Thaíssa Brogliato Junqueira Engel

THAÍSSA BROGLIATO JUNQUEIRA ENGEL

ESTUDOS CARIOTÍPICOS EM GRIFFINIA KER GAWL E ESPÉCIES RELACIONADAS (AMARYLLIDACEAE)

CAMPINAS 2014

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Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Engel, Thaíssa Brogliato Junqueira, 1989- En32e Eng Estudos cariotípicos em Griffinia Ker Gawl e espécies relacionadas ( Amaryllidaceae) / Thaíssa Brogliato Junqueira Engel. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.

Eng Orientador: Eliana Regina Forni Martins. Eng Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

Eng 1 . Hibridização in situ fluorescente. 2. Citotaxonomia vegetal. 3. Citogenética. I. Forni-Martins, Eliana Regina,1957-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Karyotypic studies in Griffinia Ker Gawl and related species (Amaryllidaceae) Palavras-chave em inglês: In situ hybridization, fluorescence Plant cytotaxonomy Cytogenetics Área de concentração: Biologia Vegetal Titulação: Mestra em Biologia Vegetal Banca examinadora: Eliana Regina Forni Martins [Orientador] Julia Yamagishi Costa Julie Henriette Antoniette Dutilh Data de defesa: 14-02-2014 Programa de Pós-Graduação: Biologia Vegetal

Dedico este trabalho à minha mãe, Vergínia Maria Junqueira, de quem herdei os cromossomos que me trouxeram até aqui.

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Arnaldo Antunes – Cromossomos

AGRADECIMENTOS

À minha professora e orientadora Eliana, que não poupa esforços para manter o laboratório funcionando e nos orienta com muita paciência e atenção, emprestando não apenas seus conhecimentos e sua experiência, mas também muito suporte emocional e apoio, principalmente naqueles momentos em que achamos que os cromossomos nunca vão colaborar, a técnica nunca vai funcionar, se funcionar, não será efetiva ao propósito do trabalho, nada vai dar certo e vamos perder o mestrado. Muito obrigada!

À Capes e ao CNPq, pelo apoio financeiro obrigada! À UNICAMP e ao instituto de Biologia, ao Laboratório de Biossistemática e Polinização, pela estrutura com a qual nos recebe, pela qualidade do ensino e do serviço que nos oferece, e pela formação profissional, acadêmica e pessoal que nos possibilita, muito obrigada! Também aos funcionários da Pós Graduação em Biologia Vegetal, em especial a Maria Roseli, e aos técnicos, Iara, João Carlos, Sebastião, aos funcionários do Herbário, muito obrigada pelo suporte prestado.

Obrigada à minha banca de qualificação e à minha pré-banca, Júlia Yamagishi Costa, André Olmo Simões, Luana Tacuatiá, Maria Victória Romero e Julie Dutilh, por suas contribuições valiosas e atenciosas, que foram essenciais para o direcionamento, o crescimento e a qualidade desse trabalho. Agradeço especialmente à Júlia, que me introduziu ao fantástico mundo dos cromossomos coloridos, me ajudando a encontrar a minha paixão dentre as inúmeras possibilidades da biologia. Agradeço por poder continuar contando com a sua ajuda e seus conselhos, e por poder compartilhar com ela mais que conhecimento: uma amizade que muito estimo.

Aos professores do departamento, muito obrigada pelos seus valiosos ensinamentos, especialmente aqueles despretensiosos, no corredor! Quem Precisa do Google, quando tem na porta ao lado pessoas como a Eliana Forni-Martins, a Marlies Sazima, o Fernando Martins, o João Semir, o Tamashiro, e tantos outros?

Aos colegas da citogenética, Ana Paula Moraes, Caroline Polido, Klenya Rocha, Vanessa Mancuso, Nair Dahmer, Luana Tacuatiá, Maria Victória, Rafael Barbosa Pinto e Ana Laura, que compartilharam os segredos que aprenderam com seus anos de prática, muito obrigada! A todos colegas que dividem conosco não apenas o laboratório, mas também um pouco de seus trabalhos e suas experiências. Incluo aqui o pessoal da Polinização, Felipe, André, Maurício, Jefferson, Pietro, Vinícius, Fernanda e Pedro, os colegas da Biologia Vegetal, especialmente o Gu Shimizu, a pessoa mais generosa e prestativa que a biologia já conheceu, o Marcelinho, a Lu Franci, as meninas da Anatomia Vegetal, o

xi pessoal da Taxonomia, da Ecologia Vegetal e da Fisiologia Vegetal. Obrigada, por contribuírem sobremaneira para o nosso conhecimento e para o nosso constante crescimento enquanto biólogos! Agradeço especialmente aos que deixaram de ser apenas colegas com quem se discute biologia no laboratório, e se tornaram amigos valiosos, com quem se discute biologia nos intervalos de trabalho, no bandejão, no happy hour, no Bar do Zé, na Borda, num almoço de domingo, num churrasco... ou até mesmo, com quem nem se discute biologia mais!

À Julie, que compartilhou comigo seu projeto, em troca de realizar o profundo e nobre desejo de compreender melhor as plantas às quais se dedica há anos. Ao Mauro Peixoto e sua equipe, pelo cuidado excepcional com as plantas e por disponibilizá-las generosamente para o desenvolvimento do trabalho. A todo o pessoal do Instituto Plantarum especialmente o Antônio, pelas Griffinia, pelas fotografias, os vouchers, a atenção dispensada e pela prestatividade de sempre. Muito obrigada!

Agradeço ao João Paulo, companheiro de mestrado, colega de laboratório, por ser, mais que isso tudo, meu vizinho caipira, um amigo valioso, atencioso, amoroso, carinhoso, que certamente levarei para a vida toda; sempre jogando just dance, discutindo os resultados, conferindo as referências e compartilhando as angústias e as alegrias. Agradeço à Carol, que guiou meus primeiros passos nesse laboratório, se tornou uma grande amiga e faz uma falta imensurável. À Vic, nossa hermana e amiga, querida e cuidadosa, atenta, prestativa, com quem aprendo e divido com enorme prazer. À Luana, amiga amada com quem, sinceramente, me identifico além da biologia: para a vida. Muitíssimo obrigada a vocês, meus queridos! Fellipe, Luis, Pedro, Peterson, Rafael, Rodrigo, Madalena, com quem divido a minha casa e a minha vida, meus companheiros queridos e amigos essenciais, bem como a Ana Paula, a Renata, o João, o pessoal da Amarela... À Sy, que segurou a barra, a onda, a minha mão... Muito obrigada a todos vocês!

Especialmente, agradeço à minha mãe, que é meu exemplo e a grande responsável pelo que sou hoje (espero que ela esteja orgulhosa disso!), ao meu irmão amado, meu orgulho, e ao Celso, que sempre carinhoso, prestativo e atento, protege cuidadosamente o que tenho de mais valioso nessa vida, a minha família! Muito obrigada!

Posso finalmente dizer que, ao concluir esse trabalho de mestrado, vejo nos meus resultados a marca deixada por cada um de vocês, e agradeço com profunda e sincera gratidão por terem dedicado de alguma forma, um pouquinho de seu tempo e sua atenção para tornar esse trabalho possível!

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...... xv

LISTA DE TABELAS ...... xix

RESUMO ...... xxi

ABSTRACT ...... xxiii

ORGANIZAÇÃO GERAL DA DISSERTAÇÃO ...... xxv

INTRODUÇÃO GERAL ...... 1 1. Amaryllidaceae ...... 1 2. Griffinia (Ker Gawl) ...... 4 3. Citogenética ...... 7 4. Citogenética em Amaryllidaceae e Griffinia ...... 12 5. Referências Bibliográficas ...... 16

ESTUDOS CARIOTÍPICOS EM GRIFFINIA KER GAWL E ESPÉCIES RELACIONADAS (AMARYLLIDACEAE) ...... 26

1. INTRODUÇÂO ...... 26

2. MATERIAIS E MÉTODOS ...... 28 2.1. Espécies e locais de coleta ...... 28 2.2. Preparações Cromossômicas ...... 30

2.3. Bandamento CMA3 e DAPI ...... 31 2.4.1. Extração de DNA genômico ...... 31 2.4.2. Obtenção de sondas de DNAr 5S ...... 32 2.4.3. Hibridização ...... 33 2.5. Obtenção dos Ideogramas ...... 33

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3. RESULTADOS ...... 34 3.1. Número e morfologia cromossômicos ...... 34

3.2. Bandamento CMA3 e FISH ...... 35

4. DISCUSSÃO ...... 51 4.1. Número e morfologia cromossômicos ...... 51

4.2. Bandamento CMA3 e FISH ...... 53

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 59

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LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO GERAL

Figura 1 – Trecho da filogenia para Asparagales, obtida com o uso de dados de sequências plastidiais (atpB, rbcL, trnL intron e trnL–F intergenic spacer, ndhF, matK) e mitocondriais (atp1). Números acima das barras indicam distância entre os grupos e bootstrap (branch/bootstrap) para dados plastidiais e mitocondriais combinados. Números abaixo das barras indicam porcentagem de bootstrap para dados plastidiais apenas. O círculo contendo o número 1 à esquerda e acima na imagem, representa Alliaceae s.l. (sensu APG II 2003), grupo atualmente reconhecido como Amaryllidaceae (APG III 2009). Modificado de Pires et al. 2006...... 2

Figura 2 – Filogenia da família Amaryllidaceae, com suas três subfamílias e as tribos correspondentes, sensu APG III (2009). Em destaque, a tribo Griffineae. Modificado de Meerow em Kamenetsky e Okubo 2012...... 3

Figura 3 - Flores de Griffinia. G. concinna (A), G espiritensis, populações de Nova Venécia (B) e Barra do Colégio (C), G. hyacinthina (D), G. intermedia, populações de Itatiaia (E) e Mangaratiba (F), G. liboniana, populações de Itapebi (G), Petrópolis (H), e Ceará (I) G paubrasilica (J), G. rochae (K), G. sp1, Alto Cariri (L), G. sp2, Santa Teresa (M), G. gardneriana, populações de Tucuns (N) e Búzios (O) e G. nocturna (P)...... 5

Figura 4 - Árvore morfológica com espécies de Griffinia feita com base em 23 caracteres morfológicos, por meio do software PAUP 4.0bl. Adaptado de Preuss 1999 ...... 6

ESTUDOS CARIOTÍPICOS EM GRIFFINIA KER GAWL E ESPÉCIES RELACIONADAS (AMARYLLIDACEAE)

Figura 1 - Cromossomos metafásicos (2n=20) e localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) em espécies Griffinia liboniana, populações de Itapebi (A e B), Petrópolis (C e D), Ceará (E e F) e Jaguaré (G e H). Em detalhe, cromossomo aumentado para melhor compreensão de sua morfologia (B). Setas indicam sinais pouco visíveis. Barra = 10µm...... 39

