UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

ESTUDO FITOQUÍMICO COMPARATIVO ENTRE Cecropia glaziovii SNETH. E

Cecropia pachystachya TRÉCUL.

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

GEISON MODESTI COSTA

Florianópolis

2009

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

ESTUDO FITOQUÍMICO COMPARATIVO ENTRE Cecropia glaziovii SNETH. E

Cecropia pachystachya TRÉCUL.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Farmácia por Geison Modesti Costa

como requisito parcial para a obtenção do grau de

Mestre em Farmácia

ORIENTADOR: Prof. Dr. Flávio Henrique Reginatto

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Eloir Paulo Schenkel

Florianópolis

2009 DEDICATÓRIA

Ao meu orientador: Flávio H. Reginatto

“Desconfie do destino e acredite em você. Gaste mais horas realizando que sonhando, fazendo que planejando, vivendo que esperando, porque embora quem quase morre esteja vivo, quem quase vive já morreu."

Luis Fernando Veríssimo

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Flávio H. Reginatto, pela orientação, dedicação, atenção e paciência que teve comigo no mestrado, além dos diversos votos de confiança que depositou em mim ao longo de toda a minha vida acadêmica. É uma honra ter sido seu primeiro aluno de mestrado! Ao Prof. Dr. Eloir P. Schenkel, pela co-orientação e pelo grande conhecimento recebido. Além disso, pelo provilégio de poder ministrar minhas primeiras aulas, na disciplina de Química Farmacêutica, sob sua supervisão. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Farmácia da Universidade Federal de Santa Catarina, especialmente a Prof. Dra. Ângela Campos, pela parceria no projeto envolvendo os estudos com Cecropia , a Prof. Dra. Cláudia M. O. Simões, pelo auxílio e atenção dispensados em meu trabalho e ao Prof. Dr. Marcos Segatto, pela amizade e auxílio na conclusão deste trabalho. Ao Prof. Dr. Miguel Caro, pela atenção e agilidade dispensada aos espectros de ressonância magnética nuclear das substâncias isoladas neste trabalho. Aos Prof. Dr. Lílian Mentz e Daniel Falkenberg pela identificação do material vegetal. As técnicas dos Laboratórios de Farmacognosia e Química Farmacêutica, ‘Claudinha’ e Solange, por todas as vezes que precisei de ajuda e sempre fui amparado. Muito obrigado! As colegas de mestrado Izabella Silva e Janaína Koelzer, pela realização dos experimentos na avaliação de atividade farmacológicas dos extratos de Cecropia glaziovii e Cecropia pachystachya. A Caroline e Lara, as melhores ajudantes que eu poderia ter e que me auxiliaram e me aguentaram muito nos momentos em que eu mais precisei. Muito obrigado! Aos amigos e colegas de laboratório Maria Izabel, Karen, Virgínia, Tatiana, Simone, Andressa, Vanessa, Thaís, Carize, Fernanda, Cíntia, Rodrigo, Débora, Tiago, Lígia e Patrícia, por todo o carinho que tenho por vocês e pela paciência que vocês tem comigo. Especialmente a Silvana, ‘mãe dos C-glicosídeos’, agradeço por sempre me ajudar e me ouvir quando precisei e por toda a força que me deu quando vim para Florianópolis. Ao João e Daniel, meus ex-colegas e sempre amigos, que me ajudaram na adaptação entre Passo Fundo e Florianópolis. A minha mãe Dianete e meu irmão Eoil Júnior, por tudo, inclusive por sempre acreditarem em mim. A minha noiva ‘Cacá’, por tudo que você é e por todo amor, carinho, paciência, apoio e dedicação incondicional que teve e tem comigo.

SUMÁRIO

Lista de Figuras Lista de Tabelas Lista de Abraviaturas Resumo Abstract

Apresentação ...... 14

Capítulo 1: O gênero Cecropia ...... 17 1. Introdução ...... 18 Publicação : Aspectos químicos e farmacológicos do gênero Cecropia ...... 20

Capítulo 2: Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para a identificação e quantificação de compostos fenólicos em Cecropia glaziovii e Cecropia pachystachya por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ...... 43 1. Introdução ...... 44 2. Revisão da Literatura ...... 44 2.1. Análise de compostos fenólicos por CLAE ...... 44 2.2. Validação de métodos analíticos ...... 45 Publicação : Simultaneous Quantitative Assay of Major Phenolic Compounds from Two Brazilian Cecropia Species by HPLC-DAD ...... 48

Capítulo 3: Isolamento e caracterização de flavonóides em folhas de Cecropia glaziovii e Cecropia pachystachya ...... 64 1. Introdução ...... 65 2. Revisão da Literatura ...... 65 2.1. Flavonóides ...... 65 2.1.1. Flavonóides C-glicosídeos ...... 66 2.1.2. Flavonóides nas espécies C. glaziovii e C. pachystachya ...... 67 Publicação: Chemical characterization of Cecropia glaziovii Sneth. and Cecropia pachystachya Trécul. leaves and seasonal variation of the major flavonoids from Cecropia glaziovii ...... 68

Discussão geral ...... 82

Conclusões ...... 92

Referências ...... 94

Apêndices ...... 103

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Espécies de Cecropia predominantes na Mata Atlântica conhecidas popularmente como ‘embaúba’...... 18

Figura 2: Núcleo fundamental dos flavonóides e sua numeração...... 66

Figura 3: Cromatografia em camada delgada da substância CP4 e flavonóides descritos na literatura para o gênero Cecropia ...... 88

Figura 4: Fórmula estrutural preliminar proposta para a substância CP4...... 89

Figura 5: Variação do teor dos flavonóides majoritários em Cecropia glaziovii ... 90

1 Figura 6: Espectro de RMN H da substância CP1 em DMSO-d6...... 105

1 Figura 7: Espectro de RMN H ampliado da substância CP1 em DMSO-d6...... 106

1 Figura 8: Espectro de RMN H ampliado da substância CP1 em DMSO-d6...... 107

1 Figura 9: Espectro de RMN H da substância CP2 em DMSO-d6...... 108

1 Figura 10: Espectro de RMN H ampliado da substância CP2 em DMSO-d6...... 109

1 Figura 11: Espectro de RMN H ampliado da substância CP2 em DMSO-d6...... 110

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Máximos de absorção e deslocamentos nos espectros UV da substância CP4 ...... 87

Tabela 2: Máximos de absorção e deslocamentos nos espectros UV de flavonóides relatados para o gênero Cecropia ...... 88

LISTA DE ABREVIATURAS

1H RMN: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio ACN: acetonitrila AcOEt: acetato de etila CCD: Cromatografia em camada delgada CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-DAD: Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção ultravioleta por arranjo de diodos. DMSO: dimetilsulfóxido EtOH: etanol HCOOH: ácido fórmico

HOCH 3CO: ácido acético HSV-1: vírus herpético simples tipo 1 HSV-2: vírus herpético simples tipo 2 IV: Infravermelho MeOH: metanol NaOAc: acetato de sódio NaOH: hidróxido de sódio NaOMe: metóxido de sódio NP: reagente natural - difenilboriloxyetilamina 1% em metanol. PEG: solução alcoólica de polietilenoglicol 4000 (5%) UV: Ultravioleta

RESUMO

RESUMO

O gênero Cecropia (Urticaceae) consiste de cerca de 60 espécies distribuídas por toda América Latina, sendo a maioria de ocorrência no Brasil. Dentre as espécies deste gênero, C. glaziovii Sneth. e C. pachystachya Trécul. são as de maior ocorrência na região Sul e Sudeste do país, em especial na zona da Mata Atlântica, sendo conhecidas popularmente como ‘embaúba’ e amplamente utilizadas na medicina popular para o tratamento da tosse, asma, bronquite, pressão alta, inflamação, problemas cardíacos e como diuréticas. Os quatro compostos fenólicos majoritários presentes nos extratos aquosos de C. glaziovii e C. pachystachya foram identificados e quantificados por metodologia desenvolvida e validada por CLAE, sendo que os teores encontrados para C. glaziovii foram, em mg/g de planta seca: ácido clorogênico: 1,8; isoorientina: 0,4; orientina: 0,1; isovitexina: 0,9; e para C. pachystachya : ácido clorogênico: 3,4; isoorientina: 2,1; orientina: 2,2; isovitexina: 0,9. A partir das folhas de C. glaziovii foram isolados dois flavonóides C-glicosídeos identificados como isovitexina e isoorientina. Das folhas de C. pachystachya , foram isolados três flavonóides C-glicosídeos, identificados como isoorientina, orientina, isovitexina, além de uma flavona codificada como CP4, a qual está em processo final de identificação. Isoquercitrina também foi identificada em ambos os extratos. Este é o primeiro relato de orientina para a espécie C. pachystachya , e, conforme análises preliminares, o primeiro relato de CP4 para o gênero Cecropia . A análise da influência da sazonalidade no teor dos flavonóides C-glicosídeos majoritários de C. glaziovii (isovitexina e isoorientina) apontou variações significativas no conteúdo destes compostos, sendo observado o maior acúmulo tanto de isovitexina (1,9 mg/g planta seca) como isoorientina (1,0 mg/g planta seca) no mês de janeiro.

ABSTRACT

Comparative phytochemical study between Cecropia glaziovii Sneth. and Cecropia pachystachya Trécul. The Cecropia genus consists of about 60 species distributed for all Latin America, most of them with occurrence in Brazil. Among the species of this genus, C. glaziovii Sneth. and C. pachystachya Trécul. are those with the higher occurence in the South and Southeast of the country, especially at Atlantic Rain Forest, being popular known as ‘embaúba’ and widely used in traditional medicine to treat cough, asthma, bronquitis, high blood pressure, inflammation, heart diseases and as diuretic. The four major phenolic compounds in the aqueous extracts from C. glaziovii and C. pachystachya species were identified and quantified by HPLC, with the follow contents, in mg/g of dry weight, for C. glaziovii : chlorogenic acid: 1.8; isoorientin: 0.4; orientin: 0.1; isovitexin: 0.9; and for C. pachystachya : chlorogenic acid: 3.4; isoorientin: 2.1; orientin: 2.2; isovitexin: 0.9. From C. glaziovii leaves, were isolated two C-glycosylflavonoids identified as isovitexin and isoorientin. From C. pachystachya leaves, were isolated three C-glycosylflavonoids identified as isoorientin, orientin and isovitexin, together with a flavone codified as CP4. Isoquercitrin was also identified in both extracts. This is the first report of orientin for C. pachystachya and, accordingly preliminary tests, the first report of CP4 for Cecropia genus. Seasonality analysis of the major C- glycosylflavonoids from C. glaziovii (isovitexin e isoorientin) showed a significative variation of these compounds, with higher contents of isovitexin (1.9 mg/g of dry weight) and isoorientin (1.0 mg/g of dry weight) in January.

APRESENTAÇÃO

Apresentação 15

Os vegetais fazem parte da vida do homem desde seus primórdios sob diferentes aspectos e importâncias. Eles não só fornecem alimentos e abrigo como servem a humanidade na cura de diversos males. Cerca de 75% da população mundial utiliza a medicina tradicional (especialmente o uso de plantas) nos cuidados com a saúde (GILANI; RAHMAN, 2005; PATWARDHAN, 2005). O gênero Cecropia (Urticaceae) possui cerca de 60 espécies descritas com ampla distribuição na América Latina. No Brasil, onde são conhecidas popularmente como embaúba, imbaúba ou umbaúba, as espécies deste gênero podem ser encontradas nas regiões Norte (Floresta Amazônica), Centro-Oeste, bem como no Sudeste e Sul (Mata Atlântica) (PIO CORRÊA, 1978; BERG; ROSSELLI, 2005). Devido ao seu rápido crescimento, suas espécies vem sendo difundidas no país por serem utilizadas como árvores de replantio em áreas de recomposição florestal (SPOSITO; SANTOS, 2001; BACKES; IRGANG, 2002; DI STASI; SEITO; HIRUMA-LIMA, 2002). A importância do gênero em países como o Brasil, México, Argentina e Paraguai não está relacionada somente na sua amplitude de distribuição, mas também pelos seus diversos usos na medicina popular. De maneira geral, espécies do gênero Cecropia são utilizadas popularmente para o tratamento de problemas respiratórios, como tosse, asma e bronquite, pressão alta, Diabetes, inflamações, além de serem empregadas como diurético e cardiotônico. Nessas preparações são utilizadas principalmente as folhas, além de cascas e brotos (PIO CORRÊA, 1978; SIMÕES et al., 1998; MORS; RIZZINI; PEREIRA, 2000; DI STASI et al., 2002; LORENZI; MATOS, 2008). Esta relevância pode ser comprovada pela inclusão de Cecropia hololeuca, identificada como Imbaúba, na 1ª edição da Pharmacopeia Brasileira (PHARMACOPEIA, 1926). No gênero Cecropia , apenas C. glaziovii Sneth. e C. pachystachya Trécul. são abundantes na região Sul do país, em especial na zona da Mata Atlântica (BERG; ROSSELLI, 2005). Embora estas espécies estejam entre as mais estudadas do gênero, poucos são os relatos sobre a composição química, em especial de C. pachystachya , assim como não há relatos sobre metodologias analíticas para assegurar o controle de qualidade dessas matérias- primas vegetais. Este trabalho teve como objetivo geral avaliar a composição química de C. glaziovii e C. pachystachya , e estabelecer um perfil comparativo entre as espécies com base na constituição de flavonóides C-glicosídeos. De maneira específica, os objetivos foram: Apresentação 16

1. Desenvolver e validar metodologia analítica para doseamento dos compostos fenólicos majoritários por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. 2. Análisar, isolar e identificar os flavonóides C-glicosídeos majoritários de ambas as espécies. Com base nos objetivos propostos, a dissertação está organizada em três capítulos: O capítulo 1 é constituído de uma revisão bibliográfica sobre o gênero Cecropia , abordando suas características botânicas, etnofarmacologia, mas principalmente estudos referentes à composição química e ensaios farmacológicos. O capítulo 2 descreve o desenvolvimento e validação de metodologia analítica para a separação, identificação e quantificação dos compostos fenólicos majoritários das folhas de C. glaziovii e C. pachystachya . O capítulo 3 apresenta o isolamento e caracterização de flavonóides C-glicosídeos a partir do extrato aquoso das folhas de C. glaziovii e C. pachystachya , assim como a avaliação da variação sazonal destes compostos em C. glaziovii por Cromatografia em Camada Delgada e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

CAPÍTULO 1: O gênero Cecropia

O gênero Cecropia 18

1. INTRODUÇÃO Primeiramente descrito na família Moraceae, o gênero Cecropia sofreu nova classificação ao final da década de 70, sendo reclassificado em uma nova família - Cecropiaceae (BERG, 1978). Embora essa proposição tenha sido adotada por muitos investigadores e seja empregada ainda nos dias atuais, estudos taxonômicos recentes, com abordagens morfológicas e filogenéticas, sugerem outra classificação para o gênero Cecropia , incluindo-o na família Urticaceae (SYSTMA et al., 2002). As espécies de Cecropia apresentam-se como árvores de médio a grande porte, podendo atingir até 25 metros de altura, características de vegetação secundária. Possuem, em sua grande maioria, troncos ocos e segmentados, que acabam por conferir alguns de seus nomes populares, como embaúba ou ambay, ambas derivadas da palavra tupi “ambaíba”, que significa “tronco oco”. As árvores deste gênero apresentam folhas largas, lobadas, cuja coloração e textura diferem conforme a espécie (Figura 1) (PIO CORRÊA, 1978; BERG; ROSSELLI, 2005).

