P1-001 白癬症起因菌の同定に対する Nucleotide tag P1-002 MLVA typing of Leptospira interrogans and L. 配列の有用性 borgpetersenii isolated from small mammals in East Asia ○山西 千晶1，佐藤 一朗1，佐野 文子3，中村 郁郎2，槇村 浩一1（1帝 ○小泉 信夫1，泉谷 秀昌1，Jung-Jung Mu2，岡野 祥3，中島 千絵4， 京大・医・大学院・宇宙環境・医・研究室，2千葉大・園芸・大学院， 鈴木 定彦4，武藤（水谷）麻紀1,5，大西 真1（1感染研・細菌第一， 3琉球大・農学部） 2Taiwan CDC，3沖縄衛環研・感染症，4北大人獣センター・バイオリソー ス，5関東学院大・理工・生命） Utilization of the RNA polymerase I partial sequence ○Nobuo Koizumi1, Hidemasa Izumiya1, Jung-Jung Mu2, Shou (Ntag) as a molecular marker of dermatophytes 3 4 4 1,5 ○ 1 1 3 2 Okano , Chie Nakajima , Yasuhiko Suzuki , Maki Muto Mizutani , Chiaki Yamanishi , Kazuo Sato , Ayako Sano , Ikuo Nakamura , 1 1 2 3 1 1 Makoto Ohnishi ( Dept. Bacteriolo. I, NIID, Taiwan CDC, Dept. Koichi Makimura ( Lab. Space Environ. Med., Grad. Sch. Med, 4 2 3 Biol. Sci., Okinawa Pref. Inst. Health Environ., Div. Bioresources, Teikyo Univ., Horticul., Grad. Sch., Chiba Univ., Dept. Agriculture, 5 Ryukyus Univ.) Hokkaido Univ. CZC, Dept. Biosci., Kanto Gakuin Univ.)

近年，RNA ポリメラーゼ I 複合体を構成する最大サブユニット Leptospira spp. are the causative agents of a worldwide zoonosis, （POLA1）の C 末端領域に存在するアミノ酸配列（Protein tag, leptospirosis, maintained by various mammals. We investigated the Ptag）が，真核生物の系統関係を反映し，また種特異性を示す事 molecular characteristics of L. interrogans and L. borgpetersenii which が報告された。Ntag は Ptag をコードする DNA 塩基配列を指し， were isolated from small feral and wild animals in Japan, Philippines, 同様に高い種特異性を示す。白癬の起因菌は系統的に極めて近 Taiwan, and Vietnam using multiple-locus variable-number tandem 縁関係にあり，既存の同定マーカー（Internal transcribed spacer repeat analysis (MLVA). 1 等）で分類された DNA 塩基配列も酷似している。そのため分 MLVA using 11 and four loci were performed on 110 L. interrogans 子系統解析の実施および種の同定指標として用いる場合，他に and 52 L. borgpetersenii, respectively. In L. interrogans, serogroups 数種類の DNA 塩基配列を解析する必要があり，時間的・経済 Autumnalis and Hebdomadis appeared more genetically diverse than 的な問題があった。Ntag 配列は種特異性が高いので，この問題 serogroups Bataviae, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Pomona, を解決する可能性がある。そこで今回我々は，Ntag 配列を用い or Pyrogenes. The former serogroup strains with the exception of た白癬菌の種間変異と種内変異について，分子系統解析を行い， one Hebdomadis strain were isolated from Apodemus speciosus while 既存の分子系統と比較することによって，Ntag 配列の白癬症起 all the latter serogroup strains with the exception of Grippotyphosa 因菌に対する系統分類と菌種同定の有用性を検証した。 were isolated from Rattus norvegicus. L. borgpetersenii was isolated （会員外共同研究者：中村郁郎 千葉大学大学院園芸学研究科） from at least 11 animal species while L. interrogans was isolated from five species, which may suggest a wider host range for L. borgpetersenii. Broad host preference in a single genotype was also observed, which colonized not only different species of the same genera but multiple animal genera. This study demonstrates that there may be variability in the range of genetic diversity among different Leptospira serogroups, which may be attributed to maintenance host animals and environmental factors.

P1-003 Mycobacterium avium の系統分岐に伴う大規 P1-004 フサオマキザル口腔から分離された新菌種 模なゲノム構造の変化 Streptococcus oricebi の解析 ○岩本 朋忠1，矢野 大和2，西内 由紀子3，有川 健太郎1，中島 千絵4， ○齋藤 真規，桑原 紀子，續橋 治，小林 良喜，落合 智子（日大・松 鈴木 定彦4，丸山 史人5（1神戸市環保研・感染症部，2東大・新領域・ 戸歯・微生物免疫） メディカルゲノム，3大阪市大・医・刀根山結核，4北大人獣センター・ バイオリソース，5京大・医・微生物感染） Streptococcus oricebi sp. nov., isolated from the oral cavity of tufted capuchin Changes in genomic architecture of Mycobacterium ○Masanori Saito, Noriko Kuwahara, Osamu Tsuzukibashi, Ryoki avium at the point of phylogenetic diversification Kobayashi, Tomoko Ochiai (Dept. Microbiol. Immunol., Sch. Dent. ○Tomotada Iwamoto1, Hirokazu Yano2, Yukiko Nishiuchi3, Kentaro Matsudo, Nihon Univ.) Arikawa1, Chie Nakajima4, Yasuhiko Suzuki4, Fumito Maruyama5 (1Dept. Infect. Dis., Kobe. Inst. Heal., 2Grad. Sch. Front. Sci., Univ. A Gram-positive, catalase-negative, coccus-shaped organism was of Tokyo, 3Toneyama Inst. Tuberculosis Res. Osaka City Univ. Med. isolated from the oral cavity of tufted capuchin (Cebus apella). Sch., 4Div. Bioresources, Hokkaido Univ. Res. Cent. Zoonosis Cont., A comparative 16S rRNA gene-sequencing analysis suggested 5Microbiol. Grad. Sch. Med., Kyoto Univ.) classification of the organism into the genus Streptococcus. Strain M8T was the most closely related to Streptococcus oralis (96.17%) followed Mycobacterium avium は，近年先進諸国を中心に患者数が急増している by Streptococcus massiliensis (95.90%) based on the 16S rRNA gene. MAC 症（難治性慢性肺疾患）の起因菌である。また，ブタや牛などの家 Strain M8T was the most closely related to S. massiliensis (86.58%) 畜にも疾病を引き起こす。本菌種は MLST や MLVA 等の遺伝子型別解析 based on the RNA polymerase β subunit-encoding gene (rpoB), the によって，遺伝子型が異なる複数の亜種や亜型から構成されていることが most closely related to Streptococcus tigurinus (81.26%) followed 知られている。本菌種は環境中の常在細菌であるといわれているが，宿主 by S. massiliensis (80.45%) based on the 60 kDa heat-shock protein 側でなく，本菌種側に病原性や宿主特異性の調節を可能にするような遺伝 gene (groEL), and the most closely related to S. massiliensis (79.6%) 的背景があるのかもしれない。そこで本研究では，M. avium の遺伝系統 based on a recombination and repair protein-encoding gene (recN), の多様性やその形成に寄与する環境要因についての情報を得るために，多 respectively. The phylogenetic trees of 16S rRNA, rpoB, groEL, 様な分離源由来の株（合計 69 株）のゲノム情報を用いて，比較ゲノム解 and recN gene sequences showed that strain M8T was most closely 析を行った。 related to S. massiliensis. Based on phenotypic characterization as コアゲノムを用いた系統樹解析により，各亜種ならびに亜系統群の進化的 well as the 16S rRNA gene and housekeeping gene (rpoB, groEL and 位置付けと分離由来との関連性を検討した。その結果，主にヒト・ブタ recN) sequence data, we here propose a novel taxon, Streptococcus から分離される M. avium subsp. hominissuis で，宿主および分離地域を反 oricebi sp. nov. (type strain M8T= JCM 30719T= DSM 100101T). This 映した 5 つの clade の存在が明らかになった。反芻動物にヨーネ病を引き work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25870768. 起こす M. avium subsp. paratuberculosis では，Sheep 型と Bison/Cow 型は， それぞれ独立して分岐・派生したことが示された。さらにコアゲノム系統 樹から推定されるゲノム配列が急速に変化した系統分岐時においては，大 規模なゲノム構造の変化も伴い，それが継承されていることが判明した。 ゲノム構造変化の機構の詳細については現在解析中である。 これらの知見は，M. avium の疫学，臨床，治療薬の開発に有用な情報を もたらすものと思われる。

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P1-005 北海道に生息するアライグマから分離されたレ P1-006 MIRU-VNTR Typing of Beijing MDR-TB プトスピラの遺伝学的解析 strains from Myanmar ○橋場 和野，高崎 真理枝，吉織 綾子，村田 亮，中野 良宣，菊池 直 ○Lai Lai San1，Nan Aye Thida Oo1，Wah Wah Aung2，Khin Saw 哉（酪農大・獣医・獣医細菌） Aye2，中島 千絵1,3，鈴木 定彦1,3（1北大・人獣セ・バイオリソース， 2ミャンマー保健省医学研究局，3北海道大学国際連携研究教育局） Genetic characterization of Leptospira isolated from ○Lai Lai San1, Nan Aye Thida Oo1, Wah Wah Aung2, Khin Saw Aye2, raccons (Procyon lotor) in Hokkaido, Japan 1,3 1,3 1 ○ Chie Nakajima , Yasuhiko Suzuki ( Divi. Biores., CZC, Hokkaido Wano Hashiba, Marie Takasaki, Ayako Yoshiki, Ryo Murata, 2 3 Yoshinori Nakano, Naoya Kikuchi (Dept. Pathobiol., Sch. Vet. Med., Univ., Dept. Med. Res., Min. Health, Myanmar, Hokkaido Univ. GI- Rakuno Gakuen Univ.) CoRE GZC)

【目的】レプトスピラは保有体であるネズミなどのげっ歯類など Introduction: Myanmar is one of the countries with the highest が尿中に排菌することで川や土壌などの環境を汚染し，ヒトや burden of tuberculosis (TB) as well as multidrug-resistant 家畜，野生動物などへの感染源となる。我々は北海道に生息す tuberculosis (MDR-TB). The previous studies on genotping in るアライグマからレプトスピラを分離し，本菌が広く浸潤して Myanmar pointed out that the Beijing strain has a significant いることを明らかにした。さらにそれらの分離株が Leptospira association with MDR-TB. The active transmission of MDR borgpetersenii 血清型Javanica と L.interrogans 血清型Autumnalis Mycobacterium tuberculosis (MTB) strains is the emerging problem, に近縁な血清型であることを明らかにした。本研究ではそれら hence, it is necessary to identify characteristics that can explain why の分離株についてさらに遺伝学的解析を実施した。【方法】アラ they keep spreading widely. イグマから分離されたレプトスピラ株 12 株を用いた。各分離株 Materials and Method: A total of 171 Beijing MDR-MTB isolates の遺伝子種を決定するために 16S rRNA・flaB・gyrB 遺伝子の塩 collected from Myanmar was analyzed by variable number of tandem 基配列の解析を行い，さらに菌株間の異同を推定するため PFGE repeat(s) of mycobacterial interspersed repetitive units (MIRU- を実施した。【成績と結論】血清型 Javanica と同定された 10 株 VNTR) typing. Fifteen loci of MIRU-VNTR (QUB26, Mtub21, は 16S rRNA・flaB 遺伝子の解析により L. borgpetersenii に近縁な MIRU31, MIRU10, QUB11b, MIRU26, MIRU4, MIRU39, MIRU40, 遺伝子種であり，遺伝学的にも血清型 Javanica と証明された。し Mtub4, QUB4156, Mtub30, MIRU39, ETR A, MIRU16) were used かし血清型 Autumnalis と推定された 2 株は L.interrogans に近縁 and the results were analyzed by bionumeric software. な遺伝子種であることが確認できたが，gyrB 遺伝子の解析では Results: There were 32 clusters in 171 isolates with the biggest 血清型 Canicola に近縁であり血清学的解析と異なる結果となっ cluster consisted of 5 isolates. VNTR set used in this study was た。PFGE の結果，10 株は L. borgpetersenii 血清型 Javanica の参 useful for the discrimination of MDR-TB Beijing genotype and 照株と類似した切断パターンを示し，2 株は L.interrogans 血清型 effective for the determination of transmission pattern of MDR-TB. Autumnalis の参照株と類似した切断パターンを示した。さらに Beijing MDR-MTB was highly diverse and it can be inferred that the 同じ血清型の切断パターンを比較すると，わずかに相違が認め outbreak of MDR-TB is less likely to occur. られたことから，北海道に生息するアライグマの保有するレプ Conclusion: MDR-MTB may be emerging in each patient トスピラは多様性を示していることが示唆された。 individually. So that we can stop spread of MDR-MTB with proper drug usage.

P1-007 Evaluation of MIRU-VNTR typing of MDR- P1-008 Anaplasma phagocytophilum specific P44 MTB Beijing genotype isolates in Nepal epitopes identified by peptide array analysis ○Yogendra Shah1，Jeewan Thapa1，Ajay Poudel2，Bhagwan ○蘇 泓如1，呉 東興1，伊藤 圭祐2，河原崎 泰昌2，大橋 典男1（1静岡 Maharjan3，鈴木 定彦1,4（1北大・人獣セ・バイオリソース，2ネパール・ 県大・食品栄養科学・微生物，2静岡県大・食品栄養科学・生分工） 人民歯科大学，3ネパール・結核予防会・ドイツ－ネパール結核プロ 1 1 2 2 ジェクト，4北大・国際連携研究教育局） ○Hongru Su , Dongxing Wu , Keisuke Ito , Yasuaki Kawarasaki , Norio Ohashi1 (1Lab. Microbiol., Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka, ○Yogendra Shah1, Jeewan Thapa1, Ajay Poudel2, Bhagwan 2Biomol. Engneer. Lab., Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka) Maharjan3, Yasuhiko Suzuki1,4 (1Divi. Biores., CZC, Hokkaido Univ., 2Peoples Dental Col., Nepal, 3GENETUP, Nepal, 4Hokkaido Univ. GI- Anaplasma phagocytophilum (Ap) causes human granulocytic Core GZC) anaplasmosis (HGA) that is a tick-borne emerging infectious disease. Recently, we found HGA patients in Japan by serodiagnosis. The Introduction: Tuberculosis (TB) caused by Mycobacterium patients’ sera reacted with Ap antigens cultured in THP-1 cells tuberculosis (MTB) poses public health problems in Nepal. Multidrug- rather than in HL60 cells. Ap has p44 multigenes encoding multiple resistant TB (MDR-TB) is an emerging threat for TB control and P44 major antigen species that are similar, but not identical, to each Beijing genotype is a major group of strains contributing to MDR- other, and generates antigenic variation. We previously showed TB. This study aims to understand the molecular epidemiological that Ap expresses P44-47E and P44-60 transcripts in THP-1, but it features of Beijing MDR-MTB genotype strains in Nepal. produces P44-18ES in HL60, and demonstrated that the recombinant Materials and Methods: A total of 28 MDR-MTB Beijing isolates proteins were specifically immunoreactive with a certain patient’s from Nepalese patients were analyzed by spoligotyping and 26 loci serum. In this study, we successfully identified specific epitopes (Mycobacterial interspersed repetitive units-variable number of of three P44 species to react with patient’s sera by peptide array tandem repeats) MIRU-VNTR. The discriminatory index for each analysis. The 15-amino acid peptides were synthesized on 194-203 locus was calculated using the Hunter Gaston Discriminatory index spots (approx. 2 mm diameter) of a cellulose sheet by shifting one (HGDI) and categorized as poor, moderate and highly discriminatory. by one a first synthesizing amino acid along N- to C-terminal amino Results and Discussion: Using HGDI, twelve MIRU loci (3191, acid sequence. Patient’s sera reacted specifically with different spot 1955, 2163b, 4052, 4156, 2531, 2687, 4340, 2461, 2163a, 3232 and regions among three P44 species, suggesting that each P44 species 3236) were found to be “highly discriminatory” (DI>0.6), ten MIRU of three has at least 2 to 3 specific epitopes. These findings suggest loci (960, 1644, 2996, 802, 2165, 2401, 154, 2059, 3007 and 3293) that synthetic peptides with specific epitopes may be useful as were “moderately discriminatory” (DI: 0.3–0.6) and four MIRU loci antigens for serodiagnosis of HGA. (424, 3690, 580 and 577) were poorly discriminatory (DI<0.3). Conclusion: The analysis of 12 loci MIRU-VNTR typing can be well suited to trace out the epidemiological link among Beijing genotype MDR-MTB in Nepal.

59 P1-009 MALDI-TOF MS を用いた Mannheimia P1-010 MALDI-TOF MS を用いた Fusobacterium 属 haemolytica の遺伝子型鑑別 菌の同定 ○井上 正亮，村田 亮，中野 良宣，菊池 直哉（酪農大・獣医・獣医 ○林 将大，松野 有美，田中 香里（岐阜大・生命セ・嫌気性菌） 細菌） Evaluation of MALDI-TOF MS systems for identification Genotypical analysis of Mannheimia haemolytica using and classification of genus Fusobacterium the MALDI-TOF MS ○Masahiro Hayashi, Yumi Matsuno, Kaori Tanaka (Div. Anaerobe ○Seiryo Inoue, Ryo Murata, Yoshinori Nakano, Naoya Kikuchi (Dept. Res., Life Sci. Res. Ctr., Gifu Univ.) Pathobiol., Sch. Vet. Med., Rakuno Gakuen Univ.) 【目的】近年，マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時 【目的】近年，細菌分野においても MALDI-TOF MS によって 間型質量分析法（以下，MALDI-TOF MS）を用いた細菌同定法 菌体構成タンパク質を測定し，得られた波形を既知の波形ラ は，分析速度が他の手法に比べて圧倒的に早く操作が簡便であ イブラリと比較することで菌種同定する方法が提案されてい ること，ランニングコストが安価であることから，有効な細菌 る。Petersen らは欧米諸国を中心としたウシ由来 Mannheimia の迅速同定技術として注目されている。Fusobacterium 属菌は， haemolytica 株について MLST 解析を行い，少なくとも 7 種類の 臨床細菌学的に重要な無芽胞グラム陰性嫌気性桿菌の一つであ Sequence type（ST）が存在することを示した。我々は，日本各 る。現在，本属は 14 菌種，7 亜種に分類されている。しかしな 地で分離されたウシ由来 M. haemolytica について MLST 解析を実 がら，少数の菌種を除き，生化学的性状に基づく本属菌の分類・ 施し，ST の国内分布を比較した。また，MALDI-TOF MS による 同定は困難な場合が多く，同定精度の高い検査法の開発が望ま 解析も行い，遺伝子型の鑑別に応用できるか検証した。【方法】M. れている。今回，Fusobacterium 属菌を対象とした MALDI-TOF haemolytica の国内分離株 33 株および基準株 1 株（ATCC33396T） MS の同定性能の検討を行ったので報告する。【方法】本検証に について MLST 解析を実施し，ST を決定した。さらに MALDI- は，Fusobacterium の基準株および臨床分離株を用いた。アルコー TOF MS を用いてこの 34 株のマススペクトルを得て，ST 毎のオ ル・ギ酸抽出法によって調製した解析試料は，VITEK MS Plus リジナルライブラリを構築した。この新たに作成したライブラ （Sysmex Biomerieux 社）を用いてスペクトルを測定し，解析ソ リの正確性は野外分離株 94 株を用いて検討した。マススペクト フトウエアには同社の SARAMIS プログラムを用いた。本検証 ルの解析にはMALDI Biotyper version3.1 softwareを使用した。【成 の比較として，16S rRNA，gyrB，rpoB 遺伝子配列解析を実施し 績と結論】MLST 解析の結果 ST1 が 28 株，ST2 が 6 株であるこ た。【結果および考察】本装置による解析の結果，臨床上高頻度 とが判明し，日本のウシ由来 M. haemolytica 株は遺伝的多様性が に分離される F. nucleatum および F. necrophorum については遺伝 乏しいことが示唆された。この 34 株から MALDI-TOF MS によっ 子学的検査結果と比較し，90% 以上の同定一致率を示した。一 て得られたマススペクトルを利用して，オリジナルライブラリ 方，一部の菌種については同定精度が下がる傾向が認められた。 「Mannheimia ST1」，「 Mannheimia ST2」を作成した。次いで野 本発表では亜種の分類における本装置の識別能についても併せ 外分離株 94 株についてこのライブラリを用いた ST 分類を行っ て報告する。 た結果，全ての株で MLST の結果と一致した。MALDI-TOF MS による正確な遺伝子型解析が可能であることが明らかとなった ため，今後本法を活用した網羅的な疫学情報収集への応用が期 待できる。

P1-011（WS18-2） 口腔細菌が腸内細菌フローラ及 P1-012 Global impact of antibiotics on population- び腸管免疫系に及ぼす影響 level diversity in the human gut microbiome ○落合 智子，小林 良喜，斎藤 真規，續橋 治，桑原 紀子（日本大学・ ○西嶋 傑1，須田 亙1,2，大島 健志朗1，Seok-Won Kim3，森田 英利4， 松戸歯・微生物免疫学） 服部 正平1,5（1東大・新領域・メディカル情報生命，2慶應・医・微生 物免疫，3理研・IMS，4岡山大・環境生命，5早稲田大・理工） Oral bacteria-induced dysbiosis of the gut microbiota ○Suguru Nishijima1, Wataru Suda1,2, Kenshiro Oshima1, Seok-Won and its effect on the gut immune system 3 4 1,5 1 ○Tomoko Ochiai, Ryoki Kobayashi, Masaki Saito, Osamu Kim , Hidetoshi Morita , Masahira Hattori ( Grad. Sch. of Front. Sci., Univ. of Tokyo, 2Dept. of Microbiol. and Immunol., Keio Univ., Tsuzukibashi, Noriko Kuwahara (Dept. Microbiol. Immunol., Nihon 3 4 Univ. Sch. of Dent. at Matsudo) RIKEN Center for Integ. Med. Sci., Grad. Sch. of Env. and Life Sci., Okayama Univ., 5Grad. Sch. of Adv. Sci. and Engi., Waseda Univ.) Growing evidence suggests an association between the dysbiosis of the gut microbiota with the pathogenesis of intestinal and extra- Human gut microbiome have profound influences on host’s intestinal disorders such as inflammatory bowel disease, allergy, physiology. Recent studies using NGS-based metagenomic asthma, metabolic syndrome, cardiovascular disease, and obesity. approaches have suggested their high ecological diversity across In this study, we assessed the potential effect of oral bacteria on the countries, suggesting that factors such as dietary intake, host’s composition of the gut microbiota and the metabolic by-products, as genetics and/or host’s life style significantly affects the gut well as the immune cell population in the small intestine in mouse microbiomes. However, little is known about the factors because the model. The microbiota in feces was analyzed using PCR and T-RFLP studies were limited mostly between a few cohorts with different analysis. The metabolic by-products in feces were analyzed by high countries. Here, we conducted a large-scale association study of the performance liquid chromatography. Further, we assessed Th17/Treg metagenomic data of 861 human gut microbiomes from 12 countries, populations and CD11b+/F4/80+ cell populations by flow cytometry. including Japan, with epidemiological data on dietary intake and Swallowing of oral bacteria (Streptococcus mitis, S. salivarius, antibiotic use. We found that the population-level diversity in gut Porphyromonas gingivalis, and Prevotella intermedia) for 3 weeks microbiomes across countries was strongly affected by antibiotics caused gut dysbiosis, as it led to increase in Clostridia and decrease as well as diet. Notably, the major species Prevotella showed a in Lactobacillus spp, although there were differences in the ratio of significant correlation with diet; whereas, another major species intestinal flora between oral bacterial species. In the small intestine, Bacteroides showed a significant positive correlation with antibiotic decrease in Th17 cells was considered to be the result of oral usage both in human and farms. The proliferation of antibiotic bacterial infection, although the population of Treg cells remained resistant genes, including the efflux pump, may underlie the positive unaffected. These results suggest a possibility that gut dysbiosis can correlation between Bacteroides with antibiotic usage. Collectively, be caused by swallowing of oral bacteria that decreases Th17 cell and our data suggests that antibiotics may have had a striking impact promotes chronic inflammation. on the shaping of the gut microbiome structure of modern human populations.

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P1-013 ハエ腸管内の細菌叢解析 P1-014 次世代シーケンサーを用いたブドウ球菌属特異 ○鈴木 駿太，Ting Wei，宮永 一彦，丹治 保典（東工大・生命理工） 的細菌叢解析法の構築 ○Yujie Lu1,2，佐々木 崇2，桑原 京子2，平松 啓一1,2（1順大・医・感 Analysis of bacterial community in fly intestine 染制御科学，2順大・医・微生物） ○Shunta Suzuki, Ting Wei, Kazuhiko Miyanaga, Yasunori Tanji (Dept. Bioeng., Sch. Biosci. & Biotecnol., Tokyo Tech) Staphylococcus-specific microbiome analyzing method using a next generation sequencer Introduction: Fly has a worldwide distribution from the sub- ○Yujie Lu1,2, Takashi Sasaki2, Kyoko Kuwahara-Arai2, Keiichi polar regions to the tropics, and propagate in all of the world. The Hiramatsu1,2 (1Dept. Infection Control Science, Sch. Med., Juntendo large population, rapid proliferation, and long distance of travelling Univ., 2Dept. Bacteriol., Sch. Med., Juntendo Univ.) make flies an ideal vector for the transfer of pathogens from the environmental to human habitat. It has also been reported that flies 【背景】ブドウ球菌（Staphylococcus）属は皮膚・鼻腔内常在菌で harbor antibiotic resistant bacteria in their gut, which pose threats to あり，時に様々な感染病態を引き起こす。S. aureus の鼻腔内保 human health. In order to investigate the relationship between flies 菌率は 2–3 割と知られてきたが，このような過去の知見は培養 and the bacteria they harbor, it is necessary to understand the fate 法によるものだった。近年，次世代シーケンサーを用いたショッ of these bacteria. In this study, we conducted a comparative analysis トガンメタゲノム法や 16S rRNA アンプリコンシーケンス法によ of the bacterial community and antibiotic resistant bacteria in fly of り，微生物生態学的に様々な新知見がもたらされている。しかし， different developmental stages (egg, maggot, pupa, and adult). これらの手法は生物分類群に対する網羅性は高いが，種レベル Material and methods: To compare bacterial communities in fly 分解能が乏しく，ブドウ球菌種の存在比の算出は不可能だった。 intestine, pyrosequencing analyses by next generation sequencer 【目的】ブドウ球菌属の種レベル分解能をもつ細菌叢解析法の構 ware performed. To assess antibiotic resistant bacteria included in fly 築。 intestine, screening of these bacteria and measurement of minimum 【方法】健常人鼻腔内スワブ，および対照群として S. aureus や S. inhibitory concentration (MIC) were performed. epidermidis を保菌しないイヌの会陰部スワブを被検材料とした。 Results and discussion: Bacterial community in fly intestine スワブ検体から DNA を抽出し，菌種同定に繁用される hsp60 と ware drastically changed along fly’s life cycle. Antibiotic resistant rpoB 遺伝子部分配列をターゲットとする PCR を実施した。ライ bacteria ware selected from fly intestine of all developmental stages. ブラリ作製後，Illumina 社の Miseq で塩基配列を解読した。一 Moreover, some of these bacteria showed high value of MIC. 検体で 105-6 リードを取得した。ペアエンドリードの stitch，お よびクオリティーチェック後，blastn 解析で各リードの種同定を 実施した。各解析パラメーター（quality value，最低リード長， E-value，% identity）のカットオフ値の最適条件を検討した。得 られた種組成の数値をターゲット遺伝子間，あるいは培養法の 結果と比較した。 【結果・考察】本方法は，現在各解析条件を検討中である。本法 が最適化されれば，皮膚・鼻腔内に存在するブドウ球菌全種の 組成の算出が可能となる。また，全体の 1/105-6 のマイナーポピュ レーションで常在するブドウ球菌種の検出も可能となり，培養 法では得られない新たな生態学的知見が得られるだろう。

P1-015 流通生鮮鶏肉表面上での細菌と原生動物のせめ P1-016 口腔 Rothia 属菌選択培地の開発とその口腔内 ぎ合い：メタゲノム解析による菌叢変化と鞭毛虫の株化 分布 ○大久保 寅彦，松尾 淳司，山口 博之（北大院・保科・病態解析） ○續橋 治1，内堀 聡史2，齋藤 真規1，小林 良喜1，桑原 紀子1，落合 智子1（1日大・松戸歯・微生物免疫，2日大・松戸歯・クラウンブリッ Metagenomic analysis of bacterial community ジ補綴） composition and isolation of protozoa on retail chicken ○Torahiko Okubo, Junji Matsuo, Hiroyuki Yamaguchi (Dept. Med. A selective medium for the isolation of Rothia species Lab. Sci., Fac. Health Sci., Hokkaido Univ.) and their distribution in oral cavities ○Osamu Tsuzukibashi1, Satoshi Uchibori2, Masanori Saito1, Ryoki 土壌や河川水，建物の床や溜め水さらに生野菜や食肉など身の Kobayashi1, Noriko Kuwahara1, Tomoko Ochiai1 (1Dept. Microbiol. 回りのさまざまな環境中に普遍的に生息するアメーバなど原生 Immunol., Nihon Univ. Sch. Dent., Matsudo, 2Dept. Crown Bridge 動物は，その多くが細菌捕食性微生物であり，微小生態系食物 Prostodont., Nihon Univ. Sch. Dent., Matsudo) 連鎖の頂点に位置している。既報における試験管内での実験で は，原生動物に捕食された一部の食中毒菌が，捕食されたアメー 【目的】口腔 Rotiha 属菌は日和見感染症起因菌の可能性が示唆さ バ内や表面で維持あるいは増殖することが報告されている。し れていることや，本属菌の中の R. dentocariosa（R.d）は歯周病罹 かしながら，これら実験に使用されている原生動物は ATCC 基 患者と比較して健常者で顕著に検出される報告が散見されるこ 準株などに限られており，実際の環境を必ずしも反映するもの とから，現在，本属菌は注目されている。しかし，ヒト口腔に ではない。そこで本研究では，実際の流通食品上で繰り広げら おける Rothia 属菌の詳細な分布については未だ不明である。そ れる食中毒菌と原生動物とのせめぎ合いが，食中毒菌の生存性 こで口腔試料から Rotiha 属全ての菌種を分離することが可能な や病原性の発動へのインパクトを明らかにすることを目的とし， 選択培地の開発を試み，Rotiha 属の口腔内分布を調査した。 流通生鮮鶏肉表面上の放置に伴う生菌数・菌叢変化と，その表 【方法】本研究において R.d，R. mucilaginosa (R.m)，R. aeria（R.a） 面からの原生動物の検出・株化を試みた。鶏肉（5 検体）は異な の認定株および分離株は，開発した選択培地（ORSM）におい るスーパー店頭で購入し，冷蔵条件 4°C と，中温菌が発育でき て平均 90% 以上と高い回収率を示したことから，ORSM を用い る 15°C でそれぞれ放置した。購入直後，購入 2 日後（消費期限 て健常者 50 名の唾液試料からこれらの検出を試みた。試料は 日），購入 7 日後の時点で，鶏肉を PBS で洗浄し遠心沈渣を得た。 ORSM と総菌数算定用の BHI 平板培地に接種し，培養後に CFU 沈渣は，菌数測定と細菌 16S rDNA を標的としたメタゲノム解析 を算定した。そして総菌数に対する検出比率を属レベルと菌種 に用いた。購入直後の生菌数は約 103 CFU/mL だったが，4°C 保 レベルで算出することにより，口腔 Rothia 属菌の詳細な分布を 存の場合でも，購入 2 日後には 105 CFU/mL 程度，購入 7 日後に 調査した。菌種同定は，16S rRNA 遺伝子を基に設計した検出用 は約 108 CFU/mL 程度にまで増加した。メタゲノム解析は北海道 プライマーを用いた Multiplex PCR 法により行なった。 システムサイエンスにて委託実施中である。食肉表面からは細 【結果および考察】R.d，R.m，R.a は ORSM 上でそれぞれ特徴的 菌を捕食すると思われる鞭毛虫（Parabodo sp., Sandona sp.）の株 な集落形態を示すことより，肉眼的に 3 者を判別することが可 化にも成功した。これらの結果は，私達が食する流通生鮮鶏肉 能であった。全被験者から R.d，R.m，R.a が検出され，総菌数 の表面上にて細菌と原生動物の複雑なせめぎ合いが繰り広げら に対する本属の検出比率は 5% 程度であった。一番優勢な菌種は れていることを示唆している。 R.d であり，次いで R.m であった。これらの結果から，ORSM は口腔 Rothia 属菌を分離するのに有用であり，また口腔 Rothia 属は健常者の口腔で優勢な菌属であると判断された。

61 P1-017 Lactobacillus inhibits the adhesion of P1-018 Effect of low dose antibiotics administration Gardnerella vaginalis to cells during prenatal period on newborns postnatal health ○張 音実，杉田 隆（Dept. Micribiol., Meiji Pharm. Univ.） ○吉本 亜由美，上番増 喬，中橋 睦美，下畑 隆明，馬渡 一諭，高橋 章（徳島大院・医歯薬・予防環境栄養） ○Otomi Cho, Takashi Sugita (Dept. Micribiol., Meiji Pharm. Univ.) ○Ayumi Yoshimoto, Takashi Uebanso, Mutsumi Nakahashi, Takaaki Introduction: Lactobacillus is predominant in the healthy vagina, Shimohata, Kazuaki Mawatari, Akira Takahashi (Dept. Prevent. where it inhibits cell invasion by pathogens by producing lactic acid Environ. Nutr., Inst. Biomed. Sci., Tokushima Univ. Grad. Sch.) and maintaining a weakly acidic vaginal pH. However, the risk of premature birth or abortion increases when the vaginal microbiome Child’s health is influenced by both genetic and environmental is disrupted for any reason and Gardnerella vaginalis predominates. factors. During the prenatal period, several environmental factors This study investigated the ability of G. vaginalis to adhere to HeLa transgenerationally affect newborns health in the future. Because cells in the presence of Lactobacillus. Materials and Methods: low dose antibiotics have been used for agriculture, we may have The ability of G. vaginalis to adhere to HeLa cells was examined taken residual antibiotics for more than several decades. However, it under three conditions: 1) co-culture of G. vaginalis and Lactobacillus is not clear that effects of low dose antibiotics administration during in HeLa cells; 2) pre-culture of G. vaginalis in HeLa cells before the prenatal period on newborns health in later life. In the present the addition of Lactobacillus; and 3) pre-culture of Lactobacillus in study, we bred mice by giving subtherapeutic antibiotics (penicillin, HeLa cells before the addition of G. vaginalis. The growth rate of G. vancomycin and chlortetracycline, 1ug/g body weight) during the vaginalis under each condition was calculated after 24 h. Results prenatal period (Ab group), and compared vehicle treat mice (control). and Discussion: The adhesion of G. vaginalis to HeLa cells was We evaluated changes of enterobacterium in both maternal and child decreased under conditions 1 and 3, but not under condition 2. mice feces by rtPCR and DGGE analysis. The body composition of The supernatant of the Lactobacillus culture strongly inhibited the child mice were scanned using an X-ray CT system. Although the adhesion of G. vaginalis to HeLa cells. This study elucidated there were no obvious changes in maternal enterobacterium, conditions that decrease the adhesive ability of G. vaginalis using abundance of feces Firmicutes phylum in Ab gourp child mice was Lactobacillus. higher than those of control group at 8 weeks old. In addition, body fat percentage of Ab group was higher than those of control group at 12 weeks old. The body fat percentage of all mice was correlated with abundance of feces Clostridium 4a and 14 groups. These results predicted that low dose antibiotics administration during the prenatal period affects newborns microbiota and health in later life.

P1-019 タイ王国児童の唾液中における口腔ベイオネラ P1-020 慢性胃炎患者の胃内フローラ解析 の分布と出現頻度 ○大崎 敬子1，Cynthia Zaman1，米澤 英雄1，高橋 志達3，岡 健太郎3， 2 1 1 1 1 ○Citra Theodorea1，眞島 いづみ1,2，中澤 太1（1医療大・歯・微生物， 北条 史 ，蔵田 訓 ，花輪 智子 ，神谷 茂 （ 杏林大・医・感染症学， 2 3 2学振・特別研究員 PD） 杏林大・医・共同研究施設・実験動物施設部門， ミヤリサン製薬（株） 東京研究部） Distribution and Frequency of Oral Veillonella species in Saliva from The Children in Thailand Metagenomic study on gastric microbiota of the patients ○Citra Theodorea1, Izumi Mashima1,2, Futoshi Nakazawa1 (1Dept. with chronic gastritis 1 1 1 Oral Microbiol., Sch. Dent., Heal. Sci. Univ. Hokkaido, 2Postdoc. ○Takako Osaki , Cynthia Zaman , Hideo Yonezawa , Motomichi 3 3 2 1 JSPS) Takahashi , Kentaro Oka , Fuhito Hojo , Satoshi Kurata , Tomoko Hanawa1, Shigeru Kamiya1 (1Dept. Infect. Diseases, Kyorin Univ. Sch. Background: Dental caries is caused by oral biofilms. Oral Med., 2Institute of Laboratory Animals, Kyorin Univ. Sch. Med., 3Tokyo Veillonella spp. contribute to the oral biofilm formation at early R&D Center, Miyarisan Pharmaceutical Co. Ltd.) stages. However, the specific roles of oral Veillonella spp. in biofilm formation of the children in Thailand have not yet been clarified. The relationship between Helicobacter pylori infection and gastric Aim: Distribution and frequency of oral Veillonella spp. in saliva from microbiota in the context of the pathogenesis of chronic gastritis the children in Thailand were evaluated in this study. Methods: 28 has not been fully clarified. 16S metagenomics analysis of H. pylori subjects among 8–15 years old children in Thailand were divided infected chronic gastritis patients was performed to investigate the into three groups based on DMFT. Oral Veillonella spp. were isolated interaction between the native microbiota and H. pylori. We focused from saliva and identified by using PCR method with species-specific on the comparison of gastric microbiota in patients with atrophic primer sets. Result & Discussion: 433 total strains of genus gastritis between H. pylori-culture positive and H. pylori-culture Veillonella were isolated in this study. 288 strains were identified negative groups. as the established oral Veillonella spp. Meanwhile, 145 strains were By comparing the gastric microbiota profiles between H. pylori- confirmed as unknown species of genus Veillonella. Our findings culture positive and H. pylori-culture negative patients, higher showed that V. atypica was detected as predominant species in High population of Helicobacteriaceae in the gastric corpus of H. pylori DMFT group, and V. rogosae was detected as predominant species culture-positive patients and higher population of Enterobacteriaceae in all DMFT groups. However, V. tobetsuensis was not detected at in antrum and corpus of H. pylori culture-negative patients were all in Low DMFT group. Based on the results, V. atypica may have detected. There was no significant difference in numbers of the related to dental caries with the children in Thailand. This study also other bacterial families. It was shown that the diversity of gastric suggested that unknown species isolated from saliva may be novel microbiota in the patients with chronic gastritis was defined by Veillonella species. Therefore, further validation with more samples Proteobacteria mainly Helicobacteriaceae and Enterobacteriaceae. is required in the future experiments.

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P1-021 健康な若者における喫煙者と非喫煙者との口腔 P1-022 高脂肪高ショ糖食投与マウスの糞便菌叢に対す 内細菌構成の違い る玄米発酵食品の影響 ○谷口 奈央1，中野 善夫2，米田 雅裕3，廣藤 卓雄3，桑田 文幸2，埴 ○森本 悠里，片岡 佳子（徳島大院・医歯薬・微生物遺伝子解析） 岡 隆1（1福歯大・口腔保健，2日大・歯・化学，3福歯大・総合歯科） Modifying effects of fermented brown rice on fecal Differences of oral microbial composition between microbiota in mice fed high fat high sugar diet smokers and non-smokers in young healthy adults ○Yuri Morimoto, Keiko Kataoka (Dept. Mol. Microbiol., Inst. Biomed. ○Nao Taniguchi1, Yoshio Nakano2, Masahiro Yoneda3, Takao Hirofuji3, Sci., Tokushima Univ. Grad. Sch.) Fumiyuki Kuwata2, Takashi Hanioka1 (1Dept. Prev. Pub. Health Dent., Fukuoka Dent. Coll., 2Dept. Chem., Nihon Univ. Sch. Dent., 3Dept. 【目的】近年，食事内容による腸内菌叢の変化と肥満やインスリ Gen. Dent., Fukuoka Dent. Coll.) ン抵抗性の出現の関連が注目されている。玄米発酵食品（FBRA） は食物繊維が豊富で，ラット腸内の Lactobacillus を増加させる 【目的】喫煙は歯肉溝細菌叢に影響を与えることが知られる。本 作用を持つ。そこで高脂肪高ショ糖食（HFHSD）を投与したマ 研究では，喫煙が唾液と舌苔の細菌叢に与える影響を，臨床的 ウスにおけるインスリン抵抗性の出現および腸内菌叢に対する に健康な口腔環境を持つ若者を対象として調べた。【方法】福 FBRA の混餌投与の影響を検討した。【方法】C57BL/6J マウス（雄， 岡歯科大学口腔歯学部 6 年生 50 名（喫煙者 18 名，非喫煙者 32 4 週齢）に，HFHSD，FBRA を 0.5%, 5%, 10% 添加した HFHSD， 名）を対象とした。安静時唾液と舌苔より抽出した細菌 DNA または通常食を自由摂取させ，インスリン抵抗性の出現を空腹 から 16S rRNA 遺伝子を PCR によって増幅し，高速シーケンス 時血糖値，HOMA-R 値およびインスリン感受性テストにより調 解析法によってそれぞれ約 3.0 億塩基の配列を得た。OTU 解析 べた。マウス糞便菌叢の解析は T-RFLP 法（Nagashima 法）によ 後，口腔内細菌 16S rRNA 塩基配列データベースを用いて相同 り行った。腸内菌由来の有機酸の便中濃度も比較した。【結果と 性検索を行った（福岡歯科大学・福岡医療短期大学倫理審査委 考察】HFHSD 投与群では試験開始 7 週間後以降にインスリン抵 員会承認番号第 249 号）。【結果・考察】唾液において，喫煙群 抗性が現れ始めたが，FBRA10% 混餌投与群ではインスリン抵抗 は Treponema 属と Selenomonas 属の割合が高く，Capnocytophaga 性の出現に対する有意な抑制効果が見られた。菌叢に対する影 属とCardiobacterium 属の割合が低かった。Treponema 属と 響は FBRA の混餌濃度に依存的に見られ，菌叢構成比を T-RFLP Selenomonas 属は，歯周炎など病的状態で多く分離されるグラ 法により比べると，HFHSD 群では通常食群に比べて Bacteroides ム陰性運動性桿菌である。舌苔において，喫煙群は Dialister が減少し，Firmicutes 門および Clostridium subclusterXI が増加 属，Atopobium 属等の割合が高く，Haemophilus 属，Gemella していた。10%FBRA 混餌投与群では HFHSD 投与群に比べて 属，Peptostreptococcus 属等の割合が低かった。Dialister 属と Bacteroides および Bifidobacterium の比率が増加し，Clostridium Peptostreptococcuscus 属は歯周病との関連が示唆され，Atopobium subclusterXI が減少していた。マウス糞便中の総有機酸濃度は通 属は口臭患者の唾液に高い割合で存在する。ブリンクマン指数と 常食群に比べて HFHSD 群では低値であったが，FBRA 投与群で の相関分析では，Selenomonas 属，Veillonella 属，Bifidobacterium は総有機酸，乳酸，酢酸の濃度が有意に増加していた。以上の 属等が正の相関を示し，Streptococcus 属や Haemophilus 属等が負 結果より，HFHSD 投与により出現するインスリン抵抗性に対す の相関を示した。【結論】喫煙は唾液や舌苔の細菌構成に影響を る FBRA の抑制効果に腸内菌叢の変化を介した機序が関係する 与えていた。喫煙者では口腔内の病的状態と関係する菌種が高 可能性がある。（会員外共同研究者：白井達也，櫻井明子） い割合でみられた。

P1-023 An analysis of microbiota in biofilm adhered P1-024 16S rRNA タイピング法を用いた幼児用簡易 to the dental metal alloys using in vitro plaque models プール水の細菌群集構造解析 ○鳥居 麻菜1，漆原 優1，大島 朋子2，大久保 力廣1，前田 伸子2（1鶴 ○澤辺 桃子1，須田 亙2,3，大島 健志朗3，服部 正平3,4，澤辺 智雄5 見大学有床義歯補綴学講座，2鶴見大学口腔微生物学講座） （1函短大・食物栄養，2慶大・医・微生物免疫，3東大・新領域・メタ ゲノム情報科学，4早大・理工学術院・共同先進健康科学，5北大・水 ○Mana Torii1, Yu Urushibara1, Tomoko Ohshima2, Chikahiro 産科学研究院・海洋微生物） Ohkubo1, Nobuko Maeda2 (1Dept. Removable Prosthodontics., Sch. Dental Med., Tsurumi Univ., 2Dept. Oral Microbiol., Sch. Dental Med., Bacterial community structure of children’s paddling Tsurumi Univ.) pool waters evaluated using 16S rRNA typing ○Toko Sawabe1, Wataru Suda2,3, Kenshiro Ohshima3, Masahira Continuous use of dental metals in oral cavity causes oral biofilm Hattori3,4, Tomoo Sawabe5 (1Dept. Food. Nutr., Hakodate Jr. Col., formation and triggers the caries, periodontal disease, and aspiration 2Dept. Microbiol. Immunol., Sch. Med., Keio Univ., 3Lab. Metagenomics pneumonia. To prevent those diseases, we analyzed the microbiota to Grad. Sch. Frontier Sci., Univ. of Tokyo, 4Coop. Major Adv. Health elucidate the characteristics of biofilms on the dental metals in oral Sci., Grad. Sch., Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 5Lab. Microbiol., Fac. cavity, in this study. Fish. Sci., Hokkaido Univ.) Biofilms were formed on dental plaque model using human saliva of healthy adult males by overnight cultivation (the five dental metals 保育施設等で夏場に行われる水遊びは，簡易プールの水を介して，幼児の and resin as controls). The bacterial DNAs in the biofilms were 細菌性集団感染のリスクとなる可能性が指摘されている 1)。集団感染を防 extracted and performed a T-RFLP analysis. The results showed ぐ対策として，プールの塩素消毒が推奨されているが 2)，幼児の健康被害 that all of T-RFs were categorized into two main clusters. Although を懸念し敬遠されているのが実情である。幼児の水遊びにより，簡易プー the T-RFs of Cobalt-chromium alloys (n=5) were classified into ルの水に様々細菌が混入する可能性が考えられるが，その実態はほとんど cluster I, those of Platinum-gold alloys were classified into cluster II. 把握されていない。本研究では，16S タイピング法を用いて，水遊び後の However, significant cluster specificity of pure Ti, Ti alloy and resin プール水の細菌群集構造を調べることを目的とした。二つの施設から採取 was not shown. した 10 種類（T 施設 1～7，F 施設 1～3）の試料において細菌群集構造が In order to elucidate the microbiota in the biofilms more accurately, 解析することができ，プロテオバクテリア門・ファーミキューテス門・バ 16S metagenomic analysis of the microbial structures in the biofilm クテロイデス門・アクチノバクテリア門を主体とした菌叢であった。また， on the Ti surface and in the saliva using NGS were carried out. As a デイノコッカス・サーマス門も検出されたが，これ以外の系統群はほとん result, salivary bacterial taxonomic profile and Ti profile were clearly どみられず，検出された細菌はヒトの腸内および皮膚常在菌群を含んでい different. These results suggested that the bacteria were attached た。また，F 施設では，幼児の年齢別にプールを使用しており，1～2 才 selectively to the metal. Moreover, the individual difference in their および 3～5 才グループ由来の試料（F1 および F2）の間でベータプロテ profiles existed. オバクテリアの割合に差がみられた。3～5 才児は，1～2 才よりもプール Further examination is necessary to clarify the mechanism of 内外を出入りして水遊びをすることが多いことから，土壌由来の細菌群が selective microbiota formation on dental metals. より多く混入したことが考えられる。さらに，ヒト病原菌の配列も検出さ れたがその比率は低く，幼児への感染リスクは低いと考えられた。以上の 結果は，簡易プールの適切な衛生管理が集団感染リスクを減らす上で重要 であることを示している。1) 環境衛生と微生物検査の栞「es」No.50, 2) 保 育所における感染症対策ガイドライン

63 P1-025 口腔 Rothia 属細菌における硝酸還元活性につ P1-026 大腸菌の single-cell ストラクトーム解析 いての検討 ○山田 博之1，山口 正視2，村山 そう明3，清水 公徳2,4，知花 博治2， 2 1 1 1 2 ○真下 千穂，円山 由郷，山根 一芳，山中 武志，王 宝禮，南部 隆之 笹川 千尋 ，高木 明子 ，御手洗 聡 （ 結核研・抗酸菌部， 千葉大・ （大歯大・細菌） 真菌医研，3日本大・薬・分子細胞生物，4東京理科大・基礎工）

Variations of nitrate-reducing activity in oral Rothia spp. Single-cell structome analyses of Escherichia coli 1 2 3 ○Chiho Mashimo, Hugo Maruyama, Kazuyoshi Yamane, Takeshi ○Hiroyuki Yamada , Masashi Yamaguchi , Somei Murayama , 2,4 2 2 Yamanaka, Hourei Oh, Takayuki Nambu (Dept. Bacteriol., Osaka Kiminori Shimizu , Hiroji Chibana , Chihiro Sasakawa , Akiko 1 1 1 Dental Univ.) Takaki , Satoshi Mitarai ( Dept. Mycobac. Ref. Res., Res. Inst. TB., JATA., 2Res. Cent. Med. Myocol., Chiba Univ., 3Lab. Mol. Cell Biol., It is well-known that nitric oxide resulting from the reduction of Nihon. Univ., 4Faculty Indust. Sci. Tech., Tokyo Univ. Sci.) salivary nitrate plays a beneficial antimicrobial role in the oral cavity. Recent genomic analysis of nitrate reductase-positive bacteria in Background: We have reported the results of structome analysis of the oral cavity revealed that certain bacterial species (members of yeast cells and tubercle bacilli. In this report, we present the data of Veillonella, Actinomyces, Rothia, Staphylococcus, etc.) have the structome analysis of E. coli cells. capacity to reduce nitrate. Recent metagenomics studies have shown Material and methods: E. coli, U14-41 strain was a cultured in LB a strong correlation between the presence of oral Actinobacteria broth at 37°C. After centrifugation, 1 μl of the bacillary pellet was (Rothia spp. and Actinomyces spp.) within oral subgingival bacterial mounted on single hole cupper grid. The grid was snap frozen by communities and the periodontal health. We hypothesize that plunging into melting propane. The frozen samples were transferred this correlation is partially resulted from the microbicidal efficacy into 2% OsO4-acetone solution and freeze substituted at –80°C. The of nitrate-reducing system in Actinobacteria and demonstrated specimens were embedded in epoxy resin. Serial ultrathin sections that Actinomyces oris kills Porphyromonas gingivalis in a nitrate- were cut to a thickness of 50 nm. The sections were mounted on dependent manner. In this study, we isolated three Rothia spp. from a grid, stained and examined with JEOL JEM-1400 and the images dorsal surface of the tongue and tested Griess reaction assay and a were analyzed with Fiji software. NOx analyzer on them. We interestingly found that they exhibited Results: Nine E. coli cells were cut into 14～23 serial ultrathin different nitrate-reducing activity. It is now on-going to investigate sections. Average value of the length, diameter, aspect ratio, surface whether this different activity is caused by gene expression levels or area, volume of the cytoplasm, total ribosome number, and ribosome genes themselves. density per 0.1 fl (μm3) were 2.4 μm, 0.89 μm, 2.82, 3.32 μm2, 0.71 fl, 25,770, and 3,780, respectively. Conclusion: This is the first report of E. coli structome analysis. The ribosome density per 0.1 fl was higher than those of yeasts and tubercle bacilli, indicating the fast growth of E. coli. These data would contribute to further understanding of the antigenicity, pathogenicity, and the mechanism of drug-resistance of E. coli.

P1-027 HlyF によって誘導される外膜小胞の産生機構 P1-028 Rv3812-encoded PE_PGRS62 protein is の解明 surface-exposed in tubercle bacilli ○村瀬 一典1，Martin Patricia2，Nougayrede Jean-Philippe2，林 哲也3， ○祝 弘樹1，中 野 美和2，松 村 和典1，宮 本 友司3，向 井 徹3，牧 野 正彦3， Oswald Eric2（1京大院・医・微生物，2フランス国立保健医学研究所， Cox Jeffery4，舩渡川 圭次5，秋山 徹1，切替 照雄1（1国際医療研セ・ 3九大院・医・細菌） 感染症制御，2国際医療研セ・共通実権室，3感染研・ハンセン病セ， 4Dept. of Microbiol. Immunol., Univ. California, San Francisco，5栃木 Outer membrane vesicle biogenesis induced by HlyF 県保健環境センター・微生物部） ○ 1 2 2 Kazunori Murase , Martin Patricia , Nougayrede Jean-Philippe , 1 2 1 3 2 1 ○Hiroki Iwai , Miwa Tamura-Nakano , Kazunori Matsumura , Yuji Tetsuya Hayashi , Oswald Eric ( Dept. Microbiol., Grad. Sch. Med., 3 3 3 4 Kyoto Univ., 2INSERM, 3Dept. Bacteriol., Sch. Med., Kyushu Univ.) Miyamoto , Tetsu Mukai , Masahiko Makino , Cox Jeffery , Keiji Funatogawa5, Toru Miyoshi-Akiyama1, Teruo Kirikae1 (1Dept. of 【目的】大腸菌を始めとする多くのグラム陰性菌は，菌体表層か Infectious Diseases, National Center for Global Medicine, 2Dept. of 3 ら 20–250 nm の細胞外膜由来の小胞（OMV）を産生する。OMV は， Infectious Diseases, National Center for Global Medicine, Dept. of 内包する多様な細菌由来分子のデリバリーシステムとして機能 Micobiol., National Institute of Infectious Diseases, 4Dept. of Microbiol. しうることが明らかとなっており，細菌においては非常に重要 Immunol., Univ. California, San Francisco, 5Tochigi Prefectural な生存戦略の一つである。一方，OMV はワクチンとして利用す Institute of Public Health and Environmental Science) ることも可能であり，近年，ワクチン開発への応用面からも注 目されている。しかしながら，OMV 産生の詳細なメカニズムは PE_PGRS family proteins are surface-exposed in M. tuberculosis 未だ解明されていない。演者の先行研究から，腸管外病原性大 and released from their cells via the type VII secretion system, may 腸菌が有する病原プラスミド上に保存されているヘモリジン F interact with mammalian cells during infection. In this study, we 遺伝子（HlyF）が，OMV の産生促進に関与している可能性が示 investigated a putative PE_PGRS effector protein, PE_PGRS62/ 唆された。本研究では，上記の成果を基に，HlyF による OMV Rv3812, regarding the cellular localization in both mycobacterial の産生誘導メカニズムを解明することを目的とする。 and mammalian cells. PE_PGRS62 was expressed using the TetR- 【方法】HlyF 誘導・非誘導株を LB にて 3, 5, 8, 24 時間振盪培養し， controlled gene expression system, allowing the M. tuberculosis 各上清を超遠心分離法（150,000×g, 3h, 4°C）により粗精製 OMV ΔPE_PGRS62 strain expressing PE_PGRS62 to grow. To detect the を回収した。OMV は透過型電子顕微鏡を用いてネガティブ染色 protein expression, PE_PGRS62 was fused to multiple tandem Myc 法により観察し，ImageJ により各サンプルにおける OMV の数・ epitopes. We detected the Myc5-tagged version of PE_PGRS62 in サイズを算出した。 M. tuberculosis expressing three tandem repeats of mCherry protein 【結果・考察】HlyF 誘導株において，OMV 産生量の顕著な増加が by confocal microscopy, electron microscopy, and Western blotting 確認され，さらに，培養時間とともに OMV の産生量は増加傾向 using anti-Myc antibody. PE_PGRS62 localized in mycobacterial cell- を示した。また，配列解析の結果，HlyF の配列上にはエピメラー surface via the N-terminal domain containing PE domain. However, ゼのモチーフ配列を有することが明らかとなり，同配列の部位 PE_PGRS62 was released from mycobaceria in an ESX-1 (eccCb1/ 特異的変異株において OMV の産生量が著しく低下した。 Rv3871)-independent manner. Transient expression of PE_PGRS62 OMV 形成機構の観点から，HlyF が外膜構成成分への修飾等に関 in cultured mammalian cells caused vesicle generation, and this 与することで OMV の産生を促進すると考えられる。現在，札幌 protein was co-localized on the vesicles via the C-terminal domain 医大の横田伸一博士，白石宗博士の協力の下，HlyF 誘導・非誘 containing putative transmembrane domains. These results suggest 導株における LPS の糖鎖とリピド部分の解析を進めている。 that PE_PGRS62 is surface-exposed in M. tuberculosis and might be involved in the interaction with the host.

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P1-029 海洋性ビブリオ菌べん毛モーター固定子と相互 P1-030 海洋性ビブリオ菌のべん毛本数制御に関与する 作用する FliL の構造解析にむけた精製 160kDa 膜タンパク質 HubP ○本間 道夫1，小嶋 誠司1，Ananthanarayanan Kumar1，伊角 実優2， ○西岡 典子，竹川 宜宏，Soojin Kwon，小嶋 誠司，本間 道夫（名大・ 朱 世偉1，西野 優紀1，佐久間 麻由子1，尾上 靖宏1，今田 勝巳2（1名 院理・生命理学） 古屋大・理・生命理学，2阪大・理・化学） Polar localizing 160kDa membrane protein of HubP for Characterization of FliL, an inner membrane protein of flagellar number regulation in marine Vibrio the flagellar stator complex from Vibrio ○Noriko Nishioka, Norihiro Takekawa, Soojin Kwon, Seiji Kojima, ○Michio Homma1, Seiji Kojima1, Ananthanarayanan Kumar1, Miyuu Michio Homma (Div. of Biol. Sci., Sch. of Sci., Nagoya Univ.) Isumi2, Shiwei Zhu1, Yuuki Nishino1, Mayuko Sakuma1, Yasuhiro Onoue1, Katsumi Imada2 (1Div. Biol. Sci., Grad. Sch. Sci., Nagoya 多くの細菌は運動器官としてべん毛を持つ。べん毛が形成さ Univ., 2Grad. Sch. Sci., Osaka Univ.) れる位置や本数は菌種によって異なり，海洋性ビブリオ菌 V. alginolyticus は細胞の極に 1 本のべん毛を持つ。この細菌のべん ビブリオ菌の極べん毛モーターは，イオンを透過する膜タンパ 毛の数と位置の制御機構について研究を行っている。ビブリオ ク質 PomA と PomB から構成されるエネルギー変換体（固定子） 菌べん毛の数と位置の制御に関与するタンパク質として，FlhF により駆動される。最近，我々は，分子量 18kDa の一回膜貫通 と FlhG が知られている。近年，V. cholerae を用いた研究から， 型タンパク質である FliL（以下 VaFliL と称する）が，固定子の ビブリオ属細菌に保存されている膜貫通型の極局在タンパク質 極局在や運動に関与することを示した。FliL を欠損すると固定 HubP の存在が明らかとなった。HubP は FlhG を含めたいくつか 子の極局在が低下する。また，FliL 欠損菌は，遊泳はできるが， の ParA 様タンパク質と相互作用し，それらの極局在における重 その遊泳スピードが低下し，特に，粘性をあげるとその影響が 要性が示された。本研究では，V. alginolyticus のべん毛本数制御 大きくなる。本研究では，pCold ベクターに，His タグを付加し における HubP の役割を明らかにすることを目的とした。hubP た全長（VaFliL）および膜貫通領域を含む N 末 39 残基を欠失し の欠損により，べん毛が細胞の極に複数形成された。hubP をプ た断片（ΔTM-VaFliL）をクローン化して大腸菌で大量発現させ， ラスミドにより相補すると，べん毛の数は野生型同様 1 本となっ これらタンパク質の精製を行い，結晶化を目指した。ゲル濾過 た。hubP の欠損により，べん毛の形成位置には大きな変化は生 クロマトグラフィーによる精製では，VaFliL のペリプラズム領 じなかった。野生株では GFP 融合 FlhF および GFP 融合 FlhG 域断片は，分子量 33kDa の位置に溶出された。また，濃度が濃 は細胞の極に局在するのに対して，hubP の欠損により，GFP 融 い状況では，より高い分子量で溶出されることから，FliL 同士 合 FlhF の局在は変化しかなったが，GFP 融合 FlhG の局在は損 の相互作用が示唆された。全長 VaFliL は界面活性剤存在下で， なわれた。HubP は，べん毛形成における負の制御因子である 大きな会合体として精製されるようであった。VaFliL 同士の相 FlhG の極局在において重要であることが明らかになった。HubP 互作用がどのように起こっているのかは解析中である。また， は細胞極において，適切な量のFlhGが正しく集合するための“場” 全長 VaFliL と ΔTM-VaFliL については，結晶が得られているが， を形成するために重要であり，それにより FlhF 機能を調節して， 構造解析には至っていない。現在，ΔTM-VaFliL について，異なっ べん毛の本数を厳密に制御すると思われる。 た断片や変異体を用いて構造決定を試みている。

P1-031 Analysis of antigenicity and functions of P1-032 Paired F1-ATPase-like hexamers involved in mycobacterial proteins gliding mechanism of Mycoplasma mobile Shymaa Enany1,2，尾関 百合子1，西山 晃史1，Anna Savitskaya1，立 ○豊永 拓真，田原 悠平，宮田 真人（大阪市大・院理） 石 善隆1，阿戸 学3，山本 格4，○松本 壮吉1（1新潟大学・大学院・細 2 ○ 菌学， Dept. Microbiol. Immunol., Fac. Pharm., Suez Canal Univ., Takuma Toyonaga, Yuhei Tahara O, Makoto Miyata (Grad. Sch. of Egypt.，3国立感染症研究所，4新潟大学・産学地域連携推進機構） Sci., Osaka City Univ.) Shymaa Enany1,2, Yuriko Ozeki1, Akifumi Nishiyama1, Anna M. mobile, a fish pathogen, glides on solid surface with a unique Savitskaya1, Yoshitaka Tateishi1, Manabu Ato3, Tadashi Yamamoto4, mechanism. The gliding machinery is divided into two parts, ○Sohkichi Matsumoto1 (1Dept. Bacteriol., Niigata Univ., 2Dept. surface and internal structures. The internal structure designated Microbiol. Immunol., Fac. Pharm., Suez Canal Univ., Egypt, 3Nation. “jellyfish” structure has an oval solid “bell” connected by dozens Institut. Infect. Diseas., 4BBC, Niigata Univ. industry-university co- of flexible “tentacles” that are covered with particles. MMOB1660 operation regional alliances promotion mechanism) and MMOB1670, the paralogs of F1-ATPase α- and β-subunits, respectively localized at the tentacle. In this study, the tentacle Non-tuberculous mycobacteria (NTM) are mycobacteria which particles were isolated, observed by negative-staining electron do not cause tuberculosis or leprosy, even though some of them microscopy, and analyzed by single particle analysis. Surprisingly, are consider as potential cause of human infections. They include a pair of hexamers, trimer of dimers about 12 nm in diameter has pathogenic bacteria such as Mycobacterium avium (MAC) and non- been visualized to be connected by two arms between the subunits pathogenic like Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis). Here we of hexamers. One hexamer in the pair had another mass about 5 nm aimed to identify relevant vaccine antigens for MAC using healthy in diameter at the center, while the center of the other hexamer was and positive MAC serum and to analyze the changes in protein empty. These features suggest that the two identical hexamers form expression profile between M. smegmatis mc2155, MDP1 mutant, a rotationally symmetrical particle and the hexamer has the same and MDP1 complemented mutant strains during the stationary subunit construction with an F1-ATPase as α3β3γ1. The shape of two phase of growth. Bacteria were cultured and proteins were extracted arms appeared variable among the averaged images. These results followed by both 1D and 2D electrophoresis. For MAC, western suggest that the F1-ATPase evolved to be the gliding machinery blotting was done and for M. smegmatis, 2DE protein patterns were motor in the complex including other unique proteins. compared using Progenesis SameSpots software. The western blotting for healthy and MAC patient serum sample produce significant bands that are characteristics for M. avium positive serum. Likewise, M. smegmatis showed 24 significantly differently expressed proteins in MDP1 mutant. Mass spectrometry identified 30 proteins specific for MAC and identified 21 proteins up-regulated in MDP1 mutant. Prediction of antigenicity of MAC specific proteins is under investigation. Gene ontology of M. smegmatis up-regulated proteins revealed that most of these up-regulated proteins play roles in mycobacterial metabolism and replication.

65 P1-033 歯周病関連細菌 Porphyromonas gingivalis の P1-034 Mycobacterium smegmatis J15cs 株の糖ペ チロシンキナーゼ変異株の性状解析 プチド脂質欠損による形態変化と宿主内生存 ○出水川 雅司1，堀江 俊1，猪俣 恵1，引頭 毅1，長谷川 義明2，吉村 ○藤原 永年1，大原 直也2，小川 みどり3，前田 伸司4，中 崇5，谷口 文信2，村上 幸孝1（1朝日大・歯・口腔微生物，2愛知大・歯・微生物） 初美3，山本 三郎6，綾田 稔7（1帝塚山大・食物栄養，2岡山大院・歯・ 口腔微生物，3産業医大・微生物，4北海道薬大・生命科学，5（株） Characterization of a tyrosine kinase mutant from MBR，6日本 BCG 研，7大阪市大院・医・ウイルス） Porphyromonas gingivalis ○Masashi Izumigawa1, Toshi Horie1, Megumi Inomata1, Takeshi Into1, The morphology and survival by deletion of Yoshiaki Hasegawa2, Fuminobu Yoshimura2, Yukitaka Murakami1 glycopeptidolipid in Mycobacterium smegmatis J15cs (1Dept. of Oral Microbiol., Asahi Univ. Sch. of Dent., 2Dept. of Oral strain Microbiol., Aichi Gakuin Univ. Sch. of Dent.) ○Nagatoshi Fujiwara1, Naoya Ohara2, Midori Ogawa3, Shinji Maeda4, Takashi Naka5, Hatsumi Taniguchi3, Saburo Yamamoto6, 【目的】蛋白質のリン酸化修飾はさまざまな生命現象を支える Minoru Ayata7 (1Dept. Food Nutri., Tezukayama Univ., 2Dept. Oral 翻訳後修飾の一つである。近年では原核生物においてもリン Microbiol., Okayama Univ. Grad. Sch., 3Dept. Microbiol., Sch. Med., 酸化蛋白質の研究が進められている。これまでにわれわれは P. Univ. Occupat. Environment. Health, 4Hokkaido Pharma. Univ., Sch. gingivalis の菌体成分から主なリン酸化蛋白質を分離し，修飾 Pharm., 5MBR Co. Ltd., 6Japan BCG Laboratory, 7Dept. Virol., Osaka 様式の検討を行ってきた。今回は，チロシンキナーゼをコード City Univ. Grad. Sch. Med.) する PGN1524 の変異株を作製し，菌体の増殖，バイオフィル ム形成能および菌体蛋白質のリン酸化への影響について，親 Mycobacterium smegmatis is a rapidly growing, nonpathogenic mycobacterium, 株と比較した。【方法】P. gingivalis ATCC 33277 を親株として， and M. smegmatis strain mc2155 in particular has been used as a tool for PGN1524 にエリスロマイシンカセットを挿入した変異株を作製 molecular analysis of mycobacteria because of its high rate of transformation. した。親株と変異株を嫌気培養し，菌体の増殖を経時的に測定 Unlike the M. smegmatis mc2155 strain, M. smegmatis J15cs strain has the した。バイオフィルム形成量はクリスタルバイオレット法によ advantage of surviving for one week in murine macrophages. We clarified that り検討した。また，嫌気培養後に回収した菌体を破砕し，全菌 the J15cs strain has deleted apolar glycopeptidolipids (GPLs) in the cell wall. 体抽出液を調製した。電気泳動で展開後，リン酸化蛋白質に特 The apolar GPLs were recognized by macrophages via toll-like receptor 2, but 異的な Pro-Q Diamond 染色を行って，菌体蛋白質のリン酸化の not 4. The gene causing the GPL deletion in the J15cs strain was identified. 様子を比較した。【結果と考察】菌体の増殖については，親株と The mps1-2 gene (MSMEG_0400-0402) correlated with GPL biosynthesis. 変異株の間に大きな違いはみられなかった。バイオフィルム形 The J15cs strain had 18 bps deleted in the mps1 gene compared to that of the 成量を比較したところ，変異株では親株の約半分に低下した。 mc2155 strain. The mps1-complemented J15cs mutant restored the expression 全菌体抽出液を電気泳動で展開し，リン酸化蛋白質のバンドを of GPLs. Although the J15cs strain produces a rough and dry colony, the 親株と比較すると，変異株ではいくつかのバンドが検出されな colony morphology of this mps1-complement was smooth like the mc2155 かった。以上のことから，PGN1524 は菌体蛋白質のリン酸化に strain. The length in the mps1-complemented J15cs mutant was shortened by 実際に関わっているとともに，バイオフィルム形成を制御して the expression of GPLs. In addition, the GPL-restored J15cs mutant did not いることが示唆された。 survive as long as the parent J15cs strain in the murine macrophage cell line J774.1 cells. The results are direct evidence that the deletion of GPLs in the J15cs strain affects bacterial size, morphology, and survival in host cells.

P1-035 Sialometabolism and surface sialylation of P1-036 腸炎ビブリオ O13 株より抽出したリポ多糖の oral Fusobacteria 糖鎖構造 ○米田 早織，今大路 治之，桑原 知巳（Dept. Microbiol., Sch. Med., ○一色 恭徳，小暮 久絵，寺元 舞，野村 陽恵，近藤 誠一（城西大・薬・ Kagawa Univ.） 病原微生物） ○Saori Yoneda, Haruyuki Imaohji, Tomomi Kuwahara (Dept. Carbohydrate structure of the lipopolysaccharides Microbiol., Sch. Med., Kagawa Univ.) isolated from Vibrio parahaemolyticus O13 ○Yasunori Isshiki, Hisae Kogure, Mai Teramoto, Harue Nomura, Fusobacteria are anaerobic components of the human oral microbiota. Seiichi Kondo (Dept. Microbiol., Sch. Pharm. Sci., Josai Univ.) Fusobacterium nucleatum (FN) has been associated with development of periodontal diseases. This species can be found at both healthy and Vibrio parahaemolyticus are gram-negative bacteria being causative affected subgingival sites, and its number increases following gingival agent of food-related enteric diseases. The bacteria are divided bleeding. We previously found that FN elongated after coaggregation into 13 serotypes based on the heat-stable somatic antigen, i.e. with blood. In this study, we evaluated the fusobacterial response to O-antigen, in which O3 serotype dominated in the pandemic strains blood. After FN ATCC25586 was cultured in a semi-defined medium of the bacteria, shared antigenic structure with O13. In this study (SDM) supplemented with whole blood, RNAs were extracted and structural investigations have been carried out on the carbohydrate analyzed by DNA microarray and qPCR. The results showed that backbone isolated from O13 lipopolysaccharides (LPS), The LPS the expression of sialic acid catabolism operon (nan operon) was was de-acylated, de-phosphorylated and pyridylaminated to yield highly induced in response to blood. Although the expression of the pyridylaminno-labeled carbohydrate backbone (PS-PA) of the nan operon in FN was increased by exogenously added sialic acid LPS. FAB-MS analysis of O13 PS-PA revealed that PS-PA have dose-dependently, this sugar gave no growth promotion. From this a decasaccharide, Hexose×3, Heptose×2, Glucuronic acid, Kdo, finding and conservation of neu operon for sialic acid synthesis in 5,7,8-triamino-3,5,7,8-pentadeoxy-non-2-usosonic acid (Non3N), Fusobacteria indicate that the anaerobes utilize this sugar for surface Glucosamine and Glucosamine-PA. The PS-PA was further purified sialylation. Sialic acid staining showed that both laboratory and by reversed phase HPLC in order to estimate the carbohydrate clinical fusobacterial strains sialylated their cell surfaces in the SDM sequence by using NMR experiments and methylation analysis. culture with sialic acid. We also demonstrated that Fusobacteria The carbohydrate moiety of O13 LPS was carrying a same sialylated their cells in dental plaque. These findings indicate that composition as that of O3 but distinguishable by the carbohydrate Fusobacteria sialylate their cell surfaces by cooperative metabolism sequence, especially on the linkage site of Non3N. The structure of of sialic acid by nan and neu operon gene products. carbohydrate moiety in O13 LPS clearly demonstrated the presence of chemical structures related to the antigenic specificity of O13 and cross-epitope(s) with O3 antigen.

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P1-037 Comparative analysis of the motility, P1-038 Campylobacter FabG affects fatty acid protease and adherence activity of Treponema denticola composition to alter growth fitness in chicken gut strains ○朝倉 宏1，川本 恵子2，橘 理人1，村上 覚史3，倉園 久生2，五十君 1 1 2 3 ○永野 恵司，長谷川 義明，吉田 康夫，吉村 文信（愛知学院大・歯・ 靜信 （ 国衛研・食品衛生管理， 帯広畜産大， 東京農業大・家畜衛生） 微生物） ○Hiroshi Asakura1, Keiko Kawamoto2, Masato Tachibana1, Satoshi ○Keiji Nagano, Yoshiaki Hasegawa, Yasuo Yoshida, Fuminobu Murakami3, Hisao Kurazono2, Shizunobu Igimi1 (1Div. Biomed. Food Yoshimura (Dept. Microbiol., Sch. Dent., Aichi Gakuin Univ.) Res., Natl. Inst. Health Sci., 2Obihiro Univ. of Agri. Vet. Med., 3Dept. Animal Hygiene, Tokyo Univ. of Agri.) Treponema denticola, a gram-negative and anaerobic spirochete, is associated with chronic periodontitis. We comparatively analyzed Campylobacter jejuni is one of the leading causes of foodborne the four bacterial strains. Phase-contrast microscopy showed high gastrointestinal illness worldwide. Here we performed ex vivo (ATCC 35404), moderate (ATCC 33521) and low (ATCC 35405 proteomic analysis of C.jejuni 81-176 in chicken, a main reservoir and ATCC 33520) motilities (rotation speed of the bacterial body). for human infection. At 0, 1 and 4 weeks post-infection (pi) with Transmission electron microscopy showed that the low motility the GFP-expressing 81-176 strain, inocula were recovered from strains exhibited highly elongated flagellar filaments which protruded chicken ceca by cell sorting using flow cytometry. iTRAQ-coupled from the cell bodies. Western blot and quantitative real-time PCR 2D-LCeMS/MS analyses that detected 55 C. jejuni proteins, among analyses indicated that the low motility strains expressed a larger which either 3 (FabG, HydB, CJJ81176_0876) or 7 (MscS, CetB, amount of the flagellar filamentous proteins FlaB2 and FlaB3, but FlhF, PurH, PglJ, LpxC, Icd) proteins exhibited >1.4-fold-increased not FlaB1, when compared with the other two strains. It was also expression at 1 or 4 week(s) pi. compared with those at 0 weeks suggested that FlaB3 was not post-translationally modified in the low pi, respectively. Deletion of the fabG gene clearly decreased the motility strains. Furthermore, the low motility strains showed higher proportion of bacterial unsaturated fatty acids (UFAs) and chicken chymotrypsin-like protease activity and higher adherence activity to colonization. The UFA proportion of the parental strain was not a gingival epithelial cell line. We will examine the genetic factors that altered when grown at 42C. These findings suggest that FabG might provide these phenotypic differences. play a pivotal role in UFA production, linked to bacterial adaptation in the poultry host. To our knowledge, this is the first example of ex vivo C.jejuni proteomics, in which fatty acid metabolism might affect bacterial adaptation to the chicken host.

P1-039 Campylobacter jejuni が保有するセリン合成 P1-040 Porphyromonas gingivalis の酪酸合成におけ 酵素の機能解析 るサクシニルセミアルデハイド産生酵素 PGN_0723 の酵素 ○岩田 剛敏，楠本 正博，秋庭 正人（動衛研・細菌寄生虫） 学的研究 ○吉田 康夫，佐藤 満成，長谷川 義明，永野 恵司，吉村 文信（愛学大・ Functional analysis of enzymes for serine synthesis in 歯・微生物） Campylobacter jejuni ○Taketoshi Iwata, Masahiro Kusumoto, Masato Akiba (Bacterial and PGN_0723 producing succinate semialdehyde in the Parasitic Dis. Res. Div., NIAH) butyrate production in Porphyromonas gingivalis ○Yasuo Yoshida, Mitsunari Sato, Yoshiaki Hasegawa, Keiji Nagano, Campylobacter jejuni は増殖時にセリンを多量に消費することが報 Fuminobu Yoshimura (Dept. Microbiolo., Sch. Dent., Aichi-Gakuin 告されている。C. jejuni は，ゲノム情報からセリン合成に関与す Univ.) る酵素をコードすると推定される serA，serB，serC 遺伝子を保 有しており，3- ホスホグリセリン酸（3PG）からホスホピルビ Background & Purpose: Although the biological function of ン酸（PP），PP からホスホセリン（PS），PS からセリンの合成に， butyrate has been comprehensively studied so far, the mechanism それぞれ SerA，SerC，SerB が関わると考えられているが，その for the short chain fatty acid (SCFA) production remains to be fully 機能については不明である。本研究では，C. jejuni の増殖に果た elucidated. Here, we evaluated the PGN_0723 producing succinate す SerA，SerB，SerC の役割を明らかにすることを目的として実 semialdehyde from succinyl-CoA in the butyrate production in 験を行った。C. jejuni NCTC11168 のゲノム情報をもとに発現・ Porphyromonas gingivalis. Materials & Methods: The recombinant 精製した C 末端 His タグ融合 SerA，SerB では，PP およびセリ PGN_0723 and the mutant proteins were prepared using Escherichia ンの合成酵素活性をそれぞれ検出したが，SerC では PS の合成 coli. LC/MS and colorimetric analyses determined enzymatic 酵素活性は検出されなかった。また，C. jejuni NCTC11168，81- properties of PGN_0723. SCFAs in the culture supernatants were 176，11-164 株を親株として serA，serB，serC 遺伝子の破壊株を quantified using GC/MS. Result & Conclusion: LC/MS analysis それぞれ作出し，アミノ酸混合液（グルタミン酸，アスパラギ demonstrated that incubation of PGN_0723 with succinyl-CoA ン酸，セリン，プロリンを各 10mM）添加 MEM 培地から，アミ in the presence of NAD(P)H resulted in production of succinyl ノ酸を 1 種類ずつ抜いて増殖性を比較したところ，親株と serC semialdehyde. Initial velocity data yielded parallel lines in double 破壊株はセリン無添加でも増殖可能であったのに対し，serA， reciprocal plots, suggesting a Ping-Pong Bi-Bi kinetic mechanism. serB 破壊株はいずれの株においてもセリン無添加では増殖しな The SCFA concentrations in the supernatant of P. gingivalis lacking かった。また，serA および serB 破壊株では，PP およびセリン the PGN_0723 gene were lower than those of the wild type. The の合成酵素活性がそれぞれ低下していたが，serC 破壊株の PS 合 point mutation analysis using mutant proteins (N110A, C239A, 成酵素活性は親株と差を認めなかった。以上の結果から，SerA， H397A, N406A, W413A and N415A) revealed that no enzyme SerB は 3PG からのセリン合成に必須であり，セリンの制限さ activity in N110A and C239A was detected, and that the activities in れた環境下での増殖に重要な役割を果たしていると考えられた。 the others were similar to that in the native PGN_0723, suggesting 一方，SerC では PS 合成酵素活性が検出されなかったことから， that Asn110 and Cys239 play important roles in the enzyme activity. 他因子が PS の合成に関与している可能性が示唆された。

67 P1-041 ピロリ菌の呼吸鎖を制御する sRNA の探索 P1-042 誘引物質 Serine による海洋性ビブリオ菌べん ○氣駕 恒太朗，Zhu Bo，三室 仁美（東大・医科研・感染症国際研究 毛固定子タンパク質 PomB 変異機能欠損の回復 センター・細菌学） ○錦野 達郎，Shiwei Zhu，竹川 宜宏，小嶋 誠司，尾上 靖宏，本間 道夫（名大・院理・生命理学） Identification of sRNAs controlling respiratory chain in Helicobacter pylori Recovery of the function of flagellar stator PomB mutant ○Kotaro Kiga, Zhu Bo, Hitomi Mimuro (Div. Bacteriol., Int’l Res. Ctr. by serine, an attractant of marine Vibrio Infct. Dis., Inst. Med. Sci., Univ. Tokyo) ○Tatsuro Nishikino, Shiwei Zhu, Norihiro Takekawa, Seiji Kojima, Yasuhiro Onoue, Michio Homma (Nagoya Univ., Grad. Sch. of Sci.) Helicobacter pylori (Hp) is a spiral-shaped, microaerophilic bacterium that is mainly found in the stomach. Chronic infection of Hp can lead To swim toward favorable condition, many bacteria rotate their to variety of gastric disorders, such as chronic gastritis and gastric flagella. An interaction between FliG, one of the components in adenocarcinoma. Although Hp forms an actively dividing helical form the rotor, and stator, composed PomA and PomB, is required for under microaerophilic condition such as in the stomach, it turns generating torque of flagellar motor. We investigated the stator from spriral form into coccoid form under hostile conditions such as activation by using double-Cysteine mutants in the periplasmic anaerobic condition in the intestine. Bacterial small RNAs (sRNA) region of B subunit of stator in V. alginolyticus. Some mutants are small (50-250 nucleotide) non-coding RNA molecules produced inhibited stator function with the intra-molecular disulfide bridge. by bacteria. In 2010, about 60 sRNAs were firstly identified in Hp. We recently found that one mutant, PomB-L160C/I186C, could Although high conservation of sRNA in Hp between species indicates recover the function by addition of serine that is an attractant to the importance of the sRNA in Hp, there are few reports about the trigger counter clockwise (CCW) rotation of flagella. To clarify this function of the sRNA until now. In this study we identified sRNA effect, we examined the relationship between the chemotaxis signal important for respiratory chain-related gene regulation in response and flagellar rotational direction. In the background of CCW-bias to anaerobic condition. We cultured Hp in either microaerophilic or mutant of FliG, CCW-locked and clockwise (CW) locked strains, we anaerobic condition and identified sRNAs, which are significantly could observe the motility restoration without treatment of serine induced in anaerobic condition. When gene expression pattern in the or dithiothreitol. Furthermore, the effect of serine on mutant stator sRNA-deletion mutant was examined by deep sequencing, a gene function was still observed in these backgrounds. Interestingly, cluster, which is important for respiratory chain, was increased in functional restoration of mutant stator by serine treatment still could the deletion mutant compared with wild type. Together, our results be observed even in the CheY deleted strain where the chemotaxis indicate that hypoxia-induced sRNA controls energy metabolism by is dysfunctional. Thus, functional restoration of mutant stator regulating respiratory chain-related gene expression in Hp. dependent on treatment of serine could be attributed to the signal- dependent CCW rotation state of FliG and an-independent way of chemotaxis.

P1-043 Mycoplasma pneumoniae 滑走運動のあし， P1-044（WS10-1） Mycoplasma mobile の新奇滑 P1 adhesin の構造と機能 走タンパク質の構造的洞察 ○松本 優1，川 北 祥人1，見 理 剛2，森 茂太郎2，木 下 実紀1，川 本 晃大3， ○浜口 祐，田原 O 悠平，松生 大輝，宮田 真人（大阪市大・院理） 加藤 貴之3，難波 啓一3，宮田 真人1（1大市大・院理・細胞機能，2感 染研・武蔵村山，3阪大・院生命機能） Structural insights for novel gliding protein of Mycoplasma mobile Structure and function of P1 adhesin, the leg for ○Tasuku Hamaguchi, Yuhei Tahara O, Daiki Matsuike, Makoto Mycoplasma pneumoniae gliding Miyata (Grad. Sch. of Sci., Osaka City Univ.) ○U Matsumoto1, Yoshito Kawakita1, Tsuyoshi Kenri2, Shigetarou Mori2, Miki Kinoshita1, Akihiro Kawamoto3, Takayuki Kato3, Keiichi Mycoplasma mobile glides on solid surfaces with a unique Namba3, Makoto Miyata1 (1Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., 2Infect. mechanism. The gliding machinery is composed of internal and Dis. Inst., 3Grad. Sch. Front. Biosciences, Osaka Univ.) surface structures. The internal structure includes FoF1 ATPase paralogs as a force generator based on ATP hydrolysis. The surface Mycoplasma pneumoniae binds to and glides on the sialylated structure composed of Gli349, Gli521 and Gli123 catches a scaffold oligosaccharides fixed on the host cell through an attachment and pull the cell forward. However, the association through the organelle. P1 adhesin, “leg” for gliding, is a 170 kDa protein cell membrane is unknown. In this study, we found that a novel consisting of 1567 amino acids. It can be divided into three protein can interact with Gli521 and internal structure as follows. domains at the 884th and 1518th amino acids and is featured by MMOB1650, composed of 1158 amino acids was reported as a a transmembrane segment at the boundary between domains II hypothetical protein and a component of the internal structure. and III. In a previous annual meeting, we reported expression and MMOB1650 has two transmenbrane segments at the C-terminus, purification of a domain I+II recombinant protein and showed its and 42 amino acids from N-terminus were processed. Most parts binding activity and the spherical morphology with sizes of 10 and are exposed to outside of the cell. This protein was purified as a 8.5 nm in two orthogonal axes. In the present study, we expressed complex with Gli521 trimer from M. mobile and interacting with the and purified two other recombinant proteins, a full length and a central part of Gli521 triskelion, which has been observed by rotary Strep-tagged domain I+II. We found that the full length protein shadowing electron microscopy. The isolated MMOB1650 monomer tends to aggregate. On the other hand, the Strep-tagged domain I+II was dumbell shaped. As a conclusion, we propose a model for protein that we purified as a monomeric form showed the binding mycoplasma gliding, (i) Gli349 catches sialylated oligosaccharide, (ii) activity to sialylated oligosaccharides similarly to the domain I+II the internal structure generates a force based on ATP hydrolysis, (iii) protein. We are studying the binding directionality by controlling the MMOB1650 transmits the force from inside to outside of the cell, (iv) protein conjugation to beads through the Strep-tag. As the Strep- Gli521 transmits the force to Gli349 and pull the cell. More advanced tagged domain I+II protein showed similar shapes to those of the analyses are ongoing. recombinant protein without Strep-tag, we are trying to construct a high resolution three-dimensional image and assign the amino acids sequence onto the molecular image.

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P1-045 Subcellular localization of putative gliding P1-046 Mycoplasma mobile が捕捉状態で発生する力 proteins in Mycoplasma mobile ○水谷 雅希1，Isil Tulum1，木下 佳昭2，西坂 崇之2，宮田 真人1（1大 2 ○木村 賢太，Isil Tulum，宮田 真人（大阪市大・院理） 阪市大・院理， 学習院大・理） ○Kenta Kimura, Isil Tulum, Makoto Miyata (Grad. Sch. of Sci., Osaka Force generation of Mycoplasma mobile at trapped state City Univ.) ○Masaki Mizutani1, Isil Tulum1, Yoshiaki Kinosita2, Takayuki Nishizaka2, Makoto Miyata1 (1Grad. Sch. of Sci., Osaka City Univ., Mycoplasma mobile, a fish pathogen, glides on solid surfaces based 2Fac. of Sci., Gakushuin Univ.) on ATP energy by a unique mechanism. The gliding machinery is a complex structure composed of surface and internal structures. The Mycoplasma mobile, a fish pathogen, glides on solid surfaces through internal jellyfish-like structure is composed of at least ten proteins repeated catches of sialylated oligosaccharides by the machinery including obvious paralogs of F1-ATPase α and β subunits. Previously, containing 450 legs. In this study, we focused on “force” in the wild- these paralogs were reported to colocalize with the surface gliding type strain and the mutant which has slower gliding speed and proteins by fluorescence microscopy using recently developed EYFP higher binding activity than those of the wild-type strain. At first, tagging technique. In the present study, subcellular localizations of we measured the stall force, which can stop the gliding mycoplasma other component proteins, MMOB1620, MMOB1640, MMOB1650, by laser trap. The stall force of mutant was 90 pN, smaller than MMOB4860, and MMOB5430, were visualized by the EYFP tagging. that of the wild-type strain, 110 pN, suggesting that the stall force The results showed that these targeted proteins localized at the is determined by the force generation rather than the binding. same position with the paralogs of F1-ATPase α and β subunits. To detect the minimum unit for force generation, we used a free The secondary structures of MMOB1620 suggested similarity to sialylated oligosaccharide and low glucose concentration to reduce the peripheral stalk proteins of FoF1-ATPase. Perhaps, the internal the working leg number. In these conditions, we could find stepwise structure evolved from an FoF1-ATPase as a unique motor complex movements as peaks, and applied a peak finding algorithm. The responsible for the force generation in the gliding motility. peak values distributed into two Gaussian curves, possibly caused by single and double units for force generation. The unit force of the mutant was smaller than that of the wild-type strain. This result can be explained by assuming that the weaker propelling force induces higher ratio of binding time in the gliding, resulting in the apparent activated binding property of this mutant.

P1-047 Mycoplasma mobile の滑走に必須なタンパク P1-048 Quantitative characterization of spirochete 質，Gli123 の構造解析 motility ○松生 大輝1，田原 O 悠平1，浜口 祐1，新井 宗仁2，宮田 真人1（1大 中村 修一，○高部 響介，Shafiqul Islam Md.，鳥谷部 祥一，工藤 成 阪市立大学・院理，2東京大学・大学院総合文化） 史（東北大・工・応用物理学）

Structural analyses of Gli123 protein, essential for Shuichi Nakamura, ○Kyosuke Takabe, Shafiqul Islam Md., Shoichi Mycoplasma mobile gliding Toyabe, Seishi Kudo (Dept. Appl. Phys., Grad. Sch. Eng., Tohoku ○Daiki Matsuike1, O Yuhei Tahara1, Tasuku Hamaguchi1, Munehito Univ.) Arai2, Makoto Miyata1 (1Dept. Biol., Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., Leptospira are spirochetes causing worldwide zoonosis leptospirosis 2Grad. Sch. of Arts and Sci., The Univ. of Tokyo) and their motility is an important factor when infecting humans and M. mobile, a fish pathogen glides on solid surfaces by a unique animals. The cell body of Leptospira exhibits right-handed helix, mechanism. Three huge proteins clustering on the surface of the called protoplasmic cylinder (PC), and two intracellular flagella are gliding machinery are essential for this mechanism. In this study, we present between the peptidoglycan layer and outer membrane. The focused on the structure of Gli123, a 123 kDa protein responsible for flagella bend one and the other ends of the cell body into a spiral- the assembly of surface gliding proteins. In the present study, the shape (S) and a hook-shape (H), respectively, and rotate the both Gli123 protein was isolated from M. mobile, observed by negative- ends together with PC for propelling the cell. Although rotations of staining electron microscopy, and reconstituted three dimensionally PC, S-end, and H-end are known to be responsible for Leptospira from 13,000 particle images, assuming two-fold rotational symmetry. motility, how the three rotations associate with each other still The molecule shaped like a “mushroom” with dimensions, 20.0, 14.5, remains unclear. Here we measured the speeds and directions of the and 16.0 nm. Next, we expressed and purified a recombinant Gli123 PC, S-end, and H-end rotations using a microscopic system capable (rGli123) with a His-tag at the C-terminus in Escherichia coli cells for of capturing individual swimming cells at 7-nm resolution for every mutant analyses with large protein amounts. The molecular shape of 2-ms image frame. The measurements showed S-end (rotation the isolated rGli123 observed by EM was consistent with the shape rate ≤ 250 revolution/s) and H-end (≤ 120 revolution/s) rotated of native protein. To obtain the information of molecular shape, size counterclockwise while PC (≤ 120 revolution/s) rotated clockwise. and mass of rGli123 in water, we applied small angle X-ray scattering We found that change in the rotation speed and direction of H-end (SAXS) to the rGli123. The SAXS analyses suggested that the strongly correlated with that of PC but not with that of S-end. These rGli123 is a globular protein with its radius of gyration about 8.7 nm, results suggest that PC is a counterpart of H-end for mechanical consistent with the EM observation. balance and the other rotating part that had never been measured yet, e.g. outer membrane, associates with the S-end rotation.

69 P1-049 局所的な照明により IV 型線毛の収縮を制御 P1-050 滑走する細菌の自己集合により形成される巨大 する 渦の一方向性回転 ○中根 大介，西坂 崇之（学習院大・理・物理） ○小高 祥子，中根 大介，西坂 崇之（学習院大院・物理） Retraction of Type IV pili was controlled by local light Directional rotation of large-scale vortex made of self- gradient assembly of gliding bacteria ○Daisuke Nakane, Takayuki Nishizaka (Dept. Phys., Gakushuin ○Showko Odaka, Daisuke Nakane, Takayuki Nishizaka (Dept. Phys., Univ.) Gakushuin Univ.)

Synechocystis sp. PCC 6803 is a cyanobacterium with the size of 1.5 Flavobacterium johnsoniae and many other member of the phylum μm and shows phototaxis as demonstrated in colony spreading on Bacteroidetes show gliding motility over surfaces at a speed of 1–2 agar. It is hypothesized that the motility is powered by the repetition μm/s. These cells lack flagella or pili, and are thought to rely on the of the extension and retraction of multiple filaments called type IV novel motility system, in which the adhesin SprB rapidly moves pili by energy of ATP hydrolysis. To uncover the mechanism of its along cell surface on a left-handed helical track. signal transduction process of the light-sensing motility apparatus, Here, we focused on their collective motion. Cells were spotted we here visualized retraction of pili by using fluorescent beads onto non-nutrient agar plate. After incubation, we found that their and observed its response to the light. The retraction activity was extraordinary behavior in the colony: multiple vortices with the size controlled more effectively by the local light gradient at 300 nm wide of a few millimeter spontaneously appeared, and all vortices rotated rather than lateral light, suggesting that the cell may recognize light in a CCW manner. To clarify the mechanism of this unique collective direction by the small difference of light intensity around its cell motion, we analyzed the motion of the vortices and the individual body. bacterium. Velocity field of a vortex showed all cells move in CCW direction with great velocity gradient, and cells of outermost shell move at approximately 0.5 μm/s. The vortices showed nearly solid- body rotation and cells were connected with each other. Before beginning CCW rotation, the vortices showed “oscillations” which moved in CW and CCW direction. At low density, each bacterium showed left-turned bias movement. These results suggest that cells of F. johnsoniae were assembled and connected with unknown secretion products to construct a large plate. The CCW direction of these vortices rotation comes from left-turned bias motion of each bacterium.

P1-051 Surface gliding proteins of Mycoplasma P1-052 大腸菌システイン tRNA 合成酵素による新規シ mobile visualized by quick-freeze replica electron ステインパースルフィド生成機構の解明 microscopy ○赤司 壮一郎1，井田 智章1，居原 秀2，Fanyan Wei3，富澤 一仁3， 1 1 1 4 1 1 ○Clothilde Bertin，田原 悠平，片山 栄作，宮田 真人（大阪市立大学） 笠松 真吾 ，松 永 哲郎 ，藤 井 重元 ，澤 智裕 ，赤 池 孝章 （ 東北大院・ 医・環境保健医学，2大阪府大院・理・生物科学，3熊本大院・生命科 ○Clothilde Bertin, Yuhei O Tahara, Eisaku Katayama, Makoto Miyata 学（医）・分子生理学，4熊本大院・生命科学（医）・微生物学） (Grad. Sch. Sciences, Osaka City Univ.) Novel mechanism of cysteine persulfide production by Mycoplasma mobile, a fish pathogen belonging to a class of wall-less cysteinyl-tRNA synthetase in bacteria bacteria, glides on solid surfaces in the direction of a membrane ○Soichiro Akashi1, Tomoaki Ida1, Hideshi Ihara2, Fanyan Wei3, protrusion at a cell pole by a unique mechanism. Our working Kazuhito Tomizawa3, Shingo Kasamatsu1, Tetsuro Matsunaga1, model relies on leg proteins which propel the cells by repeated Shigemoto Fujii1, Tomohiro Sawa4, Takaaki Akaike1 (1Dept. Environ. catching, pulling and releasing sialylated oligosaccharides. The Health Sci. Mol. Toxicol., Tohoku Univ. Grad. Sch. Med., 2Dept. Biol. force may be generated by a paralog of F1-ATPase and transmitted Sci., Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ., 3Dept. Mol. Physiol., Grad. to the leg protein through a crank protein. To clarify the surface Sch. Med. Sci., Kumamoto Univ., 4Dept. Microbiol., Grad. Sch. Med. protein assemblies of this gliding machinery, quick-freeze deep-etch Sci., Kumamoto Univ.) replication was applied. In brief, washed cells supported by mica flakes were quickly frozen. This procedure conserve the natural 【背景・目的】システインパースルフィド（CysSSH）などチオール基に過 states of the biological structures. After several steps, replica of 剰にイオウが付加（ポリサルファ化）した活性イオウ分子種は，高い求核 the sample surface obtained by metal shadowing was observed by 性・還元性により細胞機能制御に重要な役割を果たしている。我々は哺乳 transmission electron microscope. Leg-shaped and starfish-shaped 細胞においてはシスタチオニン β- 合成酵素やシスタチオニン γ- リアーゼ structures were visualized on the cell surface. The leg-shaped などが CysSSH を産生することを明らかにしてきたが，細菌の CysSSH の structures would correspond to the leg protein responsible for 産生系やタンパク質ポリサルファ化の分子メカニズムには依然として不明 binding. The starfish-shaped structures would be the crank protein な点が多い。今回，大腸菌における CysSSH 産生とタンパク質ポリサルファ 化の分子機構を明らかにするために，システイン 合成酵素によるタ arranged in a folded-trimer and complexed with MMOB1650, based tRNA ンパク質ポリサルファ化とシステインパースルフィド生成機構についての on the appearance of such complex isolated in a concurrent study. 解析を行った。 These results are the first step to clarify the protein assemblies of M. 【方法・結果・考察】組換え大腸菌システイン tRNA 合成酵素（CysRS）の mobile gliding machinery by direct visualization. アミノアシル tRNA 合成活性を質量分析装置を用いて解析した結果， CysRS は CysSSH を基質として CysSSH の tRNA 付加体（CysSSH-tRNA） を生成することが分かった。驚くべきことに，CysRS は，システインを 基質として，Cys-tRNA のみならず CysSSH-tRNA を生成することが分かっ た。CysRS の酵素反応機構を詳細に解析した結果，CysRS 自体がシステ インを基質として効率よく CysSSH を生成することが明らかとなった。ま た，哺乳細胞の CysRS も同様の CysSSH 合成活性を有することが分かっ た。以上の結果より，CysRS はこれまでに知られていない全く新しいシ ステインパースルフィド産生系であり，翻訳と共役してタンパク質ポリサ ルファ化に関わっていることが示唆された。

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P1-053 Ultraviolet-A (UVA) irradiation by light P1-054 Identification of genes associated with emitting diode (LED) inhibits growth of cyanobacteria ultraviolet-A sensitivity in Vibrio parahaemolyticus ○西坂 理沙1，馬渡 一諭1，常冨 愛香里1，渡邊 瞳1，上番増 明子1， ○馬渡 一諭1，枝川 美幸1，岩本 夏美1，前谷 実希1,2，本庄 アイリ1， 下畑 隆明1，上番増 喬1，金本 優杞2，村上 明男2，高橋 章1（1徳島大 西坂 理沙1，渡邊 瞳1，下畑 隆明1，上番増 喬1，高橋 章1（1徳島大学 学大学院医歯薬学研究部予防環境栄養学分野，2神戸大学内海域環境 大学院医歯薬学研究部予防環境栄養学分野，2大阪府立大学大学院総 教育研究センター） 合リハビリテーション学研究科）

○Risa Nishisaka1, Kazuaki Mawatari1, Akari Tsunedomi1, Hitomi ○Kazuaki Mawatari1, Miyuki Edagawa1, Natsumi Iwamoto1, Miki Watanabe1, Akiko Uebanso1, Takaaki Shimohata1, Takashi Uebanso1, Maetani-Yasui1,2, Airi Honjo1, Risa Nishisaka1, Hitomi Watanabe1, Yuki Kanamoto2, Akio Murakami2, Akira Takahashi1 (1Dept. Prevent. Takaaki Shimohata1, Takashi Uebanso1, Akira Takahashi1 (1Dept. Environ. Nutr., Inst. Biomed. Sci., Tokushima Univ. Grad. Sch., Prevent. Environ. Nutr., Inst. Biomed. Sci., Tokushima Univ. Grad. 2Research Center for Inland Seas, Kobe Univ.) Sch., 2Grad. Sch. Comprehensive Rehabilitation, Osaka Prefecture Univ.) Introduction: Cyanobacteria are gram negative photosynthetic bacteria. Some species of cyanobacteria produce neurotoxin or Ultraviolet rays can be classified by wavelength into UVA (320–400 hepatotoxin to human. People may be exposed to cyanobacterial nm), UVB (280–320 nm), and UVC (–280 nm). We reported that toxins by drinking or bathing in contaminated water, therefore ultraviolet-A irradiation had bactericidal effect to enteropathogenic growth of cyanobacteria should be controlled for serving clean water. bacteria, such as Escherichia coli and Vibrio parahaemolyticus, but We reported that UVA-LED irradiation had bactericidal effects detail mechanisms of the effect are still unknown. In this study, we on enteropathogenic bacteria, but did not observe the effect on tried to select UVA-sensitive V. parahaemolyticus mutants from the cyanobacteria yet. In this study, we investigated whether different transposon mutant library and identify some genes associated with energy UVA-LED (385 nm) irradiations (kJ/m2), low (10–40), middle UVA sensitivity. (100–200), and high (400–600), inhibit growth or photosynthetic Seven mutants (#2, #78, #87, #92, #229, #358, #521) with activity on a cyanobacteria, Synechococcus elongtus PCC7942/1. higher sensitivity to UVA irradiation (365 nm, 126 kJ/m2) than Results: Middle to high energy irradiations inhibited cell growth wild type (WT) were selected by comparing colony forming. By in BG11 media and low to high decreased photosynthetic activity. orthological calssicication of transposon-inserted gene, these High energy irradiation decreased components of photosystem mutants could be divided in three groups, F-type H+-transporting II, chlorophyll a and psbA protein, but low and middle did not, ATPase (#78; VP3069, #229; VP3075), type II secretion system suggesting that decreased photosynthetic activity by low and middle (#87 and #521; VP0136, #358; VP0140), and ubiquinone and other was not depended on degradation of photosystem II. Metabolomics terpenoid-quinone biosynthesis. (#2; VP0097, #92; VP0315). and hierarchical cluster analysis indicated that low, middle, and The mutants, #78 and #229, showed significantly lower ATP high energy irradiations induced different profiles of intracellular concentration than WT. The mutants, #87 and #358, showed metabolites. dramatically higher content of secreted proteins than WT. These Conclusion: UVA-LED (385 nm) irradiation would be available results suggest that F0F1-type ATPasea, type II secretion system, for inhibition of cyanobacterial growth, but the mechanisms were and ubiquinone biosynthesis were related with UVA sensitivity in V. different among irradiation energies. parahaemolyticus.