Figura 2 - Cromossomos metafásicos (2n=20) e localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) em espécies Griffinia espiritensis, populações de Barra do Colégio (A e B), Nova Venécia (C e D), Domingos Martins (E e F) e Kautsky (I e J), e G. rochae (G e H). Em detalhe, cromossomos aumentado para melhor compreensão de sua morfologia (E). Setas indicam cromossomos pouco visíveis. Barra = 10µm...... 40

Figura 3 - Cromossomos metafásicos (2n=20) e localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) nas espécies G. hyacinthina, (A e B) e G. sp1, do Alto Cariri (C e D). Em detalhe, cromossomo aumentado para melhor compreensão de sua morfologia (D). Setas foram designadas apenas a sinais pouco visíveis. Barra = 10µm ...... 41

Figura 4 - Cromossomos metafásicos (2n=20) e localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) nas espécies do subgênero Hyline. Griffinia nocturna (A a C) e G. gardneriana, populações de Canaã dos Carajás (D a F) e Verdelândia (G a I). Em detalhe, cromossomos observados em metáfases incompletas, livres de sobreposição, para melhor compreensão de sua morfologia (C, F e I). Cabeças de seta verdes mostram cromossomo sem correspondência no conjunto cromossômico, formando um par heteromórfico com algum cromossomo sem sinais de DNAr 5S. As demais setas indicam sinais pouco visíveis. Barra = 10µm ...... 42

Figura 5 – Cromossomos metafásicos (2n=20) e localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) nas espécies Griffinia intermedia, populações de Mangaratiba (A e B) e Itatiaia (C e D). Cabeças de seta verdes chamam atenção para a diferença em posição do sinal no cromossomo. Setas indicam sinais pouco visíveis. Barra = 10µm ...... 43

Figura 6 - Cromossomos metafásicos (2n=20) e localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) nas espécies Griffinia parviflora (A e B). Cabeças de + seta verdes indicam par heteromórfico para banda CMA3 . Setas indicam sinais pouco visíveis. Barra = 10µm ...... 44

Figura 7 - Cromossomos metafásicos (2n=20) e localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) nas espécies Griffinia paubrasilica (A a D) e G. concinna (E e F). Cabeças de seta verdes chamam atenção para um par heteromórfico de cromossomos. Setas indicam sinais pouco visíveis. Barra = 10µm...... 45

Figura 8 - Cromossomos metafásicos e localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) nas espécies Griffinia sp2, de Santa Teresa. Setas indicam sinais pouco visíveis. Barra = 10µm...... 46

Figura 9 - Localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) em cromossomos metafásicos das espécies Eithea blumenavia (2n= 18, A e B), Tocantinia mira (2n=22, C e D), Hippeastrum reticulatum (2n=44,E e F) e Worsleya procera (2n=42, G e H). Setas indicam sinais pouco visíveis. Barra = 10µm ...... 47

Figura 10 - Ideogramas das espécies de Griffinia do Complexo liboniana. Cor amarela representa bandas CMA3+, cor vermelha representa sítios de DNAr 5S. Desenho cromossômico sem borda

xvi definida representa cromossomo para o qual não pôde ser determinada a posição do centrômero. A escala à esquerda dos cromossomos encontra-se em µm ...... 48

Figura 11 - Ideogramas para espécies de Griffinia. Cor amarela representa bandas CMA3+, cor vermelha representa sítios de DNAr 5S. Desenho cromossômico sem borda definida representa cromossomo para o qual não pôde ser determinada a posição do centrômero. A escala à esquerda dos cromossomos encontra-se em µm...... 49

Figura 12 - Ideogramas para espécies proximamente relacionadas a Griffinia. Cor amarela + representa bandas CMA3 , cor vermelha representa sítios de DNAr 5S. Desenho cromossômico sem borda definida representa cromossomo para o qual não pôde ser determinada a posição do centrômero. A escala à esquerda dos cromossomos encontra-se em µm...... 50

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Lista de espécies de Griffinia e espécies proximamente relacionadas utilizadas no estudo cromossômico e suas respectivas procedências...... 29

Tabela 2 – Número cromossômico, tamanho dos cromossomos (Maior – menor), bandas CMA3+ (número de pares cromossômicos com bandas/número de pares de bandas), quantidade e posição de sítios de DNAr 5S (número de pares cromossômicos com sítios/número de pares de sítios) em espécies de Griffinia, Eithea, Hippeastrum, Tocantinia e Worsleya. “-“ simboliza dado não analisado...... 38

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RESUMO

O gênero Griffinia Ker Gawl pertence à subfamília Amaryllidoideae que, junto às subfamílias

Agapanthoideae e Allioideae, compõem a família Amaryllidaceae, com cerca de 73 gêneros e 1605 espécies. As Amaryllidaceae, incluindo as Griffinia, são apreciadas pelas suas flores e cultivadas para a jardinagem e ornamentação. Endêmico do Brasil, esse importante gênero está ameaçado de extinção pela constante degradação de seu ambiente natural, sendo que muitas espécies não foram mais encontradas na natureza e nem em cultivo. A taxonomia de Griffinia é bastante dificultada pela morfologia floral e vegetativa bastante semelhante entre algumas espécies, e pela variação morfológica dentro de uma mesma espécie, ocasionada pelo isolamento entre populações e pela existência de diferentes citótipos. Os objetivos deste trabalho foram obter o cariótipo de diferentes espécies de Griffinia e de espécies proximamente relacionadas, e fornecer à sistemática informações que auxiliem na compreensão das relações filogenéticas e evolutivas das espécies desse gênero. Foram estudadas 10 espécies e duas morfoespécies não identificadas de Griffinia, bem como quatro espécies de gêneros próximos. Pontas de raízes coletadas dessas espécies foram pré-tratadas em colchicina e fixadas em solução Farmer para a produção de lâminas com metáfases mitóticas. Foram determinados número e morfologia cromossômicos e realizados bandamentos com os fluorocromos cromomicina3 (CMA3) e 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), e in situ fluorescent hybridization (FISH) com DNA ribossomal (DNAr 5S). Todas as espécies de

Griffinia apresentaram 2n=20. Os números cromossômicos para as espécies analisadas de Eithea,

Hippeastrum, Tocantinia e Worsleya foram 2n=18, 44, 22, e 42 respectivamente. Foram

+ observadas espécies de Griffinia com duas, quatro, cinco e seis bandas CMA3 . De um a três sítios de DNAr 5S foram observados em dois a seis pares cromossômicos, em posição terminal, subterminal ou pericentromérica. Para cada espécie, foi observado um padrão único de distribuição de sítios de DNAr 5S, sendo assim possível a delimitação de espécies por meio das técnicas citogenéticas aplicadas. As espécies do grupo reportado na literatura como complexo Liboniana

xxi apresentaram semelhanças cariotípicas que podem corroborar a proximidade entre espécies:

+ possuem apenas um par cromossômico com banda CMA3 e dois pares cromossômicos com sítios de DNAr 5S. Variações cariotípicas foram observadas não apenas entre as espécies, mas também entre populações de uma mesma espécie. Casos de variação intraespecífica são conhecidos para plantas. Contudo, essa variação pode não ser uma variação interpopulacional, mas sim, reflexo da dificuldade taxonômica no gênero. Os resultados obtidos nesse estudo, apontam a citogenética como uma ferramenta útil na delimitação dos gêneros e espécies, e no reconhecimento de grupos dentro de Griffinia.

Palavras-chave: Hibridização in situ fluorescente, bandamento cromossômico, Hippeastreae,

Griffiniae

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ABSTRACT

The genus Griffinia Ker Gawl belongs to the subfamily Amaryllidoideae which together with the subfamilies Agapanthoideae and Allioideae, forms the Amaryllidaceae family, with about 73 genera and 1605 species. Amaryllidaceae plants, including Griffinia, are aprecciated because of their flowers and cultivated for gardening and ornamentals. Endemic to Brazil, the genus is endangered by the continuous degradation of their natural environment, and many species have not been found in nature. Taxonomy of Griffinia is very complicated because of its vegetative and floral morphology, which are quite similar between some species. There is also some morphological variation within a single species, caused by the isolation between populations and the existence of different cytotypes. The aim of this study was to obtain the karyotype of different species of Griffinia and closely related species, thus providing for systematic studies some information to assist in the understanding of the evolutionary and phylogenetic relationships of the species of this genus. We studied 10 species and two unidentified morphospecies of Griffinia, as well as four species of closely related genera. Root tips collected from these species were pretreated with colchicine and fixed in Farmer solution for the production of slides with metaphasic cells. We determined the number and chromosomal morphology. We performed banding with chromomicin3 (CMA3) and 4',6-diamidino-2-phenilindole (DAPI) fluorochromes and fluorescent in situ hybridization (FISH) with ribosomal DNA (5S rDNA). All Griffinia species presented 20 chromosomes. Chromosome numbers for the analyzed species of Eithea, Hippeastrum,

Tocantinia and Worsleya were 2n= 18, 44, 22 and 42 respectively. Griffinia species presented

+ two, four, five or six CMA3 bands. One to three 5S rDNA sites were observed in two to six chromosome pairs in the terminal, subterminal or pericentromeric position. For each species, there was a unique pattern of distribution of DNAr 5S sites, so it is possible to delimitate species trough this cytogenetic technique. The species of a group reported in the literature as Liboniana complex showed similar karyotypes that can corroborate the closeness among the species of the group:

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+ they have only one chromosome pair with a CMA3 band and two chromosome pairs with 5S rDNA

sites. We observed karyotypic variations not only among species but also between populations of

the same species. Cases of intraspecific variation are known for plants. However, this variation

may be either an interpopulational variation, or a simple reflection of the difficulty in taxonomy of

the genus. The data found at this analysis proved cytogenetic studies to be a quite useful tool in

the delimitation of genera and species, and recognition of groups within Griffinia.

Keywords: Fluorescent in situ hybridization, chromosome banding, Hippeastreae, Griffineae

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ORGANIZAÇÃO GERAL DA DISSERTAÇÃO

A presente dissertação, abordando o estudo citogenético de algumas espécies de Griffinia

(Amaryllidaceae) ocorrentes no Brasil, está organizada em dois tópicos:

1) Introdução Geral, onde são apresentadas informações gerais sobre a taxonomia e

distribuição geográfica de Amaryllidaceae e de Griffinia, além da contribuição dos estudos

cromossômicos (e do desenvolvimento/aperfeiçoamento de técnicas) para taxonomia e

evolução de plantas em geral e para representantes de Amaryllidaceae;

2) Manuscrito sobre a citogenética de espécies de Griffinia e de gêneros próximos,

empregando técnicas de citogenética.

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INTRODUÇÃO GERAL

1. Amaryllidaceae

A família Amaryllidaceae J. Saint-Hilaire, com cerca de 73 gêneros e 1605 espécies (Stevens

2001 onwards), pertence à ordem Asparagales, no grupo das monocotiledôneas. Composta por três subfamílias, Agapanthoideae Endlicher (= Agapanthaceae F. Voigt), Allioideae Herbert e

Amaryllidoideae Dumortier (APG III), que já foram consideradas famílias em classificações anteriores (Givnish et al. 2006), Amaryllidaceae forma um grupo monofilético fortemente embasado

(Fay & Chase 1996, Fay et al. 2000, Givnish et al. 2006, Pires et al. 2006) (Figura 1).

