patricia. Nous avons beaucoup admiré vos immenses qualités humaines et scientifiques tout au long de ce travail. Vous avez cultivé en nous, le sens du travail bien fait. Trouvez ici, cher maître, l’expression de notre profonde gratitude et de notre indéfectible disponibilité.

 A Monsieur RAFATRO Herintsoa. Professeur Titulaire d’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique. Cher Maître, c’est un grand plaisir que vous nous faites en acceptant de siéger à ce jury malgré vos multiples occupations. Permettez-nous de vous exprimer notre profonde gratitude et notre grand respect.

 A Monsieur QUANSAH Nathaniel. Pour son précieux aide, conseils et générosité tout au long de ce travail. Je tiens à vous exprimer mes très vifs remerciements.

 A tout le corps enseignant de la Mention Physiologie Animale, Pharmacologie et Cosmétologie de la Faculté des Sciences d’Antananarivo. Pour avoir déployé leurs efforts pour notre formation. C’est l’occasion de vous remercier pour la qualité de vos encadrements, de vos conseils, pour votre générosité et la disponibilité dont vous avez toujours fait preuve. Recevez ici nos sincères remerciements.

 A ma famille, j’aurais aimé que vous soyez là en ce moment mémorable qui voit l’aboutissement et la réalisation de tous les travaux consentis. Ce travail est le fruit de votre patience, vos sacrifices et vos bénédictions. Je vous remercie à tous aujourd’hui pour vos conseils, encouragements et aides depuis le début de mes études.

TABLE DES MATIÈRES LISTE DES TABLEAUX ...... i

LISTE DES FIGURES ...... ii

LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS ...... iii

I. INTRODUCTION ...... 1

II. MATÉRIELS ET MÉTHODES ...... 6

A. PARTIE CHIMIE ...... 6

1. Préparation de l’extrait ...... 6

2. Criblage phytochimique ...... 8

B. PARTIE PHARMACOLOGIE...... 10

1. Animaux d’expérimentation ...... 10

2. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la sécrétion intestinale ...... 10

3. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale ...... 11

4. Effet de l’extrait MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine ...... 12

C. EXPRESSION ET ANALYSES DES RÉSULTATS ...... 13

III. RÉSULTATS ...... 14

A. PARTIE CHIMIE ...... 14

B. PARTIE PHARMACOLOGIE...... 15

1. Effet de l’extrait MOHA-04 sur la sécrétion intestinale ...... 15

2. Effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale ...... 15

3. Effet de MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine ...... 16

IV. DISCUSSION ...... 18

V. CONCLUSION ...... 21

RÉFÉRENCES ...... 22

LISTE DES TABLEAUX Tableau I. Les tests utilisés pour détecter les différentes familles chimiques présentes dans l’extrait MOHA-04 ...... 9

Tableau II. Composition de la solution de Tyrode dans 1 litre d’eau distillée ...... 11

Tableau III. Familles chimiques présentes dans l’extrait hydroalcoolique MOHA-04 ...... 14

LISTE DES FIGURES Figure 1. Différentes étapes de l’extraction de MOHA-04 ...... 7

Figure 2. Variation du volume de fluide intestinal provoquée par le sulfate de magnésium administré par voie orale chez les témoins et les cochons d’Inde traités avec l’extrait MOHA- 04, administré par voie orale, aux doses 300 et 600 mg/kg ...... 15

Figure 3. Relâchement du duodénum, précontracté avec de l’acétylcholine, en présence de l’extrait MOHA-04 injecté dans le bain d’une manière cumulative ...... 16

Figure 4. Variation de la contraction du duodénum isolé de cochon d’Inde provoquée par l’acétylcholine administrée dans le bain de manière cumulative, en absence et présence de l’extrait MOHA-04 aux concentrations de 0,125 et 0,250 mg/ml dans le bain ...... 17

LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS

AMPc : Adénosine MonoPhosphate Cyclique.

°C : degré Celsius

CE50 : concentration donnant 50 % d’effet. cm : centimètre coll. : collaborateurs. g : gramme. e.s.m : écart type réduit. kg : kilogramme.

LPGPC : Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie.

MgSO4 : Sulfate de Magnésium. min : minutes. ml : millilitre. mM : millimole.

M : mole. mg/kg : milligramme par kilogramme. ml/kg : millilitre par kilogramme. n : nombre d’animaux.

OMS : Organisation Mondiale de la Santé.

P : probabilité.

PNLMD : Programme National de Lutte contre les Maladies Diarrhéiques.

% : pourcentage.

VIP : Peptide Vasoactif Intestinal.

푥̅ : moyenne.

iii

INTRODUCTION

I. INTRODUCTION

La diarrhée présente une situation alarmante qui a conduit l’OMS à mettre en place en 1980, le Programme National de Lutte contre les Maladies Diarrhéiques (PNLMD), dont le but est de réduire la morbidité et la mortalité infantile. En effet, chaque année, on compte 1,7 milliards de cas de diarrhée dans le monde (OMS, 2017). C’est la troisième cause de décès provoqué par des maladies infectieuses, tout âge confondu, à l’échelle mondiale (OMS, 2011 ; ASSOGBA A.L et coll., 2012), et la 5ème cause de décès prématuré, tuant des jeunes enfants à un âge très précoce (OMS, 2014). Par ailleurs, c’est la deuxième cause de mortalité chez l’enfant de moins de cinq ans, avec 525 000 de décès par an (OMS, 2017). Madagascar n’est pas épargné par ce fléau, avec une prévalence particulièrement importante chez les bébés de 6 à 11 mois, qui représente 15 % en moyenne (ANDRIANJAKA J.C. et RAKOTONDRABE F.P., 2010). Cette prévalence très élevée est liée à l’insalubrité, à l’absence de système d’assainissement de l’eau et au manque d’hygiène qui sont à l’origine de 88 % des maladies diarrhéiques (PRÜSS- USTÜN A. et coll., 2008). Selon le Ministère de l’eau et de l’Assainissement, seuls 42,63 % de la population ont accès à de l’eau potable à Madagascar, jusqu’en 2010 (MINISTERE de l’EAU, 2011).

