Pedro Tiago Cardoso Pedro Cardoso Tiago Curto ? ? ATHOGENICITY P ICKETTSIAL ICKETTSIAL R O T INK INK L A : Pedro Tiago Cardoso Curto ROPISM T RICKETTSIA-MACROPHAGE TROPISM: A LINK TO RICKETTSIAL PATHOGENICITY? ACROPHAGE ACROPHAGE -M ICKETTSIA R Tese no âmbito do Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, especialidade em Biotecnologia e Saúde orientada pela Doutora Isaura Isabel Gonçalves Simões e pelo Doutor Juan J. Martinez e apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra. Julho de 2018 Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra RICKETTSIA-MACROPHAGE TROPISM: A LINK TO RICKETTSIAL PATHOGENICITY? Pedro Tiago Cardoso Curto Tese no âmbito do programa doutoral em Biologia Experimental e Biomedicina, na área de Biotecnologia e Saúde orientada pela Doutora Isaura Isabel Gonçalves Simões e pelo Doutor Juan J. Martinez e apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra. Julho de 2018 Este trabalho foi realizado no grupo biotecnologia molecular e microbiana do Centro de Neurociências e Biologia Celular (Universidade de Coimbra, Portugal) e no departamento de ciências patobiológicas da Universidade do Estado de Louisiana, orientado pela Doutora Isaura Simões e Doutor Juan J. Martinez. Pedro Tiago Cardoso Curto é um estudante do programa doutoral em biologia experimental e biomedicina do Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra, Portugal. Este trabalho foi elaborado ao abrigo de uma bolsa de doutoramento financiada pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT, SFRH/BD/96769/2013) suportada por Fundos nacionais do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior e pelo Fundo Social Europeu através do POCH – Programa Operacional Capital Humano. Parte do trabalho foi financiado pelo projeto com a referência POCI-01- 0145-FEDER-029592, financiado pelo Programa Operacional Competitividade e Internacionalização na sua componente FEDER e pelo orçamento da Fundação para a Ciência e a Tecnologia na sua componente OE; por fundos FEDER através do Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE 2020 e por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do projeto Estratégico com referência atribuída pelo COMPETE: POCI-01-0145-FEDER- 007440 (ref.; UID/NEU/04539/2013); pelo projeto PTDC/SAU-MII/107942/2008; e pelo “National Institute of Allergy and Infectious Diseases of the National Institutes of Health” através dos projetos R01AI072606 and 5R21AI111086-02. RICKETTSIA‐MACROPHAGE TROPISM: A LINK TO RICKETTSIAL PATHOGENICITY? III Agradecimentos / Acknowledgments Uma tese de doutoramento consiste em uma busca incessante pelo conhecimento. Para mim, desde que me lembro de conseguir pensar, que me fascina entender o que ainda não é compreendido. Contudo, descobrir algo novo é um processo longo, duro, com obstáculos e que requer muita persistência, apoio e suporte de várias pessoas. Desta forma, gostaria de deixar algumas palavras de profundo e sincero agradecimento a todos aqueles que, de alguma forma, deixaram o seu contributo durante este percurso. Em primeiro lugar, gostaria de deixar um agradecimento especial à minha orientadora Doutora Isaura Simões. No entanto, sinto que as palavras que escolherei serão sempre poucas. Muito obrigado por todos estes momentos de partilha e amizade. Irei, para sempre, apreciar ter tido a oportunidade de trabalhar consigo. A sua forma de ver e fazer ciência é algo que me fascina. Obrigado por todo o seu apoio, ajuda e amizade ao longo destes anos. O caminho nem sempre tem sido fácil mas, é quando assim é, que se vêm os verdadeiros laços. Muito obrigado por tudo. Faço votos para o caminho que iremos percorrer seja carregado de sucesso. To Doctor Juan J. Martinez, who kindly welcomed me in his lab, I deeply appreciate the opportunity to perform science in a different country and environment. Working alongside you allowed me to immerse myself in diversity by operating with different people, different backgrounds, and different mentalities. Additionally, our collaboration gave me a chance to be in touch with different methods of doing science. Thank you for your friendship and you are always welcome in Portugal. Gostaria também de extender os meus sinceros agradecimentos a todos os membros que partecem, ou em algum momento perteceram, ao laboratório de Biotecnologia Molecular do CNC por terem dado o seu contributo no meu crescimento enquanto cientista e pessoa. Assim, deixo um agradecimento especial ao Doutor Pedro Castanheira, Doutor Rui Cruz, Doutor André Soares, Doutora Ana Sofia Lourenço, Carla Almeida, Liliana Antunes, Paulo Santo, Ana Rita Leal e a todos os outros, pelos bons momentos de amizade e boa disposição. RICKETTSIA‐MACROPHAGE TROPISM: A LINK TO RICKETTSIAL