As Amaryllidaceae são plantas bulbosas e perenes de hábito herbáceo, com folhas com filotaxia dística ou em espiral, inflorescência escaposa, umbeliforme ou uniflora, envolta por duas ou três brácteas maiores (espatas) e geralmente com mais brácteas internas pequenas, pedicelos não articulados, estilete longo e estigma seco ou úmido (Meerow 1998). Amaryllidoideae diferencia-se das demais subfamílias pela presença de alcaloides característicos, aminoácidos não proteicos e ovário ínfero (Stevens 2001 onwards).

Amaryllidaceae apresenta uma distribuição cosmopolita, sendo que as Allioideae concentram-se principalmente no hemisfério norte e as Agapanthoideae, no sul da África (Stevens

2001 onwards). As espécies da subfamília Amaryllidoideae distribuem-se no hemisfério sul, sendo os gêneros, em sua maioria, endêmicos da América do Sul ou África, locais que são também centros de distribuição para essas espécies (Arroyo & Cutler 1984).

Muitas Amaryllidaceae foram utilizadas como medicamento ou veneno pelos povos africanos

(Snijman & Linder 1996, Nair & van Staden 2013), e para produção de veneno para setas por povos caçadores-coletores em tempos bastante remotos (Snijman & Linder 1996, Forbes 1986, Bradlow

1994). Algumas Amaryllidaceae são cultivadas, tendo em vista o uso das belas flores para ornamentação e jardinagem (Strydom 2005). Atualmente há uma intensa investigação nos compostos de Amaryllidaceae visando a obtenção de diversos fármacos que têm mostrado atividades terapêuticas (Rønsted et al. 2012).

Em Amaryllidoideae, a tribo Griffineae, proposta por Ravenna (1974), aceita por Preuss

(1999) e legitimada por Meerow et al. (2000), é composta por dois gêneros endêmicos do Brasil, o gênero monoespecífico Worsleya (Lem.) Traub e o gênero Griffinia Ker Gawl. A tribo é uma linhagem antiga de Amaryllidaceae das Américas e se mostra irmã de Hippeastreae (Fig. 2).

2. Griffinia (Ker Gawl)

O gênero Griffinia possui 19 espécies geófitas, distribuídas pela Caatinga, Cerrado e Mata

Atlântica nos estados do Tocantins, Piauí, Ceará, Pernambuco, Bahia, Mato Grosso, Goiás, Mato

Grosso do Sul, Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo e Rio de Janeiro (Dutilh & Oliveira 2012).

Griffinia constitui-se de plantas de elevado potencial na horticultura, pois são bastante apreciadas por suas belíssimas flores (Fig. 3). Entretanto, esse gênero de plantas endêmicas encontra-se seriamente ameaçado de extinção (Dean 1995, Walter & Gillet 1997, Preuss 1999,

Kirizawa et al. 2005). Atualmente, algumas espécies não têm sido mais encontradas em seus habitats originais, e algumas poucas são cultivadas em coleções particulares (Preuss 1999, Merow et al. 2002, Kirizawa et al. 2005).

O gênero é formado por dois subgêneros; Griffinia (Fig. 3, A a M), composto por espécies com quatro a quinze flores sem odor, de cor lilás, azulada ou branca e antese diurna; e Hyline (Fig.

3, N a P), cujas espécies geralmente produzem duas ou quatro flores grandes brancas e com odor, de antese noturna (Preuss & Meerow 2001a). A filogenia para o grupo (Fig. 4), feita com base em

23 caracteres morfológicos (Preuss 1999), colocou G. gardneriana (Herb.) Ravenna e G. nocturna

Ravenna (subg. Hyline) ao lado do subgênero Griffinia, em que ainda se pode distinguir o complexo

Liboniana, formado pelas espécies G. aracensis Ravenna, G. espiritensis Ravenna, G. itambensis

Ravenna, G. liboniana E. Morren e G. rochae G.M. Morel, que seria grupo irmão de G. intermedia e

G. parviflora Ker Gawl. As espécies G. hyacintina Ker Gawl, G. alba Preuss & Meerow e G. ornata

Moore constituem um outro clado do subgênero Griffinia. (Fig 4).

Figura 4 - Árvore morfológica com espécies de Griffinia feita com base em 23 caracteres morfológicos, por meio do software PAUP 4.0bl. Adaptado de Preuss 1999

Apesar de já existirem estudos morfológicos (Preuss 1999, 2000) a taxonomia no gênero

Griffinia é muito dificultada pela morfologia floral e vegetativa bastante semelhante entre algumas espécies (Figura 3), a exemplo do ocorrido com G. alba Preuss & Meerow, inicialmente identificada como G. intermedia Lindl. Para Preuss & Meerow (2000), outros fatores que causam dificuldades taxonômicas são a variação morfológica ocasionada pelo isolamento geográfico entre populações distantes, a exemplo de G. espiritensis Rav. (Preuss & Meerow 2001b), e a existência de diferentes citótipos em uma espécie, como observado para G. espiritensis (Preuss & Meerow 2001b) e G. liboniana Morren (Preuss 1999), ambas com populações com 2n=20 e 2n=30 cromossomos.

3. Citogenética

Estudos citogenéticos permitem analisar a morfologia, a organização, a replicação, a variação e a função dos cromossomos (Guerra 1988), e dessa forma compreender mecanismos evolutivos e relações filogenéticas (Stebbins 1971). O número cromossômico por si só, um parâmetro cariotípico simples, obtido através de uma técnica simples e barata, já oferece resultados interessantes à taxonomia. Um exemplo pode ser retirado da observação da família Agavaceae. O estabelecimento dessa família foi influenciado pela uniformidade cariotípica dos gêneros Agave

(antes pertencente a Amaryllidaceae) e Yucca (antes pertencente a Liliaceae), que possuíam n=30 cromossomos, ou múltiplos desse número. Apesar de a princípio outros gêneros terem sido incluídos em Agavaceae, análises moleculares dividiram o táxon em famílias menores, e apenas gêneros com o cariótipo característico (n=30) e alguns gêneros com cariótipos bimodais parecidos foram mantidos

(Guerra 2008). Na classificação atual (APG III), o grupo é considerado uma subfamília (Agavoideae) dentro da família Asparagaceae (Chase et al. 2009).

Apesar de confiável, a contagem cromossômica nem sempre é suficiente para elucidar relações taxonômicas. No caso de números cromossômicos coincidentes, a análise do tamanho e da morfologia dos cromossomos pode ser útil. Técnicas que promovem a diferenciação longitudinal dos cromossomos, como bandamentos, que diferenciam regiões de heterocromatina e sua composição de bases nitrogenadas; e a hibridização in situ, que permite o mapeamento físico de sequências gênicas, vêm sendo cada vez mais utilizadas nos estudos citotaxonômicos.

O uso de fluorocromos com afinidade base-específica nos estudos cromossômicos teve início com os estudos de Caspersson e colaboradores (Caspersson et al. 1968, Caspersson et al. 1969a,

Caspersson et al 1969b). Nesses trabalhos foi hipotetizado que agentes alquilantes, os quais interagem com o átomo N7 da guanina no DNA, provavelmente se acumulariam preferencialmente onde há regiões cromossômicas ricas em guanina. Assim, se esse agente alquilante fosse fluorescente, regiões ricas em guanina poderiam ser distinguidas do restante do cromossomo, sob microscópio de fluorescência. O agente utilizado para essa alquilação foi quinacrina mostarda. A quinacrina mostarda, conquanto permitisse a identificação de regiões ricas em bases específicas, causava quebra nos cromossomos nessas mesmas regiões com bastante frequência (Caspersson et al. 1969b). Muitos outros agentes base-específicos vinham sendo estudados quanto às suas propriedades químicas e sua aplicabilidade na citogenética, na década de 60 (e.g. Goldberg 1965,

O’Brien et al. 1966). Além dos fluorocromos que se ligavam à guanina, também foram identificados outros agentes, também base-específicos, com maior afinidade por timina e adenina (e.g. Bhuyan &

Smith 1965). Tais agentes, contudo, não apresentavam uma fluorescência que permitisse a visualização de regiões ricas em determinadas bases. Mesmo que ainda se pesquisasse drogas e reagentes, o bandamento com químicos base-específicos já vinha sendo utilizado no estudo dos cromossomos (e.g. Caspersson 1969b, Vosa 1970).

A importância da região heterocromática poligênica da cromatina associada ao nucléolo, devido à sua função na rápida iniciação da síntese de ribossomos, era uma descoberta recente.

Assim, a ação de agentes alquilantes fluorescentes (além do bandamento NOR (nucleolus organizer region) com nitrato de prata) que permitissem localizar tais regiões no conjunto cromossômico, constituía-se de uma ferramenta inovadora e promissora para a compreensão da organização e da estrutura do DNA (Caspersson et al. 1968).

Na década de 70, os estudos sobre agentes fluorescentes base-específicos já haviam atingido um enorme avanço e muitas drogas já estavam disponíveis, tais como Hoechst 33.258, quinacrina e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que coravam regiões ricas em AT, e mitramicina, olivomicina e cromomicina A3 (CMA3), que coravam regiões ricas em CG (Sumner 1990). Schweizer

(1976) testou essas e outras drogas, buscando a combinação que oferecesse os resultados com a melhor resolução possível sobre a constituição da cromatina, e considerou a CMA3 um bom fluorocromo para se utilizar sequencialmente junto ao fluorocromo DAPI. Essa técnica foi considerada um método confiável para a identificação e diferenciação de regiões heterocromáticas ricas em CG e AT (Sumner 1990, Schweizer & Ambros 1994, Guerra 2000) e é utilizada desde então por muitos pesquisadores, auxiliando na compreensão dos mecanismos evolutivos e das relações filogenéticas entre as plantas.

Em Citrus (Rutaceae), a coloração sequencial com CMA3 e DAPI gerou padrões de bandamentos cromossômicos distintos para cada uma das seis espécies estudadas por Guerra

(1993). A análise desses cariótipos com marcadores distintos para cada espécie permitiu não apenas a diferenciação das espécies entre si, mas também a confirmação da origem híbrida de algumas espécies e clones, além da possibilidade do uso dos dados citológicos para estudos de biologia reprodutiva e evolução no grupo (Guerra 1993). Por corresponderem frequentemente a sítios de DNAr 45S e à região organizadora do nucléolo, as bandas CMA3 constituem uma

9 informação importante à compreensão da estrutura dos cromossomos, especialmente quando somam-se a ela outras informações. Barros e Silva et al. (2010) amplificaram por PCR (reação em cadeia da polimerase) um DNA satélite sabidamente rico em CG extraído de Citrus sinensis. Após o bandamento com CMA3, hibridizaram essa sonda de DNA satélite em sete espécies de Citrus e seis espécies proximamente relacionadas, a fim de compreender a evolução de bandas heterocromáticas ricas em CG dentro da subfamília Aurantioideae. Também foram utilizadas sondas

+ de DNA ribossômico (DNAr 45S), para identificar quais bandas CMA3 corresponderiam a esses sítios. Os autores obtiveram um padrão de bandas muito semelhante dentro do grupo, com satélites frequentemente em regiões terminais nos cromossomos. Concluíram que, muito provavelmente, o cariótipo básico de Aurantioideae já possuía repetições em tandem de algum tipo ancestral desse satélite rico em CG, que se encontrava na maioria das terminações cromossômicas e foram amplificadas ou reduzidas durante o curso evolutivo da subfamília. Isso teria resultado nesse padrão de bandas bastante semelhante entre as espécies do grupo, em que provavelmente a maioria dos gêneros manteve a distribuição terminal do satélite. As hibridizações foram feitas via hibridização in situ fluorescente (FISH).