La diarrhée est caractérisée par des selles molles, voire liquides, dont la quantité et/ou la fréquence est anormalement élevée (BRYCE J. et coll., 2005). C’est le résultat d'une perturbation des mouvements d'eau et d’électrolytes au niveau de l’intestin (GUANDALINI S. et VAZIRI H., 2010). En effet, l’intestin joue un rôle majeur dans le maintien de l’équilibre hydro-électrolytique de l’organisme, en gardant l’équilibre entre la réabsorption et la sécrétion hydro électrolytique (MIN/SA, 1994). Il existe un flux bidirectionnel constant d’eau et d’ions à travers la muqueuse intestinale : l’absorption et la sécrétion, et la diarrhée est due à la baisse de la réabsorption par rapport à la sécrétion, ou à l’augmentation de la sécrétion. L’absorption a lieu au niveau des cellules des villosités, et la sécrétion, au niveau des cellules de crypte en grande partie (BINDER H.J. et REUBEN A., 2009). L’absorption de sodium est assurée par les entérocytes par une pompe Na+-K+/ATPase située au niveau des membranes basolatérales des cellules de cryptes et des villosités intestinales. L’absorption de Na+ entraine celle de l’eau ; par ailleurs, la sécrétion active de Cl- contribue à la sécrétion d’eau (BINDER H.J., 2009).

Dans les conditions physiologiques normales, environ 8 litres d’eau arrivent au niveau de l'intestin grêle supérieur ; 2 litres proviennent des aliments ingérés, et les 6 litres restants sont issus des sécrétions salivaires, gastriques, biliaires et pancréatiques. La grande partie de ce

liquide est réabsorbée avant d’atteindre la partie distale de l’intestin grêle, de telle sorte que seulement environ 1 litre de liquide atteint le côlon (DEVROEDE G.J. et PHILLIPS S.F., 1969). Ensuite, le côlon réabsorbe la presque totalité du reste, de telle sorte que l’eau contenue dans les matières fécales soit inférieure à 200 ml (DEBONGNIE J.C. et PHILLIPS S.F., 1978). La diarrhée résulte, soit de l’augmentation de la sécrétion, soit de la baisse de la réabsorption (FIELD M., 2003).

Selon son origine, la diarrhée peut être sécrétoire, osmotique, motrice ou médicamenteuse (GUANDALINI S. et VAZIRI H., 2010). Les diarrhées sécrétoires sont causées par la sécrétion excessive de l’hormone Peptide Vasoactif Intestinal (VIP), qui stimule la sécrétion excessive d’eau et d’électrolytes au niveau de la muqueuse intestinale (PHILLIPS S.F., 1972). Généralement, ce genre de diarrhée est causé par des agents pathogènes qui affectent l’intestin grêle. Ils adhèrent à la muqueuse et détruisent celle-ci, perturbant le processus d’absorption et de sécrétion au niveau de la membrane de l’entérocyte, à l’origine d’une sécrétion active (FIELD M., 2003). Quant aux toxines produites par divers agents pathogènes tels que Staphylococcus, Escherichia coli, et Vibrio cholorae ; elles altèrent la structure de la paroi intestinale, provoquant une perturbation des échanges osmotiques au niveau de la lumière intestinale.

Quant à la diarrhée osmotique, elle est due à la présence de solutés non absorbables ou peu absorbables dans l’intestin, tels que l’alcool, le mannitol ou le sorbitol, le magnésium, les sulfates et les phosphates. Ces solutés exercent une force osmotique, et attirent l’eau vers la lumière intestinale, et secondairement d’autres ions. Par exemple, la malabsorption de glucides peut provoquer une diarrhée osmotique. Ceci se produit lorsqu’il existe une carence ou une défaillance des enzymes responsables de la coupure des polysaccharides en glucose, fructose et galactose, des sucres absorbables au niveau de la muqueuse intestinale. Non hydrolysés, les entérocytes sont incapables d’absorber ces glucides qui stagnent dans la lumière intestinale et retiennent de l’eau (FIELD M., 2003 ; HAMMER H.F. et coll., 1989).

Par ailleurs, les mouvements d’eau et de solutés dans l’intestin dépendent de la motilité intestinale, qui assure la progression du contenu intestinal. Une motilité accrue accélère l’évacuation du contenu intestinal, augmentant la fréquence d’émission de selles ; en plus elle diminue le temps de contact entre le contenu luminal et l’épithélium, ce qui diminue sa capacité d’absorption, et il en résulte une diarrhée motrice (FELDMAN M. et coll., 2010). Cette motricité intestinale est régulée par des neurotransmetteurs comme l’acétylcholine et la

sérotonine, et leur effet exagéré peut être à l’origine d’une diarrhée motrice. Les troubles du contrôle nerveux (du cerveau aux nerfs viscéraux) et l’intestin sous forme de nocivité viscérale et de motilité anormale causée par ces neurotransmetteurs, peuvent être à l’origine de la diarrhée motrice (GRUNDY D., 2002 ; CAMILLERI M., 2002).

