Diss Kerstin Nagel.Pdf

Naturstoffe algenassoziierter Bakterien & Naturstoffe der Gattung Pseudomonas und deren Bedeutung für die Braunalge Saccharina latissima

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

vorgelegt von Dipl. Ing. (FH) Kerstin Nagel

Kiel 2013 II

Erster Gutachter: Prof. Dr. Johannes F. Imhoff

Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Florian Weinberger

Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2013

Zum Druck genehmigt: Kiel, 18.12.2013

gez. Prof Dr. Wolfgang J. Duschl, Dekan III

Die praktischen Arbeiten wurden am Kieler Wirkstoff-Zentrum am Helm- holtz-Zentrum für Ozeanforschung Kiel GEOMAR an der Christian- Albrechts-Universität zu Kiel von Januar 2008 bis März 2011 unter der An- leitung von Prof. Dr. Johannes F. Imhoff durchgeführt. IV

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit unter Einhaltung der Regeln guter wissenschaftlicher Praxis der Deutschen Forschungsgesell- schaft verfasst habe, und dass sie nach Form und Inhalt meine eigene Ar- beit ist. Außer den angegebenen Quellen und Hilfsmitteln wurden keine weiteren verwendet. Sie wurde keiner anderen Stelle im Rahmen eines Prüfungsverfahrens vorgelegt. Dies ist mein erstes und bisher einziges Promotionsverfahren.

(Kerstin Nagel)

Ein Teil der während der Doktorarbeit erzielten Ergebnisse wurde in den folgenden Artikeln bzw. Tagungsbeiträgen veröffentlicht:

Publikationen:

Wiese, J., Thiel V., Nagel K., Staufenberger T., and Imhoff J. F. (2009). Diversity of antibiotic-active bacteria associated with the brown alga Lam- inaria saccharina from the Baltic Sea. Mar Biotechnol 11:287–300.

Nagel, K., Schneemann, I., Kajahn, I., Labes, A., Wiese, J. und Imhoff, J. F. (2012). Beneficial effects of 2,4-diacetylphloroglucinolproducing Pseu- domonads on the marine alga Saccharina latissima. Aquat Microb Ecol, 67 (3). pp. 239-249.

Ohlendorf, B., Schulz, D., Erhard, A., Nagel, K. und Imhoff, J. F. (2012). Geranylphenazinediol, an acetylcholinesterase inhibitor produced by a Streptomyces species. J Nat Prod, 75 (7). pp. 1400-1404.

Tagungsbeiträge:

Wiese, J., Gärtner, A., Heindl, H., Kajahn, I., Krämer, M., Labes, A., Lang, G., Mitova, M., Nagel, K., Schmaljohann, R., Schneemann, I., Stöhr, R., Thiel, V., Yu, Z. und Imhoff, J. F. (2008) Marine microbial resources [Pos- ter] In: 2. Bi-Annual Symposium "The Future Ocean", 06.-09.10, Kiel.

Nagel, K., Schneemann, I., Wiese, J., Kajahn, I., Labes, A. und Imhoff, J. F. (2009) Ecological impact of biologically active metabolites produced by Laminaria saccharina associated Pseudomonas sp. strains [Poster] In: 6th European Conference on Marine Natural Products, 19.-23.07, Porto, Por- tugal.

Baumann, H. I., Wiese, J., Gärtner, A., Goecke, F. R., Heindl, H., Kajahn, I., Kleinschmidt, K., Labes, A., Nagel, K., Neulinger, S., Ohlendorf, B., Schneemann, I., Schulz, D., Staufenberger, T., Thiel, V., Zinecker, H. und Imhoff, J. F. (2009) Biological role of secondary metabolites from marine microorganisms [Vortrag] In: VAAM-Symposium "Symbiotische Interakti- onen", 19.-20.11, München.

Nagel, K., Schneemann, I., Kajahn, I., Wiese, J., Labes, , Lang, G., Goe- cke, F. R., Thiel, V. und Imhoff, J. F. (2009). Ecological impact of biologi-

VI cally active metabolites produced by Laminaria saccharina associated Pseudomonas sp. strains [Poster] In: VAAM Jahrestagung, 08.-11.03, Bo- chum.

Nagel, K., Schneemann, I., Kajahn, I., Wiese, J., Labes, A. und Imhoff, J. F. (2010) Pseudomonads in association with Saccharina latissima – evidence of a beneficial interaction in marine environments? [Poster] In: In- ternational VAAM-Workshop "Biology of bacteria producing natural products", 26.-28.09., Tübingen.

Labes, A., Nagel, K., Schneemann, I., Wiese, J. und Imhoff, J. F. (2011) From marine ecology to marine biotechnology – Small bioactive molecules in biological interactions and biotechnological applications [Poster] In: Cluster retreat Future Ocean, 28.-29.03., Schleswig.

Wiese, J., Schulz, D., Stöhr, R., Nagel, K., Labes, A., Schneemann, I., Heindl, H., Jansen, N., Silber, J., Kramer, A., Goecke, F. R., Schmaljo- hann, R., Staufenberger, T., Gärtner, A., Baumann, H. I., Kleinschmidt, K. und Imhoff, J. F. (2011). Biologically active compounds from microorganisms derived from marine macroorganisms and marine sediments [Poster] In: NatPharma: Nature Aided Drug Discovery, NADD, 05.-09.06., Napoli, Italy.

INHALTSVERZEICHNIS

Inhalt

1 Einleitung ...... 1 1.1 Entwicklung von Naturstoffen am Beispiel von Antibiotika ...... 2 1.2 Marine Naturstoffe ...... 5 1.3 Assoziationen mariner Mikroorganismen ...... 8 1.4 Algen ...... 10 1.5 Pseudomonaden ...... 14 1.6 Pflanzen-assoziierte Pseudomonaden ...... 15 1.7 Fragestellung dieser Arbeit ...... 17 2 Material und Methoden ...... 19 2.1 Nährmedien und Puffer...... 19 2.2 Chemikalien ...... 23 2.3 Kits ...... 24 2.4 Geräte ...... 24 2.5 Probenahme ...... 26 2.6 Isolierung und Identifizierung der Bakterienstämme ...... 27 2.7 Konservierung der Bakterienstämme ...... 29 2.8 Molekularbiologische Methoden ...... 30 2.8.1 DNA-Extraktion ...... 30 2.8.2 Polymerase Kettenreaktion ...... 30 2.8.3 Sequenzierung ...... 31 2.9 Phylogenetischer Stammbaum von Pseudomonas-Stämmen ...... 32 2.10 Untersuchungen zu Pseudomonas sp. LD120 ...... 33 2.10.1 BIOLOG GN2 ...... 33 2.10.2 Substratverwertung ...... 34 2.10.3 Fluoreszensnachweis ...... 34 2.11 Anzucht und Extraktion der Bakterienkulturen ...... 34 2.11.1 Anzucht auf Agarplatten ...... 34 2.11.2 Anzucht in Flüssigkultur ...... 35 2.11.3 Extraktion der Agarplatten ...... 35 2.11.4 Extraktion der Kulturen im 25/100 mL Maßstab ...... 35 2.11.5 Extraktion der Kulturen im 1 L Maßstab und Großansatz ...... 36 2.12 Chromatographie ...... 36 2.12.1 Analytische Chromatographie ...... 37

INHALTSVERZEICHNIS

2.12.2 Präparative Chromatographie ...... 37 2.12.3 Semi-Präparative Chromatographie ...... 38 2.13 Dereplikation ...... 39 2.14 NMR-Spektroskopie ...... 39 2.15 Bioassays ...... 39 2.15.1 Antibiotische Bioassays ...... 40 2.15.2 Enzyminhibitionsassays ...... 41 2.15.3 Zellkulturbasierte Assays ...... 42 2.15.4 Bakterien aus der KiWiZ-Sammlung ...... 43 3 Ergebnisse ...... 44 3.1 Isolierung biologisch aktiver Bakterien ...... 44 3.2 Sind diese Bakterien mit S. latissima assoziiert? ...... 57 3.3 Physiologisches Profil von Pseudomonas sp. LD120 ...... 60 3.4 Charakterisierung von Pseudomonas sp. LD120 ...... 61 3.5 Antimikrobielle Metabolite von Pseudomonas sp. LD120 ...... 62 3.6 Screening der Naturstoffproduktion Algen-assoziierter Bakterien ...... 62 3.6.1 Naturstoffproduktion von Bacillus sp. (Stamm LB084) ...... 64 3.6.2 Naturstoffproduktion von Kiloniella laminariae (Stamm LD81) ...... 66 3.6.3 Stimulationsexperiment mit Kiloniella laminariae (Stamm LD81) .... 67 3.6.4 Naturstoffproduktion von Pseudoalteromonas sp. (Stamm LB034) .. 69 3.6.5 Naturstoffproduktion von Streptomyces sp. (Stamm LB058) ...... 70 3.6.6 Naturstoffproduktion von Streptomyces sp. (Stamm LB114) ...... 72 3.6.7 Kultivierungsexperimente von Streptomyces sp. (Stamm LB114) ... 74 3.6.8 Naturstoffproduktion von Streptomyces sp. (Stamm LB129) ...... 76 3.6.9 Naturstoffproduktion von Streptomyces sp. (Stamm LB173) ...... 78 3.6.10 Naturstoffproduktion von Amycolatopsis sp. (Stamm LB152) ...... 79 3.6.11 Naturstoffproduktion von Pseudomonas sp. (Stamm LB012) ...... 80 3.6.12 Naturstoffproduktion von Pseudomonas sp. (Stamm LD120) ...... 83 3.6.13 Kultivierungsexperimente von Pseudomonas sp. (Stamm LD120) ... 85 3.6.14 Kultivierungsexperimente von Pseudomonas sp. (Stamm LB042) ... 91 3.6.15 Kultivierungsexperimente von Pseudomonas sp. (Stamm LB061) ... 93 3.6.16 Extraktion von Pseudomonas-Agarkulturen ...... 99 3.7 Bioaktivitätsscreening isolierter Naturstoffe...... 102 3.7.1 Biologische Aktivität der Substanzen von Pseudomonas sp...... (Stamm LB012) ...... 103

INHALTSVERZEICHNIS

3.7.2 Biologische Aktivität der Substanzen von Pseudomonas sp...... (Stamm LD120) ...... 104 3.7.3 Biologische Aktivität der Substanzen von Streptomyces sp...... (Stamm LB058) ...... 106 3.7.4 Biologische Aktivität der Substanzen von Streptomyces sp...... (Stamm LB114) ...... 109 4 Diskussion ...... 111 4.1 Stimulationsexperimente ...... 111 4.2 Ökologische Bedeutung von Pseudomonas sp. LD120 ...... 114 4.2.1 Einfluss der Stoffwechselphysiologie auf S. latissima ...... 114 4.2.2 Einfluss bakterieller Sekundärmetabolite auf S. latissima ...... 116 4.3 Potential bakterieller Naturstoffproduzenten ...... 119 4.3.1 Bacillus sp. (Stamm LB084) ...... 119 4.3.2 Kiloniella laminariae (Stamm LD81T) ...... 120 4.3.3 Pseudoalteromonas sp. (Stamm LB034) ...... 120 4.3.4 Actinomyceten ...... 122 4.3.5 Pseudomonaden ...... 123 4.3.5.1 Pseudomonas-Stamm LB012 ...... 123 4.3.5.2 Pseudomonas-Stamm LD120 ...... 125 4.4 Untersuchungen zur Veränderung des Metabolitprofils ...... 126 4.4.1 Kultivierungsexperimente mit Streptomyces sp. LB114 ...... 126 4.4.2 Kultivierungsexperimente mit Pseudomonas sp...... (LB042, LB061, LD120) ...... 127 4.4.3 Agarplatten-Screening ...... 128 4.5 S. latissima assoziierte Bakterien ...... 129 4.6 Isolierung von Pseudomonaden ...... 131 4.7 Abschließende Diskussion und Ausblick ...... 133 5 Zusammenfassung ...... 136 6 Summary ...... 137 7 Danksagung ...... 138 8 Literatur ...... 140 9 Anhang ...... 167 10 Abkürzungen ...... 174 11 Lebenslauf ...... 177

EINLEITUNG

1 Einleitung Der Mensch nutzt bereits seit Jahrtausenden mikrobielle Stoffwechselleis- tungen. In Ägypten und Babylon wurden schon vor 5000 Jahren Mikroor- ganismen zur Herstellung alkoholischer Getränke, bei der Sauerteigzube- reitung und der Essigsäuregewinnung verwendet (Syldatk 2006). Im 14. Jahrhundert erfolgte die Essigherstellung bereits in größerem Maßstab (Orleans-Verfahren).

Abbildung 1: Einsatz von Mikroorganismen und deren Stoffwechselleistungen im Dienst des Menschen (Modifiziert nach Munk 2008).

Die Biotechnologie hat sich seit dem stetig weiter entwickelt und hat so zur gesellschaftlichen Entwicklung des Menschen beigetragen. Besonders rasant fand die Entwicklung neuer Prozesse in Zeiten materieller Engpässe statt, wie z.B. die Entwicklung der Antibiotika während des zweiten Welt- krieges (Ulber & Soyez 2004). Heute ist die Biotechnologie ein zukunfts- trächtiger Industriezweig mit vielen Anwendungsmöglichkeiten (siehe Ab-

EINLEITUNG bildung 1). Mikroorganismen und deren Enzyme finden Eingang in die Le- bensmittelherstellung, Gesundheit, Pharma, Chemie und im Pflanzen- und Umweltschutz (Gavrilescu & Chisti 2005).

1.1 Entwicklung von Naturstoffen am Beispiel von Antibiotika

Eine der wichtigsten Entdeckungen in der Geschichte der Medizin war die Entdeckung der Antibiotika (Davies & Davies 2010). Durch diese Art der Therapie konnten sehr viele Leben gerettet (Aminov 2009) (Davies & Davies 2010) und die durchschnittliche Lebenserwartung verlängert werden (Lederberg 2000). Trotzdem sind Infektionskrankheiten weltweit immer noch die häufigste Todesursache, wobei die Letalität durch Infekti- onskrankheiten in Entwicklungsländern deutlich höher ausfällt als z.B. Westeuropa (Sonntag 2012). Zu den 3 häufigsten Todesursachen in den Ländern mit geringem Einkommen gehören Infektionen der unteren Atemwege (11,3 %) gefolgt von Durchfallerkrankungen (8,2 %) und HIV/AIDS (7,8 %) (World Health Organization, 2011). In Ländern mit ho- hem Einkommen gehören zu den 3 häufigsten Todesursachen ischämische Herzerkrankungen (15,6 %), Schlaganfall und andere Hirngefäßerkran- kungen (8,7 %) sowie Krebserkrankungen von Lunge, Tracheen und Bron- chien (5,9 %) (World Health Organization 2011). Die moderne Antibiotika- Therapie begann mit der Entdeckung des Penicillins (1, Abbildung 2) aus Penicillium notatum (Fleming 1929) durch Alexander Fleming 1929 (Brakhage et al. 2005).

Abbildung 2: Struktur des antibiotischen Naturstoffs Penicillin G (2).

EINLEITUNG

Der erste Patient wurde 1941 mit Penicillin behandelt (Ligon 2004). Da es Schwierigkeiten gab, den Stoff entsprechender Menge zu isolieren, erfolgte die Großproduktion für therapeutische Zwecke erst 1942 (Henderson 1997). Die Großproduktion stellt ein Problem dar, dass die Verwendung von Naturstoffen auch heute noch erschwert. Die strukturelle Komplexität vieler Naturstoffe ist jedoch oftmals ein Aus- schlusskriterium für die Entwicklung einer kommerziell realisierbaren Syn- these (Kelecom 2002). Die Suche und Entdeckung vieler weiterer Antibiotika ist auf die Erfolge des Penicillins zurückzuführen (von Nussbaum et al. 2006). Die Erkennt- nis, dass Mikroorganismen eine gute Quelle für potentielle Antibiotika sind, hat die Suche nach neuen Arzneistoffen in diesen Organismengruppen an- gekurbelt, nachdem klar wurde, dass synthetische Substanzbibliotheken nicht den gewünschten Erfolg brachten (Roemer et al. 2012). In High-Throughput-Screenings hat sich gezeigt, dass Naturstoff- Bibliotheken eine höhere Trefferquote erzielen als kombinatorische Biblio- theken (Spížek et al. 2010). Die höhere Trefferquote von Naturstoffen, im Gegensatz zu synthetischen Substanzen, könnte daran liegen, dass Natur- stoffe statistisch gesehen mehr Sauerstoffatome, Stereozentren und po- lyzyklische Kohlenstoffskelette besitzen, welche Auswirkungen auf die biologische Wirkung haben können (Feher & Schmidt 2003). Dies könnte er- klären, warum sich zurzeit die meisten bekannten Antibiotika von Natur- stoffen ableiten bzw. Naturstoffe sind (Clardy & Walsh 2004). Der Erfolg von Naturstoffen in der medizinischen Chemie könnte allerdings auch auf der Tatsache beruhen, dass jeder einzelne Sekundärmetabolit im Verlauf der Evolution in einem Netzwerk komplexer biologischer Abhän- gigkeiten entstanden ist (von Nussbaum et al. 2006). In den letzten 30 Jahren (1981-2010) waren 64 % der neu zugelassenen Substanzen („small-molecules“) Naturstoffe oder sind von Naturstoffen abgeleitete Substanzen (Newman & Cragg 2007, Newman 2008, Newman & Cragg 2012).

EINLEITUNG

Trotz der früheren Erfolge des Penicillins haben viele Pharmaunternehmen ihre Forschung und Entwicklung auf die Behandlung chronischer Erkran- kungen umgestellt. Dieser Markt ist zum einen profitabler und zum anderen ist das wirtschaftliche Risiko geringer bzw. besser kalkulierbar (von Nussbaum et al. 2006). In Bezug auf das wirtschaftliche Risiko im Allgemeinen ist zu sagen, dass es durchschnittlich 9-12 Jahre dauert, aber auch zwischen 10-20 Jahre dauern kann (Dickson & Gagnon 2004) und ca. 800 Mio. $ (für das Jahr 2000) kosten kann (DiMasi et al. 2003), ein neues Medikament auf den Markt zu bringen. Dabei sind ca. 65 % der Kosten auf die klinischen Stu- dien (I – III) zurückzuführen (Paul et al. 2010, DiMasi & Grabowski 2007). Des Weiteren erlangt nur eine von ca. 5000 Substanzen die Marktreife (Gambardella 1995). Der steigende Anteil älterer Menschen und immunsupprimierter Patienten sowie die Zunahme resistenter Krankheitserreger sprechen jedoch dafür, die Suche nach neuen Antibiotika nicht einschlafen zulassen (Spížek et al. 2010), da man sonst von einem Rückfall in die „Prä-Antibiotika-Ära“ sprechen könnte (Davies 2011). Trotzdem sind die Arzneimittelneuzulassun- gen von antibiotisch wirksamen Substanzen im Zeitraum von 1981–2010 weiterhin rückläufig (Newman & Cragg 2012). Es wird jedoch wieder verstärkt nach neuen antibakteriellen Wirkstoffen geforscht (Gram et al. 2010). Neue Antibiotika werden zum einen aus der Erforschung von Actinomyce- ten erwartet (Baltz 2008) und zum anderen setzt man große Erwartungen in den Einsatz mariner Naturstoffe zur Arzneistoffentwicklung (Glaser & Mayer 2009). Eine alternative Strategie zur Entwicklung neuer Antibiotika ist es, eine Inventur bereits bekannter Antibiotika vorzunehmen. Pulcini et al. (2012) haben gezeigt, dass ca. die Hälfte von ausgewählten „altbe- kannten“ Antibiotika, welche jedoch nur in wenigen Ländern vermarktet wurden, entweder gegen resistente Gram-positive oder Gram-negative Bakterien wirksam sein können. Da nur wenige neue Antibiotika in der Entwicklungspipeline stecken (Baltz 2006), könnten diese in Vergessenheit

EINLEITUNG geratenen Antibiotika daher eine wichtige Übergangslösung im Wettlauf gegen multiresistente Erreger darstellen (Pulcini et al. 2012). Die meisten Antibiotika-Gruppen wurden nach dem zweiten Weltkrieg gefunden (Holzgrabe 2004). Vor 50 Jahren führte einfaches Screenen der Kulturüberstände von Actinomyceten und Pilzen zur Entdeckung neuer An- tibiotika (Baltz 2008). Heute ist das Auffinden neuer Substanzen immer schwieriger und teurer geworden (Holzgrabe 2004). Mit den Methoden jedoch, die heute zur Verfügung stehen, wie z.B. Hochdurchsatz- Fermentation, Isolation mariner Actinomyceten, Durchsuchung des Ge- noms nach kryptischen Biosynthesewegen und der kombinatorischen Bio- chemie, könnten neue Arzneistoffe entwickelt werden (Baltz 2008). Stu- dien an Genomen von Actinomyceten zeigten das Vorhandensein von 20 oder mehr Biosynthesewegen pro Stamm, die zur Entwicklung potentieller neuer Antibiotika genutzt werden könnten (Davies 2011). Die Variation der Kultivierungsbedingungen von Mikroorganismen, die das genetische Potential zur Produktion vieler Sekundärmetabolite haben, gilt als der wahrscheinlich einfachste Weg, neue Substanzen zu erhalten (Bode & Müller 2005). Des Weiteren kann aber auch der Zusatz von „Autoin- duktoren“ wie z.B. γ-Butyrolactonen zu Veränderungen (Steigerung) der Sekundärmetabolitproduktion führen (Ohnishi et al. 2005).

1.2 Marine Naturstoffe

Naturstoffe von terrestrischen Pflanzen und Mikroorganismen sind schon lange eine traditionelle Quelle für Arzneistoffe, wie z.B. Morphin aus Mohn oder Penicillin aus Pilzen (Jensen & Fenical 2000, Capon 2001, Cragg et al. 2009). Die Entdeckung der beiden ersten biologisch aktiven marinen Na- turstoffe, dem Spongothymidin (2, Abbildung 3) und dem Spongouridin (3, Abbildung 3) aus dem Schwamm Tethya crypta, geschah in den 1950er Jahren durch Bergmann (Bergmann & Feeney 1951, Bergmann & Burke 1955). Die beiden Substanzen Spongouridin und Spongothymidin stellen die Leitstrukturen für die Entwicklung der Virustatika Vidarabin (4,

EINLEITUNG

Abbildung 4), Cytarabin (5, Abbildung 4) und Acyclovir (6, Abbildung 4), (Proksch et al. 2002, Mayer et al. 2010).

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Abbildung 3: Struktur der beiden ersten biologisch aktiven marinen Naturstoffe Spongo- thymidin (2) und Spongouridin (3).

Diese Beispiele zeigen, dass vor allem auch marine Naturstoffe eine be- deutende Quelle für neue Leitstrukturen sind (Gulder & Moore 2009). Die Entdeckung, dass marine Organismen eine ergiebige Quelle von zuvor un- beschriebenen Sekundärmetaboliten sind, ist jedoch nicht gänzlich überra- schend, wenn man berücksichtigt, dass viele Algen- und Invertebraten- Stämme ausschließlich im Meer vorkommen (Jensen & Fenical 1994). Das Interesse an marinen Naturstoffen erforderte eine Weiterentwicklung der bisher angewandten Methoden (Molinski et al. 2009). Die Erfindung des technischen Tauchens vor ca. 60 Jahren machte die Probenahme mariner sessiler Organismen erst möglich (Molinski et al. 2009).

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Abbildung 4: Strukturen der Virustatika Vidarabin (4), Cytarabin (5) und Acyclovir(6).

Die Pionierarbeit bezüglich chemischer und pharmakologischer Grundla- genforschung sowie gezielte Bestrebungen in Richtung Arzneistoffentwick- lung aus marinen Naturstoffen begannen in den 1970er Jahren (Capon

EINLEITUNG

2001). Die Zulassung eines weiteren Wirkstoffes aus dem Meer, dem Ziconotide (ω-Conotoxins MVIIA) (7, Abbildung 5), erfolgte erst 2004 unter dem Handelsnamen Prialt (Molinski et al. 2009). Das Peptid besteht aus 25 Aminosäuren und wurde aus dem Gift der Kegelschnecke Conus magus isoliert (Oliva et al. 2001).

Abbildung 5: ω-Conotoxin MVIIA (7). Die Aminosäuren sind über drei Schwefelbrücken quervernetzt.

Es hat sich oft gezeigt, dass es sehr schwierig, manchmal auch unmöglich ist, ausreichend Substanzmenge von Invertebraten oder Makroalgen zu beschaffen. Entweder, weil die produzierte Menge im Organismus zu ge- ring ist oder weil der Organismus selbst in zu geringer Anzahl vorhanden ist (Kelecom 2002). Fortschritte in der Molekularbiologie, Genomforschung und Bioinformatik haben aber dazu geführt, das Potential der marinen Na- turstoffe besser ausnutzen zu können und die nachhaltige Verfügbarkeit von marinen Substanzen zu verbessern (Gulder & Moore 2009). Auf Grund struktureller Ähnlichkeiten von biologisch aktiven Naturstoffen aus Eukaryoten mit denen von Bakterien wird vermutet, dass die wahren Produzenten häufig bakterielle Symbionten sind und nicht die marinen In- vertebraten, von denen die Substanzen isoliert wurden (Piel 2004). Mitt- lerweile untermauern zahlreiche Beispiele die Hypothese, dass Bakterien häufig die eigentlichen Produzenten der Sekundärmetabolite sind (Unson et al. 1994, Davidson 1995, Partida-Martinez & Hertweck 2005, Piel 2004,

EINLEITUNG

Piel 2009) und somit eine aussichtsreiche Quelle für bioaktive Substanzen (Burgess et al. 1999, Debnath et al. 2007). Die Symbionten-Hypothese hat viel Interesse auf sich gezogen, da sie impliziert, dass man mittels bakterieller Fermentation wirtsunabhängige Produktionssysteme erstellen kann (Piel 2006). Da Bakterien die Naturstoffproduzenten sind, konnten auch mehrere „genomics-inspired“ Strategien entwickelt werden, die dazu geführt haben neue Metabolite zu entdecken, die unter Standardfermentationen und den üblichen Detektionsbedingungen oft übersehen wurden (Winter et al. 2011). Die meisten Bakterien produzieren durch die Nutzung verschiedener Stoffwechselwege sehr unterschiedliche Substanzklassen von Natur- stoffen (Kelecom 2002). Für lange Zeit entstammte unser Wissen über Bakterien nur von kultivier- baren Organismen (Piel 2011). Doch ca. 50 % aller identifizierten Phyla von Bakterien beinhalten auch bisher unkultivierte Vertreter (Rappé & Giovannoni 2003). Durch die Genomforschung hat sich gezeigt, dass sich bisher wenig erforschte Organismen auch als potentielle Produzenten von Sekundärmeta- boliten erweisen (Berti et al. 2007) und das metabolische Potential vieler Mikroorganismen weit unterschätzt wird (Winter et al. 2011). Die ersten marinen Arzneistoffe haben sich erfolgreich auf dem Pharma- markt etabliert, wie z.B. Prialt (Ziconotide,) und es stecken weitere Kandi- daten in der Pipeline (PharmaMar 2013). In den Jahren 2008, 2009 und 2010 wurden jeweils 1065, 1011 und 1003 neue marine Naturstoffe veröf- fentlicht (Blunt et al. 2010, 2011, 2012). Somit stellt das immer noch wenig erforschte Meer eine viel versprechende Nische für die Entdeckung neuer bioaktiver Substanzen dar (Gulder & Moore 2009).

1.3 Assoziationen mariner Mikroorganismen

Die Suche nach neuen Naturstoffen aus marinen Organismen führte auch vor 60 Jahren schon zur Frage, wie sich diese Organismen gegen Fraßfeinde, Konkurrenten und Krankheiten verteidigen (Newman et al.

EINLEITUNG

2009), da marine Makroalgen und andere sessile Organismen permanent Mikroorganismen, wie z.B. Viren, Bakterien und Pilzen, ausgesetzt sind (Potin et al. 2002). Demzufolge war neben der biotechnologischen Anwen- dung auch die ökologische Bedeutung bereits von Interesse. Rückblickend scheint die Entdeckung, dass marine Organismen eine gute Quelle für neue Naturstoffe sind, nur logisch, da z.B. viele marine Weichtiere offen- bar über keine strukturellen Verteidigungsmechanismen verfügen und sie toxische Sekundärmetabolite als chemische Verteidigung produzieren (Jensen & Fenical 1994). Auf Grund einer fehlenden zellbasierten immuno- logischen Abwehrreaktion könnte die Produktion von bioaktiven Sekun- därmetaboliten auch bei Makroalgen ein wesentlicher Mechanismus zur Abwehr mikrobieller Angriffe sein (Thomas et al. 2008). Mittlerweile weiß man jedoch, dass in vielen Fällen Mikroorganismen die eigentlichen Naturstoffproduzenten sind und nicht ausschließlich die Inver- tebraten oder Algen (Schmidt 2005, Egan et al. 2008, König et al. 2006, Lane & Kubanek 2008, Imhoff et al. 2011). Infolge vielfältiger biologischer Interaktionen haben sich auch auf den Oberflächen mariner Makroorga- nismen veränderliche und komplexe mikrobielle Gemeinschaften entwickelt (Goecke et al. 2010). Die Interaktionen zwischen Wirt und besiedelnden Mikroorganismen, welche durch chemische Moleküle vermittelt werden, sowie Interaktionen zwischen den Mikroorganismen in einer Bio- filmgemeinschaft und oberflächenspezifische physikalische und chemische Bedingungen wirken sich unterschiedlich auf die Diversität und Funktion von oberflächenassoziierten Mikroorganismenverbänden aus (Egan et al. 2008). Es gibt Untersuchungen, die belegen, dass sich die Mikroorganismen- Population z.B. von Schwämmen, gegenüber denen von unbelebten Ober- flächen in direkter Umgebung unterscheiden (Hentschel et al. 2003, Thoms et al. 2003, Lee & Qian 2004, Taylor et al. 2004, Thiel et al. 2007), was zu der Annahme führt, dass es eine spezifische Mikroorganismen- Makroorganismus-Assoziation gibt (Dobretsov & Dahms 2005, Thiel et al. 2007).

EINLEITUNG

Im Gegensatz zu freilebenden planktonischen Mikroorganismen, welche häufig sich verändernden Umweltbedingungen ausgesetzt sind und sich daher kurzfristig neu anpassen müssen, haben sich oberflächenassoziierte Mikroorganismen vermutlich spezialisierter und stabiler an ein durch den Wirt gebildetes Mikrohabitat angepasst (Penesyan et al. 2010). Das Ansie- deln von Organismen auf Oberflächen von lebenden Individuen (Epibiose) kann sowohl von Vorteil als auch von Nachteil für den Wirt sein (Dobretsov & Dahms 2005). Vorteile wären die Produktion von Antifou- ling-Substanzen durch Epibionten (Walls et al. 1993, Harder & Lau 2003, Piel 2004) und die Versorgung mit Nährstoffen (Mercado et al. 1998). Nachteile dagegen beinhalten die Möglichkeit der Wachstumshemmung, Nekrose oder Tod des Wirtsorganismus (Wahl & Mark 1999). Über die komplexen Umstände von Mikroben-Makroorganismen-Interaktionen ist bisher wenig bekannt, im Besonderen was die in-situ Situation anbelangt (Goecke et al. 2012, Nagel et al. 2012, Wahl et al. 2012). Das Verständnis bezüglich der Diversität und Ökologie von oberflächenas- soziierten mikrobiellen Gemeinschaften wird auch entscheidend zur Entde- ckung neuer bioaktiver Substanzen beitragen (Egan et al. 2008).

1.4 Algen

Marine Makroalgen sind Pflanzen, welche sich hauptsächlich an Gestein oder andere feste Substrate in der Küstenregion anheften (Rorrer & Cheney 2004). Der Vegetationskörper ist relativ undifferenziert und es gibt keine echten Wurzeln oder Blätter (Kück & Wolff 2009). Makroalgen gehören drei unterschiedlichen Gruppen an. Diese wurden auf der Basis der Farbe des Thallus in Rotalgen (Rhodophyta), Braunalgen (Phaeophyta) und Grünalgen (Chlorophyta) unterschieden (Abbildung 6a-c)(Ali et al. 2001). Die Unterschiede entstammen den verschiedenen Evolutionspro- zessen, primäre Endosymbiose bei Grün- und Rotalgen und sekundäre En- dosymbiose bei Braunalgen (Lecointre & Guyader 2006).

EINLEITUNG

Zu den braunen Meeresalgen gehören auch die beiden Gattungen Lamina- ria und Saccharina, die gemeinhin Tang oder auch Kelp genannt werden (Bolton 2010).

a b c

a Abbildung 6: Einteilung der Algen illustriert am Beispiel von Algen der Ostsee: a. Brau- nalge Fucus serratus, b. Rotalge Chondrus crispus , c. Grünalge Spongomorpha aeruginosa (Fotos, T. Staufenberger).

Laminaria und Saccharina zeigen einen heteromorphen Generationswech- sel (Abbildung 7): Die Sporophyten sind recht große, thallöse Algen (Tan- ge), während die Gametophyten aus mikroskopisch kleinen, verzweigten Zellfäden bestehen (Oltmanns 1922).

Abbildung 7: Lebenszyklus der Braunalge Saccharina latissima. Die Darstellung ist nicht maßstabsgetreu gezeichnet. Der junge Sporophyt ist anfänglich mikroskopisch klein (Ror- rer & Cheney 2004).

EINLEITUNG

Der große Sporophyt der Laminariales (Makrothallus) hat eine thallöse Struktur und wird unterteilt in das Haftorgan (Rhizoid), den Stiel (Cauloid) und den Thallus (Phylloid) (Lee 1999) (Abbildung 8). Das Rhizoid kann mit der Wurzel einer Pflanze verglichen werden. Bei den Laminariales besteht er aus sogenannten Hapteren (Krallen), mit deren Hilfe der Sporophyt sich an Steinen anheftet (Lane 2005). Das Cauloid (bei Pflanzen die Sprossachse) bildet einen Stiel von dem ein oder mehrere blattähnlichen Wedel (Phylloide) ausgehen (Raven et al. 2006). Saccharina latissima (Linnaeus) J.V. Lamouroux ist auch bekannt als La- minaria saccharina (Zuckertang, Abbildung 8, 9 a, b)(Lane et al. 2006). Der blattartige Thallus von S. latissima hat eine gelbbraune Farbe und kann bis zu 4 m lang werden. Der Thallus ist bandförmig und am Rand stark gewellt (Fish & Fish 2011). Das Verbreitungsgebiet des Zuckertangs umfasst die felsigen Meeresküs- ten der kühl-gemäßigten Zonen von Europa, Asien und Amerika. In Euro- pa kommt er vom Nordatlantik bis zur Ostsee und dem westlichen Mittel- meer vor (Oltmanns 1922).

altes Phylloid

Phylloid

junges Phylloid (Meristem)

Cauloid

Rhizoid

Abbildung 8: Schematische Darstellung von Saccharina latissima (T. Staufenberger).

EINLEITUNG

Er bildet zusammen mit Laminaria-Arten Tangwälder im Sublitoral unter- halb der Niedrigwasserlinie (Kornmann & Sahling 1977). In der Kieler För- de wächst der Zuckertang in einer Meerestiefe von 4 bis 10 Metern (Schaffelke et al. 1996). Der Zuckertang ist essbar. Er enthält Zucker, die ihn leicht süß schmecken lassen (Behrmann 1976).

a b

Abbildung 9: a. Saccharina latissima in der Kieler Förde (T. Staufenberger), b. S. latissima (CRM - Coastal Research and Management GbR, Kiel).