P1-055 還元剤，特に硫化水素と亜硫酸のウェルシュ菌 P1-056 Streptococcus pyogenes の咽頭上皮細胞株 の芽胞形成に対する影響 への付着・侵入における CAMP factor の役割 ○山田 智，三宅 眞実，安木 真世（大阪府大・生命環境・獣医公衆衛 ○黒澤 美絵1,2，小田 真隆1，土門 久哲1，寺尾 豊1（1新潟大・院医歯・ 生） 微生物，2新潟大・院医歯・小児歯）

Effect of reductants, especially hydrogen sulfide and Role of CAMP factor on adhesion/invasion of sulfite, on the sporulation of C. perfringens Streptococcus pyogenes to pharyngeal epithelial cells ○Satoshi Yamada, Masami Miyake, Mayo Yasugi (Dept. Vet. Sci., ○Mie Kurosawa1,2, Masataka Oda1, Hisanori Domon1, Yutaka Terao1 Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.) (1Div. Microbiol. Infect. Dis., Niigata Univ. Grad. Sch. of Med. & Dent. Sci., 2Div. Pediatr. Dent., Niigata Univ. Grad. Sch. of Med. & Dent. 【目的】Clostridium perfringens（ウェルシュ菌）は芽胞形成性の Sci.) 偏性嫌気性菌であり食中毒を引き起こす。下痢の原因であるエ ンテロトキシンは小腸内で芽胞が形成される時に放出されるこ Streptococcus pyogenes は，細菌性咽頭炎の起因菌のひとつとし とが知られており，芽胞形成メカニズムの解明は食中毒の予防 て知られている。同菌の産生する病原因子群は，組織への侵入 や治療の観点から重要である。本研究では培地中に還元剤を添 および組織内増殖を惹起することで感染を拡大させると考え 加し酸化還元状態が芽胞形成に与える影響を調べた。 られている。S. pyogenes の CAMP factor に着目して解析を進め 【方法】還元剤として硫化ナトリウム（Na2S），亜硫酸ナトリウ た結果，マクロファージ系細胞に対して空胞形成を惹起するこ ム（Na2SO3），還元型グルタチオン，チオグリコール酸ナトリウ と，また貪食能を低下させることが明らかとなった。本研究で ム，および L- システイン塩酸塩を用いた。前培養したウェルシュ は，S. pyogenes の咽頭上皮細胞株への付着・侵入に対する CAMP 菌 NCTC8239 株を各還元剤を添加した DMEM に接種し 37°C で factor の影響について解析した。はじめに，S. pyogenes SSI-9 株 培養した。24 時間後に菌液を回収し一部を 75°C で 20 分加熱した。 の CAMP factor 遺伝子欠失株（Δcfa 株）を作製し，ヒト咽頭癌 非加熱菌液と加熱菌液の生菌数を測定し，それぞれを栄養体菌 由来 Detroit 562 細胞に 2 時間感染させた。Δcfa 株では野生株と 数，芽胞数とした。硫化水素（H2S）濃度測定にはメチレンブルー 比較して，血清非存在下における細胞付着と侵入菌数が有意に 法を用いた。菌体内 NAD+/NADH 比はルシフェリンの発光によ 少なかった。また，Detroit562 細胞に組換え (r) CAMP factor を 1 り評価した。 時間作用させた後，Δcfa 株を 2 時間感染させたところ，Δcfa 株 【結果と考察】用いた還元剤の中で，培地中で電離して H2S を発 の細胞への付着・侵入数は rCAMP factor 添加濃度依存的に増加 生させる Na2S は芽胞形成を有意に抑制した。一方 Na2SO3 添加時， した。次に，エンドサイトーシスと密接に関連すると報告され 菌の亜硫酸還元反応による H2S の産生が確認されたが芽胞形成 ている PI3K/Akt 経路と CAMP factor との関係について調べた。 の抑制は見られなかった。そこで亜硫酸還元反応の芽胞形成へ その結果，CAMP factor 単独処理，もしくは Δcfa 株感染細胞内 の影響に注目した。亜硫酸還元には NADH の酸化反応が共役す の Akt リン酸化はほとんど認められなかった。しかしながら， ることから菌体内 NAD+/NADH 比を測定したところ，菌接種 8 rCAMP factor と Δcfa 株を作用させた細胞では，Akt のリン酸化 時間後において Na2SO3 添加群では無添加群と比較して有意に高 が観察された。さらに，CAMP factor 処理で亢進した Δcfa 株の 値を示した。以上の結果から Na2S と Na2SO3 との芽胞形成に対 付着・侵入は，PI3K 阻害剤（LY294002，Wortmannin），および する影響の違いには NADH の酸化反応を共役する亜硫酸還元反 Akt 阻害剤（MK-2206）の添加により抑制された。したがって， 応の関与が示唆された。芽胞形成に対する亜硫酸還元酵素の関 S. pyogenes の咽頭上皮細胞への付着・侵入には，同菌の CAMP 与の有無をさらに調べるために欠損株を作製中である。 factor，および宿主細胞内 PI3K/Akt 経路の活性化が関与している と推察される。

71 P1-057 ウエルシュ菌 α 毒素の赤血球系細胞に対する P1-058 肺炎球菌による肺組織傷害誘導メカニズムの 影響 解析 ○大石 恭平，高岸 照久，竹原 正也，清家 総史，宮本 和明，小林 敬 ○土門 久哲1，坂上 雄樹1，小田 真隆1，山口 雅也2，川端 重忠2，寺 子，永浜 政博（徳島文理大・薬・微生物） 尾 豊1（1新潟大・院医歯・微生物，2阪大・院歯・口腔細菌） Effect of Clostridium perfringens alpha-toxin on Analysis of mechanisms in pneumococcus-induced lung erythropoiesis in murine bone-marrow cells injury ○Kyohei Oishi, Teruhisa Takagishi, Masaya Takehara, Soshi Seike, ○Hisanori Domon1, Yuuki Sakaue1, Masataka Oda1, Masaya Kazuaki Miyamoto, Keiko Kobayashi, Masahiro Nagahama (Dept. Yamaguchi2, Shigetada Kawabata2, Yutaka Terao1 (1Div. Microbiol. Microbiol., Fac. Pharm. Sci., Tokushima Bunri Univ.) Infect. Dis., Niigata Univ. Grad. Sch. Med. & Dent. Sci., 2Dept. Oral & Mol. Microbiol., Osaka Univ. Grad. Sch. Dent.) 【目的】A 型ウエルシュ菌は，ガス壊疽だけでなく最近，ヒトで 重篤な貧血症を引き起こすと報告されている。α 毒素は，ホスホ 【目的】肺炎球菌性肺炎が重症化すると，多量に遊走した好中球 リパーゼ C 活性を有し，赤血球に対して溶血作用を示すが，こ からエラスターゼが放出され，肺組織が傷害を受けると推察さ れ以外に骨髄での造血機能にも障害を与え，貧血症を惹起して れている。しかしながら，その分子メカニズムは十分に解明さ いると考え検討を行った。 れていない。本研究では，肺炎球菌の病原因子である自己融解 【方法】C57BL/6 マウスから採取した骨髄細胞を，α 毒素または 酵素 autolysin と菌体内毒素 pneumolysin に着目し，宿主細胞に 酵素活性欠損変異体（H148G）で処理した。毒素処理した細胞 対する細胞死誘導能について解析した。【方法】肺炎球菌 D39（野 は，赤芽球系細胞のマーカーである抗 TER119 抗体で蛍光標識し， 生）株，autolysin 欠 失（ ΔlytA）株，および pneumolysin 欠 失（ Δply） フローサイトメトリー法で検出した。TER119 陽性赤芽球の採取 株を TSB 培地で培養し，上清画分を採取した。それら上清をヒ は，マウス骨髄細胞を PE-TER119 抗体で標識後，磁気ビーズを ト好中球培養液に添加し，細胞毒性試験を行った。次に，ヒト 用いて単離した。α 毒素による TER119 陽性赤芽球の細胞死の判 肺胞上皮細胞株 A549，ヒト好中球，およびマウスマクロファー 定は，Live/Dead 試薬を用いて行った。マウス骨髄細胞をヒトエ ジ細胞株 RAW264.7 に対する組換え (r)Pneumolysin の細胞毒性 リスロポエチン（EPO）と α 毒素で処理し，赤芽球系細胞の分化・ 試験を行った。その際，好中球から放出されるエラスターゼ活 増殖を測定した。 性を測定した。【結果】野生株，ΔlytA 株，および Δply 株のうち， 【結果と考察】α 毒素は，骨髄細胞に作用させると TER119 陽性 野生株上清のみが好中球に細胞毒性を示した。また，野生株上 細胞が著しく減少し，H148G では変化は認められなかった。そ 清中の pneumolysin 遊離量は高値を示した。rPneumolysin は好 こで本毒素は，その酵素活性により直接 TER119 陽性細胞に障 中球に強い細胞毒性を示し，エラスターゼ漏出を誘導した。し 害を与えると考え検討を行ったが，α 毒素は直接 TER119 陽性細 かしながら，rPneumolysin は A549 と RAW264.7 に対し，ほとん 胞の障害を示さなかった。次に本毒素は，赤芽球系前駆細胞の ど細胞毒性を示さなかった。一方，好中球エラスターゼの添加 赤芽球への分化を阻害していると考えられるので，EPO 存在下 により A549 と RAW264.7 はウェルプレートから剥離した。【考 で α 毒素処理すると，TER119 陽性細胞は，α 毒素のみより EPO 察と結論】肺炎球菌は，自己融解酵素の働きで pneumolysin を漏 の添加により顕著に回復した。以上の結果より，α 毒素は，末梢 出し，好中球を傷害して内因性エラスターゼを漏出させること 血中での溶血作用に加え，骨髄細胞中の赤芽球系前駆細胞から が判明した。漏出した好中球エラスターゼは肺胞上皮細胞およ 赤芽球への分化を阻害して赤血球数を減少させ，貧血症を増悪 びマクロファージを傷害することにより，肺組織傷害および更 させると推察される。 なる感染拡大を引き起こす可能性が示唆された。

P1-059 Clostridium difficile の毒素生産を解析するた P1-060 ウエルシュ菌 α 毒素の好中球分化抑制による めのフェノミクスの利用 自然免疫系の障害 ○Peter Turner（（社）セントラル科学貿易 , バイオメディカルサイ ○竹原 正也，高岸 照久，大石 恭平，宮本 和明，小林 敬子，永浜 政 エンス部） 博（徳島文理大・薬・微生物）

Using phenomics to analyze toxin production in Clostridium perfringens alpha-toxin impairs innate Clostridium difficile immunity via blockage of granulopoiesis ○Peter Turner (Bio-Medical Division, Central Scientific Commerce, ○Masaya Takehara, Teruhisa Takagishi, Kyohei Oishi, Kazuaki Inc.) Miyamoto, Keiko Kobayashi, Masahiro Nagahama (Dept. Microbiol., Fac. Pharm. Sci., Tokushima Bunri Univ.) For Clostridium difficile and many other pathogenic microorganisms, the nutritional or environmental factors triggering or suppressing 【目的】好中球は病原細菌に対する自然免疫による生体防御に関 toxin production are not fully understood. Genetics and physiology 与し，その産生は感染症の進行と密接に関連している。細菌感 are also likely to play a role. Phenomics, performed in high 染時に宿主内では，好中球の産生亢進により病原細菌が除去さ throughput, is now a proven technology that can be used to れるが，ある種の細菌感染は宿主免疫を回避して敗血症などの determine conditions that affect toxin production. In this study, PM 重篤な転帰をとる。ウエルシュ菌によるガス壊疽は，外傷を受 (Phenotype MicroArray) assays from Biolog were utilized to examine けて数時間で発症し，急速な経過をたどる感染症である。今回， the effect of 768 different culture conditions on toxin production by 我々は，本菌が産生する α 毒素が好中球の産生を抑制し，宿主 the type strain of C. difficile. To make this feasible, a new robust 自然免疫系を障害することを報告する。【方法と結果】A 型ウエ cell-based cytotoxicity assay was also developed and utilized in high ルシュ菌（α 毒素産生株）を C57BL/6 マウスの大腿筋に投与し throughput toxin assays. The culture conditions surveyed included て感染させ，そのマウスの大腿骨より骨髄細胞を採取し，好中 200 carbon sources, 400 nitrogen sources as well as different 球の変化を解析した。その結果，本菌の感染により高分化型の phosphorus and sulfur sources. From within these, 89 conditions 好中球（Gr-1high/CD11b+ 細胞）が減少し，その骨髄細胞より単離 produced strong toxin induction and 31 gave strong toxin repression. した Gr-1+ 好中球のギムザ染色を行うと，細胞核が分葉した高分 Examples of strong toxin inducers included purines as nitrogen 化型の好中球はほとんど観察されなかった。また，本菌の病原 sources. Toxin repressors included leucine dipeptides and the 性に寄与する α 毒素を欠失した菌株の結果より，これらの作用 triple-leucine tripeptide. In addition, this approach was successfully は α 毒素依存的であることが分かった。さらに，α 毒素のみを投 applied to and demonstrated with a broad range of toxin producing 与したマウスでも同じ病態が誘導された。次に，マウスより採 microorganisms. 取した骨髄細胞に in vitro で α 毒素を処理すると，好中球の分化 が抑制され，この作用は α 毒素の酵素活性（スフィンゴミエリ ナーゼ活性及びホスホリパーゼ C 活性）を欠損した変異毒素で は観察されなかった。【考察】以上の結果より，ウエルシュ菌の α 毒素は，感染時に直接的に好中球の産生を抑制することが判明 した。すなわち，本菌が自然免疫系を障害して本感染症が急速 に進行する，本菌の新しい免疫回避機構の存在が示唆された。

72 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P1-061 ピロリ菌の空胞化毒素 VacA の Cx43 の細胞内 P1-062 Establishment of new emetic animal model 蓄積は陰イオンチャネル活性と Rac1 が関与する using common marmoset for staphylococcal enterotoxin ○八尋 錦之助1，中野 政之2，平山 壽哉3，野田 公俊1（1千葉大学医学 ○小野 久弥，廣瀬 昌平，中根 明夫（弘前大・院医・感染生体防御学） 研究院病原細菌制御学，2長崎大学熱帯医学研究所細菌学分野 / 国際 保健学分野，3長崎大学名誉教授） ○Hisaya Ono, Shouhei Hirose, Akio Nakane (Dept. Microbiol. Immunol., Hirosaki Univ., Grad. Sch. Med.) H. pylori VacA-induced Cx43 accumulation is involved with anion channel activity and Rac1 activity Staphylococcal enterotoxins (SEs) produced by Staphylococcus ○Kinnosuke Yahiro1, Masayuki Nakano2, Toshiya Hirayama3, aureus, have emetic activity and cause staphylococcal food poisoning. Masatoshi Noda1 (1Dept. Mol. Infectiology., Grad. Sch. Med., Chiba The exact molecular and cellular mechanisms of the emetic activity Univ., 2Dept. Bacteriology/International Health., Institute Tropical of SEs still remain unclear. The primates have been recognized as Med., Nagasaki Univ., 3Nagasaki Univ.) the golden standard model for detecting the emetic activity of SEs. In this study, to clarify the mechanism of emesis induced by SEs, we 【目的】ピロリ菌の産生する VacA は，空胞形成，アポトーシス， established the new emetic animal model using common marmoset オートファジー誘導と多様な活性を示す。昨年度，VacA が ERK and analyzed emetic activity of SEA. Common marmosets were と Atg16L1 の関与のもとに Gap junction の主要構成蛋白質である anesthetized with medetomidine and midazolam, and administered connexin 43（Cx43）の細胞内蓄積引き起こして細胞死を誘導す with SEs intragastrically. The emesis of animals was observed for ることを示した。本年度は，VacA による Cx43 の細胞内蓄積に 5 h after administration. SEs induced emetic response at doses 関与するシグナル伝達経路の詳細を明らかすることを目的とし of 250 μg/kg. Next, we investigated the target cells of SEA in た。【方法】AZ-521 細胞を用い，VacA 添加後，Cx43 の発現をイ common marmoset gastrointestinal tract. Immunofluorescence of ムノブロティングで，Cx43 の細胞内局在変化は共焦点顕微鏡に intestinal sections showed that SEA bound to submucosal mast より観察・解析した。VacA のチャネル活性が Cx43 の蓄積に関 cells. Furthermore, we injected mast cell stabilizer, 5-HT3 receptor 与するかについては，チャネル阻害剤（DIDS）を用いて調べた。 antagonist or histamine H1 blocker before administration of SEA. 又，Rac1 阻害剤，及び Rac1 発現抑制細胞を用い，Rac1 の関与 These drugs significantly reduced emetic response induced by SEA. を解析した。更に，ピロリ菌感染患者，非感染者の胃組織を用 These results indicate that mast cell degranulation in intestinal いて，Cx43 の発現亢進の有無を免疫染色により明らかにした。 submucosa and chemical mediators from mast cells play important 【結果及び考察】DIDS は，VacA による ERK のリン酸化を抑制 roles of emesis induced by SEA. し，Cx43 の蓄積も抑制した。Rac1 発現抑制と阻害剤は，何れも VacA による ERK のリン酸化を有意に阻害し，Cx43 の細胞内蓄 積を阻害した。また，ピロリ菌感染患者の胃組織（8 人 /11 人中） で有意な Cx43 の染色を認めたが，非感染者の組織では認められ なかった。従って，VacA の Cx43 の細胞内蓄積には，VacA のチャ ネル活性による，グルタチオン代謝の抑制と Rac1 の活性化を伴っ た ERK 活性化が関わるオートファジーに至る一連の経路が関与 していること，また，Cx43 細胞内蓄積はピロリ菌感染による病 態発症にも密接に関与していると推察された。（Yahiro K et al., Cell Death Discovery. 2015）（非会員共同研究者：長崎大学病院消 化器内科 赤澤 裕子）

P1-063 ウエルシュ菌 β 毒素の細胞毒性発現における P1-064 III 型エフェクター ExoS の宿主細胞内注入に Pannexin-1 チャネルの役割 おける緑膿菌の IV 型線毛 pilT と pilU 遺伝子の必要性 ○並川 恵，清家 総史，高岸 照久，宮本 和明，小林 敬子，竹原 正也， ○林 直樹，四方 基嗣，藤本 祥代，中村 貴乃，松井 直之，石山 彩奈， 永浜 政博（徳島文理大・薬・微生物） 前川 結，後藤 直正（京都薬大・薬・微生物・感染制御学） Role of Pannexin-1 on Clostridium perfringens beta- Type IV pili contribute to type III ExoS effector injection toxin-induced cytotoxicity into host cell in Pseudomonas aeruginosa ○Megumi Namikawa, Soshi Seike, Teruhisa Takagishi, Kazuaki ○Naoki Hayashi, Mototsugu Shikata, Akiyo Fujimoto, Takano Miyamoto, Keiko Kobayashi, Masaya Takehara, Masahiro Nagahama Nakamura, Naoyuki Matsui, Ayana Ishiyama, Yui Maekawa, Naomasa (Dept. Microbiol., Fac. Pharm. Sci., Tokushima Bunri Univ.) Gotoh (Dept. of Microbiol. Infect. Control Sci., Kyoto Pharm. Univ.)

【目的】C 型ウエルシュ菌の β 毒素は，本菌による壊疽性腸炎 【目的】Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）の IV 型線毛は，PilA の原因の一つと考えられている。我々は，本毒素が ATP 受容 タンパク質の重合化によって形成されたフィラメント部分が 体である P2X7 受容体（P2X7R）に結合して毒性を発現すること モーター（PilT と PilU）により伸縮する。我々は，緑膿菌の III を報告した 1）。今回，β 毒素の詳細な作用機序を解明するため， 型分泌装置によって宿主細胞内に注入される ExoS エフェクター P2X7R と関連して活性化され，ATP の細胞外への遊離に関与す は上皮細胞間のタイトジャンクションの開裂を引き起こし，こ る Pannexin-1（Panx-1）の毒性発現における役割を検討した。 の注入過程に pilA 遺伝子が必要であることを明らかとした。本 【結果】β 毒素をヒト単球由来 THP-1 細胞に作用させると，5～ 研究では，上皮細胞内への ExoS 注入における緑膿菌の pilT と 15 分で一過性の ATP 遊離が認められた。そこで，P2X7R の共 pilU 遺伝子の必要性を調べた。 役分子で ATP 遊離に関与する Panx-1 の関与を検討するため， 【方法】β- ラクタマーゼ blaM と exoS 融合遺伝子の発現ベクター Panx-1 阻害剤 carbenoxolone（CBX）で処理すると，本毒素によ を導入した緑膿菌を HeLa 細胞に感染後，基質である CCF2 の分 る細胞毒性，および，ATP 遊離が抑制された。次に，細胞外に 解によって変化した蛍光により，細胞内に注入された ExoS 量を 遊離した ATP の関与を検討するため，ATP を分解するヘキソキ 測定した。Transwell 中で培養したヒト結腸癌由来 Caco-2 細胞モ ナーゼ，または，アピラーゼを添加すると，β 毒素の細胞毒性が ノレイヤの管腔側に緑膿菌を接種し，基底膜側に透過した菌数 抑制され，遊離した ATP が毒性に関与することが判明した。また， と経上皮電気抵抗値を測定した。 本毒素処理後の P2X7R と Panx-1 の細胞内での局在変化を観察す 【結果と考察】上皮細胞内への ExoS 注入量は，pilT の欠損によ ると，β 毒素処理しても THP-1 細胞の細胞膜および細胞質にお り pilA の欠損と同程度減少（pilT : 75, pilA : 80%）し，pilU の欠 ける P2X7R と Panx-1 の共局在に変化は認められないが，両者の 損により 30% 減少した。pilT の欠損は，Caco-2 細胞のタイトジャ 蛍光強度は毒素処理で減少した。さらに，Panx-1 の病原性にお ンクション破綻を pilA の欠損と同程度減少させ，pilU の欠損は， ける役割を検討したところ，CBX 投与群では本毒素による致死 それら遺伝子の欠損と比べて弱く減少させた。pilT および pilU が抑制された。 の欠損は，Caco-2 細胞モノレイヤの透過を pilA の欠損と同様に 【考察】β 毒素は P2X7R に作用後，Panx-1 を活性化して一過性に 消失させた。Caco-2 細胞に感染させた PAO1 株における pilT と ATP を遊離し，P2X7R などに作用して細胞毒性のイニシエーター pilU 遺伝子の発現量を調べたところ，培養液中に浮遊した緑膿 として働く可能性が示唆され，Panx-1 が病原性に関与すること 菌で検出された両遺伝子の発現は，Caco-2 細胞への付着により が判明した。β 毒素の治療戦略に P2X7R -Panx-1 系の阻害が有効 pilU の発現のみが減少した。これらの結果から，緑膿菌による であると思われる。 上皮細胞内への ExoS 注入には，IV 型線毛の pilT と pilU がそれ 1）Nagahama et al. Biochim. Biophys. Acta 1850, 2159 (2015) ぞれ寄与することが示唆された。

73 P1-065 ボルデテラ属細菌の III 型エフェクター BopC P1-066 肺炎クラミジア分子 CPj0783 は Huntingtin- のよるネクローシス誘導とマクロファージの貪食運動阻害 interacting protein 14 に結合する ○桑江 朝臣，阿部 章夫（北里大・院・感染制御科学） ○簗取 いずみ，今田 潔，岸 文雄（川崎医大・医・分子生物学2） Bordetella BopC induces necrosis and inhibits Chlamydia pneumoniae CPj0783 interacts with macrophage phagocytosis Huntingtin-interacting protein 14 ○Asaomi Kuwae, Akio Abe (Grad. Sch. Infect. Cont. Sci., Kitasato ○Izumi Yanatori, Kiyoshi Imada, Fumio Kishi (Dept. Mol. Genet., Univ.) Kawasaki Med. School)

Bordetella colonizes the host respiratory tract. B. pertussis is a Chlamydia pneumoniae is a Gram-negative, obligate intracellular causative agent of whooping cough. B. bronchiseptica is isolated from pathogen that causes community-acquired respiratory infections. C. many kinds of mammals. We identified BopC, also referred as BteA, pneumoniae has a unique life cycle and two developmental stages, as a type III effector secreted from Bordetella. It has been reported the elementary body (EB) and the reticulate body (RB). After C. that BopC induces necrosis in mammalian cells. In this study, we pneumoniae invades host cells, it disturbs the vesicle transport showed that the wild-type B. bronchiseptica induces membrane system to escape host lysosomal or autophagosomal degradation. ruffles at the peripheral part of L2 cells, which is a rat lung epithelial By using a yeast mis-sorting assay, we found 10 candidate genes cell line, during bacterial infection in a BopC-dependent manner. involved in aberrant vesicular trafficking in host cells. One of the The necrosis induced by the B. bronchiseptica infection was inhibited candidate genes, CPj0783, was recognized by antibodies from by addition of cytochalasin D, actin polymerization inhibitor, to C. pneumoniae-infected patients. The expression of CPj0783 extracellular media, suggesting that the actin polymerization was detected at mid to late-cycle time points. CPj0783 might be is required for the necrosis induction. We also carried out the generated in RBs, but not EBs, and is necessary for growth in the gentamicin protection assays in order to measure amounts of inclusion body. It was revealed by two-hybrid screening in yeast phagocytosed Bordetella using J774A.1, a mouse macrophage-like cell cells that CPj0783 interacted with Huntingtin-interacting protein 14 line. The phagocytosed amounts of the strains that secrete BopC into (HIP14). The specific interaction between CPj0783 and HIP14 could host cells were significantly lower than those of the strains that lost be demonstrated by co-immunoprecipitation assay and GST pull- the ability to translocate BopC into host cells, suggesting that BopC down assay. It was also demonstrated that HIP14 was localized in the has roles for the inhibition of macrophage phagocytic activity in vivo Golgi apparatus and colocalized with CPj0783. HIP14 is a palmitoyl during Bordetella infection. transferase that is involved in the palmitoylation-dependent vesicular trafficking of several acylated proteins. Our study suggests that CPj0783 interacts with HIP14 and could cause aberrant vesicle trafficking.

P1-067 グリコーゲン合成酵素キナーゼタグを用いた肺 P1-068 Analysis of roles of pertussis toxin in 炎クラミジアエフェクターの網羅的スクリーニング infection ○今田 潔，簗取 いずみ，岸 文雄（川崎医大・医・分子生物学2（遺 ○新居 佑規1，中村 佳司1，鈴木 孝一朗1,2，安倍 裕順1，新澤 直明1， 伝学）） 堀口 安彦1（1阪大・微研・分子細菌学，2（一財）阪大微生物病研究会） Screening for Chlamydia pneumoniae effector proteins ○Yuki Nii1, Keiji Nakamura1, Koichiro Suzuki1,2, Hiroyuki Abe1, Naoaki 1 1 1 by using a glycogen synthase kinase tag Shinzawa , Yasuhiko Horiguchi ( Dept. Mol. Bacteriol, RIMD, Osaka 2 ○Kiyoshi Imada, Izumi Yanatori, Fumio Kishi (Dept. Mol. Genet., Univ., BIKEN) Sch. Med., Kawasaki Univ.) Pertussis toxin (PTX) is an ADP-ribosylating toxin that is produced Chlamydia pneumoniae is a obligate intracellular pathogen causing by Bordetella pertussis. PTX shows a variety of biological effects community-acquired respiratory infections. A number of Gram- through its ADP-ribosylating activity. However, the roles of PTX in negative bacterial pathogens used type III secretion systems infection remain to be determined. To elucidate them, we attempted (T3SS) to inject effector proteins into host cells. C. pneumoniae to analyze PTX functions in vivo using rats as model animals. B. has the structural genes coding for a T3SS that may be used to pertussis, which is a strict human pathogen, produces PTX while infect host cells. To date, only few effector proteins were identified. B. bronchiseptica, which infects a wide range of mammals, does not Recently, genetic transformation system in Chlamydia trachomatis produce PTX due to a deficiency in promoter function. Therefore, we was developed. Besides, a small universal translocation tag was first tried to obtain two distinct mutant strains of B. bronchiseptica demonstrated. GSK tag, which contains only thirteen amino acid producing PTX, named B-PTXm and P-PTXm, which carry ptx genes residue derived from human glycogen synthase kinase, does derived from B. bronchiseptica and B. pertussis, respevtively. Both not interfere with the secretion of effector proteins. Once GSK the genes are driven by the B. pertussis-derived ptx promoter. PTXs tagged protein was translocated into the cytosolic compartment of from these two mutants had ADP-ribosylating activity and Chinese eukaryotic cells, GSK tag will be phosphorylated by host cell protein Hamster Ovary (CHO) cells-clustering activity that are comparable kinases. to those of B. pertussis PTX. We are now trying to compare the The purpose of this study is to identify C. pneumoniae effector manifestations and burdens of disease in rat infection models proteins by using GSK tag and transformation system of C. between wild type, B-PTXm, and P-PTXm of B. bronchiseptica. We trachomatis. First, we developed that C. trachomatis expression hope that we could discuss the results of these experiments on the library encoding GSK tagged C. pneumoniae genes (440 ORFs). day of the meeting. To screening for C. pneumoniae effector proteins, C. trachomatis was transformed with the expression vectors and then infected to HEp-2 cell. Cell lysate was analyzed by immunoblotting with anti- phosphorylated GSK antibody. At this moment, several effector candidates were found in the expression library.

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P1-069 腸管病原性大腸菌 EPEC の病原因子 NleA によ P1-070 血液成分による ily 遺伝子発現の正および負の る細胞死抑制 調節 ○狩野 真樹，顔 宏哲，戸邉 亨（阪大院・医・生体情報科学） ○千葉 真也，友安 俊文，山崎 貴大，日下 信吾，田端 厚之，長宗 秀 明（徳島大院・STS・ライフシステム） Suppression of cell death by NleA of enteropathogenic E. coli Positive and negative control of ily expression by blood ○Masaki Karino, Hilo Yen, Toru Tobe (Dept. Biomed. Inform., Grad. components Sch. Med., Osaka Univ.) ○Shinya Chiba, Toshifumi Tomoyasu, Takahiro Yamasaki, Shingo Kusaka, Atsushi Tabata, Hideaki Nagamune (Dep. of Biol. Sci. & 腸管病原性大腸菌（EPEC）の病原因子の一つである NleA は， Tech., Inst. Tech. & Sci., Tokushima Univ. Grad. Sch.) マクロファージ様 THP-1 細胞において炎症性サイトカインの分 泌を抑制する。これは NleA が NLRP3 に直接結合しインフラマ 【目的】口腔内常在菌の Streptococcus intermedius（SI）は日和見 ソームの形成を阻害した結果，カスパーゼ 1 の活性化を抑制し 的に重篤な膿瘍感染症を引き起こす。本菌の主要病原因子であ IL-1β，IL-18 の成熟および放出を低下させることによる。カスパー るヒト特異的細胞溶解毒素インターメディリシン（ILY）の発 ゼ 1 の活性化は，ピロトーシスと呼ばれる細胞死を誘導するこ 現 は，catabolite control protein A や lactose phosphotransferase とが知られている。そこで，ヒト上皮細胞において NleA がカス system repressor などで制御される。従って ILY 産生は，環境 パーゼ 1 依存性の細胞死を抑制している可能性について検討し 中のグルコースなどにより抑制され，ガラクトースにより増強 た。 される。また，SI は多基質酵素MsgA（β-galactosidase，β-N- HeLa 細胞への感染実験で，nleA 欠損株の感染細胞における死細 Acetylglucosaminidase 活性を保有）やシアリダーゼ（NanA）を 胞の割合が野生株および相補株の感染細胞と比較して増加して 持ち，これら酵素による糖鎖分解産物は，ILY 分泌量を制御する いた。また，Caco-2 細胞への感染実験では，nleA 欠損株の感染 可能性がある。我々は，SI をウシ胎児血清（FBS）中で培養す 細胞において細胞膨化および細胞膜破壊が認められた。感染細 ると ILY による溶血活性が著しく増加すること，ヒト血漿中に 胞の培養上清中の活性型カスパーゼ 1 を検出したところ nleA 欠 はそれを抑制する成分が含まれることを明らかにした。そこで， 損株感染において野生株および相補株と比較して増加している 血漿成分による ily 遺伝子の発現制御について解析を行った。 ことが確認された。以上の結果は，EPEC 感染により上皮細胞に 【結果と考察】精製 MsgA と NanA を用いて FBS 中に含まれる ピロトーシス誘導の刺激が働くが NleA の作用により細胞死を抑 糖鎖を分解した結果，約 4.3 mM のシアル酸と約 2.7 mM のガラ 制していることを示唆している。nleA 欠損株感染によるピロトー クトースが遊離することがわかった。また，これらの糖により， シス誘導の分子機構および NleA の抑制機序についての解析結果 ILY，MsgA，NanA の発現が活性化されることも確認した。FBS を併せて報告する。 にヒト血漿を添加して SI を培養した結果，溶血活性の抑制効果 ピロトーシス細胞から流出した IL-1 ファミリーにより，さらな が認められるが，それには個人差があることを発見した。さら るサイトカインの誘導や炎症部位への好中球の集積が起こり， に抑制効果が強いヒト由来の血漿は，高い抗 ILY・抗 MsgA 抗体 効率的に細菌の排除が行われることが報告されており，EPEC は 価，強い ILY 発現抑制効果と中和活性を保有していることもわ NleA を用いてこの宿主防御反応への曝露から逃避している可能 かった。現在，これら抗体が SI の感染防御にどのように働いて 性が考えられる。 いるのかについての解析を進めている。

P1-071 Manipulation of the host ubiquitin system P1-072 Vibrio vulnificus の RtxA1 毒素の解析 by Legionella Deubiquitinases ○土屋 孝弘，河野 広朗，宮本 勝城，辻坊 裕（大阪薬大・薬・微生物） ○久堀 智子，Xuan Thanh Bui，Andree Hubber，永 井 宏樹（阪大微研） The analysis of RtxA1 toxin of Vibrio vulnificus ○Tomoko Kubori, Xuan Thanh Bui, Andree Hubber, Hiroki Nagai ○Takahiro Tsuchiya, Hiroaki Kawano, Katsushiro Miyamoto, Hiroshi (RIMD, Osaka Univ.) Tsujibo (Dept. Microbiol., Osaka Univ. Pharm. Sci.)

Ubiquitin conjugation is a pivotal eukaryotic process that regulates 【目的】Vibrio vulnificus は魚介類の摂取や海水の創傷部暴露等を many cellular events. Bacterial pathogens evolved many effector 介して感染する好塩性のグラム陰性桿菌である。アルコール中 proteins that can modify the host ubiquitin pathway to utilize the 毒者，糖尿病患者，肝機能に重篤な障害を有するヒトが感染す system for their own benefit. Bacterial effector proteins mimicking ると，数日のうちに敗血症に陥り死亡する。我々は本菌が分泌 host E3 ubiquitin-ligases have been identified in recent years. Here する細胞傷害因子としてはヘモライシン（VvhA）と，RtxA1 毒 we focus on bacterial deubiquitinases (DUBs), which are ubiquitin- 素が重要であると報告してきた。ビブリオ属細菌の Rtx 毒素は deconjugating enzymes, as a negative regulator for the ubiquitin 約 5000 アミノ酸残基からなる非常に大きなタンパク質で，複数 system. Using in silico analyses, we found five candidate genes のドメインを有しており，それぞれのドメインが機能的に働い encoding DUBs from Legionella phneumophila, a causative agent ていると考えられている。しかしながら，それらドメインの機 of Legionellosis. Ectopic expression of these genes in human cells 能はいまだ解明されていない。そこで，RtxA1 毒素の受容体の探 remarkably reduced the level of polyubiquitin. Further dependence 索，細胞内への侵入および細胞内での機能を解析することによ on the catalytic cysteine residues for this reduction indicates that り RtxA1 毒素の全貌を明らかにすることを目的に実験を行った。 these actually encode DUBs. When mouse bone-marrow derived 【方法】本菌の野生株と各種欠損株を 37°C で対数増殖後期まで macrophages were infected with a Legionella strain lacking all 5 攪拌培養し実験に供した。各種欠損株の生菌のマクロファージ DUBs, accumulation of ubiquitin surrounding bacteria-containing 様細胞株 J774A.1 に対する細胞傷害活性を測定した。RtxA1 毒素 vacuoles were significantly increased. Ubiquitin decoration of の各ドメインを HeLa 細胞内で発現させ，細胞傷害活性を有する bacterial vacuoles is a known target of the host immune systems, ドメインの探索を行った。 including autophagy-mediated bacterial clearance. We are going to 【結果と考察】ΔVvhA/ΔRtxA1 株は細胞傷害活性がほとんど認め discuss the bacterial strategy to evade host defense mechanism by られないことから，VvhA と RtxA1 が本菌の細胞傷害活性を有す negatively regulating the ubiquitin system. る毒素であることが明らかとなった。RtxA1 毒素のドメインの うち GFP 融合 α/β hydrolase ドメイン発現 HeLa 細胞では，GFP 発現 HeLa 細胞と比較し細胞傷害に全く違いは認められなかった ことから α/β hydrolase ドメインは細胞傷害には関与していない ことが明らかとなった。現在，各種抗体を添加することにより， RtxA1 毒素の受容体を同定するとともに，残りのドメインの機 能解析を行っている。

75 P1-073 Vibrio cholerae Cholix toxin induces P1-074 腸管出血性大腸菌毒素 Subtilase cytotoxin に hepatocyte apoptosis through ROS production and よるインフラマソーム抑制機構の解析 MAPK activation ○津々木 博康1，Thianli Zhang1，小 野 勝彦1，八 尋 錦之助2，野 田 公俊2， 1 1 2 ○小倉 康平1,2，八尋 錦之助2，秋山 徹1，野田 公俊2（1国立国際医療 澤 智裕 （ 熊本大・院・生命科学・微生物， 千葉大・院・医・病原 研究センター研究所・感染症制御，2千葉大・医・病原細菌制御） 細菌制御学）

○Kohei Ogura1,2, Kinnosuke Yahiro2, Tohru Miyoshi-Akiyama1, Analysis of inhibitory effect of subtilase cytotoxin on Masatoshi Noda2 (1Pathogenic Microbe Lab., Research Institute, inflammasome activation 2 National Center for Global Health and Medicine, Dept. Mol. Infectiol., ○Hiroyasu Tsutsuki1, Thianli Zhang1, Katsuhiko Ono1, Kinnosuke Sch of Med., Chiba Univ.) Yahiro2, Masatoshi Noda2, Tomohiro Sawa1 (1Dept. Microbiol., Grad. Sch. Med. Sci., Kumamoto Univ., 2Dept. Mol. Infect., Grad. Sch. Med., Cholix toxin (Cholix) from Vibrio cholerae, exhibiting homology to Chiba Univ.) Pseudomonas exotoxin A (PEA), is a potent virulence factor and the gene is mainly conserved among non-O1/non-O139 Vibrio cholerae 【目的】腸管出血性大腸菌（EHEC）O113:H21 から同定された strains. Previous study showed that PEA and Cholix induce lethal AB5 毒素の一種である Subtilase cytotoxin（SubAB）は小胞体シャ damage in mice liver. Intraperitoneal administration of Cholix to ペロンタンパク質 BiP を切断することで宿主細胞に小胞体スト mice caused severe hepatocyte inflammation with decrease of レスを誘導し，細胞毒性を示す。しかしながら，EHEC 感染症 nucleus. We investigate Cholix-induced cell death mechanism in における SubAB の機能については不明な点が多い。これまで我々 human hepatocyte (HepG2) cells. Cholix alone induced apoptotic は，SubAB が細胞毒性だけでなく LPS によって誘導されるマク cell death, which was significantly enhanced by co-treatment with ロファージの自然免疫機構を抑制することを明らかにしてきた。 tumor necrosis factor (TNF-α) (TNF-α/Cholix). TNF-α alone induced 本研究では，LPS が誘導する宿主炎症応答の一種であるインフ NF-κB activation, but not cell death. At the early time points, Cholix ラマソームの活性化に及ぼす SubAB の影響を明らかにすること stimulated phosphorylation of ERK, JNK and p38 MAPKs, whose を目的とした。 activations were not affected by TNF-α. We found that ERK-specific 【方法】His-tag を付加した組換え SubAB を大腸菌 BL21 で発現 inhibitor suppressed TNF-α/Cholix-induced MAPKs activation and させ，精製したものを用いた。マウスマクロファージ様細胞株 apoptosis. Moreover, ROS inhibitor N-acetyl cysteine suppressed J774.1 細胞を SubAB 存在下あるいは非存在下，LPS で 5 時間 ERK phosphorylation by TNF-α/Cholix, leading to inhibition of 前処理した後に，ATP で細胞を 90 分間刺激した。培養上清は apoptosis signals. These data suggest that TNF-α/Cholix-inducing ELISA 法による IL-1β の定量，ウェスタンブロッティング法によ hepatic cell death is regulated by ROS production, followed by る caspase-1 の解析に用いた。 MAPKs activation. 【結果と考察】LPS で前処理した J774 細胞は ATP 刺激によって caspase-1 が活性化され，培養上清中に成熟型 IL-1β および活性 型 caspase-1 を放出した。SubAB は成熟型 IL-1β の放出を抑制 し，興味深いことに，caspase 1 の活性化を阻害した。以上より， SubAB は J774 細胞における LPS/ATP 誘導性の IL-1β の成熟およ び放出を抑制し，その機序として SubAB による caspase-1 の活 性化阻害が関与する可能性が示唆された。

P1-075 P. gingivalis ジンジパインによる PI3K/Akt 経 P1-076 Streptococcus anginosus 生理活性物質 SAA 路撹乱の分子解析 による歯肉上皮細胞での AID 異所性発現 ○中山 真彰1,2，内藤 真理子3，中山 浩次3，大原 直也1,2（1岡 山 大・院・ ○佐々木 実1，岩崎 賢介2，古玉 芳豊1，下山 佑1，石河 太知1，木村 医歯薬・口腔微生物学，2岡山大・歯・先端領域研究センター，3長崎 重信1（1岩手医科大学・分子微生物，2岩手医科大学・口腔外科学分野） 大・院・医歯薬・口腔病原微生物学） Induction of aberrant AID expression in gingival epithelial The disturbance of PI3K/Akt signaling by P. gingivalis cells by an S. anginosus antigen, SAA gingipains ○Minoru Sasaki1, Kensuke Iwasaki2, Yoshitoya Kodama1, Yu ○Masaaki Nakayama1,2, Mariko Naito3, koji Nakayama3, Naoya Shimoyama1, Taichi Ishikawa1, Shigenobu Kimura1 (1Div. Mol. Ohara1,2 (1Dept. Oral Microbiol, Okayama Univ. Grad. Sch. Med, Dent, Microbiol., Iwate, Med. Univ., 2Div. Oral Surg., Iwate, Med. Univ.) Pharmaceut. Sci., Okayama, Japan, 2ARCOCS, 3Div. Microbiol. Oral Infect., Nagasaki Univ. Grad. Sch. Biomed. Sci., Nagasaki, Japan) 【緒言】遺伝子変異を誘導する活性化誘導シチジン脱アミノ酵 素（AID）は通常，抗原刺激を受けた B 細胞にのみ発現する。 Porphyromonas gingivalis の長期感染は，慢性歯周炎を引き起こし， しかし Helicobacter pylori 感染によりマウス胃粘膜上皮細胞に異 口腔機能の顕著な低下に繋がる。我々はこれまでに，P. gingivalis 所性に発現することが示されて以来，感染発癌との関連が強く が産生するプロテアーゼ“ジンジパイン”が，宿主細胞の生存・ 示唆されている。我々はこれまで口腔癌組織への Streptococcus 増殖，代謝などに重要な機能を持つ PI3K/Akt の活性を抑制する anginosus 感染と AID 発現の関連について検討してきた。本研究 ことを示した。本研究では，ジンジパインによる PI3K/Akt 活 では，正常ヒト歯肉上皮細胞を用いて S. anginosus 生理活性物質 性抑制が Akt の下流タンパク質の機能に及ぼす影響を調べた。 による AID 発現誘導について，mRNA およびタンパク質レベル P. gingivalis ATCC33277 株（WT 株）および P. gingivalis ジンジ の両面から検討した。【材料と方法】S. anginosus 生理活性物質 パイン完全欠損株（MT 株）をヒト歯肉上皮細胞へ感染実験さ SAA は，S. anginosus NCTC 10713 株から精製した（Sasaki M ら， せ，Akt の下流タンパク質 Murine Double Minute2 (MDM2), 4E 2001）。 AID の発現ベクター（pCMV5a-AID-c-Myc-His）でトラ binding protein (4EBP), p70 S6 kinase (p70S6K)/ Ribosomal Protein ンスフェクトした歯肉上皮細胞を陽性対照として，正常ヒト歯 S6 (RPS6) のリン酸化レベルを検討した。各タンパク質のリン酸 肉上皮細胞（105/well）を SAA（10 μg/well）で（単回）刺激後 化レベルは，各タンパク質特異的リン酸化抗体を用いたウェスタ AID mRNA 発現をリアルタイム RT-PCR により検討した。さらに， ンブロッティング法により評価した。WT 株の感染では MDM2 3 日おきに 4 週間まで SAA の連続刺激を行い，AID mRNA 発現 と 4EBP のリン酸化の低下が認められたが，MT 株の感染ではそ とともに AID タンパク質発現についてウエスタンブロッティン れらは認められなかった。p70S6K のリン酸化レベルはいずれの グにより検討した。【結果】SAA の単回刺激によって正常ヒト歯 株の感染でも変化しなかった。一方，RPS6 のリン酸化レベルは， 肉上皮細胞で有意の AID mRNA 発現が誘導されたが，今回の条 WT 株の感染でのみ上昇し，Akt 以外の経路が活性化しているこ 件下では AID タンパク質は観察されなかった。しかし SAA の連 とが示唆された。以上の結果から，P. gingivalis ジンジパインは 続刺激を行った結果，4 週後まで AID mRNA が認められ，4 週 Akt の活性抑制だけでなく，RPS6 のように Akt 経路以外の別経 後には AID タンパク質の異所性発現が認められた。【結論】正常 路を活性化するなど多様な作用を示すことが考えられた。今後， ヒト歯肉上皮細胞を S. anginosus 由来抗原，SAA で刺激すると 各タンパク質の生理的機能への影響とその意義を明らかにして mRNA レベルでの AID 異所性発現が認められるが，SAA の連続 いく。 刺激によりさらに増強され，AID タンパク質の異所性発現に至 ることが明らかとなった。

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P1-077 高病原性 GAS 感染はヒト化マウスモデルで全 P1-078（WS18-3） Liver senses gut 身の骨量減少を導く environmental alteration induced by oral pathobionts ○松井 英則1，吉田 春乃1，竹内 修2，村山 そう明3（1北里大学・北里 ○大坂 利文1,3，阿部 義廣1，上芝 秀博2，常田 聡3，八木 淳二1（1東女 生命科学研究所，2北里大学・北里研究所病院，3日本大学・薬学部） 医大・医・微生物免疫，2東女医大・実験動物，3早大・先進理工・生 命医科） Hypervirulent GAS infection leads to systemic bone loss ○Toshifumi Osaka1,3, Yoshihiro Abe1, Hidehiro Ueshiba2, Satoshi in a humanized mouse model 3 1 1 ○ 1 1 2 Tsuneda , Junji Yagi ( Dept. Microbiol. Immunol., Tokyo Women’s Hidenori Matsui , Haruno Yoshida , Osamu Takeuchi , Somay 2 3 1 2 Medical Univ., Inst. Lab. Anim., Tokyo Women’s Medical Univ., Murayama ( Kitasato Inst. for Life Sci., Kitasato Univ., Kitasato Inst. 3 Hosp., Kitasato Univ., 3Nihon Univ. Sch. Pharm.) Dept. Life Sci. Med. Biosci., Waseda Univ.)

Transgenic mice expressing CD46-a receptor for the M protein Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is considered to be a of group A Streptococcus (GAS)-developed osteoclast-mediated hepatic manifestation of metabolic syndrome. Recently, dysbiotic severe bone destruction in the hind paws 3 days after subcutaneous alteration in the gut microbiota (dysbiosis) has been highlighted infection with 5×105 CFU of the emm 1 GAS strain GAS472 isolated as one possible driving forces for the progression of NAFLD. from a patient with STSS. GAS472 infection induced the RANKL However, the mechanisms causing gut dysbiosis remain obscure. expression while concomitantly reducing OPG expression in the Thus, this study aimed to investigate whether oral pathobionts- hind limb samples of CD46 Tg mice. Micro-computed tomography induced alteration in the gut environments is the contributing factor analysis of the bones suggested that GAS472 infection induced local of NAFLD progression. C57BL/6 mice were fed with a high caloric bone erosion and systemic bone loss in CD46 Tg mice. Because diet to develop obesity, and intragastrically administrated with treatment with mAbs against mouse CD4+ and CD8+ T lymphocytes live oral pathobiont (i.e. Porphyromonas gingivalis, Streptococcus did not inhibit osteoclastogenesis, T lymphocyte-derived RANKL intermedius) for 11 weeks. Serum metabolic biomarker (i.e. was not considered a major contributor to massive bone loss during cholesterol, triglyceride) and liver damage marker (i.e. aspartate GAS472 infection. However, immunohistochemical analysis of tarsal aminotransferase) tended to be elevated by long-term administration bones showed that GAS472 infection stimulated RANKL production of P. gingivalis, but not S. intermedius. Interestingly, intragastric in fibroblasts within the bone marrow cavity but not in osteocytes. administration of oral pathobionts led to enhance the production of Treatment with a mAb against mouse RANKL significantly inhibited inflammatory mediators (e.g. IL-6 and MCP-1) in the liver, while had osteoclast formation and bone resorption. These data suggest no effect on gut physiology such as inflammatory cytokine production that increased expression of RANKL in fibroblasts provoked bone and intestinal permeability. These results suggest that the liver was destruction during GAS infection. Collaborator: Koichi Matsuo (Sch. highly sensitive to gut environmental alteration than the intestine. Med., Keio Univ.) In conclusion, oral pathobionts-induced gut environmental alteration confers the susceptibility to NAFLD progression.

P1-079 Streptococcus intermedius のマウス皮下膿 P1-080 肺炎球菌培養上清はインフルエンザウイルスの 瘍における転写調節機構 感染拡大に働く ○杉 由高，長谷川 紀子，山下 明史，関塚 剛史，黒田 誠（病原体ゲ ○神尾 宜昌，今井 健一，落合 邦康（日大・歯・細菌学） ノム解析研究センター 第三室） Streptococcus pneumoniae supernatants promote Transcriptional regulation of Streptococcus intermedius influenza virus infection in mouse subcutaneous abscesss ○Noriaki Kamio, Kenichi Imai, Kuniyasu Ochiai (Dept. Microbiol., ○Yutaka Sugi, Noriko Hasegawa, Akifumi Yamashita, Tsuyoshi Nihon Univ. Sch. Dent.) Sekizuka, Makoto Kuroda (Pathogen Genomic Center, Nat. Inst. Infect. Dis.) インフルエンザウイルスは新たに合成されたウイルス粒子と感 染細胞のレセプターが結合しているため，細胞外に放出されな 痙攣で外来受診し，膿膿瘍と診断された小児患者の膿瘍ドレ い。そこで，複製されたウイルス粒子表面のノイラミニダーゼ ナージより，新規に Streptococcus intermedius を分離した（以下， （NA）により結合が切断され，細胞から細胞外へと放出される。 TYG1620）。全ゲノム解読の結果，全ゲノム長が 2,006,877 bp の 一部の細菌は NA を産生することが報告されており，われわれは 推定 2007 ORFs を有していることが明らかとなった。TYG1620 口腔細菌が産生する NA がインフルエンザウイルスの感染拡大に による脳膿瘍形成の責任遺伝子を同定するために，C57BL/6 マ 働くことを明らかにした。口腔細菌より高い NA 活性を認める肺 ウスを用いて感染実験を行った。TYG1620 菌体を直接脳内へ 炎球菌は，インフルエンザと混合感染もしくは二次感染により 投与したが，脳膿瘍の形成は認められなかった。しかしなが 重症化することが知られており，特に高齢者においては死に至 ら，C57BL/6 マウス背部への皮下投与によって効率よく皮下膿 ることも少なくない。そこで本研究では肺炎球菌の培養上清が 瘍が形成されることを見出し，マウス皮下膿瘍より回収した インフルエンザウイルス感染に及ぼす影響を検討した。肺炎球 TYG1620 菌体の RNA-seq 解析を行った。Brain Heart Infusion 培 菌培養上清を添加し MDCK 細胞を用いてウイルス感染を行った 地による in vitro 培養の TYG1620 菌体（対数増殖期および定常 結果，ウイルス放出量および感染細胞が著しく増加した。つぎ 期）を比較対象として，皮下膿瘍中で 2 倍以上の有意な転写変 に，肺炎球菌培養上清とともにウイルスをマウスに感染させた。 動（P ＜ 0.05）が認められた遺伝子が 54 個存在した。さらに， その結果，ウイルス感染群において体重の減少が認められ，肺 pGh9:ISS1 plasmid を用いた TYG1620 の Tn 挿入変異株ライブラ 炎球菌培養上清とともに感染させた群では大幅な体重の減少が リーを C57BL/6 に皮下接種して膿瘍形成に貢献する遺伝子群を 認められた。一方，培養上清のみの場合では，体重の変動が認 探索し，RNA-seq 結果と相関する遺伝子群を同定した。ゲノム められなかった。肺のウイルス量をプラーク法により測定した 情報・マウス生体内転写変動・変異株解析の結果を統合し，S. 結果，肺炎球菌培養上清とともにウイルス感染したマウスでは， intermedius TYG1620 の膿瘍形成における責任遺伝子の同定につ 上清を伴わないウイルス感染群に比べ，ウイルス量が有意に増 いて報告する。 加した。以上の結果から，肺炎球菌がインフルエンザウイルス 謝辞：pGh9:ISS1 plasmid を分与していただきました Dr. Alexandra の感染を拡大することが明らかとなった。肺炎球菌は NA を産生 Gruss と友安俊文博士（徳島大学大学院）に深謝致します。 することから，培養上清中の肺炎球菌由来の NA が感染拡大に働 いている可能性が考えられる。

77 P1-081 血清型 4b に属する Listeria monocytogenes P1-082（WS13-3） 臨床病態を反映させたインフル 菌株の病原性の検討 エンザ感染後の二次性肺炎球菌性肺炎マウスモデルの確立 ○岡田 由美子，鈴木 穂高，吉田 麻利江，百瀬 愛佳，五十君 靜信（国 ○木村 聡一郎1,2，三村 一行1，Schaller Matthew2，石井 良和1， 衛研・食品衛生管理） Kunkel Steven2，舘田 一博1（1東邦大・医・微生物感染症，2Dept. Pathology, Univ. of Michigan） Comparison of pathogenicities of Listeria monocytogenes serotype 4b isolates Secondary pneumonia model after influenza virus ○Yumiko Okada, Hodaka Suzuki, Marie Yoshida, Yoshika Momose, infection that recapitulates the clinical features Shizunobu Igimi (Div. Biomedical Food Res., NIHS) ○Soichiro Kimura1,2, Kazuyuki Mimura1, Schaller Matthew2, Yoshikazu Ishii1, Kunkel Steven2, Kazuhiro Tateda1 (1Dept. Microbiol. Listeria monocytogenes (LM) is transmitted to humans via Infect. Dis., Toho Univ. Sch. Med., 2Dept. Pathol., Univ. Michigan) contaminated foods, and causes a severe disease. To determine the pathogenicity of isolate is important to access the risk of food-borne 【目的】インフルエンザウイルス感染後の二次性肺炎球菌性肺炎 listeriosis. In this study, we compared the pathogenicities of LM では，患者が内因性に保菌していた肺炎球菌により二次性肺炎 serotype 4b isolates, which was mainly associated with food-borne を起こすことが予測されている。しかし，汎用されているマウ outbreaks, by using Mongolian gerbils. Six isolates serotype 4b from ス実験モデルでは，インフルエンザウイルス感染後に大量の肺 patients and foods, respectively, were used in this study. One isolate 炎球菌を外因性に感染させているのが現状である。そこで本研 from raw ham was used as a control. Gerbils were orally inoculated 究では，臨床病態を反映させたマウス実験モデルを構築するこ with about 108 LM cells. At 4th day of infection, the spleens were とを目的に検討を行った。【方法】実験には莢膜型 3 の肺炎球菌， removed aseptically, homogenized and diluted for counting the colony インフルエンザウイルス ATCC VR-95 株および C57BL/6 マウス forming units (CFUs). Brain was removed for histopathological を用いた。マウスに 104 cfu/mouse となるよう肺炎球菌液を経鼻 analysis. Simultaneously, the gerbils inoculated with cyclosporinA at 的に投与して保菌させた。インフルエンザウイルスは非致死量 1 day before infection were examined as a model of listerial infection となる 103 pfu を感染させた。各種遺伝子発現量は定量的リアル in the immunocompromised hosts. The CFUs in spleen of 3 isolates タイム PCR 法により評価した。【結果】肺炎球菌保菌 1 週間後 from foods and 3 isolates from patients were significantly lower にインフルエンザウイルスを感染させたところ，肺炎球菌保菌 than that of control isolate in immunocompetent gerbils. However, 群（S 群）およびインフルエンザウイルス感染群（I 群）では全 most of these isolates showed significantly increased CFUs in 匹生存したが，肺炎球菌保菌後にインフルエンザウイルスを感 immunocompromised gerbils. Meningitis was usually found in 染させた群（S＋I 群）は感染後 15 日までに全匹死亡した。この immunocompromised gerbil, however, the severity of meningitis was ときの肺内菌数を測定したところ，S 群と S＋I 群とでは，有意 not correlated with the CFUs in spleen. From these results, all of the な肺内菌数の増加が確認された（p ＜ 0.001）。【考察】本研究に isolates serotype 4b should be considered as the risk against human より，よりヒトの臨床病態に近いインフルエンザウイルス感染 health. 後に続発する二次性肺炎球菌性肺炎モデルを確立することがで きた。本モデルを用いることにより，二次性肺炎の発症前から 病態を解析することが可能となった。

P1-083 Analysis of Francisella tularensis infection P1-084 Acinetobacter baumannii 臨床分離株の肺感 in silkworm model 染マウスを用いた病原性の解析 ○鈴木 尋，渡邉 健太，清水 隆，度会 雅久（山口大院・連合獣医・ ○永川 茂，祖母井 庸之，上田 たかね，鴨志田 剛，佐藤 義則，海野 病態予防獣医学） 雄加，西田 智，斧 康雄（帝京大学・医学部・微生物学） ○Jin Suzuki, Kenta Watanabe, Takashi Shimizu, Masahisa Watarai Analysis of pathogenicity of Acinetobacter baumannii (Grad. Sch., Vet. Sci., Yamaguchi Univ.) clinical isolate with lungs infection mouse ○Shigeru Nagakawa, Tsuneyuki Ubagai, Takane Ueda, Go Francisella tularensis is a zoonotic pathogen and causes tularemia Kamoshida, Yoshinori Satoh, Yuka Unno, Satoshi Nishida, Yasuo that exhibits sporadic lymphadenoma and skin ulcer at sites of Ono (Dept. Microbiol. Immunol., Sch. Med., Teikyo Univ.) infection in human. Infection routes of tularemia are contacts with the environmental pathogens retained in wildlife and arthropods. 【目的】近年，多剤耐性の Acinetobacter baumannii による日和見 Although it is important to understand the life cycle of F. tularensis 感染症が問題になっているがその病原性は十分に解析されてい for preventing its infection, there is little information about the ない。今回，マウスの肺感染モデルを用いて A. baumannii 臨床 mechanisms by which F. tularensis survives in arthropods. In this 分離株（当院分離株）の病原性を標準株（ATCC19606 株）と比 study, we developed arthropods infection model using silkworm 較検討した。 (Bombyx mori) and investigated the behavior of F. tularensis. The 【方法】6～9 週齢 C3H/HeN マウスを用いて A. baumannii 菌液を bacterial number of F. tularensis was kept for more than 6 days, 麻酔下で気管内に接種した。107 cfu の菌接種後，肺組織片を HE whereas Escherichia coli was immediately removed. Fluorescence 染色し病理像を解析した。 microscopy revealed that F. tularensis was retained in hemolymph 【結果】肺に A. baumannii を感染させたマウスの体重は，菌接種 cells. In addition, Melanization and Nodulation known as typical 後 5 日目まで減少し以後回復することを報告した。観察終了時 silkworm immune response were significantly suppressed in の 14 日目には未感染マウスと同等の毛並みと体重になるまで回 silkworm infected with F. tularensis compered to other bacteria. 復していた。肺組織像は，菌接種 1 日目に多形核球の集積が観 These results suggest that F. tularensis control immune system and 察されたが，5 日目には単核球が集積し炎症組織の細胞分布が変 survive inside arthropods for a long period. 化していた。14 日目には，A. baumannii 数の減少に伴い集積細 胞も減少しており，炎症範囲も減少していた。 【結論】既に報告したが，A. baumannii と比較して緑膿菌を感染 させた肺組織は，感染 1 日目から出血傾向が強く 14 日目まで同 様であった。A. baumannii 接種後の炎症は，1 日目では多形核 球であったが 5 日目では単核球に推移していた。体重が最も減 少する菌接種後 5 日目の肺組織像は，炎症範囲が最も広かった。 肺感染の組織片で，A. baumannii 標準株と臨床分離株では集積 する細胞像に違いはなく，どちらも単球の集積が顕著であった。A. baumannii による感染組織に誘導される単球の解析や炎症因子や を継時的に行う予定である。

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P1-085（WS18-8） 黄色ブドウ球菌は，Isd ヘム鉄 P1-086（WS10-4） 百日咳の病態発生機序解明に向 取り込みシステムを介して糖尿病宿主環境に適応する けた感染動物モデルの確立 ○松本 靖彦，宮崎 真也，林 洋平，石井 雅樹，坂上 徹，垣内 力，関 ○中村 佳司1，神谷 重樹2，安倍 裕順1，新澤 直明1，堀口 安彦1（1大 水 和久（東大・薬・微生物薬品化学） 阪大学・微生物病研究所・分子細菌学，2大阪府大・総合リハビリテー ション） Staphylococcus aureus adapts to diabetic host environment by Isd-iron acquisition system Establishment of an animal model for elucidating the ○Yasuhiko Matsumoto, Shinya Miyazaki, Yohei Hayashi, Masaki pathogenic mechanism of whooping cough Ishii, Tohru Sakagami, Chikara Kaito, Kazuhisa Sekimizu (Lab. of ○Keiji Nakamura1, Shigeki Kamitani2, Hiroyuki Abe1, Naoaki Microbiol., Grad. Sch. of Pharm. of Sci., Univ. of Tokyo) Shinzawa1, Yasuhiko Horiguchi1 (1Dept. Mol. Bact., RIMD, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Compr. Rehabil., Osaka Pref. Univ.) 黄色ブドウ球菌は，ヒトの皮膚や鼻腔に常在する細菌である。 この菌は健常人に対してほとんど感染しないが，糖尿病患者に 百日咳は百日咳菌の上部気道感染によって起こる，発作性咳嗽 対して高い感染性を示し，敗血症，心内膜炎，足部潰瘍など重 を主徴とする呼吸器感染症である。この発作性咳嗽は患者に多 篤な疾患を引き起こす。しかし，常在菌である黄色ブドウ球菌 大な負荷をかけ，本症重篤化の原因にもなっているが，その病 が糖尿病状態の宿主に感染するための病原性調節機構は不明で 原因子および発症機構は不明である。その理由として，百日咳 ある。これまでに我々は，カイコを用いた感染モデルと糖尿病 菌がヒトに特化した病原細菌であるために，咳嗽発作を再現す モデルを確立している。また，糖尿病カイコが通常カイコより る感染動物モデルが成立しないことが挙げられる。我々は，百 細菌感染に感受性であることを見出している。そこで本研究で 日咳菌よりも広い宿主域を持ち，多くの病原因子を百日咳菌と は，糖尿病カイコ感染モデルを用いて，糖尿病宿主に対する黄 共有する気管支敗血症菌と種々の動物の組み合わせで，咳嗽発 色ブドウ球菌の病原性に必要な遺伝子の同定を試みた。 作の病態解析のできる感染モデルを検討した。その結果，少量 我々は，当研究室の黄色ブドウ球菌の遺伝子変異株ライブラリー 菌数で一定期間感染が維持され，咳嗽発作を再現する動物感染 を用いて，糖尿病カイコに対する黄色ブドウ球菌の殺傷能が低 モデルを作製することに成功し，さらに咳嗽発作の定量化観察 下した遺伝子変異株を複数同定した。同定された遺伝子群を機 の方法を考案した。この動物モデルの信頼性を検証する目的で， 能別に分類すると，Isd ヘム鉄取り込みシステムに関わる遺伝子 種々の気管支敗血症菌株による感染実験を繰り返した。その過 群が見出された。Isd ヘム鉄取り込みシステムの構成タンパク質 程で，感染は成立するが咳発作を起こさない気管支敗血症菌の である IsdA，IsdC やそれらのタンパク質を細胞壁にアンカリン 自発性変異株（A 株）を偶然に分離することができた。野生型 グするタンパク質である SrtA，SrtB をコードする遺伝子の変異 と A 株の全ゲノム配列を解析した結果，A 株の cx 遺伝子（Cough 株は，いずれも糖尿病カイコに対する殺傷能が低下していたが， X，仮称）に 1 塩基の欠失のあることがわかった。そこで野生型 通常カイコに対する殺傷能は低下していなかった。また，isdA の cx 遺伝子を人為的に欠損させると，野生株の咳嗽惹起能は著 遺伝子変異株は，糖尿病マウスに対する殺傷能が低下していた しく低下し，A 株に野生型 cx 遺伝子を相補すると，菌の咳発作 が，通常マウスに対する殺傷能は低下していなかった。以上の 惹起能は回復した。cx 遺伝子は，感染宿主に咳を惹起するボル 結果から，常在菌である黄色ブドウ球菌が Isd ヘム鉄取り込みシ デテラである百日咳菌，パラ百日咳菌，気管支敗血症菌全ての ステムにより糖尿病宿主環境に適応し，感染症を引き起こすこ ゲノムにおいて高度に保存されている。以上のことから，cx 遺 とが示唆された。 伝子産物である CX は百日咳症における咳発作の発症に関与して いることが示唆された。現在 CX の機能解析を通じて，発作性咳 嗽の直接の原因となる細菌側病原因子の同定を目指している。

P1-087（WS3-5） Characterization of P1-088 A 群レンサ球菌ゲノム上のプロファージが宿主 spontaneous fabT mutations in the novel-type の遺伝子発現に及ぼす影響の解明について Streptococcus pyogenes isolates ○山田 俊介，相川 知宏，野澤 孝志，中川 一路（京大院・医・微生物） ○立野 一郎1，松本 昌門2，松井 秀之1，井坂 雅徳1，長谷川 忠男1 （1名市大・医・細菌学，2愛知衛生研・生物・細菌） The influence of Group A Streptococcus prophages on host gene expression ○ 1 2 1 Ichiro Tatsuno , Masakado Matsumoto , Hideyuki Matsui , Masanori ○Shunsuke Yamada, Chihiro Aikawa, Takashi Nozawa, Ichiro 1 1 1 Isaka , Tadao Hasegawa ( Dept. Bacteriol., Grad. Sch. Med. Sci., Nakagawa (Dept. Micribiol., Grad. Sch. Med., Kyoto Univ.) Nagoya City Univ., 2Dept. Microbiol. Med. Zool., Aichi Prefect. Inst. Publ. Health) A 群レンサ球菌（以下，GAS）は，ヒトに特異的に感染し，不顕 性感染から咽頭炎，猩紅熱，そして劇症型 A 群レンサ球菌感染 Streptococcus pyogenes is a causative agent of streptococcal toxic 症（STSS）まで，様々な病態を示す。本菌のゲノム上には，病 shock syndrome (STSS). Mutations in covR/S or rgg, negative 原遺伝子を有する多様なプロファージ領域が存在し，このプロ regulators, can reportedly modulate the severity of infection in this ファージ領域には菌株特異的な病原因子だけでなく，種々の調 pathogen. Recently, we showed that the regions encoding the SalR- 節遺伝子も存在している。これらが多彩な病態に影響している SalK, a two-component regulatory system, were deleted in some ことは予測されるものの，具体的な病原性との関連については emm 1-type isolates (named as “novel-type”). In this study, the two 明らかとされていない。そこで本研究では，プロファージ領域 novel “STSS” isolates 10-85 and 11-171 were more virulent than の存在が GAS の遺伝子発現にどのような影響を及ぼすのか，解 the two novel “non-STSS” isolates 11O-2 and 11T-3 when examined 明することを目的とした。研究対象株は JRS4 株（実験室株）及 using a mouse model of invasive infection. Genome sequencing び国内で単離された劇症型由来の SSI-1 株を使用し，それぞれの experiments using the three strains 10-85, 11-171, and 11O-2 プロファージ領域（JRS4：4 箇所，SSI-1：6 箇所，塩基長 8k～ detected only one single nucleotide polymorphism that causes a non- 41kbp）欠損株の作成を試みた。欠損株の作成にあたっては最初 synonymous mutation in fabT encoding a transcriptional regulator にそれぞれのプロファージ領域上のインテグラーゼ遺伝子欠損 in strain 11O-2. Loss of fabT reduced the high level of virulence 株を作成した後，その他のプロファージ領域（30–40 kb）を欠損 observed in the STSS isolates to that in the non-STSS isolates, and させた。これまでに JRS4 において 2 箇所のプロファージ領域欠 introduction of an intact fabT compensated the lower virulence of 損株を，SSI-1 において 5 箇所のプロファージ領域欠損株を作成 11O-2, suggesting that the mutation in fabT, but not in covR/S or することができた。これらの欠損株のうち数種において，通常 rgg, is involved in the differential virulence among the novel-type の培地上でのコロニー形態が親株に比べ扁平になる傾向が見ら clinical isolates. This type of non-synonymous fabT mutation was れたことから，プロファージの欠損が莢膜に関わる遺伝子発現 also identified in 12 non-STSS isolates (including 11O-2 and 11T-3), に影響を及ぼすことが考えられた。現在様々な調節遺伝子，毒 and most of those 12 isolates showed impaired FabT function. 素遺伝子について遺伝子発現量を定量しているため，その結果 もあわせて報告する。

79 P1-089 Porphyromonas gingivalis における LPS 合 P1-090 A 群溶血性レンサ球菌のマウス感染モデルを用 成に関わる遺伝子の同定 いた発現解析 ○庄子 幹郎1，佐藤 啓子1，雪竹 英治1，鎌口 有秀2，内藤 真理子1， ○渡邊 真弥1,2，切替 照雄3，秋山 徹2（1自治医大・医・細菌学，2国 中山 浩次1（1長崎大・院医歯薬・口腔病原微生物学分野，2北海道医 際医療研セ・病原微生物学，3国際医療研セ・感染症制御） 療大・院歯・微生物学） Transcriptomic analysis of group A streptocci using a Identification of genes involved in Porphyromonas murine infection model gingivalis lipopolysaccharide synthesis ○Shinya Watanabe1,2, Teruo Kirikae3, Tohru Miyoshi-Akiyama2 (1Div. ○Mikio Shoji1, Keiko Sato1, Hideharu Yukitake1, Arihide Kamaguchi2, Bacteriol., Dept. Infect. Immunity, Sch. Med., Jichi Med. Univ., 2Lab. Mariko Naito1, Koji Nakayama1 (1Div. Micro. Oral Infect., Dept. Mol. Pathogenic Microbes, NCGM, 3Dept. Infect. Dis., NCGM) Micro. Immunol., Nagasaki Univ., 2Dept. Oral Micro., Sch. Dent., Health Sci. Univ. Hokkaido) 【序論】A 群レンサ球菌が引き起こす侵襲性・劇症型レンサ球菌 感染症は，容態が重篤で症状が急変するため，集中管理や外科 【目的】歯周病細菌 Porphyromonas gingivalis の病原性には，IX 型分泌機構 的処置を必要とする難治性疾患である。我々は，A 群レンサ球菌 により分泌され，菌体表面の LPS に結合する CTD タンパク質（C 末端側 が侵襲性感染症を引き起こす際に関与する因子の全体像を把握 に保存されたドメインを持つタンパク質群）が関わる。本菌には O 多糖 するために，マウス敗血症モデルと RNA-seq を用いて A 群レン （O 抗原）の組成が異なる二つの LPS があることが知られている。一つは サ球菌の発現解析を行った。 4 つの糖のリピート構造をもつもので，O-LPS と呼ばれる。もう一つは， 【方法】6 週齢 ddY マウスの腹腔に A 群レンサ球菌 GAS476 株 A-LPS と呼ばれ，その O 多糖はマンノースを主成分とする糖のリピート を投与し，経時的に菌を腹腔から回収した。回収した菌体から 構造で陰性荷電を有するとの報告がある。このうち，CTD タンパク質は RNA を抽出し，逆転写した cDNA を合成した。MiSeq を用いてシー 菌体表面の A-LPS の O 多糖に結合する。これまでに O 多糖生合成に関わ クエンス解析し，A 群レンサ球菌の遺伝子発現量の定量を行った。 る遺伝子変異株として，A-LPS O 多糖のみ欠損している株，もしくは両 劇症化に関与すると考えられる二成分制御系 covRS 遺伝子を含 LPS O 多糖を欠損している株を得ているが，両 LPS O 多糖の生合成につ む転写調節因子の遺伝子を欠損した株を作成し，同様に RNA- いては，不明な点が多い。本研究では，15 個の糖転移酵素遺伝子につい seq 解析を行った。 て変異株作製を試み，両 LPS O 多糖の存在の有無を特異抗体により調べ 【結果・考察】野生株をマウスに感染させると，感染 2 時間から た。【結果】15 個の糖転移酵素遺伝子のうち，2 個の遺伝子については， 4 時間後にストレプトリジン S 遺伝子や speB 遺伝子などの病原 変異株が得られなかった。PGN_0361 遺伝子変異株は，A-LPS O 多糖のみ 性因子の発現が上昇した。しかし，ストレプトリジン O やスト 欠損していた。PGN_1239 遺伝子変異株は A-LPS O 多糖生合成の部分的 レプトキナーゼなど劇症化に関与すると考えられている多くの 減少を示していた。また，PGN_1240 遺伝子変異株は両 LPS O 多糖を欠 病原因子をコードする遺伝子の発現は変化しなかった。一方で， 損していた。次に，PGN_0361 と PGN_1239 はアミノ酸配列に相同性があ 転写調節因子を欠損した株では，これらの病原因子の遺伝子発 ることから，それらの二重変異株を作製したところ，その変異株は両 LPS 現が上昇しており，転写調節因子の機能不全が A 群レンサ球菌 O 多糖を欠損していた。【考察】これらの結果より，PGN_1240 タンパク の高病原化に関与すると考えられた。さらに，マウス感染時に 質は両 LPS O 多糖の生合成に必須であること，PGN_0361 タンパク質は ヌクレオチド合成系や金属イオン獲得系の発現上昇がみられた A-LPS O 多糖の生合成に重要であること，また，PGN_0361 と PGN_1239 ことにより，マウス腹腔内では，これらの因子が欠乏している タンパク質はそれぞれが機能的に O-LPS O 多糖の生合成に関わることが ことが推測された。 示唆された。

P1-091 Global identification of hemolysis- P1-092 Tannerella forsythia の有する OmpA 様蛋白 associated genes in Leptospira by transposon random 質の糖鎖解析 mutagenesis ○堀江 俊1,2，猪俣 恵2，出水川 雅司2，引頭 毅2，北井 則行1，村上 幸 2 1 2 ○冨澤 莉那，小泉 信夫，大西 真（感染研・細菌第一） 孝 （ 朝日大・歯・歯科矯正， 朝日大・歯・口腔微生物） ○Rina Tomizawa, Nobuo Koizumi, Makoto Ohnishi (Dept. Bacteriol. I, Glycosylation analysis of OmpA-like protein in Tannerella NIID) forsythia ○Toshi Horie1,2, Megumi Inomata2, Masashi Izumigawa2, Takeshi Leptospirosis is a zoonosis caused by the infection of pathogenic Into2, Noriyuki Kitai1, Yukitaka Murakami2 (1Dept. Orthod., Sch. Dent., Leptospira spp. and exhibits various clinical manifestations. Although Asahi Univ., 2Dept. Oral Microbiol., Sch. Dent., Asahi Univ.) the clinical pictures of the disease have been well-documented, the lack of genetic tools hampers the elucidation of molecular mechanism 【目的】歯周病原細菌 Tannerella forsythia（Tf）の外膜蛋白質であ of pathogenesis in Leptospira spp. Mariner transposon-mediated る OmpA 様蛋白質は，菌体の形態維持や細胞外マトリックスへの random mutagenesis has recently been available in L. interrogans, 付着に寄与することが報告されている。我々は Tf の OmpA 様蛋白 but the efficiency was very low. In this study, we modified the 質の宿主細胞レクチンへの結合性を明らかにしてきた。本研究で mutagenesis method and performed a genome-wide screening of は，OmpA 様蛋白質の修飾している糖鎖の解析を行うこととした。 hemolysis-deficient mutants of L. interrogans by transposon random 【材料と方法】菌株は Tf ATCC 43037 株を用いた。OmpA 様蛋 mutagenesis. 白質は，全菌体抽出液よりコムギ胚芽レクチンアフィニティー We made modifications to the published conjugal DNA transfer カラムで精製した。OmpA 様蛋白質の糖鎖修飾の確認は，Pro-Q method including filtration process, agar medium composition and emerald 染色を用いた。N- グリカナーゼ，シアリダーゼ A なら cultivation condition. A screening of hemolysis-deficient mutants びに O- グリカナーゼを用いて脱糖鎖反応を行った。GlcNAc の were performed on an oleate-palmitate albumin agar plate covered 検出は，抗 O-GlcNAc 抗体を用いてウェスタンブロットにて調べ with bovine blood. Candidate mutants were subjected to a contact- た。シアル酸の検出は，抗 Siaα2,3 抗体を用いてドットブロット dependent hemolysis assay using bovine red blood cells. にて調べた。LC-MS を用いて OmpA 様蛋白質を修飾している糖 Our modified method improved the efficiency of mutagenesis more 鎖の質量分析を行った。 than 500 times than the published one. We obtained 10 clones 【結果および考察】精製 OmpA 様蛋白質は，Pro-Q emerald 染色 from 5000 transconjugants which exhibited 33～60% of hemolytic により糖鎖修飾が確認された。N- グリカナーゼ，シアリダーゼ activity compared to the parent strain. We are currently determining A ならびに O- グリカナーゼによる脱糖鎖反応を行っても分子量 the position in which the transposon was inserted and performing の変化は認められなかった。N- グリカナーゼは糖蛋白質から全 complementation assays. ての N 結合型糖鎖を効率よく除去することが知られているが， O- グリカナーゼは，糖鎖の修飾様式によっては O 結合型糖鎖を 完全には除去しないことが知られている。よって OmpA 様蛋白 質は，O 結合型糖鎖を有していることが考えられた。ウェスタ ンブロットとドットブロットより O-GlcNAc とシアル酸が検出さ れた。O 結合型糖鎖の質量分析より HexNAc が検出された。以 上の結果から，OmpA 様蛋白質の糖鎖は，GlcNAc とシアル酸を 含んでいることが考えられた。

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P1-093 肺炎桿菌の Aerobactin 合成遺伝子 iucB は， P1-094（WS10-6） Streptococcus suis の無莢膜 バイオフィルム形成とシデロフォア産生を促進する 化機序の比較ゲノム解析 ○金廣 優一1，冨岡 祐輔1，小早川 義貴1，多田納 豊2，飯笹 久1，冨 ○遠矢 真理1，渡辺 孝康1，丸山 史人2，新井 沙倉1，大田 篤2，中川 岡 治明3，佐野 千晶1，吉山 裕規1（1島根大・医・微生物・免疫学， 一路2，関崎 勉1（1東大院農・食の安全セ，2京大院医・微生物感染症） 2国際医療福祉大・薬・薬学，3安田女子大・看護） Comparative genome analysis for the mechanisms of Aerobactin synthetic iucB of K. pneumoniae upregulates decapsulation in Streptococcus suis biofilm formation and siderophore production ○Mari Tohya1, Takayasu Watanabe1, Fumito Maruyama2, Sakura ○Yuichi Kanehiro1, Yusuke Tomioka1, Yoshitaka Kobayagawa1, Arai1, Atsushi Ota2, Ichiro Nakagawa2, Tsutomu Sekizaki1 (1Res. Yutaka Tatano2, Hisashi Iizasa1, Haruaki Tomioka3, Chiaki Sano1, Center for Food Safety, Grad. Sch. Agr. Life Sci., Univ. Tokyo, 2Sec. Hironori Yoshiyama1 (1Dept. Microbiol. Immunol., Sch. Med., Shimane Microbiol., Grad. Sch. Med., Kyoto Univ.) Univ., 2Dept. Pharm., Sch. Pharm., IUHW, 3Sch. Nur., Yasuda Women’s Univ.) Streptococcus suis において，莢膜は食菌作用に抵抗する重要な病 原因子の一つである。我々はこれまでに，豚心内膜炎から無莢 【目的】肝膿瘍を形成する Klebsiella pneumoniae 株は，9 割以上 膜株が分離され，無莢膜株が有莢膜株に比べ血小板への高い付 が鉄補足分子の一つであるシデロフォア Aerobactin を産生する。 着能をもつことを見出していたが，その後豚心内膜炎から有・ しかし，シデロフォアには Enterobactin や Yersiniabactin も存在 無莢膜株を同時に分離し，両表現型が共存することを明らかに することから，Aerobactin 産生と菌の病原性発現の関連の詳細 した。そこで病変部の無莢膜株がいつ，どこで，どの様に生ま は不明である。昨年度我々は，Aerobactin 合成オペロンのうち れるかが次の重要な課題となった。これを明らかにする最初の L-hydroxylysine のアセチル化酵素遺伝子 iucB の欠損変異株にお ステップとして，豚心内膜炎から分離された両表現型のペアを いてバイオフィルム形成能が低下することを報告した。本研究 用いて全ゲノム塩基配列を決定し，比較ゲノム解析を行った。 では，鉄飢餓環境が細菌のシデロフォア産生を促進することに 両表現型が共存していた豚心内膜炎検体由来株から，有莢膜株 着目し，鉄キレート剤存在下における iucB 欠損変異株の性状に と無莢膜株を 1 株ずつ選び，計 25 ペア 50 菌株（ST1: 6 ペア， ついて検討した。【方法】iucB 欠損変異体（ΔiucB 株）を用いて， ST28: 19 ペア）を供試した。高速シーケンサー Illumina Miseq 鉄キレート剤存在と非存在下における，1）バイオフィルム形成 で配列決定後，CLC Genomic Workbench を用いてリードのトリ 量の比較（Crystal violet 法 ），2）mRNA 発現量の比較解析（RNA-seq ミング，ST1，ST28 それぞれの代表株へのマッピング，および 及び qRT-PCR），3）感染実験におけるマウス生存率の比較，を行っ 変異検出を行い，de novo assembly は A5-miseq，系統樹作成は た。【結果】1）ΔiucB 株は野生株と比較して，バイオフィルム形 kSNP3 で行った。その結果，系統樹分岐の順は ST →農場→ペア 成量が低下し，鉄キレートにより顕著に低下した。2）ΔiucB 株 となっていた。またペア間で変異箇所を比較した結果，無莢膜 のマウス感染モデルでは，鉄キレート剤投与により生存率が改 株では全て莢膜多糖合成遺伝子（cps）群に非同義置換を伴う変 善した。3）また，ΔiucB 株では，鉄キレートにより他のシデロフォ 異があり，それらが本菌の無莢膜化に関わることが明らかとなっ アである，Enterobactin，Yersiniabactin 合成遺伝子の発現も顕著 た。更に，ST28 では ST1 に比べゲノム上の他の領域でも多くの に低下していた。【考察】K. pneumoniae の Aerobactin 合成遺伝 変異が起こっていたが，これは ST28 がもつ進化スピードの早 子 iucB は，鉄飢餓環境においてバイオフィルム形成とシデロフォ さもしくは可動性遺伝因子の影響によるものであると思われた。 ア産生を介して病原性に寄与すると考えられた。特に，iucB は 以上から本菌は豚個体内で cps 領域に非同義置換を伴う変異が生 Aerobactin ばかりでなく，Enterobactin，Yersiniabactin 合成酵素 じることにより無莢膜化するものと考えられた。 の発現も正に制御していると考えられた。

P1-095 B 型ボツリヌス菌が保有する CBB2_2914 遺伝 P1-096 黄色ブドウ球菌の N-acetylglucosamine 子の芽胞形成への関与 malate 脱アセチル化酵素を介した糖尿病宿主に対する病原 ○幸田 知子1，細見 晃司2，安木 真世1，小崎 俊司1，向本 雅郁1（1大 性発揮機構 2 府大院・生命環境・獣医， 医薬基盤研究所） ○石井 雅樹，松本 靖彦，宮崎 真也，垣内 力，関水 和久（東大・薬・ 微生物） Characterization of CBB2_2914 gene associated with sporulation in Clostridium botulinum type B Mechanism of pathogenicity to diabetic host mediated by ○Tomoko Kohda1, Koji Hosomi2, Mayo Yasugi1, Shunji Kozaki1, GlcNAc-mal deacetylase in S. aureus Masafumi Mukamoto1 (1Dept. Vet. Sci., Grad. Sch. Life Environ. Sci., ○Masaki Ishii, Yasuhiko Matsumoto, Shinya Miyazaki, Chikara Kaito, Osaka Pref. Univ., 2Natl. Inst. Biomed. Innov.) Kazuhisa Sekimizu (Lab. of Microbiol., Grad. Sch. of Pharm., Univ. of Tokyo) Clostridium botulinum type B strain 111 was first isolated from infant botulism in Japan. We reported that strain 111 lost productivity of 糖尿病患者では黄色ブドウ球菌が敗血症，心内膜炎，足部潰瘍 toxin and spore formation during serial passage. We compared whole などの侵襲性の感染症を引き起こす。黄色ブドウ球菌が糖尿 genome sequence of strain 111 with that of the substrain 111Δ2. The 病状態の宿主に対し病原性を発揮する機構を理解し，それを substrain 111Δ2 did not possess plasmid containing the neurotoxin 担う分子（病原性因子）の機能を知ることは感染症の予防法お gene but possess the major sporulation genes such as spo0A, sigF よび治療法を確立するために重要である。カイコとマウスの and sigE on chromosome. We identified at least 50 mutations on 糖尿病モデルを用いて糖尿病宿主感染に必要な黄色ブドウ球 chromosome in the 111Δ2. To evaluate the phenotypic effects of 菌の遺伝子を同定した。同定された黄色ブドウ球菌の ddvA 遺 these mutations on sporulation, we individually inactivated some 伝子がコードする DdvA タンパク質のアミノ酸配列は枯草菌の genes using ClosTron system. A knockout mutant of CBB2_2914 N-acetylglucosamine malate（GlcNAc-mal）脱アセチル化酵素と gene (111Δ2914) showed distinguishable phenotype from strain 111. 49% の相同性を有していた。ddvA 遺伝子破壊株の細胞質画分に Heat-resistant spore formation of 111Δ2914 significantly reduced リコンビナント DdvA-His タグ融合タンパク質（DdvA-His）を添 as compared with that of strain 111. Morphological characteristics 加すると GlcNAc-mal 脱アセチル化活性が検出された。DdvA-His were investigated using phase contrast and fluorescence microscopy リコンビナントタンパク質の GlcNAc-mal 脱アセチル化活性には in 111Δ2914. Any endospores and asymmetric division cells ddvA 遺伝子破壊株の細胞質画分が必要である。プルダウンによ were not observed in the culture of 111Δ2914. The complement り得られた黄色ブドウ球菌のタンパク質を DdvA binding protein strain 111Δ2914 was constructed (111Δ2914::2914). The ability （Dbp）と命名した。Dbp と GST を融合させたリコンビナントタ of heat-resistant spore formation of the 111Δ2914::2914 mutant ンパク質を DdvA-His と混合して，GlcNAc-mal の脱アセチル化 was restored. Many endospores were observed in the cultures of 活性を検討したところ，GlcNAc-mal 脱アセチル化酵素活性が見 111Δ2914::2914. These results suggest that CBB2_2914 gene have 出された。さらに黄色ブドウ球菌の dbp 遺伝子の欠損株は，糖 an important role for sporulation. 尿病カイコに対する病原性が低下していた。これらの結果は， GlcNAc-mal 脱アセチル化酵素が黄色ブドウ球菌の糖尿病宿主に 対する病原性寄与する事を示唆する。

81 P1-097 ステロイド化合物がウェルシュ菌 SM101 系統 P1-098 Edwardsiella tarda ヒト由来株の Caco-2 上皮 の芽胞形成に与える影響 細胞モノレイヤー透過メカニズムの解析 ○平田 祥太郎，三宅 達彦，安木 真世，三宅 眞実（大阪府大・生命 ○末澤 千草，奥田 潤（香川県立保健医療大学・微生物） 環境・獣医公衆衛生） Mechanism of penetration ability through the Caco-2 cell The effect of steroid compounds on the sporulation of monolayer of E. tarda human isolates Clostridium perfringens strain SM101 ○Chigusa Suezawa, Jun Okuda (Dept. of Microbiol., Kagawa Pref. ○Shotaro Hirata, Tatsuhiko Miyake, Mayo Yasugi, Masami Miyake Univ. of Health Sci.) (Lab. Veterinary Public Health, Sch. Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture Univ.) 【背景】Edwardsiella tarda はヒラメやタイなどの海産養殖魚に魚 類エドワジエラ症を引き起こす魚病細菌としてよく知られてい Clostridium perfringens type A is a gram-positive spore-forming るが，ヒトへも感染し，ときに重篤な敗血症の原因となる。最 anaerobe that causes foodborne gastrointestinal diseases in animal 近，病魚由来株とヒトの腸管由来株では遺伝子型が異なること and human. In human cases, an enterotoxin, CPE, produced by the が報告され，前者は I 型（EdwGI 型），後者は II 型（EdwGII 型） bacteria in the intestine plays a major role in the pathogenicity. The と分類されている。魚類に対する病原性には 3 型分泌機構（Type CPE production is transcriptionally co-regulated with sporulation, 3 secretion system; T3SS）が重要であることがわかっているが， thus the control of sporulation in vivo may lead to the prevention ヒト由来株は T3SS をもたず，ヒトに対する病原因子について of the disease. Since it has been known that certain bile salts は現在のところ不明である。【目的と方法】ヒト由来株がヒトに such as deoxycholate (DCA) stimulate sporulation as well as CPE 病原性を示す未知の病原機構を明らかにするため，Caco-2 上皮 production in C. perfringens, we investigate the effect of DCA- 細胞層透過性評価系を用いて本菌の組織上皮細胞層透過活性に related steroids on C. perfringens sporulation. When a C. perfringens ついて検討を行った。次に，上皮細胞層透過活性に関与してい food-poisoning strain was cultured in Dulbecco’s Modified Eagle る未知の病原因子を明らかにするため，Caco-2 細胞を用いた上 Medium (glucose-free, 0.4% starch-supplemented), DCA enhanced 皮細胞層透過試験を利用し，ヒト由来株のゲノム上に存在する spore formation considerably at 50 μM after 8 h incubation, whereas 透過活性関連遺伝子の単離を試みた。【結果と考察】ヒト由来株 some steroid hormones exhibited weak stimulatory activities. では全ての被検菌株が腸管上皮細胞層透過活性を示した。一方， Moreover, cholesterol and plant sterol β-sitosterol did not stimulate 病魚由来株では全ての被検菌株が透過活性を示さなかった。こ sporulation even at 0.5 mM. It was of interest that the latter sterols のことから，本菌のヒトへの病原性に腸管上皮細胞層透過活性 suppressed the DCA-induced sporulation to the background levels in が関与している可能性が示唆された。次に，透過活性関連遺伝 the DCA supplemented medium, suggesting that they disturb DCA- 子の単離を試みた結果，透過活性が著しく低下する株を分離す stimulated sporulation process by unknown mechanism. The results ることができた。現在，これらの株を対象に上皮細胞層透過活 raise a possibility that a certain sterol compound can be used as a 性に関与する病原遺伝子の特定を行っている。（会員外共同研究 precautionary measure to control C. perfringens foodborne disease. 者：國方千菜美，安田仁，根ヶ山清，亀山妙子，平内美仁，中 井敏博）

P1-099 エンドトキシンショックにおけるモルヒネ投与 P1-100 Role of Sp1 in butyric acid-producing タイミングの影響 bacteria induced HIV-1 reactivation ○加藤 秀人1，深田 智子2，尾崎 眞2，今西 健一3，八木 淳二1（1東京 ○今井 健一，落合 邦康（日本大・歯・細菌） 女子医大・医・微生物免疫，2東京女子医大・医・麻酔科，3日本保健 医療大学・保健医療） ○Kenichi Imai, Kuniyasu Ochiai (Dept. Microbiol., Sch. Dent., Nihon Univ.) Impact of the timing of morphine administration on LPS- mediated lethal endotoxic shock in mice We previously reported that a bacterial metabolite butyric acid, ○Hidehito Kato1, Tomoko Fukada2, Makoto Ozaki2, Ken-ich Imanishi3, acting as a potent inhibitor of histone deacetylases (HDACs), could Junji Yagi1 (1Dept. Microbio. Immunol., Sch. Med., Tokyo Womens lead to induction of HIV-1 transcription; however, the molecular Medical Univ., 2Dept. Anesthesiol., Sch. Med., Tokyo Womens mechanism by which butyric acid activates HIV-1 gene expression Medical Univ., 3Dept. Health Sciences, Sch. Health Sciences, Japan remains unclear. Health Sciences Univ.) In this study, we found that Sp1 binding sites within the HIV-1 promoter are primarily involved in butyric acid-mediated HIV-1 We investigated the immunological function of morphine using a activation by the luciferase reporter assay using HIV-1 long terminal mouse model of septic shock. We treated mice with α-GalCer (2 repeat (LTR) and its mutants. In fact, Sp1 knockdown by siRNA μg/mouse) to induce lethal endotoxic shock following a challenge and the Sp1 inhibitor abolished the effect of butyric acid. We also with LPS (1.5 μg/mouse). This model represents acute lung injury observed that CBP was required for this effect of butyric acid. A and respiratory failure and reflects the clinical features of severe chromatin immunoprecipitation assay has revealed that Sp1 and septic shock. We evaluated the effect of the timing of morphine HDAC1 are present in the HIV-1 LTR promoter in TZM-bl cells (0.8 mg/mouse) administration on the survival rate, cytokine and dissociated from the promoter concomitantly with association production in vivo, and histological changes of mice with LPS- of acetylated histone H3 and CBP upon butyric acid stimulation. mediated lethal endotoxic shock. Morphine treatment before Furthermore, siRNA-mediated knockdown of Sp1 prevented the LPS challenge suppressed lethal endotoxic shock. In contrast, CBP recruitment to HIV-1 LTR. when we administered after LPS, morphine exacerbated lethal These results suggest that butyric acid stimulates HIV-1 promoter endotoxic shock; HE staining revealed a marked increase in the through inhibition of the Sp1-associated HDAC activity and accumulation of infiltrates comprising polymorphonuclear leukocytes recruitment of CBP to Sp1 on HIV-1 LTR leading to histone H3 and mononuclear cells in the lung, and EVG staining revealed the acetylation. Our findings suggest that Sp1 should be considered destruction of alveoli. The plasma levels of TNF-α, IFN-γ, MCP-1, as one of therapeutic targets in anti-viral therapy against HIV-1 and IL-12 in the group treated with morphine after LPS challenge infection aggravated by butyric acid-producing bacteria. were higher than those treated with morphine before LPS challenge. In conclusion, one of the factors that determine whether morphine exacerbates or inhibits infection is the timing of its administration. Morphine treatment before shock improved the survival rate, and morphine treatment after shock decreased the rate of survival.

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P1-101 Listeria monocytogenes の過酸化水素暴露対 P1-102 黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの形成を阻害 する生残，発育およびストレス関連因子発現の解析 する低分子化合物の作用機序解析 ○落合 由嗣1，山田 文也1,2，吉川 悠子1，望月 眞理子3，高野 貴士1， ○吉井 悠1，奥田 賢一1，山田 聡美1，永倉 茉莉1，杉本 真也1，長野 本藤 良1，植田 富貴子1（1日本獣医生命科学大・獣医・衛生・公衆衛 哲雄2，岡部 隆義2，小島 宏建2，水之江 義充1（1慈恵医大・医・細菌， 生学，2埼玉衛研・感染症疫学情報，3日本獣医生命科学大・獣医保健 2東大・創薬機構） 看護・応用） Mechanisms of action of ABC-JK2, a small molecule Some characteristics of resistance to hydrogen peroxide inhibitor of Staphylococcal biofilm formation in Listeria monocytogenes ○Yutaka Yoshii1, Ken-ichi Okuda1, Satomi Yamada1, Mari Nagakura1, ○Yoshitsugu Ochiai1, Fumiya Yamada1,2, Yuko Yoshikawa1, Mariko Shinya Sugimoto1, Tetsuo Nagano2, Takayoshi Okabe2, Hirotatsu Mochizuki3, Takashi Takano1, Ryo Hondo1, Fukiko Ueda1 (1Div. Vet. Kojima2, Yoshimitsu Mizunoe1 (1Dept. Bacteriol., Jikei Univ. Sch. Hygiene & Vet. Public Health, Sch. Vet. Med., Nippon Vet. & Life Med., 2Drug Discovery Initiative, Univ. of Tokyo) Sci. Univ., 2Saitama Inst. Public Health, 3Dept. Appl. Sci., Sch. Vet. Nursing & Tech., Nippon Vet. & Life Sci. Univ.) 【背景】黄色ブドウ球菌（SA）によるバイオフィルム感染症は種々 の抗菌薬に耐性を示すため臨床上脅威であり，効果的な予防法・ 【目的】食品媒介感染症起因菌の Listeria monocytogenes は，食品加工環境 治療法の開発が急務である。我々は SA の増殖は阻害せずバイオ で様々なストレスに暴露されながら生残・発育していると考えられる。我々 フィルム形成を選択的に阻害するというコンセプトのもと，バ はこれまでに本菌の過酸化水素（H2O2）暴露に対する抵抗性解析を行い， イオフィルム形成阻害活性を示す化合物の探索を行い，得られ 37°C よりも 20°C で高い生残性を示す成績を得た。本研究では，20°C と た化合物の作用機序の解明を試みた。 37°C における L. monocytogenes の H2O2 暴露に対する抵抗性の詳細解析， 【方法】東京大学創薬機構が保有する化合物ライブラリーに含ま H2O2 存在下での発育解析，H2O2 暴露下でのストレス関連因子の発現解析 れる 5 万化合物の中から，SA のバイオフィルム形成を阻害する を行った。【材料と方法】EGD-e 株を 20°C あるいは 37°C で発育した後， 化合物をスクリーニングした。また，メタボローム解析，トラ 同じ温度条件で H2O2 に暴露した。生残性解析では H2O2 暴露下で生残性 ンスクリプトーム解析を用いて作用機序の解明を目指した。 の経時的変化を観察するとともに暴露菌が寒天培地上に形成するコロニー 【結果と考察】ハイスループットシステムを用いた網羅的スク の大きさを計測した。発育解析では 0.0016% から 0.05% の H2O2 添加培地 リーニングをもとに，複数の SA，表皮ブドウ球菌臨床分離株に に接種後，OD660 の経時的変化を測定した。発現解析では H2O2 暴露菌か 対し高いバイオフィルム形成阻害活性を示す低分子化合物 ABC- ら総 RNA を抽出し，ストレス応答に関与する 10 遺伝子をリアルタイム JK2（Anti Biofilm Compound-JK2）を見出した。メタボローム解 RT-PCR 法で解析した。【成績と考察】37°C の生残動態では暴露 15 分後 析により，ABC-JK2 存在下で代謝プロファイルが大きく変化す ではほぼ全てが生残，その後減少して 45 分後には発育能を有する菌がほ ることが確認された。マイクロアレイ解析を用いて遺伝子発現 ぼ観察されなくなった。20°C の生残動態では暴露 60 分後で約 70% が生残， プロファイルを検討した結果，ABC-JK2 存在下で細胞壁合成関 90 分後で約 15% にまでの減少が観察され，20°C で長い生残性が再確認さ 連遺伝子の発現量の上昇が確認された。透過型電子顕微鏡によ れた。20°C と 37°C で H2O2 暴露された菌が形成したコロニーの大きさは， る形態観察では，ABC-JK2 存在下で SA の細胞壁の肥厚化や異常 暴露時間に依存して小さくなることが観察された。発育解析では 20°C と な隔壁構造の形成が観察された。以上より，ABC-JK2 は代謝や 37°C の両条件で，0.006% 以下の H2O2 濃度での発育が観察され，発育性 細胞壁合成に影響を及ぼし，SA のバイオフィルム形成を阻害し 状は温度間で差がみられなかった。発現解析では，37°C では kat，recA， ている可能性が示唆された。 sigB などの転写産物，20°C では特に fri の転写産物で暴露時間に比例した 誘導増強が観察され，ストレス応答機序の違いが示唆された。

P1-103 細菌におけるシステインパースルフィド関連分 P1-104 Methylome diverfication through mobile 子の生成動態 elements acquisition in Streptococcas pyogenes ○澤 智裕1，張 田力1，小 野 勝彦1，津々木 博康1，赤 池 孝章2（1熊本大・ ○大田 篤，村瀬 一典，丸山 史人，中川 一路（京大院・医・微生物） 院生命科学・微生物，2東北大・院医・環境保健医学） ○Atsushi Ota, Kazunori Murase, Fumito Maruyama, Ichiro Nakagawa Molecular identification of bacterial cysteine persulfide (Dept. Micribiol., Grad. Sch. Med., Kyoto Univ.) and related molecules ○Tomohiro Sawa1, Tachikara Chou1, Katsuhiko Ono1, Hiroyasu Group A streptococcus (GAS) cause a diverse range of diseases. Tsutsuki1, Takaaki Akaike2 (1Dept. Microbiol., Grad. Sch. Med. Sci., Many virulence factors have been reported for its pathogenicity, Kumamoto Univ., 2Dept. Environ. Health Sci. Mol. Toxicol., Tohoku however the detail mechanism of how these virulence factors are Univ., Grad. Sch. Med.) related to its pathogenicity is still unknown. Comparative genome analyses suggested diversity in its 【目的】システインパースルフィド（Cys-SSH）は，システイン pathogenicity might be resulted from virulence genes on phages and/ のチオール基（R-SH）にさらに過剰なイオウ原子が付加した分 or SNPs in such genes. However only presence of pathogenic genes 子（R-SSH）である。我々は，Cys-SSH やその関連分子である or SNPs can not explain the various pathogencity. Recent study グルタチオンパースルフィド（GSSH）が哺乳動物細胞にほぼ普 suggested the methylase on prophage affected expression levels 遍的に存在し，しかも細胞内のレドックス状態の制御に密接に in one-third of whole genes in E.coli. In this study we investigated 関わることを見出した（PNAS 111: 7600–7611, 2014）。 Cys-SSH the effect of phage-derived DNA methylation on the expression of についてはこれまでにも細菌により生成される機構が予想され virulence genes by methylome analysis. ていたものの，実際にその菌体内濃度や分子種を詳細に解析し In addition to the laboratory strains, we determined the complete た報告はほとんどない。今回我々は，細菌における Cys-SSH お genome sequence of new strains, isolated from infant pharyngitis よび関連分子の生成動態を明らかにすることを目的とした。【方 and thought to be less pathogenicity. For the comparative analysis 法】グラム陰性菌（大腸菌，ネズミチフス菌など）を LB 培地に of methylase on prophage and its specific virulence genes in each て一晩培養したものを，新鮮な LB 培地に 100 倍希釈し，さらに strains, methylated sites were detected comprehensively. 37°C で 5 時間培養した。遠心により得た菌体にモノブロモビマ As a result of the methylome analysis, we found different methylation ンのメタノール溶液（終濃度 5 mM）を加え，超音波破砕機で菌 sites and their sequences among the strains and even in same 体を破砕した。遠心して不溶成分を除去した上清を蒸留水で希 virulence gene. In addition, the type and number of methylase on 釈し，それをタンデム質量分析による多重反応モニタリング解 prophage were different for each phage. These results suggest that 析を行い，R-SSH の同定と定量を行った。【結果と考察】今回検 phage-derived diverse methylome could be one factor of a variety of 討したグラム陰性菌すべてに Cys-SSH および GSSH が検出・同 pathogenicity. 定された。また，大腸菌を一酸化窒素（NO）放出試薬や過酸化 水素，さらにはある種の抗菌剤（アミノグリコシド，テトラサ イクリンなど）で処理すると，菌体内 R-SSH が有意に減少した。 以上より，細菌におけるパースルフィド分子はそのレドックス 活性に依存したストレス応答因子としての機能が予想され，今 後さらなる解析が期待される。

83 P1-105 新興下痢症起因菌 Escherichia albertii の O 抗 P1-106 タイプ I トキシン・アンチトキシン系の遺伝子 原コード領域の多様性 発現制御機構 ○大岡 唯祐1，勢戸 和子2，小椋 義俊3，井口 純4，藺牟田 直子1，吉 ○川野 光興，石本 巧（新潟薬大・応用生命科学） 家 清貴1，林 哲也3，西 順一郎1（1鹿児島大・医歯学・微生物，2大阪 府公衛研・細菌，3九州大・医・細菌，4宮崎大・農・衛生微生物） Gene reguration mechanisms of type I toxin-antitoxin systems in Escherichia coli The genetic diversity of the O-antigen gene cluster in E. ○Mitsuoki Kawano, Takumi Ishimoto (Dept. Appl. Life Sci., Niigata albertii, an emerging enteropathogen Univ. Pharm. and Appl. Life Sci.) ○Tadasuke Ooka1, Kazuko Seto2, Yoshitoshi Ogura3, Atsushi Iguchi4, Naoko Imuta1, Kiyotaka Yoshiie1, Tetsuya Hayashi3, Junichiro Nishi1 Small regulatory RNAs (sRNAs) play an important role for regulating (1Dept. Microbiol., Grad. Sch. Med & Dent. Sci., Kagoshima Univ., gene expression via a base-pairing mechanism with target mRNAs. 2Dept. Bacteriol., Osaka Pref. Inst. Pub. Heal., 3Dept. Bacteriol., In Escherichia coli, most of the sRNAs bind to an RNA chaperon, Fac. Med. Sci., Kyushu Univ., 4Dept. Hyg. Microbiol., Fac. Agr., Univ. Hfq. In contrast to the trans-encoded sRNAs, cis-encoded sRNAs are Miyazaki) found mainly in plasmids, phages and transposons. They are encoded in the same DNA locus and are completely complementary to their 【目的】Escherichia albertii は近年同定された大腸菌の近縁種で targets. Toxin-antitoxin (TA) systems are considered to be involved ある。本菌は集団感染を起こす重要なヒト下痢症起因菌であり， in emergence of persistent cells, and they are categorized into 志賀毒素産生株も存在することから食品衛生法や感染症法でも three classes based on the type of antitoxin. In type I TA systems, 注目されつつある。本菌の分離株には既知の大腸菌 O 群血清に the antitoxin is a small antisense RNA which inhibits translation of 対して交差反応を示す株も存在するが，O 抗原コード領域の遺 small toxic proteins by binding to the corresponding mRNAs. Those 伝学的情報が少なく，この交差反応が大腸菌と同様の抗原特異 type I TA systems were originally identified as plasmid stabilization 性によるものかどうかは定かではない。本研究では，E. albertii modules rendering a post-segregational killing effect on the host 株と大腸菌株との O 抗原コード領域について詳細な比較を行い， cells. The type I TA loci also exist on the E. coli chromosome but その類似性と違いを明らかにするとともに，O 抗原が本菌の同 their biological functions are less clear. Genetic organization and 定指標として利用可能かどうかを検証する。 regulatory elements of hok/sok and ldr/rdl families are very similar 【方法】Illumina MiSeq を用いて E. albertii 株 29 株の全ゲノム配 and the toxins are predicted to contain a transmembrane domain, 列情報を取得した。IMC-GE を用いて遺伝子アノテーションを行 but otherwise share no detectable sequence similarity. I will give an い，O 抗原コード領域の情報を抽出し，既知の大腸菌 O 抗原コー overview of the type I TA modules of E. coli K-12, especially hok/sok, ド領域（184 血清型）との比較を行った。 ldr/rdl, and SOS-inducible symE/symR systems which are regulated 【結果と考察】大腸菌 O 血清と交差反応を示した 16 血清型（20 株） by divergently overlapping cis-encoded antisense RNAs. のうち 7 血清型（10 株）では，配列多様性があるものの大腸菌 の遺伝子領域と類似していたが，9 血清型（10 株）は大腸菌の 遺伝子セットとは全く異なっていた。また，大腸菌 O 血清に凝 集しない 9 株も大腸菌とは全く異なる遺伝子セットを保有して いた。このことから，E. albertii の同定指標として，特異的な O 血清や O 抗原コード領域の genotyping などが利用できる可能性 が示唆された。

P1-107 Streptococcus intermedius の ily 遺伝子の広 P1-108 腸炎ビブリオの Na+ 耐性機構に関わる遺伝子 い上流領域がその発現抑制に関与する の同定 ○友安 俊文，日下 慎也，的場 正樹，金子 幸広，田端 厚之，長宗 秀 ○春木 裕里恵1，三好 伸一2，黒田 照夫1（1岡山大学大学院・医歯薬 明（徳島大院・STS・ライフシステム） 学総合研究科・微生物医薬品開発学教室，2岡山大学大学院・医歯薬 学総合研究科・衛生微生物化学教室） Wide upstream region of ily is involved in its repression + in Streptococcus intermedius Identification of genes responsible for resistance to Na ○Toshifumi Tomoyasu, Shinya Kusaka, Masaki Matoba, Yukihiro in Vibrio parahaemolyticus Kaneko, Atsushi Tabata, Hideaki Nagamune (Dep. Biol. Sci. & Tech., ○Yurie Haruki1, Shin-ichi Miyoshi2, Teruo Kuroda1 (1Dept. Medicine, Inst. Tech. & Sci., Tokushima Univ. Grad. Sch.) Dentistry and Pharmaceutical Sciences., Okayama Univ. Grad. Sch., 2Dept. Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama 【目的】Streptococcus intermedius は主要な病原因子としてヒト Univ. Grad. Sch.) 特異的細胞溶解毒素インターメディリシン（ILY）を分泌する。 ILY をコードする ily の発現は，catabolite control protein A（CcpA） 【目的】腸炎ビブリオは低度好塩性の海洋性細菌であり，日本の や lactose phosphotransferase system repressor によって制御され 食中毒の主要な原因菌の一つである。本菌は細胞膜に Na+ 排出 る。しかしながら，CcpA 以外の発現制御因子が ily プロモーター 系である Na+/H+ antiporter や呼吸鎖 Na+ ポンプ，Na+ 流入系で 領 域（ Pily）のどの領域を認識しているのかについては不明であっ ある栄養物質輸送系や Na+ 駆動性鞭毛モーターなど Na+ と共役 たため，Pily の解析を行ったところ，ily 発現抑制に関与する領 した輸送系を多数持つ。さらに大腸菌よりも高濃度の Na+ 存在 域が 2 カ所（IREL と IRER）存在すること，両者間の距離が重要 下でも生育することができる。このように腸炎ビブリオは Na+ なことが明らかになった。しかし同定した IRE 以外にも IRE の に関して特徴的な性質を持つ。Na+ は腸炎ビブリオだけでなく， 存在が予想され，更に Pily の解析を進めた。 多くの細菌において重要なイオンである。しかし，細胞内の Na+ 【結果と考察】5’-RACE 解析から，Pribnow box の 7bp 下流の G の濃度が高くなりすぎると細菌に対して毒性を引き起こす。現 が ily 転写開始点（TSP）であることが判明した。また，IREL の 在までに，細菌における Na+ 毒性のターゲットは明らかにされ 上流域（TSP から 124bp 上流）を 5bp 欠失させても，ILY 産生量 ていない。そこで，我々は Na+ 毒性のターゲットとなり得る遺 に有為な変化は認められなかったことから，IREL より上流域に 伝子を同定することを目的に解析を行った。【方法】腸炎ビブリ ily 発現抑制に関する領域が存在する可能性は低くなった。次に， オの 3 つの Na+/H+ antiporter と呼吸鎖 Na+ ポンプの四重破壊を + IREL と IRER の間に位置する塩基にトランスバージョン変異を導 行い，Na 感受性となった MMabd 株を用いて実験を行った。細 + 入した結果，その間に ily 発現抑制に強く関わる領域は存在しな 胞内 Na の上昇により発現が変化する因子を探索するために， いことがわかった。さらに，IRER 下流側に欠失変異を導入した whole transcriptome 解析を RNA-seq 法により行った。【結果と考 + 結果，25bp 下流（TSP から 61bp 上流）までの領域の欠失変異が， 察】Whole transcriptome 解析により，Na により発現状況が変 ILY 産生量を増加させることを確認した。よって，この領域ない 化する遺伝子を多数見出した。ストレス応答（heat shock，スト しは下流域に新たな IRE が存在する可能性が高くなった。この レス応答，浸透圧適応等），膜機能，代謝系，運動性，毒素 / 病 ように，Pily の広い領域が ily 発現抑制に関わっていることが分 原性因子など，多岐にわたる遺伝子の発現が変化していた。興 + かった。今後，プルダウンアッセイなどにより IRE に結合する 味深いことに，Na の電気化学的ポテンシャルを利用して基質を 因子の同定を試みる予定である。 排出する MATE（multidrug and toxic compound extrusion）型多 剤排出ポンプの発現が変化していた。この結果から，Na+ 毒性 の回避と MATE 型多剤排出ポンプが関連していると考えられた。 そこで，MATE 型多剤排出ポンプに着目し，解析を行っている。

84 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P1-109 Riboswitch による RNA 分解を介した遺伝子 P1-110 コレラ菌におけるキチン応答性シグナル伝達の 発現制御 PTS による制御 ○竹本 訓彦1,2，渡邊 真弥3，田中 裕也2，乾 将行2,4，秋山 徹1（1国立 ○山本 章治（国立感染研・細菌第一） 国際医療研究センター・病原微生物学，2RITE，3自治医大・医・細 菌学，4奈良先端大・バイオ） Regulation of chitin signal transduction by PTS in Vibrio cholerae Control of RNA degradation by riboswitches ○Shouji Yamamoto (Dept. Bac. I., Natl. Inst. Infect. Dis.) ○Norihiko Takemoto1,2, Shinya Watanabe3, Yuya Tanaka2, Masayuki Inui2,4, Toru Miyoshi-Akiyama1 (1Lab. Pathogenic Microbes, NCGM, 二成分制御系はヒスチジンキナーゼ（HK）とレスポンスレギュ 2RITE, 3Div. Bacteriol., Dept. Infect. Immunity, Sch. Med., Jichi Med. レーター（RR）から成るリン酸基転移を介したシグナル伝達系 Univ., 4Grad. Sch. of Biol. Sci., NAIST) の一つであり，細菌が外部環境を認識して遺伝子発現を制御す る上で主要な役割を担う。コレラ菌の DNA コンピテンスに関 Riboswitch はリガンド結合性の non-coding RNA element であり， わる遺伝子群の発現は，キチン応答性 HK である ChiS に支配さ リガンド結合に応じて遺伝子発現を制御する。Riboswitch は一般 れているが，そのシグナル伝達の様式は従来までのドグマから 的に制御する遺伝子の mRNA の 5UTR に存在しており，遺伝子 大きく逸脱している。ChiS は RR ではなく非二成分制御系の膜 発現制御機構としては，蛋白質因子を介さず，RNA の構造変化 貫通型転写因子 TfoS を制御しており，その過程でリン酸基転移 のみに依存した転写と翻訳の制御がよく知られている。一方で， に関わるアミノ酸残基を必要としない。さらに最近の解析から， 最近，我々はアミノ酸生産菌として知られる Corynebacterium ChiS によるシグナル伝達は細胞外からのキチン刺激だけでなく， glutamicum において FMN 応答性の riboswitch が下流の遺伝子 糖の取り込みに関わるシグナル伝達系 PTS（phosphoenolpyruvate: の発現制御のため，転写終結因子 Rho と endo 型 RNA 分解酵 carbohydrate phosphotransferase system）を介して細胞内からも 素 RNase E/G を利用していることを明らかにした。このこと 調節されることを見出した。PTS はリン酸基の転移と糖の取り から riboswitch による遺伝子発現制御に RNase や Rho などの 込みが共役した機構であり，共通の成分である EI と HPr および RNA 代謝関連蛋白質が関わる事が一般的である可能性が考えら 糖特異的な EII から構成されている。PTS の初期ステップに関わ れる。そこで，本研究では C. glutamicum とは異なるタイプの る EI の欠損下では，ChiS/TfoS 制御下にある遺伝子の転写が活 endo 型 RNase を有し，近年，劇症型レンサ球菌感染症の原因菌 性化されないものの，後期ステップの成分 EIIAG1c を追加的に欠 として注目されている Group A Streptococcus（GAS; Streptococcus 損させるとその効果が抑圧された。また，各 PTS 成分の欠損は pyogenes）において riboswitch による制御に RNase による RNA ChiS と TfoS の発現には影響を与えなかった。以上の結果は，非 分解が関わるかどうかを検討した。本発表では C. glutamicum リン酸化型の EIIAG1c が ChiS のシグナル伝達を阻害する作用を の FMN riboswitch の制御機構と，S. pyogenes における RNAseq もつことを示唆している。 解析から RNase Y により制御されることが期待された 4 つの riboswitch（FMN-, preQ1-II, TPP-, T-box-）の解析結果を報告する。

P1-111 Regulation of three small regulatory RNAs P1-112 ウェルシュ菌における毒素産生ならびに芽胞形 CsrBs in Vibrio alginolyticus 成調節機構の解析 ○Agus Eka Darwinata1，後藤 和義1，美間 健彦1，山本 由弥子1，横 ○大谷 郁1,2，岡 健太郎1，田代 康介3，久原 哲3，高橋 志達1，清水 徹2 田 憲治2，松下 治1（1岡山大・医歯薬・病原細菌，2岡山大・保健） （1ミヤリサン製薬（株）東京研究部，2金沢大学・医・細菌感染症制 御学，3九州大学） ○Agus Eka Darwinata1, Kazuyoshi Gotoh1, Takehiko Mima1, Yumiko Yamamoto1, Kenji Yokota2, Osamu Matsushita1 (1Dept. Microbiol., Regulatory mechanism of toxin and sporulation related Grad. Sch. Med. Dent. Pha. Sci., Okayama Univ., 2Grad. Sch. Health genes in Clostridium perfringens Sci., Okayama Univ.) ○Kaori Ohtani1,2, Kentaro Oka1, Kosuke Tashiro3, Satoru Kuhara3, Motomichi Takahashi1, Tohru Shimizu2 (1Tokyo R&D Center, Miyarisan Background: GacS/GacA two-component system has been known Pharmaceutical Co. Ltd., 2Dept. Bacteriol. Kanazawa Univ., 3Kyushu to regulate the expression of regulatory RNA (CsrB). Further, CsrB Univ.) is involved in the post-transcriptional control of GacS/GacA-regulated genes. Our previous study showed that VarS/VarA (GacS/GacA C. perfringens causes gas gangrene and gastrointestinal (GI) homolog) system in Vibrio alginolyticus controls the collagenase diseases in humans. The most common cause of food poisoning is expression. In this study, we examined whether VarS/VarA system the consumption of vegetative cells followed by sporulation and regulates the expression of csrB and the role of CsrB in collagenase production of enterotoxin in the gut. However, gas gangrene and production. other non-food-borne GI illnesses occur when C. perfringens spores Methods: The collagenase production was assayed with Pz-peptide. come in contact with the host, where spores undergo germination The expression levels of csrBs were determined by β-galactosidase followed by cell proliferation and toxin secretion. Recently virX was assay. The binding of VarA to csrBs promoter was examined by identified as a negative regulator of sporulation. But until now it electrophoretic mobility shift assay (EMSA). has not been identified how C. perfringens senses the environment Result and Discussion: Sequence similarity search revealed that factors and stops production of virulence then starts sporulation. And three csrBs are encoded on the chromosome. Using Mfold software, also the strain that is transformable, has same virulence genes with the secondary structures of three predicted CsrBs consist of 11-16 strain 13 and can sporulate, has not been identified. Here we have hairpin structures and GGA motif is located in the loop of the hairpin identified the strain KZ119 that has all these characteristics. KZ119 structure. Deletion of either varS or varA significantly reduced can use to analyze both of regulatory mechanism of toxin production the expression of csrBs, indicating that the transcriptions of csrBs and sporulation and also the process between them. Microarray are positively controlled by VarS/VarA system. EMSA experiment analysis indicated that there are possible two-component systems showed that VarA directly regulates csrBs expression. Deletion of (TCSs) that can regulate sporulation. Now strain SM101 (sporulates each csrB partially reduced the collagenase production. We conclude but lacks many virulence genes) and KZ119 are using to construct that VarS/VarA two-component system regulates collagenase mutant strains of the TCSs. Furthermore, the mutant strains of production through CsrBs in V. alginolyticus. known regulatory genes were constructed by using KZ119. Now we are trying to analyze the regulatory mechanism to start sporulation in detail.

