Ecologie Des Micro-Organismes Producteurs D'hydrogène Des Sources Hydrothermales Alcalines Associées À La Serpentinisation

THESE DE DOCTORAT D’AIX-MARSEILLE UNIVERSITE

Ecole Doctorale : Sciences de l’Environnement

Présentée par Nan MEI En vue de l’obtention du grade de Docteur d’Aix-Marseille Université

Spécialité : Océanographie

Ecologie des micro-organismes producteurs d’hydrogène des sources hydrothermales alcalines associées à la serpentinisation en Baie de Prony, Nouvelle-Calédonie

Date de soutenance : le 30 Septembre 2016 devant la commission d’examen

Composition du jury :

Mme Anne GODFROY Chercheuse Ifremer, LM2E Rapportrice

M. Rémy GUYONEAUD Professeur, Université de Pau Rapporteur

Mme Bénédicte MENEZ Professeur, IPGP Examinatrice

M. Alain DOLLA Chercheur CNRS, DR Examinateur

M. Gaël ERAUSO Professeur, AMU Directeur de thèse

Mme Marianne QUEMENEUR Chercheuse IRD, MIO Co-directrice de thèse Résumé :

Le système hydrothermal de la baie de Prony en Nouvelle-Calédonie est composée de plusieurs sources émettant à faible profondeur (<50 mbsl) des fluides hyperalcalins (pH ~11), mesothermiques (<40°C), et anoxiques riches en hydrogène (H2) et méthane, produits par la réaction de serpentinisation. Dans le cadre de ces travaux de thèse, la capacité potentielle des micro-organismes à produire de l’H2 dans ces écosystèmes alcalins a été évaluée par des analyses moléculaires et culturales. Nos premières analyses moléculaires basées sur le gène codant l’ARNr 16S ont permis de mettre en évidence une grande diversité de bactéries et une faible diversité d’archées dans les fluides et cheminées hydrothermales. La diversité et la distribution des populations productrices d’H2 a ensuite été spécifiquement évaluée par des analyses métagénomiques et basées sur la PCR. Les séquences de gènes hydA, codant la sous-unité catalytique des hydrogénases [Fe-Fe], utilisés comme marqueur moléculaire des bactéries productrices d’H2, étaient principalement associées à celles du phylum des Firmicutes (ordre des Clostridiales). Deux groupes de séquences hydA se sont distinguées en fonction de l’origine « sous-marine/anoxique » ou « intertidale/oxique » des échantillons. De plus, plusieurs nouvelles bactéries alcalophiles ont été isolées des cheminées hydrothermales de différents sites intertidaux ou sous-marins de la baie de Prony. Parmi elles, la souche alcalophile et anaérobie, PROH2 (appartenant au genre Clostridium) a été isolée de l’Aiguille de Prony et est capable de produire efficacement de l’H2 par voie fermentaire (2,71 moles d’H2/mole de glucose) en condition alcaline (pH 9,5), de façon comparable aux espèces de Clostridium neutrophiles. Ces travaux présentent également la caractérisation d’une nouvelle espèce bactérienne anaérobie, mésophile et alcalophile (pH optimum de 9,5) d’un nouveau genre, nommée Serpentinicella alkaliphila, isolée d’un site intertidal de la baie de Prony. Contrairement à la souche PROH2, la souche 3bT, produit peu d’H2 et les principaux produits de fermentation du lactate sont l’acétate et le propionate, tandis que le crotonate est dismuté en acétate et butyrate. L’ensemble des données moléculaires et issues de la culture démontre la capacité des Firmicutes des environnements associés à la serpentinisation à produire de l’H2 par voie fermentaire.

Mots clefs : Serpentinisation, Hydrogène, Séquençage à haut-débit, Diversité microbienne, Hydrothermalisme, Firmicutes.

Abstract:

The Prony hydrothermal field (PHF, New Caledonia) is composed of several shallow-submarine springs (<50 mbsl) discharging into the lagoon seawater high pH (~11), moderate temperature (<40°C), low-salinity fluids, enriched in hydrogen (H2) and methane produced by serpentinization. In this work, we evaluated the potential ability of microorganisms to produce H2 in this alkaline ecosystem by using both molecular and cultural approaches. Our first molecular analyses based on 16S rRNA genes provided evidence of high bacterial abundance and diversity contrasting with low archaeal diversity in the PHF chimneys. The diversity and distribution of potential H2- producing bacteria were specifically investigated by using metagenomic analyses and different PCR-sequencing methods. The sequences of hydA genes encoding the catalytic subunit of [FeFe]-hydrogenases, used as molecular marker of H2-producing bacteria, were mainly related to those of Firmicutes (order Clostridiales). Two groups of hydA sequences were distinguished according to the "submarine/anoxic" or "intertidal/oxic" origin of the samples.

Moreover, novel alkaliphilic H2-producing Firmicutes were successfully cultivated from both intertidal and submarine PHF chimneys. Among them, an alkaliphilic and anaerobic strain, Clostridium sp. PROH2, belonging to the genus Clostridium, was isolated from the Prony Needle and demonstrated efficient H2 production (2.71 mol

H2/mol glucose) at a high pH (9.5), which is comparable to neutrophilic clostridial species. This manuscript also present the characterization of a novel anaerobic, mesophilic and alkaliphilic species belonging to a new genus, named Serpentiniticella alkaliphila 3bT, isolated from an intertidal PHF site. Contrary to the strain PROH2, the strain T 3b produces few H2 and the main lactate fermentation products are acetate and propionate, while crotonate is disproportionated into acetate and butyrate. Both molecular and cultivation-based data demonstrated the ability of Firmicutes originating from serpentinite-hosted environments to produce H2 by fermentation.

Keywords: Serpentinization, Hydrogen, High-throughput sequencing, Microbial diversity, Hydrothermalism, Firmicutes.

Remerciements

Une belle aventure touche à sa fin, une aventure Marseillaise et Luminyenne de 3 ans, sous le pied de Mont Puget près des belles calanques, avec de magnifiques collègues du MIO, qui m’ont appris le français, fait découvrir la science, et m’ont changé la vie.

Je remercie Richard Sempéré, directeur de l’unité, pour m’avoir accueillie au sein de l’institut, sans qui je n’aurais pas eu la chance de commencer cette aventure, ainsi que Chinese Scholarship Council (CSC) pour le soutien financier de ma thèse.

Je tiens à remercier les membres du jury qui ont accepté de juger ce travail de thèse et de participer à ma soutenance : Anne Godfroy, Rémy Guyoneaud, Bénédicte Ménez et Alain Dolla.

Je remercie Bernard Ollivier, directeur de recherche à l’IRD, pour m’avoir accueillie dans son laboratoire, pour son humour et ses connaissances scientifiques ; mon directeur de thèse Gaël Erauso, pour m’avoir permis de travailler sur ce projet passionnant, et pour la confiance qu’il m’a apportée ; Anne Postec ainsi que tout l’équipe Prony pour leur soutien tout au long de la thèse.

Je voudrais exprimer particulièrement mon immense reconnaissance envers Marianne Quéméneur, ma chère encadrante et co-directrice de thèse, pour son encadrement, ses conseils, son soutien, sa patience (surtout pour les nombreuses corrections de mon manuscrit), son écoute, et toutes les connaissances qu’elle a pu m’apporter au cours des 3 ans. MERCI !

Un grand merci à : - Marie-Laure Fardeau, Manon Bartoli et Wajdi Ben Hania pour m’avoir enseigné la culture en anaérobiose, et Sophie Guasco pour partager ses astuces de qPCR, -Fabrice Armougom de m’avoir formée à Linux et à la bioinformatique, et Eléonore, toujours prête à m’expliquer et donner un coup de main quand je rencontre des problèmes sur QIIME, - Bernard Ollivier, Anne Postec, Christophe Monnin, Bénédicte Ménez et Gaël Erauso pour leurs corrections d’articles, - Patricia Bonin et Valérie Michotey pour les pilotages de thèse et leurs conseils précieux, - L’organisation Deep Carbon Observatory (DCO) pour m’avoir donné l’opportunité de participer en 2015 au « Deep Life Meeting » à Lisbonne, qui m’a permis de rencontrer les chercheurs les plus connus du monde dans le domaine, ainsi que l’Association Francophone d’Ecologie Microbienne (AFEM) et la fondation Gordon and Betty Moorede m’avoir attribué une bourse pour participer au « Ramon Margalef Summer Colloquia 2016» à Barcelone.

Je tiens aussi à remercier mes camarades Eléonore, Fatma, Amira, Méline, Fernanda, Manel, Maxime, Axel, Guillaume et Yannick pour leur soutien moral et les nombreuses discussions intéressantes. Et merci à Clara, de m’avoir motivé plusieurs fois à courir aux calanques, qui m’a donné la pêche pour faire face aux difficultés.

Je voudrais aussi remercier Agnès, Manon, Wajdi, Jean-Luc, Jean, Sylvain, Pierre- Pol, Nathalie, Grégoire, Philippe, Laurie, Corinne et tous ceux qui ont partagé leur bonne humeur avec moi, pour leur sympathie et leur bienveillance.

Je n’oublie pas de remercier mes chers amis Chinois à Marseille pour les merveilleux moments partagés, et Cappuccino, mon petit félin malin qui me fait rigoler et me donne de la douceur chaque jour.

Enfin, j’adresse toute mon affection à ma famille : leur confiance, leur tendresse, et leur amour me portent tous les jours, et à ma moitié qui est toujours à mes cotés pour m’écouter et me soutenir, m’amène à voyager à chaque fois j’ai besoin de me vider la tête, en Europe, en Afrique du nord, en arctique, merci de me montrer que le monde est si beau.

Merci à tous pour cette belle aventure ! Que tous ceux qui ont contribué à faciliter cette thèse trouvent ici le témoignage de ma sincère gratitude !

Sommaire

LISTE DES COMMUNICATIONS ...... 1

LISTE DES FIGURES ...... 3

LISTE DES TABLEAUX ...... 5

ABRÉVIATIONS ...... 7

INTRODUCTION GÉNÉRALE ...... 9

CHAPITRE I : SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 15

1. SERPENTINISATION DE LA LITHOSPHÈRE OCÉANIQUE...... 17 1.1. Réaction abiotique de la serpentinisation ...... 19 1.2. Serpentinisation et l’origine de la vie ...... 21 1.3. Sites marins et terrestres associés à la serpentinisation ...... 25 1.3.1. Les sites terrestres associés à la serpentinisation : les ophiolites...... 25 1.3.2. Les sites marins associés à la serpentinisation ...... 28 Lost City ...... 28 Les sites mixtes des dorsales océaniques ...... 30 Zones de subduction et volcans de boues ...... 31 1.3.3. La baie de Prony : un écosystème côtier unique associé à la serpentinisation ...... 32 1.4. Caractéristiques géochimiques des sources alcalines ...... 34 Caractéristiques des fluides hydrothermaux de Prony ...... 35 1.5. Microbiologie des systèmes associés à la serpentinisation ...... 38 1.5.1. Approches de microbiologie utilisées ...... 38 1.5.2. Micro-organismes détectés dans les environnements associés à la serpentinisation par des approches moléculaires ...... 39 1.5.3. Micro-organismes cultivés d’environnements associés à la serpentinisation ...... 44 2. LA PRODUCTION BIOLOGIQUE D’HYDROGÈNE ...... 46 2.1. L’hydrogène : un vecteur d’énergie prometteur ...... 46

2.2. La production biologique d’H2 ...... 47 2.3. La production de biohydrogène par voie fermentaire ...... 49 2.4. Les hydrogénases ...... 54 2.4.1. Généralités ...... 54 2.4.2. Comparaison des hydrogénases [NiFe] et [FeFe]...... 55 2.4.3. Diversité des hydrogénases [FeFe] dans l’environnement ...... 57 La sous-unité catalytique HydA et le centre H ...... 57 3. LES MICRO-ORGANISMES ALCALOPHILES ...... 61 3.1. Définition ...... 61 3.2. Distribution des alcalophiles et environnements alcalins ...... 61 3.3. Mécanismes d’adaptation des alcalophiles ...... 63 3.4. Utilisation des alcalophiles et application biotechnologiques ...... 65 3.4.1. Applications des enzymes alcalines ...... 66 3.4.2. Utilisation des alcalophiles pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique ...... 67 3.4.3. Utilisation des alcalophiles dans l’alimentation ...... 68

3.5. Diversité des micro-organismes alcalophiles ...... 68 3.5.1. Micro-organismes alcalophiles aérobies ...... 68 3.5.2. Micro-organismes alcalophiles anaérobies ...... 71 CHAPITRE II : EXPLORATION DU POTENTIEL DE PRODUCTION D'HYDROGÈNE PAR LES MICRO-ORGANISMES DU SYSTÈME HYDROTHERMAL DE PRONY ...... 75

CHAPITRE III : PERFORMANCE DE PRODUCTION D’HYDROGÈNE EN CONDITION ALCALINE PAR UNE BACTÉRIE ANAÉROBIE ET ALCALOPHILE ISOLÉE DE L’AIGUILLE DE PRONY ... 127

CHAPITRE IV : CARACTÉRISATION D’UNE BACTÉRIE ANAÉROBIE ET ALCALOPHILE D'UN NOUVEAU GENRE ISOLÉE DE L’ÉCOSYSTÈME HYDROTHERMAL DE PRONY ...... 141

CHAPITRE V. CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES ...... 167

ANNEXES ...... 177

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 183

Liste des communications

Publications dans des journaux : 1. Mei N., Zergane N., Postec A., Erauso G., Ollier A., Payri C., Pelletier B., Fardeau M-L., Ollivier B., Quéméneur M. (2014). Fermentative hydrogen production by a new alkaliphilic Clostridium sp.(strain PROH2) isolated from a shallow submarine hydrothermal chimney in Prony Bay, New Caledonia. International Journal of Hydrogen Energy, 39(34), 19465-19473. 2. Quéméneur M., Bes M., Postec A., Mei N., Hamelin J., Monnin C., Chavagnac V., Payri C., Pelletier B., Guentas-Dombrowsky L., Gérard M., Pisapia C., Gérard E., Ménez B., Ollivier B., Erauso G. (2014). Spatial distribution of microbial communities in the shallow submarine alkaline hydrothermal field of the Prony Bay, New Caledonia. Environmental Microbiology Reports, 6(6), 665-674. 3. Postec A., Quéméneur M., Bes M., Mei N., Benaïssa F., Payri C., Pelletier B., Monnin C., Guentas-Dombrowsky L., Ollivier B., Gérard E., Pisapia C., Gérard M., Ménez B., Erauso G. (2015). Microbial diversity in a submarine carbonate edifice from the serpentinizing hydrothermal system of the Prony Bay (New Caledonia) over a 6-year period. Frontiers in Microbiology, 6:857. 4. Abdallah M. B., Karray F., Mhiri N., Mei N., Quéméneur M., Cayol J-L., Erauso G., Tholozan J-L., Alazard D., Sayadi S. (2016). Prokaryotic diversity in a Tunisian hypersaline lake, Chott El Jerid. Extremophiles, 20(2):125-38. 5. Mei N., Postec A., Monnin C., Pelletier B., Payri C., Ménez B., Frouin E., Ollivier B., Erauso G., Quéméneur M. Metagenomic and PCR-based diversity surveys of [FeFe]- hydrogenases combined with isolation of alkaliphilic hydrogen-producing bacteria from the serpentinite-hosted Prony hydrothermal field, New Caledonia. Frontiers in Microbiology. In press. 6. Mei N., Postec A., Erauso G., Joseph M., Pelletier B., Payri C., Ollivier B., Quéméneur M. Serpentinicella alkaliphila gen. nov., sp. nov., a novel alkaliphilic anaerobe isolated from the serpentinite-hosted Prony Hydrothermal Field, New Caledonia. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Accepted. 7. Abdallah M. B., Karray F., Mhiri N., Mei N., Quéméneur M., Cayol J-L., Erauso G., Tholozan J-L., Alazard D., Sayadi, S. Abundance and diversity of prokaryotic community in a Tunisian hypersaline Lake Chott El Jerid during the fresh season. Microbiological Research. Submitted.

Communications orales : 1. L’écosystème hydrothermal hyperalcalin sous-marin de la baie de Prony, Nouvelle- Calédonie. MEI Nan, QUEMENEUR Marianne, POSTEC Anne, BES Méline, PAYRI Claude, PELLETIER Bernard, OLLIVIER Bernard, ERAUSO Gaël. -VIIème colloque de l'Association Francophone d'Ecologie Microbienne, Anglet, 2015

2. Diversity of total microorganisms and hydrogen-producing bacteria in the hydrothermal hyperalkaline ecosystem of Prony Hydrothermal Field (New Caledonia). MEI Nan, POSTEC Anne, BES Méline, PELLETIER Bernard, PAYRI Claude, OLLIVIER Bernard, ERAUSO Gaël, QUEMENEUR Marianne. -Ramon Margalef Summer Colloquia, Barcelone, 2016

Communications posters : 1. Biological hydrogen production and [FeFe]-hydrogenase diversity in the hyperalkaline submarine Prony hydrothermal field (New Caledonia). MEI Nan, QUEMENEUR Marianne, POSTEC Anne, PELLETIER Bernard, PAYRI Claude, OLLIVIER Bernard, ERAUSO Gaël. -Deep Life Meeting, Lisbonne, 2015

2. Production de biohydrogène et diversité des hydrogénases [Fe-Fe] du système hyperthermal sous-marin hyperalcalin de la baie de Prony, Nouvelle-Calédonie. MEI Nan, LI Zhonglin, POSTEC Anne, PELLETIER Bernard, PAYRI Claude, OLLIVIER Bernard, ERAUSO Gaël, QUEMENEUR Marianne. -VIIème colloque de l'Association Francophone d'Ecologie Microbienne, Anglet, 2015

3. Serpentinicella alkaliphila gen. nov., sp. nov. : une bactérie anaérobie et alcalophile isolée d’un système hydrothermal sous-marin associé à la serpentinisation (baie de Prony, Nouvelle- Calédonie). MEI Nan, POSTEC Anne, ERAUSO Gaël, JOSEPH Manon, PELLETIER Bernard, PAYRI Claude, OLLIVIER Bernard, QUEMENEUR Marianne. -Journées thématiques de l'AFEM, 2016

Liste des figures

Figure 1. Mouvement de convection à l’intérieur de manteau qui provoque le déplacement des lithosphères ...... 17

Figure 2. Carte géologique de l’âge de la lithosphère océanique en million d’années avec les limites des plaques tectoniques …………...... 18

Figure 3. Schéma illustrant la subduction de la lithosphère océanique, la formation d’un Arc volcanique et l’obduction de la lithosphère océanique ...... 18

Figure 4. A. Serpentinisation d'olivine lors d’une expérience montrant la dissolution de l’olivine et la conversion en serpentine fibreuse (chrysotile), brucite lamellaire et magnétite octaédrique (mgt) B : Exemple d’une serpentinite échantillonnée du massif Atlantis qui abrite le site de Lost City ….……………………………………………………………..…………………...…….19

Figure 5. Schéma comparant la taille des plaques actuelles (à gauche) à celle supposée des plaques archéennes (à droite) ….…………………………………...…………..……………..21

Figure 6. Réaction de Strecker ………………………………………..………………………22

Figure 7. Modèle pour l'émergence de la vie dans un environnement sous-marin alcalin de la mer primitive ……………………………………….…………….……………………...…...24

Figure 8. Identification de serpentine d'âge noachien (plus de 3,7 milliards d’années) à la surface de Mars ………………………………………………………………………………….……24

Figure 9. Distribution des sites terrestres et marins associés à la serpentinisation et dont les communautés microbiennes et/ou la géochimie ont été étudiées ………………………...……26

Figure 10. Photographies du site hydrothermal de Lost City ...... 29

Figure 11. Localisation et un échantillon carbonaté de Ghost City …………………………..30

Figure 12. Les fumeurs noirs au site hydrothermal atlantique de Rainbow …………………...31

Figure 13. Cheminées de carbonate formées sur le volcan de boue de serpentine Mont Quaker au sud de l’arrière-arc des Mariannes …………………………………………………………32

Figure 14. Contexte géologique de la baie de Prony …………………...... ………….33

Figure 15. Structure des communautés bactériennes dans les quatre cheminées hydrothermales alcalines échantillonnées dans la baie de Prony à différentes profondeurs : 0, 16, 38 et 46 m ………………………………………………………………………………………………...39

Figure 16. Diversité des Methanosarcinales au sein des cheminées carbonatées de Prony …...... 42

Figure 17. Modèle géomicrobiologique de l’écosystème hydrothermal alcalin sous-marin associé à la serpentinisation de Prony …………………………...………..…………………..43

Figure 18. Deux voies possibles pour la production d'hydrogène chez les bactéries du genre Clostridium …………….……………………………………………………..….…………….52

Figure 19. Structure des hydrogénases [FeFe] et [NiFe] …………………………..………….55

Figure 20. Domaines fonctionnels de la sous-unité HydA ……………………………………58

Figure 21. Colonnes de tuf dans le lac Mono, en Californie, États-Unis ………………..…...... 62

Figure 22. Plateforme de carbonate du Bain des Japonais dans la baie de Prony, Nouvelle- Calédonie …………………………………………………….………………….……………63

Figure 23. Cycle de proton et de sodium interactif chez la bactérie alcalophile Bacillus pseudofirmus OF4 ……………………………………………….....…………………………64

Figure 24. Groupes microbiens impliqués dans la consommation et la production de l’hydrogène dans les environnements associés à la serpentinisation ………………………...171

Liste des tableaux

Tableau 1. Caractéristiques géochimiques des sites terrestres et côtiers associés à la serpentinisation ………………………………………………………….…………………....36

Tableau 2. Caractéristiques géochimiques des sites marins associés à la serpentinisation .……………………………………………………………………………...…………..…….37

Tableau 3. Bactéries et archées cultivées à partir d'écosystèmes associés à la serpentinisation ………………………………………………………………………………………………...45

Tableau 4. Principaux processus biologiques de production d’hydrogène ……...…………….48

Tableau 5. Performances de production d’hydrogène de souches pures fermentaires lors de cultures en batch ………………………………………………..…………………………….51

Tableau 6. Procaryotes alcalophiles isolés d'environnements serpentinisés ……………...... …70

Tableau 7. Principaux genres bactériens renfermant des espèces anaérobies alcaliphiles facultatives ou obligatoires ……………………………………………………………...……73

Abréviations

ADN : acide désoxy-ribonucléique

ADNr 16S : ADN codant pour la sous-unité 16S de l'ARN ribosomal

AGV : acides gras volatils

ARN : acide ribonucléique

ARNr 16S : sous-unité 16S de l’ARN ribosomal

ATP : adenosine triphosphate

BdJ : Bain des Japonais

CIR : Central Indian Ridge

CVA : Aquifère de Cabeço de Vide

DIC : carbone inorganique dissous

DOC : carbone organique dissous dsrB : gène codant la sous-unité β de la sulfite reductase dissimilatrice

Fd : ferrédoxine

Fe : Fer

FPM : Force proton-motrice

GC-MS : Gas chromatography-mass spectrometry hydA : gène codant l’hydrogénase [Fe-Fe]

IRD : Institut de Recherche pour le Développement

LCMS : Lost City Methanosarcinales

MAR : Axe de la dorsale Médio-Atlantique mcrA : gène codant la sous-unité alpha de la methyl coenzyme M réductase

NAD : nicotinamide adénine dinucléotide

NGS : Séquençage de l’ADN nouvelle génération

ODP : Ocean Drilling Program

OTU : Operational Taxonomic Unit

PCR : Polymerase Chain Reaction

PHF : Prony Hydrothermal Field

RK : Rivière des Kaoris

SAGMEG : South Africa Gold Mine Euryarchaeotic Group

SLIME : Subsurface Litoautotrophic Microbial Ecosystems

TCMS : The Cedars Methanosarcinales

Introduction générale

Des sources hydrothermales d’exception sont étudiées depuis peu dans la baie de Prony, au sud de la Nouvelle-Calédonie. Connues depuis des dizaines d’années, ce n’est qu’en 2011, lors de la campagne océanographique HYDROPRONY, qu’une équipe de scientifiques issus de différents laboratoires français a débuté un vaste projet visant à étudier l’ensemble du système hydrothermal de Prony de manière multidisciplinaire en associant la géochimie, la minéralogie et la biologie. Ma thèse s’inscrit dans le volet microbiologique de ce projet.

Contrairement aux sources hydrothermales plus connues sous le nom de « fumeurs noirs » qui émettent des fluides chauds (avoisinant 350°C) et acides (pH faible inférieur à 3) au niveau des dorsales océaniques, les sources sous-marines de Prony, situées à moins de 50 mètres de profondeur dans le lagon, libèrent des fluides alcalins (pH élevé supérieur à 11) très peu salés avec des températures plus modérées (inférieures à 40°C). Le contact de ces fluides avec l’eau de mer provoque des précipitations minérales qui donnent lieu à la formation de cheminées carbonatées pouvant atteindre plusieurs mètres de haut.

Ce type d’hydrothermalisme original n’avait été observé et étudié qu’à Lost City, découvert en 2000 à 800 mètres de profondeur à proximité de la dorsale médio-atlantique par des équipes américaines. A Prony, comme à Lost City, les fluides alcalins sont anoxiques (pauvres en oxygène) et contiennent des quantités élevées d’hydrogène produit lors de l'hydratation des roches du manteau terrestre : un processus abiotique dénommé serpentinisation. L’hydrogène produit réagit ensuite avec le dioxyde de carbone (gaz carbonique) environnant pour générer du méthane et d’autres molécules organiques comme les alcanes.

Depuis une dizaine d’années, les sources hydrothermales alcalines suscitent un intérêt croissant de la part de la communauté scientifique car leur contexte géochimique particulier aurait pu être favorable à l’émergence de la Vie sur la Terre primitive il y a quelques 3,5 milliards d’années et potentiellement sur d’autres planètes telles que Mars. Le site de Prony, idéalement situé à faible profondeur, à la transition entre les compartiments terrestres et marins, constitue donc un observatoire naturel facilement accessible pour mieux comprendre les processus biotiques et abiotiques qui auraient pu conduire à la première cellule vivante.

Les micro-organismes vivent en abondance au cœur des cheminées hydrothermales alacalines en contact direct avec les fluides alcalins et les carbonates, allant jusqu’à former d’importants biofilms. De nombreuses espèces ont déjà été répertoriées dans les cheminées carbonatées de Prony à l’aide d’approches moléculaires basées sur le séquençage de gènes

marqueurs. Nos récentes études moléculaires ont révélés également que leur abondance et leur diversité varient en fonction de la profondeur, de la localisation et de la structure des cheminées. Actuellement, nous recherchons les principaux groupes trophiques microbiens qui sont en liaison directe avec la géochimie de ces écosystèmes (production d’hydrogène et méthane notamment), pour mieux appréhender les mécanismes d’adaptation en condition extrême (pH alcalin) et leur rôle dans l’édification des cheminées.

Au cœur des cheminées, les micro-organismes n’ont accès qu’à des niveaux très faibles d’oxygène et de lumière et l’on peut supposer qu’ils manifestent essentiellement un métabolisme anaérobie basé sur l’utilisation et la production de l’hydrogène et du méthane. Nous tentons de reproduire en laboratoire les conditions favorables au développement des micro-organismes indigènes. Plusieurs bactéries alcalophiles ont déjà été isolées de ces sources par les chercheurs de notre équipe. Comme pour la plupart des écosystèmes étudiés sur Terre, la majorité des micro-organismes détectés sur ce site reste encore incultivée, ce qui augure des découvertes originales à faire par les microbiologistes travaillant sur cet écosystème extrême.

L’objectif général de ce travail de thèse est d’étudier la diversité microbienne des sources hydrothermales de la baie de Prony associées au cycle de l’hydrogène. Dans ce cadre, les travaux se sont principalement concentrés sur l’évaluation d’une potentielle production biologique d’hydrogène dans ces environnements, et focalisés sur la diversité des micro- organismes produisant l’hydrogène par voie fermentaire en condition alcaline. En effet, de nombreuses bactéries appartenant au phylum des Firmicutes et à l’ordre des Clostridiales, connus pour produire de l’hydrogène à partir d’un large spectre de substrats, ont été détectées dans ces environnements connus pour produire une grande quantité d’hydrogène. De plus, les conditions d’anoxie caractérisant ces environnements alcalins semblaient favorables au développement de micro-organismes impliqués dans la production d’hydrogène par voie fermentaire.

Les travaux réalisés pour rechercher la présence de micro-organismes producteurs d’hydrogène ont tout d’abord consisté en l’analyse moléculaire des échantillons pour évaluer leur diversité microbienne (PCR des gènes codant l’ARNr 16S et du gène fonctionnel hydA associé à la production de l’hydrogène, clonage/séquençage, séquençage à haut-débit et métagénomique). En parallèle, des cultures d’enrichissement ont été effectuées à partir d’échantillons de cheminées et de fluides hydrothermaux en condition alcaline, pour isoler des

micro-organismes producteurs d’hydrogène et les caractériser phylogénétiquement et physiologiquement.

Ce mémoire de thèse s’organise en cinq chapitres, afin de répondre à ces objectifs.

Le chapitre I présente une synthèse bibliographique : (i) des différents sites terrestres et sous-marins associés à la réaction de serpentinisation, i.e. leurs caractéristiques géographiques et chimiques, ainsi que les principaux micro-organismes détectés par des approches moléculaires et culturales ; (2) des processus de production biologique d’hydrogène dans l’environnement, i.e. les différents types de mécanismes et de micro-organismes mis en jeu, ainsi que les enzymes impliquées ; (3) des micro-organismes alcalophiles vivant dans les environnements alcalins, i.e. leurs stratégies d’adaptation et leurs principales caractéristiques phylogénétiques et métaboliques.

Les trois chapitres suivants, II, III et IV, présenteront les résultats obtenus durant ces travaux de thèse sous forme de publications, brièvement introduites par un avant-propos. Le chapitre II présente l’étude de la diversité des hydrogénases [Fe-Fe] par des approches métagénomiques et basées sur la PCR et l’isolement de bactéries alcalophiles productrices d’hydrogène dans le système hydrothermal de la Baie de Prony (Nouvelle-Calédonie). Cette étude avait pour objectif d’étudier le potentiel de production d’hydrogène par les bactéries de différentes sources hydrothermales de Prony par des approches moléculaires et culturales. L’étude se concentre sur l’évaluation de la diversité des gènes hydA, codant les hydrogénases [Fe-Fe], par des approches métagénomiques et basée sur la PCR. Elle donne également un aperçu de la diversité bactérienne dans les quatre sources étudiées de la baie de Prony par des analyses moléculaires basées sur le séquençage à haut débit de l’ADNr 16S. Différentes souches productrices d’hydrogène et isolées à partir du système hydrothermal de Prony sont également présentés. Les deux chapitres suivants sont consacrés à la présentation de la caractérisation de deux de ces nouvelles souches bactériennes isolées de cheminées de deux sites différents de Prony : l’Aiguille de Prony (site sous-marin) et le site de la Rivière des Kaoris (site intertidal). Le chapitre III présente l’isolement de la souche bactérienne alcalophile et fermentaire appartenant au genre Clostridium. Dans ce chapitre, les performances de production d’hydrogène de la souche PROH2 sont évaluées dans différentes conditions de pH initial, température, salinité et substrats. Le chapitre IV présente la caractérisation d’une nouvelle souche anaérobie et alcalophile, notée 3b, représentant la première espèce d’un nouveau genre de l’ordre des Clostridiales, phylum Firmicutes.

Le chapitre V propose une discussion des résultats obtenus au cours de cette thèse ainsi que des perspectives pour la suite de ce projet.

Enfin, les annexes de ce mémoire de thèse présente les deux premiers articles associés à ces travaux de thèse, et dont je suis co-auteur:

- Le premier article «Spatial distribution of microbial communities in the shallow submarine alkaline hydrothermal field of the Prony Bay, New Caledonia» a été publié dans Environmental Microbiology Report en 2014.

- Le deuxième article «Microbial diversity in a submarine carbonate edifice from the serpentinizing hydrothermal system of the Prony Bay (New Caledonia) over a 6-year period» a été publié dans Frontiers in Extreme Microbiology en 2015.

Chapitre I : Synthèse bibliographique

1. Serpentinisation de la lithosphère océanique

La Terre s'est formée il y a 4,54 milliards d'années et possède une chaleur importante du fait de la radioactivité et de la chaleur d'accrétion initiale. Au cours du temps, elle s’est refroidie en évacuant la chaleur à sa surface (mécanisme de convection) (Figure 1). La lithosphère, l’enveloppe rigide de la surface de la Terre, comprend les croûtes continentales et océaniques, ainsi qu’une partie du manteau supérieur. Elle est subdivisée en plaques tectoniques (ou lithosphériques) limitées par des zones actives où se produit une activité volcanique et sismique. La lithosphère rigide repose sur l’asthénosphère moins rigide, ce qui conduit à un déplacement de ces plaques et à une dissipation de la chaleur interne de la Terre.

Figure 1. Mouvement de convection à l’intérieur de manteau qui provoque le déplacement des lithosphères (http ://clercsvt.jimdo.com/college/quatrieme/2-volcanisme/).

La lithosphère océanique se forme à l’axe des dorsales océaniques par accrétion. Elle est constituée de la croûte océanique, composée de gabbros et de basaltes, et du manteau lithosphérique, composé de péridotites (riches en olivine. Elle s’épaissit en vieillissant en s’éloignant de la dorsale, mais reste moins épaisse (mais plus dense) que la lithosphère continentale. Actuellement, la majeure partie de la lithosphère océanique est âgée de moins de 200 millions d’années (Figure 2), car elle disparait dans le manteau asthénosphérique au niveau des zones de subduction pendant qu’une nouvelle lithosphère océanique se crée au niveau des dorsales. Néanmoins, il arrive que des portions de lithosphère océanique soient charriées sur les marges continentales lors d’une obduction (Figure 3). Elle entraine la formation de complexes ophiolitiques. Ce phénomène estla conséquence du blocage de la subduction, dû à un arc volcanique présent sur la croûte océanique normalement subduite.

Figure 2. Carte géologique de l’âge de la lithosphère océanique en million d’années avec les limites des plaques tectoniques (Source : site earthbyte.org).

Figure 3. Schéma illustrant la subduction de la lithosphère océanique, la formation d’un Arc volcanique et l’obduction de la lithosphère océanique (https://www.uwgb.edu/dutchs/CostaRica2008/CRAccretion.HTM).

1.1. Réaction abiotique de la serpentinisation

La serpentinisation est un processus géochimique qui se produit lorsque les roches du manteau lithosphérique essentiellement constitué de péridotites s’hydratent pour produire des serpentinites1. Les réactions modèles de serpentinisation sont décrites par les équations ci- dessous :

(Fe, Mg)2SiO4 + H2O → (Fe, Mg)3Si2O5(OH)4 + Mg(OH)2 + Fe3O4 + H2(g) (1) (olivine) (serpentine) (brucite) (magnétite)

H2(g) + CO2(g) → CH4(g) + H2O (2)

Lorsque les plaques s’écartent et en conséquence forment des fissures et des failles, la partie supérieure du manteau lithosphérique, composée d’olivine et de pyroxène (silicates de magnésium et de fer) réagit avec l’eau pour former un assemblage de serpentine2, de brucite et de magnétite (Figure 4). Durant cette réaction (1) exothermique, le Fer(II) est oxydé en Fer(III) sous forme de magnétite et l’eau est réduite à l'état d'hydrogène moléculaire. Le taux d’hydrogène dépendent de la température de la réaction et du type de minéraux.

Figure 4. A : Serpentinisation d'olivine lors d’une expérience montrant la dissolution de l’olivine et la conversion en serpentine fibreuse (chrysotile), brucite lamellaire et magnétite octaédrique (mgt) (McCollom et Seewald, 2013) ; B : Exemple d’une serpentinite échantillonnée du massif Atlantis qui abrite le site de Lost City.

1 La serpentinite est une roche majoritairement constituée de serpentine 2 La serpentine est le nom donné à une famille de minéraux issus de l'hydratation d'une olivine

- La destabilisation de la brucite Mg(OH)2 crée des OH et donc conduit à des pH extrêmement élevés (>10). En même temps, l’hydratation du pyroxène peut aussi s’effectuer selon la réaction 3.

(Mg, Fe)2Si2O6 + H2O → (Fe, Mg)3Si2O5(OH)4 + Fe3O4 + H2 + SiO2 (3)

L’hydrogène produit par les réactions de serpentinisation peut réagir ensuite avec le CO2 présent dans l'eau de mer, pour générer d'abord du méthane, puis d’autres petits hydrocarbures, selon une réaction (2) de type Sabatier, catalysée par des éléments tels que le nickel, le cobalt, le chrome présents et enrichis dans les roches du manteau. Ce procédé catalytique de production d’hydrocarbures à partir de monoxyde de carbone (CO) et d'hydrogène a été découvert en 1923 par Franz G. Fischer et Hans Tropsch. La formation de CH4 à partir de CO2 et H2 constitue la plus élémentaire des réactions de type Fischer-Tropsch, catalysée par la magnétite (Fe3O4), sous-produit de la réaction de serpentinisation de l’olivine (McCollom, 2013).

En effet, les fluides libérés durant une serpentinisation active à faible température (<200°C) présentent les valeurs de pH les plus élevés reportés sur Terre dans des systèmes naturels (Mottl et al., 2003). De plus, l’interaction entre des fluides de type Ca-OH avec le dioxyde de carbone atmosphérique (dissous dans l'eau de mer ou des rivières) entraine la formation de précipités de carbonates de calcium (CaCO3) cristallisés sous forme de calcite ou d'aragonite. Ces dépôts de carbonates forment des structures à l’allure d'encroûtements planes observés en milieu terrestre (travertins) ou de sortes de cheminées observées en milieu marin. Contrairement aux sources hydrothermales directement liées au magmatisme, plus connues sous le nom de « fumeurs noirs » et qui émettent des fluides chauds (avoisinant 350 °C) et acides (pH faible inférieur à 3) au niveau des dorsales océaniques, les sources hydrothermales sous-marines associées à la serpentinisation émettent des fluides alcalins (pH>10) de température modérée (40-90°C) riche en dihydrogène et méthane. Du fait de leurs caractéristiques physico-chimiques très particulières, ces environnements sont présentés comme les systèmes analogues contemporains les plus proches de ceux qui ont permis l'émergence de la vie, c'est à dire le passage de molécules organiques produites abiotiques aux premières proto-cellules (voir plus bas). Par ailleur ces environnements abritent une diversité de micro-organismes dits extrêmophiles (alcalophiles, thermophiles...) qui ont un fort potentiel pour des applications biotechnologiques. Ces deux aspects, fondamental et appliqué expliquent l'intérêt toujours croissant de la communauté scientifique pour ces écosystèmes serpentinisés.

1.2. Serpentinisation et l’origine de la vie

La vie serait apparue sur Terre il y a environ 3,8 milliards d'années. Cependant, beaucoup d’interrogations sur les origines de la vie demeurent incertaines : comment est-elle apparue ? D’où vient la matière organique ? Comment sont apparues les première biomolécules (souvent appelées molécules prébiotiques) et dans quelles conditions ? De nombreuses théories scientifiques tentent de répondre à ces grandes questions. Parmi les hypothèses avancées, l'une fait intervenir un processus géologique majeur : la serpentinisation de la lithosphère océanique.

Au début de l’Archéen (la deuxième époque géologique du Précambrien, 3,85 - 2,5 milliards d'années), marquée par la survenue d'une pluie qui a duré plusieurs centaines de millions d'années, l'eau est ainsi apportée et a dû interagir avec la surface de l'océan magmatique en hydratant la périphérie du manteau terrestre. Cette hydratation de la péridotite du manteau, et plus particulièrement de l'olivine, forme de la serpentine. La serpentine, étant moins dense que le reste du manteau fondu, devait "flotter" à la surface de la Terre. La Terre primitive est envisagée comme un ensemble de nombreuses plaques océaniques de petite taille (Figure 5), générées par des dorsales océaniques dont la longueur cumulée est bien supérieure à celle des dorsales actuelles. La Terre primitive a donc très probablement fait l’objet d’une serpentinisation à large échelle dans la croûte océanique primitive (Sleep et al., 2004).

Figure 5. Schéma comparant la taille des plaques actuelles (à gauche) à celle supposée des plaques archéennes (à droite). A l’Archéen, la plus grande production de chaleur interne était évacuée par une longueur de ride plus importante, résultant en une mosaïque de plaques beaucoup plus petites et plus rapides que celles de la Terre actuelle (2005 H. Martin).

Les plus anciennes serpentinites terrestres ont été collectées dans la région d'Isua, au Sud-Ouest du Groenland, province âgée de 3,81 Ga. (Friend et de al 2002; Sleep et al., 2011). La mesure isotopique de l'hydrogène et de l'oxygène des minéraux de serpentine présente dans ces roches a montré qu'ils se sont formés par réaction de roches ultrabasiques avec l'eau de mer. Comme dans certains sites d’aujourd’hui, les fluides émis présentaient un pH alcalin (9 à 12), une température "intermédiaire" (~150 à 200°C), et une teneur élevée en CO2 (Pons et al., 2011). Cette théorie suggère que, c’est dans ces types d’océans Archéens, protégés des rayons ultraviolets, que la Vie est apparue.

Le méthane présent en forte concentration dans la plupart des écosystèmes serpentinisés peut fournir une source de carbone aux micro-organismes capables de l’oxyder et de l’assimiler pour le convertir en biomasse. En plus du méthane, la formation d’autres composés organiques plus complexes (ex. des alcanes, alcènes et alcools) peut avoir lieu, en présence de fortes concentrations d’H2 et de catalyseurs, par des réactions de synthèse de type Fischer-Tropsch (4) ou par d’autres processus (McCollom, 2013).

(2n+1) H2 + n CO → CnH2n+2 + n H2O (4)

La synthèse abiotique d’acides aminés est d’un intérêt particulier dans la question de l’origine de la vie car ils représentent les briques essentielles constituant les protéines nécessaires au développement des êtres vivants (Konn et al., 2015). Les réactions de Strecker (Figure 6) ont été proposées comme étantà l’origine d’une synthèse abiotique d’acides aminés à partir d’aldéhydes ou de cétones en milieu hydrothermal. Elle nécessite cependant la formation de réactifs (HCN et aldéhydes ou cétones) par la réduction de carbone inorganique

(CO ou CO2) et d’azote (N2). Cette synthèse de Strecker, favorisée à pH basique, serait thermodynamiquement favorable dans les conditions hautement réductrices rencontrées dans les systèmes ultrabasiques avec les fortes concentrations en H2 et CH4.

Figure 6. Réaction de Strecker

En plus de favoriser la synthèse abiotique de matière organique, ces environnements riches en H2 sont des endroits idéaux pour le début de l'évolution métabolique, car le transfert d'hydrogène est au cœur de presque toutes les réaction de réduction ou d’oxydation biochimique dans les voies métaboliques modernes (Nealson et al., 2005). Ainsi, il est parcimonieux de supposer que les premières voies métaboliques ont été alimentés par l’H2 produit géochimiquement. Curieusement, des enzymes qui catalysent l'oxydation ou la production d’H2 (i.e. hydrogénases) contiennent du fer et / ou de nickel sur leurs sites catalytiques, les deux sont généralement enrichis en serpentinites, mais les phases minérales exactes impliquées dans les réactions de synthèse organique associés à serpentinisation doivent encore être identifiés. (McCollom et al., 2007).

Dans le modèle détaillé proposé par Martin et Russell (2008), le gradient de pH entre les fluides générés par la serpentinisation et l'eau de mer ambiante provoque une fuite des protons hors de "cellules" compartimentés par des sulfures de fer qui se seraient formés sur les dépôts de cheminées primitives. Ces cloisons de sulfures de fer sont considérés comme être les précurseurs minéraux de la membrane lipidique moderne (Russell et al, 1994 ;. Russell et Hall, 1997), et le flux de protons aurait abouti à un la création d'un potentiel chimiosmotique (Lane et Martin 2010) qu'aurait pu exploiter les premières enzymes alimentées par l’H2 pour catalyser la fixation de carbone. De plus, face à la disponibilité restreinte de phosphate sur la Terre primitive, le « monde à ARN » aurait pu exister au sein des pores dans la serpentinite qui sont riches en minéraux d'hydroxyapatite contenant du phosphate (Nisbet et al., 2001).

Ces nombreux éléments montrent que la serpentinisation pourrait avoir apporté les éléments clés à l’apparition du vivant : une source d’énergie, des molécules organiques par synthèse abiotique, les briques des principales macromolécules biologiques ainsi qu’un espace confiné pouvant faire office de réacteur chimique du vivant (Figure 7) (Russell et al., 2010). L'idée que la serpentinisation a joué un rôle dans l'origine de la vie sur Terre peut également être applicable à d'autres planètes, puisque l'olivine est une phase minérale courante dans de nombreuses météorites et sur d'autres planètes. La présence de serpentinites a également été démontrée sur Mars (Figure 8) (Blank et al., 2009 ; Schulte et al., 2006). La serpentinisation pourrait également opérer sur d’autres planètes de notre système solaire par exemple sur Europa une des lunes de Jupiter (Vance et al. 2007) et sur le satellite Encelade de Saturne (Malamud and Prialnik, 2013). En conséquence, l’étude sur les écosystèmes associés à la serpentinisation non seulement offre la possibilité d’étudier des environnements où les conditions de vie sont extrêmes en termes de pH, de disponibilité limitée en accepteurs d’électrons, et pour certains

de température et de pression, mais aussi nous aide à mieux comprendre l’émergence de la vie sur terre et potentiellement sur d’autres planètes.

Figure 7. Modèle pour l'émergence de la vie dans un environnement sous-marin alcalin de la mer primitive (Russell et Hall, 1997).

Figure 8. Identification de serpentine d'âge noachien (plus de 3,7 milliards d’années) à la surface de Mars. Localisation de serpentine identifiée de manière certaine (étoiles blanches) ou probable (carrés blancs) dans des terrains du Noachien (Guillot et Hattori, 2013).

1.3. Sites marins et terrestres associés à la serpentinisation

La serpentinisation active (i.e. présence de fluides alcalins riches en H2 et CH4) peut être observée dans des environnements sous-marins (e.g. Lost City, la fosse des Mariannes) (Schrenk et al., 2013), où l'activité tectonique conduit à l’affleurement de roches ultramafiques (caractéristiques des roches du manteau terrestre), et au sein des ophiolites (e.g. Oman, Ligurie, Tablelands, The Cedars), où la croûte océanique a été charriée sur un substrat continental (Figure 9).

1.3.1. Les sites terrestres associés à la serpentinisation : les ophiolites

Les premières descriptions de serpentinisation active ont été reportées à partir d’environnements terrestres : les ophiolites. Les ophiolites sont un ensemble de roches basiques et ultrabasiques appartenant à une portion de lithosphère océanique, charriée sur un continent lors d'une obduction. Elles représentent les derniers témoins d’océans ou de portions d’océans aujourd’hui disparus.

