Universidade Federal De Minas Gerais Instituto De Ciências Biológicas Departamento De Microbiologia

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

COMUNIDADES DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A ABELHAS SEM FERRÃO

NA REGIÃO DE MATA SECA EM MINAS GERAIS

JULIANA DE FREITAS TEIXEIRA

BELO HORIZONTE

2019 JULIANA DE FREITAS TEIXEIRA

COMUNIDADES DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A ABELHAS SEM FERRÃO

NA REGIÃO DE MATA SECA EM MINAS GERAIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do

Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Microbiologia.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa

BELO HORIZONTE

2019

Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFMG

Teixeira, Juliana de Freitas

COMUNIDADE DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A ABELHAS SEM FERRÃO NA REGIÃO DE MATA SECA EM MINAS GERAIS [manuscrito] / Juliana de Freitas Teixeira. - 2019.

66 f. : il.

Orientador: Carlos Augusto Rosa.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas.

1.Leveduras. 2.Mata seca. 3.Abelhas nativas sem ferrão. 4.Biodiversidade. I.Rosa, Carlos Augusto . II.Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. III.Título.

Dedico este trabalho a minha família, que está sempre ao meu lado me apoiando.

“Certa vez alguém disse que emoções são como cavalos selvagens. Elas são indomáveis, e os sentimentos são como corredeiras de água que você não controla e não sabe para onde irão levá-lo. Mas, em algum momento, você terá que lidar com isso. Precisará aprender a enfrentar a vulnerabilidade e a incerteza que os sentimentos trazem. Ao mesmo tempo em que os sentimentos podem levá-lo a visitar os calabouços do inconsciente e ativar pavores, desesperos e angústias que não se podem traduzir em palavras, eles também podem conduzi-lo a experiências maravilhosas e fazê-lo chorar de alegria e gratidão." Sri Prem Baba

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por todo seu amor.

Aos meus pais Elaine e Milton e aos meus irmãos Job e Jon, pelo amor, cuidado e apoio incondicional. À minha avó Geralda de Jesus por todas as orações. À minha tia Kênia Raydan. À minha prima Alexsana.

À todos os amigos por cada abraço, ajuda e palavra de incentivo, em especial Michele, Beatriz, Ludmylla, Taísa, Flávia, Gabriela, Glauciane, Diego, Patrícia, Larissa e Túlio.

Ao Prof. Carlos Augusto Rosa pela oportunidade, ensinamentos e suporte.

À minhas amigas e todos os colegas do Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e Biotecnologia de Fungos. Especialmente à Thelma pelo carinho, amizade, contribuição e toda atenção durante este processo. À Ana Raquel por toda a ajuda e contribuição neste trabalho. Agradeço a Elisa, Mayara, Rafaela, Katharina, Flávia, Ana Luíza, Mariana Anzai, Raquel, Thais e Thamar. Agradeço também a Paula Calaça, sempre atenciosa e a disposição para me ajudar.

À FAPEMIG pelo apoio a pesquisa.

Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e ao Instituto de Ciências Biológicas.

À Universidade Federal de Minas Gerais pela acolhida.

iii

RESUMO

O ecótono mata seca, região de transição entre cerrado e caatinga, abriga grande biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras, principalmente dos gêneros Starmerella e Zygosaccharomyces. No presente trabalho, as comunidades de leveduras associadas a duas espécies de abelhas nativas sem ferrão, Tetragonisca angustula (jataí) e Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), e a espécie com ferrão Apis mellifera foram estudadas em área de mata seca. Três coletas foram realizadas em área de preservação de mata seca (Janaúba, Minas Gerais), durante a estação chuvosa, no início da estação seca durante o período de floração das arvores da região, e no auge na estação seca. Amostras de mel imaturo, mel maduro, pólen e indivíduos adultos foram coletados em três ninhos de cada espécie de abelha. Durante o período de floração, amostras de flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) foram coletadas por serem a principal fonte de néctar e pólen para as abelhas na região. As amostras foram processadas e semeadas em ágar extrato de malte – extrato de levedura (YM). Oitenta e seis isolados de leveduras foram obtidos das amostras coletadas dos ninhos de T. angustula, 184 isolados a partir das amostras de Scaptotrigona, 78 isolados das amostras de A. mellifera e 33 isolados a partir das amostras de flores de Aroeira, totalizando 381 isolados de leveduras. Cinquenta e três espécies de leveduras foram obtidas, incluindo novas espécies. A espécie associada com mais frequência à T. angustula foi Starmerella etchellsii; Candida parapsilosis foi a mais frequente associada à A. mellifera. A possível nova espécie Zygosaccharomyces sp.1, próxima à Z. mellis, foi a espécie mais frequente associada à S. cfr. bipunctata. As leveduras do gênero Starmerella foram isoladas em número elevado, distribuídas entre os substratos e entre as três espécies de abelhas, indicando endemismo. As comunidades de leveduras estudadas apresentam alto número de espécies exclusivas, indicando segregação nos locais de forrageio. A identificação das espécies de leveduras associadas a estes insetos contribui para elucidação do microbioma das abelhas nativas sem ferrão e sua biodiversidade.

Palavras chave: abelha nativa, abelha sem ferrão, levedura, biodiversidade, microbiota, mata seca.

ABSTRACT

The dry forest ecotone, a transition region between cerrado and caatinga, shelters a great biodiversity native stingless bee species. These bees are closely related to several species of yeast, mainly species of the genera Starmerella and Zygosaccharomyces. In the present study, the yeast communities associated with two species of native stingless bees, Tetragonisca angustula (jataí) and Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), and the specie Apis mellifera were studied in a dry forest area. Three collections were carried out in a dry forest preservation area (Janaúba, Minas Gerais), during the rainy season, at the beginning of the dry season during the flowering period, and at the peak of the dry season. Samples of immature honey, mature honey, pollen and adult individuals were collected in three nests of each species of bee. During the flowering period, samples of flowers of Myracrodruon urundeuva (Aroeira) were collected for being the main source of nectar and pollen for bees in the region. The samples were processed and plated on agar malt extract – yeast extract (YM). Eighty-six yeast isolates were obtained from the samples collected from nests of T. angustula, 184 isolates from the samples of Scaptotrigona, 78 isolates from the samples of A. mellifera and 33 isolates from the flower samples of Aroeira, totaling 381 yeast isolates. Fifty-three yeast species were obtained, including new species. The most frequent species associated with T. angustula was Starmerella etchellsii; Candida parapsilosis was the most frequent associated with A. mellifera. The possible new species Zygosaccharomyces sp.1, next to Z. mellis, was the most frequent species associated with S. cfr. bipunctata. The yeasts of the genus Starmerella were isolated in high numbers, distributed among the substrates and among the three species of bees, indicating endemism. The studied yeast communities present a high number of exclusive species, indicating segregation in the forage sites. The identification of yeast species associated with these insects contribute to the elucidation of the microbioma of native stingless bees and its biodiversity.

Keywords: native bee, stingless bee, yeast, biodiversity, microbiota, dry forest.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ninho da abelha nativa sem ferrão Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), espécie de abelha eussocial (fonte: Autora) ...... 19

Figura 2: Mapa de localização do Município de Janaúba, norte do estado de Minas Gerais, Brasil. Construído utilizando software QGIS 3.4.2, dados espaciais obtidos no portal de mapas do IBGE (https://portaldemapas.ibge.gov.br) ...... 28

Figura 3: As espécies de abelhas Tetragonisca angustula (A, jataí), Scaptotrigona cfr. bipunctata (B, tubuna) e Apis mellifera (C) (fonte: A, http://www.ib.usp.br/beesp/; B, Paula de Souza São Thiago Calaça; C, Prof. Dr. Clemens Schlindwein) ...... 29

Figura 4: Coleta de amostras de flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) (fonte: Prof. Dr. Clemens Schlindwein) ...... 30

Figura 5: Coleta de mel com o auxílio de micropipetador (fonte: Paula de Souza São Thiago Calaça) ...... 31

Figura 6: Coleta de pólen utilizando alça estéril (fonte: Paula de Souza São Thiago Calaça) . 31

Figura 7: Indivíduos adultos das espécies Tetragonisca angustula (A), Scaptotrigona cfr. bipunctata (B) e Apis mellifera (C) em placas de ágar YM (fonte: Autora) ...... 32

Figura 8: Placa inoculada em campo (A), placa com colônias de levedura isoladas (B), placa com colônia de levedura purificada (C) (fonte: Autora) ...... 33

Figura 9: Número de isolados de leveduras em relação à cada espécie de abelha estudada (A. mellifera; S. bipunctata; T. angustula) obtidos nas diferentes datas de coletas (PC, primeira coleta - 01/04/16; SC, segunda coleta - 09/06/16; TC, terceira coleta - 07/10/16). Os valores foram expressos como média ± desvio padrão. * p < 0,05 quando comparado o grupo SC com o grupo TC. Análise de variância de Friedman seguida de pós-teste de Bonferroni...... 39

Figura 10: Diagrama de Venn com o número de espécies de leveduras exclusivas e compartilhadas entre abelhas adultas (Apis mellifera, T. angustula e S. cfr. bipunctata) e substratos associados (mel e própolis) ...... 40

Figura 11: Dendrograma de similaridade das leveduras vetorizadas por diferentes espécies de abelhas. Agrupamento realizado pela similaridade Jaccard ...... 42

Figura 12: Curvas de acumulação de espécies das comunidades de leveduras associadas a abelhas e substratos relacionados ...... 44

Figura 13: Esporos sexuais de Zygosaccharomyces sp.1. A seta indica o esporo dentro da asca em forma de haltere ...... 53

Figura 14: Árvore filogenética mostrando o posicionamento da espécie Zygosaccharomyces sp. 1, construída pelo método de ―neighbor-joining‖, baseada em sequências dos domínios D1/D2 do gene do RNAr. Foi utilizado um bootstrap de 1000 interações e a porcentagem é mostrada próxima aos ramos. A distância evolutiva foi calculada pelo método de ―Kimura 2 parâmetros―. A barra de escala mostra a proporção de divergência na sequência. Análise realizada no programa MEGA 7 ...... 54

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Número de leveduras isoladas de acordo com a espécie e substrato ...... 39

Tabela 2: Índices de diversidade e riqueza das comunidades de leveduras associadas às abelhas Scaptotrigona cfr. bipunctata, Tetragonisca angustula e Apis mellifera...... 41

Tabela 3: Índices de diversidade β das comunidades de leveduras associadas às abelhas S. cfr. bipunctata, Tetragona angustula e Apis mellifera...... 42

Tabela 4: Frequência de espécies de leveduras associadas à Tetragonisca angustula ...... 46

Tabela 5: Frequência de espécies de leveduras associadas à Scaptotrigona cfr. bipunctata...... 49

Tabela 6: Frequência de espécies de leveduras associadas à Apis mellifera ...... 51