Terrestrische Pflanzen haben Strategien entwickelt, bestimmte Gruppen von antagonistischen Mikroorganismen zu stimulieren und zu fördern, welche in der Rhizosphäre mittels ihrer Sekundärmetabolite als Verteidigung gegen bodenbürtige Pflanzenpathogene fungieren (Weller et al. 2007). Auch im marinen Habitat sind Assoziationen zwischen Bakterien und Mak- roalgen weit verbreitet (Goecke et al. 2010). Studien die die Resistenz mariner Pflanzen gegenüber Krankheiten erforschen, deuten darauf hin, dass auch hier Sekundärmetabolite eine besondere Bedeutung in der Ab- wehr schädlicher mariner Mikroorganismen spielen (Engel et al. 2006). Auch für die Makroalge S. latissima konnte nachgewiesen werden, dass die Alge mit einer Vielzahl von antimikrobiell aktiven Bakterien besiedelt ist (Wiese et al. 2009b). Weiterhin wurde gezeigt, dass sich die Bakterien- gemeinschaften der verschiedenen Algenabschnitte unterscheiden (Staufenberger et al. 2008). Die Forschung über bakterielle Krankheitserreger von Makroalgen steht allerdings immer noch am Anfang (Egan et al. 2013). Des Weiteren basieren

EINLEITUNG die meisten Studien auf kultivierungsabhängigen Methoden und sind daher nur bedingt aussagekräftig, zumindest was die natürliche Zusammenset- zung der mikrobiellen Gemeinschaft anbelangt (Goecke et al. 2010). Zu den mit S. latissima assoziierten Bakterien gehören auch Pseudomona- den. Es wird vermutet, dass die Pseudomonaden auf Grund ihrer Sekun- därmetabolitproduktion einen positiven Einfluss auf die Braunalge S. latissima haben (Nagel et al. 2012).

1.5 Pseudomonaden

Bakterien der Gattung Pseudomonas sind gerade oder leicht gebogene Stäbchen mit einem Durchmesser von 0,5–1,0 μm und einer Länge von 1,5–4,0 μm (Palleroni & Doudoroff 1972). Pseudomonaden sind Gram- negativ, Oxidase-positiv oder -negativ und Katalase-positiv (Stanier et al. 1966). Die Beweglichkeit der meisten Pseudomonaden gründet sich auf das Vorhandensein von einer oder mehreren polaren Flagellen (Stanier et al. 1966). Die Beweglichkeit ermöglicht den chemoorganotrophen Zellen, auf chemische Stimulation (Chemotaxis) zu reagieren und unterstützt die Fähigkeit der Bakterien, organische Substanzen in geringen Konzentratio- nen zu lokalisieren (Moore & Tindall 2006). Bakterien der Gattung Pseu- domonas sind ubiquitär vorkommende Organismen (Cornelis 2010). Ihr Habitat erstreckt sich vom marinen Milieu und der terrestrischen Umge- bung bis hin zu pflanzlichem und tierischem Gewebe (Spiers et al. 2000, Peix et al. 2009). Im Grunde stellen alle Bereiche mit einem Temperatur- bereich zwischen 4 und 42 °C, einem pH zwischen 4 und 8 sowie dem Vorhandensein einfacher oder komplexer organischer Substanzen ein po- tentielles Habitat dar (Moore & Tindall 2006). Der anspruchslose Nähr- stoffbedarf, der Umfang verwertbarer C-Quellen sowie die genetische und metabolische Anpassungsfähigkeit könnten Grund für das weit verbreitete Vorkommen dieser Organismen sein. Die Gattung Pseudomonas beinhaltet Arten, die eine große Auswahl an organischen und anorganischen Sub- stanzen verstoffwechseln können, inklusive toxischer organischer Chemi- kalien, wie aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe (Moore &

EINLEITUNG

Tindall 2006). Pseudomonas-Arten sind generell schnell wachsende, aero- be Bakterien. Pseudomonas-Stämme sind oft resistent gegenüber Antibio- tika, Desinfektionsmittel, Reinigungsmittel, Schwermetallen und organischen Lösungsmitteln (Palleroni 1993). Die Gattung Pseudomonas ist bekannt für ihre genetische Diversität und Plastizität (Spiers et al. 2000). Viele Arten, die zuvor als Pseudomonas beschrieben wurden, sind heute in andere Gattungen neu eingeordnet (Anzai et al. 2000). Die Anerkennung der phylogenetischen Heterogenität von Bakterien, die zuvor als Pseudomonas klassifiziert wurden, hat Anlass zu einer Neubewertung der phänotypischen Charakteristika, metabolischer Aktivitäten, Genetik, Ökologie und anderer Charakteristika gegeben (Moore & Tindall 2006). Gen-Cluster für Sekundärmetabolite von Pseudomonaden sind in Zahl und Mannigfaltigkeit mit denen von den produktiven Actinomyceten vergleich- bar (Gross & Loper 2009). Durch die in silico Analyse des Genoms von P. protegens Pf-5 konnte ein Gencluster identifiziert werden, dass wahrscheinlich für ein zyklisches Lipodecapeptid (CLP) codiert (Paulsen et al. 2005). Auch wenn die Struktur des CLP noch durch chemische Analysen bestätigt werden muss, zeigt dieser Ansatz, dass die Genomsequenzierung zur Entdeckung bisher unbekannter Gene führen kann, die relevant für die biologische Aktivität von Pseudomonaden sein könnten (de Bruijn et al. 2007). Die Suche nach neuen Gen-Clustern in Pseudomonaden wird somit das schon bemerkenswerte Spektrum an bekannten Sekundärmetaboliten noch erweitern (Gross & Loper 2009).

1.6 Pflanzen-assoziierte Pseudomonaden

Auf Grund der Sekretion von organischen Säuren und Aminosäuren durch die Pflanzen ist die Zone im Bereich der Wurzeln der Pflanzen stark mikro- biell besiedelt (Ottow 2011a). Auch Pseudomonas-Arten zählen mit zu den effektiven Besiedlern der Rhizosphäre (Lugtenberg et al. 2001), wobei fluoreszierende Pseudomonaden zu den sogenannten „plant growth- promoting rhizobacteria“ (PGPR) gehören (Kloepper et al. 1980).

EINLEITUNG

Die für eine erfolgreiche Besiedlung der Rhizosphäre nötigen Eigenschaf- ten sind Beweglichkeit, Chemotaxis, spezielle Pili zum Anheften an Ober- flächen, eine äußere Membran, welche so beschaffen ist, dass eine un- komplizierte Aufnahme von Nährstoffen gewährleistet ist, die Fähigkeit Bestandteile von Exsudaten aufnehmen zu können, Resistenz gegenüber Toxinen und anderer Pflanzenabwehrmechanismen (Lugtenberg & Bloemberg 2004). Da Pseudomonaden mit all diesen Eigenschaften ausge- stattet sind, besitzen sie einen selektiven Vorteil, die Ressourcen, die in der Rhizosphäre vorhanden sind, ausnutzen zu können (Moore & Tindall 2006). Des Weiteren ist bekannt, dass Pseudomonaden wirksam die Besiedelung von Pflanzen durch andere Mikroorganismen verhindern (Bianciotto et al. 1996). Fluoreszierende Pseudomonaden wurden bereits jahrzehntelang im Hinblick auf deren stimulierende Effekte auf das Pflanzenwachstum durch das Unterdrücken bodenbürtiger Pflanzenkrankheiten untersucht (Nowak- Thompson et al. 1994, Bakker et al. 2007). Zu den Wirkmechanismen, die eine Rolle in diesem Prozess spielen, gehören der Konkurrenzkampf um Eisen mittels Siderophoren, die Produktion lytischer Enzyme, die induzier- te systemische Resistenz und die Antibiose (Bakker et al. 2007). Wurzel- besiedelnde „plant beneficial“ Pseudomonaden setzten eine bemerkenswerte Vielfalt an Substanzen mit antibiotischer Aktivität frei, wie z.B. die Polyketide 2,4-Diacetylphloroglucinol (DAPG 8, Abbildung 10) und Pyolu- teorin (PLT 9, Abbildung 10) (Brodhagen et al. 2004, Dubuis et al. 2007).

8 9 Abbildung 10: Biologisch aktive Polyketide 2,4-Diacetylphloroglucinol (DAPG, 8) und Pyoluteorin (PLT, 9).

EINLEITUNG

Allerdings sind bisher nur wenige marine Pseudomonaden beschrieben, welche neue bioaktive Substanzen produzieren (Isnansetyo & Kamei 2009). Die Bildung und Regulation mutualistischer Interaktionen zwischen Mikro- ben und deren marinen Wirtsorganismen sind nahezu unbekannt (Harder et al. 2012). Dies trifft auch auf die Interaktion zwischen Pseudomonas Arten und marinen Algen zu.

1.7 Fragestellung dieser Arbeit

Ziel dieser Arbeit war es, marine Bakterien der Alge Saccharina latissima auf ihr Potential zur Produktion von Sekundärmetaboliten zu untersuchen, deren Bioaktivität dazu führt, dass diese Substanzen Anwendung in der biotechnologischen Nutzung (Pharmazie, Kosmetik, oder Pflanzenschutz) finden könnten. Hierzu wurden zum einen Isolate von Saccharina latissima aus der Stammsammlung des KiWiZ ausgewählt und zum anderen Bakte- rien von dieser Alge neu isoliert. Zur Stammauswahl aus der KiWiZ-Sammlung dienten folgende Kriterien: - Gibt es DNA-Fragmente von Biosynthese-Genclustern (PKSI/II, NRPS)? - Was ergaben erste chemische Analysen? - Um welche Art/Gattung handelt es sich? Ist diese neu und/oder gibt es andere Gründe dessen Potential zur Sekundärmetabolitproduktion zu erforschen? - Können Aussagen aufgrund vorhergehender Versuche und/oder Bio- aktivitätstests getroffen werden? Auf Grund der Assoziation der untersuchten Bakterien mit der Braunalge S. latissima sollte nicht nur der biotechnologische Aspekt analysiert werden, sondern auch die ökologische Bedeutung der Sekundärmetabolite für die Alge erörtert werden. Dazu wurde besonders die ökologische Rolle der von Pseudomonas-Stämmen produzierten Sekundärmetabolite untersucht. In dieser Arbeit sollten folgende Fragen beantwortet werden:

EINLEITUNG

1. Gibt es biologisch aktive Bakterien auf S. latissima aus der Kieler Förde und um welche Gattungen/Arten von Bakterien handelt es sich? Sind die Bakterien stets mit S. latissima assoziiert und ist daher eine wiederkehrende Isolation über mehrere Jahre möglich? 2. Welchen Einfluss können Bakterien bzw. deren Naturstoffe auf S. latissima haben? Ist die mutualistische Assoziation von Pseudomona- den mit Landpflanzen auch für Algen zu zeigen? 3. Welche Naturstoffe werden von den bakteriellen Isolaten von S. latissima produziert? 4. Welche biologische Aktivität besitzen die isolierten Naturstoffe? 5. Lässt sich das Sekundärmetabolitprofil von Bakterien durch Kultivie- rungs- oder Stimulationsexperimente verändern?

MATERIAL UND METHODEN

2 Material und Methoden

2.1 Nährmedien und Puffer

Alle Nährmedien wurden mit voll entsalztem Wasser (VE-Wasser) ange- setzt. Für die Herstellung von Agarplatten wurden jeweils 15,0 g/L Bacto™ Agar hinzu gegeben, wenn nicht anders angegeben. Der pH-Wert wurde mit 1 M HCl bzw. 1 M NaOH eingestellt. Alle Medien wurden bei feuchter Hitze, 120 °C, 1 bar und 20 Minuten autoklaviert. Folgende Medien und Lösungen wurden verwendet:

Marine Broth 2216 (MB) Fertigmedium (in Anlehnung an ZoBell 1941) 1,0 g/L Bacto-Hefeextrakt 5,0 g/L Bacto-Pepton 19,45 g/L NaCl

0,16 g/L NaHCO3 4 mg/L Natriumsilikat 2,4 mg/L Natriumfluorid

1,8 g/L CaCl2 0,55 g/L KCl 80 mg/L KBr

3,24 g/L MgSO4

5,9 g/L MgCl2 0,1 g/L FeCitrat

1,6 mg/L NH4NO3

8,0 mg/L Na2HPO4

34,0 mg/L SrCl2

22,0 mg/L HBO3 pH 7,6 ± 0,2

Modifiziertes GYM Streptomyces Medium (GYM) 4,0 g/L Bacto-Hefeextrakt 10,0 g/L Bacto-Malzextrakt 4,0 g/L D-Glucose-Monohydrat

MATERIAL UND METHODEN

2,0 g/L CaCO3 pH 7,2 ± 0,2

Modifiziertes GYM Streptomyces Medium (GYM4) 4,0 g/L Bacto-Hefeextrakt 4,0 g/L Bacto-Malzextrakt 4,0 g/L D-Glucose-Monohydrat

2,0 g/L CaCO3 pH 7,2 ± 0,2

Modifiziertes Pseudoalteromonas-Medium nach Kalinovskaya et al. (2004) (Pseudomonas-Agar (P)) 2,0 g/L Pepton aus Sojamehl 2,0 g/L Bacto-Hefeextrakt 1,0 g/L D-Glucose-Monohydrat

0,2 g/L KH2PO4

50 mg/L MgSO4-Heptahydrat

1,0 g/L CaCl2-Dihydrat 0,1 g/L KBr 15,0 g/L Tropic Marine Salt

Pseudomonas-Aeromonas-Selektivagar nach Kielwein (GSP) 10,0 g/L Natriumglutamat 20,0 g/L Stärke, löslich

2,0 g/L KH2PO4

0,5 g/L MgSO4 0,36 g/L Phenolrot 12,0 g/L Agar 0,01 g/L Penicillin G pH 7,2 ± 0,2

MATERIAL UND METHODEN

Pseudomonas Selektivagar Basis mit CFC (Cetrimid-Fucidin-Cephaloridin) Selektiv-Supplement (CFC) Fertigmedium 16,0 g/L Pepton aus Gelatine 10,0 g/L Caseinhydrolysat 10,0 g/L Kaliumsulfat 1,4 g/L Magnesiumchlorid 11,0 g/L Agar pH 7,1±0,2 10 mL/L Glycerin 10 mg/L Cetrimid 10 mg/L Fucidin 50 mg/L Cephaloridin

Sojapepton (SGG SP) 2,0 g/L Bacto-Hefeextrakt 5,0 g/L Pepton aus Sojamehl 10,0 g/L Stärke, löslich 2,5 g/L Bestandteile aus Maisquellwasser 10,0 g/L D-Glucose-Monohydrat 10,0 g/L Glycerin 1,0 g/L NaCl

3,0 g/L CaCO3 pH 7,0 ± 0,2

Tropic Marine Medium (TM), modifiziert nach ZoBell (ZoBell 1941) 1,0 g/L Bacto-Hefeextrakt 5,0 g/L Bacto-Pepton 19,45 g/L Tropic Marine Salt pH 7,0 – 7,2

MATERIAL UND METHODEN

Tryptic Soy Broth (TSB) Fertigmedium, Difco 0370-17, (modifiziert) 0,3 g/L Pepton aus Sojamehl 1,7 g/L Caseinpepton 0,25 g/L D-Glucose-Monohydrat 10,0 g/L NaCl

0,25 g/L K2HPO4 pH 7,3 ± 0,2

TBE (Tris Borat EDTA) Puffer 100 mM Tris 80 mM Borsäure (pH 8,0) 1 mM EDTA

Auftragspuffer für die Gelelektrophorese 50 % Saccharose 20 % Gylcerin 50 mM EDTA 0,1 % Bromphenolblau In TBE-Puffer lösen.

PBS-Puffer (1 L) 8,0 g NaCl 0,2 g KCl

1,15 g Na2HPO4

0,24 g KH2PO4 pH 8,3

Für eine möglichst spezifische Isolierung von Pseudomonaden wurden bei der Probenahme im Januar 2010 Pseudomonas Selektivagar Basis mit CFC (Cetrimid-Fucidin-Cephaloridin) Selektiv-Supplement (CFC), Pseudomo- nas-Aeromonas-Selektivagar nach Kielwein (1971) (GSP) und modifizier- ter Pseudoalteromonas-Agar nach Kalinovskaya et al. (2004) (Pseudomo-

MATERIAL UND METHODEN nas-Agar) verwendet. Das CFC Selektiv-Supplement ist ein antibiotisch wirkendes Supplement zur selektiven Isolierung von Pseudomonas-Arten. Während Cetrimid, Fucidin und Cephaloridin die Gram-positive und die Gram-negative Begleitflora hemmen, gewährleistet die Pepton- Zusammensetzung einem breiten Spektrum an Pseudomonaden das Wachstum. Die verwendete Menge an Kaliumsulfat und Magnesiumchlorid unterstützt die Pigmentproduktion. Auch beim Pseudomonas-Agar ge- währleistet die Pepton-Zusammensetzung einem breiten Spektrum an Pseudomonaden das Wachstum. Beim Pseudomonas-Aeromonas- Selektivagar nach Kielwein (1971) (GSP) sind Glutamat und Stärke die beiden einzigen Nährstoffquellen. Aeromonaden können die Stärke abbauen. Die dabei produzierte Säureproduktion führt beim Indikator Phenolrot zum Farbumschlag nach gelb, was diese von Pseudomonaden unterscheidet, da diese nicht die Stärke abbauen können, sondern nur das Glutamat. Beim GSP-Agar hemmt Penicillin G das Wachstum der Gram-positiven Be- gleitflora.

2.2 Chemikalien

Acetonitril, HPLC Gradient Grade VWR Prolabo Agar BactoTM, VWR Ameisensäure, p.a. Fluka Bromphenolblau Merck

CaCl3 Carl Roth

CaCO3 Carl Roth cAMP-Mono-Natriumsalz) Sigma-Aldrich Caseinpepton Difco, VWR Chloramphenicol Sigma-Aldrich Cornsteep solids Sigma-Aldrich D(+)-Glucose-Monohydrat Merck Dimethylsulfoxid-d6, 99.8 Atom % D Sigma-Aldrich Dimethylsulfoxid für Zellkultur AppliChem DNA-freies Wasser Sigma-Aldrich DNA Molecular Weight Marker X Roche EDTA Merck Ethanol 99 %, vergällt Walter CMP Ethidiumbromid Fluka Biochemika

MATERIAL UND METHODEN

Ethylacetat, rein Walter CMP Fötales Rinderserum Promocell Hefeextrakt BactoTM, VWR Isopropanol Baker L-Homoserinlacton Hydrochlorid Sigma-Aldrich Malzextrakt BactoTM, VWR Marine Broth DifcoTM, VWR Mc Coys 5A Fertigmedium inkubiert Invitrogen Methanol-d4, 99.8 Atom % D Carl Roth Methanol, HPLC Gradient Grade J.T. Baker NaOH Carl Roth Natriumchlorid, p.a. Merck Natriumhydroxid, p.a. Carl Roth Penicillin G Invitrogen Pepton BactoTM, VWR Pepton aus Sojabohnenmehl Merck Putrescin Sigma-Aldrich Resazurin Redoxindikator Riedel-de Häen RPMI 1640 Fertigmedium Invitrogen Saccharose Merck Salzsäure, 32 %, reinst Carl Roth SYBR® Safe DNA gel strain Invitrogen Tropic Marine Salt Knutzen Trypticase Soy Broth Difco, VWR Trypton Difco, VWR

2.3 Kits

DNeasy® Blood & Tissue Kit Qiagen puReTaqTMReady-To-GoTM PCR Beads GE Healthcare High Pure PCR Product Purification Kit Roche Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems PDE Light HTS cAMP phosphordiesterase Kit Rockland Biomol GreenTM PTP1B tyrosin phosphatase drug discovery Kit Enzy Life Science GmbH CellTiter-Blue®Cell Viability Assay Promega

2.4 Geräte

ABI PRISMA 3730 DNA Analyzer Applied Biosystems Analysenwaage CPA Sartorius

MATERIAL UND METHODEN

Gel-Jet-Imager Dokumentationsanlage Intas GeneQuant Pro Amersham Pharmacia Biotech Precellys®24 Peqlab Precellys®24 Kit VK05 Peqlab Mikrotiterplatten Readers Infinite® M200 Tecan MJ Research PTC-200 Thermo Cycler Biozym Multifuge 1 L-R, Heraeus Thermo Scientific NanoVue Spectrophotometer GE Healthcare Schüttler Multitron Inforce Thermocycler Biometra Ultra-Turrax T25 basic IKA®-Werke GmbH & Co. KG

HPLC-Anlage (analytisch): LaChrom Elite VWR-Hitachi: Organizer Diode Array Detector L-2450 Column Oven L-2300 Autosampler L-2200 Pump L-2130 Fraktionssammler Foxy Jr. ISCO Steuer- und Auswertesoftware: Hystar und Hystar Post Processing, Bruker Säule (Standard):Onyx monolithic C18, 100 x 3.0 mm Phenomenex Säule (Fraktionierung): Luna C18(2), 4,6 x 250 mm, 5 μm Phenomenex

Massenspektrometer (analytisch): esquire4000, Bruker Steuer- und Auswertesoftware: esquireControl und DataAnalysis, Bruker Nitrogen Gas Generator LCMS 30-0, Domnick Hunter Kompressor DK50 2x2V/110, Ekom Air Vakuumpumpe DS402, Varian Fraktionssammler Foxy Jr., ISCO

LC-Anlage (präparativ 1): LaPrep, VWR International: Pumpe: P311 UV/VIS-Detektor: P110 Smartline Autosampler 3900, Knauer Dynamic Mixing Chamber, Knauer Fraktionssammler: Labocol Vario2000, Labomatic Steuer- und Auswertesoftware: EZChrom Elite, VWR International Säule: Gemini 10u C18, 100A, Axia, 100 x 50,00 mm Phenomenex

MATERIAL UND METHODEN

HPLC-Anlage (semipräparativ 2): LaChrom Elite, Merck-Hitachi: Organizer Diode Array Detector L-2450 Autosampler L-2200 externe Pumpe L-7150, VWR-Hitachi Steuer- und Auswertesoftware: EZChrom Elite, VWR International Säule: Gemini 5u C18, 110A, Axia, 100 x 21,20 mm, 5 micron Phenomenex

NMR-Spektrometer: a. DRX500 (500 MHz und 125 MHz), Bruker b. Avance 600 (600 MHz und 150 MHz) mit Cryoprobenkopf, Bruker

2.5 Probenahme

Das Probenmaterial (lebende Exemplare der Braunalge Saccharina latissima) für die Isolierung der bearbeiteten Bakterien wurde während mehre- rer Tauchgänge aus ca. 6 m Tiefe aus der Kieler Förde (Nähe Tonnenhof, 54°22´N; 10°09´O) gesammelt. Die Probenahmen erfolgten im November 2002, April 2003 und Januar 2010. Im Januar 2010 wurden zusätzlich zu den Algenproben auch Sediment- und Wasserproben aus demselben Habi- tat entnommen. Die Probenahmen der Jahre 2002-2003 und auch die an- schließende Bakterienisolation erfolgte nach Wiese et al. (2009b). Die in dieser Arbeit verwendeten Reinkulturen aus den Probenahmen der Jahre 2002-2003 wurden mir freundlicherweise von Frau Dr. J. Wiese zur Verfü- gung gestellt. Im Januar 2010 wurden je fünf sterile Duranflaschen à 1 L Volumen mit Umgebungswasser vom Ort der Probenahme befüllt. Anschließend wurden fünf komplette Individuen der Braunalge S. latissima mit Hilfe eines Mes- sers vom Substrat entnommen und in sterile Autoklavierbeutel gefüllt. Aus der unmittelbaren Umgebung der Algenproben wurden mit Hilfe eines sterilen Löffels fünf Sedimentproben in jeweils sterile Plastikröhrchen über- führt. Die Proben wurden gekühlt und innerhalb von zwei Stunden ins La- bor transportiert. Bis zur vollständigen Verarbeitung wurden die Proben bei 4 °C gelagert. Um Unterschiede in den bakteriellen Gemeinschaften, die mit verschieden Algenabschnitten assoziiert sind, überprüfen zu kön- nen, wurden die Algenindividuen in jeweils fünf Abschnitte unterteilt (Rhi-

MATERIAL UND METHODEN zoid, Cauloid, junges Phylloid (Meristem), Phylloid und altes Phylloid) (Ab- bildung 8). Hierzu wurden der Algenthallus mit sterilen Seziermessern und sterilen Pinzetten in kleinere (ca. 1 cm2) Algenteile zerschnitten und auch das Rhizoid und das Cauloid wurden nach dieser Methodik in kleinere Pro- benstücke zerteilt. Die Algenstücke wurden unverzüglich nach dem Zertei- len 3 x in sterilem Seewasser gewaschen und in die vorbereiteten Gefäße überführt.

2.6 Isolierung und Identifizierung der Bakterienstämme

Die Algenstücke und die Sedimentproben wurden in Plastikröhrchen mit sterilem Fördewasser, welche zuvor gewogen wurden, überführt und an- schließend rückgewogen, um die Einwaage feststellen zu können (siehe Tabelle 1). Anschließend wurden mittels Ultra-Turrax-T25 basic Homo- genisate hergestellt. Aus den Sedimenten wurden Suspensionen hergestellt. Die Proben wurden mit jeweils 200 µL auf Agarplatten ausgespatelt. Zur Isolierung der Pseudomonaden wurden zwei Selektivmedien (Pseudomo- naden Aeromonaden-Selektivagar nach Kielwein (GSP), Pseudomonas CFC Selektivagar (CFC) und ein Komplexmedium Pseudomonas-Medium (P) verwendet. Für Sedimentproben wurden vier Verdünnungsstufen (100, 10-1, 10-2,10-3) und für Algenproben drei Verdünnungsstufen (100, 10-1, 10-2) angelegt. Die Kultivierung der Mikroorganismen (Algenproben) auf Agarplatten erfolgte bei 28 °C für mindestens vier Tage. Die Kultivierung der Mikroorga- nismen (Sedimentproben) auf Agarplatten erfolgte ebenfalls für mindestens vier Tage. Dabei wurden die Agarplatten für 36 Stunden bei 28 °C inkubiert und für die restliche Zeit bei 20 °C. Kolonien wurden zuerst nach optischen Kriterien als potentielle Pseu- domonaden identifiziert. Hierzu wurde die für fluoreszierende Pseudomo- naden charakteristische Pigmentproduktion von Pyoverdin (Fluorescein) mittels UV-Lampe (366 nm) überprüft (siehe Abbildung 43 a im Anhang).

MATERIAL UND METHODEN

Tabelle 1: Einwaagen der Algen- und der Sedimentproben der mit 14 mL sterilem Fördewasser gefüllten Plastikröhrchen.

Kennzeichnung Probeneinwaage Einwaage berechnet Probenmaterial der Probe (g/14 mL) auf (mg/200 µL)

Alge 1 1a 3,022 43,17 Alge 1 1b 1,485 21,21 Alge 1 1c 3,672 52,46 Alge 1 1d 0,243 3,47 Alge 1 1e 0,86 12,29 Alge 2 2a 2,467 35,24 Alge 2 2b 2,266 32,37 Alge 2 2c 1,383 19,76 Alge 2 2d > 0,10 > 0,10* Alge 2 2e 0,182 2,60 Alge 3 3a 4,829 68,99 Alge 3 3b 4,474 63,91 Alge 3 3c 2,249 32,13 Alge 3 3d 0,147 2,10 Alge 3 3e 2,403 34,33 Alge 4 4a 1,445 20,64 Alge 4 4b 1,988 28,40 Alge 4 4c 1,046 14,94 Alge 4 4d 0,196 2,80 Alge 4 4e 0,47 6,71 Alge 5 5a 0,717 10,24 Alge 5 5b 1,291 18,44 Alge 5 5c 0,943 13,47 Sediment 1 S1 8,689 124,13 Sediment 2 S2 6,35 90,71 Sediment 3 S3 7,293 104,19 Sediment 4 S4 6,487 92,67 Sediment 5 S5 10,678 152,54 a: altes Phylloid, b: Phylloid, c: junges Phylloid, d: Cauloid, e: Rhizoid, * zu Berechnungs- zwecken als 0,10 mg angenommen.

MATERIAL UND METHODEN

Abbildung 43 b im Anhang zeigt eine makroskopische Aufnahme einer Agarplatte mit gewachsenen Kolonien auf Pseudomonas-Medium. Die Kolonien wurden anschließend mehrmals auf MB- oder GYM- Agarplatten überimpft und bei 28 °C kultiviert. Auch andere Kolonien wurden mehrmals auf MB- oder GYM-Agarplatten überimpft und bei 28 °C kultiviert, um Reinkulturen zu erhalten. Die einzelnen Kolonien wurden op- tisch und mikroskopisch überprüft. Von den Reinkulturen wurde eine DNA- Extraktion durchgeführt. Mit dem DNA-Extrakt wurde eine PCR der 16S rDNA durchgeführt und anschließend erfolgte die Sequenzierung. Die Ergebnisse der Sequenzierung dienten zum einen der molekularbiolo- gischen Überprüfung des Vorhandenseins von Reinkulturen, welche auch konserviert werden können und zum anderen wurden die 16S rRNA- Gensequenzen mittels blastn (Altschul et al. 1990) auf den nächsten verwandten Typstamm hin untersucht. Das Umgebungswasser wurde in den Volumina 100 µL, 1 mL, 10 mL, 100 mL und 1 L auf drei verschiedenen Medien (CFC, GSP und P) untersucht. Die Volumina 100 µL und 1 mL wurden jeweils auf einer bzw. drei Agarplatten ausgespatelt. Die größeren Vo- lumina wurden unter sterilen Bedingungen filtriert und die Membranfilter anschließend auf die Agarplatten aufgelegt und für mind. zwei Tage bei 28 °C kultiviert.

2.7 Konservierung der Bakterienstämme

30 Isolate wurden in zwei Parallelen mit dem MAST CryobankTM System von MAST Diagnostica bei -100 °C eingefroren und in der Stammdaten- bank des Kieler Wirkstoff-Zentrums hinterlegt. Des Weiteren wurden diese Stämme jeweils in zwei Parallelen in MB- (Pseudomonaden) bzw. GYM- Medium (Streptomyceten, Bacillus-Arten) mit DMSO 10 % (v/v) konserviert und in flüssigem Stickstoff bei -185 °C gelagert. Für die Konservie- rung wurde mittels Impföse Zellmaterial der Reinkulturen von gut gewachsenen Agarplatten entnommen und in den Röhrchen mit dem entsprechenden Medium suspendiert.

MATERIAL UND METHODEN

2.8 Molekularbiologische Methoden

2.8.1 DNA-Extraktion

Der Zellaufschluss für die DNA Extraktion der Reinkulturen erfolgte mit dem Precellys-Glas-Kit VK05 (0,5 mm, 2 mL) und der Zellmühle Precellys 24. In das Precelly Vial wurden jeweils 400 μL DNA-freies Wasser vorgelegt und anschließend mittels Impföse das Zellmaterial dazugegeben. Der mechanische Zellaufschluss erfolgte für zweimal 45 Sekunden bei einer Schüttelfrequenz 6.500 und einer Pause von 20 Sekunden zwischen den Schüttelintervallen. Anschließend wurde die Vials für 10 Minuten bei 8.000 g zentrifugiert. Der Überstand, in welchem sich die DNA befand, wurde in sterile Eppendorfgefäße überführt und bis zur weiteren Verwen- dung bei -20 °C gelagert. Bei Isolaten, deren Zellen durch das Precellys- Glas-Kit nicht aufgeschlossen werden konnten, wurde das DNeasy® Blood&Tissue Kit verwendet. Die Konzentrations- und Reinheitsbestim- mung der DNA erfolgte photometrisch mittels NanoVue Spektrophotome- ter nach (Sambrook & Russell 2001).

2.8.2 Polymerase Kettenreaktion

Die spezifische Amplifikation der DNA-Fragmente erfolgt mit Hilfe der Po- lymerase Kettenreaktion (PCR) (Mullis et al. 1986). In dieser Arbeit diente die PCR zur Amplifizierung der 16S rDNA. Die PCR wurde in 25 μL Reakti- onsansätzen in einem Thermocycler durchgeführt. Für die Reaktionsansät- ze wurden puReTaqTMReady-To-GoTMPCR Beads verwendet und die univer- sellen eubakteriellen Primer 27f (5’-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3’) und 1492r (5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) bzw. 1387r (5′-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3′) eingesetzt. Das amplifizierte 16S rRNA- Genfragment hat eine erwartete Länge von ca. 1500 bzw. 1400 bp. Die PCR- und Cycler-Parameter sind in den Tabellen 2 und 3 zusammengefasst.

MATERIAL UND METHODEN

Tabelle 2: PCR-Reaktionsansätze zur Amplifikation der 16S rDNA.

Reaktionsansatz Volumen (µL) Konzentration Primer 27f 1 10 pmol/µL Primer 1492r* 1 10 pmol/µL DNA-Template 1 DNA-freies Wasser 22

* oder Primer 1387r

Tabelle 3: Thermocyclerparameter für die PCR zur Amplifikation der 16S rDNA.

Funktion Temperatur (°C) Dauer (s) Zyklen

Denaturierung 94 120 1

Amplifikation Denaturierung 92 40 Annealing 55 40 30 Elongation 72 60

Terminale Elongation 72 300 1 Kühlung 10 ∞

Zur Überprüfung der Amplifikate wurde mit allen PCR-Produkten eine Aga- rose-Gelelektrophorese in 1x TBE-Puffer durchgeführt. Zur Größenbe- stimmung der Amplifikate wurde neben den PCR-Produkten auch ein Län- genstandard (DNA Molecular Weight Marker X) in eine Tasche eines 1,0 %iges Agarosegels pipettiert. Die Auftrennung erfolgte für 25 Minuten bei 150 mV. Das Anfärben der DNA-Moleküle erfolgte mit dem Farbstoff SYBR® Safe DNA gel strain. Die Auswertung und Dokumentation der Gele wurde mit einer UV-Dokumentationsanlage durchgeführt.

2.8.3 Sequenzierung

Die Sequenzierung der PCR-Produkte erfolgte mit der Methode von Sanger (Sanger et al. 1977) am Institut für Klinische Molekularbiologie des Uni- versitätsklinikums Kiel. Für die Sequenzierung wurden folgende 16S rDNA-

MATERIAL UND METHODEN spezifische Primer verwendet: 342f (Lane 1991), 534r (Muyzer et al. 1993) und 790f (5’-GAT ACC CTG GTA GTC C-3’). Die Sequenzen wurden mittels ChromasPro (Version 1.33c; 2005) bearbeitet. Anschließend erfolgte der Abgleich mit der Datenbank EMBL Nucleotid Datenbank und dem Tool blastn (Basic Local Alignment Search Tool) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), um den nächsten verwandten Typstamm zu ermitteln. Mit der „List of Prokaryotes‟ wurde dieser dann als Typstamm bestätigt (http://www.bacterio.cict.fr/).