PATHOGENICITY? V I would also like to extend my acknowledgments to everyone who made my experience at LSU so meaningful. Thus, I would like to thank Doctor Sean Riley, Doctor Kevin Macaluso and his lab members, Doctor Abbie Fish, Doctor Emma Harris, Daniel Garza, Nam, Bee, Ryan Avery and all the others that made Baton Rouge a welcoming home. To Matt, I don’t have the words to describe how important you were during my time in the States. Thanks for all the moments of joy and sharing that I will forever carry with me. You made my life in Baton Rouge so much easier and enjoyable. Because of the moments we shared, returning home was nothing short of arduous. I will always miss those moments and I have high hopes that our friendship stays strong. Saudades Gostaria de agradecer aos restantes colegas e amigos do UC-Biotec pelas boas recordações e momentos vividos. Assim, agradeço a todos os membros do laboratório do Doutor Ricardo Pires e do Doutor Bruno Manadas. Não poderia passar sem deixar um agradecimento especial à Cátia Santa e a Doutora Sandra Anjo pela ajuda e apoio na interpretação dos resultados de espectrometria de massa. A todos os meus amigos, um enorme obrigado por estarem sempre presentes e por partilharem comigo muitos momentos especiais. Assim, gostaria de deixar um agradecimento especial à Isabel, Luís, Carla, Daniela Faria, Joana Novo e à sua princesa Benedita, Andreia Filipa |risinhos daqueles| e Daniela Filipa. Por fim, gostaria de agradecer a toda a minha família por me ensinarem a ser quem sou. Aos meus Pais, Avós, Irmão, Tia Rosa e primo Marcelo deixo um grande obrigado por toda esta força e momentos de partilha. As batalhas têm sido duras, mas os bons momentos serão, para sempre, parte de nós. A força e a persistência que nos caracteriza está também presente neste documento. RICKETTSIA‐MACROPHAGE TROPISM: A LINK TO RICKETTSIAL PATHOGENICITY? VI Resumo Os membros do género Rickettsia são bactérias intracelulares obrigatórias, cuja transmissão a humanos pode ocorrer através de vetores artrópodes. São responsáveis por infeções severas, das quais se destacam a febre maculosa das montanhas rochosas (Rickettsia rickettsii) e a febre escaro- nodular (Rickettsia conorii). Embora o papel das células endoteliais no desenvolvimento de doenças provocadas por Rickettsia esteja bem estudado, nenhuma função foi até agora atribuída a outros tipos celulares para o desenvolvimento da infeção. Contudo, evidências obtidas em modelos animais demonstraram a presença de bactérias intactas em vários tipos de células, tais como macrófagos, neutrófilos e hepatócitos, levantando diversas questões acerca da função desempenhada por estas células no desenvolvimento de rickettsioses. Curiosamente, evidências experimentais com mais de quarenta anos mostram que estirpes de Rickettsia do grupo tifo, com diferentes graus de patogenicidade em humanos, apresentam padrões de crescimento distintos em culturas celulares de macrófagos. No entanto, estes resultados permaneceram por explorar e os mecanismos moleculares que definem e distinguem patogenicidade entre espécies do género Rickettsia continuam por esclarecer. Este trabalho mostra que duas espécies de Rickettsia do grupo das febres exantemáticas, com diferentes graus de patogenicidade em humanos, também apresentam fenótipos intracelulares distintos em células THP-1 diferenciadas em macrófagos. Especificamente, a bactéria patogénica (R. conorii) sobrevive e prolifera dentro destas células fagocitárias, enquanto que a bactéria não patogénica (R. montanensis) é rapidamente eliminada. Estes resultados reforçam uma possível correlação entre patogenicidade no géneroRickettsia e a capacidade de sobreviver e proliferar em macrófagos, e sugerem o reposicionamento dos macrófagos comoementos el centrais no desenvolvimento da infeção. Assim, o estudo detalhado dos mecanismos moleculares que regulam a interação de bactérias do géneroRickettsia com macrófagos é fundamental para uma melhor compreensão da doença. Usando R. conorii e R. montanensis como modelos de estudo, demonstrámos também que estas duas espécies de Rickettsia apresentam requisitos distintos no que respeita aos fatores de sinalização do hospedeiro recrutados durante o processo de invasão de células do tipo macrófago. O RICKETTSIA‐MACROPHAGE TROPISM: A LINK TO RICKETTSIAL PATHOGENICITY? VII processo de entrada da bactéria patogénica R. conorii revela uma maior dependência da atividade da cinase PAK1 e de trocadores de N+/H+ (NHE), características de mecanismos de endocitose do tipo macropinocitose. Os nossos resultados sugerem assim que a bactéria R. conorii usa um mecanismo alternativo de entrada do tipo macropinocitose, envolvendo o eixo de sinalização PAK-NHE-TK. A utilização