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Einfluss von L-alpha-Lysophosphatidylinositol (LPI) auf

neuronale Schädigungsprozesse

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med.

an der Medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von:

Stine Kremzow

geb. 16.07.1990 in Erfurt

Angefertigt an der

Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Institut für Anatomie

Betreuer:

PD Dr. phil. nat. Marco Koch

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 24. Februar 2016 Bibliografische Beschreibung:

Kremzow, Stine

Einfluss von L-alpha-lysophosphatidylinositol (LPI) auf neuronale Schädigungsprozesse

Universität Leipzig, Dissertation

41 S.1, 157 Lit.², 1 Publikation

Referat:

Die vorliegende Arbeit beinhaltet experimentelle Untersuchungen zur neuroprotektiven Wirkung des körpereigenen L-alpha-Lysophosphatidylinositol (LPI). Die Vermittlung dieser Wirkung soll durch den zentralnervös exprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptor 55 (GPR55) erfolgen. Als Modelsystem diente die organotypische hippocampale Schnittkultur (OHSC) der Ratte, welche exzitotoxisch mittels N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) geschädigt wurde, um Neurodegeneration zu initiieren. Die Inkubation mit LPI nach NMDA-Schädigung reduzierte die Anzahl toter Neurone und die der Mikroglia in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus. Ein Clodronat-induzierter Verlust der Mikroglia und die siRNA-vermittelte Herabregulation von Gpr55 hoben jeweils den neuroprotektiven Effekt von LPI in der OHSC auf. Diese Beobachtungen wiesen auf eine Mikroglia- und GPR55 abhängige Neuroprotektion hin. LPI wirkte zudem synergistisch und verstärkte die (bekannter Maßen) durch Cannabinoide induzierte und über den Typ 1 Rezeptor vermittelte Neuroprotektion. Ferner wurde Gpr55 mittels qPCR in Mikroglia und Astrozyten nachgewiesen. LPI steuerte außerdem die Expression von Gpr55 in Mikroglia und beeinflusste deren Migrationsverhalten. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, dass LPI in einem in vitro Modellsystem zur Untersuchung des sekundären neuronalen Schadens protektiv wirkt und für die Vermittlung dieser Neuroprotektion Mikroglia und GPR55 in Frage kommen.

______1 Seitenzahl insgesamt 2 Zahl der im Literaturverzeichnis ausgewiesenen Literaturangaben

2 ! Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 4

1.1. Nervengewebe 4

1.2. Neurodegeneration 5

1.3. Mikroglia 6

1.4. Endocannabinioidsystem 8

1.5. Ist GPR55 ein neuer Cannabinoidrezeptor? 10

1.6. L-alpha-Lysophosphatidylinositol 12

1.7. Organotypische hippocampale Schnittkultur 13

2. Fragestellung 14

3. Literaturverzeichnis der Einleitung 15

4. Publikation 22

The G protein-coupled 55 (GPR55) L-α-lysophosphatidylinositol

(LPI) exerts microglia-dependent neuroprotection after excitotoxic lesion

5. Zusammenfassung 33

6. Summary 36

7. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 38

8. Curriculum vitae 39

9. Danksagung 40

10. Erklärung über die Vorbehaltlichkeit der Verfahrenseröffnung zur Verleihung 41 des Titels Dr. med.

3 ! 1. Einleitung

Bis heute geht vom Gehirn eine ungebrochene Faszination aus, da viele seiner Funktionsweisen immer noch wenig verstanden sind oder aber komplett im Verborgenen bleiben. Krankhafte Veränderungen des Gehirns und Rückenmarks, z. B. durch einen Schlaganfall oder ein Trauma verursacht, verdeutlichen zudem die fundamentale Wichtigkeit des Zentralnervensystems (ZNS) für die persönliche Gesundheit und Lebensqualität. Daher ist das Verständnis von grundlegenden Prozessen, die nach zentralnervösen Schädigungen innerhalb des Nervengewebes ablaufen, von fundamentaler Bedeutung. Diese Erkenntnisse könnten für die Etablierung etwaiger Therapieoptionen in der Zukunft herangezogen werden, um den Schweregrad einer körperlichen Beeinträchtigung zu reduzieren.

1.1 Nervengewebe

Das Nervengewebe, als eines der 4 Grundgewebe, besteht aus relativ großen Nervenzellen (Neuronen) und kleineren, wesentlich häufiger vorkommenden Gliazellen. Nach klassischer Definition sind hierbei die über synaptische Kontakte miteinander vernetzten Neurone die Funktionsträger des Nervengewebes, wohingegen den Gliazellen eher unterstützende Aufgaben für die Funktionen der Neurone zugewiesen werden [1]. Der Begriff der ,,Neuroglia‘‘ wurde 1858 von Rudolf Virchow geprägt [2]. In seiner Schrift beschrieb er erstmalig ein ,,Unterstützungsgewebe‘‘ der Neuronen. Virchow erlangte damit enormen Einfluss auf die medizinische Wissenschaft des 19. Jahrhunderts [3]. Der Begriff „Glia“ leitet sich vom griechischen Wort für ,,Leim‘‘ ab, da diesen Zellen zunächst nur eine passive Stützfunktion zugeordnet wurde [3]. Heute weiß man jedoch, dass die Gliazellen den Neuronen nicht funktionell unterstehen, sondern, dass diese aktiv die Homöostase des Nervengewebes mitbestimmen und aufrechterhalten. Gliazellen sind daher ebenfalls für die grundlegende Funktionsfähigkeit des ZNS von elementarer Bedeutung [3]. Nach morphologischen Aspekten werden Neuroglia entsprechend in Mikro- und Makroglia unterteilt. Die Makroglia untergliedert sich funktionell in Astrozyten und Oligodendrozyten. Während Astrozyten u.a. maßgeblich am Aufbau der Blut-Hirn-Schranke beteiligt sind, bilden Oligodendrozyten die Markscheiden um die Axone der Nervenzellen und stellen dadurch die saltatorische Erregungsleitung sicher [4]. Neuesten Erkenntnissen zufolge greifen Astrozyten jedoch auch aktiv in plastische Vorgänge innerhalb des Nervengewebes ein. So induzieren

4 ! Astrozyten den Auf- und Abbau von synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen und modulieren somit deren Aktivitätszustand [5].

Die Mikroglia stellt eine funktionell wichtige Zellpopulation des zentralnervösen Immunsystems dar [6]. Kommt es zu einer Schädigung des Nervengewebes, beginnen in diesem die Prozesse der Neurodegeneration und der Regeneration abzulaufen, an denen die Mikroglia jeweils fundmental beteiligt ist [7, 8]. Allerdings sind die exakten Aufgaben und Funktionen der Mikroglia innerhalb dieser Prozesse bisher nur unvollständig verstanden. In Bezug auf die Mikroglia mehren sich auch Hinweise darauf, dass diese nicht nur, wie bisher vermutet, an Prozessen der Neurodegeneration und Regeneration von Neuronen beteiligt sind, sondern darüber hinaus auch im gesunden Nervengewebe an der Modulation von Signalübertragungsprozessen zwischen Neuronen aktiv teilhaben [9].

1.2 Neurodegeneration

Traumatische und vaskuläre Ereignisse, sowie metabolische und neurodegenerative Prozesse führen zum Untergang von Nervengewebe. Neben dem akut erfolgten Primärschaden entsteht durch Exzitotoxizität, oxidativen Stress und Entzündungsprozessen in der Folge auch ein sogenannten Sekundärschaden [10]. Diese, den Sekundärschaden verursachenden Prozesse, sind in den letzten Jahrzenten und bis heute Gegenstand intensiver Forschung. Durch spezifische experimentelle Beeinflussung soll hierbei der innerhalb sekundärer Schädigungsprozesse erfolgende Nervenzelluntergang in kultivierten Neuronen und Hirnschnitten, sowie in Labortieren unterdrückt bzw. eingeschränkt werden. Schlussendlich sollen aus diesen experimentellen Erkenntnissen zukünftige Therapieoptionen zur Behandlung des Sekundärschadens entwickelt werden.

In diesem Zusammenhang stellt die Exzitotoxizität den bislang bekanntesten Mechanismus dar, über welchen der sekundäre Neuronenschaden ausgelöst werden kann [11]. Exzitotoxizität beschreibt dabei die unkontrollierte Freisetzung von Neurotransmittern durch untergehende Neurone, insbesondere der von Glutamat, wodurch umliegende, primär nicht geschädigte Neurone über den NMDA-(N-Methyl-D-Aspartat)-Rezeptor überstimuliert werden und der konsekutive Kalziumeinstrom diese Neurone schädigt und ebenfalls absterben lässt [12]. Einen weiteren Mechanismus innerhalb der sekundären neuronalen Schädigung stellt die Entzündung des Nervengewebes durch die Aktivierung des Immunsystems und die

5 ! Ausschüttung von Zytokinen dar. Einhergehend mit der funktionellen Störung der Blut-Hirn- Schranke werden neutrophile Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten aus dem Blut rekrutiert [13] und hierbei die lokale Mikroglia im Nervengewebe aktiviert [14]. Es ist nicht ausführlich geklärt, in wie weit die ausgelösten Entzündungskaskaden den Sekundärschaden vergrößern oder ob die Aktivierung des Immunsystems diesem entgegenwirkt. Als ortständiger Sensor neuronalen Schadens kann der Mikroglia hierbei eine Schlüsselrolle zugesprochen werden [15, 16].

1.3 Mikroglia

Mikroglia gelten als die residenten Makrophagen des ZNS [6]. Sie entstehen während der Embryonalentwicklung nicht, wie alle anderen Zellen des ZNS, aus dem Ektoderm, sondern stammen von den primitiven Makrophagen des Dottersacks ab, die dann sekundär in das Neuralrohr einwandern [17-19]. Davon abzugrenzen sind die Makrophagen des Plexus choroideus, der Pia mater encephali und die perivaskulären Makrophagen. Diese entstehen im Knochenmark und wandern von dort aus in das ZNS ein [20, 21]. Die Population der Mikroglia macht im gesamten ZNS, einschließlich der Retina, etwas 10% aller Zellen aus [22].

Als Erstbeschreiber der Mikroglia gilt Pio del Rio-Hortega [23]. Er beschrieb die Morphologie dieser Subpopulation der Glia damals schon so, wie sie heute dem Funktionszustand zuzuordnen ist [24]. Mikroglia können verschiedene Aktivierungsgrade annehmen. Im sogenannten Ruhezustand liegen sie mit einem kleinen Zellkörper und vielen feinen Zellfortsätzen, den Ramifizierungen, vor. In dieser Form sind sie fähig ihre Umgebung auf Schädigungen hin zu kontrollieren [25, 26]. Sobald ein Kontakt mit pathologischen Stoffen auftritt, wird die Mikroglia aktiviert und nimmt eine kugelige Gestalt an [27, 28]. In dieser Form sind ihre Fähigkeiten zur Phagozytose, Antigenpräsentation und Zellkommunikation über die Freisetzung von Mediatoren besonders ausgeprägt [29, 30]. In diesem Zusammenhang betonen die Autoren Hanisch und Kettenmann bei der Bezeichnung von ruhendem und aktiviertem Zustand, dass die Mikroglia auch im Ruhezustand aktiv sind und die Übergänge zwischen beiden Zuständen fließend sind [31]. Mikroglia exprimieren eine Vielzahl an spezifischen Rezeptoren. Insbesondere sind folgende Rezeptoren für die genannten Funktionen der Mikroglia relevant: Rezeptoren für a) (Purine, Glutamat, gamma-Aminobuttersäure (GABA), Acetylcholin, Noradrenalin und Dopamin), b) 6 ! Neurohormone (Bradykinin, Histamin, Endothelin, Cannabinoide, Angiotensin, Somatostatin, Glukokortikoide, Opioide, Substanz P) c) Zyto- und Chemokine sowie d) den PRRs (Pattern- Recognition Receptors), wie z. B. den Toll-like-Rezeptoren [32-39].