85 P1-113 Development of a counter-selection system P1-114（WS15-3） ルシフェラーゼ発現リコンビナ for markerless genetic deletions in Bacteroides ント BCG による新規結核薬の迅速スクリーニング系の確立 ○今大路 治之1，藤田 雅1,2，岡崎 勝一郎2，桑原 知巳1（1香川大・医・ と実践 2 分子微生物， 香川大・農・応用生物） ○尾関 百合子1，山口 雄大1，Shymaa Enany1，五十嵐 雅之2，西内 由紀子1，岡 真優子4，岩本 朋忠5，小椋 義俊3，林 哲也3，立石 善隆1， ○ 1 1,2 2 Haruyuki Imaohji , Masashi Fujita , Katsuichiro Okazaki , Tomomi 西山 晃史1，松本 壮吉1（1新潟大学院・医・細菌，2微生物資源・微化研， 1 1 2 Kuwahara ( Dept. Microbiol., Fac. Med., Kagawa Univ., Dep. Appl. 3九州大学院・医・細菌，4京都府大院・生命環境・食保健，5細菌・ BioSci., Fac. Agr., Kagawa Univ.) 神戸環境保健研）

Bacteroides are the predominant component of intestinal microbiota. A new screen for TB drug candidates utilizing a Metagenomic analyses of human gut microbes and studies using luciferase-expressing recombinant BCG gnotobiotic mice have demonstrated that Bacteroides are tightly ○Yuriko Ozeki1, Takehiro Yamaguchi1, Shymaa Enany1, Masayuki associated with host epithelial cell function, gut immunity and Igarashi2, Yukiko Nishiuchi1, Mayuko Oka4, Tomotada Iwamoto5, metabolism. We previously developed an in-frame genetic deletion Yoshitoshi Ogura3, Tetsuya Hayashi3, Yoshitaka Tateishi1, Akihito system and mariner-based transposon mutagenesis for Bacteroides. Nishiyama1, Sohkichi Matsumoto1 (1Dept. Bacteriol. Grad. Sch. Med., In this study, we used phenylalanyl-tRNA synthetase gene (pheS) Niigata Univ., 2Dept. Microbiol., Inst. Microb. Chem., 3Dept. Bacteriol. to develop an in-frame genetic deletion system for Bacteroides. Grad. Sch. Med., Kyusu Univ., 4Grad Sch. Life Envir., Kyoto Pref. We chose a mutant pheS gene (pheS*), which encodes the highly Univ., 5Dep. Microbiol. Kobe Inst. Health) conserved PheS α subunit, as a counter-selectable marker. The A294G amino acid substitution in Escherichia coli PheS confers Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease caused by a bacterial sensitivity to the phenylalanine analog p-chloro-phenylalanine pathogen. Development of new TB drugs is needed to not only to (p-Cl-Phe). To test the feasibility of p-Cl-Phe as a counter-selective shorten the medication period but also to treat multi-drug resistant and reagent in Bacteroides, we cloned the pheSA303G (equivalent to A294G extensively drug-resistant TB. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) grows in E. coli) gene into shuttle vector pLYL05. Growth of the B. fragilis slowly and only multiplies once or twice per day. Therefore, conventional strain carrying pheS* was inhibited in the presence of 20 mM p-Cl- drug screening takes more than 3 weeks. Additionally, a biosafety Phe while it showed normal growth in the absence of p-Cl-Phe. level-3 (BSL-3) facility is required. Thus, we developed a new screening Counter-selection employing pheS* successfully deleted a large method to identify TB drug candidates by utilizing luciferase-expressing chromosomal segment in the capsular polysaccharide biosynthesis recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gueren (rBCG). locus in Bacteroides species. These results indicate that counter- Using this method, we identified several candidates in 4 days in a non- selection using pheS* is a useful tool for genetic manipulation in BSL-3 facility. We screened 10,080 individual crude extracts derived from Bacteroides species. Actinomyces and Streptomyces and identified 41 compounds inhibited the growth of both Mtb H37Rv and the extensively drug-resistant Mtb (XDR- Mtb) strains. By using this method, we identified the active substance, which possessed strong activity toward rBCG, Mtb H37Rv, and XDR- Mtb but was harmless to the host eukaryotic cells. Furthermore, we also clarified the chemical structure of active substance and target gene related to mycobacterial growth suppression. Our method provides a rapid and convenient screen to identify an anti-mycobacterial drug.

P1-115 In vivo methylation in E. coli by P1-116（S7-4） 「一分子リアルタイムシーケンサー」 methyltransferases from Clostridium perfringens for によるメチローム解読 transformation ○小林 一三1,2（1東大・メディカル情報生命，2東大・医科研） ○成谷 宏文1，宮田 茂2，今大路 治之1，桑原 知巳1（1香川大・医・分 子微生物，2中部大・応用生物・食品栄養） Complete methylomes at the single base resolution by single-molecule real-time sequencers 1 2 1 ○ 1,2 1 Hirofumi Nariya , Shigeru Miyata , Haruyuki Imaohji , Tomomi ○Ichizo Kobayashi ( Dept. Computational Biol. Medical Science, 1 1 2 Kuwahara ( Dept. Microbiol., Fac. Med., Kagawa Univ., Dept. Food Univ. Tokyo, 2Inst. Med. Science, Univ. Tokyo) Nutr. Sci., College Biosci. Biotech., Chubu Univ.) Pacificbiosciences 社の第 3 世代シーケンサーでは，一分子の We have developed the MazF toxin-based markerless in-frame DNA ポリメラーゼを小部屋に固定し，鋳型 DNA を与えて， deletion method for Clostridium perfringens. Escherichia coli mazF DNA 合成のようすを窓から映画に撮る。ATGC 誘導体のうちど was employed as the counter-selectable marker under the control れを取り込んだかを，それぞれの蛍光で知り，鋳型のシークエ of the xylose-inducible ON/OFF expression system on pXM. It was ンスを決める。20 kb もの超ロングリードが得られるので，繰り used to disrupt the alpha-toxin, PLC genes of three C. perfringens 返し配列が多くても容易に一つのコンティグが得られる。また， strains 13, SM101 and ATCC13124 by using their two plc-flanking 鋳型 DNA に大きな修飾があると取り込みが遅れるので，4mC, regions cloned in pXM. Unlike 13 and SM101, ATCC13124 is 6mA などのエピジェネティックな修飾については，一塩基分解 known to be refractory to genetic transformation by electroporation, 能で，しかも全ゲノムにわたって，検出することができる。これ probably due to existence of multiple Restriction-Modification によって，多数の細菌の全メチロームの解明が進んでおり，エ system (R-M). Our genomic survey of ATCC13124 revealed it may ピジェネティクス研究は新しい段階に突入している {http://www. contain a variety of putative R-Ms, one type I, three type II, one type pacb.com/tag/rebase/}{http://rebase.neb.com/cgi-bin/pacbiolist}。私 III and two type IV. However no putative R-M was found in strains 達の成果を含め，そこから現れた知見を紹介する。現在の方法 13 and SM101. In order to overcome these restriction barriers, の問題点，今後の方向についても，議論したい。 we established E. coli HST04 (R-M-) recipient strain expressing three type II DNA methyltransferases on pACYC184 (MT304), and methylated shuttle vector pXCH and suicide vector pXM-PLC-IF prepared from E. coli MT304 was used for genetic transformation and ΔPLC construction, respectively. Here we report that genetic transformation and recombination in C. perfringens ATCC13124 was succeeded for the first time. Since the system is not required for prerequisite strains, it will be a powerful and universal tool for a wide variety of Clostridia.

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P1-117（WS10-3） ボルデテラ属菌の宿主特異性決 P1-118 大腸菌 mazF を利用したウェルシュ菌の効率的 定機構解明に向けたゲノム相補システムの開発 ゲノム編集法の開発 ○石垣 佳祐，新澤 直明，堀口 安彦（阪大・微研・分子細菌学） ○藤田 雄也1，成谷 宏文2，中村 圭那3，望月 初美3，森山 龍一3，桑 原 知巳2，宮田 茂3（1中部大院 応用生物，2香川大・医・分子微生物， Development of the novel genomic integration system to 3中部大 応用生物） study the host tropism of Bordetella spp. ○Keisuke Ishigaki, Naoaki Shinzawa, Yasuhiko Horiguchi (Dept. Mol. Development of a method for efficient genome editing Bact., RIMD, Osaka Univ.) with mazF in Clostridium perfringens ○Yuya Fujita1, Hirofumi Nariya2, Keina Nakamura3, Hatsumi Bordetella pertussis and B. bronchiseptica share many of the Mochizuki3, Ryuichi Moriyama3, Tomomi Kuwahara2, Shigeru Miyata3 virulence factors but show distinct host selectivites; B. pertussis (1Grad. Sch. Biosci. Biotechnol. Chubu. Univ., 2Dept. Microbiol., Fac. is human-adapted, while B. bronchiseptica has a broad host range. Med., Kagawa Univ., 3Col. Biosci. Biotechnol. Chubu. Univ) The comparative genome analysis revealed that B. pertussis has evolved from B. bronchiseptica-like ancestors through gene-loss and 【目的】我々のグループは以前，ウェルシュ菌のゲノム編集ツー rearrangements, suggesting that the genes lost in the evolutionally ルとして galactokinase 遺伝子（galK）をカウンターセレクション・ process are involved in their host tropism. To determine the genes マーカーとして利用した方法を報告した。この方法を用いれば， responsible for the host tropism, we newly constructed the genomic ゲノム上の任意の部位を特異的に欠失したり，外来遺伝子と置換 integration system based on the combination of bacterial artificial したりする事が可能だが，予め染色体上の galTK オペロンをノッ chromosome and phage-derived integration machinery, named クアウトした株を用いなければならなかった。そのため，ガラク BPI system. The BPI system enabled us to complement large B. トース利用能が消失し，各種表現型の観察や組換え菌を利用する bronchiseptica genomic DNA fragments (>50 kbp) into the genome of 上で問題となることがあった。今回，この問題を克服するために， B. pertussis. We utilized here the BPI system to modify the structure 大腸菌の RNA interferase 遺伝子（mazF）をカウンターセレクショ of lipopolysaccharide (LPS) in B. pertussis, which lacks O-antigen of ン・マーカーとして利用した方法の開発を試みた。 LPS, by complementation of B. bronchiseptica wbm locus required 【方法及び結果】以前，報告したキシロース誘導可能な発現ベ for the O-antigen synthesis. The wbm-complemented B. pertussis クターである pXCH の xylR-xylO-PxylB 領域を PCR で増幅し，そ expressed LPS with O-antigen similar to B. bronchiseptica. It の PxylB 下流に大腸菌染色体から増幅した mazF をオーバーラッ suggested that BPI system could be a powerful tool for functional プ PCR により連結した。この DNA 断片を pCM-GALK2 の galK genome complementation with large genomic DNA fragments. In と置換することにより，新規ゲノム編集プラスミド pXM を構築 this presentation, we would like to discuss the application of BPI した。次に，遺伝子置換用として，θ 毒素遺伝子（pfoA）の 5’- system to study the host tropism of Bordetella species. 上流領域及び 3’- 下流領域をそれぞれ約 1 kb をクローニングし， その間の PpfoA 下流に C. acetobutylicum の endoglucanase 遺伝子 （eglA）を挿入して pXM-pfoA-eglA を構築した。このプラスミド を用いて C. perfringens 13 株を形質転換し，クロラムフェニコー ル耐性株を分離した後，さらに 3% キシロース含有 GAM 培地で カウンターセレクションして pfoA-eglA 置換株を得た。この組換 え菌の染色体の組換えを PCR 及び表現型の変化で調べたところ， 設計通りに改変されていることが示された。

P1-119 Clostridium perfringens の T7 発現系の改良 P1-120 看護師養成におけるヒト遺伝学教育の必要性と ○澤入 駿哉1，鳥谷 采加2，野寺 菜美子2，玉井 栄治3，森山 龍一2， 解決策 2 1 2 3 宮田 茂 （ 中部大院・応用生物， 中部大・応用生物， 松山大・薬） ○神崎 秀嗣1,2（1京大・ウイルス研・細胞生物，2大和大学保健医療学 部） Increased expression of heterogenous genes by improved T7-expression system on C. perfringens The need of human genetics education in nurse training ○Shunya Sawairi1, Ayaka Toritani2, Namiko Nodera2, Eiji Tamai3, ○Hidetsugu Kohzaki1,2 (1Dept. Cell Biol., IVR, Kyoto Univ., 2Fac. Ryuichi Moriyama2, Shigeru Miyata2 (1Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Allied Health Science, Yamato Univ.) 2Col. Biosci. Biotechnol., 3Col. Pharm. Matsuyama. Univ.) 晩婚化や新型出生前診断（NIPT）の流布により，遺伝病が注目 【目的】Clostridium 属細菌は多種の有用なタンパク質を生産する され始めている。看護師はその養成課程の関係で，基礎教育に が，遺伝子が極端な AT-rich であるため，大腸菌などの発現系で おいて「臨床遺伝学」という科目の位置づけがない。演者は現 は特に高分子量タンパク質の発現が困難である。我々は今まで 在，4 年制大学の 1 年生を対象に看護学科の学生約 150 名に「生 に，これらの致死毒素遺伝子を欠失させ，キシロース添加によ 化学」「微生物と感染症」を講義している。今後の社会情勢も考 り T7 RNA polymerase を発現する C. perfringens T7II 株を作製し， え，看護師の遺伝学教育に力を入れることを試みた。そこで， 各種 Clostridial protein の発現に成功してきた。今回，コドンを まず 1．生化学の復習 2．PCR 法 3．生殖の初歩 4．遺伝病（主 改変した T7 RNA polymerase 遺伝子（mT7 rpo）を染色体上の α に NIPT 等で検出される染色体異常）や遺伝学の初歩を講義し， 毒素遺伝子座と置換することにより，さらなる発現量の向上を その到達度を，各項目毎に講義後，1 週間後到達度テストを計 3 目指した。 回行い（全て今回の発表に含まれる。），確認した（受験者数 145 【方法及び結果】yplC 遺伝子の上流域及び α 毒素遺伝子（plc）下 名のうち平均 98% の学生さんが協力くださった。）。本研究，公 流域のそれぞれ約 1 kb を pCM-GALK2 にクローニングし，染色 表には個人名は出さないことを学生には周知した。母体保護法 体上の yplC-plc 領域の欠失・置換用ベクター pAE-YP を構築した。 と NITP についても講義した。1．「クリックのセントラルドグマ さらに，mT7 rpo を，C. difficile のキシロース誘導プロモーター とその修正点」の問題には正解者は 0（0%）であった。2．PCR （PxylB），キシロース利用オペロンのレプレッサー遺伝子（xylR） 法に必要な温度管理機器や Mg2+ イオン以外に主に必要なもの」 とともに pAE-YP にクローニングし，pAE-YP-mT7 を構築した。 の問題に DNA ポリメラーゼ，プライマー，dNTP と答えたのは 同様に θ 毒素欠失用に pAE-pfoA を構築した。これらのプラスミ 各々 24 名（16.6%）， 14 名（9.7%）， 2 名（1.4%）であった。看 ドでC. perfringens P13株を形質転換し，染色体上のpfoAが欠失し， 護師は幅広い医療行為や診療科に配属されるため幅広い知識が yplC-plc 領域が xylR-PxylB-mT7 rpo に置換した C. perfringens mT7II 必要である。ヒト遺伝学を対象にする診療科も充実し始めてい 株を得た。次に，大腸菌‐C. perfringens のシャトルベクターに る。中学高校でも，遺伝学は履修しているはずであるが，4 年制 T7 プロモーターを挿入し，その下流に各種酵素遺伝子をクロー 大学の 1 年生（ゆとり教育最後の年の学生）対象に知識の定着 ニングした発現プラスミドを構築した。T7II 株及び mT7II 株を を調査した。その結果，全てを調査したわけではないが，知識（遺 形質転換した結果，mT7II 株では発現量が大幅に増加していた。 伝リテラシー）にムラがあるように思われた。国家試験にも遺 伝学が出題され始まっている。各校「遺伝学」講義を積極的に 行い，遺伝リテラシー向上に力を入れることが望まれる。

87 P1-121 腸管出血性大腸菌出現プロセスの解明を目指し P1-122 迅速発育抗酸菌 5 株のドラフトゲノム配列決 たウシ / ヒト由来大腸菌の大規模比較解析 定と迅速発育抗酸菌間でのゲノム配列比較 ○中島 遥子1,2，西田 留梨子1,2，大岡 唯祐3，大西 真4，吉野 修司5， ○片平 雄之1，中島 遥子1,3，西田 留梨子1,3，後藤 恭宏1，小椋 義俊1， 片平 雄之2，後藤 恭宏2，林 哲也2，小椋 義俊2（1九大院・医・病態修 林 哲也1（1九州大学大学院医学研究院 細菌学分野，2九州大学大学 復，2九州大・院医・細菌，3鹿児島大・医歯学・微生物学，4感染研・ 院医学研究院 胸部疾患研究施設，3九州大学大学院医学研究院 病 細菌第一，5宮崎衛研） 態修復内科学）

Comparative analyses of human and bovine E. coli to Draft Genome Sequence determination and genome reveal the mechanism underling emergence of EHEC comparison of Five Rapidly Growing Mycobacterium sp. ○Yoko Nakashima1,2, Ruriko Nishida1,2, Tadasuke Ooka3, Makoto ○Katsuyuki Katahira1, Yoko Nakashima1,3, Ruriko Nishida1,3, Yasuhiro Ohnishi4, Shuji Yoshino5, Katsuyuki Katahira2, Yasuhiro Gotoh2, Gotoh1, Yoshitoshi Ogura1, Tetsuya Hayashi1 (1Dept. Bacteriol., Fac. Tetsuya Hayashi2, Yoshitoshi Ogura2 (1Dept. Med. and Biosystemic Med. Sci., Kyushu Univ., 2Res. Inst. Dis. Chest., Grad. Sch. Med. Sci., Sci., Grad. Sch. Med. Sci., Kyushu Univ., 2Dept. Bact., Fac. Med. Sci., Kyushu Univ., 3Dept. Med. And Biosystemic Sci., Grad. Sch. Med. Kyushu Univ., 3Grad. Sch. Med. Dent. Sci., Kagoshima Univ., 4Dept. Sci., Kyushu Univ.) Bacteriol. I, Nat. Inst. Infec. Dis., 5Miyazaki Pref. Inst. Health Environ.) 【目的】本邦における非結核性抗酸菌症の罹患率は増加傾向にある。その 【目的】腸管出血性大腸菌（EHEC）は出血性大腸炎に加えて，溶血性尿 うち，迅速発育抗酸菌による感染症は比較的稀であるが，治療に抵抗性を 毒素症候群や脳症などの重篤な合併症を引き起こす。EHEC のリザーバー 示し，治療法が確立していない場合が多い。しかし，遺伝子解析によって はウシであり，ウシ体内においてファージなどを介した水平伝播により志 2003 年に新たに同定された Mycobacterium massiliense は，治療反応性が 賀毒素など多数の病原因子を獲得し，病原菌へと進化したと考えられてい 他の迅速発育抗酸菌に比べて格段に良いことが判明しており，遺伝子解析 る。本研究では，EHEC 出現プロセスの解明を目指した試みの一環として， による非結核性抗酸菌の菌種同定・分類は臨床的にも重要である。 ウシおよびヒト由来大腸菌の大規模比較解析を行った。【方法】国内 7 カ 【方法】ヒトに病原性を示し全ゲノムシーケンスが行われていない迅速 所の農場で採取されたウシ直腸便からウシ由来大腸菌を 1,073 株分離した 発育抗酸菌 5 菌種（M. thermoresistibile JCM6362T, M. fortuitum subsp. （EHEC 662 株，一般大腸菌 411 株）。ヒト由来大腸菌としては，国内各地 Acetamidolyticum JCM6368T, M. canariasense JCM15298T, M. brisbanense の病院で菌血症患者から分離された血液由来大腸菌を 78 株，健常人の便 JCM15654T, M. novocastrense JCM18114T）を対象として，Illumina Miseq 由来大腸菌を 348 株収集した。Illumina MiSeq でゲノム配列を決定し，得 によりショートリード配列を取得し，ドラフトゲノム配列を決定した。 られたゲノム情報から全ゲノム配列に基づいた高解像度系統解析を行っ 【結果と考察】今回解析した 5 菌種のゲノムサイズは 4,893,136～7,387,494 た。【結果・考察】全ゲノム配列に基づいて作成した系統樹では，ウシ由来 bp，G+C 含量は66～69% であり，4,717～7,146 個のCDS が同定され 大腸菌（EHEC と一般大腸菌）とヒト由来大腸菌（便由来大腸菌と血液由 た。本邦で非結核性抗酸菌の同定に用いる遺伝子としては，16S rRNA， 来大腸菌）は，少数の例外は認められるものの，それぞれが独立した系統 hsp65，rpoB 遺伝子が主流であり，MiGAP による自動アノテーションの 群を形成し，明らかに異なる系統の大腸菌であることが判明した。この結 後，各菌の rRNA オペロンと hsp65 および rpoB 遺伝子の全配列を決定した。 果は，EHEC がウシ体内での生存において，何らかの選択圧の下に病原因 rpoB 配列を用いた菌種同定には，国内では MF-MR プライマーを用いて 子を蓄積し，結果的にヒトへ病原性を示す大腸菌へと進化したこと，また 増幅した 351 bp の rpoB 領域が用いられているが，増幅に問題があること EHEC のヒトへの感染や病原性は偶発的に発生している可能性が示唆され が多い。そこで，今回のデータも加え，ヒトに病原性を示し rpoB の全長 る。現在，各株のゲノム情報を基づいて，病原因子レパートリーの詳細な 配列が判明している迅速発育抗酸菌 25 菌種の配列を検討したところ，MF 解析を進めている。［会員外共同研究者］桐野有美（宮崎大），宇野浩一， 及び MR プライマーが完全に一致するのは 3 菌種のみであり，プライマー 佐藤寿夫（日本微生物研究所） を改良する必要があることが明らかになった。

P1-123 Streptococcus dentasini が産生する非水溶性 P1-124 腸管出血性大腸菌 O157 の Stx2 高産生性に関 グルカン合成酵素遺伝子の解析 わる遺伝的要因の解明 ○桑原 紀子1，齋藤 真規1，續橋 治1，小林 良喜1，高田 和子2，落合 ○小椋 義俊1，西田 留梨子1，中島 遥子1，片平 雄之1，後藤 恭宏1， 智子1（1日大・松戸歯・微生物免疫，2日大） 大西 真2，林 哲也1（1九州大院・医・細菌，2感染研・細菌第一） Analysis of water-insoluble glucan synthase from Identification of the genetic determinants responsible for Streptococcus dentasini the high Stx2 production in EHEC O157 ○Noriko Kuwahara1, Masanori Saito1, Osamu Tsuzukibashi1, Ryoki ○Yoshitoshi Ogura1, Ruriko Nishida1, Yoko Nakashima1, Katsuyuki Kobayashi1, Kazuko Takada2, Tomoko Ochiai1 (1Dept. Microbiol. Katahira1, Yasuhiro Gotoh1, Makoto Ohnishi2, Tetsuya Hayashi1 (1Dept. Immunol., Nihon Univ., Sch. Dent. at Matsudo, 2Nihon Univ.) Bact., Fac. Med. Sci., Kyushu Univ., 2Dept. Bacteriol., Nat. Inst. Inf. Dis.) 【目的】ミュータンスレンサ球菌の系統発生学的研究の一環で分 離した Streptococcus dentasini は，Mitis Salivarius 平板培地におい 【目的】O157 の主要病原因子は志賀毒素（Stx1 と Stx2）であり， て菌体外多糖を合成していると思われる集落を形成する。今回， ファージにコードされている。O157 は Stx1 と Stx2 の両方か一 S. dentasini の齲蝕原性試験およびヒトの主要な齲蝕原性因子で 方を産生するが，Stx2 が重症化に深く関与していると考えられ， ある非水溶性グルカン（WIG）合成酵素遺伝子について解析を Stx2 高産生株の存在も知られている。本研究の目的は，Stx2 高 試みた。 産生性に関わる遺伝的要因の解明である。【方法】125 株の O157 【方法】S. dentasini のショ糖依存性菌体固着能試験，培養上清 について，Stx2 産生量の比較，stx subtyping，clade typing を行った。 中の非水溶性多糖合成能および分泌型グルコシルトランスフェ また，10 株の Stx2 ファージのゲノム配列決定と比較解析を行っ ラーゼ（GTF）の産生性を抗 GTF 抗体を用いた免疫染色により た。さらに，200 株の O157 について，ドラフトゲノム配列を決 既報に準じて行った。GTF 遺伝子の検索は，S. mutans gtfB と S. 定し，高解像度系統解析と Stx2 ファージタイピングを行った。【結 sobrinus gtfI を検出するプライマーで PCR を行い，さらに未知領 果と考察】O157 の Stx2 には 2 つのサブタイプ（Stx2a と Stx2c） 域の WIG 合成酵素遺伝子の塩基配列を検索した。 が存在する。Stx2c のみを持つ株の Stx2 産生量は非常に低いの 【結果と考察】S. dentasini の培養上清による非水溶性多糖合成 に対して，Stx2a を持つ株の Stx2 産生量は株間で大きな違いが 量およびショ糖依存性菌体固着能は，S. mutans と比較すると低 存在した。Stx2a ファージゲノムの比較から，Stx2a ファージは かったが，抗 GTF 抗体による免疫染色ではバンドが検出され， 6 タイプに分類され，ファージタイプと Stx2 産生性が相関する GTF 様の WIG 合成酵素を分泌産生していることが確認された。S. ことが判明した。また，高病原性系統といわれるクレード 8 に dentasini の WIG 合成酵素遺伝子を PCR により検索したところ， は，Stx2 高産生型ファージを持つ株と低産生型ファージを持つ S. mutans gtfB の検出プライマーでバンドが増幅された。得られ 株が存在し，全ゲノム配列に基づいた高解像度系統解析により， た DNA 断片の塩基配列を決定したところ，S. mutans gtfB 遺伝 それぞれ異なる亜系統に分類された。現在，他のクレードでも 子の該当領域 517-bp と比較して 469-bp とわずかに短く，これら 詳細な解析を進めており，各クレードが特定のタイプの Stx2a の相同性は 65% 程度であった。さらに遺伝子の未知領域を検索 ファージを有し，そのファージタイプに概ね対応した Stx2 産生 したところ，約 2.7-kb の DNA の塩基配列を決定することがで 量を示すことが明らかとなってきた。しかし，例外も存在する き，S. mutans gtfB 遺伝子の当該領域と 72% の相同性を示した。S. ことも明らかとなってきたため，その Stx2a ファージについては dentasini は S. mutans gtfB 様遺伝子の断片を有していたが，非水 詳細な解析を進めている。【共同研究者】真子俊博，八柳潤，勢 溶性多糖合成量に差が見られることから，遺伝子の発現調節が 戸和子，成松浩志，緒方喜久代，木全恵子，磯部順子，前田詠 異なり，その調節因子の存在が示唆された。 里子，江藤良樹，亀山光博（地方衛生研究所）

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P1-125 腸管出血性大腸菌 O121:H19 の比較ゲノム P1-126 Treponema phagedenis のゲノム進化と適応 解析 ○後藤 恭宏1，小椋 義俊1，大岡 唯祐2，矢野 貴久3，大島 健志朗4， 4 3 1 1 2 ○西田 留梨子1,2，村瀬 一典3，後藤 恭宏2，大岡 唯祐4，中島 遥子1,2， 服部 正平 ，三澤 尚明 ，林 哲也 （ 九 大 院・医・細 菌 ， 鹿 児 島 大・医・ 3 4 片平 雄之2，伊豫田 淳5，大 西 真5，小 椋 義俊2，林 哲也2（1九 大 院・医・ 微生物， 宮崎大・農・獣医， 東京大・院・新領域） 病態修復，2九大院・医・細菌，3京都大・医・微生物，4鹿大院・医・ 感染，5感染研・細菌第一） Dynamics in genome evolution of Treponema phagedenis ○Yasuhiro Gotoh1, Yoshitoshi Ogura1, Tadasuke Ooka2, Takahisa Comparative genome analysis of enterohemorrhagic Yano3, Kenshiro Oshima4, Masahira Hattori4, Naoaki Misawa3, Escherichia coli O121:H19 Tetsuya Hayashi1 (1Dept. Bact., Fac. Med. Sci., Kyushu Univ., 2Dept. 3 ○Ruriko Nishida1,2, Kazunori Murase3, Yasuhiro Gotoh2, Tadasuke Microbiol., Grad. Sch. Med. Dent. Sci., Kagoshima Univ., Dept. Vet. 4 Ooka4, Yoko Nakashima1,2, Katsuyuki Katahira2, Sunao Iyoda5, Sci., Fac. Agri., Univ. Miyazaki, Grad. Sch. Front. Sci., Univ. Tokyo) Makoto Ohnishi5, Yoshitoshi Ogura2, Tetsuya Hayashi2 (1Dept. Med. And Biosystemic Sci., Grad. Sch. Med. Sci., Kyushu Univ., 2Dept. ウシ趾乳頭腫症（PDD）は，歯周病や細菌性膣症などとともに Bact., Fac. Med. Sci., Kyushu Univ., 3Dept. Microbiol. Kyoto Univ. 代表的な Polymicrobial disease の一つであり，スピロヘータ様細 Grad. Sch. Med., 4Grad. Sch. Med. Dent. Sci., Kagoshima Univ., 菌などの難培養性菌を中心とした様々な細菌の存在が報告され 5Dept. Bacteriol. 1, Nat. Inst. Infec. Dis.) ている。しかし，分離培養および再現性試験が困難なため，未 だ起因菌群の同定には至っていない。そこで，最も安定した 【目的】腸管出血性大腸菌（EHEC）には様々な血清型が存在する。我々 PDD 優勢菌種として唯一分離に成功した Treponema phagedenis は，BIG7 と呼ばれる O157, O26, O111, O103, O121, O145, O45 のうち，前 YG3903R 株を対象とし，全ゲノム配列を決定した。YG3903R 株 4 者の全ゲノムを解読し，病原性進化機構の解明等を進めてきた。今回は， の全ゲノム長は 3.56 Mb であり，ゲノム上に多種多様な反復配 O121 の全ゲノム配列決定と本血清型内でのゲノム多様性の実体解明を目 列が見られた。その内訳は，180 kb の染色体重複配列や 3 種（計 的とした比較ゲノム解析を行った。【方法】HUS 由来株の全ゲノム配列を 11 コピー）のプロファージ領域，11 種（計 147 コピー）の挿 決定し，アノテーションや病原遺伝子の同定等を行った。また，海外株を 入配列領域（ ）， コピーの 含む 58 株のドラフトゲノム配列を取得し，全ゲノム系統解析や Stx2 ファー IS 690 Miniature-inverted transposable ジの解析等を実施した。【結果】O121 の染色体は 5,391 Kb で，82 Kb の element（MITE）であった。特に，MITE は爆発的な増加と多 病原プラスミドを保持していた。他の血清型の EHEC と同様に多数のプ 様化が見られた。これら反復配列の多さは，YG3903R 株特有の ロファージを有し，3 型分泌系エフェクターなどの病原因子レパートリー 特徴か，あるいは Treponema phagedenis に広く見られるものか も他の EHEC と類似していた。全ゲノム系統解析から，O121 には 2 つの 明らかにするため，ヒトから分離された Treponema phagedenis 亜系統が存在し，国内株は全て同一亜系統に属することが明らかとなっ ATCC27087 株についても全ゲノム配列（3.06 Mb）を決定した。 た。また，Stx2 ファージのゲノム構造は高度に保存されており，多型は 3 種のプロファージ領域は全て保存されていたが，各コピー数 IS の挿入などに限定されていたが，各株の Stx2 産生量には有意と思われ に違いが見られた。8 種の IS が共通して見られ，同じ構造をも る違いがみられた。【考察】O121 も O157 等と同様に水平伝播により多数 つ が コピー確認された。また，両株（ 株と の病原遺伝子を獲得し，EHEC へ進化したことが明らかとなった。また， MITE 630 YG3903R O121 株間のゲノム多様性は比較的低く，日本国内には 1 つの亜系統のみ ATCC27087 株）のゲノム構造を比較した結果，MITE がゲノム が分布していると考えられた。Stx2 ファージの微細なゲノム多型と Stx2 再編に大きく関与していることが示唆された。これらの結果か 産生量の違いの関連については，今後詳細な解析を行う必要がある。［共 ら考察される Treponema phagedenis のゲノム進化モデルについて 同研究者］井口純（宮崎大），八柳潤，勢戸和子，成松浩志，緒方喜久代， も報告したい。 木全恵子，磯部順子，前田詠里子，江藤良樹，松本裕子，永井佑樹，亀山 光博（各地の地方衛生研究所）

P1-127 黄色ブドウ球菌のファイブロネクチン結合タン P1-128 クラリスロマイシン耐性 β- ラクタマーゼ非産 パク A 領域の多型と MLST の clonal complex との関連 生アンピシリン耐性インフルエンザ菌の出現と耐性機構の ○村井 美代1，前川 純子2（1埼玉県立大・検査技術，2感染研・細菌 解析 第一） ○瀬山 翔史，輪島 丈明，中南 秀将，野口 雅久（東京薬大・薬・病 原微生物） The correlation between the FnBP sequence types and MLST in Staphylococcus aureus Occurrence of Clarithromycin-resistant BLNAR and ○Miyo Murai1, Junko Maekawa2 (1Dept. Health Sci., Saitama Pref. Analysis of these mechanisms Univ., 2Dept. Bacteriol. 1, NIID) ○Shoji Seyama, Takeaki Wajima, Hidemasa Nakaminami, Norihisa Noguchi (Dept. Microbiol., Sch. Pharm. Tokyo Univ. Pharm. Life Sci.) 黄色ブドウ球菌のファイブロネクチン結合タンパク（FnBP）は， 宿主の細胞外マトリックスタンパクに結合し，組織や細胞への 【目的】インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）は，呼吸 付着因子または細胞侵入因子として働く病原因子である。1 菌 器感染症などの起因菌である。その治療には，β- ラクタム系薬 株は隣接する fnbA および fnbB にコードされた 2 つの FnBPA やマクロライド系薬などが用いられるが，β- ラクタム系薬に （1,018 a.a.）と FnBPB（940 a.a.）を持つ。FnBPA と FnBPB の 対する耐性菌（BLNAR）の流行が問題となっている。我々は， アミノ酸配列 102 番目から約 500 アミノ酸（A67-B 領域）の同 BLNAR の中に，クラリスロマイシン（CAM）低感受性株が増 一性は約 45% と低く，それ以外は 95% と高い。A67-B 領域は 加していることを報告した。これらから，BLNAR が多剤耐性化 菌株間でも多型を示し，私達は今までに 80 株の fnbA と fnbB の し，感染症が難治化することが危惧される。そこで，本研究では， この領域のシークエンスを行い，それぞれ 19 と 18 の配列型を CAM に対する耐性化機構の解析を行った。 確認した。両者の系統樹は全く異なるにもかかわらず，1 つの 【方法】菌株は，2010 年から 2012 年に臨床分離された CAM の fnbA 配列型は特定の fnbB 配列型と結びついたので，その組合せ MIC が 32 μg/mL を示した耐性株 7 株を使用した。遺伝子の検出 のパターンを FnBP 配列タイプ（FnST）と定義した。今回私た は PCR 法により，リボソームタンパク L4，L22 中の変異と acr ちは FnST を決めた分離株 126 株とゲノム公開株 52 株について 領域の解析は，DNA シーケンス法により行った。染色体性多剤 multi locus sequence typing（MLST）のデータに基づき minimum 排出ポンプ遺伝子の発現量は，半定量的 RT-PCR 法で測定した。 spanning tree を作製し，FnST との対応を検討した。MLST で 形質転換は，H. influenzae Rd 株をレシピエントとしてエレクト 同じ sequence type（ST）を示す株はすべて同じ FnST を示し ロポレーション法で行った。 た。また，clonal complex（CC）でみた場合も，ほとんどが同じ 【結果・考察】マクロライド耐性遺伝子やリボソームタンパクの FnST であった。例外的に CC1，CC5 では 2～3 の FnST に分か 変異を解析したが，耐性遺伝子や変異は検出されなかった。し れたが，MLST で配列を決める 7 つの遺伝子のうち fnb に最も近 かし，排出ポンプ阻害剤添加により，CAM の MIC が濃度依存的 い arcC が組換えで入れ替わったとみられるグループ間で FnST に低下した。染色体性多剤排出ポンプ遺伝子を解析したところ， が異なった。まれに近縁関係にない CC に同じ FnST が割り当て acrB 遺伝子の転写量が上昇していた。そこで，acrB 周辺領域の られたが，その場合は MLST との関連が示唆されているコアグ 配列決定を行った結果，CAM 耐性株では，リプレッサーである ラーゼ遺伝子型が異なった。これらの結果は，FnBP 多型の起源 acrR にナンセンス変異による遺伝子の機能不全が生じていた。 が古く CC の形成期にまでさかのぼること，fnb 遺伝子近傍で染 さらに，標準株である Rd 株に CAM 耐性株の acr 領域を導入し 色体組換えが起こるのと同時に fnb 遺伝子内部で組換えが起こる たところ，CAM 耐性株と同様の MIC 値を持つ形質転換株が得ら と FnST 型が変化することを示唆している。 れた。以上の解析結果から，acrR の変異に起因する acrB の発現 量の上昇が，CAM 耐性化に関与していることが明らかとなった。

89 P1-129 カルバペネム分解物および阻害剤―SMB 型メ P1-130 多剤耐性菌自動判別技術開発に向けた耐性株の タロ β- ラクタマーゼ複合体の X 線結晶構造解析 形態学的解析 ○和知野 純一1，森 茂太郎2，木村 幸司1，金 万春1，荒川 宜親1（1名 ○武内 優奈1,2，西野 美都子2，古澤 力3，西野 邦彦1,2（1阪大・産研， 古屋大院・医・分子病原細菌，2国立感染研・細菌第二） 2阪大院・薬学，3理研・生命システム研究センター）

Structural insights into recognition of carbapenems and Morphological analysis of multidrug-resistant inhibitors by SMB metallo-beta-lactamase Escherichia coli ○Jun-ichi Wachino1, Shigetarou Mori2, Kouji Kimura1, Wanchun Jin1, ○Yuna Takeuchi1,2, Mitsuko Hayashi-Nishino2, Chikara Furusawa3, Yoshichika Arakawa1 (1Dept. Bacteriol., Grad. Sch. Med., Nagoya Kunihiko Nishino1,2 (1Institute of Science and Industrial Research, Univ., 2Dept. Bacteriol II., Nat. Inst. Infect. Dis.) Osaka Univ., 2Grad. Sch. Pharmaceutical Science, Osaka Univ., 3Quantitative Biology Center, RIKEN) Metallo-β-lactamase (MBL) confers resistance to carbapenems and its increasing prevalence is a growing clinical concern. To elucidate 近年，多剤耐性菌の出現が世界中で問題となっている。臨床で the mechanism by which the enzyme recognizes and hydrolyzes は様々な耐性菌が出現しており有効な対策法が求められている。 carbapenems, we solved the 1.4 A crystal structure of SMB-1, a 一方で，耐性菌の出現背景は複雑であり，正確かつ迅速な検出 subclass B3 MBL, bound to hydrolyzed carbapenems. We found 法や治療法が確立されていないのが現状である。2014 年に，様々 SMB-1 interacts mainly with the carbapenem core structure via な抗菌薬存在下での大腸菌の進化実験により 10 種類の薬剤耐性 Q157[113], S221[175], and T223[177], but there is less contact with 菌株が獲得され，同時にそれらの耐性菌株について遺伝子発現 the side chains of carbapenems, strongly indicating that SMB-1 や遺伝子変異に関するオミクス情報が取得された。そして，各 primarily recognizes the carbapenem core domain. 株において MIC 値を予測するために必要な少数の遺伝子を抽出 We also solved the crystal structure of SMB-1 in complex with the するとともに，発現量や変異と耐性能との関係の解明が行われ approved drugs captopril, an inhibitor of the angiotensin-converting た（1Suzuki S. et al., Nat. Commun., 5, art. No. 5792, 2014）。この enzyme, and 2-mercaptoethanesulfonate, a chemoprotectant. These ように，耐性菌株のオミクス情報は得られ解明が進んでいる一 drugs are potent competitive inhibitors of SMB-1 with Ki values of 方で，形態情報は未だ得られていない。これまでの予備的観察 8.9 μM and 184 μM, respectively. Like carbapenems, these inhibitors により，多剤耐性菌は野生型とは異なる形態学的特徴を持つ可 interact with the Q157[113] and T223[177], and their thiol groups 能性が示唆されている。本研究では，様々な薬剤耐性株の形態 coordinate the zinc ions at the active site. Taken together, the data 学的情報の取得と解析を行い，それぞれの耐性株において形態 indicate that Q157[113], S221[175], T223[177], and the two zinc 学的特徴を抽出し，機械学習による耐性菌自動推定技術のため ions in the active site are key targets in designing SMB-1 inhibitors の情報基盤構築を目指す。これまで人工進化実験により 10 種類 with enhanced affinity. The structural data provide a solid foundation の抗生物質に対する耐性菌株が得られている 1。今回，そのうち in developing effective inhibitors that would overcome carbapenem の 4 種類の耐性菌株において光学顕微鏡および電子顕微鏡によ resistance. る画像情報の取得および解析を行った。その結果，耐性菌株に よって菌体のサイズや外形，内部構造において異なった形態学 的特徴を有していることが判明した。今後，耐性菌株のオミク ス情報と形態情報を組み合わせることによって耐性能を記述す る特徴を抽出するために，すべての耐性菌株において形態情報 を取得する予定である。

P1-131 大腸菌バイオフィルム形成における薬剤排出ポ P1-132 グリコペプチド耐性 Staphylococcus capitis ンプの役割 のゲノム解析 ○山崎 聖司1,2，王 麗媛1,2，平田 隆弘1，西野 美都子1,2，西野 邦彦1,2 ○佐藤 祐介1，鐘司 光貴2，渡邊 真弥1，菊池 賢3，平松 啓一4，崔 龍 （1阪大・産研・生体分子制御，2阪大院・薬・細胞生物） 洙1（1自治医科大学・医・細菌学，2船橋市立医療センター，3東京女 子医科大学・医・感染症科，4順天堂大学大学院・医学研究科・感染 Multidrug efflux pumps contribute not to produce but to 制御科学研究センター） maintain the biofilm of Escherichia coli ○Seiji Yamasaki1,2, Li-Yuan Wang1,2, Takahiro Hirata1, Mitsuko Genome analysis of Staphylococcus capitis resistant to Hayashi-Nishino1,2, Kunihiko Nishino1,2 (1Dept. Biomol. Sci. & Regul., glycopeptide antibiotics ISIR, Osaka Univ., 2Dept. Cell Biol., Grad. Sch. Pharm. Sci., Osaka ○Yusuke Sato’o1, Mitsutaka Shoji2, Shinya Watanabe1, Ken Kikuchi3, Univ.) Keiichi Hiramatsu4, Longzhu Cui1 (1Dept. Microbiol., Jichi Medical Univ., 2Funabashi Municipal Medical Center, 3Dept. Infectious In gram-negative bacteria, multidrug efflux pumps have major roles Diseases, Tokyo Women’s Medical Univ. Sch. Med., 4Center of in the intrinsic and elevated resistance to a wide range of compounds. Excellence for Infect. Cont. Sci., Grad. Sch. Med., Juntendo Univ.) In addition to multidrug efflux pumps, biofilm is also important for antibiotic resistance. Biofilms protect bacteria against the 【背景】Staphylococcus capitis は，度々ヒトに感染症を引き起こし，臨床 immunological mechanisms of the host and drugs such as antibiotics, 現場で問題になっている。しかし，その病原性や薬剤耐性メカニズムに causing difficulties in treatment. Recently, the roles of multidrug は不明な点が多い。今回，私たちは同一患者から分離したバンコマイシ efflux pumps on the biofilm conformation are focused on; however, ン（VCM）耐性，テイコプラニン（TEIC）耐性と両剤感性の感染起因菌 the relationship between them remains to be studied in detail. The 1 株ずつ，計 3 株の全ゲノム解析と性状解析を行い，その遺伝学的背景 aim of this study was to identify the efflux pumps which have relation の解明を試みた。【方法】Roche 454 シークエンシングシステム，Illumina to biofilm in Escherichia coli and reveal the effect of these pumps 1G Analyzer およびサンガー法により 3 株の全ゲノム塩基配列を決定し， on the biofilm conformation by time scale observation. Our results MIGAP，in silico Molecular Cloning，GenomeTraveler と Genetyx を用いて showed that both of AcrB and MdtABC pumps relate to biofilm ゲノム構造の構築や塩基配列のアノテーション，SNP 解析などを行った。 conformation of E. coli. Furthermore, these pumps are essential not 生物性状の解析として，薬剤感受性試験とバイオフィルム形成試験を行っ to produce biofilm in an early stage but to maintain enough amount た。【結果と考察】今回解析に用いた 3 株（TW1, TW3, TW4）は，同一患 of biofilm for a long time. Sequential observation of the amount of 者の心臓ペースメーカー感染病巣から同時に分離した臨床分離株である。 biofilm revealed that the efflux pumps AcrB and MdtABC contribute その 3 株の VCM と TEIC の MIC はそれぞれ 16, 2, 1 と 8, 32, 0.5 μg/ml であっ to maintain E. coli biofilm. This report contend that focusing on time た。TW1 株は，その染色体全長が 2,479,312bp で，7,464bp のプラスミド scale conformational changes of biofilm is important to examine を持ち，それぞれ 2,393 個と 9 個の CDS を有していた。TW3 と TW4 株は， the relationship between multidrug efflux pumps and biofilm, and TW1 株と類似の染色体を有していたが，TW1 株に比べ TW3 株は walK に will promote to deepen understanding of the bacterial multidrug アミノ酸の置換を伴う一塩基の変異があり，TW4 株には walK に加えて resistance mechanism (Int. J. Antimicrob. Agents. 2015). murA 中にフレームシフト変異が起こっていた。このような変異が，上記 のグリコペプチド系抗菌薬の感受性相違の遺伝学的背景であると考えられ る。また今回解析した 3 株間のバイオフィルム形成能も異なっており，同 様に変異の関与が考えられた。現在，グリコペプチド耐性とバイオフィル ム形成能について詳細な解析を進めている。

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P1-133 化膿レンサ球菌の二成分制御系によるナイシン P1-134 Serratia marcescens における新規消毒薬耐性 耐性機構 因子の解析 ○松尾（川田）美樹1，立野 一郎2，長谷川 忠男2，小松澤 均1（1鹿児 ○星川 果南1，小川 和加野3，土屋 友房4，黒田 照夫1,2（1岡山大・薬， 島大・院・医歯学・口腔微生物学，2名古屋市立大・院・医・細菌学） 2岡山大院・医歯薬・微生物，3第一薬科大，4立命館大・薬）

Resistant mechanism of two-component system against Investigation of antiseptic resistant mechanism in nisin A in Streptococcus pyogenes Serratia marcescens ○Miki Kawada-Matsuo1, Ichiro Tatsuno2, Tadao Hasegawa2, Hitoshi ○Kanami Hoshikawa1, Wakano Ogawa3, Tomofusa Tsuchiya4, Teruo Komatsuzawa1 (1Dept. Oral Microbiol., Grad. Sch. Med. and Dent., Kuroda1,2 (1Fac. Pharm., Okawama Univ., 2Grad. Sch. Med. Dent. Kagoshima Univ., 2Dept. Bacteriol., Grad. Sch. Med., Nagoya City Pharm. Sci. Okayama Univ., 3Daiichi Pharm. Univ., 4Col., Pharm. Sci., Univ.) Ritsumeikan Univ.)

Two-component systems (TCSs) are specific regulatory systems 【目的】Serratia marcescens が消毒薬に耐性化し，院内感染を惹起 in bacteria that play an important role in sensing and adapting to した例が報告されている。しかし，現在まで S. marcescens の消 the environment. In this study, we systematically evaluated the 毒薬耐性化機構はあまり明らかにされていない。そこで我々は S. roles of TCSs in the resistance of the Group A Streptococcus (GAS, marcescens における未解析の消毒薬耐性因子の同定と解析を試み Streptococcus pyogenes) SF370 to several types of lantibiotics. In た。 a comprehensive analysis using individual TCS deletion mutants, 【方法 】RND 型多剤排出ポンプ遺伝子sdeXY を破壊したS. the deletion of srtRK (Spy_1081-82) in SF370 increased the marcescens KS24ΔsdeXY 株をchlorhexidine gluconate（CHX）を susceptibility to nisin A (class I type AI) produced by Lactococcus 含む培地で継代培養し，CHX 耐性株を分離した。得られた CHX lactis ATCC11454, while the susceptibilities of nukacin ISK1 耐性株について全ゲノム変異解析を行った。変異のみられた遺 produced by Staphylococcus warneri and C55 produced by S. aureus 伝子の破壊・相補株を作製し，感受性試験を行った。 TY4 were not altered in all TCS mutants. The expression of srtFEG 【結果・考察】CHX 耐性株では sdePQ-omsA の mRNA が発現上昇 (Spy_1085-87), which locates downstream of srtRK and shows していることが分かった。しかし sdePQ-omsA の ORF 及びプロ homology with ABC transporters, was increased in response to nisin モーター領域の DNA 配列には変異がみられなかったため，CHX A. However, srtEFG expression was not induced by nisin A in srtRK 耐性株について全ゲノム変異解析を行った。その結果，継代培 mutant. Also, inactivation of srtFEG increased the susceptibility to 養の過程において抗菌薬耐性パターンが変化する段階で変異し nisin A. These results conclude that the intrinsic resistance to nisin ている 4 つの遺伝子を見出した。そのうち，消毒薬耐性に関与 A is mediated by SrtEFG induced by SrtRK. Additional evidence している報告のない，推定 MltA-interacting protein である mipA suggests that SrtRK is required for co-existence with L. lactus に焦点をあて，破壊・相補株を作製し，各種消毒薬の MIC の測 ATCC11454 producing nisin A. Our results highlight the roles of 定と Survival assay を行った。mipA の変異はナンセンス変異ま nisin A in the interactions between S. pyogenes and the importance of たはトランスポゾンの挿入であったため，MipA の機能欠損が TCSs in this process. CHX 耐性に関与していると考えられた。しかし感受性試験の結 果，mipA 破壊株では CHX 耐性が低下した。この矛盾は，継代 培養による変異の蓄積が原因の一つであると考えられる。現在， この矛盾の原因を解明するべく解析を行っている。 【非会員共同研究者】芳賀仁美，峠雄太

P1-135 三次元数理シミュレーションを利用したバイオ P1-136 細菌集団中の確率的な ldhA 発現による休止細 フィルム中の休止細菌形成動態の解析 菌形成 ○千原 康太郎1，加川 友己2，松本 慎也1，常田 聡1（1早大・先進理工・ ○一色 理乃1，河合 祐人1，田中 大器2，関口 哲志2，松本 慎也1，常 生命医科，2阪大院・工・生命先端工学） 田 聡1,2（1早大・先進理工・生命医科，2早大・ナノライフ創新研究機 構） Analysis of dormant cell formation in biofilm based on 3-D mathematical modeling Stochastic ldhA expression induces the formation of ○Kotaro Chihara1, Yuki Kagawa2, Shinya Matsumoto1, Satoshi persisters Tsuneda1 (1Dep. Life Sci. Med. Biosci., Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., ○Rino Isshiki1, Yuto Kawai1, Daiki Tanaka2, Tetsushi Sekiguchi2, Waseda Univ., 2Dep. Biotech., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.) Shinya Matsumoto1, Satoshi Tsuneda1,2 (1Dep. Life Sci. Med. Biosci., Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2NLR, Waseda Univ.) 【目的】バイオフィルム中の細菌が遊走時よりもはるかに高い 抗生物質抵抗性をもつ原因の一つとして，休止細菌（Dormant 【目的】細菌集団中には，一定の割合で抗生物質に対し抵抗性を persister cell）の存在が挙げられる。休止細菌は代謝活性を自ら 示す細菌が存在する。これらは persister（休止細菌）と呼ばれ， 抑制しているため増殖することが無く，抗生物質に対して抵抗 分裂する細菌と遺伝的に等しく耐性遺伝子を持たないが，増殖 性を示すため，バイオフィルム関連感染症の難治化に寄与して を抑制した表現型を持つことで，抗生物質の作用から逃れるこ いると考えられる。休止細菌化のメカニズムはいくつか解明さ とができる。我々はこれまでに，休止細菌で複数の嫌気代謝遺 れているものの，バイオフィルムという複雑な環境下での休止 伝子が高発現していることを見出した。本研究では，乳酸代謝 細菌形成のメカニズムやその動態を解明することは困難である。 遺伝子 lactate dehydrogenase A（ldhA）に着目し，休止細菌形成 本研究では，三次元数理シミュレーションで休止細菌の動態を との関連を解析することを目的とした。【方法】ldhA 発現の有無 再現することで，実験結果との比較を行い，休止細菌の動態を と，その後の増殖状態およびアンピシリン抵抗性を，シングル 予測することを目的とする。 セルレベルでタイムラプス観察した。ldhA 発現を可視化するた 【方法】バイオフィルムの形成過程をシミュレートできる め，ldhA プロモーター下流に蛍光タンパク質 Venus を配置した Individual-based Model（IbM）に様々な休止化の仮説を組み込み， ldhA レポータープラスミドを作製し，大腸菌に導入した。また， バイオフィルム形成過程における休止細菌の動態を再現した。 シングルセルレベルでの観察には，マイクロ流体デバイスを用 休止化のメカニズムとして，ランダムに休止細菌が発生する仮 いた。このデバイスには，液体を流す幅・厚さの大きな流路と 説，基質・酸素濃度の低い環境で休止化する仮説，分裂までに 細菌を固定する幅・厚さの小さな溝を設置し，供給する培地や かかる時間に依存して休止化する仮説をそれぞれ実装した。 抗生物質を自由に変更しながら，生きた細菌を長時間観察した。 【結果・考察】シミュレーションの結果，単純な確率的な休止化 【結果・考察】ldhA は好気環境下でも，確率的に一部の細菌で発 によっても，バイオフィルム底部において休止細菌が多く局在 現することが明らかとなった。また，ldhA を発現した細菌は， することが示された。また，この結果はバイオフィルムの高さ 発現後に増殖が抑制され，アンピシリンに対して抵抗性を示し 方向における，細菌の増殖速度の違いによるものであることが た。以上の結果から，ldhA の確率的な発現によって休止細菌形 確認された。さらに，休止細菌分布の時間変化や供給基質依存 成が促されることが示唆された。さらに，ストレスの無い環境 性をグラフ化することで，実装したそれぞれの仮説の特徴を見 下では ldhA 発現は一時的であるのに対して，酸性ストレスを加 分けることができた。実験系でも同様の手法をとることで，バ えると長時間にわたる発現が見られたことから，外部環境の違 イオフィルム中の休止細菌化の予測が可能であることが示唆さ いにより，休止細菌を形成する遺伝子の発現様式が異なること れた。 が示唆された。

91 P1-137 ストレス環境が誘導する大腸菌休止化経路の P1-138 次世代シークエンサーによる口腔ケア剤使用時 解析 における健康高齢者および障害者口腔細菌数の網羅的解析 ○河合 祐人1，一 色 理乃1，奥 田 修二郎1,2，松 本 慎也1，常 田 聡1（1早 大・ ○田村 宗明1,2，大屋 学1,3，関 啓介1,3,4，阿部 和正1，落合 邦康1,2（1日 先進理工・生命医科，2新潟大院・医歯・バイオインフォーマティクス） 大・歯・細菌，2日大・総歯研・生体防御，3日大・大学院・歯・口腔 健康科学，4日大・歯・総合歯） Gene Expression in E. coli Persister Cells Induced by Environmental Stress Comparison of oral bacteria of healthy elderly and ○Yuto Kawai1, Rino Isshiki1, Shujiro Okuda1,2, Shinya Matsumoto1, disability patients treated with oral care gel Satoshi Tsuneda1 (1Dep. Life Sci. Med. Biosci., Grad. Sch. Adv. Sci. ○Muneaki Tamura1,2, Manabu Ohya1,3, Keisuke Seki1,3,4, Kazumasa Eng., Waseda Univ., 2Bioinfo. Lab., Niigata Univ. Grad. Sch. of Med. Abe1, Kuniyasu Ochiai1,2 (1Dept. Microbiol., Nihon Univ. Sch. Dent., and Dent. Sci.) 2Div. Immunol. Pathobiol., Dent. Res. Cent., Nihon Univ. Sch. Dent., 3Div. Oral Health Sci., Nihon Univ. Sch. Dent. Grad. Sch. Dent., 4Dept. 【目的】難治性感染症の原因として休止細菌の存在が注目されて Compre. Dent. Clin. Edu, Nihon Univ. Sch. Dent.) いる。抗生物質は細菌の増殖を標的としているが，休止細菌は 細胞増殖を抑制することで抗生物質の作用を回避している。我々 【目的】近年，口腔環境の変化は口腔内外疾患と関わっているこ はこれまでに大腸菌の休止細菌マーカーを開発して休止状態に とから，口腔ケアは予防の点から重要課題である。演者らは， 特異的に発現している遺伝子を網羅的に解析した。その結果， 要介護高齢者の口腔環境改善目的で選択的抗菌効果を発揮する 好気条件で培養したにも関わらず，休止細菌では嫌気的代謝遺 カテキン含有ジェル（カテキンジェル）を開発し，臨床応用へ 伝子が亢進していることが示唆された。しかしどのような環境 の道を開いた。今回，健康高齢者および障害者を対象に本ジェ において同様の表現型を持つかは明らかとなっていない。そこ ルの口腔内塗布が口腔細菌叢に及ぼす影響について検討を行っ で本研究では休止細菌形成が誘導されることが知られるストレ た。【方法】介護予防教室（川口市）に参加の健康高齢者 69 名 ス環境における休止細菌の分子機構を調べた。【方法】MOPS 最 （平均年齢 76.4 歳）および相模原市歯科医師会に通院中の障害者 少培地を改変し炭素源枯渇，酸性ストレス，低酸素の培養条件 19 名（平均年齢 35.5 歳）に，4 週間，カテキンジェルの口腔内 を検討した。各条件で大腸菌を培養した際の抗生物質抵抗性を 塗布を実施した。塗布前後の唾液を採取し，抽出した DNA を試 評価した。また，形成された休止細菌はトランスクリプトーム 料として次世代シーケンサ解析を行い，その解析結果より，総 解析のために，独自に開発したマーカー株を用いて分取した。 レンサ球菌数，歯周病原菌およびカンジダ菌数を real-time PCR マーカー株では大腸菌の細胞骨格である FtsZ の両端に CFP お 法にて解析した。なお，本研究は日本大学歯学部倫理委員会よ よび YFP を融合した。FtsZ は細胞分裂時にのみ分裂面で重合し り審査・承認を受けている。【結果および考察】次世代シーケン て Zring を形成するため，作成した YFP-FtsZ-CFP は Zring 特異 ス解析の結果，カテキンジェル塗布による両被験者の口腔レン 的な蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を起こす。この FRET 蛍 サ球菌属への影響が認められなかった。Real-time PCR 法の結果， 光の有無を検出し分裂を行わない休止細菌の分取が可能である。 歯周病原菌およびカンジダ菌数が減少し，健康高齢者では有意 【結果】炭素源枯渇，酸性ストレス，低酸素環境によって休止細 差が認められた。カテキンジェルは口腔細菌叢のコントロール 菌の誘導が確認された。オフロキサシンとゲンタマイシンを用 と口腔環境維持に有効であると共に長期使用の使用が可能であ いて抵抗性を評価した結果，環境毎に 2 つの抗生物質に対する ると思われ，今後，メタボローム解析等も実施し，より詳細に 抵抗性が異なることが明らかとなり，休止細菌の表現型が異な 網羅的な解析を行う予定である。（会員外実験協力者：デンタル ることが示唆された。本発表では，分取した休止細菌のトラン サポート株式会社歯科事業部口腔ケア課；仁後真記子・城 明妙・ スクリプトーム解析結果についても報告する予定である。 柳橋巳智子・新居直実，川口市介護保険課；小澤賢二・岩渕里栄， 相模原市歯科医師会；相澤 恒・吉田幸弘）

P1-139 歯周病原細菌の増殖に対して食品添加物が及ぼ P1-140 緑膿菌 PAO1 株とファージ KPP22 の短期間進 す効果 化的軍拡競走の解析 ○篠原 舞，前谷－安井 実希，矢澤 彩香，神谷 重樹（大阪府大・総 ○那須川 忠弥1，内山 淳平1，鈴木 仁人2，宮田 玲奈3，山口 琴絵3， 合リハビリテーション） 内山 伊代1，阪口 義彦4，柴山 恵吾2，阪口 雅弘1，松崎 茂展3（1麻布 大学獣医学部微生物学第一研究室，2国立感染症研究所細菌第二部， Effect of food additives on the growth of the periodontal 3高知大学医学部医学科微生物学講座，4北里大学医学部医学科微生物 pathogen 学研究室） ○Mai Shinohara, Miki Maetani-Yasui, Ayaka Yazawa, Shigeki Kamitani (Grad. Sch. Comprehensive Rehabilitation, Osaka Analysis of short-term coevolutionary arms race between Prefecture Univ.) Pseudomonas aeruginosa PAO1 and phage KPP22 ○Tadahiro Nasukawa1, Jumpei Uchiyama1, Masato Suzuki2, Reina Periodontitis is a common disease in the elderly and caused by Miyata3, Kotoe Yamaguchi3, Iyo Uchiyama1, Yoshihiko Sakaguchi4, polymicrobial infection, leads to a chronic inflammation. Recently, Keigo Shibayama2, Masahiro Sakaguchi1, Shigenobu Matsuzaki3 periodontitis has been found to be associated with aspiration (1Dept. Veterinary Microbiology, Sch. Veterinary Medicine, Azabu pneumonia and swallowing disorder is a risk factor of aspiration Univ., 2Dept. Bacteriology II, National Institute of Infectious Diseases, pneumonia. People with swallowing disorder usually use a dysphagia 3Dept. Microbiology and Infection, Fac. Medicine, Kochi Univ., 4Dept. diet, which mostly contains food additives, especially artificial Microbiology, Fac. Medicine, Kitasato Univ.) sweeteners and mid-chain fatty acids. In general, development of periodontitis is considered to be affected by foods or constituents 【目的】近年，欧米諸国では動物・ヒトの難治性緑膿菌感染症に対し in foods, but the effects of food additives on periodontal pathogens てファージ療法の臨床試験が行われている。治療用ファージには， しばしば，PB1 様ウイルス属ファージを利用している。本法の有効性・ remain largely unknown. In this study, we investigated the effect 安全性の実現には，菌とファージの共進化の情報を基にしたファー of artificial sweeteners and mid-chain fatty acids on the growth of ジ耐性菌出現リスク回避が必要である。それゆえ，本研究では，緑 the periodontal pathogen by using Porphyromonas gingivalis. Four 膿菌 PAO1 株と独自に分離したファージ KPP22 を使用した短期間共 artificial sweeteners (acesulfame K, aspartame, sucralose, and 進化実験を行い，菌とファージの解析を行った。【方法】緑膿菌ファー saccharin) and two mid-chain fatty acids (octanoic acid and decanoic ジ KPP22 を分離した。独立した実験を 3 回行い，ファージ耐性菌， acid) examined in the study showed the inhibition of the bacterial 再感染可能ファージを各 3 株分離し，菌とファージの全ゲノム解析 growth. These artificial sweeteners have also a bactericidal activity を行った。SDS-PAGE および O 抗原検出ウエスタンブロットにより against P. gingivalis. Furthermore, we examined the cytotoxicity of LPS を解析した。【結果と考察】はじめに，PAO1 株とミオウイルス 科 様ウイルス属に分類されるファージ の共培養を行い， these food additives in the human cell lines and some of them were PB1 KPP22 KPP22 吸着阻害耐性菌株，KPP22 耐性菌に吸着可能な変異ファージ cytotoxic. These findings are available for developing a dysphagia を分離した。次に，菌ゲノム解析により，全ての耐性株に共通して， diet to avoid the aspiration pneumonia. ナンセンス変異が O 抗原合成に関与する wzy 遺伝子に認められた。 実験的に，耐性菌株には O 抗原の欠失が認められた。さらに，変異 ファージのゲノム解析の結果，ビリオン遺伝子，ORFs 060, 065, 086 にミスセンス変異が見られ，ORF60 が強く宿主特異的吸着に関与し ていることが予想された。以上から，短期間の本進化的軍拡競走では， wzy 遺伝子の変異により PAO1 株は KPP22 耐性能を獲得し，それに 対応して KPP22 はビリオンを変化させ吸着能・感染性を復帰させた と考えられる。

92 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P1-141 黄色ブドウ球菌の Hmp は Streptococcus P1-142 システインプロテアーゼであるパパインとアク sanguinis の産生する過酸化水素感受性に関与する チニジンによる口腔バイオフィルム除去効果 ○大貝 悠一，小松澤 均（鹿児島大院・医歯学・口腔微生物学） ○麥田 菜穂1，南部 隆之2，高橋 一也1，王 宝禮2，小正 裕1（1大歯大・ 歯・高齢者歯科，2大歯大・歯・細菌） Staphylococcus aureus Hmp affects susceptibility to H2O2 produced by Streptococcus sanguinis The effect of plant cysteine proteases, papain and ○Yuichi Oogai, Hitoshi Komatsuzawa (Dept. Oral Microbiol., Grad. actinidin, on oral biofilm removal Sch. Med. & Dent., Kagoshima Univ.) ○Naho Mugita1, Takayuki Nambu2, Kazuya Takahashi1, Pao-Li Wang2, Yutaka Komasa1 (1Dept. Gerodontology, Fac. Dent., Osaka 黄色ブドウ球菌はヒトの鼻腔や皮膚に常在する病原性細菌であ Dent. Univ., 2Dept. Bacteriol., Fac. Dent., Osaka Dent. Univ.) り，口腔内からも分離される。黄色ブドウ球菌を含む様々な細 菌が保有するヘモグロビン様タンパク Hmp は一酸化窒素の分 Because dental plaque is a potential reservoir for respiratory 解に関与することが知られており，マクロファージにより産生 infection in the elderly, there is clearly a critical need for the される一酸化窒素の殺菌力に抵抗する因子として考えられてい development of effective methods for oral biofilm removal. We have る。一方で，いくつかの細菌種において，Hmp が酸化ストレス shown the effects of tablets containing a cysteine protease, actinidin, を増大させることが知られている。本研究では，黄色ブドウ球 on tongue coating removal. To find out more details of oral biofilm 菌 hmp 欠損株を用い，口腔常在菌 Streptococcus sanguinis の産生 removal by cysteine protease, we conducted in vitro biofilm assay する過酸化水素に対する感受性を解析した。また，二成分制御 using oral initial colonizer Actinomyces species. Solutions containing 系因子による hmp の発現制御について解析した。 various concentrations of purified papain or actinidin extracted from 黄色ブドウ球菌MW2 の野生株及びhmp 欠損株を用い，S. kiwifruit were applied to the biofilm made by Actinomyces oris strain sanguinis の産生する過酸化水素に対する感受性を Direct 法によ MG-1. After 10 to 30 minutes of incubation at 37°C, biofilm removal り解析した結果，hmp 欠損株は野生株と比べ低感受性を示した。 was observed at high enzyme concentration (e.g. 0.1, 1 and 10 mg/ また，二成分制御系因子のひとつである srrA の欠損株は著しい mL) in both proteases. Thus, we are investigating the relationship hmp の発現減少を示した。 between biofilm removal and proteolytic degradation of fimbriae, 本研究より，黄色ブドウ球菌は二成分制御系因子 SrrAB を介し since these enzyme solutions exerted no bactericidal effect. た hmp の発現制御により S. sanguinis の産生する過酸化水素に 対し感受性を変化させることが明らかとなった。黄色ブドウ球 菌においても，一酸化窒素不在時の Hmp が菌体内の酸化ストレ スを増大させ，過酸化水素高感受性を示すと考えられた。黄色 ブドウ球菌の口腔内における過酸化水素産生菌との共存に，hmp の発現制御が関与することが示唆された。

P1-143 チオール化合物と β ラクタム系抗生物質との P1-144 肉養鶏の発育段階における第 3 世代セファロ 反応による付加体形成：抗菌作用への影響と標的タンパク質 スポリン耐性菌の推移 の同定 ○鈴木 香澄，浅井 鉄夫（岐阜大学大学院・連合獣医学研究科） ○小野 勝彦1，津々木 博康1，赤池 孝章2，澤 智裕1（1熊本大・医・微 生物，2東北大学・医・環境保健医） Longitudinal study of third generation cephalosporin- resistant Escherichia coli from bloiler flocks Identification of thiol-beta-lactam antibiotics adducts in ○Kasumi Suzuki, Tetsuo Asai (United Grad. Sch. Veterinary bacteria Sciences, Gifu Univ.) ○Katsuhiko Ono1, Hiroyasu Tsutsuki1, Takaaki Akaike2, Tomohiro Sawa1 (1Dept. Microbiol., Grad. Sch. Med. Sci., Kumamoto Univ., 2Dept. 【背景・目的】国内の肉養鶏において 2004 年頃から第 3 世代セファ Environ. Health Sci. Mol. Toxicol., Tohoku Univ., Grad. Sch. Med.) ロスポリン耐性大腸菌が増加した。2012 年にセフチオフル（動 物用第 3 世代セファロスポリン）の卵内接種およびヒナへの使 【目的】近年，抗生物質はその標的特異的な作用とともに細菌の 用に対して養鶏団体による自主的注意喚起が行われて以降，耐 代謝経路の撹乱を介して活性酸素の生成を高めることで，抗菌 性菌の出現率は減少した。本研究では，鶏群から継時的に糞便 作用を発揮していることが報告された。我々は抗生物質の薬理 を採取し，発育段階において出現した耐性菌の性状について調 作用に対する菌体内酸化還元状態の影響を解析する過程で，β ラ 査した。【方法】飼育過程において抗生物質および抗菌薬を一切 クタム系抗生物質であるアンピシリンがシステインをはじめと 使用しない農場のブロイラーから 2 週間隔で継時的に新鮮鶏糞 するチオール化合物の存在下で抗菌活性を失うことを見出した。 を採材した。滅菌生理食塩水にて鶏糞を 10 倍段階希釈し，CEX 本研究では β ラクタム系抗生物質とチオール化合物との反応を 添加および非添加 DHL 寒天培地平板を用いて細菌数を計測した。 解析し，その抗菌剤感受性の制御に与える影響を明らかにする 培地上の赤色コロニーを単離して，菌種の同定，セフォタキシ ことを目的とした。【方法】β ラクタム系抗生物質とチオール化 ム（CTX）の MIC を測定した。CTX 耐性株はクラブラン酸を用 合物の反応生成物の解析には，高速液体クロマトグラフィーと いた DDST 法を行い，その後 PCR によってそれぞれの β ラクタ 質量分析機を用いた。抗菌活性はディスク法にて検定した。タ マーゼの遺伝子を検索した。【結果・考察】入雛直後（3～15 日齢） ンパク質メロペネム付加体に対する抗体を作製し，ウエスタン には 6 群中 5 群で CEX 添加 DHL 寒天培地上に 102～105 CFU/g ブロッティングとプロテオミクスにより付加体形成の標的タン of feces のコロニーが検出された。単離した大腸菌は CTX 耐性で パク質の同定を試みた。【結果と考察】質量分析の解析から β ラ あり，それらの遺伝子型別は CMY-2group と CTX-M 型であった。 クタム系抗生物質（アンピシリン，メロペネム）は低分子のチ その後の発育段階では 5 群中 4 群で CEX 耐性菌は検出されなかっ オール化合物であるシステインと特異的に反応し，両者の 1:1 付 たが，1 群のみで 103～104 CFU/g of feces の CEX 耐性菌が継続的 加体を形成することが分かった。さらに，この付加体は抗菌活 に検出された。これらのことから，鶏群ごとの差はあるものの， 性が完全に消失していた。一方，メロペネム処理した大腸菌では， CTX 耐性菌は以前の報告（Hiroi et al, 2012）と比較して減少し 複数のタンパク質にメロペネム付加体形成が起こっており，そ ていることが明らかとなった。会員外共同研究者：杉山美千代 の中にはペニシリン結合タンパク質（PBP）が含まれていた。現 在，メロペネムが結合するアミノ酸部位の同定を行うとともに， このような付加体形成がもたらす PBP 活性変化の解析を進めて いる。今回見出されたチオール基に対する β ラクタム系抗生物 質の付加体形成はこれまでほとんど解析されておらず，薬理作 用や薬剤耐性機構との関連解析が期待される。

93 P1-145 β ポア形成毒素の溶血活性に対するインドロキ P1-146 The defensive role of IL-6-producing ノリン化合物の抑制作用 immature myeloid cells in group A streptococcal ○高橋 栄造1，藤波 千明2，黒田 照夫2，竹内 靖雄2，岡本 敬の介2， infections 2 1 2 三好 伸一 （ 日本薬大・薬， 岡山大院・医歯薬） ○松村 隆之1，池辺 忠義2，大西 真2，阿戸 学1（1国立感染研・免疫， 2国立感染研・細菌 I） Indolo[3,2-b]quinoline derivatives suppressed the hemolytic activity of beta-pore forming toxins ○Takayuki Matsumura1, Tadayoshi Ikebe2, Makoto Ohnishi2, Manabu 1 1 2 ○Eizo Takahashi1, Chiaki Fujinami2, Teruo Kuroda2, Yasuo Takeuchi2, Ato ( Dept. Immunol., Natl. Inst. Infect. Dis., Dept. Bacteriol. I, Natl. Keinosuke Okamoto2, Shin-ichi Miyoshi2 (1Fac. Pharm. Sci., Nihon Inst. Infect. Dis.) Pharm. Univ., 2Grad. Sch. Med. Dent. Pharm. Sci., Okayama Univ.) Group A Streptococcus (GAS) infections range from mild symptoms, In order to discover inhibitory compounds against pore-forming such as skin infections, to serious infections including toxic shock toxins, we examined the effect of four kinds of indolo[3,2-b]quinoline syndrome. Neutrophils and myeloid cells are important in protecting derivatives on hemolysis induced by the aerolysin-like hemolysin against GAS infections. However, during severe invasive GAS (ALH) of Aeromonas sobria and by the α-hemolysin of Staphylococcus infections that accompanied with neutropenia, it had been unclear aureus. The results showed that hemolysis induced by ALH was which factors are protective against such infections, and which cell significantly reduced by every derivative, while one derivative did not population is the source of them. We have previously reported that reduce the hemolysis by α-hemolysis. In addition, it was interesting interferon (IFN)-γ-producing immature myeloid cells (IMCs), but not that the degrees of reduction induced by these derivatives were not IFN-γ, confer fully protection from severe invasive GAS infections. uniform. Each derivative exhibited its own activity to inhibit the Therefore, other cytokines except for IFN-γ also are expected to respective hemolysin. Compounds 1 and 2, which possessed the play an important role in host defense. Here we show that mice amino group bonding to the naphthalene moiety at the C-11 position infected with severe invasive GAS isolate, but not with non-invasive of indolo[3,2-b]quinoline, had strong inhibitory effect on the activity GAS isolate, exhibit excessive levels of plasma interleukin (IL)- –/– –/– of ALH. Compound 4 which consisted of benzofuran and quinoline 6. Similar to Ifng mice, Il6 mice are more susceptible to severe had strong inhibitory effect on the activity of α-hemolysin. These invasive GAS infections than are control mice. Interestingly, IMCs results indicated that the amino group bonding to the naphthalene are the source of IL-6 in mice infected with severe invasive GAS moiety of compounds 1 and 2 assisted their ability to inhibit ALH isolates at the late phase. Adoptive transfer of wild-type IMCs, but –/– activity, while the oxygen atom at the 10 position of compound 4 not Il6 IMCs, is successful to improve bacterial clearance and strengthened its interaction with α-hemolysin. These compounds survival rate of mice infected with severe invasive GAS isolate. Our also suppressed the hemolytic activity of the supernatant of A. sobria results indicate that IMC-derived IL-6 have a crucial protective role or A. hydrophila, suggesting that these compounds might be effective in severe invasive GAS infections. at the site of infection of these bacteria.

P1-147 GLMN は細菌感染における inflammasome 活 P1-148 オートファジーによる細菌感染防御機構と細菌 性化の negative regulator である 由来硫化水素による制御 ○鈴木 志穂1，鈴木 敏彦2，三室 仁美3，笹川 千尋1,4,5（1東大医科研・ ○藤井 重元1，松永 哲郎1，Shahzada Khan2，Md. Mizanur 細菌感染生物，2医科歯科大・医歯学総合・細菌感染制御，3東大医科 Rahaman1，井 田 智章1，小 野 勝彦3，澤 智裕3，赤 池 孝章1（1東北大院・ 研・感染症国際研究センター，4千葉大・真菌センター，5日生研） 医・環境保健医学，2Gladstone Inst., Univ. California, San Francisco， 3熊本大院・生命科学（医）・微生物） GLMN is a novel negative regulator of inflammasome in response to bacterial infection Autophagy-mediated antibacterial host defense and its ○Shiho Suzuki1, Toshihiko Suzuki2, Hitomi Mimuro3, Chihiro regulation by hydrogen sulfide Sasakawa1,4,5 (1Div. Bacterial Infection Biology, Inst. of Medical ○Shigemoto Fujii1, Tetsuro Matsunaga1, Shahzada Khan2, Md. Science, Univ. of Tokyo, 2Dept. of Bacterial Infection and Host Mizanur Rahaman1, Tomoaki Ida1, Katsuhiko Ono3, Tomohiro Sawa3, Response, Grad. Sch. Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical Takaaki Akaike1 (1Dept. Environ. Health Sci. Mol. Toxicol., Tohoku and Dental Univ., 3Div. Bacteriology, Dept. Infectious Diseases Control, Univ. Grad. Sch. Med., 2Gladstone Inst., Univ. California, San International Research Center for Infectious Diseases, Inst. of Medical Francisco, 3Dept. Microbiol., Grad. Sch. Med. Sci., Kumamoto Univ.) Science, Univ. of Tokyo, 4Medical Mycology Research Center, Chiba Univ., 5Nippon Inst. for Biological Science) オートファジーは，細胞内に侵入した細菌の排除に関わることが知られて いる。最近我々は，細菌感染細胞において，活性酸素と NO から生成する Glomulin（GLMN）はグロームス腫瘍の原因遺伝子として特定された，細 ニトロ化環状ヌクレオチド 8- ニトロ -cGMP がタンパク質翻訳後修飾（S- 胞にユビキタスに存在するタンパク質である。GLMN の免疫機構への関 グアニル化）を介してオートファジー誘導に関わることを見いだした。ま 与は今まで知られていなかったが，我々はこれまでの研究において，赤 た，チオール基に過剰にイオウ原子が付加したシステインパースルフィ 痢菌感染時における inflammasome 活性化に GLMN が関与していること ドなどの活性イオウ分子が 8- ニトロ -cGMP を分解・代謝し，そのシグナ を見出している。今回我々は，inflammasome 活性化に対する GLMN 関与 ル活性を制御していることを見いだした。一方，サルモネラなどの一部 の普遍性を検証するため，以下の実験を行った。GLMN をノックダウン の細菌が産生する硫化水素は 8- ニトロ -cGMP のシグナル活性に影響を与 したマクロファージ細胞を用いた各種病原細菌感染実験の結果，赤痢菌 えている可能性が考えられる。そこで今回，ネズミチフス菌（Salmonella をはじめとしてサルモネラ菌，緑膿菌の感染時に引き起こされる NLRC4 enterica Typhimurium LT2）感染細胞における S- グアニル化を介したオー 活性化において， が を抑制する活 inflammasome GLMN inflammasome トファジー誘導機構と細菌が産生する硫化水素による制御について解析し 性をもつことが確認された。更に，SiO2, Alum, MSU 処理による NLRP3 た。ネズミチフス菌を感染させたマウスマクロファージ RAW264.7 細胞で inflammasome 活性化，及び poly dAdT 処理による AIM2 inflammasome 活 は，LC3-II のウエスタンブロットと LC3 および p62 に対する免疫細胞染 性化においても同様に GLMN が抑制効果をもつことが明らかになった。 色により，オートファジーが誘導されていることが分かった。感染細胞内 次に，我々は in vivo レベルでの検証を行うべく，GLMN ノックアウトマ の一部の菌体は著明に グアニル化を受けており， グアニル化が菌体 ウスの作成を試みた。GLMN ノックアウトマウス（GLMN–/–）は，胎生 9 S- S- 日前後で胚性致死になり生まれてこなかったが，GLMN 発現量が通常の のオートファゴソームへの選択的取込みに関わることが示唆された。硫化 30% 程度にまで低下した GLMN ヘテロマウス（GLMN+/–）を得ることが 水素産生酵素を欠損したネズミチフス菌は，野生型菌株に比べ，感染後の できた。得られた GLMN+/– マウスを用いて赤痢菌経鼻感染実験を行い， 菌体の S- グアニル化およびオートファゴソームへの菌体の取込みが有意 赤痢菌に対する炎症応答を検証したところ，GLMN+/– マウスは GLMN+/+ に増加し，細胞内での菌の増殖は有意に低下した。以上より，サルモネラ マウスと比較して，IL-1β 炎症性サイトカインの上昇とそれに伴う菌体数 が産生する硫化水素は，8- ニトロ -cGMP と S- グアニル化を介するオート の増加が認められた。本研究成果は，GLMN が inflammasome の negative ファジーの誘導を抑制することにより，宿主細胞内での菌の増殖に寄与し regulator であることを示唆している。 ていることが示唆された。

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P1-149 Vaginal lactobacilli suppress the P1-150 Inhibition of periodontitis in non-human inflammation by LPS through down-regulation of TLR4 primates by a locally administered complement C3 expression inhibitor ○飛田 啓輔，渡邉 樹（（株）キティー） ○前川 知樹，前田 健康（新潟大・院医歯・口腔研究セ） ○Keisuke Tobita, Itsuki Watanabe (KITII Co., Ltd.) ○Tomoki Maekawa, Takeyasu Maeda (Res. Cent. for Adv. Oral Sci., Niigata Univ., Grad. Sch. of Med. and Dent. Sci.) Purpose: Lactobacilli are predominant in the normal vaginal microbiota. Vaginal lactobacilli (VLB) spread from the mother to Aim: We investigated whether the complement C3 inhibitor Cp40 the infant during vaginal delivery. However, the effects of VLB on could block periodontitis and the quantitative and compositional infant intestinal function remain unclear. This study investigated changes of the microbiome in non-human primates. Materials the probiotic function of VLB and the immune effects of VLB on and Methods: Non-human primates with periodontitis were intra- human intestinal epithelia cells. Materials and methods: The gingivally injected with Cp40 followed by a 6-week follow-up period. VLB Lactobacillus (Lb.) acidophilus, Lb. crispatus, Lb. gasseri, Lb. Clinical periodontal examinations and collection of crevicular fluid jensenii, and Lb. vaginalis were obtained from the Japan Collection and biopsies of gingiva were performed at baseline and during the of Microorganisms (JCM). The INT-407 human embryonic intestinal study. Dental plaque was obtained from subgingival sites. Bacterial epithelial cell line was used in this study. Cytokine levels were genomic DNA was subjected to amplified 16sRNA of total bacteria or measured using enzyme-linked immunosorbent assay. Expressions P. gingivalis. Results: Cp40 caused a significant reduction in clinical of toll-like receptors (TLRs) on cells were determined using flow indices that measure periodontal inflammation, tissue destruction cytometry. Results and discussion: VLB survived the artificial or tooth mobility. These clinical changes were associated with gastric juice and adhered to INT-407 cells. Interleukin-8 produced significantly reduced levels of pro-inflammatory and bone-resorptive by INT-407 cells on LPS stimulation decreased with Lb. gasseri mediators. Administration of Cp40 could eliminate P. gingivalis alone, and Lb. crispatus. Moreover, TLR4 expression on INT-407 cells hence to lower the P. g /total bacteria ratio, could have an impact on LPS stimulation decreased with Lb. gasseri and Lb. crispatus. on microbiome. The protective effects of Cp40 persisted, albeit at These results suggest that VLB suppresses inflammation on LPS reduced efficacy, for at least six weeks following drug discontinuation. stimulation through the down-regulation of TLR4 expression in Conclusion: Cp40 can alter microbiome and inhibit pre-existing human intestinal epithelia cells. chronic periodontal inflammation and osteoclastogenesis in non- human primates. We postulated that Cp40 would be a candidate for the treatment of human periodontitis.

P1-151 マンノース結合レクチンのサルモネラの運動性 P1-152 Interferon gamma facilitates autolysosome に対する作用 formation in macrophages ○許 駿1，中村 修一2，Shafiqul Md. Islam2，Yijie Guo3，伊原 航平1， ○松澤 健志（大阪府大院・生命環境） 富岡 倫太郎1，増田 みづ紀1，米山 裕1，磯貝 恵美子1（1東北大・農・ 2 3 ○ 動物微生物， 東北大・工・応用物理， Dept. Immunobiol. Patho. Takeshi Matsuzawa (Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Biol., Sch. Med, Xi’an Jiaotong Univ.） Univ.) Mannose-binding lectin inhibits the motility of Salmonella Interferon-γ (IFN-γ), a main macrophage activator, enhances the by affecting driving force and chemotaxis bactericidal activity of macrophages. We have recently shown ○Jun Xu1, Shuichi Nakamura2, Shafiqul Md. Islam2, Yijie Guo3, Kohei that autophagy, the mechanism by which cellular self-components Ihara1, Rintaro Tomioka1, Mizuki Masuda1, Hiroshi Yoneyama1, Emiko are transported to lysosomes, is involved in the IFN-γ-mediated Isogai1 (1Dept. Anim. Microbiol., Grad. Sch. Agri., Tohoku Univ., 2Dept. bactericidal activity of macrophages. The aim of this study was to Appl. Phys., Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 3Dept. Immunobiol. elucidate the molecular mechanism of IFN-γ-mediated autophagy Patho. Biol., Sch. Med, Xi’an Jiaotong Univ.) activation by observation of autophagosomes and autolysosomes that are generated by the fusion of autophagosomes with lysosomes. Mannose-binding lectin (MBL) is a key substance in the lectin We examined whether IFN-γ promotes the maturation of pathway of complement system, an important part of innate autophagosomes to autolysosomes by using RFP-GFP tandem immunity. It is well known that MBL has the ability triggering fluorescent-tagged LC3, an autophagosome reporter, in RAW opsonization and then enhancing sequential immune process. In 264.7 cells. IFN-γ stimulation increased the number of both this study, we report an inhibitory effect of MBL on the motility autophagosomes and autolysosomes, and this phenotype was of pathogenic bacteria by affecting their energy source for motility blocked by the inhibition of autophagy. Lipopolysaccharides (LPS) and signaling pathway of chemotaxis. When Salmonella cells were also activate macrophages via Toll-like receptor 4. LPS stimulation treated with a physiological concentration of MBL, their motile induced the formation of autophagosomes, but not autolysosomes. fraction and free-swimming speed were decreased. Rotation assays These results suggest that IFN-γ facilitates not only autophagosome of a single flagellum showed that the flagellar rotation rate was formation, but also the subsequent maturation of autophagosomes significantly reduced by the addition of MBL. Measurements of the to autolysosomes. Lysosomes are the primary digestive organelles intracellular pH and membrane potential revealed that a driving in macrophages; hence, the IFN-γ-mediated autolysosome formation force for the Salmonella flagellum, an electrochemical potential may contribute to macrophage bactericidal activity. difference of proton, was affected by the addition of MBL. We also (In collaboration with E. Fujiwara and Y. Washi) found that the reversal frequency of Salmonella flagellar rotation was increased by MBL treatment, which relatively interfered with positive chemotaxis toward an attractive substrate. We thus propose that the motility inhibition effect of MBL can be secondarily involved in attack on pathogens, potentially assisting the primary role of MBL in complement system.

95 P1-153 Stretptococcus sanguinis 由来の過酸化水素 P1-154 異なる活性化経路をもつ 2 種類の IL-17A 産生 は好中球に NETs を誘導する γδ T 細胞が，肺炎桿菌による肺感染に対して重要な役割を ○住岡 龍一1,2，中田 匡宣1，和田 聖史1，岡橋 暢夫3，住友 倫子1，山 果たす 1 2 1 1 2 口 雅也 ，林 美加子 ，川端 重忠 （ 阪大院・歯・口腔細菌， 阪大院・ ○村上 哲晋1，畑野 晋也1，山田 久方1，岩倉 洋一郎2，吉開 泰信1 歯・保存，3阪大院・歯・フロンティア） （1九州大学・生体防御医学研究所・感染制御学分野，2東京理科大学・ 生命医科学研究所・実験動物学） Hydrogen peroxide produced from Stretptococcus sanguinis induces NET formation in human neutrophils Two types of IL-17A-producing γδ T cells are activated in ○Ryuichi Sumioka1,2, Masanobu Nakata1, Satoshi Wada1, Nobuo infection with Klebsiella pneumoniae Okahashi3, Tomoko Sumitomo1, Masaya Yamaguchi1, Mikako ○Tesshin Murakami1, Shinya Hatano1, Hisakata Yamada1, Yoichiro Hayashi2, Shigetada Kawabata1 (1Dept. Oral and Mol. Microbiol., Iwakura2, Yasunobu Yoshikai1 (1Div. Host Defense, Medical Institute Grad. Sch. of Dent., Osaka Univ., 2Dept. Resto. Dent. and Endodont., of Bioregulation, Kyushu Univ., 2Center for Animal Disease Models, Grad. Sch. of Dent., Osaka Univ., 3Center Frontier Oral Sci., Grad. Research Institute for Biomedical Sciences, Tokyo Univ. of Science) Sch. of Dent., Osaka Univ.) γδ T cells with effector functions to produce IL-17A develop in Streptococcus sanguinis は細菌性心内膜炎の病巣から高頻度に分離され，病 the early fetal thymus and exist more frequently in childhood than 態形成過程で血中における宿主免疫機構を回避するとともに，心組織へ定 adulthood. The ontogenic wave of IL-17A+γδ T cells would imply 着すると考えられる。S. sanguinis は，ピルビン酸オキシダーゼ（SpxB） a hypothesis that IL-17A+γδ T cells may play the more important によるピルビン酸の代謝過程で，過酸化水素を産生する。本研究では，S. role in protection against infections in the younger mice. To clarify が産生する過酸化水素が末梢血中と好中球感染時での菌体生存 sanguinis this hypothesis, we compared the roles of IL-17A+γδ T cells in と好中球の NETs 形成に及ぼす影響について検討した。 protection against pulmonary infection with Klebsiella pneumoniae S. sanguinis SK36 株を親株（WT）として，spxB 欠失株（KO）および復 帰変異株（Wr）を作製した。各菌株の過酸化水素産生量をペルオキシダー between childhood and adulthood in mice. Although IL-17A-/- mice ゼ反応と発色基質を用いて定量した結果，spxB の欠失により有意に減少 were susceptible against K. pneumoniae, regardless of age, Cγ-/-, V した。次に，健常ヒト末梢血もしくは好中球に各菌株を感染させ，経時的 γ4-/-6-/- or Vδ1-/- mice were more susceptible against K. pneumoniae に菌体生存率を算出すると，菌体生存率は spxB の欠失により有意に減少 in childhood. On the other hand, IL-23-/- mice were more susceptible した。各菌株の好中球に対する細胞毒性について LDH の遊離量を指標に in adulthood. IL-17A+ Vγ1-Vγ4- γδ T cells expressing canonical 比較したところ，spxB の欠失により細胞毒性は有意に低下した。感染好 Vγ6/Vδ1 genes were dominant in childhood. Interestingly, CD69 and 中球の DNA を DAPI もしくは SYTOX Green で蛍光染色した結果，WT も CD25, activation markers, were upregulated only on the Vγ6 γδ T しくは Wr 感染好中球で NETs 形成像が明瞭に観察された。感染好中球の cells during K. pneumoniae infection, while IL-23R was expressed 細胞外 DNA の蛍光染色を行い，NETs 形成量を検討したところ，KO 感染 only on Vγ4 T cells. There results suggest that the Vγ6 γδ T cells 時の NETs 形成量は，WT もしくは Wr 感染時と比較して，有意に減少した。 may be activated via TCR stimulation, while IL-17A+Vγ4 γδ T cells また，カタラーゼの添加により，WT もしくは Wr の感染時の NETs 形成 may be activated in bystander manner with IL-23. These results 量は KO 感染時と同等レベルまで減少した。さらに，感染好中球のヒスト highlight recapitulation of ontogenic wave of IL-17A+γδ T cells ンのシトルリン化は，spxB の欠失により抑制された。 in host defense and provide an insight for two distinct activation 以上の結果から，S. sanguinis 由来の過酸化水素は末梢血中および好中球 pathways of IL-17A+γδ T cells during bacterial infection. 存在下で菌体生存を有利にさせ，好中球に対して NETs を誘導することが 示唆された。

P1-155 肺炎クラミジア感染における宿主シグナル伝達 P1-156 グラム陰性菌 Acinetobacter baumannii と緑 機構 膿菌由来 LPS のヒトマスト細胞への影響 ○内記 良一，小松 孝行，小出 直樹（愛知医 感染・免疫） ○上田 たかね1，祖母井 庸之1，鴨志田 剛1，永川 茂1，中野 竜一2， 中野 章代2，斧 康雄1（1帝京大学・医・微生物，2奈良県医大・微生 A host signaling mechanism in Chlamydia pneumonia 物感染症） infection ○Yoshikazu Naiki, Takayuki Komatsu, Naoki Koide (Det. of Microbiol. Analysis of gene expression and cytokine production in Immunol, Aichi Med. Univ. Sch. Med.) Acinetobacter LPS-stimulated mast cells ○Takane Kikuchi-Ueda1, Tsuneyuki Ubagai1, Go Kamoshida1, Mily Chlamydia pneumoniae is the causative agent of respiratory Shigeru Tansho-Nagakawa1, Ryuichi Nakano2, Akiyo Nakano2, Yasuo tract infections and a number of chronic diseases. Here we Ono1 (1Dept. of Microbiol. Immunol., Sch. Med., Teikyo Univ., 2Dept. investigated the involvement of the common TLR adaptor molecule Microbiol. Infect. Dis., Nara Med., Univ.) MyD88 in host responses to C. pneumoniae-induced pneumonia in mice. MyD88-deficient mice were severely impaired in their ability to 【目的】マスト細胞は細菌感染において自然免疫・獲得免疫細 mount an acute early inflammatory response toward C. pneumoniae. 胞を動員する重要な感染防御細胞である。多剤耐性の緑膿菌 Although the bacterial burden in the lungs was comparable 5 days （MDRP）や Acinetobacter baumannii（A.b）は医療関連感染症の after infection, MyD88- deficient mice exhibited only minor signs 原因菌として注目され，今回 A.b 標準株 ATCC19606 と当院臨床 of pneumonia and reduced expression of inflammatory mediators. 分離株 MDRA より精製した LPS 刺激に対する LAD2 の応答を， MyD88-deficient mice were unable to up-regulate proinflammatory TNF-α，IL-8，CCL4 遺伝子発現変化と培養上清中 TNF-α，IL-8 cytokines and chemokines, demonstrated delayed recruitment of を定量し，生菌と LPS でのマスト細胞活性化を比較した。【方法】 CD8+ and CD4+ T cells to the lungs, and were unable to clear the LAD2 2 × 106 cells/ml を，ATCC19606，MDRA，PAO-1，MDRP， pathogen from their lungs at day 14. At day 14 the MyD88-deficent 各 LPS 種々の濃度で刺激後，total RNA を抽出し遺伝子発現解析 mice developed a severe, chronic lung inflammation with elevated を行った。培養上清中のサイトカインは CBA kit を用いて解析し IL-1α and IFN-γ leading to increased mortality, whereas wild-type た。【成績】TNF-α 遺伝子はどの LPS 刺激でも 8 倍，IL-8 は 1.6 mice as well as TLR2- or TLR4-deficient mice recovered from acute ～2 倍，CCL4 は 2 倍に増強していた。上清中サイトカイン量は pneumonia and did not show delayed bacterial clearance. Thus, どの LPS でも濃度が増量しても産生された TNF-α 量に有意な差 MyD88 is essential to recognize C. pneumoniae infection and initiate は認められなかったが ,ATCC19606 の LPS 刺激が最も高かった a prompt and effective immune host response against this organism （～8pg/ml）。しかし生菌刺激の 1/10 量（ 120～160 pg/ml）であり , leading to clearance of bacteria from infected lungs. マスト細胞からの TNF-α 産生は菌の直接的な接着刺激で放出さ れていることを示唆した。IL-8 は生菌刺激で～8 pg/ml であった が，LPS 刺激では（～30 pg/ml）が検出され，ATCC19606 由来 LPS が最も強く誘導していた。A.b は生菌，LPS のいずれでも緑 膿菌より炎症性サイトカイン誘導が強いことが示唆された。

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P1-157 Effects of macrolide antibiotics on Th1 cell P1-158 The effects of M. pneumoniae antigen and Th2 cell development mediated by Langerhans cells sensitization on follicular helper T cell differentiation ○松井 勝彦，池田 玲子（明治薬大・感染制御） ○蔵田 訓1，大崎 敬子1，米澤 英雄1，花輪 智子1，田口 晴彦2，神谷 茂1（1杏林大・医・感染症，2杏林大・保健・免疫） ○Katsuhiko Matsui, Reiko Ikeda (Dept. Microb. Sci. Host Def., Meiji Pharm. Univ.) ○Satoshi Kurata1, Takako Osaki1, Hideo Yonezawa1, Tomoko Hanawa1, Haruhiko Taguchi2, Shigeru Kamiya1 (1Dept. Infect. Dis., Objective: In this study, we investigated the effects of macrolide Kyorin Univ., Sch. Med., 2Dept. Immunol., Fac. Health Sci., Kyorin antibiotics on Th1 cell and Th2 cell development mediated by Univ.) Langerhans cells (LCs). Methods: LC-like dendritic cells (LDCs) were generated from mouse bone marrow cells and used as Mycoplasma pneumoniae is a common respiratory pathogen mainly in substitutes for LCs. Mice were primed with ovalbumin (OVA) children, and the participation of the excessive host immunoresponse peptide-pulsed LDCs, which had been treated with each macrolide is thought to be involved in M. pneumoniae pneumonia and the antibiotic, via the hind footpad. After 5 days, the cytokine response in pathogenic mechanisms of the extrapulmonary complications. the draining popliteal lymph nodes was investigated by ELISA. The Recent studies indicate that follicular helper T cell (Tfh cell) is the expression of cell surface molecules on LDCs was investigated using positive effector T cell, characterized by production of IL-21 and RT-PCR. Results: Administration of OVA peptide-pulsed LDCs, is implicated in the antibody production and onset of autoimmune which had been treated with josamycin or spiramycin, inhibited diseases. Furthermore, Treg cells have been reported to act on Th2 cell development as represented by down-regulation of IL-4 suppression of hyper immunoresponse, and T cell subsets except production as well as Th1 cell development represented by down- Th1, Th2 and Th17 cells were inferred to be involved in pathogenic regulation of IFN-γ production. This inhibition of Th1 cell and Th2 mechanisms of M. pneumoniae pneumonia and the various cell development was associated with suppression of CD86 and TIM- complications. 4 expression, respectively, in LDCs. Furthermore, S. aureus strains In this report, we established an experimental pneumonia mouse isolated from skin lesions of patients with atopic dermatitis (AD) model by the sensitization of M. pneumoniae sonicated antigens, were more susceptible to josamycin than spiramycin. Conclusion: and performed immunological analyses to examine the induction These results suggest that topical application of josamycin to AD mechanisms. In addition, we have examined the specificity of Tfh lesions colonized with S. aureus would be beneficial for control of AD cell inducibility by using mouse splenocyte. by acting on superficial S. aureus and epidermal LCs, and inhibiting The mRNA expression levels of IL-21 in the lung cells were the development of Th2 cells. increased by the high dose and high frequency of M. pneumoniae antigens sensitization in vivo. It was also shown that M. pneumoniae antigens induced IL-21 release from mouse splenocyte in vitro. These results suggest that the Tfh response is initiated by sensitization of M. pneumoniae antigens.

P1-159 Exosomes transmit inflammatory signal P1-160 多機能性糖脂質によるマクロファージ細胞外捕 between cells via the MyD88-dependent signal pathway 獲網形成機構の解明 ○矢倉 大介1，岡 真優子2，市川 寛1（1同志社大・院・生命医科，2京 ○小田 真隆，黒澤 美絵，土門 久哲，寺尾 豊（新大・院医歯・微生物） 都府立大・院・生命環境） Multifunctional glycolipid induced formation of METs in ○Daisuke Yakura1, Mayuko Osada-Oka2, Hiroshi Ichikawa1 (1Grad. 2 RAW264.7 cells Sch. of Life and Medi. Sci., Doshisha Univ., Grad. Sch. of Life and ○Masataka Oda, Mie Kurosawa, Hisanori Domon, Yutaka Terao (Div. Environ. Sci., Kyoto Pref. Univ.) Microbiol. Infect. Dis., Sch. Med. Dent. Sci., Niigata Univ.)

Backgrounds: Exosomes are small extracellular vesicles secreted 【目的】結核菌の細胞表層糖脂質をリード化合物とし，多機能 from various cells, and are enriched in various proteins and 性糖脂質（Vizantin）を化学合成した。その結果，先行研究で nucleotide. Recently, exosomes are considered as a mediator of Vizantin は，マクロファージ活性化作用および緑膿菌の感染拡大 cell-to-cell communication. In last year’s this meeting, we revealed 抑制作用等を示した。本研究では，Vizantin で処理したマクロ that the exosomes derived from viable, but not heat-inactivated, ファージから放出される細胞外捕獲網（METs）に着目し，その Escherichia coli -infected macrophages (Mφs) up-regulate production 形成メカニズムについて解析した。【方法・結果】Vizantin 添加 of inflammatory molecules in uninfected Mφ. However, it is unclear RAW264.7 細胞を Sytox orange，および Alexa488 ラベルカテリ about exosome-depended signal pathway. Here, we investigated how シジン抗菌ペプチド特異的抗体で染色したところ，細胞外に拡 exosomes transmit information. がる赤染された網状核酸と緑染されたカテリシジン抗菌ペプチ Methods: Exosomes (Ec-exo or none-exo) were purified from ドが重なり合って検鏡された。次に，網状核酸を主成分とする cultured-media of mouse RAW264.7 Mφs infected with or without E. METs を形成した細胞の生死について解析したところ，90% 以上 coli. After mouse bone marrow-derived Mφs from wild type (WT) or の METs 形成細胞において細胞死が認められなかった。そこで， MyD88 knockout (MyD88 KO) were incubated with exosomes, the まず核酸を有するミトコンドリアに注目し，MitoTracker red（ミ proteins and mRNA levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) トコンドリア特異的染色剤），Rhod2-AM（ミトコンドリア特異 and cyclooxygenase-2 (COX-2) are analyzed. 的カルシウムイオンプローブ），JC-1（ミトコンドリア膜電位測 Results: The increase in the expressions of iNOS by Ec-exo were 定用蛍光プローブ）で染色した RAW264.7 細胞に Vizantin を添加 suppressed by pretreatment of Proteinase K (ProK) in Ec-exo. し，共焦点レーザー顕微鏡でタイムラプス解析した。その結果， However, COX-2 expression was not increased by the EC-exo METs 形成細胞では，ミトコンドリア内カルシウムイオンの上昇， treated with ProK in the presence TritonX-100 only. Moreover, the 膜電位の低下，およびミトコンドリアの形態変化が認められた。 expressions of iNOS and COX-2 were not increased by Ec-exo in さらに，細胞外核酸を回収後，ミトコンドリア DNA 特異的 Atp6 MyD88 KO Mφs. These results suggest that proteins contained in および Nds1 の有無について PCR 解析を行ったところ，両遺伝 EC-exo transmit infection from infected-Mφ to uninfected Mφ via 子ともに存在が確認された。【結論】Vizantin を RAW264.7 細胞 MyD88-dependent signal pathway. に作用させると，ミトコンドリアにはカルシウムイオンの流入， および形態破壊が生じる。その後，ミトコンドリア由来の核酸 を METs として放出させることが示唆された。

97 P1-161（WS5-2） Vaccination with S. aureus P1-162 Protective effects of Vaccines against fibronectin binding domain of FnBPA induces IL-17A- Bordetella holmesii in a Mouse Model of Respiratory dependent protection Infection ○成田 浩司1,2，中根 明夫1（1弘前大・院医・感染生体防御，2弘前大・ ○齋藤 桃子1，大塚 菜緒3，蒲地 一成3，渡邉 峰雄1,2（1北里大・感染 院医・動物実験施設） 制御科学府，2北里大・生命研，3国立感染研）

○Kouji Narita1,2, Akio Nakane1 (1Depart. Microbiol. Immunol., Grad. ○Momoko Saito1, Nao Otsuka3, Kazunari Kamachi3, Mineo Sch. Med., Hirosaki Univ., 2Inst. Anim. Exp., Grad. Sch. Med., Watanabe1,2 (1Grad. Sch. Infect. Ctrl. Sci, Kitasato Univ., 2Kitasato Hirosaki Univ.) Inst. Life Sci., Kitasato Univ., 3Natl. Inst. Infect. Dis.)

Staphylococcus aureus is a leading cause of community-acquired and Bordetella holmesii has been mentioned as the third causative agent nosocomial infections. Fibronectin binding protein A (FnBPA) is a of whooping cough (pertussis). However, there is no effective fibrinogen, elastin and fibronectin binding adhesin and an important vaccine against B. holmesii so far. Previously, we demonstrated that virulence factor of S. aureus. Immunization with fibronectin binding vaccines prepared from whole-cells of B. holmesii (wBHVs) were domain of FnBPA has been reported to induce specific antibody protective against B. holmesii. In this study, we prepared an acellular production and to protect animals against S. aureus infection. vaccine (aBHV) prepared from a detoxified culture supernatant of B. However, the role of cytokines in the protective effect of the holmesii, and found that the vaccine was effective against B. holmesii. immunization has not been elucidated. In this study, we investigated Immuno-proteomics analysis demonstrated that sera from mice the role of cytokines induced by immunization with fibronectin immunized with the aBHV recognized several spots of proteins in binding domain of FnBPA (FnBPA541-870). Spleen cells of the the culture supernatant of B. holmesii. Peptide mass fingerprinting immunized mice produced a large amount of IL-17A but not IFN-γ revealed that most of the spots were proteolytic fragments of a BipA or IL-4. Immunization with FnBPA541-870 protected wild type mice homologue (BipA). We prepared aBHVs from culture supernatants of but not IL-17A deficient mice against systemic S. aureus infection. wild-type strain and a BipA-deficient mutant strain, and determined The bacterial number was reduced and IL-17A mRNA expression their protective potency against B. holmesii. The aBHV prepared was increased in the spleens and livers of the immunized mice. from the wild-type strain was effective against B. holmesii, however, While the CXCL1 and CXCL2 mRNA expression was increased and that prepared from the BipA-deficient mutant strain was ineffective, myeloperoxidase activity, an index of tissue neutrophil levels was suggesting importance of BipA in protection against B. holmesii. Our higher in the organs of FnBPA541-870-vaccinated mice than those in results clearly demonstrated that BipA was a dominant protective the non-vaccinated mice. These results suggest that immunization antigen of B. holmesii. A novel pertussis vaccine containing B. with FnBPA541-870 induces IL-17A producing cells, and IL-17A plays a holmesii BipA antigen should be developed to control whooping critical role in the protection against S. aureus systemic infection. cough due to not only Bordetella pertussis, but also B. holmesii.