A FISH é uma técnica que derivou da hibridização in situ (ISH). Essa técnica, desenvolvida concomitante e independentemente por Pardue & Gall (1969) e John et al. (1969) baseia-se na propriedade cromossômica da complementaridade das fitas, e constituía-se em hibridizar sondas de

RNA mensageiro em solução com o conjunto cromossômico em preparações citológicas. As sondas, contudo, eram marcadas com radioatividade e detectadas por autorradiografia. Langer et al. (1981) introduziram novidades à técnica: as sondas passaram a ser marcadas por nick translation com nucleotídeos biotinilados, e detectadas com anticorpos, pela ligação de avidina ou streptoavidina marcadas com fluorescência às sondas. Após esse desenvolvimento inicial, a sensibilidade da técnica, agora chamada FISH, aumentou rapidamente com o surgimento de novos haptenos,

10 fluorocromos, anticorpos e enzimas, e também com o desenvolvimento marcante das técnicas e ferramentas de microscopia de fluorescência (Liehr 2009). Tornou-se possível a “multicolor FISH”, que consiste em mapear simultaneamente diversas sequências gênicas distintas, mediante a utilização de fluorocromos emissores de luz em frequências distintas, e filtros adequados para a visualização desses fluorocromos (Liehr et al. 2006).

O desenvolvimento da FISH marcou a transição da citogenética clássica para a citogenética molecular, a qual deslumbrava pesquisadores em todo o mundo. Agora era possível ver cromossomos com um novo nível de detalhamento. Trabalhos belíssimos foram desenvolvidos com essa poderosa ferramenta. A morfologia dos cromossomos de Pinus é bastante conservada entre as espécies, sendo difícil até mesmo identificar os pares dentro de cada espécie mediante a utilização de técnicas de coloração convencional. Hizume et al. (2002) aplicaram em quatro espécies de Pinus a técnica de “multicolor FISH”, em que quatro sondas foram utilizadas. Os autores conseguiram obter marcadores suficientes não apenas para identificar os pares cromossômicos dentro de cada espécie, mas também para diferenciar eficientemente cada uma das espécies. Num segundo trabalho desenvolvido com outras cinco espécies de Pinus (Liu et al. 2003), os autores conseguiram, além de distinguir as espécies, relacionar as alterações cariotípicas com as posições filogenéticas que as espécies ocupavam. Também reconheceram a origem híbrida de uma das espécies, bem como as alterações que a mesma sofreu no curso de seu estabelecimento enquanto nova espécie.

Para o gênero Zea, Kato et al. (2004) utilizaram-se da FISH e encontraram marcadores que permitiram a identificação de cada um dos 10 pares cromossômicos. Posteriormente, Albert et al.

(2010) aplicaram a técnica a 52 amostras (entre espécies do gênero e linhagens de cada espécie), e determinaram quais marcadores eram estáveis e quais variavam entre as espécies e linhagens. A comparação entre as espécies permitiu uma melhor compreensão da evolução dos caracteres

11 cromossômicos. A técnica de mapeamento dos marcadores nos cromossomos via FISH vem sendo muito utilizada, e uma revisão bastante informativa sobre ela pode ser encontrada em Kato et al.

(2005).

De fato, mesmo na era da genômica, em que técnicas moleculares permitem sequenciar o

DNA e elucidar a exata composição de suas bases, a citogenética ainda desempenha um papel crucial. A compreensão dos cromossomos traz contribuições essenciais aos projetos de genômica, pois delineia a ordem de marcadores, define lacunas e revela rearranjos genômicos (Figueroa &

Bass 2010). Para compreender melhor como a Citogenética constitui-se em uma ferramenta extremamente útil e informativa às mais variadas áreas da Biologia, estão disponíveis diversas revisões (e.g. Guerra 1990, Schwarzacher 2003, Dobigny et al. 2004, Jiang & Gill 2006, Liehr et al.

2006, Guerra 2008, Figueroa & Bass 2010). Dentre elas, Guerra (1990, 2008) e Dobigny et al. (2004) tratam especificamente sobre a citogenética aplicada à taxonomia e cladística.

4. Citogenética em Amaryllidaceae e Griffinia

Em Amaryllidaceae, o número cromossômico e o cariótipo básico mostraram-se bastante

úteis para a caracterização e delimitação de gêneros (Flory 1977, Arroyo 1982, Kubitzki 1998, Muñoz et al. 2011). Como exemplo, a simples morfologia cromossômica permitiu a Ising (1969, 1970) a compreensão de espécies de Cyrtanthus, possibilitando a delimitação de grupos dentro do gênero, segundo a similaridade dos cariótipos. Também a separação de Rhodophiala de Hippeastreae, inicialmente baseada na largura da folha e na distribuição geográfica, ganhou o respaldo nos estudos citotaxonômicos, que revelaram os números cromossômicos x=11 para Hippeastreae e x=9 em Rhodophiala (Guerra 2008). No trabalho desenvolvido por Muñoz et al. (2011), diferenças cariotípicas em número e morfologia dos cromossomos mostraram que é viável manter a separação

12 dos gêneros Rhodophiala C. Presl. e Rhodolirium Phil. Bandamentos cromossômicos com fluorocromos auxiliaram Ran et al. (1999) a compreender o gênero Clivia Lindl. Embora o número e a forma dos cromossomos fossem muito semelhantes entre as quatro espécies estudadas, os padrões de bandas forneceram resultados suficientes para identificar com precisão cada uma delas.

Atualmente, catorze microssatélites já foram isolados e identificados em Clivia (Gao et al. 2012), restando agora localizar fisicamente tais microssatélites nos cromossomos. Para o gênero Crinum

L., a morfologia das plantas não é suficiente para separar C. pratense e C. defixum eficientemente, e nem tampouco o número cromossômico e a morfologia dos cromossomos corados com orceína

(Alam et al. 1991). Entretanto, o bandamento com CMA3/DAPI mostrou padrões de bandas diferentes para as espécies, permitindo sua diferenciação (Alam et al. 1998). Posteriormente, o grupo foi estudado por meio de FISH, e a elaboração de um cariótipo bastante completo, aliado a análises filogenéticas, permitiu profunda compreensão do gênero (Ran et al. 1999, 2001a, 2001b,

2001c, Murray et al. 2011).

Alguns trabalhos foram desenvolvidos na Itália para os gêneros Leucojum, Sternbergia,

Galanthus e Narcissus (D’Amato & Bianchi 1999, Dominicis et al. 2002, D’Amato 2004), os quais elucidaram os cariótipos dessas espécies e revelaram a origem híbrida de Narcissus biflorus. Dada a grande facilidade de formação de híbridos, também foram estudados o tamanho de genoma e a variação na composição de bases em híbridos naturais e artificiais de Narcissus (Marques et al.

2012). Existem também alguns trabalhos para Zephyranthes (Felix et al. 2007, 2008, 2011a, 2011b), com elaboração de cariótipo, e discussão da grande variabilidade no número cromossômico e dos diferentes níveis de ploidia dentro do gênero ou até mesmo dentro de uma população (Felix et al.

2008).

Apesar da evidente eficiência da citogenética como ferramenta à compreensão da taxonomia e da evolução das espécies em Amaryllidaceae, são relativamente pouco numerosos os estudos

13 cromossômicos para a família. Embora haja estudos cromossômicos mais detalhados para alguns gêneros, a maioria dos representantes de Amaryllidaceae não possui tais estudos, ou possui apenas contagens. Para outros gêneros, como Tocantinia e Eithea (Figura 5), nem mesmo os números cromossômicos estão disponíveis. Até mesmo para gêneros bastante estudados, como Hippeastrum

(Figura 5), ainda há espécies cujos cromossomos nunca foram analisados. O número cromossômico básico para a subfamília Amaryllidoideae é x=11 (Goldblatt 1976). No gênero Griffinia contagens revelaram o número cromossômico 2n=20 para G. aracensis Ravenna, G. parviflora Ker Gawl, G. hyacinthina Ker Gawl, G. liboniana Morren, G. espiritensis Ravenna, G. nocturna Ravenna e G. rochae Morel, além de citótipos com 2n=30 cromossomos em G. liboniana e G. espiritensis (Preuss

1999). Para Worsleya (Figura 5), o número cromossômico é 2n=42 (Dutilh 2005). Entretanto, técnicas citogenéticas de bandamentos e hibridizações de DNA in situ, que fornecem mais detalhes sobre os cromossomos, ainda não foram aplicadas para a tribo Griffinieae.

Figura 5 - Espécies de Amaryllidaceae, proximamente relacionadas com Griffnia, para as quais não há estudos citogenéticos. Eithea sp (A), Hippeastrum retilcuatum (B), Tocantinia sp (C), Worsleya procera (D). Fotografias: A, B, D – Mauro Peixoto. C – Julie Dutilh.

O objetivo geral deste trabalho é obter o cariótipo de diferentes espécies de Griffinia e de algumas espécies proximamente relacionadas (grupos externos), a fim de obter informações acerca da evolução cariotípica do grupo. São objetivos específicos:

 Mediante a análise do cariótipo de diferentes espécies de Griffinia, revelar possíveis caracteres

cromossômicos que possam ser utilizados para auxiliar na circunscrição e na delimitação de

espécies.

 Por meio da comparação dos cariótipos de Griffinia com os cariótipos de grupos externos

proximamente relacionados, compreender as relações filogenéticas e evolutivas dentro do

grupo.

 Investigar possíveis variações populacionais e poliploidizações, a fim de compreender a

dinâmica e possíveis mecanismos de especiação.

 Fornecer à sistemática informações que auxiliem na compreensão desse gênero

taxonomicamente complicado, e na preservação dessas espécies seriamente ameaçadas.

 Contribuir para o conhecimento cromossômico sobre espécies de cerrado, caatinga e mata

atlântica, onde estudos citogenéticos e citotaxonômicos são pouco numerosos, em contraste

com a enorme biodiversidade de nossa flora.