Plusieurs ophiolites ont fait l’objet d’études scientifiques dans les domaines de la géochimie et de la microbiologie (Figure 5). Les ophiolites de Coast Range (CRO) situées à l’ouest des Etats-Unis ont été parmi les premières étudiées (Barnes et al., 1967 ; Barnes and O’Neil 1971). Depuis ces travaux pionniers, de nombreuses sources hydrothermales alcalines ont été étudiées à travers le monde, comme en Oman (Semail), aux Etats-Unis (Californie, The Cedars), en Italie (Ligurie, Voltri), au Portugal (Cabeco de Vide Aquifer), aux Philippines (Zambales), en Turquie (Tekirova), à Terre-Neuve (Bay of Islands, Canada), au Costa Rica (Santa Elena) et à Chypre (Troodos) (Schrenk et al., 2013). Les fluides déchargés par ces sources hydrothermales présentent généralement des valeurs de pH supérieures à 10 et des concentrations élevées en Ca dissous, ainsi qu’en H2 et CH4. Par conséquent, ces sources sont souvent entourées de dépôts minéraux de calcite (CaCO3), qui précipitent au contact du CO2 atmosphérique.

L’ophiolite de Semail dans le sultanat d’Oman est l’un des sites les plus connus parmi les sites terrestres associés à la serpentinisation. Il est long de 350 km, large de 40 km et d’une épaisseur de 5 km (Neal et Stanger 1983; Nicolas et al., 2000). Les gaz émanant de l’eau alcaline et des péridotites possèdent des concentrations élevées en hydrogène (99 mM), méthane (23,7

Figure 9. Distribution des sites terrestres et marins associés à la serpentinisation et dont les communautés microbiennes et/ou la géochimie ont été étudiées.

µM) et des hydrocarbures courtes chaînes tels que : éthane (1.3µM), propane (1.1), iso-butane et n-butane (0.3) (Fritz et al., 1992). Il fut le premier site associé à la serpentinisation étudié pour ces communautés microbiennes par des approches culturales (Bath et al., 1987).

Le système hyperalcalin de Ligurie (situé dans le massif de Voltri dans les Alpes italiennes) est composé de différentes sources situées sur différents substrata et réparties sur plusieurs dizaines de kilomètres. Les fluides libérés par ces sources sont non salés, hyperalcalins (de 11.2 à 11.7) et riches en calcium (Ca) (Chavagnac et al., 2013). Ils présentent la particularité d’être riches en méthane, mais appauvris en hydrogène. Le mélange de ces eaux alcalines avec les eaux de rivière soumis au CO2 atmosphérique a entrainé la formation de précipités brunâtres. Dernièrement l’équipe de Woycheese a décrit l’ophiolite de Zambales dans les Philippines, au niveau duquel des terrasses de travertin se sont formées sur plusieurs mètres (Woycheese et al., 2015).

L’aquifère de Cabeço de Vide (CVA) au sud du Portugal présente un contexte particulier de « type ophiolite » où une serpentinisation a été reconnue. Il y a plusieurs types de sources dans la région de Cabeço de Vide : des eaux souterraines peu profondes de type Mg-

HCO3 dérivées de l’interaction avec les roches serpentinisées locales, et en profondeur, des eaux minérales alcalines de type Na-Cl/Ca-OH qui sont retrouvées dans les spas de CVA (Marques et al., 2008). Ces eaux minérales sont issues du contact avec les roches mafiques/ultramafiques et avec une séquence de carbonates plus ancienne.

Une serpentinisation active a également été mise en évidence dans différents sites terrestres de Nouvelle-Calédonie (Pacifique Sud) durant les travaux pionniers de Barnes (Barnes et O’Neil, 1978). L’île de la Nouvelle-Calédonie est située sur la marge orientale de la plaque australienne sur le côté ouest de la zone de subduction du Vanuatu. L’île principale comprend un large feuillet de lithosphère océanique charrié sur le socle continental à l'Eocène supérieur (~35 Ma) (Cluzel et al., 1998). La nappe de peridotites (Figure 14A) de 3,5 km d'épaisseur couvre une superficie de 7000 km² répartie dans toute l'île, mais surtout dans la partie sud. Elle est composée d’harzburgite dans laquelle de nombreuses insertions de dunites et pyroxénites sont plafonnées par des roches gabbroïques (Pirard et al., 2013). L'intensité de la déformation tectonique permet le transfert de fluide d’origine météorique à partir de la surface jusqu'à la nappe ultramafique, comme en témoigne une épaisse (1-300 m) zone de serpentinite cisaillée (Guillon, 1975). La circulation du fluide à l'intérieur de la péridotite du manteau génère la formation des fluides hydrothermaux hyper-alcalins produits

par la serpentinisation (Pelletier, 2006). Les sources hydrothermales hyperalcalines (pH 10.8 environ) étudiées jusqu’à présent sont situées dans le sud de la Nouvelle-Calédonie, notamment La Coulée et celles présentes au niveau de la Baie de Prony.

1.3.2. Les sites marins associés à la serpentinisation

La serpentinisation en milieu marin a été décrite dans différents contextes (McCollom and Seewald, 2013) :

- à distance des dorsales océaniques, où les roches ultramafiques du manteau affleurent à la surface au travers de la tectonique et interagissent avec l’eau de mer (e.g. site de Lost City).

- le long des dorsales océaniques où les fluides hydrothermaux circulants qui interagissent avec les roches magmatiques (basaltes, gabbros) sont également influencés au contact des roches ultramafiques exposées par l’expansion des fonds océaniques. On parle alors de « sites mixtes » (e.g. site de Rainbow).

- au niveau des zones de subduction où les fluides déchargés depuis la dalle de subduction peuvent entrainer la serpentinisation des roches ultramafiques du manteau situées au-dessus.

Lost City

Depuis sa découverte en 2000, le champ hydrothermal de Lost City (nommé Lost City Hydrothermal Field, LCHF), situé à environ 800 mètres de profondeur à proximité de la dorsale médio-atlantique, sur le massif Atltantis (30°N), est le site de référence pour l’étude de l’hydrothermalisme associé aux réactions de serpentinisation. Contrairement aux sites hydrothermaux sous-marins plus connus sous le nom de « fumeurs noirs » qui émettent des fluides chauds (avoisinant 350°C) et acides (pH < 3) (e.g. Rainbow et Logatchev), le site de Lost City ne se trouve pas à l’aplomb de la dorsale océanique mais à environ une quinzaine de kilomètres (Kelley et al., 2001). L’éloignement de la source de chaleur (chambre magmatique) explique en partie les températures plus modérées (entre 40 et 90°C) des fluides mesurés à Lost City. Il présente également une géochimie très singulière, caractérisée par des fluides très alcalins (pH 9-11). Les roches du manteau terrestre affleurent au niveau du massif Atlantis.

L’hydratation de ces roches (i.e. la serpentinisation) produit de grandes quantités d’hydrogène et de chaleur. L’hydrogène produit réagit ensuite avec le dioxyde de carbone environnant pour former du méthane et d’autres molécules organiques. C’est le premier système hydrothermal découvert dans l’océan profond (750 à 900 m) où le flux hydrothermal est conduit par des réactions exothermiques de serpentinisation (Fruh-Green et al., 2003 ; Kelley et al., 2001). Il abrite de nombreuses structures hydrothermales actives dont la plus importante, appelée édifice de Poséidon, mesure près de 60 mètres de hauteur (Figure 4). Les édifices hydrothermaux sont composés de mélanges variables de calcite (CaCO3), aragonite (CaCO3) et brucite (Mg(OH)2). Les hauts pH et les fortes concentrations en Ca sont typiques des fluides émanant des roches ultrabasiques associées à la serpentinisation et provoquent une précipitation de carbonates au contact de l’eau de mer.

Figure 10. Photographies du site hydrothermal de Lost City. A. Cheminée de carbonate photographiée en 2003; B. Véhicule Hercules étudiant la structure de la face nord de Poséidon; C. Petite structure déchargeant les fluides présentant les température (91 °C) et valeur de pH (~11) les plus élevés à Lost City; D. Echantillon de carbonate récupéré à partir d’une cheminé de Lost City par le submersible Alvin (source : http://www.lostcity.washington.edu).

Des sites fossiles de type « Lost City » ont récemment été découverts, tels que le site de Ghost City situé près de l’axe de la dorsale médio-Atlantique (MAR) (Lartaud et al., 2011) et près de la marge passive ibérique (Klein et al., 2015). Des assemblages de brucite-calcite de type Lost City dans des échantillons de carottes de forage ainsi que des biomarqueurs lipidiques bactériens et archéens analogues à ceux retrouvés à Lost City ont été mis en évidence lors d’une campagne de forage du programme ODP (Ocean Drilling Program Leg 149) (Bradley et al., 2009 ; Lincoln et al., 2013).

Figure 11. Localisation et un échantillon carbonaté de Ghost City. (A) carte à grande échelle montrant les cheminés hydrothermales hébergées par des roches volcaniques (points rouges) et gabbros / péridotites (points verts); Ghost City se trouve à proximité du site Rainbow. (B) carte bathymétrique haute résolution réalisée pendant la campagne Flores du R / V L'Atalante montrant le site fossile Ghost City est situé sur le flanc nord-ouest de la structure gabbro / péridotitique, à une profondeur de 2.100 m. (C) bloc sectionné de ciments carbonatés authigènes couvert d’oxyhydroxyde de fer.

Les sites mixtes des dorsales océaniques

La majorité des systèmes hydrothermaux profonds d’origine magmatique, étudiés jusqu'à présent sont situés sur des roches basaltiques et donnent lieu à des fluides riches en

sulfure d'hydrogène (H2S). Cependant, les dorsales océaniques à expansion lente ou ultra-lente, comme la dorsale médio-Atlantique ou la crête centrale indienne (CIR pour Central Indian Ridge), comportent un grand nombre de systèmes hydrothermaux de température très élevée (>300°C) qui sont influencés également par la serpentinisation dont les sites de Rainbow, Logatchev et Ashadze, MAR (Roussel et al., 2011) et le site de Karei, CIR (Takai et al., 2004) (Figure 5). Ceux-ci présentent des concentrations plus élevées d'hydrogène, méthane et fer, et des niveaux inférieurs de sulfure d'hydrogène par rapport aux systèmes hébergés par du basalte. En comparaison à Lost City, qui se situe hors de l’axe de la MAR, ces systèmes ont des températures plus élevées, des concentrations en métaux supérieures et sont très acides (pH~3).

Figure 12. Les fumeurs noirs au site hydrothermal atlantique de Rainbow (Ifremer / MoMARDREAMnaut 2007 and MOMAR08-Leg2 2008 cruises).

Zones de subduction et volcans de boues

Il existe également des environnements associés à la serpentinisation dans les zones de subduction. Par exemple, dans la région de la fosse des Mariannes au large du Japon (Figure 13), où la plaque Pacifique subducte sous la plaque des Philippines, des volcans de boue de serpentinite forment des monts (Fryer et al., 2006 ; Fryer, 2012). Lors de la subduction d'une lithosphère océanique, les sédiments marins et minéraux hydratés perdent leur eau. L’eau libérée de la plaque plongeante hydrate le manteau péridotitique sus-jacent et entraine la remontée de boues de serpentines (minéraux peu denses) le long des failles jusqu’au plancher océanique. A la surface, celles-ci forment des édifices de volcans de boues riches en eau et CO2.

Les fluides alcalins (pH jusqu’à 12,5) émis par les volcans de boues sont enrichis en H2, CH4, formate et acétate (Wang et al., 2014) (Tableau 2). Leur température est faible au niveau des monts (5 à 20°C) mais élevée en profondeur (100 à 250°C où a lieu la serpentinisation).

Figure 13. Cheminées de carbonates formées sur le volcan de boue de serpentine Mont Quaker au sud de l’arrière-arc de Mariannes (Fryer et al., 2006).

1.3.3. La baie de Prony : un écosystème côtier unique associé à la serpentinisation

La baie de Prony, au sud de la Nouvelle-Calédonie, présente des sources hydrothermales d’exception. Les sources sous-marines du champ hydrothermal de Prony (nommé PHF pour Prony Hydrothermal Field) sont situées à moins de 50 mètres de profondeur dans le lagon sud. Elles libèrent des fluides alcalins (pH 11) très peu salés avec des températures modérées (inférieures à 40°C). Au contact de l’eau de mer, les minéraux de ces fluides précipitent et forment des cheminées carbonatées pouvant atteindre plusieurs mètres de haut. Ce type d’hydrothermalisme original n’avait été jusque-là observé et étudié qu’à Lost City. A Prony, comme à Lost City, les fluides alcalins sont anoxiques (pauvres en oxygène) et contiennent des quantités élevées d’hydrogène et de méthane produit par la serpentinisation. Cependant, ce site est singulier car son fluide hydrothermal alcalin présente une basse salinité et qu’il se déverse dans un environnement marin peu profond, le lagon.

Figure 14. Contexte géologique de la baie de Prony : A. Carte géologique simplifiée de la Baie de Prony avec l'emplacement des sites d'échantillonnage du projet HYDROPRONY (modifié de Maurizot, 2009) B. Modèle proposé du contexte géologique général du site hydrothermal de Prony (Monnin et al., 2014). Les flèches indiquent les voies hypothétiques de la percolation du fluide. C. Petites cheminées friables du Bain des Japonais ; D. Plateau de carbonate au niveau de la Rivière des Kaori ; E. Aiguille de Prony ; F. Le haut d’une cheminée de l’Aiguille de Prony.

L’existence de sources terrestres alcalines dans la Baie de Prony est connue depuis le début du siècle dernier et l’existence de l’aiguille hydrothermale de Prony connue depuis 1975, trois émergences de circulations thermales ont été décrites par Launay en 1981. La première est située sur la rive gauche de l’embouchure de la rivière des Kaoris (RK) (Figure 14D). La seconde, nommée Bain des Japonais (BdJ), se situe dans la baie du Carénage, et se trouve immergée à chaque marée haute (Figure 14C). La dernière, ST07 (station 7) également appelée « Aiguille de Prony », est un grand édifice entièrement sous-marin (Figure 14E). Elle est située au cœur de la baie du Prony et s’élève de 38 mètres à 2 mètres de profondeur. L’étendue et l’importance du site hydrothermal actif de la baie du Prony n’nt été révélées qu’en 2005 lors de campagnes de cartographie au sondeur multifaisceaux et de plongées sous-marines autonomes

réalisées depuis le navire océanographique Alis de l’IRD (Pelletier, 2006) qui a révélé l’existence des nouveaux sites hydrothermaux dans la baie. Plusieurs de ces sites hydrothermaux ont été plus largement explorés lors de la campagne HYDROPRONY de l’IRD en novembre 2011 puis lors de missions ponctuelles de prélèvements (Figure 14A). Au total, 8 sites (2 terrestres et 7 sous-marins) ont été échantillonnés dans la baie de Prony, incluant des cheminées actives et fossiles. Ces sites sont éloignés de 1 à 5 km et sont situés à des profondeurs allant de 0 à 50 m. Certains édifices de carbonates sont recouverts d’espèces marines notamment des coraux, éponges et ascidies formant une coque sur la face extérieure des cheminées diminuant leur perméabilité et attestant de leur ancienneté. Sur les cheminées actives, des cônes blancs de carbonates sont visibles aux zones d’intense sortie de fluide.

Le site de Prony en Nouvelle-Calédonie, idéalement situé à faible profondeur, à la transition entre le milieu marin et terrestre constitue donc un observatoire naturel facilement accessible pour étudier les interactions biotiques et abiotiques existant dans les environnements serpentinisés.

1.4. Caractéristiques géochimiques des sources alcalines

Depuis le travail original de Barnes et Neil, 1978, de nombreuses sources alcalines présentant des teneurs élevés en H2 et CH4 ont été étudiés de part le monde (Schrenk et al., 2013). Les caractéristiques géochimiques des sites terrestres, marins côtiers (Tableau 1) et sous-marins (Tableau 2) varient d’un site à l’autre.

Dans les environnements sous-marins, l’H2 et le CH4 ont été détectés sous forme dissoute au sein des fluides. Lorsque la pression est relativement basse comme dans les systèmes peu profonds, la concentration de l’H2 et du CH4 dans les fluides dépasse souvent leur solubilité aqueuse, ce qui entraine la formation de bulles de gaz visibles sortant des évents ou des fractures (McCollom and Seewald, 2013). L'abondance relative d’H2 et CH4 dans la phase gazeuse est très variable entre les différents sites. Par exemple, à l'ophiolite Zambales dans les Phillipines, les gaz est composé pratiquement d'une même proportion d’H2 (~46 vol%) et de CH4 (~55 vol%) (Abrajano et al., 1988), tandis que le gaz de l'ophiolite Tekirova, en Turquie, contient jusqu'à ~93 vol% de CH4 et ~10 vol% d’H2 (Etíope et al., 2011). Les composition gazeuse varient aussi entre les différentes sources d’un même site, par exemple en Oman l’abondance d’H2 varie de 0 à 99 vol% et de 15.7 à 50.9 vol% dans les sources de

The Cedars, en Californie. Parmis les sites marins, les plus fortes concentrations d’H2 dissous

sont observé à Ashadze (26 mM), suivi par Rainbow (16 mM) et Lost City (1 à 15 mM), tandis que les plus fortes concentrations de CH4 sont observé à Rainbow (2.5 mM) et Logatchev (2.1 mM).

Les concentrations en éthane, propane et butane retrouvées dans les sites serpentinisés de Lost City, Oman et Massif de Voltri sont inférieures à celles du méthane (Schrenk et al., 2013). La présence de CO (~5 µmol/kg) a été détectée dans le site Rainbow (Charlou et al., 2002). Les fluides de Lost City et de l’arrière-arc des Mariannes ont des concentrations élevées en formate (36 à 158 µM) et acétate (1 à 35 µM) (Haggerty JA, 1992; Lang et al., 2010). L'analyse des isotopes stables du carbone a montré que le formate aurait une origine abiotique alors que la présence d’acétate serait due à la dégradation de biomasse (Lang et al., 2010).

Caractéristiques des fluides hydrothermaux de Prony

La composition chimique de 45 échantillons de fluides collectés au niveau de six évents a été étudié dans la baie de Prony (Monnin et al., 2014). Les eaux hyperalcalines émises à partir de tous les sites de la baie de Prony sont très peu salés et donc d’origine météorique (Monnin et al., 2014). La composition des fluides à la sortie (pour les valeurs de pH les plus élevés) (Tableau 1) était similaire pour les différents sites mais différente de celle du site intertidal du Bain des Japonais (BdJ). En effet, les eaux collectées à BdJ sont la résultante du mélange d’eaux de trois origines : le fluide hydrothermal alcalin, l’eau de mer du lagon et l’eau de la rivière du Carénage. Les eaux alcalines (pH voisin de 11) de Prony ont une température de 31°C (à RK) à 42°C (à BdJ). Ces eaux sont riches en calcium et en sodium. La teneur en silice est constante mais faible. Les cheminées sont formées par précipitation chimique du mélange eau thermale et eau de mer, produisant de la brucite associée à la calcite, l’aragonite et la burbankite. Des bulles de gaz ont été observées aux sites Rivière des Kaoris (RK) et BdJ. Ces gaz étaient composés de 8 à 35 vol% d’H2, 5 à 17 vol% de CH4, 56 à 80 vol% de N2 et de traces de CO2, éthane et propane.

Tableau 1. Caractéristiques géochimiques des sites terrestres et côtiers associés à la serpentinisation (modifié de Schrenk et al ., 2013).

Massif de Tekirova Leka Santa Elena Troodo Site Semail Coast Range Del Puerto The Cedars Tablelands Cabeço de Vide Zambales Prony hydrothermal Voltri Chimaer ophiolite ophiolite s field Pays a b c d e f g h i j k ophiolite Oman USA USA USA Canada Portugal Italy Phillippines a Turkey Norway Costa Rica l m Chypre New Caledonia Unités RK BdJ ST09 ST12 ST11 ST07 Température °C 25 à 35,7 14,7 à18,2 17,8 à 24,2 16 à 18 17,1 à 19,8 14 à 24,7 26,4 à 34,4 8,2 à 9,4 24,6 à 30,7 31 à *34,3 37,1 à *42 *33,7 pH 11,1 à 12,1 9,8 à 12,2 8,6 8,36 à 11,9 11,8 à 12,3 10,7 à 11,1 9,5 à 11,7 8,3 à 11,3 6,7 à 9,6 7,4 à 8,77 9,4 à 11,7 10,8 11,08 10,62 11 10,64 10,14 Eh mV −630 à 165 -700 à 65 −609 à 121 −177 à −39 -158 à 158 Chimie des Fluides − ∑CO2 0 0 466 à 639 1,1 à 27,25 1,14 à 2,82 <0,1 à 0,03 0,01 à 0,18 (V%) mg/L en HCO3 Na+ mg/L 110 à 603 19 5,4 à 9,6 1,4 à 344,4 37,0 à 55,9 6,4 à 29,2 1,4(V%) à 100,5 5,0 à 12,5 1,2 à 26,6 1348 à 1636 15 54,7 148,6 921,2 932 2238,4 K+ mg/L 3,6 à 27,8 1,1 0,31 à 0,6 0,39 à 5,08 4,15 à 5,22 0,78 à 5,08 0,1 à 1,3 0,2 à 0,5 0,015 à 5,52 67,9 à 82,1 3,1 12,5 38,3 5,5 0 78,2 Ca2+ mg/L 55,2 à 120 40 3,5 à 8,1 37,3 à 57,3 5,1 à 22,5 2,8 à 34,5 1,5 à 52,8 0,6 à 2,3 2,12 à 167,7 2,0 à 38,8 14,4 20,8 110,7 22 91,4 139,9 Mg2+ mg/L <0,1 à 0,2 0,3 110 à 150 <0,02 à 51,9 0,06 à 7,57 0,16 à 0,3 0 à 6,1 0 à 23,3 1,75 à 10,2 0,29 à 62,66 0,0 à 0,5 nd 0,15 67,3 nd 61,1 302 Cl- mg/L 140 à 858 63 4,8 à 9,5 4,3 à 312 166 à 479 5,7 à 26,6 7,3 à 18,7 8,5 à 19,2 1,33 à 41,35 1880 à 2230 8,2 78,8 1796 1482 1625 5816,7 HS- mg/L NO3- mg/L 0,18 à 31,2 0,1 <0,06 5,57 à 7,60 0 à 0,22 1,3 à 5 0,11 à 1,18 <0,1 SO42- mg/L 0,19 à 34,1 0,4 10 à 16 < 0,1 à 0,96 0,96 à 12,60 0,5 à 32,8 0 à 89,1 1,53 à 3,65 <0,33 à 5,74 54 à 130 nd 9,6 165,2 36,5 147,9 723,3 SiO2 mg/L <0,1 à 0,2 0,4 5,6 à 13 5,5 à 6,1 0,17 à 4,7 bdl à 403,3 Chimie des Gaz (bulles de (gaz dissous ) (gaz dissous ) (bulles de gaz ) (bulles de gaz ) (bulles) (bulles ) (gaz dissous ) gaz ) H2 vol% 0 à 99 < 0,003 à 1,482 µM 15,7 à 50,9 0,03 à 0,6 mM 8,4 à 45,6 7,5 à 11,3 585 nM 24 ±11 19 ±11 *0,5 à 23,3 µM (‰ VSMOW) δD, H2 −733 à −697 −599 à −581 CH4 vol% 0 à 4,3 98 à 1983 µM 5,3 à 15,8 0 à 23,7 μM 13 à 55,3 65,24 à 93,22 up à 24,3 6 ±1 13±4 *24,5 à 408,3 µM δC, CH (‰ VPDB) −14,7 à −12,0 −28,5 à −15,9 −7,5 à −6,1 −12,5 à −7,9 4 (‰ VSMOW) δD, CH4 −251 à −210 −137 à −118 −129 à −97 N2 vol% 11,2 à 27,0 36,6 à 63,1 30,2 à 35,9 2,1 à 4,9 69±11 67±11 *0,3 à 0,9 µM Ethane vol% 0,005 à 0,0078 0 à 1,3 μM 0,04 à 0,15 0,17 à 0,43 traces traces Propane vol% 0,001 à 0,0018 0 à 1,1 μM 0,09 à 0,13 traces traces iso-Butane vol% 0,001 à 0,002 0 à 0,3 μM 0,027 à 0,031 n-Butane vol% 0,0001 à 0 à 0,3 μM 0,05 à 0,07 Hydrocarbures vol% 0,00080,0012 à 0 à 3,0 μM ~0,57 CO % 0 à0,0 0,00001114 < 0,003 à 0,104 µM CID ppm 21 à 210 1,1 à 10,5 <2 à 38,6 *< dl à 7,9 *< dl *42 à 1093

< dl : en dessous de la limite de détection, VSMOW (Vienna Standard Mean Ocean Water) et VPDB (Vienna Pee Dee Belemnite) : standards usuels pour la notation des valeurs isotopiques du carbone et de l'oxygène a h (Barnes, 1978; Boulart et al., 2013) (Abrajano et al., 1990 ; Cardace et al., 2015) b i (Barnes, 1978 ; Crespo-Medina et al., 2014) (Etiope et al., 2011 ; Hosgormez et al., 2008) c j (Blank et al., 2009) (Okland et al., 2012) d k (Suzuki et al., 2013) (Sánchez-Murillo et al., 2014) e l (Szponar et al., 2013) (Rizoulis et al., 2014) f m (Marques et al., 2008) (Monnin et al., 2014), *Price, non publié g (Boulart et al., 2013 ; Chavagnac et al., 2013b)

Tableau 2. Caractéristiques géochimiques des sites marins associés à la serpentinisation (Schrenk et al., 2013). CIR : Central Indian Ridge, mbsf : meters below seafloor, VSMOW (Vienna Standard Mean Ocean Water) et VPDB (Vienna Pee Dee Belemnite) : standards usuels pour la notation des valeurs isotopiques du carbone et de l'oxygène.

Localisation CIR Mariana Forearc Mid-Atlantic Ridge ODP Site ODP Site Eau de b d e e,f f f f g a Kairei c c Lost City Rainbow Logatchev 1 Logatchev 2 Ashadze 1 Ashadze 2 Nibelungen Site mer 780 1200 Latitude 25°19′ 19° 13° 47′ N 30° N 36°14′ N 14°45′ N 14°43′ N 12°58′ N 12°59′ N 8°18′ S Profondeur mètres ~2,400S 32.5′3 N 2,96 700 à 800 2300 3000 2700 4088 3263 3 Profondeurd'eau , mbsf 130 71 dans les 0 sédiments 8 3 Température °C 2 40 à 91 365 347 à 352 320 355 296 >192 à 372 pH 7,8 1 12,5 9 à ~11 2,8 3,3 à 3,9 4,2 3,1 4,1 2,9 2 H2(aq) mM 0,0004 8 <1 à 15 16 12 8 à 19 26 11,4 , δD, H (‰ VSMOW) −689 à −605 −372 −343 à −333 −270 2 5 H2S(aq) mM 0 1,2 0,5 à 0,8 1,9 1 0,035 à 1,1

CH4(aq) mM 0,0003 0,5 2 2 1 à 2 2,5 2,1 1,2 0,5 à 1,2 0,8 1,4 13 (‰ VPDB) −13,6 à −9,5 −15,8 −13,6 à −6 −6,1 −14,1 à −12,3 -8.7 δ C, CH4

δD, CH4 (‰ VSMOW) −141 à −99 −109

N2 mM 0,59 1,8 3,0

∑CO2 mM 2,3 0,0001 à 0,0026 5 à 16 10,1 6,2 3,7 formate μM 0 à 36 à 158 acétate μM ~22500 à 1 à 35 − NO mM ~210 23− mM 28,2 4 28 1 à 4 ~0 ~0 0 0 0 SO4 6 O2(aq) mM 0,1 0 0 Cl mM 546 2 510 ~550 750 515 127 614 326 6 SiO2(aq) mM <0,2 6,9 8,2 11,5 6,6 7,3 12,7 à 13,7 a (Charlou et al., 2002) 0 e (Charlou et al., 2002 ; Douville et al., 2002) b (Keir, 2010) f (Charlou et al., 2010) c (Mottl et al., 2003) g (Melchert et al., 2008 ; Schmidt et al., 2011) d (Kelley et al., 2001 ; Kelley et al., 2005 ; Lang et al., 2010 ; Proskurowski et al., 2008)

1.5. Microbiologie des systèmes associés à la serpentinisation

Les environnements associés à la serpentinisation sont riches en donneurs d’électrons directement produits par la réaction d'hydratation des péridotites : l’H2, le CH4 et dans certains cas des hydrocarbures à courte chaîne comme les alcanes C2-C6, le formate et l’acétate. Néanmoins, du fait de l'alcalinité élevée des fluides, la part de carbone en solution est extrêmement faible et par ailleurs de part sa composition et son caractère anoxique ils contiennent très peu ou pas d'accepteurs d’électrons potentiels classiques des métabolismes microbiens comme l'oxygène, les nitrates, les sulfates. Ceux-ci proviennent essentiellement de l'eau (de mer ou de rivière) environnante lors du mélange avec le fluide. Les communautés microbiennes vivant dans ce type d’écosystèmes sont donc confrontées à des défis physiologiques en termes d'adaptation aux pH élevés mais aussi de ressources énergétiques. Les zones de mélange entre le fluide hydrothermal, l’eau de mer ou les eaux souterraines, vont donner lieu à des gradients physico-chimiques, et ainsi à des micro-niches écologiques variées permettant la croissance de micro-organismes aux métabolismes divers. L’abondance et la composition des communautés microbiennes dans ce type d’écosystème, varient donc fortement sur de très courtes distances (de l'ordre du cm) à l'échelle de la cheminée selon leur degré exposition au fluide mais également en fonction du site étudié, bien que certains phyla/groupes/genres soient retrouvés dans tous des écosystèmes associés à la serpentinisation.

Dans ces systèmes anoxiques ou microaérophiles, le recyclage de l'H2, du méthane, et des composés soufrés, ainsi que des processus de fermentation semblent être les activités métaboliques dominantes.

1.5.1. Approches de microbiologie utilisées

La microflore des environnements associés à la serpentinisation est constituée d’une grande diversité de bactéries, mais également d’archées (moins diversifiées) (Schrenk et al., 2013). De nombreuses méthodes ont été appliquées pour étudier ces communautés microbiennes. Au-delà des approches culturales, différentes techniques moléculaires ont été utilisées pour étudier ces communautés dans différents sites, notamment des techniques de biologie moléculaire dépendante de la PCR et du séquençage de gènes marqueurs (gènes codant l’ARNr 16S, marqueur taxonomique des bactéries et archées ; dsrB, marqueur métabolique de la sulfato-réduction ; mcrA, marqueur de

la méthanogénèse) (Quéméneur et al., 2014 ; Postec et al., 2015 ; Suzuki et al., 2013) ou indépendante de la PCR (l'hybridation in situ en fluorescence : FISH et métagénomique) (Brazelton et al., 2012 ; Postec et al., 2015 ; Takai et al., 2004). Depuis quelques années, l’utilisation des techniques de séquençage de l'ADN nouvelles générations (NGS) (e.g. pyroséquençage, Illumina MiSeq) ont permis d’obtenir une vision plus précise de la diversité microbienne présente dans différents écosystèmes (Brazelton et al., 2013 ; Chavagnac et al., 2013 ; Quéméneur et al., 2015 ; Sanchez-Murillo et al., 2014 ; Tiago et Verissimo, 2012 ; Woycheese et al., 2015).

1.5.2. Micro-organismes détectés dans les environnements associés à la serpentinisation par des approches moléculaires

Parmi les diverses bactéries retrouvées dans les sites associés à la serpentinisation, celles appartenant aux phyla Firmicutes et Proteobacteria sont les plus ubiquistes et ont été décrites dans l’ensemble des sites. Les Chloroflexi sont également retrouvées dans la plupart de ces écosystèmes. Un changement de composition bactérienne (et de la proportion de ces trois phyla) a notamment été observé en fonction de la profondeur des cheminées hydrothermales de la baie de Prony (Quéméneur et al., 2014) (Figure 15).

Les Firmicutes sont majoritairement représentées par l'ordre des Clostridiales. Elles ont été détectées dans divers sites (Lost City, CVA, et The Cedars) où on pense qu'elles abondent dans les les habitats les plus profonds et anoxiques en raison de leur grande polyvalence métabolique notamment leurs capacités en croître en autotrophie ou mixotrophie (Schrenk et al., 2013). Les données métagénomiques ont indiquées que les Clostridiales sont les principaux producteurs d'hydrogène dans ces écosystèmes alcalins (Brazelton et al., 2012). A Prony, la majorité des Clostridiales détectées sont phylogénétiquement proches de celles de CVA, de The Cedars et des eaux souterraines hydrothermales alcalines d'une mine d'or située en Afrique du sud (pH 9,2, profondeur de 1290 m) (Lin et al., 2006 ; Suzuki et al., 2013 ; Tiago and Verissimo, 2013). Les genres Desulfotomaculum (Lost City) capable de sulfato-réduction et Dethiobacter (CVA et Ligurie) capable de la réduction du thiosulfate et du soufre ont été identifiés ainsi que plusieurs lignées d’incultivés. Les autres genres bactériens les plus proches de ceux détectées dans les systèmes serpentinisés sont capables d’utiliser les petits acides organiques et de produire du biohydrogène.

Parmi les Proteobacteria, les classes Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria et Deltaproteobacteria sont fréquemment retrouvées, et leurs abondances sont assez variables. Des Betaproteobacteria chimiolithoautotrophes hydrogénotrophes alcalophiles appartenant aux genres Hydrogenophaga et/ou ‘Serpentinomonas’ ont été détectées dans de nombreux sites continentaux (ex. Ligurie et The Cedars) et également dans le site sous- marin peu profond de Prony en Nouvelle-Calédonie. D’autres espèces appartenant notamment à la classe des Deltaproteobacteria peuvent utiliser le sulfate et/ou le thiosulfate, comme accepteurs d’électrons pour oxyder l’H2 ou la matière organique en anaérobiose (respiration anaérobie).

L’oxydation de composés soufrés est également possible en aérobiose (O2 accepteur terminal d’électrons) avec des Gammaproteobacteria du genre Thioalkalivibrio dans le site de Prony et du genre Thiomicrospira à Lost City. Les Epsilonproteobacteria, connus comme étant des bactéries abondantes dans les fumeurs noirs, sont présents uniquement dans les sites mixtes de Rainbow et de Lost City (Flores et al., 2011). Les phyla thermophiles Thermotogae, les Aquificae, et les Thermodesulfobacteria ne sont présents qu’à Rainbow dont la température des fluides est beaucoup plus élevée que pour les autres sites (Tableaux 1 et 2).

Certains phyla n’ont été détectés que dans des sites terrestres : Acidobacteria, Cyanobacteria, Planctomycetes, Verrucomicrobia et en plus faible abondance les Gemmatimonadetes et les Spirochaetes. Des micro-organismes appartenant à de nombreuses divisions candidates ont également été détectés en faible abondance. Cependant, au site de Leka (Norvège), un pourcentage élevé de séquences appartenant à des divisions candidates a été détecté dans certaines eaux (10 % d’OP11, 6% de SM2F11, 7% de WCHB1-60) (Daae et al., 2013). La division candidate OD1 (encore appelée Parcubacteria; Nelson & Stegen, 2015) a été retrouvée dans des sites marins (jusqu’à 1% à LCHF) et terrestres (< 0.4 % à Voltri en Italie et jusqu’à 23% à The Cedars). Dans la plupart des sites, un grand nombre de séquences d’ADNr 16S restent inclassifiées car trop éloignées des principaux taxons bona fidae. Ceci montre la limite des techniques actuellement utilisées pour explorer la diversité des communautés microbiennes qui dépendent notamment de la fiabilité et représentativité des bases de séquences utilisées comme référentiel pour l'assignation taxonomique.

La faible diversité d’archées retrouvée dans les sites associés à la serpentinisation correspond principalement à des Euryarchaeota et Thaumarchaeota (à l’exception du site mixte de Rainbow). Dans certains sites, ces archées sont dominées par l’ordre des Methanosarcinales (Lost City Methanosarcinales et le groupe 1 des ANME) qui pourraient être capables de produire ou d’oxyder le CH4 en condition anaérobie. Ces archées ont été retrouvées dans des sites sous- marins profonds (Lost City) et peu profonds (Prony), ainsi que dans des sites terrestres (The Cedars et Voltri (Italie)). Récemment, Kohl et al. (2016) ont démontré la présence de méthanogenèse (The Cedars) grâce à des expériences en microcosmes, activité qui serait le fait de Methanosarcinales correspondant au seul OTU archéen retrouvé dans ce site. Des représentants de l’ordre des Methanobacteriales ont également été retrouvés dans les ophiolites de Del Puerto (Californie) (Blank et al., 2009) et de Voltri (Italie) (Quéméneur et al., 2015).

A CVA, les Euryarchaea thermophiles de type SAGMEG (aujourd'hui appelés Hadesarchaea, Baker et al., 2016) sont clairement majoritaires (85.6%) (Tiago and Verissimo, 2013). Dans les eaux de Leka, les Thaumarchaeota du groupe I.1b sont dominants dans tous les échantillons de fracture alors que celles du Euryarchaeota Marine Group II dominent les eaux de surface et de sub-surface (Daae et al., 2013). Les "Marine Group I" Crenarchaeota dominent les populations de la fosse des Mariannes (Curtis et al., 2013). les Thaumarchaeota de l'ordre des

Nitrososphaerales sont retrouvés dans tous les sites du massif de Voltri avec un changement de dominance de Methanosarcinales vers Methanobacteriales de Euryarchaeota en fonction de sites.

Figure 16. Diversité des Methanosarcinales au sein des cheminées carbonatées de Prony. Arbre phylogénétique obtenu par la méthode Neighbour-Joining à partir des séquences codant le gène de l’ARNr 16S. Chaque OTU (≥ 97% de similarité) est représentée par une séquence type. Les chiffres entre parenthèses indiquent le nombre de clones obtenus pour chaque OTU. Les séquences des Methanosarcinales de PHF sont indiquées en gras (Quéméneur et al., 2014).

La communauté archéenne de PHF est composée principalement d’Euryarchaeota (88%) et de Thaumarchaeota (12%). Les séquences des gènes codant l’ARNr 16S des Methanosarcinales de PHF étant groupés en deux clusters et étroitement liés aux séquences de Methanosarcinales de Lost City (LCMS) et The Cedars Methanosarcinales (TCMS) (Figure 16) (Quéméneur et al., 2014). Les différents types de micro-organismes détectés à Prony par différentes méthodes (Postec et al., 2015 ; Quéméneur et al., 2014) sont récapitulés dans la Figure 17.

Figure 17. Modèle géomicrobiologique de l’écosystème hydrothermal alcalin sous-marin associé à la serpentinisation de Prony (Postec et al., 2015).

1.5.3. Micro-organismes cultivés d’environnements associés à la serpentinisation

Plusieurs bactéries aérobies ou anaérobies ont été cultivées de différents sites associés à la serpentinisation (Tableau 3). La majorité des bactéries isolées d’environnements serpentinisés typique (i.e. en dehors des sites mixtes) sont aérobies, telles que ‘Serpentinomonas raichei’, une alcalophile obligatoire ayant un pH optimal de croissance à 11, capable d’utiliser l’H2, le carbonate de calcium (précipité insoluble) et l’oxygène (en microaérophilie) pour une croissance autotrophe. Les premières bactéries anaérobies associées à la serpentinisation ont été isolées par les chercheurs de notre équipe du système hydrothermal de la baie de Prony et appartiennent au phylum des Firmicutes. La première d'entre elles, Alkaliphilus hydrothermalis vient d'une cheminée du site sous-marin ST09. Elle a un optimum de croissance à une température de 37°C, un pH de 8.8-9 et une salinité comprise entre 0.2%-0.5% ; elle utilise le pyruvate, le fructose, l’extrait de levure, la peptone, le biotrypcase et le crotonate comme substrats (Ben Aissa et al., 2014). Une autre bactérie anaérobie et alcalophile, Acetoanaerobium pronyense, a été isolée de l’Aiguille de Prony (site ST07) (Bes et al., 2015). Ces bactéries présentent un métabolisme fermentaire. Dans ce manuscrit, nous présenterons deux nouvelles bactéries anaérobies isolées du site côtier de Prony (chapitres III et IV), dont la souche Clostridium sp. PROH2, présentant des capacités uniques de production d’hydrogène en conditions alcaline et fermentaire (Mei et al., 2014).

Tableau 3. Bactéries et archées cultivées à partir d'écosystèmes associés à la serpentinisation (modifié de Schrenk et al., 2013). np, non publié.

Classification Habitat Référence Bacteria phylum Bacteroidetes Flexibacteriaceae Chimaereicella alkaliphila AC-74 Cabeço de Vide Tiago et al., 2006 Flavobacteriaceae Flavobacterium Semail Bath et al., 1987 Phylum Proteobacteria class Alphaproteobacteria Caulobacteriaceae Semail Bath et al., 1987 Brevundimonas Cabeço de Vide Tiago et al., 2004 Phenylobacterium Cabeço de Vide Tiago et al., 2004 Sphingomonadaceae Sphingomonas Cabeço de Vide Tiago et al., 2004 Hyphomicrobiaceae Semail Bath et al., 1987 class Gammaproteobacteria Pasteurellales Actinobacillus Semail Bath et al., 1987 Enterobacteriales Hafnia, Serratia Semail Bath et al., 1987 Vibrionales Vibrio Semail Bath et al., 1987 Pseudomonadales Pseudomonas Semail Bath et al., 1987 class Betaproteobacteria ‘ Serpentinomonas raichei’ A1T et H1, ‘S. mccroryi’ B1 The Cedars Suzuki et al., 2014 phylum Actinobacteria Micrococcales Agrococcus, Frigoribacterium, Microbacterium, Clavibacter, Leifsonia,

Micrococcus, Citrococcus, Rothia, Dentocariosa, Kocuria, Nesterenkonia, Tiago et al., 2004 Cabeço de Vide Kytococcus, Janibacter, Microcella alkaliphila AC4r Cabeço de Vide Tiago et al., 2006 Corynebacteriales Rhodococcus Cabeço de Vide Tiago et al., 2004 Dietzia natronolimnaea Cabeço de Vide Tiago et al., 2004 Coryneform bacterium Semail Bath et al., 1987 Actinomycetales Actinomyces Cabeço de Vide Tiago et al., 2004 phylum Firmicutes Bacillales Exigubacterium Prony np Exiguobacterium sp. Strain AB2 Manleluag Ophiolite Cabria et al., 2014 Staphylococcus Cabeço de Vide Tiago et al., 2004 Bacillus foraminis CV53 Cabeço de Vide Tiago et al., 2006 Bacillus Semail Bath et al., 1987 Paenibacillus Allas Rizoulis et al., 2015 Clostridiales Vallitalea pronyensis FatNI3 Prony Ben Aissa et al., 2014 Alkaliphilus Allas Rizoulis et al., 2015 Alkaliphilus hydrothermalis FatMR1 Prony Ben Aissa et al., 2014 Acetoanaerobium pronyense ST07-YET Prony Bes et al., 2015 Clostridium sp. PROH2 Prony Cette étude Serpentiniticella alkaliphila 3b Prony Cette étude Clostridium Semail Bath et al., 1987 Archaea Euryarchaeota Methanococcales Methanobacterium Prony np

2. La production biologique d’hydrogène

2.1. L’hydrogène : un vecteur d’énergie prometteur

Plus de 80% de l’énergie consommée dans le monde provient de ressources énergétiques fossiles (pétrole, gaz et charbon) (Chader et al., 2007). Alors que ces ressources énergétiques tendent à s’épuiser, leur demande s’est intensifiée par la poussée démographique et économique de nouvelles zones en pleine croissance. Par exemple, la consommation énergétique de la Chine a plus que doublée ces trente dernières années. De plus, leur impact sur le changement climatique global, dû aux émissions élevées de CO2 que leur combustion engendre, impose le développement urgent de ressources énergétiques renouvelables. Dans cette perspective, la recherche de nouveaux vecteurs énergétiques se révèle d’une importance majeure.

Dans ce contexte, l’hydrogène (H2) semble être un candidat idéal pour la diversification des vecteurs d’énergie. En effet, l’H2 est considéré comme avantageux en raison de son pouvoir calorifique élevé (121 kJ.g-1) et du fait que sa combustion ne produise que de l’eau (en absence d’azote). Actuellement, l’H2 est principalement utilisé comme réactant dans l’industrie chimique (51% pour le raffinage, 34% pour la production d’ammoniac, 14% pour la production d’autres produits chimiques). Il peut également être utilisé comme vecteur de stockage pour produire de l’électricité dans des piles à combustibles. Néanmoins, son utilisation dans les domaines de l’énergie est actuellement faible, son utilisation en tant que vecteur énergétique nécessiterait d’augmenter sa production qui est actuellement principalement dépendante des combustibles fossiles et donc polluante, car émettrice de grandes quantités de gaz à effet de serre. En effet, 95 % de l’H2 est actuellement fabriqué à partir de la transformation de sources d'énergies fossiles, telles que le gaz naturel, les produits pétroliers ou le charbon. Le procédé le plus courant de fabrication de l'H2 est le réformage du gaz naturel par de la vapeur d'eau surchauffée (48%), suivi par le réformage des hydrocarbures (30%), la gazéification du charbon de bois (18%) et enfin l’électrolyse de l'eau (4%). Ainsi, d’autres procédés de production d’H2 non-polluants et/ou moins coûteux doivent être envisagés.

Parmi les mécanismes de production d'H2 actuellement étudiés, il y a les processus abiotiques conduisant à l’émission naturelle d'H2 dans différents environnements souterrains : (i)

la réaction entre les gaz dissous dans le système C-H-O-S des magmas, (ii) la décomposition du

CH4 en graphite et H2 à des températures supérieures à 600°C, (iii) la réaction entre CO2, H2O et

CH4 à des températures élevées, (iv) la radiolyse de l’eau, la catalyse des silicates en présence d’eau (pH légèrement acide), et (v) la serpentinisation, i.e. l’hydratation et l’oxydation des minéraux ferreux présents dans les roches basiques et ultrabasiques du manteau terrestre. Au niveau des dorsales océaniques par exemple, l’H2 produit par la réaction de serpentinisation constitue >50% du gaz total de Rainbow, Lost City et Ashadze (Charlou et al., 2002 ; Kelley et al., 2005 ; Charlou et al., 2008) (cf. Chapitre 1.3). Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués au sein de ces systèmes permettrait d’envisager un procédé de production d’H2 innovant et propre.

La production biologique d’H2 est une autre solution envisagée pour produire de l’H2 à l’aide de micro-organismes à partir de ressources renouvelables. Cela nécessitera un fort développement de nouvelles biotechnologies permettant des rendements de conversion énergétique efficaces et fiables de ces ressources en H2.

2.2. La production biologique d’H2

La production biologique d'H2 (biohydrogène) est la conversion microbiologique de l’eau et/ou de substrats organiques en H2 par l’action d’enzymes : les hydrogénases ou les nitrogénases. Elle est observée dans de nombreux écosystèmes (aérobies et anaérobies), en présence ou absence de lumière, et résulte de différents métabolismes microbiens (Tableau 4) :

- la photosynthèse, réalisée par les algues vertes (e.g. Chlamydomonas, Scenedesmus) et les cyanobactéries (e.g. Anabaena, Oscillatoria),

- la photo-fermentation, réalisée par les bactéries photosynthétiques (eg. les bactéries vertes sulfureuses, telles que celles du genre Chlorobium et les bactéries pourpres non-sulfureuses telles que celles du genre Rhodobacter et Rhodopseudomonas),

- la fermentation anaérobie (appelée « fermentation obscure » ou « dark fermentation »), réalisée par des Archaea ou Bacteria (hyper-)thermophiles (e.g. Thermotoga) ou mésophiles (e.g. Clostridium).