Tabela 7: Possíveis novas espécies de leveduras ...... 55

viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DMSO – Dimetilsulfóxido DNA – Ácido desoxirribonucleico dNTP – Desoxirribonucleotídeos fosfatados EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético g – Grama GYMP – Caldo glicose, extrato de levedura, malte e peptona h – Hora kb – Kilobase M – Massa molar mL – Mililitro mm – Milímetro mM – Milimolar min – Minuto MRS – Ágar de Man, Rogosa e Sharpe NaCl – Cloreto de sódio ng – Nanograma nm – Nanômetro PCR – Reação em cadeia da polimerase pH – Potencial hidrogeniônico pmol – Picomol rpm – Rotações por minuto rRNA – RNA ribossomal SDS – Dodecil sulfato de sódio TBE – Tampão tris-hidroximetilaminometano, ácido bórico e EDTA Tris-EDTA – Tampão tris-hidroximetilaminometano e EDTA Tris-HCl – Tampão tris-hidroximetilaminometano hidrocloreto U – Unidade UV – Ultravioleta V – Volt X – Multiplicação

YM – Ágar extrato de levedura e malte µg – Micrograma µL – Microlitro oC – Grau Celsius > – Maior + – Somatória % – Porcentagem

SUMÁRIO

RESUMO ...... iv ABSTRACT ...... v LISTA DE FIGURAS ...... vi LISTA DE TABELAS ...... viii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...... ix 1 INTRODUÇÃO ...... 13 2 JUSTIFICATIVA ...... 15 3 OBJETIVOS ...... 16 3.1 Objetivo geral ...... 16 3.2 Objetivos específicos ...... 16 4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 17 4.1 Bioma Mata Seca ...... 17 4.2 Abelhas Nativas ...... 18 4.3 Ecologia de leveduras ...... 22 4.4 A relação entre abelhas, seus produtos e as leveduras ...... 24 5 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 28 5.1 Coleta das amostras ...... 28 5.2 Preservação e identificação morfológica ...... 32 5.3 Extração de DNA...... 33

5.4 Agrupamento por PCR fingerprinting com iniciador GTG5 ...... 34 5.5 PCR utilizando iniciadores ITS1 e NL4 ...... 35 5.6 Purificação e reação de sequenciamento ...... 35 5.7 Análise das sequências ...... 36 5.8 Análise estatística dos dados e determinação dos índices de diversidade ...... 37 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 38 6.1 Isolamento, preservação e agrupamento morfológico ...... 38

6.2 Identificação das leveduras ...... 45

6.3 Espécies novas de leveduras ...... 52

7 CONCLUSÃO ...... 57 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 58

xii

1 INTRODUÇÃO

A mata seca é uma área transicional de ampla biodiversidade, sendo considerada um dos ecossistemas brasileiros menos estudados. A mata seca é fortemente ameaçada pelas atividades humanas como, por exemplo, o desmatamento visando à agricultura e pecuária extensiva, fragmentando e reduzindo a vegetação nativa causando o desequilíbrio ecológico da região. Considerada um ecótono, a mata seca é uma região de transição ambiental entre os biomas cerrado e caatinga, ocorrendo principalmente no nordeste do Brasil e região do norte do estado de Minas Gerais, abrangendo 1,3% do território nacional.

Diversas espécies de abelhas sem ferrão são encontradas no ecossistema de Mata Seca, mas ainda com poucos estudos ecológicos sobre estes insetos. As abelhas nativas sem ferrão fazem parte da ordem Hymenoptera, da família Apidae e da tribo Meliponini e estão distribuídas pelo mundo basicamente em regiões tropicais. Estes insetos são altamente adaptáveis a desafios ecológicos e desempenham grande importância como polinizadoras, sendo consequentemente essenciais para produção de alimentos em escala global. Os meliponíneos representam o maior grupo existente de abelhas altamente eusociais, com mais de 500 espécies descritas, sendo que além dos meliponíneos, apenas a tribo dos apíneos apresenta abelhas eusociais. Apesar da ampla distribuição e do grande número de espécies das abelhas sem ferrão, a biologia destes insetos é consideravelmente pouco estudada se comparada à das abelhas europeias africanizadas (Apis mellifera) pertencentes à tribo Apini. Além disso, as abelhas se encontram em crescente declínio, ameaçadas especialmente pela perda de habitat e a redução de biodiversidade nos ambientes ainda ocupados por elas, em decorrência de sua dependência de flora nativa como recurso alimentar apícola.

Em vista disto, outro aspecto de grande relevância surge através da associação íntima das abelhas nativas sem ferrão às leveduras, microrganismos ubíquos e fermentadores. Durante o forrageamento, as abelhas estocam em seus ninhos uma ampla variedade de alimentos como néctar e pólen. Estes substratos podem ser fontes de microrganismos que irão colonizar os alimentos produzidos por estes insetos no interior das colmeias. Leveduras já foram encontradas em provisões de pólen e mel, e no trato intestinal de larvas de abelhas adultas. As leveduras podem produzir enzimas que auxiliam na transformação e enriquecimento nutricional do pólen. Estes substratos

servem como alimento para aquisição de nutrientes essenciais durante o processo de desenvolvimento larval de abelhas sem ferrão.

Ainda há muitos aspectos a serem explorados sobre a relação entre abelhas sem ferrão e leveduras, incluindo maiores estudos a respeito da biodiversidade e biologia desses microrganismos. As abelhas nativas sem ferrão auxiliam na sustentação de outras formas de vida que são essenciais através da polinização, e fornecem produtos de valor comercial como o mel e o própolis. As interações entre abelhas e leveduras influenciam intrinsecamente e ativamente a saúde, comportamento, distribuição e reprodução destes insetos. Portanto, o conhecimento da associação destes microrganismos e abelhas sem ferrão no bioma de mata seca poderá fornecer novas informações sobre a ecologia desta interação, e a ocorrência de espécies de leveduras ainda desconhecidas pela ciência.

2 JUSTIFICATIVA

Muito pouco é conhecido ainda sobre a associação entre leveduras e abelhas sem ferrão. As leveduras provavelmente desempenham papel importante na maturação do pólen e do mel no interior das colmeias. Isto ocorre pela produção de enzimas que hidrolisam compostos complexos presentes nestes substratos, além de compostos voláteis que influenciam no desenvolvimento de larvas e pupas. Portanto, o conhecimento de espécies de leveduras associadas a estes insetos pode gerar novos dados sobre a ecologia desta associação. Também, estes insetos são fontes de novas espécies de leveduras, principalmente dos gêneros Starmerella e Zygosaccharomyces. Estas espécies podem ter relevância em biotecnologia, como na produção de biosurfactantes e outros polímeros microbianos. Todos estes aspectos levam consequentemente à valorização e busca pela preservação do bioma mata seca e da amplitude de espécies nele encontradas, dentre elas, as abordadas neste estudo, Myracrodruon urundeuva (aroeira), as abelhas nativas sem ferrão Tetragonisca angustula e Scaptotrigona cfr. bipunctata, e as leveduras associadas a este bioma.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Descrever as comunidades de leveduras associadas a duas abelhas sem ferrão, a Apis mellifera e a flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) em uma região de mata seca no norte do estado de Minas Gerais.

3.2 Objetivos específicos

• Isolar colônias de leveduras presentes em mel imaturo, mel maduro, pólen, flores (Myracrodruon urundeuva) e associadas ao corpo de abelhas adultas dos ninhos das espécies Apis mellifera, Tetragonisca angustula e Scaptotrigona cfr. bipunctata.

• Identificar por métodos moleculares as espécies isoladas de leveduras.

• Descrever novas espécies de leveduras.

• Comparar as comunidades de leveduras isoladas dos diferentes substratos de acordo com a estação do ano.

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 Bioma Mata Seca

A mata seca representa 42% da cobertura florestal global, e é considerada como área de floresta tropical transicional. No Brasil, a mata seca se encontra entre regiões de cerrado e caatinga, com temperaturas anuais acima de 17º C, com média >25º C, precipitação anual em torno de 1.800 mm, e um período de 3 a 6 meses com menos de 100 mm por mês (MURPHY & LUGO, 1986; CAETANO et al., 2008; PORTILLO- QUINTERO & SÁNCHEZ-AZOFEIFA, 2010; FERNANDEZ & DIAZ, 2016). A mata seca é uma região que enfrenta vários meses de aridez e períodos de distribuição de chuva com sazonalidade bem demarcada (MILES et al., 2006), possui vegetação predominantemente decídua e durante a seca pode ocorrer perda de até 50% da cobertura arbórea (MURPHY & LUGO, 1986; ARRUDA et al., 2011). A região norte do estado de Minas Gerais, que faz parte do polígono das secas, apresenta áreas de mata seca nos pontos transicionais entre cerrado e caatinga (ARRUDA et al., 2011). A fisionomia deste ecossistema apresenta árvores emergentes atingindo 30 m de altura, sendo que em afloramentos rochosos podem ser encontradas árvores com dossel superior de 6 m a 15 m. Dentre as espécies que compõem o estrato arbóreo estão Myracrodruon urundeuva (aroeira-do-sertão), Anadenanthera colubrina (angico-vermelho), Astronium fraxinifolium (gonçalo-alves), Dilodendron bipinnatum (mulher-pobre, mamoninha), Sterculia striata (chichá), Amburana cearensis (amburana), Schinopsis brasiliensis (pau-preto), Cavanillesia arborea (imbaré), Commiphora leptophloeos (amburaninha), Goniorrhachis marginata (itapicuru), entre outras. Também podem ser observadas cactáceas e bromeliáceas terrestres (OLIVEIRA- FILHO, 2006). O clima e o solo fértil favoreceram a ocupação populacional em áreas de mata seca, levando ao desmatamento e acelerada degradação devido a cultivos intensivos como cana de açúcar e soja, e pela conversão em pasto para pecuária (BLACKIE et al., 2014; FERNANDEZ & DIAZ, 2016). Outro aspecto relevante é o valor econômico do corte de madeira, geralmente explorado pela população local, podendo resultar em significativo impacto ambiental se o recurso não for acessado de maneira sustentável (MURPHY & LUGO, 1986; MCLAREN et al., 2005). No âmbito das regiões florestais que se encontram em situação de vulnerabilidade, a mata seca foi identificada como um dos biomas mais ameaçados no

mundo, apesar de sua riqueza de espécies (PORTILLO-QUINTERO & SÁNCHEZ- AZOFEIFA, 2010; GILLESPIE et al., 2012; FERNANDEZ & DIAZ, 2016). O desequilíbrio ecológico e a perda de biodiversidade causam impactos econômicos e sociais. As espécies endêmicas, por exemplo, são responsáveis pela polinização de plantações que são fontes de abastecimento alimentar, e de coberturas florestais que garantem a captação e renovação de recursos hídricos além do armazenamento de carbono (HOEKSTRA et al., 2005). Mundialmente a área total de floresta tropical de mata seca remanescente é estimada em 1.048.700 km2, sendo que 97% desta área encontra-se ameaçada e 54,2% está localizada na América do Sul (MILES et al., 2006). Algumas das principais ameaças que levam ao risco de perda florestal são a extinção de espécies, a disfunção ecológica e o decréscimo de biodiversidade, estas ameaças comprometem a conservação de um ecossistema e dentre seus causadores estão o aumento da densidade populacional humana, as mudanças climáticas, queimadas, a fragmentação de habitat e degradação, a invasão de espécies não nativas, e a conversão de terras para atividade agropecuária (HOEKSTRA et al., 2005; MILES et al., 2006; GILLESPIE et al., 2012; RODRIGUES et al., 2015; NOTARO et al., 2018).