Enfin, la diarrhée peut être l’effet secondaire de médicaments ; les médicaments chimio- thérapeutiques diminuent la prolifération de l’entérocyte et par conséquent, la réabsorption intestinale. Quant aux antibiotiques, ils peuvent altérer la flore bactérienne dans le côlon, diminuant ainsi la réabsorption de glucose à l’origine d’une diarrhée de mal absorption, de type osmotique. Certains médicaments comme le lactulose, ne sont pas réabsorbés au niveau de l’intestin, et provoquent également de la diarrhée osmotique. D’autres médicaments comme la théophylline, augmentent l’AMPc intracellulaire au niveau de la paroi intestinale, et provoquent ainsi une hypermotilité intestinale aboutissant à une diarrhée motrice (FELDMAN M. et coll., 2010).

Ces perturbations entrainent une perte en eau et en électrolytes, et nécessitent un traitement selon le type de diarrhée en question. Les Solutions de Réhydratations Orales sont indiquées et recommandées par l’OMS pour rétablir l’équilibre hydrominéral (SOCIÉTE CANADIENNE DE PÉDIATRIE, 2003 ; TURCK D., 2007). Par ailleurs, différents traitements sont disponibles pour limiter cette perte en eau et en électrolytes, comme les anti-sécrétoires, les ralentisseurs du transit intestinal, les astringents et les adsorbants, les probiotiques et les antibiotiques.

Les anti-sécrétoires intestinaux sont destinés à diminuer la sécrétion excessive d’eau et d’électrolytes dans la lumière intestinale. Par exemple, le Racécadotril (TIORFAN©) qui inhibe l’enképhalinase ; une enzyme responsable de la dégradation des enképhalines (des peptides opioïdes endogènes). Ces enképhalines stimulent les récepteurs opioïdes δ de l’intestin et diminuent l’AMPc intra cellulaire qui régule l’ouverture des canaux à chlorure, réduisant la sécrétion de cet ion (SCHWARTZ J.C., 2000).

Tandis que les ralentisseurs du transit intestinal comme le Lopéramide (IMODIUM©), qui est en même temps un antisécrétoire, inhibe la sécrétion d’eau et d’électrolytes au niveau de l’entérocyte et diminue le péristaltisme. La fixation du Lopéramide sur les récepteurs opioïdes

δ de l’entérocyte diminue la production de l’AMPc, responsable de l’ouverture des canaux à chlorure. L’inhibition de l’ouverture de ces canaux réduit l’hypersécrétion de l’ion Cl- et par conséquent la sécrétion d’eau. Quant au péristaltisme, le Lopéramide se fixe aux récepteurs opioïdes µ de l’entérocyte, diminuant l’activité du plexus myentérique, système nerveux

contrôlant le péristaltisme, innervé lui-même par l’acétylcholine. Ceci diminue ainsi la motilité intestinale et augmente le temps de contact entre le bol alimentaire et la muqueuse intestinale, augmentant la réabsorption d’eau (HUIJGHEBAERT S. et coll., 2003).

Les adsorbants, tels que la siméticone©, l’attapulgite© (smectite dioctaédrique), le kaolin (silicate d’aluminium naturel) et la pectine ont toujours été utilisés pour traiter la diarrhée. Ils adsorbent les toxines dans la lumière intestinale, les bactéries et les métabolites produits par celles-ci, des substances pouvant altérer la muqueuse intestinale. La neutralisation de ces agents permet de garder l’intégrité de la paroi intestinale afin d’éviter une perte de liquide. Par ailleurs, les astringents comme les tanins resserrent la paroi intestinale. Ils dénaturent les protéines de la paroi intestinale, la rendant plus résistante et l’empêchant d’activer la sécrétion de liquide via des récepteurs entérocytaires, diminuant ainsi la sécrétion d’eau et d’électrolytes. Les adsorbants et les astringents ont également une activité antidiarrhéique en neutralisant les agresseurs microbiologiques ou chimiques (LEEMANS L., 2013 ; RATEAU J.G. et coll., 1982).

Quant aux probiotiques, ce sont des préparations à base de micro-organismes qui modifient la microflore de l’intestin en abaissant le pH du côlon par la production d’acides gras à chaînes courtes. Ces substances génèrent des composants antimicrobiens et des antitoxines contre d’autres bactéries, améliorant ainsi la fonction barrière de la muqueuse intestinale, à l’origine de la diminution de l’hypersécrétion d’eau (GOLDENBERG J.Z. et coll., 2009 ; VALERIE M. et SOCIÉTE CANADIENNE DE PÉDIATRIE, 2012).

Malgré la panoplie de molécules antidiarrhéiques existant sur le marché, beaucoup de gens utilisent les plantes médicinales pour soigner la diarrhée (JEAN-PIERRE N., 2013). Au Maroc, les gens mangent les fruits, frais ou secs de Rhus pentaphylla (ANACARDIACEAE) pour lutter contre la diarrhée (BELLAKHDAR J., 1997). En Côte-d’Ivoire, le décocté de l’écorce et du tronc d’Adansonia digitata (BOMBACACEAE) est également utilisé contre la diarrhée (KONE M.W. et coll., 2002), alors qu’au Brésil, ils utilisent le décoté de la racine de Faramea guianensis (RUBIACEA) (DOLIVO A., 2013). A Madagascar, ils utilisent le décocté de la racine de l’Adansonia suarezensis (MALVACEAE) ou des feuilles de Psidium guajava (MYRTACEAE), ou le décocté de la plante entière de Euphorbia hirta (EUPHORBIACEAE) (JEAN-PIERRE N., 2013).