P1-163 Protective effect against Listeria P1-164（WS5-5） 肺真菌症に対する樹状細胞ワクチ monocytogenes infection by excessively passive ン：肺で誘導される記憶型 T 細胞の解析 immunization ○上野 圭吾1，金子 幸弘2，金城 雄樹1（1国立感染研・真菌，2大阪市 ○浅野 クリスナ1，差波 拓志1，長内 理大1，廣瀬 昌平1，小野 久弥1， 立大院・医・細菌） 成田 浩司1，胡 東良2，中根 明夫1（1弘前大・院医・感染生体防御学， 2北里大学・獣医学部・人獣共通感染症学） Dendritic cell-based vaccine against fungal lung infection induces lung resident memory T-cells 1 1 1 ○ 1 2 1 1 Krisana Asano , Hiroshi Sashinami , Arihiro Osanai , Shouhei ○Keigo Ueno , Yukihiro Kaneko , Yuki Kinjo ( Dept. Chemother. 1 1 1 2 1 Hirose , Hisaya Ono , Kouji Narita , Dong-Liang Hu , Akio Nakane Mycoses. NIID, 2Dept. Bacteriol. Grad. Sch. Med. Osaka City Univ.) (1Depart. Microbiol. Immunol., Hirosaki Univ. Grad. Sch. Med., 2Lab. Zoonoses, Kitasato Univ. Sch. Vet. Med.) 【目的】病原性真菌 Cryptococcus gattii の主な侵入門戸は呼吸器で あり，肺や中枢神経系に病巣を形成する。本菌は病原性が強く， Listeria monocytogenes (LM) is an intracellular pathogen that causes 感染後に殆ど炎症を誘導しないことから本菌に対する感染防衛 listeriosis. Due to its intracellular niche, LM has evolved to limit 機構は殆ど不明である。本研究では，感染制御機構を明らかに immune recognitions and responses to infection. Low amounts of する目的で，樹状細胞（DC）ワクチンを開発し，その感染制御 antibodies (Abs) that are induced by infection are completely unable 効果と作用機序を解析した。 to protect a rechallenge infection with LM. However, monoclonal Ab 【方法】マウス骨髄由来の DC に莢膜欠損株の熱処理死菌を取り against the listeriolysin O (LLO) has been demonstrated to provide 込ませて DC ワクチンとし，感染前に 14 日間隔で 2 回静脈内投 protection by neutralizing LLO activity. In this study, several specific 与した。北米流行株 R265 を経気道感染させるモデルで，感染マ Abs against the virulence factors of LM were generated in the ウスの生存率や臓器内菌数を測定し，DC ワクチンの感染制御効 rabbits immunized with each recombinant protein. We demonstrated 果を評価した。また，感染前後における臓器中のサイトカイン that excessively passive immunization with Abs against Ami, 量や白血球数を測定し，DC ワクチンの免疫賦活作用を評価した。 internalin B, LLO and ActA could protect mice from listerial 【結果】DC ワクチン投与群では感染後の臓器内菌数や生存率は infection. The combination of Abs against LLO and ActA provided 有意に改善した。DC ワクチン投与群の肺では，IFNγ, IL-17A, the most protective effect. The bacterial load in the organs of listerial TNFα の産生が有意に増加し，病理解析の結果，菌体を閉じ込め infected mice and the bacterial number in the listerial infected るような多核巨細胞の形成も認めた。サイトカイン産生を伴う RAW264.7 cells significantly reduced by pre-administration with 感染制御効果は，DC ワクチン投与 2 ヶ月経過後に感染させた場 the combination of anti-LLO and -ActA Abs. We also confirmed that 合も同様に観察され，非感染状態の肺で記憶型 CD4 T 細胞の有 the anti-LLO Ab neutralized LLO activity and inhibited the bacterial 意な増加を認めた。 escape from the lysosomal compartments. Moreover, the anti-ActA 【考察】本菌の感染制御には，サイトカイン応答を伴う多核巨細 Ab suppressed actin tail formation and cell-to-cell spread. These 胞の形成が重要であると推察され，DC ワクチンにより肺で誘導 results suggest that the excessively passive immunization with LLO された記憶型 CD4 T 細胞は，ワクチン効果の持続性に関与して and ActA Abs can be use in controlling of LM infection. いる可能性が考えられた。 非会員共同研究者 : 浦井誠 , 宮崎義継（国立感染研真菌部 ), 清水 公徳（東京理科大基礎工学部生物工学科）

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P1-165 Seeking novel antigens against Bordetella P1-166 組換え結核菌抗原 MDP1 および DNA アジュバ pertussis infection ント G9.1 からなる結核ブースターワクチン候補の最適化の ○鈴木 孝一朗1,2，新澤 直明1，中村 佳司1，堀口 安彦1（1阪大微研・ 試み 2 分子細菌学， （一財）阪大微生物病研究会） ○前山 順一1，山崎 利雄1，山本 十糸子1,2，林 大介1,2，鈴木 史子3， 尾関 百合子4，伊保 澄子3,4，松本 壮吉4，山本 三郎1,2（1国立感染症研 ○ 1,2 1 1 Koichiro Suzuki , Naoaki Shinzawa , Keiji Nakamura , Yasuhiko 究所，2日本 研究所，3福井大学医学部，4新潟大学大学院医学研 1 1 2 BCG Horiguchi ( Dept. Mol. Bact., RIMD, Osaka Univ., The Research 究科） Foundation for Microbial Diseases of Osaka Univ.) Optimization of tuberculosis booster vaccine composed Bordetella pertussis causes whooping cough, a severe and prolonged of recombinant MDP1 and G9.1 as DNA adjuvant respiratory disease, resulting in substantial morbidity and mortality. ○Jun-ichi Maeyama1, Toshio Yamazaki1, Toshiko Yamamoto1,2, Recently, the number of whooping cough cases is increasing in Daisuke Hayashi1,2, Fumiko Suzuki3, Yuriko Ozeki4, Sumiko Iho3,4, many countries, despite high vaccine coverage. It is important Sohkichi Matsumoto4, Saburo Yamamoto1,2 (1Natl. Inst. Infec. Dis., that seeking novel protective antigens for B. pertussis, while many 2Japan BCG laboratory, 3Facl. Med. Sci., Univ. Fukui, 4Sch. Med., researchers were concerned that strains of B. pertussis is acclimated Niigata Univ.) to acellular pertussis vaccine (aP) by altering antigenicity. We previously developed a novel method termed in vivo expressed-tag 結核は世界人口の約 3 分の 1 が感染する重要な細菌感染症である。BCG immunoprecipitation (IVET-IP), which enables us to identify genes は唯一の結核予防ワクチンであるが，成人の肺結核発症への有効性は限定 expressed during infection in B. bronchiseptica, which is closely 的とされ，わが国では，その免疫が低下する 10 代半ばから老年にいたる related to B. pertussis. Using the method, we selected five genes 世代での発症が問題となっている。一方，現在も BCG を凌駕する新ワク of novel protective antigen candidates that were expressed in B. チンは実用化していない。ゆえに我々は，新規結核ワクチンとして，BCG bronchiseptica colonizing rats trachea. These five genes encode outer プライム免疫を前提として，その効果を増強し，成人期以降の低下した結 membrane proteins and are conserved in B. pertussis. To assess 核免疫を増強するブースターワクチンの開発を目指している。26 年度ま protective potency, we tested a cocktail of the five antigens in the でに組換え MDP1 を DNA アジュバント G9.1 と共に皮内投与されたモル intranasal murine challenge model. Immunization with the cocktail モットにおいて結核菌の噴霧感染に対する防御能が高いことを報告した。 conferred significant protection against B. pertussis infection in lungs 特に脾臓では，症状の顕著な改善が認められたが，肺での効果をより高め and trachea of mice. These results suggest that the five antigens るため，ワクチンの最適化を検討している。 could be potential components of a novel pertussis vaccine. BCG によるプライミングの有無を含め，投与方法，免疫期間，免疫間隔 および抗原アジュバント比等を変えてモルモットまたはマウスに組換え MDP1 と G9.1 を免疫し，それぞれに対する遅延型皮膚反応（DTH）を測 定した。 その結果，マウスにおいては，プライミング後のブースター免疫群では， 強い DTH が得られた。しかしながらプライミングのない場合，一定の DTH は認められたが，抗原アジュバント比の違いによって明確な DTH の 強度の差は認められなかった。一方，モルモットに気道投与した場合，強 い DTH が確認された。さらに機構解析のため免疫動物の細胞反応を調べ， ついで感染実験により有効性を確認する予定である。 会員外共同研究者：網康至，須崎百合子（国立感染研），後藤義孝（宮崎大学）

P1-167 蛋白・糖脂質ワクチンによる肺炎球菌感染防御 P1-168 膜画分を用いた Clostridium difficile 感染症 機構の解析 （CDI）ワクチンの in vivo 効果 ○仲原 真貴子1,2，水口 裕紀1，上野 圭吾1，金子 幸弘3，朴 貞玉4，明 ○妹尾 充敏1，岩城 正昭1，山本 明彦2，加藤 はる1，福田 靖1，柴山 田 幸宏4，川原 一芳5，大石 和徳1，金城 雄樹1（1国立感染症研究所， 恵吾1（1感染研・細菌2，2感染研・バイオ） 2早稲田大，3大阪市立大学，4大阪大学，5関東学院大学） Effect on in vivo experiments of vaccine for Clostridium Analysis of host defense against pneumococcal infection difficile infection using membrane fraction by pneumococcal protein/glycolipid vaccine ○Mitsutoshi Senoh1, Masaaki Iwaki1, Akihiko Yamamoto2, Haru Kato1, ○Makiko Nakahara1,2, Yuki Mizuguchi1, Keigo Ueno1, Yukihiro Tadashi Fukuda1, Keigo Shibayama1 (1Dept. Bacteriol. II, Natl. Inst. Kaneko3, Zhenyu Piao4, Yukihiro Akeda4, Kazuyoshi Kawahara5, Infect. Dis., 2Div. Bio-saf. Cont. Res., Natl. Inst. Infect. Dis.) Kazunori Oishi1, Yuki Kinjo1 (1Nat. Inst. Infect. Dis., 2Waseda Univ., 3Osaka City Univ., 4Osaka Univ., 5Kanto Gakuin Univ.) Clostridium difficile は，抗菌薬関連下痢症・腸炎の主要な原因菌 の 1 つである。その症状は軽度の下痢から消化管穿孔まで多岐 【目的】肺炎球菌は肺炎や髄膜炎の主な起炎菌である。現行肺炎 にわたり，死亡の直接原因となることもある。C. difficile 感染 球菌ワクチンは，90 種類以上の血清型のうち主な 13 種または 23 症（CDI）は医療関連感染としても重要であり，その感染予防に 種を含む。しかし，近年非ワクチン血清型による侵襲性感染症 は抗菌薬適正使用や接触予防策等が行われているものの容易で の割合が増加している。本研究では，血清型を超える感染予防効 はなく，新しいアプローチによる予防対策が必要とされている。 果をもたらすワクチン開発を目指し，肺炎球菌表層蛋白 PspA と CDI 症状は C. difficile の産生する毒素によって引き起こされるた NKT 細胞というリンパ球を活性化する糖脂質の経鼻ワクチンの め，トキソイドワクチンの使用が検討されているが，ホルマリ 肺炎球菌感染防御効果を解析した。【方法】蛋白・糖脂質ワクチ ンで無毒化したトキソイドは毒性復帰の可能性がある。そこで ンを経鼻投与した C57/BL6J マウスに肺炎球菌を感染させ，生存 我々は，C. difficile 菌株から膜画分を調製し，ワクチンとしての 率及び肺内菌数を解析した。本ワクチンによる抗体産生誘導を調 利用を試みた。培養細胞を用いた in vitro 実験を行った結果，C. べるため，免疫マウスの血漿及び気管支肺胞洗浄液中の抗原特異 difficile の膜画分を接種したマウスから得られた血清および腸液 的 IgG 抗体価を測定した。また，免疫血漿中 IgG 抗体による肺炎 で C. difficile 菌株を処理することにより，腸管上皮由来培養細胞 球菌への結合性を解析した。さらに，免疫血漿移入マウスに肺炎 Caco-2 への付着が阻害された。In vitro 実験においてワクチン効 球菌を感染させ，生存期間を観察した。【結果・考察】蛋白・糖脂 果が認められたことから，in vivo 実験を開始した。膜画分で免 質ワクチン群では，肺炎球菌感染後の有意な生存率上昇及び肺内 疫したマウスとコントロールマウスに C. difficile を経口投与し， 菌数減少を認めた。蛋白・糖脂質ワクチン群では血中及び気管支 腸管への付着数を調べたところ，免疫マウスの腸管付着数はコ 肺胞洗浄液中の抗原特異的 IgG 抗体価の上昇を認め，免疫血漿移 ントロールマウスの付着数に比べ，有意に減少していた。さら 入群では対照群と比較して生存率が有意に上昇した。さらに，免 に，ハムスターを用いて，免疫群とコントロール群における C. 疫血漿中の抗原特異的 IgG 抗体は非ワクチン血清型を含む複数の difficile の致死活性を比較したところ，死亡数に差が認められた。 肺炎球菌株に結合し，非ワクチン血清型の菌株の感染に対しても これらの結果から，C. difficile 膜画分が CDI ワクチンとして有用 感染防御効果をもたらした。本ワクチンは，抗原特異的 IgG 抗体 であることが示された。 産生を誘導することで血清型を超えた肺炎球菌感染防御効果をも たらす可能性が期待される。非会員共同研究者：大河内香代・酒 井 純・浦井 誠・井澤由衣奈・小野寺大志・高橋宜聖・宮崎義 継（感染研），竹山春子（早稲田大学）

99 P1-169（WS5-4） サルモネラ感染防御に関与する菌 P1-170 肺炎球菌表層タンパク質 A（PspA）を用いた 体成分の同定 肺炎球菌ワクチンの開発 ○江口 正浩，Marta Elsheimer Matulova，小川 洋介，下地 善弘（動 ○宮武 浩1,2,3,4，朴 貞玉1，西川 隆顕1，井上 雄嗣1，生田 和良1，古泉 衛研 細菌・寄生虫研究領域） ゆか2，明田 幸宏2，金城 雄樹3，大石 和徳4（1（一財）阪大微生物病 研究会，2大阪大学大学院医学系研究科，3国立感染症研究所真菌部第 The protective effect of an extract antigen from 三室，4国立感染症研究所感染症疫学センター） Salmonella ○Masahiro Eguchi, Marta Elsheimer Matulova, Yohsuke Ogawa, Pneumococcal surface protein A (PspA) based Yoshihiro Shimoji (Natl. Inst. Anim. Health, NARO) pneumococcal vaccine development ○Hiroshi Miyatake1,2,3,4, Zhenyu Piao1, Takaaki Nishikawa1, Yuji サルモネラはヒト，家畜などの腸管に感染し，食中毒を起こす Inoue1, Kazuyoshi Ikuta1, Yuka Koizumi2, Yukihiro Akeda2, Yuki Kinjo3, 人獣共通感染症の原因菌の一つである。サルモネラ感染に対す Kazunori Oishi4 (1Res. Found. for Micro. Dise. of Osaka Univ., 2Univ. る感染防御は細胞性免疫が優位であると考えられているが，我々 Hospital, Osaka Univ., 3Dept. Chemotherapy and Mycoses, NIID, を始め複数の研究グループがマウスモデルにおいて，液性免疫 4Infectious Disease Surveillance Center, NIID) 応答も感染防御に関与していることを報告している。これまで に，我々はサルモネラ感染防御に関与するモノクローナル抗体 Pneumococcal surface protein A (PspA) is highly immunogenic and （mAb）を作成した。しかしながら，作成した mAb は腹腔感染 can induce a protective immune responses against pneumococcal においては有意に感染防御能を示したが，経口感染において感 infection. All pneumococcal strains contain PspA as an exposed 染防御能は示さなかった。我々は，経口感染防御には複数の免 virulence factor, and it have been grouped into three families, 疫応答（免疫担当細胞）の作用が必須であると推測した。そこ Especially expressing family 1 or 2 PspA proteins constitute 98% of で，作成した mAb とサルモネラ特異的 CD8 陽性 T 細胞，mAb clinical isolates. とサルモネラ特異的 CD4 陽性 T 細胞をそれぞれマウスに移入し， Previously, we introduced our data on the evaluation of vaccine that その後，サルモネラを経口感染させたところ，mAb とサルモネ fusion form of PspA derived from two clades in the annual meeting ラ特異的 CD8 陽性 T 細胞を移入したマウスが有意に感染防御 of this society. The results showed that fusion C was the best を示すことを明らかにした。本研究では，経口感染モデルにお candidate as vaccine development. Here we aimed at developing a いて，感染防御能を示す菌体成分（抗原）の探索を行った。サ vaccine. To investigate the immunogenicity of the PspA fusion form ルモネラ抽出抗原を BALB/c マウス雌の皮下に免疫し，その後， vaccines, we subcutaneously immunized the C57/BL6j mice with Salmonella enterica serovar Typhimurium を 10LD50 経口感染させ the newly constructed fusion D plus adjuvant(alum)three times at 生存率及び各種組織の菌数を調べた。免疫したマウスは，サル weekly intervals. In consequence, vaccination with the fusion D モネラ経口感染に対して有意に感染防御を示した。現在，抗原 form exerted much more extensive efficacy against clades 1, 4 and の詳細な解析を実施している。以上の結果からサルモネラ抽出 5 than the fusion C form. We further compared the surface binding 抗原は，サルモネラ経口感染防御に関与することを明らかにし of anti-fusion C, D, and C&D to clinical isolates of S. pneumoniae by た。我々が明らかにした菌体成分は，新規の成分ワクチンとし flow cytometry. The anti-fusion C&D IgG was shown to be highly て応用ができるのではないかと考えている。 accessible to PspA broadly at the surface of the intact bacteria, 非会員研究協力者：Swarmistha Devi Aribam indicating that bivalent vaccine that PspA fusion proteins C&D constitutes an efficient immunization antigen candidate for future PspA-based anti-pneumococcal vaccine development.

P1-171 Quantitative study of humoral immune P1-172 赤痢菌の病原性発現機構にもとづいた，汎血清 response induced by oral recombinant L. lactis 型に作用するユニバーサル弱毒ワクチン候補株の開発 administration ○三戸部 治郎1，小泉 信夫1，志牟田 健1，Shiha Ritam2，Soma 2 2 2 1 ○矢野 歩1，高橋 圭太1，渡邊 詩織1，杉山 剛1，井上 直樹1，松西 優1， Mitra ，Dhrubajyoti Nag ，Hemanta Koley （ 細菌1・感染研， 2 森 祐介1，所 俊志1，Phillippe Langella2，Luis Bermudez-Humaran2 NICED India） （1岐阜薬大・薬・感染制御，2INRA Institite） Broad range immunization with an attenuated Shigella ○Ayumu Yano1, Keita Takahashi1, Shiori Watanabe1, Tsuyoshi mutant increasing virulence genes expression 1 1 1 1 Sugiyama , Naoki Inoue , Masaru Matunishi , Yhusuke Mori , ○Jiro Mitobe1, Nobuo Koizumi1, Ken Shimuta1, Shiha Ritam2, Soma 1 2 2 1 Shunji Tokoro , Phillippe Langella , Luis Bermudez-Humaran ( Lab. Mitra2, Dhrubajyoti Nag2, Hemanta Koley2 (1Dept. Bacteriol I, Nat. 2 Microbiol. Immunol., Gifu Pharm. Univ., INRA Institute) Inst. Infectious Diseases, 2Dept. Bacteriology, Nat. Inst. Cholera and Enteric Diseases (NICED), India) Most vaccines in use are administered with injection, which can induce systemic immune responses against pathogens, however, they 【目的】これまで様々な赤痢菌に対するワクチン候補が開発され have limitations in induction of mucosal immunity and, therefore, ている。これらの多くは病原遺伝子の一部を欠損させ弱毒化した in protection. On the other hand, mucosal immunization by oral and ものであるが，ワクチン株と同じ血清型の菌には効果があるも nasal administration, is expected to induce not only systemic but のの，血清型が異なる赤痢菌に対しては無効で，多様な血清群 also mucosal immune responses. To develop an efficient antigen- で構成される赤痢菌群のすべてに効果を示すワクチンは実用化 delivery vehicle for oral vaccines, recombinant DNA technologies for されていない。我々は，赤痢菌群に共通する病原蛋白の発現が Lactococcus lactis (L. lactis) have been developed, since it has safety 増加する一方，ストレス応答の低下で生存性が低下する変異体 profiles proven in human consumption. However, there are few prior を分離した。これが血清型を超えた防御効果を示すユニバーサ studies to establish the optimal conditions for the immunization. ル・ワクチンとして利用できないか調べるため，モルモットの In this study, we generated a L. lactis strain producing Staphyrococcus 腸管感染モデルを初めて開発したインド国立コレラ・腸管感染 aureus nuclease, administrated it orally into C3H/HeN mice, 症研究所（NICED）と共同研究を行った。【方法・結果】Shigella and quantified antigen (nuclease)-specific antibodies. For the flexneri 2a で作製したワクチン候補株，野生株および PBS を用い quantification of antibodies, neutralization of the nuclease activities てモルモットを免疫した。実験系として 1）眼球に免疫し角結膜 were measured by the fluorescent molecular beacon technology. 炎で評価するもの，2）経胃カテーテルで消化管を免疫し，腸管 8 Preliminary experiments demonstrated administration of 10 of the 感染で評価するもの，および 3）眼球の免疫後に腸管感染を評価 strain twice 3 days in a row by placing 2 weeks induced measurable する 3 つの系を行った。いずれの系でもワクチン候補株は病原 antibodies. Using this system, we are developing the optimized 性が減少し，血清型の異なる S. dysenteriae type1 および S. sonnei protocol for oral immunization. の接種による角結膜炎を完全に阻止し，腸管感染による死亡は 見られなかった。【考察】免疫された動物の血清を用いて赤痢菌 群を免疫染色したところ，ワクチン候補株とは血清型が異なる 複数の赤痢菌に反応する抗体が見出された。一方，この血清は 病原性プラスミドを欠落した菌には反応しないことから，赤痢 菌群に共通する病原蛋白に対する抗体ができていることが予想 された。

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P1-173 インターフェロン γ 産生 B 細胞は，ヘリコバ P1-174 脂肪細胞のアディポカイン発現に対するグラム クタースイス感染後の胃リンパ濾胞形成を誘導する 陰性桿菌由来リポ多糖の影響 ○山本 幸司，東 健（神戸大・医・消化器内科） ○海野 雄加，佐藤 義則，西田 智，永川 茂，鴨志田 剛，上田 たかね， 祖母井 庸之，斧 康雄（帝京大・医・微生物） IFNg-producing B cells induce the formation of gastric lymphoid follicles after H. suis infection The inflammatory adipokines were up-regulated by ○Koji Yamamoto, Takeshi Azuma (Dept. Gastroenterol. Sch. Med., Gram-negative LPS in 3T3-L1 adipocytes Kobe Univ.) ○Yuka Unno, Yoshinori Sato, Satoshi Nishida, Shigeru Nagakawa, go Kamoshida, Takane Ueda, Tsuneyuki Ubagai, Yasuo Ono (Dept. Helicobacter (H.) suis is a Gram-negative bacterium that colonizes Microbiol. Immunol., Sch. Med., Teikyo Univ.) the stomachs of various animals such as pigs and humans. It has been known that the gastric MALT lymphoma can be induced in 【目的】肥満はインスリン抵抗性を介して生活習慣病を誘導する 100% of mice after long-term H. suis infection. However, the detailed ために，肥満による生活習慣病誘発の分子メカニズムの解明は mechanism between the H. suis infection and the formation of gastric 非常に重要である。近年，高脂肪食負荷マウスでは，腸内のグ MALT lymphoma remains unclear. In this study, we demonstrated ラム陰性細菌由来のリポ多糖（LPS）が体内に移行した‘代謝 that the formation of gastric lymphoid follicles was induced in the 性エンドトキシン血症’が生じ脂肪組織に軽度炎症を起こすこ stomachs of suis-infected mice with the high expression of IFN-γ. So と，長期間の低濃度 LPS を投与されたマウスでは，肥満やイン far it is known that CD4+T cells are important for the development スリン抵抗性が誘発されることが明らかとなった。また最近の of lymphoid tissue. On the other hand, it has also been reported 薬剤耐性菌の蔓延はきわめて深刻であり，糖尿病や肥満患者の that IFN-γ is mainly produced by CD4+T cells, which is deeply 病巣に持続感染すると予想できる。そこで，グラム陰性桿菌と involved in the pathogenesis of gastritis and gastric cancer during 脂肪細胞とのクロストーク解析は重要であると考え，本研究で H. pylori infection. Interestingly, our present study found that the は多剤耐性 Acinetobacter baumannii（MDRA）由来 LPS を暴露さ production of IFN-γ from gastric B cells but not T cells was closely せた培養脂肪細胞の機能変化を解析した。【方法】3T3-L1 細胞 related to the development of lymphoid neogenesis in the stomachs は，化合物刺激により脂肪を蓄積した成熟脂肪細胞へと分化す of H. suis-infected mice. These findings suggest that B cell-produced る。この脂肪細胞を MDRA 由来 LPS に暴露させ，脂肪細胞内 IFN-γ is involved in the formation of gastric MALT lymphoma の遺伝子発現変化をリアルタイム PCR により解析した。【結果】 after Helicobacter infection. Therefore, using anti-IFN-γ antibody MDRA 由来 LPS で刺激した成熟脂肪細胞では，炎症性サイトカ to regulate IFN-γ production is expected to effectively inhibit the インである MIP-2 や IL-6，TNF-α だけでなく，走化性因子であ development of gastric MALT lymphomas and become a feasible る MCP-1 の mRNA 発現を顕著に増加した。また，脂肪細胞特有 therapeutic strategy for other various MALT lymphomas. の生理活性物質アディポカインである Leptin の mRNA 発現を顕 著に低下させ，FABP4 の mRNA 発現を増加させた。【結論】生 体内最大の内分泌器官である脂肪組織は，持続感染することが 多い多剤耐性菌やその菌体成分によって炎症性サイトカインの 産生や好中球の集積を促進するように作用することが明らかと なった。

P1-175 Effects of an anti-lipopolysaccharide P1-176 Rab35 regulates the ubiquitin-binding antibody on Salmonella Typhimurium adaptor protein NDP52 in selective antibacterial ○Marta Elsheimer Matulova，小川 洋介，下地 善弘，江口 正浩（動 autophagy 衛研 細菌・寄生虫研究領域） ○野澤 敦子，野澤 孝志，中川 一路（京大院・医・微生物） ○Marta Elsheimer Matulova, Yohsuke Ogawa, Yoshihiro Shimoji, ○Atsuko Nozawa, Takashi Nozawa, Ichiro Nakagawa (Dept. Masahiro Eguchi (Natl. Inst. Anim. Health, NARO) Micribiol., Grad. Sch. Med., Kyoto Univ.)

Salmonella enterica is one of the most common causative agents Autophagy is an innate immune defense against bacterial invasion. of gastroenteritis and systemic infections worldwide. As the role Recent studies show that adaptor protein, NDP52, is required of antibodies in immunity against Salmonella is not clear and often for autophagy of the bacterial pathogens, including Group A controversial, we studied interactions between S. Typhimurium streptococcus (GAS). NDP52 directly binds to ubiquitin-coated and a monoclonal antibody (mAb) raised against its major antigen bacteria and LC3 to facilitate the autophagosome formation. - lipopolysaccharide (LPS). This mAb was able to protect mice However, the machinery that regulates the recruitment of NDP52 against challenge and thus we next analyzed its function in bigger to invaded bacteria is not known. Here we show that Rab35 and detail in vitro. The mAb was agglutinating S. Typhimurium, which TBC1D10A, one of the Rab35 GTP-activating proteins (GAP), play affected bacterial swimming in a 0.3% agar and viability in a WST- a crucial role in the targeting of NDP52 and subsequent autophagic 1 cell proliferation test. Surprisingly, electron microscopy revealed degradation of GAS. We find that GAP activity of TBC1D10A changes in the outer membrane, indicating that other mechanisms negatively regulates the recruitment of NDP52 to GAS, and the than agglutination might be involved in effects of mAb in vitro. autophagosome formation. Rab35 is also required for the recruitment Therefore we analyzed gene expression in Custom Salmonella 8x15K of NDP52 to GAS and the autophagosome formation. Both Microarrays (Agilent). Adding mAb to S. Typhimurium suspension knockdown of Rab35 and overexpression of TBC1D10A increased led to an up-regulation of genes involved in amino acid metabolism, the number of intracellular GAS. In addition, we identified Rab35 as LPS synthesis and a gene aceK, which is responsible for bypassing an NDP52-binding partner. Taken together, we conclude that Rab35 the Krebs cycle via the glyoxylate shunt. Our results suggest that and TBC1D10A regulate recruitment of NDP52 to invaded GAS for LPS-binding antibodies might substantially change bacterial surface selective antibacterial autophagy. structures and metabolism, although further studies are needed to uncover the underlying mechanisms. Collaborators: Swarmistha Devi Aribam and Tomoyuki Harada

101 P1-177 Escherichia albertii の同定における大腸菌 P1-178 国内 EHEC 食中毒事件患者の糞便中志賀毒素 cdt-II 遺伝子の有用性に関する検討 濃度の解析 ○市村 秀俊1，日根野谷 淳1,2，安田 憲朋2，八柳 潤3，山崎 伸二1,2 ○山崎 栄樹1，綿引 正則2，磯辺 順子2，佐多 徹太郎2，倉園 久生1 （1大阪府大・生命環境，2大阪府大院・生命環境，3秋田県健康環境セ （1帯畜大・畜産衛生学，2富山県衛生研究所） ンター） Quantitative detection of Shiga toxins directly from stool Evaluation of E. coli cdt-II genes as reliable genetic specimens of EHEC outbreak in Japan markers to identify Escherichia albertii ○Eiki Yamasaki1, Masanori Watahiki2, Junko Isobe2, Tetsutaro Sata2, ○Hidetoshi Ichimura1, Atsushi Hinenoya1,2, Noritomo Yasuda2, Jun Hisao Kurazono1 (1Dept. Anim. Food Hyg., Obihiro Univ., 2Toyama Yatsuyanagi3, Shinji Yamasaki1,2 (1Sch. Life Env. Sci., Osaka Pref. Institute of Health) Univ., 2Grad. Sch. Life Env. Sci., Osaka Pref. Univ., 3Akita Res. Ctr. Pub. Health Env.) Detection of Shiga toxins (Stx) is important for accurate diagnosis of Enterohemorrhagic Escherichia coli infection. In this study, we Escherichia albertii (Ea) is an emerging enteropathogen closely quantitatively analyzed Stx protein in 9 patient stools during an related to E. coli (Ec). Ea has been isolated from diarrheal patients, outbreak that occurred in Japan. Highly sensitive immunoassay cases of food poisoning, dead birds, etc. In Japan, outbreaks associated (bead enzyme-linked immunosorbent assay: bead-ELISA) revealed with Ea have been reported by Ooka et al. Brandal et al. have lately that the concentrations of toxins in stool of patients ranged from reported the isolation of an stx2a (Shiga-toxin 2 variant a) gene- 0.71 to 10.44 ng/ml for Stx1 and 2.75 to 51.61 ng/ml for Stx2. To positive Ea strain from a patient with bloody diarrhea, suggesting our knowledge, this is the first report that reveals the range of Stx that Ea has a potential to cause severe symptoms in humans, like protein concentrations in human stools. those of enterohemorrhagic Ec. Therefore, it is vital to monitor Ea infection. However, this is exceedingly difficult due to the lack of a simple, rapid, and established method to detect and identify Ea strains, and differentiate Ea from Ec. It has been reported that Ea possesses cytolethal distending toxin (cdt) genes nearly identical to Ec cdt-II genes. We have recently reported that a cdt-II gene-positive Ec (CTEC-II) is indeed Ea when examined by both biochemical tests and multi-locus sequence analysis (MLSA). In this study, we attempted to re-identify 17 eae gene-positive Ec strains to see if they contain Ec cdt-II genes and are Ea by biochemical tests and MLSA. We found that all the strains contained Ec cdt-II genes and were re-identified to be Ea. Here, we show Ec cdt-II genes as reliable genetic markers of Ea, and a novel PCR- based method targeting Ec cdt-II genes to identify Ea strains.

P1-179 全ゲノム配列を用いた腸管出血性大腸菌 O121 P1-180 ゲノム SNPs 検出を利用した簡易 PCR 法によ の散在的集団感染事例の解析 る豚丹毒菌生ワクチン株の同定 ○李 謙一1，石 原 朋子1，伊豫田 淳1，小 椋 義俊2，林 哲也2，関 塚 剛史3， ○小川 洋介1，江口 正浩1，楠本 正博1，下地 善弘1,2（1動衛研 細菌・ 黒田 誠3，大西 真1，Working Group EHEC4（1感染研・細菌1，2九州 寄生虫研究領域，2東京理科大 生命医科学研） 大院・医・細菌，3感染研・ゲノム，4地方衛生研究所） An SNP-based PCR assay for rapid identification of a Diffuse outbreak investigation in enterohemorrhagic vaccine strain of Erysipelothrix rhusiopathiae Escherichia coli O121 by whole genome sequence ○Yohsuke Ogawa1, Masahiro Eguchi1, Masahiro Kusumoto1, ○Ken-ichi Lee1, Tomoko Morita-Ishihara1, Sunao Iyoda1, Yoshitoshi Yoshihiro Shimoji1,2 (1Natl. Inst. Anim. Health, NARO, 2Research Inst. Ogura2, Tetsuya Hayashi2, Tsuyoshi Sekizuka3, Makoto Kuroda3, Makoto for Biomedical Sciences, Tokyo Univ. of Science) Ohnishi1, Working Group EHEC4 (1Dept. Bacteriol I, Natl. Inst. Infec. Dis., 2Dept. Bacteriol., Sch. Med., Kyushu Univ., 3Pathogen Genomics 【背景および目的】細菌を株レベルで識別する方法は，感染症の Center, Natl. Inst. Infec. Dis., 4Local Public Health Institutes in Japan) 疫学解析に極めて有用である。豚の感染症である豚丹毒を予防 する生ワクチンは，現在，Koganei 65-0.15 株（血清型 1a）（ 以 国内で分離される腸管出血性大腸菌（EHEC）のうち，O157， 下，Koganei 株）が使用されている。Koganei 株は，アクリフラ O26，O111（3 大 O 群）以外の O 群では，パルスフィールド ビン色素耐性の弱毒株であるが，弱毒化の機構は不明であり遺 ゲル電気泳動（PFGE）法での菌株間比較解析が一般的な gold 伝子マーカーを持たない。今回，ゲノム上の一塩基多型（SNPs） standard である。これまでの PFGE 法を用いた我々の解析から， を検出することで，Koganei 株と野外臨床株とを識別できる簡易 3 大 O 群と同様，血清群 O121 の EHEC においても，散在的か PCR 法の開発を行った。 つ広域に発生している集団感染事例（いわゆる diffuse outbreak） 【方法】Koganei 株のゲノムドラフト配列と Fujisawa 株（血清型 が見いだされることが明らかとなっている。一方，EHEC O121 1a）の全ゲノム配列との比較解析から，両者間で異なる SNPs を は PFGE 型の多様性が低く，菌株間の比較解析には注意を要する。 同定した。同定された 76 個のうち，ランダムに選択した 6 箇所 2014 年末頃から 2015 年にかけて，我々は PFGE 型が類似した の SNPs をターゲットとして 6 つの PCR プライマーセットをデ O121 の diffuse outbreak 発生を捉えた。そこで，PFGE 解析の補 ザインした。プライマーの特異性の検討は，最初に Fujisawa 株 助的手段として PFGE 型が一致あるいは類似した菌株について， と Koganei 株との比較で行い，次に臨床分離株を用いて確認した。 次世代シークエンサー（Illumina Miseq）を用いた全ゲノム配列 【結果および考察】Koganei 株の DNA のみを増幅することができ 比較解析法の構築を試みた。一塩基置換（SNP）解析のためのパ た 5 つのプライマーセットの特異性について臨床分離株を用い イプラインを確立し，diffuse outbreak が疑われる O121 を中心と て確認したところ，Imada ら（J. Cli. Microbiol., 2004）が Koganei した計 44 株の SNP 解析を行ったところ，PFGE 型の完全一致株 株と推定した 9 株と，疫学情報から Koganei 株と推定された病性 を含む 23 株では SNP 数が 0–7 個となって同一クラスターを形成 鑑定依頼 10 株は 5 つのプライマーセットのすべてで陽性であり， し，その他の株（SNP 数は 50 個以上が大部分）とは明確に区別 他の臨床分離株ではすべて陰性であったことから，本 PCR 法は が可能となることが判明した。さらに，これら SNP 解析による Koganei 株を特異的かつ迅速に同定することができる方法として 同一クラスターに特異的な配列（最大で 18 kb）を，非近縁株へ 利用できることが判明した。本法は他の病原体の SNPs を簡単に のマッピング結果から抽出することで，これらの PCR による簡 検出するための方法としても応用可能であると思われる。 易スクリーニング系を構築することが可能となった。以上の結 会員外協力者：白岩和真 果を基に，次世代シークエンサーを用いた全ゲノム配列解析に よる EHEC の分子疫学的解析手法について議論したい。

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P1-181 長期観察している抗酸菌症患者から得られた経 P1-182 つつが虫病リケッチア感染細胞を抗原とした 時的分離株の遺伝子解析 ELISA 法の開発 ○有川 健太郎1，岩 本 朋忠1，西 内 由紀子2（1神戸市環保研・感染症部， ○小川 基彦，佐藤 正明，西條 政幸，安藤 秀二（国立感染症研究所・ 2大阪市大・医・刀根山結研） ウイルス第一部）

Genetic analysis of sequential mycobacterial isolates Development of scrub typhus-ELISA using antigens of obtained from long-term observed patients Orinetia tsutsugamushi-infected cells ○Kentaro Arikawa1, Tomotada Iwamoto1, Yukiko Nisiuchi2 (1Dept. ○Motohiko Ogawa, Masaaki Satoh, Masayuki Saijo, Shuji Ando (Dept. Infec. Dis., Kobe Inst. Heal., 2Toneyama Inst. Tuberculosis Res., Virology I, National Institute of Infectious Diseases) Osaka City Uni. Med. Sch.) 【目的】わが国では，つつが虫病の血清診断の標準法は，間接蛍 【目的】近年，患者数が急増している肺 Mycobacterium avium- 光抗体（IF）法である。しかし，結果の判定が主観的なため，判 intracellulare complex（MAC）症は難治性で慢性に推移すること 定者によりばらつきがみられることが問題とされている。そこ が知られているが，なかでも 10 年以上にわたって病状が変化し で，本研究では，結果が数値化される血清診断法として ELISA ない安定症例や，徐々に進行して悪化する症例（進行症例）があ 法を検討した。【方法】つつが虫病リケッチア（以下，Ots）感 る。我々は MAC 症の起因菌である M. avium subsp. hominissuis 染 L-929 細胞を抗原として，75 cm2 のフラスコ 1 本分を 1 ml の （MAH）の遺伝子型別法として，19 領域の反復配列数多型解析 2% TritonX114 溶液で可溶化し，PBS で希釈後プレートにコー （VNTR：Variable Numbers of Tandem Repeats）が有効であるこ ティングした。Ots には，標準的な 5 血清型（Kt，Kp，G，Kr， とを報告している。そこで本研究では MAH の生体内での微小進 Kw 株）を用いた。また MOCK として非感染細胞を用いた。血 化および多クローン感染を解析する目的で長期観察している肺 清には，つつが虫病患者 19 ペア血清，非患者 18 ペア血清，紅 MAC 症患者の経時的な喀痰分離株について VNTR 分析を行い解 斑熱患者 9 ペア血清および発疹熱患者 3 ペア血清を用いて，一 析した。 般的な ELISA 法により行った。【結果と考察】非患者血清の 【方法】肺 MAC 症患者の中から 2～8 年にわたり経時的に喀痰 ELISA 抗体価の平均 +3，5 および 7 標準偏差（Av+3，5，7SD） 分離株が得られた 13 進行症例 , 10 安定症例の計 76 株について， をカ cut off 値として検討したところ，つつが虫病患者血清は， 19 領域の VNTR 解析を行った。 Av+3SD のとき最も陽性率が高く，IF 抗体価との一致率も高かっ 【結果】MAH 症 23 症例 76 株中 VNTR の各領域で増幅しなかっ た。しかし，ELISA と IF の結果が，IgM でおよそ 25% および た 1 症例 5 株を除く 22 症例 71 株を対象に解析した。このうち IgG でおよそ 40% が一致しなかった。そこで，各患者で ELISA 観察期間中，単一クローン株のみが継続して検出された症例は 抗体価が最も高かった株（推定感染株）に対する抗体価を検討 17 例であり，治療の有無にかかわらず，ヒト体内での長期にわ したところ，IgM で 100% および IgG で 97.4% の一致率となった。 たるクローナリティーの安定性が認められた。一方，未治療で また，ELISA 法による血清診断基準を IgM>Av+3SD and/or ペア 経過観察されている安定症例 9 例のうち 3 例は複数株に感染し 血清で 4 倍以上の抗体価の上昇と定めると，患者すべてが陽性 ており，観察期間中の菌株のポピュレーション変化も認められ と診断され，IF 法による診断と 100% 一致した。また，紅斑熱 た。経過観察中の菌株の変化には留意するべきであり，VNTR および発疹熱患者血清は，一部に低い IgM 抗体価が認められた はその簡便な検出法として有用であることが確認された。 が，ペア血清による判定を行うことで，交差反応による偽陽性 を排除できた。以上から，今回開発した ELISA 法は実用的であ ることが示された。

P1-183 Improved laboratory diagnosis of cat- P1-184 空中浮遊菌サンプラーを用いた非結核性抗酸菌 scratch disease by a combination of serology and PCR の分離検出 on blood ○平井 一行1，下村 裕史2，伊奈田 宏康1，出屋敷 喜宏1，平井 義一2,3 1 2 3 ○柳原 正志，常岡 英弘（山口大院・医・保・生体情報検査学） （ 鈴鹿医療科学大学・薬学部， 自治医科大学・細菌学部門， 玉野総 合医療専門学校） ○Masashi Yanagihara, Hidehiro Tsuneoka (Dept. Lab. Sci., Fac. Health Sci., Grad. Sch. Med., Yamaguchi Univ.) Detection of nontuberculous mycobacterium in aerosols ○Kazuyuki Hirai1, Hirofumi Shimomura2, Hiroyasu Inada1, Yoshihiro Because isolation of Bartonella henselae by culture is very difficult, Deyashiki1, Yoshikazu Hirai2,3 (1Suzuka Univ. of Med. Sci., 2Div. of the laboratory diagnosis of cat-scratch disease (CSD) utilizes Bacteriology, Jichi Medical Univ., 3Tamano Inst. of Health and Human serological tests and/or detection of B. henselae DNA from the Services) lymph node or other specimens by PCR. However, it is not always necessary (or feasible) to perform a lymphadenectomy or biopsy 【目的】医療の高度化，並びに高齢化による免疫抵抗減弱者の増 (except for draining the pus), both of which are painful and invasive 加に伴い，非結核性抗酸菌（NTM）感染者数は世界的に増加傾 procedures, since most patients with CSD are children and an 向にあり問題となっている。NTM は結核菌と異なり，ヒト－ヒ antibiotic therapy is effective. Isolation of B. henselae DNA from ト感染はなく，環境から感染する。家庭内，病院内の主な感染 the blood of patients with CSD has been reported sporadically. To 経路としては水を介する系が強く疑われおり，エアロゾルが発 confirm the clinical utility of a serological test coupled with detection 生するシャワーは大きな感染要因と考えられる。我々は，これ of B. henselae DNA from the blood, we investigated 80 suspected までに NTM 分離検出法として，低濃度シュウ酸処理による培養 cases of CSD by using an indirect fluorescence antibody assay (IFA) 検出法の結果を報告してきた。この検出法を応用して，シャワー and real-time PCR (RT-PCR) assay on blood. Results indicated that 時におけるエアロゾルサンプルよりの NTM 分離を検討したので 17 (21.3%) and 11 (13.8%) patients were CSD positive by IFA and 報告する。 RT-PCR, respectively. Six of them were positive by both IFA and RT- 【方法】病院と一般家庭の浴室よりサンプルを採取した。エアロ PCR. Altogether, 22 of 80 (27.5%) patients were positive for CSD. ゾルに関しては，空中浮遊菌サンプラーを用いて，50L のエアー The combined use of both assays improved the sensitivity because を採取した。エアロゾル，シャワーヘッド表面，採水サンプル B. henselae DNA was detected from the blood of 7.9% (5/63) patients を 0.1%, 0.5% 濃度のシュウ酸で処理を行い，メンブレン吸引濾 who were seronegative for CSD. For the non-invasive laboratory 過により集菌した。中和処理後，メンブレンを 33°C にて 7H11 diagnosis of CSD, a combination of serological test and RT-PCR on 培地で培養した。迅速発育型 NTM については 1 週間培養後に確 blood is recommended to provide a prompt diagnosis and appropriate 認し，遅発育型については 1 ヶ月間培養後に確認した。 therapy. 【結果・考察】エアロゾルサンプルに関して，真菌のコンタミは ほとんど無く，NTM を分離検出することが出来た。採水サンプ ルにて NTM 汚染度の高い浴室では，エアロゾルサンプルにおい ても NTM が検出された。シャワーの使用が，日常的に NTM と 接触する機会になっていることが示唆された。今後は，蛇口・シャ ワーヘッドの交換前後による NTM の汚染状況の比較を行い，病 院等の浴室環境整備の参考にしていきたいと考えている。

103 P1-185 MALDI-TOF MS による迅速スクリーニングの P1-186 核酸クロマトグラフィ STH-PAS 法を用いた ための微生物および生育培養液を対象とした迅速検出 SNPs 検出法の構築 ○藤浪 良仁，武藤 淳二，水野 なつ子（科学警察研究所） ○小寺 拓也1，伊藤 隆広2，川瀬 三雄2（1株式会社 TBA，2東北大院・ 医工） Rapid detection of microorganism and growth culture medium by MALDI-TOF MS analysis Construction of SNPs detection method by STH-PAS 1 2 2 1 2 ○Yoshihito Fujinami, Junji Hosokawa-Muto, Natsuko Mizuno ○Takuya Kodera , Takahiro Ito , Mitsuo Kawase ( TBA. Ltd., Grad. (National Research Inst. of Police Sci.) Sch., Biomed. Eng., Tohoku Univ.)

【目的】我が国では過去に炭疽菌培養液の散布を行った事案が前 核酸クロマトグラフィの一種である STH-PAS 法は，DNA 検出技 例として存在する。未知資料からの病原体の絞り込みが望まれ 術である STH 法（Single Tag Hybridization）とその検出用クロマ ているが，サンプルとしては病原体を含む培養液，芽胞など種々 トストリップである PAS（Printed Array Strip）を併用した遺伝 のものが想定される。そこで今回我々は未知資料中の微生物を同 子検査ツールである。STH-PAS 法の DNA 検出原理は次の 3 つ 定するための迅速スクリーニングとして，様々な純培養微生物 の工程から成り，PCR などにより増幅させた遺伝子を迅速に目 あるいは微生物の培養液を対象に MALDI-TOF MS のマススペク 視で検出することができる。（1）一本鎖 DNA（タグ DNA）を付 トル検出を試みた。【実験方法】細菌として B. anthracis Pasteur 加したプライマ及びビオチンを付加したプライマを用いてター II，Y. pestis P3-417，C. botulinum Lamanna（Type B）等，真菌と ゲット遺伝子を増幅する，（2）増幅産物にアビジン付加着色ビー して A. brasiliensis NBRC9455 等 9 株，および γphage を使用した。 ズを加えターゲット遺伝子を標識する，（3）タグ DNA と相補な 培地は，寒天培地および液体培地を使用した。菌体は純培養で 一本鎖 DNA（キャプチャータグ DNA）がライン状に固定化して 寒天培地上に生じるコロニーを集菌し，芽胞は遠心分離法によ ある PAS に増幅産物を展開することでタグ DNA とキャプチャー り滅菌水で精製した。γphage の培養は B. cereus ATCC4342 を用 タグ DNA の会合が起こり PAS 検出ラインを呈色させる。本研究 いて行った。菌体抽出法は菌体を 1% TFA に懸濁し，ビーズ破 では，PAS による一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphisms: 砕したものを抽出液とした。培養液に対しては，得られた抽出 SNPs）の検出を可能にするために STH-PAS 法を応用し，増幅 液は遠心分離後の上清を無菌濾過した。これらを測定範囲 m/z 遺伝子産物の内部配列を認識・検出する Probe-STH 法の構築を 1,000-10,000 に限定し MALDI-TOF MS で解析を行った。【結果及 おこなった。モデル系としてプラスミド pUC18 にコードされた び考察】細菌，真菌の菌体については，それぞれ異なる MALDI- アンピシリン耐性遺伝子のうち設定した増幅領域 200 bp を検査 TOF MS のマススペクトルが得られた。培養液については C. 対象とし，変異のない野生型と増幅領域に一塩基の変異を導入 botulinum において，培養前と培養後のマススペクトルを比較す した変異型の鋳型 DNA を調製した。変異を導入した塩基の周辺 ると，培養することで発生する分子群と思われるマススペクト 配列から野生型と変異型の DNA プローブを設計し，それぞれの ル変化が観察された。さらに γ ファージに感染した ATCC4342 DNA プローブに異なるタグ DNA を付加した。DNA プローブを 株の培養液において，ファージ本体に由来すると思われるピー あらかじめ PCR 反応に加えておくことで増幅したターゲット遺 クが観察されたことから，ウイルス含有培養液にも適用できる 伝子と DNA プローブを PCR 反応の最終工程で会合させ，反応 ことが示唆された。 後に展開液を加え PAS に展開するだけで検出することを試みた 結果，一つの反応系で一塩基の違いを型別に検出することが可 能であった。

P1-187 LAMP 法を用いた膣スメア検体からの P1-188 馬パラチフス血清学的検査における DTT-MAT Gardnerella vaginalis の検出 の有用性 ○東出 誠司1，張 音実1，荻島 大貴2，杉田 隆1（1明薬大・薬・微生物， ○高橋 弘康1，丹羽 秀和2，八木 梓1，信本 聖子1，片山 芳也2，松田 2順天大・医・産婦人科） 芳和3，安斉 了4（1北海道十勝家保，2JRA 総研，3JRA・馬事部， 4JRA） Detection of Gardnerella vaginalis in vaginal smear specimens using a LAMP method The utility of microplate agglutination test using DTT in a ○Satoshi Higashide1, Otomi Cho1, Daiki Ogishima2, Takashi Sugita1 serological test of equine paratyphoid (1Dept. Microbiol., Meiji Pharm. Univ., 2Dept. Ob-Gyn, Juntendo Univ. ○Hiroyasu Takahashi1, Hidekazu Niwa2, Azusa Yagi1, Kiyoko Nerima Hosp.) Nobumoto1, Yoshinari Katayama2, Yoshikazu Matuda3, Toru Anzai4 (1Tokachi Livestock Hygiene Service Center, 2 Equine Research Introduction: Gardnerella vaginalis causes bacterial vaginosis (BV), Institute, Japan Racing Association, 3Equine Department, Japan a risk factor for premature birth. Therefore, rapid, accurate detection Racing Association, 4Japan Racing Association) methods are required for BV diagnosis. This study developed a molecular detection system for G. vaginalis using a loop-mediated 【背景と目的】馬パラチフスは，馬に流産等を引き起こすサルモネラ感染 isothermal amplification (LAMP) method. 症である。保菌馬の摘発には，菌の特性上培養が困難なため，血清学的 Materials and Methods: LAMP primers were designed from the G. 検査が用いられている。血清学的検査には，マイクロ凝集反応法（MAT） vaginalis 23S rRNA gene using PrimerExplorer ver. 4. Using LAMP, があり，2－メルカプトエタノール（2ME）処理により IgM を分解・除去 nucleic acids were amplified at a constant temperature of 65°C. For した MAT も報告されている。本研究では，2ME の作用に着目し，同じ作 comparison, real-time polymerase chain reaction (PCR) targeting 用を有し毒性の低いジチオスレイトール（DTT）を用いた MAT（DTT-MAT） cpn60 was carried out. Vaginal smears were obtained from 13 の有用性を検討した。【材料と方法】本病発生馬群の経過血清 239 検体（実 patients with threatened premature delivery and 60 healthy women. 29 頭），発生地域馬群の血清 619 検体及び非発生馬群の血清 803 検体を用 Results and Discussion: Our LAMP detection system was able い，MAT 及び DTT-MAT を実施した。また，DTT-MAT の特異性を確認 to detect 1 pg of G. vaginalis DNA. Its specificity was confirmed by するため，一部の検体は，馬パラチフス菌抽出 LPS 抗原（O4 抗原）を使 sequencing the amplified DNA. G. vaginalis DNA was detected in 43 用した ELISA（LPS-ELISA）を実施した。【結果】発生馬群の菌分離陽性 of the 73 samples using real-time PCR; the LAMP system could also 馬は，MAT で 8 頭中 5 頭が 1,280 倍以上，DTT-MAT では全頭で抗体が検 detect the DNA. In some samples, only the LAMP method was able 出（20 倍以上）された。また，MAT で陰転した後も DTT-MAT で抗体が to detect G. vaginalis DNA. Here, we describe the development of 検出された個体が認められた。同居馬は全頭，MAT で 640 倍以下であっ a rapid detection system for G. vaginalis using LAMP. Since LAMP たが，DTT-MAT では約半数で抗体を検出した。発生地域馬群では，28 can detect target DNA using fluorescence, the method can be used 頭（4.5%）で DTT-MAT により抗体を検出した。非発生馬群では，1 頭で bedside. We plan to verify the clinical significance of this method DTT-MAT により抗体を検出したが，本病と疫学的関連は認められなかっ using BV clinical samples. た。DTT-MAT で陽性となった検体は，9 割以上が LPS-ELISA で O4 抗原 に対する抗体を保有していた。【考察】DTT-MAT は，MAT と比較し，よ り鋭敏に感染抗体である IgG を検出できる方法と考えられた。MAT との 併用で，発生農場における感染状況把握や保菌リスクの高い馬の選定，サー ベイランス等における潜在的な感染馬の摘発などに有用な手法と推察され た。

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P1-189 ヒト由来 STEC から見出した 8 種類の新規 O P1-190 Detection of mutations in streptomycin 群遺伝子型と牛由来 STEC における分布 resistance Mycobacterium tuberculosis isolates from ○井口 純1，伊豫田 淳2（1宮崎大・農・畜産草地，2国立感染研・細 Myanmar 菌 I） ○Nan Aye Thida Oo1，Lai Lai San1，Khin Saw Aye2，Wah Wah Aung2，中島 千絵1,3，鈴木 定彦1,3（1北大・人獣セ・バイオリソース， Eight novel O genotypes from human STEC and the 2ミャンマー保健省医学研究局，3北海道大学国際連携研究教育局） prevalence of those genotypes in cattle STEC 1 1 2 2 1 2 1 2 ○ ○Atsushi Iguchi , Sunao Iyoda ( Fac. Agr., Univ. of Miyazaki, Dept. Nan Aye Thida Oo , Lai Lai San , Khin Saw Aye , Wah Wah Aung , 1,3 1,3 1 Bacteriol. I, Nat. Inst. Infec. Dis.) Chie Nakajima , Yasuhiko Suzuki ( Divi. Biores., CZC, Hokkaido Univ., 2Dept. Med. Res., Min. Health, Myanmar, 3Hokkaido Univ. GI- 我々はこれまでに，ほぼすべての大腸菌 O 血清群（O1 から CoRE GZC) O187）を遺伝学的に判定できるマルチプレックス PCR 法（E. coli O-genotyping PCR：ECOG-PCR）を開発し（Iguchi A et al. Background: Streptomycin (STR) is included in both retreatment JCM 2015），様々な宿主や検体から分離された病原性大腸菌につ and multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB) treatment regimens. いて O 血清群に対応した遺伝子型（Og 型）の分布調査を行って Numerous studies reported that mutations of rpsL (encoding the きた。本研究では ECOG-PCR では判定できなかった（PCR 産物 S12 protein), rrs (encoding 16S RNA) and gidB (encoding rRNA が得られなかった）ヒト由来の志賀毒素産生性大腸菌（STEC） methyltransferase) were responsible for STR resistance. The aim of を解析し，8 種類の新規 Og 型を見出したので報告する。ヒト糞 the present study was to elucidate the prevalence of STR resistant 便（血便 2 件，下痢 4 件，無症状 2 件）から分離され，ECOG- conferring gene mutations in MDR-TB strains of Myanmar. PCR では判定できなかった STEC 8 株について，O 抗原合成遺 Method: DNA fragments encoding rpsL, rrs and gidB genes of 伝子領域の解析を行った。遺伝子マーカーとなる wzx/wzy につい clinical STR resistant MDR-TB strains were amplified by PCR and て既知配列と比較した結果，特異性が高く，新規 Og 型であるこ the nucleotide sequences were analyzed. Mutations associating with とが確認された。新規 Og 型を OgN1，N6，N7，N8，N9，N10， STR resistance were identified by comparing obtained sequences N12，N31 と名付け，それぞれを検出する PCR 法を開発した。 with susceptible strains. ウシ糞便から羊血液寒天平板培地を用いて分離した STEC 335 株 Results: Of 100 phenotypically STR resistant strains, mutations （1 検体より 1 株）を用いて，ECOG-PCR および今回開発した in rpsL was identified in 70% (70/100) of isolates, while 5% (5/100) PCR 法により Og 型の分布を調べた結果，多い順に Og113（72 株 ）， showed mutations in rrs. In addition, 29% (29/100) of isolates had Og8（25 株 ）， OgN8（24 株）となった。その他の新規 Og 型は mutations in gidB. Finally, 30% (30/100) of the isolates showed no OgN6（7 株 ）， OgN7，OgN31（各 2 株 ）， OgN1（1 株）が確認さ mutation and novel mutations were also found in all studied genes. れた。OgN8 株はいずれも stx1 (–)，stx2 (+)，eae (–)，subAB (+)， Conclusion: This study showed that high proportion of mutations 亜テルル酸塩耐性遺伝子 terA (–) であり，抗血清を用いた型別で was detected among MDR-TB strains. These findings can be applied は O141（または O41）と判定された。今後は，本研究で開発し for the development of rapid STR susceptibility assays, which can た PCR 法を用いてヒトにおける新規 Og 型株 STEC の流行状況 lead to great achievement in tuberculosis treatment and control についても調査していきたい。会員外共同研究者：中嶋洋，河 strategies. 合央博，大畠律子，檀上博子（岡山県環保センター）

P1-191 健常者における新興感染症菌 Helicobacter P1-192 潜在期結核菌抗原の精製と感染診断への応用 cinaedi 感染スクリーニングと感染疫学研究 ○西田 由貴子1，北所 健悟2，尾関 百合子3，立石 善隆3，井上 学1， 1 1 3 1 2 ○松永 哲郎1，藤井 重元1，井田 智章1，津々木 博康2，澤 智裕2，河 仁木 満美子 ，金子 幸弘 ，松本 壮吉 （ 大阪市大・医・細菌学， 京 3 村 好章3，赤池 孝章1（1東北大院・医・環境保健医学，2熊本大院・生 都工芸繊維大・生体分子工学・生物物理化学， 新潟大学・医・細菌学） 命科学・医学系微生物学，3愛知学院大・薬・微生物学） Purification of the M. tuberculosis protein and its Analysis of the screening and epidemiology of application for the diagnosis Helicobacter cinaedi infection ○Yukiko Nishida1, Kengo Kitadokoro2, Yuriko Ozeki3, Yoshitaka ○Tetsuro Matsunaga1, Shigemoto Fujii1, Tomoaki Ida1, Hiroyasu Tateishi3, Manabu Inoue1, Mamiko Niki1, Yukihiro Kaneko1, Sohkichi Tsutsuki2, Tomohiro Sawa2, Yoshiaki Kawamura3, Takaaki Akaike1 Matsumoto3 (1Dept. Bacteriology, Osaka City Univ. Grad. Sch. (1Dept. Environ. Health Sci. Mol. Toxicol., Tohoku Univ. Grad. Sch. Medicine, 2 Dept. Biomolecular Engineering, Kyoto Institute of Med., 2Dept. of Microbiol., Kumamoto Univ. Grad. Sch. Med. Sci., Technology, 3Dept. Bacteriology, Graduate School of Medical and 3Dept. Microbiol., Sch. Pharmacy, Aichi-Gakuin Univ.) Dental Sciences, Niigata Univ.)

【目的】Helicobacter cinaedi は 1984 年に初めてヒトへの感染が 結核は，結核菌感染によって生じる慢性感染症であるが，感染者 確認された新興感染症菌である。現在までに我々は，動脈硬化 の殆どは潜在性結核で無症候感染であることが知られている。潜 モデルマウスおよび培養細胞を用いて本菌の持続感染が動脈硬 在性結核症患者は，老化や糖尿病，HIV 感染など結核抵抗性の 化症の進展に関与する可能性について明らかにしてきた。しか 低下により，活動性結核を発症する。したがって，潜在性結核は しながら，本菌の感染疫学については不明な点が多く残されて 疾患の源泉であり，その対処は重要な問題と認識されている。潜 いる。最近我々は，菌体成分を直接検出する方法として nested 伏する結核菌はほとんど増殖せずに代謝を停止した休眠状態であ PCR 検出法を開発した。今回，本 PCR 法による健常人における H. るが，この時結核菌内で発現が上昇している主要タンパク質の一 cinaedi の検出を試みたので報告する。 つが mycobacterial DNA-binding protein 1（MDP1）である。この 【方法・結果】本 PCR 法は，病原因子の一つとして知られる細胞 ように MDP1 は潜在性結核で発現することから，MDP1 を認識 致死性膨張性毒素（cytolethal distening toxin）のサブユニット B する抗体は，潜在感染の診断マーカーとしての利用が期待されて をコードする遺伝子配列（cdtB）をもとに構築し，高感度な検出 いる。しかし，一部の非感染健常者にも抗体応答が検出されるな 法である。本菌感染モデルマウスの試料から本 PCR 解析を行っ ど，特異性に問題があった。一般に抗体は，抗原性蛋白質の一次 たところ，各種組織・血液・尿・便試料から cdtB 遺伝子の検出 構造に加え，立体構造を認識することが知られている。しかしな を確認した。そこで，健常ボランティアの便検体から腸内細菌 がらこれまで，MDP1 の構造を考慮した抗原性解析はなされてい ゲノム DNA を抽出し，本 PCR 法にて保菌スクリーニング解析 なかった。MDP1 の C 末部位は天然変性領域と推定され特定の構 を行った結果，274 検体から複数の陽性例（9 検体）を認めた。 造を有しないが，N 末部位には DNA への結合を担うアーム領域 さらに，この 9 例について便培養を行ったところ，5 例でコロニー があり 2 量体を形成することが示されている。本研究では，特に の増殖が見られ，本 PCR 法により同遺伝子の増幅が認められた。 N 末領域の構造に注目し，1．予測される立体構造を有する組み 【考察】今回開発した H. cinaedi 特異的 nested PCR 法の解析に 換え MDP1 を精製すること，2．その診断抗原としての有用性を より，本菌は健常人の腸管に定着している可能性が示唆された。 検討した。非会員共同研究者；有坂 文雄（日本大学生物資源科 本 PCR 法は，迅速かつ特異的な検出法として，H. cinaedi 感染の 学部）森川 耿右，津中 康央（国際高等研究所）藤原 芳江（京 早期診断や治療効果判定および疫学調査において有用なツール 都大学 物質－細胞統合システム拠点），片平 正人，真嶋 司（京 となるものと期待される。 都大学エネルギー理工学研究所），前倉 亮治（刀根山病院）

105 P1-193 Detection And Characterization of P1-194（WS18-7） Streptococcus suis 特異的 Asymptomatic Group A Streptococcus in Healthy Adults real-time PCR 法の開発と豚個体・飼育環境への応用 ○Tejaswini Kulkarni1，相川 知宏2，野澤 孝志2，丸山 史人2，中川 一 ○新井 沙倉，Hyunjung Kim，遠矢 真理，渡辺 孝康，鈴木 詠律子， 路2（1東医歯大・院医歯・分子発生，2京大院・医・微生物） 山田 良子，堂崎 真一，関崎 勉（東大院農・食の安全セ） ○Tejaswini Kulkarni1, Chihiro Aikawa2, Takashi Nozawa2, Fumito Development of real-time PCR for detection of 2 2 1 Maruyama , Ichiro Nakagawa ( Grad. Sch. Med. and Dent. Sci., Streptococcus suis in pigs and its raising environment 2 Tokyo Medical and Dental Univ., Dept. Microbiol., Grad. Sch. Med., ○Sakura Arai, Hyunjung Kim, Mari Tohya, Takayasu Watanabe, Eriko Kyoto Univ.) Suzuki, Ryoko Yamada, Shinichi Dozaki, Tsutomu Sekizaki (Res. Center for Food Safety, Grad. Sch. Agr. Life Sci., Univ. Tokyo) Group A streptococcus (GAS), causative agent of human infections from mild to sever range of diseases, is found in considerable 豚に髄膜炎や敗血症を引き起こす豚レンサ球菌（Streptococcus healthy population. Such asymptomatic GAS study is important suis）感染症は，ストレスの多い離乳期によく発症するが，その to understand clonal spread of organism in community, and for 感染ルートは不明で，衛生管理の行き届いた農場でも問題となっ evolutionary diversification organism. In current study we detected ている。本研究では，S. suis を特異的に検出する real-time PCR rate of GAS carriage from 148 throat swab samples collected from 法（RT-PCRSS）を開発し，農場内の本菌の動態を調査した。 healthy adults by culture dependent and independent methods. We ハウスキーピング遺伝子の一つである， 遺伝子配列上にプ + recN used GAS specific 16S rRNA, V-Na -ATPase and emm primers. 146 ライマーとプローブを設計した。recN 遺伝子配列を元にした場 samples were detected with presence of GAS DNA, based culture 合の近縁菌やその他の豚病原細菌を用いて特異性を評価したと + independent method using 16S rRNA & V-Na -ATPase primers ころ，S. suis にのみ特異的に反応した。また，基準株を用いた while GAS was isolated from only 5 swab samples by standard 場合の検出感度は 56.3 CFU/ 反応であった。次に，国内の 3 箇 culture study. By Culture independent approach, emm-typing 所の農場から，唾液，糞便，膣，水飲み場および餌箱試料を採 information was acquired from 25 samples marked with presence of 取した。飼育時期は，哺乳期，離乳期，育成期に分け，哺乳期 emm58.16, emm6.52, emm106. These results suggested that healthy には母豚と哺乳子豚の両方から採取した。DNA を抽出後，既に adults might serve as important GAS carriers. Further we focused on 開発された総菌数測定用 real-time PCR 法（Nadkarni et al., 2002） antibiotic susceptibility of isolated 5 asymptomatic GAS. Isolates 618 に供し，各 DNA 溶液を，菌 DNA 換算値で 5 ng/μl に希釈した。 was resistant to erythromycin, clindamycin and tetracycline while その後，RT-PCRSS により，本菌の存在量を推定し，陽性の場合 isolate SH was resistant to tetracyline and showed intermediate には豚の感染が最も多い血清型 2 型の検出のために Nga ら（ 2011） response to erythromycin. Draft genome sequences for all 5 isolates の real-time PCR 法（RT-PCR2J）に供した。その結果，唾液は飼 were analyzed for antibiotic resistant genes using CARD database. 育時期に関わらずほぼ全ての試料で RT-PCRSS が陽性であり，哺 Antibiotic resistance in carrier GAS isolates indicates that such GAS 乳豚であっても全菌数に対する S. suis の存在比は他の飼育時期 population should not be neglected. のものと同程度であったことから，母子感染が示唆された。また，

S. suis 感染症の多発する農場では，RT-PCR2J 陽性の唾液もみら れた。さらに，水飲み場と餌箱試料からも本菌が検出されたため， 環境中からの感染も示唆された。

P1-195 Propidium/Ethidium monoazide (PMA/EMA)- P1-196 豚の浮腫病診断用の Shiga toxin 2e 特異的イ qPCR 法を用いた結核菌の生菌検出法の開発 ムノクロマトグラフィーの開発 ○高木 明子1，近松 絹代1，大藤 貴2，五十嵐 ゆり子1，青野 昭男1， ○有満 秀幸，佐々木 慶子，辻 孝雄（藤田保衛大・医・微生物） 山田 博之1，阪 下 健太郎2，伊 麗娜2，加 藤 朋子1，御手洗 聡1,2（1結 研・ 抗酸菌部，2長崎大院・医歯薬・基礎抗酸菌） Development of Shiga toxin 2e-specific immunochromatography for diagnosis of swine edema Quantification of viable Mycobacterium tuberculosis disease (MTB) using PMA/EMA-qPCR systems ○Hideyuki Arimitsu, Keiko Sasaki, Takao Tsuji (Dept. Microbiol., Sch. 1 1 2 ○Akiko Takaki , Kinuyo Chikamatsu , Takashi Ohfuji , Yuriko Med., Fujita Health Univ.) Igarashi1, Akio Aono1, Hiroyuki Yamada1, Kentaro Sakashita2, Lina Yi2, Tomoko Kato1, Satoshi Mitarai1,2 (1Dept. Mycobacterium Ref. and 【目的】浮腫病（Edema disease; ED）は仔豚に致死的な志賀毒 Res., Res. Inst. Tuberculosis, JATA, 2Dept. Mycobacter. Nagasaki 素産生大腸菌感染症であり，Shiga toxin2（Stx2）バリアントの Univ.) Stx2e が原因因子である。ED の診断において，Stx2e 遺伝子（stx2e） の検出は毒素産生性と一致しない場合が報告されている。毒素 Background: Given the time-consuming culture process, to develop を検出するベロ細胞を用いたアッセイは感度が高い方法である rapid method for discriminating viable MTB from dead ones will be が，判定にかかる日数と操作の煩雑性が欠点である。市販の Stx very important for the monitoring of TB treatment outcome. The の検出キットは豚の ED の診断を想定したものではなく，Stx2e nucleic acid amplification techniques utilising PMA/EMA are widely に対しての感度は悪い。そこで今回，迅速かつ簡便に ED を診 used for the detection of viable bacteria like E. coli and C. sakazakii. 断することを目的とした，Stx2e を検出するイムノクロマトグラ Those methods for Mycobacterium has been reported previously, フィー（IC）の作製を試みた。 but nothing is practical for the clear discrimination and accurate 【方法】Stx2e に対するモノクローナル抗体（mAb）を定法に従っ quantification of viable MTB. In this study, we tried to develop て作製した。各 mAb の Stx2e に対する感度は ELISA で，特異性 a qPCR system for the quantification of viable MTB in clinical はウェスタンブロット及び免疫沈降法で確認した。IC のテスト specimen. ストリップは感度の高い 2 種の mAb の一方を Hi-Flow Plus 135 Methods: PMA and EMA penetrate the impaired membrane of membrane card に塗布，もう一方は金コロイド標識後にコンジュ dead bacteria and intercalate into double-stranded DNA under light ゲートパッドに乾燥させ，サンプルパッドとともに抗体塗布ス exposure, and inhibit denaturation of DNA in PCR process. The トリップに貼付して作製した。被検試料は精製毒素の他，豚よ number of MTB H37Rv cells in the logarithmic growth phase were り分離された stx2e 陽性及び陰性株の CAYE 培地一晩培養液のポ quantified by TaqMan PCR system w/o PMA/EMA. As reference, we リミキシン B 処理上清を用いた。 counted the bacterial number under microscopy by Ziehl-Neelsen 【結果及び考察】得られた 9 種類の mAb のうち，特に高感度で staining (total cell count) and culture (CFU count). 反応する 3 種類の mAb の組合せで作製したテストストリップ Results and Conclusions: The proportion of viable MTB in the は Stx2e を検出したが，Stx2a, Stx2c, Stx2d には反応しなかった。 logarithmic growth phase with microscopy and culture were 50– Stx2e に対する検出限界はどのテストストリップも 10ng/ml で 100%. Those of TaqMan PCR with PMA and EMA were 12.5–60% あったが，この感度で試験した豚由来の stx2e 陽性株の培養上清 and 38–100%, respectively. We considered that EMA-qPCR system から Stx2e を検出できたことより，ED の診断に特化したテスト could quantify viable MTB more accurately than PMA-qPCR in our ストリップとして利用できると考えられた。 setting. The evaluation data of clinical specimens will follow soon.

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P1-197 ORNi-PCR 法および in vitro enChIP 法を用い P1-198 Effect of the El Nino on Vibrio た高精度細菌叢 NGS 解析 parahaemolyticus in clinical and environmental samples ○谷川 直紀，藤田 敏次，藤井 穂高（阪大・微研・推進室・ゲノム生 in Peru 化学） ○Oscar R. Escalante-Maldonado1，西渕 光昭2（1Grad. Sch. Med., Kyoto Univ.，2Ctr. Southeast Asian Studies, Kyoto Univ.） Cost-effective NGS analysis of microbial flora using ORNi-PCR and in vitro enChIP technologies ○Oscar R. Escalante-Maldonado1, Mitsuaki Nishibuchi2 (1Grad. Sch. 2 ○Naoki Tanigawa, Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii (Combined Med., Kyoto Univ., Ctr. Southeast Asian Studies, Kyoto Univ.) Program on Microbiol. and Immunol., RIMD, Osaka Univ.) Vibrio parahaemolyticus can cause seafood-borne infections. Strains 次世代シークエンシング（NGS）解析は，細菌叢解析や病原菌 carrying tdh and/or trh genes are considered pathogenic. In 1997, の検出などに広く利用されている。細菌叢解析において，希少 Peru reported the first case of the pandemic clone O3:K6 in America. な菌種を高精度に検出するには高いリード数が必要であり，コ Emergence and spread of this bacterium is affected by many factors, ストがかかるという問題がある。そこで希少な菌種由来の配列 with El Nino phenomenon considered an important one. Pathogenic を濃縮する技術や，優占種由来の配列を除去する技術が求めら strains of V. parahaemolyticus is detected in less than 5% of れている。 environmental isolates. A method capable of detecting the pathogenic 我々は，増幅を抑制したい鋳型DNA と相補的なoligoribo- genes contained in popular seafood at a low concentration is required. nucleotide（ORN）を用いて，PCR 増幅を抑制する技術である We previously reported development of an easy and sensitive method ORN interference-PCR（ORNi-PCR）法を開発した。この技術を for quantitative detection of pathogenic V. parahaemolyticus from 用いて NGS 解析前の PCR 反応において，PCR 増幅を配列特異 seafood by incorporating loop-mediated isothermal amplification and 的に阻害することによって優占種由来の配列を減らすことが可 Immunomagnetic separation techniques to a MPN. In this study, we 能である。我々は，小規模のマウス小腸細菌叢解析において， applied this method to evaluate the effect of El Nino phenomenon on ORNi-PCR 法を用いて優占種の割合を減少させ，新たに希少菌種 the V. parahaemolyticus-mediated diarrhea. We examined 2 batches, を検出することに成功した。 each consisting of 3 sets of shellfish samples per month starting from また，我々は，CRISPR 系などの人工 DNA 結合分子を用いて， July 2015, purchased in Lima where the seafood harvested in most 特定の配列をもつ DNA を単離する技術である engineered DNA- coastal areas of Peru are collected and sold. The change in the MPN binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation（enChIP） values obtained in our study showed very good correlation with that 法を開発した。組換え dCas9 蛋白質と合成 gRNA から構成した in the number of the patients and the sea water temperature change リボヌクレオプロテインを用いる in vitro enChIP 法を利用するこ due to the El Nino phenomenon. Collaborators: Veronica Hurtado とにより，希少種由来の配列の濃縮や優占種由来の配列の除去 and Maria Luz Zamudio. が可能である。このように，ORNi-PCR 法や in vitro enChIP 法は， 細菌叢の NGS 解析において有用な手法である。

P1-199 A new set of immunomagnetic beads ready P1-200 核酸クロマトグラフィ―を用いた糞便中のノロ for global detection of EHEC in beef ウイルスの迅速検査法の作成 ○Ahmad Yaman Kayali1，権平 文夫2，西渕 光昭1（1Ctr. Southeast ○林 佐代子1，林 将大2，江崎 孝行3（1岐阜医療科学大・臨床検査， Asian Studies, Kyoto Univ.，2Denka Seiken Co.） 2岐阜大・生命科学総合研究支援センター・嫌気性菌，3岐阜大・医・ 病原体制御） ○Ahmad Yaman Kayali1, Fumio Gondaira2, Mitsuaki Nishibuchi1 (1Ctr. Southeast Asian Studies, Kyoto Univ., 2Denka Seiken Co.) Development Quick DNA-chromatography to detect Norovirus in Stool Escherichia coli O157 has been attracting strong attention as the ○Sayoko Hayashi1, Masahiro Hayashi2, Takayuki Ezaki3 (1Dept. flagship O serotype of enteroheamorrhagic E. coli (EHEC) since medical technology., Sch. Medical Science., Gifu Univ., 2Dept. its discovery during a hamburger-mediated outbreak in the United Anaerobic. Lie Science Research Center, Gifu Univ., 3Dept. Microbiol., States in 1982. The world biggest outbreak of EHEC infection due Sch. Med., Gifu Univ) to the serotype O157 took place in Japan in 1996. Many researchers have been focusing on O157 that well represents EHEC serotypes. 【諸言】ノロウイルスは，感染性が非常に強い胃腸炎を引き起こ However, in addition to O157, the implication of non-O157 in し，本ウイルスを原因とする食中毒は 293 件，10506 人の患者が human EHEC infections has been increasing over the past 10 years. 報告されている。これは病因物質の中で第 2 位の件数，第 1 位 Non-O157 infections has become more prevalent than O157 infection の患者数になる。ノロウイルスは分離がいまだ不可能であるた recently and raising a worldwide concern. Our literature survey め，確定診断は遺伝子検出が一般的であるが，従来法は煩雑な indicated that infections due to EHEC belonging to O157 and six 手技が必要であり，検出に時間がかかるため迅速かつ簡便な検 other O serotypes (O26, O91, O103, O111, O121, and O145) are 査方法の開発が急務である。そこで我々は，ノロウイルスの G1 constantly reported in Japan; and additional eight serotypes (O15, 型および G2 型を一度に増幅可能なプライマーセットを作成し， O45, O55, O104, O113, O118, O128, and O153) totaling to fifteen O RT-PCR 反応後，増幅産物を核酸クロマト法で目視判定する迅速 serotypes in the world. In this study, we prepared immunomagnetic で簡便な検査法を確立したので報告する。【方法】公定法に基づ beads targeting these 15 O serotypes and evaluated their き RNA 抽出を行い，45 分の RT-PCR 反応を実施した後，核酸ク performance. The result indicated that they can be adopted in ロマトグラフィーと青色 Latex を用いて増幅産物を 10 分後に目 our previously reported protocol with minor modifications where 視で識別を行った。各プライマーの下流には異なった 2 種類の PickPen-assisted immunomagnetic separation and loop-mediated Tag 配列をつけ，上流のプライマーの 5 末端には PolyA 配列をつ isothermal amplification were combined. けた。核酸クロマトろ紙上には，2 種類のノロウイルスプライマー の Tag と反応する Anti-tag 配列をプリントした。上流プライマー の PolyA 配列には PolyT 配列をつけた青色 Latex で捕捉する方法 を作成した。核酸クロマトろ紙上の Anti-Tag と PCR 産物の Tag を結合させ，上流のプライマーの 5 末端の polyA と青色ラテッ クスの polyT を結合させた青色ラインを作らせ，目視判定した。 【結果】ノロウイルスの G1 型および G2 型の RT－PCR 増幅産物 を核酸クロマト上で目視判定する方法を作成した。【結語】RT 反応から PCR 増幅産物の判定まで一時間以内で検出する方法を 作成した。しかし，現在の糞便からの RNA 精製処理法には時間 がかかるため，簡便で迅速に処理する手法の改良も試みている。

107 P1-201 迅速感受性測定法を用いたメチシリン耐性ブド P1-202 多剤耐性 Acinetobacter baumannii 腸管感染 ウ球菌の迅速検出法 マウスモデルにおけるシンバイオティクスの感染防御効果 ○松本 佳巳1，榊原 昇一1，野地 博行2，山口 明人1，飯野 亮太3，西 ○朝原 崇，高橋 明，結城 功勝，加地 留美，高橋 琢也，野本 康二（株 野 邦彦1（1大阪大・産研，2東京大・工，3自然科学研究機構 岡崎統 式会社ヤクルト本社中央研究所） 合バイオサイエンスセンター） Protective effect of synbiotics against multidrug- Rapid Detection of MRSA by the New Rapid Susceptibility resistant A. baumannii in a murine infection model Testing Method ○Takashi Asahara, Akira Takahashi, Norikatsu Yuki, Rumi Kaji, ○Yoshimi Matsumoto1, Shouichi Sakakihara1, Hiroyuki Noji2, Akihito Takuya Takahashi, Koji Nomoto (Yakult Central Institute, Yakult Yamaguchi1, Ryota Iino3, Kunihiko Nishino1 (1Institute of Scientific Honsha Co., Ltd.) and Industrial Research, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Engineering, Univ. Tokyo, 3National Institutes of Natural Sciences) 多剤耐性Acinetobacter baumannii（MDRAb）の致死的なマ ウス腸管感染モデルを用いて，プロバイオティクスである 【目的】マイクロ流路チップと顕微鏡を用いる迅速感受性測定法 Bifidobacterium breve ヤクルト株（BbY）の感染防御作用，およ を考案し，緑膿菌の感受性測定法や ESBL 産生菌の検出法を提 び BbY とプレバイオティクスであるガラクトオリゴ糖（GOS） 案してきたが，新たにブドウ球菌のメチシリン耐性を迅速に検 の併用投与（シンバイオティクス）による感染防御増強作用に 出する方法を考案したので，報告する。【方法】ソフトリソグラ ついて検討した。多種の抗菌薬投与により腸内細菌叢が撹乱さ フィーにより作成したチップは，1 組 4 本のマイクロ流路が 5 れたマウスでは，MDRAb が腸内で爆発的に増殖し，そのよう 組，スライドガラス上に並んだ構造をしており，4 本の流路を顕 なマウスに 5- フルオロウラシル（5-FU）を接種すると，腸内の 微鏡で一視野にまとめて観察することができる。これらの流路 MDRAb が生体内へ侵襲して全てのマウスが斃死した。MDRAb に MPIPC，CFX，CEZ，PCG を 3 濃度ずつ固定して用いた。コ 感染前より BbY を連日経口投与したマウスでは，MDRAb の腸 ロニーを MH-broth に懸濁し OD 約 0.07 の菌液をデバイスに注 内増殖や生体内への侵襲が抑制され，生存率が上昇した。さら 入，37°C 高湿度にて培養後，顕微鏡下で菌を観察し感受性の有 に抗菌薬投与による腸内環境の異常や腸管上皮のタイトジャン 無を判断した。【結果】S. aureus は，流路内で速やかに増殖し， クション関連遺伝子の発現の上昇といった腸管バリア機能の改 3 時間培養後に感受性判定が可能であった。S. epidermidis は，や 善が認められた。以上の MDRAb 感染に対する感染防御作用は， や増殖が遅いものの，やはり，3 時間での判定が可能であった。 シンバイオティクス投与により増強された。一方 GOS の単独で MRSA も MRSE も，用いた 4 薬剤に耐性を示し，高濃度におい は感染防御作用が全く認められなかった。腸内の MDRAb 菌数 てもコントロールと類似の増殖を示し，集落の形成が見られた。 と BbY 菌数あるいは酢酸濃度との間には負の相関が認められ， 一方，メチシリン感受性株は，MPIPC および CFX に感受性を示 酢酸濃度と腸管上皮のタイトジャンクション関連遺伝子発現と し，集落形成が抑制された。感受性株の MIC よりも高い濃度を の間には正の相関が認められた。これらの結果から，MDRAb の 用いることで，感受性株と耐性株の差が顕著となり，顕微鏡下 ような多剤耐性菌による致死的な腸管感染に対してプロバイオ で肉眼判定が容易となった。MSSA の CEZ および PCG 感受性も ティクスおよびシンバイオティクスの経口投与により感染防御 同様に判定できた。【結論】顕微鏡による感受性判定は，低倍率 効果が認められることが明らかになった。プロ / シンバイオティ で形態変化を見ることが難しいブドウ球菌においても，菌数や クスの感染防御メカニズムとして，腸内環境の改善による腸内 集落形成の有無を指標に判定することが可能であり，迅速法と の病原菌の増殖の抑制および腸管バリア機能の改善作用の重要 して有用であることが明らかになった。 性が示された。

P1-203 ラットを用いた複合筋活動電位測定法によるボ P1-204 皮膚感染症に対するローズウォーターの可能性 ツリヌス毒素活性の測定方法 の検討 ○鳥居 恭司1，小崎 俊司2，高橋 元秀3，銀永 明弘4（1東京農大・農・ ○丸山 奈保1,2，下 村 一之3，安 部 茂1,3（1帝京大学医真菌研究センター， 畜産，2大阪府立大院・生命環境・獣医感染症，3医薬品医療機器総合 2帝京平成大・健康メディカル学部，3帝京大・医療技術学部） 機構，4化血研） Possibility of rose water for the care of cutaneous Establishment of an alternative potency test for infection botulinum toxin using CMAP in rats ○Naho Maruyama1,2, Kazuyuki Shimomura3, Shigeru Abe1,3 (1Teikyo ○Yasushi Torii1, Shunji Kozaki2, Motohide Takahashi3, Akihiro Univ. Institute of Medical Mycology, 2Fac. Health and Medical Ginnaga4 (1Dept. Animal Sci., Sch. Agriculture, Tokyo Univ. of Science, Teikyo Heisei Univ., 3Fac. Medical Technology, Teikyo Univ.) Agriculture, 2Dept. Vet. Sci., Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 3Office GMP/QMS Inspect., PMDA, 4The Chemo-Sero-Therapeutic 芳香蒸留水及び精油は，その抗菌作用及び抗炎症作用から皮膚 Research Institute) 感染症に対する効果が期待されている。芳香蒸留水の中でもロー ズウォーターは日常のスキンケアに広く使用されるが，皮膚感 ボツリヌス毒素活性の国際的にスタンダードな測定方法は，マ 染症への効果に対する基礎的検討は十分とはいえない。皮膚感 ウス腹腔内投与 LD50 試験である。この測定方法は，定量分析法 染症ケアでは，抗菌作用とともに，感染に伴う炎症症状の抑制 として必要な精度で測定するためには多くのマウスを必要とし という 2 つの側面からの検討が重要である。そこで本研究では， ており，動物愛護の観点で問題とされている。以前の報告で我々 C.albicans 及び MRSA に対するローズウォーターの抗菌作用，及 はマウス腹腔内投与 LD50 試験の代替法として，ラットを用いた び好中球活性化抑制作用（抗炎症作用）を検討した。 複合筋活動電位（CMAP）測定法を開発した。今回，我々はラッ C.albicans TIMM1768 はローズウォーター希釈液存在下 37 度 5% トの CMAP を用いた毒素活性の定量分析法を評価するため，日 CO2 で 16 時間培養し，菌糸形発育量を測定した。また，MRSA 米欧医薬品規制調和国際会議（ICH）の分析法バリデーション（Q2 はローズウォーター存在下 37 度で振盪培養し，一定時間ごと （R1））に従って定量試験で必要とされているパラメータ（特異性， に菌数を測定した。次に，健常人ボランティアの血液から得た 直線性・範囲，真度，精度，頑健性）について，A 型ボツリヌ 好中球を，LPS 及びローズウォーター希釈液とともに 37 度 5% ス毒素を使用して評価した。特異性の確認は，不純物存在下で CO2 で 1 時間培養し，LPS 刺激による好中球の粘着反応で見ら も正確に測定できることを確認する必要があるが，CMAP 測定 れる活性化に対するローズウォーターの抑制作用を検討した。 はサンプル中に不活化毒素が混入していても毒素活性を評価で 本実験は，帝京大学倫理委員会の承認，及びボランティアから きることが示された。測定範囲の直線性は，1 匹につき 1 サンプ 同意を得て実施している。 ル測定の場合 0.1～12.8 U/mL の範囲で認められた。使用動物数 この結果，ローズウォーターは 2–3% で C. albcans の菌糸形発育 を削減するため 1 匹につき 2 サンプルを測定するように設定し を抑制した。また，時間依存的に抗 MRSA 活性を示し，原液の た。測定の真度は 93～109% の範囲内であり，精度については， 場合，30 分後には菌数が 100 分の 1 に，1 時間後には 10000 分 併行精度は 4～8%，室内再現精度は 7～9% と非常に低い変動性 の 1 程度に減少した。さらに，10–15% で LPS 刺激による好中球 であった。頑健性については，体重を変動要因として選択した 活性化を抑制した。今回，ローズウォーターが低濃度で抗カン が CMAP 振幅への影響は認められなかった。 ジダ活性及び抗炎症活性を示したこと，MRSA に対し短時間で 今回の検討において，ラット CMAP 測定によるボツリヌス毒素 抗菌活性を示したことから，細菌・真菌感染に伴う皮膚炎の緩 活性の測定は，ICH で規定されている分析法として必要な条件 和に役立つ可能性が示された。 を満たしていることが明らかとなった。

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P1-205 早期胃癌 ESD 後再発予測における H. pylori-J P1-206 耐熱性エンテロトキシンに対するペプチド性阻 抗原を用いた IgG サブクラスの有用性 害薬の開発 ○横田 憲治1，松下 治2，山本 由弥子2，美間 健彦2，後藤 和義2，林 ○近江 純平1，高橋 美帆1，宮坂 知宏1，山崎 伸二2，日高 雄二3，杤 俊治3，阪口 義彦3（1岡山大・大学院・保健学，2岡山大・大学院・医 尾 豪人4，濱端 崇5，西川 喜代孝1（1同志社大・生命医科学，2大阪府 歯薬・病原細菌学，3北里大学医学部微生物学） 立大・生命環境科学，3近畿大・理工，4京都大・理，5国立国際医療 研究センター・感染症制御） Identification of a high risk gastric cancer recurrence group using serum H. pylori IgG subclas Development of Peptide-based Neutralizers against Heat- ○Kenji Yokota1, Osamu Matsushita2, Yumiko Yamamoto2, Takehiko stable Enterotoxin Mima2, Kazuyoshi Gotoh2, Shyunji Hayashi3, Yoshihiko Sakaguchi3 ○Jumpei Omi1, Miho Takahashi1, Tomohiro Miyasaka1, Shinji (1Grad. Sch. of Health Science, Okayama Univ., 2Dept. Bacteriol. Yamasaki2, Yuji Hidaka3, Hidehito Tochio4, Takashi Hamabata5, Okayama Univ. Grad. Sch. of Med., Dent. and Pharma. Sciences, Kiyotaka Nishikawa1 (1Grad. Sch. of Life and Med. Sci., Doshisha 3Microbiol. Kitasato Univ. Med. Sch.) Univ., 2Grad. Sch. of Life and Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 3Fac. of Sci. and Eng., Kinki Univ., 4Grad. Sch. of Sci., Kyoto Univ., 5Dept. 【背景】早期胃癌患者に対する Helicobacter pylori（Hp）除菌は， of Infect. Dis., NCGM.) 早期胃癌再発に対して抑制効果があるとされている。一方，Hp 除菌は完全に胃癌再発を抑制するわけでは無く，除菌後も定期 【目的】腸管毒素原性大腸菌（ETEC）は開発途上国における細菌性下痢 観察が必要とされている。しかしながら，初回治療後再発をき 症の主な原因細菌であり，耐熱性エンテロトキシン（ST）を分泌する。 たさない症例のほか，再発を何度もきたす症例も散見され，今 ST は 19 個のアミノ酸から成り，分子内に 3 対の S-S 結合を有する。ST 後再発リスクの層別化が重要となると考えられる。【目的】早期 は標的細胞上に存在するグアニル酸シクラーゼ C（GC-C）を受容体とし 胃癌治療後に再発を認めた症例と，初回治療後は再発をきたさ て強力に結合し，cGMP シグナルを異常亢進させ，水分調節機構を破綻さ ない症例の血清学的な相違点を明らかにする。【方法】対象は初 せる。本研究では，ST に結合してその毒性を阻害するペプチドを同定し， 診時 Hp 陽性と診断された上で早期胃癌 ESD を施行された症例 ETEC による下痢症の治療薬として確立することを最終目的とする。【方 69 症例。そのうち異時性再発をきたした症例は 22 症例（再発群）， 法】野生型 STWT，ならびに GC-C への結合に必須である Ala14 を Gly に 初回胃癌治療後再発を来していない症例は 47 症例（非再発群）。 置換した変異体 STA14G，各々のビオチン標識体をプローブとして，高密度 それら 2 群について，Hp 除菌前の H. pylori-J 抗原を用いた IgG ペプチドアレイを用いたサブトラクションスクリーニングを行い，部位特 抗体価（Total IgG とサブクラス IgG1,IgG2）ついて比較検討を行っ 異的高親和性 ST 結合モチーフの取得を試みた。結合親和性のさらなる向 た。【結果】男女比はそれぞれ再発群（男性 18 例，女性 4 例 ）， 上を目指し，得られた候補モチーフを 4 価で有するペプチド性化合物を合 非再発群（男性 33 例，女性 14 例），初発時の年齢の中央値は 成した。各化合物の ST 阻害活性は，腸管上皮細胞株 Caco-2 細胞での ST 再発群 72.5（56–87）歳，非再発群（53–82）65 歳であった。H. による cGMP の産生誘導に対する抑制能を指標として評価した。【結果】 pylori-J 抗原を用いた IgG 抗体価は，Total IgG の平均値は再発群 第一段階のスクリーニングによって決定されたモチーフ情報を，次の段階 0.82±0.46，非再発群 0.82±0.50 であった（P=0.96）。 IgG1 は再 のスクリーニングに順次組み入れてゆく多段階機能成熟法によって，最終 発群：非再発群 =0.75±0.21：0.33±0.18（P ＜ 0.001）， IgG2 は 的に 7 種類の部位特異的 ST 結合モチーフを決定した。これらの配列を 4 再発群：非再発群 =1.89±1.2：1.30±1.20（P=0.02）， IgG1/2 比 価で有する化合物の ST 阻害活性を検討したところ，3 種類の化合物が ST は再発群：非再発群 =0.6±0.43：0.58±0.68 であった（P=0.30）。 による cGMP 産生誘導を 30% 以上抑制することを見出した。【結論】本研 【考察】再発群と非再発群において，Hp 除菌前の H. pylori-J 抗原 究で確立した多段階機能成熟法により，小分子毒素を標的とした阻害薬開 を用いた IgG サブクラスは有意な差を認め，早期胃癌治療後の 発が可能であることが明瞭に示された。 再発リスクの層別化に有用と考えられた。

P1-207 Effect of shin’iseihaito on mouse macrophage P1-208 イヌと飼い主間における Porphyromonas phagocytosis activity against Haemophilus influenzae gulae の伝播 ○南 正明1，小 西 徹2，蒋 志侠3，荒 井 哲也3，牧 野 利明2（1名 市 大・医・ ○佐々木 悠，渡辺 清子，浜田 信城（神奈川歯科大学・院・歯学研究・ 細菌，2名市大・薬・生薬，3小林製薬・R&D センター） 微生物学） ○Masaaki Minami1, Toru Konishi2, Zhixia Jiang3, Tetsuya Arai3, Transmission of Porphyromonas gulae between dogs 2 1 Toshiaki Makino ( Dept. Bacteriol. Grad. Sch. Med. Sci. Nagoya City and their owners 2 Univ., Dept. Pharmacog. Grad. Sch. Pharm. Sci. Nagoya City Univ., ○ 3 Haruka Sasaki, Kiyoko Watanabe, Nobushiro Hamada (Dept. R&D Center, Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd) Microbiol., Grad. Sch., Kanagawa Dent. Univ.)

Haemophilus influenzae causes various serious diseases including Objective: Porphyromonas gulae, a novel oral bacterial species, is sinusitis, sepsis, pneumonia, and meningitis. Shin’iseihaito (SSHT), often isolated from the gingival sulcus of various animals including a traditional Japanese medicine based on ancient Chinese medicine, dogs and cats. Its related strains of human origin, Porphyromonas has been used for treatment of otolaryngeal diseases in Japan. gingivalis, is known to have fimbriae that play an important role in The objective of this study was to examine the effects of SSHT adherence of the organisms to oral epithelial cells as the initial step on mouse macrophage phagocytosis activity against H. influenzae. in the progression of periodontitis. In this study, we investigated the Both encapsulated and the unencapsulated H. influenzae strains distribution of P. gulae in dogs and their owners using oral specimens were evaluated. SSHT extract was provided from Kobayashi subjected to a molecular biological method to investigate the Pharmaceutical Co., LTD. Six-week old female Balb/c mice were possibility of dog-owner transmission of P. gulae. Methods: Dental orally treated with SSHTextract and peritoneal and bronchial plaque specimens from the dogs and their owners were collected macrophages were isolated. Macrophage phagocyte assays were from the gingival margin of the buccal side of the maxillary molar performed by mixing mouse macrophage and H. influenzae. The region using sterile cotton swabs. A 16S rRNA-based PCR detection samples were incubated at 37°C on a rotator, and plated on Chocolate method was used to determine the distribution of P. gulae. Results: agar to determine the number of CFU after adequate times. P. gulae was detected from dental plaque specimens of two owners Macrophage from SSHT-treated mice had greater phagocytosis by P. gulae species specific primes. P. gulae ATCC 51700 adhered to activity than that from control mice in both peritoneal and bronchial cultured cells as well as P. gingivalis ATCC 33277. Conclusion: P. macrophages. The phagocytosis activity of murine bronchial gulae could be transmitted humans from their dogs. P. gulae-positive macrophage was greater than that of murine peritoneal macrophage. dog may act as a source of infection for human. These findings The CFU - reduction rate of encapsulated H. influenzae was greater suggest that binding sites involved in the interaction with the human than that of unencapsulated bacteria by phagocytosis activity. Our host cell present in P. gulae. data suggest that SSHT may be useful for the treatment of H. influenzae infection.

109 P1-209 CRISPR/Cas システムを用いた遺伝子組換え P1-210 Fusobacteria inhibit butyrate-induced ファージの創生 differentiation of HT29 human colonic cancer cells ○嶋本 順明，星賀 史也，宮永 一彦，丹治 保典（東工大・生命理工） ○多田 彩乃，今大路 治之，桑原 知巳（香川大・医・分子微生物） Genetic modification of bacteriophage by CRISPR/Cas ○Ayano Tada, Haruyuki Imaohji, Tomomi Kuwahara (Dept. Microbiol., system Med., Kagawa Univ.) ○Noriaki Shimamoto, Fumiya Hoshiga, Kazuhiko Miyanaga, Yasunori The microbiota of the human gut is comprised of a great diversity Tanji (Dept. Bioeng., Sch. Biosci. & Biotechnol., Tokyo Tech.) of microbes, many of which have become deeply integrated with Introduction: Due to the emergence of anti-biotic resistant host physiology. Subsets of these gut microbes produce butyrate, bacteria, application of bacteriophage for controlling pathogens a short chain fatty acid that not only serves as an efficient energy (phage therapy) is an attractive alternation. However, phage therapy source for colonocytes but is also an apoptogenic factor for host has several obstacles to be solved for practical application; for cells. Fusobacterium nucleatum is a periodontal pathogen that example, we need to screen phage with suitable host specificity produces butyrate. F. nucleatum adhesion protein (FadA) reportedly elaborately from environmental sample and tackle emergence of binds E-cadherin, resulting in upregulation of the Wnt/β-catenin anti-bacteriophage bacteria. With respect to these obstacles, genetic signaling pathway, which promotes intestinal epithelial cell growth engineering of bacteriophage is attempted to artificially modify its and colorectal tumorigenesis. In this study, we examined the effect host specificity. In this study, we tried applying CRISPR/Cas system of F. nucleatum on the differentiation and apoptosis in three cell to engineer T2 phage to enhance the recombination efficiency and lines: HeLa-Fucci, HCT116 and HT29. Culture supernatant from simplify the screening process. F. nucleatum, F. varium, Escherichia coli, Bifidobacterium longum Materials and Methods: A point mutation was introduced by or B. adolescentis was added to each of the cell lines at 10% (v/v). homologous recombination in gene38, which encodes a receptor Supernatants from the fusobacterial cultures induced G1 arrest binding protein of T2 phage. This mutation was designed to escape in HeLa-Fucci cells and increased caspase-3/7 activity in HT29 CRISPR/Cas recognition so that the recombinant phages can survive and HCT116 cells. In addition, fusobacterial culture supernatants under the pressure of CRISPR/Cas system. inhibited butyrate-induced upregulation of alkaline phosphatase, Results and Discussion: Recombinant phages with a point which is a cell differentiation marker for colonocytes. These results mutation in the desired locus were successfully obtained. They indicate that Fusobacteria produce diverse effects in human colonic formed larger plaques than wild ones probably due to the pressure of epithelial cells, some of which might be involved in colorectal CRISPR/Cas system. However, significant increase of recombination carcinogenesis. efficiency was not observed. We are now trying to further enhance recombination efficiency.

P1-211 軟寒天培地上でのFlavobacterium johnsoniae P1-212（WS10-2） The consumption of の樹枝状コロニースプレッディング bicarbonate-rich mineral water alters gut microbiota ○今村 圭吾1,2，佐藤 啓子2，近藤 好夫1,2，成田 由香3，藤原 卓1，中 profiles 2 1 2 山 浩次 （ 長崎大・医歯薬・小児歯， 長崎大・医歯薬・口腔病原微 ○村上 慎之介1,2，後藤 康彰3，伊藤 恭4，早坂 信哉3,5，栗原 茂夫3， 3 生物， 福歯大・機能生物化学・感染生物学） 曽我 朋義1,2，冨 田 勝1,2，福 田 真嗣1,2（1慶 大・院・政 策・メ デ ィ ア ，2慶 大・ 先端生命研，3温泉医科研，4伊藤医院，5都市大・人間科学） Dendritic colony spreading of Flavobacterium johnsoniae cells on the soft agar ○Shinnosuke Murakami1,2, Yasuaki Goto3, Kyo Ito4, Shinya 3,5 3 1,2 1,2 ○Keigo Imamura1,2, Keiko Satou2, Yoshio Kondo1,2, Yuka Narita3, Hayasaka , Shigeo Kurihara , Tomoyoshi Soga , Masaru Tomita , 1,2 1 Taku Fujiwara1, Koji Nakayama2 (1Dept. Ped. Dent., Nagasaki. Univ. Shinji Fukuda ( Grad. Sch. Media and Governance, Keio Univ., 2 3 4 Grad. Sch., Biomed. Sci., 2Dept. Mol. Microbio. Immunol., Nagasaki Inst. Adv. Biosci., Keio Univ., Onsen Med. Sci. Res. Cent., Ito 5 Univ. Grad. Sch., Biomed. Sci., 3Dept. Func. Biosci., Fukuoka Dent. Hosp., Fac. Human Life Sci., Tokyo City Univ.) College) Hot spring water and natural mineral water have been therapeutically Flavobacterium johnsoniae は，Bacteroidetes 門に属する細菌で used to prevent or improve various diseases. Specifically, あり，主に土壌や水中に生息する。同じ門に属する菌として consumption of bicarbonate-rich mineral water (BMW) has been は，歯周病原細菌である Porphyromonas gingivalis やアユ冷水病 reported to prevent or improve type 2 diabetes (T2D) in humans. の原因菌である Flavobacterium psychrophilum がある。これらの However, the molecular mechanisms of the beneficial effects 細菌は近年発見された IX 型分泌機構（T9SS）を有している。P. behind mineral water consumption remain unclear. To elucidate the gingivalis では，T9SS を介して，ジンジパインプロテアーゼなど molecular level effects of BMW consumption on glycemic control, の病原性タンパク質を分泌する。本研究対象の F. johnsoniae にお blood metabolome analysis and fecal microbiota analysis were applied いては，T9SS はキチナーゼなど本菌を特徴づける菌体表層タン to the following test. During the study, 19 healthy volunteers drank パク質の輸送に関与するとともに，本菌の滑走運動とも密接な 500 ml of commercially available tap water (TW) or BMW daily. 関係があることが知られている。また，F. johnsoniae 野生株は， TW consumption periods and BMW consumption periods lasted 栄養飢餓寒天培地上で円状の colony spreading を起こすことが知 for a week each and this cycle was repeated twice. Biochemical られており，この colony spreading には本菌の滑走運動が関係す tests indicated serum glycoalbumin levels, one of the indexes of ることが報告されている。今回，滑走運動に関連する各種の遺 glycemic controls, decreased significantly after BMW consumption. 伝子の欠失株について調べたところ，colony spreading が起きな Metabolome analysis of blood samples revealed that 19 metabolites いことが確認された。さらに，グルコースを寒天培地に添加す including glycolysis-related metabolites and 3 amino acids were ると，濃度依存的に colony spreading が抑制されることがわかっ significantly different between TW and BMW consumption periods. た。一方，軟寒天培地では，上記の現象とは逆に，グルコース Additionally, microbiota analysis demonstrated that composition を添加すると樹枝状の colony spreading を起こすことがわかった。 of lean-inducible bacteria was increased after BMW consumption. Our results suggested that consumption of BMW has the possible potential to prevent and/or improve T2D through the alterations of host metabolism and gut microbiota composition.

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P2-001（WS16-2） VBNC 状態のサルモネラに対す P2-002 わが国の酪農場におけるバルク乳からのレプト るカタラーゼ及びピルビン酸の異なる回復効果 スピラ遺伝子の検出 ○森重 雄太，小池 敦資，天野 富美夫（大阪薬大・薬・生体防御学） ○芦澤 春香，小西 なつこ，村田 亮，中野 良宣，菊池 直哉（酪農大・ 獣医・獣医細菌） Differential resuscitative effects of catalase and pyruvate toward VBNC Salmonella Detection of pathogenic leptospires by PCR from bulk ○Yuta Morishige, Atsushi Koike, Fumio Amano (Lab. Biodefense & tank milk of dairy farms in Japan Regulation, Osaka Univ. Pharm. Sci.) ○Haruka Ashizawa, Natuko Konishi, Ryo Murata, Yoshinori Nakano, Naoya Kikuchi (Dept. Pathobiol., Sch. Vet. Med., Rakuno Gakuen 環境中の細菌は，その大多数が VBNC（viable but non-culturable） Univ.) 状態にあると考えられている。VBNC 化した細菌は，一般的な 培地では増殖できないことから，培養によってその存在を検出 【目的】病原性レプトスピラ血清型 Hardjo は牛のレプトスピラ症 する従来の微生物検査法では検出されず，食品衛生上及び公衆 の原因の 1 つであり，わが国でも広く浸潤していることが以前の 衛生上の問題となる。 のバルク乳および血清を用いた抗体調査により明らかにされた。 本研究では，我が国の食中毒の主たる原因菌の一つである しかし，血清学的には本症の浸潤が証明されているが，病原学 Salmonella Enteritidis（SE）を，酸化ストレス及び乾燥ストレス 的には証明はされておらず，詳細については不明である。本研 によって VBNC 状態へ誘導し，これを増殖可能な状態へ復帰す 究では，既に抗体調査を行っているバルク乳からレプトスピラ る実験系を構築した。酸化ストレス負荷は，過酸化水素を添加 遺伝子の検出を試みた。【方法】2013 年から 2014 年まで全国各 した LB 培地を用いる方法（Morishige et al. 2013）を，乾燥スト 地で採取されたバルク乳 347 検体を使用した。これらのバルク レス負荷は，自動乾燥装置を用いる方法（Tamura et al. 2009）を， 乳から DNA を抽出した後，病原性レプトスピラに特異的である それぞれ用いた。このようにして得た VBNC 菌を，グルコース 遺伝子領域（flaB）を標的とした Nested PCR を実施した。さら を含まない M9 培地に懸濁し，ウシ肝臓由来カタラーゼ（以下カ に PCR 陽性サンプルについてシークエンス解析を実施した。【成 タラーゼ）及びピルビン酸ナトリウム（以下ピルビン酸）を添 績と結論】バルク乳 347 例中 25 例（ 7.2%）が PCR 陽性を示した。 加して，37°C で 6 時間静置することで，増殖可能な状態へ復帰 これらのうち ELISA による抗体検査により強陽性（+++）を示 させた。 したバルク乳 9 例中 1 例（11%）が，中等度陽性（++）を示し その結果，カタラーゼ及びピルビン酸は，酸化ストレスによっ た 100 例中 7 例（7.0%）が，弱陽性（+）を示した 91 例中 9 例 て VBNC 化した SE に対して，共に強力な回復効果を示した。し （9.9%）が PCR 陽性を示した。ELISA 陰性（–）を示した 147 例 かし，乾燥ストレスによって VBNC 化した SE に対しては，カ 中 8 例（5.4%）も陽性を示した。PCR 産物を解析した結果，7 タラーゼのみが回復効果を示し，ピルビン酸は回復効果を示さ 例中 5 例は L. interrogans と一致し，残りの 2 例で L. interrogans なかった。また，SE 内在性のカタラーゼの活性測定及びリアル と L. borgpetersenii の 2 種類が混在していることが判明した。以 タイム PCR 法による katE 発現解析の結果から，酸化ストレスに 上のように，バルク乳からレプトスピラ血清型 Hardjo の遺伝子 よって VBNC 化した SE に対して，ピルビン酸は SE の katE 発 が検出されたことから，わが国においても本菌が浸潤している 現及び内在性のカタラーゼ活性の上昇に寄与することが示され 事が病原学的にも明らかになった。乳汁中にレプトスピラが排 た。 菌されることが推測されるため，子牛あるいは人への感染の可 以上の結果から，SE の VBNC 状態からの復帰に対して，内在性 能性や，搾乳作業等にも十分注意する必要があると思われる。 のカタラーゼが重要な役割を果たすことが示唆される。

P2-003 Helicobacter pylori の自由生活性アメーバ共 P2-004 非結核性抗酸菌のバイオフィルム形成における 培養系における生存性の向上と遺伝子発現差解析 Glycopeptidolipid の役割 ○北条 史1，大 崎 敬子2，米 澤 英雄2，花 輪 智子2，蔵 田 訓2，山 口 博之3， ○西内 由紀子1，戸谷 孝洋2，立石 善隆3，金子 幸弘2，松本 壮吉3 神谷 茂1,2（1杏林大院・医・実験動物，2杏林大・医・感染症，3北大院・ （1大阪市大・医・刀根山結研，2大阪市大院・医・細菌学，3新潟大院・ 保健科学・病態解析・感染制御検査） 医歯総合・細菌学）

Survival of H. pylori with amoeba and the differential The role of glycopeptidolipid of nontuberculous expression analysis of bacterial genes mycobacteria on biofilm formation ○Fuhito Hojo1, Takako Osaki2, Hideo Yonezawa2, Tomoko Hanawa2, ○Yukiko Nishiuchi1, Takahiro Totani2, Yoshitaka Tateishi3, Yukihiro Satoshi Kurata2, Hiroyuki Yamaguchi3, Shigeru Kamiya1,2 (1Inst. Lab. Kaneko2, Sohkichi Matsumoto3 (1Toneyama Inst. Tuberculous Res., Anim. Grad. Sch. Med., Kyorin Univ., 2Div. Med. Microbiol., Dept. Sch. Med., Osaka-city Univ., 2Dept. Bacteriol., Sch. Med., Osaka-City Infect. Dis., Kyorin Univ., 3Dept. Med. Lab. Sci., Fac. Health Sci., Univ., 3Dept. Bacteriol., Sch. Med., Niigata Univ.) Hokkaido Univ.) 環境から感染すると考えられている肺 Mycobacterium avium 胃炎・十二指腸潰瘍の起因菌である Helicobacter pylori の感染経 complex（MAC）症は，罹患率が 10 年間で約 3 倍に増加して公 路に関しては，口－口感染及び糞－口感染が想定されているが， 衆衛生上の新たな課題となっている。MAC 症の罹患率を減少さ 本菌の環境への分布も示唆されており，十分な解明はなされて せるためには，感染源・感染経路において定着している菌のク いない。一方，自由生活性アメーバ等の原生動物は，水系・土 リアランス，とくにバイオフィルム対策が重要である。細胞壁の 壌環境に普遍的に分布しており，通常は細菌を捕食して生きて 最外層に存在する Glycopeptidolipid（GPL）は sliding motility や いる。一部の細菌は捕食消化作用に抵抗を示し原生動物細胞内 バイオフィルム形成に関わっていると言われているが，その詳細 及び細胞外において生存・増殖するため，原生動物はこれらの は不明である。さらに GPL は抗原性をもっているため診断に利 細菌の環境中リザーバーとなっている。本研究は H. pylori の感 用されている。そこで M. avium subsp. hominissuis（MAH）のバ 染経路における原生動物の役割を明らかにすることを目的とし イオフィルム形成における GPL の役割を明らかにすることを目 て本菌と自由生活性アメーバである Acanthamoeba castellanii の共 的として研究を行った。用いた菌は感染源の浴室から分離した 培養実験を行い，本菌の菌数算定と形態観察，RNA-seq による MAH OCU806 と標準株の MAH104 および GPL を欠損したラフ 遺伝子発現差解析を行った。 型株（MAH OCU817, MAH104R）であり，気液界面に形成され 24 時間培養後においては H. pylori 単独培養系における生菌数が る菌膜型のバイオフィルム形成を指標とした。GPL 産生菌は厚 検出限界以下となったのに対し，共培養系における本菌生菌数 い菌膜を形成し，産生しない菌は薄い菌膜とガラス試験管の壁を は約 1.93×106 CFU/ml であった。本菌の形態は単独培養系におい 遡上する菌塊が認められた。GPL を産生しない菌に GPL を添加 てはコッコイド化した菌が見られたのに対し，共培養系におい して低酸素環境で培養すると菌膜の肥厚が認められた。菌膜が厚 てはらせん状の形態を維持していた。また，トランスクリプトー いほど消毒剤に対して抵抗性を増すかどうか検討したところ，次 ム解析の結果，共培養系の H. pylori において単培養系と比較し 亜塩素酸ナトリウム 1000 ppm は，浮遊状態の菌を 4 株とも 60 分 て 265 の遺伝子に発現増強を認めた。一方で単培養系の本菌に 以内に完全に殺菌したが，菌膜を形成した菌を 60 分処理後も 0.1% おいては 143 の遺伝子に発現増強を認めた。これらの発現増強 以下に死滅できなかった。すなわちバイオフィルム形成 MAH は， を認めた遺伝子が本菌の形態維持および A. castellanii 共培養下に GPL の有無にかかわらず消毒剤に対して強い抵抗性を示した。 おける生存性向上に関与していることが示唆された。 このことは，GPL が厚い菌膜形成に関わっているが，バイオフィ ルム形成に必須ではないことを示している。

111 P2-005 原始クラミジア Neochlamydia 共生アメーバ P2-006 原始的なクラミジア Parachlamydia におけるレジオネラ撃退に関わる責任分子の探索 acanthamoebae Bn9 は何故ヒト株化細胞 HEp-2 内で増殖で ○米田 千夏1，松尾 淳司1，山崎 智拡1,2，大久保 寅彦1，中村 眞二3， きないのか 4 1 1 2 永井 宏樹 ，山口 博之 （ 北大・保科・病態， 日本学術振興会特別 ○瀧 圭介1，山崎 智拡1,2，松尾 淳司1，大久保 寅彦1，中村 眞二3，山 3 4 研究員 DC1， 順天堂大・医・研究基盤センター， 阪大・微研） 口 博之1（1北大・保科・病態，2日本学術振興会特別研究員 DC1，3順 天堂大・医・研究基盤センター） Screening for candidate genes preventing Legionella infection in Neochlamydia symbiotic amoebae Failure of Parachlamydia acanthamoebae Bn9 growth ○Chinatsu Maita1, Junji Matsuo1, Tomohiro Yamazaki1,2, Torahiko into immortal human epithelial HEp-2 Okubo1, Shinji Nakamura3, Hiroki Nagai4, Hiroyuki Yamaguchi1 ○Keisuke Taki1, Tomohiro Yamazaki1,2, Junji Matsuo1, Torahiko (1Faculty. Health Sci. Hokkaido Univ., 2JSPS Research Fellow, 3Div. Okubo1, Shinji Nakamura3, Hiroyuki Yamaguchi1 (1Faculty Health Sci. Biomed. Imag. Res., Juntendo Univ. Grad. Sch. Med., 4RIMD, Osaka Hokkaido Univ., 2JSPS Research Fellow, 3Div. Biomed. Imag. Res., Univ.) Juntendo Univ. Grad. Sch. Med.)