Figura 1: Espécies de Cecropia predominantes na Mata Atlântica conhecidas popularmente como ‘embaúba’. Esquerda: C. glaziovii (embaúba vermelha), Direita: C. pachystachya (embaúba prateada).

Diversos são os empregos das espécies de Cecropia , seja na medicina tradicional, seja na área comercial. As cascas são utilizadas na indústria do curtume do couro, devido ao seu elevado teor de taninos. O caule é usado como instrumento de sopro, sendo a madeira dos troncos utilizada para a confecção de caixas, pequenas jangadas, além de servir como matéria- prima na obtenção da celulose. As folhas são empregadas como lixas, para o acabamento de objetos de madeira (BERG; ROSSELI, 2005). Além disso, devido ao rápido crescimento das árvores deste gênero, espécies de Cecropia vêem sendo utilizadas como árvores de replantio O gênero Cecropia 19

em áreas de desmatamento, o que tem ajudado a difundir o gênero por diversas regiões do país (SANTOS, 2000; LORENZI; MATOS, 2008). As principais aplicações populares de espécies de Cecropia , contudo, são na medicina tradicional, destacando-se o uso das folhas, em especial para tratamento de problemas respiratórios, cardiovasculares e da Diabetes (SIMÕES et al., 1998; MORS; RIZZINI; PEREIRA, 2000; DI STASI et al., 2002). Apesar de haver um número limitado de estudos que buscam comprovar essas atividades, encontram-se no mercado farmacêutico algumas preparações que possuem extratos de Cecropia em sua composição, como por exemplo, Poconéol ® gotas (Plantes et Médecines, França), uma preparação homeopática indicada para o tratamento de estados infecciosos (Medicamento Nº 48, registro: 308456.9) ou com ação antitussígena (Medicamento Nº 20, registro: 308437.4), as quais empregam em sua composição extrato de C. palmata , entre outras matérias-primas vegetais. No mercado nacional há o medicamento Tosseína (Registro ANVISA: 106460057 - Laboratório Químico Farmacêutico Bérgamo), xarope para tosse, que tem descrito em sua composição “Umbaúba”. Considerando o crescente número de trabalhos científicos com espécies do gênero Cecropia , sua ampla utilização popular e ausência de uma compilação sobre as investigações químicas e farmacológicas dessas espécies, este capítulo apresenta uma revisão sobre o gênero Cecropia , enfatizando aspectos químicos e farmacológicos, a partir das bases de dados PubMed, Scopus, ScienceDirect e SciELO, além de livros e revistas não disponíveis on-line, compreendendo dados até outubro de 2008.

PUBLICAÇÃO: Aspectos químicos e farmacológicos do gênero Cecropia Geison M. Costa, Eloir P. Schenkel, Flávio H. Reginatto Latin American Journal of Pharmacy -Submetido- (Código: 20081111O0A2LJ15DP) O gênero Cecropia - Publicação 20

Aspectos químicos e farmacológicos do gênero Cecropia

Chemical and Pharmacological aspects of Cecropia Genus

Geison M. Costa, Eloir P. Schenkel, Flávio H. Reginatto *.

Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade

Federal de Santa Catarina, CEP 88040-970, Florianópolis-SC, Brasil.

*: E-mail: [email protected] ; Tel: +55-48-37215075

RESUMO: O gênero Cecropia é constituído por cerca de 60 espécies distribuídas por toda América Latina, sendo a maioria de ocorrência no Brasil. Estas espécies são amplamente usadas na medicina tradicional para o tratamento da tosse, asma, bronquite, pressão alta, inflamação, problemas cardíacos e como diuréticas. Nos

últimos anos, houve um aumento no número de pesquisa com espécies de Cecropia , as quais relatam diversos estudos fitoquímicos e farmacológicos. Considerando a composição química flavonóides e proantocianidinas são relatados como constituintes principais enquanto que as principais atividades farmacológicas relatadas são como hipoglicemiante, hipotensora e antidepressiva. Esta revisão objetiva compilar os dados sobre a composição química e atividades farmacológicas do gênero Cecropia .

SUMMARY : The Cecropia genus consists of about 60 species distributed for all Latin

America, most of then with occurrence in Brazil. These species are widely used in traditional medicine to treat cough, asthma, bronquitis, high blood pressure, inflammation, heart diseases and as diuretic. In the last years, have been an increase in the numbers of researches with Cecropia species, which reports several phytochemical and pharmacological studies. Concerning chemical composition, phenolic as flavonoids O gênero Cecropia - Publicação 21 and proanthocyanidins compounds are related as main constituents while pharmacological activities reported as hypoglycemic, hypotensor and antidepressant.

This paper aimed to emphasize the most recently researches about the chemical composition and biological activities of Cecropia genus.

PALAVRA CHAVE: Cecropia , composição química, flavonóides, atividades farmacológicas.

KEYWORDS: Cecropia , chemical composition, flavonoids, pharmacological activities.

INTRODUÇÃO

O gênero Cecropia possui cerca de 60 espécies descritas com ampla distribuição principalmente no México, Brasil, Paraguai e Argentina. 1 No Brasil são descritas em torno de 50 espécies as quais podem ser encontradas nas regiões Norte (Floresta

Amazônica), Centro-Oeste, bem como no Sudeste e Sul (Mata Atlântica). 2

Primeiramente descrito na família Moraceae, o gênero Cecropia sofreu nova classificação na década de 70, sendo reclassificado para a família Cecropiaceae. 3,4

Embora essa proposição tenha sido adotada por muitos investigadores, estudos taxonômicos mais recentes, com abordagens morfológicas e filogenéticas, sugerem uma outra classificação para o gênero Cecropia , incluindo-o na família Urticaceae. 5

Espécies de Cecropia são, em sua grande maioria, árvores de vegetação secundária, de porte médio a alto, variando entre 5 a 25 metros, de tronco segmentado, ereto e oco, com 10-25 centímetros de diâmetro externo. Possuem folhas largas cuja coloração e textura diferem conforme a espécie. 1 As inflorescências são carnosas e apresentam cores que variam entre cinza e vermelho, servindo de alimento para diversos pássaros e morcegos. 6 Os troncos ocos de algumas espécies são habitados por formigas, em especial as do gênero Azteca , o que é considerado por muitos investigadores como O gênero Cecropia - Publicação 22 vantajoso para ambos os organismos, oferecendo proteção e influenciando no desenvolvimento da planta.7,8 O bicho-preguiça (Bradypus sp .) também faz uso dessas espécies, alimentando-se dos brotos e das folhas. 9,10

A utilização tradicional, que perdura até os dias de hoje, associada a sua ampla distribuição na América Latina, fez com que os estudos científicos com espécies do gênero Cecropia tenham tido um grande avanço nos últimos anos. Em vista disso, o objetivo dessa revisão é compilar informações da literatura sobre espécies de Cecropia , com ênfase na composição química e nas atividades farmacológicas descritas até o presente momento.

Etnofarmacologia

As espécies do gênero Cecropia são conhecidas por vários nomes populares, destacando-se no Brasil os nomes embaúba, imbaúba, umbaúba e embaúva, todas derivadas da palavra tupi “ambaíba”, que significa tronco oco. Nos demais países da

América Latina as espécies são denominadas popularmente como guarumbo, yarumo, torém, ambaí, entre outros. Na língua inglesa, são descritas principalmente como ambay e trump-tree. Essas denominações populares apresentam ainda variações conforme a coloração das inflorescências, como por exemplo, embaúba-vermelha (C. glaziovii ), embaúba-branca (C. palmata ) e embaúba-prateada (C. pachystachya ). 1,2,11

Além de distintos nomes populares, os usos tradicionais também são diversos.

De maneira geral, espécies do gênero Cecropia são utilizadas na medicina popular para o tratamento de problemas respiratórios, como tosse, asma e bronquite, pressão alta, inflamações, além de serem empregados como diurético e cardiotônico. 2,12,13,14,15

Também são citados usos para o tratamento do Diabetes, infecções fúngicas, desinterias e doenças venéreas 11,16,17 (Tabela 1) . O gênero Cecropia - Publicação 23

O uso desses vegetais pela população ocorre basicamente na forma de chá. Para algumas espécies destaca-se o uso popular para uma patologia específica, como C. obtusifolia e C. peltata (“guarumo”, “guarumbo”), as quais são freqüentemente citadas para o tratamento da Diabetes melito 1,18,19 e C. glaziovii (“embaúba”) utilizada no controle da pressão arterial e como diurética. 20 Esses usos são relatados também para outras espécies do gênero também conhecidas por “embaúba”, como C. hololeuca e C. palmata .21

Tabela 1: Indicações etnofarmacológicas descritas para espécies de Cecropia .

Material Espécie Uso popular Referência Vegetal

C. adenopus Combate a pressão alta, tosse, Folhas 31,32,33,34

asma, bronquite, diurético, tratamento de resfriado crônico e

da Diabetes melito.

Diurético Raiz

C. catarinensis Combate à asma, pressão alta e Folhas 12,17,26

inflamação, diurético e anti-

espasmódico, corrimento,

bronquite e cardiotônica

C. glaziovii Diurético, antidiabético, combate - 16,27,28

à asma, pressão alta, fortificante

do coração, tratamento de

inflamações, combate a tosse, O gênero Cecropia - Publicação 24

bronquite e dispnéia.

C. hololeuca Diurético, energético, tônico, Folhas 2,26

emenagogo, tratamento da leucorréia, amenorréia e afecções

respiratórias, combate a asma e

pressão alta.

C. obtusa Combate a doenças coronarianas, Folhas, caule e 30

reumatismo e como tranqüilizante. casca

C. obtusifolia Combate à pressão alta, Folhas 22,23,24,25

tratamento de inflamações,

calmante, tratamento de artrite e

reumatismo, tratamento da

Diabetes melito, diminuir o açúcar

no sangue (hipoglicemiante).

C. pachystachya Pressão alta. - 9,15,35,36,37

Doenças do fígado, enxaquecas, Folhas

coqueluche, combate a tosse e

asma, como diurético e fortificante

do coração.

Combate a tosse e asma e como Folhas e cascas

expectorante.

Tratamento da Diabetes melito Brotos

C. palmata Antileucorréia, antidiarréica, Folhas 11,30 O gênero Cecropia - Publicação 25

antidiabética, estimulante e

diurética

Combate a doenças coronarianas, Folhas, caule e

reumatismo e como tranqüilizante. casca

C. peltata Combate ao Mal de Parkinson e Folhas 2,13,14,17,19,29

malária, combate a tosse, bronquite e resfriados, combate a

pressão alta

Úlceras gangrenosas e cancerosas, Látex

verrugas e chagas crônicas

Tratamento da Diabetes melito Folhas e raízes

tipo 2.

Combate à asma, contra infecções -

fúngicas.

C. purpurascens Tratamento contra leishmania - 38

Além dos usos na medicina tradicional é relatada a aplicação das cascas destas

espécies na indústria de curtume do couro, devido ao seu elevado teor de taninos, e da

madeira na produção de celulose e na construção de caixas e pequenas jangadas. 1 Outro

aspecto também mencionado é a utilização como árvores de replantio em áreas de

desmatamento, devido ao seu rápido crescimento, o que tem ajudado a difundir o gênero

por diversas regiões do país. 15,39

O gênero Cecropia - Publicação 26

CONSTITUIÇÃO QUÍMICA

Entre as 60 espécies descritas no gênero Cecropia , apenas 10 espécies apresentam relatos sobre a composição química. As substâncias descritas com maior freqüência são terpenóides, esteróides e compostos fenólicos como proantocianidinas e flavonóides. 35,40,41,42,43

Especificamente sobre os terpenóides são relatados os ácido ursólico, oleanólico e pomólico, e seus derivados, 32,38,44,45,46,47 mono e sesquiterpenos, além de ácidos graxos e esteróides, especialmente β-sitosterol. 35,44,45,46,48

Dentre os flavonóides (figura 1) são relatados orientina (1) , isoorientina (2) e isovitexina (3) para C. glaziovii e C. lyratiloba , orientina e isoorientina para C. hololeuca e C. adenopus , isoorientina e isovitexina para C. pachystachya e isoorientina para C. obtusifolia .35,40,50,52 É relatado ainda a presença de vitexina (4) e rutina (5) para

C. adenopus .35 Especificamente para C. lyratiloba foi identificado também a C- glicosilflavona, 6-C-galactosil-6”-O-β-galactopiranosilapigenina (6) 50 enquanto C. glaziovii e C. pachystachya apresentam o flavonóide O-heterosídeo, isoquercitrina (7). 40

As proantocianidinas relatadas (figura 2) são catequina, epicatequina e as procianidinas B2 e C1 em C. glaziovii , C. hololeuca e C. pachystachya , além do ácido protocatéquico nestas duas últimas espécies. 40 Recentemente foram identificadas também as procianidinas B3 e B5 em C. glaziovii .42 Outros compostos fenólicos descritos em espécies de Cecropia são o ácido clorogênico em C. glaziovii, C. hololeuca, C. obtusifolia, C. pachystachya e C. peltata 40,49,51 e escopoletina em C. palmata .36

Figura 1: Glicosídeos de flavonóides isolados do gênero Cecropia . Gli = glicose; Ram

= ramnose; Gal = galactose; Pir = piranose (34,41,50,51) O gênero Cecropia - Publicação 27

R1 OH R4

OH O

R3 R2

OH O

R1 R2 R3 R4 1 OH H H Gli 2 OH H Gli H 3 H H Gli H 4 H H H Gli 5 OH O-Gli-Ram H H 6 H H Gal-O-β-Gal-Pir H 7 OH O-Gli H H

Figura 2: Procianidinas relatadas para o gênero Cecropia .(41,43)

OH OH

OH OH

OH O OH O

OH OH OH OH (+)-Catequina (-)-Epicatequina

OH

OH OH

OH OH O

OH OH O OH OH OH OH OH O OH OH OH OH OH O OH OH

OH OH O OH

OH OH Procianidina B2 OH Procianidina C1 (epicatequina-(4 β
8)- (epicatequina-(4 β
8)-epicatequina) epicatequina-(4 β
8)-epicatequina) O gênero Cecropia - Publicação 28

OH

OH

OH OH O OH

OH OH O

OH OH OH OH OH OH

OH HO OH O O

H OH H OH HO Procianidina B3 OH (catequina-(4 β
8)-ent -catequina) Procianidina B5 (epicatequina-(4 β
6)-epicatequina)

HO

O

HO C C H H O COOH

OH

OH OH Ácido clorogênico

PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS

Os ensaios farmacológicos do gênero Cecropia estão centrados principalmente nas espécies C. glaziovii, C. obtusifolia, C. lyratiloba e C. pachystachya . De maneira geral, os trabalhos referem-se a estudos pré-clínicos havendo apenas dois trabalhos que apresentam ensaios clínicos. A Tabela 2 sumariza as atividades farmacológicas descritas para as espécies do gênero.