Mikroglia besitzen in der Entwicklung und im adulten Zustand des ZNS vielfältige Funktionen. In der Neurogenese und im Zuge neuronaler Plastizität des adulten Nervengewebes beispielsweise bauen Mikroglia die Synapsen geschädigter Neurone ab – ein Prozess der als „synapse stripping“ bezeichnet wird [40-42]. Ebenso sind Mikroglia sowohl nach traumatischen, entzündlichen und ischämischen Ereignissen, als auch bei degenerativen neurologischen Erkrankungen wie Demenz, Multipler Sklerose (MS) und Parkinson im Schädigungsgebiet vermehrt nachweisbar [43-46]. Ob Mikroglia gesundheits- oder krankheitsfördernd, respektive neuroprotektiv oder neurotoxisch sind, kann in diesem Zusammenhang bis heute jedoch nicht eindeutig beantwortet werden. Verschiedene Arbeiten konnten neurotoxische Effekte zeigen [6, 47, 48]. Sauerstoffradikale, Stickstoffmonoxid und pro-inflammatorische Zytokine wie TNF-alpha (Tumornekrosefaktor-alpha), werden von aktivierten Mikroglia ausgeschüttet und schädigen umgebende Zellen. Bei inflammatorischen Krankheitsbildern wie der MS kann dies zur Progression führen [49]. Auch in einem Ratten- Modell der Parkinsonkrankheit wurde die Degeneration der Neurone durch Inflammation getriggert [44].

Auf der anderen Seite wird der Mikroglia eine neuroprotektive Rolle zugesprochen. In kultivierten Mikroglia konnte zum Beispiel ein Abtransport von Glutamat aus dem Extrazellularraum und somit eine Dämpfung der exzitotoxischen Wirkung auf Neurone nachgewiesen werden [50]. Mehrere Arbeiten belegen zudem neuroprotektive Effekte der Mikroglia nach ischämischen Ereignissen [51-53]. In diesem Zusammenhang wurden einzelne chemischen Verbindungen identifiziert werden, welche für die neuroprotektiven Wirkungen der Mikroglia verantwortlich gemacht werden konnten [54-57]. Besonders interessant waren hierbei zahlreiche Befunde, die zeigten, dass insbesondere Lipide aus der Stoffgruppe der Cannabinoide die neuroprotektiven Eigenschaften der Mikroglia auslösten [58-63]. Heute weiß man, dass die zunächst aus Pflanzen gewonnenen und später synthetisch hergestellten Cannabinoide auch endogen in Tieren und Menschen als Liganden der Cannabinoidrezeptoren vorkommen. Dort fungieren die körpereigenen Endocannabinoide als ein Hauptbestandteil des vor ca. 20 Jahren entdeckten Endocannabinoidsystems.

7 ! 1.4 Endocannabinoidsystem

Das Endocannabinoidsystem beschreibt das Zusammenspiel von Endocannabinoiden, deren metabolisierenden und katabolisierenden Enzymen sowie den Cannabinoidrezeptoren Typ 1 und 2 (CB1- und CB2 Rezeptor). 1964 konnte Mechoulam den Hauptinhaltsstoff aus der Hanfpflanze sativa, delta-9- (THC) extrahieren [64]. Diese Pflanze wird weltweit seit Jahrtausenden als Heilmittel genutzt und ist seit langem für ihre entzündungshemmenden und schmerzstillenden Wirkungen bekannt [65]. Seit der Extraktion von THC wurden über 60 weitere Stoffe, sogenannte Phytocannabinoide, isoliert und in ihrer Struktur entschlüsselt. Im Jahre 1990 gelang schließlich die Klonierung des ersten

Cannabinoidrezeptors, kurz CB1 [66]. Der CB1 Rezeptor ist ein membranständiger G-Protein- gekoppelter Rezeptor und kommt ubiquitär in Blutgefäßen, Fettgewebe und Leber, insbesondere aber in hoher Anzahl im ZNS vor [66]. Das gehäufte Vorkommen des CB1 Rezeptors in Kleinhirn, Hippocampus und Basalganglien wies zunächst auf wichtige Funktionen des Endocannabinoidsystems in Bewegungs- und Lernprozessen hin [67, 68]. Im Jahre 1992 wurde mit Anandamid (N-Arachidonoylethanolamid, AEA) der erste endogene Ligand für Cannabinoidrezeptoren, also das erste Endocannabinoid, entdeckt [69]. Ein Jahr später folgte dann die Klonierung des CB2 Rezeptors, ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, welcher überwiegend auf Makrophagen sowie B- und T-Lymphozyten der Milz, Tonsillen und Lymphknoten lokalisiert ist [70]. Der CB2 Rezeptor ist an der Regulation von Zellmigration von Makrophagen und der Zytokinfreisetzung beteiligt [71, 72]. Wiederum Mechoulam identifizierte mit 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) schließlich das zweite Endocannabinoid [73].

Im ZNS fungieren die lipophilen Endocannabinoide als Botenstoffe, die nicht nur, wie klassische Neurotransmitter, präsynaptisch gebildet werden sondern auch vom postsynaptischen Neuron synthetisiert werden können [74]. Anders als klassische Neurotransmitter wie Glutamat oder GABA werden Endocannabinoide nicht in synaptischen Vesikeln gespeichert. Die Freisetzung der Endocannabinoide in den synaptischen Spalt erfolgt dagegen direkt nach deren Synthese aus Vorläufer-Lipiden in der Plasmamembran, bei denen es sich in der Regel um Derivate der Arachidonsäure handelt [75]. Von der Postsynapse freigesetzte Endocannabinoide aktivieren dann an der Präsynapse den dort lokalisierten CB1 Rezeptor. Eine wichtige Funktion dieser retrograden Neurotransmission der Endocannabinoide liegt darin, dass durch den präsynaptischen CB1 Rezeptor die weitere Ausschüttung klassischer Neurotransmitter an der Präsynapse, wie Glutamat oder GABA, 8 ! gehemmt werden kann [74, 76]. Endocannabinoide fungieren somit im ZNS als lipiderge Modulatoren der klassischen Neurotransmission.

Innerhalb des Nervengewebes ist das Endocannabinoidsystem in zahlreiche physiologische und pathologische Prozesse involviert. In Bezug auf Erkrankungen des ZNS ist die Rolle von Endocannabinoiden jedoch nicht eindeutig geklärt. So gibt es einige Hinweise auf direkte neurotoxische Effekte von Cannabinoiden und Beschreibungen von proinflammatorischen Wirkungen der Endocannabinoide [77]. Letzterer Aspekt ist deshalb besonders interessant, da es sich bei Endocannabinoiden um Derivate der Arachidonsäure handelt. Erste experimentelle Daten weisen nun darauf hin, dass eine gezielte Synthese klassischer proinflammatorischer Arachidonsäurederivate, wie Leukotriene und Prostaglandine, direkt aus Endocannabinoiden als Vorläufermoleküle erfolgen kann [78, 79]. Hierdurch könnte auf eine indirekte Beteiligung der Endocannabinoide an inflammatorischen Prozessen geschlossen werden [78, 79]. Dem stehen jedoch zahlreiche experimentelle Arbeiten gegenüber, die zeigen, dass Endocannabinoide ein enormes neuroprotektives Potential aufweisen [80-82]. So konnte durch Hochregulation von Endocannabinoiden oder durch exogene Zugabe von Cannabinoiden nach initialer neuronaler Schädigung der Sekundärschaden eingedämmt werden [61-63, 83-86].

Da degenerative Erkrankungen des ZNS immer noch nur unzureichend therapiert werden können (s.o.), stellt die Grundlagenforschung zur Funktionsweise potentieller neuroprotektiver Substanzen, wie den Endocannabinoiden, ein Schwerpunktthema in der Neuroprotektionsforschung dar. Klinische Studien belegen bezüglich einer medizinischen Anwendung von Cannabis bisher einige positive Auswirkungen auf Symptome von Krebs, Neuropathien, Demenz und MS. So konnte eine Linderungen von Schmerzen, Spastik, Übelkeit, Erbrechen und Appetitlosigkeit aufgezeigt werden [87-90]. Diese Erfolge eröffneten schließlich einen neuen Markt für Medikamente auf Cannabisbasis. Das erste Medikament Dronabinol, welches synthetisch hergestelltes THC als Wirkstoff beinhaltet, ist in den USA seit 1985 zur Antiemesis und Appetitsteigerung zugelassen [91] und ist in Deutschland unter den verkehrsfähigen und verschreibungsfähigen Betäubungsmitteln aufgeführt (BtMG Anlage III). , als ein inverser Agonist am CB1 Rezeptor, galt bei Adipositas als potenter Appetitzügler, musste jedoch 2008 aufgrund starker psychischer Nebenwirkungen vom Markt genommen werden (Pressemitteilung: European Medicines Agency, Doc. Ref. EMEA/CHMP/537777/2008). 2012 wurde Nabiximol (Wirkstoffe THC und CBD) zur

9 ! Zusatzbehandlung bei Spastik im Rahmen von MS zugelassen (European Medicines Agency decision P/0290/2012).

Insgesamt muss man jedoch feststellen, dass die Anwendung globaler CB1- und CB2 Rezeptor Agonisten zu einer unerwarteten Komplexität im Wirkungsspektrum führte [92]. Bisher gestaltet sich eine nebenwirkungsarme und lokal beschränkte Therapie durch das ubiquitäre Vorkommen der CB1- und CB2 Rezeptoren in ZNS und peripheren Organen als schwierig. All dies macht deutlich, dass ein weitaus besseres Verständnis der pathophysiologischen Rolle des Endocannabinoidsystems zwingend notwendig ist [92].

In diesem Zusammenhang mehren sich in den letzten 10 Jahren Hinweise darauf, dass es neben den CB1- und CB2 Rezeptoren noch weitere Rezeptortypen für Cannabinoide geben muss [93]. Des Weiteren sind mittlerweile auch viele weitere, den Endocannabinoiden struktur- und funktionsverwandte, lipiderge Botenstoffe identifiziert worden [94]. All diese Befunde lassen daher auf eine enorme und bisher unbekannte Komplexität des Endocannabinoidsystems schließen. Vor allem experimentelle Studien an CB1- und CB2 Rezeptor Knockout-Mäusen deuten auf die Existenz weiterer Cannabis-sensitiver Rezeptoren hin, die das breite und auch CB1/CB2 Rezeptor-unabhängige Wirkungsspektrum von Endocannabinoiden erklären würden [93]. Mehrere sogenannte ,,orphan receptors‘‘ (Englisch für verwaiste Rezeptoren) gelten hierbei als Kandidaten. Die Strukturen verwaister Rezeptoren sind zwar entschlüsselt, jedoch konnte diesen noch kein spezifischer Ligand zugewiesen werden. In den letzten Jahren haben sich die Hinweise verdichtet, dass es sich mit GPR55, als einen der vielen ,,orphan receptors‘‘, um einen bisher unbekannten Rezeptor von Cannabinoiden bzw. seiner strukturverwandten Lipide handeln könnte [95]. Daher erscheint eine grundlegende Charakterisierung von GPR55 im Hinblick auf sein neuroprotektives Potential hin sinnvoll.

1.5 Ist GPR55 ein neuer Cannabinoidrezeptor?

GPR55 wurde 2007 erstmalig mit dem Endocannabinoidsystem in Verbindung gebracht, da diverse endogene, synthetische und pflanzliche Cannabinoide Aktivitäten an diesem Rezeptor zeigten (als Agonisten: THC, Rimonabant, O-1602, AM251, 2-AG und ; als Antagonisten: und CP55940) [95-103]. Die Gesamtheit der bisher durchgeführten Liganden-Tests ist jedoch in ihren Ergebnissen inkongruent [104]. Dies

10 ! könnte unter anderem der Nutzung von unterschiedlichen Zelllinien, Gewebearten und Testsystemen zugeschrieben werden [104].