Dans les bioprocédés, les micro-organismes photosynthétiques présentent des rendements de conversion plus élevés que les micro-organismes fermentaires (Tableau 4). Néanmoins, les micro-organismes photosynthétiques présentent des productivités plus faibles que les micro- organismes fermentaires (Das and Veziroglu 2008). Un autre avantage des micro-organismes fermentaires pour la production d’H2 est leur versatilité métabolique qui leur permet de transformer un panel plus large de substrats organiques.

Tableau 4. Principaux processus biologiques de production d’hydrogène.

Equation de transformation chimique du Procédé (nature de l’apport énergétique) procédé complet

Procédés biologiques phototrophes (énergie lumineuse)

Biophotolyse directe 2H2O → 2H2 + O2

Biophotolyse indirecte 6H2O + 6CO2 → C6H12O6 + 6O2

C6H12O6 + 6H2O → 6CO2 + 12H2

CH3COOH + 2H2O → 2CO2 + 4H2

Procédés biologiques chimiotrophes (substrat organique)

Fermentation acétique C6H12O6 + 2H2O → 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2

Fermentation butyrique C6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2

Dans la nature, l’H2 est généralement retrouvé en faible quantité (sauf exceptions telles que celle décrite dans la première partie de cette synthèse bibliographique). Dans les environnements anoxiques tels que les sédiments lacustres ou marins, les sols ou encore les tubes digestifs des animaux, l’H2 est un intermédiaire important dans la dégradation microbienne de la matière organique. Ainsi, l’H2 produit par les micro-organismes fermentaires anaérobies stricts ou facultatifs sera rapidement consommé par des micro-organismes hydrogénotrophes, se développant à proximité, tels que les bactéries homoacétogènes pour produire des composés organiques (e.g.

acétate), les archées méthanogènes et les bactéries sulfato-réductrices hydrogénotrophes, ainsi que les bactéries réduisant le nitrate. Dans les environnements anoxiques, il a été estimé que plus de

200 millions de tonnes d’H2 étaient globalement produites et consommées par an. Malgré cette production importante, les concentrations en H2 dans ces environnements restent très faibles, indiquant que la production d’H2, contrairement à la consommation, est un processus limitant dans la majorité des environnements anaérobies.

L’H2 est également produit dans les environnements oxiques, e.g. sols ou eaux douces, par des micro-organisms aérobies ou microaérophiles comme produit secondaire de la fixation du N2.

Plus de 10 millions de tonnes d’H2 par an sont globalement produites via ce processus. Les micro- organismes consommant l’H2 (avec l’O2) en conditions aérobies sont pour la plupart des bactéries fixatrices de N2.

2.3. La production de biohydrogène par voie fermentaire

La production de biohydrogène (bioH2) par voie fermentaire correspond à une étape intermédiaire de la dégradation anaérobie de la matière organique. Cette dernière est généralement constituée de quatre étapes (figure 17) :

- l’hydrolyse (fractionnement de la matière organique en unités simples de sucres, lipides et protéines), - l’acidogénèse (transformation des monomères en : (i) acides de faibles poids moléculaires, i.e. acides gras volatils, AGVs, tels que l’acétate, le butyrate, le propionate, le lactate, (ii) alcools, tels que l’éthanol, le méthanol et (iii) CO2 et H2, par des micro-organismes fermentaires,

- l’acétogénèse (transformation des acides et alcools en acétate, CO2 et H2 par des bactéries acétogènes ou synthrophes),

- la méthanogénèse (transformation de l’acétate, des composés méthylés et CO2/H2 en CH4 par des archées méthanogènes acétoclastes, méthylotrophes et hydrogénotrophes, respectivement).

Figure 17. Schéma global des réactions biochimiques de la méthanisation (Maialen Barret, 2014-2015).

L’hydrogène peut être produit par de nombreux micro-organismes fermentaires phylogénétiquement et physiologiquement différents durant l’étape d’acidogénèse. Théoriquement, il est possible de produire jusqu'a 4 moles d’H2 par mole de glucose par fermentation acétique.

Cependant, les rendements d’H2 mesurés sont bien souvent plus proches d’une moyenne de 2 moles d’H2 par mole de glucose en raison d’une production combinée d'acétate et de butyrate (Tableau 5). Les bactéries hyperthermophiles, telles que Thermotoga maritima, présentent l’avantage d’atteindre des rendements proches du théorique (4 moles d’H2 par mole de glucose), mais présentent des productivités faibles (car la biomasse est faible). Au contraire, les bactéries mésophiles anaérobies strictes (du genre Clostridium) et anaérobies facultatives (du genre

Enterobacter, Citrobacter) ont des productivités en H2 beaucoup plus élevées. Parmi elles, les bactéries du genre Clostridium ont démontré les rendements de conversion les plus élevés, pouvant atteindre 2,5 mol H2/mol hexose, correspondant à deux à trois fois plus que les entérobactéries (Bartacek et al., 2007 ; Wang et Wan 2009).

Les bactéries du genre Clostridium ont été isolées de différents environnements (e.g. compost, boues de digesteur anaérobie, boues de stations d’épuration, sédiments) (Chen et al.,

2004 ; Cai et al., 2013 ; Rajhi et al., 2013) et sont capables de produire de l’H2 à partir de différents

Tableau 5. Performances de production d’hydrogène de souches pures fermentaires lors de cultures en batch (modifié de Cai et al., 2013). Les extremophiles ont été surlignés : les alcalophiles en bleu, les haloalcalophiles en jaune, les termophiles en rouge.

Espèce Conditions de culture Source de carbone Rendement maximum en H2 Référence

Clostridium amygdalinum strain C9 37 °C, pH 7.5–8.5 10 g/L xylose 2.2–2.5 mol H2/mol xylose Jayasinghearachchi et al. 2010

Clostridium sp. PROH2 37 °C, pH 9.5 2 g/L glucose 2.71 mol H2/mol glucose this study

Clostridium sp. 6A-5 43 °C, initial pH 8 16 g/L glucose 2.50 mol H2/mol glucose Cai et al. 2013

Clostridium beijerinckii RZF-1108 35 °C, initial pH 7 9 g/L glucose 1.97 mol H2/mol glucose Zhao et al. 2011

Clostridium butyricum 37 °C, 200-400 mg phénol/L 5 g/L glucose 1.4 mol H2/mol glucose Tai et al. 2010 Clostridium saccharoperbutylacetonicum 37 °C, initial pH 6 10 g/L glucose 3.1 mol H /mol glucose Alalayah et al. 2008 N1-4 (ATCC 13564) 2

Clostridium butyricum W5 39 °C, pH 6.5 100 g/L molasses 1.85 mol H2/mol hexose Wang et al. 2009

Clostridium sp. HR-1 37 °C, pH 6.5 12 g/L glucose 2.02 mol H2/mol glucose Xu et al. 2010

Clostridium beijerinckii Fanp3 35 °C, initial pH 6.47-6.98 10 g/L glucose 2.52 mol H2/mol glucose Pan et al. 2008

Clostridium butyricum CGS5 37 °C, Initial pH 5.5 17.8 g/L sucrose 2.78 mol H2/mol sucrose Chen et al. 2005

Clostridium butyricum CWBI1009 30 °C, pH 5.2 5 g/L glucose 1.69 mol H2/mol glucose Masset et al. 2010

Clostridium sp. YM1 37 °C, pH 6.5 20 g/L glucose 1.7 mol H2/mol glucose Abdeshahian et al. 2014

Enterobacter cloacae IIT-BT 08 36 °C, pH 6.0 10 g/L sucrose 6 mol H2/mol sucrose Kumar et al. 2000

Halanaerobium hydrogeniformans 33 °C, pH 11 5.4 g/L glucose 1.9 mol H2/mol glucose Begemann et al. 2012

Clostridium cellulosi D3 60 °C, initial pH 7 10 g/L cellulose 1.2 mol H2/mol glucose Cao et al. 2010 Thermoanaerobacterium 60 °C, pH 6.25 20 g/L sucrose 2.53 mol H /mol sucrose O-Thong et al. 2008 thermosaccharolyticum PSU-2 2 Thermoanaerobacterium sp. SCUT27 55 °C, pH 6.5 10 g/L xylose 0.96 mol-H2/mol xylose Li et al. 2010 Thermoanaerobacter finnii 60 °C, pH 7.0 3.4 g/L xylose 0.14 mol-H2/mol xylose Fardeau et al. 1996

Thermotoga maritima (DSM3109) 80 °C, pH 6.0 7.5 g/L glucose 1.67 mol H2/mol glucose Nguyen et al. 2008

Thermotoga neapolitana (DSM 4359) 80 °C, pH 7.5 7.5 g/L glucose 1.84 mol H2/mol glucose Nguyen et al. 2008

substrats organiques, tels que le glucose, le xylose, la cellulose et l’amidon (Li et Fang, 2007 ; Guo et al., 2010) (Tableau 5).

Au cours de la fermentation du glucose chez les bactéries du genre Clostridium, le pyruvate est oxydé en acétyl-CoA, puis en acétate (Figure 18). Le NADH produit lors de la glycolyse n’est que partiellement consommé. Une NADH-ferrédoxine réductase (2) intervient en parallèle de la pyruvate-ferrédoxine oxydoréductase (1), dans la réduction de la ferrédoxine en consommant l’excès de NADH provenant de la glycolyse. La ferrédoxine oxydée est régénérée par les hydrogénases capables d’utiliser des protons comme accepteurs finaux d’électrons et produisant de l’H2. Une voie alternative a été récemment proposée (présente également chez les bactéries du genre Thermotoga) dans laquel une hydrogénase bifurcative trimérique oxyde simultanément la ferrédoxine réduite et le NADH sous une faible pression partielle d'H2 (Schut et Adams, 2009) (Figure 18).

Figure 18. Deux voies possibles pour la production d'hydrogène chez les bactéries du genre Clostridium : (1) liée à l'oxydation de la ferrédoxine réduite (FDH) catalysée par l'enzyme pyruvate-Fd oxydoréductase, ou (2) impliquant une réoxydation du NADH par la ferrédoxine catalysée par une enzyme NADH-Fd oxydoréductase. MH : hydrogénase monomérique; TR : hydrogénase trimérique; Fd : ferrédoxine ; les flèches en pointillées indiquent les voies en compétition pour le NADH +, H+ (Calusinska et al., 2010).

Ces dernières années, différentes cultures mixtes ont été testées pour produire de l’H2 à partir de substrats complexes (e.g. résidus agricoles lignocellulosiques). Ces consortia sont enrichis

en bactéries productrices d’H2 (telles que les bactéries du genre Clostridium) à l’aide de différentes méthodes : (i) traitement thermique (pour enrichir les bactéries sporulantes), (ii) temps de séjour court en culture continu (pour favoriser les micro-organismes à taux de croissance élevé et éliminer les plus lents tels que les méthanogènes, (iii) application d’un choc de pH (acide, <4 ou basique >10). La mise en œuvre des cultures mixtes est moins chère et plus rapide car : (i) elle ne nécessite pas d’étape couteuse de stérilisation pour éliminer les contaminants et (ii) peut être réalisée à partir de substrats complexes non-stériles (dits renouvelables). Néanmoins, les performances de production de ces cultures mixtes sont souvent plus faibles que celles des cultures pures car elles sont affectées par des changements de métabolisme au sein des communautés microbiennes, et l’installation de micro-organismes consommateurs d’hydrogène rendant ces bioprocédés instables (Koskinen et al., 2007 ; Aceves-Lara et al., 2008).

Les cultures pures de micro-organismes extrêmophiles (e.g. thermophiles /hyperthermophiles, alcalophiles, hyperhalophiles) représentent une alternative biotechnologique intéressante pour convertir efficacement la biomasse et les déchets organiques en H2. En effet, les conditions extrêmes appliquées (e.g. température élevée > 60°C, pH élevé > 9 et/ou salinité élevée > 50 g/L) réduisent le développement de la majorité des contaminants présents en conditions mésophiles et neutrophiles, et permettent de réduire les coûts de stérilisation (Cappelletti et al., 2014 ; Kivisto et al., 2010 ; Nguyen et al., 2008 ; Sompong et al., 2008). Ainsi, les environnements extrêmes, tels que les sources hydrothermales et les lacs hypersalés, représentent des réservoirs potentiels pour découvrir de nouvelles bactéries fermentaires productrices d’H2 d’intérêt biotechnologique. A ce jour, la majorité des recherches ont été effectuées sur les micro-organismes thermophiles et hyperthermophiles, mais peu d’études ont été effectuées sur la capacité de production d’H2 des micro-organismes alcalophiles ou halophiles (Pikuta et al., 2004 ; Begemann et al., 2012).

2.4. Les hydrogénases

La production biologique d’H2 est généralement réalisée par des hydrogénases. Ces hydrogénases sont des enzymes qui catalysent de façon réversible la conversion des ions H+ (protons) en dihydrogène selon la réaction : + - 2H + 2 e ↔ H2

Le sens de cette réaction, oxydation ou réduction des protons en H2, est dépendante de la nature des hydrogénases, la pression partielle en H2 et des voies métaboliques.

2.4.1. Généralités

Les hydrogénases ont été isolées à partir de micro-organismes appartenant aux trois différents domaines de la vie (Archaea, Bacteria et Eukarya) (Vignais et al., 2001, 2004 ; Meyer, 2007 ; Shima et Thauer, 2007, Posewitz et al., 2011).

Physiologiquement, elles peuvent être différenciées en fonction de leur capacité à catalyser :

(i) la production d’H2 (H2-evolving enzymes) pour disposer d’un excès de pouvoir réducteur dans la cellule, et pour ré-oxyder leurs coenzymes en absence d’oxygène, et (ii) la consommation d’H2

(H2-uptake enzymes) pour utiliser l’H2, comme source d’énergie. De nombreux micro-organismes sont capables d’oxyder ou de réduire l’H2 en fonction des conditions de croissance et possèdent différentes hydrogénases pour catalyser ces réactions (Calunsinska et al., 2010, Poudel et al., 2016).

Structurellement, la caractéristique commune de ces hydrogénases est la présence de protéines Fe-S (i.e. possédant dans sa structure un cluster [Fe-S] permettant la connexion de co- facteurs). Cependant, un grand nombre de caractéristiques les différencie : (i) leur poids moléculaire, (ii) leur localisation cellulaire, (iii) le nombre de sous-unités les composant, (iv) leur composition en métaux et co-facteurs, (v) leur sensibilité à l’O2, (vi) leur vitesse de production d’H2, (vii) leur affinité pour l’H2 et (viii) leur rôle physiologique.

Ainsi, les hydrogénases peuvent être classées en deux grandes catégories en fonction de la teneur en métaux de leurs sites actifs et de leur relation phylogénétique : les hydrogénases [NiFe] et les hydrogénases [FeFe] (Vignais et al., 2001).

2.4.2. Comparaison des hydrogénases [NiFe] et [FeFe]

Les hydrogénases [NiFe] et [FeFe] sont distribuées différemment chez les micro- organismes et présentent plusieurs différences structurelles et fonctionnelles (Figure 19).

Figure 19. Structure des hydrogénases [FeFe] et [NiFe]. A : site actif du cluster H des hydrogénases [FeFe]; B : les épines dorsales des hydrogénases [FeFe] de C. acetobutylicum (de trace verte, 3C8Y pdb) et C. reinhardtii (de trace bleue, 3LX4 pdb). C et D : le site actif et l’épine dorsale de l'hydrogénase [NiFe] de D. fructosovorans, et les acides aminés qui forment le canal de substrat du gaz (de 1YQ9 pdb). Les chaînes de clusters FeS qui sont utilisées pour le transfert d'électrons à longue distance sont visibles dans les panneaux B et D (Vincent Fourmond et al., 2013).

Les hydrogénases [NiFe] sont les plus connues et les plus largement retrouvées chez les micro-organismes. Ainsi, elles ont été identifiées au sein de bactéries photosynthétiques, telles que les cyanobactéries, et de bactéries anaérobies, notamment les acétogènes et les sulfato-réductrices (e.g. Desulfovibrio fructosovorans). Elles sont également présentes chez les archées méthanogènes, telles que Methanosarcina barkeri (Künkel et al., 1998 ; Meuer et al., 1999) et celles du genre Methanothermobacter (Tersteegen and Hedderich, 1999). Au contraire, les hydrogénases [FeFe] sont retrouvées chez les bactéries et les eucaryotes, mais absentes chez les archées. Elles sont

généralement présentes chez les micro-organismes fermentatifs anaérobies stricts produisant de l’H2 principalement affiliées à l’ordre des Clostridiales (e.g. Clostridium acetobutylicum).

Les hydrogénases [NiFe] possèdent un atome de nickel et de fer dans leur site actif. Certaines d’entre elles contiennent un atome de nickel chélaté par un atome de sélénium sous la forme d’une sélénocystéine. Néanmoins, ces hydrogénases [NiFeSe] sont peu nombreuses. In vivo, elles fonctionnent principalement dans le sens de la consommation d’H2. En comparaison, le site actif binucléaire des hydrogénases [FeFe] ne contient pas de nickel mais est seulement composé des atomes de fer. Les hydrogénases [FeFe] fonctionnent préférentiellement dans le sens de production d’H2 in vivo (Vignais et al., 2004). Alors que les hydrogénases [NiFe] affichent des vitesses approximativement égales à 100 moles d’H2 produites par mole d’enzyme par seconde (environ 10 fois plus que les nitrogénases des cyanobactéries), les hydrogénases [FeFe] sont bien plus efficaces avec des vitesses de production d’H2 pouvant atteindre plusieurs milliers de moles d’H2 par mole d’enzyme (Hallenbeck et Benemann, 2009).

Les hydrogénases [NiFe] sont des protéines hétérodimèriques constituées de petites sous- unités d'environ 30 kDa, contenant un à trois groupements fer-soufre associés à une grande sous- unité d'environ 60 kDa contenant le site actif de nickel-fer. En revanche, les hydrogénases [FeFe] sont le plus souvent des protéines monomériques avec une large gamme de tailles allant de 45 kDa à 120 kDa (Vignais et al., 2004 ; Meyer, 2007 ; Mulder et al., 2011) et sont extrêmement sensibles à l’oxygène.

En terme de localisation, les hydrogénases [NiFe] sont présentes dans la cellule soit comme des éléments liés à la membrane, soit comme des enzymes libres dans des compartiments cellulaires cytoplasmiques et périplasmiques pour la production ou l'absorption d'hydrogène, respectivement. Les hydrogénases [NiFeSe] sont liées à la membrane ou situées dans le cytoplasme et présentent une activité d'oxydation de l'hydrogène. Les hydrogénases [FeFe] sont le plus souvent abondantes dans les compartiments cytoplasmique et périplasmique ainsi que dans les chloroplastes. Jusqu'à présent, les hydrogénases [FeFe] ont été signalées pour présenter une activité de production d'H2 dans les bactéries photosynthétiques, les bactéries anaérobies fermentaires, les cyanobactéries, les algues vertes et les protozoaires (Das et al., 2006 ; Valdez-Vazquez et al., 2009).

Des études biochimiques récentes indiquent que plusieurs hydrogénases [FeFe] cytoplasmiques et multimériques sont capables de réaliser la bifurcation d'électrons, un nouveau mécanisme permettant une économie d'énergie. Il implique la réduction ou l'oxydation des deux accepteurs ou donneurs d'électrons simultanément dans un complexe enzymatique où une réaction exothermique (thermodynamiquement favorable) permet à une réaction endothermique (thermodynamiquement défavorable) de s'effectuer (Schuchmann et al., 2012 ; Zheng et al., 2014 ; Herrmann etal., 2008). Les hydrogénases [FeFe] cytoplasmiques chez Acetobacterium woodii (Schuchmann et al., 2012), Clostridium autoethanogenum (Wang et al., 2013), Moorella thermoacetica (Wang et al., 2013b) et Thermotoga maritima (Schut et al., 2009) sont toutes capables de faire la bifurcation d'électrons. L’hydrogénase [FeFe] trimérique de T. maritima couple l'oxydation simultanée de la ferrédoxine (Fd) et du NADH à la production d’H2 (Schut et al., 2009).

En revanche, l’hydrogénase [FeFe] tétramèrique d’A. woodii couple l'oxydation d’H2 à la réduction simultanée de Fd et NAD+ (Schuchmann et al., 2012 ). Curieusement, une hydrogénase [FeFe] trimérique de la bactérie acétogene M. thermoacetica peut fonctionne in vivo dans les deux sens, soit pour oxyder l’H2 soit pour le produire, selon des conditions de culture, par couplage de la Fd et du NAD+ / NADH.

2.4.3. Diversité des hydrogénases [FeFe] dans l’environnement

La sous-unité catalytique HydA et le centre H

Toutes les hydrogénases [FeFe], biochimiquement caractérisées ou identifiées à partir de recherche de séquences déduites d'acides aminés, partagent une architecture commune composée de différents domaines contenant des centres Fe-S complémentaires à celui du centre H (cluster H), qui correspond au site actif du domaine catalytique (HydA). Le centre H est un complexe dinucléaire de fer relié à un cluster [4Fe4S] via un soufre pontant. Les séquences d’acides aminés correspondant au domaine du centre H sont hautement conservées. Ainsi, le domaine du centre H peut être identifié par trois motifs de liaison distincts appelés L1 (TSCCPxW), L2 (MPCxxKxxE) et L3 (ExMACxxGCxxGGGxP) (Vignais et al., 2001). Cependant, en plus du domaine du centre H, la sous-unité catalytique HydA contient souvent des domaines N-terminaux (Centre F) et C- terminaux (centre C) qui lui confèrent une flexibilité et vraisemblablement la possibilité de coupler l'oxydation réversible d’H2 à la réduction ou l'oxydation des donneurs et des accepteurs d’électrons

externes impliqués dans divers processus métaboliques (Mulder et al., 2011 ; Calusinska et al., 2010 ; Meyer et al., 2007 ; Peters et al., 2015). Ainsi, la sous-unité catalytique HydA possède une structure modulaire variée en fonction des micro-organismes étudiés (Figure 20).

Figure 20. Domaines fonctionnels de la sous-unité HydA. Les homologues d’HydA qui ont été biochimiquement caractérisés sont signalés par un astérisque, ceux qui ont montrés une activité de bifurcation sont signalés par astérisque rouge alors que ceux qui ne font pas la bifurcation sont signalé par astérisque noir (Poudel et al., 2016).

La forme la plus simple de la sous-unité catalytique HydA a été identifiée chez les algues vertes, telles que Chlamydomonas reinhardtii, qui contient généralement seulement le domaine du centre H (Figure 20) (Mulder et al., 2011). Les formes plus complexes d’HydA sont plus fréquentes et possèdent plusieurs centres Fe-S supplémentaires, ou des centres F et C, comme chez Clostridium pasteurianum (Peters et al., 1998). En plus de la flexibilité fonctionnelle permise par les centres F- et C, la sous-unité HydA peut exister sous de multiples isoformes avec différentes structures quaternaires, y compris celles qui sont monomériques et multimériques (Meyer et al., 2007 ; Peters et al., 2015). Différentes séquences HydA de structure quaternaire variables peuvent être présentes dans un génome unique où elles forment des complexes avec des paralogues des

petites et grandes sous-unités de la NADH déshydrogénase (HydB et HydC, respectivement) (Wang et al., 2013 ; Zheng et al., 2014).

Distribution et classification des hydrogénases [FeFe] chez les micro-organismes

Une récente étude basée sur 2912 génomes d’archées et de bactéries a montré que les hydrogénases [FeFe] étaient principalement retrouvées chez les bactéries du phylum Firmicutes (160 génomes sur 622 de ce phylum). Elles sont également retrouvées en plus faible nombre chez les Proteobacteria (28), les Spirochetes (20), les Thermotogae (18), et les Chloroflexi (11) (Poudel et al., 2016 ; Peters et al., 2014). Chez les Firmicutes, une étude de génomique comparative a montré une grande diversité d’hydrogénases [FeFe] chez les bactéries du genre Clostridium avec des formes variées et des structures modulaires différentes (Calusinska et al., 2010). En effet, les génomes de Firmicutes contiennent en moyenne 2.9 gènes hydA (Poudel et al., 2016).

Récemment, une nouvelle classification des hydrogénases [FeFe] a été proposée par Poudel et al. (2016). Les enzymes de groupe 1 (G1) sont monomériques et contiennent seulement la s.u. HydA tandis que ceux de G2 et G3 sont multimériques et comprennent en plus d’HydA les sous- unités HydB, HydC (G2) et HydB, HydC, HydD (G3), respectivement. Les variantes d’hydrogénases [FeFe] sont inégalement réparties dans les phyla bactériens. Les hydrogénases [FeFe] du groupe G1 sont répandues dans les phyla Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochetes et Thermotogae alors les hydrogénases [FeFe] du groupe G2 sont principalement retrouvées chez les Choloroflexi et Thermotoga. Enfin, le groupe G3 est représenté chez les phyla Firmicutes et Spirochetes (Poudel et al., 2016). Les représentants du groupe G1 contiennent la bactérie fermentaire Clostridium pasteurianum et l’algue Chlamydomonas reinhardtii, qui produisent l’H2 avec la ferredoxine comme seul donneur d’électron, et ne sont pas bifurquante, suggérant que les hydrogénases [FeFe] d’autres bactéries du groupe G1 telles que Desulfovibrio desulfuricans ont probablement la même fonction. Les représentantes du groupe G2 ont été purifiés de Moorella thermoacetica et Thermotoga maritima : elles sont trimériques, et bifurcatives. Celle de Clostridium thermocellum appartient aussi dans ce groupe. Le groupe G3, représenté par l’hydrogénase [FeFe] d’A. woodii forme un complexe tetramérique et est bifurcative. Desulfarculus baarssi DSM 2075, Desulfobacterium autotrophicum HRM2 et Kosmotoga olearia TBF 19.5.1

sont aussi affiliées au groupe G3 mais leur capacité de bifurcation est encore inconnue (Poudel et al., 2016). Les groupes G2 et G3 qui réalise la bifurcation ont tous besoin de Fd et NADH pour leur activité, mais leur fonction peut être différente : l’hydrogénase [FeFe] chez T. maritima est impliquée dans la production fermentaire d’H2 tandis que l’hydrogénase [FeFe] chez A. woodii est impliquée dans son oxydation. Différents groupes peuvent coexister dans un même génome, ce qui implique la mise en place d’un mécanisme de régulation de leur expression en fonction des besoins physiologiques de la bactérie, lesquels dépendant notamment des conditions environnementales (Poudel et al., 2016).

Distribution et diversité des hydrogénases [FeFe] dans différents environnements

Les gènes hydA, codant la sous-unité catalytique des hydrogénases [FeFe], sont fréquemment utilisés comme marqueur moléculaire des bactéries productrices d’H2 pour suivre des changements de composition des populations bactériennes dans les bioprocédés de production d’H2 par voie fermentaire (Xing et al., 2008 ; Quéméneur et al., 2010 ; Quéméneur et al., 2011).

La diversité génétique des gènes hydA et le potentiel de la production de bioH2 associé ont également été étudiés dans divers écosystèmes, y compris des environnements extrêmes, tels que des tapis microbiens du lac salé Guerrero Negro (Mexique) ou des sources thermales du parc national du Yellowstone (Etats-Unis) libérant des fluides acides, neutres ou alcalins (Boyd et al., 2009 ; Boyd et al., 2010). Dans les tapis microbiens des lagunes de Guerrero Negro (Mexique), les séquences hydA sont affiliées aux Firmicutes (66.2%), Verrucomicrobia (24,6%), et Bacteroidetes (9,2%) (Boyd et al., 2009). Dans les sources thermales du parc national du Yellowstone, la distribution des gènes hydA est fortement contrainte par le pH : le phylum Thermotogae domine en condition acide, alors que le phylum des Fimicutes domine à pH neutre, suivi par les phyla Proteobacteria et Verrucomicrobia. Curieusement, une seule séquence affiliée à la division candidate ‘Termite group 1’ appelée ‘Elusimicrobia’ a été retrouvée en condition alcaline dans cet écosystème (Boyd et al., 2010).

Dans les sols de rizière, la plupart des clones affiliés aux phyla Firmicutes et Proteobacteria sont étroitement liés à l’ordre des Clostridiales ou à la classe des Deltaproteobacteria représentant

des sulfato-réducteurs (Baba et al., 2014). Des gènes hydA associés aux Chloroflexi ont également été détectés dans différents environnements (Boyd et al., 2009, 2010 ; Schmidt et al., 2010, 2011).

Ces gènes hydA ont récemment été recherchés dans les métagénomes de sites sous-marins (Lost City, MAR) et terrestres (Tablelands, Canada) associés à la serpentinisation et sont majoritairement associés aux Firmicutes (Brazelton et al., 2012). Dans ce manuscrit, nous présenterons la diversité et la distribution des gènes hydA retrouvées dans les cheminées et fluides des sources hydrothermales alcalines de Prony (Chapitre II).

3. Les micro-organismes alcalophiles

3.1. Définition

Le terme « alcalophile » (littéralement « qui aime les milieux alcalins ») est utilisé pour décrire les micro-organismes qui se développent de façon optimale à des valeurs de pH supérieures ou égales à 9 (souvent entre 10 et 12), mais qui ne peuvent pas se développer (ou que très lentement) à des valeurs de pH proches de la neutralité (Horikoshi et al., 2004). Contrairement aux micro- organismes alcalophiles obligatoires, les micro-organismes dits « alcalotolérants » ou alcalophiles facultatifs présentent une croissance optimale à pH neutre, mais ils sont capables de se développer à des valeurs de pH supérieures ou égales à 9.

Selon Horikoshi (2004), les micro-organismes alcalophiles peuvent être subdivisés en deux principaux groupes physiologiques : les alcalophiles et les haloalcalophiles. Les haloalcalophiles nécessitent à la fois un pH alcalin (> pH 9) et une salinité élevée (jusqu'à 33% de NaCl p/v) pour se développer (Horikoshi, 2004).

3.2. Distribution des alcalophiles et environnements alcalins

De nombreux alcalophiles ont été isolés de divers environnements présentant des pH variés : alcalins, neutres ou parfois même acides, probablement à cause de micro-niches alcalines

transitoires formées par des activités biologiques alcalinisantes, telles que l’ammonification, la réduction du sulfate ou la photosynthèse (Grant et al., 1990). De plus, les alcalophiles sont souvent confrontés à d’autres conditions environnementales extrêmes en plus du pH élévé, notamment des températures ou des concentrations en sels élevées qui dans certains environnements alcalins résultent d’une combinaison de conditions géologiques, géographiques et climatiques.

On distingue deux principaux types d’environnements alcalins naturels stables dans le monde (Ulukanli et Digrak, 2002) :

Le premier type correspond aux environnements alcalins déficients en Ca2+, tels que certains déserts et lacs hypersalins, résultant de la précipitation de grandes quantités de carbonates sous forme de carbonate de sodium (formés par la concentration d’ions par évaporation) (Grant et al., 1989, 1992 ; Jones et al., 1994). Au cours de la formation de cette alcalinité, d'autres sels (en particulier le chlorure de sodium : NaCl) se concentrent également pour généralement donner lieu à des environnements alcalins et hypersalins à la fois, tels que les lacs de la vallée du rift en Afrique de l’est (e.g. Lac Magadi au Kenya) ou les lacs salés du Grand bassin de l’ouest des Etats-Unis (e.g. Lac Mono en Californie) (Grant, 2006), où l’on retrouve des haloalcaliphiles (Blum et al., 1998) (Figure 21).

Le second type correspond aux environnements alcalins naturels riches en Ca2+, et associés à la réaction de serpentinisation (décrits en détails en 1.4) (Grant, 1992 ; Jones et al., 1994). L'hyperalcalinité des eaux libérées par ce type d’environnement (pH ~ 11), résulte du relargage en solution d’ions Ca2+ et OH- suite à l’altération à faible température des silicates contenant du calcium et/ou du magnésium : l’olivine (MgFeSiO4) et le pyroxène (MgCaFeSiO3). La réaction de serpentinisation entraine également des conditions fortement réductrices en raison de la libération 2+ de Fe . Au sein de ces environnements, l'H2 libéré peut être utilisé par un grand nombre de micro- organismes alcalophiles (Shrenk et al., 2013 ; Brazelton et al., 2010).

Figure 22. Plateforme de carbonate du Bain des Japonais dans la baie de Prony, Nouvelle-Calédonie. La plateforme est découverte à marée basse et est entourée de plusieurs évents déchargeant des eaux à pH élevé. Des bulles de gaz peuvent être visibles à marée haute (Monin et al., 2014).

3.3. Mécanismes d’adaptation des alcalophiles

Au cours de leur évolution, les micro-organismes alcalophiles ont dû développer différents mécanismes d’adaptation pour prévenir l’alcalinisation de leur cytoplasme et ainsi survivre dans des environnements hostiles présentant des pH élevés. En effet, même lorsque le pH extracellulaire

est important, ces micro-organismes peuvent maintenir leur pH intracellulaire à des valeurs proches de la neutralité (entre 7 et 8,5) à l’aide de mécanismes de régulation connus sous le terme d’homéostasie du pH (Horikoshi, 1999). Les alcalophiles extrêmes tels que Bacillus halodurans C-125 et Bacillus pseudofirmus OF4 et de nombreuses autres souches peuvent maintenir un pH cytoplasmique inférieur de 2 unités pH à celui du milieu extérieur (Hamamoto et al., 1994 ; Goto et al., 2005 ; Padan et al., 2005 ; Krulwich et al., 2007).

Les alcalophiles extrêmes aérobies qui ont un métabolisme respiratoire dont l'homéostasie du pH a été la plus souvent étudiée sont des espèces de Bacillus (Kitada et al., 2000 ; Krulwich et al., 2007) (Figure 23).

Figure 23. Cycle de proton et de sodium interactif chez alcalophile Bacillus pseudofirmus OF4. MQ, Menaquinone ; CIII, menaquinol:cytochrome c oxidoreductase ; CIV, cytochrome c oxidase ; NDH-2, NADH déhydrogénase ; MotPS, canal sodium-ion ; KtrAB et KtrCD, importateur d’ion potassium (Preiss et al., 2015).

L’homéostasie du pH en conditions alcaline peut nécessiter la mise en œuvre de plusieurs stratégies adaptatives, incluant : (i) l’augmentation de la production de métabolites acides, durant

la fermentation des sucres et la désamination des acides aminés, (ii) l’augmentation de l’activité ATP-synthase couplant l’entrée des protons à la génération d’ATP, (iii) la modification des propriétés des membranes cellulaires, telles que leur composition en lipides et (iv) l’augmentation de l’expression et de l’activité des systèmes d’échanges antiport cation monovalent/proton (Padan et al., 2005). Parmi ces stratégies, les systèmes de transport actif antiport cation monovalent/proton (e.g. Na+/H+) jouent un rôle essentiel et dominant chez de nombreuses bactéries alcalophiles pour l’homéostasie du pH intra-cellulaire.

Les micro-organismes alcalophiles exigent la présence d’ions Na+ dans le milieu environnant pour le transport effectif des solutés à travers la membrane cytoplasmique. Des études chez des alcalophiles du genre Bacillus ont montré qu’un gradient de Na+ permettait d’obtenir l’énergie nécessaire aux phénomènes d’échanges antiport Na+/H+ pour qu’une force proton-motrice (FPM) engendre la synthèse d’ATP à partir de la respiration. L'utilisation de Na+ est observée même chez les alcalophiles qui vivent dans des environnements à faibles concentrations de Na+ (Slonczewski et al., 2009). Son utilisation en tant que principal ion de couplage pour le travail bioénergétique est clairement une adaptation à la faible FPM qui existe à pH élevé. Même si la concentration de Na+ n’est pas élevée, la force motrice de Na+ est généralement beaucoup plus élevée que le FPM à un pH très élevé (Slonczewski et al., 2009). En plus de faciliter l'absorption de solutés, le Na+ qui entre dans les cellules avec des solutés pendant symport s'accumule dans le cytoplasme. Ce gradient de Na+ est à son tour nécessaire pour maintenir l'activité d’antiporteur qui permet l'entrée d'ion H+ pour maintenir l'homéostasie du pH (Krulwich et al., 1985b). D’autres stratégies d’homéostasie indépendant de Na+ pourront exister, par exemple, il a été présumé q’une production d’acide métabolique dans le cytoplasme aurait été effectué lorsque le glucose est présent chez B. pseudofirmus (Slonczewski et al., 2009).

3.4. Utilisation des alcalophiles et application biotechnologiques

De nombreux alcalophiles sont actuellement utilisés dans différentes applications biotechnologiques, car ils produisent des molécules d’intérêt industriel.

La fermentation de l’indigo est la première application industrielle de bactéries alcaliphiles dans le monde où la réduction de l'indigo à partir de feuilles d'indigo est réalisée par des espèses

variées de Bacillus (Aino et al., 2008 ; Grant et al., 1990 ; Horikoshi 1999 ; Krulwich et Guffanti 1989). Le secteur de l'artisanat traditionnel de tannage du cuir utilise une série de processus très alcalins et hostiles où l'application des enzymes alcalines a apporté des améliorations de processus importants. L’industrie du papier, ainsi que du traitement du textile, exigent également des enzymes pour le procédé enzymatique de trituration dans des conditions alcalines, qui aident les tissus végétaux à gonfler et facilitent la dégradation des substances pectiques. Les enzymes alcalines ont été considérablement utilisées dans le traitement des déchets (De Graaff et al., 2011), le processus de rouissage (la macération que l'on fait subir aux plantes textiles pour faciliter la séparation de l'écorce filamenteuse d'avec la tige) (Yoshihara et Kobayashi 1982), la dégradation des composés aromatiques (Yumoto et al., 2003) et semblent être des candidates utiles pour la biorestauration des sites contaminés par des composés toxiques chlorés (Kanekar et al., 1999), puisque l’augmentation du pH peut augmenter la biodisponibilité de ces composés, avec une diminution résultante de leur toxicité.

3.4.1. Applications des enzymes alcalines

Les enzymes les plus couramment utilisées dans les formulations détergentes sont les amylases alcalines et les protéases avec l'introduction récente de cellulases et de lipases. Ces enzymes hydrolysent l'amidon et ont un énorme potentiel dans l’industrie alimentaire ainsi que dans l’élaboration de détergents, de textile, de papier, d’adhésifs, de produits chimiques fins, pharmaceutiques et dans des fermentations variées. Comme additifs aux détergents à pH élevé, les amylases sont souvent associées aux protéases pour dissoudre des combinaisons protéine-amidon dans les taches de nourriture. Les protéases sont les enzymes les plus couramment utilisées dans les formulations détergentes et représentent la plus importante part de marché obtenue à partir de micro-organismes alcaliphiles (Grant et al., 1990 ; Krulwich et Guffanti 1989 ; Saeki et al., 2007). Les protéases à sérine produites à partir de Bacillus spp. alcalophiles sont des endopeptidases contenant un résidu serine dans son site actif. Sous forme encapsulée, elles sont ajoutées à hauteur de 0,4 - 0,6% aux détergents pour l'hydrolyse des protéines et l'élimination des taches protéiniques telles que le sang, l'œuf, l'herbe et des sécrétions corporelles (Horikoshi 1991). Des cellulases alcalines (carboxyméthyliques et extracellulaires) avec un pH optimum de 10) ont été découvertes chez deux souches de Bacillus, N4 et 1139,et sont utiliées comme additifs aux détergents de

blanchisserie (Horikoshi et al., 1984). Les cellulases ont la propriété d’adoucir les tissus et raviver les couleurs en enlevant ou en ouvrant les microfibrilles qui apparaissent sur la surface des tissus de coton en raison de l'usure et des lavages répétés, rétablissant ainsi l'aspect d'origine et la structure de la fibre lisse (Horikoshi 1991). Les cellulases peuvent également être utilisées dans le traitement des déchets, étant donné que la matière non digérée est principalement de la cellulose (Shikata et al., 1990 ; Ito,1997). Enfin, les lipases dégradent les graisses en acides gras plus hydrophiles. Cette propriété les rend plus attractifs que les détergents, car les taches hydrophobes causées par les cosmétiques, les corps gras et les aliments à base d'huile sont les plus difficiles à éliminer. L’utilisation des lipases alcalines comme additifs aux détergents est encore récente, bien que leur valeur sur le marché soit comparable à celle des protéases. En plus de ces enzymes, de nombreuses autres enzymes ont été répertoriées, telles que les xylanases alcalines (Aizawa et al., 2010 ; Gèssèssè 1998 ; Gupta et al., 2000), les pectinases (Cao et al., 1992), les phosphatases, les chitinases (Bhushan 2000 ; Nomoto et al., 1988), et l'uréase (Singh 1995).

3.4.2. Utilisation des alcalophiles pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique

La matière végétale fibreuse est constituée de lignocellulose contenant principalement de la cellulose, de l’hémicellulose et de la lignine. La lignine est récalcitrante à la dégradation bactérienne. Ainsi, le prétraitement de la biomasse est nécessaire avant la fermentation microbienne pour séparer la lignine de la cellulose et de l'hémicellulose. Le procédé de prétraitement le plus commun est l'utilisation de vapeur sous pression ce qui nécessite de l'électricité ce qui impacte sur le bilan de CO2 émis. La fermentation subséquente est également relativement inefficace. Une alternative efficace est un prétraitement alcalin de la lignocellulose. Une exposition de la biomasse à un pH élevé sépare la cellulose et l'hémicellulose de la lignine, et décompose la structure de la cellulose cristalline en le rendant plus accessibles à la dégradation et à la fermentation tout en limitant la production de composés inhibiteurs ou de CO2. La fermentation de la biomasse traitée en milieu alcalin est réalisée avec un micro-organisme haloalcalophile capable de produire du biohydrogène dans des conditions fortement alcalines et hypersalines, e. g. Halanaerobium sapolanicus qui est une souche hautement alcaliphile avec une croissance optimale à des pH compris entre 10,5 à et 11. L’H2 résultant du réacteur peut ensuite être fourni à un dispositif de conversion d'énergie de l'H2 (Elias et al., 2011).

3.4.3. Utilisation des alcalophiles dans l’alimentation

Arthrospira (Spirulina) platensis, une cyanobactérie filamenteuse alcaliphile vivant dans des lacs hypersalins (Berry et al 2003), est considérée depuis des années comme un complément alimentaire sain et efficace par un nombre grandissant de consommateurs. Elle pousse naturellement dans les eaux alcalines d’Afrique, d’Asie, d’Amérique du Nord et du Sud entre autres (Warr et al., 1985). Une grande variété de produits contenant de la spiruline est aujourd’hui disponible sur le marché des compléments alimentaires naturels (Sarethy et al.,2011).

3.5. Diversité des micro-organismes alcalophiles

Les alcalophiles sont répartis dans les trois domaines du vivant (Bacteria, Eukarya et Archaea) (Horikoshi, 1996 ; Grant et al., 1990). La première espèce bactérienne alcalotolérante, Streptococcus faecalis, une aérobie facultative renommée depuis Enterococcus faecalis, a été décrite en 1928 (Downie & Cruickshank, 1928 ; Schleifer et Kilpper-Balz, 1984). Depuis, une grande diversité de micro-organismes alcalophiles, photosynthétiques ou chimiosynthétiques, ont été découverts aussi bien d’environnements alcalins aérobies et anaérobies.

3.5.1. Micro-organismes alcalophiles aérobies

De nombreuses bactéries alcalophiles aérobies ou aérobies facultatives ont été isolées des environnements alcalins hypersalés ou associés à la serpentinisation et ont été caractérisés (Takai et al., 2005 ; Tiago et al., 2006 ; Suzuki et al. 2014).

Exemples des bactéries alcalophiles aérobies des écosystèmes liés à la serpentinisation sont décrites dans le chapitre 1. Parmi elles, on notera la prédominance des bactéries du genre

Hydrogenophaga, capable de fixer le CO2 et d’utiliser l’H2 comme source d’énergie, dans de nombreux sites tels que The Cedars aux Etats-Unis (Suzuki et al., 2013), Voltri en Italie (Quéméneur et al., 2015), Tablelands au Canada (Brazelton et al., 2013). Des représentants de ces

bactéries ont récemment été isolés du site The Cedars et leur regroupement dans le nouveau genre ‘Serpentinomonas’ a été proposé (Tableau 6) (Suzuki et al., 2014).

Parmi les bactéries alcaliphiles isolées d’environnements hypersalés, les bactéries photosynthétiques appartenant au phylum des Cyanobacteria sont largement majoritaires. Elles sont principalement affiliées aux genres Arthrospira, Cyanospira et Anabaenopsis (Ballot 2009 ; Dadheech et al., 2013). D’autres bactéries phototrophes sulfo-oxydantes (aussi appelées bactéries pourpres sulfureuses), telles que celles des genres Ectothiorhodospira et Halorhodospira, sont largement retrouvées dans ces environnements (Javor 2012 ; Sorokin 2014). Ces Cyanobacteria assurent la production primaire permettant le développement de diverses bactéries aérobies hétérotrophes dans des lacs hypersalées (Kompantseva et al., 2009), la première décrite étant un Bacillus isolé du lac Wadi El Natrun en Egypte (Weisser et Jrüper, 1984). Des bactéries aérobies facultatives et fermentaires des genres Bacillus (Blum et al., 1998), Amphibacillus (Zhilina et al., 2001), Oceanobacillus (Lu et al., 2001), Anoxybacillus (Pikuta et al., 2003) et Halolactibacillus (Ishikawa et al., 2005) ont également été isolées de ce type d’environnement. Enfin des archées aérobies haloalcalophiles et hétérotrophes, appartenant aux genres Natronobacterium et Natronococcus, sont également isolées et décrites dans les lacs hypersalés (Tindall et al., 1984).

Tableau 6. Procaryotes alcalophiles isolés d'environnements serpentinisés.

Optimum Optimum Isolats Site O2 Exemples de substrats utilisés Références pH T°C Bacillus foraminis CV53 Cabeço de Vide aérobie 7.0-8.5. 40 °C l-arabinose, ribose, xylose Tiago et al., 2006 Chimaereicella alkaliphila AC-74 Cabeço de Vide aérobie 8.0 30 °C Saccharose, Starch, Gélatine Tiago et al., 2006 Microcella alkaliphila AC4r Cabeço de Vide aérobie 9.5 35 °C l-Rhamnose, l-Fucose, d-Arabinose Tiago et al., 2006 ‘Serpentinomonas raichei’ A1, H1 The Cedars aérobie 11 30 °C Acétate, Lactate, Glucose Suzuki et al., 20114 ‘Serpentinomonas mccroryi’ B1 The Cedars aérobie 11 30 °C Acétate, Lactate, Glucose Suzuki et al., 20114 Acetoanaerobium pronyense ST07-YE Prony anaérobie 8.7 35 °C Yeast extract, peptone Bes et al., 2015 pyruvate, yeast extract, peptone, Alkaliphilus hydrothermalis FatMR1 Prony anaérobie 8.8-9 37 °C Ben Aissa et al., 2014 crotonate Clostridium sp. PROH2 Prony anaérobie 9.5 37 °C Glucose, yeast extract, Peptone Cette étude Serpentiniticella alkaliphila 3b Prony anaérobie 9.5 37 °C Crotonate, lactate, pyruvate Cette étude Vallitalea pronyensis FatNI3 Prony anaérobie 7.7 30 °C Cellobiose, glucose, mannose Ben Aissa et al., 2014 Marinobacter alkaliphilus ODP1200D-1.5 Mariana Forearc anaérobie facultative 8.5– 9.0 30–35 °C yeast extract, tryptone, caséine Takai et al., 2005 Pyrococcus yayanosii CH1 Ashadze anaérobie 7.5–8.0 98 °C yeast extract, Peptone, caséine Birrien et al., 2011 Thermococcus alcaliphilus AEDII12 Vulcano Island anaérobie 9 85 °C yeast extract, peptone, meat extract Keller et al., 1995

3.5.2. Micro-organismes alcalophiles anaérobies

Sous la surface des eaux des lacs alcalins hypersalés, les fortes salinités et les températures parfois élevées limitent la solubilisation de l’oxygène, et peuvent également générer des zones anaérobies favorables au développement de micro-organismes anaérobies. Les micro-organismes anaérobies isolés d’environnements alcalins sont indiqués dans le tableau 7. Ces environnements alcalins sont généralement riches en sulfate et par conséquent la sulfato-réduction est un des processus biologiques anaérobies prédominant. La première bactérie sulfato-réductrice alcalophile, Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, appartenant à la classe des Deltaproteobacteria, a été isolée du lac salé alcalin Magadi au Kenya (Zhilina et al., 1997). Une autre deltaprotéobactérie, Desulfonatronum lacustre, a été isolée d’un lac alcalin oligotrophe, le lac Khadyn, Touva, Russie (Zhilina et al., 2005). Curieusement, une bactérie sulfato-réductrice alcalophile modérément thermophile, appartenant au phylum des Firmicutes, Desulfotomaculum alkaliphilum, a été isolée de lisier de porcs à pH neutre (Pikuta et al., 2000).