2.9 Phylogenetischer Stammbaum von Pseudomonas-Stämmen

Zur Ermittlung der nächsten verwandten Typstämme wurde die Daten- bank Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu; Cole et al. (2009) verwendet. Zur Bestimmung der Sequenzähnlichkeiten wurde die Datenbank „bl2seq“ des National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/; Tatusova & Madden (1999) benutzt. Das Alignment der 16S rRNA Gensequenzen der Stämme LB042, LB043, LB044, LB045, LB046, LB047, LB048, LB051, LB062a, LB061, LB063, LD120, LB081, LB183, LB184 und LB185 und der Typstämme Pseudomo- nas fluorescens und Azotobacter vinelandii, wurde mittels Clustal X (Larkin et al. 2007) erstellt und manuell überarbeitet. A. vinelandii diente als Au- ßengruppe. Alle Sequenzen wurden auf eine einheitliche Länge von 1401 bp gekürzt. Zur phylogenetischen Analyse wurden LD120, LB183 und LB184 stellvertretend für die algenassoziierten Stämme ausgewählt. Der phylogenetische Stammbaum wurde mittels Neighbour-Joining- Algorhitmus (Saitou & Nei 1987) und Maximum-Likelihood method (Felsenstein 1981) unter Verwendung von MEGA Version 3.1 (Kumar et al. 2004) und PhyML Online (Guindon et al. 2005) berechnet. Die Neighbour- Joining-Analyse wurde mit 1000 Bootstrap-Replikaten berechnet und die Maximum-Likelihood-Analyse mit 500 Bootstrap-Replikaten. Der Maxi- mum-Likelihood-Stammbaum wurde nach dem GTR Model berechnet. Zur Darstellung des phylogenetischen Stammbaums wurde NJplot

MATERIAL UND METHODEN

(http://pbil.univ-lyon1.fr/software/njplot.html; Perriere & Gouy (1996) verwendet.

2.10 Untersuchungen zu Pseudomonas sp. LD120

Der Stamm Pseudomonas sp. LD120 wurde für eine nähere Charakterisie- rung für weitere Untersuchungen ausgewählt, da zu Beginn des Scree- nings nur dieser Stamm neben MAPG, DAPG und PLT auch Rhizoxine produzierte und somit das umfangreichste Metabolitspektrum aufwies. Zur Ermittlung der physiologischen Eigenschaften wurde der Test BIOLOG GN2 auf Mikrotiterplatten und die Substratverwertung mittels Agarplattentest eingesetzt. Mit Hilfe des Tests auf Mikrotiterplatten konnte die Verstoff- wechselung von 95 verschiedenen Kohlenstoffquellen untersucht werden (siehe Tabelle 39 im Anhang). Zur Überprüfung welche Substrate das Wachstum von Stamm LD120 ermöglichen wurden 11 Substrate ausge- wählt, die u. a. auch im Habitat (S. latissima) vorkommen könnten. Des Weiteren wurde überprüft, ob Stamm LD120 zu den fluoreszierenden Pseudomonaden zählt.

2.10.1 BIOLOG GN2

Pseudomonas sp. LD120 wurde nicht nur mittels 16S rRNA Gense- quenzanalyse identifiziert, sondern auch physiologisch mittels BIOLOG GN2 MicroPlateTM nach Anleitung des Herstellers. Hierzu wurde Stamm LD120 24 Stunden bei 28 °C auf LB-Agarplatten inkubiert. Mittels sterilem Wattestäbchen wurden die Zellen von der Agarplatte entnommen und in steriler 0,85 %iger NaCl-Lösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde auf eine OD620 von 0,28 eingestellt und anschließend wurden jeweils 150 µL in jedes Well pipettiert. Die Inkubation wurde in einem Plastikbe- hälter durchgeführt, welcher zusätzlich an angefeuchtetes Papiertuch enthielt und mit Alufolie abgedeckt wurde. Die visuelle Auswertung der zwei Parallelen erfolgte nach 24 Stunden.

MATERIAL UND METHODEN

2.10.2 Substratverwertung

Der Stamm Pseudomonas sp. LD120 wurde auf Minimalmedien kultiviert, welche verschiedene Substrate enthielten. Zur Herstellung von Agarplat- ten enthielt jedes Medium 1,5 % (w/v) Agar. Folgende Substrate wurden in einer Konzentration von 1 % (w/v) verwendet: Na-Alginat, Cellulose, Mannitol, Glucose, gefriergetrocknetes Pulver von S. latissima, Agar, Aga- rose, DL-Na-Malat, Na-Succinat, Na-Fumarat und L-Na-Glutamat. Alle Substrate wurden in Standortwasser gelöst. Mittels Impföse wurde eine fünf Tage alte Vorkultur (auf MB-Agar) des Stammes LD120 auf den verschiedenen Agarplatten ausgestrichen und für 12 Tage bei 28 °C inkubiert. Zur Kontrolle wurde der Stamm in gleicher Weise auf MB-Agarplatten kultiviert.

2.10.3 Fluoreszensnachweis

Für den Fluoreszensnachweis wurde Stamm LD120 drei Tage bei 28 °C auf Agarplatten kultiviert, welche Medium P enthielten. Die für fluoreszierende Pseudomonaden charakteristische Pigmentproduktion von Pyoverdin (Flu- orescein) wurde mittels UV-Lampe (366 nm) überprüft.

2.11 Anzucht und Extraktion der Bakterienkulturen

In diesem Abschnitt sind die Bedingungen zur Anzucht und Extraktion für die Screening-Ansätze und für die Großansätze beschrieben. Für die Screening-Ansätze wurden 100 und 300 mL Erlenmeyerkolben verwendet die jeweils 25 bzw. 100 mL Medium enthielten. Für die Großansätze wurden 2 L Erlenmeyerkolben verwendet, die jeweils 1 L Medium enthielten.

2.11.1 Anzucht auf Agarplatten

Die Agarplatten mit dem jeweiligen Anzuchtmedium wurden mit einem Kügelchen aus der Kryokonservierung angeimpft und anschließend bei 28 °C oder bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Kultivierungs- dauer und –temperatur für die jeweiligen Experimente sind in Tabelle 38 im Anhang ersichtlich.

MATERIAL UND METHODEN

2.11.2 Anzucht in Flüssigkultur

Zur Anzucht von Flüssigkulturen wurden Erlenmeyerkolben entweder mit je einem Kügelchen aus der Kryokonservierung angeimpft (nur 25 bzw. 100 mL-Maßstab) oder mit Stücken einer gut bewachsenen Agarplatte. Screening-Ansätze im 100 bzw. 300 mL Erlenmeyerkolben wurden mit ca. 1 cm2 großen Stücken der gut bewachsenen Agarplatten beimpft, Großan- sätze wurden pro 2 L Erlenmeyerkolben mit etwa 2 cm2 großen Stücken oder einer Flüssigvorkultur angeimpft (siehe Tabelle 38 im Anhang). Wenn nicht anders angegeben, erfolgte die Inkubation bei 28 °C oder bei Raum- temperatur im Dunkeln bei 120 rpm.

2.11.3 Extraktion der Agarplatten

Die Agarplatten-Kulturen wurden nach der jeweiligen Inkubation mittels Spatel in ein 300 mL-Erlenmeyerkolben überführt. Nach Zugabe von 100 mL EtOAc erfolgte die Homogenisation mittels Ultra-Turrax-T25 basic bei 16.000 rpm für ca. 30 Sekunden. Zur Abtrennung der organischen Phase wurde das Homogenisat über einen Phasentrennfilter (1 PS, 185 mm, Whatman Schleicher & Schuell, Dassel) gegeben. Der aufgefangene Ethyl- acetatextrakt wurde mittels SpeedVac vakuumgetrocknet und in 200 µL MeOH resuspendiert. Nach der Filtration durch einen 0,2 μm PTFE-Filter wurden 15 µL zur HPLC-Analyse verwendet.

2.11.4 Extraktion der Kulturen im 25/100 mL Maßstab

Wenn nicht anders angegeben, erfolgte die Extraktion der Zellen und des Kulturüberstandes zusammen. Nach der jeweiligen Inkubation der Kultu- ren (siehe Tabelle 38 im Anhang) erfolgte die Zugabe von EtOAc (1:1, v/v) zur Kultur. Anschließend wurden die Flüssigkulturen bei 13.000 rpm für ca. 30 Sekunden mittels Ultra-Turrax-T25 basic homogenisiert. Das homogene Gemisch aus Kultur und organischem Lösungsmittel wurde beim 25 mL-Maßstab in ein Zentrifugenglas überführt und zur Phasen- trennung für 10 Minuten bei 4.700 rpm zentrifugiert. Das EtOAc wurde mit einer Pipette in ein neues Zentrifugenglas überführt und in einer SpeedVac

MATERIAL UND METHODEN bei 40 °C und ca. 100 mbar bis zur Trockene eingeengt. Der Niederschlag wurde mit 200 μL MeOH resuspendiert und durch einen 0,2 μm PTFE-Filter in ein HPLC-Vial filtriert. Für die HPLC-Analyse wurde ein Aliquot von 15 µl verwendet. Der Rest wurde für Bioaktivitätstests verwendet bzw. bei 4 °C gelagert. Zur Extraktion des 100 mL-Maßstabs wurde das Homogenisat in einen Scheidetrichter überführt und gut durchgemischt. Die wässrige Pha- se wurde verworfen. Die Ethylacetat-Phase wurde mit 50 mL Milli-Q Was- ser gewaschen. Die Ethylacetat-Phase wurde anschließend in einen Rund- kolben überführt und mittels Rotationsverdampfer getrocknet. Der Nieder- schlag wurde mit 1 mL MeOH resuspendiert und ansonsten wurde ebenso verfahren, wie im 25 mL-Maßstab.

2.11.5 Extraktion der Kulturen im 1 L Maßstab und Großansatz

Wenn nicht anders angegeben, erfolgte die Extraktion der Zellen und des Kulturüberstandes zusammen. Ein Großansatz definiert sich in dieser Ar- beit als die parallele Kultivierung von 10 bis 12 1 L-Kulturen eines Stam- mes. Nach der jeweiligen Inkubation der Kulturen (siehe Tabelle 38 im Anhang) wurden die 1 L-Kulturen mittels Ultra-Turrax homogenisiert. An- schließend wurden jeweils 500 mL Kulturhomogenisat mit 500 mL EtOAc in einem Scheidetrichter ausgeschüttelt. Des Weiteren wurde ebenso verfahren, wie mit dem 100 mL-Maßstab. Der Waschschritt wurde mit ca. 300 mL durchgeführt. Der Niederschlag wurde mit 1 mL MeOH resuspendiert. Die Extraktion der Großansätze erfolgte ebenso wie in den 1 L- Screening-Ansätzen. Der Niederschlag des Großansatzes wurde mit 10 mL MeOH resuspendiert.

2.12 Chromatographie

Das für die Chromatographie verwendete Wasser wurde über eine Milli-Q- Anlage (Millipore) gereinigt und entionisiert. Das für die Chromatographie verwendete Acetonitril (ACN) und Methanol (MeOH) hatten die Reinheits- stufe HPLC Gradient Grade. Durch Verwendung einer mechanischen Onli- ne-Entgaser-Einheit wurden alle Lösungsmittel entgast.

MATERIAL UND METHODEN

2.12.1 Analytische Chromatographie

Um die Produktion von Naturstoffen der ausgewählten Stämme zu analysieren und erste Informationen über die Substanzcharakteristika zu erhalten, wurden die Rohextrakte zur Feststellung von Reinheitsgrad, UV/VIS- Absorption und Molekülmasse mit einem gekoppelten System bestehend aus HPLC mit Diodenarray-Detektor und Masse gemessen. Bevor die Pro- ben eingespritzt wurden, wurden diese in MeOH gelöst und durch einen 0,2 μm PTFE-Spritzenfilter filtriert. 15 μL der Probe wurden zur Analyse in die HPLC-DAD/MS injiziert. Die chromatographische Auftrennung der Ex- trakte erfolgte per monolithischer Umkehrphase, reverse phase (RP) genannt. Die stationäre Phase war unpolar und trug als lipophile Alkylreste Octadecylgruppen (Phenomenex, Onyx monolithic C18, 100 x 3,0 mm, endcapped). Als mobile Phase wurde ein Zweikomponenten-Gradient verwendet, der aus Milli-Q-Wasser (A) und ACN (B), jeweils versetzt mit Ameisensäure (0,1 %), bestand. Gradient: 0 min 5 % B, 4 min 60 % B, 6 min 100 % B; Fluss 2,0 mL/min. Der Säulenofen war stets auf 40 °C tem- periert. Die Molekülmassen wurden mit einem ESI-Ionenfallen-Detektor gemessen. Die Messung erfolgte im Positiv-Modus, so dass es primär zur Bildung von Monomer-Ionen ([M+H]+, [M+Na]+) kam und seltener zur Bildung von Dimer-Ionen ([2M+H]+, [2M+Na]+) und Kalium-Addukten ([M+K]+). Während der Messung lag eine Spannung von 3500 V an. Als Verneblergas wurde Stickstoff mit einem Druck von 2,7 bar eingesprüht. Das Trocken- gas wurde mit 9 L/min und 350 °C in die Verneblerkammer eingeleitet.

2.12.2 Präparative Chromatographie

Ausgewählte Extrakte wurden mit der präparativen LC (Liquid Chromato- graphy)-UV/VIS chromatographisch aufgetrennt. Bevor die Proben eingespritzt wurden, wurden diese in MeOH gelöst und durch einen 0,2 μm PTFE-Spritzenfilter filtriert. Als mobile Phase wurde ein Zweikomponenten- Gradient (Milli-Q-Wasser und ACN, jeweils angesäuert auf 0,1 % Ameisen- säure) verwendet. Der Gradient wurde je nach Extrakt variiert. Die Tren-

MATERIAL UND METHODEN nung erfolgte mittel Umkehrphasenchromatographie. Die Säule (Gemini- NX 10u C18, 100 Å, Axia-packed, 100 x 50,00 mm, Phenomenex) wurde bei Raumtemperatur verwendet. Am Detektor wurde die Wellenlänge so gewählt, dass möglichst viele Substanzen detektiert werden konnten. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt und der Acetonitrilanteil im Vakuum abgedampft/eingeengt. Die Substanzen wurden mit MeOH suspendiert und in Braunglasgefäße überführt. Die Proben wurden durch einen Stickstoffbegaser bei 40 °C getrocknet und anschließend bei 4 °C o- der -20 °C gelagert. Zur Abtrennung der Ameisensäure aus dem HPLC- Eluenten wurde die Lösung gegebenenfalls anschließend durch eine mit Methanol und Wasser vorkonditionierte RP-18-Kartusche (Merck, mit 500 mg RP-18-Material) gesaugt. Nach dem Waschen mit etwas Wasser wurden die am Adsorbens gebundenen Substanzen anschließend mit MeOH eluiert.

2.12.3 Semi-Präparative Chromatographie

Zur Gewinnung von Reinsubstanzen wurden ausgewählte Extrakte und ausgewählte Fraktionen von der präparativen LC-UV/VIS an der semi- präparativen HPLC-DAD chromatographisch aufgetrennt. Bevor die Proben eingespritzt wurden, wurden diese in MeOH gelöst und durch einen 0,2 μm PTFE-Spritzenfilter filtriert. Als mobile Phase wurde ein Zweikomponenten- Gradient verwendet, der aus Milli-Q-Wasser (A) und ACN (B) bestand und jeweils 0,1 % Ameisensäure enthielt. Der Gradient wurde je nach Extrakt variiert. Die Trennung erfolgte bei Raumtemperatur entweder mittels RP- Chromatographie (Säule: Gemini-NX 5u C18 (100 Å, Axia-packed, 100 x 21,20 mm, Phenomenex) oder mittels Normalphasenchromatographie (Säule: Luna Silica 5u, 100 Å, 250 x 10,00 mm, Phenomenex). Das Lö- sungsmittel aller produkthaltigen Fraktionen wurde im Vakuum entfernt. Die Substanzen wurden mit MeOH suspendiert und in Braunglasgefäße überführt. Das Lösungsmittel wurde durch einen Stickstoffbegaser bei 40 °C getrocknet. Die Proben wurden bei 4 °C oder -20 °C gelagert.

MATERIAL UND METHODEN

2.13 Dereplikation

Die Auswertung der erhaltenen UV/VIS- und Massen-Daten erfolgte mit den Programmen Data Analysis und Hystar (Bruker Daltonics, Bremen). Um möglichst frühzeitig viele Substanzen dereplizieren zu können, wurden die Daten im Anschluss mit zwei Datenbanken (Antibase (Laatsch 2007), Dictionary of Natural Products (Buckingham 2011)) abgeglichen.

2.14 NMR-Spektroskopie

Die isolierten Substanzen wurden als erstes einer 1H NMR-Messung unter- zogen. Alle NMR-Messungen wurden in der spektroskopischen Abteilung des Otto-Diels-Institut an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel bei Prof. Dr. Frank Sönnichsen gemessen. Die NMR-Spektren wurden entweder mit einem Bruker Avance 600 Spektrometer mit Cryoprobenkopf oder mit einem Bruker DRX500 mit Probenwechsler aufgenommen. Als Refe- renz wurden die Restprotonen-bzw. Restkohlenstoffsignale des jeweiligen deuterierten Lösungsmittels verwendet.

2.15 Bioassays

Die Rohextrakte wurden auf ihre antimikrobielle Aktivität hin untersucht. Dargestellt werden die Ergebnisse der Reinsubstanzen für die zellkulturba- sierten Assays, die Enzyminhibitionsassays und die antibiotischen Assays. Die Reinsubstanzen wurden in Dimethylsulfoxid gelöst und auf eine Kon- zentration von 10 mM eingestellt. Anschließend wurden die Reinsubstan- zen in eine 96-well Mikrotiterplatte pipettiert und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft.

Die Ergebnisse der Bioassays werden wie folgt definiert: ≥ 80 % Inhibition: sehr gute Aktivität < 80 % und ≥ 60 % Inhibition: moderate Aktivität < 60 % und > 30 % Inhibition: geringe Aktivität ≤ 30 % Inhibition: keine Aktivität

MATERIAL UND METHODEN

2.15.1 Antibiotische Bioassays

Zur Ermittlung der antimikrobiellen Aktivität wurden die Reinsubstanzen gegen folgende in Tabelle 4 aufgelisteten Mikroorganismen getestet.

Tabelle 4: Antibiotische Bioassays. Aufgelistet sind die für die Bioaktivitätstests verwendeten Mikroorganismen mit der entsprechenden Abkürzung, deren Stammnummer bzw. Herkunft und deren Pathogenität.

Stamm Nr./ Organismus Abkürzung Pathogenität Herkunft

Bacillus subtilis subsp. spizizenii DSM 347 B.s. n Escherichia coli K12 DSM 498 E.c. n Staphylococcus lentus DSM 6672 S.l. n Pseudomonas aeruginosa DSM 50071T Ps.a. h Pseudomonas syringae pv. aptata DSM 50252 Ps.s. p Pseudomonas fluorescens NCIMB 10586 Ps.fl. h Propionibacterium acnes DSM 1897T P.a. h Xanthomonas campestris DSM 2405 X.c. p Ralstonia solanacearum DSM 9544T R.s. p Candida glabrata DSM 6425 C.g. h Erwinia amylovora DSM 50901 E.a. p Pseudoalteromonas elyakovii CIP 105338T P.e. a Algicola bacteriolytica CIP 105725T A.b. a Botrytis cinerea BASF B.c. p Phytophthora infestans BASF P.i. p Septoria tritici BASF S.tr. p Trichophyton mentagrophytes UK-SH Kiel* T.m. h Trichophyton rubrum UK-SH Kiel* T.r. h Microsporum canis UK-SH Kiel* M.c. h Candida albicans DSM 1386 C.a. h Staphylococcus epidermidis DSM 20044T S.e. h a: potentiell algenpathogen, h: humanpathogen, n: nicht pathogen, p: pflanzenpathogen * Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie am UK-SH Kiel.

Die Bioassays mit Septoria tritici, Trichophyton rubrum (Trichophyton mentagrophytes analog) und Phytophtora infestans wurden durchgeführt

MATERIAL UND METHODEN wie bei Jansen (2012) beschrieben. Die Bioassays mit Propionibacterium acnes und Staphylococcus epidermidis wurden durchgeführt wie bei Schneemann et al. (2010) beschrieben. Die Bioassays mit Candida albicans und Microsporum canis wurden durchgeführt wie bei Schulz et al. (2011) beschrieben. Die Bioassays mit den übrigen Testorganismen wurde wie bei Nagel et al. (2012) beschrieben durchgeführt.

2.15.2 Enzyminhibitionsassays

Die Reinsubstanzen wurden zudem auf die Hemmung bestimmter klinisch relevanter Enzyme hin untersucht. Die Reinsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 μM getestet. Folgende Enzyme wurden für die Tes- tung verwendet:

Acetylcholinesterase (AchE): Die Acetylcholinesterase ist ein Enzym zur Spaltung des Neurotransmitters Acetylcholin. Sie gilt zB. als Target zur Behandlung von Morbus Alzheimer (Bolognesi et al. 2008).

Protein-Tyrosin-Phosphatase 1B (PTB1B): Protein-Tyrosin-Phosphatasen entfernen Phosphatgruppen an Tyrosin- phosphorylierten Proteinen, welche für die Signaltransduktion wichtig sind. Das Enzym gilt z.B. als Target zur Behandlung von Diabetes mellitus Typ 2, Fettleibigkeit und Krebs (Zhang 2001).

Glykogensynthase-Kinase 3ß (GSK-3ß): Das Enzym ist ein Schlüsselregulator vieler Signalübertragungswege. Der therapeutische Nutzen von Glykogensynthase-Kinase-Inhibitoren besteht in der Behandlung von Diabetes mellitus Typ 2, neurologischen und Krebserkrankungen (Martinez et al 2002).

Phosphodiesterase IV (PDE4): Phosphodiesterase IV baut sekundäre Botenstoffe wie cyclisches Andeno- sinmonophosphat (cAMP) und cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP)

MATERIAL UND METHODEN ab. Anwendungsgebiete von PDE4-Inhibitoren sind u.a. Erkrankungen der Lunge, Depressionen und Alzheimer (Houslay et al. 2005).

HIV-1 Reverse Transkriptase (HIV-1-RT): Die reverse Transkriptase ist ein Enzym, das die Umschreibung von RNA in DNA katalysiert. Inhibitoren dieses Enzyms sollen bei der Behandlung u.a. von AIDS eingesetzt werden (Sarafianos et al. 2008).

Die Enzyminhibitionsassays mit Phosphodiesterase 4 (PDE4) und Acetyl- cholinesterase (AchE) wurden durchgeführt wie bei Schulz et al. (2011) und Ohlendorf et al. (2012) beschrieben. Der Enzyminhibitionsassay zur Bestimmung von Inhibitoren der HIV-1 Re- verse Transkriptase wurde mit Hilfe des kolorimetrischen Reverse Tran- skriptase ELISA Kits (Roche, Mannheim) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Für die Untersuchung der Protein-Tyrosin-Phosphatase 1B wurde das Biomol GreenTM PTP1B Tyrosin Phosphatase Drug Discovery Kit (Enzy Life Science GmbH, Lörrach) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach Angaben des Herstellers. Der Enzyminhibitionsassay zur Bestimmung der Aktivität der Glykogensynthase-Kinase 3 β wurde wie bei Baki et al. (2007) beschrieben durchgeführt. Für den Nachweis des ATPs wurde das Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay Kit (Promega (V3772)) verwendet.

2.15.3 Zellkulturbasierte Assays

Zur Bestimmung der zytotoxischen Wirkung der Reinsubstanzen gegen eukaryotische Zelllinien wurde der CellTiterBlue® Cell Viability Assay verwendet. Die Zahl der metabolisch aktiven Zellen wird in diesem Assay anhand des Umsatzes von Resazurin in Resorufin bestimmt. Die Durchfüh- rung für die Zelllinien NIH-3T3 (Abteilung Lebensmittelwissenschaften der Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen Fakultät der CAU Kiel), HT-29 (DSMZ, Braunschweig (ACC 299)) und HepG2 (DSMZ, Braunschweig (ACC 180)) erfolgte wie bei Schneemann et al. (2010) beschrieben. Die zu tes- tende Reinsubstanz wurde in Konzentrationen von 10 μM und/oder 50 μM eingesetzt.

MATERIAL UND METHODEN

2.15.4 Bakterien aus der KiWiZ-Sammlung

Folgende Bakterienstämme gehören zur Stammsammlung des KiWiZ, so dass es über diese Stämme bereits vor dieser Arbeit Informationen bezüg- lich des Vorhandenseins von Biosynthesegenclustern und Ergebnissen aus Bioaktivitätstests gab (siehe Tabelle 9 in Kapitel 3.6): LB084, LD81, LB034, LB058, LB114, LB129, LB152, LB012, LD120, LB042 und LB061.

ERGEBNISSE

3 Ergebnisse

3.1 Isolierung biologisch aktiver Bakterien

An der Braunalge Saccharina latissima wird in der Arbeitsgruppe Marine Mikrobiologie bereits seit einigen Jahre geforscht. Mittels DGGE wurden auf S. latissima verschiedene Phylotypen von assoziierten Bakterien gefunden. Aus der Klasse der Alpha- und Gammaproteobakterien wurden je neun Phylotypen und aus der Klasse der Bacteroidetes wurden vier Phylo- typen identifiziert (Staufenberger et al. 2008). Des Weiteren wurden mittels 16S rRNA-Gensequenzanalyse 210 Isolate identifiziert, von denen 103 Isolate eine biologische Aktivität aufwiesen (Wiese et al. 2009b). Die Ab- bildung 11 zeigt die Verteilung der biologisch aktiven Isolate von S. latissima auf verschiedene Gattungen.

Abbildung 11: Verteilung der Gattungen biologisch aktiver Isolate, die von der Braunal- ge Saccharina latissima isoliert wurden nach (Wiese et al. 2009).

Unter den biologisch aktiven Bakterien befinden sich am häufigsten Ver- treter der Gattungen Streptomyces, Bacillus und Pseudomonas, gefolgt von Vertretern der Gattungen Vibrio, Pseudoalteromonas und Stenotro- phomonas. Unter den sogenannten „andere“ befinden sich vier Isolate aus der Klasse der Alphaproteobakterien, zwei aus der Klasse der Bacteroide-

ERGEBNISSE tes und nur ein Isolat aus der Klasse der Betaproteobakterien. Die restli- chen Isolate verteilen sich auf die Stämme der Actinobacteria und der Pro- teobakterien. Durch die Untersuchungen von Wiese et al. (2009b) konnte gezeigt werden, dass Pseudomonaden einen bedeutenden Anteil der biologisch aktiven Bakterien darstellen, die von S. latissima isoliert werden konnten. Daher sollte in einer erneuten Probenahme zum einen nach weiteren potentiell biologisch aktiven Pseudomonaden gesucht werden und auf der anderen Seite sollte ein Nachweis erfolgen, dass Pseudomonaden mit S. latissima auch langfristig assoziiert sind. Dieser Nachweis sollte durch eine erneute Isolation bereits bekannter, isolierter Stämme erfolgen. Als Probenmaterial dienten Alge und Sediment. Zur Isolierung der Pseudomonaden wurden drei Selektivmedien (GSP-, CFC- und Pseudomonas-Agar) verwendet. Zur Berechnung der Gesamt- keimzahl wurden die kolonienbildenden Einheiten (KBE) der Agarplatten aller drei Medien herangezogen. Nicht in die Berechnung mit einbezogen wurden Pilzkolonien. Ebenso sind, soweit auszählbar, drei Verdünnungs- stufen (10-1, 10-2, 10-3 für Sedimentproben und 100, 10-1, 10-2 für Algen- proben) in die Berechnung mit einbezogen worden. Für alle Proben wurde die Anzahl der KBE auf 1 g Ausgangsmaterial normiert. Für die fünf parallelen Sedimentproben ergab die Auszählung der KBE, nach vier Tagen Inkubation, folgende Verteilung. Die Auszählung der Se- dimentprobe 1 S1 ergab ca. 3,4 x 104 KBE. Die Auswertung der Sedi- mentprobe 2 S2 ergab knapp 7,3 x 104 KBE. Die Auszählung der Sedi- mentprobe 3 S3 ergab knapp 2,4 x 104 KBE. Die Sedimentprobe 4 S4 wies vier Tagen etwa 5,5 x 104 KBE auf. Die Auswertung der Sediment- probe 5 S5 ergab nach vier Tagen ca. 2,2 x 104 KBE (Abbildung 12). Da- mit lagen die KBE aller fünf Sedimentproben in einer ähnlichen Größen- ordnung. Die relative Standardabweichung beträgt 53 %, was einer gro- ßen Streuung der Ergebnisse entspricht.

ERGEBNISSE

8x104

6x104

KBE/1g 4x10

2x104

0 S1 S2 S3 S4 S5

Sedimentproben Abbildung 12: Anzahl der Koloniebildenden Einheiten (KBE) berechnet auf 1 g Proben- material. Dargestellt sind die fünf parallelen Sedimentproben S1 bis S5. Die Kultivierung der Mikroorganismen auf Agarplatten erfolgte für mindestens vier Tage. Für 36 Stunden wurden die Agarplatten bei 28 °C inkubiert, für die restliche Zeit wurde bei 20 °C inkubiert. Dargestellt sind die Ergebnisse der Auszählung nach vier Tagen.

Für die Bestimmung der Gesamtkeimzahl der fünf parallelen Algenproben 1 bis 5 mit den jeweiligen Abschnitten a altes Phylloid, b Phylloid, c junges Phylloid (Meristem), d Cauloid und e Rhizoid wurde ebenso verfahren wie für die Sedimentproben. Auf Grund des geringen Alters und damit ein- hergehend der geringen Größe von Alge 5 konnten weder Teile des Cauloids noch Teile des Rhizoids beprobt werden, somit flossen keine Da- ten der Alge 5 in die Auswertung mit ein. Aus der Abbildung 13 wird deutlich, dass die Gesamtkeimzahl des Rhizoid-Algenabschnitts e mit ca. 7,3 x 104 am höchsten ist. Die Gesamtkeimzahl des alten Phylloids a liegt mit ca. 5 x 103 schon deutlich darunter. Auf dem Abschnitt des Cauloids d konnten knapp 2 x 103 KBE gezählt werden. Die Auszählung des jungen Phylloids c und des Phylloids b ergaben mit jeweils ca. 680 und 250 KBE die geringsten Werte. Die relative Standardabweichung (RSD) für das alte

ERGEBNISSE

Phylloid a und das junge Phylloid c ergaben mit jeweils 139 % und 136 % die größte Streuung. Die relative Standardabweichung für das Rhizoid e lag bei 53 %. Die geringste Streuung ergaben das Phylloid b (RSD 39 %) und das Cauloid d (RSD 35 %).

105

104

103

KBE/1g

102

101 a b c d e

Algenabschnitte

Abbildung 13: Anzahl der Koloniebildenden Einheiten (KBE) berechnet auf 1 g Proben- material. Dargestellt sind die vier parallelen Algenproben 1 bis 4. a altes Phylloid, b Phy- lloid, c junges Phylloid (Meristem), d Cauloid, e Rhizoid. Die Kultivierung der Mikroorga- nismen auf Agarplatten erfolgte bei 28 °C für mindestens vier Tage. Dargestellt sind die Ergebnisse der Auszählungen nach vier Tagen Inkubation.

Die Umgebungswasserproben konnten auf Grund zu weniger bzw. zu vieler Kolonien, im Hinblick auf die Gesamtkeimzahl, nicht ausgewertet werden. Infolgedessen wurden auch keine Kolonien zur Isolierung und Identi- fizierung ausgewählt. Es soll aber nicht unerwähnt bleiben, dass die fluoreszierenden Kolonien, die auf den Agarplatten der Umgebungswasserpro- ben gewachsen sind, auf das Vorhandensein einer Vielzahl von Pseudomo- naden hindeuten. Da eine Probenahme zeit- und materialaufwendig ist, wurden im Januar 2010 neben Pseudomonaden auch weitere potentielle Naturstoffproduzen-

ERGEBNISSE ten, wie z.B. Streptomyceten isoliert, um die Probe effektiv zu nutzen. Insgesamt wurden 82 Bakterien isoliert. Mittels 16S rRNA- Gensequenzanalyse und Datenbankrecherche wurden 74 Stämme identifiziert (Tabelle 5 und Tabelle 6). Bei acht Stämmen war die Qualität der Se- quenzen so schlecht, dass keine Identifizierung stattfinden konnte (KN12, KN44, KN46, KN74, KN75, KN76, KN78, KN80). In Tabelle 7 sind die Ähn- lichkeit der bearbeiteten Stämme zu den jeweils nächsten verwandten Typstämmen inklusive deren 16S rRNA Gene Acc.-No. sowie die Sequenz- länge der Stämme und deren „accession number“ angegeben.

ERGEBNISSE

Tabelle 5: Dargestellt sind die nächsten verwandten Typstämme inklusive deren 16S rRNA Gene Acc.-No. der identifizierten Isola- te von 2010. Des Weiteren sind das Agarmedium und das Ausgangsmaterial (Sediment oder Algenabschnitt) aufgeführt aus welchem die Stämme isoliert wurden.

16S rRNA Gene Acc.- Ausgangsmaterial Medium Isolat Nächster verwandter Typstamm No.

Sediment G KN4 Pseudomonas putida ATCC 12633T D84020 Sediment C KN5 Pseudomonas kilonensis 520-20T AJ292426 Sediment C KN6 Pseudomonas lini DLE411JT AY035996 Sediment P KN7 Exiguobacterium oxidotolerans T-2-2T AB105164 Sediment P KN8 Exiguobacterium oxidotolerans T-2-2T AB105164 Sediment G KN13 Pseudomonas jessenii CIP 105274T AF068259 Sediment P KN14 Arthrobacter arilaitensis RE117T AJ609628 Rhizoid G KN15 Pseudomonas graminis DSM 11363T Y11150 Sediment G KN16 Pseudomonas lurida DSM 15835T AJ581999 altes Phylloid P KN20 Pseudomonas taiwanensis BCRC 17751T EU103629 Sediment C KN21 Pseudomonas migulae CIP 105470T AF074383 Rhizoid C KN23 Pseudomonas panacis CG20106T AY787208 Sediment G KN24 Pseudomonas psychrophila E-3T AB041885 Sediment C KN25 Pseudomonas putida ATCC 12633T D84020 altes Phylloid P KN26 Pseudomonas jessenii CIP 105274T AF068259 Sediment P KN29 Pseudomonas frederiksbergensis JAJ28T AJ249382 Rhizoid C KN30 Pseudomonas lurida DSM 15835T AJ581999 Rhizoid C KN31 Pseudomonas lurida DSM 15835T AJ581999 Rhizoid C KN32 Pseudomonas lurida DSM 15835T AJ581999 altes Phylloid C KN33 Pseudomonas lini DLE411JT AY035996

ERGEBNISSE

16S rRNA Gene Acc.- Ausgangsmaterial Medium Isolat Nächster verwandter Typstamm No. altes Phylloid P KN35 Pseudomonas oryzihabitans L-1T D84004 Sediment G KN37 Pseudomonas lurida DSM 15835T AJ581999 Sediment C KN39 Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens AY509898 DSM 6698T Phylloid G KN40 Pseudomonas psychrophila E-3T AB041885 Sediment C KN49 Pseudomonas frederiksbergensis JAJ28T AJ249382 Rhizoid C KN52 Pseudomonas trivialis DSM 14937T AJ492831 Rhizoid C KN53 Pseudomonas graminis DSM 11363T Y11150 Sediment G KN55 Pseudomonas veronii CIP 104663T AF064460 Sediment P KN56 Pseudomonas graminis DSM 11363T Y11150 Sediment C KN57 Pseudomonas frederiksbergensis JAJ28T AJ249382 Sediment G KN58 Pseudomonas putida ATCC 12633T D84020 Sediment P KN60 Pseudomonas cannabina CFBP 2341T AJ492827 Sediment P KN61 Pseudomonas cedrina subsp. fulgida DSM 14938T AJ492830 Sediment P KN62 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 Cauloid P KN64 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 altes Phylloid P KN65 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 altes Phylloid P KN66 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 Sediment P KN67 Streptomyces sampsonii ATCC 25495T D63871 Sediment G KN68 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 Rhizoid P KN69 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 Sediment P KN70 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 Sediment P KN71 Streptomyces phaeochromogenes ATCC 3338T AB184738 Phylloid P KN72 Streptomyces sampsonii ATCC 25495T D63871

ERGEBNISSE

16S rRNA Gene Acc.- Ausgangsmaterial Medium Isolat Nächster verwandter Typstamm No. altes Phylloid P KN73 Streptomyces sampsonii ATCC 25495T D63871

C: CFC-Agarplatte, G: GSP-Agarplatte, P: Pseudomonas-Agarplatte.