GPR55 wurde 1999 isoliert und kloniert. Er besteht aus 319 Aminosäuren und ist auf dem Chromosomenabschnitt 2q37 lokalisiert [96]. Die Homologie von GPR55 zum CB1 Rezeptor entspricht 13,5% und zum CB2 Rezeptor 14,4%. Hingegen sind sich der CB1- und CB2 Rezeptor mit 68% in der Transmembrandomäne und 44% in der Bindungsstelle ähnlich [97]. Die Bindungstasche von GPR55 weist keine Homologie zu den CB1 oder CB2 Rezeptoren auf [105], worin sich jedoch CB1- und CB2 Rezeptor auch unterscheiden. GPR55 sowie der CB1- und CB2 Rezeptor gehören zu den Rhodopsin-ähnlichen GPR, die größte Gruppe humaner Rezeptoren, mit circa tausend Genen im menschlichen Genom. GPR55 koppelt über

Gα12/13 [106-110] oder Gαq/11 [106, 111] an intrazelluläre Signalkaskaden. Zudem sind Wirkungen auf MAPK (mitogen-activated protein kinase), CREB (cAMP response element- binding protein), NFkB (nuclear factor k B) und NFAT (nuclear factor of activated T-cells) beschrieben worden [112]. Im Jahre 2008 wurden Überschneidungen der den GPR55 und CB1 Rezeptor nachgeschalteten Signalkaskaden aufgezeigt [113]. Dieses Phänomen konnte später auch für GPR55 und dem CB2 Rezeptor aufgedeckt werden [108, 114]. GPR55 konnte in zahlreichen Regionen des ZNS nachgewiesen werden [95, 96, 109, 115]. Hierbei lag eine starke Expression in Mikroglia vor [72]. Zudem konnte GPR55 in beta-Zellen des Pankreas [116] und Zellen des Gastrointestinaltrakts nachgewiesen werden [95, 117]. Eine eindeutige physiologische Rolle konnte jedoch für GPR55 bisher noch nicht aufgezeigt werden. Aktuelle Forschungsarbeiten zeigen, dass der GPR55 in Prozessen der Schmerzwahrnehmung [118- 120], Adipositas- [121] sowie Krebsentstehung [122] und im Knochenstoffwechsel [123] involviert ist. Zudem wird GPR55 in humanen Brustkrebs- [124, 125], Glioblastom- [125], Hautkrebs- [126], Cholangiokarzinom- [105], Ovarialkarzinom- und Prostatakarzinomzellen [127] exprimiert. In Mikroglia verändert sich der RNA-Gehalt von GPR55 auf Inflammationsstimuli wie Lipopolysacharid (LPS) und Interferon-ɣ (IFN-ɣ) hin [72]. In der GPR55-defizienten Maus konnten keine extremen neurologischen Auffälligkeiten beobachtet werden. Es lag jedoch eine gestörte motorische Koordination vor [128].

Der bisher identifizierte Hauptligand des GPR55 ist ein Phospholipid namens L-alpha- Lysophosphatidylinositol (LPI) [129]. Dieses körpereigene, endogene scheint, im Gegensatz zu den bereits oben erwähnten Cannabinoiden, ausschließlich über GPR55 und nicht zusätzlich über CB1- und CB2 Rezeptoren zu wirken [104, 130]. Diese Spezifität lässt daher experimentell eine selektive Aktivierung von GPR55 zu. 11 ! 1.6 L-alpha-Lysophosphatidylinositol (LPI)

LPI ist ein saures Phospholipid [107, 129, 131]. Lysophosphatidylinositol gehört, wie die Endocannabinoide, zu den endogenen Lipiden. Neben den herkömmlichen Signalmediatoren auf Proteinbasis umfasst diese Stoffklasse einen weiteren hochpotenten Pfad der Zellkommunikation, welchen man unter dem Begriff des „Lipid Signaling“ zusammenfasst. LPI gehört unter diesen Signalmediatoren zu den Lysophospholipiden. Lysophosphatidsäure (LPA), Lysophosphatidylcholin (LPC) und Sphingosin-1-Phosphat (S1P) sind derzeit die bekanntesten Vertreter der Lysophospholipide [131]. Sie wirken über GPR, die in einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen des Immunsystems und innerhalb des ZNS vorkommen [132]. Lysophospholipide vermitteln entscheidende zelluläre Prozesse wie Wachstum, Migration und Differenzierung [133, 134].

Lysophospholipide werden aus Phosholipiden der Zellmembran generiert. Phosphatidylinositol (PI) ist der Ausgangstoff der LPI-Synthese. PI wird aus Glycerol-3- Phosphat durch Anlagerung zweier Acylketten und einer Inositolgruppe generiert. LPI entsteht anschließend durch die Hydrolyse einer Acylkette (dafür steht das Präfix „lyso“) über die Phospholipase 1 und 2 (PLA1 und 2) [135-137]. Unklar ist noch, über welchen Transporter LPI aus der Zelle heraustransportiert wird. Im Jahre 2011 postulierte Pineiro hierfür einen aktiven Transport über ABCC1/MRP1 („ATP-binding cassette C1/multidrug resistance protein 1“) [127]. Extrazellulär erreicht LPI seinen Rezeptor GPR55 autokrin und parakrin. Pineiro nannte diesen Kreislauf ,,autokrine Schleife‘‘ [127]. Über die Lysophospholipase A, C und D wird LPI anschließend abgebaut und die Signalkaskade herunterreguliert [136, 138-140]. Ebenso gibt es Hinweise auf eine Re-Acylierung von LPI und somit Re-Synthese von PI über Acyltransferasen [141].

LPI scheint in verschiedene physiologische und pathologische Prozesse involviert zu sein. In den 1980er Jahren wurde LPI zum ersten Mal mit dem Insulinstoffwechsel in Verbindung gebracht. LPI stimulierte die Insulinsekretion aus den pankreatischen beta-Zellen der Langerhans-Inseln [142, 143]. Es reguliert entscheidend die Kalziumhomöostase in pankreatischen beta-Zellen, in Hepatozyten und in Endothelzellen [144]. In den 1990er Jahren wurde für LPI eine mitogene Aktivität nachgewiesen [145, 146]. Es gab Nachweise von erhöhten LPI-Konzentrationen in der Umgebung von Tumoren [146, 147], welche Tumormigration, -wachstum und -angiogenese anregen könnten [101]. Bei anderen Pathophysiologien, wie Adipositas, wurde LPI im Blutserum erkrankter Patienten in

12 ! gesteigerter Menge detektiert [121]. Jüngst wurde LPI zudem eine Rolle in der Nozizeption über GPR55 zugeordnet [148]. Seit der Identifizierung von LPI als Ligand von GPR55 [95, 129] findet es auch mehr Beachtung in der neurologischen Forschung. Relevante Mengen von 37,5 nmol/g LPI wurden im Gehirn von Ratten nachgewiesen [115]. Neuste Ergebnisse deuten auf die Freisetzung von LPI aus präsynaptischen Axonen hin [149]. In diesem Zusammenhang wurde im Jahre 2002 dem LPI erstmals neuroprotektive Eigenschaften zugeschrieben [150].

1.7 Organotypische hippocampale Schnittkulturen (OHSC)

Die OHSC bietet eine geeignete Möglichkeit, das physiologische und pathologische Zusammenspiel der unterschiedlichen Zelltypen des Nervengewebes in vitro zu untersuchen. Hierbei werden Gehirnschnitte aus der Hippocampus-Formation der Ratte kultiviert, pharmakologisch behandelt und über einen entsprechenden Zeitraum hin die Auswirkungen dieser Behandlung untersucht. Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht funktionelle Untersuchungen über die singuläre Zellkultur hinaus, da die Hippocampus-Formation eine Region im Gehirn darstellt, die in sich einen geschlossenen Neuronenkreis beinhaltet, wodurch Krankheitsmodelle wie Axotomie, Ischämie und Exzitotoxizität modellhaft untersucht werden können [151-155]. Man unterteilt die Hippocampus-Formation in folgende Abschnitte: Gyrus dentatus, Cornu ammonis (CA) Regionen 1-4, Subiculum und entorhinaler Cortex [156, 157]. Durch Inkubation mit NMDA ist es möglich, Neurodegeneration zu initiieren, um im Anschluss potentiell neuroprotektive Subtanzen auf ihre Wirkungen hin zu untersuchen.

13 ! 2. Fragestellung

Aus obiger Einleitung und dem aktuellen Kenntnisstand entsprechender Literatur ergaben sich im Hinblick auf das neuroprotektive Potential lipiderger Botenstoffe und deren Rezeptoren folgende Fragestellungen: a) Wie wirkt LPI im Modellsystem der OHSC nach exzitotoxischer Schädigung? b) Welche Rolle spielen GPR55 und Mikroglia für die Wirkung von LPI? c) Interagiert LPI/GPR55 mit CB1- und CB2 Rezeptoren? d) Beeinflusst LPI die Expression von Cannabinoidrezeptoren, das Migrationsverhalten und intrazelluläre Signalkaskaden primärer Mikroglia?

Um diesen Fragestellungen nachzugehen, wurden zunächst exzitotoxisch (NMDA) geschädigte OHSC mit LPI behandelt. Im Anschluss wurden Primärkulturen von Astrozyten und Mikroglia nach LPI Behandlung immunhistochemisch untersucht. Diesen Untersuchungen schlossen sich experimentelle Analysen an, in denen real-time-quantitative- PCR (qPCR), Migrationsstudien mittels Boyden Kammer, Western Blot und Kalzium- Imaging zur Anwendung kamen.

14 ! 3. Literaturverzeichnis der Einleitung

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21 ! 4. Publikation

Kallendrusch S1, Kremzow S1, Nowicki M, Grabiec U, Winkelmann R, Benz A, Kraft R, Bechmann I, Dehghani F, Koch M:

1geteilte Erstautorenschaft

The G protein-coupled receptor 55 (GPR55) ligand L-α-lysophosphatidylinositol (LPI) exerts microglia-dependent neuroprotection after excitotoxic lesion.

Glia. 2013 Nov;61(11):1822-1831. doi: 10.1002/glia.22560.

Seite 23-32

22 ! RESEARCH ARTICLE

The G Protein-Coupled Receptor 55 Ligand L-a-Lysophosphatidylinositol Exerts Microglia-Dependent Neuroprotection After Excitotoxic Lesion

Sonja Kallendrusch,1 Stine Kremzow,1 Marcin Nowicki,1 Urszula Grabiec,1 Ria Winkelmann,2 Alexander Benz,2 Robert Kraft,3 Ingo Bechmann,1 Faramarz Dehghani,1 and Marco Koch1

Searching for chemical agents and molecular targets protecting against secondary neuronal damage reflects one major issue in neuroscience. Cannabinoids limit neurodegeneration by activation of neuronal G protein-coupled cannabinoid receptor 1 (CB1) and microglial G protein-coupled cannabinoid receptor 2 (CB2). However, pharmacological experiments with CB1/CB2- deficient mice unraveled the existence of further, so-called non-CB1/non-CB2 G protein-coupled receptor (GPR) subtypes. GPR55, whose function in the brain is still poorly understood, represents a novel target for various cannabinoids. Here, we investigated whether GPR55 reflects a potential beneficial target in neurodegeneration by using the excitotoxicity in vitro model of rat organotypic hippocampal slice cultures (OHSC). L-a-Lysophosphatidylinositol (LPI), so far representing the most selective agonist for GPR55, protected dentate gyrus granule cells and reduced the number of activated microglia after NMDA (50 mM) induced lesions. The relevance of GPR55 activation for LPI-mediated neuroprotection was determined by using Gpr55 siRNA. Microglia seems to mediate the observed neuroprotection since their depletion in OHSC attenuated the beneficial effects of LPI. Moreover, LPI alone induced microglia chemotaxis but conversely significantly attenuated ATP trig- gered microglia migration. These effects seemed to be independent from intracellular Ca21 and p38 or p44/p42 MAPK phos- phorylation. In conclusion, this study unmasked a yet unknown role for GPR55 in neuroprotection driven by LPI-mediated modulation of microglia function.

GLIA 2013;61:1822–1831 Key words: microglia, neuroprotection, excitotoxicity, organotypic hippocampal slice cultures, cannabinoid receptor

Introduction pathways triggering secondary neuronal damage (Gowran et al., ngoing research is still focusing on the development of 2011). In this regard, most of the pathophysiological modifica- Oconvincing therapeutic concepts for the treatment of sec- tions induced by application of cannabinoids are associated with ondary neuronal damage as occurring in acute and chronic activation of neuronal G protein-coupled cannabinoid receptor CNS diseases (Huang and Mucke, 2012; Yenari et al., 2008). 1(CB1) and microglial G protein-coupled cannabinoid receptor

Endocannabinoids as a group of lipid messenger down-regulate 2(CB2) (Marsicano et al., 2003; Panikashvili et al., 2001;

View this article online at wileyonlinelibrary.com. DOI: 10.1002/glia.22560 Published online September 3, 2013 in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). Received Oct 12, 2012, Accepted for publication July 16, 2013.