Des archées méthanogènes méthylotrophes ont également été isolées de plusieurs lacs alcalins hypersalés (avec des concentrations en sels proches de la saturation) et appartiennent aux genres Methanosalsus et Methanohalophilus, famille des Methanosarcinaceae

(Euryarchaeota) (Kevbrin et al., 1997 ; Mathrani et al., 1988), ainsi que des archées méthanogènes hydrogénotrophes du genre Methanobacterium (Blotevogel et al., 1985 ; Kotelnikova et al., 1998).

L’acétogénèse, réalisée par des bactéries haloalcalophiles telles que Natroniella acetigena, ainsi que la réduction des nitrates par Halomonas campisalis ou Thioalkalivibrio nitratireducens, sont des activités métaboliques détectées dans les environnements alcalins salés (Grant 2006). Halonatronum saccharophilum, un représentant modérément haloalcalophile chimio-organotrophe de l’ordre des Halanaerobiales a été isolé à partir de sédiments du lac Magadi au Kenya (Zhilina et al., 2001). Des bactéries fermentant les acides aminés appelés ammonifieurs acétogènes ont été isolées de ces lacs alcalins. Les deux espèces, Natronincola histidinovorans et Tindallia magadiensis ont été isolées également du lac Magadi au Kenya et appartiennent au cluster XI de l’ordre des Clostridiales, connu pour regrouper de nombreux alcalophiles fermentaires (Zhilina et al., 1998 ; Kevbrin et al., 1998). Un certain nombre de clostridies alcaliphiles saccharolytiques ont été isolées des lacs Elmenteita, Bogoria et Magadi du Kenya (Jones et al., 1998). Les isolats des lacs Elmenteita et Bogoria sont proches des membres du groupe XI des Clostridia, tandis que les souches haloalcaliphiles du lac Magadi sont phylogénétiquement proches des membres du genre Moorella (groupe VI des Clostridium). Plusieurs espèces du genre Alkaliphilus, ont été isolées d’environnements alcalins : A. peptidofermentans (Zhilina et al., 2009), A. crotonatoxidans (Cao et al., 2003), A. halophilus (Wu et al., 2010) et A. hydrothermalis (Ben Aissa et al., 2015). Ces bactéries sont capables de se développer à des pH allant 5.5 à 9.7 et sont capables de métaboliser la peptone, l’extrait de levure, la trypcase, le tryptone et les casamino-acides.

Les eaux libérées par les sites liés à la serpentinisation sont généralement riches en H2 et dépourvues d’oxygène, ce qui est favorable au développement de micro-organismes anaérobies. La diversité de ces micro-organismes est décrite dans le chapitre 1.5 et plus spécifiquement ceux isolés des sources hydrothermales de Prony (Quéméneur et al., 2014 ; Postec et al. 2015 ; Annexes 1 et 2). La première bactérie anaérobie isolée d’un environnement alcalin associé à la serpentinisation, Alkaliphilus hydrothermalis, présente la caractéristique de se développer de façon optimale en présence de faibles concentrations en sels (NaCl), ce qui la distingue des nombreuses autres bactéries alcalophiles anaérobies décrites jusqu’à présent (Ben Aissa et al., 2014). Par rapport à ceux des environnements alcalins hypersalés, les micro- organismes issus des environnements alcalins peu salés associés à la serpentinisation ont encore été peu étudiés. La diversité microbienne globale de ces environnements a récemment été

déterminée par une dizaine d’études utilisant des approches moléculaires (Brazelton et al., 2013 ; Quéméneur et al., 2015 ; Sanchez-Murillo et al., 2014), largement décrites dans le premier chapitre bibliographique 1.5. Cependant, sur ce type d'écosystème, les études comportant une approche par des des méthodes culturales restent rares. On peut citer une étude pionnière réalisée sur le complexe ophiolitique de Semail en Oman (Bath et al., 1987), puis des études plus récentes sur d’autres sites serpentinisés, tels que l’aquifère Cabeço de Vide (CVA) dans le sud-est du Portugal (Tiago et Verissímo, 2013), sur le site Maraquin situé à 80 km au nord d’Amman en Jordanie (Pedersen et al., 2004) et enfin sur site The Cedars au Etats-Unis (Suzuki et al., 2014). Pour autant, les seules bactéries anaérobies associées ce type d’environnement ont été isolées par notre équipe à partir des sources hydrothermales de Prony (Tableau 6). Cela augure encore de nombreuses découvertes à partir de ces environnements dans les années à venir.

Tableau 7. Principales espèces bactériennes et archéennes représentant des anaérobies alcaliphiles facultatives ou obligatoires.

Phylum Class Ordre Espèce Référence DOMAINE BACTERIA Firmicutes Clostridia Clostridiales Acetoanaerobium pronyense Bes et al., 2015 Alkalibacter saccharofermentans Garnova et al., 2004 Alkalibaculum bacchi Allen et al., 2010 Alkaliphilus crotonatoxidans Cao et al., 2003 Alkaliphilus oremlandii Stolz et al., 2007 Alkaliphilus peptidofermentans Zhilina et al., 2009 Alkaliphilus transvaalensis Takai et al., 2001 Alkaliphilus halophilus Wu et al., 2010 Alkaliphilus hydrothermalis Ben Aissa et al., 2015 Anaerobacterium chartisolvens Horino et al., 2014 Anaerobranca gottschalkii Prowe et al., 2001 Anaerobranca zavarzinii Kevbrin et al., 2008 Anaerovirgula multivorans Pikuta et al., 2006 Anoxynatronum sibiricum Garnova et al., 2003 Auriminutor transvaalensis Takai et al., 2000 Caloramator indicus Chrisostomos et al., 1996 Candidatus Contubernalis alkalaceticum Zhilina et al., 2005 Cellulosibacter alkalithermophilus Watthanalamloet et al., 2012 Clostridium paradoxum Li et al., 1993 Clostridium thermoalcaliphilum Li et al., 1994 Clostridium sp. Mei et al., 2014 Desulfotomaculum alkaliphilum Pikuta et al., 2000 Dethiobacter alkaliphilus Sorokin et al., 2008 Heliorestis baculata Bryantseva et al., 2000 Natronincola ferrireducens Zhilina et al., 2008 Natronincola histidinovorans Zhilina et al., 1998 Proteinivorax tanatarense Kevbrin et al., 2013 Sporacetigenium mesophilum Chen et al., 2006 Tepidibacter thalassicus Slobodkin et al., 2003 Thermobrachium celere Engle et al., 1996 Thermincola carboxydiphila Sokolova et al., 2005 Thermosyntropha lipolytica Svetlitshnyi et al., 1996 Tindallia californiensis Pikuta et al., 2002, 2003 Tindallia magadii Kevbrin et al., 1998 Vallitalea pronyensis Ben Aissa et al., 2014 Natranaerobiales Natranaerobaculum magadiense Zavarzina et al., 2013

Natranaerobius thermophilus Mesbah et al., 2007 Halanaerobiales Halonatronum saccharophilum Zhilina et al., 2001 Natroniella acetigena Zhilina et al., 1996 Bacilli Bacillales Anoxybacillus ayderensis Dulger et al., 2004 Anoxybacillus kestanbolensis Dulger et al., 2004 Anaerobacillus alkalilacustre Zavarzina et al., 2009 Anoxybacillus pushchinensis Pikuta et al., 2000 Desulfuribacillus alkaliarsenatis Sorokin et al., 2012 Natronobacillus azotifigens Sorokin et al., 2008 Vulcanibacillus modesticaldus L'Haridon et al., 2006 Spirochaetes Spirochaetia Spirochaetales Spirochaeta americana Hoover et al., 2003 Spirochaeta sphaeroplastigenens Reddy et al., 2013 Spirochaeta dissipatitropha Pikuta et al., 2009 Spirochaeta alkalica Zhilina et al., 1996 Spirochaeta africana Zhilina et al., 1996 Spirochaeta asiatica Zhilina et al., 1996 Spirochaeta odontotermitis Sravanthi et al., 2015 Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Alkaliflexus imshenetskii Zhilina et al., 2004 Alkalitalea saponilacus Zhao et al., 2012 Alkaliflexus imshenetskii Detkova et al., 2008 Natronoflexus pectinivorans Sorokin et al., 2011 Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfobacterales Desulfonatronobacter acetoxydans Sorokin et al., 2015 Desulfurivibrio alkaliphilus Sorokin et al., 2008 Desulfovibrionales Desulfonatronum paiuteum Pikuta et al., 2002 Desulfonatronovibrio hydrogenovorans Zhilina et al., 1997 Desulfonatronospira thiodismutans Sorokin et al., 2008 Desulfonatronospira delicata Sorokin et al., 2008 Desulfuromonadales Geoalkalibacter subterraneus Greene et al., 2009 Gammaproteobacteria Chromatiales Thialkalivibrio thiocyanodenitrificans Sorokin et al., 2004 Thiorhodospira sibirica Bryantseva et al., 1999 Thioalkalicoccus limnaeus Bryantseva et al., 2000 Chrysiogenetes Chrysiogenetes Chrysiogenales Desulfurispirillum alkaliphilum Sorokin et al., 2007 Desulfurispira natronophila Sorokin et al., 2010 DOMAINE ARCHAEA Euryarchaeota Methanomicrobia Methanosarcinales Methanohalophilus zhilinae Mathrani et al., 1988 Methanosalsum natronophilum Sorokin et al., 2015 Methanosalsum zhilinaeae Kevbrin et al., 1997 Methanomicrobiales Methanocalculus natronophilus Kotelnikova et al., 1998 Methanobacteria Methanobacteriales Methanobacterium thermoalcaliphilum Blotevogel et al., 1985 Methanobacterium subterraneum Zhilina et al., 2013 Halobacteria Haloferacales Halorubrum gandharaense Kondo et al., 2015

(suite du Tableau 7)

Chapitre II : Exploration du potentiel de production d'hydrogène par les micro-organismes du système hydrothermal de Prony

Article in press : Mei N., Postec A., Monnin C., Pelletier B., Payri C., Ménez B., Frouin E., Ollivier B., Erauso G., Quéméneur M. Metagenomic and PCR-based diversity surveys of [FeFe]-hydrogenases combined with isolation of alkaliphilic hydrogen-producing bacteria from the serpentinite-hosted Prony hydrothermal field, New Caledonia. Frontiers in Microbiology

Des quantités élevées d'hydrogène (H2) sont produits naturellement dans les sources hydrothermales, associées à la réaction de la serpentinisation, dans la baie de Prony en

Nouvelle-Calédonie (Monnin et al., 2014). L’H2 produit peut être utilisé comme source d’énergie par de nombreux micro-organismes aérobies ou anaérobies présents dans ces environnements (Schrenk et al., 2013). A Prony, les récentes analyses moléculaires basées sur l’ADNr 16S et les gènes fonctionnels dsrB et mcrA (Postec et al., 2005 ; Quéméneur et al.,

2015), ont montré la présence de bactéries aérobies oxydant l’H2, ainsi que de bactéries sulfato- réductrices et d’ archées méthanogènes potentiellement hydrogénotrophes. Par des approches métagénomiques, Brazelton et al. (2012) avaient également mis en évidence un potentiel génétique pour la production d’H2 chez les communautés microbiennes colonisant le site hydrothermal sous-marin de Lost City ainsi que dans deux sources continentales ophiolithiques à Tablelands en recherchant spécifiquement les gènes des hydrogénases [FeFe], comme marqueur de la production biologique d’H2, dans les métagénomes.

Dans ce chapitre, nous avons décrit la diversité et la distribution globale des bactéries des cheminées et fluides hydrothermaux hyperalcalins (pH 11-12) de quatre sites de la baie de Prony (PHF) : deux sites intertidaux, i.e. Rivière des Kaoris (RK) et Bain des Japonais (BdJ), et deux sites sous-marins, i.e. l’Aiguille de Prony (ST07) et le site le plus profond ST09. Puis nous avons également recherché par des approches basées sur la métagénomique et la PCR, des séquences de gènes hydA, codant pour la sous-unité catalytique des hydrogénases [FeFe], considéré comme marqueur moléculaire des bactéries productrices d'H2. Cette étude a révélée une grande diversité d’hydrogénases [FeFe], phylogénétiquement éloignées de celles connues, ce qui semble refléter les conditions environnementales uniques caractérisant le système hydrothermal de Prony (i.e. température modérée, faible salinité et localisation sous-marine peu profonde et côtière). Parallèlement à ces analyses moléculaires, nous avons utilisé des approches culturales, pour enrichir et isoler des bactéries fermentaires appartenant à l’ordre des Clostridiales (phylum Firmicutes) à partir des mêmes échantillons et pour évaluer la capacité potentielle des bactéries indigènes des sources de Prony à produire de l’H2.

Metagenomic and PCR-based diversity surveys of [FeFe]-hydrogenases combined with isolation of alkaliphilic hydrogen-producing bacteria from the serpentinite-hosted Prony hydrothermal field, New Caledonia

Nan Mei1, Anne Postec1, Christophe Monnin2, Bernard Pelletier3, Claude Payri3, Bénédicte

Ménez4, Eléonore Frouin1, Bernard Ollivier1, Gaël Erauso1, Marianne Quéméneur1*

1 Aix Marseille Université, CNRS/INSU, IRD, Mediterranean Institute of Oceanography

(MIO), UM 110, 13288 Marseille, France

2 GET UMR5563 (CNRS/UPS/IRD/CNES), Géosciences Environnement Toulouse, 14 Avenue

Edouard Belin, 31400 Toulouse, France

3 Institut pour la Recherche et le Développement (IRD) Centre de Nouméa, MIO UM 110, promenade Laroque, 98848 Nouméa, Nouvelle-Calédonie

4 Institut de Physique du Globe de Paris, Sorbonne Paris Cité, Univ Paris Diderot, CNRS, 1 Rue

Jussieu, 75238 Paris Cedex 5, France

* Corresponding author: Marianne Quéméneur

Address: Aix Marseille Université, CNRS/INSU, IRD, Mediterranean Institute of

Oceanography (MIO), UM 110, 13288 Marseille, France

E-mail: [email protected]; Phone: +0033(0)491828577; Fax: +0033(0)491828570

Running title: Hydrogenases and hydrogen-producing bacteria from Prony hydrothermal field

Keywords: Hydrogen, microbial diversity, hydrogen producers, serpentinization, hydA genes,

[FeFe]-hydrogenase, metagenomics

Abstract

High amounts of hydrogen are emitted in the serpentinite-hosted hydrothermal field of the

Prony Bay (PHF, New Caledonia), where high-pH (~11), low-temperature (<40°C) and low- salinity fluids are discharged in both intertidal and shallow submarine environments. In this study, we investigated the diversity and distribution of potentially hydrogen-producing bacteria in Prony hyperalkaline springs by using metagenomic analyses and different PCR-amplified

DNA sequencing methods. The retrieved sequences of hydA genes, encoding the catalytic subunit of [FeFe]-hydrogenases and, used as a molecular marker of hydrogen-producing bacteria, were mainly related to those of Firmicutes and clustered into two distinct groups depending on sampling locations. Intertidal samples were dominated by new hydA sequences related to uncultured Firmicutes retrieved from paddy soils, while submarine samples were dominated by diverse hydA sequences affiliated with anaerobic and/or thermophilic submarine

Firmicutes pertaining to the orders Thermoanaerobacterales or Clostridiales. The novelty and diversity of these [FeFe]-hydrogenases may reflect the unique environmental conditions prevailing in the PHF (i.e. high-pH, low-salt, mesothermic fluids). In addition, novel alkaliphilic hydrogen-producing Firmicutes (Clostridiales and Bacillales) were successfully isolated from both intertidal and submarine PHF chimney samples. Both molecular and cultivation-based data demonstrated the ability of Firmicutes originating from serpentinite- hosted environments to produce hydrogen by fermentation, potentially contributing to the molecular hydrogen balance in situ.

Introduction

Hydrogen (H2) can be naturally produced by both geochemical and biological processes in various environments. Geochemically, H2 can be generated during the serpentinization of ultramafic rocks by the reduction of water coupled to the oxidation of ferrous Fe contained in olivines and pyroxenes (Schrenk et al., 2013). This reaction is accompanied by the production of exceedingly alkaline waters (pH up to 12). Produced H2 constitutes a large reservoir of energy with the capacity to sustain the development of a wide range of chemolithoautotrophic microorganisms. As an illustration, in serpentinite-hosted ecosystems, H2 has been shown to be consumed by microorganisms such as anaerobic hydrogenotrophs (e.g. methanogens) and aerobic H2-oxidizing Betaproteobacteria (i.e. ‘Serpentinomonas’ spp.) (Brazelton et al., 2006;

Tiago and Veríssimo, 2013; Quéméneur et al., 2014; Suzuki et al., 2014; Quéméneur et al.,

2015). In addition to H2 production resulting from abiotic reactions, H2 could be produced biologically by various types of microorganisms in these anoxic serpentinite-hosted environments. Among them, the Firmicutes phylum and especially the Clostridiales spp. are recognized as potential fermentative H2-producing bacteria (Xing et al., 2008; Quéméneur et al., 2011). However, the distribution and role of these microorganisms in the H2 budget of serpentinization-related systems have been scarcely addressed; so far, only two studies have investigated the potential of anaerobic microorganisms to biologically produce H2 in these hyperalkaline environments (Brazelton et al., 2012; Mei et al., 2014).

Biological H2 production is performed by phylogenetically and physiologically diverse groups of Bacteria and Archaea (i.e. anaerobes, facultative anaerobes, and photosynthetic bacteria).

This process is carried out by hydrogenases that catalyze the reversible oxidation of H2 and are divided into two major phylogenetically distinct classes: [NiFe]-hydrogenases and [FeFe]- hydrogenases (Vignais et al., 2004; Lubitz et al., 2014; Peters et al., 2015). [NiFe]-hydrogenases

are widely distributed among the Bacteria and Archaea domains, whereas [FeFe]-hydrogenases are primarily found in anaerobic bacteria of the orders Clostridiales, Thermotogales and the family Desulfovibrionaceae (Vignais et al., 2001). While [NiFe]-hydrogenases are generally involved in H2 consumption, [FeFe]-hydrogenases are usually involved in H2 production in vivo

(Vignais et al., 2004), with nonetheless some exceptions including electron-bifurcating [FeFe]- hydrogenases (Poudel et al., 2016; Wang et al., 2013; Shut and Adams, 2009). The hydA genes encoding the catalytic subunit of [FeFe]-hydrogenases have been used as a pertinent molecular marker to monitor compositional changes of bacterial H2-producers in fermentation bioreactors

(Xing et al., 2008; Quéméneur et al., 2010; Quéméneur et al., 2011). The genetic diversity of hydA genes and associated H2 production potential have also been studied by culture- independent approaches in various ecosystems including extreme environments, such as saline microbial mats of Guerrero Negro (Mexico) or geothermal springs of Yellowstone National

Park (USA) discharging acidic, neutral or alkaline fluids (Boyd et al., 2009; Boyd et al., 2010) to provide a more exhaustive picture of H2-producing community.

The hydrothermal field of the Prony Bay (PHF, New Caledonia, South Pacific) comprises several intertidal and shallow submarine hyperalkaline springs located at less than 50 meters below sea level (mbsl). Similarly to the deep-sea Lost City hydrothermal field (LCHF) located at ~800 mbsl, off the Mid-Atlantic Ridge (30°N), PHF relies on an serpentinizing basement and discharges into the seawater high pH (~11) fluids enriched in hydrogen (H2: 19-24 % vol in free gas) and methane (CH4: 6-13 % vol in free gas) (Monnin et al., 2014; Kelley et al., 2005). When alkaline fluids mix with seawater, precipitation in the form of calcium carbonates (CaCO3) and brucite [Mg(OH)2] occurs (Launay and Fontes, 1985), forming chimneys reaching up to tens of meters in height. Although PHF and LCHF display similar geochemical and mineralogical features, PHF is unique in that its hydrothermal features release low-temperature (<40°C) and low-salinity fluids in a shallow submarine environment. Recently, molecular microbial surveys

based on 16S rRNA genes analysis provided evidence of an abundant and highly diverse bacterial community inhabiting these hydrothermal chimneys with a peculiar emphasis for members of the Firmicutes (Quéméneur et al., 2014; Postec et al., 2015), as also evidenced in other serpentinization-related environments (Brazelton et al., 2013; Miller et al., 2016). Several anaerobic bacterial strains belonging to this phylum, and especially to the Clostridiales order, have been successfully isolated from the PHF submarine chimneys and described (Ben Aissa et al., 2014; Mei et al., 2014; Ben Aissa et al., 2015; Bes et al., 2015). To our knowledge, these bacteria are to date the unique anaerobic isolates reported from serpentinite-hosted environments. Those may impact the H2 budget.

The main goal of this study was to determine the diversity and distribution of the [FeFe]- hydrogenase encoding genes, considered as a molecular marker of H2-producing bacteria that may contribute to hydrogen production in different sites of the PHF located in intertidal or shallow submarine zones. [FeFe]-hydrogenases encoding genes related to those belonging to the order Clostridiales, phylum Firmicutes, were largely detected using both metagenomic analyses and PCR amplification and subsequent sequencing of hydA genes. Attempts to cultivate and isolate new alkaliphilic hydrogen-producing Clostridiales strains from these alkaline serpentinite-hosted environments were also successful.

Materials and methods

Site description

The samples used for PCR-based molecular analyses as well as microbial cultures in this study were collected in October 2012 at three different sites in the Prony Bay: (i) ‘Rivière des Kaoris’

(RK), located in the Eastern end of the Carenage Bay (22°17.969’S, 166°51.709’E), (ii) ‘Bain des Japonais’ (BdJ), located in the Western branch of the Carenage Bay (2°17.970’S,

166°51.708’E), and (iii) ‘Aiguille de Prony’ (also referred to as ST07), located in the North of the Bay (22°19.796’S, 166°50.058’E) (Figure 1) (Quéméneur et al., 2014). The samples used for metagenomic analyses were collected in November 2005 at the deepest submarine PHF site

ST09 (22°21.653S, 166°52.777E) (Figure 1) (Postec et al., 2015). Site locations are indicated on the map displayed in Monnin et al. (2014).

Figure 1. Intertidal and submarine hydrothermal sources of Prony Hydrothermal Field (PHF) in New Caledonia. Photographs show the sampling sites: 'Rivière des Kaoris' (RK), 'Bain des Japonais' (BdJ), 'Aiguille de Prony' (ST07) and the Prony ST09 site. Suffixes ‘C’ and ‘F’ in site names stand respectively for chimney and fluid.

The RK site is composed of large travertines (covered by seawater in high tide), close to an artificial pool (~3m long, ~2m wide and ~1.5m deep) fed by hyperalkaline fluids (pH 10.9) and it is located on the coast above sea level. The BdJ site is a carbonated platform located on the foreshore and thus uncovered at low tide. The tidal range in the Prony bay is about 1 m. In contrast, the ST07 site is a submarine edifice, 35 meters high, composed of carbonated chimneys sampled by scuba divers at 16 mbsl (Figure 1). At the ST09 site, an active and partially coral encrusted submarine chimney with white top was collected at 43 mbsl (Postec et al., 2015).

In PHF sites, H2 was the second most dominant gas (followed by CH4) after N2 (Monnin et al.,

2014; Deville and Prinzhofer, 2016). The range of the H2, CH4 and N2 gas contents collected at the intertidal PHF sites (RK and BdJ) were 19-24 %V, 6-13 %V and 67-69 %V, respectively

(Monnin et al., 2014). The fluids discharged by PHF sites had high pH values ranging from

10.1 (ST07) to 11.1 (BdJ). The temperature of fluids measured at sampling sites ranged from

30.8°C (RK) to 37°C (BdJ). The geological context and detailed composition of waters and gases of the PHF are given by Monnin et al. (2014).

Sample collection

Both ST07 and ST09 submarine chimneys were transversally cut from the top part generating sections of ~10 to 30 cm in diameter (Figure 1). The most central parts of sections of the ST07 and ST09 carbonated chimneys and the small BdJ (BdJC) and RK (RKC) chimneys (~10 cm in height and ~3 cm in diameter) were crushed and (i) stored in sterile FalconTM tubes at -80°C prior to DNA extraction or (ii) placed overnight at 4°C in a hermetically-sealed serum bottle with a nitrogen gas headspace prior to H2-producing enrichments. Fluid end-member samples

(checked by pH values >10.5 and salinity < 2g/L) were collected from BdJ vents (BdJF) and

RK pool (RKF) using 60 mL sterile syringes, pooled in sterile plastic bottles and stored in a

portable icebox until filtration, a few hours after sampling. The fluids (2L) were filtered through

0.2 µm pore-size IsoporeTM polycarbonate membrane filters (Millipore). The filters were then kept overnight at 4°C before cultivation or at -80°C prior to DNA extraction.

Hydrogen-producing enrichments

H2-producing enrichments were performed in duplicate using Hungate tubes containing the following basal medium components (per liter of distilled water): 0.1 g KH2PO4, 0.1 g K2HPO4,

0.1 g NH4Cl, 2 g NaCl, 0.1 g KCl, 0.1 g CaCl2.2H2O, 0.1 g yeast extract (Difco), 0.1 g cysteine hydrochloride and 10 mL trace mineral element solution (Balch et al., 1979). The initial pH was adjusted to 9.5 with NaOH. This pH above 9 can select alkalophilic microorganisms and enhances their diversity that is expected to be lower if pH is adjusted to 11. The basal medium was boiled and cooled down to room temperature under a continuous O2-free N2-flush. 5 mL of this medium was then dispensed into Hungate tubes under anaerobic conditions and autoclaved (45 min, 120°C). Prior to inoculation, the following sterile solutions were injected in each tube: 0.1 mL of 2% Na2S.9H2O (reducing agent) and 0.1 mL of 8% Na2CO3 (to adjust and buffer the pH); biotrypcase (2 g/L), yeast extract (2 g/L) and glucose (2 g/L) were used as substrates. This final medium used for H2-producing enrichments was referred to as BYG medium.

The tubes were inoculated with 0.5 g of crushed chimney rock (named BdJC, RKC or ST07 for the ‘Bain des Japonais’, ‘Rivière des Kaoris’ and ‘Aiguille de Prony’ sample, respectively) or polycarbonate filters from 0.2 µm fluids filtration of 2 L of fluid (named respectively BdJF and

RKF for the ‘Bain des Japonais’ and ‘Rivière des Kaoris’ samples). The suspensions were serially diluted in decimal steps using the same media (up to 10-6) and then incubated for one month at 37°C and 55°C. Microbial growth was determined by measuring the increase in turbidity at 600 nm after insertion of Hungate tubes into the cuvette holder of a UV-visible

spectrophotometer (Cary 50, Varian). One hundred microliters of the headspace was periodically collected in order to determine the H2 content in the gas phase. Gas composition

(H2, O2, CH4, and CO2) was determined using a Shimadzu GC 8A gas chromatograph (GC) equipped with a thermal conductivity detector (GC/TCD) (Alltech, USA). The H2 production was expressed in mM (mmol per L of culture). One to ten milliliters of the cultures were collected at the end of the experiments and then centrifuged (10,000 g, 10 min). The supernatants were stored at −20°C for further chemical analysis. The concentration of carbohydrates and soluble end-products of metabolism was determined by high-pressure liquid chromatography (HPLC) analysis and refractometric detection (Thermo Separation Products).

Details of analytical operating conditions were previously described by Mei et al. (2014). All analyses were conducted in duplicate.

Positive H2-producing cultures were subcultured into the same BYG liquid medium, and then purified by repeated use of the Hungate roll-tube method (Hungate, 1969) with medium solidified with 1.6% (w/v) agar (Difco). Several colonies that had developed were picked and cultured in BYG liquid medium. The pure cultures were identified after DNA extraction followed by 16S rRNA gene amplification, cloning and sequencing (see below).

DNA extraction

DNA was extracted following the protocol previously described by Quéméneur et al. (2014).

The matrices used were: 0.5 g of crushed carbonate chimneys or, one quarter of a 47 mm diameter polycarbonate filter or the bacterial cell pellet from 10-15 mL of positive H2- producing cultures and reference strains (used as control in PCR tests, see below). The concentration of DNA extracts was measured using Qubit® fluorometer (Invitrogen).

Metagenomic analyses

Two DNA samples from the deepest submarine PHF chimney (ST09) were used to obtain PHF metagenomes. Metagenomic libraries were prepared using 25 ng of DNA per sample. The construction kit was the Ultralow Ovation system (NuGen). The multiplex ligation adaptor mixes were L2DR_BC9 and L2DR_BC7. Fifteen PCR cycles were applied to generate sufficient materials for sequencing. Paired-end sequencing (2x100 nt) was performed on an

Illumina HiSeq 1000 at Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA.

All merged paired-end reads for ST09 samples are available on the MG-RAST server (Meyer et al., 2008) under ID 4550491.3 (P27) and ID 4550492.3 (P28). There were 5,392,044 and

7,933,927 sequence reads from P27 and P28 metagenomes, respectively.

The taxonomic annotation of these merged paired-end reads was conducted in MG-RAST server. Briefly, a phylogenomic reconstruction of the ST09 samples was computed by using both the phylogenetic information contained in the SEED nr database and the similarities to the ribosomal RNA database (Meyer et al., 2008).

The PHF metagenomes (P27 and P28) were screened for hydA genes encoding the large subunit of the [FeFe]-hydrogenase. The amino acid sequences of HydA proteins (pfam02906) were retrieved from the NCBI protein database (in May 2014) and used locally as a specific database for similarity searches using PHF metagenomes as query with BLASTX tool (version 2.2.25+) with default algorithm parameters and an E value cutoff of 10−5. The merged paired-end reads related to hydA genes with significant hits were then extracted from MG-RAST, aligned and then clustered into OTUs using an 80% identity threshold with UCLUST algorithm. The representative of each OTU was then searched with BLASTX against the NCBI nr database.

The metagenomes sequences are available in NCBI public database (SRA) under accession numbers: SRX748869 (P27) and SRX748870 (P28).

PCR amplification, cloning, sequencing and phylogenetic analyses

Three degenerate primer sets were tested from environmental samples and reference strains to target hydA genes encoding [FeFe]-hydrogenases: (i) hydF1/hydR1 (Xing et al., 2008), (ii)

FeFe-272F/ FeFe-427R (Boyd et al., 2009), and (iii) HydH1f/ HydH3r (Schmidt et al., 2010).

The bacterial 16S rRNA genes from H2-producing cultures were amplified using the primer set

27F/907R (Lane, 1991). Each PCR mixture (20 μL) contained 1X GoTaq® Hot Start Green

Master Mix (Promega), 200 nM of each primer and 1-10 ng of genomic DNA. Reactions were conducted in a T100 thermal cycler (Bio-rad). The 16S rRNA genes were amplified as follows:

94 °C for 2 min, followed by 30 cycles performed at 94 °C for 30 s, 50 °C for 30 s, and 72 °C for 30 s, with a final extension at 72°C for 10 min. The hydA genes were amplified as described above, except that 40 cycles were performed and that hybridization were carried out from 50 to

62°C using a temperature gradient in order to determine the optimal annealing temperature of each primer pair. The PCR products were then checked by electrophoresis on a 1% agarose gel containing sight DNA stain. Positive and blank controls were carried out for all amplifications.

Triplicate PCR products were pooled and purified with NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit

(Macherey-Nagel), according to the manufacturer's instructions. The purified PCR products were ligated into a pGEM®-T Easy vector and cloned into JM109 Escherichia coli competent cells (Promega), according to the manufacturer’s instructions. Sequencing of the inserts was performed by Beckman Genomics (Takeley, Essex, UK) on plasmid minipreps using primers

27F and T7 for the 16S rRNA gene and the hydA genes, respectively.

Nonchimeric 16S rRNA gene sequences (checked with the online Bellerophon program) and translated hydA sequences were aligned using Muscle implemented in the MEGA6 software

(Tamura et al., 2013). The program mothur was used to group sequences into operational taxonomic units (OTUs) based on 97% identity for 16S rRNA genes and 80% identity for HydA sequences (Baba et al., 2014). Mothur was also used to estimate richness (Chao et al., 1984)

and to compute diversity indices (Shannon and Weaver, 1949; Simpson, 1949) for each hydA clone library. The Good’s coverage C of each clone library was calculated according to the equation: C = 1–(n/N) where n is the number of OTU and N is the total number of clones in the library (Good, 1953). At least one HydA sequence deriving from translated hydA sequence and representing each OTU, designed as phylotype, was further aligned using Muscle with related sequences retrieved from NCBI databases using BLAST tools. The MEGA6 software was also used for phylogenetic tree construction by the Maximum Likelihood method using bootstrap analysis on 1000 replicates (Felsenstein, 1985). The hydA gene and HydA sequences from environmental samples were deposited in the Genbank database under the accession numbers

KT357617- KT357637. The 16S rRNA genes from bacterial cultures were deposited in the

Genbank database under the accession numbers KR349722 (3b), KJ626326 (PROH2), and

KR349723 (BJ2).

Pyrosequencing analyses of bacterial 16S rRNA gene fragments

The mixtures of 16S rRNA gene amplicons were generated from a 341F/815R bacterial primer set, as previously described by Dowd et al. (2008), and were sequenced on a 454 GS-FLX

Titanium sequencer (Roche Life Sciences, USA) by the Molecular Research Laboratory (Texas,

USA). Raw sequence data generated by pyrosequencing were uploaded into QIIME 1.8.0 and processed as described by Caporaso et al. (2010). Briefly, sequences were qualitatively trimmed, aligned using Pynast and clustered into operational taxonomic units (OTUs) using a

97% identity threshold with UCLUST (Edgar et al., 2010). Taxonomic assignment was carried out with the RDP Classifier (Wang et al., 2007) with a minimum bootstrap confidence of 80%.

BLAST searches against a non-redundant nucleotide database were performed for a representative sequence of each OTU. The OTU richness was assessed using non-parametric richness estimators. The Shannon and Simpson's diversity indices were also calculated. The

16S rRNA genes from environmental samples were deposited in the Genbank database under the accession numbers KT344933-KT344984.

Results

[FeFe]-hydrogenase gene diversity in submarine samples using metagenomic analysis

The two PHF metagenomes obtained from the submarine ST09 site contained numerous sequences related to [FeFe]-hydrogenases (Tables S1 and S2). A total of 292 and 1,386 merged paired-end reads were assigned to [FeFe]-hydrogenases in samples P27 and P28, respectively.

These 1,678 whole putative hydA reads represented 0.011% of the total reads in average

(0.005% and 0.017% for P27 and P28, respectively). The number of OTUs observed in P27

(n=113) (Table S1) was lower than that found in P28 (n=395) (Table S2) in agreement with the respective size of the two metagenomes.

Whichever the PHF metagenome considered, the HydA OTUs were mainly related to

Firmicutes (64.6% and 66.4% of the total HydA reads in P27 and P28, respectively), in which

Clostridiales-related sequences were dominant (Figure 2), in agreement with BLAST assignment of total bacterial merged paired-end reads which are widely associated with those of Firmicutes (28.3% and 28.8% of the total bacterial reads in P27 and P28, respectively)

(Figure 3). Among total merged paired-end reads related to Firmicutes sequences, Clostridia and Bacilli accounted for the two major classes (95% and 96 % of the Firmicutes reads in P27 and P28, respectively) and Clostridiales-related sequences were dominant (52% of the

Firmicutes reads) (Figure 3).

Figure 2. Distribution and taxonomic assignments of putative hydA gene sequences encoding the catalytic subunit of [Fe-Fe] hydrogenases in Prony Hydrothermal Field metagenomes. The histogram shows the relative abundance of major hydA phyla in the total hydA metagenomic sequences (n=1678) and pie charts show distributions of 'Firmicutes HydA' classes in the metagenomes P27 and P28 obtained from ST09 site.

Figure 3. Distribution and taxonomic assignments of total bacterial sequences in Prony Hydrothermal Field metagenomes P27 and P28 obtained from ST09 site. The histogram shows the relative abundance of major bacterial phyla in the total bacterial metagenomic sequences and pie charts show distributions of major Firmicutes classes.

The majority of HydA OTUs had close phylogenetic relationships with Clostridium- and

Desulfotomaculum-related sequences (Tables S1 and S2). A relatively large proportion of

HydA sequences (14.4-14.5%) from ST09 metagenomes shared high sequence similarity with those of paddy soil Firmicutes. Other HydA sequences within the Firmicutes (i.e. related to the orders Halanaerobiales, Thermoanaerobacterales and Selenomonadales) were also observed but in less amounts (Figure 2). In addition, HydA sequences retrieved with high frequency were associated with those of Spirochaetales (11.9-18.3%), as well as Deltaproteobacteria (e.g.

Desulfobulbus genus), Bacteroidetes, and Thermotogales, which are also known to be rich in fermentative H2-producers. The rest of metagenomic HydA sequences of PHF were associated with those of microbial mat inhabiting saline environments or oil fields (Boyd et al., 2009; Liu et al., 2015).

[FeFe]-hydrogenase gene diversity in intertidal and submarine samples using PCR- amplified DNA sequencing analysis

Five samples of both intertidal and submarine Prony sites (‘Bain des Japonais’ fluids, BdJF;

‘Bain des Japonais’ chimney, BdJC; ‘Rivière des Kaoris’ fluids, RKF; ‘Rivière des Kaoris’ chimney, RKC, and ST07 chimney) were tested for amplification of the large subunit of the

[FeFe]-hydrogenase encoding gene (hydA) using three degenerate primer sets (FeFe-272F

/FeFe-427R, HydH1f /HydH3r, hydF1/hydR1). PCR products of ~680 bp were obtained with the primer set hydF1/hydR1 from both the PHF samples and the control genomic DNA (i.e.

Desulfovibrio vulgaris and Clostridium saccharolyticum). In contrast, no hydA gene amplification occurred for the PHF samples by using primer sets FeFe-272F/FeFe-427R or

HydH1f /HydH3r, despite modifications of the PCR conditions (e.g. annealing temperature) with validation on controls (i.e. PCR products with the expected band size were observed at

50°C for control). Therefore, the primer sets hydF1/hydR1 was selected for further analysis (i.e. cloning and sequencing of hydA genes of PHF DNAs).

Five hydA gene libraries were analyzed to study the HydA diversity in the five different PHF samples and to gain insight into the HydA diversity of uncultivable H2-producers. A total of

181 hydA sequences were obtained from the five environmental samples BdJC (52), BdJF (61),

RKC (28), RKF (26) and ST07 (14). Both the highest richness and the highest diversity were observed in BdJ samples (Table S3).

Figure 4 shows the phylogenetic relationship of the 21 HydA OTUs corresponding to the translated sequences of the hydA gene detected in the PHF samples. They were related to the

Firmicutes (81.0% of the total sequences), followed by Bacteroidetes (9.5%) and

Alphaproteobacteria phyla (4.8%). The bacterial community of the submarine chimney ST07 was mainly represented (92.9% of the total sequences) by mesophilic to thermophilic fermenters or sulfate-reducers related to Firmicutes (i.e. Clostridiales or

Thermoanaerobacterales) isolated from terrestrial hot spring or subterrestrial environments, such as Desulfotomaculum spp.. These putative ‘submarine/anoxic Firmicutes’ HydA sequences were also mainly detected in the metagenomes of the submarine chimney ST09. In contrast, both BdJC and RKC samples were dominated by HydA sequences associated with those of uncultured Firmicutes retrieved from a paddy field soil (78.8% and 92.9% of the total sequences, respectively), which were less represented in the metagenomes of the submarine chimney ST09. BdJF sample revealed a similar proportion of HydA sequences (73.5% of the total sequences) associated with this cluster hence referred to here as ‘intertidal/oxic Firmicutes

HydA group’. The HydA sequences retrieved from RKF were mainly associated to the

Bacteroidetes/Chlorobi group (96.2%) and also affiliated with uncultured Caldithrix–like bacteria retrieved from paddy field soil or anaerobic sludge (3.9%).

Figure 4. Maximum-likelihood phylogenetic tree of [Fe-Fe]-hydrogenase sequences obtained from intertidal and submarine PHF sites. Protein HydA sequences (188 amino acids) were obtained after translation of hydA gene sequences (obtained by cloning and Sanger sequencing) for 3 PHF hydrothermal sites: 'Bain des Japonais' (BdJ), 'Rivière des Kaoris' (RK) and 'Aiguille de Prony' (ST07). The suffix ‘C’ in sample names corresponds to ‘chimney’ and the suffix ‘F’ corresponds to ‘fluid’). The [FeFe]-hydrogenase sequences from PHF samples are marked in bold. Each OTU is represented by one representative sequence (at ≥80% similarity level). Percentage of OTU with respect to the total number of retrieved sequences in each PHF site is indicated by different levels of red from 0% (white) to 100% (red). Genbank accession numbers (in brackets) were obtained from the protein sequence database. Bootstrap values <70% are not shown. The scale bar indicates 0.1% sequence divergence. UnBact and α_Prot stand for unclassified Bacteria and Alphaproteobacteria, respectively.

16S rRNA gene diversity in intertidal and submarine PHF samples

In order to obtain accurate and consistent estimates of the overall bacterial diversity in the studied sites, 16S rRNA pyrosequencing were conducted on the same five PHF subsamples

(BdJF and RKF fluids; BdJC, RKC and ST07 chimneys) previously used for hydA PCR amplification and subsequent sequencing. After quality/size trimming and removal of chimeric sequences, pyrosequencing of bacterial 16S rRNA PCR products yielded a total of 20,495 sequences. These sequences were assigned to 969 OTUs (RKC: 161; RKF: 143; BDJC: 323;

BDJF: 125; ST07: 217; Table S3). The PHF samples were dominated by 52 bacterial OTUs

(Table 1). BdJC had the highest bacterial richness while ST07 sample displayed the highest bacterial diversity (Table S3).

The global structure of the bacterial communities obtained for each sample is shown in Figure

5. The total bacterial OTUs were assigned to 26 phyla, 1 candidate division (NPL-UPA2), and other unclassified groups (Figure 5). Bacteroidetes, Cyanobacteria, Firmicutes,

Proteobacteria, and Thermus-Deinococcus accounted for the five main phyla (>10% of the total sequences each in average), representing 93.5% of the total bacterial communities.

BdJF and ST07 displayed the highest occurrence of Firmicutes and Deltaproteobacteria

(Figure 5). Firmicutes were mainly represented by fermentative heterotrophs belonging to

Clostridiales, Natranaerobiales (only detected in ST07) and Thermoanaerobacterales (Table

1). BdJF displayed the highest occurrence of Deltaproteobacteria sequences, which were exclusively affiliated to the alkaliphilic Desulfonatronum genus, while ST07 chimney sample comprised two alkaliphilic deltaproteobacterial groups: the first and most abundant related to the genus Desulfurivibrio, and the second related to the genus Desulfonatronum. BdJF bacterial community contained a large part (14.3%) of anaerobic, haloalkaliphilic, hydrolytic, and fermenting members of the Natronoflexus genus (Bacteroidetes phylum).

Figure 5. Distribution and taxonomic assignments of 16S rRNA bacterial sequences in chimneys and fluids of interdidal and submarine sites of PHF. Relative phylogenetic abundance was based on frequencies of the 16S rRNA gene sequences (with respect to the total number of sequences obtained by pyrosequencing) affiliated to major phylogenetic phyla or class in the bacterial communities of the 'Bain des Japonais' (BdJ), 'Rivière des Kaoris' (RK) and the 'Aiguille de Prony' (ST07). The suffix ‘C’ in sample names corresponds to ‘chimney’ and the suffix ‘F’ corresponds to ‘fluid’.

Remarkably, on the contrary to BdJF and ST07, the BdJC sample was dominated by

Alphaproteobacteria, mainly represented by the anoxygenic phototrophic Rhodobaca genus.

Moreover, photosynthetic Cyanobacteria were abundantly detected in RKC sample (21.9% of the bacterial community), while RKF bacteria were largely dominated by

Gammaproteobacteria. Finally, H2-consuming Betaproteobacteria (i.e. Hydrogenophaga

/‘Serpentinomonas’ members) were detected in all samples, especially in RKC and RKF, where they represented 58.4% and 24.4% of the total bacterial communities, respectively.

Cultures and isolation of alkaliphilic hydrogen-producing Firmicutes from PHF

Two subsamples of the five PHF samples (BdJC, BdJF, RKC, RKF and ST07) were cultivated into BYG medium at an initial pH of 9.5 in order to enrich for fermentative alkaliphilic H2-

producing bacteria. In total, 70 tubes were inoculated (5 samples × 7 dilutions × 2 replicates).

After one week of incubation at 37 °C, H2 production was detected for all tested chimney samples (i.e. RKC, BdJC, and ST07) (Figure 6A). The H2 production was accompanied by a decrease in both glucose concentration and pH (final pH 8.5 ± 0.5), as a result of acidic metabolite production (i.e. acetate and butyrate). No H2 production was observed in controls and enrichment cultures from fluids (BdJF and RKF) even after one month of incubation under the same culture conditions (37°C, pH 9.5). Moreover, no H2 production was observed after 1 month of incubation at 55°C with similar pH and substrate conditions from any tested samples

(chimney samples and fluids). This result suggests that no thermo-alkaliphilic fermentative microorganisms were involved in production of H2 in PHF with these substrates.

Figure 6. Hydrogen-producing cultures obtained from hydrothermal chimneys of the Prony bay: performances and identification of bacterial isolates. (A) Hydrogen-producing cultures were attempted using several dilutions of chimney subsamples from three Prony sites: 'Bain des Japonais' (BdJ), 'Rivière des Kaoris' (RK) and the 'Aiguille de Prony' (ST07). The suffix ‘C’ in sample names stands for ‘chimney’. Subcultures were also performed from the first round of positive enrichment cultures. Values are mean of biological replicates ± standard deviation (errors bars). (B) Maximum-likelihood tree based on 16S rRNA gene sequences showing the phylogenetic position of Firmicutes strains 3b, PROH2 and BJ2, isolated from hydrogen-producing cultures of Prony hydrothermal Field (PHF). Representative sequences in the tree were obtained from GenBank (accession number in the brackets). Other bacterial species isolated from PHF are indicated by asterisks. Bootstrap values >70% are indicated at nodes.