ERGEBNISSE

Tabelle 6: Dargestellt ist die Ähnlichkeit der identifizierten und auch konservierten Stämme von 2010 zu den jeweils nächsten verwandten Typstämmen inklusive deren 16S rRNA Gene Acc.-No. Des Weiteren sind die Sequenzlänge der Isolate und deren Ausgangsmaterial angegeben, sowie das Isolationsmedium.

Ausgangs- Sequenzlänge 16S rRNA Ähnlichkeit zum Stamm * Nächster verwandter Typstamm material in bp Gene Acc.-No. Typstamm

LB170 P Sediment 1484 Streptomyces mirabilis NBRC 13450T AB184412 99,7 % LB171 P Sediment 1481 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 99,9 % LB173 P Sediment 1199 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 99,5 % LB174 P Sediment 1490 Streptomyces luridiscabiei S63T AF361784 99,7 % LB176 P Sediment 1431 Streptomyces drozdowiczii NRRL B-24297T AB249957 99,6 % LB177 P Phylloid 1483 Streptomyces phaeochromogenes ATCC 3338T AB184738 100 % LB179 P altes Phyllloid 1382 Streptomyces clavifer NRRL B-2557T DQ026670 99,9 % LB181 P Sediment 1489 Streptomyces coelescens AS 4.1594T AF503496 99,9 % LB182 P Phylloid 1371 Streptomyces mirabilis ATCC 27447T AB184412 99,3 % LB183 C altes Phyllloid 1483 Pseudomonas kilonensis DSM 13647T AJ292426 99,7 % LB184 G Sediment 1483 Pseudomonas kilonensis DSM 13647T AJ292426 99,6 % LB185 C Sediment 1483 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,7 % LB186 G Sediment 414 Pseudomonas lurida DSM 15835T AJ581999 100 % Pseudomonas trivialis DSM 14937T AJ492831 100 % Pseudomonas poae DSM 14936T AJ492829 100 % LB187 C Sediment 451 Pseudomonas trivialis DSM 14937T AJ492831 99,8 % LB188 C Rhizoid 465 Bacillus weihenstephanensis DSM11821T AB021199 99,8 % LB189 P altes Phyllloid 411 Pseudomonas graminis DSM 11363T Y11150 95,1 % LB190 G Sediment 411 Pseudomonas fluorescens ATCC 13525T D84013 94,9 % LB191 C Rhizoid 492 Pseudomonas lurida DSM 15835T AJ581999 99,4 %

ERGEBNISSE

Ausgangs- Sequenzlänge 16S rRNA Ähnlichkeit zum Stamm * Nächster verwandter Typstamm material in bp Gene Acc.-No. Typstamm

LB192 C Sediment 480 Pseudomonas migulae CIP 105470T AF074383 99,8 % LB193 C Rhizoid 463 Bacillus weihenstephanensis DSM11821T AB021199 100 % LB194 C Sediment 412 Pseudomonas jessenii CIP 105274T AF068259 100 % LB195 C Sediment 454 Pseudomonas frederiksbergensis JAJ28T AJ249382 100 % LB196 C Sediment 451 Pseudomonas panacis CG20106T AY787208 99,8 % LB197 G Sediment 498 Pseudomonas marincola KMM 3042T AB301071 98,9 % LB198 P Rhizoid 447 Bacillus pumilus ATCC 7061T AY876289 98,8 % LB199 G Sediment 492 Pseudomonas cedrina subsp. fulgida AJ492830 99,8 % DSM 14938T LB200 P Sediment 492 Pseudomonas fluorescens ATCC 13525T D84013 99,4 % LB201 P Rhizoid 1138 Micromonospora aurantiaca ATCC 27029T CP002162 99,3 % LB202 P altes Phyllloid 1355 Nocardia cummidelens DSM 44490T AF430052 100 % Nocardia soli DSM 44488T AF430051 100 % LB203 C Sediment 500 Bacillus stratosphericus 41KF2aT AJ831841 100 % Bacillus aerophilus 28KT AJ831844 100 %

*: Anzahl der Basenpaare, C: CFC-Agarplatte, G: GSP-Agarplatte, P: Pseudomonas-Agarplatte.

ERGEBNISSE

Tabelle 7: Dargestellt ist die Ähnlichkeit der bearbeiteten Stämme zu den jeweils nächsten verwandten Typstämmen inklusive deren 16S rRNA Gene Acc.-No. Des Weiteren sind die Sequenzlänge der Stämme und deren Accession number angegeben.

16S rRNA Sequenzlänge 16S rRNA Ähnlichkeit zum Stamm Nächster verwandter Typstamm Gene Acc.-No. in bp* Gene Acc.-No. Typstamm

LB012a AM913885 1421 Pseudomonas gessardii CIP 105469T AF074384 99,6 % LB034a AM913890 1385 Pseudoalteromonas tunicata CIP 105928T Z25522 97,6 % LB042a AM913891 1443 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LB043a AM913892 1412 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LB044a AM913893 1501 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LB045a AM913894 1501 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LB046a AM913895 1477 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LB047a AM913896 1210 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LB048a AM913897 1478 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LB051a AM913898 1478 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LB054a AM913900 1501 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,5 % LB058a AM913901 1376 Streptomyces flavofuscus DSM 41426T AB249935 99,6 % LB061a AM913903 1479 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,7 % LB062a FR686532 1485 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,7 % LB063a AM913943 1380 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LD120a AM913905 1441 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,6 % LB066b AM749667 1450 Kiloniella laminariae NCIMB 14374T AM749667 100 % LB084b AM913918 1504 Bacillus aerophilus JCM 13347T AJ831844 99,9 % LB114a AM913982 1368 Streptomyces flavogriseus DSM 40323T AJ494864 99,7 %

ERGEBNISSE

16S rRNA Sequenzlänge 16S rRNA Ähnlichkeit zum Stamm Nächster verwandter Typstamm Gene Acc.-No. in bp* Gene Acc.-No. Typstamm

LB129b AM913952 1363 Streptomyces fimicarius DSM 40322T AY999784 100 %

LB152b AM913972 1410 Amycolatopsis palatopharyngis JCM 12460T AF479268 100 % LB183c FR675975 1483 Pseudomonas kilonensis DSM 13647T AJ292426 99,7 % LB184c FR675976 1483 Pseudomonas kilonensis DSM 13647T AJ292426 99,6 % LB185c FR675977 1483 Pseudomonas protegens DSM 19095T AJ278812 99,7 %

*: Anzahl der Basenpaare, a: Probenahme 2002, b: Probenahme 2003, c: Probenahme 2010.

ERGEBNISSE

Die Verteilung der Bakterienisolate aus der Probenahme im Januar 2010 auf verschiedene Gattungen ist in Abbildung 14 dargestellt.

Abbildung 14: Verteilung der Gattungen der isolierten Bakterien-Stämme von Sacchari- na latissima aus dem Jahr 2010.

Mit 45 Stämmen stellen die Pseudomonaden den größten Anteil der isolierten Bakterien dar, gefolgt von den Streptomyces-Stämmen mit 20 Ver- tretern. Vier Bakterien konnten der Gattung Bacillus und zwei der Gattung Exiguobacterium zugeordnet werden. Weiterhin wurde jeweils ein Bakteri- um der Gattung Arthrobacter, Micromonospora und Nocardia isoliert werden. Die Verwendung der GSP- und CFC-Agarplatten ermöglichte vorallem die Isolierung von Pseudomonaden. Aber auch einige Bakterien der Gattung Bacillus und Streptomyces wurden isoliert. Mit sieben verschiedenen Gat- tungen wurde auf den Pseudomonas-Agarplatten die höchste bakterielle Diversität aller drei Medien erhalten (siehe Abbildung 15).

ERGEBNISSE

Abbildung 15: Verteilung der Gattungen der isolierten Bakterien-Stämme nach Agar- Medien. Die Bakterien wurden aus S. latissima im Jahr 2010 isoliert. P: Pseudomonas- Agar, G: GSP-Agar, C: CFC-Agar.

Auf den Agarplatten mit Pseudomonas-Medium war auch die größte An- zahl an Kolonien zu verzeichnen (Daten nicht gezeigt).

3.2 Sind diese Bakterien mit S. latissima assoziiert?

S. latissima wurde am Standort Kieler Förde (Tonnenhof) im Oktober 2002, April 2003 und Januar 2010 beprobt. Im Januar 2010 wurde die Probenahme durch die Auswahl entsprechender Medien speziell zur Isolie- rung von Pseudomonaden ausgelegt. Des Weiteren wurden einige Kolo- nien gepickt, die auf Grund ihrer Morphologie auf die Klasse der Ac- tinobacteria hinwiesen oder deren Koloniemorphologie sich von der Mehr- zahl der weiteren Kolonien unterschied. Neben einer größeren Anzahl von Bakterien, die von der Phyllosphäre und Rhizosphäre von S. latissima aus den verschiedenen Probenahmen isoliert wurden, konnten auf Grund von 16S rRNA Gensequenzanalysen 16 Isolate der Gattung Pseudomonas zugeordnet werden. Im November 2002 wur-

ERGEBNISSE den neun Pseudomonas-Stämme von der Phyllosphäre der Alge isoliert: LB042 (AM913891), LB043 (AM913892), LB044 (AM913893), LB045 (AM913894), LB046 (AM913895), LB047 (AM913896) und LB048 (AM913897), LB051 (AM913898) und LB054 (AM913900) Weitere vier Stämme wurden von Phyllosphäre der Alge im April 2003 isoliert: LB062a (FR686532), LB061 (AM913903), LB063 (AM913943) und LD120 (AM913905). Im Januar 2010 wurden ein Stamm LB183 (FR675975) von der Phyllosphäre und zwei Stämme LB184 (FR675976) und LB185 (FR675977) von der Rhizosphäre der Algen isoliert. Zur phylogenetischen Einordnung der Isolate wurde ein Stammbaum mittels Neighbour-Joining- Algorhitmus berechnet (Abbildung 16).

Abbildung 16: Phylogenetischer Stammbaum der mit Saccharina latissima assoziierten Pseudomonas-Stämme. Der Stammbaum wurde mittels Neighbour-Joining-Algorhitmus berechnet. Bootstrap-Werte sind in % angegeben (es sind nur Werte über 50% angegeben). Die Maßstabskala gibt die Anzahl der Substitutionen pro Nukleotidposition an. Die in dieser Arbeit bearbeiteten Stämme sind fettgedruckt und die Anzahl der Stämme steht in Klammern dahinter. Gruppe 1 bzw. LD120-Gruppe beinhaltet die Sequenzen der Isola- te LB042, LB043, LB044, LB045, LB046, LB047, LB048, LB051, LB062a, LB061, LB063, LB081 und LB185.

ERGEBNISSE

Die Berechnung des Stammbaums mittels Maximum-Likelihood- Algorhitmus führte zu den gleichen Ergebnissen. Die Isolate konnten in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die meisten Pseudomonas-Stämme, die mit S. latissima assoziiert sind, haben mit einer Sequenzähnlichkeit von mindestens 99,5 % eine nahe Verwandtschaft zu Pseudomonas protegens CHA0T, wozu auch Stämme gehören, die zuvor als Pseudomonas fluorescens falsch klassifiziert wurden, wie z.B. Stamm Pf-5 (Ramette et al. 2011). Stämme, deren nächster verwandter Typstamm Pseudomonas protegens CHA0T ist, werden hier als LD120-Gruppe zusammengefasst, da ihre 16S rRNA-Gensequenz eine Ähnlichkeit von 100 % zu einander hat (Grup- pe 1). Der nächste verwandte Typstamm der zweiten Gruppe mit den Stämmen LB183 und LB184 war Pseudomonas brassicacearum DBK11T. Die zweite Gruppe bildet mit Ähnlichkeiten von 97,5 bis 97,8 % zur LD120-Gruppe ein separates Cluster. In den verschiedenen Probenahmen konnten neben Pseudomonas auch Vertreter der Gattungen Bacillus und Streptomyces, mit einer hohen Ähn- lichkeit zu bereits zuvor isolierten Stämmen, wiederkehrend isoliert werden (siehe Tabelle 8).

ERGEBNISSE

Tabelle 8: Dargestellt sind die Ähnlichkeiten der isolierten Bakterien aus dem Jahr 2010 mit den isolierten Bakterien aus den vorhergehenden Probenahmen. Die Ähnlichkeit zum nächsten verwandten Stamm aus der Stammsammlung ist in % angegeben. Des Weiteren sind die 16S rRNA Gene Acc.-No. und die Sequenz- länge in Basenpaaren angegeben.

Sequenz- Nächster verwandter Ähnlichkeit 16S rRNA Stamm länge Stamm aus zum Gene Acc.-No. in bp* Stammsammlung Stamm

LB185 1480 LB045 a AM913894 100 % KN13 411 LB025 a AM913888 99,0 % KN26 411 LB025 a AM913888 99,0 % LB194 412 LB025 a AM913888 99,0 % KN39 413 LB012 a AM913885 100 % LB171 1480 LB144 b AM913964 99,9 % LB174 1488 LB145 b AM913965 99,8 % LB173 1203 LB144 b AM913964 99,6 % LB203 500 LB087 c AM913919 100 % LB198 449 LB067 c AM913908 99,3 % LB199 490 LB012 a AM913885 99,8 % KN61 490 LB012 a AM913885 100 % LB179 1382 LB144 b AM913964 99,5 % KN70 1487 LB145 b AM913965 99,9 % KN69 1382 LB144 b AM913964 100 % KN68 1375 LB145 b AM913965 99,9 % KN66 1488 LB145 b AM913965 99,8 % KN64 1433 LB145 b AM913965 99,8 % KN65 1464 LB144 b AM913964 99,9 % KN62 1383 LB144 b AM913964 99,9 %

* Anzahl der Basenpaare, a Pseudomonas sp., b Streptomyces sp., c Bacillus sp..

3.3 Physiologisches Profil von Pseudomonas sp. LD120

Um zu überprüfen, ob Stamm Pseudomonas sp. LD120 in der Lage ist, Al- genbestandteile als Nährstoff zu verwerten, wurden Minimalmedien mit entsprechenden Zusätzen hergestellt. Auf folgenden Medien konnte kein

ERGEBNISSE

Wachstum von Stamm LD120 nachgewiesen werden: Na-Alginat, Cellulo- se, Agarose, Agar, Mannitol und gefriergetrocknetes Pulver von S. latissima. Dies deutet darauf hin, dass Stamm LD120 keine von Algen stam- menden Polysaccharide verwerten kann. Auf Minimalmedien, die als Sub- strat Natriumsalze organischer Säuren wie DL-Malat, Succinat, Fumarat und Citronensäure enthielten, sowie auf Glucose und L-Glutamat konnte Wachstum nachgewiesen werden. Stamm LD120 konnte auch auf der Kontrolle (Marine Broth Agar) wachsen. Die Analyse mittels BIOLOG GN2 Mikrotiterplatten zeigte, dass Stamm LD120 ein weites Spektrum an Koh- lenstoffquellen inklusive verschiedener Zucker (z.B. D-Fruktose, D- Glukose, D-Mannose, Saccharose, D-Gluconsäure) und Aminosäuren (z.B. L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, L-Prolin, D- und L- Alanin, L-Leucin, L-Ornitin, L-Threonin, L-Alanylglycin) verwerten kann. Zusammenfassend läßt sich sagen, dass Stamm LD120 besondere Präfe- renzen für Dicarbonsäuren, die im Citratzyklus vorkommen, und für komplexe Medien (Marine Broth), welche Proteine enthalten, zeigte.

3.4 Charakterisierung von Pseudomonas sp. LD120

Zur Validierung der Ergebnisse der 16S rRNA-Gensequenzanalyse von Stamm LD120 wurde dieser zusätzlich mittels BIOLOG GN2 Mikrotiterplat- ten physiologisch charakterisiert (Tabelle 39 im Anhang). Die Untersu- chungsergebnisse wurden mit den Ergebnissen von (Rico & Preston 2008) verglichen. Daraus folgt, dass die Substratverwertung von Stamm LD120 zu 89 % mit der von P. protegens Pf-5 überein stimmt und zu 86 bzw. 76 % mit der von P. putida KT2440 und P. syringae pathovar tomato DC3000. Die für fluoreszierende Pseudomonaden typische Bildung eines in den Agar diffundierenden gelblich-grün fluoreszierenden Pigmentes konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Auch die für P. protegens Pf-5 charakteristische Produktion der Sekun- därmetabolite Monoacetylphloroglucinol (MAPG), 2,4-Diacetylphloro- glucinol (DAPG) und Pyoluteorin (PLT) konnte bei Stamm LD120 nachge-

ERGEBNISSE wiesen werden. Somit konnte Stamm LD120 auf Grund chemischer und biochemischer Eigenschaften sowie der phylogenetischen Analyse als P. protegens identifiziert werden. Das Gleiche gilt für die weiteren Pseu- domonas-Stämme, die zur LD120-Gruppe gehören.

3.5 Antimikrobielle Metabolite von Pseudomonas sp. LD120

Alle Metabolite (Tabelle 32 in Kapitel 3.7.2) waren aktiv gegen die zwei getesteten Gram-positiven Bakterien, aber nur PLT zeigte auch eine Akti- vität gegen mehrere Gram-negative Bakterien. Zusätzlich zu der antibakteriellen Aktivität hemmten MAPG und DAPG Pilze, wie die pflanzenpathogenen Organismen Septoria tritici und Phytophthora infestans, sowie die zwei Dermatophyten Trichophyton mentagrophytes und Trichophyton rubrum. PLT zeigte eine hohe Aktivität gegen die pflanzenpathogenen Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Ralstonia solanacearum und Xanthomonas campestris sowie gegen die algenpathogenen Algicola bacteriolytica und Pseudoalteromonas elyakovii. DAPG zeigte eine Wachs- tumsinhibition von E. amylovora und A. bacteriolytica. Die bisher unaufge- klärten Metabolite Peak 15 und Peak 17 zeigten eine starke Hemmung des klinisch relevanten Keimes Candida albicans und, wie auch DAPG und PLT, eine starke Aktivität gegen Propionibacterium acnes.

3.6 Screening der Naturstoffproduktion Algen-assoziierter Bak- terien

Aus einer Vielzahl konservierter Bakterien (Stammsammlung des KiWiZ) wurden 24 Stämme ausgewählt, die von der Braunalge S. latissima isoliert wurden, um deren Naturstoffproduktion zur Auffindung neuer biologisch aktiver Substanzen näher zu untersuchen. Die zur Stammauswahl aufgestellten Kriterien, wurden in Kapitel 1.7 beschrieben. Die ausgewählten Stämme und der Status der aufgestellten Kriterien sind in Tabelle 9 aufgelistet. Außerdem wurde der Einfluss von Kultivierungsdauer bzw. –form und/ oder Medium auf die Sekundärmetabolit-Produktion für folgende Stämme untersucht: LB042, LB061, LD120, LD81, LB114 .

ERGEBNISSE

Tabelle 9: Auflistung der untersuchten Bakterien-Stämme von S. latissima sowie der vier Kriterien zur Stammauswahl.

PKS Stamm NRPS Chemie Art/Gattung Bioaktivitätstests I/II

LB084 - - inter. Bacillus B.s.; S.l. LD81 - - vorh. Kiloniella laminariae* B.s. Pseudoalteromonas LB034 k.I. k.I. k.I. k.I. tunicata LB058 +/ + vorh. Streptomyces B.s.; S.l.;C.g. LB114 +/+ + vorh. Streptomyces C.g. LB129 +/+ + vorh. Streptomyces C.g. LB152 -/+ + vorh. Amycolatopsis B.s.; S.l. LB012 +/+ + k.I. Pseudomonas k.I. LD120 - + inter. Pseudomonas B.s.; S.l. LB042 - + vorh. Pseudomonas B.s.; S.l. LB061 + + vorh. Pseudomonas B.s.; S.l. LB043 - k.I. k.I. Pseudomonas k.I. LB044 k.I. + k.I. Pseudomonas k.I. LB045 - k.I. k.I. Pseudomonas k.I. LB046 - k.I. k.I. Pseudomonas k.I. LB047 - k.I. k.I. Pseudomonas k.I. LB048 - k.I. k.I. Pseudomonas k.I. LB051 - k.I. k.I. Pseudomonas k.I. LB054 k.I. k.I. k.I. Pseudomonas k.I. LB062 - + k.I. Pseudomonas k.I. LB063 k.I. k.I. vorh. Pseudomonas B.s.; S.l. LB183 k.I. k.I. k.I. Pseudomonas k.I. LB184 k.I. k.I. k.I. Pseudomonas k.I. LB185 k.I. k.I. k.I. Pseudomonas k.I.

Inter.: interessant, k.I.: keine Information, vorh.: vohanden, +: Genfragment nachgewiesen, -: kein Genfragment nachgewiesen, B.s.: Aktivität gegen Bacillus subtilis nachgewiesen, S.l.: Aktivität gegen Staphylococcus lentus nachgewiesen, C.g.: Aktivität gegen Candida glabrata nachgewiesen, *: neue Art.

ERGEBNISSE

3.6.1 Naturstoffproduktion von Bacillus sp. (Stamm LB084)

Bei Stamm LB084 war die Analyse der Biosynthese-Gencluster negativ. Aufgrund einer vorherigen chemischen Untersuchung und anschließenden Bioaktivitätstests konnte eine Aktivität des Rohextrakts gegen B. subtillis und S. lentus nachgewiesen werden. Da dieser Stamm als chemisch interessant eingestuft wurde, erfolgte eine Kultivierung wie in Tabelle 38 im Anhang aufgeführt und mit anschließender Extraktion zu drei verschiedenen Kultivierungszeitpunkten. Die Extraktion erfolgte wie in Kapitel 2.11.4 beschrieben.

7 A 1-5 6 8-13

B 7 1-5 6 8-13

C 7 1-5 6 8-13

Abbildung 17: DAD-Chromatogramme der Extrakte von 100 mL Kulturen des Stammes LB084 in SP Medium. Die Kultivierungsdauer betrug A: 2 Tage, B: 3 Tage, C: 7 Tage. Peak 1-13 siehe Tabelle 10.

Mit den vorhandenen Daten der UV/VIS-Absorption und der Molekülmasse konnten folgende mögliche Substanzen aus dem Rohextrakt identifiziert werden (siehe Tabelle 10). Die in Tabelle 10 aufgelisteten Substanzen wie Amicoumacine, Bacilosar- cin und Pumilacidin sind bereits bekannt dafür, von Bacillus-Arten produziert zu werden (Pinchuk et al. 2001, Azumi et al. 2008, Naruse et al.

ERGEBNISSE

1990). Bei zwei Peaks konnte mit den vorhandenen Daten keine Derepli- kation durchgeführt werden.

Tabelle 10: Auflistung der Peaks aus dem Chromatogramm C des Stammes LB084, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Masse Bezeich- Retentions- UV-Absorption Dereplikation der Substan- m/z nung zeit (min) (nm) zen/Peaks [M]+

Peak 1 2,12 247, 314 423 Amicoumacin A Peak 2 2,20 247, 314 424 Amicoumacin B (AI 77-B) Peak 3 2,29 247, 308 406 Amicoumacin C (AI 77-Ba) Peak 4 2,33 247, 314 491 Bacilosarcin A Peak 5 2,38 247, 314 438 k.D. Peak 6 3,14 246, 314 389 Antibiotic Al 77-F * Peak 7 3,64 231, 350 572 k.D. *, eventuell neu a Peak 8 6,31 224 1036 Daitocidin A1

Peak 9 6,41 207, 224 1050 Daitocidin B1/Pumilacidin a F/Pumilacidin G a Peak 10 6,48 228 1064 Daitocidin A2/B2 a Peak 11 6,54 226 1064 Daitocidin A2/B2 a Peak 12 6,59 208, 224 1064 Daitocidin A2/B2 a Peak 13 6,68 226 1078 Daitocidin B3 a oder andere Peptide, k.D.: keine Dereplikation, * Dereplikation durch 1H-NMR bestätigt.

Die Dereplikation von Peak 6 und 7 erfolgte zusätzlich durch eine NMR- Analyse der in einem Großansatz isolierten Substanzen. Möglicherweise handelt es sich bei Peak 7 um eine bisher noch unbekannte Substanz, die im Rahmen anderer Arbeiten aufgeklärt wird. Die Produktion von Antibio- tic Al 77-F wurde bereits in einem marinen Bacillus-Isolat nachgewiesen (Gerard 1997).

ERGEBNISSE

3.6.2 Naturstoffproduktion von Kiloniella laminariae (Stamm LD81)

Bei Stamm LD81 war die Analyse der Biosynthese-Gencluster negativ. Aufgrund einer vorherigen chemischen Untersuchung und anschließenden Bioaktivitätstests konnte eine Aktivität des Rohextrakts gegen Bacillus subtilis nachgewiesen werden. Dieser Stamm wurde als neue Gattung beschrieben (Wiese et al. 2009a). Die Kultivierung erfolgte wie in Tabelle 38 im Anhang aufgeführt. Im Screening-Ansatz wurde zuvor festgestellt, dass die Produktion von Peak 1 in MB-Medium am Besten realisiert werden kann. Die anschließende Extraktion erfolgte zu vier verschiedenen Kulti- vierungszeitpunkten. Die Extraktion erfolgte wie in Kapitel 2.11.5 beschrieben.

Abbildung 18: DAD-Chromatogramme von Extrakten von Stamm LD81 nach einer Kulti- vierung in 1 L MB Medium. Die Kultivierungsdauer betrug A: 2 Tage, B: 6 Tage, C: 7 Ta- ge und D: 8 Tage. Peak 1 siehe Tabelle 11.

ERGEBNISSE

Die Produktion von Peak 1 konnte nur in Versuch C nach siebentägiger Kultivierung beobachtet werden.

Tabelle 11: Auflistung der Peaks aus dem Chromatogramm C des Stammes LD81, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Masse Retentions- UV-Absorption Dereplikation der Bezeichnung m/z zeit (min) (nm) Substanzen/Peaks [M]+

Peak 1 2,24 214, 225, 270 212 k.D. k.D.: keine Dereplikation.

Mit den vorhandenen Daten aus UV/VIS-Absorption und der Molekülmasse konnte keine Dereplikation von Peak 1 erfolgen. Zur Produktion von ausreichend Substanzmenge wurden Großansätze (12 L) durchgeführt, in denen weitere Substanzen in geringer Konzentration detektiert werden konnten (Daten nicht gezeigt). Die anschließende NMR-Analyse von Peak 1 führte bisher zu keinem Ergebnis.

3.6.3 Stimulationsexperiment mit Kiloniella laminariae (Stamm LD81)

In Abbildung 19 sind die Chromatogramme der Extrakte aus der Kultivie- rung von Kiloniella laminariae Stamm LD81 in MB-Medium unter Zugabe verschiedener Substanzen, die als sekundäre Botenstoffe oder als Quo- rum-Sensing-Mediatoren beschrieben wurden, zur Stimulation der Sekun- därmetabolit-Produktion dargestellt. Während Peak 1 bereits in einer vorhergehenden Untersuchung nachgewiesen wurde (siehe Abbildung 18 C), erfolgte die Produktion der Peaks 2 bis 7 erstmalig in diesem Experiment. Peak 1 trat in den Kultivierungen auf die 10 µM Putrescin, 20 nM Homo- serinlacton, 10 µM cAMP und 20 nM cAMP enthielten. Die Peaks 2-7 wurden nur in den Kultivierungen beobachtet, die jeweils 10 µM und 20 nM Putrescin enthielten.

ERGEBNISSE

A 1 2-7

2-7

D 1

E 1

Abbildung 19: DAD-Chromatogramme von Extrakten von Stamm LD81. Die Kultivierung erfolgte für sieben Tage bei 28 °C in MB Medium mit A: 10 µM Putrescin, B: 20 nM Putrescin, C: 10 µM Homoserinlacton, D: 20 nM Homoserinlacton, E: 10 µM cAMP, F: 20 nM cAMP. Peak 1-7 siehe Tabelle 12.

Es konnten weder die Masse, noch das UV-Spektrum der jeweiligen Meta- bolite von Peak 2-7 ermittelt werden, so dass keine Dereplikation erfolgen konnte (siehe Tabelle 12).

ERGEBNISSE

Tabelle 12: Auflistung der Peaks des Stammes LD81 aus der Extraktion der 25 mL Kultur mit (Putrescin 10µM), sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS- Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Masse Retentionszeit UV-Absorption Dereplikation der Sub- Bezeichnung m/z (min) (nm) stanzen/Peaks [M]+

Peak 1 2,80 214, 225, 270 212 k.D. Peak 2 6,56 ü n.i. k.D. Peak 3 6,64 ü n.i. k.D. Peak 4 6,69 ü n.i. k.D. Peak 5 6,75 ü n.i. k.D. Peak 6 6,83 ü n.i. k.D. Peak 7 6,91 ü n.i. k.D. n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation ü: UV-Spektrum überlagert.

3.6.4 Naturstoffproduktion von Pseudoalteromonas sp. (Stamm LB034)

Stamm LB034 wurde aufgrund seiner nahen Verwandschaft zu Pseu- doalteromonas tunicata ausgewählt. P. tunicata ist ein erfolgreicher Be- siedler mariner Oberflächen, was in erster Linie auf die Produktion einer Vielzahl biologisch aktiver Substanzen zurückzuführen ist (Thomas et al. 2008). Dem Großansatz vorausgehend konnte im Screeningansatz gezeigt werden, dass eine Extraktion nach sieben Tagen zur Substanzisolation geeignet ist. Die Kultivierung erfolgte wie in Tabelle 38 im Anhang beschrieben und die Extraktion erfolgte wie in Kapitel 2.11.5 beschrieben.

1 2

Abbildung 20: DAD-Chromatogramm eines Extraktes einer 11 L Kultur des Pseudoalte- romonas Isolates LB034 nach einer Kultivierungsdauer von sieben Tagen in MB Medium. Peak 1 und 2 siehe Tabelle 13.

ERGEBNISSE

Bei Stamm LB034 traten mehrere Peaks im Chromatogramm auf. Zwei Substanzen konnten isoliert werden (siehe Tabelle 13).

Tabelle 13: Auflistung der Peaks des Stammes LB034, sowie deren Retentions- zeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Bezeich- Retentions- UV-Absorption Masse Dereplikation der nung zeit (min) (nm) m/z [M]+ Substanzen/Peaks

Peak 1 4,61-5,5,41 262, 316, 421 355 Tambjamin A Derivat 1"- N-(3Z-Dodecenyl) * Peak 2 5,70-5,82 262, 316, 421 353 Derivat von Tambjamin A Derivat 1"- N-(3Z-Dodecenyl)

*: Dereplikation durch 1H-NMR bestätigt.

Die Dereplikation von Peak 1 und Peak 2 beruht neben der Daten bestehen aus UV/VIS-Absorption und Molekülmasse auch auf Daten der jeweiligen 1H-NMR-Spektren. Das Derivat 1"-N-(3Z-Dodecenyl) von Tambja- min A wurde bereits zuvor von P. tunicata isoliert (Franks et al. 2005). Aufgrund der gleichen UV-Absorption und sehr ähnlichen Molekülmasse handelt es sich bei Peak 2 möglicherweise um ein Derivat von dem Tamb- jamin A Derivat. Peak 2 könnte eine zusätzliche Doppelbindung aufweisen, was die Molekülmasse von 353 erkären könnte.

3.6.5 Naturstoffproduktion von Streptomyces sp. (Stamm LB058)

Bei Stamm LB058 war die Analyse der Biosynthese-Gencluster jeweils positiv. Aufgrund einer vorherigen chemischen Untersuchung und anschlie- ßenden Bioaktivitätstests konnte eine Aktivität des Rohextrakts gegen B. subtilis, S. lentus und C. glabrata nachgewiesen werden. Dem Großansatz vorausgehend konnte im Screeningansatz gezeigt werden, dass eine Ex- traktion nach drei Tagen zur Substanzisolation geeignet ist. Die Kultivie- rung erfolgte wie in Tabelle 38 im Anhang aufgeführt und mit anschlie- ßender Extraktion zu drei verschiedenen Kultivierungszeitpunkten. Die Ex- traktion erfolgte wie in Kapitel 2.11.5 beschrieben.

ERGEBNISSE

3 5 7 10 11 12 14 2 4 13 15 16 17 8 9

Abbildung 21: DAD-Chromatogramm eines Extraktes einer 1 L Kultur (aus Großansatz) des Isolates LB058 nach einer Kultivierungsdauer von drei Tagen in GYM4 Medium. Peak 1-17 siehe Tabelle 14.

Stamm LB058 produziert eine Vielzahl an Substanzen. Zehn Substanzen konnten mittels UV/VIS-Absorption, Molekülmasse und 1H-NMR-Spektrum identifiziert werden (siehe Tabelle 14). Da bei drei Substanzen (Peak 15, 16 und 17) keine Ionisierung stattfand, konnten diese nicht derepliziert werden.

Tabelle 14: Auflistung der Peaks des Stammes LB058, sowie deren Retentions- zeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Masse Bezeich- Retentions- UV-Absorption Dereplikation der m/z nung zeit (min) (nm) Substanzen/Peaks [M]+

Substanz¥ 242, 212 263 Anhydrocycloheximid * Substanz¥ 242, 207 263 ähnlich Anhydro- cycloheximid *, Epian- hydrocycloheximid Peak 2 1,94 sh276, 290, 244? k.D. 303, 318 Peak 3 2,11 sh276, 290, 279? k.D. 303, 318 Peak 4 2,17 344, 261, 211 291 Actiphenol-Derivat (1'''Hydroxy)

Peak 5 2,54 281, sh255, 281 Cycloheximid (Isocyclo- sh228, 216 heximid, Naramycin B) Peak 6 2,62 sh227, 210 281 Cycloheximid * Peak 7 2,67 227 562? ähnlich Cycloheximid, (281?) Masse? *(Streptomycin

A, Isocycloheximid)

ERGEBNISSE

Masse Bezeich- Retentions- UV-Absorption Dereplikation der m/z nung zeit (min) (nm) Substanzen/Peaks [M]+

Peak 8 2,73 200, 275 277 k.D.