原始クラミジア Neochlamydia（Neo）は，アカントアメーバ（ア 原始的なクラミジアの一種Parachlamydia acanthamoebae Bn9 メーバ）に共生する偏性細胞内寄生性細菌である。性感染症など （PaBn9）は，性感染症や呼吸器疾患を起こす病原性クラミジアの を引き起こす病原性クラミジアと比べてゲノムサイズが約 2 倍程 太古の姿を留めた偏性細胞内寄生性細菌と考えられ，クラミジア 度大きく，進化の過程で病原性クラミジアが宿主である哺乳動物 の適応進化機構を紐解く上で極めて有用な細菌である。病原性ク に適応するために捨て去った機能分子を今も温存している可能性 ラミジアに比べ発育至適温度は低く，37°C ではヒト株化細胞内 がある。これまで私達は Neo が共生するアメーバで，本来アメー では増殖できない。その一方，この PaBn9 が低温下 30°C では株 バの天敵であるレジオネラ（Legionella pneumophila: Lp）が増殖 化ヒト細胞 HEp-2 内において活発に増殖することを見つけ以前 できないことを見つけた。除菌アメーバで Lp は増殖できるので， 報告した。そこで本研究では，37°C 下では増殖できない理由を Neo が共生するアメーバに打ち込むエフェクター分子が，Lp の 解明するために 30°C での PaBn9 増殖様式を 37°C での病原性ク 感染 / 増殖を制御している可能性があり，アメーバでの Lp の増 ラミジア（Chlamydia trachomatis など）の増殖様式と比較し，原 殖に必須な Lp IV 型分泌エフェクター分子をその標的候補と予想 始クラミジアには見られない特徴を探った。その結果，30°C 低 している。そこで，GFP 発現 Lp を用いて，アメーバへの Lp 感 温条件下において PaBn9 特異的菌体クラスターが核周囲に観察さ 染を可視化した上で，Lp 野生株と IV 型分泌装置欠損株をそれぞ れた。37°C では菌体の核周囲への移動は観察されたがクラスター れ Neo 共生アメーバに感染させ，野生株感染時にのみ発現上昇 形成は認められなかった。菌体クラスター形成は，cytochalasin D， する遺伝子を DNA マイクロアレイで絞り込むことにより撃退機 rifampicin，または lactacystin の添加で抑制された。興味深いこ 構を探った。その結果，Lp 野生株と欠損株はいずれもアメーバ とに，病原性クラミジアが細胞内に形成する典型的な封入体は確 に感染できなかった。DNA マイクロアレイでは，Lp 感染アメー 認できなかった。PaBn9 ドラフトゲノム配列からは，病原性クラ バで特異的に発現が上昇する複数の遺伝子を見つけたが，Lp 欠 ミジアと同様に III 型分泌装置をコードする遺伝子クラスターが 損株感染時に比べシグナルは強いものではなかった。予備的な所 確認されたが，封入体形成に必須な Inc 蛋白をコードする遺伝子 見であるが，Neo を除菌すると，アメーバのアクチン重合が抑制 は見つからなかった。これらの結果より，原始クラミジア PaBn9 されることを示唆する 2D-DIGE と質量分析結果が得られた。そ が病原性クラミジアと同様にヒト細胞内で増殖する最低限の能 こで DNA マイクロアレイのデータを踏まえ，アメーバの細胞骨 力を備えていることが明らかになった。Inc 蛋白の欠損は菌体の 細胞内での感知を容易にすると考えられ，現在 を強制発現 格と Lp 撃退との関連性を精査している。（非会員：松下瑞江 1） IncA させた細胞での PaBn9 の増殖様式の検討を進めている。

P2-007 コルカタ市環境水から単離された Vibiro P2-008 非結核性抗酸菌の土壌における群集構造 cholerae の VPI と CTXΦ の多様性 ○一條 知昭1，鍵村 直樹1，菅田 真理2，山口 進康1，那須 正夫1（1大 2 ○水野 環1,2，今村 大輔2，Asish K. Mukhopadhyay3，三好 伸一1，篠 阪大・院薬・衛生・微生物学， 大阪大・薬・衛生・微生物学） 田 純男2（1岡山大・院医歯薬総合・環境生物，2岡山大・インド感染 症共同研究センター，3NICED） Community structure of nontuberculous mycobacteria in soil environments Diversity of VPI and CTXphi of Vibrio cholerae isolated ○Tomoaki Ichijo1, Naoki Kagimura1, Mari Sugata2, Nobuyasu from environmental water sample in Kolkata Yamaguchi1, Masao Nasu1 (1Env. Sci. Microbiol., Grad. Sch. Pharm. ○Tamaki Mizuno1,2, Daisuke Imamura2, Asish K. Mukhopadhyay3, Sci., Osaka Univ., 2Env. Sci. Microbiol., Fac. Pharm. Sci., Osaka Shin-ichi Miyoshi1, Sumio Shinoda2 (1Grad. Med, Dent. Pharm. Sci., Univ.) Okayama Univ., 2Collab. Res. Ctr., Okayama Univ. in India, 3NICED) 【目的】非結核性抗酸菌症の患者数は 1990 年代以降，先進国を コルカタ市はコレラをはじめとした腸管感染症の多発地域であ 中心に世界中で増加している。身の回りの水環境や土壌環境で る。生活用水に池や河川の水を使用するこの地域の人々にとっ 生じたエアロゾルが感染の媒介となっていると考えられている て，Vibrio cholerae O1/O139（コレラ菌）の糞口感染により生じ ものの未だ感染源，感染経路は明らかとなっていない。環境中 るコレラは，汚染された水が感染源であると考えられる。しか での非結核性抗酸菌の動態の解明が予防にあたっては不可欠で しながら，環境水からのコレラ菌の分離頻度は極めて低く，通 あることから，本研究では，感染源のひとつとして考えられて 常の培養法では単離できない VBNC（Viable but non-culturable） いる土壌に着目し，抗酸菌の現存量およびその群集構造を分子 状態で存在することが予想される。これまで我々は通常の培養 微生物生態学的手法により明らかとした。 方法より分離頻度が上昇する，ヒト結腸上皮細胞由来の HT-29 【方法】大阪大学吹田キャンパス内の 23 地点の表層土壌（庭園 3 ヶ 細胞から調製した細胞破砕物（FCVC）を添加した TCBS 培地 所，樹木下 10 ヶ所，植生のある土壌 6 ヶ所，植生のない土壌 4 ヶ所） （F-TCBS 培地）を使用することにより，V. cholerae を単離してき および植木鉢土壌 4 ヶ所を採取し，土壌中の微生物より DNA を た。本研究では，通常の TCBS 培地及び F-TCBS 培地を用いて 抽出した。細菌，抗酸菌の現存量は，それぞれ 16S rRNA 遺伝子， 環境水から単離した V. cholerae に対し，病原性遺伝子（コレラ毒 atpE 遺伝子を標的とした定量的 PCR 法により測定した。また， 素遺伝子 ctxA 及び TCP 線毛遺伝子 tcpA）の検出を行った。その 抗酸菌の群集構造は hsp65 遺伝子を標的とした pyrosequencing 結果，2013 年 1 月から 2015 年 7 月までにコルカタ市のため池 3 により決定した。 地点 4 カ所から単離した V. cholerae 8,656 株のうち，O1 コレラ菌 【結果と考察】対象とした土壌において細菌，抗酸菌の現存量は は 2 株であったが，V. cholerae non-O1/non-O139 の ctxA 陽性株は それぞれ 107～109 cells/g，105～107 cells/g であり，乾燥している 6 株，tcpA 陽性株は 181 株であった。また，ctxA 及び tcpA 陽性 試料を除き，抗酸菌は全細菌に対し 0.1～10% の比率で存在して 株に関してゲノム解析を行ったところ，CTXΦ 及び VPI（Vibrio いることがわかった。また，群集構造解析により多様な種の非 pathogenicity island）について多様性が確認できた。これまでの 結核性抗酸菌が存在していることが明らかとなった。これらの ところコルカタ市の環境水から単離された ctxA 陽性株は少ない うち，臨床上重要な Mycobacterium avium に着目したところ，（1） ものの，CTXΦ の受容体として機能する tcpA を保有する株が複 今回対象とした土壌には幅広く存在すること，（2）乾燥と湿潤 数単離されたことから，新たな流行株出現の危険性が危惧され を繰り返す環境において優占する可能性があることを見出した。 る。 当研究室では身の回りの水環境においても検討を進めており， これらの結果を統合して考察することにより，非結核性抗酸菌 の感染源の理解に貢献できると考えている。

112 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P2-009 環境中のキノロン耐性菌について P2-010 沖縄県内の環境水からの AmpC 及び MBL 産 ○馬場 理，佐々木 崇，森本 ゆふ，平松 啓一（順天堂大学医学研究 生菌の分離 科感染制御科学研究センター／微生物学講座） ○宮城 和文，平井 到（琉大・医・保健・病原体検査学） On environmental quinolone-resistant bacteria Detection of AmpC and MBL-producing bacteria from ○Tadashi Baba, Takashi Sasaki, Yuki Morimoto, Keiichi Hiramatsu environmental water in Okinawa Prefecture (Dept. Microbiology and Infection control Science, Juntendo Univ. ○Kazufumi Miyagi, Itaru Hirai (Lab. Microbiol., Sch. Health Sci., Fac. Sch. Medicine) Med., Univ. of the Ryukyus)

放線菌が産生する抗生物質ナイボマイシン（NYB）や植物由来 【目的】AmpC β- ラクタマーゼ（AmpC）やメタロ β- ラクタマー のアピジェニン（API）はキノロン耐性菌の生育を抑制するが， ゼ（MBL）産生菌は臨床だけでなく環境への拡散も危惧される キノロン感受性菌には奏功しないという特異な性質を示す。キ が，我が国における AmpC 及び MBL 産生菌の環境調査はほと ノロン耐性の多くは，この薬剤が標的とする細菌 Type IIA DNA んど実施されていない。そこで，沖縄県内の AmpC 及び MBL 産 topoisomerase のキノロン耐性決定部位（QRDR）に起きる点変 生菌について，どのタイプの β- ラクタマーゼ遺伝子を保有する 異によってもたらされるが，NYB や API 存在下で同薬剤の耐性 菌種が環境水へ拡散しているのかを明らかにする。【方法】環境 菌を選択すると，QRDR のアミノ酸配列がキノロン感受性の野 水は沖縄県内の 4 浄化センターの下水と 18 河川の河川水を採 生型に復帰し，それに伴い MIC 値もキノロン感受性を示す。我々 取した。AmpC 産生菌の判定は，CLSI 法によって ESBL 産生菌 は，このような全く新しい物質を「復帰抗生物質」と名付けて と判定された株と同法のクラブラン酸合剤よりも各単剤のほう 報告し，キノロン耐性菌による感染症治療困難を克服する切り の阻止円が大きくなった株について，ボロン酸を用いたダブル 札と期待しているが，そもそもなぜ自然界に復帰抗生物質が存 ディスク法（DDST）で行った。MBL 産生菌の判定は，イミペ 在するのだろうか？自然界にキノロン感受性菌が圧倒的に多け ネムディスクでの薬剤感受性試験の判定が“耐性”または“中 れば復帰抗生物質は不要なので，「自然界にはキノロン感受性菌 間”を示す株についてメルカプト酢酸を用いた DDST で行っ が多い」という前提に誤りがあるのではないか？と思い至り， た。AmpC 遺伝子の確認は Perez-Perez らの Multiplex PCR 法で 種々条件下の環境菌を集め，キノロン耐性菌と API 耐性菌をそ 行い，MBL 遺伝子は IMP 型，VIM 型及び NDM-1 型検出用のプ れぞれ寒天培地上で選択し，16S rRNA 配列に基づく細菌叢クラ ライマーを用いて行った。【結果と考察】分離された AmpC 産生 スター解析を，次世代シークエンサーを用いて行った。その結果， 菌は Enterobacter cloacae，Escherichia coli 等 6 菌種 16 株であった。 多種多様のキロノン耐性菌が見いだされた。しかし，そこには AmpC 遺伝子は EBC，CIT，DHA group の順に多く検出された。 ヒトに病原性を持つ菌が属する分類上の目（もく）がほとんど MBL 産生菌は DDST で典型的な阻止帯を示さない擬陽性の株が 含まれない一方，API 耐性（≒キノロン感受性）菌にはそれが含 12 株分離され，菌種は E. cloacae 等の 4 菌種であった。いずれの まれることが分かった。この結果より，従来キノロンが臨床で 株も IMP，VIM 及び NDM-1 型遺伝子検出用プライマーで陰性 奏功していたのは，ヒトに病原性をもつ菌のほとんどがたまた だった。日本国内の MBL 産生菌は主に IMP 型や VIM 型であり， ま感受性だったからに過ぎず，進化の過程で感受性菌のみが選 今回の分離株は非典型的であり MBL 産生菌の可能性は低いと思 択的に病原性を持つに至ったことが示唆される。 われるが，環境中にはプラスミド性の可能性のある AmpC 産生 菌も分離されたことから，引き続き両 β- ラクタマーゼ産生菌の 監視を行っていく必要があると思われた。

P2-011 生活環境空気中の浮遊薬剤耐性菌 P2-012 Campylobacter. jejuni の自己凝集因子の解析 ○吉家 清貴，大岡 唯祐，藺牟田 直子，西 順一郎（鹿児島大学医歯 ○山本 倫也，溝手 朝子（山口県立大学・栄養・食品衛生） 学総合研究科 微生物学分野） Analyses of self-aggregating factors in Campylobacter. Airborne drug-resistant bacteria in human living space jejuni ○Kiyotaka Yoshiie, Tadasuke Ooka, Naoko Imuta, Junichiro Nishi ○Tomoya Yamamoto, Tomoko Mizote (Dept. Human Nutrition, (Dept. Microbiol., Kagoshima Univ. Sch. Med. Dent. Sci.) Yamaguchi Pref. Univ.)

Background: Extended spectrum beta lactamases (ESBLs)- 【目的】C. jejuni は，食物由来食中毒原因菌として世界中で知ら producing bacteria and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae are れている。わが国においても細菌性食中毒では最多となってお clinically important. Soil bacteria are reported to become airborne り，フードチェーン各段階の衛生管理の徹底が急務である。C. by wind. We collected CTX- or IPM-resistant airborne bacteria and jejuni は，低温では増殖できないとされるが，その原因について examined their spectrum of drug resistance. Methods: Naturally 詳細は不明である。本研究では，C. jejuni の増殖を制御する因子 falling airborne bacteria within 30 min were collected on 30 μg/ml of の存在を検討した。【材料及び方法】C. jejuni（JCM2013）を使 CTX- or 2 μg/ml of IPM-containing BHI agar plates in a gymnasium 用した。培地には，Brucella 培地を用いた。必要に応じて，非働 and an open dining place. Isolated bacteria were identified by 化馬血清 3% または担体（5%～30% v/w Diaion HP-20）を添加し MALDI biotyper, and their drug resistance were determined by BD た。培養は 30～42°C 微好気条件下で行った。液体培養における SensiDisks; PCG, ABPC, CTX, CAZ, ABPC/CVA, IPM, MEPM, 増殖変化を，濁度（OD600）及び CFU を用いて比較した。担体 LMOX, CPR and CFPM. Results: Five naturally fallen drug-resistant を添加した Brucella 培地で 30°C，120 時間培養した培養液から bacteria were obtained. Two bacteria from the open dining room DiaionHP-20 を回収し，メタノール抽出した物質を蒸発乾固させ， belonged to genus Bacillus and were resistant for almost all tested 0.1N NaOH に溶解して使用した。増殖能は，24Well microtiter drugs. Three from the gymnasium belonged to genus Paenibacillus, plate を用い，OD6000.15～0.20 もしくは，OD6000.6～0.65 の菌液 Cellulosimicrobium, or Microbacterium, and showed resistance for を用いて，マイクロプレートリーダーで計測した。【結果及び考 CTX, CAZ, MEPM and LMOX. They did not produce ESBL or 察】C. jejuni は，培養液中に担体を添加することで，30°C にお carbapenemase. Discussion: Bacteria found in soils, dairy products いても良好な増殖がみられた。担体の添加量は，5% v/w が最も and wastes were airborne, and might be inhaled by respiration. Some 良い増殖を示した。担体が吸着したものを回収し，C. jejuni に添 bacteria of isolated genera were pathogens of opportunistic infection. 加したところ，37°C で 10 時間～16 時間静置すると凝集塊が形 We are examining whether these bacteria can transfer their resistant 成されたことから，自身の凝集を促進する因子を分泌している genes to Enterobacteriaceae. ことが示唆された。C. jejuni の増殖には，自身が産生する因子が 何らかの影響を及ぼしており，低温で増殖できないことに関与 している可能性がある。この自己凝集因子は H. pylori に対して 影響を及ぼさなかった。（会員外共同研究者：清水亜依美）

113 P2-013 らい菌増殖に於ける globi 形成の意義 P2-014（WS23-7） サルモネラの乾燥耐性獲得に及 ○天児 和暢1，飯田 健一郎1，齋藤 光正1，甲斐 雅規2，小椋 義俊1， ぼす SEp22 (Dps)，栄養因子，及び菌の密度の効果 1 1 1 2 吉田 眞一 ，林 哲也 （ 九大院・医・細菌学， 国立感染症研究所ハ ○天野 富美夫，野々垣 早利美，伊都 安紀子，森重 雄太，小池 敦資（大 ンセン病研究センター） 阪薬大・薬・生体防御学）

Biological significance of the Globi formation in the Effects of SEp22, nutrition factor, and cell density on growth of M. leprae acquisition of dry-resistance by Salmonella 1 1 1 ○Kazunobu Amako , Kenichiro Iida , Mitsumasa Saito , Masanori ○Fumio Amano, Satomi Nonogaki, Akiko Ito, Yuta Morishige, Atsushi 2 1 1 1 1 Kai , Yoshitoshi Ogura , Shinichi Yoshida , Tetsuya Hayashi ( Dept. Koike (Lab. Biodefense & Regulation, Osaka Univ. Pharm. Sci.) Bacteriol, Fac. Med Sci, Kyushu Univ., 2Leprosy Research Center, National Institute of Infectious Diseases) サルモネラ Salmonella Enteritidis（SE）は自然環境中に広く分布 し，乾燥に耐性を示す。我々は既に SE の乾燥耐性獲得の評価系 ハンセン病の感染組織内にはらい菌が多数集合し菌塊を形成す を確立し，本研究では，LB 培地などの栄養因子と菌の遺伝要因 る Globi 形成と呼ばれる構造が屡々見られ，らい菌感染の特徴 としての SEp22 に加え，菌の密度が乾燥耐性獲得に重要な役割 的な形態とされている。何故この様な集合体を作って増えるの を果たすことを示唆する新たな知見を得たので報告する。実験 か，その理由は未だよく分っていない。著者等は長年らい菌の には，SE の病原性の親株，SECl#15-1 とその SEp22（Salmonella 試験管培養を試みているがまだ，確実に培養できるという結果 Dps）欠損株，KO-5 株を LB 培地中で前培養して対数増殖期の を得ていない。しかし，人血漿を添加した培地で 3–5 ヶ月培養 菌を調製して使用した。菌を洗浄後，グルコースを除いた M9 最 を続けると，数倍の菌数の増加を見る事が明らかになった。そ 少培地を 10% 含む生理食塩水に終濃度 10%LB 培地を添加，あ の様な場合に，試験管内でも屡々 globi 状の大きな菌の集合体を るいは非添加し，これらに 1×1010 CFU/mL～1×108 CFU/mL とな 作っているのが観察された。培養そのものは未だ確実とは言え るように菌を懸濁した。10μL を乾燥チューブに入れて室温で一 ないが，らい菌は生体内のみならず，試験管内で増える時も凝 晩，自動乾燥機内で乾燥させた。氷冷した 1 mL の PBS を加え 集体を作る可能性が考えられる。以前行った電子顕微鏡による て乾燥から復帰させて系列希釈した後，LB 寒天培地上に塗布し globi の観察で，globi 内で多くの菌が壊れ変性していることが観 て 37°C で加温し，形成されたコロニー数を計測した。その結果， 察された事を勘案すると，らい菌は増殖途中に変性する菌が多 親株は，10%LB 存在下の乾燥では高い割合で生残し，LB 不含で く，その時に死菌から流出する物質を利用して残りの菌が増殖 は高密度でごく僅か生残した。また KO-5 株は LB 存在下でも全 すると言う可能性も考えられる。この様に考えると，globi 形成 般に生残性が低く，とくに低密度では低かった。さらに親株は， はこの菌の増殖には欠かせない重要な形態である事が予想され 10%LB 存在下では菌密度が低い方が乾燥による生残割合が高く， る。また，この様な増殖では，全ての菌が増殖に関与しないので， LB 非存在下では菌密度が高くないと生残できなかった。以上の 通常の細菌が示す対数増殖という増殖パターンを採らず，ゆっ 結果から，菌の密度は SE の乾燥耐性獲得に大きな影響を示し， くりとなだらかな増殖曲線を取る可能性をも示唆している。こ 菌密度が高いと，SEp22 の存否に拘わらず，また培地の種類に れらの事を勘案すると，らい菌の培養では，globi 状の菌の集合 よらず，SE は乾燥ストレスに抵抗して生残し，コロニーを形成 体を作り易い状態にする事と，急速な増加は期待できず長期間 することが示唆された。 の緩やかな増殖となる可能性を考え増殖を判断する必要がある。

P2-015 教育施設で共用されるスポーツ用具の細菌分布 P2-016 嫌気脱窒条件下における緑膿菌のバイオフィル と管理者の認識について ム構造は細胞外 DNA によって維持される ○上岡 尚代1，中島 拓磨1，橋本 和幸2，伊藤 まもる3（1了徳寺大学健 ○清川 達則1，野村 暢彦2（1筑波大・院・生命環境，2筑波大・生命 康科学部，2了徳寺大学教養部，3法政大学法学部） 環境）

Contamination of the Shared Gym Equipment in Schools; Extracellular DNA maintains Pseudomonas aeruginosa the Real and the Experience of Supervisors biofilm structures under denitrifying conditions ○Naoyo kamioka1, Takuma Nakajima1, Kazuyuki Hashimoto2, ○Tatsunori Kiyokawa1, Nobuhiko Nomura2 (1Grad. Sch. Life Environ. Mamoru Itou3 (1Fac. Health Science, Ryotokuji Univ., 2Center of Sci., Univ. Tsukuba, 2Fac. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba) Liberal Arts Education, Ryotokuji Univ., 3Fac. Law, Hosei Univ.) 好気性細菌として知られる緑膿菌は，嫌気条件下においても窒 Objective: Hygiene control must be indispensable issue for 素酸化物を用いた嫌気呼吸（脱窒）により良好に増殖できるこ school gym and its equipment to avoid students from the infection. とが明らかになってきた。また，感染部位の一つである痰の内 To establish a standard strategy for hygiene control, we tried to 部は低酸素状態であることから，緑膿菌の嫌気条件下における investigate the extent of contamination in some schools. Methods: 知見の重要性が世界的に報告されている。緑膿菌感染症の慢性 Eight schools from several grades participated in this investigation. 化には，本菌の持つ高い Biofilm（BF）形成能が関与すると考え Smear specimens from gym equipment such as vaulting boxes, gym られている。そのため，緑膿菌の BF に関しては現在までに様々 mats, tatami-mats for Judo and protective gears for Kendo were な解析が行われてきた。しかしながら，前述した嫌気脱窒条件 subjected for bacterial screening, and bacterial growth were checked 下における BF に関する報告は非常に少ない。先行研究において， by selective agar-plates. Moreover, we focused on Streptococci 我々は嫌気脱窒条件下の BF は好気条件下とは異なる構造を形 that are major bacteria on our skin and classify them through 成し，細胞外多糖がこの構造変化に関係していることを示した。 RFLP of 16S rRNA, because Streptococci are one of the major 本研究では，嫌気脱窒条件下における多糖以外の BF の構成成 germs of dermatological infections. Results: Distinct differences 分に着目し，BF 形成への関与について解析した。供試菌株には of contamination levels in those equipment were observed among Pseudomonas aeruginosa PAO1 株を用いた。BF 形成量の定量には schools. However, experiences of supervisors were not intended to CV アッセイ法を用い，BF 構造の観察には染色を必要としない keep hygiene conditions of their equipment despite more than 85% COCRM 顕微鏡法を用いた。BF の主要な構成成分として DNA of them recognize the importance of hygiene conditions to avoid やタンパク質が知られている。各成分が BF 形成に関与している student from infections. Discussion and conclusion: Analytical のかを解析するため，分解酵素添加時の BF 形成量および BF 構 considerations for differences of using duration, environment 造を観察した。その結果，DNA 分解酵素を添加した場合にのみ for storage and respective hygiene control must be required for BF 形成量の顕著な低下および BF 構造の崩壊が観察された。以 establishing standard strategy to keep hygiene environment of gym 上から嫌気脱窒条件下における BF は細胞外 DNA が重要な構成 equipment in schools. 成分であることが示唆された。細胞外 DNA は抗生物質への耐性 化にも寄与することから，嫌気脱窒条件下における BF の抗生物 質耐性に関しても解析を進めている。【会員外共同研究者：豊福 雅典（筑波大・生命環境），八幡 穣（Inst. Environ. Eng., ETH）】

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P2-017 変化する hemin 濃度が Porphyromonas P2-018 Mycobacterium avium の酸性環境下で誘導さ gingivalis 菌株に異なった影響を及ぼす れるアルギニンデイミナーゼの解析 ○大屋 学1，田村 宗明2,3，Marni E. Cueno2，落合 邦康2,3（1日大・大 ○瀧井 猛将1，小川 翔大1，山本 龍二1，伊藤 佐生智1，堀田 康弘2， 学院・歯学・口腔健康科学，2日大・歯・細菌，3日大・総歯研・生体 大原 直也3，小川 賢二4，八木 哲也5，前田 伸司6，藤原 永年7，山崎 防御） 利雄8，西森 敬9，後藤 義孝10，肥田 重明1，小野嵜 菊夫1（1名市大・ 院薬・衛生化学，2結核予防会・結核研・生体防御，3岡大・院医歯薬 Varying hemin concentrations affect Porphyromonas 総合・口腔微生物，4国立東名古屋病・臨床研，5名大病院，中央感染 gingivalis strains differently 制御，6北海道薬大，7帝塚山大・現代生活，8感染研・バイオセーフティ， 9 10 ○Manabu Ohya1, Muneaki Tamura2,3, Marni E. Cueno2, Kuniyasu 国立動物衛生研， 宮崎大・院農・獣医微生物） Ochiai2,3 (1Div. Oral Health Sci., Nihon Univ. Sch. Dent. Grad. Sch. Dent., 2Dept. Microbiol., Nihon Univ. Sch. Dent., 3Div. Immunol. Induction of arginine deiminase by acidic environment in Pathobiol., Dent. Res. Cent., Nihon Univ. Sch. Dent.) Mycobacterium avium ○Takemasa Takii1, Shota Ogawa1, Ryuuji Yamamoto1, Saotomo Itoh1, 【目的】 は代表的な慢性・侵襲性歯周病の原因菌である Yasuhiro Horita2, Naoya Ohara3, Kenji Ogawa4, Tetsuya Yagi5, Shinji Hemin 6 7 8 9 Porphyromonas gingivalis の生育必須栄養素であり，至適濃度は 5 Maeda , Nagatoshi Fujiwara , Toshio Yamazaki , Kei Nishimori , Yoshitaka Goto10, Shigeaki Hida1, Kikio Onozaki1 (1Dept. Mol. Health ppm と報告されている。しかし，ヒト歯周ポケット内は，病態 2 の進行状態で歯周組織の破壊状態が異なることから歯肉溝滲出 Sci. Grad. Sch. Pharm. Sci. Nagoya City Univ., Dep. Path. and Host Def., Anti-tuberculosis Association, 3Oral Microbio. Grad. Sch. 液中の hemin 濃度は常に変化していると考えられ，hemin 濃度 Med. Dent. and Pharm. Sci. Okayama Univ., 4Dept. Clin. Research, の変化は，P. gingivalis の発育や生理活性に影響する可能性が National Hosp. Organization, Higashinagoya National Hosp., 5Dept. ある。今回，我々は，線毛タイプの異なる P. gingivalis の発育 Control of Infection, Nagoya Univ. Hosp., 6Hokkaido Phar. Univ., 7Fac. ・生理活性に及ぼす hemin の影響について検討した。【方法】 Contemp. Human Life Sci., Tzukauama Univ., 8Dep. Biosafety, NIID, 実験にはP. gingivalis FDC381（線毛 typeI）， MPW1b-01（ 線毛 9Natl. Agri. and Food Res. Org., 10Dep. Micro., Grad. Sch. Veterinary typeIb），TDC60（線毛 typeII），ATCC49417（線毛 typeIII），W83（線 Med., Miyazaki Univ.) 毛 ）および （線毛 ）の 株を供試した。 typeIV HNA99 typeV 6 【目的】当研究室では，非結核性抗酸菌 Mycobacterium avium を酸性条件下で培養する Menadione 0.5 ppm を含む BHI broth に hemin を種々の濃度で添 と菌体外 pH を上昇させること，pH 上昇の原因物質がアンモニアであることを見出 加し，嫌気培養後，菌液濁度（OD 600nm）を計測した。集菌・ している。アンモニア産生機構としてアルギニンデイミナーゼ（ADI）経路に着目し， 洗浄後の菌体を破砕した後，細胞内の Arg-gingipain 活性，過酸 これらの機構について詳細を検討した。【方法】酸性の 7H9 培地で，臨床分離株，動 化水素量および SOD 量を計測し，それぞれの菌株の生理活性を 物由来，環境由来の株を 21 日間培養し，培養上清の pH を測定した。ADI 経路の基 評価した。【結果および考察】培養 24 時間後の OD 測定の結果， 質であるアルギニンを添加し，21 日間培養後のアンモニアを glutamate dehydrogenase （GLDH）法により測定した。また，ADI 阻害剤のアミノグアニジンを添加し pH を FDC381，TDC60，ATCC49417 および W83 の 4 株は OD = 1.0 を 測定した。ADI 経路の責任遺伝子の 1 つ arcA の発現変化をリアルタイム PCR 法，タ 越え，十分発育した。それら 4 菌株の細胞内 Arg-gingipain 活性 ンパク発現をウエスタンブロッティング法で測定した。ArcA の酵素活性は Knipp & を測定した結果，菌株間に差が認められた。また，hemin 濃度に Vasak らの方法により測定した。菌体内 pH の測定は蛍光法で測定した。【結果・考察】 よる過酸化水素量および SOD 量の変化のパターンも菌株ごとに アルギニン添加によりアンモニア産生が起こること，アミノグアニジン添加により濃 異なり，P. gingivalis は線毛のタイプ別で環境 hemin 濃度により 度依存的な pH 上昇の抑制が見られたことから，アルギニン代謝が菌体外 pH の上昇に 発育および生理活性に影響が認められることが確認された。こ 重要であることが示唆された。菌体内 pH は菌体外 pH に比例して低下した。M. avium の ArcA 組換えタンパク質の酵素活性の至適 pH は酸性側であり，菌体外の環境変化に れらの結果から，臨床症状の進行に伴う歯周ポケット内の hemin 応じて機能することが示唆された。由来の異なる菌株の菌体外 pH 上昇と増殖の相関 濃度の変化から，歯周病進行状態によって病巣局所内において から大きく 3 つのグループに分類され，各グループ内の由来に偏りがあることから環 優勢となる株が常に変化する可能性が考えられる。 境指向性，ヒトや動物指向性の菌が存在していることが示唆された。

P2-019 大腸菌のアルカリ条件下における新規細胞分裂 P2-020 新規顕微鏡技術を用いたう蝕原性菌が形成する 維持機構の解析 複合系口腔内バイオフィルムの 3 次元構造解析 ○山口 利男，橋本 充，本田 貴，山本 永，福原 正博（新薬大・薬・ ○中西 康大1,2，山本 達也1，尾花 望1，豊福 雅紀1，金子 明寛2，野村 微生物学） 暢彦1（1筑波大・生命環境，2東海大・医）

Possible roles of Escherichia coli DedD protein in cell Three dimensional visualization of mixed species oral division under alkaline environment biofilm by a new microscopy technique ○Toshio Yamaguchi, Takashi Hashimoto, Takashi Honda, Haruka ○Yasuhiro Nakanishi1,2, Tatsuya Yamamoto1, Nozomu Obana1, Yamamoto, Masahiro Fukuhara (Dept. Microbiol., Fac. Pharm., Masanori Toyofuku1, Akihito Kaneko2, Nobuhiko Nomura1 (1Grad. Sch. Niigata Univ. Pham. Appl. Life Sci.) Life and Env. Sci., Tsukuba Univ., 2Grad. Sch. Med., Tokai Univ.)

細菌のアルカリ環境への適応機構は，これまで主に細胞内 pH 生体内において細菌が形成するバイオフィルム（BF）は様々な や H+ 駆動力の維持機構を中心に議論されており，既に複数の 疾患の原因となる。う蝕（虫歯）は Streptococcus mutans が形成 H+ 輸送蛋白質が同定されている。しかしながら，他の機構の関 する口腔 BF が原因であり，日本において 85% 以上の人が罹患 与については殆ど検討されていなかった。一方我々は，近年の することで知られている。実際の口腔内において S. mutans は複 Keio collection を用いたスクリーニングにより，アルカリ耐性に 数種の口腔細菌と相互作用しながら複合系 BF を形成する。複 必須の遺伝子候補として H+ 輸送との関係が知られていない遺 合系 BF の構造や性状は，う蝕との関連が予想されるが，複合 伝子を 20 種程度見出し，大腸菌のアルカリ条件下における生育 系 BF の非侵襲的観察方法は確立されていない。本研究では S. の維持に複数の新規機構が関与することを示している。中でも mutans と他の口腔細菌から成る複合系 BF 構造観察及びそれに dedD 遺伝子は，破壊株が特に高いアルカリ感受性を示したこと 伴う，う蝕形成を非侵襲的且つ 3 次元的に同時観察する手法の から，アルカリ条件下における生育の維持に極めて重要な役割 確立を目指した。複合系 BF 中の S. mutans の局在を観察するた を担うと考えられた。DedD 蛋白質は分裂面に局在することが めに，蛍光タンパク質遺伝子を S. mutans のゲノムに挿入した蛍 知られており，細胞分裂に何らかの役割を持つと考えられてき 光タンパク発現株を作成した。S. mutans 蛍光タンパク質発現株 たが，生理的機能については不明な点が多かった。本研究では， と S. mitis 等の他の口腔細菌の 2 菌種を人工歯上にて混合培養し， dedD 破壊株のアルカリ条件下における表現型について詳細に解 複合系 BF を形成させた。共焦点反射顕微鏡を使用した COCRM 析した。静止期の同株を pH 7.0 および 9.0 の条件下で培養した 法（Continuous Optimizing Confocal Reflection Microscopy）と ところ，pH 7.0 では軽度の分裂障害が認められたのみであった CLSM 法を組み合わせることで 2 菌種の複合系 BF 立体構造及び が，pH 9.0 ではほぼ分裂が認められず，経時的な細胞伸長が観 その内部の S. mutans の局在，さらには人工歯のう蝕を同時に 3 察された。また dedD 遺伝子の導入により同株の分裂異常が回復 次元的に生きたまま観察することに成功した。興味深いことに，S. したことから，上述の表現型が同遺伝子の欠損に起因すること mutans と他の細菌の 2 菌種の組み合わせによって，複合系 BF が示された。さらに，dedD 破壊株の表現型が高温条件下で憎悪 構造及びう蝕形状に変化が見られることが観察された。以上の する傾向が認められた。以上の知見は，大腸菌がアルカリや高 結果から，本手法を用いることによって，S. mutans と他の口腔 温等のストレス条件下で細胞分裂を維持する新規の機構を持つ 細菌間の相互作用による複合系口腔 BF 構造と，それに伴う，う こと，およびその機構に DedD 蛋白質が中心的な役割を果たす 蝕形成への影響を解析することが可能となることが示された。 ことを強く示唆すると考えている。

115 P2-021 Mycobacterium smegmatis に感染するバク P2-022 ATP-association to intrabacterial テリオファージの形態学的解析 nanotransportation system in Vibrio cholerae ○氏原 隆子1，大原 直也2,3，谷口 初美4，山崎 利雄5，大畑 雅典1，松 ○呉 紅，中野 隆史，佐野 浩一（大阪医大・社会医学・微生物学） 崎 茂展1（1高知大学医学部微生物学教室，2岡山大学大学院医歯薬学 総合研究科口腔微生物学分野，3岡山大学・歯学部先端領域研究セン ○Hong Wu, Takashi Nakano, Kouichi Sano (Dept. Microbiol. Infect. ター，4産業医科大学・医学部・微生物学教室，5国立感染症研究所・ Control, Osaka Med. Coll.) バイオセーフティ管理室） We discovered an intrabacterial nanotransportation system (ibNoTS) Morphological characterization of Mycobacterium in Vibrio cholerae (V. cholerae) transporting cholera toxin (CT) from smegmatis bacteriophages the inner portion toward the peripheral portion of the cytoplasm ○Takako Ujihara1, Naoya Ohara2,3, Hatsumi Taniguchi4, Toshio by immunoelectron microscopy, and this system is controlled by Yamazaki5, Masanori Daibata1, Shigenobu Matsuzaki1 (1Dept. the extrabacterial environment. Since the association of ATP with Microbiology and Infection, Kochi Medical School, Kochi Univ., ibNoTS of V. cholerae CT have not yet been studied in detail, in this 2Oral Microbiology, Okayama Univ. Grad. Sch. Medicine, Dentistry, study, we demonstrated that ibNoTS of V. cholerae CT under the 3ARCOCS, 4Dept. Microbiology, Univ. of Occupational and extrabacterial alkaline condition was inhibited by two kinds of ATP Environmenta Health, 5Div. Biosafety Control and Research, National inhibitors by immunoelectron microscopy. These inhibitors are Institute of Infectious Diseases) 2,4-dinitrophenol (DNP), a protonophore, and 8-amino-adenosine, which produces inactive form of ATP. The inhibition of CT ibNoTS 【背景】バクテリオファージ（ファージ）が一般細菌に吸着する際，尾部 can be reversed by neutralization of DNP. The inhibitions of two ATP 結合型溶菌酵素による細胞壁の局所的分解が起こる。また，ファージ感染 inhibitors with different principles were associated with decrease の最終段階には，ファージにより産生された他の溶菌酵素による細胞壁破 of CT secretion by which ibNoTS followed. We propose that the 壊が起こり，子ファージが外部へ放出される。これらの溶菌酵素は，細菌 transportation of ibNoTS CT is closely associated with the ATP in V. 感染症制御のツールになると期待されているが，抗酸菌のような複雑な細 胞壁構造を有する細菌における，ファージによる細胞壁破壊の機構の詳細 cholerae. は明らかにされていない。本研究では，抗酸菌におけるファージによる溶 菌機構の解明を目的に，Mycobacterium smegmatis ファージの性状解析を行 なった。【方法】産業医科大学および国立感染症研究所で長期保存されて いた M. smegmatis ファージ 28 株を復帰させ，そのうち文献的に，結核菌 に対しても感染あるは lysis-from-without を起こす可能性のある 8 株（Y2， Y10，D29(F21)，B1 A6，HC，BK1，GS4E）について，プラーク形状，宿 主域，および形態を検討した。ファージの形態は，CsCl 密度勾配超遠心 法により精製後，透過型電子顕微鏡により検討した。【結果と考察】（1） 上記ファージ 8 株はすべて，M. smegmatis mc2 155 株において比較的大 きな透明プラークを形成し（直径約 2–10 mm），本菌株に対し強い溶菌活 性を持っていることが示された。（2）ファージ B1，D29(F21)，Y2，Y10， GSE4E は，直径 52–77 nm の正 20 面体の頭部，またファージ HC，BK1 は， 縦に伸長した頭部（幅 40–60 nm; 長さ 90–100 nm）を有していると考えら れ た 。（ 3）すべて尾部保有ファージであり，約 160–280 nm の長い尾部を 有していた。しかし，その分類学的位置（科）の確定にはゲノム DNA の 塩基配列解読が必要であると考えられた。

P2-023 Porphyromonas gingivalis における IX 型分 P2-024 酪酸は PC12 細胞のデス細胞レセプターシグナ 泌機構の調節メカニズムの解明 ルに影響を及ぼす ○雪竹 英治1，門脇 知子1,2，内藤 真理子1，庄子 幹郎1，菊池 有一郎3， ○関 啓介1,2，神尾 宜昌3,4，Cueno Marni3，田村 宗明3,4，紙本 篤2， 中山 浩次1（1長崎大学・院医歯薬・口腔病原微生物学，2長崎大・院 落合 邦康3,4（1日大・大学院・歯学・口腔健康科学，2日大・歯・総合 医歯薬・フロンティア生命科学，3東京歯科大・微生物） 歯，3日大・歯・細菌，4日大・総歯研・生体防御）

Regulation of gene expression of the type IX secretion Buyric acid independently affects death cell receptor system components in Porphyromonas gingivalis signals in PC12 cells ○Hideharu Yukitake1, Tomoko Kadowaki1,2, Mariko Naito1, Mikio ○Keisuke Seki1,2, Noriaki Kamio3,4, Cueno Marni3, Muneaki Tamura3,4, Shoji1, Yuichiro Kikuchi3, Koji Nakayama1 (1Dept. Mol. Microbiol. Atsushi Kamimoto2, Kuniyasu Ochiai3,4 (1Div. Oral Health Sci., Nihon Immunol., Grad. Sch. Biomedical. Sci., Nagasaki Univ., 2Div. Front. Univ. Sch. Dent. Grad. Sch. Dent., 2Dept. Compre. Dent. Clin. Educ., Life Sci., Dept. Med. and Dent. Sci., Nagasaki Univ., 3Dept. Oral Nihon Univ. Sch. Dent., 3Dept. Microbiol., Nihon Univ. Sch. Dent., Health Science Center., Tokyo Dental College) 4Div. Immunol. Pathobiol., Dent. Res. Cent., Nihon Univ. Sch. Dent.)

歯周病原細菌 Porphyromonas gingivalis（P. g ）は IX 型分泌機構 【目的】歯周病原菌や腸内細菌の主要代謝産物である酪酸は，免疫担当細 （T9SS）を介してジンジパインプロテアーゼなどの病原因子を分 胞のアポトーシス誘導や酸化促進作用を有し，ミトコンドリアや細胞質に 泌している。本研究では，P. g におけるジンジパイン分泌の調節 強度の酸化ストレスを誘導する。われわれはラット副腎髄質褐色細胞腫細 メカニズムを解明することを目的とした。2 つの遺伝子 porX と 胞 PC12 のアポトーシス誘導性について，ミトコンドリアを介した内因性 porY は，その変異株がジンジパインの細胞外分泌に異常を示す 経路や一部の外因性経路の関与を報告した。しかし，デス細胞レセプター ものとして発見された。PorX は細菌の環境応答システムである シグナルに関しての検討はこれまでされていない。そこで今回，酪酸誘導 二成分制御系のレスポンスレギュレーターに，PorY はセンサー アポトーシスにおいて，どのようなデス細胞レセプターが影響しているの ヒスチジンキナーゼに類似性を示すが，一般的な二成分制御系 かを検討した。【方法】PC12 細胞よりタンパク抽出試薬（N-PER, Thermo でみられるオペロン構造をとらず，孤立遺伝子として存在する。 SCIENTIFIC）にてタンパク回収後，神経成長因子（NGF）処理群と未処 PorX と PorY の組換えタンパク質の実験から，表面プラズモン共 理群に0～5.0 mMの酪酸を添加し培養を行った。培養上清中のFasL, TNF-α, 鳴（SPR）解析で両者は相互作用を示し，放射標識 ATP を用い TWEAK および TRAIL を計測し，細胞質基質では Cytochrome C (CytC), た実験によって PorY の自己リン酸化と，リン酸基の PorX への NF-kB, CASP8, CASP9, CASP10 および CASP3 を定量した。【結果および考 転移がおこることがわかった。一方 ECF シグマ因子の一つ SigP 察】TWEAK 量は酪酸濃度依存的に減少する一方，TRAIL 量は酪酸濃度依 がジンジパインの発現制御に関与していること，さらにマイク 存的に増加した。CASP8 は 1.0 および 5.0 mM で増加していることが確認 ロアレイ実験で PorX が発現制御している T9SS 構成遺伝子群は された。この結果，TRAIL または TWEAK は酪酸誘導性アポトーシスに SigP によっても同様に発現制御されていることがわかった。ま 関して初期のシグナルではないと推察された。NF-kB 量には変化がみられ たゲルシフト解析によって SigP が T9SS 構成遺伝子群のプロモー なかったが TNF-α 量は 1.0 および 5.0 mM で増加したことから，CASP8 活 タ領域に結合することがわかった。さらに SPR 解析で PorX と 性を誘導するうえで TNF-α が重要な役割を担っていることが考えられた。 SigP は相互作用を示し，PorX 欠損変異株で SigP の発現が検出 FasL 量は 5.0 mM のみで増加し，CytC 量の変化と一致していた。加えて，1.0 されなかった。以上の結果から PorX と PorY は二成分制御系を および 5.0 mM では CASP9 と CASP3 の両者が増加した。これらの結果より， 構成し，ECF シグマ因子の一つ SigP を介して T9SS 構成タンパ 酪酸誘導性のデス細胞レセプターシグナルでは初期段階で TNF-α や FasL ク質の発現調節を行い，ジンジパインの分泌を制御することが が利用される可能性が示唆された。 示唆された。

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P2-025 メチル化特異性試験によるコレラ菌走化性受容 P2-026 歯周病原性細菌 Eikenella corrodens における 体ホモログの関与する Che シグナル伝達経路の推定 オートインデューサー不活化機構 ○西山 宗一郎1,2，西岡 典子3，本間 道夫3，川岸 郁朗1,2（1法政大・生 ○Jasin Mansur，阿座上 弘行（山口大・農・生物機能） 命科学・生命機能，2法政大・マイクロ・ナノテクセンター，3名 大・院・ 生命理学） Autoinducer-inactivation mechanism in periodontopathogenic bacterium Eikenella corrodens Classification of chemoreceptor homologs in Vibrio ○Jasin Mansur, Hiroyuki Azakami (Dept. Biol. Chem., Yamaguchi cholerae by their methylation specificities Univ.) ○So-ichiro Nishiyama1,2, Noriko Nishioka3, Michio Homma3, Ikuro Kawagishi1,2 (1Dept. Frontier Biosci., Hosei Univ., 2Res. Cen. Micro- Eikenella corrodens, facultative anaerobic Gram-negative rod, is Nano Tech., Hosei Univ., 3Div. Biol. Sci., Grad. Sch. Sci., Nagoya predominatly found in subgingival plaque samples of patients with Univ.) advanced periodontitis. Previously, we reported that E. corrodens formed biofilm on the surface of polystyrene plate in an AI-2 細菌走化性については大腸菌でもっとも研究が進んでおり，1 dependent manner. We also reported that E. corrodens produces セットの走化性関連タンパク質群およびセンサーとなる 5 種類 AI-2 in the mid log phase, and AI-2 activity decreases dramatically の走化性受容体（MCP）が同定されている。一方，コレラ菌 during the stationary phase. Moreover, we suggested that E. Vibrio cholerae は 3 セットの走化性関連タンパク質群（Che シス corrodens produces AI-2 inactivation factor during the stationary テム I～III）をもつが，うち走化性に直接関わるのはシステム II phase. To analyze this mechanism, AI-2 inactivation factor was であり，残り 2 つは機能未知である。コレラ菌には走化性受容 purified from the stationary-phase culture supernatant using ion- 体ホモログ（MCP-like proteins, MLPs）が 40 種以上もあるが， exchange chromatography. SDS PAGE and Amino acid sequencing 当研究室でアミノ酸走化性受容体として同定した Mlp24・Mlp37 analysis results suggested that the purified protein was porin. We を除き，他のほとんどの MLPs はどの Che システムに属するか constructed the porin-gene deficient strain (ΔporA) and investigated 分かっておらず，機能も不明である。本研究では，刺激への適 its AI-2 production. AI-2 assay with ΔporA strain suggested that 応に伴う受容体（MLPs）のメチル化に着目してシステム帰属の porin has AI-2 inactivation activity. Moreover, expression of prin in 推定を試みた。コレラ菌はメチル化酵素 CheR のホモログを 3 membrane vesicle was observed in the stationary phase. Thus, it 種（CheR1～R3）もち，それぞれシステム I～III に属している。 was suggested that porin in membrane vesicle might be involved そこで，宿主として大腸菌の全 MCP 遺伝子および cheR 遺伝子 in AI-2 inactivation. Although MHF peak was shifted on reverse 欠失株を用い，コレラ菌の各 mlp 遺伝子と cheR1～cheR3 を共発 phase HPLC after incubation with porin, no structural change was 現させて，各 MLP がどの CheR でメチル化を受けるかを調べ observed from shifted MHF by LC-MS/MS analysis. Further study た。現在までに，過半数の MLPs がシステム II に属することを are needed to reveal the mechanism of AI-2 inactivation by porin. 示唆する結果を得ている。しかし一方で，メチル化が検出でき ていない MLPs も多く，複数の CheR ホモログでメチル化される MLPs もある。現在，CheR1～R3 の発現をモニタしつつ調節が 出来る系を構築中であり，完成次第この改良系を用いて再評価 を行う予定である。（非会員共同研究者：小野木汐里，渡邊洋介）

P2-027 Veillonella tobetsuensis 由来 AI-2 の口腔バイ P2-028（WS18-9） 細胞外多糖アルギン酸生産によ オフィルム形成初期における影響 る細胞間コミュニケーションの選択的阻害性 ○眞島 いづみ1,2，中澤 太2（1学振・特別研究員 PD，2医療大・歯・ ○楊 佳約1，豊 福 雅典1，酒 井 亮祐1，舘 田 一博2，野 村 暢彦1（1筑波大・ 微生物） 院・生命環境，2東邦大・医・微生物感染症学）

The effects of AI-2 from Veillonella tobetsuensis in oral Selective inhibition of cell-cell communication by biofilm formation at early stage alginate production ○Izumi Mashima1,2, Futoshi Nakazawa2 (1Postdoc. JSPS, 2Dept. Oral ○Jiayue Yang1, Masanori Toyofuku1, Ryosuke Sakai1, Kazuhiro Microbiol., Sch. Dent., Heal. Sci. Univ. Hokkaido) Tateda2, Nobuhiko Nomura1 (1Grad. Life and Environmental Sciences, Tsukuba Univ., 2Dept. Microbiol. Infectious Diseases, Sch. Med., Toho Purpose: According to the results of our previous study, Veillonella Univ.) tobetseuensis (V. t ) promoted Streptococcus gordonii (S. g) biofilm formation without co-aggregation. Therfore, autoinducer 2 (AI- 多くの微生物は環境中で集団を作って存在し，互いに細胞間コ 2) from V. t were focused as one of the factors associated with oral ミュニケーションをとる。微生物は細胞間コミュニケーション biofilm at early stage and purified from the supernatants. After partial の際，シグナル物質となる化合物を細胞外に排出し，特異的な purification, the effects of the AI-2 on biofilm formation and growth of 受容体でシグナル物質を受け取ることによってコミュニケー planktonic cells were examined in the present study. Methods: AI-2 ションを行う。それによって集団の遺伝子発現を調節すること activities in the supernatants were detected by using Vibrio assay as でバイオフィルム形成，呼吸，毒素生産などの集団的挙動を制 reported previously. AI-2 were purified partially (PPAI-2) by using 御している。従って，細胞間コミュニケーションについて理解 a C18 Sep-Pak reverse-phase column. The concentration of PPAI-2 を深めることは微生物制御に貢献できると考えられる。シグナ was evaluated from the bioluminescence of 4-Hydroxy-5-methyl-3- ル物質は受容体によって受け取られることで初めてコミュニ furanone. The effects of PPAI-2 from V.t against S. g biofilm formation ケーションが成り立つが，微生物の細胞外には多糖などの細胞 and growth of planktonic cells were examined by using wire method. 外マトリクスが存在し，それらの細胞間コミュニケーションに Results: PPAI-2 from V. t inhibited S. g biofilm formation clearly. 与える影響は不明である。本研究では , 緑膿菌のアルギン酸過剰 On the other hand, PPAI-2 promoted the growth of S. g planktonic 生産株（ムコイド株）を用い，細胞外多糖が細胞間コミュニケー cells in low concentration. Discussion & Conclusion: This study ションに与える影響について調べた。緑膿菌は 2 種類のアシル demonstrated that PPAI-2 from V. t inhibited S. g biofilm formation ホモセリンラクトン（AHL）系シグナル物質 3-oxo-C12-HSL 及 only. It was also suggested that the AI-2 has important role to control び C4-HSL，そして 2 種類のキノロン系シグナル物質，PQS 及び the biofilm formation with S. g in quorum sensing system. HHQ を生産する。それぞれのシグナル物質に対するムコイド株 と非ムコイド株の応答性を調べた結果，ムコイド株は非ムコイ ド株と比べて AHL シグナルの応答が低下し，またキノロンシグ ナルに対してはほとんど応答が見られなかった。アルギン酸生 産がキノロンシグナルの応答だけを特異的に阻害することが示 され，細胞外マトリクスの生産がシグナル応答に多様性をもた らすことが考えられる。

117 P2-029 青枯病菌によるバイオフィルム形成とその病原 P2-030 青枯病菌によるバイオフィルム形成とその病原 性へのクオラムセンシングの関与 性への菌体外多糖の関与 ○石川 詩歩1，森 友花1，Ruoyun Zhou1，東本 周樹1，林 一沙1，甲斐 ○東本 周樹1，森 友花1，石川 詩歩1，細井 勇希1，大西 浩平2，木場 建次2，大西 浩平3，木場 章範1，曵地 康史1（1高知大・農，2大阪府大・ 章範1，曵地 康史1（1高知大・農，2高知大・総研セ） 院，3高知大・総研セ） Involvement of exopolysaccharide in biofilm formation Involvement of the quorum sensing in biofilm formation by Ralstonia solanacearum and its virulence by Ralstonia solanacearum and its virulence ○Chikaki Higashimoto1, Yuka Mori1, Shiho Ishikawa1, Yuki Hosoi1, ○Shiho Ishikawa1, Yuka Mori1, Ruoyun Zhou1, Chikaki Higashimoto1, Kouhei Ohnishi2, Akinori Kiba1, Yasufumi Hikichi1 (1Fac. of Agri., Kochi Kazusa Hayashi1, Kenji Kai2, Kouhei Ohnishi3, Akinori kiba1, Yasufumi Univ., 2RIMG, Kochi Univ.) Hikichi1 (1Fac. of Agri., Kochi Univ., 2Osaka Pref. Univ., 3RIMG, Kochi Univ.) 土壌生息細菌である青枯病菌 Ralstonia solanacearum OE1-1 株 は，トマト植物の根の細胞間隙に侵入後，トマト細胞上に固 土壌生息細菌である青枯病菌 Ralstonia solanacearum OE1-1 株は， 着し，植物免疫を回避する。その結果，トマト細胞上で増殖 トマト植物の根の細胞間隙に侵入後，トマト細胞上にマッシュ した OE1-1 株は，クオラムセンシング（QS）シグナル methyl ルーム型バイオフィルム（mBF）を形成する。この mBF 形成時 3-hydroxymyristate を産生し，QS を作動する。そして，マッシュ に，OE1-1 株は，methyl 3-hydroxymyristate（3-OH MAME）を ルーム型バイオフィルム（mBF）を形成後，導管へ侵入し，感 産生し，クオラムセンシング（QS）を作動する。mBF 形成に関 染植物に萎凋症状をもたらす。青枯病菌の導管への侵入と病原 わる OE1-1 株細胞間情報伝達には，QS に依存して産出される 性は，QS に依存している。一方，QS 能喪失株は，著しく低い ralfuranone 化合物が関与する。本研究では，QS の mBF 形成と 細胞凝集能を示すが，mBF 形成能を有する。興味深いことに， 病原性への関与について解析した。走査型電子顕微鏡観察によ この mBF 形成には，OE1-1 株細胞間情報伝達に関わるラルフラ り，3-OH MAME 産出能欠損株（ΔphcB）は mBF 形成能を保持 ノン化合物の生産を必要とする。ラルフラノン化合物の生産は することが明らかとなった。QS により，活性化する多面的転写 QS に依存する。すなわち，QS により，mBF 形成を阻害する情 因子をコードする phcA の欠損株（ΔphcA）も mBF 形成能を保持 報伝達系が作動するが，ラルフフラノン化合物はその情報伝達 した。トマト植物の細胞間隙に侵入した ΔphcB と ΔphcA は，導 系を阻害し，青枯病菌は mBF 形成を行うと考えられる。さらに， 管へ移行できず，トマト植物への病原性を喪失した。さらに， ラルフラノン化合物は，QS に依存する主要な菌体外多糖である ralfuranone 産生能欠損株 ΔralA は mBF 形成能，導管への侵入能 EPS I の産生の制御に関与する。本研究では，EPS I のトマト植 およびトマト植物への病原性を喪失した。いずれの株も，導管 物への病原性と mBF 形成への関わりについて解析した。トマト へ直接感染した場合には，OE1-1 株よりは低下するが，病原性 植物の根の細胞間隙に感染した EPS I 産生喪失株 ΔepsB は，導 を示した。すなわち，mBF 形成は，QS に依存しない情報伝達系 管へ侵入し，トマト植物に全身感染したが，トマト植物に対す によりもたらされる。そして，QS により，mBF 形成を阻害する る病原性は喪失した。一方，トマト植物の導管へ直接感染した 情報伝達系が作動するが，ralfuranone 化合物はその情報伝達系 ΔepsB は病原性を示した。走査型電子顕微鏡観察により，ΔepsB を阻害し，青枯病菌は mBF 形成を行うと考えられた。また，QS は mBF 形成能を有することが示された。すなわち，EPS I は， が作動した mBF から遊離した OE1-1 細胞が，導管への侵入能を 細胞間隙侵入後のトマト細胞上における mBF 形成に直接関与せ 有し，トマト植物への病原性を示すと考えられた。 ず，mBF 形成時の，トマト植物への病原性に関わる青枯病菌細 胞間の情報伝達あるいは宿主植物との相互作用に関与すると考 えられた。

P2-031 Ralfuranones contribute to intercellular P2-032 高分解能液中電顕観察から見えてきたバイオ signaling between Ralstonia solanacearum cells フィルム内部におけるメンブランベシクルの産生と多彩な ○森 友花1，石川 詩歩1，東本 周樹1，嶋谷 美香2，大西 浩平3，木場 機能 1 2 1 1 2 章範 ，甲斐 建次 ，曵地 康史 （ 高知大・農・植物工学， 阪府大院・ ○杉本 真也1，奥田 賢一1，宮川 玲奈1，佐藤 真理2，千葉 明生1，佐 3 生命環境， 高知大・総研セ） 藤 主税2，水之江 義充1（1慈恵医大・医・細菌，2産総研・バイオメディ カル・構造生理） ○Yuka Mori1, Shiho Ishikawa1, Chikaki Higashimoto1, Mika 2 3 1 2 Shimatani , Kouhei Ohnishi , Akinori Kiba , Kenji Kai , Yasufumi High resolution imaging of biofilms by atmospheric SEM: 1 1 2 Hikichi ( Lab. Plant Pathol. & Biotech., Kochi Univ., Sch. Life & implications for functions of MVs Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 3RIMG, Kochi Univ.) ○Shinya Sugimoto1, Ken-ichi Okuda1, Reina Miyakawa1, Mari Sato2, Akio Chiba1, Chikara Sato2, Yoshimitsu Mizunoe1 (1Dept. Bacteriol., After invasion into intercellular spaces, Ralstonia solanacearum 2 strain OE1-1 produces mushroom type biofilms on the surfaces of The Jikei Univ. Sch. Med., Struct. Physiol. Res. Group, Biomed. Res. tomato cells, leading to its virulence on tomato plants. We previously Inst. AIST) reported extracellular production of aryl-furanone secondary 【目的】大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）は，水溶液中で細胞を直接観察 metabolites, ralfuranones A, B, I, J, K and L by the strain OE1- できる電子顕微鏡である 1）。電子線を透過する薄膜窓を底に備えた 3.5 cm 1 through enzymatic and non-enzymatic manners, dependently on 径のサンプル dish を特徴とし，この中で様々な細胞を培養装置内の通常 quorum sensing (QS). Though the ralA-deleted mutant (ΔralA) の実験環境で培養し，電顕ステージにのせることにより観察できる。分解 loses its ralfuranones productivity and losing its virulence, function 能は 8 nm である。本研究では，ASEM を用いて黄色ブドウ球菌のバイオ of ralfuranones has remained unclear. The ΔralA did not produce フィルム（BF）内部における微細構造を観察した。 any mushroom type biofilm. Application with ralfuranones A, B, J 【方法・結果】オスミウム酸・酢酸ウラン・クエン酸鉛によって黄色ブドウ and K partially recovered mushroom type biofilm formation by the 球菌の BF を多重染色し，BF 形成の過程を経時的に観察した。その結果， ΔralA. Interestingly, ralA deletion changed expression of genes 培養 4 時間目以降からメンブランベシクル（MVs）や細胞同士を連結す including major exopolysasscharide, EPS I, production-related genes るナノチューブ様構造を観察することができた。また，BF の内部におい and motility-related genes of which expression is dependently on て水や栄養分の通り道だと考えられる水チャネルや固体表面への付着に関 QS, leading to reduced EPS I production and enhanced swimming わる細胞外 DNA の線維構造を可視化することに成功した。さらに，本手 motility. Furthermore, ralA deletion also led to a decreased 法と生化学的・細胞生物学的解析を統合することにより，BF 形成の過程 expression of not only vsrAD and vsrBC encoding two component で細胞質タンパク質を MVs に入れて細胞外へ排出する新しい機構を示唆 する観察結果を得た。また，超遠心分離により単離した の画分には， systems but also rpo genes encoding sigma factors. Application MVs 溶血毒素やコアグラーゼのみならず，近年我々が BF 形成に関与すること with ralfuranone B recovered expression of these genes. Taken, を発見した細胞外 RNA2）も含まれていた。RNA が MVs に内包されている ralfuranones are involved in extracellular signaling among OE1- 様子は RNA に結合するチオフラビン T3）を用いて可視化することができた。 1 cells cooperating with QS, contributing to EPS I production, 【結論】以上より，ASEM を用いて BF 内部の溶液中での微細構造を高解 swimming motility and biofilm formation by OE1-1. 像度で観察する技術を開発し，BF 内部における MVs の多彩な機能を垣間 見ることができた。 1) Nishiyama et al., J. Struct. Biol. 2010 2) Chiba et al., submitted 3) Sugimoto et al., Nucleic Acids Res. 2015

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P2-033 緑膿菌とリポソームの物理的接触が III 型分泌 P2-034 培養温度の変化が肺炎球菌の血中での生存に及 システムに及ぼす影響の検討 ぼす影響 ○上川 翼1，扇田 隆司1，林 直樹2，後藤 直正2，小暮 健太朗1（1京都 ○中田 匡宣，住友 倫子，山口 雅也，川端 重忠（大阪大・院歯・口 薬大・薬・薬品物理化学，2京都薬大・薬・感染制御学） 腔細菌）

Effect of physical contacts of Pseudomonas aeruginosa Effect of culture temperature on pneumococcal survival with liposomes on type III secretion system in blood ○Tsubasa Uekawa1, Takashi Ohgita1, Naoki Hayashi2, Naomasa ○Masanobu Nakata, Tomoko Sumitomo, Masaya Yamaguchi, Gotoh2, Kentaro Kogure1 (1Dept. Biophys. Chem., Kyoto Pharm. Shigetada Kawabata (Dept. Oral and Mol. Microbiol., Grad. Sch. of Univ., 2Dept. Microbiol. Infect. Control. Sci., Kyoto Pharm. Univ.) Dent., Osaka Univ.)

【目的】緑膿菌等のグラム陰性菌は宿主細胞に接触し，注射器型 上気道の常在菌である肺炎球菌は，主に乳幼児と高齢者へ粘膜 の細菌 III 型分泌装置（T3SA）を細胞膜に挿入して細菌感染に 感染症や侵襲性感染症を惹起する。本菌は，生息部位である上 寄与するエフェクタータンパク質を細胞内へ注入する。しかし， 気道から感染を拡大する際，温度などの環境因子を感知し，免 感染時に T3SA を介したエフェクター注入がどのような機構で誘 疫を回避すると考えられる。 導されるのかは不明である。これまでに赤痢菌と赤血球を接触 本研究では，肺炎球菌の血中での生存と分泌タンパクの構成に させると III 型分泌システムが活性化されることが報告されてい 及ぼす培養温度の影響について解析を行った。莢膜血清型別 4 る[Blocker A,et al, J. Cell. Biol., 147 (1999)]。この報告に基づき我々 型である TIGR4 株を 37°C もしくは 28°C で培養した。ヒト末 は「細菌と宿主細胞の物理的接触が T3SA を介したエフェクター 梢血と対数増殖期の菌体を混和後，経時的に生菌数を算定した。 注入を誘導する要因の 1 つではないか」と考えた。そこで，本 その結果，28°C で前培養された菌体と比較して，37°C で培養し 研究では人工細胞膜モデルであるリポソームと緑膿菌を接触さ た菌体の生存率は高かった。そこで，各培養温度における分泌 せた際に III 型分泌システムが活性化されるかについて検討した。 タンパクの構成を比較し，血中での菌体生存に寄与する因子を 【方法】本研究では緑膿菌 PAO1 株をモデル細菌として使用した。 検索した。SDS-PAGE により菌体表層画分と培養上清画分のタ エフェクター注入の 2 つの過程，菌体内でのエフェクター発現 ンパクを展開した結果，培養温度の変化により検出量が異なる 段階と蓄積したエフェクターの注入段階のうち，まずは緑膿菌 複数のバンドが認められた。質量分析により，その 1 つはエノ とリポソームの物理的接触によるエフェクター発現に対する影 ラーゼであることが明らかになった。抗エノラーゼ抗血清を用 響を評価した。μm サイズのリポソームを調製し，これらを緑膿 いたウェスタンブロット解析から，細胞外の発現量は培養温度 菌と混合して遠心により両者を接触させた。この状態で 3 時間 の上昇とともに増加することが確認された。一方，各培養温度 静置した後，菌体内エフェクター（ExoT）量をウエスタンブロッ でエノラーゼ遺伝子の転写量に差は認められなかった。菌体外 ト法により評価した。 のエノラーゼはプラスミノーゲンとの結合能を有し，免疫回避 【結果と考察】緑膿菌をリポソームと接触させた際の菌体内エ や組織侵襲に関与する。各培養温度で生育した菌体のプラスミ フェクター量を評価した結果，菌体内画分に ExoT は検出されな ノーゲン結合能を ELISA で検討した結果，培養温度の上昇に伴 かった。このことから緑膿菌とリポソームとの物理的接触はエ い，プラスミノーゲン結合量は増加した。 フェクター発現には影響しないことを見出した。現在，菌体内 以上の結果から，肺炎球菌は環境温度の上昇とともにエノラー に蓄積されたエフェクターの注入段階に対する物理的接触の影 ゼなどの病原因子の分泌量を増加させ，血中での免疫を回避す 響について検討しており，この結果についても報告する。 る可能性が示された。

P2-035 III 型分泌機構の解明を目指した分泌装置のエ P2-036 溶菌酵素 Psm の種特異性に対する細胞壁結合 フェクター分泌速度の定量評価 ドメインの影響 ○扇田 隆司1，林 直樹2，後藤 直正2，小暮 健太朗1（1京都薬大・薬・ ○関谷 洋志1，玉井 栄治1，成谷 宏文2，牧 純1（1松山大・薬・感染症 薬品物理化学，2京都薬大・薬・微生物・感染制御学） 学，2香川大・医・分子微生物学）

Quantification of type III secretion to clarify the Influence of the cell wall binding domain to species mechanism of effector secretion via apparatus specificity of endolysin Psm ○Takashi Ohgita1, Naoki Hayashi2, Naomasa Gotoh2, Kentaro ○Hiroshi Sekiya1, Eiji Tamai1, Hirofumi Nariya2, Jun Maki1 (1Dept. Inf. Kogure1 (1Dept. Biophys. Chem., Kyoto Pharm. Univ., 2Dept. Dis., Col. Pharm. Sci., Matsuyama Univ., 2Dept. Microbiol., Fac. Med., Microbiol. Infect. Control. Sci., Kyoto Pharm. Univ.) Kagawa Univ.)

Gram negative bacteria inject effector proteins, related to infection 【目的】溶菌酵素はペプチドグリカンを分解する酵素であり，特 or toxicity, into host cells via needle-like type III secretion apparatus にグラム陽性菌に対して作用し，細胞壁を破壊することで菌を (T3SA). However, the mechanism of effector secretion through 死滅させる。私たちはウェルシュ菌に特異的に強力な溶菌活性 T3SA is unclear. Previously, we found out that T3SA rotates and it を示す Psm の解析を行い，N 末側にある触媒作用を持つ GH25 relates to effector secretion. It was also reported that conserved- ドメインだけでは結合能や溶菌活性がないこと，C 末側にある aromatic residue in needle-component align helically in the needle. SH3_3 ドメインだけでは溶菌作用がないこと，SH3_3 ドメイ Therefore, we hypothesized that T3SA might secrete effectors by ンにある菌との結合に重要なアミノ酸などを明らかにした。今 rotating opposite direction to the helix. Based on this, the rotation- 回，SH3_3 ドメインを追加した変異体の溶菌活性および菌種特 and secretion-speed would correlate linearly. To confirm this, we 異性に対する影響を調べた。【方法】Psm の C 末端に SH3_3 ド attempted to quantify effector secretion. We used Pseudomonas メインを追加した変異体（Psm-B3，Psm-B4）， GH25 ドメイン aeruginosa PAO1 strain as a model bacterium. We modified と SH3_3 ドメイン間にリンカーを追加した変異体（Psm-L2， tetracysteine (TC) tag to effector (ExoT) by gene-engineering for Psm-L3，Psm-L4）を PCR 法で作製した。大腸菌で発現させ精 detecting ExoT. TC tag can be labelled specifically by fluorescent 製した変異体の溶菌活性はウェルシュ菌の濁度変化の測定およ reagent FlAsH-EDT2. TC-tagged ExoT (ExoT-TC) was secreted び菌を封入した SDS-PAGE ゲルを用いたザイモグラフィー解析 same as native ExoT, although GFP-tagged ExoT was not. However, で測定した。また，各変異体における結合能はウェルシュ菌を secreted ExoT-TC could not be detected by FlAsH-EDT2 system, 基質としたプルダウン解析で測定した。【結果と考察】Psm-B3， although this system can detect TC tag with nM-order. This indicated B4 のウェルシュ菌に対する結合能を調べた結果，Psm と同様 that secreted amount of ExoT was less than 1 nM. Therefore, more に結合がみられた。また，他のクロストリジウム属菌に対する sensitive detection system is required for real-time evaluation of 結合能を調べた結果，Psm-B3，B4 は Psm が結合できないディ secretion. Now, we attempt to quantify effector secretion by epitope フィシル菌に対しても結合できることがわかった。さらに，ザ (3x FLAG)-tagged ExoT. In this presentation, we would also report イモグラフィー解析の結果，Psm-B3，B4 は Psm が溶菌活性を about the results. 示さないディフィシル菌に対しても溶菌活性を示した。一方， Psm-L2，L3，L4 は，溶菌活性，結合能ともに Psm と比べて， ほとんど差がみられなかった。 【会員外共同研究者】神鳥成弘，吉田裕美（香川大・医），大黒 真寿美，小林真大（松山大・薬）

119 P2-037 Streptococcus pneumoniae の形質転換誘導 P2-038 BipA is an autoagglutination inhibitor 性タンパク Ccs4 は病原因子として働く required for biofilm formation in Bordetella holmesii ○広瀬 雄二郎1,2，山口 雅也1，後藤 花奈1，住友 倫子1，中田 匡宣1， ○平松 征洋1，齋藤 桃子2，大塚 菜緒1，渡邉 峰雄2，柴山 恵吾1，蒲 川端 重忠1（1阪大院・歯・口腔細菌，2名大院・医・泌尿器） 地 一成1（1国立感染研・細菌第二，2北里大・感染制御科学府） The Streptococcus pneumoniae competence-induced ○Yukihiro Hiramatsu1, Momoko Saito2, Nao Otsuka1, Mineo 2 1 1 1 protein Ccs4 contributes to its virulence Watanabe , Keigo Shibayama , Kazunari Kamachi ( Dept. Bacteriol. 2 ○Yujiro Hirose1,2, Masaya Yamaguchi1, Kana Goto1, Tomoko II, Nat. Inst. Infect. Dis., Grad. Sch. Infect. Ctrl. Sci., Kitasato Univ.) Sumitomo1, Masanobu Nakata1, Shigetada Kawabata1 (1Dept. Oral Bordetella holmesii causes both invasive and respiratory diseases in and Mol. Microbiol., Grad. Sch. Dent., Osaka Univ., 2Dept. Urol., humans. Although the number of cases of pertussis-like respiratory Grad. Sch. Med., Nagoya Univ.) illnesses due to B. holmesii infection has increased in the last decade Streptococcus pneumoniae は肺炎の主たる起因菌であり，しばし worldwide, little is known about the virulence factors of the organism. ば髄膜炎や敗血症などの致死性疾患を引き起こす。髄膜炎の原 Here, we analyzed a B. holmesii isolate that forms large aggregates 因菌である Neisseria meningitidis において，菌体表層に局在する and precipitates in suspension, and subsequently demonstrated that Neisserial Heparin Binding Antigen がアルギンを豊富に含むアミ the autoagglutinating isolate is deficient in Bordetella intermediate ノ酸配列（Arg-rich region）を介して血中での免疫回避に働くこ protein A (BipA) by generating an in-frame deletion mutation in its とが知られている。そこで本研究では，S. pneumoniae において encoding gene. BipA-deficient mutant generated by homologous Arg-rich region を有する分子を検索し，その病原性を検討した。 recombination also exhibited the autoagglutination phenotype. 相同性検索から，S. pneumoniae TIGR4 株の形質転換誘導性タン Moreover, the BipA mutant failed to form biofilms on an abiotic パク Ccs4 が Arg-rich region を持つことが示された。in silico 解 surface, as did two other B. holmesii autoagglutinating strains, 析によって，Ccs4 はシグナルペプチドを有さない 9 回膜貫通型 ATCC 51541 and ATCC 700053, which exhibit transcriptional down- タンパクであり，Arg-rich region は細胞外に局在することが予 regulation of bipA gene expression, indicating that autoagglutination 測された。コンピテンス刺激ペプチドを用いた形質転換により， inhibits biofilm formation. In a mouse intranasal infection model, TIGR4 株の ccs4 遺伝子をスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換 the BipA mutant showed significantly lower levels of initial lung し，ccs4 遺伝子欠失株を作製した。次に，CD-1 マウスの血液を colonization than the parental strain (P<0.05), suggesting that 採取し，菌と混和後 1～3 時間における血液中の菌数を算定した。 BipA might be a critical virulence factor in B. holmesii respiratory 野生株と ccs4 遺伝子欠失株のマウス血液中における菌体生存率 infection. Together, our findings indicate that BipA plays an essential に有意差は認められなかった。また，ヒト脳微小血管内皮細胞 role in preventing autoagglutination and promoting biofilm formation へ野生株と ccs4 遺伝子欠失株を感染させ付着率を算出したとこ by B. holmesii. ろ，ccs4 遺伝子欠失により野生株の約 65% まで付着率は低下し た。さらに，マウスの尾静脈から 5×106 CFU の野生株もしくは ccs4 遺伝子欠失株を感染させ，マウスの生存率を比較した。その 結果，野生株感染マウスと比較して，ccs4 遺伝子欠失株を感染 させたマウスの生存時間は有意に延長した。 以上の結果より，S. pneumoniae の Ccs4 は病原因子として働く可能性が示された。

P2-039 腸管上皮細胞の分泌物質は緑膿菌によるムチン P2-040 緑膿菌が分泌する宿主ムチン分解プロテアーゼ 層透過を亢進する の探索 ○福西 千晶，山本 昌美，古曽志 まり子，森田 眞由，横谷 篤，林 直 ○中村 美香1，斉 藤 千尋1，藤 澤 彰宏1，鈴 木 崇2，岡 奈央子2，林 直樹1， 樹，後藤 直正（京都薬大・薬・微生物・感染制御学） 後藤 直正1（1京都薬大・薬・微生物・感染制御学，2愛媛大学大学院 医学系研究科 眼科学） Signals of epithelial cells facilitate penetration of Pseudomonas aeruginosa through a mucin layer Identification of the mucin degradation protease secreted ○Chiaki Fukunishi, Masami Yamamoto, Mariko Kososhi, Mayu by Pseudomonas aeruginosa Morita, Atsushi Yokotani, Naoki Hayashi, Naomasa Gotoh (Dept. of ○Mika Nakamura1, Chihiro Saito1, Akihiro Fujisawa1, Takashi Suzuki2, Microbiol. Infect. Control Sci., Kyoto Pharm. Univ.) Naoko Oka2, Naoki Hayashi1, Naomasa Gotoh1 (1Dept. of Microbiol. Infect. Control Sci., Kyoto Pharm. Univ., 2Dept. Ophthalmol., Ehime 【目的】Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）は，組織上皮細胞とそ Univ. Sch. Med.) れを覆うムチン層からなる粘膜上皮を越え（トランスロケーショ ン），敗血症を引き起こすことがある。私どもは，緑膿菌トラン 【目的】組織上皮細胞とそれを覆うムチン層からなる粘膜上皮は， スロケーションを，1）上皮細胞の感知，2）接近，3）付着，4） 細菌を含めた病原体や異物の侵入に対して障壁として機能する。 上皮細胞層での透過経路の形成，5）透過の 5 つの過程に分けて しかし，Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）は，それら障壁を越え， 研究してきた。その成果の一つとして，接近の過程で緑膿菌が 敗血症を引き起こすことがある。私どもは，鞭毛運動とムチン 鞭毛運動とムチン分解の少なくとも 2 つの因子が協力的に働く 分解との少なくとも 2 つの因子が協力的に働くことで本菌がム ことによりムチン層を透過することを明らかにした（Hayashi, N. チン層を透過することを明らかにした（Hayashi, N. et al. 2013. et al. 2013. J. Infect. Chemother. 19: 305-15）。本研究では，緑膿菌 J. Infect. Chemother. 19: 305-15）。しかし，緑膿菌が産生するムチ が上皮細胞を感知する機構を調べた。 ン分解プロテアーゼの同定には至らなかった。本研究では，1） 【方法】Caco-2 細胞培養上清を添加した swarming 培地（0.5% MEROPS データベースを利用した in silico 解析と 2）ムチンザ bacto-agar）に緑膿菌 PAO1 株の培養液を滴下し，37°C，5% CO2 イモグラムを用いた解析により，緑膿菌が産生するムチン分解 条件下で培養後に観察した。ムチン層透過菌数は，顎下腺由来 プロテアーゼを探索した。【方法】1）緑膿菌培養上清と Bovine ウシムチン標品を充填した Transwell の上層に緑膿菌 PAO1 株の submaxillary mucin（BSM）との混和溶液を 37°C，5% CO2 条件 培養液を接種後 3 時間目における下層の生菌数を測定した。コ 下で反応後，混和溶液を SDS-PAGE により分画し，銀染色によ ントロールに Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium を用いた。 り BSM を検出した。2）ポリアクリルアミドゲルに BSM を混 【結果と考察】Caco-2 細胞培養上清は，緑膿菌によるムチン層透 和することでムチン含有ゲルを作製し，periodic acid sciff（PAS） 過菌数をコントロールと比べて約 2 倍増加させた。Caco-2 細胞 染色により BSM を検出した。【結果と考察】1）30–50 kDa に分 培養上清は，緑膿菌の鞭毛に依存した swarming 運動ならびに鞭 画した緑膿菌培養上清は BSM を分解し，この分解はセリン系と 毛回転速度を増大させた。Caco-2 細胞培養上清による人工的ム メタロ系のプロテアーゼ阻害剤（chymostatin，EDTA）により阻 チン層透過および鞭毛回転速度の増大はトリプシン処理で消失 害されることが分かった。緑膿菌が分泌する 30–50kDa のセリン・ し，さらに限外濾過膜を用いて回収した 10 kDa 以下の画分に亢 メタロ系のプロテアーゼを MEROPS で検索したところ，21 個の 進作用があることが分かった。緑膿菌は，上皮細胞が分泌する 候補が得られた。現在，これら 21 個のプロテアーゼによるムチ 10 kDa 以下のタンパク質を感知することで鞭毛運動が亢進し， ン分解を検討している。2）緑膿菌培養上清を BSM 含有ゲルに ムチン層を透過することが示唆された。 滴下後，PAS 染色したところ BSM の分解が検出された。現在， 構築した BSM 含有ザイモグラムを用いて，緑膿菌培養上清中の ムチン分解プロテアーゼを探索している。

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P2-041 ペースメーカーより分離された P2-042 Fimbriae-mediated autoagglutination of Propionibacterium acnes の分子系統解析とバイオフィルム Bordetella pertussis 形成 ○大塚 菜緒，平松 征洋，蒲地 一成，柴山 恵吾（国立感染研・細菌 ○奥田 賢一1，山田 聡美1，杉本 真也1，岩瀬 忠行1，佐藤 真理2，佐 第二） 藤 主税2，水之江 義充1（1慈恵医大・医・細菌，2産総研） ○Nao Otsuka, Yukihiro Hiramatsu, Kazunari Kamachi, Keigo Genotypic profiles and biofilm formation of Shibayama (Dept. Bacteriol. II, Nat. Inst. Infect. Dis.) Propionibacterium acnes isolated from pacemaker Bordetella pertussis, the etiologic agent of whooping cough, produces ○ 1 1 1 Ken-ichi Okuda , Satomi Yamada , Shinya Sugimoto , Tadayuki either one or both serologically distinct fimbriae, Fim2 and Fim3. Iwase1, Mari Sato2, Chikara Sato2, Yoshimitsu Mizunoe1 (1Dept. 2 Fimbriae are filamentous cell surface structures that contribute to Bacteriol., The Jikei Univ. Sch. Med., AIST) bacterial adherence. We have found that some B. pertussis isolates 【背景】医療用デバイスに形成されたバイオフィルムに起因する exhibit an autoagglutination (Agg) phenotype when cultured on 感染症は，臨床における大きな問題となっている。本研究では， a synthetic cyclodextrin solid medium. Agg did not occur in the ペースメーカーをモデルとして培養法によるバイオフィルム形 presence of MgSO4 or nicotinic acid or when the bacterium was 成細菌の検出を行った。さらに，分離した細菌の分子系統解析 cultured on Bordet-Gengou agar. To determine the causal factor in とバイオフィルムの性状解析を行った。 the Agg of B. pertussis, we first isolated the non-agglutination mutant 【方法・結果】感染兆候のない患者から摘出された使用済みペー (designated as BP300s) from the strong-Agg clinical isolate BP300 スメーカーを血液寒天培地にスタンプし，好気および嫌気条 by repeated single colony isolation from the supernatant. By whole 件下で 3 日間培養した。31 検体を培養試験したところ，8 検 genome sequencing, two point mutations in the promoter regions of 体が培養陽性であった（陽性率：25.8%）。 16S rDNA シーケン rpoA and fim3 were revealed in BP300s. The mutation in the rpoA promoter did not influence the gene expression of , whereas a ス解析により，分離した株は，Propionibacterium acnes（7 株 ）， rpoA single C-deletion in Pfim3 abolished the production of Fim3. The Staphylococcus hominis（1 株）と同定された。P. acnes について r fim3 mutant generated by homologous recombination Multilocus sequence typing による分子系統解析を行ったところ， BP300Sm Δ lacked the Agg phenotype. We confirmed that Fim3 was highly ST2（2 株 ），ST4（1 株 ），ST53（1 株 ），ST69（2 株 ），新 規 ST（1 株） produced in B. pertussis Agg isolates but not in non-Agg isolates. に帰属された。In vitro におけるバイオフィルム形成を評価した Taken together, our findings indicate that the Agg ところ，ST2 の 1 株を除く 6 株はグルコース依存的なバイオフィ B. pertussis phenotype is controlled by the level of Fim3 production. ルム形成を示した。酵素感受性試験の結果，DNase I はすべての 株のバイオフィルム形成を強く阻害したのに対し，proteinase K と dispersin B に対する感受性は株によって異なっていた。細胞 外マトリクスに含まれる dsDNA，RNA，タンパク質，多糖の量 は株によって違いが認められ，また同一 ST 間では各構成成分の 存在比に類似性があった。さらに，透過型電子顕微鏡と大気圧 走査型電子顕微鏡を使用してバイオフィルムの微細構造を高分 解能で観察した結果，溶菌に伴って細胞質成分が漏出する様子 や，細胞間を繋ぐ線維状構造が観察され，これらの成分がバイ オフィルム形成に関与していることが示唆された。

P2-043（WS16-5） 鉄の恒常性破綻による尿路病原 P2-044（WS13-5） インフルエンザウイルス感染に 性大腸菌（UPEC）のバイオフィルム形成促進 伴う Gp96 の局在と化膿レンサ球菌感染症の関連性 ○倉林 久美子1，谷本 弘一3，富田 治芳2,3，平川 秀忠1（1群馬大・先 ○住友 倫子，中田 匡宣，山口 雅也，川端 重忠（阪大院・歯・口腔 端科学ユニット，2群馬大・医・細菌学，3群馬大・医・薬剤耐性菌実 細菌） 験施設） Influenza A virus-induced surface display of Gp96 Promoted biofilm formation by iron homeostasis promotes bacterial adherence to epithelial cells bankruptcy in uropathogenic E. coli (UPEC) ○Tomoko Sumitomo, Masanobu Nakata, Masaya Yamaguchi, ○Kumiko Kurabayashi1, Koichi Tanimoto3, Haruyoshi Tomita2,3, Shigetada Kawabata (Dept. Oral and Mol. Microbiol., Grad. Sch. Hidetada Hirakawa1 (1ASRLD Unit., Gunma. Univ., 2Dept. Bacteriol., Dent., Osaka Univ.) Sch. Med., Gunma Univ., 3Lab. Drug Resist., Sch. Med., Gunma Univ.) 化膿レンサ球菌 Streptococcus pyogenes は咽頭炎の起因菌として 知られているが，時として，軟部組織壊死や多臓器不全を伴う UPEC は，尿路感染症の主要な起因菌であり，膀胱上皮細胞表面 致死率の高い劇症型レンサ球菌感染症（streptococcal toxic shock に付着する。その後，宿主細胞内へと侵入し，IBC（Intracellular syndrome: STSS）を惹起する。これまでに，インフルエンザウ Bacterial Community）と呼ばれるバイオフィルムを形成する。こ イルスの先行感染は，STSS 発症の一因であることが明らかに の機構が，UPEC 感染症難治化の原因の 1 つであると考えられ なっている。本研究では，A 型インフルエンザウイルス（IAV） ている。我々は，UPEC の IBC 形成に関与する因子の探索を行っ 感染に伴い細胞表層での発現が誘導される宿主分子に着目し， た過程で，鉄の恒常性を担う遺伝子発現制御因子 Fur を同定し STSS 発症メカニズムへの関与を検討した。 た。UPEC の fur 遺伝子を欠損させると，膀胱上皮細胞への侵入 ヒト肺胞上皮細胞（A549）に IAV A/FM/1/47 株（ H1N1）を感染させ， 並びに，IBC 形成が促進した。さらに，fur 欠損株は親株と比べ 感染 36 時間後の細胞を免疫蛍光抗体法で観察した。その結果， て I 型線毛並びに，Curli の発現レベルが増大していた。関連して， 小胞体に局在する分子シャペロンである Gp96 が IAV 感染に伴い， I 型線毛活性の指標となるモルモットの赤血球に対する凝集能お ストレスタンパクとして細胞表層へ誘導されることを確認した。 よび，Curli 産生の指標となるコンゴーレッドによる染色度も増 そこで，IAV 感染細胞に STSS 患者由来の化膿レンサ球菌 NIH35 大していた。一方で，培地中の鉄イオンを枯渇させ，Fur の活性 株（M28）を感染させ，感染 2 時間後における菌体付着量を検 を無くした場合においても，IBC 形成促進が観察された。以上 討した。IAV 感染細胞への菌体付着量はウイルス非感染細胞と比 の結果から，UPEC にとって鉄の恒常性が破綻すると，IBC 形成 較して有意に増加したが，Gp96 阻害剤の添加により非感染細胞 を促進させることで，宿主細胞内において一過的にドーマント への付着と同等レベルまで減少した。また，Gp96 細胞外ドメイ 細胞のポピュレーションを増加させることが示唆された。鉄の ンの組換えタンパクは，菌体表層に発現する付着因子であるフィ 恒常性破綻により，Fitness が低下（代謝酵素の活性低下，ラジ ブロネクチン結合タンパクと結合することを ELISA で証明した。 カルストレス等）するが，UPEC は自らドーマント状態を作り出 Gp96 細胞外ドメインへの菌体の結合量はフィブロネクチン結合 すことで，Fitness 低下を軽減させるだけでなく，抗菌剤や宿主 タンパクの欠失により減少した。 免疫システムに対する抵抗性をも増強させると推測される。 以上の結果から，IAV 感染により上皮アピカル部位に表出した Gp96 は，化膿レンサ球菌の付着因子に対する宿主レセプターと して機能することで菌体付着を亢進させ，侵襲性を高めること が示唆された。

121 P2-045 Complete DNA sequence of the ETEC P2-046 百日咳菌ペリクル型バイオフィルム内の病原因 O169:H41 virulence plasmid and the novel colonization 子に関する解析 factor ○花輪 智子1，蒲 地 一成2，米 澤 英雄1，蔵 田 訓1，北 条 史3，大 崎 敬子1， 1 1 1 2 ○鄭 冬明1，坂 瑛里香1，池崎 沙耶加1，中台 枝里子1，和田 崇之2， Cynthia Zaman ，神谷 茂 （ 杏林大・医・感染症， 感染研・細菌 II， 3 輪島 丈明3，濱端 崇4，堀口 安彦1,5，西川 禎一1（1大阪市立大学 生 杏林大・医・実験動物） 活科学研究科，2長崎熱帯医学研究所，3東京薬科大学，4国立国際医 療センター，5大阪大学微生物病研究所） Virulence factors in the pellilce formed by Bordetella pertussis 1 1 1 1 ○ 1 2 1 Dongming Zheng , Erika Ban , Sayaka Ikezaki , Eriko Nakadai , ○Tomoko Hanawa , Kazunari Kamachi , Hideo Yonezawa , Satoshi 2 3 4 Takayuki Wada , Takeaki Wajima , Takashi Hamabata , Yasuhiko Kurata1, Fuhito Hojo3, Takako Osaki1, Cynthia Zaman1, Shigeru 1,5 1 1 Horiguchi , Yoshikazu Nishikawa ( Osaka City Univ. Grad. Sch. Kamiya1 (1Dept. Infect. Dis., Sch. Med., Kyorin Univ., 2Dept. Bacteriol. 2 Human Life Science, Institute of Tropical Medicine, Nagasaki Univ., II, NIID, 3Inst. Lab. Animals, Sch. Med. Kyorin Univ.) 3Tokyo Univ. of Pharmacy and Life Sciences, 4National Center for Global Health and Medicine, 5Institute of Microbial Diseases, Osaka 【背景と目的】百日咳菌は小児の痙攣性咳嗽や成人の慢性咳嗽を Univ.) 引き起こす。本菌はヒト以外から検出されないがその定着様式 については不明な点も多い。病原性と同様に本菌のバイオフィ Enterotoxigenic E.coli (ETEC) O169:H41 (O169) was isolated in ルム形成は BvgAS 二成分制御系により正に制御され，さらにマ Japan in 1991, and has been the most prevalent ETEC serotype in トリックス構成多糖体は鼻咽腔への定着に必須であることがマ Japan and USA. The organisms uniquely adhere to HEp-2 cells in an ウス実験モデルで示されている（Conover et al., 2010）。これまで aggregative adhesion-like manner. However, O169 loses the plasmid 本菌がペリクル型バイオフィルム形成能を有し 3 型分泌装置欠 (designated pEntYN10) easily in vitro. This study is to reveal the 損株ではこれが消失することを報告した（第 88 回日本細菌学会 mechanisms responsible for bacterial adhesion to epithelial cells 総会）。本研究ではペリクル形成の定着における役割を明らかに and the easy curing of the virulence plasmid during in vitro growth. する目的でペリクル内の病原因子を解析した。【方法】百日咳菌 The DNA sequence revealed the presence of multiple IS elements 臨床分離株および 3 型分泌装置欠損変異株を BG 培地でコロニー throughout the plasmid. The only genes to maintain the plasmid を形成させた後，加 0.5% カザミノ酸 SS 培地を用いて培養した。 were psiA, psiB, and relE. Sequence analysis identified three clusters 各画分中の病原因子は immunoblotting で検出した。【結果および of genes predicted to encode colonization factors with similarity to 考察】ペリクルは培養開始 3 日目以降に形成され，生菌数は培 CS6, CS8, and F4. CS6 is a representative human colonization factor; 養 5 日目まで増加したがその後急速に減少した。形成初期のマ although the predicted CssA protein (CS6 structural component) was トリクスおよび培養液中にはバイオフィルム構成成分と考えら encoded with a novel five-amino-acid sequence variation. The unique れている繊維状赤血球凝集素の他，百日咳毒素および 3 型分泌 adherence of O169 to HEp-2cells was presumed to result from one 装置の Tip を構成する Bsp22 が検出され，さらに 6 日目になっ of these three colonization factors. However, TOP10 organisms てもこれらの病原因子は保持されていた。一方，アデニル酸シ harboring the CS6 operon or CS8-encoding locus did not show クラーゼ（ACT）は溶菌画分に検出されたものの細胞外の濃度 adherence to HEp-2 cells. In contrast, TOP10 transforming a F4-like は低かった。ACT および 3 型分泌系は宿主免疫系に作用し，異 factor exhibited O169-like adherence to HEp-2 cells. Thus the F4- なる系により自然免疫を抑制する（Skinner et al.,, 2004）。また， like factor appeared to contribute to the unique HEp-2-adherence of ACT の過剰発現によりバイオフィルム形成が抑制されることも ETEC O169:H41. 報告されていることから（Irie et al., 2004）現在これらについて 詳細に検討を行っている。

P2-047 GAPDH as a putative fibronectin-receptor P2-048 ウェルシュ菌のペプチドグリカン層にみとめら on Clostridium perfringens れたフィブロネクチン結合タンパク質群の性状解析 ○櫃本 泰雄，清水 春花，山先 歩武，片山 誠一（岡山理大・理・臨 ○片山 誠一1，山先 歩武2，高橋 祐美2，成谷 宏文3，櫃本 泰雄1（1岡 床生命科学） 山理科大・理・臨床生命科学，2岡山理科大院・理・臨床生命科学， 3香川大・医・分子微生物学） ○Yasuo Hitsumoto, Haruka Shimizu, Ayumu Yamasaki, Seiichi Katayama (Dept. Life Sci., Faculty Sci., Okayama Univ. Sci.) Analysis of the fibronectin-binding proteins in the peptidoglycan layer of Clostridium perfringens We have reported the 4 fibronectin (Fn)-binding proteins (Fbp) ○Seiichi Katayama1, Ayumu Yamasaki2, Yumi Takahashi2, Hirofumi of Clostridium perfringens, FbpA (CPE0737), FbpB (CPE1847), Nariya3, Yasuo Hitsumoto1 (1Dept. Life Sci., Fac. Sci., Okayama Univ. FbpC (CPE0625), and FbpD (CPE0630) so far. Former 2 Fbps Sci., 2Dept. Life Sci., Grad. Sch. Sci., Okayama Univ. Sci., 3Dept. (FbpA and FbpB) are intracellular proteins, whereas both FbpC and Microbiol., Fac. Med., Kagawa Univ.) FbpD are thought to be the cell wall-associated proteins because they were found in the supernatant obtained by the endolysin (an Clostridium perfringens is a Gram-positive anaerobe, causing gas N-acetylmuramidase) treatment of C. perfringens cells. We prepared gangrene and food poisoning for humans and animals. Human a mutant C. perfringens lacking both the FbpC and FbpD (SAK3). fibronectin (Fn) binds to the bacterial cells. We have found five SAK3 cells were found to have another cell wall-associated Fn- kinds of Fn-binding proteins (Fbps) in the peptidoglycan layer of binding protein (40-kDa). The result of the LC-MS/MS analysis of C. perfringnes, so far. They were identified as FbpC (CPE0625), the 40-kDa protein suggested to be a putative glyceraldehyde-3- FbpD (CPE0630), pyruvate kinase (pykA; CPE0362), CPE1232, phosphate dehydrogenase (GAPDH) (CPE1304) which is primarily glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapC; CPE1304). a cytoplasmic enzyme involved in the glycolytic pathway. The Recently, we reported that Fn molecules bound to C. perfringens recombinant GAPDH (rGAPDH) of C. perfringens was prepared. cells through the Fn III9 and III10 regions (Katayama, S., et al. 2015. rGAPDH was found to bind to Fn by a Western ligand blotting Anaerobe 34:174–181.) Therefore, we examined whether the analysis. Moreover, the Fn binding to the surface of SAK3 cells biotinylated Fn III9-10 fragment bound to all the recombinant Fbps was partially inhibited in the presence of anti-rGAPDH polyclonal using ligand blotting and ELISA. The Fn III9-10 fragment bound to antibody. These results suggested that GAPDH is one of the Fn rFbpC, rFbpD, rCPE1232, and rGapC and not to rPykA by ligand receptors of C. perfringens. However, Fn did not bind to immobilized blotting. The Fn III9-10 fragment bound to rFbpC, and rFbpD, not to 2+ 2+ rGAPDH by ELISA in the absence of Cu or Zn but bound in the rCPE1232, rGapC, and rPykA by ELISA. These results suggested presence of those metals. The significance of these phenomena is that both FbpC and FbpD might have higher affinity to the Fn III9- now under investigation. 10 fragment than CPE1232 and GapC, but that PykA might have no affinity to the fragment. Immunofluorescens studies using anti- rFbps serums indicated that FbpC and FbpD were present on the C. perfringens HN13 cell surface. In conclusion, FbpC and FbpD might contribute the binding of Fn to C. perfringens cells although Fn bound to a null mutant (ΔfbpC ΔfbpD).