100

The RKC culture and the lowest dilution of BdJC (10-2) and ST07 (10-2) cultures yielding a significant H2 production were transferred into a fresh culture medium after two weeks of incubation. The highest H2 production (24.5 ± 2.5 mM) was reached in ST07 subcultures (Figure

6A), while extremely low H2 production (<1.5 mM) was observed in both BdJC and RKC subcultures (after 7 days of incubation). All H2-producing subcultures (BdJC, RKC and ST07) displayed before the isolation procedure, a weak bacterial richness with the detection of only one dominant OTU belonging to Firmicutes after 16S rRNA-based cloning/sequencing analyses (data not shown). These dominant OTUs corresponded to the bacterial strains finally isolated by the roll-tube method from each H2-producing subcultures. As shown in Figure 6B, the alkaliphilic, highly efficient H2-producing ST07 culture was dominated by the strain

PROH2 (sharing 99.9% and 96.8% 16S rRNA identity with Acetoanaerobium pronyense and

Clostridium sticklandii, respectively) (Mei et al., 2014; Bes et al., 2015). The RKC cultures were dominated by the alkaliphilic strain 3b having Alkaliphilus hydrothermalis as its closest phylogenetic relative (92.3% 16S rRNA identity), hence representing a novel genus in the order

Clostridiales, while the BdJC cultures were dominated by strain BJ2 closely related to

Exiguobacterium profundum (99.5% 16S rRNA identity) a facultative anaerobe originating from a deep-sea hydrothermal vent and belonging to the order Bacillales.

Discussion

Changes in [FeFe]-hydrogenase diversity between intertidal and submarine Prony sites

Bacterial populations harboring hydA genes in both intertidal and submarine PHF samples were clearly dominated by Firmicutes, as previously observed in two other serpentinite-hosted ecosystems (i.e., Lost City chimneys, discharging hot fluid (90°C) with high pH (10.8) and H2

101

(13 mmol/kg) and anoxic Tablelands-WHC2b fluid, pH 12.1, Eh -733 mV, 0.24 mM-H2;

Brazelton et al., 2012) (Figure 4). However, different hydA patterns were observed depending on the nature and physico-chemical characteristics of the PHF samples (e.g. fluid versus carbonate concretions/chimneys, or water depth), in agreement with previous 16S rRNA gene- based molecular studies on this hydrothermal field (Quéméneur et al., 2014; Postec et al., 2015; this study). PHF hydA populations were mainly divided in two groups. One is the

‘submarine/anoxic HydA group’, related to strictly anaerobic Firmicutes (e.g. Clostridium and

Desulfotomaculum genera) recovered from deep environments (Haouari et al., 2008; Aüllo et al., 2013). This is the case of submarine ST07 and ST09 chimneys, as well as fluid end-members of BdJ site (BdJF, pH 10.8, Eh -352 mV, 6.4 mM-H2(g)) and RK site (RKF, pH 10.9, Eh -195,

13.4 mM-H2(g)) (data from Monnin et al., 2014) characterized by pH close to 11 and low redox potentiel. In contrast, an ‘intertidal/oxic HydA group’, affiliated to Firmicutes HydA sequences from paddy field soil (Japan) (Baba et al., 2014), was predominant in the intertidal BdJ and RK chimneys. Irrigated paddy field soils are characterized by alternating aerobic and anaerobic conditions, when they are drained and flooded during rice cultivation periods (Lüdemann et al.,

2000). Similar fluctuating exposure/concentration of oxygen may exist in both intertidal BdJ and RK chimneys, which are alternatively uncovered or covered by seawater at low or high tide, respectively (Monnin et al., 2014; Quéméneur et al., 2014). However, hydA genes are commonly detected abundantly in anoxic zones, but not in other intertidal/oxic locations (e.g.

Tablelands-TLE and Great Salt Lake) (Boyd et al. 2014; Brazelton et al. 2012). Therefore, this new ‘intertidal/oxic HydA group’ distantly related to HydA sequences from cultivated microorganisms related to uncultured Firmicutes from paddy soils and may hence represent a new class of unknown [Fe-Fe]-hydrogenases of new aero-tolerant or microaerophilic microorganisms to be discovered (Figure 4).

102

Abundant [FeFe]-hydrogenases of Desulfotomaculum spp. in PHF metagenomes

Numerous HydA OTUs obtained from submarine PHF sites by using both metagenomic and

PCR-amplified DNA sequencing analyses were closely related to sulfate-reducing Firmicutes of the Desulfotomaculum genus. This finding is consistent with a previous metagenomic investigation of [Fe-Fe]-hydrogenases in the serpentinization-driven LCHF (Brazelton et al.,

2012). Desulfotomaculum spp. are well adapted to colonize deep submarine environments where they are nonetheless better known to consume H2 for growth through sulfate reduction

(Aüllo et al., 2013) rather than to produce H2 by fermentation. However, some

Desulfotomaculum species possess the ability to grow in syntrophy with hydrogenotrophic methanogens (to which they transfer H2 they produce) and have even lost their ability to reduce sulfate in anoxic systems (Imachi et al., 2006), when the concentration of sulfate is quite low, as it was measured in PHF end member fluids (Monnin et al., 2014; Quéméneur et al., 2014).

Some [FeFe]-hydrogenases of other sulfate-reducers (e.g. Desulfovibrio spp.) may also be bifunctional, and depending on the environmental conditions, they may produce H2 in synthrophic conditions, instead of catalyzing H2 oxidation (Meyer et al., 2013). In PHF chimney samples, no Desulfotomaculum species was previously detected by sequence analyses of dsrB genes, used as molecular marker of sulfate-reducing bacteria (Quéméneur et al., 2014; Postec et al., 2015) in contrast to the LCHF where they were found to be abundant (Gerasimchuk et al., 2010; Brazelton et al., 2006). Several attempts to cultivate sulfate-reducing bacteria, as well as anaerobic hydrogenotrophs, from these submarine serpentinite-hosted environments were unsuccessful for both locations (Postec et al., 2015), despite their abundance in both 16S rRNA and dsrB gene databases (e.g Desulfotomaculum spp. for LCHF and Desulfonatronum spp. for

PHF). However, it is well known that the use of H2 as electron donor is generally considered as more thermodynamically favourable than use of organic acids or sugars as electron donor

(Thauer et al., 1977; Amend et al., 2011). This probably means that such sulfate-reducing

103

bacteria have a particular metabolism (and/or a synthrophic life style), and consequently may possess a novel type of hydrogenases. Altogether, these results indicate that

Desulfotomaculum–related [Fe-Fe]-hydrogenases certainly play a crucial role in the biological

H2 cycle in serpentinite-hosted environments but at this stage of knowledge it is difficult to stand if these [Fe-Fe]-hydrogenases were involved mostly in H2 production or consumption or both depending on environmental conditions.

High [FeFe]-hydrogenase diversity in a hyperalkaline and mesothermic environment

An unexpectedly large HydA diversity, related to phyla that include Alphaproteobacteria,

Bacteroidetes, and Firmicutes, was observed in the alkaline serpentinite-hosted PHF, where high amounts of H2, likely of mixed origin (geological and biological), is produced. This finding strongly contrasts with that reported by Boyd et al. (2010) who also used HydA sequences to study the diversity of H2-producing bacteria in basalt-hosted hydrothermal springs of the

Yellowstone National Park (YNP). Indeed, they demonstrated that the HydA diversity in their samples was strongly constrained by pH (with the lowest diversity being found in springs with high pH of 9-10) and was mainly represented by uncultivated members of the Elusimicrobia phylum (known as 'Termite Group 1') at high pH. Although the geological, mineralogical and chemical setting differs in PHF, we show that neither pH solely nor in combination with in situ

H2 concentration can explain the HydA diversity in the PHF system, and that alkaline habitats can also harbour a wide range of potential H2-producers, comparable to previous observations in habitats with acidic or neutral pH conditions (Xing et al., 2008; Schmidt et al., 2010). This sharp difference with what was observed in YNP hot springs may be explained by the combination of two strong environmental stresses (i.e. high pH coupled with high temperature) that seems to dramatically decrease the potential of biological H2 production. In our study, no

H2 production was detected in enrichments carried out at pH 9.5 and temperature exceeding

104

55°C and only low proportions of the hydA sequences retrieved from PHF metagenomes could be affiliated to thermophilic H2 producers (such as Thermotogales), in agreement with results obtained from YNP springs, where hydA genes were undetected at alkaline pH and temperature above 65°C (Boyd et al., 2010).

Alkaliphilic and fermentative hydrogen-producing Firmicutes

Whatever the approach used, it appears that the order Clostridiales, phylum Firmicutes, contained the highest number of hydA genes and thus potential H2-producing candidates in PHF samples. Our molecular data are in agreement with recent extensive genomic studies, showing a predominance of hydA genes in Firmicutes genomes (Poudel et al., 2016; Peters et al., 2015).

Among them, the majority of the hydA Firmicutes are related to the ‘G1 Hyd group’, which mainly contains representatives of H2-producing [FeFe]-hydrogenases (Poudel et al., 2016).

Clostridiales were also the most frequently cultivated bacteria from PHF chimneys, allowing us to isolate numerous strains, some of which being already described as new species (e.g.

Alkaliphilus hydrothermalis, Acetoanaerobium pronyense, Vallitalea pronyensis) (Ben Aissa et al., 2014; Ben Aissa et al., 2015; Bes et al., 2015). These Clostridiales can be involved in H2 production by fermenting a wide range of organic compounds as substrates (e.g. sugars, proteins, individual amino acids, carboxylic acids), which could originate from the decay of primary microbial colonizers of such alkaline environments. Indeed, a high biomass has been previously detected in PHF chimneys with population ranging from 1 to 6 x 107 bacterial cells per g of chimneys (Quéméneur et al., 2014). Additionally, the hydrothermal degradation at depth of serpentinite hosted ecosystems has been shown to lead to the production of organic acids circulating throughout the hydrothermal system (Pasini et al., 2013). However, further studies on fermentative H2 producers occupying these alkaline habitats are needed to ascertain their geomicrobiological role to be played in serpentinite-hosted ecosystems and to assess to

105

what extent they contribute to the H2 budget. Most of the studies on fermentative H2 production were conducted under acidic or neutral pH conditions (optimal pH ranging from 5 to 6) (Xing et al., 2008; Wang and Wan, 2009; Quéméneur et al., 2011), and only two alkaliphilic H2- producers have been isolated from alkaline environments so far (Begemann et al. 2012; Mei et al., 2014). Nonetheless, fermentative H2 production have been not only described as thermodynamically more attractive under alkaline conditions (at ambient temperature), but also reported to be enhanced and stabilized at high initial pH (Xiao and Liu, 2006; Cai et al., 2004).

Besides, the alkaliphilic anaerobe, Clostridium sp. PROH2, isolated from the ‘Aiguille de

Prony’ (ST07 chimney), demonstrated efficient H2 production with H2 yields similar to that of other neutrophilic and mesothermic clostridial species studied so far. This clostridial strain was able to produce 2.71 moles of H2 per mole of glucose at high pH (9.5), low salinity and moderate temperature (37 °C) (Mei et al., 2014). Such pure cultures of extremophilic microorganisms constitute interesting biotechnological alternatives for producing H2 with high efficiency from vegetal biomass and organic wastes in non-sterile systems since the high-pH conditions efficiently prevent growth of most contaminants that prevail under neutrophilic conditions.

106

Conclusion

This study revealed an unexpected high diversity of [FeFe]-hydrogenase genes mostly related to Firmicutes in the hyperalkaline and serpentinite-hosted PHF. Such a high diversity may reflect either a high metabolic capability at the community level, with various fermenting bacteria occupying distinct micro-habitats in the porous structures of the carbonate chimneys and in the fluids, or individual metabolic flexibility of these indigenous microorganisms adapted to the various stresses they have to face due to harsh and fluctuating environmental conditions (e.g., Eh, pH, O2, nutrient deprivation) as recently evidenced by Pisapia et al.

(submitted). Their novelty can be explained by the unique feature of the serpentinite-hosted

PHF, which discharges low-temperature (<40°C) and low-salinity fluids in a shallow submarine environment. Clearly, further investigations are mandatory to assess the in situ functioning and directionality (i.e. reverse or forward) of these new and diverse [FeFe]-hydrogenases associated to members of the order Clostridiales. They also need to be complemented by isotopic investigations aiming at determining the ratio of biotic to abiotic H2 produced at the PHF, and field measurements to in situ assess the microbiological H2 production. As elevated concentrations of N2 were also reported in the fluids discharged at the PHF (Monnin et al., 2014;

Deville and Prinzhofer, 2016), the involvement of serpentinite-hosted microbial communities in the deep nitrogen cycle and in the overall production of N2 will be another pending question to tackle within the next future.

Conflict of Interest Statement

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

107

Acknowledgments

This project was financially supported by the French Research Institute for Development (IRD), the EC2CO-Biohefect/Ecodyn/Dril/MicrobiEn (MicroProny) CNRS program, the deepOASES

ANR project (ANR-14-CE01-0008-06), the Deep Carbon Observatory (Census for Deep Life:

Comparative metagenomics of archaeal biofilms in carbonate chimneys associated with geographically isolated sites of serpentinization; PI W.J. Brazelton) and the China Scholarship

Council. We acknowledge the support given by the Deep Life Community from the Alfred P.

Sloan Foundation to M.L. Sogin and K. Hinrichs. We sincerely thank M.O. Schrenk and W.J.

Brazelton for their helpful reading and comments on the manuscript. We are grateful to the scuba divers team of IRD Nouméa (Eric Folcher, John Butcher, and Bertrand Bourgeois) for collecting samples.

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References

Amend, J. P., McCollom, T. M., Hentscher, M., and Bach, W. (2011). Catabolic and anabolic energy for chemolithoautotrophs in deep-sea hydrothermal systems hosted in different rock types. Geochim. Cosmochim. Acta, 75, 5736-5748. doi:10.1016/j.gca.2011.07.041

Aüllo, T., Ranchou-Peyruse, A., Ollivier, B., and Magot, M. (2013) Desulfotomaculum spp. and related gram-positive sulfate-reducing bacteria in deep subsurface environments. Front.

Microbiol. 4:362. doi: 10.3389/fmicb.2013.00362

Baba, R., Kimura, M., Asakawa, S., and Watanabe, T. (2014) Analysis of [FeFe]-hydrogenase genes for the elucidation of a hydrogen-producing bacterial community in paddy field soil.

FEMS Microbiol. Lett. 350, 249-256. doi: 10.1111/1574-6968.12335

Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., and Wolfe, R. S. (1979) Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296.

Begemann, M. B., Mormile, M. R., Sitton, O. C., Wall, J. D., and Elias, D. A. (2012) A streamlined strategy for biohydrogen production with Halanaerobium hydrogeniformans, an alkaliphilic bacterium. Front. Microbiol. 3:93. doi: 10.3389/fmicb.2012.00093

Ben Aissa, F., Postec, A., Erauso, G., Payri, C., Pelletier, B., Hamdi, M., et al. (2014) Vallitalea pronyensis sp. nov., isolated from a marine alkaline hydrothermal chimney. Int. J. Syst. Evol.

Microbiol. 64, 1160-1165. doi: 10.1099/ijs.0.055756-0

Ben Aissa, F., Postec, A., Erauso, G., Payri, C., Pelletier, B., Hamdi, M., et al. (2015)

Characterization of Alkaliphilus hydrothermalis strain FatMR1 sp. nov., a novel alkaliphilic anaerobic bacterium, isolated from a carbonaceous chimney of the Prony Hydrothermal Field,

New Caledonia. Extremophiles 19, 183-188. doi: 10.1007/s00792-014-0697-y

Bes, M., Merrouch, M., Joseph, M., Quéméneur, M., Payri, C., Pelletier, B., et al. (2015)

Acetoanaerobium pronyense sp. nov., an anaerobic mesophilic bacterium isolated from the

109

Prony alkaline Hydrothermal Field, New Caledonia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 65, 2574-

2580. doi: 10.1099/ijs.0.000307

Boyd, E. S., Hamilton, T. L., Swanson, K. D., Howells, A. E., Baxter, B. K., Meuser, J. E., et al. (2014) [FeFe]-hydrogenase abundance and diversity along a vertical redox gradient in Great

Salt Lake, USA. Int. J. Mol. Sci. 15, 21947-21966. doi: 10.3390/ijms151221947

Boyd, E. S., Hamilton, T. L., Spear, J. R., Lavin, M., and Peters, J. W. (2010) [FeFe]- hydrogenase in Yellowstone National Park: evidence for dispersal limitation and phylogenetic niche conservatism. ISME J. 4, 1485-1495. doi: 10.1038/ismej.2010.76

Boyd, E. S., Spear, J. R., and Peters, J. W. (2009) [FeFe]-hydrogenase genetic diversity provides insight into molecular adaptation in a saline microbial mat community. Appl. Environ.

Microbiol. 75, 4620-4623. doi: 10.1128/AEM.00582-09

Brazelton, W. J., Morrill, P. L., Szponar, N. and Schrenk, M. O. (2013) Bacterial communities associated with subsurface geochemical processes in continental serpentinite springs. Appl.

Environ. Microbiol. 79, 3906-3916. doi: 10.1128/AEM.00330-13

Brazelton, W. J., Nelson, B., and Schrenk, M. O. (2012) Metagenomic evidence for H2 oxidation and H2 production by serpentinite-hosted subsurface microbial communities. Front.

Microbiol. 2:268. doi: 10.3389/fmicb.2011.00268

Brazelton, W. J., Schrenk, M. O., Kelley, D. S., and Baross, J. A. (2006) Methane-and sulfur- metabolizing microbial communities dominate the Lost City hydrothermal field ecosystem.

Appl. Environ. Microbiol. 72, 6257-6270. doi: 10.1128/AEM.00574-06

Cai, M., Liu, J., and Wei, Y. (2004) Enhanced biohydrogen production from sewage sludge with alkaline pretreatment. Environ. Sci. Technol. 38, 3195-3202. doi: 10.1021/es0349204

Caporaso, J. G., Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, F. D., Costello, E. K., et al. (2010) QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat.

Methods 7, 335-336. doi: 10.1038/nmeth.f.303

110

Chao, A. (1984) Nonparametric estimation of the number of classes in a population. Scand. J.

Stat. 11, 265-270. doi: 10.2307/4615964

Deville, E., and Prinzhofer, A. (2016). The origin of N 2-H 2-CH 4-rich natural gas seepages in ophiolitic context: A major and noble gases study of fluid seepages in New Caledonia. Chem.

Geol. doi:10.1016/j.chemgeo.2016.06.011

Dowd, S. E., Callaway, T. R., Wolcott, R. D., Sun, Y., McKeehan, T., Hagevoort, R. G., et al.

(2008) Evaluation of the bacterial diversity in the feces of cattle using 16S rDNA bacterial tag- encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). BMC Microbiol. 8, 125-132. doi: 10.1186/1471-2180-8-125

Edgar, R. C. (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic. Acids. Res. 32, 1792-1797. doi: 10.1093/nar/gkh340

Edgar, R. C. (2010) Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.

Bioinformatics 26, 2460-2461. doi: 10.1093/bioinformatics/btq461

Felsenstein, J. (1985) Confidence-limits on phylogenies - an approach using the bootstrap.

Evolution 39, 783-791. doi: 10.2307/2408678

Good, I. J. (1953) The population frequencies of species and the estimation of population parameters. Biometrika 40, 237-264. doi: 10.1093/biomet/40.3-4.237

Haouari, O., Fardeau, M.-L., Cayol, J. L., Casiot, C., Elbaz-Poulichet, F., Hamdi, M., et al.

(2008) Desulfotomaculum hydrothermale sp. nov., a thermophilic sulfate-reducing bacterium isolated from a terrestrial Tunisian hot spring. Int. J. Syst. Evol. Micr. 58, 2529-2535. doi: 10.1099/ijs.0.65339-0

Hungate, R. E. (1969) A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Method. Microbiol.

3B, 117-132.

Imachi, H., Sekiguchi, Y., Kamagata, Y., Loy, A., Qiu, Y. L., Hugenholtz, P., et al. (2006) Non- sulfate-reducing, syntrophic bacteria affiliated with Desulfotomaculum cluster I are widely

111

distributed in methanogenic environments. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2080-2091. doi: 10.1128/AEM.72.3.2080-2091.2006

Kelley, D. S., Karson, J. A., Früh-Green, G. L., Yoerger, D. R., Shank, T. M., Butterfield, D.

A., et al. (2005) A serpentinite-hosted ecosystem: the Lost City hydrothermal field. Science 307,

1428-1434. doi: 10.1126/science.1102556

Lane, D. J. (1991). “Nucleic acid techniques in bacterial systematics,” in Nucleic Acid

Techniques in Bacterial Systematics, eds. E. Stackebrandt and M. Goodfellow (Hoboken, NJ:

Wiley), 115–175.

Lang, S. Q., Butterfield, D. A., Schulte, M., Kelley, D. S., and Lilley, M. D. (2010) Elevated concentrations of formate, acetate and dissolved organic carbon found at the Lost City hydrothermal field. Geochim. Cosmochim. Acta. 74, 941-952. doi: 10.1016/j.gca.2009.10.045

Liu, J. F., Sun, X. B., Yang, G. C., Mbadinga, S. M., Gu, J. D., and Mu, B. Z. (2015) Analysis of microbial communities in the oil reservoir subjected to CO2-flooding by using functional genes as molecular biomarkers for microbial CO2 sequestration. Front. Microbiol. 6:236. doi: 10.3389/fmicb.2015.00236

Lubitz, W., Ogata, H., Rudiger,̈ O., and Reijerse, E. (2014) Hydrogenases. Chem. Rev. 114,

4081-4148. doi: 10.1021/cr4005814

Lüdemann, H., Arth, I., and Liesack, W. (2000) Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores. Appl. Environ. Microbiol.

66, 754-762. doi: 10.1128/AEM.66.2.754-762.2000

Mei, N., Zergane, N., Postec, A., Erauso, G., Ollier, A., Payri, C., et al. (2014) Fermentative hydrogen production by a new alkaliphilic Clostridium sp. (strain PROH2) isolated from a shallow submarine hydrothermal chimney in Prony Bay, New Caledonia. Int. J. Hydrogen

Energy 39, 19465-19473. doi: 10.1016/j.ijhydene.2014.09.111

112

Meyer, B., Kuehl, J., Deutschbauer A. M., Price, M. N., Arkin, A. P., and Stahl, D. A. (2013)

Variation among Desulfovibrio species in electron transfer systems used for syntrophic growth.

J. Bacteriol. 195, 990-1004. doi: 10.1128/JB.01959-12

Meyer, F., Paarmann, D., D'Souza, M., Olson, R., Glass, E. M., Kubal, M., et al. (2008) The metagenomics RAST server–a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics 9:386. doi: 10.1186/1471-2105-9-386

Miller, H. M., Matter, J. M., Kelemen, P., Ellison, E. T., Conrad, M. E., Fierer, N., et al. (2016).

Modern water/rock reactions in Oman hyperalkaline peridotite aquifers and implications for microbial habitability. Geochim. Cosmochim. Acta, 179, 217-241. doi:10.1016/j.gca.2016.01.033

Monnin, C., Chavagnac, V., Boulart, C., Ménez, B., Gérard, M., Gérard, E., et al. (2014) Fluid chemistry of the low temperature hyperalkaline hydrothermal system of the Prony Bay (New

Caledonia). Biogeosciences 11, 5687-5706. doi: 10.5194/bg-11-5687-2014

Pasini, V., Brunelli, D., Dumas, P., Sandt, C., Frederick, J., Benzerara, K., et al. (2013). Low temperature hydrothermal oil and associated biological precursors in serpentinites from Mid-

Ocean Ridge. Lithos, 178, 84-95. doi:10.1016/j.lithos.2013.06.014

Peters, J. W., Schut, G. J., Boyd, E. S., Mulder, D. W., Shepard, E. M., Broderick, J. B.,et al..

(2015). [FeFe]-and [NiFe]-hydrogenase diversity, mechanism, and maturation. Biochim.

Biophys. Acta-Mol. Cell Res., 1853(6), 1350-1369. doi:10.1016/j.bbamcr.2014.11.021

Pisapia, C., Gérard, E., Gérard, M., Erauso, G., Postec, A., Quéméneur, M., et al. Mineralizing filamentous bacteria from the Prony bay Hydrothermal Field open new perspectives for serpentinization-based deep ecosystems. Front. Microbiol. Submitted.

Postec, A., Quéméneur, M., Bes, M., Mei, N., Aissa, F. B., Payri, C., et al. (2015) Microbial diversity in a submarine carbonate edifice from the serpentinizing hydrothermal system of the

113

Prony Bay (New Caledonia) over a 6-year period. Front. Microbiol. 6:857. doi: 10.3389/fmicb.2015.00857

Poudel, S., Tokmina-Lukaszewska, M., Colman, D. R., Refai, M., Schut, G. J., King, P. W., et al. (2016). Unification of [FeFe]-hydrogenases into Three Structural and Functional Groups.

Biochim. Biophys. Acta.-Gen. Subjects. doi:10.1016/j.bbagen.2016.05.034

Quéméneur, M., Bes, M., Postec, A., Mei, N., Hamelin, J., Monnin, C., et al. (2014) Spatial distribution of microbial communities in the shallow submarine alkaline hydrothermal field of the Prony Bay, New Caledonia. Environ. Microbiol. Rep. 6, 665-674. doi: 10.1111/1758-

2229.12184

Quéméneur, M., Hamelin, J., Latrille, E., Steyer, J.-P., and Trably, E. (2010) Development and application of a functional CE-SSCP fingerprinting method based on [Fe-Fe]-hydrogenase genes for monitoring hydrogen producing Clostridium in mixed cultures. Int. J. Hydrogen

Energy 35, 13158-13167. doi:10.1016/j.ijhydene.2010.07.076

Quéméneur, M., Hamelin, J., Latrille, E., Steyer, J.-P., and Trably, E. (2011) Functional versus phylogenetic fingerprint analyses for monitoring hydrogen-producing bacterial populations in dark fermentation cultures. Int. J. Hydrogen Energy 36, 3870-3879. doi:10.1016/j.ijhydene.2010.12.100

Quéméneur, M., Palvadeau, A., Postec, A., Monnin, C., Chavagnac, V., Ollivier, B., et al. (2015)

Endolithic microbial communities in carbonate precipitates from serpentinite-hosted hyperalkaline springs of the Voltri massif (Ligurian Alps, Northern Italy). Environ. Sci. Pollut.

R. 22, 13613-13624. doi:10.1007/s11356-015-4113-7

Schmidt, O., Drake, H. L., and Horn, M. A. (2010) Hitherto unknown [Fe-Fe]-hydrogenase gene diversity in anaerobes and anoxic enrichments from a moderately acidic fen. Appl. Environ.

Microbiol. 76, 2027-2031. doi: 10.1128/AEM.02895-09

114

Schrenk, M. O., Brazelton, W. J., and Lang, S. Q. (2013) Serpentinization, carbon, and deep life. Rev. Mineral. Geochem. 75, 575-606. doi: 10.2138/rmg.2013.75.18

Schut, G. J., and Adams, M.W. (2009) The iron-hydrogenase of Thermotoga maritime utilizes ferredoxin and NADH synergistically: a new perspective on anaerobic hydrogen production. J.

Bacteriol. 191:4451–4457. doi:10.1128/JB.01582-08

Shannon, C. E. (1948) A mathematical theory of communication. AT&T Tech. J. 27, 623–656.

Shannon, C. E., and Weaver, W. (1949) The mathematical theory of communication. Urbana,

IL, USA: University of Illinois Press.Simpson, E. H. (1949) Measurement of diversity. Nature

163, 688-688.

Sorokin, D. Y., Tourova, T. P., Mussmann, M., and Muyzer, G. (2008) Dethiobacter alkaliphilus gen. nov. sp. nov., and Desulfurivibrio alkaliphilus gen. nov. sp. nov.: two novel representatives of reductive sulfur cycle from soda lakes. Extremophiles 12, 431-439. doi: 10.

1007/s00792-008-0148-8

Suzuki, S., Kuenen, J. G., Schipper, K., van der Velde, S., Ishii, S. I., Wu, A., et al. (2014)

Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing

Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site. Nat. Commun. 5, 3900. doi:

10.1038/ncomms4900

Suzuki, S., Ishii, S., Wu, A., Cheung, A., Tenney, A., Wanger, G., et al. (2013) Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem.

P. Natl. Acad. Sci. 110, 15336-15341. doi: 10.1073/pnas.1302426110

Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., and Kumar, S. (2013) MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30, 2725-2729. doi: 10.1093/molbev/mst197

Thauer, R. K., Jungermann, K., and Decker, K. (1977). Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria. Bacteriol. Rev., 41(1), 100.

115

Tiago, I., and Veríssimo, A. (2013) Microbial and functional diversity of a subterrestrial high pH groundwater associated to serpentinization. Environ. Microbiol. 15, 1687–1706. doi:

10.1111/1462-2920.12034

Tringe, S. G., Von Mering, C., Kobayashi, A., Salamov, A. A., Chen, K., Chang, H. W., et al.

(2005) Comparative metagenomics of microbial communities. Science 308, 554-557. doi:

10.1126/science.1107851

Vignais, P. M., Billoud, B., and Meyer, J. (2001) Classification and phylogeny of hydrogenases.

FEMS Microbiol. Rev. 25, 455-501. doi: 10.1111/j.1574-6976.2001.tb00587.x

Vignais, P. M., and Billoud, B. (2007) Occurrence, classification and biological function of hydrogenases: An overview. Chem. Rev. 107, 4206-4272. doi: 10.1021/cr050196r

Vignais, P. M., and Colbeau, A. (2004) Molecular biology of microbial hydrogenases. Curr.

Issues Mol. Biol. 6, 159-188.

Wang, J., and Wan, W. (2009) Factors influencing fermentative hydrogen production: a review.

Int. J. Hydrogen Energy 34, 799-811. doi:10.1016/j.ijhydene.2008.11.015

Wang, S., Huang, H., Kahnt, J., Thauer, R. K. (2013). A reversible electron-bifurcating ferredoxin-and NAD-dependent [FeFe]-hydrogenase (HydABC) in Moorella thermoacetica. J.

Bacteriology, 195(6), 1267-1275. doi:10.1128/JB.02158-12

Xiao, B., and Liu J. (2006) pH dependency of hydrogen fermentation from alkali-pretreated sludge. Chin. Sci. Bull. 51, 399-404. doi: 10.1007/s11434-006-0399-7

Xing, D. F., Ren, N. Q., and Rittmann, B. E. (2008) Genetic diversity of hydrogen-producing bacteria in an acidophilic ethanol-H2-coproducing system, analyzed using the Fe-hydrogenase gene. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1232-1239. doi: 10.1128/AEM.01946-07

116

Table 1. Phylogenetic affiliation of the dominant bacterial OTUs obtained from 16S rRNA pyrosequencing analyses of Prony Hydrothermal Field (PHF) sites: 'Bain des Japonais' (BdJ), 'Rivière des Kaoris' (RK) and 'Aiguille de Prony' (ST07).

Accession Sequences per samples (%) Closest relatives retrieved from NCBI nucleotide database OTU IDs Taxonomy (Phylum ; Order) number BdJC BdJF RKC RKF ST07 Bacterial strain (Genbank accession number) % Identity Clone (Genbank accession number) % Identity 254218 KT344973 - 0.16 - - 1.60 Actinobacteria; OPB41 Olsenella profusa (NR_116938) 88 clone dr84 (AY540822) 98 OTU332 KT344941 - 20.63 - 0.30 - Bacteroidetes; Bacteroidales Natranoflexus pectinivorans AP1 (NR_108635) 84 clone B257829_L43 (KP097103) 1 98 OTU161 KT344980 - 0.16 - - 2.38 Chloroflexi; Dehalococcoidetes Chloroflexi SCGC AAA240-B13 (HQ675545) 85 clone PHF_13-B5_J02 (KJ149246) 2 96 4347492 KT344946 - - 18.05 - - Cyanobacteria; Gloeobacterales Synechococcus sp. AECC1343 (EU729046) 97 clone PMB-63 (AB757744) 97 214987 KT344943 - - 1.64 - - Cyanobacteria; Pseudanabaenales Pseudanabaena sp. 1a-03 1a-03 (FR798944) 88 clone Flu2_7 (JF413310) 97 243177 KT344971 - 0.38 - - 3.44 Deinococcus-Thermus; Deinococcales Truepera radiovictrix RQ-24 (NR_074381) 89 clone St09-1-17 (KR911715) 2 98 130884 KT344969 - 0.18 0.14 - 8.12 Deinococcus-Thermus; Thermales Meiothermus hypogaeus AZM34c11 (NR_113226) 95 clone PHFST07_B5 (KF886174) 2 97 OTU55 KT344982 0.53 1.21 - - 1.25 Firmicutes; Clostridiales Caloranaerobacter azorensis MV1087(NR_028919) 87 clone PHFST07_B9 (KF886154) 2 96 545286 KT344939 - 9.15 - - 6.83 Firmicutes. Clostridiales Clostridium septicum H4 (KM975632) 89 clone PHFST07_B12 (KF886167) 2 96 OTU1056 KT344978 - 0.21 - - 2.61 Firmicutes; Clostridiales Desulfotomaculum sp. ECP-C5 (AF529223) 87 clone PHF_2C-bac-D08 (KJ159198) 2 92 244602 KT344972 - 0.01 - - 2.31 Firmicutes; Clostridiales Dethiobacter alkaliphilus AHT1 (NR_044205) 90 clone HPst091-1-1 (KM207235) 2 98 OTU10 KT344977 - - - - 1.48 Firmicutes; Natranaerobiales Natranaerobius trueperi (NR_116280) 88 clone HPst091-1-1 (KM207235) 2 97 237589 KT344970 - 0.12 - - 1.27 Firmicutes; Thermoanaerobacterales Thermosediminibacter oceani DSM 16646 (NR_074461) 86 clone PHF_2HY7-Ba-G08 (KJ159206) 2 92 OTU1120 KT344940 - 1.94 - - 4.36 Candidate division NPL-UPA2 Pelotomaculum isophthalicicum JI (NR_041320) 84 clone PHFST08_B2 (KF886073) 2 92 815112 KT344976 0.55 0.10 - - 3.34 Alphaproteobacteria; Rhizobiales Methyloceanibacter caenitepidi Gela4 (AP014648) 98 clone 1FSeds_H08 (GQ412793) 98 OTU879 KT344984 0.07 - - - 1.01 Alphaproteobacteria; Rhizobiales Methyloceanibacter caenitepidi Gela4 (AP014648) 96 clone PHF_13-B3_F02 (KJ149247) 2 97 550276 KT344975 - - - - 1.06 Alphaproteobacteria; Rhizobiales Hyphomicrobium sp. Ellin112 (AF408954) 95 clone GM-BSS-cloneDB12 (AB453748) 97 745987 KT344935 59.83 0.19 - - 0.28 Alphaproteobacteria; Rhodobacterales Rhodobaca bogoriensis SLB (EU908048) 98 clone HL7711_P4E7 (KJ004401) 98 OTU431 KT344936 1.60 0.01 - - - Alphaproteobacteria; Rhodobacterales Rhodobaca bogoriensis SLB (EU908048) 97 clone HL7711_P4E7 (KJ004401) 97 OTU890 KT344952 - - 8.56 - - Alphaproteobacteria; Rhodospirillales Paracraurococcus sp. 1PNM-27 (JQ608332) 95 clone B1203_GOR34 (KP097454) 1 96 1082059 KT344933 1.79 - 0.39 - - Alphaproteobacteria; Sphingomonadales Erythrobacter sp. A5(1) (KP265725) 98 clone MAY3C10 (KF179645) 98 838837 KT344950 - - 5.10 0.06 - Betaproteobacteria; Burkholderiales Hydrogenophaga sp. Chr-40 (JQ863382) 98 clone B93726_L43 (KP097382) 1 99 796555 KT344949 0.48 0.01 5.64 - - Betaproteobacteria; Burkholderiales Hydrogenophaga sp. TR7-01(AB166886) 98 clone B3025389_L43 (KP097124) 1 99 3025389 KT344945 0.34 0.01 3.75 - 0.02 Betaproteobacteria; Burkholderiales Hydrogenophaga sp. TR7-01(AB166886) 98 clone B3025389_L43 (KP097124) 1 99 647775 KT344934 1.79 0.18 32.73 15.53 0.87 Betaproteobacteria; Burkholderiales Hydrogenophaga sp. TR7-01(AB166886) 98 clone B3025389_L43 (KP097124) 1 99 261198 KT344944 0.02 - 2.40 0.89 - Betaproteobacteria; Burkholderiales Hydrogenophaga sp. Chr-40 (JQ863382) 98 clone B93726_L43 (KP097382) 1 99 4430221 KT344947 0.02 - 1.13 0.08 - Betaproteobacteria; Burkholderiales Hydrogenophaga sp. TR7-01(AB166886) 98 clone B3025389_L43 (KP097124) 1 98 572939 KT344957 - - 0.02 4.99 0.42 Betaproteobacteria; Burkholderiales Hydrogenophaga sp. Chr-40 (JQ863382) 93 clone B93726_L43 (KP097382) 1 99 546165 KT344974 0.05 0.01 0.92 0.47 1.11 Betaproteobacteria; Burkholderiales Hydrogenophaga sp. TR7-01(AB166886) 98 clone B3025389_L43 (KP097124) 1 99 OTU300 KT344981 - - 0.31 0.55 2.94 Betaproteobacteria; Burkholderiales ‘Serpentinomonas’ sp. B1 (AP014569) 98 clone B572939_L43 (KP097286) 1 99 OTU1176 KT344951 0.02 - 1.15 - - Betaproteobacteria; Burkholderiales Hydrogenophaga sp. TR7-01 (AB166886) 91 clone B3025389_L43 (KP097124) 1 98 OTU760 KT344983 - - - - 16.65 Deltaproteobacteria; Desulfobacterales Desulfurivibrio alkaliphilus AHT2 (NR_074971) 93 clone PHFST07_B11 (KF886157) 2 92 1126915 KT344937 - 7.44 - - 3.01 Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales Desulfonatronum cooperativum Z-7999 (NR_043143) 98 clone PHFBdJ_B8 (KF886124) 2 92 129416 KT344938 - 12.81 - - 1.18 Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales Desulfonatronum cooperativum Z-7999 (NR_043143) 97 clone PHFST07_B3 (KF886171) 2 92 OTU370 KT344942 0.02 36.55 - - 2.24 Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales Desulfonatronum cooperativum Z-7999 (NR_043143) 98 clone PHFBdJ_B8 (KF886124) 2 92 823476 KT344962 - - - 3.63 - Gammaproteobacteria; Alteromonadales Alteromonas sp. DSSK2-12 (KR094792) 92 clone 12S_128 (KP183024) 92 899488 KT344964 - - - 2.97 - Gammaproteobacteria; Alteromonadales Alteromonas sp. DSSK2-12 (KR094792) 92 clone 12S_128 (KP183024) 92 OTU159 KT344979 - - - - 1.46 Gammaproteobacteria; Methylococcales Methylomonas sp. R-49799 (HG970730) 92 clone B94840_L43 (KP097385) 1 96 939892 KT344965 - - - 1.14 - Gammaproteobacteria; Oceanospirillales Halomonas boliviensis TB-129 (KF817741) 91 clone K_87 (KF783323) 95 439982 KT344955 - - - 1.39 - Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Acinetobacter sp. CIP 102637 (JQ638581) 92 clone K323G02 (GU256408) 97 710275 KT344959 - - - 1.16 - Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Acinetobacter ursingii NBRC 110605 (LC014147) 92 clone K323G02 (GU256408) 97 OTU476 KT344968 - - - 1.66 - Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Acinetobacter baumannii GRI-SD-LC1 (KR132555) 93 clone K323G02 (GU256408) 98 405425 KT344954 - - - - - Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Acinetobacter sp. 140D (KM021154) 92 clone K323G02 (GU256408) 96 543942 KT344956 - - - 4.96 - Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Acinetobacter sp. 140D (KM021154) 92 clone K323G02 (GU256408) 96 573124 KT344958 - - - 4.08 - Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Acinetobacter sp. 140D (KM021154) 92 clone K323G02 (GU256408) 96 OTU106 KT344967 - - - 6.04 - Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Acinetobacter johnsonii 2P2D5 (HF937031) 92 clone K323G02 (GU256408) 96 1107335 KT344953 - - - 6.18 - Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Acinetobacter calcoaceticus SYJ1-3 (KR262850) 92 clone K323G02 (GU256408) 97 780555 KT344960 0.07 0.09 - 1.91 0.26 Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Pseudomonas sp. SRP1497 (KP452755) 91 clone B4316720_L43 (KP097170) 1 99 829851 KT344963 0.69 0.07 0.02 13.28 0.05 Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Pseudomonas sp. SRP1497 (KP452755) 91 clone B4316720_L43 (KP097170) 1 99 818602 KT344961 0.32 0.04 - 3.74 0.05 Gammaproteobacteria; Pseudomonadales Pseudomonas sp. SRP1497 (KP452755) 91 clone B4316720_L43 (KP097170) 1 99 578490 KT344948 0.30 - 4.21 1.14 - Gammaproteobacteria; Xanthomonadales Silanimonas sp. JK13 (KF206369) 92 clone B578490_L43 (KP097289) 1 99 967275 KT344966 - - - 2.00 - Gammaproteobacteria; Xanthomonadales Strain SCGC AAA044-J23 (HQ663492) 92 clone Mineral.top.6.4_426600 (LN540678) 92 1 Environmental sequences obtained in a previous study from serpentinite-hosted sources of Voltri Massif (Italy) (Quéméneur et al., 2015) 2 Environmental sequences obtained in previous studies of the Prony Hydrothermal field (New Caledonia) (Postec et al., 2015; Quéméneur et al., 2014)

117

Table S1. Putative taxonomic affiliation of HydA sequences obtained from Prony metagenome P27.