Os ecossistemas sustentam diversas interações ecológicas e proporcionam pressões evolucionárias que mantém a biodiversidade, permitem a evolução de novas espécies e geram características utilitárias que beneficiam os seres humanos (HOEKSTRA et al., 2005). A mata seca apresenta grande biodiversidade e a maioria das ameaças a este ecossistema resulta da atividade humana, são necessárias decisões que colocam estas áreas como alvo de alta prioridade de conservação e pesquisa. Portanto iniciativas de proteção e manejo de fragmentos florestais deste tipo de ecossistema são imprescindíveis (MILES et al., 2006; ARRUDA et al., 2011; FERNANDEZ & DIAZ, 2016; PRIETO-TORRES et al., 2016).

4.2 Abelhas Nativas

As abelhas sem ferrão (Hymenoptera: Apidae: Meliponini) compreendem o maior grupo de abelhas eussociais do planeta, incluindo mais de 500 espécies descritas, distribuídas pelas regiões Neotropicais (América tropical, África, sudeste da Ásia e Austrália) (HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016). O território brasileiro abriga diversos

gêneros e espécies de abelhas nativas sem ferrão, sendo, 244 espécies válidas e 89 ainda não descritas, pertencentes a 29 gêneros diferentes. Estes insetos não somente exercem grande importância socioeconômica em relação à população humana, como também interferem diretamente na estruturação ecológica dos ecossistemas em que estão inseridos (PEDRO, 2014).

As abelhas eussociais se estabelecem em ninhos (figura 1) que apresentam alta complexidade em sua estrutura e funcionamento, possuindo adultos de duas gerações, trabalho cooperativo, divisões de classes e manutenção de células de alimento e criação (HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016). Os indivíduos adultos fazem a maior parte ou todo o forrageamento para obtenção de alimento, enquanto a rainha acasala e faz a oviposição. A rainha normalmente apresenta maior tamanho corporal que as abelhas operárias, e sua diferenciação na fase larval se da pela quantidade muito maior de alimento disponibilizada para a rainha (MICHENER, 2007; LUNA-LUCENA, RABICO & SIMOES, 2019). As abelhas operárias forrageadoras são generalistas, ou seja, visitam uma grande diversidade floral coletando néctar e pólen (RAMALHO, 1990).

Figura 1: Ninho da abelha nativa sem ferrão Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), espécie de abelha eussocial (fonte: Autora).

As colônias de abelhas sem ferrão são perenes e resistem a longos períodos de adversidades pelo consumo de alimento estocado nos ninhos (potes contendo mel e pólen) (MICHENER, 1969; WILLE, 1983). A nidificação ocorre normalmente em buracos pré-existentes como, cavidades subterrâneas e arbóreas, associada a outros insetos como formigas, cupins e vespas, e ainda pode haver ninhos expostos (SAKAGAMI & ZUCCHI, 1967; HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016). A entrada dos ninhos é construída utilizando cera e resina, geralmente no formato de um tubo estendido permitindo a passagem de apenas um indivíduo por vez, tanto para entrada quanto saída, o que confere mais segurança para os ninhos (WILLE, 1983; ROUBIK, 2006).

As abelhas sem ferrão são importantes propagadoras da polinização de diversas plantas cultivadas, devido a influencia positiva direta no rendimento e na qualidade das plantações. Estas estão sendo cada vez mais utilizadas por serviços de polinização comercial, além disso, forrageiam efetivamente em ambientes fechados o que mostra seu potencial para polinização em estufas. Alguns exemplos de cultivo são morango, abacate, pepino, cupuaçu e tomate (SLAA et al., 2006).

O mel dos meliponíneos possui atividade antioxidante e alta quantidade de compostos fenólicos, apresenta bastante variabilidade em sua composição física e química dependendo da espécie da abelha, da florada predominante, das condições climáticas e da origem geográfica (BILUCA et al., 2016; RAO et al., 2016). Apesar dessa variação, o mel normalmente contém açúcares como frutose e glicose, que compreendem até 95% de sua composição, ácidos orgânicos, ácidos fenólicos (ex. cafeico, elágico, ferúlico e p-cumárico), flavonóides (ex. apigenina, crisina, galanina, quercetina, pinocembrina), antioxidantes (ex. ácido ascórbico, superóxido dismutase, catalase, glutationa reduzida), proteínas, aminoácidos, enzimas, vitaminas (ex. ácido fólico, riboflavina, biotina, cianocobalamina) e minerais. Cada componente possui funções nutricionais e medicinais (PATRICIA et al., 2015; RAO et al., 2016).

O mel produzido pelas abelhas sem ferrão é diferenciado em relação ao produzido por apíneos, em aspectos fisicoquímicos como cor, sabor e viscosidade, fluido e adocicado com um toque de acidez, sendo mais valorizado economicamente, porém necessita de maiores estudos para caracterização e definição de padrões de qualidade (BILUCA et al., 2016; RAO et al., 2016; ÁVILA et al., 2018; COSTA et al.,

2018). Este mel também apresenta propriedades biológicas anti-inflamatória, antimicrobiana, antiviral e anticancerígena (OTHMAN, 2012; RAO et al., 2016); diminui o risco de acidente cardiovascular (AL-WAILI, 2004); reduz o stress oxidativo do cérebro; e aumenta as concentrações de acetilcolina e fator neurotrófico (OTHMAN et al., 2015). Ainda auxilia na cicatrização de feridas através do aumento da viabilidade celular e proliferação de fibroblastos dérmicos (NORDIN et al., 2018). Estudos indicam que o mel produzido pela abelha sem ferrão Tetragonisca angustula possui atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas como Staphylococcus aureus (MIORIN et al., 2003), Bacilus cereus, Pseudomonas aeruginosa, e contra leveduras como Candida albicans e Saccharomyces cerevisiae (DEMERA & ANGERT, 2004; TORRES et al., 2018), além de ótima capacidade antioxidante (RAO et al., 2016). A produção de mel por abelhas sem ferrão ainda é pouco explorada, sua valorização pode estimular o crescimento socioeconômico de comunidades rurais e ao mesmo tempo ser uma via para atividades educacionais de conservação, criando a possibilidade da implantação de fontes de renda sustentável e manutenção de abelhas para polinização de plantas (MUSTAFA, YAACOB & SULAIMAN, 2018).

A domesticação das abelhas pelo ser humano enraizou-se de maneira cultural e econômica em nossa sociedade, levando à criação destes insetos também conhecida como apicultura ou meliponicultura para os meliponíneos, a criação de abelhas sem ferrão data de períodos remotos em nossa história (QUEZADA-EUÁN et al., 2018). Na América tropical há registros de uma relação desenvolvida durante milênios entre comunidades indígenas e abelhas. O mel das abelhas sem ferrão era tradicionalmente utilizado em trocas de valor econômico. Na medicina e em cerimônias, nas sociedades Maias pré-colombianas constituíam inclusive parte importante da mitologia. Porém com o processo de colonização europeu no século XVI, tribos indígenas foram extintas e grandes áreas florestais desmatadas para ocupação e agricultura. Este último fato afetou profundamente os processos de nidificação, forrageamento e reprodução de diversas espécies de abelhas (HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016; QUEZADA-EUÁN et al., 2018).

Desde a antiguidade as abelhas fornecem alimento e outros produtos para o homem, e é de grande importância reavivar e manter a herança cultural milenar dessa relação com as abelhas sem ferrão, e com isso auxiliar na valorização do uso sustentável

de seus produtos. O reconhecimento de sua função essencial na manutenção e conservação de ecossistemas é fundamental (QUEZADA-EUÁN et al., 2018).

4.3 Ecologia de leveduras

As leveduras são fungos ubíquos e geralmente unicelulares, que se reproduzem predominantemente de forma assexuada por brotamento ou fissão binária, podem apresentar formas sexuadas, porém, não desenvolvem corpos frutificantes como os fungos filamentosos. As espécies de leveduras estão distribuídas em dois filos do reino Fungi, Basidiomycota e Ascomycota (KURTZMAN, FELL & BOEKHOUT, 2011a). As leveduras são consideradas modelo biológico de estudo laboratorial, células eucarióticas de fácil e segura manipulação além de rápida reprodução, apresentam curto tempo entre gerações e genomas de pequeno tamanho, sendo muito interessantes para manipulação genética e estudos evolucionários (BORNEMAN & PRETORIUS, 2014). A espécie mais empregada com este propósito é Saccharomyces cerevisiae, utilizada em experimentos há mais de um século, e em 1996, o primeiro organismo eucariótico a ter seu genoma completamente sequenciado (GOFFEAU et al., 1996; LITI, 2015). O histórico de pesquisas sobre leveduras se inicia ao final do século XVIII, em 1789 com estudos da fermentação alcoólica por Lavoisier (BARNETT, 1998). Este fenômeno é uma das características metabólicas de maior destaque das leveduras, e já era observado a 7000 anos a.C. nas regiões da Mesopotâmia e Cáucaso. Nesta época, a humanidade teve os primeiros contatos com a fermentação espontânea de acordo com registros arqueológicos, e passou a produzir e preservar uma diversidade de alimentos, dentre eles pão, queijos, cerveja, vinho e outras bebidas alcoólicas (PRETORIUS, 2000). A utilização milenar de leveduras na fermentação em ambientes antrópicos levou a exposição destes microrganismos a diferentes fatores de pressão seletiva resultando em adaptações genéticas, o que foi chamado de processo de domesticação (SICARD & LEGRAS, 2011; LITI, 2015).

Entretanto, o interesse no estudo sobre as leveduras em seu ambiente natural, tanto de espécies selvagens quanto associadas a atividades humanas se inicia principalmente na década de 1950 (LITI, 2015). As leveduras estão distribuídas em todos os biomas do mundo e nos ambientes naturais podem assumir diversas funções. São essencialmente decompositoras, colonizam substratos ricos em nutrientes e são

seguidas por uma variedade de outros microrganismos completando a degradação da matéria orgânica. Além disso, como parte de um ecossistema, interagem com os organismos que o compõem em relações de mutualismo, competição, parasitismo e patogenicidade (STARMER & LACHANCE, 2011). Em situações onde há escassez de nutrientes as leveduras podem formar esporos, que são estruturas de resistência capazes de sobreviver mais tempo que as células vegetativas. Em circunstâncias extremas, como altas ou baixíssimas temperaturas e seca, os esporos persistem até que haja novamente condições de desenvolvimento favoráveis (LITI, 2015).