Address correspondence to Faramarz Dehghani, Institut fur€ Anatomie und Zellbiologie, Martin Luther Universitat€ Halle-Wittenberg, Grosse Steinstr. 52, 06097 Halle (Saale), Germany. E-mail: [email protected]

From the 1Institut fur€ Anatomie, Universitat€ Leipzig, Germany; 2Senckenbergisches Institut fur€ Pathologie, Goethe Universitat€ Frankfurt am Main, Germany; 3Carl- Ludwig Institut fur€ Physiologie, Universitat€ Leipzig, Germany.

S. Kallendrusch and S. Kremzow contributed equally to this manuscript.

Additional Supporting Information may be found in the online version of this article.

1822 VC 2013 Wiley Periodicals, Inc. Kallendrusch et al.: Microglia-Dependent GPR55-Driven Neuroprotection

Ramirez et al., 2005; Viscomi et al., 2009). However, the neuro- in a fully humidified atmosphere with 5% (v/v) CO2. The culture protective potential of several cannabinoids varies significantly medium consisted of 50% (v/v) MEM, 25% (v/v) Hanks’ balanced salt solution (Gibco), 25% (v/v) normal horse serum (Gibco), 2% (v/v) (Baker et al., 2003) and neurotoxic effects of cannabinoids were glutamine (Gibco), 1 mg/mL insulin (Roche, Mannheim, Germany), described as well (Sarne et al., 2011). 1.2 mg/mL glucose (Braun, Melsungen, Germany), 0.1 mg/mL strepto- Pharmacological studies with CB1/CB2-deficient mice mycin (Sigma-Aldrich, Seelze, Germany), 100 U/mL penicillin (Sigma- point toward additional binding sites for some cannabinoids, Aldrich), 0.8 mg/mL C (Sigma-Aldrich), at pH 7.4 and was the so-called non-CB1/non-CB2 G protein-coupled receptor changed every other day. (GPR) subtypes (Begg et al., 2005). Recently, GPR55 has LPI (Sigma-Aldrich; cat.-No 7635), WIN55,212-2 mesylate been described as a novel receptor candidate for cannabinoids (WIN; Tocris, Bioscience, Bristol, United Kingdom) were dissolved in (Baker et al., 2006; Ross, 2009; Ryberg et al., 2007; Sawz- DMSO and stored at 220C. Prior to application, compounds were dargo et al., 1999). Although the status for the best investi- diluted in cell culture medium with a maximal final solvent concen- gated endocannabinoids 2-arachidonoylglycerol (2-AG) and tration of 0.01% (v/v) DMSO. Control experiments with equimolar concentrations of DMSO alone did not show any significant effects arachidonoylethanolamine (AEA) as GPR55 ligands is still on the investigated parameters as previously reported (Kreutz et al., debatable (Ross, 2009), phytocannabinoids such as THC or 2007, 2009). cannabidiol and like AM251 or O- 1602 have been described as GPR55 ligands. However, the OHSC Treatment Protocol pathophysiological functions of GPR55 in the CNS are still The preparations were divided into different groups and treated enigmatic (Stella, 2010). L-a-Lysophosphatidylinositol (LPI) according to the following protocols: was identified as the first selective endogenous ligand for CTL. Nonlesioned OHSC were kept in culture medium for 9 days GPR55 (Oka et al., 2007). LPI does not activate CB1/CB2 and reflects a useful tool to investigate the pathophysiological in vitro (div). role of GPR55 in the CNS independently of concomitant LPI. Nonlesioned OHSC were incubated in medium containing CB1/CB2 activation. LPI (1 mM) from 6 div till 9 div. One open question with regard to cannabinoid- NMDA. OHSC were kept in culture medium for 6 days, lesioned mediated neuroprotection is whether non-CB1/non-CB2 GPR with NMDA (50 mM; Sigma-Aldrich) for 4 h at 6 div and kept in are involved in modulation of secondary neuronal damage culture medium for another 3 days. and if so, whether their activation might have a beneficial or detrimental outcome. NMDA 1 LPI. OHSC were lesioned with NMDA for 4 h at 6 div. Thereafter, OHSC were incubated with culture medium con- In this study, we thus used excitotoxically lesioned rat taining different concentrations of LPI (0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 0.1 organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) to test the mM, 1 mM, and 10 mM) for 3 more days. function of GPR55 in secondary neuronal damage. Primary neuronal, astrocyte and microglial cultures were prepared to elu- NMDA 1 LPI 1 WIN. After lesion of OHSC with NMDA for 4 h cidate further the signaling cascades behind GPR55 activation. at 6 div, OHSC were incubated with culture medium containing LPI (1 mM) and WIN (10 nM) for 3 more days. On 9 div, nuclei of Material and Methods degenerating neurons were stained with 5 mg/mL propidium iodide (PI) for 2 h in OHSC prior to fixation (4% (w/v) solution of para- Animal experimentation was performed in accordance with the direc- formaldehyde (Sigma-Aldrich) for 4 h). tive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of the European Union (September 22, 2010) on the protection of ani- mals used for scientific purposes. siRNA for Gpr55 in OHSC At 5 div, OHSC were transfected with Gpr55 siRNA 24 h before Preparation of OHSC NMDA treatment. Gene silencer transfection reagent (cat. No. P8 Wistar rats (Charles River, Sulzfeld, Germany) were sacrificed by T500020, Genelantis, San Diego, CA) was used following manufac- decapitation and brains were dissected under aseptic conditions. After turer’s instruction in combination with the Gpr55 siRNA (target removal of the frontal pole and the cerebellum, brains were placed in sequence: 50-CACGTGGAGTGCGAGAGTCTT-03, sense strand 50- minimal essential medium (MEM, Gibco BRL Life Technologies, CGUGGAGUGCGAGAGUCUUTT-03 and the antisense strand 50- Eggenstein, Germany) containing 1% (v/v) glutamine (Gibco) and AAGACUCUCGCACUCCACGTG-03) obtained from Qiagen (cat. were cut into 350 mm-thick slices using a sliding vibratome (Leica No SI03004708, Qiagen, Hilden, Germany). VT 1200 S, Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany). Six to eight OHSC were obtained from each brain and immediately transferred Depletion of Microglia in OHSC onto cell culture inserts (pore size 0.4 mm, Millipore, Schwalbach/Ts, Bisphosphonate clodronate (100 lg/mL, Calbiochem, Darmstadt, Germany). The inserts were placed in 6-well culture dishes, contain- Germany) was applied to OHSC from 1 div until 6 div before start- ing 1 mL culture medium per well and were then incubated at 35C ing the above-described NMDA treatment protocol.

November 2013 1823 Lectin Histochemistry and Confocal Laser Scanning dissolved in 20 mL DEPC water. Concentration and purity was Microscopy determined prior to reverse transcription (Superscript II, Invitrogen)

For isolectin B4 (IB4) staining, OHSC were washed with phosphate- with oligo(dT) primer into cDNA. A total of 50 ng RNA was sub- buffered saline (PBS) containing 0.3% (v/v) Triton X-100 (PBS-T) jected to RT-PCR using Platinum-SYBR GreenVR qPCR Supermix for 10 min (1-time), incubated with normal goat serum (diluted (Invitrogen). Oligonucleotide primers (see Supp. Info. Table 1; final 1:20 in PBS-T, Gibco) for 30 min and stained with FITC- concentration 10 pmol/lL) were designed with the Primer3 software conjugated IB4 (Vector laboratories, Burlingame, CA) diluted (Rozen and Skaletsky, 2000) to flank intron sequences and were syn- 1:50 in PBS-T containing 0.25% (w/v) bovine serum albumin thesized by MWG Biotech (Eversberg, Germany). Quantitative RT- (Sigma-Aldrich) over night. Finally, specimens were washed with PCR was performed by use of CFX9 (Bio Rad laboratories, PBS-T (2-times) and aqua dest. (1-time) and mounted (DAKO fluo- Munchen,€ Germany) under the following protocol: 3 min at 95C rescent mounting medium; DAKO Diagnostika GmbH, Hamburg, and 40 cycles of 10 s at 95C and 30 s at 61C. A product-melting Germany). curve was recorded to confirm the presence of a single amplicon. OHSC were analyzed with a Zeiss confocal laser-scanning The correct amplicon size and identity were additionally confirmed microscope (LSM 510 Meta, Zeiss, Gottingen, Germany). Confocal by agarose gel electrophoresis. Standard curves with serial dilutions images were obtained with a 160-fold magnification. Using the Z- of cDNA were generated for each primer pair to assert linear mode of the LSM 510, OHSC were optically cut into 2 mm-thick sec- amplification. tions. Sections were converted into binary images and Image J soft- ware (version 1.43, imagej.nih.gov/ij/download/) was used for Microglia Migration Assay counting numbers of PI-positive neuronal nuclei and IB4-positive In vitro cell migration assays were performed using a 48-well micro- microglia in every third optical section through the granule cell layer chemotaxis (Boyden) chamber and a poly-L-lysin coated PVP-free pol- (GCL) of the dentate gyrus (DG) and indicated as cells/GCL. ycarbonate filter with 8 lm diameter pores (Neuroprobe, Gaithersburg, MD). The upper wells of the Boyden chamber were Primary Cell Cultures filled with 40 lL of microglia suspension containing 125,000 cells/mL Primary microglial and astroglial cultures were isolated from cere- in serum-free DMEM. In the lower wells the different experimental bral cortices of P1 Wistar rats. After removal of the meninges, groups were either left untreated (DMEM) and served as controls 1 1 cerebral cortices were dissociated in Ca2 /Mg2 -free HBSS, con- (CTL), stimulated with LPI (1 mM), ATP (100 mM) or ATP (100 taining trypsin (4 mg/mL, Boehringer, Mannheim, Germany) and mM) 1 LPI (1 mM) and were incubated at 37 C in a 5% (v/v) CO2 DNAse (0.5 mg/mL, Worthington, Bedford, MA). Cells were atmosphere for 4 h. After the incubation, the filter was removed and 2 plated onto poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) coated 75 cm tissue cul- fixed for 10 min in 4% (w/v) PFA, followed by IB4 staining for micro- ture flasks (Falcon) containing DMEM (Gibco) supplemented with glia as described above. In addition, Hoechst 33342 (1:50,000 in PBS; 10% (v/v) fetal bovine serum (Gibco), 1% (v/v) glutamine, 0.1 Sigma-Aldrich) staining was performed for 2 min at RT. Finally, the mg/mL streptomycin and 100 U/mL penicillin. Microglia were membrane was sectioned and mounted onto microscope slides and mechanically isolated from the astroglial monolayer and were incu- each well was imaged twice in nonoverlapping areas by use of the bated with control medium [DMEM, supplemented with 2% (v/v) above described LSM. Finally, microglia found at the lower site of the fetal bovine serum, 1% (v/v) glutamine, 0.1 mg/mL streptomycin filter were counted by scorers blinded to experimental conditions. and 100 U/mL penicillin]. One day prior to all experiments, astro- glial and microglial primary cell cultures, containing 1 3 105 cells/ Calcium Imaging 3 6 21 mL for Western Blot and 1 10 cells/mL for RT-PCR, were Measurements of [Ca ]i in single cells were carried out using the transferred onto poly-L-lysine coated 24 or 6-well culture dishes, fluorescent indicator fura-2 in combination with a monochromator- respectively. based imaging system (T.I.L.L. Photonics, Grafelfing, Germany). For Primary cultures of hippocampal neurons were prepared experiments, cells were seeded on uncoated or poly-L-lysine coated according to Brewer et al. (1993). Briefly, hippocampi of P0 Wistar glass coverslips in 12-well or 24-well plates. Cells were loaded with rats were incubated in Neurobasal Medium (Gibco) containing 2 5 mM fura-2-AM (Invitrogen, Eugene) supplemented with 0.01% mg/mL BSA (Sigma-Aldrich) and 1 mg/mL papain (Sigma-Aldrich) (v/v) Pluronic F127 for 30 min (hippocampal neurons) or 60 min for 20 min at 37C. The neurons were then isolated by tissue dis- (astrocytes, microglia) at 22C in a standard bath solution contain- sociation using pasteur pipettes, centrifuged for 10 min at 45 g and ing 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2,10 plated onto poly-L-lysine coated coverslips. Neurons were main- mM glucose, and 10 mM HEPES adjusted to pH 7.4 with NaOH. 21 tained in Neurobasal medium supplemented with B-27 (Gibco), For measurements of [Ca ]i, cells were continuously perfused with GlutaMAX (Gibco) and penicillin/streptomycin at 37Cina standard bath solution at a rate of 5 mL/min. All test substances humidified atmosphere with 5% (v/v) CO2 for 2 weeks. were provided by bath application. In detail, neurons and glial cells were stimulated with 1 mM LPI, control stimulation was executed Semiquantitative Real-Time PCR with 100 mM ATP for glia cells and with 50 mM KCl for neurons. Total RNA was extracted from OHSC or primary cell cultures using Cells were excited at 340 and 380 nm and emitted fluorescence Trizol reagent (Invitrogen) according to the manufacturer’s instruc- from single cells was acquired at intervals of 2 s. The fluorescence 21 tions. Finally, total RNA was washed with 75% (v/v) ethanol and ratio F340/F380 represents [Ca ]i.