Atividades cardiovasculares

A avaliação do efeito hipotensor causada pelo extrato aquoso de C. glaziovii via oral em ratos indicou que este efeito ocorre pelo relaxamento da musculatura lisa através de dois mecanismos: bloqueio dos canais de cálcio tipo I e por ação em O gênero Cecropia - Publicação 29 receptores β-2 adrenérgicos, sendo a C-glicosilflavona isovitexina responsável pela ação

β-adrenérgica. 52 Ensaios in vitro com os extratos diclorometano/metanol e metanólico das folhas desta mesma espécie causaram inibição da Enzima de Conversão da

Angiotensina (ECA). 40,53,54 As folhas, cascas e estípulas de C. glaziovii, C. hololeuca e

C. pachystachya também apresentaram inibição da ECA, sendo a atividade relacionada a um sinergismo entre os C-glicosídeos e as proantocianidinas visto que estes compostos não apresentaram a mesma atividade quando isolados. 40

A avaliação in vivo dos efeitos inibitórios do extrato aquoso de C. glaziovii sobre a ECA demonstrou que uma única administração do extrato não causou modificação na atividade desta enzima plasmática, pressão arterial, ou nos batimentos cardíacos. Contudo, administrações repetidas, reduziram a pressão arterial após 14 dias de tratamento. Segundo os autores, a hipotensão provocada pelo extrato da planta não estaria relacionada à inibição desta enzima, mas ao bloqueio dos canais de Ca 2+ na musculatura lisa. 55 Adicionalmente, a administração crônica do extrato aquoso e da sua fração butanólica induziu hipotensão tanto em ratos normotensos quanto hipertensos, sendo que este efeito seria independente de bloqueio específico de receptores α1 ou

56 AT 1.

Extratos aquosos de C. pachystachya de região neotropical (Misiones/Argentina) e região temperada (Córdoba/Argentina) foram avaliados quanto aos seus efeitos cardiovasculares em ratos. 37 O exemplar coletado na região neotropical apresentou maior atividade hipotensora, enquanto que o coletado na região temperada apresentou um aumento significativo nos batimentos cardíacos. Esses efeitos ocorreriam devido à inibição central da inervação autônoma, justificando a hipotensão pelo bloqueio simpático nos vasos e a taquicardia pela inibição vagal no coração. Em estudo posterior, O gênero Cecropia - Publicação 30 foram observados ainda propriedades cardiotônicas do extrato aquoso desta mesma espécie em coração isolado e também efeitos sedativos. 57

O extrato metanólico de C. lyratiloba e uma fração rica em flavonóides produziram vasodilatação em aorta de maneira dose-dependente. No entanto, os flavonóides isoorientina, orientina e isovitexina, quando testados individualmente, não reproduziram esta atividade. 26

Atividades sobre o Sistema Nervoso Central

Avaliações in vivo de atividades antidepressiva e ansiolítica foram realizadas para duas espécies do gênero.

O extrato aquoso das folhas de C. obtusifolia gerou uma redução significativa da capacidade exploratória e na capacidade de evasão de camundongos. 23 Já o extrato aquoso das folhas de C. glaziovii não apresentou efeitos ansiolíticos evidentes em ratos após tratamento agudo, mas sim após tratamento crônico. A fração butanólica e uma fração purificada do extrato aquoso foram 10 vezes mais potentes que o extrato bruto, sendo as C-glicosilflavonas orientina e isoorientina, apontadas como responsáveis pela ação. 27

Mais recentemente, o mesmo grupo avaliou os efeitos antidepressivos de C. glaziovii in vivo, e também ex vivo e in vitro . O estudo biomonitorado demonstrou que a atividade antidepressiva ocorre devido ao bloqueio da recaptação de monoaminas no sistema nervoso central, principalmente de noradrenalina, sendo os compostos mais ativos a catequina, procianidina B3 e procianidina B2. 28

Atividade hipoglicemiante O gênero Cecropia - Publicação 31

A atividade hipoglicemiante do extrato aquoso, fração butanólica e dos compostos majoritários (isoorientina e o ácido clorogênico) de C. obtusifolia foram avaliadas em ratos com diabetes induzida por estreptozotocina (STZ). Os extratos, fração e as substâncias isoladas reduziram de maneira significativa os níveis de glicose após 3 horas da administração via oral, sugerindo que a isoorientina e o ácido clorogênico estejam envolvidas no efeito hipoglicemiante. 49

Outro estudo correlacionou os efeitos hipoglicemiantes dos extratos metanólicos de C. obtusifolia e C. peltata com os conteúdos respectivos de ácido clorogênico. C. peltata apresentou maior redução da taxa de glicose em camundongos não-diabéticos e um maior conteúdo de ácido clorogênico quando comparado à C. obtusifolia , observando-se uma correlação linear entre a atividade hipoglicemiante e o conteúdo de

ácido clorogênico nas espécies. 51 Entretanto, em estudo posterior com ratos diabéticos induzidos por STZ, 58 o extrato aquoso de C. peltata apresentou atividade hipoglicemiante menos promissora à observada em estudo anterior com C. obtusifolia .49

A fim de identificar o mecanismo de ação da atividade hipoglicemiante foi avaliado o efeito inibitório da fração butanólica de C. obtusifolia sobre a enzima α- glicosidase. In vivo, a fração butanólica reduziu a glicose plasmática, atingido níveis inferiores aos iniciais da enzima α-glicosidase 90 minutos após a administração do extrato. In vitro , a fração também apresentou elevado grau de inibição da mesma enzima. 59 Em seguida, outro estudo apontou um aumento na recaptação de glicose in vitro tanto em adipócitos insulino-sensíveis quanto em adipócitos insulino-resistentes quando tratados com extrato aquoso de C. obusifolia e com seu composto ativo, o ácido clorogênico, sendo este índice comparável à rosiglitazona. 60

Atividade antiinflamatória O gênero Cecropia - Publicação 32

Duas espécies foram avaliadas sobre seus efeitos antiinflamatórios in vivo . O extrato n-hexano de C. pachystachya produziu efeitos antiinflamatórios significativos através do modelo de edema de pata de rato induzido por carragenina, sendo o β- sitosterol considerado o composto isolado com maior atividade. 35 Recentemente, também foram obtidos resultados positivos para esta atividade com o extrato diclorometano, sendo o ácido pomólico o composto responsável pela atividade. 61

O extrato aquoso de C. obtusifolia apresentou ainda atividade antiinflamatória tópica e sistêmica (via oral) em dois modelos de edema: de orelha, induzido por TPA

(acetato de 12-O-tetradecanoilforbol) e de pata, induzido por carragenina. 23

Atividade antioxidante

Três espécies apresentam estudos sobre suas propriedades antioxidantes . O extrato metanólico de C. pachystachya apresentou inibição da atividade de lipoperoxidação em sistemas enzimáticos e não-enzimáticos. 62 Para C. glaziovii , o extrato hidroetanólico e sua fração butanólica suprimiram a indução de lipoperoxidação assim como atenuou a lesão hepática e ocorrência de estresse oxidativo após a administração de tetracloreto de carbono. 63 Já para C. palmata o extrato metanol:etanol:água:ácido clorídrico (69:20:10:1 v/v/v/v) apresentou atividade antioxidante em ensaios com ORAC (capacidade antioxidante para radical oxigênio) e

TEAC (capacidade antioxidante equivalente em trolox). 30

Demais atividades farmacológicas

Outras atividades para o gênero foram verificadas na literatura. Ensaios in vitro com extratos diclorometano/metanol e etanol 80º GL de caules e folhas de C. obtusifolia demonstraram que estes interagem com os receptores angiotensina (AT 1) e do endotélio O gênero Cecropia - Publicação 33

24 (ET A). O extrato aquoso desta mesma espécie apresentou efeito analgésico, com efeito significativo em modelos de dor induzida quimicamente (ácido acético e formalina), o que sugere um efeito de analgesia periférica. 23

Os triterpenos pentacíclicos ácido tormêntico, ácido euscáfico e ácidos 2 α- acetiltormêntico e 3 β-acetiltormêntico, isolados das raízes de C. lyratiloba 41 foram citotóxicos frente a células leucêmicas, inclusive para a linhagem celular multiresistente, induzindo a morte celular pela ativação da rota apoptótica dependente de caspase-3. 43

Extrato aquoso padronizado 42 de C. glaziovii apresentou atividade broncodilatadora em porcos 64 além de efeito antiulceroso e antisecretor de ácido gástrico em camundongos. 65 Outros relatos de atividades biológicas envolvendo demais espécies de Cecropia são descritos na literatura, conforme segue: C. pachystachya , atividades anticolinesterase 66 e antimalárica 47 ; C. adenopus , ação bloqueadora dos canais de cálcio 32 ; C. purpurascens , inibição do crescimento de Leishmania amazonensis na forma promastigota 38 ; C. peltata , potencial de cicatrização de tecidos in vivo .67

Ensaios Clínicos

Dentre as espécies do gênero Cecropia , apenas C. obtusifolia possui descrição na literatura de ensaios farmacológicos realizados em humanos, sendo ambas avaliações clínicas do efeito hipoglicemiante em pacientes diabéticos tipo 2.

Os efeitos da ingestão diária do extrato aquoso das folhas de C. obtusifolia em

22 pacientes com baixa resposta ao tratamento convencional com hipoglicemiantes orais, durante o período de 21 dias, indicaram que o uso deste extrato reduziu de O gênero Cecropia - Publicação 34 maneira significativa os níveis de glicose, além de reduzir as taxas de colesterol e triglicerídeos. 24

Outro estudo clínico foi realizado em 12 pacientes com diagnóstico recente de diabetes tipo 2, durante 32 semanas. 25 Os pacientes apresentaram um efeito hipoglicêmico significativo e sustentável após 18 semanas de administração diária do extrato de C. obtusifolia , sendo esse efeito mantido 4 semanas após a suspensão do tratamento. Não houve alteração nos níveis de insulina nos pacientes analisados, o que indica que o efeito hipoglicemiante desta planta não está relacionado com a indução na secreção deste hormônio.

Informações de Toxicidade

Devido ao amplo uso de extratos de C. obtusifolia na medicina popular e também pelos ensaios clínicos iniciais que vem sendo desenvolvidos, recentemente foram avaliados efeitos genotóxicos desta espécie. Nas concentrações entre 0,83 e 13,32 mg/mL, o extrato aquoso não induziu mutações somáticas ou recombinações mitóticas em Drosophila melanogaster (teste SMART), assim como também não apresentou nenhum efeito citotóxico ou genotóxico em linfócitos de seis pacientes diabéticos tipo II tratados diariamente com 13,5 g de extrato durante 85 dias. 68

Foram avaliados também efeitos no desenvolvimento físico e comportamental de camundongos expostos ao extrato de C. glaziovii (1,0 g/kg/dia) durante todo o

69 período de prenhez. A DL 50 foi maior que 5,0 g/kg, e a administração do extrato não afetou de maneira significativa o desenvolvimento físico e comportamental da prole.

Tabela 2: Atividades farmacológicas de extratos e compostos isolados de espécies do gênero Cecropia . O gênero Cecropia - Publicação 35

Espécie Extrato / Composto Bioatividade Referência

C. glaziovii Extrato H 2O / isovitexina Antihipertensiva 52

Extrato CH 2Cl 2/MeOH Inibição da ECA 53

Extrato H 2O / orientina e Ansiolítica 27

isoorientina

Extrato EtOH 40º Antioxidante 62

Extrato H 2O / catequina, Antidepressiva 28

procianidina B2 e B3

Extrato H 2O Broncodilatadora 63

Extrato H 2O Antiulcerosa e antisecretora 65

de ácido gástrico

C. obtusifolia Extrato H 2O Hipoglicemiante 49

Extrato H 2O Depressora do SNC 23

Relaxante muscular

Analgésica

Antiinflamatória

Extrato CH 2Cl 2/MeOH e Bloqueio de receptores de 22

EtOH 80º monoaminas

Extrato H 2O / Fração BuOH Inibição da α-glicosidase 59

Extrato H 2O / Ácido Aumento da recaptação de 60

clorogênico glicose O gênero Cecropia - Publicação 36

C. peltata Extrato MeOH Hipoglicemiante 51

Extrato H 2O / EtOH Cicatrizante 66

C. lyratiloba Extrato MeOH / Flavonóides Vasodilatadora 26

Ácidos tormênico, euscáfico, Citotóxica 43

2α- e 3 β-acetiltormêntico

C. pachystachya Extrato C 6H14 / β-sitosterol Antiinflamatória 35

Extrato MeOH Antioxidante 61

Extrato EtOH Anticolinesterase 64

- Antimalárica 47

Extrato H 2O Anti-hipertensiva 37

Extrato H 2O Cardiotônica 57

Sedativa

Extrato CH 2Cl 2 / ácido Antiinflamatória 60

pomólico Apoptótica

C. purpurascens Ácido ursólico Antiparasitária 38

C. catarinensis - Colinomimética 12

C. adenopus Terpenos Bloqueio dos canais de Ca 2+ 32

C. palmata Compostos fenólicos Antioxidante 30

(-): não consta na literatura consultada

CONSIDERAÇÕES FINAIS O gênero Cecropia - Publicação 37

O gênero Cecropia é amplamente distribuído pela América Latina, sendo empregado pela população no tratamento da diabetes, problemas respiratórios, cardíacos e como diurético. Apesar de seu amplo uso tradicional, apenas algumas espécies são estudadas em relação a sua constituição química e atividades farmacológicas. Dentre aquelas que já apresentam um conjunto de estudos significativos, destacam-se C. glaziovii, C. obtusifolia e C. lyratiloba .