Leveduras ascomicéticas como S. cerevisiae podem formar esporos chamados ascósporos contidos em ascas, enquanto em ambiente rico em nutrientes células diploides se reproduzem por divisão mitótica. Porém quando há baixa de nutrientes, as células diploides entram em meiose produzindo esporos haploides com, geralmente, dois (a e α) tipos reprodutivos diferentes (mating types) (VAUGHAN-MARTINI & MARTINI, 2011; BOYNTON & GREIG, 2014). Quando as condições favoráveis ao desenvolvimento retornam, os esporos germinam em células viáveis haploides, que podem se reproduzir mitoticamente (KNOP, 2006; BOYNTON & GREIG, 2014; LITI, 2015). O cruzamento entre indivíduos não relacionados pode ocorrer entre espécies próximas de leveduras diferentes, levando à formação de híbridos, como por exemplo, S. pastorianus, que é um híbrido do cruzamento entre S. cerevisiae e S. eubayanus, amplamente utilizada na indústria cervejeira para produção de cerveja larger (LIBKIND et al., 2011).

A diversidade dos habitats naturais de leveduras e sua ubiquidade é consequência da capacidade desses microrganismos de assimilar nutrientes, como carbono e nitrogênio, a partir de uma enorme variedade de fontes, além do fato de tolerarem uma ampla variação na escala de pH, altas pressões osmóticas e salinidade, dessecação e altos índices de radiação UV. As leveduras podem se tornar especializadas em apenas um nicho e apresentar características fisiológicas próprias para aquele ambiente (STARMER & LACHANCE, 2011).

As interações com os ambientes naturais e entre espécies no mesmo habitat levam ao desenvolvimento de características adaptativas, convergências fenotípicas e o estabelecimento de estratégias de sobrevivência (LITI et al., 2009). A temperatura pode influenciar diretamente na velocidade de crescimento. A disponibilidade de recursos

pode determinar a formação ou não de esporos. Ao longo de um dia ocorrem alterações de luz, umidade, temperatura, incidência de ventos, a chamada variação circadiana, este aspecto ambiental permite que duas espécies ou mais se desenvolvam em simpatria; ou seja, que se desenvolvam no mesmo habitat com, por exemplo, as espécies mais adaptadas a altas temperaturas ou termotolerantes apresentando melhor atividade nos períodos mais quentes do dia; as espécies criotolerantes, que se desenvolvem melhor a temperaturas mais baixas, apresentando um desempenho superior nos períodos mais frios (SAMPAIO & GONÇALVES, 2008; SALVADÓ et al., 2011).

Em resumo, leveduras como seres ubíquos estão amplamente dispersas, podem ocorrer nos principais ambientes bióticos e abióticos, como solo, água, na atmosfera, em plantas, animais e insetos. Em certos momentos alguns destes habitats são apenas transitórios; ventos podem atuar na dispersão destes microrganismos, tal qual, o carreamento na superfície de um inseto, ou o decaimento de uma fruta ao solo. Além disto, a migração humana também contribui para a dispersão destes microrganismos, como ocorreu no caso das leveduras fermentadoras de bebidas alcoólicas (BARBOSA et al., 2018). Leveduras que se especializaram no crescimento e reprodução em determinado habitat podem persistir, por exemplo, produzindo esporos, até surgir a oportunidade de retornarem ao seu reservatório ideal (STARMER & LACHANCE, 2011).

Com o advento das análises biomoleculares, a ferramenta de genômica populacional, assim como, o estudo de diferentes biomas ao redor do globo, tem auxiliado na construção da história natural das linhagens de leveduras, suas adaptações genotípicas e fenotípicas. Isto tem possibilitado o aperfeiçoamento do conhecimento biológico a respeito dessas espécies de microrganismos, colaborando para melhor compreensão dos fatores seletivos aos quais são expostas durante seus ciclos de vida, suas interações ambientais e seu processo evolucionário (LITI, 2015; BARBOSA et al., 2018).

4.4 A relação entre abelhas, seus produtos e leveduras

A associação entre abelhas sem ferrão e comunidades microbianas vem sendo mostrada em diversos estudos. Leveduras já foram encontradas no corpo de abelhas

adultas, em larvas, provisões larvais e pupas (ROSA et al., 2003). Microrganismos podem colonizar diversas partes no corpo de um inseto, que representam habitat diferentes, alguns exemplos são o exoesqueleto e o lúmen intestinal. A composição e abundância desta microbiota são determinadas por condições físico-químicas e o sistema imune do inseto, além das interações entre os microrganismos naquele habitat (DOUGLAS, 2015). Uma vez que a relação é estabelecida pode haver variados tipos de interações, desde neutra (0/0), passando por mutualística que é positiva para ambos (+/+), comensal (+/0), amensal (-/0) e até o parasitismo onde um participante é lesado e o outro beneficiado (-/+) (STARMER & LACHANCE, 2011; STEFANINI, 2018). Normalmente a relação é benéfica, onde a levedura oferece nutrientes essenciais ao inseto e este atua como veículo de dispersão das células fúngicas. Observa-se ainda a interação entre leveduras e plantas, ricas em compostos orgânicos e umidade, estabelecendo a tríade inseto-levedura-planta (STARMER & LACHANCE, 2011).

Leveduras foram encontradas no intestino de Apis mellifera com a dominância de espécies variando de acordo com a posição social do hospedeiro, o intestino de abelhas operárias apresentou maior dominância do gênero Saccharomyces, enquanto o de forrageiras e rainhas apresentou maior dominância pelo gênero Zygosaccharomyces (YUN et al., 2018). O gênero Zygosaccharomyces também foi encontrado em relação de simbiose mutualística com larvas da espécie de abelha sem ferrão Scaptotrigona depilis. As larvas desta abelha necessitam consumir a levedura para seu desenvolvimento, em ordem de ingerir precursores esteroidais essenciais para o processo de formação de pupas. Estes esteróis não são produzidos pelas abelhas, e sim pelas leveduras (PALUDO et al., 2018).

A levedura Starmerella meliponinorum foi isolada de abelhas adultas das espécies nativas sem ferrão Tetragonisca angustula e Melipona quadrifasciata, Starmerella etchellsii foi encontrada associada somente à T. angustula. As espécies de leveduras Starmerella apicola, Debaryomyces hansenii e Zygosaccharomyces sp. foram encontradas em associação à abelhas adultas de M. quadrifasciata (ROSA et al., 2003). Além disso, S. meliponinorum foi identificada em amostras de pão de abelha, uma mistura de mel e polén que serve de alimento para as abelhas operárias, e também no mel, no pólen, em ―pellets‖ de refugo e própolis da abelha T. angustula (ROSA et al., 2003; TEIXEIRA et al., 2003; STEFANINI, 2018). Leveduras ascomicéticas foram similarmente obtidas de amostras de himenópteros da tribo Bombini, do gênero Bombus

sp., mais conhecidas como abelhas mamangava, onde foram identificadas leveduras dos clados Metschnikowia e Starmerella, e dos gêneros Debaryomyces e Zygosaccharomyces nos potes de mel, no trato digestivo das abelhas, na superfície do corpo das operárias, e no néctar das flores de Helleborus foetidus visitadas pelas abelhas (BRYSCH-HERZBERG, 2004). As visitas florais por estas abelhas influenciam diretamente a frequência e abundância de leveduras no néctar (HERRERA et al., 2009). O comportamento de visitação de flores pelas abelhas depende de diferentes aspectos como a composição do néctar, que apresenta altas concentrações de açúcares. O néctar é a fonte primária de carboidratos para as abelhas, possui aminoácidos e compostos voláteis, responsáveis por atrair insetos polinizadores. Quanto mais atrativas as características da composição do néctar, maior a probabilidade de visitação e de células de leveduras serem inoculadas após a abertura da corola da flor (GILLIAM, 1979; BRYSCH-HERZBERG, 2004; GONZÁLEZ-TEUBER & HEIL, 2009; HEIL, 2011).

O pólen coletado pelas abelhas sem ferrão é acumulado nas corbículas, parte da tíbia posterior da abelha que serve como um ―cesto‖, e armazenado posteriormente no ninho em potes de cerúmen, formando um agregado constituído por diversos pólens florais com composições diferentes, resquícios de néctar e enzimas salivares das abelhas. Este é um alimento nutritivo, fonte de proteínas, lipídeos, vitaminas e minerais para estes insetos (GILLIAM, 1979; LINS et al., 2003). No pólen também são encontradas espécies de leveduras como S. neotropicalis e S. meliponinorum, respectivamente em ninhos de Melipona quinquefasciata e T. angustula (ROSA et al., 2003; TEIXEIRA et al., 2003; DANIEL et al., 2013). Estas leveduras podem fermentar o pólen após estocado (MENEZES et al., 2013).

O mel por sua vez, apresenta propriedades físico-químicas que usualmente impedem o crescimento de microrganismos, como baixa atividade de água, baixo pH e alta concentração de açúcares. Acredita-se que as abelhas sejam responsáveis pela inoculação das leveduras que se encontram presentes no mel. Geralmente, estas são resistentes às condições de estresse deste substrato (ESTEVINHO et al., 2012; RÓZAŃSKA & OSEK, 2012). O mel é armazenado pelas abelhas sem ferrão em potes de cerúmen. Estes potes são preenchidos com o néctar coletado das flores que após o armazenamento passa por transformações, onde a maior parte da água evapora. As leveduras e bactérias presentes iniciam um processo de fermentação, e enzimas das glândulas salivares das abelhas operárias, como amilases e invertases, são secretadas

quebrando as moléculas de sacarose do néctar em glicose e frutose (VENTURIERI et al., 2007; MENEZES et al., 2013). Espécies dos gêneros Metschnikowia, Starmerella e Zygosaccharomyces são recorrentemente observados no mel de abelhas sem ferrão (ROSA et al., 2003; TEIXEIRA et al., 2003; SEIJO, ESCUREDO & FERNÁNDEZ- GONZÁLEZ, 2011; SAKSINCHAI et al., 2012).

Maiores conhecimentos sobre qual a função das leveduras em sua associação com as abelhas são necessários. Os microrganismos podem contribuir na nutrição das abelhas, provendo nutrientes ou quebrando moléculas que o inseto é incapaz de digerir, preservando alimentos na colônia e protegendo o inseto contra microrganismos patogênicos, produzindo toxinas contra o patógeno e modulando o sistema imune do inseto (MENEZES et al., 2013; DOUGLAS, 2015; STEFANINI, 2018). Em benefício das leveduras, os insetos atuam como vetores de dispersão, influenciando na biodiversidade das populações de leveduras no meio ambiente (STEFANINI, 2018). Portanto, o estudo de leveduras associadas a abelhas e flores de um ecossistema de Mata Seca poderá fornecer novas informações sobre a associação entre estes organismos, além de possibilitar a descoberta de novas espécies destes fungos novas para a ciência.

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Coleta das amostras

Foram realizadas três coletas na cidade de Janaúba, norte do estado de Minas Gerais (figura 2), com suporte e colaboração da equipe do Serviço de Recursos Vegetais e Opoterápicos da Fundação Ezequiel Dias. As coletas foram realizadas em área de preservação de mata seca em 2016 nas respectivas datas: 01/04, durante a estação chuvosa; 09/06, no início da estação seca durante o período de floração; e 07/10 no auge na estação seca.