Highly similar sequence retrieved from Genbank OTU MG-RAST ID Taxonomy (Phylum ; Class ; Order) % similarity (Genbank accession number) Species - clone P27_hydA14 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2107:8059:82633:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.5 (YP_008699055) hydrogenase, Fe-only [Clostridium autoethanogenum DSM 10061] P27_hydA114 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1109:13172:94760:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 68.2 (WP_023062885) hydrogenase, Fe-only [Clostridium thermocellum] P27_hydA1 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1311:20647:55845:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 48.1 (WP_023062885) hydrogenase, Fe-only [Clostridium thermocellum] P27_hydA7 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2315:12483:17223:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 77.4 (WP_023062885) hydrogenase, Fe-only [Clostridium thermocellum] P27_hydA136 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2306:7045:37162:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 49.7 (GAE89903) hydrogenase [Clostridium straminisolvens JCM 21531] P27_hydA45 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2308:14654:24288:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 65.9 (GAE89903) hydrogenase [Clostridium straminisolvens JCM 21531] P27_hydA129 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2306:11382:44214:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 72.4 (YP_005047780) hydrogenase, Fe-only [Clostridium clariflavum DSM 19732] P27_hydA13 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2102:8481:71964:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.1 (YP_008699055) hydrogenase, Fe-only [Clostridium autoethanogenum DSM 10061] P27_hydA84 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1106:2370:35020:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 76.3 (WP_022116126) hydrogenase Fe-only [Clostridium sp. CAG:169] P27_hydA85 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2305:8704:48944:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 85.1 (YP_001036861) hydrogenase, Fe-only [Clostridium thermocellum ATCC 27405] P27_hydA48 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1108:1705:91727:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 78.6 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA5 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1314:8272:100789:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 80.9 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA106 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2306:18633:67353:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 71.6 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA101 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2314:5473:6798:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 48.5 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P27_hydA24 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2314:9285:21359:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.0 (YP_004545921) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P27_hydA27 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1305:16629:82167:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 77.8 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA107 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1114:19745:58907:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 77.4 (YP_001113007) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P27_hydA11 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2116:12176:59324:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 77.8 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA111 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2106:3631:63778:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 79.0 (WP_008410064) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P27_hydA134 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1303:11680:47793:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 97.1 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA135 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2316:14697:15311:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 94.0 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA123 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2302:3021:14439:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 81.6 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA19 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1309:20698:19893:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 91.0 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA51 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2110:4908:93477:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 95.0 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P27_hydA90 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2308:4104:27466:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.5 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P27_hydA91 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2301:6794:9875:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 95.0 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P27_hydA92 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2312:14796:69310:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 95.9 (YP_004545921) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P27_hydA68 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1115:15760:55593:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 66.6 (YP_004969732) hydrogenase, Fe-only [Desulfosporosinus orientis DSM 765] P27_hydA93 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2316:7439:59410:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 84.3 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA96 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2302:9663:61279:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 68.2 (WP_008410064) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P27_hydA59 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1307:7139:36512:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.5 (YP_007946226) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P27_hydA37 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1311:12003:89454:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.9 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P27_hydA38 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2313:17826:33583:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.9 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA128 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1303:17006:29935:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 93.0 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P27_hydA130 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2115:12121:70737:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 84.0 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA131 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2110:11779:25039:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.9 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P27_hydA79 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1315:7322:7202:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 63.2 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA8 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2109:10707:54209:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 93.6 (YP_004518238) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA97 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1309:12380:17569:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 72.0 (YP_004496996) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P27_hydA61 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2304:9197:41505:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 85.9 (YP_004497002) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P27_hydA63 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1106:12199:34111:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 91.0 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P27_hydA64 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2303:2598:25384:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 92.0 (YP_004545921) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P27_hydA72 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1302:19141:50190:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 65.1 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P27_hydA43 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2314:1930:100125:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 73.6 (WP_022271995) hydrogenase Fe-only [Eubacterium siraeum CAG:80] P27_hydA125 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2314:16699:37745:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 79.3 (YP_077035) Fe hydrogenase [Symbiobacterium thermophilum IAM 14863] P27_hydA126 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2310:17631:29511:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 49.7 (YP_003640841) hydrogenase, Fe-only [Thermincola potens JR] P27_hydA47 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1313:3186:85130:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 71.2 (YP_003640841) hydrogenase, Fe-only [Thermincola potens JR] P27_hydA75 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2314:7403:99385:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 67.0 (WP_021908252) hydrogenase Fe-only [Eubacterium sp. CAG:146] P27_hydA53 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2304:9596:32957:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 98.1 (YP_006910651) [Fe] hydrogenase, large subunit HymC [Dehalobacter sp. DCA] P27_hydA56 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2307:5017:82140:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.1 (YP_003640841) hydrogenase, Fe-only [Thermincola potens JR] P27_hydA78 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2308:19195:51114:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 59.3 (YP_003826883) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase iron-iron [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P27_hydA52 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1313:15591:68584:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 76.6 (YP_003239720) hydrogenase, Fe-only [Ammonifex degensii KC4] P27_hydA31 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1101:20130:2900:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 78.6 ( ACA51661) HydA [Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485] P27_hydA117 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2316:6701:34903:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 98.6 (YP_007298421) hydrogenase, Fe-only [Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M0795] P27_hydA121 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2315:6287:77241:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 97.8 (YP_007298421) hydrogenase, Fe-only [Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M0795] P27_hydA4 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2315:14097:33168:ACACGA Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 87.0 (GAF24846) iron only hydrogenase large subunit, C-terminal [Moorella thermoacetica Y72]

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P27_hydA35 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2308:15765:97985:ACACGA Thermotogae; Thermotogae; Thermotogales 96.3 (YP_005096723) hydrogenase, Fe-only [Marinitoga piezophila KA3] P27_hydA18 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2313:17713:85556:ACACGA Thermotogae; Thermotogae; Thermotogales 83.2 (YP_005470551) hydrogenase, Fe-only [Fervidobacterium pennivorans DSM 9078] P27_hydA23 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1114:2287:87019:ACACGA Thermotogae; Thermotogae; Thermotogales 82.8 (YP_004659299) hydrogenase large subunit domain-containing protein [Thermotoga thermarum DSM 5069] P27_hydA26 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1107:12202:54331:ACACGA Thermotogae; Thermotogae; Thermotogales 54.3 (YP_002534027) NADP-reducing hydrogenase, subunit D [Thermotoga neapolitana DSM 4359] P27_hydA133 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1311:8497:2283:ACACGA Thermotogae; Thermotogae; Thermotogales 89.0 (YP_005096723) hydrogenase, Fe-only [Marinitoga piezophila KA3] P27_hydA108 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2311:19981:34912:ACACGA Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales 90.1 (YP_844976) hydrogenase, Fe-only [Syntrophobacter fumaroxidans MPOB] P27_hydA70 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2312:3330:10832:ACACGA Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales 97.1 (YP_844976) hydrogenase, Fe-only [Syntrophobacter fumaroxidans MPOB] P27_hydA103 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2309:13748:77439:ACACGA Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 90.1 (YP_002952160) Fe hydrogenase [Desulfovibrio magneticus RS-1] P27_hydA15 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2312:18659:40581:ACACGA Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 84.3 (WP_006921111) hydrogenase, Fe-only, partial [Desulfovibrio magneticus] P27_hydA118 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2101:19990:24288:ACACGA Deltaproteobacteria; Desulfuromonadales 82.0 (YP_004198598) hydrogenase, Fe-only [Geobacter sp. M18] P27_hydA16 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2305:7417:37924:ACACGA Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 87.8 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P27_hydA21 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2315:11400:82351:ACACGA Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 77.8 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P27_hydA74 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1310:5971:76924:ACACGA Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 71.2 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P27_hydA119 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2116:8151:3767:ACACGA Synergistetes; Synergistia; Synergistales 81.3 (YP_003316672) hydrogenase [Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589] P27_hydA104 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2301:7976:40736:ACACGA Synergistetes; Synergistia; Synergistales 78.6 (YP_003316672) hydrogenase [Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589] P27_hydA110 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1313:7546:14195:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 95.0 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P27_hydA124 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2304:6980:81620:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 77.8 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P27_hydA3 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2311:2271:81749:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 87.4 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA32 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2313:10656:87661:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 96.0 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA25 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2314:19579:3636:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 90.5 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA49 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2116:7098:31541:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 71.6 (WP_018525843) hydrogenase Fe-only [Spirochaeta alkalica] P27_hydA46 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2305:18503:27092:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 75.1 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P27_hydA54 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2306:9291:27493:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 75.1 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P27_hydA55 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2308:18720:99679:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 90.9 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA71 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2308:7319:15774:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 85.9 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA73 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1107:7828:16538:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 95.9 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA86 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1312:2867:61608:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 70.1 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA87 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2308:16490:49170:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 78.2 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA88 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1116:7681:64020:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 88.6 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA89 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2312:19934:93270:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 87.4 (YP_005061073) hydrogenase, Fe-only [Sphaerochaeta pleomorpha str. Grapes] P27_hydA9 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2113:4052:37186:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 82.0 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA94 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1313:19524:59750:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 88.6 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P27_hydA95 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2315:16166:74536:ACACGA Spirochaetes; Spirochaetia; Spirochaetales 81.3 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P27_hydA12 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2306:15468:39944:ACACGA Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 81.3 (AGY54346) Iron hydrogenase 1 [Bacteroidales bacterium CF] P27_hydA57 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1307:6493:50547:ACACGA Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 72.4 (WP_010803103) [FeFe] hydrogenase, group A [Parabacteroides] P27_hydA120 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2312:6660:84593:ACACGA Paddy field soil, Japan 79.0 (BAM65990) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA10 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1306:1891:68256:ACACGA Paddy field soil, Japan 99.4 (BAM66117) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA100 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1313:6957:74344:ACACGA Paddy field soil, Japan 94.7 (BAM65873) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA102 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2308:10616:100738:ACACGA Paddy field soil, Japan 77.4 (BAM65979) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA82 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2309:13108:22639:ACACGA Paddy field soil, Japan 82.8 (BAM65975) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA83 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1113:15517:30091:ACACGA Paddy field soil, Japan 82.8 (BAM66175) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA80 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2115:2278:49486:ACACGA Paddy field soil, Japan 79.0 (BAM66042) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA76 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2309:7462:55567:ACACGA Paddy field soil, Japan 94.0 (BAM66088) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA58 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2302:12090:96382:ACACGA Paddy field soil, Japan 82.4 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA62 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2313:1840:13283:ACACGA Paddy field soil, Japan 90.1 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA40 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2305:19590:12472:ACACGA Paddy field soil, Japan 82.0 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA41 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2311:18282:13431:ACACGA Paddy field soil, Japan 80.1 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA29 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2108:7635:75958:ACACGA Paddy field soil, Japan 99.4 (BAM66039) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA22 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1116:13594:62969:ACACGA Paddy field soil, Japan 81.3 (BAM66042) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA20 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2316:13431:6449:ACACGA Paddy field soil, Japan 70.9 (BAM65871) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA127 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1111:13539:41334:ACACGA Paddy field soil, Japan 62.0 (BAM66154) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P27_hydA81 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2314:16120:39436:ACACGA Saline microbial mat community, Mexico 98.2 (ACM67558) iron-dependent hydrogenase [uncultured organism] clone="hydA_2 P27_hydA81 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2314:16120:39436:ACACGA Yellowstone Geothermal Ecosystem, USA 96.3 (ADC53604) [FeFe]-hydrogenase, [uncultured bacterium] clone E4_24 P27_hydA116 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2304:16632:31364:ACACGA Oil fields suBdJected to CO2 and water-flooding 77.4 (AGU38562) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] clone="FeFe-Hyd_W4-27 P27_hydA65 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2113:3477:30709:ACACGA Saline microbial mat community, Mexico 97.1 (ACM67583) iron-dependent hydrogenase [uncultured organism] clone="hydA_60 P27_hydA17 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:2302:13048:20570:ACACGA Water of high temperature petroleum reservoir 85.5 (AGU38562) [FeFe]-hydrogenase, production water of high temperature petroleum reservoir P27_hydA33 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:3:1114:20033:69531:ACACGA Yellowstone Geothermal Ecosystem, USA 93.2 (ADC53598) [FeFe]-hydrogenase, [uncultured bacterium]

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Table S2. Putative taxonomic affiliation of HydA sequences obtained from Prony metagenome P28.

Highly similar sequence retrieved from Genbank OTU MG-RAST ID Taxonomy (Phylum ; Class ; Order) % similarity (Genbank accession number) Species - clone P28_hydA157 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2305:8886:3411:GGATGT Bacteroidetes; Ignavibacteriae; Ignavibacteria 85.9 (YP_006526890) Fe-only hydrogenase, catalytic subunit alpha [Melioribacter roseus P3M-2] P28_hydA192 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1111:17909:53680:GGATGT Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 84.3 (WP_010803103) [FeFe] hydrogenase, group A [Parabacteroides] P28_hydA236 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2302:10344:19825:GGATGT Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 75.9 (WP_010803103) [FeFe] hydrogenase, group A [Parabacteroides] P28_hydA276 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1113:8675:13552:GGATGT Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 89.0 (WP_021928742) hydrogenase Fe-only [Alistipes sp. CAG:831] P28_hydA342 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2107:20273:48824:GGATGT Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 81.6 (WP_021928742) hydrogenase Fe-only [Alistipes sp. CAG:831] P28_hydA35 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2114:10078:90816:GGATGT Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 73.6 (WP_021928742) hydrogenase Fe-only [Alistipes sp. CAG:831] P28_hydA357 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1313:16042:29537:GGATGT Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 63.9 (WP_021928742) hydrogenase Fe-only [Alistipes sp. CAG:831] P28_hydA445 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2114:14460:89265:GGATGT Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 86.7 (WP_021928742) hydrogenase Fe-only [Alistipes sp. CAG:831] P28_hydA96 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1302:11799:41654:GGATGT Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales 70.9 (WP_021928742) hydrogenase Fe-only [Alistipes sp. CAG:831] P28_hydA282 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1306:12764:45449:GGATGT Dictyoglomi; Dictyoglomales 79.3 (YP_002352464) hydrogenase [Dictyoglomus turgidum DSM 6724] P28_hydA20 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2309:18606:31980:GGATGT Eukaryota; Viridiplantae; Chlorophyta 75.1 (XP_001693376) Fe hydrogenase [Chlamydomonas reinhardtii] P28_hydA344 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2116:2593:55563:GGATGT Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales 66.6 (WP_010746116) [FeFe] hydrogenase, group A [Enterococcus raffinosus] P28_hydA261 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:14293:75233:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 62.4 (WP_004629896) hydrogenase, Fe-only [RuminiClostridium] P28_hydA268 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1113:11668:83184:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 91.0 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA171 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1109:1871:50152:GGATGT Firmicutes 63.5 (WP_021856760) hydrogenase Fe only [Firmicutes bacterium CAG:555] P28_hydA27 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1114:17042:69653:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 91.3 (YP_001111834) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA269 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2106:11983:14451:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 70.9 (WP_018660435) Periplasmic [Fe] hydrogenase large subunit [Thermobrachium celere] P28_hydA271 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1105:3061:43800:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 53.5 (YP_003640841) hydrogenase, Fe-only [Thermincola potens JR] P28_hydA272 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2314:4574:35683:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 70.5 (WP_022278894) hydrogenase Fe-only [Dorea sp. AGR2135] P28_hydA273 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2310:14510:53518:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 83.2 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA277 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:13480:35918:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 67.4 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA278 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2110:3525:23785:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 85.9 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA281 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2107:7774:19512:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.4 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA283 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:11048:87799:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 74.7 (YP_004969732) hydrogenase, Fe-only [Desulfosporosinus orientis DSM 765] P28_hydA287 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1302:16282:18416:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 57.0 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA294 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2316:11710:32579:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 79.3 (WP_008410064) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA297 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1106:18479:88233:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.0 (YP_003640841) hydrogenase, Fe-only [Thermincola potens JR] P28_hydA298 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2310:11693:54229:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.0 (YP_077035) Fe hydrogenase [Symbiobacterium thermophilum IAM 14863] P28_hydA299 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2113:15551:3692:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 63.2 (WP_018660435) Periplasmic [Fe] hydrogenase large subunit [Thermobrachium celere] P28_hydA30 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:3971:69538:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 73.6 (WP_021908252) hydrogenase Fe-only [Eubacterium sp. 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CAG:452] P28_hydA314 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:15661:25130:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.1 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA321 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1314:6888:24210:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 69.3 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA323 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2311:18724:30480:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 70.9 (YP_004496996) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA324 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:14667:21673:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 84.7 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P28_hydA325 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:7933:6640:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 89.4 (WP_021944433) hydrogenase Fe-only [Clostridium sp. CAG:264] P28_hydA329 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2306:5267:3583:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 68.9 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA330 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:10790:47267:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 98.0 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA333 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2304:19319:89346:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.9 (WP_023062885) hydrogenase, Fe-only [Clostridium thermocellum] P28_hydA334 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2309:8979:10824:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 72.8 (WP_002575948) [FeFe] hydrogenase, group A [LachnoClostridium] P28_hydA338 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1111:11445:80970:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 78.6 (WP_023055471) [FeFe] hydrogenase, group A [Peptoniphilus sp. BV3C26] P28_hydA339 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1313:16269:20520:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 66.2 (WP_021631077) putative ferredoxin hydrogenase HydA1 [Clostridium sp. ATCC BAA-442] P28_hydA340 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1313:20645:57963:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 84.3 (WP_008410064) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA348 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:18829:65204:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 99.8 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA352 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2312:20149:17973:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 58.2 (YP_001717478) hydrogenase, Fe-only [Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C] P28_hydA355 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:1063:76207:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 92.0 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA358 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2313:12476:75649:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.5 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA362 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2104:11024:30939:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 91.3 (YP_004545925) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P28_hydA364 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2312:11597:12789:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 79.0 (YP_004092838) hydrogenase, Fe-only [Ethanoligenens harbinense YUAN-3] P28_hydA365 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2308:6036:12495:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 80.1 (YP_001113007) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1]

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P28_hydA366 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2311:7920:97575:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 69.3 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA367 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2314:15145:33230:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 88.2 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA368 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:15313:70001:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 88.6 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA369 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1106:17580:24317:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.5 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA370 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2116:20310:44187:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 94.7 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA375 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2107:16775:45547:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 78.2 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA378 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1313:18604:67031:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 54.7 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA379 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2310:9758:40457:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 72.4 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA38 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1310:3830:87646:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.5 (YP_004496996) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA382 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1110:6113:88488:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 86.7 (YP_007946226) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P28_hydA390 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:16851:39485:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 84.0 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA392 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2105:4564:41998:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 91.0 (YP_001717478) hydrogenase, Fe-only [Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C] P28_hydA394 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:9862:93498:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 94.4 (YP_007946226) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P28_hydA395 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1315:19794:29264:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 72.4 (YP_004497002) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA399 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2314:6545:58167:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 67.8 (YP_001036861) hydrogenase, Fe-only [Clostridium thermocellum ATCC 27405] P28_hydA4 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:7759:53542:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 91.3 (YP_001111834) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA40 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1306:1645:61729:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 87.8 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA400 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1309:6420:91463:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.8 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA404 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2102:9403:88261:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 61.2 (YP_004518238) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA405 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2112:4472:70529:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 66.6 (WP_023055471) [FeFe] hydrogenase, group A [Peptoniphilus sp. BV3C26] P28_hydA406 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2105:5939:33002:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 92.4 (YP_001113007) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA408 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2314:12785:56856:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 73.9 (YP_004496996) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA41 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1115:4212:75038:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 80.5 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA413 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1315:19383:15464:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 86.7 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA42 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:12690:67984:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 74.7 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA423 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2302:5669:10810:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 83.2 (WP_021908252) hydrogenase Fe-only [Eubacterium sp. CAG:146] P28_hydA427 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2304:15003:48833:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 98.6 (YP_001716352) hydrogenase, Fe-only [Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C] P28_hydA429 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2110:8435:29603:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 78.6 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA43 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1106:16600:90499:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 81.6 (YP_007946226) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P28_hydA432 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1113:6864:54911:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 79.3 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA435 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2308:11447:88223:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 52.4 (YP_005045889) hydrogenase, Fe-only [Clostridium clariflavum DSM 19732] P28_hydA437 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2316:19962:48015:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 69.3 (YP_004545925) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P28_hydA442 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1301:9253:62978:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 77.4 (YP_001113007) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA449 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1314:2209:70843:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.5 (YP_007946226) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P28_hydA450 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1309:2955:95343:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 73.2 (YP_002506620) hydrogenase, Fe-only [Clostridium cellulolyticum H10] P28_hydA453 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2301:13500:63367:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 65.1 (WP_008373638) hydrogenase [Coprococcus comes] P28_hydA454 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1310:12419:73074:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.8 (YP_007946226) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P28_hydA459 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1314:17708:39938:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 80.9 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA46 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1101:16067:94997:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 92.4 (WP_008410064) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA461 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2306:11974:33002:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 87.8 (YP_004545921) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P28_hydA462 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1315:2857:77555:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 72.0 (YP_008699055) hydrogenase, Fe-only [Clostridium autoethanogenum DSM 10061] P28_hydA463 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:17068:70952:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 53.9 (WP_010244148) hydrogenase [Acetivibrio cellulolyticus] P28_hydA464 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2308:9561:5891:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 74.3 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA465 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2303:8752:77532:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 93.2 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P28_hydA467 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2108:12294:80384:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.5 (YP_077035) iron hydrogenase [Symbiobacterium thermophilum IAM 14863] P28_hydA468 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1309:18520:11621:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 98.2 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA471 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:8193:42336:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 99.0 (YP_001716352) hydrogenase, Fe-only [Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C] P28_hydA5 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2313:8363:60911:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 83.2 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA50 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1113:11592:79933:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.0 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA51 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2316:12094:16372:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 74.7 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA56 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1116:9777:2323:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.5 (WP_022071136) hydrogenase Fe-only [Clostridium bartlettii CAG:1329] P28_hydA66 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2106:4911:95193:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 81.3 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA69 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2304:12327:89856:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.8 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA73 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2303:6298:51820:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 61.2 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA75 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1102:16085:5082:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 70.5 (YP_003640841) hydrogenase, Fe-only [Thermincola potens JR] P28_hydA76 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1113:5070:77194:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 80.9 (YP_004498193) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA79 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2110:14682:4653:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.4 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA8 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2105:9592:29920:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 80.5 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA84 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2114:2666:53657:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.5 (YP_008699055) hydrogenase, Fe-only [Clostridium autoethanogenum DSM 10061] P28_hydA85 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:19628:92874:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 77.0 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA86 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:8109:90227:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 83.2 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA88 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:11762:71086:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 50.8 (YP_003640841) hydrogenase, Fe-only [Thermincola potens JR] P28_hydA9 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1116:4572:23493:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 63.5 (YP_004496996) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA91 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1306:14960:38560:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 54.7 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA95 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1301:13034:98797:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 97.0 (YP_001717478) hydrogenase, Fe-only [Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C]

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P28_hydA11 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:11947:31607:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 70.5 (YP_003640841) hydrogenase, Fe-only [Thermincola potens JR] P28_hydA113 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1315:19200:83174:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 97.1 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P28_hydA116 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2306:11088:25324:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 93.6 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA117 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2116:3269:29850:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 89.7 (YP_004545921) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P28_hydA121 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2313:10137:45526:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.8 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA123 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2107:16945:52378:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 91.3 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA124 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1112:15984:85021:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 89.4 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P28_hydA126 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1101:12401:26344:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 93.6 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA127 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2114:18376:91305:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 85.1 (YP_004497002) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA130 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:20908:32283:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 89.0 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA134 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1114:16202:5057:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 69.7 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA137 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2102:3729:17264:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 79.3 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA139 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:11575:34060:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 66.2 (WP_023062885) hydrogenase, Fe-only [Clostridium thermocellum] P28_hydA14 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1304:3003:11855:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 77.0 (YP_004969732) hydrogenase, Fe-only [Desulfosporosinus orientis DSM 765] P28_hydA144 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2316:10303:37616:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.1 (YP_001113007) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA145 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2310:1848:85387:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 78.6 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA146 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2304:4583:85850:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 87.4 (YP_004545921) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P28_hydA147 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2108:19118:60589:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 84.3 (WP_022038410) hydrogenase Fe-only [Ruminococcus gnavus CAG:126] P28_hydA150 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2303:14872:83867:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.4 (YP_001716352) hydrogenase, Fe-only [Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C] P28_hydA152 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1316:19452:70846:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 74.7 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA160 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:19543:12745:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.9 (WP_023055471) [FeFe] hydrogenase, group A [Peptoniphilus sp. BV3C26] P28_hydA162 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:8325:90007:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 85.9 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA165 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1315:17668:96907:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 88.6 (YP_003828850) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA166 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1304:14131:84579:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 76.6 (YP_007946226) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P28_hydA167 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1306:17917:68044:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 57.4 (WP_023062885) hydrogenase, Fe-only [Clostridium thermocellum] P28_hydA168 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1312:6724:38486:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 92.0 (YP_004518238) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA17 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2114:16346:87258:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 77.4 (YP_004545921) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P28_hydA172 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1104:17994:78933:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.8 (WP_022288920) putative uptake hydrogenase subunit HupA [Oscillibacter sp. CAG:155] P28_hydA173 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2316:17949:94326:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 81.6 (WP_007715799) hydrogenase [Clostridium asparagiforme] P28_hydA175 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2316:18562:77270:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 88.2 (YP_004092838) hydrogenase, Fe-only [Ethanoligenens harbinense YUAN-3] P28_hydA178 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:17079:23070:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 94.7 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P28_hydA18 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1116:9957:88271:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 68.6 (YP_001318525) hydrogenase, Fe-only [Alkaliphilus metalliredigens QYMF] P28_hydA188 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1110:10828:80546:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 74.7 (WP_016146995) hypothetical protein [Butyricicoccus pullicaecorum] P28_hydA191 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1315:12108:32506:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 69.3 (WP_021945567) Fe-only hydrogenase catalytic subunit alpha [Clostridium sp. CAG:967] P28_hydA193 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1316:2809:12394:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 74.7 (YP_004545925) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P28_hydA194 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1115:12420:59393:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 90.1 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale] P28_hydA196 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2308:4906:84336:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 86.3 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA2 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:20070:69253:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.4 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA200 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:13328:77971:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 50.1 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA202 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:7452:41914:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 69.7 (WP_023062885) hydrogenase, Fe-only [Clostridium thermocellum] P28_hydA203 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2314:8087:63697:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 86.7 (YP_007946226) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P28_hydA205 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1112:11042:33174:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 79.3 (YP_004545921) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P28_hydA209 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1107:15147:89949:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 62.8 (YP_754500) NADH dehydrogenase I subunit G [Syntrophomonas wolfei subsp. wolfei str. Goettingen G311] P28_hydA211 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:4317:46474:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 98.6 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA214 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1112:2518:55363:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 91.7 (GAE88236) hydrogenase [Clostridium straminisolvens JCM 21531] P28_hydA221 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:6996:51529:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.8 (YP_004496996) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA223 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:20330:21663:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 77.8 (YP_004497002) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA224 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:19537:17191:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 73.9 (WP_004630049) hydrogenase, Fe-only [Clostridium termitidis] P28_hydA225 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:15996:39808:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 79.7 (YP_003189750) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771] P28_hydA226 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1113:13256:62433:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 95.5 (WP_006444067) ferredoxin [Clostridium hylemonae] P28_hydA230 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2310:11723:51125:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 68.6 (YP_003779039) oxidoreductase [Clostridium ljungdahlii DSM 13528] P28_hydA231 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2311:17268:5171:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 58.9 (YP_004496996) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA238 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1112:6714:70609:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 97.0 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA24 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1304:6732:92947:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 84.0 (YP_004497002) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA241 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2101:6362:31381:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 80.1 (YP_004517644) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA242 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2113:6122:96554:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 75.5 (YP_004518295) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115] P28_hydA246 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1315:18621:94191:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 84.3 (YP_007946226) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P28_hydA247 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:2356:26602:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 82.4 (WP_021908252) hydrogenase Fe-only [Eubacterium sp. CAG:146] P28_hydA248 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1105:4287:47028:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 72.4 (YP_001212560) hydrogenase subunit [Pelotomaculum thermopropionicum SI] P28_hydA249 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:14906:83643:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 59.7 (WP_021675481) putative ferredoxin hydrogenase [Peptostreptococcaceae bacterium oral taxon 113] P28_hydA250 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1302:11377:92286:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 93.0 (YP_004545921) hydrogenase Fe-only [Desulfotomaculum ruminis DSM 2154] P28_hydA253 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1102:2651:71684:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 81.6 (YP_007947570) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213] P28_hydA289 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1116:10190:42803:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 47.0 (YP_001113004) hydrogenase [Desulfotomaculum reducens MI-1] P28_hydA102 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:5878:100510:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 83.2 (YP_004498193) hydrogenase, Fe-only [Desulfotomaculum carboxydivorans CO-1-SRB] P28_hydA110 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:4033:21864:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 72.8 (WP_008410059) Iron hydrogenase 1 [Desulfotomaculum hydrothermale]

122

P28_hydA13 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1301:7743:36721:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Clostridiales 67.0 (GAE88236) hydrogenase [Clostridium straminisolvens JCM 21531] P28_hydA240 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1102:10549:18234:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 84.7 (YP_003828850) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA262 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:7479:6204:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 56.6 (YP_003826883) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA280 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2315:18278:80300:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 91.7 (YP_003828451) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA31 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2305:8863:73684:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 75.1 (YP_007316252) hydrogenase, Fe-only [Halobacteroides halobius DSM 5150] P28_hydA313 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1107:5724:58972:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 87.8 (YP_005836915) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase iron-sulfur protein [Halanaerobium praevalens DSM 2228] P28_hydA328 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1103:3193:8355:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 86.3 (YP_003828850) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA336 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1110:16335:17264:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 54.7 (YP_005836913) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Halanaerobium praevalens DSM 2228] P28_hydA353 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1112:11959:67712:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 53.5 (YP_007316252) hydrogenase, Fe-only [Halobacteroides halobius DSM 5150] P28_hydA372 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2107:9997:60658:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 77.4 (YP_003828850) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA419 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1313:15899:71497:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 68.9 (YP_005836915) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase iron-sulfur protein [Halanaerobium praevalens DSM 2228] P28_hydA425 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2103:7854:41623:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 61.2 (YP_005836915) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase iron-sulfur protein [Halanaerobium praevalens DSM 2228] P28_hydA55 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2307:15234:42821:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 69.7 (YP_003826885) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA80 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2305:7709:26197:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 78.6 (YP_003828850) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA143 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1312:17755:31435:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 73.9 (YP_003826883) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA151 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1306:8606:79764:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 65.5 (YP_005836913) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Halanaerobium praevalens DSM 2228] P28_hydA115 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2306:2069:49841:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 63.5 (WP_018249208) NADH dehydrogenase [Orenia marismortui] P28_hydA120 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:6873:11974:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 57.0 (YP_003826883) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA158 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1107:14111:95140:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 53.9 (YP_003826885) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA177 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1114:17220:95674:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales 80.1 (YP_003828850) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501] P28_hydA218 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2116:15353:54799:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 81.6 (YP_430562) Iron hydrogenase, small subunit [Moorella thermoacetica ATCC 39073] P28_hydA259 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1304:15254:15255:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 81.3 (WP_004401666) hydrogenase, Fe-only [Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus] P28_hydA284 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1302:4272:3726:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 84.0 (YP_004461911) hydrogenase, Fe-only [Tepidanaerobacter acetatoxydans Re1] P28_hydA285 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1116:10437:74421:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 73.6 (GAF24846) Fe-only hydrogenase large subunit, C-terminal domain [Moorella thermoacetica Y72] P28_hydA286 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2301:14265:87761:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 67.4 (YP_004461324) hydrogenase, Fe-only [Tepidanaerobacter acetatoxydans Re1] P28_hydA288 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:9442:99025:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 59.3 (YP_003239720) hydrogenase, Fe-only [Ammonifex degensii KC4] P28_hydA300 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2307:5041:20659:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 68.9 (GAF24846) Fe-only hydrogenase large subunit, C-terminal domain [Moorella thermoacetica Y72] P28_hydA308 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2304:10101:67081:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 79.0 (YP_002246551) hydrogenase [Coprothermobacter proteolyticus DSM 5265] P28_hydA32 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1316:17659:45702:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 82.0 (GAF24846) Fe-only hydrogenase large subunit, C-terminal domain [Moorella thermoacetica Y72] P28_hydA327 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:16700:99537:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 73.2 (YP_003825085) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase [Thermosediminibacter oceani DSM 16646] P28_hydA383 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2315:12231:55852:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 73.9 (YP_001180640) hydrogenase, Fe-only [Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903] P28_hydA39 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2103:7070:24853:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 69.3 (YP_001180640) hydrogenase, Fe-only [Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903] P28_hydA393 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1305:9485:70857:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 70.1 (YP_004461326) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase iron-sulfur protein [Tepidanaerobacter acetatoxydans Re1] P28_hydA411 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:8329:58755:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 72.4 (YP_002246551) hydrogenase [Coprothermobacter proteolyticus DSM 5265] P28_hydA434 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2303:15736:81598:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 72.4 (YP_002246551) hydrogenase [Coprothermobacter proteolyticus DSM 5265] P28_hydA451 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2314:3668:64579:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 88.2 (YP_007298421) hydrogenase, Fe-only [Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M0795] P28_hydA466 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:11913:50654:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 85.5 (YP_004463270) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Mahella australiensis 50-1 BON] P28_hydA469 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:16259:55923:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 69.7 (GAF24846) Fe-only hydrogenase large subunit [Moorella thermoacetica Y72] P28_hydA470 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2106:4343:70694:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 75.9 (GAF24846) Fe-only hydrogenase large subunit [Moorella thermoacetica Y72] P28_hydA60 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:7729:59639:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 94.0 (YP_004438253) hydrogenase, Fe-only [Thermodesulfobium narugense DSM 14796] P28_hydA98 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2305:19517:28054:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 59.3 (YP_001180640) hydrogenase, Fe-only [Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903] P28_hydA184 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1306:7062:27269:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 77.8 (YP_003239720) hydrogenase, Fe-only [Ammonifex degensii KC4] P28_hydA164 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2301:9841:57513:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 79.3 (YP_002246551) hydrogenase [Coprothermobacter proteolyticus DSM 5265] P28_hydA21 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2108:11337:43438:GGATGT Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales 95.5 (YP_007298421) hydrogenase, Fe-only [Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M0795] P28_hydA212 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:7268:98405:GGATGT Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales 81.3 (WP_021167212) NADP-reducing hydrogenase subunit HndC [Sporomusa ovata] P28_hydA291 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1314:7803:60983:GGATGT Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales 50.1 (WP_021167102) NADP-reducing hydrogenase subunit HndC [Sporomusa ovata] P28_hydA0 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1107:8897:81612:GGATGT Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales 40.0 (ETS92418) [FeFe] hydrogenase, group A [Veillonella sp. AS16] P28_hydA103 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:18262:37422:GGATGT Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales 56.6 (WP_021167212) NADP-reducing hydrogenase subunit HndC [Sporomusa ovata] P28_hydA106 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:6537:97386:GGATGT Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales 42.0 (ETS92418) [FeFe] hydrogenase, group A [Veillonella sp. AS16] P28_hydA109 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1101:12380:24778:GGATGT Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales 70.5 (WP_021167102) NADP-reducing hydrogenase subunit HndC [Sporomusa ovata] P28_hydA403 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2313:4078:52817:GGATGT Fusobacteria; Fusobacteriales 84.0 (YP_003966824) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Ilyobacter polytropus DSM 2926] P28_hydA180 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2309:6802:75822:GGATGT Ignavibacteria; Ignavibacteriales 87.4 (YP_005845237) Iron-only hydrogenase large subunit [Ignavibacterium album JCM 16511] P28_hydA243 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2314:9574:61300:GGATGT Ignavibacteria; Ignavibacteriales 87.0 (YP_006526890) Fe-only hydrogenase, catalytic subunit alpha [Melioribacter roseus P3M-2] P28_hydA33 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1310:8731:83856:GGATGT Ignavibacteria; Ignavibacteriales 75.9 (YP_005845237) Fe-only hydrogenase large subunit [Ignavibacterium album JCM 16511] P28_hydA118 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:21061:77159:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 88.6 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA138 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:13431:91130:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 82.8 (YP_002952160) Fe hydrogenase [Desulfovibrio magneticus RS-1] P28_hydA142 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2107:9900:26341:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 77.8 (WP_023407578) hypothetical protein [uncultured Desulfofustis sp. PB-SRB1] P28_hydA206 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1310:16127:97033:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 63.9 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA23 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2311:4184:36432:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 86.3 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA25 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2102:9683:12556:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 79.7 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA258 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2108:11702:74298:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 63.9 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA421 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2316:12545:22203:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 69.7 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA436 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1105:10075:54351:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 61.6 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA440 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:9791:16364:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 87.4 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA448 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2308:11112:4719:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 52.0 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032]

123

P28_hydA58 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2308:11112:4719:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 66.2 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA354 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:15477:10829:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 90.1 (WP_006921111) hydrogenase, Fe-only, partial [Desulfovibrio magneticus] P28_hydA389 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2315:17485:12079:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 85.9 (YP_002952160) Fe hydrogenase [Desulfovibrio magneticus RS-1] P28_hydA391 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:13942:46150:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 83.6 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA44 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1105:16776:32194:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 77.4 (WP_006921111) hydrogenase, Fe-only, partial [Desulfovibrio magneticus] P28_hydA446 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1316:8749:40017:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 88.2 (WP_006921111) hydrogenase, Fe-only, partial [Desulfovibrio magneticus] P28_hydA64 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2302:1649:3807:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 95.5 (WP_006921111) hydrogenase, Fe-only, partial [Desulfovibrio magneticus] P28_hydA83 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1312:9567:93217:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 55.1 (WP_006921111) hydrogenase, Fe-only, partial [Desulfovibrio magneticus] P28_hydA295 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1312:7905:70603:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfuromonadales 62.0 (YP_901164) hydrogenase, Fe-only [Pelobacter propionicus DSM 2379] P28_hydA256 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1101:7156:4545:GGATGT Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales 93.2 (YP_844976) hydrogenase, Fe-only [Syntrophobacter fumaroxidans MPOB] P28_hydA401 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1111:5768:93829:GGATGT Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales 95.0 (YP_844976) hydrogenase, Fe-only [Syntrophobacter fumaroxidans MPOB] P28_hydA441 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1102:8008:40859:GGATGT Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales 84.3 (YP_844976) hydrogenase, Fe-only [Syntrophobacter fumaroxidans MPOB] P28_hydA416 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:21254:19461:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 50.1 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA455 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2310:9367:11409:GGATGT Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales 62.4 (YP_462897) 2Fe-2S and 4Fe-4S iron-sulfur protein [Syntrophus aciditrophicus SB] P28_hydA458 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1107:6062:45666:GGATGT Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales 71.6 (YP_462897) 2Fe-2S and 4Fe-4S iron-sulfur protein [Syntrophus aciditrophicus SB] P28_hydA57 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1307:18676:50166:GGATGT Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales 78.6 (YP_844976) hydrogenase, Fe-only [Syntrophobacter fumaroxidans MPOB] P28_hydA67 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:2150:17747:GGATGT Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales 87.8 (YP_844976) hydrogenase, Fe-only [Syntrophobacter fumaroxidans MPOB] P28_hydA101 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:15132:54838:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales 86.3 (WP_006921111) hydrogenase, Fe-only, partial [Desulfovibrio magneticus] P28_hydA140 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2311:12290:15501:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 50.1 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA149 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:3943:11784:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 88.6 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA15 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2114:13414:98639:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfuromonadales 83.6 (YP_901164) hydrogenase, Fe-only [Pelobacter propionicus DSM 2379] P28_hydA16 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2116:6328:14789:GGATGT Deltaproteobacteria; Desulfobacterales 63.9 (YP_004195044) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Desulfobulbus propionicus DSM 2032] P28_hydA197 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2101:14114:76366:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 93.6 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA210 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2302:1998:88206:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 79.7 (YP_003802105) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA217 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2303:12031:86571:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 88.2 (YP_003802105) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA227 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:8720:79761:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 72.0 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P28_hydA229 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1110:6655:64887:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 80.9 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P28_hydA237 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2107:8025:67535:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 97.4 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA251 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:16128:90091:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 83.2 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA252 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2309:8988:94473:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 76.3 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P28_hydA254 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1115:16928:10462:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 70.5 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P28_hydA279 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:15795:73802:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 79.3 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA290 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2307:14352:43488:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 75.9 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA317 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2101:9681:95732:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 86.7 (YP_003802105) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA351 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1310:12256:38899:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 80.1 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P28_hydA386 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:9206:11716:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 64.7 (YP_005061073) hydrogenase, Fe-only [Sphaerochaeta pleomorpha str. Grapes] P28_hydA387 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2103:8711:61592:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 77.8 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA398 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1105:3172:49214:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 87.8 (YP_003802105) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA418 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1109:3864:42746:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 85.1 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA422 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2114:20411:45230:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 90.1 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA444 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:15662:57230:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 71.2 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P28_hydA447 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1314:12915:31002:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 91.0 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P28_hydA456 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1107:9964:40383:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 60.8 (YP_006044637) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta thermophila DSM 6578] P28_hydA460 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1302:5716:41810:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 81.3 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA62 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2310:16315:59036:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 82.8 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA266 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:15952:64033:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 95.1 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA10 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1308:5318:45616:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 71.2 (YP_003802105) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA108 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:8337:4917:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 66.2 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA12 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2304:20198:65356:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 73.2 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA125 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1302:18912:63674:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 93.6 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA136 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1316:16229:71422:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 62.4 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA148 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2313:15953:28598:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 73.9 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P28_hydA161 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1102:12280:94355:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 66.6 (YP_006044637) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta thermophila DSM 6578] P28_hydA185 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2311:19480:99240:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 92.8 (YP_003802215) NAD(P)-dependent iron-only hydrogenase catalytic subunit [Spirochaeta smaragdinae DSM 11293] P28_hydA189 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1309:11913:24310:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 60.8 (YP_006044637) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta thermophila DSM 6578] P28_hydA19 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1309:2702:32676:GGATGT Spirochaetes; Spirochaetales 73.2 (YP_005475514) hydrogenase, Fe-only [Spirochaeta africana DSM 8902] P28_hydA163 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1114:3565:23768:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 88.6 (YP_002939902) hydrogenase, Fe-only [Kosmotoga olearia TBF 19.5.1] P28_hydA255 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2311:13944:72440:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 70.9 (YP_002939902) hydrogenase, Fe-only [Kosmotoga olearia TBF 19.5.1] P28_hydA257 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1309:3954:78696:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 79.7 (YP_002939902) hydrogenase, Fe-only [Kosmotoga olearia TBF 19.5.1] P28_hydA265 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2110:8245:52454:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 82.4 (YP_005470551) hydrogenase, Fe-only [Fervidobacterium pennivorans DSM 9078] P28_hydA343 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1316:10526:19921:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 73.6 (YP_005096723) hydrogenase, Fe-only [Marinitoga piezophila KA3] P28_hydA373 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2315:7515:50488:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 82.4 (YP_002939902) hydrogenase, Fe-only [Kosmotoga olearia TBF 19.5.1] P28_hydA385 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1309:15282:15883:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 79.7 (YP_005096723) hydrogenase, Fe-only [Marinitoga piezophila KA3] P28_hydA424 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2312:16959:78448:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 72.8 (YP_002939902) hydrogenase, Fe-only [Kosmotoga olearia TBF 19.5.1] P28_hydA70 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2106:4783:93650:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 64.3 (YP_005470551) hydrogenase, Fe-only [Fervidobacterium pennivorans DSM 9078]

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P28_hydA72 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2303:6153:42186:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 87.4 (YP_002939902) hydrogenase, Fe-only [Kosmotoga olearia TBF 19.5.1] P28_hydA22 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2313:16296:62472:GGATGT Thermotogae; Thermotogales 56.2 (YP_001409760) hydrogenase, Fe-only [Fervidobacterium nodosum Rt17-B1] P28_hydA438 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:4211:76573:GGATGT Verrucomicrobia; Opitutales 61.6 (YP_001818428) hydrogenase, Fe-only [Opitutus terrae PB90-1] P28_hydA245 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2311:16033:61947:GGATGT Paddy field soil, Japan 72.8 (BAM65975) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA263 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1316:4581:3244:GGATGT Paddy field soil, Japan 83.6 (BAM65873) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA264 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2316:10927:9465:GGATGT Paddy field soil, Japan 82.4 (BAM66122) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA270 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1113:12148:29276:GGATGT Paddy field soil, Japan 82.8 (BAM65975) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA219 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1108:5767:25663:GGATGT Paddy field soil, Japan 61.2 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA220 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1105:12304:22767:GGATGT Paddy field soil, Japan 74.7 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA235 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2306:12066:75508:GGATGT Paddy field soil, Japan 75.1 (BAM65873) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA169 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2305:3576:73977:GGATGT Paddy field soil, Japan 77.8 (BAM66149) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA131 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:20757:91605:GGATGT Paddy field soil, Japan 85.5 (BAM66039) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA452 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2302:6322:95743:GGATGT Paddy field soil, Japan 75.9 (BAM66084) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA128 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1106:16034:41315:GGATGT Paddy field soil, Japan 68.6 (BAM66175) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA174 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1112:5107:21749:GGATGT Paddy field soil, Japan 77.4 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA201 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2301:20855:80465:GGATGT Paddy field soil, Japan 85.9 (BAM65965) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA104 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1109:9142:36449:GGATGT Paddy field soil, Japan 91.3 (BAM66117) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA107 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2304:3378:12314:GGATGT Paddy field soil, Japan 79.7 (BAM66175) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA3 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1104:13776:58918:GGATGT Paddy field soil, Japan 80.1 (BAM66149) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA34 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1113:8868:88278:GGATGT Paddy field soil, Japan 84.0 (BAM66175) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA346 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2311:17889:19912:GGATGT Paddy field soil, Japan 68.2 (BAM65975) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA37 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1301:11581:79121:GGATGT Paddy field soil, Japan 66.2 (BAM65845) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA377 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1313:9467:66814:GGATGT Paddy field soil, Japan 78.2 (BAM66088) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA380 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2103:7160:7503:GGATGT Paddy field soil, Japan 72.4 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA384 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:5306:87159:GGATGT Paddy field soil, Japan 81.3 (BAM65965) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA52 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1310:6679:37596:GGATGT Paddy field soil, Japan 94.7 (BAM66117) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA53 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1105:12680:81935:GGATGT Paddy field soil, Japan 93.2 (BAM66088) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA54 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1315:12857:40287:GGATGT Paddy field soil, Japan 86.7 (BAM66117) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA78 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2309:1879:88698:GGATGT Paddy field soil, Japan 85.1 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA82 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1111:13288:34560:GGATGT Paddy field soil, Japan 79.3 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA89 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1306:8669:10318:GGATGT Paddy field soil, Japan 49.7 (BAM66154) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA112 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1104:16777:32264:GGATGT Paddy field soil, Japan 86.3 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA155 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1101:19725:90289:GGATGT Paddy field soil, Japan 79.3 (BAM65896) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA244 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2109:20719:77364:GGATGT Paddy field soil, Japan 94.7 (BAM66232) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA28 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1107:21082:64239:GGATGT Paddy field soil, Japan 79.0 (BAM65975) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA99 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1110:1283:40053:GGATGT Paddy field soil, Japan 90.5 (BAM66117) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA337 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1313:15865:35313:GGATGT Paddy field soil, Japan 81.6 (BAM66175) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA439 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2315:5629:86143:GGATGT Paddy field soil, Japan 80.1 (BAM65973) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA49 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2306:14493:52422:GGATGT Paddy field soil, Japan 86.7 (BAM66042) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA94 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1316:14939:47564:GGATGT Paddy field soil, Japan 78.6 (BAM66088) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA216 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2310:20634:25267:GGATGT Paddy field soil, Japan 99.4 (BAM66088) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA415 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2110:9798:11682:GGATGT Paddy field soil, Japan 90.1 (BAM66173) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA360 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:19109:53485:GGATGT Paddy field soil, Japan 77.0 (BAM65965) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA77 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2310:3887:27231:GGATGT Paddy field soil, Japan 83.2 (BAM66084) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA207 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2111:5017:69311:GGATGT Paddy field soil, Japan 68.9 (BAM65975) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA430 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2312:11983:94515:GGATGT Paddy field soil, Japan 98.6 (BAM66117) [FeFe]-hydrogenase, partial [uncultured bacterium] P28_hydA239 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2114:3737:84393:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 91.0 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA275 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:18238:99456:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 67.4 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA347 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2115:11101:29212:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 98.0 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA397 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1305:14634:49470:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 92.8 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA417 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1112:12296:56649:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 62.0 (AGU38565) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA181 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2315:7477:90219:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 99.0 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA133 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1315:18802:34017:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 92.0 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA319 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2305:7572:15250:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 92.0 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA350 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2314:8112:100475:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 72.4 (AGU38572) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA356 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2309:11330:76283:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 78.2 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA59 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2104:21112:2451:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 75.9 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA318 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:1708:62889:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 96.7 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA409 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2305:14962:93264:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 93.6 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA61 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2312:9596:27580:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 92.0 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA111 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2315:8361:45741:GGATGT Oil fields subdJected to CO2 and water-flooding 96.7 (AGU38562) FeFe-hydrogenase, partial [uncultured prokaryote] P28_hydA170 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2113:3747:95005:GGATGT Saline microbial mat community, Mexico 95.9 (ACM67558) iron-dependent hydrogenase [uncultured organism] P28_hydA122 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2114:4910:91263:GGATGT Saline microbial mat community, Mexico 97.4 (ACM67558) iron-dependent hydrogenase [uncultured organism] P28_hydA426 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2315:9602:86691:GGATGT Saline microbial mat community, Mexico 93.2 (ACM67558) iron-dependent hydrogenase [uncultured organism] P28_hydA204 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2316:11718:88709:GGATGT Saline microbial mat community, Mexico 91.3 (ACM67558) iron-dependent hydrogenase [uncultured organism]

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P28_hydA443 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2306:6557:86865:GGATGT Acidic fen 86.7 (CAY56136) [Fe-Fe] hydrogenase large subunit [uncultured bacterium] P28_hydA213 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1311:19242:44860:GGATGT Acidic fen 90.1 (CAY56138) [Fe-Fe] hydrogenase large subunit [uncultured bacterium] P28_hydA457 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1310:6776:26173:GGATGT Water column of the Great Salt Lake, USA 95.5 (ADC53611) [Fe-Fe] hydrogenase [uncultured bacterium] P28_hydA90 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1314:14350:90820:GGATGT Water column of the Great Salt Lake, USA 92.4 (ADC53611) [Fe-Fe] hydrogenase [uncultured bacterium] P28_hydA114 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2305:14681:91239:GGATGT Earthworm gut contents 67.0 (CBX44190) [FeFe]-hydrogenase large subunit, partial [uncultured bacterium] P28_hydA182 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2302:19922:61154:GGATGT Phreatic limestone sinkholes in Mexico 57.4 (ACQ94905) [Fe-Fe] hydrogenase [uncultured bacterium] P28_hydA359 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2107:7975:61393:GGATGT Biogas digester system 62.4 (AEK22103) FeFe-hydrogenase [uncultured organism] P28_hydA410 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2308:6226:88233:GGATGT Anaerobic domestic sewage sludge 82.8 (AGF90866) FeFe-hydrogenase large subunit, partial [uncultured bacterium] P28_hydA7 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2108:1486:27443:GGATGT Biogas digester system 85.9 (AET11788) Fe-hydrogenase [uncultured organism] P28_hydA179 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1306:2483:74069:GGATGT Biogas digester system 70.1 (AET11789) hydrogenase [uncultured organism] P28_hydA431 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:2307:14244:49092:GGATGT Water column of the Great Salt Lake, USA 88.2 (ADQ86057) [FeFe]-hydrogenase subunit A large subunit [uncultured bacterium] P28_hydA335 D4ZHLFP1:60:D2HDNACXX:2:1303:8667:76848:GGATGT Termite gut microbiota 65.5 (AFH54065) [Fe-Fe] hydrogenase large subunit, partial [uncultured bacterium]

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Chapitre III : Performance de production d’hydrogène en condition alcaline par une bactérie anaérobie et alcalophile isolée de l’Aiguille de Prony

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Article publié: Mei N, Zergane N, Postec A, Erauso G, Ollier A, Payri C, Pelletier B, Fardeau ML, Ollivier B, Quéméneur M. (2014) Fermentative hydrogen production by a new alkaliphilic Clostridium sp. (strain PROH2) isolated from a shallow submarine hydrothermal chimney in Prony Bay, New Caledonia. International Journal of Hydrogen Energy. 39:19465-73

La production d’hydrogène (H2) par voie fermentaire utilisant des bactéries anaérobies, aussi appelée « dark fermentation » est une alternative prometteuse d’énergie propre et durable.