Peak 9 2,80 200, 275 277 k.D. Peak 10 2,95 354, sh275, 291 Actiphenol-Derivat 261, 232, (1''Hydroxy) sh219 Peak 11 3,07 356, 268, 221 291 Actiphenol-Derivat (1´Hydroxy) Peak 12 3,20 347, 263, 212 291 Actiphenol-Derivat (3-Hydroxy(3,4-trans-)) Peak 13 3,57 347, 261, 225, 275 Actiphenol 218 Peak 14 3,72 435, 350, 262, 544 k.D. *, eventuell neu 220 Peak 15 6,36 223 n.i. k.D.

Peak 16 6,47 222 n.i. k.D. Peak 17 6,59 224 n.i. k.D. n.i. Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation, ¥ Substanz im Rohextrakt nicht identifizierbar, konnte aber isoliert werden, * Dereplikation durch 1H-NMR besätigt, ? Masse nicht eindeutig.

Trotz vorhandener Daten aus UV/VIS-Absorption und Molekülmasse konnten 4 Peaks (2, 3, 8, 9) nicht identifiziert werden. Peak 14 konnte ebenfalls trotz zusätzlicher NMR-Analyse nicht identifiziert werden, hierbei könnte es sich um eine neue Verbindung handeln.

3.6.6 Naturstoffproduktion von Streptomyces sp. (Stamm LB114)

Bei Stamm LB114 war die Analyse der Biosynthese-Gencluster jeweils positiv. In einer vorhergehenden Untersuchung konnte eine Aktivität gegen C. glabrata festgestellt werden. Die Kultivierung erfolgte wie in Tabelle 38

ERGEBNISSE im Anhang aufgeführt. Die Extraktion erfolgte wie in Kapitel 2.11.4 beschrieben.

1 5 10 6 11 2 3 4 7 8 9 12

Abbildung 22: DAD-Chromatogramm eines Extraktes von einer 100 mL Kultur des Stammes LB114. Die Kultivierung erfolgte für neun Tage bei 28 °C in GYM4. Peak 1-12 siehe Tabelle 15.

Mittels HPLC-Analyse konnten mehrere Peaks des Extraktes von Stamm LB114 detektiert werden (siehe Tabelle 15).

Tabelle 15: Auflistung der Peaks des Stammes LB114, sowie deren Retentions- zeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Reten- Bezeich- UV-Absorption Masse Dereplikation der Sub- tionszeit nung (nm) m/z [M]+ stanzen/Peaks (min)

Peak 1 4,88 240, 273, 371 494 k.D. Peak 2 5,14 240, 286 642 (620+Na) Bafilomycin J Peak 3 5,34 241, 285 642 (620+Na) Bafilomycin J Peak 4 5,78 242, 286 626 (604+Na) Bafilomycin D* Peak 5 5,86 363, 422ü n.i. k.D.

Peak 6 5,95 244, 285, 350 837 (815+Na) Bafilomycin B1/E

Peak 7 6,05 240, 286 853 Bafilomycin A1 Derivat Peak 8 6,23 244, 287 742 (720+Na) Bafilomycin Derivat Peak 9 6,39 244, 283 k.Z. Bafilomycin Derivat

Peak 10 6,50 244, 287, 350 837 (815+Na) Bafilomycin B1/E Peak 11 6,61 244, 286, 348 k.Z. k.D. Peak 12 6,69 244, 287 k.Z. k.D. n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation, k.Z.: keine Zuordnung möglich, ü: Substanz von einer weiteren Substanz überlagert, daher keine vollständigen UV/VIS- Daten möglich, *: NMR-Analyse: 1H, 13C, HSQC, HMBC, COSY.

ERGEBNISSE

Peak 5 konnte nicht identifiziert werden, da dieser im ESI-MS nicht ionisiert hat. Auch Peak 1 konnte mit den Daten aus UV/VIS-Absorption und Molekülmasse nicht zugeordnet werden. Aus einem Großansatz konnte Peak 4 isoliert werden. Mit den zusätzlichen Daten der NMR-Spektroskopie konnte die Substanz als Bafilomycin D identifiziert werden. Das Bafilomy- cin D, und auch weitere Bafilomycine, lag als Na-Addukt vor. Das eigentli- che Molekül-Ion kam, wenn überhaupt, nur in sehr geringem Maße vor. Sowohl die Bafilomycine A1 und Derivate, A2 und Derivat, B1, B2, C1, C2 (Werner et al. 1984), als auch Bafilomycin D und E (Kretchmer et al. 1985) wurden bereits zuvor von Streptomyces-Arten isoliert. Die folgenden Peaks (2, 3, 6, 7, 8, 9, 10) wurden auf Grund derDaten aus UV/VIS- Absorption und Molekülmasse ebenfalls als Bafilomycine identifiziert. Den Peaks 11 und 12 konnte keine eindeutige Masse zu geordnet werden und somit konnte keine Dereplikation erfolgen. Aufgrund der UV-Daten wird jedoch vermutet, dass auch diese beiden Substanzen zu den Bafilomyci- nen bzw. strukturell ähnlichen Verbindungen gehören. Es kürzlich wurden von Yu et al. (2011) 2 neue Bafilomycin D Derivate isoliert, welche von dem Endophyten Streptomyces sp. YIM56209 produziert wurden.

3.6.7 Kultivierungsexperimente von Streptomyces sp. (Stamm LB114)

Das Vorscreening von Stamm LB114 aus der KiWiZ-Sammlung erfolgte zunächst mit einer Kultivierung in drei verschiedenen Medien (siehe Abbil- dung 23) und einer Extraktion nach sieben Tagen.

A B C

Abbildung 23: Kultivierung von Stamm LB114 für sieben Tage bei 28 °C und in drei verschiedenen Medien A: TSB, B: MB, C: GYM4.

ERGEBNISSE

In Abbildung 24 sind die DAD-Chromatogramme aus der HPLC-Analyse dargestellt, anhand derer der Einfluss des Mediums auf die Sekundärme- tabolit-Produktion von Stamm LB114 deutlich wird.

A 10 4 8

B 4

C 10 4 8 6 9* 11

Abbildung 24: DAD-Chromatogramme von Extrakten von 25 mL Kulturen des Stammes LB114. Die Kultivierung erfolgte für sieben Tage bei 28 °C in verschiedenen Medien A: MB, B: TSB, C: GYM4. Peak 1-11 siehe Tabelle 16.

Das Sekundärmetabolitprofil aller drei Kultivierungen ist sehr unterschiedlich. In der Kultur mit TSB-Medium erfolgte die geringste Metabolitproduk- tion. Die Kultur mit MB-Medium enthielt viele Metabolite in geringer Kon- zentration, welchen keine eindeutige Masse zugeordnet werden konnte und damit keine Dereplikation durchgeführt werden konnte. Drei der produzierten Metabolite konnten auch im GYM4-Ansatz nachgewiesen werden. In der Kultur mit GYM4-Medium wurden einige Metabolite auch in größerer Konzentration nachgewiesen. Bafilomycin D wurde in allen drei Medien produziert. Die Produktion von Peak 8 erfolgte in MB- und in GYM-Medium, ebenso wie die Produktion von * Bafilomycin B1 oder E. Die Peaks 6, 9 und 11 wurden in GYM-Medium produziert.

ERGEBNISSE

Tabelle 16: Auflistung der Peaks des Stammes LB114 aus der Extraktion der 25 mL Kulturen, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekül- massen und mögliche Dereplikation.

Reten- Bezeich- UV-Absorption Masse Dereplikation der Sub- tionszeit nung (nm) m/z [M]+ stanzen/Peaks (min)

Peak 4 5,36 242, 286 626 (604+Na) Bafilomycin D

Peak 6 5,58 244, 285, 350 837 (815+Na) Bafilomycin B1/E Peak 8 5,95 244, 287 742 (720+Na) Bafilomycin Derivat Peak 9* 6,19 228, sh249, k.Z. Bafilomycin Derivat 282

Peak 10 6,34 244, 287, 350 837 (815+Na) Bafilomycin B1/E Peak 11 6,47 230, sh250, k.Z. k.D. 286, 348 n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation, k.Z.: keine Zuordnung möglich.

3.6.8 Naturstoffproduktion von Streptomyces sp. (Stamm LB129)

Bei Stamm LB129 war die Analyse der Biosynthese-Gencluster jeweils positiv und es konnte eine Aktivität des Extraktes gegen C. glabrata festgestellt werden. Die Kultivierung erfolgte wie in Tabelle 38 im Anhang aufge- führt. Die Extraktion erfolgte wie in Kapitel 2.11.5 beschrieben.

2 5 6 7 8 9 1 4 3

Abbildung 25: DAD-Chromatogramm eines Extraktes von einer 12 L Kultur des Stam- mes LB129. Die Kultivierung erfolgte für vier Tage bei 28 °C in GYM4. Peak 1-9 siehe Ta- belle 17.

Bei Stamm LB129 konnten verschiedene Peaks detektiert werden (siehe Tabelle 15). Peak 3 konnte nicht identifiziert werden, da dieser im ESI-MS nicht ionisiert hat und Peak 1 und 2 konnten keine eindeutigen Massen zugeordnet

ERGEBNISSE werden. Auch Peak 4, 7, 8 und 9 konnten mit den Daten aus UV/VIS- Absorption und Molekülmasse nicht zugeordnet werden (siehe Tabelle 17).

Tabelle 17: Auflistung der Peaks des Stammes LB129, sowie deren Retentions- zeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Masse Bezeich- Retentions- UV-Absorption Dereplikation der m/z nung zeit (min) (nm) Substanzen/Peaks [M]+

Peak 1 0,67 238, 279 k.Z. k.D. Peak 2 1,79 212, 256 529? k.D. Peak 3 2,03 206, 244 n.i. k.D. Peak 4 2,41 225, 305 165 k.D. Peak 5 2,77 212, 249, 364 238 Phenazin-1-Carbonsäure- methylester Peak 6 2,81 216, 248, 365 296 Phenazin-1,6-Dicarbon- säure-dimethylester Peak 7 3,83 226, sh 309, 508 k.D. 325, 338, 427 Peak 8 3,91 228, 275, 371 510 k.D. Peak 9 4,03 225, 276, 506 k.D. 363, 427 n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation, k.Z.: keine Zuordnung möglich.

Bei Peak 5 und 6 handelt es sich um Phenazin-Derivate. Neben Pseu- domonaden produzieren auch Streptomyces-Stämme einfache hydroxyl- und carboxyl-substituierte Phenazine, sowie auch Methoxy- und Methyles- ter Derivate (Laursen & Nielsen 2004). Zu den Produzenten dieser einfa- chen Phenazin-Derivate gehören z.B. S. tanshiensis, S. luteoreticuli, S. thioluteus und S. lomodensis. Die komplexeren Phenazin-Derivate, wie z.B. Aldehyde, Thioester, Ester und Amide werden von S. griseus, S. gri- seoluteus, S. prunicolor, S. antibioticus, S. luteogriseus und anderen produziert (Mavrodi et al. 2006).

ERGEBNISSE

3.6.9 Naturstoffproduktion von Streptomyces sp. (Stamm LB173)

Der Stamm LB173 wurde im Rahmen dieser Studie von S. latissima isoliert. Die Kultivierung erfolgte zu nächst als Zeitreihe (3 bis 14 Tage) in 1 L GYM4-Medium in einem 2 L-Erlenmeyerkolben mit einer Schikane bei 120 rpm.

Abbildung 26: DAD-Chromatogramm eines Extraktes von einer 1 L Kultur von LB173. Die Kultivierung erfolgte für sieben Tage bei 28 °C in GYM4.

Der Extrakt von Stamm LB173 enthielt nur wenige Substanzen (siehe Ab- bildung 21). Ein Peak (1) zeigte allerdings ein charakteristisches UV- Spektrum (204, 273, 354, 374, und 458 nm) mit einer Masse von 348 Da. Mittels Großansatz (10 L) in einem Stärke-Pepton-Medium konnten Ohlen- dorf et al. (2012) 6 mg der Substanz isolieren. Mittels NMR-Analysen ge- lang es Ohlendorf et al. (2012) die Struktur aufzuklären und eine neue Verbindung, das Geranylphenazindiol (10, Abbildung 27), zu entdecken.

Abbildung 27: Struktur des Acetylcholinesterase-Hemmers Geranylphenazindiol (10).

Geranylphenazindiol hemmt mit einem IC50-Wert von 2,62 µM die Aktivität der Acetylcholinesterase (Ohlendorf et al. 2012).

ERGEBNISSE

3.6.10 Naturstoffproduktion von Amycolatopsis sp. (Stamm LB152)

Stamm LB152 war unter allen Isolaten das einzige Isolat, dessen nächster Verwandter ein Amycolatopsis-Stamm ist. Die Analyse der Biosynthese- Gencluster für war NRPS positiv und für PKS I/II negativ. In einer vorhergehenden Untersuchung konnte eine Aktivität gegen B. subtilis und S. lentus festgestellt werden. Die Kultivierung erfolgte wie in Tabelle 38 im An- hang aufgeführt. Die Extraktion erfolgte wie in Kapitel 2.11.5 beschrieben.

3 1 2

Abbildung 28: DAD-Chromatogramm eines Extraktes von einer 12 L Kultur von LB152. Die Kultivierung erfolgte für elf Tage bei 28 °C in GYM4. Peak 1-3 siehe Tabelle 18.

Der Extrakt von Stamm LB152 enthielt nur wenige Subtanzen (siehe Ta- belle 18).

Tabelle 18: Auflistung der Peaks des Stammes LB152, sowie deren Retentions- zeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Retenti- Bezeich- UV-Absorption Masse Dereplikation der Sub- onszeit nung (nm) m/z [M]+ stanzen/Peaks (min)

Peak 1 1,57 212, 250, 292 184 (464) k.D. Peak 2 1,83 212, 250, 289 184 (464) k.D. Peak 3 3,35 226, 267, 369, 423 k.D. 388, 406 k.D.: keine Dereplikation.

Peak 1, 2, und 3 konnten mit den Daten aus UV/VIS-Absorption und Mole- külmasse nicht zugeordnet werden. Die isolierten Mengen aus dem Groß- ansatz waren für eine NMR-Analyse nicht ausreichend.

ERGEBNISSE

3.6.11 Naturstoffproduktion von Pseudomonas sp. (Stamm LB012)

Bei Stamm LB012 war die Analyse der Biosynthese-Gencluster jeweils positiv. Die Kultivierung erfolgte wie in Tabelle 38 im Anhang aufgeführt. Die Extraktion erfolgte wie in Kapitel 2.11.5 beschrieben.

1 2 3 5 6 7 A

4 8

1 2 B 3

Abbildung 29: DAD-Chromatogramm eines Extraktes von einer 1L Kultur des Stammes LB012. Die Kultivierungsdauer betrug A: 2 Tage, B: 3 Tage bei 28 °C in TM Medium. Peak 1-8 siehe Tabelle 19.

Bei einer zweitätigen Kultivierung wurden bei Stamm LB012 mehr Peaks detektiert, als bei der dreitägigen Kultivierung. So wurde die Kultivie- rungsdauer für einen Großansatz zur Substanzisolation auf zwei Tage festgelegt. Im Screening-Ansatz nach zweitägiger Kultivierung in TM-Medium konnten bei einer Retentionszeit zwischen 5 und 6 min 5 Peaks (Peak 4, 5, 6, 7, 8) detektiert werden, die im darauffolgenden Großansatz nicht reproduziert wurden (siehe Abbildung 30). Somit stand für eine NMR-Analyse kein Substanzmaterial zur Verfügung. Von Peak 1 konnte genügend Substanzmenge isoliert werden, so dass eine NMR-Analyse erfolgte. Mittels 1H, 13C, HSQC, HMBC, COSY konnte die Substanz als Holomycin identifiziert werden (siehe Tabelle 19). Peak 2, das N-Propionylholothin wurde nicht mittels NMR-Analyse bestätigt, da die Substanzmenge nicht ausreichend war.

ERGEBNISSE

Tabelle 19: Auflistung der Peaks aus dem Chromatogramm A des Stammes LB012, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Bezeich- Retetions- UV-Absorption Masse Dereplikation der Substan- nung zeit (min) (nm) m/z [M]+ zen/Peaks

Peak 1 1,13 245, 300, 388 214 Holomycin* Peak 2 1,77 246, 300, 387 228 N-Propionylholothin Peak 3 2,55 353 299 k.D. Peak 4 5,56 230, 274, 388 n.i. k.D. Peak 5 5,62 230, 267, 315, n.i. k.D. 418 Peak 6 5,79 230, sh253, n.i. k.D. 295, 407 Peak 7 5,94 230, 274, 395 n.i. k.D.

Peak 8 5,99 230, 275, 388 n.i. k.D. n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation, *: Mittels NMR (1H, COSY, 13C, HSQC, HMBC) bestätigt.

Die Daten aus UV/VIS-Absorption und Molekülmasse lassen die Dereplika- tion allerdings als sehr wahrscheinlich anzunehmen, da N- Propionylholothin bereits zuvor neben Holomycin nachgewiesen werden konnte (Okamura 1977).

1 2 3

Abbildung 30: DAD-Chromatogramm eines Extraktes von einer 12 L Kultur des Stam- mes LB012. Die Kultivierung erfolgte für zwei Tage bei 28 °C in TM Medium. Peak 1-3 siehe Tabelle 19.

ERGEBNISSE

12/13

Abbildung 31: DAD-Chromatogramm eines Extraktes von einer 1 L Kultur des Stammes LB012. Die Kultivierung erfolgte für zwei Tage bei 28 °C in GYM4. Peak 12/13 siehe Ta- belle 20.

Die HPLC-Analyse des Extrates von Stamm LB012 zeigte nur wenige Peaks im DAD-Chromatogramm (siehe Abbildung 31). Im Base Peak Chromatogramm (nicht dargestellt) ließen die detektierten Massen jedoch das Vorhandensein von Peptiden vermuten (siehe Tabelle 20). Mit Hilfe der Daten der Molekülmasse und dem Abgleich in der Datenbank wurden die Peaks als Massetolide identifiziert.

Tabelle 20: Auflistung der Peaks aus dem Chromatogramm D des Stammes LB012, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

UV- Retentionszeit Masse Dereplikation der Absorption Bezeichnung (min) m/z Substanzen/Peaks (nm) [M]+

Peak 9 5,94 k.Z. 1112 Massetolide E/J Peak 10, 11 6,03, 6,08 k.Z 1126 Massetolide F/Viscosin Peak 12, 13 6,11, 6,21 k.Z 1140 Massetolide A/D/G/ Pseudophomin A Peak 14, 15 6,32, 6,36 k.Z 1154 Massetolide B/H Peak 16 6,43 k.Z 1124 Massetolide K Peak 17 6,48 k.Z 1168 Massetolide C/ Pseu- dophomin B k.Z.: keine Zuordnung möglich.

In der MS-Analyse treten noch weitere Massen auf, die vermutlich ebenfalls den Massetoliden zu geordnet werden können. Die chromtografische Auftrennung (Standardverfahren wie in Kapitel 2.12.1 beschrieben) war dazu aber nicht ausreichend.

ERGEBNISSE

3.6.12 Naturstoffproduktion von Pseudomonas sp. (Stamm LD120)

Die Analyse der Biosynthese-Gencluster für war NRPS positiv und für PKS I/II negativ. Ferner konnte eine Aktivität gegen B. subtilis und S. lentus festgestellt werden. Der Stamm wurde daher als chemisch interessant eingestuft. Die Kultivierung erfolgte wie in Tabelle 38 im Anhang aufge- führt. Die Extraktion erfolgte wie in Kapitel 2.11.5 beschrieben.

1 2 4 3

1 2 4 8 9 17 5 6 12 19 3 7 1011 15 14 16 18 20 13

Abbildung 32: DAD-Chromatogramm eines Extraktes einer 10 L Kultur des Stammes LD120. Peak 1-20 siehe Tabelle 21.

Im Extrakt von Stamm LD120 konnte eine Vielzahl verschiedener Peaks nachgewiesen werden (siehe Tabelle 21). Peak 1, 2 und 4 wurden in höherer Konzentration gebildet und konnten isoliert werden.

Tabelle 21: Auflistung der Peaks des Stammes LD120, sowie deren Retentions- zeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Reten- Masse Dereplikation der Bezeich- tionszeit UV-Absorption (nm) m/z Substanzen/Peaks nung (min) [M]+

Peak 1 2,03 228, 286 168 Monoacetylphloro- glucinol* Peak 2 3,04 256, 310 271 Pyoluteorin* Peak 3 3,51 215, 298, 311, 325 613 Rhizoxin S1

Peak 4 3,66 270, 327 210 2,4-Diacetylphloro- glucinol* Peak 5 3,77 ü 597 Rhizoxin D3

ERGEBNISSE

Reten- Masse Dereplikation der Bezeich- tionszeit UV-Absorption (nm) m/z Substanzen/Peaks nung (min) [M]+

Peak 6 3,86 ü 579 Rhizoxin D1 (WF 1360 C) Peak 7 4,06 222, 298, 311, 325 595 WF 1360 B Peak 8 4,18 ü 627 Rhizoxin M1 Peak 9 4,21 270, ü 224 DAPG-Derivat (1-Methylether) Peak 10 4,21 ü 627 Rhizoxin S2 Peak 11 4,37 215, sh298, 311, sh328 627 Rhizoxin Z1 Peak 12 4,87 224, 298, 311, 325 609 WF 1360 F Peak 13 5,18 223, 281 n.i. k.D. Peak 14 5,36 sh213, 228, 274, 332 n.i. k.D. Peak 15 6,03 228, 282 319 k.D. Peak 16 6,33 228, 282 321 k.D. Peak 17 6,39 sh218, 230, 282 347 k.D. *, eventuell neu Peak 18 6,53 224, 277, sh336 361 k.D. Peak 19 6,65 228, 279, sh334 ü 349 k.D. Peak 20 6,68 228, 280, sh331 ü 375 k.D. n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation, ü: Substanz von einer weiteren Substanz überlagert, daher keine vollständigen UV/VIS-Daten möglich, *: 1H-NMR vorhanden.

Diese Substanzen wurden mittels mittels 1H-NMR identifiziert. Es handelt sich dabei um die Substanzen Monoacetylphloroglucinol (MAPG), Pyoluteo- rin und 2,4-Diacetylphloroglucinol (DAPG). Wie bereits in Kapitel 3.6 erwähnt, handelt es sich um Substanzen mit antibiotischer Wirkung, die von Pseudomonaden produziert werden (Maurhofer et al. 1995, Isnansetyo et al. 2003). Die Rhizoxin-Analoga (Rhizoxin S1, Rhizoxin S2, Rhizoxin D1 (WF 1360 C), Rhizoxin D3, Rhizo- xin M1, Rhizoxin Z1, WF 1360 B und WF 1360 F) wurden anhand ihres charakteristischen UV-VIS-Spektrums und der Molekülmasse mittels Ab- gleich der Datenbanken identifiziert.

ERGEBNISSE

3.6.13 Kultivierungsexperimente von Pseudomonas sp. (Stamm LD120)

Das Vorscreening von Stamm LD120 aus der KiWiZ-Sammlung erfolgte zunächst mit einer Kultivierung in drei verschiedenen Medien und einer Extraktion nach sieben Tagen. Die Farbe der drei Kulturen resultiert nicht nur aus den verwendeten Medien, sondern ist auch auf die Produktion von Sekundärmetaboliten zurückzuführen (siehe Abbildung 33).

A B C

Abbildung 33: Kultivierung von Stamm LD120 für sieben Tage bei 28 °C und in drei verschiedenen Medien A: TSB, B: MB, C: GYM4.

In Abbildung 34 sind die DAD-Chromatogramme aus der HPLC-Analyse dargestellt, anhand derer der Einfluss des Mediums auf die Sekundärme- tabolit-Produktion von Stamm LD120 deutlich wird. Während sich das Sekundärmetabolitprofil von der Kultivierung in TSB- und der Kultivierung in GYM4-Medium ähneln, unterscheidet sich das Se- kundärmetabolitprofil von der Kultivierung in MB-Medium stark. Die Kon- zentration der meisten Substanzen war in GYM4-Medium am höchsten.

ERGEBNISSE

4 18

B 2 15 16 17 19/20

C 2 17 1 4 18* 15 16 19/20

Abbildung 34: DAD-Chromatogramme von Extrakten von 25 mL Kulturen des Stammes LD120. Die Kultivierung erfolgte für sieben Tage bei 28 °C in verschiedenen Medien A: MB, B: TSB, C: GYM4. Peak 1-20 siehe Tabelle 22.

Tabelle 22: Auflistung der Peaks des Stammes LD120 aus der Extraktion der 25 mL Kulturen, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekül- massen und mögliche Dereplikation.

Retenti- Masse Bezeich- UV-Absorption Dereplikation der Sub- onszeit m/z nung (nm) stanzen/Peaks (min) [M]+

Peak 1 1,66 228, 286 168 Monoacetylphloro- glucinol (MAPG) Peak 2 2,61 256, 310 271 Pyoluteorin (PLT) Peak 4 3,34 270, 327 210 2,4-Diacetylphloro- glucinol (DAPG) Peak 18 6,07 225, 275, sh336 n.i. k.D. Peak 15 5,85 sh216, 229, 282 n.i. k.D. Peak 16 6,25 229, 282 n.i. k.D. Peak 17 6,35 sh215, 231, 282 n.i. k.D. Peak 18* 6,50 227, 284 361 k.D. Peak 19 6,65 229, 281 n.i. k.D. Peak 20 6,69 228, 282 n.i. k.D. n.i. Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation.

ERGEBNISSE

Alle Substanzen sind auch aus anderen Experimenten (Stamm LB042 und LB061) dieser Dissertation bekannt.

Dass schon geringe Unterschiede in der Medienzusammensetzung einen Einfluss auf die Produktion von Sekundärmetaboliten haben, zeigen die Abbildungen 35 & 36. Die Ausgangsfarbe der Medien vor der Kultivierung entspricht der Farbe in Kolben B. Daher deutet die unterschiedliche Färbung der Flüssigkulturen (siehe Abbildung 35) bereits auf ein divergentes Sekundärmetabolitprofil hin.

A B

Abbildung 35: Kultivierung von Stamm LD120 nach einem Tag bei 30 °C. A: MB- Medium, B: TM-Medium.

Die DAD-Chromatogramme der jeweiligen Extrakte zeigen den Einfluss des Mediums auf die Sekundärmetabolit-Produktion von Stamm LD120 siehe Abbildung 36.

4 A 1 2 7 9 14 18

B 4 1 2 7 9

Abbildung 36: DAD-Chromatogramme von Extrakten von 100 mL Kulturen des Stam- mes LD120. Die Kultivierung erfolgte für einen Tag bei 30 °C in zwei verschiedenen Me- dien A. MB, B: TM. Peak 1-18 siehe Tabelle 23.

ERGEBNISSE

Das Sekundärmetabolitprofil der MB- und der TM-Kultur stimmt bis auf Peak 14 und Peak 18 überein, daher ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass eine oder beide Substanzen für die rötliche Färbung der MB-Kultur veran- tortlich sein könnten.

Tabelle 23: Auflistung der Peaks des Stammes LD120 aus der Extraktion der 100 mL Kulturen, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekül- massen und mögliche Dereplikation.

Retenti- Masse Bezeich- UV-Absorption Dereplikation der Sub- onszeit m/z nung (nm) stanzen/Peaks (min) [M]+

Peak 1 1,74 228, 286 168 Monoacetylphloro- glucinol (MAPG) Peak 2 2,72 256, 310 271 Pyoluteorin (PLT) Peak 4 3,33 270, 327 210 2,4-Diacetylphloro- glucinol (DAPG) Peak 7 3,76 222, 298, 311, 595 WF 1360 B 325 Peak 9 3,90 270, ü 224 DAPG-Derivat (1-Methylether) Peak 14 5,13 sh213, 227, 276, n.i. k.D. 337 Peak 18 6,39 220, 272, 334 n.i. k.D. n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation, ü: UV-Spektrum überlagert.

Die gebildeten Sekundärmetabolite sind auch aus den anderen Pseudomo- nas-Extrakten bekannt (siehe Stamm LB042 und Stamm LB061).

In Abbildung 37 ist der Einfluss der Kultivierungsdauer auf die Sekundär- metabolit-Produktion von Stamm LD120 anhand der DAD-Chromato- gramme der Extrakte dargestellt.

ERGEBNISSE

C 1 2 4

2 4 D 1 7 8 12 14 18

4 E 2 7 8 12 18

7 8 F

Abbildung 37: DAD-Chromatogramme von Extrakten einer 1 L MB-Kultur des Stammes LD120 zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Kultivierungsdauer betrug: A 6 Stunden, B 24 Stunden, C 30 Stunden, D 48 Stunden, E 168 Stunden, F 336 Stunden. Peak 1-18 siehe Tabelle 24.

Bei einer Temperatur von 16 °C konnten nach einer Kultivierungsdauer von sechs Stunden in MB-Medium keine Sekundärmetabolite im Kulturex- trakt nachgewiesen werden. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden waren Sekundärmetabolite in sehr geringer Konzentration im Extrakt nachweisbar. Die Substanzen MAPG, PLT und DAPG konnten nach 30 stündiger Inkubationszeit in hoher Konzentration nachgewiesen werden. Die Produktion einiger Rhizoxin-Derivate konnte nach 48 stündiger Inku- bation nachgewiesen werden.

ERGEBNISSE

Nach einer Inkubationszeit von 168 bzw. 336 Stunden waren die Metaboli- te PLT und DAPG nur noch in sehr geringer Konzentration vorhanden, während die Rhizoxin-Derivate WF 1360 B und Rhizoxin M1 noch in höhe- rer Konzentration vorhanden waren.

Tabelle 24: Auflistung der Peaks des Stammes LD120 aus der Extraktion der 1 L-Zeitreihe, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmas- sen und mögliche Dereplikation.

Retenti- Masse Bezeich- UV-Absorption Dereplikation der Sub- onszeit m/z nung (nm) stanzen/Peaks (min) [M]+

Peak 1 2,09 228, 286 168 Monoacetylphloro- glucinol (MAPG) Peak 2 3,08 256, 310 271 Pyoluteorin (PLT) Peak 4 3,66 270, 327 210 2,4-Diacetylphloro- glucinol (DAPG) Peak 7 4,16 222, 298, 311, 595 WF 1360 B 325

Peak 8 4,30 220, 298, 311, 627 Rhizoxin M1 325 Peak 12 4,96 224, 298, 311, 609 WF 1360 F 325 Peak 14 5,36 225, 275, 338 n.i. k.D. Peak 18 6,38 224, 275, 336 n.i. k.D. n.i. Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation.

Die Untersuchung der Extrakte aus der Zeitreihe führte zu keinen bisher unbekannten bzw. neuen Substanzen.

ERGEBNISSE

3.6.14 Kultivierungsexperimente von Pseudomonas sp. (Stamm LB042)

Die Analyse der Biosynthese-Gencluster für war NRPS positiv und für PKS I/II negativ. Des Weiteren konnte eine Aktivität gegen B. subtilis und S. lentus festgestellt werden. Um das Sekundärmetabolitprofil von Stamm LB042 zu ermitteln, wurde eine Kultivierung in zwei verschiedenen Medien durchgeführt, welche zu unterschiedlichen Zeitpunkten extrahiert wurden. Die DAD-Chromato- gramme der HPLC-Analyse sind in Abbildung 38 dargestellt.

1 2 4 A 9

B 2 1 4

C 2

E 1

22 F 233 1 21 4 27 28

ERGEBNISSE

22 G 23 1 21 4 27 26 28

H 22 23 1 21 4

Abbildung 38: DAD-Chromatogramme von Extrakten aus 1 L Kulturen des Stammes LB042. Kultivierungsbedingungen: A: TM 1 Tag, B: TM 2 Tage, C: TM 3 Tage, D: TM 7 Tage, E: GYM 1 Tag, F: GYM 2 Tage, G: GYM 3 Tage, H: GYM 7 Tage. Peak 1-28 siehe Tabelle 25.

Bei der Kultivierung von Stamm LB042 in TM-Medium ist eine Kultivie- rungsdauer von einem Tag sinnvoll, um möglichst viele Substanzen in größtmöglicher Menge zu produzieren. Während die im TM-Medium gebildeten Substanzen nach drei Tagen bereits überwiegend abgebaut sind, sind im GYM-Medium viele Substanzen auch nach sieben Tagen Kultivie- rungsdauer noch in der anfänglichen Konzentration nachweisbar. Bei einer Kultivierung von Stamm LB042 in GYM-Medium erscheint eine Extraktion nach zwei bis drei Tagen am sinnvollsten, da unter diesen Be- dingungen die meisten Substanzen nachgewiesen wurden.

Tabelle 25: Auflistung der Peaks aus den Chromatogrammen A-H des Stammes LB042, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Retenti- Masse Bezeich- UV-Absorption Dereplikation der Sub- onszeit m/z nung (nm) stanzen/Peaks (min) [M]+

Peak 1 1,85 228, 286 168 Monoacetylphloro- glucinol (MAPG) Peak 2 2,75 256, 310 271 Pyoluteorin (PLT) Peak 4 3,34 215, 270, 327 n.i. 2,4-Diacetylphloro- glucinol (DAPG) Peak 9 3,88 213, 270, 329 224 DAPG-Derivat (1-Methylether)

ERGEBNISSE

Retenti- Masse Bezeich- UV-Absorption Dereplikation der Sub- onszeit m/z nung (nm) stanzen/Peaks (min) [M]+

Peak 21 2,75 216, 270, 337 n.i. k.D. Peak 22 2,85 221, 282 n.i. k.D. Peak 23 2,93 224, 288, sh339 n.i. k.D. Peak 26 3,82 222, 277, sh337 n.i. k.D. Peak 27 3,90 222, 270, 337 n.i. k.D. Peak 28 4,36 222, 273, 339 252 2,4,6-Triacetylphloro- glucinol n.i. Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation.

Stamm LB042 produziert neben MAPG, DAPG und PLT, welche bereits von Stamm LD120 isoliert wurden, auch weitere Substanzen wie z.B. Peak 21- 28 im GYM-Medium. Da die meisten Substanzen in der ESI-MS nicht ionisiert haben, konnten diese Substanzen nicht derepliziert werden. Bei Peak 28 handelt es sich wahrscheinlich um 2,4,6-Triacetylphloroglucinol, einem Phloroglucinol-Derivat. Auch bei einigen der anderen Substanzen könnte es sich um weitere Phloroglucinol-Derivate handeln.

3.6.15 Kultivierungsexperimente von Pseudomonas sp. (Stamm LB061)

Die Analyse der Biosynthese-Gencluster war für NRPS positiv und für PKS I/II positiv. Außerdem zeigte sich eine Aktivität gegen B. subtilis und S. lentus. Das Vorscreening von Stamm LB061 erfolgte zunächst mit einer Kultivie- rung in drei verschiedenen Medien und einer Extraktion nach sieben Tagen (siehe Abbildung 39).

ERGEBNISSE

A B C

AbbildungH 39: Kultivierung von Stamm LB061 für sieben Tage bei 28 °C und in drei verschiedenen Medien A: TSB, B: MB, C: GYM4.

In Abbildung 40 sind die DAD-Chromatogramme aus der HPLC-Analyse dargestellt. Anhand der Chromatogramme wird der Einfluss des Mediums auf die Sekundärmetabolit-Produktion von Stamm LB061 deutlich.

18 A

B 2 1718* 15 16 19/20

C 4* 17 18* 4 15 16 19/20

Abbildung 40: DAD-Chromatogramme von Extrakten von 25 mL Kulturen des Stammes LB061. Die Kultivierung erfolgte für sieben Tage bei 28 °C in verschiedenen Medien A: MB, B: TSB, C: GYM4. Peak 1-20 siehe Tabelle 26.

