Intracelulární Symbionti Krevsajících Dvoukřídlých Skupiny Hippoboscoidea
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Přírodovědecká fakulta Intracelulární symbionti krevsajících dvoukřídlých skupiny Hippoboscoidea Bakalářská práce Eva Šochová Školitel: RNDr. Filip Husník České Budějovice 2014 Šochová, E., 2014: Intracelulární symbionti krevsajících dvoukřídlých skupiny Hippoboscoidea. [The intracellular symbionts of blood-feeding Diptera group Hippoboscoidea. Bc. Thesis, in Czech.] – 63 p., Faculty of Science, University of South Bohemia, České Budějovice, Czech Republic. Anotace: Blood-sucking parasites from the Hippoboscoidea group (Insecta: Diptera) harbor symbiotic bacteria providing them with B-vitamins and cofactors missing from their blood diet. Although including medically important vectors such as tsetse flies, evolutionary history of symbiosis in the whole group is poorly understood. This thesis is focused on analysis of symbionts in the Hippoboscidae family (parasites of birds and mammals). Phylogenetic approach was employed to determine lineages of obligatory and facultative symbionts present in this group. Results of the study indicate that relationships between Hippoboscoidea and their symbionts are extremely dynamic with frequent replacements of obligate symbionts. To which extent is this dynamic evolutionary history of symbiotic systems in Hippoboscoidea caused by features of their parasitic lifestyle (e.g. host switches from mammals to birds) will be an interesting question for further studies. Prohlašuji, že svoji bakalářskou práci jsem vypracovala samostatně, pouze s použitím pramenů a literatury uvedených v seznamu citované literatury. Prohlašuji, že v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb. v platném znění souhlasím se zveřejněním své [bakalářské – diplomové] práce, a to [v nezkrácené podobě – v úpravě vzniklé vypuštěním vyznačených částí archivovaných Přírodovědeckou fakultou] elektronickou cestou ve veřejně přístupné části databáze STAG provozované Jihočeskou univerzitou v Českých Budějovicích na jejích internetových stránkách, a to se zachováním mého autorského práva k odevzdanému textu této kvalifikační práce. Souhlasím dále s tím, aby toutéž elektronickou cestou byly v souladu s uvedeným ustanovením zákona č. 111/1998 Sb. zveřejněny posudky školitele a oponentů práce i záznam o průběhu a výsledku obhajoby kvalifikační práce. Rovněž souhlasím s porovnáním textu mé kvalifikační práce s databází kvalifikačních prací Theses.cz provozovanou Národním registrem vysokoškolských kvalifikačních prací a systémem na odhalování plagiátů. V Českých Budějovicích, 25. dubna 2014 Eva Šochová Poděkování: Ráda bych poděkovala svému školiteli Filipu Husníkovi za cenné a užitečné rady při laboratorní práci a provádění fylogenetických analýz, Evě Novákové za poskytnutí jejích dat, Alimu Halaijanovi a Kateřině Sam za sbírání vzorků klošů. Obsah 1. Úvod 1 1.1. Symbióza 1 1.2. Obligátní a fakultativní symbionti hmyzu 1 1.3. Nejčastější symbionti skupiny Hippoboscoidea 2 1.3.1. Arsenophonus (Gammaproteobacteria: Enterobacteriaceae) 3 1.3.2. Sodalis (Gammaproteobacteria: Enterobacteriaceae) 4 1.3.3. Wolbachia (Alphaproeobacteria: Rickettsiaceae) 6 1.4. Hippoboscoidea (Insecta: Diptera) 7 1.4.1. Glossinididae 8 1.4.2. Nycteribiidae a Streblidae 12 1.4.3. Hippoboscidae 13 2. Cíle 15 3. Materiály a metody 16 3.1. Vzorky a izolace DNA 16 3.2. Polymerázová řetězová reakce 18 3.3. Gelová elektroforéza 20 3.4. Klonování a transformace 21 3.5. Skládání sekvencí 21 3.6. Alignmenty a fylogenetické analýzy 22 3.7. MLST analýza wolbachie 23 3.8. Mitochondriální genomy 23 4. Výsledky 23 4.1. Sekvence a fylogenetické stromy 23 4.2. Mitochondriální genomy 24 5. Diskuze 33 5.1. Robustní fylogeneze hostitelů – zásadní faktor pro mapování evoluce symbiózy 33 5.2. 16S rRNA gen a jeho použitelnost pro fylogeneze symbiotických bakterií 36 5.3. Dynamika vztahů symbiont-parazit(Hippoboscoidea)-hostitel 36 5.4. Jaká je role Wolbachie v krevsajícím hmyzu? 38 6. Závěr 39 7. 7. Přílohy 39 8. 8. Elektronické přílohy 41 9. 9. Seznam použité literatury 41 1. Úvod 1.1. Symbióza Termín symbióza byl poprvé použit Antonem de Barrym v polovině 19. století jako ,,soužití různých druhů“. Zásadními symbiotickými kroky evoluce bylo pozření jedné prokaryotické buňky jinou prokaryotickou buňkou za vzniku buňky eukaryotické a jejích organel, mitochondrií a plastidů (Margulis, 1973). Symbióza je všudypřítomná asociace týkající se většiny organismů, od Archea přes Bacteria až po Eucaryota. Houby vytváří asociace typu mykorhiza (Wilkinson, 2001) nebo se podílí na vzniku lišejníků. Rostliny využívají opylovače a roznašeče semen, nebo hlízkové bakterie pro fixaci dusíku (Jones et al., 2007). Člověk například využil domestikace hospodářských zvířat a plodin v zemědělství. Střevní mikrobiom a genom hostitele tvoří koadaptovaný komplex, hologenom, který je důležitý pro speciaci a je považován za jednotku selekce v evoluci (Zilber-Rosenberg & Rosenberg, 2008; Brucker & Bordenstein, 2013). 