Comparativement aux autres biotechnologies, ce processus permet de produire de l’H2 à des vitesses élevées et à faible coût à partir de substrats complexes et renouvelables. Les cultures pures permettent généralement d’obtenir de meilleurs rendements en H2 que les cultures mixtes mais leur utilisation nécessite des coûts élevés destérilisation des milieux (Guo et al., 2010). L’application de conditions extrêmes pouvant réduire le développement de la majorité des contaminants existant en conditions mésothermique et neutre, pourrait permettre de réduire ces coûts. Les microorganismes extrêmophiles peuvent donc constituer une alternative prometteuse pour une production d’H2 efficace et respectueuse de l’environnement. Les écosystèmes associés à la serpentinisation caractérisés par des pH élevés (10-12) et des fluides anoxiques sont des sources potentielles pour la découverte de nouveaux microorganismes alcalophiles produisant de l’H2. Récemment, les études moléculaires basés sur l’ADNr 16S ont démontré une diversité bactérienne élevée de bactéries appartenant au phylum Firmicutes dans ces environnements (Postec et al., 2015 ; Quéméneur et al., 2014). Les membres de ce phylum et plus particulièrement ceux appartenant à l'ordre de Clostridiales, sont reconnus comme des bactéries produisant potentiellement de l’H2 (Xing et al., 2008). Des expériences ont été menées dans notre laboratoire pour enrichir puis isoler des représentants alcalophiles appartenant à ce groupe métabolique. Ce chapitre présente une nouvelle bactérie anaérobie et alcaliphile, Clostridium sp. PROH2, isolée d'une cheminée hydrothermale de la baie de Prony en Nouvelle-Calédonie : l’Aiguille de

Prony. Les performances de production d’H2 de cet isolat ont été testées dans différentes conditions de culture (i.e. pH initial, température, type de substrat, concentration du substrat, concentration en sels, i.e. NaCl). Nous avons montré que les rendements de production d’H2 maximaux sont obtenus sur glucose (2 g/L), à pH 9,5 et à 37°C. Cette bactérie semble donc un candidat idéal pour produire efficacement de l’H2 en condition alcaline et faiblement saline.

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Chapitre IV : Caractérisation d’une bactérie anaérobie et alcalophile d'un nouveau genre isolée de l’écosystème hydrothermal de Prony

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Article accepté : Mei N., Postec A., Erauso G., Joseph M., Pelletier B., Payri C., Ollivier B., Quéméneur M. Serpentinicella alkaliphila gen. nov., sp. nov., a novel alkaliphilic anaerobic bacterium isolated from the serpentinite-hosted Prony hydrothermal field, New Caledonia. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.

A ce jour peu de micro-organismes anaérobies et alcalophiles (i.e. micro-organismes présentant des pH optimaux de croissance ≥ 9) ont été cultivés à partir des environnements associés à la serpentinisation (cf. Tableau 2 Chapitre 3). Les récents résultats des études moléculaires effectuées à partir de ces environnements ont pourtant démontré l’abondance et la diversité importante des micro-organismes anaérobies au sein de différents sites terrestres ou sous-marins (Schrenk et al., 2013). Afin d’accéder à une diversité cultivable plus importante des communautés microbiennes associées à ce type d’environnement, de nombreux essais d’enrichissements de micro-organismes anaérobies ont été réalisés à partir de différents sites du système hydrothermal alcalin de Prony en Nouvelle-Calédonie. Notre équipe a isolé la première bactérie anaérobie et alcalophile à partir de ce type d’environnement : Alkaliphilus hydrothermalis (Ben Aissa et al., 2015). Une deuxième nouvelle espèce bactérienne anaérobie et alcalophile, Acetoanaerobium pronyense, phylogénétiquement proche de la bactérie productrice d’H2 Clostridium sp. PROH2, présentée dans le chapitre précédent, a été isolée à partir de l’Aiguille de Prony (Bes et al., 2015). Par la suite, deux autres nouvelles espèces bactériennes appartenant au genre Alkaliphilus, i.e. A. serpentinus et Alkaliphilus sp. LacV, ont également été isolées et caractérisées au sein de notre laboratoire (publication en cours). Malgré les nombreuses conditions testées pour cultiver des micro- organismes sulfato-réducteurs ou méthanogènes durant ma thèse, la totalité des isolats obtenus présentent un métabolisme fermentaire et appartiennent à l’ordre des Clostridiales du phylum des Firmicutes, laissant supposer que ce groupe joue un rôle majeur dans cet écosystème, probabalement grâce à leur forte adaptabilité métabolique et leurs capacités d’auxotrophie ou de mixotrophie (Schrenk et al., 2013). Ce chapitre présente l’isolement et la caractérisation de la souche mésophile et alcalophile 3b, à partir du site Rivière des Kaoris (RK) du système hydrothermal de Prony. Cette souche, nommée Serpentiniticella alkaliphila, représente une nouvelle espèce d’un nouveau genre dans l’ordre des Clostridiales.

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Chapitre V. Conclusions générales et perspectives

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Les principaux objectifs de ce travail étaient de déterminer : (i) la diversité microbienne dans les cheminées et fluides hydrothermales du site de Prony associée au cycle de l’hydrogène par des approches moléculaires, et (ii) d’étudier la diversité des micro-organismes associés à la production de l’H2 par des approches culturales.

Le chapitre II de ce manuscrit a révélé une diversité inattendue d’hydrogénases [FeFe] principalement affiliées aux Firmicutes dans les sites hyperalcalins associés à la serpentinisation de PHF par différentes approches moléculaires (e.g. clonage/séquençage et métagénomique). Ces résultats sont en contradiction avec ceux précédemment observés par Boyd et al. (2010) dans les systèmes basaltiques du Parc National de Yellowstone où les auteurs ont trouvé une faible diversité d’hydrogénases [FeFe] à pH élevé en ciblant les mêmes gènes marqueurs (hydA). La diversité plus élevée observée à Prony pourrait révéler : (i) une capacité potentielle métabolique importante pour produire de l’hydrogène au niveau de la communauté, grâce aux diverses bactéries fermentaires occupant des micro-niches distinctes dans les structures poreuses des cheminées carbonatées et les fluides, (ii) une flexibilité métabolique individuelle importante de ces micro-organismes indigènes, qui sont bien adaptés aux différentes contraintes environnementales (e.g., Eh, pH, O2, privation de nutriment). A la lumière de nos résultats, il semble donc que le pH seul n’est pas un facteur contraignant la diversité des hydrogénases [FeFe] et que les environnements alcalins peuvent

également abriter une importante diversité de producteurs d’H2, équivalente à celle observée dans les habitats naturels acides ou neutres (Schmidt et al., 2010).

Le phylum des Firmicutes est systématiquement représenté dans les systèmes hydrothermaux associés à la serpentinisation. Ses membres et plus particulièrement les Clostridiales semblent associés aux zones anoxiques de ces écosystèmes (Brazelton et al., 2013). Dans notre étude, ils constituent une partie importante dans le metagénome de Prony, et presque toutes les hydrogénases [FeFe] détectées ont des relations phylogénétiques étroites avec des homologues putatifs de Clostridiales. Deux groupes principaux de séquences HydA ont été observés en fonction de sites étudiés. Le premier groupe ‘HydA sous-marin/anoxique’, lié aux Firmicutes anaérobies obligatoires (e.g. Clostridium et Desulfotomaculum) retrouvés principalement dans des environnements profonds (Haouari et al., 2008; Aüllo et al., 2013), domine dans les cheminées sous-marines de ST07 et ST09. Ils semblent venir de la subsurface anoxique où a lieu la serpentinisation et donc ont très probablement utilisés le carbone organique

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fermentable et les hydrocarbures de faible poids moléculaire d’origine abiotique, pour ensuite être amenés à la surface par le fluide. En effet, Brazelton et al. 2010 ont trouvé une plus grande abondance de séquences de gènes ARNr 16S liées au Clostridia dans les cheminées plus jeunes et plus chaudes à Lost City, ce qui est compatible avec l’idée de la contribution du fluide dans l’apparition de Clostridiales dans les échantillons de surface (Brazelton et al., 2012). Il sera donc intéressant de comparer les communautés microbiennes des échantillons de fluide ou de cheminée d'un même site sous-marin (ST07 ou ST09) pour répondre à ces hypothèses. Un deuxième groupe ‘HydA intertidale/oxique’ est affilié aux Firmicutes de sol de rizière (Japon) (Baba et al., 2014) et domine les cheminées intertidales de BdJ et de RK. Ce groupe important appartient à des bactéries non cultivées. Aux sites BdJ et RK, le cycle des marées impose à ces habitats une alternance de périodes immergées (moins exposée à l'oxygène) et émergées (donc exposées à l'air), ce qui rappelle les conditions d’alternance oxique/anoxique (sols secs ou inondés) dans les rizières. Cependant, le pourcentage d’identité des séquences du PHF avec celles des incultivés de sol de rizière sont assez bas (55%-74%), suggérant la présence de nouvelles séquences d’hydrogénases dans nos échantillons. Ces résultats ont montré la nécessité d'enrichir les les bases de données publiques avec les séquences d'hydrogénases [FeFe] plus diversifiées en vue d'une meilleure classification des ces enzymes mais également, en retour, pour la conception de nouvelles amorces PCR qui permettront de cibler plus précisément les gènes hydA dans les environnements naturels. La nouveauté phylogénétique de ces groupes d'hydrogénases reflète certainement la diversité des micro-organismes associés à ce système hydrothermal si particulier de la baie de Prony, avec des fluides très alcalins, mésothermiques et de faible salinité (car d'origine météorique) qui se déchargent un environnement marin peu profond.

Les hydrogénases [FeFe] sont souvent utilisées comme marqueur moléculaire des populations productrices d’H2 (Baba et al., 2014 ; Brazelton et al., 2012 ; Xing et al., 2008).

Cependant, elles peuvent également fonctionner dans le sens de l’oxydation d’H2 chez certains micro-organismes en fonction notamment des conditions thermodynamiques locales. Pour évaluer la part respective des activités antagonistes des hydrogénases [FeFe] et mieux estimer leur contribution dans le bilan H2 des écosystèmes de PHF, une prochaine étape incontournable sera de mesurer in situ ou dans les microcosmes des ratios H2 biotique/abiotique par méthodes isotopiques et de relier ces données chimiques aux données microbiologiques existantes.

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Figure 24 : Groupes microbiens impliqués dans la consommation et la production de l’hydrogène dans les environnements associés à la serpentinisation.

L’approche culturale utilisée dans ce travail a non seulement confirmé la capacité des micro-organismes de PHF à produire du bioH2 mais elle a également permis l'isolement de nouvelles souches bactériennes appartenant à l'ordre des Clostridiales que les approches moléculaires avaient révélées comme acteurs majoritaires dans la production de bioH2 dans cet écosystème. Le troisième chapitre de cette thèse a présenté l’isolement et l’étude de la souche Clostridium PROH2, capable de produire efficacement de l’hydrogène en condition fermentaire et alcaline (pH 9.5). Cette bactérie alcalophile pousse en l'absence d’ajout de NaCl et a été isolée à partir d'une cheminée carbonatée du site ST07 (l’Aiguille de Prony) du PHF :. Elle a été assignée au genre Clostridium et est phylogénétiquement proche de Clostridium sticklandii. Les rendements en biomasse de la souche PROH2 et ses performances pour la production d'hydrogène par la fermentation ont été étudiés dans une série d'expériences en cultures discontinues dans différentes conditions de pH, de NaCl, de température, et de concentrations en glucose. La production d'hydrogène par la souche PROH2 atteint le taux maximum (0,55 mM-H2 / h) à la fin de la phase exponentielle. Le meilleur rendement de production d'hydrogène, 2,71 mol H2 / mol glucose, a été observé à un pH initial de 9,5 à 37°C en présence de 2 g/L de glucose, ce qui est comparable aux rendements observés pour les espèces du genre Clostridium neutrophiles. Il s’agit de la première

étude décrivant un micro-organisme anaérobie produisant de l’H2 à pH élevé et à faible salinité. La souche PROH2 peut être considérée comme un candidat attractif pour la production d’H2 par voie fermentaire à partir d'eaux usées alcaline contenant des composés organiques. Une étude approfondie de ses potentialités pourra être réalisée en conditions contrôlées en fermenteur pour

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tester notamment les différents types de déchets comme substrats, en vue d'optimiser la production d'H2 et pouvoir l’appliquer à l’échelle industrielle.

Plusieurs bactéries anaérobies fermentaires du phylum des Firmicutes, ordre Clostridiales, ont été isolées avec succès des cheminées hydrothermales sous-marines du PHF (Postec et al., 2015). Elles représentent de nouvelles espèces appartenant aux genres Acetoanaerobium, Alkaliphilus et Vallitalea (Ben Aissa et al., 2015; Bes et al., 2015; Ben Aissa et al., 2014). Au cours de ce travail de thèse, une nouvelle bactérie anaérobie alcalophile, désignée souche 3bT, a été isolée à partir d’échantillons d’une source intertidale de Prony : Rivière des Kaoris. Elle représente une nouvelle espèce d’un nouveau genre au sein du phylum des Firmicutes : Serpentinicella alkaliphila. Cette souche peut se développer à des températures comprises entre 30 et 43°C (optimum 37°C) et à des pH compris entre 7,8 et 10,1 (optimum 9,5). Ce qui en fait la souche la plus alcalophile isolée du système hydrothermal deProny jusqu’à présent. L’ajout d’NaCl n'est pas nécessaire pour sa croissance (optimum 0-0,2%), en cohérence avec la très faible salinité des fluides échantillonnés à Prony (Monnin et al., 2014). La souche utilise le crotonate, le lactate et pyruvate comme substrat, sa croissance sur le lactate a été améliorée par l'addition de fumarate qui a été converti en succinate. Contrairement à la souche PROH2, cette nouvelle souche n’utilise pas les sucres comme substrats et ne produit que très peu d’H2.

Comme toutes les autres souches isolées du système hydrothermal de Prony, la souche 3b appartient également à l’ordre des Clostridiales (phylum Firmicutes) et comme beaucoup d'entre elles, son métabolisme énergétique est la fermentation de la matière organique. Cela peut surprendre dans un environnement serpentinisé où l'H2 et le CH4 constituent des sources d'énergie abondantes et renouvelées. Cependant, la fermentation pourrait représenter une stratégie métabolique intéressante dans ces environnements en raison de la faible disponibilité des accepteurs d'électrons (quasiment absents dans le fluide anoxique et provenant essentiellement de l'eau de mer : O2, NO2, NO3, SO4, etc). En supposant que ces micro-organismes utilisent le carbone organique produits par les réactions abiotiques liées à la serpentinisation, la fermentation dans ces écosystèmes pourrait être considérée comme une forme de production primaire générant de la biomasse à partir de carbone et d’énergie d’origine abiotique (Schrenk et al., 2013). Pour étayer cette hypothèse, il sera nécessaire d'avoir des mesures plus précises (quantitatif et qualitatif) du carbone organique dissous (DOC) afin d'évaluer si les concentrations de ce DOC sont suffisantes

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pour alimenter l'écosystème microbien et si la nature des molécules produites fait qu'elles sont bien assimilables par les micro-organismes clés, à savoir dans notre hypothèse, les Clostridiales.

En effet, ces populations pourraient jouer le rôle de producteurs primaires comme il est souvent proposé dans les écosystèmes (de sub-surface) basés sur la chimiolithoautotrophie de l'H2 appelé SLIME (Subsurface LIthoautotrophic Microbial Ecosystems) (Takai et al., 2004). Pour bien comprendre le fonctionnement de ces micro-organismes, une comparaison des génomes de 7 espèces d'Alkaliphilus par séquençage du génome complet est en cours au sein de notre équipe pour étudier les métabolismes potentiels des souches alcalophiles et fermentaires. D’autres études de souches pures modèles pourront également être envisagées par méthodes omiques (e.g. transcriptomique et protéomique). L’étude des protéines impliquées dans ces souches alcalophiles isolées de Prony pourrait permettre de trouver de nouvelles enzymes potentiellement intéressantes pour des applications industrielles.

L'identification des groupes microbiens hydrogénotrophes, capables d'utiliser l’H2 pour fixer le carbone constitue une alternative importante à la précédente hypothèse. Au cours de cette thèse, plusieurs essais d’enrichissements dans différentes conditions ont été réalisés pour tenter d’isoler des micro-organismes anaérobies hydrogénotrophes, des bactéries sulfato-réductrices (notamment celles du genre Desulfonatronum) et des archées méthanogènes (notamment les Methanosarcinales mis en évidence par les approches moléculaires). Deux enrichissements réalisés

à partir des échantillons de la Rivière des Kaoris, en présence d'acétate ou d’H2:CO2 comme source de carbone et d'énergie ont produit du méthane. Les méthanogènes identifiés dans les cultures d'enrichissement étaient apparentés à l’espèce Methanobacterium alcaliphillum (95% de similarité) par séquençage des gènes codant l’ARNr 16S. Les tentatives d'isolement à partir de ces cultures n'ont pas abouti. Cependant nous avons récemment isolé une autre souche méthanogène hydrogénotrophe (souche CAN-3) justement proche de Methanobacterium alcaliphilum (98% d’identité au niveau de l'ADNr 16S) à partir d'une autre source hydrothermale alcaline, terrestre cette fois, du site de la Crouen (Canala) situé à environ 200 km des sites de la baie de Prony en Nouvelle Calédonie. Cet isolat est en cours de caractérisation. Aucune des archées de l’ordre des Methanosarcinales (LCMS-like ou TCMS-like) n'ont apparemment été enrichis dans ces conditions jusqu’à présent, probablement à cause de son besoin de se développer en synergie avec d’autres micro-organismes ou du fait que ces méthanogènes sont plus abondantes dans les habitats

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plus profonds, où les conditions environnementales peuvent être différentes de celles appliquées en culture.

Pour comprendre comment les facteurs environnementaux tels que le pH, la température, les concentrations en substrats (sels minéraux, DOC, DIC, H2, CH4, etc) peuvent influencer le fonctionnement des écosystèmes associés à l'hydrothermalisme en baie de Prony, les prochaines missions d'échantillonnage devront avoir comme priorité la collecte des meta-data concernant la géochimie et la minéralogie des habitats étudiés par une approche multidisciplinaire intégrée. Pour notre équipe, il s’agira essentiellement de mettre en œuvre également des méthodes métagénomiques. Le développement de ces méthodes est d'ailleurs au cœur d'une nouvelle thèse en cours (celle d'Eléonore Frouin) sur les écosystèmes microbiens des systèmes associés à la serpentinisation. L'ensemble des données obtenues pourra alors servir aux analyses statistiques multivariées qui pour l'instant n'ont pas pu être appliquées fautes de données suffisantes. Ces études devraient permettre de compléter le modèle des interactions existantes entre les différentes populations de bactéries et archées proposées en introduction de cette thèse (partie I.5) (Postec et al., 2015).

Une approche alternative pour analyser les interactions métaboliques au sein des communautés microbiennes est d’étudier des modèles simplifiés d’écosystèmes microbiens, autrement dits : cultiver des consortia naturels ou artificiels (co-culture de plusieurs souches sélectionnées comme des acteurs clés dans le cycle de l’H2 en PHF). Ce type de co-cultures pourraient être réalisées dans les bioréacteurs automatisées de la plateforme de culture de notre équipe MEB qui permet un contrôle très fin des paramètres de culture (en particulier du redox Eh et du pH) et permet un suivi en ligne des produits du métabolisme grâce à diverses électrodes et couplage à un chromatographe (GC-MS). Les changements dans la structure microbienne en réponse à un stress environnemental (aération, pH) peuvent aussi être suivis à l'aide de différentes méthodes moléculaires à base de gènes ARNr 16S. Un autre système très intéressant et encore en développement dans le laboratoire LME2 (Brest), avec qui nous collaborons, est de tenter de reconstituer des gradients physico-chimiques qui caractérisent l'habitat poreux au sein des cheminées carbonatées de Prony. Il s'agit d'un réacteur à double compartiments, chacun contrôlé indépendamment, qui communiquent par une interface de verre frité perméable aux ions. On

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pourrait ainsi récréer les gradients naturels qui s'établissent entre les deux compartiments : fluide hydrothermal et l'eau de mer environnante.

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Annexes

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182

Références bibliographiques

183

184

Abdeshahian, P., Al-Shorgani, N. K. N., Salih, N. K., Shukor, H., Kadier, A., Hamid, A. A., and Kalil, M. S. 2014. The production of biohydrogen by a novel strain Clostridium sp. YM1 in dark fermentation process. International Journal Of Hydrogen Energy, 39(24): 12524- 12531.

Abrajano, T.A., Sturchio, N.C., Kennedy, B.M., Lyon, G.L., Muehlenbachs, K., and Bohlke, J.K. 1990. Geochemistry of reduced gas related to serpentinization of the Zambales ophiolite, Philippines. Applied Geochemistry, 5: 625-630.

Aceves-Lara, C. A., Latrille, E., Buffiere, P., Bernet, N. and Steyer, J.-P. 2008. Experimental determination by principal component analysis of a reaction pathway of biohydrogen production by anaerobic fermentation. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 47, 1968-1975.

Aino, K., Narihiro, T., Minamida, K., Kamagata, Y., Yoshimune, K. and Yumoto, I. 2010. Bacterial community characterization and dynamics of indigo fermentation. FEMS microbiology ecology, 74, 174-183.

Aizawa, T., Urai, M., Iwabuchi, N., Nakajima, M. and Sunairi, M. 2010. Bacillus trypoxylicola sp. nov., xylanase-producing alkaliphilic bacteria isolated from the guts of Japanese horned beetle larvae (Trypoxylus dichotomus septentrionalis). International journal of systematic and evolutionary microbiology, 60, 61-66.

Alalayah, W. M., Kalil M. S., Kadhum A. A. H., Jahim J. M., Alauj N. M. Hydrogen production using Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564). International Journal of Hydrogen Energy, 2008;33:7392e6.

Allen, T. D., Caldwell, M. E., Lawson, P. A., Huhnke, R. L., Tanner, R. S. 2010. Alkalibaculum bacchi gen. nov., sp. nov., a CO-oxidizing, ethanol-producing acetogen isolated from livestock-impacted soil. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 60(10): 2483-2489.

Baba, R., Kimura, M., Asakawa, S. and Watanabe, T. 2014. Analysis of [FeFe]-hydrogenase genes for the elucidation of a hydrogen-producing bacterial community in paddy field soil. FEMS microbiology letters, 350, 249-56.

Ballot, A., Kotut, K., Novelo, E. and Krienitz, L. 2009. Changes of phytoplankton communities in Lakes Naivasha and Oloidien, examples of degradation and salinization of lakes in the Kenyan Rift Valley. Hydrobiologia, 632, 359-363.

Baker, B. J., Saw, J. H., Lind, A. E., Lazar, C. S., Hinrichs, K. U., Teske, A. P., and Ettema, T. J. 2016. Genomic inference of the metabolism of cosmopolitan subsurface Archaea, Hadesarchaea. Nature Microbiology, 1, 16002.

Barnes, I. and O'neil, J. R. 1971. Calcium-magnesium carbonate solid solutions from Holocene conglomerate cements and travertines in the Coast Range of California. Geochimica et Cosmochimica Acta, 35, 699-718.

185

Barnes, I., Lamarche, V. and Himmelberg, G. 1967. Geochemical evidence of present-day serpentinization. Science, 156, 830-832.

Bartacek, J., Zabranska, J. and Lens, P. N. 2007. Developments and constraints in fermentative hydrogen production. Biofuels, Bioproducts and Biorefining, 1, 201-214.

Bath, A. H., Christofi, N., Neal, C., Philip, J. C., Cave, M. R., Mckinley, I. G. and Berner, U. 1987. Trace element and microbiological studies of alkaline groundwaters in Oman, Arabian Gulf: a natural analogue for cement pore-waters. Report of the Fluid Processes Research Group. Report FLPU 87-2. British Geological Survey, Keyworth, United Kingdom.

Begemann, M., Mormile, M. R., Sitton, O., Wall, J. D. and Elias, D. A. 2012. A streamlined strategy for biohydrogen production with Halanaerobium hydrogeniformans, an alkaliphilic bacterium. Frontiers in microbiology, 3, 93.

Ben Aissa, F., Postec, A., Erauso, G., Payri, C., Pelletier, B., Hamdi, M., Fardeau, M.-L. and Ollivier, B. 2014. Characterization of Alkaliphilus hydrothermalis sp. nov., a novel alkaliphilic anaerobic bacterium, isolated from a carbonaceous chimney of the Prony hydrothermal field, New Caledonia. Extremophiles, 1-6.

Ben Aissa, F., Postec, A., Erauso, G.l., Payri, C., Pelletier, B., Hamdi, M., Ollivier, B., and Fardeau, M.-L. 2014. Vallitalea pronyensis sp. nov., isolated from a marine alkaline hydrothermal chimney. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 64: 1160- 1165.

Ben Aissa, F., Postec, A., Erauso, G.l., Payri, C., Pelletier, B., Hamdi, M., Fardeau, M.-L., and Ollivier, B. (2015) Characterization of Alkaliphilus hydrothermalis sp. nov., a novel alkaliphilic anaerobic bacterium, isolated from a carbonaceous chimney of the Prony hydrothermal field, New Caledonia. Extremophiles, 19: 183-188.

Bes, M., Merrouch, M., Joseph, M., Quemeneur, M., Payri, C., Pelletier, B., Ollivier, B., Fardeau, M. L., Erauso, G. and Postec, A. 2015. Acetoanaerobium pronyense sp. nov., an anaerobic alkaliphilic bacterium isolated from a carbonate chimney of the Prony Hydrothermal Field (New Caledonia). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 65, 2574-80.

Bhushan, B. 2000. Production and characterization of a thermostable chitinase from a new alkalophilic Bacillus sp. BG‐11. Journal of applied microbiology, 88, 800-808.

Birrien, J. L., Zeng, X., Jebbar, M., Cambon-Bonavita, M. A., Querellou, J., Oger, P., Bienvenu, N., Xiao, X. and Prieur, D. 2011. Pyrococcus yayanosii sp nov., an obligate piezophilic hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 61, 2827-2831.

Blank, J.G., Green, S., Blake, D., Valley, J.W., Kita, N.T., Treiman, A., and Dobson, P.F. 2009. An alkaline spring system within the Del Puerto Ophiolite (California, USA): A Mars analog site. Planetary and Space Science, 57: 533-540.

186

Blotevogel, K. H., Fischer, U., Mocha, M., and Jannsen, S. 1985. Methanobacterium thermoalcaliphilum sp. nov., a new moderately alkaliphilic and thermophilic autotrophic methanogen. Archives of microbiology, 142(3), 211-217.

Blum, J. S., Bindi, A. B., Buzzelli, J., Stolz, J. F. and Oremland, R. S. 1998. Bacillus arsenicoselenatis sp. nov., and Bacillus selenitireducens sp. nov.: two haloalkaliphiles from Mono Lake, California that respire oxyanions of selenium and arsenic. Archives of microbiology, 171, 19-30.

Boulart, C., Chavagnac, V., Monnin, C., Delacour, A., Ceuleneer, G., and Hoareau, G. 2013. Differences in gas venting from ultramafic-hosted warm springs : the example of Oman and Voltri ophiolites. Ofioliti, 38: 142-156.

Boyd, E. S., Hamilton, T. L., Spear, J. R., Lavin, M., and Peters, J. W. 2010. [FeFe]- hydrogenase in Yellowstone National Park: evidence for dispersal limitation and phylogenetic niche conservatism. The ISME journal, 4, 1485-1495.

Boyd, E. S., Spear, J. R., and Peters, J. W. 2009. [FeFe]-hydrogenase genetic diversity provides insight into molecular adaptation in a saline microbial mat community. Applied and Environmental Microbiology, 75, 4620-4623.

Bradley, A.S., Fredricks, H., Hinrichs, K.-U., and Summons, R.E. 2009. Structural diversity of diether lipids in carbonate chimneys at the Lost City Hydrothermal Field. Organic Geochemistry, 40: 1169-1178.

Brazelton, J.W., Nelson, B., and Schrenk, M.O. 2012. Metagenomic evidence for H2 oxidation and H2 production by serpentinite-hosted subsurface microbial communities. Frontiers in Microbiology, 2.

Brazelton, W. J., Ludwig, K. A., Sogin, M. L., Andreishcheva, E. N., Kelley, D. S., Shen, C. C., Edwards, R. L. and Baross, J. A. 2010. Archaea and bacteria with surprising microdiversity show shifts in dominance over 1,000-year time scales in hydrothermal chimneys. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(4), 1612-1617.

Brazelton, W.J., Morrill, P.L., Szponar, N., and Schrenk, M.O. 2013. Bacterial Communities Associated with Subsurface Geochemical Processes in Continental Serpentinite Springs. Applied and Environmental Microbiology, 79: 3906-3916.

Bryantseva, I. A., Gorlenko, V. M., Kompantseva, E. I., and Imhoff, J. F. 2000. Thioalkalicoccus limnaeus gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic purple sulfur bacterium with bacteriochlorophyll b. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 50(6), 2157-2163.

Bryantseva, I. A., Gorlenko, V. M., Kompantseva, E. I., Tourova, T. P., Kuznetsov, B. B., and Osipov, G. A. 2000. Alkaliphilic heliobacterium Heliorestis baculata sp. nov. and emended description of the genus Heliorestis. Archives of microbiology, 174(4), 283-291.

187

Bryantseva, I., Gorlenko, V. M., Kompantseva, E. I., Imhoff, J. F., and Süling, J. 1999. Thiorhodospira sibirica gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic purple sulfur bacterium from a Siberian soda lake. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 49(2), 697-703.

Cabria, G. L. B., Argayosa, V. B., Lazaro, J. E. H., Argayosa, A. M., and Arcilla, C. A. 2014. Draft genome sequence of haloalkaliphilic Exiguobacterium sp. strain AB2 from Manleluag Ophiolitic Spring, Philippines. Genome announcements, 2(4), e00840-14.

Cai, J., Wu, Q., Wang, G. and Deng, C. 2013. Fermentative hydrogen production by a new mesophilic bacterium Clostridium sp. 6A-5 isolated from the sludge of a sugar mill. Renewable Energy, 59, 202-209.

Calusinska, M., Happe, T., Joris, B. and Wilmotte, A. 2010. The surprising diversity of clostridial hydrogenases: a comparative genomic perspective. Microbiology, 156, 1575-88.

Cao, G. L., Ren, N. Q., Zhang, K., Xu, C. J., and Liu, L. H. 2010. Direct convertion of cellulosic substrate to hydrogen production by Clostridium cellulosi D3. Journal of Biotechnology, 150, 563.

Cao, J., Zheng, L. and Chen, S. 1992. Screening of pectinase producer from alkalophilic bacteria and study on its potential application in degumming of ramie. Enzyme and microbial technology, 14, 1013-1016.

Cao, X., Liu, X., and Dong, X. 2003. Alkaliphilus crotonatoxidans sp. nov., a strictly anaerobic, crotonate-dismutating bacterium isolated from a methanogenic environment. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 53(4), 971-975.

Cappeletti, M., Zannoni, D., Postec, A. and Ollivier, B. 2014. Members of the order Thermotogales : from microbiology to hydrogen production. In: ZANNONI, D. and DE PHILIPPIS, R. (eds.) Microbial bioenergy : hydrogen production. Dordrecht Springer.

Cardace, D., Meyer-Dombard, D.A.R., Woycheese, K., and Arcilla, C.A. 2015. Feasible Metabolic Schema Associated with High pH Springs in the Philippines. Frontiers in Microbiology, 6.

Chader, S., Hacene, H., Belhamel, M., and Agathos, S. N. 2007. Procédés biologiques de production de l'hydrogène. Revue des Energies Renouvelables, 10(4), 497-505.

Charlou, J. L., Donval, J. P., Fouquet, Y., Jean-Baptiste, P. and Holm, N. 2002. Geochemistry of high H2 and CH4 vent fluids issuing from ultramafic rocks at the Rainbow hydrothermal field (36 14′ N, MAR). Chemical Geology, 191, 345-359.

Charlou, J., Donval, J. and Konn, C. 2008. High flux of hydrogen, abiogenic methane and heavier hydrocarbons from the slow-spreading Mid-Atlantic Ridge. EGU General Assembley, Journal of Geophysical Research Abstracts, 10.

188

Charlou, J.L., Donval, J.P., Fouquet, Y., Jean-Baptiste, P., and Holm, N. 2002. Geochemistry of high H2 and CH4 vent fluids issuing from ultramafic rocks at the Rainbow hydrothermal field (36°14'N, MAR). Chemical Geology, 191: 345-359.

Charlou, J.L., Donval, J.P., Konn, C., Ondréas, H., Fouquet, Y., Jean-Baptiste, P., and Fourré, E. 2010. High production and fluxes of H2 and CH4 and evidence of abiotic hydrocarbon synthesis by serpentinization in ultramafic-hosted hydrothermal systems on the Mid- Atlantic Ridge. Diversity of hydrothermal systems on slow spreading ocean ridges, 265- 296.

Chavagnac, V., Monnin, C., Ceuleneer, G., Boulart, C. and Hoareau, G. 2013. Characterization of hyperalkaline fluids produced by low-temperature serpentinization of mantle peridotites in the Oman and Ligurian ophiolites. Geochemistry Geophysics Geosystems, 14, 2496-2522.

Chen, S., Song, L., and Dong, X. 2006. Sporacetigenium mesophilum gen. nov., sp. nov., isolated from an anaerobic digester treating municipal solid waste and sewage. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 56(4), 721-725.

Chen, W. M., Tseng, Z. J., Lee, K. S., and Chang, J. S. 2005. Fermentative hydrogen production with Clostridium butyricum CGS5 isolated from anaerobic sewage sludge. International Journal of Hydrogen Energy, 30(10), 1063-1070.

Chen, W., Tseng, Z., Lee, K. and Chang, J. 2005. Fermentative hydrogen production with CGS5 isolated from anaerobic sewage sludge. International Journal of Hydrogen Energy, 30, 1063-1070.

Chrisostomos, S., Patel, B. K. C., Dwivedi, P. P., and Denman, S. E. 1996. Caloramator indicus sp. nov., a new thermophilic anaerobic bacterium isolated from the deep-seated nonvolcanically heated waters of an Indian artesian aquifer. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 46(2), 497-501.

Cluzel, D., Chiron, D. and Courme, M.-D. 1998. Discordance de l'Eocene superieur et evenements pre-obduction en Nouvelle-Caledonie. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences-Series IIA-Earth and Planetary Science, 327, 485-491.

Crespo-Medina, M., Twing, K.I., Kubo, M.D.Y., Hoehler, T.M., Cardace, D., McCollom, T., and Schrenk, M.O. 2014. Insights into environmental controls on microbial communities in a continental serpentinite aquifer using a microcosm-based approach. Frontiers in microbiology, 5: 604.

Curtis, A. C., Wheat, C. G., Fryer, P. and Moyer, C. L. 2013. Mariana Forearc Serpentinite Mud Volcanoes Harbor Novel Communities of Extremophilic Archaea. Geomicrobiology Journal, 30, 430-441.

Daae, F. L., Okland, I., Dahle, H., Jorgensen, S. L., Thorseth, I. H. and Pedersen, R. B. 2013. Microbial life associated with low-temperature alteration of ultramafic rocks in the Leka ophiolite complex. Geobiology, 11, 318-39.

189

Dadheech, P. K., Ballot, A., Casper, P., Kotut, K., Novelo, E., Lemma, B., Pr Schold, T. and Krienitz, L. 2010. Phylogenetic relationship and divergence among planktonic strains of Arthrospira (Oscillatoriales, Cyanobacteria) of African, Asian and American origin deduced by 16S-23S ITS and phycocyanin operon sequences. Phycologia, 49, 361-372.

Das, D. and Veziroglu, T. N. 2008. Advances in biological hydrogen production processes. International Journal of Hydrogen Energy, 33, 6046-6057.

Das, D., Dutta, T., Nath, K., Kotay, S. M., Das, A. K. and Veziroglu, T. N. 2006. Role of Fe- hydrogenase in biological hydrogen production. Current Science, 90, 1627-1637.

De Graaff, M., Bijmans, M. F., Abbas, B., Euverink, G.-J., Muyzer, G. and Janssen, A. J. 2011. Biological treatment of refinery spent caustics under halo-alkaline conditions. Bioresource technology, 102, 7257-7264.

Detkova, E. N., Zaĭchikova, M. V., and Kevbrin, V. V. 2008. Physiology and biochemistry of alkaliphilic anaerobic hydrolytic bacterium Alkaliflexus imshenetskii. Mikrobiologiia, 78(3), 310-316.

Douville, E., Charlou, J.L., Oelkers, E.H., Bienvenu, P., Colon, C.F.J., Donval, J.P., Fouquet, Y., Prieur, D., and Appriou, P. 2002. The rainbow vent fluids (36° 14' N, MAR): the influence of ultramafic rocks and phase separation on trace metal content in Mid- Atlantic Ridge hydrothermal fluids. Chemical Geology, 184: 37-48.

Downie, A. and Cruickshank, J. 1928. The resistance of Streptococcus faecalis to acid and alkaline media. British journal of experimental pathology, 9, 171.

Dulger, S., Demirbag, Z., and Belduz, A. O. 2004. Anoxybacillus ayderensis sp. nov. and Anoxybacillus kestanbolensis sp. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 54(5), 1499-1503.

Elias, D. A., Mormile, M. R., Begemann, M. B. and Wall, J. D. 2011. Fossil fuel-free process of lignocellulosic pretreatment with biological hydrogen production. Google Patents.

Engle, M., Li, Y., Rainey, F., DeBLOIS, S. U. Z. A. N. N. E., Mai, V., Reichert, A., and Wiegel, J. 1996. Thermobrachium celere gen. nov., sp. nov., a rapidly growing thermophilic, alkalitolerant, and proteolytic obligate anaerobe. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 46(4), 1025-1033.

Etiope, G., Schoell, M., and Hosgormez, H. 2011. Abiotic methane flux from the Chimaera seep and Tekirova ophiolites (Turkey): understanding gas exhalation from low temperature serpentinization and implications for Mars. Earth and Planetary Science Letters, 310: 96- 104.

Fardeau, M.-L., Faudon, C., Cayol, J.-L., Magot, M., Patel, B. and Ollivier, B. 1996. Effect of thiosulphate as electron acceptor on glucose and xylose oxidation by Thermoanaerobacter finnii and a Thermoanaerobacter sp. isolated from oil field water. Research in Microbiology, 147, 159-165.

190

Flores, G. E., Campbell, J. H., Kirshtein, J. D., Meneghin, J., Podar, M., Steinberg, J. I., Seewald, J. S., Tivey, M. K., Voytek, M. A., Yang, Z. K. and Reysenbach, A. L. 2011. Microbial community structure of hydrothermal deposits from geochemically different vent fields along the Mid-Atlantic Ridge. Environmental Microbiology, 13, 2158-71.

Fourmond, V., Baffert, C., Sybirna, K., Dementin, S., Abou-Hamdan, A., Meynial-Salles, I., Soucaille, P., Bottin, H. and Leger, C. 2013. The mechanism of inhibition by H2 of H2- evolution by hydrogenases. Chemical Communnications, 49, 6840-2.

Fritz, P., Clark, I. D., Fontes, J.-C., Whitticar, M. J. and Faber, E., 1992, Deuterium and 13C evidence for low temperature production of hydrogen and methane in a highly alkaline groundwater environment in Oman: in WaterRock Interaction (Kharaka and Maest, eds.), Balkema, Rotterdam, 793-796.

Fruh-Green, G.L., Kelley, D.S., Bernasconi, S.M., Karson, J.A., Ludwig, K.A., Butterfield, D.A., Boschi, C., and Proskurowski, G. 2003. 30,000 years of hydrothermal activity at the Lost City vent field. Science, 301: 495-498.

Fryer, P. 2012. Serpentinite Mud Volcanism: Observations, Processes, and Implications. Annual Review of Marine Science, Vol 4 4: 345-373.

Fryer, P., Gharib, J., Ross, K., Savov, I., and Mottl, M.J.C.Q. 2006. Variability in serpentinite mudflow mechanisms and sources: ODP drilling results on Mariana forearc seamounts. Geochemistry, Geophysics, Geosystems, 7: (8).

Fryer, P., Pearce, J. A., and Stokking, L. B. 1992. Short-chain organic acids in interstitial waters from Mariana and Bonin forearc serpentinites: Leg 1251. Texas Ocean Drilling Program: p 387–395. 22.

Garnova, E. S., Zhilina, T. N., Tourova, T. P., and Lysenko, A. M. 2003. Anoxynatronum sibiricum gen. nov., sp. nov. alkaliphilic saccharolytic anaerobe from cellulolytic community of Nizhnee Beloe (Transbaikal region). Extremophiles, 7(3), 213-220.

Garnova, E. S., Zhilina, T. N., Tourova, T. P., Kostrikina, N. A., and Zavarzin, G. A. 2004. Anaerobic, alkaliphilic, saccharolytic bacterium Alkalibacter saccharofermentans gen. nov., sp. nov. from a soda lake in the Transbaikal region of Russia. Extremophiles, 8(4), 309-316.

Gessesse, A. 1998. Purification and Properties of Two Thermostable Alkaline Xylanases from an Alkaliphilic Bacillus sp. Applied and Environmental Microbiology, 64, 3533-3535.

Goto, T., Matsuno, T., Hishinuma-Narisawa, M., Yamazaki, K., Matsuyama, H., Inoue, N. and Yumoto, I. 2005. Cytochrome c and bioenergetic hypothetical model for alkaliphilic Bacillus spp. Journal of bioscience and bioengineering, 100, 365-379.

Grant, W. 2006. Alkaline environments and biodiversity. Extremophiles; Encyclopedia of Life Support Systems (EOLSS). Oxford: EOLSS publishers.

191

Grant, W., Horikoshi, K., Herbert, R. and Sharp, R. 1992. Alkaliphiles: ecology and biotechnological applications. Molecular biology and biotechnology of extremophiles, 143- 162.

Grant, W., Mwatha, W. and Jones, B. 1990. Alkaliphiles: ecology, diversity and applications. FEMS Microbiology Reviews, 6, 255-269.

Guillon, J.-H. 1975. Les massifs péridotitiques de Nouvelle-Calédonie: type d'appareil ultrabasique stratiforme de chaîne récente, IRD Editions.

Guillot, S. and Hattori, K. 2013. Serpentinites: essential roles in geodynamics, arc volcanism, sustainable development, and the origin of life. Elements, 9(2), 95-98.

Guo, X. M., Trably, E., Latrille, E., Carrere, H. and Steyer, J.-P. 2010. Hydrogen production from agricultural waste by dark fermentation: a review. International Journal of Hydrogen Energy, 35, 10660-10673.

Gupta, S., Bhushan, B. and Hoondal, G. 2000. Isolation, purification and characterization of xylanase from Staphylococcus sp. SG‐13 and its application in biobleaching of kraft pulp. Journal of Applied Microbiology, 88, 325-334.

Hallenbeck, P. C. and Benemann, J. R. 2002. Biological hydrogen production; fundamentals and limiting processes. International Journal of Hydrogen Energy, 27, 1185-1193.

Hamamoto, T., Hashimoto, M., Hino, M., Kitada, M., Seto, Y., Kudo, T. and Horikoshi, K. 1994. Characterization of a gene responsible for the Na+/H+ antiporter system of alkalophilic Bacillus species strain C‐125. Molecular microbiology, 14, 939-946.

Herrmann, G., Jayamani, E., Mai, G. and Buckel, W. 2008. Energy conservation via electron- transferring flavoprotein in anaerobic bacteria. Journal of bacteriology, 190, 784-791.

Hoover, R. B., Pikuta, E. V., Bej, A. K., Marsic, D., Whitman, W. B., Tang, J., and Krader, P. 2003. Spirochaeta americana sp. nov., a new haloalkaliphilic, obligately anaerobic spirochaete isolated from soda Mono Lake in California. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 53(3), 815-821.

Horikoshi, K. 1991. Microorganisms in alkaline environments, Kodansha; VCH.

Horikoshi, K. 1996. Alkaliphiles—from an industrial point of view. FEMS Microbiology Reviews, 18, 259-270.

Horikoshi, K. 1999. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology. Microbiology and molecular biology reviews, 63, 735-750.

Horikoshi, K. 2004. Alkaliphiles. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 80, 166-178.

Horikoshi, K., Nakao, M., Kurono, Y. and Sashihara, N. 1984. Cellulases of an alkalophilic Bacillus strain isolated from soil. Canadian Journal of Microbiology, 30, 774-779.

192

Horino, H., Fujita, T., and Tonouchi, A. 2014. Description of Anaerobacterium chartisolvens gen. nov., sp. nov., an obligately anaerobic bacterium from Clostridium rRNA cluster III isolated from soil of a Japanese rice field, and reclassification of Bacteroides cellulosolvens Murray et al. 1984 as Pseudobacteroides cellulosolvens gen. nov., comb. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 64(4), 1296-1303.

Hosgormez, H., Etiope, G., and Yalçin, M.N. 2008. New evidence for a mixed inorganic and organic origin of the Olympic Chimaera fire (Turkey): a large onshore seepage of abiogenic gas. Geofluids, 8: 263-273.

Huang, H., Wang, S., Moll, J., and Thauer, R. K. 2012. Electron bifurcation involved in the energy metabolism of the acetogenic bacterium Moorella thermoacetica growing on glucose or H2 plus CO2. Journal of bacteriology, 194(14), 3689-3699.

Ishikawa, M., Nakajima, K., Itamiya, Y., Furukawa, S., Yamamoto, Y. and Yamasato, K. 2005. Halolactibacillus halophilus gen. nov., sp. nov. and Halolactibacillus miurensis sp. nov., halophilic and alkaliphilic marine lactic acid bacteria constituting a phylogenetic lineage in Bacillus rRNA group 1. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 55, 2427-2439.

Ito, S. 1997. Alkaline cellulases from alkaliphilic Bacillus: enzymatic properties, genetics, and application to detergents. Extremophiles, 1, 61-66.

Javor, B. 2012. Hypersaline environments: microbiology and biogeochemistry, Springer Science and Business Media.

Jayasinghearachchi, H. S., Singh, S., Sarma, P. M., Aginihotri, A., and Lal, B. 2010. Fermentative hydrogen production by new marine Clostridium amygdalinum strain C9 isolated from offshore crude oil pipeline. International Journal Of Hydrogen Energy, 35(13), 6665-6673.

Jones, B. E., Grant, W. D., Collins, N. C. and Mwatha, W. E. 1994. Alkaliphiles: diversity and identification. Bacterial diversity and systematics. Springer.

Jones, B. E., Grant, W. D., Duckworth, A. W. and Owenson, G. G. 1998. Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles, 2, 191-200.

Kanekar, P., Sarnaik, S. and Kelkar, A. 1998. Bioremediation of phenol by alkaliphilic bacteria isolated from alkaline lake of Lonar, India. Journal of applied microbiology, 85.

Keir, R.S. 2010. A note on the fluxes of abiogenic methane and hydrogen from mid-ocean ridges. Geophysical Research Letters, 37.

Kelley, D. S., Karson, J. A., Blackman, D. K., Früh-Green, G. L., Butterfield, D. A., Lilley, M. D., Olson, E. J., Schrenk, M. O., Roe, K. K., Lebon, G. T., Rivizzigno, P. and AT3-60 Shipboard Party. 2001. An off-axis hydrothermal vent field near the Mid-Atlantic Ridge at 30 N. Nature, 412(6843), 145-149.