Während sich das Sekundärmetabolitprofil von der Kultivierung in TSB- und der Kultivierung in GYM4-Medium stark ähneln, unterscheidet sich das Sekundärmetabolitprofil von der Kultivierung in MB-Medium stark. Die Konzentration der produzierten Substanzen war in GYM4-Medium am höchsten.

ERGEBNISSE

Tabelle 26: Auflistung der Peaks des Stammes LB061 aus der Extraktion der 25 mL Kulturen, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekül- massen und mögliche Dereplikation.

Retenti- Masse Bezeich- tenti- UV-Absorption Dereplikation der Sub- m/z nung onszeit (nm) stanzen/Peaks [M]+ (min) Peak 2 2,55 256, 310 271 Pyoluteorin (PLT) Peak 4* 2,63 270, 337 154/ ähnlich DAPG 222 Peak 4 3,15 270, 327 210 2,4-Diacetylphloro- glucinol (DAPG) Peak 15 5,59 228, 282 319 k.D. Peak 16 5,96 228, 282 321 k.D. Peak 17 6,05 sh218, 230, 282 347 k.D. Peak 18 6,12 226, 275, sh336 n.i. k.D. Peak 18* 6,20 228, 284 361 k.D. Peak 19 6,34 228, 279, sh334 349 k.D. Peak 20 6,37 228, 280, sh331 375 k.D. n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation.

Die Peaks 15-20 und die Substanzen DAPG und PLT und wurden zuvor im 10 L Großansatz des Stammes LD120 nachgewiesen. Stamm LB061 wurde in zwei verschiedenen Medien kultiviert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten extrahiert. In Abbildung 41 sind der Einfluss von Kultivierungsdauer und Medium auf die Sekundärmetabolit-Produktion von Stamm LB061 dargestellt.

ERGEBNISSE

A 1 2 4 14 18

2 4 B 1 7 12 14 18 3 10

C 2 4 3 7 10 12 14 18

D 2 10 11 18 4

E 1 21 4

F 22 23 1 4 28 21 26 27

22 23 G 28 4 26 1 21 27

4 28 21 23 26 27

Abbildung 41: DAD-Chromatogramme von Extrakten von 1 L Kulturen des Stammes LB061. Kultivierungsbedingungen: A: MB 1 Tag, B: MB 2 Tage, C: MB 3 Tage, D: MB 7 Tage, E: GYM 1 Tag, F: GYM 2 Tage, G: GYM 3 Tage, H: GYM 7 Tage. Peak 1-28 siehe Tabelle 27.

ERGEBNISSE

In der Kultivierung mit MB-Medium war die Konzentration der Substanzen MAPG, PLT und DAPG nach einem Tag Kultivierungsdauer am größten. Nach zweitägiger Kultivierung wurden vermehrt Rhizoxine produziert und die Konzentration der Peaks 14 und 18 stieg an. In der Kultivierung mit GYM-Medium war die Konzentration der Substanz MAPG nach einem Tag Kultivierungsdauer am größten. Die Konzentration der Peaks 22, 23, 26, 27 und 28 war nach zwei- bzw. dreitägiger Kultivierung am größten.

Tabelle 27: Auflistung der Peaks des Stammes LB061 aus der Extraktion der 1 L Kulturen, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Retenti- Masse Bezeich- UV-Absorption Dereplikation der onszeit m/z nung (nm) Substanzen/Peaks (min) [M]+

Peak 1 1,85 228, 286 168 Monoacetylphloro- glucinol (MAPG) Peak 2 2,75 256, 310 271 Pyoluteorin (PLT) Peak 4 3,34 270, 327 210 2,4-Diacetylphloro- glucinol (DAPG) Peak 7 3,60 222, 298, 311, 595 WF 1360 B 325 Peak 8 3,75 222, 298, 311, 627 Rhizoxin M1 325 Peak 12 4,41 224, 298, 311, 609 WF 1360 F 325 Peak 14 4,99 sh213, 228, 274, n.i. k.D. 332 Peak 18 6,22 222, 275, sh336 n.i. k.D. Peak 21 2,73 214, 270, 337 n.i. k.D. Peak 22 2,83 221, 282 n.i. k.D. Peak 23 2,90 224, 289, sh338 n.i. k.D. Peak 25 3,49 222, 280 n.i. k.D. Peak 26 3,80 222, 277, sh337 n.i. k.D.

ERGEBNISSE

Retenti- Masse Bezeich- UV-Absorption Dereplikation der onszeit m/z nung (nm) Substanzen/Peaks (min) [M]+

Peak 27 3,88 222, 270, 338 n.i. k.D. Peak 28 4,33 222, 273, 340 252 2,4,6-Triacetylphloro- glucinol n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation.

Das Sekundärmetabolitprofil der GYM-Kultur von Stamm LB061 stimmt vorwiegend mit dem der GYM-Kultur von Stamm LB042 überein. Es unterscheidet sich lediglich in der Konzentration der Substanzen zu den Extrak- tionszeitpunkten. Bis auf die Peaks 14 und 18 und die Rhizoxine gibt es auch bei den Sekundärmetabolitprofilen der MB-Kulturen von Stamm LB061 und Stamm LB042 mehrere Übereinstimmungen (Peak 1, 2, 4 und 9). Aber auch in den Extrakten der MB-Kulturen gibt es Divergenzen be- züglich der Substanzkonzentration zu den verschiedenen Extraktionszeit- punkten.

Fazit: In dieser Arbeit hat sich gezeigt, dass sich die Produktion der Metabolite DAPG, MAPG und PLT mit den Stämmen LB061 und LD120 zuverlässig realisieren läßt. Die optimalen Bedingungen zur Metabolitproduktion sind eine Kultivierung bei 30 °C für ca. 24 bis 48 Stunden in MB-Medium.

ERGEBNISSE

3.6.16 Extraktion von Pseudomonas-Agarkulturen

Die Pseudomonas-Stämme LB183, LB184 und LB185 wurden bei der Pro- benahme 2010 isoliert und in dieser Arbeit erstmalig untersucht. Die Pseudomonas-Stämme LB042, LB043, LB044, LB045, LB046, LB047, LB048, LB051, LB054, LB061, LB062 und LB063 entstammen der KiWiZ- Sammlung, so dass es über diese Stämme schon vor dieser Arbeit Infor- mationen gab (siehe Tabelle 28).

Tabelle 28: Dargestellt sind die KiWiZ-Informationen bezüglich der Analyse der Biosynthese-Gencluster für NRPS und für PKS I/II und der antibiotischen Tes- tung.

Stamm PKS I/II NRPS Bioaktivitätstests

LB042 - + B.s. S.l. LB043 - k.I. k.I. k.I. LB044 k.I. + k.I. k.I. LB045 - k.I. k.I. k.I. LB046 - k.I. k.I. k.I. LB047 - k.I. k.I. k.I. LB048 - k.I. k.I. k.I. LB051 - k.I. k.I. k.I. LB054 k.I. k.I. k.I. k.I. LB061 + + B.s. S.l. LB062 - + k.I. k.I. LB063 k.I. k.I. B.s. S.l. k.I.: keine Information, +: Genfragment nachgewiesen, -: kein Genfragment nachgewiesen, B.s.: Aktivität gegen Bacillus subtilis nachgewiesen, S.l.: Aktivität gegen Staphy- lococcus lentus nachgewiesen.

In Abbildung 42 dargestellt sind die Chromatogramme der Extrakte aus der Kultivierung der Stämme LB183, LB184, LB185, LB042, LB043, LB044, LB045, LB046, LB047, LB048, LB051, LB054, LB061, LB062 und LB063 für sieben Tage auf MB Agarplatten bei 28 °C.

ERGEBNISSE

LB183 1 4 14 18

LB184 4 18

LB185 2 * 18 4 4

LB042 4* 18 4

LB043 * 2 4 18 4

LB044 4* 4 18

LB045 * 4 18

LB046 4* 4 18

LB047 4* 4 18

100

ERGEBNISSE

LB048 4* 4 18

LB054 4* 18

* LB061 4 18 4

LB062 * 4 4 18

LB063 * 4 4 18

LB051 * 2 4 4 18

Abbildung 42: DAD-Chromatogramme von Extrakten von Platten verschiedener Stäm- me. Die Kultivierung erfolgte für sieben Tage auf MB Agarplatten bei 28 °C. Peak 1-18 siehe Tabelle 29.

DAPG und Peak 18 waren in allen Extrakten in unterschiedlicher Konzent- ration nachweisbar. MAPG ließ sich nur in dem Extrakt von Stamm LB183 eindeutig nachweisen. PLT wurde nicht bzw. nicht in ausreichender Kon- zentration von Stamm LB183, LB184 und LB042 produziert. Die Extrakte der Stämme LB183 und LB051 zeigten jeweils ein unterschiedliches Meta- bolitprofil zu denen der anderen untersuchten Stämme. Die Metabolitprofi- le der Extrakte der Stämme LB185, LB043, LB044, LB045, LB046, LB047,

101

ERGEBNISSE

LB048, LB054, LB061, LB062 und LB063 wiesen eine starke Ähnlichkeit zueinander auf.

Tabelle 29: Auflistung der Peaks der Stämme LB183, LB184, LB185, LB042, LB043, LB044, LB045, LB046, LB047, LB048, LB051, LB054, LB061, LB062 und LB063, sowie deren Retentionszeiten, UV/VIS-Absorptionen, Molekülmassen und mögliche Dereplikation.

Reten- Masse Bezeich- UV-Absorption Dereplikation der Sub- tionszeit m/z nung (nm) stanzen/Peaks (min) [M]+

Peak 1 1,78 228, 286 168 Monoacetylphloro- glucinol* Peak 2 2,67 256, 310 271 Pyoluteorin* Peak 4* 2,76 270, 337 154/ Ähnlich DAPG 222 Peak 4 3,27 270, 327 210 2,4-Diacetylphloro- glucinol* Peak 14 4,85 sh213, 228, 274, n.i. k.D. 332 Peak 18 6,03 224, 277, sh336 361 k.D. n.i.: Unbekannte Substanz, die im UV/VIS absorbiert, aber in der ESI-MS nicht ionisiert und detektiert werden kann, k.D.: keine Dereplikation, *: Dereplikation mittels 1H-NMR bestätigt.

Die produzierten Metabolite sind bereits aus anderen Experimenten (Kapi- tel 3.6.12 bis 3.6.15) bekannt. Peak 4* wurde zuvor nur in der Flüssigkul- tivierung von Stamm LB061 in GYM-Medium nachgewiesen. Bei der Kulti- vierung auf Agarplatten produzierten bis auf LB183 und LB184 alle Stäm- me Peak 4* in unterschiedlicher Konzentration.

3.7 Bioaktivitätsscreening isolierter Naturstoffe

Die isolierten Reinsubstanzen wurden gegen eine Vielzahl verschiedener Teststämme bezüglicher ihrer antimikrobiellen Aktivität, sowie gegen verschiedene Zelllinien bezüglich ihrer cytotoxischen Aktivität untersucht. Des Weiteren wurden mit den Reinsubstanzen einige Enzymtests durchgeführt.

102

ERGEBNISSE

3.7.1 Biologische Aktivität der Substanzen von Pseudomonas sp. (Stamm LB012)

Holomycin inhibiert das Wachstum von Gram-positiven Bakterien (S. lentus, B. subtilis, P. acnes), Gram-negativen Bakterien (X. campestris) und moderat das Wachstum von Pilzen (T. rubrum, P. infestans). Gegen die Hefe Candida glabrata konnte keine Aktivität nachgewiesen werden (siehe Tabelle 30).

Tabelle 30: Antimikrobielle Aktivitäten der isolierten Substanzen aus Stamm LB012 angegeben als % Inhibition. Abkürzungen der Mikroorganismen: S.l. Staphylococcus lentus, B.s.: Bacillus subtilis subsp. spizizenii, X.c.: Xanthomonas campestris, T.r.: Trichophyton rubrum, P.i.: Phytophthora infestans, S.tr.: Septo- ria tritici, P.a.: Propionibacterium acnes, C.a.: Candida albicans.

Teststamm Substanz S.l. B.s. X.c. T.r. P.i. S.tr. P.a. C.a.

Holomycin 99 97 100 62 62 0 84 0

Aktivitäten ≥ 80 % Inhibition sind Fett hervorgehoben, Aktivitäten < 80 % und ≥ 60 % Inhibition sind grau hinterlegt.

Das Holomycin wies eine starke zytotoxische Aktivität gegen die Fibroblas- tenzellen NIH 3T3, aber nur eine moderate Aktivität gegen die Leberkarzi- nomzellen HepG2 auf (siehe Tabelle 31). Holomycin zeigte keine Aktivität gegenüber den getesteten Enzyminhibitionsassays (Acetylcholinesterase, Phosphodiesterase 4, Protein-Tyrosinphosphatase 1B).

Tabelle 31: Zelllinien- und Enzymtests der isolierten Substanzen aus LB012 angegeben als % Inhibition, sowie die getesteten Konzentrationen. Abkürzungen der Assays: NIH 3T3: NIH 3T3-Zellen, HepG2: HepG2-Zellen, AChE: Acetylcholi- nesterase, PDE4: Phosphodiesterase 4, PTP1B: Protein-Tyrosinphosphatase 1B.

Zellkulturassay Enzymassay Substanz NIH 3T3* HepG2* AChE* PDE4* PTP1B*

Holomycin 100 73 0 20 0

*: Konzentration der Substanz im Assay 10 µM, Aktivitäten ≥ 80 % Inhibition sind Fett hervorgehoben, Aktivitäten < 80 % und ≥ 60 % Inhibition sind grau hinterlegt.

103

ERGEBNISSE

3.7.2 Biologische Aktivität der Substanzen von Pseudomonas sp. (Stamm LD120)

Während alle fünf Substanzen (MAPG, DAPG, PLT, Peak 15 und 17) das Wachstum von S. lentus und B. subtilis hemmen, zeigte keine der Sub- stanzen eine Aktivität gegenüber P. aeruginosa, C. glabrata und S. epidermidis (siehe Tabelle 32). Gegen C. albicans zeigten nur Peak 15 und 17 eine starke Aktivität. Eine geringe Hemmwirkung hat DAPG auf E. coli, X. campestris und B. cinera. Während PLT wie DAPG eine geringe Aktivität gegenüber B. cinera aufweist, zeigte PLT eine starke Wachstumsinhibition von E. coli und X. campestris. Für PLT konnte eine schwache Aktivität ge- genüber P. fluorescens ermittelt werden und eine starke Aktivität gegen- über P. syringe, E. amylovora, R. solanacearum und P. elyakovii. Das Wachstum von E. amylovora konnte durch DAPG ebenfalls moderat inhibiert werden. Bis auf MAPG zeigten alle Substanzen eine starke Aktivität gegen P. acnes. Eine moderate Wachstumshemmung von A. bacteriolytica konnte bei MAPG nachgewiesen werden, DAPG und PLT führten dagegen zu einer starken Inhibition. Gegenüber T. rubrum zeigten MAPG, DAPG, Peak 15 und 17 eine starke Aktivität, während PLT das Wachstum nur ge- ring hemmt. Gegenüber T. mentagrophytes konnte nur für MAPG und DAPG eine starke Wachstumsinhibition nachgewiesen werden, während gegen S. tritici zusätzlich Peak 15 eine starke Aktivität aufwies. Das Wachstum von P. infestans wird durch MAPG, DAPG, PLT und Peak 17 stark gehemmt, aber nicht durch Peak 15.

104

ERGEBNISSE

Tabelle 32: Antimikrobielle Aktivitäten der isolierten Substanzen aus Stamm LD120 (LB053). Die Inhibition ist in % angegeben. Abkürzungen der Substanzen: MAPG: Monoacetylphloroglucinol, DAPG: 2,4-Diacetylphloroglucinol, PLT: Pyolu- teorin, Abkürzungen der Mikroorganismen: S.l.: Staphylococcus lentus, B.s.: Ba- cillus subtilis subsp. spizizenii, E.c.: Escherichia coli K12, Ps.fl.: Pseudomonas fluorescens, Ps.a.: Pseudomonas aeruginosa, C.g.: Candida glabrata, Ps.s.: Pseudomonas syringae pv. aptata, X.c.: Xanthomonas campestris, E.a.: Erwinia amylovora, R.s.: Ralstonia solanacearum, T.r.: Trichophyton rubrum, T.m.: Trichophyton mentagrophytes, P.i.: Phytophthora infestans, S.tr.: Septoria tritici, B.c.: Botrytis cinerea, P.a.: Propionibacterium acnes, C.a.: Candida albicans, S.e.: Staphylococcus epidermidis, A.b.: Algicola bacteriolytica, P.e.: Pseudoalte- romonas elyakovii.

Substanz Teststamm MAPG DAPG PLT Peak 15 Peak 17 S.l. 97 98 100 93 96 B.s. 100 100 100 94 93 E.c. 31 39 93 n.b. n.b. Ps.fl. 0 0 37 n.b. n.b. Ps.a. 0 0 0 n.b. n.b. C.g. 30 29 0 n.b. n.b. Ps.s. 0 0 97 n.b. n.b. X.c. 0 46 99 0 0 E.a. 0 75 93 n.b. n.b. R.s. 0 0 100 n.b. n.b. T.r. 98 98 34 100 97 T.m. 94 93 20 n.b. n.b. P.i. 86 86 89 n.b. 97 S.tr. 100 100 0 100 n.b. B.c. 26 40 42 n.b. 0 P.a. 0 99 92 100 93 C.a. n.b. n.b. n.b. 92 89 S.e. 0 n.b. n.b. n.b. n.b. A.b. 59 80 94 n.b. n.b. P.e. 0 0 94 n.b. n.b. n.b.: nicht bestimmt, Aktivitäten ≥ 80 % Inhibition sind Fett hervorgehoben, Aktivitäten < 80 % und ≥ 60 % Inhibition sind grau hinterlegt.

105

ERGEBNISSE

Die Substanz MAPG wirkt in sehr geringem Maße zytotoxisch gegen die Leberkarzinomzellen HepG2, aber ebenso gegen die humane Fibroblasten- zelllinie NIH 3T3 (siehe Tabelle 33). Die Substanz PLT zeigt eine stärkere zytotoxische Aktivität gegen die humane Fibroblastenzelllinie NIH 3T3 als gegen die kolorektalen Adenokarzinomzelllinie HT-29. Auch Peak 17 wirkt nur in geringem Maße zytotoxisch gegen die humane Fibroblastenzelllinie NIH 3T3, aber nicht gegen eine der Krebszelllinien. In den Enzymassays zeigte lediglich Peak 17 eine moderate Aktivität als Acetylcholinesterase-Hemmer und eine geringe Aktivität als Inhibitor des Enzyms Phosphodiesterase 4.

Tabelle 33: Zelllinien- und Enzymtests der isolierten Substanzen aus Stamm LD120 (LB053) angegeben als % Inhibition, sowie die getesteten Konzentratio- nen. Abkürzungen der Assays: NIH 3T3: NIH 3T3 murine Fibroblasten, HepG2: HepG2 humane Leberkrebszellen, HT-29: HT-29-Zellen, AChE: Acetylcholinester- ase, PDE4: Phosphodiesterase 4, PTP1B: Protein-Tyrosinphosphatase 1B, RT Re- verse Transkriptase, GSK: Glykogensynthase-Kinase-3β.

Zellkulturassay Enzymassay

Substanz NIH 3T3† HepG2† HT-29* AChE* PDE4* PTP1B* RT* GSK*

MAPG 34 32 n.b. 0 0 0 n.b. 0

DAPG 0 0 n.b. 0 0 n.b. 0 0

PLT 65 n.b. 45 0 0 n.b. 0 n.b.

Peak 17 51 0 n.b. 75 53 0 0 0

Peak 15 28 0 0 n.b. 0 0 0 n.b. n.b.: nicht bestimmt, *: Konzentration der Substanz im Assay 10 µM, †: Konzentration der Substanz im Assay 50 µM, Aktivitäten < 80 % und ≥ 60 % Inhibition sind grau hinterlegt.

3.7.3 Biologische Aktivität der Substanzen von Streptomyces sp. (Stamm LB058)

Eine moderate bzw. starke antimikrobielle Aktivität gegen S. tritici konnte jeweils bei Peak 5 und 6 nachgewiesen werden (siehe Tabelle 34). Peak 6 zeigte zusätzlich eine moderate Aktivität gegen C. glabrata. Das Wachs- tum von B. cinera konnten Peak 5 und 6, bei einer eingesetzten Sub-

106

ERGEBNISSE stanzmenge von 28,1 µg, inhibieren. Peak 10 zeigte eine geringe antimikrobielle Aktivität gegen P. infestans.

Tabelle 34: Antimikrobielle Aktivitäten der isolierten Substanzen aus Stamm LB058 angegeben als % Inhibition. Abkürzungen der Mikroorganismen und Me- thoden siehe Kapitel 2.15.1: S.l.: Staphylococcus lentus, B.s.: Bacillus subtilis subsp. spizizenii, E.c.: Escherichia coli K12, Ps.fl.: Pseudomonas fluorescens, Ps.a.: Pseudomonas aeruginosa, C.g.: Candida glabrata, Ps.s.: Pseudomonas syringae pv. aptata, X.c.: Xanthomonas campestris, E.a.: Erwinia amylovora, R.s.: Ralstonia solanacearum, P.i.: Phytophthora infestans, S.tr.: Septoria tritici, B.c.: Botrytis cinerea, P.a.: Propionibacterium acnes, S.e.: Staphylococcus epidermidis.

Substanz

Teststamm Anhydrocycloheximid Peak 4 Peak 5 Peak 6 Peak 7 Peak 10 Peak 11 Peak 12 Peak 13 Peak 14 S.l. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B.s. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 21 E.c. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ps.fl. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ps.a. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C.g. 0 0 0 79 0 0 0 0 0 0 Ps.s. 0 0 n.b. 0 0 0 0 0 0 0 X.c. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E.a. 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 R.s. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.tr. 0 0 73 100 0 0 0 0 0 0 P.a. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.e. 0 0 0 0 0 0 n.b. 0 0 0 P.i. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. 56 * n.b. n.b. n.b. Nein b B.c. n.b. n.b. a a c n.b. n.b. n.b. n.b. b Ja Ja Nein Nein n.b.: nicht bestimmt, †: Konzentration der Substanz im Assay 50 µM, a: Testmenge 28,1 µg, b: Testmenge 21,8 µg, c: Testmenge 56,4 µg, Ja: Hemmhoff-Bildung, Nein: keine Hemmhoff-Bildung, Aktivitäten ≥ 80 % Inhibition sind Fett hervorgehoben, Aktivitäten < 80 % und ≥ 60 % Inhibition sind grau hinterlegt, Peak 4: Actiphenol-Derivat, Peak 5: Cycloheximid, Peak 6: Cycloheximid, Peak 7: ähnlich Cycloheximid, Peak 10: Actiphenol- Derivat (1''Hydroxy), Peak 11: Actiphenol-Derivat (1'Hydroxy), Peak 12: Actiphenol- Derivat (3-Hydroxy(3,4 trans-)), Peak 13: Actiphenol, Peak 14: unbekannt.

107

ERGEBNISSE

Von den getesteten Substanzen zeigt nur Peak 14 eine moderate zytotoxische Aktivität gegen die Leberkarzinomzellen HepG2 und eine geringe zytotoxische Aktivität gegen die kolorektalen Adenokarzinomzelllinie HT-29, sowie auch gegen die humanen Fibroblasten NIH 3T3 (siehe Tabelle 35). Die Substanzen Peak 5 und Peak 6, bei denen es sich wahrscheinlich um Cycloheximid handelt, wirken zwar nur in geringem Maße zytotoxisch gegen die humanen Fibroblasten NIH 3T3, aber die Zytotoxizität gegenüber den getesteten Krebszelllinien ist noch geringer. Anhydrocycloheximid, Peak 7 und Peak 10 zeigen ebenfalls eine geringe zytotoxische Wirkung gegen die Zelllinie NIH 3T3, aber keine zytotoxische Aktivität gegen die Krebszelllinien. Keine der getesteten Substanzen zeigte eine Aktivität in den Enzymas- says.

Tabelle 35: Zelllinien- und Enzymtests der isolierten Substanzen aus Stamm LB058 angegeben als % Inhibition, sowie die getesteten Konzentrationen. Abkür- zungen der Assays: NIH 3T3: NIH 3T3-Zellen, HepG2: HepG2-Zellen, HT-29: HT- 29-Zellen, AChE: Acetylcholinesterase, PDE4: Phosphodiesterase 4, PTP1B: Pro- tein-Tyrosinphosphatase 1B, RT: Reverse Transkriptase, GSK: Glykogensyntha- se-Kinase-3β.

Zellkulturassay Enzymassay

Substanz NIH 3T3* HepG2* HT-29* AChE* PDE4* PTP1B* RT* GSK*

Anhydro- 51 24 n.b. 0 n.b. n.b. n.b. n.b. cycloheximid

Peak4a 0 17,5 0 0 0 0 0 n.b.

Peak 5b 61 35 n.b. 0 n.b. n.b. n.b. n.b.

Peak 6c 67 39 n.b. 0 n.b. n.b. n.b. n.b.

Peak 7d 47 16 n.b. 0 n.b. n.b. n.b. n.b.

Peak 10e 44 20 n.b. 0 n.b. n.b. n.b. n.b.

Peak 11f 27 17,5 n.b. 31 n.b. n.b. n.b. n.b.

Peak 12g 24 17,5 n.b. 0 n.b. n.b. n.b. 0

Peak 13h n.b. n.b. n.b. 27 n.b. n.b. n.b. n.b.

108

ERGEBNISSE

Zellkulturassay Enzymassay

Substanz NIH 3T3* HepG2* HT-29* AChE* PDE4* PTP1B* RT* GSK*

Peak 14i 55 79 55 0 n.b. 0 0 n.b. n.b.: nicht bestimmt, *: Konzentration der Substanz im Assay 10 µM, Aktivitäten < 80 % und ≥ 60 % Inhibition sind grau hinterlegt, a Actiphenol-Derivat, b Cycloheximid, c Cyclo- heximid, d ähnlich Cycloheximid e Actiphenol-Derivat (1''Hydroxy), f Actiphenol-Derivat (1'Hydroxy), g Actiphenol-Derivat (3-Hydroxy(3,4 trans-)), h Actiphenol, i unbekannt.

3.7.4 Biologische Aktivität der Substanzen von Streptomyces sp. (Stamm LB114)

Das Wachstum der Teststämme P. infestans und S. tritici konnte durch Bafilomycin D stark gehemmt werden (siehe Tabelle 36). Gegenüber S. lentus zeigte Bafilomycin D nur eine geringe Aktivität.

Tabelle 36: Antimikrobielle Aktivitäten der isolierten Substanzen aus Stamm LB114 angegeben als % Inhibition. Abkürzungen der Mikroorganismen und Me- thoden siehe Kapitel 2.15.1: S.l.: Staphylococcus lentus, B.s.: Bacillus subtilis subsp. spizizenii, C.g.: Candida glabrata, X.c.: Xanthomonas campestris, T.r.: Trichophyton rubrum, T.m.: Trichophyton mentagrophytes, P.i.: Phytophthora infestans, S.tr.: Septoria tritici, M.c.: Microsporum canis, P.a.: Propionibacterium acnes.

Teststamm

Substanz S.l. B.s. C.g. X.c. T.r. T.m. M.c. Ph.i. S.tr. P.a.

Bafilomycin D 44 0 0 0 0 0 0 91 100 30

Aktivitäten ≥ 80 % Inhibition sind Fett hervorgehoben.

Bafilomycin D zeigte eine starke zytotoxische Aktivität gegen die humane Leberkrebszellline HepG2, allerdings trat ebenfalls eine starke zytotoxische Aktivität gegen die murine Fibroblastenzelllinie NIH 3T3 auf (siehe Tabelle 37). In den Enzymassays konnte keine Aktivität von Bafilomycin D nachgewiesen werden (siehe Tabelle 37).

109

ERGEBNISSE

Tabelle 37: Zelllinien- und Enzymtests der isolierten Substanzen aus LB114 angegeben als % Inhibition, sowie die getesteten Konzentrationen. Abkürzungen der Assays: NIH 3T3: NIH 3T3-Zellen, HepG2: HepG2-Zellen, AChE: Acetylcholi- nesterase, PDE4: Phosphodiesterase 4, GSK: Glykogensynthase-Kinase-3β.

Zellkulturassay Enzymassay

Substanz NIH 3T3† HepG2† AChE* PDE4* GSK*

Bafilomycin D 94 99 0 0 29

*: Konzentration der Substanz im Assay 10 µM, †: Konzentration der Substanz im Assay 50 µM, Aktivitäten ≥ 80 % Inhibition sind Fett hervorgehoben.

110

DISKUSSION

4 Diskussion

Im folgenden Kapitel werden die Ergebnisse dieser Arbeit unter folgenden Gesichtspunkten diskutiert: - Kann die Produktion neuer Sekundärmetabolite durch Veränderun- gen der Kultivierungsbedingungen des Stammes Kiloniella laminariae LD81T stimuliert werden? - Welchen Einfluss haben Pseudomonas-Stämme auf S. latissima? Diskutiert wird die ökologische Rolle der Sekundärmetabolite und die Stoffwechselphysiologie des Pseudomonas-Stammes LD120. - Welches Potential besitzen die ausgewählten Bakterien-Stämme im Hinblick auf die Produktion biologisch aktiver Sekundärmetabolite? Läßt sich das Sekundärmetabolitprofil durch Veränderungen der Kul- tivierungsbedingungen beeinflussen? - Welche Informationen gibt es zur bakteriellen Gemeinschaft von S. latissima? - Methoden zur Isolierung von Pseudomonaden Das Ende dieses Kapitels bildet eine abschließende Diskussion mit Aus- blick.

4.1 Stimulationsexperimente

In der Regel sind nur wenige der Biosynthesecluster eines Bakteriums od- der Pilzes zur gleichen Zeit aktiv. Von Genomanalysen einzelner Wirkstoff- produzenten wissen wir, dass diese Organismen weit mehr Gene aufweisen, die für Enzyme des Sekundärstoffwechsels codieren, als bislang angenommen wurde (Bode & Müller 2005). Um das Potential der Mikroorga- nismen zur Produktion von Sekundärmetaboliten auszunutzen wird auch versucht, die Expression stiller oder kryptischer Biosynthesegencluster zu induzieren. Vermutlich werden diese Biosynthesegencluster in der natürli- chen Umgebung nur unter bestimmten Bedingungen exprimiert und ent- sprechend reguliert (Pettit 2009), da Mikroorganismen in der Natur nicht allein vorkommen, sondern Teil winziger Ökosysteme sind (Knight et al.

111

DISKUSSION

2003). Um diese Gene auch unter Laborbedingungen anschalten zu kön- nen, werden jedoch oft spezifische Induktoren benötigt (Knight et al. 2003), wie z.B. Signalmoleküle oder Stressfaktoren (Imhoff et al. 2011). Es wurde gezeigt, dass die Zugabe von Anthranilsäure das Sekundärme- tabolit-Spektrum eines marinen Halomonas Stammes verändern konnte, so dass die Produktion von neuen Metaboliten (Aminophenoxazinone) nachgewiesen wurde (Bitzer et al. 2006). Auch die Zugabe von zellfreien Kulturüberständen kann die Produktion antimikrobieller Substanzen steigern (Burgess et al. 1999). Ein weiterer Ansatz, die Wirkstoffsynthese zu induzieren oder zu stimulieren ist der Versuch, das natürliche Habitat der Mikroorganismen nachzu- ahmen und die Kultivierungsbedingungen zu verändern. Dies kann auch die Kultivierung mit Umgebungswasser oder den Zusatz verschiedener Ex- trakte, wie z.B. von Schwämmen (Abdelmohsen et al. 2010) oder Algen (Goecke et al. 2010, Okazaki et al. 1975) oder die Zugabe von Nährstof- fen aus der marinen Umwelt, wie Chitin oder Alginat (Rigali et al. 2008). Für Kiloniella laminariae LD81T wurden Putrescin, Homoserinlacton und cAMP als mögliche Induktoren ausgewählt. In Bakterien ist cAMP als Signalsubstanz bekannt (Camilli und Bassler 2006). Besonders gut untersucht ist die Rolle von cAMP, welches über das Enzym Adenylatcyclase synthetisiert wird, im Zusammenhang mit der Kohlenstoff-Katabolit-Repression in Escherichia coli (Kolb et al. 1993). Darüber hinaus ist cAMP an der Kontrolle vieler regulatorischer und metabolischer Prozesse in Prokaryoten und Eukaryoten beteiligt (Lory et al. 2004). Die Zugabe von cAMP konnte die Produktion neuer Substanzen zwar nicht induzieren, aber es konnte nachgeweisen werden, dass die Produktion von Peak 1 (siehe Tabelle 12) unter Zugabe von cAMP deutlich höher ausfällt (siehe Abbildung 19 E, F), als bei den Ansätzen, die Putrescin oder Homoserinlacton enthielten (siehe Abbildung 19 A-D). Auch bei Streptomyces fradiae könnte die Zugabe von cAMP in ein nährstoffar- mes Medium für die erhöhte Produktion des Antibiotikums Tylosin verantwortlich sein (Tata & Menawat 1994).

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DISKUSSION

Acylierte Homoserinlactone (AHL) gehören zu den Signalmolekülen, welche meist in Gram-negativen Bakterien vorkommen (Fuqua et al. 2001, Waters & Bassler 2005). Dadurch, dass sich die AHLs sowohl in der Länge und der Sättigung der N-Acyl-Seitenkette als auch durch eventuelle Sub- stitutionen am C3-Atom (3-Oxo oder 3-Hydroxygruppe) unterscheiden, besitzen diese eine große strukturelle Vielfalt (Chhabra et al. 1993, Geisenberger 2000). Dass eine Kommunikation zwischen Bakterien statt- findet, wurde zu erst bei Vibrio fischeri entdeckt (Nealson et al. 1970). Für diese Art der Kommunikation wurde später der Begriff Quorum sensing eingeführt (Fuqua et al. 1994). Der Begriff Quorum sensing beschreibt die Fähigkeit von Bakterien, mittels chemischer Signalmoleküle die Zelldichte der Population messen zu können und so in Abhängigkeit von der Zelldich- te bestimmte Gene zu aktivieren (Miller & Bassler 2001). Sowohl Gram- negative als auch Gram-positive Bakterien nutzten Quorum sensing zur Regulation verschiedener physiologischer Prozesse wie z.B. Virulenz, Sporulation, Beweglichkeit, Biofilmbildung und auch Antibiotikaproduktion (Eberl 1999). Die externe Zugabe von N-acyl-L-Homoserinlacton konnte unter den in dieser Arbeit angewandten Bedingungen keine Veränderung des Sekundärmetabolitprofils bewirken. Ursächlich hierfür könnte das Feh- len einer Seitenkette des Homoserinlactons sein. Je nach Bakterien-Art werden AHLs mit unterschiedlichen Seitenketten synthetisiert (Fuqua et al. 2001). Diese strukturellen Unterschiede können verschiedene Wirkun- gen auf die jeweiligen regulatorischen Proteine in Bakterien bewirken (Winson et al. 1998). So berichteten Chhabra et al. (1993), dass Homo- serinlacton (ohne Acyl-Seitenkette) die Biosynthese von Carbapenem in E. carotovora nicht induzieren konnte. Durch weitere Homoserinlacton- Derivate könnte aber die Produktion weiterer Metabolite möglicherweise stimmuliert werden. Die dritte Substanz, die zur Stimmulation weiterer Sekundärmetabolite führen sollte, war das zu den Polyaminen gehörende Putrescin. Putrescin zählt neben Jasmonsäure, Salicylsäure und weiteren Substanzen zu den Phytohormonen (Ottow 2011b), die von Pflanzenwurzeln in die Umgebung

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DISKUSSION abgegeben werden (Lugtenberg & Kamilova 2009) und auch als Osmolyt in Algen bekannt ist (Kalhoefer et al. 2011). In dieser Arbeit konnte die Produktion sechs neuer Metabolite durch die Zugabe von Putrescin zum Kulturmedium (Endkonzentration: 10 µM bzw. 20 nM) bei Kiloniella laminariae LD81T stimuliert werden.