1824 Volume 61, No. 11 Kallendrusch et al.: Microglia-Dependent GPR55-Driven Neuroprotection Western Blot the NMDA treated group, containing 136.47 6 15.82 PI posi-

Primary microglia (100,000 cells) were plated into poly-L-lysine tive neuronal nuclei and 27.25 6 1.83 IB4 positive microglia in coated 24-well-plates (Greiner). Subsequently, serum free culture the DG GCL. Nonlesioned control OHSC (CTL) showed a media was supplemented with 1 mM LPI (Sigma-Aldrich) and cells good neuronal preservation with almost no PI positive neuronal harvested 2.5 min, 5 min, 10 min, 15 min, 2 h, and 6 h after LPI nuclei (CTL, 1.2% of NMDA, n 5 24 slices, Fig. 1A,B) and treatment. Cells were collected, stored in lysis buffer containing 80 IB4 positive microglia (CTL, 12.6% of NMDA, n 5 19 slices, mM Tris, 70 mM SDS, 0.3 M saccharose (Sigma-Aldrich), 3 mM Fig. 1A,C). As compared with CTL, 1 mM LPI did not lead to sodiumvanadate (Sigma-Aldrich), 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluo- any significant alterations within the number of PI positive neu- ride (PMSF, Sigma-Aldrich) at pH 7.4 and protein extracts were m 5 obtained by sonication (3 times 3 s). After denaturation (10 min at ronal nuclei (1 M LPI, 2.1% of NMDA, n 20 slices, 70C) in lysis buffer, cell debris was removed by centrifugation for 10 P > 0.05 vs. CTL, Fig. 1A,B) and IB4 positive microglia (1 mM min at 3000g and 4C and protein concentration was determined by LPI, 5.2% of NMDA, n 5 15 slices, P > 0.05 vs. CTL, Fig. BCA test (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). After 12.5% (w/ 1A,C). Application of 1 mM LPI to NMDA-lesioned OHSC v) sodium dodecylsulfate–polyacrylamide gel electrophoresis using 10 led to both a significant reduction of PI positive neuronal nuclei mg protein, electrotransfer onto Protran nitrocellulose membranes was (NMDA alone, 136.47 6 15.82, set as 100%, n 5 20 slices; performed (Whatman, Dassel, Germany). Membranes were blocked NMDA 1 1 mM LPI, 76.29 6 7.17, 55.9% of NMDA alone, with 10% (v/v) Roti-block solution for 1 h (Carl Roth, Germany, n 5 23 slices, P < 0.001 vs. NMDA, Fig. 1B) and a reduction Karlsruhe) in Tris buffered saline containing 0.1% (v/v) Tween-20 of IB4 positive microglia as compared with NMDA-lesioned (TBST, Sigma-Aldrich) and incubated over-night with the primary OHSC (NMDA alone, 27.25 6 1.83, set as 100%, n 5 15 sli- antibodies diluted in 10% (v/v) Roti block (Roth, Karlsruhe, Ger- ces, NMDA11 mM LPI, 17.03 6 5.06, 62.5% of NMDA many) in TBST: anti-rabbit P-p38 MAPK (1:2000, cat.-No 4511, alone, n 5 13 slices, P < 0.01 vs. NMDA, Fig. 1C). Cell signaling, Danvers, MA), anti-rabbit p38 MAPK (1:2000,cat.- m No 8690S, Cell signaling), anti-rabbit P-p44/42 MAPK (1:2000, Application of 1 nM-10 M LPI to NMDA-lesioned cat.-No 4370P, Cell signaling) and anti-rabbit p44/42 MAPK OHSC led to a reduction of PI positive neuronal nuclei (1:2000,cat.-No 4695S, Cell signaling). The next day, membranes (NMDA11 nM LPI, 45.2%, n 5 21 slices; NMDA110 nM were washed 3 times with TBST for 10 min and incubated with the LPI, 31.5%, n 5 10 slices; NMDA10.1 mM LPI, 45.8%, secondary horse radish peroxidase-conjugated antibody (anti-rabbit n 5 15 slices; NMDA110 mM LPI, 56.6%, n 5 14 slices, IgG, 1:20000; cat.-No PI 1000, Vector laboratories, Burlingame, CA) P < 0.001 vs. NMDA, respectively) whereas 0.1 nM LPI for 1 h. Membranes were washed (3 times for 10 min) and exposed to showed no effect on NMDA-lesioned OHSC as compared enhanced chemiluminescence (ECL detection system, Serva, Heidel- with OHSC treated with NMDA alone (NMDA10.1 nM berg, Germany). Immunoreactive signals were visualized with MF- LPI, 106.2%, n 5 10 slices, P > 0.05 vs. NMDA, Supp. Info. ChemiBIS 1.6 (Chemiluminescens detection system, Biostep, Jahns- Fig. 1A). NMDA-lesioned OHSC treated with 0.1–10 mM dorf, Germany). Semiquantification of the immunoreactive bands was LPI showed reduced numbers in IB positive microglia as performed with ImageJ software (version 1.43, imagej.nih.gov/ij/ 4 compared with NMDA-lesioned OHSC (NMDA10.1 mM download/). The obtained area under the curve (AUC) of the proteins 5 1 m was normalized to the respective AUC of the total protein. LPI, 62.8%, n 9 slices; NMDA 10 M LPI, 60.4%, n 5 8 slices, P < 0.01 vs. NMDA, respectively) whereas 0.1– 10 nM LPI showed no effects (NMDA10.1 nM LPI, 94.5%, Statistical Analysis n 5 12 slices; NMDA11 nM LPI, 83.2%, n 5 10 slices; All data is expressed as the mean 6 SEM and was analyzed by Graph 1 5 > Pad Prism 5.0 program (GraphPad Software, San Diego, CA). Signifi- NMDA 10 nM LPI, 89.4%, n 11 slices, P 0.05 vs. cance was taken at P < 0.05. The means between two samples were NMDA, respectively, Supp. Info. Fig. 1B). analyzed by student t-test. The one-way ANOVA test was used to According to literature on LPI (Anavi-Goffer et al., determine significant effects on the number of PI positive neuronal 2012; Oka et al., 2007; Rojo et al., 2012), most studies nuclei and IB4 positive microglia, followed by the Dunnett test for showed significant effects when LPI was used in a concentra- multiple comparisons. The threshold cycle (Ct) values were set within tion range between 0.1 and 10 mM. For comparable results, the exponential phase of the PCR. After normalization to GAPDH, we focused on 1 mM LPI for subsequent experiments as it DCt values were used to calculate the relative expression levels. Gene reflected the most commonly used concentration so far. regulation was statistically evaluated by subjecting the DDCt values derived from each preparation samples to a one-way ANOVA. LPI-Mediated Neuroprotection and Reduction of Microglia Was Reversed by Transfection of OHSC Results with Gpr55 siRNA LPI protected DG granule cells and reduced microglia cell num- All experimental groups in each individual experiment ber after excitotoxic lesion in OHSC. In each individual experi- (n 5 10) were normalized against the nontransfected, NMDA- ment (n 5 5), all experimental groups were normalized against lesioned group. To confirm successful transfection of OHSC

November 2013 1825 with Gpr55 siRNA, the amount of Gpr55 transcript was eval- detectable (24 h: 19.5% remaining, n 5 3 slices, P < 0.01 vs. uated by use of semiquantitative real time-PCR. Twenty-four CTL, Supp. Info. Fig. 2) as compared with Gpr55 2siRNA hour after transfection of nonlesioned OHSC with Gpr55 transfected OHSC (set as 100%). The Gpr55 transcript 1siRNA a significant decrease of the Gpr55 transcript was remained significantly down regulated 96 h after transfection of nonlesioned OHSC with 1siRNA (96 h: 34.5%, n 5 3sli- ces, P < 0.05 vs. CTL, Supp. Info. Fig. 2). Transfection of OHSC with Gpr55 2siRNA or Gpr55 1siRNA reduced the numbers of PI positive neuronal nuclei when compared with nontransfected, NMDA-lesioned OHSC (nontransfected: NMDA, 100%, n 5 26 slices; 2siRNA: NMDA, 73.0%, n 5 30 slices; 1siRNA: NMDA, 81.2%, n 5 32 slices, P < 0.05 vs. nontransfected, NMDA, respec- tively, Fig. 2A). Application of 1 mM LPI reduced the number of PI positive neuronal nuclei in nontransfected and in Gpr55 2siRNA transfected, NMDA-lesioned OHSC (nontransfected: NMDA1LPI, 43.1%, n 5 32 slices, P < 0.01 vs. nontrans- fected, NMDA; 2siRNA: NMDA1LPI, 39.5%, n 5 34 sli- ces, P < 0.01 vs. 2siRNA, NMDA, Fig. 2A) but did not affect the number of PI positive neuronal nuclei in Gpr55 1siRNA transfected, NMDA-lesioned OHSC (1siRNA: NMDA1LPI, 69.4%, n 5 31 slices, P > 0.05 vs. 1siRNA, NMDA Fig. 2A). Transfection of OHSC with Gpr55 2siRNA or Gpr55

1siRNA did not change the numbers of IB4 positive microglia when compared with nontransfected, NMDA-lesioned OHSC (nontransfected: NMDA, 100%, n 5 23; 2siRNA: NMDA, 83.1%, n 5 25 slices; 1siRNA: NMDA, 99.2%, n 5 28 slices, P > 0.05 vs. nontransfected, NMDA, respectively, Fig. 2B).

Application of 1 mM LPI reduced the number of IB4 positive microglia in nontransfected and in Gpr55 2siRNA transfected, NMDA-lesioned OHSC (nontransfected: NMDA1LPI, 58.0%, n 5 21 slices, P < 0.01 vs. nontransfected, NMDA; 2siRNA: NMDA1LPI, 48.2%, n 5 24 slices, P < 0.01 vs. 2siRNA, NMDA, Fig. 2A) but had no effect on the number

FIGURE 1: Effects of LPI on excitotoxically lesioned OHSC. A:

Representative OHSC double labeled with IB4 (microglia, green) and PI (degenerating neurons, red). Bars 5 50 mm. (CTL) Control OHSC showed a good neuronal preservation with almost no PI

positive neuronal nuclei and very few IB4 positive microglia. (LPI) OHSC incubated with 1 mM LPI reflected control OHSC. (NMDA) A dramatic increase in PI positive neuronal nuclei and a massive

accumulation of IB4 positive microglia in the GCL of the DG was observed in NMDA-lesioned OHSC. (NMDA 1 LPI) Application of LPI to NMDA-lesioned OHSC reduced PI positive neuronal nuclei and IB4 positive microglia. B, C: Statistical analysis (one-way ANOVA test followed by Dunnett test for multiple comparisons)

of the relative numbers of PI positive neuronal nuclei (B) and IB4 positive microglia (C). Error bars 5 SEM. OHSC treated with LPI closely resembled control OHSC (B and C). As compared with OHSC treated with NMDA only, application of 1 mM LPI to NMDA-lesioned OHSC led to a significant reduction of PI posi-

tive neuronal nuclei (***P £ 0.001 vs. NMDA; B) and IB4 positive microglia (**P £ 0.01 vs. NMDA; C).