D’après les enquêtes ethnopharmacologiques que nous avions effectuées dans la Région d’Analamanga, les gens utilisent le décocté des feuilles de la plante à partir desquelles a été

extrait MOHA-04 comme antidiarrhéique. Ce décocté est pris en cas de ballonnements, de nausées, de douleurs et de crampes abdominales suivies d’une diarrhée, des symptômes pouvant être provoqués par une perte d’eau et d’électrolytes. En analysant ces informations, cette plante pourrait réduire l’hypersécrétion d’eau dans la lumière intestinale, dont son origine impliquerait une hypermotilité. Pour étudier cette activité, une extraction hydroalcoolique a été effectuée à partir des feuilles de la plante, puis des tests in vivo ont été effectués avec cet extrait chez le cochon d’Inde ; ensuite des tests in vitro ont été réalisés pour élucider le mécanisme d’action probable de l’extrait.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

II. MATÉRIELS ET MÉTHODES A. PARTIE CHIMIE 1. Préparation de l’extrait

Les feuilles de la plante utilisées dans ce mémoire ont été récoltées dans la région Analamanga au mois de décembre 2016. Elles ont été séchées à l’ombre dans un endroit aéré et sec et à la température ambiante, pendant 50 jours. Elles ont ensuite été broyées à l’aide d’un broyeur à marteau électrique BROOK CROMPTON© série 2000 au Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie (LPGPC) à la Faculté des Sciences d’Antananarivo. Deux cent grammes de la poudre obtenue ont été macérés dans un mélange éthanol : eau (60 : 40), à la température ambiante, pendant 72 heures. Le macérât obtenu a été filtré sur du coton hydrophile, puis l’alcool a été évaporé à la température de 80 °C avec un distillateur, puis l’eau a été évaporée dans un bain marie à la température de 100 °C (Figure 1).

L’extrait hydroalcoolique ainsi obtenu a été codé MOHA-04, puis pesé pour calculer le rendement selon la formule :

푀푎푠푠푒 푑푒 푙′푒푥푡푟푎푖푡 푅푒푛푑푒푚푒푛푡 = × 100 푀푎푠푠푒 푑푒 푙푎 푝표푢푑푟푒

Feuilles fraiches de la plante 200 g

Séchage à l’ombre Feuilles sèches de la plante

Broyage

Poudre de la plante

Macération éthanol-eau (60 : 40)

Macérât

Filtration

Filtrat Marc

Evaporation à 80 °C et bain marie 100 °C

Extrait MOHA-04

Figure 1. Différentes étapes de l’extraction de MOHA-04.

2. Criblage phytochimique

Un criblage phytochimique a été effectué pour détecter les familles chimiques présentes dans l’extrait MOHA-04. Cette méthode est basée sur la formation de complexes insolubles ou de complexes colorés, en utilisant des réactifs spécifiques pour chaque famille chimique (Tableau I) (FONG H.H.S. et coll., 1977).

Avec :

++ présence en teneur moyenne

+ présence en faible teneur

± présence en très faible teneur

Tableau I. Les tests utilisés pour détecter les différentes familles chimiques présentes dans l’extrait MOHA-04 (FONG H.H.S. et coll., 1977).

Familles chimiques Tests Réactifs Observations ALCALOÏDES DRAGENDORFF, Précipitation MAYER, WAGNER TANINS Gélatine + NaCl Précipitation verte

Gélatine + FeCl3 Précipitation Méthanol Bleue COMPOSÉS Gélatine 1 % Précipitation PHÉNOLIQUES STÉROÏDES ET LIERMAN Anhydride acétique + Coloration violette

TRITERPÈNES BURCHARD H2SO4 BADGET Acide picrique Coloration rouge KEDDE

SALKOWSKI H2SO4 Anneau de séparation rouge FLAVONOÏDES WIL-STATER Ruban de Mg + HCl Coloration rouge concentré LEUCOANTHOCYANES HCl concentré+bain Coloration rouge BATH-SMITH marie violacée ANTHOCYANES HCl à froid Coloration rouge POLYSACCHARIDES + 3 Volumes d’éthanol Trouble SUCRES RÉDUCTEURS Liqueur de Fehling+ Précipitation rouge Bain-marie brique COUMARINES NaOH 10 % Fluorescence à l’UV SAPONINES MOUSSE HCl + Agitation Persistance d’une mousse (3 cm d’épaisseur) après 30 min

B. PARTIE PHARMACOLOGIE

L’activité de l’extrait MOHA-04 a été étudiée chez les cochons d’Inde. Des tests in vivo ont été effectués pour étudier son effet sur la sécrétion intestinale et des tests in vitro, pour étudier son effet sur la motilité intestinale.

1. Animaux d’expérimentation

Des cochons d’Inde mâles et femelles, âgés de 3 à 5 mois et pesant entre 200 et 250 grammes ont été utilisés. Ces animaux ont été élevés à l’animalerie du Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacologie Cinétique et de Cosmétologie (LPGPC). Ils ont été nourris avec des feuilles de graminées et ont eu accès libre à de l’eau.

2. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la sécrétion intestinale

L’effet de MOHA-04 sur la sécrétion intestinale a été étudié in vivo sur une diarrhée expérimentale provoquée par le sulfate de magnésium (FINE K.D. et coll., 1991).