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ESTUDOS CARIOTÍPICOS EM GRIFFINIA KER GAWL E ESPÉCIES RELACIONADAS (AMARYLLIDACEAE)

1. INTRODUÇÂO

O gênero Griffinia Ker Gawl (Amaryllidaceae) ocorre exclusivamente no Brasil, na Caatinga,

Cerrado e Mata Atlântica. É composto por 19 espécies geófitas, bulbosas, distribuídas entre dois subgêneros: Griffinia, cujas espécies possuem de quatro a quinze flores sem odor, de cor lilás, azulada ou branca e antese diurna; e Hyline, cujas espécies geralmente produzem duas ou quatro flores grandes brancas e com odor, de antese noturna (Preuss & Meerow 2001). Em função da beleza de suas flores, Griffinia possui elevado potencial na horticultura, sendo inclusive bastante comercializada em sites de vendas principalmente na Europa, nos Estados Unidos e no Japão.

Entretanto, esse gênero de plantas endêmicas encontra-se seriamente ameaçado de extinção

(Dean 1995, Walter & Gillet 1997 apud Meerow et al. 2002, Preuss 1999, Kirizawa et al. 2005), sendo que atualmente, algumas espécies são cultivadas em coleções particulares e não mais encontradas em seus habitats originais (Preuss 1999, Meerow et al. 2002, Kirizawa et al. 2005).

A filogenia para o grupo, desenvolvida com base em 23 caracteres morfológicos (Preuss

1999), resultou em uma árvore em que diferentes acessos de G. espiritensis distribuem-se ao longo da árvore filogenética em clados distintos, bem como os acessos de G. liboniana, desfazendo a unidade desses indivíduos dentro de suas respectivas espécies. Em uma segunda filogenia, desenvolvida a partir de região ITS de DNA ribossomal (Preuss 1999), as mesmas amostras aparecem reunidas em grupos coesos que refletem sua circunscrição dentro da espécie. Dessa forma, a análise filogenética molecular mostra-se promissora. Entretanto, cabe observar que devem ser utilizados mais marcadores e amostragens mais representativas.

Observa-se uma discrepância entre os resultados obtidos por meio das análises morfológica e molecular. A falta de resolução das relações filogenéticas na análise baseada em caracteres morfológicos pode ser reflexo das dificuldades taxonômicas dentro do grupo, que advêm dos seguintes fatores: 1) as descrições são, em sua maioria, antigas, de difícil acesso, bastante imprecisas e, às vezes, a prancha e a descrição possuem incongruências; 2) as flores podem ser muito parecidas entre espécies distintas, variando apenas em características inconspícuas; 3) dentro de uma mesma espécie, pode haver grande plasticidade fenotípica; 4) populações geograficamente isoladas podem acumular variações morfológicas; 5) a mesma espécie pode apresentar diferentes citótipos (Preuss 1999). A dificuldade de circunscrição das espécies do grupo, oriunda dos fatores supracitados, aponta para a necessidade de que novas ferramentas investigativas sejam aplicadas, gerando novos marcadores morfológicos que permitam uma melhor compreensão das espécies, permitindo ao taxonomista a correta identificação das mesmas.

Estudos citogenéticos, por suas propriedades elucidativas acerca da morfologia, organização, variação, replicação e função dos cromossomos (Guerra 1988), vêm se mostrando excelentes ferramentas à compreensão de mecanismos de evolução, especiação e relações filogenéticas (Stebbins 1971, Guerra 1990). Entre as técnicas de bandamentos cromossômicos, que permitem uma diferenciação longitudinal dos mesmos, está o bandamento com fluorocromos. Essa técnica revela algumas regiões heterocromáticas nos cromossomos, à medida em que evidenciam regiões cromossômicas “ricas” em bases AT (DAPI) e GC (CMA3) (Sumner 1990). Também é bastante empregada a (FISH) com diversas sequências de DNA, sendo as mais comuns as sequências de genes ribossomais (DNAr 45S e 5S), a qual permite o mapeamento físico das sequências pretendidas no conjunto cromossômico das espécies estudadas.

O número cromossômico básico para a subfamília Amaryllidoideae é x=11 (Goldblatt 1976).

Para a tribo Griffineae, o gênero Worsleya apresenta 2n=42 cromossomos (Dutilh 2005), e para o

27 gênero Griffinia há contagens de 2n=20 para G. aracensis Ravenna, G. parviflora Ker Gawl, G. hyacinthina Ker Gawl, G. liboniana Morren, G. espiritensis Ravenna, G. nocturna Ravenna e G. rochae Morel. Também há ocorrência de citótipos com 2n=30 em G. liboniana e G. espiritensis

(Preuss 1999). Contudo, técnicas citogenéticas de bandamentos e hibridizações de DNA in situ, que fornecem mais detalhes sobre os cromossomos, ainda não foram aplicadas.

O objetivo deste estudo foi obter o cariótipo de espécies de Griffinia e de gêneros proximamente relacionados, a fim de fornecer informações que possam auxiliar na circunscrição e na delimitação das espécies. Além disso, o estudo visa auxiliar a compreensão das relações filogenéticas e evolutivas, dos mecanismos cromossômicos envolvidos na especiação, e identificar possíveis variações populacionais dentro do grupo.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Espécies e locais de coleta

Como resultado de coletas de pesquisadores colaboradores, foi reunida uma coleção de 13 espécies de Griffinia, sendo que para quatro delas, há duas populações distintas coletadas (Tabela

1). Como espécies externas proximamente relacionadas, para fins de comparação, foi estudada uma espécie de cada um dos gêneros: Eithea Ravenna, Hippeastrum Herb., Tocantinia Ravenna e

Worsleya Traub. Todas as espécies estudadas estão sendo cultivadas no Jardim Botânico do

Instituto Plantarum (Nova Odessa, SP) e em coleção particular (Mogi das Cruzes, SP). Materiais- testemunha (voucher) foram incorporados nos herbários da Unicamp (UEC) e do Jardim Botânico

Plantarum (HPL) (Tabela 1).

Tabela 1- Lista de espécies de Griffinia e espécies proximamente relacionadas utilizadas no estudo cromossômico e suas respectivas procedências.

Espécie Local de procedência Vouchers

G. concinna (Mart. ex Schult. & Schult.) Ravenna RJ, Italva HPL-12979

G. espiritensis Ravenna ES, Nova Venécia RB 86879

ES, Domingos Martins HPL 12196

ES, Kautsky UEC 170483

G. affines espiritensis ES, Barra do Colégio HPL-13185

G. gardneriana (Herb.) Ravenna RJ, Búzios IAC 47870

PA, Canaã dos Carajás HPL 13179

ES, Verdelândia BHCB64866

G. hyacinthina Ker Gawl. RJ, Parati IAC 36315/UEC 136346

G. intermedia Lindl. RJ, Itatiaia RB 384524

RJ, Mangaratiba HPL 13180

G. liboniana E. Morren BA, Itapebi; HPL 13054

RJ, Petrópolis HPL 13181

ES, Jaguaré HPL 13182

CE, Maranguape ESA 78389

G. nocturna Ravenna MT, Barra do Garças HPL 12898

G. parviflora Ker Gawl. BA, Ubaitaba HPL 12195

G. paubrasilica Ravenna BA, Porto Seguro HPL 336

G. rochae G.M. Morel RJ, Baixada Fluminense HPL 13186

G. sp 1 MG, Alto Cariri BHCB 86730/HPL 13187

G. sp 2 ES, Santa Teresa MBML 40564

E. blumenavia (Koch & Bouché) Ravenna PR, Castro HPL 12098

Hippeastrum reticulatum Herb. SC, Joinville (cultivo) HPL

Tocantinia sp Ravena MG, Jaíba BHCB 21977

Worsleya procera (Lem.) Traub RJ, Petrópolis RB 555427

2.2. Preparações Cromossômicas

A fim de realizar as contagens cromossômicas, elaborar cariótipos, identificar padrões de bandas

CMA3 e DAPI e localizar sítios de DNAr 5S nos cromossomos, foi aplicado o mesmo procedimento de preparo das lâminas para obtenção de metáfases mitóticas. Para tal, pontas de raízes jovens foram coletadas diretamente das plantas mantidas nas coleções de espécies. As pontas de raízes foram pré-tratadas em solução anti-mitótica de colchicina 0,05% por 8 horas em temperatura ambiente. Em seguida, o material foi fixado em solução Farmer (álcool etílico 3:1 ácido acético) por

24 h em temperatura ambiente e armazenadas a -20°C. Para o preparo das lâminas, as pontas de raízes foram lavadas em água destilada por duas vezes durante cinco minutos, e então sobre lâmina, cada ponta de raiz recebeu uma gota de solução enzimática com 1% de macerozima, 2% de celulase e 20% de pectinase. Após 25 minutos na estufa a 37°C, o material foi novamente lavado com água destilada e recebeu uma gota de ácido acético (60%). Foram retirados a coifa e os demais tecidos da ponta de raiz, sob estereomicroscópio, para que restasse apenas o meristema, o qual foi cortado, desfiado em pequenos pedaços e espalhado a fim de se obter o melhor espalhamento possível das células. O espalhamento do material foi reforçado com suaves batidas sobre a lamínula, e a lâmina foi aquecida para otimizar a hidrólise. A lâmina foi apertada entre duas camadas de papel filtro, a fim de retirar o excesso de ácido acético e espalhar ainda mais os cromossomos. A seguir, a lâmina foi congelada em nitrogênio líquido para a definitiva fixação do material e retirada da lamínula. Após três dias, as lâminas foram submetidas aos processos de coloração sequencial com fluorocromos.

Para cada espécie, as contagens cromossômicas foram confirmadas a partir da análise de pelo menos 5 células em condições de espalhamento cromossômico suficiente para contagem.

2.3. Bandamento CMA3 e DAPI

Para o bandamento CMA/DAPI (Guerra & Souza 2002) foi utilizada a coloração sequencial, com os corantes CMA3 e DAPI. Inicialmente, com micropipeta automática, foram adicionados 10µl de

CMA3 (0,5mg/ml) sobre as células, e colocada a lamínula. Após uma hora em caixa escura, a lâmina foi lavada para retirada da lamínula e excesso de fluorocromo, e as células receberam 10µl de DAPI

(2µg/ml). Após meia hora em caixa escura, a lâmina foi lavada com um jato de água destilada. Após a secagem da lâmina, foi colocada uma gota de meio de montagem (glicerol/tampão McIlvainepH 7, com MgCl2) sobre as células, e feita a cobertura com lamínula. A lâmina descansou em caixa escura para estabilização dos fluorocromos durante três dias antes da análise sob fotomicroscópio óptico de fluorescência. As melhores células foram fotografadas utilizando o microscópio Olympus BX51, equipado com sistema digital de captura de imagem com câmera Evolution MT CCd, por meio do software Image ProPlus v6 (Media Cybernetics, Inc.).

2.4. FISH

2.4.1. Extração de DNA genômico

Para se obter sondas de DNAr 5S, a serem utilizadas na técnica de Hibridização in situ fluorescente (FISH), foi feita a extração de DNA genômico de G. liboniana e Herbertia pulchella

Sweet (Iridaceae), ambas espécies da ordem Asparagales. A extração seguiu Weising et al. (2005).