Os estudos fitoquímicos relatam, na sua maioria, a presença de flavonóides e proantocianidinas como os principais constituintes do gênero Cecropia , sendo que muitos metabólitos secundários ocorrem concomitantemente em diferentes espécies.

Em relação às propriedades farmacológicas, C. glaziovii apresenta estudos sobre sua atividade anti-hipertensiva, na qual sugere-se como mecanismo de ação o bloqueio dos canais de Ca 2+ na musculatura lisa, sendo apontada a isovitexina como um dos possíveis princípios ativos. A atividade antidepressiva detectada para essa espécie ocorre pela ação das procianidinas B2, B3 e catequina as quais bloqueiam a recaptação de serotonina, dopamina e noradrenalina. Já C. obtusifolia se destaca pelo seu efeito hipoglicemiante, sendo a isoorientina e o ácido clorogênico as substâncias responsáveis por esse efeito. O mecanismo de ação desta atividade ainda não está totalmente esclarecido, embora relatos apontem para atividade junto à enzima α-glicosidase e sobre a recaptação de glicose pelos adipócitos.

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CAPÍTULO 2: Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para a identificação e quantificação de compostos fenólicos em Cecropia glaziovii e Cecropia pachystachya por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 45

1. INTRODUÇÃO Desenvolvida inicialmente para análises bioquímicas, a cromatografia líquida de alta eficiência tem se mostrado ao longo dos anos uma importante ferramenta na análise de produtos naturais. A produção de fases estacionárias com partículas menores e mais homogêneas, assim como o desenvolvimento de fases quimicamente ligadas e a limitação da Cromatografia Gasosa para analisar certas classes de compostos ampliaram o espectro de aplicações dessa técnica. Características como sensibilidade, robustez, precisão e reprodutibilidade fazem com que a cromatografia líquida seja uma das principais técnicas na atualidade para a separação, identificação e quantificação de metabólitos secundários (GHISALBERTI, 2000; STALIKAS, 2007; LANÇAS, 2008). Ensaios analíticos descritos na literatura com espécies de Cecropia têm relatado os flavonóides como um dos constituintes majoritários (LUENGAS-CAICEDO et al., 2007; TANAE et al., 2007), sendo esta classe de compostos apontada como responsável por atividades farmacológicas no gênero Cecropia , como anti-hipertensiva (ALMEIDA et al., 2006; LIMA-LANDMAN et al., 2007) e ansiolítica (ROCHA; LAPA; De LIMA, 2002). Contudo, a maioria das análises destas substâncias por CLAE é com fins qualitativos ou ainda técnicas preparativas. Não foram verificadas na literatura, até o momento, metodologias analíticas visando a quantificação destes compostos na sua forma isolada em qualquer espécie de Cecropia . Além de flavonóides, o ácido clorogênico também é relatado para o gênero Cecropia . Essa substância é apontada como responsável pela atividade hipoglicemiante de C. obtusifolia , o que torna relevante a sua quantificação nas espécies aqui investigadas. (ANDRADE-CETTO; WIEDENFELD, 2001; HERRERA-ARELLANO et al., 2004; REVILLA-MONSALVE et al., 2007; ALONSO-CASTRO et al., 2008; ANDRADE-CETTO; BECERRA-JIMÉNEZ; CÁRDENAS-VÁZQUEZ, 2008). Sendo assim, este capítulo descreve o processo de desenvolvimento e validação de metodologia analítica por CLAE para a identificação e quantificação dos compostos fenólicos majoritários, em especial flavonóides C-glicosídeos, nas folhas das espécies C. glaziovii e C. pachystachya .

2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Análise de compostos fenólicos por CLAE Como já apresentado (ver Capítulo 1), os constituintes majoritários do gênero Cecropia são compostos fenólicos, em especial, flavonóides. A técnica de CLAE foi usada Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 46

pela primeira vez para a determinação de flavonóides em 1976, sendo eficaz em termos de identificação e quantificação, além de fornecer excelente resolução e reprodutibilidade. (MERKEN; BEECHER, 2000) Ainda, devido à relativa massa molecular elevada e fatores intrínsecos dos flavonóides como agliconas hidrofóbicas e glicosídeos hidrofílicos, a maioria dos métodos cromatográficos descritos na literatura para estes compostos são por CLAE (MARSTON; HOSTETTMANN, 2006; STALIKAS, 2007). O uso da cromatografia líquida para a análise de flavonóides e compostos fenólicos de uma maneira geral está amplamente descrito na literatura, sendo encontradas diversas revisões sobre o assunto (MERKEN; BEECHER, 2000; MOLNÁR-PERL; FÜZFAI, 2005; RIJKE et al., 2006; STALIKAS, 2007). As fases estacionárias empregadas são quase que exclusivamente do tipo reversa, destacando-se colunas C-18 ou ainda C-8. Os sistemas de eluição utilizados na análise de compostos fenólicos são geralmente binários, sendo um dos componentes uma fase aquosa acidificada e outra, menos polar, onde se utiliza comumente metanol ou acetonitrila. Como compostos fenólicos possuem conhecida absorção na região do ultravioleta (UV), a grande maioria dos trabalhos utiliza detectores UV na análise de flavonóides, sejam eles de feixe simples ou de varredura (detecção por arranjo de diodos – DAD). A detecção por UV para flavonóides justifica-se pelo fato destes compostos apresentarem espectro característico, com duas bandas de absorções: a banda II (240-285 nm), referente ao anel A, e a banda I (300-550 nm), referente ao anel B. Nas análises por CLAE, os comprimentos de onda mais comumente utilizados são 254, 280, 330, 340 e 360 nm, sendo mais indicada a detecção em comprimento de onda referente ao anel B (330, 340 e 360 nm), o que assegura uma maior especificidade ao método (MERKEN; BEECHER, 2000; MOLNÁR-PERL; FÜZFAI, 2005; RIJKE et al., 2006; STALIKAS, 2007). Essas condições cromatográficas descritas aplicam-se tanto para flavonóides em sua forma livre ou glicosilada, sejam estas do tipo C-glicosídeo ou O-glicosídeo, ou ainda ácidos fenólicos.

2.2 Validação de métodos analíticos O desenvolvimento de um método analítico abrange vários fatores, tais como o procedimento de extração, a matriz envolvida e as próprias condições cromatográficas. Uma vez essas etapas padronizadas, elas devem ser validadas. A validação é um processo que fornece uma evidência documentada de que o método é confiável ao que se aplica. Consiste Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 47

em uma série de procedimentos que visam assegurar confiabilidade às medidas obtidas (RIBANI et al., 2004; LANÇAS, 2008). Os principais parâmetros que devem ser avaliados na validação de um método analítico que emprega extratos vegetais são seletividade, linearidade, faixa de concentração de trabalho, precisão, exatidão e sensibilidade (CASS; DEGANI, 2001; ANVISA, 2003; RIBANI et al., 2004; ICH, 2005). Seletividade é a habilidade de um método separar o composto de interesse, assegurando que o sinal medido não seja influenciado por substâncias interferentes. É determinada através de diversas replicatas (n ≥ 6), em diversos valores de detecção. O uso de detectores de arranjo de diodos é especialmente útil para esse fim, uma vez que permite em uma só análise a observação em diversos comprimentos de onda (CASS; DEGANI, 2001; ICH, 2005). A linearidade representa a capacidade de um método produzir resultados proporcionais à concentração do analito em questão, dentro de um determinado intervalo. Determina-se a linearidade através de medidas da amostra em diversas concentrações, ou seja, pela construção de curvas de calibração, sendo esta avaliada pelo cálculo de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados e da correlação linear (r 2) (CASS; DEGANI, 2001; ICH, 2005). A faixa de concentração de trabalho é o intervalo delimitado pelos níveis superior e inferior de concentração do analito, que obedeçam aos requisitos exatidão, linearidade e precisão. A precisão é definida como a habilidade do método reproduzir o mesmo resultado, sempre que o procedimento for executado, demonstrando concordância entre uma série de medidas. É obtida pelo coeficiente de variação (CV %), de amostras injetadas em, no mínimo, triplicata. Pode ser determinada através de diferentes maneiras: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade. A primeira mede o grau de variação de uma série de replicatas de injeção em um curto intervalo de tempo. A precisão intermediária expressa o efeito das variações dentro do laboratório devido a análises em diferentes dias não consecutivos, enquanto que a reprodutibilidade é avaliada através de análises realizadas em diferentes laboratórios (CASS; DEGANI, 2001; ICH, 2005). Já a exatidão representa a concordância entre o valor encontrado pelo método e o valor aceito como verdadeiro. Freqüentemente é expressa como percentagem (%) de recuperação. O parâmetro de sensibilidade compreende a determinação do limite de quantificação e detecção. O limite de quantificação representa a menor concentração do analito que pode ser medida com uma precisão especificada. Usualmente, é avaliado pelo coeficiente de variação. O limite Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 48

de detecção é a menor concentração do analito que produz resposta considerada detectável. Normalmente é avaliada através da relação sinal:ruído, em uma proporção 3:1 (CASS; DEGANI, 2001; ICH, 2005). O artigo a seguir apresenta a separação, identificação e quantificação dos compostos fenólicos majoritários das folhas das espécies C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE-DAD.

PUBLICAÇÃO: Simultaneous Quantitative Assay of Major Phenolic Compounds from Two Brazilian Cecropia Species by HPLC-DAD Geison M. Costa, Eloir P. Schenkel, Flávio H. Reginatto Phytochemical Analysis -Manuscrito em preparação-

Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE – Publicação 49

Simultaneous Quantitative Assay of Major Phenolic Compounds from Two

Brazilian Cecropia Species by HPLC-DAD

Geison M. Costa; Eloir P. Schenkel; Flávio H. Reginatto*.

Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brazil.

*Address to correspondence: Flávio H. Reginatto, Laboratório de Farmacognosia,

Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Catarina,

Campus Universitário, Trindade, Florianópolis, SC, Brazil, Postal Code: 88040-900.

Phone: +55 (48) 3721 5075; e-mail: [email protected]

ABSTRACT

An efficient and reproducible HPLC-DAD method for the simultaneous quantification of chlorogenic acid, isoorientin, orientin and isovitexin, the four major compounds from two Cecropia species ( C. glaziovii and C. pachystachya ) was developed. HPLC-DAD analysis employed a linear gradient of acetonitrile:acetic acid 1% and detection at 340 nm. The method was validated considering specificity, linearity, accuracy, precision and limits of quantification and detection. The contents of the compounds in the extracts were expressed as mg/g of dry weight material as follow: 1.8 (chlorogenic acid), 0.4

(isoorientin), 0.1 (orientin), and 0.9 mg/g of dry weight (isovitexin) for C. glaziovii and

3.4 (chlorogenic acid), 2.1 (isoorientin), 2.2 (orientin) and 0.9 mg/g of dry weight

(isovitexin) for C. pachystachya .

Keywords: HPLC-DAD, Cecropia , C-glycosylflavonoids, phenolic acids, chlorogenic acid, isovitexin, orientin, isoorietin. Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 50

INTRODUCTION

The genus Cecropia (Urticaceae) consists of about 60 species of trees distributed for all Latin America, some of them with occurrence in Brazil. Cecropia glaziovii

Sneth. and Cecropia pachystachya Trécul. are the most common species in Southeast and South of Brazil (Berg and Rosselli, 2005). These species are popularly known as

‘embaúba’ and widely used in the folk medicine to treat cough, asthma, high blood pressure, inflammations and as diuretic (Pio Corrêa, 1976; Lorenzi and Matos, 2008). In the literature, pharmacological studies have revealed cardiovascular and central nervous system as the most investigated activities for these species (Rocha, Lapa, De Lima,

2002 ; Consolini and Migliori, 2005; Consolini et al., 2006; Lima-Landmann et al.,

2007; Ninahuamann et al., 2007; Rocha et al., 2007). Concerning chemical composition, flavonoids, procyanidins and catechins were already reported from these plants

(Lacaille-Dubois, Franck, Wagner, 2001; Tanae et al., 2007).

However, as far as we are aware, there is only one report that showed a percentual evaluation of these compounds for C. glaziovii (Tanae et al., 2007), but not a individual quantitative analysis for the major phenolic compounds from C. glaziovii or

C. pachystachya leaves. In this sense, the development of chromatographic identification and assay methods based on the chemical constituents, mainly phenolic compounds, may contribute significantly to the standardization of the crude drug and extracts.

Then, the aims of this paper were the separation, identification and quantification of the major phenolic compounds from the leaves of C. glaziovii and C. pachystachya (focused on C-glycosylflavonoids), by High Performance Liquid

Chromatography (HPLC/DAD). Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 51

EXPERIMENTAL

Chemical Reagents. Acetonitrile and acetic acid (HPLC-grade) were provided by

Tedia ® (RJ, Brazil). Water was purified with a Milli-Q system (Millipore ®, Bedford,

USA). All solutions prepared for HPLC were filtered through a 0.45 m membrane before use. Chlorogenic acid and isovitexin (4’,5,7-tetrahydroxyflavone-6-glucoside) were purchased from Sigma-Aldrich ® Co. (St. Louis, USA). Isoorientin (3’,4’,5,7- tetrahydroxyflavone-6-glucoside) and orientin (3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavone-8- glucoside) were isolated from Passiflora edulis var. flavicarpa , and identified by TLC,

UV, IR and 1H NMR spectrometryc methods.

Plant material and sample preparation. Aerial parts of C. glaziovii Sneth. were collected in Florianópolis, State of Santa Catarina, Brazil, in September, 2007, and a voucher specimen (FLOR 37143) is deposited in the Herbarium of the Botany

Department of Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brazil. Aerial parts of C. pachystachya Trécul. were collected in Viamão, State of Rio Grande do Sul,

Brazil, in March of 2007 and a herbarium specimen (ICN 150025) is deposited in the

Botany Department of Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

Brazil. Leaves were air dried at 40°C for 7 days. The aqueous extracts from Cecropia species were prepared, separately, by infusion. Powdered leaf material (10 g) was extracted with distilled water (100 mL) during 30 minutes. The cooled extract was filtered and lyophilized. This procedure was made in triplicate.