L’extrait MOHA-04 et le sulfate de magnésium ont été dissouts dans de l’eau distillée. Puis les cochons d’Inde ont été mis à jeun 18 heures avant les manipulations. Ils ont ensuite été repartis en 3 lots: un lot témoin et deux lots traités avec l’extrait MOHA-04. Le lot témoin a reçu 10 ml/kg d’eau distillée, tandis que les deux autres lots ont reçu l’extrait MOHA-04 par voie orale aux doses respectives de 300 et 600 mg/kg dans 10 ml/kg d’eau distillée (MITHUM S. et coll., 2011).

Quarante-cinq minutes après, tous les animaux ont reçu 2 g/kg de sulfate de magnésium, par voie orale, dans un volume de 10 ml/kg. Trente minutes après l’administration du sulfate de magnésium, les cochons d’Inde ont été euthanasiés avec 100 mg/kg de phénobarbital, administré par voie intramusculaire (LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011). Ensuite, ils ont étés mis en position décubitus dorsale et une laparotomie a été effectuée. Les animaux avec une longueur d’intestin grêle semblable ont été sélectionnés et une ligature a été faite au niveau du pylore et une autre au niveau du caecum. Le segment de l’intestin entre les deux ligatures a été prélevé dans sa totalité et son contenu a été versé dans un récipient gradué afin de mesurer le volume du fluide intestinal (GALVEZ J. et coll., 1993).

L’effet anti-sécrétoire de l’extrait a été calculé et exprimé en % avec la formule ci-dessous :

푉0 − 푉푇 E = × 100 푉푇

Avec:

E : effet de l’extrait sur la variation du volume de liquide intestinal

V0: volume de liquide intestinal du lot témoin

VT : volume de liquide intestinal du lot traité

3. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale

L’activité de l’extrait MOHA-04 sur la motilité intestinale a été étudiée in vitro sur le duodénum isolé de cochon d’Inde, en utilisant de l’acétylcholine comme agent contracturant (RAJAMANICKAM V. et coll., 2010).

Les cochons d’Inde ont été mis à jeun 18 heures avant les manipulations avec un accès libre à de l’eau. Ensuite, ils ont été euthanasiés avec 100 mg/kg de phénobarbital, injecté par voie intramusculaire (LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011), puis ils ont été mis en position décubitus dorsale, et une laparotomie a été effectuée afin de prélever le duodénum.

L’organe ainsi prélevé a été tout de suite plongé dans une boîte de Pétri contenant une solution de Tyrode (Tableau II) (TYRODE M., 1910), maintenue à la température de 37 °C, et aérée avec de l’air à l’aide d’un aérateur électrique.

Tableau II. Composition de la solution de Tyrode dans 1 litre d’eau distillée (TYRODE M., 1910)

Ingrédients NaCl KCl CaCl2 NaHCO3 MgCl2 NaHPO4 Glucose

Concentration (mM) 136 3,4 3,4 17 1,7 0,8 17

L’organe a ensuite été nettoyé en débarrassant les mésentères puis découpé en morceaux de 2 cm de long. Puis l’organe a été monté dans une cuve à organe isolé à l’aide de 2 nœuds en fil de coton inextensible placés à ses 2 extrémités. Le premier nœud a été fixé à un crochet se trouvant au fond de la cuve, et le deuxième a été relié à un capteur isométrique Gould - Statham© sous une tension de 1,5 g (KAMGANG R. et coll., 2015). La cuve contenait 20 ml de solution de Tyrode maintenue à la température de 37 °C et aérée à l’aide d’un aérateur électrique. Les contractions du duodénum ont été enregistrées avec le logiciel SignalMonitor© (IOGA).

L’organe a été laissé se stabiliser dans la cuve pendant 45 minutes. Pendant cette période, il a été rincé toutes les 15 minutes. Après cette période de stabilisation, le duodénum a été sensibilisé avec de l’acétylcholine, à la concentration de 10-5 M dans le bain. La préparation a ensuite été rincée puis laissée de nouveau se stabiliser pendant 30 minutes en changeant trois fois le bain, et en réajustant la tension (BORGES E.L. et coll., 2003).

Après la deuxième période de stabilisation, l’acétylcholine a été injectée dans le bain, de manière cumulative, afin de réaliser des concentrations finales croissantes à partir de 10-9 M jusqu’à l’obtention de la contraction maximale. Après l’obtention de cette contraction maximale, l’extrait MOHA-04 a été injecté dans le bain, de manière cumulative afin d’apprécier le relâchement de l’organe. L’amplitude des contractions a été mesurée, puis rapportée sur un papier semi logarithmique, et la CE50 de l’extrait a été déterminée graphiquement.

4. Effet de l’extrait MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine

Afin d’étudier le mécanisme mis en jeu lors du relâchement de l’organe provoqué par l’extrait, le duodénum isolé de cochon d’Inde a été pré-incubé dans un bain contenant l’extrait à différentes concentrations avant de le contracter avec de l’acétylcholine (HAMMAD H.M. et ABDALLAH S.S., 1997).

Après la période de stabilisation et de sensibilisation, l’extrait a été injecté dans le bain contenant l’organe pour réaliser une concentration finale de 0,125 mg/ml. L’organe a été laissé en contact avec l’extrait pendant 10 minutes. Après ce temps d’incubation, l’acétylcholine a été injectée de manière cumulative dans le bain, afin de réaliser une concentration à partir de 10-9 M jusqu’à la contraction maximale. Ensuite la préparation a été rincée, puis laissée se stabiliser pendant 45 minutes en la rinçant toutes les 15 minutes, et la même manipulation a été refaite mais en pré-incubant l’organe dans le bain contenant 0,25 mg/ml de l’extrait.