Um fragmento de folha de ca. 1cm² foi macerado em nitrogênio líquido e o pó resultante foi transferido para um tubo com o buffer de extração e clorofórmio. O tubo foi incubado com agitação por 10 minutos a 55°C, e em seguida centrifugado a 12.000 rpm por cinco minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, ao qual foram acrescentados 1,2 volumes de isopropanol 100% para precipitação dos ácidos nucleicos. O tubo foi centrifugado a 12.000 rpm por 10 minutos, o

31 sobrenadante foi descartado, e o pellet foi lavado duas vezes em 1ml de álcool etílico 70%. O pellet foi seco e dissolvido em 50 µl de TE.

2.4.2. Obtenção de sondas de DNAr 5S

Duas sondas foram produzidas, sendo a primeira, a partir do DNA genômico de G. liboniana.

Segmentos de DNAr 5S foram obtidos por meio de PCR com os primers 5SrDNA-3 (5′-GTG CTT

GGG CGA GAG TAG TA-3′) e 5SrDNA-4 (5′-GGT GCG TTA GTG CTG GTA TG-3′) (Kitamura et al.

2001, Venkateswarlu et al. 1991). Para a segunda sonda, produzida a partir do DNA genômico de

H. pulchella, fragmentos de DNAr 5S foram obtidos por meio de PCR com os primers 5SL1 (5′-

CGGTGCATTAATGCTGGTAT-3′) e 5SL2 (5′-CCATCAGAACTCCGCAGTTA- 3′) (Hizume 1993). As reações de PCR para um volume total de 200 µl para cada sonda, constaram de solução tampão

1x, MgCl 2mM, dNTP 0,4mM, primers 1µM (cada primer), Taq 1,25 unidades, e 15,5ng de DNA para a reação com G. liboniana, e 50ng para a reação com H. pulchella. A amplificação consistiu em 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 66°C para G. liboniana e 60°C para H. pulchella por 30 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto. O DNA amplificado foi precipitado com acetato de sódio 3M 0,1 volume e etanol 2 volumes, homogeneizado, e incubado em freezer overnight. O pellet foi novamente precipitado e ressuspendido em água deionizada autoclavada. As sondas foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP por nick translation. Para tal, cada tubo contendo 1.000ng de DNA e o kit de marcação (DIG Nick Translation Mix, Roche) foi incubado a

15°C por 1 hora e 30 minutos. Precipitamos as sondas em 2 volumes de etanol 100% e 10% de acetato de sódio 3M. Os tubos foram incubados em freezer overnight e centrifugados no dia seguinte, quando os pellets foram secos e ressuspendidos em 30µl de água deionizada e autoclavada.

2.4.3. Hibridização

A FISH seguiu o protocolo de Schwarzacher & Heslop-Harrison (2000), com pequenas modificações. As lâminas foram incubadas por 30 minutos a 60°C, e então descansaram até atingirem temperatura ambiente novamente. Em seguida foram incubadas com solução de RNAase por uma hora a 37°C. Após duas lavagens com 2xSSC por cinco minutos e incubação em paraformaldeído 4% por 10 minutos, as lâminas foram novamente lavadas em solução salina de citrato de sódio (SSC), desidratadas em série etanólica, e secas. As lâminas receberam a mistura de hibridização (com a sonda proveniente de G. liboniana na maior parte dos casos), e foram cobertas com lamínula para então serem desnaturadas. Os ciclos de desnaturação foram de 90°C por 10 minutos, seguido de 48°C por 10 minutos e finalmente de 38ºC por 10 minutos. A seguir, as lâminas foram incubadas a 37°C overnight. Após o banho pós-hibridação em SSC, foi aplicado o anticorpo Anti-DIG-Rhodamina (Sigma) para detecção da sonda de DNAr 5S marcada com digoxigenina. Após nova lavagem em SSC, a lâmina recebeu o meio de montagem

(DAPI/Vectashield 1:1 v/v), foi coberta com lamínula e vedada.

2.5. Obtenção dos Ideogramas

Para o desenho dos ideogramas, cromossomos de uma metáfase com boas condições de espalhamento, em que a morfologia cromossômica pudesse ser determinada, foram mensuradas por meio do software Micro Measure© 3.3. A classificação da morfologia cromossômica, seguiu

Levan et al. (1964). Devido à dificuldade de encontrar células com bom espalhamento, foram utilizadas metáfases que exibiram níveis variados de condensação cromossômica. Assim, os valores de comprimento cromossômico obtidos não podem ser comparados entre as espécies. Os

33 cromossomos foram desenhados no Excel, e bandas e sinais foram acrescentados por meio do software Adobe® Photoshop® CS6 13.0x32.

3. RESULTADOS

3.1. Número e morfologia cromossômicos

Todas as 13 espécies (21 populações) analisadas de Griffinia (Tabela 1) apresentaram número cromossômico conservado, 2n=20 cromossomos (Tabela 2, Figuras 1 a 8). Nos demais gêneros, as espécies E. blumenavia, Tocantinia sp, H. reticulatum e W. procera apresentaram respectivamente

2n=18, 2n=22, 2n=44 e 2n=42 cromossomos (Tabela 2, Figura 9).

Em 10 populações analisadas, de diferentes espécies de Griffinia, o tamanho dos cromossomos variou entre 21,2 a 9,2 (G. concinna) e 12,7 a 6,1µm (G. sp – Santa Teresa) (Tabela 2, Figuras 1 a

5, 7 a 8). Entre as espécies dos grupos externos, os cromossomos medem 10,8 a 5,7 µm para

Eithea, 9,5 a 3,4 µm para Tocantinia sp, e 9,8 a 4,3 µm para Worsleya (Tabela 2, Figuras 6 e 9).

Contudo, não se pode comparar os tamanhos cromossômicos, pois em função de dificuldades com a técnica, os cromossomos medidos não apresentavam o mesmo nível de condensação.

Nas mesmas 10 populações, pertencentes a várias espécies de Griffinia, os cromossomos são, em sua maioria, metacêntricos (m) e submetacêntricos (sm), porém alguns subtelocêntricos (st) e telocêntricos (t) também foram observados. Griffinia concinna possui fórmula cariotípica 18m+2st, enquanto Griffinia espiritensis (população de Nova Venécia), 16m+2sm+2st. Griffinia liboniana possui apenas cromossomos metacêntricos (20m), enquanto G. intermedia (população de Itatiaia) apresenta a fórmula 18m+2st e G. nocturna 14m+4sm+2st. Griffinia rochae e uma das espécies não identificadas, G. sp1 (Alto Cariri), apresentaram a fórmula 16m+4sm. Para as espécies G. aff

34 espiritensis (Barra do Colégio) e G. sp2 (Santa Teresa), em um par cromossômico não pode ser definida a posição do centrômero devido ao mal espalhamento dos cromossomos, e os demais 9 pares são metacêntricos (Figuras 10 e 11). Eithea blumenavia apresenta fórmula cariotípica

4m+12sm+2st, e Tocantinia sp, 4m+14sm+2st+2t, (Figura 12).

3.2. Bandamento CMA3 e FISH

+ Todas as espécies estudadas apresentam bandas CMA3 , sempre em posição terminal. Quanto ao padrão de sítios de DNAr 5S, cada espécie apresentou um padrão diferente, ao contrário dos resultados do bandamento com fluorocromos (Tabela 2 e Figuras 1 a 9). Os sítios encontram-se em forma de bloco (sinal grande, bem visível) ou, frequentemente como dots (sinais menores, às vezes, inconspícuos). Não raramente, um par cromossômico apresenta mais de um sítio.

As espécies do “complexo liboniana” (Preuss 1999), G. espiritensis, G. liboniana e G. rochae,

+ apresentaram apenas um par cromossômico com banda CMA3 (Figuras 1, 2 e 10, Tabela 2).

Griffinia rochae e todas as populações de G. liboniana apresentaram dois pares cromossômicos com um par de dots (com exceção da população de Itapebi, em que um dos pares cromossômicos apresenta dois pares de dots) em posição terminal ou subterminal (Figuras 1, 2 e 10). A intensidade desses sítios, contudo, varia bastante entre as populações (Figura 1). Entre as populações de G. espiritensis a de Nova Venécia apresenta dois pares cromossômicos com sítios em posição terminal, a de Barra do Colégio, dois pares cromossômicos com sítios de DNAr 5s, sendo um em posição terminal e o outro, pericentromérica. As populações de Domingos Martins e do Kautsky apresentam o mesmo padrão: dois pares cromossômicos com sítios de DNAr 5s em posição terminal, e um par cromossômico com dois sítios, sendo um em posição terminal e o outro em posição pericentromérica

(Figuras 2 e 10).

+ Também apresentaram duas bandas CMA3 a espécie G. hyacithina (Figura 3, Tabela 2), mais basal que o complexo liboniana segundo a filogenia para o grupo (Preuss 1999), as espécies do subgênero Hyline (G. gardneriana e G. nocturna), e G. sp1 (Figuras 3, 4 e 11, Tabela 2). Em G.

+ hyacinthina os cromossomos com banda CMA3 apresentam um sítio de DNAr 5S em posição subterminal no braço longo. Um segundo par cromossômico exibe dois sítios de DNAr 5S, sendo um em posição terminal em um dos braços, e um em posição subterminal no outro braço (Figura 3,

Tabela 2). As espécies do subgênero Hyline, G. gardneriana e G. nocturna, apresentaram mais sítios de DNAr 5s que as espécies do subgênero Griffinia. Indivíduos de G. gardneriana apresentaram, para a população de Canaã dos Carajás, 20 sítios de DNAr 5s, sendo que o par de cromossomos

+ com banda CMA3 apresenta sítio em posição pericentromérica e os demais 18 sítios estão distribuídos entre 10 cromossomos, nas posições terminal, subterminal e pericentromérica. Na população de Verdelândia, foram observados 18 sítios distribuídos entre 11 cromossomos, sendo

+ que os cromossomos com banda CMA3 não possuem sítios de DNAr 5s, e há um cromossomo heteromórfico para sítios de DNAr 5s. Ainda, os tipos cromossômicos para as populações não são iguais (ver cromossomos em detalhe na figura 4). Em metáfases de G. nocturna, o par cromossômico

+ com banda CMA3 possui também sítio de DNAr 5s em posição subterminal. Podem ser observados mais 14 sítios distribuídos entre 6 cromossomos, nas posições terminal, subterminal e pericentromérica (Figuras 4 e 11, Tabela 2). A espécie sem identificação coletada no Alto Cariri exibe dois pares cromossômicos com um sítio de DNAr 5s em posição terminal, e um par com dois sítios em posição subterminal (Figuras 3 e 11, Tabela 2).

Em ambas as populações de Griffinia intermedia foram observados dois pares cromossômicos

+ com bandas CMA3 , os quais também possuíam sítios de DNAr 5s em posição terminal além de um terceiro par cromossômico com sítio em posição pericentromérica (Figuras 5 e 11, Tabela 2). Griffinia

+ concinna, também com dois pares cromossômicos com banda CMA3 , possui em um deles, dois

36 sítios de DNAr 5s. Mais três sítios podem ser observados, dois em posição terminal e um em posição subterminal no outro braço, do maior par cromossômico do conjunto (Figuras 7 e 11). G. paubrasilica

+ possui dois pares cromossômicos com bandas CMA3 . Essa espécie apresenta um par cromossômico heteromórfico para o sítio de DNAr 5s, sendo que um cromossomo possui um sítio em posição terminal no braço curto, e um sítio em posição subterminal no braço longo, e o outro cromossomo possui apenas um sítio em posição terminal no braço curto (Figura 7).