4.2 Ökologische Bedeutung von Pseudomonas sp. LD120

Für terrestrische Pseudomonaden und Landpflanzen wird seit Jahren über eine mögliche mutualistische Assoziation berichtet (Weller 2007, Bakker et al. 2007). In den nächsten zwei Abschnitten wird dieses Phänomen auch für die Alge S. latissima und das marine Isolat Pseudomonas sp. LD120 diskutiert. In die Diskussion sind die Daten zur Stoffwechselphysiologie und der Sekundärmetabolite (DAPG, MAPG, PLT und den Rhizoxinen) des Pseudomonas-Stammes mit eingebunden.

4.2.1 Einfluss der Stoffwechselphysiologie auf S. latissima

Die Analyse von Stamm LD120 bezüglich der Fähigkeit, bestimmte Koh- lenstoffquellen bzw. mögliche Algenbestandteile abzubauen ergab, dass Wachstum weder auf Minimalmedien stattfand, denen pulverisiertes und gefriergetrocknetes Algenmaterial zugesetzt wurde, noch auf Minimal- medien, die Alginat, ein Polysaccharid von S. latissima dessen Trockenan- teil ca. 30-36 % beträgt (Obluchinskaya 2008), enthielten. Auch der Speicherstoff Mannitol, der von S. latissima akkumuliert wird und dessen Anteil am Trockengewicht bis zu 15 % betragen kann (Obluchinskaya 2008), wurde von Pseudomonas sp. LD120 nicht als Sub- strat für das Wachstum genutzt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass intakte Zellwände der Alge nicht von diesem Bakterium angegriffen werden. Daher stehen auch Assimilationsprodukte der Alge, wie Succinat oder Glutamat (Kremer & Markham 1979), dem Bakterium nicht auf Grund bakteriellen Abbaus durch Pseudomonas sp. LD120 zur Verfügung. Folg- lich scheint Pseudomonas sp. LD120 keine schädliche Wirkung auf die ge- sunde Alge zu haben.

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DISKUSSION

Man weiß allerdings, dass Makroalgen große Mengen von Aminosäuren, Zuckern und organischem Kohlenstoff in die Umgebung abgeben und somit Mikroorganismen mit Nährstoffen versorgen (Goecke et al. 2010). Diese Bestandteile werden natürlich auch auf Grund von mechanischen oder bakteriellen Zersetzungsprozessen der Algen freigesetzt (Cole 1982) und können Pseudomonas sp. LD120 somit als Substrat zur Verfügung stehen. Diese Theorie wird von den Ergebnissen der BIOLOG-Analyse un- terstützt, aus der hervorgeht, dass Pseudomonas sp. LD120 eine Reihe an organischen Säuren (z.B. Bestandteile des Citratzyklus), Zucker und Ami- nosäuren verwerten kann. Diese Substanzen gehören auch zu den Wur- zelexudaten, die von Landpflanzen sekretiert werden (Lugtenberg & Bloemberg 2004). Die Zusammensetzung und Menge der Wurzelexudate könnte die unterschiedliche mikrobielle Gemeinschaft verschiedener Pflan- zen bedingen (Haas & Défago 2005). Die verschiedenen Bestandteile der Wurzelexudate wirken als chemische Lockstoffe und üben einen unterschiedlichen Einfluss auf die Chemotaxis der Bakterien aus (Lugtenberg & Kamilova 2009). Möglicherweise hat S. latissima ebenfalls einen Einfuss auf die Chemotaxis von Pseudomonas sp. LD120. Braunalgen akkumulie- ren eine Vielzahl von Polyphenolen mit unterschiedlichem Molekularge- wicht und Phloroglucinol als Grundbaustein (Pal Singh & Bharate 2006). Diese Substanzen können bis zu 25 % des Trockengewichtes ausmachen und kommen in löslicher Form in Zellkompartimenten vor (Amsler & Fairhead 2005), in unlöslicher Form vernetzt mit der Zellwand (Koivikko et al. 2005). Polyphenole können auch sekretiert werden (Shibata et al. 2006). Zu den verschiedenen Polyphenolen gehören beispielsweise die Phlorotannine. Auf Grund ihrer antioxidativen Wirkung wird vermutet, dass die Phlorotannine Sporen und Gametophyten von Braunalgen vor UV- Schäden schützen (Steinhoff 2010). Besonders erwähnenswert ist, das ähnlich wie bei dem bakteriellen Enzym Phloroglucinolsynthase (PhlD) (Achkar et al. 2005, Zha et al. 2006) auch in der Synthese des Phlorotan- nin Grundbausteins Phloroglucinol eine Polyketidsynthase vom Typ III in-

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DISKUSSION volviert ist und Malonyl-CoA als Starter-Substrat dient (Meslet-Cladière et al. 2013).

4.2.2 Einfluss bakterieller Sekundärmetabolite auf S. latissima

Um die biologische Aktivität der isolierten Naturstoffe zu ermitteln, wurde eine umfangreiche Auswahl an Teststämmen verwendet. Die Auswahl an Mikroorganismen beinhaltete zum einen Bakterien, die auf Makroalgen aus der Ostsee vorkommen (Wiese et al. 2009b), sowie algen- und pflanzenpathogene Mikroorganismen und zum anderen medizinisch relevante Stämme. Die umfassende Auswahl an Mikroorganismen sollte Hinweise für eine mögliche ökologische Funktion der Substanzen und außerdem für eventuelle biotechnologische Anwendungen geben. Die isolierten Substan- zen von dem Pseudomonas-Isolat LD120 wiesen diverse antimikrobielle Aktivitäten gegen verschiedene Testorganismen auf (siehe Tabelle 32). Von den Metaboliten DAPG, MAPG, PLT und den Rhizoxinen, die von Pseu- domonas-Stämmen produziert wurden, die mit der Braunalge S. latissima assoziiert sind, wurde bereits gezeigt, dass diese Substanzen auch von Pseudomonas-Stämmen terrestrischer Pflanzen produziert werden (Brodhagen et al. 2004, Weller 2007, Loper et al. 2008). Wurzelbesiedelnde, „plant-beneficial“ Pseudomonaden sekretieren eine Vielzahl unterschiedlicher antimikrobieller Metabolite, wie die Polyketide DAPG und PLT (Brodhagen et al. 2004, Dubuis et al. 2007). Die von den mit S. latissima assoziierten Pseudomonas-Stämmen produzierten Meta- bolite DAPG, MAPG, PLT und Rhizoxine, könnten ebenso chemische Media- toren der antimikrobiellen, antimykotischen, cytotoxischen und anti- protozischen Effekte sein, die dem Schutz der Alge dienen, wie es bereits für Assoziationen terrestrischer Pseudomonaden mit ihren Wirtspflanzen gezeigt wurde (Iwasaki et al. 1984, Kiyoto et al. 1986, de Souza et al. 2003, Isnansetyo et al. 2003, Jousset et al. 2006). Die Metabolite DAPG und PLT, die von den in dieser Arbeit untersuchten Pseudomonas-Stämmen produziert werden, konnten beide das Wachstum der algenpathogenen Bakterien Algicola bacteriolytica und Pseudoaltero-

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DISKUSSION monas elyakovii hemmen. Dass Epibionten in der marinen Umwelt einen Schutzmechanismus durch Ausscheiden chemischer Stoffe in das umge- bende Meerwasser darstellen und somit gegen andere Mikroorganismen, möglicherweise sowohl gegen Konkurrenten, als auch gegen Krankheitser- reger wirken, wurde bereits von Armstrong et al. (2001) berichtet. Andere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die von epiphytischen Bakterien produzierten Substanzen die Fitness ihres Algenwirtes steigern (Rao et al. 2007). Die Metabolite DAPG, MAPG, PLT und Rhizoxine könnten gegen Konkurrenten und abbauende oder andere schädliche Mikroorga- nismen, wie bakterielle und pilzliche Krankheitserreger von S. latissima wirken. Die Rhizoxine gehören zu den stark antibiotisch und antimitotisch wirksamen Substanzen und sind bekannte Verbindungen des Pilz- assoziierten Bakteriums Burkholderia rhizoxinica und auch von Pseudomo- nas protegens Pf-5 (Partida-Martinez & Hertweck 2005, Scherlach et al. 2006, Loper et al. 2008). Von Rhizoxinen und deren Derivaten wurde berichtet, dass sie erheblich das Wachstum des pflanzenpathogenen Pilzes Fusarium oxysporum hemmen. Allerdings ist Rhizoxin S2 auch die Ursache für „rice seedling blight”, daher könnte die ökologische Rolle der Rhizoxine kontext- bzw. konzentrationsabhängig sein (Brendel et al. 2007). Aus der antimikrobiellen Testung, die in dieser Arbeit verwendet wurde, geht hervor, dass DAPG, MAPG und PLT ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivität aufweisen. Besonders erwähnenswert ist, dass es eine starke Bioaktivität, sowohl gegen pflanzenpathogene Bakterien und Pilze, als auch gegen spezifisch algenpathogene Bakterien gab. Insbesondere PLT war sehr wirksam gegen die beiden algenpathogenen Algicola bacteriolytica und Pseudoalteromonas elyakovii. A. bacteriolytica ist ein marines Bak- terium, welches als ursächlich für die „red spot disease“ von Saccharina japonica (synonym Laminaria japonica) gilt (Sawabe et al. 1998) und zum Ablösen der Sporophyten von deren Haftuntergrund führen kann (Yumoto et al. 1989). P. elyakovii, ein Alginat abbauendes Bakterium, wurde von „spot wounded“ Thalli von S. japonica isoliert (Sawabe et al. 2000). Beide Bakterien stehen im Verdacht, diverse Schäden an Saccharina-Kulturen zu

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DISKUSSION verursachen (Sawabe et al. 2000). Dazu gehört z.B. der vollständige Thal- lus-Abbau von Kombu (Sawabe et al. 1992). Daher wäre ein Zusammen- wirken der drei Metabolite (DAPG, MAPG und PLT), als Schutzmaßname gegen diese pathogenen Mikroorganismen, förderlich. Die inhibitorischen Wirksamkeiten gegen andere epiphytische Bakterien, sind von großer Bedeutung in den Mikrohabitaten auf Algenoberflächen, wo häufig eine starke Konkurrenz um einen Platz zum Besiedeln herrscht (Wahl et al. 2012). Der Wettbewerb um Lebensraum zwischen den epibio- tischen Bakterien könnte, basierend auf der Produktion bioaktiver Sub- stanzen, dem Basibionten (Wahl 1989), in diesem Fall der Alge, einen An- tifoulingschutz verschaffen. Anhand der biologischen Aktivität der von den Pseudomonas-Stämmen produzierten Metabolite MAPG, DAPG und PLT, sowie der physiologischen Eigenschaften von Stamm LD120, läßt sich für die Alge S. latissima ein eher vorteilhafter Einfluss dieser assoziierten Pseudomonas-Stämme vermuten. Es ist zu bedenken, dass die meisten Studien nicht mit den in situ- Konzentrationen durchgeführt wurden, da es sich entweder um pharmoko- logisch motivierte Studien handelte (Wahl et al. 2012), oder weil die Anti- biotika-Konzentrationen in der natürlichen Umwelt, d.h. im Erdreich und in den Meeren größtenteils immer noch unbekannt ist (Davies 2006, Aminov 2009). Daher ist das Extrapolieren der in vitro-Ergebnisse auf die in vivo- Funktion problematisch (Clare 1996). Die im Labor ermittelten biologischen Aktivitäten können zwar Aufschlüsse liefern, müssen aber nicht zwangsläufig auch die Wirkung in der Natur widerspiegeln (Davies & Ryan 2012). In Labortests zeigen mikrobielle Metabolite verschiedene Wirkungen. Seit dargelegt wurde, dass subinhibitorische Antibiotika-Konzentrationen subti- lere Reaktionen wie z.B. die Beweglichkeit von Bakterien steigern und die Bildung eines Biofilms hervorrufen können, stellt sich die Frage, ob ihre ökologische Bedeutung darin liegt, nicht als „Waffe‟ sondern eher als Sig- nalsubstanz zu dienen (Linares et al. 2006). Dieser Aspekt sollte auch bei der Interpretation der biologischen Bedeutung der Antibiotika-Produktion,

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DISKUSSION von für Pflanzen nützlichen oder schädlichen Bakterien, berücksichtigt werden (Raaijmakers and Mazzola 2012). Da bioaktive Metabolite diese Vielzahl konzentrationsabhängiger biologischer Funktionen besitzen, könn- te es entscheidend sein, die natürlich vorkommende Konzentration zu kennen, um somit auch die biologische Wirkung zu verstehen (Davies & Ryan 2012). Aufschlußreich wäre ebenso die Kenntnis über das Wechsel- spiel verschiedener Substanzen an einem Standort, d.h. können Wirkun- gen sich aufheben bzw. verstärkt werden.

4.3 Potential bakterieller Naturstoffproduzenten

Es wurde bereits wiederholt gezeigt, dass oberflächenassoziierte Bakterien an der Produktion antimikrobieller Substanzen in größerem Maße beteiligt sind, als planktonisch lebende (Burgess et al., 1999, Lemos et al., 1985, Long & Azam, 2001). Diese Einschätzung wird auf den Konkurrenzkampf um Lebensraum und Nährstoffe zwischen den besiedelnden Bakterien zu- rückgeführt, der wiederum zur Evolution verschiedener effektiver Strate- gien zur Besiedlung von Oberflächen geführt hat (Burgess et al. 1999). Im Folgenden wird das Potential zur Naturstoffproduktion der untersuchten Algen-assoziierten Bakterien erörtert.

4.3.1 Bacillus sp. (Stamm LB084)

Innerhalb der Firmicutes-Gruppe produzieren Stämme der Gattung Bacil- lus die größte Anzahl an Naturstoffen in der marinen Umwelt (Månsson 2011). Viele Bacillus-Arten die aus marinen Proben isoliert wurden, hat man bereits in der terrestrischen Umwelt gefunden (Gontang et al. 2007). Unter den vielen Bacillus-Arten wurden bisher nur Vertreter von B. badius B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis, B. firmus, B. pumilus, B. mycoides, und B. lentus aus marinen Proben entdeckt (Ivanova et al. 1999). Marine Bacillus-Arten produzieren strukturell vielfältige Sekundärmetaboli- te wie Lipopeptide, Polypetide, Macrolactone, Polyketide und Isocoumarine die verschiedene biologische Aktivitäten aufweisen (Mondol et al. 2013). Das Potential zur Produktion verschiedener Naturstoffe wurde in dieser

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DISKUSSION

Arbeit für Stamm LB084 untersucht, der auch eine bislang unbekannte Substanz produziert.

4.3.2 Kiloniella laminariae (Stamm LD81T)

Stamm LD81 ist ein Alphaproteobakterium und wurde erstmalig aus der Braunalge S. latissima isoliert (Wiese et al. 2009a). Durch die geringe Ähnlichkeit seiner 16S rRNA Gensequenz zu bisher bekannten Bakterien wurde es nicht nur einer neuen Gattung Kiloniella zugeordnet, sondern auch eine neue Familie und Ordnung innerhalb der Alphaproteobakterien definiert (Wiese et al. 2009a). Das Screening neuer Arten ist zwar keine Garantie für das Auffinden neuer Substanzen (Fischbach & Walsh 2009), aber die Aussicht auf Erfolg besteht. Daher wurden viele Anstrengungen unternommen, bisher unkulti- verte Bakterien in Kultur zu bekommen (Clardy et al. 2006). Unter den in dieser Arbeit verwendeten Kultivierungsbedingungen produzierte Stamm LD81 nur wenige Substanzen (Peak 2-7 siehe Tabelle 12) und bis auf Peak 1 (siehe Tabelle 11 & 12), in meist geringer Konzentrati- on (siehe Abbildung 18 & 19). Die Entdeckung neuer Wirkstoffe wird oft dadurch erschwert, dass Extrak- te strukturell ähnliche Substanzen und Substanzen in geringer Konzentra- tion enthalten (Li & Vederas 2009). Die Untersuchungen in Kapitel 3.6.3 zeigen, dass Stamm LD81 noch weitere Metabolite produzieren kann. Um die von Stamm LD81 produzierten Naturstoffe zu analysieren und zu cha- raktereisieren, muss ein größeres Kulturvolumen (ca. 100 L) dieses Stammes extrahiert werden, damit genügend Substanzmenge zur weiteren Aufarbeitung zur Verfügung stünde.

4.3.3 Pseudoalteromonas sp. (Stamm LB034)

Die Gattung Pseudoalteromonas hat im letzten Jahrzent zunehmend an Bedeutung in der Naturstoffforschung und in der mikrobiellen Ökologie gewonnen (Bowman 2007). Die Gattung läßt sich in zwei Gruppen eintei- len, die pigmentierten Arten und die nichtpigmentierten (Vynne et al.

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DISKUSSION

2011). Bei pigmentierten Arten, zu denen auch Stamm LB034 mit seiner grünlichen Färbung gehört, wurden bereits eine große Anzahl an hoch- und niedermolekularen Verbindungen mit antimikrobieller Aktivität nachgewiesen (Bowman 2007). Pseudoalteromonas tunicata CIP 105928T ist der nächste verwandte Typstamm zu Pseudoalteromonas sp. LB034. P. tunicata ist ein marines Bakterium, welches von verschiedenen Orten isoliert wurde, einschließlich der Oberfläche von Manteltieren (Holmström et al. 1998) und Algen (Egan et al. 2000). P. tunicata produziert eine Reihe an Metaboliten, die antimikrobiell gegen Bakterien (James et al. 1996) und Pilze (Egan et al. 2002) wirksam sind sowie Aktivitäten gegen Algensporen (Egan et al. 2001) und Larven von marinen Wirbellosen (Holmström et al. 1992) aufweisen. Die antifungale Wirksamkeit wurde auf die Produktion eines gelben Pigmentes zurückge- führt (Egan et al. 2002), welches zur Klasse der Tambjamin-Alkaloide ge- hört (Franks et al. 2005). Tambjamin-Alkaloide wurden aus marinen Wir- bellosen wie Seescheiden, Nacktkiemerschnecken und Bryozoen isoliert (Lindquist and Fenical 1991, Blackman & Li 1994). P. tunicata war die erste marine bakterielle Quelle für ein Tambjamin-Alkaloid (Burke et al. 2007). Es wird vermutet, dass die Anwesenheit von Pseudoalteromonas im Ge- webe oder auf der Oberfläche höherer Organismen zur Bildung von Tamb- jamin-Alkaloiden geführt hat (Franks et al. 2005). Bisher ist die Tamjamin Produktion nur von einem weiteren Bakterium bekannt (Burke et al. 2007) und zwar von dem terrestrischen Streptomyces Stamm BE18591 (Kojiri et al. 1993). In dieser Arbeit konnte die Produktion eines Tambjamin- Alkaloids durch Pseudoalteromonas sp. LB034 gezeigt werden. Stamm LB034 produziert noch weitere Substanzen (siehe Abbildung 20), die auf Grund der geringen Konzentration in dieser Arbeit nicht derepliziert oder isoliert werden konnten. Auch von diesem Stamm sollte ein größeres Kulturvolumen extrahiert werden, um genügend Substanzmenge zur Cha- rakterisierung weiterer Substanzen zu erhalten.

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DISKUSSION

4.3.4 Actinomyceten

Actinomyceten (Vertreter der Ordnung Actinomycetales) wurden schon in den 60er Jahren aus marinen Proben isoliert (Weyland 1969). Diese weit verbreiteten Bodenbakterien galten früher als terrestrische Kontaminanten die als Sporen vom Land ins Meer gelangten (Jensen & Fenical 1994). Die Verbesserung der Probenahme- und Kultivierungsmethoden (Bull et al. 2000, Bull & Stach 2007) hat allerdings deutlich gemacht, dass eine Viel- zahl von Actinomyceten in Meeressedimenten (Maldonado et al. 2005) und marinen Makroorganismen (Montalvo et al. 2005) existieren (Lam 2006). Im Vergleich zu den vielen verschiedenen terrestrischen Vertretern ist momentan relativ wenig über die Diversität von Actinobacteria in der marinen Umwelt bekannt (Menezes et al. 2010). Trotzdem ist bereits klar, dass Vertreter der Actinobacteria aus dem Meer eine vielfältige Diversität (strukturell und biosynthetisch) von Naturstoffen bildet (Jensen & Fenical 1994, Bull & Stach 2007). So haben beispielsweise Ohlendorf et al. 2012 mit dem Geranylphenazindiol einen von Phenazinen abgeleiteten neuen Naturstoff entdeckt. Die meisten antimikrobiellen Substanzen wurden bislang von Vertretern der Gattung Streptomyces produziert (Watve et al. 2001, Bérdy 2012). Sogar von dieser als gut untersucht geltenden Gattung wurden neue marine Arten entdeckt (Fenical und Jensen 2006, Antony-Babu et al. 2008). Obwohl nur 1-3 % der von Streptomyceten produzierten Antibiotika entdeckt wurden, bedarf es zukünftig einer Kombination aus High- Throughput-Screening mit moderner Technologie (108-109 Stämme pro Jahr), einer Vorselektion seltener und langsam wachsender Actinomyce- ten, sowie einer umfangreichen mikrobiellen Sammlung und Bemühungen diese zu kultivieren, um die verbleibenden 97-99 % zu finden (Clardy et al. 2006). Das Auffinden neuer Antibiotika wird außerdem dadurch erschwert, dass gewöhnliche Antibiotika wie z.B. Streptomycin in ca. 1 % der im Boden lebenden Actinomyceten vorkommen und deren Aktivität in Screenings die der neuen antimikrobiellen Substanzen verschleiert (Li & Vederas 2009).

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Die in dieser Arbeit untersuchten Actinomyceten (LB058, LB114, LB129 und LB152) besitzen wahrscheinlich das Potential zur Produktion neuer Naturstoffe bzw. neuer Derivate. In den Extrakten konnten Substanzen detektiert werden, die teils bereits bekannten Verbindungen zugeordnet werden konnten, teils aber bisher nicht derepliziert werden konnten. Mit hoher Wahrscheinlichkeit ist eine der Substanzen aus Stamm LB058 zu der auch 1H-NMR Spektren analysiert wurden, eine neue Verbindung (Peak 14, siehe Abbildung 21 und Tabelle 14). Erfolgreich war die Suche nach neuen bioaktiven Substanzen bei dem Isolat LB173. Der im Jahr 2010 isolierte Streptomyces-Stamm LB173 produziert die Substanz Ge- ranylphenazindiol, welche das Enzym Acetylcholinesterase hemmt.

4.3.5 Pseudomonaden

Pseudomonaden gelten als gute Naturstoffproduzenten (Bérdy 2005). Sie verfügen über enorm viele Stoffwechselmöglichkeiten und eine vielfältige Biochemie, was sich in der Produktion strukturell unterschiedlicher bioaktiver chemischer Strukturen widerspiegelt (Gross & Loper 2009). Dies wird auch deutlich durch die ca. 900 Substanzen, die im Dictionary of Natural Products (Buckingham 2011) als von Pseudomonaden produziert ver- zeichnet sind. Das große Interesse an Pseudomonaden ist auf die Produk- tion einer Vielzahl von verschiedenen Metaboliten, inklusive Enzymen, flüchtigen Substanzen, Bakteriocinen, Toxinen, Antibiotika und zyklischen Lipopeptiden zurückzuführen (Haas & Défago 2005, Raaijmakers et al. 2002).

4.3.5.1 Pseudomonas-Stamm LB012

Zu den erfolgreich dereplizierten Substanzen aus Stamm LB012 gehören die Massetolide (zyklische Lipopetide), welche mittels einer nichtribosoma- len Peptidsynthetase(NRPS) synthetisiert werden (de Bruijn et al. 2008). Die Massetolide A-H wurden bereits zuvor von zwei verschiedenen marinen Pseudomonas-Stämmen isoliert. Isolat MK90E85 wurde von einer Ro- talge und Isolat MK91CC8 von einem Röhrenwurm isoliert (Gerard 1997).

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DISKUSSION

Auch Viscosin wurde zusammen mit den Massetoliden E, F, G und H von Isolat MK91CC8 isoliert (Gerard et al. 1997). Massetolide sind Tenside, die biologische Aktivität gegenüber Mykobakterien und Pilzen zeigen, sowie eine schädliche Wirkung auf Zoosporen und diverse pflanzenpathogene Oomyceten haben (Tran et al. 2007). Die in dieser Arbeit von einem Pseudomonas-Stamm isolierte Substanz Holomycin dagegen wurde erstmalig aus einem Streptomyces-Stamm isoliert (Ettlinger et al. 1959). Die Produktion von Holomycin ist auch von weiteren Streptomyceten, wie z.B. Streptomyces clavuligerus bekannt (de la Fuente et al. 2002). In diesem Stamm wurde auch das Biosynthese- Gencluster identifiziert (Li & Walsh 2010). Aber auch in anderen Bakte- rien, wie z.B. Photobacterium halotolerans (Wietz et al. 2010) und Yersinia ruckeri (Qin et al. 2013) konnte Holomycin nachgewiesen werden. Die Produktion von Holomycin ist auch ein Beispiel dafür, dass Sekundär- metabolite von Mikroorganismen über die Art- und Gattungsgrenzen hin- weg gebildet werden können, wie es z.B. auch für die Cephalosporine nachgewiesen wurde, welche sogar von verschiedenen Phyla (Actinomyce- ten, Gammaproteobakterien und Pilzen) produziert wurden (Liras & Martín 2006). Aus der Literatur ist bekannt, dass Holomycin auch antibakterielle Aktivi- tät gegen pathogene Stämme wie L. monocytogenes, S. marcescens, S. enteritidis, B. cereus, Y. enterolitica, Y. ruckeri, V. harveyi, V. vulnificus und V. parahaemolyticus, sowie gegen mehrere marine Stämme der Ro- seobacter- und Pseudoalteromonas-Gruppe zeigte (Wietz et al. 2010). Der exakte Wirkmechanismus, der der antibakteriellen Aktivität zu Grunde liegt, konnte in vitro bisher noch nicht nachgewiesen werden, aber es wird vermutet, dass es sich um die Inhibition der bakteriellen RNA-Polymerase handelt (Qin et al. 2013). Neben dem bekannten Holomycin konnten im Extrakt von Stamm LB012 Substanzen (Peak 3-8, siehe Abbildung 29 A und Tabelle 19) detektiert werden, die mit den vorhandenen Daten nicht derepliziert werden konnten. Allerdings wurden diese Substanzen (Peak 4-8) in einem darauffol-

124

DISKUSSION genden Großansatz (siehe Abbildung 30) nicht gebildet, so dass weitere Untersuchungen nötig sind, um die Bedingungen für die Produktion zu ermitteln. Unter Umständen waren die Substanzen im Großansatz zum Zeit- punkt der Extraktion bereits wieder abgebaut, da im Extrakt aus einer um ca. 24 Stunden verlängerten Kultivierung diese Substanzen auch nicht nachgewiesen werden konnten. Falls es sich bei diesen Peaks um unbekannte Substanzen handeln sollte, wäre ein Großansatz mit kürzerer Kul- tivierungsdauer nötig, um die Substanzen zu isolieren und mittels NMR- Analyse zu identifizieren.

4.3.5.2 Pseudomonas-Stamm LD120

Stamm LD120 produzierte eine Vielzahl unterschiedlicher Metabolite. Während MAPG und DAPG durch eine Typ III Polyketidsynthase gebildet werden (Achkar et al. 2005, Zha et al. 2006), handelt es sich bei PLT und den Rhizoxinen um eine durch ein hybrides PKS-NRPS-System gebildete Verbindung (Dorrestein et al. 2005, Brendel et al. 2007, Loper et al. 2008). Das 16-gliedrige Makrolid Rhizoxin wurde erstmalig aus dem pflanzenpathogenen Pilz Rhizopus microsporus isoliert und gilt als Auslöser der Reis- fäule (Iwasaki et al. 1984). Partida-Martinez & Hertweck (2005) konnten durch ihre Untersuchungen allerdings zeigen, dass die Rhizoxine durch einen bakteriellen Endosymbionten der Gattung Burkholderia produziert werden. Mit Hilfe eines genomischen Ansatzes inklusive Mutagenese und anschließendem Metabolitnachweis konnte die Produktion von Rhizoxin und dessen Derivaten auch in Pseudomonas protegens Pf-5 nachgewiesen werden (Loper et al. 2008). Rhizoxin zeigt als Tubulinhemmer (Takahashi et al. 1987) eine starke anti- tumorale Aktivität (Kiyoto et al. 1986). Rhizoxin wurde bis zur Phase II klinisch untersucht, zeigte dort jedoch keine therapierelevante Wirkung (McLeod et al. 1996, Hanauske et al. 1996). Für Rhizoxine wurden diverse Totalsynthesen entwickelt (Neuhaus et al. 2013).

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Daneben wurden zwei Substanzen, Peak 15 und 17 (siehe Abbildung 32 und Tabelle 21), isoliert, die bisher nicht derepliziert werden konnten. Während beide Substanzen eine antimikrobielle Aktivität zeigten, konnte für Peak 17 zusätzlich die Hemmung des Enzyms Acetylcholinesterase nachgewiesen werden. Möglicherweise handelt sich hier um neue Sub- stanzen eines algenassoziierten Pseudomonas-Bakteriums, die Anwendung in der biotechnologischen Nutzung finden könnten.

4.4 Untersuchungen zur Veränderung des Metabolitprofils

Sich ändernde Wachstumsbedingungen haben gleichermaßen Einfluss auf den Stoffwechsel und daher auch auf die Metabolit-Produktion (Gram et al. 2010). Die optimalen Bedingungen zur Produktion von Sekundärmeta- boliten sind nicht zwangsläufig die gleichen, wie die für das Wachstum und variieren von Mikroorganismus zu Mikroorganismus (Knight et al. 2003). Zur Auffindung neuer Substanzen werden Mikroorganismen häufig nach dem OSMAC- (one strain many compounds) Prinzip kultiviert, um das Spektrum an Metaboliten, die durch einen Mikroorganismus produziert werden, zu erweitern (Bode et al. 2002). Eine weitere Möglichkeit das Me- tabolit-Spektrum (Wietz et al. 2013) und damit auch entsprechende Anta- gonismen (Gram et al. 2010) zu beeinflussen, könnte das Nachahmen der Standortbedingungen sein. In den folgenden Kapiteln werden die Untersuchungen zur Veränderung des Sekundärmetabolitprofils durch Variation der Kultivierungsbedingun- gen des Streptomyces-Stammes LB114 und der Pseudomonas-Stämme LB042, LB061, LD120, sowie das Agarplatten-Screening diskutiert.

4.4.1 Kultivierungsexperimente mit Streptomyces sp. LB114

Die Kultivierung von Stamm LB114 in drei verschiedenen Medien führte zur Produktion von drei unterschiedlichen Metabolitprofilen (siehe Abbil- dung 24 A-C). Während Vorkultur, Kulturgefäß und Kultivierung unter gleichen Bedingungen durchgeführt wurden, bestand in der Medienzu- sammensetzung der einzige Unterschied. Daher wird die jeweilige Produk-

126

DISKUSSION tion der Sekundärmetabolite auf das Vorhandensein von Unterschieden im Nährstoffangebot zurückgeführt (Schimana et al. 2001). Die beste Produktion fand in GYM4-Medium statt. Hier wurden die meisten Substanzen produziert und dass auch in höherer Konzentration als bei den anderen Medien. Im GYM4-Medium befindet sich die höchste Glucose- Konzentration, während das MB- und das TSB-Medium keine bzw. nur eine geringe Menge an Glucose enthalten. Die Inhibition der Antibiotika-Produktion in verschiedenen Bakterien erfolgt je nach Antibiotikum durch unterschiedlich hohe Glucosekonzentrati- onen (Knight et al. 2003). Weiterhin enthält nur GYM4 Malzextrakt, welches vorrangig die Kohlenhydrate Maltose und Maltodextrine enthält und die höchste Konzentration an Hefeextrakt zur Bereitstellung von Peptiden und Aminosäuren. Auch der Salzgehalt der Medien könnte einen Einfluss auf die Metabolitproduktion haben (Singh et al. 2009).

4.4.2 Kultivierungsexperimente mit Pseudomonas sp. (LB042, LB061, LD120)

Auch für die untersuchten Pseudomonas-Stämme konnte nachgewiesen werden, dass die Zusammensetzung des Kulturmediums einen erheblichen Einfluss auf das Sekundärmetabolitprofil hat. Durch die Veränderung der Medienzusammensetzung konnte die Produktion der Substanz 2,4,6- Triacetylphloroglucinol in beiden Pseudomonas-Stämmen (LB042 und LB061) induziert werden. Die Produktion dieser Suabstanz wurde nur in GYM-Medium nachgewiesen. Ob die Änderung des Sekundärmetabolitpro- fils von der NaCl-Konzentration abhängig ist, oder das Verhältnis bzw.die Zusammensetzung der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen ursächlich ist, kann an dieser Stelle nicht geklärt werden. Für Stamm LB042 und LB061 konnte ebenfalls der Einfluss der Kultivie- rungsdauer auf die Metabolitproduktion gezeigt werden. Während bei der Kultivierung in MB-Medium eine Extraktion nach ein bis zwei Tagen geeignet ist, um möglichst viele Substanzen in relativ hoher Konzentration zu

127

DISKUSSION erhalten, sollte die Extraktion der Kultur mit GYM-Medium nach zwei bis drei Tagen erfolgen. Kidarsa et al. (2011) berichteten, dass Phloroglucinol (PG), ein Zwischen- produkt zur Biosynthese von DAPG, in nanomolaren Konzentrationen für die Biosynthese von PLT benötigt wird, aber in höheren Konzentration die PLT-Produktion wieder inhibiert. Die Inhibition der PLT-Produktion wurde zuvor dem DAPG zugeschrieben (Brodhagen et al. 2004). Weiterhin wird vermutet, dass DAPG zu MAPG (Bottiglieri und Keel 2006) und weiter zu PG abgebaut wird und die PG-Produktion durch die Autoinduktion von DAPG (Schnider-Keel et al. 2000) stimuliert wird. Jedoch sind die Mecha- nismen zur Ausscheidung von Phloroglucinol aus der Zelle sowie zur Auf- nahme von DAPG aus der Umgebung nicht bekannt (Kidarsa et al. 2011).