L’amplitude des contractions provoquées par l’acétylcholine, en absence et en présence de l’extrait a été mesurée, puis exprimée en fonction de la contraction maximale provoquée par l’acétylcholine seule, considérée comme 100 %. Ensuite, rapportée sur un papier semi- logarythmique en fonction de la concentration de l’acétylcholine et celle de l’extrait. La valeur de CE50 de l’acétylcholine a été déterminée graphiquement.

C. EXPRESSION ET ANALYSES DES RÉSULTATS

Les résultats obtenus ont été exprimés sous forme de moyenne avec écart type réduit (푥̅ ± e.s.m), puis les moyennes ont été comparées entre elles en utilisant le test « t » de Student, et la valeur de P<0,05 a été considérée comme significative.

RÉSULTATS

III. RÉSULTATS A. PARTIE CHIMIE

L’évaporation à sec du filtrat hydroalcoolique obtenu avec 200 g de poudre de feuilles, donne 32 g d’extrait, soit un rendement de 16 %.

Le criblage phytochimique effectué sur l’extrait hydroalcoolique MOHA-04 révèle la présence de tanins, de leucoanthocyanes, d’anthocyanes, de stéroïdes et de triterpènes en teneur moyenne. Tandis que les composés phénoliques, les flavonoïdes, les saponines et les alcaloïdes sont présents en faible teneur, enfin, les sucres réducteurs sont présents en très faible teneur (Tableau III).

Tableau III. Familles chimiques présentes dans l’extrait hydroalcoolique MOHA-04.

FAMILLES CHIMIQUES TENEUR

Tanins ++

Leucoanthocyanes ++

Anthocyanes ++

Stéroïdes et Triterpènes ++

Composés phénoliques +

Flavonoïdes +

Saponines +

Alcaloïdes +

Sucres réducteurs ±

B. PARTIE PHARMACOLOGIE 1. Effet de l’extrait MOHA-04 sur la sécrétion intestinale

L’administration du sulfate de magnésium chez le cochon d’Inde provoque une accumulation de fluide dans la lumière intestinale des animaux. Le volume du fluide intestinal des animaux traités avec l’extrait est inférieur à celui des animaux témoins. Chez les animaux du lot témoin, le volume du fluide intestinal est égal à 1,8 ± 0,2 ml, contre 0,9 ± 0,06 et 0,6 ± 0,1 ml chez les cochon d’Inde traités avec l’extrait aux doses respectives de 300 et de 600 mg/kg (P<0,05) (Figure 2). Ce qui correspond à une diminution respective de 51,85 % et de 66,67 % du volume du fluide intestinal par rapport au lot témoin.

1,5

0,5 Volume du fluide (ml) intestinal

0 Témoin Traité 300 mg/kg Traité 600 mg/kg

Doses (mg/kg)

Figure 2. Variation du volume du fluide intestinal provoquée par le sulfate de magnésium administré par voie orale chez les témoins et les cochons d’Inde traités avec l’extrait MOHA- 04, administré par voie orale, aux doses 300 et 600 mg/kg (푥̅ ± e.s.m ; n=3 ; P<0,05).

2. Effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale

L’injection de l’acétylcholine dans le bain contenant le duodénum isolé contracte ce dernier. Injectée d’une manière cumulative dans le bain, l’acétylcholine augmente l’amplitude de la contraction de l’organe. L’amplitude maximale est obtenue à la concentration de 10-3 M, avec -6 une CE50 égale à 1,7.10 M. En injectant l’extrait d’une manière cumulative dans le bain contenant l’organe précontracté avec de l’acétylcholine, il se relâche, et l’amplitude diminue en fonction de la concentration de l’extrait dans le bain. L’extrait provoque un relâchement de 26,19 ± 3 %, et 66,68 ± 2,06 % respectivement aux concentrations de 0,125 et de 0,5 mg/ml (P<0,05) (Figure 3).

10 Relâchement du duodénum (%) duodénum du Relâchement 0 0,125 mg/ml 0,250 mg/ml 0,500 mg/ml Concentrations MOHA-04 administrées (mg/ml)

Figure 3. Relâchement du duodénum, précontracté avec de l’acétylcholine, en présence de l’extrait MOHA-04 injecté dans le bain d’une manière cumulative (푥̅ ± e.s.m ; n=3 ; P<0,05).

3. Effet de MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine

Le mécanisme d’action de l’extrait MOHA-04 a été étudié en utilisant l’acétylcholine comme agent contracturant. En pré-incubant l’organe dans un bain contenant l’extrait avant de le contracter, l’amplitude maximale de la contraction provoquée par l’acétylcholine diminue, et sa CE50 augmente en fonction de la concentration de l’extrait dans le bain.

En absence de l’extrait, l’amplitude maximale de la contraction provoquée par l’acétylcholine -6 est de 64,28 ± 6,18 %, et sa CE50 est égale à 1,7.10 M. En présence de l’extrait aux concentrations de 0,125 et de 0,25 mg/ml dans le bain, l’amplitude maximale est de 30,95 ± -6 -6 2,06 % et 16,67 ± 2,06 % respectivement, et la CE50 est égale à 4,5.10 M et 6.10 M respectivement (P<0,05) (Figure 4).