Griffinia parviflora apresenta cinco bandas, sendo portanto, um desses cromossomos,

+ heteromórfico para essa banda CMA3 . Quanto aos sítios de DNAr 5s, a espécie mostra um par cromossômico com um sítio em cada braço, ambos em posição subterminal, sendo que desse par

+ cromossômico, um possui banda CMA3 e o outro não. (Figura 6, Tabela 2).

+ Griffinia sp2, de Santa Teresa, possui três pares cromossômicos com bandas CMA3 (Figuras 8 e 11, Tabela 2). Um desses pares exibe também um sítio de DNAr 5s em posição terminal, e mais dois pares cromossômicos com sítio de DNAr 5s podem ser observados, um em posição terminal, e outro em posição pericentromérica (Figuras 8 e 11).

Entre as espécies externas, E. blumenavia possui dois pares de cromossomos com banda, um deles com sítio de DNAr 5s e um segundo par com um sítio em posição pericentromérica. Para

Tocantinia sp, é possível observar um par cromossômico com bandas CMA3 e três pares cromossômicos com um sítio terminal. H. reticulatum possui um par cromossômico com banda CMA3 e três pares com sítio de DNAr 5s em posição terminal. W. procera também apresentou apenas um par cromossômico com bandas CMA3 e cinco pares cromossômicos com um sítio de DNAr 5s terminal (Figuras 9 e 12, Tabela 2)

Tabela 2 – Número cromossômico (#), variação de tamanho cromossômico, bandas CMA3+ (número de pares cromossômicos com bandas/número de pares de bandas), quantidade e posição (Terminais (T), Subterminais (S) e Pericentroméricas (P)) de sítios de DNAr 5S (número de pares cromossômicos com sítios/número de pares de sítios) em espécies de Griffinia, Eithea, Hippeastrum, Tocantinia e Worsleya. *Números dentro de parênteses representam cromossômicos heteromórficos e suas bandas. “-“ simboliza dado não analisado.

+ Espécie População # Tamanho (µm) Morfologia Bandas CMA3 Sítios 5S

Terminais T S P

G. concinna RJ, Italva 20 21,2 – 9,1 18m+2st 2/2 1/1 2/3 0

G. espiritensis ES, Nova Venécia 20 13,3 – 6,2 16m+2sm+2st 1/1 0 2/2 0

ES, Domingos Martins 20 - - 1/1 3/3 0 1/1

ES, Kautsky - - 1/1 3/3 0 1/1

G. aff espiritensis ES, Barra do Colégio 20 13,3 – 6,9 18m+2? 1/1 1/1 0 1/1

G. gardneriana RJ, Búzios 20 - - 1/1 - - -

PA, Canaã dos Carajás - - 1/1 2/2 5/5 3/3

ES, Verdelândia - - 1/1 1/1 2(+1)/4(+2) 3/3

G. hyacinthina RJ, Parati 20 - - 1/1 1/1 2/2 0

G. intermedia RJ, Itatiaia 20 17,3 – 7,6 18m+2st 2/2 1/1 1/1 1/1

RJ, Mangaratiba 20 - 2/2 1/1 1/1 1/1

G. liboniana BA, Itapebi; 20 13,6 – 6,8 20m 1/1 1/1 2/2 0

RJ, Petrópolis 20 13,5 – 7,9 20m 1/1 1/1 1/1 0

ES, Jaguaré 20 - 1/1 1/1 1/1 0

CE, Maranguape 20 - 1/1 1/1 1/1 0

G. nocturna MT, Barra do Garças 20 14,2 – 6,8 14m+4sm+2st 1/1 2/3 4/5 0

G. parviflora BA, Ubaitaba 20 - 2/2(+1)* 0 2/4 0

G. paubrasilica BA, Porto Seguro 20 - 2/2 1/1 (1)/(1) 0

G. rochae RJ, Baixada Fluminense 20 14,3 – 7,7 16m+4sm 1/1 2/2 0 0

G. sp 1 MG, Alto Cariri 20 12,6 – 7,4 16m+4sm 1/1 1/1 3/3 0

G. sp 2 ES, Santa Teresa 20 12,7 – 6,1 18m+2? 3/3 2/2 0 1/1

E. blumenavia PR, Castro 18 10,8 – 5,7 4m+12sm+2st 2/2 1/1 0 1/1

H. reticulatum SC, Joinville (cultivo) 44 - - 1/1 3/3 0 0

Tocantinia sp MG, Jaíba 22 9,5 – 3,4 4m+14sm+2st+2t 1/1 3/3 0 0

W. procera RJ, Petrópolis 42 9,8 – 4,3 - 1/1 5/5 1/1 0

Figura 6 - Cromossomos metafásicos (2n=20) e localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) nas espécies Griffinia parviflora (A e B). Cabeças de seta verdes indicam par + heteromórfico para banda CMA3 . Setas indicam sinais pouco visíveis. Barra = 10µm

Figura 9 - Localização de bandas CMA3+ (sinais amarelos) e/ou sítios de DNAr 5S (sinais vermelhos) em cromossomos metafásicos das espécies Eithea blumenavia (2n= 18, A e B), Tocantinia sp (2n=22, C e D), Hippeastrum reticulatum (2n=44,E e F) e Worsleya procera (2n=42, G e H). Setas indicam sinais pouco visíveis. Barra = 10µm

Figura 10 - Ideogramas das espécies de Griffinia do Complexo liboniana. Cor amarela representa bandas CMA3+, cor vermelha representa sítios de DNAr 5S. Desenho cromossômico sem borda definida representa cromossomo para o qual não pôde ser determinada a posição do centrômero. A escala à esquerda dos cromossomos encontra-se em µm

+ Figura 12 - Ideogramas para espécies proximamente relacionadas a Griffinia. Cor amarela representa bandas CMA3 , cor vermelha representa sítios de DNAr 5S. Desenho cromossômico sem borda definida representa cromossomo para o qual não pôde ser determinada a posição do centrômero. A escala à esquerda dos cromossomos encontra-se em µm.

4. DISCUSSÃO

4.1. Número e morfologia cromossômicos

O números cromossômicos observados estão de acordo com contagens anteriores para

Worsleya (Dutilh 2005) e para Griffinia (Preuss 1999). Contudo também são conhecidas populações com 2n=30 para G. espiritensis e G. liboniana (Preuss 1999). Além das espécies de Griffinia supracitadas, já foi documentado o número cromossômico para G. aracensis e, assim, são conhecidos os números cromossômicos para a maioria das 19 espécies do gênero. As contagens são inéditas para G. concinna, G. gardneriana, G. intermedia, G. paubrasilica e H. reticulatum.

Também houve ineditismo para o gênero Tocantinia. Para E. blumenavia, o número encontrado diverge do resultado obtido por Arroyo (1982), que observou 20 cromossomos. Naquele trabalho, a espécie foi denominada Hippeastrum blumenavia (K.Koch & C.D.Bouché ex Carrière) Sealy (hoje sinônimo homotípico de Eithea blumenavia).

Na tribo Griffineae, dois números cromossômicos principais são observados: 2n=20 em Griffinia e 2n=42 em Worsleya (Tabela 2). Na tribo Hippeastreae, também há variação de números cromossômicos entre gêneros, como 2n=22 para Tocantinia, 2n=18 para Eithea (Tabela 2), 2n=22,

44 ou 66 para Hippeastrum (Dutilh 2005) e 2n=44 para Habranthus (Felix et al. 2011). Também existe variação dentro de um mesmo gênero, como em Zephyranthes, com 2n=12, 18, 24, 25 e 38

(Felix et al. 2011), ou até mesmo dentro de uma população, como observado em Z. sylvatica, com

2n=12, 13 e 18 (Felix et al. 2008).

Apesar de os tamanhos cromossômicos das espécies não poderem ser comparados devido à falta de padronização na condensação cromossômica, em termos gerais, pode-se dizer que os cromossomos de Griffinia são grandes (variam de 21,2 a 6,2µm) (Tabela 2, Figuras 1 a 5, 7 a 8).

Medidas aferidas em metáfases publicadas por Meerow et; al. (2002), revelam tamanhos

51 cromossômicos dentro da variação observada no presente estudo: 17,44 a 8,01µm para G. liboniana e 10,61 a 5,10µm para G. aracensis. Aparentemente, os cromossomos das espécies dos grupos externos, especialmente Eithea, são menores que os de Griffinia (10,8 a 5,7 µm, Tabela 2, Figuras

6 e 9). Cromossomos de Griffinia são aparentemente maiores também que os de representantes da tribo Hippeastreae, como Hippeastrum (12,5 a 3,0µm - Shafiq & Vahidy 1998) e de Zephyranthes

(10,4 a 3,8µm – Felix et al. 2007). Entretanto, há outras Amarylidaceae com tamanhos cromossômicos aproximadamente semelhantes aos observados em Griffinia, como Clivia (19,5 a

6,6 µm - Ran et al. 1999), pertencente à tribo Haemantheae.

No geral pode-se dizer que os cromossomos de Griffinia apresentam variação gradual no tamanho, embora em algumas espécies possam ser identificados de dois a quatro pares menores

(ver Figuras 7 e 8, espécies G. liboniana, G. espiritensis, G. concinna, G. sp1, G. sp2). Entretanto, essa diferença de tamanho ainda não caracteriza bimodalidade em Griffinia. Em Eithea e Tocantinia, a variação dos tamanhos cromossomos também é gradual (Figura 9).

Arroyo (1982) elaborou cariótipos de algumas espécies de Amaryllidacae (Hippeastrum, Phycella e Amaryllis). Verificou que algumas espécies de Hippeastrum apresentavam cariótipos biomodais, mas outras não. Dentre elas, H. blumenavia, (= Eithea blumenavia,) não apresentava bimodalidade, o que foi confirmado em nosso estudo.

Dentro do clado Hippeastroide (Tribos Griffineae e Hippeastreae), os estudos cariotípicos para

Griffineae são pioneiros. Contudo, estão disponíveis dados cariotípicos para Hippeastreae. No estudo de Arroyo (1982), apesar de não serem apresentadas fórmulas cariotípicas, os cariogramas apresentados mostram predomínio de cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos, com poucos cromossomos metacêntricos. Para E. blumenavia, embora o número cromossômico obtido no presente estudo seja diferente do encontrado pela autora, a morfologia dos cromossomos é

52 bastante semelhante, sendo que o par menor é metacêntrico em ambos os estudos. Para

Zephyranthes, outro gênero da tribo Hippeastreae, o trabalho desenvolvido por Felix et al. (2011) mostrou que para a maioria das espécies, os cromossomos são geralmente sumetacêntricos ou subtelocêntricos, com poucos cromossomos metacêntricos. O mesmo foi observado para os gêneros Placea (Perry & Schrader 2004) e Rodophiala (Muñoz et al. 2011).