122 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P2-049（WS21-5） 百日咳菌が産生するアデニレー P2-050（WS21-4） ADP リボシル化毒素 C3 がシグ トサイクラーゼ毒素は気道の組織障害を引き起こす ナル伝達阻害を引き起こすしくみ ○福井 理，戸嶋 ひろ野，新澤 直明，中村 佳司，安倍 裕順，堀口 安 ○津下 英明，戸田 暁之，鶴村 俊治，吉田 徹（京都産業大学・総合 彦（阪大・微研・分子細菌） 生命科学部）

Adenylate cyclase toxin from B. pertussis but not B. Inhibition mechanism of RhoA signaling by ADP- bronchiseptica causes tracheal tissue damage ribosylating toxin C3 ○Aya Fukui, Hirono Toshima, Naoaki Shinzawa, Keiji Nakamura, ○Hideaki Tsuge, Akiyuki Toda, Toshiharu Tsurumura, Toru Yoshida Hiroyuki Abe, Yasuhiko Horiguchi (Dept. Mol. Bacteriol., Res. Inst. (Fac. Life Sciences, Kyoto Sangyo Univ.) Microb. Diseases, Osaka Univ.) 多くの病原菌の毒素は，ヒトのタンパク質を ADP リボシル化す Bordetella pertussis (Bp) is the pathogen causing whooping cough, ることにより，生体内シグナル伝達を狂わせることが知られて an acute respiratory human disease. Bp shares highly homologous いる。この毒素の基質となる Rho ファミリー G タンパク質（Rho virulence factors with Bordetella bronchiseptica (Bb), which, unlike GTPase）は，細胞の形態維持や運動性に関わる細胞骨格を制御 Bp, causes chronic respiratory diseases in a wide range of mammals. する役割を果たしている。代表的な Rho GTPase として，RhoA， It remains unknown why disease manifestations and host specificities Rac1，Cdc42 の 3 つが良く知られているが，1989 年に発見され are different among bordetellae. た C3（ADP リボシル化毒素）は RhoA のみを特異的に ADP リ Recently, we found that adenylate cyclase toxin (ACT) from Bp but ボシル化する。C3 の RhoA に対する特異性に，多くの研究グルー not Bb caused morphological alterations and aberrant accumulation プが興味を抱いてきたが，C3 と RhoA の複合体の構造が明らか of intracellular cAMP in various types of cells, although these ACTs ではないために，その相互作用と ADP リボシル化の機構はよく share 98% homology. We identified the Phe375 of Bp ACT as a key わかっていなかった。C3 とその基質 RhoA の複合体構造を明ら residue to exert the cytotoxicity: the substitution of Phe for Ser375 of かにして，その基質特異性と ADP リボシル化の反応機構につい Bb ACT (BbS375F) conferred the cytotoxicity, and in contrast, the て新たな知見を得ることを目的とする。セレウス菌由来の C3 を substitution of Ser for the Phe375 of Bp ACT (BpF375S) abolished the 用いて，GTP が結合した RhoA (RhoA(GTP)) と C3 の複合体およ cytotoxicity. The molecular mechanisms by which ACT with Ser375 is び，GDP が結合した RhoA (RhoA(GDP)) と C3 の複合体の結晶化 intracellularly inactivated are now under investigation. を行い，さらに，これらの結晶を NADH を含む溶液にソーキン In addition, we found that ACT with cytotoxicity (Bp and BbS375F グした後に X 線回折データを収集することで，NADH，RhoA， ACT) disrupted epithelial barrier of cultured rat tracheal cells, while C3 の 3 者複合体の結晶構造 (NADH-C3-RhoA(GTP) と NADH- the others (Bb and BpF375S ACT) did not. Epithelial barrier of rat C3-RhoA(GDP)) を明らかにした。C3 の RhoA の認識には ARTT- tracheas infected with active ACT (BbS375F ACT)-expressing Bb loop が重要で RhoA の Asn41 を特異的に ADP リボシル化するこ was also impaired. Thus, we consider that the different activities とが提唱されてきた。複合体構造により，ARTT-loop を介した相 of ACTs among the Bordetella species could lead to different 互作用が初めて明らかになった。この ARTT-loop 認識機構は異 manifestations of diseases. なった基質アクチンを ADP リボシル化する Ia でも提唱されてい るが，複合体構造で見出されていない。さらに，C3-RhoA 複合 体から得られた知見から Cdc42 変異体を作成し，C3 の良い基質 とすることに成功した。

P2-051 ウエルシュ菌 δ 毒素によるマウス小腸障害作 P2-052 ウエルシュ菌 δ 毒素の腸管上皮細胞への作用 用の解析 ○谷岡 大輔，清家 総史，高岸 照久，宮本 和明，小林 敬子，竹原 正 ○清家 総史，谷岡 大輔，宮本 和明，小林 敬子，竹原 正也，永浜 政 也，永浜 政博（徳島文理大学・薬・微生物） 博（徳島文理大・薬・微生物） Effect of Clostridium perfringens delta-toxin on intestinal Clostridium perfringens delta-toxin induces mouse small epithelial cells intestinal damage ○Daisuke Tanioka, Soshi Seike, Teruhisa Takagishi, Kazuaki ○Soshi Seike, Daisuke Tanioka, Kazuaki Miyamoto, Keiko Miyamoto, Keiko Kobayashi, Masaya Takehara, Masahiro Nagahama Kobayashi, Masaya Takehara, Masahiro Nagahama (Dept. Microbiol., (Dept. Microbiol., Fac. Pharm. Sci., Tokushima Bunri Univ.) Fac. Pharm. Sci., Tokushima Bunri Univ.) 【目的】B と C 型ウエルシュ菌が産生する δ 毒素は，ポア形成毒 【目的】B と C 型ウエルシュ菌が産生する δ 毒素は，本菌が産生 素（β-PFT）で，溶血や細胞死を引き起こすが，本菌感染症にお する β 毒素や NetB と同様のポア形成毒素（β-PFT）で，溶血や ける δ 毒素の役割は明らかにされていない。今回，我々は δ 毒 細胞死などの生物活性を示す。δ 毒素は，本菌感染症の病原性に 素の病原性における役割を検討するため，ヒトの腸管細胞であ 寄与していることが報告されているが，その詳細な毒性メカニ る Caco-2 細胞を使用し，本毒素の作用メカニズムを検討した。 ズムは不明である。我々は，δ 毒素の病原性を解明するため，本 【結果】マウス回腸ループ法で δ 毒素は，水分貯留作用と腸管 毒素のマウス腸管毒性について検討を行った。 の絨毛上皮での障害を示した。そこで，腸管上皮バリヤー機能 【結果】まず，マウス回腸ループ法により本毒素の腸管毒性を観 の変化が考えられるので，Caco-2 細胞を使用し，本毒素の詳細 察した。その結果，Control と比較して，本毒素投与で著しい水 な作用メカニズムを検討した。まず，Caco-2 細胞に本毒素を作 分貯留が認められた。さらに，回腸組織の HE 染色では，δ 毒素 用させると本毒素は細胞膜上でオリゴマーを形成し細胞毒性を の障害部位において腸管平滑筋が薄くなり，絨毛では時間依存 示した。次に，Caco-2 細胞を 3 週間培養し，経上皮電気抵抗値 的に上皮細胞の脱離や委縮が認められた。次に，本毒素による （TEER）を測定すると，濃度と時間に依存して TEER 値の低下 腸管上皮の透過性の変化を測定するため，FITC-dextran（4 kDa） が認められた。δ 毒素と同じ，β-PFT ファミリーの黄色ブドウ球 と δ 毒素を回腸ループに同時投与し，FITC-dextran の血中移行 菌の α 毒素は，細胞膜上のメタロプロテアーゼである ADAM10 量を測定した。その結果，FITC-dextran は水分貯留が起こる前 を活性化して，E-cadherin の分解を誘導することが知られている。 に血中で検出されたため，下痢症状が起こる前に，バリヤー機 そこで，本毒素による Caco-2 細胞の E-cadherin の分解を調べる 能の破壊が示唆された。そこで，回腸のバリヤー機能に関与す と，分解が認められた。次に，ADAM10 選択的阻害剤 GI254023（GI） る Tight junction（TJ），及び Adherens junction（AJ）に着目し， を前処理した細胞に，本毒素を作用させると，TEER 値の低下 δ 毒素処理した回腸組織での変化を，ウエスタンブロットで解析 及び E-cadherin の切断が抑制された。さらに，本毒素は 4°C で， を行った。その結果，δ 毒素処理した回腸では TJ タンパク質の， オリゴマーとモノマーが Caco-2 細胞に結合するが，GI 処理によ occludin が分解を受けることが判明した。 り 4°C における本毒素の結合が抑制された。 【考察】以上の結果より，δ 毒素は，マウス回腸ループにおいて， 【考察】以上の結果より，δ 毒素は Caco-2 細胞において，オリゴ 水分貯留を起こして下痢を起こすことが判明した。この時，小 マーを形成し，細胞毒性を示した。さらに本毒素の上皮バリヤー 腸絨毛の脱離や委縮，そして occludin の分解による上皮バリヤー 機能の低下は，ADAM10 を介して発現することが示唆され，病 機能の破壊など種々の腸管障害を示すことが判明した。以上よ 原性における δ 毒素の役割が明らかとなった。 り，本毒素が本菌感染症の病原性に強く関与していると考えら れる。

123 P2-053 Streptococcus infantis 由来新規コレステロー P2-054 一酸化窒素による腸管出血性大腸菌の志賀毒素 ル依存性細胞溶解毒素の細胞障害特性 産生亢進機構の解析 ○田村 郁実1，田端 厚之1，村上 漱1，高尾 亞由子2，大國 寿士3，友 ○市村 公敏，清水 健，八尋 錦之助，竹内 裕紀，野田 公俊（千葉大・ 安 俊文1，前田 伸子2，長宗 秀明1（1徳島大院・ソシオテクノサイエ 院医・病原細菌制御学） ンス・ライフシステム，2鶴見大・歯・口腔微生物，3株式会社 保健 科学東日本） Analysis of mechanism of nitric oxide-enhanced Shiga toxins production in EHEC Cytotoxic properties of a novel cholesterol-dependent ○Kimitoshi Ichimura, Takeshi Shimizu, Kinnosuke Yahiro, Hiroki cytolysin from Streptococcus infantis Takeuchi, Masatoshi Noda (Dept. Mol. Infectiol., Grad. Sch. Med., ○Ikumi Tamura1, Atsushi Tabata1, Shu Murakami1, Ayuko Takao2, Chiba Univ.) Hisashi Ohkuni3, Toshifumi Tomoyasu1, Nobuko Maeda2, Hideaki Nagamune1 (1Dept. Biol. Sci. & Tech., Life Syst., Inst. Tech. & Sci., 【目的】腸管出血性大腸菌（EHEC）の主要な病原因子である志 Tokushima Univ. Grad. Sch., 2Dept. Oral Bacteriol., Tsurumi Univ., 賀毒素（Stx）には，主に Stx1 と Stx2 が存在する。Stx1 産生の 3Health Sci. Res. Inst. East Japan Co. Ltd.) 制御は，stx1 プロモーターの活性を抑制する Fur による発現抑 制と RecA による発現亢進機構が関与している。一方，Stx2 産 【目的】我々は，ゲノム情報および生化学性状に基づいて 生は，主に後者が調節している。一酸化窒素（NO）は，宿主の Streptococcus infantis と同定された株が，新規のコレステロール 感染防御系において産生され，殺菌作用を示す。本研究では， 依存性細胞溶解毒素（CDC）である Infantilysin（InLY）をコー NO による EHEC の Stx 産生亢進機構を明らかにした。【方法】 ドする遺伝子をゲノム上に保有することを確認した。本研究 EHEC の培養液に NO ドナーを添加し，Stx の産生量を抗 Stx 抗 では，本株が産生する InLY の細胞障害特性について検討した。 血清を用いて，培養上清と菌体について解析した。RecA 量は菌 【方法】InLY は，N 末 His-tag 化組換え体（His-InLY）として大 体について抗 RecA 抗体を用いて解析した。NO による Stx 産生 腸菌発現系で調製した。His-InLY の細胞障害特性は，赤血球溶 亢進機構の解析には，Fur の過剰発現株，stx1 プロモーター欠 血反応の pH 依存性や動物種依存性，および His-InLY の受容体 失株，recA 欠失株，recA 変異株を用いた。【結果と考察】Stx1 認識性を指標として検討した。また，ヒト由来株化細胞に対す 産生は，Fur 過剰発現株と stx1 プロモーター欠失株では NO に る細胞障害性についても検討した。【結果と考察】His-InLY の溶 よって亢進し，recA 欠失株ではほとんど亢進しなかった。また， 血活性は，生理的 pH 条件で高い活性を示す典型的な CDC と異 Stx2 産生は，LexA cleavage 活性を無くした recA 変異株では NO なり，酸性条件下において高い溶血活性を示し，中性からアル によって亢進しなかった。さらに，Stx 産生亢進が認められる濃 カリ性条件下では溶血活性が低下した。また，His-InLY はヒト 度の NO ドナー添加により，RecA の増加が認められた。以上の 赤血球に高い指向性を示す動物種依存的な溶血活性を示すと共 結果から，主に RecA が，NO による EHEC の Stx1 ，Stx2 産生 に，受容体競合試験の結果より，細胞膜コレステロールとヒト 亢進に寄与することが明らかとなった。また，Fur は，NO によ 型 CD59 の双方を受容体として認識する二受容体型 CDC である る Stx1 産生亢進に関与しない事が示唆された。 可能性が強く示唆された。さらに，His-InLY はヒト口腔扁平上 皮癌由来細胞株 HSC-2 に対して細胞障害性を示すことも確認し た。以上の結果から，InLY は S. infantis の細胞障害因子の一つ として宿主への病原性に関与する可能性が示唆された。InLY の 細胞障害特性とそのメカニズムを明らかにするために，現在， InLY の受容体認識特性の詳細についてさらに検討を進めている。

P2-055 下痢症患者から分離された大腸菌が持つモザイ P2-056 β 溶血性 S. anginosus subsp. anginosus の ク CDT の性状解析 SLS ホモログ依存的な細胞障害性 ○新井 暢夫1，畑中 律敏2，安田 憲朋2，日根野谷 淳2，山崎 伸二2 ○大谷 浩美，田端 厚之，友安 俊文，長宗 秀明（徳島大院・ソシオ （1大阪府大・生命環境科学・獣医，2大阪府大大学院・生命環境科学 テクノサイエンス・ライフシステム） 研究科） Streptolysin S homolog-dependent cytotoxicity of beta- Characteristics of untypable cytolethal distending toxin hemolytic S. anginosus subsp. anginosus in E. coli isolated from diarrheal patients ○Hiromi Ohtani, Atsushi Tabata, Toshifumi Tomoyasu, Hideaki ○Nobuo Arai1, Noritoshi Hatanaka2, Noritomo Yasuda2, Atsushi Nagamune (Dept. Biol. Sci. & Tech., Life Syst., Inst. Tech. & Sci., Hinenoya2, Shinji Yamasaki2 (1Dept. Vet. Sci., Sch. Life and Environ. Tokushima Univ. Grad. Sch.) Sci., Osaka Pref. Univ., 2Grad. Sch. Life and Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.) 【目的】アンギノーサス群連鎖球菌（AGS）は，ヒト口腔内常在 細菌叢の一種である。我々は既に，β 溶血性を示す AGS（β-AGS） 【背景】細胞膨化致死毒素（CDT）は培養細胞に対する細胞の膨化と細胞 の β 溶血因子が，S. pyogenes などの化膿性連鎖球菌が産生するス 周期を停止させ細胞を致死させる。大腸菌が産生する CDT はアミノ酸配 トレプトリジン S（SLS）のホモログであることを明らかにして 列の相同性から CDT-I～CDT-V の毒素型に分類される。我々は下痢症患 きたが，この β-AGS の SLS ホモログが示す細胞障害メカニズム 者由来の大腸菌 AQ-13328 株が既報の CDT には型別できない cdt 遺伝子を の詳細は未だ不明な点が多い。そこで本研究では，β 溶血性 S. 保有することを見出した。各サブユニットの推定アミノ酸配列を比較す anginosus subsp. anginosus（β-SAA）の SLS ホモログによる細胞 ると CdtA は Cdt-IA と 98%，CdtB と CdtC は CDT-IV のそれらと 100%， 障害性について検討した。【方法】β-SAA とヒト口腔扁平上皮癌 97% と最も高い相同性を有するモザイク型であった。本研究では新たに 由来細胞株 HSC-2 を共培養し，MTT 変法を用いたミトコンドリ 見出したモザイク CDT の性状解析を行った。【方法】1）組換えモザイク ア内脱水素酵素活性を指標として細胞障害性を検討した。また， CDT (rM-CDT）発現大腸菌の破砕上清と AQ-13328（野生）株破砕上清を JC-1 キットを用いてミトコンドリア膜電位の変動を観察した。 用いて HeLa 細胞に対する細胞毒性試験と FCM にて DNA 含量を測定し さらに，乳酸脱水酵素（LDH）の漏出，ヨウ化プロピジウム（PI） た。また抗 Cdt-IVB 血清により rM-CDT と AQ-13328 株破砕上清（M-CDT） の細胞内移行，および DiBAC4(3) を用いた細胞膜電位の変化を による HeLa 細胞への毒性の中和を行った。2）M-CDT，CDT-I，CDT-IV 指標として細胞膜の障害性も検討した。【結果・考察】β-SAA と の 8 種類の培養細胞（CHO，HeLa，Vero，Caco-2，Intestine407，HEp- の共培養により，ミトコンドリア機能障害による代謝活性の低 2，Y-1，NIH/3T3）に対する細胞指向性を比較した。【結果・考察】M-CDT 化やミトコンドリア膜電位の低下が確認された。また，LDH の は既報の CDT と同様に HeLa 細胞に細胞膨化と G2/M 期で細胞周期停止 漏出に顕著な差異は確認されなかったが，PI の細胞内移行や細 を起こした。AQ-13328 株破砕上清による毒性が抗 Cdt-IVB 血清で中和さ 胞膜電位の検討結果から，β-SAA との共培養による細胞膜障害 れたことから本株が毒素活性のある CDT を産生することが考えられた。 も確認された。これらの障害性は，SLS ホモログを持たない非 Vero 細胞に対する毒素活性を比較すると CDT-IV は CDT-I，M-CDT より 溶血性株では確認されなかった。以上の結果から，β-SAA の細 強い毒素活性を示した。推定アミノ酸配列全長では CDT-IV と相同性が高 胞障害性は SLS ホモログに依存し，SLS ホモログは細胞膜の小 い M-CDT であるが細胞指向性は CDT-I と類似していた。モザイク CDT 分子透過性を高め，それに起因するミトコンドリアの機能障害 の各サブユニットの特徴からこの相違は CdtA に由来することが考えられ を惹起する可能性が示唆された。 る。今後 CDT-I と CDT-IV のサブユニットを置換した CDT による細胞指 向性比較を予定している。

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P2-057 MRSA 腎症の原因解明についての検討 P2-058 Aeromonas の病原性に関わるセリンプロテ ○神山 理明1，加藤 秀人2，芦野 滋2，八木 淳二2，新田 孝作1（1東京 アーゼの成熟化の分子メカニズム 2 女子医科大学病院・腎臓内科， 東京女子医科大学病院・微生物免疫 ○小林 秀丈1，吉田 徹2，宮川 拓也3，田代 充4，岡本 敬の介5，田之 学教室） 倉 優3，津下 英明2,3，山中 浩泰1（1広島国際大・薬，2京都産業大・ 総合生命科学，3東京大学大院・農学生命・応用生命化学，4明星大学 A Study to elucidate the cause of MRSA nephropathy 大院・理工・化学，5岡山大学大院・医歯薬学総合・薬） ○Michiaki Kamiyama1, Hidehito Kato2, Shigeru Ashino2, Junji Yagi2, Kousaku Nitta1 (1Immunology microorganisms of Univ. Tokyo Molecular mechanism of maturation of the serine Women’s Medical, 2Dept. Microbiology & Immunology, Tokyo protease produced by Aeromonas sobria Women’s Medical Univ.) ○Hidetomo Kobayashi1, Toru Yoshida2, Takuya Miyakawa3, Mitsuru Tashiro4, Keinosuke Okamoto5, Masaru Tanokura3, Hideaki Tsuge2,3, MRSA 腎症は，メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）感染 Hiroyasu Yamanaka1 (1Fac. Pharm. Sci., Hiroshima International 中によりネフローゼレベルの蛋白尿を伴い，急速進行性に腎機 Univ., 2Fac. Life Sci., Kyoto Sangyo Univ., 3Grad. Sch. Agr. and Life 能低下を呈する感染後腎疾患である。その発生機序は MRSA の Sci., Univ. of Tokyo, 4Dept. Chem., Meisei Univ., 5Okayama Univ. 産生するスーパー抗原が特定の TCRVβ 領域を介する多種類の T Grad. Sch. of Med., Dent. and Pharm. Sci.) 細胞クローンの活性化による，サイトカインの過剰放出や，そ れに伴う B 細胞の活性化による，ポリクローナルな抗体の過 Aeromonas sobria は水系環境中に生息し，ヒトの腸管感染症の原 剰産生により，免疫複合体形成をきたすこと等が考えられてい 因菌である。抵抗力の低下したヒトではしばしば重症化し全身感 る。我々は，マウスに SEA を投与した際の尿蛋白を測定し，こ 染症へと進展することが知られている。我々は培養後の上清画 の点を検証した。【方法】RAG2-/-，WT マウスに staphylococcal 分よりズブチリシンファミリーに属するセリンプロテアーゼ（A. enterotoxin A（SEA）を 50μg/ml 腹腔内投与した後，尿量を蓄尿 sobria serine protease：ASP）を見出した。さらに，ASP は腸管 にて計測し尿中 alb を SDS-PAGE にて測定した。【結果および考 上皮細胞の細胞間結合を破壊し，菌の組織浸潤を引き起こす病原 察】SEA 投与前後の蛋白尿変化を見ると RAG2-/- では 1.9mg/ml 因子として働くことを明らかにした。一方，ASP の性状を解析し から 9.5mg/ml，WT マウスでは 1.8mg/ml から 10.5mg/ml と両マ た結果，ASP はズブチリシンファミリーに属するプロテアーゼと ウスとも増加していた。このことから MRSA 腎症発症機序は，T， は異なり触媒ドメインのフォールディングに関わるプロ領域を有 B 細胞は関与しないことが示唆され，T 細胞 B 細胞以外の MHC しないことが判明した。このことから，ASP は独自の過程を経 class2 発現細胞の産生する各種サイトカインの関与を調べる為， て成熟化する細菌性プロテアーゼと推察された。そこで，その分 SEA 投与時の RAG2-/- マウスの血中サイトカイン濃度を in vivo 子メカニズムを解明することを目的に構造生物学的な解析を進め と in vitro で測定中である。さらに SEA 投与時の腎組織での た。その結果，ASP はその遺伝子の下流にコードされる ORF2 が SEA 沈着の有無，SEA 投与時の腎生検の病理的変化，podocyte 成熟化を完結させるのに不可欠であること，ASP と ORF2 との複 細胞株（E11）を用いた SEA 刺激による蛋白透過性，SEA 染色 合体の分子構造を解明した結果，ORF2 の C 末端領域が ASP の による結合能，SEA 刺激時の stressfiber 染色，スリット膜構成 活性部位に結合してその活性を阻害する一方，ORF2 のセントラ 分子変動の観察も順次報告していく予定である ルボディを軸に N 末領域が ASP のフォールディングを完結させ ているのではないかと考察された。これらの知見は，ズブチリシ ンファミリーにおいて ASP が新たな特徴を持つ細菌性プロテアー ゼであることを示唆しており，さらに詳細な分子メカニズムを解 析することによって病原因子としての細菌性プロテアーゼを制御 する新たな抗菌戦略を考える一助になると考えている。

P2-059 The mechanism of EspJ-induced cell death P2-060 レジオネラ菌の新規エフェクタータンパク質と during the infection of EPEC and EHEC その標的宿主タンパク質の網羅的探索 ○顔 宏哲，狩野 直樹，浦島 晶子，戸邉 亨（阪大院・医・生体情報） ○瀬戸 真太郎1，永田 年2（1結核研究所・生体防御，2浜松医大・健 康科学） ○Hilo Yen, Masaki Karino, Akiko Urashima, Toru Tobe (Dept. Biomed. Info., Grad. Sch. Med., Osaka Univ.) Exploratory of new effector proteins and their host target proteins of Legionella pneumophila Objective: Enteropathogenic and enterohemarrhagic Eschercia ○Shintaro Seto1, Toshi Nagata2 (1RIT, JATA, 2Dept Health Sci., coli (EPEC and EHEC) use various virulence factors to subvert Hamamatsu Univ. Sch. Med.) host cellular functions. However, functions of many factors remain undefined. In this study, we focused on one of these factors, EspJ, Legionella pneumophila（レジオネラ菌）は，レジオネラ肺炎や and attempt to elucidate its function in the host cell. ポンティアック熱などのレジオネラ症の原因細菌である。レジ Method: To observe the effect of EspJ, macrophage-like THP-1 オネラ菌はマクロファージなどの食細胞に貪食されても，貪食 cells were infected with wild type, ΔespJ or the complement strain された細胞内で増殖できる細胞内寄生性細菌である。レジオネ of EPEC, stained with Propidium iodide (PI) / DAPI, and visualized ラ菌は感染宿主細胞内でエフェクタータンパク質を分泌する。 with the confocal microscope. To quantify the cell death, LDH これらのエフェクタータンパク質によって，レジオネラ菌が含 and TUNEL assays were performed. To identify the host binding まれるファゴソームは小胞体様に改変されて，増殖ニッチが形 proteins, purified tagged-EspJ was mixed with HeLa lysates and 成される。これまでの研究によって，Dot/Icm 分泌装置と呼ばれ proteins shown high affinity was analyzed. To confirm the association る IV 型分泌装置依存的にエフェクタータンパク質がレジオネラ and the binding region, pull-down assay was performed using purified 菌体内から宿主細胞内に分泌されていることが明らかになって proteins. いる。レジオネラ菌ゲノム上の約 3100 遺伝子のうち，400 遺伝 Result: The percentage of PI+ cells were lower in the absence of 子以上がエフェクタータンパク質であるが，その多くの機能は bacterially-injected EspJ. Subsequent LDH and TUNNEL assays 明らかになっていない。本研究では，これまで宿主細胞内で発 confirmed that EspJ caused higher rate of apoptosis. To elucidate the 現することが明らかになっている 275 のエフェクタータンパク mechanism, API5 (apoptosis inhibitor 5) was identified as the binding 質の宿主標的タンパク質を探索した。HEK293 細胞で FLAG タ partner of EspJ and such association required the C-terminal end of グ融合エフェクタータンパク質を発現させて，免疫沈降法でエ API5. フェクタータンパク質を精製した。精製したエフェクタータン Conclusion: EspJ increases the degree of apoptosis in the host cells, パク質を LC-MS/MS で解析することによって，エフェクタータ which is attributed to its potentially antagonistic binding of API5. ンパク質に結合している宿主タンパク質を同定した。その結果， 25 以上の宿主標的タンパク質が明らかになっていなかった新規 エフェクタータンパク質を明らかにすることができた。これら の宿主標的タンパク質には小胞体の小胞輸送に関与するタンパ ク質である VCP や COPI 複合体などが含まれる。本研究で新し く同定したエフェクタータンパク質の細胞内寄生性における機 能について議論したい。

125 P2-061 合成コラーゲン様基剤とコラーゲン結合型線維 P2-062 ボツリヌス C 型毒素はクラスリン非依存的エ 芽細胞増殖因子を用いた複合剤による骨形成促進法の開発 ンドサイトーシスにより神経細胞内に侵入する ○濱本 奈々 1，内田 健太郎2，関口 裕之2，美間 健彦1，後藤 和義1， ○塚本 健太郎1，幸田 知子2，辻 孝雄1（1藤田保衛大・医・微生物， 山本 由弥子1，横田 憲治3，高相 晶士2，松下 治1（1岡山大・院医歯薬・ 2大阪府大院・生命環境・獣医感染症） 病原細菌学，2北里大・医・整形外科，3岡山大・院保健） Botulinum neurotoxin type C is internalized in cultured Novel therapeutic for bone fractures using synthetic neurons via clathrin-independent endocytosis scaffold and collagen-binding growth factor ○Kentaro Tsukamoto1, Tomoko Kohda2, Takao Tsuji1 (1Dept. Microbiol., ○Nana Hamamoto1, Kentaro Uchida2, Hiroyuki Sekiguchi2, Takehiko Fujita Health Univ. Sch. Med., 2Dept. Vet. Sci., Grad. Sch. Life Environ. Mima1, Kazuyoshi Gotoh1, Yumiko Yamamoto1, Kenji Yokota3, Sci., Osaka Pref. Univ.) Masashi Takaso2, Osamu Matsushita1 (1Dept. Bacteriol., Okayama Univ. Grad. Sch. Med. Dent. Pharm. Sci., 2Dept. Orthop. Surg., ボツリヌス神経毒素（BoNT）は Clostridium botulinum によって Kitasato Univ. Sch. Med., 3Okayama Univ. Grad. Sch. Health Sci.) 産生される蛋白毒素であり，その抗原性の違いから A～G 型の 7 つ（BoNT/A～G）に分類されている。BoNT/C はシナプス小胞 【目的】細菌性コラゲナーゼの基質結合領域を用いて塩基性線維芽細胞増 膜蛋白に結合せず，ガングリオシドのみを受容体として認識す 殖因子（bFGF）をコラーゲン膜にアンカリングした複合材料により骨形 ることから，他の型の BoNT とは異なる経路で細胞内に取り込 成を促進できた。しかし，動物由来材料には BSE 等の病原体感染の恐れ まれる可能性が考えられる。しかし，その細胞侵入機構の詳細 がある。そこで，細菌性コラゲナーゼ由来の種々のコラーゲン・アンカー は明らかにされていない。本研究では，この点を明らかにする を用いて bFGF をコラーゲン様ペプチド・ポリマー（ACG）にアンカリン ため，BoNT/C の神経細胞への取り込みに寄与するエンドサイ グした新しい複合剤の骨形成促進能を検討した。 トーシス経路について調べた。 【方法】アンカー部が異なる 4 種のコラーゲン結合型 bFGF（CB-bFGF） まず，小胞リサイクリングの関与について検討するため，培養 を精製した。コラーゲンへの結合は ELISA 法により確認した。細胞増殖 神経細胞を BoNT/D で前処理することで小胞リサイクリングを 促進能は，骨膜細胞に bFGF または CB-bFGF を添加して 2 日間培養し， 阻害した後に，BoNT/C を作用させた。その結果，BoNT/D 処理 WST-1 assay により測定した。骨形成促進能は，病態モデルの骨折部に 細胞は未処理の細胞と比較して，BoNT/C の細胞への取り込み量， CB-bFGF をアンカリングした ACG を直接投与し，4 週間後に microCT に および毒素による標的蛋白である SNAP-25，Syntaxin-1 の切断 より新生骨量と骨塩量を測定して評価した。 の程度に差は認められなかった。次に，クラスリン依存性エン 【結果】何れの融合タンパク質もコラーゲン・パウダーに結合するとともに， ドサイトーシスの特異的阻害剤である PitStop-2，あるいはダイ 骨膜細胞増殖誘導活性を示した。コラーゲン結合ドメイン（CBD）がタ ナミン阻害剤である Dyngo-4a を細胞に前処理したところ，阻害 ンデムリピートしたアンカー（Clostridium histolyticum コラゲナーゼ ColG 剤処理細胞と未処理の細胞の毒素感受性に差は認められなかっ 由来）を有する bFGF-CBD-CBD 投与群は，他の全ての群に比し新生骨量 た。一方，エンドソームの酸性化を阻害する Bafilomycin A1 で細 と骨塩量が有意に高かった。 胞を処理すると，Bafilomycin A1 の濃度依存的に BoNT/C による 【考察】ACG を基剤とした in vivo での骨新生誘導能にはアンカーによる SNAP-25 の切断が抑制された。以上のことから，BoNT/C はクラ 差が認められ，bFGF-CBD-CBD が最も高かった。合成基剤を用いた今回 スリン非依存的で且つダイナミン非依存的なエンドサイトーシ の複合材料は，従来の動物由来タンパク質を基剤とする複合材料と同等の スにより神経細胞内に侵入すると考えられた。 骨形成能を示したので，注射投与が可能である点も含め，優れた骨形成促 進材料であると考えられる。今後，高齢者や糖尿病患者などの難治性骨折 に有用な新規難治性骨折治療材料の開発が期待される。

P2-063（WS21-8） 血清型 A 型ボツリヌス神経毒素 P2-064（WS21-3） Interaction of Vibrio 複合体の腸管吸収機構 parahaemolyticus diarrheal T3SS effector VopV with ○松村 拓大1，菅 原 庸1，油 谷 雅広1，阿 松 翔1，藤 永 由佳子2（1大阪大・ actin filaments 2 微研・附属感染症国際研究センター・感染細胞生物学， 金沢大・医・ 日吉 大貴1，児玉 年央2，○飯田 哲也2（1阪大・微研・ゲノム病原細菌， 細菌感染症制御） 2阪大・微研・細菌感染）

Mechanism of intestinal absorption of type A botulinum Hirotaka Hiyoshi1, Toshio Kodama2, ○Tetsuya Iida2 (1Lab. Genomic neurotoxin complex Res. Pathog. Bac., Res. Inst. Microbial Dis., Osaka Univ., 2Dept. Bac. ○Takuhiro Matsumura1, Yo Sugawara1, Masahiro Yutani1, Sho Infect., Res. Inst. Microbial Dis., Osaka Univ.) Amatsu1, Yukako Fujinaga2 (1Lab. Infect. Cell Biol., RIMD, Osaka Univ., 2Dept. Bacteriol., Sch. Med., Kanazawa Univ.) A type III secretion effector, VopV, from the enteric pathogen Vibrio parahaemolyticus has been identified as a key factor in enterotoxicity. Botulinum neurotoxins (BoNTs) are produced by Clostridium We have demonstrated that VopV interacts with cytoskeletal botulinum and related species and cause the neuroparalytic actin. One of the repeat units in the long repetitive region of VopV, syndrome of botulism. BoNTs are produced along with one or more VopVrep1, functions as an actin-binding module. Here, we report the neurotoxin-associated proteins that non-covalently associate with molecular basis of the VopVrep1/actin interaction. VopVrep1 exists BoNT to form progenitor toxin complexes (PTCs). Ingestion of as an unstructured protein in solution but potently and specifically foods contaminated with PTCs causes food-borne botulism, the most binds F-actin and not G-actin. The F-actin/VopVrep1 complex was common form of botulism in adults. To cause illness, BoNT in the directly visualized at 9.6-Å resolution using electron cryomicroscopy gastrointestinal lumen must traverse an intestinal epithelial barrier. and helical image reconstitution. The density map revealed the However, the invasion site(s) and mechanism of BoNT in vivo are binding site of VopVrep1 at the interface between two actin strands, largely unknown. Here we show that serotype A1 L-PTC, which which is close to the binding site of phalloidin. Consistent with makes the predominant contribution to causing illness, breaches the this observation, VopVrep1 alone prevented the depolymerization intestinal epithelial barrier from microfold (M) cells via an interaction of F-actin. The phalloidin-like behavior, targeting the interstrand between hemagglutinin (HA), one of the nontoxic components, and region of actin filaments to stabilize the filament structure, likely glycoprotein 2 (GP2). HA strongly bound to GP2 expressed on M contributes to the pathogenicity of V. parahaemolyticus. cells, which do not have thick mucus layers. Susceptibility to orally Collaborators: M. Nishimura1,2, T. Fujii3,4, F. Makino3, H. Inoue2, D. administered L-PTC was dramatically reduced in M cell-depleted Motooka1,5, T. Ohkubo5, Y. Kobayashi2, S. Nakamura1, K. Namba3,4. mice and GP2-deficient mice. These data reveal that in order to exert 1Res. Inst. Microbial Dis., Osaka Univ., 2Osaka Univ. of Pharmaceut. its toxic effects, type A1 L-PTC invades the intestinal epithelium Sci., 3Grad. Sch. Front. Biosci., Osaka Univ., 4QBiC, RIKEN 5Grad. through M cells via HA-GP2 interaction. Taken all together, our Sch. Pharmaceut. Sci., Osaka Univ. findings shed light on the process of intestinal BoNT invasion, heretofore largely unknown, which is essential for the onset of food- borne botulism.

126 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P2-065 Vibrio alginolyticus I.029 のコラゲナーゼ発現 P2-066（WS18-10） 乳児ボツリヌス症患者および は HapR により調節される 継代培養から得られた A 型ボツリヌス菌類似無毒株について ○西川 裕太郎1，美間 健彦1，中田 悠介1，後藤 和義1，山本 由弥子1， ○門間 千枝，平井 昭彦，貞升 健志，甲斐 明美（東京都健安研・微 横田 憲治2，松下 治1（1岡山大・院医歯薬・病原細菌学，2岡山大・院 生物） 保健） Clostridium botulinum type A-like non-toxigenic Expression of colA is regulated by HapR in Vibrio organisms isolated from a botulism patient (2) alginolyticus I.029 ○Chie Monma, Akihiko Hirai, Kenji Sadamasu, Akemi Kai (Dept. ○Yutaro Nishikawa1, Takehiko Mima1, Yusuke Nakata1, Kazuyoshi Microbiol., Tokyo Met. Inst. P.H.) Gotoh1, Yumiko Yamamoto1, Kenji Yokota2, Osamu Matsushita1 (1Dept. Bacteriol., Okayama Univ. Grad. Sch. Med. Dent. Pharm. Sci., In an infant botulism case, Clostridium botulinum type A toxigenic 2Okayama Univ. Grad. Sch. Health Sci.) organisms were isolated from five fecal samples between the 16th and 164th day of illness onset and type A-like non-toxigenic organisms 【目的】Vibrio alginolyticus は，創傷感染や外耳や中耳の感染など (nt-organisms) were also isolated from the feces on the 92nd and 164th の起因菌である。本菌が産生するコラゲナーゼは，宿主の結合 day. To investigate the mechanism and the relationship between 組織を破壊し感染巣を急速に拡大するのに重要であると考えら the toxigenic C. botulinum and the nt-organisms, the two toxigenic れる。本菌のコラゲナーゼの発現は，コラーゲン（基質）によっ isolates were serially passaged 40 times using 4 kinds of broths, and て制御されている。この基質によるコラゲナーゼの発現調節機 the passaged organisms were compared with the toxigenic isolates 構を明らかにするため，コラゲナーゼ遺伝子（colA）のプロモー and the nt-organisms from the patient. ターに直接結合し転写を調節するタンパク質をプルダウン法を The toxin titers of the 26th serial passaged organisms were 104 LD50/ 用いて同定することを試みた。 mL, which were approximately equivalent to the original strain. 【方法】colA の基質による発現調節に関る染色体 DNA 領域を However, the 27th passaged organisms did not produce botulinum lacZ レポーターアッセイにより決定した。colA プロモーターに toxin by mouse assay, but carried BoNT/A, BoNT/B and the cluster 結合するタンパク質をプルダウン法により同定した。遺伝子欠 genes as same as the nt-organisms isolated from the patient. 失株を double-crossover 法によって作製した。コラゲナーゼの産 The PFGE patterns of the nt-organisms from the patient showed 生量を Pz-peptidase 活性を指標に測定した。 four types which were different from the pattern of the toxigenic 【結果と考察】lacZ レポーターアッセイにより，colA の開始コド isolates. The organism obtained on the 27th passage using GAM ンより上流 313 bp の染色体 DNA 領域が基質による発現調節に関 broth was indistinguishable from the nt-organisms isolated from the ることが明らかとなった。発現調節に関る領域の DNA 断片に結 patient. The study on the mechanism of these findings is continued. 合するタンパク質をプルダウンし質量分析により同定した結果， HapR が同定された。野生株 I.029 の染色体 DNA 上の hapR を欠 失させた変異株は，コラゲナーゼ産生能が低下した。hapR 欠失 株におけるコラゲナーゼ産生能の低下の度合いは，VarS/VarA 二 成分制御系のレスポンス・レギュレーター varA 欠失株と同等で あった。以上の結果らか，VarS/VarA 二成分制御系は HapR を介 してコラゲナーゼの発現を制御していると考えられる。

P2-067 Deoxycholate induced sporulation by P2-068 Recovery of Streptococcus suis serotype 2 facilitating Spo0A phosphorylation in Clostridium capsule and its virulence in vivo perfringens ○高松 大輔1,2，大 倉 正稔1，大 崎 慎人1，関 崎 勉3（1農研機構・動衛研・ 2 3 ○安木 真世1，奥崎 大介2，桑名 利律子3，高松 宏治3，藤田 昌也4， 細菌寄生虫， 岐阜大院・連合獣医， 東京大・院農・食の安全センター） 5，三宅 眞実1（1阪府大院・生命，2阪大・微研， Mahfuzur R. Sarker ○ 1,2 1 1 3摂南大・薬，4 ，5 Daisuke Takamatsu , Masatoshi Okura , Makoto Osaki , Tsutomu Dept. Biol. Biochem., Houston Univ. Dept. Microbiol., 3 1 2 Oregon State Univ.） Sekizaki ( Bact./Parasit. Dis. Res. Division, NIAH, NARO, Utd. Grad. Sch. Vet. Sci., Gifu Univ., 3Res. Center for Food Safety, Grad. ○Mayo Yasugi1, Daisuke Okuzaki2, Ritsuko Kuwana3, Hiromu Sch. Agr. Life. Sci., Univ. Tokyo) Takamatsu3, Masaya Fujita4, Mahfuzur R. Sarker5, Masami Miyake1 (1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 2RIMD, Osaka Streptococcus suis is an important zoonotic agent. It has been Univ., 3Fac. Pharm. Sci., Setsunan Univ., 4Dept. Biol. Biochem., frequently isolated from pigs with endocarditis, and many of the Houston Univ., 5Dept. Microbiol., Oregon State Univ.) isolates lost their capsule due to mutations in the cps genes. Because the capsule is an important virulence factor, non-encapsulated S. Clostridium perfringens type A is a common source of food suis are considered to be avirulent. To investigate whether non- poisoning in humans. Although sporulation plays a critical role encapsulated S. suis can restore the capsule and become virulent in the pathogenesis of food poisoning, the mechanisms inducing again, we repeated in vitro or in vivo passages of non-encapsulated S. sporulation remain unclear. We previously confirmed deoxycholate suis and attempted to retrieve capsule-recovered strains. Although (DCA)-induced sporulation in C. perfringens strain NCTC8239 co- we subcultured 29 non-encapsulated strains in culture media, no cultured with human intestinal epithelial Caco-2 cells. Here, we encapsulated S. suis was obtained. However, after 4 passages of focused on the mechanism underlying DCA-induced sporulation. a non-encapsulated strain NL119 in mice, a capsule-recovered Morphological differentiation showed that the bacterial population strain (NL119P4) was retrieved from the mice. NL119 has lost the in the sporulation process (stages II-VII and dormant spores) was capsule due to a point mutation (T490C) of cps2F. In NL119P4, this significantly larger in the presence than absence of DCA, indicating mutation was not changed, but a further mutation in cps2F (G491C) that DCA stimulates early events of sporulation. In accord with these restored the function, resulting in the capsule recovery. Recovery findings, global transcriptome analyses revealed that DCA markedly of virulence of NL119P4 was also confirmed using a mouse model. increased the expression of signaling molecules downstream of These results indicated that non-encapsulated S. suis are not always Spo0A, the master regulator of the sporulation process, whereas the thoroughly eliminated, but may cause diseases to the next hosts expression of spo0A itself was not altered in the presence or absence by recovering the capsule, i.e., non-encapsulated S. suis in pigs are of DCA. Furthermore, the phosphorylation of Spo0A was enhanced still potentially hazardous to people handling such pigs and their in the presence of DCA. Collectively, these results demonstrated products. (Nonmember collaborators: J.-P. Auger, N. Meekhanon, M. that DCA induced sporulation, at least partially, by facilitating the Gottschalk) phosphorylation of Spo0A and then activating Spo0A-regulated genes in C. perfringens strain NCTC8239.

127 P2-069 大腸菌由来フラジェリン蛋白は自己免疫性唾液 P2-070 Candida albicans Csa2 タンパクの菌糸形増 腺炎を惹起する 殖における鉄利用への関与 ○樋口 智昭1，春田 郁子1，柳沢 直子1，上芝 秀博2，大坂 利文1，ミ ○柴山 和子1，菊 池 有一郎1,2，国 分 栄仁1,2，石 原 和幸1,2（1東京歯科大・ ヤケ 深雪1，阿部 義廣1，八木 淳二1（1東京女子医大・医・微生物免疫， 微生物，2東京歯科大・口腔科学研究センター） 2東京女子医大・実験動物中央施設） Csa2 in iron utilization for Candida albicans hyphal E.coli-derived FliC triggers autoimmune sialadenitis in growth mice ○Kazuko Shibayama1, Yuichiro Kikuchi1,2, Eitoyo Kokubu1,2, Kazuyuki ○Tomoaki Higuchi1, Ikuko Haruta1, Naoko Yanagisawa1, Hidehiro Ishihara1,2 (1Dept. of Microbiology, Tokyo Dental College, 2Oral Health Ueshiba2, Toshifumi Osaka1, Miyuki Miyake1, Yoshihiro Abe1, Junji Science Center, Tokyo Dental College) Yagi1 (1Dept. Microbiol. Immunol., Tokyo Women’s Med. Univ., 2Inst. Lab. Animals, Tokyo Women’s Med. Univ.) 【目的】鉄の獲得機構を含め C. albicans の生体内増殖機構の詳細 は未だ解明されていない。鉄は C. albicans にとって生存・増殖 我々は以前に C57BL/6 マウスに E.coli を投与することにより， に必須の栄養素であり，病原性発揮にも重要な役割を果たすと マウス膵組織で膵管周囲を中心とした炎症細胞浸潤及び線維化 されている。宿主生体内では鉄成分の大部分が結合鉄やヘム鉄 が認められ，自己免疫性膵炎（autoimmune pancreatitis; AIP）に として存在し C. albicans が利用可能な遊離鉄は極めて低濃度で 類似した組織像を呈することを報告した。さらに，その病原因 しか存在しないため，C. albicans は鉄獲得のための種々の機構を 子の一つが大腸菌鞭毛成分のフラジェリン C（flagellin C; FliC） 有していると考えられる。C. albicans は菌糸形菌体では赤血球成 であることを同定した。一方，ヒト AIP 患者では同様の組織像 分であるヘモグロビンを生体内増殖のための鉄源として利用す を呈する涙腺炎，唾液腺炎，間質性腎炎などを併発することか る可能性が報告されている。Csa2 は，CFEM ドメインを有し鉄 ら，近年 AIP は IgG4 関連疾患の膵病変として位置づけられてい レセプターとしての機能を担うとされる C. albicans の Rbt5 タン る。そこで我々は，FliC が AIP のみならず他臓器の IgG4 関連病 パク質ファミリーメンバーであるが，Csa2 の機能解析は数少な 変を惹起するのではないかと考え，検討を行った。FliC のリコ い。Csa2 の鉄獲得機構への関与について検討を行った。【方法】C. ンビナント蛋白（rFliC）を作成し，マウスに反復投与した。反 albicans 野生株，CSA2 欠失変異株および補完株を供試した。菌 復投与後 1 週及び 15 週後に評価した。涙腺，唾液腺，肺，腎組 糸形菌体は酵母形 C. albicans を RPMI1640 培地中で 37°C 培養す 織から標本を作成し，HE 染色及び免疫染色を行った。血中抗体 ることにより得た。ヒトヘモグロビンに対する C. albicans の親 価及び免疫グロブリン値は ELISA で測定した。その結果，涙腺， 和性は，ヘモグロビンコートした試験管内壁に対する付着を観 肺，腎では対照群と比較して変化を認めなかったが，40%（2/5） 察した。C. albicans のヘモグロビン利用能は，鉄欠乏状態の培養 のマウスで唾液腺導管周囲にリンパ球を中心とした炎症細胞浸 系にヒトヘモグロビン溶液を鉄源として添加し培養後，生菌数 潤を認めた。今回の結果から，我々のマウスモデルが IgG4 関連 を測定した。【結果及び考察】野生株と比較し CSA2 欠失変異株 疾患様病変を再現しうることが示された。我々のモデルは，共 ではヒトヘモグロビンに対する親和性の低下と，ヒトヘモグロ 生菌が IgG4 関連疾患の発症に関与することを示唆する点で特異 ビン利用能の減弱が認められた。CSA2 補完株において野生株と 的であり，共生菌の dysbiosis が IgG4 関連疾患の病因となる可能 同等のヒトヘモグロビンへの親和性および利用能の回復が確認 性について，そのメカニズムを探求している。 された。以上の結果より Csa2 が C. albicans の菌糸形増殖におい てヒトヘモグロビンを鉄源として取り込むことが示唆された。

P2-071 A 群レンサ球菌の endopeptidase O による補 P2-072（WS21-7） Streptococcus pyogenes のシ 体 C1q を介した補体免疫回避機構 ステインプロテアーゼによるデスモグレイン分解が皮膚感染 ○本多 真理子，住友 倫子，毛利 泰士，山口 雅也，中田 匡宣，川端 症の発症に及ぼす影響 重忠（阪大院・歯・口腔細菌） ○毛利 泰士1,2，住友 倫子1，本多 真理子1，山口 雅也1，寺尾 豊3，中 田 匡宣1，川端 重忠1（1阪大院・歯・口腔細菌，2阪大・歯病・障害 Group A streptococcal endopeptidase O contributes to 者歯科，3新潟大・院医歯・微生物） immune evasion via complement factor C1q ○Mariko Honda, Tomoko Sumitomo, Yasushi Mori, Masaya SpeB-mediated cleavage of desmogleins contributes to Yamaguchi, Masanobu Nakata, Shigetada Kawabata (Dept. Oral and development of skin lesion Mol. Microbiol. Grad. Sch. of Dent. Osaka Univ.) ○Yasushi Mori1,2, Tomoko Sumitomo1, Mariko Honda1, Masaya Yamaguchi1, Yutaka Terao3, Masanobu Nakata1, Shigetada A 群レンサ球菌（Group A Streptococcus；GAS）は様々な病 Kawabata1 (1Dept. Oral and Mol. Microbiol., Grad. Sch. Dent., Osaka 原因子を発現し，宿主補体免疫系を回避する。肺炎球菌では Univ., 2Div. Spec. Care Dent., Dental Hosp., Osaka Univ., 3Niigata endopeptidase O（PepO）が補体 C1q と結合し，菌自身のオプソ Univ. Grad. Sch. Med. Dent. Sci. Div. Microbiol. Infect. Dis.) ニン化を阻害することが報告されている。一方，GAS の PepO ホモログと補体免疫回避の関連は明らかにされていない。そこ 【目的】Streptococcus pyogenes は伝染性膿痂疹の起因菌の一つであり， で，本研究では GAS の PepO と C1q の相互作用を解析し，補体 皮膚に化膿性の皮疹を形成する。デスモソーム構成タンパクである 系を介した殺菌への影響を検討した。 デスモグレイン（Dsg）の接着障害は，天疱瘡や水疱性膿痂疹の発 抗 C1q 抗体を用いた ELISA により，PepO 組換え体（rPepO）が 症に関与することが知られている。本研究では，ヒト表皮で発現す ヒト C1q と濃度依存的に結合することを明らかにした。rPepO る Dsg1 および Dsg3 の分解に関与する S. pyogenes の病原因子を検索 と C1q の分子間相互作用を表面プラズモン共鳴装置を用いて評 し，皮膚病態発症との関連を検証した。【方法】S. pyogenes 臨床分離 –8 価したところ，解離定数（KD）は 5.88×10 M であった。古典経 株の培養上清を各種プロテアーゼ阻害剤で処理した後，Dsg1 もしく 路の開始において，C1q の球状ヘッドは IgG Fc 領域に表在する は Dsg3 の細胞外ドメインを含む組換えタンパク（rDsg1，rDsg3）と リジン残基と静電気的相互作用で結合するため，NaCl 濃度の上 反応させ，rDsg の分解をウェスタンブロット法で解析した。また， 昇に伴いその結合が減弱することが知られている。一方，rPepO 劇症型感染症由来の NIH35 株，皮膚感染症由来の 591 株，または両 と C1q の結合は，生理条件下より高い NaCl 濃度において抑制さ 菌株を親株とする speB 欠失株と復帰変異株をマウス皮内に接種し， れた。次に，ヒト血清と野生株もしくは pepO 欠失株（ΔpepO 株） 経時的に病変サイズを計測した。さらに，病変部位における Dsg の を反応させたところ，血清中における ΔpepO 株の菌数増加率は 免疫染色を行い，デスモソームの観察を行った。【結果と考察】S. 野生株と比較して低下した。ヒト血清と反応させた野生株およ pyogenes の培養上清による rDsg1 と rDsg3 の分解は，システインプロ び ΔpepO 株の表層構造を経時的に電子顕微鏡で観察した結果， テアーゼ阻害剤の添加により阻害された。また，野生株培養上清に ΔpepO 株では，野生株と比較して反応後 30 分より著明な表層構 よる rDsg の分解は speB 欠失により抑制された。これらの結果から S. 造の破壊が認められた。 pyogenes のシステインプロテアーゼ SpeB は Dsg1 と Dsg3 の細胞外ド 以上の結果から，GAS の PepO は C1q との会合により補体古典 メインを分解することが示された。マウス皮膚感染モデルにおいて， 経路を阻害し，後期補体経路における溶菌を回避する可能性が speB 欠失株感染マウスの病変サイズは野生株感染マウスのものと比 示唆された。 較して有意に減少した。また，野生株接種部位における Dsg1 および Dsg3 の染色性は speB 欠失株感染と比較して，より顕著に低下した。 以上の結果から，SpeB によるデスモソーム構成タンパクの分解は S. pyogenes に起因する皮膚感染症の発症に関与することが示唆された。

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P2-073 腸管出血性大腸菌 EHEC の病原性における P2-074 揮発性硫化物産生における Porphyromonas OmpT protease（Omptin）の役割 gingivalis のトリプシン様酵素の役割 ○浦島 晶子，顔 宏哲，戸邉 亨（阪大院・医・生体情報） ○渡辺 清子1，平 嶺 浩子2，熊 田 秀文3，浜 田 信城1（1神奈川歯科大学・ 院・歯学研究・微生物感染学，2神奈川歯科大学・院・歯学研究・高 The Role of OmpT Protease in Enterohemorrhagic 度先進口腔医学，3神奈川歯科大学・院・歯学研究・歯学教育学） Escherichia coli Virulence ○Akiko Urashima, Hilo Yen, Toru Tobe (Dept. Biomed. Inform., Grad. Porphyromonas gingivalis produces volatile sulfur Sch. Med., Osaka Univ.) compounds utilizing trypsin-like enzymes ○Kiyoko Watanabe1, Hiroko Hiramine2, Hidefumi Kumada3, 腸管出血性大腸菌（EHEC）は志賀毒素や 3 型分泌装置（T3SS） Nobushiro Hamada1 (1Dept. Microbiol., Grad. Sch., Kanagawa Dent. をはじめ多くの病原因子を持ち，これらの遺伝子の多くは水平 Univ., 2Dept. Highly Advanced Stomatol., Grad. Sch., Kanagawa 伝播により運び込まれた外来性のものであることが強く示唆さ Dent. Univ., 3Dept. Dent. Edu, Grad. Sch., Kanagawa Dent. Univ.) れている。EHEC は，これらの病原因子を駆使して感染を成立 させていると考えられる。T3SS や 3 型分泌タンパク質（エフェ Objective: P. gingivalis is an etiological bacterium of periodontal クター）をコードする LEE 遺伝子群および他の染色体上のエ disease. This microorganism, which possesses trypsin-like enzymes フェクター遺伝子群は，転写制御因子 Ler および Pch により協 (gingipains), has been reported to produce volatile sulfur compounds 調的に発現制御されている。外膜プロテアーゼ OmpT protease (VSCs). The purpose of this study is to examine the roles of the （omptin）をコードする ompT（ECs1663）遺伝子は，Ler/Pch 制 gingipains in production of VSCs. Methods: The wild-type P. 御下にある可能性が示唆されている。また，OmpT protease は外 gingivalis ATCC 33277 strain, KDP129 (kgp–), KDP133 (rgpA–and 膜に存在し抗菌ペプチド LL-37 を分解することが報告されてい rgpB–), and KDP136 (rgpA–, rgpB– and kgp–) were used in this study. る。そこで，EHEC の ompT 遺伝子の発現制御および病原性にお The levels of VSCs production by P. gingivalis strains from 20% ける役割について検討した。EHEC の ler，pch 遺伝子欠失株，さ human serum and BHI broth culture were measured using a gas らに酪酸のセンサーとして働き LEE 遺伝子群の発現を上昇させ chromatography. Inhibitory effects of trypsin inhibitors and yolk anti- る Lrp タンパク質をコードする lrp 遺伝子欠失株では，ompT 遺 gingipain antibody to bacterial broth culture were examined. Results: 伝子の発現が野生株に比べ低下した。また，ompT 遺伝子の発現 Both KDP129 and KDP136, the Kgp-deficient mutants, significantly は酪酸により増加した。この結果は，ompT 遺伝子がこれらの遺 reduced CH3SH production from human serum compared to wild- 伝子に発現制御され LEE 遺伝子群などの病原性遺伝子群と協調 type strain. The CH3SH level in P. gingivalis ATCC 33277 culture 的に発現制御されていることを示している。さらに，LL-37 によ was remarkably increased after 3 hours incubation. Adding 1 mM る EHEC の膜傷害に対する抵抗性と病原性活性化の関連性につ PMSF or 100 μM TLCK to the culture showed significant reduction いて報告する。 of CH3SH level. The yolk anti-gingipain antibody also inhibited to produce CH3SH in P. gingivalis culture. Conclusion: These results suggest that trypsin-like enzymes of P. gingivalis play important roles in VSC production and Kgp may contribute to the degradation of substrate protein and subsequent production of VSCs.

P2-075 歯周病原性細菌 ‘red complex species’ のビル P2-076 Vibrio vulnificus M2799 株のペリプラズム結 レンス因子としてのプロテアーゼ 合タンパク質 VatD の構造解析 ○下山 佑1，根本 優子2，中里 茉那美3，根本 孝幸2，高橋 晋平3，石 ○宮本 勝城1，宮野 菜央1，友尾 幸司2，知名 秀泰1，河野 広朗1，土 河 太知1，佐々木 大輔3，八重柏 隆3，佐々木 実1，木村 重信1（1岩手 屋 孝弘1，田邊 知孝3，舟橋 達也3，辻坊 裕1（1大阪薬大・微生物， 医科大学・分子微生物，2長崎大学・医歯薬学総合・口腔分子生化， 2大阪薬大・薬品物理化学，3松山大・薬・衛生化学） 3岩手医科大学・歯周療法） Structural analysis of the periplasmic binding protein Comparison of protease activities in periodontopathic VatD from Vibrio vulnificus M2799 ‘red complex species’ ○Katsushiro Miyamoto1, Nao Miyano1, Koji Tomoo2, Hideyasu ○Yu Shimoyama1, Yuko Ohara-Nemoto2, Manami Nakasato3, China1, Hiroaki Kawano1, Takahiro Tsuchiya1, Tomotaka Tanabe3, Takayuki Nemoto2, Shinpei Takahashi3, Taichi Ishikawa1, Daisuke Tatsuya Funahashi3, Hiroshi Tsujibo1 (1Dept. Microbiol., Osaka Univ. Sasaki3, Takashi Yaegashi3, Minoru Sasaki1, Shigenobu Kimura1 (1Div. Pharmceut. Sci., 2Dept. Phys. Chem., Osaka Univ. Pharm. Sci., Mol. Microbiol., Iwate, Med. Univ., 2Dept. Oral Mol. Biol., Nagasaki 3Dept. Hyg. Chem., Col. Pharm. Sci., Matsuyama Univ.) Univ., Grad. Sch. Biomed. Sci., 3Div. Periodontol., Iwate Med. Univ.) 【目的】我々は，臨床分離株 Vibrio vulnificus M2799 株のシデロフォ 【目的】歯周病原性細菌のうち，Porphyromonas gingivalis，Tannerella アである Vulnibactin を介した鉄取り込み機構，および鉄欠乏下 forsythia，Treponema denticola の 3 菌種は ‘red complex species’ と呼ば における細胞増殖機構を解明することを目的として研究を行っ れ，重度慢性歯周炎の発症・進行と強い関連性を示すことが明らか ている。遺伝子欠損株を作製し，鉄欠乏下での増殖能について にされている。 P. gingivalis については gingipains（Rgp および Kgp） 検討した結果，Vulnibactin-Fe3+ 複合体のペリプラズム結合タン を含む種々のビルレンス因子が挙げられているが，他の 2 菌種のビ パク質は FatB が中心となって機能するが，Deferoxamine-Fe3+ 複 ルレンス因子については不明な点が数多く残されている。本研究で 合体のペリプラズム結合タンパク質（VatD）で代替可能である は，歯周病原性を担うビルレンス因子としてのプロテアーゼという ことを明らかにした。今回，VatD の高発現系を構築し，VatD- 面から ‘red complex species’ の特異性について検討を行った。【方法】 Apo 体および VatD-Deferoxamine-Fe3+ 複合体の構造解析を試み P. gingivalis ATCC 33277 株，T. forsythia ATCC 43037 株，T. denticola た。また，構造解析により，Deferoxamine- Fe3+ との結合に重要 ATCC 33520 株を用いた。各菌液を調製し，MCA ペプチドによる蛍 と思われるアミノ酸残基を推定し，それら変異体との相互作用 光測定から cell-bound のプロテアーゼ活性能について検討した。【結 解析を行った。 果と考察】‘Red complex species’3 菌種はいずれもキモトリプシン 【方法】高発現ベクター pProEX HTa に vatD 遺伝子を導入し， 様活性，コラゲナーゼ活性および tripeptidyl peptidase 活性を有して His タグ融合タンパク質である HisVatD を可溶化で回収して， おり，それらは他の歯周病原性細菌と比較して高い活性であること VatD-Apo 体および VatD-Deferoxamine-Fe3+ 複合体の構造解析を が明らかとなった。‘Red complex species’3 菌種間では，P. gingivalis 行った。さらに，構造解析により重要と思われる W53，R69， のみが高いトリプシン様活性を示すこと，P. gingivalis および T. R177 について変異体を作製し，等温滴定カロリメトリーを用い forsythia は dipeptidyl peptidase（DPP4, 5, 7, 11）活性を有することが て相互作用解析を行った。 明らかとなった。以上の成績から，‘red complex species’ はいずれも 【結論】VatD-Apo 体および VatD-Deferoxamine-Fe3+ の構造解析を 高いコラゲナーゼ活性を有しており，他のプロテアーゼについても P. 行った結果，W53，R69，R177 が相互作用に重要なアミノ酸で gingivalis および T. forsythia は他の歯周病原性細菌種と比較して高い あると推定された。そこで，変異体を作製し，相互作用解析を行っ 活性を示したことから，‘red complex species’ のプロテアーゼは歯周 た結果，これら 3 残基が必須であることが明らかとなった。 病原性を担うビルレンス因子として働くことが強く示唆された。

129 P2-077 Unique regions in the M. leprae Mce1A P2-078 Campylobacter jejuni の細胞侵入は細胞膜表 protein associated with the initial transmission of leprosy 面 CFTR により調節される ○Viesta Fadlitha Beby1，佐藤 直哉2,5，Irfan Idris1,3，Fatul Rachman1,3， ○木戸 純子，下畑 隆明，根来 幸恵，畑山 翔，佐藤 優里，中橋 睦美， 藤村 響男1,2，滝本 博明4（1北里大・大学院・医療系研究科・皮膚， 上番増 喬，馬渡 一諭，高橋 章（徳島大院・医歯薬学研究部・予防環 2北里大・医・皮膚，3Hasanuddin Univ. Med. Res. Ctr.，4北里大・理・ 境栄養） 免疫学，5東芝林間病院） The entry of Campylobacter jejuni was regulated by cell ○Viesta Fadlitha Beby1, Naoya Sato2,5, Irfan Idris1,3, Fatul Rachman1,3, 1,2 4 1 surface CFTR Takao Fujimura , Hiroaki Takimoto ( Dept. Dermatol., Kitasato ○ 2 Junko Kido, Takaaki Shimohata, Sachie Negoro, Syo Hatayama, Univ. Grad. Sch. Med. Sci., Dept. Dermal., Kitasato Univ. Sch. Med., Yuri Sato, Mutsumi Nakahashi, Takashi Uebanso, Kazuaki Mawatari, 3Hasanuddin Univ. Med. Res. Ctr., 4Dept. Biosci., Kitasato Univ. Sch. 5 Akira Takahashi (Dept. Prevent. Environ. Nutr., Inst. Biomed. Sci., Sci., Toshiba Rinkan Hospital) Tokushima Univ. Grad. Sch.)

Mycobacterium leprae, a causative pathogen of leprosy, initially infects Background: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator the nasal mucosa. However, the details of its infection mechanism (CFTR) is a cAMP-activated chloride channel that expressed in are unclear. Previously, we have demonstrated that the recombinant airways and intestines. Cystic fibrosis, major life-limiting genetic M. leprae Mce1A protein mediates the cellular uptake of protein- disease, is caused by CFTR mutations, which ultimately increases coated latex microspheres and protein-expressing Escherichia coli infection. In previous study, we observed that Campylobacter jejuni strain into the nasal epithelial cells (NECs), suggesting that the infection suppressed CFTR mediated Cl– secretion in intestinal Mce1A protein plays an important role in the NEC invasion by M. cells. Nevertheless, we did not reveal that how CFTR suppression leprae. responds to C. jejuni infection. In this study, we tried to elucidate the To further elucidate the role of this protein, we analyzed the role of CFTR suppression in C. jejuni invasion. Method: In order inhibitory effects of anti-Mce1A antibodies on the NEC uptake of to investigate the detail of relation between CFTR and C. jejuni Mce1A-expressing E. coli by CFU assay. invasion, HEK-293 cells were transfected, and established stably A 72-amino acid fragment (InvX), as the putative active domain of expressing WT-CFTR or mutant CFTR. These cells were infected C. Mce1A protein, was divided into four regions, and their peptides jejuni to evaluate bacterial invasion, adhesion and survival. Results were synthesized as immuno antigens for anti-Mce1A antibodies. and Discussion: C. jejuni invasion was inhibited by expression of An Mce1A-expressing E. coli strain was recombinantly made by the CFTR. However, the expression of CFTR did not affect cell adhesion adhesin involved in diffuse adherence system. and intracellular survival of C. jejuni. On the other hand, C. jejuni An antibody raised against a synthetic peptide corresponding to invasion was not inhibited by ΔF508-CFTR mutant strain, which is a unique 22-amino-acid region within InvX significantly inhibited reduced delivery to cell surface. Our result indicated that cell surface the cellular uptake of r-E. coli strain relative to a control IgG. An CFTR affects C. jejuni invasion, and which may associate with inhibitory effect of its antibody on the NEC uptake of leprosy bacilli endocytosis step after adhesion. is under investigation. This unique region might be a candidate for the active center of Mce1A protein that is associated with the NEC invasion by M. leprae.

P2-079 付着能の弱いリケッチア株の rOmpB を菌体表 P2-080 Treponema denticola は TLR2 認識と免疫応 面に発現する大腸菌の作製 答を変調させる ○内山 恒夫（徳島大院・医歯薬学研究部・微生物病原学） ○国分 栄仁1,2，藤瀬 和隆1，菊池 有一郎1,2，柴山 和子1，石原 和幸1,2 （1東歯大・微生物，2東歯大・口科研） Preparation of Escherichia coli expressing rOmpB of Rickettsia which has weak adherence ability Treponema denticola modulate TLR2 pattern recognition ○Tsuneo Uchiyama (Dept. Microbiol., Inst. Biomed. Sci., Tokushima and immune response Univ. Grad. Sch.) ○Eitoyo Kokubu1,2, Kazutaka Fujise1, Yuichiro Kikuchi1,2, Kazuko Shibayama1, Kazuyuki Ishihara1,2 (1Dept. Microbiol. Tokyo Dent Coll., 【目的】紅斑熱群リケッチアの主要抗原 rOmpB は菌体外膜上に 2HRC, Tokyo Dent Coll.) 局在し，宿主細胞への付着侵入および感染防御において重要な役 割を果たしている。また，徳島県吉野川以北の紅斑熱患者非発 Treponema denticola is a major pathogen of chronic periodontitis. 生地域で採集したマダニより分離したリケッチアは，Rickettsia However, the role of T. denticola in periodontitis has not been japonica に近縁だが，血管内皮細胞への付着能，増殖能が弱いこ clarified yet. Toll-like receptors (TLRs) play an important role in とが示されている。今回，リケッチアの付着因子 rOmpB の機能 periodontitis by recognizing the pathogens. The aim of the present 解析を目的として，菌体表面に分離株の rOmpB を発現させた大 study is to investigate the role of recognition of T. denticola by TLRs 腸菌を作製し，その性状を解析した。 in process of chronic periodontitis. Human gingival epithelial cell 【材料と方法】分離株の ompB 遺伝子全長，或いは ompB 遺伝子 Ca9-22 or TLRs reporter cell line were infected by T. denticola ATCC の内，翻訳後に切断されて rOmpB になる領域の DNA を pelB リー 35405, dentilisin deficient mutant, K1, and the major outer sheath ダー配列を持つ発現ベクター pET-22b（+）に組込み，大腸菌 protein (Msp) deficient mutant, DMSP-3. The infected Ca9-22 were BL21（DE3）をトランスフォームした。このベクターにより発 collected to measure the expression of inflammation cytokines. In 現される組換え蛋白質は大腸菌のペリプラズムに輸送される可 the TLR2 reporter cell line, activation of NF-κB was measured by 能性があることが知られているが，その局在，抗原性を蛍光抗 alkaline phosphatase activity. In the cells infected by DMSP-3, the 体法，ウエスタン・ブロット法等により調べた。 expression of IL-6 mRNA was higher than other strains infect cells. 【結果と考察】ompB 遺伝子全長，あるいは rOmp B 領域の DNA The activation of NF-κB in the TLR2 reporter cell line infected by を導入した組換え大腸菌は組換え蛋白質発現誘導によりそれぞ K1 or DMSP strain was 1.5 times higher than that of wild type strain. れ 165 kDa，135 kDa の蛋白質を発現した。これらの組換え蛋白 The activation of NF-κB cells exposed to sonicates of T. denticola 質は R. japonica の rOmpB に対するポリクローナル抗体，モノク mutants were two fold expression compared to that exposed to ローナル抗体を用いた蛍光抗体法，ウエスタン・ブロット法等 sonicate of wild type strain. The TLR4 reporter cell line infected by により，R. japonica の rOmpB との交差抗原性を持つことが示さ T. denticola did not show activation of NF-κB. These results suggest れた。また，菌体表面に輸送されていることも確認された。現在， that T. denticola recognized by TLR-2 and the signal including これらの発現大腸菌の各種細胞への付着度を解析中である。 cytokine production was modulated by protease or Msp.

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P2-081 代謝解析で明らかとなった Campylobacter P2-082 Anaplasma phagocytophilum promotes jejuni 感染による宿主細胞での特徴的なアミノ酸変動について endoplasmic reticulum stress response ○下畑 隆明，佐藤 優里，扶川 留音，木戸 純子，天野 幸恵，畑山 翔， ○吉川 悠子1,2，杉本 渓2，古川 英嗣2，大橋 典男2（1日獣大・獣医， 中橋 睦美，上番増 喬，馬渡 一諭，高橋 章（徳島大院・医歯薬学研 2静岡県大・薬食生命科学総合学府） 究部・予防環境栄養） ○Yuko Yoshikawa1,2, Kei Sugimoto2, Eiji Furukawa2, Norio Ohashi2 Metabolic analysis leveled the unique amino acids (1Sch. Vet. Med., Nippon Vet. and Life Sci. Univ., 2Grad. Sch. of metabolism in Campylobacter jejuni infected cell Integrated Pharm. and Nutr. Sci., Univ. Shizuoka) ○Takaaki Shimohata, Yuri Sato, Rune Fukawa, Junko Kido, Sachie Amano, Sho Hatayama, Mutsumi Nakahashi, Takashi Uebanso, Anaplasma phagocytophilum (Ap) is the causative agent of human Kazuaki Mawatari, Akira Takahashi (Dept. Prevent. Environ. Nutr., granulocytic anaplasmosis. Ap is an obligatory intracellular Inst. Biomed. Sci., Tokushima Univ. Grad. Sch.) bacterium that forms characteristic inclusions, so-called morulae. Here we show that Ap changed the distributions of endoplasmic Background: Intracellular metabolite is useful nutrition for bacteria, reticulum (ER) membrane proteins and activated three of all ER and it may closely associated with bacterial survival in invade stress sensors, inositol-requiring enzyme 1α (IRE1α), protein bacteria. Campylobacter jejuni has a limited ability to metabolize kinase RNA-like ER kinase (PERK) and activating transcription sugars, because of absence of phospho-fructokinase. Thus, it factor-6 (ATF6). In particular, Ap accelerated the phosphorylation is suggested that C. jejuni infection causes unique metabolism of IRE1α since the early stage of infection, and the intracellular changing in host cells. Here, we measured the host metabolite in C. growth of Ap was depended on the phosphorylation level of IRE1α. jejuni infection, and estimated the importance of metabolic changes Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 (TRAF2) was on intracellular bacteria in host cells. Methods: HeLa cells were activated by phosphorylated IRE1α in the Ap-infected cells. The infected with C. jejuni and were served elucidating the metabolite suppression of TRAF2 function inhibited the autophagy induction in infection of C. jejuni. Gentamicin protection assay was used for followed by the morulae maturation. These results suggest that Ap estimating the survival rate of C. jejuni into the host cells. Results growth was facilitated under the ER stress condition. Moreover, and Discussion: During the infection, essential amino acids level the phosphorylated IRE1α suppressed the activation of Caspase-2, in HeLa cells were increased, and the autophagy, one of the protein an apoptosis initiator, during Ap multiplication. In contrast, the degradation systems, was activated. And, treatment with autophagy induction of host cell apoptosis at the late stage of Ap infection was inhibitor reduced bacterial survival in HeLa cells. These data partially involved in Caspase-2 pathway. Taken together, Ap may indicated that the C. jejuni survival in host cell was maintained by manipulate a host ER stress system for the intracellular survival and autophagy mediated amino acid supply system. These data suggested the expansion of infection. that suppression of autophagy was effective for C. jejuni treatment.

P2-083 Modulation of endosymbiosis by Legionella P2-084 Rab6A and Rab33B function in Legionella pneumophila in ciliate Paramecium infection ○渡邉 健太1，中尾 亮2，藤島 政博3，橘 理人4，清水 隆1，度会 雅 ○川端 美緒，多賀谷 光男，新崎 恒平（東京薬大・生命） 久1（1山口大院・連合獣医・病態予防獣医学，2北大・獣医・寄生虫， 3山口大院・理工，4国衛研・食品衛生管理） ○Mio Kawabata, Mitsuo Tagaya, Kohei Arasaki (Sch. of Life Sci., Tokyo Univ. of Pharm. and Life Sci.) ○Kenta Watanabe1, Ryo Nakao2, Masahiro Fujishima3, Masato Tachibana4, Takashi Shimizu1, Masahisa Watarai1 (1Grad. Sch. Vet. Legionella pneumophila (L. pneumophila) invades inside the Sci., Yamaguchi Univ., 2Lab. Vet. Parasitology, Grad. Sch. Vet. Med., host through phagocytosis and then it makes unique membrane Hokkaido Univ., 3Grad. Sch. Sci. and Engineering, Yamaguchi Univ., compartment called Legionella containing vacuole (LCV). After that, 4Div. Biomed. Food Res.) LCV is transported to the endoplasmic reticulum (ER) where L. pneumophila grows in. L. pneumophila injects massive Legionella Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires’ disease, effectors into the host cytosol via type IV secretion system (also replicates within alveolar macrophages and protists such as free- called Dot/Icm system) to manipulate host function. L. pneumophila living amoebae. However, the lifestyle of L. pneumophila in the subverts the host GTPase Rab1 to recruit vesicles budded from the environment remains largely unknown. Therefore, the development ER to the LCV. Although there are about 60 Rab proteins in host of protistan host models is greatly useful to investigate the cells and each Rab protein has a function in different and specific mechanisms of Legionella infection and control the risks from them. membrane traffic, contribution of Rab proteins except for Rab1 in Here we established a novel natural host model of L. pneumophila Legionella infection has not been well understood. Previously, we endosymbiosis using the ciliate Paramecium caudatum. We also reported that Rab6A implicated in Golgi-to-ER retrograde transport identified Legionella endosymbiosis-modulating factor A (LefA), is recruited to the LCV in the middle stage of infection. We also which contributes to the change in life stage from endosymbiosis revealed that depletion of Rab6A causes delay of LCV transport to to host lysis, enabling escape to the environment. We isolated L. the ER and Rab6A specifically interact with ER resident SNARE pneumophila strains from the environment, and they exhibited complex under wild-type Legionella infection. In this time, we show cytotoxicity toward P. caudatum and induced host lysis. Acidification that Rab33B involved in Golgi-to-ER retrograde transport also of the Legionella-containing vacuole (LCV) was inhibited, and recruited to the LCV in the middle stage of infection. Furthermore, enlarged LCVs including numerous bacteria were observed in P. depletion of Rab33B affects the Rab6A recruitment to the LCV. caudatum infected with L. pneumophila. An isogenic L. pneumophila These data suggest that L. pneumophila utilize Rab33B/Rab6A lefA mutant exhibited decreased cytotoxicity toward P. caudatum and cascade to transport the LCV to the ER. impaired the modification of LCVs, resulting in the establishment of endosymbiosis between them. Our results suggest that L. pneumophila may have a mechanism to switch their endosymbiosis in protistan hosts in the environment.

131 P2-085 院内から株化されたアメーバ共生クラミジア P2-086 LC3-associated phagocytosis restricts the Protochlamydia のヒト株化 HEp-2 細胞への炎症誘導能に intracellular bacterial pathogen Legionella dumoffii ついて Andree Hubber1，久堀 智子1，Cevayir Coban2，松澤 健志3，○永井 1 1 2 3 ○松尾 淳司1，大久保 寅彦1，中村 眞二2，山口 博之1（1北 大 院・保 科・ 宏樹 （ 阪大・微研・感染症国際研究センター， 阪大・免フロ， 大 病態解析，2順大院・医・形態解析イメージング） 阪府大・獣医）

1 1 2 Induction of inflammatory response in HEp-2 cells by Andree Hubber , Tomoko Kubori , Cevayir Coban , Takeshi 3 ○ 1 1 2 amoebal endosymbiont, Protochamydia Matsuzawa , Hiroki Nagai ( RIMD, Osaka Univ., iFReC, Osaka Univ., 3Dept. Vet. Sci., Osaka Pref. Univ.) ○Junji Matsuo1, Torahiko Okubo1, Shinji Nakamura2, Hiroyuki Yamaguchi1 (1Dept. Med. Lab. Sci., Fac. Health Sci., Hokkaido Univ., 2 Legionella dumoffii is a largely unstudied agent of Legionnaires’ Div. Biomed. Imag. Res., Juntendo Univ. Grad. Sch. Med.) disease. Like the well-studied Legionella pneumophila, it possesses 自然環境中のアメーバ（アカントアメーバ）に共生する偏性細 a Dot/Icm type IV secretion system that may subvert its intracellular fate. To better understand Legionella pathogenesis, we analyzed 胞内寄生細菌 Parachlamydia のヒトへの病原性はまだ十分に理解 されていないが，院内肺炎や流産との関連性が報告されており， hallmarks of L. dumoffii phagosome maturation and host responses 考慮すべき院内感染症起因菌となる可能性がある。我々は以前， to invasion. Unlike L. pneumophila, a population of intracellular L. dumoffii colocalized with the autophagy marker LC3. These 遺伝子検出系を用いて Parachlamydia がアメーバと伴に院内に持 ち込まれる様子を明らかにした。本研究では，院内から培養系 bacteria were within undamaged vacuoles that did not associate with を用いて原始クラミジア共生アメーバを株化し，共生クラミジ autophagy signaling molecules or adaptors. Rather, our data supports アのヒト株化細胞への二次感染能および炎症誘導能について検 LC3-decoration of L. dumoffii-containing phagosomes (LdCVs) by the process of LC3-associated phagocytosis (LAP), which is 討した。北海道大学病院の床および水周り 50 検体を対象とし， 大腸菌死菌塗布寒天にスポットして這い出たアメーバを株化し distinct from classical autophagy. LC3-decoration was dependent on the bacterial Dot/Icm system and host factors: toll-like receptor た。アメーバ共生細菌は，DAPI 染色と PCR にて検出した。次 2 and diacylglycerol signaling, plus downstream involvement of に株化アメーバより回収したクラミジアを C3 アメーバ標準株 NADPH oxidases. Single-cell analysis and intracellular replication に感染させ，5 日間モニターした。またヒト株化 HEp-2 細胞に ついても同様に検討した。さらにクラミジア菌体刺激によるヒ studies indicate that LAP-targeting of LdCVs results in trafficking to degradative compartments. Together, we have discovered an ト細胞への IL-8 誘導能についても検討した。その結果，院内株 intracellular pathogen that is recognized and degraded via the 化アメーバ 3 株から共生細菌が見出され，分子系統解析からそ process of LAP over canonical endocytic maturation and classical の一株（W9）は Parachlamydia 近縁種（Protochlamydia）であっ autophagy. た。Protochlamydia W9 株は C3 アメーバに二次感染したが，ヒト 株化細胞には感染できなかった。その一方，菌体刺激はヒト細 胞に IL-8 を誘導した。これらの結果は，院内へと持ち込まれた Protochlamydia W9 株が，アメーバを介して院内に拡散するとと もに，その菌体刺激によりヒトに炎症を惹起する可能性が示唆 された。【非会員共同研究者：福元達也，小栗聡，秋沢宏次，渋谷斉， 清水力（北大病院・検査・輸血部）】

P2-087（WS21-2） VI 型分泌機構をコードする P2-088 M. leprae creates a lipid-rich intracellular Francisella パソジェニックアイランドの解析 environment via PPARs signal pathways in host cells ○清水 隆1，渡邉 健太1，宇田 晶彦2，度会 雅久3（1山口大・獣・公衆 ○Yuqian Luo1,2，鈴木 幸一1,2（1帝京大・医技・臨検，2感染研・ハン 衛生，2国立感染研・獣医科学，3山口大院・獣・病態予防） セン研）

Analysis of Francisella Pathogenic Island ○Yuqian Luo1,2, Koichi Suzuki1,2 (1Dept. Clin. Lab. Science, F. Med. 2 ○Takashi Shmizu1, Kenta Watanabe1, Akihiko Uda2, Masahisa Technol., Teikyo Univ., Dept. Mycobacteriol. Lep. Res. Ctr., NIID) Watarai3 (1Dept. Vet. Public Health, Joint Fac. of Vet. Sci., Yamaguchi Univ., 2Dept. Vet. Sci., NIID, 3Dept. Pathol. Prevent Vet. Sci., Grad. We previously elucidated that Mycobacterium leprae (M. leprae) Sch. Vet. Sci., Yamaguchi Univ.) creates a lipid-rich intracellular environment that is favorable to their survival in macrophages via modulating the expression of Francisella tularensis is facultative intracellular bacteria and causes host genes, e.g. adipose differentiation-related protein (ADRP). In tularemia in human. F. tularensis possess Francisella pathogenic order to obtain a detailed picture of such pathogen-host interaction, island (FPI) that is responsive for intracellular growth. FPI encodes a comprehensive transcriptional profiling of M. leprae-infected type VI secretion system, but the molecular mechanisms by which human macrophage precursor THP-1 cells was performed using F. tularensis survives intracellular is still unclear. To investigate the DNA microarray analysis. Non-infected cells and cells exposed to effect of FPI proteins in intracellular growth, 16 FPI proteins were heat-killed M. leprae were included as controls. Cluster analysis fused to GFP and expressed in HeLa and 293T cells. Some of FPI of the array data revealed that host transcriptional landscape proteins showed unique localization. We focused on one protein and was profoundly reshaped only after live M. leprae infection. In analyzed the intracellular behavior of this protein. This protein was particular, a cluster of downstream genes of peroxisome proliferator- localized around Golgi apparatus. This protein also co-localized with activated receptors (PPARs) associated with lipid metabolism, were LC3. Immune precipitation assay revealed that this protein was remarkably induced after infection. Real-time PCR and Western blot associated with beta-tubulin. This association was also observed with analysis further demonstrated that among the three PPAR family pull-down assay. We also demonstrated that infected F. tularensis members, PPARγ and PPARδ expressions were significantly induced was localized within the Golgi-derived vesicles, and that inhibition of after M. leprae infection, whereas PPARα was not affected. The transportation of Golgi apparatus decreased the intracellular growth antagonist of PPARγ or PPARδ abolished the effect of M. leprae to of F. tularensis. Taken togather these data suggests that the protein modulate host ADRP expression and inhibited lipid accumulation in of FPI is an effector protein of type VI secretion system, and controls host cells. These results suggest that signal pathways of PPARγ and the intracellular growth of F. tularensis in Golgi-derived vesicles or PPARδ are employed by M. leprae to create a lipid-rich environment autophagosomes through microtubules. in host macrophages.

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P2-089 Genetic dissection of multi-nucleated giant P2-090 The approach for the determination of cell formation by Burkholderia thailandensis infection chlamydial proteins inhibiting the lysosomal fusion ○木島 英美1,2，西 川 明芳1，石 垣 佳祐1，堀 口 安彦1，新 澤 直明1（1阪 大・ ○石田（黒木）香澄，高橋 秀実（日医大・微生物免疫） 微研・分子細菌，2新潟大・医） ○Kasumi Ishida Kuroki, Hidemi Takahashi (Dept. Microbiol. ○Emi Kijima1,2, Sayaka Nishikawa1, Keisuke Ishigaki1, Yasuhiko Immunol., Nippon Med Sch.) Horiguchi1, Naoaki Shinzawa1 (1Dept. Mol. Bacteriol., RIMD, Osaka Univ., 2Fac. Med., Niigata Univ.) To understand biological features of Chlamydia trachomatis (Ct) is necessary to develop the vaccine and new therapeutic agent for the Burkholderia pseudomallei, the causative bacterium of melioidosis, complete control of the chlamydial infection. Ct utilizes effector and B. thailandensis are related pathogens that invade a variety of proteins secreted from the type III secretion systems to escape from cell types, replicate in the cytoplasm, and spread to nearby cells, the immune system and survive in the host cells. For example, Ct leading the multi-nucleated giant cell (MNGC) formation. The can inhibit the lysosomal fusion while it is not cleared what kind virulence-attenuated strains of B. pseudomallei such as T3SS-3 or of effector proteins are involved in. Also, it has already known that T6SS-1 mutants also exhibits deficiency in MNGC formation, which the aberrant body of Ct (AB) induced by IFN-gamma or penicillin imply that MNGC formation is important for the pathogenicity G (PG) cannot replicate in human epithelial cells and AB converted of B. pseudomallei to host. In the present study, we utilized B. by the treatment of PG cannot avoid the lysosomal fusions. In this thailandensis as the model to study MNGC formation and performed study, we attempt to determine the proteins needed for the inhibition transposon-screening to identify the genes responsible for MNGC of the lysosomal fusion by analyzing the gene expression and the formation. Screened 1971 transposon mutants, 10 mrg mutants localization of ABs. First, we confirmed the difference of chlamydial (MNGC-related genes) exhibited no or small MNGC formation of replication in HeLa cells with or without the treatment of IFN- macrophage-like cells and epithelial cells. One mutant defected the gamma or PG. Consistent with the previous results, IFN-gamma or T3SS regulator bsaN that is required for the expression of T3SS and PG treated Ct did not replicate in HeLa cells. Furthermore, it was T6SS, suggesting that our screening strategy is reasonable to dissect revealed that the size of chlamydial vacuole treated with IFN-gamma the bacterial intracellular life cycle. In this presentation, we would was smaller than that with PG. To clarify the reason we are going to like to discuss the detail of our strategy and the molecular aspects of determine the gene expressions and the localization of ABs in rab5A, mrgs in the MNGC formation. rab9A or lamp1 gene, an endosomal marker, transfected HeLa cells that we have established.

P2-091 In vivo RNA-seq revealed infection-linked P2-092 原始的なクラミジアと Mimivirus の比較ゲノ expression pattern of Bordetella pertussis within host ム解析から紐解くクラミジアの多様性進化 ○新澤 直明1，鈴木 孝一朗1,3，元岡 大祐2，中村 昇太2，堀口 安彦1 ○山崎 すみれ1，松尾 淳司1，山崎 智拡1,2，大久保 寅彦1，山口 博之1 （1阪大・微研・分子細菌学，2阪大・微研・感染症メタゲノム解析分 （1北大・保科・病態，2日本学術振興会特別研究員 DC1） 野，3（一財）阪大微生物病研究会） Comparative genomic analysis between primitive ○Naoaki Shinzawa1, Koichiro Suzuki1,3, Daisuke Motooka2, Shota 2 1 1 chlamyidae and Mimivirus Nakamura , Yasuhiko Horiguchi ( Dept. Mol. Bacteriol., RIMD, Osaka ○ 1 1 1,2 2 3 Sumire Yamazaki , Junji Matsuo , Tomohiro Yamazaki , Torahiko Univ., Dept. Infect. Metagenom., RIMD, Osaka Univ., BIKEN) Okubo1, Hiroyuki Yamaguchi1 (1Faculty Health Sci. Hokkaido Univ., 2JSPS Research Fellow DC1) Analyses of bacterial genes expressed in response to the host environment provide clues to understanding the host-pathogen クラミジアの祖先は 7–10 億年前に二つの系統に分岐した。一 interactions that lead to the establishment of infection. In this study, 方は比較的変動の少ない安定した環境である脊椎動物の祖先に we performed massive RNA-seq of host trachea infected with the ゲノムのスリム化（約 1.0Mbp）を介して順応し，肺炎や性感染 respiratory pathogen Bordetella pertussis, the causative bacterium 症の原因菌（病原性クラミジア : 約 1,000 ORFs）へと変貌した。 of whooping cough, the method which enables us to identify global もう一方は，過酷な環境に生息するアメーバの祖先に共生体と gene expression of bacterial mRNA and non-coding RNA (ncRNA) して適応進化を遂げ（原始クラミジア：約 2,500 ORFs），そのゲ within host. Highly expressed transcripts in infected mice include ノムサイズは約 2.5Mbp とスリム化は認められず，太古のクラミ major known B. pertussis virulence factors, whose expressions are ジアの特性を維持したまま進化してきた。しかしながらこの多 mediated by BvgAS two-component system, and factors for iron 様性進化の誘因は不明である。最近になってアメーバの寄生体 sequestration and tmRNA (transfer-messenger RNA)-mediated として巨大 DNA ウイルス Mimivirus（以下 Mv：約 1,000 ORFs） protein degradation. In addition, we found the in vivo expression of が発見された。そこで本研究では，Mv との比較ゲノム解析か several bvg-repressed genes which are down-regulated by BvgAS ら，クラミジアの多様性進化の謎を検証した。クラミジアと Mv in vitro. Comprehensive analysis of ncRNA profile revealed in vivo- のゲノム情報は NCBI より取得し，比較ゲノム解析を行った。 specific ncRNA expressions that were not previously linked to ORF は RAST で予測した。その結果，クラミジゲノム上の 4–5% virulence. These results suggest that gene expression of Bordetella の ORF が Mv ORF と相同性は低いがヒットした。原始クラミジ within host is regulated by BvgAS and additional host signals raised アと病原性クラミジアとの間でこのヒット数に差は認められな by host environments. In this presentation, we would like to discuss かった。その一方で，原始クラミジアでのみ Mv とヒットする配 the usability of in vivo RNA-seq to discover novel aspects of bacterial 列があり，その配列は蛋白間相互作用に関わるアンキリン蛋白 pathogenesis within hosts with the latest results. （Ank）をコードしていた。Mv ゲノム上の Ank は断片化し，ゲ ノム上に散在していた。興味深いことに，Mv ゲノム上の 176 個 の連続する ORFs は，病原性クラミジアゲノムと全くヒットし なかった。これらの結果より，二つの系統に分岐する前の太古 のクラミジア祖先と Mv との間では，遺伝子の水平伝播が頻繁に 起こっていたと考えられた。また Ank を規定する遺伝子配列の 存在の有無がクラミジアの多様性進化を規定する要因の一つで ある可能性が示唆された。

133 P2-093 プレボテラインターメディアにおける菌株間の P2-094 次世代シークエンスデータを使った MLST タ ゲノム比較 イピングツール ○内藤 真理子1，小椋 義俊2，林 哲也2，中山 浩次1（1長崎大・院・医 ○宮本 真理（株式会社キアゲン・アドバンストゲノミクス） 歯薬・口腔病原微生物，2九州大・院・医・細菌学） MLST typing using Next Generation Sequencing data The fine-scale intra-species genomic comparison in ○Mari Miyamoto (AdGx, GISS, QIAGEN K.K.) Prevotella intermedia strains ○Mariko Naito1, Yoshitoshi Ogura2, Tetsuya Hayashi2, Koji Nakayama1 次世代シークエンサーの普及により，様々な分野での活用が広 (1Dept. Molecular Microbiol. Immunol., Nagasaki Univ. Graduate Sch. がり，微生物においてもゲノム解読，メタゲノム解析といった Biomedical Sci., 2Dept. Bacteriology, Fac. Medical Sci., Kyushu Univ.) 解析が広く行われるようになってきた。病原菌の原因となる菌 の特定についても，Sanger シークエンサーから次世代シークエ Prevotella intermedia is a pathogenic bacterium involved in ンサーを使った MLST が可能となってきた。キアゲンバイオイ periodontal diseases. Here, we present the complete genome ンフォマティクスでは，次世代シークエンサーを使った MLST sequence of a clinical strain, OMA14, of this bacterium along with をより簡便に間違いなく実施できるよう解析パイプラインを作 the results of comparative genome analysis with strain 17 of the 成した。解析パイプラインでは，次世代シークエンサーから得 same species whose genome has also been sequenced, but not fully られる配列を入力データとしトリミングから MLST のスキーマ analyzed yet. The genomes of both strains consist of two circular に沿ったタイピング，薬剤耐性菌の有無，k-mer tree, SNP tree chromosomes: the larger chromosomes are similar in size and といった様々な解析結果を得ることが出来る。配列データは様々 exhibit a high overall linearity of gene organizations, whereas the なメタデータ（環境や薬剤耐性）と紐付けることが可能で，分 smaller chromosomes show a significant size variation and have 類結果と照らし合わせる事で，多様な情報を直感的に見るこ undergone remarkable genome rearrangements. Unique features とが出来るようになる。解析パイプラインは，CLC Genomics of the Pre. intermedia genomes are the presence of a remarkable Workbench の追加モジュール CLC Microbial Genomics Module と number of essential genes on the second chromosomes and the して提供しており，使いやすい操作性とともに解析の履歴をす abundance of conjugative and mobilizable transposons (CTns and べて残す機能により解析結果がどのようにして得られたかとい MTns). The CTns/MTns are particularly abundant in the second う追跡も容易に行えるようになっている。本発表では，これら chromosomes, involved in its extensive genome rearrangement, and の開発内容の詳細についてデータと共に説明する。 have introduced a number of strain-specific genes into each strain. We identified strain-specific segments (over 10 kb) in both genomes (23 segments in stain OMA14 and nine segments in strain 17). These findings expand our understanding of the genetic features of Pre. intermedia and the roles of CTns and MTns in the evolution of bacteria.

P2-095 次世代シーケンサーによる BCG ワクチンの P2-096 全ゲノム配列情報を用いた近縁菌株の迅速高精 シードロットと市販ロットにおけるヘテロ変異の検出 度系統解析手法の開発：病原菌感染経路推測への応用 和田 崇之1，丸山 史人2，岩本 朋忠3，山本 太郎1，中川 一路2，山本 ○吉村 大1，後 藤 恭宏2，小 椋 義俊2，林 哲也2，伊 藤 武彦1（1東工大院・ 三郎4，○大原 直也5（1長崎大・熱研・国際保健，2京大院・医・微生物， 生命理工，2九大院・医・細菌） 3神戸市環保研・微生物，4日本 BCG 研究所，5岡山大院・医歯薬・口 腔微生物） whole-genome phylogenetic analysis of closely related isolates for infection route inference Deep sequencing analysis of the heterogeneity of seed ○Dai Yoshimura1, Yasuhiro Gotoh2, Yoshitoshi Ogura2, Tetsuya and commercial lots of BCG substrain Tokyo-172 Hayashi2, Takehiko Itoh1 (1Grad. Sch. Biosci. Biotech., Tokyo Tech., Takayuki Wada1, Fumito Maruyama2, Tomotada Iwamoto3, Taro 2Dept. Bact., Grad. Sch. Med. Sci., Kyushu Univ.) Yamamoto1, Ichiro Nakagawa2, saburo Yamamoto4, ○Naoya Ohara5 (1Dept. Int. Health, Inst. Trop. Med., Nagasaki Univ., 2Dept. Microbiol., 医療や畜産の分野において病原菌の感染経路を特定することは， Kyoto Univ. Grad. Sch. Med., 3Dept. Infect. Dis., Kobe Inst. Health, 感染症拡大防止のために非常に重要な意味を持つ。これまで感 4Japan BCG Lab., 5Dept. Oral Microbiol., Okayama Univ. Grad. Sch. 染経路の推定には，DNA 断片をパルスフィールドゲル電気泳動 Med. Dent. Pharm. Sci.) した際のパターンや，一部の遺伝子領域の配列パターンなどの 差異をもとにしたタイピング法が用いられてきた。しかしこれ 【背景】日本の BCG Tokyo 172 には，継代中の突然変異により形成された らの方法には，実験操作が煩雑で長時間を要する，タイピング 2 つのサブポピュレーション Type I と Type II が混在する。シードロット の分解能が不十分である，といった問題が存在している。そこ と市販ロットではこれらの混和に加え，培養中に新規変異が生じることで で近年，次世代シークエンサにより取得した全ゲノム配列をも 遺伝的均一性が損なわれた可能性が懸念される。また，同株は確立後に海 とに，菌株の系統解析をすることで感染経路を推定する新たな 外でも製造株として利用されているが，そのサブポピュレーションの混和 方法が注目を集めている。この方法では全ゲノム情報の利用に 状況も不明であった。 より高解像度な推定が可能であるが，膨大なシークエンス情報 【目的】次世代シーケンサー（ ）を用いた大量配列データ取得により， NGS の処理が臨床応用の障壁となっている。 BCG ロット内のヘテロ変異をゲノムワイドに検出する手法を確立し，ま た個々の遺伝的均一性を評価することを目的とした。 本研究ではこの新たな方法の普及に寄与するべく，シークエン 【方法】初代シードロット Tokyo 172 および継代ロット 172-1 に加え，そ ス結果の入力のみで自動的かつ高速に菌株の系統解析が可能な れぞれから作製された国内市販 5 ロット，台湾とタイの市販ロット各 1 ソフトウェアの開発を行った。本ソフトウェアは SNP 検出モ ロットからゲノム DNA を抽出後，サブポピュレーションの混和比をリア ジュールと系統推定モジュールから構成される。SNP 検出につ ルタイム PCR で確認した。同時に，Illumina GAIIx により大量配列データ いては，解析対象菌株の配列と参照配列との相同性を様々な値 を取得し，マッピング解析からヘテロ変異の検出を試みた。変異検出には に設定したシミュレーション評価を実施し，マッピングベース 3 種のバイオインフォツールを用いて結果を比較した。 やアセンブリベースの複数の方法から最良なものを採択した。 【結果および考察】各ロットの NGS データから，リアルタイム PCR によ 系統推定については，超近縁な菌株間の系統推定に特化したア る定量解析に基づくサブポピュレーション混和比と同等の比率で 7 箇所の ルゴリズムを採用した。このアルゴリズムは，院内感染などの 点変異が検出できた。これらの点変異はサブポピュレーション間の遺伝的 菌株間相同性が極めて高いケースを想定したシミュレーション 相違で，NGS データから混和比を定量可能であることが示された。新規 評価において，優れた結果を示した。本ソフトウェアは大量の 変異（混和比 5% 以上）は，市販 2 ロットに各 1 箇所検出された。各ロッ 菌株の系統推定を高精度かつ簡便，高速に実施可能であり，全 トから分離した株の中にこれらの変異を持つ株が実在したことから，本解 ゲノム情報を用いた感染症対策を実現可能なものに近づけるこ 析の精度が確認された。また，BCG Tokyo シードロットと市販ロットは とが期待される。 いずれも新規変異の混在が極めて少ないことが確認された。

134 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P2-097 C 型ボツリヌス毒素変換ファージのゲノム比較 P2-098 CRISPR 領域の配列解析による SCCmec V 型 と遺伝子機能解析 の進化学的伝播経路の推定 ○阪口 義彦1，内山 淳平2，小椋 義俊3，山本 由弥子4，松崎 茂展5， ○佐々木 崇，呂 宇傑，平松 啓一（順天堂大・医・微生物） 林 哲也3，松下 治4，小熊 惠二4，林 俊治1（1北里大・医・微生物， 2麻布大・獣医・微生物，3九大・医・細菌，4岡山大院・医歯薬総合・ Inference of transmission routes of type V SCCmec 病原細菌，5高知大・医・微生物） elements based on CRISPR sequences ○Takashi Sasaki, Yujie Lu, Keiichi Hiramatsu (Dept. Microbiol., Sch. The genome sequence of Clostridium botulinum type C Med., Juntendo Univ.) phage and functional analysis of gene products ○Yoshihiko Sakaguchi1, Jumpei Uchiyama2, Yoshitoshi Ogura3, 【背景】SCCmec は MRSA の責任遺伝子である mecA を運ぶ動的 Yumiko Yamamoto4, Shigenobu Matsuzaki5, Tetsuya Hayashi3, カセット染色体である。構造上 12 の型が分類されているが，各 Osamu Matsushita4, Keiji Oguma4, Shunji Hayashi1 (1Dept. Microbiol., 型の進化学的起源や伝播経路，多様化の道筋には不明な部分が Kitasato Univ. Sch. Med., 2Dept. Vet. Microbiol., Sch. Vet. Med., 多い。一方，CRISPR/Cas システムは細菌の免疫機構であり， Azabu Univ., 3Dept. Bacteriol., Facul. Med. Sci., Kyushu Univ., 4Dept. CRISPR 領域において direct repeat（DR）と 約 30bp のスペーサー Bacteriol., Okayama Univ. Grad. Sch. Med. Dent. Pharm. Sci., 5Dept. 配列がタンデムに連なり，cas 遺伝子群がそのスペーサー配列を Microbiol. Infect., Facul. Med., Kochi Univ.) 含む外来 DNA を認識し排除する。CRISPR 配列は免疫獲得順に 蓄積していくため，進化の時系列を追う手がかりとなる。 Background and aims: Bacteriophage (phage) laterally transfers the 【目的】CRISPR を搭載する SCCmec の水平伝播歴を CRISPR 配 botulinum neurotoxin type C (BoNT/C) gene between Clostridium botulinum. 列に基づいて推定した。 In this study, we (1) compared the genomes of the bont/C gene-converting 【方法】本研究で完全長を解読し，SCCmec V 型をもつ phages, (2) identified the virion proteins of phage c-st, and (3) analyzed these Staphylococcus schleiferi TSCC54 株を含め，SCCmec に CRISPR/ proteins for DNA partitioning during DNA replication of phage c-st. Cas を搭載した 6 種，6 株の塩基配列を用いた。CRISPR 領域の Methods: (1) The genomes of phages c-st Mut (1 and 2) and c-468 were DR とスペーサーの blast 解析，アラインメント，cas オペロンの compared with that of phage c-st. (2) The virion proteins of phage c-st were 系統解析を実施した。 analyzed. (3) The proteomic analysis of these proteins was analyzed. 【結果・考察】DR，スペーサーの並び順，相同性から，この Results and discussion: (1) The genome sizes of phages c-st Mut (1 and 2) SCCmec V 型は，S. aureus 08BA02176 株から S. capitis CR01 株 and c-468 were 160 kbp, 165 kbp, and 163 kbp, respectively. Comparison of へと伝達され，さらに S. pseudintermedius 23929 株および S. these genome structures with that of phage c-st indicated that a conserved schleiferi TSCC54 株へと水平伝播したことが示唆された。また， genome region of ca. 140 kbp was common to all. (2) Ten virion genes were cas オペロンの系統解析から，本 SCCmec 上の cas 遺伝子は，元 identified that were present in the 98–158 kbp of phage c-st. (3) The genes in 来ブドウ球菌属の種分化と共に垂直伝播され多様化してきたが， the segrosome gene cluster, which possibly function to partition phage DNA, S. argenteus（S. aureus CC75）ゲノム内で IV 型 SCCmec 上に搭載 were present in the 175–179 kbp region of the phage c-st genome. Moreover, されたことで水平伝播するようになり，やがて SCCmec V 型に組 these gene products were shown to maintain the phage DNA in host cells. み込まれ，様々な種に伝播したことが推測された。このことは， From the results of (1–3), the genomic region essential for phage conversion SCCmec が進化の過程で種を越えて水平伝播してきたこと，IV was estimated to be ca. 140 kbp. 型と V 型の間で搭載遺伝子がやりとりされたことを示唆する。 Collaborator: Maria A. Oliva1, Antonio J. Martin-Galiano1,2, Jose M. Andreu1 (CIB-CSIC1; CNM-ISC III2)

P2-099（WS3-4） 腸管出血性大腸菌 O157 が保持 P2-100 豚レンサ球菌の特定集団で見られた莢膜欠失に する新規病原因子一酸化窒素還元酵素遺伝子 norV の進化的 よる自然形質転換能の上昇 解析 ○大倉 正稔1，大 崎 慎人1，関 崎 勉2，高 松 大輔1,3（1農研機構・動衛研・ 2 3 ○清水 健1，平井 晋一郎2，横山 栄二2，市村 公敏1，野田 公俊1（1千 細菌・寄生虫， 東大院・農・食の安全センター， 岐阜大・院・連合 葉大・院医・病原細菌制御，2千葉県衛研） 獣医）

An evolutionary analysis of norV that encodes nitric Capsule loss results in hyper-competence phenotype in oxide reductase in EHEC O157 some Streptococcus suis populations 1 1 2 ○Takeshi Shimizu1, Shinichiro Hirai2, Eiji Yokoyama2, Kimitoshi ○Masatoshi Okura , Makoto Osaki , Tsutomu Sekizaki , Daisuke 1,3 1 2 Ichimura1, Masatoshi Noda1 (1Dept. Mol. Infectiol., Grad. Sch. Med., Takamatsu ( Bact./Parasit. Dis. Res. Division, NIAH, NARO, Res. 3 Chiba Univ., 2Chiba Pref. Inst. Pub. Heal.) Center for Food Safty, Grad. Sch. Agr. Life Sci., Univ. Tokyo, United Grad. Sch. Vet. Sci., Gifu Univ.) EHEC O157 was evolutionarily divided into subgroup A, B and C. Subgroup C comprises 3 sequentially emerging clusters defined by 豚や人に髄膜炎や心内膜炎など多様な症状を起こしうる豚レン the presence of a truncated bacteriophage in yehV and an intact wrbA サ球菌は，莢膜を有しており，病原性の発揮において重要な役 (cluster 1), disruption of wrbA by Stx2-encoding phage (cluster 2) 割を果たしている。一方，我々は，本菌では（特に心内膜炎由 and acquisition of stx1 by the truncated bacteriophage occupying 来株で）莢膜合成関連（cps）遺伝子の多様な変異により，莢膜 yehV (cluster 3). Although there are two types of nitric oxide (NO) が欠失すること，さらに生体内でその復帰変異が起こりうるこ reductase genes in EHEC O157, an intact norV and a deleted norV, とを見出している。近年，本菌では ComRS system を介した自 the products of deleted norV did not exhibit NO-reductase activity. 然形質転換誘導が示されており，これらの変異との関連性が示 Intact norV-type EHEC produced a lower NO concentration within 唆される。そこで，本研究では，まず，自然形質転換による cps macrophages than deleted norV-type EHEC. Intact norV-type EHEC 遺伝子への変異導入を試みた。その結果，莢膜欠失株に莢膜保 resulted in higher levels of Stx2 within macrophages compared with 有株ゲノム DNA を導入することにより，莢膜復帰変異株が得ら deleted norV-type EHEC. Thus, to provide evidence that the intact れた。同様に莢膜欠失株ゲノム DNA または実験的に作製した norV is related to the pathogenicity, we examined the evolutional cps 領域欠損遺伝子断片を莢膜保有株へ導入することにより，莢 distribution of the intact norV in EHEC O157. The intact norV 膜欠失変異株を得た。しかし，復帰変異株の出現率は欠失変異 was sought in 107 EHEC O157 isolates, which were divided into 株のそれよりも高い傾向にあった。そこで，莢膜の自然形質転 subgroups, clusters and clades based on the O157 phylogenetic 換効率への影響について調べるため，3 系統由来株について莢 model. Intact norV in EHEC O157 was correlated with the cluster 膜保有株とそれから作出した莢膜欠失変異株にプラスミドベク 1. This result indicated that deletion of norV occurred at a point ターを導入し，形質転換体の出現率を比較した。その結果，1 系 between cluster 1 and cluster 2 in EHEC O157. EHEC O157 cluster 統に関しては莢膜の有無は形質転換体出現率に影響しなかった が，他の 系統では莢膜の欠失により出現率が 倍上昇した。 1 strains are commonly associated with serious human disease. 2 7–10 以上から，本菌では莢膜保有株と欠失株が同一の環境に存在し Therefore, the intact norV in EHEC O157 would be involved in た場合，莢膜欠失・復帰につながる 遺伝子の変異が自然形質 determining clinical outcomes. cps 転換を介して起こりうること，そして，系統によっては莢膜欠 失により，自然形質転換能が上昇し，復帰しやすくなることが 示唆された。また，莢膜欠失は遺伝的多様性を加速する重要な 役割を果たしている可能性も指摘された。

135 P2-101 広島県で高頻度に分離された地域固有の P2-102 急性膀胱炎の起因菌 Staphylococcus ST235 多剤耐性緑膿菌の由来を追う saprophyticus 分離株におけるゲノムアイランド SCC の構 ○鹿山 鎭男1,2，清水 亘1,3，播野 俊江1，繁本 憲文1,4，嶋田 徳光1,3， 造比較解析 1,3 1,4 1,2 1 矢野 雷太 ，大 毛 宏喜 ，菅 井 基行 （ 広島大・院内感染症プロジェ ○加藤 健吾，関塚 剛史，稲嶺 由羽，山下 明史，黒田 誠（感染研・ クト研究センター，2広島大・医歯薬保・細菌学，3広島大・医歯薬保・ ゲノム） 外科学，4広島大・感染症科） Comparative analysis of the genomic island SCC among Molecular epidemiological study of ST235 blaIMP-1- Staphylococcus saprophyticus isolates carrying MDRP prevalently isolated in Hiroshima ○Kengo Kato, Tsuyoshi Sekizuka, Yuba Inamine, Akifumi Yamashita, 1,2 1,3 1 ○Shizuo Kayama , Wataru Shimizu , Toshie Harino , Norifumi Makoto Kuroda (Dept. Pathogen Genomics Center, Nat. Inst. Infect. 1,4 1,3 1,3 1,4 Shigemoto , Norimitsu Shimada , Raita Yano , Hiroki Ohge , Dis.) Motoyuki Sugai1,2 (1Project Res. Cent. Nosocom. Infect. Diseases, Hiroshima Univ., 2Dept. Bacteriol. Graduate Sch. Biomed. Health ブドウ球菌属に特有のゲノムアイランドである Staphylococcal Sci., Hiroshima Univ., 3Dept. Surgery, Hiroshima Univ., 4Dept. Infect. Cassette Chromosome（SCC）は外来性遺伝子の獲得に寄与して Diseases, Hiroshima Univ. Hosp.) おり，黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus はメチシリン耐性 遺伝子 mecA を内部にコードする SCCmec を獲得し Methicillin- 私共は 2004 年より広島県下の主要施設より分離された薬剤耐性 resistant S. aureus（MRSA）へと耐性化する。院内型 MRSA と市 緑膿菌の分子疫学調査を継続している。広島県において，耐性 中型 MRSA の SCCmec 構造の特徴が異なると示唆されているが， 緑膿菌が保有するメタロ -β- ラクタマーゼ blaIMP-1 インテグロン さらに複数のブドウ球菌属の SCCmec 配列構造が明らかとなる はそのカセット分類の結果，現在，8 種類存在していることを明 につれ，ブドウ球菌属の種間で伝達する可能性も示唆されてい らかにしている。なかでも IS26 挿入により intl1 が破壊された る。しかしながら，種間を越えた SCC の伝播過程に関してはほ In113 を保有する ST235 株（F 型）は，広島県において blaIMP-1 保 とんど研究がされていない。 有株の大多数を占め，長期にわたる epidemic を起こしているこ 本研究では，ブドウ球菌属の種内および種間におけるSCCの類似・ とが分かった。一方，In113 を保有する ST235（NCGM2.S1）株（ E 類縁性を検討すべく，腐生ブドウ球菌 Staphylococcus saprophyticus 型）は東北地方や関東地方で 2002 年頃からアウトブレイクを起 を対象に SCC の配列構造を調査し，MRSA 等が有する既知の こしていたが，広島県での 型の検出頻度は 型よりも低かった。 E F SCC 配列構造との比較解析を行った。S. saprophyticus は急性膀胱 を保有する多剤耐性緑膿菌は全国的に拡がっていると考え In113 炎を主訴とする市中感染型と考えられているが，SCCmec を保有 られるが，何故，広島では 型よりも 型が優位に拡がったの E F する S. saprophyticus の報告もある（Higashide et. al., 2008）。そこ かを明らかにすることを目的とした。 型， 型の多剤耐性緑膿 E F で，ヒト泌尿器および家畜から分離された S. saprophyticus 計 106 菌の関連性についてゲノム比較解析から， 型は を介した F IS26 株のドラフトゲノム配列を取得し，相同性検索により SCC およ 組換えにより E 型から生じた可能性が示唆された。このことか び SCCmec の構成に係る因子（orfX, ccrA/B/C, mecA）の有無を検 ら，日本中で広く存在していると考えられる In113 保有株が，広 出した。その結果，106 株中の 35 株が SCC を保有しており，う 島で認められる F 型多剤耐性緑膿菌の由来株であると考えられ ち 8 株は mecA を保有する SCCmec である事が明らかとなった。 た。また，NCGM2.S1 株はポーリンタンパク OprD が IS26 によっ S. saprophyticus 35 株が保有する SCC に加え，データベース等に て破壊されている一方で，F 型の OprD は破壊されていなかった 登録されたブドウ球菌属の既知の SCC の配列構造を比較した結 ことから，栄養の取り込みなどにおいて F 型よりも E 型（ NCGM2. 果のほか， 配列構造の類縁性とコアゲノム配列に基づく S1）株が不利になることから，広島では F 型のほうが優位に拡 SCC S. がったと考えられた。 saprophyticus の分子系統との関連性についても報告する。

P2-103 ウエルシュ菌のバクテリオシン遺伝子保有プラ P2-104 Characterization of CoA-transferases for スミドの複製・分配領域についての検討 propionic acid production in Porphyromonas gingivalis ○宮本 和明，清家 総史，高岸 照久，竹原 正也，小林 敬子，永浜 政 ○佐藤 満成1，吉田 康夫2，永野 恵司2，長谷川 義明2，武部 純1，吉 博（徳島文理大学 薬学部 微生物学教室） 村 文信2（1愛知学院大・歯・有床義歯，2愛知学院大・歯・微生物） Plasmid replication and partitioning region of bcn ○Mitsunari Sato1, Yasuo Yoshida2, Keiji Nagano2, Yoshiaki 2 1 2 1 plasmid in Clostridium perfringens strain F5603 Hasegawa , Jun Takebe , Fuminobu Yoshimura ( Dept. Removable 2 ○Kazuaki Miyamoto, Soshi Seike, Teruhisa Takagishi, Masaya Prosthodontics., Sch. Den., Aichigakuin Univ., Dept. Microbiology., Takehara, Keiko Kobayashi, Masahiro Nagahama (Dept. Microbiology, Sch. Den., Aichigakuin Univ.) Fac. Pharmaceutical Sciences, Tokushima Bunri Univ.) Background & Purpose: We reported previously that the To understand a relationship of pBCNF5603, with cpe plasmid, PGN_0725, PGN_1341 and PGN_1888 proteins functioned as pCPF5603, in the enterotoxigenic Clostridium perfringens strain, the CoA-transferase to produce butyric acid from butyryl-CoA in replication and partitioning region of pBCNF5603 was evaluated. To Porphyromonas gingivalis ATCC33277. In the current study, we investigate the genetic organization of bcn plasmid, we performed examined the association of those proteins with production of complete sequencing. Based on the genetic information, we identified propionic acid from propionyl-CoA. Materials & Methods: Purified the replication and partitioning region. To study the relationship with recombinant PGN_0725, PGN_1341 and PGN_1888 were obtained other plasmids, comparative genomics using GenBank data base was from E. coli using pGEX6P-1 vector. Propionyl-CoA transferase performed. pBCNF5603 encodes a putative bacteriocin gene which activity of the recombinant proteins were investigated by GC-MS and is likely to contribute virulence. Based on the identified replication colorimetric analyses. We also constructed mutant strains lacking region, pBCNF5603 is iteron-type plasmid. pCP13 which carries PGN_0725, PGN_1341 or PGN_1888 gene. The concentrations homologus sequences with the replication region, is incompatible of short chain fatty acids, including propionic acid, in the culture with pBCNF5603. Upstream of the replication region, a putative supernatant from mutant strains were also measured. Result & plasmid partitioning region which consists of parA, parB, and parS Conclusion: Incubation of either PGN_0725 or PGN_1888 with sequences is identified, therefore, pBCNF5603 plasmid partitioning propionyl-CoA resulted in production of propionic acid, while system seems to be type Ia family. In contrast, the enterotoxin PGN_1341 did not produce propionic acid from propionyl-CoA, gene (cpe) encoding plasmid harbors type II plasmid partitioning suggesting that propionyl-CoA is one of substrates for PGN_0725 system. Divergence of the plasmid replication and partitioning region or PGN_1888, but not for PGN_1341. Replacement of PGN_0725, enables pBCNF5603 to stably co-exist with cpe-encoding plasmid in PGN_1341 or PGN_1888 with the erm or tetQ cassette resulted enterotoxigenic F5603 strain. Overall, bacteriocin plasmid can stably in decreases of the propionic acid concentration in the culture co-exist with toxin encoding plasmid, and therefore might contribute supernatant. In conclusion, those proteins were directly or indirectly the virulence of enterotoxigenic C. perfringens strain. involved in a metabolic pathway of propionic acid production in P. gingivalis.

136 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P2-105 Streptococcus intermedius に対するクオラ P2-106 バクテリオファージ φSA012 に対する黄色ブ ムセンシングペプチドおよび環境因子の作用 ドウ球菌 SA003 のファージ耐性化機構に関する研究 ○高尾 亞由子1，長宗 秀明2，友安 俊文2，前田 伸子1（1鶴見大・歯・ ○Aa Haeruman Azam，星賀 史也，宮永 一彦，丹治 保典（東工大・ 口腔微生物，2徳島大院・ソシオテクノサイエンス） 生命理工）

Effects of quorum sensing peptides and environmental Study on phage-resistant mechanism of S. aureus SA003 factors on Streptococcus intermedius against phiSA012 ○Ayuko Takao1, Hideaki Nagamune2, Toshifumi Tomoyasu2, Nobuko ○Aa Haeruman Azam, Fumiya Hoshiga, Kazuhiko Miyanaga, Maeda1 (1Dept. Oral Microbiol., Sch. Dent. Med., Tsurumi Univ., 2Dept. Yasunori Tanji (Dept. Bioeng., Sch. Biosci. & Biotechnol., Tokyo Biol. Sci. & Tech., Life Syst., Inst. Tech. & Sci., Tokushima Univ.) Tech.)

Aims: Competence-stimulating peptide (CSP) and bacteriocin- Introduction: One of the big obstacles in realizing phage therapy inducing peptide (BIP) cause the expression of competence inducing is the emergence of phage-resistant bacteria. Previously the phage- genes (com genes) and that of bacteriocin production-related genes resistant strains of S. aureus SA003 have been isolated from co- (blp genes), respectively. These quorum sensing systems may play evolution experiment between SA003 and its specific phage φSA012. a role in horizontal gene transfer and bacterial competition among The present study will focus on phage-resistance mechanism of the anginosus group streptococci. To know the factors affecting SA003 against φSA012. to the functions of these quorum sensing systems, properties of Materials and Methods: Whole genome sequencing was carried Streptococcus intermedius (Si) with or without the peptides under out on wild type SA003 and 10 phage-resistant strains. Point various culture conditions were investigated. mutation was found on several genes including Teichoic acid ribitol-O Materials & Methods: Each test strain was exposed to Brain-Heart (TarO) and Ferrodoxyn-dependent glutamate synthase (FDGS). Infusion broth (BHI) containing various supplements. Parameters of Mutant TarO and FDGS were generated by TargeTron(R) gene bacterial response including transformation, biofilm formation and knockout system and allelic exchange, respectively. bacteriocin production were assayed. Result and Discussion: Mutant TarO showed less sensitivity Results & Discussion: Not only CSP but also BIP induced against φSA012 according to spot test. The complementation of transformation in the wild type strain (WT). Addition of glucose (1%) TarO wildtype proved that sensitivity was recovered. In comparison, increased the amount of biofilm in 24h culture, and the influence complementation of TarO from phage-resistant strain showed lower of peptides on biofilm formation were different among WT and sensitivity compared to TarO wildtype. We assumed that point the deletion mutants of competence-specific sigma factor genes mutation in TarO endow phage-resistance to SA003. FDGS mutant (comX). Bacteriocin production in the comX deletants was stronger showed insignificant clearance compared to wildtype according to than that in WT. These results suggest that two peptide quorum spot test. However, the Efficiency of platting (EOP) value showed it sensing systems might crosstalk and be affected by other regulation was nearly 50% relative to wildtype strain. We assumed that point processes such as catabolite repression. Details are now in process. mutation in FDGS may also influence the phage-resistance of SA003.

P2-107 黄色ブドウ球菌ファージ ΦSA012 の宿主認識 P2-108 Identification of gene that contribute to the 機構の解析 temperature-resistance in acetic acid bacterium ○竹内 一平，長田 啓太，宮永 一彦，丹治 保典（東京工業大・生命 ○荻野 英賢1，長谷川 明洋1，松谷 峰之介2，松下 一信2，水上 洋一3， 理工・生物プロセス） 白井 睦訓1（1山口大・医・微生物学，2山口大・農・応用微生物学， 3山口大・総合科学実験センター） The host-recognition mechanism of Twort-like ○Hidetaka Ogino1, Akihiro Hasegawa1, Minenosuke Matsutani2, staphylococcal phage phiSA012 2 3 1 1 ○ Kazunobu Matsushita , Youichi Mizukami , Mutsunori Shirai ( Dept. Ippei Takeuchi, Keita Osada, Kazuhiko Miyanaga, Yasunori Tanji 2 (Dept. Bioeng. Sch. Biotec., Tokyo Tech) Microbiol. Immunol., Sch. Med., Yamaguchi Univ., Dept. Biol. Chem., Yamaguchi Univ., 3Cntr. Gene. Res., Yamaguchi Univ.) Introduction: Staphylococcus aureus causes several infectious diseases in humans and animals. The application of bacteriophages Acetic acid bacteria are Gram-negative, obligate aerobic, rod-shaped (phages) to bacterial infections has been considered as one bacteria that are generally known for their ability to oxidize sugars to of the alternatives to antibiotics-based treatment due to the acetic acid. emergence of antibiotic resistance. Thanks to their high infectivity, Previous study, we performed the genomic DNA sequencing staphylococcal Twort-like phages are promising candidates for use of Acetobacter pasteurianus IFO 3283-01 and the temperature- against staphylococcal disease. To date, more than 20 species of resistant strain, A. pasteurianus IFO 3283-01-42C. The comparative staphylococcal Twort-like phages (e.g. Twort, K, ΦSA012, etc.) have analysis revealed that the 92-kb deletion and three single nucleotide been studied, mainly for therapeutic use. However, the mechanism of mutations occurred in the genome of the temperature-resistance A. their infection process remains unclear, especially in host recognition pasteurianus IFO 3283-01-42C. step. In this study, we investigated genes responsible for host In this study, the gene expression was analyzed using next recognition in staphylococcal Twort-like phage ΦSA012. Material generation sequencing to A. pasteurianus IFO 3283-01 or A. and methods: To find genes responsible for host recognition, pasteurianus IFO 3283-01-42C cultivated on 30°C or 41°C. As the whole genome sequencing of ΦSA012 and its mutant phages which results, the gene expression of several operons were different showed the different infectivity were conducted. To assess the effect between A. pasteurianus IFO 3283-01 and A. pasteurianus IFO 3283- of mutations, a chimeric phage of ΦSA012 was also generated by 01-42C cultivated on 41°C. Thus, we thought that the temperature- homologous recombination. Results and discussion: All mutations resistance was regulated by the transcription factor coding in in mutant phages were identified and the accumulations of mutations the 92-kb deletion region, APA01_13830 or APA01_13890. Each were confirmed during the passage co-culture. Currently, we have transcription factor was transformed in A. pasteurianus IFO 3283-01- been studying infection process of Twort-like phages by focusing on 42C, and the temperature sensitivity was tested. As the results, the genes which seem to be involved in host recognition. temperature sensitivity was shown in APA01_13830 transformed A. pasteurianus IFO 3283-01-42C but not in APA01_13890 transformed one. These results suggested that APA01_13830 was contributed to the temperature-resistance in A. pasteurianus IFO 3283-01-42C.