100

40 Contraction (%) Contraction

0 -10 -8 -6 -4 -2 0 log concentrations de l'acétylcholine (M)

DISCUSSION

IV. DISCUSSION

Cette étude a eu pour objectif d’étudier l’activité de l’extrait hydroalcoolique MOHA-04 sur la diarrhée chez le cochon d’Inde. Son effet sur la sécrétion intestinale a été étudié in vivo sur l’accumulation de fluide intestinal provoquée par le sulfate de magnésium administré par voie orale ; tandis que son effet sur le péristaltisme intestinal a été étudié in vitro sur le duodénum isolé de cochon d’Inde contracté avec de l’acétylcholine.

Les résultats du test in vivo chez les animaux témoins, montrent que le sulfate de magnésium augmente le volume du liquide dans la lumière intestinale. Toutefois, celui des animaux traités avec l’extrait est inférieur à celui de ces témoins, et ce volume diminue en augmentant la dose de l’extrait administrée. Ceci nous permet de dire que l’extrait a diminué l’accumulation de fluide intestinale provoquée par le sulfate de magnésium administré par voie orale.

2+ 2- Administré par voie orale, le sulfate de magnésium se dissocie en Mg et SO4 , deux ions peu absorbables par la paroi intestinale. Leur présence dans la lumière intestinale attire de l’eau par un phénomène d’osmose, entrainant une accumulation du liquide intraluminal, conduisant à une diarrhée osmotique (EWE K., 1988 ; FINE K.D et coll., 1991). La diminution du volume de liquide intestinal, suite à l’administration de l’extrait par voie orale s’explique par le fait que l’extrait empêcherait la sortie d’eau vers la lumière intestinale, ou favoriserait la réabsorption d’eau. Dans le premier cas, il est probable que l’extrait resserre les pores au niveau de la paroi de la muqueuse intestinale, la rendant imperméable à la sécrétion d’eau. En outre, la sécrétion active de l’ion chlorure entraine une sécrétion d’eau lors de la diarrhée sécrétoire (FIELD M., 2003), et le blocage du canal aux ions chlorures, inhiberait la sortie d’eau (ILLEK B. et coll., 2000).

D’une part, les tanins, par leur caractère astringent, resserrent les pores et dénaturent les protéines qui forment les canaux au niveau de la paroi intestinale, empêchant une sécrétion d’électrolytes et d’eau (BRUNETON J., 1999). Des études réalisées sur un extrait de Juglans regia (JUGLANDAEA) contenant des tanins hydrosolubles ont montré que cet extrait inhibe la sécrétion de chlorure, ce qui entraine la diminution de la sécrétion d’eau dans la lumière intestinale (WONGSAMITKUL N. et coll., 2010). Les flavonoïdes inhibent aussi les canaux chlorures dans la lumière intestinale, réduisant ainsi la sécrétion d’eau intestinale. En outre, des études effectuées sur l’extrait de l’écorce de Croton lechleri (EUPHORBIACAEA) ont montré que les flavonoïdes contenus dans cet extrait inhibent les canaux chlorures, diminuant ainsi la sécrétion de cet ion et de l’eau (FISCHER H. et coll., 2004 ; GABRIEL S.E. et coll., 1999).

Dans le deuxième cas, le MgSO4 provoque la libération de cholécystokinine au niveau du duodénum, une hormone qui inhibe la réabsorption de chlorure de sodium et de l’eau (MALAGELADA J.R. et coll., 1978). Il se pourrait que la présence de l’extrait dans la lumière intestinale favorise l’absorption de sodium au niveau de l’intestin grêle ; et l’ion chlorure et l’eau suivent les mouvements du sodium, ce qui expliquerait la diminution du volume de fluide intestinal en présence de l’extrait (BINDER H.J., 2009). Il est probable que MOHA-04 inhiberait la cholécystokinine, expliquant en partie la diminution de l’accumulation du liquide dans l’intestin. Il y a une probabilité que l’inhibition de la cholécystokinine soit liée à la présence de tanins dans l’extrait. En effet, une étude effectuée sur une alimentation à base de tanins a montré que ces derniers inhibaient la cholécystokinine (AHMED A.E. et coll., 1990).

Par ailleurs, lors des tests in vitro, l’extrait relâche le duodénum pré-contracté avec de l’acétylcholine, et ce relâchement augmente en fonction de la concentration de l’extrait dans le bain. Ceci nous permet de dire que l’extrait MOHA-04 est capable de diminuer la contraction du duodénum provoquée par de l’acétylcholine. Et en pré-incubant l’organe dans un bain contenant de l’extrait, l’effet maximal de l’acétylcholine n’est plus atteint, et sa CE50 augmente. Ceci suppose que le principe actif de l’extrait est un antagoniste non compétitif de l’acétylcholine. En se fixant sur son récepteur, l’extrait pourrait relâcher le duodénum ou empêcherait l’acétylcholine de se fixer sur son récepteur, à l’origine du relâchement de l’organe (LANDRY Y. et GIES J.P., 2014). Comme l’extrait de Dodonaea viscosa (SAPINDACEAE), utilisée contre la diarrhée, qui agit sur les récepteurs β-adrénergiques (RAJAMANICKAM V. et coll., 2010).