Foram analisadas três espécies (figura 3) Tetragonisca angustula (jataí), Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna) e Apis mellifera (ninhos em apiário próximo à área preservada de mata seca). As coletas de cada substrato analisado foram feitas em triplicata: mel imaturo, mel maduro, pólen, alimento larval. Foi considerado mel

imaturo aquele depositado em potes ainda abertos e, mel maduro aquele depositado em potes fechados. No total foram coletados dos ninhos 40 indivíduos adultos de T. angustula, 55 de S. cfr. bipunctata e 35 de A. mellifera. Em relação ao mel imaturo foram coletadas 4 amostras dos ninhos de T. angustula, 16 amostras de S. cfr. bipunctata e 21 de A. mellifera. A amostragem de mel maduro foi 15 de T. angustula, 26 de S. cfr. bipunctata e 21 de A. mellifera. Em relação ao pólen foram coletadas 6 amostras dos ninhos de T. angustula, 33 dos ninhos de S. cfr. bipunctata e 18 de A. mellifera.

No período de floração em junho foram coletadas treze amostras de flores (figura 4), de quatro indivíduos masculinos e um feminino de Myracrodruon urundeuva (Aroeira). As flores de Aroeira são o principal recurso alimentar utilizado pelas abelhas na área.

Figura 4: Coleta de amostras de flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) (fonte: Prof. Dr. Clemens Schlindwein).

As amostras de mel imaturo e maduro foram coletadas com o auxílio de micropipetador (figura 5), e as de pólen foram coletadas diretamente dos potes de alimento com alça estéril (figura 6). Alíquotas de 0,1 mL de mel e 0,1 g de pólen foram diluídas em 0,9 mL água peptonada 0,1%. Um mililitro da diluição decimal 10-1 de cada amostra foi semeado, em duplicata, em placas contendo ágar extrato de levedura e malte (YM – ágar 2%, peptona 1%, glicose 2%, extrato de malte 0.3%, extrato de levedura 0.3% e cloranfenicol 100 mg%), pelo método pour plate, as colônias foram contadas e foi calculado o número de unidades formadoras de colônia (UFC).

Figura 5: Coleta de mel com o auxílio de micropipetador (fonte: Paula de Souza São Thiago Calaça).

Figura 6: Coleta de pólen utilizando alça estéril (fonte: Paula de Souza São Thiago Calaça).

Além disso, foram coletados cinco indivíduos adultos de cada espécie, colocados para caminhar por até 15 minutos em placas de ágar YM (figura 7), sendo liberados após esse período. Este procedimento visou o isolamento de leveduras presentes no corpo das abelhas ou de fezes liberadas por estas. As placas de YM foram incubadas por até sete dias em estufa a 25º C. As amostras de flores foram inoculadas em meio líquido contendo 50% de glicose e em caldo YM, cinco flores para cada tubo. Os tubos foram incubados em shaker a 200 rpm e 25º C por cinco dias até turvação do meio pelo crescimento das leveduras. A partir dos tubos com crescimento, 100 µL de diluições decimais apropriadas foram semeadas em placas de ágar YM para o isolamento das leveduras. Estas placas foram incubadas em estufa a 25º C (KURTZMAN et al., 2011).

Figura 7: Indivíduos adultos das espécies Tetragonisca angustula (A), Scaptotrigona cfr. bipunctata (B) e Apis mellifera (C) em placas de ágar YM (fonte: Autora).

5.2 Preservação e identificação morfológica

Após o período de incubação, as colônias foram contadas e descritas morfologicamente de acordo com a cor, tamanho, textura, borda, formato e foram agrupadas. Cada morfotipo foi contado, isolado (figura 8 B), purificado (figura 8 C) e posteriormente inoculado em 2 mL de caldo GYMP. Após o crescimento, foi acrescentado 200 µL de glicerol para criopreservação das leveduras em freezer a -80º C (KURTZMAN et al., 2011).

Figura 8: Placa inoculada em campo (A), placa com colônias de levedura isoladas (B), placa com colônia de levedura purificada (C) (fonte: Autora).

5.3 Extração de DNA

Para a extração de DNA, as leveduras foram inoculadas em ágar YM, e incubadas em estufa a 25º C por 24 h. Após o crescimento, uma alçada de cada colônia foi adicionada em tubos com 100 µL de tampão de lise (Tris-HCl pH 8, EDTA pH 8, NaCl e SDS) para rompimento da parede e membrana celular. Os tubos foram agitados em vortex e incubados em banho seco a 65º C por 30 min. Após este período, 200 µL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, solvente orgânico para desnaturar as proteínas e purificar o DNA) foi adicionado a cada tubo, homogeneizado manualmente, e centrifugado à 14000 rpm por 15 min. Após,70 µL do sobrenadante de cada amostra foi transferido para um novo tubo. Em seguida, adicionou-se 70 µL de isopropanol, e os tubos foram homogeneizados por inversão, e incubados à temperatura ambiente por 15 min para precipitação do DNA. Após, as amostras foram centrifugadas 14000 rpm por

10 min. O sobrenadante foi descartado por inversão e acrescentou-se 200 µL de etanol gelado em cada microtubo. Estes foram homogeneizados por inversão e centrifugados a 14000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi descartado e esse procedimento foi realizado mais uma vez para remoção de resíduos de sais. As amostras foram incubadas em estufa à 37º C para secagem ou mantidas em temperatura ambiente overnight. O pellet formado no fundo do microtubo foi resuspendido em 50 µL de tampão TE (Tris-EDTA 0,1 M, pH 8) para hidratação e as amostras foram incubadas em estufa à 37º C por 1 h. O DNA total obtido foi dosado utilizando espectrofotômetro NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies). Ao final, o DNA foi diluído para atingir a concentração de aproximadamente 200 ng/µL e armazenado a -20º C.

5.4 Agrupamento por PCR fingerprinting com iniciador GTG5

As linhagens de leveduras com características morfológicas similares foram agrupadas utilizando a técnica de PCR fingerprinting, com o iniciador GTG 5 (5’ - GTGGTGGTGGTGGTG - 3’), que permite agrupar os isolados de acordo com seus perfis moleculares. Cada reação realizada continha: 16,8 µL de água deionizada estéril,

2,5 µL de tampão de PCR 5X (Thermo), 1,5 µL de MgCl2 25mM (Thermo), 1,0 µL de dNTP 10 pmol, 2,0 µL do iniciador GTG5 10 pmol (Invitrogen), 0,2 µL de Taq DNA polimerase 5U/µL (Sinapse) e 1 µL de DNA, totalizando volume final de 25 µL. Um tubo denominado branco contendo todos os reagentes exceto DNA foi preparado, e utilizado como controle de possíveis contaminações do processo de PCR. O ciclo básico de amplificação utilizado para reação de PCR foi: um ciclo de desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos; 40 ciclos de desnaturação a 93°C por 45 segundos, anelamento a 50°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto; um ciclo de extensão final a 72º C por 6 minutos. Por fim, os produtos da amplificação foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, eluidos por 2 h à 80 V em tampão TBE 0,5X (Tris-base 0,045 M; Ácido bórico 0,045 M; EDTA 0,001 M, pH 8,0). Foram aplicados nos géis 3 µL de solução Gel Red (Biotium) + Tampão na proporção de 1:1 e 5 µL do produto da reação de PCR, após a corrida as bandas moleculares foram visualizadas sob luz ultravioleta (WHILE et al., 1990).

5.5 PCR utilizando iniciadores ITS1 e NL4

Os representantes de cada agrupamento molecular obtido foram submetidos à PCR utilizando os iniciadores ITS1 e NL4, que amplificam as regiões ITS1/ITS2 (espaçadores transcritos internos) e os domínios D1/D2 da subunidade maior (26S) do gene do RNA ribossomal (rRNA) (KURTZMAN & ROBNETT, 1998; FELL et al., 2000; KURTZMAN, FELL & BOEKHOUT, 2011). Cada reação de PCR, totalizando volume de 50 µL, continha: 32,8 µL de água deionizada estéril, 5,0 µL de tampão de

PCR 5X (Sinapse), 3,0 µL de MgCl2 25mM (Sinapse), 2,0 µL de dNTP 10 pmol, 1,0 µL do iniciador ITS1 10 pmol (Invitrogen), 1,0 µL do iniciador NL4 10 pmol (Invitrogen), 2,0 µL de betaína, 1,0 µL de DMSO, 0,2 µL de Taq DNA polimerase 5U/µL (Sinapse) e 2 µL de DNA. Foi preparado também um branco da reação contendo todos os reagentes exceto DNA. O ciclo básico de amplificação utilizado no termociclador para reação de PCR foi: um ciclo de desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos; 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento a 54°C por 25 segundos e extensão a 72°C por 20 segundos; um ciclo de extensão final a 72°C por 10 minutos. Os amplicons foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1%, eluidos por 20 min à 120 V em tampão TBE 0,5X, foi aplicado ao gel de agarose 3 µL de solução Gel Red (Biotium) + Tampão na proporção de 1:1 e 1 µL do produto da reação de PCR, após a corrida as bandas moleculares foram visualizadas sob luz ultravioleta (WHILE et al., 1990).

5.6 Purificação e reação de sequenciamento

Os amplicons obtidos através da reação de PCR utilizando os iniciadores ITS1/NL4 foram submetidos a um processo de purificação para serem enviados ao sequenciamento. Foram adicionados a cada produto de PCR, 11,75 µL de EDTA a 125 Mm e 141,0 µL de etanol absoluto. As amostras foram homogeneizadas por inversão, e mantidas em repouso por 15 min em temperatura ambiente para precipitação do DNA. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 14000 rpm por 25 min, retirou-se o sobrenadante por inversão, adicionou-se 120,0 µL de etanol 70% gelado à parede do tubo para lavar o sedimento, homogeneizando por inversão. As amostras foram

centrifugadas novamente, por 10 min, o sobrenadante foi descartado por inversão e as amostras foram mantidas em temperatura ambiente overnight, para total evaporação do etanol. O DNA foi ressuspendido em 10,0 µL de água ultrapura e incubado em banho seco a 37º C por 30 min, para hidratação. O DNA purificado obtido, foi dosado utilizando espectrofotômetro NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies), diluído para atingir a concentração final de aproximadamente 10 a 20 ng/µL e armazenado a - 20º C. Para as reações de sequenciamento foi utilizado o kit Big Dye versão 3.1 (Applied Biosystems, EUA), a placa de sequenciamento foi armazenada a 4°C, protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado de sequenciamento por eletroforese capilar ABI3130, utilizando-se polímero POP7 no Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular do Centro de Pesquisas René Rachou de Belo Horizonte, Minas Gerais.

5.7 Análise das sequências

As sequências de DNA obtidas foram analisadas utilizando o programa Phred quality scores, disponibilizado pela EMBRAPA (http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/), selecionou-se bases contíguas com parâmetro de qualidade Phred (score de qualidade ou Q score) maior que 20. Utilizando o programa BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool – NCBI – NIH; disponível em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) as sequências de interesse foram comparadas com as sequências depositadas no banco de dados do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), permitindo identificar assim a identidade da sequência de interesse (KURTZMAN, 2014). As sequências das leveduras obtidas no presente trabalho foram comparadas com aquelas depositadas no GenBank, utilizando o programa Blastn. As espécies que apresentaram sequencias da região D1/D2 idênticas às espécies conhecidas foram consideradas como pertencentes a aquela espécie. As espécies que apresentaram mais de seis diferenças não contíguas nesta região, em relação a todas as espécies conhecidas, foram consideradas como possíveis novas espécies de leveduras (KURTZMAN, 2014).