Quantitative high-performance liquid chromatography analysis. The quantitative analysis of phenolic compounds was carried out in a PerkinElmer (Series 200 High- Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 52

Performance Liquid Chromatography (HPLC) system, equipped with EP Diode Array

Detection (DAD), quaternary pump, on-line degasser and autosampler. The data were achieved by TotalChrom ® Workstation software. The injection volume was 10 µL.

Baseline resolution was obtained at room temperature (25±1°C) using a PerkinElmer

Brownlee Choice C 18 column (150 x 4,6 mm i.d.; 5 m) and linear gradient combining solvent A (acetonitrile) and solvent B (acetic acid 1%, adjusted to pH 3.0 with NaOH) as follow: 5-20% A (0-30 min) and isocratic 20% A (30-40 min). The mobile phase was prepared daily and degassed by sonication before use. The flow rate was kept constant at 1.0 mL/min and the chromatograms were recorded at 340 nm while the UV spectra were monitored over a range of 450 to 200 nm. The peaks were characterized by comparing the retention time and UV spectra with reference standards, and by co- injection of the sample and standards. The standard solutions were prepared in different concentrations, as follow: chlorogenic acid, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 30.0 g/mL; isoorientin, 2.0, 5.0, 7.0, 15.0, 20.0 g/mL; orientin, 0.7, 1.0, 3.0, 7.0, 10.0, 20.0 g/mL and isovitexin, 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 g/mL. The quantification of the individual compounds was performed using a five point regression curve (r 2 > 0,99). All standard solutions were analyzed in triplicate and the peak average areas measured.

Validation of analytical procedures. The validated parameters were developed according to Cass and Degani, (2001), ANVISA (2003) and ICH guidelines (2005). The parameters method evaluated and validated were specificity, linearity, accuracy, precision (repeatability and intermediate precision), limit of quantification (LOQ) and limit of detection (LOD).

Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 53

RESULTS AND DISCUSSION

The source and quality of raw materials play an important role in warranty the quality and stability of herbal preparations. Chromatographic methods have been the main technique for characterization and quantification of natural products and the

HPLC is the method of choice for analysis of polyphenolic compounds due to its versatility, accuracy and relative low cost. Considering these compounds, several chromatographic systems were already proposed, employing UV detection, polar mobile phases and reversed stationary phase (Merken, Beecher, 2000; Rijke et al., 2006;

Stalikas, 2007).

The chromatographic system which showed better results in our work was consisted by a reverse-phase column (C-18), using acetonitrile and acidified water (with acetic acid, 1%, v/v – pH 3.0) as the mobile phase. The use of acetonitrile instead of methanol promoted a sharp and symmetrical peak, with good baseline resolution and minimal tailing, thus facilitating the accurate measurement of peak area ratio. Figure 1 shows a typical chromatogram of crude extracts from C. glaziovii and C. pachystachya . Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 54

(A)

(B) Figure 1: Chromatograms of C. glaziovii (A) and C. pachystachya (B) crude extracts

with diode array detection at 340 nm. 1. Chlorogenic acid; 2. Isoorientin; 3. Orientin; 4.

Isovitexin. Glu: glucose. For chromatographic conditions, see Experimental section. Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 55

The four phenolic compounds quantified in these species were the major peaks present in the extracts, and were identified by the UV spectra, as a caffeoylquinic acid and flavonoids with a flavone nucleus. Using authentic samples and by comparing their retention times and UV spectra, it was possible to characterize the substances as chlorogenic acid (1) (R t: 14.0min; λmáx : 300sh, 325nm), isoorientin (2) (R t: 24.5min;

λmáx : 255, 270, 348nm); orientin (3) (R t: 25.7min; λmáx : 255, 266, 348nm) and isovitexin

(4) (R t: 28.8min; λmáx : 270, 337nm). These compounds were already related for these species, with exception of orientin, that was previously described only for C. glaziovii ,

C. hololeuca , C. lyratiloba e C. adenopus (Hikawczuk, 1998; Lacaille-Dubois, Franck,

Wagner, 2001; Oliveira et al., 2003; Tanae et al., 2007), As far as we are aware, this is the first report of this compound from C. pachystachya leaves and quantification of these metabolites in these Cecropia species.

Quantification and validation procedures

Four standard solutions were prepared, in the concentrations range of 0.7-30 ug/mL. The standard solutions were injected in triplicate and the detector responses measured. The calibration curve was building by concentration of phenolic standard solutions ( g/mL) and their peak areas. The results are show in Table 1 , with good linear relationship between peak area and concentration (r 2 > 0,99) for all standards solutions. The limit of quantification (LOQ) and limit of detection (LOD) were defined by R.D.S. <5% and by signal:noise ratio 3:1, respectively. The content of the major phenolic compounds in these two species are show in Table 2 .

Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 56

Table 1: Calibration data of phenolic standards.

Linearity range Correlation factor LOQ b LOD b Compound Calibration equation a (g/mL) (r 2) (g/mL) (g/mL) chlorogenic acid 5.0 - 30.0 y = 20956x - 21226 0.996 1.25 0.1580 isoorientin 2.0 - 20.0 y = 30182x - 10283 0.994 0.50 0.0625 orientin 0.7 - 20.0 y = 10059x + 2484,5 0.999 0.35 0.0875 isovitexin 2.0 - 15.0 y = 22315x - 11043 0.997 0.25 0.0625

a: Five data points ( n = 3)

b: LOQ = limit of quantification; LOD = limit of detection

Table 2: Phenolic acid and C-glycosylflavonoids content in Cecropia samples a.

Caffeoylquinic acid C-glycosylflavonoids

Cecropia specie Chlorogenic acid Isoorientin Orientin Isovitexin

C. glaziovii 1.8 ± 0.07 0.4 ± 0.01 0.1 ± 0.01 0.9 ± 0.03

C. pachystachya 3.4 ± 0.10 2.1 ± 0.06 2.2 ± 0.04 0.9 ± 0.03

a: Expressed as mg/g of dry plant ± SD ( n = 3).

In the literature there is an absence of C-glycosylflavonoid quantification in

Cecropia species, but several researches concerning quantification of these compounds

in other species. Analysis with different Swertia species showed a content of isoorientin

in the range of 4.8 – 0.1 mg/g of plant (Wang et al., 2008) and in Gentiana lutea the

same compound showed variation between 0.93 – 0.32 % in relation of dry weight

(Menkovic, Fodulovic, Savin, 2000). Quantification of C-glycosylflavonoid in Cajanus

cajan showed 1.5 % of isovitexin in the crude extract (Fu et al., 2007). Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 57

In the genus Cecropia , quantitative analysis of chlorogenic acid has been report only for C. obtusifolia . The content of this compound are in the range of 13.2 – 3.0 mg/g of dry weight (Herrera-Arellano et al., 2004; Nicasio et al., 2005) or 0.2 mg/g extract (Revilla-Monsalve et al., 2007; Toledo et al., 2008). In our research the chlorogenic acid content found for C. glaziovii (3.4 ± 0.10) and C. pachystachya (1.8 ±

0.07) are similar with C. obtusifolia as described by Herrera-Arellano et al. (2004).

Considering that the qualitative fingerprint showed differences between species for phenolic compounds, quantitative analysis allowed to ensure their authenticity. Also, it was possible observe distinct flavonoid profile for these two Cecropia species, in which C. glaziovii has isovitexin as major C-glycosylflavonoid while for C. pachystachya isoorientin and orientin are observed as the major C-glycosylflavonoids.

Although a few studies reports simultaneous HPLC analysis of more than one classes of compounds in Cecropia species or a quantitative analysis of different species in this genus (Lacaille-Dubois, Franck, Wagner, 2001; Nicasio et al., 2005; Tanae et al.,

2007), the methodology herein developed allowed the analysis of two Cecropia species and quantification, in a single run, of four substances from two classes of phenolic compounds: phenolic acids and C-glycosylflavonoids, using the same chromatographic conditions.

On the other hand, the analysis showed a relative long time run (40 minutes) considering only C-glycosylflavonoids, but in view of different classes of compounds investigated and the good separation and baseline resolution between all peaks analyzed, the methodology showed an improve on simultaneous quantitative assay of these phenolic compounds when compared with others reports in the literature (Ragone et al., 2007; Pongpan; Luanratana; Suntornsuk, 2007; Tunalier et al., 2007). In addition,

C-glycosylflavonoids isomer pairs, especially orientin/isoorientin, usually show a Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 58 difficult separation, with poor resolution (Bramati; Aquilano; Pietta, 2003; Pereira;

Yariwake; McCullagh, 2005), our method was suitable for this separation, as well as for all other phenolic compounds present in the extracts.

The precision was determined by repeatability (Intra-day assay) and intermediate precision (Inter-day assay) ( Table 3 ). The intra-day assay was estimated by triplicate analysis of three different concentrations of standard solutions, and expressed as relative standard deviation. Good repeatability was obtained from the lower, medium and higher concentrations of the curve, with a R.S.D. <3.5% for all standard analysis. The inter-day assay was determined by the analysis of the medium concentration in the curve, three times a day, in three different days. As well as another precision parameter, R.S.D. value was not exceeding the limits preconized in the literature (Cass; Degani, 2001;

ANVISA, 2003; ICH, 2005).

Table 3: Repetibility and intermediate precision data of phenolic standards.

a a Repetibility Intermediate precision Compound Concentration R.S.D. (%) Concentration R.S.D. (%)

(g/mL) (g/mL)

Chlorogenic acid 10.0 2.9 15.0 0.5 15.0 0.4 25.0 0.5 Isoorientin 5.0 2.3 7.0 0.9 7.0 0.9 15.0 0.3 Orientin 1.0 2.7 7.0 1.0 7.0 4.3 10.0 1.4 Isovitexin 2.0 3.4 7.0 0.7 7.0 1.0 10.0 0.7 a: Limits: R.S.D. <5%. Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 59

The accuracy showed good recovery for all standards in both extracts, and was determined by spiking samples with the standard solutions. For this, 200 L of diluent

(acetonitrile:water, 1:1 v/v) or solution containing chlorogenic acid, isoorientin, orientin or isovitexin was added to 200 L of the crude extract solution. The concentration of samples and standards solutions, as well the average recovery values are shown in

Table 4 .

Table 4: Accuracy data of phenolic compounds.

Specie Compound Recovery b

Mean (%) R.S.D. (%)

C. glaziovii Chlorogenic acid (15.0 g/mL) 98.9 0.2

(1 500 g/mL) Isoorientin (7.0 g/mL) 101.1 1.7

Orientin (3.0 g/mL) 101.6 3.8

Isovitexin (7.0 g/mL) 104.9 0.9

C. pachystachya Chlorogenic acid (15.0 g/mL) 100.0 0.7

(700 g/mL) Isoorientin (15.0 g/mL) 101.4 0.4

Orientin (10.0 g/mL) 104.3 0.5

Isovitexin (5.0 g/mL) 101.4 1.6 b: Recovery was determined by injection of spiked samples, in triplicate, with standard solution

In summary, a precise, accurate and reproducible analytic procedure has been developed. Furthermore, the reported C-glycosylflavonoids values suggest that is Quantificação de compostos fenólicos de C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE 60 possible to use isovitexin as a phytochemical marker for C. glaziovii , while isoorientin could be a phytochemical marker for C. pachystachya .

Acknowledgements

This project was supported by CNPq (Grant: 475826/2008-6) and FAPESC (Grant:

008/2006). The authors also thanks to Prof. Dr. Ângela Campos for collaboration and

Prof. Dra. Lilian A. Mentz and Prof. Dr. Daniel Falkenberg for colletion and identification of plant materials.

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CAPÍTULO 3: Isolamento e caracterização de flavonóides em folhas de Cecropia glaziovii e Cecropia pachystachya

Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya 66

1. INTRODUÇÃO Apesar da revolução na indústria farmacêutica impulsionada pela produção de fármacos sintéticos, os medicamentos que empregam substâncias de origem natural produzidas a partir do metabolismo secundário, nunca deixaram de possuir importância clínica e econômica. Atropina, efedrina, morfina, digoxina, taxol, vincristina e vimblastina são alguns exemplos de fármacos de origem vegetal de grande relevância na área médico- farmacêutica (GILANI; RAHMAN, 2005; PATWARDHAN, 2005; NEWMAN; CRAGG, 2007). Adicionalmente, os produtos naturais, em especial os de origem vegetal, são usados ainda como matéria-prima para a síntese de moléculas complexas de interesse farmacológico, e principalmente como protótipos para o desenvolvimento de novos medicamentos pelas grandes indústrias (PIETERS; VLIETINCK, 2005). No caso de medicamentos fitoterápicos, os estudos dos constituintes químicos dos vegetais são essenciais para a padronização destas preparações. O isolamento e/ou identificação de seus metabólitos ativos, assim como a caracterização da matéria-prima vegetal e do extrato constituem uma etapa indispensável para a garantia da eficácia, segurança e qualidade destes medicamentos (SCHULZ; HÄNSEL; TYLER, 2002). Conforme apresentado no Capítulo 1, as espécies C. glaziovii e C. pachystachya possuem relatos na literatura que apontam flavonóides C-glicosídeos, tais como isovitexina (CYSNEIROS, 1996) e isoorientina (ROCHA; LAPA; De LIMA, 2002), como possíveis compostos ativos em seus extratos. Embora sejam espécies de fácil distinção considerando sua morfologia vegetal e possuam alguns trabalhos na literatura que descrevam seus constituintes químicos, suas composições ainda não foram plenamente estudas, em especial em extratos aquosos, os quais são utilizados na medicina popular, assim como o comportamento desses compostos nestas espécies ao longo de seu desenvolvimento. Este capítulo apresenta o processo de isolamento dos flavonóides C-glicosídeos majoritários das folhas das espécies de C. glaziovii e C. pachystachya , sua identificação e a caracterização destes compostos considerando possíveis variações sazonais.

2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Flavonóides Entre os principais metabólitos secundários de interesse farmacêutico destacam-se os flavonóides, sendo eles de ampla distribuição no reino vegetal e de grande diversidade estrutural. Formado a partir da conjugação do 4-cumaril-CoA com três moléculas de malonil- CoA, o núcleo básico dos flavonóides (2-fenilcromano) é constituído de 15 átomos de Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya 67

carbono distribuídos em três anéis, com distribuição do tipo C 6-C3-C6 e identificados como anéis A, C e B, respectivamente (Figura 2) (HARBORNE; WILLIAMS, 2000; ANDERSEN; MARKHAM, 2006).