1826 Volume 61, No. 11 Kallendrusch et al.: Microglia-Dependent GPR55-Driven Neuroprotection

FIGURE 2: LPI-mediated neuroprotection and reduction of microglia is driven by GPR55. A: Compared with nontransfected NMDA- lesioned OHSC, transfection of OHSC with Gpr55 2siRNA or Gpr55 1siRNA before NMDA lesion slightly reduced the relative number of PI positive neuronal nuclei (a P < 0.05 vs. nontransfected, NMDA, respectively). LPI reduced PI positive neuronal nuclei in nontrans- fected and Gpr55 2siRNA transfected OHSC after NMDA-lesion (**P < 0.01 vs. NMDA, respectively). In contrast, LPI did not significantly reduce PI positive neuronal nuclei in Gpr55 1siRNA transfected OHSC after NMDA lesion (n.s. P > 0.05 vs. NMDA). B: After LPI treat- ment, IB4 positive microglia were significantly decreased in NMDA-lesioned nontransfected OHSC and in NMDA-lesioned Gpr55 2siRNA transfected OHSC, respectively (**P < 0.01 vs. NMDA). In contrast, LPI did not reduce IB4 positive microglia in NMDA-lesioned OHSC transfected with Gpr55 1siRNA (n.s. P > 0.05 vs. nontransfected, NMDA). of IB4 positive microglia in Gpr55 1siRNA transfected, NMDA-lesioned OHSC (1siRNA: NMDA1LPI, 84.2%, n 5 27 slices; P > 0.05 vs. 1siRNA, NMDA, Fig. 2A).

LPI-Mediated Neuroprotection Depended on Microglia All experimental groups in each individual experiment (n 5 3) were normalized against the respective NMDA-lesioned group. In the presence of microglia (2clodronate: NMDA 5 100%, n 5 16 slices), LPI reduced the number of PI positive neuronal nuclei in NMDA-lesioned OHSC (2clodronate: NMDA1LPI, 67.36%, n 5 19 slices, P < 0.05 vs. NMDA). In the absence of microglia (1clodronate: NMDA 5 100%, n 5 16 slices), LPI did not reduce the number of PI positive FIGURE 3: LPI lost its neuroprotective effects in OHSC after neuronal nuclei (1Clodronat: NMDA1LPI, 112.8%, n 5 15 clodronate induced microglia depletion. Without clodronate pre- treatment (presence of microglia), LPI reduced PI positive neuro- slices, P > 0.05 vs. NMDA, Fig. 3). As previously shown nal nuclei (*P < 0.05 vs. NMDA). In clodronate pretreated OHSC (Kreutz et al., 2009), the number of PI positive neuronal (absence of microglia), LPI did not reduce PI positive neuronal nuclei was higher after NMDA lesion in clodronate pretreated nuclei after NMDA lesion (n.s. P > 0.05 vs. NMDA). OHSC when compared with NMDA-lesioned OHSC that were not pretreated with clodronate (data not shown). Pre- 55,212-2 (WIN, 10 nM) significantly reduced the number treatment of OHSC with clodronate depleted microglia in all of PI positive neuronal nuclei as compared with NMDA- experimental groups (n 5 3 individual experiments; CTL, 0.9 lesioned OHSC (n 5 3 individual experiments; NMDA1 cells/GCL, n 5 10 slices; LPI, 0.7 cells/GCL, n 5 10 slices; WIN, 70.7% of NMDA, n 5 17 slices, P < 0.001 vs. NMDA, NMDA, 1.0 cells/GCL, n 5 9 slices; NMDA1 1 mM LPI, 1.1 n 5 14 slices, Fig. 4A). WIN-mediated neuroprotection was cells/GCL, n 5 10 slices, Supp. Info. Fig. 3A). enhanced after concomitant application of LPI (NMDA1 10 nM WIN1 1 mM LPI, 51.5% of NMDA, n 5 11 sli- LPI Enhanced the Neuroprotective Effects of the ces, P < 0.05 vs. NMDA1 10 nM WIN, Fig. 4A). CB1 Agonist WIN 55,212-2 In NMDA-lesioned OHSC, the application of 10 nM As previously shown (Koch et al., 2011b), treatment of WIN did not reduce the number of IB4 positive microglia NMDA-lesioned OHSC with the CB1 receptor agonist WIN (NMDA1WIN, 92.6% of NMDA, n 5 12 slices, P > 0.05

November 2013 1827 FIGURE 4: LPI enhanced WIN mediated neuroprotection. A: WIN significantly reduced PI positive neuronal nuclei in NMDA-lesioned OHSC (***P < 0.001 vs. NMDA). Dual application of WIN and LPI led to a significant stronger reduction of PI positive neuronal nuclei after NMDA-lesion when compared with lesioned OHSC treated with WIN only (#P < 0.05 vs. NMDA1 WIN). B: WIN did not reduce IB4 positive microglia in NMDA-lesioned OHSC (n.s. P > 0.05 vs. NMDA), whereas LPI significantly reduced IB4 positive microglia (*P < 0.05 vs. NMDA). The combined treatment of lesioned OHSC with WIN and LPI decreased IB4 positive microglia to a comparable amount as observed after single LPI application (*P < 0.05 vs. NMDA).

vs. NMDA, Fig. 4B), whereas the combined application of 10 nM WIN and 1 mM LPI led to a significant decrease (NMDA1 10 nM WIN1 1 mM LPI, 81.7% of NMDA, n 5 6 slices, P < 0.05 vs. NMDA, Fig. 4B).

LPI Selectively Down-Regulated Gpr55 Transcript in Primary Microglia Gpr55 mRNA was down regulated in primary microglia after 6 h treatment with 1 mM LPI as compared with nontreated control cultures (n 5 8 individual experiments; LPI, 63.6%, P < 0.001 vs. CTL, Fig. 5A). In contrast, LPI did not signifi- cantly affect the amount of Gpr55 mRNA in primary astro- cytes (LPI, 127.9% P > 0.05 vs. CTL, Fig. 5B). In primary microglia, LPI did not affect the expression of Cb1 mRNA (n 5 8; LPI, 117.0%, P > 0.05 vs. CTL, Fig. 5C) but tended to increase Cb2 mRNA expression (n 5 7; 188.2%, P > 0.05 vs. CTL, Fig. 5D).

LPI Attenuated ATP-Induced Microglia Migration Chemotaxis of primary microglia was significantly induced after application of 1 mM LPI or 100 mM ATP when com- pared with nontreated controls (n 5 3 individual experiments; CTL, 10.48, n 5 25; LPI, 21.23, n 5 22; ATP, 24.22, n 5 27, FIGURE 5: LPI selectively down-regulated Gpr55 mRNA in pri- m P < 0.01 vs. CTL, Fig. 6). ATP induced chemotaxis was sig- mary microglia. A: After 6 h treatment with 1 M LPI, Gpr55 mRNA was reduced in primary microglia as compared with non- nificantly reduced when ATP and LPI were concomitantly treated control cultures (*P < 0.05 vs. CTL). B: In contrast, 1 mM administered (LPI1ATP, 19.41, n 5 27, P < 0.05 vs. ATP). LPI did not affect Gpr55 mRNA levels in primary astrocytes after In control experiments, in which the substances were applied 6 h stimulation (n.s. P > 0.05 vs. CTL). C, D: LPI did not signifi- cantly alter Cb1 and Cb2 mRNA in primary microglia (n.s. to the lower as well as to the upper compartment none of the P > 0.05 vs. CTL). Note that Cb2 mRNA tended to be elevated used substances affected migration of microglia (CTL, 7.50, after LPI treatment.

1828 Volume 61, No. 11 Kallendrusch et al.: Microglia-Dependent GPR55-Driven Neuroprotection n 5 6; LPI, 7.33, n 5 6; ATP, 6.60, n 5 6; LPI1ATP, 6.33/, the lysophospholipid LPI reflects an endogenous agonist at n 5 6, P > 0.05 vs. CTL, data not shown). GPR55 (Oka et al., 2007). Considerable levels of LPI were detected in the brain (37.5 nmol/g tissue) and GPR55 as its 21 LPI Did Not Affect [Ca ]i in Primary Neuronal, putative receptor was shown to be abundantly expressed in Astrocytic, and Microglial Cultures the central nervous system (Oka et al., 2009). However, the LPI did not evoke significant Ca21 responses in either cell physiological and/or pathological functions of LPI on GPR55 type. However, depolarization of neurons (n 5 29 cells; from in the brain are still poorly understood. four independent experiments, Supp. Info. Fig. 4A) by 50 mM With regard to brain pathologies, it was observed that KCl or application of extracellular ATP (100 mM) to astrocytes LPI protected hippocampal pyramidal CA1 and CA3 neurons and microglia (astrocytes, n 5 74 cells; microglia, n 5 54 cells; after cerebral ischemia in rats (Blondeau et al., 2002). How- three independent experiments, Supp. Info. Fig. 4B) produced ever in this study, LPI was administered at different times robust [Ca21] increases in all respective cell types. i before the occlusion of carotid arteries or even 30 min after LPI Did Not Impact Phoshorylation of p38 and the onset of ischemia indicating that pretreatment with LPI p44/p42 MAPK in Primary Microglia Cultures might be a useful prospective therapeutic in patients with pre- As compared with nontreated controls (CTL), treatment of disposition and high risks for future ischemic insults. Here we primary microglia with 1 mM LPI between 2.5 min and 6 h found that LPI was neuroprotective when applied 4 h after did not affect phosphorylation of p38 MAPK (2.5 min, excitotoxic lesion thus confirming and extending the findings 124.9% of CTL, n 5 4; 5 min, 84.6%, n 5 4; 10 min, of Blondeau and colleagues. However, whether acute or 98.3%, n 5 4; 15 min, 101%, n 5 5; 2 h, 111%, n 5 6; 6 h, chronic neurodegeneration may cause intrinsic up-regulation 110.1%, n 5 3, P > 0.05 vs. CTL, respectively; Supp. Info. of LPI and whether LPI act as an endogenous neuroprotective Fig. 5A) or p44/p42 MAPK (2.5 min, 106.6% of CTL, lipid messenger in vivo remains unknown. So far, it was only n 5 4; 5 min, 106.4%, n 5 4; 10 min, 82.9%, n 5 4; 15 shown that LPI plasma levels were increased in patients with min, 104.7%, n 5 7; 2 h, 92.2%, n 5 6; 6 h, 118.9%, n 5 5, ovarian cancer and obese patients (Moreno-Navarrete et al., P > 0.05 vs. CTL, respectively; Supp. Info. Fig. 5B). 2012; Xiao et al., 2000). Taken together, all these findings indicate a general importance of LPI not only in neuropatho- Discussion logical animal models but also in severe human diseases. The current results show that GPR55 is involved in LPI- Moreover, the beneficial effect of LPI was observed in mediated neuroprotection as analyzed by excitotoxically primary neuronal cultures that were excitotoxically lesioned lesioned OHSC. Furthermore, these data suggest that micro- with glutamate, suggesting a direct neuronal effect of LPI glia mediate the beneficial effect of LPI and that GPR55 acti- onto neurons (Blondeau et al., 2002). In this study, we dem- vation alters microglial behavior in the process of secondary onstrated that LPI, when applied in the micromolar range neuronal damage. protected neurons and in parallel reduced the number of acti- Although the overall pharmacology of GPR55 remains vated microglia at sites of neuronal injury. Since GPR55 was controversial (Zhao and Abood, 2012) it is well accepted that shown to be present in primary microglia (Pietr et al., 2009), we asked whether the neuroprotective effects of LPI are indeed mediated by GPR55 and whether LPI acts directly upon neu- rons and/or indirectly via microglia. To test these hypotheses, GPR55 was down regulated in OSHC using specific Gpr55 siRNA. Based on the fact that LPI lost its neuroprotective effects after treatment with Gpr55 siRNA, LPI-mediated neu- roprotection is most likely driven by GPR55. In a second approach, we observed that depletion of microglia led to an increase in the number of degenerating neurons after excito- toxic lesion, indicating the important role of microglia in the process of secondary neuronal damage (Kreutz et al., 2009). More strikingly, LPI lost its neuroprotective effects in the absence of microglia in OHSC. Nevertheless, it still remains FIGURE 6: LPI modified chemotaxis of primary microglia. Appli- debatable whether the here shown beneficial effects of LPI on cation of LPI or ATP alone induced migration of microglia, neuronal survival is solely the result of LPI induced reduction respectively (**P < 0.01 vs. CTL). ATP induced chemotaxis was significantly reduced when ATP and LPI were concomitantly of microglial cell numbers. One finding that might underline applied (*P < 0.05 vs. ATP). the existence of additional protective mechanisms behind