5.8 Análise estatística dos dados e determinação dos índices de diversidade

A Análise de Variância não paramétrica de dois fatores de Friedman foi aplicada na análise dos dados, seguida da correção de Bonferroni para comparação por método pairwise, com o objetivo de comparar os isolados de leveduras obtidos a partir de cada espécie de abelhas estudada (T. angustula; S. bipunctata; A. mellifera) e as coletas realizadas. Os gráficos e as análises estatísticas foram gerados usando o software IBM SPSS Statistics (Versão 24). Os resultados foram apresentados com média ± desvio padrão, sendo considerado o nível de significância de 5 % (p < 0,05).

Análises comparativas entre as comunidades de leveduras associadas às três espécies de abelhas e aos substratos relacionados (mel e própolis) foram conduzidas utilizando o índice de diversidade diferencial β. Este índice reflete o quanto duas comunidades diferem em função dos conjuntos de espécies que abrigam (WHITTAKER, 1972, MAGURRAN, 2004). Para o estudo da diversidade β foi utilizado o índice βH1 [βH1 = (S /∝med) – 1] de Harrison et al. (1992), onde S = total de espécies encontrado nas duas comunidades e ∝med = média da riqueza das duas comunidades.

A análise de similaridade foi realizada com base em uma matriz de presença e ausência das comunidades de leveduras isoladas de cada espécie de abelha, incluindo-se os substratos associados (mel e própolis). A análise foi realizada por meio de um dendograma (UPMG) pelo método de ligação por grupos pareados, empregando os índices de similaridade Jaccard (VALENTIN,1995; RAMETTE, 2007). Foi utilizado o programa PAST v3.25. O compartilhamento de espécies de leveduras entre as abelhas foi visualizado em diagramas de Venn, disponível online (http://jvenn.toulouse.inra.fr) (BARDOU et al., 2014). O esforço amostral foi avaliado utilizando-se curvas de acumulação (GOTELLI & CHAO, 2013). A árvore filogenética foi construída com base em sequências alinhadas dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal utilizando- se o programa Mega Molecular Evolutionay Genetics Analysis versão 7 (KUMAR et al., 2016). A árvore filogenética foi construída utilizando-se o algoritmo de Neighbor- joining. Uma análise de bootstrap foi realizada com 1000 iterações, utilizando os softwares incluídos no programa Mega Molecular Evolutionay Genetics Analysis versão 7 (KUMAR et al., 2016).

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Isolamento, preservação e agrupamento morfológico

Oitenta e seis isolados de leveduras foram obtidos a partir das amostras coletadas dos ninhos de T. angustula (jataí), 184 isolados das amostras coletadas dos ninhos de Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), 78 isolados das amostras dos ninhos de A. melífera e 33 isolados das amostras de flores de Aroeira, M. urundeuva (Tabela 1). Em um dos ninhos de S. cfr. bipunctata observou-se massa de refugo descartada pelas abelhas, este material foi coletado, plaqueado e a partir dele houve o crescimento de quatro isolados de levedura (Tabela 1).

Devido a situações adversas durante o período de coleta, os ninhos apresentaram-se fracos e com pouca ou nenhuma oferta de alimento, sendo possível a coleta de um número reduzido de amostras. Devido à baixa disponibilidade de alimento larval e ninhos com poucos discos de cria, estes substratos não foram coletados. De colmeia de A. mellifera apenas uma amostra foi plaqueada, havendo o crescimento de dois isolados de levedura (Tabela 1).

Na primeira coleta realizada em primeiro de abril de 2016, durante a estação chuvosa, foram obtidos 112 isolados de leveduras. Na segunda coleta, realizada em nove de junho de 2016, no início da estação seca e durante o período de floração foram obtidos 223 isolados de leveduras. Na terceira coleta, realizada em sete de outubro de 2016, no auge na estação seca foram obtidos apenas 46 isolados de leveduras.

O período de floração é a época do ano onde há maior disponibilidade de alimento, as abelhas nativas estocam a maior quantidade possível de recursos alimentares para manter suas colônias perenes, enfrentando posteriormente o auge da temporada de seca (WILLE, 1983), além disso, quando as temperaturas estão mais altas a taxa de crescimento das leveduras aumenta e também a diversidade de populações (BRYSCH-HERZBERG, 2004). Comparando o número de isolados de leveduras obtidos em cada coleta e de acordo com cada espécie de abelha estudada (Figura 9), foi possível observar que um número maior de leveduras foi isolado no período da segunda coleta, sendo significante a diferença na quantidade de isolados obtidos na segunda coleta (período de floração) em comparação à terceira coleta (auge da estação seca).

Tabela 1: Número de leveduras isoladas de acordo com a espécie e substrato.

Espécies Adulto Mel Mel Pólen Alimento Refugo Flores Total imaturo maduro larval Tetragonisca (n=40) (n=4) (n=15) (n=6) — — — 86 angustula 36 19 30 1 Scaptotrigona (n=55) (n=16) (n=26) (n=33) — (n=1) — 184 cfr. bipunctata 70 36 37 37 4 Apis mellifera (n=35) (n=21) (n=21) (n=18) (n=2) — — 78 50 17 6 3 2 Myracrodruon — — — — — — (n=12) 33 urundeuva 33 Total 156 72 73 41 2 4 33 381 n = número de amostras coletadas dos ninhos.

O diagrama de Venn apresentado na Figura 10 representa o compartilhamento de espécies de leveduras pelas três espécies de abelhas e os substratos associados (mel e pólen). Aureobasidium pullulans foi a única espécie de levedura encontrada em associação às três espécies de abelhas. Dezenove espécies de leveduras foram isoladas exclusivamente de insetos adultos, mel e pólen de T. angustula. A abelha Apis mellifera apresentou 13 espécies não compartilhadas com quaisquer outras abelhas. Já em associação exclusiva a S. cfr. bipunctata foram encontradas 15 espécies, incluindo três espécies novas de Starmerella e duas espécies novas de Zygosaccharomyces.

O baixo número de espécies compartilhadas e o grande número de espécies exclusivas de cada abelha pode indicar uma segregação de locais de forrageio. Ao compartilhar poucos substratos de visitação é criada uma estratégia alimentar que evita a competição entre as espécies de abelhas. As espécies R. ruineniae, Rh. mucilaginosa,

S. apicola, S. bombicola e S. etchellsii foram encontradas em associação a duas espécies de abelhas, S. cfr. bipunctata e T. angustula. Em relação às espécies de Starmerella, em especial à S. etchelsii, a levedura isolada em maior frequência na comunidade associada à T. angustula e a terceira mais frequente juntamente com S. apicola associada à S. cfr. bipunctata. O compartilhamento de leveduras desse gênero pode indicar tanto um compartilhamento de locais de forrageio como também uma relação espécie específica de leveduras do gênero Starmerella e estas espécies de abelhas. Scaptotrigona cfr. bipunctata compartilha com A. mellifera as espécies de leveduras C. parapsilosis, Ha. siamensis e Pa. laurentii. Já T. angustula e A. mellifera compartilham apenas uma espécie de fungo leveduriforme, A. melanogenum. Os índices de diversidade (Dominância e Simpson) e de riqueza (Margalef) foram analisados para as comunidades de leveduras associadas à três espécies de abelhas estudadas (Tabela 2).

Tabela 2: Índices de diversidade e riqueza das comunidades de leveduras associadas às abelhas Scaptotrigona cfr. bipunctata, Tetragonisca angustula e Apis mellifera.

Espécies_S Indivíduos Dominância (D) Simpson (1-D) Margalef

Scaptotrigona 24 93 0,1483 0,8517 5,0740 cfr. bipunctata

Tetragonisca 26 43 0,0622 0,9378 6,6470 angustula

Apis melifera 18 37 0,0928 0,9072 4,7080

Os índices de Dominância (D) e Simpson (1-D) expressam a diversidade das comunidades levando em consideração a riqueza e equitabilidade. A comunidade que apresentou a maior diversidade foi a associada à abelha T. angustula, seguida pela comunidade associada a A. mellifera. Apesar de a comunidade associada a S. cfr. bipunctata apresentar um número maior de espécies que a comunidade associada a A. melifera, em S. cfr. bupunctata houve dominância de Starmerella sp. 1 e Zygosaccaromyces sp. 1. A riqueza de espécies foi medida utilizando-se o índice de Margalef e as análises mostram que a comunidade de leveduras associadas a T.

angustula apresentam maior riqueza, seguida pela comunidade associada a S. cfr. bipunctata e A. mellifera.

Tabela 3: Índices de diversidade β das comunidades de leveduras associadas às abelhas S. cfr. bipunctata, Tetragona angustula e Apis mellifera.

Scaptotrigona cfr. Tetragonisca Apis bipunctata angustula mellifera

Scaptotrigona cfr. 0 0,7600 0,8095 bipunctata

Tetragonisca angustula - 0 0,9091

Apis mellifera - - 0

Foram analisados ainda os índices de diversidade β, que expressam o quão similar ou diferente são duas comunidades (Tabela 3). Este índice varia de 0, para comunidades similares, a 1, para comunidades bastante heterogêneas. A similaridade na composição da comunidade de leveduras entre as abelhas e substratos associados foi maior entre T. angustula e S. cfr. bipunctata (0,76). Essa mesma dinâmica pode ser observada na figura 11, que mostra o dendrograma construído a partir da matriz de similaridade de Jaccard.

Figura 11: Dendrograma de similaridade das leveduras vetorizadas por diferentes espécies de abelhas. Agrupamento realizado pela similaridade Jaccard.

As curvas de acumulação das espécies de leveduras associadas às abelhas estudadas não atingiram a estabilidade (i.e. assíntota), indicando que um maior esforço amostral poderia cobrir a riqueza de espécies esperada.

Figura 12: Curvas de acumulação de espécies das comunidades de leveduras associadas a abelhas e substratos relacionados.

6.2 Identificação das leveduras

A levedura Starmerella etchellsii foi a espécie associada com mais frequência à T. angustula e S. cfr. bipunctata. Em T. angustula foi encontrada apenas em associação ao corpo de abelhas adultas, enquanto em relação à S. cfr. bipunctata foi identificada em amostras de mel imaturo, mel maduro, pólen e no corpo de abelhas adultas. Além disso, também foi isolada do pólen de A. mellifera. Esta levedura é osmofílica e tem sido recuperada a partir de substratos diversificados, tendo sido já anteriormente isolada de abelhas sem ferrão. Além de S. etchellsii, as espécies associadas com mais frequência a T. angustula foram A. pullulans, S. apicola, Starmerella sp. 3 e S. meliponinorum. As espécies do clado Starmerella são leveduras ascomicéticas, frequentemente encontradas em associação a espécies de abelhas ou substratos visitados por estes insetos (ROSA et al., 2003). Pelo fato de apresentarem características bioquímicas muito similares, a identificação das espécies deste gênero pelo método de sequenciamento de regiões do gene do rRNA é o mais indicado (TEIXEIRA et al., 2003; LACHANCE et al., 2011; SANTOS et al., 2018).