Etant donné qu’une motilité intestinale accrue diminue le temps de contact entre le contenu luminal et l’épithélium pour l’absorption, cela provoque une diarrhée (FELDMAN M. et coll., 2010). En relâchant l’intestin contracté par l’acétylcholine, l’extrait MOHA-04 diminue le péristaltisme intestinal, ce qui augmente le temps de contact du contenu intestinal avec la paroi. Ceci expliquerait en partie la diminution du volume du fluide intestinal lors des tests in vivo.

D’une part, en dénaturant les protéines recouvrant la muqueuse intestinale, les tanins neutralisent l’irritabilité de celle-ci, diminuant ainsi sa sensibilité à la contraction et ainsi la motilité (SHARMA P. et coll., 2010). Ce fut le cas de l’étude sur Lithocarpus dealbata (FAGACEAE) qui a révélé le rôle antipéristaltique des tanins présents dans cette plante (YADAV A.K. et TANGPU V., 2007). D’autre part, les flavonoïdes diminueraient le péristaltisme intestinal en inhibant le système nerveux entérique qui est régulé lui-même par

l’acétylcholine (BERN M.J. et coll., 1989), un neuromédiateur responsable de la contraction du muscle intestinal. D’ailleurs, une étude réalisée sur Egletes viscosa (ASTERACEAE) a montré l’effet de relâchement des muscles lisses de l’intestin par les flavonoïdes contenus dans cette plante (RAO V.S., 1997).

Des études approfondies seraient nécessaires pour identifier les molécules responsables de ces effets ainsi que leurs mécanismes d’action.

CONCLUSION

V. CONCLUSION

Les résultats des tests effectués chez le cochon d’Inde montrent que l’extrait MOHA-04 diminue l’accumulation de fluide dans la lumière intestinale ainsi que la contraction du muscle lisse duodénal. Ces deux activités expliqueraient l’activité de la plante utilisée en médecine traditionnelle comme antidiarrhéique. Cette activité pourrait être associée aux tanins ou aux flavonoïdes présents dans l’extrait hydroalcoolique MOHA-04.

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« ÉTUDE DE L’ACTIVITÉ DE L’EXTRAIT MOHA-04 SUR LA DIARRHÉE CHEZ LE COCHON-D’INDE »

Auteur : AYADE Mohamed Houmadi Rapporteur : RANDRIANAVONY Patricia Année : 2016-2017 Email : [email protected] Adresse : Lot III K 3 A Ankaditoho BP : 8357 Numéro de téléphone : 032 62 755 60 Laboratoire : Laboratoire de Pharmacologie Email : [email protected] Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie - Faculté des Sciences Université d’Antananarivo

RÉSUMÉ

Cette étude avait pour objectif d’évaluer l’activité de l’extrait MOHA-04 sur la diarrhée chez le cochon d’Inde. Son activité anti-sécrétoire a été étudiée in vivo sur la diarrhée osmotique provoquée par sulfate de magnésium administré par voie orale, et son effet sur la motilité intestinale a été étudié in vitro sur le duodénum isolé de cochon d’Inde contracté avec de l’acétylcholine. L’administration de l’extrait par voie orale réduit l’accumulation de fluide intestinal de 50 ± 3,33 % et de 66,67 ± 5,56 % avec les doses de 300 et de 600 mg/kg respectivement par rapport au témoin (P<0,05). L’extrait injecté dans le bain à organe isolé d’une manière cumulative diminue la contraction du duodénum de 26,19 ± 3 %, et de 66,68 ± 2,06 % aux concentrations respectives de 0,125 et 0,5 mg/ml par rapport au témoin (P<0,05). L’incubation de l’organe dans un bain contenant de l’extrait aux concentrations respectives de 0,125 et de 0,25 mg/ml diminue l’amplitude maximale de la contraction provoquée par l’acétylcholine à 30,95 ± 2,06 %, et 16,67 ± 2,06 %, et augmente la CE50 de l’acétylcholine de 1,7.10-6 M à 4,5.10-6 et 6.10-6 respectivement (P<0,05). Ces effets sont à l’origine de l’activité anti- diarrhéique de cet extrait. Cette dernière pourrait être due à la présence des tanins ou des flavonoïdes dans l’extrait MOHA-04.

Mots clés : anti-diarrhéique, anti-motilité, anti-sécrétoire, cochon d’Inde.

ABSTRACT

The objective of this study was to investigate the activity of the extract MOHA-04 on diarrhea in guinea pig. The extract’s anti-secretory activity was studied in vivo on osmotic diarrhea induced by oral administration of MgSO4 while its effect on intestinal motility was studied in vitro on acetylcholine- induced contracted isolated duodenum.

Oral administration of the extract at doses 300 and 600 mg/kg reduces intestinal fluid accumulation by 50 ± 3.33 % and 66.67 ± 5.56 % respectively (P <0.05). Injecting the extract cumulatively into an organ bath at concentrations 0.125 and 0.5 mg/ml decreases the duodenal contraction by 26.19 ± 3 % and 66.68 ± 2.06 % respectively (P <0.05). Incubation of the organ in a bath containing the extract MOHA- 04 at concentrations of 0.125 and 0.25 mg/ml decreases the maximal amplitude of contraction caused by acetylcholine from 100 % to 30.95 ± 2.06 % and 16.67 ± 2.06 % respectively and increases the EC50 of acetylcholine 1.7.10-6 M to 4.5.10-6 and 6.10-6 respectively (P <0.05). These results indicate that extract MOHA-04 possesses anti-diarrheal activity. The presence of tannins and flavonoids in the extract MOHA-04 could be responsible for this activity.

Keywords: antidiarrheal, anti-motility, anti-secretory, guinea pig.