Em tribos mais basais, proximamente relacionadas à tribo Griffineae, como Haemantheae, existem estudos para Clivia (Ran et al. 2001b) que mostram que a morfologia cromossômica é predominantemente submetacêntrica a subtelocêntrica. Para o gênero Cyrtanthus (Tribo

Cyrtantheae), Ising (1969, 1970) estudou 21 espécies e observou que na maioria delas, a morfologia predominante é também submetacêntrica a subtelocêntrica, com apenas alguns cromossomos metacêntricos.

Portanto, Griffinia, ao contrário dos representantes dos grupos mais proximamente relacionados, possui predominantemente cromossomos metacêntricos (Figuras 7 e 8, Tabela 2), configurando um cariótipo mais simétrico. Stebbins (1970) postulou que a partir de cariótipos simétricos (com cromossomos de tamanhos semelhantes e centrômeros medianos) existe uma tendência no sentido do aumento da assimetria cariotípica. Essa tendência não foi observada em Griffinia, que apesar de na filogenia ser apontado como um grupo bastante derivado em Amaryllidaceae, possui carótipos relativamente simétricos. Situações semelhantes já haviam sido relatadas para Amaryllidaceae, a exemplo do que ocorre em Lycoris (Stebbins 1970).

4.2. Bandamento CMA3 e FISH

+ Bandas CMA3 em posição terminal em Amaryllidaceae são frequentemente observadas e já foram reportadas para Zephyranthes (Felix et al. 2011b) Clivia (Ran et al. 1999), Crinum (Alam et al.

1998) e Narcissus (D’amato et al. 2004). Bandas em posição instersticial foram observadas para

Zephyranthes brachyandra (Felix et al. 2011a), porém, são menos frequentes.

A heterocromatina é reconhecida por variar quantitativa e qualitativamente em relativamente pouco tempo na escala evolutiva como consequência de mutações Robertsonianas e replicação de

DNA saltatório (Schweizer & Loidl 1987). Contudo, não foi observada muita variação no padrão de

+ bandas heterocromáticas CMA3 . Entre os padrões observados (duas, quatro, cinco e seis bandas), nenhum reúne espécies em concordância com a filogenia para o grupo (Preuss 1999) ou de alguma outra forma que pareça parcimoniosa. Embora todas as espécies do Complexo Liboniana possuam

+ um par cromossômico com bandas CMA3 , outras espécies apresentam o mesmo padrão a exemplo das espécies do subgênero Hyline. Da mesma forma, G. intermedia e G. parviflora, espécies proximamente relacionadas segundo a filogenia, apresentam respectivamente 4 e 5 cromossomos

+ com bandas CMA3 . Entretanto, como a maioria das espécies apresentou um par cromossômico

+ com banda CMA3 , pode-se inferir que essa seja possivelmente uma característica mais basal na história evolutiva do gênero.

Ao contrário dos resultados do bandamento com fluorocromos, a hibridização com DNAr 5s revelou um padrão de sítios para cada espécie, além de diferenças interpopulacionais. Assim, observando em conjunto os resultados de bandamento e hibridização, é possível tirar conclusões acerca das relações entre espécies. Como exemplo, algumas espécies do Complexo Liboniana

(populações de Nova Venécia e Barra do Colégio de G. espiritensis, G. liboniana e G. rochae)

+ apresentam um par cromossômico com banda CMA3 e dois pares de cromossomos metacêntricos com sítios de DNAr 5S, embora a posição dos sítios possa variar entre as espécies (Figuras 1 e 7).

Griffinia concinna, que também apresenta dois pares cromossômicos com sítios, difere das espécies

+ do Complexo Liboniana por possuir não um, mas dois pares cromossômicos com bandas CMA3

(Figuras 4 e 8). Da mesma forma, Griffinia intermedia, G. sp1 e G. sp2 apresentam 3 pares cromossômicos com sítios DNAr 5S, porém diferem entre si em número e posição dos sítios, bem

+ como em número e posição de bandas CMA3 e na morfologia cromossômica (Figuras 3, 5 e 8).

A variação cariotípica em Griffinia pôde ser observada não apenas entre as espécies, mas também entre populações de uma mesma espécie. Griffinia espiritensis de Nova Venécia apresenta sítios em posição terminal no braço longo do cromossomo 4 e no braço longo do cromossomo 6.

Para a mesma espécie, na população de Barra do Colégio, os sítios encontram-se em posição terminal no braço curto do cromossomo 1 e em posição pericentromérica no braço longo do cromossomo 6. Não só a disposição de marcadores, mas também a morfologia cromossômica difere entre as populações, sendo que uma apresenta a fórmula cariotípica 16M+1Sm+1St, enquanto a outra possui 18 cromossomos metacêntricos e dois cuja posição do centrômero não pôde ser identificada (Figuras 1 e 7). A espécie coletada em Barra do Colégio foi identificada pelo especialista na família como Griffinia affines espiritensis. As populações do Kautsky e de Domingos Martins possuem padrão semelhante entre si, e diferente das demais, exibindo um terceiro par cromossômico subtelocêntrico, com sítio de DNAr 5S no braço curto. Assim, essas populações fogem inclusive ao padrão que reúne as espécies do Complexo Liboniana (um par de cromossomos

+ com banda CMA3 e dois pares de cromossomos com sítio de DNAr 5S). Ainda que existam casos de variação dentro da espécie entre populações documentados para outras espécies (Almeida e

Pedrosa-Harand, 2011, Engel 2011), existe a possibilidade de a diferença cariotípica observada entre populações de uma mesma espécie em Griffinia não ser uma variação, mas sim um indicativo da necessidade de rever a taxonomia do grupo e, possivelmente, separar espécies.

Em G. liboniana, os sítios de DNAr 5S encontram-se em posição terminal e subterminal (2 sítios) no braço longo do cromossomo 1, e em posição subterminal no braço curto do cromossomo 3 para

55 a população de Itapebi. Indivíduos de Petrópolis da mesma espécie apresentam sítios nos cromossomos 3 e 6, em posição terminal e subterminal, respectivamente. Contudo, existe a possibilidade de essa diferença decorrer do fato de apenas uma metáfase ter sido medida. Para as populações de Jaguaré e Ceará embora não tenha sido possível determinar a morfologia cromossômica, é possível observar que a quantidade de bandas e sítios é semelhante à das demais populações. Existem diferenças na intensidade do sinal, a qual indica diferença no tamanho dos sítios de DNAr 5S. Porém essa diferença pode ser atribuída a variações decorrentes do isolamento entre as populações e, provavelmente, não é suficiente para separar as populações em espécies distintas.

Diferenças interpopulacionais também podem ser observadas em G. gardneriana. A população de Verdelândia possui onze cromossomos com sítios de DNAr 5S, sendo que um dos cromossomos, marcado com um sítio subterminal em cada um dos braços, não possui correspondência no conjunto cromossômico, constituindo portanto um caso de heteromorfismo. Canaã dos Carajás não apresenta heteromorfismos entre seus cromossomos. As populações compartilham 3 pares cromossômicos semelhantes para localização de sítios de DNAr 5S e morfologia (ver cromossomos em detalhes na figura 4, F e I). O cromossomo heteromórfico nas metáfases de Verdelândia também assemelha-se com um dos pares cromossômicos de Canaã dos Carajás. Para G. gardneriana ainda podem ser observados mais dois pares cromossômicos que diferem entre as populações. Todos esses cromossomos podem ser vistos em detalhe na figura 4 (F e I). Mais uma vez, embora as populações compartilhem semelhanças que apontam para uma certa proximidade evolutiva, talvez as diferenças justifiquem a separação dessas populações em espécies distintas.

Para Amaryllidaceae, não existem muitos estudos citológicos com FISH com os quais se possa comparar os dados obtidos no presente estudo. O trabalho citotaxonômico desenvolvido com Clivia, contudo, revelou um padrão conservado de sítios de DNAr 5S. Ran et al. (2001b) estudaram cinco

56 espécies de Clivia e observaram que, apesar de algumas variações no número e na localização de sítios de DNAr 45S e bandas heterocromáticas, todas as espécies apresentaram um único sítio de

DNAr 5S, sempre em posição intersticial no braço curto do cromossomo 8. Na verdade, apesar de a sequência do DNAr 5S ser um pouco variável, seu padrão de distribuição é mais constante, ocorrendo geralmente em um único par cromossômico e, menos frequentemente em dois pares ou mais (Guerra 2004). Assim, o gênero Clivia está de acordo com essa tendência, mas Griffinia (ou algumas de suas espécies), não. Outro exemplo que foge à tendência geral de estabilidade para os sítios de DNAr 5S pode ser observado para o gênero Lycoris. Cada espécie exibe de quatro a 14 sítios de DNAr 5s distribuídos em diferentes posições nos cromossomos (Chang et al. 2009).

A partir da variação em número e posição de sítios de DNAr 5S observada em Griffinia, é possível sugerir que inversões, translocações e rearranjos estejam envolvidas na diversificação de espécies.

As forças responsáveis pelo estabelecimento das inversões, assim como sua significância para a evolução, permaneçam desconhecidas. Contudo, já é conhecida sua importância no isolamento de populações e na especiação (Kirkpatrick e Barton 2005). Para espécies do gênero Lycoris, além das fusões e fissões, inversões também estão envolvidas na evolução cromossômica (Chang et al.

2009). Rearranjos de braços inteiros de cromossomos também já foram observadas em

Amaryllidaceae, assim como amplificação de sequências repetitivas (DNAr 5S, DNAr 45S e sequências teloméricas), seguida da adição dessas sequências às extremidades de cromossomos quebrados sendo esses eventos seriam responsáveis por mudanças cariotípicas (Jones 1998).

As espécies de grupos externos possuem cariótipos bastante distintos entre si, e distintos também das espécies de Griffinia, corroborando a circunscrição dessas espécies em gêneros distintos. Análises com mais marcadores poderiam indicar quais fenômenos - poliploidização, fissão, fusão, entre outros – estariam envolvidos na diversificação dessas espécies.

A elaboração de cariótipos com aplicação de bandamento CMA3/DAPI e FISH é inédita para todas espécies estudadas, e mostrou-se uma ferramenta útil à taxonomia. O número cromossômico manteve-se constante em Griffinia e diferiu entre os gêneros, confirmando a delimitação desses grupos. No que diz respeito ao bandamento, ainda que bandas heterocromáticas não tenham por si só delimitado espécies ou grupos, somadas às informações de tamanho, morfologia e posição de sítios de DNAr 5S, essas bandas ajudaram a diferenciar as espécies. Diferentemente dos marcadores obtidos por bandamento, os marcadores oriundos da FISH podem, por si só, auxiliar na compreensão das relações filogenéticas, uma vez que sua distribuição diferencial entre as espécies caracteriza um pequeno grupo (Complexo Liboniana).

Os resultados do presente estudos sugerem a necessidade de novos estudos morfológicos para identificações mais precisas das espécies de Griffinia. As informações citológicas devem também ser consideradas caracteres taxonômicos.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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