193

Kelley, D. S., Karson, J. A., Fruh-Green, G. L., Yoerger, D. R., Shank, T. M., Butterfield, D. A., Hayes, J. M., Schrenk, M. O., Olson, E. J., Proskurowski, G., Jakuba, M., Bradley, A., Larson, B., Ludwig, K., Glickson, D., Buckman, K., Bradley, A. S., Brazelton, W. J., Roe, K., Elend, M., Delacour, A., Bernasconi, S. M., Lilley, M. D., Baross, J. A., Summons, R. E. and Sylva, S. P. 2005. A serpentinite-hosted ecosystem: the Lost City Hydrothermal Field. Science, 307, 1428-1434.

Kelley, D.S. 2005. From the mantle to microbes: The Lost City Hydrothermal Field. Oceanography, 18: 32–45.

Kevbrin, V. V., Lysenko, A. M., and Zhilina, T. N. 1997. Physiology of the alkaliphilic methanogen Z-7936, a new strain of Methanosalsus zhilinaeae isolated from Lake Magadi. MICROBIOLOGY-AIBS-C/C OF MIKROBIOLOGIIA, 66, 261-266.

Kevbrin, V. V., Zhilina, T. N., Rainey, F. A., and Zavarzin, G. A. 1998. Tindallia magadii gen. nov., sp. nov.: an alkaliphilic anaerobic ammonifier from soda lake deposits. Current microbiology, 37(2), 94-100.

Kevbrin, V., Boltyanskaya, Y., Garnova, E., and Wiegel, J. 2008. Anaerobranca zavarzinii sp. nov., an anaerobic, alkalithermophilic bacterium isolated from Kamchatka thermal fields. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 58(6), 1486-1491.

Kevbrin, V., Boltyanskaya, Y., Zhilina, T., Kolganova, T., Lavrentjeva, E., and Kuznetsov, B. 2013. Proteinivorax tanatarense gen. nov., sp. nov., an anaerobic, haloalkaliphilic, proteolytic bacterium isolated from a decaying algal bloom, and proposal of Proteinivoraceae fam. nov. Extremophiles, 17(5), 747-756.

Kitada, M., Kosono, S. and Kudo, T. 2000. The Na+/H+ antiporter of alkaliphilic Bacillus sp. Extremophiles, 4, 253-258.

Kivist, A., Santala, V. and Karp, M. 2010. Hydrogen production from glycerol using halophilic fermentative bacteria. Bioresource technology, 101, 8671-8677.

Klein, F., Humphris, S.E., Guo, W., Schubotz, F., Schwarzenbach, E.M., and Orsi, W.D. 2015. Fluid mixing and the deep biosphere of a fossil Lost City-type hydrothermal system at the Iberia Margin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 112: 12036-12041.

Kohl, L., Cumming, E., Cox, A., Rietze, A., Morrissey, L., Lang, S. Q., Richter, A., Suzuki, S., Nealson, K. H. and Morrill, P. L. 2016. Exploring the metabolic potential of microbial communities in ultra-basic, reducing springs at The Cedars, CA, USA: Experimental evidence of microbial methanogenesis and heterotrophic acetogenesis. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences, 121, 1203-1220.

Kompantseva, E., Komova, A., Krauzova, V., Kolganova, T. and Panteleeva, A. 2009. Purple nonsulfur bacteria in weakly and moderately mineralized soda lakes of the southern Transbaikal Region and northeastern Mongolia. Microbiology, 78, 246-253.

194

Kondo, Y., Minegishi, H., Echigo, A., Shimane, Y., Kamekura, M., Itoh, T., Ohkuma, M., Takahashi-Ando, N., Fukushima, Y., Yoshida, Y., and Usami, R. 2015. Halorubrum gandharaense sp. nov., an alkaliphilic haloarchaeon from commercial rock salt. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 65(8), 2345-2350.

Konn, C., Charlou, J.L., Holm, N.G., and Mousis, O. 2015. The Production of Methane, Hydrogen, and Organic Compounds in Ultramafic-Hosted Hydrothermal Vents of the Mid-Atlantic Ridge. Astrobiology, 15: 381-399.

Koskinen, P. E., Kaksonen, A. H. and Puhakka, J. A. 2007. The relationship between instability of H2 production and compositions of bacterial communities within a dark fermentation fluidised‐bed bioreactor. Biotechnology and bioengineering, 97, 742-758.

Kotelnikova, S., Macario, A. J., and Pedersen, K. 1998. Methanobacterium subterraneum sp. nov., a new alkaliphilic, eurythermic and halotolerant methanogen isolated from deep granitic groundwater. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 48(2), 357-367.

Krulwich, T. A. and Guffanti, A. A. 1989. Alkalophilic bacteria. Annual Reviews in Microbiology, 43, 435-463.

Krulwich, T., Federbush, J. G. and Guffanti, A. A. 1985. Presence of a nonmetabolizable solute that is translocated with Na+ enhances Na+-dependent pH homeostasis in an alkalophilic Bacillus. Journal of Biological Chemistry, 260, 4055-4058.

Krulwich, T., Hicks, D. B., Swartz, T. and Ito, M. 2007. Bioenergetic adaptations that support alkaliphily. Physiology and Biochemistry of Extremophiles, 24, 311-329.

Kumar, N. and Das, D. 2000. Enhancement of hydrogen production by Enterobacter cloacae IIT- BT 08. Process Biochemistry, 35, 589-593.

Künkel, A., Vorholt, J. A., Thauer, R. K. and Hedderich, R. 1998. An Escherichia coli hydrogenase ‐ 3 ‐ type hydrogenase in methanogenic archaea. European Journal of Biochemistry, 252, 467-476.

Lane, N., Allen, J. F. and Martin, W. 2010. How did LUCA make a living? Chemiosmosis in the origin of life. BioEssays, 32, 271-280.

Lang, S.Q., Butterfield, D.A., Schulte, M., Kelley, D.S., and Lilley, M.D. 2010. Elevated concentrations of formate, acetate and dissolved organic carbon found at the Lost City hydrothermal field. Geochimica et Cosmochimica Acta, 74: 941-952.

Lartaud, F., Little, C.T.S., de Rafelis, M., Bayon, G., Dyment, J., Ildefonse, B., Gressier, V., Fouquet, Y., Gaill, F.o., and Le Bris, N. 2011. Fossil evidence for serpentinization fluids fueling chemosynthetic assemblages. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108: 7698-7703.

195

Launay, J. 1981. Les sources hydrothermales de Prony. dans Dugas F., Debenay J.P., Carte sédimentologique et carte annexe du lagon de Nouvelle-Calédonie à 1 / 50 000. Feuille Prony. Paris : ORSTOM. notice explicative, 91: 17-19.

L'Haridon, S., Miroshnichenko, M. L., Kostrikina, N. A., Tindall, B. J., Spring, S., Schumann, P., Stackebrandt, E., Bonch-Osmolovskaya, E. A., and Jeanthon, C. 2006. Vulcanibacillus modesticaldus gen. nov., sp. nov., a strictly anaerobic, nitrate-reducing bacterium from deep-sea hydrothermal vents. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 56(5), 1047-1053.

Li, C. and Fang, H. H. 2007. Fermentative hydrogen production from wastewater and solid wastes by mixed cultures. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 37, 1-39.

Li, S., Lai, C., Cai, Y., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, J. and Wang, X. 2010. High efficiency hydrogen production from glucose/xylose by the ldh-deleted Thermoanaerobacterium strain. Bioresource technology, 101, 8718-8724.

Li, Y., Engle, M., Weiss, N., Mandelco, L., and Wiegel, J. 1994. Clostridium thermoalcaliphilum sp. nov., an anaerobic and thermotolerant facultative alkaliphile. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 44(1), 111-118.

Li, Y., Mandelco, L., and Wiegel, J. 1993. Isolation and characterization of a moderately thermophilic anaerobic alkaliphile, Clostridium paradoxum sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 43(3), 450-460.

Lin, L.-H., Hall, J., Onstott, T. C., Gihring, T., Sherwood Lollar, B., Boice, E., Pratt, L., Lippmann- Pipke, J. and Bellamy, R. E. S. 2006. Planktonic microbial communities associated with fracture-derived groundwater in a deep gold mine of South Africa. Geomicrobiology Journal, 23 475-497.

Lincoln, S.A., Bradley, A.S., Newman, S.A., and Summons, R.E. 2013. Archaeal and bacterial glycerol dialkyl glycerol tetraether lipids in chimneys of the Lost City Hydrothermal Field. Organic Geochemistry, 60: 45-53.

Lu, J., Nogi, Y. and Takami, H. 2001. Oceanobacillus iheyensis gen. nov., sp. nov., a deep-sea extremely halotolerant and alkaliphilic species isolated from a depth of 1050 m on the Iheya Ridge. FEMS microbiology letters, 205, 291-297.

Malamud, U. and Prialnik, D. 2013. Modeling serpentinization: Applied to the early evolution of Enceladus and Mimas. Icarus, 225, 763-774.

Marques, J. M., Carreira, P. M., Carvalho, M. R., Matias, M. J., Goff, F. E., Basto, M. J., Graca, R. C., Aires-Barros, L. and Rocha, L. 2008. Origins of high pH mineral waters from ultramafic rocks, Central Portugal. Applied Geochemistry, 23, 3278-3289.

Marques, J.M., Carreira, P.M., Carvalho, M.R.r., Matias, M.J., Goff, F.E., Basto, M.J., GraÃ§a, R.C., Aires-Barros, L.s., and Rocha, L.s. 2008. Origins of high pH mineral waters from ultramafic rocks, Central Portugal. Applied Geochemistry, 23: 3278-3289.

196

Martin, W., Baross, J., Kelley, D. and Russell, M. J. 2008. Hydrothermal vents and the origin of life. Nature Reviews Microbiology, 6, 805-814.

Masset, J., Hiligsmann, S., Hamilton, C., Beckers, L., Franck, F., and Thonart, P. 2010. Effect of pH on glucose and starch fermentation in batch and sequenced-batch mode with a recently isolated strain of hydrogen-producing Clostridium butyricum CWBI1009. International Journal of Hydrogen Energy, 35(8), 3371-3378.

Mathrani, I. M., Boone, D. R., Mah, R. A., Fox, G. E., and Lau, P. P. 1988. Methanohalophilus zhilinae sp. nov., an alkaliphilic, halophilic, methylotrophic methanogen. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 38(2), 139-142.

Maurizot, P., Vendé-Leclerc, M. 2009. Carte géologique de la Nouvelle-Calédonie au 1/500 000, Direction de l’Industrie, des Mines et de l’Energie, Service de la Géologie de Nouvelle- Calédonie, Bureau de Recherches Géologiques et Minières, Nouméa.

Mccollom, T. M. 2007. Geochemical constraints on sources of metabolic energy for chemolithoautotrophy in ultramafic-hosted deep-sea hydrothermal systems. Astrobiology, 7, 933-950.

Mccollom, T. M. and Seewald, J. S. 2013. Serpentinites, hydrogen, and life. Elements, 9, 129-134.

Mei, N., Zergane, N., Postec, A., Erauso, G., Ollier, A., Payri, C., Pelletier, B., Fardeau M.-L., Ollivier, B., and Quéméneur, M. 2014. Fermentative hydrogen production by a new alkaliphilic Clostridium sp.(strain PROH2) isolated from a shallow submarine hydrothermal chimney in Prony Bay, New Caledonia. International Journal of Hydrogen Energy, 39(34), 19465-19473.

Meier, T., Ferguson, S. A., Cook, G. M., Dimroth, P. and Vonck, J. 2006. Structural investigations of the membrane-embedded rotor ring of the F-ATPase from Clostridium paradoxum. Journal of bacteriology, 188, 7759-7764.

Melchert, B., Devey, C.W., German, C.R., Lackschewitz, K.S., Seifert, R., Walter, M., Mertens, C., Yoerger, D.R., Baker, E.T., Paulick, H., and Nakamura, K. 2008. First evidence for high-temperature off-axis venting of deep crustal/mantle heat: The Nibelungen hydrothermal field, southern Mid-Atlantic Ridge. Earth and Planetary Science Letters, 275: 61- 69.

Mesbah, N. M., Hedrick, D. B., Peacock, A. D., Rohde, M., and Wiegel, J. 2007. Natranaerobius thermophilus gen. nov., sp. nov., a halophilic, alkalithermophilic bacterium from soda lakes of the Wadi An Natrun, Egypt, and proposal of Natranaerobiaceae fam. nov. and Natranaerobiales ord. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 57(11), 2507-2512.

Meuer, J., Bartoschek, S., Koch, J., K Nkel, A. and Hedderich, R. 1999. Purification and catalytic properties of Ech hydrogenase from Methanosarcina barkeri. European Journal of Biochemistry, 265, 325-335.

197

Meyer, J. 2007. [FeFe] hydrogenases and their evolution: a genomic perspective. Cellular and molecular life sciences, 64, 1063-1084.

Monnin, C., Chavagnac, V., Boulart, C., M Nez, B., G Rard, M., G Rard, E., Pisapia, C., Qu M Neur, M., Erauso, G., Postec, A., Guentas-Dombrowski, L., Payri, C. and Pelletier, B. 2014. Fluid chemistry of the low temperature hyperalkaline hydrothermal system of Prony Bay (New Caledonia). Biogeosciences, 11, 5687-5706.

Mottl, M.J., Komor, S.C., Fryer, P., and Moyer, C.L. 2003. Deep-slab fuel extremophilic Archaea on a Mariana forearc serpentinite mud volcano: Ocean Drilling Program Leg 195. Geochemistry Geophysics Geosystems, 4.

Mulder, D. W., Shepard, E. M., Meuser, J. E., Joshi, N., King, P. W., Posewitz, M. C., and Peters, J. W. 2011. Insights into [FeFe]-hydrogenase structure, mechanism, and maturation. Structure, 19(8), 1038-1052.

Neal, C. And Stanger, G. 1983. Hydrogen generation from mantle source rocks in Oman. Earth and Planetary Science Letters, 66, 315-320.

Nealson, K. H., Inagaki, F. and Takai, K. 2005. Hydrogen-driven subsurface lithoautotrophic microbial ecosystems (SLiMEs): do they exist and why should we care? Trends in Microbiology, 13, 405-410.

Nelson, W. C., and Stegen, J. C. 2015. The reduced genomes of Parcubacteria (OD1) contain signatures of a symbiotic lifestyle. Frontiers in microbiology, 6.

Nguyen, T. A. D., Kim, J. P., Kim, M. S., Oh, Y. K. and Sim, S. J. 2008. Optimization of hydrogen production by hyperthermophilic eubacteria, Thermotoga maritima and Thermotoga neapolitana in batch fermentation. International Journal of Hydrogen Energy, 33, 1483- 1488.

Nicolas, A., Boudier, F., Ildefonse, B. and Ball, E. 2000. Accretion of Oman and United Arab Emirates ophiolite–Discussion of a new structural map. Marine Geophysical Researches, 21, 147-180.

Nisbet, E. and Sleep, N. 2001. The habitat and nature of early life. Nature, 409, 1083-1091.

Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H.-L., Chen, C.-C. and Yeh, K.-W. 1988. Purification and characterization of extracellular alkaline phosphatase from an alkalophilic bacterium. Agricultural and biological chemistry, 52, 1643-1647.

Okland, I., Huang, S., Dahle, H., Thorseth, I.H., and Pedersen, R.B. 2012. Low temperature alteration of serpentinized ultramafic rock and implications for microbial life. Chemical Geology, 318-319: 75-87.

Padan, E., Bibi, E., Ito, M. and Krulwich, T. A. 2005. Alkaline pH homeostasis in bacteria: new insights. Biochimica et Biophysica Acta, 1717, 67-88.

198

Pan, C. M., Fan, Y. T., Zhao, P., and Hou, H. W. 2008. Fermentative hydrogen production by the newly isolated Clostridium beijerinckii Fanp3. International Journal of Hydrogen Energy, 33(20), 5383-5391.

Pelletier, B., Chevillon, C., Menou, J., Butscher, J., Folcher, E., Geoffray, C., Bore, J. M., Panche, J. Y., Perrier, J. 2006. Plongées, forage et cartographie Baie du Prony et Banc Gail, lagon Sud de Nouvelle-Calédonie, campagne 2005-NC-PL du N.O. ALIS 13-17 Juin 2005 et cartographie baie du Prony et canal Woodin N.O. ALIS 25-26 September 2005: Nouméa IRD Sept. 2006. Missions Sci Terre, Géol-Géophys, 70.

Peters, J. W., Lanzilotta, W. N., Lemon, B. J., and Seefeldt, L. C. 1998. X-ray crystal structure of the Fe-only hydrogenase (CpI) from Clostridium pasteurianum to 1.8 angstrom resolution. Science, 282(5395), 1853-1858.

Peters, J. W., Schut, G. J., Boyd, E. S., Mulder, D. W., Shepard, E. M., Broderick, J. B., King, P. W., and Adams, M. W. 2015. [FeFe]-and [NiFe]-hydrogenase diversity, mechanism, and maturation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 1853(6), 1350-1369.

Pikuta, E. V. and Hoover, R. B. Potential application of anaerobic extremophiles for hydrogen production. Optical Science and Technology, the SPIE 49th Annual Meeting, 2004. International Society for Optics and Photonics, 203-214.

Pikuta, E. V., Hoover, R. B., Bej, A. K., Marsic, D., Detkova, E. N., Whitman, W. B., and Krader, P. 2003. Tindallia californiensis sp. nov., a new anaerobic, haloalkaliphilic, spore-forming acetogen isolated from Mono Lake in California. Extremophiles, 7(4), 327-334.

Pikuta, E. V., Hoover, R. B., Bej, A. K., Marsic, D., Whitman, W. B., and Krader, P. 2009. Spirochaeta dissipatitropha sp. nov., an alkaliphilic, obligately anaerobic bacterium, and emended description of the genus Spirochaeta Ehrenberg 1835. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 59(7), 1798-1804.

Pikuta, E. V., Itoh, T., Krader, P., Tang, J., Whitman, W. B., and Hoover, R. B. 2006. Anaerovirgula multivorans gen. nov., sp. nov., a novel spore-forming, alkaliphilic anaerobe isolated from Owens Lake, California, USA. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 56(11), 2623-2629.

Pikuta, E., Cleland, D. and Tang, J. 2003. Aerobic growth of Anoxybacillus pushchinoensis K1T: emended descriptions of A. pushchinoensis and the genus Anoxybacillus. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 53, 1561-1562.

Pikuta, E., Hoover, R. B., Marsic, D., Whitman, W., Cleland, D., Krader, P., and Six, N. F. 2002. Desulfonatronum paiuteum sp. nov.: A New Alkaliphilic, Sulfate-Reducing Bacterium, Isolated from Soda Mono Lake, California.

Pikuta, E., Lysenko, A., Chuvilskaya, N., Mendrock, U., Hippe, H., Suzina, N., Nikitin, D., Osipov, G., and Laurinavichius, K. 2000. Anoxybacillus pushchinensis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, alkaliphilic, moderately thermophilic bacterium from manure, and description

199

of Anoxybacillus flavitherms comb. nov. International Journal of Systematic and evolutionary microbiology, 50(6), 2109-2117.

Pikuta, E., Lysenko, A., Suzina, N., Osipov, G., Kuznetsov, B., Tourova, T., Akimenko, V., and Laurinavichius, K. 2000. Desulfotomaculum alkaliphilum sp. nov., a new alkaliphilic, moderately thermophilic, sulfate-reducing bacterium. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 50(1), 25-33.

Pikuta, E., Marsic, D., Hoover, R. B., Kevbrin, V., Whitman, W. B., Krader, P., Cleland, D., and Six, N. F. 2002. Tindallia Californiensis sp. nov.: A New Halo-Alkaliphilic Primary Anaerobe, Isolated from Meromictic soda Mono Lake in California and the Correction of Diagnosis for Genus Tindallia.

Pirard, C., Hermann, J. and O’neill, H. S. C. 2013. Petrology and geochemistry of the crust–mantle boundary in a nascent arc, Massif du Sud Ophiolite, New Caledonia, SW Pacific. Journal of Petrology, egt030.

Postec, A., Quemeneur, M., Bes, M., Mei, N., Benaissa, F., Payri, C., Pelletier, B., Monnin, C., Guentas-Dombrowsky, L., Ollivier, B., Gerard, E., Pisapia, C., Gerard, M., Menez, B. and Erauso, G. 2015. Microbial diversity in a submarine carbonate edifice from the serpentinizing hydrothermal system of the Prony Bay (New Caledonia) over a 6-year period. Frontiers in Microbiology, 6, 857.

Poudel, S., Tokmina-Lukaszewska, M., Colman, D. R., Refai, M., Schut, G. J., King, P. W., Maness, P. C., Adams, M. W., Peters, J. W., Bothner, B. and Boyd, E. S. 2016. Unification of [FeFe]-hydrogenases into three structural and functional groups. Biochimica et Biophysica Acta, 1860, 1910-1921.

Preiss, L., Hicks, D. B., Suzuki, S., Meier, T. and Krulwich, T. A. 2015. Alkaliphilic Bacteria with Impact on Industrial Applications, Concepts of Early Life Forms, and Bioenergetics of ATP Synthesis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 3, 75.

Proskurowski, G., Lilley, M.D., Seewald, J.S., Früh-Green, G.L., Olson, E.J., Lupton, J.E., Sylva, S.P., and Kelley, D.S. 2008. Abiogenic Hydrocarbon Production at Lost City Hydrothermal Field. Science, 319: 604-607.

Prowe, S. G., and Antranikian, G. 2001. Anaerobranca gottschalkii sp. nov., a novel thermoalkaliphilic bacterium that grows anaerobically at high pH and temperature. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 51(2), 457-465.

Quéméneur, M., Bes, M., Postec, A., Mei, N., Hamelin, J., Monnin, C., Chavagnac, V., Payri, C., Pelletier, B., Guentas-Dombrowsky, L., G Rard, M., Pisapia, C., G Rard, E., Ménez, B., Ollivier, B. and Erauso, G. 2014. Spatial distribution of microbial communities in the shallow submarine alkaline hydrothermal field of the Prony Bay, New Caledonia. Environmental Microbiology Reports, 6, 665-674.

Quéméneur, M., Hamelin, J., Latrille, E., Steyer, J.-P. and Trably, E. 2010. Development and application of a functional CE-SSCP fingerprinting method based on [Fe–Fe]-hydrogenase

200

genes for monitoring hydrogen-producing Clostridium in mixed cultures. International Journal of Hydrogen Energy, 35, 13158-13167.

Quéméneur, M., Hamelin, J., Latrille, E., Steyer, J.-P. and Trably, E. 2011. Functional versus phylogenetic fingerprint analyses for monitoring hydrogen-producing bacterial populations in dark fermentation cultures. international journal of hydrogen energy, 36, 3870-3879.

Quéméneur, M., Palvadeau, A., Postec, A., Monnin, C., Chavagnac, V., Ollivier, B. and Erauso, G. 2015. Endolithic microbial communities in carbonate precipitates from serpentinite- hosted hyperalkaline springs of the Voltri Massif (Ligurian Alps, Northern Italy). Environmental Science and Pollution Research, 22, 13613-13624.

Rajhi, H., Conthe, M., Puyol, D., Diaz, E. and Sanz, J. L. 2013. Dark fermentation: isolation and characterization of hydrogen-producing strains from sludges. International Microbiology, 16, 53-62.

Reddy, S. V., Aspana, S., Tushar, D. L., Sasikala, C. H., and Ramana, C. V. 2013. Spirochaeta sphaeroplastigenens sp. nov., a halo-alkaliphilic, obligately anaerobic spirochaete isolated from soda lake Lonar. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 63(6), 2223-2228.

Rizoulis, A., Milodowski, A.E., Morris, K., and Lloyd, J.R. 2014. Bacterial diversity in the hyperalkaline Allas Springs (Cyprus), a natural analogue for cementitious radioactive waste repository. Geomicrobiology Journal, 00-00.

Roussel, E.G., Konn, C., Charlou, J.-L., Donval, J.-P., Fouquet, Y., Querellou, J., Prieur, D., and Cambon Bonavita, M.-A. 2011. Comparison of microbial communities associated with three Atlantic ultramafic hydrothermal systems. FEMS Microbiology Ecology, 77: 647- 665.

Russell, M. J. and Hall, A. 1997. The emergence of life from iron monosulphide bubbles at a submarine hydrothermal redox and pH front. Journal of the Geological Society, 154, 377- 402.

Russell, M. J., Daniel, R. M., Hall, A. J. and Sherringham, J. 1994. A hydrothermally precipitated catalytic iron sulphide membrane as a first step toward life. Journal of Molecular Evolution, 39, 231–243.

Russell, M.J., Hall, A.J., and Martin, W. 2010. Serpentinization as a source of energy at the origin of life. Geobiology, 8: 355-371.

Saeki, K., Ozaki, K., Kobayashi, T. and Ito, S. 2007. Detergent alkaline proteases: enzymatic properties, genes, and crystal structures. Journal of Bioscience and Bioengineering, 103, 501-508.

Sánchez-Murillo, R., Gazel, E., Schwarzenbach, E.M., Crespo-Medina, M., Schrenk, M.O., Boll, J., and Gill, B.C. 2014. Geochemical evidence for active tropical serpentinization in the

201

Santa Elena Ophiolite, Costa Rica: An analog of a humid early Earth? Geochemistry, Geophysics, Geosystems, 15: 1783-1800.

Sarethy, I. P., Saxena, Y., Kapoor, A., Sharma, M., Sharma, S. K., Gupta, V. and Gupta, S. 2011. Alkaliphilic bacteria: applications in industrial biotechnology. Journal of industrial microbiology and biotechnology, 38, 769-790.

Schleifer, K. H. and Kilpper-B Lz, R. 1984. Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the Genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 34, 31-34.

Schmidt, K., Garbe-Schönberg, D., Koschinsky, A., Strauss, H., Jost, C.L., Klevenz, V., and Königer, P. 2011. Fluid elemental and stable isotope composition of the Nibelungen hydrothermal field (8°18'S, Mid-Atlantic Ridge): Constraints on fluid-rock interaction in heterogeneous lithosphere. Chemical Geology, 280: 1-18.

Schmidt, O., Drake, H. L. and Horn, M. A. 2010. Hitherto unknown [Fe-Fe]-hydrogenase gene diversity in anaerobes and anoxic enrichments from a moderately acidic fen. Applied and environmental microbiology, 76, 2027-2031.

Schrenk, M. O., Brazelton, W. J. and Lang, S. Q. 2013. Serpentinization, Carbon, and Deep Life. Reviews in Mineralogy and Geochemistry, 75, 575-606.

Schuchmann, K. and M Ller, V. 2012. A bacterial electron-bifurcating hydrogenase. Journal of Biological Chemistry, 287, 31165-31171.

Schulte, M., Blake, D., Hoehler, T., and McCollom, T. 2006. Serpentinization and its implications for life on the early Earth and Mars. Astrobiology, 6: 364-376.

Schut, G. J., and Adams, M. W. 2009. The iron-hydrogenase of Thermotoga maritima utilizes ferredoxin and NADH synergistically: a new perspective on anaerobic hydrogen production. Journal of bacteriology, 191(13), 4451-4457.

Shikata, S., Saeki, K., Okoshi, H., Yoshimatsu, T., Ozaki, K., Kawai, S. and Ito, S. 1990. Alkaline cellulases for laundry detergents: production by alkalophilic strains of Bacillus and some properties of the crude enzymes. Agricultural and Biological Chemistry, 54, 91-96.

Shima, S. and Thauer, R. K. 2007. A third type of hydrogenase catalyzing H2 activation. The Chemical Record, 7, 37-46.

Singh, S. 1995. Partial purification and some properties of urease from the alkaliphilic cyanobacterium Nostoc calcicola. Folia microbiologica, 40, 529-533.

Sleep, N. H., Bird, D. K. and Pope, E. C. 2011. Serpentinite and the dawn of life. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 366, 2857-2869.

202

Sleep, N.H., Meibom, A., Fridriksson, T., Coleman, R.G., and Bird, D.K. 2004. H2-rich fluids from serpentinization: Geochemical and biotic implications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101: 12818-12823.

Slobodkin, A. I., Tourova, T. P., Kostrikina, N. A., Chernyh, N. A., Bonch-Osmolovskaya, E. A., Jeanthon, C., and Jones, B. E. 2003. Tepidibacterthalassicus gen. nov., sp. nov., a novel moderately thermophilic, anaerobic, fermentative bacterium from a deep-sea hydrothermal vent. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 53(4), 1131-1134.

Slonczewski, J. L., Fujisawa, M., Dopson, M. and Krulwich, T. A. 2009. Cytoplasmic pH Measurement and Homeostasis in Bacteria and Archaea. Advances in microbial physiology, 55, 1-317.

Sokolova, T. G., Kostrikina, N. A., Chernyh, N. A., Kolganova, T. V., Tourova, T. P., and Bonch- Osmolovskaya, E. A. 2005. Thermincola carboxydiphila gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, carboxydotrophic, hydrogenogenic bacterium from a hot spring of the Lake Baikal area. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 55(5), 2069-2073.

Sompong, O., Prasertsan, P., Karakashev, D., and Angelidaki, I. 2008. Thermophilic fermentative hydrogen production by the newly isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum PSU-2. International Journal of Hydrogen Energy, 33(4), 1204- 1214.

Sorokin, D. Y., Abbas, B., Merkel, A. Y., Rijpstra, W. I. C., Damsté, J. S. S., Sukhacheva, M. V., and van Loosdrecht, M. C. 2015. Methanosalsum natronophilum sp. nov., and Methanocalculus alkaliphilus sp. nov., haloalkaliphilic methanogens from hypersaline soda lakes. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 65(10), 3739- 3745.

Sorokin, D. Y., Chernyh, N. A., and Poroshina, M. N. 2015. Desulfonatronobacter acetoxydans sp. nov.: a first acetate-oxidizing, extremely salt-tolerant alkaliphilic SRB from a hypersaline soda lake. Extremophiles, 19(5), 899-907.

Sorokin, D. Y., Foti, M., Tindall, B. J., and Muyzer, G. 2007. Desulfurispirillum alkaliphilum gen. nov. sp. nov., a novel obligately anaerobic sulfur-and dissimilatory nitrate-reducing bacterium from a full-scale sulfide-removing bioreactor. Extremophiles, 11(2), 363-370.

Sorokin, D. Y., Panteleeva, A. N., Tourova, T. P., Kaparullina, E. N., and Muyzer, G. 2011. Natronoflexus pectinivorans gen. nov. sp. nov., an obligately anaerobic and alkaliphilic fermentative member of Bacteroidetes from soda lakes. Extremophiles, 15(6), 691-696.

Sorokin, D. Y., Tourova, T. P., Henstra, A. M., Stams, A. J., Galinski, E. A., and Muyzer, G. 2008. Sulfidogenesis under extremely haloalkaline conditions by Desulfonatronospira thiodismutans gen. nov., sp. nov., and Desulfonatronospira delicata sp. nov.–a novel lineage of Deltaproteobacteria from hypersaline soda lakes. Microbiology, 154(5), 1444- 1453.

203

Sorokin, D. Y., Tourova, T. P., Mußmann, M., and Muyzer, G. 2008. Dethiobacter alkaliphilus gen. nov. sp. nov., and Desulfurivibrio alkaliphilus gen. nov. sp. nov.: two novel representatives of reductive sulfur cycle from soda lakes. Extremophiles, 12(3), 431-439.

Sorokin, D. Y., Tourova, T. P., Sukhacheva, M. V., and Muyzer, G. 2012. Desulfuribacillus alkaliarsenatis gen. nov. sp. nov., a deep-lineage, obligately anaerobic, dissimilatory sulfur and arsenate-reducing, haloalkaliphilic representative of the order Bacillales from soda lakes. Extremophiles, 16(4), 597-605.

Sorokin, I. D., Zadorina, E. V., Kravchenko, I. K., Boulygina, E. S., Tourova, T. P., and Sorokin, D. Y. 2008. Natronobacillus azotifigens gen. nov., sp. nov., an anaerobic diazotrophic haloalkaliphile from soda-rich habitats. Extremophiles, 12(6), 819-827.

Sravanthi, T., Tushar, L., Sasikala, C., and Ramana, C. V. 2015. Spirochaeta odontotermitis sp. nov., an obligately anaerobic, cellulolytic, halotolerant, alkaliphilic spirochaete isolated from the termite Odontotermes obesus (Rambur) gut. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 65(12), 4589-4594.

Stolz, J. F., Perera, E., Kilonzo, B., Kail, B., Crable, B., Fisher, E., Ranganathan, M., Wormer, L., and Basu, P. 2007. Biotransformation of 3-nitro-4-hydroxybenzene arsonic acid (roxarsone) and release of inorganic arsenic by Clostridium species. Environmental Science and Technology, 41(3), 818-823.

Suzuki, S., Ishii, S. I., Wu, A., Cheung, A., Tenney, A., Wanger, G., Kuenen, J. G. and Nealson, K. H. 2013. Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem. Proceedings of the National Academy of Sciences.

Suzuki, S., Kuenen, J. G., Schipper, K., Van Der Velde, S., Ishii, S., Wu, A., Sorokin, D. Y., Tenney, A., Meng, X., Morrill, P. L., Kamagata, Y., Muyzer, G. and Nealson, K. H. 2014. Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site. Nature Communication, 5, 3900.

Svetlitshnyi, V., Rainey, F., and Wiegel, J. 1996. Thermosyntropha lipolytica gen. nov., sp. nov., a lipolytic, anaerobic, alkalitolerant, thermophilic bacterium utilizing short-and long-chain fatty acids in syntrophic coculture with a methanogenic archaeum. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 46(4), 1131-1137.

Szponar, N., Brazelton, W.J., Schrenk, M.O., Bower, D.M., Steele, A., and Morrill, P.L. 2013. Geochemistry of a continental site of serpentinization, the Tablelands Ophiolite, Gros Morne National Park: A Mars analogue. Icarus, 224: 286-296.

Tai, J., Adav, S. S., Su, A., and Lee, D. J. 2010. Biological hydrogen production from phenol- containing wastewater using Clostridium butyricum. International Journal of Hydrogen Energy, 35(24), 13345-13349.

Takai, K., Gamo, T., Tsunogai, U., Nakayama, N., Hirayama, H., Nealson, K., and Horikoshi, K. (2004) Geochemical and microbiological evidence for a hydrogen-based,

204

hyperthermophilic subsurface lithoautotrophic microbial ecosystem (HyperSLiME) beneath an active deep-sea hydrothermal field. Extremophiles, 8: 269-282.

Takai, K., Hirayama, H., Nakagawa, T., Suzuki, Y., Nealson, K. H. and Horikoshi, K. 2005. Lebetimonas acidiphila gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic, acidophilic, hydrogen- oxidizing chemolithoautotroph within the 'Epsilonproteobacteria', isolated from a deep-sea hydrothermal fumarole in the Mariana Arc. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55, 183-189.

Takai, K., Moser, D. P., Onstott, T. C., Spoelstra, N., Pfiffner, S. M., Dohnalkova, A., and Fredrickson, J. K. Auriminutor transvaalensis gen. nov., sp. nov., an Extremely Alkaliphilic Bacterium Isolated from a Deep South African Gold Mine.

Takai, K., Moyer, C. L., Miyazaki, M., Nogi, Y., Hirayama, H., Nealson, K. H., and Horikoshi, K. 2005. Marinobacter alkaliphilus sp. nov., a novel alkaliphilic bacterium isolated from subseafloor alkaline serpentine mud from Ocean Drilling Program Site 1200 at South Chamorro Seamount, Mariana Forearc. Extremophiles, 9(1), 17-27.

Tersteegen, A. and Hedderich, R. 1999. Methanobacterium thermoautotrophicum encodes two multisubunit membrane‐bound [NiFe] hydrogenases. European Journal of Biochemistry, 264, 930-943.

Tiago, I., and Veríssimo, A. 2013. Microbial and functional diversity of a subterrestrial high pH groundwater associated to serpentinization. Environmental microbiology, 15(6), 1687- 1706.

Tiago, I., Mendes, V., Pires, C., Morais, P.V., and Verissimo, A. 2006a. Chimaereicella alkaliphila gen. nov., sp. nov., a Gram-negative alkaliphilic bacterium isolated from a nonsaline alkaline groundwater. Systematic and Applied Microbiology, 29: 100-108.

Tiago, I., Morais, P.V., da Costa, M.S., and Verissimo, A. 2006b. Microcella alkaliphila sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a non-saline alkaline groundwater, and emended description of the genus Microcella. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56: 2313-2316

Tiago, I., Pires, C., Mendes, V., Morais, P.V., da Costa, M.S., and Verissimo, A. 2006c. Bacillus foraminis sp. nov., isolated from a non-saline alkaline groundwater. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56: 2571-2574.

Tindall, B., Ross, H. and Grant, W. 1984. Natronobacterium gen. nov. and Natronococcus gen. nov., two new genera of haloalkaliphilic archaebacteria. Systematic and Applied Microbiology, 5, 41-57.

Ulukanli, Z. and Diğrak, M. 2002. Alkaliphilic micro-organisms and habitats. Turkish Journal of Biology, 26, 181-191.

Valdez-Vazquez, I. and Poggi-Varaldo, H. M. 2009. Hydrogen production by fermentative consortia. Renewable and sustainable energy reviews, 13, 1000-1013.

205

Vance, S., Harnmeijer, J., Kimura, J., Hussmann, H., Demartin, B. and Brown, J. M. 2007. Hydrothermal systems in small ocean planets. Astrobiology, 7, 987-1005.

Vignais, P. and Colbeau, A. 2004. Molecular biology of microbial hydrogenases. Current issues in molecular biology, 6, 159-188.

Vignais, P. M., Billoud, B. and Meyer, J. 2001. Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS microbiology reviews, 25, 455-501.

Wang, J. and Wan, W. 2009. Factors influencing fermentative hydrogen production: a review. International journal of hydrogen energy, 34, 799-811.

Wang, S., Huang, H., Kahnt, J. and Thauer, R. K. 2013b. A reversible electron-bifurcating ferredoxin-and NAD-dependent [FeFe]-hydrogenase (HydABC) in Moorella thermoacetica. Journal of bacteriology, 195, 1267-1275.

Wang, S., Huang, H., Kahnt, J., Mueller, A. P., K Pke, M. and Thauer, R. K. 2013a. NADP-specific electron-bifurcating [FeFe]-hydrogenase in a functional complex with formate dehydrogenase in Clostridium autoethanogenum grown on CO. Journal of bacteriology, 195, 4373-4386.

Wang, X., and Jin, B. 2009. Process optimization of biological hydrogen production from molasses by a newly isolated Clostridium butyricum W5. Journal of bioscience and bioengineering, 107(2), 138-144.

Wang, X., Ouyang, Z., Zhuo, S., Zhang, M., Zheng, G., and Wang, Y. 2014. Serpentinization, abiogenic organic compounds, and deep life. Science China Earth Sciences, 57: 878-887.

Warr, S., Reed, R., Chudek, J., Foster, R. and Stewart, W. 1985. Osmotic adjustment in Spirulina platensis. Planta, 163, 424-429.

Watthanalamloet, A., Tachaapaikoon, C., Lee, Y. S., Kosugi, A., Mori, Y., Tanasupawat, S., Kyu, K. L., and Ratanakhanokchai, K. 2012. Cellulosibacter alkalithermophilus gen. nov., sp. nov., an anaerobic alkalithermophilic, cellulolytic-xylanolytic bacterium isolated from soil of a coconut garden. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 62(10), 2330-2335.

Weisser, J. and Trüper, H. G. 1985. Osmoregulation in a new haloalkaliphilic Bacillus from the Wadi Natrun (Egypt). Systematic and applied microbiology, 6, 7-11.

Woycheese, K.M., Meyer-Dombard, D.A.R., Cardace, D., Argayosa, A.M., and Arcilla, C.A. 2015. Out of the dark: transitional subsurface-to-surface microbial diversity in a terrestrial serpentinizing seep (Manleluag, Pangasinan, the Philippines). Frontiers in microbiology, 6: 44.

Wu, X. Y., Shi, K. L., Xu, X. W., Wu, M., Oren, A., and Zhu, X. F. 2010. Alkaliphilus halophilus sp. nov., a strictly anaerobic and halophilic bacterium isolated from a saline lake, and

206

emended description of the genus Alkaliphilus. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 60(12), 2898-2902.

Xing, D., Ren, N. and Rittmann, B. E. 2008. Genetic diversity of hydrogen-producing bacteria in an acidophilic ethanol-H2-coproducing system, analyzed using the [Fe]-hydrogenase gene. Applied and environmental microbiology, 74, 1232-1239.

Xu, J. F., Ren, N. Q., Wang, A. J., Qiu, J., Zhao, Q. L., Feng, Y. J., and Liu, B. F. 2010. Cell growth and hydrogen production on the mixture of xylose and glucose using a novel strain of Clostridium sp. HR-1 isolated from cow dung compost. International Journal of Hydrogen Energy, 35(24), 13467-13474.

Yoshihara, K. and Kobayashi, Y. 1982. Retting of Mitsumata bast by alkalophilic bacillus in papermaking. Agricultural and Biological Chemistry, 46, 109-117.

Yumoto, I., Yamaga, S., Sogabe, Y., Nodasaka, Y., Matsuyama, H., Nakajima, K. and Suemori, A. 2003. Bacillus krulwichiae sp. nov., a halotolerant obligate alkaliphile that utilizes benzoate and m-hydroxybenzoate. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 53, 1531-1536.

Zavarzina, D. G., Tourova, T. P., Kolganova, T. V., Boulygina, E. S., and Zhilina, T. N. 2009. Description of Anaerobacillus alkalilacustre gen. nov., sp. nov.—Strictly anaerobic diazotrophic bacillus isolated from soda lake and transfer of Bacillus arseniciselenatis, Bacillus macyae, and Bacillus alkalidiazotrophicus to Anaerobacillus as the new combinations A. arseniciselenatis comb. nov., A. macyae comb. nov., and A. alkalidiazotrophicus comb. nov. Microbiology, 78(6), 723-731.

Zavarzina, D. G., Zhilina, T. N., Kuznetsov, B. B., Kolganova, T. V., Osipov, G. A., Kotelev, M. S., and Zavarzin, G. A. 2013. Natranaerobaculum magadiense gen. nov., sp. nov., an anaerobic, alkalithermophilic bacterium from soda lake sediment. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 63(12), 4456-4461.

Zhao, B., and Chen, S. 2012. Alkalitalea saponilacus gen. nov., sp. nov., an obligately anaerobic, alkaliphilic, xylanolytic bacterium from a meromictic soda lake. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 62(11), 2618-2623.

Zhao, X., Xing, D., Fu, N., Liu, B., and Ren, N. 2011. Hydrogen production by the newly isolated Clostridium beijerinckii RZF-1108. Bioresource technology, 102(18), 8432-8436.

Zheng, Y., Kahnt, J., Kwon, I. H., Mackie, R. I. and Thauer, R. K. 2014. Hydrogen formation and its regulation in Ruminococcus albus: involvement of an electron-bifurcating [FeFe]- hydrogenase, of a non-electron-bifurcating [FeFe]-hydrogenase, and of a putative hydrogen-sensing [FeFe]-hydrogenase. Journal of bacteriology, 196, 3840-3852.

Zhilina, T. N., Appel, R., Probian, C., Brossa, E. L., Harder, J., Widdel, F., and Zavarzin, G. A. 2004. Alkaliflexus imshenetskii gen. nov. sp. nov., a new alkaliphilic gliding carbohydrate- fermenting bacterium with propionate formation from a soda lake. Archives of microbiology, 182(2-3), 244-253.

207

Zhilina, T. N., Detkova, E. N., Rainey, F. A., Osipov, G. A., Lysenko, A. M., Kostrikina, N. A., and Zavarzin, G. A. 1998. Natronoincola histidinovorans gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic acetogenic anaerobe. Current microbiology, 37(3), 177-185.

Zhilina, T. N., Garnova, E. S., Tourova, T. P., Kostrikina, N. A., and Zavarzin, G. A. 2001. Halonatronum saccharophilum gen. nov. sp. nov.: a new haloalkaliphilic bacterium of the order Haloanaerobiales from Lake Magadi. Microbiology, 70(1), 64-72.

Zhilina, T. N., Zavarzin, G. A., Detkova, E. N., and Rainey, F. A. 1996. Natroniella acetigena gen. nov. sp. nov., an extremely haloalkaliphilic, homoacetic bacterium: a new member of Haloanaerobiales. Current microbiology, 32(6), 320-326.

Zhilina, T. N., Zavarzin, G. A., Rainey, F. A., Pikuta, E. N., Osipov, G. A., and Kostrikina, N. A. 1997. Desulfonatronovibrio hydrogenovorans gen. nov., sp. nov., an alkaliphilic, sulfate- reducing bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 47(1), 144-149.

Zhilina, T. N., Zavarzin, G. A., Rainey, F., Kevbrin, V. V., Kostrikina, N. A., and Lysenko, A. M. 1996. Spirochaeta alkalica sp. nov., Spirochaeta africana sp. nov., and Spirochaeta asiatica sp. nov., alkaliphilic anaerobes from the continental soda lakes in Central Asia and the East African Rift. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 46(1), 305-312.

Zhilina, T. N., Zavarzina, D. G., Kevbrin, V. V., and Kolganova, T. V. 2013. Methanocalculus natronophilus sp. nov., a new alkaliphilic hydrogenotrophic methanogenic archaeon from a soda lake, and proposal of the new family Methanocalculaceae. Microbiology, 82(6), 698-706.

Zhilina, T. N., Zavarzina, D. G., Kolganova, T. V., Lysenko, A. M., and Tourova, T. P. 2009. Alkaliphilus peptidofermentans sp. nov., a new alkaliphilic bacterial soda lake isolate capable of peptide fermentation and Fe (III) reduction. Microbiology, 78(4), 445-454.

Zhilina, T. N., Zavarzina, D. G., Kolganova, T. V., Tourova, T. P., and Zavarzin, G. A. 2005. “Candidatus Contubernalis alkalaceticum” an obligately syntrophic alkaliphilic bacterium capable of anaerobic acetate oxidation in a coculture with Desulfonatronum cooperativum. Microbiology, 74(6), 695-703.

Zhilina, T. N., Zavarzina, D. G., Kuever, J., Lysenko, A. M., and Zavarzin, G. A. 2005. Desulfonatronum cooperativum sp. nov., a novel hydrogenotrophic, alkaliphilic, sulfate- reducing bacterium, from a syntrophic culture growing on acetate. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 55(3), 1001-1006.

Zhilina, T. N., Zavarzina, D. G., Osipov, G. A., Kostrikina, N. A., and Tourova, T. P. 2009. Natronincola ferrireducens sp. nov., and Natronincola peptidovorans sp. nov., new anaerobic alkaliphilic peptolytic iron-reducing bacteria isolated from soda lakes. Microbiology, 78(4), 455-467.

208

Zhilina, T., Garnova, E., Tourova, T., Kostrikina, N. and Zavarzin, G. 2001. Amphibacillus fermentum sp. nov. and Amphibacillus tropicus sp. nov., New Alkaliphilic, Facultatively Anaerobic, Saccharolytic Bacilli from Lake Magadi. Microbiology, 70, 711-722.

209