137 P2-109 Synechococcus elongatus PCC 7942 におけ P2-110 Porphyromonas gingivalis ECF シグマ因子 るゲノムコピー数制御機構の解析 変異株の性状解析 ○辻出 亘寛1，渡辺 智1，橋本 千晴1，大林 龍胆1,3，兼崎 友2，吉川 博 ○菊池 有一郎1，藤瀬 和隆1，柴山 和子1，国分 栄仁1，大原 直也2， 文1,3（1東農大・応生科・バイオ，2東農大・生物資源ゲノム解析センター， 中山 浩次3，石原 和幸1（1東歯大・微生物，2岡山大院・医歯薬・口 3JST・CREST） 腔微生物，3長崎大院・医歯薬・口腔病原微生物） Proliferation mechanism of polyploidy cyanobacteria Characterization of putative ECF sigma factor mutants of ○Nobuhiro Tsujide1, Satoru Watanabe1, Chiharu Hashimoto1, Ryudo Porphyromonas gingivalis Ohbayashi1,3, Yu Kanesaki2, Hirohumi Yoshikawa1,3 (1Dept. Biosci., ○Yuichiro Kikuchi1, Kazutaka Fujise1, Kazuko Shibayama1, Eitoyo Tokyo Univ. Agric., 2NGRC, Tokyo Univ. Agric., 3JST, CREST.) Kokubu1, Naoya Ohara2, Koji Nakayama3, Kazuyuki Ishihara1 (1Dept. Microbiol., Tokyo Dent Coll., 2Dept. Oral Microbiol., Grad. Sch. Med. Synechococcus elongatus PCC 7942（以下 S.7942）は細胞あたり Dent. Pharm. Sci., Okayama Univ., 3Div. Microbiol. Oral Infect., Grad. 複数コピーのゲノムを保持している。これまでの研究から，S.7942 Sch. Biomed. Sci., Nagasaki Univ.) のゲノムコピー数は培養時間，培養環境によって変動すること が示された。特に定常期の細胞においてコピー数が顕著に減少 【目的】細菌の ECF シグマ因子は，菌体外の生活環境変化に応 したことから，定常期の培養上清を調製し，これを培養に用い 答し，菌体の環境ストレスからの回避に働く。歯周病原細菌 ると対数増殖期の細胞であってもコピー数の減少が誘導された。 Porphyromonas gingivalis は 6 種の ECF シグマ因子を保有している また培養上清の成分分析から定常期の培養上清はリン酸が枯渇 が，その機能については十分に明らかにされていない。我々は本 していることが明らかとなった。以上のことから定常期におけ 研究にて ATCC 33277 株を親株としたそれぞれの ECF シグマ因子 るコピー数の減少には培地中のリン酸量が深く関与しているこ の遺伝子挿入変異株の性状解析を行い，その機能の解明を試みた。 とが示された。リン酸欠乏時におけるコピー数減少のより詳細 【方法】P. gingivalis ATCC 33277 株を親株とし，各 ECF シグマ因 な機構を解明するために，トランスクリプトーム解析を行った 子遺伝子内にエリスロマイシン耐性遺伝子カセットが挿入され 結果，定常期及びリン酸欠乏条件下においてリン酸のセンサー た変異株を作製した。親株と ECF シグマ因子変異株を用い，ジ sphS-sphR，トランスポーター pts オペロンと共に転写因子 ptrA ンジパイン活性試験，赤血球凝集活性試験，バイオフィルム形 の転写量の増加が確認された。転写因子 ptrA がコピー数減少に 成能，各種抗菌薬に対する MIC 測定を行い評価した。 関与しているかを検証するため ptrA を破壊及び過剰発現し，コ 【結果と考察】ジンジパイン活性試験の結果，野生株と比較し ピー数変動を解析した。その結果，ptrA の破壊によりリン酸欠 PGN_0274 変異株は，Rgp, Kgp ともに活性の顕著な減少を認め 乏時におけるコピー数の減少が遅延し，一方，ptrA を過剰発現 た。さらに PGN_0274 変異株は赤血球凝集活性試験にて凝集能 するとDNA複製への阻害効果が観察された。本研究会ではコピー を認めず，これらの現象は PGN_0274 欠失によるジンジパイン 数減少と転写因子 ptrA の機能について議論したい。 の膜外輸送の停止が原因と考えられる。また，野生株と比較し， PGN_0274 と PGN_1740 変異株で顕著なバイオフィルム形成能の 増加を認めた。テトラサイクリン，オフロキサシンに対する感 受性に顕著な変化は認められなかったものの，アンピシリンに 対する感受性は PGN_0274 変異株で増加，PGN_0450, PGN_1740 変異株で低下した。以上の結果より，P. gingivalis が病原性を発 現する際 ECF シグマ因子は，重要な役割を果たすことが示唆さ れた。

P2-111 PrhN is involved in positive regulation of P2-112（WS10-5） バイオフィルム超高産生性黄色 type III secretion system of Ralstonia solanacearum ブドウ球菌臨床分離株から見出された新規転写調節因子の機 張 勇1，木場 章範2，曵地 康史2，○大西 浩平3（1Coll. Resources 能解析 2 3 Environ., Southwest Univ.， 高知大・農・植物工学， 高知大・遺伝 ○Liansheng Yu，久恒 順三，加藤 文紀，水町 栄美理，菅井 基行（広 子実験施設） 島大院・医歯薬保健学・細菌学） Yong Zhang1, Akinori Kiba2, Yasufumi Hikichi2, ○Kouhei Ohnishi3 1 2 A novel transcriptional regulator of biofilm formation ( Coll. Resources Environ., Southwest Univ., Dept. Agric., Kochi from a clinically isolated S. aureus Univ., 3Res. Inst. Mol. Genet., Kochi Univ.) ○Liansheng Yu, Junzo Hisatsune, Fuminori Kato, Emiri Mizumachi, The MarR family of transcriptional regulators are involved in various Motoyuki Sugai (Dept. Bacteriol., Grad. Sch. Biomed. Health Sci., cellular processes. We reported a new MarR regulator PrhN, which Hiroshima Univ.) was involved in the pathogenesis of Ralstonia solanacearum. The 【目的】バイオフィルム（BF）内で生育している細菌は，抗菌 prhN mutant exhibited significantly reduced virulence and stem 薬や消毒剤への抵抗性を示し，感染症治療上大きな問題となっ colonization compared to the wild type in tomato plants. The prhN ている。S. aureus の BF 産生は様々な因子により複雑に制御 mutant caused identical hypersensitive response (HR) on resistant されていることが明らかになりつつある。私どもは臨床分離株 plants with the wild type. Deletion of prhN substantially reduced の表現型解析の過程で，BF 超高産生性 TF2758 株を見出した。 the expression of type III secretion system (T3SS) in vitro and TF2758 の遺伝子発現解析から，BF 産生に関与する新規転写因 in planta and the complemented PrhN could restore its virulence 子 Rob（repressor of biofilm）を見出した。本研究では，Rob の and T3SS expression to the wild-type level. T3SS is directly BF 形成における制御機構について検討した。 controlled by AraC-type transcriptional regulator HrpB, and the 【方法】遺伝子変異株の作製：遺伝子変異株，欠損株は常法の相 transcription of hrpB is activated by HrpG and PrhG. HrpG and 同組換え法にて，遺伝子相補用の plasmid を用いて作製した。転 PrhG are homologs and regulated by PhcA positively and negatively, 写因子の結合実験：EMSA 法とフラグメント解析により転写因 respectively. Deletion of prhN abolished the expression of both 子の結合領域を推定した。 hrpB and prhG. However, it didn’t change the expression of hrpG 【結果と考察】Microarray 解析から，TF2758 株では 2 つの遺伝 and phcA. These results indicated that PrhN positively regulates 子 群（ satf2580-satf2585 と ica operon）の発現量が極めて高かった。 T3SS expression through PrhG and HrpB. PrhN and PhcA should ゲノムの配列比較解析をすると，rob（satf2583）の 111 位 Lys に regulate prhG expression in a parallel way. This is the first report ナンセンス変異を認めた。野生型 Rob を TF2758 株で過剰発現 on the pathogenesis of MarR regulator in R. solanacearum, and this させると，BF 産生性および PIA 合成量が顕著に低下した。また， new finding will improve our understanding of the various biological BF 低産生標準株 NCTC8325 株で同様の変異を導入すると，BF functions of MarR regulator and the complex regulatory network on 形成性が著しく増大した。DNA 結合実験により，Rob は icaA- hrp regulon in R. solanacearum. icaR 遺伝子間領域にある short stretch DNA に結合することを明 らかにした。以上の事から，標準株で新規転写因子 Rob は icaR promoter 領域近傍に結合し，ica オペロン依存性の BF 形成を制 御することが示唆された。従って，TF2758 株はこの Rob の変異 により，PIA 合成を抑制する機能が壊れ，BF 形成が異常に高く なったものと考えられた。

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P2-113 Small regulatory RNA Esr41 による腸管出血 P2-114 コレラ菌の病原性発現調節におけるレトロンと 性大腸菌 LEE 遺伝子群の発現制御 msDNA の機能解析 ○須藤 直樹1，相馬 亜希子2，伊豫田 淳3，齋藤 健太1，関根 靖彦1 ○湯ノ谷 学，島本 敏，島本 整（広島大・院・生物圏科学・食品衛生 （1立教大・理・生命理学，2千葉大・園芸，3国立感染症研究所・細菌 学） 第一部） Functional analysis of retron and msDNA in relation to Regulation of the LEE expressions by a small regulatory virulence regulation in Vibrio cholerae RNA, Esr41, in enterohemorrhagic E. coli ○Gaku Yunotani, Toshi Shimamoto, Tadashi Shimamoto (Lab. Food ○Naoki Sudo1, Akiko Soma2, Sunao Iyoda3, Kenta Saito1, Yasuhiko Microbial. Hyg., Grad. Sch. Biosphere Sci., Hiroshima Univ.) Sekine1 (1Dept. Life Sci., Coll. Sci., Rikkyo Univ., 2Divi. Appl. Biol. Chem. Fac. of Hortic. Chiba Univ., 3Dept. Bacteriol., Natl. Inst. Infect. 【背景】細菌の逆転写酵素（RT）は，multicopy single-stranded Dis.) DNA（msDNA）と呼ばれる RNA-DNA 複合体の合成に必須の 酵素である。Vibrio cholerae の RT 遺伝子（ret）はゲノム上で 近年，細菌において small regulatory RNA（以下，sRNA）によ msDNA をコードする領域（msr -msd）と 2 つの機能未知の ORF る遺伝子発現ネットワークの広範性が明らかにされており，病 （orf540，orf205）とともに，レトロン -Vc95 と呼ばれるオペロン 原性細菌における病原性遺伝子の発現制御に関わる sRNA も多 を形成している。レトロン -Vc95 の機能は未解明だが，流行性コ く報告されている。我々が同定した腸管出血性大腸菌 O157:H7 レラの原因となる V. cholerae O1/O139 血清型のすべての株がレト Sakai 株に存在する sRNA Esr41 もその一つである。esr41 の過剰 ロン -Vc95 を保有しているため，病原性とレトロンの関係が強く 発現は，宿主細胞への接着に直接関与する III 型分泌装置をコー 示唆されている。先行研究でレトロン，msDNA は VC0176 遺伝 ドする LEE（locus of enterocyte effacement）遺伝子群の発現量 子と VC0177 遺伝子を制御している可能性を示した。両遺伝子は の減少を引き起こし，その結果，O157 株の宿主細胞への接着能 VSP-1 と呼ばれる pathogenicity island 上にコードされているため， が低下する。さらなる解析の結果，この LEE 遺伝子群の発現量 レトロンまたは msDNA を介して V. cholerae の病原性を調節して の減少は，Esr41 による LEE 遺伝子群の正の転写因子 ler の翻 いることを示唆している。【目的】両遺伝子のプロモーター領域 訳抑制に起因すること，また，この制御は RNA 結合タンパク質 の塩基配列を調べたところ msDNA の DNA ステム部分と部分的 Hfq に依存することを示した。一般的に，Hfq 依存型 sRNA は， に一致する配列が存在した。そこで，msDNA がデコイ DNA と 標的 mRNA と塩基対を形成することで翻訳を制御する。そのた して機能し，転写制御因子である VC0176 タンパク質と結合す め，細胞内における Esr41-Hfq- ler mRNA 複合体の検出を目的と ることで VC0177 遺伝子を制御しているのではないかという仮 し，タグ配列を付加した Esr41 と共精製されるタンパク質，及 説を立てた。この仮説を検証するため，VC0176 タンパク質が制 び RNA の解析を行った結果，Esr41 と共に Hfq，及び ler mRNA 御する遺伝子群を ChIP-seq 法によって網羅的に解析した。【結 が共精製された。このことは，細胞内におけるこれら三者の複 果】VC0176 タンパク質が結合する領域の中に RNA polymerase β 合体の存在を示す。また，ler mRNA の SD 配列上流の A に富ん subunit 遺伝子が含まれていた。別の実験から msDNA 結合タン だ配列が Esr41 による抑制に必須であり，in vitro の解析から同 パク質として同じタンパク質が同定されている。これらの事実は じ配列に Hfq が結合することが示唆された。これらの結果は， msDNA および VC0176 タンパク質が協同して RNA polymerase ler mRNA の SD 配列上流の A に富んだ配列に Hfq が結合するこ の発現や活性を調節している可能性を示唆しており，またそれ とが，Esr41 による ler 抑制に必要であることを示唆する。 らがコレラ菌の病原性の発現調節に関与している可能性が考え られた。

P2-115 結核菌におけるポリフェノールの抗菌作用の P2-116 プロポリスによる Porphyromonas gingivalis 検討 の殺菌機序 ○立石 善隆，尾関 百合子，西山 晃史，松本 壮吉（新潟大・医・細 ○吉益 由莉1,2，中尾 龍馬2（1日大院・生物資源，2感染研・細菌第一） 菌学） Mechanism of antimicrobial action with propolis on Antimicrobial effect of polyphenols in M. tuberculosis Porphyromonas gingivalis ○Yoshitaka Tateishi, Yuriko Ozeki, Akihito Nishiyama, Sohkichi ○Yuri Yoshimasu1,2, Ryoma Nakao2 (1Grad. Sch. Bioresour. Sci., Matsumoto (Dept. Bacteriol., Sch. Med., Niigata Univ.) Nihon Univ., 2Dept. Bacteriol I., Natl. Inst. Infect. Dis.)

【目的】緑茶成分カテキンに示されるように，ポリフェノールは 【緒言】プロポリスは，樹液や花粉等にミツバチの唾液を混ぜ合 抗微生物作用を有するものが存在する。機序の一つに鉄結合能 わせて作られる樹脂状の物質であり，これまでに抗炎症作用， が考えられるが，抗菌作用と鉄結合能との関係は未解明である。 抗微生物作用，免疫賦活作用，鎮痛作用等の生理活性が報告さ 今回，結核菌に対する各種ポリフェノールの鉄結合能と抗菌作 れている。本研究では，プロポリスのエタノール抽出物（EEP） 用の関係を検討した。【方法】4 種のフラボン，4 種のフラボノー を用いて歯周病原細菌等の口腔細菌に対する抗菌活性を調べた。 ル，2 種のフラバノール，2 種のフラバノン，その他 5 種の関連 また特に Porphyromonas gingivalis を用いて，EEP による抗菌機 化合物を被験薬とした。鉄結合能は，紫外可視分光光度計によ 序の解明を目指した。【方法】5 菌種 10 株の歯周病原細菌と 8 菌 る吸光スペクトルの変化により評価した。抗菌作用は，結核菌 種 8 株の口腔レンサ球菌を EEP による増殖阻害試験に供試した。 H37Rv における，グリセロール，アラニン，塩化ナトリウムを EEP による P. gingivalis の形態変化は原子間力顕微鏡（AFM）動 主体とした血清アルブミンを含まない培地（GAST 培地）での最 画システム（BIXAMTM,OLYMPUS）により観察した。P. gingivalis 少発育阻止濃度（MIC）測定を行い，クエン酸アンモニウム鉄 の膜透過性の変化は Live/Dead 染色により調べた。【結果】EEP は， 存在下（約 160 μM）および非存在下の二条件での結果を比較検 口腔レンサ球菌群よりも歯周病原細菌に対して発育阻止効果が 討した。【成績】ヒドロキシフェニル・ピロガールあるいはカテ 高い傾向を示した。特に P. gingivalis は供試した 4 菌種の全て コールの各基をもつフラボン，フラボノールおよびフラバノー の MIC が口腔レンサ球菌群の 1/4 以下と高い EEP 感受性を示し ルは鉄結合能を示したが，ピロカテコール自体は鉄結合能を示 た。AFM 動画観察においては，EEP 処理後少なくとも 5 分間で さなかった。ピロカテコール，レスベラトロール，フラボンは， 菌体表層上に次々と小胞が形成され，それら小胞同士が融合し 他のポリフェノールに比べて良好な抗菌活性を示した（MIC 値： ていく過程が観察された。また，P. gingivalis の膜透過性は EEP それぞれ 39 μM，0.156 mM.，0.625 mM）。鉄結合能をもつフラ 濃度依存的に亢進した。【考察】EEP は口腔細菌の中でも特に P. ボノールとフラバノールは，鉄非存在で 1mM 未満の MIC 値を gingivalis に選択的かつ殺菌的に作用したことから，歯周病治療 示した。グリコシル化ポリフェノールは，抗菌活性を示さなかっ への応用の可能性が示唆された。AFM 動画観察及び Live/Dead た。【結論】いくつかのポリフェノールが結核菌に対して抗菌作 染色の結果から EEP による殺菌機序は，P. gingivalis 菌体膜での 用を示した。直接的な鉄奪取と抗菌作用の関連性は示唆されな 小胞形成と小胞融合を伴う膜の傷害であることが明らかとなっ かったが，活性酸素種産生 / 抗酸化能と抗菌活性の関係について， た。（会員外共同研究者：日本大学生物資源科学部・古川壮一， 今後検討を行う。 森永康，オリンパス株式会社・八木明）

139 P2-117 ダプトマイシン耐性化が MRSA バイオフィル P2-118 プラズマ合成された高純度過ギ酸による殺芽胞 ム形成に与える影響 活性 ○濱田 将風，山口 哲央，青木 弘太郎，石井 良和，舘田 一博（東邦大・ ○南部 隆之1，森岡 裕貴2，麥田 菜穂2，真下 千穂1，山根 一芳1，円 医・微生物感染症） 山 由郷1，山中 武志1，高橋 一也2，小正 裕2，王 宝禮1（1大歯大・歯・ 細菌，2大歯大・歯・高齢者歯科） Influence of daptomycin resistance on MRSA biofilm formation Sporicidal activity of pure performic acid synthesized the ○Masakaze Hamada, Tetsuo Yamaguchi, Kotaro Aoki, Yoshikazu DBD plasma Ishii, Kazuhiro Tateda (Dept. Microbiol. Infect. Dis., Sch. Med., Toho ○Takayuki Nambu1, Hiroki Morioka2, Naho Mugita2, Chiho Mashimo1, Univ.) Kazuyoshi Yamane1, Hugo Maruyama1, Takeshi Yamanaka1, Kazuya Takahashi2, Yutaka Komasa2, Pao-Li Wang1 (1Dept. Bacteriol., Fac. 【目的】ダプトマイシンは抗 MRSA 薬として治療に用いられるが， Dent., Osaka Dent. Univ., 2Dept. Gerodontology, Fac. Dent., Osaka 治療の長期化で MRSA が耐性化する恐れがある。耐性化の機序 Dent. Univ.) として膜組成の変化が挙げられる。この変化は MRSA の病原性 に影響を及ぼすと考えられる。そこで，今回我々は術後感染の Performic acid (PFA, HCOOOH) can be produced by mixing formic 治療前後で分離されたダプトマイシン感受性及び耐性 MRSA の acid with hydrogen peroxide. Due to its strong oxidizing properties, バイオフィルム形成能を解析した。 it has been used widely in organic synthesis industries. On the other 【方法】分離株の薬剤感受性試験として Etest を行った。分子疫 hand, the chemically produced performic acid solution exhibits strong 学的解析として MLST と SCCmec typing を行った。耐性因子の acidity and contains substantial amounts of residual formic acid, アミノ酸配列解析を行った。バイオフィルム形成能の解析に当 and thus this disinfectant is yet not often used in the medical field. たっては，クリスタルバイオレット染色法と共焦点反射顕微鏡 Recently, Kawasaki et al. demonstrated facile CO2 fixation process 法を用いた。バイオフィルムの細胞外マトリクス解析の為，各 that yields extremely pure and neutral pH PFA from CO2 and water 種分解酵素を形成されたバイオフィルムに添加した。 by dielectric barrier discharge (DBD). We are now investigating the 【成績】分離株に対するダプトマイシンの MIC は 0.094 μg/ml（治 sporicidal effect of pure PFA produced by DBD plasma with spores 療前）と 1.5 μg/ml（治療後）であった。分子疫学的解析より， of Bacillus subtilis. The evaluation of the bactericidal activity of PFA 同一クローンであることが確認された。治療後の耐性株では， against various pathogens and antibiofilm efficacy is also in progress. ダプトマイシン耐性化に関与する MprF のアミノ酸配列が変異し Here, we will present the results of these analyses of PFA. ていた（S295P）。感受性株に比較して，耐性株におけるバイオフィ ルム形成量は低かった。プロテイナーゼ K 処理によるバイオフィ ルム崩壊の程度に違いは無かった。 【結論】ダプトマイシン耐性化で MRSA のバイオフィルム形成能 が低下した。この耐性化では MprF が変異しており，膜組成が変 化している可能性がある。この変化がバイオフィルム形成に与 える影響を解明することで，バイオフィルム感染症に対する新 たな治療戦略を見出せると期待される。

P2-119 Inhibitory activities of a new 8-methoxy P2-120 辛味成分カプサイシンはヒト株化細胞 HeLa 内 fluoroquinolone against DNA gyrase of Mycobacterium での Chlamydia trachomatis の増殖を抑制する leprae ○山川 和也1，山崎 智拡1,2，松尾 淳司1，大久保 寅彦1，中村 眞二3， 1 1 2 ○山口 智之，中島 千絵，鈴木 定彦（北大・人獣セ・バイオリソース） 山口 博之 （ 北大・保科・病態， 日本学術振興会特別研究員 DC1， 3順天堂大・医・研究基盤センター） ○Tomoyuki Yamaguchi, Chie Nakajima, Yasuhiko Suzuki (Divi. Biores., CZC, Hokkaido Univ.) Capsaicin as biter taste inhibits Chlamydia trachomatis growth in immortal human cell line HeLa Introduction: Emergence of resistance to fluoroquinolone (FQ) is ○Kazuya Yamakawa1, Tomohiro Yamazaki1,2, Junji Matsuo1, Torahiko a huge concern for leprosy treatment because FQs are prescribed Okubo1, Shinji Nakamura3, Hiroyuki Yamaguchi1 (1Faculty Health Sci. as drugs of recommended leprosy regimens. Potency of FQs varies Hokkaido Univ., 2JSPS Research Fellow, 3Div. Biomed. Imag. Res., widely depending on their chemical structures. A newly developed Juntendo Univ. Grad. Sch. Med.) 8-methoxy FQ was reported to possess high potency and is expected to remain effective against mycobacterial strains resistant 偏性細胞内寄生性細菌 Chlamydia trachomatis（Ct）は，感染能 to ofloxacin, a currently used drug in a regular leprosy treatment 力のある基本小体（EB）と増殖能力のある網様体（RB）とのユ regimen. Thus we accessed the inhibitory activity of this drug and ニークな二相性の増殖環を持つ。細胞内での Ct は食胞をリソソー compared with other FQs of high potency by in vitro assays with ムとの融合しない封入体へと変化させ，その中で増殖分化する。 recombinant DNA gyrases of Mycobacterium leprae. これまでの研究で Ct は，細胞への侵入や封入体膜を安定化させ Methods: DNA supercoiling assay and DNA cleavage assay were るために，感染細胞のアクチンを修飾することが知られており conducted with moxifloxacin, sitafloxacin and the newly developed Ct の細胞内での生存の鍵は，Ct による感染宿主細胞のアクチン 8-methoxy FQ. Wild type DNA gyrase and three types of mutants の再構成の可否にあるといっても過言ではない。一方，サルモ with amino acid substitutions of Gly89Cys, Ala91Val, and Asp95Gly ネラやヘリコに抗菌活性を持つ唐辛子の辛味成分カプサイシン in DNA gyrase subunit A were subjected to the assays. が，健康食品として注目を集めている。興味深いことに，カプ Result and Discussion: The results showed high potencies of サイシンには，アクチンの再構成を修飾変化させる機能がある。 sitafloxacin and the new 8-methoxy FQ. The inhibitory effects そこで本研究では，カプサイシンが Ct の細胞内増殖に与える影 of these two drugs were retained even on mutated DNA gyrases 響について検証した。その結果，HeLa 細胞内での Ct（UW-3/ much more effective than moxifloxacin. Because sitafloxacin and CX）の封入体形成能が，カプサイシン（シグマ M2028）の添加 moxifloxacin are thought to be better than ofloxacin, our result 濃度依存的に未添加感染細胞に比べ有意に 100 倍程度抑制され suggested that this new 8-methoxy FQ can be a good candidate, ることを見いだした。100μg/ml 添加濃度で最も強い Ct 発育抑制 which may help the improvement of regular regimens for the leprosy 効果が認められた。また真核細胞に特異的な蛋白合成阻害剤サ treatment. イクロヘキサミド添加によっても，この抑制効果は阻害できな かった。また抑制効果は Ct16SrRNA を標的とした定量 PCR で も確認された。これらの結果から，カプサイシンが Ct の RB か ら EB への分化を制御しているのではなく，Ct の増殖を直接阻 害している可能性が示唆された。MTT 法では，Ct の増殖抑制効 果を示したカプサイシン添加濃度では HeLa 細胞への細胞毒性は 認められなかった。

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P2-121 サルモネラ菌の硫化水素産生能を用いた銅の抗 P2-122 ATP は鉄イオン捕捉作用により抗菌活性を 菌性評価 示す ○翠川 裕1，仲井 正昭1，新家 光雄1（1鈴鹿医療科学大学，2東北大学 ○多田納 豊1,2，金廣 優一2，佐野 千晶2，清水 利朗3，冨岡 治明2,4 金属材料研究所） （1国際医療福祉大・薬・薬，2島根大・医・微生物・免疫， 3安田女子大・ 家政・管理栄養，4安田女子大・看護・看護） Antibacterial evaluation of copper using a hydrogen sulfide-producing ability of Salmonella ATP exhibits antimicrobial activity by its iron-chelating ○Yutaka Midorikawa1, Masaaki Nakai1, Mitsuo Ninomi1 (1Suzuka ability Univ. of Med. Sci., 2IIns. Mater. Res. Tohoku Univ.) ○Yutaka Tatano1,2, Yuichi Kanehiro2, Chiaki Sano2, Toshiaki Shimizu3, Haruaki Tomioka2,4 (1Dept. Pharm. Sci., Int’l Univ. of Health and 【目的】サルモネラの H2S 産生能を用いて新たな抗菌性検査法 Welfare, 2Dept. Microbiol. Immunol., Sch. Med., Shimane Univ., 開発【方法】非チフス性 Salmonella を供試定性試験；抗菌性を 3Dept. Nutr. Sci., Yasuda Women’s Univ., 4Dept. Basic Med. Sci. for 示す銅化合物である塩化第 2 銅 2 水和物（CuCl2・2H2O）1g を Nursing, Yasuda Women’s Univ.) 100 ml の蒸留水に溶解し 1% 溶液とした。一方，抗菌性を示さ ないアルミ化合物である塩化アルミニウム（AlCl3）1g を 100 ml 【目的】ATP は，細胞表面の P2 レセプターを介して多様な生物 の蒸留水に溶解し対照とした。銅とアルミとの抗菌性の差を確 活性を持つことが知られている。我々はこれまでに，ATP は抗 認するため，1% CuCl2 水溶液及び 1% AlCl3 水溶液に 20 mm × 酸菌感染マクロファージ（MΦ）のアポトーシス誘導に連動して 20 mm × 0.2 mm の正方形透明 OHP 片を浸潤，乾燥させた。乾 抗酸菌に対する MΦ の抗菌活性増強作用を示す事を報告してい 燥後菌を全面接種した DHL 培地表面に OHP 片を密着させ嫌気 る（第 87 回日本細菌学会総会）が，今回，ATP の抗酸菌をはじ 状態にし，37°C24 時間培養した。定量試験；銅イオンの抗菌性 めとする細菌に対する直接的な抗菌作用を認めたため，そのメ を定量するため，10 ml の蒸留水に 7g の CuCl2・2H2O を溶解し カニズムについて明らかにすることを目的として検討を行った。 た水容液を原液とし，順次 2 倍希釈水溶液を用意した。菌を全 【方法】液体培地中での Mycobacterium avium complex（MAC）を 面塗布した DHL 培地の中心に，0.6836 mg/mL から 700.0 mg/mL はじめとする種々の細菌に対する ATP（0.5～5 mM）の抗菌効果 までの各濃度まで希釈した CuCl2 水溶液を 25 μl ずつ滴下し，滴 を検討した。ATP のキレート作用に着目し，ATP 含有の培地中 下場所を 50 mm × 50 mm × 0.2 mm の正方形の OHP 片で覆い培 に鉄イオン（Fe 3+）を添加して，ATP の増殖阻害活性に対する 養した。【結果】サルモネラは嫌気条件下では菌の H2S を産生し， 抑制効果を調べた。シデロフォア産生能と ATP 感受性との連関 培地中の鉄源と反応し黒色の FeS を形成した。OHP で覆わなかっ 性を調べるため，肺炎桿菌，および樹立した肺炎桿菌シデロフォ た部分でサルモネラは増殖していたが，FeS は形成されておらず， ア産生能欠損株を用いて，ATP の増殖阻害作用を検討した。 黒色は認められなかった。また，アルミニウム存在下では FeS 【結果・考察】ATP は，種々の抗酸菌株および緑膿菌などの一部 形成による黒色変化を認めたが，銅存在下では，黒色変化を認 の細菌に対して抗菌作用を示した。一般細菌を用いた検討によ めなかった。銅の濃度勾配を付けた条件下でサルモネラを培養 り，ATP はシデロフォア高産生菌に対して増殖阻害作用を示さ すると，銅を滴下した部分を中心に発育阻止円が形成され，そ なかったことや，培養中への Fe 3+ の添加により ATP の増殖阻害 の面積は銅濃度に比例して増加した。本法を現行の Kirby-Bauer 活性が阻害されたことから，ATP による増殖阻害作用は，細菌 法と比較したところ，本法は，現行法に比べて 129 倍も高い感 の鉄イオンの取り込みを阻害することによるものと考えられた。 度の抗菌性を示した。 ATP は細胞内に豊富に存在していることから，マクロファージ 内における菌の増殖阻害にも関与している可能性が示唆された。

P2-123（WS19-7） 新規抗生物質ライソシン E の同 P2-124（WS19-3） 大腸菌の外膜不安定化変異と薬 定と作用メカニズム 剤超感受性化 ○浜本 洋，関水 和久（東京大・薬・微生物） 木幡 光1，栃 木 佐枝子1，草 野 友延1，○児島 征司1,2（1東北大院・生命， 2東北大・学際研） Identification and mechanistic analysis of a novel antibiotic lysocin E Outer membrane destabilized mutants of Escherichia ○Hiroshi Hamamoto, Kazuhisa Sekimizu (Lab. of Microbial., Grad. coli and its drug hypersensitivity Sch. of Pharm. Sci., Univ. of Tokyo) Hikaru Kowata1, Saeko Tochigi1, Tomonobu Kusano1, ○Seiji Kojima1,2 (1Grad. Sch. Life Sciences, Tohoku Univ., 2Frontier Research Institute 従来の試験管内での探索法による抗生物質は，その大部分が体 for Interdisciplinary Sciences, Tohoku Univ.) 内動態や毒性の問題から感染個体に対し治療効果を示さない。 従って，動物実験による治療効果の評価が必須となるが，近年 【背景・目的】2013 年に米国疾病予防管理センターにより報告さ では倫理的，コストの面からの実験動物代替モデルが必要とさ れた多剤耐性菌の多くはグラム陰性細菌が占める。グラム陰性 れてきている。そこで，我々はコストが安く倫理的な問題が無 細菌の多剤耐性は，1）外膜の透過障壁性により薬剤の流入を制 いため，多数の個体を感染実験に供することができるカイコの 限し，かつ 2）多剤排出ポンプが外膜を通過した薬剤を細胞外へ 細菌感染モデルを用いた抗生物質の定量的な治療評価系を確立 排出する二つの機構が主因となる。多剤耐性問題の克服を目指 した。これまでの我々の研究から，カイコ黄色ブドウ球菌感染 す研究では排出ポンプの阻害に重点が置かれているが，一方で モデルにおける抗生物質の治療効果，及び毒性を同時に評価で 外膜の透過障壁性を克服・回避するための方策は十分に検討さ き，哺乳動物と同等な結果が得られることを明らかにしている。 れていない。本研究では大腸菌の外膜安定化因子であるムレイ そこで我々は，カイコ黄色ブドウ球菌感染症モデルを用いて， ンリポ蛋白質（Lpp）と Tol-Pal 複合体に着目し，これら因子の 治療効果を指標に土壌細菌の培養抽出物から抗生物質の探索を 外膜安定化機能と透過障壁性及び薬剤耐性との関連を解明する 実施した。その結果，Lysobacter 属が生産する培養上清から新規 ことを目的とした。 抗生物質ライソシン E を見いだした（Hamamoto et al, Nat Chem 【方法・結果】Lpp および Tol-Pal 欠損株に対する薬剤の最小生育 Biol, 2015）。ライソシン E は，新規構造を有する環状リポペプチ 阻害濃度を測定した結果，Tol-Pal 欠損株でのみ多様な薬剤に著 ド系抗生物質であり，多剤耐性の黄色ブドウ球菌を含む，グラ しく高い感受性を示し，その感受性は多剤排出ポンプ AcrAB- ム陽性細菌の一部に対し抗菌活性を示した。さらに，マウス黄 TolC の欠損株とほぼ同等であることがわかった。外膜透過障壁 色ブドウ球菌感染モデルにおいてバンコマイシンと比較して優 性を penicillin G の外膜透過速度を指標に評価したところ，Tol- れた治療効果を示し，毒性も低かった。その作用機序は，細菌 Pal 欠損株で透過障壁性の著しい低下が見られ，Tol-Pal 欠損に伴 の細胞膜上に存在するメナキノンを標的として膜破壊性を示し， う薬剤超感受性化が外膜透過障壁性の低下に起因することが裏 極短時間で強力な殺菌活性を有していた。さらに，ライソシン 付けられた。また，1）透過障壁性の低下は対数増殖期の細胞に E は宿主因子によって抗菌活性が促進されることを見いだした。 限られること，2）分裂中の細胞の隔壁部でのみ外膜構造の異常 これらの結果は，カイコ細菌感染モデルを用いた治療効果を指 が観察されたことから，Tol-Pal 複合体は細胞分裂時の外膜安定 標とした探索によって，治療効果に優れた新規治療メカニズム 性維持に寄与すると推察した。本研究により Tol-Pal 複合体に特 を有する抗生物質を発見できることを示している。 異的な外膜安定化機能が明らかになると共に，グラム陰性細菌 の薬剤耐性克服を目指す研究において，Tol-Pal 複合体が多剤排 出ポンプと同等に有力な研究標的に成り得ることが示された。

141 P2-125 Prevalence and characteristics of colistin- P2-126（WS19-2） 多剤耐性緑膿菌における resistant Klebsiella pneumoniae isolated in Japan mexXY 発現調節因子の同定 ○島 綾香，鈴木 里和，松井 真理，鈴木 仁人，柴山 恵吾（感染研・ ○田川 芽衣1，小川 和加野2，土屋 友房3，黒田 照夫1（1岡山大院・医 細菌第二） 歯薬・微生物，2第一薬大，3立命館大・薬）

○Ayaka Shima, Satowa Suzuki, Mari Matsui, Masato Suzuki, Keigo Identification of a mutation involved in mexXY Shibayama (Dept. Bacteriol. II, NIID,) overexpression in multidrug resistant P. aeruginosa ○Mei Tagawa1, Wakano Ogawa2, Tomofusa Tsuchiya3, Teruo Kuroda1 Colistin became the last-resort treatment option for infections (1Grad. Sci. Med. Dent. Pharm., Okayama Univ., 2Daiichi Univ. of caused by multidrug-resistant (MDR) bacteria. The most important Pharm., 3Col. Pharm. Sci., Ritsumeikan Univ.) mechanism of colistin resistance is the modification of LPS which is regulated by PmrA/PmrB two-component system (TCS). The 【目的】近年臨床現場において多剤耐性緑膿菌（MDRP）の出 inactivation of mgrB which negatively regulates the TCS is often 現・拡大が問題となっている。MDRP による感染症は治療が難 found in colistin-resistant Klebsiella pneumoniae. We analyzed the 渋化するため，抗菌薬の適正使用など MDRP の出現を抑える対 characteristics of colistin resistance in MDR-K. pneumoniae collected 策が必要である。そのため，本研究では人為的に MDRP を分離 from the hospitals in Japan. Two (5.7%) isolates out of 35 MDR-K. し，治療に用いる抗菌薬とその結果生じる耐性機構の関係性に pneumoniae showed higher MIC than the EUCAST break point (>2 ついて検討した。【方法】緑膿菌 PAO1 株に，imipenem（IPM）， ug/mL) by agar dilution method. PCR amplicon of mgrB was obtained gentamicin（GM）， ciprofloxacin（CPFX）を順次作用させ，各段 from only one isolate and sequencing analysis revealed the 13 bp 階で耐性変異株を分離した。多剤排出ポンプの発現を RT-PCR deletion in mgrB. NGS analysis was attempted for another isolate 法，OprD の発現は western blotting 法により確認した。次世代 which PCR amplicon was not obtained and it found 5 kb deletion シーケンサーを用いた全ゲノム解析により遺伝子変異部位を同 containing mgrB. Both of these isolates were from patients without 定した。変異の確認された遺伝子の cloning を行い，薬剤耐性と international travel history. In Japan, the approval of colistin revoked の因果関係を調べた。【結果と考察】PAO1 株に 3 系統の抗菌薬 in 1997 and these isolates were obtained from domestic patients を順次作用させると，3 段階目に初めて MDRP が生じた。各耐 before the re-approval of it in 2015. It was shown that laboratory 性変異株の耐性機構を解析した結果，IPM 耐性株では外膜ポー confirmed clinical isolates of colistin-resistant K. pneumoniae existed リン OprD の減少が，GM 耐性変異株では多剤排出ポンプ mexXY in Japan even colistin was almost not on clinical use for more than a の発現上昇が確認された。CPFX 耐性変異株では多剤排出ポンプ decade. This study shows the importance of adequate assessment of mexCD の発現上昇した株と，DNA gyrase に変異の生じた株が存 colistin susceptibility even in countries with limited clinical use of it. 在した。また，mexXY と mexCD を同時に発現上昇した株では， 顕著な生育遅延が観察された。全ゲノム解析により，mexCD の 発現上昇株ではリプレッサーである NfxB の変異が確認され，一 部の mexXY 発現上昇株ではリボソームタンパク質 L1 をコード する rplA に変異が確認された。rplA に変異の認められた GM 耐 性株に野生型の rplA を相補すると，GM 耐性が低下し生育速度 も回復したことから，rplA の変異と mexXY の発現上昇，細菌の 生育速度には関係性があると考えられる。 【非会員共同研究者】藤岡孝浩，保田菜美

P2-127 機能する AcrB-AcrA 融合蛋白質による P2-128 抗酸菌の PAS 耐性機序の解明 : BCG thyX 欠 AcrAB-TolC システムの結合量比決定 損株および過剰発現株の作製 ○林 克彦1,2,3，中島 良介2，櫻井 啓介2，北川 公惠2，山崎 聖司1,2，西 ○有村 友紀1，中山 真彰1，妹尾 昌紀1，田川 淳平1，阿戸 学2，中島 野 邦彦1,2，山口 明人2（1阪大院薬・細胞生物学，2阪大・産業科学研 千絵3，鈴木 定彦3，中山 浩次4，小林 和夫5，大原 直也1（1岡 山 大・院・ 究所，3学振特別研究員 DC1） 医歯薬・口腔微生物，2国立感染研・免疫，3北海道大・人獣共通感染 症セ・バイオリソース，4長崎大・院・医歯薬・口腔病原微生物，5堺 The Stoichiometry Determination of the AcrAB-TolC 市衛生研） system with AcrB-AcrA Fusion Proteins ○Katsuhiko Hayashi1,2,3, Ryosuke Nakashima2, Keisuke Sakurai2, Novel mechanisms of PAS resistance in Mycobacterium 1 1 1 1 Kimie Kitagawa2, Seiji Yamasaki1,2, Kunihiko Nishino1,2, Akihito ○Yuki Arimura , Masaaki Nakayama , Masaki Seno , Junpei Tagawa , 2 3 3 4 Yamaguchi2 (1Lab. of Cell Biol., Grad. Sch. of Phram. Sci., Osaka Manabu Ato , Chie Nakajima , Yasuhiko Suzuki , Koji Nakayama , 5 1 1 Univ., 2ISIR, Osaka Univ., 3JSPS Research fellowship DC1) Kazuo Kobayashi , Naoya Ohara ( Dept. Oral Microbiol., Okayama Univ. Grad. Sch. Med. Dent. Pharm. Sci., 2Dept. Immunol., Natl. Inst. The AcrAB-TolC system in Escherichia coli resists anti- or xeno- Infect. Dis., 3Div. Biores., Hokkaido Univ. Res. Ct. Zoon. Cont., 4Dept. biotics by efflux. The homologues, RND transport systems, are Microbiol. Oral Infect., Nagasaki Univ. Grad. Sch. Biomed. Sci., one of the important factors of the multi-drug resistance in Gram- 5Sakai City Inst. Pub. Health) negative bacteria. AcrB and TolC have plectonemic trimer respectively, but the number 【目的】パラアミノサリチル酸（PAS）は prodrug としてパラアミノ安息 of AcrA molecules in this complex is under debate; 3 or 6 molecules. 香酸（PABA）の代わりに葉酸代謝系に取り込まれ，その代謝産物が静菌 作用を示す。結核菌の 耐性機構として最近になり の Disulfide cross-linking suggested a 1:1:1 stoichiometry, on the other PAS thyA, folC, ribD 変異が関与することが示されたが，その耐性機序には未だ不明な点が多 hand cryo-electron microscopy showed a 1:2:1. い。本研究では ThyA 酵素と同じくチミジル酸合成活性を示す ThyX 酵素 To reveal the minimal stoichiometry for function, we constructed が PAS 耐性に関与する可能性を考え，thyX の変異株を作製し，その性状 1:1-fixed AcrB-AcrA fusion proteins. We expressed fusion proteins を解析した。【方法】1）BCG Tokyo 株を親株に，thyX 欠損株（ΔthyX）， in the acrB-, acrAB- or acrABacrEF-deficient E. coli BL21 strains. thyA 欠損株（ΔthyA），thyX 過剰発現株（thyX＋ ），thyA 過剰発現株（thyA＋ ）， Western blotting revealed the expression of fusion proteins in thyA と thyX の過剰発現株（thyAX＋）を作製した。2）これらを PAS 含 full length and the existence of free AcrA molecules only in acrB- 有 7H10-ADC 寒天培地で培養し，PAS 感受性を検討した。3）さらに定 deficient cells. Because of the improved minimum inhibitory 量 RT-PCR により thyA と thyX の発現量を調べた。【結果・考察】ΔthyA 株 concentration values and of the ethidium bromide (EB) rejection in 同様に thyX＋株も 200 μg/mL 濃度の PAS に耐性を示した。PAS 感受性 EB efflux assay, all of the fusion proteins functioned by themselves. の BCG Tokyo 株では thyA の発現が高く thyX の発現量はその 10% 程度に In addition, when we checked the expression-activities relationship, とどまっていた。これに対して ΔthyA 株と thyX＋株では thyX の発現量 we found that AcrB-AcrA fusion proteins seemed to ignore the free が高くなっており，ΔthyA 株においても thyX の発現量は BCG Tokyo 株 AcrA molecules in acrB-deficient cells, which highly indicated not における発現量よりも高かった。しかし thyX と thyA の両者を同時に過 only the 1:1:1 stoichiometry but also an AcrA binding position at the 剰発現させた thyAX＋株は PAS 感受性を示した。以上のことから thyX の interprotomer on an AcrB trimer. 発現量が thyA の発現量に比して上昇することが PAS 耐性につながること が示唆された。葉酸代謝において ThyA 酵素は 5,10-methylene-THF から dihydrofolate（DHF）を産生するが，ThyX 酵素は Tetrahydrofolate（THF） を産生する。すなわち，5,10-methylene-THF から DHF では無く THF に 循環させることが PAS 耐性機序に寄与していると考えられた。

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P2-129 緑膿菌の一過的な耐性株の出現機構についての P2-130 サルモネラ多剤排出システム AcrAB-TolC の 解析 発現制御因子による胆汁酸認識機構 ○市瀬 裕樹1，上手 麻希1，北島 圭1，白井 昭博1，中江 太治2，間世 山崎 優1，中島 良介1，櫻井 啓介1，Sylvie Baucheron2，Etienne 田 英明1（1徳島大院・STS，2北里大・抗感薬研究センター） Giraud2，Benoit Doublet2，Axel Cloeckaert2，○西野 邦彦1（1大阪大・ 産研，2フランス国農研） Analysis of the transient resistant cells in Pseudomonas aeruginosa Bile recognition by the regulator of the AcrAB-TolC ○Yu-ki Ichise1, Maki Uwate1, Kei Kitajima1, Akihiro Shirai1, Taiji multidrug efflux system in Salmonella Nakae2, Hideaki Maseda1 (1Dept. Biol. Sci. & Tech., Inst. Tech. & Sci., Suguru Yamasaki1, Ryosuke Nakashima1, Keisuke Sakurai1, Sylvie Tokushima Univ. Grad. Sch., 2Lab. Antimicrobial Agents, Kitasato Baucheron2, Etienne Giraud2, Benoit Doublet2, Axel Cloeckaert2, Univ.) ○Kunihiko Nishino1 (1ISIR, Osaka Univ., 2INRA)

クローナルな細胞集団に致死量の抗生物質を晒しても，ほとんど サルモネラ多剤排出システム AcrAB-TolC は，胆汁耐性に必須の の細胞は死滅するなか，生き残る細胞が存在する。この様な細 因子であり，主に RamR/RamA により制御されている。acrAB と 胞は，抗生物質が除かれると再び元の細胞集団を形成するため， tolC 遺伝子の転写活性は，RamA によって促進され，ramA 遺伝 遺伝的な変異なしに一過的に耐性を獲得した細胞であると考え 子の発現は RamR によって抑制されている。ベルベリン，クリ られている。また，同細胞は，一過的な耐性を示すため，慢性 スタルバイオレット，デカリニウム，臭化エチジウム，ローダ 感染症を引き起こす原因の一つとして報告されており，その制 ミン 6G といった複数の抗菌性化合物が RamR によって認識され 御が求められている。しかし，この様な細胞の出現機構につい ることを，これまでに明らかにした。これら化合物が RamR に ては未だ不明な点が多く，意外にも，この様な細胞で本当に変 結合することにより，抑制が解除され，ramA の転写活性が上昇 異が存在していないことも確認されていない。そこで，本演題 し，その結果，AcrAB-TolC の発現誘導が起こる。しかし，これ では，緑膿菌由来の一過的耐性株を用いて変異解析，および出 ら化合物は，腸内をはじめとするサルモネラの生育環境には通 現機構の解析を行ったので報告する。我々は，既に，抗生物質 常存在していないと考えられる。 による選択により，緑膿菌野生株から，野生株では発現してい AcrAB-TolC は，抗菌薬排出に加え，胆汁酸排出による胆汁酸抵 ない耐性因子 MexEF-OprN 排出ポンプが一過的に発現している 抗性に関係していることから，acrAB と tolC 遺伝子の胆汁酸に 耐性株（3DR 株）を分離する系を確立している。また，3DR 株 応答した発現制御機構を解明することは重要である。私達は， では，mexEF-oprN の負の制御遺伝子 mexS に変異がないことを 以前に，胆汁酸が RamA を介して，AcrAB の発現を誘導するこ 確認している。まず，この 3DR 株の全塩基配列の決定を行った。 とを報告した。また，最近になり，胆汁酸が RamR による ramA その結果，予想通り，野生株のゲノム配列と 100% 同一であった。 の転写抑制を解除することにより，acrAB-tolC の遺伝子発現を誘 このことから，一過的な耐性株である 3DR 株では，ゲノムの変 導する新たな機構を発見した。今回，RamR が胆汁酸を直接認識 異なしに耐性を獲得しているということが初めて明確になった。 して，AcrAB-TolC の発現誘導に関係しているという仮定のもと 次に，3DR 株が如何にして MexEF-OprN を発現しているのか検 に，RamR と各胆汁構成成分との相互作用について，生化学的な 討するために，mexS の発現量を測定した。その結果，3DR 株では， らびに構造学的解析を行ったので，ここに報告する。得られた 野生株に比べて mexS の発現量が著しく減少していることが明ら 研究成果は，複数種の腸内細菌に保存されている RamR による かとなったことから，mexS 遺伝子の発現の“ゆらぎ”によって 胆汁酸認識機構の知見を深めるものであると考えられる。 MexEF-OprN の発現が誘導されたということが示唆された。現 在，mexS の発現を減少させる因子の探索を進めている。

P2-131 新規化合物が耐性菌やバイオフィルムに及ぼす P2-132 Analysis of the clinical enterococcal 影響 isolates with low-level VanB-type vancomycin resistance ○天羽 崇1，村上 圭史1，狩山 玲子2,3，弘田 克彦1，三宅 洋一郎1（1徳 ○橋本 佑輔，野村 隆浩，久留島 潤，富田 治芳（群馬大・院医・細 島大院・医歯薬・口腔微生物，2岡山学院大・人間生活・食物栄養， 菌学） 3岡山大院・医歯薬・泌尿器病態学） ○Yusuke Hashimoto, Takahiro Nomura, Jun Kurushima, Haruyoshi The effect of a new compound on resistant bacteria and Tomita (Dept. Bacteriol., Grad. Sch. Med., Gunma Univ.) biofilm cells 腸球菌（ ）は腸管の常在菌叢の一部を形成するグラ ○Takashi Amoh1, Keiji Murakami1, Reiko Kariyama2,3, Katsuhiko Enterococci ム陽性球菌であり，臨床では主に胆道感染症，尿路感染症な Hirota1, Yoichiro Miyake1 (1Dept. Oral Microbiol., Institute Biomed. どの起炎菌となる。臨床分離される主な腸球菌は Sci., Tokushima Univ. Grad. Sch., 2Dept. Food and Nutr, Okayama Enterococcus と である。本菌は日和見感染菌であるが，医 Gakuin Univ., 3Dept. Urol., Grad. Sch. of Med. Dent. and Pharm. Sci., faecalis E. faecium 療の高度化に伴う易感染性患者の増加により院内感染症の主要 Okayama Univ.) な起因菌として問題となっている。また腸球菌の持つ各種遺伝 我々はこれまでに，緑膿菌クオラムセンシング機構のシグナル 子伝達機構により耐性遺伝子の効率的な伝播と拡散が生じ，急 分子の新規類似化合物が，ビアペネム（BIPM）と併用すること 速な薬剤耐性化とバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）を含む多 により BIPM の殺菌効果を増強すること，またこの併用効果は 剤耐性腸球菌の増加に繋がっている。VRE のバンコマイシン カルバペネムに耐性を示す OprD 変異株においても確認されたこ （VCM）耐性には，現在までに 9 個の耐性型が報告されている とを報告した。本研究では，他の耐性菌への併用効果ならびに （VanA, VanB, VanC, VanD, VanE, VanG, VanL, VanM, VanN）。臨床 バイオフィルム形成菌に対する効果について検討した。菌株は， 上問題にされるのは，多くが高度耐性を示し，かつ分離頻度の 排出ポンプ MexE が過剰発現した nfxC-type mutant である臨床 高い VanA または VanB 型 VRE である。VanB 型耐性遺伝子群は， 分離株 TUH81 株と，gylA 遺伝子に変異が認められ，レボフロキ 二成分制御系調節遺伝子 vanRB, vanSB と，オペロンを形成する サシン（LVFX）に耐性を示す臨床分離株 TUH44 株を使用した。 耐性関連遺伝子 vanHB, vanB, vanXB, vanYB, vanW で構成される。 殺菌試験では，これらの菌株を対数増殖期まで培養後，BIPM も 一般に VanB 型 VRE は VCM に対しては耐性を，テイコプラニ しくは LVFX と新規化合物を同時に作用させ，各時間の CFU を ンに対しては感受性を示し，また他の型と比較して，VCM の 測定し生存率を算出した。バイオフィルム形成菌については， 最少発育阻止濃度（MIC）値に幅があることが報告されている。 野生株 PAO1 株を用い，ペグバイオフィルムシステムにて行っ CLSI の判定基準では VCM の MIC 値≧ 32 μg/ml を耐性とする一 た。前培養した菌を，2 枚の 96 ウェルプレートに植えつぎペグ 方，国内の感染症法で全数報告対象として届出義務がある VRE の表面にバイオフィルムを形成させた。その後，生理食塩水のみ， は MIC 値≧ 16 μg/ml と設定されている。このため VanB 型耐性 もしくは新規化合物を含んだ生理食塩水の入ったプレートにペ 遺伝子を保持しながら，MIC 値＜ 16 μg/ml を示す VCM 低度耐 グを挿入し 1 時間作用させた。次いで，BIPM を含んだ培地へペ 性株は届出対象とならず，この VCM 耐性遺伝子群の伝播・拡散 グを挿入し，24 時間作用させた。翌日ソニケーションにてバイ のリスクに繋がっていると考えられる。現在，VCM の MIC 値＜ オフィルムを剥離し，寒天培地上で生菌数を測定した。殺菌試 16 μg/ml と低度耐性を示した複数の臨床分離 VanB 型 VRE 株に 験では，TUH81 株及び TUH44 株いずれにおいても，化合物を ついて解析を行っており報告する。 併用することにより生存率が減少していた。また，バイオフィ ルム形成菌においても，化合物を作用させることにより生存率 が減少していた。今後はこの併用効果のメカニズムについて検 討していく予定である。

143 P2-133 リアレンジメントによる新たな遺伝子発現調節 P2-134（WS19-5） 難治性 MRSA 感染症の再燃に 機構 寄与する slow-VISA のバンコマイシン耐性化機構について ○上手 麻希1，市瀬 裕樹1，北島 圭1，中江 太治2，間世田 英明1（1徳 ○片山 由紀1，相羽 由詞2，関根 美和1，松尾 美記1，菱沼 知美1，平 島大院・STS，2北里大・抗感薬研究センター） 松 啓一2（1順天堂大学・医・微生物学講座，2順天堂大学大学院・感 染制御科学） Novel gene regulation system mediated by rearrangement Mechanism of Resistance to Vancomycin in ‘slow-VISA ○Maki Uwate1, Yu-ki Ichise1, Kei Kitajima1, Taiji Nakae2, Hideaki Responsible for a Recurrent MRSA Infection Maseda1 (1Dept. Biol. Sci. & Tech., Inst. Tech. & Sci., Tokushima Univ. ○Yuki Katayama1, Yoshifumi Aiba2, Miwa Sekine1, Miki Matsuo1, Grad. Sch., 2Lab. Antimicrobial Agents, Kitasato Univ.) Tomomi Hishinuma1, Keiichi Hiramatsu2 (1Dept. Microbiology, Fac. Medicine, Juntendo Univ., 2Dept. Infection Control Science, Grad. 緑膿菌は，外膜の透過障壁性と RND 型薬剤排出ポンプの高発 Sch. Medicine, Juntendo Univ.) 現により構造的にも機能的にも異なる様々な薬剤に耐性を示す。 緑膿菌の染色体上には，RND 型薬剤排出ポンプ遺伝子が 12 個 The Vancomycin (VCM)-intermediate Staphylococcus aureus (VISA) も存在しているが，大半が野生株では発現していないため，そ strains generally grow slowly, and form colonies on VCM-containing れらの機能は未だ明確ではない。その中の一つ MexEF-OprN の agar-plates after 48 hours of incubation in population analysis. 発現は，MexT により正に制御されており，本ポンプの高発現に However, we have found a curious group of VISA strains whose より，キノロン系薬剤やクロラムフェニコール等に耐性を示す。 colonies appear only after 72 h incubation. We designated them ‘slow- mexT 遺伝子は通常野生株では存在しておらず，特異的なゲノム VISA’ (sVISA) (M. Saito, Y. Katayama, et. al., AAC 2014 [1]). As のリアレンジメントを介して出現してくる。このことは，本ポ compared to extant VISA strains, sVISA strains had 1) significantly ンプの発現制御が，未だ明らかとなっていない新たな遺伝子発 prolonged doubling-times, 2) increasing resistance to VCM after 72 現制御機構であることを示している。そこで本演題では，本現 h, 3) unstable phenotypic expression, 4) RNA polymerase subunit 象の保存性，配列・構造特異性等について解析を加えたので報 gene mutations are frequently detected. In this study, to characterize 告する。 sVISA, we established 26 (26/34[76.5%]) sVISA strains by selecting まず緑膿菌ゲノムの mexT 遺伝子出現領域の下流に，開始コド hVISA Mu3 with VCM 6mg/L. We found mutations in the gene(s) ンを除いたクロラムフェニコール耐性（Cmr）遺伝子を融合さ involved in various metabolic pathways such as purine/pyrimidine せ，リアレンジメントが生じた時のみ，Cmr を示すような TdCm synthesis, PRPP (5P-D-ribosyl-1pyrophosphate) synthesis (prs), カセットを構築した。本カセットを各々の生物で複製可能なベ and in Embden-Meyerhof (EM) pathway. These mutations seemed クターに挿入し，検討したところ，大腸菌，セラチア等でも高 to change the flow of metabolites in the cell and promote cell-wall 頻度で Cmr 株が出現したことから，本現象が他の生物にも保存 peptidoglycan synthesis by concentrating energy and metabolites されたシステムであることが明らかとなった。次にリアレンジ into the pathway. There were 24 sVISA-converted strains, in which メントが生じる領域のみを Cmr 遺伝子の開始コドンの下流に挿 the most frequent SNPs were on the transcription machinery, i.e, 入し，上記同様，リアレンジメントが生じた時のみ Cmr を示す in rpoB or rpoC genes. The sVISA spontaneously returns to hVISA ようなアッセイカセットを構築した。さらに配列の異なる同構 when the threat of VCM is lifted. Furthermore we investigate the 造の DNA 断片を挿入したベクターを作製し，検討したところ， metabolomic analysis in sVISA. Cmr 株が高頻度で出現したことから，本現象が配列依存的では なく，構造依存的である可能性が示唆された。

P2-135 Analysis of the POT644-41 genotype of P2-136 Bacteroides fragilis の新規メロペネム中等度 multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa 耐性因子の同定 ○中田 裕二，牧 美南世（藍野大・医療保健・微生物） ○後藤 隆次1，森田 雄二2，林 将大1，田中 香お里1（1岐阜大・生命セ・ 嫌気性菌，2愛知学院大・薬・微生物） ○Yuji Nakada, Minase Maki (Fac. Nurs. Reha., Aino Univ.) Identification of novel meropenem-intermediate Multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa (MDRP) strains that resistance factor from Bacteroidesa fragilis carry the metallo-β-lactamase (MBL) gene are becoming a major ○Takatsugu Goto1, Yuji Morita2, Masahiro Hayashi1, Kaori Tanaka1 problem in medical facilities as a causative agent of nosocomial (1Div. Anaerobe Res., Life Sci. Res. Ctr., Gifu Univ., 2Dept. Microbiol., infection. We had previously isolated POT644-41 genotype of Sch. Pharm., Aichi Gakuin Univ.) MDRPs from a hospital in the Osaka Prefecture, which could not be detected using generic PCR primers for detection of IMP-type MBL. 腸管常在の嫌気性菌 Bacteroides fragilis のカルバペネム耐性は， In this study, we tried to isolate the MBL gene of this strain and 化学療法で時に深刻な問題を引き起こす。本研究では，メロペ analyze the surrounding gene structure. ネム中等度耐性（MIC, 16 μg/ml）を呈した B. fragilis GAI92214 We used the AUH-66 strain, belonging to the POT644-41 genotype of 株のゲノムライブラリーを用いて，新規中等度耐性因子の同定 MDRPs, for genetic analysis. The digested genomic DNA fragments を試みた。本株ゲノムを物理的に切断後，約 3～5 kb の DNA 分 of AUH-66 were inserted into the pNIT6011 to create a genomic 画を精製・平滑化し，高コピーの pHSG398 ベクターへ挿入した。 library. To identify the clone harboring the plasmid containing 得られた 92 万種の組換えプラスミド混合物（目的分画の挿入率， the MBL gene, the genomic library was screened by growing the 約 82%）の一部を，多剤高度感受性大腸菌宿主 KAM3 ΔtolC 株 transformants in the CAZ medium. The sequencing results showed （メロペネム MIC, 0.04 μg/ml）へ導入し，耐性クローンの選出を that the AUH-66 strain possessed an IMP-7 type MBL, which cannot 行った。結果，約 4 万個のクローンから 1 個のメロペネム耐性 be detected using the generic PCR primers often used for detection クローン（宿主 MIC より僅かに耐性を示す）を得た。本耐性プ of IMP-type MBL. Analysis of the surrounding gene structure ラスミド（pHS1271 と命名）挿入断片の塩基配列を決定した結 revealed that although the integron structure of this gene was 果，ベクターのクローニングサイト末端部に，major facilitator similar to that of the IMP-7-containing strain detected in Europe, superfamily（MFS）transporter の配列が N 末 1/3 欠落した状態 the gene from AUH-66 had a characteristic structure with three で挿入されていた（ベクタープロモーターとは逆向き）。配列の allied aminoglycoside resistance genes. We will continue to study 欠落が，先の耐性度の低さに影響している可能性があるため，染 the significance of the presence of three aminoglycoside resistance 色体を鋳型にした直接シークエンス等により，MFS transporter genes. 全長およびその上下流配列を決定した。本 transporter 配列は 12 個の膜貫通領域を有し，既知の B. fragilis 株（ゲノム配列公開 株）の MFS transporter 配列と 99% 一致した。現在，transporter 全長およびその上下流領域を pHSG398 へ挿入し，発現した本 transporter のメロペネム耐性への貢献度を調べている。

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P2-137 黄色ブドウ球菌の β ラクタム薬高度耐性化に P2-138 Predominant role of msr(D) over mef(A) in 関与する新規遺伝子の同定 macrolide-resistance in Streptococcus pyogenes ○松尾 美記1，平松 啓一2（1順天堂大・医・微生物，2順天堂大・院・ 張 顔1，立野 一郎1，松本 昌門2，井坂 雅徳1，○長谷川 忠男1（1名市 感染制御センター） 大院・医・細菌，2愛知衛研・生物・細菌）

Identification of a novel gene involved in high-level beta- Yan Zhang1, Ichiro Tatsuno1, Masakado Matsumoto2, Masanori Isaka1, 1 1 lactam resistance in S. aureus ○Tadao Hasegawa ( Dept. Bacteriol., Nagoya City Univ. Grad. Sch. 2 ○Miki Matsuo1, Keiichi Hiramatsu2 (1Dept. Microbiol., Sch. Med., Med. Sci., Dept. Microbiol and Med. Zool., Aichi Pref. Inst. Pub. Juntendo Univ., 2Center for Infection Control Science, Grad. Sch. of Health) Med., Juntendo Univ.) mef(A) positive macrolide-resistant emm1 S. pyogenes strains are 私達はバンコマイシン中間耐性黄色ブドウ球菌（VISA）を世界 thought to possibly contribute to the increase of streptococcal で初めて臨床分離し，その耐性メカニズムの解明を行ってきた。 toxic shock syndrome. The role of mef(A) in macrolide-resistance ごく最近，新たな VISA の表現型 slow VISA（sVISA）を見出し， has not been completely investigated in S. pyogenes. Therefore sVISA の有する性質こそが難治性 MRSA 感染症の原因の本質な we established the mef(A) knockout strain using an emm1 type のではないかとの考えのもと，その耐性機構の解析を行ってい strain, and tested its susceptibility to macrolide. We found that the る。sVISA は増殖が大変遅く，容易に増殖速度が回復した変異株 antimicrobial susceptibilities were almost identical as those of the が分離される。本総会では，sVISA 株から分離した増殖が復帰し parental strain. Hence, we established a knockout strain for another た株の中に，β ラクタム薬の耐性度が大きく低下した株（L4）を gene, msr(D), that is located immediately downstream of mef(A). The 見出し，その原因因子を同定した結果について報告する。 macrolide resistances of the resulting strain significantly decreased, まず L4 株の全ゲノム解析を行い，二つの変異を同定した。 and were further altered when both mef(A) and msr(D) were knocked 一つは緊縮応答遺伝子 relQ，もう一つは機能未知の遺伝子 out. The introduction of the msr(D) gene into a macrolide sensitive SAHV_1047 であった。次に，どちらの変異が β ラクタム高度耐 strain conferred more resistance than the introduction of the mef(A) 性に寄与するか検討した。マルチコピープラスミドに各野生型 gene. The erythromycin susceptibilities of knockout strains were 遺伝子をつなぎ，L4 に導入後，β ラクタム薬に対する耐性度を further dissected using two additional emm4 and emm75 type 調べた。その結果，ベクター導入株では耐性は低下したまま（OX strains. We found almost identical results for both strains except for MIC=1.5mg/L）であったが，SAHV_1047 導入株では親株である the mef(A)-knockout emm4 type, whose susceptibility was altered, sVISA と同じ MIC>256mg/L まで耐性度が回復したため，この遺 although the change was lesser than that for the msr(D)-knockout. 伝子変異が β ラクタム耐性低下の要因であると判定した。驚い These results suggest that both mef(A) and msr(D) are involved in たことに，relQ 導入株でも，48 時間まで培養すると >256mg/L macrolide resistance in S. pyogenes, and that the msr(D) gene plays a の MIC を示したため，relQ がマルチコピーサプレッサーとして more predominant role in macrolide resistance than mef(A). 機能すると考えられた。このことから新規遺伝子 SAHV_1047 は 緊縮応答関連遺伝子と推定され，現在，この遺伝子の機能につ いてさらに詳細に解析中である。

P2-139 インドの環境由来 β- ラクタム系抗生物質耐性 P2-140 国内の市販鶏肉における ESBL 産生大腸菌の 大腸菌における耐性遺伝子の分布 分布状況と保有するプラスミドの諸性状について ○秋庭 正人1,2，関塚 剛史3，山下 明史3，黒田 誠3，李 謙一4，岩田 剛 ○山本 詩織1,2，朝倉 宏1，岡田 由美子1，吉田 麻利江1，五十君 靜信1 敏1，楠本 正博1，Keerthi Guruge5（1動衛研・細菌寄生虫，2大阪府大 （1国衛研・食品衛生管理，2日本食品衛生学会） 院・生命環境，3感染研・ゲノム，4感染研・細菌1，5動衛研・病態） Prevalence and harboring plasmid of ESBL producing Analysis of beta-lactam antibiotic-resistant Escherichia Escherichia coli from chicken in Japan coli isolated from the environment in India ○Shiori Yamamoto1,2, Hiroshi Asakura1, Yumiko Okada1, Marie ○Masato Akiba1,2, Tsuyoshi Sekizuka3, Akifumi Yamashita3, Makoto Yoshida1, Shizunobu Igimi1 (1Div. Biomed. Food Res., Nat. Inst. Kuroda3, Ken-ichi Lee4, Taketoshi Iwata1, Masahiro Kusumoto1, Health Sci., 2Jpn. Soc. Food Hyg. Saf.) Keerthi Guruge5 (1Bacterial Parasitic Dis. Res. Div., Natl. Inst. Anim. Health, 2Grad. School Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 3Pathogen 基質特異性拡張型 β ラクタマーゼ（ESBL）産生菌は，第三世代 Genomics Ctr., Natl. Inst. Infect. Dis., 4Dept. Bacteriol. 1, Natl. Inst. セフェム系抗菌薬を分解する代表的な院内感染症起因菌の一つ Infect. Dis., 5Pathol. Pathophysiol. Res. Div., Natl. Inst. Anim. Health) である。ESBL 産生菌は鶏及び鶏肉から多く分離され，食品を 介してヒトへ伝播すると考えられてきた。しかし，ESBL 産生 【目的】インドでは第 3 世代セファロスポリン系抗生物質（3GC）やカル 菌の遺伝学的解析が進むにつれ，菌株自体の直接伝播ではなく， バペネム系抗生物質（CAR）に耐性を示す腸内細菌科細菌が環境から広く ESBL 産生遺伝子を含むプラスミドがヒト腸内細菌へ伝播するこ 分離される。本研究ではこれらの細菌における耐性遺伝子の分布を明らか とで ESBL 産生菌の拡散に寄与している可能性が高いことが明 にすることを目的とした。【方法】インド国内 5 州の河川及び汚水処理場 らかにされつつある。本研究では，国産・輸入市販鶏肉におけ の水から大腸菌をランダムに分離し，ディスク法による薬剤感受性試験に る ESBL 産生大腸菌の汚染実態を調査すると共に，分離菌株が 供した。3GC または CAR に耐性を示す株が保有する β- ラクタマーゼの遺 保有するプラスミドの諸性状について検討を行ったので，報告 伝子型を PCR 産物の塩基配列解析により決定した。一部の株についてプ する。国内で市販される鶏肉 50 検体を供試検体とし，ESBL 産 ラスミドの全塩基配列を決定し，レジストーム解析を実施するとともに， 生大腸菌を検出分離した。分離菌株は薬剤感受性試験，耐性遺 ネットワーク解析により，各プラスミドの遺伝的関連を調べた。【成績】 伝子型別，PFGE 法による遺伝子型別及びプラスミドレプリコン 水検体から 446 株の大腸菌を分離した。薬剤感受性試験の結果，3GC ま 型の同定等に供した。市販鶏肉 50 検体における ESBL 産生大腸 たは CAR に耐性を示した 169 株を以降の解析に供した。169 株中 98 株が 菌の陽性率は，全体で 76.0%（陽性検体数 =38）であり，国産・ 8 剤以上に耐性であった。blaCTX 遺伝子は 112 株から検出された（blaCTX-M-15， 輸入鶏肉の別ではほぼ同等の陽性率を示した。ESBL 産生大腸菌 108 株；blaCTX-M-55，4 株 ）。 CAR 耐性の 21 株中 14 株で blaNDM 遺伝子が検 は計 45 株分離され，国産鶏肉由来株では blaCTX-M-1 及び blaCTX-M-15 出された（blaNDM-1，2 株；blaNDM-5，7 株；blaNDM-7，5 株）。ランダムに選ん の両遺伝子を保有する割合が，輸入鶏肉由来株に比べ，高い傾 だ一部の株から抽出した 49 プラスミドの全塩基配列を解析したところ， 向であった。PFGE 型別及びプラスミドレプリコン型より，各分 50 の異なる薬剤耐性遺伝子が検出された。ネットワーク解析の結果，4～ 離株は異なるものであることが示された。blaCTX-M-1 及び blaCTX-M-15 17 のプラスミドから構成される 4 つのコミュニティーが確認できた。う を併せ持つ分離菌株では，IncI1 プラスミドが 73.3% の割合で認 ち 3 つは異なる州に由来するプラスミドから構成されていた。【結論】イ められ，接合伝達性プラスミドであることが示唆された。今後は， ンドの環境に由来する 3GC または CAR 耐性大腸菌は多様な薬剤耐性遺伝 これらの形質を精査し，国内における ESBL 産生菌の拡散に寄 子を保有し，多くの薬剤に耐性を示した。プラスミドのネットワーク解析 与する可能性を明らかにしたい。 の結果は類似のプラスミドを保有する大腸菌がインドの環境を広範に汚染 している可能性を示唆している。

145 P2-141 生野菜・果物より単離したグラム陰性細菌の薬 P2-142 2015 年に日本で分離された VanN 型 VRE の 剤耐性化機構の解析 解析 ○田中 大貴，Ashraf M. Ahmed，島本 敏，島本 整（広島大・院・生 ○野村 隆浩1，谷本 弘一2，柴山 恵吾3，渡邉 治雄4，富田 治芳1,2（1群 物圏科学・食品衛生学） 馬大・院医・細菌学，2群馬大・院医・薬剤耐性菌施設，3国立感染研・ 細菌第二，4国立感染研・細菌第一） Analysis of antibiotics resistance in Gram-negative bacteria isolated from vegetables and fruits 2015 for analysis of VanN-type VRE strains in Japan 1 2 3 ○Daiki Tanaka, Ashraf M. Ahmed, Toshi Shimamoto, Tadashi ○Takahiro Nomura , Koichi Tanimoto , Keigo Shibayama , Haruo 4 1,2 1 Shimamoto (Lab. Food Microbiol. Hyg., Grad. Sch. Biosphere Sci., Watanabe , Haruyoshi Tomita ( Dept. Bacteriol., Grad. Sch. Med., 2 Hiroshima Univ.) Gunma Univ., Lab. Bacterial Drug Resistance, Grad. Sch. Med., Gunma Univ., 3Dept. Bacteriol. II., Natl. Inst. Infec. Dis., 4Dept. 【目的】薬剤耐性菌は重篤な感染症をもたらす原因となっており， Bacteriol. I., Natl. Inst. Infec. Dis.) 薬剤耐性遺伝子を介し急速に広がっている。食品を通して薬剤 耐性菌を摂取した場合，ヒト腸管内での薬剤耐性細菌の定着や， バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）は現在まで，9 種類の耐性型 薬剤感受性常在細菌へ薬剤耐性遺伝子を伝播する可能性がある。 が報告されている。このうち VanN 型 VRE 株はフランスで初め 野菜や果物は非加熱で食べることが多く，さらに有機野菜や果 て臨床分離され，2011 年 10 月に報告された新規の型である。我々 物は，抗生物質や薬剤耐性菌を多く含んだ家畜の糞便を原料と は 2011 年の国産鶏肉から日本で初めて VanN 型耐性遺伝子を持 した肥料を用いることから，薬剤耐性菌の汚染が懸念されてい つ VRE 株の分離解析を行い，2012 年 12 月に報告した。その後， る。本研究では，野菜や果物における薬剤耐性菌のモニタリン 2009 年と 2014 年のそれぞれ異なる地域から収集された国産鶏肉 グと，耐性化機構を明らかにすることを目的とした。 から VanN 型 VRE を分離した。今回，2015 年 1 月から 3 月に収 【方法】広島県内の小売店で購入した有機栽培（21 種），非有機 集した鶏肉ふき取りスワブ及びミンチ肉から分離した VCM に対 栽培（27 種）の野菜や果物からグラム陰性菌選択培地を用い細 して低度耐性を示す E. faecium 株について報告する。【材料・方法】 菌を単離した。PCR 法により，インテグロン（クラス 1，クラス 2）， 2015 年 1 月から 3 月までに収集した国産の鶏肉 90 検体の拭き取 りスワブと外国産の鶏肉 検体のミンチ肉の計 検体を用い β- ラクタマーゼ遺伝子（blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaCMY, blaCTX-M）， プ 61 151 ラスミド性キノロン剤耐性遺伝子（qnrA，qnrB，qnrS，aac(6’)- た。VRE の検出，PCR，PFGE，MLST，VCM の MIC の測定は Ib-cr）の検出を行った。薬剤耐性遺伝子が検出された株に対して， 既報に従った。【結果】型別不明 VRE 株を関東地域の国産鶏肉 2 ディスク拡散法による薬剤耐性表現型の決定および，API20E を 検体から 3 株分離した。これらの株は全て E. faecium 株であり， 用いた菌種の同定を行った。 低度 VCM 耐性（MIC：4 mg/L）を示した。各耐性型に特異的 【結果・考察】野菜および果物から 198 株のグラム陰性細菌を単 な ligase 遺伝子領域を PCR で調べたところ，すべて VanN 型で 離した。スクリーニングの結果，クラス 1 インテグロンが 2 株， あった。PFGE 解析ではこれらの株は，2009 年，2011 年，2014 blaTEM が 4 株，blaSHV が 10 株，blaCTX-M が 1 株，qnrB が 3 株， 年に分離した VanN 型 VRE と非常によく似たパターンを示した。 qnrS が 3 株，aac(6’)-Ib-cr が 4 株から見つかった。有機と非有 MLST 解析をした結果，3 株とも ST669 となりこれまでに分離し 機における薬剤耐性遺伝子の存在量に明確な差は見られなかっ た VanN 型 VRE と同一のタイプであった。【考察】今回国産鶏肉 た。しかし，有機野菜から基質拡張型 β- ラクタマーゼ遺伝子 から分離された VCM 低度耐性株は遺伝子解析から VanN 型 VRE blaCTX-M-15 を保有した，高度多剤耐性の菌が単離されるなど，有 であった。異なる複数の地域から継続的に同一の ST 型及び類似 機野菜において肥料が薬剤耐性菌汚染を促進している可能性が する PFGE 型の株が検出されたことは，起源を同じくする VanN 示唆された。 型 VRE 株が日本の環境中に既に拡がっていることを示している。

P2-143 A novel mutation in mprF of Staphylococcus P2-144 CTX-M 型基質拡張型 β ラクタマーゼ産生 aureus effects on susceptibility for daptomycin Escherichia coli における染色体性 blaCTX-M-14 遺伝子の高頻 ○岡村 奎太，山田 景子，和知野 純一，木村 幸司，金 万春，荒川 宜 度な検出 親（名古屋大・医・分子病原細菌学） ○浜元 宏太1，平井 到1,2（1琉球大・保健・微生物，2AMED/JICA SATREPS） ○Keita Okamura, Keiko Yamada, Jun-ichi Wachino, Kouji Kimura,

Wanchun Jin, Yoshichika Arakawa (Dept. Bacteriol., Sch. Med., High detection rate of chromosomal blaCTX-M-14 in Nagoya Univ.) Escherichia coli isolates ○Kouta Hamamoto1, Itaru Hirai1,2 (1Lab, Microbiol., Sch. Health. Sci., Background: Daptomycin (DAP) is applied for infections such as 2 skin, soft tissue infections, and infective endocarditis caused by Univ. The Ryukyus, AMED/JICA SATREPS) methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Several reports have 【背景・目的】第三世代セファロスポリンを分解する基質拡張型 β pointed out increases of DAP MIC for after long time S. aureus ラクタマーゼ（ESBL）産生菌は臨床上重要なものの一つとして exposure to DAP. In case of , strains for which MIC 1 g/ S. aureus ≤ μ あげられる。ESBL 遺伝子は主にプラスミドを介して伝達される ml of DAP are considered to be susceptible to DAP by Clinical and と考えられているが，ESBL 遺伝子が染色体に移行した例もこれ Laboratory Standards Institute (CLSI). Many mechanisms have まで報告されている。しかし染色体性 ESBL 遺伝子を保持する been suggested in getting reduced susceptibility to DAP, and one ESBL 産生菌について詳しく解析された研究は少ない。一般的に of the possible mechanism is mutations of mprF encoding a lysyl- 染色体上の遺伝子はプラスミド上の遺伝子に比べて安定である phosphatidylglycerol synthase. ことが考えられる。染色体上の薬剤耐性遺伝子は比較的長時間 A total of 2,329 clinical isolates were checked with Method: 存在し続けられると考えられるため，染色体性 ESBL 遺伝子を susceptibility to DAP. MICs of DAP for five isolates were 2 μg/ml by 保持する薬剤耐性菌は公衆衛生上の問題となりうる。本研究で CLSI’s microdilution method. One of them, NUBL276 had a novel は CTX-M-14 型 ESBL 産生 Escherichia coli を用いて，染色体性 mutation in mprF, without previous exposure to DAP. We knocked blaCTX-M-14 を保持する菌の割合を明らかにすることを目的とした。 out the mprF gene of RN4220, subsequently complemented mprF 【対象・方法】タイの健常人及び近畿地方の介護老人保健施設入 NUBL276 and RN4220 constructed with a shuttle vector, pHY300PLK, mprF 所者由来の CTX-M-14 型 ESBL 産生 E. coli 計 74 株を対象とし and we measured DAP MIC for them. た。被検株は MLST 及び Phylogenetic group 分類を行った。S1- Results and conclusion: The mprF deletion caused reduction パルスフィールド電気泳動を行い染色体とプラスミドを分離後， of DAP MIC to 0.25 μg/ml. Complementation of strain RN4220 blaCTX-M-14 及び 16S rDNA プローブを用いたサザンハイブリダイ (ΔmprF) with mprF NUBL276 showed a higher DAP MIC than that of ゼーション法により blaCTX-M-14 が染色体もしくはプラスミドのど complemented mprF RN4220, suggesting contribution of the novel mprF ちらに存在するか確認した。【結果・考察】本研究によって被検菌 mutation to the reduced susceptibility to DAP found in NUBL276. の50パーセント以上と高頻度に染色体性blaCTX-M-14 が確認された。 (Non-member collaborator: D. kim) この染色体性 ESBL 産生菌の出現頻度と MLST や Phylogenetic 分類の結果には相関がみられなかった。以上のことから様々な

遺伝学的背景を持つ E. coli において染色体性 blaCTX-M-14 が存在し ていることが示唆された。

146 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P2-145 肺炎桿菌の RND 型多剤排出ポンプ OqxAB 発 P2-146 High prevalence of carbapenemase- 現亢進株の分離と変異の同定 encoding genes among clinical Gram-negative bacteria ○小川 和加野1，土屋 友房2，松原 大1，黒田 照夫3（1第一薬科大学， from Egypt 2 3 立命館大学・薬学部， 岡山大学・大学院医歯薬学総合研究科） ○Hazim O. Khalifa1，Ahmed M. Soliman1，Ashraf M. Ahmed1,2，島 本 敏1，島本 整1（1広島大・院・生物圏科学・食品衛生，2Dept. Isolation and investigation of a mutant over-expressing Bacteriol. Mycol. Immunol., Fac. Vet. Med., Kafrelsheikh Univ.） RND-type multidrug efflux pump, OqxAB 1 1 1,2 1 2 1 ○ ○Wakano Ogawa , Tomofusa Tsuchiya , Futoshi Matsubara , Teruo Hazim O. Khalifa , Ahmed M. Soliman , Ashraf M. Ahmed , Toshi 1 1 1 Kuroda3 (1Daiichi Univ. of Pharm., 2Col. Pharm. Sci., Ritsumeikan Shimamoto , Tadashi Shimamoto ( Lab. Food Microbiol. Hyg., 2 Univ., 3Grad. Sci. Med. Dent. Pharm., Okayama Univ.) Grad. Sch. Biosphere Sci., Hiroshima Univ., Dept. Bacteriol. Mycol. Immunol., Fac. Vet. Med., Kafrelsheikh Univ.) 【目的】肺炎桿菌 ATCC10031 株を利用し，オキサシリン存在下 で多剤耐性変異株 OXA128 株を分離した。この変異株では RND The development and the spread of carbapenem-resistant Gram- 型多剤排出ポンプ OqxAB の発現亢進が観察されたため，この発 negative bacteria represents a major world-wide problem, since 現上昇の原因について解析した。【方法】多剤耐性変異株 Oxa128 carbapenems represent the last resort for severe infections caused 株において，多剤排出ポンプ遺伝子 oqxAB に隣接した推定レギュ by multidrug-resistant bacteria. Currently, little is known about the レーター遺伝子の発現を RT-PCR により調べた。【結果と考察】 extent and the molecular mechanisms underlying this resistance 多剤耐性変異株 Oxa128 株について RND 型多剤排出ポンプ遺伝 in Egypt. Therefore, this study was designed to characterize at 子 acrA ，oqxA，kexC，kexD，kexE，kexG の発現を調べた結果， the molecular level the carbapenemase production in 128 non- oqxA の発現上昇が認められた。oqxA は RND 型多剤排出ポンプ repetitive Gram-negative isolates from hospitalized patients in のペリプラズムコンポーネントをコードする遺伝子であり，こ Egypt. All the isolates were subjected to phenotypic and genotypic の遺伝子は oqxB とオペロンを形成していると考えられている。 testing for carbapenemases production. Our results indicated that 他の研究グループにより，oqxA の上流に存在する rarA が oqxAB high prevalence of carbapenemase-encoding genes among Gram- のアクチベーターをコードしていると報告されている。このグ negative bacteria, where 50.8% of the isolates harbored at least ループによると，OqxAB の発現が上昇した臨床分離株では RarA one carbapenemase gene. OXA-48 and NDM-1 were the most の発現上昇が観察されている。そこで，変異株 Oxa128 株につい prevalent among carbapenemase-positive bacteria by 49.2% and て RT-PCR により rarA の mRNA 発現について調べたが，rarA 47.6%, respectively, with low prevalence of VIM by 26%. This 発現亢進は認められなかった。このことから，変異株 Oxa128 に study demonstrated carbapenemase-producing Serratia marcescens, おける OqxAB の発現上昇には別の原因があると考えられた。変 Morganella morganii, blaVIM-1-producing P. aeruginosa and blaVIM-2- 異株 Oxa128 株の oqxAB 周辺について塩基配列を調べた結果， producing K. pneumoniae for the first time in Egypt. Moreover, rarA と oqxA の遺伝子間領域に点変異が生じていることが分かっ for the first time we demonstrated the coexistence of different た。この変異が OqxAB の発現上昇に関係しているのではないか carbapenemases in 18.5% of carbapenemase-positive isolates. Good と考えている。【非会員共同研究者】北川良子，Ni Rui-ting infection control and effective antibiotics supervision are imperative to prevent their future spread into epidemic form.

P2-147 多剤耐性グラム陰性菌由来 LPS がヒト好中球 P2-148 細菌感染特異的オートファジーにおけるアポ 内で炎症増強因子 TREM1 遺伝子発現に及ぼす影響 トーシス抑制タンパク質 Bcl-xL の機能解析 ○祖母井 庸之，永川 茂，上田 たかね，鴨志田 剛，海野 雄加，斧 康 ○中島 慎太郎，野澤 孝志，相川 知宏，丸山 史人，中川 一路（京大・ 雄（帝京大・医・微生物） 院医・微生物感染症学）

Gene expression analysis of TREM1 in neutrophils Functional analysis of the anti-apoptotic protein Bcl-xL stimulated by LPSs from multi-drug resistance rods in anti-bacterial autophagy ○Tsuneyuki Ubagai, Shigeru Nagakawa, Takane Ueda, Go ○Shintaro Nakajima, Takashi Nozawa, Chihiro Aikawa, Fumito Kamoshida, Yuka Unno, Yasuo Ono (Dept. Microbiol. Immunol., Sch. Maruyama, Ichiro Nakagawa (Dept. Micribiol., Grad. Sch. Med., Kyoto Med., Teikyo Univ.) Univ.)

【目的】リポ多糖（LPS）はグラム陰性菌細胞壁成分であり，食 【背景・目的】オートファジーは，栄養飢餓時に細胞内小器官等 細胞の膜上 TLR4 を介して認識されることによって自然免疫反 の分解によって栄養源の供給を行うと同時に，細胞侵入菌を分 応を発現誘導している。しかし，菌種が異なる LPS に対する好 解・排除する役割を担っている。飢餓時のオートファジー誘導 中球（PMN）内の遺伝子発現変化についてはよく分かっていな には PI3K（Phosphoinositide 3-kinase）複合体形成が重要であり， い。今回我々は多剤耐性緑膿菌（MDRP）とアシネトバクター Bcl-2/Bcl-xL がこの複合体形成を制御している。一方，細菌感染 （MDRA）を含む 5 種類の LPS を PMN に加え，細胞内の炎症増 時のオートファジーは選択的オートファジーと呼ばれ，その誘 強因子 TREM1（triggering receptor expressed on myeloid cells-1） 導には細胞内での菌体認識を必要とすることから，飢餓時のオー 遺伝子発現変化を中心に解析した。【方法】健常者 PMN（5×106 トファジーとは誘導機序が大きく異なることが予想される。そ cells/ml）に E. coli，P. aeruginosa，MDRP，A. baumannii，MDRA のため，細菌感染時の PI3K 複合体と Bcl-2/Bcl-xL の相互作用を 由来 LPS を種々の濃度（0–500 ng/ml）にて添加後 37°C で加温 詳細に検討した例はなく，これらの背景から本研究では，A 群レ し，PMN 内の TREM1 を中心に，パターン認識受容体（TLR2, ンサ球菌（Group A Streptococcus, GAS）感染時の PI3K 複合体形 TLR4, CD14），炎症性サイトカイン（TNFα, IL1β, IL6），ケモカ 成とオートファジー誘導における Bcl-2/Bcl-xL の生理的役割を明 イン受容体（IL8Rs, MAC-1），並びに抗炎症性サイトカイン（IL10） らかにすることを目的とした。【方法】Bcl-2/Bcl-xL 強発現細胞 の遺伝子発現変化について定量した。【結果】PMN を LPS で刺 および Bcl-xL 欠損細胞における GAS 感染時のオートファジー誘 激すると，種類に関わらず TREM1 と炎症性サイトカインの遺伝 導能を評価した。【結果・考察】強発現細胞を用いた解析において， 子発現は亢進し，多剤耐性菌の方が感受性菌よりもその割合は Bcl-xL 強発現細胞でのみオートファゴソーム形成率の低下と細 高かった。同様に TLR4, CD14 の遺伝子発現は抑制された。一方， 胞内生存菌数の増加が認められたことから，GAS 感染時のオー 菌種や菌株間，投与量，反応時間の差で上記以外の遺伝子発現 トファジーは Bcl-2 ではなく Bcl-xL により制御されていること に変動が認められた。【結論】LPS 活性化 PMN で，反応条件や が示唆された。Bcl-xL 欠損細胞においては，野生型細胞と比べて， 菌種間で遺伝子発現に違いが見られた理由の一つは，各種 LPS 感染後早期での細胞への菌の付着と侵入が観察され，オートファ の立体構造が側鎖の付加等修飾を受けて変化していることが考 ゴソーム形成率とオートファゴソーム - リソソームの共局在率の えられた。また，LPS が PMN 内 TREM1 遺伝子を発現誘導した上， 増加が認められた。以上より，Bcl-xL は，エンドサイトーシス 多剤耐性菌由来 LPS 刺激の方が増強していたことから，生体内 経路，オートファゴソーム形成，ならびにリソソームとの融合 での TREM-1 発現の量的な変動はグラム陰性菌感染症の病態形 に関与することで細菌感染時のオートファジー誘導を制御して 成に関与しており，耐性菌感染の診断や治療の標的候補である いることが示唆された。 可能性が示唆された。

147 P2-149（WS13-7） ピロリ菌感染は EB ウイルスの P2-150 Newly identified BCL11b-independent γδ T 胃上皮細胞における増殖を活性化する cell subset in the periphery in mice ○飯笹 久1，金廣 優一1，溝手 朝子2，吉山 裕規1（1島根大・医・微生 ○畑野 晋也，村上 哲晋，松村 友美子，山田 久方，吉開 泰信（九州大・ 物，2山口県大・食・微生物） 生体防御医学研究所・感染制御）

Helicobacter pylori augments Epstein-Barr virus ○Shinya Hatano, Tesshin Murakami, Yumiko Matsumura, Hisakata infection of gastric epithelial cells Yamada, Yasunobu Yoshikai (Div. Host Defense, Med. Inst. ○Hisashi Iizasa1, Yuichi Kanehiro1, Tomoko Mizote2, Hironori Bioregulation., Kyushu Univ.) Yoshiyama1 (1Dept. Microbiol., Sch. Med., Shimane Univ., 2Dept. B cell leukemia/lymphoma 11b (Bcl11b), a zinc finger transcription Hum. Nutr., Yamaguchi Pref. Univ.) factor is essential for transition from the early DN2a to late DN2b Background: H. pylori causally associates with gastric cancer. stage of T cell development in thymus. Using mice conditionally deficient for Bcl11b by expressing Cre-recombinase under Rag1 Epstein-Barr virus (EBV) also associates with almost 10% of ΔRag1-Cre all gastric cancer. Since these two pathogens belong to class I promoter (Bcl11b mice), we found a unique subset of γδ T carcinogen, they seemingly play roles for gastric oncogenesis cells expressing NK1.1, NKG2D, CD122, but no CD5, designated independently. However, EBVaGC frequently locates near the as DN2a-γδ T cells, in thymus and periphery during adulthood. mucosal atrophic border, where inflammatory response is strong. The newly identified DN2a-γδ T cells produced IFN-γ but not IL- 17A without Ca2＋ influx upon γδTCR stimulation. The DN2a-γδ T We examined pathogenic role of H. pylori by coinfecting with EBV － ＋ on gastric epithelial cells. Methods: Gastric epithelial cells were cells of CD5 NK1.1 phenotype were abundantly localized in the infected with live H. pylori. After 7 hrs, EBV expressing GFP was liver during childhood of wild mice, secreted IFN-γ immediately infected. Expression of EBV genes were examined by the Q-PCR after infection with L. monocytogenes, and contributed to an early method. Toxin non-producing H. pylori (CagA KO, VacA KO, double protection against the bacterial infection. Thus, the DN2a-γδ T cells KO) was generated. Results: H. pylori infection enhanced expression in the liver precede in appearance following infection, which may of EBV genes for up to 10 fold with increase of interfereon-β recapitulate ontogeny of development in fetal thymus. production. Toxin non-producing H. pylori also enhanced EBV gene expression. A bacterial component from H. pylori was found to enhance expression of the EBV genes up to 10 fold. Conclusions: Disturbance of anti-viral response by bacterial infection seems to enhance EBV infection. The mechanism of enhancement should be clarifyied.

P2-151 DHA downregulates inflammasome activity P2-152 常在細菌―TLRs の相互作用を介した腸管炎症 in A. actinomycetemcomitans-invaded macrophages 制御機構 ○沖永 敏則，有吉 渉，西原 達次（九歯大・感染分子） ○上田 統悟1，大坂 利文1,2，常田 聡1（1早大院・先進理工・生医， 2東女医大・微生物免疫） ○Toshinori Okinaga, Wataru Ariyoshi, Tatsuji Nishihara (Div. Infect. Mol. Microbiol., Kyushu Dental Univ.) Gut inflammation regulation mechanism through the interaction between commensal bacteria and TLRs Objective: It is well known that the deficiency of fatty acids can ○Togo Ueda1, Toshifumi Osaka1,2, Satoshi Tsuneda1 (1Dept. Life lead to chronic disease. In particular, previous study reported that Sci. Med. Biosci., Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Dept. omega-3 fatty acids, such as docosahexaenoic acid (DHA), suppress Microbiol. Immunol., Tokyo Women Medical. Univ.) inflammatory activation and play a beneficial role in inflammatory human diseases. Periodontitis is known to be an infectious disease 【目的】腸炎モデルマウスを用いた研究により，腸内細菌は腸管 caused by bacterial infection, followed by inflammation. In the present 炎症の発症だけでなく，制御性 T 細胞の分化誘導などの炎症の study, we clarified the role of omega-3 fatty acids in periodontopathic 抑制にも重要な役割を果たしていることが知られるようになっ bacteria-invaded macrophages. Results: The expression of IL-1β た。本研究では，腸管炎症の抑制機構として，腸炎の進行に伴 and caspase-1 induced by A. actinomycetemcomitans invasion い出現する常在性細菌と宿主免疫細胞の相互作用が潜在してい was downregulated in DHA-treated U937 cells. In addition, the る可能性を考えた。特に，ヒトやマウスの腸管炎症期に出現す expression of Clathrin, which is mediator of endocytosis, was found る Enterobacteriaceae 科細菌に着目し，腸炎抑制への関与を検証 in macrophages. Interestingly, DHA prevented the expression することを目的とした。 of Clathrin in A. actinomycetemcomitans-invaded U937 cells. 【方法】野生型マウス C57BL/6J（日本クレア）に 2% DSS を投 Furthermore, pitstop, endocytosis inhibitor, prevented the production 与することで大腸炎を誘導した後に，抗生物質リンコマイシン of IL-1β and caspase-1 induced by A. actinomycetemcomitans invasion. （LCM）を共投与することで，腸内細菌叢を Enterobacteriaceae Discussion: These results indicate omega-3 fatty acid, particularly 優勢とした。LCM 投与により腸炎病態が抑制されたマウスの結 DHA downregulated the inflammasome activity in U937 cells 腸粘膜固有層細胞における単球・マクロファージサブセットの割 induced by A. actinomycetemcomitans, suggesting the involvement of 合をフローサイトメトリーにより解析した。また，結腸粘膜固有 the combination in the suppression of Clathrin-mediated endocytosis. 層細胞の機能解析として，LPS 刺激に対する応答性を評価した。 【結果および考察】フローサイトメトリーの解析結果から，腸炎 の進行に伴い，結腸粘膜固有層への単球およびマクロファージ の浸潤が確認された。また，結腸粘膜固有層細胞の機能解析より， 腸炎の抑制が起こる LCM 共投与群は，LPS 刺激に対して不応答 であることがわかった。以上の結果から，腸内細菌叢の改変は， DSS 腸炎の病態進展に寄与する炎症性細胞の機能的な変化をも たらすことが示唆された。腸炎発症後の LCM 投与により高力価 な LPS を有する Enterobacteriaceae 科細菌の優勢化が起き，炎 症性細胞が一過的に強い自然免疫刺激を受け，エンドトキシン・ トレランス様の表現型を呈することで，過剰な免疫応答を抑制 していると考えられる。

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P2-153 Inhibitory effects of diffusely adherent E. P2-154（WS18-1） IL-1alpha-inducing activity of coli strains on cytokine secretions of epithelial cells Streptococcus sanguinis in murine dendritic cells and ○玉井 沙也加1，能重 匠1，谷本 佳彦1，松崎 壮宏1，中臺（鹿毛） 枝 macrophages 1,2 2 3 3 1 1 里子 ，山口 良弘 ，児玉 年央 ，飯田 哲也 ，西川 禎一 （ 大阪市立 ○佐伯 歩1，長谷部 晃1，鈴木 敏彦2，柴田 健一郎1（1北大・歯・口腔 大学大学院生活科学研究科，2大阪市立大学複合先端研究機構，3大阪 分子微生物，2東京医科歯科大・医歯学総合・細菌感染制御学） 大学微生物研究所） ○Ayumi Saeki1, Akira Hasebe1, Toshihiko Suzuki2, Ken-ichiro 1 1 1 ○Sayaka Tamai , Takumi Noju , Yoshihiko Tanimoto , Takehiro Shibata1 (1Div. Oral Mol. Microbiol., Dept. Oral Pathobiol. Sci., 1 1,2 2 Matsuzaki , Eriko Kage-Nakadai , Yoshihiro Yamaguchi , Toshio Hokkaido Univ. Grad. Sch. Dent. Med., 2Dept. Bacterial Infection and 3 3 1 1 Kodama , Tetsuya Iida , Yoshikazu Nishikawa ( Osaka City Univ. Host Response., Grad. Sch. Med. Dent. Sci., Tokyo Medical and 2 Grad. Sch. Human Life Science, The OCU Advanced Research Dental Univ.) Institute for Natural Science and Technology, 3Institute of Microbial Diseases, Osaka Univ.) Streptococcus sanguinis (Ss), a human oral inhabitant, is one of the most potent agents of infective endocarditis (IE). Recently, the Diarrheagenicity of diffusely adherent Escherichia coli (DAEC) proinflammatory cytokine IL-1 consisting of IL-1α and IL-1β has remains controversial. Previously, we found that all motile DAEC been shown to contribute to the onset of IE. Last year, we showed strains isolated from diarrheal patients induced high levels of IL-8 that Ss activates the NLRP3 inflammasome to produce IL-1β in secretion via TLR5. In contrast, only 6 of 15 motile strains from murine dendritic cells and macrophages. Therefore, this study was healthy carriers induced IL-8 secretion. DAEC isolates that induced designed to examine whether Ss has the activity to induce IL-1α lower levels of IL-8 were referred to as MBLI (Motile-But-Low- production by these cells. The murine dendritic cell line XS106 Inducer) strains. We found the MBLI strains could suppress IL-8 and bone marrow-derived macrophages (BMMs) from C57BL/6 secretion of epithelial cells receiving inflammatory stimuli. HEK293 (B6), NLRP3-, ASC- and caspase-1-deficient mice were used. IL-1α cells were infected by the DAEC. Then, flagellin, TNF-α, or PMA secreted was measured by ELISA and Western blotting. Ss had the were added to the cells, and the levels of IL-8 assayed by ELISA. activity to induce secretion of IL-1α by XS106 and BMMs from B6 in The transcription levels of genes were assessed by RT-PCR. a dose-dependent manner, but the activity toward NLRP3-, ASC- and Afimbrial adhesin gene (afa) of the MBLI strain was knocked out by caspase-1-deficient BMMs were significantly attenuated. The calpain the method of Wanner et al. When HEK293 cells were infected with 1 inhibitor MDL 28170 but not the caspase 1 inhibitor z-YVAD-fmk the MBLI strain, neither flagellin, TNF-α nor PMA induced IL-8 attenuated the IL-1α-inducing activity in XS106 cells. Stimulation secretion. These results indicate that MBLI strains inhibited the with Ss induced ATP release in XS106 cells and oATP downregulated response of epithelial cells to inflammatory stimuli. However, the the IL-1α production. Thus, this study suggests that the NLRP3 level of IL-8 mRNA was very high in these epithelia. Thus, the MBLI inflammasome activation and extracellular ATP are involved in the strain seems to impede cytokine secretion by interfering with post- IL-1α-inducing activity of Ss, which is mediated by calpain but not transcriptional events. MBLI strain of that afa gene was knocked caspase-1. out did not suppress IL-8 secretion. SK1144 needs the contact to HEK293 cells, but the adhesion is not necessary to suppress the IL-8 induction.

P2-155 Bacteroides fragilis 由来多糖の TLR2 活性化 P2-156 細菌の新しいシグナル伝達物質：8- ニトロ - 能への影響 cGMP の生成と機能解析 ○橋本 雅仁1，大薗 まみ1，今大路 治之2，桑原 知巳2（1鹿児島大・院 ○井田 智章1，松永 哲郎1，赤司 壮一郎1，Minkyung Jung1，津々木 理工，2香川大・医・分子微生物学） 博康2，小野 勝彦2，藤井 重元1，居原 秀3，澤 智裕2，赤池 孝章1（1東 北大院・医・環境保健医学，2熊本大院・生命科学（医）・微生物， A role for Bacteroides fragilis polysaccharides in TLR2 3大阪府立大院・理・生物） mediated cell activation ○Masahito Hashimoto1, Mami Ozono1, Haruyuki Imaohji2, Tomomi A new signal molecule 8-nitro-cGMP in bacteria 1 1 1 Kuwahara2 (1Grad. Sch. Sci. & Eng., Kagoshima Univ., 2Fac. Med., ○Tomoaki Ida , Tetsuro Matsunaga , Soichiro Akashi , Minkyung 1 2 2 1 Kagawa Univ.) Jung , Hiroyasu Tsutsuki , Katsuhiko Ono , Shigemoto Fujii , Hideshi Ihara3, Tomohiro Sawa2, Takaaki Akaike1 (1Dept. Environ. Health Sci. Bacteroides fragilis is widely distributed in the normal human Mol. Toxicol., Tohoku Univ. Grad. Sch. Med., 2Dept. Microbiol., Grad. intestinal flora and is reported to involved in host immunostimulation Sch. Med. Sci., Kumamoto Univ., 3Dept. Biol. Sci., Grad. Sch. of Sci., via TLR2. Its cell surface components, such as lipopolysaccharide Osaka Pref. Univ.) (LPS) and capsular polysaccharide (PSA), are reported to participate in host immunostimulation. Recently, we found that a lipoprotein 【目的】我々は真核生物において，活性酸素と NO 産生の下流に新規セン distributed in B. fragilis cells acts as a TLR2 stimulant. In this カンドメッセンジャーである 8- ニトロ -cGMP（8-nitroguanosine 3’,5’-cyclic study, we investigated a role for B. fragilis polysaccharides in TLR2 monophosphate）が産生され，タンパク質 S－グアニル化を介して，抗 mediated cell activation. B. fragilis wild type (WT) and PSA deficient 酸化シグナル経路を活性化することを報告してきた。最近，8- ニトロ - strain (ΔPSA) were used in this study. The TLR2-stimulating cGMP が，cysteine hydropersulfide（CysSSH）のような過イオウ化し求 lipoproteins fraction (LP) and polysaccharide fraction (PS) were 核性が高まった活性イオウ分子によって代謝されることを報告した。一 obtained using Triton X-114-water phase partitioning and phenol- 方，原核生物における 8- ニトロ -cGMP の産生や代謝機構は不明である。 hot water extraction, respectively. No significant difference was そこで，本研究では細菌における 8- ニトロ -cGMP 産生と代謝機構の解 observed in TLR2-stimulating activity of LP between WT and ΔPSA. 明を目指した。【方法・結果】ネズミチフス菌（Salmonella enterica serovar The SDS-PAGE profile of LP from WT was also similar to that from Typhimurium, LT2 株）のメタノール抽出液を用いて質量分析装置で 8- ニ ΔPSA. Further TLR2-stimulating activities of PS were identical for トロ -cGMP 産生を検討した結果，cGMP と同等の 8- ニトロ -cGMP が産 both strains. These results show that the PSA is not responsible for 生されていた。また，細菌由来のアデニル酸シクラーゼを用いて，8- ニト the TLR2-stimulation by LP in B. fragilis. ロ -GTP を基質に 8- ニトロ -cGMP 生成を検討した結果，8- ニトロ -cGMP を生成することが分かった。さらに，ネズミチフス菌のプロテオミクス 解析により，酸化ストレス応答関連タンパク質である chaperon protein, DnaK などが S－グアニル化の標的タンパク質であることが示された。現 在，8- ニトロ -cGMP の代謝機構について，活性イオウ分子生成に注目し て解析をおこなっている。【考察】原核生物においても 8- ニトロ -cGMP が産生され，酸化ストレスにおける S- グアニル化を介したシグナル伝達 機能を発揮していることが示唆された。今後，原核生物～真核生物にいた る多様な生物種に共通のシグナル分子である 8- ニトロ -cGMP の産生・代 謝機構と生物学的意義の解明が待たれる。

149 P2-157（WS21-1） Functional analysis of long P2-158 Nod like receptor NLRX1 は GAS 感染による noncoding RNAs induced by Salmonella infection オートファジーを制御する ○今村 亮俊1，高屋 明子1，今町 直登2，掛田 実穂2，渡辺 千尋2，佐 ○相川 知宏，野澤 孝志，中島 慎太郎，丸山 史人，中川 一路（京大院・ 藤 亜以子2，鈴木 穣3，山本 友子4，秋光 信佳2（1千葉大院・薬・微生 医・微生物） 物薬品化学，2東大・アイソトープ総合センター，3東大院・新領域創 成科学研究科，4千葉大・真菌センター） NLRX1 regulates the GAS induced-autophagy in epithelial cells ○Katsutoshi Imamura1, Akiko Takaya1, Naoto Imamachi2, Miho ○Chihiro Aikawa, Takashi Nozawa, Shintaro Nakajima, Fumito Kakeda2, Chihiro Watanabe2, Aiko Sato2, Yutaka Suzuki3, Tomoko Maruyama, Ichiro Nakagawa (Dept. Micribiol., Grad. Sch. Med., Kyoto Yamamoto4, Nobuyoshi Akimitsu2 (1Dept. Microbial and Molecular Univ.) Genetics, Grad. Sch. Pharmaceutical Sciences, Chiba Univ., 2Radioisotope Centre, The Univ. Tokyo, 3Dept. Computational Biology, 4 Background: Group A Streptococcus (GAS) can invade epithelial Graduate School of Frontier Sciences, The Univ. of Tokyo, Med. cells but is destroyed by autophagy. Nod-like receptors (NLRs) are Mycol. Res. Cen., Chiba Univ.) thought to be critical to the autophagic response to invasive bacteria, but their precise roles responsible for anti-bacterial autophagy are The new inventory of long non-codingRNA (lncRNA) has been found largely unknown. Here, we investigate the relationship between a in our genomes through the deep sequencing. Although numerous new NLR protein NLRX1 and autophagy in GAS infected epithelial studies have revealed that lncRNAs have important roles in many cells. Methods: The effect of NLRX1 in GAS-induced autophagy biological processes, the function of lncRNA in pathogenic infection was evaluated in NLRX1-deficient or NLRX1-overexpressing is remained largely unclear. In this study, we found that Salmonella cells. The production of reactive oxygen species (ROS) promoting infection induced many lncRNAs, such as NEAT1, a nuclear lncRNA. autophagosome formation and the promoter activity of nuclear Heat-killed Salmonella, LPS, Flagella stimuli did not induce NEAT1, factor κB (NF-κB) negatively regulating ROS production were indicating that the pathogenicity of is necessary for up- Salmonella measured. Results and Discussion: The rate of autophagosome regulation of lncRNAs. To examine whether up-regulation of NEAT1 formation increased in NLRX1-overexpressing cells and reduced levels by Salmonella infection was controlled by transcriptional in ΔNLRX1 cells. Increase of autophagosome formation in NLRX1- regulation, we analyzed luciferase reporter activity in HeLa cells overexpressing was initiated by potentiation of mitochondrial ROS. transfected with a luciferase reporter gene linked to a NEAT1 The NACHT domain of NLRX1 interacted with ABIN1, a negative promoter and found that Salmonella infection did not enhance the regulator of NF-κB activation. The NLRX1-induced increase in luciferase reporter activity. Next, we found that Salmonella infection autophagosome formation and ROS generation were inhibited by suppressed the degradation of NEAT1, indicating that NEAT1 knockdown of ABIN1. These results indicate that NLRX1 increases was induced by Salmonella infection through RNA stabilization in mitochondrial ROS production by suppressing NF-κB activation via HeLa cells. We also found that NEAT1 knockout cells were hyper- interaction with ABIN1 and that the increase in ROS production susceptible to Salmonella infection. Our results highlight that the stimulates autophagy against intracellular GAS. involvement of lncRNAs in cellular response against pathogenic infection in mammalian cells and uncover an unexpected fierce battle between host and pathogens.

P2-159 Neutrophil extracellular traps (NETs) P2-160 加齢に伴う自然免疫機能の低下とピオグリタゾ induces the IL-1beta production by macrophages ン投与による増強 ○Zhongshuang Hu1，鈴木 香1，田村 弘志2，長岡 功1（1順 天 堂 大・医・ ○中島 正裕1，木 下 学1，中 島 弘幸1，宮 崎 裕美2，関 修司1（1防衛医大・ 生化学・生体防御学，2LPS コンサルティング事務所） 医・免疫微生物，2防衛医大・研・外傷） ○Zhongshuang Hu1, Kaori Suzuki1, Hiroshi Tamura2, Isao Nagaoka1 Decreased innate immunity in aged mice and its 1 ( Dept. of Host Defense and Biochem. Res., Juntendo Univ., Sch. improvement by pioglitazone pretreatment 2 Med., LPS Consulting Office) ○Masahiro Nakashima1, Manabu Kinoshita1, Hiroyuki Nakashima1, Hiromi Miyazaki2, Shuhji Seki1 (1Dept. Immunol. Microbiol., Nat. Def. Background: NETs are network structures of extracellular fibers, Med. Col., 2Div. Trauma, Nat. Def. Med. Col. Res.) which are released from neutrophils in response to bacterial or sterile stimuli. In addition to the well described antimicrobial Elderly people are more sensitive and vulnerable to bacterial capability, NETs modulate the inflammatory reactions in the host. In infections. This study aims to delineate how aging affects functions this study, we focused on the effect of NETs on the IL-1β production of phagocytes in mice after E. coli infection and the effect of by macrophages. Methods: NETs were recovered from LPS-treated pioglitazone on their function. Aged mice showed higher mortality mouse bone marrow derived neutrophils. Thereafter, mouse J774 and lower bacterial clearance in the liver and blood than young mice macrophage-like cells were treated with NETs in the absence or when they were intravenously injected with near-lethal dose of E. presence of LPS, and the cell supernatants were used for the assay coli. LysoTracker staining of acidified phagolysosomes showed that of IL-1β production. Moreover, to clarify the components of NETs liver F4/80+ cells and peripheral blood Gr-1+ cells in aged mice involved in the IL-1β production, J774 cells were incubated with did not effectively phagocytose E. coli as compared to young mice, NETs and LPS in the presence of serine protease inhibitors and and liver F4/80+ cells were susceptible to apoptosis after infection. endonucleases. Results and conclusion: In the presence of LPS, Similar results were observed in their phagocytic activity and NETs significantly increased the IL-1β production. Interestingly, susceptibility to death in vitro. Lower mRNA expression of PPAR-γ IL-1β production was reduced by the caspase-1 and caspase-8 in aged liver mononuclear cells prompted us to investigate the inhibitors, confirming that caspase-1 and caspase-8 are involved immunological effects of pioglitazone (PPAR-γ agonist) on sepsis. in the IL-1β production. Of note, serine protease inhibitors and Surprisingly, this agent prevented elderly mice from septic death, endonucleases inhibited the NETs/LPS-induced IL-1β production. accompanied with improved bacterial clearance. In vitro experiments Together these observations indicate that both NETs and LPS are also showed that pioglitazone treated liver F4/80+ cells increased required for the induction of IL-1β production by macrophages, and phagocytic and bactericidal activities. These results demonstrated serine proteases and nuclear DNA are the essential components for that the function of phagocytes is impaired in aged hosts and suggest triggering the IL-1β production. that metabolism-related molecules can improve the immunological state of the aged hosts.