A levedura S. apicola é uma espécie de ampla distribuição, comumente isolada de insetos que visitam flores, dentre eles as abelhas, sendo produtora de soforolipídeos, um biosurfactante anfifílico (ROSA et al., 2003; KURTZMAN et al., 2010; LACHANCE et al., 2010; SANTOS et al., 2018). No presente trabalho, esta espécie foi encontrada em amostras de mel maduro, pólen e em associação à abelhas adultas. Starmerella bombicola foi isolada de amostras de mel imaturo de T. angustula e S. cfr. bipunctata. Leveduras desta espécie também são frequentemente encontradas associadas a flores visitadas por abelhas (LACHANCE et al., 2011). A espécie S. lactis- condensi foi isolada de amostra de pólen coletado por Scaptotrigona cfr. bipunctata, é uma espécie de levedura considerada nutricionalmente especializada, capaz de crescer apenas em glicose e lactose como fontes de carbono, além de tolerar substratos com baixa atividade de água, podendo causar deterioração em alimentos, sendo vetorizada por insetos (LACHANCE et al., 2011; STRATFORD et al, 2002). Três isolados de S. meliponinorum foram obtidos a partir de amostras de mel maduro de T. angustula. Teixeira et al. (2003) descreveram S. meliponinorum a partir de isolados obtidos de vários substratos associados a espécies de abelhas sem ferrão da tribo Meliponini, incluindo amostras de mel, própolis, provisões de pólen e abelhas adultas de T. angustula.

Quatro isolados de S. sorbosivorans foram obtidos a partir de amostras de alimento larval, mel imaturo e adultos de A. mellifera. Essa espécie de levedura é frequentemente isolada de vespas e abelhas e dos substratos por esses insetos visitados (LACHANCE et al., 2001a; LACHANCE et al., 2001b). Outras quatro espécies de leveduras pertencentes ao clado Starmerella, isoladas nesse trabalho, representam possíveis espécies novas. Estas novas espécies são filogeneticamente pŕoximas às espécies Starmerella etcheslsii, S. davenportii, S. lactis-condensie S. bombicola. Outras espécies mais frequentemente associadas à A. mellifera foram A. pullulans, Papiliotrema laurentii e S. sorbosivorans (tabela 6).

Tabela 4: Frequência de espécies de leveduras associadas à Tetragonisca angustula.

Substratos Espécies

Mel imaturo Mel maduro Pólen Adulto Total Média

n=4 n=15 n=6 n=40 UFC/mL, ou g

Aureobasidium melanogenum 1 1 10 Aureobasidium pullulans 1 4 5 68 Aureobasidium sp. 1 1 10 Blastobotrys chiropterorum 1 1 10 Candida intermedia 1 1 2,4x102 Citeromyces siamensis 1 1 20 Cystobasidium sp. 1 1 10 Hannaella luteola 1 1 2,4x102 Hannaella zeae 1 1 1,1x102 Kwoniella mangrovensis 1 1 10 Papiliotrema flavescens 1 1 10 Papiliotrema rajasthanensis 1 1 1,2x102 Papiliotrema sp. 1 1 10 Rhodosporidiobolus ruineniae 1 1 10 Rhodotorula mucilaginosa 2 2 2x103

Rhodotorula toruloides 1 1 10 Schizosaccharomyces octosporus 1 1 10 Spencerozyma crocea 1 1 10 Starmerella apicola 2 1 3 20 Starmerella bombicola 1 1 10 Starmerella etchellsii 6 6 27 Starmerella meliponinorum 3 3 2,1x102 Starmerella sp. 3 1 1 2 35 Ustilago sp. 1 1 1 20 Vishniacozyma sp. 1 1 20 Yamadazyma siamensis 1 1 10 Zygosaccharomyces sp. 1 1 1 30 Total 10 13 — 20 42 n = número de amostras coletadas.

A levedura Candida parapsilosis foi a espécie obtida com maior frequência dos insetos adultos e substratos associados a A. mellifera. Esse microrganismo é encontrado em uma grande variedade de substratos e localidades, e é considerado um patógeno oportunista (LACHANCE et al., 2011). Um representante de Cryptococcus gattii foi isolado de pólen de S. cfr. bipunctata, uma espécie de levedura patogênica que pode causar doença em indivíduos imunocompetentes (tabela 5). A RDC 12/2001 atribuída pela ANVISA determina o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos, e a Instrução normativa nº 3 de 19 de janeiro de 2001, regulamenta a qualidade do pólen e outros produtos apícolas, porém ambos os documentos não estabelecem parâmetros de qualidade comercial em relação a presença ou quantidade de leveduras no pólen, considerando que o pólen e os outros produtos das abelhas são utilizados como alimento e suplemento alimentar, é necessária a definição de parâmetros de segurança microbiológica para os mesmos (BÁRBARA et al., 2018).

Também foram encontradas nesta pesquisa outras leveduras ascomicéticas pertencentes aos clados Clavispora, Citeromyces, Debariomyces, Meyerozyma, Schizosaccharomyces, Spencerozyma, Wickerhamiella, Yamadazyma e Zygosaccharomyces. Debariomyces hansenii e espécies de Zygosaccaromyces já foram

isoladas anteriormente das espécies das abelhas T. angustula e Melipona quadrifasciata e substratos associados a esses insetos (mel e pópolis) (ROSA et al., 2003). Debaryomyces hansenii é uma espécie xerotolerante com crescimento ótimo em elevadas concentrações de NaCl (RASPOR et al., 2006). Pode ser isolada de substratos diversos, tais como solo, filoplano de algumas plantas, ambiente marinho, produtos fermentados a base de soja e outros alimentos ricos em sal (SUZUKI et al., 2011).

A possível espécie nova Zygosaccharomyces sp. 1 foi a segunda espécie mais frequente associada à S. cfr. bipunctata. Foram obtidos 20 isolados de Zygosaccharomyces sp.1 (tabela 5), a partir de amostras de mel e adultos de S. cfr. bipunctata, e um isolado a partir de mel maduro de T. angustula (tabela 4). Filogeneticamante a espécie descrita mais próxima a Zygosaccharomyces sp.1 é Z. mellis, um microrganismo considerado osmotolorante e halotolerante, capaz de manter o pH intracelular regulado mediante situação de choque hiperosmótico (VINDELØV & ARNEBORG, 2002). Espécies de Schizosaccharomyces também são resistentes a substratos com baixa atividade de água, e são geralmente isoladas de ambientes ricos em açúcar (VAUGHAN-MARTINI et al., 2011b). Nesse trabalho um isolado de Schizosaccharomyces octosporus foi obtido a partir de mel maduro de T. angustula (tabela 4).

A espécie Wickerhamiella versatilis é halotolerante e osmotolerante, sintetizadora de ésteres e glicerol, muito utilizada na fermentação de molho de soja (HOU et al., 2016; RUAN et al., 2019). Nesse trabalho foi isolada de amostras de mel imaturo, pólen e de abelhas adultas. Candida intermedia pertence ao clado Clavispora (DANIEL et al, 2015) e é considerada uma espécie generalista (LACHANCE et al., 2011).

Também foi isolada neste estudo a levedura Citeromyces siamensis, de mel maduro produzido por T. angustula, é considerada uma espécie halotolerante e foi descrita a partir de isolados obtidos na Tailândia (NAGATSUKA, et al., 2002). Além disso, foi isolada a partir de inseto adulto de T. angustula a espécie. Blastobotrys chiropterorum, descrita em associação a fígado de morcegos (Mormoops megalophylla), na Colômbia (GROSE et al. 1968; SMITH et al., 2011). Há também um relato clínico do isolamento dessa espécie de levedura em água de diálise de um paciente do Havaí (FURMAN et al., 1983). Recentemente essa espécie foi isolada de

sedimento de manguezal na Tailândia (KUNTHIPHUN et al., 2018). Yamadazyma siamensis foi descrita em 2013 a partir de um isolado obtido do filoplano de cana de açúcar na Tailândia (KAEWWICHIAN et al., 2013). Nesse trabalho foi isolada a partir de inseto adulto de T. angustula (tabela 4).

Tabela 5: Frequência de espécies de leveduras associadas à Scaptotrigona cfr. bipunctata.

Substratos Espécies Mel imaturo Mel maduro Pólen Adulto Total Média

n=16 n=26 n=33 n=55 UFC/mL, ou g

Aureobasidium pullulans 1 1 2x103 Candida parapsilosis 1 1 10 Coniochaeta sp. 1 1 20 Cryptococcus gattii 1 1 10 Cyrenella sp. 1 1 10 Cystobasidium calyptogenae 1 1 10 Debaryomyces hansenii 1 1 2 103 Hannaella sinensis 1 1 10 Papiliotrema laurentii 1 2 3 10 Piskurozyma sp. 1 1 10 Rhodosporidiobolus ruineniae 2 1 3 90 Rhodotorula mucilaginosa 1 1 60 Sporidiobolus pararoseus 1 1 20 Starmerella apicola 1 1 9 11 7,3x102 Starmerella bombicola 2 2 4,2x102 Starmerella cf. etchellsii 1 2 2 6 11 8,3x102 Starmerella lactis-condensi 1 1 1,7x102 Starmerella sp. 1 5 3 4 1 13 5,6x102 Starmerella sp. 2 2 2 2x103

Starmerella sp. 4 1 1 4,5x102 Ustilago sp. 2 1 1 10 Wickerhamiella versatilis 4 1 2 7 33 Zygosaccharomyces sp. 1 10 9 1 2 22 3,4x102 Zygosaccharomyces sp. 2 2 1 3 9,9x102 Total 24 22 19 27 92 n = número de amostras coletadas.

Aureobasidium é um gênero de fungo negro, do filo Ascomycota, que apresenta estágio leveduriforme, sendo A. pullulans a espécie mais conhecida. São frequentemente isolados de ambientes com baixa atividade de água e considerados como microrganismos halotolerantes (KOGEJ et al., 2005). Aureobasidium pullulans é uma espécie generalista, encontrada com frequência em matéria orgânica em decomposição, na superfície de folhas, solo, água doce e ar (POZO et al., 2011). Espécies de Aureobasidium foram isoladas de adultos de todas as três abelhas estudadas. A associação de espécies de Aureobasidium a abelhas pode ser explicada pelo caráter generalista dessas espécies, que podem estar associadas à superfície das plantas visitadas por esses insetos. Além disso foram obtidos três isolados de Aureobasidium a partir de amostras de mel e um isolado de amostra de pólen. A presença de A. pullulans no mel imaturo pode ser relacionada à capacidade desse microrganismo de tolerar ambientes com baixa atividade de água.