November 2013 1829 GPR55 activation within the process of secondary neuronal state of microglia activation. We observed a tendency of damage is the observation that LPI, in the micromolar range, increased Cb2 but not Cb1 expression in primary microglia reduced microglia and exerted neuroprotection whereas LPI, after LPI treatment. LPI and cannabinoid mediated effects when applied in the nanomolar range, protected neurons under pathological conditions might be orchestrated by without affecting the number of microglia. GPR55 and CB2 in microglia and by interaction between It is well known that GPR55 is not only activated by LPI GPR55/CB2 on microglia and CB1 on neurons, as shown here but also does recognize certain CB1 and CB2 receptor ligands, for the enhanced neuroprotective effects of WIN after concom- leading some authors to suggest GPR55 as the third cannabi- itant LPI application. noid (CB3) receptor (Sharir and Abood, 2010). However, As observed for neutrophils (Balenga et al., 2011), we most of these pharmacological analyses are showing effects of also found LPI per se as a chemoattractive molecule for micro- cannabinoids on GPR55 in cell culture systems mostly with glia. ATP accumulates in the extracellular space during neuro- cell lines over-expressing the Gpr55 gene (Ross, 2009). degeneration and triggers the migration of microglia. However, Whether GPR55 naturally responds to endocannabinoids such concomitant application of LPI and ATP here reduced the as AEA or 2-AG under physiological concentrations in vivo migration of microglia compared with ATP alone. This obser- remains open. Since endocannabinoids by acting on CB1 and vation might explain the LPI-induced reduction of microglia CB2 were clearly shown to modulate the signaling machinery numbers at sites of neuronal damage that occurred in parallel of excitotoxicity in vivo and in vitro and since we established a to LPI-mediated neuroprotection. Within the brain, microglia differential neuroprotective paradigm for certain endocannabi- is defined as an indispensible player in both beneficial and det- noids in OHSC (Koch et al., 2011a; Kreutz et al., 2007), we rimental inflammatory cascades that determine the final out- asked whether the protective effect of LPI interacts with CB1 come in the context of brain diseases (Hanisch and receptor mediated neuroprotection. By using the CB1 receptor Kettenmann, 2007). Thus, the here observed down-regulation agonist WIN 55.212-2 (WIN) in OHSC, we found that WIN of ATP-triggered microglia migration by LPI might switch was neuroprotective but did not affect the number of micro- microglia to a more beneficial phenotype within the process of glia. These findings suggest that WIN might protect neurons secondary neuronal damage. by directly acting upon neuronal CB1 (Koch et al., 2011b). Finally, we sought to determine the respective intracellu- Interestingly, the application of LPI enhanced the neuroprotec- lar events behind LPI-mediated activation of GPR55 in tive effects of WIN assuming that dual activation of CB1 and microglia. We first followed the idea that LPI might affect 21 GPR55 may lead to enhanced beneficial effects of cannabi- the release of intracellular calcium ([Ca ]i), a well known noids in processes of neurodegeneration. Moreover, these second messenger. LPI-mediated influx of Ca21 was described results again point toward a mechanism by which LPI- in endothelial cells and was found to accompany the migra- mediated neuroprotection depends on the presence of func- tion of human prostate cancer cells [PC 3 cells; (Monet et al., tional GPR55 on microglia. 2009; Waldeck-Weiermair et al., 2008)]. However, we did 21 Thus, we studied Gpr55 mRNA expression in primary not observe an effect of LPI on [Ca ]i in brain derived cell microglia and observed that prolonged LPI treatment selec- types, namely in primary cultures of neurons, astrocytes and tively down-regulated Gpr55 in microglia but not in astrocytes, microglia indicating that neither of these cell types might 21 supporting the idea that microglia is a selective target for LPI. respond to LPI stimulation with increase in [Ca ]i. Interestingly, it was previously shown that Gpr55 expression LPI-mediated activation of GPR55 was linked to phos- was selectively altered in microglia by application of inflamma- phorylation of p38 and p44/42 MAPK in numerous cell tory stimuli such as lipopolysaccharide (LPS) or interferon- types [PC3 and DU145 prostate cancer cells, OVCAR3 ovar- gamma (IFN-gamma; Pietr et al., 2009). In that study, Pietr ian cancer cells (Pineiro et al., 2011); osteoclasts (Whyte and colleagues additionally showed a similar Gpr55 expression et al., 2009); EVSA-T breast cancer cells and T98G glyoma in microglia to that of the Cb2 receptor before and after treat- cells (Andradas et al., 2011)]. Here, we investigated the short ment with LPS and IFN-gamma. Indeed, a functional crosstalk and long term effects of LPI on p38 and p44/p42 MAPK between GPR55 and CB2 receptors in immunocompetent cells phosphorylation and observed no alterations in p38 or p44/ was reported in a study on regulation of neutrophil migration 42 MAPK phosphorylation in microglia after LPI treatment. (Balenga et al., 2011). More precisely, GPR55 activation aug- In summary, our results show that GPR55 on microglia mented CB2 receptor dependent migratory responses towards is driving the neuroprotective effects of LPI in secondary neu- 2-AG, while GPR55 activation further inhibited neutrophil ronal damage. Although this study points to GPR55 as a degranulation and production of reactive oxygen species. These promising future therapeutic target to reduce neurodegenera- findings suggest that the expression of Gpr55 and Cb2 in tion, the exact mechanisms behind GPR55 activation in microglia is controlled in a similar pattern depending on the microglia have yet to be unraveled in more detail.

1830 Volume 61, No. 11 Kallendrusch et al.: Microglia-Dependent GPR55-Driven Neuroprotection

Marsicano G, Goodenough S, Monory K, Hermann H, Eder M, Cannich A, Acknowledgment Azad SC, Cascio MG, Gutierrez SO, van der Stelt M, Lopez-Rodriguez ML, Casanova E, Schutz G, Zieglgansberger W, Di Marzo V, Behl C, Lutz B. 2003. The authors would like to thank Claudia Merkwitz, Con- CB1 cannabinoid receptors and on-demand defense against excitotoxicity. stanze Hobusch, Dana Tschirske, and Chalid Ghadban for Science 302:84–88. excellent technical assistance. Moreno-Navarrete JM, Catalan V, Whyte L, Dıaz-Arteaga A, Vazquez- MartInez R, Rotellar F, Guzman R, Gomez-Ambrosi J, Pulido MR, Russell WR, Imbernon M, Ross RA, Malagon MM, Dieguez C, Fernandez-Real JM, Fruhbeck€ G, Nogueiras R. 2012. The L-a-lysophosphatidylinositol/GPR55 sys- Author contribution tem and its potential role in human obesity. Diabetes 61:281–291. Conceived and designed the experiments: SOKA, STKR, MN, Oka S, Nakajima K, Yamashita A, Kishimoto S, Sugiura T. 2007. Identification of GPR55 as a lysophosphatidylinositol receptor. Biochem Biophys Res Com- MK, and FD. Performed the experiments: SOKA, STKR, RW, mun 362:928–934. and RK. Analyzed the data: SOKA, STKR, AB, RK, MK, and Oka S, Toshida T, Maruyama K, Nakajima K, Yamashita A, Sugiura T. 2009. FD. Contributed reagents/materials/analysis tools: MN, RW, AB, 2-Arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol: A possible natural ligand for GPR55. J Biochem 145:13–20. UG, RK, and IB. Wrote the article: SOKA, STKR, MK, and FD. Panikashvili D, Simeonidou C, Ben-Shabat S, Hanus L, Breuer A, Mechoulam R, Shohami E. 2001. An endogenous cannabinoid (2-AG) is neuroprotective References after brain injury. Nature 413:527–531. Anavi-Goffer S, Baillie G, Irving AJ, Gertsch J, Greig IR, Pertwee RG, Ross RA. Pietr M, Kozela E, Levy R, Rimmerman N, Lin YH, Stella N, Vogel Z, Juknat A. 2012. Modulation of L-alpha-lysophosphatidylinositol/GPR55 mitogen-activated 2009. Differential changes in GPR55 during microglial cell activation. FEBS protein kinase (MAPK) signaling by cannabinoids. J Biol Chem 287:91–104. Lett 583:2071–2076. Andradas C, Caffarel MM, Perez-Gomez E, Salazar M, Lorente M, Velasco G, Pineiro R, Maffucci T, Falasca M. 2011. The putative cannabinoid receptor Guzman M, Sanchez C. 2011. The orphan G protein-coupled receptor GPR55 GPR55 defines a novel autocrine loop in cancer cell proliferation. Oncogene promotes cancer cell proliferation via ERK. Oncogene 30:245–252. 30:142–152. Baker D, Pryce G, Davies WL, Hiley CR. 2006. In silico patent searching Ramirez BG, Blazquez C, Gomez del Pulgar T, Guzman M, de Ceballos ML. 2005. reveals a new cannabinoid receptor. Trends Pharmacol Sci 27:1–4. Prevention of Alzheimer’s disease pathology by cannabinoids: Neuroprotection Baker D, Pryce G, Giovannoni G, Thompson AJ. 2003. The therapeutic mediated by blockade of microglial activation. J Neurosci 25:1904–1913. potential of cannabis. 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Palmitoylethanolamide protects dentate gyrus granule cells Molinari M, Maccarrone M. 2009. Selective CB2 receptor agonism protects via peroxisome proliferator-activated receptor-alpha. Neurotox Res 19:330–340. central neurons from remote axotomy-induced apoptosis through the PI3K/ Koch M, Kreutz S, Bottger C, Grabiec U, Ghadban C, Korf HW, Dehghani F. Akt pathway. J Neurosci 29:4564–4570. 2011b. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus Whyte LS, Ryberg E, Sims NA, Ridge SA, Mackie K, Greasley PJ, Ross RA, Rogers granule cells is driven by CB1 receptors and modulated by TRPA1 and Cav MJ. 2009. The putative cannabinoid receptor GPR55 affects osteoclast function in 2.2 channels. Hippocampus 21:554–564. vitro and bone mass in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 106:16511–16516. Kreutz S, Koch M, Bottger C, Ghadban C, Korf HW, Dehghani F. 2009. 2-Arach- Xiao Y, Chen Y, Kennedy AW, Belinson J, Xu Y. 2000. Evaluation of plasma idonoylglycerol elicits neuroprotective effects on excitotoxically lesioned den- lysophospholipids for diagnostic significance using electrospray ionization tate gyrus granule cells via abnormal-cannabidiol-sensitive receptors on mass spectrometry (ESI-MS) analyses Ann N Y Acad Sci 905:242–259. microglial cells. Glia 57:286–294. Yenari M, Kitagawa K, Lyden P, Perez-Pinzon M. 2008. Metabolic downregu- Kreutz S, Koch M, Ghadban C, Korf HW, Dehghani F. 2007. Cannabinoids lation: A key to successful neuroprotection? Stroke 39:2910–2917. and neuronal damage: Differential effects of THC, AEA and 2-AG on acti- vated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned Zhao P, Abood ME. 2013. GPR55 and GPR35 and their relationship to canna- rat organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol 203:246–257. binoid and lysophospholipid receptors. Life Sci 92:453–457.

November 2013 1831 5. Zusammenfassung

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr.med.)

Titel: Einfluss von L-alpha-lysophosphatidylinositol (LPI) auf neuronale Schädigungsprozesse

Eingereicht von: Stine Kremzow

Angefertigt am: Institut für Anatomie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Betreuer: PD Dr. phil. nat. Marco Koch

Eingereicht im: Dezember 2014

Traumatische und vaskuläre Ereignisse führen innerhalb des Zentralnervensystems unmittelbar und unwiderruflich zum Absterben von Nervenzellen (Neuronen). Stunden bis Tage nach dieser primären Schädigung des Nervengewebes erfolgt am ursprünglichen Läsionsort ein weiterer Verlust von Neuronen. Dieser, als sekundäre neuronale Schädigung bezeichneter Vorgang, wird vorwiegend durch exzitotoxische und inflammatorische Prozesse ausgelöst. Da der Sekundärschaden wesentlich zum Gesamtschaden des Nervengewebes beiträgt, sollten therapeutische Ansätze das Ziel verfolgen, dass Neurone, die den ursprünglichen Schaden überlebt haben, vor einem sekundären Absterben bewahrt werden. Innerhalb dieser sekundären Schädigungsprozesse üben Mikroglia als die ortständigen Makrophagen des ZNS eine Schlüsselfunktion aus. Bisher konnte der Mikroglia dabei jedoch keine eindeutige Rolle zugeschrieben werden, da für diese sowohl neuroprotektive als auch neurotoxische Eigenschaften beschrieben wurden.