3'

2' 4' B 8 1' O 5' 7 2 6' A C 3 6 4 5 O Figura 2: Núcleo fundamental dos flavonóides e sua numeração.

Diversas atividades farmacológicas estão associadas à presença de flavonóides, o que os qualifica como uma classe de produtos naturais com alto potencial biológico. Dentre estas citam-se atividade antiviral (EVERS et al., 2005; VELJKOVIC et al., 2007), antifúngica e antibacteriana (CUSHNIE; LAMB, 2005), antioxidante (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; PIETTA, 2000), anti-inflamatória (KIM et al., 2004) e antitumoral (GALATI; O´BRIEN, 2004; PLOCHMANN et al., 2007).

2.1.1 Flavonóides C-glicosídeos Nas espécies vegetais, os flavonóides ocorrem na forma de aglicona (forma livre) ou sob a forma de glicosídeos, a mais comum, onde encontram-se ligados ao núcleo fundamental resíduos de açúcar. Essa ligação pode ocorrer através de uma hidroxila, normalmente nas posições C 3 ou C 7, originando os chamados O-glicosídeos ou através de um átomo de carbono, em especial nas posições C 6 ou C 8, originando os C-glicosídeos. Os flavonóides C- glicosídeos podem ser divididos em quatro grupos: os mono-C-glicosilflavonóides, os di-C- glicosilflavonóides, os O-glicosil-C-glicosilflavonóides e os O-acil-C-glicosilflavonóides (HARBORNE; WILLIAMS, 2000; JAY; VIRICEL; GONNET, 2006). Ensaios farmacológicos com flavonóides C-glicosídeos na sua forma isolada também demonstram atividades de grande interesse. Orientina e vitexina, isoladas das folhas de Trollius chinensis Bunge, demonstraram potente atividade antiviral contra o vírus Parainfluenza tipo 3 (LI et al., 2002), além de vitexina e isoorientina, isoladas de Arum palaestinum , as quais apresentaram atividade antimicrobiana contra Escherichia coli e Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya 68

Staphylococcus aureus (AFIFI; SHERVINTON; DARWISH, 1997). Também são relatadas atividade antioxidante e antiinflamatória para os compostos isoorientina e isovitexina (TUNALIER et al., 2007), além de atividade hipoglicemiante para isoorientina (SEZIK et al., 2005).

2.1.2 Flavonóides nas espécies C. glaziovii e C. pachystachya Conforme já apresentado, uma das classes de metabólitos secundários que mais se destaca para o gênero Cecropia são os flavonóides. Considerando as espécies estudadas, são relatados os flavonóides C-glicosídeos isoorientina, orientina e isovitexina para C. glaziovii, e isoorientina e isovitexina para C. pachystachya . Além disso, o flavonóide O-glicosídeo isoquercitrina também é relatado para ambas as espécies (LACAILLE-DUBOIS; FRANCK; WAGNER, 2001; TANAE et al., 2007). O artigo a seguir descreve o processo de isolamento e identificação dos flavonóides C- glicosídeos majoritários das folhas das espécies de C. glaziovii e C. pachystachya , além de uma análise da sazonalidade destes compostos em C. glaziovii .

PUBLICAÇÃO: Chemical characterization of Cecropia glaziovii Sneth. and Cecropia pachystachya Trécul. leaves and seasonal variation of the major flavonoids from Cecropia glaziovii Sneth. Geison M. Costa, Caroline F. Ortmann, Lara A. Zimmermann, Eloir P. Schenkel, Flávio H. Reginatto Biochemical Systematics and Ecology -Manuscrito em preparação-

Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 69

Chemical characterization of Cecropia glaziovii Sneth. and Cecropia pachystachya

Trécul. leaves and seasonal variation of the major flavonoids from Cecropia

glaziovii .

Geison M. Costa, Caroline F. Ortmann, Lara A. Zimmermann, Eloir P. Schenkel, Flávio

H. Reginatto *

Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Catarina,

Campus Universitário Trindade, CEP 88040-900, Florianópolis, SC, Brazil

* Corresponding author. Tel.: +55 48 3721-5075.

E-mail address: [email protected]

Abstract

Five substances were isolated from the leaves of Cecropia glaziovii and Cecropia pachystachya . Isoorientin and isovitexin were isolated from C. glaziovii while from C. pachytachya , orientin, reported for the first time from this species, and also isoorientin and isovitexin were isolated. Other compounds such as chlorogenic acid and isoquercitrin were also identified for both species. Seasonal variation were observed for isoorientin and isovitexin from C. glaziovii by HPLC-DAD analysis, with higher content in January (1.0 and 1.9 mg/g of dry weight, respectively), while the lower contents were observed in March and May for isoorientin (0.2 mg/g of dry weight) and

September, for isovitexin (0.8 mg/g of dry weight).

Keywords – Cecropia glaziovii ; Cecropia pachystachya ; phenolic compounds; C- glycosylflavonoids; seasonality; HPLC-DAD.

Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 70

1. Introduction

The two most common species from the Cecropia genus (Urticaceae) in

Southeast and South of Brazil are Cecropia glaziovii Sneth. and Cecropia pachystachya

Trécul. (Berg and Rosselli, 2005). These species are popular known as ‘embaúba’ and widely used in the folk medicine to treat cough, asthma, high blood pressure, inflammations and as diuretics (Pio Corrêa, 1976; Lorenzi and Matos, 2008). Recently, some additional pharmacological properties, such as antihypertensive, cardiotonic, sedative, anxiolytic-like and antidepressive-like, have been reported (Rocha, Lapa, De

Lima, 2002 ; Consolini and Migliori, 2005; Consolini et al., 2006; Lima-Landmann et al., 2007; Ninahuamann et al., 2007; Rocha et al., 2007).

Previous studies had report the presence of C-glycosylflavonoids as one of the major compounds for the genus (Lacaille-Dubois; Franck; Wagner, 2001; Oliveira et al.,

2003; Tanae et al., 2007). Although these species posses distinct morphologies, there are few studies in the literature which evaluated their chemical fingerprint or possible seasonal variations, especially from aqueous extract, that is used in the folk medicine.

The aims of this work were the isolation and identification of the C- glycosylflavonoids in the aqueous extracts from the leaves of C. glaziovii and C. pachystachya and also evaluate a possible seasonality for the two major C- glycosylflavones (isoorientin and isovitexin) from C. glaziovii leaves.

2. Material and methods

2.1. Chemicals

Chlorogenic acid and isovitexin (4’,5,7-trihydroxyflavone-6-glucoside) were purchased from Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Isoquercitrin (3’,4’,5,7- tetrahydroxyflavone-3-O-glucoside) were from Carl Roth (Germany). Isoorientin Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 71

(3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavone-6-glucoside) and orientin (3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavone-

8-glucoside) were previous isolated from Passiflora edulis var. flavicarpa , and identified by TLC, UV, IR and 1H NMR spectrometry methods. The purity of these three compounds was more than 98%. Water was purified with a Milli-Q system

(Millipore, Bedford, USA) and all solutions prepared for HPLC were passed through a

0,45 m filter before use. Acetonitrile and acetic acid (HPLC-grade) were provided by

Tedia ® (Brazil). Methanol, ethanol, acetic acid, acetone and ethyl acetate ( p.a. -grade) were provided by Vetec ® (Brazil).

2.2. Plant material

Aerial parts of C. glaziovii Sneth. were colleted in Florianópolis, State of Santa

Catarina, Brazil, in September, 2007. Voucher specimens (FLOR 37143) of the material are deposited in the Herbarium of the Botany Department of Universidade Federal de

Santa Catarina, Florianópolis, Brazil. Aerial parts of C. pachystachya Trécul. were colleted in March, 2007 in Viamão, State of Rio Grande do Sul, Brazil and a herbarium specimen (ICN 150025) is on deposit in the Botany Department of Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil.

2.3. Extraction and isolation

The different species were treated and extracted as the same form. The leaves were air-dried (30-35°C) and powdered. The infusion (30 minutes) was prepared by adding 1000 mL of boiling water to 100 g of powdered leaves. After cooling, the extract was filtered and evaporated under reduced pressure until a volume of 500 mL. The crude extracts were stirred with 50 g of Amberlite ® XAD-16 during 1 hour. After, the mixture was filtered and resin stirred again (1 h) with 500 mL of methanol. This MeOH Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 72 solution was then filtered and the solvent removed under reduce pressure. This procedure was repeated until yield 5 g of MeOH fraction from each Cecropia species.

MeOH fraction from C. pachystachya (5 g) was submitted to vacuum column chromatography over silica gel (Merck 60), using a gradient of ethyl acetate:methanol, starting with 100% ethyl acetate to 100% methanol. The fractions were pooled accordyling their chromatographic profile by TLC, yielding four sub-fractions (A, B, C, and D). Sub-fractions B (984 mg) and C (2 520 mg) were chromatographed, separately, on a silica gel column (70-230 Mesh), eluted with ethyl acetate:acetone:acetic acid:water (60:20:10:10 v/v/v/v), yielding 11 pooled fractions from each column. These fractions were purified on a Sephadex LH-20 column, using a gradient with increasing polarity of ethanol:methanol [100% EtOH, EtOH:MeOH (1:1), 100% MeOH], resulting in compound CP1 (36.4 mg), CP2 (40.8 mg), CP3 (3.3 mg).

MeOH fraction from C. glaziovii (5 g) was also submitted to vacuum column chromatography with the same conditions described before, yielding seven sub-fractions

(A - G). Sub-fraction B (94 mg) yielded pure compound CG1 (9.0 mg) after column chromatography on silica gel (230-400 Mesh) using ethyl acetate:acetone:acetic acid:water (60:20:10:10 v/v/v/v) as mobile phase. CG2 (9.0 mg) was isolated from sub- fraction D (104 mg) by column chromatography on silica gel (230-400 Mesh) using ethyl acetate:formic acid:water (80:10:10 v/v/v) as mobile phase.

The identity of the compounds were established by TLC [Silica gel plates, using

EtOAc:HCOOH:H 2O (80:10:10 v/v/v) as mobile phase and diphenylboryloxyethylamine 1% in methanol, followed by PEG 400 (5%, w/v) (Natural

Reagent) as color reagent], by HPLC-DAD co-chromatography (chromatographic system describe at section 2.4), by UV spectra/shift reagents (Markham, 1982; Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 73

Andersen; Markham, 2006) (PerkinElmer Lambda 25) 1H NMR (Varian AS, 400MHz), and by comparison with literature data.

2.4. Seasonal analysis

For seasonality analysis, leaves of C. glaziovii Sneth. were colleted in

Florianópolis, SC, Brazil, bimonthly, between January 2008 and January 2009. A similar number of leaves (3-4, depending on the leaf size) were randomly collected from the lower branches of the trees. To reduce variation among leaves within a sample, we specifically avoided the hard and resected leaves. The different collections were treated and extracted with the same procedures. The leaves were air-dried (30-35 °C), powdered and extracted by infusion as described above. The crude extracts were lyophilized and stored (-20 °C) until use.

Chromatographic analyses of the crude extracts were carried out in a

PerkinElmer (Series 200) HPLC system, equipped with EP Diode Array Detection

(DAD), quaternary pump, on-line degasser and autosampler. The data acquisition system was achieved by TotalChrom Workstation software. Separation was performed using a PerkinElmer Brownlee Choice C 18 column (150 x 4,6 mm i.d.) and linear gradient combining solvent A (acetonitrile) and solvent B (acetic acid 1%, adjusted to pH 3.0 with NaOH) as follow: 5-20% A (0-30 min) and isocratic 20% A (30-40 min).

The mobile phase was prepared daily and degassed by sonication before use. The flow rate was kept constant at 1.0 mL/min and the chromatograms were recorded at 340 nm while the UV spectra were monitored over a range of 450 to 200 nm. The phenolic compounds were characterized by comparing the retention time with reference standards, by co-injection of standards by adding them to the extracts and by UV spectra. The methodology parameter specificity, linearity, accuracy, precision, Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 74 sensibility was validated according to Cass and Degani, (2001), ANVISA (2003) and

ICH guidelines (2005).

2.5 Statistical analysis

Data from seasonal variations were expressed as mean ± SD values of triplicates. Differences between treatments were compared by one-way analysis of variance, followed by Tukey’s test for approximately normally distributed variables.

Data analyses were performed using the SPSS version 13.0 software package (SPSS

Inc., Chicago, IL), and the statistical significance was set at the 0.05 level (two-tailed) for isovitexin and 0.001 (two-tailed) for isoorientin.

3. Results and Discussion

3.1. Isolation and identification

Analysis of the crude aqueous extracts by TLC and HPLC-DAD showed different profiles between C. glaziovii and C. pachystachya based in their flavonoid fingerprint (Figure 1). Although previous phytochemical analysis reports the presence of flavonoids in these species (Lacaille-Dubois et al., 2001; Oliveira et al., 2003; Tanae et al., 2007), there are an absence of comparative studies concerning the chemical profile between Cecropia species.

Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 75

Figure 1: Chromatograms of MeOH fractions from C. pachystachya (up) and C. glaziovii (down) leaves with diode array detection at 340 nm. 1. Chlorogenic acid; 2.

Isoorientin; 3. Orientin; 4. Isovitexin; 5. Isoquercitrin. For chromatographic conditions, see Experimental section.

Thereafter, both extracts were fractionated and three flavonoids were isolated from C. pachystachya , codified as CP1 (36.4 mg), CP2 (40.8 mg), CP3 (3.3 mg). By co- chromatographic analysis with standard C-glycosylflavonoids and UV spectra/shift reagents, CP1 was identified as isoorientin, CP2 as orientin and CP3 as isovitexin.

Additionally, CP1 and CP2 were submitted to 1H NMR spectrometry analysis in order to confirm its identity. (Table 1).

Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 76

Table 1: 1H NRM ( δ ppm) of compounds CP1 and CP2 in DMSO, compared with literature data for isoorientin and orientin, respectively. Compound CP1 Isoorientin (Peng et al., 2005) Compound CP2 Orientin (Li et al., 2006)

1H (multiplicity, 1H (multiplicity, Attribution 1H (multiplicity, 1H (multiplicity, Attribution J Hz) J Hz) J Hz) J Hz) 13.55 (S) 13.55 5-OH 13.17 (S) - 5-OH

7.40 (d, 2.15) 7.44 (dd, 2.5) 6’ H 7.57 (d, 2.15) - 6’ H

7.37 (d, 2.15) 7.38 (d, 2.5) 2’ H 7.55 (d, 2.15) 7.55 (m) 2’ H, 6’ H

6.86 (d, 8.20) 6.90 (d, 9.0) 5’ H 6.83 (d, 8.0) 6.65 (d, 8.7) 5’ H

6.64 (S) 6.64 (S) 3-H 6.61 (S) - 3-H

6.44 (S) - 8-H 6.22 (S) 6.27 (S) 6-H

4.56 (d, 9.76) 4.58 (d, 10.0) 1’’ H 4.68 (d, 9.76) 4.69 (d, 9.80) 1’’ H

(-): not reported in these literatures.

From C. glaziovii , two flavonoids were isolated, codified as CG1 (9 mg) and

CG2 (9 mg). TLC and HPLC-DAD co-chromatography with compounds previously

isolated from C. pachystachya , together UV spectra/shift reagents led identified CG1 as

isovitexin and CG2 as isoorientin (Table 2).

Table 2: Phenolic compounds identified in C. pachystachya and C. glaziovii leaves * Common name Rt (min) UV λλλmáx (nm) Identification

Chlorogenic acid 14,0 300sh, 325 a

Isoorientin 24,5 255, 270, 348 a + b + c

Orientin 25,7 255, 266, 348 a + b + c

Isovitexin 28,8 270, 337 a + b

Isoquercitrin 31,7 255, 354 a

*All substances were compared with respectively reference samples. a TLC and HPLC-DAD co-chromatography; bUV spectra with shift reagents; c 1 H-RMN. Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 77

These flavonoids have been described for these Cecropia species (Andrade-

Cetto and Wiedenfeld, 2001; Lacaille-Dubois et al., 2001; Tanae et al., 2007), with exception of orientin. As far as we aware, is the first report of orientin to C. pachystachya leaves. Besides those compounds, other two phenolic compounds were recorded for these species, chlorogenic acid and isoquercitrin.

3.2. Seasonal variation of major C-glycosylflavonoids in C. glaziovii

Although literature reports a seasonal and intraspecific variation of total flavonoids and proanthocyanidins content in C. glaziovii (Luenga-Caicedo et al., 2007) there are no seasonality studies of individual flavonoids in any Cecropia specie. The content of the major C-glycosylflavonoids were recorded in wild plants at various stages of development bimonthly since January/08 till January/09.

The analysis of crude aqueous extracts from Cecropia species did not show difference in the chromatographic fingerprint, but showed significative quantitative differences on the content of the major C-glycosylflavonoids in the extracts, isoorientin and isovitexin. Isoorientin showed the highest content in January/08 (1.0 mg/g of dry weight) and the lowest during March and May, with 0.2 mg/g of dry weight in these months. Considering isovitexin, the month that show higher concentration was also

January/08 (1.9 mg/g of dry weight), while the lower content was found in September

(0.8 mg/g of dry weight) (Table 3, Figure 2).

Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 78

Table 3: The C-glycosylflavonoids content in C. glaziovii leaves during January/08 and January/09.

Month Content (mg/g dry weight)*

Isoorientin Isovitexin January/08 1.0 ± 0.005 a 1.9 ± 0.010 a

March 0.2 ± 0.005 b 1.4 ± 0.001 b

May 0.2 ± 0.006 b 1.3 ± 0.006 c

July 0.3 ± 0.002 c 1.1 ± 0.016 d

September 0.5 ± 0.020 d 0.8 ± 0.022 e

November 0.8 ± 0.016 e 1.3 ± 0.023 f

January/09 0.5 ± 0.009 d 1.4 ± 0.003 b

*: Data are mean ± SD values, expressed as mg/g of dry weight. Means in columns followed by the same letters indicate no significant differences ( P < 0.05).

2,5

2

1,5 Isovitexin Isoorientin 1

0,5 Content (mg/g dry weight) dry (mg/g Content

0

h ly r r u e 09 rc May J b / a m mbe ry M te e a p nu anuary/08 e a J S Nov J

Figure 2: Variation in the content of the two major C-glycosylflavonoids from C. glaziovii in the period from January, 2008 to January, 2009.

Flavonóides em C. glaziovii e C. pachystachya - Publicação 79

Although Menkovic et al. (2000) propose that during the flowering phase, leaves of Gentiana lutea are rich with flavonoids possessing mainly C-glycoside structures, our results showed that these period are not with higher content of C-glycosylflavonoids in C. glaziovii leaves. The phase of flowering for this specie is since August to

December, and in these months, it is possible to observe an increase in the content of isoorientin, while isovitexin showed the lowest content in September, which shows a distinct characteristics of isoorientin and isovitexin concerning its concentration in the plant. Nevertheless, the analysis showed the higher contents of both compounds are in the summer.

4. Acknowledgements

This project was supported by CNPq (Grant: 475826/2008-6) and FAPESC

(Grant: 008/2006). The authors also thank to Prof. Dra. Lilian A. Mentz and Prof. Dr.

Daniel Falkenberg for colletion and identification of plant materials.

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DISCUSSÃO GERAL

Discussão geral 84

Nos últimos anos, um expressivo aumento no número de trabalhos científicos com espécies de Cecropia ampliou os relatos sobre a constituição química e atividades farmacológicas deste gênero. Esses estudos, realizados por diversos grupos de pesquisa do mundo, inclusive Brasil e demais países da América Latina, contribuem com um maior conhecimento científico sobre o gênero, e a compilação destas informações da literatura faz- se necessária vista a importância etnofarmacológica e potencial uso terapêutico das espécies em questão. Em vista disso, foi elaborada uma revisão objetivando compilar os dados sobre a composição química e atividades farmacológicas do gênero Cecropia até o presente momento. Esta revisão, apresentada no capítulo 1 desta dissertação, englobou cerca de 70 trabalhos científicos, onde se destacam estudos sobre as espécies C. glaziovii, C. obtusifolia , C. lyratiloba e C. pachystachya. Amplamente utilizadas na medicina tradicional, estas espécies são empregadas no tratamento da tosse, asma, diabetes, pressão alta, problemas cardíacos, inflamações e como diuréticas (PIO CORRÊA, 1978; MORS; RIZZINI; PEREIRA; 2000; DI STASI et al., 2002). Em relação à composição química, os estudos fitoquímicos relatam, na sua maioria, a presença de triterpenos (HIKAWCZUK et al., 1998; ROCHA et al., 2007b; MACHADO et al., 2008; SCHINELLA et al., 2008), flavonóides e proantocianidinas (LACAILLE-DUBOIS; FRANCK; WAGNER, 2001; OLIVEIRA et al., 2003; TANAE et al., 2007) como os principais constituintes do gênero Cecropia , sendo que muitos destes metabólitos ocorrem concomitantemente em diferentes espécies. A maioria dos ensaios farmacológicos realizados com espécies de Cecropia são relacionados às atividades hipoglicemiante (ANDRADE-CETTO; WIEDENFELD, 2001; ANDRADE-CETTO; BECERRA-JIMÉNEZ; CÁRDENAS-VÁZQUEZ, 2008), hipotensora (ALMEIDA et al., 2006; LIMA-LANDMAN et al., 2007; NINAHUAMAN et al., 2007) e ação sobre o sistema nervoso central tais como ansiolítica (ROCHA; LAPA; De LIMA, 2002), sedativa (CONSOLINI et al., 2006) e antidepressiva (ROCHA et al., 2007a). Na literatura, observa-se um elevado número de publicações com as espécies C. glaziovii e C. obtusifolia nos últimos 7 anos. Para a primeira espécie, destacam-se estudos referentes a atividade anti-hipertensiva, para a qual sugere-se como mecanismo de ação o bloqueio dos canais de cálcio na musculatura lisa, sendo apontada a isovitexina como um dos possíveis componentes ativos (LIMA-LANDMAN et al., 2007; NINAHUAMAN et al., 2007). Atividades tipo antidepressiva e ansiolítica também têm sido avaliadas para esta Discussão geral 85

espécie e os autores sugerem as procianidinas B2, B3 e catequina como responsáveis pelo bloqueio na recaptação de serotonina, dopamina e noradrenalina (ROCHA; LAPA; De LIMA, 2002; ROCHA et al., 2007a). Já C. obtusifolia possui diversos relatos sobre seus efeitos hipoglicemiantes, apresentando inclusive dois estudos clínicos (HERRERA-ARELLANO et al., 2004; REVILLA-MONSALVE et al., 2007). Os dados obtidos até o momento sugerem o ácido clorogênico como o responsável por esta atividade, embora o mecanismo de ação desta atividade ainda não esteja totalmente esclarecido (ALONSO-CASTRO et al., 2008; ANDRADE-CETTO; BECERRA-JIMÉNEZ; CÁRDENAS-VÁZQUEZ, 2008). A espécie C. pachystachya é encontrada em diferentes biomas no território brasileiro, como Mata Atlântica, Pantanal e Cerrado (BERG; ROSSELLI, 2005). Devido a esta ampla distribuição, alguns pesquisadores divergem no que diz respeito a ocorrência ou não desta espécie no Sul do país. Alguns estudiosos defendem que, além de C. glaziovii , a outra espécie predominante nesta região seria denominada C. catarinensis e não C. pachystachya (CARAUTA, 1996). Esse impasse botânico poderia ser esclarecido por meio de análises químicas entre espécies coletadas como C. pachystachya e C. catarinensis . A diferenciação entre as espécies foi realizada por CCD e CLAE-DAD entre espécies de C. pachystachya coletadas em Campo Verde-MT (FLOR 37051) e Campo Grande-MS (FLOR 37052) e espécie coletada em Viamão-RS (ICN 150025). Os resultados demonstraram não haver diferenças no perfil fitoquímico entre os extratos aquosos destas três amostras. Contudo, a amostra coletada em Viamão apresentou um maior teor de compostos fenólicos quando comparada às outras duas amostras. Considerando a similiaridade química entre as amostras, optou-se pelo uso da denominação C. pachystachya para o material trabalhado nesta dissertação. A avaliação e caracterização dos constituintes químicos de um extrato vegetal, englobando inclusive seus teores no extrato, as variações destes constituintes em diferentes épocas do ano e o emprego de técnicas analíticas modernas, como a cromatografia líquida de alta eficiência, são fatores fundamentais na garantia da qualidade desse extrato. (HE, 2000; GOBBO-NETO; LOPES, 2007; LANÇAS, 2008). Mesmo apresentando composição química semelhante, com vários compostos em comum, o perfil cromatográfico de C. glaziovii e C. pachystachya é distinto. Para C. glaziovii , foi identificado como composto majoritário a isovitexina, enquanto que para C. pachystachya, o flavonóide majoritário foi identificado como isoorientina. Essa diferenciação é facilmente observada em técnicas cromatográficas como CCD e CLAE, visto que há uma predominância Discussão geral 86

de flavonas de núcleo apigenina em C. glaziovii e flavonas de núcleo luteolina em C. pachystachya . Sendo assim, foram realizadas análises para a identificação e quantificação dos compostos fenólicos majoritários presentes nas folhas de ambas as espécies, dados apresentados no Capitulo 2. Embora existam relatos de flavonóides C-glicosídeos nas espécies C. glaziovii (orientina, isoorientina e isovitexina) e C. pachystachya (isoorientina e isovitexina), pouco ainda é conhecido sobre seus constituintes (LACAILLE-DUBOIS; FRANCK; WAGNER, 2001; TANAE et al., 2007). Análises cromatográficas por CCD e CLAE-DAD com amostras de referência permitiram identificar cinco compostos fenólicos em ambos os extratos: o ácido fenólico ácido clorogênico, os flavonóides C-glicosídeos isoorientina, orientina, isovitexina e o flavonóide O-glicosídeo isoquercitrina. Com exceção desta última, as demais subtâncias apresentam-se como compostos majoritários, quer seja no extrato de C. glaziovii , C. pachystachya ou em ambos. Dessa maneira, foi desenvolvido um método por CLAE-DAD para quantificar estas quatro substâncias. A quantificação dos compostos majoritários sugere que C. pachystachya apresenta um maior conteúdo correspondente a estes quatro compostos, quando comparada a C. glaziovii , sendo o ácido clorogênico o composto com maior teor em ambas as espécies ( C. pachystachya : 3,4 mg/g planta seca; C. glaziovii : 1,8 mg/g planta seca). Já em relação aos flavonóides C-glicosídeos, C. glaziovii apresenta isovitexina como flavonóide majoritário (0,9 mg/g planta seca) enquanto que para C. pachystachya os flavonóides majoritários são isoorientina e orientina (2,1 e 2,2 mg/g planta seca, respectivamente). É importante ressaltar que a quantificação do ácido clorogênico faz-se relevante pelo fato deste composto ser apontado como o responsável pela atividade hipoglicemiante de C. obtusifolia (ANDRADE-CETTO; WIEDENFELD, 2001; ALONSO-CASTRO et al., 2008; ANDRADE-CETTO; BECERRA-JIMÉNEZ; CÁRDENAS-VÁZQUEZ, 2008). Alguns trabalhos inclusive apresentam dados sobre os teores de ácido clorogênico encontrados nesta espécie. Um ensaio clínico empregou extratos nos quais o conteúdo deste composto era de aproximadamente 3,0 mg/g de planta seca (HERRERA-ARELLANO et al., 2004). Posteriormente, outro trabalho apontou concentrações diferentes para este ácido fenólico, em torno de 13,2 mg/g de planta seca (NICASIO et al., 2005). A grande disparidade no conteúdo de ácido clorogênico destes dois estudos, entre diversos fatores, pode ser devido ao processo extrativo, uma vez que o primeiro emprega um extrato obtido por infusão aquosa e o segundo, um extrato por maceração em metanol. Outros dois estudos, os quais empregaram extratos Discussão geral 87

preparados de forma padronizada, descrevem que 13,5 g de extrato contém 2,91 mg de ácido clorogênico (aproximadamente 0,21 mg/g extrato) (REVILLA-MONSALVE et al., 2007; TOLEDO et al., 2008). Sendo assim, os teores de ácido clorogênico encontrados para C. glaziovii (1,8 mg/g planta seca) e C. pachystachya (3,4 mg/g planta seca) são semelhantes ao descrito por Herrera-Arellano e colaboradores (2004) para C. obtusifolia , o que pode tornar promissora a investigação da atividade hipoglicemiante para C. glaziovii e C. pachystachya . A análise do conjunto dos resultados obtidos e as correspondentes análises estatísticas indicaram que a metodologia desenvolvida para as análises quantitativas apresentou as características exigidas de exatidão, precisão, especificidade e linearidade (CASS; DEGANI, 2001; ICH, 2005). Com relação ao processo de isolamento foi utilizada a resina Amberlite ® XAD-16 para a obtenção de uma fração enriquecida em flavonóides C-glicosídeos. Esse procedimento, previamente descrito na literatura (ROSLER, 1984; COLETA et al., 2006), apresenta-se como uma alternativa à técnica clássica de partição, possuindo certas vantagens como custo e tempo reduzido, além de apresentar resultados efetivos. A partir destas frações enriquecidas, foram iniciados trabalhos de isolamento dos flavonóides C-glicosídeos majoritários presentes nas folhas de C. glaziovii e C. pachystachya , bem como a caracterização destes compostos no material vegetal frente a uma possível variação sazonal. Cabe destacar que os extratos foram preparados na forma de infusão das folhas (chá), semelhante à forma empregada pela população em suas preparações medicinais (PIO CORRÊA, 1978; ROCHA; LAPA; De LIMA, 2002; LORENZI; MATOS, 2008). Assim, foram isolados dois flavonóides C-glicosídeos das folhas de C. glaziovii , isovitexina e isoorientina. Das folhas de C. pachystachya foram isolados três flavonóides C- glicosídeos, isoorientina, orientina e isovitexina, além de uma flavona codificada como CP4. Orientina é aqui relatada pela primeira vez para a espécie C. pachystachya. Além disso, ensaios preliminares com a substância CP4, como análises cromatográficas por CCD e CLAE-DAD com substâncias de referência, espectros de UV com adição de reagentes de deslocamento ( Tabela 1), além de comparação com dados da literatura, sugerem que este composto possua uma estrutura distinta em relação aos flavonóides já relatados para o gênero Cecropia (Figura 3; Tabela 2,) (LACAILLE-DUBOIS; FRANCK; WAGNER, 2001; OLIVEIRA et al., 2003; TANAE et al., 2007).