1.2. Obligátní a fakultativní symbionti hmyzu Obligátní symbionti jsou nutní pro podporu normálního vývoje hostitele (Moran et al., 2008). Obligátní symbionti poskytují svým hostitelům látky chybějící nebo nedostatečně zastoupené v jejich potravě (Baumann, 2005). Vyskytují se především u hmyzu sajícího na rostlinách, kde doplňují esenciální aminokyseliny chybějící ve floému a xylému (Douglas et al., 1998; Baumann, 2005), a u obligátně krevsajících členovců, kterým poskytují B vitamíny a kofaktory (Aksoy, 2003). Jejich výskyt v hostiteli je omezen na specializovaný orgán zvaný bakteriom, který je tvořený skupinou specializovaných buněk hostitele zvaných bakteriocyty. Bakteriom může být tvořen z buněk tukového tělesa, buněk střevní stěny nebo vysoce specializovanými buňkami, které jsou vývojově určeny v embryu (Buchner, 1965; Braendle et al., 2003). Obligátní symbionti jsou přenášeni vertikálně a ko-divergují se svým hostitelem, protože jejich asociace s hostitelem vznikla před miliony let. Obligátní symbionti jsou nutní pro vývoj a reprodukci hostitele, a proto nedochází příliš často k jejich úplné ztrátě (Moran et al., 2008), spíše jsou nahrazeni jinou linií symbionta, nebo doplněni dalším obligátním ko-symbiontem. Tyto příklady jsou známy téměř ze všech symbiotických skupin hmyzu a jsou nejlépe zmapované pro skupinu Auchenorrhyncha (Moran et al., 2005; 1 McCutcheon et al., 2009; Koga et al., 2013). Mikroorganismem, který nahrazuje, nebo doplňuje, obligátního symbionta a přebírá jeho funkci, může být velmi často fakultativní symbiont. Pro obligátní symbionty je typická extrémní redukce genomu. Také je pro ně běžné zastoupení nukleotidů bohaté na adenin a thymin. Dalším charakteristickým znakem je rychlá evoluce sekvencí, která vede k zrychlení substituce aminokyselin ve všech genech. U obligátních symbiontů chybí mobilní elementy, bakteriofágové, většina repetitivní DNA a také obsahují málo pseudogenů (Moran et al., 2008). Fakultativní symbionti tvoří heterogenní skupinu s ohledem na jejich funkci i lokalizaci v hostiteli (Baumann, 2005). Fakultativní symbionti nejsou nutní pro reprodukci hostitele (Moran et al., 2008). Jsou podobní invazivním patogenům svou schopností napadat různé buňky včetně reproduktivních orgánů a také se vyskytují v hemolymfě (Dobson et al., 1999; Fukatsu et al., 2000). Pro zajištění úspěšného šíření ovlivňují fakultativní symbionti hostitelův fenotyp dvěma způsoby. V prvním případě zvyšují hostitelovu životnost, například ochranou proti přirozeným nepřátelům, nepříznivým environmentálním podmínkám jako je teplota (Oliver et al., 2010) a poskytováním různých metabolitů (Moran et al., 2008). Druhým mechanismem je indukce reprodukčních fenotypů. Strategií přenosu v populaci je přeměna samců na samice. Toho může být dosaženo feminizací nebo indukcí thelytokie. Zvýšená produkce dcer samicí je dosažena pomocí zabíjení samců/synů (male- kiling/son-killing). Poslední strategií, kterou reprodukční manipulátoři užívají je cytoplasmatická inkompatibilita (Stouthamer et al., 1999). Fakultativní symbionti se šíří horizontálním přenosem jak mezi hostiteli jednoho druhu, tak i mezi hostiteli různých druhů (O´Neil et al., 1992; Sandström et al., 2001). Vzhledem k tomu, že mnoho fylogeneticky jasně vymezených skupin symbiotických bakterií obsahuje obligátní i fakultativní symbionty, zřejmě dochází k přechodu od fakultativního k obligátnímu životnímu stylu. Obligátní symbionti se tak pravděpodobně často vyvíjí z fakultativních symbiontů, kteří ztratili schopnost horizontálního přenosu a byli domestikováni hostitelem. Genomy fakultativních symbiontů obsahují mnoho repetitivních úseků, velké množství mobilních elementů, plazmidy, bakteriofágy a geny od nich odvozené (Moran et al., 2008). 1.3. Nejčastější symbionti skupiny Hippoboscoidea Níže jsem rozepsala obecnou charakteristiku třech rodů bakterií, které jsou pro skupinu Hippoboscoidea nejčastějšími symbionty. Mikrobiomy krevsajícího hmyzu jsou obecně velmi chudé. Kromě endosymbiotických bakterií může mikrobiom dále obsahovat 2 bakterie získané z prostředí (Geiger et al., 2009; Lindh & Lehane, 2011) nebo patogenní bakterie savců jako například Bartonella spp. (Morse et al., 2012b). 1.3.1. Arsenophonus (Gammaproteobacteria: Enterobacteriaceae) Rod Arsenophonus vytváří polyfyletickou skupinu se širokým spektrem hostitelů a symbiotických vztahů od fakultativních reprodukčních manipulátorů ke koevolvujícím obligátním mutualistům. Zahrnuje jak fakultativní symbionty, tak obligátní symbionty, a proto v tomto rodu vzniká mnoho nejasností ve fylogenezi i taxonomii celé skupiny. Do rodu Arsenophonus dle fylogenetických