In den letzten 10 Jahren haben sich lipiderge Botenstoffe aus der Substanzgruppe der Endocannabinoide in primären neuronalen Zellkulturen und Mausmodellen für akute bzw. chronische Erkrankungen des ZNS als neuroprotektiv erwiesen. Dabei zeigte sich, dass Endocannabinoide ihre protektiven Eigenschaften auch in Abhängigkeit von Mikroglia

33 vermitteln können. Endocannabinoide werden nach Verletzungen im Nervengewebe hochreguliert und üben ihre Wirkungen über G-Protein-gekoppelte (GPR) Cannabinoidrezeptoren Typ 1 und 2 (CB1- und CB2 Rezeptor) aus. Das ubiquitäre Vorkommen dieser Rezeptoren gestaltet jedoch die Etablierung einer nebenwirkungsarmen Therapie als schwierig. Daher beschäftigt sich die aktuelle Forschung weiterhin mit der Suche und der Charakterisierung von zusätzlichen und möglicherweise spezifischeren Bindungsstellen für die neuroprotektiv wirkenden Endocannabinoide. Dabei wurde mit dem GPR55 ein weiterer Rezeptor für Endocannabinoide identifiziert, wodurch einmal mehr die enorme Komplexität des Endocannabinoidsysytems verdeutlicht werden kann. Im Gegensatz zu den Endocannabinoiden, welche CB1, CB2 und GPR55 aktivieren können, handelt es sich bei L-alpha-lysophosphatidylinositol (LPI) um einen spezifischen und ausschließlich an GPR55 bindenden lipidergen Botenstoff. Da über eine mögliche neuroprotektive Wirkung von LPI wenig bekannt war, wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe des in vitro Schädigungsmodells der organotypischen hippokampalen Schnittkultur (OHSC) das neuroprotektive Potential von LPI getestet. Nach exzitotoxischer Schädigung der Hirnschnitte mit N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) wurde ein Sekundärschaden in vitro nachgestellt. Mittels anschließender immunhistochemischer Färbung und Darstellung abgestorbener Neurone und aktivierter Mikroglia am konfokalen Laserscanning Mikroskop wurde das Ausmaß der Schädigung quantifiziert.

Die Behandlung NMDA-geschädigter Hirnschnitte mit LPI reduzierte die Anzahl toter Neurone und aktivierter Mikroglia. Dieser Effekt konnte GPR55 zugeordnet werden, da die neuroprotektive Wirkung von LPI in Hirnschnitten, in denen durch siRNA gegen Gpr55 der Rezeptor herunterreguliert wurde, aufgehoben war. Zudem führte die experimentelle Entfernung der Mikroglia aus den Hirnschnitten zum Verlust der LPI-induzierten Neuroprotektion. Ferner konnte eine Expression von Gpr55 in Astrozyten und Mikroglia nachgewiesen werden. LPI verstärkte des Weiteren die (bekannter Maßen) durch Cannabinoide induzierte und über den CB1 Rezeptor vermittelte Neuroprotektion.

Mikroglia überprüfen ihre unmittelbare Umgebung auf mögliche Schädigungen. Zudem können Mikroglia schnell und zielgerichtet zum Schädigungsort migrieren. In einer Boyden Kammer ist es möglich, Zelltypen aus einem Kompartiment durch eine Membran hindurch in ein anderes Kompartiment migrieren zu lassen. Dieses Zielkompartiment ist dabei mit einer chemoattraktiven Substanz versehen. Die Anzahl der Zellen kann dann in dem Zielkompartiment quantifiziert und somit die Wirkung der entsprechenden Substanz auf das 34

Migrationsverhalten bestimmter Zellen ermittelt werden. LPI alleine zeigte hierbei eine chemoattraktive Wirkung auf Mikroglia. Eine gemeinsame Gabe von LPI mit der besonders stark die Migration von Mikroglia fördernden Substanz ATP bewirkte jedoch, dass weniger Mikroglia zur Migration angeregt wurden.

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass LPI in NMDA geschädigten Hirnschnitten der Ratte neuroprotektive Eigenschaften besitzt. Dabei scheint LPI über GPR55 und in Abhängigkeit der Mikroglia zu wirken. Ferner beeinflusste LPI das Migrationsverhalten der Mikroglia und verstärkte die CB1 Rezeptor-vermittelte Neuroprotektion von Cannabinoiden. Anschließende Arbeiten müssen nun klären, ob LPI auch in Mausmodellen für akute und chronische Erkrankungen des ZNS protektive Eigenschaften ausüben kann.

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6. Summary

Secondary neuronal damage, as occurring in acute and chronic central nervous system (CNS) diseases, reflects the indirect result of an initial, primary insult, such as traumatic or ischemic brain injury. Hours and days after the initial insult, secondary neuronal damage is mainly induced by excitotoxic and inflammatory processes, which enlarge the primary loss of neurons. Therapeutic concepts for the treatment of secondary neuronal damage thus aim to protect neurons that survived the primary lesion.

Microglia, as the resident macrophages of the brain, play a key role within the process of secondary neuronal damage. However, it remains enigmatic whether microglia primarily protect or harm neurons since both, neuroprotective and neurotoxic properties of microglia have been described in the literature. Research within the last decade unraveled endocannabinoids as neuroprotective lipid messengers that can act upon microglia. Endocannabinoid levels increase after neuronal damage and activate G protein-coupled (GPR) cannabinoid receptors type 1 and 2 (CB1- and CB2 receptor). Both receptors are ubiquitously expressed in the CNS and in many peripheral tissues. For that reason, current research still focuses on identification and characterization of novel, and potentially more specific target sites of endocannabinoids. Based on this, GPR55 was identified as a novel receptor for endogenous and synthetic cannabinoids, underlying the complexity of the endocannabinoid system. In contrast to endocannabinoids, such as anandamide or 2-AG, which can act via CB1, CB2 and GPR55, the endogenous lipid messenger L-alpha-lysophosphatidylinositol (LPI) solely binds to and activates GPR55. Since LPI might reflect a useful tool for selective GPR55 activation, and due to the so far unknown role of GPR55 within excitotoxic and inflammatory processes, we here aimed to investigate the neuroprotective potential of GPR55 signaling by use of LPI.

Rat organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) were used as an in vitro model of secondary neuronal damage. Excitotixic neuronal lesion of the brain slices was induced by N- Methyl-D-Aspartat (NMDA) treatment. This was followed by application of LPI to test the neuroprotective potential. Immunhistochemical stainings and confocal laserscanning microscopy allowed the quantification of dead neurons and activated microglia in the dentate gyrus granule cell layer.

Treatment of NMDA-lesioned brain slices with LPI significantly reduced the number of degenerating neurons and activated microglia. This protective effect of LPI could be assigned 36 to GPR55 signaling, since down-regulation of GPR55 by transfection of brain slices with Gpr55 siRNA abolished the neuroprotective effects of LPI. Accordingly, experimental depletion of microglia from brain slices also abrogated LPI-mediated neuroprotection, assuming that LPI acts upon GPR55 on microglia to exert neuroprotective effects. Finally, LPI amplified the well-known CB1 receptor mediated neuroprotection of classical cannabinoids, indicating that GPR55- and CB1 signalling cascades obtain synergistically neuroprotective properties.

Microglia are able to explore their direct environment and screen for local pathogens. Moreover, microglia are cells that have a strong migratory capacity. Once recognized, microglia migrate to and phagocyte detrimental pathogens, such as debris of degenerating neurons. By use of the Boyden Chamber method, the chemo-attractive potential of LPI was analysed. Application of LPI alone led to induction of microglia migration. However, combined treatment of microglia with LPI and the well-known potent chemo-attractive ATP, strongly reduced migration of microglia when compared to that one observed after treatment with ATP alone. Finally, expression of Gpr55, as analysed by qPCR technique, was detected in astrocytes and microglia, and the treatment with LPI reduced Gpr55 expression specifically in microglia.

Taken together, we identified LPI as a neuroprotective agent in NMDA-lesioned brain slices. LPI-mediated neuroprotection was driven by GPR55 involving microglia. LPI modulated the migration of microglia and the expression of Gpr55 mRNA in microglia. Further studies now have to clarify whether LPI also exerts neuroprotective properties in mouse-models of acute and chronic CNS diseases.

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7. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

......

Datum Unterschrift

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8. Curriculum vitae

Name: Stine Kremzow

Anschrift: Lößniger Straße 47

04275 Leipzig

Geburtstag/Ort: 16.07.1990 in Erfurt

Familienstand: ledig

Schulbildung: 1996-2000 Grundschule, Erfurt

2000-2008 Gymnasium, Erfurt

2008 Abitur (Note: 1,3)

Studium: seit 2008 Studium der Humanmedizin, Universität Leipzig

Promotion: seit Oktober 2010

Thema: Einfluss von L-alpha-lysophosphatidylinositol (LPI) auf neuronale Schädigungsprozesse

Betreuer: PD Dr. phil. nat. Marco Koch

Publikation: The G protein-coupled receptor 55 (GPR55) ligand L-α- lysophosphatidylinositol (LPI) exerts microglia-dependent neuroprotection after excitotoxic lesion

Poster: The GPR55-ligand L-alpha-lysophosphatidylinositol (LPI) limits neuronal death after excitotoxic damage and initiates microglia migration in vitro 29. Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft in Würzburg (26.- 28.9.2012)

Role of GPR55 in excitotoxic neuronal damage 11. Research Festival der Medizinischen Fakultät, Universität Leipzig, in Leipzig (14.12.2012)

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9. Danksagung

Die vorliegende Promotionsarbeit entstand am Institut für Anatomie der Universität Leipzig. Ich möchte mich bei Herrn Prof. Ingo Bechmann, Herrn Prof. Faramarz Dehghani und Herrn PD Dr. phil. nat. Marco Koch für das Überlassen des Themas und die Ermöglichung dieser Arbeit bedanken. Herrn Prof. Dehghani und Herrn PD Dr. phil. nat. Marco Koch danke ich für die angenehme Betreuung. Sie führten mich geduldig in das wissenschaftliche Arbeiten ein, in perfekter Ergänzung zu meiner geplanten klinischen Tätigkeit. Insbesondere danke ich Frau Dr. Sonja Kallendrusch. Sie ist fähig junge Kollegen in die Arbeit einzuführen und sie früh zur Selbstständigkeit zu bringen. Für jegliche Fragen hatte sie ein offenes Ohr und konnte mit ihren Erfahrungen immer weiterhelfen. Wir hatten auch neben der Arbeit viel auszutauschen, was den Alltag immer wieder bereicherte. Danke an Constanze Hobusch, Chalid Ghadban, Angela Ehrlich und Claudia Merkwitz für die tolle Unterstützung im Labor. Mein Dank gilt auch allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Leipziger Instituts für Anatomie für die schöne Stimmung im Institut. Zuletzt möchte ich meiner Familie, meinen Freunden und insbesondere Sebastian Kirmse für die liebevolle Unterstützung und das Abfangen aller Höhen und Tiefen danken. Wir alle haben diesen Weg ermöglicht.

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10. Erklärung über die Vorbehaltlichkeit der Verfahrenseröffnung zur Verleihung des Titels Dr. med.

Der erfolgreiche Abschluss des letzten Staatsexamens oder die Approbation zum Arzt ist Voraussetzung für den Abschluss des Promotionsverfahrens und damit der Verleihung des akademischen Grades. Die Zulassung zum Promotionsverfahren ist insoweit nur vorläufig und steht unter der auflösenden Bedingung des Nichtbestehens des letzten Staatsexamens oder der Approbation zum Arzt. Dieser Abschluss ersetzt nach Regelung im § 12 der Promotionsordnung das Rigorosum. Das Rigorosum ist essentieller Bestandteil und notwendig zum erfolgreichen Abschluss des Promotionsverfahrens. Entsprechend den Reglungen in § 12 wird das eröffnete Promotionsverfahrens bei Nichtbeendigung des Studiums durch die Promotionskommission ohne Titelvergabe eingestellt. Hiermit erkläre ich, dass mir dieser Sachverhalt im Rahmen der Eröffnung meines Promotionsverfahrens bekannt ist und ich im Falle des Fehlens der Voraussetzung des Abschlusses meines Promotionsverfahrens keine rechtlichen Ansprüche an eine Vergabe eines akademischen Grades oder Titels stelle.

...... Datum Unterschrift

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