Discussão geral 88

Tabela 1: Máximos de absorção e deslocamentos nos espectros UV da substância CP4. Solvente/ λλλ máximo (nm) Deslocamento avaliado Informações Reagente (nm)* estruturais Banda II Banda I Banda II Banda I propostas MeOH 270 333 - - Núcleo flavona NaOMe 278 397 - + 64, sem -OH livre em C- decréscimo da 4’ intensidade NaOAc 271; 299 343 + 1 - Não possui –OH livre em C-7 NaOAc + 270 338 - + 5 Não possui

H3BO 3 grupamento o- diidroxil

AlCl 3 277; 303 349; 380 - Sem Não possui deslocamento grupamento o- em relação OH

AlCl 3 + HCl

AlCl 3 + HCl 279; 302 342; 380 - + 47 -OH livre em C-5 *: Deslocamento observado após a adição dos reagentes apresentados. Discussão geral 89

Tabela 2: Máximos de absorção e deslocamentos nos espectros UV de flavonóides relatados para o gênero Cecropia . (MARKHAM, 1982; ANDERSEN; MARKHAM, 2006) Máximos de absorção e deslocamentos (nm)

6-C-galactosil- Solvente/ 6’’-O-βββ- Reagentes Isoorientina Vitexina Isovitexina Rutina galactopiranosil apigenina MeOH 242sh; 255; 270; 302sh; 271; 336 259; 266sh; 272; 336 271; 349 336 299sh; 359 NaOMe 267; 278; 279; 329;3 278; 329; 272; 327; 280; 330; 394 337sh; 406 95 398 410

AlCl 3 278; 302sh; 277; 305; 262sh; 278; 275; 303sh; 279; 304; 353 332; 429 350; 386 304; 352; 433 382

AlCl 3 + 265sh; 279; 278; 303; 260sh; 280; 271; 300; 281; 304 346 HCl 296sh; 361; 343; 383 302; 344; 364sh; 402 384 380 NaOAc 276; 323; 393 280; 300; 279; 303; 271; 325; 280; 379 379 385 393 NaOAc + 265; 377; 272; 329sh; 274; 346; 262; 298; 272; 343

H3BO 3 429sh 344 408sh 387

Figura 3: Cromatografia por CCD com a substância CP4 (em destaque) e flavonóides descritos na literatura para o gênero Cecropia . Sistema cromatográfico: AcOEt:HCOOH:H 2O (80:10:10, v/v); NP/PEG / UV 366 . 1. rutina, 2. orientina, 3. isoorientina, 4. vitexina, 5. isoquercitrina, 6. isovitexina. Discussão geral 90

Até o momento, as análises permitem inferir certas características estruturais da substância CP4, tais como: o valor de Rf deste composto em análise por CCD no sistema empregado ( Figura 3) é caracterísco de flavonóides glicosilados, mais especificamente de di- glicosídeos, tendo em vista valores de Rf de outros flavonóides di-glicosiladas utilizados como referência (rutina, vitexina 2”-O-ramnosídeo, spinosina). Além disso, seu perfil cromatográfico apresenta coloração condizente a núcleo apigenina ou ainda genkwanina, quando revelada com Reagente Natural / PEG (WAGNER; BLADT, 1996). Essa característica também é observada em análises por CLAE-DAD, através do espectro obtido da substância, ou ainda através dos ensaios no UV com adição de reagentes de deslocamento, que apontam hidroxilações em C-5 e C-4’ e ausência de hidroxila em C-7, ou então a presença de uma metoxila ou um O-glicosídeo nesta posição (Figura 4 ).

3' OH 4' 2' R2 B R 8 1 7 O 5' 2 6' AC 6 3 R 3 5 OH O

Figura 4: Fórmula estrutural proposta até o momento para a substância CP4. R 1 = H ou OMe ou O-açúcar; R 2 e R3 = H ou açúcar.

Outro item investigado na presente dissertação foram as possíveis alterações no perfil químico dos extratos brutos de C. glaziovii em relação a sua composição flavonoídica devido a variações sazonais, assim como possíveis alterações nos teores de isovitexina e isoorientina, dois dos flavonóides C-glicosídeos majoritários deste extrato. A análise dos extratos aquosos liofilizados das folhas de C. glaziovii coletadas em diferentes épocas do ano (Janeiro/2008 à Janeiro/2009) não indicou alteração qualitativa no perfil de flavonóides C-glicosídeos nestes extratos, contudo, foram observadas variações quantitativas, em especial dos compostos isovitexina e isoorientina. O primeiro apresentou concentração máxima e mínima, respectivamente, nos meses de janeiro/08 (1,9 mg/g planta seca) e de setembro (0,8 mg/g planta seca). Isoorientina apresentou maior concentração no vegetal no mês de janeiro/08 (1,0 mg/g planta seca), sendo, o menor teor deste flavonóide observado nos meses de março e maio (0,2 mg/g planta seca em ambos os meses) ( Figura 5 ). Discussão geral 91

2,5

2

1,5 Isovitexina Isoorientina 1

Teor (mg/gTeor planta seca) 0,5

0

8 o io o 9 a lh 0 /0 u arç M J jan M jan/ Setembro Novembro Figura 5: Variação do teor dos flavonóides majoritários em Cecropia glaziovii.

No caso da isoorientina é observada uma redução no seu conteúdo no mês de março, mantendo valores baixos também nos meses de maio e julho, tornando a aumentar a partir do mês de setembro. No que concerne ao conteúdo de isovitexina é possível verificar um descréscimo a partir do mês de março, e que se estende mais lentamente ao longo do ano, atingindo o menor teor em setembro. A literatura relata variações nos teores de isoorientina em Gentiana lutea , as quais estariam relacionadas ao estágio de desenvolvimento do vegetal, apontando para um acúmulo de isoorientina no período de floração (MENKOVIC; SAVIKIN-FODULOVIC; SAVIN, 2000). Para a espécie C. glaziovii , o período de floração ocorre entre os meses de agosto e dezembro (LORENZI, 2002), período no qual é possível observar um aumento no teor de isoorientina na planta, embora não sejam estes os meses onde o conteúdo deste composto se mostrou mais elevado. Por outro lado, a isovitexina apresenta o seu menor teor durante este período. O flavonóide C-glicosídeo isovitexina ocorre como o flavonóide majoritário em extratos aquosos de C. glaziovii , independente da época do ano em que seja realizada a coleta. Em C. pachystachya , a predominância das duas C-glicosilflavonas do tipo luteolina (isoorientina e orientina), em teores semelhantes, são características para esta espécie. Considerando a conhecida estabilidade destes compostos, suas concentrações no vegetal e o papel que desempenham nas atividades farmacológicas já descritas, pode-se propor a utilização destes flavonóides como marcadores químicos na caracterização destes materiais vegetais. Discussão geral 92

Adicionalmente aos resultados já descritos neste trabalho, foram realizados ensaios farmacológicos com extratos e frações de C. glaziovii preparados ao longo deste trabalho, através de colaborações com o Laboratório de Virologia Aplicada, sob responsabilidade da Prof.ª Dr.ª Cláudia M. O. Simões, e com o Laboratório de Pesquisa de Imunologia, sob responsabilidade da Prof.ª Dr.ª Tânia Fröde, ambos laboratórios desta instituição. A avaliação da atividade antiviral foi desenvolvida pela mestranda Izabella Thais da Silva, sob orientação da Prof.ª Cláudia M. O. Simões. Os ensaios, realizados a partir de fracionamentos bioguiados, iniciaram com o extrato bruto das folhas de C. glaziovii . Foram avaliadas a citotoxicidade das amostras, assim como sua potencial atividade antiviral frente a vírus herpético tipo 1 (HSV-1), cepas KOS e vírus herpético tipo 2 (HSV-2), cepa 333. Os resultados obtidos demonstraram que a espécie C. glaziovii possui promissora atividade antiviral, em especial frente ao vírus HSV-1, sendo que o fracionamento bioguiado levou a obtenção de uma fração enriquecida em flavonóides C-glicosídeos, a qual apresentou promissor índice de seletividade (IS > 130) (SILVA et al., 2008). Ao longo do fracionamento bioguiado, foi observada uma correlação entre o conteúdo de flavonóides totais com a atividade antiviral. Além disso, análises cromatográficas por CLAE-DAD da fração enriquecida em flavonóides C-glicosídeos apontam a isovitexina como o composto majoritário desta fração. Entretanto, não foi encontrado relato prévio na literatura sobre atividade antiviral para esta substância. A avaliação da atividade antiinflamatória foi desenvolvida pela mestranda Janaína Koelzer, sob orientação da Prof.ª Dr. Tânia Fröde. O objeto de estudo foi o extrato aquoso das folhas de C. pachystachya e suas frações, avaliados em quadros de inflamação em camundongos, pelo modelo de pleurisia. O estudo demonstrou que C. pachystachya teve significativa atividade antiinflamatória inibindo a exsudação e o influxo de leucócitos do tipo polimorfonucleares, células as quais estão relacionadas à resposta inflamatória aguda, no local da inflamação, sendo a fração acetato de etila a que apresentou os resultados mais promissores (KOELZER et al., 2008). Conforme verificado em análises cromatográficas, os compostos majoritários deste extrato são os flavonóides C-glicosídeos isoorientina e orientina, os quais poderiam estar relacionados com a atividade anti-inflamatória observada, uma vez que a literatura relata esse tipo essa atividade para isoorientina (TUNALIER et. al., 2007). A atividade poderia ainda ocorrer devido à presença de compostos não identificados no extrato bruto e que também se fazem presentes na fração acetato de etila.

CONCLUSÕES

Conclusões 94

• Foi caracterizada através de CCD e CLAE-DAD a presença de flavonóides C- glicosídeos e ácido clorogênico nas espécies Cecropia glaziovii e Cecropia pachystachya , constatando-se para C. glaziovii, a predominância de C-glicosilflavonas com núcleo do tipo apigenina enquanto C. pachystachya apresentou predominância de C-glicosilflavonas com núcleo do tipo luteolina • Foram isolados dois flavonóides C-glicosídeos a partir das folhas de C. glaziovii , identificados como isovitexina e isoorientina. A partir das folhas de C. pachystachya , foram isolados quatro flavonóides de núcleo flavona; três flavonóides C-glicosídeos, identificados como isoorientina, orientina e isovitexina, além de uma flavona de núcleo do tipo apigenina, codificada como CP4, sendo este o primeiro relato de orientina para a espécie C. pachystachya e o primeiro relato de CP4 no gênero Cecropia . • A metodologia analítica desenvolvida para separação, identificação e quantificação dos compostos fenólicos majoritários das folhas das espécies C. glaziovii e C. pachystachya por CLAE-DAD apresentou as características desejáveis de especificidade, linearidade, precisão e exatidão. • Os compostos majoritários foram analisados e quantificados, sendo os teores dos compostos fenólicos verificados nos extratos aquosos brutos de C. glaziovii , em mg/g de planta seca: ácido clorogênico: 1,8; isoorientina: 0,4; orientina: 0,1; isovitexina: 0,9 e para C. pachystachya : ácido clorogênico: 3,4; isoorientina: 2,1; orientina: 2,2; isovitexina: 0,9. • Análises da variação sazonal dos flavonóides C-glicosídeos majoritários de C. glaziovii no período de Janeiro de 2008 à Janeiro de 2009 demonstraram que os maiores teores tanto de isovitexina quanto isoorientina ocorreram no mês de Janeiro/08 (1,9 e 1,0 mg/g planta seca, respectivamente). Já os menores teores foram observados nos meses de Setembro, para isovitexina (0,8 mg/g planta seca), e Março à Maio, para isoorientina (0,2 mg/g planta seca).

REFERÊNCIAS

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APÊNDICES

Apêndices 105

1 Figura 6: Espectro de RMN H da substância CP1 em DMSO-d6 Apêndices 106

1 Figura 7: Espectro de RMN H ampliado da substância CP1 em DMSO-d6 Apêndices 107

1 Figura 8: Espectro de RMN H ampliado da substância CP1 em DMSO-d6 Apêndices 108

1 Figura 9: Espectro de RMN H da substância CP2 em DMSO-d6 Apêndices 109

1 Figura 10: Espectro de RMN H ampliado da substância CP2 em DMSO-d6 Apêndices 110

1 Figura 11: Espectro de RMN H ampliado da substância CP2 em DMSO-d6

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