Algumas espécies de leveduras basidiomicéticas generalistas foram isoladas do mel e adultos das abelhas estudadas. Espécies de leveduras do gênero Hannaella, Kwoniella, Papiliotrema,Rhodosporidiobolus, Rhodotorula e Vishniacozyma podem ser consideras ubíquas e são frequentemente isoladas de substratos vegetais, como filoplano e flores. Rosa et al. (2003) também isolaram espécies generalistas de leveduras basidiomicéticas a partir de mel e adultos de T. angustulata, onde foram obtidos isolados de Cryptococcus albidus-like (= Naganishia albida), Cryptococcus spp. e Rhodotorula spp. em amostras coletadas em Belo Horizonte e Betim, Minas Gerais.

Para algumas espécies de leveduras basidiomicéticas, apenas um isolado foi obtido a partir das abelhas estudadas e substratos associados (mel e pólen). Apiotrichum

porosum já foi isolada de solo, exsudato de árvore e guano de morcego (SUGITA, 2011).

Tabela 6: Frequência de espécies de leveduras associadas à Apis mellifera.

Substratos Espécies Alimento Mel Mel Pólen Adulto Total Média

larval imaturo maduro n=18 n=35 UFC/mL, n=2 n=21 n=21 ou g

Apiotrichum posorum 1 1 9,4x102 Apiotrichum sp. 1 1 12,5x102 Aureobasidium melanogenum 1 1 30 Aureobasidium pullulans 1 5 6 40 Aureobasidium thailandense 1 1 10 Candida parapsilosis 2 4 6 3,5x102 Coniochaeta rhopalochaeta 1 1 10 Cutaneotrichosporon mucoides 1 1 10 Hannaella siamensis 1 1 10 Meyerozyma guilliermondii 1 1 2x103 3 Meyerozyma sp. 1 1 2x10 Papiliotrema aurea 1 1 10 Papiliotrema laurentii 4 4 13 Rhynchogastrema tunnelae 1 1 10 Saitozyma flava 1 1 10 Starmerella cf. etchellsii 2 2 15 Starmerella sorbosivorans 2 1 1 4 1,6x102 Total 2 7 2 3 20 34 n = número de amostras coletadas.

Cutaneotrichosporon mucoides é uma espécie com importância médica, capaz de causar infecção disseminada, e já foi isolada de pacientes com pneumonia e

meningite. Pode causar onicomicose e piedra branca (SUGITA, 2011). Já foi isolada de amostras de água coletadas na costa do Mar Vermelho em Israel e do Mar Morto (BUTINAR et al., 2005). Cystobasidium calyptogenae é uma espécie de levedura isolada inicialmente de um molusco (Calyptogena sp.) em ambiente marinho profundo do mar da Baía de Sagami, Japão (SAMPAIO, 2011). Em 2008 também foi isolada de água marinha em Taiwan (TIEN et al., 2008). Rhinchogastrema tunnelae foi descrita a partir de isolados obtidos de unha e de substrato desconhecido na Finlândia (VALENTE et al., 2012). Spencerozyma crocea já foi isolada de besouro, árvore e bebida fermentada (SAMPAIO, 2011). Para todas essas espécies o habitat natural ainda não está bem estabelecido, uma vez que há poucos trabalhos que relatam o isolamento das mesmas de substratos naturais ou mesmo um número muito pequeno de isolados da espécie é conhecido.

Trinta e três isolados foram obtidos a partir das flores de Aroeira, distribuídas em 4 espécies diferentes. Os isolados das flores de Aroeira foram identificados como Rhodosporidiobolus ruineniae, Pseudosydowia eucalypti, Kwoniella heveanensis e Aureobasidium thailandense. A espécie prevalente foi R. ruineniae, levedura basidiomicética, produtora de óleo antimicrobiano, e geralmente associada com superfície de folhas (WANG et al., 2016; SITEPU et al., 2017). Esta espécie também foi encontrada em amostra de mel maduro de T. angustula, e no mel maduro e pólen de S. cfr. bipunctata. A ocorrência desta espécie associada à flores justifica a presença no mel das duas abelhas sem ferrão, já que seria coletada juntamente com o néctar de aroeira e transportada para os ninhos dos insetos.

6.3 Espécies novas de leveduras

Quinze espécies identificadas no presente trabalho apresentaram divergência considerável na análise da sequência dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal e representam possíveis espécies novas (Tabela 7). Quatro possíveis espécies novas pertencem ao clado Starmerella. Starmerella sp.1 possui 13 isolados obtidos a partir de amostras de mel e pólen de Scaptotrigona cfr. bipunctata e também de abelhas adultas. Essa espécie é filogeneticamente próxima a S. etchellsii, com seis pares de bases divergentes na comparação de sequências dos domínios D1/D2. Starmerella sp.2 possui dois isolados obtidos a partir de amostras de pólen de S. cfr. bipunctata, e é

filogeneticamente próxima a S. davenpotii, com 16 pares de bases de divergência nos domínios D1/D2. Starmerella sp. 3 possui três linhagens obtidas a partir de amostras de mel da abelha T. angustula. Essa espécie é filogeneticamente relacionada a S. lactis- condensi, e a divergência em relação à sequência da linhagem tipo é de seis pares de bases. Starmerella sp. 4 possui apenas 1 isolado obtido a partir de amostra de pólen coletado em colmeia de S. cfr. bipunctata, e é filogeneticamente próxima a S. bombicola, com divergência de 4 pares de bases em relação à linhagem tipo.

Duas possíveis novas espécies pertencentes ao clado Zygosaccharomyces foram obtidas a partir de abelhas adultas e substratos associados a Scaptotrigona cfr. bipunctata. Zygosaccharomyces sp. 1 possui 20 isolados obtidos a partir de mel, pólen e abelhas adultas. Essa espécie é filogeneticamente próxima a Z. rouxii (Figura 14), e apresenta 16 pares de bases divergentes em reação à linhagem tipo (CBS:732) na comparação das sequências dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal. Zygosaccharomyces sp. 2 é filogeneticamente próxima a Z. siamensis e possui 3 isolados obtidos a partir de amostras de abelha adulta e mel maduro. Ensaios de esporulação foram realizados e foi possível observar a formação de esporos sexuais pela espécie Zygosaccharomyces sp. 1. (Figura 13). Os esporos observados estão contidos em uma asca permanente, com 2-4 esporos, que apresentam morfologia esferoidal a elipsoidal. Ascas em forma de haltere, típicas do gênero Zygosaccharomyces também foram observadas. A ascosporulação foi observada em meio YM após sete dias de incubação a 25ºC.

Figura 13: Esporos sexuais de Zygosaccharomyces sp.1. Esporo dentro da asca em forma de haltere.

Apiotrichum sp.1 foi isolada a partir de abelha adulta e mel imaturo de A. mellifera e é filogeneticamente próxima a A. posorum, com 27 bases divergentes na comparação de sequências dos domínios D1/D2. As outras possíveis espécies novas obtidas possuem apenas um isolado obtido e a designação de possível espécie nova foi baseada na divergência apresentada na comparação de sequencias do domínio D1/D2 do gene do RNA ribossomal. Cyrenella sp. foi isolada de adulto de T. angustula e apresenta 12 pares de bases divergentes em relação a C. elegans. Cystobasidium sp. foi isolado a partir de adulto de S. cfr. bipunctata, com quatro pares de bases diferentes em relação a C. benthicum.

Tabela 7: Possíveis novas espécies de leveduras.

Gênero Espécie Substrato de Quantidade aproximada/ % identidade/ isolamento Acesso GenBank Apiotrichum sp. A. porosum (90%) / (MG707703.1) mel imaturo 1

Cyrenella sp. Cy. elegans (97%) / (KJ708454.1) abelha 1

Cystobasidium sp. Cys. benthicum (99%) / abelha 1 (KY107427.1) Meyerozyma sp. M. guilliermondii (98%) / mel maduro 1 (MG707678.1) Papiliotrema sp. P. rajasthanensis (98%) / abelha 1 (KY108743.1) Piskurozyma sp. P. taiwanensis (98%) / abelha 1 (KY107271.1) Starmerella sp. 1 S. cf. etchellsii (98% - 99%) / abelha, pólen, mel 13 (AY257049.1) imaturo, mel maduro Starmerella sp. 2 S. davenportii (95% - 96%) / pólen 2 (EF452219.1) Starmerella sp. 3 S. cf. lactis-condensi (96% - 99%) mel imaturo, mel 2 / (AY257059.1) maduro Starmerella sp. 4 S. bombicola (99%) / pólen 1 (HQ111045.1) Ustilago sp. 1 U. calamagrostidis (99%) / mel imaturo 1 (AY740119.1) Ustilago sp. 2 U. sporoboli-indici (99%) / mel maduro 1 (MF716450.1) Vishniacozyma sp. V. victoriae (92%) / mel imaturo 1 (MG735809.1) Zygosaccharomyces sp.1 Z. mellis (97%) / (KY110273.1) abelha, mel imaturo, 23 mel maduro, pólen Zygosaccharomyces sp.2 Z. siamensis (99%) / abelha, mel maduro 3 (KY110251.1) Total 53

Meyerozyma sp. foi isolada de mel maduro de A. melifera e apresenta seis pares de bases divergentes em relação a M. gulliermondii. Papiliotrema sp. foi obtida a partir de adulto de A. mellifera e apresenta quatro pares de base divergentes em relação a P. rajasthanensis. Piskurozyma sp. foi isolada de adulto de S. cfr. bipunctata e apresenta uma divergência de oito pares de bases em relação a P. taiwanensis. Ustilago sp. 1 foi isolada de mel imaturo de T. angustula e apresenta 14 pares de bases divergentes em

relação a U. calamagrostidis. Já Ustilago sp. 2 foi obtida a partir de mel maduro de S. cfr. bipunctata e apresenta 32 pares de bases divergentes em relação a U. sporoboli- indici. Vishiniacozyma sp. foi isolada de mel imaturo de T. angustula e apresenta 30 pares de bases divergentes em relação à sequência de V. victoriae. Futuramente serão realizadas novas análises de sequenciamento utilizando os primers ITS1/ITS4 para confirmação das novas espécies e posterior descrição.

7 CONCLUSÃO

 As comunidades de leveduras estudadas apresentaram baixo compartilhamento de espécies e elevado número de espécies exclusivas o que indica que possivelmente as abelhas possuem segregação de locais de forrageio, que pode resultar em uma menor competição por alimentos.

 O elevado número de espécies de leveduras do gênero Starmerella, aliado ao grande compartilhamento de espécies desse gênero entre as espécies de abelhas, indica forte endemismo de espécies de Starmerella a abelhas e substratos a estas relacionados.

 A similaridade apresentada entre as três comunidades de leveduras estudadas apresentou baixos valores. Além disso, a curva de acumulação de espécies não apresentou estabilidade para nenhuma das três comunidades. Esses dados indicam que um maior esforço amostral é necessário para cobrir a riqueza de leveduras das comunidades estudadas.

 O isolamento de 15 possíveis espécies novas no presente trabalho mostra o potencial dos substratos estudados para o isolamento de espécies ainda não descritas, além de evidenciar a importância de estudos de biodiversidade de leveduras associadas a abelhas.

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