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P2-161 マンノース結合レクチンの抗レプトスピラ活性 P2-162 Lactobacillus ペプチドグリカンの可溶化フラ ○冨岡 倫太朗1，Jun Xu1，Yijie Guo2，磯貝 恵美子1（1東北大・農・動 グメントによるオートファジー誘導 2 物微生物， Dept. Immunobiol. Patho. Biol., Sch. Med., Xi’an Jiaotong ○多田 浩之1，川原 一芳2，高田 春比古1（1東北大・歯・口腔微生物， Univ.） 2関東学院大・理工・生命科学）

Antimicrobial effect of mannose-binding lectin against Lactobacillus-derived soluble peptidoglycan fragments genus Leptospira promote autophagy induction 1 1 2 1 1 ○Rintaro Tomioka , Jun Xu , Yijie Guo , Emiko Isogai ( Dept. Anim. ○Hiroyuki Tada1, Kazuyoshi Kawahara2, Haruhiko Takada1 (1Div. 2 Microbiol., Grad. Sch. Agri. Sci., Tohoku Univ., Dept. Immunobiol. Oral Microbiol., Grad. Sch. Dent., Tohoku Univ., 2Dept. Biosciences, Patho. Biol., Sch. Med., Xi’an Jiaotong Univ.) College of Sci. Eng., Kanto Gakuin Univ.)

Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic bacteria, 【緒言】ペプチドグリカン（PG）は，細菌細胞壁の骨格成分であり， genus Leptospira. In innate immunity, mannose binding lectin (MBL) アジュバント活性を始めとする多彩な免疫・生物学的活性を有 activates the complement pathway, in charge of frontline defense している。宿主細胞の細胞質に発現するパターン認識レセプター during various infections. It is unclear whether MBL can bind である Nod1 および Nod2 は，それぞれ PG の γ-D-Glu-mesoDAP with Leptospira, leads an anti-leptospiral activity. In this study, we （iE-DAP）およびムラミルジペプチド（MDP）構造を認識して自 investigated anti-leptospiral effect of MBL in bovine serum. 然免疫応答を発現する。オートファジーは細胞内の自己蛋白質 We demonstrated mannose-repeating unit (MRU) as a sugar を分解することで恒常性維持を担うほか，細胞内に侵入した細 component on the cell surface in many leptospiral strains. Six 菌を分解・排除して感染防御にも働く。本研究は，Lactobacillus representative strains were incubated in 40% fresh bovine serum PG の可溶化フラグメントによるオートファジー誘導について検 with MBL, and then the viability was assessed by observing under 討した。【材料と方法】Lactobacillus brevis 細胞壁を，SDS および dark-field microscopy. Anti-MBL antibody was used for MBL トリクロル酢酸処理による粗 PG 画分，同画分をリゾチーム処理 blocking experiment. した可溶性画分（リゾチーム処理 PG），さらに NaOH 処理によ All strains were able to survive after the treatment of bovine serum りリポペプチドを除去した画分（NaOH 処理 PG）を調製した。 except Patoc I. MRU-rich strains such as Moulton and Akiyami マウス樹状細胞株 DC2.4 を各種 PG 関連標品で刺激後，LC3 type A decreased the viability after MBL was added into the bovine II（LC3-II）発現をウェスタンブロット法で測定した。【結果と serum. In contrast, MRU-lacked strain Hond Utrecht IV, Pomona, 考察】DC2.4 細胞を L. brevis 由来 NaOH 処理 PG 画分で刺激する and Okinawa still remained survival. These are consistent with the と，LC3-II 発現が亢進した。同作用は陽性対照の MDP よりも強 different expression level of MRU among strains. Meanwhile, such かった。他方，粗 PG 画分ならびにリゾチーム処理可溶性 PG 画 antibacterial effect of MBL was attenuated in the presence of anti- 分の作用は弱かった。Lactobacillus PG による Nod2 を介すると推 MBL antibody, this suggests that MBL is involved in the immune 測されるオートファジー誘導の増強は，細胞内寄生性細菌の感 responses against Leptospira in domestic animals such as cattle. 染防御に有用であると考えられる。現在，PG によるオートファ ジー誘導作用について，様々な PG 関連標品の検討，レセプター / シグナル伝達系の検討ならびにマクロファージや上皮細胞など 他の細胞による検討を進めている。 会員外共同研究者：西岡 貴志（東北大院・歯・口腔診断）

P2-163 A Disrupted PI4P-Enriched TGN Induced by P2-164 マクロファージの Hypoxia-inducible factor- Group A Streptococcus Contributes to Xenophagy 1α による結核菌の増殖調節機構 ○野澤 孝志，野澤 敦子，中川 一路（京大院・医・微生物） ○岡 真優子1，尾 関 百合子2，山 口 雄大2，松 本 壮吉2（1京都府立大院・ 生命環境・食環境安全性，2新潟大学院・医・細菌） ○Takashi Nozawa, Atsuko Nozawa, Ichiro Nakagawa (Dept. Micribiol., Grad. Sch. Med., Kyoto Univ.) Hypoxia-inducible factor-1alpha in macrophages suppresses intracellular growth of M. tuberculosis Group A Streptococcus (GAS; Streptococcus pyogenes) is a major ○Mayuko Osada-Oka1, Yuriko Ozeki2, Takehiro Yamaguchi2, Sohkichi human pathogen that invades human epithelial cells. After invading Matsumoto2 (1Grad. Sch. Life Enviro. Sci., Kyoto Pref. Univ., 2Dept. though endocytosis, GAS escapes into the cytoplasm by secreting Bacteriol., Grad. Sch. Med., Niigata Univ.) streptolysin O (SLO), but is targeted by autophagosomes-termed GAS-containing autophagosome-like vacuoles (GcAVs)-and degraded. 【研究目的】結核（症）は，マクロファージ（Mφ）などに寄生 However, the intracellular host-GAS interactions besides autophagy する細胞内寄生菌のグラム陽性結核菌 Mycobacterium tuberculosis that occur during GAS infection are largely unknown. Here, we による慢性の肺肉芽腫性疾患である。我々は，転写因子 hypoxia- show that GAS invasion induces Golgi fragmentation and inhibits inducible factor-1α（HIF-1α）を発現する Mφ が，肺結核肉芽腫に retrograde transport in infected epithelial cells, and the fragmented 発現しており，HIF-1α が Mφ 内での結核菌増殖に影響を与える trans-Golgi network (TGN) contributes to GcAV formation ことを見いだした。そこで，結核菌増殖の調節を行う HIF-1α の and restricts the proliferation of intracellular GAS. Our results ターゲット因子を探索した。 demonstrated that Golgi fragmentation was triggered in a SLO- 【研究方法・結果】Cre-loxP システムにより作製した Mφ HIF-1α dependent manner, and that the dispersed TGN-derived elements コンディショナル欠損マウス（HIF-1α CKO）および野生型マウ were recruited to GcAVs. Golgi-resident Rab30 regulated the fusion ス（WT）由来の単球系 Mφ に，M. tuberculosis を 12 時間感染し between the fragmented TGN and GcAVs and was required for た後，interferon-γ（IFN-γ）により活性化された Mφ 内での菌の autophagy-mediated degradation of intracellular GAS. Furthermore, 増殖を経時的に比較した。IFN-γ 活性化 WT Mφ に比べ，HIF-1α the fragmented TGN contained phosphatidylinositol 4-phosphate CKO MΦ では菌の増殖が有意に上昇しており，HIF-1α は活性化 (PI4P), and inhibitors of PI4P-synthesizing enzymes impaired Mφ 内での菌の増殖抑制に重要な役割を持つと考えられた。また， GcAV formation and allowed GAS proliferation; this suggests that Mφ では，M. tuberculosis 感染に伴い HIF-1α 依存的に解糖系酵素 PI4P regulates, through the TGN, autophagy directed against GAS が誘導されており，グルコース濃度依存的に Mφ 内の結核菌が infection. 増殖したことから，HIF-1α による菌の増殖調節機構にはグルコー スの関与が示唆された。さらに乳酸脱水素酵素を CRISPR 法に よって knockout したマウス Mφ で菌の増殖が促進された。 【考察】結核菌感染 Mφ において，HIF-1α は乳酸脱水素酵素を誘 導し Mφ 内での結核菌の増殖を抑制する可能性が示された。

151 P2-165 サルモネラ感染による免疫応答と SCV 形成に P2-166 HDL-cholesterol suppresses the production おける抑制性レセプター Ly49Q の役割 of cytokines from M. tuberculosis infected macrophages ○半田 浩，反町 典子（国際医療セ・分子炎症制御プロジェクト） ○井上 学1，仁木 満美子1，尾関 百合子2，岡 真優子3，凪 幸世5，一 瀬 休生4，金子 幸弘1，濱野 真二郎5，松本 壮吉2（1大 阪 市 大・院・医・ Role of inhibitory receptor Ly49Q on SCV formation and 細菌学，2新潟大・院・医歯・細菌学，3京都府立大・院・生活環境科 inflammatory response triggered by Salmonella 学・食環境安全性学，4長崎大・熱研・ナイロビ研究拠点，5長崎大・ ○Yutaka Handa, Noriko Toyama-Sorimachi (Dept. Molecular 熱研・寄生虫学） Immunology and Inflammation, National Center for Global Health and ○Manabu Inoue1, Mamiko Niki1, Yuriko Ozeki2, Mayuko Oka3, Medicine) Sachiyo Nagi5, Yoshio Ichinose4, Yukihiro Kaneko1, Shinjiro Hamano5, 2 1 Ly49 ファミリーメンバーである Ly49Q は，プラズマ細胞様樹 Sohkichi Matsumoto ( Dept. Bacteriol. Grad. Sch. Med., Osaka City Univ., 2Dept. Infectious Disease Control and International Medicine, 状細胞や好中球，そしてマクロファージに特異的に発現して 3 いる。これまでに我々は Ly49Q が細胞内領域に存在する ITIM Niigata Univ. Grad. Sch. Medical and Dental Science, Food Hygine （Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif）のチロシンリ and Environmental Health Div. Applied Life Science, Grad. Sch. Life and Environmental Science, Kyoto Prefectural Univ., 4Nagasaki Univ. ン酸化依存的にフォスファターゼを含む種々のシグナル伝達分 5 子を会合して炎症制御に関与していることを報告しているが， Nairobi Research Station, Dept. Parasitology, Institute of Tropical 細菌感染時における免疫応答への関わりは不明であった。そこ Medicine, Nagasaki Univ.) で，細菌感染下における の役割を解明するためネズミチ Ly49Q 結核は Mycobacterium tuberculosis による最大級の細菌感染症で フス菌（ ）による感染 Salmonella enterica serovar Tyhimurium: ST あり，2014 年には 940 万人の新規発症者と 150 万人の死亡者が 実験を行った。野生型および Ly49Q-KO マウス由来の腹腔マク 報告された。感染後，ただちに発症する一次結核は約 5% と稀で ロファージに ST を感染させ，マクロファージ内増殖能を観察 あるが，一度感染した菌は終生，生体内で生存し続け（潜在性 した結果，Ly49Q-KO マクロファージでは野生型と比較して細 結核），宿主の免疫力低下に伴い，発症する（内因性再燃）。ま 胞内生菌数が上昇していた。ST は SCV（Salmonella-containing た成人型肺結核の多くが，この内因性再燃に起因することから， vacuole）を形成して細胞内増殖を果たすことから，SCV を観察 潜在性結核の診断技術および治療薬の開発に向けた病態の解明 した結果，興味深いことに Ly49Q-KO マクロファージでは野生 は，結核を制圧する上で，非常に重要な意味を持つ。しかしリス 型と比較して巨大な SCV を形成していた。さらに ST 感染下に ク因子を始め，その詳細なメカニズムについては未だ明らかに おける免疫応答を評価するために炎症性サイトカイン産生を解 されていない。我々は，以前に結核高負担国にて，潜在性結核 析した結果，Ly49Q-KO マクロファージでは IL-6 の産生低下と 菌感染に対するリスク因子として High-Density Lipoprotein（HDL- 共に誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の発現低下が認められ cholesterol）を推定した。そこで本研究は，HDL-cholesterol が結 た。そして，iNOS，IL-6 の発現を制御している NF-κB 活性化も 核菌感染防御において中心的な役割を担うマクロファージに与 同様に低下していた。以上の結果から Ly49Q はサルモネラ感染 える影響について解析した。その結果，HDL-cholesterol はマク において SCV 形成と共に，免疫応答を促進してサルモネラの細 ロファージの貪食能を促進するとともに，病原体認識に重要な 胞内増殖抑制に深く関与していることが明らかとなった。今後 役割を担う Pattern-recognition receptor の発現抑制を介し，結核 防御的サイトカインの産生を著しく抑制することを明らかにし は Ly49Q がどのように上記の役割を制御しているか詳細な解析 た。以上の結果から，リスク因子と推定された HDL-cholesterol を行っていく予定である。 は結核菌によるマクロファージへの侵入を容易にするとともに， 免疫活性を阻害することで，細胞内における長期的な生存維持 に大きく寄与することが判明した。

P2-167 Mycoplasma pneumoniae の分泌型 Nuclease P2-168（WS18-5） 肺炎球菌の菌体表層タンパク は好中球 NETs による殺菌の回避に関与する PfbA による自然免疫回避機構の解析 ○山本 武司，桑野 剛一，木田 豊，坂本 勇一（久留米大・医・感染 ○山口 雅也1，広瀬 雄二郎1,2，住友 倫子1，中田 匡宣1，川端 重忠1 医学） （1阪大院・歯・口腔細菌，2名大院・医・泌尿器）

Secretory nuclease of Mycoplasma pneumoniae Molecular analysis of pneumococcal surface protein contributes to evasion of NETs-mediated killing PfbA in the evasion from host innate immunity ○Takeshi Yamamoto, Koichi Kuwano, Yutaka Kida, Yuichi Sakamoto ○Masaya Yamaguchi1, Yujiro Hirose1,2, Tomoko Sumitomo1, (Dept. Infect. Med., Sch. Med., Kurume Univ.) Masanobu Nakata1, Shigetada Kawabata1 (1Dept. Oral Mol. Microbiol., Grad. Sch. Dent., Osaka Univ., 2Dept. Urol., Nagoya Univ., M. pneumoniae（Mp）感染に伴うマイコプラズマ肺炎では，肺内 Grad. Sch. Med.) への著明な好中球浸潤を認める事が知られている。近年，好中 球が neutrophil extracellular traps（NETs）と呼ばれる網目状の殺 肺炎球菌は，健常な小児の口腔から約 30% の頻度で分離される 菌性分子を放出し，病原体を捕捉・殺菌する事が明らかとなった。 一方で，肺炎などの侵襲性感染症の主たる原因菌である。肺炎 Mp 感染防御における本因子の関与は不明であるが，Mp は好中 球菌性肺炎においては感染局所に多数の好中球が流入し，炎症 球の殺菌機構に抵抗性を示す事が知られており，本因子に対し 応答が引き起こされる。しかし，肺炎球菌はしばしば好中球に ても何らかの殺菌抵抗性機構を備えていると予想される。そこ よる殺菌機構を回避して深部に侵入し，敗血症や髄膜炎を惹起 で本研究では，Mp が NETs 抵抗性を示すか，またその抵抗性に する。本研究では，肺炎球菌が宿主の自然免疫機構を回避する はどのような分子が関与するかについて解析を行った。 メカニズムを解明するため，菌体表層タンパク PfbA に着目し， まず，ヒト末梢血由来の polymorphonuclear leukocytes（PMNs） その機能解析を行った。ヒト好中球と肺炎球菌を混和し，1～3 を用いて，Mp が NETs 抵抗性を示すか NETs killing assay にて 時間後の菌体生存率を比較した。その結果，pfbA 遺伝子の欠失 調べた。その結果，Mp は PMNs の NETs 依存的な殺菌を回避す により有意に生存率が低下した。一方，アクチン重合阻害剤で る事がわかった。その詳細を明らかにする為，Mp の生菌及び死 好中球を処理した場合，野生株と pfbA 遺伝子欠失変異株の生存 菌を用いて，PMNs からの NETs 形成，NETs 形成に関わるヒス 率に差が認められなかった。また，好中球に TLR2/4 阻害ペプ トンのシトルリン化及びヒストンの細胞外放出を比較解析した。 チドを添加した場合，コントロールペプチド添加群と比較して， その結果，生菌と死菌は同様に NETs の形成を惹起するが，生 野生株の生存率に有意な変化は認められなかったが，pfbA 遺伝 菌は形成された NETs を分解する事が明らかとなった。続いて， 子欠失変異株の生存率はおよそ 2 倍に上昇した。次に，好中球 この NETs の分解に関与する分子の解析を行った結果，Mp は と肺炎球菌を混和し，タイムラプス顕微鏡観察を行ったところ， NETs 分解活性を示す Nuclease を分泌・産生する事がわかった。 pfbA 欠失株は混和後 1 分以内に貪食されたのに対し，野生株は さらに，この Nuclease を産生しない変異株をトランスポゾン変 5 分以上が経過した後にも貪食されなかった。さらに，組換え 異株ライブラリより抽出し，その NETs 抵抗性を調べた結果，こ PfbA を固相化した蛍光マイクロビーズまたは非固相化ビーズを の変異株は NETs を分解せず，PMNs の NETs 依存的な殺菌作用 好中球もしくは単球と混和した後，細胞の蛍光強度を指標に各 に感受性を示す事が明らかとなった。 ビーズに対する貪食能を検討した。非固相化ビーズと比較して， 以上の結果から，Mp 感染に応答して PMNs は NETs 放出するが， PfbA 固相化ビーズの好中球ならびに単球に取り込まれる割合は Mp は Nuclease を産生・分泌する事で NETs を分解し，その殺菌 低かった。以上の結果から，肺炎球菌の菌体表層タンパク PfbA は， 作用を回避する事が明らかになった。 好中球に直接的に作用することで貪食を抑制する働きを有する ことが示唆された。

152 日本細菌学雑誌 71（ 1 ）， 2016

P2-169 Group B streptococcus sialic acid promotes P2-170（WS10-7） A novel bacterial transport resistance against platelet antimicrobial killing mechanism of Acinetobacter baumannii via activated ○深堀 響子1，Victor Nizet2，内山 聡2（1新潟大・医，2Dept. Ped. human neutrophils Sch. Med. UCSD） ○鴨志田 剛，上田 たかね，永川 茂，祖母井 庸之，斧 康雄（帝京大・ 医・微生物） ○Kyoko Fukahori1, Victor Nizet2, Satoshi Uchiyama2 (1Sch. Med., Niigata Univ., 2Dept. Ped. Sch. Med. UCSD) ○Go Kamoshida, Takane Ueda, Shigeru Nagakawa, Tsuneyuki Ubagai, Yasuo Ono (Dept. Microbiol. and Immunol., Teikyo Univ. Sch. Recent research shows the importance of circulating platelets in Med.) innate immunity. We found that platelets killed methicillin-resistant Staphylococcus aureus significantly, whereas strains of different Group Background: Hospital-acquired infections due to Acinetobacter B streptococcus (GBS) serotypes exhibited remarkable resistance baumannii have become problematic due to the acquisition of high against platelet-mediated killing. In this project we explored the drug resistance. Although neutrophils play a critical role in early potential mechanisms of GBS resistance to platelet antimicrobial protection against bacterial infection, the details of interaction with activation. GBS express a polysaccharide capsule with sialic acid A. baumannii remain largely unknown. Methods: To elucidate that mimic sialic acid on human cells. Previously, we reported that the interaction between A. baumannii and human neutrophils, we interaction of GBS sialic acid with Sia-recognizing immunoglobulin observed the co-cultivating form by microscopy or scanning electron superfamily lectins (Siglecs) on neutrophils suppresses their microscopy and analysed it by flow cytometry. We next examined activation and microbicidal activity. We report for the first time that infiltration into Matrigel basement membranes of neutrophils and A. platelets express multiple Siglecs. Platelets bound to GBS wild- baumannii by the in vitro transmigration assay. Results: We found type (wt) bacteria significantly better compared to an isogenic that A. baumannii strongly adhered to neutrophils. Furthermore, sialic acid-deficient mutant strain ΔneuA. GBS ΔneuA activated neutrophils were activated by A. baumannii and enhanced invasive platelet degranulation significantly than the GBS wt parent strain. ability through increased interleukin (IL)-8 production. More GBS ΔneuA was significantly more susceptible to killing by human interestingly, A. baumannii was transported together by infiltrating platelets and activated platelet releasates than the wt strain. Our neutrophils. Moreover, the transport of A. baumannii was suppressed studies indicate that GBS sialic acid has dual role in evading platelet by inhibiting the infiltration of neutrophils by blocking the effect antimicrobial immunity: inhibiting activation of platelets through of IL-8. Conclusions: A. baumannii appears to be transported by engagement of inhibitory Siglec receptors and by conferring intrinsic hijacking neutrophils; therefore, the mechanism behind the novel resistance to platelet-derived antimicrobial components. bacterial transport will be referred to as the ‘bacterial immunity taxi’.

P2-171 サルモネラ感染による骨髄 B 系列細胞の傷害 P2-172（WS18-4） 口腔常在菌 Streptococcus ○山崎 禅1，高屋 明子1，Christian Maenne2，常世田 好司2，山本 友 intermedius が呼吸器疾患重症化に関与するメカニズム 3 1 2 子 （ 千葉大・院薬・微生物薬品化学， Deutsches Rheuma- ○弘田 克彦1，湯本 浩通2，村上 圭史1，平尾 功治2，天羽 崇1，三宅 Forschungszentrum Berlin，3千葉大・真菌セ） 洋一郎1（1徳島大・口腔微生物，2徳島大・歯科保存）

The reduction of B lineage cells in bone marrow by Mechanism involved in respiratory disease aggravation Salmonella infection by Streptococcus intermedius infection 1 1 2 ○Yuzuru Yamasaki , Akiko Takaya , Christian Maenne , Koji ○Katsuhiko Hirota1, Hiromichi Yumoto2, Keiji Murakami1, Kouji Hirao2, 2 3 1 Tokoyoda , Tomoko Yamamoto ( Dept. Microbiol. Mol. Genet., Takashi Amoh1, Yoitiro Miyake1 (1Dept. Oral Microbiol. Tokushima 2 Grad. Sch. Pharm. Sci., Chiba Univ., Deutsches Rheuma- Univ., 2Dept. Conserv. Dent. Tokushima Univ.) Forschungszentrum Berlin, 3Med. Mycol. Res. Cen., Chiba Univ.) 【目的】口腔常在菌 Streptococcus intermedius（Si）は，時に誤嚥 全身感染型サルモネラは宿主に感染すると致死的な病態をもた 性肺炎の起炎菌となり，また嚢胞性線維症患者からの分離報告 らす一方，宿主に持続感染することがある。サルモネラが持続 例も急増している。我々は，PAMPs である HLP に焦点を当て， 感染した宿主はサルモネラに対する免疫を獲得している。しか Si の菌体外 HLP（eSi-HLP）が病原性を発揮する分子メカニズ し，なぜサルモネラが宿主の免疫応答から回避しているかは未 ムを解析してきた（Cell Microbiol, 2008）。近年，グラム陽性菌 だに不明である。我々はマウスに持続感染する Lon 欠損株感染 でも extracellular vesicle（eV）の存在が報告され，eV により炎 モデルを用いて宿主免疫応答の解析を行ったところ，サルモネ 症惹起作用を有する物質が運搬されることも示されている（Nat ラが骨髄の B 前駆細胞や抗体産生細胞といった B 細胞を特異的 Rev Microbiol, 2015）。我々は，免疫電顕観察により，Si-HLP に減少させることを新たに見出した。 が eV 外表面に突出した状態で菌体外へ分泌される可能性を示 まず，C57BL/6 マウスに Lon 欠損株を 1×104 CFU で腹腔内投与 した。本研究では，単球や上皮細胞に対する eSi-HLP の反応性 により感染させ，4 日後の脾臓及び骨髄の免疫細胞数の変化を解 を解析し，呼吸器疾患重症化の分子メカ二ズムについて検討し 析した。脾臓が肥大しており，T 細胞，B 細胞，ミエロイド系細 た。【材料と方法】eSi-HLP がヒト単球系細胞（THP-1 細胞）に 胞すべてにおいて細胞数増加がみられたが，骨髄では B 前駆細 及ぼす影響について，DNA Microarray にて網羅的な遺伝子発現 胞と抗体産生細胞が減少した。脾臓での抗体産生細胞には影響 を，Mutiplex Bead Assay にて包括的にサイトカイン産生量を解 しなかった。この時，脾臓からは 2–4×104 CFU/organ の菌が検出 析した。ICAM-1 の局在と発現強度は，免疫組織学的蛍光染色及 されたが，骨髄からは 1–3×102 CFU/organ と少ない菌数であった。 び FACS により解析した。また，eSi-HLP が，口腔，咽頭，気道 この B 系列細胞の有意な減少は，サルモネラ培養上清投与時に 及び肺胞の各上皮細胞株の ICAM-1 発現に及ぼす影響も FACS と も認められた。さらに，LPS を除去した培養上清及びべん毛欠 ELISA にて解析した【結果と考察】Si-HLP は，THP-1 細胞から 損株の培養上清でも有意に B 系列細胞を減少させた。又，大腸 CXCL8, CXCL10, CCL2, CCL4 を各 2,000 pg/ml 以上の濃度で一括 菌の培養上清ではみられなかったことより，サルモネラ菌体外 放出させる誘導因子であった。呼吸器系では，これらの一括放 成分による特異的な免疫系への障害と考えられる。 出により自然免疫が過剰に活性化され，呼吸不全へと導かれる 以上より，サルモネラは感染早期に骨髄の B 前駆細胞と抗体産 可能性が指摘されている。また，単球や各上皮細胞での ICAM-1 生細胞の両方を傷害した結果，成熟 B 細胞と抗体の供給を阻害 の高発現誘導は，好中球等の炎症局所への集積等を惹起すると することで，宿主体内での生存を有利にしていると考えられる。 考えられる。本研究より，eV を含めた eSi-HLP の分泌産生制御が， 呼吸器疾患重症化に関与することが示唆された。

153 P2-173 IgG 依存的黄色ブドウ球菌の凝集はファージの P2-174 国内の豚群における多剤耐性病原性大腸菌系統 攻撃を妨げる の出現 ○丹治 保典1，田中 愛里1，谷 夏織1，栗本 実希1，宮永 一彦1（1東工 ○楠本 正博1，小椋 義俊2，後藤 恭宏3，岩田 剛敏1，林 哲也2，秋庭 大院・生命理工，2東工大・生命理工） 正人1,4（1動衛研・細菌寄生虫，2九大・医・細菌，3宮崎大・医・感染 症，4大阪府大院・生命環境） IgG-dependent aggregation of Staphylococcus aureus inhibits bacteriophage attack Emergence of a multidrug-resistant pathogenic ○Yasunori Tanji1, Airi Tanaka1, Kaori Tani1, Miki Kurimoto1, Kazuhiko Escherichia coli lineage in diseased swine in Japan Miyanaga1 (1Dept., Bioeng, Tokyo Inst. of Tech., 2Dept. Bioeng. Tokyo ○Masahiro Kusumoto1, Yoshitoshi Ogura2, Yasuhiro Gotoh3, Inst. of Technol.) Taketoshi Iwata1, Tetsuya Hayashi2, Masato Akiba1,4 (1Bact. Parasit. Dis. Res. Div., NIAH, NARO, 2Dept. Bact., Fac. Med. Sci., Kyushu Introduction: Staphylococcus aureus is an aggregating species, Univ., 3Dept. Infect. Dis., Fac. Med., Univ. Miyazaki, 4Grad. Sch. Life which easily forms clumps, biofilms, and abscesses. In this study, we Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.) identified the primary component that facilitates S. aureus aggregate formation, and analyzed the effect of aggregate formation on phage 毒素原性大腸菌（ETEC）および志賀毒素産生性大腸菌（STEC）は attack on host cells. Materials and methods: S. aureus phage 豚の下痢や浮腫病の原因となり，世界的には O8，O138，O139， ψSA012 was isolated from sewage influent. S. aureus strain SA003 O141，O147，O149，O157 などがその代表的な O 群血清型とされて was isolated from raw milk samples from cows with mastitis. SA003 いる。しかし国内では十分な調査が行われておらず，豚から分離さ was cultured in crude milk, skim milk, whey, or LB for 5 h at 37°C, れた病原性大腸菌の特徴については不明な点も多い。本研究では， and then stained with DAPI. To test the effect of IgG addition on 1991 年から 2014 年にかけて国内で下痢または浮腫病の豚から分離さ phage adsorption onto host cells, adsorption assays were conducted. れた病原性大腸菌 967 株について，O 群血清型，遺伝学的系統，病 Results: Polyclonal bovine IgG enhanced aggregation of SA003. 原性関連遺伝子保有状況，薬剤感受性などを調査した。その結果， IgG-dependent aggregation delayed lysis of SA003 by the specific 国内では O139，O149，O116，OSB9（Shigella boydii 9 型）の 4 種が bacteriophage (ψSA012). Addition of IgG also lowered the phage- 全体の 71% を占める主要な O 群血清型であった。O139 および O149 host adsorption rate constant. IgG-dependent S. aureus aggregation はパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）によりそれぞれ O 群血清 in crude milk is a problem that must be solved before phage therapy 型特異的なクラスター（I および II）に分類されたが，O116 と OSB9 can be successfully used to treat bovine mastitis caused by this は同一のクラスター（III）に分類された。PFGE クラスター III に属 bacterium. するすべての株が MLST により単一のシークエンスタイプ（ST88） に分類され，エンテロトキシン（LT/ST）および志賀毒素（Stx2e） 両方の遺伝子を保有していた。また，様々なカテゴリーの抗菌剤 21 種に対する感受性を調べたところ，PFGE クラスター III/ST88 に属す る菌株は高度な多剤耐性（4～15 剤・平均 9.3 剤）を有しており，驚 くべきことにその 90% がフルオロキノロン耐性であった。以上の結 果より，家畜飼養環境への PFGE クラスター III/ST88 の浸潤は，そ の毒素産生性および薬剤耐性の点から畜産における重大なリスクと 考えられる。会員外共同研究者：彦田夕奈（愛媛家保），藤井勇紀（茨 城県北家保），村田美聡（熊本中央家保），三好洋嗣（佐賀中部家保）

P2-175 腸管出血性大腸菌 O157 の臨床分離株で見出さ P2-176 同一患者より分離された Helicobacter pylori れた一塩基変異による RpoS の機能不全 の多様性について ○岩瀬 忠行，田嶌 亜紀子，水之江 義充（東京慈恵会医科大学・細菌 ○吉良 瑞喜，岡崎 亜美，森本 徳仁，竹内 啓晃（高知大・医・病態 学講座） 情報）

RpoS desfunction of Escherichia coli O157 by single Diversity among Helicobacter pylori strains from a point mutation patient ○Tadayuki Iwase, Akiko Tajima, Yoshimitsu Mizunoe (Dept. ○Mizuki Kira, Ami Okazaki, Norihito Morimoto, Hiroaki Takeuchi Bacteriol., Sch. Med., Jikei Univ.) (Dept. of Clin. Lab. Med., Kochi Med. Sch.)

腸管出血性大腸菌 O157 の臨床分離株のストレス抵抗性を調べ 【はじめに】Helicobacter pylori（ピロリ菌）は消化器系疾患のみ る中で，RpoS を発現するが，RpoS 機能の指標となるカタラー ならず多彩な病態に関与する病原性細菌である。本菌は著しい ゼ（HPII）の活性が著しく低下している菌株が見つかった。本 genetic diversity があるが，実地臨床では 1 株での検査しか行な 菌株の rpoS の塩基配列を解析したところ，2 カ所の missense 変 われていない。今回，同一患者から分離された複数の臨床分離 異が確認された。一つは，residue 33 のグルタミン（Gln）がグ 株を用いて薬剤感受性試験及び遺伝子多型性を検証し株間の多 ルタミン酸（Glu）に変わっており，もう一方は，domain 2 に存 様性について解析した。【材料・方法】内視鏡下 3 ヵ所（胃前庭部， 在するイソロイシン（Ile）がアスパラギン（Asn）に変わって 体部，腫瘍部）の生検を実施し，各々最低 5 株を目標に臨床分 いた。前者は，臨床分離株でよく見られる RpoS の機能に影響を 離株を採取した。ピロリ菌は Vi ヘリコ寒天培地で増殖，グラム 与えない変異であるため，本菌株の表現型は，domain 2 におけ 染色，ウレアーゼ試験及び PCR にて確認した。培養は 10% ウマ る変異によるものと考えられた。そこでこれを明らかにするた 血清添加 Brucella Broth（BB）培地を使用した。薬剤感受性試験： め，大腸菌 K-12 株の rpoS の domain 2 に変異を導入したところ， MNZ，AMPC，CAM，STFX を使用した。前 3 種は E-test を用 上記の O157 臨床分離株と同様，RpoS の発現は認められたが， いて，STFX は寒天希釈法にて MIC を求めた。遺伝子多型性解析： HPII 活性は認められなかった。Domain 2 の Ile を種々のアミノ ピロリ菌から gDNA を抽出し PCR およびシーケンスを実施し 酸（Asp，Gln，Glu，Lys，Pro）に置換したところ，HPII 活性 た。【結果】薬剤感受性試験結果から，同一患者から分離した株 はほとんど認められなかったが，Leu，Ala，Met，Phe に置換し 中には感受性株と耐性株が混在していることが明らかとなった。 た場合では HPII の活性が認められた。また，RpoS の転写機能 さらに耐性株間の MIC に大きな差を認めた。遺伝子多型性解析 を β-galactosidase を用いた reporter assay により検討したところ， では病原因子である CagA 遺伝子の EPIYA motif にアミノ酸配列 HPII の活性と同様，Asp，Gln，Glu，Lys，Pro に置換した株で の多型が認められた。【結論・考察】薬剤感受性試験の結果から は転写活性は認められなかったが，Leu，Ala，Met，Phe に置換 株間の MIC に大きな差が認められ，さらに遺伝子多型性解析で した場合では活性が認められた。これらの結果から，今回見出 はアミノ酸配列に多型を認めた事から，同一患者に感染してい された domain 2 の変異箇所は，RpoS の転写活性機能にきわめて るピロリ菌の多様性が示唆された。引き続き被験者数を増やし， 重要な役割を担っていると考えられる。RpoS の DNA への結合 網羅的な遺伝子多型解析を行う予定である。〈共同研究者：松村 能や RNA ポリメラーゼとの相互作用にどのような影響をおよぼ 敬久，杉浦哲朗，矢野有佳里，水田洋，小野正文〉 すのかを解析することで，本変異による RpoS の機能不全につい て，分子レベルでの理解が深まるものと考えられる。

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P2-177 国内初 VanD 型バンコマイシン耐性 P2-178 北海道における肺炎球菌血清型とマクロライド Enterococcus faecium の検出 耐性遺伝子型の経時的変化 ○久恒 順三1，小原 忠博2,4，大地 哲郎4，明見 能成4，谷本 弘一5，富 ○川口谷 充代，漆原 範子，Meiji Soe Aung，小林 宣道（札幌医科大・ 田 治芳5，大毛 宏喜2,3，菅井 基行1,2（1広島大院・医歯薬保健学・細 医・衛生学） 菌学，2広島大・院内感染プロジェクト研究センター，3広島大学病院 感染症科，4広島赤十字・原爆病院，5群馬大院・医・細菌学） Temporal changes in serotypes and macrolide resistance genotypes of S. pneumoniae in Hokkaido First clinical isolate of VanD-type Vancomycin-resistant ○Mitsuyo Kawaguchiya, Noriko Urushibara, Meijisoe Aung, Enterococcus faecium in Japan Nobumichi Kobayashi (Dept. Hygiene, Sapporo Med. Univ., Japan) ○Juno Hisatsune1, Tadahiro Ohara2,4, Tetsuro Daichi4, Norinari Myoken4, Koichi Tanimoto5, Haruyoshi Tomita5, Hiroki Ohge2,3, In Japan, 7-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV7) was Motoyuki Sugai1,2 (1Dept. Bacteriol., Grad. Sch. Biomed. Heal. Sci., introduced as routine immunization program in Apr. 2013, and Hiroshima Univ., 2Proj. Res. Cen. Noscom. Infect. Dis., Hiroshima replaced by PCV13 in Nov. 2013. Distribution of serotypes and Univ., 3Dept. Infect. Dis. Infect., Hiroshima Univ. Hospit., 4Hiroshima macrolide resistance (MR) genotypes were investigated for a total of Red Cro. Hospit., 5Dept. Bacteriol., Lab. Drug Resist., Gunma Univ.) 1097 (975, children; 122, adults) and 960 (873, children; 87, adults) noninvasive pneumococcal clinical isolates in Hokkaido, in the バンコマイシン（VCM）耐性腸球菌（VRE）は院内感染菌とし PCV7- and PCV13-routine immunization periods (Apr.-Oct. 2013 て重要であり，国内において増加傾向にある。国内での主な分 and Nov. 2013-Nov. 2014, respectively). Serotype was determined 離菌種は，E. faecalis 及び E. faecium であり，遺伝子型は VanA by sequential multiplex PCR and additional genetic analyses. MR 型が最も多く，次いで VanB 型である。現在，VCM 耐性遺伝子 genes ermB and mefA/E were detected by PCR. Although the most は 9 種類が報告されている。このうち，VanD 型は世界でも 10 prevalent serotypes in children were 23A and 6C in the PCV7 例のみで極めて稀である。症例は高血圧，糖尿病などを加療中 period, after replacement with PCV13, 19A became the most の 73 歳女性で，濾胞性リンパ腫と診断され，入院加療となっ common followed by 6C, 15A, and 23A. Among adults, serotype 3 た。咽頭培養より MRSA が検出され，個室隔離にて VCM 吸入 was consistently the most frequent throughout the study periods. 療法開始したが，便から VRE が検出された。分離された VRE Compared with previous study in the pre-PCV7 routine immunization について遺伝子型解析を行った。van 遺伝子型の解析は PCR に period, PCV7 serotypes decreased from 48.3% to 3.3% in the PCV13 て決定した。また，イルミナ社 MiSeq を用いて，本株のゲノム period among children, while the rates of non-PCV13 serotypes 概要配列を取得し，van 遺伝子配列及びその周辺構造について (particularly 15A, 23A, 11A, and 35B) increased up to 75.1%. In the 各 遺伝子型と比較解析した。便培養より検出された van VRE PCV13 period, ermB, mefA/E, and both of these genes were detected （ ）は， 解析により 型と判定された。ゲノ E. faecium PCR VanD in 75.8%, 31.6%, and 11.3% of all isolates, respectively. Serotype 19A ム配列解析の結果， 遺伝子クラスターは 型高頻度接 VanD pMG1 accounted for 76.9% of the isolates with both MR genes and non- 合伝達性プラスミド上の topoisomerase 遺伝子内に IS family 256 PCV13 serotypes 15A, 15C, and 23A mostly harbored ermB. transposase を介して挿入されている事が判明し，このプラスミ ドを pEFV-D と名付けた。また，接合伝達実験の結果，pEFV-D は同菌種間で 104～105 の頻度で伝達することがわかった。VanD 型は，国内では 2006 年に初めて E. raffinosus で分離された 1 例 のみである。今回の解析から，分離された VanD 型の E. faecium は， 日本国内において初めての報告である。

P2-179 Mycobacterium avium から分離された新規プ P2-180 ミャンマーにおける病院獲得型ブドウ球菌の薬 ラスミド，pMAH135 の特徴 剤耐性と遺伝学的特徴 ○打矢 惠一，二改 俊章（名城大・薬・微生物） ○Meijisoe Aung，川口谷 充代，漆原 範子，小林 宣道（札幌医科大 学医学部衛生学講座） Characterization of a novel plasmid, pMAH135, from Mycobacterium avium Drug resistance and genetic characteristics of hospital- ○Kei-ichi Uchiya, Toshiaki Nikai (Dept. Microbiol., Fac. Pharm., Meijo acquired staphylococcal isolates in Myanmar Univ.) ○Meijisoe Aung, Mitsuyo Kawaguchiya, Noriko Urushibara, Nobumichi Kobayashi (Dept. Hygiene, Sapporo Med. Univ. Sch. Mycobacterium avium causes mainly two types of disease. The Med.) first is disseminated disease in immunocompromised hosts, such as individuals infected by human immunodeficiency virus (HIV). S. aureus has been reported as the major pathogen of various The second is pulmonary disease in individuals without systemic infectious diseases. However, there is no study on molecular immunosuppression, and the incidence of this type is increasing epidemiology of staphylococci from health care setting in Myanmar. worldwide. Here, we report the characteristics of a novel plasmid, We analysed drug resistance and genetic characteristics for a total designated pMAH135, derived from M. avium strain TH135 in a of 128 clinical isolates of staphylococci from a tertiary hospital in patient with pulmonary M. avium disease. The pMAH135 plasmid Myanmar during 2012–2013. The dominant species was S. aureus consists of 194,711 nucleotides and encodes 164 CDSs. Interestingly, (39%) and S. haemolyticus (35%), followed by S. epidermitis (6%), and it contains CDSs with sequence homology to mycobactin S. saprophyticus (5%). Majority of S. haemolyticus isolates (71.1%) biosynthesis proteins and type VII secretion system-related proteins, harboured mecA gene, showing high resistance rate to ampicillin, which are involved in the pathogenicity of mycobacteria. Screening cephalosporin, erythromycin and levofloxacin, while MRSA was only of isolates from humans and pigs for genes located on pMAH135 8% (4 isolates) among S. aureus and belonged to type-IV SCCmec. revealed that the detection rate of these genes was higher in Detection rate of PVL genes among S. aureus was notably high (40%, clinical isolates from pulmonary M. avium disease patients than in 20 isolates), among which only one isolate was MRSA belonging those from HIV-positive patients, whereas the genes were almost to ST88/spa-t729/agr-III/coa-IIIa and remaining 19 MSSA isolates entirely absent in isolates from pigs. Collectively, the pMAH135 were classified into six different STs (ST8, ST121, ST1153, ST1155, plasmid contains genes associated with M. avium’s pathogenicity and ST1930, ST3206). The most common sequence type was ST121 resistance to antimicrobial agents. The results of this study suggest in the PVL-positive MSSA (47%, 9/19), harbouring genes of bone that pMAH135 influence not only the pathological manifestations of sialoprotein and variant of elastin binding protein as a distinctive M. avium disease, but also the host specificity of M. avium infection. feature. Novel coa type XIIIa was detected in MSSA isolate with （非会員共同研究者：中川 拓，小川賢二） ST1153. ST59 PVL-negative MRSA and MSSA had more resistance genes than other MRSA and PVL-positive MSSA, showing resistance to various antimicrobials.

155 P2-181 腸管出血性大腸菌 O26 の高病原性系統の同定 P2-182 国内における腸管出血性大腸菌 O146 の発生動 ○石嶋 希1，伊豫田 淳1，井口 純2，Working Group EHEC1，大西 真1 向について 1 2 （ 感染研・細菌第一， 宮崎大・農） ○石原 朋子1，伊豫田 淳1，寺嶋 淳2，泉谷 秀昌1，大西 真1，Working Group EHEC3（1感染研・細菌第一，2国衛研・衛生微生物，3地衛研） Identification of a high-virulence lineage of EHEC O26 isolates Trend of enterohemorrhagic E.coli O146 in Japan ○Nozomi Ishijima1, Sunao Iyoda1, Atsushi Iguchi2, Working Group ○Tomoko Ishihara1, Sunao Iyoda1, Jun Terajima2, Hidemasa EHEC1, Makoto Ohnishi1 (1Dept. Bacteriol. I., Nat. Inst. Infect. Dis., Izumiya1, Makoto Ohnishi1, Working Group EHEC3 (1Dept. Bacteriol. 2Fac. Agricul., Miyazaki Univ.) I, Nat. Inst. Infect. Dis., 2Dept. Microbiol., Nat. Inst. Health Sci., 3Pref. Muni. Pub. Health Inst.) 腸管出血性大腸菌（EHEC）の主要な病原性因子である志賀毒 素（Stx）は Stx1 と Stx2 の 2 つに大別され，Stx2 は Stx1 よりも 【背景と目的】1999 年以降，国内で報告される腸管出血性大腸菌 感染患者の重篤化により密接に関係しているものと考えられて （enterohemorrhagic E.coli : EHEC）の感染者数は毎年 3,000 例（ 無 いる。国内で分離される EHEC のうち，O26 は O157 に次いで 2 症状保菌者を含む）を超える。分離された EHEC の O 群は例年 番目に分離頻度の高い血清群である。O26 のほとんどは stx1 の O157 が最も多いが，近年 non-O157 の分離株数が増加している。 みを保有するが，近年重症例を中心に stx2 のみを保有する O26 さらに，同一感染源による感染事例が広域で散発的に発生する が分離されている。stx2 のみを保有する O26 株は，Multi-locus 事例が増加傾向にあり，それらの動向には注意が必要である。 sequence typing（MLST）解析からSequence type（ST）21 と EHEC の国内サーベイランスにおいて，2013 年以降 EHEC O146 ST29 の 2 系統に分類されることが報告されている。我々は，国 分離株数の増加が認められる。本研究では，国内における流行 内で分離された EHEC O26 の stx2 保有（stx2 のみ，または stx1 株の把握，広域・散発的発生事例の探知，およびこれらの原因 stx2 の両方）株を用いて高病原性系統の同定を試み，MLST によ 究明や今後の発生予防・対策に寄与するため，分子疫学解析に る系統解析および stx1/2 遺伝子保有パターンによる分類と，各系 より EHEC O146 の発生動向を調べた。 統株における Stx2 産生能の相関を解析した。その結果，stx2 の 【方法】2007 年以降に地方衛生研究所等から感染研・細菌第一部 みを保有する株のうち，ST29 に Stx2 高産生性株が存在すること に送付されたヒト由来の EHEC O146 分離株 62 株（2015 年 10 を昨年度の本大会で発表した。本研究では，より詳細な系統解 月 31 日現在）について，PFGE（pulsed-field gel electrophoresis） 析を行うため，O26 が保有する大プラスミド上にコードされる 4 による分子疫学解析を実施した。 つの病原性遺伝子（EHEC-hemolysin [hlyA]，katP，espP および 【結果および考察 】PFGE 解析の結果，同一PFGE 型（TN） etpD）の保有パターンの解析を行った。昨年度までの知見を総合 146k1 株が広域で検出されていることが明らかとなった。 すると，stx2 のみを保有する ST29 のうち，EHEC-hlyA +/katP –/ TN146k1 株は 2013 年に初めて 2 株が検出され，2014 年には 5 espP +/etpD –（遺伝子保有 +，非保有 –）を示す系統が Stx2 高 県（12 株 ）， 2015 年には 4 県（5 株）において検出された。いず 産生性であり，Vero 細胞への毒性も高いことが判明した。以上 れも散発事例由来株（家族内事例株を含む）であったが，2014 の結果から，本系統が EHEC O26 における細菌側の重症化危険 年以降の EHEC O146 分離株の半数以上を占め，PFGE 解析結果 因子となりうると考えられた。 から近縁と推測される EHEC O146 が近年広域で流行しているこ とが示唆された。本発表では TN146k1 株の細菌学的特性につい ても併せて報告したい。

P2-183 ネパールにおける病院獲得型黄色ブドウ球菌の P2-184 多剤耐性アシネトバクター属菌に対する低水準 遺伝子学的解析 消毒薬の効果 ○小林 宣道，Meijisoe Aung，川口谷 充代，漆原 範子（札幌医科大・ ○林 美智子1，川村 久美子1，松井 真理2，鈴木 里和2，柴山 恵吾2， 医・衛生学） 荒川 宜親3（1名古屋大・院医・医療技術，2感染研・細菌第二部，3名 古屋大・院医・細菌） Genetic analysis of hospital-acquired Staphylococcal aureus in Nepal Efficacy of disinfectants against multidrug resistant ○Nobumichi Kobayashi, Meijisoe Aung, Mitsuyo Kawaguchiya, isolates of Acinetobacter species Noriko Urushibara (Dept. Hygiene, Sapporo Medical Univ.) ○Michiko Hayashi1, Kumiko Kawamura1, Mari Matsui2, Satowa Suzuki2, Keigo Shibayama2, Yoshichika Arakawa3 (1Dept. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the Pathophysiol. Lab. Sci., Grad. Sch. Med., Nagoya Univ., 2Dept. common nosocomial pathogens worldwide. However, in Nepal, Bacteriol. II, Nat. Inst. Infect. Dis., 3Dept. Bacteriol., Grad. Sch. Med., there has been no report on genetic characteristics of MRSA. In Nagoya Univ.) the present study, 100 clinical isolates of S. aureus derived from a general hospital in Kathmandu, Nepal, from Aug. 2012 to Feb. Multidrug resistant Acinetobacter species, especially A. baumannii 2014 were analysed. Thirty two isolates were MRSA, with type V international clone II (IC II), have become a global clinical concern. as the dominant SCCmec type (20 isolates, 63%). Panton-Valentine We investigated susceptibility profiles to 5 antimicrobial agents and leukocidin (PVL) genes were detected in 73% of all S. aureus 3 disinfectants among 305 clinical Acinetobacter isolates collected isolates; 78% (25/32) of MRSA and 71% (48/68) of methicillin- between October 2002 and March 2013 in Japan. Species-level susceptible S. aureus (MSSA). Common coagulase genotype (coa) identification was performed by rpoB sequencing, and IC II was of PVL-positive MRSA and MSSA were VIa (64%) and IVa (54%), determined by PCR-based ORF typing. MICs were measured by the respectively. A total of 17 isolates, including MRSA and MSSA, PVL- agar dilution method recommended by the CLSI. Of 305 isolates, positive and -negative isolates were genetically characterized. Four 236 isolates (77.4%) were A. baumannii and 137 isolates (44.9%) PVL-positive, coa-VIa MRSA isolates belonged to ST772, which were IC II. In the 305 isolates, the resistance rates to ciprofloxacin has been colloquially referred to as “Bengal Bay clone”. ST772 was (CIP), amikacin (AMK), imipenem, sulbactam/ampicillin and similarly found in a PVL-negative MRSA as well as PVL-positive ceftazidime (CAZ) were 65.6, 12.1, 3.3, 4.6 and 31.8%, respectively. MSSA isolates. ST22 isolates (PVL-positive MRSA and MSSA, The rate of IC II in resistant isolates was above 50%. For all isolates, PVL-negative MRSA) possessed a variant of elastin-binding protein MIC90s of chlorhexidin gluconate, benzethonium chloride and gene (ebpS) with an internal deletion of 180-bp which was similar to alkydiaminoethylglycine hydrochloride were 100, 150 and 350 mg/L. that had been reported in ST121 S. aureus. The present study first The MIC90s of disinfectants for IC II were nearly the same as those reported presence of ST772 MRSA (Bengal Bay clone) in Nepal, for all isolates, but they were relatively higher than those for non-IC together with high prevalence of PVL among S. aureus. II and non- A. baumannii. In correlation coefficients between MICs of disinfectants and antimicrobials, MICs of disinfectants were well correlated with those of CIP, AMK and CAZ (P<0.001), suggesting co-resistance between multiple antimicrobials and disinfectants.

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P2-185 ヒト腸管内における Streptococcus P2-186 肺炎球菌ワクチン導入以降に分離された無莢膜 gallolyticus の分布に関する研究 型肺炎球菌の遺伝学的特徴 ○野本 竜平1，小田巻 俊孝2，清水（肖）金忠2，大澤 朗3（1神戸市環 ○輪島 丈明，野口 雅久（東京薬大・薬・病原微生物） 保研，2森永乳業（株）・基礎研，3神戸大院・農・資源生命科学） Molecular characterization of null-capsule Pneumococci Distribution of Streptococcus gallolyticus species in isolated after introduction of vaccine human gut ○Takeaki Wajima, Norihisa Noguchi (Dept. Microbiol., Sch. Pharm., ○Ryohei Nomoto1, Toshitaka Odamaki2, Jin-zhong Xiao2, Ro Osawa3 Tokyo Univ. Pharm. Life Sci.) (1Dept. Infect. Dis., Kobe Inst. Health, 2Next Generat. Sci. Inst., Morinaga Milk Industry Co., Ltd., 3Dept. Bioresour. Sci., Grad. Sch. 【背景】肺炎球菌の莢膜は，病原性に重要である。本邦では，本 Agric. Sci., Kobe Univ.) 菌による重症感染症の予防を目的として，莢膜抗原を用いたワ クチンが 2010 年に導入されており，2013 年より定期接種化され 【背景・目的】S. gallolyticus はしばしば様々な動物の腸管から常 ている。しかし，ワクチンの接種率の上昇とともに，ワクチン 在細菌として分離される一方で，家畜やヒトの臨床検体からも 型株の減少と，非ワクチン型株の増加が報告されている。我々は， 分離される。近年 S. gallolyticus による感染症の症例が増加して 本菌の血清型を継続的に調査しているが，非ワクチン型株中に きているにもかかわらず，その病原因子や疫学などについての 莢膜を持たない株（無莢膜型株）が増加していることを見出した。 情報は未知の部分が多い。現在 S. gallolyticus には 3 つの亜種が そこで，本研究ではこれら無莢膜型株の遺伝学的背景を解析し 提唱されており｛ssp. gallolyticus (SGG), ssp. pasteurianus (SGP), たので報告する。 ssp. macedonicus｝，演者らはこれまでにその亜種を判別可能な 【方法】2010 年から 2014 年に東京都内の大学病院で分離された MLST 法を開発し，S. gallolyticus の疫学研究を進めてきた。一 肺炎球菌 430 株のうち，無莢膜型株 27 株を対象とした。莢膜コー 方で S. gallolyticus のヒト腸管内での分布に関する報告は散発事 ド領域の塩基配列は，DNA シークエンス法で解析した。菌株の 例が多く大規模な調査は行われていない。そこで今回は年齢性 遺伝学的背景は，multilocus sequence typing（MLST）で解析した。 別が多様なヒト糞便サンプルを用いて，S. gallolyticus のヒトに 抗菌薬感受性は，微量液体希釈法で測定した。 おける存在割合を調査することにした。【方法】ヒト糞便は新生 【結果・考察】無莢膜型株の莢膜領域の塩基配列を解析したとこ 児から 100 歳以上の男女合計 400 人以上の糞便サンプルを使用 ろ，すべての株が病原性との関連が報告されている PspK を保 した。S. gallolyticus の中でもヒトでの臨床報告のある SGG, SGP 有していた。これらの株の MLST を行ったところ，6 種類の既 に焦点を当て，それぞれを特異的に検出するプライマーを設計 知 ST と 8 種類の新規 ST に分類された。これらの中には，莢膜 した。それぞれのプライマーを用いて PCR 法により糞便中の S. 保持株で見いだされた ST も認められた。抗菌薬感受性を測定し gallolyticus の存在有無を調査した。【結果】SGG, SGP 共に全サン たところ，80.8% の株がペニシリンおよびクラリスロマイシンに プル中に 10～20% の割合で存在していた。SGP に関しては授乳 耐性を示した。無莢膜型は病原性を示さないと言われていたが， 期の乳児の糞便中からは殆ど検出されなかったのに対し，離乳 多剤耐性かつ PspK 保持株が顕在化しつつあり，これらは様々な 後から 9 歳児までの糞便中には 30% を超える割合で存在してい 遺伝学的背景を有することから，莢膜の脱落と PspK の獲得が起 た。SGP は出生後数カ月程度の新生児での臨床検体からの分離 こった可能性が考えられる。 報告が殆どであったことを考えると非常に興味深い結果となっ 【会員外共同研究者】長谷部太相，大里隆二（東京薬大・薬・病 た。また，男女間での差異は認められなかった。SGG に関して 原微生物） は現在調査を継続中である。今後は新鮮糞便からの菌株の取得 も試みる予定である。

P2-187 カンボジアにおける野生げっ歯類からのレプト P2-188 冷却塔水から分離されたレジオネラ属菌の多様 スピラ検出 性および遺伝学的解析 ○増澤 俊幸1，工藤 芳子2，Ket Vansith3，小玉 澄香4，内田 耕大4，益 ○田中 忍，中西 典子，有川 健太郎，岩本 朋忠（神戸市環保研・感 田 翔1，福井 貴史1（1千葉科学大・薬・免疫微生物，2昭和大院・医・ 染症部） 薬理，3カンボジア・国立血液センター，4千葉科学大・危機管理・医 療危機管理） Prevalence and molecular characteristics of Legionella in cooling tower environments Detection of Leptospira from wild rodents in Cambodia ○Shinobu Tanaka, Noriko Nakanishi, Kentaro Arikawa, Tomotada 1 2 3 ○Toshiyuki Masuzawa , Yoshiko Kudo , Ket Vansith , Sumika Iwamoto (Dept. Infec. dis., Kobe Inst. Heal.) Kodama4, Kouta Uchida4, Shou Masuda1, Takashi Fukui1 (1Lab. Microbiol. Immunol., Sch. Pharm., Chiba Inst. Sci., 2Dept. Pharmaco., 【目的】我が国のレジオネラ属菌の感染事例は主に浴槽水を感染 Sch. Med., Showa Univ., 3Nat. Blood Transfusion Center, Cambodia, 源とするが，海外の事例報告を考慮すると，感染源不明とされ 4Dept. Med. Crisis Manage., Sch. Risk & Crisis Manage., Chiba Inst. る国内感染事例の中に冷却塔水を原因とする事例が存在してい Sci.) る可能性が考えられる。そこで，冷却塔水から分離したレジオ ネラ属菌の多様性および遺伝学的特徴を明らかにすることを目 【目的】レプトスピラ症は東南アジアにおいては重要な感染症で 的とした。【方法】2003 年から 2012 年に 194 基の冷却塔の冷却 あるが，その実態は明らかにされていない。カンボジア国首都 水から分離した Legionella pneumophila（以下，L. pneumophila） プノンペンとその周辺地において捕獲した野鼠からのプトスピ 158 株を血清型（SG）， SBT 解析，12 領域の MLVA を実施し， ラの培養と検出を行い，感染の実態を調べた。【方法】野鼠 163 解析結果に基づいて，Minimum Spanning Tree（以下，MST）を 匹を捕獲後解剖し腎臓を .1% 寒天を含む Korthof 培地と EMJH 培 描いた。また，他のレジオネラ属菌（以下，Legionella spp.）62 地に接種した。腎臓と膀胱より抽出した DNA を用いたミトコン 株について，mip 遺伝子または 16S rRNA 遺伝子により，菌種を ドリアチトクロム -C オキシダーゼ I（COI）遺伝子 PCR 産物の 同定した。【結果】SBT の結果，28 種類の ST 型に分けられた。 制限酵素 MboI 断片長多型性解析，並びに同遺伝子の配列解析に 内訳は，ST1 が 88 株（55.7%）， ST154 が 15 株（9.5%）， ST715 より野鼠種の同定を行った。また，レプトスピラ鞭毛遺伝子 flaB とデータベースに登録されていない新たな ST 型（STnew）がそ を標的とした Taqman-PCR，さらに通常の Nested PCR による増 れぞれ 13 株（8.2%）存在していた。血清型と SBT の型別に関 幅 DNA の遺伝系統解析により種の同定を行った。【結果・考察】 しては，ST1 と ST154 は SG1，ST715 は SG7，STnew は SG13 野鼠種は Rattus norvegicus（ドブネズミ 49%）， R. argentiventer のグループであった。一方，MLVA タイプは 32 種類に分離され （32%）， Bandicota indica（9%）， R. exulans, Maxomys surifer， た。MST の結果，3 つの clonal complex が形成され，SBT の結 Rattus 不明種であった。20 匹からレプトスピラ特異的 DNA が検 果を反映していた。これら clonal complex は毎年検出されていた。 出された。感染野鼠は L. interrogans 18 匹，L. noguchii 2 匹であっ Legionella spp. は L. erythra 22 株（ 32.3%），L. anisa 12 株（ 19.4%）， た。野鼠種による感染率は R. norvegicus 17.5%，未同定 Rattus L. rubrilucens 9 株（14.5%）の順に，計 10 菌種を同定した。【考 16.7%，R. argentiventer 9.4% であり，保有動物として重要である 察】3 つの clonal complex は冷却塔という環境条件に定着しやす ことが判明した。1 匹の野鼠からレプトスピラの分離に成功し，L. いグループであると考えられる。また，L. anisa，L. rubrilucens interrogans 血清型 Losbanos と同定された。プノンペンとその周 は，レジオネラ症患者から分離報告のある菌種であることから， 辺地位ではレプトスピラ症発生のリスクがあることが判明した。 感染原因となる可能性が示唆された。

157 P2-189 次世代シークエンスリードによる結核菌ゲノム P2-190 Molecular characterization of community- 分子疫学解析ツール associated MRSA in Japan ○関塚 剛史1，山下 明史1，村瀬 良朗2，岩本 朋忠3，御手洗 聡2，加 ○山口 哲央1,2，小 山 忍3，玉 井 清子3，松 本 哲哉2（1東邦大学・微生物・ 藤 誠也2，黒田 誠1（1感染研・ゲノムセンター，2結核予防会・結核 感染症学講座，2東京医科大学・微生物学分野，3株式会社ミロクメディ 研究所，3神戸市環保研・感染症部） カルラボラトリー）

TGS-TB: Total Genotyping Solution for M. tuberculosis ○Tetsuo Yamaguchi1,2, Shinobu Koyama3, Kiyoko Tamai3, Tetsuya 2 1 using short-read whole-genome sequencing Matsumoto ( Dept. Microbiology and Infectious Diseases, Toho Univ., 2 3 ○Tsuyoshi Sekizuka1, Akifumi Yamashita1, Yoshiro Murase2, Dept. Microbiology, Tokyo Medical Univ., Miroku Medical Laboratory Tomotada Iwamoto3, Satoshi Mitarai2, Seiya Kato2, Makoto Kuroda1 Co., Ltd., Nagano, Japan) (1Pathogen Genomics Center, NIID, 2Res. Inst. of TB, Jpn Anti-TB 【背景および目的 】 市 中 感 染 型 MRSA（Community Associated Assoc., 3Dept. Infect. Dis., Kobe Inst. Heal.) MRSA：以下 CA-MRSA）は米国において，市中のみならず医 The Whole-genome sequencing approach is highly affordable for the 療関連施設内においても検出が増えており，最も注意すべき病 characterization of the Mycobacterium tuberculosis (Mtb) strains, 原菌の一つと考えられている。我が国では CA-MRSA の検出は but comprehensive genotyping tools, including various traditional 少なく，米国とは異なる固有のクローンの存在が知られている genotyping (spoligo, IS6110 and VNTRs typing), have been expected が，高病原性クローンである USA300 clone の検出頻度が少ない to integrate all genetic information thus far. ながらも増加傾向にあり，その動向には注意を払う必要がある。 We developed an all-in-one web-based tool for genotyping Mtb, 【方法】2014 年 1 月から 12 月の間に，全国の医療関連施設から referred to as Total Genotyping Solution for TB (TGS-TB), to ミロクメディカルラボラトリーに培養を依頼された検体のうち， facilitate multiple genotyping platforms using NGS for the traditional 1）外来患者，2）皮膚や膿から分離された，3）オキサシリン耐 genotyping and the detection of phylogenies with core genomic 性，の全ての条件を満たす株を対象とした。PCR にて mecA 遺 single nucleotide variations (SNVs) through a simple click interface. 伝子の確認及び SCCmec typing，病原因子遺伝子の検出（PVL， The results using TGS-TB are consistent with conventional molecular TSST-1，ET，ACME）を行い，薬剤感受性を測定した。【結果】 genotyping methods, suggesting that NGS short reads could provide 対象期間において皮膚検体から分離された S. aureus は 2390 件 sufficient multiple genotypes at once to discriminate multiple strains であり，MRSA と判定された株は 463 件（19.4%）であった。う of Mtb during an outbreak. Indeed, seven Mtb isolates showing the ち，当施設に送られてきた MRSA 計 408 株に関して解析を行っ same VNTR profile were accurately discriminated through median た。現在 305 株まで解析が終了し，SCCmec type I が 1 株（ 0.3%）， joining network analysis using specific SNVs unique to those type II が 70 株（23.0%）， type IV が 171 株（56.1%）， type V が isolates. Furthermore, an additional IS6110 insertion was detected in 59 株（ 19.3%）であった。PVL 遺伝子が検出された 38 株（ 12.5%） one of those isolates as supportive genetic information in addition to のうち，SCCmec type IVc は 18 株で最も多く検出され，USA300 core genomic SNVs. clone と同じ SCCmec type IVa が 13 株検出された。【結論】CA- The all-in-one tool, TGS-TB, provides a more accurate and MRSA の 12.5% が PVL 遺伝子陽性株であり，過去 2 年の検出率（約 discriminative strain typing for clinical and epidemiological 10%）より高かった。SCCmec typeIV 株における PVL 遺伝子検 investigations. 出率も 19.9% と上昇傾向にあり，USA300 clone も増加傾向にあっ TGS-TB: https://gph.niid.go.jp/tgs-tb/ た。会員外共同研究者：安藤里奈

P2-191 コルカタにおける 2007–2014 年コレラ流行株 P2-192 Genomic epidemiological analysis of の全ゲノム解析によって明らかになった VSP-II の変化 Salmonella Paratyphi A isolated in Japan ○今村 大輔1，森田 昌知2，関塚 剛史3，水野 環1，竹村 太地郎4，山 ○森田 昌知1，齊藤 剛仁2，李 謙一1，泉谷 秀昌1，大西 真1（1国立感 城 哲4，三 好 伸一5，黒 田 誠3，大 西 真2，篠 田 純男1（1岡山大・インド， 染症研究所・細菌第一部，2国立感染症研究所・感染症疫学センター） 2感染研・細菌第一部，3感染研・ゲノムセンター，4長崎大・ベトナム， 1 2 1 5岡山大学・医歯薬） ○Masatomo Morita , Takehito Saitoh , Ken-ichi Lee , Hidemasa Izumiya1, Makoto Ohnishi1 (1Dept. Bacteriol. I, Nat. Inst. Infect. Dis., Comparative genomic analysis reveals heterogeneity in 2IDSC, Nat. Inst. Infect. Dis.) VSP-II of Vibrio cholerae in Kolkata, India ○Daisuke Imamura1, Masatomo Morita2, Tsuyoshi Sekizuka3, Tamaki Paratyphoid fever, a systemic infection caused by Salmonella Mizuno1, Taichiro Takemura4, Test Yamashiro4, Shin-ichi Miyoshi5, Paratyphi A, is transmitted from human to human via food or Makoto Kuroda3, Makoto Ohnishi2, Sumio Shinoda1 (1Collab. Res. drinking water. Therefore, hygiene and sanitary conditions mainly Cent. of Okayama Univ. for Infect. Dis. in India, Okayama Univ., determine its spread. In Japan, most of cases have travel histories 2Dept. of Bacteriol. I, NIID, 3Pathogen Genomics Center, NIID, to endemic countries. Isolates of S. Paratyphi A were examined by 4Vietnam Res. Stat. Int. of Trop. l Med. Nagasaki Univ., 5Vietnam Res. phage typing for the demonstration of epidemiological association. Stat. Inst. of Tropical Med. Nagasaki Univ.) However this typing has limitation because it could classify isolates into only 6 types. In this study, we performed whole-genome Cholera remains a major public health problem in many countries. sequencing of the S. Paratyphi A isolates to identify SNPs, providing To characterize the genotypic change of clinically isolated Vibrio more detailed discrimination among the isolates. The whole-genome cholerae strains over time in Kolkata, India, whole genome sequence sequencing was performed on 59 S. Paratyphi A isolates of 2013 of strains isolated between 2007 and 2014 were analyzed. Mapping and 2014 using an Illumina MiSeq. The short reads were aligned to of sequence reads on the V. cholerae N16961 chromosomal sequence genome sequence of S. Paratyphi A strain ATCC9150 as a reference suggested that several strains lacked large region of the Vibrio and we identified 860 SNPs on non-repetitive genome. A maximum seventh pandemic island-II (VSP-II). De novo assembly of sequence likelihood tree based on these SNPs displayed strains with same reads and Sanger sequencing of gaps between contigs confirmed phage type could be located on different clades according to their totally six variants of VSP-II. Interestingly, strains lacking 14 kb country of origin. Additionally, it was revealed isolates from Indian internal region of VSP-II were less than half until 2009, however, all subcontinent had genetic diversity. In conclusion, the SNP-based strains after 2011 lacked this region. To understand the phylogeny of phylogenetic tree offered the powerful discrimination between the lineage in Kolkata, we identified single nucleotide polymorphisms the S. Paratyphi A isolates, which showed the potential of whole- in Kolkata’s isolates as well as global representative V. cholerae genome sequencing for the molecular epidemiological study with the strains. This phylogenetic analysis revealed the several replacement information of phage type. of predominant strains in Kolkata. Two distinct V. cholerae strain groups with and without internal 14 kb deletion of VSP-II, were coexisted from 2007 to 2009. In 2010, other group of V. cholerae emerged and became predominant, however, it was totally replaced by the closely related strains of the Haitian outbreak strains in 2011. During 2012, new group emerged and thereafter, these strains are persisting as predominant strain in Kolkata.

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P2-193 下痢症患児由来大腸菌おける腸管凝集性大腸菌 P2-194 腸管出血性大腸菌 OUT 株の E. coli EAEC と ESBL 産生大腸菌の動向（2011 ～ 2013） O-genotyping 法による O 型別 ○藺牟田 直子，大岡 唯祐，吉家 清貴，西 順一郎（鹿児島大学・大 ○伊豫田 淳1，井口 純2，勢戸 和子3，李 謙一1，石原 朋子1，大西 真1， 学院医歯学総合研究科・微生物学分野） Working Group EHEC4（1感染研・細菌一，2宮崎大・農，3大阪府公 衛研・細菌，4地衛研） Trend of EAEC and ESBL producing E. coli isolated from diarrheal children (2011–2013) Application of E. coli O-genotyping PCR to determine Og ○Naoko Imuta, Tadasuke Ooka, Kiyotaka Yoshiie, Junichiro Nishi type of EHEC OUT isolates (Dept., Microbio., Grad., Sch., Med., Dnt., Sci., Kagoshima Univ.) ○Sunao Iyoda1, Atsushi Iguchi2, Kazuko Seto3, Ken-ichi Lee1, Tomoko Ishihara1, Makoto Ohnishi1, Working Group EHEC4 (1Dept. 【背景】腸管凝集性大腸菌（EAEC）は，特徴的線毛 AAF を持 Bacteriol. I, Nat. Inst. Infect. Dis., 2Fac. Agr., Miyazaki Univ., 3Dept. ち凝集性付着を示す下痢原性大腸菌である。一方，尿路病原 Bacteriol., Osaka Pref. Inst. Publ. Health, 4Pref. and Municip. Pub. 性大腸菌（UPEC）における ESBL（基質拡張型 β ラクタマー Health Inst.) ゼ）産生大腸菌の増加が問題となっている。われわれはこれま でに 2001～10 年にかけて下痢症患児由来大腸菌の中で ESBL 国内で 2007 年から 2014 年までにヒトから分離された腸管出血 産生菌と EAEC が増加し，UPEC O25:H4:ST131 が EAEC の病 性大腸菌（enterohemorrhagic E. coli: EHEC）のうち，分離株数 原因子を獲得して増加したことを報告した。【目的】2011 年以 が 250 以上の O 群は頻度の高い順に O157 (65.2%), O26 (18.2%), 後の鹿児島県の下痢症患児由来大腸菌における ESBL 産生菌と O111 (3.8%), O103 (2.8%), O145 (2.4%), O121 (2.3%), O91 (1.1%), EAEC の動向を明らかにする。【方法】対象は 2011～13 年に下 O165 (0.4%) となり，これらの 8 血清群で全体の約 95% を占め 痢症患児由来大腸菌 1,281 株。ESBL CTX-M 遺伝子と EAEC の る。一方，重症者（血便，溶血尿毒症症候群発症例，死亡例） マーカー aggR を PCR で検出し，CTX-M 型はシークエンスで決 由来の EHEC 株に限定すると，分離株数が 50 以上の O 群は頻 定した。【結果】CTX-M 遺伝子の検出率は 2011 年 8.3%，2012 度の高い順にO157 (81.7%), O26 (8.7%), O121 (2.7%), O111 (1.9%), 年 6.9%，2013 年 10.7% で，EAEC は 6.2%，2.8%，4.7% であっ O145 (1.7%), O103 (1.2%), O165 (0.6%) となり，これら 7 血清群 た。CTX-M 型は CTX-M-14 54%，CTX-M-27 23% であった。 で重症者由来株全体の約 98% を占める。大腸菌の O 群型別は抗 EAEC の 34.5% が AAF3 を保有し，UPEC の付着因子 Sfa 25.9%， 血清を用いて血清学的に行われているが，つい先頃，我々は大 Pap 34.5% を保有していた。CTX-M をもつ EAEC は 6 株（0.5%） 腸菌 O 群のほぼすべてを PCR で決定できる遺伝学的型別法（E. みられ，O111 5 株，O127 1 株だった。【考察】ESBL 産生株は coli O-genotyping: Og タイピング）を開発した（Iguchi A. et al., J 2013 年には 10.7% と増加した。今回 EAEC/UPEC O25 は検出さ Clin Microbiol. 53: 2427–32, 2015）。本研究では，国内で血清学的 れなかったが，EAECO111，O127 が初めて CTX-M を獲得した に型別不能（O untypable: OUT）となる EHEC について Og タ ことが明らかになった。今後下痢原性大腸菌においても薬剤耐 イピング法で型別を試みた。その結果，多くの OUT 株は特定の 性化の監視が必要である。 Og 型（Og183, Og84, Og113 等）としてタイピングされ，これら の Og 型には血便患者由来株が含まれることが明らかとなった。 Og タイピング法による型別結果から，国内で分離される EHEC の O 群の分布について再解析を行うと共に，これまで OUT とさ れてきた重症例由来 EHEC 株の血清型（Og 型）および病原性遺 伝子の保有状況について併せて報告したい。

P2-195 South Asia is an endemic region for P2-196 Dissemination of CC2 multidrug-resistant Mycobacterium orygis Acinetobacter baumannii strains in Vietnam ○Jeewan Thapa1，中島 千絵1，Zeaur Rahim2，Sarad Paudel3， ○多田 達哉1，秋山 徹2，切替 照雄1（1国立国際医療研究セ・研究所・ Yogendra Shah1，Bhagwan Maharjan4，Ajay Poudel1，Kamal 感染症制御，2国立国際医療研究セ・研究所・病原微生物） 5，坪 田 敏男3，鈴 木 定彦1（1北大・人獣セ・バイオリソー Prasad Gairhe 1 2 1 1 ス，2バングラデシュ・国際下痢症研究セ・結核，3北大・獣医・野生 ○Tatsuya Tada , Tohru Miyoshi-Akiyama , Teruo Kirikae ( Dept. 動物，4ネパール・結核予防会・ドイツ－ネパール結核プロジェクト， Infect. Dis., NCGM., 2Path Microb Lab., NCGM.) 5ネパール・チトワン国立公園） Acinetobacter baumannii strains co-producing carbapenemase ○Jeewan Thapa1, Chie Nakajima1, Zeaur Rahim2, Sarad Paudel3, and 16S rRNA methylase are highly resistant to carbapenems and Yogendra Shah1, Bhagwan Maharjan4, Ajay Poudel1, Kamal Prasad aminoglycosides. Ninety-three isolates of multidrug-resistant A. Gairhe5, Toshio Tsubota3, Yasuhiko Suzuki1 (1Divi. Biores., CZC, baumannii were obtained from an intensive care unit in a hospital Hokkaido Univ., 2TB Lab, Intl. Ctr. Diarrhoeal Dis. Res., Bangladesh, in Vietnam. Antimicrobial susceptibility tests and whole genome 3Lab. Wildlife Biol. Med., Grad. Sch. Vet. Med., Hokkaido Univ., sequencing were performed. Multilocus sequence typing and the 4Nepal Anti-TB Assoc., GENETUP, 5Chitwan Ntl. Pk., Nepal) presence of drug resistant genes were determined and a maximum- likelihood phylogenetic tree was constructed by SNP alignment Introduction: Mycobacterium orygis, a new member of Mycobacterium of whole genome sequencing data. The majority of isolates tuberculosis complex (MTC) species cause tuberculosis (TB) in humans belonged to clonal complex 2 (ST2, ST570 and ST571), and carried and animals. We have isolated this bacterium from different wild carbapenemase encoding genes blaOXA-23 and blaOXA-66. Two isolates animals in Nepal and captured monkeys and dairy cattle in Bangladesh. encoded carbapenemase genes blaNDM-1 and blaOXA-58 and the 16S Materials and Methods: MTC isolates from a spotted deer, a blue rRNA methylase encoding gene armA and did not belong to clonal bull and a greater one horned rhinoceros in Nepal and isolates from complex 2 (ST16). A. baumannii isolates producing 16S rRNA a dairy cattle herd and captured rhesus monkeys in Bangladesh were methylase ArmA and belonging to clonal complex 2 are widespread, included. Most of these animals had TB suspected lung lesions. and isolates co-producing NDM-1 and ArmA are emerging, in Spoligotyping, mycobacterial interspersed repetitive units-variable medical settings in Vietnam. number of tandem repeats (MIRU-VNTR), region of difference analysis and SNP detection were performed to ascertain species and molecular epidemiology. Results and discussion: All the isolates had a typical M. orygis spoligotype, SIT587 in SpolDB4 database. RD analysis and SNP detection of gyrB, mmpL6, TbD1, PPE55 and Rv2042c confirmed the isolates to be M. orygis. The MIRU-VNTR analysis of these isolates grouped them into five clusters. These finding suggests its wide distribution and long historical existence in the region that eventually provide evidence for endemic prevalence in the sub-continent. Conclusion: M. orygis was isolated from different animals in Nepal and Bangladesh. Our findings suggest its endemic prevalence in the South Asia.

159 P2-197 Emergence and spread of epidemic multi- P2-198 Clostridium difficile の臨床分離株における分 drug resistance Pseudomonas aeruginosa 子疫学的解析 ○大城 聡1，多 田 達哉2，切 替 照雄2，秋 山 徹1（1国立国際医療研究セ・ ○千葉 菜穂子1，谷本 弘一2，富田 治芳1,2（1群馬大・院医・細菌学， 研究所・病原微生物学，2国立国際医療研究セ・研究所・感染症制御） 2群馬大・院医・附属薬剤耐性菌実験施設）

○Satoshi Oshiro1, Tatsuya Tada2, Teruo Kirikae2, Tohru Miyoshi- Molecular epidemiology of Clostridium difficile 1 1 2 Akiyama ( Path Microb Lab., NCGM., Dept. Infect. Dis., NCGM.) ○Naoko Chiba1, Koichi Tanimoto2, Haruyoshi Tomita1,2 (1Dept. Bacteriol., Gunma Univ. Grad. Sch. Med., 2Lab. Bacteriol. Drug Pseudomonas aeruginosa is one of the most common nosocomial Resistance, Gunma Univ. Grad. Sch. Med.) pathogens. In addition to the intrinsic drug resistance mechanisms, the ability to acquire exogenous genes of P. aeruginosa leads to 【目的】Clostridium difficile（CD）は，特に高齢者において抗菌 emergence of MDR P. aeruginosa resistant against carbapenems, 薬投与後の菌交代症である偽膜性大腸炎や抗菌薬関連下痢症な aminoglycosides and fluoroquinolones. Emergence of multi-drug どの CD 関連下痢症（CDAD）の起因菌として重要である。本 resistant (MDR) P. aeruginosa is critical problem in medical practice. 菌の主な病原因子は毒素であり，toxin A（TcdA)，B（TcdB） However, the key events in emergence and the spread of MDR およびbinary toxin（CDT）を産生する。TcdA+TcdB+CDT+ で P. aeruginosa remain unknown. Here, we applied whole-genome ribotype が 027 の株は，高病原性株として医療関連施設や院内で sequence (WGS) analyses to define the population structure of 185 アウトブレイクを起こし世界的に問題となっている。 P. aeruginosa strainsmainly isolated from Japan in addition to Thai, 本研究では，アウトブレイク株 TcdA+TcdB+CDT+/ribotype027 の Vietnam, Poland, and Nepal. Interestingly, 135 isolates of them were 有無と，どのようなタイプの CD 株が本邦において優勢であるか clustered in one clade and categorized into sequence type (ST) 235, を調べるため分子疫学解析を行ったので報告する。 which is one of the most endemic types in the world. Additionally, 【方法】ミロクメディカルラボラトリーを通じ全国 25 都府県か 135 isolates fell within highly clustered 7 lineages. Each lineage ら収集され，本施設に保存された臨床分離株を用いた。2012 年 showed the different drug resistance genes, different genome –2014 年分離株の中からランダムに 250 株を抽出し，PCR によ arrangement and different isolation area. For example, Some lineage, る毒素遺伝子の検索，寒天平板法による薬剤感受性測定，およ which consist of 11 strains, harbors blaTEM, aac(6’)Iae, aadA1 and び ribotyping を実施した。 imp1 and were isolated from same prefecture. These results could 【成績】被検菌株が分離された患者年齢は，80 歳代が 86 株 indicate that MDR P. aeruginosa having the same properties, spread （34.4%）と最も多く，70 歳以上が 74.0% を占めていた。毒素 in the limited area. It is also suggested that antibiotics which is used 遺伝子タイプは TcdA＋TcdB＋CDT－ が最も多く 208 株（83.2%）， in limited area generate the specific MDR P. aeruginosa. TcdA+TcdB+CDT+ が 2 株（ 0.8%），TcdA–TcdB+CDT+ が 1 株（ 0.4%） であった。毒素遺伝子を持たない株は 39 株（15.6%）であっ た。薬剤感受性は治療薬である Metronidazole が最も優れていた （MIC90; 0.5μg/mL）。次いで Vancomycin および Teicoplanin であっ た（MIC90; 1μg/mL）。 ribotype は，様々な type が検出されたが， TcdA+TcdB+CDT+/ribotype027 は検出されなかった。 【考察】本研究では，アウトブレイク株は検出されなかったが， グローバル社会の現在において今後もその動向を観察する必要 がある。

P2-199 大阪における健康保育園児の保菌由来肺炎球菌 P2-200 Legionella pneumophila の血清群 1 の PCR と侵襲性感染症由来肺炎球菌との関連性について によるサブグルーピング ○河原 隆二1，森 裕一2，井 澤 恭子1，浜 端 朋子1，勝 川 千尋1，武 内 一3,4 ○前川 純子1，倉 文明1，村井 美代2，大西 真1（1感染研・細菌第一， （1大阪府立公衆衛生研究所・感染症部，2大阪メディカルラボラトリー， 2埼玉県立大・検査技術） 3佛教大・社会福祉，4耳原総合病院・小児科） PCR-based serotyping and subgrouping of Legionella Relatedness of pneumococci from healthy children and pneumophila serogroup 1 patients of invasive desease in Osaka ○Junko Maekawa1, Fumiaki Kura1, Miyo Murai2, Makoto Ohnishi1 ○Ryuji Kawahara1, Yuichi Mori2, Kyoko Izawa1, Tomoko Hamabata1, (1Dept. Bacteriol. I, NIID, 2Dept. Health Sci., Saitama Pref. Univ.) Chihiro Katsukawa1, Hajime Takeuchi3,4 (1Dept. Infect. Dis., Osaka Pref. Institute of Public Health, 2Osaka Medical Lab., 3Fac. Social Legionella pneumophila はそのリポ多糖体（LPS）の免疫性の違い Wellfare, Bukkyo Univ., 4Mimihara General Hosp.) により，血清群 1 から 15 に分けられるが，L. pneumophila 血清 群 1 がレジオネラ症起因菌のおよそ 8 割を占めている。血清群 我々は，小児における肺炎球菌の保菌に対するワクチンの影響 1 は他の血清群に比べ，血清群内での免疫多様性が高いことが知 を調べるため，2014 年 4 月～2015 年 3 月に健康保育園児の保菌 られている。L. pneumophila 血清群 1 の LPS 構造は 28（あるい 調査を行った。分離された全菌株のうちワクチン血清型は 4% は 29）の ORF から成る LPS 生合成遺伝子群により規定されて で，一方，非ワクチン血清型である 15A 型は 31% と最も多く分 いる。環境分離株のおよそ 2 割に見られる ORF2 と ORF3 の間 離された。15A 型は，国内の小児侵襲性感染症（IPD）において に位置する lag-1 遺伝子は，臨床分離株では，その 9 割に存在す 19A，24F についで多い血清型であり，本研究ではこの保菌株と ることから，病原性に関与していると考えられる。また，ORF7 IPD 株との関連性を検討することを目的として解析を行った。 と ORF8 の遺伝子配列は株によりそれぞれ大きく 2 種類に分け 保菌株で 15A 型と判定された株のうちランダムに選択した 14 株 られ，その違いが，LPS のエピトープの差異をもたらしている と，IPD 株として 2013 年以降に大阪府内で検出された 15A 型 とされるが，その機能は不明である。lag-1 遺伝子の有無と，そ の 14 株を対象とした。各菌株は，薬剤感受性試験を実施し，ペ れぞれ特異的な ORF7，ORF8 を検出する 3 種類の PCR を行う ニシリンG の MIC 値により，PRSP；＞2 μg/mL，PISP；0.12 ことにより，血清群 1 株のサブグルーピングが可能となった。 ～1 μg/mL，PSSP；≦0.06 μg/mL とした。また，マクロライド さらに lag-1 遺伝子の多形を検出する PCR を行うことにより，L. （ermB, mefE）およびテトラサイクリン耐性遺伝子（tetM）の検 pneumophila 血清群 1 株は 12 種類の型に分けられた。PCR によ 出と MLST 解析を実施した。保菌株 14 株は PRSP が 8 株，PISP る血清群 1 株のサブグルーピングは簡便で，疫学的解析に有用 が 6 株で，IPD 株は 1 株のみ PSSP で，PRSP が 10 株，PISP が であると考えられる。 3 株であった。また，エリスロマイシンは全株耐性，テトラサイ 会員外協力者：坂田美穂（埼玉県立大・検査技術） クリンの MIC 値は≦0.25～8 と幅広く，保菌株・IPD 株の耐性率 は 57% と 64% であった。全株が薬剤耐性遺伝子 ermB と tetM を 保有し，MLST は保菌株の 1 株（ST4561）をのぞき ST63 であっ た。これらの結果は，保菌株と IPD 由来株との関連性を示唆し ており，さらに 15A 型・ST63 というタイプは，国際流行クロー ンである Sweden15A-25 と一致していた。このクローンが国内で ワクチンによって選択されて健康小児と IPD ともに広く蔓延し つつあることが推測され，今後警戒が必要であると思われた。

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P2-201（S7-7） 患者及び食材から分離された P2-202 臨床分離株およびヘアブラシサンプルからの Salmonella Infantis 株の次世代シークエンサーによるゲノ LAMP 法による T. tonsurans 検出・同定法 ム系統解析 ○楊 彩佳，山崎 丘，槇村 浩一（帝京大・医・大学院・宇宙環境・医・ 仙波 敬子1，山下 まゆみ1，園部 祥代1，横山 栄二2，関塚 剛史3，調 研究室） 恒明4，黒田 誠3，○四宮 博人1（1愛媛衛生環境研，2千葉衛研，3国立 感染研，4山口環境保健センター） Detection and identification of T. tonsurans from clinical isolates and hairbrush samples by LAMP Whole genome data of Salmonella strains from foods ○Ayaka Yo, Takashi Yamazaki, Koichi Makimura (Lab. Space and patients reveal their detailed relationships Environ. Med., Grad. Sch. Med, Teikyo Univ.) Keiko Semba1, Mayumi Yamashita1, Sachiyo Sonobe1, Eiji Yokoyama2, Tsuyoshi Sekizuka3, Komei Shirabe4, Makoto Kuroda3, Trichophyton tonsurans 感染症は 1990 年代以降，国際的に柔道や ○Hiroto Shinomiya1 (1Ehime Pref. Inst. Public Health Environ. Sci., レスリング等の接触性の高い格闘技選手間に流行している皮膚 2Chiba Pref. Inst. Public Health, 3NIID, 4Yamaguchi Pref. Inst. Public 糸状菌症（白癬）であり，我が国でも 2000 年頃から集団発生が Health Environ.) 報告されている。本症は主に頭部白癬および体部白癬などの病 態を呈するが，その症状は軽微であることが多く，無症候性保 Nontyphoidal Salmonella is the most commonly identified cause of 菌者となったり，治療を開始してもコンプライアンスが悪くな bacterial foodborne illness. Salmonella Infantis is among the top 3 る傾向にある。そのため，保菌者から家族や友人など，身近な most common serotypes associated with human infections in 2014 ヒトへの感染が拡大しつつある。本菌の感染力は高く，宿主の in Japan. Seventy isolates of S. Infantis were collected in Ehime 状態によっては強い炎症を伴う重篤なケルスス禿瘡を生ずるこ prefecture and analyzed by PFGE. These strains were isolated from とから，迅速な感染管理が必要である。現在行われている本症 diarrheal patients, chicken meat, pork, and pigs. To perform whole- 病原菌の検出は，ブラシ検体を用いた培養が基本であるが，菌 genome analysis of these strains, next-generation DNA sequencing の発育に一定の時間を要することや，験者に習熟を要するなど (NGS) technologies were used. Based on the NGS typing, the の問題があった。そこで，臨床検体等から本菌をより迅速，正 strains were classified into three major clusters; cluster A contained 確かつ簡便に検出同定するための分子生物学的診断法を開発す only clinical strains, while cluster B contained pig strains and るべく，Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法を検 clinical strains and cluster C contained meat strains and clinical 討した。LAMP 法は標的 DNA 塩基配列の 6 または 8 つの領域に strains. In the cluster C, it was found that SNV (single nucleotide 対して 4 または 6 種類のプライマーを設定し，鎖置換反応を利 variation) of several pairs of patient strains and chicken meat strains 用して一定温度で特異的DNA を増幅させる遺伝子検出法である。 were identical or very similar, suggesting that the chicken meat 本法の利点として，感度・特異度並びに迅速性に優れている点 was very close to the causative food of the respective patient. In が挙げられる。今回我々は T. tonsurans 特異的プライマーを設計 addition, comparison with available DNA sequences revealed that し，その特異度および感度を確認した後，臨床分離株 96 検体と S. Infantis isolates from chicken egg shells belong to our cluster A, 柔道選手および健常人から採取したヘアブラシサンプル 37 検体 suggesting that the patients carrying cluster A strains were infected を用いた検討を行った。 with S. Infantis from eggs. These findings indicate that an NGS- based genome wide analysis is very useful for precisely resolving phylogenetic relationships among Salmonella strains.

P2-203 Aspergillus fumigatus 由来エラスターゼイン P2-204 RNA-seq of Malassezia restricta under ヒビター AFUEI の病原性抑制作用 microgravity: space flight simulation ○小森 由美子1，奥村 欣由1，岡本 古都1，山下 伸雄2，二改 俊章1 ○杉田 隆1，張 音実1，渡辺 愛弓1，齋藤 智慧1，石岡 憲昭2（1Dept. （1名城大・薬・微生物，2白鶴酒造・研究開発） Micribiol., Meiji Pharm. Univ.，2JAXA 宇宙科学研究所） Pathogenicity suppressing effect of elastases inhibitor ○Takashi Sugita1, Otomi Cho1, Ayumi Watanabe1, Chie Saito1, 2 1 2 (AFUEI) from Aspergillus fumigatus Noriaki Ishioka ( Dept. Micribiol., Meiji Pharm. Univ., Institute of ○Yumiko Komori1, Yoshiyuki Okumura1, Koto Okamoto1, Nobuo Space and Astronautical Science, JAXA) Yamashita2, Toshiaki Nikai1 (1Dept. Microbiol., Fac. Pharm., Meijo Introduction: The skin microbiome diversity of astronauts staying Univ., 2Res. & Dev. Dept., Hakutsuru Sake Brew. Co., Ltd.) in the International Space Station (ISS) decreases because the ISS 【目的 】A. fumigatus が産生するエラスターゼインヒビター is a closed habitant environment. Therefore, knowledge of gene AFUEI の阻害機構，およびエラスターゼの病原性抑制作用を解 expression of the skin microbiome under microgravity will provide 明することを目的として研究を行った。 useful information to help manage the health of astronauts. In this 【方法】AFUEI は A. fumigatus のエラスターゼインヒビター遺伝 study, we sequenced the RNA (RNA-seq) of Malassezia restricta, 子を導入した A. oryzae（AFU-12）株の培養上清から精製した。 which dominates the skin mycobiome. Materials and Methods: エラスターゼは A. fumigatus，A. flavus，A. nidulans，A. ustus，A. M. restricta was incubated in microgravity (uG) using a three- ochraceus，A. oryzae，A. versicolor を YCB-elastin 培地で培養後， dimensional clinostat and in normal gravity (1G), and RNA sequences 既報に従い各々精製し，酵素活性は Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA were determined using an Illumina HiSeq 2000 Sequencing System. （GAAPLNA）を基質として測定した。病原性抑制効果はヒト由 Results and Discussion: Maser and Trinity analyses produced 来肺動脈血管内皮細胞（HPAEC），微小気管支上皮細胞（HSAEC） 9,469 UniGenes; 72.1% of the genes were annotated using UniProt. などを使用し，細胞傷害性を指標として検討した。 The expression of 54 and 59 genes was increased significantly in 【結果】組換え AFUEI は 7 種のエラスターゼの酵素活性をモル uG and 1G, respectively. Although M. restricta is part of the normal 比（enzyme：inhibitor）1：1 で完全に阻害した。各エラスター skin microbiome in healthy individuals, it can cause seborrheic ゼの GAAPLNA に対する代謝回転数 kcat は様々であったが， dermatitis and dandruff via secreted lipase. There were no significant kcat が低値を示すエラスターゼほどモル比を 1：0.25 と減少させ differences in the expression of lipase genes between uG and 1G ても強く阻害された。各エラスターゼは HPAEC や HSAEC に対 conditions. These findings suggest that the virulence of M. restricta し終濃度 0.5～10 μg/mL で病原性の指標となる細胞傷害作用を示 is not enhanced in uG conditions. したが，AFUEI を添加することで細胞傷害性は消失した。 【考察】Aspergillus 属の産生するエラスターゼは，呼吸器系の細 胞に傷害を与えるとともに，フィブリノーゲン分解作用により 血液凝固系にも影響を与える重要な病原因子である。AFUEI は その作用を強く抑制したことから，血管侵襲性肺アスペルギル ス症などの治療薬開発につなげるために，その阻害機構をさら に詳細に検討する予定である。

161 P2-205 β-D- グルカン検出における各種 β- グルカン認 P2-206 Analysis of cell surface proteins of adherent 識タンパク質の結合活性の応用 Trichosporon asahii cells ○安達 禎之，竹原 由香，鉄井 絢子，石橋 健一，山中 大輔，大野 尚 ○市川 智恵，小池 智美，中島 里貴，池田 玲子（明治薬大・感染制御） 仁（東京薬大・薬・免疫） ○Tomoe Ichikawa, Tomomi Koike, Riki Nakajima, Reiko Ikeda (Dept. Application of various beta-glucan recognition proteins Microb. Sci. Host Defense, Meiji Pharm. Univ.) for beta-D-glucan detection ○Yoshiyuki Adachi, Yuka Takehara, Junko Tetsui, Ken-ichi Ishibashi, Objective: Trichosporon asahii is a pathogenic yeast that causes a Daisuke Yamanaka, Naohito Ohno (Lab. Immunopharm. Microbial deep-seated fungal infection known as trichosporonosis; however, Prod., Sch. Pharm., Tokyo Univ. Pharm. Life Sci.) its pathogenic factor is unclear. We previously reported that the colony morphology and adhesion ability of T. asahii are variable. In 【目的】深在性真菌症の血清診断において (1 → 3)-β-D-glucan（BG） this study, we investigated cell surface proteins of adherent T. asahii は重要な分子マーカーである。既存の BG 検出法はカブトガニ cells. の BG 結合タンパクを含む天然のタンパク分子群を利用してい Methods: T. asahii strains, with white, off-white (O), off-white る。我々は生態系に依存しない BG 検出系を作製する目的で組 rugose (OR), and yellowish-white morphologies, from clinical 換え型 BG 認識タンパク（BGRP）を使った ELISA 等の BG 検出 isolates were used. The strains were cultured in cell culture dishes システム作製を試みた。【方法】無脊椎動物の組換え型 BGRP を containing Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with ELISA プレートや磁気ビーズに固相化し，標識 BG または標識 serum, and adhesion was assayed by staining with crystal violet. Cell BGRP で試料中の BG をサンドイッチ検出する ELISA 法やビー surface proteins were extracted in 3 M LiCl after cells were cultured ズ ELISA 法で血清試料中の BG 測定を行い，感度と操作の簡便 at 37°C for 2 days in yeast nitrogen base broth with 2% glucose and 性の観点から両者を比較し，有用性を検討した。【結果及び考 1% casamino acids. Crude extracts were separated using sodium 察】ELISA 法とビーズ ELISA 法の両者において，BGRP は低濃 dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and blotted onto 度の BG を認識した。BG の構造特性による違いも示し，低分子 a polyvinylidene difluoride membrane. Protein bands were stained BG の検出においてはビーズ ELISA 法により検出限界濃度が改 with Coomassie Brilliant Blue. Adherent cell-specific proteins were 善した。サンドイッチ検出においてもバックグラウンドは低値 identified using N-terminal sequencing. を保ち，同濃度の BG に対してより高い吸光度を示した。ビーズ Results and Discussion: Adhesion ability varied among different ELISA 法ではプレート法よりも，簡便で洗浄時間も短縮できる， colony morphologies. O- and OR-type strains attached strongly to 少量でも測定可能な点など，操作上においても利便性があると the cell culture dish. Several proteins were specific to adhesive 言える。BGRP ビーズの安定性，操作の簡便性，感度向上など strains, suggesting that these proteins have an effect on T. asahii が今後の検討課題であり，これらの検討結果も含めて発表する adhesion. 予定である。本研究は『農林水産業・食品産業科学技術研究推 進事業』の助成により行われているものである。

P2-207 アスペルギルス細胞壁 α-1,3- グルカンの調製 P2-208 LAMP 反応を利用した主要環境真菌検出法の と生物活性の検討 開発 ○石橋 健一，西村 祐亮，水上 亜友美，柳井 千穂，山中 大輔，安達 ○中山 孝子1，山崎 丘2,3，楊 彩佳2，戸根 一哉2，Alshahni Mohamed 禎之，大野 尚仁（東京薬大・薬・免疫） Mahdi3，藤崎 竜一4，槇村 浩一1,2,3（1帝京大院・医療技術・臨床検査， 2帝京大院・宇宙環境医学，3帝京大・医療共通教育研究センター， The preparation and biological activities of Aspergillus 4帝京大医・救急医学） alpha-1,3-glucan ○Ken-ichi Ishibashi, Yusuke Nishimura, Ayumi Mizukami, Chiho Development of the Fungal Detection Method from an Yanai, Daisuke Yamanaka, Yoshiyuki Adachi, Naohito Ohno (Labo. Environment using the LAMP Reaction Immunopharm. Microbial Products, Sch. Pharm., Tokyo Univ. Pharm ○Takako Nakayama1, Takashi Yamazaki2,3, Ayaka Yo2, Kazuya Tone2, and Life Sciences) Alshahni Mohamed Mahdi3, Ryuichi Fujisaki4, Koichi Makimura1,2,3 (1Dept. Clinic. Lab. Sci., Grad. Sch. Med. Tech., Teikyo Univ., 2Lab. 【目的】アスペルギルスは日和見感染を引き起こす主要病原真菌 Space Environ. Med., Grad. Sch. Med., Teikyo Univ., 3Gen. Med. Edu. である。我々はこれまでに，α-1,3- グルカンはアスペルギルス細 Res. Center, 4ER, Sch. Med., Teikyo Univ.) 胞壁主要構成多糖であり，菌種・菌株ごとに含量が異なってい る事を報告した。本研究では，アスペルギルス細胞壁 α-1,3- グ 閉鎖された環境中での過剰な真菌の増殖は，アレルギー，真菌毒 ルカン（ASAG）を調製し，生物活性を検討した。 による中毒又は，重大な真菌感染症を引き起こす可能性がある。 【方法・結果】A. fumigatus NBRC33022 の脱脂乾燥菌体を NaClO 近年の住構造は快適性を得るために気密性，断熱性に優れ，結果 溶液に懸濁し 1 夜酸化し，次亜塩素酸酸化菌体 OX-Asp を得た。 として高湿な環境を生じ，真菌の発生を一層早めている。このた この OX-Asp を 8M Urea に懸濁し，121°C 20min 処理した。この め，食品製造現場や宿泊施設では，真菌数の管理基準が設けら 反応液を遠心分離し，上清と沈殿に分けた。沈殿画分を 1D およ れ，また東日本大震災被災地の仮設住宅においては，アレルギー び 2D-NMR 解析したところ，α-1,3- グルカンを主要構成成分と 性気管支肺真菌症の発生と高濃度の真菌発生との関連が疑われ， すること事が明らかとなった。沈殿画分を DMSO に懸濁し，超 研究が進められている。しかし，環境中真菌の評価は培養法が 音波処理によって可溶化し ASAG を得た。ASAG を糖組成分析 主流であり，検出までに長い時間を必要とする。Loop-mediated したところ，主要構成糖はグルコースであり，元素分析したと isothermal amplification（LAMP）法は標的遺伝子に対し 4 種類あ ころ，窒素含量は 0.5% であった。また，C57bl/6 マウス脾臓細 るいは 6 種類の特定のプライマーを設定することにより，60～ 胞を ASAG で刺激し，48h 培養後，上清中の炎症性サイトカイン 65°C の一定温度で伸長反応を行う DNA 増幅・検出法である。通 TNF-α 産生濃度を検討したところ，刺激濃度依存的に TNF-α 産 常の PCR よりも検出までの時間が短く，目視で検出が可能であ 生が認められた。 り，サーマルサイクラーのような大掛りな装置を必要としない。 【考察】ASAG に関する研究は少なく，その生物学的意義につい そのため，迅速な検出が求められる医療現場や，検査機材の使用 ては良く知られていない。本研究において，次亜塩素酸酸化お が制限される災害現場，食品製造現場等での実用化が期待され よび Urea オートクレーブ法を用いることで，アスペルギルス菌 ている。本研究では，Candida albicans，Cryptococcus neoformans， 体から ASAG を調製することが出来た。ASAG は，脾臓細胞か Mucor racemosus の 28S rDNA の D1/D2 領域をもとに，LAMP プ ら TNF-α 産生を誘導したことから，アスペルギルス感染に伴っ ライマーセットを作成した。さらに，煩雑なピペット操作や高速 て起きる肺炎やグラニュローマ形成の病態に関与していること 遠心分離操作を必要としない Ultra Rapid Extraction（PURE）法 が示唆された。 を用いて DNA 抽出の簡略化を図ることにより，より簡便かつ迅 速な主要環境真菌検出系の開発を試みた。

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P2-209 靴に付着した真菌・細菌を植物精油とその成分 P2-210（WS20-3） 鉄欠乏条件において誘導される で殺菌する方法の開発 Candida glabrata のストレス応答 ○石島 早苗，安部 茂（帝京大学医真菌研究センター） ○田辺 公一1，名木 稔2（1龍谷大学農学部・食品栄養学科，2国立感 染症研究所・真菌部） New sterilizing method by essential oil for fungal and bacterial contamination in shoes Stress response in pathogenic fungus Candida glabrata ○Sanae Ishijima, Shigeru Abe (Teikyo Univ. Inst. Med. Mycol.) under iron-depleted conditions ○Koichi Tanabe1, Minoru Nagi2 (1Dept. Food Sci. and Human Nutr., 【目的】靴内部を汚染し増殖する微生物は，足白癬の原因や，足 Faculty Agr., Ryukoku Univ., 2Dept. Chemother. and Mycoses NIID) の臭いの原因になる。私達は，植物由来の精油に含まれる多様 な低分子揮発成分が持つ抗菌・抗真菌効果を用いて，靴底の繊 【目的】Candida glabrata の生息する宿主体内環境には多量の鉄結 維中に入り込んだ菌を殺菌する方法の開発を目指している。 合タンパク質が存在し，菌が利用することのできる遊離鉄の濃 【方法 】1．精油の抗菌効果（密閉箱気体法）：白癬菌 度は極めて低い。鉄欠乏応答機構は宿主体内での生育や病原性 A.vanbreuseghemii（TIMM2789），及び，足臭に関連するS. に重要であると考えられる。C. glabrata では鉄欠乏条件において epidermidis，B. subtilis を植菌した寒天培地を底面に置き下降法 発現量が増加する遺伝子を網羅的遺伝子発現解析により明らか で抗菌活性を測定した。2．靴の抗菌装置：靴の開口部分を密 にし，生育や病原性における役割を解明することを目的とした。 閉し精油を添加する装置を開発し，靴内の抗菌効果を検討した。 【方法】鉄欠乏条件で発現量の上昇が認められたステロールトラ 消臭効果を半導体臭いセンサーとアンケートで判定した。 ンスポーター遺伝子 AUS1 およびミトコンドリア選択的オート 【結果及び考察】既に抗微生物効果が報告されているレモングラ ファジー（マイトファジー）関連遺伝子 ATG32 について遺伝子 ス精油成分を溶解する溶媒（Tween80, 2- プロパノール，エタノー 破壊株を作製し，それぞれの現象における機能を評価した。また， ル）の検討を行い 40% の 2- プロパノールを選択した。溶媒で希 マウスに C. glabrata の野生株およびそれぞれの遺伝子破壊株を 釈した 7 種類の精油の抗菌効果を密閉箱気体法で検討した結果， 感染させ，臓器定着率を測定した。 TIMM2789 に対して，レモングラス，タイム，パルマローザの 【結果】鉄欠乏条件では，細胞外ステロール取り込みとマイトファ 順に強い殺菌効果が認められ，レモングラスとタイムの主成分 ジーが活性化されており，AUS1 および ATG32 破壊株ではそれ であるシトラール，チモールでも同様の効果が得られた。他の 2 ぞれの機能が消失することを明らかにした。感染実験において， 種の被験菌に対しても同様の効果が得られた。精油と靴の抗菌 AUS1 および ATG32 破壊株は野生株と比較し，腎臓における生 装置を用いて靴内部の抗菌を検討した結果，密閉箱同様の効果 菌数が有意に低下しており，細胞外ステロール取り込みとマイ を得ることができ，B. subtilis 汚染による臭いも減少した。また， トファジーがそれぞれ病原性に関与していることが示唆された。 シトラール希釈液は市販の抗菌スプレーより高い抗菌活性を示 【結論】C. glabrata は鉄欠乏環境である宿主体内において，合成 した。精油とその成分が低濃度で，蒸気のみで強い抗菌効果を が困難なステロールを細胞外から獲得し，マイトファジーによっ 示したので，今後さらに，広い空間で，多菌種に対する殺菌法 てミトコンドリアの機能を保持している可能性が示唆された。 を開発したいと考えている。また，他の抗菌物質などとの併用 効果も検討していく予定である。

P2-211 病原性真菌 Candida glabrata のエルゴステ P2-212 A549 細胞における MEIS3 のデオキシニバレ ロール取込に関連する新たな因子の同定 ノール処理による発現抑制とその影響 ○中山 浩伸1，犬飼 達也2,3，名木 稔2,4，伊藤 茉里奈1，近藤 健太1， ○豊留 孝仁1，亀井 克彦2（1帯畜大・動食検診セ，2千葉大学・真菌セ） 田辺 公一4（1鈴鹿医療大・薬，2国立感染研・真菌部，3東大（院）・医・ 感染病態，4龍谷大・農） Repression of MEIS3 in A549 lung epithelial cell by deoxynivalenol Identification of factors participate in sterol uptake in a ○Takahito Toyotome1, Katsuhiko Kamei2 (1DCAHFS, Obihiro Univ. pathogenic fungus, Candida glabarata Agr. Vet. Med., 2MMRC, Chiba Univ.) ○Hironobu Nakayama1, Tatsuya Inukai2,3, Minoru Nagi2,4, Marina Ito1, Kenta Kondo1, Koichi Tanabe4 (1Fac. Pharm, Suzuka Univ. Medical デオキシニバレノールはフザリウム属菌が産生する重要なカビ Science, 2Dept. Chemother Mycoses, NIID, 3Div. Pathol, Immun & 毒である。特に穀物を汚染し，経口摂取による毒性が懸念され Microbiol, Grad. Sch. Med, the Univ. of Tokyo, 4Dept. Agr Ryukoku Univ.) る。一方で粉末状となった汚染穀物や汚染された粉じんととも にデオキシニバレノールを吸入する場面も考えられ，呼吸器へ 【目的】病原真菌カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）では， の影響も懸念される。しかしながら，呼吸器への影響を念頭に 宿主体内での環境ストレスである鉄欠乏によりステロール取り 置いた検討はほとんど行われていない。そこで我々はデオキシ 込みが起こり，感染成立に深い関わりがあることが示唆されて ニバレノールが及ぼす影響について肺胞上皮由来 A549 細胞の いる。そこで我々は，鉄欠乏ストレスに応答したステロール取 遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。マイクロアレイ，さらに り込みとその制御機構の解明を目的として研究を行っている。 定量 PCR 法により解析を行った結果，デオキシニバレノール処 本発表では，好気条件でもステロールを取り込めるようになる 理により 6 遺伝子において発現低下が生じることが確認された。 ことで生育可能となった変異株を作製し，それらを用いたトラ これら発現低下が認められた遺伝子をそれぞれトランスフェク ンスクリプトーム解析から，ステロール取り込みに関わる因子 ションにより強制的に A549 細胞に発現させた後，デオキシニバ の同定を試みた。【方法】ステロール骨格が合成された以降で働 レノール処理を行った。その結果，それら遺伝子の一つ，MEIS3 く合成酵素の破壊株（erg1，erg7，erg25，erg27）のうち，各株の を発現させた細胞ではデオキシニバレノールによる毒性の減弱 ゲノムに変異が加わることで通常生育できない好気的条件下で が見られた。これらの結果から，MEIS3 の発現を低下させるこ も細胞外からステロールを取り込むことで生育可能となった復 とがデオキシニバレノールの毒性発現に寄与していることが示 帰変異株を取得した。DNA マイクロアレイ解析からこれらの株 唆された。 と野生株の発現プロファイルを比較し，ステロール取り込みに （会員外共同演者：高橋弘喜（千葉大学・真菌医学研究センター）） 関わる因子の同定を試みた。【結果と展望】ほとんどの変異復帰 株で，既に同定されているステロールトランスポーター（AUS1） とマンノプロテイン（TIR3）の発現が顕著に増加していた。さ らに，erg7 復帰変異株の中で，AUS1 や TIR3 の発現の上昇が確 認できない株も存在した。この株においては，脂肪酸の合成の 亢進と細胞壁保全に関与する MAP キナーゼの発現の亢進が見ら れたほか，宿主細胞接着因子の発現上昇が見られた。これらの 結果から，細胞壁の構造変化とステロール取込との関連が示唆 されたほか，宿主細胞への接着に，真菌の宿主細胞膜中のステ ロールの認識が関連していることが予想された。

163 P2-213 国際宇宙ステーション「きぼう」における真菌 動態研究：中間報告 ○佐藤 一朗1，山崎 丘1,2，槇村 浩一1（1帝京大・医療共通教育研， 2宇宙航空研究開発機構）

Fungal dynamics in Japanese Experiment Module “KIBO”, International Space Station ○Kazuo Satoh1, Takashi Yamazaki1,2, Koichi Makimura1 (1Gen. Med. Educ. Res. Center, Teikyo Univ., 2JAXA)

国際宇宙ステーション（ISS）に存在あるいは増殖した真菌が， 機器の健全性や宇宙飛行士の健康に影響を及ぼすことが懸念さ れている。そこで ISS 日本実験モジュール（JEM）「きぼう」内 における真菌を含めた環境微生物動態について，運用開始後約 500 日（Microbe-I）， 約 1000 日（Microbe-II）， 約 1500 日時点 （Microbe-III）それぞれにおいて軌道上のサンプルを採取し，解 析した。Microbe-I において真菌は分離されず，DNA が検出され るのみであったが，Microbe-II では，複数の真菌が分離培養され た。引き続き，Microbe-II および III で船内壁面を拭き取ったス ワブから抽出した DNA を用いて，クローンライブラリ法による 解析を実施した結果，Malassezia 属のみならずヒトが持ち込んだ 各種の環境真菌による真菌叢が形成されていたので，その結果 を報告する。 本研究は，宇宙航空研究開発機構（JAXA）が公募した JEM 第二 期利用テーマとして 2009 年に採択された「国際宇宙ステーショ ン内における微生物動態に関する研究（Microbial dynamics in International Space Station; Microbe-I, II&III）」として実施された 軌道上微生物叢解析実験の真菌関連研究成果の中間報告である。 会員外共同研究者：梅田宜子（帝京大）

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