4.4.3 Agarplatten-Screening

Bakterien, inklusive Pseudomonas-Arten wurden herkömmlich in der planktonischen Lebensweise in Flüssigkulturen untersucht. Mittlerweile weiß man jedoch, dass Bakterien aus verschiedenen Ökosystemen in Bio- filmen leben (Tolker-Nielsen & Molin 2004). Bei der Entstehung von Bio- filmen scheint Quorum-sensing oft eine wichtige Rolle zu spielen (de Kievit 2009, Goldstone et al. 2012). Die in dieser Arbeit auf Agarplatten kultivierten Pseudomonas-Stämme zeigten größtenteils ein ähnliches Metabolitspektrum. Einander ähnliche Stämme wurden untersucht, da Stämme derselben Art in vielen Fällen unterschiedliche Substanzen produzieren können (Knight et al. 2003). Eine der von den Pseudomonas-Stämmen produzierte Substanz, der bisher nicht dereplizierte Peak 18 (siehe Tabelle 21, 22, 23, 24, 26, 27 und Abbildung 32, 40 A, 41 A-D, 34 A, 36 A, 37 D, E), wurde in allen Extrak- ten von MB-Agarplatten (siehe Abbildung 42 und Tabelle 29) nachgewiesen, und in den Flüssigkulturen die ebenfalls MB-Medium enthielten. In den Extrakten aus den Kulturen mit TM-Medium, welches als Analogon zum MB-Medium eingesetzt wurde, konnte diese Substanz nicht detektiert werden (siehe Abbildung 36).

128

DISKUSSION

Es gibt einige Beispiele, die zeigen, dass die Oberflächenassoziation vieler mariner Mikroorganismen die Produktion antibakterieller Substanzen er- möglicht (Bruhn et al. 2005, Yan et al. 2003). In Biofilmen erreichen Bak- terien hohe Zelldichten (Matz et al. 2008), so dass es in Abhängigkeit von der Zelldichte zur Bildung von Signalmolekülen und damit auch zur Akti- vierung bestimmter Gene kommen kann (De Kievit et al. 2001, Davies 1998). Ein weiterer Hinweis dafür, dass die Produktion von Peak 18 ab- hängig von der Bildung eines Biofilms sein könnte, liefern die Extrakte aus der Zeitreihe von Stamm LD120 (siehe Abbildung 37). Die Produktion von Peak 18 konnte nach 48 stündiger Kultivierung in Flüssigkultur nachgewiesen werden (siehe Abbildung 37 D). Nach einer 36 stündigen Kultivie- rung konnte die Bildung eines Biofilms an der Wand des Kulturgefäßes beobachtet werden (siehe Abbildung 44 im Anhang). Auch Allison et al. (1998) konnten die Bildung eines Biofilms nach maximal 20 bis 50 Stun- den nach der Inokulation von P. fluorescens nachweisen. In der vorliegen- den Arbeit konnte die Produktion einer neuen Substanz zwar nicht induziert werden, aber die Bildung eines Biofilmes scheint für die Steigerung der Ausbeute von Peak 18 förderlich zu sein.

4.5 S. latissima assoziierte Bakterien

Bisher gibt es nur wenige Studien zu bakteriellen Gemeinschaften, die mit S. latissima assoziiert sind, sowie ihrer ökologischen Bedeutung und ihrer Interaktionen mit der Alge oder anderen Organismen und bezüglich ihres biotechnologischen Potentials (Wiese et al. 2009b). Für Laminaria digitata wurde durch mikroskopische Untersuchungen gezeigt, dass je nach Jahreszeit unterschiedlich viele Bakterien auf der Alge vorkommen, wobei die Anzahl im Winter (106 Bakterien pro cm2) geringer und im Frühjahr (bis zu 6 x 107 Bakterien pro cm2) höher ausfällt (Corre & Prieur 1990). Die jahreszeitlichen Unterschiede wurden auch mittels kulti- vierungsabhängier Methoden ermittelt (Laycock 1974, Mazure & Field 1980). Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass der kultivierbare Anteil der bakteriellen Gemeinschaft variiert, wobei im Winter psychrophile Bak-

129

DISKUSSION terien häufiger vorkommen und im Sommer mesophile Bakterien (Laycock 1974). Die jahreszeitlichen Unterschiede in der bakteriellen Gemeinschaft könnten darin begründet liegen, dass das mikrobielle Wachstum in der Natur abhängig von den jeweiligen Standortparametern, der Vegetation, der Jahreszeit und dem Wetter ist (Davies & Ryan 2012). Mittels molekularbiologischer Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass sich die mit S. latissima assoziierte bakterielle Gemeinschaft je nach Al- genabschnitt (Rhizoid, Cauloid, Meristem und altes Phylloid) deutlich unterscheidet. Die DGGE-Analyse zeigte, dass das Rhizoid im Durchschnitt mit fünf Banden die geringste Diversität und das Phylloid mit ca. 16 Ban- den die größte Diversität aufwiesen. Außerdem wurde nachgewiesen, dass sich das Bandenmuster der DGGE-Analyse der Algenproben von denen der Wasserproben unterscheidet. Dass die bakterielle Gemeinschaft spezifisch mit S. latissima assoziiert ist und sich vom Umgebungswasser unterscheidet, wurde außerdem durch Ergebnisse aus der 16S rRNA-Genbibliothek unterstützt (Staufenberger et al. 2008). Für diese Selektivität könnten artspezifische Eigenschaften der Algenober- flächen und/oder bestimmte Interaktionen zwischen Algen und Bakterien verantwortlich sein (Lachnit et al. 2009). Braune Makroalgen haben sich an ihre marine Umgebung angepasst und Phylum-spezifische Charakteris- tika entwickelt, wie z.B. einen umgebungsspezifischen molekularen Ab- wehrmechanismus, der zu einer aktiven Abwehr gegenüber pathogenen Organismen führt (Cosse et al. 2009). Im Detail weiß man jedoch nur wenig über diese Interaktionen (Sneed & Pohnert 2011), da im Gegensatz zu terrestrischen Pflanzen und Tieren die molekularen Abwehrmechanismen in Seegräsern weitgehend unbekannt sind (Cosse et al. 2007). In dieser Arbeit wurden Vertreter der Gattung Bacillus aus dem Rhizoid und dem Sediment isoliert. Pseudomonaden und Streptomyceten konnten zusätzlich aus dem alten Phylloid isoliert werden. Aus dem terrestrischen Erdreich wird über eine Assoziation zwischen diesen beiden Gattungen berichtet, wobei die Streptomyceten (bekannt für den Abbau komplexer or-

130

DISKUSSION ganischer Stoffe) die Pseudomonaden mit monomeren Kohlenstoffquellen für das Wachstum versorgen (Moore & Tindall 2006). Gestärkt wird das Indiz für eine beständige Assoziation zwischen Pseu- domonaden, Streptomyceten und auch Bacillus-Stämmen mit S. latissima durch die über Jahre wiederholte Isolierung (siehe Tabelle 8). Des Weite- ren ist die Ähnlichkeit der 16S rRNA-Gensequenzen der LD120-Gruppe (Pseudomonaden) untereinander größer als die Ähnlichkeit zum nächsten verwandten Typstamm, was ein Hinweis auf eine spezifische Anpassung einer Bakteriengemeinschaft an ihr Habitat sein könnte.

4.6 Isolierung von Pseudomonaden

Ziel dieser Arbeit war es, spezifisch Pseudomonaden von S. latissima zu isolieren und nicht die gesamte Bakteriengemeinschaft abzubilden. Daher wurden Kultivierungsmedien zur selektiven Anreicherung bzw. zur Diffe- rentierung von Pseudomonas-Arten ausgewählt. Sowohl die Wahl des Me- diums als auch die Inkubationstemperatur beeinflussen dabei den Erfolg der Kultivierung und auch die Diversität (Bernard et al. 2000). Im Allgemeinen konnte bei Pseudomonaden gutes Wachstum in Medien beobachtet werden, die als Kohlenstoff- und Energiequelle organische Substanzen in einer Konzentration zwischen 0,1-1,0 % (w/v) enthalten (Moore & Tindall 2006). Mit Hilfe der CFC- und der GSP-Nährmedien konnten viele Pseudomona- den anhand ihrer Koloniemorphologie und mittels Fluoreszenznachweis isoliert werden. Auch das Pseudomonas-Medium führte zur Isolierung von Pseudomonaden. Allerdings war in diesem Medium die Nährstoffzusam- mensetzung auch für viele weitere Bakterien gut geeignet, so dass es zur Bildung vieler unterschiedlicher Kolonien kam. Das Wachstum unterschiedlicher Bakterien auf dem Pseudomonas-Medium könnte darin be- gründet liegen, dass Zusätze wie Antibiotika (z.B. Penicillin G, Novobiocin und Cycloheximid), welche die fluoreszierenden Pseudomonas-Arten nicht inhibieren (Sands & Rovira 1970) und in anderen Medien enthalten sind, hier nicht zugesetzt wurden.

131

DISKUSSION

Mit der kultivierungsabhängigen Methode können nur Aussagen über Bak- terien, die unter den gewählten Bedingungen wachsen, gemacht werden. Pseudomonaden können sich allerdings, wie auch andere Bakterien, in einer Art Ruhezustand befinden, der auch „viable but nonculturable state“ (VBNC) genannt wird, in welchem die Zellen auf den üblicherweise verwendeten bakteriologischen Medien eigentlich wachsen und eine Kolonie bilden würden (Oliver 2000). Dieser Ruhezustand ist definiert als reversib- les Stadium geringer metabolischer Aktivität wobei die Lebensfähigkeit erhalten bleibt (Overmann 2013). Bunker et al. (2004) haben gezeigt, dass P. fluorescens für länger als ein Jahr in dem VBNC-Stadium verweilen kann, was allerdings nur eine geeignete Überlebensstrategie sein kann, wenn die Zellen ihre metabolische Aktivität wieder zurückgewinnen kön- nen (Oliver 2005). Daher könnte die tatsächliche Zahl von Pseudomona- den und anderen Bakterien noch höher ausfallen. Zur Isolation von Pseudomonas-Arten können Komplex- oder Selektiv- medien verwendet werden. Die Wahl ist abhängig von den zu analysieren- den Proben (Schroth et al. 2006), da die Pseudomonas-Arten auf stark selektiven Medien in geringerer Anzahl und Diversität wachsen (Gilardi 1985). Zwei oft genutzte Selektivmedien zur Detektion und Isolation fluoreszie- render Pseudomonas-Arten sind die Medien King A und King B (King et al. 1954), welche Kalium- und Magnesiumsalze zur Steigerung der Pyocyanin und Pyoverdin Pigmentproduktion enthalten. Auch sollten die zur Detekti- on von fluoreszierenden Pseudomonas-Arten verwendeten Kultivierungs- medien einen Mangel an Eisen aufweisen, da die Fluoreszenz auf die er- höhte Produktion von Siderophoren zurückzuführen ist, die in das Medium abgegeben werden (Moore & Tindall 2006). Mittels UV-Lampe (366 nm) konnten fluoreszierende Pseudomonaden auf allen drei Medien detektiert werden. Dies erleichterte die Auswahl der Ko- lonien besonders beim Pseudomonas-Medium sehr deutlich (siehe Abbil- dung 43 a im Anhang).

132

DISKUSSION

Trotzdem stellt sich die Frage nach der tatsächlichen Häufigkeit mit der die bakteriellen Taxa in den jeweiligen Ökosystemen vorkommen. Wahr- scheinlich konnten mit den verwendeten Medien viele weiterere Pseu- domonaden, die nicht, oder nicht unter diesen Bedingungen fluoreszierten, der Detektion entgehen. Auch Ward et al. (1990) vermuten, dass die na- türliche bakterielle Gemeinschaft mittels kultivierungsabhängiger Metho- den meist nicht richtig dargestellt wird, weil gängige Kultivierungsmetho- den nicht die realen Umweltbedingungen imitieren, welchen die Gemein- schaft ausgesetzt ist. Das Ziel der Pseudomonaden-Isolierung konnte mit den in dieser Arbeit verwendten Methoden erreicht werden.

4.7 Abschließende Diskussion und Ausblick

Viele marine Bakterienarten konnten bislang noch nicht kultiviert werden, da man die Wachstumsbedingungen noch nicht kennt (Schut et al. 1997), oder die Bakterien keine Kolonien an der Luft/Feststoff-Grenzfläche bilden können (Eilers et al. 2000). Daher stellen marine Bakterien auch zukünftig eine aussichtsreiche Quelle für neue Naturstoffe dar. Um dieses Potential verfügbar zu machen, wurde vorgeschlagen, mehrere Medien verschiedener Zusammensetzung zu verwenden, um so auch neue Arten isolieren zu können (Martin & MacLeod 1984, Gonzalez & Moran 1997). Auch wurden Verdünnungstechniken zur Kultivierung oligotropher Arten entwickelt, welche nicht auf nährstoffreichen Medien wachsen (Button et al. 1993). Die Untersuchungen dieser Arbeit haben nachgewiesen, dass es für das zukünftige Naturstoffscreening von Bakterien sinnvoll ist, mindestens zwei verschiedene Medien für die Kultivierung auszuwählen. Außerdem sollten während der Kultivierung, unabhängig von der Bakterien-Art, mehrere Probenahmezeitpunkte für die Extraktion erfolgen, da Wirkstoffe zu unterschiedlichen Zeitpunkten während des Wachstums gebildet werden kön- nen. Bei langsam wachsenden Gattungen wie Streptomyces, kann der geeignete Zeitpunkt für die Extraktion daher bereits nach drei- bis viertägi-

133

DISKUSSION ger Kultivierung erreicht sein oder aber erst nach neun- oder elftägiger Kultivierung. Ebenso verhält es sich mit den Vertretern der schnell wachsenden Gattungen wie Bacillus oder Pseudomonas. Auch hier kann der geeignete Zeitpunkt bereits nach zwei- oder dreitägiger Kultivierung erfolgen, oder aber auch erst nach siebentägiger Kultivierung. Da die traditionelle Naturstoffforschung labor- und kostenintensiv ist (Wagenaar 2008), muss für ein sinnvolles Screening eine Balance zwischen Aufwand und Nutzen gefunden werden. Daher erscheint es nur für ausgewählte Bakterien-Stämme als sinnvoll weitere Kultivierungsexperi- mente nach dem OSMAC-Verfahren, der Ko-Kultivierung und der Zugabe von Induktoren durchzuführen, um so Zugang zu Metaboliten zu erhalten, die nicht konstitutiv exprimiert werden. Die nahezu grenzenlose Möglich- keit zur Variation der Wachstumsparameter führt zu einer Erhöhung von Aufwand und Kosten und ist daher für das Standardscreening weniger geeignet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl das Screening unbekannter bzw. wenig erforschter Arten, als auch das Screening gut unter- suchter Arten der Gattungen Streptomyces oder Bacillus eine geeignete Strategie zur Entdeckung neuer Metabolite sein kann. Für die Naturstoffforschung sind Innovationen der Methoden essentiell. Da viele Naturstoffe oft nur in geringen Mengen zur Verfügung stehen (Li & Vederas 2009), ermöglicht die Verbesserung der NMR-Technologie, durch eine höhere Empfindlichkeit, auch die Erforschung seltener neuer Natur- stoffe (Molinski 2010). Auch die wachsende Zahl von Genomsequenzie- rungen von Mikroorganismen wird zur Entdeckung neuer Naturstoffe beitragen (Bode & Müller 2005). Für weiterführende Untersuchungen zur bakteriellen Gemeinschaft der Braunalge S. latissima in der Ostsee wäre die Anwendung kultivierungs- unabhängiger Methoden sinnvoll. Die mittels kultivierungsabhängiger Me- thoden erhaltenen Ergebnisse könnten so bestätigt und ergänzt werden. Für in situ-Studien von der Alge könnte die RING-FISH- (recognition of individual genes) Methode sinnvoll sein. Mit dieser Methode können gezielt

134

DISKUSSION einzelne Gene in Kombination mit High-Throughput-Methoden, wie z.B. Durchflusszytometrie, untersucht werden, was ein schnelles und effizien- tes Instrument für die Untersuchung einer großen Anzahl von Bakterien- zellen in der natürlichen Umgebung darstellt (Grossart 2010).

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ZUSAMMENFASSUNG

5 Zusammenfassung

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Assoziation von Bacillus-, Pseudomonas- und Streptomyces-Arten mit der Braunalge Saccharina latissima in der Ostsee besteht. Im speziellen kann für den Pseudomonas- Stamm LD120 auf Grund des Sekundärmetabolitprofils sowie der stoff- wechselphysiologischen Eigenschaften des Bakteriums eine mutualistische Interaktion mit S. latissima als wahrscheinlich angenommen werden. Zu den Bakterien, die biologisch aktive Substanzen produzieren und die von der Alge S. latissima isoliert wurden, gehören Vertreter der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Pseudoalteromonas und Streptomyces. Änderun- gen der Kultivierungsbedingungen konnten das Sekundärmetabolitprofil dieser Bakterien verändern. Besonders erwähnenswert ist die Bildung von sechs weiteren Substanzen durch Stamm LD81 nach Zugabe des biogenen Amins Putrescin zum Kulturmedium. Die biologische Aktivität der isolierten bakteriellen Naturstoffe umfasst sowohl antimikrobielle Wirksamkeiten gegen über Bakterien und Pilzen als auch Hemmung humaner Krebszelllinien und die Inhibition von Acetylcho- linesterase. Etwa die Hälfte der 134 identifizierten Substanzen konnte derepliziert und so literaturbekannten Substanzen zugeordnet werden. Zwei Substanzen (Holomycin und N-Propionyl-holothin) konnten erstmals aus der Gattung Pseudomonas isoliert werden. Es konnten mehrfach potentiell neue Substanzen mit biologischer Aktivität identifiziert werden und zwar aus Vertretern der Gattungen Bacillus (LB084, m/z 572), Pseudomo- nas (LD120, m/z 347) und Streptomyces (LB058, m/z 544). Zusätzlich wurden in mindestens zwei Stämmen neue Derivate bekannter Naturstoffe identifiziert.

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SUMMARY

6 Summary

An association between strains of Bacillus, Pseudomonas and Streptomy- ces with the brown alga Saccharina latissima from the Baltic Sea was shown by the results of this thesis. In particular, a mutualistic symbiosis is assumed for Pseudomonas strain LD120 and S. latissima, due to metabolic characteristics and the secondary metabolite profile. Members of the genera Bacillus, Kiloniella, Pseudomonas, Pseudoalter- omonas and Streptomyces, all isolated from S. latissima, produced bioactive compounds. Variations of cultivation conditions lead to different secondary metabolite profiles of these bacteria. Particularly noteworthy is the production of six new compounds by strain LD81 after addition of the bio- genic amine putrescine to the culture medium. Bioactivity of the isolated bacterial natural products comprises antibacterial and antifugal activity, as well as inhibition of human cancer cell lines and acetylcholinesterase. Approximately half of the 134 identified compounds was dereplicated and assigned to compounds already known from literature. However, two compounds (holomycin and N-propionylholothin) were isolated for the first time from the genus Pseudomonas. Potentially novel bioactive compounds were identified from members of the genera Bacillus (LB084, m/z 572), Pseudomonas (LD120, m/z 347) and Streptomyces (LB058, m/z 544). In addition, derivatives of known compounds were identified in at least two strains.

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DANKSAGUNG

7 Danksagung

Mein Dank gilt: Prof. Dr. Johannes F. Imhoff für die Übernahme meiner Betreuung, die Überlassung des Themas, die Ermöglichung zur Teilnahme an interessanten Tagungen und Konferenzen, sowie die Freiheit über den Tellerrand meiner Arbeit hinaus forschen zu dürfen. Dr. Antje Labes für Deine Hilfe und Unterstützung in einfach allem. Dr. Jutta Wiese für Dein Interesse, Deine Unterstützung und das entgegengebrachte Vertrauen. Imke für das „High-Throughput-Arbeiten‟. Dr. Inga Knopf-Kajahn & Dr. Birgit Ohlendorf für die Auswertung der NMR-Spektren. Katrin für die Hilfe bei vielen Extraktionen, Spaziergänge und Massagen zwischendurch. Arlette & Dr. Heidi Zinecker für die Durchführung der vielen Bioassays. Susann für die Hilfe bei der präparativen Chromatographie. Herwig & Tim für die IT- und Technik-Hilfe, für ein offenes Ohr und die Korrekturen vorallem meiner englischsprachigen Schriftversuche und beiden für das Tauchen und die Hilfe bei der Probenahme. Franz, Herwig, Nils & Tim für das super Doktorandenbüroklima, mit den interessanten fachlichen Diskussionen und den noch schöneren fachfrem- den Gesprächen. Allen KiWiZ-lern und Mikros danke ich für die tolle Arbeitsatmosphäre, die mir entgegengebrachte Hilfe und die erheiternden Mittagspausen. Vor allem werden mir die gemeinsam verbrachten Stunden nach Feierabend unvergessen bleiben. Marion Höftmann und Gitta Kohlmeyer-Yilmaz aus der spektroskopischen Abteilung des Otto Diels-Institut für organische Chemie der Christi- an-Albrechts-Universität zu Kiel danke ich für die Durchführung der NMR- Experimente.

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DANKSAGUNG

Ganz besonders Bedanken möchte ich mich bei meinen Eltern für die lie- bevolle Unterstützung in wirklich jeglicher Hinsicht. Ohne Euch wäre ich nicht da, wo ich jetzt bin. Zum Schluss bedanke ich mich bei meinem Freund Michael dafür, dass er mir die Freiheit gelassen hat meinen Weg zu gehen. Du hast immer zu mir gestanden und mir die Zeit gegeben, die ich gebraucht habe. Danke für so vieles.

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft, Wirtschaft und Verkehr Schleswig Holstein innerhalb des “Kieler Wirkstoff- Zentrum KiWiZ” Projekts, welches durch die Europäische Union (EFRE) mitfinanziert wurde.

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166

ANHANG

9 Anhang

a b

Abbildung 43: Makroskopische Aufnahme von zwei Petrischalen. a: Sedimentprobe Nr. 2 auf Pseudomonas-Medium ausplattiert und für 34 Stunden bei 28 °C kultiviert; Verdünnungsstufe 10-1. b: Rhizoid der Alge Nr. 4 auf Pseudomonas-Medium ausplattiert; Verdünnungsstufe 100, die Kultivierung erfolgte für 34 Stunden bei 28 °C und anschlie- ßend für fünf Tage bei 18 °C.

Biofilm

Abbildung 44: Makroskopische Aufnahme von Stamm LD120 in einem 2 L-Erlen- meyerkolben mit drei Schikanen. Die Kultivierung erfolgte für 36 Stunden bei 16 °C in MB-Medium.

167

ANHANG

Tabelle 38: Kultivierungsbedingungen der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente. Soweit nicht anders angegeben, wurden die Experimente in Erlenmeyerkolben durchgeführt.

Schüttlerge- Volumen Gefäß Temperatur Dauer Stamm schwindigkeit Medium Vorkultur (mL) (mL) (°C) (d) (rpm)

LB084 100 300 130 28 SP 2/3/7 Agarplatte 10 d bei RT ~ 1 cm2 LD81 1000 2000 120 28 MB 2/6/7/8 MB-Agarplatte 7 d bei RT ~ 2 cm2 LB034 11x1000 2000 120 28 MB 7 MB-Agarplatte 2 d bei 28 °C ~ 2 cm2 LB058 12x1000 2000† 120 28 GYM4 3 a LB114 100 300 120 28 GYM4 9 1 Kryokugel LB129 11x1000 2000 120 28 GYM4 4 a LB152 12x1000 2000† 120 28 GYM4 11 GYM4-Agarplatte 14 d bei RT ~ 2 cm2 LB012 1000 2000 120 28 TM 2/3 c LB012 12x1000 2000 120 28 TM 2 b LB012 1000 2000 120 28 GYM4 2 c LD120 10x1000 2000 120 28 TM 2 MB-Agarplatte 30 d bei RT ~ 2 cm2 LB042 1000 2000‡ 120 28 TM/GYM 1/2/3/7 GYM-Agarplatte 3 d bei RT ~ 2 cm2 LB061 25 100 120 28 TSB/MB/GYM4 7 e LB061 1000 2000‡ 120 28 TSB/MB/GYM 1/2/3/7 MB-Agarplatte 3 d bei 28 °C ~ 2 cm2 LD120 25 100 120 28 TSB/MB/GYM4 7 e

168

ANHANG

Schüttlerge- Volumen Gefäß Temperatur Dauer Stamm schwindigkeit Medium Vorkultur (mL) (mL) (°C) (d) (rpm)

LD120 100 300 120 30 MB/TM 1 MB-Agarplatte 7 d bei 30 °C ~ 1 cm2 LD120 1000 2000 120 16 MB 6-336 h MB-Agarplatte 10 d bei RT ~ 2 cm2 LD81 25 100 120 28 TSB/MB/GYM4 7 e LB114 25 100 120 28 TSB/MB/GYM4 7 f LD81 25 100 120 28 MB* 7 gut gewachsene MB-Agarplatte LB183 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB184 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB185 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB042 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB043 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB044 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB045 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB046 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB047 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB048 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB051 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB054 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel

169

ANHANG

Schüttlerge- Volumen Gefäß Temperatur Dauer Stamm schwindigkeit Medium Vorkultur (mL) (mL) (°C) (d) (rpm)

LB061 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB062 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel LB063 Agarplatte Stand 28 MB 7 1 Kryokugel a VK: 1 Kryokugel in 100 mL GYM4 in 300 mL-Erlenmeyerkolben 3 Tage bei 28 °C und 120 rpm -> 1 % b VK: 1 Kryokugel in 100 mL TM in 300 mL-Erlenmeyerkolben 1 Tage bei 28 °C und 120 rpm -> 5 % c VK: 1 Kryokugel in 100 mL TM/GYM4 in 300 mL-Erlenmeyerkolben 1Tage bei 28 °C und 120 rpm -> 5 % e VK: Von MB-Agarplatte mittels Impföse in 25 mL MB-Medium (100 mL Erlenmeyerkolben) 1 Tag bei 28 °C und 120 rpm. Daraus 200 µL. f VK: Von MB-Agarplatte mittels Impföse in 25 mL MB-Medium (100 mL Erlenmeyerkolben) 5 Tage bei 28 °C und 120 rpm. Daraus 200 µL. † Kolben mit einer Schikane, ‡ Kolben mit vier Schikanen * MB-Medium mit verschiedenen Zusätzen. A: 10 µM Putrescin, B: 20 nM Putrescin, C: 10 µM Homoserinlacton, D: 20 nM Homoserinlacton, E: 10 µM cAMP, F: 20 nM cAMP

170

ANHANG

Tabelle 39: Vergleich der Substratverwertung von Pseudomonas sp. LD120 und Pseudomonas fluorescens Pf-5 mittels BIOLOG GN2 Mikrotiterplattena.

Substrat Pf-5 LD120

D-fructose + + α-D-glucose + + D-mannose w + pyruvic acid methyl ester w + acetic acid + + cis-aconitic acid + + citric acid + + D-gluconic acid + + β-hydroxybutyric acid + + α-ketoglutaric acid + + D,L-lactic acid + + succinic acid wc + bromosuccinic acid + + L-asparagine + + L-aspartic acid + + L-glutamic acid + + L-proline + + γ-aminobutyric acid + + glycerol + + L-arabinose wy w D-galactose - w sucrose + + succinic acid mono-methyl ester - + formic acid + w D-galactonic acid lactone - - malonic acid + + quinic acid wc + succinamic acid +c - inosine + + uridine - w tween 40 + + D-arabitol - - m-inositol -c,d + D-mannitol +y - D-sorbitol - - D-psicose w w

171

ANHANG

Substrat Pf-5 LD120

D-galacturonic acid - - glucosaminic acid - - D-glucuronic acid - - D-saccharic acid - - glycogen w w glucuronamide - - L-alaninamide w + D-alanine w + L-alanine w + L-alanyl-glycine w + glycyl-L-glutamic acid - + L-histidine + + L-leucine + + L-ornithine - + D-serine - w L-serine w w L-threonine - + dextrin - - tween 80 w + i-erythritol -c,d - D-raffinose - - D-trehalose + + turanose - - γ-hydroxybutyric acid - +y α-ketobutyric acid - w α-ketovaleric acid -c,d + propionic acid + + L-pyroglutamic acid +y w D,L-carnitine - + urocanic acid + + D,L-α-glycerol phosphate w + adonitol - - xylitol - - 2-aminoethanol + + 2,3-butanediol - - D-cellobiose - -c maltose - - α-hydroxybutyric acid + +

172

ANHANG

Substrat Pf-5 LD120

p-hydroxy-phenylacetic acid +y + itaconic acid + - sebacic acid w + N-acetyl-D-glucosamine w + glycyl-L-aspartic acid - - hydroxy-L-proline + + phenylethylamine - - L-phenylalanine - w putrescine + + D-glucose-6-phosphate w + α-cyclodextrin - - L-fucose - - gentiobiose - w α-D-lactose -c,d - lactulose - - D-melibiose - w β-methyl-D-glucoside - - L-rhamnose - - N-acetyl-D-galactosamine - - thymidine - - α-D-glucose-1-phosphate - - a Stamm LD120 wurde 24 h bei 28 °C auf LB-Agarplatten inkubiert und anschließend in steriler 0,85 %iger NaCl-Lösung resuspendiert. Die Zellsuspension wurde auf eine OD620 von 0,28 vor dem Beimpfen der BIOLOG GN2 Mikrotiterplatten eingestellt. Der Umsatz bzw. die Oxidation des Substrats wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm mittels Farbumschlag im Medium gemessen, welcher durch die Reduktion des Tetrazoli- umviolets hervorgerufen wird. Es wurden mindestens 2 Parallelen durchgeführt. +: Wachstum war positiv (OD620 > 0,2), –: Wachstum war negativ (OD620 < 0,05), c w: Wachstum schwach positiv (0,2 > OD620 <0,05), Der Mittelwert ist (w oder -), aber die einzelnen Parallelen ergaben unterschiedliche Ergebnisse (w/-), d Eine Parallele ergab y eine OD620 > 0,05, aber es gab keinen Farbumschlag, Aufgrund der hohen Siderophor- produktion war der Farbumschlag nicht deutlich sichtbar.

173

ABKÜRZUNGEN

10 Abkürzungen

Abb. Abbildung A.b. Algicola bacteriolytica Acc.-No. Accession-Number AchE Acetylcholinesterase ACN Acetonitril ATP Adenosintriphosphat B.c. Botrytis cinerea blast Basic Local Alignment Search Tool blastn Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool bp Basenpaare B.s. Bacillus subtilis bzw. beziehungsweise ca. circa C.a. Candida albicans

CaCl2 Calciumchlorid CaCO3 Calciumcarbonat cAMP zyklisches Adenosin-3´,5´-monophosphat C.g. Candida glabrata cm2 Quadratzentimeter

CO2 Kohlenstoffdioxid COSY correlated spectroscopy DAD Photodioden-Array-Detektor DAPG Diacetylphloroglucinol DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DMSO Dimethylsulfoxid DNA desoxyribonucleic acid = Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen E.a. Erwinia amylovora E.c. Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraaceticacid ELISA Enzym-linked immunosorbent assay EMBL European Molecular Biology Laboratory ESI Elektrospray-Ionisation et al. et alteri EtOAc Ethylacetat FeCitrat Eisencitrat g Erdbeschleunigung g Gramm °C Grad Celsius GSK-3β Glykogensynthase-Kinase 3 beta GYM Glucose Yeast Malt h hour = Stunde

H2O Wasser HBO3 Perborsäure HCL Salzsäure HIV-1-RT Humane Immundefizienz-Virus-1 Reverse Transkriptase HMBC heteronuclear multiple bond coherence HPLC high performance liquid chromatography = Hochleistungsflü- ssigkeitschromatographie

174

ABKÜRZUNGEN

HSQC heteronuclear single quantum coherence Hz Hertz KBE Kolonienbildende Einheit KBr Kaliumbromid KCl Kaliumchlorid

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat KiWiZ Kieler Wirkstoff-Zentrum LB Lysogeny Broth MAPG Monoacetylphloroglucinol MB Marine Broth M.c. Microsporum canis MeOH Methanol mg Milligramm μg Mikrogramm

MgCl2 Magnesiumchlorid MgSO4 Magnesiumsulfat MHz Megahertz min Minute(n) mL Milliliter μL Mikroliter mm Millimeter mM millimolar μM mikromolar MS Masse mV Millivolt m/z Masse-zu-Ladung-Verhältnis N Stickstoff NaCl Natriumchlorid

NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat NaOH Natriumhydroxyd NCBI National Center for Biotechnology Information

NH4NO3 Ammoniumnitrat n.i. hat nicht ionisiert nm Nanometer NMR nuclear magnetic resonance = Kernspinresonanzspektroskopie NOESY nuclear overhauser enhancement spectroscopy NRPS nicht-ribosomale Peptid-Synthetase

OD620 Optische Dichte bei 620 nm P.a. Propionibacterium acnes PBS phosphate buffered saline = Phosphatgepufferte Salzlösung PCR polymerase chain reaction = Polymerasekettenreaktion PDE4 Phosphodiesterase 4 P.e. Pseudoalteromonas elyakovii pH potentia hydrogenii P.i. Phytophthora infestans PKS Polyketid-Synthase PLT Pyoluteorin Ps.a. Pseudomonas aeruginosa Ps.fl. Pseudomonas fluorescens Ps.s. Pseudomonas syringae pv. aptata PTFE Polytetrafluorethylen PTP1B Protein Tyrosin Phosphatase 1B

175

ABKÜRZUNGEN

RP-18 Octadecylgruppen RP-HPLC reverse phase high performance liquid chromatography rpm rounds per minute = Umdrehung pro Minute rDNA ribosomal desoxyribonucleic acid = ribosomale Desoxyribo- nukleinsäure rRNA ribosomal ribonucleic acid = ribosomale Ribonukleinsäure RSD relative Standardabweichung R.s. Ralstonia solanacearum s Sekunde S.e. Staphylococcus epidermidis sh bezeichnet das Auftreten einer Schulter bei angegebener Wellenlänge S.l. Staphylococcus lentus sp. species S.tr. Septoria tritici TBE Tris-Borat-EDTA T.m. Trichophyton mentagrophytes T.r. Trichophyton rubrum TSB tryptic soy broth UV Ultraviolett VIS visible = sichtbar w/v weight per volume X.c. Xanthomonas campestris z.B. zum Beispiel

176

LEBENSLAUF

11 Lebenslauf

Kerstin Nagel geb. am 01.03.1979 Staatsangehörigkeit: deutsch Wohnort: Fleckeby

Schulbildung 1989-1995 Realschule Kappeln 1995-1998 Berufsbildende Schule „BBZ Schleswig“ in Schleswig Juni 1998 Allgemeine Hochschulreife

Berufsausbildung 1998-2001 Milchwirtschaftliche Laborantin bei der Cremilk in Kappeln

Studium September 2001 - Februar 2006 Studium der Biotechnologie- Verfahrenstechnik an der Fachhochschule Flensburg

März 2005 – November 2005 Experimentelle Diplomarbeit am Leibniz-Institut für Meereswissenschaften bei Prof. Dr. Johannes F. Imhoff in der Forschungseinheit Marine Mikrobiologie mit dem Thema: „Produktionsoptimierung eines von Penicillium chrysogenum gebildeten biologisch aktiven Wirkstoffes‟

Januar 2006 fächerübergreifendes Kolloquium

Beruflicher Werdegang März 2006 – Dezember 2007 Technische Angestellte am Kieler Wirkstoff-Zentrum in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Johannes F. Imhoff am Leibniz-Institut für Meereswissenschaften in Kiel

Studium Januar 2008 - April 2011 wissenschaftliche Mitarbeiterin in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Johannes F. Imhoff in der For- schungseinheit Marine Mikrobiologie am Leibniz-Institut für Mee- reswissenschaften in Kiel

177